(57)【要約】      （修正有）【課題】それ自体が既にアミロイド−β−結合特性を有して結合した複数の物質から成る新規多価アミロイド−β−結合ポリマー物質、ならびにこれらの物質（以後“ポリマー”と称する）の特に医薬品における使用の提供。【解決手段】アミロイドβ−オリゴマーに結合する少なくとも２個の物質（モノマー）を含有しているポリマー、及びモノマーがペプチドであり、当該ペプチドは実質的に、Ｄ−アミノ酸から成るか、又はアミロイド−βに結合する抗体若しくは抗体断片から成ることを特徴とするポリマーを提供する。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβ−オリゴマーに結合する少なくとも２個の物質（モノマー）を含有しているポリマー。
【請求項２】
前記モノマーがペプチドであり、当該ペプチドは実質的に、Ｄ−アミノ酸から成るか、又はアミロイド−βに結合する抗体若しくは抗体断片から成ることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記ポリマーが形成される各々のモノマーは、アミロイド−β−ペプチドのモノマー及び／又はオリゴマー及び／又はフィブリルに、最大で５００μＭ、好ましくは最大で１００μＭ、有利には最大で１０μＭ、特に有利には６μＭ、とりわけ最大で４μＭの解離定数（ＫD値）で結合する、請求項１又は２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項４】
２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のモノマーを含有している、請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
前記モノマーは、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、及び配列番号７９から成る群、又は
上記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上から成る任意の組合せ
から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
ダイマーは、２個のＤ３−モノマーから成る、請求項１から５までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項７】
前記モノマーが、共有結合又は非共有結合により互いに結合している、請求項１から６までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
前記モノマーが、リンカー無しで、すなわち直接に互いに結合しているか、又はリンカー基で互いに結合している、請求項１から７までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
前記モノマーが、線状又は分枝状に互いに結合している、請求項１から８までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
デンドリマーであるか、又は前記モノマーがプラットフォーム分子と結合しているか、又はこれらの任意の組合せで結合している、請求項１から９までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
同一又は同一ではないモノマーを含有している、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記アミロイド−β−オリゴマーは、最大で１μＭ、有利には８００、６００、４００、２００、１００、１０ｎＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００ｐＭ、特に有利には最大で５０ｐＭ、最も有利には最大で２０ｐＭの解離定数で結合する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１３】
医薬品において使用するための、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
アルツハイマー病の治療のための、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１５】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載のポリマーを含有しているキット。
【請求項１６】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載のポリマーを含有しているプローブ。
【請求項１７】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載のポリマーを含有している、好ましくはアルツハイマー病を治療するための組成物。
【請求項１８】
ペプチド合成法若しくは低分子量化合物用の有機合成法を使用するか、又はタンパク質の組み換え製造によりポリマーを製造することを特徴とする、請求項１から１６までのいずれか１項に記載のポリマーを製造する方法。
【請求項１９】
アミロイド−β−オリゴマーを同定、定性的及び／又は定量的に決定するためのプローブとしての、請求項１から１７までのいずれか１項に記載のポリマーの使用。
【請求項２０】
アミロイド−β−オリゴマーを阻止するための、請求項１から１８までのいずれか１項に記載のポリマーの使用。
【請求項２１】
無毒性ポリマー・アミロイド−β−オリゴマーの複合体を形成するための、請求項１から１９までのいずれか１項に記載のポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既にアミロイドβ結合特性を有する互いに結合した複数の物質から成る新規多価アミロイドβ結合ポリマー物質ならびに以後“ポリマー”と称する物質の、特に医薬品におけるその使用に関する。
【０００２】
今後数十年での人口統計的増大に基づき、高齢に条件付けられる疾病を被る人の数は多くなるであろう。ここでは、特にいわゆるアルツハイマー病（ＡＤ、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｃｈｅ  Ｄｅｍｅｎｚ、ラテン名＝Ｍｏｒｂｕｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）と称することにする。
【０００３】
これまでにＡＤの原因に働く作用物質又は医薬品は存在していない。これまでに使用され、かつ認可されている医薬品はアルツハイマー病の際に生じる症状を僅かに緩和する。しかし、これらは病気の進行を遅らせることが出来ないか又は治療を伴う。動物実験で予防では成功したが、しかし（無条件に）ＡＤの治療では達成されていなかった幾つかの物質が存在する。神経変性疾患に対する作用物質は、ＤＥ１０２００６０１５１４０Ａ１から公知である。
【０００４】
アルツハイマー病の特徴は、アミロイドβ−ペプチド（Ａ−β−ペプチド、Ａβ又はＡβ−ペプチド）の細胞外沈殿物である。プラークの形のこれらのＡ−β−ペプチドの沈殿物は、死後ＡＤ−患者の脳内に通常は確認される。従って、種々の形のＡ−β−ペプチド、例えば、フィブリルのようなものは疾患の発生と進行の原因になっていると推定されている。更に数年来、遊離した小さな拡散性Ａ−β−オリゴマーは、ＡＤの発症と進行の主な原因になっているとみなされている。
【０００５】
Ａ−β−オリゴマーの構成成分としてのＡ−β−モノマーは、人体で持続的に生じ、かつ自体は毒性ではないと推定されている。それどころか、モノマーが肯定的な機能を備えている可能性がある。Ａ−β−モノマーは、その濃度により無作為に結合することができる。この濃度は、体内でのその形成速度と分解速度に応じる。年齢が上がるにつれて体内でのＡ−β−モノマーの濃度が増大するので、Ａ−β−オリゴマーへのモノマーの自発的な結合が常に起こり得る。このように生じるＡ−β−オリゴマーは、プリオンと同様に増大し、かつ最後にはアルツハイマー病を生じる。
【０００６】
ＡＤの予防と治療又は治癒の重要な違いは、初めのＡ−β−オリゴマーの形成を阻止することにより、すでに予防を達成できるということにある。このために、Ａ−β−オリゴマーに関して僅かに親和性かつ選択的である幾つかの僅かなＡ−β−リガンドで十分である。
【０００７】
多くのモノマーからのＡ−β−オリゴマーの形成は、高い系統の反応であり、従ってＡ−β−モノマー濃度の高い能力による。従って、初めのＡ−β−オリゴマーの形成を阻止するために、活性なＡ−β−モノマー濃度の僅かな減少が既に生じる。これまでの開発に存在していた予防的治療コンセプトと治療物質は、おそらくこのメカニズムに基づいていると推定される。
【０００８】
しかし、ＡＤの治療の場合には、完全に異なる状況から出発する。ここでは、プリオンに似たメカニズムにより増大されるＡ−β−オリゴマー又は事実上既に大きなポリマー又はフィブリルも存在する。しかし、この増大はより低い系統の反応であり、かつＡ−β−モノマーの濃度に殆ど依存しない。
【０００９】
従来技術から公知の物質は、種々の方法でＡ−β−モノマー及び／又はオリゴマーの濃度を減少する。従って、例えば、動物実験で予防に使用されたγ−骨格のモジュレーターが公知である。
【００１０】
ＷＯ０２／０８１５０５Ａ２からは、Ａ−β−ペプチドに結合するＤ−アミノ酸の種々の配列が公知である。Ｄ−アミノ酸からのこれらの配列は、４μＭの解離定数（ＫD値）でアミロイド−β−ペプチドに結合する。
【００１１】
ＷＯ２０１１／１４７７９７Ａ２からは、Ａ−β−オリゴマー化を阻止するアミノピラゾールとペプチドから成るハイブリッド化合物が公知である。
【００１２】
Ａ−β−ペプチドと相互作用する化合物は、ＤＥ１０２００８０３７５６４Ａ１、ＤＥ６９６２１６０７Ｔ２又はＤＥ１０２０１００１９３３６Ａ１から公知である。２個の結合相手への多価ポリマーの結合は、ＷＯ２００８／１１６２９３Ａ１に記載されている。
【００１３】
動物実験でプラスの結果を示した多くの物質では、この作用をヒトにおける臨床実験では証明できなかった。臨床実験では、フェーズＩＩとＩＩＩは明らかにＡＤと診断されたヒトだけに処置できた。ここでは、例えばプリオンに類似したメカニズムにより、既に存在するＡ−β−オリゴマーから更なる形成を阻止するためにＡ−β−モノマー濃度を僅かに減少するだけでは十分ではない。しかし、疾患の経過に影響を与えるために、Ａ−β−オリゴマーの増大、なお良好にはその破壊又は無害化は無条件に必要である。
【００１４】
これまでに、アルツハイマー病は、痴呆の症状が認知されたヒトでの試験により主に神経−心理試験により診断されている。しかし、Ａ−β−オリゴマー及び更にそれに続くフィブリル及びプラークは、該症状が生じる前に患者の脳内で２０年間まで遡って生じていて、かつ既に不可逆的な障害を引き起こし得たことが公知である。しかし、これまでにＡＤが該症状の発症前に診断された可能性はない。
【００１５】
従って、極めて特異的かつ高い親和性でＡ−β−オリゴマーに結合して、それらの増大を阻止する新規化合物（作用物質）の必要性が更にある。これらの化合物は、不所望な副作用を有する効果を示すべきではなく、特に免疫反応を妨げてはならない。該化合物は、更に毒性Ａ−β−オリゴマー、ひいては遊離した小さな拡散性オリゴマーが低濃度でさえも検出され、完全に根絶する及び／又はそれらの（プリオンに類似した）増大を阻止すべきである。
【００１６】
更に、特にこれらのオリゴマーが初めて低濃度で生じた場合に、Ａ−β−オリゴマーの検出とマーキング用のプローブとして使用可能な新規化合物が必要とされている。
【００１７】
この課題は、アミロイド−β−オリゴマーに結合する少なくとも２個の物質（モノマー）を含有する本発明によるポリマーにより解決された。
【００１８】
本発明の意味で、Ａ−β−オリゴマーという用語は、Ａ−β−凝集体とＡ−βオリゴマー、また遊離する小さな拡散性Ａ−β−オリゴマーの両方を意味する。本発明の意味で、ポリマーとは、既にアミロイド−βに結合する物質（モノマー）用に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個又はその数倍から形成される物質である。
【００１９】
１実施態様では、ポリマーとはペプチドである。これらは有利には実質的にＤ−アミノ酸から成る。
【００２０】
本発明の意味で、“実質的にＤ−アミノ酸から成る”という用語は、使用すべきモノマーが、少なくとも６０％、有利には７５％、８０％、特に有利には８５％、９０％、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％がＤ−アミノ酸から構成されていることを意味する。
【００２１】
本発明の１変法では、Ａ−β−モノマー及び／又はＡ−β−オリゴマー及び／又はＡ−β−ペプチドのフィブリルが、最大で５００μＭ、有利には２５０、１００、５０μＭ、特に有利には２５、１０、６μＭ、とりわけ４、２、１μＭの解離定数（ＫD値）で結合するモノマーが使用される。
【００２２】
本発明によるポリマーは、上記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上を含有する。
【００２３】
もう１つの実施態様では、モノマーは次のもの：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９ならびにそれらの相同体；から成る群から選択される。
【００２４】
もう１つの変法では、本発明によるポリマーは、アミロイドβ−ペプチドの一部分と結合する。
【００２５】
もう１つの変法では、モノマーは、所定の配列から３個までのアミノ酸が異なる配列を有する。更にモノマーとして上記配列を含有する配列も使用される。
【００２６】
もう１つの変法では、モノマーは上記配列の断片を有するか、又は上記配列に相同の配列を有する。
【００２７】
本発明の意味では、“相同配列”又は“相同性”とは、１つのアミノ酸配列が、モノマーの上記アミノ酸配列のうち１つと少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有することを意味する。“同一性”という用語の代わりに、本記載では、“相同”又は“相同体”も同じ意味で使用される。２個の核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９（１９８１））のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いる比較により、アミノ酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：８及びギャップ伸長ペナルティー：２；及び核酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップ伸長ペナルティー：３の調整下に算定した。
【００２８】
２個の核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、それぞれ全体の配列長さにわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性により定義付けるのが有利であり、これは例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを用いる比較により、アミノ酸に関して以下のパラメーター：キャップクリエーションペナルティー：８及びギャップ伸長ペナルティー：２；及び核酸に関して以下のパラメーター：ギャップクリエーションペナルティー：５０及びギャップ伸長ペナルティー：３の調整下に算定した。本発明の意味で、２個のアミノ酸配列が同じアミノ酸配列を有する場合には、これらは同一である。
【００２９】
１変法で相同体とは、上記モノマーの相応するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列を意味すると解釈される。“ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列”という用語は、本発明によればエナンチオマー型のアミノ酸から組成されるアミノ酸配列を指し（ｉｎｖｅｒｓ：α−炭素原子のキラリティーが逆になっている）及びその際に更に配列順序は元のアミノ酸配列とは逆になっている（ｒｅｔｒｏ＝逆方向）。
【００３０】
本発明によるポリマーは同一のモノマーから構成されるか、又は種々のモノマーを含有している。
【００３１】
代替方法では、本発明によるポリマーは、上記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の任意の組合せから各々構成される。
【００３２】
１実施態様では、本発明によるポリマーは、２個のＤ３−モノマーから成るダイマー（配列番号１３）である。
【００３３】
もう１つの実施態様では、本発明によるポリマーは、２個のＲＤ２−モノマーから成るダイマー（配列番号７６）である。
【００３４】
ダイマーは、例えば化学合成又はペプチド合成により製造できる。
【００３５】
本発明の１実施態様では、モノマーは共有結合により互いに結合する。もう１つの実施態様では、モノマーは非共有結合により互いに結合する。
【００３６】
本発明の意味では、ペプチドが頭−頭、尾−尾又は頭−頭でその間にリンカー又はリンカー基を使用せずに互いに直線状に結合する場合には、モノマー単位の１つの共有結合又は結合が存在する。
【００３７】
本発明の意味では、モノマーがビオチン及びストレプトアビジンを介して、特にストレプトアビジンテトラマーを介して互いに結合する場合には非共有結合が存在する。
【００３８】
本発明のもう１つの変法では、特に上記のようにモノマーは直線状に互いに結合できる。もう１つの他の変法では、モノマーは本発明によるポリマーに分枝状に互いに結合する。
【００３９】
分枝ポリマーは、本発明によればデンドリマーであることができ、その際、モノマーは共有結合又は非共有結合により互いに結合する。
【００４０】
二者択一的に、モノマーはプラットフォーム分子（例えば、ＰＥＧ又は糖のようなもの）と一緒に結合することもでき、かつこのように分枝ポリマーが形成される。
【００４１】
二者択一的に、これらの任意選択の組合せも可能である。
【００４２】
本発明によるポリマーは、アミロイド−β−オリゴマーが、最大で１μＭ、有利には８００、６００、４００、２００、１００、１０ｎＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｐＭ、特に最大で２０ｐＭの解離定数で結合することに特徴付けられる。もう１つの実施態様では、本発明によるポリマーは、アミロイド−β−オリゴマーが最大で１ｍＭ、有利には８００、６００、４００、２００、１００、１０μＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｎＭ、特に有利には１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０ｐＭ、最も有利には最大で２０ｐＭ、特に１５、１０、９、８、７、６、５ｐＭの解離定数で結合することに特徴付けられる。
【００４３】
本発明によるポリマーは医薬品で使用するために適切である。
【００４４】
１実施態様では、これはアルツハイマー病を治療するためのポリマーである。もう１つの実施態様では、これはパーキンソン、ＣＪＤ（クロイツフェルトヤコブ病）、又は糖尿病の治療に使用できるポリマーである。
【００４５】
本発明により構成されたポリマーは、それ自体がＡ−β−オリゴマーに結合したモノマーから成り、モノマーと比べてＡ−β−オリゴマーに対するその選択性と親和性に関して著しい共同作用を示す。言い換えると、本発明によるポリマーはモノマーよりも優れている。本発明の意味での相乗効果とは、Ａ−β−オリゴマーに関して高い選択性と親和性を示す効果であり、特にモノマー単体として又はその付加においてＡβ−オリゴマーへの結合に関するＫD値の効果である。
【００４６】
リンカーとは、共有結合によりモノマーに結合した１個又は複数の分子を意味すると解釈され、その際、このリンカーは互いに共有結合により結合していてもよい。
【００４７】
本発明のもう１つの代替方法では、リンカーによって、モノマーにより予め与えられたポリマーの特性、すなわち、Ａβ−オリゴマーへの結合は変化しない。
【００４８】
もう１つの代替方法では、リンカーはモノマーにより予め与えられたポリマーの特性の変化に作用する。このような実施態様では、本発明によるポリマーの選択性及び／又は親和性は、Ａβ−オリゴマーに関して強くなる及び／又は解離定数が下がる。もう１つの実施態様では、リンカーは、これが特定の大きさのＡ−β−オリゴマーだけに選択的に結合し、本発明によるポリマーの立体作用を変化させるように選択されるか又は構成できる。
【００４９】
リンカーの限定されない例は、アミノ酸配列“ｎｗｎ”である。
【００５０】
本発明によるポリマーの立体作用のこのような変化は、本発明による分枝ポリマーの構成によっても、特殊な構造のデンドリマーによって又はモノマー及びプラットフォーム分子によるポリマーの相応する構造又はこれらの任意選択の組合せによって達成できる。
【００５１】
本発明の対象は、特にアルツハイマー病を治療するための、本発明によるポリマーを含有している組成物でもある。
【００５２】
更に本発明の対象は、特に毒性Ａ−β−オリゴマーを阻止するための、又はそれから形成されるポリマー又はフィブリルを分解するための本発明によるポリマーを含有している組成物である。
【００５３】
本発明による“組成物”は、専門知識に基づき製造すべき調製物中に、本発明によるポリマーを含有している例えば、ワクチン、医薬品（例えば、タブレット型）、注射溶液、栄養又は栄養補助剤であることができる。
【００５４】
本発明によるポリマーは、Ａ−β−オリゴマー又はそこから形成されるポリマー又はフィブリルを、これらに結合し、かつ無毒性化合物に変換することにより解毒する。フィブリルの形成を阻害できる物質は、必ずしも予め形成されたフィブリルを分解できなくてもよい。それというのも、予め形成されたＡ−β−フィブリルは極めて安定であり、かつ極めて分解し難く、かつ緩慢にしか再分解できないからである。
【００５５】
従って、本発明の対象はＡ−β−オリゴマー、そこから形成されるポリマー又はフィブリルを解毒する方法でもある。
【００５６】
遊離する小さな拡散性Ａ−β−オリゴマー、結合してフィブリルになるまでのより大きなＡ−β−オリゴマーのその特性に基づき、ＡＤの全ての段階で本発明によるポリマーが使用可能である。本発明の教示に基づき、種々の形のＡ−β−オリゴマーに選択的に結合するポリマーを製造できる。
【００５７】
更に本発明の対象は、本発明によるポリマーの製法でもある。有利な方法は、例えば、ペプチド合成法（Ｐｅｐｔｉｄｅ）、タンパク質の組み換え製造及びいわゆる任意の低分子量化合物用の容認されている有機合成法である。
【００５８】
本発明は、アミロイド−β−オリゴマーを同定、定性的及び／又は定量的に決定するためのプローブとしてのポリマーの使用にも関する。また本発明の対象は、アミロイド−β−オリゴマーを同定、定性的及び／又は定量的に決定するための本発明によるポリマーを含有するプローブである。
【００５９】
このようなプローブは大変重要である。それというのも、これによりアルツハイマー病の早期診断が可能になるからである。よって病気を極めて早期の段階で抑えるはたらきをすることができる。
【００６０】
このような分子のプローブは、本発明によるポリマーを含有し、かつ患者に例えば静脈内に注入できる。プローブの更なる構成成分は以下のものである：染料、蛍光染料、放射線アイソトープ（例えば、ＰＥＴ）、ガドリニウム（ＭＲＩ）及び／又は画像でプローブに使用される成分である。血液脳関門の経過後に、プローブはＡ−β−オリゴマー及び／又はプラークに結合することができる。このようにマークされたＡ−β−オリゴマー及び／又はプラークは、イメージング法、例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲＴ、プロトン−ＭＲ−分光法などにより目視可能にすることができる。
【００６１】
本発明の更なる対象は、毒性アミロイド−β−オリゴマーの増大を阻止するためのポリマーの使用である。
【００６２】
本発明によるポリマーは、更に無毒性ポリマー・アミロイド−β−オリゴマーの複合体の形成にも使用される。
【００６３】
本発明の更なる対象は、本発明によるポリマーを含有しているキットである。このようなキットでは、本発明によるポリマーは容器中に場合によりバッファー又は溶液と一緒にパッキングできる。キットの全ての成分は、この容器中に又は互いに別々にパッケージングされてもよい。更に、キットはその実用のための指示書を含んでいてもよい。このようなキットは、例えば、本発明によれば注射用ボトル中にストッパー及び／又は隔膜を含んでいてもよい。更に、その中に例えば使い捨てシリンジを含んでいてもよい。
【００６４】
本発明により使用可能である配列は以下に示されている通りである：
【数１】
2019048847.tif 000003
【００６５】
【数２】
2019048847.tif 000004
【００６６】
【数３】
2019048847.tif 000005
【００６７】
Ａ−β−に結合する抗体は以下に示されている通りである：
ａ）アミロイドβ−ペプチド又はアミロイドβ−ペプチド−部分断片のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｅ配列に結合する及び／又は
ｂ）アミロイドβ−ペプチドの多量体化ドメインに結合し、かつアミロイドβ−ペプチドにも結合する及び／又は
ｃ）次の群：
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９又はそれらの相同配列；
から選択される本発明による上記配列のうち１つに結合する抗体。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】Ｄ３もしくはＤ３多量体の存在でＡ−β（１〜４２）の凝集挙動を分析するためのＴｈＴ試験の結果を示す図である。
【図２】Ｄ３とＤ１もしくはＤ３Ｄ１多量体の存在でＡ−β（１〜４２）の凝集挙動を分析するためのＴｈＴ試験の結果を示す図である。
【図３】凝集体の大きさを示す図である。
【図４】ＴｈＴ蛍光の吸収を示す図である。
【図５】Ａ−β（１〜４２）フィブリルへのＤ３結合を示す図である。
【図６】Ａ−β（１〜４２）フィブリルへのＤ３Ｄ３結合を示す図である。
【００６９】
実施例：
例１：以下の４つのＤ３−ダイマーを製造した：
Ｄ３Ｄ３：ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（配列番号１３）
Ｄ３ｎｗｎＤ３：ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｎｗｎｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（配列番号１４）
二重−Ｄ３−遊離Ｎ末端：（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2−ＰＥＧ３（配列番号１５）
二重−Ｄ３−遊離Ｃ末端：ＰＥＧ５−（ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ）2（配列番号１６）
【００７０】
更に、Ｄ３とＤ１から成る（配列ｑｓｈｙｒｈｉｓｐａｑｖ、配列番号６）か、又はＤ３とＶ１から成るダイマーを製造した（化学合成又はペプチド合成による）。その際、Ｖ１はＮ−末端の１番目のアミノ酸が欠失したＤ１の変異体である（配列ｓｈｙｒｈｉｓｐａｑｋ、配列番号６２）
Ｄ３Ｄ１
Ｄ３Ｖ１
Ｖ１Ｄ３
【００７１】
例２：
チオフラビンＴ−試験
例１で製造したＤ３−ダイマーならびにＤ３−モノマーを通常の当業者に公知のオチオフラビンＴ（ＴｈＴ）試験で比較した。ＴｈＴは通常のフィブリルに結合する際に高い蛍光を有する染料であるので、フィブリル化の指標として使用される。Ｄ３−ダイマーはＤ３−モノマーよりもはるかに効率的にＡ−β−フィブリル化を低減する。
【００７２】
図１には、Ｄ３もしくはＤ３−多量体の存在でＡ−β（１〜４２）の凝集挙動を分析するためのＴｈＴ試験の結果が示されている。Ａ−β−ペレットを一晩ＨＦＩＰと一緒に予備インキュベートし、引き続き真空遠心分離を用いるエバポレーションにより製造した（ＨＦＩＰ中にＡβが２２２μＭ）。Ａ−βペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬ中（１０μＭ  ＴｈＴ及び１０μＭ  Ｄ３又はＤ３−多量体を含めて）で再懸濁し、かつ４回測定するためにアリコート化した。ＴｈＴの蛍光をλex４４０ｎｍとλem＝４９０ｎｍで蛍光スペクトロメーター中で測定した。
【００７３】
例３：
例１で製造したＤ３Ｄ１−ダイマーならびにＤ１−モノマーとＤ３モノマーを当業者に公知の通常のＴｈＴ試験ＣｈＴＴｈＴ試験において比較した。Ｄ３Ｄ１−ダイマーは、Ｄ３−モノマーよりもはるかに効率的にＡ−β−フィブリル化を減少させた。
【００７４】
図２には、Ｄ３とＤ１もしくはＤ３Ｄ１−多量体の存在でＡ−β（１〜４２）の凝集挙動を分析するためのＴｈＴ試験の結果が示されている。Ａ−βを一晩ＨＦＩＰ中で予備インキュベートした（ＨＦＩＰ中Ａ−β２２２μＭ）。引き続き、１３．５μｇのアリコートを製造し、かつ一晩ＨＦＩＰを留去した。Ａ−βペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．４）２７０μＬ中（１０μＭ  ＴｈＴを含めて）で再懸濁し、引き続き相応する濃度Ｄ３もしくはＤ３Ｄ１−多量体（５μＭ、１０μＭ、５０μＭもしくは１００μＭ、）に添加し、その後に５回測定用にアリコート化した。ＴｈＴの蛍光をλex４４０ｎｍとλem＝４９０ｎｍで蛍光スペクトロメーター中で測定した。
【００７５】
例４：
例１で製造したＤ３−ダイマーならびにＤ３−モノマーをＡβ（１〜４２）と混合し、及び密度勾配遠心分離に課した。この場合に、溶液中のＡ−βとＡ−β−ペプチド混合物のサイズ分布は、イオジキサノール勾配（５〜５０％）における沈殿分析により試験した。
【００７６】
混合物は、８０μＭ  Ａ−β及び２０μＭ（Ｄ３）又は１０μＭ（Ｄ３Ｄ３）ペプチドを含有していた。遠心分離の後、それぞれ１４０μｌの１５フラクションを連続したピペッティングにより表面から獲得し、かつ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により及び引き続く銀染色により分析した。結果（図３）は、ペプチドがＡ−β−オリゴマーの含有量を著しく減少（フラクション４〜１０）させ、Ｄ３Ｄ３が試験した時点でＤ３よりも相当に高いレベルで減少させたことを示した。フラクション１２〜１５で検出可能である大きな凝集体が生じた。更なる段階では、Ｄ３−Ａ−β−オリゴマーが沈降し、かつ非晶質で無毒性の大きな凝集体に変化することが判明した（Ｆｕｎｋｅら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０）。
【００７７】
例５：
本発明による物質は、フィブリルの形成を阻害し、かつ予備成形されたフィブリルを分解することができる。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）−脱フィブリル化アッセイでインヒビター−ダイマー（Ｄ３Ｄ３配列番号１３、ＲＤ２ＲＤ２配列番号７６、Ｄ３（Δ）デルタ−ｈｔｈＤ３（Δ）デルタ−ｈｔｈ配列番号７５）を相応するインヒビター−モノマー（Ｄ３配列番号：６６、ＲＤ２配列番号１、Ｄ３（Δ）デルタ−ｈｔｈ配列番号６９）と比較し、どの程度効率的であるのかを試験した。
【００７８】
この場合に、予備形成されたどのフラクションのＴｈＴ陽性フィブリルが一定のインキュベーション時間の後に減少するのかを試験した。チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、アミロイドとの相互作用の際に変化し、ＴｈＴ陽性フィブリルは、その分光学的特性が測定可能である。測定されたＴｈＴ蛍光の吸収（λem：４５０ｎｍ、λex：４９０ｎｍ）は、Ａ−β−フィブリルの特徴であるβ−折り畳み構造の吸収を反映した。予備形成されたＡ−β−フィブリルを製造するために、合成されたＡ−β（１〜４２）３３μＭを１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）及び８．５％ＤＭＳＯ中、３７℃で６日間インキュベートした。これにより生じたＡβフィブリルを、各々の物質（Ｄ３Ｄ３、ＲＤ２ＲＤ２、Ｄ３デルタ−ｈｔｈＤ３デルタ−ｈｔｈ、Ｄ３、ＲＤ２、Ｄ３Δｈｔｈ）０．１μｇ／μｌと２０μＭにし、かつ１０μＭ  ＴｈＴと一緒にした。各反応混合物５０μＬを３８４個のウェルを有する黒いマイクロタイタープレートのウェルに満たした（Ｎｕｎｃ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ）。ＴｇＴ−蛍光を１７．５時間にわたり追跡測定した。その際に、マイクロタイタープレートを各々の測定前に３０秒間振盪した。全てのプローブを５回測定した。評価の際に、中間値、標準偏差及び有意（モノマーとダイマーエフェクターの間）を算出した。エフェクターのＴｈＴ蛍光をインヒビター物質の不在でＡβ−フィブリルのＴｈ−蛍光に関して標準化した。
【００７９】
試験した全てのインヒビター物質は、ＴｈＴ蛍光の吸収を示した（図４）。これは、予備形成されたＡβ−フィブリルを非繊維性Ａβ−種に変換できたことを示している。その際に、ダイマー物質Ｄ３Ｄ３、ＲＤ２ＲＤ２及びＤ３デルタｈｔｈＤ３デルタ−ｈｔｈは、モノマーペプチドＤ３、ＲＤ２及びＤ３デルタ−Δｈｔｈに対して著しく強い効果を示した。有意は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験により算出し、及び図中に星印で表示してある：*、ｐ＜０．０５；**、ｐ＜０．０１。
【００８０】
例６：
Ｄ３とＤ３Ｄ３に関して比較による定量的アフィニティーデータを得るために、例６に記載したようにＡβ（１〜４２）−フィブリルを調製した。これとは異なり、Ａβ（１〜４２）９０％と、アミノ末端をビオチニル化しておいたＡβ（１〜４２）１０％から成る混合物をフィブリル化試験に使用した。
【００８１】
可能性としてあり得る他のＡβ構造体、例えばモノマー及び非晶質オリゴマーのフラクションからこのフィブリルを分離するために、例４に記載されているようにフィブリル調製物に濃度勾配遠心分離の行程を課した。フラクション１１と１２で得られたフィブリルだけは、引き続きリガンドとして表面プラズモン共鳴分析に使用した。この場合に、これはストレプトアビジンを被覆したチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ）上に固定化した。引き続き、分析Ｄ３とＤ３Ｄ３のアフィニティーを“シングルサイクル動的”分析により決定した。使用した分析濃度、得られたセンサーグラム（太線）、得られたフィット−曲線（細い破線）及び得られた解離定数は、図５と図６に含まれている。
【００８２】
結果から、１．１μＭと０．１２μＭの解離定数で２個の僅かに異なる結合部位にＤ３−モノマーが結合していることが明らかである。また、Ｄ３−ダイマーは２個の異なる結合部位で結合し、そのうち１つはＤ３−モノマーと似た０．１７μＭの解離定数を有するが、もう一方は、数桁少ない８．８ｐＭの解離定数を有する。この事は、多価物質（ここではＤ３Ｄ３）が、相応する一価の物質（ここではＤ３）よりも、およそ１００００倍強くその標的に結合することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月10日(2018.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド−β−オリゴマーに結合する少なくとも２個の物質（モノマー）を含有しているポリマーであって、その際、前記少なくとも２個の物質のうち少なくとも１個は、配列番号６５により表されたＤＢ３モノマーであるか、あるいは前記ＤＢ３モノマーと少なくとも９０％の同一性を有し、かつ、前記ＤＢ３モノマーの有するアミロイド−β−オリゴマーに対する結合活性が損なわれていない相同体である、前記ポリマー。
【請求項２】
前記モノマーがペプチドであり、当該ペプチドは実質的に、Ｄ−アミノ酸から成ることを特徴とする、請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記ポリマーを構成する各々のモノマーは、アミロイド−β−ペプチドのモノマー及び／又はオリゴマー及び／又はフィブリルに、最大で５００μＭの解離定数（ＫD値）で結合する、請求項１又は２のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項４】
２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のモノマーを含有している、請求項１から３までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
さらなるモノマーが、
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、及び配列番号７９から成る群から選択されるか、あるいは前記モノマーの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の任意の組みあわせから成る、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項６】
少なくとも１個のリンカー基を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項７】
前記モノマーが、共有結合又は非共有結合により互いに結合している、請求項１から６までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項８】
前記モノマーが、リンカー無しで、すなわち直接に互いに結合しているか、又はリンカー基で互いに結合している、請求項１から７までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項９】
前記モノマーが、線状又は分枝状に互いに結合している、請求項１から８までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１０】
デンドリマーであるか、又は前記モノマーがプラットフォーム分子と結合しているか、又はこれらの任意の組合せで結合している、請求項１から９までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１１】
同一又は同一ではないモノマーを含有している、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１２】
前記アミロイド−β−オリゴマーは、最大で１μＭの解離定数で結合する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１３】
２個のＤＢ３モノマーから成るダイマーである、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１４】
医薬品において使用するための、請求項１から１３までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１５】
アルツハイマー病の治療のための、請求項１から１４までのいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーを含有しているキット。
【請求項１７】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーを含有しているプローブ。
【請求項１８】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーを含有している、アルツハイマー病を治療するための組成物。
【請求項１９】
ペプチド合成法若しくは低分子量化合物用の有機合成法を使用するか、又はタンパク質の組み換え製造によりポリマーを製造することを特徴とする、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーを製造する方法。
【請求項２０】
アミロイド−β−オリゴマーを同定、定性的及び／又は定量的に決定するためのプローブとしての、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーの使用。
【請求項２１】
ポリマー／アミロイド−β−オリゴマーの複合体を形成するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載のポリマーの使用。
【外国語明細書】
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