(57)【要約】【課題】本発明は筋組織の交感神経を活性化させるために用いられる組成物、及び筋組織内の血流を増加させるために用いられる組成物を提供することを課題とする。また、本発明は筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長を促進するために用いられる組成物を提供することも課題とする。【解決手段】イミダゾールジペプチドを有効成分とする外用組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミダゾールジペプチドを有効成分とする外用組成物。
【請求項２】
前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン、及びバレニンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載する外用組成物。
【請求項３】
更に、経皮吸収促進剤を含有する請求項１又は２に記載する外用組成物。
【請求項４】
筋組織の交感神経活性化のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載する外用組成物。
【請求項５】
筋組織内の血流増加のために用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載する外用組成物。
【請求項６】
筋肉の疲労回復の促進及び筋肉の成長の促進のどちらか一方又はそれらの両方のために用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載する外用組成物。
【請求項７】
イミダゾールジペプチドと、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む、請求項1〜６に記載する外用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長の促進に有用な外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを初めとする脊椎動物では、その運動器の筋組織を作動させることによって、カルシノンに代表されるイミダゾールジペプチドを産生することが知られている（非特許文献１）。そして、骨格筋の交感神経を活性化することによって、β２アドレナリン受容体を介して筋組織に流入する血流を増加させることが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
上記する作用によって筋組織内に十分量の酸素や栄養素を供給し、筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長を促進することで、結果的に筋肉のパフォーマンスを上昇させることが知られる。例えば、ある量のカルノシンをラットの十二指腸に直接投与することによって、筋組織を支配する交感神経を活性化させて、筋組織の血流を増加させることが確認されている（非特許文献３）。
【０００４】
一方で、ヒトはラットとは異なり、血液中にイミダゾールジペプチドを分解する酵素が多量に含まれている事も知られている（非特許文献４）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K. Nagai et al. Exp. Biol. Med. (Maywood) 228 (2003)1138-1145.
【非特許文献２】W.F. Ganong, Review of medical physiology, in: Lange Medical Book, 22 ed,McGraw-Hill, New York, 2003, pp. 912.
【非特許文献３】Yuko Horii et.al. Neuroscience Letters 591 (2015) 144-148
【非特許文献４】A. Baguet et al. J. Appl. Physiol. 116 (2014): 553-559
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
運動機能が低下したヒトでは筋肉量も低下し、運動能力の低下のみならず、血圧や血糖に悪影響を与える。従って、運動機能の低下に伴って筋肉量が低下したヒトにとって、その筋肉のパフォーマンスを回復することは生活のみならず、QOLの向上にとって重要な問題である。
【０００７】
これを解決するために、非特許文献３に記載するようにカルノシンの腸管吸収によってヒト体内に取り込んだとしても、非特許文献４に記載されるように取り込んだカルノシンが体内で分解されてしまう可能性が高く、非特許文献３に記載する効果を発揮させるに十分な濃度に上昇する可能性は低いと考えられる。
【０００８】
本発明は筋組織の交感神経を活性化させるために用いられる組成物、及び筋組織内の血流を増加させるために用いられる組成物を提供することを課題とする。また、本発明は筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長を促進するために用いられる組成物を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記する課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、イミダゾールジペプチドの典型例であるカルシノンを筋膜下の筋肉に作用させることによって、筋組織の交感神経を上昇させ、筋組織内の血流を増大させることも見出した。本発明は斯かる知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。
【００１０】
項１  イミダゾールジペプチドを有効成分とする外用組成物。
【００１１】
項２  イミダゾールジペプチドが、L-ヒスチジン若しくはL-ヒスチジンが有するイミダゾール環の１位及び3位のどちらか一方又はそれらの両方の窒素原子がアルキル化されたアミノ酸と、もう１つのアミノ酸とがペプチド結合したものである、請求項１に記載する外用組成物。
【００１２】
項３  イミダゾールジペプチドが、L-ヒスチジン又はアルキル化されたL-ヒスチジンのN末端に、前記もう1つのアミノ酸C末端が結合したジペプチドである、上記項２に記載する外用組成物。
【００１３】
項４  前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン、及びバレニンからなる群より選択される少なくとも１つである、項１〜項３のいずれか１項に記載する外用組成物。
【００１４】
項５  更に、経皮吸収促進剤を含有する、項１〜項４のいずれか１項に記載する外用組成物。
【００１５】
項６  筋組織の交感神経活性化のために用いられる、項１〜項５のいずれか１項に記載する外用組成物。
【００１６】
項７  筋組織内の血流増加のために用いられる、項１〜項５のいずれか１項に記載する外用組成物。
【００１７】
項８  筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長を促進するために用いられる、項１〜項７のいずれか１項に記載する外用組成物。
【００１８】
項９  イミダゾールジペプチドと、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む、項1〜項８に記載する外用組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の外用組成物は、筋組織の交感神経を活性化する効果を発揮する。本発明の外用組成物は、筋組織内の血流を増加する効果を発揮する。また。本発明の外用組成物は、筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長を促進する効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実験例の結果を示す図であり、L-カルノシンをラットの右大腿部に作用（滴下）させた時の、同一個体における左大腿部を支配する交感神経の活性値を示す図である。図中の縦軸の値はL-カルノシンの作用前（滴下前）の交感神経の活動値を100%とする百分率（％）で示し、図中の横軸はL-カルノシンの作用後の時間（分）を示す。図中のＰ値は作用（滴下）開始5分から60分までの値を群として解析するanalysis of variance (ANOVA) with repeated measuresによる統計的有意差検定の結果を示す。
【図２】実験例の結果を示す図であり、L-カルノシンをラットの右大腿部に作用（滴下）させた時の、同一個体における左大腿部の血流を示す図である。図中の縦軸の値はL-カルノシンの作用前の血流を100%とする百分率（％）を示し、図中の横軸はL-カルノシンの作用後の時間（分）を示す。図中のＰ値は作用（滴下）開始5分から60分までの値を群として解析するanalysis of variance (ANOVA) with repeated measuresによる統計的有意差検定の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の外用組成物は、イミダゾールジペプチドを有効成分とする。有効成分とは、本発明の外用組成物が発揮する効果として後述する筋組織の交感神経活性化、筋組織内の血流増加、筋肉の疲労回復の促進及び筋肉の成長の促進からなる群より選択される少なくとも1つの効果を発揮する必須成分であることを意味する。
【００２２】
上記するイミダゾールジペプチドとは、イミダゾール環を有するアミノ酸と、その他のアミノ酸とがペプチド結合したジペプチドである。
【００２３】
このようなイミダゾールジペプチドは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。具体的には、L-ヒスチジン若しくはL-ヒスチジンが有するイミダゾール環の1位及び3位のどちらか一方又はそれらの両方の窒素原子がアルキル化されたアミノ酸と、もう一つのアミノ酸とがペプチド結合したジペプチドを挙げることができる。
【００２４】
上記するイミダゾールジペプチドにおけるL-ヒスチジン若しくはL-ヒスチジンが有するイミダゾール環の１位及び3位のどちらか一方又はそれらの両方の窒素原子がアルキル化されたアミノ酸（以後、これを「アルキル化されたL-ヒスチジン」と呼ぶことがある。）と、もう１つのアミノ酸とのペプチド結合の態様は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。
【００２５】
例えば、L-ヒスチジン又はアルキル化されたL-ヒスチジンのN末端と、もう１つのアミノ酸のC末端とがペプチド結合する態様とすることもできるし、その逆のL-ヒスチジン又はアルキル化されたL-ヒスチジンのC末端と、もう１つのアミノ酸のN末端とがペプチド結合する態様とすることもできる。好ましくは、L-ヒスチジン又はアルキル化されたL-ヒスチジンのN末端と他のアミノ酸のC末端とがペプチド結合する態様である。
【００２６】
上記するアルキル化されたL-ヒスチジンとは、L-ヒスチジンが有するイミダゾール環の１位及び3位のどちらか一方又はそれらの両方の窒素原子がアルキル化されたアミノ酸である。上記するアルキル化とは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、メチル化、エチル化、プロピル化及びブチル化等を挙げることができる。好ましくは、メチル化である。なお、アルキル化されたL-ヒスチジンにおいて、イミダゾール環の1位及び3位の両方の窒素原子がアルキル化される場合、両者のアルキル化は同一であっても異なっていても良い。
【００２７】
上記するもう１つのアミノ酸とは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。具体的には、コドンに対応する20種類のアミノ酸には限られず、カルボキシル基及びアミノ基を少なくとも1個ずつ含有する化合物を挙げることができる。
【００２８】
上記するもう１つのアミノ酸におけるアミノ基の位置は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、α-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸及びδ-アミノ酸等を挙げることができる。中でも、α-アミノ酸、β-アミノ酸及びγ-アミノ酸が好ましく、β-アミノ酸が好ましい。
【００２９】
また、上記するもう１つのアミノ酸がグリシン以外の場合の立体異性体は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、D体、L体又はラセミ体(DL体)とすることもできる。好ましくは、L体である。
【００３０】
上記するイミダゾールジペプチドの具体例として、例えば、カルノシン、アンセリン、又はバレニン等を挙げることができる。
【００３１】
上記する本発明の外用組成物に含有されるイミダゾールジペプチドは、単独で用いてもよいし、２種以上を組みわせて用いてもよい
本発明の外用組成物に含有されるイミダゾールジペプチドの量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、本発明の外用組成物100質量％当たり、通常は0.001〜99質量％程度の含有量とすることができる。
【００３２】
本発明の外用組成物の形態は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、液状（液剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤、エキス剤、チンキ剤、エアゾール剤、リポソーム剤等）、固形状（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等）、半固形状（軟膏、硬膏、クリーム等）等の形態を挙げることができる。
【００３３】
本発明の外用組成物には、上記する外用組成物の形態に応じて、外用組成物に添加することが許容される任意の成分（担体、基剤、添加剤等）を含有させることができる。具体的な任意の成分とは、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ホホバオイル、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール、糖、高分子化合物、界面活性剤、ｐＨ調整剤、粉末成分、キレート剤、着色剤（着色料）、水などが含まれる。
【００３４】
これらの任意の成分は、所望する外用組成物の形態に合わせて、適宜組み合わせて使用することができる。例えば、水性液状組成物を調製する場合、通常、基剤として水を用いることができ、また非水性液状組成物の調製には、種々の油性基剤、例えば、植物油（例えば、オリーブ油、大豆油、ゴマ油、綿実油等）、アルコール類（セチルアルコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、鉱物油（流動パラフィン等）等が使用できる。クリーム状又は乳液状組成物の調製には、水性基剤（水等）、油性基剤（流動パラフィン、スクワラン等の鉱物油；ラノリン等のロウ；セチルアルコール、プロピレングリコール等のアルコール類等）、界面活性剤等が使用できる。軟膏状組成物の調製には、油性基剤（炭化水素系基剤、例えば、ワセリン、流動パラフィン等の鉱物油；ロウ；セチルアルコール等のアルコール類；高級脂肪酸エステルなどの各種軟膏基剤等）などが用いられ、またゲル状組成物の調製には、ゲル基剤（例えば、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ガム質等）を用いられ、さらに散剤などの粉末状の組成物の調製には粉末成分を基剤として用いることができる。
【００３５】
本発明の外用組成物には、更に経皮吸収促進剤を含有することができる。
【００３６】
上記する経皮吸収促進剤とは皮膚透過性を向上させる化合物であり、本発明の有効成分であるイミダゾールジペプチドを経皮吸収を促進させる効果を発揮する成分で、且つ、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。具体的には、ジメチルポリシロキサン等のシリコーン類、オリーブ油などの動植物油、流動パラフィン、ワックス等の炭化水素類；ラウリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸；ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール、イソステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル等の一価アルコール脂肪酸エステル；2-ヘキシルデカノール、2-オクチルデカノール、グリセリン等のアルコール；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、脂肪酸グリセリンエステル、脂肪酸ポリエチレングリコール、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤、ポリブテン、ポリイソプレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等の液状樹脂；レチノール、パルミチン酸レチノール、トコフェノール、酢酸トコフェノール等の油性ビタミンが挙げられる。
【００３７】
本発明の外用組成物に含有される経皮吸収促進剤の量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、本発明の外用組成物100質量％当たり、通常は0.001〜99質量％程度の含有量とすることができる。
【００３８】
後記する実施例にて示すように、本発明の外用組成物に含有されるイミダゾールジペプチドの典型例であるカルノシンは、筋組織の交感神経を活性化させる効果を奏するので、本発明の外用組成物は筋組織の交感神経活性化のために用いることができる。
【００３９】
同様に、本発明の外用組成物に含まれるイミダゾールジペプチドの典型例であるカルノシンは筋組織内の血流を増加させる効果を奏するので、本発明の外用組成物は筋組織内の血流増加のために用いることができる。
【００４０】
これらの効果は、疲労した筋肉の回復及び/又は筋肉の成長を促進させるために重要な作用であることから、本発明の外用組成物は筋肉の疲労回復及び/又は筋肉の成長の促進のために用いることができると期待される。
【００４１】
本発明の外用組成物の適用対象としては、上記のような効果を必要とするヒトであれば特に限定されることはない。
【００４２】
本発明の外用組成物の使用量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、後述する本発明の外用組成物の1つの形態である化粧料組成物又は医薬組成物における使用量から、適宜決定することができる。例えば、外用組成物に含有されるイミダゾールジペプチドの量に換算して、肌または頭皮の1cm2当たり、通常は0.00001mg〜1000mg程度の量とすることができる。肌とは、ヒトにおいて頭皮以外の外部に露出した粘膜以外の領域である。
【００４３】
本発明の外用組成物の適用箇所は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、適用対象者の性別や年齢、当該化粧料組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。具体的には、前腕、上腕、大腿、下腿、肩、頸部、臀部などの皮下に筋肉が存在する部位を例示することができる。
【００４４】
本発明の外用組成物の適用回数及び頻度は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。適用対象者の性別や年齢、当該外用組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。大人に対する適用回数として、通常は1日１回〜３回の適用回数を例示することができる。また、大人に対する適用頻度として、通常は毎日、又は２日〜３日に一回の適用回数を例示することができる。
【００４５】
本発明の外用組成物の形態は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、化粧料組成物又は外用医薬組成物を挙げることができる。中でも、化粧料組成物が好ましい。
【００４６】
化粧料組成物
本発明の外用組成物は、化粧料組成物の形態とすることができる。本発明の化粧料組成物には、薬用化粧品などの医薬部外品も包含される。
【００４７】
化粧料組成物に含まれるイミダゾールジペプチドの配合量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、100質量％の化粧料組成物に対する有効成分の配合量として、通常は0.000001質量％〜100質量％程度を挙げることができる。
【００４８】
化粧料組成物の具体的な態様は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、ファンデーション、頬紅、白粉などのメイクアップ化粧料；化粧水、乳液、スキンクリーム、ローション、オイル、パックなどの基礎化粧料；洗顔料、クレンジング、ボディソープなどの皮膚洗浄料；シャンプー、リンス、コンディショナー、整髪剤、育毛剤などの毛髪化粧料；バスソルト、バスタブレット、バスリキッドなどの入浴剤、マッサージ剤、清拭剤などの態様を挙げることができる。
【００４９】
化粧料組成物の形状は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、ローション状（液状）、ムース状、ジェル状、ゼリー状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、シート状、エアゾール状、スプレー状などを挙げることができる。このような種類の形状とすることで、肌のみならず、頭皮にも適用することができる。
【００５０】
化粧料組成物の適用対象としては、上記する発明の外用組成物による効果を必要とするヒトであれば特に限定されることはない。
【００５１】
化粧料組成物の適用量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。具体的には、適用対象者の性別や年齢、当該化粧料組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。例えば、化粧料組成物に含有されるイミダゾールジペプチドの量に換算して、肌または頭皮の1cm2当たり、通常0.00001mg〜1000mg程度の量にて適用することができる。
【００５２】
本発明の化粧料組成物の適用箇所は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、適用対象者の性別や年齢、当該化粧料組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。具体的には前腕、上腕、大腿、下腿、肩、頸部、臀部などの皮下に筋肉が存在する部位を例示することができる。
【００５３】
本発明の化粧料組成物の適用回数及び頻度は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。適用対象者の性別や年齢、当該化粧料組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。大人に対する適用回数として、通常は1日1回〜3回の適用回数を例示することができる。また、大人に対する適用頻度として、通常は毎日または2日〜3日に一回の適用回数を例示することができる。
【００５４】
外用医薬組成物
本発明の外用組成物は、外用医薬組成物の形態とすることができる。
【００５５】
医薬組成物に含まれるイミダゾールジペプチドの配合量は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定されない。例えば、100質量％の医薬組成物に対するイミダゾールジペプチド成分の配合量として、通常は0.000001質量％〜100質量％程度を挙げることができる。
【００５６】
外用医薬組成物の剤形は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、エアゾール剤、液剤、エキス剤、（眼）軟膏剤、経皮吸収型製剤、懸濁剤、乳剤、酒精剤、貼付剤、チンキ剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤などの、主として外用される剤形を挙げることができる。
【００５７】
外用医薬組成物の適用対象としては、上記する発明の外用組成物による効果を必要とするヒトであれば特に限定されることはない。
【００５８】
外用医薬組成物の投与量は、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定はされない。具体的には、適用対象者の性別や年齢、当該外用医薬組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。例えば、外用医薬組成物に含有されるイミダゾールジペプチドの量に換算して、肌または頭皮の1cm2当たり通常0.00001mg〜1000mg程度の量にて適用することができる。
【００５９】
本発明の外用医薬組成物の適用箇所は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。例えば、適用対象者の性別や年齢、当該外用医薬組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。具体的には前腕、上腕、大腿、下腿、肩、頸部、臀部などの皮下に筋肉が存在する部位を例示することができる。
【００６０】
本発明の外用医薬組成物の適用回数及び頻度は、本発明の効果を発揮する範囲において、特に限定はされない。適用対象者の性別や年齢、当該外用医薬組成物の適用形態、所望する効果の程度などに基づいて適宜設定することができる。大人に対する適用回数として、通常は1日2回〜3回の適用回数を例示することができる。また、大人に対する適用頻度として、通常は毎日、又は2日〜3日に一回の適用回数を例示することができる。
【００６１】
外用組成物の製造方法
本発明の外用組成物の製造方法は、イミダゾールジペプチドと、外用組成物に添加することが許容される成分とを混合する工程を含む。
【００６２】
イミダゾールジペプチドとは、上記する本発明の外用剤にて説明したものと同様とすることができる。
【００６３】
外用組成物に添加することが許容される成分とは、本発明の課題を解決する範囲において、特に限定されない。例えば、上記する本発明の外用剤にて説明した外用組成物に添加することが許容される任意の成分又は上記する外用組成物の一つの形態として挙げた化粧料組成物若しくは外用医薬組成物に添加することが許容される成分とすることができる。
【実施例】
【００６４】
以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
【００６５】
実験例１
被験動物にカルノシンを投与し、骨格筋を支配する交感神経活動の変化の有無と血流の変化を評価した。
（１）被験動物
被験動物として、予め３〜４時間絶食させておいたラット（8週齢から9週齢のWistar系雄）を16匹、使用した。これを、カルノシン投与群（n=8；神経活動測定n=4、血流測定n=4）とカルノシン非投与群（n=8；神経活動測定n=4、血流測定n=4）の２群に分けた。
【００６６】
（２）カルノシン投与処置
体重約300gのラットにウレタン水溶液を腹腔内（IP）注射して麻酔した（1g/kg bw）。次いで、麻酔したラットの右大腿部の大腿四頭筋の内側広筋の筋膜を切開し、当該切開部に、カルノシン投与群にはカルノシン生理食塩水溶液をカルノシン投与量が10pgとなるように0.1mL滴下した湿潤綿花を留置し、カルノシン非投与群には0.1mLの生理食塩水を滴下した湿潤綿花を留置した。なお、カルノシンはL-カルノシン（浜理薬品工業株式会社、日本）を生理食塩水に10pg/0.1mlになるように溶解して調製したものを使用した。
【００６７】
（３）骨格筋交感神経活動の測定
骨格筋交感神経活動の変化の有無は、非特許文献２に記載する方法に準じて測定した。具体的には、まず前準備として、前記麻酔したラット（カルノシン投与群（n=3）とカルノシン非投与群（n=3）の左大腿部の中央を縦切開し、大腿四頭筋の内側広筋を支配する交感神経を顕微鏡下で取り出し露出した。露出させた交感神経の遠位端を結紮切断し、当該神経を一対の銀線電極（記録電極）に引っ掛けて、遠心性神経活動が記録できるようにした。なお、遠心性神経活動の記録に際して、交感神経を露出させた切開部に流動パラフィン油を注ぎ、銀線電極を完全に浸漬することで、脱水（乾燥）を防ぎ、電気的に絶縁できるようにした。交感神経を電極に吊り上げた後、30〜60分間程度、ラットを安静にして神経の電気活動を安定させた。
【００６８】
斯くして前準備した各ラットについて、前述するようにカルノシン投与群には右大腿部筋膜切開後に大腿四頭筋の内側広筋にカルノシンを滴下した綿花を、またカルノシン非投与群には生理食塩水を滴下した綿花を留置し、乾燥を防ぐため、当該部位をラップで覆った後、滴下から60分間、上記の記録電極にて交感神経の活動変化の有無を測定した。具体的には、カルノシン又は生理食塩水の滴下後の交感神経の電気的変化を、増幅後、オシロスコープでモニターすることによって測定した。測定データは、バックグラウンドとなる電気ノイズをwindow discriminatorで差し引き、標準パルスに変換したものを利用した。なお、滴下前の安静時（カルノシン等の滴下前５分間の平均値）の神経活動（spikes/5 s）を100 %とした百分率にてデータを計算した。その結果を図１に示す。
【００６９】
図１に示すように、カルノシン非投与群では反対側の大腿四頭筋の正中広筋を支配する交感神経の変化は殆ど認められなかったが、カルノシン滴下群では、カルノシン投与後、その交感神経活動が増加することが認められた。
【００７０】
なお、各物質の投与直前の血流値（絶対値；spikes/5s）は、カルノシン投与群で262±14であり、そしてカルシノン非投与群では268±10であった。両者の絶対値に有意差は見られなかった（Mann-Whitney U-test）。
【００７１】
（４）血流変化の測定
血流の変化は、非特許文献２に記載するレーザー血流計（ALF21、Advance Co.、日本）を用いて測定した。具体的には、まず前準備として、前記麻酔したラット［カルノシン投与群（n=4）とカルノシン非投与群（n=4）］の左大腿四頭筋の内側広筋の筋膜を切開し、その表面を露出させ、レーザ血流計のプローブ（先端径1cm）を、外科用テープを用いて筋表面に固定した。
【００７２】
斯くして前準備した各ラット（カルノシン投与群およびカルノシン非投与群）の各々に対して、前述するようにカルノシン投与群には右大腿部筋膜切開後に大腿四頭筋の内側広筋にカルノシンを滴下した綿花を、またカルノシン非投与群には生理食塩水を滴下した綿花を留置し、乾燥を防ぐため、当該部位をラップで覆った後、血流を60分間かけて測定した。具体的な血流データは、アナログからPower-Labアナログデジタル変換器でデジタルに変換して取得した。なお、滴下前の安静時血流量（カルノシン等の滴下前５分間の平均値）を100%とする百分率で結果を表した。結果を図２に示す。
【００７３】
図２に示すように、カルノシン非投与群（生理食塩水滴下群）では経時的に血流が低下するのに対して、カルノシン投与群では血流の低下は認められず、むしろ投与から２０分経過した以降は血流が増加する傾向が認められた。
【００７４】
なお、各物質の投与直前の血流値（絶対値；mL/min/100g of tissue）は、カルノシン投与群で87.4±8であり、そしてカルシノン非投与群では82.3±19であった。両者の絶対値に有意差は見られなかった（Mann-Whitney U-test）。
【００７５】
（５）考察
上記する実験結果から、右大腿部の筋膜を切開して筋肉表面にカルノシンを滴下することによって、左大腿部の筋肉を支配する交感神経が活性化されることが明らかとなった（図１）。このように、投与した脚とは反対側の脚の筋肉を支配する交感神経の活性化が認められたことから、運動時に骨格筋から放出されるカルノシンに感受性のあるシステムが骨格筋の近傍にあり、その信号が何らかのメカニズムで反対側の骨格筋を支配する交感神経の活動を高めて、その血流を促進して増加させることを示唆する結果が認められた（図２）。
【００７６】
なお、非特許文献３では、カルノシンを十二指腸内に投与すると共にβブロッカーであるプロプラノールを投与すると、カルノシンによる血流増加作用が認めらないことが示されている。一方、本発明では、カルノシンを筋組織に投与すると共にプロプラノロールを投与しても、カルノシンによる血流の増加作用は阻止されなかった（データ示さず）。このことから、カルノシンの十二指腸内投与（腸管吸収）と筋組織投与での骨格筋交感神経の遠心枝の活動促進作用とでは、作用メカニズム（伝達メカニズム）が異なることが示唆された。具体的には、筋組織にカルノシンを投与することで交感神経がアセチルコリンを放出するメカニズムで反対側の筋肉の血流が促進される可能性が考えられる。
【００７７】
ヒト血液中にはカルノシン分解酵素が著量存在することが知られている。一方、10pgと極めて少量のカルノシンを脚の筋肉に投与することで、反対側の脚の筋肉を支配する交感神経の活性化及び反対側の筋肉の血流の増加が認められた。
【００７８】
このことから、カルノシンを経皮吸収を介してカルノシン筋組織に作用させることで、上記効果（他の筋肉の血流促進の効果と、それによる筋肉の疲労回復及び/又は成長を促進する効果）が発揮できることが期待される。
【図１】
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【図２】
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