(57)【要約】【課題】骨格筋の萎縮抑制に効果的な栄養素を提供すること。【解決手段】本願の発明者は、大豆ペプチドに着目し、高齢者の筋萎縮という観点から無負荷モデルで引き起こされる筋萎縮に対する大豆ペプチドの効果を検討し、鋭意研究を進めた結果、大豆ペプチドに、骨格筋の萎縮抑制作用と骨格筋の成長促進作用があることを見出した。すなわち本発明は、大豆ペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤及び筋成長促進剤である。大豆ペプチドの種類は特に限定されないが、好ましくは、分子量が５０００以下の大豆ペプチドが望ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆ペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤。
【請求項２】
大豆ペプチドを有効成分とする筋成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋の萎縮を抑制する作用のある筋萎縮抑制剤と、骨格筋の成長を促進させる作用のある筋成長促進剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省によると、現在、日本には500万人近くの要支援・要介護認定者がおり、その中には寝たきり状態や、下肢の障害で歩行が困難な状態の患者がいる。このような患者では、骨格筋萎縮が進み、筋量が減少し、如いては機能低下を招く。また高齢者社会を迎え、老化によってサルコペニアを引き起こし骨格筋量が減少して、行動力の低下とともに、生活の質低下を招いている。このような骨格筋萎縮にともなう行動力の低下・変容は社会的に深刻な問題であり、そのメカニズムの解明と治療法の開発が求められている。
【０００３】
また、無重力の宇宙空間では骨格筋、特に抗重力筋である遅筋線維の萎縮とそれに伴う筋力の低下など、生体に有害な変化が起こるが、有効な対処法は未だ開発されていない。しかしながら、長期間宇宙に滞在する宇宙飛行士の筋萎縮の抑制は、今後人類が宇宙開発を進める上において解決しなければならない重要な課題である。
【０００４】
無重力での宇宙飛行では、抗重力筋（体幹筋、大腿四頭筋、下腿三頭筋など）が随意筋（上腕二頭筋）よりも萎縮しやすく、遅筋の速筋化が生じる。微小重力下での筋の萎縮は、最初の一、二週間が最も激しく、その後はゆっくりになる。６ヶ月の飛行後には、筋量、筋肉、最大酸素摂取能は平均１０〜２０％減少し、帰還後の回復には６週間を要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
身体組成は加齢とともに大きく変化する。ヒトでは30歳を過ぎると10年ごとに約5％前後の割合で筋量が減少する。また、60歳を超えるとその減少率はさらに加速するといわれている。この骨格筋の萎縮は、骨格筋内でのタンパク質の合成と分解のインバランスが生じ、筋タンパク質量が減少することによって起こる筋萎縮である。
【０００６】
高齢者の筋萎縮の原因は、加齢、低栄養、や身体活動量の低下が要因として挙げられる。また、高齢者の場合、筋力の低下が誘導され、それがもとで転倒や骨折のリスクが増加し、寝たきりなど要介護状態に陥る場合も少なくない。この筋萎縮を改善する方法として運動が効果的である報告がなされているが、運動することのできない介護状態の方やベット生活を強いられた方の筋萎縮を予防・改善するためには運動以外の方法が必須である。
【０００７】
そこで本発明の目的は、骨格筋の萎縮抑制に効果的な栄養素を見出すことにある。さらに本発明の目的は、骨格筋の成長を促進させるのに効果的な栄養素を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願の発明者は、大豆ペプチドに着目し、高齢者の筋萎縮という観点から無負荷モデルで引き起こされる筋萎縮に対する大豆ペプチドの効果を検討し、鋭意研究を進めた結果、大豆ペプチドに、骨格筋の萎縮抑制作用と骨格筋の成長促進作用があることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、大豆ペプチドを有効成分とする筋萎縮抑制剤及び筋成長促進剤である。大豆ペプチドの種類は特に限定されないが、好ましくは、分子量が５０００以下の大豆ペプチドが望ましい。
【００１０】
なお本発明において、所望の形態の製剤を調製するために、本発明の効果を損なわない範囲で、その用途や形態に応じて、様々な成分や添加物を適宜選択し、一種またはそれ以上を併用して配合させてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
ギブスなどによる固定や不使用、老化、寝たきり、無重力の宇宙空間への暴露などによって筋重量の低下を起こし得る環境下であっても、本発明の筋萎縮抑制剤を継続して摂取することにより、骨格筋の萎縮を効果的に抑制できる。また、本発明の筋成長促進剤を継続して摂取することにより、骨格筋の萎縮を効果的に抑制できると同時に、骨格筋の成長を促進させることができる。
【００１２】
したがって、本発明の筋萎縮抑制剤及び筋成長促進剤は、例えば、加齢に伴う筋力低下の予防、こどもの体力低下の予防、病後体力回復（骨折などによる筋萎縮の回復）、閉経後の筋力低下予防、カヘキシーによる筋萎縮の予防、宇宙飛行士の筋萎縮の予防などに有用である。さらに、本発明の筋成長促進剤は、スポーツ選手の筋力アップ、発育期の筋力アップ、労働者の筋力アップなどにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウスに対する筋萎縮誘導方法である尾部懸垂法を示す図である。
【図２】実験結果を示すグラフである。
【図３】実験結果を示すグラフである。
【図４】実験結果を示すグラフである。
【図５】実験結果を示すグラフである。
【図６】実験結果を示すグラフである。
【図７】実験結果を示すグラフである。
【図８】実験結果を示すグラフである。
【図９】実験結果を示すグラフである。
【図１０】実験結果を示すグラフである。
【図１１】実験結果を示すグラフである。
【実施例１】
【００１４】
［実験１］AM摂取の筋湿重量に対する効果
この実験では、雄性ICRリタイアマウス （体重；平均42.3±2.7 g、日本エスエルシー株式会社） 20匹を用いた。
【００１５】
室温24±1℃、12時間昼夜逆転明暗サイクルの環境下にて、食餌及び飲料水を自由摂取とし、7日間個別ゲージにて飼育した。食餌はMF （オリエンタル酵母工業株式会社）を用い、飲料水は純水（正起薬品工業株式会社）及び175 mg/mLに調製した大豆ペプチドハイニュートAM （不二製油株式会社）を用いた。この実験で用いた大豆ペプチの分子量は５０００以下であった。
【００１６】
以下の表に示すとおり、これらのマウスを純水摂取群（以下「W群」）、純水摂取＋尾部懸垂群（以下「WTS群」）、大豆ペプチドハイニュートＡＭ摂取群（以下「AM群」）大豆ペプチドハイニュートAM摂取＋尾部懸垂群（以下「AMTS群」）の 4群に5匹ずつ分けた。不活動方法として1949年にEmily R.Moreyが考案した尾部懸垂法を用いた（図１参照）。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
尾部懸垂7日後、W群、WTS群、AM群、AMTS群の各マウスを麻酔下で屠殺して、体重および遅筋であるヒラメ筋と速筋である足底筋をそれぞれ採取した。ヒラメ筋と足底筋の重量は電子天秤（METTLER TOLEDO株式会社）にて小数第2位まで計測した。
【００１９】
今回の実験では、大豆ペプチドであるAM摂取により筋湿重量、骨格筋タンパク質量、筋細胞面積の萎縮が抑制した。しかしながら、今回の実験で尾部懸垂モデルは、ヒラメ筋に影響を与えたが、足底筋の筋湿重量と筋細胞面積に多少の減少傾向がみられただけで有意な差は観察されなかった。
【００２０】
［実験２］ＡＭ摂取の骨格筋タンパク質量に対する効果
実験１で採取した骨格筋を分析するまで-80℃で保存し使用した。筋原線維タンパク質含有量は、ブラッドフォード法に基づき595nmの波長でOdyssey（LI-OCR,Inc） にて吸光度を測定した。検量線は、BSA （BIO RAD, Bovine Serum Alubumin Standard Set）を使って引き、タンパク質量を求めた。図２に示すように、明らかに、大豆ペプチドハイニュートＡＭ（以下必要に応じて「ＡＭ」と略称）の投与により、骨格筋の萎縮が抑制された。
【００２１】
［実験３］ＡＭ摂取の筋細胞横断面積に対する効果
試料は、筋細胞横断面積を測定するために実験１と同様にマウスを飼育・採取した骨格筋を液体窒素で冷やしたイソペンタンで凍結させたのち液体窒素に移し保存したものを使用した。クリオスタット（LEICA,CM1510 S）で骨格筋中腹部の切片を作製した。HE染色を行い、筋細胞面積を各群100個ずつデジタルマイクロスコープ （KH-7700,株式会社HYROX） で計測した。 
【００２２】
＜統計的処理＞
データは平均±標準偏差で表した。データは一元配置分散分析を用いて有意差を確認し、多重比較 （Tukey） で各群の有意性について検討した。Ｐ＜0.05を有意とした。
【００２３】
図３に示すように明らかにヒラメ筋の尾牽引による萎縮はＡＭ投与により抑制された。このようにＡＭは何らかの機構で骨格筋の萎縮を抑制しているものと思われる。
【００２４】
［実験４］ＡＭ摂取が筋萎縮を促進するＴＮＦα発現に及ぼす効果
ＴＮＦαは尾牽引による骨格筋萎縮を誘導する有力な因子として報告されている。従って、ＡＭがこのＴＮＦαの阻害因子として働いている可能性が考えられることから、このＴＮＦαの活性と萎縮筋での遺伝子発現について検討した。
【００２５】
＜RT-PCR法によるTNF-αmRNA遺伝子発現＞
a. サンプルの調整
骨格筋を採取前に使用する器具類はオートクレーブで滅菌操作を行った。また加熱できないものに関してはRNase AWAY （Molevular Bio Productsa）を用いた。採取した骨格筋はRNAlater（QUIAGEN）で安定化させた。
【００２６】
b. RNA精製
QUIAGENのmiRNeasy Mini kitを用いてRNAの精製をおこなった。
上記aで調整したサンプルをチューブ（1.5mL滅菌バイオマッシャー：株式会社アシスト）に移し、700μLのQlAzol Lysis Regentを加えて、ホモジナイズした。ホモジナイズは株式会社ニッピのパワーマッシャーを用いた。操作方法はkitのプロトコルに従った。遠心操作は日立工機株式会社のhimac CR 15Dを用いた。
【００２７】
c. RNA精製度の確認
上記bで精製したRNAの一部を別のチューブに移し、10mM Tris - HCl pH7.5で12倍に希釈をした。これをA260とA280で測定し精製度を確認した。測定にはBio Photometer Plus（eppendorf）を用いた。精製度はA260/A280が1.8〜2.1が適当である。またRNA濃度の算出は、A260＝1が40μg/mLとしてRNA濃度＝40μg/mL× A260 ×希釈倍率の式より算出を行った。
【００２８】
d. cDNAの合成
上記bで精製したRNAを用いてcDNAの合成を行った。cDNAの合成は、Applied BiosystemsのHigh Capacity RNA-to-cDNA kitを用いた。操作方法はkitのプロトコルに従った。酵素反応装置はタイテック株式会社のGene Thermo Unit GTU-1615を用いた。
【００２９】
e. RT-PCR  ΔΔCt法による解析
合成したcDNAをテンプレートとしてPCRを行った。RT-PCRはApplied Bio systemsのABI  PRISM 7000を用いた。96wellプレートで内在性コントロールをβ‐アクチンとし、ΔΔCt法により解析を行った。
【００３０】
＜統計処理＞
解析を行い、ターゲット遺伝子、及び内在性コントロール遺伝子（β-actin）のCt値をソフトウェア上で算出し、ターゲット遺伝子のCt値及び内在性コントロールのCt値の平均値と標準偏差を求めた。内在性コントロールのCt値を用いた初期RNA量の補正を行い、標準偏差の値から、ΔCt値の標準偏差を算出した。基準とするサンプルのΔCt値をその他サンプルのΔCt値から引いて得られた値をΔΔCt値とした。
【００３１】
結果は、図４及び図５に示すとおりである。
【００３２】
ＴＮＦαの血液中の濃度はＡＭ投与により明らかに低下を示し、ＴＮＦαの活性を抑制したものと考えられる。しかしながら骨格筋での遺伝子発現をみるとＡＭのＴＮＦαの活性を抑制したものとは考えられない。
【００３３】
［実験５］ＡＭ摂取が筋成長を促進するＩＧＦ−１発現に及ぼす効果
上記のＴＮＦαによるタンパク質分解系の抑制効果をＡＭ投与に求めたが明確な変化は観察されなかった。そこで、ＡＭ投与はがより積極的に骨格筋萎縮を抑制している可能性を考え、骨格筋の肥大を誘導する因子ＩＧＦ−１に注目して実験を進めた。ＩＧＦ−１は骨格筋肥大時、あるいは骨格筋の発育発達時に顕著に増加することが知られている。
【００３４】
遺伝子は発現に関する実験方法はＴＮＦαの測定方法と基本的に同じである。
【００３５】
結果は、図６〜図８に示すとおりである。
【００３６】
実験の結果、図に示すように明らかにＡＭ投与によりＩＧＦ−１の濃度が増加することが判明した。さらにこのＩＧＦ−１の遺伝子発現かＡＭ投与により増加することが明らかとなった。またＩＧＦ−１の受容体であるＩＧＦ−１Ｒの増加が観察された。以上の結果から、ＡＭ投与によりＩＧＦ−１の遺伝子が発現し、合成されたＩＧＦ−１は自己分泌機構によりタンパク質合成を促し筋萎縮を抑制しているものと考えられる。
【実施例２】
【００３７】
ヒトが大豆ペプチドを摂取した際の骨格筋に及ぼす影響について調べるため、以下の実験を行った。
【００３８】
［実験の対象者］
実践女子大学ラクロス部に所属する20〜22歳の女子大学生30名である。
【００３９】
［実験の群分け］
大豆ペプチドハイニュートAM（不二製油株式会社）摂取群4名、プラセボ（乳糖）摂取群3名、何も摂取しない対照群10名の3群に分けて行った。大豆ペプチドハイニュートAM摂取群と、プラセボ（乳糖）摂取群には、サプリメントの形態で学生に摂取させた。なお
、この実験で用いた大豆ペプチの分子量は５０００以下であった。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
［サプリメント摂取期間］
99日間である。
【００４２】
［サプリメント摂取量］
朝、運動直後、就寝前の1日3錠（計150mg）各自で摂取してもらった。
【００４３】
［実験の測定方法］
体組成測定は株式会社バイオスペース社のボディコンポジションアナライザーInbodyを用いて測定した。
【００４４】
［実験結果］
図９は身体を構成する体タンパク質量を測定した結果である。大豆ペプチドハイニュートＡＭを摂取した群は明らかに摂取後増加した。
【００４５】
また、図１０に示すように、その体タンパク質の中でも骨格筋の量は統計的に有意に増加した。
【００４６】
また、図１１に示すように、また、脂肪の量は骨格筋とは逆に減少した。
【００４７】
［実験結果まとめ］
上述した各実施例の実験結果より、廃用性筋萎縮を惹起する条件下であっても、大豆ペプチドを継続して与えることで、骨格筋の萎縮が効果的に抑制されると同時に、骨格筋の成長が促進されることが確認された。
【００４８】
したがって、ギブスなどによる固定や不使用、老化、寝たきり、無重力の宇宙空間への暴露などによって筋重量の低下を起こし得る環境下であっても、本発明の筋萎縮抑制剤を継続して摂取することにより、骨格筋の萎縮を効果的に抑制できる。また、本発明の筋成長促進剤を継続して摂取することにより、骨格筋の萎縮を効果的に抑制できると同時に、骨格筋の成長を促進させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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