(57)【要約】      （修正有）【課題】慢性炎症に伴う疾病の患者を診断する方法及びキット、及びこのような患者を治療する薬剤を提供する。【解決手段】慢性炎症に伴う疾病の患者を診断する方法であって、分子表現型がサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」、及び「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のグループから成る前記分子表現型から選択されると共に、前記患者の生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの遺伝子発現が測定され、疾病の前記分子表現型の分類に利用される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性炎症に伴う疾病の患者を診断する方法であって、分子表現型がサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」、及び「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のグループから成る前記分子表現型から選択されると共に、前記患者の生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの遺伝子発現が測定され、疾病の前記分子表現型の分類に利用される方法。
【請求項２】
タンパク質量で前記ＧＡＴＡ−３及び／又は前記Ｔｂｅｔの発現レベルが判定され、前記タンパク質量が、免疫分析、好適にはＥＬＩＳＡ検査、放射免疫分析、電気化学発光免疫分析、ＣＬＩＡ（化学発光結合免疫吸着分析）、ＦＬＩＡ（蛍光結合免疫吸着分析）、又は多重分析によって決定され、及び／又は、
前記ＧＡＴＡ−３及び／又は前記Ｔｂｅｔの前記発現レベルがｍＲＮＡ量によって決定され、該ｍＲＮＡ量がＰＣＲ又はマイクロアレイチップを用いて定量的に判定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記の条件の少なくとも１つが満たされる場合に、すなわち、
ａ）前記生物学的単離における前記ＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも高く、及び／又は
ｂ）前記生物学的単離における前記ＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔ遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
下記の条件の少なくとも１つが満たされる場合に、すなわち、
ａ）前記生物学的単離における前記ＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも低い場合、及び／又は
ｂ）前記生物学的単離における前記ＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔ遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも低い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
下記の条件の少なくとも１つが満たされる場合に、すなわち、
ａ）前記生物学的単離における前記Ｔｂｅｔ遺伝子発現が所定の基準値よりも高い、及び／又は
ｂ）前記生物学的単離における前記ＴｂｅｔとＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
下記の条件の少なくとも１つが満たされる場合に、すなわち、
ａ）前記生物学的単離における前記Ｔｂｅｔ遺伝子発現が所定の基準値よりも低く、
ｂ）前記生物学的単離における前記Ｔｂｅｔと、前記生物学的単離における前記ＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも低い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＡＴＡ−３及び／又は前記Ｔｂｅｔの遺伝子発現の判定の他に、血清ＩｇＥ濃度及び／又は好酸性顆粒球数が判定され、且つ／又はＦｅＮＯ値が判定されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
慢性炎症疾患が、アレルギー性気管支喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、天疱瘡、潰瘍性結腸炎、寄生虫疾患を含むＴｈ２関連の慢性炎症疾患、又は疥癬、アレルギー性接触性皮膚炎、クローン病、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、自己免疫性疾患、１型糖尿病、ＭＳを含むＴｈ１関連の慢性炎症疾患であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
慢性炎症に伴う疾病の患者を治療する薬剤であって、分子表現型が、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」、及び「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のグループから成る前記分子表現型から選択されると共に、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により判定される薬剤。
【請求項１０】
ＧＡＴＡ−３又はＴｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムを含むことを特徴とする、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の前記分子表現型を有する前記患者を治療するための前記ＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムを含み、又は前記サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の前記分子表現型を有する前記患者を治療するための前記Ｔｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
外水相Ｗ１、該外水相Ｗ１に分散させた油相Ｏ、及び該油相Ｏ内に分散させた内水相Ｗ２を含み、該内水相に分散させた少なくとも１つの電解質がハロゲン化アルカリ及びハロゲン化アルカリ土類及びその硫酸塩群から選択され、少なくとも１つの前記ＧＡＴＡ−３又はＴｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムを含み、前記外水相Ｗ１は、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドである親水性乳化剤を含み、前記油相Ｏがトリアシルグリセルドから形成され、ジメチコーン群の親油性乳化剤を含むことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の分子表現型を診断するキットであって、前記患者の生物学的単離においてタンパク質量又はＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのｍＲＮＡ量を定量的に決定するための請求項１から８のいずれか一項に記載の方法の特徴を含む、キット。
【請求項１４】
前記タンパク質量を定量的に決定するため、前記ＧＡＴＡ−３及び／又は前記Ｔｂｅｔに対するそれぞれに特異的な抗体を含み、好適には免疫分析、特にＥＬＩＳＡＳを実行するための構成を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ｍＲＮＡ量を定量的に判定するため、前記ＧＡＴＡ−３及び／又は前記Ｔｂｅｔ遺伝子用の配列特異的なサンプル、及び／又はプライマーを含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は慢性炎症に伴う疾病の患者を診断する方法及びキット、及びこのような患者を治療する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性炎症は、社会経済的に極めて重要な増大する医学的問題領域を呈している。それには特に以下の疾病群が挙げられる。自己免疫疾患、及びリウマチ性疾患（特に皮膚、肺、腎臓、血管系、神経系、結合組織、筋骨格、内分泌系の兆候）、即時型アレルギー反応及び喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム性動脈硬化症、乾癬及び接触性皮膚炎及び臓器移植後及び骨髄移植後の慢性拒絶反応。これらの疾患の多くはこの１０年間、先進工業国だけではなく一部は世界中で罹患率が高まっている。このように、欧州、北米、日本及びオーストラリアではこの間、人口の２０％超がアレルギー性疾患及び喘息を罹っている。慢性破壊性肺疾患は現在、死因が世界５番目であり、ＷＨＯの試算では２０２０年には３番目の死因になるとされている。心臓発作、脳卒内、及び末梢動脈閉塞疾患の二次疾患を伴う動脈硬化症は、罹患率と死亡率の統計で世界的に首位を占めている。乾癬及び接触性皮膚炎は神経皮膚炎と共に、該して最も頻繁に見られる慢性皮膚炎である。
【０００３】
今日まで環境要因と遺伝性素因との相互作用の理解が不十分であったため、免疫系の調節異常が続いている。それに関して、これらの異なる疾患については以下の共通原理を確認することができる。
【０００４】
（Ａ）通常は人に無害な抗原に対する過剰な免疫反応が生じる。これらの抗原は環境要素（例えば花粉、動物の毛、食品、ダニなどのアレルギー誘発物質、防腐剤、色素、洗剤などの化学物質）であることがある。これらの場合、患者にアレルギー反応が生じる。例えば喫煙者及び受動喫煙者の場合は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が生じる。他方では、免疫系も特定の器官に対して反応し、これを異物として認識し、それに対する炎症反応が始まることがある。これらの場合は、自己免疫疾患が生じる。いずれの場合も、無害の非毒性抗原が異物又は危険であると誤認され、不適切な炎症反応が始まる。
（Ｂ）疾病は開始、進行、すなわち炎症反応の進展と同時に進み、それに関連する破壊及び器官の機能損失を伴う変質（いわゆるリモデリング）が加わる。
（Ｃ）疾病は、患者特有の亜表現型の顕著な特徴を呈する。
（Ｄ）開始、持続及び破壊及び変質過程には先天性及び後天性免疫が持続的に関与する。先天性免疫の影響（重要な要素：多様な固定集団を有する抗原提示細胞、及び補体系）は、適応免疫系の細胞の活性化と分化とを生じる。
【０００５】
（重要な要素：Ｔリンパ球及びＢリンパ球）Ｔ細胞は、その後の過程で高度分化エフェクターに分化することで中心的な機能を果たす。
【０００６】
その際、Ｔ細胞は特定のエフェクター機構を活性化し、且つ獲得し、それには以下の機能が含まれる。抗原の産生、免疫系のエフェクター細胞の機能制御（例えば好中球、好塩基球、好酸性顆粒球など）、先天性免疫系の機能のフィードバック、例えば上皮、内皮、結合組織、骨、軟骨、及び特に神経細胞などの非造血細胞の機能への影響。そこで、免疫系と神経系との間の特別な相互作用が生じ、慢性炎症における神経免疫相互作用の概念がそこから発展した。
【０００７】
前述のＴ細胞は疾病過程で中心的な機能を果たすため、その分化を理解することは決定的に重要である。複雑な信号伝達カスケードは、ナイーブＣＤ４＋細胞からＴｈ１細胞（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ｃｅｌｌ）又はＴｈ２細胞（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ２  ｃｅｌｌ）への分化に関与している。
【０００８】
適宜のペプチド−ＭＨＣ複合体によるＴ細胞受容体を介した刺激は、クローン性増殖と、ＣＤ４＋Ｔリンパ球からＴヘルパー（Ｔｈ）１細胞又はＴｈ２細胞へのプログラムされた分化を誘発する。これらの２つの亜型の区別はそのサイトカインプロファイルに基づいて行われる。Ｔｈ１細胞はインターフェロンγ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）及び腫瘍壊死因子−αを産生し、一方、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、及びＩＬ−１３を分泌する。細菌感染及びウイルス感染は、Ｔｈ１細胞により支配される免疫反応を誘発する。他方では、Ｔｈ２細胞は抗寄生虫ＩｇＥの産生を調整する。その際、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とはバランスが取れている。このバランスが崩れると疾病の原因となるため、過剰なＴｈ１細胞反応は自己免疫疾患に関連し、一方、アレルギー性疾患は増強されたＴｈ２細胞反応に基づくものである。
【０００９】
Ｔｈ１サイトカインは、例えば自己免疫性ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、１型糖尿病又はクローン病などの自己免疫性疾患の発症に関与し、一方Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３又はＩＬ−９）は、例えば気道好酸球増多、喘息、粘液過分泌及び気道反応性亢進などの炎症性気道疾患に関与することが知られている。これらの疾患の原因は、抗原特異的Ｔｈ細胞による特性サイトカインの産生中の病態生理学的変化である。肺及び気道内のＴｈ２細胞亜集団は、動物モデルで気管支喘息の特徴的な症候を誘発する。
【００１０】
自己免疫性疾患及び慢性炎症反応には、特に２つの転写因子、すなわちＴｈ１細胞に特異の転写因子Ｔｂｅｔ及びＴｈ２細胞に特異の転写因子ＧＡＴＡ-３が関与している。
【００１１】
Ｔｈ１細胞特異の転写因子Ｔｂｅｔは特にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化に関与している。その発現はＴ細胞受容体（ＴＺＲ）のシグナル伝達経路を介して、及びＩＮＦγ−受容体／ＳＴＡＴ１を介して制御される。Ｔｂｅｔは内在性ＩＮＦγ遺伝子を転写活性化し、ＩＮＦγ産生を誘発する。Ｔｂｅｔの生体内機能はノックアウトマウス（Ｔｂｅｔ−／−）内で確認される。Ｔｂｅｔが欠損したマウスではＴｈ２サイトカインの量が増加する。
【００１２】
炎症性腸疾患の発症時の粘膜Ｔ細胞の機能は知られている。転写因子Ｔｂｅｔは特にＴｈ１細胞の成長を誘発し、これらの細胞内のＩＮＦγ産生を制御する。Ｔｂｅｔの抑制によって、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランスはＴｈ２の方に移行する。
【００１３】
これに対して例えばアレルギー性喘息などの炎症疾病は、Ｔｈ２細胞の活性化に関連している。Ｔｈ２細胞は、アレルギー性疾患、特に様々な喘息疾患の発症に重要な役割を果たす。それに必要なＴｈ０細胞のＴｈ２細胞への分化は、転写因子ＧＡＴＡ−３に依存する。ＧＡＴＡ−３は、転写因子のＧＡＴＡファミリーに属する。
【００１４】
Ｔｈ２細胞に特異な転写因子ＧＡＴＡ−３は、特にナイーブＣＤ４+Ｔ細胞からＴｈ２細胞への分化に関与している。その際、Ｔｈ２細胞の分化は主として２つの細胞受容体（ＴＺＲ）及びＩＬ−４受容体経路によって制御される：ＴＺＲから伝達されるシグナルはＴｈ２細胞に特異な転写因子ｃ-Ｍａｆ及びＧＡＴＡ-３と、転写因子ＮＦＡＴ及びＡＰ−１の両方によって活性化される。ＩＬ−４受容体の活性化によってＳＴＡＴ６はＩＬ−４受容体の細胞質ドメインに結合され、そこでＪａｋ１キナーゼ及びＪａｋ３キナーゼによってリン酸化される。リン酸化自体は核内のＳＴＡＴ６の二量化と転写とを引き起こし、そこでＳＴＡＴ６はＧＡＴＡ−３及びその他の遺伝子の転写を活性化する。ＧＡＴＡ−３は、Ｔｈ１細胞内ではなく成熟したＴｈ２細胞内でのみ発現される亜鉛フィンガー転写因子である。
【００１５】
Ｔｈ２細胞は例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３及びＧＭ-ＣＳＦなどのサイトカインを産生する。Ｔｈ２への分極はＴｂｅｔの抑制によってＴｈ１の分化を抑止し、逆の場合も同様である。しかしＧＡＴＡ−３の発現はＴ細胞に限定されない。ＧＡＴＡ−３の発現は好酸球及び好塩基球、肥満細胞及び上皮細胞内でも検出できよう。ＧＡＴＡ−３は、慢性炎症性疾患、特にアレルギー性喘息の免疫病因に重要な役割を果たす。
【００１６】
慢性炎症性疾患を治療するための確立された製剤は特に、コルチコステロイド、抗ロイコトリエン、免疫抑制剤、及び抗ＩｇＥモノクロナール抗体である。しかし、これらの治療薬が喘息患者に良好に効く程度は異なる。長期間にわたって、これらの効能の差の原因は不明のままである。結論として、患者には多かれ少なかれ「試行錯誤」の原理で個々の症例に基づいて適切な治療を施さなければならなかった。
【００１７】
しかし、最近になって、例えば喘息に苦しむ患者をサブグループに区分できることが確認された（非特許文献１）。そこで喘息患者には「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」及び「Ｔｈ２  ｌｏｗ」と呼ばれる少なくとも２つのサブグループがあることが示された。その際、喘息患者のサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」は特に、ペイオスチンタンパク質をコードする遺伝子ＰＯＳTＮ、及びＩＬ−１３遺伝子及びＩＬ−５遺伝子を有している。喘息治験患者の「Ｔｈ２  ｌｏｗ」グループは、健常者の対照群と同程度の低いＰＯＳＴＮ遺伝子発現を示した。これらの異なる分子表現型は、現在の治療薬の効能が異なる原因である可能性がある。このように、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」では、コルチステロイドでの治療への応答挙動が改善することが確認できた。
【００１８】
更に、２グループ、すなわち「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」と「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の喘息患者にヒト化モノクロナール抗体による治療がＩＬ−１３に対して効く程度が異なることも判明している（非特許文献２）その際、血清ＩｇＥの値が１００ＩＵ／ｍｌ以上で、好酸性顆粒球の細胞数が１リットル当たり０．１４ｘ１０９個以上である場合は、喘息患者は経験的に先ず「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」グループに分類された。それ未満の値の場合はそれぞれ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」グループに分類された。あるいは、血液検体又は気道検体では検出困難なＴｈ２サイトカインＩＬ−１３の代理マーカー（Ｓｕｒｒｏｇａｔｍａｒｋｅｒ）として使用される血清ペリオスチン濃度に基づいて分類が行われた。その際、ＩＬ−１３が特に生体内上皮細胞内のペリオスチンコード遺伝子ＰＯＳＴＮの発現を誘発するという事実が利用される。（非特許文献３）血清ペリオスチン濃度が平均を超える患者は、Ｃｏｒｒｅｎ他、２０１１年刊によれば「ペリオスチンｈｉｇｈ」に分類された。上記のサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」及び「ペリオスチンｈｉｇｈ」の場合は、抗ＩＬ−１３抗体による治療での応答挙動がより良好である傾向があると言うことができよう。
【００１９】
特許文献１によれば、例えばＰＯＳＴＮ、ＣＬＣＡ１及びＳＥＲＰＩＮＢ２などの多くの候補遺伝子の遺伝子発現を利用した、喘息患者のある種の分類も提案されている。これらの遺伝子は周知のようにＴｈ２サイトカインＩＬ−４又はＩＬ−１３によって上方制御されたため、クラスタは「ＩＬ−４／ＩＬ−１３シグネチャー」とも呼ばれている。血清ペリオスチン濃度及び対応するｍＲＮＡ量の測定と共に、対応する血清ＩｇＥ値及び好酸性顆粒球の数の決定も記載された。
【００２０】
この遺伝子発現、特にＰＯＳＴＮに基づく患者の分類の欠点は、「ＩＬ−４／ＩＬ−１３シグネチャー」と共に、サイトカインＩＬ−５も喘息の病因に重要な役割を果たすことにある。その上、免疫カスケード内の、ひいては発症に対するペリオスチンタンパク質の役割は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第２００９／１２４０９０号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｗｏｏｄｒｕｆｆ他著、２００９年刊、「２型Ｔヘルパー誘発性炎症は喘息の主要な亜表現型を規定する」、Ａｍ  Ｊ  Ｒeｓｐｉｒ  Ｃriｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１８０巻、３８８〜３９５ページ
【非特許文献２】Ｃｏｒｒｅｎ他著、２０１１年刊、「喘息の成人へのＬｅｂｒｉｋｉｚuｍａｂ治療」、Ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１  １０６４６９
【非特許文献３】Ｗｏｏｄｒｕｆｆ他著、２００７年刊、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０４（４０）：１５８５８−６３．「ゲノムワイドなプロファイリングは、喘息及びコルチコステロイドへの治療反応性に関する上皮細胞を特定する」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」又は「Ｔｈ２  ｌｏｗ」ないし「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」又は「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のグループの慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の許容され、同時に臨床的に実際的な分子表現型検査に適するバイオマーカーを発見することが課題である。更に、このように分類された患者を特にこれらのサブグループに特効がある治療薬で治療する必要がある。そのためにバイオマーカーは患者、特に喘息患者に関する治療薬の効能の個々の予測を可能にする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記の課題は、本発明により分子表現型がサブグループ「Ｔｈ２
ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」及び「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のグループから選択され、患者が生物学的に単離されてＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの遺伝子発現が測定され、疾病の分子表現型への分類に利用される、慢性炎症を伴う疾患を患うヒト患者の分子表現型を診断する方法によって解決される。その際、慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の分子表現型のより詳細な分類は、転写因子ＧＡＴＡ−３、及び／又は転写因子Ｔｂｅｔの遺伝子発現を測定することによって行われる。冒頭部に前述したように、自己免疫性疾患及び慢性炎症反応の発症にはＴｈ１細胞に特異の転写因子ＴｂｅｔとＴｈ２細胞に特異の転写因子ＧＡＴＡ−３が関与している。Ｔｈ２への分極はＴｂｅｔの抑制によってＴｈ１の分化を抑止し、逆の場合も同様である。ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの発現レベルに応じて、慢性炎症を伴う疾病の分子表現型への、ひいてはサブグループへの分類がなされる。本発明による診断方法により、臨床診療で簡単に前記の分子表現検査を高い有効度で行うことができる。
【００２５】
転写因子ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔは、Ｔｈ１又はＴｈ２に依存する炎症疾患の発症時の中心的な鍵分子である。したがって、タンパク質発現又はｍＲＮＡ発現の直接的な測定は、仲介メカニズムが結果を損なうことが在り得ないため可能な最良の患者層別方法である。
【００２６】
方法の実施形態によれば、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの発現レベルはタンパク質量又はｍＲＮＡ量によって決定される。その際、タンパク質の量は免疫分析を用いて定量的に決定される。免疫分析は好適には、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）検査、放射免疫測定（ＲＩＡ）、電気化学発光（ＥＣＬ）免疫測定、ＣＬＩＡ（化学発光結合免疫吸着測定）、ＦＬＩＡ（蛍光結合免疫吸着測定）、又はマルチプレックス測定である。
【００２７】
上記の分析は、高い感度と特異性の他に、可能な自動化のあらゆる利点をもたらし、したがって、臨床診療に特に適している。もちろん、本発明に基づいて、場合によってはＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのタンパク質量を定量的に検出するのに適する他のいずれかの検査を選択することもできる。更に、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの発現レベルを質量分析法、ガスクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法、ＨＰＬＣなどの固相単離による液状診断法、又はマイクロ流体法又はナノ流体法によって判定することができる。
【００２８】
方法は場合によっては、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔを判定するためにＥＬＩＳＡ検査を用いた以下のステップを含むことができる：
−細胞破壊により溶解物を生成し、
−第１のＧＡＴＡ−３特異抗体及び／又はＴｂｅｔ特異抗体を被覆したマイクロタイタープレートのウェルに溶解物を添加し、
−マイクロタイタープレートを洗浄し、
−マイクロタイタープレートのウェルに第２のＧＡＴＡ−３特異抗体又はＴｂｅｔ特異抗体を添加し、
−マイクロタイタープレートを洗浄し、
−ＧＡＴＡ−３タンパク質又はＴｂｅｔタンパク質を検出し、定量化するステップ。
【００２９】
検出のために、第２の特異抗体を例えばビオチンで標識することができ、ストレプトアビジンと結合した酵素を別個に添加することができる。第２の特異抗体を直接酵素と結合させることもできる。適切な場合は、第２の特異抗体に対する、酵素と結合した第３の抗体を使用することもできる。
【００３０】
酵素は好適には、ペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼであり、比色分析又は化学発光などに適する適宜の基質で変換される。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、それに加え、又はその代わりに、タンパク質量を上記のように検出するために補足的にＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのｍＲＮＡ量を決定することができる。それには好適には、ＰＣＲ、特に好適にはｑＰＣＲ、又はマイクロアレイチップが適している。ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔなどに特有のプローブ又はプライマーを上記の検出方法のためにどのように選択するかという方法は当業者には周知である。
【００３２】
生物学的単離は本発明の好適な実施形態により、全血、尿、痰、肺細胞洗浄液（ＢＡＬ）、生体検査、ブラシ生検、脳脊椎液、気管分泌物、精液、腹水、唾液又はリンパ液から得られた。当業者は、適宜の生物学的単離を得るための常法を周知している。
【００３３】
ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔは、転写因子として亜種Ｔｈ１及びＴｈ２のＴヘルパー細胞の細胞核内で有効なタンパク質である。これらの両方の核タンパク質の濃度を特定量の全血内などでの特定量の生物学的単離で決定するために、ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔを形成する細胞を先ず単離し、次いで溶解させなけらばならない。これらのタンパク質をヒト血清又は血漿から直接検出することは、そこには検出可能な濃度で存在しないため、ほぼ不可能である。したがって、ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの分析は場合によっては以下の４つのステップで行われる。
−ＧＡＴＡ−３／Ｔｂｅｔを発現する細胞を全血のその他の細胞成分から単離し、
−細胞を破壊し、細胞間タンパク質／核タンパク質を放出し、
−ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの濃度を測定し、
−判明したＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの濃度を正規化するステップ。
【００３４】
有利な変形形態によれば、本発明の方法はＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの発現レベルがタンパク質量、又はｍＲＮＡ量のいずれで決定されるかに関わりなく、以下のステップの１つ又は複数を含んでいる。
（ｉ）好適にはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心法により白血球を単離し、
（ｉｉ）好適にはサイズ排除濾過により白血球を濃縮し、又は、
（ｉｉｉ）好適には磁気ビーズに結合された細胞特異的抗体を用いてＴｈ１細胞／Ｔｈ２細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮するステップ。
【００３５】
上記のステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）は、細胞破壊の前に実行され、特に白血球内では遺伝子ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔがそれぞれ異なって発現されるため、診断方法の感度及び有効度を高めることができる。
【００３６】
本発明の別の態様では、下記の条件のうち少なくとも１つが満たされれば、患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型に分類できる。
ａ）生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも高く、
ｂ）生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔ遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高いこと。
【００３７】
したがって、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」は、所定の基準値と比較して高い絶対的ＧＡＴＡ−３遺伝子発現を特徴としてもよい。その際、タンパク質量を測定する場合、単離における健常者の対応するＧＡＴＡ−３のタンパク質含有値を基準値として用いることができる。更に絶対的な基準値を用いることもできる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、健常者の単離におけるＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡ量の対応値を用いることができる。更に、この場合も例えばコピー／ｍｌなどの絶対基準値を用いることもできる。
【００３８】
本発明の有利な実施形態により、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現を高める代わりに、又はそれに加えて生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３と、Ｔｂｅｔ遺伝子発現との比率を所定の基準値よりも高くすると、患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」への分類がなされる。その際、基準値として、健常者の単離におけるＧＡＴＡ−３と、Ｔｂｅｔ遺伝子発現との比率の対応値を用いることができる。ＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔとの比率を決定することで、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現の他に補足的パラメータとしてＴｂｅｔ遺伝子発現が確認されるため予測の確実性が高まる。冒頭に記載したように、両方の転写因子は発現を逆調整するため、Ｔｂｅｔを含めることでＧＡＴＡ−３遺伝子発現を測定するための内部制御がなされる。
【００３９】
有利な変形形態によれば、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型に患者を分類するための本発明の方法は以下のステップを含んでいる：
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はＲＮＡを放出し、
−ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを確定し、
−上記のａ）又はｂ）に記載の条件の少なくとも１つが当てはまる場合は、患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の１つに分類するステップ。
【００４０】
あるいは、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔ遺伝子発現の上記の決定に加えて、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」に確実に分類するための別のパラメータの決定が行われる。このように、例えば血清ＩｇＥ濃度及び好酸性顆粒球の数を測定することができる。サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」への分類は更に、血清ＩｇＥ濃度が１００ＩＵ／ｍｌより高く、且つ／又は１リットル当たりの好酸性顆粒球の細胞数が０.１４ｘ１０９個以上である場合になされる。あるいは、必要に応じて、呼気中の一酸化窒素の濃度、すなわちＦｅＮＯ値を判定することができる。
【００４１】
本発明の方法の別の有利な実施形態は、以下の条件の少なくとも１つが満たされた場合に、患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の分子表現型に分類することに関するものである。
ａ）生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも低い場合、
ｂ）生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔ遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも低い場合。
【００４２】
したがって、サブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」は、所定の基準値よりも絶対的ＧＡＴＡ−３遺伝子発現が低いことを特徴としてもよい。その際、タンパク質量を測定する場合、単離における健常者の対応するＧＡＴＡ−３のタンパク質含有値を基準値として用いることができる。その際、サブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の慢性炎症を伴う疾病の患者の場合、それにも関らず絶対的ＧＡＴＡ−３遺伝子発現は通常は健常者の単離の場合よりも高くなることに留意されたい。しかし絶対的遺伝子発現は、健康な場合よりも低くことがある。いずれにせよ、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現はサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の場合ほど高くはないとされている。したがって、患者がサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」に分類されるのは、そのＧＡＴＡ−３タンパク質含有率が高まったとしても健常者の分類と比較して緩やかにしか高まらない場合である。固定基準値を用いることもできる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、基準値として健常者の単離における対応するＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡ量の値を用いることができ、その際、患者のＧＡＴＡ−３のｍＲＮＡ量が対応する健常者のサンプルよりも低いか、大幅に高くない場合にサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」への分類がなされる。この場合も固定基準値を用いることができる。
【００４３】
本発明の有利な実施形態では、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現の低減の代わりに、又はそれに加えて、生物学的単離でＧＡＴＡ−３と、Ｔｂｅｔとの比率が所定の基準値よりも低い場合に、患者の前記のサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の分子表現型への分類がなされる。その際、基準値として、健常者の単離におけるＧＡＴＡ−３と、Ｔｂｅｔ遺伝子発現との比率の対応値を用いることができる。ＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔ遺伝子発現との比率を判定することで、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現と共に補足的パラメータとしてＴｂｅｔ遺伝子発現が確認されるので、この場合も予測の確実性が高まる。前述のように、両方の転写因子の発現は逆調整するので、Ｔｂｅｔを用いると、ある点ではＧＡＴＡ−３遺伝子発現を測定するための内部制御がなされる。
【００４４】
有利な変形形態では、患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の分子表現型に分類する本発明の方法は下記のステップを含んでいる：
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はＲＮＡを放出し、
−ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを確定し、
−前述のａ）又はｂ）の条件の少なくとも１つが該当する場合に患者をサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」に分類するステップ。
【００４５】
あるいは、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔ遺伝子発現の上記の判定に加えて、サブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」により確実に分類する更に別のパラメータを決定することもできる。このように、例えば血清ＩｇＥ濃度及び好酸性顆粒球の数を測定することができる。この場合も血清ＩｇＥ濃度が１００ＩＵ／ｍｌ未満であり、且つ／又は好酸性顆粒球の細胞数が１リットル当たり０．１４ｘ１０９個未満である場合にサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」への分類がなされる。あるいは、必要に応じて、呼気中の一酸化窒素の濃度、すなわちＦｅＮＯ値を判定することができる。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、下記の条件の少なくとも１つが満たされると患者のサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型への分類がなされる。
ａ）生物学的単離におけるＴｂｅｔ遺伝子発現が所定の基準値よりも高い、
ｂ）生物学的単離におけるＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高い。
【００４７】
したがって、サブグループ「Ｔｈ1 ｈｉｇｈ」は、所定の基準値と比較して高い絶対的ＧＡＴＡ−３遺伝子発現を特徴としてもよい。その際、タンパク質量を測定する場合、健常者の単離におけるＴｂｅｔタンパク質含有量の対応する値を基準値として用いることができ、患者のＴｂｅｔタンパク質含有量が高まると患者のサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」への分類がなされる。固定基準値を用いることもできる。その際、ｍＲＮＡ量を測定する場合、健常者の単離におけるＴｂｅｔ  ｍＲＮＡ量の対応する値を基準値として用いることができ、患者のＴｂｅｔ  ｍＲＮＡ量が高まると患者のサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」への分類がなされる。この場合も固定基準値を用いることができる。
【００４８】
本発明の方法の有利な実施形態では、Ｔｂｅｔの上昇の代わりに、又はそれに加えて、生物学的単離におけるＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも高い場合に、患者の前記のサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型への分類がなされる。その際、基準値として、健常者の単離におけるＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率を用いることができる。この場合もＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率の測定は、Ｔｂｅｔ遺伝子発現の他に補足的パラメータとしてＧＡＴＡ−３遺伝子発現が確認され、ＧＡＴＡ−３を用いるとＴｂｅｔ遺伝子発現の測定が内部制御されるため、予測の確実性が高まる。
【００４９】
有利な変形形態では、患者をサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型に分類する本発明の方法は下記のステップを含んでいる：
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はＲＮＡを放出し、
−Ｔｂｅｔ及び／又はＧＡＴＡ−３のタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを確定し、
−前述のａ）又はｂ）に記載の条件の少なくとも１つが該当する場合は、患者をサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型に分類するステップ。
【００５０】
本発明の別の態様は、下記の条件の少なくとも１つが満たされると、患者をサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の分子表現型に分類できる方法に関する。すなわち、
ａ）生物学的単離におけるＴｂｅｔ遺伝子発現が所定の基準値よりも低く、
ｂ）生物学的単離におけるＴｂｅｔと、生物学的単離におけるＧＡＴＡ−３遺伝子発現が所定の基準値よりも低いこと。
【００５１】
したがって、サブグループ「Ｔｈ１   ｌｏｗ」は、所定の基準値よりも低い絶対的Ｔｂｅｔ遺伝子発現を子表現型を特徴としてもよい。その際、タンパク質量を測定する場合、健常者の単離におけるＴｂｅｔタンパク質含有量の対応する値を基準値として用いることができる。その際、サブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の慢性炎症を伴う疾病の患者の場合、それにも関らず絶対的Ｔｂｅｔ遺伝子発現は通常は健常者の単離の場合よりも高くなり得ることに留意されたい。しかし、絶対的Ｔｂｅｔ遺伝子発現も健常者の場合よりも低くなり得る。いずれにせよ、Ｔｂｅｔ遺伝子発現は、サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の場合ほど高くはないとされている。したがって、患者がサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に分類されるのは、そのＴｂｅｔタンパク質含有量が健常者の単離と比較して高まったとしても大幅に高くない場合である。固定基準値を用いることもできる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、基準値として健常者の単離における対応するＴｂｅｔ  ｍＲＮＡ量の値を用いることができ、その際、患者のＴｂｅｔ  ｍＲＮＡ量が対応する健常者の検体よりも低いか、大幅に高くない場合に患者はサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に分類される。この場合も固定基準値を用いることができる。
【００５２】
本発明の有利な変形形態では、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現の低減の代わりに、又はそれに加えて、生物学的単離でＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率が所定の基準値よりも低い場合に、患者の前記のサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の分子表現型への分類がなされる。その際、基準値として、健常者の単離におけるＴｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率を用いることができる。Ｔｂｅｔと、ＧＡＴＡ−３遺伝子発現との比率の決定は、Ｔｂｅｔ遺伝子発現の他に補足的パラメータとしてＧＡＴＡ−３遺伝子発現が確認され、ＧＡＴＡ−３を用いると、ある点ではＴｂｅｔ遺伝子発現の測定が内部制御されるため、予測の確実性が高まる。
【００５３】
有利な変形形態では、患者をサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の分子表現型に分類する本発明の方法は下記のステップを含んでいる：
−患者の生物学的単離細胞からタンパク質又はＲＮＡを放出し、
−Ｔｂｅｔ及び／又はＧＡＴＡ−３のタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを確定し、
−上記のａ）又はｂ）に記載の条件の少なくとも１つが当てはまる場合は、患者をサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の１つに分類するステップ。
【００５４】
あるいは、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔ遺伝子発現の上記の決定に加えて、サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」及び「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に確実に分類するための別のパラメータの決定が行われる。このように、例えば好酸性顆粒球の数又は血清ＩｇＥ濃度を測定することができる。血清ＩｇＥ濃度が１００ＩＵ／ｍｌ未満であり、且つ／又は好酸性顆粒球の細胞数が１リットル当たり０．１４ｘ１０９個未満である場合にサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」への分類がなされる。それ以外の場合は、サブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に分類される。あるいは、必要に応じて、呼気中の一酸化窒素の濃度、すなわちＦｅＮＯ値を判定することができる。
【００５５】
サンプル調製時の差異を考慮に入れるため、ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度の正規化を行うことができる。サンプル調製時の差異は、例えば溶解される細胞数の差により、個々のサンプルの異なる溶解効率により、又は細胞調製中に様々な細胞型が異なる含有率となることにより生じることがある。本発明による正規化の可能性は特に、細胞溶解物の全タンパク質含有量への正規化、溶解した細胞数に基づく正規化、又は特定の細胞型内の特異に判明したマーカータンパク質濃度に基づく正規化である。
【００５６】
サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型と診断された患者は、場合によっては同時にサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に分類されることがある。サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型と診断された患者は、場合によっては同時にサブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」に分類されることがある。それは、Ｔｈ２への分極がＴｂｅｔの抑制によりＴｈ１の分化が抑止され、逆も同様であるからである。
【００５７】
本発明により例えば自己免疫性疾患及びリウマチ性疾患（特に皮膚、肺、腎臓、血管系、神経系、結合組織、筋骨格、内分泌系の兆候）、即時型アレルギー反応及び喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム性動脈硬化症、乾癬及び接触性皮膚炎及び臓器移植後及び骨髄移植後の慢性拒絶反応などが診断され、治療される。ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔが発症に関与し、且つ／又はその結果として脱調整される場合は、本発明による腫瘍性疾患の診断又は治療も可能である。
【００５８】
本発明により慢性炎症疾患は、例えばアレルギー性気管支喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、天疱瘡、潰瘍性結腸炎、寄生虫疾患などのＴｈ２関連の、又は例えば疥癬、アレルギー性接触性皮膚炎、クローン病、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、自己免疫性疾患、１型糖尿病、又はＭＳなどのＴｈ１関連の慢性炎症疾患である。
【００５９】
上記の課題は、本発明によって更に、分子表現型を有するヒト患者の慢性炎症を伴う疾病を治療する薬剤によって解決され、前記本発明による診断方法によって１つ又は複数の実施形態により分子表現型が判定される。その際、特定された分子表現型には特に「Ｔｈ１  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」又は「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」グループが含まれる。
【００６０】
好適な実施形態により、前記薬剤はＧＡＴＡ−３、又はＴｂｅｔ特異のリボ核酸又はデオキシリボ核酸、特にＧＡＴＡ−３特異、又はＴｂｅｔ特異のＤＮＡザイムを含んでいる。
【００６１】
ＤＮＡザイムの一般モデルは「１０−２３」モデルである（Ｓｏｎｔｏｒｏ他、１９９７年）「１０−２３ＤＮＡザイム」とも呼ばれる１０−２３モデルのＤＮＡザイムは、２つの基質結合ドメインが側面にある１５ヌクレオチドの触媒ドメインを有している。触媒ドメインは、好適には配列ｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａ（配列番号１５４）を有している。基質結合ドメインの長さは可変であり、同一の長さ、又は異なる長さである。好適な実施形態では、基質結合ドメイン長は６から１４のヌクレオチド長であり、特に好適には少なくとも９ヌクレオチドの長さである。このようなＤＮＡザイムは基本配列ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａｎｎｎｎｎｎｎｎｎ（配列番号１５５）を含んでいる。その際、タンパク質ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔをコードするｍＲＮＡを結合する基質結合ドメインが特に好適である。
【００６２】
記載の触媒中央ドメインｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａは好適な実施形態の１つであるに過ぎない。同等の生物学的活性を有する「１０−２３ＤＮＡザイム」が改変触媒ドメインで得られることは当業者には周知である。
【００６３】
特に好適な実施形態では、基質結合ドメインは、切断部位が側面にある領域と完全に相補形である。しかし、標的ＲＮＡを結合し、これを開裂するには、ＤＮＡザイムは必ずしも完全な相補形でなくてもよい。１０−２３型のＤＮＡザイムは標的ｍＲＮＡをプリン−ピリミジン連続配列で開裂する。本発明により、ＤＮＡザイムには好適には、その内容が本発明の開示内容に記載されているＷＯ２００５／０３３３１４Ａ２号明細書に記載のＧＡＴＡ−３又はＴｂｅｔに対する生体内活性ＤＮＡザイムが含まれる。
【００６４】
生体内でＧＡＴＡ−３遺伝子発現を特異的に抑止する薬剤は特に、配列番号１から配列番号７０までに基づく配列のＤＮＡザイムからなるグループから選択される少なくとも１つのＤＮＡザイムを含んでいる。このようなＤＮＡザイムは好適には、配列番号１５１（データバンク番号：ＸＭ_０４３１２４）からのヒトＧＡＴＡ−３、配列番号１５２（データバンク番号：Ｘ５８０７２からのヒトＧＡＴＡ−３、及びプラスミドｐＣＲ２．１から配列されたヒトＧＡＴＡ−３）から選択された遺伝子配列を有するヒト遺伝子をコードするｍＲＮＡに結合する。
【００６５】
生体内でＧＡＴＡ−３遺伝子発現を特異的に抑止するための薬剤は、好適には配列５’ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ（配列番号４０）を有するＤＮＡザイムｈｇｄ４０を含んでいる。
【００６６】
生体内でＧＡＴＡ−３遺伝子発現を特異的に抑止するための薬剤は、好適には特に配列番号７１から配列番号１４８までに基づく配列を有するＤＮＡザイムからなるグループから選択された少なくとも１つのＤＮＡザイムを含んでいる。このようなＤＮＡザイムは好適には、配列番号１４９（データバンク番号ＮＭ_０１３３５１からのヒトＴｂｅｔ）及び配列番号１５０（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ-ＳＫから配列決定されたヒトＴｂｅｔ）から選択された遺伝子配列を有するヒトＴｂｅｔをコードするｍＲＮＡに結合する。
【００６７】
生体内Ｔｂｅｔ発現を特異に抑止するための薬剤は、好適には配列５’-ＧＧＣＡＡＴＧＡＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＴＧＧＧＴＴＴＣＴ（配列番号１３９）を有するＤＮＡザイムｔｄ６９、又は配列番号５’-ＴＣＡＣＧＧＣＡＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＡＡＣＴＧＧＧＴ（配列番号１４０）を有するｔｄ７０を含んでいる。
【００６８】
ＤＮＡザイムの代わりに、ＧＡＴＡ−３表現又はＴｂｅｔ表現を特異的に抑止するための薬剤は、適宜のｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。
【００６９】
薬剤は好適には、前記の特異なリボ核酸分子又はデオキシリボ核酸分子を医薬として許容できる組成物の形態で、経口、経直腸、非経口、静脈内、筋肉内、又は皮下、槽内、膣内、腹腔内、髄腔内、経脈内、局所（粉末剤、軟膏、又は点滴）又は噴霧の形態で投与できる剤形を有している。本発明の薬剤の経口投与のための投薬形態には、軟膏、粉末、噴霧又は吸入剤が含まれる。活性組成物は必要に応じて無菌状態で生理学的に許容可能な担体及び可能な防腐剤、緩衝液、又は噴射剤と混合される。
【００７０】
薬剤は、慢性炎症を伴う疾病群全体の治療に使用できる。
【００７１】
本発明の特に好適な実施形態では、ＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムを有するサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型を有する患者の治療を行う。サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型を有する患者の治療はＴｂｅｔ特異のＤＮＡザイムを用いて行われる。更に、サブグループ「Ｔｈ２  ｌｏｗ」の分子表現型を有する患者の治療をＴｂｅｔ特異のＤＮＡザイムを用いて、及びサブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の分子表現型を有する患者の治療をＧＡＴＡ−３のＤＮＡザイムを用いて行うことができる。
【００７２】
したがって、ＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムを有する本発明の薬剤は、好適にはサブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型を有する患者の治療に使用され、Ｔｂｅｔ特異のＤＮＡザイムを有する薬剤は好適にはサブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型を有する患者の治療に使用される。
【００７３】
本発明により、診断される患者のサブグループ、すなわち「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」、「Ｔｈ２  ｌｏｗ」、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」又は「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の分子表現型患者を治療するための薬剤の特別な利点は、特異な薬剤、特にＤＮＡザイム及び／又はｓｉＲＮＡを使用して、差次的発現が事前に確認され、慢性炎症反応及び自己免疫性疾患に関与する、転写因子のコードされたリボ核酸分子の機能的不活性化が行われることにある。この戦略は、従来の方法、及び上記のＣｏｒｒｅｎ他、２０１１年のアプローチとは明らかに異なっているが、それはこれらの場合は一方では例えばペリオスチン（代理マーカー）が測定され、次いで抗ＩＬ−１３抗体を用いて別の標的、例えばＩＬ−１３に対して治療が提案されているからである。これに対して本発明の薬剤は高い特異性を備えている。これは細胞特異の介在を引き起こし、区画及び器官にとって特異な薬剤である。
【００７４】
本発明の投与形態には、信頼できる医学的評価によれば患者に過剰な毒性、刺激又はアレルギー反応を引き起こさない限り、医薬として許容される組成、改変、及び「プロドラッグ」が含まれる。「プロドラッグ」という用語は、例えば血液中の加水分解によるなどで吸収改善のために形質転換される化合物を指す。
【００７５】
本発明の薬剤はまた、前記の特異な核酸分子を適用するために使用される多重乳剤の形態でもよい。適切な多重乳剤は更に、外水相Ｗ１、外水相W1に分散させた油相Ｏ、及び油相Ｏ内に分散させた内水相Ｗ２を含み、内水相Ｗ２に分散させた少なくとも１つの電解質がハロゲン化アルカリ及びハロゲン化アルカリ土類及びその硫酸塩群から選択され、少なくとも１つの特異なリボ核酸分子又はデオキシリボ核酸分子、好適にはＧＡＴＡ−３特異又はＴｂｅｔ特異のＤＮＡザイムを備え、外水相Ｗ１は、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドである親水性乳化剤を含み、油相Ｏはトリアシルグリセルドから形成され、ジメチコーン群の親油性乳化剤を備えている。このような複数の乳化剤を使用して、特に核酸分子を特に効果的に不都合な劣化から防護することができる。
【００７６】
投与形態は臨床的因子に応じて主治医によって決定される。投与形態は例えば患者の体格、体重、体表面積、年齢、性別又は全般的な健康状態などのさまざまな要因によって左右され、更には投与される特定の薬剤、及び可能な場合には並行して投与されるその他の薬剤の投与期間と形態によって左右される。その際、特に有利な変形形態では、薬剤の有効成分の量を測定された発現レベルに適合させる。したがって、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」に分類され、極めて高いＧＡＴＡ−３発現が確認されると、有効成分、特にＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムを高投与量で投与することができる。したがって、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」に分類され、極めて高いＧＡＴＡ−３発現が確認されると、有効成分、特にＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムを高投与量で投与することができる。
【００７７】
本発明の別の態様は、慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の分子表現型を診断するキットであって、患者の生物学的単離においてタンパク質又はＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのｍＲＮＡ量を定量的に決定するための少なくとも１つの特別な要素を含むキットに関する。
【００７８】
本発明の診断用キットは、既成の「キット」で簡単に実施することができ、これは担体の表面で吸収される抗体又は抗原を含み、例えばヒトの場合はビオチン−ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ型、又はアルカリ性ホスファターゼ型の反応カスケードによって検出されるように標識された抗ヒトＩｇＥ抗体の投与を行う。
【００７９】
あるいは、診断用キットは担体の他に緩衝液及び試薬、例えば色素反応を生じるマーカーと結合された、例えば反応を検出するためのストレプアビジンなどの試薬をも含んでいる。
【００８０】
あるいは、キットはそれに加えて、キットを較正するためのＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔの標準サンプルを含んでおり、タンパク質又はＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔのｍＲＮＡの量を検出するために標準サンプルが使用される。
【００８１】
好適な実施形態では、タンパク質の量を定量的に決定するため、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔに対するそれぞれに特異的な抗体を含んでいる。場合によっては、改良によって免疫測定分析、特にＥＬＩＳＡＳを実施するための別の要素を含めてもよい。
【００８２】
ＥＬＩＳＡＳを実施するための別の要素は、細胞破壊のための界面活性剤、マイクロタイタプレート、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔ用のタンパク質量基準、二次抗体、及び検出のために基質を転換するための結合酵素のグループから選択される。好適には、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔに対する第１の特異抗原の他に、ＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔに対する別の特異抗原がキットに含まれる。
【００８３】
キットは、ｍＲＮＡを定量的に判定するために、それぞれＧＡＴＡ−３及び／又はＴｂｅｔ遺伝子用の配列特異的なプローブ及び／又はプライマーを含むことができる。
【００８４】
本発明のその他の特徴、詳細及び利点は、特許請求の範囲、及び図面を参照した実施例の以下の説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】刺激ジャーカット細胞からのＧＡＴＡ−３の放出に対する様々な界面活性剤の影響を示すグラフである。
【図２ａ】発色サンドイッチＥＬＩＳＡによるＴｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３の定量化の結果を示すグラフである。
【図２ｂ】発色サンドイッチＥＬＩＳＡによるＴｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３の定量化の結果を示すグラフである。
【図３】サンプルを定量化するためのＧＡＴＡ−３  ＥＬＩＳＡＳの標準曲線である。
【図４】サンプルを定量化するためのＴｂｅｔ  ＥＬＩＳＡＳの標準曲線である。
【図５】健康なボランティアとアレルギー患者のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）溶解物内のＴｂｅｔの正規化決定値を示すグラフである。
【図６】未処置のマウスと比較した、ＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号４０）で４日間処置した後のアレルギー性気道炎症の大幅な改善を示すグラフである。
【図７】８週間の処置後の慢性炎症で発生する好中球の数、ＢＡＬ内の好酸球の数、及びＩＬ-５の放出に対するＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号４０）の影響を示すグラフである。
【図８】気管支周囲／血管周囲の炎症及び肺組織内の杯細胞過形成に対するＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号４０）の影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
材料及び方法：
例えば、特異抗体の結合に基づく技術で細胞を単離することができる。ここでＭｉｌｔｅｎｙｉ社（Ｍａｃｓ−システム）、Ｄｙｎａｌ社（ＤｙｎａＢｅａｄｓ）又はＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（ｉＭＡＧ）から市販されている磁気ビーズが使用される。代替としてこれは、例えばＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（ＭＯＦＬＯ）、ＢＤ-Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（ＦＡＣＳ−バンテージ）の細胞分別装置において蛍光マーカーで標識された抗体を用いた細胞洗浄によって行われる。標的細胞の純度は好適には、少なくとも８０％、より好適には少なくとも９５％、最も好適には少なくとも９９％である。
【００８７】
ＲＮＡを単離する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ共著、「分子クローニング」、ラボラトリマニュアル３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年刊）、ニューヨーク、及びＡｕｓｕｂｅｌ他著、「分子生物学における最新プロトコル」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８年刊）ニューヨーク、に記載されている。更に、市販のキット（シリカテクノロジー）、例えばＱｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙキットをＲＮＡ単離のために使用することも標準的な当業者には可能である。更に、例えば市販のキット、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡキット）、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍＲＮＡ単離システム）又はＭｉｌｔｅｎｙｉ社（ｍＲＮＡｄｉｒｅｃｔ）を使用して標的細胞から直接ｍＲＮＡを洗浄することが好適である。
【実施例】
【００８８】
実施例１
ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔは、いわゆる転写因子として亜型Ｔｈ１及びＴｈ２のＴヘルパー細胞の効果を発揮するタンパク質である。所定量の生物学的単離、特に所定量の全血でのこれらの両方の核タンパク質の濃度を決定するため、ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔを形成する細胞を先ず単離し、次いで溶解させなけらばならない。このタンパク質をヒト血清又は血漿から直接検出することは、そこには検出可能な濃度で存在しないため不可能である。したがって、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの分析は４段階で行われる。すなわち、
−ＧＡＴＡ−３／Ｔｂｅｔを発現する細胞を全血のその他の細胞成分から単離し、
−細胞を破壊し、細胞内タンパク質／核タンパク質を放出し、
−ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度を測定し、
−判明したＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度を正規化する。
ＧＡＴＡ−３／Ｔｂｅｔの発現細胞を全血のその他の細胞成分から分離して単離するステップ。
【００８９】
これは、様々な方法により異なる複雑さで実施され、特に本発明による分離及び単離のための下記のステップが実行される。
【００９０】
−Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法により全血から白血球を単離し、引き続き特異的な表面マーカーに対する抗体によりＴｈ１／Ｔｈ２の親和性精製を行う。
−場合によっては、表面マーカーに対する抗体によりＴｈ１／Ｔｈ２の細胞型の親和性精製、及び白血球を事前に濃縮せずに１段階の方法を実行することができる。
−場合によっては、タンパク質ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔを定量化するために、白血球の単離をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法で行うことで十分である。
−場合によっては、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法の代わりに、９６ウェルフォーマットのディープウェルプレート内の特異な表面マーカーに対する抗体によるビードベースの親和性精製を用いることができる。
−場合によっては、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法の代わりに、９６ウェルフォーマットのディープウェルプレート内の特異的な表面マーカーに対する抗体によるビードベースの親和性精製を用いることができる。
−場合によっては、白血球調合液を得るために赤血球の低浸透圧溶解を行うことができ、又は、
−場合によっては、全血から直接タンパク質分解を行うことができる。
【００９１】
細胞破壊及び細胞内タンパク質／核タンパク質の放出
これは、様々な方法及び原理、特に本発明により以下の方法ステップで達成することができる。
−細胞膜を異なる活性成分の溶解緩衝液で破壊する：
ａ）細胞の破裂を引き起こす低張緩衝液、
ｂ）細胞膜を破壊することにより細胞内タンパク質を放出する界面活性剤含有緩衝液、
ｃ）細胞から水分を引き出すことにより細胞の完全性を破壊する、イオン強度が高く、又は浸透活性の緩衝液、
−加熱、衝撃凍結又は超音波などの物理的方法、
−均質化又は乳鉢粉砕などの機械的方法。
【００９２】
界面活性剤含有緩衝液の例として以下が可能である。
−高濃度のイオン性界面活性剤（例えばＳＤＳ、又はコール酸塩及びその派生物）、又は非イオン性界面活性剤（例えばトリトン又はＴｗｅｅｎ−２０）の緩衝液系、
−イオン性と非イオン性界面活性剤の混合物（例えば５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ）、
−未知組成の市販の溶解緩衝液（例えばＭ−ＰＥＲ）。
【００９３】
刺激ジャーカット細胞からのＧＡＴＡ−３の放出に対する様々な界面活性剤の影響が図１に示されている。その際、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のＲＩＰＡ）を使用すると、様々な溶解緩衝液によるジャーカット細胞（ヒトＴ細胞株）の溶解、及びＥＬＩＳＡによるＧＡＴＡ−３の定量化によってＧＡＴＡ−３タンパク質の特に高度の放出が生じる。約５０ｎｇ／ｍｌのＧＡＴＡ−３が検出された。
【００９４】
ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度測定
ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの両方の転写因子の濃度は基本的に様々な方法で決定することができる。本発明により、特に、
−ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）
−ＣＬＩＡ（化学発光免疫吸着測定法）
−ＦＬＩＡ（蛍光免疫吸着測定法）
−質量分光分析法
−クロマトグラフィー法（例えばガスクロマトグラフィー）
−固相分離による液状化法（例えばＨＰＬＣ）
ミクロ液体法及びナノ流体法が使用される。
【００９５】
図２ａ及び２ｂは、発色サンドイッチＥＬＩＳＡを用いたＴｂｅｔ及びＧＡＴＡ−３を定量化した結果を示している。細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって全血から採集された。細胞（刺激ヒト単核細胞）は、Ｒｉｐａ緩衝液で溶解された。ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度に関して溶解物が２つのＥＬＩＳＡプロトタイプ法で分析された。両方のタンパク質の濃度が、細胞溶解物の全タンパク質濃度に関して示された（タンパク質含有量に正規化）。
【００９６】
図２ａに記載の結果は、Ｔｈ１細胞がＴｈ２細胞（約５６ｎｇ／ｍｌ被分析物／ｍｇタンパク質）よりも高いＴｈ１細胞含有量（約１６０ｇ／ｍｌ被分析物／ｍｇタンパク質）を有することを示しており、この状態はＥＬＩＳＡ試験の結果から明確に読み取ることができる：
【００９７】
【表１】
2019007977.tif 000002
【００９８】
したがってこの表では、サブグループ「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」の分子表現型Ｔｈ１細胞内のＴｂｅｔ含有量は、Ｔｈ２細胞内よりも２倍よりも多い、すなわち約３倍である。
【００９９】
図２ｂによれば、Ｔｈ２細胞内のＧＡＴＡ−３の含有量（約１０ｎｇ／ｍｌ被分析物／ｍｇタンパク質）は、Ｔｈ１細胞内よりも多い（約６ｎｇ／ｍｌ被分析物／ｍｇタンパク質）したがってこの表では、Ｔｈ２細胞内のＧＡＴＡ−３含有量は、Ｔｈ１細胞内よりも１．５倍よりも多い、すなわち１．７倍多い。
更に、図２ａ及び図２ｂから、タンパク質含有量に正規化すると、Ｔｈ１細胞内のＴｂｅｔＧＡＴＡ−３との比率はＴｈ２細胞内の対応する比率とは異なっていることが分かる。したがって、Ｔｈ１細胞内のＴｂｅｔとＧＡＴＡ−３との比率は約２７、すなわち２０よりも多いのに対して、Ｔｈ２細胞内の対応する含有量の比率は約６、すなわち１０未満である。
【０１００】
ＧＡＴＡ−３とＴｂｅｔの定量的決定は、それぞれサンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法により行われる。
【０１０１】
実施例２−ＧＡＴＡ−３  ＥＬＩＳＡ：
そのため、９６ウェルマイクロタイタプレートのウェルはＧＡＴＡ−３に対する特異抗体で被覆される。サンプル又は標準液を追加した後に、ＧＡＴＡ−３は９６ウェルプレート上の抗体と結合する。非結合物質の洗浄プロセスの後、ＧＡＴＡ−３に対する第２の特異ビオチン化特異抗体が追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジンが追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、基質が追加される。発色は、所定の時間後に停止液を追加することにより停止する。発色強度はマイクロタイタープレート読み取り装置によって定量化される。サンプルの定量化は、既知のタンパク質濃度の付随標準液との比較によって行われる。図３は、ＧＡＴＡ−３  ＥＬＩＳＡＳに対応する標準曲線を示している。
【０１０２】
ＧＡＴＡ−３  ＥＬＩＳＡを実行する実施例によれば、ステップは特に下記を含んでいる。
−９６ウェルプレートの範囲内で必要なウェルの数を使用する。
−５０μｌ／ウェル分析緩衝液を追加する
−１００μｌ／ウェル標準／コントロール／サンプルを追加する。
−震とう機で６０分間培養する。
−それぞれ４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェル  ビオチン化抗ＧＡＴＡ−３抗体を追加する。
−震とう機で６０分間培養する。
−それぞれ４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェル  ペルオキシダーゼを標識したストレプトアビジンを追加する。
−震とう機で３０分間培養する。
−それぞれ４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェル基質を培養する。
−３０分間培養する。
−１００μｌの停止液を追加して反応を停止する。
−マイクロタイタープレート読み取り装置により４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
【０１０３】
実施例３−Ｔｂｅｔ  ＥＬＩＳＡ：
以下の試験原理に基づいてＴｂｅｔタンパク質を検出する。サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）を用いてＴｂｅｔの定量的決定が行われる。そのために９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルにＴｂｅｔに対する特異抗体が被覆される。サンプル又は標準液の追加後にＴｂｅｔが９６ウェルプレート上の抗体に結合される。非結合物質の洗浄プロセスの後に、Ｔｂｅｔに対する第２の特異抗体を追加する。非結合物質の更なる洗浄プロセスの後に、Ｔｂｅｔ特異抗体に対するぺルオキシダーゼを標識した抗体が追加される。非結合物質を除去するための更なる洗浄プロセスの後、基質が追加される。発色は、所定の時間後に停止液を追加することにより停止する。発色強度はマイクロタイタープレート読み取り装置によって定量化される。サンプルの定量化は、既知のタンパク質濃度の付随標準液との比較によって行われる。図４はＴｂｅｔ  ＥＬＩＳＡＳの対応する標準曲線を示している。
【０１０４】
Ｔｂｅｔ  ＥＬＩＳＡを実施するための実施例によれば、ステップは特に下記を含んでいる。
−９６ウェルプレートの範囲内で必要なウェルの数を使用する。
−５０μｌ／ウェル分析緩衝液を追加する。
−１００μｌ／ウェル標準／コントロール／サンプルを追加する。
−震とう機で６０分間培養する。
−４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェル抗Ｔｂｅｔ抗体を追加する。
−震とう機で６０分間培養する。
−４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェルのぺルオキシダーゼを標識した抗Ｔｂｅｔ抗体を追加する。
−震とう機で３０分間培養する。
−４００μｌ／ウェル洗浄緩衝液で全てのウェルを４回洗浄する。
−１００μｌ／ウェル基質を追加する。
−３０分間培養する。
−１００μｌの停止液を追加して反応を停止する。
−マイクロタイタープレート読み取り装置により４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
【０１０５】
ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度を正規化する。
サンプル調製時の差異を考慮に入れるため、ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度の正規化を行うことができる。サンプル調製時の差異は以下によって生じることがある。
−溶解される細胞数の差
−個々のサンプルの異なる溶解効率
−細胞調製中に様々な細胞型が異なる含有率となる。
【０１０６】
本発明による正規化の可能性は特に、
−細胞溶解物の全タンパク質含有量への正規化（「ＧＡＴＡ−３及びＴｂｅｔの濃度測定」を参照）
−溶解した細胞数に基づく正規化（図５を参照）、又は
−特定の細胞型内の特異に判明したマーカータンパク質濃度への正規化
【０１０７】
図５は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）溶解物内のＴｂｅｔの正規化決定値を示している。その際、溶解は、健康な被験者と、例えばアレルギー性気管支喘息鼻炎結膜炎、アレルギー性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギーなどを患う患者のＰＢＭＣとで行われる。Ｔｂｅｔの濃度は溶解物内の細胞数に基づいて正規化される。疾病はＴｈ２細胞依存性であり、その結果、アレルギー患者では健康な被験者（約２７ｎｇ／ｍｌ／１００万の細胞）と比較してＴｂｅｔ濃度が低い（約１２ｎｇ／ｍｌ／１００万の細胞）。したがって、Ｔｂｅｔ濃度はアレルギー患者の場合は健康な被験者と比較して２倍よりも多かった。したがってこの場合、生物学的単離におけるＴｂｅｔ遺伝子発現は所定の基準値、この場合は健康な被験者よりも低いため、患者を容易に分子表現型「Ｔｈ１  ｌｏｗ」に分類することができる。
【０１０８】
実施例４
実施例２及び３の変更形態として、実施例４では、サンプル調製のために特異抗体を被覆した磁気ビードを使用してＴｈ１／Ｔｈ２が濃縮される。次いで、実施例２の条件に基づいてＧＡＴＡ−３の検出がなされる。
【０１０９】
実施例５
実施例２及び３の変更形態として、実施例４では、サンプル調製のためにサイズ排除濾過を用いて溶解物が濃縮される。次いで、実施例２の条件に基づいてＧＡＴＡ−３の検出がなされる。
【０１１０】
実施例６
ＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムは、ＯＶＡ誘発性の「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」のアレルギー性気道炎症のマウスモデルで治療効果を示す。
【０１１１】
臨床的表現型「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」をマウスモデルで最善にマッピングするため、０日目、１４日目及び２１日目に、アジュバントＡＬ（ＯＨ）３の存在下でモデルアレルゲンのオボアルブミン（ＯＶＡ）を有するＢＡＬＢ／ｃ-マウスが腹腔内注射で感作された。肺内のＴｈ２優位アレルギー性炎症反応を誘発するために、マウスは２４〜２６日目に１％のＯＶＡエアロゾルを吸入した。２３〜２６日目に、ＰＢＳ中に溶解したＧＡＴＡ−３特異のＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号４０）が鼻腔内に投与された。
【０１１２】
その際、Ｂａｌｂ／ｃ−マウス株の特徴は、好適には強いＴｈ２反応を生じることである。これは、Ｔｈ２優位の免疫反応の形成を明確に裏付けるアジュバントとしてＡＬ（ＯＨ）３を使用することにより強化される。これに対応して、記載のマウスモデルは強化される粘液産生、及び気道過敏性を有する粘液形成杯細胞と共に気道内の好酸球及びＴｈ２の大量浸潤を特徴とする。免疫学的には、典型的なサイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の産生を特徴とするアレルゲン特異のＴｈ２細胞の他に、ＩｇＥ及びＩｇＧ１型免疫グロブリン（マウスでは両方ともＴｈ２依存性）のＯＶＡ特異抗体も確認できる。これらのパラメータは全て「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」表現型の典型的な臨床的特徴である。（Ｗｅｎｚｅｌ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１９９９年９月；１６０（３）：１００１〜８ページ
；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ他、２００９年）その際、動物モデルの幾つかのパラメータに関する反応強度は、ヒト患者の臨床状態におけるよりも明確に顕著であるため、例えば好酸性顆粒球はマウスモデルの肺細胞洗浄液（ＢＡＬ）中の全溶解物の約６０〜７０％を占め、一方、患者の痰中のこの細胞の３〜５％はＴｈ２優位表現型を示した。
【０１１３】
図６によれば、ＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｇｄ４０（配列番号４０）で４日間処置した後、未処置のマウスと比較してアレルギー性気道炎症の著しい改善を確認できた。特に、ＢＡＬ内の好酸球の数が著しく減少した。更に、表現型「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」に特徴的なサイトカインＩＬ−５及びＩＬ−１３のＢＡＬ濃度を明確に低減することができた。
【０１１４】
実施例７
ＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムは、Ｔｈ２優位の慢性アレルギー性気道炎症のマウスモデルに顕著な治療効果を示している。
【０１１５】
臨床的表現型「Ｔｈ２  ｈｉｇｈ」を最大限慢性マウスモデルにマッピングするため、０日目、１４日目及び２１日目に、アジュバントＡｌ（ＯＨ）３の存在下でモデルアレルゲンのオボアルブミン（ＯＶＡ）を有するＢＡＬＢ／ｃ-マウスが腹腔内注射で感作された。１４週間の期間で週２回のＯＶＡエアロゾル誘発により、マウスには気道の慢性炎症が誘発された。最後の８週間は、ブデソニド又はＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｄｇ４０が週３回鼻腔内に投与された（１２１日まで）。
【０１１６】
図７及び図８によれば、ＧＡＴＡ−３特異ＤＮＡザイムｈｄｇ４０（配列番号４０）で８週間処置した後、ＢＡＬ内の好酸球の数は顕著に減少し、更に慢性炎症で発生する好中球の数の減少を確認できた。それに伴って、肺組織内では気管支周囲／血管周囲の炎症の軽減及び杯細胞過形成の軽減が確認された。同時に、再刺激されたリンパ球内でｈｇｄ４０で処置された被験者のＩＬ−５放出の減少が観察された。これに対してブデソニドグループではパラメータの管著な改善は確認できなかった。
【０１１７】
本発明は上記の実施形態に限定されず、多様に変更可能である。
【０１１８】
特許請求の範囲、明細書及び図面から生じる特徴及び利点の全ては、構造上の細部、空間配置、及び方法ステップを含め、それ自体でも様々な組み合わせでも発明的である。
【図１】
2019007977.tif 000003
【図２ａ】
2019007977.tif 000004
【図２ｂ】
2019007977.tif 000005
【図３】
2019007977.tif 000006
【図４】
2019007977.tif 000007
【図５】
2019007977.tif 000008
【図６】
2019007977.tif 000009
【図７】
2019007977.tif 000010
【図８】
2019007977.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月5日(2018.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料におけるＴｈ１細胞特異の転写因子Ｔｂｅｔのタンパク質発現を測定し、所定の基準値と比較することにより、「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」または、「Ｔｈ１  ｌｏｗ」のいずれかの分子表現型のサブグループに分類し、
当該分類は、
タンパク質量で前記Ｔｂｅｔの発現レベルが判定され、
前記タンパク質量が、免疫分析のうち、ＥＬＩＳＡ検査、放射免疫分析、電気化学発光免疫分析、ＣＬＩＡ（化学発光結合免疫吸着分析）、ＦＬＩＡ（蛍光結合免疫吸着分析）、又は多重分析のいずれかによって決定され、及び／又は、
前記Ｔｂｅｔの前記発現レベルがｍＲＮＡ量によって決定され、該ｍＲＮＡ量がＰＣＲ又はマイクロアレイチップを用いて定量的に判定されることを特徴とする、慢性炎症に伴う疾病の患者の分子表現型の分類方法。
【請求項２】
前記生物学的試料における前記Ｔｂｅｔのタンパク質発現が所定の基準値よりも高い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ２１  ｈｉｇｈ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的試料における前記Ｔｂｅｔのタンパク質発現が所定の基準値よりも低い場合に、前記サブグループ「Ｔｈ１  ｌｏｗ」の前記分子表現型に前記患者を分類する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔｂｅｔのタンパク質発現の判定の他に、血清ＩｇＥ濃度及び／又は好酸性顆粒球数が判定され、且つ／又はＦｅＮＯ値が判定されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記慢性炎症に伴う疾患が、アレルギー性気管支喘息、鼻炎結膜炎、アレルギー性副鼻腔炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、天疱瘡、潰瘍性結腸炎、寄生虫疾患を含むＴｈ２関連の慢性炎症疾患、又は疥癬、アレルギー性接触性皮膚炎、クローン病、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、自己免疫性疾患、１型糖尿病、ＭＳを含むＴｈ１関連の慢性炎症疾患のいずれかであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
慢性炎症に伴う疾病に罹患している分子表現型を有する患者を治療する薬剤であって、
該薬剤は、Ｔｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムを含み、
該Ｔｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムが、前記患者の生物学的試料におけるＴｂｅｔのタンパク質発現に基づいて、前記請求項１から５のいずれかの方法により分類された、サブグループ「Ｔｈ１  ｈｉｇｈ」の分子表現型を有する前記患者の治療に用いられることを特徴とする、薬剤。
【請求項７】
外水相Ｗ１、該外水相Ｗ１に分散させた油相Ｏ、及び該油相Ｏ内に分散させた内水相Ｗ２を含み、
該内水相Ｗ２に分散させた少なくとも１つの電解質がハロゲン化アルカリ及びハロゲン化アルカリ土類及びその硫酸塩群から選択され、少なくとも１つの前記ＧＡＴＡ−３又はＴｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムを含み、
前記外水相Ｗ１は、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドである親水性乳化剤を含み、前記油相Ｏがトリアシルグリセルドから形成され、ジメチコーン群の親油性乳化剤を含むことを特徴とする、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
慢性炎症を伴う疾病を患うヒト患者の分子表現型を分類するキットであって、前記患者の生物学的試料中のタンパク質量及び／又はＴｂｅｔのｍＲＮＡ量を定量的に決定するための請求項１から５のいずれか一項に記載の方法に用いられる、キット。
【請求項９】
前記タンパク質量を定量的に決定するため、前記Ｔｂｅｔに対する特異的な抗体を含み、免疫分析のうち、ＥＬＩＳＡを実行するための構成を含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ｍＲＮＡ量を定量的に判定するため、前記Ｔｂｅｔ遺伝子用の配列特異的なサンプル、及び／又はプライマーを含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。