(57)【要約】【課題】アピコンプレックス門の寄生虫に対する免疫応答を強化し、さらにその後の感染に関連する罹病率又は死亡率を軽減するワクチンベクター及び前記ワクチンベクターを使用する方法を提供する。【解決手段】ワクチンベクターは、ロンボイドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、さらに場合によって免疫刺激性ポリペプチドを含み、前記はワクチンベクターの表面で適切に発現される。【選択図】図５
2019073554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンベクターであって、場合によって該ワクチンベクターの表面で発現される、アピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含み、該ロンボイドポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:1の免疫原性フラグメント、配列番号:2の免疫原性フラグメント、配列番号:3の免疫原性フラグメント、配列番号:4の免疫原性フラグメント、配列番号:37の免疫原性フラグメント、配列番号:38の免疫原性フラグメント若しくはその組合せの少なくとも１つである又は少なくとも１つと９０％超の配列同一性を有する、前記ワクチンベクター。
【請求項２】
免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を更に含み、該免疫刺激性ポリペプチドが該ワクチンベクターの表面で発現される、請求項1に記載のワクチンベクター。
【請求項３】
該免疫刺激性ポリペプチドがHMGB1ポリペプチドである、請求項2に記載のワクチンベクター。
【請求項４】
該HMGB1ポリペプチドが、配列番号:15〜23の少なくとも1つから選択されるポリペプチド、配列番号:15〜23の少なくとも1つのフラグメント、配列番号:15〜23と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、及びそれらの組合せを含む、請求項3に記載のワクチンベクター。
【請求項５】
該免疫刺激性ポリペプチドが、CD40と結合する能力を有するCD154ポリペプチドであり、該CD154ポリペプチドが50未満のアミノ酸を有し、かつ配列番号:24、配列番号:25又はそのホモローグのアミノ酸140〜149を含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項６】
該CD154ポリペプチドが、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30であるか、又は配列番号:26〜30の少なくとも1つと少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項5に記載のワクチンベクター。
【請求項７】
該ベクターが、該第一のポリヌクレオチドの2つ以上のコピー及び／又は該第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピーを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項８】
該第一のポリヌクレオチド配列が該第二のポリヌクレオチド配列とインフレームで連結されている、請求項2〜7のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項９】
該第一のポリヌクレオチド及び該第二のポリヌクレオチドがスペーサーヌクレオチドを介して連結されている、請求項8に記載のワクチンベクター。
【請求項１０】
該ベクターがウイルス、細菌、酵母及びリポソームから成る群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項１１】
該ワクチンベクターがバシルス属種である、請求項10に記載のワクチンベクター。
【請求項１２】
TRAPポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを更に含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項１３】
該TRAPポリペプチドが、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:40、配列番号:5の免疫原性フラグメント、配列番号:6の免疫原性フラグメント、配列番号:7の免疫原性フラグメント又は配列番号:40の免疫原性フラグメントと少なくとも９５％同一である、請求項12に記載のワクチンベクター。
【請求項１４】
該ワクチンベクターが、配列番号:32、配列番号:34のポリペプチド、又は配列番号:32若しくは配列番号:34と95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項1に記載のワクチンベクター。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項に記載のワクチンベクター及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
対象におけるアピコンプレックス門寄生虫に対する免疫応答を強化する方法であって、アピコンプレックス門寄生虫に対する該対象の免疫応答を強化するのに有効な量で、請求項1〜14のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は請求項15に記載の医薬組成物を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
該強化された免疫応答が、強化された抗体応答、強化されたT細胞応答又は両方を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
対象におけるアピコンプレックス門寄生虫による感染に関連する罹病率を軽減する方法であって、前記方法が、該ワクチンベクターを投与されていないコントロール対象と比較してアピコンプレックス門寄生虫による該対象の後の感染に関連する罹病率を軽減するのに有効な量で、請求項1〜14のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は請求項15に記載の医薬組成物を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
該ワクチンベクターが、経口、粘膜、非経口、皮下、筋肉内、眼内及び卵内から成る群から選択されるルートで投与される、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
該対象が家禽種のメンバーである、請求項16〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
該家禽種がニワトリ又はシチメンチョウである、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
該対象が哺乳動物である、請求項16〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
該対象がヒト、ブタ又はウシである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
該ワクチンの約104〜約109のベクターコピーが該対象に投与される、請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
該ワクチンの約105〜約107のベクターコピーが該対象に投与される、請求項16〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
該ワクチンベクターが、前記対象への投与前に殺滅されるか、又は対象において複製する能力がない、請求項16〜25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
該アピコンプレックス門寄生虫が、アイメリア属、プラスモジウム属、トキソプラズマ属、ネオスポラ属及びクリプトスポリジウム属から成る群から選択される、請求項16〜26のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本特許出願は、米国仮特許出願No.61/764,681（2013年2月14日出願）（前記出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）の優先権を主張する。
配列リスト
本出願はEFS-Webにより電子出願され、電子提出されたテキスト形式の配列リストを含む。本テキストファイルは、“2014-02-13 5658-00201_ST25.txt”（2014年2月13日作成）と題する配列リストを含み、サイズは40.3キロバイトである。本テキストファイルに含まれる配列リストは本明細書の部分であり、前記は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
コクシジウム症（アピコンプレックス門の原生動物寄生虫（アイメリア属の種（Eimeria spp.）及び関連寄生虫）によって引き起こされる家禽、ブタ及びウシの感染症）は世界的範囲の問題を提示する。コクシジウム症は、その養鶏産業における経済的影響という観点から家禽感染症の上位10に入り、生産損失は年間10億ドルに達すると概算される。他のアピコンプレックス門の寄生虫もまた疾患を引き起こし、前記にはプラスモジウム属（Plasmodium）、クリプトスポリジウム属（Cryptosporidium）及びトキソプラズマ属（Toxoplasma）が含まれる（前記はそれぞれマラリア、クリプトスポリジウム症及びトキソプラズマ症の原因因子である）。
コクシジウム症の典型的な徴候には、食欲の急速な低下、体重減少、下痢及び急激な死が含まれる。鶏群内での大流行は高レベルの病原体に曝露されたときに発生し、大半の事例で、コクシジウム症によって鳥は二次細菌感染を発症し易くなる。疾患を制御する伝統的な方法は抗生物質及び化学療法剤の投与を含む。しかしながら、持続的使用により、前記は耐性の問題をもたらした。抗生物質の使用はまた家禽肉の社会的許容を低下させる。ワクチン接種は、長期の防御（典型的には産業鶏の一生における防御）を付与するその能力のゆえに合理的なアプローチである。
市場でもっとも入手可能なアイメリア属に対するワクチンは、本質的に完全に病毒性であるが薬剤に感受性を有するアイメリア寄生虫の管理された低投与量に依拠している。従来のアイメリア主体ワクチンによるワクチン免疫は、ワクチン接種鶏群で実質的なワクチン反応罹病及び経済的損失を生じる。したがって、アイメリア属に対して有効な低病毒性ワクチンが要求される。保存された免疫原性標的に依拠する有効なアイメリアワクチンはまた、他のアピコンプレックス門寄生虫に対するワクチンとして有用であると立証し得る。
【発明の概要】
【０００３】
アピコンプレックスロンボイドポリペプチド（Apicomplexan Rhomboid polypeptide）をコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むワクチンベクター及び前記を用いる方法が本明細書で提供される。
ある特徴では、アピコンプレックスロンボイドポリペプチド又はその免疫原性フラグメントをコードする第一のポリヌクレオチド及び免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリペプチド配列を含むワクチンベクターが開示される。アピコンプレックスロンボイドポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドは、ワクチンベクターの表面で適切に発現される。アピコンプレックスロンボイドポリペプチドは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:1−4、37−38の少なくとも1つの免疫原性フラグメント、又は配列番号:1−4及び37−38の組合せを含むことができる。免疫刺激性ポリペプチドは、CD40と結合できるCD154ポリペプチド又はHMGB1ポリペプチドであり得る。該CD154ポリペプチドは50より少ないアミノ酸を含み、CD154又はそのホモローグのアミノ酸140−149を含む。
【０００４】
別の特徴では、ワクチンベクターは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:37、配列番号:38のアピコンプレックスロンボイドポリペプチド、配列番号:1−4若しくは37−38の少なくとも1つの免疫原性フラグメント、又は配列番号:1−4若しくは37−38の組合せをコードする第一のポリヌクレオチドを含む。アピコンプレックスロンボイドポリペプチドはワクチンベクターの表面で発現され得る。
本発明のワクチンベクターはウイルス、酵母、細菌又はリポソームベクターであり得る。医薬組成物は本明細書に記載のワクチンベクター及び医薬的に許容できる担体を含むことができる。
さらに別の特徴では、アピコンプレックス門寄生虫に対する免疫応答を対象で強化する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載のワクチンベクターを該対象に投与することによる。免疫応答の強化は、抗体応答の強化、T細胞応答の強化又は前記の組合せであり得る。
さらにまた別の特徴では、アピコンプレックス門寄生虫による感染に関連する罹病率及び死亡率を対象で軽減する方法が提供され、前記方法は該対象に本明細書に記載のワクチンベクターを投与することによる。該ワクチンベクターは、コントロールと比較して、該ワクチンベクターを投与された対象でアピコンプレックス門寄生虫によるその後の感染に関連する罹病率及び死亡率を軽減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】いくつかのアピコンプレックス門寄生虫におけるMPP配列の相同性を示す模式図である。コンセンサスMPP配列は、アピコンプレックス門のアミノ酸配列で高度に類似する。同一でない場所はコンセンサス配列内でXにより示される。コンセンサス配列は図の一番上の列で示され、前記は配列番号:38である。トキソプラズマ・ゴンジー（Toxoplasma gondii）の配列（コンセンサスの下の最初の4列）は、アイメリア・マキシマ（Eimeria maxima）由来の配列番号:2のMPP配列と100％同一性を共有する。一番下の2つの配列は、それぞれネオスポラ・カニヌム（Neospora caninum）のホモローグ（配列番号:3）及びアイメリア・テネラ（Eimeria tenella）（配列番号:4）である。
【図２】実施例に記載するワクチンベクター構築物の模式図である。
【図３】表示の配列を発現する表示のワクチンベクターを接種後にアイメリア・マキシマを感染させてから8日後のニワトリの体重（グラム）を示す棒グラフである。処置グループ間の有意な相違（p＜0.05）は異なる文字で示される。
【図４】表示の配列を発現する表示のワクチンベクターを接種後にアイメリア・マキシマをチャレンジ感染させてから29日後の生存鶏の体重（グラム）を示す棒グラフである。処置グループ間の有意な相違（p＜0.05）は実際のp値及びアステリスク（*）によって示される。
【図５】表示の配列を発現する表示のワクチンベクターを接種後にアイメリア・マキシマをチャレンジ感染させてから8日後におけるアイメリア・マキシマ病毒チャレンジ感染相のパーセント死亡率を示す棒グラフである。有意な相違（p＜0.05）はアステリスク（*）で示される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
コクシジウム症に対する一般的ワクチンは、概して制御数でデリバーされる生/弱毒寄生虫を主体にしている。しかしながら、寄生虫は生存していて疾患を引き起こす能力を有するので、感染のリスクは排除されない。さらにまた、これらのワクチンタイプの製造コストは極めて高い。なぜならば、前記は、生きている鳥で寄生虫を継代し、定期的間隔でそれらを収集し、さらに製造から孵化場又は農場での使用まで中断のない一続きの冷却輸送を担保することを必要とするからである。ワクチン接種は厳密制御方法であるので、組換えワクチンの使用は、コクシジウム症系ワクチンの全体的有効性を改善しながら、一方で製造コストを下げることができる。
【０００７】
アイメリア属の種は高度に免疫原性であり、激しい宿主免疫応答を刺激する能力がある。この真核細胞の部分である幅広い抗原レパートリーは機能が高度に特殊化され、組換えワクチン開発のために適切な標的である。スポロゾイト及びメロゾイトは該寄生虫の運動性がもっとも高い時期であり、活発な感染を開始し持続するために必要である。この時期の腸上皮細胞への侵入は、寄生虫が宿主内でそのライフサイクルを継続するために必須のプロセスである。寄生虫の頭端（先端）に位置する高度に特殊化された小器官セットは、腸管腔から上皮層へのこれら運動期における移動のために要求される多数のタンパク質の輸送に必要とされる。この先端複合体は、多数の短系を含む多様な分泌小器官から成る（前記短系はタンパク質環境を運動性アピコンプレックススポロゾイトの表面に輸送し必須の運動性機能を支える）。
【０００８】
いくつかの詳細に記載されている短系関連タンパク質の中で、スロンボスポンジン関連粘着タンパク質（TRAP）が、サルモネラ（Salmonella）組換え体及びバシルスベクター系で首尾よい組換え抗原として用いられてきた（米国公開公報2011/0111015を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。多くの短系タンパク質は、それらが宿主細胞に接近し寄生虫間を連結するものとして機能するとき、さらにそれらがどんな基質上に存在していようとも、それらはスポロゾイトの頭端で短系複合体から放出されるという点で類似の作用態様を有する。続いて、短系タンパク質は寄生虫の表面を尾部に向けて移動し、それによって寄生虫を宿主細胞に近付ける。この滑走運動形式は全てのアピコンプレックス門の寄生虫に典型的である。単系タンパク質が寄生虫の尾端に場所を移されたとき、進入プロセスを首尾よく完了させるために、前記タンパク質は切断され寄生虫の表面から放出されねばならない。この機能は、寄生虫の細胞膜内で又は細胞膜上で構成的に発現されるプロテアーゼファミリーによって達成される。この切断プロセスは細胞内で発生し、感染の伝播のための絶対要件である。
【０００９】
組換えワクチン設計のための新規なアプローチは、このプロテアーゼを狙い撃ちし切断/侵入プロセスを妨害することを必要とする。切断プロセスに必要とされるプロテアーゼファミリーはロンボイドプロテアーゼと呼ばれ、アイメリア属及び他のアピコンプレックス門のホモローグとともにトキソプラズマ種で極めて詳細に記載されている。ロンボイドプロテアーゼ（ROM4及びROM5、MPP）は短系タンパク質の切断に中心的に関係し、種々のアピコンプレックス門の寄生虫間で良好な相同性を共有する。我々の仮説は、このプロテアーゼを免疫学的に標的とすることができれば、抗体結合は前記切断プロセスを妨害し、それによってスポロゾイト/メロゾイトの運動性を障害するであろうという前提に依る。首尾よく感染が成立するためには、寄生虫の細胞内発育は必須であり、したがって我々のアプローチは細胞侵入を縮小し、ライフサイクルの確立を妨害することができる。MPPを狙い撃ちする1つの利点は、アピコンプレックス門の多くの種におけるこのタンパク質の保存された性状は、MPPをアイメリア属だけでなく他のアピコンプレックス門に対しても同様に適切な標的にするということである。
【００１０】
MPP（ROM5）の予想される抗原性領域のアラインメントを実施し、6つの異なるアピコンプレックス門間の相同性について調べた（図1）。比較した7つの配列は以下のとおりであった：アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）ROM4（JN558353）、トキソプラズマ・ゴンジーME49 ROM5（XP_002370238）、トキソプラズマ・ゴンジーROM5（AAT84606）、トキソプラズマ・ゴンジーROM5（AY587208）、トキソプラズマ・ゴンジーRH ROM5（AM055942）、トキソプラズマ・ゴンジー（AY634626）、及び配列番号：2のアイメリア・マキシマ由来のMPP挿入物。適切なアピコンプレックス門の寄生虫には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アイメリア種（アイメリア・テネラ、アイメリア・マキシマ及びアイメリア・ブルネッチ（Eimeria brunetti）が含まれるが、ただしこれらに限定されない）；トキソプラズマ・ゴンジー；ネオスポラ・カニヌム；クリプトスポリジウム種；及びプラスモジウム種（プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、プラスモジウム・マラリアエ（Plasmodium malariae）、プラスモジウム・クノウレシ（Plasmodium knowlesi）及びプラスモジウム・ビバクス（Plasmodium vivax）が含まれるが、ただしこれらに限定されない）。
【００１１】
組換えDNA技術は、多くの酵母、細菌及びウイルス種の比較的容易な操作を可能にする。いくつかの微生物は軽度に病原性であるか又は非病原性であるが、激しい免疫応答を生じさせることができる。これらの微生物は、ベクター内の組換え発現された抗原に対する免疫応答を誘引するための有力なワクチンベクターとなる。微生物によるワクチンベクターは天然の感染を模倣して激しくかつ長期持続する粘膜免疫を発生させることができ、さらに製造及び投与が比較的安価であり得る。さらにまた、そのようなベクターはしばしば2つ以上の抗原を保持することができ、多数の伝染性因子に対する防御を提供する潜在能力を有する。
【００１２】
ある特徴では、配列番号：1−4、37−38のアピコンプレックスロンボイドポリペプチド、その免疫原性フラグメント又は前記の組合せをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むワクチンベクターが提供される。別の実施態様では、アピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド及び免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含むことができるワクチンベクターが提供される。ロンボイドポリペプチド及び自由選択の免疫刺激性ポリペプチドはワクチンベクターの表面で発現される。ロンボイドポリペプチドは、完全長タンパク質（配列番号：39）又は免疫原性フラグメント（例えば配列番号：1−4及び37−38で提供されるもの）を含むことができる。例えば、ロンボイドポリペプチドは、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：37、配列番号：38又はこれら配列番号のいずれかの免疫原性フラグメントを含むことができ、本質的に前記から成ることができ、又は前記から成る。これらのフラグメントの組合せもまたワクチンベクターで用いることができる。ワクチンベクターは配列番号：1−4又は37−38を含むことができる。同様に単一ワクチンベクターが単一フラグメントの多数のコピーを含むことができる。
【００１３】
ロンボイドポリペプチドの免疫原性フラグメントは、長さが少なくとも5、6、7、8、10、12、14、16、18又は20アミノ酸であり、本明細書で提供される配列番号：1−4又は37−38のフラグメントと少なくとも85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する配列であり得る。理論に拘束されないが、本明細書で提供されるワクチンベクターは、該寄生虫の細胞内への侵入を阻止する能力がある抗体応答を誘発することによって、アイメリア感染に関連する罹病率及び死亡率を軽減していると考えられる。当業者はB細胞エピトープがしばしば本質的に親水性であることを認識しており、この情報を用いて本明細書で提供する配列番号：1−4及び37−38のポリペプチドの免疫原性フラグメントを作製することができる。配列番号：2の親水性小区画は、このペプチドの3つの親水性領域及び3つの潜在的B細胞エピトープ（配列番号：2のアミノ酸1−11、18−27及び31−43を含む）を明らかにする。これらのアミノ酸フラグメントは、配列番号：3及び37のアミノ酸7−16、並びに配列番号：4のアミノ酸12−21と一致する。配列番号：1及び配列番号：38の2つのコンセンサス配列によって示されるように、配列番号：2の18−27と一致するアミノ酸は、アピコンプレックス門の寄生虫の種及び属で高度に保存されている。そのような高度に保存されたエピトープに対する免疫応答は、ただ1つのワクチンによる種を又は属さえもまたぐ免疫を可能にするかもしれない。
【００１４】
ワクチンは、該ポリペプチドに対する免疫応答を誘引する能力を有する抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む任意の組成物を含む。ワクチンベクターは、抗原又は免疫刺激性ポリペプチドを保持するように操作され得る、さらにまたアジュバントを含むか若しくはアジュバントと一緒に投与されて、寄生虫に対する免疫応答をさらに高めてその後の感染に関連する罹病率及び死亡率に対するより良好な防御を提供することができる組成物である。アイメリア属又は他のアピコンプレックス門の寄生虫（例えばプラスモジウム属（マラリアの原因因子）、トキソプラズマ属及びクリプトスポリジウム属）に対するワクチン免疫及び免疫応答発生のために、ベクター（例えば細菌ベクター）の使用が開示される。ワクチンベクターの投与後の免疫応答は完全な防御である必要はないが、その後の感染に関連する罹病率又は死亡率パーセンテージ（すなわち死亡の蓋然性）を低下させることができる。
【００１５】
配列番号：1−4、37−38のロンボイドポリペプチド抗原又はそのフラグメント及び多数の病原性生物由来の他の抗原をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し当該ベクターで発現させることができる。ベクターによるこれらのポリヌクレオチドの発現は、対象の免疫に続いて抗原性ポリペプチドの生成を可能にするであろう。該ポリヌクレオチドはベクターの染色体に挿入されるか、又はプラスミド若しくは他の染色体外DNAでコードされ得る。ベクター（例えばサルモネラ又はバシルス）でポリヌクレオチドの発現を達成する多数の方法論が存在することは当業者には理解されるであろう。ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって、プロモーター（例えば構成的プロモーター、誘導性プロモーターなど）に作動できるように連結できる。適切には、ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが発現されるようにベクター（例えば細菌ベクター）に挿入される。
ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドは、トランスメンブレンタンパク質をコードするポリヌクレオチドにインフレームで挿入できる。ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドはベクターのポリヌクレオチド配列に挿入されて、当該ベクターの表面での該ロンボイド抗原の発現を可能にする。例えば、ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドは、ベクターポリヌクレオチド配列がインフレームのままであるように、トランスメンブレンタンパク質の外側ループ領域をコードする領域内にインフレームでベクターポリヌクレオチドに挿入できる。ある実施態様では、ロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドは、サルモネラ属のlamB遺伝子のループ9に挿入できる。
【００１６】
別の実施態様では、第一のポリヌクレオチドは、細胞壁に結合されてあるがトランスメンブレンタンパク質ではないタンパク質中に、又は該タンパク質の表面の曝露末端に挿入される。該タンパク質は、タンパク質又は脂質アンカーを介して細胞壁に固着されるか又は結合される分泌タンパク質である。実施例では、MMP（配列番号:2）ポリペプチドは、枯草菌（Bacillus subtilis）のフィブロネクチン結合タンパク質（FbpB）の3’末端に挿入される。また別には、ロンボイド抗原をコードする第一のポリヌクレオチドは、分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに挿入できる。
ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドを極めて多様なベクターポリヌクレオチドに挿入して、ロンボイド抗原の発現及び該ワクチンで処置された対象の免疫細胞への該抗原の提示を提供できることは当業者には理解されるであろう。ロンボイド抗原をコードするポリヌクレオチドを一コピー又は二コピー以上で含むことができる。多数のコピーをただ1か所に又は2か所以上に挿入してもよい。また別には、多数のエピトープ、例えば配列番号:1−4及び37−38として本明細書で提供されるロンボイド抗原の組合せ、又は前記エピトープと他のアピコンプレックスのエピトープ（例えばTRAP）若しくは他の病原体由来のエピトープとの組み合わせを、ベクターの同じ場所に又は2か所以上に挿入してもよい。
【００１７】
適切には、第一のポリヌクレオチドは、ロンボイドポリペプチドの一部分、完全なロンボイドポリペプチド、又はロンボイドポリペプチド由来の2つ以上のエピトープをコードする。一寄生虫若しくは病原体由来の2つ以上のポリペプチドのエピトープの組み合わせ、又は関連病原体由来のエピトープの組み合わせが特に意図される。ポリヌクレオチドはベクターに挿入でき、さらに二エピトープ以上を含む融合タンパク質として挿入できる。実施例では、配列番号:2及び15（MPP-HMBG1）又は配列番号:2、40及び15（MPP-TRAP-HMGB1）がバシルスベクターに組み入れられた。適切には、ベクターに挿入されるロンボイドポリペプチドの部分は抗原フラグメントである。抗原性フラグメントは、細胞性若しくは液性免疫応答を誘引する能力があるか、又は該寄生虫によるその後の感染に関連する罹病率又は死亡率を軽減する能力があるペプチド又はポリペプチドである。
【００１８】
抗原性ポリペプチド又はエピトープには免疫原性である任意のポリペプチドが含まれる。該抗原性ポリペプチドには、病原体関連、アレルゲン関連、腫瘍関連又は疾患関連の抗原が含まれるが、ただしこれらに限定されない。病原体には、ウイルス、寄生虫、カビ及び細菌の病原体が、タンパク質病原体（例えばプリオン）と同様に含まれる。抗原性ポリペプチドは完全長タンパク質でもその部分でもよい。多くのタンパク質の免疫系による認識は、比較的少数のアミノ酸（しばしばエピトープと称される）に依拠することは十分に確立されている。エピトープは長さがほんの4−8アミノ酸である。したがって、本明細書に記載する抗原性ポリペプチドは、完全長タンパク質、4アミノ酸の長さのエピトープ、又はこれら両極端の間の任意の部分であり得る。実際、該抗原性ポリペプチドは、本明細書で提供する配列番号に対して少なくとも85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％のパーセント同一性を有し得る。適切には、ロンボイド抗原又はポリペプチドの抗原性フラグメントは、完全長タンパク質配列の4、5、6、7、8、9、10若しくは11以上のアミノ酸、15若しくは16以上のアミノ酸、又は20若しくは21以上のアミノ酸であり得る。
【００１９】
同じエピトープの多数のコピー又は同じ若しくは異なるタンパク質に由来する多数のエピトープがワクチンベクターに含まれ得る。ワクチンベクター中の複数のエピトープは、単一ワクチンベクターによる多数の関連する病原体の狙い撃ちを可能にするために、関連性を有し同族であることができる。同じ又は異なる病原体若しくは疾患に由来するいくつかのエピトープ又は抗原を単一ワクチンベクター中で組み合わせて投与し、多数の抗原に対して免疫応答の強化をもたらすことができる。組換えワクチンベクターは、多数の病原性微生物、ウイルス由来抗原又は腫瘍関連抗原をコードすることができる。多数の抗原を発現する能力を有するワクチンベクターの投与は、同時に2つ以上の疾患に対して免疫を誘発する利点を有し、単一病原体の多数の株に対してより広い防御又は単一病原体に対してより激しい免疫応答を提供する。
【００２０】
実施例では、MPP抗原（配列番号:2）はいくつかのベクターでは第二の抗原性ポリペプチドと同時発現された。アイメリア・マキシマ由来の高分子量無性期抗原（EmTFP250）は、この原生動物寄生虫に感染した雌鶏を生育させることによって製造された母体由来抗体の標的であることが示された。前記抗原のアミノ酸配列の分析は、TRAP（スロンボスポンジン関連の不詳タンパク質）ファミリーの新規メンバーであることを明らかにし、前記は、16のスロンボスポンジンタイプ1リピート及び31の上皮増殖因子様カルシウム結合ドメインを含む（米国特許公開公報2011/0111015を参照されたい）。EmTFP250又はTRAPはまた、2つの多少複雑な親水性のグルタミン酸及びグリシン残基に富む領域、並びにトランスメンブレンドメイン/サイトゾルテールを含む（前記トランスメンブレンドメイン/サイトゾルテールは、アピコンプレックスの短系タンパク質内で高度に保存されている寄生虫滑走運動性と密接に関係する）。いくつかの潜在的エピトープを選択した。前記は米国特許公開公報2011/0111015の配列番号:1−3及び11で同定され、本明細書では配列番号:5−8として復元される。配列番号:40は本明細書に提供する実施例で用いられ、同様にTRAP抗原と称される。配列番号:40及び配列番号:6はただ1つのアミノ酸が変化する。配列番号:6の6位のプロリンは、配列番号:40の同じ6位でアルギニンに変わる。この変更は、前記をより良好な抗原にするという目標とともに、より可撓性及び親水性のエピトープを作製するために実施された。当業者は、本発明の範囲内で抗原性を改善するために他の一アミノ酸変更を実施できる。この抗原の保存された性状のために、ベクターによるこれらエピトープの発現は多数のアピコンプレックス門の寄生虫に対する防御免疫を誘発することができ、2つの別個の抗原性ポリペプチドを含むワクチンベクターの投与はより激しい免疫応答を誘発することができる。
【００２１】
他の病原体由来の抗原性ポリペプチドを用いて、2つ以上の病原体に対する免疫応答を単一ワクチンによって強化できることは当業者には理解されるであろう。多数の病原体に対抗する単一ワクチンを投与することは有益であろう。インフルエンザ、サルモネラ属、カンピロバクター属又は他の病原体と組み合わせて、アピコンプレックス門の寄生虫（例えばアイメリア）に対して免疫応答を誘引する能力を有するワクチンが考えられる。
例えば、第二の抗原性ポリペプチドはインフルエンザポリペプチドであり得る。適切には、前記は、インフルエンザポリペプチドH5N1ポリペプチド、又はインフルエンザウイルスの多数の株に関連するポリペプチド、例えばインフルエンザM2タンパク質のポリペプチドである。インフルエンザAウイルスM2タンパク質のエクトドメイン（M2eとして知られている）は、このウイルスの表面から突き出ている。M2タンパク質のM2e部分は約24アミノ酸を含む。M2eポリペプチドはインフルエンザ内で1つの単離株から別の単離株でほとんど変化しない。実際、1918年のインフルエンザ大流行以来、感染者からは天然に生じたいくつかのM2eの変異しか単離されていない。さらにまた、トリ及びブタ宿主から単離されたインフルエンザウイルスは、異なっているがなお保存されているM2e配列を有する。ヒト、トリ及びブタ宿主から単離されたM2eポリペプチド配列についての概論は以下を参照されたい：Liu et al., Microbes and Infection 7:171-177, 2005；及びReid et al., J. Virol. 76:10717-10723, 2002（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。適切には、完全なM2eポリペプチドをワクチンベクターに挿入できるが、又は一部分のみを用いてもよい。8アミノ酸ポリペプチド（アミノ酸配列、EVETRIRN（配列番号:9）を有するLM2、又はアミノ酸配列、EVETPTRN（配列番号:10）を有する前記の変種M2eA）がワクチンベクターに組み入れられ、ニワトリへの投与後に抗体応答を生じることが示された（米国特許公開公報2011/0027309を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
【００２２】
インフルエンザAワクチンベクターに含まれる他の適切なエピトープには、インフルエンザAのヘマグルチニン（HA）又は核タンパク質（NP）のポリペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13又は配列番号:14のペプチドをワクチンベクターに含むことができる。これら配列のいずれも他の病原体又は抗原に由来するエピトープを含む任意の他のエピトープと組み合わせて用いることができることは当業者には理解されるであろう。
ワクチンベクターの部分として含まれる免疫刺激性分子は、長期持続防御に決定的に重要な免疫系の部分を潜在的に活性化するか、又はアジュバント効果を提供できよう。免疫刺激性ポリペプチドは、ナイーブ又は適合免疫応答を刺激する能力を有するポリペプチドであり得る。免疫刺激性ポリペプチドは当該ワクチンベクターに本来付随せず、脊椎動物免疫系（例えば当該ワクチンが投与される対象の免疫系）に本来関連するポリペプチドである。本明細書では2つの免疫刺激性ポリペプチド（すなわちCD154及び高運動性グループボックス1（High Mobility Group Box1（HMGB1））が記載されるが、他の免疫刺激性ポリペプチドを用いるか、或いは本明細書に記載したものと組み合わせて用いることができることは当業者には理解されるであろう。
【００２３】
免疫系の始動に必要とされるポリペプチドをコードするさらに別のポリヌクレオチドもまたワクチンベクターに含まれ得る。該ポリヌクレオチドは、それらの刺激性作用のために知られている免疫系分子、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、補体をコードするか、又は免疫調節に必要とされる別のポリヌクレオチドであり得る。ワクチンはまた、免疫応答を刺激することが知られているペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、本明細書では例えばCD154又はHMGB1ポリペプチドが記載される。
HMGB1は、活性化マクロファージ及び損傷細胞によって分泌され、炎症のサイトカイン媒介因子として機能し本来の免疫応答に影響を及ぼす。HMGB1配列の部分が実施例に記載するワクチンベクターに含まれている。HMGB1（高運動性グループボックス1）タンパク質は、最初にDNAの構造及び安定性のために決定的に重要なDNA-結合タンパク質として同定された。前記は、配列特異性なしにDNAと結合する普遍的に発現されるタンパク質である。このタンパク質は、植物から動物まで高度に保存され発現される。ゼブラフィッシュ、ニワトリ及びヒトのHMGB1アミノ酸配列がそれぞれ配列番号:23、配列番号:15及び配列番号:22で提供される。この配列は98％のアミノ酸同一性で哺乳動物を通して高度に保存され、アミノ酸の変化は保存的である。したがって、1つの種に由来するHMGB1タンパク質が別の種のHMGB1タンパク質のために機能的に代用となることは大いにあり得る。完全長HMGB1タンパク質又はその部分を、本明細書に記載するワクチンベクターのHMGB1ポリペプチドとして用いることができる。HMGB1は2つのDNA結合領域を有し、前記は、配列番号:16及び17に示すAボックス並びに配列番号:18及び19に示すBボックスと称される（以下を参照されたい：Andersson and Tracey, Annu. Rev. Immunol. 2011, 29:139-162（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
【００２４】
HMGB1は炎症の媒介因子であり、（例えば壊死細胞からの）核損傷のシグナルとして機能する。HMGB1はまた、タンパク質のアセチル化、核を縦断する移動及び分泌を要求するプロセスで、単球/マクロファージ系列の細胞によって活発に分泌され得る。細胞外HMGB1は、後期糖化生成物受容体（RAGE）又はToll様受容体ファミリー（TLR）のメンバー（特にTLR4）を介するシグナルによって強力な炎症媒介因子として機能する。RAGE結合活性が同定され、前記は配列番号:20のポリペプチドを要求する。TLR4結合は配列番号:15の106位にシステインを要求する（前記はHMGB1のBボックス領域で見出される）。
HMGB1の炎症性活性は完全長タンパク質を必要とせず、機能的フラグメントが同定された。HMGB1の前炎症作用の媒介にはBボックスで十分であることが示され、したがって本発明の関係では、配列番号:18及び19がHNGB1ポリペプチド又はその機能的フラグメントである。さらにまた、RAGE結合部位及び前炎症性サイトカイン活性はそれぞれ配列番号:20及び21にマッピングされた。したがって本発明の関係では、これらポリペプチドはHMGB1ポリペプチドの機能的フラグメントである。
当業者は、例えば国際特許出願公開公報WO02/092004（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）の方法を用いて、前炎症性サイトカイン活性を刺激する能力を有するHMGB1ポリペプチド及びそのフラグメントを同定できる。適切には、HMGB1ポリペプチドは、配列番号:15のアミノ酸150−183にRAGE結合ドメイン（配列番号:20又はそのホモローグ）及び配列番号:15のアミノ酸89−109に前炎症性サイトカイン活性ドメイン（配列番号:21又はそのホモローグ）を含む。特に、HMGB1ポリペプチド及びその機能的フラグメント又はホモローグは、配列番号:15又は16−23のHMGB1ポリペプチドと同一であるか、又は少なくとも99％同一、少なくとも98％同一、少なくとも97％同一、少なくとも96％同一、少なくとも95％同一、少なくとも90％同一、少なくとも85％同一、若しくは少なくとも80％同一であるポリペプチドを含む。
【００２５】
下記でより詳細に記載するように、ワクチンベクターはCD154ポリペプチドを含み、前記CD154ポリペプチドは、対象でCD40と結合し、ベクター及びその付随抗原に応答するように該対象を刺激する能力を有する。樹状突起細胞（DC）はナイーブT細胞を活性化してT細胞の増加及びエフェクター細胞への分化を引き起こすので、樹状突起細胞の関与は強力な免疫応答の開始に必須である。抗原を捕捉し、それらを関連リンパ系組織に輸送し、続いてそれらをナイーブT細胞に提示するのはDCの役割である（DCは身体の実質的に全ての組織で見出される抗原提示細胞（APC）である）。DCによる活性化時に、T細胞は増加し、エフェクター細胞に分化し、二次免疫器官を出て、末梢組織に入る。活性化された細胞傷害性T細胞（CTL）は、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、又は細胞内寄生生物（例えばサルモネラ属）感染APCすら破壊することができ、さらにウイルス感染に対する防御には決定的に重要であることが示された。CD40は、分子のTNF受容体ファミリーのメンバーであり、多様な細胞タイプ（専門的抗原提示細胞（APC）（例えばDC及びB細胞）を含む）で発現される。CD40とそのリガンドとの相互作用は極めて重要であり、液性及び細胞性免疫の両方に対して刺激性である。CD40（DCの表面で発現される）を介するDCの刺激は、抗CD40抗体によって模倣することができる。しかしながら身体では、前記は、活性化T細胞の表面で発現されるCD40のための天然のリガンド（すなわちCD154）との相互作用によって生じる。興味深いことに、CD154のC40結合領域が同定された。CD154のCD40結合領域をベクター（例えばサルモネラ又はバシルスベクター）の表面で発現させ、同時に提示されるペプチド配列に対する免疫応答の強化をもたらすことができる（本明細書で提供する実施例及び米国特許公開公報2011/0027309（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）で示される）。CD154ポリペプチドは、CD154完全長タンパク質の部分でも完全なCD154タンパク質でもよい。適切には、該CD154ポリペプチドはCD40と結合する能力を有する。
【００２６】
上記で考察したように、抗原に対する免疫応答を強化する能力があるCD154をコードするCD154ポリヌクレオチドをワクチンに含むことができる。適切には、CD154ポリペプチドは長さが50アミノ酸より短く、より適切には長さが40より短く、30より短く又は20アミノ酸より短い。該ポリペプチドは、長さが10から15アミノ酸、10から20アミノ酸又は10から25アミノ酸であり得る。CD154配列及びCD40結合領域は多様な種間で高度には保存されていない。ニワトリ及びヒトのCD154配列はそれぞれ配列番号:24及び25に提供される。
CD154のCD40結合領域は、ヒト、ニワトリ、アヒル、マウス、及びウシを含む多数の種について決定され、それぞれ配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29及び配列番号:30に示される。CD40結合領域には種間で配列の可変性が存在するが、ヒトCD154ポリペプチドはニワトリで免疫応答を強化することができた。したがって、種特異的CD154ポリペプチド又は異種CD154ポリペプチドを用いて本発明を実施してもよい。したがって、配列番号:24−30のCD154ポリペプチドをワクチンベクターに含むことができ、配列番号:24−30の配列と少なくとも99、98、97、96、95、93、90又は85％同一のポリペプチドをワクチンベクターに含むことができる。
CD154由来のポリペプチドは、その受容体（CD40）との結合によって少なくとも部分的に免疫応答を刺激する。対象の免疫細胞で発現される、CD154ポリペプチドと相同なポリペプチドは、マクロファージ及び他の抗原提示細胞上のCD40受容体と結合する能力を有する。このリガンド-受容体複合体の結合はマクロファージ（及びマクロファージ系列細胞、例えば樹状突起細胞）を刺激して食作用及び抗原提示を強化し、一方、他の局所免疫細胞（例えばBリンパ球）を活性化することが知られているサイトカインの分泌を高める。したがって、CD154ペプチドと結合した分子は、優先的に免疫応答及び抗体産生増加の標的となる。
【００２７】
抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドはワクチンベクターを介してデリバーされる。ワクチンベクターは、細菌、酵母、ウイルス又はリポソーム系ベクターである。可能なワクチンベクターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：バシルス属（枯草菌）、サルモネラ属（腸炎菌（Salmonella enteritidis））、赤痢菌属（Shigella）、エシェリキア属（Escherichia）（大腸菌（Escherichia coli））、エルジニア属（Yersinia）、ボルデテーラ属（Bordetella）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、連鎖球菌属（Streptococcus）、ビブリオ属（Vibrio）（コレラ菌（Vibrio cholerae））、リステリア属（Listeria）、酵母（例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）又はピキア属（Pichia））、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、及びアデノ随伴ウイルス。生きている細菌、酵母又はウイルスワクチンベクターは、免疫低下個体にはなおリスクを引き起こし、更なる規制的監視を必要とし得る。したがって、殺滅（kill）若しくは弱毒化されているか、又は“一般に安全と認められる”（GRAS）生物というアメリカ食品医薬品局（FDA）の安全基準合格証が得られるベクターの使用が所望される。問題はそのようなベクターを用いて激しい免疫応答を発生させることである。細菌、酵母又はウイルスワクチンベクターを不活化又は殺滅する方法は当業者には公知であり、例えばホルマリン不活化、抗生物質による不活化、熱処理及びエタノール処理のような方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。免疫刺激性ポリペプチド（例えばHMGB1（高運動性グループボックス1）ポリペプチド）をワクチンベクターの表面に含むことによって、我々は、バシルス属種（Bacillus spp.）ベクターを用いてアピコンプレックス門の寄生虫に対して激しい免疫応答を発生させることができる。実際、実施例は、投与後にこのベクターが複製できず、なお激しい免疫応答を誘引できるように、ベクターを不活化できることを示している。ワクチンベクターは、病原性がない野生型細菌、酵母又はウイルスであり得る。また別には、ベクターは、宿主内で限定的複製能力をもつように、又は補充培地がなければ数世代より長くは増殖できないように弱毒化することができる。ベクターを弱毒化する多様な方法及びそのような実施手段が存在することは当業者には理解されるであろう。
【００２８】
抗原性ポリペプチドの少なくとも一部分及び免疫刺激性ポリペプチドの少なくとも一部分が、ワクチンベクターの表面に存在するか又は表面で発現される。ワクチンベクターの表面での存在は、トランスメンブレンタンパク質の外側ルート内に含まれるか、トランスメンブレンタンパク質、膜脂質又は膜固着炭水化物若しくはペプチドと相互作用する（例えば共有結合的に又は化学的に架橋される）ポリペプチドを含む。ポリペプチドは、N-末端、C-末端又はトランスメンブレンタンパク質内の任意の場所にペプチド結合により連結される、該ポリペプチドを構成するアミノ酸を有することによって（すなわちトランスメンブレンタンパク質の2つのアミノ酸の間に又はトランスメンブレンタンパク質の1つ以上のアミノ酸の代わりに（すなわち欠失-挿入）挿入されることによって）、トランスメンブレンタンパク質内に含まれ得る。適切には、ポリペプチドはトランスメンブレンタンパク質の外側ループに挿入できる。適切なトランスメンブレンタンパク質は、srtA、cotB 及びlamBであるが、当業者は多くの適切なトランスメンブレンタンパク質が利用可能であることを理解していよう。ポリペプチドは、膜若しくは細胞壁の固着タンパク質又は脂質に、抗原性ポリペプチド及び免疫原性ポリペプチドが当該ワクチンベクターの表面で発現されるように連結され得る。
【００２９】
上記に記載したように、抗原性又は免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターの染色体に挿入されるか、又は染色体外で（例えばプラスミド、BAC又はYACで）維持され得る。これらのポリヌクレオチドを多様なポリヌクレオチド中にインフレームで挿入し、ベクターの種々の部分で発現させるか又は分泌させることができることは当業者には理解されるであろう。抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を強化する能力を有する免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた抗原性ポリペプチドをコードすることができる。抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクター中で2つのポリペプチドが同じポリペプチドの部分であるように（例えば融合タンパク質のように）、免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結することができる。実施例では、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた免疫刺激性ポリペプチドをコードする。ある実施態様では、ポリペプチドをコードする2つのポリヌクレオチドは両方とも、腸炎菌のlamB遺伝子のループ9に又は別のワクチンベクターにインフレームで挿入される。他のトランスメンブレンタンパク質をコードする細菌のポリヌクレオチド及びlamB遺伝子の他のループもまた用いることができることは当業者には理解されるであろう。
【００３０】
また別には、抗原性ポリペプチド及び／又は免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンベクターの表面のタンパク質、脂質又は炭水化物との結合を介してワクチンベクターの表面でディスプレーされるか又は提示される分泌ポリペプチドに挿入できる。抗原性ポリペプチド及び／又は免疫刺激性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを極めて多様なワクチンベクターポリヌクレオチドに挿入して、該ワクチンベクター処置対象の免疫細胞への抗原性ポリペプチド及び／又は免疫刺激性ポリペプチドの発現及び提示を、該ワクチンベクター表面での発現により提供できることは当業者には理解されるであろう。アピコンプレックスロンボイドポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドのコード領域を、リステリア属由来ソーターゼのための分類モチーフを含む黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）フィブロネクチン結合タンパク質のC-末端と融合させることができる。これはグラム陽性細菌（例えばバシルス属）の細胞壁への分泌タンパク質の固着を可能にする（以下を参照されたい：Nguyen and Schumann, J Biotechnol (2006) 122: 473-482（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。実施例ではこの系を用いて、HMGB1と連結させたロンボイドポリペプチドをバシルス属の表面で発現させた。他の類似の方法もまた用いることができる。
【００３１】
また別には、ポリペプチドは、当業者に利用可能な方法により、膜、細胞壁又はキャプシド(ウイルスベクターが用いられる場合)のタンパク質、脂質又は炭水化物と共有結合的に若しくは化学的に連結させることができる。例えば、ジスルフィド結合又はビオチン-アビジン架橋を用いて、抗原性及び免疫刺激性ポリペプチドをワクチンベクターの表面に提示できよう。適切には、抗原性ポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドは融合タンパク質の部分である。2つのポリペプチドはペプチド結合により直に連結されてもよく、又はリンカー、スペーサー若しくは第三のタンパク質の断片（その中に2つのポリペプチドがインフレームで挿入される）によって分離されてもよい。実施例では、アミノ酸スペーサーがポリペプチドの間に用いられた。スペーサーは2から20アミノ酸、適切には4から10アミノ酸、適切には6から8アミノ酸であり得る。適切には、スペーサーのアミノ酸は小さな側鎖を有し、かつ非荷電であり、例えばグリシン、アラニン又はセリンである。実施例では、2つのグリシン残基、2つのセリン残基、並びにアルギニン及びさらに2つのセリン残基を含むスペーサーが用いられた。他のスペーサーも用い得ることは当業者には理解されるであろう。
実施例では、ワクチンベクターは、同じヌクレオチド上でかつ互いにインフレームでコードされる抗原性ポリペプチド（MPP及び／又はTRAPポリペプチド）及び免疫刺激性ポリペプチド（CD154若しくはHMGB1又は両方）を有する。また別の実施態様では、免疫刺激性ポリペプチド及び抗原性ポリペプチドは、別個のポリヌクレオチドによってコードされる。多様な方法を用いて、抗原性ポリペプチド及びHMGB1ポリペプチドのワクチンベクター表面での発現を達成できることは、当業者には理解されるであろう。そのような方法は当業者には公知である。
【００３２】
ワクチンベクター及び医薬的に許容できる担体を含む組成物もまた提供される。医薬的に許容できる担体は、in vivo投与に適切な任意の担体である。適切には、医薬的に許容できる担体は、経口、鼻又は粘膜デリバリーのために許容できる。医薬的に許容できる担体には水、緩衝溶液、グルコース溶液又は細菌培養液が含まれ得る。組成物の追加成分には、適切には、賦形剤（例えば安定化剤、保存料、希釈剤、乳化剤及び滑沢剤）が含まれ得る。医薬的に許容できる担体又は希釈剤の例には、安定化剤、例えば炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、シュクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、タンパク質含有剤（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝剤（例えばリン酸緩衝剤）が含まれる。特にそのような安定化剤が組成物に添加されるとき、組成物は凍結乾燥又は噴霧乾燥に適切である。組成物中のワクチンベクターは複製する能力を持つことができない。適切には、ワクチンベクターは組成物に添加する前に不活化されるか又は殺滅される。
【００３３】
ワクチンベクターを投与することによって対象で免疫応答を強化する方法もまた提供される。該ワクチンベクターは、アピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド及び免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含むことができる。該免疫刺激性ポリペプチドは、適切には、脊椎動物の免疫系に本来付随し、免疫応答に必要とされるポリペプチドである。該免疫刺激性ポリペプチドは、対象の本来の又は適合性の免疫応答を刺激することができる。適切には、上記でより完全に記載したHMGB1ポリペプチド又はCD154ポリペプチドを免疫刺激性ポリペプチドとして用いることができる。本明細書で提供する方法では、アピコンプレックスロンボイドポリペプチド及び免疫刺激性ポリペプチドを含むワクチンベクターが、該ワクチンベクターに対して（特に該抗原性ロンボイドポリペプチドに対して、さらに適切にはアピコンプレックス門の寄生虫に対して）、対象の免疫応答を強化する又は達成するために有効な量で対象に投与される。強化される免疫応答には抗体又はT細胞応答が含まれ得る。適切には、免疫応答は防御性免疫応答である。しかしながら。免疫応答は完全には防御性ではないことがあるが、感染に関連する罹病率又は死亡率を軽減することができる。免疫刺激性ポリペプチドを用いて、ロンボイドポリペプチドに加えて当該ワクチンベクターに存在する任意の外来抗原又は抗原性ポリペプチドに対して対象の免疫応答を強化することができる。免疫刺激性ポリペプチドを用いて、ワクチンベクターに存在する2つ以上の抗原性ポリペプチドに対して免疫応答を強化し得ることは当業者には理解されるであろう。免疫応答の強化には、対象の免疫系によって媒介される治療的又は予防的効果の誘発が含まれるが、ただし前記に限定されない。特に、免疫応答の強化には、抗体産生の強化、抗体重鎖のクラス切り換えの強化、抗原提示細胞の成熟、ヘルパーT細胞の刺激、細胞傷害性T細胞の成熟、又はT及びB細胞メモリーの誘発が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３４】
適切には、ワクチンベクターは、HMGB1ポリペプチド（配列番号:15）又はそのホモローグのアミノ酸150−183及び89−109を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。実施例では、HMGB1の190アミノ酸ポリペプチドが用いられた。適切には、該ポリヌクレオチドは、対象と同じ種に由来するHMGB1ポリペプチドをコードする。HMGB1ポリペプチドと対象の異種組合せ（例えばニワトリワクチンでの使用にヒトHMGB1ポリペプチド）は、HMGB1が多数の種で高度に保存されるので本発明の方法で有用であり得る。HMGB1ポリペプチドを用いて、ワクチンベクターに存在する2つ以上の抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を強化し得る。 HMGB1由来のポリペプチドは、樹状突起細胞及びマクロファージを活性化し、したがってサイトカイン（例えばIL-1、IL-6、IFN-γ及びTNF-α）の産生を刺激することによって少なくとも部分的に免疫応答を刺激する。実施例では、HMGB1のポリペプチドはワクチンベクターの表面で発現された。
【００３５】
適切には、ワクチンベクターは、CD40と結合してCD40を活性化する能力を有するCD154ポリペプチドを含むことができる。CD40と結合する能力を有するCD154ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンが、該ワクチンに対する対象の免疫応答を強化するために又は免疫応答に影響を与えるために有効な量で対象に投与される。適切には、ワクチンは、ヒトCD154ポリペプチド（配列番号:25）又はそのホモローグのアミノ酸140−149を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。上記に特記したように、1つの種に由来するアミノ酸140−149のホモローグを用いて、別個の種で免疫応答を刺激することができる。適切には、該ポリヌクレオチドは対象と同じ種に由来するCD154ポリペプチドをコードする。適切には、配列番号:26のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがヒト対象で用いられ、配列番号:27のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがニワトリで用いられ、配列番号:28のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがアヒルで用いられ、配列番号:29のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがマウスで用いられ、さらに配列番号:30のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがウシで用いられる。ヒトCD154ポリペプチド（配列番号:26）がニワトリワクチンで用いられて、外来抗原に対する免疫応答を強化することが示された。したがって、CD154ポリペプチドと対象の他の異種組合せも本発明の方法で有用であり得る。
【００３６】
さらにまた、アピコンプレックス門の寄生虫に対する免疫応答を強化する方法、及びアピコンプレックス門の寄生虫によるその後の感染に関連する罹病率を軽減する方法が開示される。略記すれば、前記方法は、アピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含むワクチンベクターの有効量を対象に投与する工程を含む。該ワクチンベクターはまた、有効量の免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドを含むことができる。該ロンボイドポリペプチドは配列番号:1−4、37、38又はその組み合わせ若しくはフラグメントを含むことができる。ロンボイドポリペプチドのベクターへの挿入は当業者に公知の多様な方法で達成でき、以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：無瘢痕位置指定変異導入系（以下に記載されている：BMC Biotechnol. 2007 Sept, 17: 7(1): 59, Scarless and Site-directed Mutagenesis in Salmonella Enteritidis chromosome（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））及び本明細書で用いられる方法（以下に記載されている：Nguyen and Schumann J Biotechnol 2006 122: 473-482（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。またベクターを操作して、アピコンプレックス門の寄生虫に由来する他の抗原性ポリペプチド（例えばTRAP）又は他の病原体（例えばウイルス（例えばインフルエンザM2e）又は細菌（例えばサルモネラ属又は大腸菌）を含む）に由来するものと組み合わせてロンボイドポリペプチドを発現させることができる。特にCD40と結合する能力を有するCD154のポリペプチド又はHMGB1をベクターに発現させて、ロンボイドポリペプチドに対する対象の免疫応答を強化することができる。
【００３７】
抗原性ポリペプチドを含む組成物もまた、アピコンプレックス門の寄生虫によるその後の感染に関連する罹病率の低下のために用いることができる。該組成物は、当該寄生虫の疾患惹起を防止するか、又は本明細書に記載の組成物又はワクチンベクターが投与された対象で任意の関連する罹病率を限定又は軽減することができる。本明細書に記載の組成物及びワクチンベクターは、病気の期間、体重低下、当該疾患の症状の重篤度を軽減することによって、当該疾患に関連する罹病率若しくは死亡率を減少させることによって、又は当該疾患に罹患する蓋然性を低下させることによってその後の疾患の重篤度を軽減することができる。該組成物はまた伝播を制限することによって当該寄生虫の拡散を軽減することができる。本明細書に記載のワクチンベクターの投与後の当該疾患に関連する罹病率又は死亡率は、当該ワクチンベクターを提供されていない類似の対象と比較して、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％に、又は100％にすら低下する。
【００３８】
動物又は人間への投与については、該組成物は多様な手段によって投与でき、前記には鼻内、粘膜、スプレー、皮内、非経口、皮下、腹腔内、静脈内、頭蓋内、経口、エーロゾル、又は筋肉内投与が含まれるが、ただしこれらに限定されない。点眼投与、胃管栄養、又は飲料水若しくは食物への添加もさらに別に適切である。家禽類のためには、該組成物は卵内に投与できる。
本発明のいくつかの実施態様は、対象で免疫応答を強化する方法を提供する。適切な対象には、脊椎動物、適切には哺乳動物（適切には人間）及び鳥類（適切には家禽、例えばニワトリ又はシチメンチョウ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。他の動物、例えばウシ、ネコ、イヌ又はブタもまた用いることができる。適切には、対象は非ヒトであり、農産業動物であり得る。
投与されるべきワクチンの有用な投与量は、対象の年齢、体重及び種、投与の態様及びルート、並びに免疫応答を求められる病原体のタイプに応じて変動するであろう。組成物は、免疫応答を惹起させるために十分な任意の用量で投与できる。103から1010のベクターコピー（すなわちコロニー形成ユニット又はプラーク形成ユニット）、104から109のベクターコピー又は105から107のベクターコピーの範囲の用量が適切であろうと考えられる。
【００３９】
組成物は1回だけ投与してもよく、又は2回以上投与して免疫応答を高めてもよい。例えば、組成物は、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年又はそれより長く間をあけて2回以上投与することができる。ワクチンベクターは投与前に生命活性を有する微生物を含むことができるが、いくつかの実施態様では、ベクターは投与前に殺滅することができる。いくつかの実施態様では、ベクターは対象内で複製することができるが、他の実施態様では、ベクターは対象内で複製ことができない。ベクターとして用いられる微生物の不活化方法は当業者には公知である。例えば、細菌ワクチンベクターは、ホルマリン、エタノール、熱曝露、又は抗生物質を用いて不活化できる。当業者は他の方法も同様に用いることができる。
【００４０】
同じ又は異なる病原体に由来するいくつかのエピトープ又は抗原をただ1つのワクチン中で組み合わせて投与し、多数の抗原に対して強化された免疫応答を生じることができると考えられる。組換えワクチンは、多数の病原性微生物、ウイルス又は腫瘍関連抗原に由来する複数の抗原をコードすることができる。多数の抗原を発現する能力を有するワクチンの投与は、同時に2つ以上の疾患に対する免疫を誘発する利点を有する。例えば、生きている弱毒細菌は、単一病原体に由来する多数の抗原（例えばアイメリア由来のMPP（配列番号:2）及びTRAP（配列番号:6））に対し、又は異なる病原体に由来する多数の抗原（例えばアイメリア及びインフルエンザ又はサルモネラ）に対し免疫応答を誘引するための適切なベクターを提供する。
【００４１】
ワクチンベクターは、ワクチンベクターの非必須部位に挿入することができるか、或いは、当業者に周知の方法を用いプラスミド又は他の染色体外ベヒクル（例えばBAC又はYAC）上で保持することができる、抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドを用いて構築できる。ポリヌクレオチドの挿入のための1つの適切な部位は、トランスメンブレンタンパク質の外側部分内に存在するか、又は、分泌経路のために外因性ポリヌクレオチドを標的とする及び／又は細胞壁との結合を可能にする配列に連結される。ポリヌクレオチドの挿入のための適切なトランスメンブレンタンパク質の一例はlamB遺伝子である。細胞壁結合の1つの適切な方法は実施例で提供される。
外因性ポリヌクレオチドには、病原性微生物又はウイルスから選択される抗原をコードするポリヌクレオチドが含まれ（ただしこれらに限定されない）、さらに有効な免疫応答が生じるような態様で発現されるポリヌクレオチドが含まれる。そのようなポリヌクレオチドは、病原性ウイルス、例えばインフルエンザ（例えばM2e、ヘマグルチニン又はノイラミニダーゼ）、ヘルペスウイルス（例えばヘルペスウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子）、レトロウイルス（例えばgp160エンベロープタンパク質）、アデノウイルス、パラミクソウイルス、コロナウイルスなどから誘導することができる。外因性ポリヌクレオチドはまた、病原性細菌から入手できる。前記は、例えば細菌性タンパク質、例えば毒素、外側膜タンパク質又は高度に保存されたタンパク質をコードする遺伝子である。さらにまた、寄生虫（例えば他のアピコンプレックス門の寄生虫）に由来する外因性ポリヌクレオチドは、ベクターワクチンでの使用のために興味深い候補ポリヌクレオチドである。
【００４２】
本開示は、本明細書に示す構築物、成分の配合、又は方法の工程の個々の詳細に限定されない。本明細書に開示する組成物及び方法は、以下の開示を考慮し当業者に明白な多様な態様で、作製し、実施し、使用し、実行し及び／又は形成することができる。本明細書で用いられる表現及び用語は単に記載を目的とし、特許請求の範囲を限定すると解されるべきではない。明細書及び特許請求の範囲で用いられる通常の指示語、例えば第一の、第二の及び第三のという語は、多様な構造物又は方法の工程を指し、いずれか特定の構造物若しくは工程、又はそのような構造物若しくは工程に対するいずれかの具体的な順序若しくは構成を指定すると解されるべきであることを意味しない。本明細書に記載する全ての方法は、本明細書で特段に指示されないかぎり、又はそうでなければ明らかに文脈に矛盾を生じないかぎり任意の適切な順序で実施できる。任意の及び全ての例の使用又は本明細書で提供される例示の言葉（例えば“such as”）は、単に開示を容易にすることを意図し、特段の請求がないかぎり特許請求の範囲の制限を一切含蓄しない。明細書中のいずれの言葉及び図面中のいずれの構造物も、特許請求されていないいずれの成分も開示の対象の実施のために必須であることを示していると解されるべきではない。“including（含む）”、“comprising（含む）”又は“having（有する）”という用語及び前記用語の変型の本明細書での使用は、前記用語の後に列挙される成分及びその等価物を、さらに追加される成分とともに包含することを意味する。ある種の成分を“including（含む）”、“comprising（含む）”又は“having（有する）”と記載された実施態様はまた、それらある種の成分 “consisting essentially of（から本質的に成る）”、及び“consisting of（から成る）”ことが意図される。“a”、“an”及び“the”という用語は、具体的に正確に示されないかぎり1つ又は2つ以上を意味することができる。
【００４３】
本明細書における数値範囲の列挙は、本明細書で特段の指示がなければ、当該範囲内にある別々の各数値を個々に言及するための便法として役立てることを単に意図し、各々別々の値は、前記値があたかも個々に本明細書に列挙されるかのように本明細書に取り込まれる。例えば、濃度範囲が1％から50％と記載される場合、例えば2％から40％、10％から30％又は1％から3％などの値を明確に本明細書で列挙することが意図される。これらは具体的に意図されるものの単なる例であり、列挙された最小値と最高値との間及び前記最小値及び最高値を含む数値の全ての可能な組み合わせが、本開示に明確に記載されたと考えられるべきである。個々に列挙される量又は量の範囲を示す“約”という用語の使用は、列挙される量に非常に近い値（例えば製作公差、測定の実施における装置及び人的エラーなどに帰し得る値）が当該量に含まれることを示そうとするものである。量に関する全てのパーセンテージは特段の指示がなければ重量による。
以下の実施例は単に例示を意図し、本発明の範囲又は添付の特許請求の範囲の制限を意図しない。本明細書に引用される全ての参考文献（特許、特許公開公報及び非特許文献を含む）は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。参考文献中の記述と本明細書の記述との間の一切の矛盾は、本明細書に含まれる記述を優先して解決されるべきである。
【実施例１】
【００４４】
ワクチンベクターの構築
有効性を試験してアイメリア・マキシマチャレンジに対する防御における各々の影響を決定する目的のために、ワクチンの多数の組み合わせを構築した。実施例で使用する構築物を示す模式図は図2に示されている。TRAP MPP HMGB1及びMPP HMGB1配列を合成し、細胞表面発現のためにpNDH10プラスミドに挿入した。各々の配列は、5’末端のBamHI制限部位及びフィブロネクチン結合タンパク質B（fbpB）の直ぐ近傍の3’末端のAatII制限部位を用いて合成した。ワクチン配列及びfbpBの発現は、pNDH10プラスミド[1]に以前に挿入されたxylオペロンによって調節される。fbpBはソーティングモチーフを含み、前記モチーフは、ソーターゼA発現細菌[1]の細胞表面にfbpBを固着させるソーターゼAによって認識された。したがって、ワクチン配列は、上流にかつfbpB配列とインフレームで配置され、それにより、fbpBが細胞壁のソーターゼAに固着されるときワクチンベクター配列は当該細菌の表面で発現されるであろう。ワクチン配列、fbpB、及びxylオペロンを含むプラスミドpNDH10で、ソーターゼAを発現する枯草菌1A857[2]を形質転換した。0.1Mのエチレングリコール四酢酸（EGTA）を用い0.6μgの挿入物/プラスミドをコンピテントな1A857培養に添加することによって、1A857を各プラスミドで形質転換した。形質転換後、5μg/mLのクロラムフェニコールを含むLB寒天上でpNDH10発現1A857を選別して、抗生物質耐性を保有する細胞のみを選別した（前記耐性は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするcat配列を介してプラスミドによって付与される）。MPP HMGB1（配列番号:33）又はTRAP MPP HMGB1（配列番号:31）pNDH10プラスミドで形質転換された枯草菌1A857は、プラスミド抽出とその後に続くPCRによって確認された。1A857/pNDH10/挿入物構築物を各々増殖させ、5μg/mLのクロラムフェニコールを含むLBブロス＋0.1％グルコース中の0.6％キシロースで37℃、9時間震盪しながら誘発した。MPP-HMGB1（配列番号:34）及びTRAP-MPP-HMGB1（配列番号:32）タンパク質発現が、ウサギ抗HMGB1抗体を用いたウェスタンブロット及び間接蛍光顕微鏡法によって確認された。
【実施例２】
【００４５】
アイメリア感染後の雛の罹病率及び死亡率の軽減
改変キトサンアジュバントを加えた飲料水を介して投与されたときのアイメリア・マキシマチャレンジに対する防御を提供する能力について、ベクターワクチンMPP HMGB1及びTRAP MPP HMGB1を試験した。4日齢及び14日齢でブロイラーの雛を飲料水中のそれぞれのワクチン（1:128希釈（5ｘ105cfu/雛）で24時間）によりワクチン免疫した。21日齢で全てのグループの重量を測定し、さらにE.マキシマの4ｘ104胞子形成オーシストで胃管投与によりチャレンジした。28日齢で、体重（BW）及び生存鶏の体重増加（BWG）をチャレンジ期間の間記録した。さらにまた、死亡率を記載してワクチン候補の有効性を決定した。チャレンジ後8日のBWは、非ワクチン接種雛と比較したとき、TRAP-MPP-HMGB1及びMPP-HMGB1でワクチン接種した雛で有意に高かった（図3）。BWGは、コントロールと比較したとき、チャレンジ後8日で全ワクチン接種グループについて有意に高かった（図4）。死亡率もまた、非ワクチン接種グループに関してTRAP-MPP-HMGB1及びMPP-HMGB1ワクチン接種グループで有意に低かった（図5）。
【００４６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月21日(2019.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンベクターであって、該ワクチンベクターの表面で発現されるアピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含み、該ロンボイドポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:38、配列番号:3と配列番号:4と配列番号:37とその組み合わせとからなる群から選択されるポリペプチドと９０％超の配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:2のアミノ酸1〜11、18〜27若しくは31〜43を含む配列番号:2の免疫原性フラグメントのみからなる、前記ワクチンベクター。
【請求項２】
免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を更に含み、該免疫刺激性ポリペプチドが該ワクチンベクターの表面で発現される、請求項1に記載のワクチンベクター。
【請求項３】
該免疫刺激性ポリペプチドがHMGB1ポリペプチドであり、該HMGB1ポリペプチドが、配列番号:15〜23、配列番号:15〜23の少なくとも1つのフラグメント、配列番号:15〜23と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、及びそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項2に記載のワクチンベクター。
【請求項４】
該免疫刺激性ポリペプチドが、CD40と結合する能力を有するCD154ポリペプチドを含み、該CD154ポリペプチドが50未満のアミノ酸を有し、かつ配列番号:24及び配列番号:25からなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸140〜149を含むか、又は配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30及び配列番号:26〜30の少なくとも1つと少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドである、請求項2又は3に記載のワクチンベクター。
【請求項５】
該ベクターが、該第一のポリヌクレオチドの2つ以上のコピー及び／又は該第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピーを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項６】
該第一のポリヌクレオチド配列が該第二のポリヌクレオチド配列と同じリーディングフレームで連結されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項７】
該ワクチンベクターがウイルス、細菌、酵母及びリポソームから成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項８】
該ワクチンベクターがバシルス属種である、請求項7に記載のワクチンベクター。
【請求項９】
TRAPポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを更に含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
【請求項１０】
該TRAPポリペプチドが、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7及び配列番号:40と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項9に記載のワクチンベクター。
【請求項１１】
該第一のポリヌクレオチド及び該第二のポリヌクレオチドが、配列番号:32、配列番号:34及び配列番号:32若しくは配列番号:34と95％の配列同一性を有するポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項2に記載のワクチンベクター。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のワクチンベクター及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
非ヒト対象におけるアピコンプレックス門寄生虫に対する免疫応答を強化する方法であって、アピコンプレックス門寄生虫に対する該対象の免疫応答を強化するのに有効な量で、請求項1〜11のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は請求項12に記載の医薬組成物を該非ヒト対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
非ヒト対象におけるアピコンプレックス門寄生虫による感染に関連する罹病率を軽減する方法であって、該ワクチンベクターを投与されていないコントロール対象と比較してアピコンプレックス門寄生虫による該対象の後の感染に関連する罹病率を軽減するのに有効な量で、請求項1〜11のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は請求項12に記載の医薬組成物を該非ヒト対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
該ワクチンベクターが、経口、粘膜、非経口、皮下、筋肉内、眼内及び卵内から成る群から選択されるルートで投与される、請求項13又は14に記載の方法。
【請求項１６】
該対象が家禽種又は非ヒト哺乳動物である、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
該対象が、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ及びウシからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
該ワクチンの104〜109のベクターコピーが該対象に投与される、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
該ワクチンベクターが、前記対象への投与前に殺滅されるか、又は対象において複製する能力がない、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
該アピコンプレックス門寄生虫が、アイメリア属、プラスモジウム属、トキソプラズマ属、ネオスポラ属及びクリプトスポリジウム属から成る群から選択される、請求項13〜19のいずれか1項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
2019073554.tif 000009
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕ワクチンベクターであって、場合によって該ワクチンベクターの表面で発現される、アピコンプレックスロンボイドポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列を含み、該ロンボイドポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:1の免疫原性フラグメント、配列番号:2の免疫原性フラグメント、配列番号:3の免疫原性フラグメント、配列番号:4の免疫原性フラグメント、配列番号:37の免疫原性フラグメント、配列番号:38の免疫原性フラグメント若しくはその組合せの少なくとも１つである又は少なくとも１つと９０％超の配列同一性を有する、前記ワクチンベクター。
〔２〕免疫刺激性ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を更に含み、該免疫刺激性ポリペプチドが該ワクチンベクターの表面で発現される、前記〔1〕に記載のワクチンベクター。
〔３〕該免疫刺激性ポリペプチドがHMGB1ポリペプチドである、前記〔2〕に記載のワクチンベクター。
〔４〕該HMGB1ポリペプチドが、配列番号:15〜23の少なくとも1つから選択されるポリペプチド、配列番号:15〜23の少なくとも1つのフラグメント、配列番号:15〜23と少なくとも95％の配列同一性を有するポリペプチド、及びそれらの組合せを含む、前記〔3〕に記載のワクチンベクター。
〔５〕該免疫刺激性ポリペプチドが、CD40と結合する能力を有するCD154ポリペプチドであり、該CD154ポリペプチドが50未満のアミノ酸を有し、かつ配列番号:24、配列番号:25又はそのホモローグのアミノ酸140〜149を含む、前記〔2〕〜〔4〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
〔６〕該CD154ポリペプチドが、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30であるか、又は配列番号:26〜30の少なくとも1つと少なくとも90％の配列同一性を有する、前記〔5〕に記載のワクチンベクター。
〔７〕該ベクターが、該第一のポリヌクレオチドの2つ以上のコピー及び／又は該第二のポリヌクレオチド配列の2つ以上のコピーを含む、前記〔1〕〜〔6〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
〔８〕該第一のポリヌクレオチド配列が該第二のポリヌクレオチド配列とインフレームで連結されている、前記〔2〕〜〔7〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
〔９〕該第一のポリヌクレオチド及び該第二のポリヌクレオチドがスペーサーヌクレオチドを介して連結されている、前記〔8〕に記載のワクチンベクター。
〔１０〕該ベクターがウイルス、細菌、酵母及びリポソームから成る群から選択される、前記〔1〕〜〔9〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
〔１１〕該ワクチンベクターがバシルス属種である、前記〔10〕に記載のワクチンベクター。
〔１２〕TRAPポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチドを更に含む、前記〔1〕〜〔11〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター。
〔１３〕該TRAPポリペプチドが、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:40、配列番号:5の免疫原性フラグメント、配列番号:6の免疫原性フラグメント、配列番号:7の免疫原性フラグメント又は配列番号:40の免疫原性フラグメントと少なくとも９５％同一である、前記〔12〕に記載のワクチンベクター。
〔１４〕該ワクチンベクターが、配列番号:32、配列番号:34のポリペプチド、又は配列番号:32若しくは配列番号:34と95％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記〔1〕に記載のワクチンベクター。
〔１５〕前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター及び医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
〔１６〕対象におけるアピコンプレックス門寄生虫に対する免疫応答を強化する方法であって、アピコンプレックス門寄生虫に対する該対象の免疫応答を強化するのに有効な量で、前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は前記〔15〕に記載の医薬組成物を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
〔１７〕該強化された免疫応答が、強化された抗体応答、強化されたT細胞応答又は両方を含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔１８〕対象におけるアピコンプレックス門寄生虫による感染に関連する罹病率を軽減する方法であって、前記方法が、該ワクチンベクターを投与されていないコントロール対象と比較してアピコンプレックス門寄生虫による該対象の後の感染に関連する罹病率を軽減するのに有効な量で、前記〔1〕〜〔14〕のいずれか1項に記載のワクチンベクター又は前記〔15〕に記載の医薬組成物を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
〔１９〕該ワクチンベクターが、経口、粘膜、非経口、皮下、筋肉内、眼内及び卵内から成る群から選択されるルートで投与される、前記〔16〕〜〔18〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２０〕該対象が家禽種のメンバーである、前記〔16〕〜〔19〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２１〕該家禽種がニワトリ又はシチメンチョウである、前記〔18〕に記載の方法。
〔２２〕該対象が哺乳動物である、前記〔16〕〜〔21〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２３〕該対象がヒト、ブタ又はウシである、前記〔22〕に記載の方法。
〔２４〕該ワクチンの約104〜約109のベクターコピーが該対象に投与される、前記〔16〕〜〔23〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２５〕該ワクチンの約105〜約107のベクターコピーが該対象に投与される、前記〔16〕〜〔23〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２６〕該ワクチンベクターが、前記対象への投与前に殺滅されるか、又は対象において複製する能力がない、前記〔16〕〜〔25〕のいずれか1項に記載の方法。
〔２７〕該アピコンプレックス門寄生虫が、アイメリア属、プラスモジウム属、トキソプラズマ属、ネオスポラ属及びクリプトスポリジウム属から成る群から選択される、前記〔16〕〜〔26〕のいずれか1項に記載の方法。
【外国語明細書】
2019073554000001.pdf