(57)【要約】【課題】サンプル（２７０）を画像化するための顕微鏡モジュール（３００）。【解決手段】この顕微鏡モジュール（３００）は、そのサンプル（２７０）の下面を照射するように配置された照明ビーム・パス（２１５）に沿って照射ビームを生成するための少なくとも１つの照明対物レンズ（２１０）と、検出パス（２２５）を有する少なくとも１つの検出対物レンズ（２２０）と、を備える。その検出パス（２２５）は、その照明ビーム・パス（２１５）に対してある角度にある。【選択図】図３
2019066861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（４０、２７０）を画像化する顕微鏡構成（２００）のための顕微鏡モジュール（３００）であって、
該顕微鏡構成（２００）は、
照明ビーム・パス（２１５）に沿って照明ビームを生成するための光源（２０）と、
検出パス（２２５）に沿った放射された光を検出する検出器（５０）と、
を備え、
前記顕微鏡モジュール（３００）は、
サンプル・ホルダー（２４０）であって、前記顕微鏡構成（２００）において取り外し可能に構成され、前記サンプル（４０、２７０）を前記サンプル・ホルダー（２４０）の上部に保持するのに適合し、前記照明ビームおよび前記サンプル（４０、２７０）からの放射された光に対して少なくとも部分的に透明な底（２６０）を有するサンプル・ホルダー（２４０）と、
前記サンプル・ホルダー（２４０）の下に位置し、前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記照明ビームを向けるための前記顕微鏡構成（２００）のなかに構成される少なくとも１つの照明対物レンズ（２１０）と、
前記サンプル・ホルダー（２４０）の下に位置し、前記検出パス（２２５）に沿って前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記サンプル（４０、２７０）から放射された光を集めるために、前記顕微鏡構成（２００）のなかに構成される少なくとも１つの検出対物レンズ（２２０）と、
を備え、
前記検出パス（２２５）は、前記照明ビーム・パス（２１５）に対してある角度にあり、
前記照明対物レンズ（２１０）および前記検出対物レンズ（２２０）は、前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）に接触する浸漬媒体（２３０）の中に位置し、
前記浸漬媒体（２３０）の屈折率は、光学収差を減少させるために前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）の屈折率と同様である、
顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項２】
前記照明ビーム・パス（２１５）に対する前記検出パス（２２５）の角度は、実質的に直角である、請求項１に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項３】
前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）は、前記サンプル・ホルダー（２４０）の壁（２５０）にアタッチされた膜（２６０）でできている、請求項１または２に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項４】
培養基（２８０）の中に位置する前記サンプル（４０、２７０）を有するのに、更に適合する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項５】
前記培養基（２８０）は、光学収差を減少させるために前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）の屈折率と同様の屈折率を有する、請求項４に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項６】
前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）は、前記サンプル（４０、２７０）を保持するのに適合した突起（２９０）を形成する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項７】
前記照明ビームは、前記突起（２９０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記照明ビームを向けるように構成される、請求項６に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項８】
前記突起（２９０）が、細長いトラフ（２９５）の形をしている、請求項７に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項９】
前記照明ビーム・パスは、水平に対して３０°に構成される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の顕微鏡モジュール（３００）。
【請求項１０】
１つ以上のサンプル（４０、２７０）を画像化する方法であって、
１つ以上のサンプル（４０、２７０）を少なくとも部分的に透明な底（２６０）を有するサンプル・ホルダー（２４０）の上部に配置するステップと、
照明対物レンズ（２１０）および検出対物レンズ（２２０）の上方に前記サンプル・ホルダー（２４０）を取り外し可能に配置するステップであって、前記照明対物レンズ（２１０）および前記検出対物レンズ（２２０）は、前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）に接触する浸漬媒体（２３０）の中に位置し、前記浸漬媒体（２３０）の屈折率は、光学収差を減少させるために前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）の屈折率と同様である、ステップと、
前記照明対物レンズ（２１０）を通して、光源（２０）からの光をパスすることによって、照明ビーム・パス（２１５）に沿って照明ビームを生成するステップと、
前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記照明ビームで前記１つ以上のサンプル（４０、２７０）を照明するステップと、
前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記１つ以上のサンプル（４０、２７０）からの放射された光を前記検出対物レンズ（２２０）で検出するステップと、
前記１つ以上のサンプル（４０、２７０）の画像を生成するステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記１つ以上のサンプル（４０、２７０）の異なるものを選択するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明の分野は、サンプルを画像化するための顕微鏡モジュールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｌａｎｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）は、サンプルを照射するために光シートの生成、および、サンプルの光学セクションの画像化を可能にする垂直検出システムを採用する技術である。サンプルは、生体であってもそうでなくても良い。ほとんどの実施形態においては、ＳＰＩＭシステムは、画像化に対してサンプルを正しい位置に保持するために大がかりなサンプル準備を必要とする。例えば、サンプルは、典型的には、水などの浸漬媒体で充填された小さなチャンバーに浸漬されたアガロース・シリンダーに埋め込まれている。この技術は、１００年以上もの間知られているものであるが、しかし、生体サンプル画像化における広範囲なアプリケーションが見つかったのは、つい、最近のことである。この技術の１つの不利な点は、アガロースが、すべての生物学的試料と両立できないことである。サンプルは、また、現在のＳＰＩＭシステムにおいて限られた高さのアガロースの垂直シリンダーに埋め込まれている。この構成では、画像可能あいだにサンプルにアクセスすること、または、サンプルを再配置することは可能ではない。例えば、５０のサンプルをアガロース・シリンダーの限られた長さにスタックすることができないので、この構成は、画像化できるサンプルの数を制限する。
【０００３】
ＳＰＩＭシステムは、例えば、国際特許出願第ＷＯ  ２００４／０５３５５８号（発明者：Ｓｔｅｌｚｅｒほか、出願人：欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などに記載されている。この開示は、薄い光ストリップ（光シート）がサンプル（試料）を照明し、サンプルを検出器を通して見られる顕微鏡を教示する。検出器の軸が、照射ビームの方向に対して実質的に垂直である。サンプルは、光のストリップを通して位置がずれ、検出器が、サンプルからの拡散光またはサンプルからの蛍光を、一連の画像に記録する。サンプルの３次元画像をサンプルの光学セクショニング、次に、サンプルの全ての画像を再構築することによって生成することができる。
【０００４】
Ｓｈｒｏｆｆほかは、従来の顕微鏡のトランスレーション・ベースに結合する従来の顕微鏡のためのモジュールを開発した（国際特許出願第ＷＯ  ２０１２／１２２０２７号、発明者  Ｓｈｒｏｆほか、出願人：米国）。モジュールと倒立顕微鏡の組合せは、同一のサンプルが２つの方向で互いを補うことができるように画像化されるのを可能にする。
【発明の概要】
【０００５】
サンプルを画像化するための顕微鏡モジュールが、開示される。顕微鏡モジュールは、照明ビーム・パスに沿って照明ビームを生成するための照明デバイスと、検出パスを有する少なくとも１つの検出デバイスとを備える。照明ビームが、１つ以上のサンプルの下表面を照明するように配置される。この照明ビーム・パスは、検出パスに対してある角度に配置される。本願開示の１つの態様において、その角度は、実質的に直角である。サンプルは、培養基に置かれる。サンプルを、生体サンプルの生き残りと相容れないかもしれない、また、サンプルの検索と操作を難しくする、固体または粘りけがあるマウント媒体に搭載する必要はない。
【０００６】
サンプルは、サンプル・ホルダーに置かれる。サンプル・ホルダーの底は、照明ビームが、サンプルを照明することができるように、少なくとも部分的には、照明ビームに対して透明である。そのような透明な底の１つの例は、膜である。サンプル・ホルダーは、その中にサンプルが保持される少なくとも１つの突起を備える。本願開示の１つの態様において、その突起は、複数のサンプルが、培養基で保持される細長いトラフの形であることができる。
【０００７】
サンプル・ホルダーは、顕微鏡モジュールから容易に除去できるように配置される。これは、サンプルを顕微鏡モジュールの外部のサンプル・ホルダーで培養し、そして、次に、邪魔されることなく、画像化のために顕微鏡モジュールに置くことを可能にする。
【０００８】
本願のこの開示の構成は、照明対物レンズと検出対物レンズとをサンプルが置かれる培養基から分離された浸漬媒体に配置されることを可能にする。浸漬媒体からの培養基の分離は、無菌性を維持するのを助け、そのうえ、培養基の少ない量の使用を可能にする。透明な底、浸漬媒体、および、培養基は、光学収差を最小にするために、実質的に同じ屈折率を有する。
【０００９】
本願の開示は、また、複数のサンプルの下表面を照明する照明対物レンズを配置するステップと、照明ビーム・パスに対しておよそ直角の角度で複数のサンプルから放出される光を検出する検出対物レンズを配置するステップと、を含む複数のサンプルを画像化する方法を教示する。検出された光は、複数のサンプルのうちの１つ以上の画像を作成するのに用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、サンプル画像化のための先行技術のＳＰＩＭ構成の概要を示す。
【図２】図２は、本願のこの開示の１つの態様で使用されるＳＰＩＭ構成の概要を示す。
【図３】図３は、顕微鏡モジュールの概要を示す。
【図４】図４は、サンプルが置かれる細長いトラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、本願発明を、図面に基づいて記述する。ここに記述される本願発明の実施形態と態様は、例示的なものにすぎず、どんな形であれ本願請求項の保護範囲を制限しないことが理解される。本願発明は、本願請求項とそれらの均等物によって定義される。本願発明の１つの態様または実施形態の特徴は、本願発明の異なる態様や実施形態の特徴と組み合わせることができることが理解される。
【００１２】
図１は、ＳＰＩＭの基本的な原理を図示しており、より詳細には、米国特許番号ＵＳ７５５４７２５号に記載されている。この開示は、参照によって組み込まれる。構成１０は、レーザー２０を備え、それは、照明対物レンズ２５を通して、サンプル４０のセクションを照明する光シート３０を生成する。光シート３０は、照明ビーム・パス３５に沿って方向付けされる。検出対物レンズ６５は、検出方向５５は、光シート３０の平面に対して実質的に直角（すなわち、照明ビーム・パス３５に対して垂直）であるように、配置される。
【００１３】
サンプル４０は、回転軸４５のまわりに回転することができ、光シート３０は、サンプル４０の光学セクションを照明するように配置することができる。レーザー２０は、典型的には、多くの方向に蛍光を放出するようにサンプル４０でフルオロフォアを励起する。
【００１４】
検出器５０は、検出対物レンズ６５と光学構成６６を通して、光シート３０における放射線によって励起されたサンプル４０のフルオロフォアから放射された蛍光の一部を検出する。検出器５０は、ＣＣＤカメラなどの画像化デバイス６０を有する。これは、メモリ・ストア８０を有するプロセッサ７０に接続している。メモリ・ストア８０は、サンプル４０の光学セクションの各々からの個々の画像８５を格納し、プロセッサ７０は、サンプル４０の３次元画像をつくることができる。
【００１５】
図２は、本願の開示の中で使用される、顕微鏡構成２００の実施形態を示す。図１および図２の中で同一の参照番号は、同一の要素を示すのに用いられる。以下に説明されるように、サンプル４０は、この装置において、十分に安定な状態に保持されるので、この開示において、サンプル４０をアガロースに埋め込む必要はない。
【００１６】
レーザー２０は、ミラー６７と照明対物レンズ２５とを通して、サンプル４０のセクションを照明する光シート３０を生成する。光シート３０は、サンプル４０の下表面を通して、サンプル４０に入る。サンプル４０からの放射された蛍光の大部分は、検出対物レンズ６５を通過し、ミラー２７で反射され、そして、光学的構成６６を通して、画像を形成するように検出器５０の画像化デバイス６０の上にフォーカスする。検出器５０からの画像は、プロセッサ７０へパスされ、そして、個々の画像８５としてメモリ・ストア８０に格納される。
【００１７】
図３は、照明対物レンズ２１０、および、検出対物レンズ２２０を有する顕微鏡モジュール３００の例を示す。照明対物レンズ２１０は、照明ビーム（光シート）によって、照明ビーム・パス２１５に沿って照明する。照明対物レンズ２１０を通した照明ビーム・パス２１５および、検出対物レンズ２２０を通した検出パス２２５は、互いに対して、およそ直角に配置される。照明対物レンズ２１０と検出対物レンズ２２０との両方は、浸漬媒体２３０の中に位置し、そして、それは、典型的にはガスを除去された水または浸漬オイルから成る。水のガス除去は、バブルが、浸漬媒体２３０に存在しないを確実にする。
【００１８】
照明対物レンズ２１０を通した照明ビーム・パス２１５は、サンプル・ホルダー（２４０）の平面に対しておよそ３０°に、サンプル・ホルダー２４０の下に位置する検出パス（２２５）は、したがって、サンプル・ホルダー（２４０）の平面に対しておよそ６０°に位置する。柔軟なプラスチックが、照明対物レンズ２１０の周りを囲み、検出対物レンズ２２０は、浸漬媒体２３０のリークを防止する。
【００１９】
壁２５０を有するサンプル・ホルダー２４０が、ＰＥＥＫなどの生体親和性材料でできている。しかし、それに限られるものではない。また、光学収差を減少するために、浸漬媒体２３０や培養基２８０の実質的に同様の屈折率を持つデュポンによって製造されたテフロン（登録商標）ＦＥＰフィルムなどの、薄い透明な膜でできている底２６０を有する。底２６０の透明な膜は、したがって、透明な膜２６０の上面の上に位置するサンプル２７０の上への放射線の通過を可能にする。底２６０を形成している透明な膜は、生物学的適合性のシリコーン接着剤により、または、クランプにより、サンプル・ホルダー２４０の壁２５０にアタッチされる。この透明な膜は、透明な膜のテンションを保つために、壁２５０によりサポートされない領域においてカーブしている。サンプル・ホルダー２４０は、上部で開いており、そして、この開口部は、要求される場合には、サンプル２７０への容易なアクセスおよびその除去を可能にする。この透明な膜は、それを親水性にするためにプラズマ処理され、そして、浸漬媒体２３０においてバブル形成を防止するのを助ける。
【００２０】
サンプル２７０は、適切な培養基２８０における透明な膜のカーブした領域に位置する。培養基（２８０）は、胚または組織培養基であり、蒸発を防止するために、その表面の上にオイルの層を持つことができる。異なるオイルの屈折率は、サンプル２７０の画像化に影響を及ぼさない。照明ビーム・パス２１５や検出パス２２５は、オイルの中を通過しないからである。培養基（２８０）は、非常に少ない体積、たとえば１０μｌ、を有することができる。そのような培養基２８０の例は、ＫＳＯＭ、Ｍ１６（マウス胚）、ＤＭＥＭ、および、ＲＰＥ（細胞培養）を含む。ただし、それらに限られるものではない。アガロース・シリンダーにサンプル２７０を埋め込む必要はない（当該技術領域で知られているように）。突起２９０は、トラフを形成するように細長いものであることができる（図４参照）。
【００２１】
図３に示される顕微鏡モジュール３００は、培養基２８０から浸漬媒体２３０の隔離を可能にする。これは、浸漬媒体は、サンプル４０を保持している水性媒体と同じである図１の構成１０とは異なることが分かる。
【００２２】
サンプル２７０は、容易に操作することができる。サンプル２７０は、上面から培養基２８０を通してアクセスできるからである。サンプル・ホルダー（２４０）における開口部は、サンプル２７０へのアクセスを可能にする。
【００２３】
図３の構成から、底表面と側表面を含む、サンプル２７０の下部表面だけが、照明対物レンズ２１０からの放射線によって照明されることが分かる。同様に、サンプル２７０の下部表面からの蛍光が、検出対物レンズ２２０によって収集され、したがって、メモリ・ストア８０における画像８５を作成するのに用いられる。
【００２４】
突起２９０は、図４に示されるように、細長いトラフ２９５の形であることができる。本願発明のこの態様は、サンプル２７０の複数のものを、トラフに沿って配置し、同じ顕微鏡モジュール３００を使用して、画像化することを可能にする。そのような構成は、複数のサンプル２７０の高スループット画像化を可能にする。
【００２５】
顕微鏡モジュール３００は、例えば、試験管内で画像化される哺乳類の胚と卵母細胞などの長期の高いスループット生体セルおよび胚画像化実験を可能にする。
【００２６】
長期の高いスループット生体セルおよび胚画像化実験を実行するための方法は、顕微鏡モジュール３００によって実行することができる。この方法は、照明ビーム・パス２１５に沿って複数のサンプル２７０の下部表面を照明する照明ビームは生成されるように、照明対物レンズ２１０を配置することを含む。検出対物レンズ２２０は、複数のサンプル２７０から放射される蛍光の部分を集める。蛍光は、すべて方向に放射され、検出パス２２５についておよそ１２０°の弧の蛍光が、収集される。検出対物レンズ２２０によって集められる蛍光は、ミラー２７で反射され、光学的構成６６を通して、検出器５０の中の画像化デバイス６０にフォーカスする。画像化デバイス６０は、プロセッサ７０に、画像８５に関するデータを送信し、プロセッサ７０は、複数のサンプル２７０のうちの１つ以上の３次元画像を作成することができる。
【００２７】
図４から、細長いトラフ２９５は、検出対物レンズ２２０と照明対物レンズ２１０とが、複数のサンプル２７０の異なるものを画像化するために、細長いトラフ２９５をスキャンするように、動かされることができることが分かる。検出対物レンズ２２０と照明対物レンズ２１０とは、光学テーブルにたいして固定されたままである。
【００２８】
培養基２８０が、検出対物レンズまたは、照明対物レンズのどちらによっても邪魔されないままであり、また、無菌のままであり、長期の実験を可能にする。
【符号の説明】
【００２９】
参照番号
１０    構成
２０    レーザー
２５    照明対物レンズ
２７    ミラー
３０    光シート
３５    照明ビーム・パス
４０    サンプル
４５    回転軸
５０    検出器
５５    検出方向
６０    画像化デバイス
６５    検出対物レンズ
６６    光学構成
６７    ミラー
７０    プロセッサ
８０    メモリ・ストア
８５    画像
２００    顕微鏡構成
２１０    照明対物レンズ
２１５    照明ビーム・パス
２２０    検出対物レンズ
２２５    検出パス
２３０    浸漬媒体
２４０    サンプル・ホルダー
２５０    壁
２６０    底
２７０    サンプル
２８０    培養基
２９０    突起
２９５    トラフ
３００    顕微鏡モジュール
【図１】
2019066861.tif 000003
【図２】
2019066861.tif 000004
【図３】
2019066861.tif 000005
【図４】
2019066861.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月28日(2018.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（４０、２７０）を画像化する顕微鏡構成（２００）のための顕微鏡モジュール（３００）であって、
該顕微鏡構成（２００）は、
照明ビーム・パス（２１５）に沿って照明ビームを生成するための光源（２０）と、
検出パス（２２５）に沿った放射された光を検出する検出器（５０）と、
を備え、
前記顕微鏡モジュール（３００）は、
サンプル・ホルダー（２４０）であって、前記顕微鏡構成（２００）において取り外し可能に構成され、前記サンプル（４０、２７０）を前記サンプル・ホルダー（２４０）の上部に保持するのに適合し、前記照明ビームおよび前記サンプル（４０、２７０）からの放射された光に対して少なくとも部分的に透明な底（２６０）を有するサンプル・ホルダー（２４０）と、
前記サンプル・ホルダー（２４０）の下に位置し、前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記照明ビームを向けるための前記顕微鏡構成（２００）のなかに構成される少なくとも１つの照明対物レンズ（２１０）と、
前記サンプル・ホルダー（２４０）の下に位置し、前記検出パス（２２５）に沿って前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）を通して前記サンプル（４０、２７０）から放射された光を集めるために、前記顕微鏡構成（２００）のなかに構成される少なくとも１つの検出対物レンズ（２２０）と、
を備え、
前記検出パス（２２５）は、前記照明ビーム・パス（２１５）に対してある角度にあり、
前記照明対物レンズ（２１０）および前記検出対物レンズ（２２０）は、前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）に接触する浸漬媒体（２３０）の中に位置し、
前記浸漬媒体（２３０）の屈折率は、光学収差を減少させるために前記サンプル・ホルダー（２４０）の前記少なくとも部分的に透明な底（２６０）の屈折率と同様である、
顕微鏡モジュール（３００）。