(57)【要約】      （修正有）【課題】肝細胞癌を早期に検出できるマーカーや、薬剤の治療効果を予測し得るマーカーを提供する。【解決手段】ＦＧＦ１９と従来の肝細胞癌のマーカーであるＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰを併用して用いることによって、感度良く肝細胞癌を検出することが可能となる。また、ＦＧＦ１９値を測定することによって、ソラフェニブの治療反応性を予測することが可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
早期の肝細胞癌を検出する方法であって、
検体のＦＧＦ１９濃度を測定することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
肝細胞癌の検査方法であって、
検体中のＦＧＦ１９濃度と、
ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
前記検体が血液、又は血清であることを特徴とする
請求項１又は２記載の検査方法。
【請求項４】
前記検体が自覚症状を有さない個体から得られたものである
早期の肝細胞癌患者、又は再発肝細胞癌患者を検出するための請求項１〜３いずれか１項記載の検査方法。
【請求項５】
検体中のＦＧＦ１９の濃度を測定することによって、
ソラフェニブに対する治療反応性を予測する方法。
【請求項６】
さらに、検体中のＦＧＦＲ４発現を検査することを特徴とする
請求項５に記載のソラフェニブに対する治療反応性を予測する方法。
【請求項７】
前記検体が血液、又は血清であることを特徴とする
請求項５、又は６記載の検査方法。
【請求項８】
ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬を含有する早期の肝細胞癌を検出するための検査キット。
【請求項９】
ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬と、
ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定するための試薬を含有する肝細胞癌の検査キット。
【請求項１０】
前記ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬が抗ＦＧＦ１９抗体を含むものであり、
ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定するための試薬が、抗ＡＦＰ抗体、抗ＡＦＰ  Ｌ３抗体、抗ＤＣＰ抗体のいずれか１つ以上を含むものである請求項９記載の肝細胞癌の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌の診断マーカーに関する。特に、既存のマーカーと組み合わせることによって、感度高く早期の肝細胞癌を検出することのできるマーカー、及びこれを用いた検査方法に関する。さらに、このマーカーを治療薬の選択に用いる検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の統計によれば、日本では死亡原因の第１位を「がん」が占めており、２人に1人が「がん」になり、３人に1人が「がん」で亡くなっている。しかし、「がん」は早期に発見することができれば、手術など適切な治療を行うことが可能であり、早期発見、早期治療を行うことが望まれている。
【０００３】
肝臓癌に関しては、国立がん研究センターの統計によると、年間の死亡者数は約３０，０００人であり、男女合わせた主要部位別のがんの死亡率では第５位を占めている。しかし、罹患者数、死亡者数が多いものの肝臓癌の検診については、現在、厚生労働省により定められている指針があるわけではない。肝臓は、炎症や癌があっても初期にはほとんど症状がなく、医療機関での定期的な検診や、他の病気の検診などの際にたまたま発見されることも多い。
【０００４】
癌診療においては、ＣＴなどの画像診断の進歩によって、腫瘍マーカーは、サーベイランス、治療効果指標としての役割が重要になってきている。すなわち、血液検査による腫瘍マーカーの測定は、低侵襲であることから、早期発見、あるいは再発の診断において必要不可欠とされている。実地臨床では、α−フェトプロテイン（α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＦＰ）、ＡＦＰ-Ｌ３分画（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  α−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＣＰ（ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ、又はＰＶＫＡ-ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｂｓｅｎｃｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ−ＩＩ）ともいう。）の３つのマーカーが保険収載されており、これらのマーカーが多用されている（非特許文献１）。
【０００５】
以下に詳細に説明するが、肝細胞癌患者と、健常者、慢性肝炎／肝硬変患者の血清を解析したところ、ＦＧＦ１９（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １９、線維芽細胞増殖因子１９）が肝細胞癌患者において高値であることが認められた。また、ＦＧＦ１９は、肝細胞癌のステージとは関係なく発現し、従来のマーカーでは見落とされがちな早期癌の段階で肝細胞癌を検出できること、従来のマーカーと組み合わせることによって感度が高くなることが明らかとなった。
【０００６】
ＦＧＦは、血管新生、創傷治癒、胚発生など広範囲な細胞や組織の増殖・分化に関与する成長因子である。ＦＧＦはヒトでは２２種類が同定されている。また、ＦＧＦ受容体はＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４までの４種類の受容体があることが知られており、ＦＧＦ１９は、ＦＧＦＲ４と特異的に結合し、代謝や分化を制御することが明らかになっている。
【０００７】
ＦＧＦ１９は、通常は小腸から分泌され、正常肝細胞では胆汁酸生成における律速酵素であるＣＹＰ７Ａ１を制御する。また、ＦＧＦ１９、あるいはその受容体であるＦＧＦＲ４が、肝細胞癌を含む数種の癌で高発現していることから、癌発症との関連が示唆されている（特許文献１〜３、非特許文献２）。肝細胞癌から分泌されたＦＧＦ１９は、ＰＩ３ＫやＲＡＳシグナル伝達系を活性化し、細胞増殖、脱分化、抗アポトーシス作用に寄与することも示唆されている。
【０００８】
特許文献１には、乳癌において、ＦＧＦ１９を含むＦＧＦＲリガンドの増幅をバイオマーカーとして検査し、診断を行うことが開示されている。特許文献２には、ＦＧＦＲの変化が、肝細胞癌を含むいくつかの癌種と関連があること、また、ＦＧＦＲ４が肝細胞癌において重要な役割を担っていることが示唆されている。特許文献３には、肝細胞癌を含む数種の癌種において、ＦＧＦ１９、及びＦＧＦＲ４のｍＲＮＡ発現を解析し、肝細胞癌の５０例中２３例でＦＧＦ１９発現が陽性であることが開示されている。また、肝硬変で生じる再生結節肝細胞でＦＧＦ１９のｍＲＮＡが高発現であったことが記載されている。非特許文献２には、肝細胞癌外科術後の再発進行例に対するソラフェニブの効果予測因子を解析したところ、ＦＧＦ１９のコピー数が増加している患者にソラフェニブ著効例が集積している可能性が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１４−５１３９３０号公報
【特許文献２】特表２０１７−５３０１５４号公報
【特許文献３】特表２００９−５２５７６４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Toyoda H. et al., 2015, Liver Cancer Vol.4,p.126-136.
【非特許文献２】海堀  昌樹他、２０１６、第１１６回日本外科学会定期学術集会、ＰＤ−１０−２
【非特許文献３】Hagel M, et al., 2015, Cancer Discov.,Vol.5, p.427-437.
【非特許文献４】Davis M.I. et al., 2011, Nat Biotechnol.Vol.29, p.1046-1051.
【非特許文献５】Nishitsuji, H. et al., 2004, Microbes andInfection, Vol.6,  p.76-85.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来使用されている３つの腫瘍マーカーは、肝癌の検出において特異度は高いものの感度が低いことが知られている。そのため、日本肝臓学会の２０１３年度版の肝癌診療ガイドラインにおいても２種類以上の腫瘍マーカーの測定が推奨されている。しかし、肝細胞癌患者の全体の３０〜４０％のケースでは、これらのマーカーは異常値を示さないと言われている。さらに、こうした症例では、診断のみならず治療効果判定においても、上記３つの腫瘍マーカーは鋭敏な変化を示さないことから、腫瘍マーカーを用いて判定することが非常に難しい。
【００１２】
また、特許文献１、及び２では、ＦＧＦ１９と、乳癌を含む数種の癌との関連が示唆されているが、肝細胞癌との関連は記載されていない。特許文献３には、肝細胞癌でＦＧＦ１９の発現が確認されているものの、５０例中２３例と低い検出率でしか陽性例が検出できず、感度良く肝細胞癌を検出できるとは言い難い。さらに、肝硬変で生じる再生結節肝細胞でＦＧＦ１９のｍＲＮＡが高発現であるとの記載から、肝硬変と早期の肝細胞癌の区別を付けることができないものと考えられる。また、非特許文献２では、ソラフェニブの奏効率とＦＧＦ１９遺伝子の増幅との関連が示唆されているが、ＦＧＦ１９発現と早期癌との関連を示唆するものではない。
【００１３】
本願は、感度の高い肝細胞癌マーカーを提供することを課題とする。肝細胞癌は１病変で、腫瘍径が２０ｍｍ以下の小肝細胞癌と分類される小さい病変の場合には、手術やラジオ波焼灼による根治的治療を行うことができる。したがって、発症早期で発見することが非常に重要である。
【００１４】
本発明は、既存のマーカーでは検出することのできなかった患者を検出するとともに、既存のマーカーを併用することによって、従来のマーカーでは見落とされる可能性の高かった早期の肝細胞癌を検出し、再発診断を確度良く行う方法を提供する。また、ソラフェニブをはじめとする、標的治療薬を選択する際のバイオマーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は以下の肝細胞癌の検査方法、検査キット、及びソラフェニブに対する治療反応性予測方法に関する。
（１）早期の肝細胞癌を検出する方法であって、検体のＦＧＦ１９濃度を測定することを特徴とする検査方法。
（２）肝細胞癌の検査方法であって、検体中のＦＧＦ１９濃度と、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定することを特徴とする検査方法。
（３）前記検体が血液、又は血清であることを特徴とする（１）又は（２）記載の検査方法。
（４）前記検体が自覚症状を有さない個体から得られたものである早期の肝細胞癌患者、又は再発肝細胞癌患者を検出するための（１）〜（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）検体中のＦＧＦ１９の濃度を測定することによって、ソラフェニブに対する治療反応性を予測する方法。
（６）さらに、検体中のＦＧＦＲ４発現を検査することを特徴とする（５）に記載のソラフェニブに対する治療反応性を予測する方法。
（７）前記検体が血液、又は血清であることを特徴とする（５）、又は（６）記載の検査方法。
（８）ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬を含有する早期の肝細胞癌を検出するための検査キット。
（９）ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬と、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定するための試薬を含有する肝細胞癌の検査キット。
（１０）前記ＦＧＦ１９濃度を測定するための試薬が抗ＦＧＦ１９抗体を含むものであり、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのいずれか１つ以上の濃度を測定するための試薬が、抗ＡＦＰ抗体、抗ＡＦＰ  Ｌ３抗体、抗ＤＣＰ抗体のいずれか１つ以上を含むものである（９）記載の肝細胞癌の検査キット。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）は、血清ＦＧＦ１９濃度のプロットを、図１（Ｂ）は箱ひげ図で示した図である。
【図２】小肝細胞癌患者における血清ＦＧＦ１９濃度を箱ひげ図で示した図である。
【図３】ＦＧＦ１９濃度の感度、特異度をＲＯＣ曲線により解析した図である。カットオフ値は２００ｐｇ／ｍｌと算出された。
【図４】ＵＩＣＣ分類に基づくステージ毎に分類した患者における各種マーカーの陽性率を示す図。
【図５】肝癌細胞株においてＦＧＦ１９の産生能、ＦＧＦＲ４発現を解析した結果を示す図。
【図６】図６（Ａ）は、ｓｈＲＮＡによってＦＧＦＲ４発現を抑制した細胞株の生存率を解析した図。図６（Ｂ）は、ｓｈＲＮＡによるＦＧＦＲ４発現が抑制されていることをウェスタンブロッティングにより示した図。
【図７】ＦＧＦＲ４をノックダウンした細胞株でのソラフェニブの効果を示す図。
【図８】マルチキナーゼ阻害剤ソラフェニブとＦＧＦＲ４阻害剤ＢＬＵ９９３１の細胞増殖に対する相乗効果を示す図。
【図９】ゼノグラフトモデルにおけるソラフェニブ、ＢＬＵ９９３１の抗腫瘍効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に示す実施例では、ＦＧＦ１９の血清中の濃度をＥＬＩＳＡによって測定しているが、ＦＧＦ１９の発現を測定することができれば、どのような方法を用いてもよい。例えば、バイオプシーで得られた検体の免疫組織染色、ｍＲＮＡ発現のＰＣＲによる測定、血中を循環するエクソソーム中のＦＧＦ１９の測定などが挙げられる。中でも、実施例で行っているように血清中のＦＧＦ１９濃度のＥＬＩＳＡによる測定は、低侵襲であることから患者の負担が少なく、濃度を測定することができることから好ましい方法である。また、組み合わせて使用するＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰも同様に血清中の濃度をＥＬＩＳＡによって測定しており、併用して使用する場合には、ＦＧＦ１９も同様にＥＬＩＳＡによって測定することが好ましい。
【００１８】
２０１４年１月から２０１７年１２月に千葉大学医学部附属病院に来院した３０４人の初発肝細胞癌患者（ＨＣＣ）と３４人の慢性肝疾患患者（ＣＨ（慢性肝炎）/ＬＣ（肝硬変）、１０人の健常者（Ｃｏｎｔｏｒｏｌ）の血清中の血清ＦＧＦ濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。肝細胞癌患者の背景因子を表１に、血清ＦＧＦ１９濃度を図１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
なお、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈは肝障害の程度を示す分類であり、ＢＣＬＣはバルセロナ臨床肝癌病期分類、ＴＮＭは原発腫瘍の大きさと進展度、リンパ節転移、遠隔転移の有無から病期を判断する指標を示す。また、治療の項のＯＰＥは手術を、ＲＦＡはラジオ波焼灼治療法を、ＴＡＣＥは肝動脈化学塞栓療法、ＨＡＩＣは肝動注化学療法、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂはソラフェニブによる化学療法、ＲＴは放射線治療、ＢＳＣはベスト・サポーティブ・ケアを示す。ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰは、上述のように従来から用いられている肝癌のバイオマーカーの指標であり、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＢ、Ｔ−Ｂｉｌは肝機能を示す値であり、ＰＬＴ、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘは肝線維化の指標を示す値である。
【００２１】
図１に示すように、血清ＦＧＦ１９濃度値は、肝細胞癌患者群と、健常者群、慢性肝疾患患者群との間に、Ｐ＜０．００１で有意な差が認められた。さらに、腫瘍径が２０ｍｍ以下の１病変のみの小肝細胞癌患者６９名について、同様にＦＧＦ１９濃度を健常者群、慢性肝疾患患者群と比較した（図２）。小肝細胞癌患者群に限って比較しても、ＦＧＦ１９濃度値は、健常者群、慢性肝疾患患者群との間に、Ｐ＜０．００１で有意な差が認められた。ＦＧＦ１９濃度の中央値は、全ステージの肝細胞癌患者の値が２０５．８であるのに対し、小肝細胞癌患者の値が２１１．１とほとんど変わらなかった。特許文献３には、肝硬変の一病態である再生結節肝細胞での発現が高いことが開示されているが、本発明者らの詳細な検討により、ＦＧＦ１９発現は肝硬変を含む慢性肝疾患の患者群では、有意に低い値を示しており、早期の肝細胞癌患者と有意な差があることが明らかとなった。したがって、ＦＧＦ１９濃度を測定することによって、自覚症状を有さない早期の肝細胞癌患者を検出することが可能である。小肝細胞癌として分類された患者群は、手術、ラジオ波焼灼などの根治的治療を行うことが可能な群である。したがって、早期の肝細胞癌患者も検出することができるマーカーであることは非常に有用である。
【００２２】
ＦＧＦ１９値は、肝細胞癌患者群と、慢性肝炎、肝硬変などの慢性肝疾患患者群との間に、有意な差が認められた。肝細胞癌は慢性肝疾患を伴っていることが多い。肝線維化などの慢性肝疾患の症状を示すマーカーと肝細胞癌のマーカーとが相関する場合、両者を区別することができない。したがって、慢性肝疾患のマーカーと相関しないマーカーであることが早期の肝細胞癌を検出するためには重要となる。これを確認するために、肝線維化のマーカーとして知られている、ＡＰＲＩ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒａｔｉｏ  ｉｎｄｅｘ）、ＦＩＢ  ４（ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎｄｅｘ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｏｕｒ  ｆａｃｔｏｒｓ）と、ＦＧＦ１９値の間に相関があるか解析を行った。ＡＰＲＩ、ＦＩＢ  ４は一般的な血液検査の項目に含まれる血小板数とＡＳＴ、ＡＬＴから以下の式で算出することができる。
APRI  =  (AST/upper  limit normal AST IU/l)×(100/platelet 109/l)
FIB  4 = (age×AST  IU/l)/(platelet 109/l×√ALT IU/l)
【００２３】
【表２】
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【００２４】
上記の初発肝細胞癌患者、慢性肝疾患患者のすべてを対象として、ＡＰＲＩ、ＦＩＢ  ４とＦＧＦ１９との相関を解析した。表２から明らかなように、ＦＧＦ１９と肝線維化の指標である、ＡＰＲＩとＦＩＢ  ４との間に相関は認められなかった。したがって、ＦＧＦ１９は肝細胞癌に特異的なマーカーであり、肝線維化の影響を受けていないものであることが確認された。
【００２５】
さらに、ＲＯＣ解析を行い、ＦＧＦ１９濃度のバイオマーカーとしての感度、特異度を解析した（図３）。ＦＧＦ１９のＡＵＣは０．７３６であり、従来から用いられている３つのマーカーのＡＵＣは、ＡＦＰが０．８７６、ＡＦＰ  Ｌ３が０．８８２、ＤＣＰが０．８８４であることから、ほとんど遜色ない値であるといえる。また、各マーカーのカットオフ値は、ＦＧＦ１９が２００ｐｇ／ｍｌ、ＡＦＰが２０ｎｇ／ｍｌ、ＡＦＰ  Ｌ３が７％、ＤＣＰが１００ｍＡＵ／ｍｌと決定した。なお、カットオフ値は用いるＥＬＩＳＡキットや、計算方法によっても変化することから、絶対的な値ではないが、同条件で検査を行えば、ほぼ同程度の値となる。
【００２６】
次にＦＧＦ１９と、従来から用いられている３つのマーカーの相関を解析した（表３）。ＦＧＦ１９とＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰはいずれも相関が認められなかった。したがって、従来から用いられているマーカーと併用して用いることによって、感度が増加する可能性が示唆された。
【００２７】
【表３】
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【００２８】
次に、ＦＧＦ１９と従来から用いられているマーカーを単独で用いた場合、２つのマーカーを併用して用いた場合、複数用いた場合について、感度、特異度を求めた。全ての肝細胞癌患者のデータから算出した値を表４に、小肝細胞癌患者から求めた値を表５に示す。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
【表５】
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【００３１】
全肝細胞癌患者を対象とした場合には、いずれのマーカーも単独で用いると感度は５０前後とさほど高くはない。しかしながら、ＦＧＦ１９とＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰを併用して用いると、夫々７４．０、７５．０、７３．４と高い感度を得ることができる。これに対し、従来のマーカーを２つ併用した場合には、ＡＦＰとＤＣＰを併用した場合が６６．４と最高であり、ＦＧＦ１９と併用した場合ほど感度の増強は見られない。さらに、３つのマーカーを併用した場合、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰの３つのマーカーを併用した場合には、感度は７３．４であるのに対し、従来から使用されているマーカー２種とＦＧＦ１９とを併用した場合にはいずれも８０以上の感度を得ることができる。したがって、従来から用いられているＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰのマーカーとＦＧＦ１９を併用して用いることにより、感度良く肝細胞癌を検出することができる。
【００３２】
小肝細胞癌患者を対象とした場合には、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰを単独で用いると感度が夫々２９．０、２６．１、２２．１と非常に低い値を示している。これに対し、ＦＧＦ１９を単独で用いると感度５３．６と全肝細胞癌患者を対象とした場合の感度５０．７よりも高い値を示している。このことは、ＦＧＦ１９は早期の肝細胞癌であっても、病期の進んだ状態でも、同程度の感度で検出することができることを示す。一方、従来の肝細胞癌マーカーは、早期の癌を検出する感度が非常に低い。表５に示すように、小肝細胞癌患者について、複数のマーカーで検査を行った場合にも、ＦＧＦ１９を併用することにより、顕著に感度が上がることが示された。したがって、従来のマーカーとＦＧＦ１９を併用して用いることにより、早期の肝細胞癌であっても感度良く検出することができることが明らかとなった。
【００３３】
表４、５の結果から、ＦＧＦ１９は癌のステージによらず検出することができると考えられた。そこで、ＦＧＦ１９、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰの各マーカーについて、ＵＩＣＣ分類に基づき患者をステージ毎に分類し、各種マーカーの陽性率をまとめた（図４）。
【００３４】
ＦＧＦ１９はいずれのステージにおいても陽性率は５０前後の値をとっており、ほとんど変わらない。これに対し、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰではステージIではいずれも３０未満の低い値を示し、病期のステージが上がるにつれて高い陽性率を示す。従来のマーカーは、ステージＩＩＩ以上ではじめて検出に十分な感度となる。
【００３５】
ＦＧＦ１９のように、癌のステージによらず同程度の感度を示すバイオマーカーは今まで報告されていない。病期によらず同程度の感度を示すマーカーであることは、ＦＧＦ１９に特徴的である。すなわち、従来の肝癌マーカーは腫瘍の大きさや腫瘍の量に影響されるが、ＦＧＦ１９は腫瘍の大きさ、病期に影響されず、癌が小さい早期の段階でも発現している。そのため、早期癌を発見することができる。特に、従来の肝癌マーカーと併用して用いることにより、感度良く肝癌を検出することができる。ステージＩに分類されるような小肝細胞癌を発見することができれば、手術などの根治的治療を行うことができることから非常に有用なマーカーとなる。
【００３６】
肝炎ウイルス感染者、脂肪肝などの肝細胞癌を発症するリスクの高い患者は、定期的に血液検査と超音波による検査を行っていることが多い。しかしながら、超音波による検査では２０ｍｍ以下の小さな癌を見落とす可能性もある。また、ＡＦＰ、ＡＦＰ  Ｌ３、ＤＣＰの３つのマーカーは併用したとしても、早期癌を検出する感度は非常に低い。ＦＧＦ１９と従来の肝細胞癌マーカーを併用して検査を行うことにより、今まで見落としていた早期の肝細胞癌患者を検出することが可能となる。ＦＧＦ１９をマーカーとして用いる血液検査によって、肝細胞癌の疑いがある者をスクリーニングし、ＣＴなどによる検査を行えば、早期癌を検出することができることから、根治的治療を行うことが可能となる。
【００３７】
次に、ＦＧＦ１９の濃度を治療薬選択の指標として用いることが可能か検討を行った。現在、進行肝細胞癌に対しては、マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが唯一承認された薬剤として用いられている。ソラフェニブは全生存期間の有意な延長は認められるものの奏効率は低く、また、皮膚症状、高血圧などの副作用が生じることがある。さらに、ソラフェニブが効果を示さない患者も多い。ソラフェニブが効果を有するか否かを治療開始前に判断することができれば、患者の利益も大きい。
【００３８】
ＦＧＦ１９は癌の病期によらず検出されることから、ＦＧＦ１９、及びその受容体であるＦＧＦＲ４によるシグナル伝達系が癌発症と何らかの関わりを持っていることが示唆される。そこで、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性化している肝細胞癌の細胞株と、不活性な細胞株を用いて解析を行った。
【００３９】
肝細胞癌株、Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５のＦＧＦ１９産生能、ＦＧＦＲ４発現を解析した。ＦＧＦ１９産生能は、各細胞を１０万個播種し、２４時間後のＦＧＦ１９濃度をＥＬＩＳＡによって解析した（図５左）。また、ＦＧＦＲ４発現はウェスタンブロッティングにより解析を行った。抗ＦＧＦＲ４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、コントロールとして抗チューブリン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ  キット（東洋紡社製）によって検出した（図５右）。
【００４０】
図５下段にまとめているが、ＨｕＨ７、及びＪＨＨ７は、ＦＧＦ１９を産生し、ＦＧＦＲ４発現も認められることから、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性化している細胞株であると考えられる。一方、ＨｅｐＧ２はＦＧＦ１９産生能も低く、ＦＧＦＲ４も発現していない。また、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５は、ＦＧＦＲ４の発現は高いものの、ＦＧＦ１９の産生能が著しく低い。したがって、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５は、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系は不活性であると考えられる。
【００４１】
これらＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性型、不活性型の細胞株を用いて、ＦＧＦＲ４の機能をｓｈＲＮＡによって消失させ、細胞の生存に対する影響を解析した。活性型（ＨｕＨ７、ＪＪＨ７）、不活性型（ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）の細胞は、５〜１０万個の各細胞に、レンチウイスルベクターを用い、以下の配列を標的とする２種のＦＧＦＲ４のｓｈＲＮＡ、Ｓｈ−ＦＧＦＲ４−１（配列番号１）、Ｓｈ−ＦＧＦＲ４−２（配列番号２）を導入し、トリパンブルー染色によって生細胞数を求め、生存率を６０時間後、１２０時間後に解析した。図６（Ａ）に細胞の生存率を、図６（Ｂ）に２種のＦＧＦＲ４  ｓｈＲＮＡによるＦＧＦＲ４の発現低下をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【００４２】
Ｓｈ−ＦＧＦＲ４−１：ＧＣＡＧＡＡＴＣＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＴＡＣ
（配列番号１）
Ｓｈ−ＦＧＦＲ４−２：ＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＡＣＴ
（配列番号２）
【００４３】
図６（Ａ）に示すように、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性型の細胞株、Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７では、ＦＧＦＲ４  ｓｈＲＮＡを導入すると細胞の生存率が著しく低下する。一方、不活性型の細胞株、ＨｅｐＧ２，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５では、ＦＧＦＲ４  ｓｈＲＮＡを導入しても細胞の生存率の低下は非常にわずかである。したがって、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性化している細胞では、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系の機能を抑制することによって、細胞の増殖を抑えることができる可能性がある。
【００４４】
ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系とソラフェニブが作用するシグナル伝達系が異なれば、ＦＧＦＲ４をノックダウンしたうえで、ソラフェニブを作用させると少なくとも相加的な効果が得られる可能性がある。そこで、ｓｈＲＮＡによって、ＦＧＦＲ４の発現を抑制し、ソラフェニブ添加による細胞の生存率の解析を行った。
【００４５】
ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系活性型細胞株、Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７、不活性型細胞株ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５にｓｈ−ＦＧＦＲ４−２、あるいはコントロールとしてｓｈ−Ｌｕｃ（非特許文献５）を導入した細胞各１０万個に、０、２．５、５．０μＭ濃度になるようにソラフェニブを添加した。４日後に細胞の生存率をトリパンブルー染色により解析を行った（図７）。
【００４６】
活性型細胞株Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７では、ＦＧＦＲ４発現を抑制するとソラフェニブの細胞増殖抑制効果が増強される。これに対し、不活性型細胞株ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５では、もともとＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が不活性であることから、ＦＧＦＲ４のｓｈＲＮＡの効果は認められない。したがって、ソラフェニブが高い抗腫瘍効果を発揮するためには、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系の抑制が必要であることが示唆された。
【００４７】
そこで、ＦＧＦＲ４の不可逆的かつ選択的な阻害剤であるＢＬＵ９９３１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）をＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系が活性化しているＨｕｈ７、ＪＨＨ７の培養液に添加し、解析を行った。ＢＬＵ９９３１は、ＦＧＦＲファミリー受容体であるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４を、夫々５９１ｎｍｏｌ／Ｌ、４９３ｎｍｏｌ／Ｌ、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、３ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０で阻害する。すなわち、ＢＬＵ９９３１は、ＦＧＦＲ４に選択的に作用する薬剤である（非特許文献３、４）。ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系活性型細胞株Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７にソラフェニブとＢＬＵ９９３１を同時に添加し、細胞増殖に対する効果の解析を行った（図８）。
【００４８】
ＢＬＵ９９３１は０、１、３、５μＭ濃度で、ソラフェニブは０、１、３μＭ濃度で添加し、ＢＬＵ９９３１、ソラフェニブともに添加しない細胞をコントロールとして細胞増殖の解析を行った。各細胞は、１０万個播種し、それぞれ上記条件で阻害剤を添加して培養を行い、９６時間後の生存細胞数をトリパンブルー染色によって求め、薬剤を添加していない培地で培養したコントロールに対する割合を算出した。Ｈｕｈ７、ＪＨＨ７いずれの細胞株でも、ＢＬＵ９９３１、ソラフェニブ両者を添加することによって、細胞増殖が単剤添加よりも阻害されることが明らかになった。Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ解析は、ＣｏｍｐｕＳｙｎ  １．０．１ソフト（ＣｏｍｂｏＳｙｎ社製）によって算出した。Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘが、１．０以下の値であることから、ＢＬＵ９９３１、ソラフェニブの効果は相乗的であることが示された。
【００４９】
細胞株を用いてＢＬＵ９９３１、ソラフェニブの相乗効果が確認されたので、次に、ゼノグラフトモデルを用いて２つの薬剤の効果を解析した。６週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（（株）三協ラボサービスより入手）に、２×１０６個のＨｕｈ７細胞を背部に移植した。ソラフェニブ単独投与群、ＢＬＵ９９３１単独投与群、ソラフェニブとＢＬＵ９９３１併用投与群、コントロールとして溶媒投与群の４群各１０匹に、ソラフェニブは５ｍｇ／ｋｇ、ＢＬＵ９９３１は３０ｍｇ／ｋｇ、４週間毎日経口投与した。Ｈｕｈ７移植４週間後に各群の皮下腫瘍体積の解析を行った。図９は、４週間後の各群の代表的なマウスの写真を示している。なお、腫瘍の範囲を点線で示している。
【００５０】
ソラフェニブ単独投与群（図９中、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ＢＬＵ９９３１単独投与群（ＢＬＵ９９３１）でも、コントロール群（Ｍｏｃｋ）に比べ、腫瘍の増殖は抑制されていたが、ソラフェニブとＢＬＵ９９３１併用投与群（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ＋ＢＬＵ９９３１）では著しく腫瘍の増殖の抑制が見られた。したがって、ソラフェニブとともに、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系を阻害することによって、腫瘍増殖に対してより顕著な抑制効果を期待することができる。
【００５１】
以上の結果は、ソラフェニブによる治療効果は、患者の血清ＦＧＦ１９濃度によって異なる可能性を示している。そこで、ソラフェニブ投与開始前の血清ＦＧＦ１９値を、そのカットオフ値である２００ｐｇ/ｍｌを境界として２群に分け、ソラフェニブに対する治療反応性と無増悪生存期間の解析を行った。
【００５２】
ＦＧＦ１９が２００ｐｇ／ｍｌ未満のＦＧＦ１９低値群（ＦＧＦ１９−ｌｏｗ、ｎ＝１８）、２００ｐｇ／ｍｌ以上のＦＧＦ１９高値群（ＦＧＦ１９−ｈｉｇｈ、ｎ＝２１）について治療反応性（表６）を解析した。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
表６に示すように、ソラフェニブの奏効率、疾患制御率ともに、ＦＧＦ１９低値群では非常に高い値を示すのに対し、ＦＧＦ１９高値群では、奏効率は０％であり、疾患制御率も１９．０％と非常に低い値にとどまっていた。これらの結果から、ＦＧＦ１９の血清濃度を測定することによって、ソラフェニブが効果を奏するか予測することが可能となる。
【００５５】
以上の結果が示すように、ソラフェニブが阻害するキナーゼと、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系とは異なるものと考えられる。また、ＦＧＦ１９の発現が低ければ、ソラフェニブが効果を奏すると考えられる。非特許文献２は、ＦＧＦ１９のコピー数が増加している患者、すなわちＦＧＦ１９発現が高い患者においてソラフェニブの著効例が集積していることを開示しており、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系にソラフェニブが作用していることを示唆している。したがって、ここで示した結果と、非特許文献２に記載されている結果とは、異なる結論となっている。
【００５６】
ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系の阻害剤は、現在のところ承認されている薬剤がない。しかし、将来的には、血清ＦＧＦ１９値が高い患者群には、ＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４シグナル伝達系の阻害剤を投与し、ソラフェニブを併用すれば、相乗効果が認められるはずである。
【００５７】
以上の結果から、ＦＧＦ１９は早期の肝細胞癌を検出するためのバイオマーカーとして用いることができるだけではなく、ソラフェニブの治療効果を予測するマーカーとしても使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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