(57)【要約】【課題】リアノジン受容体活性化剤およびその利用を提供する。【解決手段】本発明は、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化剤であって、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を有効成分として含有する、リアノジン受容体活性化剤、およびその利用を提供する。また、本発明は、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有するリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬および一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬ならびにそれらの利用も提供する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化剤であって、
一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を有効成分として含有する、リアノジン受容体活性化剤。
【請求項２】
上記一酸化炭素供与体および一酸化炭素生成誘導物質は、一酸化炭素含有錯体および一酸化炭素合成物質からなる群から選択される、請求項１に記載のリアノジン受容体活性化剤。
【請求項３】
神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化方法であって、
請求項１または２に記載のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する、リアノジン受容体の活性化方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する、神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法。
【請求項５】
上記モノアミンは、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン、メラトニン、Ｌ−ドーパ、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、３−メトキシチラミン、Ｎ−メチルチラミン、シネフリン、３−イオドチロナミンおよびトリプタミンからなる群より選択される、請求項４に記載の神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法。
【請求項６】
神経細胞に発現しているリアノジン受容体に関連するリアノジン受容体関連疾患の治療用医薬であって、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
【請求項７】
神経細胞に発現しているリアノジン受容体に関連するリアノジン受容体関連疾患の治療用医薬であって、一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
【請求項８】
上記リアノジン受容体関連疾患は、てんかん、躁鬱、不安、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、脳梗塞、脳塞栓症、脳血管障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障、網膜症および黄斑変性から選択される、請求項６または７に記載のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
【請求項９】
一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する、モノアミン関連疾患治療用医薬。
【請求項１０】
一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する、モノアミン関連疾患治療用医薬。
【請求項１１】
請求項９に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬と、
請求項１０に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬およびリアノジン受容体阻害剤のうち、少なくとも一種と
を含む、モノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
【請求項１２】
上記モノアミンは、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン、メラトニン、Ｌ−ドーパ、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、３−メトキシチラミン、Ｎ−メチルチラミン、シネフリン、３−イオドチロナミンおよびトリプタミンからなる群より選択される、請求項９または１０に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬または請求項１１に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
【請求項１３】
上記モノアミン関連疾患は、統合失調症、認知症、ニューロパシー、発作、パーキンソン病、てんかん、ハンチントン病、記憶障害、注意又は学習障害、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、不安障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、解離性障害、転換性障害、気分障害、睡眠障害および摂食障害からなる群より選択される、請求項９、１０または１２に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬または請求項１１または１２に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
【請求項１４】
非ヒト生物、培養細胞または生物から分離された生物学的試料に、被験物質を投与することによって、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性に変化が生じるか否かを調べる工程を包含しており、当該被験物質は、一酸化炭素供与、一酸化炭素生成誘導、一酸化炭素代謝阻害または一酸化炭素生成抑制に関与する物質である、モノアミン放出調節物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリアノジン受容体活性化剤およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物における脳や脊椎などの中枢神経系をはじめとする神経細胞では、モノアミンを介した神経修飾が行われており、様々な脳機能（例えば、歩行活動、覚醒、認知、記憶形成等）に関わっている。
【０００３】
モノアミンを含めた神経伝達物質の分泌には細胞内カルシウムレベルの上昇が必須だが、生体の細胞内カルシウム濃度調節機構として、リアノジン受容体の活性化経路が重要な役割を果たすことは以前から知られている。神経細胞においては、リアノジン受容体の活性化により、モノアミン分泌が促進することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wan et al., Biochem Biophys Res Commun, 266(2):588-92 (1999)
【非特許文献２】Kim et al., J Neurosci 27, 7640-7647 (2007)
【非特許文献３】Ueno et al., J Physiol 591, 287-302 (2013)
【非特許文献４】Ueno et al., Elife 6,(2017)
【非特許文献５】Aso et al., Curr. Biol. 20, 1445-51 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでに知られているモノアミン分泌異常を治療するための手法は、細胞外に分泌されたモノアミン量増減のための、トランスポーターもしくはモノアミン受容体に対する阻害剤の投与、またはモノアミン前駆体の投与などが主たるものであり、モノアミン分泌機構そのものを調節する方法は少ない。よって、細胞においてモノアミン放出経路のさらなる詳細な解明が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らはこれまでに、ハエの匂い記憶はドパミンに完全に依存していることを見出している（非特許文献２〜５）。本願発明者らは、ハエの脳における活性化したキノコ体からのドパミン作動性神経への情報伝達経路を探索した結果、新規な事象を見出し、本発明を完成させるに至った。本願発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞  神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化剤であって、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を有効成分として含有する、リアノジン受容体活性化剤。
＜２＞  上記一酸化炭素供与体および一酸化炭素生成誘導物質は、一酸化炭素含有錯体および一酸化炭素合成物質からなる群から選択される、＜１＞に記載のリアノジン受容体活性化剤。
＜３＞  神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化方法であって、＜１＞または＜２＞に記載のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する、リアノジン受容体の活性化方法。
＜４＞  ＜１＞または＜２＞に記載のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する、神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法。
＜５＞  上記モノアミンは、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン、メラトニン、Ｌ−ドーパ、フェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、３−メトキシチラミン、Ｎ−メチルチラミン、シネフリン、３−イオドチロナミンおよびトリプタミンからなる群より選択される、＜４＞に記載の神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法。
＜６＞  神経細胞に発現しているリアノジン受容体に関連するリアノジン受容体関連疾患の治療用医薬であって、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
＜７＞  神経細胞に発現しているリアノジン受容体に関連するリアノジン受容体関連疾患の治療用医薬であって、一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
＜８＞  上記リアノジン受容体関連疾患は、てんかん、躁鬱、不安、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳卒中、脳梗塞、脳塞栓症、脳血管障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障、網膜症および黄斑変性から選択される、＜６＞または＜７＞に記載のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬。
＜９＞  一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する、モノアミン関連疾患治療用医薬。
＜１０＞  一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する、モノアミン関連疾患治療用医薬。
＜１１＞  ＜９＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬と、＜１０＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬およびリアノジン受容体阻害剤のうち、少なくとも一種とを含む、モノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
＜１２＞  上記モノアミンは、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン、メラトニン、Ｌ−ドーパ、フェネチルアミン、N-メチルフェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、３−メトキシチラミン、Ｎ−メチルチラミン、シネフリン、３−イオドチロナミンおよびトリプタミンからなる群より選択される、＜９＞または＜１０＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬または＜１１＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
＜１３＞  上記モノアミン関連疾患は、統合失調症、認知症、ニューロパシー、発作、パーキンソン病、てんかん、ハンチントン病、記憶障害、注意又は学習障害、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、不安障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、解離性障害、転換性障害、気分障害、睡眠障害および摂食障害からなる群より選択される、＜９＞、＜１０＞または＜１２＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬または＜１１＞または＜１２＞に記載のモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物。
＜１４＞  非ヒト生物、培養細胞または生物から分離された生物学的試料に、被験物質を投与することによって、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性に変化が生じるか否かを調べる工程を包含しており、当該被験物質は、一酸化炭素供与、一酸化炭素生成誘導、一酸化炭素代謝阻害または一酸化炭素生成抑制に関与する物質である、モノアミン放出調節物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化剤および当該活性剤を用いた、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化方法およびモノアミン放出を促進する方法を提供する。また、本発明は、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびリアノジン受容体関連疾患治療用医薬の組合せ物、モノアミン関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物、ならびにこれらを用いたリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療方法を提供する。本発明は、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療に有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】synapto-pHluorin（ｓｐＨ）の動作原理を示す図である。
【図２】キノコ体からのシナプス伝達を抑制した際のドパミン放出を示す図である。
【図３】一酸化炭素合成阻害剤（ＣｒＭＰ）によるドパミン放出への影響を示す図である。
【図４】一酸化炭素合成酵素（heme oxygenase, ＨＯ）のキノコ体特異的発現抑制によるドパミン放出への影響を示す図である。
【図５】一酸化炭素吸着剤（ｈｅｍｏ−ＣＤ）によるドパミン放出の影響への影響を示す図である。
【図６】ＣＯＲＭ−３によるドパミン放出誘導を示す図である。
【図７】ＣＯＲＭ−３によるドパミン放出誘導のＣａ２＋依存性を示す図である。
【図８】ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出に対する各種阻害剤の効果を示す図である。
【図９】ハエ脳におけるドパミン放出の機構を示す図である。
【図１０】マウス扁桃体における一酸化炭素によるドパミンおよびセロトニン放出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
【００１０】
〔１．リアノジン受容体活性化剤〕
本発明は神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化剤であって、一酸化炭素（ＣＯ）、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を有効成分として含有する、リアノジン受容体活性化剤を提供する。
【００１１】
（神経細胞）
神経細胞は、神経系を構成する細胞であって、中枢神経系に存在する中枢神経細胞と末梢神経系に存在する末梢神経細胞とに大別される。中枢神経系とは、脳および脊髄等の集中神経系の中心部を指し、神経細胞（neuron）と、その突起の間を埋め神経細胞を支持しているグリア細胞等とが含まれる。末梢神経系とは神経系のうち、中枢神経系以外のものを指す。末梢神経細胞には中枢神経系以外の神経線維と神経節とが含まれる。末梢神経系には、体の知覚および運動を制御する体性神経系と内臓および血管などの自律的制御に関わる自律神経系とにさらに分けられる。
【００１２】
（リアノジン受容体）
本明細書において「リアノジン受容体（Ryanodine receptor、RyR）」とは、小胞体膜上に存在するカルシウムチャネルであり、小胞体内および筋小胞体に貯蔵されたカルシウムを細胞内に放出する。リアノジン受容体は、同じく小胞体膜上に存在するカルシウムチャネルである、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（IP３ receptor、IP3R）と共に、細胞内カルシウム濃度調節を担っている。リアノジン受容体にはＲｙＲ１、ＲｙＲ２およびＲｙＲ３の３つのサブタイプがあり、互いに高い相同性を示す。これらのサブタイプは、生体の各部位において、それぞれ異なる局在分布を示すが、例えば哺乳類の脳においては、３つのサブタイプすべての発現がみられる。
【００１３】
本発明のリアノジン受容体の活性化剤は、神経細胞に発現しているリアノジン受容体を活性化させるものであって、これらの全てのサブタイプのリアノジン受容体を活性化させるものであり得る。また、本発明のリアノジン受容体の活性化剤の一例は、中枢神経系の神経細胞に発現しているリアノジン受容体を活性化させるものであることが好ましい。
【００１４】
（有効成分）
有効成分のうち、一酸化炭素供与体および一酸化炭素生成誘導物質の一実施形態は、一酸化炭素含有錯体および一酸化炭素合成物質からなる群から選択されるものである。
【００１５】
一酸化炭素供与体の例としては、一酸化炭素含有錯体である。当該錯体の例としては、ＣＯＲＭ−１、ＣＯＲＭ−２、ＣＯＲＭ−３、ＣＯＲＭ−Ａ１、ＣＯＲＭ−Ｆ３、Tricarbonyl dichlororuthenium (II) dimer等の一酸化炭素放出分子を挙げることができる。
【００１６】
一酸化炭素合成物質は、生体内で一酸化炭素の合成に関与する物質であり、一酸化炭素合成物質の例としては、一酸化炭素の産生酵素であるheme oxygenase （ＨＯ（例えばheme oxygenase-1（ＨＯ−１）、heme oxygenase-2（ＨＯ−２）など））、heme oxygenaseの生成および活性を誘導する因子（例えば、Cobalt protoporphyrin、Hemin、protoheme IX、protoporphyrin IXなど）等が挙げられる。
【００１７】
また、有効成分のうち、一酸化炭素代謝阻害物質としては、例えばチトクロームP450阻害剤（例えばアミオダロン等）が挙げられる。
【００１８】
生体内に投与され取り込まれた一酸化炭素は、ヘモグロビン（hemoglobin）に結合して末梢組織に運ばれる。また、ＨＯは生体内でヘムを分解し、一酸化炭素を発生させる。上記ＨＯの生成および活性を誘導する因子は、ＨＯを介した分解を促進することにより、一酸化炭素を発生させる。一酸化炭素代謝阻害物質は生体内での一酸化炭素の代謝を阻害して生体内に発生した一酸化炭素を維持する。
【００１９】
（溶媒、その他の成分、剤型等）
本発明のリアノジン受容体活性化剤は上述の有効成分となる物質そのものであってもよく、その他の成分を含有する組成物の形態であってもよい。組成物である場合のリアノジン受容体活性化剤には、溶媒、その他の成分、剤型等については、〔４．リアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬〕において後述するものが適用できる。したがって、ここでは記載を省略する。
【００２０】
本発明のリアノジン受容体活性化剤は、神経細胞に発現するリアノジン受容体を活性化することにより、リアノジン受容体を介した細胞内カルシウム放出を促進させるものである。
【００２１】
〔２．リアノジン受容体の活性化方法〕
本発明はまた、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性化方法であって、
上述のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程（リアノジン受容体活性化剤投与工程）を包含する、リアノジン受容体の活性化方法を提供する。
【００２２】
本発明のある態様として、本発明のリアノジン受容体活性化剤は、神経細胞に発現するリアノジン受容体を活性化するための、in vitroまたはin vivoの方法または分子生物学的な研究の手段として用いることにも当然有効である。
【００２３】
従って、本発明の一実施形態における活性化方法は、in vitroまたはin vivoの神経細胞において、上述のリアノジン受容体活性化剤を投与し、該神経細胞に発現しているリアノジン受容体を活性化させることを包含する、方法である。本方法の別の態様として、上述のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程の代わりに、対象とする神経細胞内外の一酸化炭素濃度を上昇させる工程を包含するものであってもよい。
【００２４】
一酸化炭素を細胞内外で上昇させる方法としては、一酸化炭素合成酵素の活性化による方法、または一酸化炭素の産生増大による方法が挙げられ、これらの方法に用いられる物質または因子として、具体的にはヘム、ヘム誘導体、熱ショック、重金属、一酸化窒素、虚血、リポ多糖、酸化脂質、ホルボースエステル、亜ヒ酸ナトリウム、放射線、紫外線、過酸化水素、エンドトキシン、成長因子（血小板由来成長因子やトランスフォーミング増殖因子等）、オカダ酸、メチルグリオキサール、クルクミン、酸化ストレス、サイトカイン、血管シェアストレス、強度の光刺激、アンジオテンシン、グルコース欠乏、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、イノシトールリン脂質、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ、チロシンリン酸化酵素、副腎グルココルチコイド、オピエート、コルチコステロン、エストロゲン、カルモジュリン、カゼインキナーゼ２およびグルタミン酸が挙げられる。
【００２５】
対象とする細胞は、リアノジン受容体を発現している神経細胞であれば、in vitroまたはin vivoのいずれの細胞であってもよく、例えば、非ヒト生物の生体細胞、各種の細胞株の培養細胞（ヒトおよび非ヒト生物の生体細胞、ならびにＥＳ細胞（胚性幹細胞（embryonic stem cells、ES cells））、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、iPS cells））等の幹細胞由来の細胞を包含する）、生物から分離された生物学的試料としての細胞等が挙げられる。
【００２６】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００２７】
（リアノジン受容体活性化剤投与工程）
神経細胞に投与されるリアノジン受容体活性化剤の具体例は上述した通りのものが適用できる。本方法において、投与されるリアノジン受容体活性化剤は一種類であっても、複数種類であってもよい。
【００２８】
物質の投与形態は、特に限定されず、例えば、細胞にリアノジン受容体活性化剤を添加してもよく、生体の体内に注射等の好適な投与方法を用いて投与してもよい。
【００２９】
一実施形態におけるリアノジン受容体の活性化方法は、リアノジン受容体活性化剤の投与を受けた神経細胞において上記リアノジン受容体活性の変化が生じているか調べる工程（リアノジン受容体活性検査工程）をさらに包含する。
【００３０】
（リアノジン受容体活性検査工程）
リアノジン受容体が活性化されたか否か検査する方法としては、蛍光検出法、放射活性トレイサーイオン法、および微小電極などによる電流測定を行う電気生理学的方法（例えばパッチクランプ法等）が挙げられる。
【００３１】
また、リアノジン受容体活性は、間接的には、細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇の有無を調べることによって行うことができる。カルシウム濃度を調べる方法としては、蛍光検出法、放射活性トレイサーイオン法、および微小電極などによる電流測定を行う電気生理学的方法等を用いることができる。
【００３２】
リアノジン受容体の活性化の有無は、神経細胞におけるモノアミンの放出促進の有無によって検査することもできる。つまり、一実施形態におけるリアノジン受容体の活性化方法は、リアノジン受容体活性検査工程に加えて、またはリアノジン受容体活性検査工程の代わりに、リアノジン受容体活性化剤の投与を受けた神経細胞においてモノアミンの放出促進が生じているか調べる工程（モノアミン放出量検査工程）を、包含する。つまり、本発明は、上述した本発明のリアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する、神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法も提供する。モノアミン放出量検査工程については、以下の項目に詳述する。
【００３３】
〔３．神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法〕
本発明の神経細胞からのモノアミン放出を促進する方法は、リアノジン受容体活性化剤を神経細胞に投与する工程を包含する。
【００３４】
（モノアミン）
本明細書において、「モノアミン」とは、神経系において、神経伝達物質または神経修飾物質（neuromodulator）として働く物質である。モノアミンとしては、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン、メラトニン、Ｌ−ドーパおよびこれらの産生経路におけるフェネチルアミン、Ｎ−メチルフェネチルアミン、フェニルエタノールアミン、３−メトキシチラミン、Ｎ−メチルチラミン、シネフリン、３−イオドチロナミン、トリプタミン等が挙げられる。
【００３５】
（モノアミン放出量検査工程）
モノアミン放出が促進されたか否か検査する方法としては、synapto-pHluorin（ｓｐＨ）による可視化法、微小電極などによる膜容量測定法、ボルタンメトリー法、マイクロダイアリシス法、モノアミントランスポーターの蛍光基質FEN206による可視化法等が挙げられる。
【００３６】
（判定工程）
本発明のリアノジン受容体活性化方法およびモノアミン放出の促進方法は、上述の検査工程における測定結果に基づき、リアノジン受容体が活性化されているか否かまたはモノアミン放出が促進されているか否か判定する工程の少なくとも一方をさらに包含していてもよい。
【００３７】
判定の一例では、対照と比較して被験細胞におけるリアノジン受容体の活性レベルまたはモノアミン放出レベルが有意に高い場合、被験細胞のリアノジン受容体が活性化されている、または、モノアミン放出が促進されていると判定される。なお、リアノジン受容体活性レベルまたはモノアミン放出レベルが有意に高いとは、定量的測定による結果であっても定性的測定による結果であってもよい。すなわち、具体的な数値の比較のみならず、相対的な量の比較（実際に量を算出する必要は無く、ある基準より高いか低いかを判断する）も含む。対照は、一例として、本発明のリアノジン受容体活性化剤を投与していない、定常状態の細胞である。対照試料の上記測定は、被験細胞試料の測定と同時に行われてもよく、また別々に行われてもよい。すなわち、被験細胞試料の数値と比較される対照試料の数値は、被験細胞試料が測定されるときとは異なるときに行われた測定で得られた値であってもよい。また、対照試料の検査（リアノジン受容体活性レベルまたはモノアミン放出レベルの測定）は、被験細胞の検査を行うと同時に行う必要は無く、例えば、既に取得されデータベース等に蓄積されている対照試料の測定値を閾値として用いることもできる。
【００３８】
モノアミンに限らず、神経伝達物質の放出はその神経細胞の活動性が主たる要因であると考えられており、神経細胞を電気的に興奮させることがその伝達物質を放出させる唯一の方法と考えられてきた。また、これまで、モノアミンなど神経伝達物質の放出は、前シナプスからの神経細胞が興奮して細胞外からのＣａ２＋を流入し、神経伝達物質が放出される、神経活動依存的な経路が唯一の経路と思われていた。一方、脳組織は様々な神経細胞が複雑に配置されているため、脳組織の一部を電気的に興奮させても様々な神経伝達物質が放出されてしまうこととなる。これに対し、本発明では、実施例の図７等でも証明している通り、細胞外Ｃａ２＋の消失剤ＥＧＴＡによって神経活動を遮断した状態で、ＣＯ誘導剤であるＣＯＲＭ−３によってドパミンが放出されていることを確認した。
【００３９】
つまり、本発明では、前シナプスの神経細胞の興奮とは無関係に、ＣＯが神経伝達物質の放出を誘導する経路、すなわち、リアノジン受容体による細胞内のＣａ２＋放出によるモノアミン放出経路が存在することが初めて明らかとなった。モノアミンを普段から放出している神経からの放出量を増加または抑制させるこれまでのモノアミンの放出制御とは異なり、本発明の方法を用いれば、モノアミンの分泌を抑制している状態でも、ＣＯ誘導性のモノアミン放出経路を介して、神経からのモノアミンを放出させることが可能である。さらには、本発明の一酸化炭素誘導によるモノアミン放出促進方法では、簡便に、かつ安定的にモノアミン放出を誘導することができる。
【００４０】
〔４．リアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬〕
〕
（リアノジン受容体関連疾患治療用医薬）
本発明の一実施形態に係るリアノジン受容体関連疾患治療用医薬は、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する。本発明の治療用医薬に、薬効成分として含有される一酸化炭素、一酸化炭素供与体および一酸化炭素生成誘導物質からなる群から選択される物質は、〔１．リアノジン受容体活性化剤〕の項目において有効成分として上述した通りのものが適用される。なお、単一の治療用医薬において、複数種の物質が含まれていてもよい。
【００４１】
また、上述の薬効成分物質は、神経細胞特異的に送達されるために好適な化合物によって修飾された構造を有していてもよい。
【００４２】
本発明の別の実施形態に係るリアノジン受容体関連疾患治療用医薬は、一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有する。一酸化炭素生成抑制物質としては、一酸化炭素吸着剤（例えばhemo-CD、Ngb-H64Q-CCCなど）、および一酸化炭素合成阻害剤（例えばCrMPなど）が挙げられる。
【００４３】
（リアノジン受容体関連疾患）
本明細書において、「リアノジン受容体関連疾患」とは、神経細胞で発現しているリアノジン受容体の活性調節が関連する疾病、疾患または障害全般を指す。
【００４４】
本発明の医薬を適用するリアノジン受容体関連疾患には、リアノジン受容体が発現している神経細胞の細胞内カルシウム放出の調節異常を伴う疾病、疾患または障害およびモノアミンの分泌異常をさらに伴う疾病、疾患または障害も包含する。
【００４５】
リアノジン受容体関連疾患は、てんかん、躁鬱、不安、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）、脳卒中、脳梗塞、脳塞栓症、脳血管障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障、網膜症および黄斑変性から選択されるものであり得る。
【００４６】
（モノアミン関連疾患治療用医薬）
本発明の別の実施形態では、一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有するモノアミン関連疾患治療用医薬、ならびに一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有するモノアミン関連疾患治療用医薬を提供する。本発明のモノアミン関連疾患治療用医薬に薬効成分として含有される物質等は、上述のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬において用いられるものが適用される。
【００４７】
（モノアミン関連疾患）
本明細書において、「モノアミン関連疾患」とは、神経伝達物質としてのモノアミンの分泌異常によって生じる疾病、疾患または障害全般を指す。
【００４８】
モノアミン関連疾患には、「神経疾患または神経障害」「神経発達障害」および「精神疾患または精神障害」が包含される。本発明の治療対象となるモノアミン関連疾患には、リアノジン受容体関連疾患の一部を包含する。
【００４９】
モノアミン関連疾患は、統合失調症、認知症、ニューロパシー、発作、パーキンソン病、てんかん、ハンチントン病、記憶障害、注意または学習障害、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、不安障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、解離性障害、転換性障害、気分障害、睡眠障害および摂食障害からなる群より選択されるものであり得る。
【００５０】
神経変性を伴うモノアミン関連疾患としては、パーキンソン病、パーキンソン症候群、認知症、ニューロパシーが挙げられる。運動障害としては、協調運動発達障害、常同性運動障害およびチック障害等が挙げられる。
【００５１】
自閉症スペクトラム障害としてさらに具体的には、従来型自閉性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児崩壊性障害、および特定不能の広汎性発達障害等が挙げられる。
【００５２】
記憶障害として、具体的には、記憶を思い出すことができない障害と、新たなことを覚えることができない障害とが含まれる。また、記憶障害には、一時的に思い出すことができない短期記憶障害と、長期間思い出すことができない長期記憶障害とが含まれる。
【００５３】
気分障害として、さらに具体的には、躁病、うつ病および躁うつ病、双極性障害等が挙げられる。また、気分障害には、抑うつ状態、感情鈍麻、興奮、不安または怒りなどの感情または気分の障害および食欲低下等も包含される。
【００５４】
不安障害として、さらに具体的には、全般性不安障害、社会不安障害、パニック障害、強迫性神経障害心的外傷後ストレス障害が挙げられる。
【００５５】
本明細書において「治療」とは、すでに罹患している疾病、疾患もしくは障害、またはそれに伴う症状を、緩和または除去することを指す。また、本明細書において「治療」というときは、疾病、疾患または障害に罹患することを防いで予防することも包含する。
【００５６】
ある実施形態としてリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬が、一酸化炭素を薬効成分として含有する場合、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬は、ガスの形態で提供される場合がある。別の実施形態として、一酸化炭素ガス以外の物質を成分として含有する医薬の場合は、例えば組成物の形態が挙げられる。
【００５７】
以下に、医薬が組成物の形態である場合の各成分について詳細に説明する。
【００５８】
（溶媒）
一実施形態のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬の溶媒の例としては、水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液として具体的には、生理食塩水、リン酸緩衝液、リンゲル液等が挙げられる。また、組成物に用いられる溶媒は上述の溶媒の２種類以上の混合物であってもよい。
【００５９】
（その他成分）
一実施形態のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬は、上述の薬効成分以外のその他の成分をさらに含んでいてもよい。当該その他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、および粘度調整剤等が挙げられる。また、必要に応じて、公知の薬剤を、本発明に係るリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬の一構成として加えて複合剤を構成してもよい。組成物に含有されるこれらの成分は、薬効成分の薬効を阻害せず、かつ、投与対象となる被験体に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。
【００６０】
リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬は、例えば経口投与した場合に神経細胞特異的に送達されるような形態として製剤されていてもよい。例えば組成物中に医薬的に許容される神経細胞特異的に結合する担体を含んでいてもよい。
【００６１】
上記その他成分としては、この分野で公知のものを広く使用でき、具体的には、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、セルロース、タルク、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、アルギン酸等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、組成物の剤型および投与方法等に応じて、適宜選択すればよい。
【００６２】
（組成物の剤型）
上記リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬の剤型も特に限定されず、ガス（気体）、液体、固体または半固体もしくは半液体とすることができる。さらに凍結乾燥製剤としてもよい。例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、および注射剤等が挙げられ、好ましくは吸入剤、注射剤または経口投与用の錠剤等の剤型である。
【００６３】
（投与経路）
投与経路は、静脈内、皮下、動脈内、腹腔内、点眼、筋肉内、経口腔、経直腸、経膣、眼窩内、大脳内、皮内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、クモ膜下、槽内、関節内、肺内、鼻腔内、経粘膜、経皮および吸入経由のいずれであってもよく、また、経口および非経口のいずれであってもよい。静脈内、皮下および腹腔内等の非経口投与が好ましい。好ましい他の投与態様では、投与の容易さ等の観点で優れるため、経口投与される。
【００６４】
医薬が一酸化炭素ガスの形態である場合は、吸入経由で投与することが好ましい。
【００６５】
ここで、薬効成分が一酸化炭素以外の物質である場合、一酸化炭素は、上述の経路で投与された医薬から、神経細胞内外で生成されることが理解される。このような場合、後述する好適な剤型によって、目的の細胞を標的とすることができる。
【００６６】
（投与量、投与回数、投与期間）
上記リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬の投与量（治療有効量）は、投与対象となる上記ヒトまたは非ヒト生物の年齢、性別、体重、症状、投与経路、投与回数、および投与期間等に応じて適宜設定すればよい。また、必要であれば、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬を用いたインビボアッセイを事前に行い、過度の実験を要することなく上記投与量を決定することができる。上記リアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬の投与回数および投与期間も治療効果が得られる限り特に限定されず、例えば、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬の種類、上記投与量、投与経路、症状、ヒトまたは非ヒト生物の年齢、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。
【００６７】
（投与の対象）
投与対象となる被験体としては、あらゆる生物が挙げられ、無脊椎動物でも脊椎動物でもよいが、脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。無脊椎動物の場合は、昆虫（ハエ、ハチ等）および線虫が挙げられ、ショウジョウバエ（例えばキイロショウジョウバエ等）が好ましい。さらに、哺乳類の被験体としては、ヒトの他に、家畜類（ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等）、ペット動物（ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、モルモット等）および実験動物（マウス、ラット等のげっ歯類、サル等）が挙げられるが、特にヒトが好ましい。
【００６８】
また、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患に関連する遺伝子の変異遺伝子を有する変異体の非ヒト生物、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患に関連する遺伝子を特異的に欠損させたノックアウトまたはノックダウン、およびリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患に関連する変異遺伝子の変異を模したノックイン等の遺伝子改変を行った非ヒト生物も、本発明の投与の対象の範囲に含まれる。これらの非ヒト生物は、公知の遺伝子組み換え方法またはノックアウト、ノックイン、トランスジェニックもしくはノックダウン方法等を用いて作製されたものでもよい。一例ではこれらのトランスジェニック生物はリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療モデルとして使用される非ヒト生物であり得る。また、これらの非ヒト生物は、リアノジン受容体関連疾患もしくはモノアミン関連疾患に関連する遺伝子を調節する、または遺伝子産物を調節する能力を有したウイルスに感染した、非ヒト生物でもあり得る。
【００６９】
例示的な被験体は、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を有する患者であるか、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を発症するリスクを有する。リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を発症するリスクを有するとは、発症には至っていないが、発症の可能性が健常者と比べて高いことを意図しており、例えば、臨床症状を発症していないが、健常者のものと比べて過剰量のモノアミン分泌または低下したモノアミン分泌を有するなどのモノアミンの分泌異常の症状を有すること、またはリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の前段階であって、疾患に至る可能性の高い状態であることなども包含する。
【００７０】
なお、本明細書において「健常」であるとは、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患に罹患していないことを指す。また、本明細書で「健常」であるとは、例えばモノアミンの分泌異常を有することなどによって、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患に罹患するリスクを有しているが、臨床的症状の発症には至っていない場合も包含している。
【００７１】
さらに投与対象の被験体は、いかなる年齢であってもよく、性別も限定されない。一実施形態の被験体は、上述したリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の少なくとも１つの臨床的症状を呈している。
【００７２】
〔５．リアノジン受容体関連疾患治療用医薬の組合せ物およびモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物〕
上述した一酸化炭素、一酸化炭素供与体、一酸化炭素生成誘導物質および一酸化炭素代謝阻害物質からなる群から選択される物質を薬効成分として含有する、モノアミン関連疾患治療用医薬（以下、医薬（Ａ）とする）と、一酸化炭素生成抑制物質を薬効成分として含有するモノアミン関連疾患治療用医薬およびリアノジン受容体阻害剤のうち、少なくとも一種（以下、医薬（Ｂ）とする）と、を含む、モノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物も本発明の範疇である。リアノジン受容体阻害剤としては、dantrolen、リアノジン、ルテニウムレッド、アズモレン、カルケストリン、プロカイン等が挙げられる。
【００７３】
また、上述のモノアミン関連疾患治療用医薬（Ａ）（Ｂ）を、それぞれリアノジン受容体関連疾患治療用医薬とした場合の、リアノジン受容体関連疾患治療用医薬の組合せ物もまた、本発明の範疇である。
【００７４】
一実施形態の組合せ物において、医薬（Ａ）と医薬（Ｂ）とは、これらの医薬を組合せとして使用するための別個の医薬としての組合せである。例えば、医薬（Ａ）と医薬（Ｂ）とはそれぞれ別個の組成物の形態となっていてもよい。なお、組成物に含まれる他の成分や剤型等は、上述の〔４．リアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬〕に記載のものが適用可能である。
【００７５】
組合せ物は本発明のリアノジン受容体関連疾患の治療方法またはモノアミン関連疾患の治療方法に好適に使用することができる。組合せ物の具体的な一例としては、医薬（Ａ）と医薬（Ｂ）とをそれぞれの医薬ラベルが貼付されたリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬として準備し、これらの医薬を組合せて使用するための組合せ物としたものが挙げられる。なお、医薬の互いの医薬ラベルには組合せ物としての互いの医薬との組合せとして使用されることが記載されていてもよい。
【００７６】
また、医薬（Ａ）と医薬（Ｂ）とを別個の医薬の形態とする場合、それぞれの組成物は、その他の成分として同一の成分を含んでいてもよく、異なる成分を含んでいてもよい。
【００７７】
本発明のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬の組合せ物またはモノアミン関連疾患治療用医薬の組合せ物であれば、被験体におけるモノアミン分泌状態の変化または病態変化に応じて、医薬（Ａ）の投与と医薬（Ｂ）の投与とを、それぞれ適切な量を適切な時期に行うために使用できる。
【００７８】
本発明のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬およびこれらの組合せ物は、長期間にわたる投与および短期的投与のいずれにも用いることができる。したがって、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療のために好適に使用可能である。
【００７９】
以上のように本発明のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬は、神経細胞に発現するリアノジン受容体の活性を調節して、神経細胞の細胞内カルシウム放出の調節を行う。また、さらには神経細胞からのモノアミンの放出を促進する。当該医薬を被験体に投与することにより、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を予防または治療することができる。よって、本実施形態のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬を投与することは、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を罹患している患者の治療に有用である。また、本発明の医薬は、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を発症する危険性（リスク）が高くなっている被験体を治療的または予防的に処置するために用いることができる。本発明の医薬および医薬の組合わせは、本発明のリアノジン受容体関連疾患の治療方法およびモノアミン関連疾患の治療方法に好適に用いることができる。
【００８０】
〔６．リアノジン受容体関連疾患の治療方法およびモノアミン関連疾患の治療方法〕
本発明は、リアノジン受容体関連疾患の治療方法およびモノアミン関連疾患の治療方法を提供する。
【００８１】
本発明に係るリアノジン受容体関連疾患の治療方法は、上述のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬を、被験体に対して、治療有効量投与する工程を含む。また、本発明に係るモノアミン関連疾患の治療方法は、上述のモノアミン関連疾患治療用医薬を、被験体に対して、治療有効量投与する工程を含む。一実施形態においては、投与対象となる被験体へ、該医薬のみを単独で投与してもよく、または、投与の目的に適した薬学的組成物の一構成成分として投与してもよい。
【００８２】
本明細書において「治療的有効量」という用語は、本明細書中に記載される処置方法に従って所望の治療効果を発揮するのに十分な、本発明の医薬の濃度を意味している。
【００８３】
上記リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬の投与量（治療有効量）、投与経路、投与期間、投与回数等は〔４．リアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬〕に記載した通り適宜設定すればよい。
【００８４】
なお、臨床的に健常な被験体に対して、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を発症する前に該リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬を投与する工程を包含する、予防投与の形態も、本発明の治療方法の範疇に含まれる。すなわち、被験体に該組成物が有効量以上生体中に投与された状態にし、あらかじめリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患を予防するという態様である。
【００８５】
本発明の治療方法の別の態様として、上述のリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患治療用医薬を神経細胞に投与する工程の代わりに、神経細胞内外の一酸化炭素濃度を上昇または低下させる工程を包含するものであってもよい。
【００８６】
一酸化炭素を細胞内外で上昇させる方法としては、一酸化炭素合成酵素の活性化による方法、または一酸化炭素の産生増大による方法が挙げられ、これらの方法に用いられる物質または因子として、具体的にはヘム、ヘム誘導体、熱ショック、重金属、一酸化窒素、虚血、リポ多糖、酸化脂質、ホルボースエステル、亜ヒ酸ナトリウム、放射線、紫外線、過酸化水素、エンドトキシン、成長因子（血小板由来成長因子やトランスフォーミング増殖因子等）、オカダ酸、メチルグリオキサール、クルクミン、酸化ストレス、サイトカイン、血管シェアストレス、強度の光刺激、アンジオテンシン、グルコース欠乏、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ、イノシトールリン脂質、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ、チロシンリン酸化酵素、副腎グルココルチコイド、オピエート、コルチコステロン、エストロゲン、カルモジュリン、カゼインキナーゼ２およびグルタミン酸が挙げられる。一酸化炭素を細胞内外で低下させる方法としては、一酸化炭素合成酵素の抑制による方法または一酸化炭素産生量減少による方法があり、これらの方法に用いられる物質または因子として、具体的には、インターフェロンγ、虚血、Bach1、CrMP、ZnPP、SnPPが挙げられる。
【００８７】
また、本発明の一実施形態において、被験体の神経細胞（例えば分離された細胞生物学的試料中）の、本発明に係るリアノジン受容体活性化レベルまたはモノアミン放出レベルを測定した結果、治療が必要と診断された被験体に対し、本発明のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬を投与することを特徴とするリアノジン受容体関連疾患の治療方法またはモノアミン関連疾患の治療方法を提供する。
【００８８】
一実施形態においてリアノジン受容体活性化レベルまたはモノアミン放出レベルの測定は、本発明のリアノジン受容体活性化方法における（リアノジン受容体活性検査工程）およびモノアミン放出の促進方法における（モノアミン放出量検査工程）に記載の測定方法によって行われる。一例において、上述の測定工程で得られたリアノジン受容体活性化レベルまたはモノアミン放出レベルが、ある規定値（例えば対照から算出されたカットオフ値）より高いもしくは低い場合に、当該被験体に、本発明の医薬または医薬の組合せ物を投与することを特徴とするものの治療方法を提供する。
【００８９】
（併用療法）
本発明に係るリアノジン受容体関連疾患の治療方法またはモノアミン関連疾患の治療方法において、本発明に係るリアノジン受容体関連疾患治療用医薬またはモノアミン関連疾患治療用医薬以外の従来の療法（例えば、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療に用いられる薬剤（選択的セロトニン再取り込み阻害薬等）を投与する療法）のうちの１以上と組み合わせた併用療法を行ってもよい。本発明に係るリアノジン受容体関連疾患の治療方法またはモノアミン関連疾患の治療方法は、従来のリアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療とは異なるメカニズムを利用した新規な治療方法である。それゆえ、本併用療法を採用すれば、併用する別の療法の治療効果と相乗的な治療効果が期待できる。
【００９０】
上記治療方法を用いて治療中の被験体の治療効果は、上述した、リアノジン受容体の活性化レベルまたはモノアミン放出レベルの検査方法を適宜用いて調べることもできる。そのため、治療の各段階において、治療効果の有無の検査を行うことができる。
【００９１】
〔７．モノアミン放出調節物質のスクリーニング方法〕
本発明はまた、非ヒト生物、各種の細胞株の培養細胞（ヒトおよび非ヒト生物の生体細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等幹細胞由来の細胞を包含する）、生物から分離された生物学的試料に、被験物質を投与することによって、神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性に変化が生じるか否かを調べる工程を包含しており、当該被験物質は、一酸化炭素供与、一酸化炭素生成誘導、一酸化炭素代謝阻害または一酸化炭素生成抑制に関与する物質である、モノアミン放出調節物質のスクリーニング方法を提供する。
【００９２】
一実施形態においてモノアミン放出調節物質のスクリーニング方法は、（ａ）非ヒト生物に、一酸化炭素供与、一酸化炭素生成誘導、一酸化炭素代謝阻害または一酸化炭素生成抑制に関与する物質である被検物質を投与する工程、（ｂ）該生物における神経細胞に発現しているリアノジン受容体の活性に変化が生じるか否かを調べる工程、および（ｃ）被検物質を適用しなかった場合と比較して、リアノジン受容体活性に変化が生じたときに、該被検物質を、モノアミン放出調節物質の候補として選択する工程を包含する。
【００９３】
上記工程（ａ）は、材料となる非ヒト生物は上述の（非ヒト生物）の記載と同様であり、被験物質の投与は本発明の物質の代わりに被験物質を投与するほかは上述の（リアノジン受容体活性化剤投与工程）における方法と同様であるので投与方法、投与期間および投与形態についての詳細は省略する。被検物質としては、一酸化炭素供与、一酸化炭素生成誘導、一酸化炭素代謝阻害または一酸化炭素生成抑制に関与する候補物質であれば特に限定されない。上記工程（ｂ）についても、上述の（リアノジン受容体活性検査工程）に記載の方法と同様に実施可能である。
【００９４】
上記工程（ｃ）において、工程（ｂ）で調べたリアノジン受容体活性の程度を、対照（例えば被検物質を投与しなかった非ヒト生物におけるリアノジン受容体活性の程度）と比較する。比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行われる。その結果、対照と比較して、リアノジン受容体活性が高くなったときに、該被検物質を、モノアミン放出促進物質候補として選抜する。一方、被検物質を適用しなかった場合に比べて、リアノジン受容体活性が抑制されたときに、該被検物質をモノアミン放出抑制物質候補として選択する。当該スクリーニング方法は、該被検物質をモノアミン関連疾患の治療効果を有する物質の候補のスクリーニング法として適用することができる。
【００９５】
以上の通り、本発明のリアノジン受容体活性化剤は、神経細胞に発現するリアノジン受容体を活性化させ、その結果神経細胞のモノアミン放出を促進することができるという優れた効果を有する。また、本発明のリアノジン受容体関連疾患治療用医薬およびモノアミン関連疾患治療用医薬はリアノジン受容体関連疾患およびモノアミン関連疾患の治療に有効に用いることができる。
【００９６】
以上に示したように、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９７】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９８】
無脊椎動物であるキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster、以下ハエ）の脳は機能的にはヒトと相同な部分が極めて多い。例えば神経伝達物質の種類の多くが重複しており（グルタミン酸、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、ヒスタミン、ドパミン、セロトニン等）、機能も類似している（グルタミン酸、アセチルコリンは興奮性、ＧＡＢＡ、ヒスタミンは抑制性等）。このうち、ドパミンはハエにおいてもヒト同様に脳機能に重要であり、ドパミンシグナルの欠損変異体では、認知機能または睡眠に障害が発生し、パーキンソン病様の歩行以上を表出する。特に、匂いと電気ショックによる古典的条件付けによる匂い記憶形成にはドパミンは必須であり、１型ドパミン受容体（Ｄ１Ｒ）の欠損変異体は記憶形成がまったくできない（非特許文献２）。このことを利用し、ハエの脳を摘出・培養し、匂い中枢（antennal lobe、ＡＬ: primary central of odor）と電気ショックなどの体性感覚を受容する中枢（ascending fibers of VNC、ＡＦＶ）を刺激すると、Ｄ１Ｒ依存性にハエの匂い記憶に必須なキノコ体と呼ばれる脳領域で長期的な匂い中枢刺激に対する応答増強が得られた（非特許文献３）。
【００９９】
ドパミン放出をsynapto-pHluorin（以下ｓｐＨ、詳細は実施例参照）によって可視化したところ、キノコ体をALとAFV、またはAFVの代わりにＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸、N-methyl-D-aspartic acid）を与えこれと同時にAL刺激で活性化すると（ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激）ドパミン放出が引き起こされた（非特許文献４）。
【０１００】
２つの入力経路（匂い中枢および体性感覚中枢）によって活性化されたキノコ体はどのようにドパミン作動性神経にドパミン放出を誘導させているのかを明らかにするため、以下の実験を行った。
【０１０１】
〔実験方法〕
ハエ飼育条件：ハエは通常のコーンミールおよびイーストを主体とした餌を用い、１２時間の明暗サイクル下で飼育した。飼育温度および湿度は２５±２℃、６０±１０％に設定した。
【０１０２】
イメージング解析：手法は非特許文献３の方法に準拠している。具体的には、Ｃａ２＋を含まないＨＬ３培養液中において麻酔したハエからの脳を取り出し、ナイロン線で固定した。顕微鏡観察用チャンバーに置き、Ｃａ２＋を含んだＨＬ３培養液中に静置した。匂い中枢であるＡＬにガラス電極を密着させ、刺激装置と接続した（ＳＥＮ−７１０３、ＳＳ−１０４Ｊ、日本光電社）。蛍光観察はニコン社のA1R共焦点顕微鏡システムで行い、画像解析はニコン社のNISelementを用いて行った。
【０１０３】
ｓｐＨ観察：ドパミンの放出を可視化するためにドパミン作動性神経にｓｐＨを発現するハエを使用した（ＵＡＳ−ｓｐＨ；ＴＨ−ＧＡＬ４）。図１は、ｓｐＨの動作原理を示している。シナプス小胞内には神経伝達物質以外にＨ＋が多量にありｐＨが低く抑えられている。ｓｐＨはｐＨ感受性であるため低いｐＨ下では蛍光強度が低い。シナプス小胞が細胞膜に融合し神経伝達物質を放出すると共にＨ＋も放出しｓｐＨ周辺のｐＨが上昇する。それに伴い、ｓｐＨの蛍光強度も増大する。
【０１０４】
ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激は、観察用チャンバーにＮＭＤＡを２００μＭ加えた後、ＡＬを電気刺激して行った。ＡＬ刺激直前のキノコ体周辺のｓｐＨ蛍光強度５フレーム平均値をＦ０としてその後の蛍光強度Ｆから、蛍光変化ΔＦを（Ｆ−Ｆ０）／Ｆ０の式から求めた。薬剤投与の実験では薬剤を加える直前のｓｐＨ蛍光強度５フレーム平均値をＦ０として同様に計算を行った。
【０１０５】
マウス飼育条件：Ｃ５７ＢＬ／６系の４週齢から６週齢の野生型マウスを使用した。飼育環境は、１２時間の明暗サイクルとし、飼育温度および湿度は２２±２℃、５５±５％に設定した。飼料には動物固形飼料（ＣＥ２、オリエンタル酵母、日本）、飲水には限外濾過水を用い、ともに２４時間自由摂取させた。
【０１０６】
マイクロダイアリシス法：マウスの扁桃体に、プローブ先端位置が、ブレグマより（−１．２５ｍｍ，±２．７５ｍｍ，−３．２ｍｍ）となるように留置した。プローブをマイクロポンプに接続し、自由行動下で、１０分間隔で経時的に２０μｌの透析液を採取した。ドパミンおよびセロトニンの値が３０分以上安定したのを確認したのち（ベース値）、ＨＰＬＣおよび電気化学検出器によって測定した。０．２％のＤＭＳＯを含む灌流液によって得られた値がベース値と変わらないのを確認したのち、順に、ＣＯＲＭ−３、ＲｙＲ阻害剤（dantrolen）、およびＲｙＲ阻害剤とＣＯＲＭ−３との両方を灌流液に添加、それぞれ添加２０分後の値を測定した。実験終了後、ソムノペンチル２００ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射による深麻酔下で心臓カテーテルによって４％パラフォルムアルデヒドで潅流固定し、１％bromophenol blueをプローブ穴に１０μｌ注入、プローブ挿入位置の確認を行った。
【０１０７】
〔実施例１：ドパミン放出に関与するシグナル伝達様式の探索〕
活性化した神経が別の神経に情報を伝達する上で最も良く使われる経路は当然ながらシナプス伝達である。そこで、ハエの熱遺伝学を利用し活性化したキノコ体のシナプス伝達を一時的に抑制することの出来るハエを作成し実験を行った。このハエは環境温度が３２度程度になると熱感受性ダイナミンによってキノコ体のシナプス伝達が抑制されるが、温度を２２℃に戻せば伝達は正常になる。
【０１０８】
図２は、キノコ体からのシナプス伝達を抑制した際のドパミン放出を示している。縦軸はドパミン作動性神経終末のｓｐＨの蛍光変化を示し、ドパミン放出を表す。キノコ体からのシナプス伝達を抑制した場合（左、３２℃）も抑制しない場合（右、２２℃）もどちらも同様に匂い中枢刺激とＮＭＤＡ投与によるドパミン放出は同様に引き起こされる。このように、温度が３２℃の場合も２２℃の場合いずれにおいてもＡＬ／ＮＭＤＡ刺激はドパミン放出を誘導した。
【０１０９】
この結果から、シナプス伝達以外の経路がキノコ体-ドパミン作動性神経間の伝達を行っていることが示唆された。シナプス伝達以外の神経-神経伝達は、１つにはギャップ結合による電気的共役、もう１つは逆行性シグナルが挙げられる。そこでＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出がギャップ結合や逆行性シグナルの阻害剤で抑制されるか否か、阻害剤が無い場合は逆行性シグナルそのものでドパミン放出が誘導されるか否かを検討した（表1）。
【０１１０】
その結果、逆行性シグナルの１つである一酸化炭素の合成阻害剤のＣｒＭＰがＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出を抑制した。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
〔実施例２：一酸化炭素生成抑制によるドパミン放出の影響への影響〕
ドパミン作動性神経にｓｐＨを発現させたハエにおいて、ＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激を行った。
【０１１３】
図３は一酸化炭素合成阻害剤（ＣｒＭＰ）によるドパミン放出への影響を示す図である。コントロールはドパミン放出を示したが、ＣｒＭＰ存在下はドパミン放出が抑制された。従ってＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出には一酸化炭素が関与していることが示された。
【０１１４】
また、次に、ショウジョウバエのgene switchシステムによりキノコ体のＨＯ発現をＲＵ４８６（ＲＵ）摂取により抑制させることの出来るハエを作成した。このハエにおいて、同時にドパミン作動性神経にｓｐＨを発現させている。図４は、一酸化炭素合成酵素（heme oxygenase，ＨＯ）のキノコ体特異的発現抑制によるドパミン放出への影響を示す図である。ＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激を行うとＲＵを摂取していないハエ脳では（ＲＵ−）ドパミン放出を示したが、ＲＵ摂取によりＨＯ発現抑制されているハエ脳では（ＲＵ＋）ドパミン放出が抑制された。従ってＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出にはキノコ体のＨＯ活性が必要な事が示された。
【０１１５】
図５は、一酸化炭素吸着剤（ｈｅｍｏ−ＣＤ）によるドパミン放出の影響への影響を示す図である。ドパミン作動性神経にｓｐＨを発現させたハエにおいて、ＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激を行った。コントロールはドパミン放出を示したが、ｈｅｍｏ−ＣＤ存在下はドパミン放出が抑制された。従ってＡＬ＋ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出には一酸化炭素が必要であることが再確認された。
【０１１６】
〔実施例３：一酸化炭素生成誘導によるドパミン放出の影響への影響〕
さらに、一酸化炭素が真にドパミン放出を誘導するのか否かを検討するために、一酸化炭素供与体であるＣＯＲＭ−３を投与した。その結果、ＣＯＲＭ−３はドパミン放出を誘導した（図６）。このように、水溶液中で一酸化炭素を遊離させるＣＯＲＭ−３を脳に投与すると、ドパミン放出が観察された。
【０１１７】
図６では、細胞外Ｃａ２＋の消失剤ＥＧＴＡによって神経活動を遮断した状態で、ＣＯ誘導剤であるＣＯＲＭ−３によってドパミンが放出されていることを確認している。
【０１１８】
これまで、モノアミンなど神経伝達物質の放出は、前シナプスからの神経細胞が興奮して細胞外からのＣａ２＋を流入し、神経伝達物質が放出される、神経活動依存的な経路が唯一の経路と思われていた。
【０１１９】
しかし、図７に示すように、本実験で、前シナプスの神経細胞の興奮とは無関係に、ＣＯが伝達物質を放出する経路、すなわち、リアノジン受容体による細胞内のＣａ２＋放出による経路が存在することが明らかとなった。また、これまでのモノアミンの放出制御は、モノアミンを普段から放出している神経からの放出量を増加または抑制させるものであったが、図７では、ＣＯが、既存の経路にてドパミンの分泌を抑制している状態でも、神経からのドパミンを放出させることが可能であることを示した。
【０１２０】
〔実施例４：一酸化炭素によるリアノジン受容体（ＲｙＲ）活性化による細胞内Ｃａ２＋の上昇を介したドパミン放出〕
神経伝達物質の放出には一般的に細胞内Ｃａ２＋の上昇が必要であり、その上昇は細胞外からのＣａ２＋流入が主な要因である。一酸化炭素によるドパミン放出にも細胞内Ｃａ２＋の上昇が必要か否かを検討した。
【０１２１】
図７は、ＣＯＲＭ−３によるドパミン放出誘導のＣａ２＋依存性を示す図である。
ＣＯＲＭ−３の投与前に細胞外のＣａ２＋を消失させた場合（左、ＥＧＴＡ）は、ドパミン放出は阻害されない。一方、細胞内のＣａ２＋を消失させた場合（右、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）は、ドパミン放出は著しく阻害される。
【０１２２】
このように、確かに細胞内Ｃａ２＋の上昇は必要であるが、それは細胞外からのＣａ２＋に依存しないことが見出された（図７）。細胞外に依存しない細胞内Ｃａ２＋の上昇は小胞などに蓄えられたＣａ２＋の放出によることが知られており、その放出経路はイノシトールリン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）経路とリアノジン受容体（ＲｙＲ）経路とが知られている。
【０１２３】
そこで、次に、ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出をそれぞれの経路阻害剤下で行った。
その結果を図８に示す。図８は、ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によるドパミン放出に対する各種阻害剤の効果を示す図である。ＡＬ／ＮＭＤＡ刺激によってドパミン放出が引き起こされるが、ＲｙＲの阻害剤であるdantrolenを投与するとその放出が阻害される（左、実線）。一方、ＩＰ３Ｒの阻害剤である２−ＡＰＢは阻害効果を示さない（右、実線）。
【０１２４】
ＩＰ３Ｒ経路ではなくＲｙＲ経路が重要であることが見出された（図８）。
【０１２５】
図９は、ハエ脳におけるドパミン放出の機構を示す図である。活性化したキノコ体神経から一酸化炭素が生成され、それが逆行的にドパミン作動性神経に伝達される。一酸化炭素はドパミン作動性神経のＲｙＲに直接ないしは間接的に作用し、細胞内のＣａ２＋濃度を上昇させる。これによりドパミンが放出される。
【０１２６】
以上の通り、ハエの摘出培養脳におけるドパミンは図９に示すような分子経路によって引き起こされることが示された。すなわち、活性化したキノコ体神経は一酸化炭素生成酵素（heme oxygenase）によって一酸化炭素を生成し、これが逆行性シグナルとなりドパミン作動性神経終末に到達する。一酸化炭素はおそらくは間接的にドパミン作動性神経終末のＲｙＲを活性化させ、活性化したＲｙＲが小胞等に貯蔵されたＣａ２＋を細胞質内に放出させることで細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇させる。上昇したＣａ２＋がドパミンのシナプス小胞を放出させる。
【０１２７】
〔実施例５：ほ乳類におけるモノアミン放出調節への一酸化炭素およびリアノジン受容体の関与〕
上記モデルがハエに限らずヒトを含めた脊椎動物で保存されているのか否かを検討するために、マイクロダイアリシス法を用いてマウス生体で検証を試みた。マイクロダイアリシス法は先端に中空の半透膜チューブを取り付けたプローブを目的組織内に留置し、チューブ内に透析液を潅流させる手法である。組織で分泌された物質が半透膜を通じて透析液に移動するので、これを回収し、高速液体クロマトグラフィーによって目的物質の濃度を測定することができる。逆にチューブ内に薬剤を注入することで組織に薬剤を搬送することができる。カニューレによってマウス扁桃体に半透膜チューブを留置し、実験を行った。
【０１２８】
図１０は、マウス扁桃体における一酸化炭素によるドパミンおよびセロトニン放出を示す図である。
縦軸はｓａｌｉｎｅによるモノアミン放出レベル（ベース値）に対する相対的な値を示す。リアノジン受容体阻害剤dantrolenそのものはドパミンおよびセロトニン放出に影響を与えない。ＣＯＲＭ−３を投与するとドパミンおよびセロトニンの分泌量が２．５〜１．５倍放出されるようになるが、そこにdantrolenを加えるとその効果は抑制される。
【０１２９】
その結果、一酸化炭素供与体のＣＯＲＭ−３はマウス脳においてはドパミンおよびセロトニンの放出を誘導することが明らかとなり、さらに一酸化炭素によるドパミンおよびセロトニン放出はリアノジン受容体阻害剤で抑制されることが見出された（図１０）。リアノジン受容体阻害剤そのものによる投与はドパミンおよびセロトニンの放出には影響を与えないことから、マウスにおいてもハエで見出された一酸化炭素→リアノジン受容体→モノアミン放出という経路が保存されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明は、例えば、リアノジン受容体関連疾患またはモノアミン関連疾患の治療および研究等に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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