(57)【要約】      （修正有）【課題】アテローム性動脈硬化などの代謝性障害を処置するための組成物の提供。【解決手段】アッカーマンシア・ムシニフィラ、又はその断片を、賦形剤、希釈剤及び／又はキャリアーと共に含む組成物。代謝性障害としては、アテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝、脂質異常症、アテローム性脂質異常症、循環器疾患、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、体重過剰及び肥満に関連する免疫系の機能不全、免疫性障害、癌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象での代謝性障害を処置するための組成物であって、前記組成物はアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはその断片を、賦形剤、希釈剤および／またはキャリアーと共に含み、前記代謝性障害がアテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝、脂質異常症、アテローム性脂質異常症、循環器疾患、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、免疫性障害、および癌からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
前記代謝性障害が喘息である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記代謝性障害が、心臓性病態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記代謝性障害が、癌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記代謝性障害が、神経変性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記代謝性障害が、脂質異常症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラの生細胞が、それを必要とする前記対象に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラが経口投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕの範囲の前記アッカーマンシア・ムシニフィラの量が前記対象に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラが少なくとも１週間に３回投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラが、別のプロバイオティクス株および／または１つ以上のプレバイオティクスと同時に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
賦形剤を伴って含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が栄養性組成物である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は経口投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
対象におけるアテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝、脂質異常症、アテローム性脂質異常症、循環器疾患、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、免疫性障害、および癌からなる群から選択される代謝性障害を処置するための医薬組成物であって、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはその断片を薬学的に許容可能なビヒクルを伴って含む、医薬組成物。
【請求項１６】
対象におけるアテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝、脂質異常症、アテローム性脂質異常症、循環器疾患、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、免疫性障害、および癌からなる群から選択される代謝性障害を処置するための薬物であって、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはその断片を、賦形剤、希釈剤および／またはキャリアーと共に含む、薬物。
【請求項１７】
対象の腸の内部のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の正常な量および／または比率を回復するための、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の使用。
【請求項１８】
対象の上皮性関門および／または免疫系を回復させるための、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはその断片の使用。
【請求項１９】
対象の腸のバリア機能を回復させるための、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）またはその断片の使用。
【請求項２０】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片は、食物添加剤、飲料添加剤、栄養補助食品、栄養製品、メディカルフード、または栄養補助組成物の形態である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラの生細胞が前記対象に投与される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラは、経口投与される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１１ｃｆｕ、およびさらに好ましくは約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕの範囲の量の前記アッカーマンシア・ムシニフィラが前記対象に投与される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラは、少なくとも１週間に３回投与される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記アッカーマンシア・ムシニフィラは、別のプロバイオティクス株および／または１つ以上のプレバイオティクスと共投与する、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記プレバイオティクスは、イヌリンおよびイヌリン型フルクタン、フラクトオリゴ糖、キシロース、アラビノース、アラビノキシラン、リボース、ガラクトース、ラムノース、セロビオース、フルクトース、ラクトース、サリシン、スクロース、グルコース、エスクリン、ｔｗｅｅｎ  ８０、トレハロース、マルトース、マンノース、メリビオース（ｍｅｌｌｉｂｉｏｓｅ）、粘液（ｍｕｃｕｓ）またはムチン、ラフィノース、フラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコール、およびそれらの組み合わせ、ならびに好ましくは、イヌリン、イヌリン型フルクタン、またはフラクトオリゴ糖である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
対象の体脂肪量の低下および／または体脂肪量増加の減少のための、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば真性糖尿病または高コレステロールなど、体重過剰および肥満に関する代謝障害などの、代謝障害の処置に関する。具体的には、本発明は、代謝障害を処置するアッカーマンシア菌種またはそれらの断片を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は世界的な問題であり、肥満の成人が約２億５０００万人いると推定されている。肥満の蔓延は、たとえば、糖尿病、高血圧、心臓の病態および肝疾患などの肥満に関連する障害の罹患率の大幅な増加と相関する。これらの非常に悪化する病態のため、西洋諸国では、肥満は現在最も重要な公衆衛生の問題の１つとして考慮されている。したがって、肥満および／もしくは肥満関連障害を処置または予防する組成物ならびに方法が現実に必要とされている。
【０００３】
肥満および肥満関連疾患は、（ｉ）代謝機能不全（たとえばグルコースホメオスタシスおよび脂質代謝への影響をともなう）、（ｉｉ）より高い血中リポ多糖（ＬＰＳ）レベルに関連する低度の炎症状態（代謝性内毒血症ともよばれる）、および（ｉｉｉ）腸バリア機能不全（すなわち腸の透過率の増大）に関連する。したがって、肥満を処置するためには、これらの３つの要因の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つに影響を与えることが必要とされる。
【０００４】
ヒトの腸では、１０００もの異なる種が存在する多様で複雑かつ動的な微生物の共同体がコロニーを形成し、宿主と絶えず相互作用している（Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ，  Ｒａｊｉｌｉｃ−Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ，  Ｇｕｔ  ２００８，  ５７：  １６０５−１６１５）。腸の微生物叢のホメオスタシスは、宿主の特徴（年齢、性別、遺伝的背景・・・）および環境条件（ストレス、薬剤、消化器の外科手術、感染性薬剤および毒性薬剤．．．）に依存するが、日々の食事の変化にも依存する。肥満および関連障害の発症における腸微生物叢の役割を裏付ける証拠が増えつつある（Ｄｅｌｚｅｎｎｅ  ＆  Ｃａｎｉ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｕｔｒ．  ２０１１，  ３１：  １５−３１）。
【０００５】
したがって、腸微生物叢を標的とする生成物による処置が、肥満および関連障害を処置する有望な治療ツールとして登場した。これらの生成物は、大部分のプロバイオティクスの場合などのように、生存している微生物からなってもよく、または死んだ微生物もしくはそれらの断片を含んでもよい。さらに、これらの生成物は、プレバイオティクスの場合などのように、腸微生物叢により使用される物質を含んでもよく、または特異的な抗菌化合物などの、腸の微生物叢の均衡を変化させる化合物を含んでもよい。
【０００６】
たとえば、国際特許公開公報第２００８／０７６６９６号は、肥満および関連障害を処置する治療上の標的としての腸微生物叢を記載する。国際特許公開公報第２００８／０７６６９６号は、対象に抗生剤および／またはプロバイオティクスを投与することによる、対象の腸におけるバクテロイドおよびファーミキューテスの存在量を変える方法を特に記載する。
【０００７】
さらに、欧州特許第２０３０６２３号は、腸における腸内細菌の量を調節することによる、たとえば肥満関連障害などの、代謝性障害の予防および／または処置に関する。欧州特許第２０３０６２３号は、たとえば、ビフィズス菌、ラクトコッカス、連鎖球菌、腸球菌または乳酸桿菌などのプロバイオティクスを投与することにより、腸における腸内細菌の量を低減させることを開示した。
【０００８】
さらに、本出願人は、プレバイオティクスで処置した肥満マウスにおいて微生物叢が改変されることを記載した（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ２０１１  Ｎｏｖ；６０（１１）：２７７５−８６）。さらに、プレバイオティクスは、（１）肥満マウスにおいてグルコースおよび脂質の代謝を改善し、（２）肥満マウスにおいて血漿のＬＰＳを低減しかつ腸のバリア機能を改善（たとえば炎症を低減）し、（３）肥満マウスにおいて腸内分泌Ｌ細胞数の増加を誘導し、ならびに（４）食事誘導型の肥満かつ糖尿病のマウスにおいてレプチン感受性およびグルコースのホメオスタシー（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｙ）を改善する。
【０００９】
肥満マウスのプレバイオティクスの処置により誘導される改変には、腸微生物叢の組成のかなりの変化があり、（ｉ）バクテロイデス、乳酸桿菌種およびバクテロイデス−プレボテラ群の細菌の存在量の減少、ならびに（ｉｉ）ビフィズス菌種、Ｅ．ｒｅｃｔａｌｅ／Ｃ．ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ分類群の細菌および本出願人により２００４年に最初に同定された細菌であり、健康な成人の微生物叢の合計の約１〜３％に当たるＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ．  Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに属するアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００４，  ５４：１４６９−１４７６；  Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００８，  ７４，  １６４６−１６４８．）の存在量の増加により特徴付けられる。
【００１０】
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの存在量と腸機能不全または肥満関連障害との間の関係が、間接的な証拠により示唆された。たとえば、国際特許公開公報第２０１１／１０７４８１号は、バクテロイデスカピロススおよびクロストリジウムレプタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ）の存在と同時に起こる、対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの欠如は、この対象が潰瘍性大腸炎を罹患していることを示唆すると記載している。さらに、Ｈａｎｓｅｎらは、新生ＮＯＤマウス（ＮＯＤマウスモデルは糖尿病用のモデルである）への抗生剤であるバンコマイシンの投与は、糖尿病の臨床的発症を抑制し、アッカーマンシア・ムシニフィラを増殖させることを示した（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ２０１２  Ａｕｇ；５５（８）：２２８５−９４）。しかしながら、これは、使用される抗生剤に対する腸管内のアッカーマンシア菌種の非感受性による、間接的な作用である可能性がある。
【００１１】
したがって、これらの結果は、腸微生物叢の完全な組成が、マウスでのプレバイオティクスの投与後に改変されることを示す。より具体的には、プレバイオティクスの投与への有用な応答における、たとえばアッカーマンシア・ムシニフィラなどの、１種の細菌の特定の役割を示唆する証拠はない。さらに、本出願人の知る限りでは、アッカーマンシア・ムシニフィラの直接投与の有益な効果は、これまでに記載されておらず、示唆もされていない。
【００１２】
ここで、本出願人は驚くべきことに、アッカーマンシア・ムシニフィラのみの反復投与が、肥満および関連障害に関連する３つの根底にある調節不全、すなわち、代謝機能不全、より高い血中リポ多糖（ＬＰＳ）レベルに関連する低度の炎症状態、および腸バリア機能障害に影響を与えることを示した。本発明はしたがって、肥満および関連障害を処置するアッカーマンシア・ムシニフィラおよびその断片の使用に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、それを必要とする対象の代謝性障害を処置し、または処置する際に使用する、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。本発明の１つの実施形態では、この代謝性障害は肥満である。本発明の別の実施形態では、この代謝性障害は、メタボリックシンドローム、インスリン欠損性またはインスリン抵抗性関連障害、真性糖尿病（たとえば２型糖尿病など）、耐糖能障害、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、高血糖症、脂肪肝、脂質異常症、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、循環器疾患、高コレステロール、トリグリセリドの増加、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、炎症性障害および免疫性障害、アテローム性脂質異常症ならびに癌を含む群から選択される。
【００１４】
本発明はまた、対象のエネルギー消費を、好ましくは対象の食物摂取量に影響を与えることなく、増大させるアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。また、本発明は、対象の満腹度を増大させるアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。
【００１５】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの生細胞を、それを必要とする対象に投与する。
【００１６】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラを経口投与する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ、およびさらに好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕの範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを対象に投与する。本発明の別の実施形態では、約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１１ｃｆｕ、およびさらに好ましくは１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕの範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを対象に投与する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、少なくとも１日に１回アッカーマンシア・ムシニフィラを投与する。本発明の１つの実施形態では、少なくとも１週間に３回、アッカーマンシア・ムシニフィラを投与する。別の実施形態では、少なくとも１週間に１回、アッカーマンシア・ムシニフィラを投与する。
【００１９】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラを別のプロバイオティクス株および／または１つ以上のプレバイオティクスと共投与する。
【００２０】
本発明の別の目的は、対象の代謝性障害を処置もしくは処置する際に使用するか、対象のエネルギー消費を増大させるか、または対象の満腹度を増大させる組成物であって、賦形剤を伴う本明細書に上述したアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片を含む、組成物である。１つの実施形態では、この組成物は栄養性組成物である。１つの実施形態では、この組成物を経口投与する。
【００２１】
本発明はまた、対象の代謝性障害を処置もしくは処置する際に使用するか、対象のエネルギー消費を増大させるか、または対象の満腹度を増大させる医薬組成物であって、薬学的に許容可能なビヒクルを伴う本明細書に上述したアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片を含む、医薬組成物である。
【００２２】
本発明の別の目的は、対象の代謝性障害を処置もしくは処置する際に使用するか、または対象のエネルギー消費を増大させるか、または対象の満腹度を増大させる薬物であって、本明細書に上述したアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片を含む、薬物である。
【００２３】
本発明の別の目的は、その必要のある対象の体重の減少を促進するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の使用である。
【００２４】
本発明はまた、それを必要とする対象の体重の減少を促進するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片を含む、美容組成物に関する。
【００２５】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
「処置」は、ある疾患、障害または病態の少なくとも１つの有害作用を予防（すなわち発症しないようにする）、低減または軽減させることを意味する。したがってこの用語は、治療上の処置および予防または防止措置を指し、ここでの目的は、標的となる病態の状態または障害を予防または鈍化する（低減する）ことである。本発明の１つの実施形態では、処置を必要とする対象は、すでにこの障害を伴う対象、およびこの障害が生じやすい対象またはこの障害を予防すべき対象を含む。
【００２６】
「有効量」は、標的に対して顕著な負の作用または有害な副作用を引き起こすことなく、（１）代謝性障害の発症を遅延または予防し、（２）代謝性障害の１つ以上の症状の進行、悪化、もしくは増悪を鈍化または停止し、（３）代謝性障害の症状の回復をもたらし、（４）代謝性障害の重症度もしくは発生率を低下させ、（５）代謝性障害を治癒し、または（６）処置すべき対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な量および／または比率を回復させることを目的とする薬剤のレベルまたは量を指す。予防または防止作用のために、代謝性障害の発症の前に有効量を投与してもよい。あるいはまたはさらに、治療作用のために、代謝性障害の発生後に有効量を投与してもよい。
【００２７】
「アッカーマンシア・ムシニフィラ」は、Ｄｅｒｒｉｅｎにより同定された絶対嫌気性ムチン分解細菌を指す  （Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００４，  ５４：１４６９−１４７６）。細胞は長円形の形状であり、非運動性であり、グラム陰性株である。また、アッカーマンシア・ムシニフィラは、アッカーマンシア菌種またはアッカーマンシア様細菌とよばれてもよい。アッカーマンシア・ムシニフィラはクラミジア／ベルコミクロビア群、ウェルコミクロビウム門に属している。分類が変化する場合、当業者は、本発明に使用できる株を推論するための分類における変化に適合する方法を知るであろう。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラの完全なゲノムは本出願人により決定されている（ｖａｎ  Ｐａｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ２０１１：  ｅ１６８７６）。一般的に、約７０％のゲノム類似性を有する株は、同一種であると考慮できることが受け入れられている。
【００２８】
「プロバイオティクス」は、微生物細胞の調製物（たとえば、生存している微生物細胞など）または微生物細胞の成分であり、有効量で投与される際に対象の健康または健康状態（ｗｅｌｌ−ｂｅｉｎｇ）への有益な作用を提供する。定義により、すべてのプロバイオティクスは、証明されている非病原性の特徴を有する。１つの実施形態では、これらの健康上の利点は、消化管におけるヒトもしくは動物の微生物叢の均衡の改善、および／または正常な微生物叢の回復に関連する。
【００２９】
「プレバイオティクス」は、たとえば、食用物質などの物質を指し、ヒトにより消化されない場合もあるが、腸微生物叢の細菌により使用される場合があり、腸におけるプロバイオティクス細菌の増殖を促進すると考えられている。
【００３０】
「体重過剰」は、２５〜３０の範囲の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する対象の状態を指す。本明細書で使用されるように、ＢＭＩは、対象の身長（メートル）の２乗で対象の体重（ｋｇ）を除算することにより定義される。
【００３１】
「肥満」は、３０以上のＢＭＩを有する対象の状態を指す。
【００３２】
「対象」は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。１つの実施形態では、対象はオスである。別の実施形態では、対象はメスである。本発明の１つの実施形態では、対象は、たとえば、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、フェレット、ウサギなどのペットをも指す。
【００３３】
数字に先行する「約」は、この数字±２０％、好ましくは±１０％を意味する。
【００３４】
「断片」は、アッカーマンシア・ムシニフィラなどの代謝からもたらされる細胞の構成要素、代謝物、分泌分子および化合物を指す場合がある。断片は、たとえば、アッカーマンシア・ムシニフィラの培養液の上清を回収すること、またはアッカーマンシア・ムシニフィラの培養液由来の細胞の構成要素もしくは細胞画分、代謝物もしくは分泌化合物を抽出することにより、取得してもよい。断片との用語はまた、分解産物を指してもよい。断片は、アッカーマンシア・ムシニフィラ由来の単離形態の構成要素、または１つ以上の構成要素の任意の混合物に対応してもよい。１つの実施形態では、断片は、微生物の宿主または他の任意の（生）合成工程において、組み換えＤＮＡ技術を使用するなどの、別の方法で産生される、アッカーマンシア・ムシニフィラに存在する１つ以上のこのような構成要素に対応してもよい。
【００３５】
「代謝性障害」は、異常な体重増加、異常なエネルギーの使用もしくは消費、摂取した栄養素もしくは内在性の栄養素、エネルギー供給源、ホルモンもしくは体内の他のシグナリング分子に対する応答の変化、または炭水化物、脂質、タンパク質、核酸もしくはこれらの組み合わせの代謝の変化により引き起こされるまたは特徴付けられる障害、疾患および病態を指す。代謝性障害は、炭水化物、脂質、タンパク質および／または核酸の代謝に不均衡をもたらす代謝経路の欠損または過剰のいずれかに関連してもよい。代謝性障害の例として、限定するものではないが、メタボリックシンドローム、インスリン欠損性またはインスリン抵抗性関連障害、真性糖尿病（たとえば２型糖尿病など）、耐糖能障害、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、高血糖症、脂肪肝、脂質異常症、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、循環器疾患、高コレステロール、トリグリセリドの増加、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、炎症性障害および免疫性障害、アテローム性脂質異常症ならびに癌が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、それを必要とする対象の代謝性障害を処置、または処置する際に使用するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。
【００３７】
本明細書で使用されるように、代謝性障害は、変化した糖質または脂質のホメオスタシスなどの、変化した代謝性ホメオスタシスに関する障害である。
【００３８】
本発明の１つの実施形態では、この代謝性障害は肥満である。
【００３９】
他の代謝性障害の例として、限定するものではないが、メタボリックシンドローム、インスリン欠損性またはインスリン抵抗性関連障害、真性糖尿病（たとえば２型糖尿病など）、耐糖能障害、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、高血糖症、脂肪肝、脂質異常症、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、循環器疾患、高コレステロール、トリグリセリドの増加、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、炎症性障害および免疫性障害、アテローム性脂質異常症ならびに癌などが挙げられる。
【００４０】
別の実施形態では、代謝性障害は、体重過剰および／または肥満に関連する代謝性障害、すなわち、体重過剰および／または肥満に関連し得るまたは引き起こされ得る代謝性障害である。体重過剰および／または肥満に関連する代謝性障害として、限定するものではないが、メタボリックシンドローム、インスリン欠損性またはインスリン抵抗性関連障害、真性糖尿病（たとえば２型糖尿病など）、耐糖能障害、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化、高血圧、心臓性病態、脳卒中、非アルコール性脂肪肝疾患、高血糖症、脂肪肝、脂質異常症、体重過剰および肥満に関連する免疫系の機能不全、循環器疾患、高コレステロール、トリグリセリドの増加、喘息、睡眠時無呼吸、変形性関節症、神経変性、胆嚢疾患、シンドロームＸ、炎症性障害および免疫性障害、アテローム性脂質異常症ならびに癌が挙げられる。
【００４１】
１つの実施形態では、この代謝性障害は、真性糖尿病、好ましくは２型糖尿病である。別の実施形態では、この代謝性障害は、高コレステロール血症（高コレステロールとしても知られる）である。１つの実施形態では、高コレステロール血症は、２ｇ／Ｌまたは５ｎｍｏｌ／Ｌ以上の血漿コレステロール濃度に対応する。別の実施形態では、高コレステロール血症は、４．５：１、好ましくは、５：１以上である総コレステロールの血漿濃度：ＨＤＬ（高密度リポタンパク質コレステロール）の血漿濃度の比率に対応する。
【００４２】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの生存株を本明細書で使用し、好ましくは、この生存株は、増殖の定常期の細胞由来である。
【００４３】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラは生細胞の形態であってもよい。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラは非生細胞の形態であってもよい。
【００４４】
１つの実施形態では、代謝的に活性であるアッカーマンシア・ムシニフィラ細胞を本発明に使用する。１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラ株は代謝的に不活性ではなく、この代謝的な不活性は、たとえば、オートクレーブ処置から生じてもよい。
【００４５】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラはまたはその断片は実質的に精製されている。本明細書で使用されるように、「実質的に精製されている」との文言は、アッカーマンシア・ムシニフィラはまたはその断片が試料に含まれており、アッカーマンシア・ムシニフィラはまたはその断片が、この試料の細菌株またはそれらの断片の少なくとも約５０％に相当し、好ましくは少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９９％またはそれを超えることを意味する。
【００４６】
本発明はまた、代謝性障害を処置するか、または処置する際に使用するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量を含む組成物に関する。
【００４７】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの有効量は、対象の腸の内部のアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な量および／または比率を回復するために十分な細菌の量に対応する。実際に、本出願人は、肥満または体重過剰の対象の腸でアッカーマンシア・ムシニフィラが枯渇していることを示した（実施例参照）。本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの正常な量および／または比率は、健康な対象の腸に存在するアッカーマンシア・ムシニフィラの量および／または比率に対応する。
【００４８】
本明細書に使用されるように、用語「健康な対象」は、処置される疾患を罹患していない対象を定義するのに使用される。たとえば、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片が肥満を処置するために使用される場合、健康な対象は肥満を罹患していない。好ましくは、健康な対象は処置される対象と共通の特徴、たとえば、同じ性別（ｇｅｎｄｅｒまたはｓｅｘ）、年齢、食事、薬剤摂取、または測位（ｇｅｏｌｏｃａｔｉｏｎ）など、を共有する。
【００４９】
本発明の１つの実施形態では、腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な比率は、約０．１％〜約１０％（腸の細菌細胞数の合計に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ細胞の数）、好ましくは約０．３％〜約５％、より好ましくは約１％〜約３％の範囲である。
【００５０】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの有効量は、１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ、好ましくは約１×１０４〜１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ、さらにより好ましくは１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕの範囲であり、ここでｃｆｕは、「コロニー形成単位」を意味する。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの有効量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕの範囲である。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの有効量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕである。
【００５３】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の有効量は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ由来の断片の範囲にあり、ここで、ｃｆｕは「コロニー形成単位」を意味する。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の有効量は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ由来の断片からの範囲である。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の有効量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ由来の断片からの範囲である。
【００５４】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／ｇ組成物、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ／ｇ組成物、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物、さらにより好ましくは、１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物の範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを含む。本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌ組成物、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ組成物の範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物の範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは、約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物の範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラを含む。
【００５５】
本発明の１つの実施形態では、本発明の組成物は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物由来の断片からの範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラの断片を含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは、約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物由来の断片からの範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラの断片を含む。本発明の別の実施形態では、本発明の組成物は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／ｇ組成物またはｃｆｕ／ｍｌ組成物由来の断片からの範囲の量のアッカーマンシア・ムシニフィラの断片を含む。
【００５６】
本発明はまた、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。本発明の１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、代謝性障害を処置することを目的とする。本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な比率を回復させることを目的とする。
【００５７】
本発明で使用されるように、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与する際の不都合な反応、アレルギー反応、または他の有害反応を起こさない賦形剤を指す。薬学的に許容可能な賦形剤は、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤などを含んでもよい。ヒトへの投与では、製剤はＦＤＡ局の生物学的基準により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準と一致するべきである。
【００５８】
本発明はまた、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量を含む薬物に関する。本発明の１つの実施形態では、本発明の薬物は代謝性障害を処置することを目的とする。本発明の別の実施形態では、本薬物は、それを必要とする対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な比率を回復させることを目的とする。
【００５９】
本発明はまた、それを必要とする対象の代謝性障害を処置する方法であって、この方法が、対象にアッカーマンシア・ムシニフィラまたはそれらの断片の有効量を投与することを含む、方法に関する。
【００６０】
本発明の別の目的は、それを必要とする対象の腸においてアッカーマンシア・ムシニフィラの正常な比率を回復させる方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量を対象に投与することを含む、方法である。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明の方法は、本発明の組成物、医薬組成物または薬物の有効量を対象に投与することを含む。
【００６２】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本組成物、医薬組成物もしくは薬物を、少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１週間に２回、より好ましくは少なくとも１週間に３回、さらにより好ましくは１週間に３回投与する。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本組成物、医薬組成物もしくは薬物を、少なくとも１日に１回、好ましくは少なくとも１日に２回投与する。
【００６３】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはそれらの断片、または本発明の組成物、医薬組成物もしくは薬物を１週間にわたり、より好ましくは、２、３、４、５、６、７または８週間以上にわたり投与する。
【００６４】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはそれらの断片、または本発明の組成物、医薬組成物もしくは薬物を、所望の結果が達成される（たとえば、体重の減少、代謝性障害の処置、コレステロール血漿レベルの減少．．．）まで続く期間にわたり投与する。
【００６５】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本発明の組成物、医薬組成物もしくは薬物の投与を永続的、すなわち時間を限定せずに行う。
【００６６】
本発明の１つの実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、およびさらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日の範囲である。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日の範囲である。
【００６８】
本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／日の範囲である。
【００６９】
本発明の１つの実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の１日の量は、約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日由来の断片からの範囲にある。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の１日の量は、１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日由来の断片の範囲にある。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の１日の量は、１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／日由来の断片からの範囲にある。
【００７０】
本発明の１つの実施形態では、対象は体重過剰である。別の実施形態では、対象は肥満である。
【００７１】
本発明の１つの実施形態では、対象は、たとえば、体重過剰および／または肥満に関連する代謝性障害などの、代謝性障害と診断される。
【００７２】
本発明の別の実施形態では、対象は、たとえば、体重過剰および／または肥満に関連する代謝性障害などの、代謝性障害を発症するリスクを有する。１つの実施形態では、このリスクは、対象が体重過剰または肥満であるの事実に関連する。別の実施形態では、このリスクは、たとえば、体重過剰および／または肥満に関連する代謝性障害などの、代謝性障害に関連する家族性の素因などの、素因に対応する。
【００７３】
本発明の１つの実施形態では、対象は腸の微生物の組成の脱制御を呈する。好ましくは、この対象の腸微生物叢で、アッカーマンシア・ムシニフィラ株が枯渇している。１つの実施形態では、対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの比率は、腸における細菌細胞の合計数に対するアッカーマンシア・ムシニフィラ細胞数において、１％未満、好ましくは０．５％未満、より好ましくは０．１％未満である。
【００７４】
本発明はまた、対象の体重の減少を促進するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはそれらの断片の美容上の使用に関する。
【００７５】
したがって、本発明の別の目的は、対象の体重の減少を促進させる、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の美容上有効量を含む美容組成物、およびその使用である。本明細書で使用されるように、「美容上有効量」は、たとえば、対象での体重減少を誘導するなどの、美容上の効果を促進するために必要かつ十分な美容組成物の量を指す。
【００７６】
本発明はまた、それを必要とする対象の体重減少を促進させる方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはそれらの断片の美容上有効量を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明の方法は、本発明の組成物または美容組成物の美容上有効量を対象に投与することを含む。
【００７８】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの美容上有効量は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕの範囲である。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの美容上有効量は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕの範囲である。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの美容上有効量は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕの範囲である。
【００７９】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の美容上有効量は約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ、好ましくは約１×１０４〜約１×１０１２ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０５〜約１×１０１０ｃｆｕ、さらにより好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ由来の断片からの範囲である。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の美容上有効量は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ由来の断片からの範囲である。本発明の別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラの断片の美容上有効量は約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ由来からの範囲である。
【００８０】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または組成物もしくは美容組成物を、少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１週間に２回、より好ましくは少なくとも１週間に３回、さらにより好ましくは１週間に３回投与する。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本組成物もしくは美容組成物を、少なくとも１日に１回、好ましくは１日に２回投与する。
【００８１】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本発明の組成物もしくは美容組成物を１週間、好ましくは、２、３、４、５、６、７または８週間以上にわたり投与する。
【００８２】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本発明の組成物もしくは美容組成物を、所望の結果が達成される（たとえば体重の減少．．．）まで続く期間にわたり投与する。
【００８３】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本発明の組成物もしくは美容組成物の投与を永続的、すなわち時間を限定せずに行う。
【００８４】
本発明の１つの実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０５〜約１×１０１２ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、さらにより好ましくは１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日の範囲にある。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日の範囲にある。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの１日の量は、１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／日の範囲である。
【００８５】
本発明の１つの実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の１日の量は、約１×１０２〜約１×１０１５ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０５〜約１×１０１２ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、さらにより好ましくは、１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日に由来する断片に及ぶ。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の日の量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０８〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、より好ましくは、１×１０９〜約１×１０１０ｃｆｕ／日に由来する断片からの範囲である。本発明の別の実施形態では、１日あたり投与されるアッカーマンシア・ムシニフィラの断片の１日の量は、約１×１０６〜約１×１０１０ｃｆｕ／日、好ましくは約１×１０６〜約１×１０９ｃｆｕ／日、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０９ｃｆｕ／日由来の断片からの範囲である。
【００８６】
１つの実施形態では、この対象は肥満の対象ではない。別の実施形態では、この対象は体重過剰である。
【００８７】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物または薬物は、たとえば、細菌の生菌株もしくは種；細菌以外の原核性プロバイオティクス；もしくは真菌株または種、好ましくは酵母株もしくは種などの、追加的な生菌株または種をさらに含む。１つの実施形態では、この追加的な生菌株または種は、対象の腸に、好ましくはヒトの腸に、より好ましくは健常なヒトの腸に天然に存在する生菌株または種から選択される。
【００８８】
本発明に使用し得る細菌の生菌株または種の例として、限定するものではないが、乳酸桿菌、ラクトコッカス、ビフィズス菌、ベイロネラ、デセムジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）、コプロコッカス、コリンゼラ、サイトロバクター、ツリシバクター、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、連鎖球菌、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒａｃｅｔｉｇｅｎｉｕｍ、ルミノコッカス、ロゼブリア、プロテウス、Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、リューコノストック、ワイセラ、ペディオコッカス、連鎖球菌、プレボテラ、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、オスシロスピラ、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ、ドレア、ジアリスタ、クロストリジウム、セデセア、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ブチリビブリオ、ブティアウクセラ、ブレイディア、ビロフィラ、バクテロイデス、アナエロボラックス、Ａｎａｅｒｏｓｔｏｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、腸内細菌、フィルミクテス、アトポビウム、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、アシネトバクター、Ｓｌａｃｋｉｅ、赤痢菌、シュワネラ、セラチア、Ｍａｈｅｌｌａ、ラクノスピラ、クレブシエラ、イディオマリナ、フソバクテリウム、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ユーバクテリウム、腸球菌、エンテロバクター、エガセラが挙げられる。
【００８９】
本発明で使用し得る原核生物株または種の例として、限定するものではないが、古細菌、ファーミキューテス、バクテロイデス（たとえば、Ａｌｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｌａｃｈｎｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ・ルミニコラ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎｄａｃｅａｅ、および関連する属など）、プロテオバクテリア、βプロテオバクテリア（たとえば、Ａｑｕａｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびバークホルデリアなど）、γプロテオバクテリア（たとえば、キサントモナスなど）、放線菌（たとえば、アクチノミセタセエおよびアトポビウムなど）、フソバクテリウム、メタノバクテリウム、スピロヘータ、フィブロバクター、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、デイノコッカス、サーマス、シアノバクテリア、ペプトストレプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、ルミノコッカス、コプロコッカス、ズブドリングラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｎｇｒａｎｕｌｕｍ）、ドレア、ブレイディア、アナエロフスティス（Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ）、ゲメラ、ロゼブリア、ジアリスタ、アナエロツルンカス、ブドウ球菌、ミクロコッカス、プロピオノ酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、腸内細菌、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉａ、バクテロイデス、パラバクテロイデス、プレボテラ、ユーバクテリウム、桿菌（たとえば、ラクトバチルス‐サリヴァリゥスおよび関連種、アエロコッカス、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、ストレプトコッカス‐ボビスおよび関連する属、およびストレプトコッカス‐インターメジウスおよび関連する属など）、クロストリジウム（たとえば、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍおよび関連する属など）ならびにブチリビブリオが挙げられる。
【００９０】
本発明で使用し得る真菌のプロバイオティクス株または種、好ましくは酵母のプロバイオティクス株または種の例として、限定するものではないが、子嚢菌、接合菌および不完全菌が挙げられ、好ましくは、アスペルギルス、トルロプシス、ザイゴサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、サッカロミケス、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、ブレタノマイセス、ピキア、アミロミセス、ザイゴサッカロミセス、エンドミセス、ハイフォピキア、ザイゴサッカロミセス、クルイベロミセス、ムコール、クモノスカビ、ヤロウイア、エンドミセス、デバリオミケス、および／またはアオカビの群から挙げられる。
【００９１】
本明細書において本出願人は、アッカーマンシア・ムシニフィラ投与の後に観察される有益な効果がこの細菌株に特異的であることを示す。実際、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＳＦ−１の投与は、同一の有益な効果を有さないことが実施例に示されている。
【００９２】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、細菌株乳酸桿菌−腸球菌、バクテロイデス、および／またはアトポビウムを含まない。
【００９３】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物に含まれる唯一の微生物株または種、好ましくは細菌株または種が、アッカーマンシア・ムシニフィラである。
【００９４】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、アッカーマンシア・ムシニフィラからなる。
【００９５】
本発明の別の実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、本質的にアッカーマンシア・ムシニフィラからなり、本明細書中の「本質的に〜からなる」は、アッカーマンシア・ムシニフィラが本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物に含まれる唯一の微生物株または種、好ましくは唯一の細菌株または種であることを意味する。
【００９６】
本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片は、腸微生物叢の他の細菌株または種の増殖および／もしくは生物活性を、活性化または阻害する。
【００９７】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物はプレバイオティクスをさらに含む。
【００９８】
本発明で使用し得るプレバイオティクスの例として、限定するものではないが、イヌリンおよびイヌリン型フルクタン、フラクトオリゴ糖、キシロース、アラビノース、アラビノキシラン、リボース、ガラクトース、ラムノース、セロビオース、フルクトース、ラクトース、サリシン、スクロース、グルコース、エスクリン、ｔｗｅｅｎ  ８０、トレハロース、マルトース、マンノース、メリビオース（ｍｅｌｌｉｂｉｏｓｅ）、粘液またはムチン、ラフィノース、フラクトオリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコール、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００９９】
プレバイオティクスの他の非限定的な例として、水に可溶なセルロース誘導体、水に不溶なセルロース誘導体、未加工のオートミール、メタムシル、オールブラン、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１００】
水に可溶なセルロース誘導体の例として、限定するものではないが、メチルセルロース、メチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
【０１０１】
本発明の、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または組成物、医薬組成物、美容組成物もしくは薬物は、いくつかの投与経路により投与されてもよい。投与に適合した経路の例として、限定するものではないが、経口投与、直腸投与、食道胃十二指腸内視鏡検査を介した投与、大腸内視鏡検査を介した投与、鼻腔胃または経口胃のチューブを使用した投与などが挙げられる。
【０１０２】
ある実施形態によると、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または組成物、医薬組成物、美容組成物もしくは薬物は、経口投与に適合する形態である。第１の実施形態によると、経口投与に適合した形態は、錠剤、ピル、カプセル、軟ゼラチンカプセル、糖衣ピル、崩壊錠剤（ｏｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ／ｏｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）、発泡性錠剤または他の固体を含む群から選択される固体の形態である。第２の実施形態によると、経口投与に適合した形態は、たとえば、飲用可能な溶液、リポソーム形態などの液体の形態である。
【０１０３】
１つの実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、美容組成物または薬物は、意図される投与経路に応じて選択される賦形剤、希釈剤および／またはキャリアーをさらに含む。賦形剤、希釈剤および／またはキャリアーの例として、限定されるものではないが、水、リン酸緩衝生理食塩水、嫌気性リン酸緩衝生理食塩水、炭酸水素ナトリウム、ジュース、ミルク、ヨーグルト、調整粉乳、乳製品、着色剤（たとえば、二酸化チタン（ｔｉｔａｎｅ  ｄｉｏｘｉｄｅ）（Ｅ１７１）、二酸化鉄（ｉｒｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ）（Ｅ１７２）、およびブリリアントブラックＢＮ（Ｅ１５１）など）；香味剤；グリセロールモノステアレートなどの濃厚剤；甘味料；コーティング剤（たとえば精製済のナタネ油、ダイズ油、ラッカセイ油、ダイズレシチンまたは魚ゼラチンなど）；希釈剤（たとえば、ラクトース、一水和物のラクトースまたはスターチ；結合剤（たとえば、ポビドン、αでんぷん、ガム類、サッカロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００またはＰＥＧ６０００など）；崩壊剤（たとえば、結晶セルロースまたはデンプングリコール酸ナトリウムＡ型などデンプングリコール酸ナトリウムなど）；たとえばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；たとえば無水コロイドシリカなどの流動剤（ｆｌｏｗ  ａｇｅｎｔ）などが挙げられる。
【０１０４】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、栄養組成物の形態であり、すなわち、液状または固形状の食品、飼料、または飲料水を含む。本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、たとえば、乳製品、乳性飲料、ヨーグルト、フルーツジュースまたは野菜ジュースまたはそれらの濃縮物、粉体、麦芽またはダイズまたは穀物ベースの飲料、ムーズリフレークなどの朝食用シリアル、果物および野菜のジュース粉体、穀物バーおよび／またはチョコレートバー、菓子類、ペースト類（ｓｐｒｅａｄｓ）、小麦粉、牛乳、スムージー、菓子類、牛乳製品、牛乳粉体、還元牛乳、発酵乳、ヨーグルト、飲料ヨーグルト、固形ヨーグルト、飲料、乳性飲料、牛乳飲料、チョコレート、ゲル、アイスクリーム、穀物、還元果物製品、スナックバー、食物バー、ムーズリバー、ペースト類（ｓｐｒｅａｄｓ）、ソース類、ディップ類、ヨーグルトおよびチーズを含む乳製品、乳性ベース飲料および非乳性ベース飲料を含む飲料、乳性ベースおよび非乳性ベースのスポーツ補助食品を含むスポーツ補助食品などの食品である。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態では、本組成物、医薬組成物、美容組成物、または薬物は、食物添加剤、飲料添加剤、栄養補助食品、栄養製品、メディカルフード、または栄養補助組成物の形態である。
【０１０６】
アッカーマンシア・ムシニフィラは絶対嫌気性細菌である。したがって、生存可能または生存する株を使用する実施形態では、長期にわたる酸素との接触は回避されるべきである。長期にわたる酸素との接触を回避する手段の例として、限定するものではないが、細菌細胞の凍結または密封コンテナにおけるパッケージングなどが挙げられる。
【０１０７】
本明細書中で本出願人は、肥満および関連障害が腸の透過率の増大に関連し、かつ障害された粘液産生、上皮性関門（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｂａｒｒｉｅｒ）、免疫系、および／または対象による抗菌化合物の産生に関連するということを示し；かつＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの投与がこれらのパラメータを回復させることを示した。
【０１０８】
したがって、本発明はまた、腸の透過率を減少させ、かつ／または障害された粘液産生を回復させ、かつ／または上皮性関門（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｂａｒｒｉｅｒ）を回復させ、かつ／または免疫系を回復させ、かつ／または抗菌化合物の産生を減少させるアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片にも関する。本発明の別の目的は、それを必要とする対象での腸の透過率を減少させ、かつ／または障害性の粘液産生を回復させ、かつ／または上皮性関門を回復させ、かつ／または免疫系を回復させ、かつ／または抗菌化合物の産生を減少させる方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。
【０１０９】
本出願人は驚くべきことに、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの投与が粘液層の厚さおよび結腸の抗菌ペプチド（たとえばＲｅｇＩＩＩγなど）の産生を調節することにより、腸のバリアを制御することを示した。さらにまた、本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが炎症、腸のバリアおよび腸のペプチド分泌（ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２）の制御に関与するエンドカンナビノイドファミリーに属するアシルグリセロールの産生を調節することをも示した。ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２は、インスリンシグナリングの改善、炎症の低減、および満腹度の促進を含む、非常に多様な機能に関与する。
【０１１０】
したがって、本発明はまた、腸のバリア機能を制御するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片、および腸のバリア機能を制御する方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片は、粘液層の厚さを調節する（肥満または他の代謝性障害では減少し得る）。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、たとえばＲｅｇＩＩＩγなどの結腸の抗菌ペプチドの産生を誘導する。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、たとえば２−オレオイルグリセロール、２−パルミトイルグリセロールおよび２−アラキドノイルグリセロールを含む群から選択されるアシルグリセロールなどの、エンドカンナビノイドファミリーの化合物の産生を誘導する。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は粘液の代謝回転を調節する。
【０１１１】
本発明の別の目的は、代謝性障害に関連するか、または代謝性障害により引き起こされる代謝機能不全を処置する際に使用するためのアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。本発明のさらに別の目的は、それを必要とする対象の代謝性障害に関連するか、または代謝性障害により引き起こされる代謝機能不全を、処置する方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０１１２】
また、本出願人は、アッカーマンシア・ムシニフィラの投与が脂肪の貯蔵および脂肪組織の代謝を制御することを示した。したがって、本発明の別の目的は、脂肪の貯蔵および脂肪組織の代謝を制御する際に使用するためのアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関する。本発明の別の目的はまた、脂肪の貯蔵および脂肪組織の代謝を制御する方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法である。１つの実施形態では、この制御は、食物摂取量の変化に全く関与しない。本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、代謝性内毒血症を無効にする。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片は、体脂肪量を少なくする。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、好ましくは脂質生合成に影響を与えることなく、脂肪細胞の分化および脂質酸化のｍＲＮＡの発現を増大させる。
【０１１３】
また、本出願人は、アッカーマンシア・ムシニフィラの投与が脂肪組織の代謝およびグルコースのホメオスタシスを調節することを示した。したがって、本発明は、脂肪組織の代謝およびグルコースのホメオスタシスの調節の際に使用するためのアッカーマンシア・ムシニフィラまたはそれらの断片に関し、ならびに脂肪組織の代謝およびグルコースのホメオスタシスを調節する方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、食事により誘導される空腹時の高血糖を元に戻す。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％の肝臓グルコース−６−ホスファターゼの発現の低減を誘導する。別の実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、インスリン抵抗指数の低下を誘導する。１つの実施形態では、インスリン抵抗指数の低下は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１５％の低下である。
【０１１４】
さらに、本出願人は、アッカーマンシア・ムシニフィラの投与が、脂肪組織のＤ１１ｃマクロファージ亜集合の正常化をもたらすことを示した。このマクロファージの集合の細胞数は、たとえば肥満および２型糖尿病などの代謝性障害で増加しており、かつこれらの代謝性障害に関する炎症の特徴である。したがって本発明はまた、炎症、好ましくは代謝性障害に関連するか、または代謝性障害により引き起こされる低度の炎症を処置するアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関し、ならびに代謝性障害に関する炎症を処置する方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。本発明の１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、脂肪組織におけるＣＤ１１ｃマクロファージの量を減少させる。
【０１１５】
最後に、本出願人は、アッカーマンシア・ムシニフィラの投与が、高脂肪の食事で飼育したマウスでの血漿コレステロールを減少させることを示した。したがって、本発明はまた、血漿コレステロールを減少させるアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片に関し、および血漿コレステロールを減少させる方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の有効量または美容上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１１６】
本発明の１つの実施形態では、対象へのアッカーマンシア・ムシニフィラまたはその断片の投与は、対象の食物摂取量に全く影響しない。
【０１１７】
本発明の１つの実施形態では、対象へのアッカーマンシア・ムシニフィラまたはそれらの断片の投与は、好ましくは対象の食物摂取量に影響を与えることなく、対象のエネルギー消費を増大させる。
【０１１８】
したがって、本発明はまた、対象のエネルギー消費を増大させる方法であって、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片、または本発明の組成物、医薬組成物、美容組成物もしくは薬物を、好ましくは治療上有効量または美容上有効量で、対象に投与することを含む、方法に関する。好ましくは、本発明の方法は、対象の食物摂取量を調節することを含まず、またはさらに含むものではない。本発明の１つの実施形態では、本発明の方法はエネルギー消費を増大させ、それにより対象において持続可能な体重の減少を誘導し、それにより肥満関連代謝性障害などの対象の代謝性障害を処置する。
【０１１９】
１つの実施形態では、アッカーマンシア・ムシニフィラもしくはその断片の対象への投与は対象での満腹度を増大させる。結果として、この実施形態によると、本発明の方法は、対象での満腹度を増大させ、それにより対象における持続可能な体重減少を誘導し、かつそれにより、肥満関連代謝性障害などの対象の代謝性障害を処置する。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】は、肥満かつ糖尿病のマウスにおいてアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量が減少していることを示すグラフの組み合わせであり、この図では、プレバイオティクス処置がこの存在量を基礎レベルまで回復させ、かつ、代謝性内毒血症および関連障害を改善することを示している。（ａ）レプチン欠損（ｏｂ−ｏｂ）肥満マウス（ｎ＝５）および同腹の除脂肪マウス（ｌｅａｎ）（ｎ＝５）の盲腸の内容物で測定したアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量（ｌｏｇ１０（細菌／盲腸の内容物（ｇ））。（ｂ）５週の間、通常の固形飼料の食事を与えるか（ｏｂ−ＣＴ）、またはプレバイオティクスで処置した（ｏｂ−Ｐｒｅ）肥満マウス（ｎ＝１０）の盲腸の内容物で測定したアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量（ｌｏｇ１０（細菌／盲腸の内容物（ｇ））。（ｃ）８週の間、対照の食事を与えられたマウス（ＣＴ）または水道水中に添加したプレバイオティクス（ＣＴ−Ｐｒｅ）で処置したＣＴ給餌マウス（ＣＴ−Ｐｒｅ）ならびにＨＦ給餌マウス（ＨＦ）または水道水中に添加したプレバイオティクスで処置したＨＦ給餌マウス（ＨＦ−Ｐｒｅ）の盲腸の内容物で測定したアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量（ｌｏｇ１０（細菌／盲腸の内容物（ｇ））（ｎ＝１０）。（ｄ）門脈の血清ＬＰＳレベル（ｎ＝７〜９）。（ｅ）脂肪組織のマクロファージの浸潤マーカーＣＤ１１ｃ  ｍＲＮＡ（ｎ＝１０）。（ｆ）門脈ＬＰＳレベルの対数値とアッカーマンシア・ムシニフィラ存在量（ｌｏｇ１０（盲腸内容物）ｇ）あたりの細菌））との間のピアソン相関。挿入図はピアソン相関の係数（ｒ）および対応するＰ値を示す。（ｇ）時間領域核磁気共鳴により測定した体脂肪量の増加分の合計（ｎ＝１０）。ａ〜ｃのデータを箱ひげ図として示す（※ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定による）。ｃ〜ｇのデータは、同一のグループのマウスから得た。ｄ、ｅ、およびｇのデータを、平均値±標準誤差（ｓｅｍ）として示す。異なる上付き文字を備えたデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により、有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【図２】アッカーマンシア・ムシニフィラが、食事誘導型肥満マウスにおいて、腸微生物叢の組成を変化させ、食事誘導型の腸バリアの機能不全を相殺し、腸のエンドカンナビノイドのレベルを変化させ、かつ代謝性障害を改善させることを示すグラフおよび写真の組み合わせである。マウスを４週の間、毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置して対照の食事（ＣＴ−Ａｋｋ）または高脂肪の食事（ＨＦ−Ａｋｋ）を与え、かつ、対照食（ＣＴ）または高脂肪食（ＨＦ）を与えて毎日の強制経口投与により等量の無菌嫌気性ＰＢＳで４週間処置したマウス（ｎ＝１０）と比較した。（ａ）対照グループ（ＣＴおよびＨＦ）ならびにアッカーマンシア・ムシニフィラ処置グループ（ＣＴＡおよびＨＦＡ）の盲腸内容物からの微生物叢のＭＩＴＣｈｉｐ系統的フィンガープリントに基づくＰＣＡ解析。（ｂ）門脈血清ＬＰＳレベル（ｎ＝６〜１０）。（ｃ）時間領域核磁気共鳴により測定した体脂肪量増加分の合計（ｎ＝１０）。（ｄ）処置から４週間後に実施した経口グルコース負荷（グルコース２ｇ／ｋｇ体重）の後に取得した血中グルコースおよび血漿インスリンの曲線下面積（０分〜１５分）を乗じることにより、インスリン抵抗指数を決定した（ｎ＝１０）。（ｅ）脂肪組織マクロファージ浸潤マーカーＣＤ１１ｃ  ｍＲＮＡ（ｎ＝１０）。（ｆ）脂肪細胞分化（ＣＣＡＡＴ／エンハーサー−結合タンパク質α、Ｃｅｂｐａによりコードされる）、脂質生合成（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、Ａｃｃ１によりコードされる；脂肪酸シンターゼ、Ｆａｓｎによりコードされる）ならびに脂質酸化（カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１、Ｃｐｔ１によりコードされる；アシルＣｏＡオキシダーゼ、Ａｃｏｘｌによりコードされる；ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γコアクチベータ、Ｐｇｃ１ａによりコードされる；およびペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α、Ｐｐａｒａによりコードされる）マーカーのｍＲＮＡ発現を内臓の貯蔵脂肪（腸間膜の脂肪）において測定した（ｎ＝１０）。（ｇ）回腸の２‐パルミトイルグリセロール（２‐ＰＧ）、２‐オレオイルグリセロール（２−ＯＧ）、２‐アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）（対照の％として表す）（ｎ＝１０）。（ｈ）アルシアンブルー染色後の組織学的解析により測定した粘液層の厚さ。粘液層の厚さの測定に使用した代表的なアルシアンブルーの画像、バー＝４０μｍ（ｎ＝７〜８）。（ｉ）結腸の再生小島由来３−γ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ３−γ）（ＲｅｇＩＩＩγ、Ｒｅｇ３ｇによりコードされる）ｍＲＮＡ発現（ｎ＝１０）。ａ〜ｉのデータは同一のグループのマウスで得た。ｂ〜ｉのデータを、平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。
【図３】プレバイオティクス処置マウスがアッカーマンシア・ムシニフィラと脂肪組織マクロファージ浸潤または体脂肪量増加分との間で反比例の関係を示したことを示すグラフおよび写真の組み合わせである。（ａ）８週間対照の食餌を与えたマウス（ＣＴ）または水道水中に添加したプレバイオティクスで処置したＣＴ給餌マウス（ＣＴ‐Ｐｒｅ）およびＨＦ給餌マウス（ＨＦ）または水道水中に添加したプレバイオティクスで処置したＨＦ給餌マウス（ＨＴ‐Ｐｒｅ）の盲腸の内容物で測定した、脂肪組織のＣＤ１１ｃのｍＲＮＡレベルとアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量（ｌｏｇ１０（細菌／盲腸の内容物（ｇ））との間のピアソン相関。挿入図はピアソン相関係数（ｒ）および対応するＰ値を示す。（ｂ）皮下、腸間膜および精巣上体の貯蔵脂肪の重量（ｇ／１００ｇの体重）（ｎ＝１０）。（ｃ）脂肪組織の質量増加分と盲腸の内容物のアッカーマンシア・ムシニフィラの存在量（ｌｏｇ１０（細菌／盲腸の内容物（ｇ））との間のピアソン相関。挿入図はピアソン相関係数（ｒ）および対応するＰ値を示す。ａ〜ｃのデータは、同一のグループのマウスで取得し、平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を備えるデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なっている（Ｐ＜０．０５）。
【図４】アッカーマンシア・ムシニフィラの毎日の強制経口投与により、盲腸でのこれら細菌の存在量が増加することを示すグラフの組み合わせである。アッカーマンシア・ムシニフィラの存在量は（ａ）では１６ＳのＲＮＡ総量の％で、（ｂ）ではＬｏｇ１０ＤＮＡコピーで表し、これらはマウスを４週間、毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置しかつ対照食を与え（ＣＴ−Ａｋｋ）または高脂肪食を与え（ＨＦ−Ａｋｋ）、等量の無菌嫌気性ＰＢＳで毎日の強制経口投与により処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ）または高脂肪食を与えたマウス（ＨＦ）と比較することで測定した（ｎ＝１０）。
【図５】アッカーマンシア・ムシニフィラ処置が、食物摂取量に影響を与えることなく体脂肪を低減することを示すグラフおよび写真の組み合わせである。（ａ）４週間、毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ−Ａｋｋ）もしくはＨＦ食を与えたマウス（ＨＦ−Ａｋｋ）、または毎日の強制経口投与により等量の無菌嫌気性ＰＢＳで処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ）もしくは高脂肪食を与えたマウス（ＨＦ）の皮下、腸間膜、および精巣上体の貯蔵脂肪の重量（ｇ／体重１００ｇ）（ｎ＝１０）。（ｂ）４週間の処置にわたる累積食物摂取量（ｇ）。（ｃ）最終体重（ｎ＝１０）。（ｆ）最終的な体重のパーセンテージで表しかつ７．５ＭＨｚの時間領域ＮＭＲ（ＬＦ５０  ｍｉｎｉｓｐｅｃ；Ｂｒｕｋｅｒ，ｎ＝１０）を使用して測定した、最終的な体脂肪量および除脂肪量。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図６】アッカーマンシア・ムシニフィラ処置が絶食時の糖血症を正常化し、かつ絶食時の肝臓のＧ６ｐｃのｍＲＮＡ発現を低減することを示すグラフの組み合わせである。（ａ）４週間、毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ−Ａｋｋ）もしくはＨＦ食を与えたマウス（ＨＦ−Ａｋｋ）、または毎日の強制経口投与により等量の無菌嫌気性ＰＢＳで処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ）または高脂肪食を与えたマウス（ＨＦ）で測定した絶食時の糖血症（ｎ＝１０）。（ｂ）４週間の期間の最後に肝臓で測定したグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ｐｃによりコードされる）のｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝１０）。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図７】アッカーマンシア・ムシニフィラ処置が、回腸における抗菌ペプチド含量および糞便でのＩｇＡレベルに関して軽微な影響を有することを示すグラフの組み合わせである。（ａ）再生小島由来３−γ（ＲｅｇＩＩＩγ、Ｒｅｇ３ｇによりコードされる）、（ｂ）ホスホリパーゼＡ２グループＩＩＡ（Ｐｌａ２ｇ２ａによりコードされる）、（ｃ）αデフェンシン（Ｄｅｆａによりコードされる）および（ｄ）リゾチームＣ（Ｌｙｚｌによりコードされる）の抗菌ペプチドｍＲＮＡ発現であり、これらは４週間、毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ−Ａｋｋ）もしくはＨＦ食を与えたマウス（ＨＦ−Ａｋｋ）の回腸、または毎日の強制経口投与により等量の無菌嫌気性ＰＢＳで処置しかつ対照食を与えたマウス（ＣＴ）もしくは高脂肪食を与えたマウス（ＨＦ）の回腸で測定した（ｎ＝１０）。（ｅ）糞便のＩｇＡレベル（μｇ／ｇ糞便）。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図８】熱失活させたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが食事誘導型肥満マウスにおいて、代謝性内毒血症、食事誘導型肥満、経口耐糖機能障害を相殺せず、脂肪組織の代謝および腸のバリア機能を改善しないことを示すヒストグラム、グラフおよび画像の組み合わせである。対照のマウスに、４週間毎日、対照食（ＣＴ）またＨＦ食（ＨＦ）を与え、かつ、無菌の嫌気性ＰＢＳおよびグリセロールを含む毎日の強制経口投与で処置した。処置したマウスにＨＦ食を与え生存Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＨＦ−Ａｋｋ）または代謝的に不活性化されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＨＦ−Ｋ−Ａｋｋ）（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）を強制経口投与した（ｎ＝８）。（Ａ）門脈の血清ＬＰＳレベル（ｎ＝６〜７）。（Ｂ）時間領域核磁気共鳴により測定した体脂肪量増加分の合計（ｎ＝７〜８）。（Ｃ）自由に移動するマウスにおける２ｇ／ｋｇグルコースの経口投与後の血漿グルコースプロファイル。（Ｄ）グルコース負荷後０〜１２０分に測定した平均曲線下面積（ＡＵＣ）のヒストグラム。（Ｅ）脂肪細胞の分化（Ｃｅｂｐａ）、脂質生合成（Ａｃｃ１；Ｆａｓｎ）および脂質酸化（Ｃｐｔ１；Ａｃｏｘ１；Ｐｇｃ１ａ；およびＰｐａｒａ）のマーカーのｍＲＮＡ発現を、内臓の貯蔵脂肪（腸間膜の脂肪）で測定した（ｎ＝８）。（Ｆ）アルシアンブルー染色後の組織学的解析により測定した粘液層の厚さ（ＣＴ  ｎ＝４、ＨＦ  ｎ＝６、ＨＦ−ＡｋｋおよびＨＦ−Ｋ−Ａｋｋ  ｎ＝５）。（Ｇ）粘液層の厚さの測定に使用した代表的なアルシアンブルーの画像（バー＝４０μｍ、Ｍ＝粘液、ＩＭ＝内側の粘液層）。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図９】熱により不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａは、ＨＦ食のマウスにおける皮下、腸間膜、および精巣上体の体脂肪量を低減せず、かつ結腸の抗菌ペプチドを増大させなかったことを示すヒストグラムの組み合わせである。（Ａ）４週間毎日、対照食（ＣＴ）またはＨＦ食（ＨＦ）を与えかつ無菌嫌気性ＰＢＳおよびグリセロールを含む毎日の強制経口投与で処置した対照マウスで測定した皮下、腸間膜、および精巣上体の貯蔵脂肪の重量（ｇ／１００ｇの体重）。処置したマウスに、生存Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＨＦ−Ａｋｋ）または死滅したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＨＦ−Ｋ−Ａｋｋ）（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）の強制経口投与を行いＨＦ食を与えた（ｎ＝８）。（Ｂ）結腸の再生小島由来３−γ（ＲｅｇＩＩＩγ、Ｒｅｇ３ｇによりコードされる）のｍＲＮＡ発現（ｎ＝８〜１８）。データは２回のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ試験からの結果を表す。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図１０】８週間の間、１週間に３回のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａによる処置の効果を示すヒストグラムの組み合わせである。（Ａ）８週間、対照食（ＣＴ）（ｎ＝８）、またはＨＦ食（ｎ＝１０）を与え、かつ無菌のグリセロール含有嫌気性ＰＢＳまたはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）（ＨＦ−Ａｋｋ）（ｎ＝１０）の強制経口投与により１週間あたり３回処置した対照マウスで測定した体重（ｇ）。（Ｂ）皮下体脂肪量。（Ｃ）内臓の脂肪組織（腸間膜および精巣上体（ｅｐｉｄｙｄｉｍａｌ））。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【図１１】Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが高脂肪の食事を与えたマウスで血漿コレステロールを低減することを示すヒストグラムである。（ＣＴ）対照食を与えたマウス。（Ａｋｋ）毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）で処置し、対照食を与えたマウス。（ＨＦ）高脂肪食を与えたマウス。（ＨＦ−Ａｋｋ）毎日の強制経口投与によりアッカーマンシア・ムシニフィラ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した１０９の細菌細胞）で処置し、ＨＦ食を与えたマウス。
【図１２】は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１が、食事誘導型肥満マウスにおいて体脂肪量を低減せず、かつ脂肪組織の代謝および腸のバリア機能を改善しなかったことを示すヒストグラムの組み合わせである。対照のマウスに、４週間、対照食（ＣＴ）またはＨＦ食（ＨＦ）を与え、かつ無菌の嫌気性ＰＢＳおよびグリセロールを含む毎日の強制経口投与により処置した。処置したマウスにＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１（ＨＦ−ＬＰ）（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）の強制経口投与を行い、ＨＦ食を与えた（ｎ＝７〜８）。（Ａ）時間領域ＮＭＲにより測定した最終的な体脂肪量。皮下、腸間膜、および精巣上体の貯蔵細胞の重量（ｇ／１００ｇ体重）。（Ｂ）脂肪細胞の分化（Ｃｅｂｐａ）、脂質生合成（Ａｃｃ１；Ｆａｓｎ）および脂質酸化（Ｃｐｔ１；Ａｃｏｘ１；Ｐｇｃ１ａ；およびＰｐａｒａ）のマーカーのｍＲＮＡ発現を、内臓の貯蔵脂肪（腸間膜の脂肪）で測定した（ｎ＝７〜８）。（Ｃ）アルシアンブルー染色後の組織学的解析により測定した粘液層の厚さ（ｎ＝４〜６）。（Ｄ）門脈の血清のＬＰＳレベル（ｎ＝６〜７）。（Ｅ）結腸のＲｅｇＩＩＩγ（Ｒｅｇ３ｇによりコードされる）のｍＲＮＡ発現（ｎ＝８〜１８）。データを平均値±標準誤差として示す。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ一元統計解析により有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
【０１２１】
実施例
本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。
材料および方法
マウス
ｏｂ／ｏｂ実験：ｏｂ／ｏｂ対除脂肪の試験：６週齢のｏｂ／ｏｂ（ｎ＝５／グループ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、ジャクソン研究所、アメリカ合衆国メイン州バー・ハーバー）を、２または３匹のマウス／ケージで、食物および水に自由にアクセスできる状況の中、管理環境下（１２時間の明暗周期、午後６時に明かりを消す）で収容した。マウスに対照の食事（Ａ０４、Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ−ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、フランス）を１６週間与えた。盲腸の内容物を収集し、液体窒素に浸し、さらなるアッカーマンシア・ムシニフィラ解析のため−８０℃で保存した。
【０１２２】
ｏｂ／ｏｂ  プレバイオティクス試験：６週齢のｏｂ／ｏｂ（ｎ＝１０／グループ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、ジャクソン研究所、アメリカ合衆国メイン州バー・ハーバー）を、２匹のマウス／ケージで、食物および水に自由にアクセスできる状況の中、管理環境下（１２時間の明暗周期、午後６時に明かりを消す）で収容した。以前に報告されたように、マウスに対照食（Ｏｂ−ＣＴ）（Ａ０４、Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ−ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、フランス）またはフラクトオリゴ糖（Ｏｒａｆｔｉ、ベルギーティーネン）などのプレバイオティクスを補充した対照食（Ｏｂ−Ｐｒｅ）を５週間与えた（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２７７５−２７８６  （２０１１））。この一連のマウスは、Ｅｖｅｒａｒｄらにより以前に特徴付けられている（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２７７５−２７８６  （２０１１））。
【０１２３】
高脂肪プレバイオティクス実験：１組の１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４０匹のマウス、ｎ＝１０／グループ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ベルギーブリュッセル）を、食物および水に自由にアクセスできる状況の中、５匹のマウス／ケージのグループで収容した。マウスに対照の食事（Ａ０４、Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ−ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、フランス）を与え（ＣＴ）、または対象食を与えかつ水道水中に添加したフラクトオリゴ糖（Ｏｒａｆｔｉ、ベルギーティーネン）（０．３ｇ／マウス／日）などのプレバイオティクスで処置し（ＣＴ−Ｐｒｅ）、または高脂肪の食事（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ニューブランズウィック）を与え（ＨＦ）、またはＨＦ食を与えかつ水道水中に添加したフラクトオリゴ糖（０．３ｇ／マウス／日）で処置した（ＨＦ−Ｐｒｅ）。この処置を８週間続行した。
【０１２４】
ＨＦＤアッカーマンシア・ムシニフィラ処置：１組の１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４０匹のマウス、ｎ＝１０／グループ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ベルギーブリュッセル）を、食物および水に自由にアクセスできる状況の中、２匹のマウス／ケージで収容した。マウスに、対照の食事（ＣＴ）（ＡＩＮ９３Ｍｉ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ニューブランズウィック）または高脂肪の食事（ＨＦ）（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ニューブランズウィック）を与えた。無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した２×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌの用量での強制経口投与によるアッカーマンシア・ムシニフィラの経口投与でマウスを処置し（ＣＴ−ＡｋｋおよびＨＦ−Ａｋｋ）、対照のグループを、等量の無菌嫌気性リン酸緩衝生理食塩水の強制経口投与で処置した（ＣＴおよびＨＦ）。この処置を４週間続行した。
【０１２５】
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ＭｕｃＴ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５）を以前に報告されているようにムチンベースの基本培地で嫌気的に増殖し（Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４，  １４６９−１４７６  （２００４））、その後洗浄し、２５％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む嫌気性リン酸緩衝生理食塩水に、１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度となるよう懸濁した。
【０１２６】
ＨＦＤ  アッカーマンシア・ムシニフィラの生存処置対熱殺傷したアッカーマンシア・ムシニフィラおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１：１組の１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４０匹のマウス、ｎ＝８／グループ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ベルギーブリュッセル）を、食物および水に自由にアクセスできる状況の中、２匹のマウス／ケージのグループで収容した。このマウスに、対照の食事（ＣＴ）（ＡＩＮ９３Ｍｉ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ニューブランズウィック）または高脂肪の食事（ＨＦ）（６０％の脂肪および２０％の炭水化物（ｋｃａｌ／１００ｇ）、Ｄ１２４９２，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ニューブランズウィック）を与えた。マウスを強制経口投与により、無菌のリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した２×１０８ｃｆｕ／０．２ｍｌの用量でのアッカーマンシア・ムシニフィラの経口投与で毎日処置した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを、オートクレーブ処理（１５分、１２１℃、２２５ｋＰａ）により熱殺傷／不活性化した。ムチン含有培地での培養による生存率チェックにより、生細胞が全く存在しないことを確認した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１をＭＲＳ培地（ラクトバチリＭＲＳブロス；ＢＤ）中で嫌気的に増殖させ、洗浄し、濃縮してＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ調製物と同一の方法で処置した。２つの対照グループ（ＣＴおよびＨＦ）を、同様の最終濃度のグリセロール（２．５％）を含む等量の無菌嫌気性ＰＢＳの強制経口投与で４週間毎日処置した。
【０１２７】
食物および水の摂取を１週間に１度記録した。７．５ＭＨｚの時間領域核磁気共鳴（ＴＤ−ＮＭＲ）（ＬＦ５０  ｍｉｎｉｓｐｅｃ、Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツラインシュテッテン）を用いることにより体の組成を評価した。
【０１２８】
すべてのマウス実験は、特定地域の倫理委員会のガイドランにより承認されており、かつこのガイドラインにしたがって実施された。収容条件は、実験動物の保護に関する、２０１０年４月６日のベルギーの法律により特定されている（合意番号ＬＡ１２３０３１４）。
【０１２９】
組織のサンプリング
全採血および組織のサンプリングの前にイソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ、イギリスケント州クイーンズバラ）で動物に麻酔をかけ、次いで頚椎脱臼によりマウスを屠殺した。貯蔵脂肪（精巣上体、皮下および腸間膜）、肝臓を正確に解剖して重量を測定した。３つの脂肪組織の加算は、肥満指数に対応する。腸の部分（回腸、盲腸および結腸）、盲腸の内容物、ならびに脂肪組織を液体窒素に浸し、さらなる解析のため−８０℃で保存した。
【０１３０】
粘液層の厚さ
近位の結腸部分をすぐに除去し、カーノイズ溶液（エタノール−酢酸−クロロホルム、６／３／１  ｖ／ｖ／ｖ）中で、４℃で２時間固定した。次いで試料を、パラフィン包埋の処理の前に、１００％のエタノールに２４時間浸した。５μｍのパラフィン切片をアルシアンブルーで染色した。最低２０の異なる測定を、実験グループについて知らされていない調査者により、区画ごとに内部の粘液層と直交して行った。ランダムに選択した５〜１９の区画を、画像解析器（Ｍｏｔｉｃ−ｉｍａｇｅ  Ｐｌｕｓ  ２．０ＭＬ、Ｍｏｔｉｃ、中国）を使用することにより、合計２１４６の測定を各結腸について解析した。
【０１３１】
ＲＮＡ調製およびリアルタイムｑＰＣＲ解析
総ＲＮＡを、トリピュア試薬（ロシュ）を使用して組織から調製した。総ＲＮＡの定量および完全性の解析を、１μｌの各試料をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキット、アジレント社）にかけることにより実施した。
【０１３２】
ｃＤＮＡを、逆転写システムキット（プロメガ社、オランダライデン）を使用して、１μｇの総ＲＮＡの逆転写により調製した。リアルタイムｐＣＲを、製造者の説明書にしたがった検出のためのＭｅｓａ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ（商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー  セラン）を使用したＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムおよびソフトウェア（アプライドバイオシステムズ、オランダ  デン・エイセル）を用いて実施した。ＲＰＬ１９を、ハウスキーピング遺伝子として選択した。全ての試料は単一の９６ウェル反応プレート中で二重に実験を行い、データは２−ΔＣＴ法により解析した。増幅した産物の同一性および純度を、増幅の最後に実行した融解曲線の解析を介して検証した。標的とされるマウスの遺伝子のプライマー配列を以下の表１に提示する。
【表１】
2019048825.tif 000002
【０１３３】
インスリン抵抗指数
インスリン抵抗指数を、４週間の処置（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの試験）の後に実施した経口グルコース負荷（ｋｇ体重あたり２ｇのグルコース）に続いて取得した血中グルコースおよび血漿インシュリンの両方の曲線下面積（０分および１５分）を乗じることにより決定した。明暗周期の開始後から２時間後に食物を除去し、以前に報告されているようにマウスを６時間の飢餓期間の後に処置した（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２７７５−２７８６  （２０１１））。
【０１３４】
生化学的解析
門脈の血液のＬＰＳの濃度を、試料中のエンドトキシン濃度に直接関連する色強度を測定するリムルス血球抽出液（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍａｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ、ＬＡＬ）速度論的発色法（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）に基づくＥｎｄｏｓａｆｅ−ＭＣＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フランス  リヨン）を使用することにより決定した。反応中の干渉（阻害および亢進）を最小限にするためにエンドトキシンフリーバッファーで１／１０に血清を希釈し、７０℃で１５分加熱した。各試料を、エンドトキシンフリーＬＡＬ試薬水（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１／７０または１／１００に希釈し、二重で処置し、各試料につき２つのスパイクを決定に含めた。全ての試料を、回収および変動係数について確認した。検出の下限は０．００５ＥＵ／ｍｌであった。血漿インシュリンの濃度を、製造者の説明にしたがってＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、スウェーデン  ウプサラ）を使用して２５μｌの血漿において決定した。
【０１３５】
糞便のＩｇＡのレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｅ９９−１０３、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、テキサス州モンゴメリ）を使用して決定した。新鮮な状態で回収した糞便を−８０℃に凍結し、次いで、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％のウシ血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２で希釈した。１／２５０の希釈を使用して製造者の指示に従ったＥＬＩＳＡによりＩｇＡを測定した。
【０１３６】
マウスの盲腸の試料からのＤＮＡ単離
死後に回収したマウスの盲腸の内容物を−８０℃で保存した。メタゲノムＤＮＡを、製造者の指示にしたがってＱＩＡａｍｐ−ＤＮＡツールミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ  ヒルデン）を使用して、盲腸の内容物から抽出した。
【０１３７】
エンドカンナビノイドの腸中レベルの測定
回腸の組織をＣＨＣｌ３（１０ｍｌ）中でホモジナイズし、重水素化標準物質を添加した。以前に報告されたように抽出曲線および較正曲線を作成し（Ｍｕｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ，２０１０，６，３９２）、データを組織試料の重量により正規化した。
【０１３８】
ｑＰＣＲ：プライマーおよび条件
アッカーマンシア・ムシニフィラを検出するために使用したプライマーおよびプローブは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列であるＦ−アッカーマンシア・ムシニフィラ  ＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＴ（配列番号：２９）、Ｒ−アッカーマンシア・ムシニフィラ  ＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣ（配列番号：３０）に基づくものであった。検出は、製造者の指示に従ったＭｅｓａ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ（商標）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー  セラン）を使用したＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムおよびソフトウェア（アプライドバイオシステムズ、オランダ  デン・エイセル）を用いて行った。各アッセイは、同じ実験を２連で行った。次いで、各試料の周期の閾値を、ゲノムＤＮＡを希釈すること（５倍の連続希釈）により作成した標準曲線（３連で実施）と比較した（ＤＳＭＺ、ドイツ  ブラウンシュヴァイク）。このデータを、ｌｏｇ（細菌／盲腸の内容物（ｇ））として表した。
【０１３９】
ＭＩＴチップ：ＰＣＲプライマーおよび条件
マウス腸管チップ（ＭＩＴチップ）、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２つの超可変領域（Ｖ１領域およびＶ６領域）を標的とする３５８０の異なるオリゴヌクレオチドプローブからなる系統学的マイクロアレイを使用して、盲腸の内容物から抽出したＤＮＡを解析した。以前に報告されたようにＭＩＴチップの解析を実施した（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２７７５−２７８６  （２０１１）；Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２，  １４９  （２０１１））。簡単に述べると、微生物叢の解析を、遺伝子様レベルに対応するレベル２で実施した。多変量解析を、９９の細菌のグループ（レベル２）の平均シグナル強度に関して、ＣＡＮＯＣＯ  ４．５シグナルソフトウェアパッケージ（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｓ、オランダ  ヴァーヘニンゲン）で実施されるように、ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  解析（ＲＤＡ）により実施した。すべての環境変数を、ｌｏｇ（１＋Ｘ）として変形した。９９９ランダム置換に基づくモンテカルロ法の並べ替え検定を使用して有意性を試験した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０１４０】
血漿コレステロールの測定
商業的なキット（ＤｉａＳｙｓ、フランス  コンドン）を使用して、エステルコレステロールの酵素的加水分解の後に存在するコレステロールを測定することにより、血漿試料をコレステロールについて解析した。
【０１４１】
統計解析
データを平均値±標準誤差（ｓｅｍ）として示す。２つのグループ間の差異を、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して評価した。２超のグループを含むデータセットをＡＮＯＶＡにより評価し、その後ニューマン・コイル  ポストホック検定により評価した。ピアソン相関を使用して相関を解析した。異なる上付き文字を有するデータは、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ統計解析により有意に異なっている（ｐ＜０．０５）。データはウィンドウズ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、アメリカカリフォルニア州サンディエゴ）を使用して解析した。結果は、ｐ＜０．０５の場合に統計的有意であるとみなした。
【０１４２】
結果
本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの存在量がレプチン欠損肥満マウスにおいて除脂肪の同腹のマウスに対し３３００倍少なかったことを見出した（図１ａ）。一致して、本出願人は、高脂肪（ＨＦ）摂食マウスにおいてＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの存在量が１００倍低下したことを見出した（図１ｃ）。両方のモデルで、プレバイオティクスは完全にＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ数を回復させた（図１ｂ、ｃ）。ＨＦ摂食マウスでは、プレバイオティクスは代謝性内毒血症を無効にし（図１ｄ）、脂肪組織におけるマクロファージの亜集合ＣＤ１１ｃを正常化し（図１ｅ）かつ体脂肪量を低下させた（図１ｇおよび図３ｂ）。これらの結果は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａと有意にかつ逆比例して相関した（図１ｆおよび図３ａ、ｃ）。しかしながら、これらの障害の発症の根底にある分子機構がＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの欠損に依存するかどうか、および対照的に、プレバイオティクス処置後の改善がより高い濃度のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａからもたらされるものかどうかは、まだ示されなかった。
【０１４３】
この疑問にこたえるため、４週間の間、対照またはＨＦ摂食マウスにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを経口投与し、それによりＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを増大させた（図４ａ、ｂ）。系統学的マイクロアレイ（ＭＩＴチップ）（Ｅｖｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０，  ２７７５−２７８６  （２０１１）；Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２，  １４９  （２０１１））を使用することにより、本出願人は、ＨＦ食およびＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成の両方が、主成分分析（ＰＣＡ）により示され（図２ａ）、異なる分類群の相対変化により支持されるように、腸微生物叢の組成の中の細菌の間の複合的な関係に有意に影響を与えることを見出した。
【０１４４】
本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ処置が、食物摂取量に全く影響を与えることなく（図５ｂ）、食事誘導型の代謝性内毒血症、脂肪症および脂肪組織のＣＤ１１ｃマーカーを正常化することを見出した（図２ｂ、ｃ、ｅおよび図５ａ）。さらに、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ処置が体重を減少させ、かつ体の組成（すなわち、体脂肪量／除脂肪量の比率）を改善した（図５ｃおよび５ｄ）。したがって、本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが脂肪組織の代謝に影響を与えると仮定し、かつＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａがＨＦ食の条件下で、脂質生合成に影響を与えることなく脂肪細胞分化および脂質酸化のマーカーのｍＲＮＡ発現を増大させることを見出した（図２ｆ）。合わせて、これらのデータはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが脂肪貯蔵および脂肪組織の代謝を制御することをさらに示唆する。
【０１４５】
次に、本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成が、肝臓グルコース−６−ホスファターゼ発現の４０％の低減に関連する機構により、食事誘導型空腹時高血糖症を完全に元に戻すことを発見し（図６ａ、ｂ）、これにより糖新生の低減が示唆された。特に、インスリン抵抗指数は、処置後同様に低減した（図２ｄ）。合わせて、これらの結果はＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが脂肪組織の代謝およびグルコースホメオスタシスの調節に寄与することを示唆する。１つの説明として、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが腸のバリア機能の調節の異なるレベルで鍵となる役割を果たしていることが考えられる。最近のデータは、腸の細胞もまた、抗菌ペプチドを分泌することにより腸のバリアの維持に寄与しており、これにより細菌の共同体を決定していることを示唆する（Ｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  （２０１２））。
【０１４６】
どのようにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成が腸のバリア機能に影響するかをさらに解明するため、本出願人は、回腸におけるパネート細胞および上皮細胞の抗菌マーカーの発現を測定した。本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが対照食下でＲｅｇ３ｇ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ３−γ，  ＲｅｇＩＩＩγ）発現を増大したが、一方この効果はＨＦ摂食マウスでは観察されなかったことを見出した（図７ａ）。Ｐｌａ２ｇ２ａ，  Ｄｅｆａ発現は、グループ間で類似しており、その一方Ｌｙｚｌ発現は細菌投与後に低くなる傾向がある（図７ｂ、ｃ、ｄ）。ＩｇＡは、腸の管腔で分泌され、かつ粘膜での細菌の浸透を制限することが知られているが（Ｖａｉｓｈｎａｖａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４，  ２５５−２５８  （２０１１））、ここで本出願人は、糞便のＩｇＡレベルが処置により影響されないことを見出した（図７ｅ）。これにより、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａは、その上皮のシグナリングを含む他の機構により腸のバリア機能を制御することが示唆される（Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，  １６６  （２０１１））。本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの処置が２−オレオイルグリセロール、２−パルミトイルグリセロール、および２−アラキドノイルグリセロールの腸でのレベルを増大させること見出したため、エンドカンナビノイドシステムがこの状況で重要な役割を果たすことを除外するものではない（図２ｇ）。重要なことに、２−オレオイルグリセロールは腸のＬ細胞からのグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）の放出を刺激することが示されており、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２の両方が、この状況で腸のバリアおよびグルコースホメオスタシスを改善し得ることを示唆している（Ｈａｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ９６，  Ｅ１４０９−１４１７  （２０１１））。さらに、２−アラキドノイルグリセロールは腸の透過率を低下させ、２−パルミトイルグリセロール（Ａｌｈｏｕａｙｅｋ  ｅｔ  ａｌ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２５，  ２７１１−２７２１  （２０１１）；  Ｂｅｎ−Ｓｈａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３５３，  ２３−３１  （１９９８））は２−アラキドノイルグリセロールの抗炎症作用を増強する。したがって、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成後に観察されたこれらの３つのエンドカンナビノイドのレベルの増大が、これらの代謝的特徴をつなぐ分子事象を構成しているのであろう。
【０１４７】
最近の物証により、腸の微生物叢および粘液層の間の相互作用は、粘液のバリアに生物学的に影響を与える動的システムであることが支持されている（Ｂｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＩＳＭＥ  Ｊ  ６，  １４４９−１４５８  （２０１２）；  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８  Ｓｕｐｐｌ  １，  ４６５９−４６６５  （２０１１））。したがって、本出願人は、内部粘液層の厚さに対するＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａコロニー形成の影響を調査した。注目すべきことに、本出願人は、ＨＦ摂食マウスでの粘液層が４６％薄くなり（図２ｈ）、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのコロニー形成がこの減少を相殺する（図２ｈ）ことを見出した。これらの新規発見はともに、粘液層内でのＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの存在が、粘液の代謝回転を制御するための重要な機構であることを支持する（Ｂｅｌｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ＩＳＭＥ  Ｊ  ６，  １４４９−１４５８（２０１２））。次に、本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが、結腸上皮細胞のＲｅｇ３ｇの発現にも影響を与えるかどうかを試験した。厳密に、Ｒｅｇ３ｇ発現は、ＨＦ食の下で約５０％低減した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａはこの影響を完全に鈍化させ、さらにはＨＦ摂食マウスと比較して４００％Ｒｅｇ３ｇの発現を増大させた（図２ｉ）。したがって、このことは、ＲｅｇＩＩＩγが宿主の細菌の相利共生を促進し、微生物叢と宿主との間の空間的な関係を調節する基本的な免疫機構を備える、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａにより、結腸のコロニー形成に関連するが、回腸のコロニー形成には関連しなかった（Ｖａｉｓｈｎａｖａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４，  ２５５−２５８  （２０１１））。無菌マウスにおいて、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａは回腸よりも結腸で遺伝子発現を誘導することに留意することが重要である（Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２，  １６６  （２０１１））。
【０１４８】
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが代謝性の効果を発揮するために生存している必要があるかどうかをさらに例証するために、本出願人は、熱で殺傷した／不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（オートクレーブ処理、１５分、１２１℃、２２５ｋＰａ）に対し生存可能なＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（２００μｌの無菌の嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した２×１０８の細菌細胞）投与の影響を比較した。本出願人は、生存可能かつ代謝的に活性であるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが、第１の組の実験で観察したものと同様の程度で食事誘導型代謝性内毒血症、体脂肪量の発達および変化した脂肪組織の代謝を相殺したことを見出した（図８Ａ、Ｂ、Ｄおよび図９Ａ）。重要なことに、これらの効果は、熱で不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの投与後では観察されなかった（図８Ａ、Ｂ、Ｄおよび図９Ａ）。さらに、本出願人は、代謝的に活性であるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが経口グルコース負荷試験後の血漿グルコースレベルを顕著に低減し（図８Ｃ）、一方、熱で不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａはＨＦ摂食マウスと類似した耐糖能障害を示すことを見出した（図８Ｃ）。最後に、本出願人は、代謝的に活性であるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａがＨＦ食での粘液層の厚さを回復させ、対して熱で不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａはＨＦと比較して粘液層の厚さを改善しないことを確認した（図８ＥおよびＦ）。注目すべきことに、本出願人はＨＦおよび熱で不活性化した細菌グループと比較して、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａで処置したマウスの盲腸および結腸の含有物から１００倍超の代謝的に活性であるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを見出した（ＨＦ−Ａｋｋ：９．５＋／−１．０２Ｌｏｇ１０細胞／ｍｇ含有物、ＨＦおよびＨＦ−Ｋ−Ａｋｋ：６．８＋／−０．５１Ｌｏｇ１０細胞／ｍｇ含有物、Ｐ＝０．００５９）。これにより、経口投与後のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの生存能力が証明された。
【０１４９】
したがってこれらの結果から、ＨＦ食事誘導型の肥満は腸微生物叢の組成の変化に関連するが、回腸の抗菌ペプチドはこの処置に影響されないことが確認された。対照的に、結腸の上皮細胞のＲｅｇ３ｇ発現は、ＨＦおよび熱不活性化Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａで処置したマウスで約５０％低減し、一方で代謝的に活性であるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの処置はこの作用を完全に鈍化させ、かつＨＦ食におけるＲｅｇ３ｇ発現を増大させた（図９Ｂ）。
【０１５０】
ついで、本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ投与が長期間の高脂肪の食事の処置（８週間）の間でも有効であるか、および（毎日ではなく）１週間に３回のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの投与が食事誘導型の肥満を防ぐのに十分であるどうかを試験することを希望した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの調製および容量は、毎日の強制経口投与または代謝的に不活性化したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを使用したプロトコルにおいて提示したものと同様であった。
【０１５１】
本出願人は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ処置が、糞便中での脂肪の喪失および食物摂取行動を変化させることなくマウスが高脂肪の食事を消化していたにもかかわらず、体重増加を約３０％減少させたことを見出した（図１０Ａ）。このことはまた、脂肪組織（皮下、脂肪組織）重量の約４５％の減少（図１０Ｂ）ならびに内臓の貯蔵脂肪（腸間膜および精巣上体）の３５％の減少（図１０Ｃ）に関連した。したがって、このデータセットは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ投与は長期間の処置の間でも有効性を維持し、処置は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが毎日ではなく１週間に３回投与される場合にも有効であることを支持する。
【０１５２】
これらの結果がＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的であることを確認するために、本出願人は、プロバイオティクス（すなわちＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１）でＨＦ摂食マウスを処置した。本出願人は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ投与は、体脂肪量の発達、脂肪組織の代謝、粘液層の厚さ、結腸のＲｅｇ３ｇのｍＲＮＡ、および代謝性内毒血症が変化させないことを見出した（図１２Ａ〜Ｅ）。
【０１５３】
高コレステロール値症は、循環器疾患に関与する鍵となる因子として知られている。それゆえ、本出願人は、高脂肪食を与えたマウスの血漿コレステロールに対するＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの効果を試験した。図１１に示すように、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ処置は血漿コレステロールを顕著に減少させ（約１５％）、これにより、ＬＰＳおよび他の代謝パラメータとともに心臓−代謝リスクプロファイルの改善に貢献する。
【０１５４】
まとめると、本出願人の発見は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが宿主と腸微生物叢との間のクロストークを調節する複雑な機構についての実質的な知見を提供するだけでなく、肥満および高コレステロール血漿などの関連する代謝性障害の予防または処置のための、このヒトの粘液−生着菌を使用した処置の開発を検討するための理論的根拠を提供する。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図１Ｅ−Ｇ】
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【図２Ａ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｉ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図８Ｅ−Ｇ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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