(57)【要約】【課題】本発明は検体に含まれる細胞について、染色体上の遺伝情報に由来するバリアント（多型）を含む目的生体物質について解析するための手段を提供する。【解決手段】第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む目的生体物質を、下記工程（１）〜（３）を含む方法で解析する方法：  工程（１）検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する；工程（２）工程（１）を行った後、第１目的生体物質に特異的に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に特異的に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させて蛍光染色する；工程（３）工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する。【選択図】図５
2019007875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を含む、検体中の目的生体物質を解析する方法であって、
前記目的生体物質が、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む、解析方法。
工程（１）  検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（２）  工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３）  工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程
【請求項２】
前記工程（１）を行った後、前記工程（２）を行う前または前記工程（２）を行うと同時に、さらに下記工程（Ａ）を行う、請求項１に記載の解析方法。
工程（Ａ）  前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程
【請求項３】
前記工程（３）が、下記工程（３’）である、請求項１または２に記載の解析方法。
工程（３’）  工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞を測定し、さらに細胞を分取する解析工程
【請求項４】
前記第１目的生体物質および／または前記第２目的生体物質が疾患のマーカーとなる物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項５】
前記疾患が、がん、神経変性疾患、炎症性疾患、血液疾患、代謝異常から選択される、請求項４に記載の解析方法。
【請求項６】
前記第１目的生体物質および前記第２目的生体物質がタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項７】
前記質第１目的生体物質が野生型タンパク質であり、前記第２目的生体物質が変異型タンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項８】
前記変異型タンパク質が短縮型タンパク質である請求項７に記載の解析方法。
【請求項９】
前記質第１目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｆであり、前記第２目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｓである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の解析方法。
【請求項１０】
上記検体が、ヒトまたはヒト以外の動物から採取した、組織、血液または骨髄液から調製される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析方法に関し、詳しくは、検体中の目的生体物質を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダウン症(Ｄown syndrome）は２１番染色体のトリソミーが原因で起こる、ヒトで最も多い染色体異常症である。ダウン症の患者は合併症として、白血病、特に巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ；acute megakaryoblastic leukemia）の幼少期における発症リスクが高いことが知られており、０〜４才におけるダウン症児のＡＭＫＬ発症リスクは非ダウン症児に比較して４００〜５００倍とされている。ダウン症の新生児の５〜１０％において、白血病様芽球が末梢血中に増加する病態を示す血液疾患である、一過性骨髄異常増殖症（Transient Abnormal Myelopoiesis；ＴＡＭ）が発症する。ＴＡＭ患者の多くは寛解するが、その後患者の２０〜３０％が生後３年以内にＡＭＫＬを発症する。ＡＭＫＬを発症した場合は治療介入が必要であることから、ＴＡＭを早期に診断し、またＴＡＭと診断された場合には経過観察を行い、さらに反復して検査を繰り返すことにより迅速にＡＭＫＬの確定診断を行うことが、臨床上求められている。
【０００３】
近年、ＴＡＭおよびＡＭＫＬを発症したダウン症児のほぼ全例において、転写因子ＧＡＴＡ−１遺伝子（Gene ID；2623）の変異が認められ、Ｎ末端にある転写活性化領域を欠くバリアントであるＧＡＴＡ−１ｓが発現するようになることが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ＧＡＴＡ−１が変異を起こしているかどうかを確認するためには遺伝子レベルでの解析が必要であるが、患者から採取した細胞から核酸を抽出して遺伝子を増幅して塩基配列を解析するなど、遺伝子の解析には非常に時間がかかるという問題がある。
【０００５】
また、ＡＭＫＬを含む急性骨髄性白血病の診断においては、患者から採取した骨髄で作製した骨髄塗抹標本に、形態染色（ＨＥ染色等）、細胞染色（ペルオキシダーゼ染色等）、免疫染色などによる病理検査が一般的に行われている。これらの方法においては結果がでるまでに時間がかかったり、検査を行う技師の経験や技術、または検査を行う際の温度・時間などの環境条件により結果が左右されるなどの問題がある。
【０００６】
近年では、フローサイトメーターを用いて蛍光色素で標識した細胞マーカーを検出する方法が用いられるようになってきた。この方法では短時間に多量（数千個から数百万個）の細胞について高精度かつ高速で解析することができることから、従来行われてきた方法よりも検査にかかる時間が大幅に短縮でき、さらに高い精度で定量的に解析が可能である。特許文献１には、造血器腫瘍細胞株における細胞や、患者から採取した末梢血から分離した単核球表面におけるタンパク質の発現を、フローサイトメトリーで測定する方法が記載されている。しかし特許文献１においては一つのタンパク質について一つの抗体を用いて検出をおこなっており、この方法を用いたとしてもＧＡＴＡ−１が変異を起こしているか否かの判断をすることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／００８５９４号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Wechsler et al. Nature Genetics 32, p.148-152, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
遺伝子変異に基づいた変異を確認するには上述したように遺伝子レベルでの解析が必要である。本発明は検体に含まれる細胞について、染色体上の遺伝情報に由来するバリアント（多型）を含む目的生体物質について解析するための手段である解析方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、目的生体物質に対して、２種類の標識物質を用いてフローサイトメトリーによる解析を行うことにより、検体中の目的生体物質が、生物が本来保有する遺伝子配列を有する遺伝子（野生型遺伝子）に由来するものであるか、あるいはそのバリアントであるかを迅速に判定できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は次のような解析方法を提供する。
［１］
下記工程（１）〜（３）を含む、検体中の目的生体物質を解析する方法であって、
前記目的生体物質が、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む、解析方法。
工程（１）  検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（２）  工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３）  工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程
［２］
前記工程（１）を行った後、前記工程（２）を行う前または前記工程（２）を行うと同時に、さらに下記工程（Ａ）を行う、項１に記載の解析方法。
工程（Ａ）  前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程
［３］
前記工程（３）が、下記工程（３’）である、項１または２に記載の解析方法。
工程（３’）  工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞を測定し、さらに細胞を分取する解析工程
［４］
前記第１目的生体物質および／または前記第２目的生体物質が疾患のマーカーとなる物質である、項１〜３のいずれか１項に記載の解析方法。
［５］
前記疾患が、がん、神経変性疾患、炎症性疾患、血液疾患、代謝異常から選択される、請求項４に記載の解析方法。
［６］
前記第１目的生体物質および前記第２目的生体物質がタンパク質である、項１〜５のいずれか１項に記載の解析方法。
［７］
前記質第１目的生体物質が野生型タンパク質であり、前記第２目的生体物質が変異型タンパク質である、項１〜６のいずれか１項に記載の解析方法。
［８］
前記変異型タンパク質が短縮型タンパク質である項７に記載の解析方法。
［９］
前記質第１目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｆであり、前記第２目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｓである、項１〜８のいずれか１項に記載の解析方法。
［１０］
上記検体が、ヒトまたはヒト以外の動物から採取した、組織、血液または骨髄液から調製される、項１〜９のいずれか１項に記載の解析方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の解析方法によれば、従来の評価手法と比べて、目的生体物質の検出・解析を、より迅速にまた高精度で行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、蛍光標識された野生型（全長型）ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）および変異型(短縮型)ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｓ）、並びにこれらについてフローサイトメトリーによる解析を行った場合の結果を示す模式図である。
【図２】図２はヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞の、野生型細胞およびＧＡＴＡ−１遺伝子を改変した３つのクローン細胞（＃２４、＃２６、＃２７）における、ＧＡＴＡ−１変異遺伝子の塩基配列である。
【図３】図３はＫ５６２細胞の、野生型細胞およびＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞（＃２４、＃２６、＃２７）を用いておこなったウェスタンブロッティングの結果である。
【図４】図４はＫ５６２細胞の、野生型細胞およびＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞（＃２４、＃２６、＃２７）を用いておこなったフローサイトメトリーの解析結果である。
【図５】図５はＫ５６２細胞の、野生型細胞およびＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞＃２６を混和した細胞を用いておこなったフローサイトメトリーの解析結果である。
【図６】図６はＫ５６２細胞の、野生型細胞およびＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞＃２６を混和した細胞を用いておこなったフローサイトメトリーの解析結果（Ａ）および、分取前の細胞および分取した細胞のそれぞれについて遺伝子解析を行うことにより分取精度を確認した結果の表である。
【図７】図７は急性巨核芽球性白血病細胞株ＣＭＫ１１−５細胞を用いておこなったフローサイトメトリーの解析結果である。
【図８】図８はＴＡＭ患者から単離したＰＢＭＣを用いておこなったフローサイトメトリーの解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の「解析方法」においては、第１標識物質および第２標識物質として、例えば蛍光色素で修飾した抗体を用いることができる。前記標識物質を用いた標識した細胞をフローサイトメトリーで測定することによって、検体に含まれる細胞における第１目的生体物質および第２目的生体物質の量並びにそれぞれの生体物質が存在している細胞の割合を測定・解析することができる。
【００１５】
＜フローサイトメトリーによる解析方法＞
本発明の解析方法は、下記工程（１）〜（３）を含む、検体中の目的生体物質を解析する方法である。本発明において、前記目的生体物質としては、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む。
工程（１）  検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（２）  工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３）  工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程
【００１６】
（工程（１）、固定処理工程）
前記工程（１）は、本発明の解析方法の対象となる検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程である。工程（１）では、細胞に含まれるタンパク質を固定化される。前記細胞固定液は特に限定されないが、メタノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド等を用いることができる。細胞固定液の濃度は、使用する細胞固定液に応じて決定すればよく、例えばパラホルムアルデヒドを用いる場合には、３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）にするとよい。工程（１）を行ったあと工程（２）を行う前に、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）等で細胞を洗浄して細胞固定液を細胞から除去することが好ましい。
【００１７】
（工程（Ａ）、細胞膜透過処理工程）
本発明の解析方法では、工程（１）を行った後、工程（２）を行う前または工程（２）を行うと同時に、さらに、前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程（工程（Ａ））を行なってもよい。特に後述する目的生体物質が細胞内に存在するタンパク質または核酸である場合には、標識物質を細胞内の目的生体物質と結合させるために工程（Ａ）を行うことがより好ましい。
【００１８】
細胞膜透過処理液は、細胞の形態を保持しつつ細胞膜及び核膜の透過性を増大させるものであれば特に限定されないが、市販の細胞膜透過処理試薬を用いてもよいし、任意の界面活性剤等を用いて調製したものを用いてもよい。このような目的の膜透過処理液としては、特に限定されないが、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００等の非イオン系界面活性剤やメタノール等のアルコール類が好適に用いられる。細胞膜透過処理液の濃度は、使用する細胞膜透過処理液に応じて決定すればよく、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いる場合には０．０５％（ｖ／ｖ）〜１．０％（ｖ／ｖ）とするとよく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００やＮＰ−４０を用いる場合には０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）とするとよく、またメタノールを用いる場合には９０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）とするとよい。工程（Ａ）を行ったあと工程（２）を行う前に、ＰＢＳ等で細胞を洗浄して細胞固定液を細胞から除去することが好ましい。
【００１９】
（工程（２）、蛍光染色工程）
前記工程（２）は、工程（１）を行った後に行われる工程であり、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程である。
前記蛍光染色工程における蛍光染色は、第１標識物質および第２標識物質によって行われる。蛍光染色としては、特に限定されないが、蛍光免疫染色であることが好ましい。工程（２）は、検体に含まれる細胞と標識物質とを接触させることにより、該蛍光色素を直接的または間接的に目的生体物質に結合させて行うことが好ましい。
【００２０】
蛍光染色の時間、好ましくは、細胞と標識物質とを接触させる時間は、一般的な蛍光染色を行う場合に準じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は５分〜半日程度とすればよい。
【００２１】
蛍光染色の温度、すなわち反応温度は、一般的な蛍光染色を行う場合に準じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は４〜３７℃程度とすればよい。
【００２２】
蛍光染色において、細胞に接触させる標識物質の濃度は、特に限定されないが、標識物質および目的生体物質の選択に応じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができる。
【００２３】
(工程（３）、解析工程)
前記工程（３）は、工程（２）を行った後に行われる工程であり、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程である。
前記工程（３）は前記蛍光染色工程を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞の蛍光強度や波長等を検出・測定し、得られた測定結果（検出データ）を用いて解析を行う工程である。
【００２４】
検出データは相関ヒストグラムとして示され、これらのヒストグラムを解析することにより、検体に含まれる細胞の特性を、細胞ごとに明らかにできる。近年では複数の光線と検出器を装備した装置が市販されており、複数の測定情報から相関解析や統計解析を行うことができる。
【００２５】
蛍光の検出に先行して、前方散乱光（Forward Scatter: FSC）及び側方散乱光（Side Scatter: SSC）を測定してゲートをかけることで、目的の細胞集団の蛍光強度のみを測定してもよい。具体的には例えば、前方散乱光及び側方散乱光をそれぞれＸ軸及びＹ軸にとり、ドットプロット展開から得られるデータにおいて目的細胞と思われる細胞集団にゲートをかけ、ゲート内の蛍光強度を測定することで目的の細胞集団の測定結果のみを取得することで、より精度の高い解析が可能になる。
(工程（３’）、解析工程)
【００２６】
本発明の解析方法においては、前記工程（３)として、工程（３’）を行ってもよい。工程（３’）は工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析するとともに、該データに基づいて特定の細胞を分取する工程である。工程（３’）を行うことにより、例えば、蛍光染色処理を行った細胞から第１標識物質および／または第２標識物質で標識されている細胞を選別して分取することができる。
【００２７】
＜フローサイトメトリー＞
フローサイトメトリーとは流体中に分散させた細胞を光学的に分析する手法であり、蛍光標識した細胞を分散させた流体に、一定波長の光線（レーザー光線）を照射することで生じた蛍光を蛍光検出器によって検出し、得られた検出データに基づいて、標識された細胞の数や全細胞中に占める割合、各細胞における蛍光標識された生体物質の量などを定量測定することができる。フローサイトメトリーに用いられる装置をフローサイトメーターと呼び、例えば日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、ベックマン・コールター株式会社などから販売されており、本発明ではこれらを利用することができる。基本的な操作法、解析条件などは装置に添付の取扱説明書に従えばよい。また、フローサイトメトリー解析に関する論文や成書も数多く存在し、例えば、国際サイトメトリー学会（ISAC）による学会誌「Cytometry」や、一般社団法人日本サイトメトリー学会による学会誌「Cytometry Research」等が参考になる。
【００２８】
また上述したように細胞の分取を行うためには、セルソーターを装備したフローサイトメーターを用いることができる。セルソーターは、例えば、フローサイトメーターにおいて前述のように検出データが取得された後、この検出データに基づいて、細胞をソーティングする装置である。市販のセルソーター装備フローサイトメーターとして、例えば、ＰＥＲＦｌｏｗ Ａｌｌ（古河電気工業社製）等が挙げられる。
【００２９】
＜検体＞
本発明において「検体」は、特に限定されないが、典型的には培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の動物から採取した、組織、血液（末梢血）、骨髄液等から適切な方法で調製した、細胞浮遊液であることが好ましい。
【００３０】
検体の調整方法は、特に限定されないが、フローサイトメトリーに用いる試料を調製する際に従来慣用されている手順に従って行うことができる。例えばヒトから採取した血液を用いて検体を調製する場合、ＥＤＴＡ、クエン酸等の抗凝固剤が添加された採血チューブに採血した血液を、溶血処理溶液により溶液処理して赤血球を除去することで検体とすることができる。溶血処理の代わりに、採取した血液を遠心分離することで取得した単核球画分を検体としてもよい。組織から検体を調製する場合には酵素処理またはホモジナイザーを用いた処理により、組織に含まれる細胞以外の物質（間質等）を除去し、組織に含まれる細胞のみを回収してＰＢＳ等に懸濁したものを検体とすることが好ましい。検体に含まれる細胞は特に限定されないが、例えば、がん細胞、免疫細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）等が挙げられる。
【００３１】
本発明の実施形態の一例において、検体は疾患に罹患したヒト（患者）や健常者から採取した組織、血液、骨髄液から調製することが好ましい。疾患は特に限定されないが、がん（固形がん、血液がん、リンパ腫等）、神経変性疾患、炎症性疾患、血液疾患、代謝異常等の、遺伝子変異によって引き起こされる疾患やその発病に遺伝子変異が関与していると推定される疾患、および患者の多くに特定の遺伝子変異が確認される疾患等が挙げられる。
【００３２】
患者とは、疾患に罹患していることが疑われる者、他の方法により疾患に罹患していると判断された者、疾患に罹患するリスクが高い者等を含んでいてもよい。具体的な例としては、ダウン症新生児、ＴＡＭを発症した患者、染色等の病理検査でＡＭＫＬが疑われている者等が挙げられる。
【００３３】
＜目的生体物質＞
本発明において「目的生体物質」とは、検体に含まれる細胞に存在している生体物質であり、好ましくは検体に含まれる細胞が発現している生体物質である。本発明において検出される目的生体物質は、特に限定されないが、タンパク質であることが好ましく、染色体上の遺伝情報に由来するバリアント（多型）を含むことがより好ましい。本明細書においては目的生体物質の１つを第１目的生体物質、そのバリアントを第２目的生体物質という。本発明の目的生体物質には、第１目的生体物質および第２目的生体物質に加えてさらに別のバリアント（第Ｎ目的生体物質（Ｎ≧３））が含まれていてもよいし、第１目的生体物質および第２目的生体物質に加えてさらに別の生体物質が含まれていてもよい。
【００３４】
典型的な例を挙げると、目的生体物質がタンパク質である場合、第１目的生体物質は、該タンパク質をコードする遺伝子であって生物が本来保有する遺伝子配列を有する遺伝子（野生型遺伝子）に由来する野生型タンパク質であり、第２目的生体物質は変異型の遺伝子配列を有する遺伝子（変異型遺伝子）に由来する変異型タンパク質である。第１目的生体物質と野生型タンパク質および第２目的生体物質と変異型タンパク質の組み合わせはそれぞれ逆（つまり第１目的生体物質が変異型タンパク質であり、第２目的生体物質が野生型タンパク質である）であってもよい。また、第１目的生体物質および第２目的生体物質がそれぞれ異なった変異型遺伝子に由来する変異型タンパク質であってもよい。
【００３５】
前記変異型タンパク質は特に限定されないが、野生型タンパク質と大きく構造が異なったものが好ましい。例えば、野生型の遺伝子配列のある部分の塩基が変化することで、タンパク質中のあるアミノ酸をコードしていたコドンがストップコドンに変化する、ナンセンス突然変異(nonsense mutation)により生じる、正常タンパク質よりも短い短縮型タンパク質（truncated protein）が好ましい例として挙げられる。遺伝子変異により短縮型タンパク質を形成し得るタンパク質としては、特に限定されないが、ＧＡＴＡ−１、ＣＥＢＰ／α、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣ、ＰＬＥＣ１等が挙げられる。例えば、第１目的物質および第２目的物質の具体的な一例としては、第１目的物質が野生型（全長型）のＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）であり、第２目的物質がＧＡＴＡ−１の変異型（短縮型）タンパク質であるＧＡＴＡ−１ｓである組み合せが挙げられる。
【００３６】
本発明の実施形態の一例においては、第１目的物質または第２目的物質が疾患のマーカーなど、疾患に関連する生体物質であることが好ましい。例えば、第１目的物質が野生型タンパク質であり、第２目的物質が変異型タンパク質（第１目的物質である野生型タンパク質の変異型タンパク質）であって、該変異タンパク質が疾患関連タンパク質である。このような疾患関連タンパク質は、ある疾患の患者に由来する細胞に特徴的に発現しているタンパク質であってもよいし、患者に由来する細胞においてのみ修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、糖鎖化等）を受けるタンパク質であってもよい。疾患関連タンパク質は特に限定されないが、例えば腫瘍関連タンパク質、免疫関連タンパク質、炎症系タンパク質等が挙げられる。より具体的には例えばシグナル伝達にかかわる受容体またはリガンドであることが挙げられ、さらに具体的には、転写因子、増殖因子、サイトカイン、およびそれらの受容体等が挙げられる。
【００３７】
＜標識物質＞
本発明の標識物質は、前記目的生体物質を特異的に認識して結合することにより、前記目的生体物質を標識する物質であり、典型的には、目的生体物質を認識して結合する構成要素と検出のための標識である構成要素とを含み、それぞれの構成要素が直接的にまたは間接的に結合したものである。検出のための標識である構成要素としては、通常蛍光色素が用いられるが、生体物質を検出するための標識として用いることができるものであれば特に限定されない。目的生体物質を特異的に認識して結合する構成要素としては、典型的には、目的生体物質がタンパク質である場合には抗体であり、目的生体物質が核酸である場合、目的生体物質と相補的な配列を有する核酸である。標識物質は、例えば、市販されている蛍光標識試薬（キット）を利用して、抗体または核酸と蛍光色素とを結合させることで作製することができる。また、あらかじめ所望の抗体に所望の蛍光色素が結合されている蛍光標識抗体が市販されていれば、それを標識物質として利用してもよい。
【００３８】
本発明においては、前記第１目的生体物質に結合する標識物質を第１標識物質、第２目的生体物質に結合する標識物質を第２標識物質と称する。第１標識物質および第２標識物質は、それぞれ第１目的生体物質、第２目的生体物質のみに結合するものであってもよいし、第１標識物質および第２標識物質のどちらか一方が第１目的生体物質および第２目的生体物質の両方に共通する部分と結合するものであってもよい。但し、第１標識物質および第２標識物質それぞれが、共に第１目的生体物質および第２目的生体物質の両方に共通する部分と結合するものではない。
【００３９】
例えば、第１目的物質が野生型タンパク質であり、第２目的物質が変異型タンパク質である場合、第１標識物質は野生型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質は変異型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含む様態が挙げられる。また別の様態としては、第１標識物質が野生型タンパク質および変異型タンパク質に共通する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質が変異型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含む態様が挙げられる。さらに別の様態としては、第１標識物質が野生型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質が野生型タンパク質および変異型タンパク質に共通する構造をエピトープとして認識する抗体を含む態様が挙げられる。
【００４０】
第１標識物質および第２標識物質が含む検出のための標識である構成要素として蛍光色素を用いる場合、それぞれの標識は異なった励起波長の蛍光色素であってもよいし、同じ励起波長の蛍光色素であってもよい。また、それぞれの標識は異なる発光波長の蛍光色素であることが好ましい。それぞれの標識としては、励起波長および発光波長が異なる蛍光色素を用いることが最も好ましい。標識物質は市販の蛍光標識抗体や蛍光標識核酸を用いてもよいし、常法に従って、所望の蛍光色素で抗体・核酸を修飾したものを用いてもよい。
【００４１】
＜蛍光色素＞
本発明において用いられる蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、DYOMICS社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ATTO-TEC社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Mobitec社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
【００４２】
＜抗体＞
本発明の標識物質における、目的生体物質を特異的に認識して結合する構成要素が抗体である場合、該抗体は、通常免疫染色法に用いる場合に検出目的となるタンパク質（抗原）と直接的にまたは間接的に結合できる抗体であれば特に限定されない。前記抗体は、抗原に特異的に結合する１次抗体であってもよいし、その１次抗体に特異的に結合する２次抗体、またはそれ以上の高次抗体であってもよいが、１次抗体または２次抗体であることが好ましい。
【００４３】
１次抗体は、抗原にユニークなエピトープを認識して結合する抗体であり、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい２種類以上のモノクローナル抗体を混合して使用する場合、抗体ごとに異なるエピトープについて特異的に結合するモノクローナル抗体の組合せが好ましい。
１次抗体を産生する免疫動物としては特に限定されず、一般的な動物から選択することができ、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。
【００４４】
２次抗体またはそれ以上の高次抗体は、１次抗体または低次抗体にユニークなエピトープ、好ましくはそれらの抗体の目的タンパク質（抗原）等との結合に関与していない領域（Ｆｃ等）に存在するエピトープを認識して結合する抗体である。２次抗体等は、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましいが、経済的な観点からポリクローナル抗体を用いてもよい。
２次抗体等を産生する免疫動物は、１次抗体を産生する免疫動物として例示した動物種等の中から、１次抗体等を産生する動物種またはＦｃ等の領域を形成している動物種に応じて、適切な動物を選択すればよい。例えば、１次抗体として天然型のマウス抗体（マウスが産生したＩｇＧ）を用いる場合は、２次抗体として、マウス以外の免疫動物（ウサギ等）が産生する、マウスＩｇＧに特異的に結合する抗体を用いることが適切である。
【００４５】
前記抗体は、いずれのアイソタイプを用いてもよいが、通常はＩｇＧまたはＩｇＭであり、特にＩｇＧが好ましい。抗体は、目的タンパク質または低次抗体を特異的に認識して結合する能力を有する限り、完全長のＩｇＧのような天然型の抗体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、または、これらの抗体断片を用いて多機能化（多価化または多重特異性化）された人工抗体などの、非天然型の抗体であってもよい。また、特定の免疫動物に由来する天然型の抗体（例えばマウスによって産生されるマウス抗体）であってもよいし、ベクター等を用いた人工的な手段により作製されるキメラ抗体、ヒト型化抗体または完全ヒト抗体であってもよい。
【実施例】
【００４６】
［作製例１］
＜ＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞株の作製＞
ｇＲＮＡ（GATA1 C1 Target 配列；GTGTCCTCCACACCAGAATC）およびGeneArt(登録商標)CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit；（Thermo Fisher Scientific社；Cat# A21174）を用いて、遺伝子導入装置4D-Nucleofector(商標）システム(Lonza社)  ＸユニットおよびプログラムＦＦ−１２０により、ヒト慢性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞１ｘ１０6個に対して、ＧＡＴＡ−１遺伝子の編集をおこなった。トランスフェクション後のプール細胞から、ゲノムＤＮＡを抽出し、ターゲット領域をＰＣＲにて増幅し、ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスを行うことでＧＡＴＡ−１遺伝子の配列を確認した。ＧＡＴＡ−１遺伝子に変異が確認された細胞プールから、限界希釈法によりシングルクローン化した２８クローンについて、シークエンスを行うことによりゲノムＤＮＡの配列を確認をおこなった。その結果３つのクローン細胞（＃２４、＃２６、＃２７）のＧＡＴＡ−１遺伝子においてエキソン２の中にフレームシフト変異を有することが確認された。以下図２にそれぞれの配列を示す。
【００４７】
野生型（遺伝子を編集していない）Ｋ５６２細胞および上記クローン細胞である３つのＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞について、それぞれ２０μｇの細胞を用いて、常法によりウェスタンブロット用のサンプルを作成した。野生型（遺伝子を編集していない）Ｋ５６２細胞および上記クローン細胞である３つのＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞からタンパクを抽出し、各20μｇのサンプルを用い常法によりSDS-PAGEおよび膜への転写を実施した。抗ＧＡＴＡ−１ウサギモノクローナル抗体（Cell signaling社；Ｄ２４Ｅ４）および抗ウサギＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロットを行うと、得られた３つのクローンからは野生型ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）のものよりも短いＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｓ）のみが存在することが確認された（図３）。抗ＧＡＴＡ−１ウサギモノクローナル抗体（Cell signaling社；Ｄ２４Ｅ４）および抗ウサギＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロットを行うと、得られた３つのクローンからは野生型ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）のものよりも短いＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｓ）のみが存在することが確認された（図３）。
【００４８】
［作製例２］
Lightning  Link  Rapid Conjugation System（Innova Biosciences社;326-0030）を用いて、抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体抗体（Ｍ−２０）（Santa Cruz Biotechnology社；sc-1234）をAlexaFlour（登録商標）488で標識した。
【００４９】
［実施例１］
(細胞の回収)
野生型Ｋ５６２細胞および作製例１で作製したＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞株３クローンの細胞それぞれについて以下の処理を行った。１×１０6個の細胞をＦａｌｃｏｎ（登録商標）ラウンドチューブ（falcon社；製品番号352053）（１２×７５ｍｍ）に入れ、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、細胞を回収した。
回収した細胞に対して、０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）（Sigma-Aldrich社；製品番号A2153）含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った。
【００５０】
（固定処理工程）
回収した細胞に、FIX & PERM（登録商標）Cell Permeabilization Kit（Invitrogen社）のMedium A（固定用試薬）１００μＬを添加し、室温で３分間インキュベーションを行った。なお、本実施例において、Medium A（固定用試薬）が本発明の「細胞固定液」に相当する。
【００５１】
（細胞膜透過処理工程・蛍光染色処理工程）
固定処理を行った細胞を、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った。さらに−２０℃に調整した１００％メタノールを３ｍｌ加えてゆっくりと攪拌した後、氷上で３０分間インキュベーションを行い、同様に０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で２回洗浄した。  FIX & PERM（登録商標）Cell Permeabilization Kit（Invitrogen社）のMedium B（透過処理用試薬）１００μＬに、抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体（Ｍ−２０）４μＬおよびＲ−フィコエリスリン標識抗ＧＡＴＡ−１抗体（Cell Signaling Technology社；#13353）４μＬを加えたものを細胞に添加し、室温で１０分間インキュベーションをおこなった。その後、細胞を０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った後、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水１００μＬに懸濁した。そこに、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水４９５μＬにＡｌｅｘａ４８８標識ドンキー抗ゴートＩｇＧ抗体５μＬ(Invitrogen社 ；Molecular A11055）を加えたものを添加しさらに室温で１０分間インキュベーションをおこなった。
【００５２】
（解析工程）
その後、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で細胞を２回洗浄して、懸濁したうえで、すみやかにフローサイトメ−ター（BD FACS Aria;励起波長４８８ｎｍ）により解析をおこなった。
【００５３】
本実施例で用いた抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体（Ｍ−２０）はＧＡＴＡ‐１タンパク質のＣ末端を認識する抗体であり、Ｒ−フィコエリスリン標識抗ＧＡＴＡ−１抗体はＧＡＴＡ‐１タンパク質のＮ末端を認識する抗体であり、上述したようにＧＡＴＡ−１ｓはＧＡＴＡ−１のＮ末端にある転写活性化領域を欠くバリアントである。したがってＡｌｅｘａ４８８はＧＡＴＡ−１ｆおよびＧＡＴＡ−１ｓを含む全ＧＡＴＡ−１タンパク質を、Ｒ−フィコエリスリンはＧＡＴＡ−１ｆのみを標識している。図４に示すように、野生型Ｋ５６２細胞にはＧＡＴＡ−１ｆが、３つのクローン細胞（＃２４、＃２６、＃２７）においてはＧＡＴＡ−１ｓのみが発現している結果が確認できた。
【００５４】
［実施例２］
作製例１で得られた遺伝子改変細胞＃２６と野生型Ｋ５６２細胞をそれぞれ１×１０6個ずつ回収して、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ラウンドチューブ中で混和した。実施例１と同様の手法で洗浄し、さらに固定処理工程、細胞膜透過処理工程、蛍光染色処理工程を行ない、解析工程を行った。
【００５５】
ドットプロットおよびヒストグラムによる検出データからは、解析に用いた細胞群においてＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞がそれぞれ検出されていることがわかる。さらに得られた検出データを解析することで、それぞれのＧＡＴＡ−１が発現している細胞数、およびその割合について算出することができる。結果を図５に示す。
【００５６】
［実施例３］
実施例３と同様に遺伝子改変細胞＃２６と野生型Ｋ５６２細胞を混和したサンプルを用いて解析を行い、さらにフローサイトメーターによりＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞をそれぞれ分取した。分取前の細胞および分取された細胞のそれぞれについて、次世代シーケンサー（イルミナ社）を用いて遺伝子解析を行うことで、それぞれの細胞群に発現しているＧＡＴＡ−１の遺伝子型を調べ、より分取精度を確認した。分取前の細胞群においてはＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞はほぼ半々の割合であったが、分取後の細胞群においてはほぼ９８％と高い割合でＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞を分取できていることがわかる。結果を図６に示す。
【００５７】
［実施例４］
ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したＡＭＫＬ患者骨髄由来細胞株ＣＭＫ１１−５を用いた以外は実施例１と同じ手法で解析を行った。結果を図７に示す。検出されたほとんどのＧＡＴＡ−１がＧＡＴＡ−１ｓであることが確認できる。
【００５８】
［実施例５］
リンパ球分離溶液Lymphoprep(商標)（リンホプレップ）(コスモバイオ株式会社；1114544)を用いて、ＴＡＭ患者から採取した血液からＰＢＭＣ(Peripheral Blood Mononuclear Cell；末梢血単核細胞)を単離した。単離したＰＢＭＣについて実施例１と同様の手法で洗浄、解析を行った。結果を図８に示す。検出されたほとんどのＧＡＴＡ−１がＧＡＴＡ−１ｓであることが確認できる。
【００５９】
＜考察＞
上記実施例から明らかなように、異なるエピトープを認識する複数の抗体を用いることで、検出に用いたそれぞれの細胞において、ＧＡＴＡ−１ｆが発現しているか、ＧＡＴＡ−１ｓが発現しているか、を検出することができる。また、実施例３で示したようにＧＡＴＡ−１ｆが発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞が混在している場合においても、それぞれの細胞の割合や蛍光強度について解析を行うことが可能である。またＧＡＴＡ−１の遺伝子を改変した細胞のみならず、ＡＭＫＬ患者由来の培養細胞株であるＣＭＫ１１−５細胞株やＴＡＭ患者から採取した血液から単離したＰＢＭＣにおいても、本発明の解析を行うことが可能であり、いずれの細胞においても発現しているＧＡＴＡ−１が変異型（ＧＡＴＡ−１ｓ）であるという結果が得られた。
【００６０】
上記の結果から、例えば、ダウン症児から採取した血液等を用いて本発明の解析方法を行なうことにより、発現しているＧＡＴＡ−１が、ＧＡＴＡ−１ｆであるかＧＡＴＡ−１ｓであるかを検出することで患者のＧＡＴＡ−１遺伝子において変異が起きているかどうかを迅速に判定することができる。このことから、ＴＡＭまたはＡＭＫＬに罹患する可能性の高いダウン症の新生児において、本発明の解析方法を適用することで、今後の発病の可能性を予測することができると考えられる。また、あわせてセルソーターを用いて変異タンパク質が検出された細胞集団を分取し、遺伝子解析をおこなうことで当該遺伝子にどのような変異が起きているかどうかを高い精度で決定することができる。またＡＭＫＬのみならず、本発明の解析方法を他の生体物質および細胞に適用することも考えられる。特に遺伝子変異に基づいて多数の病型に分類される白血病やリンパ腫において本発明の解析方法を行なうことで、その病型を迅速に判定したり、予後の予測や治療の有効性の有無を判断することができるという可能性を提示することができる。
【図１】
2019007875.tif 000003
【図２】
2019007875.tif 000004
【図３】
2019007875.tif 000005
【図４】
2019007875.tif 000006
【図５】
2019007875.tif 000007
【図６】
2019007875.tif 000008
【図７】
2019007875.tif 000009
【図８】
2019007875.tif 000010
【配列表】
2019007875000001.app