(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法を提供する。【解決手段】試料を特定の式による化合物と接触させる工程、及び特定の式による化合物と接触した試料に対してマススペクトロメトリーを実施する工程を含む。また、本発明は、対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを診断する方法、弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法、及び、対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットも提供する。更に、本発明は、正常な肺機能を有する対象における、アルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法であって：
当該試料を式（１）
【化１】
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の化合物と接触させる工程；及び
当該式（１）の化合物を含有する試料に対してマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記式（１）の化合物の量が予め決定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、マススペクトロメトリーの前に、前記式（１）の化合物を含有する試料を酸加水分解に供する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、結合組織マトリックス、尿、血漿、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患しているおそれのある対象から取得されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化、大動脈瘤、皮膚損傷、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＯＰＤが肺気腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中のデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中のデスモシン及びイソデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マススペクトロメトリーが、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）又は液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マススペクトロメトリーが、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを判定するための診断用組成物であって、式（１）：
【化２】
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の化合物を含有し、当該判定が：
（ａ）当該対象から取得した試料を当該組成物と接触させる工程；及び
（ｂ）当該試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって測定する工程；
を含む、診断用組成物。
【請求項１５】
前記疾患が、アテローム性動脈硬化、大動脈瘤、皮膚損傷、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の診断用組成物。
【請求項１６】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項１５に記載の診断用組成物。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の診断用組成物。
【請求項１８】
前記試料中のデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１４に記載の診断用組成物。
【請求項１９】
前記試料中のデスモシン及びイソデスモシンの量が、式（１）の化合物の量に関連して較正される、請求項１４に記載の診断用組成物。
【請求項２０】
試料中の弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法であって、当該マーカーは、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され：
（ａ）弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患しているおそれのある対象から取得した試料を式（１）
【化３】
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の化合物と接触させる工程；
（ｂ）当該式（１）の化合物を含有する工程（ａ）の試料の酸加水分解を実施する工程；及び
（ｃ）酸加水分解された工程（ｂ）の試料に対しマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む、方法。
【請求項２１】
対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットであって：式（１）
【化４】
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の化合物及び説明書を備え、当該弾性繊維損傷のマーカーが、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、キット。
【請求項２２】
正常な肺機能を有する対象におけるアルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防するためのキットであって、アルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）増強治療剤、式（１）
【化５】
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の化合物及び説明書を備え、当該予防が：
（ａ）当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーをマススペクトロメトリーによって測定する工程；及び
（ｂ）当該対象の弾性繊維損傷のマーカーの量が通常よりも高い場合、対象に当該ＡＡＴＤ増強治療剤を投与する工程；
を含み、ここで、工程（ａ）において、マススペクトロメトリーを実施する前に、当該対象由来の試料が、当該式（１）の化合物と接触させられる、キット。
【請求項２３】
前記対象が哺乳類である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記対象がヒトである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記試料が、結合組織マトリックス、尿、血漿、血清、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
正常な肺機能を有する対象における肺エラスチンの分解を検出する方法であって、当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーを、マススペクトロメトリーによって測定する工程を含み、ここで、マススペクトロメトリーを実施する前に、当該対象由来の試料が、式（１）
【化６】
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の化合物と接触させられる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２０１３年４月３０日に出願された米国仮出願Ｎｏ．  ６１／８１７，６６９の利益を主張し、当該出願の全てが参照により援用される。
【０００２】
本発明は、とりわけ、試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法を提供する。また、本発明は、対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを診断する方法、正常な肺機能を有する対象における、アルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防する方法、弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法、及び、対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットも提供する。
【背景技術】
【０００３】
弾性繊維は、皮膚、血管及び肺の重要な構造的成分であり、それらの器官に、歪曲力に対する物理的反跳を提供し、正常な生理機能に寄与する（Ｍｅｃｈａｍ，  Ｒ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。弾性繊維の主要な構造的成分であるエラスチンは、可溶性前駆体のトロポエラスチン（７８６アミノ酸）中のリシン残基のリシルオキシダーゼによる転写後修飾、及び重合反応によって形成される、高度に架橋した不溶性タンパク質である。デスモシン（ＤＥＳ）及びイソデスモシン（ＩＤＳ）は、アミノ酸の重合鎖をエラスチンの３Ｄネットワークに結合させる主要な架橋分子として機能する、２つの特有のピリジニウムアミノ酸である（Ｔｈｏｍａｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  １９６３，  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ａｋａｇａｗａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【０００４】
アテローム性動脈硬化（Ｇａｌｉｓ，  Ｚ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｄｏｌｌｅｒｙ，  ＣＭ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｕｍｅｄａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）、大動脈瘤（Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９９，  Ｍａｒｑｕｅ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００１  ）、皮膚損傷（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９０，  Ａｎｎｏｖａｚｚｉ，  Ｌ，  Ｖｉｇｌｉｏ，  Ｓ．，  Ｇｈｅｄｕｚｚｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００４）、嚢胞性線維症（Ｖｉｇｌｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  Ｓｔｏｎｅ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｋｏｎｓｔａｎ，  Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９５）、及び肺気腫等の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等（Ｓｃｈｒｉｖｅｒ，  Ｅ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｔｅｎｈｏｌｄｅｒ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９１  ，  Ｓｔｏｎｅ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９５，  Ｂｏｄｅ，  Ｄ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０００，  Ｂｏｓｃｈｅｔｔｏ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  Ｌｕｉｓｅｔｔｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００３，  Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００７）の幾つかの広く普及した疾患において生じるエラスチン含有組織の分解（Ｓａｎｄｂｅｒｇ，  Ｌ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ，  １９８１  ，  Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）は、これらの２つのピリジニウム化合物を含有するペプチドの体液中の放出の増大に関連している。
【０００５】
例えば、アルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）は、１００，０００人もの米国人におけるＣＯＰＤの遺伝的原因である（Ｂｒａｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８）。重症のＡＡＴＤの自然史の研究は、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）が、疾患の発生及び進行の不完全なマーカーであることを示唆する（Ｄｉｒｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）。近年の研究は、定量的胸部ＣＴ（ＱＣＴ）スキャンが、多くのＡＡＴＤ患者において起こる肺実質の破壊の検出で、肺機能試験よりも高感度であることを示唆している（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。従って、肺エラスチンの分解を検出するより良い方法が要求されている。
【０００６】
更に、α−１抗トリプシン（ＡＡＴ）タンパク質の循環中のレベルの増大は、２５年以上に渡り幾つかのＡＡＴＤの長期的治療において処方された治療であった（Ｗｅｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）。この治療は、血液及び組織中のアルファ−１タンパク質をより高いレベルに維持することは、ＡＡＴがその主要な全身的阻害剤である好中球エラスターゼの効果に対して保護的であるという仮説に基づく。しかしながら、増強療法によるエラスチン分解に対する正の効果を示す試みは、一貫性が認められない。
【０００７】
Ｓｔｏｎｅらは、ＦＥＶ１が７２％と予測された６３歳の女性、及びＦＥＶ１が４５％と予測された４１歳の男性の２名のＡＡＴＤ患者に対して試験を行った。彼らは２６０ｍｇ／ｋｇのＡＡＴを毎月投与され、１８ヶ月追跡された。同位体希釈高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定された治療後の尿中デスモシン値の平均値は、両対象において治療前のレベルから３５％を超える継続的な低下を示した（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。尿以外の体液中のデスモシンの測定はこの試験では実施されなかった。
【０００８】
２０００年に米国とイタリアのグループによって１つの研究が実施された（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。この研究は、非盲検で、重度乃至中度の肺気腫（ベースラインＦＥＶ１  ４１  ＋１９％予想）に罹った１２名のＡＡＴＤ対象（男性８名、女性４名；遺伝型は１１名がＰＩＺＺ、１名がＰＩ  Ｍｐｒｏｃｉｄａ／Ｍｐｒｏｃｉｄａ）に対して実施され、６０  ｍｇ／ｋｇの毎週計画が４週間行われた。スポット尿試料が試行中４週間毎週回収され、各毎週の注入の前に、毎週回収された（プラズマ１２標本）。更に週２及び４の注入の２日後にも尿試料が回収された（ピーク標本）。尿デスモシンレベルは、同位体希釈ＨＰＬＣ法によって決定された（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１  ）。
【０００９】
補充の間、尿中へのデスモシン排出は、試行中と比較して変化しなかった。この試験において、補充治療を受けていない肺気腫に罹ったＡＡＴＤ対象は、健康な喫煙者又は通常のＡＡＴに罹ったＣＯＰＤ患者と比較してデスモシンの排出が多く、この結果は、非ＡＡＴＤのＣＯＰＤ患者よりもＡＡＴＤ患者において、ＤＩの血漿レベルが高いという最近の報告と一致する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
【００１０】
２００２年、Ｓｔｏｌｌｅｒらは、２６名のＡＡＴＤ患者に対する無作為化したコントロールされた試験を報告して、２つのプールされたヒト血漿ＡＡＴの商業的に利用可能な調製品の生物学的同等性を評価するために、２６名のＡＡＴＤ患者に対する無作為化したコントロールされた試験を報告した。患者は２４週間に渡り試験され、尿中へのデスモシン排出が、同位体希釈ＨＰＬＣ法（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１  ）及びＲＩＡ法（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０）によって、毎週測定された。デスモシン値は２つの測定方法の間で良好な相関を示したが、治療の開始及び２４週間後の間で顕著な違いは無かった。
【００１１】
２００３年にマススペクトロメトリーを使用したデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）の解析の方法において変化が導入された（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。これは、血漿、痰及び尿を含む体液におけるそのような測定において特異性及び感度を増大させた。この方法は、現在は改変されて、精度を改善しこの研究で利用されたアセチル化ピリジノリン内部標準を含む（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【００１２】
尿中のＤＩの遊離した非会合タンパク質成分はマススペクトロメトリーによって測定可能で、排出の前のインビボでのエラスチンペプチド分解のインジケーターであり、エラスターゼ活性の増大と一致する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  １９７９）。
【００１３】
２００７年、ＡＡＴＤに関連したＣＯＰＤに罹った患者、及び正常なＡＡＴレベルのＣＯＰＤ患者における、尿、血漿及び痰中のＤＩの測定の結果が公開された（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。両方の群において、血漿及び痰中のＤＩのレベル並びに尿中の非会合遊離ＤＩ成分のレベルは、対照の値に対して顕著に増大した。ＡＡＴＤに罹った患者のＤＩの値は、非ＡＡＴＤ患者よりも顕著に高かった。全てのＡＡＴＤ患者は増強療法中であった。増強療法前の値は、この患者集団において入手できなかった。増強を開始する前、及び増強療法の再開後の血漿、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び尿の解析における体液試料の利用可能性は、そのような解析を可能とした。
【００１４】
ＤＥＳ及びＩＤＳを測定するための幾つかの方法が、過去２０年の間に開発されている。これらは、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）  （Ｃｏｃｃｉ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｌｕｉｓｅｔｔｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、ラジオイムノアッセイ（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，  Ｄ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｓｔａｒｃｈｅｒ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）、キャピラリー電気泳動（Ｖｉｇｌｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｎｎｏｖａｚｚｉ，  Ｌ．，  Ｖｉｇｌｉｏ，  Ｓ．，  Ｐｅｒａｎｉ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｆｉｏｒｅｎｚａ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｓｔｏｌｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）  （Ｓｔｏｎｅ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，  Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｓｔｏｎｅ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｋｏｎｓｔａｎ，  Ｍ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９５  （２），  Ｓｔｏｎｅ，  Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，  １９９１  ，  Ｃｕｍｉｓｋｅｙ，  Ｗ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）、動電クロマトグラフィー（Ｖｉｇｌｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）及び液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）又はタンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）  （Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｂｏｕｔｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  （１  ），  Ａｌｂａｒｂａｒａｗｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１０，  Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）を含む。
【００１５】
これらの方法の中で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、最高の感度及び特異性を提供すると考えられる。ＤＥＳ及びＩＤＳは極端な低濃度で体液中に存在するため、これらの正確かつ特異的な測定は困難であった。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法における２つの主要な改善が最近なされた。１つはＡｌｂａｒｂａｒａｗｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．によるもので、尿中の全ＤＥＳ＋ＩＤＳ解析のために内部標準として触媒的に交換された重水素ＤＥＳを導入している（Ａｌｂａｒｂａｒａｗｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。２つ目は、Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１  ）によるもので、幾つかの種類の体液（尿、血漿、痰等）においてＤＥＳ及びＩＤＳに対してＩＳとしてアセチルピリジノリンを使用した（Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１）。
【００１６】
要するに、弾性繊維損傷のマーカーの量を測定し、肺エラスチン分解を検出するための、より優れた方法が求められている。本願発明は、特に、この要求を充たすものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
発明者らは、上記方法で使用されるＩＳは、試料中の架橋ＤＥＳ及びＩＤＳ分子を開放するのに必要な解析工程である酸加水分解に対して十分に安定ではないことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
最近、発明者らは、ＤＥＳ分子の完全な化学合成に成功した。続いて、発明者らは、架橋ＤＥＳ及びＩＤＳのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析における理想的なＩＳと見做される安定な重水素化分子ＤＥＳ−ｄ４（図１）を合成した。発明者らは、本発明において、エラスチン分解に関連する様々な生物学的試料と共に用いられる、ＤＥＳ−ｄ４の化学合成、及びそのＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析における利用を報告する。
【００１９】
上記を考慮して、本発明の一つの態様は、試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法である。この方法は、当該試料を式（１）
【化１】
2019066481.tif 000003
の化合物と接触させる工程；及び
当該式（１）の化合物を含有する試料に対してマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む。
【００２０】
本発明の他の態様は、対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを診断する方法である。この方法は：
（ａ）当該対象から取得した試料を式（１）
【化２】
2019066481.tif 000004
の化合物と接触させる工程；及び
（ｂ）当該試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせから選択される弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって測定する工程；
を含む。
【００２１】
本発明の追加の態様は、試料中の弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法であって、当該マーカーは、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。この方法は：
（ａ）弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患している恐れのある対象から取得した試料を式（１）
【化３】
2019066481.tif 000005
の化合物と接触させる工程；
（ｂ）当該式（１）の化合物を含有する工程（ａ）の試料の酸加水分解を実施する工程；及び
（ｃ）酸加水分解された工程（ｂ）の試料に対しマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む。
【００２２】
本発明の他の態様は、対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットである。当該キットは：式（１）
【化４】
2019066481.tif 000006
の化合物及び説明書を備え、当該弾性繊維損傷のマーカーが、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００２３】
本発明の更なる態様は、正常な肺機能を有する対象におけるアルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防する方法である。この方法は：
当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせから成る群から選択される弾性繊維損傷のマーカーをマススペクトロメトリーによって測定する工程；及び
当該患者の弾性繊維損傷のマーカーの量が通常よりも高い場合、ＡＡＴＤ増強治療剤を投与する工程；
を含む。
【００２４】
本発明の追加の態様は、正常な肺機能を有する対象における肺エラスチンの分解を検出する方法である。この方法は、当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーを、マススペクトロメトリーによって測定する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＤＥＳ−ｄ４の化学合成スキームを示す。
【００２６】
【図２】図２は、１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを示す。ｄ  ８．５６  （２Ｈ，  ｓ，  Ｈ２／６），  ４．５２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  Ｈ７），  ４．１４−４．１２  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ２０／２０´），  ４．０５−３．９６  （１  Ｈ，  ｍ，  Ｈ１６），  ４．０５−３．９６  （１  Ｈ，  ｍ，  Ｈ１  １  ），  ３．０８−２．９１  （４Ｈ，  ｍ，  Ｈ１８／１８´），  ２．２４−２．２２  （４Ｈ，  ｍ，  Ｈ１９／１９´），  ２．１０  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ１５），  ２．０４−１  ．９７  （４Ｈ，  ｍ，  Ｈ８／１０），  １  ．４１  （２Ｈ，  ｍ，  Ｈ９）
【００２７】
【図３】図３は、ＤＥＳ−ｄ４のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）マススペクトルを示す。
【００２８】
【図４Ａ】図４Ａは、（ＤＥＳ＋ＩＤＳ）／ＩＳのピーク比からのＤＥＳ及びＩＤＳにおける較正を示す。
【００２９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＤＥＳ／ＩＳ又はＩＤＳ／ＩＳのピーク比からのＤＥＳ及びＩＤＳにおける較正を示す。
【００３０】
【図５】図５は、体液：Ａ）尿、Ｂ）血漿、及びＣ）ＢＡＬＦ中のＤＥＳ、ＩＤＳ及びＩＳ（ＤＥＳ−ｄ４）の３つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【００３１】
【図６】図６は、ＣＯＰＤ患者における、血漿中の全及び遊離ＤＥＳ＋ＩＤＳレベル、並びにＢＡＬＦ中の全ＤＥＳ＋ＩＤＳレベルを示す。
【００３２】
【図７】図７は、アルファ−１抗トリプシン欠乏症における、血漿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対する、静脈内アルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。各ボックスの上半分は第三四分位数（７５ｔｈ  ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）、下半分は第一四分位数（２５ｔｈ  ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）を示す。各ボックスの上方及び下方のＷｈｉｓｋｅｒ（エラーバー）は、最大値及び最小値を示す。正常の平均±標準偏差（ＳＤ）：０．２２  ±  ０．０４，  ｎ＝４７；増強の平均±標準偏差（ＳＤ）：０．２５  ±  ０．０１  ，  ｎ＝５０；増強無しの平均±標準偏差（ＳＤ）：０．３６  ±  ０．０１  ，  ｎ＝５０。ｔ検定の結果は以下のようになった：正常対増強：Ｐ＝０．００３５；増強対増強無し：  Ｐ＜０．０００１；正常対増強無し：  Ｐ＜０．０００１。
【００３３】
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、血漿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対する静脈内アルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。
【００３４】
【図９】図９は、ＢＡＬＦにより取得された上皮層液中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対する静脈内アルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。
【００３５】
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、血漿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対するエアロゾルアルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。
【００３６】
【図１１】図１１は、ＢＡＬＦにより取得された上皮層液中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）のレベルに対するエアロゾルアルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。
【００３７】
【図１２】図１２は、静脈内増強療法の１２週間後の血漿及びＢＡＬＦ中のＤＩの相関を示す。
【００３８】
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、尿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）：全ＤＩに対する遊離ＤＩの比率に対するエアロゾルアルファ−１抗トリプシン増強療法の効果を示す。
【００３９】
【図１４】図１４は、正常な対象、又は静脈内アルファ−１抗トリプシン増強療法を受けた又は受けていないアルファ−１抗トリプシン欠乏症の対象における、年齢と、デスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）との関連性を示す。
【００４０】
【図１５】図１５は、３年周期に渡る早期アルファ−１抗トリプシン欠乏症におけるデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）の血漿レベルを示す。
【００４１】
【図１６】図１６は、デスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）の血漿レベルと、年齢（Ａ）、一酸化炭素における肺の拡散能力（ＤＬＣＯ＋）（Ｂ）、及びＦＥＶ１（Ｃ）との間の関連性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明の一つの態様は、試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーの量を測定する方法である。この方法は、当該試料を式（１）
【化５】
2019066481.tif 000007
の化合物と接触させる工程；及び
当該式（１）の化合物を含有する試料に対してマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む。本発明の式（１）において、「Ｄ」は重水素を意味する。重水素原子は、下記実施例１に開示される方法のような、任意の簡便な方法を使用して付加される。
【００４３】
本明細書中、「弾性繊維損傷」は、皮膚、血管、肺及び他の組織のエラスチン含有成分の分解又は完全性の減少をもたらす、エラスチン含有成分の何らかの破壊を意味する。
【００４４】
本明細書中、「マススペクトロメトリー」は、試料中の質量／電荷の比率のスペクトル及び分子成分の相対存在量を検出することにより、試料中の分子成分を同定する任意の技術を意味する。限定されないが、マススペクトロメトリーの種類として、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、同位体希釈液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー、アクセラレーターマススペクトロメトリー、ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー、誘導結合プラズママススペクトロメトリー、熱イオン化マススペクトロメトリー、及びスパーク光源マススペクトロメトリーが含まれる。好ましくは、本発明において使用されるマススペクトロメトリーは、ＬＣ−ＭＳ又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳである。より好ましくは、当該マススペクトロメトリーは、液体クロマトグラフィータンデムマススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である。
【００４５】
本明細書中、「試料」は、生物の幾つかの特性、又は生物に影響する幾つかの条件を判定するために解析され得る、その生物から取得した何らかの物体を意味する。試料の例として、限定されないが、結合組織マトリックス、尿、血漿、血清、痰及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）が挙げられる。
【００４６】
この態様の一つの側面において、式（１）の化合物の量は予め決定されている。
【００４７】
この態様の他の側面において、式（１）の化合物と接触した試料が、マススペクトロメトリーの前に酸加水分解に供される。
【００４８】
本明細書中、「酸加水分解」は、物体を酸に晒して分解することによってその物体の成分を取得することを意味する。本発明の文脈において、酸加水分解は、試料中の全ＤＥＳ及びＩＤＳを解析するために使用される。ＤＥＳ及びＩＤＳの一部は、弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹った患者の試料中に遊離状態で存在するが、全ＤＥＳ及びＩＤＳレベルを測定するためには、酸加水分解によってエラスチン含有構造から架橋ＤＥＳ及びＩＤＳを開放しなければならない。
【００４９】
この態様の追加の側面において、試料は、結合組織マトリックス、尿、血漿、血清、痰、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。他の試料も、それらが本発明の方法に使用可能な限り使用され得る。
【００５０】
本明細書中、「結合組織マトリックス」は、生物に対して構造的支持を提供する細胞外成分を意味する。細胞外マトリックスは、限定されないが、間質マトリックス及び基底膜を含む。これらのマトリックスの成分は、限定されないが、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及びエラスチンを含む。
【００５１】
この態様の他の側面において、前記試料は、弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患した恐れのある対象から取得される。
【００５２】
本明細書中、「対象」は、哺乳類、好ましくはヒトである。ヒトに加えて、本発明の範囲内の哺乳類の分類は、例えば、農業動物、愛玩動物、実験動物等を含む。農業動物の例として、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ等が挙げられる。愛玩動物の例として、イヌ、ネコ等が挙げられる。実験動物の例として、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等が挙げられる。
【００５３】
本発明において、弾性繊維損傷を特徴とする疾患は、限定されないが、アテローム性動脈硬化、大動脈瘤、皮膚損傷、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）からなる群から選択される。より好ましくは、ＣＯＰＤは肺気腫である。
【００５４】
この態様の追加の側面において、試料中のＤＥＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。本明細書中、「較正」は、化合物（１）の既知の量等の標準と比較することにより調整することを意味する。較正の方法は、本明細書中に記載されている。この態様の他の側面において、試料中のＤＥＳ及びＩＤＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。
【００５５】
本発明の他の態様は、対象が弾性繊維損傷を特徴とする疾患を有するか否かを診断する方法である。この方法は：
（ａ）当該対象から取得した試料を式（１）
【化６】
2019066481.tif 000008
の化合物と接触させる工程；及び
（ｂ）当該試料中の、ＤＥＳ、ＩＤＳ及びそれらの組み合わせから選択される弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって測定する工程；
を含む。
【００５６】
本明細書中、「診断する」、「診断」及びその文法的バリエーションは、疾患等を同定することを意味する。弾性繊維損傷を特徴とする疾患、適切な好ましい対象、様々な種類のマススペクトロメトリーは、上記で開示されている。
【００５７】
この態様の追加の側面において、試料中のＤＥＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。この態様の他の側面において、試料中のＤＥＳ及びＩＤＳは、式（１）の化合物の量に関連して較正される。
【００５８】
本発明の追加の態様は、試料中の弾性繊維損傷のマーカーのマススペクトロメトリー解析の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精密度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善する方法であって、当該マーカーは、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。この方法は：
（ａ）弾性繊維損傷を特徴とする疾患に罹患している恐れのある対象から取得した試料を式（１）
【化７】
2019066481.tif 000009
の化合物と接触させる工程；
（ｂ）当該式（１）の化合物を含有する工程（ａ）の試料の酸加水分解を実施する工程；及び
（ｃ）酸加水分解された工程（ｂ）の試料に対しマススペクトロメトリーを実施する工程；
を含む。
【００５９】
本明細書中、「正確度」及び「精密度」は、それぞれ、解析で試料中の化合物の実際の濃度が得られる度合い、及びその後の解析で一致した結果が得られる度合いを意味する。
【００６０】
本発明における、弾性繊維損傷を特徴とする疾患、適切な好ましい対象、及び様々な種類のマススペクトロメトリーは、上記に開示されている。
【００６１】
この態様の追加の側面において、前記試料中のＤＥＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。この態様の他の側面において、試料中のＤＥＳ及びＩＤＳは、式（１）の化合物の量に関連して較正される。
【００６２】
本発明の他の態様は、対象由来の試料中の弾性繊維損傷のマーカーの量をマススペクトロメトリーによって決定するためのキットである。このキットは：式（１）
【化８】
2019066481.tif 000010
の化合物及び説明書を備え、当該弾性繊維損傷のマーカーが、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。当該キットは、ＩＳ及び／又は他の試薬、例えば緩衝溶液及び酸加水分解用の試薬等、本明細書中に開示される方法を実施するための試薬のための１つ以上の容器を任意で備え得る。当該容器は、ガラスやプラスチック等の適切な材料で出来ている。当該ＩＳ及び／又は他の様々な試薬は、例えば粉末や凍結乾燥形態、及び／又は液体形態等の任意の簡便な形態でキット中に存在する。
【００６３】
弾性繊維損傷を特徴とする疾患、適切な好ましい対象、及び様々な種類のマススペクトロメトリーは、上記に開示されている。
【００６４】
本発明の他の態様は、正常な肺機能を有する対象におけるアルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）に関連する作用の進行を予防する方法である。この方法は：
当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン及びそれらの組み合わせから成る群から選択される弾性繊維損傷のマーカーをマススペクトロメトリーによって測定する工程；及び
当該患者の弾性繊維損傷のマーカーの量が通常よりも高い場合、ＡＡＴＤ増強治療剤を投与する工程；
を含む。
【００６５】
本明細書中、「正常な肺の機能」は、全肺気量等の伝統的な試験を使用して医療の専門家により判定されたとき、対象の肺系が典型的な状態で機能していることを意味する。
【００６６】
本明細書中、弾性繊維損傷のマーカーの「正常な量」は、デスモシンレベル及び／又はイソデスモシンレベルが集団における平均と同等又はそれ以下であることを意味する。例えば、本明細書中、血漿中の全デスモシン及びイソデスモシンレベルは、非喫煙者で副流煙に晒されていない正常な対象において、約０．１９  ±  ０．０２  ｎｇ／ｍｌである。
【００６７】
適切な好ましい対象、試料、及び試料を取得する方法は、上記に開示されている。
【００６８】
この態様の一つの側面において、前記試料は、マススペクトロメトリーを実施する前に、式（１）
【化９】
2019066481.tif 000011
の化合物と接触される。
【００６９】
この態様の追加の側面において、試料中のＤＥＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。この態様の他の側面において、試料中のＤＥＳ及びＩＤＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。
【００７０】
本発明の態様の追加の態様は、正常な肺機能を有する対象における肺エラスチンの分解を検出する方法である。この方法は、当該対象由来の試料中の、デスモシン、イソデスモシン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される弾性繊維損傷のマーカーを、マススペクトロメトリーによって測定する工程を含む。
【００７１】
適切な好ましい対象、試料、及び試料を取得する方法は、上記に開示されている。
【００７２】
この態様の一つの側面において、前記試料は、マススペクトロメトリーを実施する前に、式（１）
【化１０】
2019066481.tif 000012
の化合物と接触される。
【００７３】
この態様の追加の側面において、前記試料中のＤＥＳの量は、式（１）の化合物の量に関連して較正される。この態様の他の側面において、試料中のＤＥＳ及びＩＤＳは、式（１）の化合物の量に関連して較正される。
【００７４】
下記実施例は、本発明の方法を更に例示するために提供される。これらの実施例は例示のみを目的とし、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
材料及び方法−試薬
ＤＥＳ−ｄ４の化学合成において：重水素ガス（９９．９％原子％）を、Ｓｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から購入した。全ての反応は、他に言及の無い限り、無水溶媒を使用して磁石で撹拌しながら行われた。反応のためのＣＤ３ＯＤは、Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）から購入した。全ての試薬は商業的供給者から取得し、他に言及の無い限り、更に精製をせずに使用した。解析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が、Ｍｅｒｃｋ  （Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪ）製Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４プレート上で行われた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＥＸＣ  ３００スペクトロメーター（３００  ＭＨｚ）  （ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）上で記録された。１Ｈ  ＮＭＲデータは、以下のように提示された。化学シフト（δ，  ｐｐｍ）、統合、多重度（ｓ、一重；  ｄ、二重；  ｔ、三重；  ｑ、四重；  ｍ、多重）、結合定数（Ｊ）Ｈｚ。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  （ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．，  Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）上で記録された。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析において、ＤＥＳ及びＩＤＳ標準（５０％ＤＥＳ及び５０％ＩＤＳを混合したもの）は、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，  Ｍｌ）から購入し、ＣＦ１セルロース粉末はＷｈａｔｍａｎ  （Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ）から購入し、他の試薬はＳｉｇｍａ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手した。
【００７６】
ＤＥＳ−ｄ４の化学合成
出発材料は、予め合成した４−アルキニルＤＥＳ誘導体化合物１（図１）である（Ｕｓｕｋｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２，  Ｙａｎｕｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２）。ＣＤ３ＯＤ（０．９ｍｌ）中の化合物１（３５．２  ｍｇ，  ２７．４μｍ，  １  ．０  ｅｑ）を１０％  Ｐｄ／Ｃ  （１４５．６  ｍｇ，  ０．１４  ｍｍｏｌ，  ５．０  ｅｑ）で処理し、Ｄ２大気下で、室温で、風船を使用して重水素化した。室温で６日間撹拌した後、反応混合物を中性シリカ上のセライトパッドを通して濾過して分離し、ＭｅＯＨで溶出し、濾過物を減圧下で濃縮して、黄色の固体として化合物２の粗混合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ  （ｍ／ｚ）  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｄ４Ｈ６８Ｎ５Ｏ６［Ｍ］＋：  ９３０．５２，  ｆｏｕｎｄ：  ９３０．３９。得られた産物を更に精製せずに次の反応に使用した。ＴＦＡ及び蒸留水の混合物（７．０  ｍＬ，  ＴＦＡ／水＝  ９５／５）を室温で粗混合物２に添加し、２時間撹拌した。溶媒を真空下で除去した。Ｃ１８カラムクロマトグラフィーで精製して（蒸留水中０．１％ＴＦＡ）、黄色の固体として、所望のＤＥＳ−ｄ４を得た（２８．９  ｍｇ，  ４４．９μｍｏｌ，  ｑｕａｎｔ  （２工程））；Ｒｆ０．２２  ［ＭｅＯＨ  （０．１  ％  ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ（０．１  ％  ＴＦＡ）  ＝  １  ：  ９］。ＤＥＳ−ｄ４の構造は、ＮＭＲ（図２）及びマススペクトル（図３）の両方によって確認された。新しく合成されたＤＥＳ−ｄ４は、酸性条件で安定なアルカン炭素が４つの重水素を有していた。この合成された重水素−ＤＥＳは、４つの重水素化アイソトポマーからなり：図３に示すＭＳスペクトルによって決定されるように、ＤＥＳ−ｄ４（５０．５３  ％）、−ｄ３  （３８．９３  ％）、−ｄ２（１０．１０  ％）、−ｄ１  （０．３９  ％）であった。最も豊富なＤＥＳ−ｄ４イオン（ｍ／ｚ  ５３０）が、同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に使用される。
【００７７】
ＤＥＳ及びＩＤＳ解析用の生物学的試料
良く特徴付けられたＣＯＰＤ患者から採取した１０個の血漿及び１６個のＢＡＬＦ試料を、ＦＯＲＴＥ試験から取得した（Ｒｏｔｈ，  Ｍ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）。
【００７８】
ＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、従来公開された標準化された３つの手順を改変して実施された（Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。液体試料の解析手順は下記に示す。
【００７９】
工程１：酸加水分解：ＤＥＳ−ｄ４  ＩＳ（５ｎｇ）を、ガラスバイアル中の解析試料（０．５ｍｌ）と等量の濃塩酸（３７％）に添加した。バイアル中の空気を窒素に置換し、１１０℃で２４時間加熱した。加水分解した試料を濾過し、乾燥により蒸発させた。ＤＥＳ及びＩＤＳの遊離（非会合）形態の解析のために、試料は、ＨＣｌ加水分解無しで直接解析された。
【００８０】
工程２：セルロース（ＣＦ１）カートリッジ抽出：酸加水分解した試料（真空又は窒素流下で乾燥して残留酸を除去したもの）又は非加水分解試料（遊離ＤＥＳ／ＩＤＳ解析用）を、２ｍｌのｎ−ブタノール／酢酸／水（４：１：１）中に溶解し、３ｍｌの５％ＣＦ１セルロース粉末のｎ−ブタノール／酢酸／水（４：１：１）スラリーを導入して調製された３ｍｌセルロースカートリッジに適用した。セルロース粉末スラリーは良く分散されたスラリーでなければならず、２４時間の撹拌を要する。当該カートリッジを３ｍｌのｎ−ブタノール／酢酸／水（４：１：１）で３回洗浄し、カートリッジ中に保持された試料を３ｍｌの水で溶出し、乾燥させ、１００μｌのＬＣ流動相中に溶解し、そしてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。
【００８１】
工程３：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析：ＴＳＱ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙエレクトロスプレータンデムマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に使用した。使用したＨＰＣＬ条件は、２ｍｍ  ｘ  １５０  ｍｍ  ｄＣ１８  （３μｍ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ，  ＭＡ）であり、流動相Ａ（水中７  ｍＭ  ＨＦＢＡ／５  ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ）及びＢ（８０％アセトニトリル中７  ｍＭ  ＨＦＢＡ／５  ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ）は、１２ｍ中で１００％Ａから８２％Ａまで直線的にプログラムされた。定量は、ＤＥＳ及びＩＤＳ（ｍ／ｚ  ５２６〜ｍ／ｚ  ４８１  ＋  ｍ／ｚ  ３９７）及びＩＳ（ｍ／ｚ  ５３０〜ｍ／ｚ  ４８５）の遷移の選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）により実施され、衝突エネルギーは両方の遷移で３３Ｖに設定され、衝突ガス圧は１．５ｍＴｏｒｒで、チューブレンズは１３２Ｖで、シースガス圧は４５に設定され、補助ガス圧は６単位、及びイオンスプレー電圧は３．８ｋＶとした。走査時間は１．００ｍｓに設定し、両方の四重極（Ｑ１及びＱ３）は０．７  Ｄａ  ＦＷＨＭであった。
【００８２】
統計解析
不等分散で調整されるｔ−検定が、帰無仮説を試験するのに使用された。有意性のレベルは０．０５であった。ｐ−パルスは、対応の無いｔ−検定を使用してＤＥＳ及びＩＤＳの積算された値に基づいて計算された（全ての計算はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．２を使用して実行された）。
【００８３】
実施例２
ＩＳとしてのＤＥＳ−ｄ４の安定性
ＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析におけるＩＳとして使用するときのＤＥＳ−ｄ４の安定性及び信頼性を試験した。ＤＥＳ−ｄ４（１００ｎｇ）を、６Ｎ  ＨＣｌ中の５０、１００、１５０、２００及び１００ｎｇ／ｍｌの５つの濃度のＤＥＳ及びＩＤＳ中に添加して、混合溶液を１１０℃で２４、４８及び７２時間加熱した。得られた溶液のマススペクトル解析は、ＤＥＳ−ｄ４が殆ど完全な回収率を示す安定性を有することを示した（表１）。
表１．６Ｎ  ＨＣｌ中１１０℃でのＤＥＳ−ｄ４（ＩＳ）安定性
【表１】
2019066481.tif 000013
＊下記の５つの濃度のＤＥＳ  ＋  ＩＤＳ及びＩＳ  （ＤＥＳ−ｄ４）の混合物が、５Ｎ  ＨＣｌ中で２４、４８及び７２時間加水分解された。回収率はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析された。
Ｃｏｎ．  １：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  １００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ２：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ２００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ３：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ３００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ４：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ４００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ５：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ５００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ  （全て１ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌ中）
【００８４】
ＤＥＳ及びＩＤＳは、６Ｎ  ＨＣｌ中での酸加水分解の過程で安定であることが示されている（Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。更に、発明者らは、生物学的試料の解析において使用されるのに最も近い５つの異なる濃度でのＩＳの存在下でのＤＥＳ及びＩＤＳの回収率を確認した。表２に示すように、その結果は、５つの全ての濃度において、ＩＳに対するＤＥＳ＋ＩＤＳの一致した比率をもたらした。これらの結果は、ＤＥＳ−ｄ４が、酸加水分解下でＤＥＳ及びＩＤＳを測定するための信頼できるＩＳと見做されることを実証している。
表２．６Ｎ  ＨＣｌ中１１０℃でのＤＥＳ＋ＩＤＳ／ＩＳの精密度
【表２】
2019066481.tif 000014
＊下記の５つの濃度のＤＥＳ  ＋  ＩＤＳ及びＩＳ  （ＤＥＳ−ｄ４）の混合物が、６Ｎ  ＨＣｌ中で２４、４８及び７２時間加水分解され、回収率はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析された。
Ｃｏｎ．  １：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  １００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ２：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ２００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ３：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ３００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ４：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ４００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ；
Ｃｏｎ．  ５：  ＤＥＳ＋ＩＤＳ  ５００ｎｇ，  ＩＳ  １０００ｎｇ  （全て１ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌ中）
【００８５】
実施例３
ＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析
合成されたＤＥＳ−ｄ４をＩＳとして使用して、ＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を新しく開発した。ＤＥＳ及びＩＤＳ測定の再現性及び正確度が、それらのｓ定量的直線性及びそれらの生物学的マトリックスからの回収率の両方によって試験された。
【００８６】
ＤＥＳ及びＩＤＳ定量の較正曲線が、１ｇのＩＳ（ＤＥＳ−ｄ４）の存在下、０．０５〜４００ｎｇ／ｍｌの１５個の希釈物を用いて作成された。ＩＳに対するＤＥＳ＋ＩＤの同位体比率（図４Ａ）又はＩＳに対するＤＥＳ又はＩＤＳの個別の同位体比率（図４Ｂ）の優れた直線性が取得された。良好なアッセイ間の精密度（ＣＶ％）及び正確度（％ｂｉａｓ）が、２．０  ｎｇ／ｍｌ〜４００  ｎｇ／ｍｌ  ＤＥＳ＋ＩＤＳレベルにおいて達成された。０．２〜１．５  ｎｇ／ｍｌのより低い濃度のＤＥＳ＋ＩＤＳで（図４Ａに挿入）、アッセイ間の精密度は低く、これは、ＥＳＩ−ＭＳスペクトロメーター中のイオン集団がより低い場合にイオン安定性が不十分であることによる。我々は、そのような低い濃度での精密度は、ＥＳＩ−ＭＳ装置のより新しいモデルを使用してイオン安定性を改善することより達成され得ると考えている。
【００８７】
同位体希釈解析は、図４Ｂに示す個別の較正の使用によっても達成され得るが、２つの異性体のベース−ピーククロマトグラフィー分離が不完全であるため、個別のＤＥＳ及びＩＤＳ測定によって僅かに高い非精密度が観察され得ることを留意すべきである。これは、そのような個別のＤＥＳ及びＩＤＳ測定を要するとき、より優れたクロマトグラフィー分離によって改善され得る。
【００８８】
実施例４
結合組織マトリックスからのＤＥＳ／ＩＤＳの回収
図５は、３つの代表的な結合組織マトリックス：尿、血漿及びＢＡＬＦの同位体希釈解析の典型的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。尿及び血漿の２つの組織マトリックスの品質管理試料からのＤＥＳ及びＩＤＳの回収率を、表３に示す。これらの結果は、血漿及び尿試料中の全ＤＥＳ＋ＩＤＳ及び遊離ＤＥＳ＋ＩＤＳが、優れた正確度で同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定され得ることを示す。
表３．生物学的マトリックス中のＤＥＳ及びＩＤＳの回収
Ａ）血漿（全ＤＥＳ＋ＩＤＳ）
【表３Ａ】
2019066481.tif 000015
Ｂ）血漿（遊離ＤＥＳ＋ＩＤＳ）
【表３Ｂ】
2019066481.tif 000016
Ｃ）尿（全ＤＥＳ＋ＩＤＳ）
【表３Ｃ】
2019066481.tif 000017
Ｄ）尿（遊離ＤＥＳ＋ＩＤＳ）
【表３Ｄ】
2019066481.tif 000018
＊標準的な尿試料（血漿０．５ｍｌ及び尿１．０ｍｌ）に、表に示す３つの濃度のＤＥＳ及びＩＤＳを滴下した。ＤＥＳ＋ＩＤＳレベルは、同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によって決定した。
【００８９】
実施例５
ＣＯＰＤにおけるエラスチン分解の生体マーカーとしてのＤＥＳ及びＩＤＳの測定
Ｅｘａｍｐｌｅ  ５
開発された同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析が、ＦＯＲＴＥ試験（Ｒｏｔｈ，  Ｍ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）に参加した中度〜重度のＣＯＰＤに罹った良く特徴付けられた患者からの１０個の血漿及び１６個のＢＡＬＦ試料中のＤＥＳ及びＩＤＳレベルを試験するために使用された。血漿及びＢＡＬＦ中のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムの典型例を図５に示す。（Ａ）は酸加水分解後の血漿中の全ＤＥＳ及びＩＤＳレベルを示し、（Ｂ）は血漿中の遊離ＤＥＳ及びＩＤＳレベルを示し、及び（Ｃ）はＢＡＬＦ中の全ＤＥＳ及びＩＤＳレベルを示す。
【００９０】
ＣＯＰＤ患者におけるＤＥＳ＋ＩＤＳレベルは、上記同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析によって測定され、その結果は、図６にまとめられている。血漿中の全ＤＥＳ＋ＩＤＳレベル（血漿の酸加水分解後）は平均０．５１  ±  ０．１５を示し、これは正常者で全ＤＥＳ＋ＩＤＳレベルが０．１９  ±  ０．０２であったのがＣＯＰＤ患者で０．６５  ±  ０．１４  ｎｇ／ｍｌとなった過去の報告（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７）のＣＯＰＤ患者の顕著な増大の範囲内である。加えて、この新しく開発された同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の増大した感度及び特異性は、血漿中の遊離ＤＥＳ及びＩＤＳ０．０９  ±  ０．０３  ｎｇ／ｍｌ及びＢＡＬＦ中のＤＥＳ及びＩＤＳ０．０３  ±  ０．０１  ｎｇ／ｍｌのレベルの測定を可能とする。
【００９１】
実施例６
発明者らは、安定な重水素同位体ＤＥＳ−ｄ４を化学的に合成し、これはＤＥＳ分子中のアルキルアミノ酸のアルカニル炭素において４つの重水素を有しており、酸加水分解に対して安定である。後者の特徴は、弾性組織分解の生体マーカーとして２つの架橋分子ＤＥＳ及びＩＤＳを測定するのに必要である。ＤＥＳ分子の全合成における発明者らの最近の達成（Ｕｓｕｋｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｙａｎｕｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  ２０１２）により、正確な同位体希釈マススペクトロメトリー解析のための理想的なＩＳとなり得る安定なＤＥＳ−ｄ４の合成が可能となった。過去に公開されたＤＥＳ及びＩＤＳの同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、ＩＳとして天然のＤＥＳから得られた化学的に交換された重水素化合物を使用する（Ｂｏｕｔｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  （１），  Ａｌｂａｒｂａｒａｗｉ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｂｏｕｔｉｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  （２），  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，  Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。この触媒的に交換された重水素化合物は酸性条件下で安定でなく、エラスチン分解の不正確な測定をもたらし得る。ＤＥＳ−ｄ４を使用した同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、酸性及び酵素的分解下での架橋ＤＥＳ及びＩＤＳ分子の解析に使用でき、エラスチン分解を含む生体医学及び病理学的研究における生体マーカーとしてＤＥＳ及びＩＤＳを正確に測定するための一般化された方法と見做される。この方法は、低レベルの血漿中の遊離ＤＥＳ及びＩＤＳの、及び更に低レベルのＢＡＬＦ中の全ＤＥＳ及びＩＤＳの検出によって示されるように、感度及び特異性を改善する。
【００９２】
ＣＯＰＤにおける肺のエラスチン分解は良く認識されている。ＣＯＰＤは世界的に主要な健康の問題であり、現在では米国で３番目の死亡原因である（Ｍａｎｎｉｎｏ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｒａｂｅ，  Ｋ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｍｉｎｉｎｏ，  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。この疾患の進行を止め、生存率を改善する治療は不足している。新しい薬物の発見は、治療に対する応答や疾患の重症度のインジケーターとして作用する生体マーカーの開発によって補助され得る。エラスチン分解産物は、そのような生体マーカーの需要を充たし得る（Ｒｅｎｎａｒｄ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。尿中のＤＥＳ及びＩＤＳはエラスチン分解のインジケーターとして以前も測定されているが、血漿、血清又はＢＡＬＦ等の循環系の体液中のより低いレベルのＤＥＳ及びＩＤＳの測定は、エラスチン分解の病理的又は生化学的変化をより直接反映すると考えられる。ＣＯＰＤ患者の尿中の正常レベルより高いレベルの遊離ＤＥＳ及びＩＤＳの検出は、ＣＯＰＤ患者におけるエラスチン分解における顕著なマーカーとして報告されている（Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。しかしながら、血漿中の遊離ＤＥＳ及びＩＤＳの検出は、低濃度であるためこれまで報告されていない。ＢＡＬＦ中のＤＥＳ及びＩＤＳの検出は、ＣＯＰＤ患者の肺で起こっているエラスチン分解の指標となるものである。
【００９３】
上記同位体希釈ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は、エラスチン分解を含む生体医学及び病理学的研究における生体マーカーとしてＤＥＳ及びＩＤＳを測定するための一般化された方法と見做される。
【００９４】
実施例７
解析用の体液
この実施例において、この試験で解析される患者及び患者の親類から採取した血漿試料を、Ａｌｐｈａ−１  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋから取得した。Ａｌｐｈａ−１  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋプロジェクトは、Ａｌｐｈａ−１  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの援助を受けており、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ  ＦＬに所在している。Ａｌｐｈａ−１  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ＩＲＢは、このプロトコルを認可している（６５９−２００２）。この研究で解析される気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び尿試料は、過去にＩＲＢで認可されたＬｕｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｓｔｕｄｙ  （ＵＦ−ＩＲＢ５７７−２００２）から取得された。全ての対象はインフォームドコンセントフォームにサインしている。アルファ−１抗トリプシンのフェノタイピング及びジェノタイピングはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＦｌｏｒｉｄａのＡｌｐｈａ−１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで実施された。
【００９５】
４つの体液試料の供給源が解析された。（１）ＡＡＴ増強をしていない５０名のＡＡＴＤ患者及び５０名の正常な対象と比較される、市販のヒト血液供給源からのアルファ−１抗トリプシンタンパク質を与えられた４７名の患者からの血漿試料；（２）ＩＶ治療の開始前、及びその後１２及び２４週間後に血漿試料を提供したホモ接合重症ＡＡＴＤ患者１１名；（３）ＩＶ置換を受けて１２週目にＢＡＬＦを提供したホモ接合ＡＡＴＤ患者１０名（投与用量は上記患者群において各週６０ｍｇ／ｋｇ体重）；（４）組換え生産ＡＡＴをエアロゾルとして８週間投与した患者（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）（投与用量は各日エアロゾル化した組換えＡＡＴ２５０ｍｇ）。ベースライン時点及びエアロゾル治療の８週間後、８名の患者がＢＡＬＦを提供し、１２名の患者が血漿試料を提供し、５名の患者が尿試料を提供した。
【００９６】
下記３つの方法が、アルファ−１ゲノムを決定するために使用された：（１）ＴａｑＭａｎ  （Ｓ＆Ｚ  ａｌｌｅｌｅｓ），  ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した対立遺伝子識別（ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）によるジェノタイプ；（２）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ，  Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ  ＢＮ  ＩＩによるＡＡＴ  Ｌｅｖｅｌ、及び（３）Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｅ  ＩＩの等電点電気泳動法によるフェノタイピング。血漿、ＢＡＬＦ及び尿中のデスモシン及びイソデスモシン（ＤＩ）における解析の方法は、記載の通りである（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＢＡＬＦ中のＤＩ量は、希釈のマーカーとして尿素を使用してＢＡＬＦのｍｌあたりのＤＩの濃度として計算された（Ｒｅｎｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）。
【００９７】
ＤＩの解析方法
記載されている高性能液体クロマトグラフィー及びタンデムマススペクトロメトリーを使用した（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【００９８】
統計的方法
大きい患者コホートに対する増強療法の効果を比較するために、Ｔ−検定を使用した。個人における治療前後の変化を比較するために、対応のあるＴ−検定を使用した。年齢とＤＩのレベルとの関連性を判定するために、線形回帰を使用した。
【００９９】
結果
正常な個人の血漿中のＤＩの平均レベルは０．２２  ｎｇ／ｍｌ、標準偏差（ＳＤ）は０．０４  （ｎ＝４７）である一方、増強療法を受けている患者において平均０．２５  ｎｇ／ｍｌ、ＳＤは０．０１  （ｎ＝５０）であり、この差においてｐ＝０．００３５であった（ｎ＝５０）。増強療法を受けていないＡＡＴＤ患者（ｎ＝５０）のＤＩレベルは平均０．３６  ｎｇ／ｍｌ、ＳＤ  ０．０１、ｐ＜０．０００１であり、ＡＡＴ治療を受けていないＡＡＴＤ患者におけるＤＩのレベル及び正常な対象及び増強を受けている及び受けていないＡＡＴＤ対象の間の比較のためである（図７）。
【０１００】
静脈内置換を受けている１１名の患者において、治療のベースライン及び１２及び２４週でのＤＩのレベルは、両方の時点で血漿中のＤＩの統計的に顕著な減少を示した（即ち−１３．９％及び−２０．３％、ｐ＝０．０３８）（図８Ａ及び８Ｂ）。
【０１０１】
ＩＶ増強療法を受ける前及び１２週後のＢＡＬＦ中のＤＩのレベルを１０名の患者について解析した。ＤＩのレベルは８名の患者で減少し、２名で増大した。全体の平均の変化は−３７％であった（範囲：−１２．８％  ｔｏ  −８５．９％  ）  ｐ＝０．０２７３（図９）。
【０１０２】
１２名の患者において、血漿中のＤＩのエアロゾル増強療法前後の比較は、６．５％の平均の減少及びベースラインからの２２．３％から−５０．８％の様々なパーセント変化を示した。この１２名の患者におけるＤＩの濃度の変化は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１６７５）（図１０Ａ及び１０Ｂ）。１２名の患者の内９名のＤＩレベルの減少は統計的に有意であり、平均の減少は１２．１％であった（範囲：−０．２％〜−５０．８％）  ｐ＝０．０１４２。３名の患者におけるＤＩの平均の増大は４．３％であって、統計的に有意ではない。
【０１０３】
エアロゾル投与によってＡＡＴを受けている８名の患者において、ＢＡＬＦ中のＤＩレベルは全員減少した。平均の減少は−５８．５％であった（範囲：−１４．７％〜−  ９３．５％）  ｐ＝０．００７８（図１１）。ＢＡＬＦ中のＤＩの解析も、補正因子としてＢＡＬＦの全タンパク質量を使用して行われ、その結果は、上記のものと類似していた。
【０１０４】
静脈内増強を受けた患者１０名において、同時に同一の患者中の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）及び血漿中のＤＩのレベルを比較することが可能であった。２つの間に正の有意な相関が存在する（図１２）。
【０１０５】
増強療法の前後に５名の対象の尿試料を取得した。５名中４名において、０．１〜１３．０％の範囲のＤＩ排出の遊離成分における減少があった。１名の対象は、７５．３％の排出の増加を示した。ＤＩの全排出は、３名の対象で治療後に増大し、２名で減少した。全ＤＩ排出に渡る遊離ＤＩのパーセントは５名全てで減少し、平均の減少が２１．６％、範囲は−１．３３％〜−４２．３６％であった。この結果は、統計的有意性を僅かに下回った（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【０１０６】
図１４に示すように、正常な対象において、及び増強療法を受けている及び受けていないＡＡＴＤ患者において、ＤＩの血漿レベルと加齢との間に統計的に有意な正の相関が存在する。
【０１０７】
この研究は、長期間静脈内投与によりＡＡＴ置換されたＡＡＴＤ患者中の血漿中のＤＩレベルの統計的に有意な減少を示す。１０名中８名の患者のＢＡＬＦ中のＤＩの測定は、濃度レベルの統計的に有意な減少を示した。この結果は、静脈内（Ｉ．Ｖ．）増強療法が、特に肺において、所望の治療結果であるエラスチン分解の減少を達成していることを示唆する。
【０１０８】
増強療法を受けている及び受けていないＡＡＴＤ患者の集団、及びＡＡＴ治療を受ける前後の個人におけるＤＩの血漿レベルの減少は、全身的なエラスチン分解の減少及び全身的な抗炎症効果と一致する。
【０１０９】
ＡＡＴのエアロゾル投与を受けている患者におけるＢＡＬＦ中のＤＩの顕著な減少は、霧状のＡＡＴ自体が肺の好中球エラスターゼの活性を減少させることを示唆するものであり、この投与ルートがＡＡＴＤの効果的な治療であり得ることが示唆される。この限定された数の患者におけるＤＩの血漿レベルの減少は、静脈内投与を受けている患者の血漿中のＤＩの減少程はエアロゾル投与と一致していなかった。エアロゾル投与による血漿中のＤＩレベルの一貫していない減少は、静脈内投与と比べてエアロゾルにより投与されているＡＡＴの毎週の合計用量が少ないことに関連し得る。体重７０ｋｇの対象は、エアロゾルによる場合、毎週の用量がＩ．Ｖ．よりも４３％少なかった。１２週間の治療において同時に採取された血漿及びＢＡＬＦ中のＤＩレベルの正の相関（図１２）は、血漿中のレベルに正に寄与する肺内のＤＩのレベルと一致する。
【０１１０】
尿中の遊離ＤＩのパーセントの減少は、ＡＡＴ増強の抗炎症効果とも一致し得る、排出前のインビボでのエラスチン断片のエラスターゼによる分解の減少を示唆する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  １９７９）。利用可能な生検を有する５名の患者において取得されたこの結果は、統計的有意性を僅かに下回った（ｐ＝０．０６２５）。
【０１１１】
増強療法を受けている５０名の患者のＤＩの血漿レベルが尚も正常な範囲を上回ることは注目に値する。この結果は、より高い増強療法の用量は、ＡＡＴＤの個人におけるエラスターゼ活性の尚もより効果的な減少を達成し得ることを見込ませる。
【０１１２】
４３名の肺疾患又はアルファ−１抗トリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の無い対象におけるＤＩの解析は、ＤＩの血漿レベルが年齢と関連することを推察させる。図１４に示すように、非ＡＡＴＤ正常対象における、血漿ＤＩレベルの増大と、加齢との間の正の相関が存在した（ｒ２＝０．１７０５及びｐ＝０．００５９）。これらのデータは、喫煙者及び非喫煙者の正常な対象を含んでいた。増強を受けた、及び受けていないＡＡＴＤコホートにおいて、血漿ＤＩレベルと年齢の正の相関が存在する。
【０１１３】
喫煙歴についてのアンケート調査から得たこれらのコホートにおける患者からの情報は、この解析に加えるのに充分に信頼できるとは考えられなかった。患者アンケートは、２０箱以上の煙草を吸ったことの無い個人を非喫煙者と分類していた。患者が何時煙草を吸い始めて吸うのを止めたのかが特定できず、副流煙に晒された者を除外する情報が存在しなかった。従って、発明者らは、煙草の煙に晒された又は晒されていない者を分けずに、年齢に関する各コホートを解析した。
【０１１４】
この研究における３つの全てのコホートにおける年齢と関連したＤＩの血漿レベルの増大は、年齢が身体のエラスチンの分解の増大に関連していることの証拠である。この効果を引き起こす確かなメカニズムは不明である。しかしながら、これらのヒト対象におけるデータは、老化促進マウスにおけるそのような証拠と一致しており（Ａｔａｎａｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、ヒトの大動脈エラスチンは、高齢の対象における、加齢に伴う大動脈の男性の減少及び大動脈エラスチンの架橋の発展的減少を示す（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。酸化したエラスチンがエラスターゼによる分解の増大に供されることがインビトロで示されていることから（Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｕｍｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、加齢に伴うエラスチンの酸化の増大が一定の役割を果たし得ると考えられる。ＤＩの血漿レベルと年齢との正の相関は、マススペクトロメトリー解析法を使用した２つの最近の研究によって示されている（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０１１５】
この研究における正常な対象中の血漿ＤＩの平均値（０．２２  ｎｇ／ｍｌ  ±  ０．０４  ＳＤ）は、１３名の対象（８名男性、５名女性）において過去に報告された（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）血漿ＤＩの平均の正常値（０．１９  ｎｇ／ｍｌ  ±  ０．０１  ＳＤ）よりも僅かに高かった。この違いは、過去の研究において喫煙者又は副流煙に晒された対象を厳密に除外していることに関連し得る。
【０１１６】
過去の研究は、Ｉ．Ｖ．でＡＡＴ補充療法を一週間行った後の痰中のロイコトリエンＢ−５、インターロイキン−８及び好中球エラスターゼのレベルが減少したことに基づいて、ＡＡＴ増強療法の抗炎症効果を実証した。この結果は、好中球エラスターゼの直接の阻害に加えて、増強療法は、追加的な抗炎症効果を通じ、好中球及びマクロファージによるエラスターゼ生産減少によって、エラスチン分解を減少し得ることを示唆する。
【０１１７】
血漿及びＢＡＬＦ中の測定における肯定的な結果は、これらの体液が、全身のエラスチン分解及び器官系における変化を反映し得ることを示唆している。ＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳ技術の使用は、尿以外のこれらの体液におけるより高感度かつ正確な測定を実現し、そしてＣＯＰＤの潜在的な治療手段を評価するための生体マーカーとしての更なる用途が見込まれる。
【０１１８】
この研究における解析のための血漿、ＢＡＬＦ及び尿は、深冷凍状態（−２０℃）で数年間保存され得るが、長期間に渡る保存は、冷凍状態にあってもＤＩの含有量に影響を及ぼす。発明者らは、１）正常な対象及びＡＡＴＤコホートにおけるＤＩのレベルが類似のコホートからの新鮮な血漿試料において以前取得したものと同一の範囲内であったこと（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）；２）６年以上ラボ内で保存してあった血漿及び尿の凍結サンプルを反復して解析したがＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＤＩの定量値に変化が無いこと；３）この研究の目的が増強療法の実施前後のＤＩレベルの変化を決定することであるため、前後の試料は同一の保存条件に置かれること；及び４）ＤＩの化学結合は安定で、体液中でＤＩの分子が分解する化学的メカニズムは現在のところ示されていないこと；は、試料の長期の凍結保存のＤＩに対する影響が無視できるレベルである十分な根拠となり得ると考えている。試料の酸加水分解がＤＩを分解しないことは、既に示されている（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【０１１９】
この研究は、増強療法を受けていないＡＡＴＤ患者が、疾患の重症度が異なることにより、血漿中のＤＩレベルが高くなり得るという考察を導く。しかしながら、増強療法を受けている患者における平均ＦＥＶ１レベルが４１．３％（Ｓ．Ｄ．  ２２．１）であったのに対して、増強療法を受けていない者における平均ＦＥＶ１は、７２．７％（Ｓ．Ｄ．  ２９．３）であった。過去の研究はこの前提に対立し、尿及び血漿中のＤＩレベルはＦＥＶ１によって示唆されるように疾患の重症度の増大に伴って高くなることを示している（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｆｒｅｇｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【０１２０】
これらの患者コホートにおけるＤＩの血漿レベルと年齢の正の相関は、この研究で得られる最終的な結果に影響しない。これに関連して、増強療法を受けている患者の平均年齢は受けていない患者の平均年齢よりも高かったが、ＤＩの平均レベルは統計的に有意により低かった。
【０１２１】
実施例８
この研究は、重症のＡＡＴＤ及び正常な肺機能を有する４９名の患者に対して行われた。この研究における個人は、増強療法中ではなかった。ベースライン定量的コンピューター断層撮影（ＱＣＴ）は、肺のパーセンテージを−９１０ハンスフィールドユニットと規定し、中間値が、対象を肺の密度がより高い者とより低い者とに区分するように選択される。被験者は２年間６ヶ月毎に通院し、３年目の終りに最後に通院する。ＱＣＴは、通院毎に高及び低解像度でモニターされ、１回目及び２年目の終わりの通院時に呼気ＱＣＴがモニターされた。この研究は、肺組織の損失のより正確な評価の開発を導き、ＡＡＴＤにおける肺破壊の理解を改善し得る。
【０１２２】
結果
各対象において、３年間に渡って血漿又は血清の６個の試料の解析を行った。３年間の期間中、生体マーカーの顕著な安定性が認められた。ベースラインにおけるＤＩのレベルは全４９名の対象において０．３１  ±０．０７  ｎｇ／ｍｌであり、最後の読み取り値は０．３０±０．０７  ｎｇ／ｍｌであった。これらのレベルは、通常の０．１９±０．０３  ｎｇ／ｍｌに対して顕著に増大している。３０名の対象において、ＤＩレベルは３年レベルベースラインを下回って減少し、減少値は１１．１１％であり（２．２０−３６．７０％の範囲）、１９名の対象において、Ｄ１レベルは３年時点よりも増大しており、平均の増大は１５．８７％（０．６１−４９％の範囲）であった。３１名の女性の対象において、ベースラインでのＤＩの平均値は０．３２  ｎｇ／ｍｌ（０．２１−０．４７の範囲）で、３年時点では平均０．３２  ｎｇ／ｍｌ（０．１９−０．４６の範囲）であった。１８名の男性において、ベースラインＤＩレベルは０．２９  ｎｇ／ｍｌ（０．２０−０．３６の範囲）で、３年時点で０．２９  ｎｇ／ｍｌ（０．１９−０．３６の範囲）であった。
【０１２３】
図１６に示すように、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、一酸化炭素における肺の拡散能力（ＤＬＣＯ＋）及び年齢において、ＤＩのレベルとの統計的に有意な相関が存在した。ベースラインＱＣＴ密度値、ＦＥＶと強制肺活量の比率（ＦＥＶ１／ＦＶＣ）、及び全肺容量においては、有意な相関は見られなかった。
【０１２４】
これらの結果は、３年の期間の血漿中のＤＩのレベルの安定性は、ＡＡＴ増強療法において既に示されている（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）ように、治療剤の有効性の評価における有用なベースラインを提供し得る。
【０１２５】
上記のように、血漿中のＤＩレベルと年齢との間には正の相関が存在する。この相関はこの試験においても示されている。
【０１２６】
ＤＩの血漿レベルがベースライン及びフォローアップの３年後における全ての患者で正常な値を上回って増大したのは注目すべきである。これらの増大の顕著さは、全身のエラスチン分解が正常な者を上回っているためである。肺気腫はこの集団において好中球エラスターゼの阻害能力が減少した結果であり、このエラスチンの分解が肺において起こっていると認められる。また、過去の研究において（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）、血漿中のＤＩが増大したＡＡＴＤ患者が、ＢＡＬＦ及び痰に顕著な量のＤＩを含有することが認識されている。この早期の疾患コホートにおける血漿中のＤＩの増大は、ＡＡＴＤ肺気腫に関連した病理プロセスが既に始まっており、治療の標的となり得ることを示している。
【０１２７】
予想外なのは、３年間観察した個人におけるＤＩのレベルの近接性であり、これは、ＤＩの血漿レベルを決定する因子が測定期間に渡って定常を維持していることを示唆する。また、これらの結果は、３年間のＤＩレベルの安定性が、ＡＡＴ増強療法で既に示されているように、治療剤の潜在的な有効性の評価において有用なベースラインを提供することも示唆する。
【０１２８】
血漿中のＤＩのレベルと年齢との間には正の相関が存在する。この相関は、この研究において、２５歳以降の５０年間で２０％の増大を示している。過去の研究は、インビトロでのエラスチンの酸化が分解に対する感受性を増大させることを示唆している。もしかすると、インビボでのエラスチンの酸化の増大が加齢に従って起こり、それが身体のエラスチン分解に対する年齢の効果を引き起こす一つの要因になっているのかもしれない。
【０１２９】
血漿試料に対して更に、活性なエラスチン分解の亢進した指標として、遊離（非会合）ＤＩのレベルの解析が行われている。
【０１３０】
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【０１３１】
本出願において引用されている全ての文献は、それらの全てが本明細書中に記載されているものとして参照により援用される。
【０１３２】
本発明の例示的態様が本明細書中に記載されているが、本発明はそのような記載によって限定されないこと、及び様々な他の変化及び改変が、本発明の範囲又は精神から逸脱せずに当業者によってなされ得ることを理解されたい。
【図１】
2019066481.tif 000025
【図２】
2019066481.tif 000026
【図３】
2019066481.tif 000027
【図４Ａ】
2019066481.tif 000028
【図４Ｂ】
2019066481.tif 000029
【図５】
2019066481.tif 000030
【図６】
2019066481.tif 000031
【図７】
2019066481.tif 000032
【図８】
2019066481.tif 000033
【図９】
2019066481.tif 000034
【図１０】
2019066481.tif 000035
【図１１】
2019066481.tif 000036
【図１２】
2019066481.tif 000037
【図１３】
2019066481.tif 000038
【図１４】
2019066481.tif 000039
【図１５】
2019066481.tif 000040
【図１６】
2019066481.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2019066481.tif 000042
の化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を合成する方法であって、以下の工程：
（ａ）以下の構造：
【化２】
2019066481.tif 000043
で表される４−アルキニルＤＥＳ誘導体のＣＤ３ＯＤ溶液を調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）で調製した溶液を、室温でＤ２大気下、１０％Ｐｄ／Ｃで処理し、６日間撹拌して、以下の構造：
【化３】
2019066481.tif 000044
で表される化合物の粗混合物を取得する工程；
（ｃ）当該粗混合物にＴＦＡ及び蒸留水を添加し、室温で２時間撹拌する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の反応産物を精製して、請求項１に記載の化合物を取得する工程；
を含む、方法。