(57)【要約】      （修正有）【課題】マメ科カンゾウ属に属する植物種を簡便に、かつ正確に同定する方法を提供する。【解決手段】マメ科カンゾウ属に属する植物の植物種を同定する方法は、当該植物の抽出物を得る抽出物取得工程Ｓ０１と、抽出物を精製して精製物を得る精製物取得工程Ｓ０２と、精製物のＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲデータを取得するＮＭＲ測定工程Ｓ０３と、ＮＭＲデータに基づいて多変量解析処理を行う解析工程Ｓ０４と、解析結果に基づいて植物種を同定する同定工程Ｓ０５とを含み、精製物取得工程において、抽出物に固相抽出処理を施し、所定濃度の低級アルコール水溶液にて溶出させた画分として精製物を得る。【選択図】図１
2019066291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マメ科カンゾウ属に属する植物の抽出物を得る抽出物取得工程と、
前記抽出物を精製して精製物を得る精製物取得工程と、
前記精製物のＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲデータを取得するＮＭＲ測定工程と、
前記ＮＭＲデータに基づいて多変量解析処理を行う解析工程と、
前記解析結果に基づいて前記植物の種を同定する同定工程と
を含み、
前記精製物取得工程において、前記抽出物に固相抽出処理を施し、所定濃度の低級アルコール水溶液にて溶出させた画分を前記精製物として得ることを特徴とするカンゾウの植物種の同定方法。
【請求項２】
前記低級アルコール水溶液の濃度が、３０〜９９容量％であることを特徴とする請求項１に記載のカンゾウの植物種の同定方法。
【請求項３】
前記低級アルコール水溶液の濃度が、５０〜８０容量％であることを特徴とする請求項１に記載のカンゾウの植物種の同定方法。
【請求項４】
前記カンゾウ属に属する植物が、グリチルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glycyrrhiza inflata）又はグリチルリーザ・ウラレンシス（Glycyrrhiza uralensis）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカンゾウの植物種の同定方法。
【請求項５】
前記解析工程において、前記ＮＭＲデータに主成分解析処理を施して主成分スコアを算出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカンゾウの植物種の同定方法。
【請求項６】
前記同定工程において、前記主成分スコアに基づいて、前記植物の種を同定することを特徴とする請求項５に記載のカンゾウの植物種の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マメ科カンゾウ属に属する植物の種を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マメ科カンゾウ属には、多数の植物種が属する。カンゾウ属に属する代表的な植物として、グリチルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glycyrrhiza inflata）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glycyrrhiza uralensis）等が知られている。カンゾウ属に属する植物の抽出物は、抗炎症作用、抗酸化作用、抗菌作用等の生理活性を有するとともに、甘味を呈することから、医薬品、化粧品、食品等に添加される添加材料として広く用いられている。
【０００３】
カンゾウ属に属する植物からの抽出物が有する生理活性は、例えば植物種に応じて異なる場合がある。また、複数の植物種からの抽出物が同一の生理活性を示すとしても、その生理活性の強さが植物種に応じて異なる場合もある。そのため、目的とする生理活性が効果的に奏されるカンゾウ抽出物を得るために、当該生理活性を効果的に奏し得る特定の植物種を抽出原料として用いて抽出物を取得するのが望ましい。しかしながら、抽出原料としてのカンゾウの根茎部等の外観から植物種を同定することは極めて困難であるため、カンゾウ属に属する植物種を正確に同定する方法が求められている。
【０００４】
従来、植物種を同定する方法として、代謝酸物を含む抽出物を同定対象の植物種から取得し、当該抽出物に含まれる代謝産物と植物種を同定するための同定マーカーとを比較し、その比較結果に基づいて植物種を同定する方法等が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０５９０６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１に記載の方法においては、２種以上の植物種の混合物の抽出物が、同定マーカーと合致する代謝産物を含むか否かを検索し、その代謝産物を質量分析法等により定量する。そして、同定マーカーと合致する代謝産物の蓄積量が統計学的に有意に多い場合、その植物種が同定マーカーに対応する種であると同定することができる。
【０００７】
しかしながら、マメ科カンゾウ属に属する植物種においては、抽出物中に含まれる植物種に特有の成分に基づき質量分析法等を用いてその含有量を定量したり、それにより種を同定したりすることは、抽出物中に含まれる夾雑物の影響が大きいため、非常に困難である。
【０００８】
上記課題に鑑みて、本発明は、マメ科カンゾウ属に属する植物種を簡便に、かつ正確に同定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は、マメ科カンゾウ属に属する植物の抽出物を得る抽出物取得工程と、前記抽出物を精製して精製物を得る精製物取得工程と、前記精製物のＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲデータを取得するＮＭＲ測定工程と、前記ＮＭＲデータに基づいて多変量解析処理を行う解析工程と、前記解析結果に基づいて前記植物の種を同定する同定工程とを含み、前記精製物取得工程において、前記抽出物に固相抽出処理を施し、所定濃度の低級アルコール水溶液にて溶出させた画分を前記精製物として得ることを特徴とするカンゾウの植物種の同定方法を提供する。
【００１０】
前記低級アルコール水溶液の濃度が、３０〜９９容量％であるのが好ましく、５０〜８０容量％であることがより好ましい。前記カンゾウ属に属する植物が、グリチルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glycyrrhiza inflata）又はグリチルリーザ・ウラレンシス（Glycyrrhiza uralensis）であることが好ましい。
【００１１】
前記解析工程において、前記ＮＭＲデータに主成分分析処理を施して、主成分スコアを算出するのが好ましく、前記同定工程において、前記主成分スコアに基づいて、前記植物の種を同定するのが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、マメ科カンゾウ属に属する植物種を簡便に、かつ正確に同定する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係るカンゾウ種の同定方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、試験例１における５０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットである。
【図３】図３は、試験例１における８０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットである。
【図４】図４は、試験例２における５０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットである。
【図５】図５は、試験例２における８０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本実施形態に係るカンゾウ種を同定する方法は、マメ科カンゾウ属に属する植物の抽出物を得る抽出物取得工程と、当該抽出物を精製して精製物を得る精製物取得工程と、当該精製物のＮＭＲ測定を行い、ＮＭＲデータを取得するＮＭＲ測定工程と、ＮＭＲデータに基づいて多変量解析処理を行う解析工程と、多変量解析処理の解析結果に基づいて植物の種を同定する同定工程とを含む。
なお、本明細書において「種」とは、生物分類学上の種を意味するものとし、種の下位概念である亜種、品種等も含むものである。
【００１５】
〔抽出物取得工程（Ｓ１）〕
同定対象であるマメ科カンゾウ属に属する植物を準備し、その抽出物を取得する。本実施形態における「抽出物」には、植物を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はそれらの粗精製物等が含まれる。
【００１６】
マメ科カンゾウ属に属する植物は、多年生草本であり、当該植物としては、例えば、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）、グリチルリーザ・アスペラ（Glychyrrhiza aspera）、グリチルリーザ・ユーリカルパ（Glychyrrhiza eurycarpa）、グリチルリーザ・パリディフロラ（Glychyrrhiza pallidiflora）、グリチルリーザ・ユンナネンシス（Glychyrrhiza yunnanensis）、グリチルリーザ・レピドタ（Glychyrrhiza lepidota）、グリチルリーザ・エキナタ（Glychyrrhiza echinata）、グリチルリーザ・アカンソカルパ（Glychyrrhiza acanthocarpa）等の種が存在する。これらのうち、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）及びグリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）は、それらの植物種に含まれる代表的な成分が既知であり、また化粧品、食品等の添加材料や生薬として広く用いられているため、同定対象の植物として好適である。同定対象の植物は、上記各種の植物のうちから選択される１種であってもよいし、２種以上の混合物であってもよい。好ましくは、同定対象の植物は、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）及びグリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）のうちの１種である。
【００１７】
本実施形態において、抽出原料として使用されるカンゾウの構成部位としては、例えば、葉部、茎部等の地上部；根茎部等が使用され得る。好ましくは、当該構成部位として、根茎部が使用され得る。
【００１８】
マメ科カンゾウ属に属する植物の抽出物は、天然物の抽出に一般に使用されている抽出方法によって取得され得る。例えば、抽出原料を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、上記抽出物が取得される。抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒を用いて脱脂等の前処理が施されたものを抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理が行われた抽出原料が使用されることで、上記植物の抽出処理を効率的に行うことができる。
【００１９】
抽出溶媒としては、例えば、水、親水性有機溶媒等の極性溶媒を使用するのが好ましく、特に親水性有機溶媒を使用するのが好ましい。これらの抽出溶媒は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用されてもよく、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用され得る。
【００２０】
抽出溶媒として使用され得る水には、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理が施されたものが含まれる。水に施される処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が挙げられる。したがって、本実施形態において抽出溶媒として使用され得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等が含まれ得る。
【００２１】
抽出溶媒として使用され得る親水性有機溶媒には、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が含まれ得る。
【００２２】
２種以上の極性溶媒の混合液が抽出溶媒として使用される場合、その混合比は適宜調整され得る。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液が抽出溶媒として使用される場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比（容量基準）を９：１〜１：９とすればよく、７：３〜１：９とするのが好ましく、５：５〜１：９とするのが特に好ましい。また、水と低級脂肪族ケトンとの混合液が抽出溶媒として使用される場合には、水と低級脂肪族ケトンとの混合比（容量基準）を９：１〜２：８とするのが好ましい。さらに、水と多価アルコールとの混合液が抽出溶媒として使用される場合には、水と多価アルコールとの混合比（容量基準）を５：５〜１：９とするのが好ましい。
【００２３】
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限りにおいて特に制限されるものではなく、常法に従って行われ得る。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量基準）の抽出溶媒に抽出原料を浸漬させ、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液から溶媒を留去するとペースト状の濃縮物が得られ、この濃縮物をさらに乾燥すると乾燥物が得られる。
【００２４】
〔精製物取得工程（Ｓ２）〕
上記のようにして取得された抽出物に固相抽出処理を施して精製することで、精製物を取得する。後述するように、本実施形態に係る同定方法においては、ＮＭＲスペクトルデータを多変量解析処理に供することで算出されたＰＣＡスコアに基づいて、カンゾウの植物種を同定する。上記のようにして取得された抽出物には、カンゾウの植物種に代表的な成分が含まれるものの、当該抽出物をＮＭＲ測定に付すると、当該代表的な成分以外の成分（夾雑物）を示すＮＭＲスペクトルの影響により、カンゾウの植物種を正確に同定することが困難となるおそれがある。しかしながら、本実施形態のように、上記抽出物に固相抽出処理を施して取得した精製物についてＮＭＲ測定を行うことで、上記代表的な成分以外の成分（夾雑物）を示すＮＭＲスペクトルの影響を最小限にすることができるため、カンゾウの植物種を正確に同定することができる。
【００２５】
固相抽出処理としては、例えば、予め固定相が充填されたカラムを用いて当該カラムに抽出物を通液させるカラム法、抽出物を含む溶液に固定相を添加するバッチ法等が挙げられるが、いずれの方法が使用されてもよい。上記固相抽出処理に使用され得るカラムとしては、例えば、Ｓｅｐ−Ｐａｋシリーズ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、ＯＡＳＩＳシリーズ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、ＩｎｅｒｔＳｅｐシリーズ（ジーエルサイエンス社製）、Ｓｔｒａｔａシリーズ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、ＢｏｎｄＥｌｕｔシリーズ（アジレント・テクノロジー社製）等が挙げられる。
【００２６】
上記固相抽出処理において抽出物を固定相に接触させることで、抽出物に含まれる各種成分を固定相に保持させ、当該固定相に保持されている各種成分を所定の溶出液にて溶出させ、上記精製物としての溶出画分を得る。目的とする精製物（溶出画分）を得るための溶出液としては、例えば、所定濃度の低級アルコール水溶液が使用され得る。低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール等が挙げられる。低級アルコール水溶液の濃度は、３０容量％以上であるのが好ましく、５０〜８０容量％であるのがより好ましい。低級アルコール水溶液の濃度が３０容量％以上、特に５０容量％以上であることで、溶出画分に含まれる所定の成分を指標として、カンゾウの植物種を容易に同定することができる。後述する実施例等から明らかなように、例えば、メタノール抽出物の５０容量％メタノール水溶液により溶出された溶出画分には、カンゾウの植物種に代表的な水溶性フラボノイド類が含まれる。また、メタノール抽出物の８０容量％メタノール水溶液により溶出された溶出画分には、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分としてのグラブリジン（Glabridin）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的成分としてのリコカルコンＡ（licochalcone A）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分としてのグリシクマリン（glycycoumarin）等の脂溶性フラボノイド類、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分としてのグリチルリチン酸（Glycyrrhizin）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的成分としてのリコリスサポニンＨ２（Licorice-saponin H2）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分としてのリコリスサポニンＧ２（Licorice-saponin G2）等サポニン類等が含まれ得る。なお、本実施形態においてカンゾウの植物種を正確に同定するためには、上記のようにして得られる精製物（溶出画分）に、カンゾウの植物種を同定するための指標となる代表的成分が主に含まれ、その他の成分（交雑物）が可能な限り含まれていないのが望ましい。したがって、所定濃度（例えば５０〜８０容量％）の低級アルコール水溶液の溶出画分を取得するのに先立ち、それよりも低濃度（例えば０〜３０容量％）の低級アルコール水溶液を溶出液として用い、その他の成分（交雑物）を溶出させておくのが好ましい。
【００２７】
〔ＮＭＲ測定工程（Ｓ３）〕
上記精製物取得工程により取得された溶出画分（例えば、５０〜８０容量％の低級アルコール水溶液により溶出された溶出画分）を重溶媒（ＤＭＳＯ−ｄ6、メタノール−ｄ4、ピリジン−ｄ5、アセトン−ｄ6、重水−ｄ2等）に溶解させて、ＮＭＲ測定用のサンプル溶液を調製する。そして、当該サンプル溶液を1Ｈ−ＮＭＲ測定に供し、ＮＭＲスペクトルデータを取得する。本実施形態においては、上記精製物（溶出画分）をＮＭＲ測定に供し、得られたＮＭＲスペクトルデータを後述する解析工程（Ｓ４）に供し、多変量解析を行う。一般に、植物抽出物に含まれる各種成分を同定する方法として、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）が用いられるが、本発明者らが鋭意検討した結果、ＬＣ／ＭＳを用いたとしても、カンゾウの植物種を同定するのが困難であった。しかしながら、本実施形態のように、上記精製物のＮＭＲ測定により得られたＮＭＲスペクトルデータを用いて多変量解析を行うことで、後述する実施例からも明らかなように、カンゾウの植物種を正確に同定することができる。
【００２８】
ＮＭＲの測定条件（測定パラメータ等）は、特に限定されるものではなく、例えば、所定濃度（３０容量％以上）の低級アルコール水溶液による溶出画分に含まれるカンゾウ種の代表的な成分を有意に検出可能な範囲で適宜設定されればよい。
【００２９】
〔解析工程（Ｓ４）〕
上記ＮＭＲ測定工程により取得されたＮＭＲスペクトルデータを、バケット積分により、データ量のより小さいＮＭＲのヒストグラムデータに縮約する。バケット積分は、ＮＭＲスペクトルデータのケミカルシフト軸（周波数軸）に沿った観測範囲を一定幅（典型的には０．０４ｐｐｍ）の刻みで多数のバケット（ケミカルシフトの小区間）に分割して、各パケットのＮＭＲスペクトルの強度の積分を行う処理である。その結果として、多数のバケットの積分値のセットからなるヒストグラムが、ＮＭＲスペクトルデータの縮約として得られる。バケット積分は、例えば、ＮＭＲ処理ソフト（例えば、ＡＬＩＣＥ２ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ，日本電子社製等）等を用いて行われ得る。
【００３０】
このようにして得られたヒストグラムデータが多変量解析処理に供せられる。多変量解析の具体的手法としては、例えば、主成分（ＰＣＡ）分析、ＳＩＭＣＡ（Soft Independent Modeling of Class Analogy）分析等が挙げられ、特に主成分（ＰＣＡ）分析が好ましい。主成分（ＰＣＡ）分析においては、サンプルの成分である多数の変数の座標軸からなる多次元空間中で、サンプル間の相違（分散）が最も顕著に現われる少数本（例えば３本程度）の新しい座標軸が定義され、新しい座標軸上での各サンプルの座標値が計算される。新しい座標軸は「主成分軸」と称され、各主成分軸に沿った変数は「主成分」と称され、各サンプルの各主成分軸上の座標値は「スコア」と称される。本実施形態において、上記溶出画分のＮＭＲ測定により取得されたＮＭＲスペクトルデータをバケット積分し、得られたヒストグラムデータを主成分分析に供することで、カンゾウの植物種に含まれる代表的成分のＰＣＡスコアを算出する。なお、多変量解析処理もまた、例えば、ＮＭＲ処理ソフト（例えば、ＡＬＩＣＥ２ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ，日本電子社製等）等を用いて行われ得る。
【００３１】
〔同定工程（Ｓ５）〕
上記のようにして算出されたＰＣＡスコアに基づいて、カンゾウの植物種を同定する。カンゾウの植物種に含まれる代表的成分のＰＣＡスコアは、各植物種において異なる。したがって、予め、カンゾウの各植物種に含まれる代表的成分のＰＣＡスコアを求めておき、上記解析工程（Ｓ４）にて算出されたＰＣＡスコアと、予め求めておいたカンゾウの各植物種のＰＣＡスコアとを対比することで、カンゾウの植物種を正確に同定することができる。
【００３２】
例えば、後述する実施例からも明らかであるが、精製物取得工程（Ｓ２）において５０〜８０容量％低級アルコール水溶液を溶出液として用い、水抽出物又はメタノール抽出物から得られた溶出画分に主成分分析を実施すると、ローディングプロット上において、各植物種の代表的成分である水溶性フラボノイド類、脂溶性フラボノイド類、サポニン類等がＮＭＲチャートのケミカルシフト値に対応してプロットされる。そして、ＰＣＡスコアプロットを確認することで、各々の植物種を分類することができる。したがって、植物種が未知であるマメ科カンゾウ属に属する植物について、上記のようにしてＰＣＡスコアを求めることで、その植物種を簡便に、かつ正確に同定することができる。
【００３３】
上述したように、本実施形態によれば、同定対象であるカンゾウの抽出物を固相抽出処理により精製した精製物をＮＭＲ測定に供し、得られたＮＭＲスペクトルデータを多変量解析処理に供することで、カンゾウの植物種を簡便に、かつ正確に同定することができる。
【００３４】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
【実施例】
【００３５】
以下、試験例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の試験例等に何ら限定されるものではない。
【００３６】
〔試験例１〕
カンゾウの植物種として、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の根茎部（１０ｇ）、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の根茎部（１０ｇ）及びグリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の根茎部（１０ｇ）を準備し、各根茎部を抽出溶媒としてのメタノールで還流抽出し、エバポレータで溶媒を留去して３種のカンゾウの抽出物を得た。
【００３７】
超純水（４ｍＬ）に溶解させた各抽出物（１５０ｍｇ）を固相抽出処理に供した。具体的には、各抽出物の溶液をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８ ２０ｃｃ Ｖａｃ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｇ，Ｗａｔｅｒｓ社製）に通液させた後、溶出液としての水、３０容量％メタノール、５０容量％メタノール、８０容量％メタノール及びメタノールを用いてその順で溶出させ、各溶出液を分取し、溶媒を留去することで精製物としての各溶出画分を得た。
【００３８】
得られた各溶出画分のうち、５０容量％メタノール溶出画分と８０容量％メタノール溶出画分とのそれぞれを、濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように重溶媒（ＤＭＳＯ−ｄ6）に溶解させ、ＮＭＲ測定用サンプル溶液を調製し、1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。ＮＭＲの測定条件は、下記の通りとした。
【００３９】
＜ＮＭＲ測定条件＞
測定装置：Ａｇｉｌｅｎｔ ４００ＭＲ ＶＮＭＲＳ４００（アジレント・テクノロジー社製）
サンプル濃度：１０ｍｇ／ｍＬ
重溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ6 
測定温度：２０℃
遅延時間：１．５ｓｅｃ
パルス幅：４５．０ｄｅｇｒｅｅ
観測時間：３．５ｓｅｃ
積算回数：１６回
【００４０】
上記ＮＭＲ測定により得られたＮＭＲスペクトルデータをバケット積分処理に付し、データ量のより小さいＮＭＲのヒストグラムデータに縮約した。バケット積分処理において、バケット積分幅を０．０４ｐｐｍとし、Ｈ2Ｏ及びＤＭＳＯの信号近傍を主成分（ＰＣＡ）分析の対象としない領域とするために削除した。また、1Ｈスペクトルの０〜１０ｐｐｍ幅でバケット積分した全積分値を「１００」と設定した。
【００４１】
得られたヒストグラムデータを主成分（ＰＣＡ）分析に供してＰＣＡスコアを算出した。なお、ＮＭＲスペクトルデータのバケット積分処理及びヒストグラムデータの主成分（ＰＣＡ）分析処理は、ＮＭＲ処理ソフト（ＡＬＩＣＥ２ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ，日本電子社製）を用いて行われた。３種のカンゾウについての５０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットを図２に、８０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットを図３に示す。図２及び図３に示すＰＣＡスコアプロットにおいて、「○」はグリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）のＰＣＡスコアを示し、「×」はグリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）のＰＣＡスコアを示し、「△」はグリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）のＰＣＡスコアを示す。
【００４２】
図２に示す結果から明らかなように、３種のカンゾウの５０容量％メタノール溶出画分に含まれる各代表的成分（水溶性フラボノイド類）が、ＰＣＡスコアプロットにおいて判別可能であることが確認された。具体的には、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値６．７４ｐｐｍ、７．３０ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。また、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値５．３０ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。さらに、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値７．０２ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。そして、これらのケミカルシフト値から、各植物種の代表的成分が水溶性フラボノイド類であると同定された。
【００４３】
また、図３に示す結果から明らかなように、３種のカンゾウの８０容量％メタノール溶出画分に含まれる各代表的な脂溶性成分（グラブリジン（Glabridin）、リコカルコンＡ（licochalcone A）、グリシクマリン（glycycoumarin）等）が、ＰＣＡスコアプロットにおいて判別可能であることが確認された。具体的には、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値７．７４ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。また、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値７．８２ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。さらに、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値６．７４ｐｐｍ、１．６６ｐｐｍ、１．５８ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。そして、これらのケミカルシフト値から、各植物種の代表的成分がグラブリジン（Glabridin）、リコカルコンＡ（licochalcone A）、グリシクマリン（glycycoumarin）などの脂溶性成分であると同定された。
【００４４】
〔試験例２〕
抽出溶媒を超純水に変更した以外は、試験例１と同様にして、３種のカンゾウについての５０容量％メタノール溶出画分及び８０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアを算出した。５０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットを図４に、８０容量％メタノール溶出画分のＰＣＡスコアプロットを図５に示す。図４及び図５に示すＰＣＡスコアプロットにおいて、「○」はグリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）のＰＣＡスコアを示し、「×」はグリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）のＰＣＡスコアを示し、「△」はグリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）のＰＣＡスコアを示す。
【００４５】
図４に示す結果から明らかなように、３種のカンゾウの５０容量％メタノール溶出画分に含まれる各代表的成分（水溶性フラボノイド類）が、ＰＣＡスコアプロットにおいて判別可能であることが確認された。具体的には、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値７．３０ｐｐｍ、６．７４ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。また、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値７．０２ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。さらに、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値１．８６ｐｐｍにプロットされることが確認された。そして、これらのケミカルシフト値から、各植物種の代表的成分が水溶性フラボノイド類であると同定された。
【００４６】
また、図５に示す結果から明らかなように、３種のカンゾウの８０容量％メタノール溶出画分に含まれる代表的なサポニン成分（グリチルリチン酸（Glycyrrhizin）、リコリスサポニンＨ２（Licorice-saponin H2）、リコリスサポニンＧ２（Licorice-saponin G2）等）が、ＰＣＡスコアプロットにおいて判別可能であることが確認された。具体的には、グリチルリーザ・グラブラ（Glychyrrhiza glabra）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値０．９８ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。また、グリチルリーザ・インフラータ（Glychyrrhiza inflata）の代表的は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値３．４６ｐｐｍ、１．８６ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。さらに、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glychyrrhiza uralensis）の代表的成分は、ローディングプロット上において、ＮＭＲチャートのケミカルシフト値３．７４ｐｐｍに対応してプロットされることが確認された。そして、これらのケミカルシフト値から、各植物種の代表的成分がグリチルリチン酸（Glycyrrhizin）、リコリスサポニンＨ２（Licorice-saponin H2）、リコリスサポニンＧ２（Licorice-saponin G2）等のサポニン類であると同定された。
【００４７】
試験例１及び試験例２の結果から、マメ科カンゾウ属に属する植物であるが、種が不明なものについて、その抽出物の固相抽出処理により得られる精製物をＮＭＲ測定に付し、そのスペクトルデータを主成分分析処理に付して算出されるＰＣＡスコアに基づいて、当該植物の種を容易に、かつ正確に同定可能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、医薬品、化粧品、食品等に添加される添加材料や生薬として使用可能なマメ科カンゾウ属に属する植物の種を簡便に同定する方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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