(57)【要約】【課題】本発明は、新規なアクアポリンおよびアクアグリセロポリン機能亢進剤を提供することを主な目的とする。【解決手段】本発明は、ヒアルロン酸またはその塩を有効成分として含有する、アクアポリンおよびアクアグリセロポリン機能亢進剤に関するものである。本発明機能亢進剤は、アクアポリンの機能を亢進し、腎性尿崩症、多尿、皮膚の乾燥、皮膚掻痒症、皮膚潰瘍、創傷、肥満若しくは脂肪肝の治療剤、小腸及び大腸での水分吸収促進剤、又は、眼、口腔、鼻粘膜及び気管の分泌促進剤、または膣の潤滑剤として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸又はその塩を有効成分として含有し、ヒアルロン酸又はその塩の粘度平均分子量が３０００−５０００である、アクアポリン機能亢進剤。
【請求項２】
皮膚の乾燥治療剤である、請求項１に記載のアクアポリン機能亢進剤。
【請求項３】
アクアポリンがアクアポリン３である、請求項１または２に記載のアクアポリン機能亢進剤。
【請求項４】
アクアポリン機能が、アクアポリンの水及びグリセロール透過機能である、請求項１〜４のいずれかに記載のアクアポリン機能亢進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸を含有するアクアポリン機能亢進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリン（ＡＱＰ）は細胞への水取り込みに関与する蛋白質で３００以下のアミノ酸からなる比較的小さい蛋白質である。通常、細胞膜を６回貫通し、Ｎ末端とＣ末端はいずれも細胞内に伸びる構造を有している。アスパラギン、プロリン、アラニンからなる保存された領域（ＮＰＡボックス）が配列中に２回存在し、これはほぼ全てのアイソフォームで保存されており、水の透過性を規定する役割をしている。細胞膜では通常４分子が集まって４量体で存在し、１つの分子に１つずつ約０．３ｎｍの小さな孔が開いており、水分子だけを選択的に通すことができる。アクアポリンには水だけでなく、水よりも分子径が大きく細胞内での水保持に重要なグリセロールや尿素などの分子を通過させる一群が存在し、アクアグリセロポリンと呼ばれる。アクアグリセロポリンでは、孔の径が少し広めになっている。このように、アクアポリンは水チャネルとして水透過に働く以外にもグリセリンや尿素などの小物質やガスの透過、細胞接着、細胞遊走などに働き、多様性があることが明らかになってきている。
【０００３】
アクアポリンは細菌から哺乳類、植物にまで普遍的に存在し、哺乳類では現在までに１３種類のアクアポリンアイソフォームの存在が確認されている。アクアポリンのアイソフォームは水を選択的に透過させるＡＱＰ０、ＡＱＰ１、ＡＱＰ２、ＡＱＰ４、ＡＱＰ５と、水のほかにグリセロールや尿素などの小分子を透過させるアクアグリセロポリンであるＡＱＰ３、ＡＱＰ７、ＡＱＰ９、ＡＱＰ１０、さらには、いずれにも分類されがたいＡＱＰ６、ＡＱＰ８、ＡＱＰ１１、ＡＱＰ１２の３つのグループに分けられる（非特許文献１）。
【０００４】
アクアポリンは、全身の臓器に分布しており、様々な疾病と関係があることも知られている（非特許文献２、３、４、５）。ＡＱＰ２は腎臓の集合管に存在して尿濃縮に重要な役割を果たしており、この遺伝子変異により腎性尿崩症になる。また、目の水晶体に存在するＡＱＰ０の遺伝子変異では白内障が起こる。一方、後天的な病気であるドライアイ、ドライマウスを主訴とするシェーグレン症候群では、ＡＱＰ５の細胞内での分布異常が原因であることが報告されている。ノックアウトマウスやラットの解析などからは、ＡＱＰ１、３、４が尿濃縮に、ＡＱＰ１、２、３、が膣の潤滑に、ＡＱＰ３が皮膚の湿潤保持、創傷治癒や小腸での水の吸収に、ＡＱＰ５が唾液分泌に、ＡＱＰ７がグリセロールの代謝を介して脂質代謝に、ＡＱＰ４が脳浮腫形成に関与していること等が分かってきている。
【０００５】
ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が二糖単位で直鎖状に結合した繰り返し構造を有している。生体内に極めて高分子で存在し、分子量は１００万以上になると言われる。生体内では、関節、硝子体、皮膚、脳など広く細胞外マトリックスに存在する。
【０００６】
ヒアルロン酸は、その優れた保水力や粘弾性をはじめとする様々な作用が注目され、化粧品、医薬品、食品の形態で利用されている。分子量約９５万または１００万の高分子ヒアルロン酸は、線維芽細胞増殖促進作用を有することが報告されている（非特許文献６)。また、４糖からなるヒアルロン酸（ＨＡ４）は、細胞保護作用を有することが報告されている（非特許文献７）。しかし、ヒアルロン酸がアクアポリンの機能を亢進することは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、７０、３０１−３２７、２００８
【非特許文献２】日本薬理学雑誌 １２２（３）, ２８０，２７３, ２００３
【非特許文献３】第１９回「大学と科学」  みずみずしい体のしくみ−水の通り道「アクアポリン」の働きと病気−、１０２−１１８、１５４−１６９、２００５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８６、２２１−２３１、２００８
【非特許文献５】Ｊ．Ｓｅｘ．Ｍｅｄ．２００８、５、７７−８２
【非特許文献６】Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ. 、９０ 、２６５−２７３、１９８８
【非特許文献７】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ. １０；２７７ （１９）：１７３０８−１７３１４、２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アクアポリン機能亢進剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討した結果、ヒアルロン酸がアクアポリンの機能を亢進する作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明として、下記のものを挙げることができる。
（１）ヒアルロン酸又はその塩を有効成分として含有する、アクアポリン機能亢進剤。
（２）アクアポリン機能亢進剤がアクアポリン２機能亢進剤またはアクアポリン３機能亢進剤である、上記（１）に記載のアクアポリン機能亢進剤。
（３）アクアポリン機能亢進剤が、皮膚の乾燥治療剤、腎性尿崩症及び多尿治療剤、皮膚掻痒症及び皮膚潰瘍治療剤、創傷治癒剤、肥満若しくは脂肪肝の治療剤、小腸及び大腸での水分吸収促進剤、眼、口腔、鼻粘膜及び気管の分泌促進剤、または、膣の潤滑剤である、上記（１）または（２）に記載のアクアポリン機能亢進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るアクアポリン機能亢進剤（以下、本発明機能亢進剤という。）は、アクアポリンおよびアクアグリセロポリンの機能を亢進することから、腎臓では尿濃縮作用（腎性尿崩症や多尿の改善）が期待され、小腸・大腸では水分吸収を促進することが期待され、眼、口腔、鼻粘膜、気管の分泌促進や膣の潤滑に有用であることが期待される。また、アクアグリセロポリンは水だけでなくグリセロールの取り込みや代謝に関与することから、本発明機能亢進剤は、皮膚では乾燥、皮膚掻痒症や皮膚潰瘍の治療、創傷治癒にも有効であると期待され、肝臓では、脂肪細胞からのグリセロールの流出に関与することから、肥満や脂肪肝への有用性も期待される。また、本発明機能亢進剤は、生体成分由来であることから、安全性が高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒアルロン酸がアクアポリン２（ＡＱＰ２）の水透過性に及ぼす影響を示す図である。横軸は、添加したヒアルロン酸のサンプル名を表す。縦軸は、ヒアルロン酸無添加時を１００としたときのＡＱＰ２の水透過性を表す。
【図２】ヒアルロン酸がアクアポリン３（ＡＱＰ３）の水透過性に及ぼす影響を示す図である。横軸は、添加したヒアルロン酸のサンプル名を表す。縦軸は、ヒアルロン酸無添加時を１００としたときのＡＱＰ３の水透過性を表す。
【図３】ヒアルロン酸がアクアポリン３（ＡＱＰ３）のグリセロール透過性に及ぼす影響を示す図である。横軸は、添加したヒアルロン酸のサンプル名を表す。縦軸は、ヒアルロン酸無添加時を１００としたときのＡＱＰ３のグリセロール透過性を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明機能亢進剤は、ヒアルロン酸またはその塩の少なくとも一方を有効成分として含有するものである。
【００１４】
本発明にかかるヒアルロン酸としては、例えば、市販のもの（ヒアルロン酸ＬＭ、ヒアルロン酸ＳＴ、ヒアルロン３０００（全て日本新薬社製）等）を用いることができるし、通常の方法で鶏冠から抽出したものや微生物の培養液から精製したものを適宜、酵素や加水分解により低分子化して用いることもできる。かかるヒアルロン酸の平均分子量としては、１０万以下が好ましく、２万以下がより好ましい。１５００−５０００の範囲内が特に好ましい。分子量の調製方法としては、酵素、酸あるいはアルカリの濃度及び処理時間等を適宜選択することで、目的の分子量に調製することができる。ヒアルロン酸の塩としては、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩を挙げることができる。
【００１５】
本発明にかかるヒアルロン酸の平均分子量は、ヒアルロン酸の極限粘度から算出された粘度平均分子量を示す。まず、適当な複数のヒアルロン酸溶液を調製し、粘度計により測定したヒアルロン酸溶液の粘度をもとに比粘度および還元粘度を算出する。次に、各ヒアルロン酸溶液について、得られた還元粘度を縦軸に、乾燥物換算のヒアルロン酸濃度を横軸にプロットして検量線を作成し、ヒアルロン酸濃度を０に外挿したときの還元粘度を求めることにより、ヒアルロン酸の極限粘度を得る。得られた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、４２、４７６−４８５、１９６０）に代入することで、ヒアルロン酸の極限粘度から分子量を求めることができる。
【００１６】
本発明機能亢進剤は、アクアポリンを活性化することで、例えば、細胞内への水及びグリセロール、尿素の取り込みを促進する。
【００１７】
本発明機能亢進剤は、上記のヒアルロン酸を、そのまま又は担体として使用することのできる素材と混合し、次いで、常法により粉末状、塊状、液状などの各種形態に加工することにより製造することができる。本発明機能亢進剤のヒアルロン酸の含有量は、特に限定されないが、例えば、０．００１重量％（以下、単に「％」という）以上が適当であり、好ましくは、０．００５〜５０％の範囲内である。
【００１８】
本発明機能亢進剤には、医薬上又は食品上許容される添加物を任意に配合することができる。かかる添加剤としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、酸化防止剤、賦形剤、界面活性剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、防腐剤、抗菌剤、保湿剤、色素を挙げることができ、これらを１種又は２種以上使用することができる。
【００１９】
本発明機能亢進剤は、常法により、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、ドロップ錠、トニック、ローション、軟膏、クリーム等の剤型に適宜調製することができる。
【００２０】
本発明機能亢進剤の摂取量は、症状、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、ヒアルロン酸の重量として、０．００１〜１００ｇの範囲内とするのが適当であり、０．００３ｇ〜６０ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２〜４回に分割して摂取してもよい。
【実施例】
【００２１】
以下に、実施例を掲げて本発明をさらに詳述する。但し、本発明が下記実施例に限定されないことは言うまでもない。
参考例１  試験試料の調製
試験試料として、平均分子量３０００、１５０００、５００００、１０００００、５０００００、７５００００のヒアルロン酸（以下、順にＨＡ３Ｋ、ＨＡ１５Ｋ、ＨＡ５０Ｋ、ＨＡ１００Ｋ、ＨＡ５００Ｋ、ＨＡ７５０Ｋとよぶ）を用いた。
【００２２】
ストレプトコッカス属の培養液より抽出・精製して得られた高分子ヒアルロン酸を原料とした。高分子ヒアルロン酸を溶解後、塩酸を加え、ｐＨを調整したのち、酸加水分解を行うことにより適宜目的の分子量まで低分子化した。続いて、水酸化ナトリウムを加えて中和した後、エタノールを加えて、ヒアルロン酸を抽出・精製した。分子量は、上記の方法に従って算出した。なお、試験試料の濃度はいずれも０．５％となるように調製した。
参考例２  ｃＲＮＡの合成およびアフリカツメガエルの卵母細胞の注入
ヒトアクアポリン２（ＡＱＰ２）およびヒトアクアポリン３（ＡＱＰ３）を用い、ｃＲＮＡ合成キット（ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、ＡＱＰ２およびＡＱＰ３のｃＲＮＡを合成した。
【００２３】
卵母細胞は、以下のようにテイラー（Ｔ ａ ｙ ｌ ｏ ｒ ） らの文献（ Ｐ ｒ ｏ ｃ ． Ｎ ａ ｔｌ ． Ａ ｃ ａ ｄ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｕ Ｓ Ａ ． ， ８ ２ ， ６ ５ ８ ５ − ６ ５ ８ ９ （ １ ９ ８ ５ ） ）に記載の方法に準じて調製した。卵塊をカエルから摘出し、コラゲナーゼ処理後、各卵母細胞にＡＱＰ２またはＡＱＰ３  ｃＲＮＡを５０ｎｇ/５０ｎｌ注入した。ネガティブコントロールとして、卵母細胞に蒸留水を注射した。
試験例１  本発明機能亢進剤のアクアポリン２水透過性（Ｐｆ）値の測定
水透過性実験は、以下のように、文献（Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， ２ ５ ６ ， ３ ８ ５ − ３ ８ ７ （ １ ９９ ２ ） 、及び、Ｐ ｒｏ ｃ ． Ｎ ａ ｔ ｌ ． Ａ ｃ ａ ｄ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｕ Ｓ Ａ ． ， ９ １ ， ６ ２ ６ ９ − ６２ ７ ３ （ １ ９ ９ ４ ） ） に記載されている方法に準じて行った。２日間培養したＡＱＰ２  ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を試験試料：Ｂｉｒｔｈｍｅｄｉｕｍ＝２：１の液中に投入し、ビデオ顕微鏡で撮影した。卵母細胞の体積変化を計算し、Ｐｆ値を算出した。さらに、ヒアルロン酸無添加群のＰｆ値を１００としたときの相対値を算出した。
【００２４】
図１に示すように、ヒアルロン酸はヒアルロン酸無添加時と比較してＡＱＰ２の水透過性を促進した。分子量の小さいＨＡ３Ｋが特に強く促進した。
【００２５】
実施例２  本発明機能亢進剤のアクアポリン３水透過性およびグリセロール透過性測定
ＡＱＰ３の水透過性測定は、実施例１と同様の方法により行った。また、グリセロール透過性の測定は以下の方法により行った。
グリセロール透過性の測定
グリセロールの測定はＢｉｏＶｉｓｉｏｎＦｒｅｅ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（和光純薬社製）を用いて測定した。ＡＱＰ３  ｃＲＮＡを注入された卵母細胞を２０℃で２日間、ＢｉｒｔｈＭｅｄｉｕｍで培養した後、２４穴プラスチック培養器に０．５％ヒアルロン酸と２００ｍＭグリセロールを添加したＢｉｒｔｈＭｅｄｉｕｍの１ｍｌ中に卵母細胞を投入し、３０分間、２０℃で培養した。その後、ＢｉｒｔｈＭｅｄｉｕｍ で３回洗浄した。卵母細胞のみチューブに移し、２０％ＳＤＳ添加ＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒ  ２０μｌに溶解後、１４，０００ ｒｐｍ、５分遠心し、上清１０μｌにキット酵素ｍｉｘ １０μｌを加えて、３０分反応後、ＯＤ５６２ｎｍで吸光度を測定した。グリセロール濃度を算出したのち、ヒアルロン酸無添加のＰｆ値を１００としたときの相対値を算出した。
【００２６】
図２および図３に示すように、ヒアルロン酸はＡＱＰ３の機能を亢進し、水及びグリセロールの透過性を促進した。また、その効果は分子量の小さいHA３Kが特に強かった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明機能亢進剤は、アクアポリン機能亢進作用を有するため、腎性尿崩症、多尿、皮膚の乾燥、皮膚掻痒症、皮膚潰瘍、創傷、肥満若しくは脂肪肝の治療剤、小腸及び大腸での水分吸収促進剤、眼、口腔、鼻粘膜及び気管の分泌促進剤、又は、膣の潤滑剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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