(57)【要約】【課題】対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかを予測するための方法が提供される。【解決手段】方法の態様は、液体子宮頸部細胞性試料から形態計測データおよびバイオマーカーデータの両方を得るステップと、次いで両方のタイプのデータを使用して対象がCIN病変を有するかどうかを予測するステップとを含む。方法を実施する際に使用を見出すシステムもまた提供される。方法およびシステムは、子宮頸癌スクリーニングへの適用を含む、様々な適用において使用を見出す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかを予測し、かつ/または対象由来の試料中の癌性細胞の存在を決定するための方法であって、
対象由来の浮遊液中の子宮頸部細胞の標識液体試料からデータを得るステップであって、データが、形態計測データならびにバイオマーカーデータ、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含むステップと、
対象がCIN病変を有するかどうかを前記データから予測し、かつ/または癌性細胞が試料中に存在するかどうかを前記データから決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記CINがCIN2+病変である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記予測が、85%以上の感度および/または85%以上の特異性によって特徴付けられる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記データが、フローサイトメトリーデバイスを用いて液体試料を分析することによって得られる、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記形態計測データが、前方光散乱データ、側方光散乱データ、画像データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含む、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標識液体試料がバイオマーカー標識液体試料であり、前記データがバイオマーカーデータを含み、前記バイオマーカーデータが、細胞当たりのバイオマーカー定量化データを含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
子宮頸部細胞のバイオマーカー標識液体試料を調製するステップをさらに含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記調製するステップが、細胞を固定し、透過処理するために、最初の子宮頸部細胞試料を固定試薬および透過処理試薬と組み合わせるステップと、固定および透過処理した細胞を、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識バイオマーカープローブと接触させるステップとを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記子宮頸癌バイオマーカーが核酸またはタンパク質である、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
異なる子宮頸癌バイオマーカーにそれぞれ特異的に結合する2つ以上の異なる蛍光標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させるステップを含む、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
異常細胞が試料中に存在することが決定した場合に、子宮頸部生検を推奨するステップをさらに含む、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記標識液体試料がDNA標識液体試料であり、前記データが、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、またはその両方を含む、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
フローチャネル、
前記フローチャネルのアッセイ領域に対して光を当てるように構成された光源、
前記フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、形態計測データを生成するように構成された第1の検出器、
前記フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、追加データを生成するように構成された第2の検出器、ならびに
前記第1および前記第2の検出器から前記形態計測データおよび前記追加データを受け取り、前記形態計測データおよび前記追加データの両方に基づく、対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかの予測の結果を出力するように構成されたシグナル処理モジュール
を含むシステム。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれかに記載の方法を実行するように構成される、請求項13に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法119(e)条に従い、本出願は、2011年5月9日に出願された米国仮特許出願第61/484,142号および2010年11月12日に出願された米国仮特許出願第61/413,302号の出願日に対する優先権を主張するものであり、これらの出願の開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
パパニコロー(PAP)スミアは、1949年以来、子宮頸癌スクリーニングの基本であった。定義によると、PAPスミアは、スライド上に塗抹された細胞に対して実行され、顕微鏡検査法によって可視化される染色である。液体ベースの子宮頸部細胞診(LBC)の出現の結果、子宮頸部由来の細胞は、ブラシを使用して得られ、固定液中に浮遊させ、次いで、染色前にスライドに塗布される。高度に訓練された細胞検査士および細胞病理学者は、染色されたスライドを調査し、Table 1(表1)における特徴によって示されるような異常細胞の証拠を探す。
【０００３】
【表１】
2019124701.tif 000002
【０００４】
PAPスミアのためにスライドを使用することが必要であるために、子宮頸癌スクリーニングのために使用される他のバイオマーカー、とりわけHPV DNAの分子的検出のために使用されるバイオマーカーは、LBCの別々のアリコートに対して実行される。p16などのようないくつかのバイオマーカーは、スライド上で実行することができるが、そのスループットは、米国において毎年得られる6〜7千万の子宮頸部細胞診検体および世界中の1億5千万以上の試料に対応するのに望ましくない。さらに、スライド上で実行される分子的技術は、扱いにくく、時間がかかり、子宮頸癌スクリーニングに受け入れられない特徴である。
【０００５】
臨床的に、PAPスミアおよびHPV試験は、非常に異なる技術であるが、共に使用される。PAPスミアは、高度子宮頸部病変(子宮頸癌前癌状態(pre-cervical cancer)および子宮頸癌)に対して比較的低い感度(50%)および比較的高い特異性(90%)を有する。逆に、HPV DNA試験は、高度子宮頸部病変(子宮頸癌前癌状態および子宮頸癌)に対して高い感度(〉90%)を有するが、低い特異性(30%)を有する。これらの性能特徴は、有効な子宮頸癌スクリーニングのためのこれらの試験の使用の組み合わせを支持してきた。何人かの研究者は、子宮頸癌スクリーニング(プライマリHPVスクリーニング(primary HPV screening))のためにHPV検出の単独の使用を押したが、現在のHPV DNA試験は、PAPスミアを使用する形態学的アセスメントによってもたらされる特異性を欠き、不必要なコルポスコピー/生検処置のはなはだしい数に対する懸念を起こしている。したがって、HPV試験のみによるPAPスミアの置き換えは、非常に論議の的となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第2,955,591号
【特許文献２】米国特許第3,626,470号
【特許文献３】米国特許第3,815,580号
【特許文献４】米国特許第3,877,464号
【特許文献５】米国特許第3,881,464号
【特許文献６】米国特許第3,945,372号
【特許文献７】米国特許第4,127,113号
【特許文献８】米国特許第4,175,008号
【特許文献９】米国特許第4,700,713号
【特許文献１０】米国特許第4,754,764号
【特許文献１１】米国特許第4,762,133号
【特許文献１２】米国特許第4,873,992号
【特許文献１３】米国特許第4,862,899号
【特許文献１４】米国特許第4,953,560号
【特許文献１５】米国特許第5,445,164号
【特許文献１６】米国特許第5,787,891号
【特許文献１７】米国特許第5,795,309号
【特許文献１８】米国特許第6,387,058号
【特許文献１９】米国特許第6,740,049号
【特許文献２０】米国特許第7,371,518号
【特許文献２１】米国特許第6,329,167号
【特許文献２２】米国特許公開第20100234445号
【特許文献２３】米国特許第7,524,631号
【特許文献２４】米国特許第6211955号
【特許文献２５】米国特許第6249341号
【特許文献２６】米国特許第6256096号
【特許文献２７】米国特許第6473176号
【特許文献２８】米国特許第6507391号
【特許文献２９】米国特許第6532061号
【特許文献３０】米国特許第6563583号
【特許文献３１】米国特許第6580504号
【特許文献３２】米国特許第6583865号
【特許文献３３】米国特許第6608680号
【特許文献３４】米国特許第6608682号
【特許文献３５】米国特許第6618140号
【特許文献３６】米国特許第6671044号
【特許文献３７】米国特許第6707551号
【特許文献３８】米国特許第6763149号
【特許文献３９】米国特許第6778263号
【特許文献４０】米国特許第6875973号
【特許文献４１】米国特許第6906792号
【特許文献４２】米国特許第6934408号
【特許文献４３】米国特許第6947128号
【特許文献４４】米国特許第6947136号
【特許文献４５】米国特許第6975400号
【特許文献４６】米国特許第7006710号
【特許文献４７】米国特許第7009651号
【特許文献４８】米国特許第7057732号
【特許文献４９】米国特許第7079708号
【特許文献５０】米国特許第7087877号
【特許文献５１】米国特許第7190832号
【特許文献５２】米国特許第7221457号
【特許文献５３】米国特許第7286719号
【特許文献５４】米国特許第7315357号
【特許文献５５】米国特許第7450229号
【特許文献５６】米国特許第7522758号
【特許文献５７】米国特許第7567695号
【特許文献５８】米国特許第7610942号
【特許文献５９】米国特許第7634125号
【特許文献６０】米国特許第7634126号
【特許文献６１】米国特許第7719598号
【特許文献６２】米国特許第4,704,891号
【特許文献６３】米国特許第4,727,029号
【特許文献６４】米国特許第4,745,285号
【特許文献６５】米国特許第4,867,908号
【特許文献６６】米国特許第5,342,790号
【特許文献６７】米国特許第5,620,842号
【特許文献６８】米国特許第5,627,037号
【特許文献６９】米国特許第5,701、012号
【特許文献７０】米国特許第5,895,922号
【特許文献７１】米国特許第6,287,791号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Serrano, M.ら、Nature, 1993年12月16日; 366(6456): 704〜7頁
【非特許文献２】Faulkner-Jonesら  J. Virol Methods 1993年  vol. 41 277〜296頁
【非特許文献３】Plummerら  Diagnostic Mol. Path. 1998年  vol. 7、76〜84頁
【非特許文献４】Schmidtら、2008年、「Visual estimates of nucleus-to-nucleus ratios: can we trust our eyes to use the Bethesda ASCUS and LSIL size criteria?」  Cancer 1 14(5):287〜93頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかを予測するための方法が提供される。方法の態様は、浮遊液中の試料をアッセイすることによって、液体子宮頸部細胞性試料から形態計測データならびにバイオマーカーデータおよび/または非特異的細胞データを得るステップと、次いで異なるタイプのデータを使用して対象がCIN病変を有するかどうかを予測するステップとを含む。方法を実施する際に使用を見出すシステムもまた提供される。方法およびシステムは、子宮頸癌スクリーニングへの適用を含む、様々な適用において使用を見出す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の態様は、対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかを予測するための方法を含む。いくつかの場合には、方法は、対象由来の浮遊液中の子宮頸部細胞の標識液体試料からデータを得るステップであって、データが、形態計測データならびにバイオマーカーデータ、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含むステップと、対象がCIN病変、たとえばCIN2+病変を有するかどうかをデータから予測するステップとを含む。予測は、85%以上の感度および/または85%以上の特異性によって特徴付けることができる。データは、たとえば、試料を流し、照明源および1つまたは複数の光検出器を通過させるステップを含む方法において、フローサイトメトリーデバイスを用いて液体試料を分析することによって得ることができる。形態計測データは、前方光散乱データ、側方光散乱データ、画像データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含んでいてもよい。いくつかの場合には、標識液体試料はバイオマーカー標識液体試料であり、データはバイオマーカーデータを含み、バイオマーカーデータは、細胞当たりの(per cell)バイオマーカー定量化データを含み、細胞当たりのバイオマーカー定量化データは、蛍光標識検出データを含んでいてもよい。いくつかの場合には、方法は、子宮頸部細胞のバイオマーカー標識液体試料を調製するステップをさらに含む。子宮頸部細胞のバイオマーカー標識液体試料は、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させることによって調製することができる。子宮頸癌バイオマーカーは、核酸、たとえばHPV核酸(E6、E7核酸など)またはタンパク質(たとえばp16、E6、E7)であってもよい。方法は、異なる子宮頸癌バイオマーカーにそれぞれ特異的に結合する2つ以上の異なる蛍光標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させるステップを含んでいてもよい。いくつかの場合には、最初の子宮頸部細胞試料中の細胞は、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識バイオマーカープローブと接触させる前に、固定および透過処理される。いくつかの場合には、方法は、異常細胞が試料中に存在することが決定した場合に、子宮頸部
生検を推奨するステップをさらに含む。いくつかの場合には、標識液体試料はDNA標識液体試料であり、データは、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、またはその両方を含む。
【００１０】
本発明の態様は、
フローチャネル、
フローチャネルのアッセイ領域に対して光を当てるように構成された光源、
フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、形態計測データを生成するように構成された第1の検出器、
フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、追加データを生成するように構成された第2の検出器、ならびに
第1および第2の検出器から形態計測データおよび追加データを受け取り、形態計測データおよび追加データの両方に基づく、対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかの予測の結果を出力するように構成されたシグナル処理モジュール
を含むシステムもまた含む。システムは、上記に概説されるものを含めて、本発明の方法を実行するように構成することができる。
【００１１】
本発明の態様は、対象由来の試料中の癌性細胞の存在を決定するための方法であって、対象由来の浮遊液中の子宮頸部細胞の標識液体試料からデータを得るステップであって、データは、形態計測データならびにバイオマーカーデータ、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含むステップと、癌性細胞が試料中に存在するかどうかをデータから決定するステップとを含む方法をさらに含む。データは、たとえば、試料を流し、照明源および1つまたは複数の光検出器を通過させるステップを含む方法において、フローサイトメトリーデバイスを用いて液体試料を分析することによって得ることができる。形態計測データは、前方光散乱データ、側方光散乱データ、画像データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含んでいてもよい。いくつかの場合には、標識液体試料はバイオマーカー標識液体試料であり、データはバイオマーカーデータを含み、バイオマーカーデータは、細胞当たりのバイオマーカー定量化データを含み、細胞当たりのバイオマーカー定量化データは、蛍光標識検出データを含んでいてもよい。いくつかの場合には、方法は、子宮頸部細胞のバイオマーカー標識液体試料を調製するステップをさらに含む。子宮頸部細胞のバイオマーカー標識液体試料は、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させることによって調製することができる。子宮頸癌バイオマーカーは、核酸、たとえばHPV核酸(E6、E7核酸など)またはタンパク質(たとえばp16、E6、E7)であってもよい。方法は、異なる子宮頸癌バイオマーカーにそれぞれ特異的に結合する2つ以上の異なる蛍光標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させるステップを含んでいてもよい。いくつかの場合には、最初の子宮頸部細胞試料中の細胞は、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識バイオマーカープローブと接触させる前に、固定および透過処理される。いくつかの場合には、方法は、異常細胞が試料中に存在することが決定した場合に、子宮頸部生検を推奨するステップをさらに含む。いくつかの場合には、標識液体試料はDNA標識液体試料であり、データは、DNA含有量データ、パーセント核形成データ、またはその両方を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】縦横比対面積ドットプロットを使用して液体ベースの子宮頸部細胞診(LBC)検体中の(ゲートをかけた)完全な単一の細胞を同定する機器設定を示す図である。
【図２】図1における機器設定を使用する、N/C(核対細胞質)比分析によるLBC検体中の異常細胞の同定を示す図である。N/C比の増加は、異常細胞を示す。
【図３Ａ】LBC検体中の単一の細胞について得られた例示的なデータを示す図である。それぞれの細胞について、明視野画像、E6/E7 mRNAハイブリダイゼーションを示す画像(FITC)、DNA定量を示す画像(DAPI)、ならびにE6/E7およびDAPI画像の合成画を示す画像を示す。高N/C比を有する細胞がE6/E7陽性であり、異常なDNA含有量を有することを示す。
【図３Ｂ】LBC検体中の単一の細胞について得られた例示的なデータを示す。それぞれの細胞について、明視野画像、E6/E7 mRNAハイブリダイゼーションを示す画像(FITC)、DNA定量を示す画像(DAPI)、ならびにE6/E7およびDAPI画像の合成画を示す画像を示す。低N/C比を有する細胞がE6/E7陰性であり、正常なDNA含有量を有することを示す。
【図４】E6/E7 mRNAの過剰発現がDNA含有量の増加を有する細胞において見出されることを示すドットプロットである。細胞周期分析は、DNA染色試薬を使用して決定し(DAPI;X軸)、E6/E7 mRNAは、E6/E7 mRNAプローブのハイブリダイゼーションによって検出した(FITC;Y軸)。異常細胞(E6、E7過剰発現およびDNA含有量の増加を有する)は、ゲート中に示される。
【図５Ａ】異常細胞を同定するためのLBC検体のN/C比(Y軸)およびDNA含有量(x軸)を示すドットプロットを示す図である。正常な子宮頸部細胞(上パネル)およびLSIL子宮頸部細胞(下パネル)のN/C比対DNA含有量のドットプロットを示す。このもう1つの方法は、1つのみの染色試薬、つまり非特異的DNA染色試薬を使用する。
【図５Ｂ】異常細胞を同定するためのLBC検体のN/C比(Y軸)およびDNA含有量(x軸)を示すドットプロットを示す図である。HSIL子宮頸部細胞のN/C比対DNA含有量のドットプロットを示す(上および下パネル)。このもう1つの方法は、1つのみの染色試薬、つまり非特異的DNA染色試薬を使用する。
【図６】子宮頸部細胞診試料中の細胞の側方(直角)光散乱(Y軸)および電気的体積(electronic volume)(X軸)の組み合わせのドットプロットを示す図である。このプロットは、これらの形態計測パラメーターを使用して、試料中の異なる細胞を定めることができることを示す。4つの異なるゲートは、デブリ、子宮膣部の細胞、子宮頸管内の細胞、および多形核白血球(PMNS)を同定する。そのようなゲーティングを用いて、本発明の態様によって分析する対象とする細胞にゲートをかけることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかを予測するための方法が提供される。方法の態様は、浮遊液中の試料をアッセイすることによって、液体子宮頸部細胞性試料から形態計測データならびにバイオマーカーデータおよび/または非特異的細胞データを得るステップと、次いで異なるタイプのデータを使用して対象がCIN病変を有するかどうかを予測するステップとを含む。方法を実施する際に使用を見出すシステムもまた提供される。方法およびシステムは、子宮頸癌スクリーニングへの適用を含む、様々な適用において使用を見出す。
【００１４】
すでに、本発明は、非常に詳細に記載されているが、本発明が、記載されている特定の実施形態に限定されず、そのため、もちろん、様々でよいことを理解されたい。本発明の範囲が添付の請求項によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定するようには意図されないこともまた理解されたい。
【００１５】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に指示しない限り、その範囲の上限値および下限値の間の、下限値の単位の10分の1までのそれぞれの介在値ならびに任意の他の明示される値またはその明示される範囲における介在値が本発明の範囲内に包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、そのより小さな範囲の中に独立して含まれてもよく、これらもまた、明示される範囲においてあらゆる明確に除かれる限界値に従って、本発明の範囲内に包含される。明示される範囲が、一方または両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【００１６】
ある範囲は、用語「約」が前につけられた数値により本明細書において示される。用語「約」は、それが前につく、まさにその数およびその用語が前につく数に近い数またはおよそその数である数について、文字どおりの補足を提供するために本明細書において使用される。数が明確に記載される数に近いまたはおよそその数であるかどうかを決定する際に、近いまたは近似する、記載されていない数は、それが示される文脈において、明確に記載される数の実質的な等価物を提供する数であってもよい。
【００１７】
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは、代表的な例証となる方法および物質が記載されている。
【００１８】
本明細書において引用される刊行物および特許はすべて、それぞれの個々の刊行物または特許が、参照により組み込まれるように明確にかつ個々に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれ、刊行物を引用する方法および/または物質を開示し、記載するために参照により本明細書に組み込まれる。あらゆる刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、本発明が、先の発明によって、そのような刊行物に先立つ権利を与えられないということを許可するものとして解釈されない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行の日付とは異なることがあり、これは、独立して確認される必要がありうる。
【００１９】
本明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示物を含むことに注意されたい。請求項は、いかなる任意選択の要素を除くために採用されてもよいことにさらに注意されたい。そのため、この表現は、請求項の要素の記載に関する「単独で」、「のみ」などのような排他的な術語の使用または「否定的な」限定の使用のための先行詞として働くように意図される。
【００２０】
明確にするために別々の実施形態の文脈において記載される本発明のある特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供できることを十分に理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の適した下位の組み合わせで提供することができる。実施形態の組み合わせはすべて、本発明によって明確に包含され、それぞれおよびすべての組み合わせが、そのような組み合わせが使用可能な方法および/またはデバイス/システム/キットを包含する程度まで、個々にかつ明白に開示されるかのように、本明細書において開示される。さらに、そのような変化するものを記載する実施形態において列挙される下位の組み合わせのすべてもまた、本発明によって明確に包含され、化学基のそれぞれのおよびすべてのそのような下位の組み合わせが個々にかつ明白に本明細書において開示されるかのように、本明細書において開示される。
【００２１】
本開示を読む際に当業者らに明らかになるように、本明細書において記載され、例証される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分けてもよくまたはそれと組み合わせてもよい別個の成分および特徴を有する。任意の記載される方法は、記載される事象の順序でまたは論理的に可能な任意の他の順序で実行することができる。
【００２２】
本発明の実施形態をさらに記載する際に、方法の実施形態の態様を、より詳細に、最初に記載する。次に、本発明の方法を実施する際に使用することができるシステムの実施形態を、概説する。
【００２３】
方法
上記に概説されるように、本発明の実施形態は、対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変または子宮頸癌を有するかどうかを予測するための方法に関する。用語「CIN病変」(当技術分野において子宮頸部異形成とも呼ばれる)は、子宮頸部の表面上の扁平上皮細胞の異常成長を指すためにその通常の意味で使用される。当技術分野において知られているように、CIN病変は、CIN1、CIN2/3、CIN2、およびCIN3として組織学的に類別することができる。CIN1病変は、上皮の基底の1/3に限られる病変であり、他のカテゴリーの病変に比べて、癌性の病変へ進展する最小の危険性を有する。CIN2病変は、上皮の基底の2/3に限られる中程度の異形成によって特徴付けられる。CIN3病変(時に当業者らによって子宮頸部上皮内癌と呼ばれる)は、上皮の2/3以上を横断する重症の異形成の存在によって分類される。CIN2/3カテゴリー(つまりCIN2+)は、まとめて、CIN2およびCIN3病変の両方を指す。
【００２４】
本発明の実施形態は、高度の感度および特異性により、対象のCIN病変の存在を予測することによって特徴付けられる。予測は、対象の子宮頸部の生検材料を実際に採取することなく、対象のCIN病変の存在を予知するまたは予見することを意味する。感度および特異性という用語は、それらの通常の意味で使用される。そのため、感度は、正確に同定される実際の陽性(偽陽性に対立するものとしての)の割合の程度であり、特異性は、正確に同定される陰性の程度である。本発明の実施形態は、任意のタイプのCIN病変の存在または不在を予測することができる。本発明の実施形態はまた、CIN病変のタイプ、たとえばCIN病変がCIN1、CIN2+、CIN2、またはCIN3病変であるかどうかを予測することができる。方法の実施形態は、高度の感度および特異性により、この予測、たとえば、病変が存在するかどうか、どのタイプの病変が存在するか(CIN2+病変が存在するかどうかなど)を行う。いくつかの場合には、感度は、95%以上を含み、90%以上など、85%以上である。いくつかの場合には、特異性は、90%以上を含み、87%以上など、85%以上である。
【００２５】
方法の態様は、対象由来の浮遊液中の子宮頸部細胞の標識液体試料、たとえばバイオマーカー標識および非特異的細胞標識の一方または両方により標識された液体試料から、(1)形態計測データならびに(2)バイオマーカーデータおよび/または非特異的細胞データの両方を得るステップを含む。言いかえれば、子宮頸部細胞の液体試料は、対象から収集され、子宮頸部細胞は、液状培地中に浮遊しており(たとえば下記により詳細に記載される)、形態計測データおよびバイオマーカー/非特異的細胞データの両方を得るためにアッセイされる。したがって、方法の態様による標識液体試料は、バイオマーカー標識液体試料、非特異的細胞標識液体試料、またはバイオマーカー標識液体試料および非特異的細胞標識液体試料であってもよい。アッセイされる子宮頸部細胞の標識液体試料は、任意の好都合なプロトコールに従って提供することができる。
【００２６】
一実施形態では、最初の液状子宮頸部細胞性試料は、子宮頸部から細胞性試料を採取し、適した液状培地とそれを組み合わせることによって調製される。子宮頸部細胞を収集するための任意の好都合なプロトコールを用いることができる。対象とするプロトコールの例は、子宮頸部および子宮頸内膜の表面から細胞を収集するために子宮頸部ブラシまたはほうきデバイスを用いるプロトコールを含む。本発明の方法における使用を見出すことができる子宮頸部細胞収集デバイスの例の記載は、米国特許第2,955,591号;第3,626,470号;第3,815,580号;第3,877,464号;第3,881,464号;第3,945,372号;第4,127,113号;第4,175,008号;第4,700,713号;第4,754,764号;第4,762,133号;第4,754,764号;第4,873,992号;第4,862,899号;第4,953,560号;第5,445,164号;第5,787,891号;第5,795,309号;第6,387,058号、および第6,740,049号において提供される。
【００２７】
収集の後に、細胞性試料は、所望されるように適した液体培地と組み合わせてもよい。対象とする液体培地は、生理食塩水または平衡塩類、溶液(ハンクス平衡塩類溶液、基礎(MEM)組織培養培地、POLYSAL(商標)溶液、および通常生理食塩溶液など);細胞診培地、たとえばUniversal Collection Medium(UCM);米国特許第7,371,518号において記載されるuniversal collection medium(本開示は参照により本明細書に組み込まれる);Standard Transport Medium(STM)、PRESERVCYT(商標)液状培地(Cytyc, Inc.(Boxborough、Mass.));CytoPtich(商標)液状培地(TriPath, Inc.(Burlington、N.C.)などを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
所望される場合、収集された最初の試料を、方法においてさらに進める前に妥当性について評価することができる。たとえば、試料のアリコートは、たとえば本開示が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,329,167号において記載されるように、適切な標的細胞が試料中に存在するかどうかを決定するために光散乱分析にかけることができる。
【００２９】
調製の後に、結果として生じた最初の液状子宮頸部細胞性試料は、所望されるように、固定および/または透過処理することができる。そのため、本発明の方法は、適した固定試薬と試料を接触させることによって細胞性試料を固定するステップを含む。対象とする固定試薬は、所望の時点で細胞を固定するものである。任意の好都合な固定試薬を用いることができ、適した固定試薬は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド/アセトン、メタノール/アセトン、IncellFP(IncellDx, Inc)などを含むが、これらに限定されない。たとえば、約1〜2%の最終濃度で使用されるパラホルムアルデヒドは、好適な架橋固定液であることが分かっている。いくつかの場合には、試料中の細胞は、細胞を透過処理試薬と接触させることによって透過処理される。対象とする透過処理試薬は、標識バイオマーカープローブが、たとえば、下記により詳細に記載されるように、細胞内環境に到達するのを可能にする試薬である。任意の好都合な透過処理試薬を用いることができ、適した試薬は、Triton X-100、NP-40、サポニンなどのような緩やかな界面活性剤;メタノールなどを含むが、これらに限定されない。陽性重金属対照、たとえば、重金属、たとえばイリジウムなどにより標識されたDNA干渉物質により細胞を標識することが望ましいこともある。細胞はまた、所望されるように、固定前に、バイアビリティー色素(viability dye)、たとえば臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、DAPI、RhCI3などにより染色することができる。
【００３０】
ある実施形態では、また、上記に概説されるように、形態計測データおよびバイオマーカーデータを得るためにアッセイされる試料は、バイオマーカー標識試料である。したがって、試料は、対象とする1つまたは複数のバイオマーカーについて標識されている試料である。「バイオマーカー標識試料」によって、バイオマーカーが細胞性試料中に存在する場合、対象とするバイオマーカーに特異的に結合する標識バイオマーカープローブ(たとえば下記により詳細に記載される)と接触させた試料を意味する。対象とするバイオマーカーは、子宮頸癌バイオマーカーを含むが、これらに限定されない。子宮頸癌バイオマーカーは、特有の生物学的または生物学的に誘導されるインジケータ、たとえば核酸またはタンパク質であり、この存在は、対象が子宮頸部癌を発症する傾向または対象における子宮頸癌の存在と関連づけられる。したがって、対象とするバイオマーカーは、核酸およびタンパク質分析物を含み、細胞におけるこの存在および/または量は、少なくとも、対象が子宮頸癌に罹患する傾向の予測を行うために使用することができる。対象とするバイオマーカーは、HPV遺伝子L1、L2、E2、E4、E5、E6、またはE7などのようなHPV遺伝子のHPV発現産物;サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、たとえばp14、p15INK4b、p16(つまり、Serrano, M.ら、Nature, 1993年12月16日; 366(6456): 704〜7頁において記載されるp16INK4a)、p18INK4c、p19INK4d、p21WAF/CIP1、およびp27KIP1;細胞周期調節タンパク質、たとえばp14ARF;特異的マイクロRNA、または米国特許公開第20100234445号(本開示は参照により本明細書に組み込まれる)において記載されるものなどのような染色体変化3q-子宮頸癌と関連、などを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の方法においてアッセイされるバイオマーカー標識液体子宮頸部細胞性試料は、任意の好都合な標識プロトコールを使用して調製することができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカー標識液体試料の調製は、子宮頸癌バイオマーカーに特異的に結合する標識バイオマーカープローブと最初の子宮頸部細胞試料を接触させるステップを含む。実行されることとなる特定のアッセイに依存して、最初の試料は、単一の標識バイオマーカープローブまたは異なる分子組成の異なるバイオマーカーに結合する、2つ以上の別個の標識バイオマーカープローブと組み合わせてもよく、そのような別個の標識バイオマーカープローブの数は、たとえばアッセイが2つ以上のバイオマーカーについての多重アッセイである場合、2以上、たとえば3以上、4以上、5以上などであってもよい。
【００３２】
標識バイオマーカープローブと最初の試料を接触させる際に、試料を1つまたは複数の標識バイオマーカープローブと組み合わせて反応混合物を生成する。対象とする標識バイオマーカープローブは、特異的結合ドメインおよび標識ドメインを含む。特異的結合ドメインは、対象とするバイオマーカーに特異的に結合する捕捉リガンドを含む。特定のアッセイに依存して、対象とするバイオマーカーは、タンパク質、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、およびこれらの分子のそれぞれの断片;核酸、たとえばDNAおよびmRNAなどのようなRNAなどを含むが、これらに限定されない、様々な異なるタイプの分子であってもよい。そのため、捕捉リガンドは、対象とするバイオマーカー分子に結合するリガンドであり、この捕捉リガンドは、もちろん、検出されることとなる特異的なタイプのバイオマーカー分子に依存して様々でよく、たとえばタンパク質バイオマーカーに対する抗体、mRNAバイオマーカーに対するオリゴヌクレオチドであってもよい。ある実施形態では、それらが結合複合体で互いに特異的に結合する場合に、捕捉リガンドおよびそれが特異的に結合するバイオマーカー分子の間の親和性は、10-15M以下を含めて、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下、10-13M以下、10-14M以下のKD(解離定数)によって特徴付けられる。
【００３３】
上記に示されるように、様々な異なるタイプの特異的結合剤を、捕捉リガンドとして用いることができ、特定のタイプの結合剤は、対象とするバイオマーカーの分子の特定のタイプに少なくとも部分的に基づいて選択される。対象とする特異的結合剤は、抗体結合剤、タンパク質、ペプチド、ハプテン、核酸などを含む。本明細書において使用される用語「抗体結合剤」は、対象とする分析物に結合するのに十分な、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または断片を含む。抗体断片は、たとえば単量体Fab断片、単量体Fab'断片、または二量体F(ab)'2断片とすることができる。単鎖抗体分子(scFv)またはキメラ抗体を産生するための重鎖および軽鎖の定常領域の置き換えもしくはヒト化抗体を産生するための定常領域および可変領域のフレームワーク部分の両方の置き換えによってモノクローナル抗体から産生されるヒト化もしくはキメラ抗体などのような、抗体工学によって産生される分子もまた、用語「抗体結合剤」の範囲内にある。対象とする核酸結合剤は、細胞中のバイオマーカー核酸に特異的に結合する核酸である。これらの核酸の長さは、オリゴヌクレオチドが特異的結合剤として働くのに十分である限り様々でよく、いくつかの場合には、14〜50nt、たとえば15〜25ntなどのように、13〜100ntに及ぶ。これらの核酸結合剤を構成するオリゴヌクレオチドは、所望されるように、DNAもしくはRNAまたはその合成類似体であってもよい。
【００３４】
特異的結合ドメインに加えて、標識バイオマーカープローブは、検出可能な標識をさらに含む。検出可能な標識として対象とするのは、蛍光色素である。蛍光色素(蛍光団)は、画像化の適用(たとえばフローサイトメトリー)において使用するのに適した多くの色素のいずれかから選択することができる。多くの色素は、たとえばMolecular Probes(Eugene、OR)およびExciton(Dayton、OH)などのような様々な供給源から市販で入手可能である。対象とする蛍光団の例は、4-アセトアミド-4'-イソチオシアン酸スチルベン-2,2'ジスルホン酸;アクリジンならびにアクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アクリジンレッド、およびアクリジンイソチオシアネートなどのような誘導体;5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS);4-アミノ-N-[3-(ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド-3,5ジスルホネート(ルシファーイエローVS);N-(4-アニリノ-1-ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;ブリリアントイエロー;クマリンおよびクマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、クマリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(クマラン151)などのような誘導体;シアニンならびにシアノシン、Cy3、Cy5、Cy5.5、およびCy7などのような誘導体;4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI);5',5''-ジブロモピロガロールスルホンフタレイン(ブロモピロガロールレッド);7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン;ジエチルアミノクマリン;ジエチレントリアミンペンタアセテート;4,4'-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸;4,4'-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸;5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-塩化スルホニル(DNS、ダンシルクロリド);4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL);4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオシアネート(DABITC);エオシンならびにエオシンおよびエオシンイソチオシアネートなどのような誘導体;エリトロシンならびにエリトロシンBおよびエリトロシンイソチオシアネートなどのような誘導体;エチジウム;フルオレセインならびに5-カルボキシフルオレスセイン(FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオレセイン(DTAF)、2'7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレスセイン(JOE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、およびQFITC(XRITC)などのような誘導体;フルオレサミン;IR144;IR1446;緑色蛍光タンパク質(GFP);サンゴ由来蛍光タンパク質(Reef Coral Fluorescent Protein)(RCFP);Lissamine(商標);リサミンローダミン、ルシファーイエロー;マラカイトグリーンイソチオシアネート;4-メチルウンベリフェロン;オルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;ナイルレッド;オレゴングリーン;フェノールレッド;B-フィコエリトリン;o-フタルジアルデヒド;ピレンならびにピレン、ピレンブチレート、およびスクシンイミジル1-ピレンブチレートなどのような誘導体;リアクティブレッド4(Cibacron(商標)ブリリアントレッド3B-A);ローダミンならびに6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシローダミン(R6G)、4,7-ジクロロローダミンリサミン、ローダミンB塩化スルホニル、ローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101の塩化スルホニル誘導体(Texas Red)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラメチルローダミン、ならびにテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)などのような誘導体;リボフラビン;ロゾール酸およびテルビウムキレート誘導体;キサンテン;またはその組み合わせを含むが、これらに限定されない。当業者らに知られている他の蛍光団またはその組み合わせ、たとえばMolecular Probes(Eugene、OR)およびExciton(Dayton、OH)から入手可能なものもまた使用することができる。
【００３５】
多数の別個の標識バイオマーカープローブが用いられる場合、それぞれの別個のプローブの標識は、識別可能なシグナルをもたらすように選択することができる。たとえば、第1および第2の別個の標識バイオマーカープローブが用いられる実施形態では、第2のプローブ中の標識は、第1のプローブの標識の第1の蛍光シグナルと識別可能である蛍光シグナルを産生する蛍光標識である。したがって、第1および第2の蛍光標識の励起に際して産生される第1および第2の蛍光シグナルは、互いに識別可能であり、両方を同時に検出することができ、一方のシグナルが他方のシグナルを改変しないまたは変化させないことを意味する。それぞれの別個の標識は、任意の他の標識と識別可能なシグナルを産生することができる。たとえば、細胞は、第1および第2の蛍光シグナルと識別可能な第3の蛍光シグナルを産生する第3の蛍光標識により染色することができる。
【００３６】
いくつかの場合には、用いられる標識バイオマーカープローブは、HPV E6、E7オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブである。そのようなプローブは、長さが様々でよく、いくつかの場合には、14〜50nt、たとえば15〜25ntなどのように、13〜100ntに及ぶ。そのようなプローブの特定の配列は様々でよい。対象とする特異的配列は、HPV OncoTect(商標) E6,E7 mRNA Detection Kit(incellDx、Menlo Park、CA)のプローブカクテルにおいて見出されるものを含むが、これらに限定されない。
【００３７】
HPV E6/E7遺伝子(またはmRNA)に対して特異的で例示的なプローブ配列は、Faulkner-Jonesら(参照により本明細書に組み込まれているJ. Virol Methods 1993年  vol. 41 277〜296頁)において記載されるものを含む。そのような例示的なHPV E6/E7特異的プローブ配列を示すFaulkner-JonesらのTable 1(表1)の配列は、下記に提供される。
【００３８】
【表２】
2019124701.tif 000003
【００３９】
HPV E6/E7についての追加の例示的なプローブ配列は、Plummerら(参照により本明細書に組み込まれているDiagnostic Mol. Path. 1998年  vol. 7、76〜84頁)において記載されるものを含む。そのような例示的なHPV E6/E7プローブ配列を示すPlummerらにおけるTable 1(表1)の配列は、下記に提供される。
【００４０】
【表３】
2019124701.tif 000004
【００４１】
本明細書において記載される方法およびシステムにおいて使用を見出す追加のHPV特異的プローブ配列は、任意の好都合なプローブ設計方法を用いて、設計および試験することができる。
【００４２】
反応混合物を調製する際に、試料は、任意の好都合なプロトコールを使用して、標識バイオマーカープローブと組み合わせてもよい。組み合わせは、所望されるように、混合により実行することができる。標識バイオマーカープローブとの試料の接触は、存在する場合、試料中のそれらのそれぞれのバイオマーカーへのプローブの結合をもたらすインキュベーション条件下で実行される。いくつかの場合には、プローブおよび試料を、20〜約40℃などのような15〜50に及ぶ温度で接触させ、組み合わせる。接触は、反応成分および試料の十分な組み合わせをもたらすために、混合または撹拌により、たとえばボルテックスなどにより、実行することができる。
【００４３】
次いで、結果として生じた反応混合物は、形態計測データおよびバイオマーカーデータについての、たとえば、フローサイトメトリー分析を介してのアッセイ前に、一定期間、維持またはインキュベートしてもよい(たとえば、下記により詳細に記載される)。いくつかの場合には、反応混合物は、1時間〜3時間を含む、1時間〜24時間などのような、約30分〜72時間に及ぶ一定期間、20〜約40℃などのような15〜50に及ぶ温度でインキュベートする。上記のインキュベーションステップの後に、試料を直ちにアッセイしてもよくまたは後のアッセイのために保存してもよい。保存される場合、いくつかの実施形態では、試料は、低温で、たとえば氷上で保存される。
【００４４】
所望のところで、結果として生じた反応混合物は、たとえば、あらゆる非結合プローブおよび他の試料成分を除去するために洗浄してもよい。洗浄は、たとえば、適した洗浄バッファーと反応混合物を組み合わせ、液体から細胞を分離することによって、任意の好都合なプロトコールを使用して実行することができる。所与の洗浄プロトコールは、所望されるように、1つまたは複数の別個の洗浄工程を含んでいてもよい。任意の洗浄プロトコールの後に、標識細胞は、たとえばフローサイトメトリー分析を介しての続く分析のために、適した液体、たとえば洗浄バッファーまたは他のバッファー中に再懸濁させてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上記に記載されるように、標識液体細胞試料は、バイオマーカー標識に加えてまたはその不在下において、非特異的な細胞染色により標識される(または染色される)。細胞は、任意の好都合なプロトコールを使用して、非特異的な染色により染色することができる。非特異的な細胞染色として対象とするのは、DNA特異的染色である。DNAに対して特異的であり(または一本鎖ポリヌクレオチドとは対照的に二本鎖ポリヌクレオチドに優先的に結合し)、そのため、非特異的な染料として用いることができる色素および染料は、Hoechst 33342(2'-[4-エトキシフェニル]-5-[4-メチル-1-ピペラジニル]-2,5'-ビ-1H-ベンゾイミダゾール)およびHoechst 33258(2'-[4-エトキシフェニル]-5-[4-メチル-1-ピペラジニル]-2,5'-ビ-1H‐ベンゾイミダゾール)およびHoechstシリーズの他のもの;SYTO 40、SYTO 11、12、13、14、15、16、20、21、22、23、24、25(グリーン);SYTO 17、59(レッド)、DAPI、DRAQ5(商標)(二本鎖DNAに対して高い親和性を有するアントラキノン色素)、YOYO-1、ヨウ化プロピジウム、YO-PRO-3、TO-PRO-3、YOYO-3およびTOTO-3、SYTOXグリーン、SYTOX、メチルグリーン、アクリジンホモ二量体、7-アミノアクチノマイシンD、9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジンを含むが、これらに限定されない。特定の染料およびアッセイに依存して、染料は、細胞周期の指標などとして、バイオマーカーの定量化において働くことができる。
【００４６】
標識試料の調製の後に、たとえば上記に記載されるように、試料は、形態計測データならびにバイオマーカーデータおよび/または非特異的細胞データの両方を得るためにアッセイされる。いくつかの場合には、試料の同じアリコート、つまり同じ物理量の試料が、形態計測データおよびバイオマーカー/非特異的細胞データの両方を得るためにアッセイされる。したがって、これらの実施形態は、試料の第1のアリコートが、形態計測データのために、一方のプロトコール、たとえばスライドベースのプロトコールを使用してアッセイされ、試料の第2のアリコートが、他のプロトコール、たとえばフローサイトメトリープロトコールを使用してアッセイされるプロトコールと区別される。
【００４７】
形態計測データは、細胞形態学の情報、つまり、細胞のサイズ、形状、および/または構造に関する情報を得ることができる任意のタイプのデータを指す。対象とする形態計測データは、前方光散乱データ、側方光散乱データ、画像データ、およびその組み合わせからなる群から選択されるデータを含むが、これらに限定されない。対象とする形態的パラメーターは、核面積、周囲長、テクスチャーまたは空間周波数量(spatial frequency content)、重心位置、形状(つまり円、楕円、バーベル状など)、体積、およびこれらのパラメーターのいずれかの比を含むが、これらに限定されない。得られた形態計測データは、全体としての細胞についてのものまたはその下位部分、たとえば、細胞の細胞質についてのものであってもよい。いくつかの場合には、形態計測データは、異常細胞のタイプを含めて、細胞が正常であるか異常であるかどうかの実際の指定を含んでいてもよい。たとえば、形態計測データは、いくつかの場合には、所与の細胞が異常であるという指定、たとえば、細胞が、異型扁平上皮細胞、たとえば意義不明異型扁平上皮細胞(ASC-US)、HSILを除外できない異型扁平上皮細胞(ASC-H);低悪性度扁平上皮内病変(LGSILまたはLSIL);高悪性度扁平上皮内病変(HGSILまたはHSIL);扁平上皮癌;特定不能な異型腺細胞(AGC-NOS);AISまたは癌が疑われる異型腺細胞(AGC-新生物);および上皮内腺癌(AIS)であるという指定を含んでいてもよい。
【００４８】
バイオマーカーデータは、細胞についてのバイオマーカー情報を得ることができる任意のタイプのデータを指す。いくつかの場合には、バイオマーカーデータは、アッセイにおいて用いられる標識バイオマーカープローブの標識によって放出されるシグナルを含むデータである。バイオマーカーデータは、放出された光の存在および振幅、それから光シグナルが生じる細胞または他の物体における別個の位置の数、シグナル源の相対的な配置、ならびに細胞におけるそれぞれの位置で放出される光の色(波長またはウェーブバンド)の形態をしていてもよい。バイオマーカーデータは、定性的データ、半定量的データ、または定量的データの形態を取ってもよい。定性的データは、単に、バイオマーカーの存在または不在である。半定量的または定量的データは、細胞におけるバイオマーカーの、量、たとえばコピー数、濃度などのいくつかの指標を提供するデータである。たとえば、半定量的データは、対象とするバイオマーカーのコピー数が一定の閾値数を上回るという指標の形態を取ってもよい。定量的データは、細胞におけるバイオマーカーの絶対値、たとえばコピー数、量などの指標を提供する。半定量的および定量的データは、まとめて、バイオマーカー定量化データと呼ぶことができる。
【００４９】
いくつかの場合には、対象とするバイオマーカーは、対象が危険性が高いHPV株に感染している場合に存在するmRNAである。対象とするmRNAはHPV E6、E7 mRNAを含む。これらの実施形態では、対象とするmRNA種の定量化データが得られるように、対象とするmRNA種の絶対的なコピー数が決定されてもよい。バイオマーカーがHPV E6、E7であるいくつかの場合には、細胞当たりのE6、E7 mRNA種の合計量が決定される。これらの場合には、対象とするのは、これらの細胞が宿主においてCIN病変の存在と関連し得るので、細胞当たり、10以上、50以上、100以上、200以上、500以上を含む5以上などのような2つ以上のHPV E6、E7 mRNAのコピーの細胞の同定である。いくつかの場合には、本発明の方法において得られるバイオマーカーデータは、細胞当たり、2〜1000コピーのHPV E6、E7 mRNA、たとえば、細胞当たり、10〜500コピーのHPV E6、E7 mRNAを含む、細胞当たり、5〜750コピーのHPV E6、E7 mRNAがあるという情報を提供する。いくつかの場合には、得られるバイオマーカーデータは、本開示が参照により本明細書において組み込まれている米国特許第7,524,631号において記載されるように、細胞当たりのHPV E6、E7 mRNAのコピー数のデータである。コピー数の決定は、たとえば、非特異的なDNA染料(下記に記載)によって、基準値によってなどによって提供されるように、1つを適した対照と比較することを含んでいてもよい。
【００５０】
いくつかの場合には、光度測定もまた得られる。光度測定は、核光学濃度、細胞質光学濃度、バックグラウンド光学濃度、およびこれらの値のいずれかの比の決定を可能にする。
【００５１】
非特異的細胞データは、試料中の細胞についての非特異的(つまり非バイオマーカー特異的)細胞情報を得ることができる任意のタイプのデータである。いくつかの場合には、非特異的細胞データは、アッセイにおいて用いられる非特異的細胞染料によって放出されるシグナルを含むデータである。非特異的細胞データは、放出された光の存在および振幅、それから光シグナルが生じる細胞または他の物体における別個の位置の数、シグナル源の相対的な配置、ならびに細胞におけるそれぞれの位置で放出される光の色(波長またはウェーブバンド)の形態をしていてもよい。非特異的細胞データは、定性的データ、半定量的データ、または定量的データの形態を取ってもよい。たとえば、定量的または半定量的非特異的細胞データは、DNA染料(たとえば上記に記載される)を使用して得られる、細胞のDNA含有量についてのデータを含んでいてもよい。他の定量的データは、電気的体積(EV)を含む。したがって、非特異的細胞データは、細胞における非特異的細胞成分の絶対値または相対値、たとえばコピー数、量などの指標を提供することができる。半定量的および定量的データは、まとめて、非特異的細胞定量化データと呼ぶことができる。定性的非特異的細胞データは、細胞の特定の特徴の存在または不在に関しての情報を提供することができる。たとえば、DNA染料により染色された細胞では、細胞核の存在または不在を決定することができる(たとえば試料中の有核細胞の数、パーセント核形成とも呼ばれる)。
【００５２】
多数の別個の標識、たとえば、単一の試料において使用されるバイオマーカープローブ標識および非特異的細胞染料が、単一の標識液体細胞試料において検出されることになっている場合、用いられる標識および染料は、識別可能なシグナルをもたらすように選ぶことができる(上記に、単一の試料において多数のバイオマーカープローブを使用するために上記に記載される)ことに注意されたい。たとえば、標識バイオマーカープローブおよびDNA染料が用いられる実施形態では、バイオマーカープローブについての標識は、DNA染料の蛍光シグナルから識別可能な蛍光シグナルを産生する蛍光標識である。したがって、バイオマーカープローブ標識およびDNA染料の励起に際して産生される蛍光シグナルは、互いに識別可能であり、両方を同時に検出することができ、一方のシグナルが他方のシグナルを改変しないまたは変化させないことを意味する。それぞれの別個の標識は、任意の他の標識と識別可能なシグナルを産生することができる。たとえば、細胞は、励起に際して互いに識別可能な、3つの別個の蛍光シグナルを生成する3つの蛍光標識により染色することができる。
【００５３】
上記のタイプのデータ、たとえば形態計測データ、バイオマーカーデータ、および非特異的細胞データは、任意の好都合なプロトコールを使用して、試料の同じアリコートから得ることができる。いくつかの場合には、それぞれのタイプのデータを収集するフローサイトメトリープロトコールが用いられる。フローサイトメトリーは、液状培地中の異なる粒子(たとえば細胞)タイプ、つまり、標識(波長、強度)、サイズなどに関して互いに異なる粒子を同定し、区別するために多重パラメーターデータを使用する、よく知られている方法である。上記に記載されるように調製される試料をフローサイトメトリーにより分析する際に、試料のアリコートは、フローサイトメーターの流路に最初に導入される。流路において、細胞のそれぞれが単一波長の光源(またはいくつかの場合には、2つ以上の別個の光源)に別々に個々に暴露される1つまたは複数の感知領域を、試料中の細胞が実質的に1度に1つずつ通過すると、形態計測パラメーター、たとえば光散乱パラメーターおよび/またはバイオマーカーパラメーター、たとえば、所望されるように蛍光放射の測定値がそれぞれの細胞について別々に記録される。それぞれの細胞について記録されるデータは、所望されるように、リアルタイムで分析され、または後の分析のためにコンピューターなどのようなデータ記憶装置および分析手段中に保存される。
【００５４】
より具体的には、フローサイトメーターにおいて、細胞は、それぞれの領域においてそれぞれの細胞がエネルギー源によって照明される1つまたは複数の感知領域を、流路において浮遊して、実質的に1度に1つずつ通過する。エネルギー源は、レーザー(たとえばHe/Neもしくはアルゴン)によって提供されるものなどのような単一の波長の光を放出する照明器または適切なフィルターを有する水銀灯を含んでいてもよい。たとえば、488nmの光は、単一の感知領域を有するフローサイトメーターにおいて放射の波長として使用することができる。2つの別個の波長の光を放出するフローサイトメーターについては、放射光の追加の波長を用いることができ、対象とする特異的な波長は、535nm、635nmなどを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
感知領域と連続して、検出器、たとえば、光電子増倍管(または「PMT」)などのような光収集器、画像収集器(たとえば電荷結合デバイス(CCD)の形態をした)などは、細胞が感知領域を通過し、エネルギー源によって照明されると、それぞれの細胞を通過する光(一般に前方光散乱と呼ばれる)、感知領域を通る細胞のフローの方向に対して直角に反射される光(一般に直角または側方光散乱と呼ばれる)、およびそれが蛍光マーカーにより標識されている場合に細胞から放出される蛍光を記録するために使用される。得られるそれぞれのタイプのデータは、たとえば前方光散乱(あるいはFSC)、直角光散乱(SSC)、および蛍光放射(FL1、FL2など)、ならびに画像などは、それぞれの細胞(またはそれぞれの「事象」)についての別々のパラメーターを含む。
【００５６】
フローサイトメーターは、コンピューターなどのようなデータ獲得、分析、および記録手段をさらに含み、多数のデータチャネルは、それが感知領域を通過すると、それぞれの細胞によって放出される形態計測データおよびバイオマーカーデータについてのそれぞれの検出器からのデータを記録する。分析システムの目的は、細胞を分類し、数えることであり、細胞はそれぞれ、デジタル化されたパラメーター値のセットとして示される。本発明の方法において細胞をフローサイトメトリーによりアッセイする際に、フローサイトメーターは、バックグラウンドおよびノイズから対象とする細胞を区別するために選択されたパラメーターに対してトリガーを設定してもよい。「トリガー」は、パラメーターの検出のためにプレセットされた閾値を指す。それは、細胞がレーザー光線を通過するのを検出するための手段として典型的に使用される。選択されたパラメーターについての閾値を超える事象の検出は、細胞についての光散乱および蛍光データの獲得を引き起こす。データは、閾値より下の応答を引き起こす、アッセイされている培地中の細胞または他の成分については獲得されない。トリガーパラメーターは、細胞が光線を通過することによって引き起こされる前方光散乱の検出であってもよい。次いで、フローサイトメーターは、細胞についての光散乱および蛍光データを検出し、収集する。
【００５７】
次いで、対象とする特定の亜集団は、全集団について収集されたデータに基づいて「ゲートをかける」ことによってさらに分析される。適切なゲートを選択するために、データは、可能性のある亜集団の最善の分離を得るようにプロットされる。この処置は、2次元ドットプロット上に前方光散乱(FSC)対側方(つまり直角)光散乱(SSC)をプロットすることによって典型的に行われる。次いで、フローサイトメーターオペレーターは、細胞の所望の亜集団(つまりゲート内の細胞)を選択し、ゲート内にない細胞を除く。所望される場合、オペレーターは、コンピュータースクリーン上でカーソルを使用して、所望の亜集団のまわりに線を引くことによってゲートを選択してもよい。次いで、ゲート内のそれらの細胞のみが、蛍光などのようなこれらの細胞についての他のパラメーターをプロットすることによってさらに分析される。
【００５８】
液体試料の同じアリコートから、たとえば上記に記載されるように、形態計測データおよびバイオマーカー/非特異的細胞データの両方を得ることができる任意のフローサイトメーターを用いることができる。対象とするのは、米国特許第6211955号、第6249341号、第6256096号、第6473176号、第6507391号、第6532061号、第6563583号、第6580504号、第6583865号、第6608680号、第6608682号、第6618140号、第6671044号、第6707551号、第6763149号、第6778263号、第6875973号、第6906792号、第6934408号、第6947128号、第6947136号、第6975400号、第7006710号、第7009651号、第7057732号、第7079708号、第7087877号、第7190832号、第7221457号、第7286719号、第7315357号、第7450229号、第7522758号、第7567695号、第7610942号、第7634125号、第7634126号、第7719598号において記載されているフローサイトメーターシステムであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
たとえば上記に記載されるように、子宮頸部細胞性試料の同じアリコートから得られる形態計測データおよびバイオマーカー/非特異的細胞データは、上記に記載されるように、対象がCIN病変を有するかどうかについて用いられる。形態計測データ、バイオマーカーデータ、および非特異的細胞データの様々な組み合わせは、対象がCIN病変を有するかどうかの予測を行うのに用いることができる。対象とする組み合わせは、以下を含むが、これらに限定されない:a)E6、E7 mRNAの定量と結び付けられた核対細胞質(N/C)比分析(たとえば異常細胞を同定するための);b)DAPI染色によって決定される細胞周期分析およびE6、E7 mRNAハイブリダイゼーションシグナルの緑色蛍光と結び付けられたN/C比分析;c)p16染色によって決定される細胞周期分析およびE6、E7 mRNAハイブリダイゼーションシグナルの緑色蛍光と結び付けられたN/C比分析;d)DAPI(または他のDNA染料)染色によって決定される細胞周期分析と結び付けられたN/C比分析など。
【００６０】
増加したまたは高N/C比は、0.25以上、0.30以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上、0.95以上などのN/C比を含む。
【００６１】
N/C比に加えて、核面積(NA)アセスメントを、形態計測データとして使用することができる。たとえば正常な中層型扁平上皮細胞(intermediate squamous cell)における核と比較して、核面積が増加した子宮頸部細胞試料中の細胞は、異常細胞として同定される細胞とすることができる。異常細胞は、1 .25以上、1.75以上、2.0以上、2.25以上、2.75以上、3.0以上、3.25以上、3.5以上などの核面積対核面積比(対象とする細胞の核面積/正常な中層型扁平上皮細胞の核面積)を有しうる。標準的な顕微鏡検査法による観察を使用すると、核面積を評価する精度が低いことにここで注意されたい(たとえばSchmidtら、2008年、「Visual estimates of nucleus-to-nucleus ratios: can we trust our eyes to use the Bethesda ASCUS and LSIL size criteria?」  Cancer 1 14(5):287〜93頁を参照されたい。本発明の態様は、核面積のより正確でより再現可能なアセスメントを提供する。
【００６２】
側方(直角)光散乱、前方散乱、および電気的体積(EV;細胞サイズの測定値;コールターの原理に基づく)を含む、追加のデータパラメーターもまた、子宮頸部細胞試料中の細胞を分析するのに用いることができる。そのようなパラメーターは、異常細胞の存在について分析されることとなる試料中の細胞の集団または亜集団を同定する際に使用を見出す(たとえば、図6および本明細書におけるその説明を参照されたい)。たとえば、EVおよびDNA含有量(たとえばDAPIを使用する)の分析は、有核扁平上皮細胞からの除核細胞の区別を可能にする。
【００６３】
いくつかの場合には、方法は、アッセイされる細胞性試料が癌性細胞を含むことを決定するステップを含む。これらの実施形態では、方法は、試料中の1つまたは複数の癌性細胞の存在を同定するステップを含み、同定は、たとえば上記に記載されるように、形態計測データおよびバイオマーカーデータに基づいて行われる。そのような実施形態は、これらの実施形態の方法が試料中の実際の癌性細胞の存在を同定するので、対象におけるCINの存在を予測するステップを含んでいてもよくまたは含んでいなくてもよい。
【００６４】
いくつかの場合には、CIN病変の存在の予測は、サイトメーターへの試料の導入の後の短期間内に行われる。したがって、結果は、1時間以下を含めて、3時間以下、たとえば2時間以下などのような6時間以下の期間でユーザに提供することができる。所望される場合、対象からの試料の獲得から対象への結果の配達に及ぶ全アッセイ時間は、3時間以下、たとえば2時間以下含む、5時間以下、たとえば4時間以下などのような6時間以下である。
【００６５】
いくつかの場合には、方法は、方法が対象におけるCIN病変の予測をもたらす場合に、対象のさらなる分析を実行するステップをさらに含む。たとえば、本発明の方法が対象におけるCIN2+病変の予測をもたらす場合、次いで、方法は、たとえば生検などのようなさらなる診断法の形態でさらなる処置を取るという推奨を対象に提供するステップをさらに含んでいてもよい。いくつかの場合には、方法は、診断上の処置をさらに取るステップを含む。さらなる診断上の処置は、コルポスコピーを含んでいてもよく、子宮頸部の拡大目視検査は、異常細胞を同定するために子宮頸部の表面上で実行される。癌または前癌病変が存在し得ることを生検が示す場合、ループ式電気外科円錐切除法(loop electrical excision procedure)(LEEP)および円錐切除術などのようなさらなる診断および治療処置を取ることができ、子宮頸部の内膜は、病理学的に検査するために取り出される。
【００６６】
方法が、様々な異なる雌哺乳動物の対象での使用に適しているが、対象とするのは、10歳以上の、たとえば、20歳以上を含む、15年歳以上のヒト女性対象などのようなヒト女性対象での方法の使用である。
【００６７】
デバイスおよびシステム
本発明の態様は、本発明の方法の実施において使用されるシステムをさらに含む。対象とするシステムは、たとえば上記に記載されるように、形態計測データおよびバイオマーカーデータの両方について液体試料をアッセイするように構成されたフローサイトメーターを含む。対象とするフローサイトメーターは、必要であれば、上記に記載されるような画像データを得るための能力を含むように改変される、米国特許第4,704,891号;第4,727,029号;第4,745,285号;第4,867,908号;第5,342,790号;第5,620,842号;第5,627,037号;第5,701、012号;第5,895,922号;および第6,287,791号において記載されているデバイスならびに米国特許第6211955号、第6249341号、第6256096号、第6473176号、第6507391号、第6532061号、第6563583号、第6580504号、第6583865号、第6608680号、第6608682号、第6618140号、第6671044号、第6707551号、第6763149号、第6778263号、第6875973号、第6906792号、第6934408号、第6947128号、第6947136号、第6975400号、第7006710号、第7009651号、第7057732号、第7079708号、第7087877号、第7190832号、第7221457号、第7286719号、第7315357号、第7450229号、第7522758号、第7567695号、第7610942号、第7634125号、第7634126号、第7719598号において記載されているサイトメーターを含むが、これらに限定されず、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
いくつかの場合には、フローサイトメーターは、フローチャネル;フローチャネルのアッセイ領域に対して光を当てるように構成された少なくとも1つの第1の光源(いくつかの場合には、サイトメーターは2つ以上の光源を含む);フローチャネルのアッセイ領域から第1の波長の光を受け取るように構成された第1の検出器;およびフローチャネルのアッセイ領域から第2の波長の光を受け取るように構成された第2の検出器;ならびに細胞の画像データを得るように構成された画像検出器を含む。そのようなサイトメーターは、画像検出器に加えて少なくとも2本の検出チャネルを有するであろう。いくつかの場合には、デバイスは、2つを超える検出チャネル、たとえば3以上、4以上、5以上、10以上などの検出チャネルを含んでいてもよい。
【００６９】
本発明の態様は、第1および第2の検出器から形態計測データおよびバイオマーカーデータを受け取り、形態計測データおよびバイオマーカーデータの両方に基づく、対象が子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変を有するかどうかの予測の結果を出力するように構成されたシグナル処理モジュールを含むシステムをさらに含む。シグナル処理モジュールは、単一のデバイスとしてサイトメーターに統合されてもよくまたはサイトメーターから分散していてもよく、シグナル処理モジュールおよびサイトメーターは、たとえば、有線または無線通信プロトコールを介して互いに通信し合う。
【００７０】
したがって、本発明の態様は、システム、たとえばコンピューターベースのシステムをさらに含み、これらは、たとえば上記に記載されるように、対象におけるCIN病変の存在を予測するように構成される。「コンピューターベースのシステム」は、本発明の情報を分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ保存手段を指す。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウェアは、中央処理装置(CPU)、入力手段、出力手段、およびデータ保存手段を含む。当業者は、現在入手可能なコンピューターベースのシステムのいずれか1つが本発明において使用するのに適していることを容易に、十分に理解することができる。データ保存手段は、上記に記載されるように、本発明の情報の記録を含む任意の製品またはそのような製品にアクセスすることができるメモリアクセス手段を含んでいてもよい。
【００７１】
「記録」データについて、コンピューター読み取り可能なメディア上のプログラミングまたは他の情報は、当技術分野において知られている任意のそのような方法を使用して情報を保存するための方法を指す。任意の好都合なデータ保存構造が、保存された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて選ぶことができる。様々なデータプロセッサープログラムおよび形式、たとえば文書処理テキストファイル、データベース形式などは、保存のために使用することができる。
【００７２】
「プロセッサー」は、それに必要とされる機能を実行するであろう任意のハードウェアおよび/またはソフトウェアの組み合わせを参照する。たとえば、本明細書における任意のプロセッサーは、電子制御器、メインフレーム、サーバー、またはパーソナルコンピューター(デスクトップもしくはポータブル)の形態で入手可能なような、プログラム可能なデジタルマイクロプロセッサーであってもよい。プロセッサーがプログラム可能である場合、適したプログラミングは、リモート位置からプロセッサーに通信することができ、またはあらかじめ、コンピュータープログラム製品(磁気、光学、またはソリッドステートデバイスベースであるかどうかにかかわらずポータブルまたは固定コンピューター読み取り可能な保存メディアなど)中に保存することができる。たとえば、磁気メディアまたは光ディスクは、プログラミングを保持してもよく、その対応するステーションでそれぞれのプロセッサーと通信する適したリーダーによって読み取ることができる。
【００７３】
本発明のシステムの実施形態は、以下の成分を含む:(a)下記に記載される、たとえばユーザコンピューターを介して、システムおよび1つまたは複数のユーザの間の情報転送を促進するための通信モジュール;ならびに(b)本発明の定量分析方法において含まれる1つまたは複数のタスクを実行するための処理モジュール。
【００７４】
ある実施形態では、その中に保存される制御論理(プログラムコードを含むコンピューターソフトウェアプログラム)を有するコンピューター利用可能なメディアを含むコンピュータープログラム製品が、記載される。制御論理は、コンピューターのプロセッサーによって実行される場合、本明細書において記載される機能をプロセッサーに実行させる。他の実施形態では、いくつかの機能は、たとえば、ハードウェアステートマシンを使用して、主としてハードウェア中に構築される。本明細書において記載される機能を実行するためのハードウェアステートマシンの実装は、任意の好都合な方法および技術を使用して達成することができる。
【００７５】
たとえば、上記に記載されるセンサーデバイスおよびシグナル処理モジュールに加えて、本発明のシステムは、データ出力デバイス、たとえばモニターおよび/またはスピーカー、データインプットデバイス、たとえばインタフェースポート、キーボードなど、流体操作(fluid handling)成分、電源などのような多くの追加の成分を含んでいてもよい。
【００７６】
いくつかの場合には、システムは、その反応混合物誘導体(たとえば、そこから産生された洗浄細胞)をさらに含んでいてもよく、反応混合物は、たとえば、試料を、1つまたは複数の標識バイオマーカープローブおよび任意選択の非特異的な染料と組み合わせることによって、上記に記載されるように調製される。
【００７７】
有用性
本発明の方法およびシステムは、対象におけるCIN病変の検出予測が、所望される、様々な異なる適用において使用を見出す。そのような適用は、研究および診断上の適用、たとえば、対象が、たとえば上記に記載されるように、子宮頸癌の存在またはそれを発症する傾向に関して診断される適用の両方を含む。本明細書において記載される方法およびシステムの臨床的有用性は、初期および末期の両方において、HPV関連性の病変形成および子宮頸癌の進行を検出し、スクリーニングするための強力なツールを提供し、したがって、疾患進行を予防するための治療的介入および早期治療を提供するための機会を可能にする。さらに、本発明の方法およびシステムは、HPV関連性の疾患または症状の進展をモニターするためのおよびたとえば抗HPVワクチンまたは抗HPVワクチン候補などのような抗HPV薬剤または治療の効率をモニターするためのHPV関連性の疾患または症状の予後またはリスクアセスメントにおいて使用を見出す。
【００７８】
コンピューター関連の実施形態
本発明の態様は、様々なコンピューター関連の実施形態をさらに含む。具体的には、前の部において記載されるデータ分析方法は、コンピューターを使用して実行することができる。したがって、本発明は、CIN病変を検出するまたは予測するために上記の方法を使用して産生されるデータを分析するためのコンピューターベースのシステムを提供する。
【００７９】
ある実施形態では、方法は、「プログラミング」の形態をした物理的なコンピューター読み取り可能なメディア上にコードされ、本明細書において使用される用語「コンピューター読み取り可能なメディア」は、実行および/または処理のためにコンピューターに命令および/またはデータを提供するのに参加する任意の保存または伝送メディアを指す。保存メディアの例は、そのようなデバイスがコンピューターの内部にあるか外部にあるかにかかわらず、フロッピー(登録商標)ディスク、磁気テープ、CD-ROM、ハードディスクドライブ、ROMもしくは集積回路、光磁気ディスク、またはPCMCIAカードなどのようなコンピューター読み取り可能なカードなどを含む。情報を含有しているファイルは、コンピューター読み取り可能なメディア上に「保存」されてもよく、「保存」は、それが、コンピューターによって後の日にアクセス可能であり、検索可能となるように、情報を記録することを意味する。メディアとして対象とするのは、非一時的メディア、つまり物理的メディアであり、プログラミングは、物理的構造物上に記録されるなどのように、物理的構造物と関連する。非一時的メディアは、無線プロトコールを介して移行中の電子信号を含まない。
【００８０】
コンピューター読み取り可能なメディアに関して、「固定記憶」は、永久の記憶を指す。固定記憶は、コンピューターまたはプロセッサーへの給電の停止によって削除されない。コンピューターハードドライブ、CD-ROM、フロッピー(登録商標)ディスク、およびDVDはすべて、固定記憶の例である。ランダムアクセスメモリ(RAM)は、非永久記憶の例である。固定記憶中のファイルは、編集可能で、再書き込み可能であってもよい。
【００８１】
キット
他の態様では、本発明は、たとえば上記に記載されるように、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、たとえば上記に記載されるように、標識バイオマーカープローブを含んでいてもよい。さらに、キットは、上記に記載されるように、非特異的染料を含んでいてもよい。さらに、キットは、所与のアッセイにおいて用いることができるバッファー、希釈剤、固定試薬、透過処理試薬などを含むが、これらに限定されない、用いられる1つまたは複数の追加の組成物を含んでいてもよい。キットは、上記に記載されるように、試料獲得デバイス、たとえば子宮頸部ほうきをさらに含んでいてもよい。上記の成分は、別々の容器中に存在してもよく、または1つもしくは複数の成分は、単一の容器、たとえばガラス製もしくはプラスチックバイアルの中に組み合わせてもよい。
【００８２】
上記の成分に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための説明書をさらに含むであろう。これらの説明書は、様々な形態で本発明のキット中に存在してもよく、これらの1つまたは複数は、キット中に存在してもよい。これらの説明書が存在してもよいある形態は、適したメディアまたは基板上の印刷情報、たとえば、キットの包装、添付文書などに情報が印刷されている1枚または複数枚の紙としてのものである。他の手段は、情報が記録されているコンピューター読み取り可能なメディア、たとえばディスケット、CDなどであろう。存在してもよい他の手段は、遠く離れたサイトで情報にアクセスするためにインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の好都合な手段が、キット中に存在してもよい。
【００８３】
以下の実施例は、限定としてではなく、例証として提供される。
【００８４】
(実施例)
実験
液体ベースの子宮頸部細胞診(LBC)検体の1ml試料アリコートを得、室温で、5分間、1000xgで遠心分離した。結果として生じた細胞ペレットは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4中で2回洗浄し、細胞は、IncellFP(Incelldx、Menlo Park、CA)を使用して、室温で、1時間、固定および透過処理した。結果として生じた、固定および透過処理した細胞は、2つの異なるプレハイブリダイゼーションバッファー(PBSおよび2XSSC)を使用して2回洗浄し、ハイブリダイゼーションカクテルは、ハイブリダイゼーションバッファー(5XSSC、30%ホルムアミド)を、すべての既知の危険性が高いHPVタイプについての蛍光標識HPV E6、E7 mRNAプローブカクテルと混合することによって調製した(プローブカクテルは、HPV OncoTect(商標)  E6,E7 mRNA Detection Kit(incellDx、Menlo Park、CA)のプローブカクテルにおいて見出されるものからのものとした)。ハイブリダイゼーション反応は、30分間、予熱した43±1℃のウォーターバス中で実行し、非結合プローブを除去するために2つのポストハイブリダイゼーションバッファー(2XSSC、Triton X-100および0.1XSSC、Triton X-100)により細胞のストリンジェンシー洗浄を続けた。細胞は、2%ウシ胎仔血清を含有する1mlPBS中で洗浄し、60μlのPBS、0.05%Triton X-100、および1μg/ml DAPI中に再懸濁した。機器に流す前に、PBS中の200μlの10μΜ  EDTAを追加した。試料は、シリンジによりホモジナイズし、ImageStream機器(Amnis Inc、Seattle、WA)に流した。機器は、たとえば図1において示されるように、縦横比対面積ドットプロットを使用して、完全な単一の細胞を区別するために設定した。この設定は、(1)N/C(核対細胞質)比分析による異常細胞の同定(たとえば図2を参照されたい);ならびに(2)DAPI染色およびE6、E7 mRNAハイブリダイゼーションシグナルの緑色蛍光によって決定されるE6、E7 mRNAの定量を可能にした(図3Aおよび3Bを参照されたい)。
【００８５】
その代わりに、DNA染色試薬(たとえば細胞のDAPIまたはDRAQ5染色)によって決定される細胞周期分析およびE6、E7 mRNAハイブリダイゼーションシグナルの緑色蛍光は、異常細胞を検出するために使用することができる。たとえば、図4におけるヒストグラムにおいて知ることができるように、E6/E7 mRNAの過剰発現(Y軸)は、DNA含有量(X軸;DNA染料はDRAQ5とする)が増加した細胞において見出される。
【００８６】
すべて浮遊している細胞に対して実行される、Table 1(表1)における容認されたスライドベースの基準と一致する形態計測測定および細胞ごとのE6、E7 mRNAの過剰発現の使用の組み合わせは、それぞれ>95%および>90%までCIN 2+の検出のための感度および特異性を増加させた。単一のアッセイにおけるこの性能は、CIN 2+病変の検出のために組み合わせたPAPスミアおよびHPV DNAの試験性能を大幅に上回る。
【００８７】
このアプローチは、E6、E7 mRNAの検出の代わりにp16抗体を用いて、E6、E7 mRNAプローブを、子宮頸癌と関連する特異的マイクロRNAもしくは染色体変化3q‐に対するプローブと置き換えて、またはE6、E7 mRNAプローブの代わりにE6、E7特異的抗体を用いて使用することができる。
【００８８】
追加のもう1つの方法として、形態計測測定、たとえば細胞の核/細胞質比と結び付けた、DNA染色試薬によって決定される細胞周期分析は、異常細胞を検出するために使用することができる。たとえば、図5Aおよび5Bは、正常な子宮頸部細胞(図5A、上パネル)、LSIL子宮頸部細胞(図5A、下パネル))、およびHSIL子宮頸部細胞(図5B、両方のパネル)のN/C比(Y軸)対DNA含有量のヒストグラムを示す。このもう1つの方法は、1つのみの染色試薬、つまり非特異的DNA染色試薬を使用する。
【００８９】
さらに、下記のTable 2(表4)において示されるように、発明者らは、DNA染色試薬の使用によって決定される、試料中の扁平上皮細胞の核形成の程度が、細胞学的異常の重症度と一致することを見出した。具体的には、試料中の扁平上皮細胞のパーセント核形成の増加は、細胞学的異常の重症度の増加と一致する。Table 2(表4)では、正常な扁平上皮細胞は、約50%の%核形成を有し、LSIL扁平上皮細胞は、約80%の%核形成を有し、HSIL扁平上皮細胞は、90%以上の%核形成を有した。そのため、約80%以上の対象由来の試料中の扁平上皮細胞についてのパーセント核形成は、対象が、子宮頸部上皮内腫瘍(CIN)病変(たとえばLSILまたはHSIL)を有することを示し、試料における約90%以上のパーセント核形成は、対象が、高悪性度扁平上皮病変(high grade squamous epithelial lesion)(HSIL)を有することを示す。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
子宮頸部細胞試料は、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイに適切でない細胞型(および他のデブリ)を含み得、そのため、分析からそれらを除くことは好都合であろう。図6は、子宮頸部細胞診試料中の細胞の側方(直角)光散乱(Y軸)および電気的体積(X軸)の組み合わせのドットプロットを示す。このプロットは、これらの形態計測パラメーターを使用して、試料中の異なる細胞(および他の成分)を定めることができることを示す。4つの異なるゲートは、デブリ、子宮膣部の細胞、子宮頸管内の細胞、および多形核白血球(PMNS)を同定する。そのようなゲーティングを用いて、本発明の態様によってスクリーニングする対象とする細胞(たとえば子宮頸管内のおよび/または子宮膣部の細胞)を同定することができる。
【００９２】
前述の発明は、理解の明瞭さのために例証および実施例として詳細に記載されたが、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある変化および改変が成されてもよいことは、本発明の教示を考慮して当業者らに容易に明らかである。
【００９３】
したがって、前述のものは、単に本発明の原理を例証するものである。本明細書において明白に記載されていないまたは示されていないが、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な構成を当業者らが考案することができるであろうということが十分に理解されるであろう。さらに、本明細書において記載される実施例および条件付きの用語はすべて、主として、本発明の原理および技術を進展させるために発明者によって提供された概念を理解する際に、読者を支援することを意図し、そのような具体的に記載される実施例および条件に対する限定を伴わないものとして解釈されたい。本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその特定の実施例を記載する本明細書におけるすべての表現は、その構造的および機能的等価物を包含するように意図される。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物、つまり、構造に関係なく、同じ機能を実行する、開発されるあらゆる要素の両方を含むことが意図される。本発明の範囲は、そのため、本明細書において示され、記載される例示的な実施形態に限定されるようには意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の請求項によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月21日(2019.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマーカー標識された液体細胞試料において、前癌細胞の存在を検出する方法であって、一連の試料をフローサイトメトリーアッセイする工程を含み、前記アッセイが、
ａ）試料の細胞から得られる、形態計測データ、細胞周期データ、またはそれらの組みわせに基づき異常細胞を同定すること、及び
ｂ）異常細胞から得られるバイオマーカー定量データフローサイトメトリーに基づき、異常細胞が前癌細胞であるか否かを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
異常細胞が、核対細胞質比定量、核面積定量、DNA含量定量を含む細胞周期データ、またはそれらの組み合わせを含む形態計測データに基づき同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異常細胞の同定が、電気的体積定量をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
被験者から得られた液体細胞試料を固定及び透過処理して、バイオマーカー標識液体細胞試料の生成に使用される、固定及び透過処理した液体細胞試料を生成することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
バイオマーカープローブと、固定及び透過処理した液体細胞試料を接触させ、バイオマーカー標識液体細胞試料を生成することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
バイオマーカープローブが核酸バイオマーカープローブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バイオマーカー標識液体細胞試料を、DNA特異的染料により染色することをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
2以上のバイオマーカープローブのバイオマーカー定量データに基づき、異常細胞が前癌細胞であるか否かを検出することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
2以上のバイオマーカープローブのハイブリダイゼーションカクテルと、固定及び透過処理した液体細胞試料を接触させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
一連の試料をアッセイして、一連の試料の細胞またはその亜集団の核形成度を測定するフローサイトメトリーをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカー標識液体細胞試料がHPV関連試料である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
HPV関連性の疾患または症状の予後またはリスクアセスメントを提供する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
バイオマーカー標識液体細胞試料が扁平上皮細胞を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
フローチャネル、
前記フローチャネルのアッセイ領域に対して光を当てるように構成された光源、
前記フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、形態計測データ、細胞周期データ、またはそれらの組み合わせを生成するように構成された第1の検出器、
前記フローチャネルのアッセイ領域から光を受け取り、バイオマーカーデータを生成するように構成された第2の検出器、ならびに
ａ）前記第1の検出器から前記形態計測データ、細胞周期データ、またはそれらの組み合わせを受け取り、前記形態計測データ、細胞周期データ、またはそれらの組み合わせに基づき、異常細胞がフローチャネル中に存在する場合に検出するように構成され、かつ
ｂ）前記第2の検出器から前記バイオマーカーデータを受け取り、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によるバイオマーカーデータに基づき、前記検出された異常細胞が前癌細胞であるか否かの結果を出力するように構成されたシグナル処理モジュール
を含むシステム。
【請求項１５】
バイオマーカーで標識され、DNA特異的染料で染色された液体細胞試料をさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
核酸バイオマーカーに特異的に結合する蛍光標識核酸バイオマーカープローブ、及び
DNA特異的染料
を含むキット。
【請求項１７】
透過処理剤をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
固定剤をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
単一の容器中に存在する透過処理剤と固定剤を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
蛍光標識核酸バイオマーカープローブが、HPV関連核酸バイオマーカーに特異的に結合する、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のキット。
【外国語明細書】
2019124701000001.pdf