(57)【要約】【課題】骨形成を促進させ、骨量を増加させることができる組成物の提供。【解決手段】ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨形成促進用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨形成促進用組成物。
【請求項２】
ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨吸収抑制用組成物。
【請求項３】
ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨リモデリング改善用組成物。
【請求項４】
ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨量増加用組成物。
【請求項５】
ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨粗しょう症予防又は治療用組成物。
【請求項６】
骨芽細胞活性を増強する、請求項１記載の骨形成促進用組成物。
【請求項７】
破骨細胞活性を抑制する、請求項２記載の骨吸収抑制用組成物。
【請求項８】
骨芽細胞活性を増強し、かつ破骨細胞活性を抑制する、請求項３〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリアミン含有酵母がポリアミンを１５０ｍｇ／１００ｇ菌体乾燥質量以上の量で含有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリアミン含有酵母が、該ポリアミン含有酵母の全細胞、その粉砕物、又は該粉砕物の濾過物もしくは遠心上清である、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリアミンがプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
食品組成物である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は常に破壊と再生を繰り返しながら恒常的に骨量のバランスを保っており、これを骨のリモデリングと呼ぶ。骨の破壊（骨吸収）には破骨細胞が、骨の再生（骨形成）には骨芽細胞がそれぞれ機能している。加齢や閉経等に伴って骨のリモデリングのバランスが崩れて骨吸収が骨形成を上回るようになると、骨量は減少する。骨量の減少に関連する代表的な疾患として、骨粗しょう症がある。骨粗しょう症は、骨量の減少を伴い、骨強度の低下、骨折しやすいなどの症状を示す疾患である。骨粗しょう症の治療には、活性型ビタミンＤ３やビスホスフォネートといった薬剤が用いられている、しかし、これらの薬剤には副作用もあるため、より安全な治療法が求められている。
【０００３】
ポリアミンは、第１級アミノ基を複数有する直鎖状脂肪族炭化水素の総称であり、生物の細胞内に普遍的に存在する。現在までに、２０種類以上のポリアミンの存在が報告されている。ヒトの体内のポリアミンは、主にプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの３種類であり、２０歳台をピークにその量は減少する。ポリアミンは、細胞の分裂に必要な成分であり、細胞内ポリアミン量が減少すると、細胞のターンオーバーが低下し、老化が促進すると考えられている。特許文献１及び非特許文献１には、スペルミン及びスペルミジンが破骨細胞への分化及び／又は破骨細胞の増殖に対して阻害作用を有することが開示されている。また特許文献１には、スペルミン又はスペルミジンを有効成分として含む、破骨細胞への分化及び／又は破骨細胞の増殖が関与する疾患の予防剤及び／又は治療剤が開示されている。しかしながら、骨粗しょう症患者等で低下した骨量を回復させるためには、破骨細胞の活性を抑制するのみでは必ずしも充分ではない。
【０００４】
酵母は、古くからパンやビールなどの発酵食品に利用されていて食経験が豊富にある食品素材である。特許文献２には、酵母菌体をアルカリ処理後水洗浄、粉砕処理及び可溶性成分の除去処理を行うことにより得られる酵母細胞壁画分を有効成分とする、ミネラル吸収促進剤、及び骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤が記載されている。特許文献３には、酵母由来の可溶性β-1,3/1,6-D-グルカンが、未熟な骨芽細胞から成熟骨芽細胞への発育を刺激し、また破骨細胞の形成を阻害することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５９７９６５８号公報
【特許文献２】特開２００４−２９２３８２号公報
【特許文献３】特開２００６−１２２０５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】British Journal of pharmacology, 2012, 166:1084-1096
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、骨形成を促進させることにより、骨リモデリングのバランスを改善して骨量を増加させることができる組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、菌体中にポリアミンを含有するポリアミン含有酵母が、骨形成を促進する作用と骨吸収を抑制する作用とを有し、骨量の増加に有効であることを見出した。
【０００９】
したがって、本発明は、ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨形成促進用組成物を提供する。
また本発明は、ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨吸収抑制用組成物を提供する。
また本発明は、ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨リモデリング改善用組成物を提供する。
また本発明は、ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨量増加用組成物を提供する。
また本発明は、ポリアミン含有酵母を有効成分とする、骨粗しょう症予防又は治療用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の骨形成促進用組成物は、骨形成を促進し、さらに骨吸収を抑制することで、骨リモデリングを改善し、骨量を増加させ、さらには骨量減少による種々の疾患を予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】骨粗しょう症モデルマウスの骨量に対するポリアミン高含有酵母の効果。ＯＶＸ；骨粗しょう症モデルマウス群、Ｓｈａｍ；偽手術群
【図２】骨粗しょう症モデルマウスの破骨細胞活性に対するポリアミン高含有酵母の効果。ＯＶＸ；骨粗しょう症モデルマウス群、Ｓｈａｍ；偽手術群
【図３】骨粗しょう症モデルマウスの骨芽細胞活性に対するポリアミン高含有酵母の効果。ＯＶＸ；骨粗しょう症モデルマウス群、Ｓｈａｍ；偽手術群
【図４】前駆破骨細胞に対するポリアミン高含有酵母の影響：ＴＲＡＰ陽性多核細胞数の相対値。
【図５】前駆破骨細胞に対するポリアミン高含有酵母の影響：破骨細胞マーカー遺伝子相対発現量。
【図６】前駆骨芽細胞に対するポリアミン高含有酵母の影響：アリザリンレッド染色レベルの相対値。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「ポリアミン」とは、特に説明がない場合、第１級アミノ基を複数有する直鎖状脂肪族炭化水素をいい、その種類は特に限定されない。通常、酵母が主に産生するポリアミンはプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの３種類である。したがって、本明細書における「ポリアミン」とは、好ましくはプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される少なくとも１種をいい、より好ましくはプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの混合物をいう。また好ましくは、本明細書における「酵母が含有するポリアミンの量」又は「酵母菌体中のポリアミンの量」とは、好ましくは、該酵母菌体中におけるプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの合計量を指す。酵母菌体中のポリアミンの量は、ＨＰＬＣ法（例えば、後述の参考例２参照）等によって測定することができる。
【００１３】
本明細書において、「骨形成促進」とは、骨芽細胞による骨形成を促進させることをいい、好ましくは、骨芽細胞活性の増強によって骨形成を促進させることをいう。本明細書において、「骨芽細胞活性」とは、好ましくは細胞増殖能及び細胞分化能をいう。より好ましくは、本明細書における「骨形成促進」とは、骨芽細胞の増殖及び成熟化の促進、又はそれらによる骨形成促進をいう。
【００１４】
本明細書において、「骨吸収抑制」とは、破骨細胞による骨吸収を抑制することをいい、好ましくは、破骨細胞活性の抑制によって骨吸収を抑制することをいう。本明細書において、「破骨細胞活性」とは、好ましくは細胞分化能及び骨吸収能をいう。
【００１５】
また本明細書において、「骨リモデリング改善」とは、骨形成促進により、又は骨形成促進と骨吸収抑制とにより、骨リモデリングのバランスをより骨形成側に傾かせることをいう。
【００１６】
本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、生菌であっても死菌であっても、又はそれらの加工物であってもよい。また、本発明において有効成分として用いられるポリアミン含有酵母は、その菌体全体（全細胞）もしくはその粉砕物であってもよく、又は菌体の粉砕物から水不溶性の破片を除いた菌体内容物を含む画分（例えば、菌体粉砕物の濾過物もしくは遠心上清）であってもよい。好ましくは、発明で用いられるポリアミン含有酵母は、その抽出物や画分ではなく、その菌体全体もしくはその粉砕物が有効成分として使用される。
【００１７】
当該ポリアミン含有酵母を加工する手法としては、乾燥、粉砕、凍結等、及びそれらの組み合わせが挙げられる。当該酵母を加工する場合、加工条件によっては本発明の効果が得られにくくなる場合があるため、比較的温和に加工することが好ましい。例えば、当該酵母の乾燥は、乾熱条件下、菌体の温度が９０℃を超えない条件での加熱乾燥や風乾燥、あるいは凍結乾燥が好ましく、また当該酵母を粉砕する場合、必要に応じて菌体を凍結させた後、菌体の温度が過度に上昇しないように、臼、ミル、ホモジナイザー等により粉砕することが好ましい。
【００１８】
好ましくは、本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、ポリアミンを含有する酵母菌体の乾燥物である。該乾燥物はさらに粉砕されていてもよい。菌体を乾燥させることにより、本発明の組成物の風味がより向上する。
【００１９】
好ましくは、本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、菌体中にポリアミンを高濃度で含有するポリアミン高含有酵母である。より好ましくは、本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、菌体１００ｇ（乾物換算）中に、ポリアミンを５０ｍｇ以上、より好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上、なお好ましくは２００ｍｇ以上、なお好ましくは３００ｍｇ以上の量で含有する。一般的な酵母におけるポリアミン含有量は、５０ｍｇ／１００ｇ未満である。
【００２０】
本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、通常の食用又は発酵に用いられる酵母種の酵母であればよい。そのような酵母の例としては、子嚢菌門のサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ウィッケルハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、及び担子菌門のスポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母、などが挙げられる。これらの中でも、サッカロマイセス属、カンジダ属及びジゴサッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉがより好ましい。本発明において、上記酵母種は、いずれか１種又は２種以上の組み合わせで使用することができる。
【００２１】
本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、天然の酵母株又は培養酵母株の中から選択された菌体中のポリアミン量の高い酵母であってもよく、又は、ポリアミンを高含有するように改変された酵母であってもよい。ポリアミンを高含有するように酵母を改変する手段としては、例えば、特開２０１６−１８７３３６号公報に記載される、所定濃度のポリアミン及び／又はナトリウム源を含有する培地で酵母を培養する方法、ならびに特願２０１６−０４８５２８に記載される、突然変異処理された酵母を、変異処理前における生育抑制濃度以上の濃度のスペルミジン及び／又はスペルミンを含有する培地で培養する方法、が挙げられる。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、下記Ａ成分及び／又はＢ成分：
Ａ成分）プトレスシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群より選択される１種以上のポリアミンを、合計で０．１ｍＭ以上、好ましくは０．３〜３０ｍＭ、より好ましくは０．５〜２０ｍＭ；
Ｂ成分）塩化ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、クエン酸と水酸化ナトリウム、クエン酸のナトリウム塩、及びリンゴ酸ナトリウムからなる群より選択される１種以上のナトリウム源を、ナトリウム濃度として２５ｍＭ以上、好ましくは２５ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは２５〜５００ｍＭ、
を含む培地で酵母を培養することによって製造されたポリアミン高含有酵母であり、好ましくは、ポリアミンを１５０ｍｇ／１００ｇ菌体（乾物換算）以上の量で含有する。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明で用いられるポリアミン含有酵母は、突然変異処理された酵母を、７５ｍＭ以上、好ましくは１００〜２００ｍＭのスペルミジン、又は２ｍＭ以上、好ましくは３〜５０ｍＭのスペルミンを含有する培地で培養することによって製造されたポリアミン高生産性酵母であり、好ましくは、ポリアミンを２００ｍｇ／１００ｇ菌体（乾物換算）以上の量で含有する。当該ポリアミン高生産性酵母の例としては、サッカロマイセス・セレビシエＳ６３１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１９９）、サッカロマイセス・セレビシエＳ６３５株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２００）、及びサッカロマイセス・セレビシエＳＳ２０８株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２２０１）が挙げられる。
【００２４】
培養物中のポリアミン含有酵母は、濾過や篩等の手法で培地や他の夾雑物と分離してから本発明に用いることが好ましい。
【００２５】
上述したポリアミン含有酵母は、骨芽細胞を活性化させる作用、より詳細には、骨芽細胞を増殖及び成熟化させる作用を有し、骨石灰化を促進する。したがって、該ポリアミン含有酵母は、骨形成促進に有効である。また該ポリアミン含有酵母は、破骨細胞の活性化を抑制する作用を有する。当該破骨細胞の活性化を抑制する作用は、加齢や閉経等により破骨細胞の活性が亢進している者において顕著である。これらの骨芽細胞活性化作用と破骨細胞活性化抑制作用は、骨形成を促進し、かつ骨吸収を抑制することで、骨リモデリングを改善し、骨量を増加させるように働く。該ポリアミン含有酵母によるこれらの作用は、加齢者、閉経後女性、又はエストロゲンの減少や疾患等に伴って破骨細胞の活性が亢進し、骨リモデリングのアンバランスをきたしている者に対して特に有用である。さらに該ポリアミン含有酵母は、骨粗しょう症を発症している者又はその危険性がある者における骨粗しょう症の予防又は治療のために有用である。
【００２６】
以上のとおり、本発明において、上述のポリアミン含有酵母は、骨形成促進のために使用することができる。また本発明において、該ポリアミン含有酵母は、骨吸収抑制、骨リモデリング改善、骨量増加、又は骨粗しょう症の予防もしくは治療のために使用することができる。また本発明において、該ポリアミン含有酵母は、骨形成促進用組成物の製造のために使用することができる。また本発明において、該ポリアミン含有酵母は、骨吸収抑制用組成物、骨リモデリング改善用組成物、骨量増加用組成物、又は骨粗しょう症の予防もしくは治療用組成物の製造のために使用することができる。
【００２７】
したがって、本発明は、上述のポリアミン含有酵母を有効成分として含有する骨形成促進用組成物を提供する。また本発明は、該ポリアミン含有酵母を有効成分として含有する骨吸収抑制用組成物、骨リモデリング改善用組成物、骨量増加用組成物、又は骨粗しょう症予防もしくは治療用組成物を提供する。以下の本明細書において、本発明により提供される骨形成促進用組成物、骨吸収抑制用組成物、骨リモデリング改善用組成物、骨量増加用組成物及び骨粗しょう症の予防又は治療用組成物を、まとめて本発明の組成物とも称する。
【００２８】
本発明の組成物は、上述のポリアミン含有酵母からなるものであってもよいが、その他の成分をさらに含有していてもよい。好ましくは、本発明の組成物は経口組成物であり、経口投与又は経口摂取される。好ましくは、本発明の組成物は、医薬品組成物、食品組成物の形態である。あるいは、本発明の組成物を非ヒト動物に適用する場合は、ペットフードを含む飼料組成物の形態としてもよい。当該医薬品組成物、食品組成物及び飼料組成物は、骨形成促進、骨吸収抑制、骨リモデリング改善、骨量増加、又は骨粗しょう症の予防もしくは治療の作用を有し、該ポリアミン含有酵母を当該作用のための有効成分として含有する。
【００２９】
本発明による医薬品組成物は、上述のポリアミン含有酵母による本発明の効果が失われない限りにおいて、必要に応じて薬学的に許容される担体又は他の薬理成分を含有していてもよい。好ましくは、該医薬品組成物は経口組成物である。該経口組成物の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。このような剤型は、該ポリアミン含有酵母に、慣用される添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。また各剤型は、周知の方法でその表面をコーティングしてもよい。
【００３０】
本発明による食品組成物及び飼料組成物の形態は特に制限されず、固形、半固形、又は液状（例えば流動食又は飲料）であり得る。該食品組成物及び飼料組成物は、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の形態を有するサプリメントであってもよい。また、該食品組成物は、栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等の保健機能食品や、健康食品、経管経腸栄養剤などであってもよい。該食品組成物及び飼料組成物は、上述のポリアミン含有酵母による本発明の効果が失われない限りにおいて、他の食品材料又は食品に許容される添加物を含有していてもよい。該食品組成物及び飼料組成物は、該ポリアミン含有酵母と、当該他の食品材料又は添加物とを適宜組み合わせて、定法に従って製造することができる。
【００３１】
本発明の組成物における上述のポリアミン含有酵母の含有量は、乾燥質量換算で、好ましくは１〜２０質量％、より好ましくは３〜１５質量％である。あるいは、該組成物中における該ポリアミン含有酵母の含有量は、ポリアミン換算で、好ましくは３ｍｇ／１００ｇ（乾燥質量）、より好ましくは１０ｍｇ／１００ｇ（乾燥質量）以上、さらに好ましくは１５〜５０ｍｇ／１００ｇ（乾燥質量）である。本発明の組成物中における該ポリアミン含有酵母の含有量は、後述する該ポリアミン含有酵母の１日用量を摂取できるように、該組成物の形態や適用対象に合わせて適宜調整することができる。
【００３２】
また本発明は、骨形成促進方法、骨吸収抑制方法、骨リモデリング改善方法、骨量増加方法、又は骨粗しょう症の予防もしくは治療のための方法を提供する。これらの本発明の方法は、対象に上述のポリアミン含有酵母を有効量で適用することを含む。
【００３３】
本発明において、当該ポリアミン含有酵母は、ヒト又は非ヒト動物に適用され得る。本発明による該ポリアミン含有酵母の適用対象の例としては、骨形成促進、骨吸収抑制、骨リモデリング改善、骨量増加、又は骨粗しょう症の予防もしくは治療を必要とするか又は所望するヒト又は非ヒト動物が挙げられる。該対象の好ましい例としては、加齢、閉経、エストロゲンの減少、疾患等に伴って骨リモデリングのアンバランスをきたしているか又は骨量が減少しているヒト又は非ヒト動物、骨粗しょう症を発症しているか又はその危険性があるヒト又は非ヒト動物が挙げられる。該非ヒト動物としては、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類などの非ヒト哺乳動物、鶏等の鳥類、爬虫類などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明において、対象に適用される当該ポリアミン含有酵母の量及び適用方法は、該対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って、当業者が適宜決定することができる。例えば、本発明における該ポリアミン含有酵母の用量は、成人１人１日当たり、好ましくは、酵母乾燥質量換算で０．１ｇ〜１０ｇであり、ポリアミン換算で０．１ｍｇ〜５０ｍｇである。また好ましくは、本発明における成人１人１日当たりの該ポリアミン含有酵母の用量は、ポリアミン換算で１０ｍｇ〜１０ｇ程度である。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を示し、本発明の効果を具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。
【００３６】
（参考例１  酵母菌体からのポリアミンの抽出）
乾燥酵母１５ｍｇを５ｍＬメスフラスコに添加し、０．２Ｍ過塩素酸で５ｍＬにメスアップして、１００℃で１０分間加熱した後、遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、３分間）した。上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、得られたろ液を０．２Ｍ過塩素酸で５倍希釈した。希釈液１ｍＬに対して、飽和炭酸ナトリウム水溶液０．５ｍＬ、１（ｗ／ｖ）％ダンシルクロライド−アセトン溶液１ｍＬを添加して混和後、遮光下にて４５℃で１時間反応させた。反応液に１０（ｗ／ｖ）％プロリン０．５ｍＬを添加してよく混和し、遮光下にて１０分間静置した後、トルエン２ｍＬを加えて２５０ｒｐｍで１０分間振盪してトルエン層を採取した。トルエン層１ｍＬを４０℃で減圧乾固し、アセトニトリル１ｍＬで溶解してＨＰＬＣ測定用サンプルを調製した。
【００３７】
（参考例２  ポリアミン量の測定）
既知の濃度のポリアミン標準品を用いて、下記条件でＨＰＬＣ測定を行い、各ポリアミン標準品の濃度と、ＨＰＬＣリテンションタイムのピーク下面積から検量線を作成した。ポリアミン標準品には、プトレスシン二塩酸塩、スペルミジン三塩酸塩、及びスペルミン四塩酸塩（いずれもＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、それぞれについて検量線を作成した。次いで、同条件にて参考例１で調製したＨＰＬＣ測定用サンプルをＨＰＬＣ測定し、プトレスシン、スペルミジン及びスペルミンのピークを検出した。それぞれのピーク下面積から、対応する検量線に基づいて該サンプルのプトレスシン、スペルミジン及びスペルミンの量を定量した。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ−１２０
３μｍ、４．６×１００ｍｍ（資生堂）
溶離液Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウム
溶離液Ｂ：アセトニトリル
グラジエントプログラム：
時間（分）      Ａ（％）    Ｂ（％）
０          ５０        ５０
１５          １０        ９０
２５          １０        ９０
２５．１      ５０        ５０
３５          ５０        ５０
カラム温度：３５℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ．３６５ｎｍ、Ｅｍ．５１０ｎｍ
【００３８】
（製造例１）ポリアミン高含有酵母の調製
特願２０１６−０４８５２８の実施例１と同様の手順で、ポリアミン高含有酵母を調製した。すなわち、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；オリエンタル酵母工業（株））に突然変異処理を行い、高濃度ポリアミン含有培地で選択することで、ポリアミン高生産株を取得した。これを、ＹＭＰＤ培地（イーストエキス０．３（ｗ／ｖ）％、モルトエキス０．３（ｗ／ｖ）％、ペプトン０．５（ｗ／ｖ）％、グルコース３．０（ｗ／ｖ）％）５ｍＬが入った試験管に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。得られた培養液０．５ｍＬを遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ）して菌体を回収した。回収した菌体から、参考例１及び２に記載の手順に従ってポリアミンを抽出し、菌体中のポリアミン量を測定した。得られた酵母の菌体に含まれるポリアミン量は、菌体乾燥質量１００ｇ中、プトレスシン７９．３ｍｇ、スペルミジン２３０．９ｍｇ、スペルミン２２．７ｍｇ、ポリアミン総量で３３２．９ｍｇであった。
【００３９】
（試験例１）ポリアミン高含有酵母が骨量に与える影響
マウス・ラット用の標準栄養飼料組成ＡＩＮ−９３Ｇの基礎配合に製造例１のポリアミン高含有酵母を含有量５質量％（乾燥物質量）になるよう混合し、マウス用ペレット形状に成形して飼料組成物を製造した（実施例１）。同様の手順で製造例１のポリアミン高含有酵母を配合しないペレット状の飼料組成物を製造した（対照）。
【００４０】
７週齢のｄｄｙ系雌性マウスを１群１０匹で４群に分け、２群に実施例１の飼料組成物を与え、残り２群には対照の飼料組成物を与えて飼育した。飼育開始から１週間後、実施例１投与群と対照群から各１群のマウスに卵巣摘出術を施し、骨粗しょう症モデルマウス群（ＯＶＸ）を作製した。実施例１投与群と対照群の残り各１群は、腹部を切開した後卵巣摘出せずに縫合し、偽手術群（Ｓｈａｍ）とした。術後４週間引き続き飼育後、全群を骨解析に供した。
【００４１】
骨解析では各マウスから脊椎を摘出し、摘出した脊椎をプラスチック包埋後、切片を作製した。切片をＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色し、画像解析ソフト（ＧＩＭＰ２）を使用して骨組織体積（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＴＶ）に対する骨体積（Ｂｏｎｅ  Ｖｏｌｕｍｅ；ＢＶ）を算出することで骨量（ＢＶ／ＴＶ（％））を測定した。骨芽細胞活性（Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ：ＢＦＲ）及び破骨細胞活性（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｂｏｎｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ：ＯＳＢＳ）は、それぞれ、トルイジンブルー染色とカルセイン二重標識、及びＴＲＡＰ染色した切片から、骨形態計測ソフト（Ｏｓｔｅｏ  Ｍｅａｓｕｒｅ；ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ社）を用いて測定した。
【００４２】
結果を図１〜３に示す。対照飼料を与えた骨粗しょう症モデルマウス（ＯＶＸ）は、偽手術群（Ｓｈａｍ）と比べて骨量が著しく低下し、骨粗しょう症の状態を示した。実施例１の摂取は、このＯＶＸにおける骨量低下を改善した（図１）。対照飼料を与えたＯＶＸでは、Ｓｈａｍと比べて著しい破骨細胞の活性化がみられ、これが骨量低下の要因になったと考えられた。ＯＶＸにおける破骨細胞活性は、実施例１の摂取により顕著に抑制された（図２）。また実施例１の摂取は、ＯＶＸ及びＳｈａｍの両群で、骨芽細胞活性を顕著に増強させた（図３）。これらの結果から、ポリアミン高含有酵母が、骨芽細胞の活性化による骨形成促進と、破骨細胞活性抑制による骨吸収抑制の双方に作用し、骨量の増加に寄与することが示された。
【００４３】
（試験例２）ポリアミン高含有酵母が骨リモデリングに与える影響
（１）ポリアミン含有酵母粉砕物の調製
製造例１のポリアミン高含有酵母１ｇ（乾燥物質量）をリン酸緩衝生理食塩水（ＢＰＳ）１０ｍＬに懸濁した。この懸濁液１．５ｍＬを専用チューブに入れ、直径０．５ｍｍのガラスビーズを１ｇ加えて、ビーズ式細胞破砕装置（ＭＳ−１００Ｒ、トミー精工）を用いて、４℃下で４０００ｒｐｍ２分間の粉砕を７回繰り返すことによって酵母菌体を粉砕した。得られた酵母粉砕液を遠心分離（４℃、１４０００ｒｐｍ）し、上清をフィルターろ過滅菌して酵母粉砕物を調製した。酵母粉砕物中に含まれるポリアミン量は、酵母粉砕物１００ｇ中、プトレスシン７．３６ｍｇ、スペルミジン１５．８９ｍｇ、スペルミン０．９９ｍｇ、ポリアミン総量で２４．２４ｍｇであった。この酵母粉砕物を以下の試験に用いた。
【００４４】
（２）破骨細胞に対する酵母粉砕物の作用の評価
（細胞培養）
細胞（前駆破骨細胞ＲＡＷ２６４．７；ＡＴＣＣより入手）を、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、１０％牛胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、２０ｎｇ／ｍＬのＲｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、及び（１）で調製したポリアミン高含有酵母粉砕物０．２５％の存在下で４日間培養した（試験群）。同様の条件で酵母粉砕物非存在下（ＰＢＳ添加）にて培養した細胞を対照群とした。
【００４５】
（ＴＲＡＰ染色）
培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間、室温で固定した。さらにＰＢＳで洗浄し、エタノール−アセトン（５０：５０、ｖ／ｖ）液に浸した後、溶液を除去して完全に風乾した。得られた細胞試料に、用時調製したＴＲＡＰ染色液（０．２２ｍＭリン酸ナフトールＡＳ−ＭＸ、１．３３ｍＭ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌｔ及び０．１１Ｍ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０）を添加して、３７℃、３０分間反応させた。ＴＲＡＰ染色液を除去した後、細胞を超純水及びＰＢＳで洗浄し、次いで落斜型倒立蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ：ＢＺ−８１００）により観察した。５個以上の核を有するＴＲＡＰ陽性多核細胞を計数し、対照群に対する相対値を求めた。
【００４６】
（破骨細胞マーカー遺伝子発現の定量）
培養した細胞からＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡを鋳型にＭ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡを鋳型にした定量ＰＣＲにより、破骨細胞マーカー遺伝子Ｃｔｓｋ及びＭｍｐ９の発現量を定量した。定量ＰＣＲにはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤTMＳＹＢＲ  ｑＰＣＲｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。測定した発現量は、３６Ｂ４の発現量で補正した。各遺伝子について対照群に対する相対発現量を求めた。
【００４７】
（３）骨芽細胞に対する酵母粉砕物の作用の評価
（細胞培養）
細胞（前駆骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１；ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣより入手）を、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下、αＭＥＭ培地で、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、５ｍＭ  β−グリセロフォスフェート、及び（１）で調製したポリアミン高含有酵母粉砕物０．２５％の存在下で２８日間培養した（試験群）。同様の条件で酵母粉砕物非存在下（ＰＢＳ添加）にて培養した細胞を対照群とした。
【００４８】
（アリザリンレッド染色）
得られた培養物から培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、７０％エタノール中で６０分間細胞を固定した。得られた細胞試料を超純水で３回洗浄後、０．４％Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ  Ｓ溶液で１０分間染色し、次いで超純水で３回洗浄後、ＰＢＳで１５分間処理し、非特異的な染色を脱色させた。得られた染色試料にギ酸を加え、１０分間撹拌して色素を溶出した。溶出液の４９０ｎｍでの吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定し、対照群に対する相対値を求めた。
【００４９】
（４）結果
（２）及び（３）の結果を表１、及び図４〜６に示す。図４はＴＲＡＰ染色の結果、図５は遺伝子発現の定量結果、図６はアリザリンレッド染色の結果を表す。試験群では、対照群と比べて、分化した破骨細胞を表すＴＲＡＰ陽性多核細胞の数が顕著に減少しており、また破骨細胞マーカー遺伝子の発現が顕著に低下していた。骨芽細胞の成熟化（石灰化）を表すアリザリンレッド染色では、試験群は、対照群と比べてより強度に染色されていた。これらの結果から、ポリアミン高含有酵母が、骨芽細胞の成熟化による骨形成促進と、破骨細胞分化抑制による骨吸収抑制の双方に作用し、骨リモデリングの改善に寄与することが示された。
【００５０】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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