(57)【要約】      （修正有）【課題】発酵飲食品やその製造過程で生成するジアセチル量を、最終製品を得る前に予測することができる簡便かつ精度の高い方法を提供する。【解決手段】（ａ）発酵飲食品又はその製造中間体に含まれるグルコース量を１質量％以下にする希釈工程、（ｂ）発酵飲食品又はその製造中間体に水酸化アルカリ水溶液を添加して、発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを０℃以上１５℃以下の条件でジアセチルに酸化させる工程、及び（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を行った試料中のジアセチルを比色法で測定する工程、を有することを特徴とする発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインの測定法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）発酵飲食品又はその製造中間体に含まれるグルコース量を１質量％以下にする希釈工程、
（ｂ）発酵飲食品又はその製造中間体に水酸化アルカリ水溶液を添加して、発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを０℃以上１５℃以下の条件でジアセチルに酸化させる工程、及び
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を行った試料中のジアセチルを比色法で測定する工程、
を有することを特徴とする発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインの測定法。
【請求項２】
工程（ａ）と工程（ｂ）が、同時、又は工程（ａ）次いで工程（ｂ）の順に行われる請求項１記載のアセトインの測定法。
【請求項３】
工程（ａ）と（ｂ）を行って得られる反応液、及び工程（ｃ）での反応液のアルカリ規定度が０．３Ｎ〜２Ｎである請求項１又は２記載のアセトインの測定法。
【請求項４】
工程（ａ）と（ｂ）を行って得られる反応液、及び工程（ｃ）での反応液のアルカリ規定度が０．５Ｎ〜１Ｎである請求項１又は２記載のアセトインの測定方法。
【請求項５】
工程（ｃ）の比色法が、試料にα−ナフトール及びクレアチンを反応させて吸光度を測定する方法である請求項１〜４のいずれか１項記載のアセトインの測定法。
【請求項６】
前記製造中間体が、醪である請求項１〜５のいずれか１項記載のアセトインの測定法。
【請求項７】
工程（ａ）が、発酵飲食品又はその製造中間体を２倍以上に希釈する工程である請求項１〜６のいずれか１項記載のアセトインの測定法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法により発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを測定することを特徴とする、発酵飲食品又はその製造中間体中のジアセチル含有量の予測方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法または請求項８の予測方法を使用し、酒類を製造することを特徴とする酒類の製造方法。
【請求項１０】
容器中に粉末状のクレアチン及びα−ナフトールを含有するアセトイン測定用キット。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法でアセトインを測定できるプロトコールを有する請求項１０記載のアセトイン測定用キット。
【請求項１２】
さらに、アセトインの測定に使用するアセトイン標準溶液、及び反応に使用する水酸化アルカリ水溶液を有する請求項１０又は１１記載のアセトイン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は醪等の発酵物試料中のアセトインの簡易測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの発酵飲食品において、ジアセチル臭はその食品の特性を左右する臭いである。ヨーグルトなどの発酵乳製品では、ジアセチル臭は良い臭いとされる。しかし、酒類では、バター様の臭いであり、好ましくない臭いであると認識されている。従って、発酵飲食品やその製造過程におけるジアセチルのモニタリングは重要である。
【０００３】
ジアセチルやアセトインの測定法としては、クレアチン水溶液と、２．５Ｎ水酸化ナトリウムに溶解したα−ナフトールとを準備し、これらの試薬を速やかにジアセチル又はアセトイン含有試料と反応させて吸光度変化を測定するフォゲス−プロスカウェル反応（以下、「ＶＰ反応」という）が知られている（非特許文献１）。
【０００４】
しかし、酒類中のジアセチルを人が感知する閾値（臭いに敏感な人であれば２００〜３００ｐｐｂ、多くの人は５００ｐｐｂ程度）は低いため前記の比色法では正確に測定することができず、その測定には低濃度で定量測定できるＧＣ／ＭＳが必要となる。従って、ＧＣ／ＭＳが設置されていない工場等の現場では測定することは難しく、官能検査に依って判断するところが大きい。
【０００５】
酒類製造において、ジアセチルは醪の段階でも存在はするが、当該醪を上槽又はろ過した後に増加する。上槽又はろ過前においては、ジアセチルの前駆体でもあるアセト乳酸は、酵母によって他の代謝物へと変化する。しかし、上槽又はろ過すると酵母が分離され、他の代謝物への流れが遮断されるため、存在するα−アセト乳酸は保存期間中に徐々に非酵素的な反応生成物であるジアセチルやアセトインに変化する。一般に上槽又はろ過直後はジアセチル含量が少なく、保存期間を置かないとジアセチル臭を官能検査で判別することは難しいことが多い。発酵途中での官能検査によるジアセチルの定量的なモニタリングはさらに難しい問題があった。
【０００６】
ジアセチルを直接測定することが難しいことから、ジアセチル前駆体であるアセト乳酸及びアセトヒドロキシ酪酸を定量する方法が報告されている（例えば、特許文献１）。
また、酒類の製造工程でジアセチルの発生を防ぐために、ジアセチルの発生と相関があるとされているピルビン酸の濃度（ｐｐｍオーダー）を測定し、１００ｐｐｍを境として管理指標とすることが一般的とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２６３９７７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J.Biol. Chem. 1945, 161:495-502
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１の方法は、酒類に含まれるアセト乳酸等のジアセチル前駆体量がごくわずかであることから、測定感度が悪く、正確にジアセチルの生成を予測できなかった。
また、ピルビン酸の測定による方法でジアセチル分析の結果を検証してみると、ピルビン酸値が低くてもジアセチルが高い値を示す場合が見られた。従って、ピルビン酸のモニタリングだけでは、ジアセチルの発生リスクを管理するのに十分とは言えないと考えられた。
【００１０】
従って、本発明の課題は、発酵飲食品やその製造過程で生成するジアセチル量を、最終製品を得る前に予測することができる簡便かつ精度の高い方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明者が蓄積されたジアセチル分析データを解析したところ、ジアセチルと相関性がある化合物として、アセトインが候補化合物として浮上した。
酵母の場合、アセトインはジアセチルと同様にα−アセト乳酸から非酵素的脱炭酸反応で生成するが、乳酸菌の場合はα−アセト乳酸脱炭酸酵素によりアセトインが生成される。
ジアセチルはｐｐｂオーダーで微量であるのに対し、アセトインはｐｐｍオーダーであり、一般的にジアセチルの約３０〜１００倍程度の生成量である。
また、上述のようにアセトインはジアセチル、２，３−ペンタンジオン等に比べ量が多いため、近似的にアセトイン量として比色測定を行うことができ、品質管理の現場で容易に測定できる。
かかる知見に基づき、発酵飲食品やその製造中間体に含まれるアセトインを測定し、これを指標とすれば、ジアセチル量が予測できることを見出し、特許出願した（特願２０１５−２４８４６７）。
【００１２】
しかしながら、醪等の発酵飲食品製造中間体中には、グルコース、エタノール等の成分が含まれており、簡便な比色法であるＶＰ法によっては、ｐｐｍオーダーで含まれるアセトインであっても、正確に測定できないことが判明した。醪等の発酵飲食品製造中間体では、グルコース及びエタノールの量が経時的に変化するため、これら成分の影響を受けると、ジアセチル量の予測精度が低下することにつながってしまい、好ましくない。
そこで、さらにアセトインを正確かつ簡便に測定し、ジアセチル量を正確に予測できる手段を開発すべく検討を行った。その結果、醪等の発酵飲食品製造中間体に含まれるグルコース量が一定値以下になるよう希釈し、低温度条件下で予め一定濃度の水酸化アルカリで処理しておき、その後にα−ナフトールとクレアチンを用いた比色測定を行えば、グルコースやエタノールの影響を受けずに正確にかつ簡便にアセトイン量が測定でき、ジアセチル量も予測できることを見出した。また、α−ナフトールとクレアチンは、水酸化アルカリ水溶液とは別に反応に用いる容器内で予め粉末化しておけば、試薬を測定時に調製することなく簡便にアセトインの測定が可能になることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
【００１４】
〔１〕（ａ）発酵飲食品又はその製造中間体に含まれるグルコース量を１質量％以下にする希釈工程、
（ｂ）発酵飲食品又はその製造中間体に水酸化アルカリ水溶液を添加して、発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを０℃以上１５℃以下の条件でジアセチルに酸化させる工程、及び
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を行った試料中のジアセチルを比色法で測定する工程、
を有することを特徴とする発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインの測定法。
〔２〕工程（ａ）と工程（ｂ）が、同時、又は工程（ａ）次いで工程（ｂ）の順に行われる〔１〕記載のアセトインの測定法。
〔３〕工程（ａ）と（ｂ）を行って得られる反応液、及び工程（ｃ）での反応液のアルカリ規定度が０．３Ｎ〜２Ｎである〔１〕又は〔２〕記載のアセトインの測定法。
〔４〕工程（ａ）と（ｂ）を行って得られる反応液、及び工程（ｃ）での反応液のアルカリ規定度が０．５Ｎ〜１Ｎである〔１〕又は〔２〕記載のアセトインの測定方法。
〔５〕工程（ｃ）の比色法が、試料にα−ナフトール及びクレアチンを反応させて吸光度を測定する方法である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアセトインの測定法。
〔６〕前記製造中間体が、醪である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアセトインの測定法。
〔７〕工程（ａ）が、発酵飲食品又はその製造中間体を２倍以上に希釈する工程である〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のアセトインの測定法。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法により発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを測定することを特徴とする、発酵飲食品又はその製造中間体中のジアセチル含有量の予測方法。
〔９〕〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法または〔８〕の予測方法を使用し、酒類を製造することを特徴とする酒類の製造方法。
〔10〕容器中に粉末状のクレアチン及びα−ナフトールを含有するアセトイン測定用キット。
〔11〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法でアセトインを測定できるプロトコールを有する〔１０〕記載のアセトイン測定用キット。
〔12〕さらに、アセトインの測定に使用するアセトイン標準溶液、及び反応に使用する水酸化アルカリ水溶液を有する〔１０〕又は〔１１〕記載のアセトイン測定用キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアセトイン測定法によれば、グルコースやエタノールが含まれている発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを簡便な操作で正確に測定することができ、ジアセチル量が簡便かつ正確に予測できる。また、本発明のアセトイン測定用キットは、従来のＶＰ法のように測定時に試薬を調製することなく簡便にアセトインが測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】グルコースによる反応遅延を示す。
【図２】エタノールによる反応抑制を示す。
【図３】２，３−ブタンジオールによる発色の漸次的増加を示す。
【図４】反応温度の低温設定による２，３−ブタンジオールによる発色の漸次的増加の抑制効果（４０℃と３０℃の比較）を示す。
【図５】グルコース存在下でのジアセチルとアセトインの反応性の比較を示す。
【図６】前処理導入した測定操作手順を示す。
【図７】前処理温度の比較を示す。
【図８】前処理温度１５℃でのグルコース濃度の比較を示す。
【図９】清酒醪のグルコース濃度分布を示す。
【図１０】清酒醪のエタノール濃度分布を示す。
【図１１】清酒醪のアセトイン濃度分布を示す。
【図１２】グルコースおよびエタノールの影響による検量線の変動を示す。
【図１３】前処理（０℃、０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１０分間）導入による検量線の安定化を示す。
【図１４】清酒醪の２，３−ブタンジオール濃度分布を示す。
【図１５】アルカリ強度と発色性を示す。
【図１６】測定操作手順の改良を示す。
【図１７】キットの試作条件と出来上がり状態を示す。
【図１８】試作キットによる検量線作成を示す。
【図１９】試作キットの４０℃保存試験を示す。
【図２０】試作キットの４℃保存試験を示す。
【図２１】清酒に含まれるジアセチルとアセトインの相関関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインの測定法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有することを特徴とする。
（ａ）発酵飲食品又はその製造中間体に含まれるグルコース量を１質量％以下にする希釈工程。
（ｂ）発酵飲食品又はその製造中間体に水酸化アルカリ水溶液を添加して、発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトインを０℃以上１５℃以下の条件でジアセチルに酸化させる工程。
（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を行った試料中のジアセチルを比色法で測定する工程。
【００１８】
被測定試料である発酵飲食品としては、ジアセチル及び／又はアセトインが含まれている可能性のある発酵飲食品が挙げられ、具体的には発酵乳製品（ヨーグルト等）、酒類が挙げられる。このうち、ジアセチル臭が好ましくないとされる酒類に適用するのが好ましい。本発明において、酒類とは、アルコール分０．０１％以上の飲料をいう。本発明における酒類は、発泡性酒類、醸造酒類、蒸留酒類、混成酒類、しょう油の５種類を含む。
発酵飲食品の製造中間体としては、酒類の製造中間体、特に醪に適用するのが好ましい。醪中のアセトイン濃度を測定すれば、ジアセチル濃度が予測でき、その後の発酵工程を管理することができる。
醪とは、酒類の原料となる物品に発酵させる手段を講じたもの（酒類の製造の用に供することができるものに限る。）で、こし又は蒸留する前のもの（こさない又は蒸留しない酒類に係るものについては、主発酵が終わる前のもの）をいう。
【００１９】
醪を試料とする場合には、醪の発酵終了予定日の１０日前から発酵終了予定日までの間に、醪に含まれるアセトインを測定することが好ましい。酒類にジアセチルが発生することを回避するためには、できるだけ早い醪の段階でアセトインを測定することが好ましいが、アセトインの測定が早すぎても予測精度が低くなってしまうため、トレードオフの関係にある。醪に含まれるアセトインの測定は、発酵終了予定日の１０日前から発酵終了予定日３日前までの間に行うことがより好ましく、発酵終了予定日の１０日前から発酵終了予定日５日前までの間に行うことがさらに好ましい。清酒醪の場合、留添後１０日前後から発酵終了予定日までの間に、清酒醪に含まれるアセトインを測定することが好ましく、留添後１０日前後から発酵終了予定日３日前までの間に行うことがより好ましく、留添後１０日前後から発酵終了予定日５日前までの間に行うことがさらに好ましい。
発酵終了予定日とは、特定の酒類を製造するときに予め設定した、醪をこし又は蒸留する予定日（こさない又は蒸留しない酒類に係るものについては、主発酵が終わる日）をいう。工業的に酒類を製造する場合、発酵条件にもよるが、目的とする酒類やその原料、発酵タンク等によっておおよその発酵日数は定まっている。
発酵終了予定日の１１日以上前にアセトインを測定する場合、酒類の原料にもよるが、醪には糖類やアミノ酸等の成分量が多く含まれており、アセトインの測定精度が下がるおそれがあり、ジアセチルの発生予測精度が下がるおそれがあるからである。
発酵終了予定日を超えてアセトインを測定することも可能である。しかしながら、この場合は、通常発酵終了予定日に醪をこし又は蒸留していることから、発酵日数を増やすことでジアセチル臭を低減させる手段がとれないことになる。
【００２０】
本発明者の検討により、発酵飲食品又はその製造中間体（以下、試料ということもある）中に含まれるグルコースは、アルカリ条件下において、アセトインをジアセチルに酸化する反応を遅延させることが判明した。このグルコースによる反応遅延は、工程（ａ）試料に含まれるグルコース量を１質量％以下になるように希釈することにより解消する。一方、試料をこのように希釈しても、アセトインの定量には問題がないことも見出した。希釈は、水又は工程（ｂ）の水酸化アルカリ水溶液を用いて行うことができる。
また、試料中に含まれるエタノールは、ＶＰ反応を抑制する。本発明においては、グルコース濃度が１質量％以下になるように試料を希釈することにより、エタノールの含有量も減少し、結果としてエタノールのＶＰ反応への影響を受け難くすることができる。すなわち、試料をグルコース濃度が１質量％以下になるように希釈することにより、アセトイン測定値に対する、試料中に含まれるグルコース及びエタノールの影響を低減することができる。希釈倍率は、通常醪等に含まれるグルコース量を考慮すれば、２倍以上であればよいが、２〜４倍が好ましく、特に３倍程度が好ましい。なお、工程（ａ）の希釈は、常温（５〜３５℃）でもよいが、０℃以上１５℃以下で行うのが好ましい。
【００２１】
また、試料中のグルコースによるアセトインからジアセチルへの反応遅延は、一定範囲のアルカリ条件とすること及び反応温度を低くすることによっても解消できることを見出した。すなわち、工程（ｂ）試料に、水酸化アルカリ水溶液を添加して、試料中のアセトインを０℃以上１５℃以下の条件でジアセチルに酸化させることによって、グルコースによる反応遅延が解消できる。ここで、工程（ａ）と工程（ｂ）は、工程（ａ）次いで工程（ｂ）を行ってもよいし、同時に行うこともできる。工程（ａ）と工程（ｂ）を同時に行う場合は、試料中のグルコース濃度が１質量％以下で、かつアルカリ規定度が０．５Ｎ〜１Ｎになるように水酸化アルカリ水溶液で、試料を希釈するのが好ましい。
【００２２】
水酸化アルカリ水溶液を試料に添加して得られる反応液のアルカリ規定度は、広い範囲で設定できるが、アセトインからジアセチルへの反応の進行及び得られる呈色の吸光度の安定推移の観点から、０．３Ｎ〜２Ｎが好ましく、０．５Ｎ〜１Ｎがより好ましい。具体的には、工程（ｂ）を１０分間以内に、工程（ｃ）を３０分程度で完了させ、安定な呈色反応を得るためには、反応液のアルカリ規定度は０．３Ｎ〜２Ｎになるようにするのが好ましく、さらに０．５Ｎ〜１Ｎがより好ましい。
また、水酸化アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられるが、水酸化ナトリウムが好ましい。
【００２３】
水酸化アルカリ水溶液と混合した試料は、それらが混合された容器を０℃以上１５℃以下の水槽に速やかに浸し、１分間以上静置して冷却処理すればよいが、手軽に冷却でき、かつ処理温度を確実に０℃以上１５℃以下とする容易な方法として、氷冷水を用意して、そこに浸して処理することがより好ましい。また、反応時間は、短い方が作業を早く進める上では好ましいが、短すぎると余裕がなくなり、作業の正確性が悪くなるため、この反応時間は1分〜１０分の間のどこかに設定することが好ましく、さらに作業の速さと正確性の両者を最大とするには５分間程度に設定することがより好ましい。
【００２４】
当該希釈及び低温でのアルカリ処理により、試料中に含まれるグルコース及びエタノールのアセトイン測定値に対する影響が回避できる。また、アルカリ処理により、試料中のアセトインは酸化され、ジアセチルに変化しているので、この前処理された試料に比色反応（工程（ｃ））、例えばα−ナフトール及びクレアチンを反応させれば、下記反応式に従って、赤色色素が生成する。
【００２５】
【化１】
2019007868.tif 000002
【００２６】
工程（ｃ）における前処理された試料とα−ナフトール及びクレアチンとの反応は、３０〜４０℃で３０分間行えばよい。この反応により赤色色素が生成するので、試料の吸光度を測定すれば、試料中のアセトイン濃度が定量できる。吸光度は、５３０ｎｍ付近の吸光度を測定すればよい。
【００２７】
本発明のアセトインの測定法においては、反応を行うための容器中に粉末状のクレアチン及びα−ナフトールを含有するアセトイン測定用キットを用いることで、従来のＶＰ法のように測定毎にα−ナフトールの水酸化アルカリ水溶液を調製する必要がなく、さらに、調製したα−ナフトールの水酸化アルカリ水溶液の経時的な劣化による測定値への影響も心配する必要がない。また、粉末状としたクレアチン及びα−ナフトールの混合物は、試料と混合した水酸化アルカリ水溶液を添加後、撹拌により３０〜４０秒で溶解することが可能である。すなわち、本発明のキットを用いれば、前記工程（ａ）、工程（ｂ）及び工程（ｃ）、好ましくは工程（ａ）と工程（ｂ）を同時に、次いで工程（ｃ）を行うことにより、簡便かつ正確に試料中のアセトインが測定できる。
【００２８】
粉末状のクレアチン及びα−ナフトールは、容器にクレアチン水溶液及びα−ナフトールのエタノール溶液を添加し、凍結乾燥することにより得られる。また、本発明のキットには、定量用検量線の作成のため使用するアセトイン標準溶液を付属させてもよい、また水酸化アルカリ水溶液を付属させてもよい。さらに、本発明のキットには、測定手順を記載したプロトコールを付属させてもよい。付属させる水酸化アルカリ水溶液は、いずれのアルカリ規定度でもよいが、１．２５Ｎ以下のものであれば劇物指定から除外されて取扱管理の負担を軽減できるので、より好ましい。付属させる水酸化アルカリ水溶液のアルカリ規定度を０．１Ｎとして低くすることも可能であるが、反応液中のアルカリ規定度を０．５Ｎ〜１.０Ｎにできる濃度が好ましい。
【００２９】
前記の方法により発酵飲食品又はその製造中間体中のアセトイン量が簡便かつ正確に測定できる。一方、このアセトイン量を測定した試料中のジアセチル量は、アセトイン量よりも低濃度であるが、不明である。しかし、本発明者の蓄積データによれば、特定の発酵飲食品の製造過程では、アセトイン量とジアセチル量は、一定の関係にあることが判明した。従って、同じ発酵飲食品の製造過程におけるジアセチル量とアセトイン量との関係をＧＣ／ＭＳ分析により予め測定しておけば、本発明方法により簡便に測定されたアセトイン量からジアセチル量を予測することができる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３１】
＜測定方法＞
ＶＰ反応を利用したジアセチルやアセトインの発色定量測定では、通常は、０．５％クレアチン水溶液（試薬液１）と５％α−ナフトール／２．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液（試薬液２）を事前調製により用意して、表１のような手順操作で行う。まず、この系で実施例の吸光度を測定した。
【００３２】
【表１】
2019007868.tif 000003
【００３３】
実施例１
（１）発色反応系に影響を及ぼす成分
前記のＶＰ反応により試料として市販の清酒を測定したところ、発色反応が清酒に含まれる成分によって影響を受けている可能性が示唆されたので、その成分と影響の内容について特定する検討を行った。
その結果、グルコースによる反応の遅延（図１参照）、エタノールによる反応の抑制（図２参照）、２，３−ブタンジオールによる発色の漸次的増加（図３参照）が明らかとなった。図１は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液にグルコースを所定量溶解させた結果であり、図２は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液にエタノールを所定量溶解させた結果である。図３の清酒Ａ，Ｂは市販の異なる清酒を示す。
また、２，３−ブタンジールによる発色の漸次的な増加については、反応温度を低くすると増加速度を抑制することも明らかとなった（図４参照）。３０℃での反応の場合、反応時間４０分以内であれば、２，３−ブタンジールによる発色はかなり抑えられることが分かったので、今後の検討では、反応温度は３０℃とすることにした。図４の清酒Ｃ〜Ｅは、市販の異なる清酒を示す。
【００３４】
（２）グルコースとエタノールの影響に対する検討
ＶＰ反応によるアセトインの測定では、下記反応式のように、アルカリ条件下でアセトインがジアセチルに変換する反応ステップとジアセチルがアルカリ条件下で試薬と反応して発色するステップの２段階が同時並行で進んでいる。
【００３５】
【化２】
2019007868.tif 000004
【００３６】
グルコースがこれらのうちどちらのステップに影響を及ぼしているかを調べた。その結果、ジアセチルが試薬と反応して発色するステップ２に対しては、グルコースの影響はなく、アセトインがジアセチルに変換する酸化反応（ステップ１）に影響を及ぼして、反応を遅延させることが判明した（図５参照）。グルコースは、アルカリ条件下で鎖状構造となりやすく、これにより末端にアルデヒド基が露出して還元性を示す。この還元性が、アセトインがジアセチルに変換する酸化反応を妨害していると推察された。また、ジアセチルは速やかに試薬と反応して発色するが、アセトインはジアセチルに変換されるのにラグタイムがあり、３％グルコース存在下では約３０分間を要することも明らかとなった。これらの知見を基にグルコースの影響性を回避する方策を種々検討した結果、グルコースの還元性を回避できる条件下でアセトンをジアセチルへ変換するステップを前処理として分けて実施することを考案した。
図５の「ジアセチル  ０％グルコース」は５ｐｐｍのジアセチルを含む水溶液、「アセトイン  ０％グルコース」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液、「ジアセチル  ３％グルコース」は５ｐｐｍのジアセチルを含む水溶液にグルコースを３％添加したもの、「アセトイン  ３％グルコース」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液にグルコースを３％添加したものをそれぞれ示す。
【００３７】
図６に示すように、ジアセチルが試薬と反応して発色するステップ２の前に、前処理を導入した測定手順を新たに組み、その測定方法を用いてグルコースの還元性を回避できる条件を検討した。その結果、前処理温度を１５℃以下にすることで、３％グルコース存在下でも発色は安定化（図７参照）し、さらにグルコース濃度を１％以下にすることで発色抑制は回避されることが確認された（図８参照）。これは、０．５Ｎ水酸化ナトリウムでのアルカリ条件下において１５℃以下の低温であればグルコースの開環は抑制され、さらに１％以下のグルコースであれば、開環して還元力をもつグルコースは微量となり、ほとんど影響を及ぼさなくなると推察された。
図７の「Ｇ０％６分」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液を所定の温度で６分間前処理したもの、「Ｇ０％４２分」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液を所定の温度で４２分間前処理したもの、「Ｇ３％６分」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液にグルコースを３％添加し所定の温度で６分間処理したもの、「Ｇ３％４２分」は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液にグルコースを３％添加し所定の温度で４２分間処理したものをそれぞれ示す。
図８は５ｐｐｍのアセトインを含む水溶液と、その水溶液にグルコースを１、３、５％添加したものに前処理温度１５℃にて、処理時間を６分と４２分で測定した。
【００３８】
また、前処理温度が１５℃であれば、前処理時間は６分という短時間であっても、４２分という長時間であっても差が無いことも明らかとなった（図７、図８）。
【００３９】
清酒醪や清酒中のグルコース濃度を１％以下にする方法として、グルコースオキシダーゼで処理する方法を検討したが、良好な結果は得られなかった。そこで、分析対象となる清酒醪中のグルコース濃度の分布を調査し、その上限値に対してグルコース濃度が１％以下となるような希釈をすることで対処することとした。清酒醪留添後１０日目以降の測定対象となる清酒醪中のグルコース、エタノール、アセトインの濃度分布を分析調査した結果、それぞれ図９、図１０、図１１に示す結果となった。
その結果から、グルコースの最高濃度は３％であることが確認できたので、清酒醪のグルコース濃度を１％以下にするためには３倍希釈すればよいことが分かった。この希釈に伴って、エタノール濃度は６．４％以下、アセトイン濃度は９ｐｐｍ以下となる。
【００４０】
そこで、グルコース濃度が１％、エタノール濃度が６．４％となるよう水に溶解したモデル試料を用いて、１５℃以下での前処理を導入した測定での検量線作成を行った。なお、特別な冷却恒温槽を用意することなく前処理温度を１５℃以下とするため、氷冷水を使って０℃設定とした。試験の結果、従来、グルコースとエタノールの影響を受けて検量線の傾きが変動していた（図１２参照）ものが、グルコースとエタノールが存在していても影響を受けることなく一定の傾きの検量線を作成することができた（図１３参照）。つまり、グルコース濃度を１％以下、エタノール濃度を６．４％以下として、０℃での前処理を行うと、グルコースの影響を回避できるのみではなく、エタノールの影響をも回避できることが分かった。すなわち、清酒醪や清酒を水で２倍〜４倍希釈した後で、１５℃以下での前処理を行い、ＶＰ反応を行うことで、グルコースとエタノールの影響を回避することが可能となる。
【００４１】
（３）２，３−ブタンジオールの影響に対する検討
２，３−ブタンジオール（以下、「ＢＤ」という）は、清酒醪中には必然的に存在する成分で、さらに最終代謝産物であることから発酵が進むにつれて蓄積されて、清酒醪では平均で５００ｐｐｍ前後にまでなるという報告がある。そこで、清酒醪留添後１０日目以降の醪に含まれるＢＤの濃度を測定して、その濃度分布を調査した。その結果、９３〜６５６ｐｐｍの範囲で図１４に示したような濃度分布となることが分かった。醪の多くで検出されるＢＤの濃度は、２１１〜２５０ｐｐｍであり、そのＢＤ濃度ではアセトイン０．８ｐｐｍ相当として発色することを確認したので、その加算部分を測定値から差し引くことで、十分対応できると考えられた。しかし、ジアセチルの生成予測をする時期は、まだＢＤの蓄積が少ないタイミングとなることが考えられることから、ＢＤによる発色加算分は無視しても問題ないと思われた。
【００４２】
（４）測定感度の向上検討
反応液のアルカリ強度を上げることで、反応性を上げて測定感度を向上できないかを検討した。その結果、反応液中の水酸化ナトリウムの規定度を０．５Ｎから０．７５Ｎに上げることで、ブランクおよびＢＤによる発色には変化を及ぼすことなく、アセトインの発色を向上させることができることが分かった（図１５参照）。つまり、反応液のアルカリ強度をできるだけ上げることで感度を向上させることができるということになるので、改めて測定操作手順を検討した。試料と１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を一定比率で混合するだけで、試料が自動的に３倍希釈され、かつできるだけアルカリ強度を上げることができるように工夫した測定操作手順を図１６のように改良した。
【００４３】
実施例２
（１）キットの作成
本発明の測定方法の実施に直接使用することに適しているキットを表２に示した要領で作成した。凍結乾燥の条件は図１７に示した。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
（２）試作キットでの試料測定
キットを使った測定は、図１６右の改変後に示した手順操作で行い、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（劇物指定から除外される）は市販のもの使用した。
【００４６】
（５）試作キットの性能試験
図１７に示した要領で凍結乾燥条件の異なる２種類のキットを試作し、その性能を確認する試験を行った。試験では、改良した操作手順で測定を行い、グルコースとエタノール存在下での検量線を作成することで確認することとした。
検量線作成のために設定したグルコースとエタノールの濃度は３種類で、測定対象となる清酒を想定して、それぞれ３％と１５．２％、２％と１６．１％、１％と１７．０％の組み合わせとした。
試験を行った結果、グルコースとエタノールの濃度設定３種類において、キットＡ、Ｂともに、作成された検量線にほとんど差は認められなかったが、キットＡの方が直線性に優れていたのに対して、キットＢはアセトインの濃度が高くなると吸光度が若干低めになることが示された。検量線を作成する際に使用する基準液のグルコースとエタノールの濃度については、測定対象となる清酒の中間的な濃度とすることにし、グルコース２％、エタノール１６．１％に設定することに決定した。
【００４７】
（６）キットの保存試験
試作したキットを用いて４０℃での保存試験を実施した。２５℃保存の２ヵ月に相当する４０℃保存１０日目の検量線をみると、キットＡは直線性を維持し、かつ４℃保存のものとほぼ一致していたが、キットＢは直線性を維持していたものの試薬着色による上方へのシフトが見られた（図１９参照）。キットＡとＢにおけるこの差は、キットＢの乾燥状態がキットＡより若干劣っていたためと考えられたので、今後のキット作製では、キットＡの作製条件に準じて、凍結時間を１２時間以上、真空乾燥時間を３時間とすることに決定した。また、４℃での保存であれば、１年半という長期間に及んでも安定であることも分かった（図２０参照）。あらかじめ上記のキットを手元に用意しておき、４℃以下で保存しておけば、醪や清酒の測定時に迅速に対応することが可能である。
【００４８】
参考例１
市販されている清酒を３１９種（同じ銘柄である場合は、別ロットのもの。うち１１１種が純米酒系）について、その清酒に含まれるジアセチル及びアセトインをＧＣ／ＭＳで分析した。
ＧＣ／ＭＳ分析は、２ｍＬマイクロチューブに上記清酒０．５ｍＬと４−メチル−２−ペンタノール１ｐｐｍを含む０．６Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬと酢酸エチル０．５ｍＬを加え、２分間ボルテックスミキサーで撹拌抽出し１２，０００ｇ、１分間遠心分離した。上層の酢酸エチル層２００μＬをＧＣ／ＭＳ分析用試料管に移し、以下の条件でＧＣ／ＭＳ分析を行った。
（測定条件）
装置：島津ＧＣ／ＭＳ  ＱＰ−２０１０ｐｌｕｓ／島津ＡＯＣ−５０００
カラム：ジーエルサイエンスＩＮＥＲＴ  ＣＡＰ  Ｐｕｒｅ  ＷＡＸ（６０ｍ×０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×０．２５μｍ）
カラム温度：４０℃（１０ｍｉｎ）→（４℃／ｍｉｎ）→５５℃（０ｍｉｎ）→（４０℃／ｍｉｎ）→２００℃（２ｍｉｎ）→（６０℃／ｍｉｎ）→２３０℃（３０ｍｉｎ）
キャリアガス：Ｈｅ，全流量５０ｍＬ／ｍｉｎ  線速度３０．０ｃｍ／ｓｅｃ一定  バージ流量３．０ｍＬ／ｍｉｎ
インジェクション：２５０℃  スプリットレス  サンプルタイム１ｍｉｎ
インジェクション量：１μＬ
イオン源：ＥＩ，２００℃  インターフェイス：２３０℃
【００４９】
得られた結果を図２１に示した。図２１に示すように、清酒に含まれるジアセチルとアセトインの間に正の相関関係（相関指数０．７５）が認められた。清酒にバター様の臭いを生ずる原因となるジアセチルの量がｐｐｂオーダーであるのに対し、アセトインはｐｐｍオーダーであることを確認した。アセトインは比色法で測定できる可能性が示唆された。
ジアセチルが５００ｐｐｂ以上の清酒は、いずれもジアセチル臭が認められた。図２１に示した相関係数から計算すると、清酒に含まれるジアセチルを５００ｐｐｂ未満に制御するにはアセトインを１８ｐｐｍ以下に、ジアセチルを３００ｐｐｂ未満に制御するにはアセトインを１０ｐｐｍ以下に、ジアセチルを２００ｐｐｂ未満にするにはアセトインを５ｐｐｍ以下にすればよいことが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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