(57)【要約】      （修正有）【課題】肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であって、ＺＡＰ低発現腫瘍又はＺＡＰ陰性腫瘍である、ヒトの腫瘍の治療薬、及び投与システムの提供。【解決手段】寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有するＭ１ウイルス、ゲタウイルスから選択されるアルファウイルス、及びＺＡＰ阻害抗体又はＺＡＰ阻害ＲＮＡｉであるＺＡＰ阻害剤とからなる抗腫瘍薬、及びその投与システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のアルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への使用であって、
前記少なくとも１種のアルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であって、ZAP低発現腫瘍又はZAP陰性腫瘍であることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記抗腫瘍薬は注射剤、錠剤、カプセル又は貼付剤であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
ZAP発現レベル検出試薬と少なくとも１種のアルファウイルスとを含む抗腫瘍投与システムであって、前記アルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする抗腫瘍投与システム。
【請求項９】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項８に記載の抗腫瘍投与システム。
【請求項１０】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項８又は９に記載の抗腫瘍投与システム。
【請求項１１】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
【請求項１２】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項８乃至１１のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
【請求項１３】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
【請求項１４】
少なくとも１種のアルファウイルスとZAP阻害剤とを含む抗腫瘍薬であって、前記アルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であり、前記ZAP阻害剤は、ZAP阻害抗体又はZAP阻害RNAiであることを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項１５】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項１４に記載の抗腫瘍薬。
【請求項１６】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の抗腫瘍薬。
【請求項１７】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１８】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１９】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項１４乃至１８のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項２０】
前記ZAP阻害剤は腫瘍標的化ZAP阻害剤であることを特徴とする請求項１４乃至１９のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項２１】
ZAP阻害剤の、アルファウイルスによる抗腫瘍の増感剤/薬剤耐性克服剤の製造への使用であって、
前記アルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であり、前記ZAP阻害剤は、ZAP阻害抗体又はZAP阻害RNAiであることを特徴とする使用。
【請求項２２】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項２１乃至２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項２１乃至２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項２１乃至２５のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医薬分野に属し、アルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は正常細胞での遺伝子変化及びエピジェネティックな累積的変化に起因するものであり、このような変化は正常細胞の悪性腫瘍への変化を誘発する。この複雑な病理学的変化は、異なる腫瘍の発生、維持及び転移におけるメカニズムの多様性を決める。現在、通常用いられる腫瘍の臨床治療方法として、外科的切除、化学療法及び放射線療法がある。しかし、外科的切除では、腫瘍が再発しやすく、放射線療法、化学療法は副作用が大きい。
【０００３】
ヒト癌は１５〜２０％ウイルス感染に関係しており、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)は肝臓癌、ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌に繋がる等である。
【０００４】
アルファウイルスはトガウイルス科に属し、エンベロープ構造を有する一本鎖プラス鎖RNAウイルスであって、主に節足動物を伝播媒質とするものである。２９種類のアルファウイルスのうち１３種類はヒトや動物の疾患を誘発することができる(David M.Knipe,Peter M.Howley,Chapter ２３,Alphaviruses,Fields Virology ６th edition：６５１-６８５,２０１３)。
【０００５】
アルファウイルスベネズエラウマ脳炎ウイルスは、キャリアとして樹状細胞を導入することにより腫瘍を治療することができる(Moran TP,Burgents JE,Long B,et al:Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice.Vaccine ２５:６６０４-６６１２,２００７)。
【０００６】
しかし、このようなウイルスはヒト発熱、痙攣、流産、さらには死亡を誘起したことがあるため、選択性及び安全性の問題はウイルスの抗腫瘍治療への応用に大きく影響を与えている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、安全且つ効果的なウイルスによる抗腫瘍薬を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の別の目的は、特定の腫瘍タイプに対する安全且つ効果的なウイルス抗腫瘍薬を提供することにある。
【０００９】
本発明の更に別の目的は、特定の個体/腫瘍に対して安全且つ効果的なウイルス抗腫瘍薬を提供することにある。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、効果的な抗腫瘍投与システム及び投与方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、より効果的な抗腫瘍薬及び腫瘍治療方法を提供することにある。
【００１２】
本発明は以下の手段により上記の目的を実現する。
【００１３】
本発明はアルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への応用を提供しており、前記アルファウイルスはM１ウイルス又はゲタウイルスである。
【００１４】
M１ウイルス(Alphavirus M１)はアルファウイルス属(Alphavirus)に属し、１９６４年に中国海南島のイエカ属(Culex)の蚊から分離されたものである(Li XD,et al:Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island,China,and results of a serosurvey.Southeast Asian J Trop Med Public Health ２３:７３０-７３４,１９９２.)。２００８年にM１ウイルスの全ゲノム配列が決定された(Zhai YG,et al:Complete sequence characterization of isolates of Getah virus(genus Alphavirus,family Togaviridae)from China.J Gen Virol ８９:１４４６-１４５６,２００８.)。その取得方法として、上記の文献に記載の方法又は以下の寄託情報により取得することができるが、これに限定されない(寄託番号：CCTCC V２０１４２３；寄託時間：２０１４年７月１７日；分類学上の位置：Alphavirus M１；寄託機関：中国典型培養物保蔵センター；寄託住所：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大学)。
【００１５】
本発明者らはこの前M１ウイルスについて研究した結果、M１ウイルスはある腫瘍細胞、例えばラット悪性神経膠腫細胞C６、ヒト悪性神経膠腫細胞U２５１及びU-８７に対して殺滅作用を有する一方、他の腫瘍細胞、例えばヒト悪性神経膠腫細胞T９８Gに対して殺滅作用を有しないことが示された。これらの研究は、M１ウイルスが有効な抗腫瘍効果を有することを確定できるものではない。
【００１６】
本発明は、さらに、M１ウイルスの抗腫瘍薬としての治療有効性を高めるために、該ウイルスが適用される腫瘍タイプを提供する。
【００１７】
さらに好ましくは、本発明に係るM１ウイルスが抗腫瘍薬として適用される腫瘍タイプは、肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌、胃癌の１種類又は２種類以上である。
【００１８】
本発明者らは、M１ウイルスが各種類の腫瘍細胞に対し異なる程度の細胞死亡を誘起することを発見した。M１ウイルス(MOI＝１０)で腫瘍細胞を４８時間処理した結果、膵臓癌、鼻咽頭癌、前立腺癌及び黒色腫細胞の死亡率は５０％を超え、結腸直腸癌(LoVo、HCT-８、SW６２０及びSW４８０)、肝臓癌(Hep３B、Huh-７及びHuh-６)、膀胱癌及び乳癌細胞の死亡率は４０％を超え、神経膠腫、子宮頸癌、肺癌細胞の死亡率は３０％を超え、胃癌細胞の死亡率は２０％を超えた。上記の結果から明らかなように、M１ウイルスの抗腫瘍薬としての効果について、最も顕著なのは、膵臓癌、鼻咽頭癌、前立腺癌及び黒色腫に対する効果；次は、結腸直腸癌、肝臓癌、膀胱癌及び乳癌に対する効果；さらに次は、神経膠腫、子宮頸癌、肺癌に対する効果；さらに次は、胃癌に対する効果である。
【００１９】
M１ウイルスはゲタウイルスに類似するウイルスであることに鑑み、ゲタウイルスとの相同性が９７.８％と高いため、当業者にとって、M１ウイルスの抗腫瘍効果に基づいて、ゲタウイルスはM１ウイルスと類似する作用及び効果を奏することができることが認められる。
【００２０】
さらに、本発明は、特定の個体/腫瘍に対して、より正確且つ効果的に治療計画を設計し、治療薬物を投与する方法、及び特定の個体/腫瘍に対する薬物を提供する。
【００２１】
本発明者らは、前記ウイルスがZAP低発現腫瘍又はZAP陰性腫瘍の治療に好適に使用され、好ましくは、ZAP低発現の固形腫瘍又はZAP陰性の固形腫瘍の治療に使用されることを、初めて発見した。
【００２２】
M１ウイルスの腫瘍治療に対する有効性は、腫瘍ZAP発現調節と密接に関連している。M１ウイルスの複製がZAPに抑制され、且つZAPが数多くの腫瘍において低発現又は陰性であるため、M１ウイルスはZAP低発現又はZAP陰性の腫瘍/個体を選択的に治療することができる。
【００２３】
ZAPとは、CCCH型亜鉛フィンガー抗ウイルスタンパク質１の略語を意味し、英語でZinc finger CCCH-type antiviral protein １と表記され、zc３hav１遺伝子によってコードされる。細胞内のZAPは、RNA分解及び翻訳抑制の誘導メカニズムによりあるウイルス、例えばエボラウイルス及びマールブルグウイルスの複製を阻害する一方、他のウイルス、例えば水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス及び黄熱ウイルス等の複製には阻害作用を有しない。
【００２４】
本発明者らは、M１ウイルスはZAP低発現/ZAP陰性の細胞株において細胞の死亡を顕著に誘起することができ、M１ウイルスは腫瘍担持動物の体内でZAP低発現/ZAP陰性の腫瘍組織に集中し、腫瘍の成長を抑制するとともに、ZAP低発現/ZAP陰性のヒト体外の腫瘍組織の生存を抑制することを発見した。
【００２５】
本発明者らは、複数の異なる腫瘍では、腫瘍組織におけるZAPの発現量が腫瘍周囲の非腫瘍組織より低いことを初めて発見した。臨床で複数の腫瘍病理標本に対する免疫組織化学的分析から明らかなように、６９％の肝臓癌、５２％の結腸直腸癌及び６１％の膀胱癌組織において、ZAP発現レベルが、対応する腫瘍周囲の非腫瘍組織より顕著に低いことが分かった。M１ウイルスはZAP低発現/ZAP陰性の腫瘍への選択的な治療に使用されることができる。
【００２６】
本発明者らの実験結果により、M１ウイルスの複製がZAPにより抑制され、ZAPの発現レベルはM１ウイルスが腫瘍細胞の死亡を選択的に誘起し、腫瘍成長を抑制する決定的要素であることが初めて証明された。本発明者らは、研究によりM１ウイルスの抗腫瘍効果はZAPの発現レベルと直接関連していることを発見した。また、ZAPがノックダウンされた腫瘍細胞は、M１ウイルスに感染することで、腫瘍細胞の生存率がZAPのノックダウンされていない細胞よりも顕著に低下することを発見した。従って、好ましい治療計画として、癌患者にM１ウイルスによる治療を行う場合に、同時に又は事前にZAP阻害剤を投与することにより、腫瘍のM１ウイルスに対する感受性を高めることができる。
【００２７】
従って、M１ウイルスの抗腫瘍薬としての治療効率を更に高めるために、治療計画を選択する時に、まず、患者の腫瘍のZAP発現状況を判断し、さらにM１ウイルスによる治療計画を実施することにより、治療計画の有効性を高め、無効な投与による時間の遅延及び薬物乱用を避けることができる。例えば、投与する前にまず患者の腫瘍のZAP発現状況を測定し、ZAP低発現又はZAP陰性の腫瘍である場合、直接M１ウイルスによる治療を実施することができ、ZAP正常発現/ZAP高発現の腫瘍である場合、M１ウイルスを投与する前に又は同時にZAP阻害剤(例えば、ZAP発現阻害剤又は機能阻害剤、ZAP干渉断片、或いはZAP抗体等)を投与することにより、腫瘍のM１ウイルスに対する感受性を高め、治療の有効性を高めることができる。腫瘍のZAP発現量の高さはM１治療の有効性に直接影響を及ぼす。ZAP発現量が低いほど腫瘍のM１による治療効果は高くなる。ある個体/腫瘍がM１による治療が適切かどうかを判断する際に、まず腫瘍ZAPの発現レベルを検出することができる。ZAP発現レベルの判断は、以下の手段が好ましいが、それに限定されない。
【００２８】
ZAP低又は高発現は、２つの群(個)の試料のZAP mRNA又はタンパク質の数を比較した結果、一方の群(個)の試料のZAP mRNA又はタンパク質の数が他方の群(個)よりも少ない又は多い場合、当該試料はZAP低又は高発現と称する。ZAP陰性とは、試料が全く発現しないZAP mRNA又はタンパク質のことをいう。ZAP mRNA及びタンパク質の数の比較のための試料は、腫瘍細胞及び正常細胞、腫瘍組織及び腫瘍周囲の非腫瘍組織、或いはM１治療に対して有効又は無効である腫瘍であってもよい。
【００２９】
１つの態様として、腫瘍のZAP高、低又は陰性発現の何れも、腫瘍組織を対応する腫瘍周囲の非腫瘍組織と比較した場合、ZAP mRNA及びタンパク質の数が多い、少ない又は発現無しとのことをいう。前者のZAPのmRNA又はタンパク質の均一化発現量が後者より少ない(つまり、腫瘍組織と腫瘍周囲の非腫瘍組織との、ZAP均一化発現量の比が<１である)と、ZAP低発現であり、M１により治療を行うことが好適である。より効果的な治療対象は、腫瘍組織と腫瘍周囲の非腫瘍組織とのZAP均一化発現量の比が<０.８である腫瘍であり、より好ましくは<０.６であり、さらに好ましくは<０.４であり、さらに好ましくは<０.３であり、さらに好ましくは<０.２であり、さらに好ましくは<０.１であり、最も好ましくは腫瘍組織がZAP陰性である。これらの腫瘍組織及び対応する腫瘍周囲の非腫瘍組織は、病理学的穿刺手術又は外科的切除手術からの組織試料を含むが、それに限定されない。臨床研究により分かるように、ある腫瘍組織において、ZAP発現量は腫瘍周囲の非腫瘍組織より高く、これらの腫瘍又は腫瘍患者について、M１により直接治療を行うことが適切ではない。
【００３０】
ZAP mRNA又は蛋白の検出方法は、QRT-PCR、Northern Blot、Western Blot、免疫組織化学、ELISA等を含むが、これらに限定されない。異なる試料のZAP mRNA又はタンパク質の数の差を正確に判断するために、まず、試料毎にZAP mRNA又はタンパク質の均一化発現量を算出する。均一化発現量とは、各試料のZAP mRNA又はタンパク質発現値を試料内標準mRNA又はタンパク質発現値で除することで均一化処理して得られた該試料のZAP均一化発現量をいう。異なる検出方法において内標準物質は異なってもよいが、異なる細胞又は組織試料において内標準物質の発現量が一致すればよい。このように、均一化処理された異なる試料のZAP発現量が比較可能性を有し、試料のZAP mRNA又はタンパク質の数の差の判断に用いられる。
【００３１】
本発明の一実施例(図４)において、M１ウイルスはヒト体外で培養された生肝臓癌組織及び結腸直腸癌組織に対して異なる成長阻害効果(表２及び表３)を有し、腫瘍成長阻害率が１０％を超えた試料は、合計で３２例である一方、腫瘍成長阻害率が１０％以下の試料は１９例である。さらに、QRT-PCR方法によりこの２つの群の各腫瘍組織におけるZAP及び内標準mRNAの発現レベル(それぞれ２-Ct値)を分析し、各試料の２-Ct-ZAPを２-Ct-内標準で除して、各自のZAP均一化発現量を得る。上記２つの群の試料のZAP均一化発現量を統計的分析したところ、阻害率が１０％を超えたサンプル群のZAP均一化発現量は０.１１７±０.８９０で、阻害率が１０％以下の群(０.７９１±０.１０８)より低く、両者の平均値の比は０.１４８であることを発見した。
【００３２】
別の態様として、腫瘍のZAP高、低又は陰性発現とは、腫瘍細胞(例えば、腫瘍患者からの培養腫瘍細胞)は、正常細胞よりZAP mRNA及びタンパク質の数が多い、少ない又は発現無しということをいう。前者のZAPのmRNA又はタンパク質均一化発現量が後者より少ない(即ち、腫瘍細胞と正常細胞とのZAP均一化発現量の比率が<１である)と、ZAP低発現であり、M１により治療を行うことが好適である。より効果的な治療対象は腫瘍細胞と正常細胞とのZAP均一化発現量の比が<０.８である腫瘍、より好ましくは<０.６であり、さらに好ましくは<０.４であり、さらに好ましくは<０.３であり、さらに好ましくは<０.２であり、さらに好ましくは<０.１であり、最も好ましくは腫瘍細胞がZAP陰性である。
【００３３】
本発明の一実施例(図３c)において、Western Blot方法によりHepG２肝臓癌細胞の細胞株とL-０２正常肝細胞株とのZAPタンパク質発現レベルの差を測定するとともに、異なる試料で発現量が同じである標準対照のβ-actinを測定し、Western blot方法により検出される分子数としてバンド階調を検出し、ZAP均一化タンパク質発現量＝ZAPバンド階調平均値/β-actinバンド階調平均値である。HepG２のZAP均一化タンパク質発現量とL-０２との比は０.８で、ZAPはHep G２において低発現である。M１ウイルスに感染した後、Hep G２細胞の生存率は７０.４％±３.５％だけである一方、同様に処理されたL-０２の生存率は１００.３±１０.０％になり、両方の生存率の差が統計的に有意である。
【００３４】
別の実施例(図３a及び図３b)において、腫瘍細胞株T２４、SCaBER、LoVo及びHep３BのZAPは、mRNA(図３a)とタンパク質(図３b)との何れもQRT-PCR及びWestern blotにより検出された後、各自の内標準と比較した均一化発現量は検出されていない又は０に近い(<０.１)、即ち、ZAP発現は陰性であり又は陰性に近い(<０.１)。これらの腫瘍細胞はM１に感染すると、細胞死亡を誘起し、細胞の生存率はT２４２１.１％、SCaBER １１.５％、LoVo ６.９％及びHep３B ３.８％と著しく低下した(表１)。図３a及び図３bにおける正常細胞L-０２とHEBにおいて、ZAPのmRNA(図３a)及びタンパク質均一化発現量は何れも前記腫瘍細胞との比が１より大きく、ZAP高発現であるため、M１に感染したそれらの正常細胞の生存率は顕著に低下せず、L-０２は１００.３％、HEBは９８.８％である(表１)。
【００３５】
従って、本発明は、さらにZAP発現レベル検出試薬及びアルファウイルスを含み、前記アルファウイルスはM１ウイルス又はゲタウイルスであることを特徴とする抗腫瘍投与システムを提供する。患者腫瘍のZAP発現レベルを検出することにより、適切な投与計画を選択する。
【００３６】
さらに、本発明は、アルファウイルス及びZAP阻害剤を含み、前記アルファウイルスはM１ウイルス又はゲタウイルスである抗腫瘍薬を提供する。前記ZAP阻害剤はZAP発現又は機能阻害剤、ZAP干渉断片或いはZAP抗体等である。
【００３７】
M１ウイルスの正常細胞に対する殺滅作用を避けるために、ZAP阻害剤は、選択的に腫瘍組織に与えられ、或いは腫瘍組織を標的とし、腫瘍標的化ZAP阻害剤であることが好ましい。
【００３８】
一つの実施形態において、本発明で提供する抗腫瘍薬は注射剤、錠剤、カプセル、貼付剤等であってもよい。好適な実施形態として、本発明の抗腫瘍薬は注射剤であり、静脈内注射が好ましい。
【００３９】
投与方式として、本発明のM１ウイルスは静脈内注射又は腫瘍内注射により投与することができる。腫瘍内注射の場合、日ごとに２×１０５PFU/kg〜２×１０９PFU/kg投与し、静脈内注射の場合は、日ごとに２×１０６PFU/kg〜２×１０１０PFU/kg投与する。溶媒対照群に比べ、M１ウイルス群は腫瘍の成長を顕著に抑制した。
【００４０】
従来技術に比べて、本発明は以下の有益的な効果を有する。
【００４１】
本発明で提供する抗腫瘍薬は複数種類の腫瘍、例えば、肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌、胃癌の治療に適用される。細胞学実験によりM１ウイルスが複数種類の腫瘍細胞の死亡を誘起することを証明し、動物実現によりM１ウイルスが体内で肝臓癌、結腸直腸癌の成長を顕著に抑制することを証明し、ヒト体外腫瘍組織培養実験によりM１ウイルスが肝臓癌、結腸直腸癌組織の生存を顕著に抑制することを証明する。
【００４２】
本発明の提供する抗腫瘍薬はZAP低発現/ZAP陰性腫瘍を好ましく治療することができる。該ZAP低発現/ZAP陰性腫瘍は、肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌、胃癌を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明で提供する抗腫瘍薬は選択的な抗腫瘍作用を有し、安全性が良好である。M１ウイルスが正常細胞の生存に影響を与えず、腫瘍細胞の死亡を選択的に誘起することは、M１ウイルスが腫瘍細胞選択性を有することを示す。担癌ヌードマウスの体内で、尾静脈内注射されたM１ウイルスは腫瘍組織に高度に集中でき、正常組織におけるウイルスの量が比較的に低く、両者のウイルスの量には１０２〜１０６倍の差があることにより、M１ウイルスの腫瘍選択性をさらに証明する。また、M１ウイルスの投与はヌードマウスの体重及び精神状態に影響を与えないため、M１ウイルスの安全性が良好であることを示す。
【００４４】
本発明は初めて特定の個体/腫瘍に対して安全且つ効果的なウイルス抗腫瘍薬を提供する。本発明の薬物はZAP低発現/ZAP陰性の腫瘍を選択的に治療することにより、投与有効率を向上させ、無効な投与及び薬物乱用を防止する。
【００４５】
本発明はより効果的な投与方法及び投与システム提供する。まず患者の腫瘍のZAP発現レベルを検出し、さらに検出結果により選択的に薬物治療を行う、或いは他の手段で治療することにより、M１ウイルスの治療の特異性及び有効性を高めることができる。
【００４６】
本発明はより効果的な抗腫瘍薬及び腫瘍治療方法を提供する。投与前或いは投与と同時にZAP阻害剤を与えることで、腫瘍の薬物に対する感受性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１はM１ウイルスが腫瘍細胞病変効果を顕著に誘起することを示すグラフである。  a)はM１ウイルス感染が腫瘍細胞の形態学的病変を誘起することを示すグラフである。  b)はM１ウイルス感染が正常細胞株に形態学的影響を与えないことを示すグラフであり、ただし、ControlはOptiPROTMSFM培地対照群を示し、M１はM１ウイルス感染実験群を示す。
【図２】図２はM１ウイルスが担癌マウスの腫瘍成長を効果的に抑制することを示すグラフである。  a)はM１ウイルスの腫瘍内注射後の、Hep３B担癌マウスの腫瘍体積及び動物体重に対する影響を示すグラフであり、ただし、M１はM１ウイルス処理群、溶媒はOptiPROTMSFM培地溶媒対照群を示し、n＝９である。  b)はM１ウイルスの腫瘍内注射後の、LoVo担癌マウスの腫瘍体積及び動物体重に対する影響を示すグラフであり、ただし、n＝１１である。  c)はM１ウイルスの静脉注射後の、Hep３B担癌マウスの腫瘍体積及び動物体重に対する影響を示すグラフであり、ただし、n＝９である。  d)はQRT-PCRにより検出した、静脉注射後のM１ウイルスのHep３B担癌マウスにおける組織分布を示すグラフであり、ただし、n＝６である。  腫瘍体積及び体重のデータは平均値±標準偏差で表され、ANOVA法により統計される。矢印はM１ウイルス処理群、丸はOptiPROTMSFM培地対照群、nsは有意差無し、i.tは腫瘍内注射、i.vは静脉注射；*はM１ウイルスのmRNA発現が検出されないことを示す。
【図３】図３はM１ウイルスがZAP低発現/ZAP陰性腫瘍細胞の死亡を選択的に誘起することを示すグラフである。  a)はZAP mRNA発現量の異なる細胞における差異を示すグラフであり、ただし、NDはZAPのmRNA発現が検出されないことを示す。  b)はZAPのタンパク質発現量の異なる細胞における差異を示すグラフである。β-actinは内標準である。  c)は細胞のZAPタンパク質レベル及びM１ウイルス感染による細胞生存率の変化を示すグラフである。β-actinは内標準であり、students't検定により統計分析を行い、**はP<０.０１を示す。  d)はM１ウイルスがZAPのノックダウンされた正常細胞L-０２、腫瘍細胞PLC及びHCT１１６の死亡を顕著に誘起することを示すグラフである。中空円/中空三角形/中空逆三角形は干渉ノックダウンZAPを示し、ソリッド円/ソリッド三角形/ソリッド逆三角形は文字化け干渉陰性対照を示す。students't検定により統計分析を行い、*/#/&はP<０.０５、&&はP<０.０１、nsは有意差無しを示す。  e)はZAPがノックダウンされた正常細胞L-０２、腫瘍細胞PLC及びHCT１１６においてM１ウイルスの相対力価が高まることを示すグラフであり、students't検定により統計分析を行い、*はP<０.０５を示す。  f)はZAPがノックダウンされた正常細胞L-０２、腫瘍細胞PLC及びHCT１１６においてM１ウイルスのRNA発現が高まることを示すグラフであり、students't検定により統計分析を行い、*はP<０.０５、**はP<０.０１を示す。  g)はZAPがノックダウンされた正常細胞L-０２、腫瘍細胞PLC及びHCT１１６においてM１ウイルスの蛋白NS３、E１発現が高まることを示すグラフであり、GAPDHを内標準とする。  h)はZAPの過剰発現がM１ウイルスによる腫瘍細胞の死亡を部分的に遮断することを示すグラフであり、students't検定により統計分析を行い、#はP<０.０５、nsは有意差なしを示す。  i)はZAP過剰発現の腫瘍細胞においてM１ウイルスの相対力価が減少することを示すグラフであり、students't検定により統計分析を行い、**はP<０.０１を示す。  j)はZAP過剰発現の腫瘍細胞においてM１ウイルスのRNAが減少することを示すグラフであり、students't検定により統計分析を行い、**はP<０.０１を示す。  k)はZAP過剰発現の腫瘍細胞において、M１ウイルスのタンパク質NS３、E１発現が高まることを示すグラフであり、β-actinを内標準とする。
【図４】図４はM１ウイルスとヒト体外生腫瘍組織阻害率及びZAP mRNA発現レベルとは負の相関であることを示すグラフである。  QRT-PCRによりZAPのmRNA発現を検出し、M１ウイルス無効群(阻害率≦１０％)とM１ウイルス有効群(阻害率>１０％)とのZAP相対発現量の差を比較し、M１ウイルス処理による阻害率が１０％以下の腫瘍組織のZAP均一化発現量メジアンは０.４１４であり、１０％を超えた腫瘍組織のZAP発現量メジアンは０.０７５である。順位和検定により統計分析し、P<０.０５である。
【図５】図５はZAPの複数種類の腫瘍臨床病理組織での低発現を示すグラフである。  a）は免疫組織化学染色により臨床腫瘍病理組織でのZAPの発現状況を検出するグラフであり、N：腫瘍周囲非腫瘍群、T：腫瘍群である。  b)は複数種類の腫瘍臨床病理組織において、腫瘍群のZAP発現が腫瘍周囲非腫瘍群より顕著に低いことを示すグラフであり、N：腫瘍周囲非腫瘍組、T：腫瘍組、NとTを順位和検定により統計分析し、***はP<０.００１を示す。c)は複数種類の腫瘍臨床病理組織において、腫瘍組織のZAP発現が腫瘍周囲非腫瘍組織より低いことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下の実施態様は本発明を詳しく説明するものであるが、本発明の実施態様は以下の実施例の記載に制限されなく、本発明の趣旨又は含意に基づいた同様な変形又は変更は本発明の保護範囲に含まれると解されるべきである。
【００４９】
特に明記しない限り、本発明で使用される材料及び実験方法は通常材料及び常法である。
実施例１ M１ウイルスの腫瘍細胞死亡への選択的な誘起
【００５０】
１)M１ウイルスは腫瘍細胞の形態学的病変を顕著に誘起する。
材料：
肝細胞癌Hep３B、ヒト膀胱移行上皮癌T２４、ヒト結腸直腸癌LoVo、ヒト不死化正常肝細胞株L-０２、M１ウイルス、高グルコースDMEM培地、F-１２培地、倒立型位相差顕微鏡。
方法：
a)細胞培養：ヒト肝細胞癌細胞株Hep３B細胞株、ヒト膀胱移行上皮細胞癌細胞株T２４、ヒト不死化正常肝細胞株L-０２を１０％FBS、１００U/mlペニシリン及び０.１mg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM完全培地で成長させ、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVoを１０％FBS、１００U/mlペニシリン及び０.１mg/mlストレプトマイシンを含有するF-１２完全培地で成長させる。すべての細胞株を５％CO２、３７℃のクローズド型恒温器(相対湿度９５％)に置いて継代培養し、倒立顕微鏡で成長状況を観察する。凡そ２〜３日に１回継代し、対数増殖期にある細胞を採取して正式な実験に用いる。
b)顕微鏡による細胞への観察：対数増殖期の細胞を採取し、DMEM或いはF-１２完全培養液(１０％ウシ胎児血清、１％二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を２.５×１０４/ウェルの密度で２４ウェルの培養プレートに接種する。M１ウイルス(MOI＝１)で４８時間感染した後、倒立型位位相差顕微鏡で細胞の形態学的変化を観察する。
結果：
位相差顕微鏡で細胞の形態を観察した結果、Hep３B細胞、T２４細胞及びLoVo細胞はどちらも単層で付着成長し、且つ細胞が密に配列し、表現型が均一である。一方、図１aに示すように、M１ウイルス(MOI＝１)で４８h処理した後、細胞の形態が顕著に変化して、対照細胞群に比べ感染ウイルス群細胞数は顕著に減少し、細胞体が球形に収縮し、屈折率が明らかに増加し、死亡様病変を呈する。図１bはM１ウイルス感染の正常細胞に対する影響を示し、同じである力価のM１ウイルスによりL-０２細胞を感染した結果、細胞数、形態が顕著に変化することを発見しない。その結果は、M１ウイルスは腫瘍細胞に対して細胞死亡を選択的に誘起する一方、正常細胞の生存に影響を与えないことを示す。
【００５１】
２)M１ウイルスは腫瘍細胞株の生存を選択的に低減させる。
材料：
３４株の腫瘍細胞株(表１参照)、３株のヒト不死化正常細胞株(表１参照)、M１ウイルス、高グルコースDMEM培地、F-１２培地、MTT(テトラメチルチアゾリルテトラゾリウム)。
方法：
a)細胞接種及び投与処理：対数増殖期の細胞を採取し、DMEM(又はF-１２)完全培養液(１０％ウシ胎児血清、１％二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、４×１０３/ウェルの密度で９６ウェルの培養プレートに接種する。１２時間後、細胞が完全に付着することを発見する。実験は実験群と対照群に分けられ、実験群：M１ウイルス(MOI＝１０)感染細胞、対照群：高グルコースDMEM溶媒対照群である。何れの群はpentaplicateで行われる。
b)MTTと細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応：４８ｈ培養した時、ウェル毎にMTT １５μl(５mg/ml)を加え、４時間培養し続けた後、顕微鏡により生細胞内で形成した粒子状の青紫色のホルマザン結晶が観察される。
c)ホルマザン粒子の溶解：澄みを慎重に抽出し、DMSOを１００μl/ウェルで加えて、形成した結晶を溶解させた後、微小発振器で５min振動し、その後酵素結合検出器で波長５７０nmで各ウェルの光密度(OD値)を測定する。各群の実験を３回繰り返す。細胞生存率＝薬物処理群OD値/対照群OD値×１００％。
結果:
表１に示すように、M１ウイルス(MOI＝１０)で腫瘍細胞を４８時間処理した結果、膵臓癌、鼻咽頭癌、前立腺癌及び黒色腫細胞の死亡率は５０％を超え、結腸直腸癌(LoVo、HCT-８、SW６２０及びSW４８０)、肝臓癌(Hep３B、Huh-７及びHuh-６)、膀胱癌及び乳癌細胞の死亡率は４０％を超え、神経膠腫、子宮頸癌、肺癌細胞の死亡率は３０％を超え、胃癌細胞の死亡率は２０％を超える。正常細胞(L-０２、HEB及びSV-HUC-１)とPLC及びHCT１１６細胞の生存率には統計学的に有意な変化がない。その結果は、M１ウイルス感染は大部の腫瘍細胞死亡を選択的に誘起することを示す。
【００５２】
表１.M１ウイルスによる腫瘍細胞生存率の顕著な低減
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(注：**p<０.０１,*p<０.０５,ns：差異は統計学的意義無し、統計方法：students't検定、-：統計してない。)
実施例２ M１ウイルスは腫瘍成長を選択的且つ効果的に抑制する。
【００５３】
１)担癌マウス体内でM１ウイルスは腫瘍成長を効果的に抑制する。
材料：
M１ウイルス、ヒト肝臓癌細胞株Hep３B、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVo、４週齢の雌BALB/cヌードマウス５８匹
方法：
a)担癌マウスモデルの構築：５×１０６Hep３B又はLoVo細胞を４週齢BALB/cヌードマウスの背側から皮下注射する。
b)腫瘍内投与：Hep３B腫瘍体積が約５０mm３又はLoVo腫瘍体積が約７０mm３に到した時、腫瘍内注射投与を始め、１２日でM１ウイルスを合計６回(２×１０６PFU/回)注射する。OptiPROTMSFM培地注射を溶媒対照群とする。２日毎に腫瘍の長さ及び幅と体重を測定する。腫瘍の体積は、長さ×幅２/２により計算される。
c)静脈内投与：Hep３B細胞腫瘍体積が約５０mm３に到した時、M１ウイルスを静脈内注射(３×１０７PFU/回)し、３日後、二回目の静脈内注射をする。OptiPROTMSFM培地注射を溶媒対照群とする。３日毎に体重と腫瘍の長さ及び幅を測定する。腫瘍の体積は、長さ×幅２/２により計算される。
結果：
BALB/cヌードマウスで皮下担癌Hep３B(図２a及び２c)及びLoVo(図２b)ヌードマウスのモデルを構築した後、連続的に複数回の腫瘍内注射(図２a及び図２b)又は静脈内注射(図２c)によりM１ウイルスを投与し、ヌードマウス腫瘍体積及び動物体重の変化状況を観察する。Hep３Bヌードマウスモデルにおいて、腫瘍内注射投与は図２aに示すように行い、２０日目に実験を終了し、溶媒対照群腫瘍の体積平均値は０.３６８±０.０５１cm３で、M１ウイルス群の腫瘍体積平均値は０.１７２±０.０５８cm３であることから、M１ウイルスがHep３B担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM１ウイルス群ヌードマウスの平均体重（１６.４±１.５４g）と対照群ヌードマウスの平均体重(１７.０±１.１６g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M１ウイルスは安全性に優れることを示す。一方、LoVoヌードマウスモデルにおいて、腫瘍内投与は図２bに示すように行い、２４日目に実験を終了し、対照群腫瘍の体積平均値は０.５４６±０.０８７cm３で、M１ウイルス群腫瘍の体積平均値は０.３８９±０.０４９cm３であることから、M１ウイルスがLoVo担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM１ウイルス群ヌードマウスの平均体重(１８.９±１.４０g)と対照群ヌードマウスの平均体重(１９.４±１.８６g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M１ウイルスは安全性に優れることを示す。Hep３Bヌードマウスモデルにおいて、静脈内注射投与は図２cに示すように行い、２１日目に実験を終了し、対照群腫瘍の平均体積は０.２４７±０.０６７cm３、M１ウイルス群腫瘍の平均体積は０.１３４±０.０５７cm３であることから、M１ウイルスはHep３B担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM１ウイルス群ヌードマウスの平均体重(１７.２±２.５０g)と対照群ヌードマウスの平均体重(１７.５±２.１６g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M１ウイルスは安全性に優れることを示す。
【００５４】
２)M１ウイルスは腫瘍組織に選択的に集中する。
材料：
４週齢雌性BALB/cヌードマウス２４匹、肝臓癌細胞株Hep３B、Trizol、組織ホモジナイザー、リアルタイムPCR装置
β-actinプライマー：
センス鎖(SEQ ID No.１：GATCATTGCTCCTCCTGAGC)
アンチセンス鎖(SEQ ID No.２：ACTCCTGCTTGCTGATCCAC)
M１ウイルス非構造蛋白NS１プライマー：
センス鎖(SEQ ID No.３：GTTCCAACAGGCGTCACCATC)
アンチセンス鎖(SEQ ID No.４：ACACATTCTTGTCTAGCACAGTCC)
方法：
４週齢のヌードマウスの背側皮下に５×１０６ Hep３B細胞を注射する。４日後、各マウスにM１ウイルス(３×１０７PFU)を尾静脈注射する。投与後、それぞれ１、２、３及び４日目にヌードマウスを殺し、組織サンプル(腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、筋肉)を収集して、組織RNAを抽出する。さらに、QRT-PCRによりM１ウイルスの量を検出することにより、M１ウイルス非構造蛋白NS１をM１ウイルス量として検出し、同時にβ-actin内標準を検出し、相対M１ウイルスRNA量を、
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により計算する。Ct-NS１、Ct-内標準はApplied Biosystems ７５００Fast Real-Time PCR System装置から読み取って得られる。
結果：
図２dに示すように、ヌードマウス皮下Hep３B腫瘍モデルにおいて、異なる４つの時点でM１ウイルスの腫瘍組織における量は他の臓器・組織の１０２〜１０６倍以上であり、M１ウイルスは選択的に腫瘍組織に集中することを示す。
実施例３ M１ウイルスはZAP低発現/ZAP陰性腫瘍細胞の死亡を選択的に誘起する。
【００５５】
M１ウイルスはZAP低発現の腫瘍細胞死亡を選択的に誘起することに対し、正常細胞に影響を与えないため、ZAPの発現レベルはM１ウイルス選択性の決定的な要素である。正常細胞及びZAP正常発現/高発現の腫瘍細胞において、RNAを干渉し、ZAPの発現レベルをノックダウンすることにより、M１ウイルスは細胞死亡を顕著に誘起することができる。さらに、ZAP低発現の腫瘍細胞において、ZAPの過剰発現はM１ウイルスによる腫瘍細胞の死亡を部分的に遮断することができる。
【００５６】
１)M１ウイルスはZAP発現レベルが高い正常細胞及び腫瘍細胞の死亡は誘起しない。
材料：
M１ウイルス、ヒト肝細胞L-０２、ヒトグリア細胞HEB、ヒト膀胱癌細胞SCaBER及びT２４、ヒト肝臓癌細胞株Hep３B及びPLC、ヒト肝臓癌細胞株Hep G２、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVo及びHCT１１６；
Western bolt：細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、β-actin抗体(Neomarker、USA)；
RNA、PCRの抽出：RNA抽出試薬Trizol、リアルタイムPCR装置  Applied Biosystems ７５００ Fast Real-Time PCR System(Life、USA)、
ZAPプライマー：
ZAPセンス鎖(SEQ ID No.５：TCACGAACTCTCTGGACTGAA)
ZAPアンチセンス鎖(SEQ ID No.６：ACTTTTGCATATCTCGGGCATAA)
β-actinプライマー：実施例２と同様。
方法：
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM又はF-１２完全培養液(１０％のウシ胎児血清、１％の二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を２×１０５/ウェルの密度で３５mmウェルの培養プレートに接種する。RNAを抽出し、PCRにより細胞におけるZAPmRNA発現量を検出する。本実験の内標準はβ-actinである。ZAP mRNA 均一化発現量は公式：
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により計算される。Ct-ZAP、Ct-内標準はApplied Biosystems ７５００Fast Real-Time PCR Systemから読み取って得られるものであり、PCR増幅過程における、蛍光信号がバックグラウンドから指数増殖段階に入り始まる閾値に対応する循環回数を示す。
細胞総タンパク質を抽出し定量し、Western Blot実験(電気泳動、膜貫通、密封、一抗と二抗の培養、顕象)を行う。イメージングソフトウェアImage LabによりZAP及び内標準β-actinバンド階調を走査し、バンド階調を検出し、ZAP均一化タンパク質発現量の計算は、公式：ZAP均一化タンパク質発現量＝ZAPバンド階調/内標準バンド階調により行われる。試験は３回繰り返し、平均値をZAP均一化タンパク質発現量として計算する。
結果：
図３a及び３bに示すように、腫瘍細胞SCaBER、T２４、Hep３B及びLoVoにおいて、ZAPのmRNA(図３a)及びタンパク質(図３b)均一化発現量がほとんど検出されず、正常細胞(L-０２及びHEB)及び腫瘍細胞(PLC、HCT１１６)により明らかに低い。
M１ウイルスはZAP低発現/陰性の腫瘍細胞の死亡を誘起するが、ZAP高発現の細胞の死亡を誘起することがない。正常細胞(L-０２及びHEB)及び腫瘍細胞(PLC、HCT１１６)の一部はM１ウイルスに感染した後、生存率が統計的有意性の変化がなく、L-０２は１００.３％、HEBへ９８.８％である(表１)。一方、腫瘍細胞SCaBER、T２４、Hep３B及びLoVoは、M１ウイルスに感染した後、細胞生存率がT２４ ２１.１％、SCaBER １１.５％、LoVo ６.９％及びHep３B ３.８％に顕著に低減する(表１)。
図３c及び表１に示すように、Hep G２肝臓癌細胞のZAPタンパク質均一化発現量がL-０２正常細胞より低く、比率が０.８である。L-０２細胞はM１ウイルスに感染した後、生存率の顕著な変化がない一方、Hep G２細胞はM１ウイルスに感染した後、生存率が７０.４％に低減するため、両方の細胞に対して、統計的差異がある。それは、さらに、M１ウイルスがZAP低発現の腫瘍細胞死亡を誘起することを証明できる。
【００５７】
２)M１ウイルスはZAPレベルがノックダウンされた正常細胞及び腫瘍細胞の死亡を顕著に誘起する。
材料：
M１ウイルス、ヒト肝細胞L-０２、ヒト肝臓癌細胞PLC、ヒト結腸直腸癌細胞HCT１１６、ZAP RNA干渉断片、MTT(メチルチアゾリルテトラゾリウム)、LipofectamineTM RNAiMAX(invertrogen、USA)
Western bolt：細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、M１ウイルスNS３抗体(Beijing Protein Innovation)、M１ウイルスE１抗体(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗体(CST、USA)；
RNA、PCRの抽出：Trizol、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems ７５００ Fast Real-Time PCR System)、β-actin、M１ウイルス非構造蛋白NS１プライマーは、実施例２と同様；
ZAP干渉断片(Si RNA)は標的配列SEQ ID No.７：５'CCAAGAGTAGCACTTGTTA３'のために設計される。
Si RNAセンス鎖(SEQ ID No.８：５'CCAAGAGUAGCACUUGUUA dTdT ３')
Si RNAアンチセンス鎖(SEQ ID No.９：３'dTdT GGUUCUCAUCGUGAACAAU ５')
ZAP文字化け干渉断片対照(siNC)：センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド比率がSi RNA断片と同じであるが、配列順序が完全にランダムである。
方法：
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM完全培養液(１０％ウシ胎児血清、１％二重抗体)で細胞懸濁液を調製し、細胞を１×１０５/ウェルの密度で６ウェルの培養プレートに接種する。２４時間後、RNAiMAXで包まれたSi RNA断片を加える。４８時間後、M１ウイルスに感染させる。感染してから４８時間後、試料を処理する。
ウェル毎にMTT ２０μl(５mg/ml)を加え、４時間後、吸光度の値を測定し、細胞の生存率を計算し、siZAP実験群はZAP RNA干渉断片で処理し、siNC対照群はZAP文字化け干渉断片で処理する。
a)細胞澄み液を収集し、TCID５０の方法によりウイルス力価を測定する。
b)RNA試料を抽出し、PCRによりM１ウイルス非構造蛋白NS１量を検出することでM１ウイルス量を検出し、β-actinは内標準である。
c)タンパク質試料を抽出し、Western blotによりZAPタンパク質発現及びM１ウイルスタンパク質NS３とE１を検出し、内標準はGAPDHである。ZAP均一化発現量の計算は、内標準としてβ-actinをGAPDHに変更した以外、実施例３の１)と同様である。
d)試験を３回繰り返し、データは平均値±標準偏差で表される。それぞれの対照群と比較してstudents't検定統計する。*/#/&はP<０.０５、**/&&はP<０.０１、nsは統計的差異無しであることを示す。
結果：
図３d-３gに示すように、ZAP RNA干渉断片でヒト正常肝細胞L-０２、ヒト肝臓癌細胞PLC及びヒト結腸直腸癌細胞HCT１１６を処理した後、ZAPタンパク質発現量は検出不能であるほど顕著に低減する一方(図３g)、M１ウイルスタンパク質NS３及びE１タンパク質は顕著に増加する。M１ウイルス(MOI＝１００)に感染した後、ZAPレベルがノックダウンされたL-０２細胞(siZAP群)の生存率が６９.７％±３.４５％、PLC細胞生存率が６３.９％±１１.５％、HCT１１６細胞生存率が４９.６％±１.２１％に低減することを顕著に誘起する(図３d)。図３eに示すように、M１ウイルスに感染してから４８時間後、ZAPがノックダウンされた(siZAP群)のL-０２細胞において、相対M１ウイルス力価は対応するsiNC群の４.１０±１.３８倍であり、HCT１１６細胞(siZAP群)において、対応するsiNC群の３.３９±１.２７倍であり、PLC細胞(siZAP群)において、対応するsiNC群の３２.６±２.３４倍である。又、図３fに示すように、M１ウイルスに感染してから４８時間後、ZAPがノックダウンされた(siZAP群)L-０２細胞において、M１ウイルスRNA発現量は対応するsiNC群の１６.３±８.２０倍であり、HCT１１６細胞において、対応するsiNC群の８.８２±４.０２倍であり、PLC細胞において、対応するsiNC群の３０.５±１２.２３倍である。上記の結果から、M１ウイルスはZAPレベルがノックダウンされた正常細胞及び腫瘍細胞の死亡を顕著に誘起することが分かる。
【００５８】
３)ZAP過剰発現はM１ウイルスによる腫瘍細胞死亡を拮抗する。
材料：
M１ウイルス、ヒト肝臓癌細胞Hep３B、GFPを発現するpReceiver-M０２-GFPプラスミド(ブランク対照プラスミド、広州複能遺伝子)、ZAPを発現するpReceiver-M０２-ZAPプラスミド(ZAP過剰発現プラスミド)、FuGENE HDトランスフェクション試薬、MTT(メチルチアゾリルテトラゾリウム)
RNA、PCRの抽出：Trizol、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems ７５００Fast Real-Time PCR System)、β-actin、M１ウイルス非構造蛋白NS１プライマーは、実施例２と同様。
Western bolt：細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、M１ウイルスNS３抗体(Beijing Protein Innovation)、M１ウイルスE１抗体(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗体(CST、USA)。
方法：
対数増殖期の細胞を採集し、DMEM完全培養液(１０％のウシ胎児血清、１％の二重抗体)で細胞懸濁液を調製し、細胞を１×１０５/ウェルの密度で６ウェルの培養プレートに接種する。２４時間後、GFP過剰発現対照プラスミド及びZAP過剰発現プラスミドをそれぞれトランスフェクションして、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞及びZAP過剰発現の細胞を得る。４８時間後、M１ウイルスに感染させる。感染してから４８時間後、試料を処理して検出する。
a)MTT法により細胞生存率を検出し、ウェル毎にMTT ２０μl(５mg/ml)を加え、４時間後５７０nM波長により吸光度の値を測定する以外の処理は実施例１と同様である。
b)細胞澄み液を収集し、TCID５０の方法によりウイルス力価を検出する。
c)サンプルの総RNA試料を抽出し、QRT-PCR法によりM１ウイルスRNA発現量を測定し、計算は実施例２の方法により行われる。
d)タンパク質試料を収集し、Western blotによりZAPタンパク質発現量及びM１ウイルスタンパク質NS３、E１タンパク質発現量を検出し、処理方法は実施例３の１)と同様である。
e)各試験をそれぞれ３回繰り返し、データを平均値±標準偏差で表す。ぞれぞれの対照群と比較してstudents't検定統計する。#はP<０.０５、**はP<０.０１、nsは統計的差異無しであることを示す。
結果：
図３kに示すように、ヒト肝臓癌細胞Hep３BにZAP過剰発現プラスミドがトランスフェクションされた後、Image Labソフトウェアにより異なる試料のZAP及び内標準β-actinバンドについて階調走査を行った後、それぞれのZAP均一化タンパク質発現量を計算する。ZAP均一化タンパク質発現量ZAP過剰発現群は１.６１±０.０５、GFP過剰発現対照群は０.０３±０.０１であり、前者の平均値が後者の５３.７倍であり、M１ウイルスタンパク質NS３及びE１タンパク質が顕著に増加する。
図３hに示すように、ZAPの過剰発現はM１ウイルス感染によるHep３B細胞の死亡を部分的に遮断する。異なるM１ウイルス力価で感染してから４８時間後、MOI＝０.１である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は７４.７％±８.９４％で、GFP過剰発現対照群の細胞生存率(５９.０％±６.２７％)より顕著に高い。MOI＝１である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は６９.４％±６.９５％で、GFP過剰発現対照群の生存率(５１.４％±５.３１％)より顕著に高い。MOI＝１０である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は６３.７％±６.０４％で、GFP過剰発現対照群の生存率(４０.５％±３.１９％)より顕著に高い。
図３iに示すように、M１ウイルスに感染したZAP過剰発現のHep３B細胞におけるM１相対ウイルス力価は対応するGFP過剰発現対照群の３１.５±１１.６％である。また、M１ウイルスに感染したZAP過剰発現のHep３B細胞におけるM１ウイルスRNA発現量は対応するGFP過剰発現対照群の９.５±４.７％である。
【００５９】
実施例４ M１ウイルスはZAP低発現のヒト体外生腫瘍組織(ex vivo)の成長を抑制する。
材料：
DMEM高グルコース培地、TECIA(Tissue Culture-MTT Endpoint Computer Image Analysis Chemo-sensitivity Test)、β-actin及びZAP：実施例３の１)と同様。
方法：
a)ヒト体外生肝臓癌組織及び結腸直腸癌組織の培養
体外活組織は中山大学腫瘍防治中心での外科的切除により得られたもので、４℃の保存し、４時間以内に実験室に送られて薬物感受性試験を行い、すべての病例が病理組織検査により診断された。無菌条件下で腫瘍組織を取り出して、直径０.５〜１mmの組織ブロックに切り、ウェル毎に４〜６個で２４ウェル培養プレートに置き、ウェル毎に１ml DMEM培地を入れる。１時間培養した後、薬剤感受性試験専用の画像分析器で腫瘍組織ブロックの投影照明映像を撮影し、各ウェルの腫瘍ブロックの面積(area、A)を測定し比較することにより、M１ウイルスのヒト体外生腫瘍組織に対する抑制作用を分析する。
b)薬物処理及び組織活性測定
腫瘍組織をCO２細胞インキュベーターで１２時間培養し、安定した後、１０７PFUのM１ウイルス及び陽性対照薬物である５-フルオロウラシル(５-Fu、１０mg/L)を添加し,９６時間感染した後、MTT(５mg/ml)５０μl/ウェルを加え、３時間培養し、その後、薬剤感受性試験専用の画像分析器で腫瘍組織ブロックの散乱光照明画像を撮影し、ウェル毎に腫瘍ブロックのホルマザンにより染色された面積及び着色度(blue area、BA)を測定し、以下の式に基づいて組織生存率(survival fraction、SF)を計算する。
2019048863.tif 000006
腫瘍組織阻害率(Cell inhibition、CI)：CI＝(１-SF)×１００％、BA薬物処理はM１ウイルス/５-Fu処理群の染色面積、A薬物処理はM１ウイルス/５-Fu処理群の腫瘍ブロック面積、BA対照は溶媒対照処理群の染色面積、A対照は溶媒対照処理群の腫瘍ブロック面積を示す。
c)ZAP mRNA均一化発現量の検出
M１ウイルスの腫瘍阻害率１０％を基準として、前記すべての病例組織を２群に分け、それぞれ試料RNAを抽出し、QRT-PCR法によりZAP mRNA、β-actin(内標準)レベルを検出し、両方のZAP均一化発現量の差を比較し、順位和検定により統計分析する。なお、ZAP均一化発現量の計算方法は実施例３の１)と同様である。
結果：
a)表２に示すように、肝臓癌組織において、阻害率が１０％を超えた病例の比率について、M１ウイルス群は５９.５％で、５-Fu群(５３.８％)より高いため、M１ウイルスの有效率は現在の肝臓癌の臨床治療薬である５-Fuより高い。
【００６０】
表２ M１ウイルス、５-Fuのヒト体外生肝臓癌組織生存率に対する抑制
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b)表３に示すように、結腸直腸癌組織において、阻害率が１０％を超えた病例の比率について、M１ウイルス群は７１.４％で、５-Fu群(６１.５％)より高いため、M１ウイルスの有效率は現在の結腸直腸癌の臨床治療薬である５-Fuより高い。
【００６１】
表３ M１ウイルス、５-Fuのヒト体外生結腸直腸癌組織成長に対する抑制
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c)前記M１ウイルス処理されたヒト体外生腫瘍組織を、阻害率１０％を基準として２つの群に分け、さらにそれらの組織におけるZAP mRNA発現レベルと阻害率との相関性を分析する。M１ウイルス処理による阻害率が１０％を超えるサンプル群のZAP均一化発現量は０.１１７±０.８９０で、阻害率が１０％以下の群(０.７９１±０.１０８)より低く、両方の平均値の比が０.１４８である。図４に示すように、M１ウイルス処理による阻害率が１０％以下の腫瘍組織のZAP均一化発現量のメジアンは０.４１４で、１０％を超えた腫瘍組織のZAP発現量のメジアンは０.０７５である。順位和検定の方法により統計し、差異が統計学的に有意であることを示し、P<０.０５は、M１ウイルスがZAP低発現/ZAP陰性の腫瘍組織の死亡を選択的に誘起できることを示す。
【００６２】
実施例５ ZAPは複数種類の腫瘍臨床病理組織において低発現である。
材料：
５０６人の患者由来の８枚の組織マイクロアレイ(肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌及びペアの腫瘍周囲組織)、ZAP抗体(Thermo、USA)、APERIO完全自動デジタル病理切片スキャナー
方法：
複数のセンター由来の８枚の組織マイクロアレイに免疫組織化学染色(IHC)を行い、APERIOスキャナーにより走査して付属するソフトウェアにより染色密度を計算し、ZAP均一化発現量を検出する。ZAP均一化発現量＝視野内ZAP染色強度/視野内細胞数、ただし、視野内細胞数を均一化標準とする。
結果：
本発明者らは、免疫組織化学方法によりZAPのヒトの複数種類の腫瘍病理試料での発現状況を検出した。図５aはヒト肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌病理組織試料のZAPの免疫組織化学染色の代表的なマッピングを示し、ZAP染色は腫瘍組織で腫瘍周囲組織より浅い。
図５bに示すように、肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌及びそれぞれの腫瘍周囲非腫瘍組織のZAPタンパク質均一化発現量の平均値を統計分析した結果、前記の各腫瘍組織におけるZAP蛋白均一化発現量の平均値はそれぞれの腫瘍周囲非腫瘍組織より顕著に低く、ZAPが腫瘍組織において低発現である。すべての肝臓癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は５.８３±８.４９で、対応する腫瘍周囲非腫瘍組織(１１.８±１１.５)より顕著に低く、両方の平均値の比は０.４９４であり、すべての結腸直腸癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は２.４１±３.６０で、対応する腫瘍周囲非腫瘍組織(８.３０±８.９４)より顕著に低く、両方の平均値の比は０.２９０であり、すべての膀胱癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は２.９３±４.６３で、腫瘍周囲非腫瘍組織(１０.３±８.３６)より低く、両方の平均値の比は０.２８４である。
図５cに示すように、分析されたすべての肝臓癌の病例に対して、ZAP低発現の病例数は６９％であり、分析されたすべての結腸直腸癌の病例に対して、ZAP低発現の病例は５２％であり、分析されたすべての膀胱癌の病例に対して、ZAP低発現の病例は６１％である。従って、ZAPはM１ウイルスによる肝臓癌、結腸直腸癌及び膀胱癌に対する治療の選択的な分子マーカーとなる。
【００６３】
実施例 ６  M１ウイルスの製造方法
材料：
アフリカミドリザル腎臓細胞Vero、高グルコースDMEM培地、OptiPROTMSFM培地(１×)、M１ウイルス、１００mm細胞培養皿、遠心分離機
方法：
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM完全培地(１０％ウシ胎児血清、１％二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を１００mm細胞培養皿に接種する。細胞の融合度が８０％〜９０％に達する時に、OptiPROTMSFMに変更する。さらに、５０μl(MOI＝０.０１)M１ウイルスを加え感染させ、細胞は大面積の病変(約３６時間)が発生する時に、細胞澄みを収集する。２０００〜３０００RPMで５min遠心し、慎重に澄みを吸い出し、均一に混合して小分けして、-８０℃で冷蔵庫に保存する。
【００６４】
上記の実施例は本発明の例示的な実施方式及び効果の説明であり、本発明の実施方式は上記の実施例に限定されるものではない。その他、本発明の方針及び原理を基に行われる変更、修飾、組み合わせ、簡略化は、何れも本発明の内容を脱離しないとし、本発明の保護する範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月22日(2018.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のアルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への使用であって、
前記少なくとも１種のアルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記抗腫瘍薬は注射剤、錠剤、カプセル又は貼付剤であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
少なくとも１種のアルファウイルスとを含む抗腫瘍薬であって、前記少なくとも１種のアルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項９】
少なくとも１種のアルファウイルスとZAP阻害剤とを含む抗腫瘍薬であって、前記アルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする抗腫瘍薬。
【請求項１０】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項９に記載の抗腫瘍薬。
【請求項１１】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の抗腫瘍薬。
【請求項１２】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項９乃至１１のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１３】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項９乃至１２のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１４】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項９乃至１３のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１５】
前記ZAP阻害剤は腫瘍標的化ZAP阻害剤であることを特徴とする請求項９乃至１４のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
【請求項１６】
ZAP阻害剤の、アルファウイルスによる抗腫瘍の増感剤/薬剤耐性克服剤の製造への使用であって、
前記アルファウイルスはM１ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする使用。
【請求項１７】
前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの１種又は複数種であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が少なくとも９７.８％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１６乃至１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
前記アルファウイルスは、寄託番号：CCTCC V201423のM１ウイルスとの相同性が１００％の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項１６乃至１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項１６乃至２０のいずれかに記載の使用。