(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔｒｏｐ−２発現細胞に対する免疫応答を誘発するキットの提供。【解決手段】抗Ｔｒｏｐ−２抗体断片及び抗ＣＤ３抗体断片を含む二重特異性抗体を含むキット。好ましくは、二重特異性抗体が融合タンパク質である、キット。さらに好ましくは、Ｔｒｏｐ−２抗体断片及び抗ＣＤ３抗体断片がｓｃＦｖ抗体断片である、キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｏｐ−２発現癌を有する対象に投与することで、Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発するためのキットであって、抗Ｔｒｏｐ−２抗体断片及び抗ＣＤ３抗体断片を含む二重特異性抗体を含むキット。
【請求項２】
前記二重特異性抗体が融合タンパク質である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体断片及び前記抗ＣＤ３抗体断片がｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体断片が、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１１５）；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：１１６）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：１１７）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：１１８）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：１１９）、及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：１２０）を含む、ヒト化ＲＳ７抗体の断片である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体断片が、配列番号１０８のアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び配列番号１１０のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記抗ＣＤ３抗体断片が、配列番号１１４のアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び配列番号１１２のアミノ酸配列の重鎖可変領域を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
（ｉ）インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ１、インターフェロン−λ２、及びインターフェロン−λ３からなる群から選択されるインターフェロン；（ｉｉ）チェックポイント阻害物質抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなる群から選択される少なくとも１種の治療薬をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
前記インターフェロンがインターフェロン−αである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記チェックポイント阻害物質抗体が、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＡＭＰ−２２４、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、イピリムマブ、リルルマブ、ＩＰＨ２１０１、及びトレメリムマブからなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記チェックポイント阻害物質抗体が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＫＩＲ、及びＴＩＭ３からなる群から選択される抗原に結合する、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、ｈＬＬ１−ドキソルビシン、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ２−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＭＮ−１４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ２−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＡ２０−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＰＡＭ４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ１−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、Ｐ４／Ｄ１０−ドキソルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、グレムバツモマブベドチン、ＳＡＲ３４１９、ＳＡＲ５６６６５８、ＢＩＩＢ０１５、ＢＴ０６２、ＳＧＮ−７５、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＡＭＧ−１７２、ＡＭＧ−５９５、ＢＡＹ−９４−９３４３、ＡＳＧ−５ＭＥ、ＡＳＧ−２２ＭＥ、ＡＳＧ−１６Ｍ８Ｆ、ＭＤＸ−１２０３、ＭＬＮ−０２６４、抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ、ＲＧ−７４５０、ＲＧ−７４５８、ＲＧ−７５９３、ＲＧ−７５９６、ＲＧ−７５９８、ＲＧ−７５９９、ＲＧ−７６００、ＲＧ−７６３６、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ−８５３、ＩＭＧＮ−５２９、ボルセツズマブマホドチン、及びロルボツズマブメルタンシンからなる群から選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
前記Ｔｒｏｐ−２発現癌が、食道、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、または前立腺の癌である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
第２の抗体またはその抗原結合性断片、薬物、毒素、酵素、細胞毒性薬物、抗血管新生薬、アポトーシス促進性作用物質、抗生物質、ホルモン、免疫調節薬、サイトカイン、ケモカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ホウ素化合物、及び放射性同位体からなる群から選択される治療薬をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記二重特異性抗体が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発し得るレベルまでサイトカイン産生を増大させることなく、Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発するためのものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年２月２１日出願の米国特許仮出願第６１／９４２，７５２号及び２０１４年９月１２日出願の同第６２／０４９，８２６号の、米国特許法１１９条（ｅ）に基づく利益を請求する。各優先権出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列一覧
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列一覧を含む。２０１４年１２月２９日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＢＣ１４０ＷＯ１＿ＳＬと名付けられており、そのサイズは６２，６９４バイトである。
【０００３】
分野
本発明は、Ｔｒｏｐ−２発現細胞、例えば、Ｔｒｏｐ−２＋癌細胞に対する免疫応答を誘発することができる、Ｔｒｏｐ−２及びＣＤ３を標的とする二重特異性抗体の組成物及び使用法に関する。好ましくは、上記二重特異性抗体を、１種または複数種の他の治療薬、例えば、抗体−薬物コンジュゲート、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、若しくはインターフェロン−λ、またはチェックポイント阻害物質抗体（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と組み合わせて投与する。より好ましくは、上記二重特異性抗体は、インターフェロン−αと組み合わせて投与される抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３抗体である。最も好ましくは、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、ｈＲＳ７抗体である。上記組成物及び方法を、Ｔｒｏｐ−２＋腫瘍、例えば、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、ならびに前立腺の癌、より好ましくは膵臓癌または胃癌を処置するために使用する。好ましい実施形態では、構成要素が、ヒトプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）調節サブユニットからの二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）部分と、ＡＫＡＰ（Ａ−キナーゼアンカータンパク質）からのアンカードメイン（ＡＤ）部分との間の結合相互作用を使用して一緒に結合されているＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）複合体として、上記二重特異性抗体を作製する。しかしながら、二重特異性抗体複合体を作製する他の方法も公知であり、使用してよい。上記二重特異性抗体は、罹患細胞または組織を標的とするように、エフェクターＴ細胞、単球、ＮＫ細胞、または好中球を再指導（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）して、その標的に対する免疫応答を誘発する。
【背景技術】
【０００４】
エフェクターＴ細胞を再指導して、腫瘍細胞を標的化して死滅させるための二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の使用は、前臨床及び臨床の両方で多大な将来性を示している（例えば、Ｔｏｐｐら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５１８５〜８７；Ｂａｒｇｏｕら、２００８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９７４〜７７を参照されたい）。今日までに開発されている二重特異性抗体は、Ｔ細胞動員及び活性化のためのＣＤ３に特異的な第１の結合部位と、標的とされた疾患関連抗原、例えば、ＣＤ１９に対する第２の結合部位とを含む（Ｂａｓｓａｎ、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５０９４〜９５）。二重特異性抗体は、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、標的とされた疾患細胞と直接接触させて、細胞媒介性細胞毒性を誘発する（Ｂａｓｓａｎ、２０１２）。抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体は、非常に低い濃度で、完全かつ永続的な分子緩解を、ＭＲＤ＋  ＡＬＬの成人患者の約７０％においてもたらすと報告されている（Ｔｏｐｐら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５１８５〜８７）。膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者において、脳腫瘍を処置する際に成功裏に使用されている（Ｎｉｔｔａら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９０；３５５：３６８〜３７１）。
【０００５】
白血球再指導性ｂｓＡｂは、Ｔ細胞に限定されない。ＮＫ細胞抗原ＣＤ１６及び腫瘍関連抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３）に対するｓｃＦｖを含む二重特異性キラーエンゲージャー（ｋｉｌｌｅｒ  ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＫＥ）も、強力な抗癌活性を示している（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｏｇｒａｍ  ２０１３：２４７〜５３）。他の選択肢には、三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、例えば、抗ＣＤ１６×抗ＣＤ１９×抗ＣＤ２２が含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１３；Ｇｌｅａｓｏｎら、２０１２、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２６７４-８４）。抗ＣＤ１６×抗ＣＤ３３ＢｉＫＥは、ＡＭＬ及び骨髄異形成症候群を処置するために使用された（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１３；Ｗｉｅｒｎｉｋら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：３８４４〜５５）。難治性ＡＭＬにおいて、ＣＤ１６×ＣＤ３３ＢｉＫＥは、ＮＫ細胞による強力な腫瘍細胞死滅及びサイトカイン産生をもたらした。ＡＤＡＭ１７の阻害は、ＣＤ１６×ＣＤ３３  ＢｉＫＥ応答を増強した（Ｍｉｌｌｅｒ、２０１３）。例えばＣＤ１６／ＣＤ１９／ＨＬＡ−ＤＲに対する他の三重特異性三価コンストラクトが報告されている（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、２０１２、ｍＡｂｓ  ４：４５〜５６）。
【０００６】
二重特異性抗体を生成するための多数の方法が公知である（例えば、米国特許第７，４０５，３２０号を参照されたい）。二重特異性抗体は、異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体をそれぞれ産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を伴うクアドローマ法によって生成することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；  ３０５：５３７〜５４０）。上記融合ハイブリドーマは、２本の異なる重鎖及び２本の異なる軽鎖を合成することを可能にし、これは、ランダムに会合して、１０の異なる抗体構造からなる不均一な集団をもたらし得て、そのうち、それらの１種のみ（全抗体分子の１／８に等しい）が二重特異性となり、したがって、他の形態からさらに精製する必要がある。融合ハイブリドーマは多くの場合に、親ハイブリドーマよりも細胞遺伝学的に安定性が低く、産生細胞系の発生をより困難にしている。
【０００７】
二重特異性抗体を生成するための別の方法は、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用して、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に係留し、得られたハイブリッドコンジュゲートが、２種の異なる標的に結合するようにする（Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１４：６２８〜６３１；Ｐｅｒｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１６：３５４〜３５６）。この手法によって生成された二重特異性抗体は本質的に、組織にゆっくりと拡散して、循環から迅速に除去される２個のＩｇＧ分子のヘテロコンジュゲートである。２個の親モノクローナル抗体のそれぞれを個々の半分子に還元し、次いで、それらを混合し、再酸化して、ハイブリッド構造を得ることによっても、二重特異性抗体を生成することができる（Ｓｔａｅｒｚ及びＢｅｖａｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８６；８３：１４５３〜１４５７）。代替の手法は、適切なリンカーを使用して、２個または３個の別々に精製されたＦａｂ’断片を化学的に架橋することを伴う。これらの化学的方法はすべて、高い製造コスト、面倒な生成プロセス、広範な精製ステップ、低い収率（＜２０％）、及び不均質な生成によって、商業的開発には望ましくない。
【０００８】
組換えＤＮＡ技術によって生成された抗体の別個のＶＨ及びＶＬドメインは、相互に対になって、結合能力を有する二量体（組換えＦｖ断片）を形成し得る（米国特許第４，６４２，３３４号）。しかしながら、そのような非共有結合で会合している分子は生理学的条件下で十分に安定ではなく、実用にはならない。同源ＶＨ及びＶＬドメインは、適切な組成及び長さのペプチドリンカー（通常、１２超のアミノ酸残基からなる）によって連結され、結合活性を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し得る。リンカー長さを変えることによって、多価及び多重特異性のｓｃＦｖベースの作用物質を製造する方法は、米国特許第５，８４４，０９４号、米国特許第５，８３７，２４２号、及びＷＯ９８／４４００１において開示された。多価及び多重特異性のｓｃＦｖベースの作用物質の発生に多くの場合に伴う、多く見られる問題は、低い発現レベル、不均質な生成物、凝集物をもたらす溶液中での不安定性、血清中での不安定性、及び親和性の減退である。
【０００９】
ＣＤ３及びＣＤ１９を標的とするいくつかの二重特異性抗体が臨床開発中である。ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）として公知のｓｃＦｖベースの二重特異性抗体コンストラクトは、柔軟なリンカーを介してタンデムで連結された同源ＶＨ及びＶＬによってそれぞれ与えられた２つの抗原結合特異性を含有する単一ポリペプチドを使用する（例えば、Ｎａｇｏｒｓｅｎら、２００９、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＆  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５０：８８６〜９１；Ａｍａｎｎら、２００９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：４５３〜６４；Ｂａｅｕｅｒｌｅ及びＲｅｉｎｈａｒｄｔ、２００９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４９４１〜４４を参照されたい）。ＤＡＲＴ（登録商標）（Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）と呼ばれる別の二重特異性抗体は、ジスルフィド安定化二重特異性抗体設計を利用する（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２〜５１；Ｖｅｒｉら、２０１０、関節炎  Ｒｈｅｕｍ  ６２：１９３３〜４３を参照されたい）。ＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（登録商標）は両方とも、それらの小さいサイズ（約５５ｋＤａ）によって、急速な血液クリアランスを示し、二重特異性抗体の治療レベルを維持するためには頻繁な投与を必要とする。
【００１０】
インターフェロンは、抗腫瘍及び抗微生物宿主防御において重要な役割を果たし、癌及び感染症のための治療薬として広く調査されている（Ｂｉｌｌｉａｕら、２００６、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １７：３８１〜４０９；Ｐｅｓｔｋａら、２００４、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２０２：８〜３２）。Ｉ及びＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β及びγ）を用いるかなりの努力にも関わらず、患者における短時間の循環半減期、全身毒性、及び最適以下の応答によって、臨床状況におけるそれらの使用は限定されている（Ｐｅｓｔｋａら、２００４、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２０２：８〜３２；Ｍｉｌｌｅｒら、２００９、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１８２：６９〜７９）。２００３年初めにおけるＩＦＮ−λファミリーの発見は、これらの満たされていない臨床的適用のための代替となるＩＦＮ作用物質を開発する刺激的で新たな機会をもたらした（Ｋｏｔｅｎｋｏら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６９〜７７；Ｓｈｅｐｐａｒｄら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６３〜８）。
【００１１】
ＩＦＮの治療有効性は、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、悪性黒色腫、濾胞性リンパ腫、尖圭コンジローマ、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、ならびにＢ型及びＣ型慢性肝炎を処置するためのＩＦＮ−α２；多発性硬化症を処置するためのＩＦＮ−β；ならびに慢性肉芽種性疾患及び悪性骨化石症を処置するためのＩＦＮ−γの承認によって、今日までに確認されている。この群の自己分泌及びパラ分泌サイトカインに対する広範な文献にも関わらず、健康及び疾患に対するそれらの機能は、より有効で、新規の形態が臨床で導入されていることを含め、さらに明瞭になりつつある（Ｐｅｓｔｋａ、２００７、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ２８２：２００４７〜５１；Ｖｉｌｃｅｋ、２００６、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：３４３〜４８）。様々なインターフェロンと抗体ベースの治療との組合せの効果も、まだ調査中である。
【００１２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞毒性薬物を標的細胞、例えば癌細胞に標的として送達することを可能にする治療用コンストラクトの強力な群である。標的化機能によって、これらの化合物は、同じく全身送達される作用物質と比較してかなり高い治療指数を示す。ＡＤＣは、インタクトな抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖｓとして開発されている。抗体または断片は、生理学的条件下では安定であるが、標的細胞内部では切断され得るリンカーを介して、１つまたは複数の薬物のコピーに連結される。治療用途について承認されたＡＤＣには、ＡＭＬのためのゲムツズマブオゾガマイシン（後に、市場から回収）、ＡＬＣＬ及びホジキンリンパ腫のためのブレンツキシマブベドチン（ｖｅｄｏｔｉｎ）、ならびにＨＥＲ２陽性転移乳癌のためのトラスツズマブエムタンシンが含まれる（Ｖｅｒｍａら、２０１２、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６７：１７８３〜９１；Ｂｒｏｓｓら、２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：１４９０〜９６；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１４５８〜６５）。多数の他の候補ＡＤＣ、例えば、イノツズマブオゾガマイシン（Ｐｆｉｚｅｒ）、グレムバツモマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｏｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＳＡＲ５６６５８（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＡＭＧ−１７２（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ−５９５（Ａｍｇｅｎ）、ＢＡＹ−９４−９３４３（Ｂａｙｅｒ）、ＢＩＩＢ０１５（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ＢＴ０６２（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＳＧＮ−７５（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ボルセツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＡＢＴ−４１４（ＡｂｂＶｉｅ）、ＡＳＧ−５ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＳＧ−２２ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＳＧ−１６Ｍ８Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＩＭＧＮ−５２９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ−８５３（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＭＤＸ−１２０３（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＬＮ−０２６４（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、ＲＧ−７４５０（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７４５８（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９３（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９８（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９９（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７６００（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７６３６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ロルボツズマブメルタンシン（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ミラツズマブ−ドキソルビシン（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１３０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、及びプロ−２−ピロリノドキソルビシンの抗体コンジュゲートが現在、治験中である（例えば、Ｌｉら、２０１３、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｈｅｒ  ７：１７８〜８４；Ｆｉｒｅｒ  ＆  Ｇｅｌｌｅｒｍａｎ、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５：７０；Ｂｅｃｋら、２０１０、Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ  １０：３２９〜３９；Ｍｕｌｌａｒｄ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：３２９、米国特許仮出願第６１／７６１，８４５号を参照されたい）。低い全身毒性で強力な抗癌作用物質として作用するＡＤＣの可能性によって、それらは、腫瘍量を低減するために単独で、または補助的治療として使用され得る。
【００１３】
免疫療法のための別の有望な手法は、免疫チェックポイントタンパク質に対するアンタゴニスト抗体の使用に関する（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜６４）。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、抗原刺激に対する免疫応答の期間及び規模をモジュレートするために作用する免疫系機能のための内因性阻害経路として機能する（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２）。しかしながら、腫瘍組織及びおそらくある種の病原体は、宿主免疫応答の有効性を低減するようにチェックポイントシステムを組み入れ得、腫瘍増殖及び／または慢性感染をもたらす（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜６４；Ｎｉｒｓｃｈｌ  ＆  Ｄｒａｋｅ、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：４９１７〜２４を参照されたい）。チェックポイント分子には、ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４）、ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子−３）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質−３）、及び他の数種が含まれる（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜６４；Ｎｉｒｓｃｈｌ  ＆  Ｄｒａｋｅ、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：４９１７〜２４）。チェックポイントタンパク質のいくつか（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体が治験中であり、標準的な処置に抵抗性である腫瘍に対して予測されていなかった有効性を示している。
【００１４】
より長いＴ１／２、より良好な薬物動態特性、増大したｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、及び／または改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有する改善された二重特異性抗体複合体を生成する方法及び組成物が必要とされている。さらに、様々な疾患、例えば、Ｔｒｏｐ−２＋癌に対する免疫応答を誘発することを対象とした処置の有効性を改善するための併用療法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、Ｔｒｏｐ−２＋細胞、例えば、Ｔｒｏｐ−２＋癌細胞が関与する疾患を処置するために使用する二重特異性抗体に関する。Ｔｒｏｐ−２は、多数の種類の充実性腫瘍、例えば、食道、膵臓、肺、胃、結腸及び直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、子宮頸、腎臓、ならびに前立腺の癌において過剰発現される。好ましくは、上記二重特異性抗体は、胃癌または膵臓癌を治療するために使用される。上記二重特異性抗体の投与は、Ｔｒｏｐ−２＋である細胞に対する免疫応答を誘発する。Ｔｒｏｐ−２は、一部の正常な組織においても発現されるが（例えば、Ｓｔｅｐａｎら、２０１１、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５９：７０１〜１０）、下記の例によって、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、許容可能な毒性のみで、動物モデル系及びヒト対象の両方においてｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができることが実証されている。他の好ましい実施形態では、対象への二重特異性抗体の投与は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発するであろうサイトカインレベルの上昇を伴うことなく、Ｔｒｏｐ−２＋癌細胞に対する免疫応答を誘発する。代替の好ましい実施形態では、上記二重特異性抗体は、Ｔｒｏｐ−２＋癌細胞とＴ細胞との間で細胞表面抗原のトロゴサイトーシスを誘発する。
【００１６】
好ましい実施形態では、上記二重特異性抗体は、Ｔｒｏｐ−２及びＣＤ３に対する結合部位を含有する。しかしながら、ＣＤ３のほかにも、他のＴ細胞または白血球抗原を標的としてもよい。例示的なＴ細胞抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、及びＣＤ９０からなる群から選択される。ＮＫ細胞上で発現される例示的な抗原は、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＡＤＡＭ１７、ＫＩＲ、及びＣＤ１３７からなる群から選択される。例示的な単球抗原は、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲアルファ鎖、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、及びＣＤ８９からなる群から選択される。例示的な好中球抗原は、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１７７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、及びＳＬＣ４４Ａ２からなる群から選択される。好ましくは、Ｔ細胞抗原はＣＤ３であるか、またはＮＫ細胞抗原はＣＤ１６である。
【００１７】
代替の実施形態では、Ｔｒｏｐ−２のほかにも、他の腫瘍関連抗原を標的としてもよい。標的としてもよい腫瘍関連抗原には、限定されないが、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ−β、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、発癌��伝子マーカー、ならびに発癌遺伝子生成物が含まれる（例えば、Ｓｅｎｓｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６、１２：５０２３〜３２；Ｐａｒｍｉａｎｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７、１７８：１９７５〜７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５、５４：１８７〜２０７を参照されたい）。
【００１８】
使用してもよい例示的な抗ＴＡＡ抗体には、限定されないが、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、米国特許出願公開第１２／７２２，６４５号、２０１０年３月１２日出願）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６、米国特許第７，５４１，４４０号）、Ａｂ１２４及びＡｂ１２５（抗ＣＸＣＲ４、米国特許第７，１３８，４９６号）が含まれ、それぞれ引用した特許または出願の実施例の節は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１９】
様々な病態を処置するために使用してもよい代替の抗体には、限定されないが、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、アバゴモマブ（抗ＣＡ−１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、ベンラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ、米国特許出願公開第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ、ＷＯ２００９／１３０５７５）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、アタリズマブ（ａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）；抗ＴＮＦ−α抗体、例えば、ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉら、２０１１、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１〜８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；抗ＣＤ３８抗体、例えば、ＭＯＲ０３０８７（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＡＧ）、ＭＯＲ２０２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ３８（Ｇｅｎｍａｂ）、またはダラツムマブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）が含まれる。
【００２０】
好ましくは、上記二重特異性抗体を、１種または複数種の他の治療薬、例えば、抗体、抗体断片、ペプチド、薬物、毒素、化学療法薬、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート薬、ホウ素化合物、光活性薬剤、色素、及び放射性同位体と組み合わせて投与する。より好ましくは、追加の治療薬は、抗体−薬物コンジュゲート、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、若しくはインターフェロン−λ、またはアンタゴニストチェックポイント阻害物質抗体である。最も好ましくは、治療薬はインターフェロン−αである。
【００２１】
下記の実施例において開示する白血球再指導性ｂｓＡｂのための例示的な設計は、抗ＣＤ３ｓｃＦｖを、抗ＣＤ１９Ｆ（ａｂ）２と組み合わせて、Ｂ細胞を特異的に標的とする、（１９）−３ｓと名付けられたコンストラクトを形成した。下で詳細に論述する、抗ＣＤ３を、他の腫瘍関連抗原に対する抗体断片と組み合わせた他のｂｓＡｂは、様々な充実性腫瘍の標的化白血球免疫療法において使用される。この設計の利点には、腫瘍細胞への二価結合、迅速な腎臓クリアランスを防ぐ比較的大きなサイズ（約１３０ｋＤａ）、及び強力な白血球媒介性細胞毒性が含まれる。上記ｂｓＡｂは、白血球と同源標的細胞との間の免疫シナプスの形成を媒介し、標的細胞の存在下で白血球活性化及び増殖を誘発し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的細胞の強力な白血球媒介性死滅を再指導し、かつｉｎ  ｖｉｖｏでヒト腫瘍の増殖を阻害する。
【００２２】
好ましい実施形態は、比較的長いＴ１／２、より良好な薬物動態特性、及び高いｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を有する、三価ＤＮＬ（商標）複合体として生成された白血球再指導性二重特異性抗体に関する。ＡＫＡＰからのＡＤ部分に結合した、ヒトＰＫＡ調節サブユニットＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、またはＲＩＩβからのＤＤＤ部分の二量体を含むＤＮＬ（商標）複合体を生成及び使用するための方法は、周知である（例えば、それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，６６６，４００号；同第７，９０６，１１８号；同第７，９０１，６８０号；同第８，００３，１１１号、及び同第８，０３４，３５２号を参照されたい）。異なるエフェクター部分、例えば、抗体または抗体断片を、ＤＤＤ及びＡＤ部分に結合することによって、エフェクターの実際上任意の組合せを含むＤＮＬ（商標）複合体を構築し、使用することができる。
【００２３】
使用する抗体は、様々なアイソタイプ、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってよく、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ及び定常領域配列を含む。抗体またはその断片は、キメラヒト−マウス、ヒト化（ヒトフレームワーク及びマウス超可変（ＣＤＲ）領域）、または完全ヒト、さらには、それらの変形、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４〜１５５７）によって記載されているとおりの半ＩｇＧ４抗体（「ユニボディ」と称される）であってよい。より好ましくは、ヒト対象に投与した場合に、免疫原性の低下をもたらし得る特異的アロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように、抗体またはその断片を設計または選択することができる。投与に好ましいアロタイプには、非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）、例えば、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２、またはＧ１ｍ３，１，２が含まれる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２、及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される。
【００２４】
他の好ましい実施形態は、１種または複数種のチェックポイント阻害物質抗体と組み合わせた白血球再指導性複合体の組成物及び／または使用に関する。そのような抗体は、チェックポイント阻害物質機能について拮抗性である。多くのそのような抗体、例えば、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＤＸ−１１０５（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、及びトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が当技術分野で公知である。抗ＫＩＲ抗体、例えば、リルルマブ（ｌｉｒｌｕｍａｂ）（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）及びＩＰＨ２１０１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）は、ＮＫ細胞において同様の機能を果たし得る。任意の公知のチェックポイント阻害物質抗体を、他の作用物質の１種または複数種と組み合わせて使用することができる。免疫賦活性抗体との併用療法は、例えば、腫瘍細胞に対する有効性を増強することが報告されている。Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａら（２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：６１５１〜６２）は、抗ＰＤ−Ｌ１（１０Ｂ５）抗体と抗ＣＤ１３７（１Ｄ８）及び抗ＯＸ４０（ＯＸ８６）抗体との組み合わせが、肝細胞癌のトランスジェニックマウスモデルにおいて、有効性の増強をもたらすことを示した。抗ＣＴＬＡ４及び抗ＰＤ１抗体の組合せも、高度に有効であると報告されている（Ｗｏｌｃｈｏｋら、２０１３、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：１２２〜３３）。リツキシマブと抗ＫＩＲ抗体、例えば、リルルマブ（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）またはＩＰＨ２１０１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）との組合せも、造血性腫瘍に対してさらに有効であった（Ｋｏｈｒｔら、２０１２）。主題の併用療法には、免疫賦活性、抗腫瘍、または抗感染因子である多数の抗体との組合せも含まれ得ることを、当業者は了解するであろう。
【００２５】
組合わせて使用することができる別の作用物質は、インターフェロンである。使用するインターフェロンは、当技術分野で公知であり、それらには、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ１、インターフェロン−λ２、またはインターフェロン−λ３が含まれ得る。好ましくは、インターフェロンはインターフェロン−αである。対象のインターフェロンを、遊離インターフェロン、ペグ化インターフェロン、インターフェロン融合タンパク質、または抗体にコンジュゲートされたインターフェロンとして投与することができる。
【００２６】
代替の実施形態では、上で論述した免疫調節作用物質の１種または複数種を、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と組み合わせて使用することができる。ＡＤＣは、重大な全身毒性を伴うことなく、腫瘍量を低減するために特に有効であり、白血球再ターゲティングｂｓＡｂ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体によって誘発される免疫応答の有効性を改善するように作用し得る。使用する例示的なＡＤＣには、ＡＭＬのためのゲムツズマブオゾガマイシン（後に、市場から回収）、ＡＬＣＬ及びホジキンリンパ腫のためのブレンツキシマブベドチン、ならびにＨＥＲ２陽性転移乳癌のためのトラスツズマブエムタンシンを含む、治療用途について承認されたＡＤＣが含まれ得る（Ｖｅｒｍａら、２０１２、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６７：１７８３〜９１；Ｂｒｏｓｓら、２００１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：１４９０〜９６；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１４５８〜６５）。多数の他の候補ＡＤＣ、例えば、イノツズマブ  オゾガマイシン（Ｐｆｉｚｅｒ）、グレムバツモマブベドチン（Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＡＲ３４１９（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＳＡＲ５６６５８（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＡＭＧ−１７２（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ−５９５（Ａｍｇｅｎ）、ＢＡＹ−９４−９３４３（Ｂａｙｅｒ）、ＢＩＩＢ０１５（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ＢＴ０６２（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＳＧＮ−７５（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ボルセツズマブマホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＡＢＴ−４１４（ＡｂｂＶｉｅ）、ＡＳＧ−５ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＳＧ−２２ＭＥ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＳＧ−１６Ｍ８Ｆ（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＩＭＧＮ−５２９（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＩＭＧＮ−８５３（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ＭＤＸ−１２０３（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＬＮ−０２６４（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、ＲＧ−７４５０（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７４５８（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９３（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９８（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７５９９（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７６００（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＲＧ−７６３６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ロルボツズマブメルタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ）、ミラツズマブ−ドキソルビシン（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、ＩＭＭＵ−１３０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）、及びＩＭＭＵ−１３２（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）が現在、治験中である（例えば、Ｌｉら、２０１３、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ  Ｔｈｅｒ  ７：１７８〜８４；Ｆｉｒｅｒ  ＆  Ｇｅｌｌｅｒｍａｎ、Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５：７０；Ｂｅｃｋら、２０１０、Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ  １０：３２９〜３９；Ｍｕｌｌａｒｄ、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １２：３２９．を参照されたい）。好ましくは、ＡＤＣ��免疫調節薬と組み合わせて使用する場合、そのＡＤＣを、免疫調節薬の前に投与する。
【００２７】
対象の作用物質を、免疫応答を増強するために、１種または複数種の他の免疫調節薬と組み合わせて投与することができる。免疫調節薬には、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−β、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−λ、「Ｓ１因子」と名付けられた幹細胞成長因子、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、瀘胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、ＮＧＦ−β、血小板−成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、またはリンホトキシンが含まれ得る。ある種の実施形態では、白血球再指導性二重特異性抗体または抗体断片を、サイトカインなどの免疫調節薬に結合させることができる。サイトカイン複合体は、例えば、それぞれの実施例節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，９０６，１１８号及び同第８，０３４，３５２２号において開示されている。
【００２８】
次の図面は、本明細書の一部を成しており、本発明のある種の実施形態をさらに説明するために含まれている。本明細書に示されている具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによって、実施形態をより良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】抗ＣＤ１９Ｆ（ａｂ）２×抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含むＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）複合体の形成の模式図である。
【図２Ａ】（１９）−３ｓによって媒介されたＤａｕｄｉバーキットリンパ腫とＴ細胞との間の免疫シナプスの形成。新たに単離されたＴ細胞を、２．５：１のＥ：Ｔ比でＤａｕｄｉ細胞と組み合わせた。細胞を０、１、または５μｇ／ｍＬの（１９）−３ｓで３０分間にわたって室温で処理し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ７−ＡＰＣを使用して、それぞれＤａｕｄｉ細胞及びＴ細胞を特定した。同時結合が、ＣＤ２０＋／ＣＤ７＋イベントの％として示された。（１９）−３ｓで処理した後に、フローイベントの４５．５％がＣＤ２０／ＣＤ７二重陽性であったが、これは、シナプス形成された（ｓｙｎａｐｓｅｄ）Ｄａｕｄｉ及びＴ細胞を示していた。
【図２Ｂ】（１９）−３ｓ抗体の不在を除いて、条件は、図２（Ａ）においてのとおりであった。図２（Ａ）と比較して、抗体を含まないと、フローイベントの２％のみが、ＣＤ２０／ＣＤ７二重陽性であった。
【図２Ｃ】（１９）−３ｓの添加が、Ｄａｕｄｉ細胞とＴ細胞との９０％超の会合をもたらした。
【図３Ａ】Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＤａｕｄｉ（Ｂ細胞）を１：１の比で組合せ、０．１μｇ／ｍＬ（１９）−３ｓで３０分間にわたって処理し、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣで染色し、その後、蛍光顕微鏡によって分析した。
【図３Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＤａｕｄｉ（Ｂ細胞）を１：１の比で組合せ、０．１μｇ／ｍＬ（１９）−３ｓで３０分間にわたって処理し、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ３−ＰＥで染色し、その後、蛍光顕微鏡によって分析した。
【図３Ｃ】図３Ａ及び３Ｂの合併画像は、緑色染色されたＤａｕｄｉ細胞と、赤色染色されたＪｕｒｋａｔ細胞との間のシナプス形成を明らかにしている。
【図３Ｄ】（１９）−３ｓの不在下では、シナプス形成が明白ではなかった。
【図４】（１９）−３ｓの漸増濃度の関数とした、Ｄａｕｄｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の（１９）−３ｓ媒介性細胞−細胞会合の用量応答分析。
【図５】Ａ：ＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（商標）によって媒介される細胞−細胞会合の比較を示す。ＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（商標）についてのデータは、Ｍｏｏｒｅら（２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２〜４５５１から取得した。Ｂ：（１９）−３ｓによって媒介される細胞−細胞会合の比較。
【図６】Ａ：（１９）−３ｓ対照ｂｓＡｂによって媒介されるＴ細胞とＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞との間のシナプス形成。そのｂｓＡｂの存在下で、ＣＦＳＥ標識Ｃａｐａｎ−１細胞をＰＫＨ２６標識Ｊｕｒｋａｔと共に同時インキュベートした。Ｂ：（Ｍ１）−３ｓ  ＭＵＣ５ＡＣ  ｂｓＡｂによって媒介されるＴ細胞とＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞との間のシナプス形成。そのｂｓＡｂの存在下で、ＣＦＳＥ標識Ｃａｐａｎ−１細胞をＰＫＨ２６標識Ｊｕｒｋａｔと共に同時インキュベートした。Ｃ：（Ｅ１）−３ｓ  ＴＲＯＰ−２ターゲティングｂｓＡｂによって媒介されるＴ細胞とＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞との間のシナプス形成。そのｂｓＡｂの存在下で、ＣＦＳＥ標識Ｃａｐａｎ−１細胞をＰＫＨ２６標識Ｊｕｒｋａｔと共に同時インキュベートした。
【図７Ａ】（１９）−３ｓによるＴ細胞活性化。ＣＤ６９発現のアップレギュレーションは、Ｔ細胞活性化における初期事象である。ＰＢＭＣと組み合わせたＤａｕｄｉ細胞を指示抗体で終夜処理し、抗ＣＤ３−ＰＥ及び抗ＣＤ６９−ＡＰＣで染色し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。前方散乱対側方散乱によるＴ細胞のゲーティング及び抗ＣＤ３染色の後に、ＣＤ６９発現を評価した。Ｄａｕｄｉ細胞と、等数のＰＢＭＣとの組合せは、ＣＤ６９＋Ｔ細胞１．６％をもたらした。３ｎｇ／ｍＬ（１９）−３ｓの添加は、ＣＤ６９＋Ｔ細胞２７％を誘発した。非標的化Ｆ（ａｂ）２と融合したＯｋｔ３−ｓｃＦｖ−ＡＤ２モジュールを含む対照コンストラクト［（Ｍ１）−３ｓ］も、ｈＡ１９−Ｆａｂ−ＤＤＤ２モジュールも、Ｔ細胞活性化を誘発しなかった。
【図７Ｂ】（１９）−３ｓによるＴ細胞活性化。精製Ｔ細胞と組み合わせたＤａｕｄｉ細胞を指示抗体で終夜処理し、抗ＣＤ３−ＰＥ及び抗ＣＤ６９−ＡＰＣで染色し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。前方散乱対側方散乱によるＴ細胞のゲーティング及び抗ＣＤ３染色の後に、ＣＤ６９発現を評価した。（Ｍ１）−３ｓまたはｈＡ１９−Ｆａｂ−ＤＤＤ２でのＤａｕｄｉ細胞及び精製Ｔ細胞の処理は、未処置の細胞混合物と比較して、ＣＤ６９＋Ｔ細胞の数を増大させなかった（４％未満）。一方、（１９）−３ｓは、確固たるＴ細胞活性化を誘発し、ＣＤ６９＋細胞８０％を生じた。
【図７Ｃ】（１９）−３ｓによるＴ細胞活性化。精製Ｔ細胞のみを指示抗体で終夜処理し、抗ＣＤ３−ＰＥ及び抗ＣＤ６９−ＡＰＣで染色し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。前方散乱対側方散乱によるＴ細胞のゲーティング及び抗ＣＤ３染色の後に、ＣＤ６９発現を評価した。Ｄａｕｄｉ（標的）細胞を添加しないと、（１９）−３ｓは、ＣＤ６９発現及びＴ細胞活性化を誘発しなかった。これらの結果は、Ｔ細胞活性化にはＴ細胞と標的細胞との間の（１９）−３ｓ−媒介性シナプス形成が必要であり、かつ十分であることを実証している。
【図８】Ａ：（１９）−３ｓによるＴ細胞増殖の誘発。ＰＢＭＣを、３ｎＭまたは３０ｐＭの（１９）−３ｓと共にインキュベートし、ＩＬ−２／ＰＨＡ陽性対照及び（１４）−３ｓ（非標的結合対照）と比較した。Ｂ：（１９）−３ｓによるＴ細胞増殖の誘発。Ｔ細胞増殖は、Ｂ細胞を欠失したＰＢＭＣ中では観察されず、標的細胞（Ｂ細胞）が、Ｔ細胞活性化及び増殖には必要であることを示す。
【図９Ａ】（１９）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。Ｎａｌｍ−６、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＮａｍａｌｗａ癌細胞に対する細胞毒性についての用量反応曲線を（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）ｂｓＡｂ複合体について決定した。
【図９Ｂ】（１９）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。Ｎａｌｍ−６、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、及びＮａｍａｌｗａ癌細胞に対する細胞毒性についての用量反応曲線を、（１４）−３ｓ（非標的化）ＤＮＬ（商標）ｂｓＡｂ複合体で決定した。
【図９Ｃ】２人の異なるドナーから得られたＰＢＭＣまたはＴ細胞、及びＮａｌｍ−６癌細胞を使用しても、一致する結果が得られた。
【図１０Ａ】（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂによって誘発されたＮａｍａｌｗａ細胞に対する細胞毒性について決定した。
【図１０Ｂ】（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂによって誘発されたＪｅｋｏ細胞に対する細胞毒性について決定した。
【図１０Ｃ】（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂによって誘発されたＤａｕｄｉ細胞に対する細胞毒性について決定した。
【図１１Ａ】充実性腫瘍細胞系におけるＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、非標的化（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂと比較して、（１４）−３ｓ  ｂｓＡｂでのＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌細胞系に対する細胞毒性について決定した。
【図１１Ｂ】充実性腫瘍細胞系におけるＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、非標的化（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂと比較して、（Ｅ１）−３ｓ  ｂｓＡｂでのＣａｐａｎ−１膵臓腺癌細胞系に対する細胞毒性について決定した。
【図１１Ｃ】充実性腫瘍細胞系におけるＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。用量反応曲線を、非標的化（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂと比較して、（Ｅ１）−３ｓ及び（１５）−３ｓ  ｂｓＡｂでのＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞系に対する細胞毒性について決定した。
【図１２】癌細胞系におけるＴ細胞再指導性ｂｓＡｂでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性データのまとめ。
【図１３Ａ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞）で再構成され、かつ矢印によって示されているとおりに投与される（１９）−３ｓで１週間だけ処置されたＲａｊｉバーキットリンパ腫（１×１０６細胞）異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス。未処置マウスを対照とした。
【図１３Ｂ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞）で再構成され、かつ矢印によって示されているとおりに投与される（１９）−３ｓで１週間だけ処置されたＲａｊｉバーキットリンパ腫（１×１０６細胞）異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス。細胞を、１３０μｇの単回投与で処置した。
【図１３Ｃ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞）で再構成され、かつ矢印によって示されているとおりに投与される（１９）−３ｓで１週間だけ処置されたＲａｊｉバーキットリンパ腫（１×１０６細胞）異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス。細胞を、１回の投与あたり４３μｇで３回処置した。
【図１３Ｄ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化。ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞）で再構成され、かつ矢印によって示されているとおりに投与される（１９）−３ｓで１週間だけ処置されたＲａｊｉバーキットリンパ腫（１×１０６細胞）異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス。細胞を、１回の投与あたり２６μｇで５回処置した。
【図１４Ａ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片を、図１３に対する説明文において示したとおりに調製した。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。図１４Ａは、未処置の対照を示している。
【図１４Ｂ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。細胞を、静脈内投与される（１９）−３ｓの１回の投与あたり１３０μｇで２回処置した。
【図１４Ｃ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。細胞を、皮下投与される（１９）−３ｓの１回の投与あたり１３０μｇで２回処置した。
【図１４Ｄ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。細胞を、静脈内投与される（１９）−３ｓの１回の投与あたり６５μｇで４回処置した。
【図１４Ｅ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。細胞を、静脈内投与される（１９）−３ｓの１回の投与あたり４３μｇで６回処置した。
【図１４Ｆ】（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂを使用しての、Ｒａｊｉリンパ腫異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ再標的化に対する繰り返し投与の効果。（１９）−３ｓを、矢印によって示されているとおりに投与した。細胞を、静脈内投与される対照（Ｍ１）−３ｓの１回の投与あたり４３μｇで６回処置した。
【図１５Ａ】充実性腫瘍異種移植片におけるＴ細胞再標的化ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片をＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌で調製した。マウスに、ｂｓＡｂなしでＴ細胞のみを投与した。
【図１５Ｂ】充実性腫瘍異種移植片におけるＴ細胞再標的化ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片をＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌で調製した。マウスを、示されているとおりに（Ｅ１）−３ｓ  ｂｓＡｂで処置した。
【図１５Ｃ】充実性腫瘍異種移植片におけるＴ細胞再標的化ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片をＣａｐａｎ−１膵臓癌で調製した。マウスに、ｂｓＡｂなしで、ＰＢＭＣのみを投与した。
【図１５Ｄ】充実性腫瘍異種移植片におけるＴ細胞再標的化ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片をＣａｐａｎ−１膵臓癌で調製した。マウスを、示されているとおりに（１４）−３ｓ  ｂｓＡｂで処置した。
【図１６Ａ】インターフェロン−αの存在または不在下での（Ｅ１）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体による腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＣａｐａｎ−１膵臓癌異種移植片を、インターフェロン−αを添加して、または添加せずに抗ＴＲＯＰ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂで処置した。インターフェロン−αをＴＲＯＰ−２標的化ＤＮＬ（商標）複合体の形態で添加した。
【図１６Ｂ】インターフェロン−αの存在または不在下での（Ｅ１）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体による腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＣａｐａｎ−１膵臓癌異種移植片を、インターフェロン−αを添加して、または添加せずに抗ＴＲＯＰ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂで処置した。インターフェロン−αを市販のＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグインターフェロンアルファ−２ａ）として添加した。
【図１７】インターフェロン−αと共に、またはそれを伴わずに、（Ｅ１）−３ｓで処置されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの生存曲線。対照は処置しなかったか、またはインターフェロン−αのみで処置した。
【図１８】ＴＦ１２対照と比較しての、インターフェロン−αの存在または不在下での（Ｅ１）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体による腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害。未処置対照、ＴＦ１２対照、またはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）のみと比較して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＣａｐａｎ−１膵臓癌異種移植片を、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）として添加されるインターフェロン−αを添加して、または添加せずに抗ＴＲＯＰ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂで処置した。
【図１９】インターフェロン−α（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））と共に、またはそれを伴わずに（Ｅ１）−３ｓで処置されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの生存曲線。対照は処置しなかったか、またはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独若しくはＴＦ１２単独で処置した。
【図２０】ＴＦ１２対照と比較しての、インターフェロン−αの存在または不在下での（Ｅ１）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体による腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害。未処置対照、ＴＦ１２対照、またはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独と比較して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌異種移植片を、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）として添加されるインターフェロン−αを添加して、または添加せずに抗ＴＲＯＰ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂで処置した。
【図２１】インターフェロン−α（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））と共に、またはそれを伴わずに（Ｅ１）−３ｓで処置された、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでの生存曲線。対照は処置しなかったか、またはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独若しくはＴＦ１２単独で処置した。
【図２２】未完成Ｅ１−３ポリペプチドの概略表示。ＬＰ、成熟タンパク質中で除去されるリーダーペプチド；ＶＨ、重鎖可変ドメイン、ＶＫ、カッパ軽鎖可変ドメイン、Ｌ１、リンカーペプチド１；Ｌ２、リンカーペプチド２；Ｌ３、リンカーペプチド３；６Ｈ、ヘキサ−ヒスチジン。
【図２３Ａ】ＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌充実性腫瘍細胞系のｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞再指導死滅。
【図２３Ｂ】Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓癌充実性腫瘍細胞系のｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞再指導死滅。
【図２３Ｃ】ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌充実性腫瘍細胞系のｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞再指導死滅。
【図２４】ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｎ８７胃癌のｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞再指導治療。
【図２５】（Ｅ１）−３ｓによって媒介される免疫シナプス形成及び両方向トロゴサイトーシス。精製Ｔ細胞を、ＢｘＰＣ３細胞と５：１の比で混合し、０．１ｎｍｏｌ／Ｌの指示ｂｓＡｂと共に６０分間にわたってインキュベートし、その後、抗Ｔｒｏｐ−２  ＭＡｂ  Ｃ５１８及びＧＡＭ−Ｆｃ−ＦＩＴＣで染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析したが、非コンジュゲートＴ細胞及びＢｘＰＣ３細胞を、前方散乱対側方散乱によって初めにゲーティングした。ＢｘＰＣ３細胞からＴ細胞へのＴｒｏｐ−２のトロゴサイトーシスは、特に（Ｅ１）−３ｓを含む細胞混合物において、Ｔｒｏｐ−２陽性非コンジュゲートＴ細胞に対するパーセンテージとして示されるＴ細胞上でのＴｒｏｐ−２の検出によって明らかであった。
【図２６】（Ｅ１）−３ｓによって媒介される免疫シナプス形成及び両方向トロゴサイトーシス。精製Ｔ細胞を、ＢｘＰＣ３細胞と５：１の比で混合し、０．１ｎｍｏｌ／Ｌの指示ｂｓＡｂと共に６０分間にわたってインキュベートし、その後、抗Ｔｒｏｐ−２  ＭＡｂ  Ｃ５１８及びＧＡＭ−Ｆｃ−ＦＩＴＣで染色した。細胞をフローサイトメトリーによって分析したが、非コンジュゲートＴ細胞及びＢｘＰＣ３細胞を前方散乱対側方散乱によって初めにゲーティングした。トロゴサイトーシスは、幾何学的ＭＦＩとして示される、ＢｘＰＣ３細胞上でのＴｒｏｐ−２の低減をもたらした。
【図２７Ａ】サイトカイン誘発。（Ａ）ＰＢＭＣ（６×１０６細胞／ウェル）をＲａｊｉ（５×１０５細胞／ウェル）と組み合わせ、０．１ｎＭ  １９−３ＢｉＴＥ（格子）、（１９）−３ｓ（黒色）と共に２０時間にわたって処理するか、またはｂｓＡｂなし（白色、Ｄ−５について試験せず）でインキュベートした。上清液中のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。Ｄ−１からＤ−８は、独立した献血者であり、Ｄ−５のみを、Ａ及びＢの両方において同時に使用した。
【図２７Ｂ】ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（５×１０５細胞／０．５ｍＬ／ウェル）を２４ウェルプレート内で終夜培養して、細胞付着を可能にした。ＰＢＭＣを、付着ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を含有するウェルに添加し（１０：１の比）、０．１ｎＭの（Ｅ１）−３ｓ（黒色）、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（白色）、（Ｅ１）−３ｓ＋ペグインターフェロンアルファ−２ａ（格子）で２０時間にわたって処理、または未処理（灰色）とした。上清液中のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の濃度を、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。Ｄ−１からＤ−８は、独立した献血者であり、Ｄ−５のみを、Ａ及びＢの両方において同時に使用した。
【図２８】Ａ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性。第１のドナーから単離された精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａ（黒三角、点線）、０．１ｎＭ２０＊−２ｂ（黒丸、灰色）、または媒体（黒四角、黒色）で２４時間にわたって事前処理し、その後、ＰＫＨ−６７グリーン蛍光標識ＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１の比で組み合わせた。細胞混合物を用量設定の（Ｅ１）−３ｓで２日間にわたって処理し、その後、生ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。溶解率の非線形回帰分析（シグモイド用量反応）であり、（Ｅ１）−３ｓのモル濃度の対数に対する、式：［１−（Ａ１／Ａ２）］×１００［式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ、試験試料及び未処置試料中の生標的細胞の数を表す］を使用して各試料で算出された。Ｂ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性。第２のドナーから単離された精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａ（黒三角、点線）、０．１ｎＭ２０＊−２ｂ（黒丸、灰色）、または培地（黒四角、黒色）で２４時間にわたって事前処理し、その後、ＰＫＨ−６７グリーン蛍光標識ＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１の比で組み合わせた。細胞混合物を用量設定の（Ｅ１）−３ｓで２日間にわたって処置し、その後、生ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の数をフローサイトメトリーによって計数した。溶解率の非線形回帰分析（シグモイド用量反応）であり、（Ｅ１）−３ｓのモル濃度の対数に対する、式：［１−（Ａ１／Ａ２）］×１００［式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ、試験試料及び未処置試料中の生標的細胞の数を表す］を使用して各試料で算出された。
【図２９Ａ】Ｔ細胞活性化。精製Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１で混合し、１８時間にわたって（Ｅ１）−３ｓで処理し、その後、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現を測定した。０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａの存在（破線）または不在（実線）下での（Ｅ１）−３のモル濃度の対数に対する、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋（黒丸）またはＣＤ８＋（黒四角）Ｔ細胞のパーセントの非線形回帰分析（シグモイド用量反応）。
【図２９Ｂ】Ｔ細胞活性化。精製Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１で混合し、１８時間にわたって（Ｅ１）−３ｓで処理し、その後、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現を測定した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の存在下で０．１ｎＭ（Ｅ１）−３ｓ（点線）、０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａ（灰色）、または両方の作用物質の組合せ（黒色）で処置した後の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗ＣＤ６９−ＡＰＣ染色を示すヒストグラム。
【図２９Ｃ】Ｔ細胞活性化。精製Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１で混合し、１８時間にわたって（Ｅ１）−３ｓで処理し、その後、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現を測定した。ＮＣＩ−Ｎ８７標的細胞（Ｔ）の不在または存在下で０．１ｎＭ（Ｅ１）−３ｓ（Ｅ）及び／または０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐ）と共にインキュベートした後のＣＤ６９−陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセント。各処理を３連でアッセイした。エラーバー、標準偏差＊、Ｐ＜０．００１。
【図２９Ｄ】Ｔ細胞活性化。精製Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１で混合し、１８時間にわたって（Ｅ１）−３ｓで処置し、その後、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現を測定した。ＮＣＩ−Ｎ８７標的細胞（Ｔ）の不在または存在下で、０．１ｎＭ（Ｅ１）−３ｓ（Ｅ）及び／または０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐ）と共にインキュベートした後のＣＤ６９＋細胞の相乗平均蛍光。各処理を３連でアッセイした。エラーバー、標準偏差＊、Ｐ＜０．００１。
【図３０】Ａ：ヒト膵臓及び胃癌異種移植片でのｉｎ−ｖｉｖｏ有効性。ヒトＴ細胞及びＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞を接種された８匹のマウスからなる群を、毎日５日間にわたって（Ｅ１）−３ｓ５０μｇ（黒三角、中実の黒色）またはＴＦ１２  ６０μｇ（黒逆三角、灰色）で、週１回４週間にわたってペグインターフェロンアルファ−２ａ０．６μｇ（アスタリスク、中実の黒色）、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａレジメンの組合せ（黒丸、中実の黒色）で、または生理食塩水（黒丸、点線の黒色）で処置した。追加の群に、Ｃａｐａｎ−１を接種したが、Ｔ細胞は接種せず、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（白四角、点線の黒色）で処置した。上のパネルは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットである。下のパネルは、平均腫瘍体積（＋標準偏差）対日数である。アステリスクでマークされたデータは、Ｒｏｓｓｉら（２０１４、ＭＡｂｓ  ６：３８１〜９１）における図６Ｃからアレンジした。Ｂ：ヒト膵臓及び胃癌異種移植片でのｉｎ−ｖｉｖｏ有効性。ヒトＴ細胞及びＣａｐａｎ−１膵臓癌細胞を接種された８匹のマウスからなる群を、毎日５日間にわたって（Ｅ１）−３ｓ５０μｇ（黒三角、中実の黒色）またはＴＦ１２  ６０μｇ（黒逆三角、灰色）で、週１回４週間にわたってペグインターフェロンアルファ−２ａ０．６μｇ（アスタリスク、中実の黒色）、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａレジメンの組合せ（黒丸、中実の黒色）で、または生理食塩水（黒丸、点線の黒色）で処置した。追加の群に、Ｃａｐａｎ−１を接種したが、Ｔ細胞は接種せず、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（白四角、点線の黒色）で処置した。上のパネルは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットである。下のパネルは、平均腫瘍体積（＋標準偏差）対日数である。アステリスクでマークされたデータは、Ｒｏｓｓｉら（２０１４、ＭＡｂｓ  ６：３８１〜９１）における図６Ｃからアレンジした。Ｃ：ヒト膵臓及び胃癌異種移植片でのｉｎ−ｖｉｖｏ有効性。ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞を接種された８匹のマウスからなる群を、毎日５日間にわたって（Ｅ１）−３ｓ５０μｇ（黒三角、中実の黒色）またはＴＦ１２  ６０μｇ（黒逆三角、灰色）で、週１回４週間にわたってペグインターフェロンアルファ−２ａ０．６μｇ（アスタリスク、中実の黒色）、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａレジメンの組合せ（黒丸、中実の黒色）で、または生理食塩水（黒丸、点線の黒色）で処置した。追加の群に、Ｃａｐａｎ−１を接種したが、Ｔ細胞は接種せず、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（白四角、点線の黒色）で処置した。上のパネルは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ生存率プロットである。下のパネルは、平均腫瘍体積（＋標準偏差）対日数である。アステリスクでマークされたデータは、Ｒｏｓｓｉら（２０１４、ＭＡｂｓ  ６：３８１〜９１）における図６Ｃからアレンジした。
【図３１】Ｅ１−３によって誘発されるサイトカイン産生。ＰＢＭＣを５：１の比でＢｘＰＣ−３細胞と組み合わせ、用量設定のＥ１−３で２４時間にわたって処理した。サイトカイン濃度を、Ｓｉｎｇｌｅ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して測定した。Ｅ１−３の不在下では、すべてのサイトカインレベルは１０ｐｇ／ｍＬ未満であった。
【図３２】膵臓及び胃癌細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏ再指導Ｔ細胞殺傷。精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（１．２×１０５／ウェル）を６：１で標的細胞（２×１０４／ウェル）と混合し、９６ウェルプレート内で用量設定のＥ１−３で処理した。４８時間後に、ウェルを洗浄してＴ細胞を除去し、生標的細胞密度をＭＴＳアッセイで決定した。複数人のＴ細胞ドナーのうちの１人での結果の例。
【図３３Ａ】ヒト胃腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ治療。ＰＢＭＣを２：１でＮＣＩ−Ｎ８７細胞と混合し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてマトリゲルと共に皮下注射した。動物に、Ｅ１−３  ５０μｇを０及び３日目に静脈内投与した。マウスを腫瘍増殖の徴候について毎日モニターし、その後、腫瘍を週２回、１．０ｃｍ３超を終点測定値として測定した。１７６日後に、Ｅ１−３処置群内の８匹のマウスのうちの７匹が、終点に達せず、６匹の動物は、腫瘍非含有のままであった。
【図３３Ｂ】ヒト胃腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ治療。ＰＢＭＣを２：１でＮＣＩ−Ｎ８７細胞と混合し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてマトリゲルと共に皮下注射した。動物に、Ｅ１−３  ５０μｇを０及び３日目に静脈内投与した。マウスを腫瘍増殖の徴候について毎日モニターし、その後、腫瘍を週２回、１．０ｃｍ３超を終点測定値として測定した。ＰＢＭＣ及びＮＣＩ−８７のみを含む対照群における腫瘍は、３９．５日の中央時で終点に達した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
別段の指定がない限り、「ａ」または「ａｎ」は、「１つ（個、種）または複数（個、種）」を意味する。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「及び（ならびに）」及び「または（若しくは）」という用語は、接続詞または離接的接続詞のいずれかを意味するために使用されていることがある。すなわち、両方の用語とも、別段に述べない限り「及び／または」と同等と理解されるべきである。
【００３２】
「治療薬」は、疾患を処置する際に有用な原子、分子、または化合物である。治療薬の例には、抗体、抗体断片、ペプチド、薬物、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレート薬、ホウ素化合物、光活性薬剤、色素、及び放射性同位体が含まれる。
【００３３】
「抗体」は、本明細書において使用する場合、全長（すなわち、天然に存在するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子断片の組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または免疫グロブリン分子の免疫活性な（すなわち、特異的に結合する）部分、例えば、抗体断片を指す。「抗体」には、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性、多重特異性、マウス、キメラ、ヒト化、及びヒト抗体が含まれる。
【００３４】
「裸の抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、治療薬または診断薬に結合していない抗体またはその抗原結合性断片である。インタクトな裸の抗体のＦｃ部分は、エフェクター機能、例えば、補体結合反応及びＡＤＣＣを提供し得る（例えば、Ｍａｒｋｒｉｄｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５０：５９〜８７、１９９８を参照されたい）。裸の抗体が細胞死を誘発する他の機構には、アポトーシスが含まれ得る（Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：  １０５〜１１９、１９９８）。
【００３５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂなどである。構造に関わらず、抗体断片は、全長抗体が認識する同じ抗原と結合する。例えば、抗体断片には、可変領域からなる単離断片、例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、または軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）が含まれる。「ｓｃＦｖ」と略されることが多い「単鎖抗体」は、相互作用して抗原結合部位を形成するＶｈ及びＶｌドメインの両方を含むポリペプチド鎖からなる。ＶＨ及びＶＬドメインは通常、１〜２５アミノ酸残基のペプチドによって連結される。抗体断片には、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）も含まれる。
【００３６】
「キメラ抗体」は、ある種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有するが、抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する組換えタンパク質である。獣医学用途では、キメラ抗体の定常ドメインは、他の種、例えば、ネコまたはイヌのものに由来してよい。
【００３７】
「ヒト化抗体」は、ある種からの抗体；例えば、げっ歯類抗体からのＣＤＲが、げっ歯類抗体の可変重鎖及び軽鎖から、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含むヒト可変重鎖及び軽鎖ドメインに移されている組換えタンパク質である。その抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来する。結合活性を維持するために、親（例えば、マウス）抗体からのＦＲアミノ酸残基の限られた数が、対応するヒトＦＲ残基で置換されていてよい。
【００３８】
「ヒト抗体」は、抗原攻撃に応じて特異的なヒト抗体を産生するように遺伝子操作されている遺伝子導入マウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素を、内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウスの株に導入する。遺伝子導入マウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用することができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６：５７９（１９９４）によって記載されている。ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、さらに、ファージディスプレイ技術によって構築することができ、それらはすべて、当技術分野で公知である（例えば、未免疫ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及びその断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成するためには、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３を参照されたい）。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかへインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片としてディスプレイさせる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。このようにして、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができ、それらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって生成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「抗体融合タンパク質」という用語は、抗体または抗体断片が別のタンパク質またはペプチド、例えば、同じか、または異なる抗体若しくは抗体断片、またはＤＤＤ若しくはＡＤペプチドに連結されている組換え生成された抗原結合性分子である。融合タンパク質は、単一の抗体構成要素、異なる抗体構成要素の多価若しくは多重特異性組合せ、または同じ抗体構成要素の複数コピーを含んでよい。融合タンパク質は加えて、抗体または抗体断片、及び治療薬を含んでよい。そのような融合タンパク質に適した治療薬の例には、免疫調節薬及び毒素が含まれる。好ましい毒素の１つは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、好ましくは組換えＲＮアーゼを含む。好ましい免疫調節薬は、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−λであろう。
【００４０】
「多重特異性抗体」は、構造が異なる少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、またはハプテン及び／若しくは抗原またはエピトープに同時に結合し得る抗体である。「多価抗体」は、構造が同じか、または異なる少なくとも２つの標的に同時に結合し得る抗体である。価は、単一抗原またはエピトープに対してその抗体がいくつの結合アームまたは部位を有するかを示している；すなわち、一価、二価、三価、または多価。抗体の多価は、それが、抗原に結合する際に複数の相互作用を利用し得て、したがって、抗原に結合する結合活性が増大することを意味する。特異性は、何種の抗原またはエピトープに抗体が結合し得るかを示している；すなわち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性。これらの定義を使用すると、天然抗体、例えば、ＩｇＧは、２個の結合アームを有するので、二価であるが、１種のエピトープに結合するので、単一特異性である。多重特異性多価抗体は、特異性が異なる１つより多い結合部位を有するコンストラクトである。
【００４１】
「二重特異性抗体」は、構造が異なる２つの標的に同時に結合し得る抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）及び二重特異性抗体断片（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、または好中球に特異的に結合する少なくとも１個のアームと、罹患細胞、組織、器官、または病原体によって産生されるか、またはそれに関連する抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１個の他のアームとを有し得る。様々な二重特異性抗体を、分子操作を使用して生成することができる。
【００４２】
本明細書に記載の抗体調製物または組成物は、その投与量が生理学的に有意である場合に、「治療有効量」で投与されると述べられる。作用物質は、その存在が、受容対象の生理において検出可能な変化をもたらす場合に、生理学的に有意である。特定の実施形態では、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍応答を引き起こすか、または感染症状況の徴候及び症状を緩和する場合に、生理学的に有意である。生理学的に有意な効果はまた、標的細胞の増殖阻害またはその死をもたらす受容対象における体液性及び／または細胞性免疫応答の喚起であり得るであろう。
【００４３】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体
好ましい実施形態では、主題の二重特異性抗体は、Ｔｒｏｐ−２に結合する少なくとも１個の抗体またはその断片を含む。より好ましい実施形態では、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１１５）；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：１１６）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：１１７）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：１１８）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：１１９）、及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：１２０）を含む、ヒト化ＲＳ７抗体であってよい（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，２３８，７８５号を参照されたい）。
【００４４】
ＲＳ７抗体は、ヒト原発性扁平上皮細胞肺癌の粗製の膜調製物に対して増大するマウスＩｇＧ１であった（Ｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０：  １３３０、１９９０）。ＲＳ７抗体は、クラスター１３として特徴づけられる４６〜４８ｋＤａ糖タンパク質を認識する（Ｓｔｅｉｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐ．  ８：９８〜１０２、１９９４）。その抗原は、ＥＧＰ−１（上皮性糖タンパク質−１）と名付けられているが、Ｔｒｏｐ−２とも称される。
【００４５】
Ｔｒｏｐ−２は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、ヒト（Ｆｏｒｎａｒｏら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９５；６２：６１０〜８）及びマウス細胞（Ｓｅｗｅｄｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７５：３２４〜３０）の両方からクローニングされている。腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー（Ｒｉｐａｎｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７６：６７１〜６）としてのその役割に加えて、ヒトＴｒｏｐ−２の発現は、結腸癌細胞の腫瘍形成及び侵襲性に必要であることが示されたが、これは、Ｔｒｏｐ−２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体で有効に低減され得るであろう（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７：２８０〜５）。
【００４６】
固形癌のための治療標的としてのＴｒｏｐ−２の重要性の増大（Ｃｕｂａｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９；１７９６：３０９〜１４）は、乳房（Ｈｕａｎｇら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１：４３５７〜６４）、結腸直腸（Ｏｈｍａｃｈｉら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：３０５７〜６３；Ｆａｎｇら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００９；２４：８７５〜８４）、及び口腔扁平上皮細胞（Ｆｏｎｇら、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８；２１：１８６〜９１）癌におけるＴｒｏｐ−２過剰発現の臨床的重要性を詳細に記録したさらなる報告によって立証される。高レベルのＴｒｏｐ−２を発現する前立腺基底細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ幹様（ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ）活性では富化されているという最新の証拠は、特に注目すべきである（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０８８２〜７）。
【００４７】
フローサイトメトリー及び免疫組織化学的染色研究によって、ＲＳ７  ＭＡｂは、限定された正常なヒト組織への結合を有して、様々な腫瘍種上の抗原を検出することが示されている（Ｓｔｅｉｎら、１９９０）。Ｔｒｏｐ−２は、癌、例えば、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮、及び前立腺の癌によって主に発現される。動物モデルにおいて放射標識マウスＲＳ７  ＭＡｂを使用する位置限定及び治療研究によって、腫瘍を標的とすること及び治療効力（Ｓｔｅｉｎら、１９９０；Ｓｔｅｉｎら、１９９１）が実証されている。
【００４８】
強力なＲＳ７染色が、肺、乳房、膀胱、卵巣、子宮、胃、及び前立腺からの腫瘍において示されている（Ｓｔｅｉｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８、１９９３）。肺癌の症例は、扁平上皮細胞癌及び腺癌の両方を含んだ（Ｓｔｅｉｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８、１９９３）。両方の細胞種が強く染色され、ＲＳ７抗体が、肺の非小細胞癌の組織学的群を識別しないことを示している。
【００４９】
ＲＳ７  ＭＡｂは、標的細胞内に急速に内部移行される（Ｓｔｅｉｎら、１９９３）。ＲＳ７  ＭＡｂでの内部移行速度定数は、免疫毒素産生に有用であることが実証されている２つの他の急速内部移行性ＭＡｂの内部移行速度定数の中間である（同著）。免疫毒素コンジュゲートの内部移行は、抗腫瘍活性のための要件であることが十分に記録されている（Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ  ４７：６４１、１９８６）。薬物免疫複合体の内部移行は、抗腫瘍有効性の主な要因として記載されている（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  １１８９、１９８８）。したがって、ＲＳ７抗体は、治療適用のためのいくつかの重要な特性を示す。
【００５０】
ｈＲＳ７抗体は好ましいが、他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が公知であり、かつ／または公に入手可能であり、代替の実施形態において、対象のＡＤＣにおいて利用することができる。ヒト化またはヒト抗体が、免疫原性の低減のためには好ましいが、代替の実施形態において、キメラ抗体を使用することもできる。下で論述するとおり、抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知であり、入手可能なマウスまたはキメラ抗体をヒト化形態に変換するために利用することができる。
【００５１】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、いくつかの供給源から市販されており、それらには、ＬＳ−Ｃ１２６４１８、ＬＳ−Ｃ１７８７６５、ＬＳ−Ｃ１２６４１６、ＬＳ−Ｃ１２６４１７（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）；１０４２８−ＭＭ０１、１０４２８−ＭＭ０２、１０４２８−Ｒ００１、１０４２８−Ｒ０３０（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）；ＭＲ５４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ｓｃ−３７６１８１、ｓｃ−３７６７４６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；ＭＭ０５８８−４９Ｄ６、（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）；ａｂ７９９７６、及びａｂ８９９２８（ＡＢＣＡＭ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれる。
【００５２】
他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が特許文献において開示されている。例えば、米国特許出願公開第２０１３／００８９８７２号は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体Ｋ５−７０（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５１）、Ｋ５−１０７（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５２）、Ｋ５−１１６−２−１（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５３）、Ｔ６−１６（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４６）、及びＴ５−８６（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５４）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ、筑波に寄託）を開示している。米国特許第５，８４０，８５４号は、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１６９８）を開示した。米国特許第７，４２０，０４０号は、ハイブリドーマ細胞系ＡＲ４７Ａ６．４．２によって産生される抗Ｔｒｏｐ−２抗体（ＩＤＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｃａｎａｄａ）に受入番号１４１２０５−０５として寄託）を開示した。米国特許第７，４２０，０４１号は、ハイブリドーマ細胞系ＡＲ５２Ａ３０１．５によって産生される抗Ｔｒｏｐ−２抗体（ＩＤＡＣに受入番号１４１２０５−０３として寄託）を開示した。米国特許出願公開第２０１３／０１２２０２０号は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体３Ｅ９、６Ｇ１１、７Ｅ６、１５Ｅ２、１８Ｂ１を開示した。代表的な抗体をコードするハイブリドーマが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、受入番号ＰＴＡ−１２８７１及びＰＴＡ−１２８７２で寄託された。米国特許第８，７１５，６６２号は、ハイブリドーマによって産生される抗Ｔｒｏｐ−２抗体（ＡＩＤ−ＩＣＬＣ（Ｇｅｎｏａ、Ｉｔａｌｙ）に寄託番号ＰＤ  ０８０１９、ＰＤ  ０８０２０、及びＰＤ  ０８０２１で寄託）を開示した。米国特許出願公開第２０１２０２３７５１８号は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体７７２２０、ＫＭ４０９７、及びＫＭ４５９０を開示している。米国特許第８，３０９，０９４号（Ｗｙｅｔｈ）は、配列一覧によって同定される抗体Ａ１及びＡ３を開示している。この段落において上で引用した各特許または特許出願の実施例の節は、参照によって本明細書に組み込まれる。非特許公報で、Ｌｉｐｉｎｓｋｉら（１９８１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７８：５１４７〜５０）は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体１６２−２５．３及び１６２−４６．２を開示した。
【００５３】
多数の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が当技術分野で公知であり、かつ／または公に入手可能である。下で論述するとおり、既知の抗原に対する抗体を調製する方法は、当技術分野で日常的であった。ヒトＴｒｏｐ−２タンパク質の配列も、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＡ５４８０１．１を参照されたい）。ヒト化、ヒト、またはキメラ抗体を生成する方法も公知である。当技術分野で一般的な知識に照らして本開示を読めば、当業者は、対象のＡＤＣにおける複数の抗Ｔｒｏｐ−２抗体を作製及び使用することができるであろう。
【００５４】
抗ＣＤ３抗体
特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用することができるＣＤ３に対する様々な抗体は公知であり、かつ／または例えば、ＬＳＢｉｏ（カタログ番号ＬＳ−Ｂ６６９８、ＬＳ−Ｂ８６６９；ＬＳ−Ｂ８７６５、ＬＳ−Ｃ９６３１１、ＬＳ−Ｃ５８６７７など）；ＡＢＣＡＭ（登録商標）（カタログ番号ａｂ５６９０、ａｂ１６６６９、ａｂ６９９、ａｂ８２８、ａｂ８６７１、ｅｔｃ．）；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号ｓｃ−２００４７、ｓｃ−２００８０、ｓｃ−１９５９０、ｓｃ−５９００８、ｓｃ−１０１４４２など）；及び多くの他の供給者から市販されている。
【００５５】
好ましい実施形態では、ＤＮＬ（商標）複合体の部分として使用される抗ＣＤ３部分のアミノ酸配列は、配列番号９６から配列番号１０１において下で開示するとおりである。しかしながら、任意の公知の抗ＣＤ３抗体を、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において利用することができることを、当業者は了解するであろう。好ましくは、使用される抗体部分は、ヒト化またはヒトである。
【００５６】
白血球再指導性二重特異性抗体複合体
好ましい実施形態では、主題の二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２抗体を含む。上で論述したとおり、ＣＤ３またはＴｒｏｐ−２に対する様々な抗体が当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の抗体を利用することができる。しかしながら、代替の実施形態では、ＣＤ３以外の白血球抗原またはＴｒｏｐ−２以外の疾患関連抗原に対する抗体を利用することもできる。
【００５７】
例示的なＴ細胞抗原には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、及びＣＤ９０が含まれる。他の例示的な抗原は、ＮＫ細胞ではＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＡＤＡＭ１７、及びＣＤ１３７；単球ではＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲアルファ鎖、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、及びＣＤ８９；ならびに好中球ではＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１７７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、及びＳＬＣ４４Ａ２から選択することができる。好ましくは、抗Ｔ細胞抗体はＣＤ３に結合するか、または抗ＮＫ抗体はＣＤ１６に結合する。下で論述するとおり、疾患関連抗原の多くの例、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。例示的な好ましいＴＡＡは、Ｔｒｏｐ−２である。
【００５８】
ある種の代替の実施形態は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体に関し得る。様々な二重特異性抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９抗体、例えば、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）（例えば、Ｎａｇｏｒｓｅｎら、２００９、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＆  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５０：８８６〜９１；Ａｍａｎｎら、２００９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：４５３〜６４；Ｂａｅｕｅｒｌｅ及びＲｅｉｎｈａｒｄｔ、２００９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４９４１〜４４）及びＤＡＲＴ（登録商標）（例えば、Ｍｏｏｒｅら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２〜５１；Ｖｅｒｉら、２０１０、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２：１９３３〜４３を参照されたい）が当技術分野で公知であり、現在臨床開発中である。ブリナツモマブは、５−アミノ酸リンカーで接続されていて、かつそれ自身に融合して抗原結合性部位を形成する単一ポリペプチド鎖として発現される、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１９抗体断片のＶＨ及びＶＬドメインを含むＢＩＴＥ（登録商標）抗体である。ブリナツモマブは、Ｔ細胞特異的ＣＤ３及びＢ細胞特異的ＣＤ１９抗原を近接させて、並列Ｂ細胞に対してＴ細胞細胞毒性応答を開始することによって作用すると考えられ、これは癌細胞に対するＴ細胞特異性を必要としない（例えば、Ｐｏｒｔｅｌｌら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５（Ｓｕｐｐｌ  １）：５〜１１）。その短い半減期によって、ブリナツモマブは、有効であるには、連続的な静脈内注入が必要である（Ｐｏｒｔｅｌｌら、２０１３）。持続性または再発の軽微な残存疾患を有するＢ細胞ＡＬＬ患者の第ＩＩ相試験は、約８０％の率の完全な緩解を報告した（Ｐｏｒｔｅｌｌら、２０１３）。
【００５９】
０．００５ｍｇ／ｍ２／日という低いブリナツモマブの用量が、非ホジキンリンパ腫患者において癌細胞を除去するために有効であることが報告された（Ｂａｒｇｏｕら、２００８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９７４〜７７）。部分的及び完全な緩解が、０．０１５ｍｇの用量レベルで開始して観察され、０．０６ｍｇの用量で試験された６人の患者すべてが、腫瘍退縮を経験した（Ｂａｒｇｏｕら、２００８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ブリナツモマブは、１０ｐｇ／ｍＬの濃度でＭＥＣ−１細胞の５０％細胞溶解を誘発した（Ｔｏｐｐら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５１８５〜８７；Ｂａｓｓａｎら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５０９４〜９５）。
【００６０】
ブリナツモマブの抗ＣＤ１９部分は、公的に入手可能な（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ｓｃ−１８８９４）ＨＤ３７ハイブリドーマに由来した（例えば、その実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５７５，９２３号を参照されたい）。ブリナツモマブの抗ＣＤ３部分は、同じく公に入手可能な（例えば、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＡＬＸ−８０４−８２２−Ｃ１００）ＴＲ６６ハイブリドーマに由来した（米国特許第７，５７５，９２３号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３６５５〜５９）。
【００６１】
ＣＤ１９に対する様々な抗体が公知であり、かつ／または例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カタログ番号ｓｃ−３９０２４４、ｓｃ−３７３８９７、ｓｃ−１８８９４、ｓｃ−１８８９６など）；ＡＢＣＡＭ（登録商標）（カタログ番号ａｂ２５２３２、ａｂ１３４１１４、ａｂ１４０９８１、ａｂ１２５５など）；ＡＢＢＩＯＴＥＣ（商標）（カタログ番号２５２２６２、２５２２４８、２５０５８５、２５１０６３など）、及び多くの他の供給者から市販されている。
【００６２】
好ましい実施形態では、抗ＣＤ１９抗体部分は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１  ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号９０）；ＣＤＲ２  ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号９１）；及びＣＤＲ３  ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号９２）、ならびに重鎖ＣＤＲ配列  ＣＤＲ１  ＳＹＷＭＮ（配列番号９３）；ＣＤＲ２  ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号９４）、及びＣＤＲ３  ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号９５）を含むヒト化Ａ１９抗体である。
【００６３】
他の抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体、例えば、ＨＤ３７の抗ＣＤ１９Ｆｖ配列及びＴＲ６６の抗ＣＤ３Ｆｖ配列も組み込んでいるＤＡＲＴ（登録商標）が公知である（Ｍｏｏｒｅら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２〜５１；Ｖｅｒｉら、２０１０、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２：１９３３〜４３）。Ｍｏｏｒｅら（２０１１）は、ＤＡＲＴ（登録商標）二重特異性抗体は、ｐｇ／ｍＬ範囲のＥＣ５０値で、同一の抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３可変領域配列を有する単鎖二重特異性抗体（ＢＩＴＥ（登録商標））よりも、Ｂ細胞溶解の誘発において、より強力であったことを報告した（Ｍｏｏｒｅら、２０１１）。ＤＡＲＴ（登録商標）及びＢＩＴＥ（登録商標）のほかにも、他の抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体が報告されている（例えば、Ｗｅｉら、２０１２、Ｃｅｌｌ  Ｏｎｃｏｌ  ３５：４２３〜３４；Ｐｏｒｔｎｅｒら、２０１２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６１：１８６９〜７５；Ｚｈｏｕら、２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ３４：１１８３〜９１を参照されたい）。ある種の実施形態では、任意の公知の抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９二重特異性抗体を、疾患関連細胞に対する免疫応答を誘発するために使用することができる。
【００６４】
カツモキソマブは、転移癌に伴う悪性腹水を処置するために欧州において承認されている抗ＣＤ３×抗ＥｐＣＡＭ二重特異性抗体である（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９、ＭＡｂｓ  １：５３９〜４７）。マウスモデル系では、カツモキソマブは、１０ｐＭの濃度範囲で腫瘍細胞を死滅させることができ、黒色腫腫瘍の完全根絶をもたらすと報告された（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９）。悪性腹水を有する卵巣癌患者でのヒト治験も、統計的に有意な有効性を示した（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９）。しかしながら、ラット／マウスハイブリッドｂｓＡｂの高い免疫原性は、抗体の静脈内投与を限定し得る（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９）。抗腫瘍ｂｓＡｂの使用は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９に限定されず、抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ６４（ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−Ｈ２１０）、抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ６４（ＭＤＸ−４４７）、抗ＣＤ３０×抗ＣＤ１６（ＨＲＳ−３／Ａ９）、抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３（Ｈｅｒ２Ｂｉ）、抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３（ＣＤ２０Ｂｉ、Ｂｉ２０）、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３（カツモキソマブ、ＭＴ１１０）、抗ＨＥＲ２×抗ＣＤ３（エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ））、及び抗ＮＧ２×抗ＣＤ２８（ｒＭ２８）（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９）も含まれている。
【００６５】
主題の白血球再指導性二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２コンストラクトに限定されず、抗ＣＤ３抗体部分に結合する任意の公知の疾患関連抗原に対する抗体を含み得ることを、当業者は了解するであろう。別法では、ＣＤ３のほかにも、他のＴ細胞抗原、またはＮＫ細胞、単球、若しくは好中球上で発現される他の抗原に対する抗体も使用することができる。例示的なＴ細胞抗原には、限定されないが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、及びＣＤ９０が含まれる。他の例示的な抗原は、ＮＫ細胞ではＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＡＤＡＭ１７、ＫＩＲ、及びＣＤ１３７；単球ではＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲアルファ鎖、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、及びＣＤ８９；ならびに好中球ではＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２ａ、ＣＤ８９、ＣＤ１７７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、及びＳＬＣ４４Ａ２から選択され得る。白血球抗原のそれぞれに対する抗体は、公知であり、かつ／または公に入手可能である（例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）カタログ番号ａｂ１３１２７６、ａｂ１３９２６６、ａｂ８３６０、ａｂ５１３１２、ａｂ８４６、ａｂ１３３６１６、ａｂ７５８７７、ａｂ１３３２５５、ａｂ１０９２１７、ａｂ９３２７８、ａｂ１７１４７、ａｂ１１５８５１、ａｂ１２８９５５、ａｂ１３４６３、ａｂ８５９８６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号ｓｃ−４６６８３、ｓｃ−５９０４７；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．カタログ番号ＡＬＸ−８０５−０３７−Ｃ１００；Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．カタログ番号１２２１１−ＲＰ０２、１１１５０−Ｒ０７４；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号０４−１１０２、０４−１１０２、ＭＡＢ１４０６を参照されたい）。これらの抗白血球抗体及び多数の他の抗白血球抗体は公に入手可能であり、主題の白血球再指導性ｂｓＡｂにおいて使用することができるであろう。下で論述するとおり、広範囲の様々な疾患関連抗原に対する多数の抗体が公知であり、かつ／または市販されていて、主題の白血球再指導性二重特異性抗体において使用することができたであろう。潜在的に使用される他の例示的な白血球再指導性ｂｓＡｂには、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０×抗ＣＤ３）及びＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２×抗ＣＤ３）が含まれる。
【００６６】
インターフェロン治療
様々な実施形態で、主題の二重特異性抗体を、１種または複数種のインターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−λ、好ましくはインターフェロン−αと組み合わせて使用することができる。ヒトインターフェロンは、当技術分野で周知であり、ヒトインターフェロンのアミノ酸配列は、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２７１６．１；ＡＡＡ５２７２４；ＡＡＣ４１７０２．１；ＥＡＷ５６８７１．１；ＥＡＷ５６８７０．１；ＥＡＷ５６８６９．１）から容易に得ることができる。ヒトインターフェロンは、様々な供給者（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ；  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ；  ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）から商業的に得ることもできる。
【００６７】
インターフェロン−α（ＩＦＮα）は、癌の動物モデル（Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら、１９９４、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：４６０４〜１５）及びヒト癌患者（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９８０、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ９３：３９９〜４０６）において抗腫瘍活性を有すると報告されている。ＩＦＮαは、発癌遺伝子のダウンレギュレーション、腫瘍抑制因子のアップレギュレーション、腫瘍表面ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現の増大を介した免疫認識の増強、アポトーシスの強化作用、及び化学療法薬に対する増感を含む、様々な直接的な抗腫瘍効果を発揮し得る（Ｇｕｔｔｅｒｍａｎら、１９９４、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：１１９８〜２０５；Ｍａｔａｒｒｅｓｅら、２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０：１５０７〜２０；Ｍｅｃｃｈｉａら、２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１６７〜７９；Ｓａｂａａｗｙら、１９９９、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １４：１１４３〜５１；Ｔａｋａｏｋａら、２００３、Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：５１６〜２３）。一部の腫瘍では、ＩＦＮαは、ＳＴＡＴ１の活性化によって、直接的かつ強力な抗増殖効果を有し得る（Ｇｒｉｍｌｅｙら、１９９８  Ｂｌｏｏｄ  ９１：３０１７〜２７）。インターフェロン−α２ｂは、抗腫瘍抗体、例えば、ｈＬ２４３抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体にコンジュゲートされていて、リンパ腫及び骨髄腫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで除去する（Ｒｏｓｓｉら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１８：１８７７〜８４）。
【００６８】
間接的には、ＩＦＮαは、血管新生を阻害し（Ｓｉｄｋｙ及びＢｏｒｄｅｎ、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：５１５５〜６１）、宿主免疫細胞を刺激し得て、これらは、抗腫瘍応答全体に極めて重要であり得るが、広くは認められていない（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：３６９〜７２）。ＩＦＮαは、骨髄系細胞（Ｒａｅｆｓｋｙら、１９８５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：２５０７〜１２；Ｌｕｆｔら、１９９８、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：１９４７〜５３）、Ｔ細胞（Ｃａｒｒｅｒｏら、２００６、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０３：９３３〜４０；Ｐｉｌｌｉｎｇら、１９９９、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：１０４１〜５０）、及びＢ細胞（Ｌｅら、２００１、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：４６１〜７０）に対する効果によって、免疫応答に対して多面的影響を有する。先天免疫系の重要なモジュレーターとして、ＩＦＮαは、樹状細胞の急速な分化及び活性化を誘発し（Ｂｅｌａｒｄｅｌｌｉら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：６８２７〜３０；Ｐａｑｕｅｔｔｅら、１９９８、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６４：３５８〜６７；Ｓａｎｔｉｎｉら、２０００、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１：１７７７〜８８）、ＮＫ細胞の細胞毒性、遊走、サイトカイン産生、及び抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を増強する（Ｂｉｒｏｎら、１９９９、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１８９〜２２０；Ｂｒｕｎｄａら  １９８４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４：５９７〜６０１）。
【００６９】
インターフェロン−βは、様々な充実性腫瘍を治療するために有効であると報告されている。６百万単位のＩＦＮ−βで週２回、３６カ月にわたって処置された患者は、ＨＣＶ関連肝臓癌を有する患者において、原発腫瘍を完全に切除または除去した後に、肝細胞癌の再発の低減を示した（Ｉｋｅｄａら、２０００、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：２２８〜３２）。インターフェロン−βでの遺伝子治療は、膠腫、黒色腫、及び腎細胞癌のアポトーシスを誘発した（Ｙｏｓｈｉｄａら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９５：８５８〜６５）。内因性ＩＦＮ−βは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を阻害することによって、腫瘍増殖を阻害することが観察されている（Ｊａｂｌｏｎｓｋａら、２０１０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２０：１１５１〜６４）。
【００７０】
ＩＩＩ型インターフェロンと名付けられたＩＦＮ−λは、ＩＦＮ−λ１、２、３（それぞれインターロイキン−２９、２８Ａ、及び２８Ｂとも称される）からなり、染色体１９に位置する３種の異なる遺伝子によって遺伝子でコードされる新たに記載されたサイトカインの群である（Ｋｏｔｅｎｋｏら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６９〜７７；Ｓｈｅｐｐａｒｄら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６３〜８）。タンパク質レベルでは、ＩＦＮ−λ２及び−λ３は、９６％のアミノ酸相同性で高度に相同であるが、ＩＦＮ−λ１は、ＩＦＮ−λ２及び−λ３と約８１％の相同性を共有している（Ｓｈｅｐｐａｒｄら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６３〜８）。ＩＦＮ−λは、ＪＡＫ１及びＴＹＫ２キナーゼの活性化、ＳＴＡＴタンパク質のリン酸化、ならびにＩＦＮ刺激遺伝子因子３（ＩＳＧＦ３）の転写複合体の活性化を含む、Ｉ型ＩＦＮによって誘発されるものと同様のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によってシグナル伝達を活性化する（Ｗｉｔｔｅら、２０１０、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２１：２３７〜５１；Ｚｈｏｕら、２００７、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：７７４９〜５８）。
【００７１】
ＩＩＩ型とＩ型ＩＦＮシステムとの間の主要な差異は、それらの個々の受容体複合体の分布である。ＩＦＮ−α／βは、２種の広範囲に発現されるＩ型インターフェロン受容体によってシグナル伝達し、その結果生じるＩＦＮ−α／β投与に伴う全身毒性が、治療薬としてのそれらの使用を限定している（Ｐｅｓｔｋａら、２００７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２：２００４７〜５１）。対照的に、ＩＦＮ−λは、独特のＩＦＮ−λ受容体１（ＩＦＮ−λＲ１）及びＩＬ−１０受容体２（ＩＬ−１０Ｒ２）からなるヘテロ二量体受容体複合体を介してシグナル伝達する。すでに報告されたとおり（Ｗｉｔｔｅら、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  １０：７０２〜１４）、ＩＦＮ−λＲ１は、非常に制限された発現パターンを有し、最高レベルは上皮細胞、メラニン細胞、及び肝細胞においてであり、最低レベルは、一次中枢神経系（ＣＮＳ）細胞においてである。血液免疫系細胞は、ＩＦＮ−λ作用を阻害する高レベルの短いＩＦＮ−λ受容体スプライシング変異型（ｓＩＦＮ−λＲ１）を発現する。神経細胞及び免疫細胞の限定された応答性は、ＩＦＮ−α治療に多くの場合に随伴する重度の毒性が、ＩＦＮ−λでは、存在しないか、またはかなり低減され得ることを暗示している（Ｗｉｔｔｅら、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  １０：７０２−１４；Ｗｉｔｔｅら、２０１０、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ２１：２３７〜５１）。最近の刊行物が、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−λが、肝細胞において一連の一般ＩＳＧ（インターフェロン刺激遺伝子）の発現を誘発するが、ＩＦＮ−αと異なり、ＩＦＮ−λの投与は、精製リンパ球または単球においてＳＴＡＴ活性化またはＩＳＧ発現を誘発しなかったことを報告した（Ｄｉｃｋｅｎｓｈｅｅｔｓら、２０１３、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ９３、１２年１２月２０日オンライン公開）。ＩＦＮ−α治療に多くの場合に随伴する白血球減少症を誘発することがおそらく少ないので、ＩＦＮ−λは、慢性ＨＣＶ感染の処置には、ＩＦＮ−αよりも優れ得ることが示唆された（Ｄｉｃｋｅｎｓｈｅｅｔｓら、２０１３）。
【００７２】
ＩＦＮ−λは、ＩＬ−１０関連サイトカインと同様の構造的特徴を示すが、機能的にはＩ型ＩＦＮ様抗ウイルス性及び抗増殖活性を有する（Ｗｉｔｔｅら、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  １０：７０２〜１４；Ａｎｋら、２００６、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：４５０１〜９；Ｒｏｂｅｋら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：３８５１〜４）。ＩＦＮ−λ１及び−λ２は、ＤＮＡウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス（Ｒｏｂｅｋら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：３８５１〜４、Ｄｏｙｌｅら、２００６、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４：８９６〜９０６）及び単純ヘルペスウイルス２（Ａｎｋら、２００８、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：２４７４〜８５））、ｓｓ（＋）ＲＮＡウイルス（ＥＭＣＶ；Ｓｈｅｐｐａｒｄら、２００３、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：６３〜８）、及びＣ型肝炎ウイルス（Ｒｏｂｅｋら、２００５、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９：３８５１〜４、Ｄｏｙｌｅら、２００６、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４：８９６〜９０６；Ｍａｒｃｅｌｌｏら、２００６、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １３１：１８８７〜９８；Ｐａｇｌｉａｃｃｅｔｔｉら、２００８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：３００７９〜８９）、ｓｓ（−）ＲＮＡウイルス（水疱性口内炎ウイルス；Ｐａｇｌｉａｃｃｅｔｔｉら、２００８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：３００７９〜８９）、及びインフルエンザ−Ａウイルス（Ｊｅｗｅｌｌら、２０１０、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４：１１５１５〜２２）、ならびに二本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ロタウイルス（Ｐｏｔｔら、２０１１、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０８：７９４４０４９）を含む、様々なウイルスのウイルス複製または細胞変性効果を低下させることが実証されている。ＩＦＮ−λ３は、遺伝子研究から、ＨＣＶ感染における重要なサイトカインとして同定されており（Ｇｅら、２００９、Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：３９９〜４０１）、ＥＭＣＶに対する強力な活性も示している（Ｄｅｌｌｇｒｅｎら、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ  １０：１２５〜３１）。ライノウイルス誘発ＩＦＮ−λ産生の不全は、ライノウイルス誘発性喘息増悪の重症度と高度に関連していると報告されており（Ｃｏｎｔｏｌｉら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １２：１０２３〜２６）、ＩＦＮ−λ治療は、アレルギー性喘息を処置するための新たな手法として示唆されている（Ｅｄｗａｒｄｓ及びＪｏｈｎｓｔｏｎ、２０１１、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３：３０６〜８；Ｋｏｌｔｓｉｄａら、２０１１、ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ３：３４８〜６１）。
【００７３】
ＩＦＮ−λの抗増殖性活性が、神経内分泌癌ＢＯＮ１（Ｚｉｔｚｍａｎｎら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４４：１３３４〜４１）、神経膠芽細胞腫ＬＮ３１９（Ｍｅａｇｅｒら、２００５、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ３１：１０９〜１８）、不死化角質細胞ＨａＣａＴ（Ｍａｈｅｒら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７：１１０９〜１５）、黒色腫Ｆ０１（Ｇｕｅｎｔｅｒｂｅｒｇら、２０１０、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ９：５１０〜２０）、及び食道癌ＴＥ−１１（Ｌｉら、２０１０、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１８０〜９０）を含むいくつかのヒト癌細胞系において確立されている。動物モデルでは、ＩＦＮ−λは、腫瘍アポトーシスと、先天及び適応免疫応答による破壊との両方を誘発し、ＩＦＮ−λの局所送達が、ヒト悪性病変の処置において有用な補助的戦略であり得ることを示唆している（Ｎｕｍａｓａｋｉら、２００７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：５０８６〜９８）。Ｆａｂ連結インターフェロン−λは、標的化細胞において、強力な抗腫瘍及び抗ウイルス活性を有することが実証された（Ｌｉｕら、２０１３、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ６３９４０）。
【００７４】
臨床設定で、ペグ化ＩＦＮ−λ１（ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１）は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染を有する患者のために暫定的に使用されている。第Ｉｂ相試験（ｎ＝５６）において、抗ウイルス活性が、すべての用量レベル（０．５〜３．０μｇ／ｋｇ）で観察され、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１を、ＩＦＮ−α治療の後に再発した遺伝子型１のＨＣＶ患者に投与した場合、ウイルス負荷が、２．３〜４．０対数低減した（Ｍｕｉｒら、２０１０、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５２：８２２〜３２）。第ＩＩｂ相試験（ｎ＝５２６）は、ＨＣＶ遺伝子型１及び４を有する患者が、ＰＥＧ−ＩＦＮ−αと比較して、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１での処置に対して有意に高い奏功率を有することを示した。同時に、Ｉ型インターフェロン処置に一般に随伴する有害事象の比率は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−αを用いるよりも、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１を用いると低かった。好中球減少症及び血小板減少症はまれにしか観察されず、インフルエンザ様症状、貧血、及び筋骨格症状の比率は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−α処置で見られた比率の約１／３に低下した。しかしながら、重篤有害事象、うつ病、及び他の共通有害事象の比率（１０％以上）は、ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１とＰＥＧ−ＩＦＮ−αとで同様であった。ＰＥＧ−ＩＦＮ−αと比較して、より高い比率の肝毒性が、最高用量ＰＥＧ−ＩＦＮ−λ１において見られた（「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ＰＥＧ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｌａｍｂｄａ  Ａｃｈｉｅｖｅｄ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｅｗｅｒ  Ｆｌｕ−ｌｉｋｅ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｅｎｉａｓ  Ｔｈａｎ  ＰＥＧ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ  ｉｎ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩｂ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ５２６  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−Ｎａｉｖｅ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、２０１１年４月２日、Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。
【００７５】
様々な実施形態において、主題の白血球再指導性二重特異性抗体、ＡＤＣ、及び／またはチェックポイント阻害薬ｍＡｂを、１種または複数種のインターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ１、インターフェロン−λ２、またはインターフェロン−λ３と組み合わせて使用することができる。他の作用物質と共に使用する場合、インターフェロンは、他の作用物質の前、それと同時に、またはその後に投与することができる。同時に投与する場合、インターフェロンは、他の作用物質にコンジュゲートさせても、またはそれとは別々であってもよい。
【００７６】
チェックポイント阻害物質抗体
癌治療のためのチェックポイント阻害物質抗体での研究によって、癌処置に対して抵抗性であると以前は考えられていた癌において、従来なかった奏功率が生じている（例えば、Ｏｔｔ  ＆  Ｂｈａｒｄｗａｊ、２０１３、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：３４６；Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＆  Ｌｏｎｇ、２０１３、Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ５：２７８−８５；Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−６４；Ｍａｖｉｌｉｏ  ＆  Ｌｕｇｌｉを参照されたい）。ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＰＤ−Ｌ１等の免疫系チェックポイントに対するアンタゴニストチェックポイント阻止抗体を用いる治療は、癌及び他の疾患のための免疫療法の最も有望な新たな手段の１つである。抗癌作用物質の大部分とは対照的に、チェックポイント阻害薬は、腫瘍細胞を直接標的とするのではなく、免疫系の内因性抗腫瘍活性を増強するために、リンパ球受容体またはそれらのリガンドを標的とする（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。そのような抗体は、罹患細胞、組織、または病原体に対する免疫応答を調節することによって主に作用するので、これらは、そのような作用物質の抗腫瘍を増強するために、他の治療種類、例えば、主題の白血球再指導性二重特異性抗体、ＡＤＣ、及び／またはインターフェロンと組み合わせて使用することができる。
【００７７】
腫瘍は、特に、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞におけるある種の免疫チェックポイント経路を組み入れることによって、免疫学的監視を逃れ得ることが、今では明らかである（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。多くのそのような免疫チェックポイントは、リガンド−受容体相互作用によって開始されるので、それらは、リガンドに対する抗体及び／またはそれらの受容体によって容易に遮断され得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＰＤ−Ｌ１に対するチェックポイント阻害物質抗体が臨床的には最も進められているが、他の潜在的なチェックポイント抗原、例えば、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、及びＴＩＭ３が公知であり、治療用抗体の標的として使用され得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。
【００７８】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても公知）は、Ｂ細胞及びＮＫ細胞において発現される免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面膜タンパク質をコードする（Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、１９９５、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２３：７０４〜６；Ｂｌａｎｋら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６：７３９〜４５；Ｆｉｎｇｅｒら、１９９７、Ｇｅｎｅ  １９７：１７７〜８７；Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＰＤ１の主な役割は、感染に応答しての炎症中に末梢組織においてＴ細胞の活性を制限すること、さらに、自己免疫を制限することである（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＰＤ１発現は、活性化Ｔ細胞において誘発され、その内因性リガンドの１つへのＰＤ１の結合は、刺激キナーゼを阻害することによって、Ｔ細胞活性化を阻害するように作用する（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＰＤ１も、ＴＣＲ「停止シグナル」を阻害するように作用する（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＰＤ１は、Ｔｒｅｇ細胞上で高度に発現され、リガンドの存在下でそれらの増殖を増大させ得る（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。
【００７９】
抗ＰＤ１抗体は、黒色腫、非小細胞肺癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、三種陰性乳癌、白血病、リンパ腫、及び腎臓細胞癌を処置するために使用されている（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１２、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４４３〜５４；Ｌｉｐｓｏｎら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：４６２〜８；Ｂｅｒｇｅｒら、２００８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：３０４４〜５１；Ｇｉｌｄｅｎｅｒ−Ｌｅａｐｍａｎら、２０１３、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ  ４９：１０８９〜９６；Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＆  Ｌｏｎｇ、２０１３、Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ５：２７８〜８５）。ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ４は、異なる経路によって作用するので、それぞれに対するチェックポイント阻害物質抗体を用いる併用療法は、免疫応答の増強をもたらし得ることが可能である。
【００８０】
例示的な抗ＰＤ１抗体には、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）、及びピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ  ＬＴＤ．）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。
【００８１】
プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４、及びＢ７−Ｈ１としても公知）は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、骨髄系細胞、及びマクロファージ上に存在するＰＤ１に対するリガンドである。ＰＤ１には２種の内在性リガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２が存在するが、抗腫瘍治療は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に焦点を当てている。ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１の複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害し、免疫応答を低減する（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１２、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４４３〜５４；Ｂｒａｈｍｅｒら、２０１２、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４５５〜６５）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、非小細胞肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、腎臓細胞癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、乳癌、及び血液悪性疾患の処置のために使用されている（Ｂｒａｈｍｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４５５−６５；Ｏｔｔら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：５３００〜９；Ｒａｄｖａｎｙｉら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：５５４１；Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＆  Ｌｏｎｇ、２０１３、Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ５：２７８〜８５；Ｂｅｒｇｅｒら、２００８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１３０４４〜５１）。
【００８２】
例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）からも市販されている。
【００８３】
細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても公知）も、Ｔ細胞上で専ら発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化を阻害するように作用し、ヘルパーＴ細胞活性を阻害し、かつ調節性Ｔ細胞免疫抑制活性を増強すると報告されている（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。ＣＴＬ４−Ａの正確な作用機序は調査中であるが、これが、ＣＤ８０及びＣＤ８６への結合においてＣＤ２８を打ち負かし、さらに、阻害シグナルをＴ細胞に活発に送達することによって、Ｔ細胞活性化を阻害することが示唆されている（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、黒色腫、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を処置するための治験において使用されている（Ｒｏｂｅｒｔ  ＆  Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ、２００９、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １４：８４８〜６１；Ｏｔｔら、２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：５３００；Ｗｅｂｅｒ、２００７、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １２：８６４〜７２；Ｗａｄａら、２０１３、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。抗ＣＴＬ４Ａの顕著な特徴は、生理的応答に必要な当初処置から最高６ヶ月後の遅滞期を伴う、抗腫瘍作用の反応速度である（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。場合によっては、腫瘍は、処置開始後に、サイズを実際に増大させることがあり、その後、低減が見られる（Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２〜２６４）。
【００８４】
例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、及びＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは最近、転移黒色腫の処置について、ＦＤＡの承認を受けた（Ｗａｄａら、２０１３、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００８５】
単独で、または１種または複数種の他の作用物質と組み合わせて必要とする患者に投与するために、チェックポイント阻害物質抗体の最適な投薬量を決定する方法は、当技術分野で周知である標準的な用量反応及び毒性研究によって決定され得ることを、当業者は了解するであろう。例示的な実施形態では、チェックポイント阻害物質抗体を好ましくは、約０．３〜１０ｍｇ／ｋｇで、または最大許容用量で投与し、約３週毎または約６週毎に投与することができる。別法では、チェックポイント阻害物質抗体を、約３ｍｇ／ｋｇの第１の投薬量、約５ｍｇ／ｋｇの第２の投薬量、及び約９ｍｇ／ｋｇの第３の投薬量の投与を含む、漸増投与計画によって投与することができる。別法では、漸増投与計画は、約５ｍｇ／ｋｇのチェックポイント阻害物質抗体の第１の投薬量及び約９ｍｇ／ｋｇの第２の投薬量を投与することを含む。別の段階的漸増投与計画は、約３ｍｇ／ｋｇのチェックポイント阻害物質抗体の第１の投薬量、約３ｍｇ／ｋｇの第２の投薬量、約５ｍｇ／ｋｇの第３の投薬量、約５ｍｇ／ｋｇの第４の投薬量、及び約９ｍｇ／ｋｇの第５の投薬量を投与することを含み得る。別の態様では、段階的漸増投与計画は、５ｍｇ／ｋｇの第１の投薬量、５ｍｇ／ｋｇの第２の投薬量、及び９ｍｇ／ｋｇの第３の投薬量を投与することを含み得る。チェックポイント阻害薬ｍＡｂの例示的な報告された投薬量には、３週毎に４回の投与で投与されるイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇ；３週毎に８サイクルにわたる１０ｍｇ／ｋｇ；３週毎に４サイクル、次いで、１２週毎に合計３年にわたるイピリムマブ１０ｍｇ／ｋｇ；２週毎または３週毎にＭＫ−３４７５  １０ｍｇ／ｋｇ；３週毎にＭＫ−３４７５  ２ｍｇ／ｋｇ；３カ月毎にトレミリムマブ（ｔｒｅｍｉｌｉｍｕｍａｂ）１５ｍｇ／ｋｇ；２週毎に最高９６週間にわたるニボルマブ０．１、０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ；２週毎に最高９６週間にわたるＢＭＳ−９３６５５９  ０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇが含まれる（Ｋｙｉ  ＆  Ｐｏｓｔｏｗ、２０１３年１０月２３日、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｃａｌｌａｈａｎ  ＆  Ｗｏｌｃｈｏｋ、２０１３、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ９４：４１〜５３）。
【００８６】
腫瘍及び／または病原体に対する免疫応答を刺激するこれらの作用物質及び他の公知の作用物質を、改善された癌治療のために、白血球再指導性二重特異性抗体のみと組み合わせて、またはインターフェロン、例えば、インターフェロン−α、及び／または抗体−薬物コンジュゲートとさらに組み合わせて使用することができる。組み合わせて使用することができる他の公知の同時刺激経路モジュレーターには、限定されないが、アガトリモド、ベラタセプト、ブリナツモマブ、ＣＤ４０リガンド、抗Ｂ７−１抗体、抗Ｂ７−２抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、ＡＧ４２６３、エリトラン、抗ＯＸ４０抗体、ＩＳＦ−１５４、及びＳＧＮ−７０；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定な抗原、Ｂ７ｈ、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、及びＣＤ２４が含まれる。
【００８７】
ある種の実施形態では、抗ＫＩＲ抗体を、白血球再指導性ｂｓＡｂ、インターフェロン、ＡＤＣ、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体と組み合わせて使用することもできる。ＮＫ細胞は、自発的細胞毒性によって、かつ抗体によって活性化される場合にはＡＤＣＣによって、抗腫瘍及び抗感染作用物質活性を媒介する（Ｋｏｈｒｔら、２０１３、Ｂｌｏｏｄ、［２０１３年１２月１０日の印刷前にＥｐｕｂ］）。細胞毒性応答の程度は、ＮＫ細胞が受ける阻害シグナル及び活性化シグナルのバランスによって決定される（Ｋｏｈｒｔら、２０１３）。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）は、ＮＫ細胞応答を低減する阻害シグナルを媒介する。抗ＫＩＲ抗体、例えば、リルルマブ（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）及びＩＰＨ２１０１（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）は、多発性骨髄腫において抗腫瘍活性を示している（Ｂｅｎｓｏｎら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：４３２４〜３３）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、抗ＫＩＲ抗体は、ＮＫ細胞と標的細胞との免疫寛容原性相互作用を妨げ、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞細胞毒性応答を増強する（Ｋｏｈｒｔら、２０１３）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）と組み合わせると、０．５ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＫＩＲ抗体は、リンパ腫腫瘍に対するＮＫ細胞媒介性リツキシマブ依存性細胞毒性の増強を誘発した（Ｋｏｈｒｔら、２０１３）。腫瘍細胞または病原性生体に対する細胞毒性を強化するために、抗ＫＩＲ  ｍＡｂを、ＡＤＣ、白血球再指導性ｂｓＡｂ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体と組み合わせることができる。
【００８８】
一般抗体技術
事実上任意の標的抗原に対するモノクローナル抗体を調製するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、ＶＯＬ．  １、２．５．１〜２．６．７頁（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡単には、マウスに、抗原を含む組成物を注射し、脾臓を除去してＢリンパ球を得、そのＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、抗体をハイブリドーマ培養物から単離することによって、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００８９】
様々な十分に確立された技術によって、ＭＡｂをハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１〜２．７．１２頁及び２．９．１〜２．９．３を参照されたい。Ｂａｉｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  （ＩｇＧ）」、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、ＶＯＬ．  １０、７９〜１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９２）も参照されたい。
【００９０】
免疫原に対して抗体を初めに生成した後に、その抗体を配列決定し、引き続いて、組換え技術によって調製することができる。マウス抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、当業者に周知である。ヒト化、キメラ、またはヒト抗体に由来する抗体構成要素の使用は、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を除去する。
【００９１】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、マウス抗体の可変領域によって置き換えられている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与した場合に、免疫原性の低下及び安定性の増大を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）において開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。例として、Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４）は、マウスＬＬ２、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体のＶκ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、個々のヒトκ及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによって、ＬＬ２キメラを生成した。
【００９２】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを生成するための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：  ３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  １５３４（１９８８）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：  ４２８５（１９９２）、Ｓａｎｄｈｕ、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １２：  ４３７（１９９２）、及びＳｉｎｇｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５０：  ２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラまたはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖及び軽鎖からのマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに移すことによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）も、ヒトＦＲ配列で置き換えられる。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単純に移すと多くの場合に、抗体親和性の低下またはさらには喪失が生じるので、マウス抗体の本来の親和性を復元するために、追加の改変が必要となり得る。これは、ＦＲ領域中の１個または複数個のヒト残基をそれらのマウス対応残基に替えて、そのエピトープに対して良好な結合親和性を有する抗体を得ることによって、達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。一般に、それらのマウス対応残基とは異なり、１個または複数個のＣＤＲアミノ酸残基の近くに、または接触して位置するヒトＦＲアミノ酸残基が、置換のための候補であろう。
【００９３】
ヒト抗体
組合せ手法、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを使用して、完全ヒト抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉら、２００４、Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２７：３１５〜２８；Ｃｏｎｒａｄ及びＳｃｈｅｌｌｅｒ、２００５、Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ及びＬｏｓｅｔ、２００３、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｍａｃｏｌ．  ３：５４４〜５０）。完全ヒト抗体はまた、すべて当技術分野で公知である、遺伝子または染色体トランスフェクション法によって、さらに、ファージディスプレイ技術によって構築することができる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３（１９９０）を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を示し、かつｉｎ  ｖｉｖｏで、本質的に内因性ヒト抗体として機能すると予測される。ある種の実施形態では、特許請求の範囲に記載の方法及び手順は、そのような技術によって生成されるヒト抗体を利用し得る。
【００９４】
選択肢の１つでは、ヒト抗体を生成するために、ファージディスプレイ技術を使用することができる（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５、Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｓ．  ４：１２６〜４０）。ヒト抗体を、正常なヒトから、または特定の病態、例えば、癌を示しているヒトから生成することができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら、２００５）。罹患個体からヒト抗体を構築することの利点は、循環抗体のレパートリーを、疾患関連抗原に対する抗体に偏らせることができることである。
【００９５】
この技法の非限定的例の１つで、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉腫患者から、ヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリを構築した。一般に、全ＲＮＡは、循環血液リンパ球から得られた（同書）。組換えＦａｂが、μ、γ、及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリに挿入された（同書）。ＲＮＡが、ｃＤＮＡに変換され、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用して、Ｆａｂ  ｃＤＮＡライブラリを作製するために使用された（Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１〜９７）。ライブラリ構築が、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆらによって行われた（２０００、Ｉｎ：  ＰＨＡＧＥ  ＤＩＳＰＬＡＹ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｂａｒｂａｓら（ｅｄｓ）、１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  ｐｐ．  ９．１〜９．２２）。最終Ｆａｂ断片が、制限エンドヌクレアーゼで消化され、ファージディスプレイライブラリを作成するために、バクテリオファージゲノムに挿入された。そのようなライブラリは、当技術分野で公知のとおり、標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングされ得る（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４〜３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９、Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４３：１５９〜１６２を参照されたい）。
【００９６】
ファージディスプレイは、それらの調査のために、様々な形式で行うことができる。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって生成することもできる。全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい。これらの技術は例示であって、ヒト抗体または抗体断片を作製及びスクリーニングするために任意の公知の方法を利用することができることを、当業者は了解するであろう。
【００９７】
別の選択肢では、標準的な免疫プロトコルを用い、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されているトランスジェニック動物を使用して、実質的に任意の免疫原性標的に対する抗体を生成するすることができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６：５７９（１９９４）によって開示されている。そのような系の非限定的例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎら、１９９９、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３）である。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）及び同様の動物において、マウス抗体遺伝子は、不活性化され、機能性ヒト抗体遺伝子に替えられているが、マウス免疫系の残りはインタクトなままである。
【００９８】
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）は、補助遺伝子及び調節性配列に沿って可変領域配列の大部分を含むヒトＩｇＨ及びＩｇカッパ遺伝子座の一部を含む、生殖細胞系構成断片を有するＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換された。ヒト可変領域レパートリーを、抗体産生Ｂ細胞を生成するために使用することができ、抗体産生Ｂ細胞は公知の技術によってハイブリドーマに加工することができる。標的抗原で免疫化されたＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）は、正常免疫応答によってヒト抗体を産生し、それらを、上で論述した標準的な技術によって採取及び／または生成することができる。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の様々な株を利用することができ、そのそれぞれが別の群の抗体を産生し得る。形質転換で生成されたヒト抗体は、正常なヒト抗体の薬物動態特性を維持しつつ、治療上の可能性を有することが示されている（Ｇｒｅｅｎら、１９９９）。特許請求の範囲に記載の組成物及び方法は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されている任意のトランスジェニック動物を利用することもできることを、当業者は了解するであろう。
【００９９】
抗体クローニング及び生成
キメラまたはヒト化抗体の生成などの様々な技術は、抗体クローニング及び構築の手順を伴い得る。対象とする抗体での抗原結合性Ｖκ（可変軽鎖）及びＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングなどの様々な分子クローニング手順によって得ることができる。マウス抗体を発現する細胞からの抗体のＶ遺伝子を、ＰＣＲ増幅によってクローニングし、配列決定することができる。それらの確実性を確認するために、クローニングされたＶＬ及びＶＨ遺伝子を、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６：  ３８３３（１９８９））によって記載されたとおりに、キメラＡｂとして細胞培養中で発現させることができる。次いで、Ｖ遺伝子配列に基づき、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：  １４１３（１９９５））によって記載されたとおり、ヒト化抗体を設計及び構築することができる。
【０１００】
一般分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ（１９８９））によって、ｃＤＮＡを、マウス抗体を産生する任意の公知のハイブリドーマ系またはトランスフェクトされた細胞系から調製することができる。プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）またはＬｅｕｎｇら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５：２８６（１９９３））によって記載された延長プライマーセットを使用して、抗体でのＶκ配列を増幅することができる。プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）またはＬｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））によって記載されたマウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを使用して、ＶＨ配列を増幅することができる。Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：  １４１３（１９９５））によって記載されているとおり、ヒト化Ｖ遺伝子は、長オリゴヌクレオチドテンプレート合成とＰＣＲ増幅とを組み合わせることによって構築することができる。
【０１０１】
ＶκのＰＣＲ産物を、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、及び簡便な制限部位を含有するｐＢＲ３２７ベースのステージングベクター、ＶＫｐＢＲなどのステージングベクターにサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳなどの同様のステージングベクターにサブクローニングすることができる。プロモーター及びシグナルペプチド配列と一緒にＶκ及びＶＨ配列を含有する発現カセットを、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切除し、適切な発現ベクター、例えば、それぞれｐＫｈ及びｐＧ１ｇにライゲートすることができる（Ｌｅｕｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１３：４６９（１９９４））。発現ベクターを、適切な細胞に同時トランスフェクトし、上清液を、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体の産生についてモニターすることができる。別法では、Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）、また、Ｌｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６０（１９９７）においても示されている）によって記載されているとおり、Ｖκ及びＶＨ発現カセットを切除し、ｐｄＨＬ２などの単一発現ベクターにサブクローニングすることができる。
【０１０２】
代替の実施形態では、発現ベクターを、トランスフェクション、無血清培地中での増殖、及び発現のために事前適合されている宿主細胞にトランスフェクトすることができる。使用することができる例示的な細胞系には、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦ、及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞系が含まれる（例えば、それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３１，３２７号；同第７，５３７，９３０号、及び同第７，６０８，４２５号を参照されたい）。これらの例示的な細胞系は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞系に基づき、変異Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子でトランスフェクトされ、トランスフェクトされた遺伝子配列を増幅するようにメトトレキサートに曝露され、タンパク質発現のために無血清細胞系に事前適合される。
【０１０３】
抗体断片
特定のエピトープを認識する抗体断片を、公知の技術によって生成することができる。抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど、抗体の抗原結合性部分である。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成することができ、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ’発現ライブラリを構築することができる（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７４〜１２８１）。Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体のパパイン消化によって生成することができる。
【０１０４】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。それらのＶＬ及びＶＨドメインは会合して、標的結合部位を形成している。これらの２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によってさらに共有結合で連結される。ｓｃＦｖ分子を作成し、適切なペプチドリンカーを設計するための方法は、米国特許第４，７０４，６９２号；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｒａａｇ及びＷｈｉｔｌｏｗ、ＦＡＳＥＢ  ９：７３〜８０（１９９５）、ならびにＢｉｒｄ及びＷａｌｋｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ、９：１３２〜１３７（１９９１）において記載されている。
【０１０５】
例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＣｏｓｓｉｎｓら（２００６、Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｕｒｉｆ  ５１：２５３〜２５９）において開示されているとおり、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）を生成する技術も、当技術分野で公知である。標準的な免疫化技術によって、例えば、ラクダ、アルパカ、またはラマから、単一ドメイン抗体を得ることができる（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、ＴＩＢＳ  ２６：２３０〜２３５、２００１；Ｙａｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：１６１〜７５、２００３；Ｍａａｓｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２４：１３〜２５、２００７を参照されたい）。ＶＨＨは、強力な抗原結合能を有し得、従来のＶＨ−ＶＬ対が到達し得ない新規のエピトープと相互作用し得る（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１）。アルパカ血清ＩｇＧは、約５０％ラクダ重鎖のみＩｇＧ抗体（ＨＣＡｂ）を含有する（Ｍａａｓｓら、２００７）。アルパカをＴＮＦ−αなどの公知の抗原で免疫化することができ、標的抗原と結合して、それを中和するＶＨＨを単離することができる（Ｍａａｓｓら、２００７）。事実上すべてのアルパカＶＨＨコード配列を増幅するＰＣＲプライマーが同定されていて、アルパカＶＨＨファージディスプレイライブラリを構築するために使用することができ、そのライブラリを、当技術分野で周知の標準的なバイオパニング技術による抗体断片の単離のために使用することができる（Ｍａａｓｓら、２００７）。ある種の実施形態では、抗膵臓癌ＶＨＨ抗体断片を、特許請求の範囲に記載の組成物及び方法において利用することができる。
【０１０６】
抗体断片は、全長抗体のタンパク質分解性加水分解によって、またはその断片をコードするＤＮＡの、Ｅ．ｃｏｌｉ若しくは別のホストにおける発現によって調製することができる。抗体断片を、慣用の方法によって全長抗体をペプシンまたはパパイン消化することによって得ることができる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによって、米国特許第４，０３６，９４５号及び同第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参照文献において記載されている。Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．  １、４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７）、及びＣｏｌｉｇａｎ、２．８．１〜２．８．１０及び２．１０．〜２．１０．４頁も参照されたい。
【０１０７】
抗体アロタイプ
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスクの上昇及び治療反応持続期間の低下と関連している（Ｂａｅｒｔら、２００３、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２〜０８）。治療用抗体がホストにおいて免疫応答を誘発する規模は一部、抗体のアロタイプによって決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、２０１１、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３〜２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列中の特異的位置でのアミノ酸配列変異に関連する。重鎖γ型定常領域を含有するＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプと称される（１９７６、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６〜５９）。
【０１０８】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体では、最も優勢なアロタイプは、Ｇ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、２０１１、Ｇｅｎｅｓ及びＩｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３〜２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプも、コーカサス人種において頻繁に生じる（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、２０１１）。Ｇ１ｍ１抗体は、非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）受容者、例えば、Ｇ１ｍ３患者に投与されると免疫応答を誘発する傾向のあるアロタイプ配列を含むことが報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、２０１１）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与されてもそれほど免疫原性とならない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒら、２０１１）。
【０１０９】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列内のＫａｂａｔ位３５６にアミノ酸であるアスパラギン酸を、かつＫａｂａｔ位３５８にロイシンを含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、Ｋａｂａｔ位３５６にアミノ酸であるグルタミン酸を、かつＫａｂａｔ位３５８にメチオニンを含む。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１のアロタイプは両方とも、Ｋａｂａｔ位３５７にグルタミン酸残基を含み、それらのアロタイプは、時としてＤＥＬ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれる。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体の重鎖定常領域配列の非限定的例を、例示的な抗体リツキシマブ（配列番号：８５）及びベルツズマブ（配列番号：８６）について示す。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号８５）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ベルツズマブ重鎖可変領域（配列番号８６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１１０】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９、ｍＡｂｓ  １：１〜７）は、ＩｇＧアロタイプに特徴的な配列変異及び免疫原性へのそれらの作用を検討した。彼らは、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおけるＫａｂａｔ位２１４のリシン残基と比較して、Ｇ１ｍ３アロタイプがＫａｂａｔ位２１４のアルギニン残基によって特徴づけられることを報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位３５８のメチオニン、及びＫａｂａｔ位４３１のアラニンによって特徴づけられた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位３５６のアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ位３５８のロイシン、及びＫａｂａｔ位４３１のグリシンによって特徴づけられた。重鎖定常領域の配列変異に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９）は、Ｋａｂａｔ位１５３のバリン及びＫａｂａｔ位１９１のロイシンによって特徴づけられるＫｍ１アロタイプ、Ｋａｂａｔ位１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位１９１のロイシンによって特徴づけられるＫｍ１，２アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ位１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位１９１のバリンによって特徴づけられるＫｍ３アロタイプを含む、カッパ軽鎖定常領域内のアロタイプ変異体を報告した。
【０１１１】
治療用抗体に関連して、ベルツズマブ及びリツキシマブはそれぞれ、広範囲の様々な血液悪性病変及び／または自己免疫疾患の治療のために使用される、ＣＤ２０に対するヒト化及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１で、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較する。表１において示すとおり、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、ベルツズマブでのアルギニンに対してリツキシマブではリシンで、Ｋａｂａｔ位２１４（重鎖ＣＨ１）に追加の配列変異を有する。ベルツズマブは、リツキシマブよりも対象における免疫原性が低いことが報告されていて（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒら、２００９、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６〜５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、２００９、Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２〜７０；Ｒｏｂａｋ  ＆  Ｒｏｂａｋ、２０１１、ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３〜２５を参照されたい）、その作用はヒト化抗体とキメラ抗体との差に帰せられている。しかしながら、ＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプとのアロタイプにおける差異も、ベルツズマブのより低い免疫原性の原因である可能性が高い。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療用抗体の免疫原性を低減するためには、Ｋａｂａｔ位２１４のアルギニンによって特徴づけられるＧ１ｍ３アロタイプ、ならびにＫａｂａｔ位３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位３５８のメチオニン、及びＫａｂａｔ位４３１のアラニンによって特徴づけられるｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプ（ｎｕｌｌ−ａｌｌｏｔｙｐｅ）に対応する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。意外にも、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復皮下投与は有意な免疫応答をもたらさないことが見出された。代替の実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと共通するヒトＩｇＧ４重鎖は、Ｋａｂａｔ位２１４にアルギニン、Ｋａｂａｔ位３５６にグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位３５９にメチオニン、及びＫａｂａｔ位４３１にアラニンを有する。免疫原性は少なくとも一部、それらの位置にある残基に関係すると考えられるので、治療用抗体のためのヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列の使用も、好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との組み合わせも、治療的投与に使用され得る。
【０１１４】
既知の抗体
標的抗原及び例示的な抗体
好ましい実施形態では、標的細胞で高レベルで発現され、かつ正常組織に対して、罹患細胞上で主に、または専ら発現される抗原を認識し、かつ／またはそれに結合する抗体を使用する。例えば、癌を治療するために使用される例示的な抗体には、限定されないが、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ１）、ニボルマブ（抗ＰＤ１）、ＭＫ−３４７５（抗ＰＤ１）、ＡＭＰ−２２４（抗ＰＤ１）、ピジリズマブ（抗ＰＤ１）、ＭＤＸ−１１０５（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＭＥＤＩ４７３６（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤ−Ｌ１）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、トレビリズマブ（抗ＣＴＬ４Ａ）、ＲＳ７（抗上皮性糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１、ＴＲＯＰ−２としても公知））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても公知）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗αフェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ・イウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（クリバツズマブとしても公知、抗ムチン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ならびにトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が含まれる。そのような抗体は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６４２，２３９号；及び米国特許出願公開第２００５０２７１６７１号；同第２００６０１９３８６５号；同第２００６０２１０４７５号；同第２００７００８７００１号；それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる）。使用される具体的な公知の抗体には、ｈＰＡＭ４（��国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）、ｈＲ１（米国特許出願公開第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願公開第１１／９８３，３７２号、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が含まれ、列挙した特許または出願それぞれの内容が、図及び実施例の節に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
記載のコンジュゲートを使用して標的とすることができる他の有用な抗原には、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｂ７、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  ＭＡｂｓ）、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＬＡ４、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、フィブロネクチンスプライシング変異型）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ１）（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、因子Ｈ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇａ７３３、ＧＲＯ−β、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ガングリオシド、ＨＣＧ、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、すなわち、ＣＤ６６ａ〜ｄまたはそれらの組合せ、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＡＭ４抗原、ＰＤ１受容体、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、メソテリン、Ｓ１００、テネイシン、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍａｓ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＴＲＯＰ−２、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、さらには、癌幹細胞抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び発癌遺伝子産物が含まれる。
【０１１６】
フローサイトメトリーによって示されるとおりであり、かつ免疫療法に適した抗体を選択するガイドとなり得る造血性悪性細胞上の適切な抗原（クラスター分類またはＣＤ）標的の包括的な分析が、Ｃｒａｉｇ及びＦｏｏｎ、Ｂｌｏｏｄ（２００８年１月１５日にオンラインで先行公開；ＤＯＬ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００７−１１−１２０５３５）である。
【０１１７】
ＣＤ６６抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーである、ＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１、及びＣＥＡによってそれぞれコードされる同様の構造を有する５種の異なる糖タンパク質ＣＤ６６ａ〜ｅからなる。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は、顆粒球、消化管の正常な上皮細胞、及び様々な組織の腫瘍細胞において主に発現される。癌精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１２０（１１）：２４１１〜７）、さらには、骨髄性白血病（Ｋｏｚｌｏｖら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  ２００５；１６３（１）：６２〜７）、またＢ細胞疾患におけるＣＤ７９ａ、及び非ホジキンリンパ腫でのＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１０（２）：６１６〜６２３）も、癌に適した標的として含まれる。いくつかの上述の抗原は、２００２年１１月１５日出願の「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」との表題の米国特許仮出願第６０／４２６，３７９号において開示されている。より治療抵抗性の前駆体悪性細胞の集合であるとされる癌幹細胞（Ｈｉｌｌ及びＰｅｒｒｉｓ、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ２００７；９９：１４３５〜４０）は、特定の種類の癌において標的とすることができる抗原、例えば、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄら、Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｐｒｏｃ．  ２００６；５：１５５〜７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５〜９１）、及び神経膠芽細胞腫（Ｂｅｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；６７（９）：４０１０〜５）におけるＣＤ１３３、ならびに結腸直腸癌（Ｄａｌｅｒｂａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８〜６３）、膵臓癌（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００７；６７（３）：１０３０〜７）、及び頭頚部扁平上皮細胞癌（Ｐｒｉｎｃｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３〜８）におけるＣＤ４４を有する。
【０１１８】
抗癌抗体は、一部の場合において、ヒストンに結合することが示されている。Ｋａｔｏら（１９９１、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：９４〜１０１）は、肺癌特異的ヒトモノクローナル抗体ＨＢ４Ｃ５がヒストンＨ２Ｂに結合することを報告した。Ｇａｒｚｅｌｌｉら（１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：２７７〜８２）は、エプスタイン−バーウイルス−形質転換ヒトＢリンパ球が、ヒストンに対する天然抗体を産生することを観察した。ある種の実施形態では、ヒストンに対する抗体を、本組合せにおいて使用することができる。公知の抗ヒストン抗体には、限定されないが、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、及びＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）が含まれる（例えば、Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒら、１９９１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１７２５〜３１；Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒら、１９９３、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１０６９〜７５を参照されたい）。
【０１１９】
多発性骨髄腫の治療のために、例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００６；１２（１１−１２）：３４５〜３４６；Ｔａｓｓｏｎｅら、Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４（１２）：３６８８〜９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎら、ｉｂｉｄ．）、ＣＳ１（Ｔａｉら、Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（４）：１３２９〜３７）、及びＣＤ４０（Ｔａｉら、２００５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（１３）：５８９８〜５９０６）に対する適切な標的化抗体が記載されている。
【０１２０】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、先天及び適応免疫、ならびにアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４は、ＭＩＦに対する内因性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇら、２００３、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７〜７６）。ＭＩＦ媒介性細胞内経路に対するアンタゴニスト抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、幅広い範囲の病態、例えば、膀胱、前立腺、乳房、肺、結腸の癌、及び慢性リンパ球性白血病を処置するために使用され得る（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒら、２００４、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ、２０１１、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６〜５４）。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介性疾患を処置するために治療的に使用される例示的な抗ＣＤ７４抗体である。
【０１２１】
最も好ましい抗体／抗原対の例は、、抗ＣＤ７４ＭＡｂのＬＬ１（不変鎖、クラスＩＩ−特異的シャペロン、Ｉｉ）である（例えば、米国特許第６，６５３，１０４号；同第７，３１２，３１８号を参照されたい；それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる）。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、ある種のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸、肺、及び腎臓の癌、神経膠芽細胞腫、ならびにある種の他の癌で高度に発現される（Ｏｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６〜３０２（１９９９））。癌におけるＣＤ７４抗体の使用についての総説は、参照によって本明細書に組み込まれるＳｔｅｉｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００７年９月１５日；１３（１８  Ｐｔ  ２）：５５５６ｓ〜５５６３ｓに含まれる。抗ＣＤ７４抗体で処置されることが好ましい疾患には、限定されないが、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺、腎臓、結腸の癌、多形性神経膠芽腫、組織球腫、骨髄性白血病、及び多発性骨髄腫が含まれる。
【０１２２】
様々な実施形態において、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物は、当技術分野で公知の任意の様々な抗体を利用することができる。使用される抗体は、いくつかの公知の供給源から商業的に得ることができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手することができる。限定されないが、腫瘍関連抗原を含む様々な疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されていて、かつ／または可変領域配列を公開されていて、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用するために利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２号；同第８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０号、同第６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６号；同第６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号、同第５，５２５，３３８号（それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらは例示に過ぎず、広範囲の様々な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが当技術分野で公知である。ほぼあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを、該当する選択された疾患関連標的に対する抗体についてのＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、及び／またはＵＳＰＴＯデータベースの簡単な検索によって得ることができることを、当業者は了解するであろう。当技術分野で周知の標準的な技術を使用して、クローニングされた抗体の抗原結合性ドメインを増幅し、切除し、発現ベクターにライゲートし、適合させた宿主細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生のために使用することができる（例えば、それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３１，３２７号；同第７，５３７，９３０号；同第７，６０８，４２５号、及び同第７，７８５，８８０号を参照されたい）。
【０１２３】
他の実施形態では、抗体複合体は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、または補助分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に結合する。抗体複合体は、白血球活性化サイトカインに、またはサイトカインメディエーター、例えば、ＮＦ−κＢにも結合し得る。
【０１２４】
ある種の実施形態では、２種の異なる標的の一方は、癌細胞受容体または癌関連抗原、特に、Ｂ細胞系抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３など）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、テネイシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、ＮＣＡ６６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＩＬ−６、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ａ３、ＣＡ１２５、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、葉酸受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、Ｉａ、ＥＬ−２、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）及びＩＧＦ受容体、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、壊死抗原、ＰＡＭ−４、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｐｒ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ７２、ＴＲＡＩＬ受容体、ならびに炭酸脱水酵素ＩＸからなる群から選択されるものであり得る。
【０１２５】
免疫複合体
ある種の実施形態では、抗体またはその断片を、１種または複数種の治療薬または診断薬にコンジュゲートさせることができる。治療薬は、同じである必要はなく、異なってよく、例えば、薬物及び放射性同位体であってよい。例えば、１３１Ｉを、抗体または融合タンパク質のチロシンに組み込むことができ、薬物を、リシン残基のイプシロンアミノ基に結合させることができる。治療薬及び診断薬を、例えば、還元ＳＨ基に、かつ／または炭水化物側鎖に結合させることもできる。治療薬または診断薬と、抗体または融合タンパク質との共有結合または非共有結合コンジュゲートを作製するための多くの方法が当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の方法を利用することができる。
【０１２６】
治療薬または診断薬は、ジスルフィド結合形成によって、還元抗体構成要素のヒンジ領域で結合させることができる。別法では、そのような作用物質を、ヘテロ二官能性架橋リンカー、例えば、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）を使用して結合させることができる。Ｙｕら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５６：  ２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲーションのための一般技術は当技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｂｉｒｃｈら（編）、１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９９５）；Ｐｒｉｃｅ、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｒｉｔｔｅｒら（編）、６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。別法では、治療薬または診断薬を、抗体のＦｃ領域内の炭水化物部分によってコンジュゲートさせることができる。炭水化物基を使用して、チオール基に結合する同じ作用物質の負荷を増やすことができるか、または炭水化物部分を使用して、異なる治療薬または診断薬を結合することができる。
【０１２７】
抗体炭水化物部分を介してペプチドを抗体構成要素にコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。例えば、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれるＳｈｉｈら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：  ８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４６：  １１０１（１９９０）；及びＳｈｉｈら、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体要素を、少なくとも１個の遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることを伴う。この反応は、当初のシッフ塩基（イミン）連結をもたらし、これを、第二級アミンに還元することによって安定化させて、最終コンジュゲートを形成することができる。
【０１２８】
免疫複合体の抗体構成要素として使用される抗体が抗体断片である場合、Ｆｃ領域は存在しなくてもよい。しかしながら、炭水化物部分を、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に導入することが可能である。例えば、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬｅｕｎｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら、米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）、Ｌｅｕｎｇら、米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい。操作した炭水化物部分を、治療薬または診断薬を結合させるために使用する。
【０１２９】
一部の実施形態では、キレート剤を、抗体、抗体断片、または融合タンパク質に結合させ、放射性核種などの治療薬または診断薬をキレートするために使用することができる。例示的なキレート剤には、限定されないが、ＤＴＰＡ（Ｍｘ−ＤＴＰＡなど）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＥＴＡ、またはＮＯＴＡが含まれる。金属または他のリガンドをタンパク質に結合させるためのキレート剤のコンジュゲーション及び使用方法は、当技術分野で周知である（例えば、その実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６３，４３３号を参照されたい）。
【０１３０】
ある種の実施形態では、イオンを結合させるための多数のキレート基を結合させることができるロングテールを有する試薬と反応させることによって、放射性金属または常磁性イオンをタンパク質またはペプチドに結合させることができる。そのようなテールは、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的のために有用であると公知の基などのキレート基を結合させることができるペンダント基を有するポリリシン、多糖、または他の誘導体化若しくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであってよい。
【０１３１】
キレートを、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２４，６５９号において開示されているとおり、抗体またはペプチドに直接連結させることもできる。特に有用な金属−キレートの組合せには、放射線画像では６０〜４，０００ｋｅＶの一般エネルギー範囲の診断用同位体、例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒと共に使用される２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチル及びシクロヘキシル類似体が含まれる。非放射性金属、例えば、マンガン、鉄、及びガドリニウムと錯体形成させると、同じキレートがＭＲＩのために有用である。大環状キレート、例えば、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、及びＴＥＴＡは、様々な金属及び放射性金属、特には、それぞれガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共に使用される。そのような金属−キレート錯体を、環サイズを該当する金属に合わせることによって非常に安定にすることができる。核種、例えば、ＲＡＩＴでは２２３Ｒａを安定的に結合するために重要な大環状ポリエーテルなどの他の環タイプのキレートも包含される。
【０１３２】
より最近では、例えば、Ｆ−１８と、アルミニウムなどの金属または他の原子との反応による、ＰＥＴスキャニング技術において使用される１８Ｆ標識の方法が開示されている。１８Ｆ−Ａｌコンジュゲートは、抗体と直接結合するキレート基、例えば、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、またはＮＥＴＡと錯体形成し得るか、または事前標的化法において標的化可能なコンストラクトを標識するために使用することができる。そのようなＦ−１８標識技術は、実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５６３，４３３号において開示されている。
【０１３３】
具体的な好ましい実施形態では、免疫複合体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であり得る。ＡＤＣ生成において使用される２種の例示的な薬物は、ＳＮ−３８及び２−ピロリノドキソルビシン（Ｐ２ＰＤｏｘ）のプロドラッグ形態である。ＳＮ−３８−コンジュゲートされたＡＤＣの組成物及びその生成法は、例えば、そのそれぞれの図及び実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，９９９，０８３号；同第８，０８０，２５０号；同第８，７４１，３００号；同第８，７５９，４９６号において開示されている。Ｐ２ＰＤｏｘ  ＡＤＣの組成物及びその生成法は、例えば、その図及び実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，８７７，１０１号において開示されている。
【０１３４】
二重特異性抗体を生成する方法
様々な実施形態において、主題の併用療法は、１種または複数種の二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、例えば、白血球再指導性ｂｓＡｂを利用し得る。本明細書において使用する場合、二重特異性抗体は、２種の異なる抗原、または同じ抗原上の２種の異なるエピトープに対する結合部位を含有する抗体である。単一の抗原の単一のエピトープにのみ結合し得る抗体は、抗体分子上の抗原結合性部位の数に関わらず、単一特異性である。
【０１３５】
二重特異性抗体の構築における初期の試みでは、２種の異なる抗体の半分を２つ一緒に合わせるために、化学的架橋またはハイブリッドハイブリドーマ若しくはクアドローマのいずれかが利用された（例えば、Ｓｔａｅｒｚら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：６２８〜３１；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；３０５：５３７〜５４０；Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、１９８４、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６０：１６８６〜７０１）。それらの技術は、ｂｓＡｂを作製するために機能するが、様々な生成の問題、例えば、抗原結合性部位の異なる組合せを含む混合集団の生成、タンパク質発現の難しさ、該当するｂｓＡｂを精製する必要性、低い収率、生成費用などが、そのような複合体の使用を困難にした。
【０１３６】
さらに最近の手法は、望ましくない副産物を除去するための広範な精製を必要とせずに、単一ｂｓＡｂの均質な産物を生成し得る遺伝子操作されたコンストラクトを利用している。そのようなコンストラクトは、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、二重可変ドメイン抗体、及びＣｈ１／ＣｋドメインまたはＤＮＬ（商標）などのモチーフを使用するヘテロ二量化を含んでいる（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、２００９、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ  １２：２７６〜８３；Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。
【０１３７】
トリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）は、ラット／ラットまたはマウス／マウスクアドローマにおいて典型的に見られるランダムな対合と比較して、組換え抗体を優先的に生成するために、マウスＩｇＧ２ａ及びラットＩｇＧ２ｂ抗体の組合せを使用するクアドローマ手法での一変形形態である（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。この技術によって作成された抗ＣＤ３×抗ＥｐＣＡＭ  ｂｓＡｂ（カツモキソマブ）は、マクロファージ及びＮＫ細胞を効率的に動員し、かつＴ細胞を活性することができた（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。上で論述したとおり、カツモキソマブは、ＥｐＣＡＭ陽性癌を有する患者において悪性腹水を処置するために欧州において承認されている（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。意外にも、組換えｂｓＡｂは、おそらく少なくとも一部では、腹水への腹腔内投与経路によって、ヒトにおいて中程度の抗マウス及び抗ラット応答しか誘発しないと報告された（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）は、転移乳癌のために使用することができる、ＨＥＲ２を標的とする別のトリオマブである。Ｂｉ２０は、ＣＤ２０を標的とする別のトリオマブである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｂｉ２０は、ＣＬＬ患者からのＢ細胞の効率的な溶解を示した（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。
【０１３８】
ＢＩＴＥ（登録商標）は、短いペプチドリンカーによって合わせられているタンデムｓｃＦｖを指す（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。ブリナツモマブは、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３  ＢＩＴＥ（登録商標）であり、非常に低い濃度で、非ホジキンリンパ腫及びＡＬＬなどの血液癌において有効性が報告されている（Ｎａｇｏｒｓｅｎら、２００９、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＆  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５０：８８６〜９１；Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７；Ｔｏｐｐら、２０１２、Ｂｌｏｏｄ  １２０：５１８５〜８７；Ｂａｒｇｏｕら、２００８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９７４〜７７）。ＥｐＣＡＭについて特異性を有する別のＢＩＴＥ（登録商標）が、胃腸、卵巣、結腸直腸、及び肺の癌において使用されている（Ａｍａｎｎら、２００９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３２：４５２〜６４；Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。ＣＥＡＣＡＭ５を標的とした別のＢＩＴＥ（登録商標）（ＭＥＤＩ−５６５）は、黒色腫、結腸直腸、肺、膵臓、胃、卵巣、子宮、及び乳房の癌において使用するために提案されている（Ｓａｎｄｅｒｓら、１９９４、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７２：３４３〜８）。ＢＩＴＥ（登録商標）は、ピコモルまたはフェムトモル濃度で抗腫瘍活性を示すことが報告されている（Ｃｈａｍｅｓ  ＆  Ｂａｔｙ、ｍＡｂｓ  １：５３９〜４７）。
【０１３９】
２種の異なる先在の抗体に由来する２つの重鎖及び２つの軽鎖のアセンブリを伴うｂｓＡｂ形成の別の方法は、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモダイマーの形成を防止するｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ手法に基づく（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１１８７〜９２）。「ＣｒｏｓｓＭａｂ」技術はさらに、二重特異性抗体の一方の半分のＦａｂ内の重鎖及び軽鎖ドメインを交換して、軽鎖−重鎖の誤対合が起こり得ないように２つのアームを異ならせることを含む（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１）。ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ手法は、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン内の適切に設計されたキャビティに適合する片方の重鎖のＣＨ３ドメインに、嵩高な側鎖を有するアミノ酸を導入する。手法を組み合わせることで、重鎖と重鎖との、及び重鎖と軽鎖との両方の相互作用のミスマッチを防止し、主に単一の産物を生じさせる。アンギオポイエチン−２（Ａｎｇ−２）及びＶＥＧＦ−Ａに対して生成された当初のＣｒｏｓｓＭａｂは、強力な抗脈管形成活性及び抗腫瘍活性と共に、親ｍＡｂに匹敵する結合特性を示した（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０１１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：１１１８７〜９２；Ｋｉｅｎａｓｔら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、Ｏｃｔ．  ２５、２０１３、刊行前にＥｐｕｂ）。
【０１４０】
上で論述したＤＡＲＴ（商標）技術に加えて、ｂｓＡｂ生成のための他の手法には、四価ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合（Ｄｏｎｇら、２０１１、ＭＡｂｓ  ３：２７３〜８８）；二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）抗体（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０〜１４）；Ｉｇｇ様二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（Ｗｕら、２００７、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２９０〜９７）；及びＩｇＧ４分子間の動的交換の使用（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら、２００７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１５５４〜５７）が含まれる。上で論述したＤＮＬ（商標）技術は、白血球再指導性ｂｓＡｂの形成のために好ましいが、他の種類のｂｓＡｂを特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用することができることを、当業者は了解するであろう。
【０１４１】
ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））
一部の実施形態では、単独か、または他に、サイトカインなどの１種または複数種のエフェクターと複合体化させた二重特異性抗体を、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体として形成する（例えば、そのそれぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５２１，０５６号；同第７，５２７，７８７号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５５０，１４３号；同第７，６６６，４００号；同第７，９０１，６８０号；同第７，９０６，１１８号；同第７，９８１，３９８号；同第８，００３，１１１号を参照されたい）。一般に、その技術は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、任意の様々なＡＫＡＰタンパク質に由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列との間で起こる特異的で高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．  ２００５；５７９：３２６４．  Ｗｏｎｇ及びＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチド、または他の分子に結合し得る。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化し、ＡＤ配列に結合するので、この技術は、ＤＤＤまたはＡＤ配列に結合し得る任意の選択された分子間での複合体の形成を可能にする。
【０１４２】
標準的なＤＮＬ（商標）複合体は、１個のＡＤ連結分子に結合した２個のＤＤＤ連結分子を有する三量体を含むが、複合体の構造の変化によって、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、及び他の多量体の形成が可能である。一部の実施形態では、ＤＮＬ（商標）複合体は、同じ抗原決定基に、または２種以上の異なる抗原に結合する２種以上の抗体、抗体断片、または融合タンパク質を含み得る。ＤＮＬ（商標）複合体はまた、１種または複数種の他のエフェクター、例えば、タンパク質、ペプチド、免疫調節薬、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合性タンパク質、ペプチドリガンド、担体タンパク質、毒素、リボヌクレアーゼ、例えば、オンコナーゼ、阻害性オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、抗原、若しくは異種抗原、ポリマー、例えば、ＰＥＧ、酵素、治療薬、ホルモン、細胞毒性薬物、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、または任意の他の分子若しくは凝集体を含み得る。
【０１４３】
セカンドメッセンジャーｃＡＭＰをＲサブユニットに結合することによって開始される最も良く研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的な役割を果たすＰＫＡは、ウサギ骨格筋から１９６８年に初めて単離された（Ｗａｌｓｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性な形態で保持されている２個の触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは、２種類のＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）で見い出されており、それぞれの種類が、α及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １９９１；５０：１２３）。したがって、ＰＫＡ調節サブユニットの４種のアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、及びＲＩＩβであり、それらはそれぞれ、ＤＤＤ部分アミノ酸配列を含む。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、二量化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４アミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；６：２２２）。下で論述するとおり、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の同様の部分は二量化及びドッキングに関与し、それぞれ調節サブユニットのＮ末端近くに位置する。ｃＡＭＰがＲサブユニットに結合すると、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒サブユニットが放出され、これらは、ＡＫＡＰとのそのドッキングを介してＰＫＡを区画化することによって、選択された基質に向けられる。（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９０；２６５；２１５６１）。
【０１４４】
微小管関連タンパク質−２である最初のＡＫＡＰが１９８４年に特徴づけられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４；８１：６７２３）、酵母からヒトの範囲にわたる種において、形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含む様々な細胞下部位に局在する５０種超のＡＫＡＰが多様な構造で同定されている（Ｗｏｎｇ及びＳｃｏｔｔ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性へリックスである（Ｃａｒｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰ内で様々であり、ＲＩＩ二量体で報告された結合親和性は、２〜９０ｎＭの範囲である（Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαでは、ＡＤは、２３アミノ末端残基によって形成される疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ及びＳｃｏｔｔ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９９；６：２１６）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、本明細書においてＤＤＤと称される同じＮ末端４４アミノ酸配列内に位置する（Ｎｅｗｌｏｎら、Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１；２０：１６５１）。
【０１４５】
本発明者らは、本明細書において以下Ａ及びＢと称される任意の２つの実体をドッキングして非共有結合複合体にし、これをさらに、戦略的位置においてＤＤＤ及びＡＤの両方にシステイン残基を導入することによって、ＤＮＬ（商標）複合体にロックしてジスルフィド結合の形成を促進することができるようなリンカーモジュールの優れた対として、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを利用するためのプラットフォーム技術を開発した。その手法の一般技法は、下記のとおりである。ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結して、本明細書において以下ａと称される第１の構成要素を生じさせることによって、実体Ａを構築する。ＤＤＤ配列は、二量体の自発的形成を実行するので、Ａはａ２からなるであろう。ＡＤ配列をＢの前駆体に連結して、本明細書において以下ｂと称される第２の構成要素を生じさせることによって、実体Ｂを構築する。ａ２に含有されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含有されるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を作成するはずであるので、ａ２及びｂの容易な会合を促進して、ａ２ｂからなる二成分三量体複合体を形成する。この結合事象は、後続の反応で安定化されて、ジスルフィド架橋を介してその２つの実体を共有結合で固定し、これは、当初の結合相互作用が、ＤＤＤ及びＡＤの両方に位置する反応性チオール基を近接させて（Ｃｈｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００１；９８：８４８０）、部位特異的にライゲートするはずであるので、有効な局所濃度の原理に基づき非常に効率的に起こる。リンカー、アダプターモジュール、及び前駆体の様々な組み合わせを使用して、種々の化学量論の広範囲の様々なＤＮＬ（商標）コンストラクトを生成及び使用することができる（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号、及び同第７，６６６，４００号を参照されたい）。
【０１４６】
２つの前駆体の官能基から離してＤＤＤ及びＡＤを結合させることによって、そのような部位特異的ライゲーションはまた、２つの前駆体の本来の活性を保存すると予期される。この手法はモジュラーの性質を有し、広範な活性を有するペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、及び他のエフェクター部分を含む広範な物質を部位特異的に、かつ共有結合で連結するために潜在的に適用することができる。下記の実施例において記載するＡＤ及びＤＤＤコンジュゲートされたエフェクターを構築する融合タンパク質法を利用して、事実上任意のタンパク質またはペプチドをＤＮＬ（商標）コンストラクトに組み入れることができる。しかしながら、その技術は、限定的ではなく、コンジュゲーションの他の方法を利用することもできる。
【０１４７】
該当する融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を生成するための核酸合成、ハイブリッド形成、及び／または増幅を含めて、融合タンパク質を作製するための様々な方法が公知である。そのような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学技術によって、融合タンパク質産生のために発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、２ｎｄ  Ｅｄ、１９８９を参照されたい）。そのような好ましい実施形態では、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させることができる。しかしながら、その生理学的活性に関係するエフェクター部分及びエフェクター部分の一部（複数可）の化学的性質に応じて、エフェクター部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の結合部位が、様々であり得ることを、当業者は了解するであろう。様々なエフェクター部分の部位特異的結合を、二価架橋試薬及び／または他の化学的コンジュゲーション技術の使用など、当技術分野で公知の技術を使用して行うことができる。
【０１４８】
Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（商標）（ＤＮＬ（商標））技術は、多彩な形式の様々な複合体を生成するために使用されている（Ｒｏｓｓｉら、２０１２、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２３：３０９〜２３）。ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）及びエプラツズマブ（抗ＣＤ２２）に基づく二重特異性六価抗体（ｂｓＨｅｘＡｂ）は、二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）に融合させた安定化（Ｆａｂ）２を、各重鎖のＣ末端に付加されたアンカードメイン（ＡＤ）を含有するＩｇＧ（ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ）と組み合わせることによって構築された（Ｒｏｓｓｉら、２００９、Ｂｌｏｏｄ  １１３、６１６１〜７１）。それらの親ｍＡｂの混合物と比較して、以下「Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂ」と称されるこれらのＦｃベースのｂｓＨｅｘＡｂは、独特のシグナル伝達事象を誘発し（Ｇｕｐｔａら、２０１０、Ｂｌｏｏｄ  １１６：３２５８〜６７）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて強力な細胞毒性を示した。しかしながら、Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂは、親ｍＡｂよりも約２倍速くマウスの循環から排除された（Ｒｏｓｓｉら、２００９、Ｂｌｏｏｄ  １１３、６１６１〜７１）。Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂは、ｅｘ  ｖｉｖｏでは高度に安定であるが、例えば、細胞内プロセシングによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでは多少の解離が起こり得る。さらに、Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂは、ＣＤＣ活性を欠いている。
【０１４９】
Ｆｃベースの免疫サイトカインも、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ  ＦｃのＣ末端に融合した２個または４個のインターフェロン−アルファ２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）の分子を含むＤＮＬ（商標）複合体として組み立てられている（Ｒｏｓｓｉら、２００９、Ｂｌｏｏｄ  １１４：３８６４〜７１；Ｒｏｓｓｉら、２０１０、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０：７６００〜０９；Ｒｏｓｓｉら、２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１８：１８７７〜８４）。Ｆｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαは、組換えＩＦＮαに近い高い特異的活性を維持し、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）異種移植片に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで顕著な効力があった。マウスにおけるＦｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαのＴ１／２は、ペグ化ＩＦＮαよりは長かったが、親ｍＡｂの半分の長さであった。Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂと同様に、Ｆｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαは、ｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に解離し、ＣＤＣの低下を示したが、ＡＤＣＣは増強した。
【０１５０】
ＡＤ及びＤＤＤ部分における構造と機能の相関
異なる種類のＤＮＬ（商標）コンストラクトでは、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用することができる。例示的なＤＤＤ及びＡＤ配列を下に示す。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号４）
【０１５１】
ＤＤＤ１及びＤＤＤ２は、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームのＤＤＤ配列に基づくことを、当業者は了解するであろう。しかしながら、代替の実施形態では、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、下記のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ、及びＡＤ３において例示するとおり、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づいてもよい。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号５）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号６）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号７）
【０１５２】
他の代替の実施形態では、ＤＮＬ（商標）複合体の構築において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分の他の配列変異体を利用することができる。例えば、ＰＫＡ  ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ、及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応して、ヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列には、変異体は４種のみ存在する。ＲＩＩα  ＤＤＤ配列は、上で開示したＤＤＤ１及びＤＤＤ２の基礎である。４種のヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列を下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの残基１〜４４、ＲＩＩβの残基１〜４４、ＲＩαの残基１２〜６１、及びＲＩβの残基１３〜６６を表している（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ部分から多少改変されていることに注意されたい）。
ＰＫＡ  ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号８）
ＰＫＡ  ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列番号９）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列番号１０）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列番号１１）
【０１５３】
ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造と機能の相関は、調査の対象となっている（例えば、それぞれのテキスト全体が参照によって本明細書に組み込まれるＢｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２〜９２；Ｃａｒｒら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２〜３８；Ａｌｔｏら、２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７〜３０６；Ｓｔｏｋｋａら、２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３〜９９；Ｇｏｌｄら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３〜９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７〜４０８を参照されたい）。
【０１５４】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７〜４０８）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調査し、ヒトＤＤＤ配列が、下記の配列番号１において下線を付された、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかにおいて重要ないくつかの保存アミノ酸残基を含有すると結論づけた（参照によって本明細書に組み込まれるＫｉｎｄｅｒｍａｎら、２００６の図１を参照されたい）。ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する際に、二量化及びＡＫＡＰ結合について重要性の低い残基では、保存的アミノ酸置換を成し得るであろうが、下線を付された残基のいずれの変更も回避することが望ましいであろうことを、当業者は了解するであろう。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１）
【０１５５】
下でより詳細に論述するとおり、保存的アミノ酸置換は、２０種の共通Ｌ−アミノ酸のそれぞれについて特徴づけられている。したがって、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ（２００６）及び保存的アミノ酸置換のデータに基づき、配列番号１に基づく潜在的な代替ＤＤＤ配列を表２において示す。表２の考案において、高度に保存的なアミノ酸置換のみを考慮した。例えば、荷電残基は、同じ電荷の残基でのみ置換され、小さな側鎖を有する残基は、同様のサイズの残基で置換され、ヒドロキシル側鎖は、他のヒドロキシルでのみ置換された、などである。アミノ酸二次構造に対するプロリンの独特な作用によって、他の残基が、プロリンに代わることはなかった。限られた数のそのような潜在的な代替ＤＤＤ部分配列を、下記の配列番号１２〜配列番号３１において示す。標準的な技術によって、例えば、市販のペプチドシンセサイザーまたは周知の特定部位の突然変異誘発技術を使用して、ＤＤＤ部分の属の範囲内で代替種を構築することができることを、当業者は了解するであろう。ＡＤ部分結合に対するアミノ酸置換の作用はまた、標準的な結合アッセイによって、例えば、Ａｌｔｏら（２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜５０）において開示されているとおりに、容易に決定することができる。
【０１５６】
【表２】
2019048869.tif 000003
【０１５７】
ＴＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１２）
ＳＫＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１３）
ＳＲＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１４）
ＳＨＩＮＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１５）
ＳＨＩＱＩＰＰＡＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＳＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＤＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＮＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１９）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＡＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２０）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＳＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２１）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＤＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２２）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＫＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２３）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＮＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２４）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＮＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２５）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＥＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＬＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＩＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２９）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＶＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３０）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＤＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３１）
【０１５８】
Ａｌｔｏら（２００３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５〜５０）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列の生物情報学的分析を行って、０．４ｎＭのＤＤＤについての結合定数を有する、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号３）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換がＤＤＤとの結合を減少させる傾向があるＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基に、下記の配列番号３において下線を付す。ＡＤ配列の配列変異体を設計する際に、ＤＤＤ結合について重要性の低い残基では、保存的アミノ酸置換を成し得るであろうが、下線を付された残基のいずれの変更も回避することが望ましいであろうことを、当業者は了解するであろう。表３は、上記の表２においてＤＤＤ１（配列番号１）のために示したものと同様に、ＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１、配列番号３）の配列における潜在的な保存的アミノ酸置換を示している。
【０１５９】
限られた数のそのような潜在的な代替ＡＤ部分配列を、下記の配列番号３２〜配列番号４９において示す。当業者は、Ａｌｔｏら（２００３）のデータに基づき、考えられ得るＡＤ部分配列の属内の他の種を作製、試験、及び使用することができるであろう。Ａｌｔｏ（２００３）の図２は、実際の結合実験に基づき、ＤＤＤ部分への結合活性を残しつつ成し得るいくつかのアミノ酸置換を示していることに注意されたい。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
【０１６０】
【表３】
2019048869.tif 000004
【０１６１】
ＮＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３２）
ＱＬＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３３）
ＱＶＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３４）
ＱＩＤＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３５）
ＱＩＥＦＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３６）
ＱＩＥＴＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３７）
ＱＩＥＳＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３８）
ＱＩＥＹＩＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３９）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４０）
ＱＩＥＹＬＡＲＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４１）
ＱＩＥＹＬＡＫＮＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４２）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＥＮＡＩＱＱＡ（配列番号４３）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＱＡＩＱＱＡ（配列番号４４）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＮＱＡ（配列番号４５）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＮＡ（配列番号４６）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＬ（配列番号４７）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＩ（配列番号４８）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＶ（配列番号４９）
【０１６２】
Ｇｏｌｄら（２００６、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３〜９５）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを利用してＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号５０）を開発し、ＲＩアイソフォームと比較して、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームについて５桁高い選択性を示した。下線を付した残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分との結合を増大させるアミノ酸置換の位置を、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対して示している。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基を、残基番号４として付番し、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。置換がＲＩＩαについての親和性に影響を及ぼすようにされた残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、及び２０であった（Ｇｏｌｄら、２００６）。ある種の代替実施形態では、ＤＮＬ（商標）コンストラクトを調製するために、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列を、ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分配列の代わりに置換することができることが企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列の代わりに置換され得るであろう他の代替配列を、配列番号５１〜５３において示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対する置換に、下線を付す。配列番号４において示されるＡＤ２配列と同様に、ＡＤ部分は、追加のＮ末端残基システイン及びグリシン、ならびにＣ末端残基グリシン及びシステインも含んでよいと予測される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号５０）
代替のＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５１）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５２）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５３）
【０１６３】
Ｇｏｌｄらの図２は、下記に示す、様々なＡＫＡＰタンパク質からの追加のＤＤＤ結合性配列を開示した。
ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰ−ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号５４）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号５５）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号５６）
ＲＩ特異的ＡＫＡＰ
ＡＫＡＰｃｅ
ａｌｙｑｆａｄｒｆｓｅｌｖｉｓｅａｌ（配列番号５７）
ｒｉａｄ
ｌｅｑｖａｎｑｌａｄｑｉｉｋｅａｔ（配列番号５８）
ｐｖ３８
ｆｅｅｌａｗｋｉａｋｍｉｗｓｄｖｆ（配列番号５９）
二重特異性ＡＫＡＰ
ａｋａｐ７
ｅｌｖｒｌｓｋｒｌｖｅｎａｖｌｋａｖ（配列番号６０）
ｍａｐ２ｄ
ｔａｅｅｖｓａｒｉｖｑｖｖｔａｅａｖ（配列番号６１）
ｄａｋａｐ１
ｑｉｋｑａａｆｑｌｉｓｑｖｉｌｅａｔ（配列番号６２）
Ｄａｋａｐ２
ｌａｗｋｉａｋｍｉｖｓｄｖｍｑｑ（配列番号６３）
【０１６４】
Ｓｔｏｋｋａら（２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３〜９９）も、配列番号６４〜６６において示される、ＰＫＡと結合するＡＫＡＰのペプチド競合物質を開発した。それらのペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号６４）、ＲＩＡＤ（配列番号６５）、及びＰＶ−３８（配列番号６６）と名付けられた。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームについてより大きな親和性を示し、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８は、ＲＩについてより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号６４）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号６５）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号６６）
【０１６５】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７〜３０６）は、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対して０．４ｎＭの低い結合定数を有する、ＰＫＡと結合するＡＫＡＰについてさらに他のペプチド競合物質を開発した。様々なＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１において示されており、これを、下記の表４において再現する。ＡＫＡＰＩＳは、合成ＲＩＩサブユニット結合性ペプチドを表す。他のペプチドはすべて、指示ＡＫＡＰのＲＩＩ結合性ドメインに由来する。
【０１６６】
【表４】
2019048869.tif 000005
【０１６７】
種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン内で高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号３）に関して下線を付すことによって下記に示す。残基は、Ａｌｔｏら（２００３）によって観察されたものと同じであるが、Ｃ末端アラニン残基の付加を伴う（参照によって本明細書に組み込まれるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照されたい）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列について特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ、及びＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐの配列であった。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３）
【０１６８】
Ｃａｒｒら（２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２〜３８）は、ヒト及び非ヒトタンパク質からの種々のＡＫＡＰ結合性ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調査し、種々のＤＤＤ部分の間で最も高度に保存されていると考えられるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号１のヒトＰＫＡ  ＲＩＩα  ＤＤＤ配列に関して下線を付すことによって下記に示す。特に保存された残基を斜体によってさらに示す。残基は、ＡＫＡＰタンパク質への結合に重要であるとＫｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）によって示唆されたものと重複するが、それらと同一ではない。ＤＤＤの配列変異体を設計する際には、下線を付されてなく、斜字とされてもいない残基については、保存的アミノ酸置換は考慮し得るが、最も保存された残基（斜体）の変更を回避することが最も好ましく、かつ保存残基（下線）の変更を回避することも好ましいであろうことを、当業者は了解するであろう。
【化１】
2019048869.tif 000006
【０１６９】
Ｃａｒｒら（２００１）のデータに基づき、ＤＤＤ１（配列番号１）配列での保存的アミノ酸置換の改変セットを表５において示す。置換配列のこの縮小セットでも、過度の実験をすることなく、当業者が生成、試験、及び使用することができる６５，０００超の考えられる代替のＤＤＤ部分配列が存在する。当業者は、表２及び表３について上で開示したとおり、そのような代替のＤＤＤアミノ酸配列を容易に得ることができるであろう。
【０１７０】
【表５】
2019048869.tif 000007
【０１７１】
ＡＤまたはＤＤＤ部分の属の範囲内で代替種を生成するために、当分野で標準的な技術及び日常的に過ぎない実験を使用して、ＤＤＤまたはＡＤアミノ酸配列におけるこれらのアミノ酸置換及び他のアミノ酸置換を利用することができることを、当業者は了解するであろう。
【０１７２】
アミノ酸置換
代替の実施形態では、開示した方法及び組成物は、１個または複数個の置換アミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの生成及び使用を伴い得る。例えば、ＤＮＬ（商標）コンストラクトを作製するために使用するＤＤＤ及び／またはＡＤ配列を、上で論述したとおりに改変してもよい。
【０１７３】
一般に、アミノ酸置換が典型的には、あるアミノ酸を、相対的に同様の特性の別のアミノ酸で置き換えること（すなわち、保存的アミノ酸置換）を伴うことが、当業者は分かるであろう。様々なアミノ酸の特性、ならびにタンパク質構造及び機能に対するアミノ酸置換の作用は、当技術分野における広範な研究及び知識の対象となっている。
【０１７４】
例えば、アミノ酸の疎水性親水性指数が考慮され得る（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３２）。アミノ酸の相対的疎水性親水性特性は、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、そのタンパク質の二次構造は、そのタンパク質と他の分子との相互作用を定める。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づき、疎水性親水性指数を割り当てられており（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタマート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルタート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。保存的置換を行う際には、その疎水性親水性指数が±２以内であるアミノ酸を使用することが好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内がさらにより好ましい。
【０１７５】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮し得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０）；グルタマート（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸と、同様の親水性を有する他のアミノ酸との置き換えが好ましい。
【０１７６】
他の検討事項には、アミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、コンパクトな側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシンまたはセリンを、嵩高な側鎖を有するアミノ酸、例えば、トリプトファンまたはチロシンと置き換えることは一般に好ましくないであろう。タンパク質二次構造に対する様々なアミノ酸残基の作用も、検討事項である。経験的研究によって、アルファ−へリックス、ベータ−シート、または逆向ターン二次構造を取るタンパク質ドメインの傾向に対する種々のアミノ酸残基の作用が決定されており、当技術分野で公知である（例えば、Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：２２２〜２４５；１９７８、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４７：２５１〜２７６；１９７９、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．、２６：３６７〜３８４を参照されたい）。
【０１７７】
そのような検討及び広範な経験的研究に基づき、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当技術分野で知られている。例えば：アルギニン及びリシン；グルタマート及びアスパルタート；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン及びイソロイシンである。別法では：Ａｌａ（Ａ）  ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）  ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）  ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）  ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）  ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）  ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）  ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）  ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）  ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）  ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）  ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）  ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）  ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）  ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）  ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）  ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）  ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）  ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）  ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【０１７８】
アミノ酸置換についての他の検討事項には、残基が、タンパク質の内部に位置するか、または溶媒曝露されるかどうかが含まれる。内部残基では、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｓｅｒ及びＡｌａ；Ｔｈｒ及びＡｌａ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｌｅｕ及びＭｅｔ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ；Ｔｙｒ及びＴｒｐが含まれるであろう（例えば、ＰＲＯＷＬウェブサイト、ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕを参照されたい）。溶媒曝露残基では、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ａｓｐ及びＧｌｕ；Ｇｌｕ及びＧｌｎ；Ｇｌｕ及びＡｌａ；Ｇｌｙ及びＡｓｎ；Ａｌａ及びＰｒｏ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ａｌａ及びＳｅｒ；Ａｌａ及びＬｙｓ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｐｈｅ及びＴｙｒが含まれるであろう（同上）。アミノ酸置換を選択する際の援助となるように、様々なマトリックス、例えば、ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、Ｌｅｖｉｎマトリックス、及びＲｉｓｌｅｒマトリックス（同書）が構築されている。
【０１７９】
アミノ酸置換を決定する際に、分子間または分子内結合の存在、例えば、正の電荷をもつ残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負の電荷をもつ残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間でのイオン結合（塩橋）、または近傍システイン残基間でのジスルフィド結合の形成も考慮することができる。
【０１８０】
コード化タンパク質配列中の任意のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換する方法は周知であり、例えば、特定部位の突然変異誘発の技術によるか、またはアミノ酸置換をコードし、発現ベクターコンストラクトにスプライシングするオリゴヌクレオチドの合成及びアセンブリによる、当業者にとっては日常的な実験事項である。
【０１８１】
治療薬
代替の実施形態では、治療薬、例えば、細胞毒性薬、抗血管新生薬、アポトーシス促進薬、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、または他の作用物質を、対象ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／若しくは抗体にコンジュゲートさせて、またはｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／または抗体の前に、それと同時に、若しくはその後に別に投与して使用することができる。使用される薬物は、抗有糸分裂薬、抗キナーゼ薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗生物質、アルカロイド薬、抗脈管形成薬、アポトーシス促進薬、及びそれらの組合せからなる群から選択される薬学的特性を有し得る。
【０１８２】
使用される例示的な薬物には、限定されないが、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アンスラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合薬、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９が含まれ得る。
【０１８３】
使用される毒素には、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えば、オンコナーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌腸毒素−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、及びシュードモナス内毒素が含まれ得る。
【０１８４】
使用されるケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ、及びＩＰ−１０が含まれ得る。
【０１８５】
ある種の実施形態では、抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチド及び抗体、抗血管成長因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体及びペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走−阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害薬、組織メタロプロテイナーゼ阻害薬、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポイエチン−２、インターフェロン−アルファ、ヘルビマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノシクリンを使用することもできる。
【０１８６】
使用される免疫調節薬は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血性因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、及びそれらの組合せから選択することができる。リンホトキシン、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血性因子、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、または−λ、及び幹細胞成長因子、例えば、「Ｓ１因子」と称されるものが特に有用である。サイトカインには、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、瀘胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板−成長因子；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド、またはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、ならびにＬＴが含まれる。
【０１８７】
使用される放射性核種には、限定されないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ｐｂ、及び２２７Ｔｈが含まれる。治療用放射性核種は好ましくは、オージェ放射体では２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体では１００〜２，５００ｋｅＶ、及びアルファ放射体では４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子で実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、及びＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。アルファ−粒子の発生で実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。そのような放射性核種には、限定されないが：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７、及びＦｍ−２５５が含まれる。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。使用される追加の可能性のある放射性同位体には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが含まれる。一部の有用な診断用核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、または１１１Ｉｎが含まれ得る。
【０１８８】
治療薬には、光活性薬または色素が含まれ得る。蛍光組成物、例えば、蛍光色素、及び他の色素原、または色素、例えば、可視光感受性のポルフィリンが、病変に適切な光を照射することによって病変を検出及び処置するために使用されている。治療では、これは、光放射線、光治療、または光線力学的治療と称される。Ｊｏｒｉら（編）、ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＴＵＭＯＲＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ  Ｐｒｏｇｅｔｔｏ  １９８５）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ、Ｃｈｅｍ．  Ｂｒｉｔａｉｎ（１９８６）、２２：４３０を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体が、光治療を達成するために光活性化色素とカップリングされている。Ｍｅｗら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３），１３０：１４７３；同書、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８５）、４５：４３８０；Ｏｓｅｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８６）、８３：８７４４；同書、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．（１９８７）、４６：８３；Ｈａｓａｎら、Ｐｒｏｇ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓ．（１９８９）、２８８：４７１；Ｔａｔｓｕｔａら、Ｌａｓｅｒｓ  Ｓｕｒｇ．  Ｍｅｄ．（１９８９）、９：４２２；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９１）、６７：２５２９を参照されたい。
【０１８９】
他の有用な治療薬は、好ましくは発癌遺伝子及び発癌遺伝子産物、例えば、ｂｃｌ−２またはｐ５３に向けられるオリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。治療用オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。任意のｓｉＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ種を、標的とする組織に送達するために抗体またはその断片に結合させることができることを、当業者は了解するであろう。広範囲の様々な標的に対する多くのｓｉＲＮＡ種が当技術分野で公知であり、任意のそのような既知のｓｉＲＮＡを、特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において利用することができる。
【０１９０】
使用することができる既知のｓｉＲＮＡ種には、ＩＫＫ−ガンマ（米国特許第７，０２２，８２８号）；ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ−１及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（米国特許第７，１４８，３４２号）；Ｂｃｌ２及びＥＧＦＲ（米国特許第７，５４１，４５３号）；ＣＤＣ２０（米国特許第７，５５０，５７２号）；トランスデューシン（ベータ）様３（米国特許第７，５７６，１９６号）；ＫＲＡＳ（米国特許第７，５７６，１９７号）；炭酸脱水酵素ＩＩ（米国特許第７，５７９，４５７号）；補体成分３（米国特許第７，５８２，７４６号）；インターロイキン−１受容体関連キナーゼ４（ＩＲＡＫ４号）（米国特許第７，５９２，４４３号）；サバイビン（米国特許第７，６０８，７０７０号）；スーパーオキシドジスムターゼ１（米国特許第７，６３２，９３８号）；ＭＥＴ癌原遺伝子（米国特許第７，６３２，９３９号）；アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ号）（米国特許第７，６３５，７７１号）；ＩＧＦ−１Ｒ（米国特許第７，６３８，６２１号）；ＩＣＡＭ１（米国特許第７，６４２，３４９号）；補体因子Ｂ（米国特許第７，６９６，３４４号）；ｐ５３（７，７８１，５７５号）、及びアポリポタンパク質Ｂ（７，７９５，４２１号）について特異的なものが含まれる（各参照特許の実施例の節は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１９１】
追加のｓｉＲＮＡ種を、公知の市販品供給元、例えば、他の多くのなかでも、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、及びＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から入手することができる。ｓｉＲＮＡ種の他の公に利用可能な供給源には、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＣｅｎｔｒｅのｓｉＲＮＡｄｂデータベース、ＭＩＴ／ＩＣＢＰ  ｓｉＲＮＡデータベース、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲＮＡｉ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｓｈＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ、及びＮＣＢＩのＰｒｏｂｅデータベースが含まれる。例えば、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｂｅデータベースには、３０，８５２種のｓｉＲＮＡ種が存在する。任意の該当する遺伝子について、ｓｉＲＮＡ種は、すでに設計されているか、または公に利用可能なソフトウェアツールを使用して容易に設計され得ることを、当業者は了解するであろう。任意のそのようなｓｉＲＮＡ種を、対象ＤＮＬ（商標）複合体を使用して送達することができる。
【０１９２】
治療的処置法
様々な実施形態が、対象、例えば、ヒト、家庭用またはコンパニオンペット、例えば、イヌ及びネコを含む哺乳動物において癌を処置する方法であって、対象に、治療有効量の細胞毒性及び／または免疫調節薬の組合せを投与することを含む方法に関する。
【０１９３】
細胞毒性ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体の投与を、標的細胞の表面上の別の抗原と結合するか、またはそれと反応する治療有効量の別の抗体と同時に、または順に投与することによって補足することができる。好ましい追加のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＭ４抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、Ｉａ、ＭＩＦ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｆｌｔ−３、ＶＥＧＦＲ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、テネイシン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、補体因子Ｃ５、発癌遺伝子産物、またはそれらの組合せと反応性のＭＡｂからなる群から選択される少なくとも１種のヒト化、キメラ、またはヒトＭＡｂを含む。使用される様々な抗体、例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、及び抗ＣＤ２２抗体は、当業者に公知である。例えば、それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれるＧｈｅｔｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ８：３５３（１９９６）、米国特許第５，７９８，５５４号；同第６，１８７，２８７号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６７６，９２４号；同第７，１０９，３０４号；同第７，１５１，１６４号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３０，０８５号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５０１，４９８号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６７０，８０４号；米国特許出願公開第２００８０１３１３６３号；同第２００７０１７２９２０号；同第２００６０１９３８６５号；同第及び２００８０１３８３３３号を参照されたい。
【０１９４】
併用療法をさらに、少なくとも１種の治療薬を同時に、または順に投与することで補足することができる。例えば、「ＣＶＢ」（シクロフォスファミド１．５ｇ／ｍ２、エトポシド２００〜４００ｍｇ／ｍ２、及びカルムスチン１５０〜２００ｍｇ／ｍ２）は、非ホジキンリンパ腫を処置するためのレジメンである。Ｐａｔｔｉら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ５１：  １８（１９９３）。他の適切な組み合わせ化学療法レジメンが、当業者に周知である。例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎら、「Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＣＡＮＣＥＲ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，  ＶＯＬＵＭＥ  ２、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｈｏｌｌａｎｄら（編）、ｐａｇｅｓ  ２０２８〜２０６８（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９３）を参照されたい。例として、中悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を処置するための第一世代化学療法レジメンには、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾン）及びＣＨＯＰ（シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン）が含まれる。有用な第二世代化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、及びロイコボリン）であり、適切な第三世代レジメンは、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、及びロイコボリン）である。追加の有用な薬物には、酪酸フェニル、ベンダムスチン、及びブリオスタチン−１が含まれる。
【０１９５】
治療薬の組合せを、公知の方法によって製剤化して、薬学的に有用な組成物を調製することができ、それによって、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を、薬学的に適切な添加剤と混合して組み合わせる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにその改訂版を参照されたい。
【０１９６】
主題ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／または抗体は、例えば、ボーラス注射または連続注入を介しての静脈内投与のために製剤化することができる。好ましくは、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／または抗体を、約４時間未満の期間にわたって、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって注入する。例えば、第１のボーラスを、３０分以内、好ましくはさらに１５分以内に注入し、残りを続く２〜３時間にわたって注入することもできるであろう。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルで、または防腐剤を添加して多回用量容器中で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤などの形態を取ることができ、かつ懸濁化剤、安定剤、及び／または分散剤などの製剤用薬剤を含有することができる。別法では、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、発熱物質不含の滅菌水で構成するための散剤の形態であってよい。
【０１９７】
追加の薬学的方法を使用して、治療薬の組合せの作用持続時間を制御してもよい。制御放出製剤を、投与する作用物質を複合体化または吸着するポリマーを使用することによって調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックス、ならびにステアリン酸ダイマー及びセバシン酸のポリ無水コポリマーのマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １４４６（１９９２）。そのようなマトリックスからの放出速度は、治療薬の分子量、マトリックス内の治療薬の量、及び分散粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ５５：  １６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、前出。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌら、ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ、５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、及びその改訂版において記載されている。
【０１９８】
ｂｓＡｂ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体は、哺乳動物に皮下で、またはさらに、他の非経口経路によって、例えば、静脈内で、筋肉内で、腹腔内で、若しくは血管内で投与することができる。ＡＤＣは、静脈内で、腹腔内で、または血管内で投与することができる。さらに、投与は、連続注入によるか、または単回若しくは多回ボーラスによってよい。好ましくは、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を、約４時間未満の期間にわたって、より好ましくは、約３時間未満の期間にわたって注入する。
【０１９９】
より一般には、ヒトに投与されるｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身的医学的状態、及び先行する病歴などの要因に応じて様々であろう。受容者に、単回静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量のｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／または抗体を提供することが望まれ得るが、状況が必要とする場合には、より少ない、またはより多い投薬量を投与することもできる。７０ｋｇの患者で１〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量は例えば、１．７ｍの患者では７０〜１，４００ｍｇ、または４１〜８２４ｍｇ／ｍ２である。投薬を、必要に応じて繰り返すことができ、例えば、週１回で４〜１０週間、週１回で８週間、または週１回で４週間である。維持療法において必要な場合には、より低い頻度で、例えば、隔週で数週間、または月１回若しくは３カ月に１回で多くの月にわたって投与することもできる。
【０２００】
別法では、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体は、２または３週間ごとに１回の投薬として、合計少なくとも３回の投薬を繰り返して投与することができる。または、組合せを、週に２回、４〜６週間にわたって投与することができる。投薬量を、約２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者で投与１回当たり３４０ｍｇ、または７０ｋｇの患者で４．９ｍｇ／ｋｇ）に減らすならば、これを、週１回またはさらに２回で４〜１０週間にわたって投与してもよい。別法では、投薬スケジュールを減らす、すなわち、２〜３か月間にわたって２または３週間ごとにすることもできる。しかしながら、より多い用量、例えば、週１回２０ｍｇ／ｋｇ、または２〜３週ごとに１回を、ゆっくりとした静脈内注入によって繰り返し投与サイクルで投与することができることが決定されている。投与スケジュールを任意選択で、他の間隔で繰り返すことができ、投薬量を、用量及びスケジュールを適切に調節して様々な非経口経路によって投与することができる。
【０２０１】
上で論述した投薬スケジュールは、ＡＤＣ、ｂｓＡｂ、及び／またはｍＡｂに対しては適切であるが、インターフェロン作用物質は、全身毒性を回避するために、かなり少ない投薬量で投与すべきことを、当業者は了解するであろう。ヒトでのインターフェロン（ペグインターフェロンなど）の投薬量はより典型的には、マイクログラム範囲であり、例えば、１８０μｇ（皮下）を週１回、または１００〜１８０μｇ、若しくは１３５μｇ、若しくは１３５μｇ／１．７３ｍ２、若しくは９０μｇ／１．７３ｍ２、若しくは２５０μｇ（皮下）を１日おきに、インターフェロンの種類に応じて使用することができる。
【０２０２】
ｂｓＡｂ、インターフェロン、ＡＤＣ、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を定期的なボーラス注射として投与することができる一方で、代替の実施形態では、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を連続注入によって投与することができる。血中における治療薬のＣｍａｘを上昇させ、ＰＫを延長させるために、例えば、留置カテーテルによって、連続注入を投与することもできる。そのようなデバイス、例えば、ＨＩＣＫＭＡＮ（登録商標）、ＢＲＯＶＩＡＣ（登録商標）、またはＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）カテーテルは、当技術分野で公知であり（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋら、Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  ３２：７４１〜４８、２０１０を参照されたい）、任意のそのような公知の留置カテーテルを使用することができる。様々な連続注入ポンプも、当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の注入ポンプを使用することができる。連続注入での投薬量範囲は、１日当たり０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇであり得る。より好ましくは、ｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を、２〜５時間、より好ましくは２〜３時間の比較的短期間にわたって静脈内注入することによって投与することができる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、作用物質の組合せを、癌の治療のために使用する。癌の例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、神経膠芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病、骨髄腫、またはリンパ悪性病変が含まれる。そのような癌のより個別的な例を以下に記載するが、それらには、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、神経膠星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、多形神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、さらには、頭頸部癌が含まれる。「癌」という用語には、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、その細胞が、元々の悪性疾患または腫瘍の部位以外の対象の身体の部位に移動していない癌）及び続発性悪性細胞または腫瘍（例えば、元々の腫瘍の部位とは異なる続発部位への悪性細胞または腫瘍細胞の転移、遊走から生じた癌）が含まれる。本発明の処置方法を促す癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現、過剰発現、または異常発現する細胞に関係する。
【０２０４】
癌または悪性病変の他の例には、限定されないが：急性小児期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性病変、肛門癌、神経膠星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳神経膠星状細胞腫、脳神経膠星状細胞腫、子宮頸癌、小児期（原発性）肝細胞癌、小児期（原発性）肝臓癌、小児期急性リンパ芽球性白血病、小児期急性骨髄性白血病、小児期脳幹膠腫、小児期小脳神経膠星状細胞腫、小児期脳神経膠星状細胞腫、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期ホジキン病、小児期ホジキンリンパ腫、小児期視床下部及び視路膠腫、小児期リンパ芽球性白血病、小児期髄芽細胞腫、小児期非ホジキンリンパ腫、小児期松果体及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期原発性肝臓癌、小児期横紋筋肉腫、小児期軟部組織肉腫、小児期視路及び視床下部膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵臓膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵臓外分泌部癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発扁平上皮性頸部癌、転移性原発性扁平上皮性頸部癌、転移性扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮性頸部癌、口咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性多血症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視路及び視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに任意の他の過剰増殖性疾患、他にも、上で列挙した臓器系に位置する新生物が含まれる。
【０２０５】
本明細書及び特許請求の範囲に記載した方法及び組成物は、悪性または前悪性状態を処置し、限定されないが、上記の障害を含む新生物または悪性状態への進行を予防するために使用することができる。そのような使用は、新形成または癌への前述の進行が知られているか、それが疑われる状態において、特に、過形成、化生、または最も特には異形成からなる非新生細胞増殖が起きている場合に適応とされる（そのような異常な増殖状態の総説については、Ｒｏｂｂｉｎｓ及びＡｎｇｅｌｌ、ＢＡＳＩＣ  ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、２ｄ  Ｅｄ．、Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．  ６８〜７９（１９７６）を参照されたい）。
【０２０６】
異形成は多くの場合に、癌の前兆であり、主に上皮において見出される。これは、個々の細胞の均一性及び細胞の建築的配向の喪失を伴う非新生細胞増殖の最も無秩序な形態である。慢性刺激または炎症が存在する場合に特徴的に、異形成は起こる。処置することができる異形成障害には、限定されないが、無汗性外胚葉性異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、脳異形成、子宮頚部異形成、軟骨外胚葉性異形成、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、ぞうげ質異形成、骨幹異形成、外胚葉性異形成、エナメル質異形成、脳−眼異形成、半肢骨端異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色ひだ性異形成、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎臓−網膜異形成、発汗性外胚葉性異形成、発汗減少症性外胚葉性異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳房異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単発性線維性異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖端セメント質異形成、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が含まれる。
【０２０７】
処置することができる追加の新生物発生前障害には、限定されないが、良性異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、線維性嚢胞状態、組織肥大、腸管ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光性口唇炎、及び日光性角化症が含まれる。
【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明の方法を、癌、特に、上で列挙したものの増殖、進行、及び／または転移を阻害するために使用する。
【０２０９】
追加の過剰増殖性疾患、障害、及び／または状態には、限定されないが、悪性病変及び関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病を含む）を含む）及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、及び充実性腫瘍（限定されないが、肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫を含む）の進行及び／または転移が含まれる。
【０２１０】
発現ベクター
さらに他の実施形態は、抗体、抗体断片、サイトカイン、またはｂｓＡｂの構成成分融合タンパク質、例えば、ＤＮＬ（商標）コンストラクトをコードする核酸を含むＤＮＡ配列に関し得る。融合タンパク質は、例えば、ＡＤまたはＤＤＤ部分に結合している抗体若しくは断片、またはサイトカインを含み得る。
【０２１１】
様々な実施形態が、コーディングＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。ベクターは、キメラ、ヒト化、またはヒト可変領域配列が結合し得るヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖定常領域、ならびにヒンジ領域をコードする配列を含み得る。ベクターは加えて、選択された宿主細胞においてコード化タンパク質（複数可）を発現するプロモーター、エンハンサー、及びシグナルまたはリーダー配列を含んでよい。特に有用なベクターは、ｐｄＨＬ２またはＧＳである。より好ましくは、軽鎖及び重鎖定常領域、ならびにヒンジ領域は、ヒトＥＵ骨髄腫免疫グロブリンからのものであってよく、その際、任意選択によって、アロタイプ位にあるアミノ酸の少なくとも１個は、異なるＩｇＧ１アロタイプにおいて見出されるものに変えられ、任意選択によって、ＥＵ付番系に基づくＥＵの重鎖のアミノ酸２５３がアラニンに置き換えられ得る。Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８〜８５（１９６９）を参照されたい。他の実施形態では、ＩｇＧ１配列を、ＩｇＧ４配列に変換することができる。
【０２１２】
発現コンストラクトを遺伝子操作し、操作タンパク質を発現するために宿主細胞に挿入する方法が当技術分野で周知であり、日常的な実験事項であることを、当業者は了解するであろう。宿主細胞、及びクローニングされた抗体または断片の発現方法は、例えば、それぞれの実施例の節が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３１，３２７号、同第７，５３７，９３０号、同第７，７８５，８８０号、同第８，０７６，４１０号、同第８，１５３，４３３号、及び同第８，３７２，６０３号において記載されている。
【０２１３】
キット
様々な実施形態が、患者において罹患組織を処置または診断するために適した構成要素を含有するキットに関し得る。例示的なキットは、本明細書に記載のとおりの１種または複数種のｂｓＡｂ、ＡＤＣ、インターフェロン、及び／またはチェックポイント阻害物質抗体を含有し得る。投与のための構成要素を含有する組成物が、例えば、経口送達による、消化管を介しての送達のために製剤化されていなければ、いくつかの他の経路を介して、キット構成要素を送達することができるデバイスが含まれ得る。非経口送達などの適用のためのデバイスの１種は、対象の身体に組成物を注射するために使用されるシリンジである。吸入デバイスも使用することができる。ある種の実施形態では、滅菌液体製剤または凍結乾燥製剤を含有するプレフィルドシリンジまたは自動注射ペンの形態で、治療薬を提供することができる。
【０２１４】
キット構成要素を一緒に、または２個以上の容器に分離して包装することができる。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に適している組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアルであってよい。キットは、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１種または複数種の緩衝液を含有してもよい。使用することができる他の容器には、限定されないが、パウチ、トレイ、ボックス、管などが含まれる。キット構成要素を容器内に包装し、滅菌維持することができる。含まれ得る別の構成要素は、その使用のためにキットを使用する人への指示書である。
【実施例】
【０２１５】
次の例は、本発明の特許請求の範囲を例示するために提供するものであって、制限するために提供するものではない。
【０２１６】
実施例１．  Ｔ細胞再指導性二重特異性抗体ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体
例示的な白血球再指導性二重特異性抗体のいくつかの種を、下記のとおりのＤＮＬ（商標）複合体として作製した。それらの複合体は、限定されないが、Ｔｒｏｐ−２＋癌細胞を含む適切な標的細胞に対する免疫応答を誘発するために有効であった。
【０２１７】
材料及び方法
ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体を作製及び使用するための一般技術を下記の実施例において記載する。ＣＤ３及びＣＤ１９に対する結合部位を有する例示的な白血球再指導性二重特異性抗体を、（１９）−３ｓ（図１）と称されるＤＮＬ（商標）複合体として作製した。抗ＣＤ１９  Ｆ（ａｂ）２  ＤＮＬモジュールを、Ｆｄ鎖のカルボキシル末端での二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ２）の組換え融合によって構築した。抗ＣＤ３−ｓｃＦｖモジュールをＯｋｔ３  ｍＡｂから、アンカードメイン（ＡＤ２）の付加を伴って設計し、ＶＨ−Ｌ１−ＶＫ−Ｌ２−６Ｈ−Ｌ３−ＡＤ２（「６Ｈ」は配列番号１０５として開示）の形式で組み立てたが、ここで、Ｖドメインを柔軟なペプチドリンカーによって融合させ、６−Ｈｉｓリンカー（配列番号１０５）をＡＤ２ペプチドに先行させた。抗ＣＤ３可変領域、リンカー、及びＡＤ２の配列を下記に示す。
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＨ配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＳＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号９６）
Ｌ１リンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖのＶＫ配列
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号９８）
Ｌ２リンカー
ＧＧＧＧＳ（配列番号９９）
ポリ−Ｈｉｓ−Ｌ３リンカー
ＨＨＨＨＨＨＧＧＧＳＧ（配列番号１００）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１０１）
【０２１８】
発現ベクター及びＤＮＬ（商標）モジュール
様々な疾患関連抗原に対する抗体部分を含み、抗ＣＤ３抗体部分に連結されていて、一般に（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂと略されるＤＮＬ（商標）複合体を構築した。独立した産生細胞系をＳｐＥＳＦＸ−１０マウス骨髄腫細胞（Ｒｏｓｓｉら、２０１１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２７：７６６−７５）において、（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂを作製するために使用されるＤＮＬ（商標）モジュールのそれぞれのために開発した。Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２ポリペプチド（配列番号９６〜１０１）をコードするｃＤＮＡ配列を合成し、５’Ｘｂａ  Ｉ及び３’Ｅａｇ  Ｉ制限部位によって、ｐｄＨＬ２発現ベクターにクローニングした。コンストラクトは、構造ＶＨ−Ｌ１−ＶＫ−Ｌ２−６Ｈ−Ｌ３−ＡＤ２（「６Ｈ」は配列番号１０５として開示）を有するｓｃＦｖにおいて、ＶＬに融合したＶＨドメインを含んだ。発現タンパク質は、本来のＯｋｔ３  ｍＡｂから２個のアミノ酸置換を有した。ＣＤＲ−Ｈ３中のシステイン残基をセリンに変えた（Ｋｉｐｒｙａｎｏｖ、１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００：６９〜７７）。ＶＬの末位から二番目の残基を、アスパラタートからリシンに変えた。
【０２１９】
Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２モジュールを、様々なＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールと組み合わせて、（Ｘ）−３ｓ三価ｂｓＡｂのパネルを生成した（表６）。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｐｄＨＬ２発現ベクターを、同様のコンストラクトのために以前に記載されたとおりに構築した（Ｒｏｓｓｉら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８３８４〜９２）。簡単には、対応するＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターから、Ｓａｃ  ＩＩ及びＥａｇ  Ｉ制限酵素を用いてＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのためのコード配列を切り出し、それを、同じ酵素を用いてＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡ２０−ｐｄＨＬ２発現ベクターから切除されたＣＨ１−ＤＤＤ２をコードする５０７  ｂｐ配列に置き換えることによって、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂをコードする発現ベクターを生成した（Ｒｏｓｓｉら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８３８４〜９２）。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールは、ヒト化ｍＡｂ  ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ラベツズマブ（ｈＭＮ−１４、抗ＣＥＡＣＡＭ５）、クリバツズマブ（ｈＰＡＭ４、抗ｍｕｃｉｎ）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、及びエプラツズマブ（ｈＬＬ２、抗ＣＤ２２）から誘導した。ｈＡ１９と名付けたｍＡｂを、マウス抗ＣＤ１９  ｍＡｂ  Ｂ４３からヒト化した（Ｕｃｋｕｎら、１９８８、Ｂｌｏｏｄ  ７１：１３〜２９）。各発現ベクターを、Ｓａｌ  Ｉ制限酵素での消化によって直線化し、電気穿孔によってＳｐＥＳＦＸ−１０細胞にトランスフェクトするために使用した。
【０２２０】
クローンを、０．２μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を含有する培地中で選択し、ＥＬＩＳＡによってタンパク質発現についてスクリーニングした。Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２をＮｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＳｏｒｂプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上で捕捉し、抗ＡＤ２  ｍＡｂで検出した。ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールをヤギ−抗ヒト−カッパ鎖で捕捉し、ヤギ−抗ヒト−Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰで検出した。タンパク質発現の生産性を、３μＭまでのＭＴＸ濃度の段階的な上昇によって増幅した。ローラーボトル培養のブロスから、アフィニティークロマトグラフィーによって、それぞれＮｉ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）及びＫａｐｐａ−Ｓｅｌｅｃｔ樹脂を使用して、Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２及びＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールを均一になるまで精製した。ＤＮＬ（商標）法を使用して、モル当量のＯｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２及びＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂモジュールの部位特異的コンジュゲーションによって、（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂを組み立てた。例えば、Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２  ２２ｍｇをＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＡ１９  ８０ｍｇと組み合わせることによって、（１９）−３ｓ約１００ｍｇを生成した。混合物を、１ｍＭ還元グルタチオンを用いて室温で終夜還元し、その後、２ｍＭ酸化グルタチオンを添加した。Ｋａｐｐａ−Ｓｅｌｅｃｔ及びＮｉ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）での連続アフィニティークロマトグラフィーによって、（１９）−３ｓを反応混合物から精製した。追加の（Ｘ）−３ｓコンストラクトを、同様のプロセスに従って様々なスケールで組み立てた
【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
分析法
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を、ＢＩＯＳＵＩＴＥ（商標）２５０、４−μｍ  ＵＨＲ  ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ）を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。エレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ−ＴＯＦ）液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）を、６２１０  ＴＯＦ  ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に連結された１２００シリーズＨＰＬＣで行った。（１９）−３ｓを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって６０℃で、Ａｅｒｉｓワイドポア３．６μｍ  Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で０．１％ギ酸水溶液中の３０〜８０％アセトニトリルの１４分勾配を使用して分析した。ＴＯＦ  ＭＳでは、キャピラリー電圧及びフラグメンター電圧をそれぞれ、５５００及び３００Ｖに設定した。
【０２２３】
細胞系及び試薬
Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｄａｕｄｉ、ＬＳ１７４Ｔ、及びＣａｐａｎ−１細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＭＤ）から購入し、Ｎａｌｍ−６細胞を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｉｎｉｅｎ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）から購入した。Ｃａｐａｎ−１を除くすべての細胞系を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。Ｃａｐａｎ−１細胞を２０％ＦＢＳで維持した。すべての細胞培養培地及び補充物は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【０２２４】
ＰＢＭＣ及びＴ細胞単離
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をドナー全血（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ＮＪ、Ｅａｓｔ  Ｏｒａｎｇｅ、ＮＪ）から、ＵＮＩ−ＳＥＰＭＡＸＩ管（Ｎｏｖａｍｅｄ、Ｌｔｄ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して精製した。ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、製造者プロトコルに従ってＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用する負の選択によってＰＢＭＣから単離した。Ｔ細胞単離の効率を、富化Ｔ細胞を抗ＣＤ３−ＰＥ抗体で染色した後に、ＦＡＣＳによって評価した。場合によっては、ＣＤ−１９及びＣＤ−１４でのさらなる染色も行って、汚染性細胞を同定した。
【０２２５】
Ｔ細胞活性化
単離されたＴ細胞を６ウェル組織培養プレート内で、２．２５×１０６細胞／ウェルの最終密度で平板培養した。Ｄａｕｄｉ細胞を一部のウェルに、１．５×１０６細胞／ウェルの最終密度で添加し、他のウェルは、Ｔ細胞のみを含有するままにした。別法では、ＰＢＭＣを６ウェル組織培養プレートに、６×１０６細胞／ウェルの最終細胞密度で添加した。各ウェルの体積を３ｍＬにした。適切なウェルに、３ｎｇ／ｍＬの（１９）−３ｓ、（Ｍ１）−３ｓ、または（１９）−ＤＤＤ２を添加した。３７℃で終夜インキュベーションした後に、各試料１ｍＬを除去した。細胞をペレット化し、氷上で、ＣＤ６９−ＡＰＣ及びＣＤ３−ＰＥで２０分間にわたって標識した。細胞をＰＢＳ中の１％ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＥＲ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０２２６】
Ｔ細胞増殖
ＰＢＭＣをＴ２５フラスコ内に、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で、規定試薬を含有させて播種した。Ｂ細胞欠失フラスコについて、Ｂ細胞を、製造者プロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ製のＢ細胞単離キットを使用する負の選択によって除去した。選択日に、培地１００μＬを各フラスコから除去し、氷上で２０分間にわたって抗ＣＤ７−ＡＰＣで標識し、一度洗浄し、７−ＡＡＤを含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ３００μＬ中に再懸濁させた。各試料について、全体積を、ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＥＲ（商標）フローサイトメーターを使用して分析する。各試料を２連で計数する。分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して行う。各試料について、死（７−ＡＡＤ＋）細胞、及び砕片（前方散乱対側方散乱に基づく）を除去した。最後に、生ＣＤ７＋細胞を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して選択及びプロットした。
【０２２７】
細胞結合アッセイ（Ｊｕｒｋａｔ／Ｃａｐａｎ−１）
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、製造者プロトコルに従ってＰＫＨ２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で染色した。Ｃａｐａｎ−１細胞を、製造者プロトコルに従って５μＭ  ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。標識されたＣａｐａｎ−１細胞を８ウェルチャンバースライド（ＴｈｅｒｍｏＷａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に添加し、終夜付着させた。翌日、培地を除去し、ＰＫＨ２６標識Ｊｕｒｋａｔ細胞を、０．１μｇ／ｍＬ  ｏｆ（Ｅ１）−３ｓ、（Ｍ１）−３ｓ、または（１９）−３ｓを含有する培地に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後に、スライドをＰＢＳで洗浄して、いずれの未結合細胞も除去し、蛍光顕微鏡によって観察した。
【０２２８】
細胞結合アッセイ（Ｊｕｒｋａｔ／Ｄａｕｄｉ）
Ｊｕｒｋａｔ及びＤａｕｄｉ細胞を、それぞれ抗ＣＤ３−ＰＥ及び抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣで標識した。次いで、標識された細胞を室温で３０分間にわたって（１９）−３ｓ０．１μｇ／ｍＬと共に２．５：１の比で同時インキュベートした。次いで、細胞のアリコットを蛍光顕微鏡によって観察した。
【０２２９】
細胞毒性アッセイ（血液腫瘍細胞系）
標的細胞を、製造者プロトコルに従ってＰＫＨ６７  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で標識した。簡単には、５×１０６個の標的細胞を２５０μＬの希釈液Ｃに再懸濁させた。第２の管で、ＰＫＨ２６色素１μＬを、２５０μＬの希釈液Ｃに添加する。次いで、細胞懸濁液を色素溶液に添加し、十分に混合し、室温で２分間にわたってインキュベートする。反応を、等体積のＦＢＳを添加することによってクエンチした。次いで、標識された細胞を完全ＲＰＭＩで３回洗浄した。未刺激の単離Ｔ細胞を、エフェクター細胞として使用した。エフェクター細胞及びＰＫＨ６７標識標的細胞を１０：１の比で合わせ、（１９）−３ｓまたは（１４）−３ｓの系列希釈を含有する４８ウェルプレートで平板培養した。各ウェルは、５×１０４個の標的細胞及び５×１０５個のエフェクター細胞を含有した。Ｊｅｋｏ−１アッセイを２０％ＲＰＭＩ中で行った。プレートを、５％ＣＯ２を含有する３７℃インキュベーター内で１８〜２４時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後に、すべての細胞を４８ウェルプレートからフローサイトメーター管に除去し、７ＡＡＤ１ｕｇ／ｍＬを含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁させて、生細胞を、死細胞及び３０，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から識別した。細胞をＦＡＣＳＣＡＬＩＢＥＲ（商標）フローサイトメーターで分析した。各試料で、８，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）ビーズを正規化参照として計数した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。各試料で、死細胞及び砕片を排除し、全生存標的細胞を計数した。
【０２３０】
細胞毒性アッセイ（充実性腫瘍細胞系）
ＰＫＨ２３での染色についてと同じ手順に従って、標的細胞をＰＫＨ６７  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）で標識した。使用したエフェクター細胞は、次のとおりであった：Ｃａｐａｎ−１アッセイでは、ＣＤ８＋富化カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からの精製後に、ＣＤ８＋富化Ｔ細胞を使用した。ＬＳ１７４Ｔ細胞では：ＰＢＭＣをＩＬ−２  ２５Ｕ／ｍＬ及びＯｋｔ３  Ｍａｂ５０ｎｇ／ｍＬを含有する培地中で５日間にわたってインキュベートし、続いて、ＩＬ−２  ２５Ｕ／ｍＬのみを含有する培地中で２日間にわたってインキュベートした後に、刺激Ｔ細胞を使用した。エフェクター細胞及びＰＫＨ６７標識標的細胞を３：１の比（５×１０４個の標的細胞及び１．５×１０５個のエフェクター細胞／ウェル）で合わせ、（Ｅ１）−３ｓ、（１４）−３ｓ、または（１９）−３ｓの系列希釈を含有する４８ウェルプレート上で平板培養した。Ｃａｐａｎ−１アッセイを２０％ＲＰＭＩ中で行った。プレートを５％ＣＯ２を含有する３７℃インキュベーター内で４２〜４８時間にわたってインキュベートした。インキュベーションの後に、懸濁細胞を、すべてのウェルからのトリプシン処理済み付着細胞と合わせ、フローサイトメーター管に移した。細胞を１回洗浄し、１ｕｇ／ｍＬの７ＡＡＤを含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁させ、生細胞を、死細胞及び３０，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓから識別した。細胞をＦＡＣＳＣＡＬＩＢＥＲ（商標）フローサイトメーターで分析した。各試料で、８，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）ビーズを正規化参照として計数した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。各試料で、死細胞及び砕片を排除し、全生存標的細胞を計数した。
【０２３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。マウスに、マトリゲルと１：１混合したＲａｊｉ（１×１０６個）及びヒトＰＢＭＣ（５×１０６個の細胞）の混合物を皮下注射した。治療を１時間後に開始した。各実験における処置レジメン、投薬量、及び動物数は、結果の節に記載する。動物を、腫瘍増殖の徴候について毎日モニターした。腫瘍が現れたら、それらを週２回測定した。腫瘍体積（ＴＶ）を、キャリパーを使用して２つの寸法で測定することによって決定し、体積を、Ｌ×ｗ２／２として定義した［式中、Ｌは、腫瘍の最長寸法であり、ｗは、最短寸法である］。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ｖ５；ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で使用し、生存代理終点を１．０ｃｍ３まで腫瘍が進行するまでの時間（ＴＴＰ）として使用して、有効性を対数順位検定によって決定した。Ｐ＜０．０５で、有意とした。
【０２３２】
結果
白血球再指導性二重特異性抗体の構築及び生化学分析
ＤＮＬ（商標）法を使用して、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＯＰ−２、ＣＥＡＣＡＭ５、及びＭＵＣ５ＡＣを含む様々な腫瘍関連抗原を標的とするための（Ｘ）−３ｓ、白血球再指導性ｂｓＡｂのパネルを生成した。これらの構造の純度は、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって実証され、その際、３種の構成成分ポリペプチド（Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２、ｈＡ１９−Ｆｄ−ＤＤＤ２、及びｈＡ１９カッパ）を表すバンドのみが明らかであった（データは図示せず）。ＬＣ−ＭＳ分析によって、Ｏｋｔ３ｓｃＦｖ−ＡＤ２及び２つのＣＨ１−ＤＤＤ２−ｈＡ１９Ｆｄ鎖のそれぞれで予測されたアミノ末端ピログルタマートを含むその演繹アミノ酸配列から計算された（１９）−３ｓの質量（１３７４３２．３７Ｄａ）と一致する逆重畳質量スペクトル（質量確度＝１１ｐｐｍ）を有する単一ＲＰ−ＨＰＬＣピークが特定された（データ図示せず）。糖鎖形成を含む追加の翻訳後修飾は示されなかった。
【０２３３】
（１９）−３ｓによって媒介されたＤａｕｄｉバーキットリンパ腫とＴ細胞との間での免疫シナプス形成
ＣＤ１９＋リンパ腫細胞へのエフェクターＴ細胞の標的化対する白血球再指導性（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体の効果を調査した（図２）。新たに単離されたＴ細胞をＤａｕｄｉ細胞と、２．５：１のＥ：Ｔ比で合わせた。細胞を（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体０、１、または５μｇ／ｍＬで室温で３０分間にわたって処理し、その後、フローサイトメトリーによって分析した。抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ７−ＡＰＣを使用して、それぞれＤａｕｄｉ及びＴ細胞を特定した。ＣＤ２０＋／ＣＤ７＋イベントの％として、同時結合が示された。（１９）−３ｓで処置した後に、抗体を含まない混合細胞で測定された２％と比較して（図２Ｂ）、フローイベントの４５．５％が、ＣＤ２０／ＣＤ７二重陽性であり、これは、シナプス形成したＤａｕｄｉ及びＴ細胞（図２Ａ）を示した。（１９）−３ｓの添加は、Ｔ細胞とＤａｕｄｉとの＞９０％の会合をもたらした（図２Ｃ）。これらの結果は、（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体が、Ｔ細胞を標的化抗原発現リンパ腫細胞に向かわせるために有効であったことを示している。
【０２３４】
Ｔ細胞と標的リンパ腫細胞との間のシナプス形成を蛍光顕微鏡によって実証し（図３）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＤａｕｄｉ（Ｂ細胞）を１：１比で合わせ、（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体０．１μｇ／ｍＬで３０分間にわたって処理し、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ（図３Ａ）及び抗ＣＤ３−ＰＥ（図３Ｂ）で染色し、その後、蛍光顕微鏡によって分析した。併合イメージ（図３Ｃ）は、緑色に染色されたＤａｕｄｉと赤色に染色されたＪｕｒｋａｔ細胞との間のシナプス形成を明らかにしている。（１９）−３ｓが存在しない状態では、シナプス形成は明らかではなかった（図３Ｄ）。図３Ｃは、標的リンパ腫細胞が、標的化Ｔ細胞と直接接触していることを実証している。
【０２３５】
一連の用量反応、例示的なＢ細胞リンパ腫系へのＴ細胞の（１９）−３ｓ媒介性会合について行った（図４）。図４において示すとおり、この実験の条件下で、Ｔ細胞と標的細胞との（１９）−３ｓ媒介性細胞−細胞会合の飽和は、ＤＮＬ（商標）複合体０．０３７〜０．１１１μｇ／ｍｌの間の濃度で達成された。
【０２３６】
図５は、標的化ＣＤ１９＋Ｂ細胞へのＴ細胞の再指導についてのＢＩＴＥ（登録商標）（図５Ａ）、ＤＡＲＴ（商標）（図５Ａ）、及びＤＮＬ（商標）（図５Ｂ）抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９複合体の相対的有効性の比較を示している。ＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（商標）でのデータは、Ｍｏｏｒｅら（２０１１、Ｂｌｏｏｄ  １１７：４５４２〜５１）から得た。Ｂ細胞リンパ腫へのＴ細胞の標的化において、０．０００５μｇ／ｍｌの試験された最低濃度で、（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体は、ＢＩＴＥ（登録商標）またはＤＡＲＴ（商標）よりも有効であった（図５）。（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体はまた、同等のＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（商標）複合体よりも、やや高い細胞−細胞会合の最大レベルを誘発した（図５Ａ）。（１９）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）複合体で生成された単一データポイントから外挿することは困難であるが、ＥＣ５０レベルは、ＢＩＴＥ（登録商標）、ＤＡＲＴ（商標）、及びＤＮＬ（商標）について同様であるようであった（図５）。
【０２３７】
Ｔ細胞と標的腫瘍細胞との（１９）−３ｓ、（Ｅ１）−３ｓ、及び（Ｍ１）−３ｓ−媒介性細胞−細胞会合
Ｔ細胞とそれらの標的腫瘍細胞との会合を促進するＴ細胞再指導性ＢｓＡｂの能力を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を標的腫瘍細胞と共に、（Ｘ）−３ｓを含めて同時インキュベートし、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡によって評価した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞白血病系であり、これを、様々な濃度の（１９）−３ｓの存在下でＦＩＴＣ標識Ｄａｕｄｉ細胞を消失させずにＴ細胞結合を示すそれらの能力によって選択し、Ｔ細胞−Ｂ細胞会合複合体を示す二重陽性（ＣＤ３＋ＣＤ２０＋）集団の検出のためにフローサイトメトリーによって分析した。明らかな細胞−細胞会合が、（１９）−３ｓ０．５ｎｇ／ｍＬでの処置の後に見られ、０．１μｇ／ｍＬでの処置の後には、細胞集団の２５％超が、細胞−細胞会合して存在した（図５）。（１９）−３ｓ０．１μｇ／ｍＬで処理した後に免疫シナプスが明らかであるとおり、蛍光顕微鏡がこのデータを裏付けている（図４）。（１９）−３ｓの不在下では、シナプス形成は見られなかった（データは図示せず）。
【０２３８】
この細胞−細胞会合を、膵臓腫瘍系Ｃａｐａｎ−１でも観察した（図６）。Ｃａｐａｎ−１は、高レベルのＴＲＯＰ２及び中レベルのＭＵＣ５ＡＣを発現する。したがって、ＴＲＯＰ２を標的とするｂｓＡｂの（Ｅ１）−３ｓ（図６Ｃ）、及びＭＵＣ５ＡＣを標的とするｂｓＡｂの（Ｍ１）−３ｓ（図６Ｂ）の両方を、非標的化対照ｂｓＡｂの（１９）−３ｓ（図６Ａ）と比較した。ＣＦＳＥ標識Ｃａｐａｎ−１細胞を、これらのｂｓＡｂの存在下で、ＰＫＨ２６標識Ｊｕｒｋａｔと共に同時インキュベートした。予測されたとおり、蛍光顕微鏡は、（Ｅ１）−３ｓによって媒介された大量のＴ細胞／Ｃａｐａｎ複合体、続いて（Ｍ１）−３ｓによって媒介されたより少量であるが、それでもかなりの量の複合体、及び（１９）−３ｓ処置後には比較的少ない複合体形成を明らかにした（図６）。
【０２３９】
（１９）−３ｓは、Ｔ細胞活性化及び増殖を特異的に誘発する。
Ｔ細胞を活性化する（１９）−３ｓの能力を、ＰＢＭＣ（図７Ａ）、またはＤａｕｄｉ  Ｂ細胞と同時インキュベートされたＴ細胞（図７Ｂ）において、Ｔ細胞活性化の初期マーカーであるＣＤ６９の発現レベルを測定することによって評価した。非標的化対照抗体、（１９）−ＤＤＤ２及び（Ｍ１）−３ｓ、さらには、Ｄａｕｄｉ標的細胞なしで（１９）−３ｓで処理されたＴ細胞と比較して、ＣＤ６９発現の５０倍超の増大によって示されるとおり、（１９）−３ｓ３ｎｇ／ｍＬでの処置は、Ｄａｕｄｉ  Ｂ細胞と共に同時インキュベートされたＴ細胞においてＴ細胞活性化を誘発した（図７Ｂ）。抗体を、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方を含めてＰＢＭＣと共にインキュベートすると、同様の結果が観察され；（１９）−３ｓは、非標的化対照よりも２０倍超高く、ＣＤ６９発現レベルを刺激した（図７Ａ）。標的細胞の不在下では、（１９）−３ｓで処理した精製Ｔ細胞は、活性化を示さなかった（図７Ｃ）。
【０２４０】
Ｔ細胞活性化の別の指標としてのＴ細胞増殖を、様々なＣＤ３を標的とする抗体でＰＢＭＣを処理した後に評価した。３ｎＭまたは３０ｐＭの（１９）−３ｓは、陽性対照ＩＬ−２／ＰＨＡのものと同様のＴ細胞増殖を誘発した（図８Ａ）。非標的化対照抗体、（１４）−３ｓは、最高（３ｎＭ）濃度で多少の非特異的Ｔ細胞増殖を示している（図８Ａ）。しかしながら、Ｔ細胞増殖は、Ｂ細胞を欠失したＰＢＭＣにおいては観察されず（図８Ｂ）、これは、標的細胞が特異的（１９）−３ｓ誘発Ｔ細胞増殖に必要とされることを示唆した。
【０２４１】
悪性細胞系の（Ｘ）−３ｓ再指導Ｔ細胞媒介性殺傷
各白血球を標的とする分子の細胞毒性を、特定の腫瘍標的細胞の溶解を媒介するその能力によって評価した。血液腫瘍細胞系では、１８〜２４時間アッセイにおいて未刺激の富化Ｔ細胞集団をエフェクター細胞として使用する１０：１のＥ：Ｔ比が、最適なアッセイ条件を示した。ＣＤ１９を標的とするｂｓＡｂの（１９）−３ｓは、比較的低いＣＤ１９発現細胞系Ｒａｍｏｓ（ＩＣ５０＝０．１７ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝７９％）、Ｄａｕｄｉ（ＩＣ５０＝１ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝６０％）、及びＮａｌｍ６（ＩＣ５０＝６ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝９３％）の最も強力な特異的殺傷を誘発した（図９Ａ）。興味深いことに、高ＣＤ１９発現細胞系であるＮａｍａｌｗａ（ＩＣ５０＝６３ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝６０％）及びＲａｊｉ（ＩＣ５０＝３ｎＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝４１％）は、（１９）−３ｓに対して感受性が最も低かった（図９Ａ）。非標的化（１４）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）コンストラクトは、試験した細胞系のいずれにおいても細胞毒性をほとんど有さなかった（図９Ｂ）。２人の異なるドナーから得られたＰＢＭＣで、Ｎａｌｍ−６ＡＬＬ細胞系に対する（１９）−３ｓコンストラクトの一致する細胞毒性性作用が得られた（図９Ｃ）。
【０２４２】
（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓＴ細胞再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性作用を、数種の細胞系において決定した（図１０）。ＣＤ２２を標的とするｂｓＡｂの（２２）−３ｓは、ＣＤ２２陽性Ｄａｕｄｉ細胞系において強力な（ＩＣ５０＝５ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝６０％）特異的Ｔ細胞媒介性溶解を示したが（図１０Ｃ）、ＣＤ２２陰性Ｎａｍａｌｗａ細胞においては示さなかった（図１０Ａ）。
【０２４３】
ＣＤ２０を標的とするｂｓＡｂの（２０）−３ｓは、より低いＣＤ２０発現のＮａｍａｌｗａ細胞系（ＩＣ５０＝３０ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝５３％）（図１０Ａ）と比較して、ＣＤ２０高発現の細胞系、Ｄａｕｄｉ（ＩＣ５０＝＜０．３ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝９０％）（図１０Ｃ）及びＪｅｋｏ（ＩＣ５０＝１ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝９０％）（図１０Ｂ）において最高の効力を示した。
【０２４４】
ＨＬＡ−ＤＲを標的とするｂｓＡｂの（Ｃ２）−３ｓを、ＨＬＡ−ＤＲ発現Ｊｅｋｏ−１細胞系（ＩＣ５０＝２０ｐＭ、ＬｙｓｉｓＭａｘ＝８８％）において試験した（図１０Ｂ）。
【０２４５】
１０：１のＥ：Ｔ比で、単離Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用すると、ｂｓＡｂは、バーキットリンパ腫（Ｄａｕｄｉ、Ｒａｍｏｓ、Ｎａｍａｌｗａ）、マントル細胞リンパ腫（Ｊｅｋｏ−１）、及び急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｌｍ−６）を含む様々なＢ細胞悪性病変において強力なＴ細胞媒介性細胞毒性を誘発した（表７）。非腫瘍結合対照の（１４）−３ｓは、１０ｎＭ超で中程度のＴ細胞死滅しか誘発しなかった。抗原／エピトープの性質、特に、そのサイズ及び細胞表面への近接が、Ｔ細胞再標的化効力について、抗原密度よりも重要であると考えられる（表７）。それぞれＮａｍａｌｗａ及びＪｅｋｏ−１で見られるとおり、ＣＤ１９またはＨＬＡ−ＤＲの発現がＣＤ２０よりもかなり高くても、（２０）−３ｓは、（１９）−３ｓ及び（Ｃ２）−３ｓよりも一貫して強力であるようである。これはおそらく、ＣＤ２０エピトープが、細胞表面近くに近接する小さな細胞外ループを含むためである。Ｄａｕｄｉを直接的に使用して比較すると、（２２）−３ｓが、最も効力が低かった。ＣＤ１９及びＣＤ２０と比較して、ＣＤ２２は、最も低い密度で発現され、急速内部移行性抗原であり、そのエピトープは、細胞表面からさらに離れている。これらの要因のそれぞれが、その低減された効力の原因であり得る。最終的に、Ｔ細胞再標的化殺傷に対する感受性は、（１９）−３ｓを使用して観察されたとおり細胞系依存性であり、Ｒａｊｉの方がより高いＣＤ１９抗原密度を発現するが、Ｒａｊｉは主に非応答性（ＩＣ５０＞３ｎＭ）であり、Ｒａｍｏｓ（ＩＣ５０＝２ｐＭ）は高度に感受性である（表７）。
【０２４６】
結論として、（１９）−３ｓ、（２０）−３ｓ、（２２）−３ｓ、及び（Ｃ２）−３ｓは、Ｔ細胞及び標的Ｂ細胞に同時に結合し、Ｔ細胞媒介性殺傷をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて誘発する。ＤＮＬ法のモジュラー性は、追加の組換え操作及びタンパク質生成を必要とせずに、様々なＢ細胞悪性病変の再指導白血球殺傷のための数種の関連コンジュゲートの迅速な生成を可能にした。細胞表面へのＣＤ２０細胞外エピトープの近接が、（２０）−３ｓで最高の効力をもたらした。
【０２４７】
【表７】
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【０２４８】
白血球再指導性ｂｓＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性作用をまた、充実性腫瘍細胞において決定した（図１１）。充実性腫瘍細胞系では、最適なアッセイ条件は、４２〜４８時間アッセイにおいて刺激Ｔ細胞を使用して、３：１のＥ：Ｔ比であると決定した。各ｂｓＡｂは、腫瘍標的細胞の特異的Ｔ細胞媒介性溶解を誘発した。ＣＥＡＣＡＭ５発現ヒト結腸腺癌細胞系のＬＳ−１７４Ｔは、（１４）−３ｓでの処理後に、強力な特異的溶解（ＩＣ５０＝２ｐＭ）を示しした（図１１Ａ）。（Ｅ１）−３ｓは、ＴＲＯＰ２発現Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腺癌細胞系の強力な特異的溶解（ＩＣ５０＝２９ｐＭ）を媒介した（図１１Ｂ）。ＣＥＡＣＡＭ６及びＴＲＯＰ  ２の両方を高レベルで発現する胃癌細胞系ＮＣＩ−Ｎ８７は、Ｔ細胞を標的とする分子、（１５）−３ｓ及び（Ｅ１）−３ｓの両方に対して非常に強力な特異的溶解（それぞれＩＣ５０＝３ｐＭ及び０．８５ｐＭ）を示した（図１１Ｃ）。非標的化対照抗体の（１９）−３は、Ｃａｐａｎ−１及びＬＳ１７４Ｔについて、濃度１ｎＭ超で低い（２０％未満）非特異的溶解を、かつＮＣＩ−Ｎ８７細胞において中程度（約４０％）の非特異的溶解を誘発した（図１１Ａ〜Ｃ）。様々な腫瘍細胞系における様々な白血球再指導性ｂｓＡｂでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性データの概要を図１２において示す。様々なコンストラクトが、標的とされた抗原を発現する細胞系について一般に低いピコモル範囲のＩＣ５０値で、最高９０％以上の標的とされた腫瘍細胞の最大細胞溶解を示した（図１２）。
【０２４９】
実施例２．  白血球再指導性ＤＮＬ（商標）複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ研究
小さい（６０ｋＤａ未満）ｓｃＦｖベースのコンストラクト、例えば、ＢＩＴＥ（登録商標）及びＤＡＲＴ（商標）の潜在的な限界の１つは、それらの毒性及び循環からの急速なクリアランスによる、長期連続注入による投与の必要である。ＤＮＬ（商標）ｂｓＡｂの分子サイズは、腎クリアランスに典型的に関係する閾値を超えているので、循環からのよりゆっくりとしたクリアランスを示すはずである。本発明者らは、（１９）−３ｓ  ｂｓＡｂ５ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス静脈内注射後のマウスにおける薬物動態パラメーターを測定した（データ図示せず）。それぞれ１．１及び５．１時間のｔ１／２α及びｔ１／２βで、二相クリアランスが観察され、１８８０ｐｍｏｌ*ｈ／ｍＬの曲線下面積（データ図示せず）が生じ、これは、同じモル濃度で投与されたＭＴ１０３（抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３  ＢＩＴＥ（登録商標））で報告された曲線下面積（米国特許出願公開第２０１０／０３０３８２７Ａ１号）よりも約６倍大きかった。主な相違は明らかに、（１９）−３ｓでのより長いｔ１／２αである（データ図示せず）。（１９）−３ｓの潜在的に有意な特性によって、本発明者らは、動物研究においてＢＩＴＥ（登録商標）のために典型的に使用される毎日の投与ではなく、より少ない頻度の投与スケジュールを使用する可能性を評価した。
【０２５０】
ヒトＰＢＭＣで再構成されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス中のＲａｊｉヒトバーキットリンパ腫異種移植片を使用して、パイロット研究を行った（図１３、図１４）。Ｒａｊｉ細胞（１×１０６細胞／マウス）を、１人の健康なドナーから新たに単離されたＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）と合わせ、マトリゲルと１：１で混合し、研究の動物のすべてに０日目に皮下注射した。５匹のマウスからなる群に、（１９）−３ｓ合計１３０μｇの静脈内注射剤を０日目に単回投与（図１３Ｂ）、４３μｇの３回投与（０、２、及び４日目）（図１３Ｃ）、または２６μｇの５回投与（０〜５日目）（図１３Ｄ）として投与した。同じ細胞混合物を接種されているが、（１９）−３ｓを投与されなかった未処置群（図１３Ａ）は、３１日の生存時間中央値（ＭＳＴ）を示した。各治療レジメンは、生存を改善し（Ｐ≦０．０５）、３回投与（１日おき）スケジュールが、最も高い延命効果をもたらした（ＭＳＴ＝９１日；対数順位分析でＰ＝０．００１８）。
【０２５１】
追跡研究を、低頻度投与の有効性を決定するために開始した（図１４）。９匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからなる群に、上記と同様の様式でＲａｊｉ及びＰＢＭＣを接種した。この研究では、第１の研究における１週間に対して、治療を２週間に延長した。群に、（１９）−３ｓ合計３６０μｇの静脈内注射剤を、２×１３０μｇ（図１４Ｂ）、４×６５μｇ（図１４Ｄ）、または６×４３μｇ（図１４Ｅ）投与として２週間にわたって投与した。追加の群には、静脈内の代わりに、２×１３０μｇ皮下投与を投与した（図１４Ｃ）。比較のために、未処置マウス（図１４Ａ）または非標的化（Ｍ１）−３ｓ抗体で処置されたマウス（図１４Ｆ）の対照を調製した。２８日目時点で、（１９）−３ｓ処置群のそれぞれが、未処置対照よりも有意に小さいＡＵＣを有した（Ｐ＜０．０５）。意外にも、皮下経路による２週間の投与は明らかに、より頻繁な静脈内投与と同様に有効であった。
【０２５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究をまた、充実性腫瘍を使用して行った（図１５）。ＬＳ１７４Ｔ結腸腺癌（図１５Ａ、図１５Ｂ）またはＣａｐａｎ−１膵臓癌（図１５Ｃ、図１５Ｄ）のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス異種移植片を上記のとおり調製した。それぞれの場合において、標的化（Ｅ１）−３ｓ（図１５Ｂ）または（１４）−３ｓ（図１５Ｄ）ｂｓＡｂ  ＤＮＬ（商標）コンストラクトを投与されたマウスは、対照と比較して改善した生存を示した。
【０２５３】
結論として、（１９）−３ｓ、（Ｅ１）−３ｓ、及び（Ｍ１）−３ｓ  ＤＮＬ（商標）コンストラクトを含む白血球再標的化ｂｓＡｂは、それぞれＣＤ３及びＣＤ１９への一価及び二価結合によって、Ｔ細胞と、それぞれＢ細胞、結腸腺癌、または膵臓癌細胞との間のシナプス形成を媒介した。Ｔ細胞の活性化、増殖、及び標的細胞殺傷は、ｅｘ  ｖｉｖｏ設定ではｐＭ濃度で、ＤＮＬ（商標）  ｂｓＡｂによって誘発された。二価腫瘍結合及びより低速のクリアランスを含むＤＮＬ（商標）ｂｓＡｂの有利な特性は、動物モデルにおいて、かつクリニックにおいて連続注入として毎日静脈内投与されるＢＩＴＥ（登録商標）またはＤＡＲＴ（商標）コンストラクトと比較して、より低頻度の投与及びもしかすると皮下投与を可能にするであろう。ＤＮＬ（商標）法のモジュラー性は、追加の組換え操作及びタンパク質生成を必要とせずに、様々な悪性病変の再指導白血球死滅のための多数の関連コンジュゲートの迅速な生成を可能にする。
【０２５４】
ＣＤ３または他の白血球抗原に結合する他の抗体、さらには、Ｔｒｏｐ−２または他の疾患関連抗原に結合する他の抗体が当技術分野で公知であり、任意のそのような抗体を、当技術分野で周知の技術を使用して、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、または他の抗体断片を作製するために使用することができることを、当業者は了解するであろう。そのような代替の抗体またはその断片を、本方法及び組成物において利用することができる。下で論述するとおり、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））複合体を作製する方法を、任意の公知の抗体または抗体断片を安定な生理学的に活性な複合体に組み込むために適用することができる。
【０２５５】
実施例３．  インターフェロン−αは、抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３二重特異性抗体の細胞毒性作用を増強する
ヒトＴ細胞と混合し、マウスに注入した場合の、ｈＲＳ７及びＯＫＴ３からＤＮＬ（商標）複合体として作製された抗ヒトＴｒｏｐ−２×抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体（（Ｅ１）−３ｓ）の治療効力を、Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腺癌腫瘍細胞の腫瘍増殖を遅延させるその能力について試験した。この治療と組み合わせた場合のインターフェロン−α（Ｅ１＊−２ｂまたはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の形態のいずれか）の効果も評価した。
【０２５６】
方法
５週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、マトリゲルと１：１で混合したＣａｐａｎ−１（５ｘ１０６）及びヒトＴ細胞（２．５×１０６細胞）の混合物を皮下注射した（１：２のＥ：Ｔ比）。それぞれ８匹のマウスからなる６つの異なる処置群が存在した。処置は、Ｃａｐａｎ−１／Ｔ細胞混合物の投与の１時間後に開始して（Ｅ１）−３ｓ４７μｇを静脈内で毎日５日間にわたって投与される１群からなった。２つの群を、等モル量のＩＦＮで処置し、１つの群には、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＣＫ−ｈＲＳ７  ＩｇＧ１から作製されたＤＮＬ分子を投与し（Ｅ１＊−２ｂ；皮下で週１回２．５μｇ×４週間）、別の群には、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ；皮下で週１回０．６μｇ×４週間）を投与した。２つの他の群には、（Ｅ１）−３ｓ＋Ｅ１＊２ｂまたは（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の組合せを投与した。対照群である最後の群は未処置のままであった。表８に、様々な処置群をまとめる。
【０２５７】
【表８】
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【０２５８】
マウスを、腫瘍増殖の徴候について毎日モニターした。腫瘍が生じ始めたら、すべての動物で、腫瘍を週に２回測定した。それらの腫瘍体積のサイズが１．０ｃｍ３を超えたら、疾患進行のためにマウスを安楽死させた。
【０２５９】
結果
様々な群での平均腫瘍体積を図１６において示す。明確にするために、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）群を含有するデータ（図１６Ｂ）を、Ｅ１＊２ｂ群（図１６Ａ）とは別のグラフに示す。未処置群の最初のマウスを疾患進行のために安楽死させたときである２９日目の未処置マウスと比較すると、すべての処置が、曲線下面積（ＡＵＣ）の点において、腫瘍増殖の制御について有意に良好であった（Ｐ＜０．０００９；ＡＵＣ２９日）。（Ｅ１）−３ｓをＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）と組み合わせると、腫瘍増殖の点において総じて最高の抗腫瘍応答が生じた（図１６Ｂ）。この処置は、どの個々の処置よりも有意に良好であり（Ｐ＜０．０４２；ＡＵＣ）、さらには、（Ｅ１）−３ｓ＋Ｅ１＊−２ｂ（Ｐ＝０．０３１２；ＡＵＣ５３日）の組合せよりも優れていた（図１６Ａ）。（Ｅ１）−３ｓ単独ではなく、Ｅ１＊２ｂまたはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独と比較すると（Ｐ＜０．００７３；ＡＵＣ４６日）、（Ｅ１）−３ｓ＋Ｅ１＊２ｂの組合せは、腫瘍増殖を有意に制御し得た（図１６Ａ〜Ｂ）。（Ｅ１）−３ｓ、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、またはＥ１＊−２ｂで処置されたマウスの間では、有意な差は存在しなかった（図１６Ａ〜Ｂ）。
【０２６０】
生存の点において、未処置マウスと比較すると、すべての処置が、有意な延命効果をもたらす（Ｐ＜０．０１１２；対数順位）（図１７）。８１日目時点で、（Ｅ１）−３ｓ＋Ｅ１＊−２ｂの組合せで処置されたマウスと、（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）で処置されたマウスとの間で、生存時間中央値（ＭＳＴ）に有意な差はなかった（それぞれＭＳＴ＝７９．５及び＞８１日）（図１７）。（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）で処置されたマウスは、どの個々の処置よりも生存結果の有意な改善を示した（Ｐ＜０．０２３７）（図１７）。（Ｅ１）−３ｓ＋Ｅ１＊２ｂで処置されたマウスは、Ｅ１＊−２ｂ単独で処置されたマウスと比較すると（ＭＳＴ＝５３日；Ｐ＜０．０３１１）、延命効果を有したが、（Ｅ１）−３ｓまたはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独で処置されたマウス（それぞれＭＳＴ＝６８及び５３日）と比較すると、延命効果を有さなかった（図１７）。（Ｅ１）−３ｓでの処置は、Ｅ１＊−２ｂで処置されたマウスと比較すると（Ｐ＝０．０４０６）、生存に有意な改善をもたらしたが、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独で処置されたマウスと比較するともたらさなかった（図１７）。Ｅ１＊２ｂのみで処置されたマウスと、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）単独で処置されたマウスとの間で、有意な差は存在しなかった（図１７）。
【０２６１】
この結果は、白血球再指導性ｂｓＡｂと組み合わせた場合に、インターフェロン−αの添加が、生存のかなりの増大及び腫瘍増殖の減少をもたらすことを実証している。タイプＩまたはタイプＩＩＩインターフェロン（インターフェロン−α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−λ）の添加で観察される有効性の改善は、特異的（Ｅ１）−３ｓ  ｂｓＡｂに限られず、ＤＮＬ（商標）複合体として、または他の形態、例えば、ＢＩＴＥ（登録商標）若しくはＤＡＲＴ（商標）で作製された他の白血球再指導性ｂｓＡｂでも観察されるであろうことを、当業者は了解するであろう。
【０２６２】
実施例４．  白血球再指導性二重特異性抗体とのインターフェロン−α併用療法についてのさらなる研究
上記実施例において、（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の組合せは、腫瘍増殖の制御における非常に有効な処置であることを実証した。これらの結果を確認し、それを拡大するために、２つの新たな群を加えた研究を行った。初めに、等モル量のＴＦ１２を動物に投与する（Ｅ１）−３ｓのための対照群を含ませた。ＴＦ１２は、１個の非標的化６７９Ｆａｂ（抗ＨＳＧ）に連結された２個のｈＲＳ７−Ｆａｂ分子からなる。加えて、Ｃａｐａｎ−１はＩＦＮに対して感受性があるので、Ｔ細胞の利点なしで、Ｃａｐａｎ−１腫瘍増殖に対するＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の効果を評価する別の群を加えた。
【０２６３】
マウス（４０匹）にＣａｐａｎ−１／Ｔ細胞混合物を注射した後に、それらを５つの処置群に無作為割り当てした。１時間後に、１１匹のマウスからなる１つの群に、（Ｅ１）−３ｓ４７μｇを毎日静脈内投与したが、これを腫瘍細胞注射の１時間後に開始して、さらに連続４日間継続した（１日４回×５）。７匹の動物からなる１群に、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の形態のインターフェロンを、週１回ベースで４週間にわたって皮下投与した。別の群には、（Ｅ１）−３ｓ（静脈内）＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（皮下）の組合せを皮下投与した。未処置対照動物には、Ｃａｐａｎ−１／Ｔ細胞を投与したが、処置はしなかった。さらなる対照群には、ＴＦ１２を、モルの点において（Ｅ１）−３ｓと同量で投与した（５７μｇ、１日４回×５）。群６のマウス（８匹の動物）には、Ｃａｐａｎ−１細胞のみ（すなわち、Ｔ細胞なし）の別の注射を投与し、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）で処置した。治療用の注射剤はすべて、１００μＬの体積であった。表９に、様々な群をまとめる。
【０２６４】
【表９】
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【０２６５】
マウスを、腫瘍増殖の徴候について毎日モニターした。腫瘍が生じ始めたら、すべての動物で、腫瘍を週に２回測定した。それらの腫瘍体積のサイズが１．０ｃｍ３を超えたら、疾患進行のためにマウスを安楽死させた。
【０２６６】
結果
平均腫瘍体積（図１８）及び生存曲線（図１９）を示す。相互には異ならないが、（Ｅ１）−３ｓ、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、またはＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｔ細胞なし）で処置されたマウスは、ＴＦ１２及び未処置対照群と比較すると、有意な抗腫瘍作用を示した（Ｐ＜０．０１０２；ＡＵＣ）。この実験を終了した日（５９日目）に、（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の組合せで処置されたマウスでの平均腫瘍体積は、０．０８３±０．０４８ｃｍ３であった。総じて、この処置群は、他の処置群すべてと比較して、有意な抗腫瘍作用を示した（Ｐ＜０．００７２；ＡＵＣ）。
【０２６７】
それぞれ個々の処置（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、Ｔ細胞なしのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、及び（Ｅ１）−３ｓ）は、ＴＦ１２及び未処置対照群の両方と比較して、有意に生存を改善した（Ｐ＜０．００５９；対数順位）（図１８、図１９）。（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の組合せを除くすべての群が、それらの個々のＭＳＴに達した。この組み合わせ群では、疾患進行（ＴＶ＞１．０ｃｍ３）によって、動物を安楽死させることはなかった。重要なことに、（Ｅ１）−３ｓ＋ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）の組合せは、すべての他の処置と比較して、有意な延命効果をもたらした（Ｐ＜０．０００７；対数順位）（図１８、図１９）。
【０２６８】
実施例５．  ヒト胃癌におけるＴ細胞再指導性二重特異性抗体とのインターフェロン−α併用療法の効果
先行する２つの実施例において開示した方法及び組成物を、ＩＦＮ−難治性ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃腫瘍系における、単独か、またはインターフェロン−α（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））と組み合わせての白血球再指導性ｂｓＡｂの効果を研究するために使用した。マウスの群（各群Ｎ＝８）に、マトリゲルと混合した５×１０６個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞＋２．５×１０６個のＴ細胞（１：２のＥ：Ｔ比）を皮下注射し、治療を１時間後に開始した。処置群を表１０において示す。
【０２６９】
【表１０】
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【０２７０】
単独か、またはインターフェロンと組み合わせた白血球再指導性ｂｓＡｂ（Ｅ１）−３ｓの作用を図２０及び図２１において示す。（Ｅ１）−３ｓ  ｂｓＡｂは、胃癌において腫瘍増殖を低減し、及び生存を増大させるのに有効であった。重要なことに、インターフェロン−αとの組合せは、インターフェロン抵抗性腫瘍においても、白血球再指導性ｂｓＡｂの作用を増強した。併用療法は、単独で添加されたいずれの作用物質よりも有効であった。単独か、またはインターフェロン−αと組み合わせたＴＦ１２  ｂｓＡｂで処置されたマウスでの対照は、未処置動物と比較して、腫瘍増殖または死亡率に対してほとんど作用を示さなかった。
【０２７１】
実施例６．  ヒト膵臓癌または結腸癌の前臨床モデルにおける抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ治療用途
ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８−抗体コンジュゲートを、すでに記載されているとおりに調製した（例えば、米国特許第７，９９９，０８３号及び同第８，０８０，２５０号を参照されたい）。皮下ヒト膵臓または結腸腫瘍異種移植片を持つ免疫不全の無胸腺ヌードマウス（雌）を、特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートまたは対照コンジュゲートのいずれかで処置するか、または未処置のままとした。特異的コンジュゲートの治療有効性を観察した。Ｃａｐａｎ１膵臓腫瘍モデルでは、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ２）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ）、及びｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体の特異的ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲートは、対照ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８コンジュゲート（抗ＣＤ２０）及び未処置対照（図示せず）よりも良好な有効性を示した。同様にヒト膵臓癌のＢＸＰＣ３モデルにおいて、特異的ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、対照処置よりも良好な治療効力を示した（図示せず）。同様に、ヒト結腸癌の進行性ＬＳ１７４Ｔモデルにおいて、特異的ｈＭＮ−１４−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８での処置は、非処置よりも有効であった（図示せず）。
【０２７２】
実施例７．  ＡＤＣ  ｈＭＮ−１４−［ＣＬ２−ＳＮ−３８］、ＩＭＭＵ−１３０を使用しての、ヌードマウスにおけるＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍の肺転移のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
結腸癌の肺転移モデルをヌードマウスにおいて、ＧＷ−３９ヒト結腸腫瘍懸濁液の静脈内注射によって定着させ、治療を１４日後に開始した。特異的抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体コンジュゲート、ｈＭＮ１４−ＣＬ２−ＳＮ−３８、さらには非標的化抗ＣＤ２２  ＭＡｂ対照コンジュゲート、ｈＬＬ２−ＣＬ２−ＳＮ−３８、ならびにｈＭＮ１４及びＳＮ−３８の等用量混合物を４日に１回×８の投与スケジュールで異なる用量を使用して注射した。選択的治療効果がｈＭＮ−１４  ＡＤＣで観察された（図示せず）。２５０μｇの投薬量では、ｈＭＮ１４−ＣＬ２−ＳＮ−３８で処置されたマウスは、１０７日超の生存期間中央値を示した。肺癌細胞を特異的に標的としない対照コンジュゲート化抗体ｈＬＬ２−ＣＬ２−ＳＮ−３８で処置されたマウスは、７７日の生存期間中央値を示し、非コンジュゲート化ｈＭＮ１４  ＩｇＧ及び遊離ＳＮ−３８で処置されたマウスは、４３．５日の未処置生理食塩水対照に匹敵する４５日の生存期間中央値を示した。非コンジュゲート化抗体及び遊離化学療法薬単独よりもかなり有効であったコンジュゲート化癌細胞標的化抗体−ＳＮ−３８コンジュゲートの有効性の有意で意外な増大が明らかに見られた（図示せず）。コンジュゲート化抗体の治療効果の用量−反応性も観察された（図示せず）。これらの結果は、同じｉｎ  ｖｉｖｏヒト肺癌系における、非コンジュゲート化抗体及び遊離ＳＮ−３８の両方の合計効果と比較して、ＳＮ−３８−抗体コンジュゲートの明らかな優位を実証する。
【０２７３】
実施例８．  治療不応性転移結腸癌（ｍＣＲＣ）を治療するためのＡＤＣ（ＩＭＭＵ−１３２またはｈＲＳ７−ＳＮ−３８）の使用
患者は、２０１２年１月に転移性疾患を初めに示したｍＣＲＣを有する６２歳の女性であった。女性は、診断の２週後に第１の治療として腹腔鏡による回腸横断結腸切除を受け、次いで、４サイクルのＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、５−フルオロウラシル、オキサリプラチン）化学療法をネオアジュバント設定で投与され、その後、肝臓の右葉の転移病変を除去するために２０１２年３月に右肝切除を受けた。これに、２０１２年６月に開始される合計１２サイクルのＦＯＬＦＯＸでのアジュバントＦＯＬＦＯＸレジメンが続いた。８月に、オキサリプラチンが、神経毒性の悪化によってレジメンから外された。５−ＦＵの女性の最終サイクルは２０１２年９月２５日であった。
【０２７４】
２０１３年１月に行われたＣＴは、肝臓への転移を示した。その後、女性は、ＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８）調査研究に登録するための良好な候補者として評定された。女性の病歴における共存症には、喘息、糖尿病、高血圧、高コレステロール血症、心雑音、裂孔ヘルニア、甲状腺機能低下症、手根管症候群、緑内障、うつ病、レストレスレッグ症候群、及び神経障害が含まれた。女性の手術歴には、卵管結紮（１９７５）、甲状腺除去（１９８３）、胆嚢摘出（２００１）、手根管解離術（２００８）、及び緑内障手術が含まれる。
【０２７５】
この治療へのエントリの時点で、女性の標的病変は、肝臓左葉内の３．１ｃｍ腫瘍であった。非標的病変には、肝臓内のいくつかの低減弱腫瘤（ｈｙｐｏ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍａｓｓｅｓ）が含まれた。女性の基線ＣＥＡは、７８１ｎｇ／ｍＬであった。
【０２７６】
ＩＭＭＵ−１３２を、週１回スケジュールで注入によって連続２週間にわたって投与し、次いで、１週休止し、これが、処置サイクルを構成した。これらのサイクルを、許容されるかぎり繰り返した。ＩＭＭＵ−１３２（８ｍｇ／ｋｇ）の第１の注入を２０１３年２月１５日に開始し、特記すべき事象なく完了した。女性は、第１のサイクルの経過中に悪心（グレード２）及び倦怠（グレード２）を経験し、以降は、主要な有害事象なしに、処置を継続している。女性は、２０１３年３月に脱毛症及び便秘を報告した。２０１３年４月８日の１回目の応答評価（６回の投与後）は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によると、標的病変の２９％の縮小を示した。女性のＣＥＡレベルは、２０１３年３月２５日に２３０ｎｇ／ｍＬに低下した。２０１３年５月２３日の２回目の応答評価（１０回投与後）において、標的病変は３９％縮小し、したがって、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分的応答を構成した。女性は、処置を継続し、８ｍｇ／ｋｇでのｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）の１２回の投与からなる６回のサイクルを受けている。この調査処置を開始してから、女性の全身健康及び臨床症状はかなり改善した。
【０２７７】
実施例９．  転移固形癌のためのＩＭＭＵ−１３２でのＡＤＣ治療
ＩＭＭＵ−１３２は、ｐＨ感受性リンカー（平均薬物−抗体比＝７．６）によって、Ｔｒｏｐ−２に結合すると急速な内部移行を示すｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ−２ヒト化モノクローナル抗体にコンジュゲートされたＣＰＴ−１１の活性代謝産物、ＳＮ−３８を含むＡＤＣである。ＩＭＭＵ−１３２は、高い普及率及び特異性で多くの癌腫によって発現されるＴｒｏｐ−２、タイプＩ膜貫通タンパク質を標的とする。この実施例では、中央値３の先行処置（一部はトポイソメラーゼ−Ｉ及び−ＩＩ阻害薬を含む）に失敗した後の種々の転移癌（膵臓癌、７；三種陰性乳癌［ＴＮＢＣ］、４；結腸直腸癌［ＣＲＣ］、３；胃癌、３、食道癌、前立腺癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌［ＳＣＬＣ］、腎臓癌、扁桃癌、膀胱癌、各１）を有する２５人の患者の第Ｉ相治験を報告する。
【０２７８】
ＩＭＭＵ−１３２を繰り返し２１日サイクルで投与し、各処置を１日目及び８日目に投与した。投与を８ｍｇ／ｋｇ／投与（すなわち、１６ｍｇ／ｋｇ／サイクル）で開始し、用量限定性好中球減少症に遭遇する前に、３＋３試験デザインで１８ｍｇ／ｋｇに漸増させた。倦怠、脱毛症、及び時折の軽度から中程度の下痢が、比較的共通する非血液毒性のいくつかであり、２人の患者が発疹を報告した。２４人の評価可能な患者の８０％超が、ＣＴによると最良の応答として、様々な転移癌のなかで安定疾患または腫瘍縮小（ＳＤ及びＰＲ）を示した。３人の患者（ＣＲＣ、ＴＮＢＣ、ＳＣＬＣ）は、ＲＥＣＩＳＴによるＰＲを有し；膵臓癌の患者を除くすべての患者での中央値ＴＴＰは、１８週超である。好中球減少症は、８〜１０ｍｇ／ｋｇ／投与（１６〜２０ｍｇ／ｋｇ／サイクル）に用量を低減することによって制御されている。
【０２７９】
免疫組織化学は、多くの保管患者腫瘍においてＴｒｏｐ−２の強い発現を示したが、血清中では、これは検出されない。血液腫瘍マーカー力価（例えば、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９）における対応する低減が腫瘍応答を反映した。繰り返し投与にもかかわらず、抗抗体または抗ＳＮ−３８抗体は検出されていない。血清中のＩＭＭＵ−１３２濃度のピーク及びトラフ評価は、コンジュゲートが７日以内に完全に排除されることを示しており、これは、５０％のＳＮ−３８が血清中に毎日放出されることを示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づき予測された所見である。これらの結果は、１サイクルあたり１６〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与されたこの新規のＡＤＣが、多様な転移固形癌において高い治療指数を示すことを示している。
【０２８０】
実施例１０．  ＣＥＡＣＡＭ５を標的とするＳＮ−３８ＡＤＣであるＩＭＭＵ−１３０は、転移結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）において治療活性である
ｐＨ感受性リンカー（７．６の平均薬物−抗体比）によってヒト化抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（ラベツズマブ）にコンジュゲートされているＳＮ−３８のＡＤＣであるＩＭＭＵ−１３０は、２つの第Ｉ相試験を完了しつつある。両方において、進行ｍＣＲＣを有する適任の患者は、その１つがトポイソメラーゼ−Ｉ阻害薬、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）である標準的な処置に失敗／再発していて、高い血漿ＣＥＡ（５ｎｇ／ｍＬ超）を有することが必要とされた。
【０２８１】
ＩＭＭＵ−１３０を、第１のプロトコル（ＩＭＭＵ−１３０−０１）では２．０ｍｇ／ｋｇから開始する用量で、１４日ごと（ＥＯＷ）に投与した。２４ｍｇ／ｋｇで、熱性好中球減少症が、３人の患者のうちの２人で起こり；それ以外では、１６ｍｇ／ｋｇ以下で、好中球減少症（グレード２以上）が、７人の患者で観察され、１人も、血小板減少症を経験した。１人の患者［４回投与（２サイクル）以上を投与された８人のうち］は、４．７カ月間で肝臓（７ｃｍで開始）及び肺標的病変の４０．６％減少（ＲＥＣＩＳＴによるＰＲ）を主な毒性なしで示し、１６ｍｇ／ｋｇで合計１８回投与を許容した。研究は、１週おきで１２ｍｇ／ｋｇで継続中である。
【０２８２】
ＳＮ−３８はＳ期細胞において最も有効であるので、より遷延性の曝露は、有効性を改善し得るであろう。したがって、第２の第Ｉ相試験（ＩＭＭＵ−１３０−０２）では、投与を週２回に増強し、３＋３試験デザインで６ｍｇ／ｋｇ／投与で開始して２週間（４回投与）、次いで、１週間の休止を１処置サイクルとした。４．０ｍｇ／ｋｇで週２回に用量を低減するまで、好中球減少症及び管理可能な下痢が主な副作用であり、初期の結果は、複数サイクルが良好に許容されることを示した。現在、４回以上投与（１サイクル）を完了した６人の患者のうち、腫瘍縮小が３人の患者で生じ、１人は、ＲＥＣＩＳＴによるＰＲ（約４６％）を継続中である。両方の試験において、ＣＥＡ血液力価は腫瘍応答と相関し、高レベルが治療を干渉することはなかった。ＥＬＩＳＡ試験に基づくと、抗抗体または抗ＳＮ−３８抗体反応は存在していない。各研究において、ＡＤＣは、最初の２４時間以内に５０％除去されたが、これは、親分子、ＣＰＴ−１１の典型的な投与においてよりもかなり長い。これらの結果は、平均約１６〜２４ｍｇ／ｋｇ／サイクルで種々のレジメンにおいて投与されたこの新規のＡＤＣは、進行ｍＣＲＣ患者において高い治療指数を示すことを示している。ＣＥＡＣＡＭ５は乳房及び肺癌、さらには他の上皮性腫瘍において高い発現を示すので、他の癌においても有用な標的であり得る。
【０２８３】
実施例１１．  単独か、または抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂ、ＩＦＮ−α、または抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣと組み合わせたチェックポイント阻害物質抗体の抗腫瘍活性
例示的なチェックポイント阻害物質抗体であるイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）の抗腫瘍活性が、他の治療薬の添加と相乗的であるか、またはそれによって阻害されるかを決定するために、マウス腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを単独で、または例示的なＴ細胞再指導性ｂｓＡｂ（Ｅ１）−３ｓ、インターフェロン−α（ＰＥＧＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ（登録商標））、または例示的なＡＤＣ  ｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＩＭＭＵ−１３２）と組み合わせて評価する。様々な作用物質及びＣＴＬＡ４遮断に対する異なる感受性に基づき、Ｍ１０９肺癌、ＳＡ１Ｎ線維肉腫、及びＣＴ２６結腸癌モデルを選択する。ヒトＴ細胞を抗体と同時投与する。
【０２８４】
すべての化合物を、それらの最適な用量及びスケジュールで試験する。組み合わせて使用する場合、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを、ＩＭＭＵ−１３２、（Ｅ１）−３ｓ、またはインターフェロン−αの初回の投与の１日後に開始する。有効性を評価するために、腫瘍増殖阻害率及び標的腫瘍サイズに達するまでの日数を使用する。抗腫瘍活性を下記のとおりスコアリングする：完全な退縮（ＣＲ；触診不可能な腫瘍）または部分的な退縮（ＰＲ；腫瘍体積の５０％低減）。相乗作用を、各作用物質での単独治療の活性よりも有意に優れた抗腫瘍活性（ｐ＜０．０５）と定義する。
【０２８５】
ＣＴＬＡ４遮断に対して感受性であり、かつ（Ｅ１）−３ｓ、インターフェロン−α、及びＩＭＭＵ−１３２に対して中程度に感受性であるＳＡ１Ｎ線維肉腫腫瘍モデルにおいて、境界相乗作用が、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ及び（Ｅ１）−３ｓの組合せで明白である一方で、インターフェロン−αでは、効果は観察されない。ＩＭＭＵ−１３２単独治療は、有意なＳＡ１Ｎ抗腫瘍活性をもたらさない。しかしながら、ＩＭＭＵ−１３２をＣＴＬＡ４  ｍＡｂと組み合わせると、相乗作用が生じる。Ｍ１０９肺転移モデル及びＣＴ２６結腸癌モデルでは、ＩＭＭＵ−１３２、（Ｅ１）−３ｓ、及びインターフェロン−αのそれぞれと組み合わせたＣＴＬＡ４  ｍＡｂについて、相乗作用が検出される。
【０２８６】
まとめると、インターフェロン−α、ＩＭＭＵ−１３２、または（Ｅ１）−３ｓにＣＴＬＡ４  ｍＡｂを添加すると、モデル依存性相乗活性が生じる。腫瘍の免疫原性にかかわらず、治療の少なくとも１種が活性である場合にのみ、相乗作用が観察される。すべての組合せレジメンが良好に許容され、併用療法が、ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ活性を阻害するようには見えない。ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ単独には応答しない腫瘍において、相乗作用が観察され、これは、他の治療薬が免疫原性細胞死を誘発し得るであろうことを示唆している。
【０２８７】
実施例１２．  難治性転移非小細胞肺癌を治療するための抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ＩＭＭＵ−１３２）及びインターフェロン−α（ＰＥＧＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ（登録商標））での併用療法
患者は、非小細胞肺癌を有すると診断された６０歳の男性である。患者に、カルボプラチン、ベバシズマブの化学療法レジメンを６ヶ月間にわたって投与すると、応答を示し、次いで、進行の後に、カルボプラチン、エトポシド、タキソテール（登録商標）、ゲムシタビンを含む化学療法のさらなるコースを次の２年間にわたって投与するが、時折の応答は、２カ月以上は持続しない。次いで、患者は、６．５×４ｃｍと測定される左縦隔腫瘤及び胸膜滲出を示す。
【０２８８】
インフォームドコンセントへの署名の後に、患者に、１８ｍｇ／ｋｇの用量で隔週でＩＭＭＵ−１３２を投与する。処置の第１週の後に、患者に、ＩＭＭＵ−１３２及びＰＥＧＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ（登録商標）の併用療法を投与する。初めの２回の注射中に、短期間の好中球減少症及び４時間以内に４回の便通で下痢が経験されるが、これらは、２日以内に解消するか、または対症薬物に応答する。合計６回のＩＭＭＵ−１３２の注入及び５回のＰＥＧＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ（登録商標）の注入の後に、インデックス病変のＣＴ評価は、部分応答未満の２２％の低減であるが、明確な腫瘍縮小を示す。患者は、この治療をさらに２カ月継続し、そのとき、インデックス病変の直径の合計の４５％腫瘍縮小の部分応答がＣＴによって示されるので、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分応答を構成する。併用療法は、別々に投与される２種の作用物質と比較して、相乗的応答を提供すると考えられる。
【０２８９】
実施例１３．  進行結腸癌を治療するためのＡＤＣ（ＩＭＭＵ−１３０）及びＴ細胞再指導性ｂｓＡｂ（ＭＴ１００）での併用療法
患者は、転移結腸癌（ステージＩＶ）と当初診断された７５歳の女性である。女性は、右部分結腸半切除及び小腸の切除を受け、次いで、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ＋ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ＋ラムシルマブ、及びＦＯＬＦＩＲＩ＋セツキシマブ治療を１年半にわたって投与され、そのとき、女性は、後盲嚢、網への疾患の展開、骨盤内の腹水及び女性の胸腔の右側での胸膜滲出液で、疾患の進行を示す。この治療の直前の女性の基線ＣＥＡ力価は、１５ｎｇ／ｍＬである。女性に、ＩＭＭＵ−１３０  ６ｍｇ／ｋｇ（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８）を週２回、連続２週間にわたって投与し、次いで、１週休止する（３週サイクル）。１回目のサイクルの後に、患者に、ＩＭＭＵ−１３２及び白血球再指導性ｂｓＡｂ  ＭＴ１１０での併用療法を投与するが、これを、同じ３週サイクルで連続注入によって投与する。いずれの重症の血液または非血液毒性も伴うことなく非常に良好に許容される５サイクルの後に、女性の血漿ＣＥＡ力価は、１．３ｎｇ／ｍＬまで中程度に縮小するが、８週評価では、女性は、インデックス腫瘍病変の２１％縮小を示し、これは、１３週目には２７％縮小まで上昇する。意外にも、患者の腹水及び胸膜浸出液の両方が、この時点で減少するので（後者は消失）、患者の全身状態は顕著に改善する。併用療法は、別々に投与される２種の作用物質と比較して、相乗的応答を提供すると考えられる。
【０２９０】
実施例１４．  ステージＩＶ転移疾患を有する胃癌患者を治療するためのＡＤＣ（ＩＭＭＵ−１３０）、抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３  ｂｓＡｂ（（Ｅ１）−３ｓ）、及びインターフェロン−αでの併用療法
患者は、６年間にわたる胃の不快感及び食事に関連する疼痛によって、医学的処置を求めていて、過去１２か月の間に体重減少を示している５２歳の男性である。胃領域の触診によって、硬い腫瘍が明らかになり、次いで、これを胃鏡検査すると、男性の胃の下部に潰瘍性腫瘤が明らかとなる。これは生検され、胃腺癌と診断される。検査室試験では、具体的な異常変化は明らかとならないが、ただし、肝機能試験は別で、ＬＤＨ及びＣＥＡが上昇し、後者は１０．２ｎｇ／ｍＬである。次いで、患者は、全身ＰＥＴスキャンを受け、これによって、胃腫瘍に加えて、左腋窩及び肝臓の右葉の転移疾患が明らかとなる（２つの小さい転移）。患者は、異腫瘍を切除され、次いで、転移腫瘍の基線ＣＴ測定を受ける。外科手術から４週後に、男性は、３コースの、シスプラチン及び５−フルオロウラシル（ＣＦ）のレジメンからなる併用化学療法を投与されるが、これを良好に許容しないので、ドセタキセルでの処置に変更される。疾患は、ＣＴスキャンに基づき約４か月間にわたって安定化されていると考えられるが、次いで、さらなる体重減少、腹部疼痛、食欲不振、及び著しい倦怠の患者の愁訴によって、ＣＴ調査を繰り返すと、合計２０％の転移のサイズの増大と、元の胃切除の部位での病変の疑いとが示される。
【０２９１】
次いで、患者に、ＩＭＭＵ−１３０（抗ＣＥＡＣＡＭ５−ＳＮ−３８）での実験的治療を８ｍｇ／ｋｇの週１回スケジュールで投与する。第１週の後に、ＩＭＭＵ−１３０、（Ｅ１）−３ｓ及びインターフェロン−αでの併用療法を開始する。患者は、続く４週間にわたって、下痢または好中球減少症の証拠を示さない。次いで、患者は、男性の転移腫瘍サイズを測定し、胃切除の元の面積を調べるためにＣＴ試験を受ける。放射線医師が、ＲＥＣＩＳＴ基準に従って、治療前の基線と比較して、２３％の転移病変の合計の低減を測定する。元の胃切除の領域に何らかの明らかな病変は存在しないようである。この時点での患者のＣＥＡ力価は７．２ｎｇ／ｍＬであり、これは、１４．５ｎｇ／ｍＬの基線値からかなり低減している。患者は、週１回併用療法を継続し、合計１３回の注入後に、男性のＣＴ研究によって、１個の肝臓転移が消失していて、すべての転移病変の合計が４１％低下し、ＲＥＣＩＳＴによる部分応答を構成していることが示される。患者の全身状態は改善し、男性は、３週ごとに維持療法を受けることを継続しつつ、通常の活動を再開している。血液ＣＥＡの最新の測定では、その値は４．８ｎｇ／ｍＬであり、これは、この患者が該当する喫煙者での正常範囲内である。
【０２９２】
実施例１５．  Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（商標）のための一般技術
開示の方法及び組成物を使用して、任意の抗体または抗原結合性抗体断片に結合したＡＤまたはＤＤＤ部分を有するＤＮＬ（商標）複合体を生成するために、下で論述する一般技術を使用することができる。
【０２９３】
発現ベクター
いくつかの抗体及び抗体ベースのコンストラクトを生成するために、プラスミドベクターｐｄＨＬ２が使用されている。Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９）、１２５：１９１〜２０２；Ｌｏｓｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７）、８０：２６６０〜６を参照されたい。ジシストロン性哺乳動物発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の合成を指示する。ベクター配列は、多くの異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２コンストラクトでほぼ同一であり、唯一の差異は、可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）配列に存在する。当業者に公知の分子生物学ツールを使用して、これらのＩｇＧ発現ベクターを、Ｆａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。
【０２９４】
Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成するために、ヒンジ、重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのためのコード配列を、ヒンジの最初の４残基、１４残基リンカー、及びＤＤＤ部分、例えば、ヒトＲＩＩαの最初の４４残基（ＤＤＤ１と称される、配列番号１）をコードする配列に置き換えた。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成するために、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインのための配列を、ヒンジの最初の４残基、１５残基リンカー、及びＡＤ部分、例えば、ＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基合成ＡＤ（ＡＤ１と称される、配列番号３）（これは、生物情報学及びペプチドアレイ技術を使用して生成され、非常に高い親和性（０．４ｎＭ）でＲＩＩα二量体に結合することが示されている）をコードする配列と置き換えた。Ａｌｔｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３）、１００：４４４５〜５０を参照されたい。下記のとおり、ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターからＦａｂ−ＤＤＤ１またはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれかへの変換を促進するために、２つのシャトルベクターを設計した。
【０２９５】
ＣＨ１の調製
ＣＨ１ドメインをＰＣＲによって、ｐｄＨＬ２プラスミドベクターをテンプレートとして使用して増幅した。左ＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）末端と、ＣＨ１コード配列の５’であるＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とからなった。右プライマーは、ヒンジの最初の４残基（ＰＫＳＣ、配列番号１０２）と、それに続く４個のグリシン及びセリンをコードする配列と、Ｂａｍ  ＨＩ制限部位を含む最後の２個のコドン（ＧＳ）とからなった。４１０ｂｐのＰＣＲアンプライマーをＰＧＥＭＴ（登録商標）ＰＣＲクローニングベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標），Ｉｎｃ．）にクローニングし、クローンをＴ７（５’）配向のインサートについてスクリーニングした。
【０２９６】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２個のコドンと共に、リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードするために、二重鎖オリゴヌクレオチドを合成した。停止コドン及びＥａｇＩ制限部位を３’末端に付加する。コード化ポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１０３）
【０２９７】
３’末端上の３０塩基対が重複するＲＩＩＡ１−４４トップ及びＲＩＩＡ１−４４ボトムと名付けられた２つのオリゴヌクレオチドを合成し、１７４ｂｐ  ＤＤＤ１配列の中央１５４塩基対を含むように組み合わせた。それらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼでのプライマー伸長反応に供した。プライマー伸長の後に、二重鎖をＰＣＲによって増幅した。アンプライマーをＰＧＥＭＴ（登録商標）にクローニングし、Ｔ７（５’）配向でのインサートについてスクリーニングした。
【０２９８】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２個のコドンと共に、リンカーペプチドの１１残基が先行するＡＤ１のアミノ酸配列をコードするために、二重鎖オリゴヌクレオチドを合成した。停止コドン及びＥａｇＩ制限部位を３’末端に付加する。コード化ポリペプチド配列を下記に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１０４）
【０２９９】
ＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｔｏｐ及びＡＫＡＰ−ＩＳ  Ｂｏｔｔｏｍと名付けられた上記のペプチド配列をコードする２つの相補的重複オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングした。二重鎖をＰＣＲによって増幅した。アンプライマーをＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）配向でのインサートについてスクリーニングした。
【０３００】
ＤＤＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素でＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出し、次いで、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）の同じ部位にライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。
【０３０１】
ＡＤ１とＣＨ１とのライゲーション
ＡＤ１配列をコードする１１０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩでＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出し、次いで、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）の同じ部位にライゲートして、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。
【０３０２】
このモジュール設計を用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のいずれかを、ｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧコンストラクトに組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それを、個々のＰＧＥＭＴ（登録商標）シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と置き換えることによって、全重鎖定常ドメインを、上記コンストラクトの１つと置き換える。
【０３０３】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル末端に結合されるＤＤＤ２の二量化及びドッキングドメイン配列（配列番号２）を持つＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を生成するための発現ベクターである。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合相互作用によって一緒に保持されるｈＭＮ−１４  Ｆａｂの２つの同一のコピーからなる。
【０３０４】
発現ベクターを、次のとおりに操作した。リンカーペプチドの一部のためのコード配列及びＤＤＤ２の残基１〜１３を含む２つの重複相補的オリゴヌクレオチドを合成によって作製した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化すると、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化されるＤＮＡとライゲートするために適合した５’及び３’末端上にオーバーハングが生じた。
【０３０５】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでの消化によって調製されたシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）とライゲートさせて、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）から、５０７ｂｐ断片を切り出し、ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩでの消化によって調製されたＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２とライゲートさせた。最終発現コンストラクトを、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と名付けた。いくつかの異なるヒト化抗体のＦａｂ断片のＤＤＤ２−融合タンパク質を生成するために、同様の技術が利用されている。
【０３０６】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と対合するように設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合されるＡＤ２（配列番号４）のアンカードメイン配列を有するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を生成するための発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列に先行する１個のシステイン残基及びそれに続くもう１個のシステイン残基を有する。
【０３０７】
発現ベクターを、次のとおりに操作した。ＡＤ２のためのコード配列及びリンカー配列の一部を含む２つの重複相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２トップ及びＡＤ２ボトム）を合成によって作製した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化すると、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化されるＤＮＡとライゲートするために適合した５’及び３’末端上にオーバーハングが生じた。
【０３０８】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩでの消化によって調製されたシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）とライゲートさせて、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を生成した。ＳａｃＩＩ及びＥａｇＩ制限酵素でシャトルベクターから、ＣＨ１及びＡＤ２コード配列を含有する４２９塩基対断片を切り出し、同じ酵素での消化によって調製されたｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターとライゲートさせた。最終発現ベクターは、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
【０３０９】
ＴＦ２  ＤＮＬ（商標）コンストラクトの生成
ＴＦ２と名付けられた三量体ＤＮＬ（商標）コンストラクトを、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４とｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２との反応によって得た。ＴＦ２のパイロットバッチを、次のとおり収率９０％超で生成した。プロテインＬ−精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）を、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と１．４：１のモル比で混合した。合計タンパク質濃度は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中１．５ｍｇ／ｍｌであった。その後のステップは、ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化、及びＩＭＰ  ２９１アフィニティークロマトグラフィーを伴った。ＴＣＥＰの添加前に、ＳＥ−ＨＰＬＣは、ａ２ｂ形成のいかなる証拠も示さなかった。５ｍＭ  ＴＣＥＰの添加は、二元構造で予測される１５７ｋＤａタンパク質と一致するａ２ｂ複合体の形成を迅速にもたらした。ＴＦ２を、ＩＭＰ  ２９１アフィニティークロマトグラフィーによってほぼ均質になるまで精製した（図示せず）。ＩＭＰ  ２９１は、６７９Ｆａｂが結合するＨＳＧハプテンを含有する合成ペプチドである（Ｒｏｓｓｉら、２００５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：７１２２ｓ〜２９ｓ）。ＩＭＰ２９１非結合画分のＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって、生成物からのａ４、ａ２、及び遊離カッパ鎖の除去が実証された（図示せず）。
【０３１０】
ＴＦ２の機能性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイによって決定した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合ａ２ｂ複合体の対照試料として使用）、またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（非還元ａ２及びｂ構成要素の対照試料として使用）を１μｇ／ｍｌ（全タンパク質）に希釈し、ＨＳＧで固定化されたセンサーチップ上を通過させた。ＴＦ２での応答は、これら２種の対照試料の応答の約２倍であったが、これは、対照試料中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ構成要素だけが、センサーチップに結合し、その上に残存することを示している。ＷＩ２  ＩｇＧ、ｈＭＮ−１４についての抗イディオタイプ抗体のその後の注入によって、追加のシグナル応答によって示されるとおり、ＴＦ２だけが、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと緊密に関連するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４構成要素を有したことが示された。センサーチップ上に固定化されたＴＦ２とのＷＩ２の結合から生じる応答単位のさらなる上昇は、それぞれＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１個のサブユニットによって与えられる２個の完全機能的結合部位に対応する。これは、ＷＩ２の２個のＦａｂ断片を結合するＴＦ２の能力によって確認された（図示せず）。
【０３１１】
ＴＦ１０  ＤＮＬ（商標）コンストラクトの生成
同様のプロトコルを使用して、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４の２つのコピー及びＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９の１つのコピーを含む三量体ＴＦ１０  ＤＮＬ（商標）コンストラクトを生成した。上記のとおりの（抗ＣＥＡ）２×抗ＨＳＧ  ｂｓＡｂ  ＴＦ２を生成するために開示された方法を使用して、ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２×ｈ６７９）抗体を生成した。ＴＦ１０コンストラクトは、２つのヒト化ＰＡＭ４  Ｆａｂ及び１つのヒト化６７９  Ｆａｂを有する。
【０３１２】
２種の融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤ２及びｈ６７９−ＡＤ２）を、安定的にトランスフェクトされた骨髄腫細胞において独立して発現させた。組織培養上清液を合わせると、２倍モル過剰のｈＰＡＭ４−ＤＤＤ２が生じた。反応混合物を室温で２４時間にわたって、１ｍＭ還元グルタチオンを使用する穏やかな還元条件下でインキュベートした。還元の後に、２ｍＭ酸化グルタチオンを使用する穏やかな酸化によって、反応を完了させた。ｈ６７９Ｆａｂに対して高い特異性で結合するＩＭＰ２９１−アフィゲル樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、ＴＦ１０を単離した。
【０３１３】
実施例１６．  多数の抗体からのＡＤ−及びＤＤＤ−連結Ｆａｂ及びＩｇＧ融合タンパク質の生成
先行する実施例において記載した技術を使用して、表１１に示すＩｇＧ及びＦａｂ融合タンパク質を構築し、ＤＮＬ（商標）コンストラクトに組み込んだ。融合タンパク質は、親抗体の抗原結合特性を保持し、ＤＮＬ（商標）コンストラクトは、組み込まれた抗体または抗体断片の抗原結合性活性を示した。
【０３１４】
【表１１】
2019048869.tif 000013
【０３１５】
実施例１７．  ＮＫ−標的化白血球再指導性ｂｓＡｂの使用
白血球を再標的とするためのｂｓＡｂの使用は、Ｔ細胞に対する抗体に限定されない。代替の実施形態では、単球、ＮＫ細胞、または好中球に結合するｂｓＡｂも、再標的化の目的のために使用することができる。
【０３１６】
ＣＤ１６は、ＮＫ細胞のＣＤ５６ｄｉｍサブセットによって高度に発現されるＩｇＧでの活性化低親和性Ｆｃ−γ受容体である（Ｇｌｅａｓｏｎら、２０１２、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２６７４〜８４）。ＮＫ細胞再標的化におけるそれらの使用に加えて、抗ＣＤ１６抗体構成要素を含むｂｓＡｂは、ＣＤ１６の直接的なシグナル伝達によって、ＮＫ媒介性細胞毒性を活性化する能力を有し、溶解顆粒の指導分泌及び標的細胞の死を誘発する（Ｇｌｅａｓｏｎら、２０１２）。
【０３１７】
ＣＤ１６／ＣＤ１９二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）及びＣＤ１６／ＣＤ１９／ＣＤ２２三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫｅ）を、（Ｇｌｅａｓｏｎら、２０１２、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：２６７４〜８４）によって、以前に報告されたＤＮＡシャッフリング及びライゲーション技術（Ｖａｌｌｅｒａら、２００５、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：３８７９〜８８）を使用して調製する。発現されたＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥを、連続するイオン交換及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって精製する。休止ＰＢＭＣを、ＣＤ１６／ＣＤ１９  ＢｉＫＥまたはＣＤ１６／ＣＤ１９／ＣＤ２２  ＴｒｉＫＥ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で原発性ＡＬＬ及びＣＬＬ腫瘍細胞に曝露する。再標的化抗体を伴わない細胞と比較して、ＢｉＫＥまたはＴｒｉＫＥの存在下では、腫瘍細胞に対する細胞毒性の有意な上昇が観察される。ＰＢＭＣの不在下ではＢｉＫＥまたはＴｒｉＫＥに曝露された腫瘍細胞において効果は観察されない。ＴｒｉＫＥは、ＢｉＫＥと比較して腫瘍細胞毒性に対してより大きな効果を有し、これは、追加の腫瘍細胞抗原への結合が、再標的化効果を増強し得ることを示している。ＰＢＭＣの代わりにＮＫ細胞を使用して、同様の結果が得られる。
【０３１８】
ＣＤ１６／ＣＤ３３  ＢｉＫＥを、Ｗｉｅｒｎｉｋら（２０１３、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：３８４４〜５５）において開示されているとおりに調製する。ＢｉＫＥを、ヒトＨＬ６０前骨髄球性白血病異種移植片細胞を注射されたヌードマウスに投与し、ヒトＰＢＭＣを同時投与する。ＢｉＫＥ処置マウスは、対照ｂｓＡｂで処置されたマウスと比較して、死亡率及び腫瘍増殖速度の低下を示す。抗ＣＤ３３−ＳＮ−３８  ＡＤＣの添加は、ＢｉＫＥの細胞毒性作用をさらに増強する。
【０３１９】
実施例１８．  治療用途のための三価抗体
三価三重特異性細胞ターゲティングコンストラクトを、欧州特許第１３０９７９５Ｂ１号において記載されているとおり作製するが、これは、（ｉ）欧州特許第１３０９７９５号の請求項１に記載のＦａｂが由来する、米国特許第６１８７２８号において記載されているとおりのマウス抗ＣＤ１６ｍａｂをキメラ化またはヒト化すること；（ｉｉ）米国特許７，２３８，７８５号に記載のヒト化抗Ｔｒｏｐ−２抗体のＦｖからなる単鎖抗体を構築し、そのｓｃＦｖを、リンカーによって（ｉ）の抗ＣＤ１６  Ｆａｂの軽鎖のカルボキシル末端に合わせること；及び（ｉｉｉ）米国特許第８４８６３９５号に記載のヒト化抗ＣＤ１９のＦｖの単鎖を構築し、そのｓｃＦｖを、リンカーによって（ｉｉ）の抗ＣＤ１６  ＦａｂのＣＨ１のカルボキシル末端に合わせることを含む。
【０３２０】
上記三価コンストラクトを、転移膵臓癌を有する対象に、ＩＭＭＵ−１３２と組み合わせて投与する。部分的応答が観察され、腫瘍はサイズの退縮を示し、それが１２か月間にわたって続く。
【０３２１】
実施例１９．  抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３二重特異性抗体
ＣＤ３結合によってＴ細胞を、Ｔｒｏｐ−２ターゲティングを介して腫瘍細胞、特に癌腫に再指導するためのタンデム単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）を生成した。Ｔｒｏｐ−２は、様々な上皮癌を標的とするのに高度に有効であり得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。しかしながら、これはまだ、Ｔ細胞再指導治療のためのいずれのｂｓＡｂ形式においても調査されていない。Ｔｒｏｐ−２は、膵臓癌及び胃癌を含む様々なヒト癌において、正常組織と比較して過剰発現される３５ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、発現の増大は、不十分な予後と相関している（Ｆｏｎｇら、２００８、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９：１２９０〜５；Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅら、２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０：１２３９〜４９；Ｋａｐｏｏｒ、２０１３、Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ  ３４：１９６７〜８；Ｍｕｈｌｍａｎｎら、２００９、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ６２：１５２〜８；Ｓｔｅｉｎら、１９９３、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８〜４６；Ｓｔｅｉｎら、１９９３、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８〜４６）。元のマウス抗Ｔｒｏｐ−２ｍＡｂ、ＲＳ７のヒト化バージョンであるｈＲＳ７に由来する可変ドメイン（ＶＨ及びＶＫ）を、マウス抗ＣＤ３  ｍＡｂ、Ｏｋｔ３の可変ドメインと組み合わせて、Ｅ１−３  ｂｓＡｂを生成した。
【０３２２】
哺乳動物細胞においてＥ１−３を発現するためのプラスミドベクターの構築
二本鎖ＤＮＡ配列（配列番号１０６）を合成し、ｐＵＣ５７プラスミドベクターに組み立てた。配列番号１０６をＸｂａ  Ｉ及びＥａｇ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの消化によってｐＵＣ５７から切り出し、同じ酵素での消化によって調製したｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターにライゲートした。コード配列は、リーダーペプチドを含む単一ポリペプチド（配列番号１０７）、ｈＲＳ７ＶＫ（配列番号１０８）、Ｌ１（配列番号１０９）、ｈＲＳ７ＶＨ（配列番号１１０）、Ｌ２（配列番号１１１）、Ｏｋｔ３ＶＨ（配列番号１１２）、Ｌ３（配列番号１１３）、Ｏｋｔ３ＶＫ（配列番号１１４）、及び６−Ｈｉｓ（配列番号１０５）の合成を指示する。タンデムｓｃＦｖ  Ｅ１−３の略図を図２２において示す。
Ｅ１−３インサートを含む合成ＤＮＡ配列
ｔｃｔａｇａｃａｃａｇｇｃｃｇｃｃａｔｃａｔｇｇｇａｔｇｇａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｃｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｔａｇｃａａｃａｇｃｔａｃａｇｇｔｇｔｃｃａｃｔｃｃｇａｃａｔｔｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｃｔｇｔａｇｇａｇａｃａｇａｇｔｃａｇｃａｔｃａｃｃｔｇｃａａｇｇｃｃａｇｔｃａｇｇａｔｇｔｇａｇｔａｔｔｇｃｔｇｔａｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇｇａａａｇｃｃｃｃｔａａｇｃｔｃｃｔｇａｔｃｔａｃｔｃｇｇｃａｔｃｃｔａｃｃｇｇｔａｃａｃｔｇｇａｇｔｃｃｃｔｇａｔａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｔｃｔｇｃａａｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａａｃａｔｔａｔａｔｔａｃｔｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｔｇｃｔｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｇｇｔｇｇａｇｇａｇｇｇｔｃｃｇｇｔｇｇａｇｇａｇｇｇｔｃｔｇｇｔｇｇａｇｇａｇｇｇａｇｃｃａｇｇｔｃｃａｇｃｔｇｃａｇｃａａｔｃｔｇｇｇｔｃｔｇａｇｔｔｇａａｇａａｇｃｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃａｇｔｇａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃｔｔｃｔｇｇａｔａｃａｃｃｔｔｃａｃａａａｃｔａｔｇｇａａｔｇａａｃｔｇｇｇｔｇａａｇｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｇａｃａａｇｇｇｃｔｔａａａｔｇｇａｔｇｇｇｃｔｇｇａｔａａａｃａｃｃｔａｃａｃｔｇｇａｇａｇｃｃａａｃａｔａｔａｃｔｇａｔｇａｃｔｔｃａａｇｇｇａｃｇｇｔｔｔｇｃｃｔｔｃｔｃｃｔｔｇｇａｃａｃｃｔｃｔｇｔｃａｇｃａｃｇｇｃａｔａｔｃｔｃｃａｇａｔｃａｇｃａｇｃｃｔａａａｇｇｃｔｇａｃｇａｃａｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｔｔｔｃｔｇｔｇｃａａｇａｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｇｔａｇｔａｇｃｔａｃｔｇｇｔａｃｔｔｃｇａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｇｔｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｇｔｃｃｇａｔａｔｃａａｇｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃａｇａｇｃｔｃｇｃｔｃｇａｃｃａｇｇａｇｃｔａｇｔｇｔｇａａｇａｔｇｔｃａｔｇｔａａａａｃａａｇｔｇｇｃｔａｔａｃｔｔｔｃａｃｃｃｇｇｔａｃａｃｔａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｃａａｇｃａｇｃｇｃｃｃａｇｇａｃａｇｇｇｔｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｃｇｇｃｔａｃａｔｔａａｃｃｃｃａｇｃａｇｇｇｇａｔａｔａｃｃａａｃｔａｃａａｔｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｔａａａｇｃｃａｃｃｃｔｇａｃｔａｃｃｇａｃａａｇｔｃｃｔｃｔａｇｔａｃａｇｃｔｔａｔａｔｇｃａｇｃｔｇｔｃａａｇｃｃｔｃａｃｔｔｃｃｇａｇｇａｃｔｃｔｇｃａｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｃｇｃｃａｇａｔａｔｔａｃｇａｃｇａｔｃａｔｔａｔｔｇｔｃｔｇｇａｔｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａａｃａａｃｔｃｔｃａｃａｇｔｇｔｃｃｔｃｔｇｔｃｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａｇｇｇｔｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃｇｇａｇｇｇｔｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｇｇａｃｇａｔａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃｔｇｃｃａｔｔａｔｇａｇｃｇｃｔｔｃｃｃｃａｇｇｃｇａｇａａｇｇｔｇａｃａａｔｇａｃｔｔｇｃｃｇｇｇｃｃａｇｔｔｃａａｇｃｇｔｃａｇｃｔａｔａｔｇａａｔｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｔｃｔｇｇａａｃｃａｇｔｃｃｔａａａｃｇａｔｇｇａｔｃｔａｔｇａｃａｃａｔｃｔａａａｇｔｇｇｃａａｇｃｇｇｇｇｔｃｃｃａｔａｃａｇｇｔｔｃｔｃｔｇｇｇａｇｔｇｇｔｔｃａｇｇｃａｃｔａｇｃｔａｔｔｃｃｃｔｇａｃｃａｔｔｔｃｃｔｃｔａｔｇｇａｇｇｃｃｇａａｇａｔｇｃａｇｃｃａｃｃｔａｔｔａｃｔｇｔｃａｇｃａｇｔｇｇａｇｔｔｃａａａｔｃｃａｃｔｃａｃｃｔｔｃｇｇａｇｃａｇｇｃａｃｔａａａｃｔｇｇａａｃｔｃａａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｔａａｇｇｃｇｇｃｃｇ（配列番号１０６）
Ｅ１−３の演繹アミノ酸配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０７）
ｈＲＳ７  ＶＫのアミノ酸配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＨＹＩＴＰＬＴＦＧＡＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１０８）
リンカーＬ１のアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０９）
ｈＲＳ７  ＶＨのアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＳ（配列番号１１０）
リンカーＬ２のアミノ酸配列
ＧＧＧＧＳ（配列番号１１１）
Ｏｋｔ３  ＶＨのアミノ酸配列
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号１１２）
リンカーＬ３のアミノ酸配列
ＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤ（配列番号１１３）
Ｏｋｔ３  ＶＫのアミノ酸配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥ（配列番号１１４）
【０３２３】
ＳｐＥＳＦ骨髄腫細胞における安定的産生クローンの開発
Ｅ１−３−ｐｄＨＬ２ベクターをＳａｌ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼでの消化によって直線化し、３０μｇを、８５０Ｖ及び１０μＦでの２つのパルスを使用する電気穿孔によって１×１０７個のＳｐＥＳＦＸ骨髄腫細胞（Ｒｏｓｓｉら、２０１１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  ２７：７６６〜７５）に安定的にトランスフェクトするために使用した。選択及び産生培地に、０．２μＭメトトレキサート（ＭＴＸ）を補充した。トランスフェクタントクローンを、９６ウェル組織培養プレートにおいて選択し、Ｎｉ−ＮＴＡ  ９６ウェルプレートを使用するＥＬＩＳＡによってＥ１−３発現についてスクリーニングした。Ｎｉｃｋｅｌ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）樹脂を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いて、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって、Ｅ１−３タンパク質をローラーボトル培養の培養ブロスから精製した。精製生成物は、単一ＳＥ−ＨＰＬＣピーク（図示せず）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一ポリペプチドバンド（図示せず）として分析され、相対可動度は、５３，４２３Ｄａの算出分子サイズと一致した。
【０３２４】
実施例２０．  ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴｒｏｐ−２発現充実性腫瘍細胞の再指導Ｔ細胞殺傷
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２人の健康なドナー（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ＮＪ）の血液試料の軟膜から調製し、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を単離するために使用した。Ｃａｐａｎ−１（膵臓癌、１５７，０００  Ｔｒｏｐ−２／細胞）、ＢｘＰＣ３（膵臓癌、５００，０００  Ｔｒｏｐ−２／細胞）、及びＮＣＩ−Ｎ８７（胃癌、２４７，０００  Ｔｒｏｐ−２／細胞）細胞系（ＡＴＣＣ）を、低レベル、高レベル、及び中レベルのＴｒｏｐ−２を発現する標的細胞として使用した。ＢｘＰＣ３及びＮＣＩ−Ｎ８７は、１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で維持し、Ｃａｐａｎ−１細胞は、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０中で維持した。ＣＤ８＋Ｔ細胞（１．２×１０５細胞／ウェル）を標的細胞（２×１０４細胞／ウェル）と６：１の比で、９６ウェル組織培養プレート内で組み合わせた。用量設定のＥ１−３及び（Ｅ１）−３ｓをアッセイプレートに添加した。３７℃での４８時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳで２回洗浄してＴ細胞を除去し、次いで、３０％ＭＴＳ試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ  ９６（登録商標）  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を補充された新鮮な培地１５０μＬを各ウェルに添加した。３７℃での１〜２時間の後に、４９０ｎｍでの吸光度を、ＥＮＶＩＳＩＯＮプレートリーダー（登録商標）で測定した。
【０３２５】
３種のＴｒｏｐ−２発現細胞系（ＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ−１、及びＮＣＩ−Ｎ８７）において、各細胞系について３人のドナーからのＴ細胞を使用して、Ｅ１−３二重特異性抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を同等のＤＮＬコンストラクト、（Ｅ１）−３ｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力と比較した（図２３）。同じドナーからのＴ細胞と比較した場合に、そのＥ１−３に対する相対的感受性がＴｒｏｐ−２−抗原密度と相関していると考えられる３種の細胞系すべてにおいて、ＩＣ５０値に基づき（表１２）、Ｅ１−３は、（Ｅ１）−３ｓよりも少なくとも５倍強力である。しかしながら、効力は、使用したドナーＴ細胞の間では変動した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｅ１−３は、ＢｘＰＣ３［ＩＣ５０＝０．０９（±０．０４）ｐＭ］、Ｃａｐａｎ−１［ＩＣ５０＝１．２（±１．１）ｐＭ］、及びＮＣＩ−Ｎ８７［ＩＣ５０＝１．２（±１．２）ｐＭ］標的細胞の高度に強力なＴ細胞溶解を媒介した。
【０３２６】
【表１２】
2019048869.tif 000014
【０３２７】
実施例２１．  Ｅ１−３対（Ｅ１）−３ｓでの充実性腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
雌の４〜８週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、等体積のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と混合したＰＢＭＣ及びＮＣＩ−Ｎ８７（２：１）の混合物の皮下注射剤を投与した。治療は、１及び４日目のでＥ１−３  ５０μｇの静脈内注射、または１〜５日目での（Ｅ１）−３ｓ４７μｇの毎日の注射からなった。非処置群は、ｂｓＡｂなしでＮＣＩ−Ｎ８７及びＰＢＭＣの混合物を投与された。腫瘍体積（ＴＶ）を、キャリパーを使用する２寸法の測定によって週２回決定し、体積をＬ×Ｗ２／２と定義した［式中、Ｌは、腫瘍の最長寸法であり、Ｗは、最短寸法である］（図２４）。腫瘍増殖の統計的解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいた。個々の腫瘍増殖のプロファイルを、線形曲線モデリングによって得た。Ｆ検定を使用して、増殖曲線の統計的解析の前に、群の間の分散同一性を決定した。生存データでの限界Ｚ検定（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｚ  ｔｅｓｔ）は、最終データ分析から検閲されたＰ＜０．０５を有する所与の処置群内のいずれの異常値も特定した。片側ｔ検定を使用した未処置対照を除いて、両側ｔ検定を使用して、様々な処置群と対照群との間の統計的有意性を評価した。加えて、ＰｒｉｓｍソフトウェアをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で使用し、生存代理終点を１．０ｃｍ３まで腫瘍が進行するまでの時間として使用して、有効性を対数順位検定によって決定した。すべての比較について、Ｐ≦０．０５で有意性を判断した。
【０３２８】
Ｅ１−３（Ｐ）及び（Ｅ１）−３ｓは両方とも、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の増殖を有意に遅延させた（Ｐ≦０．００１；ＡＵＣ２５日）（図２４）。Ｅ１−３は、（Ｅ１）−３ｓよりも優れていた（Ｐ＝０．０３２４、ＡＵＣ３６日）（図２４）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、３日空けて投与された２回のＥ１−３の５０μｇ投与は、ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を持つマウス（Ｎ＝８）のすべてを治癒させた（Ｐ＝０．０００５；対数順位）。対照群（ＰＢＭＣのみ）の腫瘍は、３９．５日目に終点（ＴＶ＞１ｃｍ３）に達した。７８日後に、Ｅ１−３群では、すべてのマウスが腫瘍非含有であった。
【０３２９】
実施例２２．  抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２二重特異性抗体によって誘発されるトロゴサイトーシス
Ｔｒｏｐ−２は、正常組織では存在が限定されているが、多様な上皮癌で高度に発現される。上の実施例において論述したとおり、（Ｅ１）−３ｓは、Ｔｒｏｐ−２ターゲティングＦａｂの安定化二量体に共有結合で連結された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むＴ細胞再指導性三価二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）ＤＮＬ（登録商標）複合体である。本発明者らは、本明細書において初めて、ｂｓＡｂ−媒介性両方向トロゴサイトーシスが、標的細胞とＴ細胞との間で起こり、免疫シナプスの形成を伴うことを示す。
【０３３０】
方法
ＢｘＰＣ３細胞を、トリプシン（Ｔｒｏｐ−２に影響を及ぼさない）で剥離し、精製Ｔ細胞と混合した。細胞混合物を、０．１ｎｍｏｌ／ＬのｂｓＡｂで、３７℃で１時間にわたって処理した。細胞を、（ｉ）抗Ｔｒｏｐ−２  ＭＡＢＣ５１８、続いて、ＧＡＭ−ＦＩＴＣ、または（ｉｉ）抗Ｔｒｏｐ−２−ＰＥクローンのＭＲ５４及び抗ＣＤ４−ＡＰＣのいずれかで染色した。単一ＢｘＰＣ３及びＴ細胞を、前方散乱対側方散乱、さらにはＴｒｏｐ−２及びＣＤ４蛍光によって、細胞コンジュゲートからゲートした。
【０３３１】
結果
（Ｅ１）−３ｓは、Ｔ細胞と標的細胞との間の免疫シナプスの形成を誘発する。これは、Ｃａｐａｎ−１膵臓癌細胞を使用して示された（Ｒｏｓｓｉら、２０１３、ＭＡｂｓ  ６：３８１〜９１）。ここでは、（Ｅ１）−３ｓ０．１μｇ／ｍＬを、それぞれ赤色及び緑色蛍光で膜標識された精製ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞の混合物に添加すると、蛍光顕微鏡によって明らかなコンジュゲートの形成が生じた（図示せず）。それぞれＴ細胞またはＮＣＩ−Ｎ８７のみと結合する（１９）−３ｓ（図示せず）またはＴＦ１２（図示せず）の存在下では、コンジュゲートは観察されなかった。（１９）−３ｓまたはＴＦ１２を含有するウェルでは、生理食塩水中にスライドを浸すと、Ｔ細胞の大部分は洗浄除去されたが、（Ｅ１）−３ｓで処理されたウェルでは、多くのＴ細胞は、付着ＮＣＩ−Ｎ８７細胞に結合したままであった。
【０３３２】
（Ｅ１）−３ｓでのＢｘＰＣ３（５００，０００  Ｔｒｏｐ−２／細胞）及び精製Ｔ細胞混合物の処理は、トロゴサイトーシスを特異的に誘発し、それによって、Ｔｒｏｐ−２は、ＢｘＰＣ３からＴ細胞に移動した（図２５）。（Ｅ１）−３ｓ処理は、Ｔｒｏｐ−２＋Ｔ細胞４０％をもたらしたが、Ｔｒｏｐ−２（ＴＦ１２）若しくはＣＤ３のみに結合する対照ｂｓＡｂ［（２０）−３ｓ］、またはＢｘＰＣ３細胞の不在下での（Ｅ１）−３ｓでの処理後には、Ｔ細胞の５％未満が、Ｔｒｏｐ−２＋ゲートにおいて計数された。Ｔ細胞によるＴｒｏｐ−２の取込みは、ＢｃＰＣ３細胞でのその低減と同時に起こった（図２６）。短いインキュベーション時間中に、Ｔ細胞（９７．５％生存）及びＢｘＰＣ３（９４．５％生存）は高い生存度で残存し、これは、Ｔ細胞が、死細胞の膜断片への付着によってではなく、トロゴサイトーシスによって腫瘍抗原を獲得したことを示している（図示せず）。ＣＤ４について実証されたとおり、Ｔ細胞膜構成要素がＢｘＰＣ３細胞に移動したので、（Ｅ１）−３ｓによって媒介されるトロゴサイトーシスは二方向性であった（データは図示せず）。
【０３３３】
実施例２３．  二重特異性抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２抗体及びサイトカイン放出
上記実施例において論述したとおり、本発明者らは、ヒト胃癌及び膵臓癌細胞系の（Ｅ１）−３ｓ媒介性Ｔ細胞殺傷に対するインターフェロン−α（ＩＦＮα）の効果を研究した。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞を、標的細胞としてのＮＣＩ−Ｎ８７胃癌と共に使用して、Ｔ細胞活性化、サイトカイン誘発、及び細胞毒性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。標的細胞及びＰＢＭＣの存在下で、（Ｅ１）−３ｓは、過剰のサイトカイン産生をもたらさなかった。（Ｅ１）−３ｓと組み合わせると、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（単独では、Ｔ細胞活性化を増大させないか、または基線を超えてサイトカインを上昇させなかった）は、ＣＤ６９発現を増大させたが、サイトカイン誘発を有意に増大することはなかった。他のサイトカインの産生を、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発し得るレベルまで上昇させることなく、ＩＦＮαは、（Ｅ１）−３ｓの治療効力を増強させた。ＩＦＮα、または他のサイトカインでのアジュバント治療は、Ｔ細胞免疫療法の有効性の増強ために普遍的に適用可能であろう。
【０３３４】
方法
終夜付着させたＮＣＩ−Ｎ８７またはＲａｊｉのいずれかを５×１０５細胞／０．５ｍＬ／ウェルで使用して、サイトカイン放出をｅｘ  ｖｉｖｏで測定した。新たに単離されたＰＢＭＣ（５×１０６細胞／０．４ｍＬ／ウェル）を各ウェルに添加した。（１９）−３ｓ、１９−３  ＢｉＴＥ、（Ｅ１）−３ｓ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、または（Ｅ１）−３ｓ＋ペグインターフェロンアルファ−２ａを含む処理（１００μＬ、１０×）を、各試薬で０．１ｎｍｏｌ／Ｌまで添加した。別法では、１ｐｍｏｌ／Ｌ〜１０ｎｍｏｌ／Ｌの範囲の用量設定を用量−反応研究のために使用した。穏やかに振盪しながら３７℃で２０時間インキュベートした後に、上清液を１：２希釈し（または必要な場合にはそれ以上で）、ＴＮＦα、ＩＦＮｇ、ＩＬ２、ＩＬ６、及びＩＬ１０の濃度を、製造者プロトコルに従ってＳｉｎｇｌｅ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して測定した。
【０３３５】
結果
Ｔｒｏｐ−２×ＣＤ３  ＢｉＴＥ（または同等物）を、（Ｅ１）−３ｓと比較するために利用することはできなかった。しかしながら、（Ｅ１）−３ｓと同じ（Ｘ）−３ｓ分子配置を有する（１９）−３ｓと、ＣＤ１９×ＣＤ３  ＢｉＴＥ、ブリナツモマブと同一のアミノ酸配列を有する１９−３  ＢｉＴＥとの両方の利用可能性は、それら２種のｂｓＡｂ形式の相対的サイトカイン誘発効力を評価するための直接比較を可能にした。
【０３３６】
初めに、用量設定の（１９）−３ｓ及び１９−３  ＢｉＴＥをＰＢＭＣ（２人の独立したドナー）、及びＲａｊｉ  ＮＨＬ細胞の混合物に添加し、２０時間後に、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ６のレベルを測定した（図示せず）。ｂｓＡｂを添加していても、ＰＢＭＣ単独からは、軽微なサイトカインレベルしか検出されなかった。しかしながら、ＲａｊｉとドナーＰＢＭＣ（ドナーＡの方が強い）との間で混合リンパ球反応が生じたので、未処置細胞混合物におけるサイトカインレベルは、ＴＮＦα（２００及び５０ｐｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（６００及び２００ｐｇ／ｍＬ）、及びＩＬ６（１９０及び２２０ｐｇ／ｍＬ）のそれぞれで上昇した。ＴＮＦα及びＩＬ６のレベルは、１ｎｍｏｌ／Ｌ超の（１９）−３ｓでのみ、未処置のレベルを超えて上昇した。明らかに、より低い濃度では、（１９）−３ｓは、ＴＮＦα及びＩＬ６産生を阻害した。比較すると、ＴＮＦα及びＩＬ６は、試験されたすべての濃度の１９−３  ＢｉＴＥ（１ｐｍｏｌ／Ｌ以上）で、１，０００ｐｇ／ｍＬ超に上昇した。（１９）−３ｓによって、有意にＩＦＮγのレベルは上昇しなかったが、１９−３  ＢｉＴＥは、２，０００ｐｇ／ｍＬ超までの用量依存性上昇を示した。
【０３３７】
さらなる比較すべてで、作用物質を、ＢｉＴＥでの同様の研究（Ｂｒａｎｄｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００７、５６：１５５１〜６３）において使用されたものに近似する０．１ｎｍｏｌ／Ｌで試験した。本発明者らは、４人の異なるドナーを使用して、ＰＢＭＣと混合されたＲａｊｉから、（１９）−３ｓまたは１９−３  ＢｉＴＥ０．１ｎｍｏｌ／Ｌによって誘発されたＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ６、及びＩＬ１０のレベルを比較した（図２７Ａ）。４人のドナーそれぞれで、５種のサイトカインのそれぞれのレベルが、（１９）−３ｓと比較して、１９−３  ＢｉＴＥで有意に高かった。１９−３  ＢｉＴＥでの平均ＴＮＦα濃度（２，２８４±１，４８３ｐｇ／ｍＬ）は、（１９）−３ｓでの平均ＴＮＦα濃度（２８０±１８８ｐｇ／ｍＬ）よりも８倍高かった（Ｐ＝０．０００１）。１９−３  ＢｉＴＥでの処理は、（１９）−３ｓと比較して、ＩＦＮγ（３，００２±５６０ｐｇ／ｍＬ対４１６±１６９ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ２（１３，６３５±２，６０１ｐｇ／ｍＬ対１，０２４±５９８ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（９８１±３６４ｐｇ／ｍＬ対１６８±９６ｐｇ／ｍＬ）、及びＩＬ１０（４，００６±２，５２０ｐｇ／ｍＬ対４９３±２４２ｐｇ／ｍＬ）のレベルをもたらし、これらはそれぞれ、１９−３  ＢｉＴＥが７倍、１３倍、６倍、及び８倍高かった（それぞれＰ＜０．０００１）。これらの結果は、（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂ形式はＢｉＴＥ形式と比較して、サイトカイン放出のかなり効力の低い誘導因子であることを示している。
【０３３８】
一般に、ＰＢＭＣ及び標的細胞の存在下での（Ｅ１）−３ｓは、（１９）−３ｓよりもさらに少ないサイトカイン産生をもたらし、これは、基線レベルを上昇させる混合リンパ球反応が存在しないためである（図２７Ｂ）。５人のドナーのうちの４人で、炎症誘発性サイトカインＩＦＮγ（１００ｐｇ／ｍＬ未満）、ＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍＬ未満）、及びＩＬ２（２５０ｐｇ／ｍＬ未満）のレベルは低いままであった。ＩＬ６は、５人のドナーのうちの３人で低く（４００ｐｇ／ｍＬ未満）、かつドナーＤ−２及びＤ−５では中程度（８００〜１，１００ｐｇ／ｍＬ）であった。ドナーＤ−２はまた、ＩＦＮγ（１，０００ｐｇ／ｍＬ）及びＴＮＦα（１９０ｐｇ／ｍＬ）について、他のドナーよりも（Ｅ１）−３ｓに応答した。抗炎症サイトカインのＩＬ１０は、５人のドナーのうちの３人で、（Ｅ１）−３ｓによって１，２００ｐｇ／ｍＬ超まで有意に（Ｐ＜０．０００１）上昇した。注意すべきことに、独自に強力な炎症誘発性応答を示したドナーＤ−２は、（Ｅ１）−３ｓでの処理後に比較的低いレベルのＩＬ１０（２３０ｐｇ／ｍＬ）を産生した。単独のペグインターフェロンアルファ−２ａは、いずれのサイトカインのレベルも、バックグラウンドを超えて上昇させることはなかった。ペグインターフェロンアルファ−２ａを（Ｅ１）−３ｓに添加すると一貫して、ＩＦＮγ（約１．５〜３倍）は、単独の（Ｅ１）−３ｓよりも上昇した。残りのサイトカインでは、上記の組合せで、中程度に産生を増大させる明らかな傾向が存在したが；しかしながら、一貫した作用は観察されなかった。
【０３３９】
実施例２４．  二重特異性抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２抗体によって誘発されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２二重特異性抗体によって誘発されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を調査するために、さらなる研究を行った。
【０３４０】
方法
新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を２４時間にわたって、０．１ｎＭのペグインターフェロンアルファ−２ａ、０．１ｎＭの２０＊−２ｂ、または培地のみと共にインキュベートした。処理または未処理Ｔ細胞及びＰＫＨ６７緑色蛍光標識ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を５：１の比（５×１０４標的細胞及び２．５×１０５エフェクター細胞／ウェル）で、（Ｅ１）−３ｓの系列希釈を含有する４８ウェルプレート中で３連で合わせた。ペグインターフェロンアルファ−２ａまたは２０＊−２ｂを、適切な細胞混合物中の０．１ｎＭで維持した。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。懸濁細胞を除去し、付着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、対応する懸濁液と合わせた。細胞を洗浄し、３０，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び７−ＡＡＤ１μｇ／ｍＬを含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁した。合計生存標的細胞（７−ＡＡＤ−／ＰＫＨ６７＋）をフローサイトメトリーによって計数した。各試料について、８，０００個のＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴ（商標）ビーズを正規化参照として計数した。式：［１−（Ａ１／Ａ２）］×１００［式中、Ａ１及びＡ２はそれぞれ、試験試料及び未処置試料中の生存標的細胞の数を表す］を使用して、特異的溶解（％）を計算した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアで非線形回帰（シグモイド用量反応）曲線でのＦ検定によって、統計的有意（Ｐ≦０．０５）をＩＣ５０（５０％溶解が生じる濃度）、ＥＣ５０（５０％有効濃度）、及び溶解ｍａｘ（最大標的細胞溶解）について決定した。
【０３４１】
結果
Ｔｒｏｐ−２発現腫瘍細胞の再指導Ｔ細胞死滅を評価するために、用量設定の（Ｅ１）−３ｓと共にＩＦＮ−α２（０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａまたは２０＊−２ｂ）の存在下または不在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｎ８７細胞と混合した（図２８）。ドナーの間で、Ｔ細胞効力のかなりの変動性が観察された（図２８Ａ、図２８Ｂ）。非常に活性なＴ細胞のドナーでは、（Ｅ１）−３ｓは、高度に強力な（ＩＣ５０＝０．３７ｐＭ；溶解ｍａｘ＝７７．１％）ＮＣＩ−Ｎ８７細胞のＴ細胞溶解を媒介し、ペグインターフェロンアルファ−２ａの包含は、その活性を増強して、ＩＣ５０（０．１４ｐＭ；Ｐ＝０．０００１）を２．５倍超改善し、溶解ｍａｘ（８４．０％；Ｐ＜０．０００１）を上昇させた（図２８Ａ）。ＮＣＩ−Ｎ８７は、ＩＦＮ−αの直接的な作用に対して弱い感受性しかなく（ペグインターフェロンアルファ−２ａ  ＩＣ５０≧１０ｎＭ、データ図示せず）、（Ｅ１）−３ｓの不在下で、０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａによって１０％未満阻害された。ＤＮＬ（登録商標）によって二価抗ＣＤ２０ｍＡｂに融合されている４個のＩＦＮ−α分子からなるＩＦＮα、２０＊−２ｂのより強力な形態は、（Ｅ１）−３ｓの効力を７倍超増強した（ＩＣ５０＝０．０５ｐＭ；Ｐ＜０．０００１）。０．１ｎＭでは、２０＊−２ｂは、（Ｅ１）−３ｓの不在下でＮＣＩ−Ｎ８７を１２．６％阻害した。２０＊−２ｂは、別の（より強力な）形態のＩＦＮ−αでの活性の増強を示し、かつ作用がペグインターフェロンアルファ−２ａに制限されないことを示すためにのみ含まれた。抗ＣＤ２０ｍＡｂ部分は、この実験では機能性ではない。非常に弱いドナーＴ細胞を使用する同様のアッセイでは、（Ｅ１）−３ｓは、効力がかなりより低かったが（ＥＣ５０＝３９ｐＭ；溶解ｍａｘ＝２１％）；しかしながら、ペグインターフェロンアルファ−２ａの添加は、効力を２５倍超増強した（ＥＣ５０＝１．４ｐＭ；Ｐ＝０．０００８）（図２８Ｂ）。強力な（Ｅ１）−３ｓ媒介性Ｔ細胞殺傷は、ヒト膵臓癌系、ＢｘＰＣ３（ＩＣ５０＝０．４ｐＭ）でも観察されたが；しかしながら、ＩＦＮ−α添加の効果は、この細胞系では評価されなかった（図示せず）。
【０３４２】
実施例２５．  抗ＣＤ３×抗Ｔｒｏｐ−２二重特異性抗体によるＴ細胞活性化での用量反応曲線
０．１ｎＭペグインターフェロンアルファ−２ａの添加は、（Ｅ１）−３ｓで処理されたＴ細胞でのＣＤ６９アップレギュレーションを中程度に、しかし有意に増大させた。ＣＤ６９＋Ｔ細胞％を測定する（Ｅ１）−３ｓ用量反応実験では、ＥＣ５０が、ＩＦＮ−αの存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞では２６ｐＭから１６ｐＭに（Ｐ＜０．０００１）、かつＣＤ８＋Ｔ細胞では１１ｐＭから６ｐＭ（Ｐ＝０．０２０４）に低下した（図２９Ａ）。（Ｅ１）−３ｓと組み合わせたペグインターフェロンアルファ−２ａは、より多くのＣＤ６９＋細胞をもたらし（図２９Ｂ、図２９Ｃ、Ｐ＜０．０００１）、また、活性化細胞は、ＩＦＮ−αで、有意に高いＣＤ６９発現を示した（図２９Ｂ、図２９Ｄ；ＭＦＩ＝９０７対７２６；Ｐ＜０．０００１）。ペグインターフェロンアルファ−２ａは、（Ｅ１）−３ｓの不在下では、軽微なＣＤ６９発現を誘発した。同様に、（Ｅ１）−３は、単独でも、ペグインターフェロンアルファ−２ａと組み合わせても、標的細胞の不在下では、Ｔ細胞を活性化させなかった。
【０３４３】
実施例２６．  （Ｅ１）−３ｓで延長されるｉｎ  ｖｉｖｏ生存が、ＩＦＮ−αで増強される
上記実施例３において報告したｉｎ  ｖｉｖｏ生存についての先行データを、１２６日の長さにさらに延長した。下に示すとおり、（Ｅ１）−３ｓとＩＦＮ−αとの組合せは、Ｔｒｏｐ−２＋異種移植片腫瘍を持つ動物に最大の利益をもたらした。
【０３４４】
方法
雌の４〜８週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）に、等体積のマトリゲルと組み合わせた５×１０６個の腫瘍細胞（Ｃａｐａｎ−１またはＮＣＩ−Ｎ８７）及びＴ細胞（２．５×１０６個）の混合物を皮下注射した。ＢｉＴＥ方法（Ｄｒｅｉｅｒら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：４３９７〜４０２）に従って、治療を１時間後に静脈内注射によって開始した。各実験での処置レジメン、投薬量、及び動物数は、図の注に記載する。腫瘍体積を週２回、キャリパーを使用して２つの寸法を測定することによって決定し、体積を、Ｌ×ｗ２／２として規定した［式中、Ｌは、腫瘍の最長寸法であり、ｗは、最短寸法である］。
【０３４５】
腫瘍増殖の統計的解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいた。個々の腫瘍増殖のプロファイルを、線形曲線モデリングによって得た。Ｆ検定を使用して、増殖曲線の統計的解析の前に、群の間の分散同一性を決定した。生存データでの限界Ｚ検定は、最終データ分析から検閲されたＰ≦０．０５を有する所与の処置群内のいずれの異常値も特定した。片側ｔ検定を使用した未処置対照を除いて、両側ｔ検定を使用して、様々な処置群と対照群との間の統計的有意性を評価した。加えて、ＰｒｉｓｍソフトウェアをＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線で使用し、生存代理終点を１．０ｃｍ３まで腫瘍が進行するまでの時間として使用して、有効性を対数順位によって決定した。すべての比較について、Ｐ≦０．０５で、有意性を判断した。
【０３４６】
結果
ヒト膵臓癌でのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をＣａｐａｎ−１異種移植片で評価した。第１の研究において、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａ［生存時間中央値（ＭＳＴ）＞５９日］の組合せでの処置は、単独の（Ｅ１）−３ｓ（ＭＳＴ＝５０日）またはペグインターフェロンアルファ−２ａ（ＭＳＴ＝５３日）を含む他のすべての処置よりも優れていた（Ｐ＜０．０００７、対数順位）（図３０Ａ）。Ｔ細胞を除外しても、ペグインターフェロンアルファ−２ａは、生存を延長し（ＭＳＴ＝４５日、生理食塩水に対してＰ＝０．００５９、対数順位）、これは、腫瘍細胞に対する直接的な作用を示している。しかしながら、ペグインターフェロンアルファ−２ａは、Ｔ細胞の存在下でより有効であり（Ｐ＝０．０２６０、ＡＵＣ）、これは、ＩＦＮ−αによるＴ細胞の刺激を示唆した。Ｔ細胞ではなく標的に結合するＴＦ１２は、腫瘍増殖または生存に影響を及ぼさなかった。異なるドナーからのＴ細胞を使用する繰り返し実験によって、第１の研究の結果を確認した（図３０Ｂ）。すべての群がそれらのＭＳＴに達するまで、第２の研究を継続した。当初の実験においてのとおり、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａの組合せ（ＭＳＴ＝１１９．５日）は、腫瘍増殖の阻害及び全生存期間の両方の点において、他のすべての群よりも優れていた（（Ｅ１）−３ｓ単独に対してＰ＝０．０４７５；他のすべての群に対してＰ＜０．０００１；対数順位）。（Ｅ１）−３ｓ（ＭＳＴ＝６８日）（Ｐ＝０．０３７３、２９日にわたるＡＵＣ）は、Ｔ細胞を伴うペグインターフェロンアルファ−２ａ（ＭＳＴ＝５３日）よりも、かつＴ細胞単独（ＭＳＴ＝３７．５日；Ｐ＝０．００１４、対数順位）よりも優れていた。
【０３４７】
ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植片モデル（図３０Ｃ）では、（Ｅ１）−３ｓ及びペグインターフェロンアルファ−２ａの組合せ（ＭＳＴ＞８８日）が、（Ｅ１）−３ｓ単独（ＭＳＴ＝４９日；Ｐ＝０．０００７、対数順位）よりも優れていた。Ｔ細胞のみでの対照群（ＭＳＴ＝３２日）と比較して、Ｔ細胞を伴うペグインターフェロンアルファ−２ａ単独は、僅かのみの、しかし有意な延命効果（ＭＳＴ＝３５日；Ｐ＝０．０２７６）をもたらした。Ｔ細胞を伴わない（Ｅ１）−３ｓ＋ペグインターフェロンアルファ−２ａは、生存を有意に改善しなかった。
【０３４８】
ＮＣＩ−Ｎ８７［２４７，０００（±６５，０００）  Ｔｒｏｐ−２／細胞］及びＣａｐａｎ−１［１５７，０００（±３７，０００）  Ｔｒｏｐ−２／細胞］で測定された抗原密度は、有意には異ならなかった。ＮＣＩ−Ｎ８７と比較して、Ｃａｐａｎ−１細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペグインターフェロンアルファ−２ａによる直接阻害に対して感受性が５倍超高かった（ＩＣ５０＝２ｎＭ対＞１０ｎＭ）（図示せず）。（Ｅ１）−３ｓは、マウスＴｒｏｐ−２またはＣＤ３と交差反応せず（図示せず）、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞欠損である。
【０３４９】
考察
この節では、実施例２３〜２６において示した結果を考察する。本発明者らは、上記の実施例１及び２において、（Ｅ１）−３ｓ、（１９）−３ｓ、及び（２０）−３ｓを含むいくつかのコンストラクト例を使用して、造血性及び充実性腫瘍の両方のＴ細胞媒介治療を再指導するための（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂ形式の使用を記載した。Ｃａｐａｎ−１異種移植片を（Ｅ１）−３ｓで処置した研究からのｉｎ  ｖｉｖｏ実験の１つにおいて、先行する（未公開）データが、Ｃａｐａｎ−１がＩＦＮ−αによって阻害されることを示したので、本発明者らは、ペグインターフェロンアルファ−２ａを伴う群を含めた。ＩＦＮ−αの添加で観察された顕著な増強によって、さらに調査に拍車がかかり、この研究につながった。ペグインターフェロンアルファ−２ａと組み合わせたＴ細胞再指導性二重特異性抗体での研究結果を、本明細書において報告する。すべての群がそれらのＭＳＴを達するまで、それらの研究を延長して、ＩＦＮ−αが、ＩＦＮ−α感受性細胞系のＴ細胞死滅のｉｎ−ｖｉｖｏ有効性を増強し得ることを確認した。ＩＦＮ−αはまた、ＩＦＮ−αの直接作用に対する感受性が弱い細胞系のＴ細胞媒介性殺傷も増強し得る。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を、投与及びスケジュールを含めて、ＢｉＴＥコンストラクトで典型的に使用される方法に従って行った。
【０３５０】
Ｆｌｉｅｇｅｒ及びその同僚らは、ｅｘ  ｖｉｖｏで展開され、ＥｐＣＡＭｘＣＤ３  ＢｉＴＥ（ＭＴ１１０）で再指導されたＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫ−Ｔ細胞によるｉｎ−ｖｉｔｒｏ殺傷が、ＩＦＮ−αまたはＩＬ−２のいずれかで増強されることを実証した（Ｆｌｉｅｇｅｒら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４９：４４１〜８）。しかしながら、ｂｓＡｂの不在下でも、ＩＦＮ−αは、標的細胞を有意に阻害した。標的細胞に対するＩＦＮ−αの潜在的な直接的な効果を評価するための対照が欠如していたので、標的細胞の直接的な阻害と比較して、どの程度、ＮＫ−Ｔ細胞を刺激するＩＦＮ−αによって細胞毒性が増強されるかを決定することはできなかった。したがって、本発明者らは、両方の標的細胞でＩＦＮ−αに対する感受性を測定し、ｐａｎ−Ｔ細胞の存在下及び不在下の両方で、ペグインターフェロンアルファ−２ａのみを伴う群を含めた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−αに対して感受性がより高かったＣａｐａｎ−１腫瘍では、ペグインターフェロンアルファ−２ａは、Ｔ細胞の不在下でも、ましてＴ細胞の存在下でも、生存を改善し、これは、ＩＦＮ−αがこのモデルにおいて、Ｃａｐａｎ−１と、さらにはＴ細胞との両方に対して作用したことを示した。Ｔ細胞の不在下では、ペグインターフェロンアルファ−２ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−αに対する感受性が低かったＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を持つマウスの生存を改善せず、このことは、ＩＦＮ−αでの増強が主に、Ｔ細胞に対するその作用によるものであったことを示した。観察されたＩＦＮ−αによるＴ細胞増強の機構は不明である。ＩＦＮ−αに帰せられるＣＤ６９発現の増大は中程度であったが、有意であり、これは、サイトカインが、ｂｓＡｂで誘発されたＴ細胞活性化を増強し得ることを示唆した。加えて、ＩＦＮ−αは、細胞毒性Ｔ細胞によって産生される主な細胞毒性サイトカインと考えられるＩＦＮ−γの放出を特異的に増大させた一方で（最高３倍）、測定された他のサイトカインのいずれも、一貫して増大しなかった。
【０３５１】
ＩＦＮ−α及びＴ細胞再指導性ｂｓＡｂでの併用療法は、臨床で、または動物モデルにおいても調査されていない。しかしながら、治験において、ＩＬ−２は、抗ＣＤ３／ＥｐＣＡＭクアドローマのＦ（ａｂ’）２断片と組み合わされたが（Ｋｒｏｅｓｅｎら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４５：２０３〜６）、処置は、ＣＲＳまたはサイトカインストームとして知られる二次性サイトカインの誘発におそらく多くは起因するかなりの毒性によって限定された。ＩＬ−２の全身投与は、サイトカインストームを誘発することが公知であり（Ｐａｎｅｌｌｉら、２００４、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：１７）、ＣＲＳと、例えば、ＴＧＮ１４１２破局試験（ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｔｒｉａｌ）と関連した有害事象の重症度は、ＩＬ−２放出と相関する（Ｅａｓｔｗｏｏｄら、２０１３、Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７６：２９９〜３１５）。副作用がないということではないが、Ｔ細胞によって産生されないＩＦＮ−αでの免疫療法は典型的には、サイトカインストームを伴わない。
【０３５２】
ＣＲＳは、ＢｉＴＥ（Ｋｌｉｎｇｅｒら、２０１２、血液  １１９：６２２６〜３３）を含むどのＴ細胞指導性ｍＡｂ（例えば、Ｏｋｔ３）またはｂｓＡｂを使用するにしても免疫療法と関連するリスクである。しかしながら、すべてのｂｓＡｂ形式が必ずしも同じリスクを有するということではない。Ｂｒａｎｄｌらは、ブリナツモマブでのサイトカイン誘発を報告しており、その際、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの応答レベルはドナーによって様々であり、典型的には１ｎｇ／ｍＬ超がピークであり、一部のドナーは、５ｎｇ／ｍＬの高いレベルに達した（Ｂｒａｎｄｌら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６：１５５１〜６３）。本発明者らは、（Ｅ１）−３ｓと直接比較するために適したＢｉＴＥまたは同等のコンストラクトを持っていなかった。しかしながら、本発明者らは、ＣＤ１９ＸＣＤ３  ＢｉＴＥ（ブリナツモマブと同一の配列）及びＤＮＬ（登録商標）によって作製された（１９）−３ｓを使用して、（Ｘ）−３ｓとＢｉＴＥ形式との間の相対的サイトカイン誘発効力を比較することができた。１９−３  ＢｉＴＥは、同様の条件下で、Ｂｒａｎｄｌ及びその同僚によって報告されたのと同様のサイトカインレベルを誘発した。測定された５種のサイトカインのレベルは、（１９）−３ｓのレベルと比較して、１９−３  ＢｉＴＥで７〜１３倍高かった。外来リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）の使用は、様々なリンパ球反応をもたらし、これは、特にＩＬ−２で基線サイトカインレベルを上昇させた。ＢｉＴＥは、サイトカインレベルを、混合リンパ球基線レベルをかなり超えて上昇させたが、（１９）−３ｓは上昇させなかった。（Ｅ１）−３ｓのための標的としてのＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞の使用は、基線サイトカインレベルを上昇させなかった。本発明者らは、（Ｅ１）−３ｓに対するドナー応答の予測された変動性を観察したが；しかしながら、生じたサイトカインレベルは、特に、１００ｐｇ／ｍＬ未満であったＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γでは、（１９）−３ｓによって誘発されたレベルよりもなお低かった。それにも関わらず、５人のドナーのうちの１人は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６のレベルの上昇（約１ｎｇ／ｍＬ）を示した。（Ｅ１）−３ｓへのＩＦＮ−α（ペグインターフェロンアルファ−２ａ）の添加は、ＩＦＮ−γを２〜３倍増大させたが、他のサイトカインのレベルに影響を及ぼすことは一貫してなかった。これらの結果は、他のコンストラクト、例えば、ＢｉＴＥと比較して、（Ｘ）−３ｓ  ｂｓＡｂ形式はおそらく、ＣＲＳを誘発する可能性が低く、治療レジメンへのＩＦＮ−αの添加は、このリスクを増大させないことを示唆している。
【０３５３】
本発明者らは、ドナーＴ細胞の効力のかなりの変動性を観察した。図２８において示したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果は、本発明者らが試験した、ＮＣＩ−Ｎ８７を殺傷するための効力に１００倍の差違がある最も活性な、かつ最も活性の低いＴ細胞を表しているが（ＩＣ５０＝０．３７ｐＭと、３９ｐＭ）；しかしながら、ＩＣ５０＝〜１５ｐＭが、最も代表的であり（１０超のドナー）、低活性Ｔ細胞は一般的ではなかった。特に、比較的弱いＴ細胞での溶解は、強力なＴ細胞を用いた場合よりもＩＦＮ−αによって増強された。
【０３５４】
ＥｐＣＡＭは、多くの癌腫において過剰発現される広く利用されているＴＡＡである。しかしながら、癌腫におけるＥｐＣＡＭの不均一な発現と、多くの正常な上皮で発現されるので、ＥｐＣＡＭが腫瘍特異的でないという事実とによって、ＥｐＣＡＭを対象とした免疫療法は重度の副作用を有し得るであろうという懸念が生じる（Ｂａｌｚａｒら、１９９９、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）  ７７：６９９〜７１２；Ｍｏｍｂｕｒｇら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：２８８３〜９１）。ＥｐＣＡＭと同様に、Ｔｒｏｐ−２は、多様な癌腫において高度に発現されるが、正常組織におけるその発現は検討中である。いくつかの報告が、腫瘍細胞とは対照的に、体性成体組織は、正常組織における基線発現にかかわらず、腫瘍において一定にアップレギュレーションされるＴｒｏｐ−２発現をほとんど示さないか、示さないことを示している（Ｗａｎｇら、２００８、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２８０〜５；Ｚｈａｎｇら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８〜７２）。しかしながら、最近の証拠は、いくつかの正常組織の上皮上でのＴｒｏｐ−２の発現を示している（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａら、２０１３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３２：２２２〜３３）。それにもかかわらず、カニクイザルにおけるＴｒｏｐ−２の発現は、合理的に高い用量の、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としてＳＮ−３８とコンジュゲートされたｈＲＳ７（ヒト化抗Ｔｒｏｐ−２）の投与後に、毒性をもたらさなかった（Ｃａｒｄｉｌｌｏら、２０１１、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７〜６９）。さらに、この抗Ｔｒｏｐ−２ＡＤＣを用いた臨床研究において、治療量で、薬物（イリノテカンの代謝産物）から予測された管理可能な好中球減少症及び下痢以外の正常臓器毒性の増大は観察されなかった（Ｓｔａｒｏｄｕｂら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１４（ａｂｓｔｒ  ＣＴ２０６））。したがって、腫瘍ターゲティングのためにＴｒｏｐ−２を使用するＴ細胞再指導療法を含む免疫療法は、ＥｐＣＡＭを標的とする同様のレジメンと比較して、同様か、またはより高い治療指数を有すると予測される。
【０３５５】
これは、ｂｓＡｂによって媒介される標的腫瘍とＴ細胞との間のトロゴサイトーシスの最初の報告である。この所見は、（Ｅ１）−３ｓで誘発された標的／Ｔ細胞コンジュゲートが、機能性免疫シナプスを有することを実証している。本発明者らは、（１９）−３ｓ（未公開するデータ）によって媒介されるＢ細胞とＴ細胞との間での同様の二方向トロゴサイトーシスを観察し、これはおそらく、Ｔ細胞再指導性ｂｓＡｂで共通の現象であると考えている。
【０３５６】
実施例２７．  Ｅ１−３二重特異性抗体でのさらなる研究
概要
Ｔ細胞再指導性二重特異性タンデムｓｃＦｖ、Ｅ１−３を上記実施例１９において記載したとおり、ｈＲＳ７（ヒト化抗Ｔｒｏｐ−２  ｍＡｂ）及びＯｋｔ−３（抗ＣＤ３  ｍＡｂ）の可変ドメインを使用して生成した。この実施例において報告した研究は、実施例２０〜２５において示した結果に継続し、それを拡張する。ここで報告する結果と、実施例２０〜２５において示した結果との間の矛盾はいずれも、追加データの収集に基づく。ＰＢＭＣまたは精製Ｔ細胞を、標的細胞としてのヒト膵臓（Ｃａｐａｎ−１及びＢｘＰＣ−３）及び胃（ＮＣＩ−Ｎ８７）癌細胞系と共に使用して、Ｔ細胞活性化、増殖、サイトカイン誘発、及び細胞毒性をｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。２倍数のヒトＰＢＭＣ及びマトリゲルとの混合物で皮下接種されたＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性をアッセイした。
【０３５７】
結果
標的細胞及びＰＢＭＣの存在下で、Ｅ１−３は、Ｔ細胞活性化、増殖、ならびにＩＬ−２（２ｎｇ／ｍＬ超）、ＩＬ−６（１ｎｇ／ｍＬ超）、ＩＬ−１０（７ｎｇ／ｍＬ超）、ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍＬ超）、及びＩＦＮ−γ（５０ｎｇ／ｍＬ超）の用量依存性サイトカイン産生を強力に誘発した。３〜５人の異なるＴ細胞ドナーを使用すると、Ｅ１−３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢｘＰＣ−３［ＩＣ５０＝０．０９（±０．０４）ｐＭ］、Ｃａｐａｎ−１［ＩＣ５０＝１．２（±１．１）ｐＭ］、及びＮＣＩ−Ｎ８７［ＩＣ５０＝１．２（±１．２）ｐＭ］標的細胞の高度に強力なＴ細胞溶解を媒介した。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、３日空けて投与されたＥ１−３の２回の５０μｇ用量が、ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を持つ８匹のマウスのうちの６匹を治癒させた（Ｐ＜０．０００１；対数順位）。対照群（ＰＢＭＣのみ）の腫瘍は、３９．５日の中央値で終点（ＴＶ＞１ｃｍ３）に達した。８匹の動物のうちの７匹は終点に達せず、実験を１７６日後に終了したとき、Ｅ１−３群では、マウスのうちの６匹は、腫瘍非含有のままであった。
【０３５８】
Ｔ細胞活性化及び増殖
精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞と５：１で混合し、０．０１ｎＭ  Ｅ１−３で１８時間にわたって処理し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９は、標的細胞の存在下でＥ１−３によってアップレギュレートされた（図示せず）。Ｅ１−３またはＮＣＩ−Ｎ８７標的細胞を省略しての処理は、ＣＤ６９発現を誘発しなかった（図示せず）。加えて、Ｔ細胞は、Ｅ１−３及び標的細胞の存在下での培養の後に、前方（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）の増大を経験した（図示せず）。Ｔ細胞増殖は、３日後に明らかであった（Ｐ＜０．００５、データ図示せず）。
【０３５９】
サイトカイン放出
サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の放出を誘発するＥ１−３二重特異性タンデムｓｃＦｖの能力を投薬量を関数として決定した。図３１において示すとおり、Ｅ１−３二重特異性抗体は、ピコモル濃度範囲においてサイトカインを有効に誘発した。
【０３６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞媒介性殺傷
標的膵臓及び胃癌細胞のＴ細胞媒介性殺傷を誘発するＥ１−３の能力を、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（１．２×１０５／ウェル）の存在下で決定した。代表ドナーからのＴ細胞を使用しての例示的な用量反応曲線を図３２において示す。この実験では、Ｅ１−３でのＩＣ５０値は、Ｃａｐａｎ−１では０．６ｐＭ、ＢｘＰＣ−３では０．１ｐＭ、及びＮＣＩ−Ｎ８７では０．３ｐＭであった。
【０３６１】
Ｅ１−３のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片を有するヌードマウスを、３日空けて投与されたＥ１−３の２回の５０μｇ用量で処置した。この処置（図３３Ａ）は、ヒト胃癌異種移植片を有する８匹のマウスのうちの６匹を治癒させた（Ｐ＜０．０００１；対数順位）。対して、対照群（ＰＢＭＣでのみ処置）の腫瘍は、３９．５日の中央値で終点（ＴＶ＞１ｃｍ３）に達した（図３３Ｂ）。研究を１７６日後に終了したとき、Ｅ１−３群の８匹の動物のうちの７匹は終点に達してなかった。
【０３６２】
結論
上記の研究は、Ｔｒｏｐ−２が、膵臓癌、胃癌、及び他の上皮癌のＴ細胞媒介性殺傷のための魅力的な標的であることを示している。Ｅ１−３抗Ｔｒｏｐ−２×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、強力なＴ細胞活性化及びサイトカイン産生を誘発した。Ｅ１−３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで充実性腫瘍の殺傷において高度に有効であった。
【０３６３】
本明細書において開示し、特許請求の範囲に記載した組成物及び方法はすべて、本開示を考慮することで、過度の実験なしに作製及び使用することができる。上記組成物及び方法を、好ましい実施形態について記載したが、本発明の概念、意図、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法のステップにおいて、またはステップの連続において、上記組成物及び方法に変更を適用することができることは当業者には明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成されるであろう限り、化学的及び生理学的の両方について関連するある種の作用物質を、本明細書に記載の作用物質の代わりに使用することができる。当業者に明らかなそのような同様の置換及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲において定義されているとおりの本発明の意図、範囲、及び概念の範囲内であるとみなされる。
【０３６４】
本発明の好適な実施形態は以下の通りである。
［１］  Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発する方法であって、Ｔｒｏｐ−２発現癌を有する対象に、Ｔｒｏｐ−２に対する少なくとも１個の結合部位と、ＣＤ３に対する少なくとも１個の結合部位とを含む二重特異性抗体を投与することを含む上記方法。
［２］  上記対象に、（ｉ）インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ１、インターフェロン−λ２、及びインターフェロン−λ３からなる群から選択されるインターフェロン；（ｉｉ）チェックポイント阻害物質抗体；ならびに（ｉｉｉ）抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなる群から選択される少なくとも１種の治療薬を投与することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］  上記インターフェロンがインターフェロン−αである、［２］に記載の方法。
［４］  上記チェックポイント阻害物質抗体が、ラムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＡＭＰ−２２４、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、イピリムマブ、リルルマブ、ＩＰＨ２１０１、及びトレメリムマブからなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［５］  上記チェックポイント阻害物質抗体が、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＫＩＲ、及びＴＩＭ３からなる群から選択される抗原に結合する、［２］に記載の方法。
［６］  上記抗体−薬物コンジュゲートが、ｈＬＬ１−ドキソルビシン、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ｈＭＮ−１４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ２−ＳＮ−３８、ｈＡ２０−ＳＮ−３８、ｈＰＡＭ４−ＳＮ−３８、ｈＬＬ１−ＳＮ−３８、ｈＲＳ７−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＭＮ−１４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ２−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＡ２０−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＰＡＭ４−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ｈＬＬ１−Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、Ｐ４／Ｄ１０−ドキソルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、グレムバツモマブベドチン、ＳＡＲ３４１９、ＳＡＲ５６６６５８、ＢＩＩＢ０１５、ＢＴ０６２、ＳＧＮ−７５、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＡＭＧ−１７２、ＡＭＧ−５９５、ＢＡＹ−９４−９３４３、ＡＳＧ−５ＭＥ、ＡＳＧ−２２ＭＥ、ＡＳＧ−１６Ｍ８Ｆ、ＭＤＸ−１２０３、ＭＬＮ−０２６４、抗ＰＳＭＡ  ＡＤＣ、ＲＧ−７４５０、ＲＧ−７４５８、ＲＧ−７５９３、ＲＧ−７５９６、ＲＧ−７５９８、ＲＧ−７５９９、ＲＧ−７６００、ＲＧ−７６３６、ＡＢＴ−４１４、ＩＭＧＮ−８５３、ＩＭＧＮ−５２９、ボルセツズマブマホドチン、及びロルボツズマブメルタンシンからなる群から選択される、［２］に記載の方法。
［７］  上記二重特異性抗体及び上記治療薬を同時に、または順次投与する、［２］に記載の方法。
［８］  ＡＤＣを、いかなる他の作用物質よりも前に投与する、［２］に記載の方法。
［９］  上記インターフェロンを、遊離インターフェロン、ペグ化インターフェロン、インターフェロン融合タンパク質、または抗体にコンジュゲートしたインターフェロンとして投与する、［３］に記載の方法。
［１０］  上記二重特異性抗体が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びｄＡｂからなる群から選択される少なくとも１個の抗体断片を含む、［１］に記載の方法。
［１１］  上記Ｔｒｏｐ−２発現癌が、食道、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、または前立腺の癌である、［１］に記載の方法。
［１２］  上記対象に、第２の抗体またはその抗原結合性断片、薬物、毒素、酵素、細胞毒性薬物、抗血管新生薬、アポトーシス促進性作用物質、抗生物質、ホルモン、免疫調節薬、サイトカイン、ケモカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ホウ素化合物、及び放射性同位体からなる群から選択される治療薬を投与することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［１３］  上記薬物が、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アンスラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシグリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合薬、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、フラボピリドール、ホスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］  上記ケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ、及びＩＰ−１０からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１５］  上記免疫調節薬が、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、及びトロンボポイエチンからなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１６］  上記サイトカインが、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、瀘胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）ＮＧＦ−β、血小板−成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ（リンホトキシン）からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１７］  上記第２の抗体が、炭酸脱水酵素ＩＸ、アルファ−フェトプロテイン、α−アクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１α、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯＢ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＡＧ−３、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、膵臓癌ムチン、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＰｌＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、Ｓ１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＲＯＰ−２、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、ｃＭＥＴ、ならびに発癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、［１２］に記載の方法。
［１８］  上記第２の抗体が、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、ｈＰＡＭ４（抗ムチン）、ＫＣ４（抗ムチン）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ｈＭｕ−９（抗ＣＳＡｐ）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ｈＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ｈＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、インフリキシマブ（抗ＴＮＦ−α）、セルトリズマブペゴル（抗ＴＮＦ−α）、アダリムマブ（抗ＴＮＦ−α）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、トシリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ−ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、ＢＷＡ−３（抗ヒストンＨ２Ａ／Ｈ４）、ＬＧ２−１（抗ヒストンＨ３）、ＭＲＡ１２（抗ヒストンＨ１）、ＰＲ１−１（抗ヒストンＨ２Ｂ）、ＬＧ１１−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）、及びＬＧ２−２（抗ヒストンＨ２Ｂ）からなる群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１９］  上記二重特異性抗体が、ヒト化ＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）抗体またはその抗原結合性を含む、［１］に記載の方法。
［２０］  上記二重特異性抗体が、Ｏｋｔ３（抗ＣＤ３）抗体またはその抗原結合性断片を含む、［１］に記載の方法。
［２１］  上記二重特異性抗体が、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、［１］に記載の方法。
［２２］
上記二重特異性抗体が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発し得るレベルまでサイトカイン産生を増大させることなく、Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発する、［１］に記載の方法。
［２３］  上記二重特異性抗体が、Ｔｒｏｐ−２発現癌細胞とＴ細胞との間で細胞表面抗原のトロゴサイトーシスを誘発する、［１］に記載の方法。
［２４］  Ｔｒｏｐ−２に対する少なくとも１個の結合部位と、ＣＤ３に対する少なくとも１個の結合部位とを含む二重特異性抗体。
［２５］  Ｔｒｏｐ−２発現癌を有する対象に投与した場合に、Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発し得る、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［２６］  ヒト化ＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）抗体またはその抗原結合性断片を含む、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［２７］  Ｏｋｔ３（抗ＣＤ３）抗体またはその抗原結合性断片を含む、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［２８］  配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［２９］  ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及びｄＡｂからなる群から選択される第１及び第２の抗体断片を含む、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［３０］  上記Ｔｒｏｐ−２発現癌が、食道、膵臓、肺、胃、結腸、直腸、膀胱、乳房、卵巣、子宮、腎臓、または前立腺の癌である、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［３１］  薬物、毒素、酵素、細胞毒性薬物、抗血管新生薬、アポトーシス促進性作用物質、抗生物質、ホルモン、免疫調節薬、サイトカイン、ケモカイン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ホウ素化合物、及び放射性同位体からなる群から選択される治療薬にコンジュゲートされている、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［３２］  上記薬物が、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アンスラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害薬、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合薬、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、フラボピリドール、ホスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、Ｐｒｏ−２−Ｐ−Ｄｏｘ、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９からなる群から選択される、［３１］に記載の二重特異性抗体。
［３３］  上記ケモカインが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−アルファ、ＭＩＰ１−ベータ、及びＩＰ−１０からなる群から選択される、［３１］に記載の二重特異性抗体。
［３４］  上記免疫調節薬が、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、及びトロンボポイエチンからなる群から選択される、［３１］に記載の二重特異性抗体。
［３５］  上記サイトカインが、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、瀘胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制因子、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（ＮＧＦ）ＮＧＦ−β、血小板−成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−λ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、及びＬＴ（リンホトキシン）からなる群から選択される、［３１］に記載の二重特異性抗体。
［３６］  サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘発することなく、Ｔｒｏｐ−２発現癌に対する免疫応答を誘発し得る、［２４］に記載の二重特異性抗体。
［３７］  Ｔｒｏｐ−２発現癌細胞と及びＴ細胞との間で細胞表面抗原のトロゴサイトーシスを誘発する、［２４］に記載の二重特異性抗体。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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