(57)【要約】      （修正有）【課題】抗血管新生特性および抗腫瘍形成特性を有する生体模倣ペプチド、および、それらを用いて、癌、加齢黄斑変性症などの眼疾患、および他の血管新生依存性疾患を処置する方法の提供。【解決手段】アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦを含む単離ペプチドであって、内皮細胞の増殖、遊走、接着、および管形成アッセイにおける抗血管新生活性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト乳癌細胞における抗遊走活性、乳癌異種移植モデルおよび加齢黄斑変性症モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏの抗血管新生および抗腫瘍形成活性、抗リンパ管新生特性、ならびに、直接的抗腫瘍形成特性を示す前記ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
【請求項２】
薬学的に許容し得る担体および、有効量の請求項１に記載の単離ペプチドを含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の単離ペプチドを含む、キット。
【請求項４】
請求項１に記載の単離ペプチドを含む、ナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項５】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む、請求項４に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項６】
ＰＬＧＡおよび／もしくはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷された、約２質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む、請求項５に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項７】
ＰＬＧＡおよび／もしくはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷された、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む、請求項５に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項８】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）および／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧを含む、請求項４に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項９】
ＰＢＡＥおよび／もしくはＰＢＡＥ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷された、約１質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む、請求項８に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項１０】
ＰＢＡＥおよび／もしくはＰＢＡＥ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷された、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む、請求項８に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項１１】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧの組み合わせを含む、請求項４に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項１２】
ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧの組み合わせを含む粒子の上またはその中に負荷された、約１質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む、請求項１１に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項１３】
ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧの組み合わせを含む粒子の上またはその中に負荷された、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む、請求項１１に記載のナノ粒子またはマイクロ粒子。
【請求項１４】
細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するための方法であって、方法が、以下：
前記細胞を、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの、前記細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するのに十分な量と接触させること、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
細胞を接触させることが、細胞が関与する接着、遊走、増殖、および／または管形成の阻害をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、内皮細胞、微小血管細胞、およびリンパ系細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、脂肪組織中に見出され、方法が、肥満を低減または防止する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、移植された細胞であり、方法が、細胞移植後の組織および／または器官の拒絶反応を低減または防止する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
単離ペプチドが、細胞と接触する前に、ナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＢＡＥおよび／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＢＡＥ、ＰＬＧＡ、およびＰＥＧを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患に罹患している対象を処置するため、または、対象が、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患を発症するのを予防または遅延させるための方法であって、該方法が、以下：
前記対象に対して、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの、対象において前記疾患を処置、遅延、または予防するのに十分な量を、投与すること、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
対象がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象が非ヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
疾患が新生物形成を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
新生物形成が固形腫瘍を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
新生物形成が癌を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
癌が、乳癌、肺癌、神経膠芽腫、眼の癌、腎細胞癌、肝細胞癌、頭部癌、および頸部癌からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
方法が、腫瘍内またはその周囲の、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍が、原発腫瘍または確立された転移腫瘍である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
手術時および／または手術後の、リンパ管新生、血管新生および／または腫瘍形成を阻害する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
癌の転移の確立を阻害するか、または癌のさらなる転移を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
血液および／またはリンパ脈管構造を介した腫瘍細胞の伝播を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
疾患が、眼の血管新生または糖尿病性網膜症に関連する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
眼の血管新生に関連する疾患が、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
単離ペプチドが、対象に投与する前に、ナノ粒子またはマイクロ粒子の上またはその中に負荷される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＢＡＥおよび／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が、ＰＬＧＡ、ＰＢＡＥ、およびＰＥＧを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＬＧＡナノ粒子またはＰＬＧＡを含むマイクロ粒子の上またはその中に負荷された約２質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＰＬＧＡナノ粒子またはＰＬＧＡを含むマイクロ粒子の上またはその中に負荷された約１質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＢＡＥナノ粒子またはＰＢＡＥを含むマイクロ粒子の上またはその中に負荷された約１質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
単離ペプチドを、少なくとも１種の他の抗血管新生剤と組み合わせて投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種の他の抗血管新生剤が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月７日に出願された米国仮出願第61/832,290号の利益を主張し、この仮出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発
本発明は、政府の支援を受けて、国立衛生研究所により授与されたR21 CA131931およびR01 CA138264の下で実施された。政府は本発明において、一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は配列表を含む。これは「111232-00291_ST25.txt」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出された。配列表のサイズは１９６６バイトであり、２０１４年６月９日に作成された。これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌は、米国および世界の他の地域において公衆衛生上の大きな問題である。現在、米国での死亡の４分の１は癌に起因する。血管新生は、癌のほとんどの種類における腫瘍成長および転移に重要な役割を果たしている。特に、その重要性は、米国で最も一般的に診断される女性の悪性腫瘍である乳癌で実証されている。抗血管新生治療は、単独療法として、または他の治療と組み合わせて有望であり、前臨床試験および臨床試験両方で精力的に研究されている。抗ＶＥＧＦ療法は、臨床試験において初期に有望性を示した；しかしながら、抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（Genentech/Roche）は２００８年に、化学療法との併用で乳癌について食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されたにも関わらず、ＦＤＡは２０１１年１１月、全体的な生存利益を実証しなかったとして乳癌への適用を取り消した。
【０００５】
乳癌および他の癌、ならびに加齢黄斑変性症などの眼の増殖性疾患を処置するための抗血管新生療法の開発は、進行中である。リンパ管新生もまた、癌の転移に重要な役割を果たしている（Holopainen et al., 2011）。現在のところ、癌または他の血管新生およびリンパ管新生依存性疾患の処置のために承認されたペプチド薬剤は、存在しない。
ペプチドは多数の疾患のための治療薬として使用されており、最近、腫瘍を画像化または治療のためのいずれかについて標的とする、臨床用途で検討されている（Folkman, 2010；Senger et al., 1983；Leung et al., 1989；Carmeliet, 2005；Carmeliet and Jain, 2000；Carmeliet and Jain, 2011；Rosca et al., 2011）。模倣ペプチドは、生体分子上で活性な決定因子を生物学的に模倣するペプチドである。一般に、ペプチドは、それらの特異的標的結合、細胞を貫通する能力および、異なる用途に対して柔軟性を与える修飾の容易さのために、治療薬として魅力的なツールである（Carmeliet and Jain, 2000；Folkman, 2006）。さらに、高い特異性でその標的に結合するために低毒性であり、安価に製造される。
【０００６】
ペプチドを魅力的な候補とする特性のいくつかは、しかし、その欠点にも寄与している。ペプチドは細胞受容体と特異的に相互作用することができるが、これらの相互作用は、低親和性でも生じる場合がある。さらに、治療剤としてのペプチドの使用は現在、それらの短い半減期および低い生物学的利用能のために制限されている。その生物学的利用能を高めるためにペプチドを改変する試みは、非天然アミノ酸による置換、ペプチドのペグ化、およびペプチドのナノ粒子またはマイクロ粒子への送達を含む。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の主題は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患、障害、または機能不全を処置するためのペプチド組成物、方法、およびキットを提供する。本開示のペプチド組成物および方法は、いくつかの側面において、複数の疾患または障害において重要な役割を果たす、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を、阻害する。したがって、いくつかの側面において、本開示の主題の組成物および方法は、細胞、組織または器官が関連する血管、リンパ管、または腫瘍の形成の、予防または低減を可能にする。
【０００８】
いくつかの側面において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、単離ペプチドを提供する。
別の側面において、本開示の主題は、薬学的に許容し得る担体および、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す単離ペプチドの有効量を含む、組成物を提供する。
さらなる側面において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す単離ペプチドの有効量を含む、キットを提供する。
【０００９】
さらに別の側面において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す単離ペプチドを含む、ナノ粒子またはマイクロ粒子を提供する。
いくつかの側面において、本開示の主題は、細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するための方法であって、方法が、以下：前記細胞を、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの、前記細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するのに十分な量と接触させること、を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
いくつかの別の側面において、本開示の主題は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患に罹患している対象を処置するため、または、対象が、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患を発症するのを予防または遅延させるための方法であって、該方法が、以下：前記対象に対して、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの、対象において前記疾患を処置、遅延または予防するのに十分な量を投与すること、を含む、前記方法を提供する。
本開示の主題によって全体的にまたは部分的に対処される、本開示の主題の特定の側面を上述したので、他の側面は、本明細書に最良に記述された添付の実施例および図面に関連して説明が進むにつれ、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本開示の主題を一般的に説明したが、ここで添付の図面を参照する；これらの図は必ずしも一定の縮尺で描かれておらず、以下を示す：
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた、増殖（パネルＡ）、接着（パネルＢ）、および遊走（パネルＣ）を示す図である。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）とヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）を用いた、接着（パネルＡ）、増殖（パネルＢ）、および遊走（パネルＣ）を示す図である。
【図３】図３Ａ−３Ｄは、ＣＭ対照（パネルＡ）とＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）（２５μＭのＳＰ２０４３ペプチド；パネルＢ）を用いた、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイ；および対照（Ctrl；パネルＣ）とＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）（２５μＭのＳＰ２０４３ペプチド；パネルＤ）を用いた、微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）管形成アッセイを示す図である。
【図４】図４は、本明細書および図面においてＳＥＱ．１とも記載されるＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）接着に対する効果を示す図である。
【００１２】
【図５】図５は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、リンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）管形成に対する効果を示す図である。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の効果であって、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）の、微小血管内皮細胞（ＭＥＣ；パネルＡ）およびリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ；パネルＢ）とのin vitroでのシグナル伝達に対する前記効果を示す図である。
【図７】図７は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、トリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１４９、およびエストロゲン受容体陽性細胞株ＭＣＦ−７の増殖に対する効果を示す図である。
【図８】図８は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）シグナル伝達に対する効果を示す図である。
【図９】図９は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、ＳＣＩＤマウスにおいて３３日を超えた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性腫瘍の増殖に対する効果を示す図である。
【００１３】
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）（パネルＢ）の、in vivoでのｃ−Ｍｅｔのリン酸化および血管新生（パネルＡ、対照）に対する効果を示す図である。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｇは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の血管新生に対する効果を、免疫組織化学（ＩＨＣ）についてレクチン染色により、およびin vivoでのリンパ管新生についてＬＹＶＥ−１染色により示すものである：対照、レクチン染色(パネルＡ)およびＬＹＶＥ−１染色（パネルＢ）；ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）、レクチン染色(パネルＣ)およびＬＹＶＥ−１染色（パネルＤ）；対照およびＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）（パネルＥ）；およびレクチン(パネルＦ)およびＬＹＶＥ−１（パネルＧ）を用いた画素密度。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、腫瘍馴化培地で前処理された転移モデルの複数の器官における、腫瘍細胞からの光子束によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍の転移に対する効果(パネルＡ)、および、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、ヒト細胞の存在についてビメンチン抗体で染色することによって見られる、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍のリンパ節転移に対する効果(パネルＢ)を示す図である。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｅは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の血管新生に対する効果を、ＣＮＶモデルにおけるアフリベルセプト（パネルＡ−Ｂ）と、およびロー−ＶＥＧＦマウスモデルにおける対照（パネルＣ−Ｅ）と比較して示した図である。
【００１４】
【図１４】図１４は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、マウスの眼のレーザー誘発ＣＮＶモデルにおける新血管系に対する効果を示す図である。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、Ｔｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦマウスモデルにおける血管漏出に対する効果を示す図である。
【図１６】図１６は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、ウサギの眼における、ＶＥＧＦ媒介性の血管透過性に対する効果を示す図である。
【図１７】図１７は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロ粒子に負荷（２％）されたＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、代表的な例である；ＰＬＧＡは、Ｌ：Ｇ比６５／３５で使用され、ＭＷ＝４０〜７５ｋＤａである。スケールバーは１０ミクロンである。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂは、以下を示す：（パネルＡ）２％および５％のＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を負荷したＰＬＧＡマイクロ粒子およびサイジング；数平均粒度分布（Num. Avg）および体積平均粒度分布（Vol. Avg）を示す（平均＋ＳＤ）；（パネルＢ）２％および５％のＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を負荷したマイクロ粒子のゼータ電位（表面電荷）。
【００１５】
【図１９】図１９は、in situの生理学的条件下での、ＰＬＧＡマイクロ粒子からの、ＳＰ２０４３の標識されたペプチド類似体の制御放出を示す図である。
【図２０】図２０は、in situの生理学的条件下での、任意の標識なしまたはＰＬＧＡマイクロ粒子における修飾なしの、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の制御放出を示す図である（方法は、下の図３２に示す）。
【図２１】図２１は、２重量％（左）および５重量％（右）のＳＰ２０４３を組み込んだＰＬＧＡマイクロ粒子の、ＳＥＭ画像を示す図である。この例では、ＰＬＧＡは、Ｌ：Ｇ比８５／１５、ＭＷ＝１９０〜２４０ｋＤａを用いた。スケールバーは１０ミクロンである。
【図２２】図２２は、ナノ粒子ＰＬＧＡ ６５／３５に封入されたＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を示す。楕円ナノ粒子（左）と球状ナノ粒子（右）。
【図２３】図２３は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を封入したＰＬＧＡ ８５／１５マイクロ粒子の、マウスモデルにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生の後の、マウスの眼における退縮に対する効果を示す図である。
【図２４】図２４は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を含有するＰＬＧＡ ８５／１５マイクロ粒子の、レーザー誘発湿潤ＡＭＤマウスモデルにおける、時間の経過による血管新生への効果を示す図である。
【００１６】
【図２５】図２５は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を含有するＰＬＧＡ ６５／３５マイクロ粒子の、レーザー誘発湿潤ＡＭＤマウスモデルにおける、時間の経過による血管新生への効果を示す図である。
【図２６】図２６は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、ウサギモデルにおける血管新生の阻害に対する効果を示す図である。３４日目のデータは、ウサギの眼への硝子体内注射後である。
【図２７】図２７は、ロー／ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を封入したＰＬＧＡ（８５／１５）を示す図である。
【図２８】図２８は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、マウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける、他の抗血管新生剤と組み合わせた効果を示す図である。
【図２９】図２９は、ＰＢＡＥなどのポリマーの効果であって、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の、約１００ｎｍのナノ粒子中に自己組織化する能力に対する前記効果を示す図である。ポリマー４４７は、（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン末端封鎖１，４−ブタンジオールジアクリレート／４−アミノ−１−ブタノール共重合体を意味し、ポリマー６５７は、（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン末端封鎖１，６−ヘキサンジオールジアクリレート／５−アミノ−１−ペンタノール共重合体（Ｂ６−Ｓ５−Ｅ７）を意味する。＋／−は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の有無を意味する。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）が自己組織化のためにポリマーと共に存在する場合には、粒径が大きくなり、ナノ粒子の濃度が高くなる。
【００１７】
【図３０】図３０は、ＳＰ２０４３を封入したＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を示す図である。
【図３１】図３１Ａ−３１Ｂは、全身静脈内注射されたＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）含有ナノ粒子、または遊離ペプチドの、腫瘍および他の器官への蓄積に対する効果を示す図である。図３１Ａは器官ごとの蓄積を示し、図３１Ｂは総蓄積を示す。両方の図において、用語「裸の」は遊離ペプチドを意味し、一方用語「球状」、「楕円」、および「ＰＥＧ」すなわちポリエチレングリコールは、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）含有のナノ粒子の異なる種類を意味する。
【図３２】図３２Ａ−３２Ｂは、本開示のペプチドを定量するための、電気泳動およびSimplyBlue染色（パネルＡ）に続いて質量分析（パネルＢ）による方法を示す図である。パネルＡは、次の試料を含む：レーン１、マーカー；レーン２、４μｇのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）陽性対照。レーン３、ＰＢＳ培地中の４μｇのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）；レーン４、ＦＢＳ培地中の４μｇのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）。
【００１８】
詳細な説明
本開示の主題を、添付図面を参照して以下にさらに詳細に説明する；この図面には、本開示の主題の全てではないがいくつかが示されている。同じ番号は、全体を通して同じ要素を指す。本開示の主題は多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された態様に限定されると解釈されるべきではない；むしろこれらの態様は、本開示が適用可能な法的要件を満たすようにと提供される。実際、本明細書に記載された本開示の主題の多くの改変および別の態様が、本開示の主題に関連し、上記の説明および付随する図面に提示された教示の利益を有する当業者に、思い浮かぶであろう。したがって、本開示の主題は、開示された特定の態様に限定されるものではなく、改変および別の態様も、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていると理解されるべきである。
【００１９】
Ｉ．ＩＶ型コラーゲン由来の模倣ペプチド
ペプチドは一般的に、特定の疾患に対して他の種類の治療法よりも、以下の点で、すなわちその標的に高い特異性で結合しているために、非免疫原性でより毒性が低いという点で、多くの利点を提供し、また安価に製造される。例えば、国際ＰＣＴ特許公開WO 2008/085828およびＰＣＴ特許出願公開WO 2007/033215を参照；これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示のペプチドは、抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示し、これは特定の疾患において全体的な生存率の増加につながり得る。例えば、本開示のペプチドは、癌患者に利益をもたらすことができ、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの眼の増殖性疾患の処置に役立つことができる。
【００２０】
一般に、本開示のペプチドは、アミノ酸配列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF（配列番号２）を含むモチーフを有することを特徴とする。アミノ酸配列LRRFSTXPXXXXNINNVXNF（配列番号４）を含むモチーフ有することを特徴とするペプチドは、国際公開WO 2012/079088（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。このモチーフは、ペンタスタチン−１ペプチドに置換を作ることによって決定された。WO 2012/079088公開は、次のことを開示している：いくつかの態様において、配列番号３のＸで表される位置は変化させることができ、得られたペプチドは、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するために、および対象をこれで処置するために、やはり使用でき、またはいくつかの態様においてはより良好であり、一方、配列番号３の別の位置は、阻害特性を保持するために変更することができなかった。他の態様において、次の位置のＸは、配列番号３に以下の置換を有し得ることがわかった：７位はＭ、Ａ、またはＧであることができ；９位は、Ｆ、Ａ、Ｙ、またはＧであることができ；１０位はＭ、Ａ、Ｇ、ｄＡ、またはＮｌｅであることができ；１１位は、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｇ、または４−ＣｌＰｈｅであることができ；１２位および１８位は、Ａｂｕ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、ＬまたはＡｌｌｙＧｌｙであることができる。一態様において、アミノ酸配列LRRFSTAPFAFININNVINF（配列番号３、ＳＰ２０３６とも呼ばれる）を含むモチーフを有することを特徴とするペプチドが、開示された。
【００２１】
本開示のペプチドは、以前に開示された配列番号４と位置１３および１６で異なっている、アミノ酸配列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF（配列番号２）を含むモチーフを有することを特徴とする（表１）。特定の態様において、以前に開示された配列番号３（ＳＰ２０３６とも呼ばれる）と１３位および１６位で異なっている、アミノ酸配列LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１、ＳＰ２０４３およびＳＥＱ．１とも呼ばれる）を含むモチーフを有することを特徴とするペプチドが、開示される（表１）。本明細書において、１３位および１６位におけるアスパラギン酸の置換は、疎水性は弱いが、しかしそれでも細胞、組織、または器官が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するため、および対象をこれで処置するために使用できる、ペプチドがもたらされる。さらに、このペプチドは疎水性が弱いため、生産が容易である。
【表１】
2019089790.tif 000002
【００２２】
Ａ．代表的態様
特定の態様において、単離ペプチドは、アミノ酸配列LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）を含む。
いくつかの態様において、ペプチドは、アミノ酸配列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF（配列番号２）を含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。Ｘは、天然または非天然アミノ酸であってもよい。
別の態様において、ペプチドは、アミノ酸配列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF（配列番号２）を含み、ここで７位のＸは、Ｍ、Ａ、またはＧであり；９位のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、またはＧであり；１０位のＸは、Ｍ、Ａ、Ｇ、ｄＡ、またはＮｌｅであり；１１位のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｇ、または４−ＣｌＰｈｅであり；１２位および１８位のＸは、Ａｂｕ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、ＬまたはＡｌｌｙＧｌｙである。本態様におけるＸ残基における各置換は、試験されているか（その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ特許出願公開WO 2012/079088に示すように、または下記の実施例に示すように）、または試験されたアミノ酸の保存的アミノ酸置換である。
【００２３】
いくつかの態様において、本開示のペプチドは、天然または非天然の、任意のアミノ酸であってよいいくつかのＸ残基を有する（Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１８）。天然アミノ酸とは、天然に存在するアミノ酸を意味し、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、システイン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、プロリン、ピロリジン、およびセレノシステインである。非天然アミノ酸とは、天然に存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込むことができるアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸としては、限定はされないが、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）、アリルグリシン（ＡｌｌｙＧｌｙ）、および例えばMa(2003)に詳述されているような他の非天然アミノ酸が挙げられる。当技術分野で知られているアミノ酸類似体を、本開示の主題に使用してもよい
【００２４】
「ペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって一緒に連結された少なくとも３つのアミノ酸のストリングを含む。用語「タンパク質」および「ペプチド」は、交換可能に使用してよい。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集合を指すことができる。また、本開示のペプチド中の１または２個以上のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、および共役、機能化、またはその他の改変のためのリンカーなどの化学物質を添加することによって、修飾することができる。いくつかの態様において、ペプチドの修飾は、より安定なペプチドをもたらす（例えば、in vivoでのより長い半減期）。他の態様において、他の修飾として挙げられるのは、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸、Ｎ末端およびＣ末端にコンジュゲートした他の分子の組み込み、蛍光プローブ、ポリ（エチレングリコール）などの生体分子、標的リガンドなどのコンジュゲーション、レトロ反転などである。修飾のいずれも、ペプチドの所望の生物学的活性を実質的に妨害してはならない。
【００２５】
「コラーゲンＩＶ由来ペプチド」とは、Ｃ−Ｎ−Ｘ（３）−Ｖ−ＣまたはＰ−Ｆ−Ｘ（２）−ＣまたはＬＸ（２）ＦＸ（３）ＰＦＸ（２）ＣＮＸ（４）ＣＮＸコラーゲンモチーフを含むペプチドを意味する。所望の場合、ペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列のモチーフのカルボキシまたはアミノ末端に隣接する、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のアミノ酸を含む。ＩＶ型コラーゲン由来ペプチドは、例えば、ペンタスタチン−１、タムスタチン、および標的ＲＧＤを含む。「改変」とは、内因性野生型参照配列に対する、配列の変化または遺伝子もしくはポリペプチドの修飾（例えば、翻訳後修飾）を意味する。
「単離ペプチド」とは、天然における付随する成分から分離された、本開示のペプチドを意味する。典型的には、ペプチドが単離されているとは、それが天然に関連するタンパク質および天然に存在する有機分子を、少なくとも６０重量％含まない場合を言う。好ましくは調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、および最も好ましくは少なくとも９９重量％が、本開示のペプチドである。単離ペプチドは、例えば、天然源からの抽出によって、かかるペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または化学的にタンパク質を合成することによって、得ることができる。純度は、任意の適切な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって、測定することができる。
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列と、少なくとも５０％の同一性を示すペプチド、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、かかる配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸において、少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、さらにより好ましくは９０％、９５％または９９％、同一である。
【００２６】
配列番号１および配列番号２の「機能的変異体」は、機能的断片および／または機能的融合ペプチドを含む。本開示の配列の機能的変異体とは、配列番号１または配列番号２によってコードされるペプチドの、特性、活性、および／または機能特性の少なくとも１つを有する、例えば、特定の疾患の全体的な生存率の増加につながり得る抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、単離および／または組換えペプチドを指す。一般に、本開示の主題に包含される本開示のペプチドの断片または部分は、配列番号１または配列番号２によってコードされるペプチドに対して、アミノ酸（すなわち、１または２個以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１または２個以上の欠失）を有するものを含む（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部欠失など）。隣接するアミノ酸のみが欠失した、または隣接しないアミノ酸が欠失した断片または部分も想定される。一般に、本開示のペプチドの変異体または誘導体には、１もしくは２以上の隣接または非隣接のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって異なる、天然または人工の変異体、または、１もしくは２以上の残基が修飾された、修飾ペプチド、および１もしくは２以上の修飾残基を含む変異体が挙げられる。
【００２７】
一般に、配列番号１または配列番号２の機能的変異体は、変異体の全長にわたり、配列番号１または配列番号２と少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一の、アミノ酸配列を有する。
一般に、本開示の配列に対してパーセント同一性を有するアミノ酸配列は、変異体の全長にわたり、本開示の配列に対して、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８１％同一、少なくとも約８２％同一、少なくとも約８３％同一、少なくとも約８４％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８６％同一、少なくとも約８７％同一、少なくとも約８８％同一、少なくとも約８９％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一である。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、かつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、単離ペプチドを提供する。別の態様において、本開示の主題は、薬学的に許容し得る担体および、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、有効量の単離ペプチドを含む、組成物を提供する。さらなる態様において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す単離ペプチドを含む、キットを提供する。さらに別の態様において、本開示の主題は、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含みかつ抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す単離ペプチドを含む、ナノ粒子またはマイクロ粒子を提供する。
【００２９】
さらに、本開示のペプチドは、タンパク質分解に対する感受性を低くするために修飾することができる。例えば、それらは、最小限の強力な配列へと切断することができる。かかる切断は、有効な濃度を希釈し、予期しない副作用につながる可能性のある他の受容体への結合を制限するために、重要である。かかる切断はまた、各々が異なるメカニズムによって血管新生、リンパ管新生および腫瘍形成を標的とする複数の短いペプチドから、単一の多様式ペプチド（multimodal peptide）を作製する可能性を開く。多様式の処置は薬剤耐性の発生率を減少させるために非常に重要であり、何故ならば腫瘍は、複数の前線から同時に攻撃された場合には、成功した耐性を装備できる可能性が少なくなるからである。
【００３０】
加えて、異なる配列を有する複数の本開示のペプチドは、１つの組成物または方法において一緒に使用することができる。本開示のペプチドの複数の種類が、血管新生、血管透過性、腫瘍形成および／またはリンパ管新生の優れた予防または低減を可能にするような組成物または方法が存在し得る。したがって、単一の多様式ペプチドを有する組成物の代わりに、組成物は、互いに共有結合されていない単離ペプチドの複数の種類から構成されてもよい。
さらに、いくつかの態様において、本開示のペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩である。しかし、ヒトにおける使用のために、ＴＦＡ塩は、酢酸塩または他の薬学的に許容し得る塩に変更することができる。
【００３１】
用語「薬学的に許容し得る塩」とは、本明細書に記載の組成物上に見出される特定の置換基部分に応じて、比較的無毒の酸または塩基を用いて調製される活性組成物の塩を含むことを意味する。本開示の組成物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、かかる組成物の中性形態を、整った（neat）または適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容し得る塩基付加塩の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または類似の塩が挙げられる。本開示の組成物が比較的塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は、かかる組成物の中性形態を、整ったまたは適切な不活性溶媒中のいずれかで、十分な量の所望の酸と接触させることにより、得ることができる。薬学的に許容し得る酸付加塩の例としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、モノヒドロゲン炭酸、リン酸、モノヒドロゲンリン酸、ジヒドロゲンリン酸、硫酸、モノヒドロゲン硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などから誘導されるもの、ならびに比較的無毒の有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などから誘導されるものが挙げられる。さらに挙げられるのは、アルギン酸などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩などである（例えば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19参照）。本開示の特定の具体的な組成物は、組成物が塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする、塩基性および酸性官能基の両方を含む。
【００３２】
また、ペプチドの半減期を、ペプチドを特定の組成物にコンジュゲートすることによって増加させることが可能である。例えば、ペプチドを、触媒性抗体またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーにコンジュゲートして、それらの半減期を増加させ、および／または粒子への自己組織化を促進することが可能である。
いくつかの態様において、本開示の主題は、薬学的に許容し得る担体および有効量の本開示のペプチドまたはその機能的変異体を含む、組成物を提供する。他の態様において、本開示の主題は、本開示の単離ペプチドまたはその機能的変異体を含む、キットを提供する。ペプチドの量は広範に変化し得るが、一般的に量は、本開示の方法の少なくとも1つを実行するのに十分である。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る担体」とは、水、生理食塩水、デキストロース溶液、ヒト血清アルブミン、リポソーム、ハイドロゲル、マイクロ粒子およびナノ粒子を含むことを意図しているが、これに限定されない。かかる媒体および薬剤の、薬学的に活性な組成物のための使用は、当技術分野で知られており、したがって、それぞれを組成物中に効果的なレベルで組み込むさらなる例および方法は、ここで説明する必要はない。かかる組成物はまた、コーティング、抗菌剤および／または抗真菌剤、および生物学的に許容し得る任意の他の成分を含むことができる。
【００３３】
一般的に、活性剤または薬物送達デバイスの「有効量」とは、所望の生物学的応答を誘発するのに必要な量を意味する。当業者によって理解されるように、薬剤またはデバイスの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬剤、カプセル封入マトリックスの組成、標的組織などの要因に依存して変化し得る。
一般に、本開示のキットは、本開示の主題による方法を実施するための成分、試薬、供給材料などの一部または全てを含む。本開示の主題による単離ペプチドまたはその機能的変異体を含むキットにおいて、キットは、典型的には、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患を防止、遅延、軽減、または、処置するためのペプチドの有効量を含む。一態様において、キットは、本開示の主題の単離ペプチドを含有する、少なくとも1つの容器（例えば、バイアル、チューブ、またはアンプル）を含む。典型的には、単離ペプチド（単数または複数）は、１または２以上の容器内に供給され、各容器は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成の発生における変化を可能にする、単離ペプチドの有効量を含む。
【００３４】
Ｂ．代表的生分解性送達プラットフォーム
いくつかの態様において、本開示のペプチドは、ナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷されたか、またはその他で関連させられた場合に、有効である。したがって、いくつかの態様において、本開示の主題は、本開示のペプチドまたはその機能的変異体を含む、ナノ粒子またはマイクロ粒子を提供する。
特定の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）および／またはＰＬＧＡ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの態様において、約２質量％〜約５質量％の単離ペプチドが、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷される。さらに他の態様において、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドが、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷される。
【００３５】
さらに、他の態様において、本開示の主題と共に使用するのに適する特定のポリマー調合物、マイクロ粒子、ナノ粒子などが、国際ＰＣＴ特許出願公開WO/2012/0128782において、「Multicomponent Degradable Cationic Polymers（多成分分解性カチオン性ポリマー）」について開示されている。国際ＰＣＴ特許出願公開WO/2012/0114759には「Peptide/Particle Delivery Systems（ペプチド／粒子送達システム）」について、国際ＰＣＴ特許出願公開WO/2014/066811には、「Bioreducible Poly(beta-amino ester)s for siRNA Delivery（ｓｉＲＮＡ送達のための生体減少性ポリ（β−アミノエステル））」について、および国際ＰＣＴ特許出願公開WO/2014/066898には、「A Layer-by-Layer Approach to Co-deliver DNA and siRNA via AuNPs: a Potential Platform for Modifying Release Kinetics（ＡｕＮＰを介したＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの同時送達への層ごとのアプローチ：放出動態を改変するための潜在的プラットフォーム）」について開示されており、全てGreen et al.によるものであり、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）」は、次の一般式の化合物を指すことができる：
【化１】
2019089790.tif 000003
式中、
ｎは１〜１０，０００の整数であり、
Ｒは、次からなる群から選択されるジアクリレートの骨格を含み：
【化２】
2019089790.tif 000004
【化３】
2019089790.tif 000005
【化４】
2019089790.tif 000006
【００３７】
Ｒ’は、次からなる群から選択される化合物から誘導される側鎖を含み：
【化５】
2019089790.tif 000007
【化６】
2019089790.tif 000008
【００３８】
Ｒ”は、次からなる群から選択される化合物から誘導される末端基を含む：
【化７】
2019089790.tif 000009
【化８】
2019089790.tif 000010
【００３９】
かかる態様において、ポリマー組成物は、例えばＢ６−Ｓ５−Ｅ７または６５７として指定することができ、式中、ＲはＢ６であり、Ｒ’はＳ５であり、およびＲ”はＥ７である。
したがって、いくつかの態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）および／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧを含む。特定の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＰＢＡＥおよび／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷された、約１質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む。さらに他の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＰＢＡＥおよび／またはＰＢＡＥ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷された、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む。
さらに他の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡおよびＰＥＧの組み合わせを含む。特定の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡおよびＰＥＧの組み合わせを含む粒子の上または中に負荷された、約１質量％〜約５質量％の単離ペプチドを含む。さらに他の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＬＧＡおよびＰＥＧの組み合わせを含む粒子の上または中に負荷された、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドを含む。
【００４０】
本明細書で使用する用語「ナノ粒子」とは、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲に少なくとも１つの寸法を有する粒子を指し、これは、１ｎｍ〜１０００ｎｍの間の任意の整数値を含む（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、および１０００、および全ての整数およびその間の分数（fractional integer）を含む）。いくつかの態様において、ナノ粒子は、例えば、約１００ｎｍの少なくとも一つの寸法、例えば直径を有する。いくつかの態様において、ナノ粒子は、約２００ｎｍの直径を有する。他の態様において、ナノ粒子は、約５００ｎｍの直径を有する。さらに他の態様において、ナノ粒子は、約１０００ｎｍ（１μｍ）の直径を有する。かかる態様において、粒子は、「マイクロ粒子」とも呼ぶことができる。したがって、用語「マイクロ粒子」は、約１マイクロメーター（１μｍ）、すなわち１×１０−６メーターから約１０００μｍの範囲に、少なくとも１つの寸法を有する粒子を指す。本明細書で使用する用語「粒子」は、ナノ粒子およびマイクロ粒子を含むことを意味する。いくつかの態様において、マイクロ粒子は、１〜５μｍの間である。他の態様において、マイクロ粒子は、３〜１０μｍである。他のいくつかの態様において、マイクロ粒子は、１０〜２０μｍである。さらなる態様において、マイクロ粒子およびナノ粒子は、球状形状である。さらなる態様において、マイクロ粒子およびナノ粒子は、非球形の形状を有する。いくつかの態様において、粒子は、長軸対短軸のアスペクト比２〜１０の楕円形状を有する。
【００４１】
いくつかの態様において、三次元のマイクロ粒子またはナノ粒子は、以下の特徴の１または２以上を有する材料を含む：（ｉ）１または２以上の分解性結合；（ｉｉ）伸縮性弾性率；および（ｉｉｉ）三次元のマイクロ粒子またはナノ粒子を含む材料が、室温および／または体温において固体であるようなガラス転移温度。他の態様において、分解性結合は、エステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、無水物結合、および酵素分解に感受性の結合からなる群から選択される。
特定の態様において、マイクロ粒子またはナノ粒子は、生分解性ポリマー、または以下からなる群から選択されるポリマーのブレンドを含む：乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（Ｐ３ＨＢ）とヒドロキシブチレート−ヒドロキシバレレートの共重合体。他の態様において、ポリスチレンなどの当技術分野で使用される非分解性ポリマーを、分解性ポリマーまたは上記のポリマーとブレンドして、共重合体系を作製する。したがって、いくつかの態様において、非分解性ポリマーを、生分解性ポリマーとブレンドする。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「生分解性」組成物は、細胞に導入された場合に、細胞機構によって、または加水分解により、細胞が再利用できるか、または細胞への有意な毒性効果なしに廃棄できるか（すなわち、成分がin vitroで細胞に添加された場合、約２０％未満の細胞が死滅される）、どちらかの成分へと、分解されるものである。成分は、好ましくは、in vivoで炎症または他の副作用を誘発しない。特定の好ましい態様において、生分解性組成物の分解が依存する化学反応は、無触媒である。
いくつかの他の態様において、マイクロ粒子またはナノ粒子は、生体適合性である。本明細書で使用する「生体適合性」という用語は、細胞に対して毒性ではない組成物を記述することを意図する。組成物は、それらのin vitroでの細胞への添加が２０％以下の細胞死をもたらし、それらのin vivoでの投与が炎症または他のかかる副作用を誘発しない場合に、「生体適合性」である。
当業者は、本開示の方法で使用するのに適したナノ粒子およびマイクロ粒子は、様々な形状で存在することができることを理解し、これには、限定はされないが、球状体、ロッド、ディスク、ピラミッド、立方体、円筒、ナノヘリックス、ナノスプリング、ナノリング、ロッド状粒子、矢状粒子、涙滴状の粒子、テトラポッド状粒子、角柱状粒子、および他の多くの幾何学的および非幾何学的形状を含む。
【００４３】
Ｃ．一般的用語
明確化のために、その他の一般的な用語を以下に説明する。配列同一性は、一般的に配列解析ソフトウェアを用いて測定する（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 5370、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。かかるソフトウェアは、種々の置換、欠失、および／またはその他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることにより、同一または類似の配列を適合させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを、密接に関連する配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の間の確率スコアを用いて使用することができる。
【００４４】
２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウにわたり最大の一致のために整列させた場合に同一である２つの配列中の残基への参照を含み、付加、欠失および置換を考慮に入れることができる。配列同一性のパーセンテージをタンパク質を参照して使用する場合、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換によって異なり、ここではアミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸残基で置換されているため、分子の機能的特性を害するように変化はさせない。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を補正するように上方に調整することができる。このような保存的置換により異なる配列は、配列類似性を有すると言われる。この調整を行うための方法は、当業者に周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換をスコア付けすることを含み、それによってパーセント配列同一性を増加させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアを与え、非保存的置換に０のスコアを与える場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えばMeyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17, 1988のアルゴリズムに従って、例えばＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA）に実装されているようにして、算出される。
【００４５】
「配列同一性のパーセンテージ」とは、２つの最適に整列された配列を比較ウィンドウにわたり比較することによって決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加、置換、または欠失を含まない）と比較して、付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において生じる位置の数を決定して適合する位置の数を得、この適合する位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、得られた結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得る。
【００４６】
ポリヌクレオチドの文脈におけるそれらの様々な文法的形態において、用語「実質的な同一性」または「相同な」とは、ポリヌクレオチドが、参照配列と比較して、標準的なパラメータを使用して記述されたアラインメントプログラムのいずれかを使用して、所望の同一性、例えば少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、およびさらになお好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を、含むことを意味する。当業者は、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、これらの値を、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置づけなどを考慮して、適切に調節できることを認識する。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも６０％の、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の、配列同一性を意味する。
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる、規定の配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット、またはその全体であってよい；例えば、完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列である。ポリペプチドに対して、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約５、１０、または１５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸である。
【００４７】
ＩＩ．血管新生およびリンパ管新生依存性疾患を処置する方法
Ａ．代表的態様
いくつかの態様において、本開示のペプチドは、抗血管新生、抗リンパ管新生、抗腫瘍形成、および／または抗血管透過性特性を示す。血管新生は、既存の血管から生じる新しい血管の成長を指す。リンパ管新生は、血管の発生または血管新生に類似であると思われる方法による、de novoのまたは既存のリンパ管からのリンパ管の形成を指す。腫瘍形成は、腫瘍の形成を指す。血管透過性は、物質の選択的な交換を可能とする、毛細血管壁を含む微小血管壁の特性を指す。
いくつかの態様において、本開示の主題は、細胞が関与する血管新生、リンパ管、血管透過性形成、および／または腫瘍形成を阻害するための方法を提供する。この方法は、細胞を、本開示の単離ペプチドまたはその機能的変異体の、細胞の血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するのに十分な量と、接触させることを含む。細胞の接触は、細胞が関与する接着、遊走、増殖、および／または管形成の阻害をもたらし得る。特定の態様において、細胞は内皮細胞である。
【００４８】
他の態様において、細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するための方法は、以下を含む：細胞を、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）に対して少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの、細胞が関与する血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害するのに十分な量と、接触させること。さらなる態様において、細胞を接触させると、細胞が関与する接着、遊走、増殖、および／または管形成の阻害がもたらされる。特定の態様において、細胞は、内皮細胞、微小血管細胞、およびリンパ系細胞（lymphatic cell）からなる群から選択される。他の態様において、細胞は脂肪組織中に見出され、方法は、肥満を低減または防止する。さらに他の態様において、細胞は移植された細胞であり、方法は、細胞移植後の組織および／または器官の拒絶反応を、低減または防止する。「細胞の移植」という用語は、細胞が１つの身体から他の身体に移動されることを意味する。
【００４９】
いくつかの態様において、単離ペプチドは、細胞と接触する前に、ナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷される。別の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む。
本開示の主題の方法は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成が関与する疾患または障害を処置するための治療法、または血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を防止するための予防法のいずれかとして、in vivoで実施することができる。同様に方法はin vitroで、細胞上の血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成の効果を研究するための研究ツールとして実施することができる。方法はまた、治療または研究目的のためにex vivoで実施することができる。
【００５０】
「接触させること」とは、少なくとも１つの本開示の主題の単離ペプチドを、少なくとも１つの細胞と物理的に接触させる、任意の行為を意味する。したがってこれは、細胞（複数可）を、単離ペプチドの、少なくとも１つの単離ペプチドと少なくとも１つの細胞の接触がもたらされるのに十分な量に、暴露することを含んでよい。方法はin vitroまたはex vivoで、単離ペプチドおよび細胞を、培養皿またはチューブなどの制御された環境中に導入すること、および好ましくは混合する事により、実施することができる。方法はin vivoで実施することができ、この場合、接触させることは、対象における少なくとも１つの細胞を、本開示の主題の少なくとも１つの単離ペプチドに暴露すること、例えば、単離ペプチドを対象に対して、任意の適切な経路を介して投与することを意味する。本開示の主題によれば、接触させることとは、単離ペプチドを、接触させるべき細胞から離れた部位において導入する、暴露する、などにより、対象の身体機能を可能とし、または天然（例えば、拡散）もしくは人によって誘導される（例えば、旋回）流体の動きを可能にして、単離ペプチドの細胞（複数可）への接触をもたらすことを含んでよい。
いくつかの態様において、本開示の主題は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患に罹患している対象を処置する方法、または対象が、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患を発症するのを予防または遅延させる方法を提供し、ここで該方法は、対象に対して、本開示の主題の単離ペプチドまたはその機能的変異体を、対象における疾患を処置、遅延、または予防するのに十分な量で投与することを含む。
【００５１】
特定の態様において、本開示の主題は、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患に罹患している対象を処置する方法、または対象が、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患を発症するのを予防または遅延させる方法を提供し、ここで該方法は、対象に対して、LRRFSTAPFAFIDINDVINF（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む単離ペプチドを、対象における疾患を処置、遅延、または予防するのに十分な量で投与することを含む。
【００５２】
いくつかの態様において、対象はヒトである。他の態様において、対象は、非ヒトである。
代表的疾患としては、血管新生、リンパ管新生、腫瘍形成およびまたは血管透過性に依存性の疾患が含まれる。したがって、いくつかの態様において、疾患は癌である。他の態様において、癌は、乳癌、肺癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、肝細胞癌、頭部癌および頸部癌からなる群から選択される。さらに他の態様において、方法は、腫瘍内またはこれを囲む、血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成を阻害する。さらなる態様において、腫瘍は、原発腫瘍または確立された転移腫瘍である。さらに別の態様において、方法は、転移の確立を阻害するか、または癌のさらなる転移を阻害する。他の態様において、方法は、血液および／またはリンパ脈管構造を介した腫瘍細胞の伝播を阻害する。
【００５３】
いくつかの態様において、方法は、リンパ管新生、血管新生および／または腫瘍形成を手術中に阻害して、腫瘍の再増殖および転移を低減または予防する。他の態様において、方法は、リンパ管新生、血管新生および／または腫瘍形成を手術後に、原発腫瘍の外科的な完全または部分的切除後に阻害して、腫瘍の再増殖および転移を低減または予防する。したがって、いくつかの態様において、方法は、リンパ管新生、血管新生および／または腫瘍形成を、手術中および／または手術後に阻害する。
さらに別の態様において、方法はリンパ管新生を阻害し、これにより、例えば皮膚移植片、骨移植片、および他の組織および器官での移植後の、組織および器官の拒絶反応を低減または予防する。
いくつかの態様において、方法は、脂肪組織における血管新生および／またはリンパ管新生を阻害し、これにより肥満を低減または防止する。
【００５４】
いくつかの態様において、疾患は、眼の血管新生または糖尿病性網膜症に関する。他の態様において、疾患は、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症からなる群から選択される。
さらなる態様において、単離ペプチドは、対象に投与される前に、ナノ粒子またはマイクロ粒子に負荷される。さらに別の態様において、ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む。他の態様において、約２質量％〜約５質量％の単離ペプチドが、ＰＬＧＡナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷される。さらに他の態様において、約６質量％〜約１０質量％の単離ペプチドが、ＰＬＧＡおよび／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子またはマイクロ粒子の上または中に負荷される。
【００５５】
いくつかの態様において、単離ペプチドは、少なくとも１種の他の抗血管新生剤と組み合わせて投与される。特定の態様において、少なくとも１種の他の抗血管新生剤は、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の態様において、本開示の主題は、血管新生、リンパ管新生、腫瘍形成、および／または血管透過性に関連した疾患の処置における、単離ペプチドの使用を提供する。使用は特に、血管新生、リンパ管新生、腫瘍形成、および／または血管透過性を阻害する、in vivoでの治療的または予防的方法用である。特定の態様において、単離ペプチドの、医薬または治療用組成物などの、医療使用の組成物の調製における使用を提供する。一般に、単離ペプチドの使用は、医薬組成物を製造するために他の物質と組み合わせることにある。
本開示のペプチドは、広い用量範囲にわたって有効である。例えば、ヒト成人の処置において、１日当たり、０．０１〜１０００ｍｇ、０．５〜１００ｍｇ、１〜５０ｍｇ、および５〜４０ｍｇの用量が、使用することができる用量の例である。非限定的な用量は、１日あたり１０〜３０ｍｇである。正確な用量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置される対象、処置される対象の体重、および担当医の選択および経験に依存するであろう。
【００５６】
Ｂ．一般用語
「疾患」とは、細胞、組織、または器官の正常な機能を損害または妨害する、任意の状態、障害または疾患を意味する。
動物における「癌」は、癌を引き起こす細胞の典型的な特徴を有する細胞の存在を意味し、特徴とは例えば、制御されない増殖、特別な機能の喪失、不死性、顕著な転移能、抗アポトーシス活性の顕著な増大、迅速な成長および増殖速度、および特定の特徴的な形態および細胞マーカーである。いくつかの状況では、癌細胞は腫瘍の形態である；かかる細胞は、動物内に局所的に存在するか、または独立した細胞、例えば白血病細胞として血流中を循環することができる。
「血管形成」とは、血管の発生および／または成熟の１または２以上のステップを含む動的なプロセスを意味し、例えば、血管新生、脈管形成、未熟な血管網の形成、血管リモデリング、血管の安定化、血管の成熟、血管の分化、または機能的血管網の確立などである。
【００５７】
「脈管形成」とは、幹細胞、血管芽細胞、またはその他の前駆細胞に由来する新しい血管の発生を意味する。
「血管安定性」とは、血管網の維持を意味する。
「新形成」とは、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス、またはその両方によって引き起こされるか、これをもたらす疾患を意味する。固形腫瘍、血液疾患、および癌は、新形成の例である。
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず、全ての新形成細胞成長および増殖、および全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
本明細書で使用する場合、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などは、疾患および／またはこれに関連する症状を、低減または改善することを指す。疾患または状態を処置するとは、疾患、状態またはそれに関連する症状が完全に排除されることを除外するものではないが、これを必要としないことが理解されよう。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などは、疾患または状態を有してはいないが、これを発症するリスクがあるか、発症に感受性である対象において、疾患または状態を発症する確率を低下させることを指す。
「低減する」とは、本明細書に記載のものなどの標準的な当技術分野で周知の方法によって検出されるパラメータ（例えば、血管形成）の減少を意味する。本明細書で使用する場合、低減は、１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、さらにより好ましくは５０％以上の変化を含む。
【００５９】
本開示の方法によって処置される対象は多くの態様において、望ましくはヒト対象であるが、ただし、本明細書に記載の方法は、用語「対象」に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に関して有効であることが、理解されるべきである。したがって、「対象」は、医学的目的のための、例えば既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発症を防ぐための予防的処置のための、ヒト対象；または医学的、獣医学的目的のため、または発生の目的のための、動物対象を含むことができる。適切な動物対象は哺乳動物を含み、これには、限定はされないが、霊長類、例えばヒト、サル、類人猿など；ウシ類、例えば、雌ウシ、雄ウシなど；ヒツジ類、例えば、ヒツジなど；ヤギ類、例えば、ヤギなど；ブタ、例えば、ブタ、雄ブタなど；ウマ類、例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど；ネコ科、例えば野生ネコおよび飼い猫など；イヌ科、例えばイヌ；ウサギ類、例えばウサギ、野ウサギなど；げっ歯類、例えばマウス、ラットなどを含む。動物は、トランスジェニック動物であってもよい。いくつかの態様において、対象は、限定はされないが、以下を含むヒトである：胎児、新生児、乳児、若年、および成人対象。さらに、「対象」は、状態または疾患に罹患もしくは罹患している疑いのある患者を、含めることができる。したがって、用語「対象」および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６０】
治療および／または診断用途において、本開示の組成物は、全身および局所または局在化投与を含む、様々な投与様式に製剤化することができる。一般的な技術および製剤化は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)に見出すことができる。生物学的利用能を補助するために、本開示の組成物は、ナノ粒子またはマイクロ粒子中で送達してもよい。
薬学的に許容し得る塩は一般に当業者に知られており、限定はされないが、例として、以下を含むことができる：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベシル酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カルンシレート（carnsylate）、炭酸塩、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキシルリゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ムケート、ナプシレート、硝酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロネート、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、またはテオクル酸塩。他の薬学的に許容される塩は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)に見出すことができる。薬学的に許容し得る塩は、例えば、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、ナプシル酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、リン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、または酒石酸塩を含む。
【００６１】
処置される特定の条件に応じて、かかる薬剤は、液体または固体の剤形に製剤化し、全身または局所的に投与することができる。薬剤は、当業者に知られているように、例えば時間的または持続的低放出形態で、送達することができる。製剤化および投与のための技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)に見出すことができる。適切な経路は、以下を含んでよい：経口、頬側、吸入スプレーによる、舌下、直腸、経皮、経膣、経粘膜、経鼻または腸内投与；非経口送達であって、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射またはその他の送達様式を含むもの。
注射のために、開示の薬剤は、例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中などの水溶液に配合し、希釈してもよい。かかる経粘膜投与の場合、透過すべき障壁に適切な浸透剤を、製剤に用いる。かかる浸透剤は、当技術分野で一般に知られている。
【００６２】
本開示の実践のための本明細書に開示の組成物を、全身投与に適した用量に製剤化するための、薬学的に許容し得る不活性な担体の使用は、本開示の範囲内である。担体および適切な製造の実践の適切な選択により、本開示の組成物は、特に液剤として処方されるものは、静脈注射などにより非経口投与することができる。組成物は、当該技術分野において周知の薬学的に許容し得る担体を用いて、経口投与に適した用量に、容易に製剤化することができる。かかる担体は、処置される対象（例えば、患者）による経口摂取のために、本開示の組成物を、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
経鼻または吸入送達のために、本開示の薬剤はまた、当業者に知られた方法によって製剤化することができ、例えば、限定されないが、生理食塩水などの可溶化剤、希釈剤、または分散物質、およびベンジルアルコールなどの保存剤、吸収促進剤およびフルオロカーボンを含んでよい。
【００６３】
本開示における使用に適した医薬組成物は、活性成分がその意図された目的を達成するために有効な量で含まれる組成物を含む。有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性組成物の薬学的に使用可能な製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を含む、薬学的に許容し得る適切な担体を含有してもよい。経口投与のために配合された製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、または液剤の形態であってよい。
【００６４】
経口使用のための医薬製剤は、活性組成物を固体賦形剤と混ぜ合わせ、得られた混合物を任意に粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を錠剤または糖衣錠コアを得るために処理することにより、得ることができる。適切な賦形剤は、特に、糖などの充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ｓｃＣ）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）である。所望の場合、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加してもよい。
糖衣錠コアは、好適なコーティングを施して提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を用いてよく、これは任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。染料または顔料を、識別のため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【００６５】
経口で使用できる医薬製剤は、ゼラチン製の押し込み型カプセル（push-fit capsules）、ならびにゼラチン製のソフト密封カプセル、および、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤を含む。押し込み型カプセルは、活性成分を、ラクトースなどの混合剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と共に混合されて含むことができる。ソフトカプセルでは、活性組成物は、例えば脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの適切な液体に、溶解または懸濁してもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。
本明細書中で具体的な用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定目的ではない。特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術的および科学的用語は、ここに説明される主題が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
長年の特許法の慣習に従って、用語「a」、「an」、および「the」は、特許請求の範囲を含み本出願において使用される場合に、「１または２以上」を意味する。したがって例えば、「対象」への言及は、文脈から明らかに逆でない限り（例えば、複数の対象）、複数の対象を含む。
【００６６】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含むこと（comprising）」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、非排他的な意味で使用されている。同様に、用語「含む（include）」およびその文法的変形は、非限定的であることが意図され、すなわち、リスト内の項目列挙が、列挙された項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないことが意図される。
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、特に断らない限り、量、サイズ、寸法、比率、形状、処方、パラメータ、パーセンテージ、数量、特性、および明細書および特許請求の範囲で使用されるその他の数値を表す全ての数は、全ての場合において、たとえ「約」という用語が値、量または範囲と共に表示されていない場合であっても、「約」という用語によって修飾されているとして理解されるべきである。したがって、逆が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、正確である必要はなく、所望に応じて近似および／または大きくても小さくてもよく、本開示の主題によって得ようとする所望の特性に応じて、許容度、換算係数、丸め、測定誤差など、および当業者に知られている他の因子を反映する。例えば、値を参照する場合の「約」という用語は、具体的な量から、いくつかの態様においては±１００％、いくつかの態様においては±５０％、いくつかの態様においては±２０％、いくつかの態様においては±１０％、いくつかの態様においては±５％、いくつかの態様においては±１％、いくつかの態様においては±０．５％、およびいくつかの態様においては±０．１％の変動を包含することを意味することができ、それは、かかる変動が、開示された方法を実行するか、または開示された組成物を使用するのに適切であるためである。
【００６７】
さらに、用語「約」を１もしくは２以上の数値または数値範囲と関連して使用する場合、これは、範囲内の全ての数値、および記載された数値の上下に境界を拡張することによるこの範囲の変更を含む、全てのかかる数値を指すと理解されるべきである。端点による数値範囲の記述は、その範囲に包含される、全ての整数および分数を含む全ての数値（例えば、１〜５の記載は、１、２、３、４、および５、ならびにその間の分数、例えば１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）、および、その範囲内の全ての範囲を含む。
【実施例】
【００６８】
以下の例は、当業者に対して、本開示の主題の代表的な態様を実施するための指針を提供するために含まれる。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の例が例示のみを意図していること、多数の変更、修飾、および改変を、本開示の主題の範囲から逸脱することなく、用いることができることを、理解することができる。以下の例は例示のために提供され、限定するものではない。
【００６９】
例１
材料および方法
細胞培養における細胞の増殖。細胞培養での細胞の増殖のために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）、およびリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）をLonzaから購入し、Bullet Kit（ＥＧＭ−２、Lonza）を補充した内皮基本培地（ＥＢＭ−２）を用いて、製造業者の推奨に従って維持した。ＭＥＣとＬＥＣは、微小血管内皮細胞増殖培地−２（ＥＧＭ−２ＭＶ、Lonza）で増殖させた。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、Dr. Zaver Bhujwalla（JHMI, Radiology and Oncology）から供給を受けた。細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco, Carlsbad, CA）中で増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の標準条件下で維持し、使用した全ての細胞の継代数は、２〜７の間であった。
【００７０】
ペプチド合成。ペプチドは、固相合成を用いて合成し、アミド化Ｃ末端およびＮ末端のアミンを有するＴＦＡ塩として供給された（New England Peptide, Garder, MA）。ペプチドの純度は＞９５％であり、供給者は製品特性（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＰＬＣ／ＭＳおよびＨＰＬＣトレース）を、ＭＷおよび純度の精度の証明として提出した。ペプチドを、その疎水性プロファイルのために、５％ＤＭＳＯおよび水に溶解した。溶解されたペプチドのｐＨをチェックし、ｐＨ７程度であることが見出された。全ての実験について、ＤＭＳＯ％は、非毒性の閾値（細胞におけるＤＭＳＯの毒性曲線により決定）に維持し、最終的なＤＭＳＯ％（＜０．２％）を、全ての実験において対照として用いた。
【００７１】
増殖アッセイ。ＷＳＴ−１（Roche, 11644807001）増殖試薬を使用した比色ベースの増殖アッセイを、ＨＲＥＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、および乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、およびＳＵＭ１４９を用いて行った。２０００個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。翌日培地を、ペプチドまたは対照として同等のＤＭＳＯビヒクルを含有する完全補充培地と交換した。３日後、ペプチドを含有する培地を、ＷＳＴ−１試薬を含む無血清ＥＢＭ−２培地と交換し、プレートを製造者の推奨に従って４時間インキュベートした。テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の、ミトコンドリアのコハク酸−テトラゾリウム還元酵素による開裂に起因するホルマザン色素による色の変化を、Victor V蛍光プレートリーダー（Perkin Elmer、MA）で、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより読み取った。生細胞パーセントの応答曲線を作成した（未処理の、しかし０．２％ＤＭＳＯを含む完全培地中でインキュベートした細胞と比較）。アッセイは、少なくとも２つの独立した反復で行い、それぞれの反復は、３回の三重の実験を使用して行った。
【００７２】
遊走アッセイ。ペプチドの阻害能力は、電気インピーダンスに基づくリアルタイム遊走アッセイシステムを用いて測定した（RT-CIM, ACEA Biosciences, CA）。ＣＩＭ １６ウェルプレート（Roche, 05665817001）は、微孔質（８μｍ）ポリカーボネート膜によって分離された上部および下部チャンバーで構成されている。膜は、フィブロネクチン（２０μｇ／ｍｌ）で被覆され、ペプチド有りまたは無しの無血清培地中の４５，０００細胞／ウェルを、上部区画に添加した。化学誘引物質（すなわち、完全補充ＥＢＭ−２）を有する培地を、チャンバーの下部区画に添加し、プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。センサーは、膜モニタの下側に一体化され、細胞が膜を通って移動するのにつれて、インピーダンスの変化を連続的に記録する。ＲＴ−ＣＩＭ技術は、測定されたインピーダンスに由来する細胞の指標をモニタリングすることによって、細胞遊走の容易な定量化を可能にする。アッセイは、少なくとも２つの独立した反復で行い、それぞれの反復は、２回の実験の重複を用いて行った。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、その薄く細長い表現型のためにＲＴ−ＣＩＭ型の実験に適さず、したがって、遊走の阻害は、創傷治癒型のアッセイを用いて調べた。このアッセイは、Oris Pro Migration assay（Platypus Technologies, CMA 1.101）を用いて行った。簡単に述べると、完全培地中の２５，０００細胞／ウェルを、ウェルの中心領域への細胞の遊走を阻止するストッパーを含む９６ウェルプレートに添加した。細胞を４時間接着させ、その後ストッパーを除去した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、化合物有りまたは無しの完全補充培地を、ウェルに添加した。１８時間後、細胞をカルセインＡＭ（０．５μｇ／ｍＬ）（Invitrogen, CA）で染色し、ウェルの中央に遊走した細胞を、Nikon顕微鏡（Eclipse T-100）を用いて画像化した；画像は、Nikon顕微鏡上に取り付けられたCCD Sensicamで取得した（Cooke Company, MI）。以前に制限されていた領域に遊走した細胞の検出は、プレートの下部に検出マスクを添加することによって可能であり、検出マスクは遊走しなかった測定細胞から遮られた。
【００７３】
創傷治癒アッセイ。乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、その薄く細長い表現型のためにＲＴ−ＣＩＭ型実験に適さず、したがって遊走の阻害を、創傷治癒型アッセイを用いて調べた。このアッセイは、Oris Pro Migration assay (Platypus Technologies, CMA 1.101) を用いて行った。簡単に述べると、完全培地中の２５，０００細胞／ウェルを、ウェルの中心領域への細胞の遊走を阻止するストッパーを含む９６ウェルプレートに添加した。細胞を４時間接着させ、その後ストッパーを除去した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、化合物有りまたは無しの完全補充培地を、ウェルに添加した。１８時間後、細胞をカルセインＡＭ（０．５μｇ／ｍＬ）（Invitrogen, CA）で染色し、ウェルの中央に遊走した細胞を、Nikon顕微鏡（Eclipse T-100）を用いて画像化した；画像は、Nikon顕微鏡上に取り付けられたCCD Sensicamで取得した(PCO-TECH, Inc., Romulus, MI)。前に制限されていた領域に遊走した細胞の検出は、プレートの下部に、遊走しなかった測定細胞を妨害する検出マスクを添加することにより、可能とされた。
【００７４】
接着アッセイ。遊走アッセイと同様に、細胞接着におけるペプチドの阻害活性を、ＲＴ−ＣＩＭ技術を用いて評価した。この場合、２５，０００細胞／ウェルを、ペプチドの存在下または不在下で１６ウェルのＥ−プレート（Roche, Basel Switzerland）に播種した。接着は、電極に接着した細胞の直接的な尺度である電気インピーダンスの変化を測定することによって、時間に渡り（３時間）モニタリングした。アッセイは、少なくとも２つの独立した反復で行い、それぞれの反復は、２回の重複実験を用いて行った。
管形成阻害アッセイ。組成物はまた、血管新生において重要なプロセスである管形成を阻害するそれらの能力についても試験した。内皮細胞は、細胞外マトリックスの抽出物上にプレーティングされると、自発的に管網を形成する。このin vitroアッセイは、接着および遊走の側面を組み合わせており、血管新生の研究に日常的に使用されている（Oliveira-Ferrer et al., 2008）。管形成を阻害する能力は、抗血管新生能の総合評価である。プロトコルはArnaoutova et al. (2009)によって記載され、ＨＵＶＥＣを基底膜抽出物の上にプレーティングすることにより構成されている。３７℃でインキュベートした後、細胞は天然に、管網内にそれ自身を再配置する。したがって、５０μＬ／ウェルのMatrigel（BD Biosciences, San Jose, CA）を、冷却した９６ウェルプレートにプレーティングし、重合のために３７℃で３０分間インキュベートした。１５，０００細胞／ウェルをゲルの上部に添加し、ペプチドの存在下または不在下で完全培地中１９時間、インキュベートした。画像は、Nikon顕微鏡（Eclipse T-100）に取り付けたCCD Sensicam で捕捉した。アッセイは、少なくとも２つの独立した反復で行い、それぞれの反復は３回の実験の反復を用いて行い、１ウェルにつきランダムに選択されたフィールドの1つの画像を取得した。
【００７５】
腫瘍異種移植片。同所性乳房腫瘍を、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用して、ＳＣＩＤマウスに誘導した。１００μＬのアリコートあたり２×１０６細胞の単一細胞懸濁液を、乳房の乳腺脂肪パッドに注射した。腫瘍は、約１４〜２１日間で７５〜１００ｍｍ３の体積に達した。マウスを無作為化し、同様の腫瘍体積の群（平均値の間には統計的な差なし）に分け（１群あたり８匹のマウス）、処置を開始した。ペプチドは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ｉｐ）に1日1回投与した。腫瘍はカリパスを用いて４日ごとに測定し、腫瘍体積は、式：Ｖ＝ａｂ２／２を用いて計算し、この式中、「ａ」および「ｂ」はそれぞれ、より大きいおよびより小さい直径である。
【００７６】
ＴＣＭ誘発性転移モデル。腫瘍移植の前に、無胸腺ヌードマウス（雌５〜６週齢、１８〜２０ｇ）を、５０μＬのＴＣＭまたはＳＦＭを用いて、首筋を通って皮下で２週間処置した。ＴＣＭ処置の２週間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ腫瘍異種移植片を、同じ動物で確立した；細胞（２×１０６）を、５０μＬの完全培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０）、および５０μＬのMatrigel（High Concentrated, BD Biosciences）と混合し、麻酔下で（ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｋｇのケタミン＋５ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン、腹腔内投与）、動物の上鼠径部乳腺脂肪パッドに注射した。原発腫瘍の大きさはカリパスを用いて測定し、体積ｗは式：Ｖ＝０．５２×ａ×ｂ２を用いて計算し、この式中、「ａ」は腫瘍の長軸、「ｂ」は短軸である。動物はまた、前腫瘍転移を追跡するために毎週画像化した；ｄ−ルシフェリン（Caliper １５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した後に、ＩＶＩＳ Xenogen 200光学イメージャ（Xenogen, Alameda, CA）を使用した。ｉ．ｐ．注入の失敗を防止するため、１００μＬのＤ−ルシフェリン（２回希釈）を、腹部の両側に腹腔内投与した（合計２００μＬ／動物）。４週間後、腋窩および上腕ＬＮ（リンパ節）、肺、および脳を採取し、Ｄ−ルシフェリン溶液に３分間浸漬し、ＩＶＩＳイメージャに入れて、ex vivoで転移を検出した。ルシフェラーゼ媒介光子束は、Living Image（登録商標）3D Analysis（Xenogen）を用いて定量化し、前に記載のように、平均光子束を、８個の肺、８個の脳、および１４〜１６個のＬＮから得た。腹腔内転移を示す動物の場合には、胃、脾臓、腎臓、肝臓、および腸を含む腹部器官のex vivoの画像を、ＩＶＩＳイメージャを用いて取得した。
【００７７】
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデル。レーザー光凝固誘発によるブルック膜の破裂を、ＣＮＶを生成するために使用した。簡単に述べると、４〜５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、塩酸キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）および塩酸ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、瞳孔を１％トロピカミド（Alcon Labs, Inc., Forth Worth, TX, USA）で拡大させた。５３２ｎｍのダイオードレーザー光凝固（７５μｍのスポットサイズ、０．１秒の持続時間、１２０ｍＷ）による３つの熱傷（burn）を、スリットランプ送達システムOcuLight GL Photocoagulator（Iridex, Mountain View, CA, USA）およびハンドヘルドのカバースライドをコンタクトレンズとして使用して、各網膜に送達した。熱傷は、網膜の後極の９，１２および３時の位置で行われた。ブルック膜の破裂を示す、レーザー光凝固時のバブルの生成は、ＣＮＶを得る際の重要な要因であり、バブルが生成された熱傷のみを研究に含めた。処置は、レーザー光凝固の７日後に開始し、０．１％のＳＰ２０４３（配列番号１）（１μＬの体積中１μｇ）、１％（１μＬのＳＰ２０４３（配列番号１）の体積中、１０μｇ）、またはビヒクルの硝子体内注射を、Harvard Pump Microinjection System（Harvard Apparatus, Holliston, MA）および引っ張りガラスマイクロピペット付きの解剖顕微鏡下で行うことを含む。いくつかのマウスは、ベースライン測定のために安楽死させた。レーザーの１４日後に、残りのマウスを使って、ブルック膜の破裂部位におけるＣＮＶの量を測定した。ブルック膜の破裂の２週間後、マウスを麻酔し、フルオレセイン標識デキストランで灌流し（２×１０６平均モル質量、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、脈絡膜フラットマウントを、前に記載のように調製した。簡単に説明すると、眼を取り出し、１０％リン酸緩衝ホルマリンで１時間固定し、角膜およびレンズを除去した。網膜全体を慎重に眼杯から切開した後、放射状のカットを、全４つの象限で眼杯の縁から赤道へと作製し、Aquamount（Polysciences, Warrington, PA）にフラットマウントした。フラットマウントは、Axioskop顕微鏡（Zeiss, Thornwood, NY, USA）を使用して蛍光顕微鏡により検査し、画像を、３ ＣＣＤカラービデオカメラ（IK-TU40A, Toshiba, Tokyo, Japan）およびフレーム取込み器を使用してデジタル化した。Image-Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA）を使用して、各ＣＮＶ病変の面積を測定した。統計的比較は、ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニを用いて行った。
【００７８】
ＣＮＶ回帰モデル。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの両眼のブルック膜を、マウスを麻酔しその瞳孔を１％トロピカミドで拡大した後、レーザーで破裂させた。７日後、一部のマウスは、ベースライン血管新生の確立のために屠殺した。その時点で、別のマウスに対し、１μｇのＳＰ２０４３（配列番号１）を一方の眼に投与し、ビヒクルを他眼に投与した。７日後、全ての動物をフルオレセイン標識デキストランで灌流し、眼を取り出し、網膜を切開し、放射状のカットを作製後にフラットマウントして、蛍光を測定した。画像は３色の電荷結合素子ビデオカメラおよびフレーム取込み器を使用してデジタル化し、過剰血管新生化の領域を、画像解析ソフトウェアで定量した。
【００７９】
ＶＥＧＦ誘発性血管新生を有するトランスジェニックマウス。生後１４日目のヘミ接合ロー／ＶＥＧＦマウスに、１μＬの５％ＤＭＳＯ／水、１μＬの、０．１μｇもしくは１μｇのＳＰ２０４３（配列番号１）含有の５％ＤＭＳＯ／水を、１つの眼に眼内注射した。眼内注射は、Harvard Pump Microinjection System（Harvard Apparatus, Holliston, MA）および引っ張りガラスマイクロピペット付きの解剖顕微鏡下で行った。生後２１日目に、１つの眼あたりの網膜下血管新生（ＮＶ）の総面積を定量した。簡単に述べると、マウスを麻酔し、２５ｍｇ／ｍＬのフルオレセイン標識デキストラン（平均分子量２×１０６、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を含有する１ｍＬのＰＢＳで灌流した。眼を取り出し、１０％リン酸緩衝ホルマリンで１時間固定した。角膜とレンズを除去し、網膜全体を慎重に眼杯から切開し、全４つの象限で網膜の縁から赤道へと放射状にカットし、封入剤（Aquamount；Polysciences, Warrington, PA）中に光受容体を上向きにフラットマウントした。網膜は、蛍光顕微鏡によって２００×倍率で検査し、これにより深度の浅い視野を提供し、したがって網膜の外側表面上のＮＶに着目すると、網膜血管の残りの部分は焦点から外れて、ＮＶの容易な描写が可能となる。in vivoでの網膜下腔に対応する網膜の外縁は容易に識別され、したがって、スライドごとに焦点面の標準化が存在する。画像は、３色の電荷結合素子（ＣＣＤ）ビデオカメラおよびフレーム取込み器を使用してデジタル化した。画像解析ソフトウェア（Image-Pro Plus；Media Cybernetics, Silver Spring, MD）を用いることにより、処置群に関してマスクされた研究者が、１つの眼当たりの網膜下ＮＶの総面積をソフトウェアにより認識し、前述のようにしてこれを算出することを可能とした。
【００８０】
マウスの眼における血管透過性：マウスの一方の眼に１μｇのＳＰ２０４３（配列番号１）を、他の眼にビヒクルを注射し、ビヒクル対照は、成体の二重トランスジェニックＴｅｔ／Ｏｐｓｉｎ／ＶＥＧＦマウスの一方の眼に注射した。３日後、マウスに対し、飲料水中２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを３日間与えた。その時点で動物を麻酔し、それらの瞳孔を標準的な眼底検査用に拡大させた。眼を検査して、Micron II網膜イメージングを用いた眼底撮影および公開されたプロトコルを使用した光干渉断層撮影により、２つの処置のもとで網膜剥離を有する動物の数を比較した。
【００８１】
ウサギの眼における血管透過性の測定：０日目において、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１；５０μｇ）を、ダッチベルト着色ウサギの硝子体に注射し、ビヒクルを他の眼に注射した。３日目に、５０μｇのＶＥＧＦ（ヒト）を両眼に注射した。１０日目に、フルオレセインを全身的にウサギに注入し、２時間後に網膜の５ｍｍ〜８ｍｍ前の蛍光を、Fluoroton Master FM-2蛍光光度計により測定した。
【００８２】
ペプチド製剤のための材料：ＰＬＧＡ［（Ｄ，Ｌ−ラクチド−グリコリド共重合体）；３つの調合物−ラクチド：グリコリド（６５：３５）、ＭＷ４０，０００〜７５，０００；ラクチド：グリコリド（７２：２５）、ＭＷ７６，０００〜１１５，０００；ラクチド：グリコリド（８５：１５）、ＭＷ１９０，０００〜２４０，０００］、ＤＣＭ［ジクロロメタン］、ＤＭＳＯ［ジメチルスルホキシド］、およびＤＭＦ［Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド］は、Sigma（St. Louis, MO）から購入した。ＰＶＡ［ポリ（ビニルアルコール）；Ｍｗ２５０００］は、Polysciences（Warrington, PA）から購入した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ［メトキシポリ（エチレングリコール）−ｂ−（ラクチド−グリコリド共重合体）；ＰＥＧ：ＰＬＧＡ ５：２０ｋＤａ；１：１のＬＡ：ＧＡ）は、PolySciTech（West Lafayette, IN）から購入した。ＰＢＡＥ［ポリ（β−アミノエステル）］は、前述のように合成した。ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ＝５）［酢酸ナトリウム緩衝液］は、Invitrogen （Grand Island, NY）から購入した。
【００８３】
ペプチドを負荷したＰＬＧＡマイクロ粒子：ＰＬＧＡを最初に、所望の濃度（通常は２０ｍｇ／ｍｌまたは４０ｍｇ／ｍｌ）でＤＣＭに試験管中で溶解し、完全に溶解するまでボルテックスした。ＤＭＳＯ中のペプチドストック（通常は２０ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液にマイクロピペットした。ペプチド：ＰＬＧＡの質量比は変えることができる；一般的な処方は、ペプチド：ＰＬＧＡが１：５０である。ブランクのマイクロ粒子については、ピペット同等体積のＤＭＳＯのみを使用した。混合物を氷上で試験管で超音波処理した。超音波処理は、約５〜１０Ｗに等しい「３０」の振幅設定で２０秒間実施した。この一次エマルジョンを直ちに、５０ｍＬの１％ＰＶＡ溶液に注ぎ、３．６〜３．８ｋｒｐｍで１分間均質化した。全体積を次に１００ｍＬの０．５％ＰＶＡ溶液に移し、化学フード内で３時間攪拌した。３回の洗浄工程を行った。各洗浄工程のために、マイクロ粒子溶液を４℃、４ｋｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去した。続いて、冷蔵水４０ｍＬを添加し、マイクロ粒子ペレットを再懸濁させ、洗浄工程を繰り返した。最後の遠心分離工程の後に、５ｍＬの水を加えて試料を再懸濁させた。試料は液体窒素中でスナップ凍結し、直ちに凍結乾燥機に入れた。凍結乾燥後、全てのマイクロ粒子を、−２０℃で保存した。
【００８４】
ペプチドを負荷したＰＬＧＡナノ粒子：ＰＬＧＡを最初に、所望の濃度（通常は２０ｍｇ／ｍｌまたは４０ｍｇ／ｍｌ）でＤＣＭに試験管中で溶解し、完全に溶解するまでボルテックスした。ＤＭＳＯ中のペプチドストック（通常は２０ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＬＧＡ／ＤＣＭ溶液にマイクロピペットした。ペプチド：ＰＬＧＡの質量比は変えることができる；一般的な処方は、ペプチド：ＰＬＧＡが１：５０である。ブランクのナノ粒子については、ピペット同等体積のＤＭＳＯのみを使用した。混合物を氷上で試験管で超音波処理した。超音波処理は、約５〜１０Ｗに等しい「３０」の振幅設定で２０秒間実施した。この一次エマルジョンを直ちに、５０ｍＬの１％ＰＶＡ溶液に注ぎ、「６０」の振幅設定で２分間超音波処理した。全体積を次に１００ｍＬの０．５％ＰＶＡ溶液に移し、化学フード内で３時間攪拌した。３回の洗浄工程を行った。各洗浄工程のために、マイクロ粒子溶液を４℃、１７ｋｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を除去した。続いて、冷蔵水３０ｍＬを添加し、マイクロ粒子ペレットを再懸濁させ、洗浄工程を繰り返した。最後の遠心分離工程の後に、５ｍＬの水を加えて試料を再懸濁させた。試料は液体窒素中でスナップ凍結し、直ちに凍結乾燥機に入れた。凍結乾燥後、全てのマイクロ粒子を、−２０℃で保存した。
【００８５】
ペプチドを負荷したＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子：ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−マレイミド、またはリガンドにコンジュゲートしたＰＬＧＡ−ＰＥＧは、最初に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度（または他の所望の濃度）でＤＭＦに溶解した。次にペプチド（２０４３、２０４３−ＩＲＤ８００、ＤＭＦ中の２０ｍｇ／ｍＬのストック）を、２％の最終ペプチドｗ／ｗ％（または他の所望の割合）でＰＬＧＡ−ＰＥＧに添加した。ブランクのナノ粒子については、同等体積のＤＭＳＯのみを、ＰＬＧＡ−ＰＥＧに添加した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ／ペプチド／ＤＭＦ溶液を、撹拌プレート上のMilli-Q水に滴下し、有機：水の最終体積比１：１０とした。混合物を、化学フードの下で４時間、回転させた。粒子は、各スピンについて、Amicon Ultra-15遠心分離管（Millipore）を用いて４℃で１０分間、２回洗浄した。濃縮された粒子は、４℃の水中で保存するか、または異なる量のスクロース（Sigma-Aldrich）を用いて凍結乾燥した。
ポリマー−ペプチド複合体：各種類のポリマー（ＰＢＡＥ）およびペプチド（ＳＰ２０４３；配列番号１）を、所望のＰＢＡＥ：２０４３質量比（１：１〜１００：１）に応じて、種々の濃度でＮａＡｃ緩衝液中に希釈した。ＰＢＡＥ溶液を２０４３溶液にピペッティングし、室温で５分間インキュベートした。粒子は、Nanosightナノ粒子トラッキング分析、動的光散乱法、および／または透過型電子顕微鏡により特徴付けた。
【００８６】
ＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧ粒子の特徴付け：サイジングのため、マイクロ粒子またはナノ粒子は、最初に水またはＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＤＬＳ、ＮＴＡ、ＳＥＭ、またはＴＥＭを適切に用いてサイジングした。負荷するために、粒子は最初にＤＭＳＯに溶解した。一部の試料については、ＤＭＳＯ試料をより大きな体積の水に添加して、ＰＬＧＡを沈殿させた。標識ペプチドについては、Biotek Synergy 2のプレートリーダーを使用して、試料および標識ペプチド標準のみ（only standard）の蛍光を測定した。非標識２０４３試料については、ＰＡＧＥおよび銀染色を使用して、ペプチドを定量した。
マイクロ粒子のＳＥＭイメージングおよびImageJ定量：凍結乾燥粒子をカーボンテープ（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA）上に置き、アルミニウムマウント上に載せた。試料を金−パラジウムでスパッタリングし、ＳＥＭイメージングをLEO/Zeiss FESEM（Johns Hopkins School of Medicine）を用いて実施した。
【００８７】
例２
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；図１）および網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ；図２）の増殖、遊走、および接着を阻害することが見出された。また、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）（２５μＭ）は、ＨＵＶＥＣ管形成（図３、パネルＡとＢ）および微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）の管形成（図３、パネルＣとＤ）を阻害することが見出された。さらに、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、リンパ管内皮細胞接着（ＬＥＣ；図４）およびＬＥＣ管形成（図５）を阻害することが見出された。
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、ＭＥＣおよびＬＥＣ細胞における、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）のin vitroでのシグナル伝達を阻害することが見出された（図６）。また、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、in vitroでトリプルネガティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＵＭ１４９、ならびにエストロゲン受容体陽性細胞株ＭＣＦ−７の増殖を阻害することが見出された（図７）。さらに、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＨＧＦシグナル伝達を阻害することが見出された（図８）。
【００８８】
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、ＳＣＩＤマウスにおいてＭＤＡ−ＭＢ−２３１同所性腫瘍の成長を阻害することにより、in vivoでの阻害を示した（図９）。マウスへのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の注射の３３日後に、腫瘍の成長は約８２％阻害された（２０ｍｇ／ｋｇのＳＰ２０４３を使用して腹腔内注射）。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、in vivoでのｃ−Ｍｅｔのリン酸化および血管新生を阻害することが見出された（図１０）。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、免疫組織化学（ＩＨＣ）についてレクチン染色によって見られるように、血管新生を阻害し、およびin vivoでＬＹＶＥ−１染色によって見られるようにリンパ管新生を阻害した。ＳＰ２０４３は、腫瘍細胞からの光子束による、腫瘍馴化培地で前処理された転移モデルにおける、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍の複数の器官への転移を阻害した（図１２Ａ）。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、ヒト細胞の存在についてビメンチン抗体で染色することによって示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ腫瘍のリンパ節への転移も阻害した（図１２Ｂ）。
【００８９】
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の効果は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、黄斑浮腫（ＭＥ）および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）などのヒト眼疾患の眼のモデルにおいても見られた。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、レーザー誘発性の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおいて、アフリベルセプトより強力に血管新生を阻害し（図１３Ａ−Ｂ）、また対照と比較して、ロー−ＶＥＧＦマウスモデルにおいて血管新生を阻害した。また、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、マウスの眼のレーザー誘発性ＣＮＶモデルにおいて、新生血管の退縮を引き起こした（図１４）。さらに、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、Ｔｅｔ／Ｏｐｓｉｎ／ＶＥＧＦマウスモデルにおいて、血管漏出を阻害した（図１５Ａ−Ｂ）。また、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、ウサギの眼において、ＶＥＧＦ媒介性の血管透過性を阻害した（図１６）。
【００９０】
例３
マイクロ粒子におけるＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）
本明細書に開示された単離ペプチドは、マイクロ粒子またはナノ粒子に配合して使用することができる。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、ＰＬＧＡマイクロ粒子中に配合されて、長期の持続放出を可能にし、これは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）のイメージングによって示される（２％負荷；図１７）。図１８Ａは、２％および５％のＳＰ２０４３を負荷したＰＬＧＡマイクロ粒子のサイジングの、代表的な例を示す。マイクロ粒子のサイジングは、ＳＥＭ画像のImageJ（Rasband, 1997-2012）を用いて測定した。結果は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の負荷が、粒度分布に有意な影響を与えないことを示した。いくつかの態様において、２％〜５％のＳＰ２０４３を負荷したＰＬＧＡを、本開示の方法に使用する。in vivoでの使用のために、５質量％のＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、１μＬの注入マイクロ粒子溶液中の１μｇのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）に等価である。２％および５％のＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を負荷したＰＬＧＡマイクロ粒子のゼータ電位（表面電荷）を、Malvern Zetasizer（Malvern Instruments, Ltd, Malvern, Worcestershire, UK；図１８Ｂ）で測定した。結果は、対照（ブランク）およびペプチドを負荷したマイクロ粒子の間の表面電荷に、有意な差は示されなかった。
【００９１】
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の標識されたペプチド類似体の、ＰＬＧＡマイクロ粒子からの制御放出を、in situの生理学的条件下で６ヶ月にわたって観察した（３７℃のＰＢＳ；図１９）。また、ＰＬＧＡマイクロ粒子中の任意の標識または修飾なしのＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）の放出制御も、in situの生理学的条件下で観察した（図２０）。
図２１は、２重量％（左）および５重量％（右）のＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を組み込んだＰＬＧＡマイクロ粒子の、ＳＥＭ画像を示す。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、ナノ粒子に封入することができ、これらの粒子（マイクロまたはナノ）は、楕円形などの異なる非球形状および球形状を有することができる（図２２）。
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を封入したＰＬＧＡ ８５／１５マイクロ粒子は、マウスモデルにおいてレーザー誘発脈絡膜血管新生後のマウスの眼で、退縮を引き起こした（図２３）。また、これらのマイクロ粒子は、レーザー誘発湿潤ＡＭＤマウスモデルにおいて、時間にわたり血管新生を阻害した(図２４)。２０４３を封入したＰＬＧＡ ８５／１５マイクロ粒子は、単一の硝子体内注射後、in vivoで少なくとも３ヶ月間有効性を示した。
【００９２】
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）含有ＰＬＧＡ ６５／３５マイクロ粒子は、レーザー誘発湿潤ＡＭＤマウスモデルにおいて、時間にわたり血管新生を阻害した(図２５)。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）による血管新生の阻害は、ウサギモデルでも見られた（図２６）。
図２７は、ロー／ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を封入したＰＬＧＡ（８５／１５）を示す。図２８は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を、例えばアフリベルセプトなどの他の抗血管新生剤と組み合わせて、マウスにおけるレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおいて見られるような増大効果のために、使用できることを示す。
ＰＢＡＥなどのポリマーをＳＰ２０４３に添加して、約１００ｎｍのナノ粒子に自己組織化させることができる（図２９）。粒径とナノ粒子の濃度は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）が自己組織化のためにポリマーと共にある場合には大きくなることが見出された。図３０は、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を封入したＰＬＧＡおよびＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子の効果を示す。
全身的に静脈内（intervenous）注射されたＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）含有ナノ粒子、または遊離ペプチドは、腫瘍および他の器官に蓄積した（図３１）。
ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）を定量化する方法には、電気泳動およびSimplyBlueによる染色（図３２、パネルＡ）、続いて質量分析（図３２、パネルＢ）が含まれる。
【００９３】
例４
考察
本開示の主題は、癌、加齢黄斑変性症などの眼疾患、およびその他の血管新生依存性およびリンパ管新生依存性疾患の異なる形態のために使用することができる、模倣ペプチドを提供する。特に、活性模倣ペプチドＳＰ２０４３（配列番号１）を、in vitroで血管新生およびリンパ管新生のアッセイにおいて試験した。より詳細には、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、血液内皮細胞増殖、遊走、接着、および管形成アッセイにおいて、抗血管新生活性を示し、乳癌異種移植モデルおよび加齢黄斑変性症モデルにおいて、in vivoの抗血管新生および抗腫瘍形成活性を示した。ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）はまた、抗リンパ管新生特性を有する。さらに、ＳＰ２０４３ペプチド（配列番号１）は、マイクロ粒子またはナノ粒子に配合して使用できることが示された。
【００９４】
参考文献
明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が属する当業者のレベルの指標である。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が具体的かつ個別に、参照によって組み込まれることが示されたかのようにして、本明細書に同程度に参照によって組み込まれる。多くの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書で言及されているが、かかる参照は、これらの文書のいずれかが、当該技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することの承認を構成するものではない、ということが理解されるであろう。
【００９５】
【表２−１】
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【００９６】
【表２−２】
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【００９７】
【表２−３】
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【００９８】
【表２−４】
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【００９９】
【表２−５】
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【０１００】
前述の主題は、例示および実施例により、理解の明確化を目的としてある程度詳細に記載されているが、当業者は、一定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲内で実施できることを、理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月18日(2019.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、任意に１以上のＤ−アミノ酸を有していてもよいLRRFSTXPXXXXDINDVXNF（配列番号２）のアミノ酸配列含むペプチドであって、ここでXは任意のアミノ酸である、前記ペプチド。
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生、抗血管透過性、抗腫瘍形成および／または抗リンパ管新生特性を示す、任意に１以上のＤ−アミノ酸を有していてもよいＬＲＲＦＳＴＸＰＸＸＸＸＤＩＮＤＶＸＮＦ（配列番号２）のアミノ酸配列含むペプチドであって、ここでＸは任意のアミノ酸である、前記ペプチド。
【請求項２】
７位のＸが、Ｍ、ＡまたはＧである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
９位のＸが、Ｆ、Ａ、ＹまたはＧである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
１０位のＸが、Ｍ、Ａ、Ｇ、ｄＡまたはＮｌｅである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
１１位のＸが、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｇまたは４−Ｃ１Ｐｈｅである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
１２位および１８位のＸが、Ａｂｕ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、ＬまたはＡｌｌｙＧｌｙである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドと少なくとも８０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドと少なくとも８５％の同一性を示すアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドと少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１０】
薬学的に許容し得る担体および有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
局所または全身投与用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
眼内注射用である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
血管新生、リンパ管新生、血管透過性、および／または腫瘍形成に関連する疾患に罹患している、または、発症のリスクのある対象を処置するための医薬組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象の疾患を処置、遅延、または予防するのに十分な量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１４】
対象がヒトである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
疾患が、眼の血管新生に関連する、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
疾患が、新生物形成または癌を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌が、原発腫瘍または転移腫瘍を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
眼の血管新生に関連する疾患が、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2019089790000001.pdf