(57)【要約】【課題】洗浄バッファによる洗浄過程を省略しつつ泳動時間ＭＴを安定化し、測定時間を短縮する。【解決手段】泳動液１６を用いてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）−質量分析（ＭＳ）方法により試料８を測定する際に、金属イオンと相互作用する物質、試料８中に含まれる金属イオンを溶存状態に保つことが可能な物質（金属キレート剤、例えばアセチルアセトン）、又は、試料８中に含まれる金属イオンの溶解度を下げる物質（例えばリン酸）を前記泳動液１６に含有させることによって泳動時間ＭＴの変動を緩和する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、金属イオンと相互作用する物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することを特徴とするキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項２】
泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、試料中に含まれる金属イオンを溶存状態に保つことが可能な物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することを特徴とするキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項３】
前記泳動液に金属キレート剤を含有することを特徴とする請求項２に記載のキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項４】
前記金属キレート剤がアセチルアセトンであることを特徴とする請求項３に記載のキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項５】
泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、試料中に含まれる金属イオンの溶解度を下げる物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することを特徴とするキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項６】
前記泳動液にリン酸を含有することを特徴とする請求項５に記載のキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【請求項７】
前記リン酸の濃度が２０〜５００μｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項６に記載のキャピラリー電気泳動−質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）−質量分析（ＭＳ）方法に係り、特に、泳動液（バッファとも称する）を用いて生物試料や、その他の試料を測定する際に用いるのに好適な、泳動時間（ＭＴ）を安定化することが可能なキャピラリー電気泳動−質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メタボローム研究が盛んに行われるようになり、ＣＥ−ＭＳが広く使用されるようになってきている（特許文献１、２参照）。
【０００３】
ＣＥ−ＭＳで試料を測定する場合、ＭＴが不安定化するケースがある。特に塩基性泳動液を用いて生体組織試料、生物試料、それらを含む環境試料などを測定すると、測定回数の増加に伴いＭＴが遅れていく現象が確認されている。
【０００４】
そこで、ＣＥ−ＭＳにおける従来のアニオンモードでは、ＭＴ安定化のために分析用のバッファ（分析バッファと称する）に加え、比較的高濃度（７５ｍｏｌ／Ｌ）のリン酸アンモニウムが含まれた洗浄用のバッファ（洗浄バッファと称する）を使用している。
【０００５】
又、非特許文献１では、ＣＥ−ＭＳではないが液体クロマトグラフ（ＬＣ）−ＭＳの溶離液の添加剤としてアセチルアセトンを採用している。これは、リン酸化合物の金属配管への吸着抑制を目的としており、揮発性のキレート剤として採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０２９４３１号公報
【特許文献２】特開２０１４−７７７３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Siegel et al., 2013 “Controlling detrimental effects of metal cations in the quantification of energy metabolites via ultrahigh pressure-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry by employing acetylacetone as a volatile eluent modifier” Journal of Chromatography A, 1294, 87-97
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら従来は、分析バッファに加え洗浄バッファによる洗浄過程が必要であった。
【０００９】
本発明は、前記従来の問題点を解決するべくなされたもので、洗浄バッファによる洗浄過程を省略しつつＭＴを安定化することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、金属イオンと相互作用する物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することにより、前記課題を解決するものである。
【００１１】
本発明は、又、泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、試料中に含まれる金属イオンを溶存状態に保つことが可能な物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することにより、同様に前記課題を解決するものである。
【００１２】
ここで、前記泳動液に金属キレート剤を含有することができる。
【００１３】
又、前記金属キレート剤をアセチルアセトンとすることができる。
【００１４】
本発明は、又、泳動液を用いてキャピラリー電気泳動−質量分析方法により試料を測定する際に、試料中に含まれる金属イオンの溶解度を下げる物質を前記泳動液に含有することによって泳動時間の変動を緩和することにより、同様に前記課題を解決するものである。
【００１５】
ここで、前記泳動液にリン酸を含有することができる。
【００１６】
又、前記リン酸の濃度を２０〜５００μｍｏｌ／Ｌとすることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、泳動液に、金属イオンと相互作用する物質、試料中に含まれる金属イオンを溶存状態に保つことが可能な物質（金属キレート剤、例えばアセチルアセトン）、又は、試料中に含まれる金属イオンの溶解度を下げる物質（例えばリン酸）を含有することによって泳動時間の変動を緩和することで、洗浄バッファによる洗浄過程を省略しつつＭＴを安定化することができ、測定時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の適用対象であるＣＥ−ＭＳの一例の構成を示す図
【図２】本発明の原理を説明するための、３−ヒドロキシナフタレン−２,７−ジスルホン酸二ナトリウム（ＮＤＳ）のＭＴ推移を示す図
【図３】本発明の第１実施形態によるリン酸化合物のテーリングの抑制効果を示すフラクトース１,６−ジホスファートのエレクトロフェログラムを示す図
【図４】同じくイオン源の汚れ抑制状態を（Ａ）従来法と（Ｂ）第１実施形態で比較して示す図
【図５】同じくシロイヌナズナにおけるトリメサートのＭＴ推移を示す図
【図６】本発明の第２実施形態における測定回数とＭＴの推移を示す図
【図７】（Ａ）第１実施形態と（Ｂ）第２実施形態の各泳動液のマススペクトグラムを比較して示す図
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。又、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要件には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のもの、いわゆる均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。
【００２０】
本発明が適用されるＣＥ−ＭＳの一例は、図１に示す如く、試料８の分離を行なうためのキャピラリ１２、試料容器１４中の試料８と共に該キャピラリ１２の中に導入され、試料８を分離するためのバッファ１６、及び、キャピラリ１２の両端に高電圧を印加するための、前記バッファ１６に挿入される電極１８を備えた、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置１０と、前記試料容器１４に蓋をして密閉し、加圧することによってバッファ１６に注入されて、前記キャピラリ１２から生ずる液流をスプレー噴霧させイオン化を行なうための、サンプル用イオンスプレー（ＩＳ）２２及びシース液用ポンプ２４を備えたインターフェイス（Ｉ／Ｆ）２０と、該インターフェイス２０により噴霧された試料を質量分析するための質量分析計（ＭＳ）４０とを備えている。
【００２１】
図において、４２は、インターフェイス２０でイオン化された分子をサンプリングして、運動エネルギの方向を揃えるための、イオンを加速して窒素ガスに衝突させ、フラグメントイオンを生成するためのフラグメンタ電圧が印加されると共に、ＣＥ１０から入ってきた溶媒を揮発させるための乾燥ガス（例えば窒素ガス）が供給されるサンプリングコーン、４４は、該サンプリングコーン４２を通過したイオンを収束するためのイオンレンズ、４６はスキマーコーン、４８はプレフィルタ、５０は、真空度が下がるのを防止するための隔壁、５２は、イオンの質量を選択するためのマスフィルタ、５４は、該マスフィルタ５２を通過してきた測定質量のイオンを計数するための検出器である。
【００２２】
バッファ１６へ、分析バッファとしてリン酸の最終濃度が２０、１００、２００、５００μｍｏｌ／Ｌとなるようにリン酸を添加し、前処理したマウス肝臓試料を１０倍希釈し、リン酸を含有した分析バッファを用いて５０回の連続測定を行った際の測定条件を表１、測定結果を図２に示す。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
図２では測定１回目のＮＤＳのＭＴを０分とし、そこからの偏差をプロットしている。リン酸濃度を１００μｍｏｌ／Ｌ以上としたときはＭＴは安定であり、２０μｍｏｌ／Ｌを下回るとＭＴの遅延傾向が確認された。
【００２５】
なお、リン酸は不揮発性の化合物であるため、ＭＳの汚染を生じ、又、リン酸はイオン化しやすい物質であるためバックグラウンドの上昇の原因となる。そこで、リン酸の濃度の上限は５００μｍｏｌ／Ｌとした。以上を総合して、添加するリン酸濃度は２００μｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００２６】
本発明の第１実施形態では、分析バッファに低濃度（２００μｍｏｌ／Ｌ）のリン酸アンモニウムを添加することで、リン酸アンモニウムバッファによる洗浄過程を省略し、且つ、これまでよりも安定性を向上させることができた。更に、洗浄過程の省略により測定時間を約２分短縮できた。
【００２７】
フラクトース１,６−ジホスファート１０μｍｏｌ／ＬをＣＥ−三連四重極質量分析計（ＱｑＱ）に従来法及び第１実施形態を適用し、測定した結果得られたエレクトロフェログラムを図３に示す。従来法ではテーリングが存在していたが、第１実施形態では、そのテーリングが改善している。この傾向はリン酸化合物、特にリン酸の数の多い化合物で顕著である。これは、分析バッファにリン酸が存在することで、キャピラリ１２のガラス表面のシラノールへのリン酸化合物の吸着が抑制された結果と考えられる。
【００２８】
イオンスプレー（ＩＳ）２２の溶液を従来法及び第１実施形態で２００回連続測定し、イオン源の汚れを確認した。従来法では測定１００回目で白い汚れが付着し、２００回測定後は、図４（Ａ）に示す如く、更に汚れが増大した。これに対して第１実施形態では、図４（Ｂ）に示す如く、２００回測定しても目視では汚れが確認されなかった。イオン源の汚れは洗浄バッファに含まれる高濃度のリン酸が原因であると考えられ、第１実施形態により、イオン源の汚れも低減できるものと考えられる。
【００２９】
シロイヌナズナにおけるトリメサートのＭＴ推移を図５に示す。図５から明らかなように、植物試料でＭＴが安定化されている。
【００３０】
なお、リン酸は不揮発性の化合物であるため、ＭＳの汚染の原因となり、又、リン酸はイオン化しやすい物質であるため、バックグラウンドの上昇の原因となる。第１実施形態のようにリン酸を添加することでＭＴが安定化する理由について考察した結果、試料中に含まれる金属イオンが原因であると考えられる。即ち、試料中の金属イオン若しくは塩基条件により析出した金属水酸化物がキャピラリ１２の内壁に吸着しキャピラリ１２内の電気浸透流ＥＯＦを抑制していると推測できる。従って、金属イオンを溶存状態に保つことができればＭＴが安定化するはずであり、その手段として金属キレート剤を用いることが考えられる。又、その金属キレート剤が揮発性を有していれば、ＭＳの汚染も防ぐことができる。
【００３１】
本発明の第２実施形態は、上記の点に着目し、金属キレート剤としてアセチルアセトンを選択し、ＭＴの安定化を図ったものである。
【００３２】
表２の条件でウサギ肝臓試料をＣＥ−ＭＳで測定した結果、図６に示す如く、アセチルアセトンを添加することでＭＴの安定化効果を確認できた。即ち、従来法ではＭＴの上昇傾向が維持され、遅れていくのに対し、第２実施形態では遅延が防止されている。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
又、表３に示す如く、リン酸を添加した第１実施形態のバッファとアセチルアセトンを添加した第２実施形態のバッファを比較したところ、図７に示す如く、第１実施形態（Ａ）に比べて第２実施形態（Ｂ）の方がバックグラウンドが低減することが確認できた。
【００３５】
【表３】
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【００３６】
なお、第２実施形態においては添加物としてアセチルアセトンが用いられていたが、添加物の種類はこれに限定されず、金属キレート剤であれば他のものであってもよい。
【符号の説明】
【００３７】
８…試料
１０…キャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置
１２…キャピラリ
１６…泳動液（バッファ）
２０…インターフェイス（Ｉ／Ｆ）
２２…スプレー
４０…質量分析計（ＭＳ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019200072.tif 000010
【図６】
2019200072.tif 000011
【図７】
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