(57)【要約】【課題】  本発明は、繊維芽細胞遊走能及び増殖能に優れ、創傷の治癒や皮膚状態の改善を促進することができる細胞賦活剤を提供することを目的とする。【解決手段】  アミノ酸配列としてＶＧＶＰＧ配列（１）を必須部分として含み、ＶＧＶＰＧ配列（１）のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸を有するポリペプチド（Ａ）を含有する細胞賦活剤を用いる。さらにアミノ酸配列としてＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を含むポリペプチド（Ａ）が好ましい。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列としてＶＧＶＰＧ配列（１）を必須部分として含み、ＶＧＶＰＧ配列（１）のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸を有するポリペプチド（Ａ） を含有する細胞賦活剤 。
【請求項２】
アミノ酸配列としてＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を含むポリペプチド（Ａ）を含有する請求項１に記載の細胞賦活剤。
【請求項３】
アミノ酸配列として（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（３）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（４）を含むポリペプチド（Ａ）を含有する請求項１又は２に記載の細胞賦活剤。
【請求項４】
アミノ酸配列がＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）であるポリペプチド（Ａ）を含有する請求項１又は２に記載の細胞賦活剤。
【請求項５】
ポリペプチド（Ａ）のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量 が０．４〜２００ｋＤａである請求項１〜４いずれかに記載の細胞賦活剤。
【請求項６】
細胞賦活剤の重量に基づいて、ポリペプチド（Ａ）の含有量が ０．００００００００１〜３０重量％である請求項１〜５いずれかに記載の細胞賦活剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞賦活剤を含む創傷治癒剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞賦活剤を含む化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞賦活剤に関する。詳しくは、細胞の遊走や増殖を促進する作用を有し、創傷治癒や皮膚状態の改善に適した細胞賦活剤に関する。  
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒や皮膚状態の改善は、炎症細胞や繊維芽細胞等の移動、増殖、新たな血管の形成及び細胞間質の蓄積等のような組織反応が順次起こることによりなされる。
このような創傷治癒や皮膚状態の改善に関連した一連の過程は、損傷部位組織の種々の細胞、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）上皮成長因子（ＥＧＦ）等の多様な種類のサイトカイン及びコラーゲン、フィブロネクチン及びプロテオグリカン等のような細胞間質等の相互作用によりなされている。
【０００３】
近年、創傷治癒や皮膚状態の改善を促進する為の組成物として上述したサイトカインを含む組成物等が開発されている。
例えば、線維芽細胞増殖因子は繊維芽細胞の増殖を促進することにより、創傷治癒や皮膚状態の改善を促進するものとして知られており、これを利用した創傷治療剤等が開発されている(特許文献１）。
一般的に、上述の線維芽細胞増殖因子のような多数のアミノ酸からなるタンパク質（ペプチド）は生体内に投与すれば、代謝されてペプチド結合が切断され、医薬品や化粧品等として製品化する段階で分解され易い短所がある。
【０００４】
従って、ペプチドの長さをなるべく短くして分解されにくくするのが好ましいものの、その活性は維持されなければならないので、細胞賦活活性を有する最小アミノ酸配列を見出すことは有益な課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５１５５２１４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、繊維芽細胞遊走能及び増殖能に優れ、創傷の治癒や皮膚状態の改善を促進することができる細胞賦活剤を提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、アミノ酸配列としてＶＧＶＰＧ配列（１）を必須部分として含み、ＶＧＶＰＧ配列（１）のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸を有するポリペプチド（Ａ） を含有する細胞賦活剤；並びにこの細胞賦活剤を含む創傷治癒剤及び化粧料である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞賦活剤は、繊維芽細胞遊走能及び増殖能に優れ、細胞を賦活化させることで創傷の治癒や皮膚状態の改善を促進するという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の細胞賦活剤について具体的な実施形態を示しながら説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において適宜変更して適用することができる。
【００１０】
本発明の細胞賦活剤は、アミノ酸配列としてＶＧＶＰＧ配列（１）を必須部分として含み、ＶＧＶＰＧ配列（１）のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸を有するポリペプチド（Ａ） を含有する。
本発明の細胞賦活剤が、上記構成であることにより、繊維芽細胞遊走能及び増殖能に優れ、細胞を賦活化させることができる。したがって、創傷の治癒や皮膚状態の改善を促進することが期待される。
【００１１】
本発明において、細胞賦活剤とは細胞賦活性を高めるものであり、細胞賦活性とは細胞の繊維芽細胞遊走能や増殖能を高める性能である。
【００１２】
まず、本発明の細胞賦活剤に含有されるポリペプチド（Ａ）について説明する。
ポリペプチド（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。
有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。
遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。
天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、ポリペプチド（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
【００１３】
ポリペプチド（Ａ）はアミノ酸配列としてＶＧＶＰＧ配列（１）を必須部分として含み、ＶＧＶＰＧ配列（１）のＮ末端又はＣ末端に少なくとも１個のアミノ酸を有するポリペプチド（Ａ） である。
また、ポリペプチド（Ａ）は、細胞賦活性の向上の観点から、上記アミノ酸配列を１〜２００個有することが好ましく、さらに好ましくは１〜１５０個であり、１〜１００個有することが特に望ましい。
【００１４】
ポリペプチド（Ａ）が、ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸配列を２個以上有する場合、各アミノ酸配列は同一でも異なっていてもよい。
また、同一のアミノ酸配列を複数含む場合、連続していてもよい。具体的には、（ＶＧＶＰＧ）ａ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてａは、アミノ酸配列の連続する個数であり、２〜２００の整数である。
アミノ酸配列が連続する個数のａは、細胞賦活性の向上の観点から、２〜１００が好ましく、さらに好ましくは２〜５０であり、特に好ましくは２〜１０である。
【００１５】
また、ポリペプチド（Ａ）において、アミノ酸配列が連続するものである場合、ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸配列の連続する個数のａは、同一でも異なっていてもよい。
【００１６】
また、ポリペプチド（Ａ）としては、細胞賦活性の向上の観点から、アミノ酸配列としてＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を含むポリペプチドが好ましい。
さらに、ポリペプチド（Ａ）は、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を１〜５０個有していることが好ましく、１〜４０個有することがさらに好ましく、１〜２０個有することが最も好ましい。
【００１７】
また、ポリペプチド（Ａ）が、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を２個以上有する場合、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）は連続していてもよい。具体的には、ポリペプチド（Ａ）は（ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ）ｂ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてｂはＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）の連続する数であり、整数である。
ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）が連続する数は、細胞賦活性の向上の観点から、ｂは２〜３０が好ましく、さらに好ましくは２〜１０である。
【００１８】
ポリペプチド（Ａ）は、さらに、ＶＧＶＰＧ配列（１）及びＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列同士の間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。
介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したアミノ酸配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、細胞及び組織への親和性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。
介在アミノ酸配列（Ｚ）の具体例としては、ＶＡＡＧＹ配列（５）、ＧＡＡＧＹ配列（６）及びＬＧＰ配列（７）等が挙げられる。
【００１９】
ポリペプチド（Ａ）のＮ末端及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｓ）があってもよい。
末端アミノ酸配列（Ｓ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｓ）を構成するアミノ酸の数は、細胞及び組織への親和性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。
末端アミノ酸配列（Ｓ）の具体例としては、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（８）等が挙げられる。
【００２０】
ポリペプチド（Ａ）は、上記の末端アミノ酸配列（Ｓ）以外に、発現させたポリペプチド（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、ポリペプチド（Ａ）のＮ末端及び／又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下、これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。
【００２１】
精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
【００２２】
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）と（ｉｉ−１）グルタチオンとの組み合わせ
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と（ｉｉ−２）アミロースとの組み合わせ
（ｉ−３）ＨＱタグと（ｉｉ−３）ニッケルとの組み合わせ
（ｉ−４）Ｍｙｃタグと（ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体との組み合わせ
（ｉ−５）ＨＡタグと（ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体との組み合わせ
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグと（ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体との組み合わせ
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグと（ｉｉ−７）ニッケル又はコバルトとの組み合わせ
【００２３】
前記の精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるポリペプチド（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００２４】
ポリペプチド（Ａ）のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子質量は、細胞賦活性の向上の観点から、０．４〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは０．４〜１２０ｋＤａである。
【００２５】
なお、ＧＰＣ法による分子質量の測定条件は以下の通りである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
【００２６】
本発明の細胞賦活剤として有用なポリペプチド（Ａ）の例としては、（ｉ）ＶＧＶＰＧ配列（１）を含むポリペプチドである。
（ｉ）のうち、さらに好ましい例としては、（ｉｉ）ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（２）を含むポリペプチド； 
（ｉｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（３）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（４）を含むポリペプチドが挙げられる。
【００２７】
これらの好ましいポリペプチド（Ａ）の具体例としては、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（３）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（４）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるポリペプチドに、さらに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（９）が１個化学結合した、分子質量が約８０ｋＤａの配列（１０）のポリペプチド（ＳＥＬＰ８Ｋ）； 
（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（９）を１７個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（４）を１７個有し、これらが交互に化学結合してなる、分子質量が約８２ｋＤａの配列（１１）のポリペプチド（ＳＥＬＰ０Ｋ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明の細胞賦活剤は、上記ポリペプチド（Ａ）を含有するものである。
ポリペプチド（Ａ）の含有量は、細胞賦活性の向上の観点から、細胞賦活剤の重量を基準として、０．００００００００１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００００１〜１０重量％である。
【００２９】
本発明の細胞賦活剤には、ポリペプチド（Ａ）以外に、水を含んでもよい。
水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２０μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
【００３０】
本発明の細胞賦活剤は、人間の体液と同等にするという観点から、さらに無機塩を含んでもいい。
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。
細胞賦活剤中の無機塩の含有量は、人間の体液と同等にするという観点から、細胞賦活剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
【００３１】
本発明の細胞賦活剤は、細胞や組織との親和性の観点から、さらにリン酸及び／又はリン酸塩を含んでもいい。
リン酸塩としては、リン酸のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
細胞賦活剤中のリン酸（塩）の含有量は、細胞や組織との親和性の観点から、細胞賦活剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
【００３２】
細胞賦活剤のｐＨは、細胞賦活剤の安定性及び細胞や組織との親和性の観点から、６．８〜８．８が好ましく、さらに好ましくは７．３〜８．３である。
【００３３】
本発明の細胞賦活剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明の細胞賦活剤は、細胞や、組織等の生体材料を培養する際に、該生体材料の細胞賦活性を向上させる目的で、該生体材料の培地に加えてもよい。
生体材料の培地としては、特に限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地及びαＭＥＭ培地等が挙げられる。
また、本発明の細胞賦活剤は、最終濃度が０．００００００００１〜３０重量％となるように培地に加えられることが好ましく、０．０００００００１〜１０重量％となるように加えられることが望ましい。
培養対象の生体材料としては、特に限定されないが、移植用細胞、移植用組織等が挙げられる。また、本発明の細胞賦活剤を培地に加え、該培地を生体の創傷部位及び皮膚に適用してもよい。すなわち、生体に直接使用してもよい。
【００３５】
本発明の細胞賦活剤は、細胞賦活性を向上させる目的で、創傷治癒剤、化粧料、皮膚外用剤、医薬品、研究用試薬等に用いることができる。これらの中で、特に創傷治癒剤や化粧料として皮膚表面に塗布されることが好ましい。
【００３６】
本剤を創傷治癒剤として用いる場合には、皮膚への塗布によって投与する場合のほか、皮下注射、経皮投与等の投与方法を用いることができる。
形状としては、特に限定されないが、例えば、粉末状、液状、注射剤、スポンジ形状及びフィルム形状等が挙げられる。また、添加剤として基剤、乳化剤、溶剤及び安定剤等を配合することができる。
【００３７】
本剤を化粧料組成物の有効成分原料としての化粧料として用いる場合には、化粧料基材に配合することによって製造することができる。
化粧料の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状などのいずれであっても良く、このような化粧料を肌に適用することによって、皮膚繊維芽細胞の細胞遊走作用や細胞増殖作用等の細胞賦活作用をもたらすことができる。
化粧料基剤は、一般に化粧料に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される基剤等を配合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に定めない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００３９】
製造例１  ＜ポリペプチド（Ａ−１）の作製＞  
ペプチド受託合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によりアミノ酸配列がＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ  (２）であるポリペプチド（Ａ−１）を得た。
【００４０】
製造例２  ＜ポリペプチド（Ａ−２）の作製＞
ペプチド受託合成によりアミノ酸配列が（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３（ＧＡＧＡＧＳ）４（１２）であるポリペプチド（Ａ−２）を得た。
【００４１】
製造例３    ＜ＳＥＬＰ８Ｋ［ポリペプチド（Ａ−３）］の作製＞
＜ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の作製＞
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。
以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、本発明のポリペプチド（Ａ）の一種である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（３）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（４）を１３個有し、これらが交互に化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１０）のポリペプチドであるＳＥＬＰ８Ｋ［ポリペプチド（Ａ−３）］を生産する方法を示す。
【００４２】
＜ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の培養＞
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。このＬＢ培地に、カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加えて培養液とし、培養液を３０℃で、２００ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。培養液の濁度がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、培養液４０ｍｌを、４０℃に温められた別のフラスコに移し、４０℃で約２時間培養した。
その後、培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
【００４３】
＜ＳＥＬＰ８Ｋの精製＞
集菌した大腸菌を用い、下記の工程１：菌体溶解、工程２：遠心分離による不溶性細片の除去、工程３：硫安沈殿、工程４：限外濾過、工程５：陰イオン交換クロマトグラフィー、工程６：限外濾過、工程７：凍結乾燥により、大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。
このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの精製したＳＥＬＰ８Ｋ［ポリペプチド（Ａ−３）］を得た。
【００４４】
工程１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
【００４５】
工程２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
【００４６】
工程３：硫安沈殿
工程２で回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。
その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。次に、溶解した液に対して、硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
【００４７】
工程４：限外濾過
工程３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファイバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。工程３で得た溶液に対して、２０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
【００４８】
工程５：陰イオン交換クロマトグラフィー
ポリペプチドの濃度が２０ｇ／Ｌとなるように限外濾過後のポリペプチド溶液を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に加え、その後、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ    ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
【００４９】
工程６：限外濾過
工程５で得た溶出画分を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
【００５０】
工程７：凍結乾燥
ポリペプチド濃度が３ｇ／Ｌとなるように、工程６で得たポリペプチド溶液を脱イオン水で希釈し、水位が１０ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−３０℃、２４時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が５Ｐａ以下、−３０℃で、１１０時間かけて１次乾燥、真空度が５Ｐａ以下、３０℃で、４８時間かけて２次乾燥させ、ＳＥＬＰ８Ｋ［ポリペプチド（Ａ−３）］を得た。
【００５１】
精製したポリペプチド（Ａ−３）を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した後、ポリフッ化ビニリデン膜にトランスファーした。
その後、一次抗体に抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体、２次抗体に抗ラビットＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（ＧＥヘルスケア社製）を用いたウエスタンブロット分析を行った。
この精製物の見かけ分子質量は約８０ｋＤａであった。
【００５２】
製造例４    ＜動物試験に使用するタンパク質の作製＞  
製造例３において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に換えて、「ＳＬＰ４．１．３をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２」を用いる以外は同様にして、分子質量が約１５０ｋＤａの配列（１３）のタンパク質を得た。このタンパク質は動物試験に使用する。
【００５３】
比較製造例１  ＜比較例のためのポリペプチド（Ａ’−１）＞
ペプチド受託合成によりアミノ酸配列がＶＰＧＶＧ（１４）であるポリペプチド（Ａ’−１）を得た。
【００５４】
比較製造例２  ＜比較例のためのポリペプチド（Ａ’−２）＞
ペプチド受託合成によりアミノ酸配列がＶＧＶＰＧ（１５）であるポリペプチド（Ａ’−２）を得た。
【００５５】
＜実施例１〜３および比較例１と２＞
それぞれ５μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ポリペプチド（Ａ−１）〜（Ａ−３）および（Ａ’−１）と（Ａ’−２）の含有量がそれぞれ０、０．００００００００１、０．００００００１、０．００００１、０．００１、０．１、１０重量％になるように添加して調製し、線維芽細胞遊走性試験に使用した。
【００５６】
＜線維芽細胞の遊走性試験＞
繊維芽細胞の遊走作用は、スクラッチアッセイ法で評価した。
遊走性試験には、マウス繊維芽細胞であるＬ９２９細胞を使用し、滅菌シャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。培地は１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を使用した。
１０ｃｍのシャーレで培養したサブコンフルエント状態のＬ９２９細胞を５ｍＬの１×ＰＢＳ（−）で1回洗浄し、１ｍＬのトリプシン溶液（ナカライテスク社製）を加えた。３７℃で１分間加温し、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を４ｍＬ加えてピペッティングし、細胞を回収した。血球計算盤を用いて細胞濃度を測定し、２×１０４個／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。２４穴プレートに細胞懸濁液を５００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。
７日目にマイクロチップを用いて細胞培養面をひっかき、細胞を剥離し、細胞が存在しない線状の領域を作製した。１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、実施例１で調製した溶液を０．５ｍＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、培養開始前と、２４時間後に、顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、キーエンス社製）を用いて撮影を行った。細胞の遊走距離をＢＺ−Ｘ解析アプリケーションを用いて測定した。ランダムに１０箇所の距離を測定し、その平均値を細胞の遊走した距離（μｍ）とした。
【００５７】
細胞遊走距離は以下の式から算出される。
細胞遊走距離（μｍ）＝培養開始前の細胞が存在しない領域（μｍ）−２４時間後の細胞が存在しない領域（μｍ）
細胞遊走性（％）は以下の式から算出される。
細胞遊走性（％）＝［ポリペプチド含有条件の細胞遊走距離（μｍ）／ポリペプチド非含有条件の細胞遊走距離（μｍ）］×１００
このとき、ポリペプチド非含有条件の細胞遊走性は以下の式から算出した。
ポリペプチド非含有条件の細胞遊走性（％）＝［ポリペプチド非含有条件の細胞遊走距離（μｍ）／ポリペプチド非含有条件の細胞遊走距離（μｍ）］×１００
結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2019073469.tif 000002
【００５９】
また、実施例１で調製した溶液に代えて、実施例２と３で調製した溶液若しくは比較例１と２で調製した溶液を使用して、上記＜線維芽細胞遊走性試験＞に記載の方法と同様に測定した。結果を表１に示す。
【００６０】
＜実施例４〜６および比較例３と４＞
それぞれ１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ培地でポリペプチド（Ａ−１）〜（Ａ−３）および（Ａ’−１）と（Ａ’−２）の含有量が０、０．００００００００１、０．００００００１、０．００００１、０．００１、０．１、１０重量％になるように添加して調製し、線維芽細胞の増殖試験に使用した。
【００６１】
＜比較例５＞
１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ社製）及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＤＭＥＭ培地でｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）の含有量が０、０．００００００００１、０．００００００１、０．００００１、０．００１、０．１、１０重量％になるように添加して調製し、試験に使用した。
【００６２】
＜線維芽細胞の増殖試験＞
増殖試験にはマウス繊維芽細胞であるＬ９２９細胞を使用し、１０ｃｍの滅菌シャーレに播種して３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。培地は１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を使用した。
１０ｃｍのシャーレで培養したサブコンフルエント状態のＬ９２９細胞を５ｍＬの１×ＰＢＳ（−）で１回洗浄し、１ｍＬのトリプシン溶液を加えた。３７℃で1分間加温し、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン＆ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を４ｍＬ加えてピペッティングし、細胞を回収した。血球計算盤を使用して細胞数を計数した。実施例４で調製した溶液と混合して、播種細胞数が１×１０４個／ウェルとなるように９６穴プレートに播種した。
３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行い、培養３日目及び７日目にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク社製）を使用して４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
細胞増殖性は以下の式から算出される。
３日目の細胞増殖性（％）＝［３日目のポリペプチド含有条件の４５０ｎｍの吸光度／３日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度］×１００
７日目の細胞増殖性（％）＝［７日目のポリペプチド含有条件の４５０ｎｍの吸光度／７日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度］×１００
【００６４】
このとき、ポリペプチド非含有条件の細胞増殖性は以下の式から算出される。
３日目のポリペプチド非含有条件の細胞増殖性（％）＝［３日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度／３日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度］×１００
７日目のポリペプチド非含有条件の細胞増殖性（％）＝［７日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度／７日目のポリペプチド非含有条件の４５０ｎｍの吸光度］×１００
【００６５】
また、実施例４で調製した溶液に替えて、実施例５〜６で調製した溶液若しくは比較例３〜５で調製した溶液を使用して、上記＜線維芽細胞増殖試験＞に記載の方法と同様に測定した。
培養３日目の結果を表２に、培養７日目の結果を表３に示す。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
【表３】
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【００６８】
＜実施例７と８＞
製造例４で作製したタンパク質の含有量が２０重量％及びポリペプチド（Ａ−１）、（Ａ−２）の含有量がそれぞれ２０重量％になるようにＤＰＢＳ（ｇｉｂｃｏ製）に添加して調製し、後述の動物試験に使用した。
【００６９】
＜実施例９＞
ポリペプチド（Ａ−３）の含有量が２０重量％になるようにＤＰＢＳに添加して調製し、動物試験に使用した。
【００７０】
＜比較例６と７＞
タンパク質の含有量が２０重量％、及びポリペプチド（Ａ’−１）、（Ａ’−２）の含有量が２０重量％になるようにＤＰＢＳに添加して調製し、動物試験に使用した。
【００７１】
＜比較例８＞
タンパク質の含有量が２０重量％、及びｂＦＧＦの含有量が２０重量％になるようにＤＰＢＳに添加して調製し、動物試験に使用した。
【００７２】
＜動物試験＞
糖尿病マウスを用いたＩＶ度褥瘡モデルでの治療実験を行い、ポリペプチドを評価した。
（１）病理標本の作製（病理標本は、それぞれ９個作製した。）
遺伝的糖尿病マウス♀（日本クレア）８週齢を麻酔下で除毛し、大腿第三転子部の皮膚を圧迫（４００ｇ／８ｍｍ×２時間×４）し、褥瘡（直径８ｍｍ）を作製した。圧迫終了後５日目に壊死組織を除去し、実施例７〜９及び比較例６〜８で調製した溶液をそれぞれ５６μｌ注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。
その後、創傷部の上にガーゼをあてて、シルキーテックス（アルケア社製）で固定した。治療期間１４日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。
【００７３】
（２）組織学的検査
作製した病理標本用いて、組織学的検査を実施した。
未熟な毛細血管と繊維芽細胞が一体となった良好な肉芽組織を肉芽組織とみなした。ガス嚢胞やコレステリン血漿を含む肉芽組織は、肉芽組織ではないものとみなした。
肉芽組織の形成を、以下の５段階の評価基準で評価し、点数化した。なお、点数が高いほど、より肉芽組織形成が促進されており、組織再生用材料の肉芽組織形成促進作用が優れていることを示している。評価結果は表４に示す。
【００７４】
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態
２点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が０％より大きく２５％未満
３点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が２５％以上５０％未満
４点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が５０％以上７５％未満
５点：欠損部の全面積中の肉芽組織形成面積率が７５％以上
【００７５】
【表４】
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【００７６】
表１の実施例１〜３で調製した溶液を用いると、繊維芽細胞の遊走性が、比較例１と２で調製した溶液を用いた場合、及びブランクと同等又はそれ以上であった。
また、表２の実施例４〜６で調製した溶液を用いると、培養３日目の繊維芽細胞の増殖が比較例３〜５で調製した溶液を用いた場合、及びブランクと同等又はそれ以上であった。また、表３の培養７日目においては実施例４〜６で調製した溶液を用いると、比較例３〜５で調製した溶液を用いた場合、及びブランクと比較して有意に繊維芽細胞の増殖が上昇した。
また、表４の実施例７〜９で調製した溶液を用いると、動物試験における肉芽組織形成が比較例６〜８で調製した溶液を用いた場合と比較して顕著に上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の細胞賦活剤は、繊維芽細胞遊走能及び増殖能に優れ、細胞を賦活化させることで創傷の治癒や皮膚状態の改善を促進することができる。従って、創傷治癒剤、医薬部外品、及び機能性化粧品への添加剤として医療及び化粧品用途に有用である。