(57)【要約】      （修正有）【課題】酸素運搬ナノ粒子、ナノ粒子作製方法及び血中での酸素運搬での使用方法の提供。【解決手段】両凹型円板形状を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層状シェル及びペイロードを含み、前記二層状シェルは、親水性外層、親水性内層、及び前記層間に疎水性領域を有し、前記両親媒性ポリマーは、脂質に結合するアミン含有分岐ポリマーを含み、前記ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む、前記ナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に両凹型円板形状を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層状シェル及びペイロードを含み、
前記二層状シェルは、親水性外層、親水性内層、及び前記層間に疎水性領域を有し、
前記両親媒性ポリマーは、脂質に結合するアミン含有分岐ポリマーを含み、
前記ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記シェルの前記親水性外層を含む前記両親媒性ポリマーは、前記粒子が、約−１５ｍＶ〜約＋１５ｍＶのゼータ電位を有するように、ポリエチレングリコールから誘導体化される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の前記平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであって、前記ナノ粒子の前記平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記酸素運搬剤は、合成ヘモグロビンまたは天然ヘモグロビンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記アロステリック調節因子−は、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、及び２−［４−［［（３，５−ジメチルアニリノカルボニル］メチル］−フェノキシ］−２−メチルプロピオン酸からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記還元剤は、ロイコメチレンブルー、グルタチオン及びアスコルビン酸塩からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、約３０００〜約１０，０００のヘモグロビン分子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンまたは約３０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記ナノ粒子は、実質的に、一酸化窒素を隔離することはない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中のヘモグロビン全濃度の約１０％以下まで酸化を制限する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記分岐アミン含有ポリマーはポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマー及びグラフト重合ポリマーからなる群から選択さる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記脂質は脂肪酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
前記脂肪酸は、１０，１２−ペンタコサジイン酸、ヘキサデシルオクタデカン酸、コラン酸、リノール酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸及びパルミチン酸からなる群から選択される、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
ナノ粒子の調製方法であって、前記ナノ粒子は、実質的に両凹型円板状を有し、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマーを含む二層状シェル並びに酸素運搬剤、前記アロステリック調節因子及び前記還元剤を含むペイロードを含有し、前記工程は、
（ａ）脂質を分岐ポリマーの前記遊離反応性基の少なくとも２５％に共有結合より共役することによって、前記分岐ポリマーを疎水的修飾し、両親媒性ポリマーを形成すること；
（ｂ）前記両親媒性ポリマーを非極性溶媒と混合すること、及び前記混合物を攪拌して、前記両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成すること；
（ｃ）前記ペイロードを極性溶媒と混合すること、及び前記ペイロード混合物を（ｂ）の前記混合物に添加して、二相混合物を形成すること、及び前記二相混合物を攪拌し、前記ペイロードを前記反転ミセルに移行すること；
（ｄ）熱及び水性溶媒の存在下において前記ペイロード含有前記反転ミセルを攪拌して、前記ペイロード含有前記両凹型円板状ナノ粒子を形成すること；を含む前記方法。
【請求項１６】
前記ペイロードは、前記ナノ粒子の前記内部に含有される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、血液代用組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、溶液または凍結乾燥粉末である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の有効量のナノ粒子を前記対象に投与することを含む、対象者の血液の前記酸素運搬能力を補充する方法。
【請求項２０】
ナノ粒子の対象への投与方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子含有溶液を輸注することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、酸素運搬組成物を含むナノ粒子、ナノ粒子作製方法及び血液中で酸素を運搬するためのナノ粒子使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血は、血液の不足成分に取って代わるために、医学的状態及び緊急事態において使用される救命手段である。米国赤十字社によれば、米国では、二秒ごとに血液が必要とされ、毎日、４万４千を超える献血が必要とされている。米国では、毎年、合計３千万の血液構成成分の輸血が行われている。自動車事故による犠牲者一人に対して、１００パイントほどの血液が必要とされ得る。加えて、鎌状赤血球貧血及び癌などの疾患を有する患者は、米国では、何百万もの人に影響を及ぼし、これらの疾患を有する患者は、生涯の間に、頻繁に輸血を必要とする可能性がある。主に世界中での血液不足、献血の感染、血液型判定の必要性、保存血液の貯蔵期限が短いほか、戦場など、特定の状況において使用する場合の不適切な血液保存及び外傷などにより、科学者は、血液代用製剤の合成及び試験を行っている。再建量のみ必要とされる場合、非血液増量剤は広く入手可能であるが、現在まで、十分に受入れられている酸素運搬血液代用剤は存在していない。ペルフルオロカーボン系酸素運搬製剤は、溶存酸素に依存し、赤血球よりも３倍以上、酸素に溶解し、貯蔵寿命も長い。しかし、ＰＦＣ系製剤は、酸素送達の機能性が不十分であり、循環中の半減期が短く、ＰＦＣ系製剤中でのプルロニック界面活性剤による補体活性化、凝固点温度での冷蔵を必要とすることから、奏功しなかった。他方では、現在利用可能なヘモグロビン系酸素担体（ＨＢＯＣ）は、循環中、機能性が短く、酸素捕捉及び放出動態が少なく、また、乾式貯蔵に不適合であり、遠隔領域におけるこれらの使用が制限される。加えて、ヘモグロビン系酸素担体については、安全でないこと、一酸化窒素（ＮＯ）除去に関連して、血行力学的摂動及び胃腸機能の摂動を引き起こすこと、遊離基誘導、肝酵素値の上昇及び血小板の凝集などの生化学的及び血液学的パラメーターが変化することが判明している。
【０００３】
したがって、血管径の正常な調節に干渉しない適切な酸素捕捉動態及び酸素放出動態を有する安全かつ効率的な酸素運搬血液代用剤が必要とされ、これにより、循環中、酸素運搬機能を維持することができ、長期保管及び使用容易性が可能になる。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、一態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。両親媒性ポリマーは、脂質に共役結合する分岐ポリマーを含み得る。両親媒性含有ポリマーシェル外層の表面は、ポリエチレングリコールにより誘導体化されていてもよい。ナノ粒子の平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。両親媒性ポリマーは、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸にポリエチレンイミン共役結合する分岐ポリマーを含んでいてもよい。また、両親媒性ポリマーは、パルミチン酸に共役結合するポリエチレンイミンを含んでいてもよい。酸素運搬剤は、ヘモグロビンであってもよい。アロステリック調節因子は、２，３−ＤＰＧであってもよい。還元剤は、ロイコメチレンブルーであってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含んでもよい。ナノ粒子は、凍結乾燥することができてもよく、また、長期間、周囲条件にて保存され得る。凍結乾燥ナノ粒子は、投与前に、種々の濃度で水性緩衝液中において再構成されてもよい。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【０００５】
別の態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子の調製方法を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。この方法は、脂質をポリマーの遊離反応基に共有結合によって連結することによって、分岐ポリマーに疎水的修飾を行い、両親媒性ポリマーを形成することを含む。次に、両親媒性ポリマーは、非極性溶媒と混合させる。混合物は、攪拌して、両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成する。次に、反転ミセルを熱及び水性溶媒の存在下で攪拌し、両凹型円板状のナノ粒子を形成する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に添加し、その混合物を攪拌して、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に負荷する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の水性内側コア部内に含有されていてもよい。
【０００６】
別の態様では、本発明は、酸素運搬ナノ粒子の調製方法を提供する。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。この方法は、脂質をポリマーの遊離反応基に共有結合によって連結することによって、分岐ポリマーに疎水的修飾を行い、両親媒性ポリマーを形成することを含む。次に、両親媒性ポリマーは、非極性溶媒と混合させる。混合物は、攪拌して、両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成させる。次に、反転ミセルを熱及び水性溶媒の存在下で攪拌し、両凹型円板状のナノ粒子を形成させる。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に添加し、その混合物を攪拌して、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤をナノ粒子に負荷する。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の水性内側コア部内に含有されていてもよい。
【０００７】
更に別の態様では、本開示は、血液代用組成物を提供する。本組成物は、酸素運搬ナノ粒子を含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。血液代用組成物は、約４ｘ１０１２〜約４ｘ１０１３ナノ粒子／ｍｌを含んでもよい。血液代用剤は、患者の循環血液量の状態に合わせて調整する方法で再構成させ得る。血液代用剤は、正常血液量対象（例えば、貧血症を伴う対象）に投与されるより高濃度の方法で、または血液量減少患者（例えば、出血を伴う対象）に投与するために更に希釈する方法で構成されていてもよい。
【０００８】
別の態様では、本開示は、対象の血液の酸素運搬能力を補充する方法を提供する。本方法は、対象に有効量の酸素運搬ナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。症候性貧血または出血を伴う対象に投与するとき、投与されたナノ粒子は、肺からの潅流中、Ｏ２を捕捉し、その後、全身潅流中にＯ２を組織に送達させる。以下の主要なナノ粒子デザイン特性により、ナノ粒子による組織へのＯ２の送達が可能になる：（１）ナノ粒子シェルにより、酸素運搬剤（例えば、ヘモグロビン、改質ヘモグロビン、レグヘモグロビン、ヘミンまたはその他）による一酸化窒素の捕獲が阻止され、通常、Ｏ２の送達が不足している領域まで、血流が経由する内因性シグナル伝達が可能になる。（２）ナノ粒子ペイロードは、ヘテロトロピックアロステリック調節因子分子（例えば、２，３−ＤＰＧまたはその他）を含有し、肺潅流中、アロステリック調節因子は内側シェルに隔離され（高ｐＨにて。それによって酸素運搬剤のＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、アロステリック調節因子酸素運搬剤は、内側シェルから放出される（低ｐＨにて。それによって酸素運搬剤のＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、酸素運搬剤のＯ２親和性が変化し；粒子コア中におけるアロステリック調節因子の遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節される。生理学的必要性の設定［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。（３）ナノ粒子ペイロードは、酸化した酸素運搬剤を再循環させる還元剤（例えば、ロイコメチレンブルー、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｉｎｅ）、アスコルビン酸塩またはその他）を含有し、効果的にナノ粒子の循環時間を延長させる。それによって、ナノ粒子は、正常／異常な生理学（例えば、ヒトにおいて、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体にわたり、潅流中、効率よく、Ｏ２を放出させる。
【０００９】
更なる態様では、本開示は、酸素運搬ナノ粒子の対象への投与方法を提供する。この方法は、酸素運搬ナノ粒子含有溶液を対象に輸注することを含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性コア部及び両親媒性ポリマー含有シェルを含む。ナノ粒子は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤も含む。
【００１０】
別の態様では、本開示は、対象の血液の酸素運搬能力を補充する方法を提供する。本方法は、対象に有効量の酸素運搬ナノ粒子を投与することを含む。ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状を有し、水性内部コア部及び両親媒性ポリマー含有親水性外シェルを含む。また、ナノ粒子は、ヘモグロビンまたは合成ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧ及びロイコメチレンブルーも含む。症候性貧血または出血を伴う対象に投与するとき、投与されたナノ粒子は、肺からの潅流中、Ｏ２を捕捉し、その後、全身潅流中にＯ２を組織に送達させる。以下の主要なナノ粒子デザイン特性により、ナノ粒子による組織へのＯ２の送達が可能になる：（１）ナノ粒子シェルにより、ヘモグロビンまたは合成ヘモグロビンによる一酸化窒素の捕獲が阻止され、通常、Ｏ２の送達が不足している領域まで、血流が経由する内因性シグナル伝達が可能になる。（２）ナノ粒子ペイロードは、２，３−ＤＰＧを含有し、肺潅流中、２，３，−ＤＰＧは内側シェルに隔離され（高ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、２，３−ＤＰＧは、内側シェルから放出される（低ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、ＨｂＯ２親和性が変化し；ナノ粒子コア中での２，３−ＤＰＧの遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節される。生理学的必要性の設定値［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。（３）ナノ粒子ペイロードは、酸化Ｈｂを再利用するロイコメチレンブルーを含有し、ナノ粒子の有効循環時間を延長させる。それによって、ナノ粒子は、正常／異常な生理学（例えば、ヒトにおいて、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体にわたって、潅流中、効率よく、Ｏ２を放出させる。
出願書類には、少なくとも１枚のカラー写真を含む。カラー写真と共に本明細書公報の写しは、必要に応じて、必要な手数料の支払い時に、特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヘモグロビン含有ナノ粒子の調製及び種々の特性を示す図である。（Ａ）ナノ粒子の調製の略図及びナノ粒子の略図である。（Ｂ）ナノ粒子の調製におけるナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｃ）時間の経過に伴う様々な凍結乾燥ナノ粒子径及び非凍結乾燥ナノ粒子径の変動を示すプロットである。（Ｄ）ニッケルグリッド上に堆積させたナノ粒子滴の透過型電子顕微鏡画像である。（Ｅ）Ｄにおけるナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像の方形化部分の拡大図である。（Ｆ）ナノ粒子の原子間力顕微鏡画像である。
【図２】ｐＨ１０（濃青色曲線）、ｐＨ９（緑色の曲線）、ｐＨ８．５（マゼンタ色の曲線）、ｐＨ８（薄青色の曲線）及びｐＨ６（赤色の曲線）にて計測されたナノ粒子の酸素結合−分離曲線を示す図である。（Ａ）ロイコベンジルメチレンブルーで標識した酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｂ）約５日間保管後の（Ａ）の酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｃ）非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。（Ｄ）約５日間保管後の（Ｃ）の非標識酸素運搬ナノ粒子の酸素結合−解離曲線。
【図３】ナノ粒子のレオロジー特性（Ａ）及び薬物動態学特性（Ｂ）示すグラフである。（Ａ）ナノ粒子：少なくとも１０％トルク（ウエルズ−ブルックフィールド・コーン／プレート型粘度計）に相当するデータポイントを使用して、血漿懸濁液対ＮＺＷ（ウサギ）血漿の体積比１：９及び１：１０について、３７．１℃で試験を行った。せん断速度に対する粘度のプロットにより、ナノ粒子は、血漿粘度にいかなる影響も及ぼさないことが明らかになった。（Ｂ）ナノ粒子ヘモグロビンは、９９ｍＴｃトレーサー投与量（５０μＣｉ／ｋｇ）により放射線標識し、ラット（ｎ＝３）に投与した。ヘパリン化マイクロキャピラリーチューブに投与後、０分、５分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分の時点で血液サンプルを取り、密封して、マイクロシリンジ内に入れたアリコート１０μｌをプラスチックチューブに入れ、キャップを付け、オートウェルガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｉｚａｒｄ３）を使用してカウントした。所見から、こうした特定の粒径範囲のナノ粒子にとって典型的な二項指数クリアランスが判明する。
【図４】表２に記載されている４つの異なるナノ粒子配合物のＮＯ隔離アッセイの代表的なトレースを図示する。差し込み図では、サンプルＦ−３を除き、その他の応答のより鮮明な画像が得られる。サンプル注入は、ヘムと等モルであり、データが正規化され、重複してもよい。
【図５】ＲＢＣ、無細胞Ｈｂ及び２つの異なるナノ粒子製剤Ｆ−３及びＦ−４のＮＯ隔離アッセイの代表的トレースを図示する（表２を参照されたい）。サンプルは、ヘムと等モルである。データが正規化され、重複し得る。挿入：各サンプルの初期隔離速度（データの最初の１０秒までにフィットさせる傾向線）。
【図６】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）について、除去されたすべてのＮＯを示す棒グラフである。曲線下面積（ＡＵＣ）は、隔離された全ＮＯを表す。いずれのサンプルも、ヘムと等モルである。＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。ナノ粒子配合物は、いずれも、ＲＢＣサンプル及びＨｂサンプルとは異なる。
【図７】生理学的対照（ＲＢＣ及び無細胞Ｈｂ）と比較して、４つのナノ粒子配合物（Ｆ−１、Ｆ−２、Ｆ−３及びＦ−４；表２を参照されたい）のＮＯ隔離速度を示す棒グラフである。ＮＯ除去の初期速度は、サンプル投与後の最初の１分までのデータに対して、トレッド（ｔｒｅａｄ）線のフィッティングにより計算した：＊ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ（ｎ＝５）。無細胞Ｈｂにより、無処置ＲＢＣよりも、ＮＯがさらに活発に隔離され（周知のとおり）、すべてのナノ粒子配合において、ＮＯの隔離は、ＲＢＣより少ない。ただし、Ｆ−３（ＲＢＣと当量）は除く。
【図８】全身及び組織のＨＩＦレベルがＨＩＦ−α（ＯＤＤ）中の［Ｈｂ］の関数に応じて変化することを示すグラフ及び画像である（ルシフェラーゼマウス）。（Ａ−Ｂ）全身ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルは、希釈性貧血症中において有意に増加した。（Ａ）は、ＨＩＦ−ルシフェラーゼレベルを図示し、（Ｂ）は、動物の全身を示す画像である。（Ｃ〜Ｅ）類似の方法で組織特異的ＨＩＦ−ルシフェラーゼルミネセンスを変更して行った；脳（Ｃ）、腎臓（Ｄ）及び肝臓（Ｅ）。（Ｆ〜Ｇ）（Ｃ〜Ｅ）と同様に、ウェスタンブロット法による脳ＨＩＦ−１αタンパク質発現の測定結果であり、血液希釈が比例的に増大している。（Ｆ）は、ＨＩＦ−αと対照（α−チュブリン）とのウェスタンブロットイメージを示し、；（Ｇ）では、ＨＩＦ−αタンパク質のレベルを図示する。（Ｈ〜Ｊ）同様に、選択されたＨＩＦ−依存性ｍＲＮＡレベルも同様に上昇している：（Ｈ）ＧＬＵＴ１、（Ｉ）ＰＤＫ１、（Ｊ）ＭＣＴ４。（Ｋ−Ｌ）Ｈｂレベルと動物全身のＨＩＦルシフェラーゼとの関係を示す画像及びグラフを示す。具体的には、貧血が発現しているかまたは貧血から回復している間のＨＩＦルシフェラーゼシグナルは、Ｈｂと逆相関している。（Ｋ）全身の画像及び（Ｌ）正規化全身放射輝度（左ｙ軸）またはヘモグロビン濃度（右ｙ軸）対貧血（ｘ軸）。ＮＢ：急性血液希釈中の脳ｐＯ２のペア測定結果（リン光クエンチによる）は、［Ｈｂ］と相関し、解析、ＨＩＦ発現傾向の分析を確認する。以下の（［Ｈｂ］（ｇ／Ｌ）＆ｐＯ２（ｍｍＨｇ）（平均±標準偏差））、Ｎは、８匹（マウス）の測定値である：Ｈｂ  １２５．１±８．３−＞ｐＯ２  ６５．０±８．３；Ｈｂ  ８８．３±５．４−＞ｐＯ２  ５６．４±９．５；Ｈｂ  ７２．５±７．４−＞ｐＯ２  ５２．１±１０．３；Ｈｂ  ５２．４±３．９−＞ｐＯ２  ４０．６±６．８。
【図９】は、げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を示すグラフを示す。グラフ（Ａ）及び（Ｂ）は、脱血による、予測されるＡＶＯ２差の顕著な増大（２４〜６７％へ増大）を示し、（Ａ）では、生理食塩水による蘇生後、その状態が持続し、また、（Ｂ）では、血液代用剤により蘇生後、溶解する（６７〜３１％で正規化）。（Ｃ）いずれかの蘇生流体（生理食塩水＝ＮＳ、ナノ粒子溶液＝ＮＰ）により得られた血流力学的効果の差が観察されなかったのは、血圧の回復に加えて、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、改善されたＯ２含量によるものであることが示唆される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、形態的に赤血球に類似している酸素運搬ナノ粒子を提供する。本開示の酸素運搬ナノ粒子は、自己組織化され、これは、比較的迅速かつ容易に調製されることを意味する。また、本開示の酸素運搬ナノ粒子は、実質的に、両凹型円板状であり、これにより機械的安定性が増す。本開示の酸素運搬ナノ粒子は、ペイロードを含有する。ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む。有利には、本開示の酸素運搬ナノ粒子は、１粒子ペイロード当たり多くを導入することができ、また、必要な組織に基づいて、酸素に対する酸素運搬剤の親和力を変化させて、赤血球の酸素運搬特性を模倣することができる。加えて、酸素運搬ナノ粒子により、血管緊張が変化することはなく、循環中、酸素運搬機能を維持することができ、細網内皮系粒子クリアランスを介して、組織の血管外遊出を避けることができる。重要なことに、本開示のナノ粒子は、保管の延長のために凍結乾燥されていてもよく、また、使用前に迅速に再構築されてもよい。
【００１３】
ナノ粒子含有溶液及びナノ粒子及び溶液の使用方法も記載されている。
【００１４】
Ｉ．ナノ粒子
本開示の一態様では、実質的に両凹型円板状である酸素運搬ナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマー含有シェル及びペイロードを含む。ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む。ナノ粒子の各態様は、以下に詳細に記載されている。ナノ粒子は更に、米国特許明細書第２０１０／０２９７００７号に記載されているものであってよく、その開示は本発明において参考としてその全体に含まれる。
【００１５】
（ａ）形態学
ナノ粒子は、環状体を含む。すなわち、実質的に両凹型円板状である。このようなナノ粒子は、概して、丸みがあり、両面上で凹状である有限厚の板状形態を有し、ヒト赤血球の形状を模倣し、球状のナノ粒子と比較したとき、ナノ粒子表面積が増大し、このため、酸素運搬ナノ粒子の酸素交換動態が促進される。ナノ粒子の凹面は、各表面、または開口部、または円盤中心部近隣を介して「貫通孔」上に陥凹の形態をとってもよい。ナノ粒子の集団内では、いくつかのナノ粒子は、陥凹部含んでもよく、また、いくつかのナノ粒子は、貫通孔を含んでもよい。一般に、ナノ粒子集団の少なくとも約５０％が両凹型円板状であってもよい。両凹型円板状ナノ粒子の割合は、ナノ粒子全集団の約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であってよい。あるいは、両凹型円板状ナノ粒子の割合は、ナノ粒子全集団の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であってもよい。
【００１６】
ナノ粒子の形状により、ナノ粒子の直径は、ナノ粒子の高さよりも大きい。一般に、ナノ粒子の直径は、約５０ナノメートル〜約５００ナノメートルの範囲であってもよく、また、ナノ粒子の高さは、約２０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの範囲であってもよい。したがって、ナノ粒子の直径は、約１００ナノメートル〜約３００ナノメートルの範囲であってもよく、また、ナノ粒子の高さは、約４０ナノメートル〜約８５ナノメートルの範囲であってもよい。あるいは、ナノ粒子の直径は、約１００ナノメートル〜約２５０ナノメートルの範囲であってもよく、また、ナノ粒子の高さは、約３０ナノメートル〜約８０ナノメートルの範囲であってもよい。好ましくは、ナノ粒子の直径は、約１２０ナノメートル〜約２５０ナノメートルの範囲であってもよく、また、ナノ粒子の高さは、約５０ナノメートル〜約７０ナノメートルの範囲であってもよい。ナノ粒子の直径は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００ナノメートルであってもよく、また、ナノ粒子の高さは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０または８５ナノメートルであってもよい。
【００１７】
ナノ粒子集団を含有するナノ粒子は、実質的にサイズが均一であり、そのサイズは、ナノ粒子の直径として測定される。集団のナノ粒子におけるサイズの変化は、約１５％未満である。好ましくは、集団のナノ粒子におけるサイズの変化は、約１０％未満であってもよく、更に好ましくは、約５％未満であってもよい。好ましくは、集団のナノ粒子におけるサイズの変化は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満であってもよい。
【００１８】
２つまたはそれ以上のナノ粒子集団間のサイズは変化することもあり、そのサイズは、ナノ粒子の直径として測定される。ナノ粒子のサイズは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子、還元剤及び両親媒性ポリマー及び／または任意の剤の種類及び濃度による影響を受け得る。理論に束縛されるものではないが、ナノ粒子のサイズは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子、還元剤及び／または任意の剤の濃度の上昇により、増大し得ると考えられる。また、両親媒性ポリマー含有分岐ポリマーの分子量の増大と共に、ナノ粒子のサイズは増大し得る。
【００１９】
一般に、両凹型円板状ナノ粒子は、非両凹型円板状ナノ粒子に対して、安定度が増加している。安定度は、時間の経過に伴う粒径、ゼータ電位及び／または多分散性の変化によって測定され得る。安定度は、更に、時間の経過に伴うペイロード放出の変化によって測定され得る（例えば、時間の経過に伴う酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び／または還元剤の放出）。安定ナノ粒子は、基準特性からの変化を約２０％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約１０％反映し得る。両凹型円板状ナノ粒子は、少なくとも数ヶ月間、３ヶ月以上、または３ヶ月超の間、室温にて安定する。安定度は、典型的には、単一のナノ粒子というよりも、ナノ粒子の集団に対して測定される。一般に、両凹型円板状ナノ粒子は、少なくとも数ヶ月間、または３ヶ月以上４℃で安定させる。更なる詳細は、実施例に提供される。
【００２０】
（ｂ）シェル
両凹型円板状ナノ粒子のシェルは、両親媒性ポリマーを含み、この両親媒性ポリマーは、共有結合により脂質に共役される分岐ポリマーを含む。また、シェルは更に、水、バッファ溶液、食塩水、血清溶液及びこれらの組み合わせを含んでもよい。シェルは、以下に詳細に示すとおり、生物学的活性剤、造影剤、金属原子または治療薬を更に含んでもよい。
【００２１】
両凹型円板状ナノ粒子のシェルは、二層状であり、親水性の外層及び親水性の内層並びに層間の疎水性領域から構成される。ナノ粒子のシェルを形成するには、両親媒性ポリマーは、最初に自己組織化されて、親水性の外層及び親水性の内層並びに層間の疎水性領域から構成される二層を形成し、次に、両凹型円板状ナノ粒子に自己組織化される。両凹型円板状粒子の形成は、両親媒性ポリマーの疎水性−親水性ブロック比及びナノ粒子の自己組織化方法手順によって引き起こされる。
【００２２】
両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の約１重量％〜約４０重量％含まれてもよい。例えば、両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の１重量％、１．５重量％、２重量％、２．５重量％、３重量％、３．５重量％、４重量％、４．５重量％、５重量％、５．５重量％、６重量％、６．５重量％、７重量％、７．５重量％、８重量％、８．５重量％、９重量％、９．５重量％、１０重量％、１０．５重量％、１１重量％、１１．５重量％、１２重量％、１２．５重量％、１３重量％、１３．５重量％、１４重量％、１４．５重量％、１５重量％、１５．５重量％、１６重量％、１６．５重量％、１７重量％、１７．５重量％、１８重量％、１８．５重量％、１９重量％、１９．５重量％、２０重量％、２０．５重量％、２１重量％、２１．５重量％、２２重量％、２２．５重量％、２３重量％、２３．５重量％、２４重量％、２４．５重量％、２５重量％、２５．５重量％、２６重量％、２６．５重量％、２７重量％、２７．５重量％、２８重量％、２８．５重量％、２９重量％、２９．５重量％、３０重量％、３０．５重量％、３１重量％、３１．５重量％、３２重量％、３２．５重量％、３３重量％、３３．５重量％、３４重量％、３４．５重量％、３５重量％、３５．５重量％、３６重量％、３６．５重量％、３７重量％、３７．５重量％、３８重量％、３８．５重量％、３９重量％、３９．５重量％、または約４０重量％含まれてもよい。両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の約１重量％〜約１５重量％、約５重量％〜約２０重量％、約１重量％〜約１０重量％または約１０重量％〜約２０重量％含まれてもよい。あるいは、両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の約１重量％〜約５重量％、約５重量％〜約１０重量％、約１０重量％〜約１５重量％または約１５重量％〜約２０重量％含まれてもよい。
【００２３】
追加の態様は、以下に詳細に記載されている。
【００２４】
ｉ．分岐ポリマー
分岐ポリマーは、１つ以上の遊離反応性基を含む分枝鎖、アミン含有ポリマーであってもよい。好適な分岐ポリマーの非限定的タイプとしては、星型分岐ポリマー、グラフト分岐ポリマー、櫛型分岐ポリマー、ブラシ型分岐ポリマー網状、網目分岐ポリマー、超分岐ポリマー及び樹枝状ポリマーが挙げられる。
【００２５】
ポリマーは、合成ポリマー、半合成ポリマーまたは天然ポリマーであってよい。好適なポリマーの非限定的例としては、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミドスルホン酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミン、ポリアミド、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリブタジエン、ポリジメチルシロキサン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリエチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリイソプレン、ポリメタクリレート、ポリメタクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルオキサゾリン、ポリオキシアルキレンオキシド、ポリフェニレン、ポリプロピレンイミン、ポリプロピレンオキシド、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、アルジネート、寒天、カラギナン、キサンタン、グアー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン、ポリグリシン、及びポリセリン）、コポリマー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
分岐ポリマーは、少なくとも１種の反応性基を含む。好適な反応性基としては、これらに限定されるものではないが、第一級、第二級、または第三級アミン基、カルボキシレート基、ヒドロキシル基、アルキル基、フルオロアルキル基、アリール基、アセタート基、アミド基、エステル基、スルホン基、スルホキシド基、スルホネート基、スルホンアミド基、ホスホネート基及びホスホンアミド基が挙げられる。
【００２７】
分岐ポリマーの平均分子量は、変化し得る。例えば、分子量の増大するポリマーを選択して、厚さの増大した外シェルを作製してもよい。分子量は、数平均分子重量％（Ｍｎ）または重量平均分子重量％（Ｍｗ）として表してもよい。一般に、分岐ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は、約２００〜約１，０００，０００ダルトンの範囲であってもよい。一般に、分岐ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は、約２００〜約５，０００、約５，０００〜約５０，０００、約５０，０００〜約２５０，０００または約２５０，０００〜約１，０００，０００ダルトンなど、約２００〜約５０，０００ダルトンの範囲であってもよい。好ましくは、分岐ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は、約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトンまたは約５０，０００ダルトンであってもよい。
【００２８】
理論に束縛されるものではないが、分岐ポリマーの固有の性質により、静電相互作用を介して、アロステリック調節因子の保持が可能になる（セクションＩ（ｆ）に記載されている）と考えられる。当業者は、分岐ポリマーの選択がこのような相互作用に影響を与え得ることは理解されるであろう。例えば、分岐ポリマーが第二級または第三級アミンを含むカチオン性分岐ポリマーであるとき、アミン密度は重要な因子であり得る。しかし、カチオン性分岐ポリマーとなる分岐状カチオン性ポリマーの場合、アロステリック調節因子との静電的相互作用は必須ではない。アロステリック調節因子により静電相互作用を生み出すためには、分岐ポリマーアミンで十分である。好ましい分岐ポリマーとしては、これに限定されないが、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーを挙げることもできる。更により好ましくは、分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマーである。例示的分岐ポリマーは、１０Ｋポリエチレンイミン分岐ポリマー、５０Ｋポリエチレンイミン分岐ポリマーまたは１００Ｋポリエチレンイミン分岐ポリマーである。例示的な分岐ポリマーは、Ｇ４ポリアミドアミンである。
【００２９】
ｉｉ．脂質
また、両親媒性ポリマーは、分岐ポリマーに結合された脂質も含む。脂質は、共有結合によりまたは非共有結合により分岐ポリマーに結合されていてもよい。理論に束縛されるものではないが、脂質に結合する分岐ポリマーの反応性基の割合は、疎水性性質に影響を与え、このため、粒子形態学に影響があると考えられている。疎水性−親水性ブロック比を制御するために、脂質と結合する分岐ポリマーの遊離反応性基の割合は、材料と共に変化し、二層タイプの膜を形成して、両凹型円盤様形状粒子にする。一般に、両親媒性ポリマーは、分岐ポリマーに結合された脂質を含み、分岐ポリマーの反応性基の少なくとも約２５％が脂質に結合している。例えば、脂質に結合している遊離反応性基の割合は、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であってもよい。脂質に結合している遊離反応性基の割合は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％若しくは７５％以上であってもよい。好ましくは、脂質に結合している遊離反応性基の割合は、約４０％〜約７０％または約５０％〜約６０％の範囲であってもよい。脂質に結合している遊離反応性基の例示的割合は、約５５％であってもよい。
【００３０】
好適な脂質の非限定的例としては、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、胆汁酸、糖脂質、脂肪族疎水性化合物及び芳香族疎水性化合物が挙げられる。脂質は、天然、合成または半合成であってもよい。一般に、脂質は、極性先端基及び少なくとも１つの疎水性ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビル基を含む。極性先端基により、脂質は、共有結合を介して分岐ポリマーに連結する。好適な極性先端基の実施例としては、これらに限定されるものではないが、カルボキシ基、アシル基、プロパルギル基、アジド基、アルデヒド基、チオール基、エステル基、サルフェート基及びリン酸基が挙げられる。好ましい疎水性ヒドロカルビル基としては、これらに限定されないが、アルキル基、アルキニル基、複素環式及びこれらの組み合わせが挙げられる。典型的には、アルキル基またはアルキニル基は、炭素原子約６〜約３０個、より好ましくは炭素原子約１２〜約２４個を含む。置換ヒドロカルビル基とは、炭素鎖原子が、窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素またはハロゲン原子などのへテロ原子によって置換されている部分及び炭素鎖が追加の置換基を含む部分など、炭素以外の少なくとも１つの原子により置換されているヒドロカルビル部分を意味する。これらの置換基としては、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、アシルオキシ基、アルケニル基、アルケノキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アミノ基、アミド基、アセタール基、カルバミル基、カルバミン酸塩基、カルボシクロ基、シアノ基、エステル基、エーテル基、ハロゲン基、ヘテロシクロ基、ヒドロキシル基、ケト基、ケタール基、ホスホ基、ニトロ基、チオ基、トリフルオロメチル基、スルホニル基、スルホンアミド基などが挙げられる。脂質は、例えば、ホスファチジルエタノールアミン基、ホスファチジルセリン基、ホスファチジルイノシトール基、カルジオリピン基、ホスファチジルエチレングリコールなどまたはコール酸などの胆汁酸などのリン脂質であってよい。好ましくは、脂質は脂肪酸であってよく、脂肪酸鎖は、上記に定義されたように、アルキル（飽和）基またはアルキニル（不飽和）基を含む。好ましい脂肪酸としては、これらに限定されるものではないが、１０，１２−ペンタコサジイン酸、ヘキサデシルオクタデカン酸、コラン酸、リノール酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸及びパルミチン酸が挙げられる。好ましくは、脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。
【００３１】
例示的分岐ポリマーは、ポリエチレンイミンであってよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約４０％の遊離反応性基が脂質に結合する。例示的分岐ポリマーは、ポリエチレンイミンであってよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約５０％の遊離反応性基が脂質に結合する。例示的分岐ポリマーは、ポリエチレンイミンであってよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約５５％の遊離反応性基が脂質に結合する。分岐ポリマーがポリエチレンイミンであるとき、遊離反応性基はアミンであり、典型的には、第一級アミン及び／または第二級アミンである。
【００３２】
例示的分岐ポリマーは、ＰＡＭＡＭであってもよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約１０％の遊離反応性基が脂質に結合する。例示的分岐ポリマーは、ＰＡＭＡＭであってもよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約２０％の遊離反応性基が脂質に結合する。例示的分岐ポリマーは、ＰＡＭＡＭであってもよく、例示的脂質は、パルミチン酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸またはリノール酸であり、ポリマーの少なくとも約３０％の遊離反応性基が脂質に結合する。分岐ポリマーがＰＡＭＡＭであるとき、遊離反応性基はアミンであり、典型的には、第一級アミンである。
【００３３】
（ｃ）水性コア
ナノ粒子は、水性コア部を含む。水性コア部は、水、バッファ溶液、食塩水、血清溶液及びこれらの組み合わせを含んでもよい。また、水性コアは、以下に詳細に示すとおり、生物学的活性剤、造影剤、金属原子、治療薬、酸素運搬剤、アロステリック調節因子、還元剤またはこれらの組み合わせを含んでよい。好ましくは、水性コア部は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む。
【００３４】
（ｄ）粒子外側の分子内架橋
ナノ粒子の外側は、シェルの外層を含む。シェルの外層は、表面反応性基を中性にするために分子内架橋される。別の方法を記載すると、シェルの外層は、ナノ粒子が近接する中性面を有するように分子内架橋される。近接中性面を得るために必要な架橋の程度は、両親媒性ポリマーに応じて変化することになる。ゼータ電位が約−１５〜約＋１５ｍＶであるナノ粒子は、ほぼ中性であると考えられる。近接する中性面を有するナノ粒子は、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−７、−６、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４または＋１５ｍＶのゼータ電位を有してもよい。近接する中性面を有するナノ粒子はまた、約−１５〜約０ｍＶ、約−１０〜約０ｍＶ、約−１０〜約−５ｍＶ、約−９〜約−４ｍＶ、約−８〜約−３ｍＶ、約−７〜約−２ｍＶ、約−６〜約−１ｍＶまたは約−５〜約０ｍＶのゼータ電位を有してもよい。あるいは、近接する中性面を有するナノ粒子はまた、約０〜約＋１５ｍＶ、約０〜約＋１０ｍＶ、約＋５〜約＋１０ｍＶ、約＋４〜約＋９ｍＶ、約＋３〜約＋８ｍＶ、約＋２〜約＋７ｍＶ、約＋１〜約＋６ｍＶまたは約０〜約＋５ｍＶのゼータ電位を有してもよい。ゼータ電位は、ナノ粒子の傾向に影響を及ぼして、タンパク質、微小粒子、細胞及び他の生体分子と相互作用する可能性がある。ナノ粒子が対象に投与され、血液中のタンパク質、細胞及び他の粒子と実質的に相互作用することはナノ粒子にとって望ましくないため、近接する中性面は、本開示のナノ粒子の重要な特徴である。また、理論に束縛されるものではないが、出願人らは、架橋の程度は、実質的に、粒子内部にペイロードを含有し、ナノ粒子内部へのまたは粒子内部での酸素、二酸化炭素及び一酸化窒素などの気体の拡散に影響を及ぼすとも考えている。また、架橋により、ナノ粒子に対して機械的安定性の増大がもたらされ、生体適合性が改善し、かつ／または循環寿命が延長され得る。また、架橋により、酸素運搬剤への酸化損傷が阻害され得る。
【００３５】
外シェルの両親媒性ポリマーの表面脂質は、化学的手段によって架橋されていてもよい。あるいは、両親媒性ポリマーのコアポリマーは、光化学的手段によって架橋されていてもよい。一般に、両親媒性ポリマーの利用可能な反応性基の少なくとも約３０％は、架橋されていてもよく、両親媒性ポリマーの利用可能な反応性基の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上が架橋されていてもよい。好適な架橋手段は、以下のセクションＩＩに詳細に記述する。架橋の程度は、当該技術分野において既知の任意の方法によって決定され得る。
【００３６】
約３０％〜約５０％、約５０％〜約７０％または約７０％〜約１００％など、両親媒性ポリマーの表面反応性基の少なくとも約３０％が架橋されてもよいように、粒子表面は、二官能性リンカーと分子内架橋されることが好ましい。好ましい二官能リンカーとしては、これらに限定されないが、活性化（または官能化）短鎖ＰＥＧが挙げられる。あるいは、カップリング剤が使用されてもよい。短鎖ＰＥＧは、約１、２、３、４、５または約６のエチレンオキシドモノマーを含んでもよい。好ましくは、短鎖ＰＥＧは、１〜３のエチレンオキシドモノマーを含み、またはより好ましくは、２のエチレンオキシドモノマーを含む。例示的二官能性リンカーとしては、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ）、エポキシド、トシレートまたはクロロホルメートを挙げることもできる。更なる詳細は、以下のセクションＩＩに提供される。
【００３７】
（ｅ）任意のＰＥＧ化
さらに、ナノ粒子の両親媒性ポリマーは、以下のセクションＩＩに詳細に示すように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により誘導体化されていてもよい。ナノ粒子は、短鎖ＰＥＧを用いて誘導体化されることが好ましい。短鎖ＰＥＧは、約１、２、３、４、５または約６のエチレンオキシドモノマーを含んでもよい。好ましくは、短鎖ＰＥＧは、１〜３個のエチレンオキシドモノマーを含み、またはより好ましくは、２個のエチレンオキシドモノマーを含む。
【００３８】
（ｆ）ペイロード
本開示のナノ粒子は、ペイロードを含有し、このペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む。ペイロードは、ナノ粒子内部に含有される。酸素運搬ナノ粒子の酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の水性コア部内に含まれていてもよく、また、ナノ粒子のシェルを含む内層の親水性領域内に含まれていてもよく、ナノ粒子のシェルを含む疎水性領域内に含まれていてもよく、またはこれらの組み合わせであってもよい。また、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、ナノ粒子の異なる場所に局所化されていてもよいことは想定される。
【００３９】
ｉ．酸素運搬剤
本開示の酸素運搬ナノ粒子は、酸素運搬剤を含有する。酸素を運搬することができる任意の分子は、酸素運搬剤として使用するのに好適であってよい。酸素運搬剤の非限定的例としては、ペルフルオロカーボン系酸素担体（ＰＦＢＯＣ）、ヘモグロビン系酸素担体（ＨＢＯＣ）、レグヘモグロビンなどのヘモグロビン様酸素担体及びヘミンなど人工ヘモグロビン系酸素担体が挙げられる。したがって、酸素運搬剤は、ヘモグロビン系酸素担体（ＨＢＯＣ）、ヘモグロビン様酸素担体、ＰＦＢＯＣまたは人工ヘモグロビン系酸素担体であってよい。
【００４０】
ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり、酸素運搬剤分子約２０００〜約１０，０００を含んでもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり約２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または約１０，０００の酸素運搬剤分子を含んでもよい。また、ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり、酸素運搬剤分子約１０，０００超を含んでもよい。ナノ粒子１個当たりの酸素運搬剤分子の絶対数は、ナノ粒子のサイズ、酸素に対する酸素運搬剤の親和性、及びＯ２の無負荷状態間の自動酸化形成の制限能力に依存して変化し得る。
【００４１】
本開示のナノ粒子の約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）は、酸素運搬剤を含んでもよい。例えば、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、酸素運搬剤を含んでもよい。あるいは、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または約６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、酸素運搬剤を含む。好ましくは、約２５％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約３５％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約６０％、約５０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、酸素運搬剤を含む。
【００４２】
好ましくは、酸素運搬剤は、ヘミンなど、人工ヘモグロビン系酸素担体である。更に好ましくは、酸素運搬剤は、ヘモグロビン系酸素担体である。ヘモグロビンは、鉄含有酸素運搬金属タンパク質であり、赤血球の主成分であり、約３３％の細胞集団を含む。ヘモグロビンの各分子は、４つのサブユニット、２本のα鎖、及び２本のβ鎖を有し、四量体構造内に配置されている。また、各サブユニットは、１つのヘム基を含有し、酸素と結合する鉄含有中心部である。したがって、各ヘモグロビン分子は、４つの酸素分子と結合することができる。
【００４３】
本開示は、ヘモグロビン源によって制限されるものではない。用語「ヘモグロビン」は、天然または合成ヘモグロビンを指す。例えば、本開示のヘモグロビン系酸素運搬剤は、動物由来であってもよい。あるいは、本開示のヘモグロビン系酸素運搬剤は、ヒト由来であってもよい。好ましいヘモグロビン源は、ヒト、雌ウシ及びブタである。
【００４４】
ヘモグロビン酸素系運搬剤は、ヒトまたは動物、例えば雌ウシ及びブタから単離され、精製されていてもよい。あるいは、ヘモグロビン系酸素運搬剤は、化学合成技術及び組み換え技術によって作製されてもよい。ヒトα−及びβ−グロビン遺伝子は、いずれも、クローン化され、配列化されている（例えば、Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．７７：７０５４−７０５８（１９８０）；Ｍａｒｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５３：５０４０−５０５３（１９７７）（ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｃＤＮＡを参照されたい）。
【００４５】
ヘモグロビンアミノ酸配列多型は、集団（例えば、ヒト、雌ウシ、またはブタなどの集団）内に存在し得ることは、当業者によって明らかであろう。このような遺伝的多型は、対立遺伝子の自然変異により、集団内の個々に存在し得る。このような任意のあらゆるアミノ酸変異、並びに、対立遺伝子の自然変異の結果であり、かつ、ヘモグロビンの機能的活性が変化しない、アミノ酸変異の結果得られた多型は、本開示の範囲内であることを目的としている。同様に、用語ヘモグロビン酸素系運搬剤としては、酸素運搬ナノ粒子中に酸素運搬剤として使用されるとき、ヘモグロビンの酸素結合及び放出特性を調節するために遺伝子操作を受けたヘモグロビンが挙げられる（例えば、Ｎａｇａｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８２：７２５２−７２５５及び米国特許第５，０２８，５８８号）。また、ヘモグロビン酸素系運搬剤は、自然発生ヘモグロビン、キメラヘモグロビン、組み換えヘモグロビン、ヘモグロビン断片または本開示の範囲から逸脱することのないこれらの組み合わせを含むヘモグロビンであってもよい。
【００４６】
ヘモグロビン酸素系運搬剤は、未変性であってもまたは分子内または分子間架橋、重合または化学基（例えば、ポリアルキレンオキシドまたはその他の付加物）の付加などの化学反応によってその後に修飾されていてもよい。修飾ヘモグロビン酸素運搬剤の代表例は、発行された多数の米国特許明細書（米国特許明細書第４，８５７，６３６号、米国特許明細書第４，６００，５３１号、米国特許明細書第４，０６１，７３６号、米国特許明細書第３，９２５，３４４号、米国特許明細書第４，５２９，７１９号、米国特許明細書第４，４７３，４９６号、米国特許明細書第４，５８４，１３０号、米国特許明細書第５，２５０，６６５号、米国特許明細書第４，８２６，８１１号及び米国特許明細書第５，１９４，５９０号）に記載されている。
【００４７】
好ましくは、酸素運搬剤は、ヒト、雌ウシまたはブタから分離されたヘモグロビンである。更に好ましくは、酸素運搬剤は、ヒトから分離されたヘモグロビンである。対象からのヘモグロビン分離方法は、当技術分野において既知であり、実施例及びＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ２３：３１５９−３１７０に記載されているとおりであってよく、その開示は全体が明細書に組み込まれる。ヘモグロビン源に関係なく、ヘモグロビン酸素運搬剤は、実質的に純粋であり、かつ、ストローマ細胞及びエンドトキシンを含まない。
【００４８】
ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり、ヘモグロビン分子約２０００〜約１０，０００を含んでもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり約２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００または約１０，０００またはそれ以上のヘモグロビン分子を含んでもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり、ヘモグロビン分子約２０００〜約６０００または約６０００〜約１００００を含んでもよい。ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約３０００〜約６０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約４０００〜約７０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約５０００〜約８０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約６０００〜約９０００、またはナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約７０００〜約１０，０００を含んでもよい。あるいは、ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約３０００〜約４０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約４０００〜約５０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約５０００〜約６０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約６０００〜約７０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約７０００〜約８０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約８０００〜約９０００、ナノ粒子１個当たりヘモグロビン分子約９０００〜約１０，０００を含んでもよい。ナノ粒子１個当たりのヘモグロビン分子の絶対数は、ナノ粒子のサイズに依存して変化し得る。
【００４９】
一般に、ナノ粒子の約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）は、ヘモグロビンを含んでもよい。例えば、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、ヘモグロビンを含んでもよい。あるいは、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％または約６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、ヘモグロビンを含む。好ましくは、約２５％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約３５％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約４５％〜約６０％、約５０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のナノ粒子は、ヘモグロビンを含む。理論に束縛されるものではないが、高濃度のヘモグロビンによりヘモグロビンは安定することができ、また、濃度依存ヘモグロビン四量体の個々のα及びβ二量体（ｄｉｍｍｅｒｓ）への解離を阻止し得ると考えられている。
【００５０】
酸素運搬ナノ粒子のヘモグロビン濃度を直接測定できない場合、本明細書で記載されているように、ナノ粒子の鉄含有量から推定してもよい。ヘモグロビンの鉄含有量は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｔ  ＦＷ  ａｎｄ  Ｓｋｅｇｇｓ  Ｌ  １９４３  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １４７：１９−２２を参照されたい。
【００５１】
ｉｉ．アロステリック調節因子
本開示のナノ粒子は、酸素運搬剤の酸素に対する親和性を調節し、ナノ粒子中における酸素運搬剤の酸素の結合速度または量若しくは酸素運搬剤からの放出速度または量を調節するアロステリック調節因子を含む。アロステリック調節因子により、対象内での酸素担体から脱酸素された組織または細胞への無負荷が増加し、かつ／または肺など、酸素化された組織からの酸素担体への酸素の負荷が増大し得る。したがって、アロステリック調節因子により、脱酸素組織内及び酸素を豊富に含む肺内において、酸素分圧４０〜１００ｍｍＨｇである狭い生理学的範囲内において、酸素は肺内で結合され、組織内で放出され得る。頑強な酸素運搬ナノ粒子のデザインにとって、Ｏ２親和性の簡便な制御は必須であり、これによりナノ粒子デザインを臨床状況に適合させる能力が付与される。例えば、Ｏ２親和性を調節できることにより、標高の高いところでの低酸素症の治療に好適なＯ２親和性の増大を伴うナノ粒子のデザイン及び海面での低酸素症の治療に好適なＯ２親和性の低下を伴うナノ粒子のデザインが可能である。
【００５２】
ナノ粒子は、１つのアロステリック調節因子または２つ以上のアロステリック調節因子の組み合わせを含んでもよい。酸素に対するヘモグロビンの親和性を調節することができるアロステリック調節因子の非限定的例としては、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）（２，３−ビスホスホグリセリン酸または２，３−ＢＰＧとしても公知である）若しくはそこから誘導された異性体、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）またはＲＳＲ−４、ＲＳＲ−１３（２−［４−［［（３，５−ジメチルアニリノカルボニル］メチル］−フェノキシ］−２−メチルプロピオン酸）が挙げられ、その構造は以下に示す。
【化１】
2019089832.tif 000002
【００５３】
酸素運搬ナノ粒子中のアロステリック調節因子の濃度は、変更することができ（変更することになり）、また、本明細書に記載されているように、ナノ粒子の酸素結合動態及び放出動態を最適化するために、実験により測定され得る。酸素運搬剤に対するモル比に関して、２，３−ＤＰＧの濃度が記載されていてもよい。酸素運搬剤に対するアロステリック調節因子のモル比は、約０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、２．００、２．０５、２．１０、２．１５、２．２０、２．２５、２．３０、２．３５、２．４０、２．４５、２．５０、２．５５、２．６０、２．６５、２．７０、２．７５、２．８０、２．８５、２．９０、２．９５、３．００、３．０５、３．１０、３．１５、３．２０、３．２５、３．３０、３．３５、３．４０、３．４５、３．５０、３．５５、３．６０、３．６５、３．７０、３．７５、３．８０、３．８５、３．９０、３．９５、４．００、４．０５、４．１０、４．１５、４．２０、４．２５、４．３０、４．３５、４．４０、４．４５、４．５０、４．５５、４．６０、４．６５、４．７０、４．７５、４．８０、４．８５、４．９０、４．９５、５．００、５．０５、５．１０、５．１５、５．２０、５．２５、５．３０、５．３５、５．４０、５．４５、５．５０、５．５５、５．６０、５．６５、５．７０、５．７５、５．８０、５．８５、５．９０、５．９５、６．００、６．０５、６．１０、６．１５、６．２０、６．２５、６．３０、６．３５、６．４０、６．４５、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５、７．７０、７．７５、７．８０、７．８５、７．９０、７．９５、８．００、８．０５、８．１０、８．１５、８．２０、８．２５、８．３０、８．３５、８．４０、８．４５、８．５０、８．５５、８．６０、８．６５、８．７０、８．７５、８．８０、８．８５、８．９０、８．９５、９．００、９．０５、９．１０、９．１５、９．２０、９．２５、９．３０、９．３５、９．４０、９．４５、９．５０、９．５５、９．６０、９．６５、９．７０、９．７５、９．８０、９．８５、９．９０、９．９５または約１０．００であってもよい。
【００５４】
アロステリック調節因子は、２，３−ＤＰＧであることが好ましい。２，３−ＤＰＧは、ｐＨに対する酸素運搬ナノ粒子の応答性を向上させることによって、酸素に対する酸素運搬剤の親和性を調節することができる。２．３−ＤＰＧは、化学合成または酵素的合成など、当該技術分野において任意の公知の方法によって、合成され得る。例えば、それぞれ、その全体が参考として本明細書に組み込まれる、Ｂａｅｒ  Ｅ．「Ａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２，３−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ−ｄ−ｇｌｙｃｅｒｉｃ  ａｉｄ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９５０；１８５：７６３−７６７；またはＧｒｉｓｏｌｉａ  Ｓ，  Ｊｏｙｃｅ  ＢＫ「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，３−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９５８；２３３：１８−１９を参照されたい。合成は、ＭＳ及び／またはＮＭＲによって確認されてもよい。
【００５５】
酸素運搬ナノ粒子中の２，３−ＤＰＧの濃度は、変更することができ（変更することになり）、また、本明細書に記載されているように、ナノ粒子の酸素結合動態及び放出動態を最適化するために、実験により測定され得る。酸素運搬剤がヘモグロビンであるとき、２，３−ＤＰＧの濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または約２ｍｇ／ｍｇヘモグロビンであってよい。好ましくは、２，３−ＤＰＧの濃度は、約０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、または約１．３ｍｇ／ｍｇヘモグロビンであってよい。あるいは、２，３−ＤＰＧの濃度は、ヘモグロビンに対するモル比に関して記載されていてもよい。酸素運搬剤がヘモグロビンであるとき、２，３−ＤＰＧ対ヘモグロビンのモル比は、約０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、２．００、２．０５、２．１０、２．１５、２．２０、２．２５、２．３０、２．３５、２．４０、２．４５、２．５０、２．５５、２．６０、２．６５、２．７０、２．７５、２．８０、２．８５、２．９０、２．９５、３．００、３．０５、３．１０、３．１５、３．２０、３．２５、３．３０、３．３５、３．４０、３．４５、３．５０、３．５５、３．６０、３．６５、３．７０、３．７５、３．８０、３．８５、３．９０、３．９５、４．００、４．０５、４．１０、４．１５、４．２０、４．２５、４．３０、４．３５、４．４０、４．４５、４．５０、４．５５、４．６０、４．６５、４．７０、４．７５、４．８０、４．８５、４．９０、４．９５、５．００、５．０５、５．１０、５．１５、５．２０、５．２５、５．３０、５．３５、５．４０、５．４５、５．５０、５．５５、５．６０、５．６５、５．７０、５．７５、５．８０、５．８５、５．９０、５．９５、６．００、６．０５、６．１０、６．１５、６．２０、６．２５、６．３０、６．３５、６．４０、６．４５、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５、７．７０、７．７５、７．８０、７．８５、７．９０、７．９５、８．００、８．０５、８．１０、８．１５、８．２０、８．２５、８．３０、８．３５、８．４０、８．４５、８．５０、８．５５、８．６０、８．６５、８．７０、８．７５、８．８０、８．８５、８．９０、８．９５、９．００、９．０５、９．１０、９．１５、９．２０、９．２５、９．３０、９．３５、９．４０、９．４５、９．５０、９．５５、９．６０、９．６５、９．７０、９．７５、９．８０、９．８５、９．９０、９．９５または約１０．００であってもよい。
【００５６】
ｉｉｉ．還元剤
本開示のナノ粒子は、還元剤を含有する。酸素運搬剤がヘモグロビンであるとき、ヘモグロビンは、酸化して、メトヘモグロビンとなり得る。ヘム基内の鉄は、正常ヘモグロビンのＦｅ２＋（第一鉄）中ではなくＦｅ３＋（第二鉄）状態内にある。ヘモグロビンが酸化してメトヘモグロビンとなることにより、酸素に対するヘモグロビンの親和性が低下し、かつ、時間の経過と共にナノ粒子の酸素運搬能力が低下する。還元剤により、ヘモグロビンの酸化を防止することができ、酸化ヘモグロビンまたは両者の組み合わせを再生することができる。還元剤は、任意のヘム含有酸素運搬剤の酸化を防止し得ることが本発明の範囲内で検討される。したがって、還元剤では、還元剤が存在しない場合と比較して、長時間にわたり、ナノ粒子の酸素運搬機能を維持し、かつ、延長させることができる。
【００５７】
ナノ粒子は、１つの還元剤または２つ以上のアロステリック調節因子の組み合わせを含み得る。酸化ヘモグロビンの再生に好適な還元剤の非限定的例としては、ロイコメチレンブルー及びロイコベンジルメチレンブルーなど、その誘導体、並びにグルタチオニン及びアスコルビン酸塩が挙げられる。還元剤の濃度は、ナノ粒子中のメトヘモグロビン濃度をナノ粒子中のヘモグロビン全濃度に対して約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％未満、２０％以下に制限するのに十分であってもよい。還元剤の濃度は、ナノ粒子中のメトヘモグロビン濃度をナノ粒子中のヘモグロビン全濃度に対して約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％未満、約１５％以下に制限するのに十分であるのが好ましい。酸素運搬剤がヘモグロビンであるとき、還元剤の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または約２ｍｇ／ｍｇヘモグロビンであってよい。好ましくは、還元剤の濃度は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または約０．８ｍｇ／ｍｇヘモグロビンであってよい。あるいは、還元剤の濃度は、ヘモグロビンとのモル比に記載されている濃度であってもよい。酸素運搬剤がヘモグロビンであるとき、還元剤対ヘモグロビンのモル比は、約０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、１．００、１．０５、１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０、１．９５、２．００、２．０５、２．１０、２．１５、２．２０、２．２５、２．３０、２．３５、２．４０、２．４５、２．５０、２．５５、２．６０、２．６５、２．７０、２．７５、２．８０、２．８５、２．９０、２．９５、３．００、３．０５、３．１０、３．１５、３．２０、３．２５、３．３０、３．３５、３．４０、３．４５、３．５０、３．５５、３．６０、３．６５、３．７０、３．７５、３．８０、３．８５、３．９０、３．９５、４．００、４．０５、４．１０、４．１５、４．２０、４．２５、４．３０、４．３５、４．４０、４．４５、４．５０、４．５５、４．６０、４．６５、４．７０、４．７５、４．８０、４．８５、４．９０、４．９５、５．００、５．０５、５．１０、５．１５、５．２０、５．２５、５．３０、５．３５、５．４０、５．４５、５．５０、５．５５、５．６０、５．６５、５．７０、５．７５、５．８０、５．８５、５．９０、５．９５、６．００、６．０５、６．１０、６．１５、６．２０、６．２５、６．３０、６．３５、６．４０、６．４５、６．５０、６．５５、６．６０、６．６５、６．７０、６．７５、６．８０、６．８５、６．９０、６．９５、７．００、７．０５、７．１０、７．１５、７．２０、７．２５、７．３０、７．３５、７．４０、７．４５、７．５０、７．５５、７．６０、７．６５、７．７０、７．７５、７．８０、７．８５、７．９０、７．９５、８．００、８．０５、８．１０、８．１５、８．２０、８．２５、８．３０、８．３５、８．４０、８．４５、８．５０、８．５５、８．６０、８．６５、８．７０、８．７５、８．８０、８．８５、８．９０、８．９５、９．００、９．０５、９．１０、９．１５、９．２０、９．２５、９．３０、９．３５、９．４０、９．４５、９．５０、９．５５、９．６０、９．６５、９．７０、９．７５、９．８０、９．８５、９．９０、９．９５，または約１０．００であってよい。
【００５８】
ｉｖ．酸素運搬ナノ粒子の調節
本開示のナノ粒子の重要な特徴は、粒子Ｏ２親和性と組織の呼吸との間の生理的連結である。当該技術分野において公知の従来の血液代用剤では、人工Ｏ２含有量が増加すると、これらの血液代用剤による適切なＯ２の放出（すなわち、生理学的Ｏ２解離曲線に沿って）は、ＨｂからＯ２親和性の正常なアロステリック制御の欠如によりインビボで稀に得られる（ｐ５０として表される、Ｏ２（ＳＨｂＯ２）のヘモグロビン飽和ｐＯ２は５０％である）。本発明では、革新的デザインのアロステリック調節因子シャトル式リザーバによりこの問題を解決する。ナノ粒子の構造がその機能に与える影響を示すために、例示的酸素運搬剤として、ヘモグロビン、例示的なアロステリック調節因子として２，３−ＤＰＧ、及び例示的分岐ポリマーとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含有する粒子を検討する。ナノ粒子ペイロードは、ヘテロトロピックアロステリック調節因子分子（２，３−ＤＰＧ）を含有し、肺潅流中、２，３，−ＤＰＧはシェルに隔離され（高ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が増大し、Ｏ２捕捉が促進される）、かつ、全身潅流中、２，３−ＤＰＧは、シェルから放出される（低ｐＨにて。それによってＨｂＯ２親和性が低下し、Ｏ２放出が促進される）ように、ＨｂＯ２親和性が変化し；粒子コア中での２，３−ＤＰＧの遊離濃度は、ナノ粒子内側シェルへのｐＨ応答性結合によって調節する。生理学的必要性の設定値［肺病理学では、過呼吸によりｐＨが上昇し、Ｏ２の捕捉が増大し、組織低酸素を伴う場合、嫌気的代謝によりｐＨが低下し、Ｏ２の放出が増大する］において、この効果が増幅される。肺において循環性移行が完了し（または低酸素症が軽減するとき）、ｐＨが上昇すると、２，３−ＤＰＧは、ますますシェルと再結合し、それによって：１）肺中でのＯ２の負荷を促進させる及び２）組織Ｏ２負荷及びその分解物にｐ５０を連結させる。こうした生理学的応答性アロステリック調節因子リザーバ−シャトルにより、本開示の酸素運搬ナノ粒子をすべての酸素運搬ヘモグロビンと区別することが重要である。更に、本開示の酸素運搬ナノ粒子のデザインにより、このシャトルの態様をさらに洗練させるか、または「調整」することができ、これによりナノ粒子デザインを臨床状況に適合させる能力が付与される。
【００５９】
本開示のナノ粒子は、赤血球の酸素運搬特徴を模倣するように調節されてもよい。当該分野の当業者は、赤血球の酸素運搬特性がヘモグロビンの酸素−ヘモグロビン解離曲線によって示され得ることを理解するであろう。酸素−ヘモグロビン解離曲線では、血液中の酸素分圧に対する酸素飽和（ｓＯ２）をプロット（ｐＯ２）し、他の因子におけるｐＯ２の生理学的条件下での酸素に対するヘモグロビン親和性、ＣＯ２分圧（ｐＣＯ２）、ｐＨ、温度及びアロステリック調節因子の濃度について記載する。したがって、ナノ粒子は、実質的に、ヘモグロビンの酸素−ヘモグロビン解離曲線を模倣するように調節されてもよい。
【００６０】
ナノ粒子は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５または約４０ｍｍＨｇ以上の５０％飽和酸素運搬剤（ｐ５０）により、ナノ粒子を産生させるために調整されてもよい。好ましくは、酸素運搬ナノ粒子は、約２０ｍｍＨｇ、２５ｍｍＨｇまたは約３０ｍｍＨｇのｐ５０を有するナノ粒子を産生させるために調整される。また、好ましくは、酸素運搬ナノ粒子は、約２６ｍｍＨｇのｐ５０を有するナノ粒子を産生させるために調整される。ナノ粒子のｐ５０の調節方法としては、ナノ粒子の表面積を増大するか、または減少させるためにナノ粒子の形態を調節すること、ナノ粒子中のヘモグロビンなどの酸素運搬剤の濃度を調節すること、ナノ粒子中のヘモグロビンの酸化を制限するために還元剤の濃度を調節すること、ナノ粒子の中へのまたはナノ粒子外での酸素の拡散を制御するためにナノ粒子の外シェルを調節すること及びこれらを組み合わせたものを挙げることもできる。
【００６１】
ナノ粒子は、酸素運搬ナノ粒子のｐＨに対する応答性を向上させるために調節してもよい。ボーア効果とも称されるヘモグロビンのｐＨに対する応答性は、肺の高ｐＨ環境においてより効率の良い酸素結合が可能であり、かつ、脱酸素組織の低ｐＨ環境において、より効率の良い酸素の放出が可能である。ＰＨに対するナノ粒子の応答性を向上する方法としては、ナノ粒子のアロステリック調節因子の濃度の調整を挙げることもできる。こうしたアロステリック調節因子は、２，３−ＤＰＧであってもよい。
【００６２】
ナノ粒子は、メトヘモグロビンへのヘモグロビンの酸化を制限するために、調整してもよい。上述のとおり、ナノ粒子は、ナノ粒子中のメトヘモグロビン濃度をナノ粒子中のヘモグロビン全濃度に対して約１％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％未満、２０％以下に制限するために調整されてもよい。好ましくは、酸素運搬ナノ粒子は、ナノ粒子中のメトヘモグロビン濃度をナノ粒子中のヘモグロビン全濃度に対して約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％未満または約１５％以下に制限するために調整される。ヘモグロビン酸化の調節方法としては、ナノ粒子の表面積を増大するか、または減少させるためにナノ粒子の形態を調節すること、ナノ粒子の還元剤の濃度を調節すること及びこれらを組み合わせたものを挙げることができる。ヘモグロビンの酸化は、ロイコメチレンブルーまたはロイコベンジルメチレンブルーなど、還元剤の濃度を調整することによって、調整され得ることが好ましい。
【００６３】
また、ナノ粒子は、ＮＯ除去を制限するために、調整されてもよい。ＮＯは、哺乳類において重要な細胞内シグナル伝達分子であり、多くの生理学的工程及び病理学的工程に関与する。加えて、ＮＯは、強力な血管拡張薬である。ヘモグロビンは、酸素に対するヘモグロビンの結合活性と平行する結合活性を有するＮＯに結合する。制御しない状態で、ヘモグロビン系酸素担体は、ＮＯを隔離することができ、血管収縮をもたらし得る。ＮＯ除去を制限するための本開示の酸素運搬ナノ粒子の調整方法としては、酸素及びＮＯに曝露したナノ粒子の表面積を増大するか、または減少させるためにナノ粒子の形態を調整すること、ナノ粒子へのＮＯ拡散を制御するためにナノ粒子の外シェルを調整すること、全粒子径を調整すること、ペイロード密度を調整すること、またはこれらを組み合わせたものを挙げることもできる。当業者は、ナノ粒子を調整して、ナノ粒子中へのＮＯの拡散を制限することができるが、酸素運搬のための酸素拡散が可能であることは、理解されよう。例えば、外層の架橋程度を変更して、ナノ粒子によるＮＯ隔離範囲及び速度を調節することができる。
【００６４】
ナノ粒子シェルの調節方法としては、シェルの成分比、シェル成分の架橋、及びナノ粒子のシェルのＰＥＧ化を挙げることができる。シェルの成分、シェル成分の架橋の調節、及びナノ粒子のシェルのＰＥＧ化は、上述のとおりであってもよい。好ましくは、ナノ粒子のシェルは、シェル厚の増減、若しくは、疎水性または親水性の上昇または低下、及びシェルの架橋レベルまたはＰＥＧ化レベルの上昇または低下によって調節してもよい。更なる詳細は、実施例に提供される。
【００６５】
（ｇ）任意の分子
両凹型円板状の酸素運搬ナノ粒子は、標的部分、生物学的活性剤、造影剤、金属原子及び治療薬からなる群から選択される少なくとも１つの分子を更に含んでよい。分子は、水溶性または水不溶性であってもよい。分子は、ナノ粒子の水性内部コア内に含まれていてもよく、ナノ粒子の外シェルを含む両親媒性ポリマーの表面に共役結合されていてもよく、ナノ粒子の外シェルを含む両親媒性ポリマーの親水性領域内に共役結合されていてもよく、ナノ粒子の外シェルを含む両親媒性ポリマーの疎水性領域内に共役結合されていてもよい。また、２種以上の任意の分子を含むナノ粒子では、分子は、異なるナノ粒子の場所に局所化していてもよいことが想定される。一般に、標的部分は、ナノ粒子の外側シェルを含む両親媒性ポリマーの表面に共役される。本明細書で使用するとき、「共役」とは、共有結合または非共有結合のいずれかを意味する。非共有結合手段は、イオン結合、供与結合、水素結合、金属結合並びに静電相互作用、疎水性相互作用、及びファンデルワールス相互作用などを挙げることもできる。
【００６６】
ｉ金属原子
ナノ粒子に含有されるには、種々の金属原子が好適である。金属原子は、一般に、原子番号２０以上を有する原子で構成される金属原子族から選択され得る。例えば、金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオビウム原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジミウム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バークリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子またはローレンシウム原子であってよい。
【００６７】
ナノ粒子含有金属原子は、金属イオンであってもよい。金属原子は、＋１、＋２または＋３酸化状態の形態であってよい。例えば、非限定的例としては、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｐｂ２＋、Ｐｂ４＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋及びＺｎ２＋が挙げられる。金属イオンは、金属錯体、化合物またはキレート類を含んでもよい。例えば、金属原子は、ポルフィリン、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラメチルヘプタンジオナート（ＴＭＨＤ）、２，４−ペンタンジオン、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ、Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−三酢酸三ナトリウム塩（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）を有する錯体、キレートまたは化合物を含んでもよい。金属錯体、化合物、またはキレートは、オルガノ可溶性または水溶性であってもよい。好適なオルガノ可溶性錯体の非限定的例としては、ペンタンジオン−ガドリニウム（ＩＩＩ）、ビスマスネオデカノエート、イオヘキソール及び関連化合物並びに金のオルガノ可溶性錯体が挙げられる。例示的水溶性金属キレートまたは錯体としては、これらに限定されないが、Ｍｎ−ＤＴＰＡ、Ｍｎ−ポルフィリン及びＧｄ−ＤＴＰＡが挙げられる。
【００６８】
金属原子は、金属酸化物を含んでもよい。例えば、金属酸化物の非限定的例としては、酸化鉄、酸化マンガンまたは酸化ガドリニウムを挙げることができる。追加の実施例としては、マグネタイト、マグヘマイトまたはこれらを組み合わせたものを挙げることができる。金属酸化物は、式ＭＦｅ２Ｏ４を有し得る（式中、Ｍは、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｓｒまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される）。金属酸化物は、磁気性であってもよい。好ましくは、金属原子は、酸化鉄を含んでもよい。また、ナノ粒子は、金属酸化物及び本明細書に記載されているような追加の金属のいずれを含んでもよい。例えば、ナノ粒子は、金属酸化物及び例えばヨウ素、ガドリニウム、ビスマスまたは金など、追加の金属を含んでもよい。概して、ナノ粒子に含まれている金属酸化物は、直径が約１ｎｍ〜約３０ｎｍである。例えば、金属酸化物は、直径約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５または３０ｎｍであってもよい。
【００６９】
典型的には、ナノ粒子は、少なくとも、５０，０００個の金属原子を含む。ナノ粒子は、少なくとも１００，０００個、少なくとも１５０，０００個、少なくとも２００，０００個、少なくとも２５０，０００個、少なくとも３００，０００個、少なくとも３５０，０００個または少なくとも４００，０００個の金属原子を含んでもよい。
【００７０】
ｉｉ生物学的活性剤
また、酸素結合ナノ粒子は、酸素運搬ナノ粒子に加えて、少なくとも１つの生物学的活性剤を含んでもよい。好適な生物学的活性剤の非限定的例としては、医薬品、治療薬、診断薬、放射性同位元素、遺伝物質、タンパク質、炭化水素、脂質、核酸系材料及びこれらの組み合わせが挙げられる。生物学的活性剤は、ナノ粒子への組み込みまたは吸着を向上するために、その未変性形態であってもよく、または疎水性部分または荷電部分により誘導体化されていてもよい。したがって、生物学的活性剤は、水溶性であってもよく、または水不溶性であってもよい。上記に詳細に示すように、生物学的活性は、水性内部コア内に含まれていてもよく、外シェルを含む両親媒性ポリマーの表面に共役結合されていてもよく、外シェルを含む両親媒性ポリマーの親水性領域内に共役結合されていてもよく、または外シェルを含む両親媒性ポリマーの疎水性領域内に共役結合されていてもよい。
【００７１】
生物学的活性剤の非限定的例としては、免疫関連薬剤、甲状腺薬、呼吸系製剤、抗腫瘍薬、駆虫薬、抗マラリア薬、分裂阻害剤、ホルモン剤、抗原虫剤、抗結核剤、心血管製剤、血液製剤、生物応答修飾剤、抗真菌剤薬剤、ビタミン剤、ペプチド剤、抗アレルギー剤、抗凝固剤、循環器系作用薬、代謝増強剤（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒｓ）、抗ウイルス薬、抗狭心症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗リウマチ剤、麻薬、強心配糖体、神経筋遮断薬、鎮静剤、局所麻酔薬、全身麻酔薬、若しくは放射性原子または放射性イオン、を挙げることもできる。さらに、ナノ粒子は、２つまたはそれ以上の、３つまたはそれ以上の、若しくは、４つまたはそれ以上の生物学的活性剤を含んでもよい。
【００７２】
また、生物学的活性剤は、標的部分であってもよい（以下、参照のこと）。例えば、抗体、核酸、ペプチド断片、有機小分子または生物学的活性リガンドの模倣体は、特定のエピトープに結合するとき、例えば、アンタゴニストまたはアンゴニストなどの治療薬であってもよい。したがって、標的部分及び治療薬は、ナノ粒子を標的にするため及び治療薬を所望の部位へ投与するために機能する単一構成成分によって構成されてもよい。
【００７３】
ナノ粒子に組み込まれる治療薬の量は、変動してもよい。当業者は、負荷速度が、例えば、治療薬の種類及び目的の標的に依存するであろうことは理解するであろう。
【００７４】
ｉｉｉ．標的部分
両凹型円板状ナノ粒子は、標的部分を含んでもよい。標的部分は、ナノ粒子を特定部位または場所に向けるか、またはナノ粒子を特定部位または場所に標的にする。標的粒子としては、外シェル表面に共役結合される多種多様の標的部分を挙げることができ、これらに限定されないが、抗体、抗体断片、ペプチド、小分子、多糖、核酸、アプタマー、ペプチド模倣体、その他の模倣物質及び薬物を単独または組み合わせたものを挙げることもできる。標的部分は、ナノ粒子を細胞内エピトープ及び／またはレセプターに特異的に結合するために利用されてもよい。標的部分は、ナノ粒子に直接的にまたは間接的に共役結合されていてもよい。
【００７５】
標的部分とナノ粒子との直接共役とは、標的部分−ナノ粒子錯体の調製を意味し、イオン結合、静電相互作用、疎水結合または他の非共有結合手段のいずれかを介してナノ粒子表面に吸着される（例えば、アシル化−抗体または相補的核酸配列間でのハイブリダイゼーションを介して）か、または共役脂質の成分との共有結合を介して外シェル表面と化学的連結するか、または外シェルの両親媒性ポリマー中に内因的に取り込まれる（例えば、誘導されペプチド模倣薬となる脂質）。また、標的部分は、リンカー分子を介して、ナノ粒子に直接的に共役結合されていてもよい。リンカー分子が、ナノ粒子と標的部分との間に配置されるように、リンカー分子は、少なくとも２つの官能基を含む。
【００７６】
間接的共役結合とは、インビボにおいて、２つまたはそれ以上のステップにおいて、ナノ粒子と標的部分との間に錯体を形成することを指す。間接的共役結合では、化学的連結系を利用して、ナノ粒子の標的細胞または組織表面への密封された特異的付着を形成する。間接標的システムの非限定的例としては、アビジン−ビオチンが挙げられる。
【００７７】
ｉｖ．造影剤
両凹型円板状ナノ粒子は、更に、造影剤を含んでもよい。造影剤は、上記に詳細を示すように、金属原子を含んでもよく、または放射性核種であってもよい。好適な放射性核種の非限定的例としては、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３及び１３１、タリウム−２０１、ガリウム−６７、フッ素−１８、フルオロデオキシグルコース及びインジウム−１１１が挙げられる。また、造影剤は、フルオロフォアであってよい。好適なフルオロフォアとしては、これらに限定されるものではないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）及び近赤外（ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光染料が挙げられる。
【００７８】
（ｈ）好ましい実施形態
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約２５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）の酸素運搬剤分子を含んでもよい。酸素運搬剤対アロステリック調節因子及び酸素運搬剤対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中における酸素運搬剤全濃度の約１０％以下まで酸素運搬剤の酸化を制限し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約２５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。 
【００８３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、反応性基を有する分岐アミン含有ポリマーを含み、遊離反応性基の少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。分岐ポリマーは、ポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマーまたはグラフトポリマーであってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約４０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、ＭＷは１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上であってもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約５０％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上のＭＷを有していてもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に両凹型円板形状を有し、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層シェルを含み、かつ、ヘモグロビン、２，３−ＤＰＧのほか、ロイコメチレンブルー、アスコルビン酸塩及びグルタチオンからなる群から選択される還元剤を含むペイロードを有する。ペイロードは、ナノ粒子内部にある。両親媒性ポリマーは、ＰＥＩを含み、遊離第一級アミンの少なくとも約５５％が脂質に結合しているように、反応性基を介して、脂質に結合する。両親媒性ポリマー含有シェルの表面反応性基は、二官能性リンカーに架橋している。ナノ粒子の平均直径は、約１３０ｎｍ〜約３００ｎｍであってもよく、ナノ粒子の平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである。ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含んでいてもよい。ＰＥＩでは、１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ以上のＭＷを有していてもよい。脂質は、パルミチン酸またはＣ２４−ペンタコサジイン酸であってもよい。ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン分子を含み得る。ヘモグロビン対アロステリック調節因子及びヘモグロビン対還元剤の比率は、ほぼ独立して、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１及び１０：１からなる群から選択してもよい。ナノ粒子デザインにより、潅流中、正常／異常なヒト生理学（例えば、組織ｐＯ２は、４０〜５Ｔｏｒｒの範囲である）にあるＯ２分圧／勾配全体に、Ｏ２を効率よく放出することができる。ナノ粒子は、実質的に一酸化窒素を隔離することはできない。ナノ粒子は、ナノ粒子中におけるヘモグロビン全濃度の約１０％以下までヘモグロビンの酸化を制限し得る。
【００８７】
ＩＩ．酸素運搬ナノ粒子調製方法
本開示の別の態様は、自己組織化された、実質的に凹部円板状であるナノ粒子集団の調製方法である。概して、方法は、両親媒性ポリマーを形成すること；非極性溶媒中に両親媒性ポリマーを含む複数個の反転ミセルを形成すること；極性溶媒中に酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含むペイロードを懸濁すること；及びペイロードを攪拌によって反転ミセルを含む有機層に移行すること；及び反転ミセル自己組織化して、実質的に、両凹型円板状ナノ粒子とすることを含む。ナノ粒子は、ＰＥＧ化されていてもよい。あるいは、ナノ粒子は、架橋されていてもよい。更に別の代替形態では、ナノ粒子は、ＰＥＧ化及び架橋されていてもよい。
【００８８】
（ａ）両親媒性ポリマーの形成
本開示の粒子調製方法は、一部、両親媒性ポリマーを形成することを含む。概して、方法には、共有結合により両親媒性脂質が分岐ポリマーに共役された疎水的修飾された分岐ポリマーを含む。好適な分岐ポリマー及び両親媒性脂質は、上記セクションＩに詳細に記載されている。上記のように、分岐ポリマーは、遊離反応性基を含む。遊離反応性基は、アミン基であってもよい。
【００８９】
概して、ポリマーの少なくとも２５％の遊離反応性基は、両親媒性脂質と連結している。例えば、ポリマーの遊離反応性基の約２５％〜約５５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約３０％〜約５５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約３５％〜約５５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約４０％〜約５５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約４５％〜約６０％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約５０％〜約６５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約５５％〜約７０％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約６０％〜約７５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約６５％〜約８０％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約７０％〜約８５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約７５％〜約９０％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約８０％〜約９５％が脂質に連結し、ポリマーの遊離反応性基の約８５％〜約１００％が脂質に連結する。あるいは、約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のポリマーの遊離反応性基が脂質に連結する。ポリマー対脂質のモル比は、通常、約１：０．４〜約１：０．８である。一般に、ポリマー対脂質のモル比は、約１：０．４、１：０．４５、１：０．５、１：０．５５、１：０．６、１：０．６５、１：０．７、１：０．７５または１：０．８であってよい。
【００９０】
脂質とポリマーとの共役結合方法は、当技術分野において既知であり、かつ、実施例に詳細に記載されている。要約すると、ポリマーの活性基は、脂質の活性基と共有結合を形成する。好適なポリマー活性基については、上記に記載している。脂質は、ポリマー活性基との結合を形成する（すなわち、直接共役）ために、好適な活性基を含んでいてもよいか、または、好適な活性基を付与するために、リンカーで処理されてもよい（すなわち、間接共役）。活性基の非限定的例としては、エポキシド、カルボキシレート、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル、アルデヒド、ヒドラジン、マレイミド、メルカプタン、アミノ基、ハロゲン化アルキル、イソチオシアネート、カルボジイミド、ジアゾ化合物、トレシルクロリド、トシルクロリド、プロパルギル、アジド及びトリクロロＳ−トリアジンを挙げることもできる。一般に、反応性基は、光反応性基であってもよく、光と接触すると、活性化させることができ、また、共有結合によりポリマー反応性基に付着させることができる。例示的光反応性基としては、アリールアジド、ジアザレン、β−カルボニル及びベンゾフェノンを挙げることもできる。反応種は、ニトレン、カルベン及びラジカルである。これらの反応種は、概して、共有結合形成が可能である。反応性基は、カルボキシル基及びアミン基であることが好ましい。
【００９１】
（ｂ）複数個の反転ミセルの形成
ナノ粒子の調製方法は、更に、一部、複数個の反転ミセルを形成することを含む。概して、上記セクションＩＩ（ａ）の両親媒性ポリマーと非極性溶媒との混合物の攪拌によって、単分子反転ミセル（すなわち、逆ミセル）が形成される。典型的には、非極性溶媒中の両親媒性ポリマーの濃度は、約１０−７〜約１０−５Ｍである。一般に、両親媒性ポリマーの濃度は、約１０−６Ｍである。
【００９２】
非極性溶媒は、有機物質であってもよい。非極性溶媒の非限定的例としては、アセトン、メチルアセタート、エチルアセテート、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン及びクロロホルムを挙げることもできる。例示的溶媒は、クロロホルムまたはジクロロメタンであってもよい。
【００９３】
混合物は、物理的反転、ボルテックス、混合、振盪、超音波処理、撹拌または他の類似手段を介して攪拌されてもよい。典型的には、混合物は、約１分間〜約１０分間攪拌されてもよいが、さらに長い攪拌時間が可能であってもよい。混合物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分以上、攪拌されてもよい。概して、約４℃〜ほぼ室温で攪拌が行われる。
【００９４】
（ｃ）ペイロードの反転ミセル含有有機層への移行
ナノ粒子は、ペイロードを含有し、このペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む。酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤は、上記セクションＩ（ｆ）に記載されるようであってよい。ペイロードは、水性溶媒と混合し、混合物は、反転ミセルの非極性溶媒混合液に添加し、二相性混合物がもたらされる。二相性混合物は、必要に応じて沈下させ、次いで、攪拌することによってペイロードを反転ミセル含有有機層に移す。典型的には、最小の攪拌のみが必要とされ、かつ、物理的転化及び／または旋回または振盪は、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を逆ミセル内部に移動させるのに十分である。攪拌は更に、高せん断混合によって行われてもよい。高せん断攪拌の非限定的例としては、微流動化、音波処理、均質化または関連する混合を挙げることもできる。水性溶媒は、セクションＩＩ（ｄ）に記載されている極性溶媒であってよい。
【００９５】
（ｄ）両凹型円板状ナノ粒子の自己組織化
上記セクションＩＩ（ｃ）において、ペイロードを含有する複数の反転ミセル形成後、本開示の方法は、反転ミセルの実質的に両凹型円板状ナノ粒子への自己組織化を含む。概して、方法には、熱及び溶媒系の存在下において、反転ミセルを攪拌することを含む。
【００９６】
攪拌中の温度は、一部、得られたナノ粒子のサイズによって決定する。典型的には、温度が上昇すると、ナノ粒子サイズが増大する。攪拌中の温度は、約３０℃〜約６５℃の範囲であってよい。例えば、温度は、約３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃であってよい。
【００９７】
混合物は、物理的手段または音響手段を介して攪拌されてもよい。例えば、混合物は、物理的反転、ボルテックス、混合、振盪、超音波処理または他の類似手段によって攪拌されてもよい。好ましくは、混合物は、高せん断混合によって攪拌されてもよい。概して、反転ミセルは、約１５分間〜約９０分間、約３０分間〜約６０分間または約２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間または７０分間、攪拌される。
【００９８】
反転ミセルは、典型的には、溶剤系の存在下において熱により攪拌される。溶媒系は、極性溶媒及び非極性溶媒をいずれも含む。例えば、極性溶媒は、水性溶媒であり、非極性溶媒は有機溶媒である。一例として、非極性溶媒は、上記セクションＩＩ（ｂ）で使用される非極性溶媒であってよく、また、水性溶媒を短時間攪拌し、非極性溶媒に添加してもよい。極性溶媒と非極性溶媒との間に適切な比率を得るために、非極性溶媒を混合物から蒸発させてもよい。極性溶媒対非極性溶媒の重量比は、約１：５であってよい。例示的極性溶媒は、メタノールであってよく、例示的非極性溶媒は、クロロホルムであってもよい。
【００９９】
極性溶媒と非極性溶媒との間に適切な比率を得るために、非極性溶媒は、混合物から蒸発させてもよい。蒸発は、減圧下にて行ってもよい。概して、選択される圧力は、一部、非極性溶媒に依存する。減圧は、約３５０ｍｂａｒ〜１０００ｍｂａｒの間、または約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または９５０ｍｂａｒであってよい。非極性溶媒がクロロホルムである場合、減圧は、約４００〜約５００ｍｂａｒの間であってよい。例えば、減圧は、約４００ｍｂａｒ〜約４５０ｍｂａｒの間、または約４２０ｍｂａｒ〜約４４０ｍｂａｒの間であってよい。
【０１００】
（ｅ）任意の分子
ナノ粒子は、標的部分、生物学的活性剤、造影剤、金属原子及び治療薬からなる群から選択される少なくとも１つの分子を更に含んでよい。好適な分子は、上記に詳細に記載されている。これらの分子は、ナノ粒子のシェル表面に共役結合されていてもよいか、または、ナノ粒子内部に含まれていてもよい。
【０１０１】
分子は、ナノ粒子のシェル中に組み込まれていてもよい。このような分子を組み込むためには、標的部分、生物学的活性剤、造影剤、金属原子または治療薬は、典型的には、上記セクションＩＩ（ｂ）に記載されている非極性溶媒中において、複数個の反転ミセルを含む混合物に添加される。混合後、分子は、水相から有機相への相転移によってミセル中に組み込まれる。その結果、自己組織化後、分子は、ナノ粒子のシェル中に組み込まれる。
【０１０２】
水溶性生物学的活性剤、造影剤、金属原子または治療薬は、ナノ粒子の水性コア部中に組み込まれてもよい。こうした分子を組み込むために、生物学的活性剤、造影剤、金属原子または治療薬は、反転ミセルの内部に移動させてもよい。例えば、複数個のミセル形成後ではあるが、ナノ粒子の自己組織化前に、複数個のミセルが、非水溶性分子と混合してもよい。混合物は、攪拌されてもよく、その結果として、水溶性分子は、反転ミセルの内部に移動し、かつ、その結果として、反転ミセルの自己組織化後、ナノ粒子の水性コア部に移動する。典型的には、最小の攪拌のみが必要とされ、物理的反転は、水溶性分子を逆ミセルの内部に移動させるのに十分である。
【０１０３】
また、水不溶性の標的部分、金属原子、生物学的活性剤、造影剤、または治療薬は、ナノ粒子のシェルの両親媒性ポリマーの疎水性領域内に配置されてもよい。このような分子を組み込むためには、水不溶性分子は、有機非極性溶媒に溶解させてもよく、また、反転ミセルと混合させてもよい。その結果として、反転ミセルの自己組織化後、水不溶性分子は、両親媒性ポリマーの疎水性領域に移動する。
【０１０４】
標的部分、生物学的活性剤、造影剤、金属原子または治療薬で、両親媒性ポリマーの親水性領域内またはナノ粒子外表面に配置されてもよい。分子は、両親媒性ポリマーへの非共有結合または共有結合による結合を介して、表面に吸着してもよい。例えば、分子は、共有結合、供与結合、イオン結合、水素結合またはファンデルワールス結合を介して、ナノ粒子の表面に結合してもよい。
【０１０５】
（ｆ）架橋
ナノ粒子の自己組織化後、シェルは、架橋されていてもよい。上記に詳細に記述するとおり、架橋を用いて、酸素及び治療用分子の放出速度を変更することができる。あるいは、架橋を使用して、ナノ粒子の安定性を増大させることができる。粒子は、外シェルの表面上に架橋されていてもよく、または外シェル内で架橋されていてもよい。架橋は、化学的架橋または光化学架橋であってもよい。当該技術分野において、架橋方法は公知である。要約すると、好適な架橋剤は、両親媒性ポリマーの１つ以上の活性基と反応する。架橋剤は、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性であってよい。架橋剤は、化学的架橋または非化学的架橋であってもよい。好適な化学的架橋剤としては、グルタルアルデヒド、ビス−カルボン酸スペーサーまたはビス−カルボン酸活性エステルを挙げることもできる。光化学架橋は、ポリジアセチレン（ｐｏｌｙｄｉａｃｅｔｙｌｉｎｉｃ）結合の紫外線架橋によって得られてもよい。当該分野の当業者は、好適な架橋剤は、ナノ粒子の組成及び使用目的に応じて変更し得ると理解している。
【０１０６】
（ｇ）ＰＥＧ化
本開示の粒子は、ＰＥＧ化され得る。本明細書で使用するとき、「ＰＥＧ化」は、外シェルにポリエチレングリコールを添加することを意味する。ＰＥＧ化方法は、当技術分野においてよく知られており、かつ、実施例に詳細に記載されている。ＰＥＧ化を用いて、ナノ粒子のゼータ表面電荷を減少させることができる。別の方法を記載すると、ＰＥＧ化を使用して、ナノ粒子の近接する中性面を付与することができる。ＰＥＧ化を使用して、ナノ粒子のインビボ循環を変更することができる。
【０１０７】
（ｈ）滅菌及び凍結乾燥
インビボで適用するには、ナノ粒子組成物の無菌性は重要である。滅菌は、当該技術分野において公知の任意の方法を介して達成されてもよく、提供された方法により、粒子の安定性及び／またはＯ２結合／放出に大きく影響が及ぶことはない。例えば、ナノ粒子組成物または溶液は、孔径０．２２μｍ以下の膜を介して濾過滅菌されてもよい。好適な膜の非限定的例としては、疎水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性のＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）（ポリフッ化ビニリデン）及びポリエーテルスルホンが挙げられる。各膜の濾過効率は、適用され、かつ、回収した容積、粒径及び／またはゼータ電位を比較することによって、測定され得る。
【０１０８】
バッファ懸濁液中のナノ粒子アリコートは、乾燥粉末にしてもよく、凍結防御物質の有無にかかわらず、凍結乾燥粉末として、不活性ガス下で密閉し得る。好ましくは、アリコートの懸濁液は凍結乾燥し、当該技術分野において公知のその他の方法を使用してもよい。好適な不活性ガスは、当技術分野において既知であり、また、これに限定されないが、アルゴンを挙げることもできる。同様に、好適な抗凍結剤（ｃｙｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）は、当技術分野において既知であり、かつ、これに限定されないがソルビトールを挙げることができる。再構成アリコートについては、本明細書に記載されているように、変更した粒径、ゼータ電位、ｐＨ、粘度、滅菌及び／またはＯ２解離に関して、評価され得る。受入れ保管条件、満期及び公開明細書は、ベースライン特性からの変動が、２０％未満、より好ましくは１５％未満、更により好ましくは１０％未満であることを示す。凍結乾燥粉末は、使用目的及び／または患者の循環血液量の状態に適合させる方法で、再構成されてもよい。例えば、本開示のナノ粒子を含む血液代用組成物は、正常血液量の貧血症患者に投与する更に濃度の高い方法で、または出血を伴う血液量減少患者に投与する更に希釈された方法で、構成され得る。
【０１０９】
ＩＩＩ．ナノ粒子含有血液代用組成物
本開示の更なる態様は、本開示のナノ粒子を含む血液代用組成物を包含する。典型的には、ナノ粒子は、インビボ、インビトロ、インサイチュまたはエクスビボの血液代用剤として使用するために、組成物として配合される。
【０１１０】
血液代用剤ナノ粒子は、ナノ粒子を任意の賦形剤及び好適な希釈剤と混合することによって配合され得る。希釈剤中のナノ粒子濃度は、用途に応じて変化し得る。好ましくは、ナノ粒子の濃度は、約４ｘ１０１２〜６ｘ１０１２ナノ粒子／ｍｌであってよい。
【０１１１】
複数個のナノ粒子を含む組成物は、ナノ粒子含有凍結乾燥組成物などの乾燥粉末であってもよい。あるいは、複数個のナノ粒子含有組成物は、溶液、混合物または懸濁液であってもよい。懸濁液の非限定的例は、コロイドである。概して、コロイドは、容易に懸濁液が沈降することのない微細な微粒子の懸濁液である。乾燥粉末は、例えば凍結乾燥など、既知の技術に従って、ナノ粒子を形成してもよい。次に、ナノ粒子含有乾燥粉末は、水溶液と混合して、液体血液代用剤を作製することによって再構成され得る。
【０１１２】
組成物は、配合され、患者の血液の酸素運搬能力を補充する幾つかの異なる手段によって、対象に投与されてもよい。このような組成物は、一般に、所望の場合、従来の無毒性医薬上許容可能な担体、アジュバント、賦形剤及びビヒクルを含む製剤を、血管内投与形態で投与され得る。
【０１１３】
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤及び沈殿防止剤を用いて、周知の技術に従って調製され得る。また、滅菌注射用製剤は、無毒性非経口投与用希釈剤または溶媒の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液、乳酸リンガー溶液及び生理食塩液である。加えて、滅菌不揮発性油は、通常、溶媒または懸濁媒質として用いられる。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドなど、任意の無刺激不揮発性油を用いてもよい。加えて、脂肪酸、例えばオレイン酸は、注射用製剤に有用である。ジメチルアセトアミド、イオン性及び非イオン性洗剤などの界面活性剤、並びにポリエチレングリコールは使用可能である。例えば上述したものなど、溶媒混合物及び湿潤剤もまた有用である。
【０１１４】
ＩＶ．酸素運搬ナノ粒子の使用方法
本開示の別の態様は、本開示の両凹部形状酸素運搬ナノ粒子の使用方法を包含する。本質的には、酸素運搬ナノ粒子は、酸素を送達させることができる。したがって、酸素運搬ナノ粒子は、Ｏ２レベルの迅速な回復、Ｏ２レベルの上昇、または、Ｏ２レベルの置き換えが臨床上指示される必要のある対象に酸素を運搬するために使用することができる。酸素運搬ナノ粒子は、対象の血液の酸素運搬能力を補充するため、血液を必要とする対象に処置するため、または患者において輸血を行うために使用することができる。典型的には、ナノ粒子は、セクションＩＩＩに記載されているように、インビボ、インビトロ、インサイチュまたはエクスビボの組成物として配合される。
【０１１５】
ナノ粒子組成物は、酸素を生物学的組織に送達させるために、対象に投与されてもよい。好適な対象としては、これらに限定されるものではないが、哺乳類、両生類、爬虫類、鳥類及び魚類が挙げられる。好適な哺乳類としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、ウマ、ネコ及びイヌが挙げられる。
【０１１６】
本明細書で使用するとき、生物学的組織は、細胞、器官、腫瘍若しくは細胞、臓器または腫瘍と関連している物質、例えば血餅を指す。好適な組織としては、これに限定されないが、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、骨、膵臓、胆汁膀胱、腎臓、肝臓、腸、皮膚、子宮、膀胱、眼、リンパ節、血管、及び血液並びにリンパ構成要素を挙げることもできる。
【０１１７】
本開示の酸素運搬ナノ粒子を使用して酸素を送達する多数の設定により、以下などの使用を見出す：
【０１１８】
外傷。全血の急性損失は、間質空間及び細胞内空間からの体液の移動をもたらして、血液損失量と取って代わることができ、皮膚及び腸など優先度の低い器官から血液を迂回させる。器官からの血液を迂回させることにより、これらの器官では、Ｏ２レベルが低下し、時には、Ｏ２レベルが消失し、その結果、進行性組織死となる。
【０１１９】
虚血。虚血では、ある特定の器官（複数可）では酸素が「不足」している。梗塞として知られているが、Ｏ２の欠乏により小器官のわずかな部分の死が始まる。Ｏ２レベルの迅速な回復が重大な意味を持ち、決定組織において梗塞の形成が始まる。虚血となる状態としては、心臓発作、脳卒中または脳血管の外傷が挙げられる。
【０１２０】
血液希釈：この臨床応用では、手術前に除去される血液を置き換えるには、血液代用剤が必要とされる。患者の脱血が発生したときに、手術後の同種輸注の必要がなくなると考えられている。この用途において、血液代用剤を投与して、取り出した自家血液のＯ２レベルに置き換える（または代用する）。これにより、手術中及び手術後の輸注に必要であるために取り出した自家血液の使用が可能になる。手術前の脱血を必ず伴うこうした手術の１つは、人工心肺手法である。
【０１２１】
敗血症性ショック。重篤な敗血症では、大量輸液療法及び血管収縮（ｖａｓｏｃｏｎｔｒｉｃｔｏｒ）薬による治療にもかかわらず、一部の患者は、高血圧性となり得る。この例では、一酸化窒素（ＮＯ）の過剰産生によって、血圧が最低値となる。このため、ヘモグロビンは、こうした患者の治療にとって、ほぼ理想的な薬剤である。これは、ヘモグロビンがＯ２と類似している結合活性を有するＮＯと結合するためである。
【０１２２】
癌。腫瘤の低酸素内部コアへＯ２を送達させることにより、放射線療法及び化学療法に対するその感度が増大する。腫瘍の微小血管系は、その他の組織のものとは異なるため、Ｏ２レベルの上昇による増感には、低酸素コア内で無負荷であるＯ２を必要とする。換言すれば、ｐ５０は、初期のＯ２の無負荷を阻止するのに非常に低くなければならず、その後の放射線療法処置及び化学療法処置に対して、最適の腫瘍感度を確保するには、Ｏ２レベルを上昇させる。
【０１２３】
慢性貧血。これらの患者では、損失または代謝されたヘモグロビンの置換は、損なわれるか、または完全に欠失する。血液代用剤は、患者において、効果的に還元Ｏ２レベルを置き換えるか、または上昇させる必要があると考えられている。
【０１２４】
鎌状赤血球貧血。鎌状赤血球貧血では、患者は、鎌状化工程中に発生するＯ２レベルの低下並びに非常に高い赤血球代謝率によって衰弱する。鎌状化工程は、ｐＯ２の関数であり、ｐＯ２が低くなるほど、鎌状化率が高くなる。理想的な血液代用剤により、鎌状化が発生している間、患者のＯ２レベルが正常範囲まで回復すると考えられている。
【０１２５】
心臓麻痺。ある心臓外科的処置では、適切な電解質（ｅｌｅｃｔｒｏｃｙｔｅ）液及び患者温度の低下により心臓が停止する。任意の通常の生理学的条件下で、温度が低下すると、ｐ５０が有意に低下し、おそらくＯ２の無負荷を阻止する。こうした処置の間、組織損傷及び組織死の低減の可能性があることから、Ｏ２レベルの置き換えが考えられる。
【０１２６】
低酸素症。軍人、高地居住者及び極限条件下の超一流アスリートは、肺における空気からのＯ２の抽出が制限されるため、還元Ｏ２レベルとなる場合もある。Ｏ２抽出が制限されることにより、Ｏ２輸送が更に制限される。血液代用剤は、このような各個人において、Ｏ２レベルが置き換わるか、または上昇させられ得ると考えられている。
【０１２７】
臓器潅流。エクスビボにて臓器が維持される時間、Ｏ２含量の維持は、構造及び細胞の完全性を保持し、かつ、梗塞の形成を最小限に抑えるために、必須である。血液代用剤により、このような臓器のＯ２要件が持続されることになると考えられている。
【０１２８】
細胞培養。この要件では、Ｏ２消費速度が更に速い点を除いて、臓器潅流と実質上同一である。
【０１２９】
造血。血液代用剤は、造血中、新規ヘモグロビンの合成に使用するためのヘム及び鉄供給源として機能すると考えられる。
【０１３０】
本開示は、非ヒトにおいても更に使用され得る。本開示の方法及び組成物は、飼育家畜、例えば食用家畜及びコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、鳥、爬虫類）、並びに水族館、動物園、海洋水族館及び動物を収容する他の設備の他の動物と共に使用してもよい。本開示により、傷害、溶血性貧血などによる失血の認められる家畜及び野生動物の非常治療における有用性が明らかになると考えられている。例えば、本開示の実施形態は、馬伝染性貧血、ネコ感染性貧血、化学物質及び他の物理的因子による溶血性貧血、細菌感染、第ＩＶ因子染色体断片化、脾機能亢進症（ｈｙｐｅｒｓｐｌｅｎａｔｉｏｎ）及び脾腫、家禽における出血症候群、再生不良性貧血、無形成性貧血、特発性免疫性溶血性状態、鉄欠乏、同種免疫溶血性貧血、細血管性溶血性貧血、寄生の病態において有用であると考えられている。特に、本開示により、供血する稀少動物及び／または外来種を見出すのは困難である領域での使用が明らかになる。
【０１３１】
定義
本明細書で使用するとき、用語「アロステリック調節因子」とは、酸素が酸素担体と結合するか、または酸素が酸素担体から放出される速度または量を調節する分子を意味する。
【０１３２】
本明細書で使用するとき、語句「ナノ粒子の外側」とは、ナノ粒子の外シェル及びナノ粒子シェルの外層と共有結合または非共有結合により付着している任意の構成成分（複数可）、若しくはナノ粒子シェルの外層内の任意の構成成分（複数可）を指す。例えば、ナノ粒子の外側は更に、任意の分子を含んでもよい。
【０１３３】
本明細書では、用語「ヘモグロビン」は、一般に、酸素を輸送する赤血球内に含まれてもよいタンパク質を指すために使用される。ヘモグロビンの各分子は、４つのサブユニット、２本のα鎖及び２本のβ鎖を有し、四量体構造内に配置されている。また、各サブユニットは、１つのヘム基を含有し、酸素と結合する鉄含有中心部である。したがって、各ヘモグロビンは、４つの酸素分子と結合することができる。用語「ヘモグロビン」は、天然または合成ヘモグロビンを指す。ヘモグロビンは、ヒトまたは動物から単離し精製されたものでよく、若しくは、化学合成技術及び組み換え技術によって作製されてもよい。
【０１３４】
本明細書で使用するとき、用語「ヘモグロビン非含有間質」とは、全ての赤血球膜が除去されるヘモグロビンを指す。
【０１３５】
本明細書で使用するとき、用語「血流力学パラメーター」は、血圧、血流及び血量状態を示す測定値、例えば、血圧、心拍出量、右心房圧及び左心室末端の拡張期圧などの測定値などを幅広く指す。
【０１３６】
本明細書で使用するとき、語句「ナノ粒子の内部」とは、ナノ粒子外側部ではないナノ粒子の任意の部分を指す。ナノ粒子内部は、ナノ粒子シェルの内層、ナノ粒子シェルの内層と外層との間の疎水性領域、水性コア部及びペイロードを含む。また、ナノ粒子の内側は、任意の分子を含んでもよい。
【０１３７】
本明細書で使用するとき、用語「メトヘモグロビン」とは、第二鉄状態の鉄を含有し、酸素担体として機能することのできないヘモグロビンの酸化形態を示す。
【０１３８】
本明細書で使用するとき、用語「ペルフルオロカーボン」は、フッ素原子を含有し、完全にハロゲン（Ｂｒ、Ｆ、Ｃｌ）及び炭素原子からなる合成不活性分子を指す。乳化形態では、ペルフルオロカーボンは、血漿または水の等価量よりも数倍多い酸素を溶解する能力を有するため、血液物質として発現している。
【０１３９】
用語「修飾ヘモグロビン」としては、これらに限定されないが、他の化学基（例えば、ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）、又はタンパク質、ペプチド、炭化水素、合成ポリマーなどの他の付加物）との分子内架橋及び分子間架橋、遺伝子操作、重合、共役結合などの化学反応によって変化したヘモグロビンが挙げられる。本質的には、任意のその構造的性質または機能的性質が、その未修飾状態から変化している場合は、ヘモグロビンは、「修飾されている」。本明細書で使用するとき、用語「ヘモグロビン」自体は、未変性、未修飾ヘモグロビン並びに修飾ヘモグロビンをいずれも指す。
【０１４０】
用語「ナノ粒子」及び「酸素運搬ナノ粒子」は、本出願全体において同義に用いられる。
【０１４１】
用語「酸素親和性」とは、酸素担体、例えばヘモグロビンが分子酸素に結合する結合活性を示す。この特性は、ヘモグロビン分子と酸素（Ｙ軸）の飽和程度と酸素分圧（Ｘ軸）との関連である酸素平衡点曲線によって定義される。この曲線の位置は、酸素分圧ｐ５０値（酸素担体の酸素が半分飽和状態である）によって表され、酸素親和性と逆相関の関係にある。従って、ｐ５０が低くなるほど、酸素親和性は高くなる。全血の酸素親和性（及び全血構成成分、例えば、赤血球及びヘモグロビンなど）は、当該技術分野において公知の種々の方法によって測定され得る（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２（７）：２３３１−３７（１９７７）参照をされたい）。酸素親和性は、また、市販のＨＥＭＯＸ（登録商標）アナライザー（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ，Ｐａ．）を使用して測定されてもよい（例えば、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ  ａｎｄ  Ｓｈｒａｇｅｒ  ｉｎ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ｅｖｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，編）２３２：４６０（１９９４）を参照されたい）。
【０１４２】
用語「酸素運搬能力」または単に「酸素能力」とは、酸素を運搬する血液代用剤の能力を意味するが、必ずしも酸素を送達する効率と相関があるものではない。ヘモグロビン１グラムは、酸素１．３４ミリリットルに結合することが公知であることから、酸素運搬能力は、概して、ヘモグロビン濃度から求める。したがって、ヘモグロビン濃度（単位ｇ／ｄｌ）に因子１．３４を掛けると酸素能力となる（単位ｍｌ／ｄｌ）。ヘモグロビン濃度は、β−ヘモグロビン光度計（ＨｅｍｏＣｕｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｇｅｌｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するなど、任意の既知の方法によって測定され得る。同様に、酸素能力は、例えば、燃料電池器具（例えば、Ｌｅｘ−Ｏ２−Ｃｏｎ；Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いることによって、ヘモグロビンサンプルまたは血液サンプルからの酸素放出量によって測定され得る。
【０１４３】
用語「酸素運搬構成成分」は、幅広く、酸素を体内循環系に運搬することができ、かつ、その酸素の少なくとも一部を組織に送達することができる物質を指す。酸素運搬構成成分は、未修飾または修飾ヘモグロビンであってもよく、また、本明細書においては、「ヘモグロビン系酸素担体」または「ＨＢＯＣ」と称し得る。
【０１４４】
用語「ペイロード」とは、ナノ粒子内部に含まれる構成成分を意味する。ペイロードは、酸素運搬剤、調節因子及び還元剤を含む。ペイロードが、任意の分子を更に含んでもよい。
【０１４５】
用語「シェル」及び「二層状シェル」は、同義的に使用され、一般に、ナノ粒子のシェルを指す。シェルは、二層状であり、親水性の外層及び親水性の内層並びに層間の疎水性領域から構成される。
【０１４６】
本開示に詳細に記載されているように、添付の特許請求の範囲で定義される本開示の範囲を逸脱することなく、変更形態及び変形形態が可能であることは明かである。
【実施例】
【０１４７】
以下の実施例は、本開示を実証するために示す。以下実施例に開示されている技術は、本開示の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を示すことは、当該分野における当業者によって理解されるものとする。しかし、当該分野の当業者は、本開示を考慮すれば、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示において多くの変更がなされ、また、同様または類似の結果を得ることができ、このため、明らかになっているすべての事項は、制限するものではなく、例証として解釈されるものであることは、理解している。
【０１４８】
実施例１  ナノ粒子の調製
両凹型ナノ粒子の調製及び負荷は、すべて、参照によって、それらの全体が本明細書に組み込まれている、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：９１８６−９１８７、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９４１４及び米国公開番号２０１０／０２９７００７にて記載されているとおりである。粒子の略図及びナノ粒子の調製は図１に示す。
【０１４９】
ポリエチレンイミンポリマーは、疎水性アルキル基と共有結合手段によりグラフト重合させた。パルミチン酸は、カルボジイミドＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で活性化し、その後、ポリマーを付加して、遊離第一級アミン基の５０％超を官能基化させる。両親媒性ポリマーは、ボルテックス後の有機溶媒中における粒径７〜１０ｎｍの単分子反転ミセル構造体であると想定される。
【０１５０】
ヘモグロビン、ヘモグロビンと２，３−ＤＰＧまたはヘモグロビン、２，３−ＤＰＧ及びロイコメチレンブルーまたはロイコベンジルメチレンブルーは、ナノ粒子に負荷した。ナノ粒子は、ヘモグロビン、ヘモグロビンと２，３−ＤＰＧまたはヘモグロビン、２，３−ＤＰＧ及びロイコメチレンブルーまたはロイコベンジルメチレンブルーを含有する溶液をナノ粒子の水溶性懸濁液に添加することによって負荷し、続いて、短時間振盪／旋回させる。
【０１５１】
ヘモグロビンは、呼気ＲＢＣから抽出され、精製されたヒトヘモグロビンであった。ヘモグロビンは、カルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯ）として安定化させ、イオン−交換クロマトグラフィーを介して精製し、限外濾過法を用いて、４．０ｇ／ｄＬに濃縮した。ナノ粒子の産生に使用したヘモグロビンの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。２，３−ＤＰＧの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。ロイコメチレンブルーまたはロイコベンジルメチレンブルーの濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり平均３４８８個のヘモグロビン分子を含んでいた。
【０１５２】
他の方法のなかでもＴＥＭ、ＤＬＳ及びＡＦＭによってナノ粒子径、形状及び形態を測定した。ナノ粒子は、再懸濁後、流体力学的径１５０〜１８０ｎｍまたは１７３±１０ｎｍ、多分散度０．２６±０．０１及びゼータ電位１２±２ｍＶ以下であった。Ｐａｎ  Ｄ，  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＳＤ，  Ｈｕ  Ｇ，  Ｓｅｎｐａｎ  Ａ，  Ｓｃｏｔｔ  ＭＪ，  Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ，  Ｗｉｃｋｌｉｎｅ  ＳＡ，  Ｌａｎｚａ  ＧＭ．Ｌｉｇａｎｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｂｉａｌｙｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ.Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００８；１３０：９１８６−９１８７に記載されているように、分析を行った。
【０１５３】
自己組織化後、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、ＰＢＳ、ｐＨ８．５）を用いて、ヒドロキシルアミンと組み合わせて、５時間、３７℃にて表面化学的架橋を行う。架橋により、粒径及びゼータ電位（それぞれ、１６７±５６ｎｍ、＋７±２ｍＶ）への影響が制限されている。
【０１５４】
実施例２  標識及び非標識ナノ粒子の酸素結合特性
ロイコベンジルメチレンブルーで標識され作製されたナノ粒子または非標識ナノ粒子は、水中で再懸濁され、酸素結合特性を特徴付けるために使用される。ナノ粒子は、概して、実施例１に記載されているように、産生した。得られた溶液は、全濃度５ｘ１０１２ナノ粒子／ｍｌ、及び糖化ヘモグロビン２ｇ／ｌとした。
【０１５５】
Ｈｅｍｏｘアナライザーを使用して、ｐＨ１０、８、６及ｐＨ８．５にて、ナノ粒子の酸素結合解離の特徴付けを行った。測定値はすべて、３７．３℃にて求めた。一般に、非標識粒子は、標識ナノ粒子よりも（図２及び表１）低いｐＨにて、著しく高いｐ５０値（酸素については低親和性）を示した。
【０１５６】
いずれのｐＨ測定値においても、ナノ粒子のｐ５０は、概して、ヒト血液のｐ５０値よりもさらに低く、典型的には、２６．６ｍｍＨＧ（これらの読取り値において５３．２ｍｍＨｇ）である。概して、ｐ５０が低い場合には、酸素に関して、高い親和性を示す。標識ナノ粒子ではなく、非標識ナノ粒子については、ボーア効果（ｐＨが低下するのに伴い、右側に移動する）が観察された。加えて、酸素結合解離曲線は、新たに調製されたナノ粒子及び約１ヶ月間保存した粒子を使用して測定した。要するに、より古いヘモグロビンにより、記録上更にノイズの多い酸素結合解離曲線（図２）が作製される。
【表１】
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【０１５７】
実施例３  実施例１のナノ粒子の性質
血液ガスアナライザーを用いて、Ｏ２親和性及び可逆性結合の特徴付けを行った。Ｐ５０（ＨｂＳＯ２のＯ２圧力＝５０％）は、ヒルのｎ（Ｉｏｇ［ＨｂＳＯ２／（１−ＨｂＳＯ２）］／ｌｏｇｐＯ２）に基づき、３７℃にて、測定した。ＰＯ２が７２０ｍｍＨｇであり、ｐＨが７．３であれば、ＨｂＳＯ２は、９９．９９％であり［ｌｏｇ［ｐ０２（７．４）］＝２．８０７３３２４９６；１／ｋ＝３８００．５０３８０８］、ｐ５０を算出すると、２１．１８ｍｍＨｇ（正常ＲＢＣ、ｐ５０のＨｂＡ０は、２６．５ｍｍＨｇ及びＨｂｆは２０．０ｍｍＨｇ）であった。
【０１５８】
ＮＯ除去及び不適切な血管収縮は、ＨＢＯＣにとって問題であり、ＨＢＯＣ使用後、心臓血管の合併症が増加すると考えられている。予備的ＮＯ結合実験では、ナノ粒子の懸濁（室温、１５分）を介して、ＮＯガスの気泡を立てた。ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度分析では、典型的には、次の除去が観察されるヘム付加化合物に対応するいずれのスペクトルピークも明らかにならなかった（Ｆｅ（ＩＩ）ＮＯ、ピーク値、４１５、４７９、５４２、６１０ｎｍ）。
【０１５９】
予測される投与量によって血液粘度及び血行動態が変動するため、Ｏ２担体の流動学的性質は非常に重要である。ＮＺＷラビット血漿中に懸濁後、ナノ粒子が血漿流動性に与える影響を調べ、血漿粘度への影響は制限されていることが明らかになった（図３Ａ）。懸濁液粘度のわずかな低減は、ナノ粒子の水媒体による血漿の希釈によるものであった。ナノ粒子組成物ごとに粘度の上昇が認められない点から、血漿タンパク質の存在下では、ナノ粒子が凝集せず、かつ、血漿の流動学的パラメーターに最小の影響を与えることが示唆される。
【０１６０】
ラットにおけるナノ粒子の薬物動態（ｐＫ）プロファイルは、放射線標識Ｈｂ（９９ｍＴｃトレーサー、照射量５０μＣｉ／ｋｇ）を取り込むことによって測定した。トレーサー活性は、連続して測定し、減衰を調整した（図３Ｂ）。１８５に記載したとおり、ＰＫパラメーターは、ルーチン非線形コンパートメントモデルによって測定した。標準２コンパートメントモデルでは、良好なフィットが得られ、分布ｔ１／２＝２６．２±３．６分、消失ｔ１／２＝３００±１２分（Ｒ２＞０．９６）であった。
【０１６１】
実施例４  Ｏ２結合／放出特性に関するナノ粒子の最適化
ナノ粒子合成は、重症貧血症の状況において、組織低酸素症を軽減するために、必要に応じて、Ｏ２送達能力及び反応速度論に関して、最適化されてもよい。実施例３に記載されているように、ｐ５０が２１．１８ｍｍＨｇであるナノ粒子が産生された（ＨｂＡｏ（非糖化ヘモグロビン）のｐ５０は、２６．５であり；ＨｂＦ（胎児性ヘモグロビン）は２０．０ｍｍＨｇである）。同様に、ｐ５０が２０以下（高親和性、現在の製剤）、２５（標準親和性）、及び３０（低親和性）である剤形を有するナノ粒子を産生することもできる。
【０１６２】
例えば、Ｈｂ及び両親媒性ポリマー混合物は（２，３−ＤＰＧ及びＬＭＢによる前負荷／無負荷）リン酸緩衝液（ＰＢ）中、ｐＨ７．３［Ｈｂ］で自己組織化を行い、バッファ中、滴定して、異なる濃度、例えば、１００、１５０、２００、２５０及び３００ｍｇ／ｍＬにすることができる。ナノ粒子表面の化学的架橋では、ヒドロキシルアミンと組み合わされてＳｕｌｆｏ−ＥＧＳを利用し（ＰＢバッファ、ｐＨ８．５、５時間、３７℃）、続いて、５０ｍｍＰＢに対して透析を行い、ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ副産物を除去することができる。各ナノ粒子製剤の粒径、多分散度及びゼータ電位は、実施例３に記載されているように、評価することができる。
【０１６３】
Ｏ２親和性の分析により、産生が明かになり得る。各ナノ粒子製剤に関して、温度、ｐＣＯ２及びｐＨの関数としてＯ２解離曲線を求めることができ、また、Ｒｏｇｅｒｓ  ＳＣ，Ｓａｉｄ  Ａ，Ｃｏｒｃｕｅｒａ  Ｄ，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｄ，Ｋｅｌｌ  Ｐ，Ｄｏｃｔｏｒ  Ａに記述されているように、洗浄し、Ｋｒｅｂｓ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁後、治験参加志願者から得られたヒト新鮮赤血球（ＲＢＣ）値に関連付けることができる。低酸素症により、グリコール経路優先度の変更により、赤血球中での酸化防止剤能力が制限される。ヒト生理学において遭遇するガス圧の全範囲にわたるＯ２解離及び関連するヒステリシス曲線は、Ｇｕａｒｎｏｎｅ  Ｒ，  Ｃｅｎｔｅｎａｒａ  Ｅ，  Ｂａｒｏｓｉ  Ｇ．  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｘ−ａｎａｌｙｚｅｒ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．  １９９５；８０：４２６−４３０に記載されているように、ＨＥＭＯＸアナライザーを用いて、測定することができ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｉｓｈｉｇａｋｉ  Ｋ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｉｍａｉ  Ｋ．Ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｏｘｙｇｅｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｕｒｖｅ  ａｎｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ.Ｒｅｓｐｉｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４；９５：３２１−３２８  ｏｒ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｓａｔｏｈ  Ｇ，Ｉｓｈｉｇａｋｉ  Ｋ．Ｓｉｇｍｏｉｄ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｕｒｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐ５０  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ.Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．１９９４；５０：７０５−７０７に記載されているとおり、アデアの式に従って、ｐ５０及び協同性（ヒル）係数を求めることができる。Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  ＲＢＣ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｂｙ  ｅｑｕｉｍｏｌａｒ  ［Ｈｂ］．  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ［Ｈｂ］  ａｎｄ  Ｈｂ：２，３ＤＰＧ  ｍｏｌａｒ  ｒａｔｉｏｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐ５０  （ｔｏｒｒ）  ｏｆ  〜  ２０  （ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ），  ２５  （ｎｏｒｍａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ），  ａｎｄ  ３０  （ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２，３−ＤＰＧ  ｓｈｕｔｔｌｅ／ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｃａｎ  ｂｅ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｈｉｆｔ  ｉｎ  ｐ５０  ａｎｄ，  ｉｆ  ｎｅｅｄｅｄ，  ＰＥＩ  ｉｎｎｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ａｍｉｎｅ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ｖａｒｉｅｄ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｐ５０  ｓｈｉｆｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐＨ  ７．２  （ｔｉｓｓｕｅ）  ａｎｄ  ７．８  （ｌｕｎｇ）．
【０１６４】
また、こうしたナノ粒子の産生は、生理学的ガス圧全体にわたるＯ２結合−放出を測定することによって明らかになってもよい。摘出−灌流マウス肺（ＩＰＬ）は、理想的には、無処置の血管床において、生理学的に意味のある速度で潅流中の、ナノ粒子Ｏ２負荷及び無負荷の反応速度の評価に適している。ＩＰＬは、Ｄｏｃｔｏｒ  Ａ，Ｐｌａｔｔ  Ｒ，Ｓｈｅｒａｍ  ＭＬ，Ｅｉｓｃｈｅｉｄ  Ａ，ＭｃＭａｈｏｎ  Ｔ，Ｍａｘｅｙ  Ｔ，Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｊ，Ａｘｅｌｒｏｄ  Ｍ，Ｋｌｉｎｅ  Ｊ，Ｇｕｒｋａ  Ｍ，Ｇｏｗ  Ａ，Ｇａｓｔｏｎ  Ｂ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ−ｎｉｔｒｏｓｏｔｈｉｏｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｔｏ  Ｏ２  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ.  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２００５；１０２：５７０９−５７１４；Ｍａｘｅｙ  ＴＳ，  Ｅｎｅｌｏｗ  ＲＩ，Ｇａｓｔｏｎ  Ｂ，Ｋｒｏｎ  ＩＬ，Ｌａｕｂａｃｈ  ＶＥ，Ｄｏｃｔｏｒ  Ａに記載されているようにして調製することができる。常在肺細胞の腫瘍壊死因子−αは、肺動脈虚血−再潅流傷害における主要開始因子である。Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．２００４；１２７：５４１−５４７；またはＺｈａｏ  Ｍ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＬＧ，Ｄｏｃｔｏｒ  Ａ，Ｓｈａｒｍａ  ＡＫ，Ｚａｒｂｏｃｋ  Ａ，Ｔｒｉｂｂｌｅ  ＣＧ，Ｋｒｏｎ  ＩＬ，Ｌａｕｂａｃｈ  ＶＥ。肺胞マクロファージ活性化は、急性肺虚血−再潅流傷害の主要反応開始シグナルである。ＡＪＰ  −  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２００６；２９１：Ｌ１０１８−Ｌ１０２６。ナノ粒子製剤または洗浄ヒトＲＢＣ懸濁液（Ｈｂの等モル、２ｍＭ）は、肺循環時間２秒、４秒及び８秒で灌流することができ、次に、左心房の流出として回収した（空気曝露なく）。流出ガス圧及びＨｂＯ２含有量を監視することができる（ＲａｐｉｄＬａｂ８４０血液ガスアナライザー及びコ−オキシメータ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＡＧ，ＧＤＲ）。Ｏ２負荷速度及び効率は、Ｏ２、２１％、ＣＯ２、５％、Ｎ２バランスにて換気を行ない、肺を介する脱酸素懸濁液の灌流によって求めることができ、Ｏ２不負荷速度及び効率は、Ｏ２％、ＣＯ２、１０％、Ｎ２バランスにて換気を行ない、肺を介する酸素化懸濁液の灌流によって、求めることができる。Ｐ５０が低い、正常及び高いナノ粒子の負荷／無負荷速度（上記のとおり）を求めることができ、また、ｐＨ、温度及びｐＣＯ２の応答性について、ヒトＲＢＣで得られた値と比較して、評価することができる。
【０１６５】
実施例５  ＭｅｔＨｂ形成速度の低下によるナノ粒子Ｏ２送達の持続性
環状Ｏ２負荷／非負荷間でのＭｅｔ−ヘモグロビン（ＭｅｔＨｂ）の蓄積は、薄膜回転圧力計を用いて、生理学的バッファ（例えば、Ｋｒｅｂ）またはヒト血漿の存在下において定量化し得る。ＭｅｔＨｂ産生の目標は、疑似循環を３時間行い、ｐＯ２を１２０〜５０Ｔｏｒｒで循環させた後、１０％を制限することであってもよい。本開示のナノ粒子は、還元剤を含み、還元剤対ヘモグロビンのモル比（例えば、約０．５〜約１０Ｘの間のモル比）の変動は、ｍｅｔＨｂの増加に影響を及ぼす１つの手段である。サンプルは、０分、１０分、３０分、１時間、３時間に得ることができ、酸素化ヘモグロビン、還元ヘモグロビン及びｍｅｔＨｂの相対的割合を測定する（ＲａｐｉｄＬａｂ  ８４０血液ガスアナライザー及びコ−オキシメータ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＡＧ，ＧＤＲ）。
【０１６６】
実施例６  凍結乾燥形態での産生中及び長期保管中無菌ナノ粒子配合物の維持
滅菌産生物、凍結乾燥形態でのナノ粒子の持続性安定度、及びＯ２結合／放出特性の再構成回復は、実証され得る。加えて、ナノ粒子の無菌濾過は、最適化されていてもよい。凍結乾燥し、４℃、２５℃及び４０℃で保管した後（１２ヶ月以内）、ナノ粒子の機能性の回復（ベースラインから＜１０％の変化）を確認することができる。
【０１６７】
実施例７  ナノ粒子ＮＯの隔離及び血管収縮の評価及び制限
本開示の酸素運搬ナノ粒子は、環状Ｏ２負荷／無負荷全体にわたって、ＮＯ結合を最小にするために最適化されてもよい。ナノ粒子配合物の速度及び全ＮＯ消費量は、有効な一酸化窒素（ＮＯ）消費量アッセイを用いて、測定され得る。ＮＯの隔離を正常ＲＢＣの１０％以内に制限して、ヘモグロビンペイロード及びヘモグロビンの膜の特徴を変化させてもよい。Ｏ２負荷／無負荷サイクル全体にわたって、最小の血管収縮となるように、ナノ粒子を最適化してもよい。これらの実験では、標準的血管輪アレイ（ＶＲＡ）におけるＮＯ隔離速度と血管収縮とを、いずれもＯ２含量の関数として相関させ得る。任意のＮＯ捕獲が生理学的に有意なレベル未満であることを確認するために、血管緊張の変化は、正常ＲＢＣ値に対して基準点（１０％以内）とし得る。
【０１６８】
この特徴を更に評価するために、様々なヘモグロビンパッキング及びシェル架橋（表２）により、ナノ粒子配合物を作製し、未修飾ＲＢＣ及び遊離Ｈｂと比較して、ＮＯ除去を定量化した。これらの実験結果（図４〜７）は以下を示す。１）ナノ粒子配合物による全ＮＯ隔離は、ＲＢＣ及び遊離Ｈｂの全ＮＯ隔離未満であり、シェル特性及びＨｂ充填密度（図６）の関数ならば、さらに変化する。及び２）ナノ粒子配合物によるＮＯ隔離速度は、主にシェル架橋の関数として変化し、未修飾ＲＢＣの速度未満に低下され得る（図５及び図７）。
【表２】
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【０１６９】
実施例８  ナノ粒子のＯ２送達有効性の測定
ＨＩＦ−１αが安定化を示すことは、組織への不適切なＯ２送達のゴールドスタンダード手段である。これを完了させるために、全動物ＨＩＦ新規動的レポーティングモデルを使用して、本開示の酸素運搬ナノ粒子の能力の特徴付けを行い、未修飾Ｈｂの段階的低減中での組織へのＯ２送達を維持することができる。正常血液の希釈は、この分野において、急性外傷性失血及び急速輸液を促進するための１つの手段であり、この方法により、低血圧を制御し、血液Ｏ２含量減少の交絡因子として、低潅流を消失させる。対象の主要転帰：１）生存；２）組織ＰＯ２及び３）ＨＩＦ（ＯＤＤ）−ルシフェラーゼシグナル。ＨＩＦ−α（ＯＤＤ）ルシフェラーゼマウスにおける、全動物生物発光の定量化による急性貧血中のＨＩＦ発現／安定化及びその分解の非侵襲性監視方法が記述され、妥当性確認が行われた。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｆｒａｎ  Ｍ，Ｋｉｍ  ＷＹ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  Ｆ，Ｆｌｉｐｐｉｎ  Ｌ，Ｇｕｎｚｌｅｒ  Ｖ，Ｈｏｒｎｅｒ  ＪＷ，Ｄｅｐｉｎｈｏ  ＲＡ，Ｋａｅｌｉｎ  ＷＧ，Ｊｒ．Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｆ  ｐｒｏｌｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６；１０３：１０５−１１０；またはＴｓｕｉ  ＡＫ，Ｍａｒｓｄｅｎ  ＰＡ，Ｍａｚｅｒ  ＣＤ，Ａｄａｍｓｏｎ  ＳＬ，Ｈｅｎｋｅｌｍａｎ  ＲＭ，Ｈｏ  ＪＪ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＦ，Ｈｅｘｉｍｅｒ  ＳＰ，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ  ＫＡ，Ｂｏｌｚ  ＳＳ，Ｌｉｄｉｎｇｔｏｎ  Ｄ，Ｅｌ−Ｂｅｈｅｉｒｙ  ＭＨ，Ｄａｔｔａｎｉ  ＮＤ，Ｃｈｅｎ  ＫＭ，Ｈａｒｅ  ＧＭ．Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｅｍｉａ.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１；１０８：１７５４４−１７５４９；を参照されたい。
【０１７０】
したがって、Ｈｂの下降として、全身生物発光のリアルタイムでの段階的増大が観察され、複数の組織におけるＨＩＦタンパク質レベル（Ｗｅｓｔｅｒｎ）とＨＩＦ依存性ＲＮＡ発現とのペア評価により、ＨＩＦシグナル伝達の非侵襲性インビボ評価を確認する（図８）。このモデルでは、貧血誘発後６時間ほどで、ＨＩＦ−ルシフェラーゼ発現が増大し、２４時間までの時点でピークが発現し、かつ、Ｈｂレベル及びｐＯ２の急性低下に比例する。［Ｈｂ］は、７日を超えて生理学的メカニズム（内因性エリスロポエチン）により回復し、ＨＩＦレベルは、ベースラインに戻る（図８Ｅ）。低酸素曝露は、本モデルにおけるＨＩＦ発現の陽性対照としての機能を果たす。
【０１７１】
ＨＩＦ−α（ＯＤＤ）ルシフェラーゼマウスモデルを使用し、未修飾［Ｈｂ］の低減後、組織へのＯ２送達を回復させるための、残部組織への酸素運搬ナノ粒子の能力の特徴付けを行ってもよい。ナノ粒子（正規化全ヘモグロビン）またはペンタスターチ（正常血液量貧血、対照）を用いて、交換輸血を実施し、インビボ生物発光イメージング及び組織オキシフォア（ｏｘｙｐｈｏｒ）クエンチによって、Ｏ２送達＋／−低酸素ストレスを調べてもよい。別の血液希釈群では、ヘモグロビンは、再注入群マウスＲＢＣによって正規化し、標準ＨＩＦ-ルシフェラーゼ及びオキシフォア活性を構築してもよく、ナノ粒子クエンチは、再注入マウスＲＢＣによって得られる１０％以内であってもよい。ナノ粒子の薬物動態（ＰＫ）も測定され得る。ナノ粒子は、９９ｍＴｃによって標識し、上記のように投与されてもよい。活性は、連続して測定してもよく、また、ＰＫパラメーターを算出してもよい。ＨＩＦ-ルシフェラーゼ及びオキシフォアクエンチを用いて、有効性持続時間に適合する循環時間で、３時間の時点で、７５％保持されていることが予測され得る。
【０１７２】
実施例９  げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性評価
ポリエチレンイミンポリマーは、疎水性アルキル基と共有結合手段によりグラフト重合させた。パルミチン酸は、カルボジイミドＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で活性化し、その後、ポリマーを添加して、遊離第一級アミン基の５０％を超える官能基化及び第二級アミン基の部分的官能基化を達成した。両親媒性ポリマーは、無水クロロホルム中に分散させ、２〜５分間緩やかにボルテックスした。この構成物の流体力学的径測定値により、７〜１０ｎｍサイズの単分子反転ミセル（ＩＭ）構造体の形成を確認する。
【０１７３】
濃縮され、精製されたヘモグロビン及び２，３−ＤＰＧ混合物及びメチレンブルーは、水性媒体に懸濁し、ＩＭの有機溶媒混合物に添加した。この二相性混合物は、すべてのペイロードがＩＭ含有有機層に移行するまで、数回、沈降させ、反転させた。短時間の振盪／旋回及び転化または組み合わせ方法により、移行が行われ得る。ヘモグロビンは、呼気ＲＢＣから抽出され、精製されたヒトヘモグロビンであった。ヘモグロビンは、カルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯ）として安定化させ、イオン−交換クロマトグラフィーを介して精製し、限外濾過法を用いて、４．０ｇ／ｄＬに濃縮した。ナノ粒子の産生に使用されるヘモグロビン濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。２，３−ＤＰＧの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。ロイコメチレンブルーの濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。ペイロード含有ＩＭを、長首形ガラス管に移し、同量のｎａｎｏｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ（０．２ｕＭ）を添加した。混合物を１〜２分間、簡単に超音波処理し、逆相溶剤蒸発プロトコール後、減圧下にて有機溶媒をゆっくり蒸発させた。有機溶剤の除去は、持続的回転蒸発及び透析によって確認した。典型的な調製では、ナノ粒子は、ナノ粒子１個当たり、平均４０００個のヘモグロビン分子を含んでいた。自己組織化し、逆相溶剤の蒸発後、ナノ粒子には、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］、ＰＢＳ、ｐＨ８．５）を用いて、ヒドロキシルアミンと組み合わせて、５時間、３７℃にて表面化学的架橋を行った。分子内架橋工程では、いずれの化学架橋剤も使用していない。他の方法のなかでもＴＥＭ、ＤＬＳ及びＡＦＭによってナノ粒子径、形状及び形態を測定した。ナノ粒子は、再懸濁後、流体力学的径１５０〜１８０ｎｍまたは１７３±１０ｎｍ、多分散度０．２６±０．０１及びゼータ電位１２±２ｍＶ以下であった。架橋により、粒径及びゼータ電位へ影響が制限されている（それぞれ、１６７±５６ｎｍ、＋７±２ｍＶ）。アッセイは、Ｐａｎ  Ｄ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＳＤ，Ｈｕ  Ｇ，  Ｓｅｎｐａｎ  Ａ，Ｓｃｏｔｔ  ＭＪ，Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ，Ｗｉｃｋｌｉｎｅ  ＳＡ，Ｌａｎｚａ  ＧＭ.  Ｌｉｇａｎｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｂｉａｌｙｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ.Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００８；１３０：９１８６−９１８７に記載されているとおり、実施した。
【０１７４】
実施例１０  げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性評価
げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を評価した。ナノ粒子は、実施例９に記載されているように産生した。ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，４００ｇ，Ｎ＝３）は、麻酔下（イソフルラン）にて、人工換気施設にて気管切開（ＲＡ）を行い、頚静脈及び大腿静脈並びに頚動脈及び大腿動脈のカニューレーションを行った。血液Ｏ２含量及びＡＶＯ２差のベースライン値を制定後、血液量の２５％を脱血し、新しい値を得て、等量の血液代用剤（Ｎ＝２）または標準生理食塩水（Ｎ＝１）でラットを蘇生した。ナノ粒子（ＮＰ）を懸濁液［Ｈｂ］４ｍＭで４０ｗｔ／ｖｏｌ％にて懸濁した。図９に実験結果を示す。プロットから、脱血を伴う予期されるＡＶＯ２差の著明な増大（２４％〜６７％へ上昇）が明らかであり、（Ａ）生理食塩水で蘇生した後持続し、また、（Ｂ）血液代用剤で蘇生した後分解している（６７％〜３１％まで正規化）。（Ｃ）では、いずれかの蘇生流体によって得られた血流力学的効果の差は、観察されず、これは、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、血圧の回復に加えて改善されたＯ２含量から生じていることが示唆される。さらに、ＮＯ隔離により、血管収縮及び高血圧を引き起こすことが知られている他のヘモグロビン系血液代用剤とは異なり、ＮＰ系血液代用剤により、標準血行動態を再構築した。これにより、ＮＰが有意なＮＯ隔離を生じさせることはないことを示すインビトロデータが更に裏付けられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月14日(2019.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
実施例１０  げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性評価
げっ歯類出血性ショックモデルにおけるナノ粒子の有効性を評価した。ナノ粒子は、実施例９に記載されているように産生した。ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，４００ｇ，Ｎ＝３）は、麻酔下（イソフルラン）にて、人工換気施設にて気管切開（ＲＡ）を行い、頚静脈及び大腿静脈並びに頚動脈及び大腿動脈のカニューレーションを行った。血液Ｏ２含量及びＡＶＯ２差のベースライン値を制定後、血液量の２５％を脱血し、新しい値を得て、等量の血液代用剤（Ｎ＝２）または標準生理食塩水（Ｎ＝１）でラットを蘇生した。ナノ粒子（ＮＰ）を懸濁液［Ｈｂ］４ｍＭで４０ｗｔ／ｖｏｌ％にて懸濁した。図９に実験結果を示す。プロットから、脱血を伴う予期されるＡＶＯ２差の著明な増大（２４％〜６７％へ上昇）が明らかであり、（Ａ）生理食塩水で蘇生した後持続し、また、（Ｂ）血液代用剤で蘇生した後分解している（６７％〜３１％まで正規化）。（Ｃ）では、いずれかの蘇生流体によって得られた血流力学的効果の差は、観察されず、これは、血液代用剤のＯ２送達における有益性は、血圧の回復に加えて改善されたＯ２含量から生じていることが示唆される。さらに、ＮＯ隔離により、血管収縮及び高血圧を引き起こすことが知られている他のヘモグロビン系血液代用剤とは異なり、ＮＰ系血液代用剤により、標準血行動態を再構築した。これにより、ＮＰが有意なＮＯ隔離を生じさせることはないことを示すインビトロデータが更に裏付けられる。
本願は、以下の発明を包含する。
［発明１］
実質的に両凹型円板形状を有するナノ粒子であって、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマー含有二層状シェル及びペイロードを含み、
前記二層状シェルは、親水性外層、親水性内層、及び前記層間に疎水性領域を有し、
前記両親媒性ポリマーは、脂質に結合するアミン含有分岐ポリマーを含み、
前記ペイロードは、酸素運搬剤、アロステリック調節因子及び還元剤を含む、前記ナノ粒子。
［発明２］
前記シェルの前記親水性外層を含む前記両親媒性ポリマーは、前記粒子が、約−１５ｍＶ〜約＋１５ｍＶのゼータ電位を有するように、ポリエチレングリコールから誘導体化される、発明１に記載のナノ粒子。
［発明３］
前記ナノ粒子の前記平均直径は、約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍであって、前記ナノ粒子の前記平均高さは、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍである、発明１〜２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明４］
前記ナノ粒子は、貫通孔またはくぼみを含む、発明１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明５］
前記酸素運搬剤は、合成ヘモグロビンまたは天然ヘモグロビンである、発明１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明６］
前記アロステリック調節因子−は、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ）、イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、及び２−［４−［［（３，５−ジメチルアニリノカルボニル］メチル］−フェノキシ］−２−メチルプロピオン酸からなる群から選択される、発明１〜５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明７］
前記還元剤は、ロイコメチレンブルー、グルタチオン及びアスコルビン酸塩からなる群から選択される、発明１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明８］
前記ナノ粒子は、約３０００〜約１０，０００のヘモグロビン分子を含む、発明１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明９］
前記ナノ粒子は、約２０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンまたは約３０％〜約６０％（ｗ／ｖ）のヘモグロビンを含む、発明１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明１０］
前記ナノ粒子は、実質的に、一酸化窒素を隔離することはない、発明１〜９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明１１］
前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子中のヘモグロビン全濃度の約１０％以下まで酸化を制限する、発明１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明１２］
前記分岐アミン含有ポリマーはポリエチレンイミン分岐ポリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、星型ポリマー及びグラフト重合ポリマーからなる群から選択さる、発明１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明１３］
前記脂質は脂肪酸である、発明１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
［発明１４］
前記脂肪酸は、１０，１２−ペンタコサジイン酸、ヘキサデシルオクタデカン酸、コラン酸、リノール酸、Ｃ２４−ペンタコサジイン酸及びパルミチン酸からなる群から選択される、発明１３に記載のナノ粒子。
［発明１５］
ナノ粒子の調製方法であって、前記ナノ粒子は、実質的に両凹型円板状を有し、前記ナノ粒子は、水性コア部、両親媒性ポリマーを含む二層状シェル並びに酸素運搬剤、前記アロステリック調節因子及び前記還元剤を含むペイロードを含有し、前記工程は、
（ａ）脂質を分岐ポリマーの前記遊離反応性基の少なくとも２５％に共有結合より共役することによって、前記分岐ポリマーを疎水的修飾し、両親媒性ポリマーを形成すること；
（ｂ）前記両親媒性ポリマーを非極性溶媒と混合すること、及び前記混合物を攪拌して、前記両親媒性ポリマーを含む複数の反転ミセルを形成すること；
（ｃ）前記ペイロードを極性溶媒と混合すること、及び前記ペイロード混合物を（ｂ）の前記混合物に添加して、二相混合物を形成すること、及び前記二相混合物を攪拌し、前記ペイロードを前記反転ミセルに移行すること；
（ｄ）熱及び水性溶媒の存在下において前記ペイロード含有前記反転ミセルを攪拌して、前記ペイロード含有前記両凹型円板状ナノ粒子を形成すること；を含む前記方法。
［発明１６］
前記ペイロードは、前記ナノ粒子の前記内部に含有される、発明１７に記載の方法。
［発明１７］
発明１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、血液代用組成物。
［発明１８］
前記組成物は、溶液または凍結乾燥粉末である、発明１７に記載の組成物。
［発明１９］
発明１〜１４のいずれか一項に記載の有効量のナノ粒子を前記対象に投与することを含む、対象者の血液の前記酸素運搬能力を補充する方法。
［発明２０］
ナノ粒子の対象への投与方法であって、発明１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子含有溶液を輸注することを含む前記方法。
【外国語明細書】
2019089832000001.pdf