(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の細胞サンプルの顕微鏡によるサイトメトリー解析方法を提供する。【解決手段】透過モード及び／または蛍光モード、特に落射蛍光モードで、好ましくは選択的および／または交互に、操作可能であり、または操作され、少なくとも１つの細胞サンプルは、少なくとも１つの蛍光標識を有する。本方法では、とりわけ、細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、透過モードで記録された画像において検出し、その後、蛍光モードで記録された画像の検出強度を、細胞サンプル中の細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する、および／または、細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、蛍光モードの画像において検出し、その後、透過モードで記録された画像の検出強度を、細胞サンプル中の細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡下で複数の細胞サンプルを検査するための顕微鏡による複数の細胞サンプルのサイトメトリー解析方法であって、前記顕微鏡は、透過モードおよび／または蛍光モード、特に落射蛍光モードで、好ましくは選択的におよび／または交互に、操作可能であり、または操作され、少なくとも１つの細胞サンプルは少なくとも１つの蛍光標識を有し、該方法が、
‐前記細胞サンプルを、少なくとも１つの顕微鏡カメラを備えた前記顕微鏡の光学系に対して、１つの平面内で連続的に、好ましくは直線的に移動させる工程と、
‐前記細胞サンプルの移動中に、前記細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、透過モードまたは蛍光モードで記録し、かつ、前記細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、前記少なくとも１つの顕微鏡カメラを用いて、蛍光モードで、特に落射蛍光モードで、好ましくは少なくとも部分的に記録し、前記画像を好ましくはデジタル化する工程と、
‐前記透過モードまたは蛍光モードの前記細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像と、前記蛍光モードの前記細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像とを、好ましくは局所的に、互いに関連付ける工程と、
‐前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、前記透過モードの画像において検出し、その後、前記蛍光モードで記録された画像の検出強度を、前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する工程、
および／または、
前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、前記蛍光モードの画像において検出し、その後、前記透過モードで記録された画像の検出強度を、前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する工程、
および／または、
前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、前記蛍光モードの画像において検出し、その後、２番目の蛍光モードで記録された画像の検出強度を、前記細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
時間的に、特に遅くまたは早く、オフセットされた前記透過モードの細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、当該時間オフセットに応じて、または、所定の第１画像と時間オフセット画像との間の少なくとも１つの顕微鏡カメラについての前記細胞サンプルの相対的な変位に応じて、前記透過モードの前記細胞サンプルのサブ領域の所定の第１画像について修正され、それにより、特に、前記所定の第１画像と前記時間オフセット画像とが、前記細胞サンプルの同じサブ領域に関連付けられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
時間的に、特に遅くまたは早く、オフセットされた前記蛍光モードの細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、当該時間オフセットに応じて、または、所定の第１画像と時間オフセット画像との間の少なくとも１つの顕微鏡カメラについての前記細胞サンプルの相対的な変位に応じて、前記蛍光モードの前記細胞サンプルのサブ領域の所定の第１画像について修正され、それにより、特に、前記所定の第１画像と前記時間オフセット画像とが、前記細胞サンプルの同じサブ領域に関連付けられることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞サンプルの動きが、前記細胞サンプルのサブ領域の画像の時系列と同期することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記透過モードの前記細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、第１の平面に記録され、前記透過モードの前記細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、前記第１の平面とは異なる第２の、好ましくは焦点がずれた平面に、記録されることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞サンプルのサブ領域の少なくとも２つの画像が、蛍光モードで、特に落射蛍光モードで記録されることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞サンプルのサブ領域の画像が透過モードおよび／または蛍光モードで記録された後に、さらなる画像が、前記細胞サンプルの先行するサブ領域に隣接した、好ましくは直接隣接した前記細胞サンプルのサブ領域について透過モードおよび／または蛍光モードで記録され、前記さらなる画像が、特に、前記細胞サンプルにおける先行する、好ましくは１番目のサブ領域としての隣接するサブ領域と同様の方法で記録されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記細胞サンプルの複数のサブ領域についての透過モードの細胞サンプルの画像が、すべて、透過モードの１つの完全な画像に合成されること、および／または、前記細胞サンプルの複数のサブ領域についての蛍光モードの細胞サンプルの画像が、すべて、蛍光モードの１つの完全な画像に合成されることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記各画像タイプの画像、特に透過モードまたは蛍光モードの画像、または、前記各画像タイプの完全な画像、特に透過モードまたは蛍光モードの前記完全な画像を、好ましくは自動化手段によって分析することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
位相コントラスト画像が、前記透過モードの画像または前記透過モードの前記完全な画像から生成されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、複数の細胞サンプルのサイトメトリー解析方法に関する。
例えば、蛍光染色された細胞の画像ベース分析用のサイトメトリー解析方法が、サイトメトリーの分野では知られている。古典サイトメトリーでよく知られた画像ベースサイトメトリーのパラメータまたは特徴のほかに、利用できるパラメータまたは特徴の数が増加しているのは、蛍光顕微鏡などによって微視的に記録された細胞サンプルの各画像のオブジェクトサイズ（特に細胞サイズ）および他の形態学的パラメータが、古典サイトメトリーで知られたパラメータ（通常、色（または波長）、強度および散乱光信号）と共に得られるためである。
【０００２】
従来技術でよく知られているさらなる方法によって、組織サンプルまたは細胞培養物などのサンプルの蛍光特性が、イメージング法および非イメージング法を用いて検査される。様々な方法によってもまた、個々の生物学的細胞および細胞成分の蛍光強度の決定が可能になっている。蛍光強度は、例えば、米国特許第６２１１９５５号に記載されているような撮像時間遅延積分検出器（ＴＤＩ検出器）を使って、または米国特許第５２４７３３９号に記載されているようなパルス照明を使って、あるいはレーザービームでサンプルを走査することによって、フローサイトメーターまたはイメージングフローサイトメーターで定量される。
【０００３】
フローサイトメトリーは、また、細胞の定量蛍光分析のための方法として知られている。フローサイトメトリーでは、集束レーザービームは（染色された）細胞懸濁液を通過し、こうして生成される散乱光および蛍光が検出される。測定の間、個々の蛍光標識された細胞は、毛細管を通して運ばれ、個々の細胞はフロー細胞を通して流れ、レーザー光により励起される。細胞中の蛍光染料はレーザービームによって励起され、その結果、細胞はレーザー光を散乱させる。こうして、光の散乱と放出された蛍光とが検出される。
【０００４】
他の定量蛍光分析のための方法は、蛍光定量のためのデジタル撮像およびその後の画像分析と組み合わせて、従来の落射蛍光顕微鏡を使用する。これらの方法ではサンプルおよびサンプルキャリアが使用されるため、接着性細胞は、例えば、マイクロタイタープレート（「ウェルプレート」）などの培養容器中で直接分析可能である。
【０００５】
ドイツ特許出願公開公報１０２０１１０７５３６９（Ａ１）には、オブジェクトが横方向に隣接する領域の個々の画像を高速記録するための方法、ならびに、連続画像記録周期中にオブジェクトの個々の画像を記録し、その後、個々の画像をオブジェクトの完全画像へ合成するための顕微鏡が記載されている。
【０００６】
科学的研究および品質管理の目的で、ならびに毒物学または診断のために、液体細胞固定液または液体緩衝液に細胞を加えて、細胞培養液中で蛍光サンプルを定量することが知られている。細胞は、通常、検査処理の間、液体で覆われる。
【０００７】
顕微鏡検査では、細胞サンプルは、テーブル上のサンプルキャリアとして、顕微鏡プレート（マイクロタイタープレート；ウェルプレート）に配置される。テーブルを、サンプルキャリアと共に、ある位置から次の位置へと徐々に搬送し、画像の記録のために停止させる。その後、サンプルキャリアをさらに移動させる。サンプルキャリアのぎくしゃくした動きにより、研究対象の細胞は加速力および振動を受け、その結果、細胞培養液中で変化する可能性があると共に、表面波が生成され、透過像の記録が妨げられる。
【０００８】
あるいは、研究対象のサンプル上の振動を防止するために、顕微鏡の光学系全体または光学部品をサンプルキャリアに対して移動させる。この結果、問題の顕微鏡の構成要素の重量が重くなり、すばやい動きが困難になる。
【０００９】
本発明の目的は、細胞サンプルの蛍光定量を改善することにあり、細胞サンプル、特には接着性細胞の負荷、特に機械的負荷、および光への曝露を低減すること、特には接着性細胞上でより迅速に分析を行えるようにすることである。
【００１０】
この目的は、複数の細胞サンプルを顕微鏡検査するための顕微鏡を用いて複数の細胞サンプルのサイトメトリー解析を行う方法によって解決される。顕微鏡は、透過モードおよび／または蛍光モード、特に落射蛍光モードで、好ましくは選択的および／または交互に、操作可能である、または操作される。少なくとも１つの細胞サンプルは少なくとも１つの蛍光標識を有する。該方法には以下の工程が含まれる。
【００１１】
‐細胞サンプルを、少なくとも１つの顕微鏡カメラを備えた顕微鏡の光学系に対して、１つの平面内で連続的に、好ましくは直線的に移動させる工程と、
‐細胞サンプルの移動中に、細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、透過モードまたは蛍光モードで記録し、かつ、細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、少なくとも１つの顕微鏡カメラを用いて、蛍光モードで、特に落射蛍光モードで、好ましくは少なくとも部分的に記録し、画像を好ましくはデジタル化する工程と、
‐透過モードまたは蛍光モードの細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像と、蛍光モードの細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像とを、好ましくは局所的に互いに関連付ける工程と、
‐ａ）細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を透過モードの画像において検出し、その後、蛍光モードで記録された画像の検出強度を細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する、および／またはｂ）細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、蛍光モードの画像において検出し、その後、透過モードで記録された画像の検出強度を細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する、および／またはｃ）細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を蛍光モードの画像において検出し、その後、さらなる蛍光モードで記録された画像の検出強度を細胞サンプルの細胞または細胞成分の検出位置および／または輪郭に応じて分析する工程。
【００１２】
本発明は、蛍光標識分子を備えた１つ以上の細胞サンプルを、顕微鏡の光学系に対して移動させるという考えに基づいており、細胞サンプルのサブ領域の写真または画像は、ｉ）透過モードと蛍光モードとの間で交互に、またはｉｉ）好ましくは、蛍光モードのみで、記録される。顕微鏡の交互操作時、照明時間が非常に短いにもかかわらずデジタル画像分析のために（十分に）照明された画像を許容する好ましくは透過モードで、細胞の配置、細胞構造、および／または、細胞内領域が検出され、その後、検査されたサブ領域の蛍光が記録され、続いて蛍光定量が実行される。
【００１３】
本発明の範囲内では、顕微鏡を好ましくは蛍光モードのみで操作することが可能であり、細胞サンプルの移動中に、細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、第１の蛍光モードで記録し、その後、細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、好ましくは少なくとも部分的に、少なくとも１つの顕微鏡カメラによって第２の蛍光モードで記録し、続いて、第１の蛍光モードの細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像と、第２の蛍光モードの細胞サンプルの同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像とを、好ましくは局所的に互いに関連付ける。続いて、細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を、第１の蛍光モードの画像において検出し、その後、第２の蛍光モードで記録された画像における検出強度を、検出された第１の蛍光モードの細胞サンプル中の細胞または細胞成分の位置および／または輪郭に応じて分析する。
【００１４】
明るい透過チャネルにおいて細胞サンプル中の細胞および細胞成分を検出することによって、細胞サンプルを連続的に移動させること、及び、照明時間を非常に短くすることが可能になる。これにより、光毒性ならびに光による他の損傷などの細胞への影響を低減することが可能であり、細胞生存率に影響を与える機械的振動または加速力も同時に減少する。ここに提供されるのは簡単かつ迅速な方法であり、その方法はまた、個別または複数の接着性細胞についての細胞情報の定量に対しても侵襲性が低い。本方法は、特に細胞保護的であると同時に、フローサイトメトリー解析とは対照的に、後の段階で同じサンプルについて容易に繰り返すこともできるため、本方法が複数の連続した時点で繰り返される、一時的な生細胞分析にも適している。
【００１５】
少なくとも１つのデジタルカメラを備えた光学顕微鏡システムを使用して、個々の細胞内の細胞内領域からより多くの情報を得ることが可能である。この場合、限定された視野のすべての細胞サンプルまたは１つのサンプル領域から画像が記録されるように、光学顕微鏡システムをデジタルカメラまたはカメラと一緒に配置する。記録されたサブ領域の画像は、少なくとも１つの顕微鏡カメラによってデジタル記録され、画像はデジタル化され、撮像方法に従って、すなわち透過モードまたは蛍光モードで、保存されるか、または、研究対象のサンプルを顕微鏡の光学系に対して連続的に動かす間に直接分析される。
【００１６】
撮像方法、すなわち透過モードまたは蛍光モードに応じて、相互に重なり合う視野から画像を記録する。その後、透過モードまたは（第１の）蛍光モードで記録された検査されたサブ領域の画像を、対応するサブ領域から、蛍光モードまたは第２の蛍光モードで記録された対応する画像と関連付け、それにより、関心のある細胞サンプルの領域を、その後、さらに研究することができる。
【００１７】
細胞サンプルが移動している間に、細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を、透過モードまたは蛍光モードで記録し、次いで、同じサブ領域の少なくとも１つ以上の画像を記録する。細胞サンプルは、以前に記録された第１画像と比較して連続的に移動するので、同じサブ領域の１つ以上の部分が、第２の、後の画像に記録される。
【００１８】
本発明によれば、生物学的細胞または細胞サンプルを自動的に分析するための方法が提供される。蛍光強度の定量分析を行うために、顕微鏡及びデジタル画像解析の分野の方法を用いて、多数の個々の細胞または細胞成分を調べることができる。
【００１９】
加えて、本方法の一実施形態では、さらに有利には、時間的に、特に遅くまたは早く、オフセットされた透過モードの細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、その時間オフセットに応じて、または所定の第１画像と時間オフセット画像との間の少なくとも１つの顕微鏡カメラについての細胞サンプルの相対的な変位に応じて、透過モードの細胞サンプルのサブ領域の所定の第１画像について修正され、それにより、特に、所定の第１画像と時間オフセット画像とが、細胞サンプルの同じサブ領域に関連付けられる。
【００２０】
検出された細胞サンプルのサブ領域の２つの時間オフセット画像が記録されるので、透過モードの２つの画像は、画像が記録された間の期間、細胞サンプルの変位に応じた仮想位置補正によって、互いに正確に重ね合わされる。
【００２１】
さらに、本方法の実施形態は、少なくとも１つの時間的に、特に遅くまたは早く、オフセットされた蛍光モードの細胞サンプルのサブ領域の画像が、その時間オフセットに応じて、または所定の第１画像と時間オフセット画像との間の少なくとも１つの顕微鏡カメラについての細胞サンプルの相対的な変位に応じて、蛍光モードの細胞サンプルのサブ領域の所定の第１画像について修正され、それにより、特に、所定の第１画像と時間オフセット画像とが、細胞サンプルの同じサブ領域に関連付けられるという事実により区別される。
【００２２】
透過モードで記録された同じサブ領域の画像と同様に、蛍光モードで記録された同じサブ領域の画像については、異なる時間に記録されたサブ領域の画像も、異なる時間に記録された画像間の細胞サンプルの移動経路を考慮して記録された後に、互いに重ね合わされる。細胞サンプルは、連続的に、好ましくは直線的に、２つの画像間を移動するからである。
【００２３】
さらに、本方法の一実施形態では、細胞サンプルの動きが、細胞サンプルのサブ領域の画像の時系列と同期するか、または同期していると有利であると考えられる。
透過モードおよび蛍光モードで画像を記録する顕微鏡の好ましくは静止光学系に対する細胞サンプルの連続した、好ましくは均一の移動に応じて、細胞サンプルのサブ領域の画像または写真を連続して記録し、所定の一定の間隔で保存し、その後、それに続く方法工程で分析し、評価する。
【００２４】
本発明によれば、細胞サンプルを移動させるための装置が提供されるかまたは存在する。この装置は制御装置を備え、これにより細胞サンプル上の所定の位置にトリガー信号、好ましくは電子トリガー信号が生成され、これにより、画像を撮像するカメラと、異なる画像タイプ、すなわち透過モードまたは蛍光モードの画像のための少なくとも１つの光源とを同期させる。
【００２５】
さらに、本方法の有利な実施形態では、透過モードの細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、好ましくは焦点の合った第１の平面に記録され、透過モードの細胞サンプルのサブ領域の少なくとも１つの画像が、第１の平面とは異なる第２の、好ましくは焦点がずれた平面に記録される。
【００２６】
さらに、細胞サンプルのサブ領域または同じサブ領域の少なくとも２つの画像が、蛍光モード、特に落射蛍光モードで記録されると有利である。
さらに、一実施形態の本方法は、細胞サンプルのサブ領域の画像が透過モードおよび蛍光モードで記録された後に、さらなる画像が、細胞サンプルの先行するサブ領域に隣接した、特に直接隣接した細胞サンプルのサブ領域について透過モードおよび／または蛍光モードで記録されるという事実によって区別される。さらなる画像は、特に、細胞サンプルにおける先行するサブ領域、好ましくは１番目のサブ領域としての隣接するサブ領域と同様の方法で記録される。
【００２７】
細胞サンプルの複数の隣接するサブ領域の複数の画像を記録することにより、より大きな細胞サンプルの領域を検査することが可能であり、より多くの細胞サンプルの自動サイトメトリー解析が可能になり得る。
【００２８】
さらに、本方法の一実施形態では、細胞サンプルの複数のサブ領域についての透過モードの細胞サンプルの画像がすべて、透過モードの１つの完全な画像に合成される、および／または、細胞サンプルの複数のサブ領域についての蛍光モードの細胞サンプルの画像がすべて、蛍光モードの１つの完全な画像に合成されると有利である。
【００２９】
さらに、本方法の実行中に、各画像タイプの画像、特に透過モードまたは蛍光モードの画像、または各画像タイプの完全な画像、特に透過モードまたは蛍光モードの完全な画像を、好ましくは自動化手段によって分析するのがさらに好ましい。この目的のために、適切な記録モード、好ましくは透過モードからの画像または写真を、デジタル画像処理および解析由来の方法を用いて、例えば個々の細胞または細胞成分の存在について調べ、検出されたオブジェクトの位置および／または輪郭、すなわち細胞サンプルの細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を識別または決定する。これにより、仮想位置補正が行われるとすぐに、他の撮像モードで撮像された写真における同じオブジェクトの蛍光強度を定量することができる。オブジェクトのためのオブジェクトマスクまたはセグメンテーションマスクが直接的に識別され、透過モードで決定されるのが好ましい。なぜなら、蛍光モードで撮像された写真内のセグメンテーションマスクを決定するときに、独立性の欠如のために、測定に誤差が生じ得る。蛍光モードで撮像した写真でセグメンテーションマスクまたはオブジェクトマスクを決定することは、実質的に長い照明時間を使用することによってより高い信号対ノイズ比またはより高いコントラストを達成する状況に適している。
【００３０】
さらに、本方法の一実施形態では、位相コントラスト画像を、透過モードの画像または透過モードの完全画像から生成すると実用的である。本方法の一実施形態では、さらに、透過モードで得られた画像が位相コントラスト画像として既に記録されていることが開示されている。
【００３１】
特に、研究のために興味のある細胞サンプルの領域を、位相コントラスト透過画像から決定することができる。この結果、画像のコントラストは、染色されていない細胞などの透明または半透明の細胞サンプルで増加する。例えば、ゼルニケ（Ｚｅｒｎｉｃｋｅ）位相コントラスト法または微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）法によって生成された位相コントラスト画像が生成される。
【００３２】
さらに、焦点がずれた透過画像の使用によって位相コントラスト画像を得ることもできる。焦点のずれによる収差による位相コントラストを使用し、後で画像のデジタル画像処理によってコントラストを最大化することができる。
【００３３】
位相コントラスト画像は、デジタルホログラフィ法又はタイコグラフィー（ｐｔｙｃｈｏｇｒａｐｈｙ）ベースの方法などの定量位相測定または推定法によっても得ることができる。
【００３４】
さらに、強度輸送方程式（ＴＩＥ）法に基づく位相コントラスト画像を得ることができることが開示されている。
また、ある構成においては、光学系または撮像システムの色の縦収差の特性を利用することによって焦点がずれた画像を得ることができる。この場合、ある構成においては、サンプルは、その後、波長の異なる光で照らされる。あるいは、ＲＧＢカメラによって、または、細胞サンプルと少なくとも１つのカメラとの間の光路内の色フィルタを用いて、画像が記録される。
【００３５】
また、本方法では、透過モードにおいても、サブ領域のＲＧＢ透過画像が得られる。
得られたまたは作成された位相コントラスト画像によって、画像を用いて、個々の細胞サンプル中の細胞または細胞成分の位置および／または輪郭を決定することが可能である。細胞および／または細胞成分に関する位置および／または輪郭情報は、局所的に関連付けられた蛍光画像における強度を測定することを可能にし、これらの測定値は、識別された細胞サンプルの細胞および／または細胞成分と関連付けられる。特に、様々な細胞タイプまたは細胞特性を、強度測定値を用いて適切に分類することができる。
【００３６】
本方法を実施するために、カメラを備えた好ましくは自動化された広視野顕微鏡を有する顕微鏡装置が、例えば生細胞の検査および撮像のために提供される。この場合、装置は、透過モードについては明視野方式または位相コントラスト方式で、そして蛍光モードについては反射方式で操作される。
【００３７】
したがって、本方法は、非常に高速な連続撮像モードで、細胞および細胞構造が検出され、対応する蛍光強度が上記の本発明の方法によって決定される「サイトメトリーモード」で操作される。通常、フローサイトメトリーに基づく分析により得られる、例えば、細胞サンプルについてのデータまたは画像データは、このモードで得られる。液体中に懸濁させた非接着性細胞で作業するフローサイトメトリーとは対照的に、本発明による方法は、フローサイトメトリーモードのマイクロタイタープレートまたはウェルプレートにおける接着性細胞での作業をも可能にする。
【００３８】
次のスクリーニングモードでは、細胞サンプルの複数のサブ領域の高品質画像を、透過モードおよび蛍光モードで自動的に記録することができる。
本方法の実行中に、サンプル、または細胞サンプルを、全体領域が顕微鏡のカメラによって連続的に撮像されるように、固定対物レンズの前方のＸＹ平面内で移動する。細胞サンプルは、ＸＹ平面内で連続的に、好ましくは直線的に移動する。このようにして得られた細胞サンプルのサブ領域の画像は、必要に応じて、より大きな、シームレス画像に融合され、部分写真または部分画像は、それに応じて融合される。
【００３９】
顕微鏡対物レンズに対する細胞サンプルの連続的な動きの間、細胞サンプルのサブ領域の画像は、連続的かつ規則的な間隔で得られる。ここで、画像位置は、透過モードでの連続的な移動の間、オートフォーカスによって調整されることが理解される。例えば、画像位置は、上側の基板平面の焦点に設定されるか、または、異なる方法に従って設定される。
【００４０】
細胞サンプルの画像が撮像されている間に、細胞サンプル、または、それぞれの得られた画像に対応する細胞サンプルキャリアの位置データが記録される。
こうして、本方法の実行のために、少なくとも２つのＺ面で、透過モードで、同時にまたは素早く連続的に透過光が検出される。
【００４１】
通常、画像は同様にして１つ以上の蛍光チャネルに記録される。蛍光モードで記録されたサブ領域の画像は、品質が低い可能性があり、視覚化のために必ずしも使用されない。代わりに、蛍光モードの画像は、所定の領域にわたる強度測定のために記録される。
【００４２】
非常に短い光パルスを、それぞれの画像の記録の間あるいは記録のために使用するため、細胞サンプルは、非常に短い時間、光に曝露されており、サンプルキャリアの連続移動時に画像がぼやけるのが防止される。特に、サンプルの照明時間は、通常１００μｓより短く、特に５０μｓより短い。サンプルを照らすために、発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用することが好ましい。
【００４３】
細胞サンプルの画像の記録時間の大幅な短縮は別として、本発明による方法の更なる利点は、細胞サンプルがさらなる画像記録および分析のために複数回検査され得ることにある。これは、マイクロタイタープレート（「ウェルプレート」）上に細胞サンプルを配置し、更なる画像記録のために、顕微鏡システムを使用してマイクロタイタープレートを移動させるためである。
【００４４】
本発明のさらなる特徴は、特許請求の範囲および添付の図面および図とともに本発明の実施形態の説明から明らかになるであろう。本発明による実施形態は、個々の特徴によって、または複数の特徴の組み合わせによって実現することができる。
【００４５】
一般的な発明概念を限定すること無く、本発明は、図面及び図の参照を伴う例示的な実施形態に基づき以下に説明されるであろう。参照は、本文の特定の部分ではなく、全ての詳細についての図面及び図を示すために設けられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】顕微鏡下で細胞サンプルを検査するための配置の概略図である。
【図２】細胞サンプルをサイトメトリー解析するための方法を実行するための記録処理の概略図である。
【図３】細胞サンプルの自動顕微鏡検査及び分析のための方法工程の概略図である。
【図４】個々の蛍光染色された細胞核の画像データの例、および、関連する多数の細胞核のサイトメトリー評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
顕微鏡下で細胞サンプルを検査するための基本的な装置１０を、図１に概略的に示す。装置１０により、細胞サンプルをサイトメトリー解析するための方法を実行することができる。
【００４８】
装置１０は、光源１２を備える。この光源１２を使って、光は、集束レンズ１４を通ってサンプルキャリア１６に透過される。この場合、サンプルキャリア１６は、モータ２２によってＸＹ平面を移動可能な移動テーブル１８上に配置される。好ましくは発光ダイオードとしてまたは発光ダイオードと共に構成された光源１２によって、サンプルキャリア１６上の細胞サンプルは、透過モードで透照され、そして、細胞サンプルを通る光は、対物レンズ２４およびデジタルカメラ２８によって検出される。このようにして、細胞サンプルのサブ領域の画像が、デジタルカメラ２８によってデジタル記録される。
【００４９】
光がテーブル１８と対物レンズ２４との間の細胞サンプルを通った後、光源１２とデジタルカメラ２８との間のビーム経路に装置２６を設けて、Ｚ平面で焦点を合わせることができる。さらに、ある実施形態では、透過モードの光のビーム経路における対物レンズ２４とデジタルカメラ２８との間に、さらなる光学素子３０を設けて、細胞サンプルの２つの平行なＺ面に画像を記録することができる。
【００５０】
光源１２は、好ましくは、発光ダイオード（ＬＥＤ）として構成される。光源１２は、例えば５０μｓ未満の持続する光のフラッシュを生成する。また、光源１２は、異なる波長の光を生成する複数の発光ダイオードをも備えることができる。発光ダイオードは、同時にまたは連続して作動させることができる。
【００５１】
移動テーブル１８は、ＸＹ平面において、例えば２０ｍｍ／秒の速度で連続的に移動する。
デジタルカメラ２８によって記録された画像は、コンピュータ３２に送信され、デジタル化された画像は、コンピュータ３２によって保存および処理されることができる。同時に、コンピュータ３２は、モータ２２の制御装置として構成されており、テーブル１８が同期して制御され、所定の速度で移動するように、モータ２２と接続する。その結果、サンプルキャリア１６の動きは、デジタルカメラ２８によって記録された画像と位置的に正確に同期する。
【００５２】
さらに、コンピュータ３２は、光源１２（ここには図示せず）にも接続されており、それにより、光源１２の回路も同様に同期する。
サブ領域の細胞サンプルの画像が透過モードで記録された後に、その後の蛍光モードで細胞サンプルを照らすために、蛍光が生成される光源３４が、テーブル１８の下に配置される。生成された蛍光によって、また、例えば励起フィルタを通過した後、生成された光は、細胞サンプルに向かって、すなわちテーブル１８の方向にビームスプリッタ３６によって偏向または反射される。その結果、短波励起光が、サンプルキャリア１６の細胞サンプルに当たる。励起光を吸収した直後により長い波の蛍光を発するように、細胞サンプルに蛍光標識等を付与することにより、放射された蛍光がビームスプリッタ３６に当たり、ビームスプリッタ３６の半透明性のために、より長い波の蛍光が偏向することなくビームスプリッタ３６を通過し、場合によってはブロッキングフィルタ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ）を通過した後、デジタルカメラ２８によって記録される。
【００５３】
デジタルカメラ２８によって撮像された写真は、細胞サンプルによって放射された蛍光に基づいている。細胞サンプルのサブ領域の複数の画像が蛍光モードで記録されるのが好ましい。
【００５４】
例えば顕微鏡（図１参照）による細胞サンプルのサブ領域の画像の記録処理は、図２に概略的に示されており、顕微鏡は、透過モードと蛍光モードとで交互に操作される。次いで、このようにして得られた画像を細胞サンプルのサイトメトリー解析に使用する。
【００５５】
細胞サンプルを有するサンプルキャリアのそれぞれの位置は、図２の上部に示されており、細胞サンプルは、顕微鏡の光学システムの顕微鏡カメラに対して左から右へ連続移動する。サンプルキャリアの連続移動中に、細胞サンプルの第１のサブ領域ａの４つの画像１ａ、２ａ、３ａ、４ａが、画像周期で連続的に記録される。次の画像周期では、細胞サンプルのサブ領域ｂの画像１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂが、顕微鏡システムのデジタルカメラによって記録される。同様に、第２の画像周期の後、第３の画像周期で、画像１ｃ、２ｃ、３ｃ、４ｃが連続して記録される。その後、第４の画像周期で、細胞サンプルのサブ領域ｄの画像１ｄ、２ｄ、３ｄ、４ｄが記録され、保存される。
【００５６】
各画像周期において、それぞれのサブ領域ａ、ｂ、ｃ、ｄなどの４つの画像が、４つの画像チャネル（１、２、３、４）に連続的に記録され、サンプルキャリア上の細胞サンプルは、固定顕微鏡システムに対する方向に連続的かつ直線的に移動する。各サブ領域ａ、ｂ、ｃまたはｄの第１画像１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄは、第１の透過画像としての透過光法における焦点の合った明視野画像である。各サブ領域ａ、ｂ、ｃまたはｄの最後の画像４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄは、それぞれのサブ領域の焦点がずれた明視野画像である。
【００５７】
続いて、画像周期の第３（３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ）および第４（４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ）画像として、サブ領域ａ、ｂ、ｃまたはｄなどの、異なる２つの画像が、様々な波長の蛍光画像として記録される。細胞サンプルのサブ領域ａについての第１画像周期の４つの画像１ａ、２ａ、３ａ、４ａは、それぞれ別々に記録され、例えば別々の保存チャネルに別々に保存される。次に、第２の画像周期では、透過画像１ｂ、２ｂおよび蛍光画像３ｂ、４ｂの両方が、画像周期ごとの４つの異なる画像について適切な記憶チャネルにそれぞれ保存される。
【００５８】
複数のサブ領域またはそれらの全体の細胞サンプルが検出された後、それぞれの撮像モードのサブ領域のそれぞれの関連画像は、好ましくは局所的に互いに関連付けられる。
さらに、細胞サンプルのサイトメトリー評価のために、サブ領域の時間オフセット画像は、細胞サンプルの変位移動を考慮に入れて、時間オフセットに応じて変更され、この結果、それぞれのサブ領域についての画像周期の４つの画像は、互いに局所的に関連付けられる。このデジタルまたは仮想画像変位を使用して、画像１ａ、２ａ、３ａ、４ａは、例えば、図２の下側に示すように、サブ領域ａに対して、互いに局所的に関連付けられる。画像１ａ、２ａ、３ａそれぞれが、サブ領域ａを完全に覆わない場合には、問題のサブ領域と重なる隣接するサブ領域からの画像１ｂ、２ｂ、３ｂが、同様に、サブ領域ａに比例的に関連付けられる。その結果、サブ領域ａは完全に撮像される。これは、画像１ｂ、２ｂ、３ｂ、４ｂについても、画像１ｃ、２ｃ、３ｃ、ならびに、サブ領域ｂ、ｃ、およびｄの画像周期におけるさらなる画像についても同様に起きる。
【００５９】
後処理およびデジタル画像変位の結果、細胞サンプルとのサンプルキャリアの変位経路および変位時間を考慮して、画像は局所的に正確に関連付けられる。対応する撮像モードのそれぞれの画像間のシーム領域内の画像の重なりについて、後処理中に、従来の方法を用いて画像を互いに適合させることができ、それぞれの撮像モードで、１つの大きな画像または対応する完全な画像に合成され得る。
【００６０】
細胞サンプル、特に接着性細胞の自動顕微鏡検査および分析のための方法工程を、図３に概略的に示す。
この場合、細胞サンプルのサブ領域の画像は、異なるチャネルに記録され、サブ領域は、透過モードおよび蛍光モードで交互に記録される。図３に示す処理では、チャネル１の顕微鏡システムの透過モードで画像が最初に記録され、サンプルキャリアは引き続き移動する。細胞サンプルを有するサンプルキャリアの位置データに基づいて、サンプルキャリア内またはサンプル中の画像位置が決定される。ここでは、細胞サンプルを有するサンプルキャリアの動きを制御部により制御することにより、制御部からの制御データに基づいて画像位置を判定することができる。続いて、明るい透過モードでのサブ領域の撮像のために、コントラスト最適化などのデジタル画像処理が実行される。その後、適切なオブジェクトマスクが、好ましくは自動的に、適切な認識アルゴリズムなどを使用して、画像チャネル１における細胞または細胞内構造の輪郭が検出される。
【００６１】
細胞サンプルの最初のサブ領域が撮像されると、サブ領域の蛍光画像は下流画像チャネル２に記録され、サブ領域の画像の画像位置は、その後、サンプルキャリアのための制御部からの制御データに基づいて決定される。それによって、画像記録の位置が、その後、第１のチャネルでの画像記録に対する変位経路および変位時間を考慮して、デジタル画像変位によって適合される。必要であれば、識別された信号のノイズ最適化などのデジタル画像処理を実行することができる。その後、画像チャンネル１および画像チャンネル２については、対応する画像記録が、細胞サンプルが連続的に移動している間に、細胞サンプルの蛍光モードまたは透過モードで交互に記録され、取得された画像データは、後処理工程において前の画像に対してデジタル変位される。対応する画像記録のデジタル画像処理は、必要に応じて、対応するチャネルで行われる。
【００６２】
部分画像内の識別されたまたは所定のオブジェクトマスクが各チャネルに送信された後、得られた強度測定値は、ハイコンテントスクリーニング分析ツールまたはサイトメトリー解析プログラムによって分析される。ここでは、サイトメトリーデータ分析を用いて、所定のオブジェクトマスク内の透過モードまたは蛍光モードで検出された光の強度を測定することが可能である。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）は、細胞または細胞サンプルの画像を自動記録し、分析するための方法または処理であって、記録された画像は、画像処理または画像処理プログラム等により、ここで評価、提示、および分析される。このようにして、細胞サンプルをサイトメトリー解析することが可能である。したがって、この分析により、例えば、細胞の分類が可能になる。このようにして得られた分類は、細胞のサブグループの即座の事前分類としても機能することができ、その活性化は、手続き中に後から徐々に自動的に活性化され、例えばより高い顕微鏡分解能で記録および分析することができる。（データ）分析は、ヒストグラムおよび散布図、ならびに細胞の分類および集団の識別などによって提示され得る。
【００６３】
図４は、上部に個々の蛍光染色された細胞核の記録画像の例を示し、多数の細胞核の画像データの下部に、それぞれのサイトメトリーによる評価を示す。
これらの図は、透過およびセグメンテーションを伴う画像に基づくサイトメトリー解析と、細胞周期のＧ１期およびＧ２期の（低信号での）蛍光の分析とを示す。ここに示した例Ａの画像および評価は、照明時間１００ｍｓでの細胞サンプルの増分移動の間に行った。第２の例Ｂでは、細胞サンプルを増分移動させ、照明時間１ｍｓで照らした。例Ｃでは、細胞サンプルを連続移動させ、照明時間は５０μｓであった。
【００６４】
例Ａ、ＢおよびＣは、（Ａ）通常の照明パラメータによる従来の画像記録、ならびに、（Ｂ）照明時間が特に短い従来の画像記録と、（Ｃ）連続的に移動するサンプルキャリアを用いた照明時間が非常に短い本発明による画像記録とを示す。示された散布図（下記）の情報の内容は、蛍光情報の定量に直接基づいており、示されたすべての場合において同等である。にもかかわらず、本発明によるＣの場合、サンプルの負荷が著しく低減され、データ記録の速度が増加した。
【００６５】
本発明による方法を使用して可能になる分析の本質的な特性を、例に基づいて図４に示す。例Ａの上部は、従来の顕微鏡検査、すなわち顕微鏡テーブルの増分移動および１００ｍｓの範囲内の照明時間、を用いて蛍光モードで記録された、単一細胞核を含む顕微鏡画像の一部を示す。例Ａの画像の下部には、サンプル中の多数の細胞核に関連するサイトメトリーデータ分析が、散布図によって表されている。
【００６６】
例示されたアプリケーションの目的は、有糸分裂段階Ｇ１およびＧ２における細胞核の亜集団として識別され得る２つの異なるクラスターを、検出された蛍光の平均強度が表面上に示される散布図において識別可能にすることである。例Ａの条件では、蛍光画像から位置および輪郭データを直接導出することが技術的に可能である。代わりに、この情報が蛍光画像とは独立して確認できるように、サンプル中の同じ位置の透過画像を選択した。示された細胞のセグメンテーションマスクまたはオブジェクトマスクを、上部画像にプロットし、Ｍと指定する。
【００６７】
例Ｂに示す第２の例では、例Ａと同じ状況が描かれているが、照明時間がより短く、１ｍｓである。この場合、原理的には、蛍光画像から細胞のセグメンテーションマスクを直接決定することは可能であるが、そうすることは、さらなる分析のために堅牢ではない。従来技術によれば、顕微鏡テーブルの増分移動を伴うより高速の画像記録に関しては、著しく短い照明時間は不適当である。なぜなら、顕微鏡テーブルの移動における活性化、加速、および制動処理のために費やされる典型的な時間は、比較的長く、画像の記録中に生じる力および振動は、生きている細胞にとって有害であるからである。
【００６８】
本発明による状況は例Ｃに示されている。顕微鏡テーブルの連続的な移動の結果として、非常に短い照明時間、この場合５０μｓは、合理的であり、画像記録速度を非常に速くすることができると同時に、細胞および液体に作用する非常に小さい力および振動が生じる。
【００６９】
照明時間が非常に短いために、光に起因する細胞への害は最小限に抑えられる。記録された細胞の蛍光画像は、評価および分析のための適切なオブジェクトマスクまたはセグメンテーションマスクを直接的に得るまたは決定するための自動細胞分割を実行するのに十分に適していないが、透過モードから決定されたセグメンテーションマスクまたはオブジェクトマスクの使用は、蛍光画像の信号対ノイズ比が非常に低いにもかかわらず、細胞の蛍光強度の堅牢な定量を可能にする。下側の散布図では、アプリケーションに関連する多数の測定された細胞核についての強度データの表示は、（従来技術による）例Ｂと同様の亜集団の分類をはっきりと示している。
【００７０】
図面のみから得られたものを含むすべての明示された特徴、および、他の特徴と組み合わせて開示された個々の特徴は、単独でまたは組み合わせて、本発明に必須であると考えられる。本発明による実施形態は、個々の特徴によって、または複数の特徴の組み合わせによって実現することができる。本発明の範囲内で、「特に」または「好ましくは」と特徴づけられる特徴は、任意の特徴であると理解される。
【符号の説明】
【００７１】
１０  装置  １２  光源  １４  集束レンズ  １６  サンプルキャリア  １８  テーブル  ２２  モータ  ２４  対物レンズ  ２６  装置  ２８  デジタルカメラ  ３０  光学素子  ３２  コンピュータ  ３４  光源  ３６  ビームスプリッタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【外国語明細書】
2019007941000001.pdf