(57)【要約】【課題】短時間でプロシアニジン類を容易に分析できるプロシアニジン類の分析方法を提供する。【解決手段】プロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備え、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備え、
前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出するプロシアニジン類の分析方法。
【請求項２】
前記分析工程において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるようにカラムに通過させる請求項１に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項３】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項１又は２に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項４】
前記固定相がジオール相である請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項５】
固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、
を備えるプロシアニジン類の分析システム。
【請求項６】
前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御する請求項５に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【請求項７】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項５又は６に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【請求項８】
前記固定相がジオール相である請求項５〜７のいずれか一項に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロシアニジン類の分析方法及び分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロシアニジン類は、ポリフェノール類の一種であり、カテキン類が重合した複合体である。また、プロシアニジン類は、リンゴやブドウ等の果実、香辛料、穀類、茶類、カカオ等、広く食物に含まれている。近年、プロシアニジン類について、強い抗酸化作用、脂肪蓄積抑制効果、肥満予防効果、中性脂肪吸収抑制効果、発癌抑制効果、末梢循環改善作用、血液流動性改善作用及び血小板凝集抑制効果等の様々な効果が報告されている。上記のとおり、プロシアニジン類は、広く食物に含まれていることから、プロシアニジン類を含む特定保健用食品や機能性表示食品の開発等が期待されている。
【０００３】
一方、特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保し、食品や商品の品質保証を行うことが重要になっている。これまで、プロシアニジン類の分析には、比色定量法やＨＰＬＣ法が使用されてきた。近年では、プロシアニジン類を重合度別に分離する順相クロマトグラフィー法による分析が行われている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gu L et al., “Concentrations of Proanthocyanidins in Common Foods and Estimations of Normal Consumption.”, J Nutr., Vol. 134, p613-617, 2004.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プロシアニジン類は、カテキン類の結合数、結合位置及び種類によって、多くの異性体が存在し、逆相クロマトグラフィーによる分析では、ピークが重なって溶出されることから定量可能なプロシアニジン類に限界がある（図５参照）。
【０００６】
また、非特許文献１に記載の方法では、プロシアニジン類の各重合度の標準品は市販されていないため、調製する必要がある。さらに、測定時間が１試料に対し７５分程度と長い。
【０００７】
特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保するために、数多くの試料を分析することが必要である。そのため、短時間でプロシアニジン類を容易に分析できる分析方法が求められていた。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、短時間でプロシアニジン類を容易に分析できるプロシアニジン類の分析方法及び分析システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備える方法であり、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。
【００１０】
前記分析工程において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるようにカラムに通過させてもよい。
【００１１】
上記第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法において、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。
【００１２】
上記第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法において、前記固定相がジオール相であってもよい。
【００１３】
本発明の第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムは、固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、を備える。
【００１４】
前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御してもよい。
【００１５】
上記第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムにおいて、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。
【００１６】
上記第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムにおいて、前記固定相がジオール相であってもよい。
【発明の効果】
【００１７】
上記態様のプロシアニジン類の分析方法及び分析システムによれば、短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの一例を示す概略構成図である。
【図２】実施例１におけるリンゴ抽出液を、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図３】比較例１におけるリンゴ抽出液を、従来の順相高速液体クロマトグラフィー法を用いて分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図４】実施例２における本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて、プロシアニジンの単量体、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体及び７量体、並びに、リンゴ抽出液を分析した結果を示すクロマトグラムである。
【図５】リンゴ抽出液を逆相クロマトグラフィー法を用いて分析した結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
≪プロシアニジン類の分析方法≫
本発明の一実施形態に係るプロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備える方法である。また、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入する。次いで、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。
【００２０】
本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、従来では１試料あたりの分析時間が６０分間程度かかっていたの対し、１０分間程度の短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。
【００２１】
また、特定保健用食品や機能性表示食品では、機能性関与成分を担保するために、プロシアニジン類の各重合度の含有濃度を定量する必要はなく、２量体以上の重合体の合計濃度を容易に定量する方法が求められている。本実施形態のプロシアニジン類の分析方法では、液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分析結果であるクロマトグラムにおいて、２量体以上の重合体の同じピークに現れる。そのため、試料中の２量体以上の重合体の合計濃度を容易に算出することができる。
【００２２】
［分析工程］
分析工程において、まず、プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入する。
【００２３】
プロシアニジン類を含む試料としては、特別な限定はなく、例えば、リンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、ライチ、ブルーベリー、カシス、アボカド、大麦、グァバ、ホップ、小豆、クルミ、クリ、カカオ、松樹皮、紅茶、緑茶、ワイン等が挙げられ、これらに限定されない。プロシアニジン類を含む試料としては、１種類の植物から由来するものを用いてもよく、複数種の植物から由来するものを組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
プロシアニジン類を含む試料を調製する方法としては、例えば、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料である場合、特開平７−２８５８７６号公報（参考文献１）、特開２００２−８７９７８号公報（参考文献２）等に記載の方法等が挙げられる。
【００２５】
また、液体クロマトグラフィーカラムに導入される試料中のプロシアニジン類の濃度は、５μｇ／ｍＬ以上５００μｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
【００２６】
カラムに充填された固定相としては、極性物質が結合しているものであればよく、例えば、ジオール相、グリセロール相、アミノ相、シアノ相、トリメチルシリル相、ジメチルシリル相、プロピル相、ブチル相、ペンチル相、ヘキシル相、フェニル相、ハロゲン化相、ニトロ相等が挙げられる。
【００２７】
中でも、固定相としては、ジオール相であることが好ましい。ジオール相が充填されたカラムとしては、例えば、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  １００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ３００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等が挙げられる。
【００２８】
また、固定相の粒径は、３μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
【００２９】
また、カラムの内径は、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましい。カラムの長さは、１００ｍｍ以上５００ｍｍ以下であることが好ましい。
【００３０】
次いで、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出する。
【００３１】
極性非プロトン溶媒としては、例えば、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル、ニトロメタン等が挙げられる。これらの溶媒を
１種を用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。中でも、極性非プロトン溶媒としては、アセトニトリルであることが好ましい。
【００３２】
極性プロトン溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等が挙げられる。これらの溶媒を
１種を用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。中でも、極性非プロトン溶媒としては、メタノールであることが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「極性非プロトン溶媒から実質的になる」及び「極性プロトン溶媒から実質的になる」とは、Ａ液中の極性非プロトン溶媒又はＢ液中の極性プロトン溶媒が１００容量％である、又は、極性非プロトン溶媒又は極性プロトン溶媒の移動相としての性質を妨げない程度の任意の鉱酸、有機酸（例えば、酢酸等）及び水からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む状態を意味する。中でも、Ａ液中の極性非プロトン溶媒又はＢ液中の極性プロトン溶媒が５０容量％以上であることが好ましく、９０容量％以上であることがより好ましい。また、Ａ液中の極性非プロトン溶媒は９８容量％以上のアセトニトリルであることが特に好ましく、Ｂ液中の極性プロトン溶媒は９５容量％以上のメタノールであることが特に好ましい。
【００３４】
また、段階溶出法のパターンとしては、分析開始から１分間以上２分間以下、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるようにカラムに通過させることが好ましい。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、即座にＢ液の濃度を上昇させてカラムに通過させることが好ましい。これにより、液体クロマトグラフィーによる分析の結果として得られるクロマトグラムにおいて、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをより明確に分離することができる。
【００３５】
また、液体クロマトグラフィーを用いて分離されたプロシアニジン類は、蛍光検出器の波長を励起波長２３０ｍｍ及び蛍光波長３２１ｍｍ、又は、励起波長２７６ｎｍ及び蛍光波長３１６ｎｍに設定することで検出することができる。
【００３６】
また、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体の濃度を定量することができる。
【００３７】
定量方法としては、まず、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法を用いて、プロシアニジン類を含む試料、及び、既知の濃度のプロシアニジン類の標準液を分析する。次いで、得られたクロマトグラムから、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体のピーク、及び、既知の濃度のプロシアニジン類のピークの面積をそれぞれ算出する。次いで、以下の式（Ａ）を用いて、試料中のプロシアニジン類の２量体以上の重合体の濃度を算出することができる。
【００３８】
ＣＥＸ＝ＣＳＴＤ／ＡＥＸ×ＡＳＴＤ      ・・・（Ａ）
【００３９】
上記式（Ａ）中の各成分は、以下に示すとおりである。
ＣＥＸ…試料中のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＣＳＴＤ…試料のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
ＡＥＸ…標準液のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＡＳＴＤ…標準液のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
【００４０】
≪プロシアニジン類の分析システム≫
本発明のプロシアニジン類の分析システムは、以下の構成を備える。
固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフ；
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液；
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液；
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部。
【００４１】
本実施形態のプロシアニジン類の分析システムによれば、従来では１試料あたりの分析時間が６０分間程度かかっていたの対し、１０分間程度の短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。
【００４２】
図１は、本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの一例を示す概略構成図である。本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの各構成について、図１を参照しながら以下に詳細を説明する。
【００４３】
図１に示すプロシアニジン類の分析システム１００は、高速液体クロマトグラフ１０と制御部２０とを備える。高速液体クロマトグラフ１０は、移動相Ａ液１が貯蔵された移動相Ａ液貯槽２と、移動相Ｂ液３が貯蔵された移動相Ｂ液貯槽４と、移動相Ａ液１及び移動相Ｂ液３をカラムに送液するためのポンプ５と、サンプル注入装置６と、順相カラム７と、検出器８と、を有する。
【００４４】
移動相Ａ液及び移動相Ｂ液としては、上述のプロシアニジン類の分析方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、Ａ液中の極性非プロトン溶媒は９８容量％以上のアセトニトリルであることが特に好ましく、Ｂ液中の極性プロトン溶媒は９５容量％以上のメタノールであることが特に好ましい。
【００４５】
順相カラム７には、固定相が充填されている。固定相としては、上述のプロシアニジン類の分析方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、ジオール相であることが好ましい。ジオール相が充填されたカラムとしては、例えば、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  １００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ３００Ｄｉｏｌ−５（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）（Ｎｏｍｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）等が挙げられる。
【００４６】
また、ポンプ５は、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっている。制御部２０は、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように、ポンプを制御してカラムに移動相を送液することが好ましい。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、ポンプを制御して、カラムに即座にＢ液の濃度を上昇させた移動相を送液することが好ましい。これにより、液体クロマトグラフによる分析の結果として得られるクロマトグラムにおいて、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをより明確に分離することができる。
【００４７】
また、図示していないが、試料注入装置６も、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。これにより、試料注入のタイミングを制御することができ、試料注入と同時にポンプ５の制御によって段階溶出法による分析を開始することができる。
【００４８】
検出器８は、プロシアニジン類を検出されたためのものである。検出器８としては、蛍光検出器であればよく、例えば、ＲＦ−２０ＡＸＳ（株式会社島津製作所製）等が挙げられ、これに限定されない。
【００４９】
また、図示していないが、検出器８も、制御部２０としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータ６からの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。これにより、検出器８からの検出結果が制御部２０に伝達されて、コンピュータ画面上にクロマトグラムを作成することができる。さらに、作成されたクロマトグラムを用いて、上記式（Ａ）により、試料中のプロシアニジン類の濃度を自動で算出することができる。
【００５０】
また、高速液体クロマトグラフ１０は、図１に示すように廃液瓶９及び記録計１１を有してもよい。廃液瓶９は、検出器８においてプロシアニジン類が検出された後の試料を排出するためのものである。また、記録計１１は、検出器８において検出されたクロマトグラムを記録するためのものである。
【００５１】
本実施形態のプロシアニジン類の分析システムの使用方法は、以下に示すとおりである。まず、高速液体クロマトグラフ１０の移動相Ａ液貯槽２に移動相Ａ液１を、移動相Ｂ液貯槽４に移動相Ｂ液３を充填する。次いで、コンピュータ６は、キーボードやマウスからの入力（送液速度、送液量、初期での移動相組成及び送液時間の入力）に基づき、ポンプ５を始動させるための指令を発する。次いで、ポンプ５の始動により、移動相を送液してライン中を移動相で置換する。次いで、カラムオーブン温度を３０℃以上３５℃以下程度に設定し、安定化させる。次いで、検出器８の波長を励起波長２３０ｍｍ及び蛍光波長３２１ｍｍ、又は、励起波長２７６ｎｍ及び蛍光波長３１６ｎｍに設定し、平衡化する。次いで、コンピュータ６に段階溶出パターン（移動相の組成及び送液時間等）を入力してポンプ５に指令を発し、さらに、試料注入装置６から、プロシアニジン類を含む試料を１μＬ以上１０μＬ以下程度注入し、試料中のプロシアニジン類の分離及び検出を開始する。具体的には、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように、ポンプを制御してカラムに移動相を送液する。次いで、移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して９０容量％以上９８容量％以下となるように、ポンプを制御して、カラムに即座にＢ液の濃度を上昇させた移動相を送液する。これにより、検出器８において、プロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとが検出される。この検出結果は記録計１１に伝達されて、記録計１１を用いて、検出されたプロシアニジン類の単量体のピークと、２量体以上の重合体のピークとをクロマトグラムとして記録することができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］段階溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
１．試料の調製
試料としてリンゴの抽出液を調製した。まず、凍結乾燥したリンゴをワーリングブレンダーを用いて粉末化した。次いで、粉末を１．０ｇ遠心沈殿管に量り取り、抽出溶媒（アセトン：水：酢酸＝７０：２９．５：０．５）９ｍＬを加えた。次いで、高速攪拌機を用いて１０分間撹拌した。次いで、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、１０℃、１５分間）した。次いで、遠心沈殿管を傾けずに垂直に保ったまま、ディスポーザブルスポイトを用いて、沈殿を乱さないように注意しながら、固形部以外の上清をフラスコに移した。次いで、試料残渣が残った遠心沈殿管に抽出溶媒（アセトン：水：酢酸＝７０：２９．５：０．５）８ｍＬを加えて、撹拌、遠心分離及び上清回収の抽出操作を２回繰り返した。次いで、得られた抽出液に抽出溶媒を加えて、２５ｍＬに定容した。次いで、転倒混和し、均一な溶液としてリンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
【００５４】
２．段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、以下に示す測定条件及び段階溶出パターン（表１）にて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図１に示す。
【００５５】
（測定条件）
高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製
検出器：蛍光検出器、ＲＦ−２０ＡＸＳ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＷＰ３００  Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製
カラム温度：３５℃
移動相：（Ａ液）アセトニトリル及び酢酸の混合溶液（アセトニトリル：酢酸＝９８：２）
（Ｂ液）メタノール、水及び酢酸の混合溶液（メタノール：水：酢酸＝９５：３：２）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：２３０ｎｍ
蛍光波長：３２１ｎｍ
注入量：５μＬ
【００５６】
【表１】
2019066360.tif 000002
【００５７】
また、２量体の標準液（プロシアニジンＢ２標準品、和光純薬工業社製、ＡＢ−０００１６２３１−００５）５μＬについても同様に段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによる分離及び検出を行った。以下に示す式（Ａ）を用いて、試料中のプロシアニジン類の濃度（ＣＥＸ）を算出した。結果は、５８．１μｇ／Ｌであった。
【００５８】
ＣＥＸ＝ＣＳＴＤ／ＡＥＸ×ＡＳＴＤ      ・・・（Ａ）
【００５９】
上記式（Ａ）中の各成分は、以下に示すとおりである。
ＣＥＸ…試料中のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＣＳＴＤ…試料のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
ＡＥＸ…標準液のプロシアニジン類の濃度［μｇ／Ｌ］
ＡＳＴＤ…標準液のクロマトグラムから算出されたプロシアニジン類のピーク面積
【００６０】
［比較例１］勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
【００６１】
２．勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、以下に示す測定条件及び段階溶出パターン（表２）にて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図２に示す。
【００６２】
（測定条件）
高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製
検出器：蛍光検出器、ＲＦ−２０ＡＸＳ、株式会社島津製作所製
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＷＰ３００  Ｄｉｏｌ（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、粒子径５μｍ）、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製
カラム温度：３５℃
移動相：（Ａ液）アセトニトリル及び酢酸の混合溶液（アセトニトリル：酢酸＝９８：２）
（Ｂ液）メタノール、水及び酢酸の混合溶液（メタノール：水：酢酸＝９５：３：２）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
励起波長：２３０ｎｍ
蛍光波長：３２１ｎｍ
注入量：５μＬ
【００６３】
【表２】
2019066360.tif 000003
【００６４】
［実施例１及び比較例１の考察］
図１から、段階溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーでは、単量体のピークが分析開始から５分程度に見られ、２量体以上のプロシアニジン類のピークが８分程度に見られ、１０分以内という短時間で分析が終了した。
【００６５】
一方、図２から、勾配溶出法を用いた順相高速液体クロマトグラフィーでは、単量体、２量体〜８量体まで重合度に基づいたピークが見られたが、分析完了まで６０分程度と長時間かかった。
【００６６】
以上のことから、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、短時間で容易にプロシアニジン類を分析できることが明らかとなった。また、２量体以上のプロシアニジン類の合計濃度について、本実施形態のプロシアニジン類の分析方法によれば、容易に算出できることが明らかとなった。
【００６７】
［実施例２］順相高速液体クロマトグラフィーにおける段階溶出パターンの検討
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。
【００６８】
２．順相高速液体クロマトグラフィーにおける段階溶出パターンの検討
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、上記実施例１に示す測定条件及び表３に示す段階溶出パターンにて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
2019066360.tif 000004
【００７０】
表３から、開始から１分間以上１．５分間以下に、移動相Ｂ液の濃度が移動相Ａ液及び移動相Ｂ液の合計容量に対して、７容量％程度となるように溶媒組成を調整することで、単量体と２量体以上の重合体とのピークを分離できることが明らかとなった。
【００７１】
［実施例３］
１．試料の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料を得た。また、プロシアニジン類の単量体、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体及び７量体について市販品又は化学合成品を準備し、抽出溶媒に溶解した。
【００７２】
２．段階溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィーによるプロシアニジン類の分離及び検出
次いで、「１．」で得られた試料を使用して、上記実施例１に示す測定条件及び上記表１に示す段階溶出パターンにて高速液体クロマトグラフィーを用いて分離及び検出を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。なお、図４において、Ａ：単量体、Ｂ：２量体、Ｃ：３量体、Ｄ：４量体、Ｅ：５量体、Ｆ：６量体、Ｇ：７量体、及び、Ｈ：リンゴ由来のプロシアニジン類を含む試料の結果である。
【００７３】
図４から、２量体以上の重合体について、同じ位置にピークが出現することが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本実施形態のプロシアニジン類の分析方法及び分析システムによれば、短時間でプロシアニジン類を容易に分析することができる。
【符号の説明】
【００７５】
１…移動相Ａ液、２…移動相Ａ液貯槽、３…移動相Ｂ液、４…移動相Ｂ液貯槽、５…ポンプ、６…サンプル注入装置、７…順相カラム、８…検出器、９…廃液瓶、１０…高速液体クロマトグラフ、１１…記録計、２０…制御部（コンピュータ）、１００…プロシアニジン類の分析システム。
【図１】
2019066360.tif 000005
【図２】
2019066360.tif 000006
【図３】
2019066360.tif 000007
【図４】
2019066360.tif 000008
【図５】
2019066360.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備え、
前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出しており、
分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように前記２成分移動相をカラムに通過させるプロシアニジン類の分析方法。
【請求項２】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項１に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項３】
前記固定相がジオール相である請求項１又は２に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項４】
固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、
を備え、
前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御するプロシアニジン類の分析システム。
【請求項５】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン性溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項４に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【請求項６】
前記固定相がジオール相である請求項４又は５に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法は、プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備える方法であり、前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出しており、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように前記２成分移動相をカラムに通過させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明の第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムは、固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、を備え、前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月5日(2019.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジン類を含む試料を、順相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、検出する分析工程を備え、
前記分析工程において、前記プロシアニジン類を含む試料を、固定相が充填された液体クロマトグラフィーカラム中に導入し、極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液及び極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液を含む２成分移動相を用いて、段階溶出法で、前記プロシアニジン類を分離し、検出しており、
分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように前記２成分移動相をカラムに通過させるプロシアニジン類の分析方法。
【請求項２】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項１に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項３】
前記固定相がジオール相である請求項１又は２に記載のプロシアニジン類の分析方法。
【請求項４】
固定相が充填された順相カラムを有する高速液体クロマトグラフと、
極性非プロトン溶媒から実質的になる移動相Ａ液と、
極性プロトン溶媒から実質的になる移動相Ｂ液と、
前記順相カラムに送液される前記移動相Ａ液と前記移動相Ｂ液との容量比を制御する制御部と、
を備え、
前記制御部において、分析開始から１分間以上２分間以下、前記移動相Ｂ液の濃度が前記移動相Ａ液及び前記移動相Ｂ液の合計容量に対して５容量％以上９容量％以下となるように制御するプロシアニジン類の分析システム。
【請求項５】
前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であり、
前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上である請求項４に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【請求項６】
前記固定相がジオール相である請求項４又は５に記載のプロシアニジン類の分析システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
上記第１態様に係るプロシアニジン類の分析方法において、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
上記第２態様に係るプロシアニジン類の分析システムにおいて、前記極性非プロトン溶媒が、アセトニトリル、アセトン、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、酢酸メチル、酢酸エチル及びニトロメタンからなる群より選択される１種以上であってもよく、前記極性プロトン溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールからなる群より選択される１種以上であってもよい。