(57)【要約】【課題】本願の課題は、新たな免疫賦活化剤またはそのスクリーニング方法を提供することである。【解決手段】ＳＭＧ１阻害剤を含む免疫賦活化剤を提供する。また、当該免疫賦活化剤および抗原を含むワクチン組成物を提供する。さらに、（１）被験物質のＳＭＧ１阻害能を測定する工程、および、（２）工程（１）においてＳＭＧ１阻害能を有することが示された被験物質が免疫賦活化剤であると判定する工程を含む、免疫賦活化剤をスクリーニングする方法を提供する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＭＧ１阻害剤を含む免疫賦活化剤。
【請求項２】
ＳＭＧ１阻害剤が式（Ｉ）
【化１】
2019073466.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロ置換アルキルアミノ、ヒドロキシアルキルアミノ、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、および、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいアミノカルボニルアミノアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アルコキシ、ハロ置換アルコキシ、シアノ、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択される］
の化合物、または、それらのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である、請求項１に記載の免疫賦活化剤。
【請求項３】
Ｒ１が、
【化２】
2019073466.tif 000015
からなる群から選択される、請求項２に記載の免疫賦活化剤。
【請求項４】
Ｒ２が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＯＣＨ３、ＣＮ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から選択される、請求項２または３に記載の免疫賦活化剤。
【請求項５】
Ｒ３が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３およびＳＯ２ＮＨ２からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項６】
Ｒ１が、
【化３】
2019073466.tif 000016
である、請求項２〜５のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項７】
Ｒ２が、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２からなる群から選択される、請求項２〜６のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項８】
Ｒ３が、Ｈ、ＣｌまたはＣＨ３である、請求項２〜７のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項９】
Ｒ１〜Ｒ３が下表１に記載する基である、請求項２〜５のいずれかに記載の免疫賦活化剤：
【表１−１】
2019073466.tif 000017
【表１−２】
2019073466.tif 000018
【表１−３】
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【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物が、請求項９に記載の化合物１７〜２６のいずれかである、請求項２〜９のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物が、式
【化４】
2019073466.tif 000020
で表される化合物である、請求項２〜１０のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【請求項１２】
ＳＭＧ１阻害剤がＳＭＧ１の発現を阻害する核酸である、請求項１に記載の免疫賦活化剤。
【請求項１３】
ＳＭＧ１阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項１２に記載の免疫賦活化剤。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡが配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の免疫賦活化剤。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の免疫賦活化剤および抗原を含むワクチン組成物。
【請求項１６】
１種またはそれ以上の他の免疫賦活化剤をさらに含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
他の免疫賦活化剤がＴＬＲリガンドである、請求項１６に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
免疫賦活化剤をスクリーニングする方法であって、
（１）被験物質のＳＭＧ１阻害能を測定する工程、および、
（２）工程（１）においてＳＭＧ１阻害能を有することが示された被験物質が免疫賦活化剤であると判定する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、免疫賦活化のためのＳＭＧ１阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ分解酵素であるレグナーゼ１（Regnase-1；Ｒｅｇ１、Ｚｃ３ｈ１２ａまたはＭｃｐｉｐ１とも呼ばれる）は、Ｒｅｇ１に媒介されるｍＲＮＡ分解（ＲＭＤ）に必須の酵素であり、マクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞において、インターロイキン（ＩＬ）６およびＩＬ１２ｐ４０などのサイトカイン並びに炎症惹起に関わる分子をコードするｍＲＮＡの分解を行うことにより、過剰な免疫応答を抑制している。また、Ｒｅｇ１は、獲得免疫Ｔ細胞においても、Ｔ細胞活性化に関わる分子のｍＲＮＡを分解することにより、過剰なＴ細胞活性化を抑制している。Ｒｅｇ１は、標的ｍＲＮＡの３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）に存在するステムループ構造を認識して、ＲＮＡヘリカーゼであるＵＰＦ１に依存的に、タンパク質翻訳が生じているｍＲＮＡを分解している（非特許文献１）。したがって、Ｒｅｇ１の機能を制御することにより免疫応答を調節できると考えられるが、これまで、医薬として使用し得るＲｅｇ１阻害剤は製造されていない。
【０００３】
ＳＭＧ１は、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼであり、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼタンパク質ファミリーに属する。ＳＭＧ１はこれまで、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）と呼ばれるｍＲＮＡ品質管理に関わるキナーゼとして報告されており、ＮＭＤにおいてＵＰＦ１のリン酸化に機能すると考えられている（非特許文献２および３）。ＳＭＧ１を阻害する化合物やペプチドが知られている（特許文献１、非特許文献４）。また、ＳＭＧ１を阻害するｓｉＲＮＡが知られている（特許文献２、非特許文献５）。
【０００４】
ワクチン用の免疫賦活化剤として、水酸化アルミニウムゲル、モノホスホリルリピドＡなどのＴｏｌｌ様受容体刺激剤などが使用されている。Ｒｅｇ１の機能を制御する免疫賦活化剤は、これまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−０１１２７２号公報
【特許文献２】特開２００５−０２１０９４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mino, T. et al., Cell 161, 1058-1073 (2015)
【非特許文献２】Yamashita, A. et al., Genes Dev 15, 2215-2228 (2001)
【非特許文献３】Yamashita, A., Genes Cells 18, 161-175 (2013)
【非特許文献４】A. Gopalsamy et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (2012) 6636-6641
【非特許文献５】Kashima, I. et al., Genes Dev 20, 355-367 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願は、新たな免疫賦活化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＳＭＧ１がＲｅｇ１のｍＲＮＡ分解機能に必須であることを突き止め、ＳＭＧ１の阻害が、免疫応答に関連する分子のｍＲＮＡ分解を阻害することにより、樹状細胞の活性化を引き起こすことを見出した。
【０００９】
従って、ある態様では、本願は、ＳＭＧ１阻害剤を含む免疫賦活化剤を提供する。
また別の態様では、本願は、上記免疫賦活化剤および抗原を含むワクチン組成物を提供する。
また別の態様では、本願は、免疫賦活化剤をスクリーニングする方法であって、
（１）被験物質のＳＭＧ１阻害能を測定する工程、および、
（２）工程（１）においてＳＭＧ１阻害能を有することが示された被験物質が免疫賦活化剤であると判定する工程、
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本願の開示により、対象におけるＳＭＧ１阻害剤による免疫賦活化が可能になる。従って、ＳＭＧ１阻害剤を単独で、または、他の免疫賦活化剤と組み合わせて、免疫賦活化の目的で使用できる。また、ＳＭＧ１の阻害を指標として、免疫賦活化剤として使用し得る物質をスクリーニングし得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＵＰＦ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入され、ｓｉＲＮＡ−耐性ＨＡ−ＵＰＦ１Ｒ−ＷＴまたはその変異体で再構成されたＨｅＬａ細胞における、ＵＰＦ１のイムノブロット分析を示す。
【図２】ＵＰＦ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入され、ｓｉＲＮＡ−耐性ＷＴ ＵＰＦ１またはその変異体で再構成され、次いで、対照プラスミド（Ｍｏｃｋ）またはＲｅｇ１発現プラスミドと共にルシフェラーゼレポータープラスミドを導入されたＨｅＬａ細胞における、ルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】ＵＰＦ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入され、ｓｉＲＮＡ−耐性ＷＴ ＵＰＦ１またはその変異体で再構成されたＨｅＬａ細胞における、ＲＮＡ発現レベルを示す。細胞をＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。
【図４】ＨｅＬａ細胞におけるＰ−Ｔ２８−ＵＰＦ１およびＰ−Ｓ１０７８／Ｓ１０９６−ＵＰＦ１のイムノブロット分析を示す。ＨｅＬａ細胞にＳＭＧ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入し、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。
【図５】ＨｅＬａ細胞においてＳＭＧ１のノックダウン下で一過性に発現されたＦｌａｇ−Ｒｅｇ１と共免疫沈降されたＵＰＦ１のウェスタンブロット分析を示す。
【００１２】
【図６】ＨＥＫ２９３Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞にＳＭＧ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入し、ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｉｌ６ＣＤＳ−３'ＵＴＲとＲｅｇ１発現プラスミドまたは対照（Ｍｏｃｋ）プラスミドを同時導入した。Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）処理後に全ＲＮＡを調製し、Ｉｌ６およびβ−アクチンのｍＲＮＡレベルをノザンブロット分析により測定した。
【図７】図６のオートラジオグラフを定量し、β−アクチンに対するＩｌ６の割合として表したグラフである。
【図８】図中に示すｓｉＲＮＡおよびルシフェラーゼレポータープラスミドを、対照プラスミド（Ｍｏｃｋ）またはＲｅｇ１発現プラスミドと共に導入されたＨｅＬａ細胞における、ルシフェラーゼ活性を示す。
【図９】ＳＭＧ１および／またはＲｅｇ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入され、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたＨｅＬａ細胞における、ＲＮＡ発現レベルを示す。
【図１０】ＳＭＧ１および／またはＲｅｇ１に特異的なｓｉＲＮＡを導入されたＨｅＬａ細胞における、ＧＡＳ５およびＳＭＧ５のＲＮＡ発現レベルを示す。
【００１３】
【図１１】実施例で使用したＳＭＧ１阻害剤の化学構造を示す。
【図１２】Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）および／またはＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）と共に２時間培養したＢＭＤＣにおけるＰ−Ｔ２８−ＵＰＦ１およびＰ−Ｓ１０７８／Ｓ１０９６−ＵＰＦ１のイムノブロット分析を示す。
【図１３】ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現レベルを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＢＭＤＣを、ＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）で処理し、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。
【図１４】Ｒｅｇ１＋／＋（ＷＴ）およびＲｅｇ１−／−（ＫＯ）マウス由来のＢＭＤＣにおけるＲｅｇ１のウェスタンブロット分析、および、ＲＮＡ発現レベルを示す。ＢＭＤＣをＰａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。
【図１５】Ｒｅｇ１−／−マウス由来ＢＭＤＣにおけるＲＮＡ発現レベルを示す。ＢＭＤＣをＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）で処理し、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。
【００１４】
【図１６】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＢＭＤＣを、ＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）で処理し、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｒ８４８（１００ｎＭ）またはＣｐＧＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８，１００ｎＭ）で２４時間刺激した。培養上清におけるＩＬ６およびＴｎｆの産生を、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＢＭＤＣを、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）および／またはＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）と共に４８時間培養し、ＢＭＤＣ上のＣＤ４０およびＣＤ８０の発現をフローサイトメトリーにより分析した。
【図１８】Ｒｅｇ１＋／＋（ＷＴ）およびＲｅｇ１−／−（ＫＯ）マウス由来のＢＭＤＣをＰａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）と共に４８時間培養し、ＢＭＤＣ上のＣＤ４０およびＣＤ８０の発現をフローサイトメトリーにより分析した。
【図１９】対照プラスミド（Ｍｏｃｋ）またはＲｅｇ１発現プラスミドと共に、図中に示すルシフェラーゼレポータープラスミドを導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ルシフェラーゼ活性を示す。
【図２０】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＳＭＧ１阻害剤（０.３μＭ）およびＰａｍ３ＣＳＫ４（１ｎｇ／ｍＬ）と共に４８時間培養したＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＢＭＤＣの、同種混合リンパ球反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１６】
本願発明者らは、ＲＭＤにおいて、転写後的に活性な正常な免疫関連ｍＲＮＡをＲｅｇ１がＵＰＦ１依存的に分解するメカニズムを解明し、さらに、キナーゼＳＭＧ１によるＵＰＦ１のリン酸化がＲＭＤに必須であることを解明した。興味深いことに、本願実施例において、ＳＭＧ１キナーゼ活性の阻害は、ＲＭＤを抑制し、かくして樹状細胞の成熟化を誘導し、Ｔ細胞刺激活性を強化した。また、ＳＭＧ１の阻害は、サイトカイン産生およびＣＤ４０およびＣＤ８０などの共刺激分子の発現を増強した。これらの結果は、ＳＭＧ１の阻害が免疫細胞を活性化することを示す。従って、ＳＭＧ１の活性または発現の阻害剤を、免疫賦活化剤として使用し得る。
【００１７】
「ＳＭＧ１阻害剤」は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−関連キナーゼ（ＰＩＫＫ）の１つである、ＳＭＧ１を阻害する物質を意味する。例えば、ヒトのＳＭＧ１の代表的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、各々ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５０９２およびＮＰ＿０５５９０７として登録されている（配列番号１および２）。ＳＭＧ１阻害剤は、ＳＭＧ１の活性を阻害するものであっても、ＳＭＧ１の発現を阻害するものであってもよい。ＳＭＧ１阻害剤は、例えば、ＳＭＧ１の活性または発現を阻害する化合物、ペプチドまたは核酸であり得る。
【００１８】
ＳＭＧ１阻害剤として、下記式（Ｉ）
【化１】
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［式中、
Ｒ１は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロ置換アルキルアミノ、ヒドロキシアルキルアミノ、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、および、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいアミノカルボニルアミノアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アルコキシ、ハロ置換アルコキシ、シアノ、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択される］
の化合物、または、それらのエステル、オキシド、プロドラッグ、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を使用し得る。
【００１９】
基の接頭語「置換」は、当該基の１個またはそれ以上の水素原子が、同一または異なる指定する置換基によって置換されていることを意味する。
【００２０】
「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。「（Ｃｘ〜Ｃｙ）アルキル」は、ｘ〜ｙ個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよびネオペンチルを意味するが、これらに限定されない。
【００２１】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている通りである）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｎ−ペントキシを含む。
【００２２】
「アリール」は１個の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４個の炭素原子の１価芳香族性炭素環式基を意味する。アリール基は典型的には、フェニルおよびナフチルを含む。
【００２３】
「ヘテロシクロアルキル」は、Ｏ、ＮもしくはＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、場合により炭素環式環と縮合した多環式基を含む、３員ないし１２員、好ましくは４員ないし１０員のシクロアルキル基を意味する。「ヘテロシクロアルキル」は、場合により、炭素環式環、例えばアリールと縮合した多環式基を含むシクロアルキル基であって、Ｏ、ＮまたはＳから選択される１〜４個のへテロ原子を有するシクロアルキル基を含む。例えば、ヘテロシクロアルキルには、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラン、ピロリジニル、ジオキソラニル、モルホリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、オキサビシクロ［２.２.２］オクタン、アザビシクロ［２.２.２］オクタン、オキサアザビシクロ［２.２.２］オクタン、オキサビシクロ［３.２.１］オクタン、アザビシクロ［３.２.１］オクタン、オキサアザビシクロ［３.２.１］オクタン、ジヒドロキノリニル、インドリニル、ジヒドロキノキサリニル、オキソ−チアゾリル、オキソ−ピラニル、アゼパニル、アザビシクロ［３.２.２］ノナニル、ベンゾオキサジニル、キノキサリニル、イソインドリニル、インドリニルまたはテトラヒドロピラニル、特に、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニル、３−オキサ−８−アザビシクロ［３.２.１］オクタン、３−アザ−８−オキサビシクロ［３.２.１］オクタンが含まれる。
【００２４】
「アミノ」は−ＮＨ２の基を意味する。
「カルボニル」は−Ｃ（Ｏ）−の基を意味する。
「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ２）−の基を意味する。
「シアノ」は−ＣＮの基を意味する。
「ハロ」または「ハロゲン」はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
「ヒドロキシ」は−ＯＨの基を意味する。
【００２５】
「アミノスルホニル」は、−ＳＯ２ＮＨ２の基を意味する。
「アルキルアミノスルホニル」は、１個のアルキル基（ここで、アルキルは本明細書に定義されている通りである）で置換されているアミノスルホニルを意味する。
「ジアルキルアミノスルホニル」は、２個の同一または異なるアルキル基（ここで、アルキルは本明細書に定義されている通りである）で置換されているアミノスルホニルを意味する。
【００２６】
特に定めのない限り、本明細書において明示的に定義されていない置換基の命名法は、官能基の末端部分を命名し、次いで結合点に向かって隣接する官能基を命名して行う。例えば、置換基「アルキルアミノカルボニルアミノ」は、アルキル−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を意味する。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物は、置換パターンによっては、像および鏡像をとる立体異性体（エナンチオマー）、または、像および鏡像をとらない立体異性体（ジアステレオマー）で存在し得る。式（Ｉ）の化合物は、ラセミ体であってもよく、既知方法で立体異性的に純粋な成分に分離したものであってもよい。ある種の化合物は、互変異性体であり得る。
【００２８】
「エステル」は、インビボで加水分解され得るエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが含まれる。
「オキシド」は、ヘテロアリール基の窒素環原子が酸化され、Ｎ−オキシドを形成しているものを意味する。
【００２９】
「プロドラッグ」は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー性応答等なくヒトまたは動物の組織と接触させて使用するのに適した、合理的な利益／危険比で釣り合った、そして意図した使用に有効な化合物のプロドラッグを意味する。プロドラッグは、インビボで速やかに、例えば血中で加水分解によって変換されて、上記式の親化合物をもたらす化合物である。一般的な説明は、T. Higuchi and V. Stella, Pro drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposium SeriesおよびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987 に記載されている（いずれも参照により本明細書に引用する）。
【００３０】
「薬学的に許容し得る塩」は、式（Ｉ）の化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸との塩、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
【００３１】
また、言及し得る薬学的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミンまたはメチルピペリジン）から誘導されるアンモニウム塩を含む。
【００３２】
「溶媒和物」は、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している式（Ｉ）の化合物を意味する。好適な溶媒和物は水和物である。
【００３３】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロシクロアルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノカルボニルアミノアリールからなる群から選択される。
【００３４】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ１は、
【化２】
2019073466.tif 000004
からなる群から選択される。
【００３５】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ１は、
【化３】
2019073466.tif 000005
である。
【００３６】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロ置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、シアノ、アミノスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルおよびジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルからなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＯＣＨ３、ＣＮ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２からなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ２は、アミノスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルおよび（Ｃ１〜Ｃ６）ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ２は、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２からなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ２は、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２である。
【００３７】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルおよびアミノスルホニルからなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３およびアミノスルホニルからなる群から選択される。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｈ、ハロゲンまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｈ、ＣｌまたはＣＨ３である。
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ３は、Ｃｌである。
【００３８】
ある実施態様では、式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ３は下表１に記載する基である。
【表１−１】
2019073466.tif 000006
【００３９】
【表１−２】
2019073466.tif 000007
【００４０】
【表１−３】
2019073466.tif 000008
【００４１】
ある実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、上記表１に記載の化合物１７〜２６のいずれかである。
【００４２】
ある実施態様において、式（Ｉ）の化合物は、下記式
【化４】
2019073466.tif 000009
で表される化合物（上記表の化合物２６）である。
【００４３】
式（Ｉ）の化合物、特に、上記表１に記載の化合物の特性および合成方法は、A. Gopalsamy et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (2012) 6636-6641（非特許文献４）に詳細に記載されており、非特許文献４において式（Ｉ）の化合物のＳＭＧ１阻害活性が立証されている。この文献の全体を出典明示により本明細書の一部とする。これらの化合物は、非特許文献４および当分野の技術常識に基づいて合成してもよく、購入してもよい。
【００４４】
ＳＭＧ１の活性または発現を阻害する核酸は、ＳＭＧ１遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいかなる段階で作用するものであってもよい。このような核酸として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、核酸アプタマー、デコイ核酸等が挙げられる。ＳＭＧ１の発現を阻害する核酸は、好ましくは、ｓｉＲＮＡである。
【００４５】
「ｓｉＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡを特異的に破壊する二本鎖ＲＮＡを意味する。ループ領域を介してかかる二本鎖を連結させた一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も、ｓｉＲＮＡに含まれる。ｓｉＲＮＡは、（１）ＳＭＧ１ ｍＲＮＡ（スプライシング前後のいずれも含む）のヌクレオチド配列に相補的なＲＮＡとその相補鎖からなる二本鎖領域を含むが、加えて、（２）各鎖の５'および／または３'末端に塩基対を形成しない付加的な塩基（オーバーハング）を含む付加的領域を有していてもよく、かつ／または、（３）二本鎖を連結するループ領域を有していてもよい。二本鎖領域は、原則として、ＳＭＧ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なＲＮＡ鎖を有するが、必ずしも完全に相補的なものでなくてもよい。
【００４６】
各鎖における二本鎖領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、１５、１６、１７、１８または１９塩基であり、その上限は、好ましくは１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基である。各鎖における二本鎖領域の塩基長は、好ましくは、１７〜２３塩基、より好ましくは、１９〜２１塩基である。
【００４７】
各鎖における付加的領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、１、２または３塩基であり、その上限は、好ましくは３、４または５塩基である。各鎖における付加的領域の塩基長は、好ましくは、１〜４塩基、より好ましくは、２〜３塩基である。
【００４８】
ループ領域の塩基長に特に制限はないが、その下限は、好ましくは、４、５、６、７、８、９または１０塩基であり、その上限は、好ましくは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基である。ループ領域の塩基長は、好ましくは、５〜２０塩基、より好ましくは、４〜１５塩基、さらに好ましくは、３〜９塩基である。
【００４９】
ｓｉＲＮＡは、天然型のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってよい。培養液や生体中における安定性向上等の観点から、種々の化学修飾を加えたものでもよい。かかる化学修飾としては、例えば、糖部分における修飾（２'−Ｏメチル化等）、リン酸部分における修飾（チオリン酸化等）、塩基部分における修飾を挙げることができる。また、細胞への導入効率を高めるために、核酸鎖の末端にシグナルペプチドやコレステロール等の部分を付加することも可能である。
【００５０】
ｓｉＲＮＡは、細胞内において、複数のタンパク質と共にＲＮＡ誘発性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を構成し、特定のｍＲＮＡに特異的なＲＮＡ干渉または遺伝子ノックダウンを触媒すると考えられている。ｓｉＲＮＡを利用したＲＮＡ干渉は広く使用されており、ｓｉＲＮＡを設計および／または導入するためのいずれの戦略および／または方法も使用可能である。上記の通り、ＳＭＧ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既に報告されているから、かかる配列情報に基づき、常法により、ｓｉＲＮＡを設計および／または導入することができる。例えば、以下の手順により、ｓｉＲＮＡを設計できる：（１）ＳＭＧ１のヌクレオチド配列を参照し、開始コドンから５０〜７５塩基以上下流の最初のＮＡ（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのいずれでもよく、好ましくはＡである）を見つける、（２）ＮＡおよびそれに後続する１７〜２３塩基（ＮＡと合わせて１９〜２５塩基）、好ましくは、１９〜２１塩基（ＮＡと合わせて２１〜２３塩基）についてＧＣ含量を計算し、５０％前後であることを確認する、および（３）ＮＣＢＩ等のデータベースを利用して、ＮＡおよびそれに後続する配列がＳＭＧ１遺伝子に特異的であることを確認する。このようにして決定した配列を有するｓｉＲＮＡは、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機により合成することができる。例えば、ＳＭＧ１に対するｓｉＲＮＡとして、特許文献２または非特許文献５に記載のｓｉＲＮＡを使用し得る。
【００５１】
ある実施態様では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域において、センス鎖に5'-GUGUAUGUGCGCCAAAGUA-3'（配列番号３）のヌクレオチド配列を含み、かつ／または、アンチセンス鎖に5'-UACUUUGGCGCACAUACAC-3'（配列番号４）のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、5'-GUGUAUGUGCGCCAAAGUAdTdT-3'（配列番号５）のヌクレオチド配列を含み、かつ／または、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、5'-UACUUUGGCGCACAUACACdTdT-3'（配列番号６）のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５のヌクレオチド配列からなり、かつ／または、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６のヌクレオチド配列からなる。
【００５２】
「アンチセンス核酸」は、ＳＭＧ１ ｍＲＮＡおよび／または遺伝子に特異的にハイブリダイズすることにより、その発現を阻害する核酸を意味する。アンチセンス核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラの何れであってもよいが、好ましくは、ＤＮＡである。
【００５３】
「リボザイム」は、ＳＭＧ１ ｍＲＮＡおよび／または遺伝子を切断する酵素活性を有する核酸分子を意味する。リボザイムは、通常、ＲＮＡ分子を意味するが、同様の機能を有するＤＮＡ分子も含むものであってもよい。
【００５４】
「核酸アプタマー」は、特定の標的分子に結合する核酸分子であって、かつ、ＳＭＧ１の活性または発現を阻害するものを意味する。
【００５５】
「デコイ核酸」は、ＳＭＧ１における転写因子結合領域を模倣する核酸分子であり、ＳＭＧ１遺伝子と転写因子との結合を競合的に阻害することによって、ＳＭＧ１の発現を阻害するものを意味する。
【００５６】
ＳＭＧ１阻害剤として、上記の種々の核酸を含むベクターを使用することもできる。ベクターの例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクター等を挙げることができる。
【００５７】
本明細書に開示される免疫賦活化剤は、典型的には、ワクチンの免疫補助剤として用いられる。即ち、免疫賦活化剤と抗原との組合せによって、ワクチンを構成することができる。従って、ある態様では、免疫賦活化剤および抗原を含むワクチン組成物が提供される。
【００５８】
「ワクチン組成物」とは、疾患の予防および／または処置を目的として、生体に接種または投与される医薬組成物である。ワクチンの種類としては弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、遺伝子組換えサブユニットワクチン、トキソイドワクチン、多糖体・タンパク質結合型ワクチン等がある。ワクチンの成分となる「抗原」とは、生体である宿主の免疫系を刺激し、抗原特異的免疫応答および／または体液性免疫を行わせる分子をいう。
【００５９】
様々な抗原を用いることができる。抗原の例として、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、或いはこれらの一部（成分）、腫瘍組織、腫瘍細胞、腫瘍細胞成分、腫瘍抗原タンパク、腫瘍抗原ペプチド、アレルゲン等が挙げられる。抗原は、天然材料からの単離ないし抽出、化学合成、遺伝子組換え技術による調製などによって用意することができる。
【００６０】
上記ウイルスの例としては、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、アブラウイルス、イサウイルス、イヌジステンパーウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、カリチウイルス、ノーウォークウイルス、コロナウイルス、サル免疫不全ウイルス、ソゴトウイルス、デングウイルス、ネコ白血病ウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、ヒト肺炎後ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、ブタ呼吸傷害・繁殖症候群ウイルス、フラビウイルス、ヘニパウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ヘンドラウイルス、ポリオウイルス、マラリア抗原、マレック病ウイルス、メタニューモウイルス、モルビリウイルス、ライノウイルス、ルブラウイルス、レスピロウイルス、レトロウイルス、ロタウイルス、ワクシニア、黄熱ウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、牛疫ウイルス、狂犬病ウイルス、水痘ウイルス、脳炎ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルスを挙げることができる。
【００６１】
上記細菌の例としては、アクチノバチラス・プルロニューモニエ、アロイオコックス・オティディティス、インフルエンザ菌、エルシニア菌、オウム病クラミジア、キャンピロバクター、クラミジア肺炎病原体、クロストリジア種、コレラ菌、サルモネラ・コレレシウス、ジアルジア、ジフテリア菌、シュードモナス種、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコックス・アガラクチエ、トラコーマクラミジア、トリ結核菌群、ネズミチフス菌、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・マルトシダ、ヒト結核菌、ブタ連鎖球菌、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘリコバクター・ピロリ、マイコプラスマ・ガリセプチクム、モラクセラ・カタラリス、レプトスピラ・インテロガンス、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、髄膜炎菌、赤痢菌、腺疫菌、大腸菌、炭疽菌、腸チフス菌、破傷風菌、肺炎連鎖球菌、百日咳菌、表皮ブドウ球菌、糞便連鎖球菌、緑色連鎖球菌、淋菌を挙げることができる。
【００６２】
上記寄生虫の例としては、赤痢アメーバ、プラスモジウム属、回虫属、鞭虫属、ジアルジア属、住吸血虫属、クリプトスポリジウム属、トリコモナス属を挙げることができる。
【００６３】
ワクチンの目的、即ち、予防または処置の対象となる疾患も特に限定されない。疾患の例として、天然痘、狂犬病、腸チフス、コレラ、ペスト、ジフテリア、破傷風、百日咳、結核、黄熱、インフルエンザ、ポリオ、肺炎球菌感染、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、水痘、帯状疱疹、ロタウイルス感染症、日本脳炎、ダニ媒介脳炎、Ａ型肝炎、髄膜炎菌性疾患、インフルエンザ菌ｂ型感染症、Ｂ型肝炎、炭疽、ヒトパピローマウイルス感染症が挙げられる。
【００６４】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物は、当業者に公知の医薬品添加物により製剤化されていてもよい。このような医薬品添加物としては、限定されないが、賦形剤（例えば、マンニトール、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、リン酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなど）、結合剤（例えば、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ポビドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）など）、崩壊剤（例えば、架橋カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、架橋ポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウムなど）、コーティング剤（例えば、白糖、タルクなどの糖衣用コーティング剤、カルボキシメチルエチルセルロースなどの腸溶性コーティング剤、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートなどの胃溶性コーティング剤など）、カプセル基剤（例えば、ゼラチンなど）、可塑剤（例えば、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリドなど）、着色剤（例えば、食用タール色素、レーキ色素、三酸化二鉄など）、溶剤（例えば、注射用水、滅菌精製水などの水性溶剤、植物油（オリーブ油、ダイズ油、ゴマ油等を含む）などの非水性溶剤など）、安定化剤（例えば、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡなどのキレート剤、Ｌ−アスコルビン酸などの還元物質など）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなど）、緩衝剤（例えば、クエン酸、酢酸、リン酸などのナトリウム塩など）、無痛化剤（例えば、ベンジルアルコール、プロカイン塩酸塩、ブドウ糖など）、基剤（例えば、カカオ脂、ゼラチンなどの坐剤用基剤および流動パラフィン、カルナウバロウなどの軟膏用基剤）、乳化剤（例えば、アラビアゴム、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、懸濁化剤（例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント、モノステアリン酸アルミニウムなど）、矯味剤、甘味剤、吸着剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、増粘剤、等張化剤、分散剤、防腐剤、湿潤剤、着香剤、抗酸化剤等が挙げられる。
【００６５】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物は、固形製剤、半固形製剤、液状製剤、注射剤、坐剤、その他当業者に公知の製剤形態のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、坐剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤、ローション剤、経皮吸収型製剤、貼付剤、パップ剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００６６】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物は、当業者に公知の方法に従ってＳＭＧ１阻害剤を調製し、必要に応じて抗原および／または医薬的に許容される賦形剤等と混合して製剤化することによって製造することができる。
【００６７】
例えば、剤形を注射剤や液状製剤とする場合には、例えばＳＭＧ１阻害剤を適切な溶剤に分散させ、必要により抗原の添加および／または濾過もしくは滅菌処理を行い、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
【００６８】
抗原を含まない免疫賦活化剤は、抗原と共に投与し得る。抗原と同時に投与してもよく、別の時点で投与してもよい。同時に投与されることが好ましい。例えば、免疫賦活化剤は、抗原またはそれを含む組成物と混合して、生体に投与される。ここで、「抗原と共に投与する」とは、上記のとおり、必ずしも同一の時点で投与されなければならないことを意味するものではなく、１つの投与計画の中で抗原と免疫賦活化剤との両方をそれぞれ別の時点で投与することを包含する。
【００６９】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物の投与経路は、特に限定されないが、例えば経粘膜投与（例えば経口投与、経鼻投与、鼻内投与、口腔投与、注腸投与等）、非経口的投与（例えば腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射等）、経皮的投与等が挙げられる。皮下注射または筋肉内注射が好ましい。
【００７０】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物の投与量および投与回数は、有効量のＳＭＧ１阻害剤が対象に投与されるように、抗原の種類、投与対象の動物種、投与対象の健康状態、年齢、体重、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、０．０１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは１．０μｇ〜１０ｍｇのＳＭＧ１阻害剤を含む免疫賦活化剤またはワクチン組成物を、適当な回数、例えば１〜２０回、１〜１０回、１〜５回または１〜３回にわたり、適当な頻度で、例えば、１日〜数日、１週〜数週または１月〜数月に１回の頻度で、対象に投与し得る。
【００７１】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物は、生体、より具体的にはヒトやヒト以外の動物（ヒト以外のほ乳類、鳥類、は虫類など）を投与対象とすることができる。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどを挙げることができる。
【００７２】
免疫賦活化剤またはワクチン組成物は、１種以上の他の免疫賦活化剤と併用してもよい。公知の免疫賦活化剤を適宜選択して併用し得る。具体的には、例えば、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩またはその組み合わせ）、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ＴＬＲリガンド（例えば、ＣｐＧ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４など）、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリル脂質Ａ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、ホルミルメチオニルペプチドなどが挙げられる。ある実施態様では、本願の免疫賦活化剤をＴＬＲリガンドと併用する。ある実施態様では、本願の免疫賦活化剤をＴＬＲ２リガンドと併用する。ある実施態様では、本願の免疫賦活化剤をＰａｍ３ＣＳＫ４と併用する。
【００７３】
免疫賦活化剤を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが免疫賦活化のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなるアジュバントを併用することも可能である。
【００７４】
別の態様では、本願は、ＳＭＧ１阻害剤を対象に投与することを含む、対象における免疫賦活化方法を提供する。
また別の態様では、本願は、免疫賦活化のためのＳＭＧ１阻害剤の使用を提供する。
また別の態様では、本願は、免疫賦活化剤またはワクチン組成物を製造するための、ＳＭＧ１阻害剤の使用を提供する。
【００７５】
また別の態様では、本願は、免疫賦活化剤のスクリーニング方法を提供する。
当該方法に関して、「被験物質」には、タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物等を含む、あらゆる物質が包含される。被験物質は、典型的には、精製、単離されているものを使用できるが、未精製、未単離の粗精製品や、被験物質を生成する生細胞そのものを試験系に投入することも可能である。被験物質は、コンビナトリアルケミストリー技術等により人工的に製造した化合物ライブラリーとして提供されてもよく、固相合成やファージディスプレイ法等により製造したランダムペプチドライブラリーとして提供されてもよく、また、天然成分の精製、未精製品として提供されてもよい。
【００７６】
被験物質のＳＭＧ１阻害能を測定する工程（工程（１））には、当該目的を達成する限り、あらゆる方法を使用できる。例えば、被験物質のＳＭＧ１活性阻害能を測定し得る。かかる測定工程は、被験物質を、ＳＭＧ１タンパク質、基質（ＵＰＦ１など）、リン酸供給源等を含むインビトロ試験系に投入し、これを投入しない対照系と比べて、ＳＭＧ１による基質リン酸化が阻害されたか否かを確認することによって行われ得る。
【００７７】
ＳＭＧ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はすでに公開されているため、かかる配列情報を基に、常法に従い、ＳＭＧ１タンパク質を調製することが可能である。例えば、ＳＭＧ１遺伝子を包含するベクターを好適な宿主細胞に形質転換し、当該宿主細胞を好適な培養条件で培養することにより細胞溶解物または細胞分泌物としてＳＭＧ１を得ることができる。また、ＳＭＧ１タンパク質またはＳＭＧ１遺伝子を含む核酸は、購入してもよい。
【００７８】
「基質」としては、ＵＰＦ１またはその類似体を使用可能であり、「リン酸供給源」としては、あらゆるリン酸供給源を使用可能である。リン酸供給源の例として、ＡＴＰやリン酸（Ｈ３ＰＯ４）を挙げることができる。基質やリン酸供給源に検出可能な標識を付加することにより、リン酸化の程度を検出してもよい。標識としては、当該目的を達成するためのあらゆる標識を利用可能であるが、例えば、放射性標識や蛍光標識を使用し得る。かかる標識化リン酸供給源としては、例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰやＨ３［３２Ｐ］Ｏ４が挙げられる。
【００７９】
あるいは、工程（１）において、被験物質のＳＭＧ１生成阻害能を測定してもよい。例えば、工程（１）は、（ａ）被験物質を、ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞またはインビトロ発現系と接触させる工程、および（ｂ）被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるＳＭＧ１発現量を測定する工程、を含み得る。
【００８０】
工程（ａ）において、ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞とは、特定の培養条件下においてＳＭＧ１の発現を測定可能な細胞である。ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞としては、ＳＭＧ１を発現する天然由来細胞、ＳＭＧ１を発現するように遺伝的に改変された細胞、または、ＳＭＧ１の転写調節領域に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子としては、検出可能な標識を直接的または間接的に生成するものであればいずれも使用可能であり、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、その他のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００８１】
工程（ａ）において、ＳＭＧ１発現を測定可能なインビトロ発現系とは、細胞を使用しない方法において、ＳＭＧ１発現を測定可能とするあらゆる発現系を意味するものである。このようなインビトロ発現系としては、その目的を達成する限りあらゆる系を使用可能であるが、例えば、ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞からの抽出液や分泌液をそのまま使用したものや、また、ＳＭＧ１とその転写制御因子の結合を阻害するか否かを測定できる系が挙げられる。
【００８２】
工程（ｂ）において、被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるＳＭＧ１発現量を測定する工程には、その目的を達成する限り、あらゆる方法を使用可能である。例えば、ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞として、ＳＭＧ１を発現する天然由来細胞またはＳＭＧ１を発現するように遺伝的に改変された細胞を使用した場合、ＳＭＧ１発現量は、その転写産物であるｍＲＮＡ（スプライシング前後のいずれも含む）を指標にして測定してもよいし、翻訳産物であるタンパク質またはその断片を指標にして測定してもよい。他方、ＳＭＧ１発現を測定可能な細胞としてＳＭＧ１の転写調節領域に機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する細胞を使用した場合、ＳＭＧ１発現量は、レポーター遺伝子による発現産物を直接的または間接的に測定することにより決定し得る。
【００８３】
工程（ｂ）において、被験物質と接触した細胞またはインビトロ発現系におけるＳＭＧ１発現量を測定する工程は、既知のあらゆる方法を利用可能である。小工程（ｂ）において、ＳＭＧ１のｍＲＮＡやタンパク質またはその断片を指標とする場合、あらゆる核酸検出方法および／またはタンパク質検出方法を利用可能である。このような核酸検出方法および／またはタンパク質検出方法としては、ノザンブロット解析やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ウェスタンブロット解析、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、電気化学発光イムノアッセイ、サンドイッチ法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］ＳＭＧ１阻害剤を含む免疫賦活化剤。
［２］ＳＭＧ１阻害剤が式（Ｉ）
【化５】
2019073466.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ハロ置換アルキルアミノ、ヒドロキシアルキルアミノ、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、および、ハロまたはアルキルで置換されていてもよいアミノカルボニルアミノアリールからなる群から選択され、
Ｒ２は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アルコキシ、ハロ置換アルコキシ、シアノ、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、アルキル、ハロ置換アルキル、アミノスルホニル、ハロ置換アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ハロ置換アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびハロ置換ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択される］
の化合物、または、それらのエステル、オキシド、薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である、第１項に記載の免疫賦活化剤。
【００８５】
［３］Ｒ１が、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノ、ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロシクロアルキルおよび（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノカルボニルアミノアリールからなる群から選択される、第２に記載の免疫賦活化剤。
［４］Ｒ１が、
【化６】
2019073466.tif 000011
からなる群から選択される、第２項または第３項に記載の免疫賦活化剤。
［５］Ｒ１が、
【化７】
2019073466.tif 000012
である、第２項〜第４項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【００８６】
［６］Ｒ２が、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロ置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、シアノ、アミノスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルおよびジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルからなる群から選択される、第２項〜第５項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［７］Ｒ２が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＯＣＨ３、ＣＮ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２からなる群から選択される、第２項〜第６項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［８］Ｒ２が、アミノスルホニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアミノスルホニルおよび（Ｃ１〜Ｃ６）ジアルキルアミノスルホニルからなる群から選択される、第２項〜第６項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［９］Ｒ２が、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ（ＣＨ３）、ＳＯ２Ｎ（ＣＨ３）２およびＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２からなる群から選択される、第２項〜第８項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［１０］Ｒ２がＳＯ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２である、第２項〜第９項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【００８７】
［１１］Ｒ３が、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルおよびアミノスルホニルからなる群から選択される、第２項〜第１０項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［１２］Ｒ３が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３およびアミノスルホニルからなる群から選択される、第２項〜第１１項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［１３］Ｒ３が、Ｈ、ハロゲンまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルからなる群から選択される、第２項〜第１１項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［１４］Ｒ３が、Ｈ、ＣｌまたはＣＨ３からなる群から選択される、第２項〜第１３項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
［１５］Ｒ３がＣｌである、第２項〜第１４項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【００８８】
［１６］Ｒ１〜Ｒ３が表１に記載の基である、第２項に記載の免疫賦活化剤。
［１７］式（Ｉ）の化合物が、表１に記載の化合物１７〜２６のいずれかである、第１６項に記載の免疫賦活化剤。
［１８］式（Ｉ）の化合物が、式
【化８】
2019073466.tif 000013
で表される化合物である、第２項〜第１７項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【００８９】
［１９］ＳＭＧ１阻害剤がＳＭＧ１の発現を阻害する核酸である、第１項に記載の免疫賦活化剤。
［２０］ＳＭＧ１阻害剤がｓｉＲＮＡである、第１９項に記載の免疫賦活化剤。
［２１］ｓｉＲＮＡが配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を含む、第２０項に記載の免疫賦活化剤。
［２２］ｓｉＲＮＡが配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列を含む、第２０項または第２１項に記載の免疫賦活化剤。
［２３］ｓｉＲＮＡが配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列からなる、第２０項〜第２２項のいずれかに記載の免疫賦活化剤。
【００９０】
［２４］第１項〜第２３項のいずれかに記載の免疫賦活化剤および抗原を含むワクチン組成物。
［２５］１種またはそれ以上の他の免疫賦活化剤をさらに含む、第２４項に記載のワクチン組成物。
［２６］他の免疫賦活化剤がＴＬＲリガンドである、第２５項に記載のワクチン組成物。
［２７］他の免疫賦活化剤がＴＬＲ２リガンドである、第２５項または第２６項に記載のワクチン組成物。
［２８］他の免疫賦活化剤がＰａｍ３ＣＳＫ４である、第２５項〜第２７項のいずれかに記載のワクチン組成物。
【００９１】
［２９］免疫賦活化剤をスクリーニングする方法であって、
（１）被験物質のＳＭＧ１阻害能を測定する工程、および、
（２）工程（１）においてＳＭＧ１阻害能を有することが示された被験物質が免疫賦活化剤であると判定する工程、
を含む方法。
［３０］工程（１）において、被験物質のＳＭＧ１活性阻害能を測定する、第２９項に記載の方法。
［３１］工程（１）において、被験物質のＳＭＧ１生成阻害能を測定する、第２９項に記載の方法。
【００９２】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００９３】
ＵＰＦ１のＴ２８でのリン酸化がＲＭＤに必須である
ＵＰＦ１のリン酸化がＲＭＤに重要であるか否かを調べた。ＨｅＬａ細胞において、ＵＰＦ１をノックダウンし、外来性ｓｉＲＮＡに抵抗性であるＵＰＦ１ＲのＷＴ、Ｔ２８Ａおよび４ＳＡ（ＳＳＳＳ１０７３／１０７８／１０９６／１１１６ＡＡＡＡ）変異体を用いて細胞を再構成した（図１）。ＷＴおよび４ＳＡは、Ｒｅｇ１ ＲＮａｓｅ活性依存的なＩｌ６ ３'ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターの抑制を回復させたが、Ｔ２８Ａはしなかった（図２）。ＲＮａｓｅ活性を欠くＲｅｇ−１−Ｄ１４１Ｎ（ＤＮ）変異体はこのレポーターを抑制しなかったことが以前に報告されている（Matsushita, K., et al., Nature 458, 1185-1190 (2009)）。同様に、ＩＬ−１βに媒介されるＩｌ６およびＰＴＧＳ２の発現の抑制は、ＵＰＦ１のＴ２８リン酸化部位を必要とするが、Ｓ１０７３／１０７８／１０９６／１１１６は必要としなかった（図３）。対照的に、ＵＰＦ１変異体Ｔ２８Ａおよび４ＳＡの両方が、ＳＭＧ５、ＧＡＳ５などのＮＭＤ標的遺伝子の発現を抑制しなかった（図３）。これらの結果は、ＵＰＦ１のＴ２８のリン酸化がＲＭＤに必須であり、Ｃ末端のリン酸化部位のリン酸化は必須ではないことを示す。
【００９４】
ＳＭＧ１はＵＰＦ１の直接的リン酸化によりＲＭＤを制御する
ＲＭＤにおいてＵＰＦ１をリン酸化するキナーゼを探索した。ＳＭＧ１は、ＮＭＤにおいて、ＵＰＦ１のリン酸化により決定的な役割を果たすので（非特許文献２および３）、ＳＭＧ１がＲＭＤを制御するか否かを調べた。ＳＭＧ１のノックダウンは、ＨｅＬａ細胞において、ＩＬ−１βによるＰ−Ｔ２８−ＵＰＦ１の誘導を阻害し、Ｒｅｇ１とＵＰＦ１の会合を阻害した（図４および５）。このことは、ＳＭＧ１が、ＴＬＲ／ＩＬ−Ｒシグナル伝達に応答するＵＰＦ１のＴ２８リン酸化の誘導を担うことを示す。ＨＥＫ２９３ Ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞においてＳＭＧ１をノックダウンすると、Ｒｅｇ１の過剰発現はＩｌ６ ｍＲＮＡを不安定化しなかった（図６および７）。さらに、ＨｅＬａ細胞において、Ｒｅｇ１の過剰発現は、ＳＭＧ１のノックダウン下でＩｌ６およびＰｔｇｓ２の３'ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターコンストラクトを抑制しなかった（図８）。また、ＨｅＬａ細胞におけるＳＭＧ１またはＲｅｇ１のノックダウンは、ＩＬ−１β刺激に応答する内在性ＩＬ６およびＰＴＧＳ２の発現を高めたが、ＮＦＫＢＩＡの発現は高めなかった（図９）。ＳＭＧ１のノックダウンは、ＳＭＧ５およびＧＡＳ５などのＮＭＤ標的遺伝子の発現の増加をもたらしたが、Ｒｅｇ１のノックダウンはこれをもたらさなかった（図１０）。これらのデータは、ＳＭＧ１が、ＵＰＦ１のリン酸化を介して、Ｒｅｇ１とＵＰＦ１の会合およびＲｅｇ１に媒介されるｍＲＮＡ分解を制御することを示唆する。
【００９５】
ＳＭＧ１活性を操作することによる、樹状細胞成熟および炎症促進性遺伝子発現の制御
骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を、図１１に示すＳＭＧ１阻害剤（非特許文献４に記載の「Compound 11J」）で処理した。ＵＰＦ１のＴ２８におけるリン酸化は、未刺激の細胞またはＰａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２リガンド）で処理された細胞において、大幅に抑制された（図１２）。野生型ＢＭＤＣをＳＭＧ１阻害剤で処理すると、Ｐａｍ３ＣＳＫ４刺激に応答するＩｌ６およびＰｔｇｓ２の発現は増加したが、ＴｎｆおよびＮｆｋｂｉａの発現は増加しなかった（図１３）。炎症性サイトカインに加えて、共刺激分子であるＣｄ４０およびＣｄ８０の発現レベルも、ＳＭＧ１阻害剤処理により増強された（図１３）。ＢＭＤＣにおけるＲｅｇ１の欠損は、炎症性遺伝子の発現を高め（図１４）、Ｒｅｇ１−／−ＢＭＤＣにおいて、ＳＭＧ１阻害剤はそれらの発現に影響しなかった（図１５）。このことは、ＳＭＧ１がＲｅｇ１依存的にサイトカイン発現を制御することを示唆する。ＢＭＤＣにおいて、ＴＬＲリガンド、即ち、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７）およびＣｐＧ−ＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８、ＴＬＲ９）に応答するＩｌ６の産生は、ＳＭＧ１阻害剤処理により増加したが、Ｔｎｆの産生は増加しなかった（図１６）。このことは、自然免疫細胞において、ＳＭＧ１がサイトカイン発現を転写後レベルでＲｅｇ１経路を介して制御し、ＳＭＧ１−ＵＰＦ１−Ｒｅｇ１経路がサイトカイン発現に決定的であることを示唆する。
【００９６】
次いで、ＢＭＤＣの細胞表面のＣＤ４０およびＣＤ８０発現をＦＡＣＳ分析により調べた。ＳＭＧ１阻害剤処理は、ＴＬＲ２リガンド刺激があってもなくても、ＣＤ４０およびＣＤ８０の発現レベルを高めた（図１７）。このことは、Ｃｄ４０およびＣｄ８０のｍＲＮＡがＲｅｇ１の分解標的であることを示唆する。実際に、Ｃｄ４０およびＣｄ８０の発現レベルは、Ｒｅｇ１−／−ＢＭＤＣにおいて高く（図１８）、Ｃｄ４０およびＣｄ８０のｍＲＮＡ発現もＲｅｇ１−／−ＢＭＤＣにおいて増加していた（図１４）。さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲｅｇ１の過剰発現は、Ｃｄ４０およびＣｄ８０の３'ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ＲＮａｓｅ活性依存的に抑制した（図１９）。
【００９７】
次いで、ＤＣのＴ細胞刺激能に対するＳＭＧ１阻害剤の効果を調べた。これを調べるために、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＳＭＧ１阻害剤および／またはＰａｍ３ＣＳＫ４により処理されたＢＭＤＣの、同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを実施した。興味深いことに、ＳＭＧ１阻害剤処理は、単独でＤＣに誘導されるＴ細胞刺激活性を高め、Ｐａｍ３ＣＳＫ４による共刺激は、さらに活性を高めた（図２０）。これらのデータは、阻害剤を使用してＳＭＧ１キナーゼ活性を制御することにより、Ｒｅｇ１に媒介される炎症性ｍＲＮＡ分解を介して、ＤＣの成熟を操作し得ることを示唆する。
【００９８】
材料と方法
マウス
Ｒｅｇ１欠損マウスは以前に報告されたものを使用した（Matsushita et al., 2009)。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃマウスは、CREA Japanから購入した。すべての動物実験は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所の動物実験委員会の承認を得て行った。
【００９９】
細胞培養
ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから購入し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳおよび５０μＭ β−メルカプトエタノール（Invitrogen）を添加したＤＭＥＭ（NacalaiTesque）中で維持した。Ｔｅｔ−ｏｆｆ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Clontech から購入し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ（Clontech）、５０μＭ β−メルカプトエタノールおよび１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（NacalaiTesque）を添加したα−ＭＥＭ（NacalaiTesque）中で維持した。
【０１００】
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の調製には、骨髄細胞を野生型またはＲｅｇ１−／−マウスから単離し、樹状細胞増殖培地（１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ、５０μＭ β−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび１０ｎｇ／ｍｌマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（PeproTech）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中で培養した。２日毎に、接着していない細胞を廃棄し、残っている細胞に新鮮な樹状細胞増殖培地を与えた。６日目に、ゆるく接着している細胞を回収し、アッセイに使用した。
【０１０１】
ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの導入
Lipofectamine 2000 または Lipofectamine LTX（Thermo Fisher Scientific）を製造業者の推奨通りに使用して、細胞にプラスミドＤＮＡを導入した。
ｓｉＲＮＡに媒介されるノックダウンのために、Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) または MISSION siRNA Transfection Reagent (Sigma) を使用して細胞にｓｉＲＮＡを導入した。Thermo Fisher Scientific によって合成されたｓｉＲＮＡを使用した。以下のｓｉＲＮＡ標的を使用した: hUPF1, 5'-GAUGCAGUUCCGCUCCAUUdTdT-3'（配列番号４）; hSMG1, 5'-GUGUAUGUGCGCCAAAGUAdTdT-3'（配列番号５）; hReg1, 5'-GUGUCCCUAUGGAAGGAAAdTdT-3'（配列番号６）。コントロールとして Silencer Select Negative Control #1 siRNA（Thermo Fisher Scientific）を使用した。
【０１０２】
プラスミドの構築および試薬
マウスＲｅｇ１（Ｚｃ３ｈ１２ａ）、Ｒｅｇ１変異体およびマウスＩｌ６のｃＤＮＡは、以前に報告されたものを使用した（Matsushita et al., 2009）。Ｒｅｇ１のｃＤＮＡを、哺乳動物発現用のベクターである pFlag-CMV2 (SIGMA) または pcDNA3.1(+) (Invitrogen) に連結した。Ｉｌ６ ＣＤＳ−３'ＵＴＲのｃＤＮＡを、pTREtight ベクター（Clontech）に挿入した。一群の遺伝子の３'ＵＴＲのｃＤＮＡを、ｐＧＬ３−プロモーター（Promega）に挿入した。
【０１０３】
野生型ヒトＵＰＦ１、野生型ヒトＳＭＧ１およびその変異体［ｐＳＲ−ＨＡ−ｈＵＰＦ１−ＷＴ（アミノ酸６−１１１８）、ｐＳＲ−ＨＡ−ｈＵＰＦ１−Ｔ２８Ａ、ｐＳＲ−ＨＡ−ｈＵＰＦ１−４ＳＡ（ＳＳＳＳ１０７３／１０７８／１０９６／１１１６ＡＡＡＡ）、ｐＳＲ−Ｆｌａｇ−ｈＳＭＧ１−ＷＴ］の哺乳動物発現ベクターは、以前に報告されたものを使用した（Morita, T., et al., J Biol Chem 282, 7799-7808 (2007); Nicholson, P., et al., Nucleic Acids Res 42, 9217-9235 (2014); Okada-Katsuhata, Y., et al., Nucleic Acids Res 40, 1251-1266 (2012)）。
【０１０４】
Ｒｅｇ１およびＵＰＦ１遺伝子への変異導入には、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）を使用した。
サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）由来ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｒ８４８およびＣｐＧオリゴヌクレオチドＯＤＮ１６６８は、Invivogen から購入した；組換えサイトカインは、R&D Systemsから購入した；ＳＭＧ１阻害剤（非特許文献４に記載の「Compound 11J」）は、TLC Pharmaceutical Standards から購入した。
【０１０５】
イムノブロット分析
細胞全体の抽出物を、リシスバッファー（１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Nonidet P-40、０.１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよびComplete Mini Protease Inhibitor Cocktail without EDTA (Roche））中で調製し、ＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６.８、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）β−メルカプトエタノール、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールおよびブロモフェノールブルー）に懸濁した。タンパク質を５分間９５℃でボイルし、ポリアクリルアミドゲル（ｅ−ＰＡＧＥＬ；ＡＴＴＯ）で分離し、０.２μｍポアサイズの Immun-Blot PVDF メンブレン（Bio-Rad）に移した。メンブレンを一次抗体およびＨＲＰ結合二次抗体（NA9310 および NA9340; GE Healthcare）とインキュベートした。以下の一次抗体をイムノブロット分析に使用した：Ｆｌａｇ（F3165 および F7425; Sigma）、ＳＭＧ１（A300-393A; Bethyl Laboratories）、ＩκＢα（sc-371; Santa Cruz）、およびβ-アクチン（sc-1615; Santa Cruz）の抗体。ウサギＩκＢ−ｚ（ＮＦＫＢＩＺ）ポリクローナル抗体は、牟田達史氏（東北大学）から提供された。ウサギＲｅｇ１抗体は、以前に記載されたものを使用した（Iwasaki et al., 2011）。ウサギ抗ＵＰＦ１親和抗体、ウサギ抗Ｐ−Ｔ２８−ＵＰＦ１抗体およびマウス抗Ｐ−Ｓ１０７８／Ｓ１０９６−ＵＰＦ１モノクローナル抗体（cone 8E6）は、以前に記載されたものを使用した（Ohnishi, T., et al., Mol Cell 12, 1187-1200 (2003); Okada-Katsuhata et al., 2012; Yamashita et al., 2001）。メンブレンを Luminata Forte Western HRP 基質（Millipore）で処理し、発光イメージアナライザー（Amersham Imager 600; GE Healthcare）で発光を検出した。
【０１０６】
ノザンブロット
ISOGEN II（Wako）または Trizol（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡを単離し、電気泳動し、Hybond-N+（GE healthcare）にブロットし、以前に記載された通り（Matsushita et al., 2009）、Ｉｌ６およびβ−アクチン用のプローブとハイブリダイズした。メンブレンをイメージングプレートに露出し、BAS-5000 イメージングアナライザー（Fuji Film）により分析した。
【０１０７】
定量的ＰＣＲ分析
ISOGEN II（Wako）または Trizol（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡを単離し、ReverTra Ace（Toyobo）を製造業者の指示に従って使用して、逆転写した。定量的ＰＣＲのために、ユニバーサル SYBR Select Master Mix（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ｃＤＮＡフラグメントを増幅させた。蛍光を StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems）で検出した。各遺伝子のｍＲＮＡ量を、β−アクチンのｍＲＮＡ量に対して標準化した。
【０１０８】
タンパク質の免疫沈降
ｓｉＲＮＡおよび発現プラスミドを導入したＨｅＬａ細胞を、リシスバッファー（０.１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Nonidet P-40、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０および Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail without EDTA （Roche））で溶解した。プロテインＧ磁気ビーズ（Invitrogen）に結合した、各実験に示す抗体または抗Ｆｌａｇ抗体（F3165; Sigma）を、溶解物と、４℃で３時間インキュベートした。ビーズをリシスバッファーで３回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６.８、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＳＤＳ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）β−メルカプトエタノール、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールおよびブロモフェノールブルー）に懸濁した。サンプルを５分間９５℃でボイルし、各実験に示す抗体を用いて、ウェスタンブロットにより分析した。
【０１０９】
ルシフェラーゼアッセイ
ＨｅＬａ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各実験に示す３'ＵＴＲを含むルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ３を、リグナーゼ−１発現プラスミドまたは空（対照）のプラスミドと共に導入した。２４時間培養した後、細胞を溶解し、溶解物のルシフェラーゼ活性を Dual-Luciferase Reporter Assay system（Promega）により測定した。ウミシイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子を、内部対照として同時に導入した。
【０１１０】
培養上清のＥＬＩＳＡ
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来ＢＭＤＣを、０.３μＭ ＳＭＧ１阻害剤で処理して、または処理せずに、１０ｎｇ／ｍＬ Ｐａｍ３ＣＳＫ４（Invivogen）、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（Invivogen）、１００ｎＭ Ｒ８４８（Invivogen）または１００ｎＭ ＯＤＮ１６６８（Invivogen）で２４時間刺激し、培養上清のサイトカインレベルを、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡキット（affymetrix eBioscience）により、製造業者のプロトコールに従って測定した。
【０１１１】
フローサイトメトリー
ＢＭＤＣを、１ｎｇ／ｍＬ Ｐａｍ３ＣＳＫ４（Invivogen）および／または０.３μＭ ＳＭＧ１阻害剤と共に４８時間培養し、各実験に示す抗体で３０分間４℃で染色し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中の０.５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。以下の抗体をフローサイトメトリー分析に使用した：抗ＣＤ１１ｃ（117308; BioLegend）、抗ＣＤ４０（124612; BioLegend）および抗ＣＤ８０（104713; BioLegend）。FACSVerse および LSRFortessa X-20（BD Biosciences）によりデータを取得し、FlowJo を使用して分析した。
【０１１２】
混合リンパ球反応
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（CREA Japan）由来のＢＭＤＣを、１ｎｇ／ｍＬ Ｐａｍ３ＣＳＫ４（Invivogen）および／または０.３μＭ ＳＭＧ１阻害剤と共に４８時間培養し、洗浄し、３０Ｇｙの放射線量で照射し、９６ウェル丸底プレートに３倍連続希釈で播種した。これらの刺激性ＢＭＤＣを、５×１０４細胞／ウェルのＢＡＬＢ／ｃマウス（CREA Japan）由来脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞と、３日間、共培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズを有する autoMACS（Miltenyi Biotec）により単離した。最後の１６時間にわたって［３Ｈ］チミジンを添加し、［３Ｈ］チミジンの取り込みを、マイクロプレートシンチレーションカウンター TopCount NXT （Packard）で測定した。
【０１１３】
統計分析
データを平均±ＳＤで示す。特記しない限り、ｎ＝３である。統計的有意性をスチューデントのｔ検定で算出した。ｐ＜０.０５（＊）、ｐ＜０.０１（＊＊）またはｐ＜０.００１（＊＊＊）で有意とみなした。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本願は、免疫細胞におけるｍＲＮＡ分解を妨げるという新しい作用機序に基づく免疫賦活化剤を提供する。さらに、作用機序の異なる従来の免疫アジュバントと組み合わせることにより、より効果の高いワクチンアジュバントを提供し得ると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号５：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
配列番号６：ＤＮＡ／ＲＮＡ結合分子
【図１】
2019073466.tif 000021
【図２】
2019073466.tif 000022
【図３】
2019073466.tif 000023
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2019073466.tif 000039
【図２０】
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【配列表】
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