(57)【要約】      （修正有）【課題】混和しない抽出溶媒を使用して、抽出されたサンプルを分析するためのシステムおよび方法を提供する。【解決手段】延伸先端を伴う毛細管内に隣接して注入される、液体サンプルおよび有機溶媒の２つの不混和性相を示す。異なる相の異なる極性を前提として、１つまたはそれを上回る検体は、サンプルから溶媒の中に移動する。抽出プロセスは、毛細管を傾けるか、またはガス圧力を印加すること等により、液相を前後に毛細管内で移動させ、マイクロ抽出を促進することによって、促進されることができる。液相は、プローブに動作可能に結合されるガス生成デバイスから、ガス圧力を印加することによって、抽出相が毛細管の延伸先端に到達するのに伴って押動され得、金属ワイヤ電極が、抽出溶媒の中に挿入され、ナノＥＳＩのために、ＤＣ電圧を印加する。電圧は、質量分析計の入口に到達するスプレーとして、溶媒を中空本体の遠位先端から排出させる。【選択図】図３Ａ
2019124696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を生物学的サンプルから抽出するための方法であって、前記方法は、
溶媒を毛細管の中に導入することと、
検体を含む生物学的サンプルを前記毛細管の中に導入することであって、前記溶媒は、前記生物学的サンプルと混合せず、前記溶媒は前記検体の抽出およびイオン化の両方に適合する、ことと、
前記毛細管内の前記生物学的サンプルおよび前記溶媒を前後に移動させることであって、前記生物学的サンプルおよび前記溶媒内に循環を誘発し、それによって、前記生物学的サンプルと前記溶媒との相界面で前記検体を前記生物学的サンプルから前記溶媒の中に抽出させる、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
前記抽出された検体を分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析することは、
前記検体が前記毛細管から排出されるように、前記毛細管内において、前記抽出された検体を含む前記溶媒に電圧を印加することであって、それによって、前記検体のイオンを生成する、ことと、
前記イオンを分析することと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
分析することは、
前記抽出された検体を含む前記溶媒を前記毛細管から除去することと、
前記検体を分析するアッセイを行うことと
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒が、最初に、前記毛細管に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的サンプルが、最初に、前記毛細管に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記毛細管内の前記生物学的サンプルおよび前記溶媒の移動を停止させることと、
前記溶媒の一部を除去することと、
前記溶媒の中に抽出された検体の量を分析することと
によって、前記抽出を監視することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分析するステップの結果に基づいて、前記毛細管内の前記生物学的サンプルおよび前記溶媒の移動を再開させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒は、前記生物学的サンプルと混和しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒は、前記生物学的サンプルとの混和性があり、前記方法は、第２の溶媒を前記毛細管の中に導入することをさらに含み、前記第２の溶媒は、前記第２の溶媒が前記溶媒と前記生物学的サンプルとの間にある態様で、前記溶媒および前記生物学的サンプルと混和しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、荷電官能基を前記検体に付与する薬剤を導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
分析することは、イオンをベンチトップ質量分析計または小型質量分析計に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶媒は、前記生物学的サンプルの導入に先立って、前記毛細管に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複数の検体が、前記溶媒の中に抽出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の検体は、前記複数の検体の異なる極性に基づいて前記溶媒の中に時間において差動的に抽出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記電圧を印加することは、
前記生物学的サンプルを通して前記溶媒の中に金属ワイヤを挿入することと、
前記金属ワイヤを介して、前記電圧を前記溶媒に印加することと
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
噴霧ガスもまた、前記抽出された検体に印加される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１４年２月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６１／９４２，９４９号、および２０１４年６月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０１３，００７号の利益およびこれら出願に基づく優先件を主張しており、これら出願の各々の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた第ＧＭ１０６０１６号の下で政府支援によって成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して、不混和性抽出溶媒を使用して、抽出されたサンプルを分析するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
複合生物学的サンプル（例えば、血液、唾液、または尿等の複合混合物）の高速分析は、臨床、法医学、および多くの他の用途において非常に着目されている。質量分析法を使用したそのようなサンプルの分析における問題は、生物学的サンプルの非標的成分（例えば、塩）が、イオン化プロセスの間、電荷に対してサンプル中の標的と競合することである。そのような競合は、サンプルの非標的成分がサンプル中の標的のイオン化を抑制することにつながり、これは、マトリクス効果として知られる。検体イオン化に及ぼす抑制効果を最小限にし、検体を事前に濃縮するために、複合生物学的サンプルが、ルーチン的に抽出され、次いで、質量分析法測定の前に、クロマトグラフィを使用して分離される。しかしながら、そのようなプロセスは、高価なクロマトグラフィ機器および時間のかかるサンプル調製プロトコルを使用する、実験室設定においてのみ行われることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、液体−液体抽出のための新しいアプローチを提供し、また、サンプル調製および事前処理がイオン化プロセスと組み合わせられることを可能にする、システムおよび方法を提供する。特に、本発明は、液体−液体抽出が、２つの液体間に非常に小さい界面を提供する、非常に小さい直径の毛細管（例えば、５００μｍ程の小さい内径の毛細管）内で行われることを可能にする。これは、典型的には、従来の液体−液体抽出には非常に好ましくないと考えられる。毛細管内の液体は、前後に移動され、抽出プロセスの制御を可能にする、すなわち、抽出は、オンおよびオフにされることができる。この運動は、不混和性流体の各プラグの内側に循環を誘発し、抽出を促進する。薄型毛細管を使用する付加的利点は、少量のサンプルが定量的分析のために取り扱われることができることである。
【０００６】
加えて、抽出毛細管は、イオン化プローブとしての役割も果たすことが可能である。このように、本発明は、サンプル中の標的検体が、別個のサンプル調製および事前処理プロトコルを行わずに、質量分析法によって抽出および分析されることを可能にする、システムおよび方法を提供する。むしろ、本発明のシステムおよび方法は、サンプル調製および事前濃縮がイオン化プローブ内で行われるように構成される。精製された検体は、次いで、直接、イオン化され（但し、要求されない）、サンプル調製および事前処理が生じるイオン化プローブから質量分析計の中に注入されることができる。
【０００７】
本発明の側面は、サンプルと混和しない溶媒を使用して遂行される。溶媒およびサンプルは、本発明のイオン化プローブ内に置かれる。サンプルからの１つまたはそれを上回る標的検体は、溶媒の中に抽出される一方、サンプルの非標的成分（例えば、尿中の塩）は、サンプル中に残る。電極は、次いで、イオン化プローブの本体内の溶媒に動作可能に結合され、標的検体は、イオン化され、質量分析計の中に注入される。このように、サンプル調製および事前処理は、イオン化プロセスと組み合わされ、電圧が溶媒に印加されると、標的検体は、電荷に対してサンプルの非標的成分と競合する必要はない。故に、本発明のシステムおよび方法は、マトリクス効果を効果的に抑制し、サンプルからの標的検体、特に、血液、唾液、尿、または脊髄液等の生物学的サンプルからのより優れたイオン化を可能にする。本発明のシステムおよび方法はまた、標的検体をサンプルから抽出溶媒の中に事前に濃縮させ、それによって、高価なクロマトグラフィ機器および時間のかかる分離プロトコルを回避し、診療現場サンプル分析システムおよび方法を可能にする利点を追加する。
【０００８】
本発明の側面は、サンプル中の検体を分析するための方法を提供する。これらの方法は、溶媒を、随意に、遠位先端を有する中空本体の中に導入するステップを伴い得る。サンプルもまた、中空本体の中に導入される。溶媒は、サンプルと混合しない。本方法は、次いで、少なくとも１つの検体をサンプルから溶媒の中に抽出するステップを伴う。電圧が、検体が本体の遠位先端から排出されるように、中空本体内に抽出された検体を含む溶媒に印加され、それによって、検体のイオンを生成する。イオンは、次いで、分析される。当業者は、サンプルおよび溶媒が中空本体に導入される順序が問題ではないことを認識し得る。ある実施形態では、溶媒が、最初に、導入され、サンプルが、次に、導入される。他の実施形態では、サンプルが、最初に、導入され、溶媒が、次に、導入される。ある実施形態では、サンプルおよび溶媒は、混和しない。ある実施形態では、１つを上回る溶媒が、使用される。例えば、第２の溶媒が、第１の溶媒とサンプルとの間にあるように導入されることができる（３相実施形態）。第２の溶媒は、溶媒架橋として作用することができ、そしてサンプルおよび第１の溶媒とは混和せず、これらは、このような実施形態では、典型的には、相互に混和性である。
【０００９】
ある実施形態では、サンプルおよび溶媒は、電圧の印加に先立って、ゆっくり混合される。これは、毛細管をゆっくり傾けることによって、手動で、または可動機構の使用を通して、行われることができる。ある実施形態では、２つまたはそれを上回る相は、相互に混合しない。例示的可動機構は、中空本体内に交互する空気圧力を印加し、サンプルを本体内で押動および引動させ、それによって、ゆっくりとした移動を生じさせる、ポンプである。ある実施形態では、高電圧が、溶媒に印加され、溶媒を中空本体から吐出し、サンプルを脱溶媒和およびイオン化する。他の実施形態では、噴霧ガスもまた、パルス状または連続流れのいずれかとして、抽出されたサンプルに印加される。
【００１０】
本発明の方法は、任意のタイプのサンプルと併用されることができる。ある実施形態では、サンプルは、血液、尿、唾液、または脊髄液等の生物学的流体である。サンプルは、典型的には、着目標的を含む。生物学的サンプルの場合、その標的は、治療用薬物、乱用薬物、またはステロイド等の他の分子であってもよい。標的は、サンプル由来の成分またはサンプルに人工的に導入されたものであってもよい。ある実施形態では、内部標準もまた、導入される。
【００１１】
ある実施形態では、分析されるべき標的は、例えば、スプレーイオン化によって効率的にイオン化されない標的である。そのような実施形態では、荷電基を標的に付与し、それによって、イオン化をより受けやすくすることが可能な薬剤を導入することによって、標的分子を誘導体化することが有益である。例えば、ステロイドは、スプレーイオン化によってイオン化することが困難である。ヒドロキシルアミン等の薬剤をサンプルに導入することは、荷電基をステロイドに付与し、スプレーイオン化を受けやすくする。
【００１２】
選定される抽出溶媒は、抽出されるべき標的に依存し得る。また、イオン化のための溶媒の有効性を考慮することも重要である。理想的溶媒は、抽出およびイオン化の両方に良好である。そのような例示的溶媒は、酢酸エチルであるが、当業者は、他の溶媒もまた、サンプル中の標的の抽出およびイオン化の両方に効果的であることを認識し得る。複数の検体がサンプルから溶媒の中に抽出される実施形態では、溶媒はまた、検体を差動的に抽出することが可能であってもよい。
【００１３】
イオンを分析するための多数の方法が、存在する。ある実施形態では、分析は、イオンを質量分析計または小型質量分析計の質量分析器に導入するステップを伴う。例示的小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，７１９８−７２０５）に説明されており、その内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。数千ワットの電力を伴う実験室規模の器具のために使用されるポンプシステムと比較して、小型質量分析計は、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌに説明されるシステムの場合、５Ｌ／分（０．３ｍ３／時間）ダイヤフラムポンプおよび１１Ｌ／秒ターボポンプのみを伴う１８Ｗポンプシステム等、概して、より小さいポンプシステムを有する。他の例示的小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，８０：７１９８−７２０５，２００８）、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ８３：１８５７−１８６１，  ２０１１）、およびＳｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１１、３０６、１８７−１９５）に説明されており、そのそれぞれの内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明の他の側面は、サンプル中の検体を分析するためのシステムを提供する。本システムは、イオン化プローブと、質量分析計とを含む。前述のように、質量分析計は、ベンチトップ質量分析計または小型質量分析計であってもよい。イオン化プローブは、遠位先端を含む、中空本体（例えば、先端まで伸展されたガラス製毛細管）を含む。中空本体は、本体内に基質が存在せず、電極が本体の表面上に配置されないように構成される。むしろ、電極は、少なくとも部分的に、中空本体内に配置される。ある実施形態では、電極は、中空本体の表面から離間される、すなわち、中空本体の表面に触れない。ある実施形態では、電極は、中空本体内に同軸に配置される。ある実施形態では、電極は、中空本体の遠位部分まで延在する。例示的電極は、金属ワイヤである。
【００１５】
ある実施形態では、プローブは、空気圧補助を伴わずに動作する。他の実施形態では、本システムは、噴霧ガス源を含む。噴霧ガス源は、ガスのパルスを提供するように構成されてもよく、またはガスの連続流れを提供するように構成されてもよい。
【００１６】
他の側面では、本発明は、検体をサンプルから抽出するための方法を提供する。これらの方法は、溶媒を毛細管の中に導入するステップを伴う。検体を含むサンプルもまた、毛細管の中に導入される。溶媒は、サンプルと混合しない。サンプルおよび溶媒は、毛細管内で移動され、サンプルおよび溶媒内に循環を誘発し、それによって、検体をサンプルから溶媒の中に抽出させる。ある実施形態では、溶媒が、最初に、導入され、サンプルは、次に、導入される。他の実施形態では、サンプルが、最初に、導入され、溶媒は、次に、導入される。ある実施形態では、サンプルおよび溶媒は、混和しない。ある実施形態では、１つを上回る溶媒が、使用される。例えば、第２の溶媒が、第１の溶媒とサンプルとの間にあるように導入されることができる（架橋溶媒を使用する３相実施形態）。第２の溶媒は、溶媒架橋として作用することができ、そのような実施形態では、典型的には、相互に混和性である、サンプルおよび第１の溶媒と混和しない。
【００１７】
ある実施形態では、本方法は、加えて、抽出された検体を分析するステップを伴ってもよい。分析は、検体が毛細管から排出されるように、毛細管内において、電圧を抽出された検体を含む溶媒に印加し、それによって、検体のイオンを生成し、イオンを分析するステップを伴ってもよい。他の実施形態では、分析するステップは、抽出された検体を含む溶媒を毛細管から除去するステップと、検体を分析するアッセイを行うステップとを伴ってもよい。
【００１８】
本発明の方法は、反応が監視されることを可能にする。反応を監視するために、本方法は、加えて、毛細管内のサンプルおよび溶媒の移動を停止させるステップ、溶媒の中に抽出された検体のある量を分析するステップを伴ってもよい。分析するステップの結果に基づいて、本発明の方法は、加えて、分析するステップの結果に基づいて、毛細管内のサンプルおよび溶媒の移動を再開させるステップを伴ってもよい。
【００１９】
本発明の別の側面は、複数の溶媒を毛細管の中に導入するステップを伴う、検体をサンプルから抽出するための方法を提供し、この方法では、各２つの隣接する溶媒は、相互に混合せず、毛細管内の溶媒を移動させ、各溶媒内に循環を誘発し、それによって、化学的化合物を溶媒間で移送させる。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
サンプル中の検体を分析するためのシステムであって、前記システムは：
中空の本体であって、前記本体内に基質はなく、前記本体の表面上に配置される電極はない中空本体と、少なくとも部分的に前記中空本体内に配置される電極とを備えるイオン化プローブと、質量分析計とを備える、システム。
（項目２）
前記プローブは、空気圧補助を伴わずに動作する、項目１に記載のシステム。
（項目３）
噴霧ガス源をさらに備える、項目１に記載のシステム。
（項目４）
前記噴霧ガス源は、ガスのパルスを提供するように構成される、項目１に記載のシステム。
（項目５）
前記噴霧ガス源は、ガスの連続流れを提供するように構成される、項目１に記載のシステム。
（項目６）
前記電極は、前記中空本体内で同軸に配置される、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記電極は、前記中空本体の遠位部分まで延在する、項目６に記載のシステム。
（項目８）
前記電極は、金属ワイヤである、項目７に記載のシステム。
（項目９）
前記中空本体は、ガラスを含む、項目１に記載のシステム。
（項目１０）
前記質量分析器は、小型質量分析器である、項目１に記載のシステム。
（項目１１）
サンプル中の検体を分析するための方法であって、
溶媒を遠位先端を備える中空本体の中に導入するステップと、
サンプルを前記中空本体の中に導入するステップであって、前記溶媒は、前記サンプルと混合しない、ステップと、
少なくとも１つの検体を前記サンプルから前記溶媒の中に抽出するステップと、
前記検体が前記本体の遠位先端から排出されるように、前記中空本体内において、電圧を前記抽出された検体を含む溶媒に印加し、それによって、前記検体のイオンを生成するステップと、
前記イオンを分析するステップと
を含む、方法。
（項目１２）
前記方法はさらに、荷電官能基を前記検体に付与する薬剤を導入するステップを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記溶媒は、前記抽出および前記抽出された検体のイオン化の両方に適合する、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
分析するステップは、前記イオンをベンチトップ質量分析計または小型質量分析計に導入するステップを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記溶媒は、前記サンプルの導入に先立って、前記中空本体に導入される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記電圧を印加するステップに先立って、前記サンプルおよび前記溶媒を混合するステップをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
複数の検体が、前記溶媒の中に抽出される、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記複数の検体は、前記溶媒の中に差動的に抽出される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記電圧を印加するステップは、
前記サンプルを通して前記溶媒の中に金属ワイヤを挿入するステップと、
前記金属ワイヤを介して、前記電圧を前記溶媒に印加するステップと、を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
噴霧ガスもまた、前記抽出されたサンプルに印加される、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
検体をサンプルから抽出するための方法であって、
溶媒を毛細管の中に導入するステップと、
検体を含むサンプルを前記毛細管の中に導入するステップであって、前記溶媒は、前記サンプルと混合しない、ステップと、
前記毛細管内の前記サンプルおよび前記溶媒を移動させるステップであって、前記サンプルおよび前記溶媒内に循環を誘発し、それによって、前記検体を前記サンプルから前記溶媒の中に抽出させるステップと
を含む、方法。
（項目２２）
前記抽出された検体を分析するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
分析するステップは、
前記検体が前記毛細管から排出されるように、前記毛細管内において、電圧を前記抽出された検体を含む溶媒に印加するステップであって、それによって、前記検体のイオンを生成するステップと、
前記イオンを分析するステップと
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
分析するステップは、
前記抽出された検体を含む溶媒を前記毛細管から除去するステップと、
前記検体を分析するアッセイを行うステップと
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記溶媒が、最初に、前記毛細管に導入される、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記サンプルが、最初に、前記毛細管に導入される、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記毛細管内の前記サンプルおよび前記溶媒の移動を停止させること、
前記溶媒の一部を除去すること、
前記溶媒の中に抽出された検体のある量を分析することによって、前記抽出を監視するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
前記分析することの結果に基づいて、前記毛細管内の前記サンプルおよび前記溶媒の移動を再開させるステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記溶媒は、前記サンプルと混和しない、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記溶媒は、前記サンプルと混和性であって、前記方法はさらに、架橋溶媒が前記溶媒と前記サンプルとの間にある様式において前記溶媒および前記サンプルと混和しない架橋溶媒を前記毛細管の中に導入するステップを含む、項目２１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の例示的システムを示す。
【００２１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のシステムを使用する方法を示す。本図では、液体サンプルおよび有機溶媒の２つの不混和性相が、延伸先端を伴う毛細管内で隣接して注入される。液相は、毛細管を傾けるか、またはガス圧力を印加することによって、毛細管内で前後に移動され、マイクロ抽出を促進する。液相は、次いで、ガス圧力を印加することによって、抽出相が毛細管の延伸先端に到達するのに伴って押動され、ワイヤ電極が、抽出溶媒の中に挿入され、ナノＥＳＩのために、ＤＣ電圧を印加する。
【００２２】
【図２】図２パネルＡ−Ｃは、合成尿サンプル中の異なる化合物の定量化のための較正曲線を示す。図２パネルＡは、メタンフェタミンを示す。図２パネルＢは、ニコチンを示す。図２パネルＣは、ベンゾイルエクゴニンを示す。薬物および内部標準を含有する１０μＬの合成尿が、測定のためのサンプルとして使用された。５μＬの酢酸エチル（ＥＡ）が、抽出、精製、およびスプレーのための抽出相として使用された。内部標準：メタンフェタミン−ｄ８（０．８ｎｇ／ｍＬ）、ニコチン−ｄ３２（ｎｇ／ｍＬ）、ベンゾイルエクゴニン−ｄ３（１ｎｇ／ｍＬ）。使用された単一反応監視（ＳＲＭ）遷移：メタンフェタミンｍ／ｚ１５０→９１、メタンフェタミン−ｄ８ｍ／ｚ１５８→９３；ニコチン１６３→１３０、ニコチン−ｄ３ｍ／ｚ１６６→１３０；ベンゾイルエクゴニンｍ／ｚ２９０→１６８、ベンゾイルエクゴニン−ｄ３ｍ／ｚ２９３→１７１。分配係数：ＬｏｇＰメタンフェタミン＝２．０７；ＬｏｇＰニコチン＝１．１７、ＬｏｇＰベンゾイルエクゴニン＝−０．５９。
【００２３】
【図３Ａ】図３Ａは、反応性スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩを示し、サンプル相、誘導体化試薬相、および抽出相が隣接して注入された。抽出相は、試薬相またはサンプル相と混和しない。サンプル相および試薬相は、混和性であり得る。サンプル相中の検体は、ＳＦＭＥ動作の間、誘導体化され、抽出相の中に抽出される。液相は、次いで、押動され、したがって、抽出相は、毛細管の延伸先端に到達するように押動され、ワイヤ電極が、抽出相の中に挿入され、ナノＥＳＩのために、ＤＣスプレー電圧を印加する。
【００２４】
【図３Ｂ】図３Ｂは、荷電錯体を形成するための荷電試薬とサンプル中の標的の結合を示し、これは、非荷電標的をよりスプレーイオン化を受けやすくする。
【００２５】
【図４】図４パネルＡ−Ｂは、スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩを使用して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。それぞれ、４０ｎｇ／ｍＬニコチン（図４パネルＡ）および４０ｎｇ／ｍＬメタンフェタミン（図４パネルＢ）を含有する、ウシ血液サンプルが、水で１０倍に希釈され、次いで、ＳＦＭＥナノＥＳＩを使用して分析された。１０μＬの希釈されたサンプル、５μＬの酢酸エチルが使用された。
【００２６】
【図５】図５パネルＡ−Ｄは、試薬としてヒドロキシルアミンを伴う反応性スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩを使用して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。合成尿中、１０μＬの８ｎｇ／ｍＬエピテストステロン（図５パネルＡ）、５ｎｇ／ｍＬ５α−アンドロスタン−３β、１７β−ジオール−１６−オン（図５パネルＢ）、５ｎｇ／ｍＬ６−デヒドロコレステノン（図５パネルＣ）、および５ｎｇ／ｍＬスチグマスタジエノン（図５パネルＤ）とした。０．１％酢酸および１０％ヒドロキシルアミンを含有する５μＬ水溶液が、試薬相として添加された。５μＬ酢酸エチルが、抽出相として使用された。
【００２７】
【図６】図６は、例示的３相流体システムを示す。不混和性３相ＳＦＭＥを使用したサンプル分析：サンプル相は、高極性であって、Ｈ２Ｏおよびアセトニトリル等の比較的に高極性の溶媒が、抽出溶媒として使用されている。サンプルおよび抽出溶媒と混和しない、比較的に低極性の溶媒は、それらの間にプラグされ、それらを分離して保つ。ガラス製管類ではなく、疎水性管類が、この場合、使用され、単離を確実にする。押動および引動力は、抽出のために印加され、スラグ流移動を誘発する。抽出後、抽出物は、ナノＥＳＩによって直接もしくは間接的のいずれかで分析されるか、またはさらなる動作のために貯蔵されることができる。
【００２８】
【図７】図７は、低極性サンプル中の化学物質を分析するためのマイクロ抽出を示す。比較的に高極性の溶媒が、抽出およびスプレーイオン化のために使用され得る。
【００２９】
【図８】図８は、本発明のシステムおよび方法を使用した植物油の分析を示す。水およびメタノールの混合物が、抽出溶媒として使用された。図８パネルＡは、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール種が、ポジティブモードにおいて、ＭＳスペクトル中で観察されたことを示す、ＭＳスペクトルである。図８パネルＢは、異なる脂肪酸が、ネガティブモードにおいて取得されたＭＳスペクトル中で観察されたことを示す、ＭＳスペクトルである。
【００３０】
【図９】図９パネルＡ−Ｂは、３相ＳＦＭＥ（図６）を使用した尿中の１００ｎｇ／ｍＬフェニルアラニン（１６５Ｄａ、ｌｏｇＰ＝−１．３８）の分析を示す。分子イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルが、収集された。図９パネルＡは、マトリクスの減少としてメタノールを使用して１０倍に希釈され、直接、ナノＥＳＩによってスプレーされた５μＬサンプルのＭＳスペクトルを示す。図９パネルＢは、ヘキサン／Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（１：１）を架橋／抽出溶媒として用いて３相ＳＦＭＥによって処理され、次いで、ナノＥＳＩによって分析された５μＬサンプルのＭＳスペクトルを示す。
【００３１】
【図１０】図１０は、溶融石英製毛細管を使用したウシ全血中の５０ｎｇ／ｍＬアミトリプチリンの分析を示す。
【００３２】
【図１１】図１１パネルＡは、スラグ流マイクロ抽出を使用した毛細管内サンプル抽出を示す。図１１パネルＢは、ナノＥＳＩ．ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた後続ＭＳ分析を示す。図１１パネルＣは、５μＬ尿中の１０ｎｇｍＬ−１メタンフェタミンの分析を示す。図１１パネルＤは、５μＬ尿中の５０ｎｇｍＬ−１ベンゾイルエクゴニンの分析を示す。図１１パネルＥは、検体の抽出に及ぼすＳＦＭＥサイクルの回数の影響を示し、ＭＳ／ＭＳ生成イオンの強度は、それぞれ、尿サンプル中５０ｎｇ／ｍＬにおいて、メタンフェタミン（ｍ／ｚ１５０→９１）、ニコチン（ｍ／ｚ１６３→１３０）およびベンゾイルエクゴニン（ｍ／ｚ２９０→１６８）であることが監視された。２ｋＶが、ナノＥＳＩのために使用された。
【００３３】
【図１２】図１２パネルＡ−Ｂは、毛細管の内側の液体プラグの移動が２つの方法において生成され得ることを示す。図１２パネルＡは、毛細管を上下にゆっくりと傾ける様子を示す。図１２パネルＢは、ピペットを通して空気圧によって押動力および引動力を加える様子を示す。ピペット採取体積は、本目的のために、１０μＬと設定された。
【００３４】
【図１３】図１３パネルＡ−Ｂは、直接ＭＳ／ＭＳ分析のために記録されたスペクトルを示す。図１３パネルＡは、５μＬの未希釈のヒト貯留血液中の１ｎｇｍＬ−１ベラパミルを示す。図１３パネルＢは、ヒト全血中に含有される内因性クレアチニンを示す。
【００３５】
【図１４】図１４Ａは、平衡時の濃度を計算するための導出を示す。
【００３６】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＳＦＭＥ後の平衡時の内部標準的（ＩＳ）組み込み濃度を計算するための導出を示す。
【００３７】
【図１５】図１５は、メタンフェタミン（１−１００ｎｇｍＬ−１）がスパイクされた全血の定量的分析を示す。血液サンプルは、粘度低下のために、１０倍に希釈された。抽出溶媒酢酸エチル中のメタンフェタミン−ｄ８（２ｎｇｍＬ−１）。
【００３８】
【図１６】図１６パネルＡは、生体流体サンプルと抽出溶媒との間に注入された試薬プラグを伴う、反応性ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩを示す。図１６パネルＢのＭＳ／ＭＳスペクトルは、合成尿中の２００ｎｇｍＬ−１エピテストステロンの直接ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ分析を示す。５０ｍＭヒドロキシルアミンを含有する５μＬ水が、試薬液体プラグのために使用された。図１６パネルＣは、合成尿中の２００ｎｇｍＬ−１エピテストステロンの反応性ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ分析を示す。５０ｍＭヒドロキシルアミンを含有する５μＬの水が、試薬液体プラグのために使用された。
【００３９】
【図１７】図１７パネルＡは、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）によって触媒されたアセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）からチオコリン（ＴＣｈ）の酵素変換の反応スキームを示す。図１７パネルＢは、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩによって判定されたＡＴＣｈ消化の進行曲線を示す。インキュベーションが、３０分にわたって行われ、血液コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）によって室温で触媒された。ヨウ化アセチルチオコリン標準が、ヒト全血の中に添加され、インキュベーション前の最終濃度１．８ｍｇ／ｍＬとした。チオコリン（ｍ／ｚ１０２→６１）および酵素基質（ｍ／ｚ１６２→１０３）からの生成イオンの強度比が、ＭＲＭを使用して監視された。図１７パネルＣは、異なるレベルの酵素阻害を伴う、血液ＣｈＥの評価を示す。血液サンプル中のＣｈＥ活性は、５分間のインキュベーション後、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩによって判定された。
【００４０】
【図１８】図１８パネルＡは、希釈された血液の中へのアセチルチオコリンの混合直後（上）と６０分後（下）に得られたサンプル（それぞれ５μＬ）のＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ  ＭＳ分析のために記録されたＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ−ＭＳスペクトルを示す。図１８パネルＢは、抽出溶媒による酵素活性に及ぼす影響の調査を示す。特定の溶媒の試験のために、５μＬ血液サンプル（希釈された）が、アセチルチオコリンを血液の中に混合直後、抽出溶媒プラグとともに毛細管の中に注入された。毛細管内での５分間のインキュベーション後、ＴＣｈ／ＡＴｃｈ比が、ＳＦＭＥナノＥＳＩ  ＭＳを使用して測定された。対照のために、アセチルチオコリンを希釈された血液の中に混合して５分後、サンプルが、採取され、ＳＦＭＥナノＥＳＩ  ＭＳと抽出相として酢酸エチルを併用して、直ちに分析された。１．５ｋＶのスプレー電圧が、ナノＥＳＩのために使用された。
【００４１】
【図１９】図１９は、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩにおいて使用される抽出相のための異なる有機溶媒の比較を示す。試験毎に、５ｎｇｍＬ−１メタンフェタミンがスパイクされたウシ全血が、水で１０倍に希釈され、５μＬサンプルが、次いで、サンプルプラグを調製するために使用され、５μＬの１つの有機溶媒が、抽出プラグのために使用された。遷移ｍ／ｚ１５０→９１を伴うＳＲＭ（単一反応監視）が、スプレー電圧が変動される間、プロトン化メタンフェタミンｍ／ｚ１５０からの生成イオンｍ／ｚ９１の強度を記録するために使用された。
【００４２】
【図２０】図２０パネルＡ−Ｄは、５μＬ生物学的サンプル（未希釈）中の低濃度の薬物またはステロイドのＭＳ／ＭＳ分析を示す。図２０パネルＡは、ウシ全血中の０．５ｎｇｍＬ−１メタンフェタミンを示す。図２０パネルＢは、ウシ全血中の０．５ｎｇｍＬ−１アミトリプチリンを示す。図２０パネルＣは、ウシ全血中の０．８ｎｇｍＬ−１ベラパミルを示す。図２０パネルＤは、反応性ＳＦＭＥを使用した合成尿中の９ｎｇｍＬ−１エピテストステロンを示す。
【００４３】
【図２１】図２１は、エピテストステロンの誘導体化およびＭＳ／ＭＳ断片化経路と、反応性ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩを使用したステロイドのＭＳ／ＭＳ分析のための標的イオンの概要を提供する表とを示す。
【００４４】
【図２２】図２２は、ＳＬＭＥナノＥＳＩを用いて得られたＬＯＤと、検出または監視するためのカットオフ濃度とを示す、表である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（詳細な説明）
本発明は、スラグ流マイクロ抽出（ＳＦＭＥ）、随意に、サンプルの高速分析のための抽出された検体のイオン化が続くためのシステムおよび方法を提供する。本発明のシステムおよび方法は、生体医療分野、医薬品分野、食品安全分野、および環境分野等、任意の商業または研究分野における検体の分析のために有用である。
【００４６】
ある実施形態では、本発明は、サンプル中の検体を分析するためのシステムを提供する。図１Ａは、本発明のシステムの例示的実施形態を提供する。本システムは、イオン化プローブと、質量分析計とを含む。イオン化プローブは、遠位先端を含む、中空本体を含む。多数の異なるタイプの中空本体が、当業者によって想定されることができ、全て、本発明のシステムと協働し得。中空本体は、プローブの中に装填される溶媒のスプレーを吐出するための遠位先端を有することができる。例示的中空本体は、遠位先端を伴う、ナノＥＳＩプローブ毛細管である。例示的ナノＥＳＩプローブは、例えば、Ｋａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．３６６（６−７）：６６９−７６、２０００）およびＥｌ−Ｆａｒａｍａｗｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１６：１７０２−１７０７、２００５）のそれぞれに説明されており、そのそれぞれの内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。ナノＥＳＩ針は、Ｐｒｏｘｅｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＮｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から市販され入手可能である。他の実施形態では、本システムは、１つまたはそれを上回るスプレー先端と、１つまたはそれを上回る電極とを含む、サンプルカートリッジを含んでもよい。
【００４７】
例示的中空本体は、延伸先端を伴う、０．８６ｍｍ内径のホウケイ酸ガラス製毛細管である。先端は、典型的には、約２μｍ〜約５０μｍの直径を有し得る。プラスチックおよびゴム製管類もまた、中空本体のために使用されることができる。例えば、中空本体は、ＰＥＥＫ管類（ポリエーテルエーテルケトンポリマー管類）またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）管類（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ポリマー管類）、もしくはＴＹＧＯＮ管類（種々のベース材料から成る可撓性管類）を含むことができる。
【００４８】
例示的中空本体は、延伸先端の有無にかかわらず、０．５ｍｍまたは０．２５ｍｍ内径の溶融石英製毛細管である。
【００４９】
図１Ａに示されるように、中空本体は、溶媒と、溶媒と混和しないサンプルと等、少なくとも２つの不混和性流体で装填され、抽出は、プローブの中空本体内で行われる。本発明のこれらの側面は、以下により詳細に論じられる。ある実施形態では、プローブ本体内で抽出を行うために、本体は、任意の他の材料を欠いているべきである。例えば、基質（例えば、紙基質等の多孔性基質）、フィルタ、ビーズ、ゲル、または本体内に配置される他の物質は、存在しない。むしろ、本体は、抽出に伴われるであろう不混和性流体を受容するために、他の物質がなく、完全に空のままである。
【００５０】
ある実施形態では、磁気ビーズが、サンプルおよび溶媒プラグ中に添加され、交流磁場が、印加され、液体プラグの内側の磁気ビーズの移動を誘発し、それによって、液体−液体界面へおよびそこからの検体の移送のために、各プラグの内側の乱流を促進する。
【００５１】
ある実施形態では、本体の内側表面は、本体の内側表面の疎水性を調節するためにコーティングされる。疎水性領域は、フォトリソグラフィ、印刷方法、またはプラズマ処理を使用して等、公知の技法を使用して表面上にコーティングされてもよい。Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，１３１８−１３２０）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００８，１０５，１９６０６−１９６１１）；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，６９２８−６９３４）；Ｂｒｕｚｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，３３８７−３３９２）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ
ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００８，８，２１４６−２１５０）；およびＬｉ
ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，８０，９１３１−９１３４）（そのそれぞれの内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ある実施形態では、本体は、均一疎水性を有するように調製される。他の実施形態では、本体は、多数の異なる領域を有するように調製されることができ、それぞれ、本体のその領域を充填する液体のタイプに基づき得る、異なる疎水性を有する。例えば、油系サンプルを受容する本体の領域は、水およびメタノール系溶媒を受容する本体の領域より疎水性となるように処理されることができる。
【００５２】
ある実施形態では、中空本体は、電極が本体の表面上に配置されないように構成される。代わりに、電極は、少なくとも部分的に、中空本体内に配置される。図１Ａに示されるように、電極は、中空本体の中に延在する、金属ワイヤであることができる。電極のために典型的に使用される任意の金属が、金属電極のために使用されることができる。本金属ワイヤは、高電圧源等の電圧源に接続される。図１Ａに示される金属ワイヤの長さは、例示にすぎない。金属ワイヤは、中空本体の中に任意の長さで延在することができる。金属ワイヤは、図１Ａに示されるように、中空本体の遠位端まで延在することができる。代替として、金属ワイヤは、本体の中にそれほど遠く延在せず、図１Ａに示されるものよりはるかに短くあることができる。中空本体に添加される溶媒の量は、ワイヤが本体に添加された溶媒と相互作用するために本体の中に十分に延在すべきであるため、金属ワイヤの長さを決定し得る。
【００５３】
図１Ａに示されるように、金属ワイヤは、中空本体内で同軸に配置されてもよいが、これは、要求されない。典型的には、金属ワイヤは、図１Ａに示されるように、中空本体の壁に触れない。金属ワイヤ電極およびその結合部は、中空本体に取り外し可能または恒久的に取り付けられることができる。図１Ａに示されるように、金属ワイヤ電極およびその連結部は、中空本体に取り外し可能に取り付けられる。これは、中空本体の近位端が、本体の中への流体の導入のためのポートとして作用することを可能にする。そのような実施形態では、金属ワイヤ電極およびその結合部は、中空本体から除去され、流体が本体の中に導入される開口部を残す。いったん導入されると、金属ワイヤ電極およびその結合部は、中空本体に取り付けられ、中空本体を密閉する。
【００５４】
他の実施形態では、取付は、恒久的取付であって、本体に沿った１つまたはそれを上回る別個の流体ポートが、流体を中空本体に導入するために使用される。中空本体への金属ワイヤ電極およびその結合部の取付が、取り外し可能な取付である場合でも、中空本体は、依然として、本体に沿って１つまたはそれを上回る別個のポートを含み、流体を中空本体に導入することができる。
【００５５】
図１Ａに示されるように、中空本体内の液体への高電圧の導入は、スプレーの形態で中空本体の遠位先端から液体を吐出させる。質量分析計の入口は、プローブから吐出された液体を受容するように動作可能に位置する。本距離は、典型的には、１０ｍｍ未満であるが、しかしながら、サンプルからの信号が質量分析計内において生成されることを可能にする任意の距離が、好適である。本距離は、単に、プローブと質量分析計の入口との間の間隔を調節し、質量分析計によって生成される読取値を監視することによって、当業者によって決定されることができる。
【００５６】
他の実施形態では、延伸先端の外側壁は、金属でコーティングされることができる。高電圧は、スプレーイオン化のために、金属コーティングを通して印加されることができる。
【００５７】
当技術分野において公知の任意のタイプの質量分析計が、本発明のプローブと併用されることができる。例えば、質量分析計は、標準的ベンチトップ質量分析計であることができる。他の実施形態では、質量分析計は、小型質量分析計である。例示的小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ  ，２００６，  ７８，  ５９９４−６００２）に説明されており、その内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。数千ワットの電力を伴う実験室規模の器具のために使用されるポンプシステムと比較して、小型質量分析計は、概して、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．に説明されるシステムのための５Ｌ／分（０．３ｍ３／時間）ダイヤフラムポンプおよびｌｌＬ／秒ターボポンプのみを伴う１８Ｗポンプシステム等、より小さいポンプシステムを有する。他の例示的小型質量分析計は、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８０：７１９８−７２０５，２００８）、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８３：１８５７−１８６１，２０１１）、およびＳｏｋｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２０１１、３０６，１８７−１９５）に説明されており、そのそれぞれの内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。小型質量分析計はまた、例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＪＡＬＡ，２０１０，１５，４３３−４３９）；Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１，２４２１−２４２５）；Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２，１８７−２１４）；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，２００９，１６，１１−２０）；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７８（１７），５９９４−６００２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍ．，２００６，１７０９−１７１１）；およびＦｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，７９，８０７６−８０８２）にも説明されており、そのそれぞれの内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。
【００５８】
ある実施形態では、質量分析計入口は、イオン化プローブから遠隔に位置し、イオン移送部材が、より長い距離にわたって移送するために使用される。例示的イオン移送部材は、例えば、Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第８，４１０，４３１号）に説明されており、その内容は、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。
【００５９】
ある実施形態では、本発明のイオン化プローブは、空気圧補助を伴わずに動作する。すなわち、本発明のプローブを用いると、空気圧補助が、検体を輸送するために要求されない。むしろ、電圧は、単に、質量分析計の正面に保持される基質に印加される。しかしながら、ある実施形態では、噴霧ガスが、本発明のシステムと併用され、脱溶媒和を補助してもよい。噴霧ガスは、パルス状であるか、または連続流れとして提供されるかのいずれかであってもよい。他の実施形態では、ガス生成デバイスが、ガスを中空本体の中に注入し、サンプルおよび溶媒をプローブの遠位先端まで押動し得るように、プローブに動作可能に結合される。ガスは、典型的には、窒素またはアルゴン等の不活性ガスであるが、また、空気であることもできる。
【００６０】
ある実施形態では、イオン化プローブは、溶媒の連続流れ等の溶媒流れから離散（すなわち、別個または分断される）されて保たれる。代わりに、溶媒およびサンプルの離散量が、プローブの中空本体の中に導入される。プローブは、次いで、電圧源に接続され、サンプルのイオンを生成し、これは、続いて、質量分析される。サンプルは、別個の溶媒流れの必要なく、中空本体を通して輸送される。前述のように、空気圧補助は、検体を輸送するために要求されない。むしろ、電圧は、単に、質量分析計の正面に保持される、抽出された検体を含むプローブ内の溶媒に印加される。
【００６１】
図１Ｂは、本発明のシステムのための例示的使用方法を示す。ある実施形態では、そのような方法は、溶媒を遠位先端を含む中空本体の中に導入するステップを伴う。サンプルもまた、中空本体の中に導入される。溶媒は、サンプルと不混和性であって、少なくとも１つの検体をサンプルから溶媒の中に抽出する。電圧は、検体が本体の遠位先端から排出されるように、中空本体内において、抽出された検体を含む溶媒に印加され、それによって、検体のイオンを生成する。これらの排出されたイオンは、次いで、分析される。
【００６２】
図１Ｂは、延伸先端を伴う毛細管内に隣接して注入される、液体サンプルおよび有機溶媒の２つの不混和性相を示す。異なる相の異なる極性を前提として、１つまたはそれを上回る検体は、サンプルから溶媒の中に移動する（サンプルから溶媒の中への検体の抽出）。本抽出プロセスは、毛細管を傾けるか、またはガス圧力を印加すること等により、液相を前後に毛細管内で移動させ、マイクロ抽出を促進することによって、促進されることができる。液相は、次いで、ガス圧力を印加することによって（プローブに動作可能に結合されるガス生成デバイスから）、抽出相が毛細管の延伸先端に到達するのに伴って押動され得、ワイヤ電極が、抽出溶媒の中に挿入され、ナノＥＳＩのために、ＤＣ電圧を印加する。電圧は、質量分析計の入口に到達するスプレーとして、溶媒を中空本体の遠位先端から排出させる。
【００６３】
本発明の方法は、有機または非有機、生物学的または非生物学的等、任意のタイプのサンプルと併用されることができる。ある実施形態では、サンプルは、生体組織から導出されるか、または血液、尿、唾液、もしくは脊髄液等の生物学的流体である。サンプルは、分析されるべき着目検体を含んでもよい。本検体は、サンプル由来であることができ、またはサンプルの中に導入されてもよい。例示的検体として、治療用薬物、乱用薬物、および他のバイオマーカーが挙げられる。本明細書における実施例は、マトリクス効果の効果的抑制が、治療用薬物、乱用薬物、および他のバイオマーカーに対して達成されたことを示す。ある実施形態では、本発明のシステムおよび方法は、生体流体サンプルまたは液体サンプルの直接分析のために使用されることができる。
【００６４】
溶媒は、サンプルと不混和性であって、サンプルの抽出およびイオン化の両方に対して機能する限り、任意の溶媒であってもよい。典型的には、選定される溶媒は、分析されるべきサンプルおよび／またはサンプル中にあると考えられる着目検体に依存し得る（図１９）。考慮されるべき要因は、溶媒の極性である。２相抽出システムでは、理想的には、溶媒は、サンプルおよび／またはサンプル中にあると考えられる着目検体と異なる極性を有する。例えば、水性サンプルは、典型的には、高極性を有し、したがって、溶媒の良好な選択肢は、低極性を伴う有機溶媒となるであろう（例えば、メタノールまたは酢酸エチル、もしくはそれらの溶媒を含む混合物、例えば、水／メタノール混合物または水／酢酸エチル混合物）。油サンプルは、典型的には、低極性を有し、したがって、溶媒の良好な選択肢は、水／メタノール混合物等のより高い極性を伴う溶媒となるであろう。当業者は、分析されるべきサンプルに基づいて、使用に適切な溶媒を判定することが可能であり得る。
【００６５】
溶媒の別の考慮点は、サンプルからの検体の抽出のために良好であることに加え、また、サンプルをイオン化するためにも使用されることができることである。すなわち、溶媒は、抽出および抽出された検体のイオン化の両方に適合性であり得る。実施例に図示されるように、メタノールおよび酢酸エチルは、検体の抽出ならびに検体のイオン化のために良好に機能する一方、クロロホルムは、抽出のためには良好に機能するが、検体のイオン化のためにはそうではない。典型的には、溶媒がまた、サンプルと不混和性であって、検体をサンプルから抽出可能である限り、エレクトロスプレーイオン化と適合性のある溶媒が、可能性として、本発明のシステムおよび方法と併用されることができる。質量分析法の経験を有する当業者は、エレクトロスプレーイオン化と適合性のある特定の溶媒を熟知している。
【００６６】
本発明の方法はまた、標的検体の全体的分析効率を改善するために使用され得る、リアルタイム化学的反応を伴うことができる。そのような派生を行うために、荷電官能基を検体に付与する薬剤を含有する溶液が、中空本体に導入される。本溶液は、典型的には、溶媒とサンプルとの間に導入される。溶液中の薬剤は、サンプル中の検体と相互作用し、荷電官能基をサンプルに付与し、検体のイオン化を可能にする。
【００６７】
ある実施形態では、１つを上回る検体（例えば、複数の検体）が、サンプルから溶媒の中に抽出される。複数の検体は、同時に抽出されることができる。代替として、検体は、典型的には、検体の極性および溶媒の極性に基づいて、溶媒の中に差動的に抽出される。
【００６８】
本発明の方法は、２つの不混和性流体を使用して論じられたが、本発明のシステムおよび方法は、２つの流体の使用に限定されない。任意の数の流体が、３つの流体、４つの流体、５つの流体等、本発明のシステムおよび方法と併用されることができる。ある実施形態では、３つの流体システムが、使用される。そのような実施形態では、２つの混和性流体は、不混和性流体によって分離される。例示的３つの流体システムは、図６に示される。サンプル−溶媒架橋−抽出／スプレー溶媒の極性は、高−低−高または低−高−低であることができる。適切な疎水性を伴う毛細管表面は、溶媒架橋を安定化させるために選択することができ、これは、類似極性（混和性であることを意味する）のサンプル相および抽出溶媒相を分離する。実施例として、抽出のための尿サンプルプラグおよびメタノール／水プラグが、酢酸エチルまたはヘキサンによって分離されることができ、そして疎水性表面を伴うＴｅｆｌｏｎ毛細管が、使用され得る。
【００６９】
ある実施形態では、本発明のシステムおよび方法はまた、後に分析されるであろうサンプルを調製するために使用されることができる。抽出溶媒は、液体サンプルとして貯蔵されるか、または紙基質もしくはＭＡＬＤＩプレート上に堆積され、乾燥されたサンプルスポットを調製することができる。内部標準が、ＳＦＭＥプロセスの間、乾燥されたサンプルスポットの中に組み込まれることができる。標的検体は、ＳＦＭＥプロセスの間、化学修飾されることができる。
【００７０】
他の実施形態では、中空本体は、抽出毛細管がイオン化プローブとして使用されないため、遠位先端を要求しない。そのような実施形態では、抽出は、単に、前述のように、毛細管内で行われる。抽出が完了した後、抽出された検体を含有する溶媒は、毛細管から取り出され、次いで、当技術分野において公知の任意の方法を使用して分析される。例えば、抽出された検体を含有する溶媒が、図６に示されるように、別個のイオン化プローブの中に装填され、次いで、質量分析法によって分析されてもよい。他の実施形態では、検体は、当技術分野において公知の任意の分光法技法または他のアッセイ等の異なる様式で分析される。
【００７１】
（参照による援用）
特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ等、他の文書の参照および引用が、本開示全体を通してなされている。全てのそのような文書は、あらゆる目的のために、それらの全体が、本明細書に参照することによって本明細書に援用される。
【００７２】
（均等物）
本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の種々の修正および多くのそのさらなる実施形態が、本明細書に引用される科学的および特許文献の参照を含む、本書の全容から、当業者に明白となる。本明細書における主題は、その種々の実施形態およびその均等物における、本発明の実践に適合され得る、重要な情報、例示、および指針を含んでいる。
【実施例】
【００７３】
実施例１：マイクロ抽出プロトコル
本発明のシステムおよび方法が、ベンゾイルエクゴニン、ニコチン、またはメタンフェタミンを含有する１０μＬ尿サンプルを分析するために使用され、１ｎｇ／ｍＬを上回るＬＯＤが達成された（図２パネルＡ−Ｃ）。化学的平衡が、より高い傾斜率（約３０／分）でより高速に達成された。信号の有意な改善が、マトリクス効果の効果的抑制に起因して、抽出溶媒に対して比較的に低分配係数を伴う検体に対しても観察された。異なる溶媒が、抽出のために試験された。クロロホルム等の非極性溶媒は、抽出のために効率的であるが、後続イオン化のためには比較的不良であることが見出された。メタノールのオンライン注入が、これらの溶媒の中に抽出される検体の直接イオン化を促進するために使用され得た。しかしながら、酢酸エチルは、ナノＥＳＩによって等、抽出およびイオン化の両方のために効果的であることが見出された。種々の方法がまた、動作手順を単純に維持しながら、定量化のための内部標準の組み込みのために模索された。良好な直線性（Ｒ２＝０．９９）を伴うニコチンの較正が、得られた（図２パネルＢ）。
【００７４】
実施例２：リアルタイム誘導体化
本発明の方法はまた、標的検体の全体的分析効率を改善するために使用され得る、リアルタイム化学反応を伴うことができる。これは、尿中のステロイドの分析によって例示される。その効率は、ステロイドを尿から抽出するために高いはずであると期待された。しかしながら、ステロイドは、スプレーイオン化によってイオン化することが困難である。リアルタイム誘導体化が、５％ヒドロキシルアミンを伴う３μＬ水溶液を抽出溶媒（酢酸エチル）と尿サンプルとの間に注入することによって、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩのために行われた（図３Ａ−Ｂ）。サンプルおよびステロイドと迅速に混合された反応物溶液は、有機相の中に抽出されている間に、荷電官能基を用いて誘導体化された。ＭＳスペクトル中の信号は、数桁の大きさで改善された。０．２、０．７、０．６、０．８ｎｇ／ｍＬのＬＯＤが、それぞれ、１０ｍＬを下回る量の尿サンプル中において、５α−アンドロスタン−３β、１７β−ジオール−１６−オン、エピテストステロン、４，６−コレスタジエン−３−オン、およびスチグマスタジエノンに対して得られた。
（反応スキーム）
【化１】
2019124696.tif 000003
（生成イオン）
スキーム１．ステロイドに及ぼすヒドロキシルアミンとカルボニル基との間の反応
【００７５】
図５パネルＡ−Ｄは、反応性スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩと試薬としてヒドロキシルアミンを併用して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。合成尿中、１０μＬの８ｎｇ／ｍＬエピテストステロン（図５パネルＡ）、５ｎｇ／ｍＬ５α−アンドロスタン−３β、１７β−ジオール−１６−オン（図５パネルＢ）、５ｎｇ／ｍＬ６−デヒドロコレステノン（図５パネルＣ）、および５ｎｇ／ｍＬスチグマスタジエノン（図５パネルＤ）とした。０．１％酢酸および１０％ヒドロキシルアミンを含有する５μＬ水溶液が、試薬相として添加された。５μＬ酢酸エチルが、抽出相として使用された。
【００７６】
前述のサンプルの分析は、そうでなければ、サンプル抽出、液体クロマトグラフィ、およびエレクトロスプレーイオン化または大気圧化学的イオン化を使用した質量分析を使用する、従来の実験室手順を使用して分析される必要があるであろう。要求されるサンプル量は、有意により大きくなる（約１ｍＬ）。
【００７７】
実施例３：低粘度を伴う生物学的流体の直接分析
尿等の生物学的サンプルが、直接、ＳＦＭＥナノＥＳＩを使用して分析された。図２パネルＡ−Ｃは、合成尿サンプル中のメタンフェタミン（図２パネルＡ）、ニコチン（図２パネルＢ）、およびベンゾイルエクゴニン（図２パネルＣ）の定量化のための較正曲線である。薬物および内部標準を含有する１０μＬ合成尿が、測定のためのサンプルとして使用された。５μＬ酢酸エチル（ＥＡ）が、抽出、精製、およびスプレーのための抽出相として使用された。内部標準：メタンフェタミン−ｄ８（０．８ｎｇ／ｍＬ）、ニコチン−ｄ３２（ｎｇ／ｍＬ）、ベンゾイルエクゴニン−ｄ３（１ｎｇ／ｍＬ）。使用される単一反応監視（ＳＲＭ）遷移：メタンフェタミンｍ／ｚ１５０→９１；メタンフェタミン−ｄ８ｍ／ｚ１５８→９３；ニコチン１６３→１３０、ニコチン−ｄ３ｍ／ｚ１６６→１３０；ベンゾイルエクゴニンｍ／ｚ２９０→１６８；ベンゾイルエクゴニン−ｄ３ｍ／ｚ２９３→１７１。分配係数：ＬｏｇＰｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ＝２．０７；ＬｏｇＰｎｉｃｏｔｉｎｅ＝１．１７、ＬｏｇＰbenzoylecgonine＝−０．５９。
【００７８】
高濃度塩に起因するマトリクス効果は、最小限にされた。良好なＬＯＤが、乱用薬物である、抽出相に対して比較的に低分配係数を伴うベンゾイルエクゴニンに対しても得られた。分配係数（ＬｏｇＰ）は、以下のように定義される。
ＬｏｇＰ＝ｌｏｇ（［溶質］ｏｃｔａｎｏｌ／［溶質］ｗａｔｅｒ）（これは、平衡時の水性相と混和しないオクタノール等の有機相中の非イオン化化合物の溶解度差を表す。）
【００７９】
実施例４：粘性生体流体の直接分析
粘性生体流体サンプルのために、サンプルの希釈が、本発明のシステムおよび方法との動作を可能にするために適用された。実施例として、薬物を含有する血液サンプルは、ＳＦＭＥナノＥＳＩによる分析の前に、１０倍に希釈された。図４パネルＡ−Ｂにおけるデータは、本発明の方法が血液サンプルからの検体を分析可能であったことを示す。図４パネルＡ−Ｂは、スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩを使用して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。それぞれ、４０ｎｇ／ｍＬニコチン（図４パネルＡ）および４０ｎｇ／ｍＬメタンフェタミン（図４パネルＢ）を含有するウシ血液サンプルが、水で１０倍に希釈され、次いで、ＳＦＭＥナノＥＳＩを使用して分析された。１０μＬの希釈されたサンプル、５μＬ酢酸エチルが、使用された。
【００８０】
実施例５：分析性能の概要
【表１】
2019124696.tif 000004
【００８１】
実施例６：油サンプルの直接分析
前述の実施例は、血液または尿等の高極性の水性サンプル中の薬物化合物が、低極性の有機溶媒に対して抽出されたことを示す。本発明のシステムおよび方法はまた、図７に示されるように、油等の低極性サンプルのサンプルからの検体を水／メタノール溶媒等の高極性の抽出溶媒に対して抽出することによっても適用されることができる。結果は、図８に示されており、これは、本発明のシステムおよび方法を使用した植物油の分析を示す。水とメタノールの混合物が、抽出溶媒として使用された。図８パネルＡは、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール種が、ポジティブモードにおいて、ＭＳスペクトル中で観察されたことを示す、ＭＳスペクトルである。図８パネルＢは、異なる脂肪酸がネガティブモードにおいて取得されたＭＳスペクトル中で観察されたことを示す、ＭＳスペクトルである。
【００８２】
実施例７：３相法
３相法が、図６に例示されるように行われることができる。サンプル−溶媒架橋−抽出／スプレー溶媒の極性は、高−低−高または低−高−低であることができる。適切な疎水性を伴う毛細管表面が、類似極性（混和性であることを意味する）のサンプル相および抽出溶媒相を分離する、溶媒架橋（中央相）を安定化させるために選択されることができる。実施例として、尿サンプルプラグおよび抽出のためのメタノール／水プラグが、酢酸エチルまたはヘキサンによって分離されることができ、疎水性表面を伴うＴｅｆｌｏｎ毛細管が、使用されることができる。尿からのフェニルアラニンの分析は、図９パネルＡ−Ｂに示される。フェニルアラニンは、比較的に高極性である。フェニルアラニン分子は、尿中の塩からそれらを分離するヘキサンを通して、尿からＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ（１：１）に対して抽出された。これは、精製プロセスである。
【００８３】
尿およびヘキサンを伴う２相法が、使用される場合、フェニルアラニンは、比較的に高極性であって、したがって、ヘキサン中の溶解度は、比較的に低く、濃度は、ヘキサン中で低くなるであろう。また、ヘキサンは、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ（１：１）等の極性溶媒と比較して、スプレーイオン化のためにあまり好ましくない。高−低−高としての極性順序におけるサンプル−架橋−スプレーを伴う３相法は、高極性の化合物が、高極性溶媒の中に濃縮されることを可能にし、これは、スプレーイオン化に好適である。後続分析が、前述のように、抽出溶媒をスプレーイオン化のための延伸先端を伴う毛細管（図６）に移送することによって、または毛細管からの直接スプレーイオン化を用いて行われる。
【００８４】
リアルタイム化学的誘導体化が、反応試薬を架橋溶媒または抽出／スプレー溶媒の一方または両方内に添加することによって適用されることができる。リアルタイム内部標準的組み込みは、架橋溶媒または抽出／スプレー溶媒の一方または両方内に内部標準を事前に添加することによって適用されることができる。
【００８５】
実施例８：溶融石英製管類（内径５００μｍ）内におけるマイクロ抽出
ＳＦＭＥサンプル処理は、一般に、液体クロマトグラフィシステム内の液体ラインとして使用される、より小さい直径の溶融石英製管類（例えば、５００μｍまたはそれ未満の内径を有する管類）内で行われることができる。抽出は、押動および引動力を管類の片側に印加することによって、誘発されることができる。抽出物は、ナノＥＳＩによって直接分析されるか、またはさらなる動作のために貯蔵されるかのいずれかであることができる。
【００８６】
図１０は、ウシ全血中の５０ｎｇ／ｍＬアミトリプチリンの分析を示す。分子イオンのＭＳ／ＭＳスペクトルが、収集された。血液サンプルは、最初に、粘度の減少としてＨ２Ｏを使用して１０倍に希釈された。抽出のために、５μｍの希釈されたサンプルが、本発明の方法を使用して、溶融石英製管類（内径５００μｍ）内で処理された。抽出物は、次いで、ナノＥＳＩエミッタの中に注入され、ナノＥＳＩによって分析された。
【００８７】
実施例９：スラグ流マイクロ抽出ナノＥＳＩを使用した生体流体サンプルの直接質量分析法分析
単純手順を伴う生体流体の直接質量分析法（ＭＳ）分析は、ＭＳ技術の臨床および診療現場用途への移行における重要なステップを表す。現在の研究は、血液および尿中の有機化合物のＭＳ分析のために、スラグ流マイクロ抽出およびナノＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）を使用した単一ステップ方法の開発を報告している。高感度および定量化精度が、５μＬサンプル中の治療用および違法薬物の分析のために達成されている。リアルタイム化学的誘導体化が、アナボリックステロイドを分析するために組み込まれている。酵素機能の監視もまた、湿潤血液中のコリンエステラーゼを用いて実証されている。報告された研究は、生物学的サンプルのＭＳ分析の従来の複雑な実験室手順の代わりに、単純動作で高度に機能する使い捨てカートリッジの将来的開発を促す。
【００８８】
質量分析法（ＭＳ）は、化学的および生物学的分析のための有力なツールとして実証されている。定量化における高特異性、高感度、および高精度は、従来、マトリクス効果をＭＳ分析に先立ったサンプル抽出およびクロマトグラフィ分離を通して排除することによって、実験室において達成される。特に、ペーパースプレーを使用した最近の実証を伴う、大気圧イオン化の開発は、高定量化性能であるが、ごく少量のサンプルを消費する高度に簡略化されたプロトコルを使用する、直接ＭＳ分析のための有望な将来性を示した。これは、ＭＳ分析の実験室外用途、特に、診療現場（ＰＯＣ）診断への移行に非常に重要であり得る。本方向性に沿った開発成功のための根本原理は、サンプル消費を最小限にし、検体抽出およびイオン化のための統合されたプロセス内で高効率を達成することである。スラグ流マイクロ抽出（ＳＦＭＥ）およびナノＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）は、生体流体サンプルの１ステップ分析を行うために組み合わせられることができる。優れた感度および高定量化精度が、わずか５μＬの血液および尿サンプルを用いて得られた。より重要なこととして、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ方法は、単純デバイスを使用して、高性能質量分析のために必要である、液体−液体抽出、内部標準（ＩＳ）の組み込み、化学的誘導体化、またはさらに酵素反応を含む、種々の異なるプロセスを組み込む方法を実証した。
【００８９】
全ての実験は、ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて実施された。ウシ血液は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｖ．（Ｎｏｖｉ，ＭＩ，ＵＳＡ）から購入された。酵素反応研究のためのヒト貯留血液が、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入された。合成尿は、ＣＳＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入された。ステロイドは、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｐｏｒｔ，ＲＩ，ＵＳＡ）から購入された。全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入された。
【００９０】
ナノＥＳＩのための延伸先端を伴う０．８ｍｍ内径（図１１パネルＡ）の使い捨てガラス製毛細管が、サンプリングイオン化プロセス全体を行うために使用された。２つの隣接する液体プラグが、５μＬ有機溶媒および５μＬ尿または血液サンプルを毛細管の中に連続して注入することによって形成された。生体流体から有機溶媒の中への検体の液体−液体抽出が、予期されるが、小界面接触面積に起因して、非常に低効率である。しかしながら、抽出速度は、毛細管を傾けることによって（図１１パネルＡおよび図１２パネルＡ）、または空気圧を通して押動および引動力を印加することによって（図１２パネルＢ）、促進され得る、２つの液体プラグの移動によって誘発されたスラグ流を用いて有意に改善され得た。スラグ流は、毛細管壁との摩擦に起因して形成され、各プラグの内側の流れ（図１１パネルＡ）は、検体を液体−液体界面に、およびそこから離れるように移送し、したがって、抽出効率を有意に改善する。抽出プロセス後、有機溶媒プラグは、単に、毛細管の先端に押動されることができる。ステンレス鋼ワイヤが、次いで、生体流体サンプルを通して挿入され、有機溶媒プラグに到達した。高電圧が、印加され、ＭＳ分析のためのナノＥＳＩを生成した（図１１パネルＢ）。有機溶媒の選択は、重要である。それは、生体流体サンプルと不混和性であって、標的検体に対して良好な溶解度を有し、ナノＥＳＩに好適なものであるべきである。いくつかの有機溶媒が、試験され（図１９）、弱極性の酢酸エチルが、尿（図１１パネルＣ−Ｄ）および血液サンプル（図１３パネルＡ−Ｂ）中の広範囲の化学化合物を分析するための最適性能を提供することが見出された。
【００９１】
スラグ流を用いた抽出プロセスは、メタンフェタミン、ニコチン、およびベンゾイルエクゴニン（コカインの主要代謝物）を尿サンプルから抽出するために試験されたとき、非常に効率的であることが示された。平衡が、毛細管を５回傾けた後に達成された（図１１パネルＥおよび図２０パネルＡ−Ｄ）。ベラパミルに対する０．０５ｎｇ／ｍＬと良好な検出限界（ＬＯＤ）が、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩを使用して、全血サンプルに対して得られた（表２）。
【表２】
2019124696.tif 000005
【００９２】
血液サンプルが粘度を減少させるために希釈された場合、平衡に到達するために、より少ない抽出サイクルが必要とされた。サンプルと抽出相との間の検体の分布は、分配係数（ｌｏｇＰ、図１４参照）によって相対的に推定されることができる。ｌｏｇＰ２．１を伴うメタンフェタミンの場合、有機抽出溶媒中のその濃度は、ＳＦＭＥ後の尿サンプル中より１００倍高くあることができ、尿サンプルを用いて達成された０．０３ｎｇ／ｍＬの良好なＬＯＤを明白に説明している（表１）。ベンゾイルエクゴニンに対するｌｏｇＰ値は、−０．６であって、これは、有機溶媒中より尿中においてより高い溶解度を有し、酢酸エチルの中への抽出が希釈プロセスであったことを意味する。しかしながら、０．０８ｎｇ／ｍＬのＬＯＤは、それにもかかわらず達成された。これは、未加工尿サンプル中のベンゾイルエクゴニンの検出における制限要因が、ベンゾイルエクゴニンの絶対量または濃度ではなく、尿サンプル中の高濃度の塩に起因するイオン化抑制等のマトリクス効果による干渉であり得ることを示す。塩からのベンゾイルエクゴニンの効率的分離が、ＳＦＭＥプロセスにおいて達成された。抽出相中のベンゾイルエクゴニン濃度が低くても、分析のイオン化効率および全体的感度は、有意に改善された。
【００９３】
感度に加え、定量化における適正な精度が、多くの場合、臨床およびＰＯＣ用途に必須である。内部標準の正確な組み込みのための単純手段が、重要であるが、低侵襲的方法によって採取される小体積のサンプルに対しては困難であり得る。ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩを使用することによって、ＩＳ化合物が、抽出相中にスパイクされ（図１５）、続いて、スラグ流抽出プロセスの間、検体と混合され得る。この方法は、ＩＳが２ｎｇ／ｍＬで酢酸エチル中にスパイク混入されたとき、メタンフェタミン−ｄ８を伴うウシ血液サンプル中のメタンフェタミンの定量化のために試験された。血液サンプルは、１０倍に希釈され、次いで、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩおよびＭＲＭ分析を使用して分析された（それぞれ、検体およびＩＳに対して、遷移ｍ／ｚ１５０から９１およびｍ／ｚ１５８から９４）（図１５、差込図）。測定された検体／ＩＳ比（Ａ／ＩＳ）は、図１５に示されるように、血液中のオリジナル検体濃度の関数としてプロットされた。良好な直線性が、得られ、これは、分配プロセスによって左右される（補足情報における導出参照）。１０％より良好なＲＳＤが、１０ｎｇ／ｍＬより高い濃度のサンプルに対して得られた。
【００９４】
化学的誘導体化は、ＭＳ分析のための分離またはイオン化の効率を改善するために、標的検体の特性を改変する効果的方法である。例えば、尿または血液サンプル中のステロイドは、ＳＦＭＥを使用して、有機相の中に良好に抽出されることが予期される。しかしながら、ナノＥＳＩによる後続イオン化に対する効率は、ステロイド分子の低プロトン親和力に起因して低いであろう。ヒドロキシルアミンとの反応は、ステロイドのイオン化効率を改善する際に効果的であることが以前に証明されており、したがって、本研究では実施例として使用された。５０ｍＭヒドロキシルアミンを含有する５μＬ水の付加的液体プラグが、５μＬ酢酸エチルと２００ｎｇｍｌ−１エピテストステロンがスパイクされた５μＬ尿サンプルとの間に注入された（図１６パネルＡ）。５回のＳＦＭＥサイクルを用いて、ヒドロキシルアミン溶液は、尿サンプルと良好に混合された。反応生成物ｍ／ｚ３０４のＭＳ／ＭＳ分析は、有意に改善された信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）のスペクトルを生成した（図１６パネルＢ−Ｃおよび図２１）。反応性ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩが、エピテストステロン、６−デヒドロコレステノン、５α−アンドロスタン−３β、１７β−ジオール−１６−オン、およびスチグマスタジエノンを含む、５μＬ尿サンプル中の一連のアナボリックステロイドの分析のために適用され、それぞれ、０．７、０．６、０．２、および０．８ｎｇ／ｍＬのＬＯＤが、得られた（表１および図２２）。
【００９５】
ＳＦＭＥを用いた液体−液体抽出プロセスを使用することによって、分析は、今や、直接、湿潤血液サンプルを用いて行われることができる。これは、オリジナル液体サンプルとともにのみ存在する、化学的および生物学的特性を調査するための機会を提供する。例えば、タンパク質の酵素機能は、典型的には、乾燥された血液スポット内またはサンプル抽出のための従来の実験室手順後には、抑えられる。ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩが、全血サンプル中のコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）の酵素活性を監視するために適用された。ＣｈＥは、アセチルチオコリン（ＡＴＣｈ）からチオコリン（ＴＣｈ）への酵素変換を促進する（図１７、パネルＡ）。血液サンプルは、１０倍に希釈され、反応速度を減速させ、ＳＦＭＥのためのスラグ流を促進した。基質であるヨウ化アセチルチオコリンが、１．８ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈された血液サンプルの中に添加され、次いで、５μＬサンプルが、直ちに採取され、５μＬ抽出相とともに毛細管の中に注入された。サンプルおよび抽出溶媒を伴う毛細管は、インキュベーションのために、室温２５℃に置かれた。ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩは、同一サンプル上で繰り返し行われることができ、基質ＡＴＣｈと反応生成物ＴＣｈの比率が、ＣｈＥの酵素活性を特性評価するために、時間の関数として監視することができた。本アプローチにおける潜在的問題は、有機溶媒による酵素機能への損傷であろう。有機抽出相による影響が、５分間のインキュベーションを用いて、酢酸エチルおよびクロロホルム等の他の溶媒に対して調査された。酢酸エチルとの接触に起因するＣｈＥ活性の減少は、最小限であるが、クロロホルムでは、はるかに深刻であった（６０％を上回る低下）ことが見出された。酢酸エチルのような弱極性溶媒は、酵素構造をより良好に保存することができる。
【００９６】
酢酸エチルを抽出溶媒として使用することによって、ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩが、３０分にわたって繰り返し行われ、分析毎に１５００ＶにおけるＳＦＭＥのための５回のサイクルおよび５秒（５ｓ）のナノＥＳＩを伴った。ＴＣｈ／ＡＣＴｈ比は、図１７パネルＢにおいて、時間の関数としてプロットされ、これは、ＣｈＥの酵素活性について特性である。酵素阻害研究が、次いで、本方法の検証として実施された。ドネペジル（アルツハイマー病のための治療用薬物）およびエチオン（ニューロン毒性物）の２つのＣｈＥ阻害剤が、血液サンプルの中に別個にスパイクされ、酵素阻害を異なる程度でシミュレートした。損なわれた酵素活性が、次いで、５分間のインキュベーションを用いたＳＦＭＥ−ナノＥＳＩ方法を使用して、判定された。阻害剤の添加を伴わない血液サンプルと比較して、測定された欠損が、２５ｎｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬにおけるドネペジルと、１０μｇ／ｍＬにおけるエチオンで、処理された血液サンプルについて、図１７パネルＣで報告される。観察された低下％は、以前の研究で報告された知見と一致する。
【００９７】
要するに、スラグ流マイクロ抽出とナノＥＳＩとの組み合わせは、生体流体中の有機化合物の高感度直接分析を可能にした。従来、実験室における複雑な設定を要求する、サンプル処理のための複数のタイプのプロセスが、今や、非常に簡略化された動作手順を伴う、１ステップ分析の中に組み込まれることができる。生体流体サンプルは、乾燥されたスポットにされずに、直接分析されるため、効率的液体−液体抽出が、分配特性に基づいて、設計されることができる。湿潤生体流体の化学的および生物学的特性もまた、留保され、それによって、特性評価されることができる。抽出プロセスは、サンプルおよび抽出プラグの移動を制御することによって、オンおよびオフにされることができる。これは、わずか５μＬの生体流体サンプル中の化学的および生物学的反応のオンライン監視を可能にする。ＭＳ技術の臨床用途への移行の増加する関心に伴って、本開発は、直接分析のための適正な機能を伴う使い捨てサンプルカートリッジを設計することに深い含意を有する。これは、最終的には、複雑な設定および専門知識を要求する、従来の実験室手順の排除につながり得る。小型質量分析計を伴うその実装は、ＰＯＣ診断のための有力な解決策をもたらすであろう。
【００９８】
実施例１０：ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩによる酵素活性監視
酵素反応を開始するために、アセチルチオコリン（最終濃度１．８ｍｇｍＬ−１）が、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍に希釈されたヒト血液サンプルの中に添加された。図１７パネルＢについてのデータを生成する実験のために、アセチルチオコリンが添加された５μＬ血液サンプルが、５μＬ抽出溶媒とともに毛細管の中に装填された。酵素反応進行は、基質（ｍ／ｚ１６２）および反応生成物チオコリン（ｍ／ｚ１２０）のＳＦＭＥ−ナノＥＳＩＭＳ分析を周期的に行うことによって判定された（図１８パネルＡ−Ｂ）。ＳＦＭＥ−ナノＥＳＩＭＳ分析毎に、液体プラグが、押動され、抽出溶媒をスプレーのための毛細管先端に到達させ、次いで、ＭＳ分析後に引き戻された。ＭＲＭが、ＴＣｈ（ｍ／ｚ１２０→６１）およびＡＴＣｈ（ｍ／ｚ１６２→１０２）の強度を測定するために行われた。ＴＣｈ／ＡＴｃｈの比率は、図１７パネルＢにおけるプロットを生成するために使用される。３回の繰り返しが、各時間点について行われ、標準偏差は、図１７パネルＢにおける誤差バーでマークされる。
【図１Ａ】
2019124696.tif 000006
【図１Ｂ】
2019124696.tif 000007
【図２】
2019124696.tif 000008
【図３Ａ】
2019124696.tif 000009
【図３Ｂ】
2019124696.tif 000010
【図４】
2019124696.tif 000011
【図５】
2019124696.tif 000012
【図６】
2019124696.tif 000013
【図７】
2019124696.tif 000014
【図８】
2019124696.tif 000015
【図９】
2019124696.tif 000016
【図１０】
2019124696.tif 000017
【図１１】
2019124696.tif 000018
【図１２】
2019124696.tif 000019
【図１３】
2019124696.tif 000020
【図１４】
2019124696.tif 000021
【図１４Ｂ】
2019124696.tif 000022
【図１５】
2019124696.tif 000023
【図１６】
2019124696.tif 000024
【図１７】
2019124696.tif 000025
【図１８】
2019124696.tif 000026
【図１９】
2019124696.tif 000027
【図２０】
2019124696.tif 000028
【図２１】
2019124696.tif 000029
【図２２】
2019124696.tif 000030