(57)【要約】【課題】様々な制限のない状態で、生体分子の検出が実施できるようにする。【解決手段】第１ステップＳ１０１で、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を所定の流路で輸送し、検出液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する。第２ステップＳ１０２で、輸送している検出液に検体溶液を混合する。検体溶液は、検出対象の生体分子の有無を測定する対象である。次に、第３ステップＳ１０３で、検出液に検体溶液が混合した混合液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する。第４ステップＳ１０４で、第１ステップＳ１０１の観測による第１観測結果と、第３ステップＳ１０３の観測による第２観測結果とを比較し、検体溶液における生体分子の有無を判断する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を所定の流路で輸送し、前記検出液の輸送に伴う前記粒子の移動状態を観測する第１ステップと、
前記第１ステップの後で、輸送している前記検出液に検体溶液を混合する第２ステップと、
前記第２ステップの後で、前記検出液に前記検体溶液が混合した混合液の輸送に伴う前記粒子の移動状態を観測する第３ステップと、
前記第１ステップの観測による第１観測結果と前記第３ステップの観測による第２観測結果とを比較して前記検体溶液における前記生体分子の有無を判断する第４ステップと
を備えることを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子検出方法において、
前記第４ステップでは、前記第２観測結果が前記第１観測結果と異なる場合に、前記検体溶液に前記生体分子が存在していると判断することを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の生体分子検出方法において、
前記粒子の移動状態の観測は、表面プラズモン共鳴法により行うことを特徴とする生体分子検出方法。
【請求項４】
検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を輸送する第１流路と、
測定対象の検体を含む検体溶液を輸送する第２流路と、
前記第１流路および前記第２流路が合流する合流部と、
前記合流部に連続する第３流路と、
前記第３流路を輸送される液体に含まれる粒子の前記液体の輸送に伴う移動状態を観測する観測部と、
前記第３流路を前記検体溶液のみが輸送される状態で、前記検体溶液に含まれる粒子の前記検体溶液の輸送に伴う移動状態を観測した第１観測結果と、前記検出液と前記検体溶液とが前記合流部で合流した混合液が前記第３流路を輸送される状態で、前記混合液に含まれる粒子の前記混合液の輸送に伴う移動状態を観測した第２観測結果とを比較して前記検体溶液における前記生体分子の有無を判断する判断部と
を備えることを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の生体分子検出装置において、
前記判断部は、前記第２観測結果が前記第１観測結果と異なる場合に、前記検体溶液に前記生体分子が存在していると判断することを特徴とする生体分子検出装置。
【請求項６】
請求項４または５記載の生体分子検出装置において、
前記観測部は、表面プラズモン共鳴法により前記粒子の移動状態の観測を行うことを特徴とする生体分子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする生体分子を検出する生体分子検出方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化や生活スタイルの多様化などの社会背景を受け、現在特定の医療機関でのみ行われている病態検査を、診療所や薬局、将来的には個人が気軽に行うことができる検査技術(システム)の研究開発が進められている。手軽に生体検査を行うためには、襲侵を伴うことなく得られる微量の検体（＞１０μＬ）より、小型の検出機器を用いてオペレータの手技に寄らずに測定する技術が要求される。
【０００３】
これら要求を解決するために、マイクロ流路技術を用いた検査システムの検討が数多く報告されている。例えば、検出対象とする分子を特異的に捕手することのできる生体分子（ＤＮＡ、抗体など）で内壁を修飾したマイクロピラーを用いた検査技術がある。この検査では、マイクロピラー内を検体が通過することで、検体に含まれる対象分子が内壁を修飾している生体分子の特定部位に吸着することで、対象分子を検出する。
【０００４】
更に、蛍光分子で修飾した増感剤もしくは呈色剤を反応させることで、得意部位に吸着した対象分子の量を測定（定量）する。実際の測定では、検体溶液に上述したマイクロピラーを浸漬し、対象分子の得意部位への吸着による発色度を、蛍光測定器による蛍光検出、もしくは呈色の状態をカラー撮像装置により撮影することで測定する。
【０００５】
自身の病態を把握するためには、罹患した、もしくはその予兆がある際に生体内で増加または減少する、各種疾患における対象分子の存在量を測定することが求められる。対象分子はタンパク質、ＤＮＡなどの核酸、糖類、脂質と様々種類があり、疾患によって検出対象は変わる。例えば、インフルエンザの場合は、インフルエンザウイルスの表面に顕在する糖たんぱく質を対象分子とする。また、がんリスクは、血中内を流れるマイクロＲＮＡを検出することで推定できることが、近年の研究で明らかとされつつある（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、上述した多種多様な対象分子を捕捉するための分子（検出分子）も多種多様となっている。多くの対象分子は、対象分子と特異的に結合する抗体やペプチドなどの酵素によって捕捉できる。このような抗体や酵素などの生体機能分子を、塗布などによる修飾で測定チップに固定している。しかしながら、抗体やペプチドなどは、タンパク質から成る機能性分子のため取り扱いには十分注意を払う必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. L. Hood et al., "Exosomes released by melanoma cells prepare sentinel lymph nodes for tumor metastasis", Center Research, 10.1158/0008-5472.CAN-10-4455, 2011.
【非特許文献２】D. J. Estes and M. Mayer, "Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, vol. 42, pp. 115-123, 2005.
【非特許文献３】M. Yamada et al., "Pinched Flow Fractionation: Continuous Size Separation of Particles Utilizing a Laminar Flow Profile in a Pinched Microchannel", Analytical Chemistry, vol. 76, no. 18, pp. 5465-5471, 2004.
【非特許文献４】I. Halaciuga et al., "Deposition of continuous nickel shells on polymer microspheres", Journal of Colloid and Interface Science, vol. 383, pp. 215-221, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、現在、生体分子を検出するための生体機能分子は、抗体や酵素であり、従来のマイクロ流路内に生体機能分子を配置する技術では、この保管が容易ではない。流路を用いる技術では、測定を実施するに当たり、流路内が常に一定の状態とされていることが重要であり、流路内が乾燥していることが重要となる。しかしながら、生体機能分子は、乾燥している状態では、暗室・低温条件下で保存することが必須となり、また、生体機能分子の活性の安定性が確保されている活性時間が短い。このように、従来の技術では、測定に用いる装置に様々な制限があり、生体分子の検出が容易に実施できないという問題があった。
【０００９】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、様々な制限のない状態で、生体分子の検出が実施できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る生体分子検出方法は、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を所定の流路で輸送し、検出液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する第１ステップと、第１ステップの後で、輸送している検出液に検体溶液を混合する第２ステップと、第２ステップの後で、検出液に検体溶液が混合した混合液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する第３ステップと、第１ステップの観測による第１観測結果と第３ステップの観測による第２観測結果とを比較して検体溶液における生体分子の有無を判断する第４ステップとを備える。
【００１１】
上記生体分子検出方法において、第４ステップでは、第２観測結果が第１観測結果と異なる場合に、検体溶液に生体分子が存在していると判断する。
【００１２】
上記生体分子検出方法において、粒子の移動状態の観測は、表面プラズモン共鳴法により行う。
【００１３】
本発明に係る生体分子検出装置は、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を輸送する第１流路と、測定対象の検体を含む検体溶液を輸送する第２流路と、第１流路および第２流路が合流する合流部と、合流部に連続する第３流路と、第３流路を輸送される液体に含まれる粒子の液体の輸送に伴う移動状態を観測する観測部と、第３流路を検体溶液のみが輸送される状態で、検体溶液に含まれる粒子の検体溶液の輸送に伴う移動状態を観測した第１観測結果と、検出液と検体溶液とが合流部で合流した混合液が第３流路を輸送される状態で、混合液に含まれる粒子の混合液の輸送に伴う移動状態を観測した第２観測結果とを比較して検体溶液における生体分子の有無を判断する判断部とを備える。
【００１４】
上記生体分子検出装置において、判断部は、第２観測結果が第１観測結果と異なる場合に、検体溶液に生体分子が存在していると判断する。
【００１５】
上記生体分子検出装置において、観測部は、表面プラズモン共鳴法により粒子の移動状態の観測を行う。
【発明の効果】
【００１６】
以上説明したように、本発明によれば、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液に検体溶液を混合し、この混合液における粒子の移動状態を観測するようにしたので、様々な制限のない状態で、生体分子の検出が実施できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の実施の形態における生体分子検出装置の構成を示す構成図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１における生体分子検出装置の構成を示す構成図である。
【図４】図４は、本発明の実施例１における生体分子検出装置の一部構成を示す構成図である。
【図５】図５は、表面プラズモン共鳴法によるＳＰＲ装置２１０を用いた検出領域１５１の構成を示す斜視図である。
【図６Ａ】図６Ａは、粒子が浮遊している場合の表面プラズモン共鳴法による観測結果について説明するための説明図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、粒子が沈降している場合の表面プラズモン共鳴法による観測結果について説明するための説明図である。
【図７】図７は、表面プラズモン共鳴法により、粒子の移動状態を実際に測定（観測）した結果を示す特性図である。
【図８】図８は、表面プラズモン共鳴法により、粒子の移動状態を実際に測定（観測）した結果を示す説明図である。
【図９】図９は、本発明の実施例２における生体分子検出装置の構成を示す構成図である。
【図１０】図１０は、実施例２における表面プラズモン共鳴法による実際の観測結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態における生体分子検出方法について図１を参照して説明する。
【００１９】
まず、第１ステップＳ１０１で、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を所定の流路で輸送し、検出液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する。粒子は、ガラスやプラスチックなどから構成すればよい。また、金属から構成してもよい。また、ガラスやプラスチックから構成し、表面に金属層を形成した粒子を用いてもよい。また、脂質二分子膜による粒子でもよい（非特許文献２参照）。
【００２０】
生体分子検出用分子は、検出対象とする生体分子に特異的に結合する核酸またはペプチドから構成されるリガンド（アプタマー）や、生体分子に特異的に結合する抗体または生体分子と特異的な化学反応を行う酵素であればよい。また、アプタマー，抗体，または酵素の化学構造の中の予め設計した部位に、粒子の表面によく吸着する性質を有するリンカー分子または結合部位、検出可能な信号変化を引き起こすシグナル材料、特異的結合機能を持たないスペーサの配列などが結合されていてもよい。
【００２１】
次に、第２ステップＳ１０２で、輸送している検出液に検体溶液を混合する。検体溶液は、検出対象の生体分子の有無を測定する対象である。次に、第３ステップＳ１０３で、検出液に検体溶液が混合した混合液の輸送に伴う粒子の移動状態を観測する。
【００２２】
次に、第４ステップＳ１０４で、第１ステップＳ１０１の観測による第１観測結果と、第３ステップＳ１０３の観測による第２観測結果とを比較し、検体溶液における生体分子の有無を判断する。例えば、第２観測結果が第１観測結果と異なる場合に、検体溶液に生体分子が存在していると判断する。
【００２３】
上述した実施の形態における生体分子検出方法を実施する装置について、図２を用いて説明する。この生体分子検出装置は、まず、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液を輸送する第１流路１０１、および測定対象の検体を含む検体溶液を輸送する第２流路１０２を備える。第１流路１０１および第２流路１０２は、合流部１０３で合流し、合流部１０３に連続する第３流路１０４に連通する。
【００２４】
また、この生体分子検出装置は、第３流路１０４を輸送される液体に含まれる粒子の液体の輸送に伴う移動状態を観測する観測部１０５を備える。観測部１０５は、例えば、表面プラズモン共鳴法により、第３流路１０４を輸送される粒子の移動状態の観測を行う。
【００２５】
また、この生体分子検出装置は、検体溶液における生体分子の有無を判断する判断部１０６を備える。判断部１０６は、第３流路１０４を検体溶液のみが輸送される状態で、検体溶液に含まれる粒子の検体溶液の輸送に伴う移動状態を観測した第１観測結果と、検出液と検体溶液とが合流部１０３で合流した混合液が第３流路１０４を輸送される状態で、混合液に含まれる粒子の混合液の輸送に伴う移動状態を観測した第２観測結果とを比較して検体溶液における生体分子の有無を判断する。判断部１０６は、第２観測結果が第１観測結果と異なる場合に、検体溶液に生体分子が存在していると判断する。
【００２６】
以上に説明した実施の形態によれば、所定の流路を輸送されている検出液に検体溶液を混合した後、この混合液の輸送に伴う粒子の移動状態の変化により、検体溶液における生体分子の有無を判断するようにした。このように、上述した実施の形態によれば、生体分子検出用分子を、予め流路内に配置させておく必要が無い。実施の形態では、粒子に生体分子を配置している。粒子は、乾燥させておく必要は無く、生体分子検出用分子の活性の安定性が長期に確保可能な溶液内に保管することが可能である。この結果、実施の形態によれば、装置の長期保管ができないなどの様々な制限のない状態で、生体分子の検出が実施できる。
【００２７】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００２８】
［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。実施例１では、図３に示すように、合流部１０３の直後の第３流路１０４は、流路径を小さくした反応領域１４１とし、反応領域１４１の後の第３流路１０４は、流路幅を広くした観測領域１４２としたマイクロ流路を用いる。また、観測領域１４２の所定箇所に、検出領域１５１を備える。反応領域１４１は、流路径を小さくすることで、検出液と検体溶液とがより効率的に混合する状態とする。
【００２９】
ここで、第３流路１０４の、特に観測領域１４２は、サフマン効果が得られる設計とするとよい（非特許文献３参照）。反応領域１４１と観測領域１４２との流路幅の差が大きいほど、より大きなサフマン効果が得られるようになる。この設計とすることで、粒子径の異なる粒子を、粒子径の大きさによって仕分けることができる。
【００３０】
これら流路は、例えば、ＢＫ７ガラスなどによる基板の上に、流路となる溝部，２箇所の導入口，および排出口などを備える流路基板を貼り付けて形成すればよい。流路基板は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から構成すればよい。検出領域１５１となる領域の基板には、膜厚５０ｎｍ程度のＡｕ層を形成しておく。
【００３１】
流路基板に形成する溝部は、深さ（高さ）１００μｍ程度とすればよい。また、導入口および排出口の口径は、０．５ｍｍとすればよい。これらは、例えば、よく知られた生検トレパンにより形成すればよい。また、基板と流路基板とは個別に作製し、貼り合わせる。例えば、Ａｕ層を形成した基板および流路溝を形成した流路基板の各々の貼り合わせ面を、酸素ガスのプラズマ（反応イオン）の照射により活性化させた後、各々の貼り合わせ面を当接させて貼り合わせることで、両者を一体とすればよい。
【００３２】
プラズマの照射は、プラズマ処理装置の処理室内で実施する。プラズマは、出力７０Ｗのマイクロ波により生成し、また、処理室内には酸素を１００ｓｃｃｍで供給し、処理室内における酸素分圧は１０Ｐａとすればよい。なお、ｓｃｃｍは流量の単位であり、０℃・１０１３ｈＰａの流体が１分間に１ｃｍ3流れることを示す。また、プラズマの照射は、５秒程度実施すればよい。
【００３３】
上述したように流路を形成した測定チップにおいて、２箇所の導入口には、各々フッ素樹脂によるチューブを介してマイクロシリンジポンプを接続する。また、排出口には、フッ素樹脂によるチューブを介して廃液回収部を接続した。マイクロシリンジポンプは、例えば、検出液の側は３μＬ／ｍｉｎで送液し、検体溶液の側は、１４μＬ／ｍｉｎで送液する条件とすればよい。また、粒子１１１は、粒子径が１００μｍφのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（比重１０９５ｋｇ／ｍ3）を用いればよい。また、検出液は、一般的な緩衝溶液である１ｘＴＢＳを使用すればよい。
【００３４】
合流部１０３で合流して混合された検出液と検体溶液との混合液が、観測領域１４２を流れて（輸送されて）いくと、生体分子が付着した粒子と、生体分子が付着していない分子とでは、軌跡が異なる。例えば、図４に示すように、第１流路１０１を検出液とともに輸送される生体分子検出用分子で修飾された粒子１１１が、単独で観測領域１４２を流れていくと、この軌跡は、第１流路１０１の配置側に曲がっていく。
【００３５】
これに対し、生体分子１１２が付着した粒子１１１ａは、粒径が大きくなるため、観測領域１４２のより中央に近い側を通る軌跡となる。また、第２流路１０２を流れる検体溶液により多くの生体分子１１２が含まれている場合、合流部１０３では、より多くの粒子１１１に生体分子１１２が付着し、この結果、複数の粒子１１１が生体分子１１２とともに一体となり集合体１１３を形成するようになる。集合体１１３は、擬似的に粒径が大きな粒子となるので、さらに観測領域１４２の中央に近い側を通る軌跡となる。
【００３６】
従って、上述した観測領域１４２を輸送されている粒子の移動状態を観測することで、生体分子が付着した粒子と、生体分子が付着していない粒子とが区別できる。また、粒子に対する生体分子の付着量の大小が判別できる。生体分子が付着した粒子と、生体分子が付着していない粒子とが区別できれば、検体中における生体分子の有無が判断できる。
【００３７】
例えば、表面プラズモン共鳴法を用いる場合、検出領域１５１を、第３流路１０４の流路方向に直交させて配置すればよい。
【００３８】
ここで、表面プラズモン共鳴法によるＳＰＲ（Surface plasmon resonance）装置２１０を用いた検出領域１５１について、図５を用いて説明する。検出領域１５１では、流路を構成する基板２０１の上にＡｕ層２０２を備えている。基板２０１は、例えば、ＢＫ７ガラスから構成されている。また、Ａｕ層２０２は、厚さ５０ｎｍ程度とされている。
【００３９】
ＳＰＲ装置２１０は、光源２１１、測定プリズム２１２、測定面２１３、センサー２１４を備える。センサー２１４は、いわゆるＣＣＤイメージセンサーなどの撮像素子より構成されている。ＳＰＲ装置２１０は、例えば、エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株式会社製の「Ｓｍａｒｔ  ＳＰＲ  ＳＳ−１００」である。
【００４０】
観測においては、測定プリズム２１２に形成されている測定面２１３上に、基板２０１裏面を配置する。また、ＳＰＲ装置２１０の光源２１１から出射される光の光軸上に、検出領域１５１が重なる状態に配置する。このとき、基板２０１と測定面２１３との間には、屈折率がＢＫ７ガラスと等しいマッチングオイル（不図示）を塗布しておく。
【００４１】
光源２１１から出射された光を集光して測定プリズム２１２に入射させ、測定プリズム２１２の測定面２１３に配置している検出領域１５１に照射する。検出領域１５１におけるＡｕ層２０２の裏面に、基板２０１を透過してきた集光光が照射される。
【００４２】
このようにして照射された集光光は、検出領域１５１を通過する液体（溶液）や粒子が接触したＡｕ層２０２の裏面で反射し、センサー２１４で光電変換されて強度（光強度）が得られる。この光強度が、液体のみが通過した場合と、粒子も同時に通過した場合とで異なる状態となる。
【００４３】
検出領域１５１には、センサー２１４の検出領域が対応している。センサー２１４の検出領域には、複数のフォトダイオード素子が並んで配置されており、検出領域１５１では、各フォトダイオード素子の位置（ピクセル位置）毎に、光強度の変化（ＳＰＲ角度）が測定される。なお、各ピクセル位置の間隔は、例えば、１０μｍである。
【００４４】
基板２０１の屈折率をｎ、Ａｕ層２０２の誘電率をεｍ、試料の誘電率をεｓ、基板２０１とＡｕ層２０２との界面に入射する光の入射角度をθとすると、「ｎ（ω/ｃ）ｓｉｎθ＝（ω/ｃ）［εｍ×εｓ/（εｍ＋εｓ）］1/2・・（１）」が成り立つ条件の時に、入射角度と、基板２０１とＡｕ層２０２との界面に誘起されるプラズモンの共鳴が起こる。また、プラズモンの共鳴が起きると反射する光が減衰するため、この状態がセンサー２１４のいずれかのフォトダイオード素子の検出値の変化として現れる。
【００４５】
上述したプラズモンの共鳴が起きた状態における検出値の強度が、液体のみが通過した場合と、粒子も同時に通過した場合とで異なる。従って、検出領域１５１におけるピクセルの配列方向を、第３流路１０４の流路方向に直交させておくと、第３流路１０４の幅方向における粒子１１１の通過位置が検出できる。
【００４６】
ところで、粒子１１１の質量が軽く、混合液の流れの中で、流路底面（Ａｕ層２０２表面）に沈降しない状態では、粒子１１１が検出領域１５１を通過しても、上述したＳＰＲ装置２１０（表面プラズモン共鳴法）ではこの状態が検出されない。ＳＰＲ装置２１０では、Ａｕ層２０２の表面におけるプラズモン共鳴の状態を検出するためである。
【００４７】
例えば、図６Ａの（ａ）に示すように、基板２０１の上の流路２０３において、粒子１１１が浮遊している場合、図６Ａの（ｂ）に示すように光強度（反射率）の変化（ＳＰＲ角度）が測定される。これは、検出領域１５１を、液体のみが通過した状態と同じである。
【００４８】
一方、図６Ｂの（ａ）に示すように、粒子１１１が沈降すると、粒子１１１によるプラズモン共鳴の吸収が発生するため、図６Ｂの（ｂ）に実線で示すように、光強度（反射率）の変化（ＳＰＲ角度）が変化する。
【００４９】
粒子１１１が沈降していれば、粒子１１１が検出領域１５１を通過したことが表面プラズモン共鳴法により検出できる。従って、粒子１１１は、混合液の流れの中で沈降しやすい比重の大きい材料から構成することが重要である。図７に実際に測定（観測）した結果を示す。図７の（ａ）に示すように、液体のみの場合は、粒子によるプラズモン共鳴の吸収がないため、反射する光が大きく減衰している。これに対し、図７の（ｂ），（ｃ）に示すように、粒子が存在していると、プラズモン共鳴が吸収され、反射光の減衰が少なくなる。
【００５０】
上述したように、沈降する粒子１１１を用いると、図８に示すように、観測領域１４２の第１流路１０１の配置側に偏って検出されていることが分かる。図８は、実際の観測結果であり、粒子１１１として、粒子径が１００μｍφのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（比重１０９５ｋｇ／ｍ3）を用い、検出液は、一般的な緩衝溶液である１ｘＴＢＳを使用している。また、検出液は、３μＬ／ｍｉｎで送液している。なお、図８の紙面の上側が、第１流路１０１の配置側である。
【００５１】
図８に示すように、どの時間においても、検出領域１５１に配列されている複数のピクセルの中で、特定の領域で最大吸光強度を示す変化が見られている。粒子１１１の表面が、流路底面に近接するほど吸収光が大きくなるので、各時間における最大吸光強度を示す点は、流れてくる粒子１１１の中心が通過した点であると考えられる。この結果は、同じ大きさの粒子であれば、観測毎に同じ特定の領域を中心に通過していることを示している。
【００５２】
ここで、混合液などが輸送されている流路内で、粒子が受ける浮力は、以下の式により計算される。まず、「Hagen-Poiseuille」の法則より、圧力駆動の定常流動は以下のように表現される。
【００５３】
【数１】
2019007876.tif 000003
【００５４】
また、溶液の速度ｕは、下記の「No slip boundary condition」式から算出される。
【００５５】
【数２】
2019007876.tif 000004
【００５６】
「Friction & Reynolds Number」の式より、摩擦係数ｆ、レイノルズ数Ｒｅは、以下の式で算出される。
【００５７】
【数３】
2019007876.tif 000005
【００５８】
このレイノルズ数の算出に対し、粒子でのサイズを考慮すると最終的には以下式で、粒子に対するレイノルズ数が計算できる。
【００５９】
【数４】
2019007876.tif 000006
【００６０】
上述した式をサフマン効果との関連式とすると、以下の式となる。
【００６１】
【数５】
2019007876.tif 000007
【００６２】
上記において、ＦLは粒子が受ける浮力となり、負であれば流路の底面に沈降し、正であれば流路の底面から離れ浮遊する。例えば粒子が、ポリスチレンラテックスから構成されて粒径４０μｍとされている場合、１０μＬ／ｍｉｎ以上の流速で流動すると、ＦLが正値となるため浮遊する状態となり、粒子が沈降していることが重要となる上述した表面プラズモン共鳴法による検出には適さない。
【００６３】
表面プラズモン共鳴法による検出では、粒子に対して浮力を生じさせないために、比重の大きな粒子を使用することが望ましい。粒子の例として、磁気粒子や、金属コート粒子などが挙げられる。近年粒子表面を金属メッキする技術が報告されている（非特許文献４）。粒子を脂質二分子膜から構成する場合、脂質二分子膜の内外の比重を調製することが挙げられる。脂質二分子膜の内外の濃度差は浸透圧の影響を受けるため、分子量の大きな分子、例えばデキストランなどの長糖鎖を用いた溶液を、脂質二分子膜による粒子内部に収容する液体として用いることが望ましい。なお、脂質二分子膜は、膜厚が３〜５ｎｍであり、表面プラズモン共鳴法による検出可能な２００ｎｍ内に収まる。
【００６４】
［実施例２］
次に、実施例２について説明する。実施例２では、図９に示すように、合流部１０３の直後の第３流路１０４は、流路径を小さくした反応領域１４１とし、反応領域１４１の後の第３流路１０４は、検出領域１５１と同程度の幅とした観測領域１４２ａによるマイクロ流路を用いる。また、実施例２では、流路方向に平行に、検出領域１５１を配置する。観測領域１４２ａおよび検出領域１５１の配置状態以外は、前述した実施例１と同様である。
【００６５】
実施例１では、検出領域１５１を、流路方向に直交させて配置したが、これに限るものではない。実施例２では、第３流路１０４の観測領域１４２ａにおいて、流路方向に平行に、検出領域１５１を配置する。この場合、第３流路１０４の観測領域１４２ａは、検出領域１５１と同程度の幅とするとよい。このように構成することで、観測領域１４２ａ（検出領域１５１）を通過する粒子の軌跡における微小な変化を捉えることが可能となる。
【００６６】
観測例を図１０に示す。図１０の（ａ）では、時間経過に従って、吸光強度が変化する観測点（ピクセル）がある程度重なった状態で推移している。一方、図１０の（ｂ）では、時間経過に対する観測点の重なりがなく点滅するように吸光強度が変化する観測点が推移している。なお、いずれにおいても、同一の粒子を用いている。
【００６７】
これらの２つの違いは、粒子の流れ方の違いに起因しているものと考えられる。（ａ）は、粒子が底面付近を引きずるように移動し、（ｂ）は、粒子が流路高さ方向に振動しながら移動しているものと推測される。このような粒子の流れの違いは、粒子径の変化ではなく、粒子が受ける浮力の違いによるものと考えられる。具体的には、粒子全体の比重もしくは粒子表面に存在する分子の密度および吸着状態に変化が生じることにより、上述した流れの違いが発生したものと考えられる。例えば、検体溶液中に測定対象の生体分子が存在している場合、検体溶液が混合された検出液では、粒子に生体分子が結合し、粒子全体の比重が異なる状態となり、粒子の表面状態が異なるものとなる。これらの状態が、上述した観測結果の違いとして現れる。
【００６８】
化学現象に伴う粒子の状態変化量が粒子径に影響を与えにくい場合は、上述したように、流路方向に平行に検出領域１５１を配置し、粒子の軌跡における微小な変化を捉えることで、生体分子の有無による差を検出するようにした方がよい。
【００６９】
以上に説明したように、本発明によれば、検出対象の生体分子と特異的に結合する生体分子検出用分子で修飾した粒子を含む検出液に検体溶液を混合し、この混合液における粒子の移動状態を観測するようにしたので、様々な制限のない状態で、生体分子の検出が実施できるようになる。本発明によれば、例えば、検体溶液を流す流路に、生体分子検出用分子を修飾しておく必要が無いので、様々なニーズに応じた分析チップを迅速に調整することが可能となる。例えば、医療現場での迅速な診断や食品検査、個人の体質に応じた在宅治療時のモニタリング、水耕栽培の環境測定などに役立てることができる。
【００７０】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、粒子の移動状態を観測は、表面プラズモン共鳴法による測定に限らず、光学的に粒子の移動状態を観測するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００７１】
１０１…第１流路、１０２…第２流路、１０３…合流部、１０４…第３流路、１０５…観測部、１０６…判断部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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