(57)【要約】      （修正有）【課題】天然のヘモグロビンと比較して、亜硝酸塩を微小血管系において強化された速度で酸化窒素に還元させるための、高酸素親和性を有するＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）されたヘモグロビン及びヘモグロビン組成物の提供。【解決手段】３７℃およびｐＨ７．４で測定される、２〜５ｍｍＨｇの範囲のＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ポリエチレンオキシドヘモグロビン四量体抱合体であって、前記ヘモグロビン四量体抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示すヘモグロビン四量体抱合体。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３７℃およびｐＨ７．４で測定される、約２〜５ｍｍＨｇの範囲のＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体であって、２５℃で完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、ヘモグロビン抱合体。
【請求項２】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１５倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも２０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも１０倍〜約２５倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項５】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも約１５倍〜約２５倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項６】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも１０倍〜約２１倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項７】
前記ヘモグロビン抱合体が、完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも約１５倍〜約２１倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す、請求項１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項８】
３７℃およびｐＨ７．４で測定される、約２．０〜５．０ｍｍＨｇの範囲のＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ヘモグロビン抱合体であって、２５℃で完全に脱酸素化されたときに少なくとも０．２５μＭ／秒の最大亜硝酸還元酵素活性を有する、ヘモグロビン抱合体。
【請求項９】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が少なくとも約０．３０μＭ／秒である、請求項８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１０】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が、少なくとも約０．３５μＭ／秒である、請求項８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１１】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が、少なくとも約０．４０μＭ／秒である、請求項８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１２】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が、０．２５〜約０．５０μＭ／秒にわたる、請求項８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１３】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が、０．３０〜約０．４７μＭ／秒にわたる、請求項８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１４】
前記ヘモグロビンが、四量体当たり平均約７〜約１１個のＰＡＯ分子に抱合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１５】
前記ヘモグロビンが、四量体当たり平均約９〜約１０個のＰＡＯ分子に抱合される、請求項１４に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１６】
前記ポリアルキレンオキシドが、前記ヘモグロビンが酸素化状態にある間、前記ヘモグロビン分子上で露出されたアミノ酸側鎖のチオール基へチオール反応性部分を介して共有結合される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１７】
前記ポリアルキレンオキシドが、アルキレンまたはフェニレンから成るリンカーによって前記チオール反応性部分に結合される、請求項１６に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１８】
前記ヘモグロビンが、前記ヘモグロビン分子の２つのβ８２リジン残基で架橋されたビス（２，５−ジブロモサリチル）フマレートである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項１９】
膠質浸透圧が少なくとも７５ｍｍＨｇである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２０】
前記Ｐ５０が約２〜約４ｍｍＨｇである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２１】
前記Ｐ５０が約３ｍｍＨｇである、請求項２０に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２２】
前記ヘモグロビン抱合体が、酸素に対して結合基である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２３】
前記ヘモグロビン抱合体が、一酸化炭素に対して結合基である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２４】
前記ヘモグロビン抱合体が、一酸化窒素に対して結合基である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２５】
前記ヘモグロビン抱合体が脱酸素化されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２６】
前記ＰＡＯがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２７】
前記ＰＥＧが約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項２６に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２８】
前記ＰＥＧが約３，０００〜約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項２６に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項２９】
前記ＰＥＧが約４，０００〜約６，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項２６に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３０】
前記ＰＥＧが約５，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項２９に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３１】
前記ＰＥＧがマレイミド−ＰＥＧである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３２】
前記マレイミドがアルキレンまたはフェニレンリンカーを介して前記ＰＥＧに結合される、請求項３１に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３３】
前記アルキレンリンカーがエチレンリンカーである、請求項３２に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３４】
前記マレイミド−ＰＥＧが、前記ヘモグロビンのシステイン残基の内因性のチオール部分、前記ヘモグロビンのチオール化リジン残基のチオール部分、またはそれらの組み合わせから選択された前記ヘモグロビンのチオール部分に抱合される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３５】
Ｎ−エチルマレイミドが、前記ヘモグロビンのβ９３システイン残基に抱合された、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３６】
前記マレイミド−ＰＥＧは、下記の構造
【化１】
2019089789.tif 000009
［式中、Ｈｂがヘモグロビンであり、
Ｓがヘモグロビンのチオールであり、
Ｒ３がアルキレンまたはフェニレン基であり、
Ｘが末端基であり、
ｍが前記ヘモグロビンに抱合されたマレイミジル活性化ＰＥＧポリマーの平均値であり、
ｎが約２，０００〜約２０，０００ダルトンの平均分子量を有する、ＰＥＧのオキシエチレン単位の平均数である］を有する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３７】
Ｒ３がエチレンである、請求項３６に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３８】
Ｘがメトキシまたはカルボキシである、請求項３６ないし３７に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項３９】
Ｘがメトキシである、請求項３８に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４０】
ｎが約３，０００〜約１０，０００ダルトンである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４１】
ｎが４，０００〜約６，０００ダルトンである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４２】
ｎが約５，０００ダルトンである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４３】
ｍが約７〜約１１である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４４】
ｍが約９または約１０である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体および薬学的に許容な担体を含む医薬品組成物。
【請求項４６】
前記組成物が全血で正常腫脹である、請求項４５に記載の医薬品組成物。
【請求項４７】
前記組成物が血漿と比較して高張性である、請求項４５ないし４６に記載の医薬品組成物。
【請求項４８】
急性肝不全、ベータ地中海貧血症、やけど、慢性重症下肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、酸欠、マラリア、器官虚血、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠中の子癇前症、敗血症、鎌状赤血球貧血、網膜疾患、眼内状態、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷性脳損傷、潰瘍、血管痙攣、またはそれらの組合わせの治療に使用するための、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項４９】
器官虚血が急性腸虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓）、心臓性ショック、急性脈管器官虚血、脳卒中、心筋梗塞、または重篤な心虚血を含む、請求項４８に記載の医薬品組成物。
【請求項５０】
非外傷性出血ショック、入院前設定外傷、外傷性出血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸窮迫症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官劣化（生体外）、器官劣化（受容者における）、重篤な敗血症、敗血症性ショック、心筋梗塞、心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺塞栓またはそれら組合わせの治療に使用するための、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項５１】
血管形成術の補助的手段として、形成手術のための補助的手段として、または心室補助装置を移植するにおける補助的手段として； 代用血液、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助的手段、腫瘍剤、器官保存剤、機能強化剤、手術補助剤または創傷治癒剤として； 画像診断において； 肺機能を改善するため； またはそれらの組合わせに使用するための、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項５２】
損傷による失血の獣医学治療、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染症、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進症および脾腫、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、等免疫性溶血性貧血、細血管障害性溶血性貧血、寄生虫症、または外科的麻酔によって誘発された脳外傷のための、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【請求項５３】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘモグロビン抱合体または請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の医薬品組成物を必要とする被験者に投与することを含む治療方法。
【請求項５４】
前記被験者が動物である、請求項５３に記載の治療方法。
【請求項５５】
前記被験者がヒトである、請求項５３に記載の治療方法。
【請求項５６】
前記方法が、急性肝不全、ベータ地中海貧血症、やけど、慢性重症下肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、酸欠、マラリア、器官虚血、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠中の子癇前症、敗血症、鎌状赤血球貧血、網膜疾患、眼内状態、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷性脳損傷、潰瘍、血管痙攣、またはそれらの組合わせのための治療方法である、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項５７】
前記器官虚血が急性腸虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓）、心臓性ショック、急性脈管器官虚血、脳卒中、心筋梗塞、または重篤な心虚血を含む、請求項５６に記載の治療方法。
【請求項５８】
前記方法が、非外傷性出血ショック、入院前設定外傷、外傷性出血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸窮迫症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官劣化（生体外）、器官劣化（受容者における）、重篤な敗血症、敗血症性ショック、心筋梗塞、心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺塞栓またはそれらの組合わせのための治療方法である、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項５９】
前記ヘモグロビン四量体または医薬品組成物が、血管形成術の補助的手段として、形成手術のための補助的手段として、または心室補助装置を移植するにおける補助的手段として； 代用血液、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助的手段、腫瘍剤、器官保存剤、機能強化剤、手術補助剤または創傷治癒剤として； 画像診断において； 肺機能を改善するため； またはそれらの組合わせで投与される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項６０】
前記ヘモグロビン四量体または医薬品組成物が、血管形成術の補助的手段として、胸部の大動脈修復の補助的手段として、両心バイパスの補助的手段として、または両心バイパスのための充填液として投与される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項６１】
前記被験者がヒトではなく動物であり、前記方法が、損傷、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染症、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進症および脾腫、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、等免疫性溶血性貧血、微小血管症性溶血性貧血、寄生虫症、または外科的麻酔誘発性脳損傷による失血の獣医治療方法である、請求項５３ないし５４に記載の治療方法。
【請求項６２】
酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはそれらの混合物を組織に送達し、微小血管で亜硝酸塩を一酸化窒素（ＮＯ）に還元する方法であって、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体、または請求項４５〜６０のいずれか一項に記載の医薬品組成物を必要とする被験者に投与することを含み、投与後に、前記微小血管においてヘモグロビンの非リガンド化ヘムが、亜硝酸塩を一酸化窒素に変換する、方法。
【請求項６３】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体を製造する方法であって、
チオール化ヘモグロビンを形成するために、水性希釈剤の中でβ，β−分子内架橋ヘモグロビンを２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合することと、
β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体を形成するために、水性希釈剤の中で前記チオール化ヘモグロビンにＰＡＯを添加すること、を含む、方法。
【請求項６４】
前記２−イミノチオランがタンパク質濃度に対する約８倍および約２５倍の間のモル過剰の濃度で存在する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記２−イミノチオランがヘモグロビン濃度に対する約１５倍のモル過剰の濃度で存在する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＰＡＯ−マレイミドがタンパク質濃度に対する約１０倍および約４０倍の間のモル過剰の濃度で存在する、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＰＡＯ−マレイミドがヘモグロビン濃度に対する約２８倍のモル過剰の濃度で存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記チオール生成が約７〜約９のｐＨで実行される、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＰＡＯ−マレイミド抱合タンパク質を形成するために前記チオール化タンパク質にＰＡＯ−マレイミドを添加することが、約７〜約９の間のｐＨで実行される、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に天然のヘモグロビンと比較して、亜硝酸塩を微小血管系において強化された速度で酸化窒素に還元させるための、架橋ＰＥＧヘモグロビン及びヘモグロビン組成物に関するものである。具体的には、本発明は酸素、一酸化炭素、一酸化窒素、またはこれらの混合物を組織へ送達することができる、強化された亜硝酸還元酵素活性を有する高酸素親和性分子内架橋ＰＥＧヘモグロビン抱合体を使用することを対象としている。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンベースの酸素担体（「ＨＢＯＣ」）は、長い間ヘムによる一酸化窒素（ＮＯ）の掃気に起因する血管収縮に関連してきた。安定化されたヘモグロビン（Ｈｂ）のような酸素治療薬として有用な酸素担体（時には「酸素運搬血漿増量剤」ともいう）は、血管収縮と高血圧を引き起こす一酸化窒素を捕捉するために、限られた効力を持つことが示されている。血管収縮を引き起こすこれらの酸素運搬溶液の傾向は、動物や人の高血圧として現れる可能性がある。根本的なＨＢＯＣ等の血管収縮作用のメカニズムはよく理解されていないが、ヘム鉄が強力な血管拡張剤である内因性ＮＯを、急速かつ不可逆的に組み合わせることができ、それによって血管収縮を引き起こすことが示唆されている。
【０００３】
これらの血管収縮作用の理由の１つとして、改質無細胞Ｈｂを含有する製品が最も有望視されているが、酸素担体は現在まで酸素治療薬（ＯＴＡ）としては完全に成功していない。α鎖とビスジブロモサリチルフマレート（ααＨｂ）とが架橋した人のＨｂは、赤血球代替品のモデルとして米軍によって開発されたが、それは肺および全身血管抵抗内で深刻な増加を示した後に放棄された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｌｏｏｄ  ７８：３５６Ａ）。この製品の商用版も、期待外れの第ＩＩＩ相臨床試験の後に放棄された（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，２０００，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７９：１−２０）。
【０００４】
２つの分子アプローチが、ＨｂのＮＯ結合活性を克服しようとする中で進められている。第一のアプローチは、還元されたＮＯ結合親和性を有する組換ヘモグロビンを作成する試みで、遠位ヘムポケットの部位特異的突然変異誘発法を使用していた（Ｅｉｃｈ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：６９７６−８３）。第２のアプローチは化学的修飾法を使用したが、この場合、Ｈｂの大きさは、血管腔内から間質腔へのＨｂの溢出を減少させるか、または可能であれば、完全に阻害する試みの中で、オリゴマー化を介して向上された（Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７４：１７６９−７８；Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５７９−８３；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｖ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５６５−７５；Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．，１９８４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１７５−９７；およびＫｉｌｂｏｕｒｎｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９：１５５−６２）．
【０００５】
実際には、トップロードラット実験において、高血圧性の少ない、ＮＯのための低下した会合結合率を有する組換えＨｂが製造されてきた。（Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７２−６７６、およびＬｅｍｏｎ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｔｅｃｈ２４：３７８）。しかし、研究では、ＮＯ結合がＨｂの血管活性のための唯一の説明ではないことを示唆している。これは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で改質された特定の大きさのＨｂ分子は、そのＮＯ会合率が重度の高血圧性ααＨｂと同一であったとしても、実質的に血管収縮を含まないものであったことが見出されている（Ｒｏｈｌｆｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２１２８−１２１３４）。さらに、ＰＥＧ−Ｈｂは、出血前の交換輸血として与えられたとき、出血の影響を防止するために非常に効果的であることが分かった（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８５：９９３−１００３）。
【０００６】
ＰＥＧのＨｂへの抱合はその抗原性を低下させ、その循環半減期を延長する。しかしながら、ＰＥＧ抱合反応は、Ｈｂ四量体のαβ二量体サブユニットへの解離を生じ、交換輸血ラットで４０，０００ダルトン（「Ｄａ」）以下のＨｂ単量体単位のＰＥＧ抱合体を受ける総ヘモグロビン尿症を引き起こすことが報告されている（Ｉｗａｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ａｊｉｓａｋａ  Ｏｒｇａｎ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ：Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄｉｃｉｅｓ  Ｍｅｃｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．，Ｂｒｏｗｎ  ら  １９８１，Ｅｄｓ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ  ｐｇｓ  ９７−１０１）。８４，０００ダルトンより大きい分子量を持つポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）抱合Ｈｂが、そのαおよびεアミノ基でＨｂに結合したＰＥＧ−５，０００鎖の約１０個のコピーを持つエンゾン社（米国特許第５，６５０，３８８号）によって調製された。この置換の程度は、哺乳動物におけるヘモグロビン尿症と関連付けて、臨床的に意味のある腎臓毒性を回避すると説明された。しかしながら、不均一な抱合集団において抱合反応が生じ、カラムクロマトグラフィーによって除去しなければならない、他の望ましくない反応物を含有した。
【０００７】
ＰＥＧの抱合は、一般的には、生体分子の表面上の官能基と活性化ＰＥＧ部分の反応により行われる。最も一般的な官能基は、リジンのアミノ基、ヒスチジン残基のイミダゾール基、タンパク質のＮ末端であるシステイン残基のチオール基と、セリンのヒドロキシル基、トレオニンとチロシン残基、およびタンパク質のＣ末端である。ＰＥＧは通常、ヒドロキシル末端を穏やかな水性環境の中で、これらの官能基と反応可能な反応性部分に変換することによって活性化される。治療用生物薬剤の抱合のために使用される最も一般的な単官能性ＰＥＧの１つは、１つだけの官能基（すなわち、ヒドロキシル）を有する二官能性ＰＥＧと関連した、架橋および凝集の問題を最小にするメトキシＰＥＧ（「ｍＰＥＧ−ＯＨ」）である。しかしながら、ｍＰＥＧ−ＯＨはしばしば、その製造プロセスにより、１０から１５パーセントと高い範囲に亙る可能性がある高分子量二官能性ＰＥＧ（すなわち、「ＰＥＧジオール」）で汚染される（Ｄｕｓｔ  Ｊ．Ｍ．ら１９９０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ２３：３７４２−３７４６）。この二官能性ＰＥＧジオールは、所望の単官能性ＰＥＧの約２倍のサイズを有する。汚染問題はさらに、ＰＥＧの分子量が増加すると悪化する。ｍＰＥＧ−ＯＨの純度は、ＦＤＡが最終薬物製品の生産プロセスと品質について高いレベルの再現性を要求するため、ＰＥＧ化された生物学的治療薬の製造のために特に重要である。
【０００８】
ＨｂのＰＡＯ等への抱合は、酸素化と脱酸素化状態の両方において実行された。米国特許第６，８４４，３１７号は、結果として得られたＰＥＧ−Ｈｂ抱合体の酸素親和力を強化するために、Ｈｂを抱合前に大気と平衡化することにより、酸素化または「Ｒ」状態において抱合すると述べている。他は、酸素親和力を弱めて構造の安定性を増すための抱合前の脱酸素化段階は、Ｈｂが化学的修飾、血液透析濾過、および／または滅菌濾過、および殺菌の物理的応力に耐えることを可能にする、と述べている（米国特許第５，２３４，９０３号）。Ｈｂの分子内架橋のためには、α鎖のリジン９９を架橋試薬へ露出させるために、Ｈｂを改質前に脱酸素化することが必要とされ得るということが示唆されている（米国特許第５，２３４，９０３号）。
【０００９】
ＰＥＧと抱合する前の２−イミノチオランとのＨｂのチオール化の動態は、Ａｃｈａｒｙａらによって調査された（米国特許第７，５０１，４９９号）。四量体当たり５つの外因性チオールの平均を導入するイミノチオランの濃度を１０倍から３０倍に増加させると、Ｈｂの外因性チオールの数をほぼ倍増することが観察された。しかしながら、ＰＥＧ抱合後に見られる大きさの増大は、倍の数のチオールでもごくわずかだった。これは、マレイミジルＰＥＧ−５０００の２０倍モル過剰の存在下で、より低い反応性のチオールでＨｂの表面を覆っている抱合反応が、より反応性のチオールを有するＨｂの更なる改質に抵抗した立体障害を生じることを示唆した。その結果、変性Ｈｂの望ましい抱合度を達成するために（すなわち、Ｈｂ分子当たり６±１ＰＥＧ）、ＡｃｈａｒｙａらはＨｂをイミノチオランの８〜１５倍モル過剰でチオール化させ、それから、チオール化されたＨｂをマレイミジルＰＥＧ−５０００の１６〜３０倍モル過剰で反応させた。しかしながら、これらの大規模生産における高モル過剰反応物濃度は、ＨＢＯＣを調整するためのコストを大幅に増加させ、最終製品の不均一性を増加させる。また、このようなマレイミジルＰＥＧ−５０００の高モル過剰は、望ましくない副反応物のより多数の生産で、より不均一な製品も生じる。
【００１０】
これまでの研究では、表面改質されたヘモグロビンの分子サイズは、腎臓によって除去されるのを避け、所望の循環半減期を達成するために、十分な大きさでなければならないことが観察された。Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．らは、これは８４，０００ダルトン（「Ｄａ」）またはそれ以上の分子量で達成できるということを測定した（「Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｅｘｐａｎｄｅｒｓ」，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐａｇｅｓ  ２０５−２１２（１９７８））。その研究では、著者らは分子量を変化させたデキストランをＨｂに抱合させた。彼らは、Ｈｂの抱合体（６４，０００Ｄａの分子量を有する）とデキストラン（２０，０００Ｄａの分子量を有する）は、「腎臓を介してゆっくりと循環から無視できる程度に除去された。」と報告した。また、８４，０００Ｄａを超えるまで分子量を増加しても、これらの除去曲線を著しく変化させなかったことが観察された。分子内架橋は、二量体の形成を防止するために、腎臓によって早期に排泄される四量体ヘモグロビンユニットのサブユニットを、化学的に一緒に結合する。（例えば、米国特許第５，２９６，４６５号を参照のこと。
【００１１】
亜硝酸塩は、メトヘモグロビンを形成するためにオキシヘモグロビンと反応し、メトヘモグロビンおよび一酸化窒素を形成するためにデオキシヘモグロビンと反応する。亜硝酸塩の血管拡張作用は、ヘモグロビンの存在下で従来のＮＯドナーのものとは異なり、部分的にはヘモグロビンの亜硝酸還元酵素活性によって説明することができる。Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ら２００６  Ｂｌｏｏｄ１０７：５６６−５７４；Ｈｕａｎｇ  ら２００５  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：３１１２６−３１１３１；Ｈｕａｎｇ  ら２００５  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１１５：２０９９−２１０７を参照のこと。研究では、亜硝酸塩はヘモグロビン四量体を持つデオキシヘムとの反応によりのみＮＯに変換される（Ｃｏｓｂｙ，Ｋ  ら２００３，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４９８）、そしてさらに、その亜硝酸塩の速い還元は、タンパク質ヘムが弛緩またはＲ状態配座にある場合に起きることを示している。このヘモグロビンの亜硝酸還元酵素活性はアロステリック調節下にあって、脱酸素化ヘムがＲ状態配座にあるときに、ＮＯを最大速度で生成すると考えられている。Ｒ状態の安定化効果は、例えば、マレイミドＰＥＧ抱合の結果、亜硝酸還元酵素活性が増加するように、βＣｙｓ９３部位での改質を介して発生する可能性がある。また、無細胞Ｈｂｓが血管収縮を引き起こして灌流を還元する間に、マルＰＥＧ−Ｈｂ等が血管収縮の欠如に関連すると考えられる血流と微小血管の灌流圧を維持することが示されている（Ｔｓａｉ，  Ａ．Ｇ．  ら  ２００６，Ｂｌｏｏｄ  １０８：３６０３）。他の研究はまた、ＰＥＧの複数鎖を有する無細胞ヘモグロビン誘導体の改質は、血管作用を抑制することができることを示唆している。５個から６個のＰＥＧ鎖でＨｂを安定したＲ状態で利用した実験では、天然のＨｂに比べて１０倍速い亜硝酸還元酵素活性を示した（Ｌｕｉ，Ｆ．Ｅ．ら２００８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７（４０），１０７７３−１０７８０）。しかしながら、アクセス可能なリジン残基でのいかなるさらなるＰＥＧ抱合も、亜硝酸還元酵素活性の増加に寄与しないと結論付けられた。
【００１２】
したがって、酸素、一酸化炭素、一酸化窒素、またはこれらの混合物を組織へ送達し、既存のＨｂに比べて増大した亜硝酸還元酵素の性質を有する高酸素親和性ヘモグロビンの使用を介して、強化速度で、微小血管系内で、亜硝酸塩を一酸化窒素へ還元させる方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
一態様において、本発明は、３７℃およびｐＨ７．４で測定して、約２から５ｍｍＨｇにわたるＰ５０を有する、β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ヘモグロビン抱合体を対象としている。ヘモグロビン抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化された時に、同じ条件下で測定した脱酸素化ストローマフリーヘモグロビンよりも、少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す。
【００１４】
本発明の別の態様は、２５℃で完全に脱酸素化された時のヘモグロビン抱合体が、少なくとも０．２５μＭ／秒の最大亜硝酸還元酵素を有する場合に、３７℃とｐＨ７．４で測定して、約２．０から５．０ｍｍＨｇの範囲のＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ＰＡＯヘモグロビン抱合体を対象としている。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体、および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を対象とする。この組成物は、急性肝不全、ベータ地中海貧血症、やけど、慢性重症肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、酸欠、マラリア、器官虚血、抹消血管疾患、ポルフィリン症、妊娠中の子癇前症、敗血症、鎌状赤血球病、網膜疾患、眼内状態、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷性脳損傷、潰瘍、血管痙攣、またはそれらの組み合わせの治療に使用することができる。この組成物はまた、肺機能を改善するために、またはそれの組み合わせを想像するにあたり、血管形成術の補助的手段として、形成手術のための補助的手段として、または代用血液、心臓保護、凍結保存剤、血液透析の補助的手段、腫瘍剤、器官保存剤、機能強化薬剤、手術補助剤、または創傷治癒剤としてなどの、心室補助装置を移植するにおける補助的手段として使用することができる。この組成物はまた、損傷、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染症、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進症および脾腫、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、等免疫性溶血性貧血、微小血管症性溶血性貧血、寄生虫症、虫症、または外科麻酔誘発性脳損傷、またはそれらの組み合わせによる失血の獣医治療のためにも使用することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、そのようなヘモグロビン抱合体または医薬組成物を、それらを必要とする被験者に投与することを含む治療方法を対象とする。この方法は、上記状態のいずれか１つ以上の治療のためのものである。
【００１７】
本発明の別の態様は、酸素、一酸化窒素、一酸化炭素、またはそれらの混合物を組織に送達し、微小血管系における亜硝酸塩の一酸化窒素（ＮＯ）へ還元する方法を対象とする。この方法は、β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体または医薬的組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含み、この場合、投与後に、ヘモグロビンが非リガンド化され(becomes unliganded)、微小血管系内で亜硝酸塩を一酸化窒素に変換する。
【００１８】
本発明の別の態様は、β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体を上記記述のように作る方法を対象とする。この方法は、チオール化ヘモグロビンを形成するために、β，β−分子内架橋ヘモグロビンを水性希釈剤の中で２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合する、およびβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体を形成するために、ＰＡＯを水性希釈剤の中のチオール化ヘモグロビンを添加する段階を含む。
【００１９】
他の目的および特徴は、一部は明らかであり、一部は以下に指摘する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ββ−ＨｂのＤＢＢＦ架橋の実証確認を示す、非解離状態（ＰＢＳ）でストローマを含まないＨｂ（ＳＦＨ）（−−−）、およびββ−Ｈｂ（―――）、それぞれのサイズ排除クロマトグラムである。
【図２】ββ−ＨｂのＤＢＢＦ架橋の実証確認を示す、非解離状態（ＰＢＳ）でストローマを含まないＨｂ（ＳＦＨ）（−−−）、およびββ−Ｈｂ（―――）、それぞれのサイズ排除クロマトグラムサイズ排除クロマトグラムである。
【図３】（ＳＦＨ）（−−−）とββ−Ｈｂ（―――）のそれぞれが、βサブユニットのＤＢＢＦ架橋の場合の実証確認を示す逆相高性能液体クロマトグラムである。
【図４】ＰＥＧ−ββ−ＨｂのＰＥＧ化を示すＰＥＧ−ββ−Ｈｂ（−−−）とββ−Ｈｂ（―――）それぞれの、非解離状態でのサイズ排除クロマトグラム。
【図５】様々なヘモグロビンの亜硝酸塩還元特性のグラフィカル描写である。  対応する参照文字は、図面を通して対応する部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
従来のヘモグロビン治療薬に比べて向上された治療特性を有する、高酸素親和性のβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体が発見されている。これらのヘモグロビン抱合体は、脱酸素化された時に、同じ条件下で測定した脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも、少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す。このヘモグロビン抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化された形態の時に、少なくとも０．２５μＭ／秒の最大亜硝酸還元酵素活性を有する。このヘモグロビンは、酸素、一酸化炭素または一酸化窒素を被験者へ送達するためにリガンド結合形態で送達され得、また、一度非リガンド化されると、微小血管内の亜硝酸塩を一酸化窒素に変換する。
【００２２】
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、非解離性四量体内でヘムを脱酸素化した、酸素化されたＲ状態配座中のヘモグロビンを架橋することにより、非解離性Ｒ状態内のこれらのデオキシヘムで、亜硝酸塩の還元促進がロックされると考えられている。本発明のヘモグロビン抱合体の、予想外にずっと大きい亜硝酸還元酵素活性は、ヘムキャプチャーを逃れるより多くのＮＯを与え、Ｈｂから組織へ放出され、そこで、他のヘモグロビンの治療薬に比べてより大きな血管拡張効果につながる。これは、高親和性のＲ状態構造の架橋が、亜硝酸塩の還元を高めるヘムポケット内の特性を促進するために生じると考えられる。架橋がなければ、Ｔ状態及びＲ状態のヘム配座構造が交互になるより多くのヘモグロビンのアロステリック配座変化がある。架橋された、完全に安定化したＲ状態構造は、四量体の中の脱酸素化されたヘムポケット内であっても、ヘムポケットの中で亜硝酸からＮＯへの還元を強化すると考えられる。
【００２３】
本発明は、３７℃およびｐＨ７．４で測定して、約２から５ｍｍＨｇにわたるＰ５０を持つ、β，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ヘモグロビン抱合体を対象としている。このヘモグロビン抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化された時に、同じ条件下で測定した場合、ストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す。
【００２４】
このヘモグロビン抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化された時、同一の条件で測定した時に、ストローマフリーヘモグロビンのものよりも、少なくとも１５倍または２０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示す可能性がある。好ましくは、このヘモグロビン抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化された時、同一の条件で測定した時に、ストローマフリーヘモグロビンのものよりも、１０倍から２５倍大きい亜硝酸還元酵素活性を示し、もっと好ましくは、同一の条件で測定した時に、ストローマフリーヘモグロビンのものよりも、約１５倍から約２５倍大きい、１０倍から約２１倍大きい、または、約１５倍から約２１倍大きい。
【００２５】
本発明のβ，β−分子内架橋ＰＡＯヘモグロビン抱合体は、３７℃とｐＨ７．４で測定して２．０から５．０ｍｍＨｇにわたる、および２５℃で完全に脱酸素化された時に、少なくとも０．２５μＭ／秒の最大亜硝酸還元酵素活性のＰ５０を持つ可能性がある。好ましくは、ヘモグロビン抱合体の最大亜硝酸還元酵素活性は、２５℃で完全に脱酸素化された時に、少なくとも０．３０μＭ／秒で、より好ましくは０．３５、０．４０、または０．４５μＭ／秒である。ヘモグロビン抱合体の最大亜硝酸還元酵素活性は、０．２５から約０．５０μＭ／秒、または約０．３０から約０．４７μＭ／秒にわたることができる。
【００２６】
様々なＨｂ等が本発明に利用することができる。Ｈｂはヒト、ウシ、ブタ、またはウマのヘモグロビンなどの動物源から得ることができる。ヒトのＨｂが好ましい。Ｈｂは天然の供給源から得ることができるか、または既知の組換方法により生産することができる。
【００２７】
本発明のヘモグロビン抱合体は、ストローマフリーヘモグロビンのものよりも大きい高酸素親和性を有する。これは、このヘモグロビンが、３７℃およびｐＨ７．４で測定して１５ｍｍＨｇ未満の、好ましくは約２から約５ｍｍＨｇ、最も好ましくは約２から約４ｍｍＨｇ、もしくは３ｍｍＨｇのＰ５０を有することを意味する。
【００２８】
このヘモグロビン抱合体は、少なくとも約５０ｍｍＨｇの、好ましくは少なくとも約６０、６５、７０または７５ｍｍＨｇの膠質浸透圧（ＣＯＰ）を持つ可能性がある。
【００２９】
このヘモグロビンは、二量体への解離を防ぎ、腎臓により除去されるのを避けるために、循環半減期を延長するβ，β−分子内架橋である。ヘモグロビン分子の２つのβ８２のリジン残基を架橋するために、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレート（ＤＢＢＦ）架橋剤が使用される。ＷａｌｄｅｒらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７９；１８（２０）：４２６５−７０に記載されているように、ＤＢＢＦ架橋の既知の方法を使用することができる。
【００３０】
本発明のヘモグロビンの抱合に使用するためのポリエチレンオキシドとしては、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレン／ポリプロピレンオキシド共重合体が挙げられるが、これらに限定されない。このＰＡＯは、約２，０００から約２０，０００ダルトン、好ましくは約３，０００から約１０，０００ダルトン、より好ましくは４，０００から約６，０００ダルトン、および最も好ましくは約５，０００ダルトンの分子量を有する。Ｈｂの表面を改質するために現在使用される最も一般的なＰＡＯは、その製薬的受容性および商業的入手可能性の理由からＰＥＧである。ＰＥＧは、ＰＥＧ分子の数と大きさに基づいてＨｂに抱合した所望の分子量を達成するために、分子内のエチレンオキシドの反復サブユニット（すなわち、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）の数に基づいた様々な分子量で利用可能である
【００３１】
ヘモグロビンは、ヘモグロビン四量体当たり平均約７個から約１１個のＰＡＯ分子上に抱合させることができる。好ましくは、ヘモグロビンは、四量体当たり平均約９から約１０のＰＡＯ分子上に抱合される。
【００３２】
１つまたは両方のＰＡＯ重合体の終端末端基が、反応性官能基（「活性化された」）に変換される。例えばＰＥＧ−ＯＨは、アンモニア水（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．らによる１９８３、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７−１１８３）、アジ化ナトリウム、またはカリウムフタルイミドと求核置換反応を行うことにより、次にＰＥＧアミン（「ＰＥＧ−ＮＨ２」に変換されるＰＥＧハロゲン化物、メシレートまたはトシレートを調製するために使用される。活性化ＰＥＧは、次に、ヘムタンパク質のカルボキシル基（「−ＣＯＯＨ」）を有するＰＥＧアミン基（−「ＮＨ２」）との相互作用によってヘムタンパク質に抱合される可能性がある。
【００３３】
ＰＥＧをアミン基と官能化し、それをマレイミド基に変換することに加えて、活性化されたＰＥＧは当該分野で使用されることが知られている。例えば、ＰＥＧは、いくつか例を挙げると、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルデヒド、アミノプロピル、アミノエチル、チオール、アミノオキシ、ヒドラジド、およびヨードアセトアミドと活性化されることもできる。このような官能性ＰＥＧは、既知の方法を用いて、タンパク質の表面アミノ酸側鎖に抱合させることができる。
【００３４】
ＰＥＧ−ＮＨ２はさらに、カルボキシル以外の基と抱合するために官能化される可能性がある。例えば、米国特許第６，８２８，４０１号は、ｍＰＥＧマレイミドを形成するために、マレイミドを持つＰＥＧ−ＮＨ２との反応を開示している。この反応では、ｍＰＥＧ−ＯＨは、ｍＰＥＧトシレートを生産するために、有機溶媒（ジクロロメタン）の存在下で、トシル試薬（ｐ−トルエンスルホニルクロリド）および塩基触媒（トリエチレンアミン）と反応させる。このｍＰＥＧトシレートは次に、マレイン酸化合物を生産するために、２８％アンモニア水とマレイン酸無水物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（「ＤＭＡｃ」）、およびＮ−シクロヘキシルピロリジノン（「ＣＨＰ」）の有機溶媒混合物の中で反応させる。この化合物はその後、ｍＰＥＧマレイミドを生産するために、ジクロロメタンの存在下で、ペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテートと反応させる。
【００３５】
あるいは、ｍＰＥＧマレイミドは、ｍＰＥＧトシレートを生産するために、ｍＰＥＧ−ＯＨを有機溶媒（ジクロロメタン）の存在下で、トシル試薬（ｐ−トルエンスルフォニルクロリド）、および塩基触媒（トリエチレンアミン）と反応させることにより製造することができる。ｍＰＥＧトシレートはその後、ｍＰＥＧ−ＮＨ２を調製するために、２８％アンモニアと反応させる。このｍＰＥＧ−ＮＨ２はその後、ｍＰＥＧマレイミドを生産するために、飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）の存在下で、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド（ＭＣＭ）と反応させる。
【００３６】
ＰＡＯへの抱合のための、アミン反応化学を使用して変性することができる、ヒトＨｂのアミノ酸残基の側鎖の非限定的な例は以下の表１に示す：
【００３７】
【表１】
2019089789.tif 000003
【００３８】
Ｈｂ上で利用可能な抱合部位の数を増加させる１つの方法は、遊離アミンよりもマルＰＥＧとより反応する傾向があるスルフヒドリル基（チオール化としても知られている）を導入することである。タンパク質のチオール化のために種々の方法が知られている。１つの方法では、タンパク質遊離アミンは、ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（「ＴＣＥＰ」）で還元した後に、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩と反応させる。この反応は、チオール化の程度を測定するために用いることができる、２−ピリジンチオン発色団を放出する。アミンはまた、中性付近のｐＨで、５０ｍＭのヒドロキシルアミンまたはヒドラジンに続いて、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの間接的反応によってチオール化され得る。
【００３９】
米国特許第５，５８５，４８４号に記載された別の方法は、抱合後にＨｂのアミノ（α−またはε−）基の正電荷を維持する。この方法は、タンパク質上にスルフヒドリル基を導入するための、２−ＩＴによるＨｂのεアミノ基のアミジン化を含む。このアプローチは、以前に使用されたスクシンイミジル化学よりも少なくとも２つの追加の利点を有する：１）スルフヒドリル基を持つマレイミド基の高い反応性および選択性は、試薬の過剰液制限を伴うチオールのほぼ定量的な変性を容易にする、また、２）２−ＩＴのチオール基は潜在的なものであり、タンパク質アミノ基を持つ試薬の反応の結果として、原位置においてのみ生成される。これらの利点は１つの追加の利益を提供する：これらは表面改質用のチオール化とＰＥＧ化試薬の両方を持つＨｂの同時潜伏を可能にする。
【００４０】
例えば、マルＰＥＧは、Ｈｂの表面上のチオール基を導入するために、Ｈｂのアミンをチオール化することにより、Ｈｂに抱合させることができる。反応に利用可能であるＨｂの２つの内因性チオール基はβＣｙｓ９３にあり、Ｈｂの表面上の添加されたチオール基は、ＰＥＧ化されたＨｂ抱合体を形成するために、マレイミジルＰＡＯのマレイミドと反応することができる。
【００４１】
ポリアルキレンオキシドは、ヘモグロビンが酸素化された状態にある間、チオール反応性部分を介してヘモグロビン分子上の露出したアミノ酸側鎖のチオール基へ共有的に付着することができる。
【００４２】
マレイミドＰＥＧはヘモグロビンのシステイン残基、ヘモグロビンのチオール化リジン残基のチオール部分、またはそれらの組み合わせの内因性チオール部分から選択されたヘモグロビンのチオール部分へ抱合させることができる。
【００４３】
マレイミドＰＥＧにはマレイミドをＰＥＧに付着するためにリンカーが含まれている。リンカーはエチレン、プロピレンまたはイソプロピレン、フェニレン、アミド（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）、またはフェニールカルバメート（すなわち、−Ｐｈ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−）などのアルキレンを含む可能性があるがそれらには限定されない。好ましくは、ポリアルキレンオキシドは、アルキレンまたはフェニレン、およびより好ましくはエチレンなどのアルキレンを含有するリンカーによってチオール反応性部分へつながることである。
【００４４】
マレイミドＰＥＧは下記の構造を持つ
【化１】
2019089789.tif 000004
式中、Ｈｂはヘモグロビンであり、Ｓはヘモグロビンのチオールであり、Ｒ３はアルキレン基またはフェニレン基であり、Ｘは末端基であり、ｍはヘモグロビンに抱合したマレイミジル活性化ＰＥＧポリマーの平均数であり、ｎは約２，０００から約２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレン単位の平均数である。好ましくは、Ｒ３はエチレンなどのアルキレンで、ＸはベンジルオキシまたはＣ１−Ｃ２０アルコキシで、より好ましくはＣ１−Ｃ１０のアルコキシ基であり、さらに好ましくはメトキシまたはエトキシなどのＣ１−Ｃ５のアルコキシ基などのヒドロキシやアリールオキシで、ｎは約３，０００から約１０，０００ダルトンの、より好ましくは４，０００から約６，０００ダルトンの、そして最も好ましくは約５，０００ダルトンで、ｍは約７から約１１まで、より好ましくは約９または約１０である。
【００４５】
チオール反応化学を使用して変性することができるアミノ酸残基側鎖の非限定的な例を、以下の表２に示す：
【００４６】
【表２】
2019089789.tif 000005
【００４７】
ヘモグロビンのβＣｙｓ９３残基での２つの内因性チオールはＰＥＧ化させる、またはＮ−エチルマレイミドと反応させることができる。これらのシステイン残基のそのような変性はＰ５０を還元させ、Ｒ状態での安定化効果を有する。
【００４８】
ＰＡＯ−Ｈｂの分子量は抱合反応によって調節することができる。従来の考えは、反応物のモル比を増加させると、Ｈｂに結合したＰＥＧ分子の数を増加させることを示唆した。これは、Ｈｂのチオール化プロセス（すなわち、Ｈｂへのチオール化剤のモル比を増加させる）、および抱合過程（すなわち、チオール化されたＨｂへのチオール活性化ＰＥＧのモル比を増加する）の両方を含んだ。しかし、これらの過剰液モル比は、Ｈｂ当たり６±１だけのＰＥＧ分子の結合をもたらした（米国特許第７，５０１，４９９号を参照のこと）。
【００４９】
より多くの数のＰＡＯ分子を、反応物のより低いモル比を用いてＨｂに結合することができることを最近測定した。チオール化前後および抱合後のＨｂ上の利用可能なチオール基の数を、ジチオピリジン比色分析を用いて測定した（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ３２：１６３−１６９）。ヒトのＨｂはジチオピリジン反応により、β９３システイン残基で２つの内因性反応性チオール基を含んでいることが確認された。ＳＦＨを２−ＩＴとチオール化した後に、反応性チオール基の数は２から７以上に増加した。この例では、平均で８個のＰＥＧ分子がＨｂに結合された。これは、チオール化反応においてＳＦＨの７．５倍モル過剰の２−ＩＴ、および抱合反応において、チオール化Ｈｂの１２倍モル過剰のマルＰＥＧを使用して達成された。
【００５０】
Ｈｂ−ＰＡＯ抱合体の酸素親和性を高めるために、ヘモグロビンは酸素状態にあるときにポリアルキレンオキシドと抱合されている。
【００５１】
したがって本発明の別の態様は、ヘモグロビン抱合体を作る方法を対象にしている。この方法は次の段階を含む：チオール化ヘモグロビンを形成するために、水性希釈剤の中でβ，β−分子内架橋ヘモグロビンを２−イミノチオラン（２−ＩＴ）と混合すること、およびβ，β−分子内架橋ポリオキシアルキレンオキシドヘモグロビン抱合体を形成するために、水性希釈剤の中でチオール化されたヘモグロビンへＰＡＯを添加すること。
【００５２】
この方法では、２−イミノチオランは、ヘモグロビン濃度よりも約８倍から約２５倍モル過剰間で、好ましくは約１５倍モル過剰の濃度で存在する。
【００５３】
チオール化は約７から約９のｐＨで行うことができる。
【００５４】
抱合は約７から約９のｐＨで行うことができる。
【００５５】
この方法では、ＰＡＯ−マレイミドは１００％の末端活性に基づいて、ヘモグロビン濃度よりも約１０から約４０倍モル過剰、好ましくは約２８倍モル過剰の濃度で存在する。
【００５６】
本発明のヘモグロビン抱合体は、酸素化または脱酸素化形態、ＣＯまたはＮＯに対して結合基である、あるいはこれらの４つの形態の２つ以上を含む混合物であることができる。ＨｂＯ２は、非酸素化ヘモグロビンを空気、純Ｏ２ガスまたはＯ２／窒素混合ガスと平衡化することによって調製される。
【００５７】
脱酸素化は、当技術分野で既知のいかなる方法でも行うことができる。１つの簡単な方法は、ヘモグロビン溶液を窒素、アルゴン、またはヘリウムなどの不活性ガスに暴露することである。脱酸素化が比較的均一であることを保証するために、Ｈｂ溶液はこのプロセスで循環される。所望のレベルを達成するために脱酸素化を監視することは、共同酸素濃度計６８２（計器ラボラトリーズ社）を用いて行うことができる。部分的な再酸素化が所望される場合、脱酸素化Ｈｂを、酸素または空気などの酸素を含有するガス混合物に暴露することができる。
【００５８】
別のガスと分子状酸素を交換するガス交換は、ポリプロピレンまたはセルロースアセテート膜として、気体透過性膜を介して達成され得る。例えば、公告された米国特許出願第２００６／０２３４９１５号を参照のこと。これらの膜を用いた市販のガス交換装置は、Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｃｅｌａｎｅｓｅ（テキサス州、ダラス）のセルガード（商標）ポリプロピレン微多孔中空繊維装置、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（コネチカット州、イーストライム）のＣｅｌｌ−Ｐｈａｒｍ（商標）中空繊維人工肺を含む。Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｓｅ  Ｃｅｌｇａｒｄ（商標）装置では、酸素化Ｈｂは、装置が５〜２０ｐｓｉで窒素でパージされる間に、水性Ｈｂ溶液を１０〜１００ミリリットル／分／平方フィートで、ポリプロピレン微多孔中空フィルターを通して通過させることにより脱酸素化される。Ｈｂは一般的に、デオキシＨｂの所望の割合を達成するために、約５〜３０分間循環させる。脱酸素化Ｈｂを産生するための別の方法は、Ｈｂ溶液を、アスコルビン酸ナトリウム、ジチオン酸ナトリウム、および重亜硫酸ナトリウムなどの化学的還元剤に暴露することを含む。Ｈｂは、還元剤濃度、反応時間および温度を調整することにより、部分的に脱酸素化される。あるいは、還元剤は実質的にＨｂを脱酸素化するために使用することができ、その後酸素は、部分的に脱酸素化生産物を形成するために再導入することができる。例えばＨｂは、酸化防止剤を添加する前に約１時間、重亜硫酸ナトリウムの１００ｍＭ濃度に暴露することができる。
【００５９】
Ｈｂは、いかなる既知の方法を用いても、オキシヘモグロビンを形成するために、単にＣＯをＯ２に置換することにより、ＣＯに対して結合基になることができる。これは一般に、ヘモグロビンがＯ２ではなくＣＯに対して結合基になるように、ＣＯの発生源をヘモグロビンの溶液に導入することを含む（Ｋ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８２：１８３−１８９（２００４））。ヘモグロビンは、酸素と比べてＣＯに対してより高い親和性を有するので、最初にヘモグロビンを脱酸素化する必要はない。したがって、ＣＯ−Ｈｂの複合体を形成する最も便利な方法は、１００％ガス状のＣＯをヘモグロビンの溶液へ導入することである。
【００６０】
ＨｂＮＯは、脱酸素化ヘモグロビンを、ＮＯがＣＯに交換するように、酸化窒素ガスと反応させる、またはＣＯ−ＨｂをＮＯガスに暴露することにより調製することができる。ＨｂＮＯはまた、脱酸素化ヘモグロビンを、ＰＲＯＬＩ  ＮＯＮＯａｔｅ（商標）（すなわち、１−（ヒドロキシ−ＮＮＯ−アゾキシ）−Ｌ−プロリン、ジナトリウム塩、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）のような小さなＮＯ−ドナー分子と反応させることによっても作ることができる。
【００６１】
遊離基ＮＯがグロビン鎖の中でアミノ酸側基へ結合されるヘモグロビンは、本明細書で定義されるようなＮＯ−Ｈｂの複合体ではない、なぜならば、そのような化合物は、酸素の代わりに、ヘムポケット内のリガンドとして、二原子のＮＯ（非イオン性）を含まないことに留意すべきである。例えば、天然のヘモグロビンが、遊離スルフヒドリル基へ結合させる条件下でＮＯ供与体に暴露される時に、ニトロシルヘモグロビンが形成される（米国特許第６，６２７，７３８号）。このようなニトロシルヘモグロビンがまだ酸素を運ぶのに対し、本発明のＮＯ−Ｈｂの複合体は運ばない。さらに、改質されたヘモグロビンが、上記のように、スルフヒドリル部分に向かった反応によって形成される時、これらの部分はＮＯ結合のためには、もはや利用可能なものでない。
【００６２】
本発明のＰＡＯ−Ｈｂ抱合体は、水性希釈剤などの非経口投与のために、医薬的に受容可能な運搬体の中にＰＡＯ−Ｈｂ抱合体を含む医薬組成物として、製剤化することができる。運搬体の中のＰＡＯ−Ｈｂ抱合体の濃度は、用途に応じて変えることができる。ＰＡＯ−Ｈｂの抱合体濃度は、好ましくは約０．１ｇ／ｄｌから約１０ｇ／ｄｌまで、より好ましくは約２．０ｇ／ｄｌから約８．０ｇ／ｄｌまで、最も好ましくは約４．０から約６．０ｇ／ｄｌまでにわたる。ヘモグロビンの適切な濃度の選択は、最終的なヘモグロビン製品のコロイド浸透圧（膠質）特性に依存する。好ましくは、本発明の組成物は、全血と比較して標準膠質、または血漿と比較して高張膠質であり得る。ヘモグロビン濃度は、それぞれの適応症のための所望の膠質浸透圧を得るために調整することができる。
【００６３】
組成物が非経口として製剤化される場合、溶液は一般に、全血で生理学的相溶性電解質キャリア等浸透圧性を備え、可逆酸素、ＣＯ−またはＮＯ−の運搬、およびヘモグロビンの送達特性を維持する。
【００６４】
医薬的に受容可能なキャリアは水性希釈剤である。水性希釈剤は、コロイドの水溶液、またはアルブミン、糖タンパク質の水溶液、多糖の水溶液、またはそれらの組み合わせのようなタンパク質の水溶液のような非酸素運搬成分の水溶液を含むことができる。水性希釈剤は、水性細胞を含まない溶液を含むことができる。
【００６５】
適した水性希釈剤に含まれるものはそれらには限定されないが、生理食塩水、生理食塩水とグルコースの混合液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液、ロックリンゲル液、クレブスリンゲル液、ハルトマンの平衡生理食塩水、ヘパリン化クエン酸ナトリウム−クエン酸−デキストロース溶液、酢酸塩溶液、複数の電解質溶液（例えば、イリノイ州ディアフィールドのＢａｘｔｅｒ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＰｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ（登録商標）またはＰｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ−Ａ（登録商標））、ラクトビオン酸溶液、およびポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、エチレンオキシドプロピレングリコール凝縮液、またはそれらの組み合わせのようなポリマー代用血漿である。
【００６６】
組成物はさらに医薬的に許容される充填剤、塩、および当技術分野で周知の他の材料を含むことができ、その選択は、当該分野の普通熟練職人の測定、およびそのような添加物の性質に従った投与形態、治療される状態、達成されるべき特定の目的に依存する、例えば、組成物は、生理学的緩衝剤、炭水化物（例えば、グルコース、マンニトール、またはソルビトール）、アルコールまたはポリアルコール類、医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウムまたは塩化カリウム）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）、抗酸化剤、抗菌剤、膠質浸透圧剤（例えば、アルブミンまたはポリエチレングリコール）、または還元剤（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、またはＮ−アセチルシステイン）を含むことができる。
【００６７】
医薬組成物は、少なくとも約２センチポアズ（ｃＰ）の粘度を有する。より具体的には、粘度は約２から約５ｃＰ、および特に約２．５から約４．５ｃＰにわたる。
【００６８】
投与の合併症を回避するために、医薬組成物はＬＡＬ（リムルス変形細胞溶解物）試験によって測定された、かつ８％未満のメトヘモグロビンを持つ、せいぜい０．２５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンレベルを有する間質、リン脂質、および発熱物質を含まないで高純度である。
【００６９】
医薬組成物は、皮下、静脈内、または筋肉内注射、または大容量の非経口溶液などにより非経口的に投与することができる。組成物はまた強制経口投与もすることができる。
【００７０】
治療薬としてのヘモグロビン抱合体の標準的な用量は、１患者の体重の１ｋｇ当たりのヘモグロビンの約１から１５，０００ｍｇである。例えば、酸素の治療として使用される場合、投与量は１００から７，５００ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは５００から５，０００ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは７００から３，０００ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲になる。したがって、人間の患者のための標準的な用量は１，０００グラム以上の可能性がある。これは、個々の投薬回数の投与によって、各投薬形態の個々の用量に含まれる活性成分の単位含量が必要な有効量が到達できるので、それ自体で有効量を構成する必要はないと理解される。投約量の選択は利用する投薬形態、処置する状態、およびこの分野の技術に精通した者の測定に従って達成される特定の目的により異なる。
【００７１】
ＰＡＯ−Ｈｂ抱合体および医薬組成物は、酸素、ＣＯおよび／またはＮＯを被験体へ送達するために用いることができる。さらに内因性酸化窒素（ＮＯ）を微小血管系内で生産するために、酸素、一酸化窒素、一酸化炭素またはそれらの混合物を組織へ送達して亜硝酸塩を還元する方法は、それらをヘモグロビン結合体または組成物を必要とする被験者に投与することを含み、その場合、投与後に、ヘモグロビンは非リガンド化され、亜硝酸塩は微小血管系内で窒素酸化物に変換される。
【００７２】
本発明のそのヘモグロビン抱合体および組成物は以下に使用することができる：急性肝不全、ベータ地中海貧血症、やけど、慢性重症虚血肢、二酸化炭素又はシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（例えば、急性増悪）、うっ血性心不全（例えば、急性心不全、慢性心不全）、酸欠（例えば、高度での使用を含めた肺水腫、減圧症）、マラリア（例えば、脳マラリア（熱帯熱閉塞事象）、器官虚血（例えば、急性腸管虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓症）、心原性ショック、急性血管器官虚血、脳卒中（ＣＡＴスキャン前）、脳卒中（ＣＡＴスキャン後）、心筋梗塞／重度心虚血、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠中の子癇前症、敗血症、鎌状赤血球症（例えば、脳卒中／一過性脳虚血発作、脾臓隔離、肝隔離、持続勃起症）、網膜疾患／眼内症状（例えば、網膜中心動脈閉塞、中心静脈閉塞）、睾丸捻転、外傷／ショック（例えば、外傷性出血性ショック、非外傷性出血性ショック、入院前／現場での使用（軍事／救急）、外傷性脳損傷／爆風）、潰瘍、または血管攣縮の処置；血管形成術の補助的手段として、形成外科（皮膚フラップ）（例えば、急性治療、慢性治療）の補助剤として、または心室補助装置の移植の補助的手段として；（例えば、急性失血、エホバの証人、交差適合患者に対する困難性、珍しい血液型、鎌状再生不良性危機、鎌状赤血球貧血周術期管理、急性溶血性貧血（自己免疫）、急性溶血性貧血（毒素）、または他の不応性貧血）のための代用血液として；心臓保護、凍結保存剤、血液透析の補助的手段、腫瘍剤（例えば、放射線療法または化学療法、固形腫瘍に対する補助）、器官保存剤（例えば、提供者と受容者の生体外で）、機能強化薬剤（例えば、民間／アスレチック、軍事）、手術補助剤（例えば、心肺バイパス（主要）、心肺バイパス（調整）、肺の虚血、手術前の調整、大動脈瘤破裂、胸部大動脈の置換（切開または動脈瘤）、または創傷治癒剤；画像化において（Ｘ線または磁気共鳴画像（ＭＲＩ））；肺機能（例えば、急性肺障害、慢性肺障害、一過性ウイルス性肺炎、新生児促迫症候群）の改善；またはそれらの組み合わせ。このような用途は、それを必要とする被験者に対する抱合体または組成物の投与を含む。
【００７３】
さらに、本発明のヘモグロビンおよび組成物は、非外傷性出血性ショック、入院前の設定外傷、外傷性出血性ショック、急性肺傷害、成人呼吸促迫症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍がん、臓器の劣化（生体外）、臓器の劣化（受容者の）、重症敗血症／敗血症性ショック、心筋梗塞／心臓虚血、心原性ショック、急性心不全、肺塞栓症、手術による様々な条件（例えば、血管形成術の補助、胸部大動脈修復の補助的手段、心肺バイパス、心肺バイパス用の主要溶液）、またはそれらの組み合わせを治療するために使用することができる。
【００７４】
本発明のヘモグロビンおよび組成物が有用である多数の臨床設定には次のものが含まれる：
【００７５】
外傷。全血の急性損失は、皮膚や腸などの優先度の低い臓器からの血液の運び出しを短絡したままで、血液の失われた容量を置換するために、間質腔と細胞内腔からの体液の移動をもたらす可能性がある。臓器からの血液の運び出しを短絡することは、これらの臓器内のＯ２レベルを還元および時には排除して進行性組織死をもたらす。第一の目標は、影響を受けた組織を酸素化することである。この外傷は入院前の設定、または外傷性出血性ショック、もしくは外傷性脳損傷である可能性がある。
【００７６】
虚血。この抱合体および組成物は、酸素、ＣＯおよび／またはＮＯを、赤血球または他の多くの酸素治療薬が浸透できない領域へ送達するために使用することができる。これらの領域は、赤血球の流れに対して障害物の下流に位置している血栓、鎌状赤血球閉塞、動脈閉塞、血管形成術用バルーン、外科用器具などの下流域などのいかなる組織領域、および酸素飢餓に苦しんでいるまたは低酸素のすべての組織の下流域なども含むことができる。組織虚血のすべての種類、例えば、脳卒中、新興脳卒中、一過性脳虚血発作、気絶心筋および冬眠、急性または不安定狭心症、新興狭心症、心筋梗塞、および同類のものなどは治療することができる。特に、虚血を生じる状態には、急性心不全、心原性ショック、心筋梗塞／心筋虚血、脳卒中、肺塞栓症、非外傷性出血性ショック、または脳血管外傷が含まれる。
【００７７】
血液希釈。この妥当性において、除去された自己血のＯ２レベルを置換するために、治療薬が投与される。これは、手術中および手術後の必要な輸血のために除去された自己血の使用を可能にする。そのような手術前の血液除去を必要とする１つの外科手術は心肺バイパス術になる。
【００７８】
敗血症／敗血症性ショック。敗血症では、一部の患者は、大量の輸液療法や血管収縮剤での治療にもかかわらず高血圧になることがある。この場合には、一酸化窒素（ＮＯ）の過剰液産生産の結果、血圧の低下が生じる。従って、ヘモグロビンが高親和性でＮＯと結合するので、ヘモグロビンはこれらの患者の治療のための望ましい薬剤である。
【００７９】
低酸素血症。患者が肺炎または膵炎のいずれかによって引き起こされた急性肺損傷を有する場合、低酸素血症が観察され、影響を受けた組織を酸素化するために、本発明のヘモグロビンまたは組成物を与えることによって和らげることができる。
【００８０】
癌。固形腫瘍塊の低酸素内核へのＯ２の送達は、放射線療法と化学療法への感受性を高める。腫瘍の微小血管系が他の組織のものとは違っているので、Ｏ２レベルを介しての感作は、Ｏ２を低酸素内核内で無負荷にすることを必要とする。言い方を換えれば、Ｐ５０は、その後の放射線および化学療法治療に対し、腫瘍の最適な感作を保証する、Ｏ２の初期無負荷を防ぐ、Ｏ２レベルを増加させるために非常に低くなければならない。
【００８１】
手術。本発明のヘモグロビンおよび組成物は、様々な外科的処置中に使用することができる。例えばそれらは、血管形成術の補助、胸部大動脈修復、心肺バイパス手術中、または心肺充填液として使用することができる。
【００８２】
臓器灌流。臓器が生体外で、または臓器提供受容者で維持されている時間の間にＯ２含有量を維持することは、構造的および細胞の完全性を保存することに役立ち、梗塞形成を最小限に抑えることができる。ヘモグロビンおよび組成物は、そのような臓器のための酸素要求を持続することができる。
【００８３】
そのヘモグロビンおよびその組成物はまた、家畜動物（例えば、家畜およびイヌ、ネコ、ウマ、鳥、爬虫類などのペット動物）などの非人間で使用することができる。本発明は、負傷、溶血性貧血症などのために、血液の損失に苦しんでいる家畜および野生動物の緊急治療で有用性を見出すことを意図している。家畜への使用は、負傷、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染症、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進症および脾腫、家禽における出血性症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、等免疫性溶血性貧血、微小血管症性溶血性貧血、寄生虫症、または外科麻酔誘発性脳損傷による失血の治療を含む。
【００８４】
定義
特に断りのない限り、この開示で「１つの」、「ａ」または「ａｎ」という用語が使用されている場合、それらは「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００８５】
「活性化ポリアルキレンオキシド」または「活性化ＰＡＯ」は、本明細書で使用される少なくとも１つの官能基を持つＰＡＯ分子を指す。官能基は、分子上でＰＡＯと抱合される遊離アミン、スルフヒドリル、またはカルボキシル基と相互作用する反応性部分である。例えば、遊離スルフヒドリル基と反応する１つのそのような官能基がマレイミド基である。遊離アミンと反応する官能基はスクシンイミド基である。
【００８６】
「デオキシヘモグロビン」または「非リガンド化ヘモグロビン」は、どの外因性リガンドもヘムに結合されていないすべてのヘモグロビンを意味する。
【００８７】
「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」は、一般的に酸素を運ぶヘムタンパク質のことを意味する。ヒトでは、Ｈｂの各分子は、四量体構造に配置されている４個のサブユニット、２個のα鎖サブユニット、および２個のβ鎖サブユニットを有している。各サブユニットはまた、第一鉄（Ｆｅ２＋）の中でＯ２、ＮＯまたはＣＯを結合する鉄含有中心である１個のヘム基を含む。よって、それぞれのＨｂ分子は最大４個のリガンド分子まで結合することができ、ＨｂＯ２、ＨｂＮＯ、またはＨｂＣＯそれぞれを化合物に対して結合基化させる。さらにヘモグロビンは、Ｏ２、ＮＯとＣＯの混合物とリガンド結合する可能性がある。
【００８８】
「ヘモグロビンをベースとした酸素運搬体」（ＨＢＯＣ等）とは酸素を運ぶヘモグロビンを指すが、また、一酸化炭素や一酸化窒素などの他の分子ガスを運ぶためにも有用である。
【００８９】
「高酸素親和性」とは、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）のものよりも大きい酸素親和性を示すように改質されたヘモグロビンのことを指す。したがって、「高酸素親和性」Ｈｂは、３７℃およびｐＨ７．４で測定した１５ｍｍＨｇのＰ５０を持つＳＦＨのものより少ないＰ５０を有している。
【００９０】
「リガンド結合ヘモグロビン」とは、外因性リガンドがヘムに化学結合したヘモグロビンのことを意味する。一般的な好ましいリガンドは、酸素、一酸化炭素、および一酸化窒素を含む。
【００９１】
「マルＰＥＧ」とは、マレイミジルポリエチレングリコールのことを指し、リンカーを介してポリエチレングリコールに付着した、マレイミジル部分を含む。
【００９２】
「マルＰＥＧ−Ｈｂ」とは、マレイミジル活性化ＰＥＧが抱合されているＨｂのことを指す。この抱合は、Ｈｂ上でマルＰＥＧを形成するために、マルＰＥＧ−Ｈｂをチオール基（およびより少ない程度のアミノ基）と反応させることにより行われる。チオール基はβＣｙｓ９３での２つの内因性チオールのように、ヘモグロビンのアミノ酸配列中に存在するシステイン残基の中に見出され、チオール基を含有するために、表面アミノ基を改質することによって導入することができる。ＭＰ４（Ｓａｎｇａｒｔ社）として知られている典型的なマルＰＥＧ−Ｈｂは次式を有す：
【化２】
2019089789.tif 000006
式中のＨｂはヘモグロビンである；Ｓはヘモグロビン上のチオール基であり、ｎは５，０００ダルトンのポリアルキレンオキシドポリマーのオキシエチレン単位の数であり、ｍはヘモグロビンに抱合したマレイミジル活性ポリアルキレンオキシドポリマーの平均数であり、それは７から８である。
【００９３】
「メトヘモグロビン」または「メトＨｂ」とは、第二鉄の状態で鉄を含有するＨｂの酸化形態のことを指す。メトＨｂは酸素またはＣＯ担体として機能しない。本明細書で使用する用語「メトヘモグロビン％」は、総ヘモグロビンに対する酸化されたＨｂの割合を指す。
【００９４】
「メトキシ−ＰＥＧ」または「ＭＰＥＧ−ＯＨ」とは、水酸基末端の水素がメチル（−ＣＨ３）基で置換されていることを指す。
【００９５】
「修飾ヘモグロビン」または「修飾Ｈｂ」とは、Ｈｂがもはやその「天然の」状態ではない、分子内および分子間架橋、重合、抱合、および／または組換技術などの化学反応によって改質されたヘモグロビンのことを指す。本明細書で使用する場合、用語「ヘモグロビン」または「Ｈｂ」とは、特に明記しない限り、天然の非改質Ｈｂおよび改質されたＨｂの両方のことを指す。「亜硝酸還元酵素活性」または「ＮＲＡ」とは、亜硝酸塩を一酸化窒素へ還元するヘモグロビン、またはヘモグロビンをベースとしたタンパク質の能力のことである。「最大亜硝酸還元酵素活性」とは、ヘモグロビン、またはヘモグロビンをベースとしたタンパク質が、亜硝酸塩を一酸化窒素へ還元することができる最大率のことである。「初期の亜硝酸還元酵素活性」とは、完全に脱酸素化されたタンパク質に酸化窒素が添加された時に、ヘモグロビンまたはヘモグロビンをベースとしたタンパク質が、亜硝酸塩を酸化窒素へ還元させる初期速度のことである。
【００９６】
用語「非酸素化」は、ヘムタンパク質またはヘモグロビンが、非リガンド化されて、脱酸素化状態にあるか、またはＮＯもしくはＣＯなどのＯ２以外のガスとリガンド結合していることを意味する。
【００９７】
「酸素親和性」とは、Ｈｂなどの酸素担体が分子状酸素と化学結合することを指す。この特性は、Ｈｂ分子の飽和度を酸素（Ｙ軸）と酸素分圧（Ｘ軸）とで関連付けした酸素平衡曲線によって定義される。この曲線の位置は、酸素担体が酸素で半飽和され、酸素親和性に逆関連している地点における酸素の分圧である「Ｐ５０」の値で示されている。故に、Ｐ５０が低くなるほど、酸素親和性が高くなる。全血（および、赤血球とＨｂのような全血の成分）の酸素親和性は、この技術分野で既知の種々の方法によって測定することができる。（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：２３３１−３７を参照のこと）。酸素親和性はまた、市販のＨＥＭＯＸ（商標）分析器（ペンシルベニア州ニューホープ、ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて測定することができる。（例えば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ  ａｎｄ  Ｓｈｒａｇｅｒ  ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ｅｖｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）２３２：４６０（１９９４））；および（Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６（１）：１０７−１１６（１９９８））を参照のこと）。
【００９８】
本明細書で使用する用語「酸素治療剤」は、それを必要とする細胞／組織／器官に化学結合し、酸素分子を運ぶことができるヘムタンパク質のことを指す。ＣＯ−またはＮＯ−リガンド結合ヘムタンパク質の形態で投与される場合は、ＣＯまたはＮＯがヘム基部分から放出されると、ヘム基はその後分子状酸素に結合し、それを運ぶことが自由である。
【００９９】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、「ｎ」が４と等しいかそれ以上、好ましくは約４５から約５００まで、より好ましくは約７０から約２５０まで、そして最も好ましくは約９０から約１４０までか約１１５までである場合に、一般化学式Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨの重合体のことを指す。この重合体は置換または非置換することができ、また末端ヒドロキシル基は、メトキシ基またはカルボキシなどの異なる従来の末端基と置換することができる。ＰＥＧ等は多くの供給源から市販されている（例えば、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州ミッドランド）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（登録商標）（Ａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、コネチカット州ノーウォーク）、およびソルベース）。
【０１００】
「ポリエチレングリコール抱合ヘモグロビン」、「ＰＥＧ−Ｈｂ抱合体」または「ＰＥＧ−Ｈｂ」とは、少なくとも１つのＰＥＧが共有結合しているＨｂのことを指す。
【０１０１】
「溶液」とは液体混合物し、用語「水溶液」とは、いくらかの水を含有し、また、多成分溶液を形成するために水を持つ１つ以上の他の液体物質も含むことができる溶液のことを指す。
【０１０２】
「ストローマフリーヘモグロビン」または「ＳＦＨ」とは、赤血球の細胞膜が除去されたＨｂのことを指す。
【０１０３】
「表面改質ヘモグロビン」とは、デキストランまたはポリアルキレンオキシドのような化学基、通常はポリマー、が付着されているヘモグロビンのことを指す。用語「表面改質酸素化ヘモグロビン」とは、表面改質された時に「Ｒ」状態にあるＨｂのことを指す。
【０１０４】
「ターミナル活性」とは、ヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応性基と反応することができる部分と官能化されるＰＡＯの割合のことを示す。「１００％末端活性」とは、抱合反応に使用されるＰＡＯのモル過剰は、ＰＡＯのすべてがヘムタンパク質またはヘモグロビンの反応性基と反応可能な部分を持つことに基づいて発現されることを示す。例えば、利用可能なマルＰＥＧが、ＰＥＧ等の８０％がモルと官能化される、また、このマルＰＥＧがヘモグロビンを２０倍超えるモル過剰で使用される場合、このモル比は８０％末端活性を有している場合、１００％端末活性に基づいて、ヘモグロビンより１６倍モル過剰のマルＰＥＧとして発現することができる。
【０１０５】
「チオール化」とは、分子上のスルフヒドリル基の数を増加させるプロセスのことを指す。例えば、２−イミノチオラン（「２−ＩＴ」）を持つタンパク質を反応させると、タンパク質の表面上の遊離アミンをスルフヒドリル基へ変換する。これらのスルフヒドリル基はその後、マレイミドなどのチオール反応性部分との反応のために利用される。
【０１０６】
「非リガンド化ヘモグロビン」とは、酸素、一酸化炭素、または一酸化窒素などの分子ガスにリガンド結合していない、少なくとも１つの部分を含有する、すべてのヘモグロビンのことを指す。このように、ヘモグロビンはヘム部分の１つだけが分子ガスとリガンド結合していない場合、「非リガンド化されている」と考えられる。
【０１０７】
この明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれのそのような刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に示されたことを参照することにより本明細書に組み込まれるかのように、本明細書に具体的に参照される主題のために参照することにより本明細書に組みこまれる。
【０１０８】
本発明を詳細に説明したが、修正および変更は、添付の特許請求に規定された本発明の範囲から逸脱することなく可能であることは明らかであろう。
【実施例】
【０１０９】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供する。
【０１１０】
実施例１：ＰＥＧ化ββ−ＤＢＢＦ架橋ヘモグロビン抱合体の調整
包装された赤血球（「ＲＢＣ等」）は、地方の血液銀行、ニューヨーク血液センター、または米国赤十字社などの商業的供給源で製造されている。材料は採取時から４５日を超えずに入手される。すべてのユニットは使用前に、ウイルス感染のためにスクリーニングされ、核酸検査に供される。白血球が除去されていないプールされたユニットは、白血球を除去するための膜濾過により無白血球化される。包装済ＲＢＣ等を滅菌容器にプールし、さらなる処理まで２〜１５℃で保存する。容積を記録し、市販の共酸素濃度計、または他の当該分野で認められた方法を用いてＨｂ濃度を測定する。
【０１１１】
細胞溶解に続いて塩の濃度を減少させることによって、０．４５μｍ接線流濾過器を使用して、０．９％塩化ナトリウムの６倍の容積でＲＢＣ等を洗浄する。Ｈｂの抽出は同じ膜を用いて行う。血漿成分の除去を確認するために、アルブミン用分光学的定量法によって細胞洗浄を分析する。溶解物は、Ｈｂを精製する冷所で０．１６μｍ膜を通して処理する。精製されたＨｂは、滅菌脱パイロジェン内で回収し、それからウイルスを除去するために限外濾過する。ウイルスをさらに削減するために、溶媒／界面活性剤処理、ナノ濾過、およびアニオンＱ膜精製などの追加の段階を行ってもよい。このプロセスのすべての段階は２〜１５℃で行う。
【０１１２】
溶解物からのＨｂは、３０ｋＤの膜を用いて、乳酸リンゲル液（「ＲＬ」）、またはリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」、ｐＨ７．４）の中で交換する。Ｈｂは１．１〜１．５ｍＭまで濃縮する（四量体で）。溶媒交換のために、ＲＬまたはＰＢＳの１０から１２倍の容量を使用する。このプロセスは２〜１５℃で行う。ＲＬまたはＰＢＳの中で調製した溶液のｐＨは、チオール化前に８．０に調製する。Ｈｂは０．４５または０．２μｍ使い捨てフィルターカプセルを通して滅菌濾過し、化学的改質反応を行う前に４±２℃で保存する。
【０１１３】
架橋：ββ−ＤＢＢＦ架橋Ｈｂは、前述のＷａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９；１８（２０）：４２６５−７０に記載された、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレート（ＤＢＢＦ）を持つ、包装済み赤血球から調製された、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）との反応により調製した。ホウ酸塩緩衝液中の酸素化ＳＦＨ（ｐＨ約８．５）をＤＢＢＦの２倍モル過剰と約２〜８℃で約１６時間反応させた。
【０１１４】
チオール化：上記のように調製したＳＦＨを使用して、Ｈｂより２−イミノチオラン（２−ＩＴ）の１５倍モル過剰を用いてチオール化を行った。比率および反応時間は、ＰＥＧ抱合のためのチオール基の数を最大にし、製品の不均一性を最小にするように最適化した。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳまたはすべての同様の緩衝液の中の約１ｍＭのＨｂ（四量体）を、同じ緩衝液の中で１５ｍＭの２−ＩＴと結合させた。この混合物を連続的に１０±５℃で約６時間撹拌した。
【０１１５】
ジチオピリジン比色分析（Ａｍｐｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９６９，３２：１６３−１６９）を使って、チオール化の前後、さらに再度ＨｂのＰＥＧ抱合後に、Ｈｂ四量体の表面上の利用可能なチオール基の数を測定した。ヒトのＨｂはジチオピリジン反応によって確認したβ９３システイン残基で、２つの内因性反応性チオール基を含む。ＳＦＨを１対８より大きい割合でチオール化した後に（ＳＦＨ：２−ＩＴ）、反応性チオール基の数は２つのチオールから７つ以上に増加した。
【０１１６】
ＰＥＧ抱合化：１００％の末端活動に基づいた、出発四量体Ｈｂ濃度よりマルＰＥＧの２８倍モル過剰を使用して、マルＰＥＧをチオール化されたββ−ＤＢＢＦ架橋Ｈｂに結合させた。Ｈｂは酸素化するために、まず大気と平衡化させた。ＲＬ（ｐＨ７．０〜８．５）、ＰＢＳ、またはすべての同様の緩衝液の中の約１ｍＭのチオール化されたＨｂを、同じ緩衝液の中で２８ｍＭのマルＰＥＧと結合した。この混合物を連続的に１０±５℃で約６時間撹拌した。
【０１１７】
生じたＰＥＧ−Ｈｂの抱合体は、未反応試薬を除去するために、７０ｋＤの膜（すなわち、０より大きい容量の濾過）を通して処理した。このプロセスは、５４０ｎｍおよび２１７ｎｍでのサイズ排除液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）でモニターした。濃度は４．４ｇ／ｄｌのＨｂに調整し、ｐＨは６．０〜７．８に調整した。
【０１１８】
ＰＥＧ−Ｈｂ抱合体は、０．２μｍ無菌使い捨てカプセルを用いて滅菌濾過し、４±２℃で滅菌脱パイロジェン化容器に集めた。ＰＥＧ−Ｈｂ抱合体を４．４ｇ／ｄｌのＲＬに希釈し、ｐＨを７．４±０．２に調整し、その後、滅菌濾過（０．２μｍ）し、エンドトキシンを含まない滅菌容器の中に等分した。
【０１１９】
最後のＰＥＧββ−ＤＢＢＦ架橋ヘモグロビン抱合体（「ＰＥＧ−ββ−Ｈｂ」）は、表３に示す特性を有していた：
【０１２０】
【表３】
2019089789.tif 000007
【０１２１】
ＰＥＧ−ββ−Ｈｂの構造はさらに標準的な方法論を介して確認された。サイズ排除クロマトグラフィーでＤＢＢＦ架橋の存在を確認した（図１および２）。逆相高速液体クロマトグラフィーで、ヘモグロビンのβグロビンサブユニットのＤＢＢＦ架橋の存在を確認した（図３）。ββ−ＤＢＢＦＨｂのＰＥＧ化は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて確認した（図４）。
【０１２２】
実施例２：ＰＥＧ−ββ−Ｈｂが示す強化亜硝酸還元酵素活性
比較のため、実施例１の脱酸素ＰＥＧ化ββ−ＤＢＢＦ架橋ヘモグロビン、および他のヘモグロビン種を、亜ジチオン酸ナトリウムの存在下で、密封キュベット中で亜硝酸ナトリウムと嫌気的に反応させた。亜硝酸塩の１０倍過剰液をヘム上で使用し、反応を分光光度法でモニターした。その結果のスペクトルデータは、デオキシヘモグロビン、鉄ニトロシルヘモグロビン、およびメトヘモグロビンの親スペクトルを用いて解析した。速度は、デオキシヘモグロビンの消失の誘導体として描画し、最大速度は比較目的のために使用した。
【０１２３】
ＳＦＨおよびＰＥＧ化ββ−ＤＢＢＦ架橋ヘモグロビンは、亜硝酸を０．０２１５μＭ／ｓおよび０．４６２μＭ／ｓそれぞれの最大速度でＮＯへ還元したところ、ＳＦＨと比較して、ＰＥＧ化ββ−ＤＢＢＦ架橋ヘモグロビンの２１倍大きい最大速度を示した。
【０１２４】
図５を参照すると、Ｐ５０を減少させるために、Ｈｂβ９３Ｃｙｓ残基で反応するマレイミド抱合体化非架橋ヘモグロビンなどの、改質されたＨｂのいくつかの種類の亜硝酸還元酵素活性が測定された。マレイミド試験されたものは、小分子、Ｎ−エチルマレイミド（ΝΕΜ）、およびＭＰ４（Ｓａｎｇａｒｔ社）だけでなく、表４で指定された他のヘモグロビンを含む。
【０１２５】
【表４】
2019089789.tif 000008
【０１２６】
αまたはβサブユニット間架橋Ｈｂ等はさまざまなＰ５０を示す。Ｐ５０の値は３ｍｍＨｇ（ＰＥＧ−ββ−Ｈｂの場合）から３３ｍｍＨｇ（αα架橋Ｈｂの場合）にまで及んだ。Ｐ５０と亜硝酸還元酵素活性との間に直接的相関関係があることが観察された。高酸素親和性を持つＨｂ等（低Ｐ５０）は、低親和性Ｈｂ等より速い速度で、亜硝酸塩をＮＯへ還元した。亜硝酸塩１０倍過剰液では、亜硝酸還元の最大速度は、０．４６μＭ／ｓ（ＰＥＧ−ββ−Ｈｂの場合）から０．０１５μＭ／ｓ（αα架橋Ｈｂの場合）にまで及んだ。この反応で生み出されたＮＯは、ヘムキャプチャーから漏れ出てＨｂから放出され、そのＮＯ放出速度は亜硝酸還元酵素活性と関連する。これらの結果を一緒にすると、酸素親和性はヘモグロビンリガンドの送達の強化だけでなく、亜硝酸還元酵素活性を最大化するためにも、無細胞Ｈｂの構造において重要であることを示唆している。
【０１２７】
本発明の要素またはその好適実施形態（等）を紹介するにあたり、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記」は、１つ以上の要素が存在することを意味することを意図している。「有する」、「含む」、「持つ」という用語は包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することを意図している。
【０１２８】
上記の観点から、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が得られることが分かるであろう。
【０１２９】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の組成物および方法において、様々な変更がなされ得るので、上記の説明に含まれる、および添付の図面に示されているすべての事項は例示として解釈されるべきで、限定的意味として解釈されるべきではないことを意図している。
【図１】
2019089789.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月17日(2019.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３７℃およびｐＨ７．４で測定される、２〜５ｍｍＨｇの範囲のＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ポリエチレンオキシドヘモグロビン四量体抱合体であって、前記ヘモグロビン四量体抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示し、前記ヘモグロビン四量体抱合体は、式
【化１】
2019089789.tif 000015
［式中、Ｈｂがヘモグロビン四量体であり、
Ｓがヘモグロビン四量体のチオールであり、
Ｒ３がアルキレンまたはフェニレン基であり、
Ｘがヒドロキシ、アリールオキシまたはＣ１−Ｃ２０アルコキシであり、
ｍが７から１１であり、前記ヘモグロビン四量体が酸素化状態にある間、前記ヘモグロビン四量体のチオール基に抱合されるマレイミド−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基の数を示し、
ｎが２，０００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレン単位の数である］を有し、
前記ヘモグロビンが、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレートによって前記ヘモグロビン四量体分子の２つのβ８２リジン残基で架橋される、ヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項２】
前記ヘモグロビン四量体抱合体の最大亜硝酸還元酵素活性が２５℃で完全に脱酸素化されたときに少なくとも０．２５μＭ／秒の最大亜硝酸還元酵素活性を有する、請求項１に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項３】
前記最大亜硝酸還元酵素活性が、０．２５〜０．５０μＭ／秒にわたる、請求項２に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項４】
膠質浸透圧が少なくとも７５ｍｍＨｇであり、前記Ｐ５０が２〜４ｍｍＨｇである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項５】
前記Ｒ３がエチレンである、請求項１に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項６】
前記マレイミド−ＰＥＧが、前記ヘモグロビン四量体のシステイン残基の内因性のチオール部分、前記ヘモグロビン四量体のチオール化リジン残基のチオール部分、またはそれらの組み合わせから選択された前記ヘモグロビン四量体のチオール部分に抱合される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項７】
Ｒ３がエチレンであり、Ｘがメトキシであり、ｎが３，０００〜１０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレン単位の数である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項８】
ｍが９〜１０である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項９】
前記Ｐ５０が２〜４ｍｍＨｇである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項１０】
前記Ｐ５０が２．６ｍｍＨｇである、請求項９に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項１１】
前記ＰＥＧが４，０００〜６，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項１２】
前記ＰＥＧが５，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１１に記載のヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項１３】
３７℃およびｐＨ７．４で測定される、２．６ｍｍＨｇのＰ５０を有するβ，β−分子内架橋ポリエチレンオキシドヘモグロビン四量体抱合体であって、前記ヘモグロビン四量体抱合体は、２５℃で完全に脱酸素化されたときに、同じ条件下で測定されたときの脱酸素化されたストローマフリーヘモグロビンのものよりも少なくとも１０倍大きい最大亜硝酸還元酵素活性を示し、前記ヘモグロビン四量体抱合体は、式
【化２】
2019089789.tif 000016
［式中、Ｈｂがヘモグロビン四量体であり、
Ｓがヘモグロビン四量体のチオールであり、
Ｒ３がエチレン基であり、
Ｘがメトキシであり、
ｍが９から１０であり、前記ヘモグロビン四量体のチオール基に抱合されるマレイミド−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基の数を示し、
ｎが５，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧのオキシエチレン単位の数である］を有し、
前記ヘモグロビンが、ビス（３，５−ジブロモサリチル）フマレートによって前記ヘモグロビン四量体分子の２つのβ８２リジン残基で架橋される、ヘモグロビン四量体抱合体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヘモグロビン四量体抱合体および薬学的に許容な担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
急性肝不全、ベータ地中海貧血症、やけど、慢性重症下肢虚血、二酸化炭素またはシアン化物中毒、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、酸欠、マラリア、器官虚血、末梢血管疾患、ポルフィリン症、妊娠中の子癇前症、敗血症、鎌状赤血球貧血、網膜疾患、眼内状態、睾丸捻転、外傷、ショック、外傷性脳損傷、潰瘍、血管痙攣、またはそれらの組み合わせの治療に使用するための；
非外傷性出血ショック、入院前設定外傷、外傷性出血性ショック、急性肺損傷、成人呼吸窮迫症候群、外傷性脳損傷、脳卒中、固形腫瘍癌、器官劣化（生体外）、器官劣化（受容者における）、重篤な敗血症、敗血症性ショック、心筋梗塞、心虚血、心臓性ショック、急性心不全、肺塞栓またはそれら組み合わせの治療に使用するための；
血管形成術の補助的手段として、形成手術のための補助的手段として、または心室補助装置を移植するにおける補助的手段として；代用血液、心臓保護剤、凍結保存剤、血液透析補助的手段、腫瘍剤、器官保存剤、機能強化剤、手術補助剤または創傷治癒剤として；画像診断において；肺機能を改善するため；またはそれらの組み合わせに使用するための；または
損傷による失血、溶血性貧血、感染性貧血、細菌感染症、第ＩＶ因子断片化、脾機能亢進症および脾腫、家禽における出血症候群、形成不全性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、等免疫性溶血性貧血、細血管障害性溶血性貧血、寄生虫症、または外科的麻酔によって誘発された脳外傷の獣医学治療のための、
請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
器官虚血が、急性腸虚血（捻転）、急性腸虚血（塞栓）、心臓性ショック、急性脈管器官虚血、脳卒中、心筋梗塞、または重篤な心虚血を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。