(57)【要約】【課題】被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法を提供する。【解決手段】被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、上記収集工程において収集した毛髪の少なくとも一部分に含まれている生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程と、を含む測定方法とする。【選択図】図１
2019007833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、
被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、
上記収集工程において収集した毛髪の少なくとも一部分に含まれている生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程とを含む測定方法。
【請求項２】
被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、
被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、
上記収集工程において収集した毛髪の、２つ以上の部分における上記生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程とを含む測定方法。
【請求項３】
上記測定工程において測定した上記生理活性物質の蓄積量を、較正式により較正する較正工程をさらに含む、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
上記較正式は、毛髪における上記生理活性物質の蓄積量が経時的に低下する現象に基づく式である請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
上記較正式は、上記被検体から定期的に収集した複数の毛髪の特定部位における上記生理活性物質の蓄積量を測定することによって得られたものであり、
互いに異なる時期に収集された上記毛髪のそれぞれについて設定された上記特定部位は、上記毛髪の伸長速度を考慮して、互いに位置をずらして設定されている請求項３または４に記載の測定方法。
【請求項６】
上記複数の毛髪のそれぞれにおいて複数の上記特定部位が設定されている請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
上記較正式は、上記被検体から定期的に採取した、毛髪以外の特定のサンプルにおける上記生理活性物質の蓄積量の経時的変化に基づいて得られたものである請求項３または４に記載の測定方法。
【請求項８】
上記毛髪は、頭髪である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】
上記生理活性物質は、コルチゾールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の測定方法における上記測定工程において使用される測定キットであって、
毛髪を包埋するための包埋剤と、
上記毛髪に含まれる生理活性物質を特異的に認識する抗体を含んでいる抗体反応剤と、を備えている測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、毛髪における生理活性物質の蓄積量を測定する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
被検体から採取したサンプルに含まれる生理活性物質を測定し、上記被検体の生理状態を判断する技術が存在する。例えば、特許文献１は、被検体から採取した血液または唾液中に存在する、テストステロンおよびコルチゾールの量を測定し、得られた測定値を（１）健常者および（２）男性の更年期またはうつ病患者における測定値と比較することを特徴とする、男性の更年期またはうつ病の鑑別法が開示されている。
【０００３】
また、被検体から採取した毛髪に含まれる生理活性物質を測定し、上記被験体の生理状態を判断する技術が存在する。例えば、非特許文献１は、新生児の毛髪におけるコルチゾールのレベルが、上記新生児の経験する慢性ストレスと関連するバイオマーカーとなりうる旨を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−０２４８２２号公報（２００７年２月１日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yamada J et al (2007) "Hair Cortisol as a Potential Biologic Marker of Chronic Stress in Hospitalized Neonates", Neonatology, Vol.92 (No.1), pp.42-49
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上述のような従来技術は、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定するという観点からは、改善の余地を残すものであった。
【０００７】
本開示の一態様は、被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本開示の一態様に係る測定方法は、被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、上記収集工程において収集した毛髪の少なくとも一部分に含まれている生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程と、を含む。
【０００９】
また、本開示の他の態様に係る測定方法は、被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、上記収集工程において収集した毛髪の、２つ以上の部分における上記生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程と、を含む。
【発明の効果】
【００１０】
被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の実施形態１に係る測定方法の概要を表す模式図およびグラフである。
【図２】本開示の実施形態１に係る測定方法における、測定工程の一例（ＥＬＩＳＡ法）を表すフローチャートである。
【図３】本開示の実施形態１に係る測定方法における、測定工程の他の例（免疫染色法）を表すフローチャートである。
【図４】上記免疫染色法において、毛髪を切断する切断工程を表す模式図である。（ａ）は、包埋剤２に包埋されている毛髪１を表す。（ｂ）は、（ａ）を複数箇所で切断して得られる、毛髪サンプル１０を表す。
【図５】上記免疫染色法において、毛髪の切断面を規定する座標を示す図である。
【図６】上記免疫染色法において、毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程の、各ステップを表す模式図である。
【図７】上記免疫染色法において、生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程に用いられる光学系を表す模式図である。
【図８】本開示の実施形態２に係る測定方法の概要を表す模式図およびグラフである。
【図９】本開示の実施形態３に係る測定方法の概要を表す模式図およびグラフである。（ａ）は、被検体から定期的に採取した複数の毛髪の特定部位における、生理活性物質の蓄積量を測定する方法の概要を表す模式図およびグラフである。（ｂ）は、（ａ）の結果から得られた較正式を表すグラフである。（ｃ）は、上記較正式により較正された、上記生理活性物質の蓄積量の経時的変化を表すグラフである。
【図１０】本開示の実施形態４に係る測定方法の概要を表す模式図およびグラフである。
【図１１】本開示の実施形態５に係る測定方法の概要を表すグラフである。（ａ）は、被検体から定期的に採取した毛髪以外の特定のサンプル（唾液）における、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を表すグラフである。（ｂ）は、（ａ）の測定値により構成された、上記生理活性物質の蓄積量の経時的変化を表すグラフである。
【図１２】本開示の実施形態５に係る解析システムの要部を表すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示の実施の形態の一例について詳細に説明する。しかし本開示は、これらに限定されない。
【００１３】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１４】
〔用語の説明〕
以下、実施形態の説明に先立って、本明細書において広く用いられる用語について説明する。
【００１５】
本明細書における「被検体」の範囲には、ヒトに加えて、非ヒト哺乳類も含まれる。非ヒト哺乳動物の例としては、霊長類（サル、類人猿など）、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。上述の非ヒト哺乳動物は、家畜または愛玩動物であってもよく、野生動物であってもよい。
【００１６】
本明細書において「毛髪」とは、「被検体に生える毛」を意図する。被検体がヒトの場合、毛髪の例として、頭髪、髭、眉毛、睫毛、鼻毛、耳毛、腋毛、陰毛、体毛が挙げられる。被検体をヒトとする場合は、採取が容易であるという観点から、頭髪または髭を用いることが好ましい。
【００１７】
ここで、生体サンプルとして毛髪を用いることには、生体サンプルとして血液や唾液などを用いることに対して、以下に例示される利点が存在する。
（１）毛髪の採取は非侵襲性であり、容易である。このため、医師または医療関係者でない者であってもサンプルを採取できる。
（２）他の種類のサンプルに汚染される危険性が低い。例えば、唾液中と血液中では生理活性物質のレベルが異なるのが通常であるから、唾液を採取する際に血液が混入すると上記生理活性物質のレベルを正確に測定できない。しかし、採取された毛髪は、洗浄により容易に他の種類のサンプル（血液、唾液など）の混入を除くことができる。
（３）生理活性物質の「蓄積量」を測定するのに適している。すなわち、血液、唾液などから測定された生理活性物質のレベルは、サーカディアンリズム、急性の生体反応などが原因となり、サンプル採取時点における生体条件および環境条件に左右されがちである。これに対し、毛髪の伸長速度は頭髪で１ｃｍ／月程度である。したがって、毛髪をサンプルとすることにより、「特定の期間に分泌された生理活性物質の蓄積量」を反映した測定値を得ることができる。
【００１８】
本明細書において、「生理活性物質」とは、生命活動および生理機能の維持、調節などに関わる物質を意図する。生理活性物質の具体例としては、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ビタミン、酵素、タンパク質、ペプチドなどが挙げられる。
【００１９】
本開示の方法は、被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法である。したがって、上記被験体の生命活動および生理機能の経時的変化を判断する方法でありうる。
【００２０】
例えば、被検体から採取した毛髪における、ストレス関連生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することにより、上記被験体が経験した慢性ストレスの経時的変化を知ることができる。このようなストレス関連生理活性物質の例としては、コルチゾール（ヒドロコルチゾン；１１β，１７α，２１−トリヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン；３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オン）、ＤＨＥＡ−Ｓ（硫酸結合型DHEA；DHEA-sulfate；DHE-S）、テストステロン、カテコールアミン（アドレナリン、ノルアドレナリン）、クロモグラニンＡ、Neuropeptide Yなどが挙げられる。このうち、コルチゾール、アドレナリン、クロモグラニンＡは、蓄積量の増加と慢性ストレスの増加とが関連付けられる。一方、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ−Ｓは、蓄積量の増加と慢性ストレスの減少とが関連付けられる。
【００２１】
また、例えば、ストレス関連疾患である鬱病の患者においては、コルチゾールの蓄積量が高く、ＤＨＥＡの蓄積量が低いことが判っている。このような場合に、複数の生理活性物質の蓄積量の比（上記の例では、「コルチゾールの蓄積量／ＤＨＥＡの蓄積量」の値）の経時的変化を求めることも、本開示の範囲に含まれる。
【００２２】
以上に例示した他にも、種々の生理活性物質の蓄積量の経時的変化と、対応する生命活動および生理機能の経時的変化との関係は、医学・生理学分野における技術常識を用いて解釈することができる。
【００２３】
ところで、毛髪中にはステロイド骨格を有する物質が蓄積されやすいことが知られている。このため、被検体から採取された毛髪における、ステロイド骨格を有する物質の蓄積量の経時的変化を測定することは、本開示の方法の好ましい態様の一つである。ステロイド骨格を有する物質の例としては、コルチゾール、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ−Ｓ、テストステロンが挙げられる。
【００２４】
なお、「生理活性物質の蓄積量」は、例えば、上記生理活性物質の存在量、濃度、力価などによって表すことができる。
【００２５】
〔実施形態１〕
実施形態１では、被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、（１）被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、（２）上記収集工程において収集した毛髪の少なくとも一部分に含まれている生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程と、を含む測定方法について、それぞれの工程を説明する。
【００２６】
収集工程は、被検体から切断された毛髪を収集する工程である。この収集工程に先立って、被験体から毛髪を切断し採取する工程（採取工程）を実行する。以下では、採取工程について具体的に説明する。
【００２７】
採取工程では、毛髪を採取する器具として、カッター、鋏、櫛、クリップなどを用いることができる。また、毛髪として髭などを用いる場合には、電動髭剃り器、手動髭剃り（剃刀）などを用いることもできる。
【００２８】
実施形態１における採取工程で被検体から採取される毛髪は、頭髪または髭が好ましい。上述の通り、頭髪または髭は、特殊な器具を用いることなく、容易に採取できるためである。
【００２９】
実施形態１における採取工程で被検体から採取される毛髪の数は、１本以上であれば特に限定されない。より正確な生理活性物質の蓄積量を測定するという観点からは、複数本の毛髪を採取することが好ましい。この場合、生理活性物質の蓄積量の経時的変化をより正確に測定するという観点からは、５０〜１５０本程度の毛髪を採取することがより好ましいが、統計的解釈が可能な本数であるならば特に限定されない。
【００３０】
皮膚や血液などの混入を防ぐ観点から、毛髪の採取に際しては、毛根を含まない部位を採取することが好ましい。一方、後述する通り、時間経過による生理活性物質の蓄積量の変化の影響を小さくするためには、毛髪の根元に近い部位における上記生理活性物質の蓄積量を測定することが好ましく、したがって毛髪の根元に近い部位を採取することが好ましい。以上より、毛髪の採取に際しては、毛髪を根元の近くから切断することが好ましい。
【００３１】
実施形態１における採取工程で被検体から毛髪を採取する間隔は、特に限定されず、必要とする時間分解能に応じて決定すればよい。例えば、１箇月ごとに毛髪を採取すれば、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を１箇月単位で測定することができる。また、毛髪として髭を採用し、１日〜数日ごとに採取すれば、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を１日〜数日単位で測定することができる。
【００３２】
実施形態１における採取工程で被検体から定期的に毛髪を採取する際、個々の採取における上記毛髪の種類および上記毛髪を採取する部位は、特に限定されない。より正確なデータを得るという観点からは、全ての採取において、毛髪の種類は同一であることが好ましい。同様の観点から、全ての採取において、毛髪を採取する部位も同じであることが好ましい。
【００３３】
以上の説明を模式的に表したのが、図１の上段である。図１の上段は、１箇月ごとに被検体から採取された毛髪を表している。このうち、根元に近い部位における生理活性物質の蓄積量が、次の測定工程において測定される。
【００３４】
実施形態１における測定工程で、生理活性物質の蓄積量を測定される毛髪の部位は、特に限定されない。すなわち、採取した毛髪の全部を用いて上記生理活性物質の蓄積量を測定してもよいし、採取した毛髪の一部のみを用いて上記生理活性物質の蓄積量を測定してもよい。上述した通り、毛髪には「特定の期間に分泌された生理活性物質の蓄積量」を反映するという特徴があるため、採取した毛髪の一部のみを用いて測定することが好ましい。上記採取した毛髪の一部は、例えば、１箇月分の伸長に相当する長さとすることができる。頭髪の場合、１箇月に１ｃｍ程度伸長することが知られているから、採取した毛髪から１ｃｍ分の長さを取り出し、生理活性物質の蓄積量を測定すればよい。
【００３５】
また、後述する通り、時間経過による生理活性物質の蓄積量の変化の影響を小さくするという観点からは、毛髪の根元に近い部位における上記生理活性物質の蓄積量を測定することが好ましい。以上より、測定工程においては、被検体から採取した毛髪のうち、根元に近い側から適当な伸長期間（例えば、１日、１週間、１箇月など）に相当する長さを切り出して、生理活性物質の蓄積量を測定することが好ましい。
【００３６】
以上に説明した工程によって得られる、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を表すグラフが、図１の下段である。上記グラフは、１箇月ごとに被検体から毛髪を採取し、根元に近い部位における生理活性物質の蓄積量を追跡したものである。
【００３７】
なお、生理活性物質の蓄積量の経時的変化は、代表値によって表されてもよい。例えば、図１において１月の生理活性物質の蓄積量に相当する測定値が複数ある場合（複数の毛髪から蓄積量を測定した場合など）には、上記測定値の平均値、上記測定値において累積度数が５０％となる値、上記測定値の最頻値、上記測定値の中央値などを代表値としてもよい。
【００３８】
実施形態１における測定工程で、生理活性物質の蓄積量の測定方法は、特に限定されず、公知の手法を用いることができる。公知の手法の例としては、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、液体クロマトグラフィ、質量分析などが挙げられる。以下に、ＥＬＩＳＡおよび免疫染色による生理活性物質の蓄積量の測定方法を、順に説明する。
【００３９】
以下、ＥＬＩＳＡによる生理活性物質の測定方法を、図２のフローチャートに従って説明する。
【００４０】
Ｓ１０は、上記に「収集工程」および「採取工程」として記載した通りである（毛髪採取工程）。
【００４１】
Ｓ１１では、Ｓ１０において採取した毛髪を、根元側で揃えて束ね、整列させる（毛髪整列工程）。Ｓ１１では、テープ、シールなど粘着性を有する器具を使用することができる。
【００４２】
Ｓ１２では、Ｓ１１で整列させた毛髪を、適当な長さに切り出す（切り出し工程）。Ｓ１２において上記毛髪を切断する長さは、必要とする時間分解能に応じて決定すればよい。例えば、１箇月分の生理活性物質の蓄積量を評価したい場合は、毛髪が１箇月に伸長する長さ（頭髪の場合は１ｃｍ程度）を切り出せばよい。また、時間経過による生理活性物質の蓄積量の変化の影響を小さくするという観点からは、毛髪の根元に近い部位を切り出すことが好ましい。
【００４３】
Ｓ１２において切断する毛髪の本数は、生理活性物質の検出限界に応じて定めればよい。また、それぞれの毛髪による蓄積量の偏差の影響を除くためには、複数本の毛髪（例えば５０〜１５０本程度）を切断することが好ましい。
【００４４】
なお、Ｓ１２において切り出した毛髪を秤量し、一定の重量に揃えておくと、Ｓ１４（粉砕工程）以降に毛髪を秤量する場合と比べて、粉砕した毛髪をサンプルチューブから取り出す手間が省くことができる。
【００４５】
Ｓ１３では、Ｓ１２において切り出した毛髪を洗浄する（洗浄工程）。これにより、毛髪に付着している汗、皮脂などを取り除き、コンタミネーションを防止する。より具体的な洗浄工程の一例を、以下に提示する。
１．容量２ｍＬのマイクロチューブ（トミー精工製、ＴＭ−６２５Ｓ）に、Ｓ１２で切り出した毛髪約３ｍｇと、イソプロピルアルコール（キシダ化学製、２−プロパノール  高速液体クロマト用、製品番号１４０−６４７８１）１ｍＬと、封入する。
２．上記マイクロチューブを、攪拌機（アズワン製、ＡＣＲ−１００）にセットし、１０ｒｐｍにて３分間攪拌する。
３．上記マイクロチューブから、イソプロピルアルコールを除去する。
４．１〜３の工程を３回程度繰り返す。
５．上記マイクロチューブの蓋を開け、遠心濃縮機（トミー精工製、ＭＶ−１００）で毛髪を乾燥させる。
【００４６】
Ｓ１４では、毛髪を粉砕する（粉砕工程）。粉砕した毛髪は、次のＳ１５に供される。なお、Ｓ１４において毛髪を粉砕した後に、一定量（例えば２．５ｍｇ）の毛髪を量り取ってもよい。毛髪を粉砕するには、例えば、ビーズ式細胞破砕機を使用することができる。より具体的な粉砕工程の一例を、以下に提示する。
１．ビーズ式細胞破砕機（トミー精工製、ＭＳ−１００Ｒ）およびジルコニア製ビーズ（トミー精工製、ＺＢ−２０、直径２．０ｍｍ）を用いて、回転数４０００ｒｐｍ、破砕時間６０秒間の条件で毛髪を粉砕する。
２．冷却時間を１分間以上空けて、毛髪が充分に粉砕されるまで１を繰り返す。
【００４７】
Ｓ１５では、毛髪から生理活性物質を抽出する（抽出工程）。これにより、Ｓ１４で粉砕された毛髪から、溶媒中へと生理活性物質を溶出させる。より具体的な抽出工程の一例を、以下に提示する。
１．容量２ｍＬのマイクロチューブ（トミー精工製、ＴＭ−６２５Ｓ）に、Ｓ１４で粉砕した毛髪と、メタノール（和光純薬工業製、メタノール（ＬＣ／ＭＳ用）、製品番号１３８−１４５２１）１．５ｍＬと、を封入する。
２．攪拌機（アズワン製、ＡＣＲ−１００）で、室温において１０ｒｐｍにて１６〜２４時間転倒攪拌しながら生理活性物質を抽出する。
【００４８】
Ｓ１６では、上澄みを採取した上で、生理活性物質を濃縮する（濃縮工程）。これにより、Ｓ１４で溶媒中に溶出した生理活性物質を析出させる。より具体的な濃縮工程の一例を、以下に提示する。
１．生理活性物質の抽出工程終了後のマイクロチューブ（トミー精工製、ＴＭ−６２５Ｓ）を、遠心分離機（日立工機製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ−１５ＲＸ）により、６５００Ｇにて５分間遠心分離する。
２．固液分離後の上澄み液を、他のマイクロチューブに移す。
３．遠心濃縮機（トミー精工製、ＭＶ−１００）を用いて、マイクロチューブを真空条件に置きながら、メタノールを蒸発させる。これにより、生理活性物質を含む固形物が乾固する。
【００４９】
メタノールを蒸発させる方法としては、例えば、マイクロチューブを格納したベルジャーなどの真空容器を、真空ポンプまたはアスピレータなどと接続することにより、上記マイクロチューブを真空下に置く方法が挙げられる。上述の操作は、安全上、有機ドラフト内で作業することが好ましい。あるいは、有機ドラフト内で、マイクロチューブの蓋をあけた状態で静置し、風乾させてもよい。
【００５０】
Ｓ１７では、ＥＬＩＳＡによって生理活性物質を定量する（定量工程）。ＥＬＩＳＡにより特定の化学物質を定量する方法は、公知である。また、種々のＥＬＩＳＡ用キットを用いてもよい。この場合は、上記ＥＬＩＳＡ用キット附属のプロトコールに従って定量を行えばよい。より具体的な定量工程の一例を、生理活性物質としてコルチゾールを測定する場合に即して、以下に提示する。
１．乾固後に残った固形物を、キット附属の緩衝液（Assay Diluent）０．１ｍＬに溶解させる。
２．ＥＬＩＳＡには、唾液用ＥＬＩＳＡ測定キット（Salimetrics製、Cortisol EIA Kit）を転用して用いる。
３．プレートリーダー（PerkinElmer製、ARVO-MX）を用いて、コルチゾールのレベルを測定する。
【００５１】
以下、免疫染色による生理活性物質の測定方法を、図３のフローチャートに従って説明する。
【００５２】
Ｓ２０は、上記に「収集工程」および「採取工程」として記載した通りである（毛髪採取工程）。
【００５３】
Ｓ２１では、Ｓ２０で採取した毛髪を洗浄する（洗浄工程）。より具体的な洗浄工程の一例を、以下に提示する。
１．毛髪を５０ｍＬ遠沈管へ入れる。
２．上記遠沈管に、イソプロピルアルコール（キシダ化学製、２−プロパノール  高速液体クロマト用、製品番号１４０−６４７８１）約４０ｍＬを加える。
３．上記遠沈管を、攪拌機（Thermo Fisher Scientific製）を用いて、１０ｒｐｍにて３分間転倒撹拌する。
４．上記遠沈管からイソプロピルアルコールを除去する。
５．２〜４の工程を２回繰り返す。
６．毛髪をペーパータオル上に置き、３０〜６０分間ほど風乾させる。
【００５４】
Ｓ２２では、洗浄を終えた毛髪１を、包埋剤２により包埋する（包埋工程、図４の（ａ）を参照）。包埋剤の主成分としては、パラフィン、セロイジン、ゼラチン、カーボワックス、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、シアノアクリレート、氷などを用いることができる。包埋の方法は、公知の方法に従うことができる。
【００５５】
Ｓ２３では、包埋された毛髪１を、ミクロトーム、カッター、治具などを用いて切断し、毛髪サンプル１０を得る（切断工程、図４の（ｂ）を参照）。毛髪サンプル１０の厚さは特に限定されないが、１０ｎｍ〜５００μｍ程度を目安とすることができる。
【００５６】
ここで、毛髪サンプル１０は、生理活性物質の蓄積量を測定する直前に作製されたものであってもよいし、事前に作製されたものであってもよい。しかし、毛髪に含まれる生理活性物質のうち、その存在量が毛髪採取からの時間経過により変化しやすいものに関しては、生理活性物質を正確に測定するという観点から、測定の直前に作製した毛髪サンプル１０用いることが好ましい。
【００５７】
毛髪１を切断するときの方向は特に限定されず、毛髪の成長軸に対して、垂直であってもよく、斜交していてもよく、平行であってもよい。このことを、図５に基づいて説明する。図５は、毛髪１の切断面を規定する座標を示す図である。上記座標において、Ｙ軸は毛髪１の成長軸であり、太い矢印は切断面の法線ベクトル（すなわち、切断面に対して垂直な方向ベクトル）である。このとき、上記法線ベクトルは、０°≦θ≦１８０°および０°≦φ≦１８０°の範囲で、任意に定めうる。
【００５８】
Ｓ２４、Ｓ２５は、毛髪サンプル１０に対して、免疫染色を行う工程である（反応工程）。以下、図６に基づいて、反応工程をＳ１〜Ｓ４のステップに分けて説明する。
【００５９】
Ｓ１〜Ｓ４は、毛髪サンプル１０のうち、１つの毛髪の断面近傍を拡大した模式図である。毛髪サンプル１０には、毛髪断面１１（内部に毛髄質断面１１ａを有する）の他に、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３が含まれている（Ｓ１）。
【００６０】
Ｓ２では、抗体用ブロッキング剤１２ａを毛髪サンプル１０に滴下し、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２をブロッキングする。これにより、一次抗体１４ａと、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２と、の非特異的な結合を防止する。
【００６１】
Ｓ３では、蛍光色素用ブロッキング剤１３ａを毛髪サンプル１０に滴下し、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３をブロッキングする。これにより、蛍光色素１５と、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３と、の非特異的な結合を防止する。
【００６２】
抗体用ブロッキング剤１２ａの例としては、人工合成ポリマー、正常血清、動物血清（ウサギ血清、ヤギ血清、ラット血清など）、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。蛍光色素用ブロッキング剤１３ａの例としては、FX signal enhancer（Thermo Scientific製）などバックグラウンド染色を低減させる試薬が挙げられる。
【００６３】
Ｓ４では、特定の生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該生理活性物質と結合させる。ここで、一次抗体１４ａは、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記生理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａを介して、蛍光色素１５が結合することとなる。
【００６４】
なお、反応工程では、免疫染色に関する公知の手法を用いることができる。このような手法に関しては、例えば、［高田邦昭、斎藤尚亮、川上速人 編『染色・バイオイメージング実験ハンドブック』羊土社、２００６年（実験医学別冊）］を参照することができる。
【００６５】
一次抗体１４ａと蛍光色素１５とは、公知の技術により結合させられる。耐光性の観点からは、一次抗体１４ａと反応して結合を形成しうる官能基を有する蛍光粒子中に、蛍光色素１５が内包されている状態が好ましい。このとき、上記蛍光色素１５は、ナノ粒子によって内包されて蛍光粒子を形成し、上記ナノ粒子と一次抗体１４ａとの間に結合が形成される。上記ナノ粒子の成分の例としては、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、メラミン樹脂など、安定的に蛍光色素を内包できるものが挙げられる。
【００６６】
上記ナノ粒子に内包される蛍光色素１５の例としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などが挙げられる。あるいはAlexa Fluor（登録商標、Invitrogen社製）系色素分子、BODIPY（登録商標、Invitrogen製）系色素分子、Cy（登録商標、GE Healthcare製）系色素分子、DY系色素分子（登録商標、DYOMICS製）、HiLyte（登録商標、AnaSpec製）系色素分子、DyLight（登録商標、Thermo Scientific製）系色素分子、ATTO（登録商標、ATTO-TEC製）系色素分子、MFP（登録商標、Mobitec社製）系色素分子などを用いてもよい。
【００６７】
蛍光粒子と一次抗体１４ａとの結合は、公知の手法が用いられる。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化などを用いることができる。
【００６８】
なお、Ｓ２４、２５（反応工程）後の毛髪サンプル１０には、Ｓ２６（検出工程）に必要な処理（例えば、封入工程）を適宜施すことができる。封入工程の具体例を挙げると、以下の通りである。
１．ＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）などの水性洗浄液で洗浄し風乾させる。
２．毛髪サンプル１０をスライドガラス上に載置し、封入剤を滴下する。
３．毛髪サンプルの上にカバーガラスを載置する。
【００６９】
封入工程で用いられる封入剤は、蛍光色素１５を光退色させることがなければ、特に限定されない。封入工程で用いられるカバーガラスおよびスライドガラスも、特に限定されない。
【００７０】
Ｓ２６では、反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する（検出工程）。以下、検出工程で用いられる光学系の一例について、図７に基づいて説明する。
【００７１】
図７では、カバーグラス２１およびスライドグラス２２に挟まれて封入されている毛髪サンプル１０が、ステージ２３上に載置されている。毛髪サンプル１０は、励起光３１が照射されることにより、中に含まれる蛍光色素１５から蛍光３２が発せられる。
【００７２】
このとき、励起光３１は、ダイクロイックミラー２５により反射され、光学レンズ２４を経由して毛髪サンプル１０に照射される。また、蛍光３２は、ダイクロイックミラー２５を透過して、フィルタ２６により特定波長成分のみが取り出される。
【００７３】
以上の構成を取ることにより、蛍光色素１５から発せられた蛍光３２を、少ないノイズで検出することができる。蛍光色素１５は、一次抗体１４ａに結合しており、一次抗体１４ａは生理活性物質に結合しているから、蛍光３２を検出することは、生理活性物質に結合している一次抗体１４ａを検出することになる。
【００７４】
蛍光３２は、蛍光顕微鏡の鏡筒から観察してもよいし、ＣＣＤ(charge-coupled device)などに検出させた結果を、モニターなどの表示手段に表示させてもよい。
【００７５】
もっとも、図７で説明されているのは、検出工程に用いることのできる光学系の一例に過ぎない。本開示の方法における検出工程は、反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出すれば足りるのであるから、蛍光３２を検出しているならば、検出工程として充分である。
【００７６】
なお、上記の説明は、標識として蛍光色素を用いる場合について成されている。他の種類の標識を用いる場合は、適宜、顕微鏡観察に関する技術常識により、上記の説明を読み換えればよい。
【００７７】
また、一次抗体１４ａを特異的に認識する二次抗体を、標識付けされた抗体とすることにより、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる（二次免疫染色）。さらに、アビジン−ビオチン反応などと組み合わせることによっても、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる。このような手法を取るためは、免疫染色に関する技術常識（例えば、［高田邦昭、斎藤尚亮、川上速人 編『染色・バイオイメージング実験ハンドブック』羊土社、２００６年（実験医学別冊）］を参照）を適宜採用すればよい。
【００７８】
〔実施形態２〕
実施形態２では、被検体から収集した毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、（１）被検体から切断された毛髪を定期的に収集する収集工程と、（２）上記収集工程において収集した毛髪の、２つ以上の部分における上記生理活性物質の蓄積量を測定する測定工程と、を含む測定方法について説明する。
【００７９】
実施形態２においても、実施形態１と同様に、被験体から毛髪を切断し採取する採取工程を収集工程の前に実行する。実施形態２における採取工程は、毛髪を１回採取すれば充分である点において、実施形態１の採取工程とは異なる。このため、実施形態２に係る測定方法によれば、毛髪の採取から、生理活性物質の経時的変化の測定が完了するまでの所要期間を短縮することができる。実施形態２における採取工程の、他の要素に関しては、実施形態１に記載の通りである。
【００８０】
実施形態２における採取工程で被検体から採取される毛髪は、頭髪であることが好ましい。頭髪は成長期が長く、数箇月（例えば、１〜１２箇月）〜数年（例えば、１〜９年）にわたる生理活性物質の蓄積量の経時的変化を表すデータが、入手できる可能性があるためである。
【００８１】
実施形態２における測定工程では、採取工程において採取した毛髪の、２つ以上の部分における上記生理活性物質の蓄積量を測定する。この点を、図８に基づいて説明する。
【００８２】
図８では、まず、採取した毛髪を６つの部位に分割する（上段）。次に、それぞれの部位における生理活性物質の蓄積量を測定する。これにより、上記生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる（下段）。なぜならば、毛髪のうち、より先端に近い部位は、より古い時期における生理活性物質の蓄積量を反映しているためである。
【００８３】
毛髪を分割する間隔は、毛髪の伸長速度と、必要とする時間分解能に応じて決定すればよい。例えば頭髪の場合は、１箇月に１ｃｍ程度伸長するから、１ｃｍごとに分割すると、１箇月ごとの生理活性物質の蓄積量の経時的変化が測定できる。同様に、０．５ｃｍごとに分割すると、０．５箇月ごとの生理活性物質の蓄積量の経時的変化が測定できる。
【００８４】
実施形態２における測定工程で、生理活性物質の蓄積量の測定方法は、特に限定されず、公知の手法を用いることができる。公知の手法の例としては、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、液体クロマトグラフィ、質量分析などが挙げられる。以下に、ＥＬＩＳＡおよび免疫染色による生理活性物質の蓄積量の測定方法を、実施形態１における測定方法との相違点に絞って説明する。
【００８５】
実施形態２における測定工程でＥＬＩＳＡを用いる場合、図２のＳ１２（切り出し工程）が、実施形態１とは異なる。すなわち、実施形態１のＳ１２は毛髪の一部分を切り出すのに対し、実施形態２のＳ１２は毛髪から複数の部分を切り出す。このとき、毛髪を根元側から一定の長さで切断してゆくと、より簡便に複数の部分を切り出すことができる。その後、Ｓ１３〜Ｓ１７の工程をＳ１２で切り出した毛髪のそれぞれの部分に施すことにより、生理活性物質の蓄積量の経時的変化が測定できる。
【００８６】
実施形態２における測定工程で免疫染色を用いる場合、図３のＳ２３（切断工程）が実施形態１とは異なる。すなわち、実施形態１では、包埋剤２に包埋された毛髪１を切断して、１つの毛髪サンプル１０を得る（図４参照）。これに対し実施形態２では、包埋剤２に包埋された毛髪１を複数箇所で切断して、複数の毛髪サンプル１０を得る。その後、Ｓ２４〜Ｓ２６の工程を、Ｓ２３で得た複数の毛髪サンプル１０に対して施すことにより、生理活性物質の蓄積量の経時的変化が測定できる。
【００８７】
〔実施形態３〕
実施形態３では、測定工程において測定した生理活性物質の蓄積量を、較正式により較正する較正工程をさらに含む測定方法について説明する。なお、収集工程、採取工程および測定工程については、実施形態１、２に記載した通りである。
【００８８】
毛髪に含まれる生理活性物質は、洗髪などの外的要因により、あるいは代謝などの内的要因により、時間経過とともに存在量が変化する可能性がある。このような変化を較正式により較正することにより、実施形態１または２の測定結果をより正確なものとすることができる。一実施形態において、上記較正式は、毛髪における上記生理活性物質の蓄積量が経時的に低下する現象に基づく式である。
【００８９】
実施形態３における較正工程は、まず、被検体から定期的に毛髪を収集する。次に、異なる時期に収集した複数の毛髪の特定部位における、生理活性物質の蓄積量を測定する。このとき、上記特定部位は、上記毛髪の伸長速度を考慮して、互いに位置をずらして設定されている。なお、上記生理活性物質の蓄積量は、測定値で表してもよいし、代表値で表してもよい。
【００９０】
毛髪を収集する方法、毛髪を採取する方法、採取される毛髪の本数、個々の採取における毛髪の種類および毛髪を採取する部位については、実施形態１に記載の通りである。
【００９１】
毛髪に含まれる生理活性物質の蓄積量を測定する方法は特に限定されず、公知の手法を用いることができる。このような手法としては、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、液体クロマトグラフィ、質量分析などが挙げられる。ＥＬＩＳＡおよび免疫染色の具体的な方法は、実施形態１に記載の通りである。
【００９２】
上記特定部位は、異なる時期に採取した毛髪のそれぞれについて、毛髪の伸長速度に応じて設定される。この点を、図９の（ａ）に基づいて、より具体的に説明する。図９の（ａ）は、毛髪として頭髪を、１箇月ごとに採取している。そして、１番目に採取した頭髪からは、根元付近から０〜１ｃｍの部位における生理活性物質の蓄積量（濃度）を測定している。同様に、２番目に採取した頭髪からは、根元付近から１〜２ｃｍの部位における生理活性物質の蓄積量を測定している。３番目、４番目、５番目、６番目に採取した頭髪についても、それぞれ根元付近から２〜３ｃｍ、３〜４ｃｍ、４〜５ｃｍ、５〜６ｃｍの部位における生理活性物質の蓄積量を測定している。
【００９３】
上述した特定部位の設定は、頭髪の伸長速度が１箇月に１ｃｍ程度であることに基づいている。すなわち、１番目に採取した頭髪における根元付近から０〜１ｃｍの部位は、頭髪の伸長のため、１箇月後には根元付近から１〜２ｃｍの位置に移動していることに基づいている。このため、２番目に採取した頭髪の根元付近から１〜２ｃｍの部位は、１番目に採取した頭髪における根元付近から０〜１ｃｍの部位に相当する部位であると考えられる。
【００９４】
このように特定部位を設定して生理活性物質の蓄積量を測定することにより、時間経過による毛髪中の生理活性物質の蓄積量の変化を追跡することができる。
【００９５】
上記に説明した工程において、毛髪を採取する回数は、例えば６〜１２回程度であるが、特に限定されない。例えば、１年間にわたり毛髪中の生理活性物質の蓄積量の変化を追跡し、そのパターンを得たならば、季節ごとに使用する較正式を変更することもできる。また、データの蓄積により、毛髪中の生理活性物質の蓄積量の変化に一定の傾向があることが見出されている場合は（例えば、「線形に減少する」「指数曲線に従って減少する」など）、毛髪を採取する回数をより少なくすることが可能である。
【００９６】
次に、上記の工程により得られた生理活性物質の蓄積量の測定結果から、較正式を得る（図９の（ｂ））。上記測定結果から較正式を得るためには、例えば、フィッティングにより回帰曲線（回帰直線）を導出すればよい。このような回帰曲線の例としては、１次直線、指数曲線、累乗を含む多項式、シグモイド関数などが考えられるが、測定値に対してよくフィッティングする関数であるならば特に限定されない。測定値に対してよくフィッティングする関数を選択する基準としては、例えば、最小二乗法により残差の２乗和を最小にした際に、上記残差の２乗和が最小となる関数を選択すればよい。フィッティングによる回帰曲線の導出方法は公知であり、市場に流通しているソフトウェアなどを利用して得ることができる。
【００９７】
上記の工程を経て得られた較正式は、当該較正式を得るための毛髪を採取した被検体における生理活性物質の蓄積量の測定値を較正するために用いてもよいし、他の被検体における生理活性物質の蓄積量の測定値を較正するために用いてもよい。前者の場合、同一の被検体に由来する較正式を用いることになるため、較正の結果がより正確になることが期待できる。
【００９８】
最後に、得られた回帰曲線に基づいて、測定工程で得た生理活性物質の蓄積量を較正する（図９の（ｃ））。上記回帰曲線が１次直線の場合は、当該１次直線の傾きを求めることにより、測定工程で得た生理活性物質の蓄積量の測定値を較正することができる。
【００９９】
上記回帰曲線が指数曲線（ただし、生理活性物質が時間経過とともに減衰するモデル）の場合は、以下の手順により、測定工程で得た生理活性物質の蓄積量の測定値を較正することができる。概略すると、１、２では較正のための減衰曲線を求めている。次いで、３、４では上記減衰曲線に基づいて、注目する毛髪の部分（較正係数を算出したい部分）における生理活性物質の蓄積量を較正している。
１．生理活性物質の蓄積量（濃度）の変化を、時間ｔを変数とする関数ｆ（ｔ）として、以下の通り定義する。
ｆ（ｔ）＝Ａｅｘｐ（−ｔ／τ）・・・（１）
（式中、Ａは定数、τは時定数とする）
２．次に、上記ｆ（ｔ）において、Ａおよびτをパラメータとしてフィットさせる。例えば、ｔ＝ｎ１からｔ＝ｎ４まで、４箇月間、１箇月毎に毛髪を採取して４つの毛髪検体を取得し、それぞれの毛髪の対応する位置における生理活性物質の蓄積量を測定したとする。このとき、上記生理活性物質の蓄積量の測定結果（４つの測定結果）を基に、（１）式に対するフィッティングを行い、Ａ＝Ａ０、τ＝τ０を求めることができる。
３．較正係数を算出したい部分の、伸長期間ｎを計算する。これは、毛髪の根元付近から上記較正係数を算出したい部分までの長さを、単位時間あたりの毛髪の伸長速度で除算することにより求められる。例えば、頭髪の根元付近から４ｃｍの部分における伸長期間は、頭髪の伸長速度が１ｃｍ／月であることから、４箇月である、と計算できる。
４．２および３で求めたτ０およびｎを基に、下記式（２）に基づいて、上記較正係数を算出したい部分の較正係数を求める。
（ｅｘｐ（−１／τ０）／ｅｘｐ（−ｎ／τ０））・・・（２）
５．４で求めた較正係数を、上記較正係数を算出したい部分における生理活性物質の蓄積量に乗算する。このようにして、較正された測定値を得ることができる。
【０１００】
〔実施形態４〕
実施形態４では、被検体から定期的に収集された複数の毛髪に、複数の特定部位が設定されている補正工程を有する測定方法について、図１０に基づいて説明する。なお、収集工程、採取工程および測定工程については、実施形態１に記載の通りである。また、「較正式の導出」および「生理活性物質の蓄積量の測定値の較正」については、実施形態３に記載の通りである。
【０１０１】
図１０では、実施形態３で生理活性物質の蓄積量（濃度）が測定される特定部位の系列（白丸）に加えて、２つ（斜線丸および黒丸）の特定部位の系列においても、生理活性物質の蓄積量を測定している。すなわち、（１）１番目に採取された頭髪の根元付近から１〜２ｃｍの部位、２番目に採取された頭髪の根元付近から２〜３ｃｍの部位、３番目に採取された頭髪の根元付近から３〜４ｃｍの部位、４番目に採取された頭髪の根元付近から４〜５ｃｍの部位、５番目に採取された頭髪の根元付近から５〜６ｃｍの部位、６番目に採取された頭髪の根元付近から６〜７ｃｍの部位からなる特定部位の系列（斜線丸）、および、（２）２番目に採取された頭髪の根元付近から０〜１ｃｍの部位、３番目に採取された頭髪の根元付近から１〜２ｃｍの部位、４番目に採取された頭髪の根元付近から２〜３ｃｍの部位、５番目に採取された頭髪の根元付近から３〜４ｃｍの部位、６番目に採取された頭髪の根元付近から４〜５ｃｍの部位からなる特定部位の系列（黒丸）、における生理活性物質の蓄積量が測定されている。
【０１０２】
その後、実施形態４と同様に、それぞれの系列における生理活性物質の蓄積量の測定結果に基づいて、複数の較正式を得ることができる。複数の較正式から、最終的な較正式を得るには、公知の手法（例えば、減衰の時定数τの平均値を算出する方法）を用いることができる。
【０１０３】
このように、複数の特定部位における生理活性物質の蓄積量を追跡することにより、得られる測定値の数が増加し、したがって、より正確な較正式が得られる。これによって、生理活性物質の蓄積量の経時的変化をより正確に測定することができる。
【０１０４】
〔実施形態５〕
実施形態５では、被検体から定期的に採取した、毛髪以外の特定のサンプルにおける生理活性物質の蓄積量の経時的変化に基づいて較正式を得る較正工程を有する測定方法について説明する。
【０１０５】
実施形態５における「毛髪以外の特定のサンプル」は、被検体に由来するサンプルであれば、特に限定されない。このようなサンプルには、血液、脳脊髄液、リンパ液、母乳、唾液、鼻汁、汗、尿、便、呼気などに加えて、生組織可溶化物、細胞可溶化物なども包含される。蓄積量を測定する生理活性物質の種類に応じて、毛髪以外の特定のサンプルを適宜選択すればよい。
【０１０６】
以下、実施形態５に係る較正方法を、図１１に基づいてより具体的に説明する。図１１では、毛髪以外の特定のサンプルとして唾液を、生理活性物質としてコルチゾールを、それぞれ選択している。
【０１０７】
まず、被検体の唾液を採取する。唾液の採取には、例えば、サリベット（SALSTED製）を好適に用いることができる。採取は唾液中のコルチゾール濃度が安定する１４〜１６時に行うことが好ましい。採取した唾液を即座に用いない場合は、冷凍保存する。
【０１０８】
なお、被検体の唾液を採取する回数は、週３回程度、１箇月当たり１２回程度とすることが好ましい。このように、所定期間内に複数回の測定を行う場合は、得られた複数個の測定値から、代表値を決定する。複数の測定値から代表値を決定する方法としては平均値を取る方法、累積度数が５０％となる値を取る方法、最頻値を取る方法、中央値を取る方法などが挙げられる。
【０１０９】
次に、唾液中のコルチゾール濃度を測定する。測定には、例えば、唾液用ＥＬＩＳＡ測定キット（Salimetrics製、Cortisol EIA Kit）を好適に用いることができる。例えば、図１１の（ａ）では、４月から１箇月ごとに、唾液中のコルチゾール濃度を測定している。得られた測定値は、適宜基準値を設定することにより規格化する（例えば、最大の測定値を１とする、測定値の平均を１とする、最新の測定値を１とする、など）。
【０１１０】
このようにして得られる、唾液中のコルチゾール濃度の推移を表すグラフが、図１１の（ａ）である。上記散布図では、規格化により、８月の測定値が１．０となっている。
【０１１１】
次に、被検体から採取した毛髪に対して、所定期間におけるコルチゾールの蓄積量を測定する。測定された値は、唾液の場合と同じ方法により規格化する。図１１の（ｂ）では、８月末に採取した頭髪に対して、４月、５月、６月、７月、８月におけるコルチゾールの蓄積量（濃度）を測定し、規格化により８月の測定値が１．０となっている（図１１の（ｂ）、黒丸；なお、８月の黒丸は８月の白丸と重なっている）。
【０１１２】
最後に、規格化された毛髪中のコルチゾール濃度を、規格化された唾液中のコルチゾール濃度に基づいて較正する（図１１の（ｂ）、白丸）。この際の較正係数は、下記式（３）により導出される。このようにして得られた較正係数を、実験により測定された実測値に乗算することにより、較正値が得られる。
【０１１３】
Ｈ’ｎ＝Ｓｎ／Ｈｎ・・・（３）
（式中、ＳｎはＮ月における規格化された唾液中のコルチゾール濃度の代表値、ＨｎはＮ月における規格化された毛髪中のコルチゾール濃度の測定値、Ｈ’ｎはＮ月における規格化された毛髪中のコルチゾール濃度の較正係数を表す）。
【０１１４】
〔実施形態６〕
実施形態６では、生理活性物質（例えば、コルチゾール）の経時的データを解析する解析システムの一例について説明する。図１２は、生理活性物質の経時的データを解析する解析システム４の一例を示す機能ブロック図である。
【０１１５】
図１２に示すように、解析システム４は、解析装置４０およびサーバ５０を備えている。解析装置４０は、生理活性物質の測定結果を保存し、保存された複数の測定結果に基づいて、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を解析したり、特定の時点における生理活性物質の蓄積量の較正値を算出したりするための装置である。解析装置４０は、例えば、パーソナルコンピュータである。
【０１１６】
解析装置４０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）４１１、記憶部４１２および送受信部４１３を備える演算部４１、入力装置としての入力部４２、および出力装置としての表示部４３を備えている。入力部４２は、例えば、キーボードおよびマウスである。
【０１１７】
記憶部４１２は、不揮発性の記憶装置であり、ユーザが入力した測定データおよび当該測定データを解析するためのコンピュータプログラム（解析用アプリケーション）が格納されている。
【０１１８】
ＣＰＵ４１１は、ユーザからの指示に従って、解析用アプリケーションを読み取って実行することにより、記憶部４１２に格納された測定データを用いた解析を行う。前記解析用アプリケーションには、表計算ソフト、グラフ作成ソフトなどが含まれる。ＣＰＵ４１１による解析結果は、数値、表、グラフなどの様式で、表示部４３に表示される。
【０１１９】
送受信部４１３は、インターネットなどの通信回線を介して、サーバ５０とデータ通信を行う通信装置である。ＣＰＵ４１１は、記憶部４１２に格納された測定データをサーバ５０に送信し、複数の被検体の測定データをサーバ側で集計し、ビックデータを生成してもよい。また、ＣＰＵ４１１は、サーバ５０に保存されている他の被検体の測定データを、送受信部４１３を介してサーバ５０から取得し、測定データの解析に利用してもよい。
【０１２０】
〔実施形態７〕
実施形態７では、実施形態１〜５において、毛髪中の生理活性物質の蓄積量を測定するときに用いられる、キットについて説明する。上記キットは、実施形態１に説明されている、免疫染色を行うためのキットである。
【０１２１】
実施形態７に係るキットは、（１）毛髪を包埋するための包埋剤、および（２）上記毛髪に含まれる生理活性物質を特異的に認識する抗体を含んでいる抗体反応剤、を備えている。以下、順に説明する。
【０１２２】
包埋剤は、毛髪を切断して毛髪サンプルを作製する際に用いられる（図４を参照）。包埋剤の主成分としては、パラフィン、セロイジン、ゼラチン、カーボワックス、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、シアノアクリレート、氷などを用いることができる。
【０１２３】
抗体反応剤は、毛髪に含まれる生理活性物質を特異的に認識する抗体を含んでいる。例えば、上記抗体として標識付けされた抗体を用いることにより、毛髪中に含まれる生理活性物質を検出することができる（一次免疫染色）。また、上記抗体反応剤に含まれている抗体を特異的に認識する二次抗体として標識付けされた抗体を用いることにより、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる（二次免疫染色）。さらに、アビジン−ビオチン反応などと組み合わせることによっても、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる。
【０１２４】
実施形態７に係るキットは、包埋剤および抗体反応剤の他に、キットの使用に必要となる薬剤（試薬、溶媒、緩衝液、洗浄剤など）、器具、容器（ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）、説明書などを備えていてよい。上述した薬剤、器具、容器、説明書などは、市場または通信回線などを通じて、別途使用者に入手させる態様を取ってもよい。
【０１２５】
〔変形例〕
実施形態６と、実施形態３〜５とを組み合わせることにより、例えば、較正式の導出に必要な時間を短縮することができる。すなわち、既に取得されている毛髪中の生理活性物質の蓄積量に関するデータから、較正式を所与のものとして取得したり、較正式のフィッティングに必要なデータ数を減らしたりすることが可能である。
【符号の説明】
【０１２６】
１：毛髪
２：包埋剤
１０：毛髪サンプル
１１：毛髪断面
１１ａ：毛髄質断面
１２：抗体が非特異的に結合しうる箇所
１２ａ：抗体用ブロッキング剤
１３：蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所
１３ａ：蛍光色素用ブロッキング剤
１４ａ：一次抗体
１５：蛍光色素
２１：カバーガラス
２２：スライドガラス
２３：ステージ
２４：光学レンズ
２５：ダイクロイックミラー
２６：フィルタ
３１：励起光
３２：蛍光
４：解析システム
４０：解析装置
４１：演算部
４１１：ＣＰＵ
４１２：記憶部
４１３：送受信部
４２：入力部
４３：表示部
５０：サーバ
【図１】
2019007833.tif 000003
【図２】
2019007833.tif 000004
【図３】
2019007833.tif 000005
【図４】
2019007833.tif 000006
【図５】
2019007833.tif 000007
【図６】
2019007833.tif 000008
【図７】
2019007833.tif 000009
【図８】
2019007833.tif 000010
【図９】
2019007833.tif 000011
【図１０】
2019007833.tif 000012
【図１１】
2019007833.tif 000013
【図１２】
2019007833.tif 000014