(57)【要約】【課題】自己免疫疾患の発症前の萌芽を捉えることを課題とし、発症の萌芽期の自己免疫異常を検査する方法、検査用プログラム、検査用装置、及び検査用試薬を提供することを課題とする。【解決手段】自己免疫予測スコアを指標として被験動物の自己免疫異常を検査する。自己免疫予測スコアは、被験動物から採取された試料中の（ａ）炎症性サイトカイン（ｂ）可溶性サイトカイン受容体（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ｄ）免疫グロブリンに含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定し、得られた測定値を、予め作成された重回帰式に当てはめて算出する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）の工程を含む、自己免疫予測スコアを指標とする被験動物の自己免疫異常の検査方法；
（１）該被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定する工程；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
（２）（１）の工程で得られた測定値を、予め作成された重回帰式に当てはめて自己免疫予測スコアを算出する工程。
【請求項２】
前記３つの因子にＩｇＧ４が含まれる、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記３つの因子に可溶性ＦＡＳが含まれる、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記３つの因子にＩＬ−６が含まれる、請求項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項５】
前記３つの因子にＩｇＧ４、可溶性ＦＡＳおよびＩＬ−６が含まれる、請求項１に記載の検査方法。
【請求項６】
前記予め作成された重回帰式が以下の数式１である、請求項１〜５のいずれか１に記載の検査方法：
（数式１）自己免疫予測スコア＝ｄ＋ａ×[ＩＬ−６量]＋ｂ×[可溶性ＦＡＳ量]＋ｃ×[ＩｇＧ４量]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数〕
【請求項７】
さらに、前記自己免疫予測スコアがカットオフ値以上である場合に免疫異常であると判定する工程を含む、請求項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項８】
前記被験動物がヒトである、請求項１〜７のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項９】
前記試料が血液、血清または血漿のいずれかである、請求項１〜８のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１０】
自己免疫予測スコア算出手段としてコンピューターを機能させる、自己免疫異常の検査用プログラムであって、自己免疫予測スコアが、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量の測定値、および、予め作成された重回帰式より算出される、自己免疫異常の検査用プログラム；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
【請求項１１】
自己免疫予測スコア算出手段を備えた、自己免疫異常の検査用装置であって、自己免疫予測スコアが、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量の測定値、および、予め作成された重回帰式より算出される、自己免疫異常の検査用装置；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
【請求項１２】
被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定するための少なくとも３種以上の試薬を含む、自己免疫予測スコアを指標とする自己免疫異常の検査用試薬キット；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験動物の自己免疫異常の検査方法、検査用試薬キット、検査用プログラム、検査用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、本来免疫の攻撃対象から免れるべき自己の細胞が、何らかの原因で攻撃対象になり破壊されてゆく疾患である。健全な免疫システムでは、自己と非自己が明確に区別される「自己寛容」が機能するが、自己免疫疾患ではこの自己寛容システムが破綻してしまっている。自己免疫疾患には全身性のものと臓器特異的なものとがあり、いずれも神経、消化器、呼吸器、骨格組織、皮膚、その他ありとあらゆる組織が標的となり徐々に破壊される。患者らの苦痛は堪え難く、治療も長期かつ難渋を極める。しかし、近年、多くの治療法が開発され、早期であるほど治療効果が高く、寛解の可能性も高い。早期発見は、患者自身はもちろんのこと、支える家族らの負担を顕著に軽減し、関わる人々のＱＯＬの向上につながっている。
【０００３】
自己免疫疾患は異常を自覚するまで診断されることはないが、早期診断を逃すとその治療効果が格段に低下してしまう。自己免疫疾患の診断は、クームス試験、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）測定、そして疾患マーカーになる血中自己抗体測定などがある。しかし、これは自己免疫疾患が発症、疑義が有る場合の診断項目であり、萌芽をとらえることはできない。
【０００４】
患者が症状を自覚する前に発症の萌芽をとらえることが重要である。自己免疫疾患の「萌芽」を捉えることができれば、寛解や完全治癒までの可能性を大いに高めることができる。必要なのは、極々初期の自己免疫疾患の萌芽のタイミングを逸さないことであるが、そのようなツールは現状まだ存在しない。
【０００５】
珪肺症の患者は呼吸器症状の他に、リウマチ、強皮症、ＡＮＣＡ関連血管炎などに代表される自己免疫疾患を高頻度で合併することが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lee S, et al., Allergy and Immunotoxicology in Occupational Health, p 15-26, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はヒトおよびヒト以外の動物が自己免疫疾患を発症する前、もしくは自己免疫疾患の症状を自覚する前の発症の萌芽を捉えることを課題とする。また、自己免疫疾患の発症の萌芽期の自己免疫異常の検査方法、検査用プログラム、検査用装置、及び検査用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、炎症反応に関係すると考えられる、炎症性サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体など、また抗体の本体である各種免疫グロブリンについて検討を重ねた。その結果、被験動物より採取された試料中の少なくとも３つの因子の量を測定することで、簡便かつ高い測定精度で自己免疫疾患発症前の自己免疫異常を検査することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の（１）および（２）の工程を含む、自己免疫予測スコアを指標とする被験動物の自己免疫異常の検査方法；
（１）該被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定する工程；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
（２）（１）の工程で得られた測定値を、予め作成された重回帰式に当てはめて自己免疫予測スコアを算出する工程。
２．前記３つの因子にＩｇＧ４が含まれる、前項１に記載の検査方法。
３．前記３つの因子に可溶性ＦＡＳが含まれる、前項１または２に記載の検査方法。
４．前記３つの因子にＩＬ−６が含まれる、前項１〜３のいずれか１に記載の検査方法。
５．前記３つの因子にＩｇＧ４、可溶性ＦＡＳおよびＩＬ−６が含まれる、前項１に記載の検査方法。
６．前記予め作成された重回帰式が以下の数式１である、前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法：
（数式１）自己免疫予測スコア＝ｄ＋ａ×[ＩＬ−６量]＋ｂ×[可溶性ＦＡＳ量]＋ｃ×[ＩｇＧ４量]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数〕
７．さらに、前記自己免疫予測スコアがカットオフ値以上である場合に免疫異常であると判定する工程を含む、前項１〜６のいずれか１に記載の検査方法。
８．前記被験動物がヒトである、前項１〜７のいずれか１に記載の検査方法。
９．前記試料が血液、血清または血漿のいずれかである、前項１〜８のいずれか１に記載の検査方法。
１０．自己免疫予測スコア算出手段としてコンピューターを機能させる、自己免疫異常の検査用プログラムであって、自己免疫予測スコアが、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量の測定値、および、予め作成された重回帰式より算出される、自己免疫異常の検査用プログラム；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
１１．自己免疫予測スコア算出手段を備えた、自己免疫異常の検査用装置であって、自己免疫予測スコアが、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量の測定値、および、予め作成された重回帰式より算出される、自己免疫異常の検査用装置；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
１２．被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定するための少なくとも３種以上の試薬を含む、自己免疫予測スコアを指標とする自己免疫異常の検査用試薬キット；
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、自己免疫疾患の症状が発症していない自己免疫疾患発症予備動物（自己免疫疾患発症予備者を含む）と健常動物（健常人を含む）における免疫状態を、初めて明確に区別できるようになった。自己免疫疾患発症予備動物を捉えることにより、寛解や完全治癒までの可能性を大いに高めることが可能になる。
【００１１】
本発明では、簡便かつ高い精度で、自己免疫疾患の萌芽である自己免疫異常を捉えることができる。本発明では、試料中の自己抗体ではない３以上の因子変動より自己免疫異常を捉えることができる。試料が血液（血清、血漿）の場合は、自己抗体ではない３以上の血中因子の変動で、自己免疫疾患の萌芽が捉えられるので、検査は簡便で被験動物への負担は少なく、一般の検査に取り入れられやすい。
【００１２】
また、本発明の検査を一般健康診断項目に加えることで、自己免疫疾患とは無縁と考え、早期診断の機会を失う人々を救うことが出来るようになる。特に、珪肺症に代表される、塵肺患者、様々な化学物質に曝露される人々の健康診断項目や、自己免疫疾患が頻発する若年層女性などの健康診断項目に加えることにより、これら人々を救うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は、自己免疫予測スコアからのＲＯＣ曲線を示すグラフである。（ｂ）最適ＲＯＣ曲線を描くためのスコア（ＲＯＣ曲線の座標）を示す表である（実施例２）。
【図２】健常人（ＨＶ）と自己免疫疾患発症予備群（自己免疫疾患未発症珪肺症例 （ＳＩＬ））における自己免疫予測スコアの分布を示すグラフである（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の検査方法、検査用プログラム、検査用装置および検査用試薬キットは、自己免疫異常を検査する。自己免疫疾患の症状が発症する前および発症した後における動物の免疫系の状態は、健常動物とは異なる状態に陥っている。本明細書において自己免疫異常とは、このような自己免疫疾患の症状が発症する前および発症した後における免疫系の異常な状態を意味する。本発明の検査対象は、自己免疫疾患の症状が発症する前の動物でも発症後の動物でもよいが、他に検査手段がないことから、自己免疫疾患の症状が発症する前の動物を好適な検査対象とする。
【００１５】
本明細書において被験動物は、いかなる動物であってもよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳動物である。ヒト以外の動物としては、例えば、ペット動物、動物園で飼育する動物、実験動物、家畜などが挙げられ、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等が挙げられる。より好適な被験動物はヒトまたはペット動物であり、さらに好適な被験動物はヒトである。
【００１６】
本明細書において被験動物がヒトの場合、検査対象はヒトであればいかなる者であってもよい。例えば、被験者は一般的な健康診断や人間ドック等の対象者であってもよい。珪肺症に代表される塵肺患者や様々な化学物質に曝露される者であってもよい。自己免疫疾患が頻発する若年層女性等であってもよい。
【００１７】
本明細書において試料とは、被験動物から得られる試料であればよい。例えば、血液、尿、髄液、検査のために取得された組織、摘出された組織等が挙げられる。さらに血液や組織を処理または分画して得た試料も本発明における試料に含まれる。被験動物の負担や検査が簡易なことから、試料としては血液、およびそれを処理した血漿や血清が好ましい。
【００１８】
本発明の検査方法、検査用プログラム、検査用装置および検査用試薬キットは、自己免疫予測スコアを自己免疫異常の指標とする。自己免疫予測スコアは、該被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定し、得られた測定値を、予め作成された重回帰式に当てはめて算出される。
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
【００１９】
本明細書において因子には、因子自体の他に、因子（分子）の一部からなる因子（分子）、因子をコードするｍＲＮＡ等も含まれる。
【００２０】
炎症性サイトカインは、炎症に関連するサイトカインであり、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＴＧＦ−β１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−８等が挙げられる。測定対象として好適な炎症性サイトカインとしてＩＬ−６が挙げられる。
【００２１】
可溶性サイトカイン受容体は、サイトカイン受容体の一部からなり、血液中等に存在する。可溶性サイトカイン受容体として、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−６ｓＲ、ＩＬ−１２Ｒ等が挙げられる。
【００２２】
ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、ＴＮＦスーパーファミリーおよびＴＮＦ受容体スーパーファミリーを意味する。本明細書において、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーには、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの因子（分子）の一部からなる、可溶性の因子（分子）も含まれる。ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに含まれる因子として、例えば、ＦＡＳ、可溶性ＦＡＳ、ＤｃＲ３、ＢＡＦＦ等が挙げられる。可溶性ＦＡＳは、ＦＡＳが切断されて可溶化した因子（分子）である。試料としては血液、およびそれを処理した血漿や血清が好ましいことより、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに含まれる因子としては、可溶性の因子（分子）が好ましい。可溶性の因子として、可溶性ＦＡＳ、ＢＡＦＦ、ＤｃＲ３等が挙げられる。測定対象として好適な可溶性因子として可溶性ＦＡＳ（以下ｓＦＡＳともいう。）が挙げられる。
【００２３】
免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤの５つのクラスに分類され、さらにサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類される。測定対象となる免疫グロブリンはいずれでもよい。測定対象として好適な免疫グロブリンとしてＩｇＧ４が挙げられる。
【００２４】
自己免疫予測スコアを算出するために、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定する。
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子とは、（ａ）（ｂ）（ｃ）および（ｄ）のいずれに属していてもよい因子である。少なくとも３つの因子は、（ａ）〜（ｄ）にどのように属していてもよい。各グループに分散して属していてもよいし、1つのグループにすべての因子が属していてもよい。例えば、測定対象が３つの因子の場合、その３因子は、（ａ）炎症性サイトカインから選択された１因子、（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーから選択された１因子、（ｄ）免疫グロブリンから選択された１因子からなる３因子であり得、また、（ａ）炎症性サイトカインから選択された３つの因子であり得る。
【００２５】
前記少なくとも３つの因子に、好適にはＩｇＧ４とｓＦＡＳが含まれる。さらに好適には、ＩｇＧ４、ｓＦＡＳおよびＩＬ−６が含まれる。ＩｇＧ４、ｓＦＡＳおよびＩＬ−６を測定対象とすることにより、高い精度で自己免疫疾患発症前の免疫異常者と健常人を判別することができる。
【００２６】
自己免疫予測スコアを算出するために測定する因子の数は、感度および特異度を上げるために３個以上であり、検査の煩雑さと感度および特異度の観点から、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましく、５個以下であることがさらに好ましく、４個以下がさらに好ましい。検査を簡易にするために最も好ましくは３個である。ＩｇＧ４、ｓＦＡＳおよびＩＬ−６の３因子を測定対象とすることにより、測定が簡易で精度が高い検査が可能になる。
【００２７】
試料中のこれら因子の量は、当業者に周知の任意の方法により測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法により測定することができる。好適な測定方法は、ＥＬＩＳＡ法である。試料をそのまま、または前処理して測定することができる。試料が血液や血漿等であれば、そのまま測定することも可能であり、試料が組織である場合は、各因子を抽出してから測定してもよい。
【００２８】
本明細書において、因子の量は、因子の重量、濃度、活性、相対量等で表される。試料としては血液、およびそれを処理した血漿や血清が好ましいことより、好適には因子の量は濃度で表される。
【００２９】
測定した各因子の量を予め作成された重回帰式に当てはめて自己免疫予測スコアを算出する。重回帰式は、自己免疫疾患発症予備群である複数の動物の試料中の因子の量を重回帰分析して得る。該因子は、被験動物の測定対象となる少なくとも３つの因子と同一の因子である。すなわち、重回帰式は、自己免疫疾患発症予備群である動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定し、その測定値を独立変数として重回帰分析して得られる数式である。
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
【００３０】
重回帰式として好ましい数式は、ＩＬ−６量、ｓＦＡＳ量、及び、ＩｇＧ４量を独立変数とする。例えば、以下の数式１が好ましい。
（数式１）自己免疫予測スコア＝ｄ＋ａ×[ＩＬ−６量]＋ｂ×[ｓＦＡＳ量]＋ｃ×[ＩｇＧ４量]
〔ただし、数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄはゼロでない任意の実数〕
【００３１】
数式１におけるａ，ｂ，ｃ，ｄの具体的な値は、重回帰分析により設定されたものであればよい。例えば、以下の数式２が例示される。
（数式２）自己免疫予測スコア＝０．０６３＋０．０５９×[ＩＬ−６量]＋０．１１９×[ｓＦＡＳ量]＋１．０６３×[ＩｇＧ４量]
（[ＩＬ−６量]はＩＬ−６の血漿中濃度（ｐｇ／ｍｌ）、[ｓＦＡＳ量]はｓＦＡＳの血漿中濃度（ｎｇ／ｍｌ）、[ＩｇＧ４量]はＩｇＧ４の血漿中の濃度（μｇ／ｍｌ））
【００３２】
本発明の検査方法は、さらに、自己免疫予測スコアがカットオフ値以上である場合に免疫異常であると判定する工程を含んでいてもよい。ＲＯＣ曲線の座標（図１ｂ）の｛感度−（１−特異）｝の値が最も大きい値をカットオフ値とすることができる。
【００３３】
重回帰式は、被験動物の検査の測定値を重回帰分析の独立変数に加えることより、更新されることができる。更新された重回帰式は、その後に得られる測定値を用いて自己免疫予測スコアを算出するときに用いられる。取得された測定値を含めて重回帰分析が行われることにより、重回帰式における係数、決定項、およびカットオフ値の設定は随時更新される。
【００３４】
本発明の自己免疫異常の検査用試薬キットは、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量を測定するための少なくとも３種以上の試薬を含む。
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
【００３５】
本発明の検査用試薬キットに含まれる試薬の種類や数は、測定する因子の数により増減する。好適には、ＩｇＧ４量を測定する試薬が含まれる。また、好適には、ｓＦＡＳ量を測定する試薬が含まれる。また、好適には、ＩＬ−６量を測定する試薬が含まれる。より好適には、ＩｇＧ４量を測定する試薬とｓＦＡＳ量を測定する試薬が含まれる。さらに好適には、ＩｇＧ４量を測定する試薬、ｓＦＡＳ量を測定する試薬およびＩＬ−６量を測定する試薬が含まれる。
【００３６】
各因子の量を測定する試薬は、各因子に結合し得る抗体を含み得る。抗体は公知の抗体であってもよいし、既存の一般的な製造方法によって製造した抗体や市販の抗体を用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、標識物質により標識されていてもよい。標識物質は、具体的には、酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、染料ゾルおよび金コロイドやラテックス粒子等の不溶性担体を用いることができる。また、標識は公知の方法で行うことができるが、標識物質は抗体に結合させていてもよい。上記抗体は試薬（試薬組成物）として本発明の検出用試薬キットに含まれる。抗体を含む試薬は、生理食塩水、緩衝液等で希釈した形態、又は凍結乾燥形態等の長期間保存可能な試薬が例示される。抗体を、添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤等を含有する溶液に溶解した後、凍結乾燥されて試薬が調製されていてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、１〜１０ｗ／ｖ％程度が添加されていることが好ましい。また本発明の検出用試薬キットには、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液等が含まれていてもよい。
【００３７】
各因子の量を測定する試薬は、各因子のｍＲＮＡ検出用試薬を含み得る。各因子のｍＲＮＡ検出用試薬は、各因子の発現を検出し得るポリヌクレオチドを含むものである。本明細書において、ポリヌクレオチドは塩基・糖・リン酸からなるヌクレオチドが２以上リン酸エステル結合した生体高分子を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を含む。前記ポリヌクレオチドは、８ヌクレオチド（塩基）以上の長さを有するものである。当該ポリヌクレオチドは特定のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、特定のｍＲＮＡに特異的にアニーリングし得るプライマー、当該プライマーと対になって核酸断片を増幅し得るプライマーとして機能するものである。当該ポリヌクレオチドの塩基配列は、発現を検出する遺伝子の塩基配列に１００％相補的な配列である必要はなく、１塩基〜５塩基ほど（好ましくは１〜４塩基ほど、より好ましくは１〜２塩基ほど）欠失していてもよいし、相補的でない塩基が置換、挿入又は付加されていてもよい。また、ポリヌクレオチドがプライマーである場合は１７〜２５ヌクレオチド程度とすることが好ましく、プローブである場合は８〜４０ヌクレオチド程度とすることが好ましく、１０〜３０ヌクレオチド程度とすることがより好ましい。プライマーは、一対のプライマーセットとして本発明の検出用試薬キットに含まれてもよい。
【００３８】
本発明の自己免疫異常の検査用プログラムは、自己免疫予測スコア算出手段としてコンピューターを機能させる。該自己免疫予測スコアは、被験動物から採取された試料中の以下の（ａ）〜（ｄ）に含まれる因子からなる群から選択される少なくとも３つの因子の量の測定値、および、予め作成された重回帰式より算出される。
（ａ）炎症性サイトカイン
（ｂ）可溶性サイトカイン受容体
（ｃ）ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体スーパーファミリー
（ｄ）免疫グロブリン
【００３９】
本発明のプログラムは複数の試料について測定された各種因子の量の測定値を独立変数として重回帰分析する手段を有していてもよい。また本発明の検査用プログラムは、測定値を記憶させるための記憶手段を有していてもよい。また、重回帰式に独立変数として使用するさらなる因子を選別する選別手段を有していてもよい。さらに、被験動物より採取された試料より得られた測定値を、記憶されている測定値に加えて重回帰分析をして、重回帰式を更新する更新手段を有していてもよい。さらに、カットオフ値を決定する手段を有していてもよく、当該カットオフ値に基づき、自己免疫異常の有無を判定する判定手段を有していてもよい。
【００４０】
本発明の自己免疫異常の検査用装置は、自己免疫予測スコア算出手段を備える。自己免疫予測スコア算出手段は、被験動物から採取された試料中の各種因子の量の測定値の入力手段、予め作成された重回帰式に入力値を当てはめる手段を含む。本発明の検査装置は、各種因子の測定値を重回帰分析する手段を備えていてもよい。また本発明の検査用装置は、被験動物から採取された試料中の各種因子を測定する測定手段を備えていてもよい。さらに、測定値を記憶させるための記憶手段を備えていてもよい。また、重回帰式に独立変数として使用するさらなる因子を選別する選別手段を有していてもよい。さらに、被験動物より採取された試料より得られた測定値を、記憶されている測定値に加えて重回帰分析し、重回帰式を更新する更新手段を有していてもよい。さらに、カットオフ値を決定する手段を有していてもよく、当該カットオフ値に基づき、自己免疫異常の有無を判定する判定手段を有していてもよい。さらに、該判定手段に基づく判定結果や測定値を示すための表示手段を備えていてもよい。
【実施例】
【００４１】
本発明の理解を助けるために以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでない。
【００４２】
（実施例１）  各種因子の測定値の取得
珪肺症患者は自己免疫疾患を発症する頻度が高い。このことから自己免疫疾患未発症の珪肺症患者らを自己免疫疾患発症予備群と捉え、炎症反応に関わる末梢血中因子を測定した。
【００４３】
川崎医科大学附属病院の倫理委員会の承認を得て、健常人（１９名、うち男性８名、女性１１名、平均年齢４４．８４±８．５８歳）、および自己免疫疾患発症予備群（自己免疫疾患未発症珪肺症例）（２０名、男性１９名、女性１名、平均年齢７４．８５±５．３５歳）から末梢血を採血し、その血漿中因子の濃度を測定した。測定対象とする因子は、炎症反応に関係すると考えられる、炎症性サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体など、また抗体の本体である各種免疫グロブリンを選択した（表１）。
【表１】
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【００４４】
測定にはEnzyme-Linked Immuno Solvent Assay (ELISA法)を用いた。各因子の測定用試薬を以下に示す。
ＩｇＧ４：Human IgG Subclass Profile ELISA Kit (Invitrogen)
sＦＡＳ：Human Fas/TNFRSF6 Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＩＬ−６：Human IL-6 Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＤｃＲ３：LEGEND MAXTM Human Soluble DcR3/TNFRSF6B ELISA kit (BioLegend（登録商標）)
ＩＬ−２Ｒα： Human IL-2Rα Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＩＬ−１０：Human IL-10 Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＩＬ−１α： RayBio（登録商標） Human IL-1α ELISA Kit (RayBiotech, Inc.)
ＩＬ−６ｓＲ： Human IL-6sR Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＴＧＦ−β１： Human TGF-β1 Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
Ｇ−ＣＳＦ： Human G-CSF Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＩｇＧ： Human IgG ELISA Kit (Bethyl Laboratories, Inc.)
ＩｇＡ： Human IgA ELISA Kit (Bethyl Laboratories, Inc.)
ＩｇＥ： Human IgE ELISA Kit (Bethyl Laboratories, Inc.)
ＩｇＭ： Human IgM ELISA Kit (Bethyl Laboratories, Inc.)
ＩｇＧ１： Human IgG Subclass Profile ELISA Kit (Invitrogen)
ＩｇＧ２： Human IgG Subclass Profile ELISA Kit (Invitrogen)
ＩｇＧ３： Human IgG Subclass Profile ELISA Kit (Invitrogen)
ＢＡＦＦ： Human BAFF/BLys/TNFSF13B Quantikine（登録商標） ELISA (R&D)
ＬＡＧ３： Human lymphocyte activation gene 3 protein (LAG3) ELISA kit (CUSABIO)
【００４５】
（実施例２）重回帰式の作成
実施例１により得られた各因子の測定値について、統計ソフト（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｖｅｒ．２２）を用いて自動線形モデリングによる重回帰分析を行った。独立変数として表１に示すすべての因子の血漿中濃度を導入し、従属変数を自己免疫予測スコア(健常人：１、自己免疫疾患発症予備群：２)にして解析した。
【００４６】
その結果、以下の自己免疫予測スコアを求める式が得られた（表２）。
自己免疫予測スコア＝０．０６３＋０．０５９×[ＩＬ−６量]＋０．１１９×[ｓＦＡＳ量]＋１．０６３×[ＩｇＧ４量]
（[ＩＬ−６量]はＩＬ−６の血漿中濃度（ｐｇ／ｍｌ）、[sＦＡＳ量]はsＦＡＳの血漿中濃度（ｎｇ／ｍｌ）、[ＩｇＧ４量]はＩｇＧ４の血漿中の濃度（μｇ／ｍｌ））
【表２】
2019066340.tif 000004
【００４７】
自己免疫予測スコアからＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）解析を行ったところ感度９４．４％、カットオフ値１．３９３５という結果が得られた（図１）。自己免疫予測スコアから、健常人と珪肺症例をカットオフ値で分けたところ、健常人で偽陽性なし、珪肺症例で偽陰性１例とかなり信憑性が高い結果となった（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明により、自己免疫疾患の症状が発症していない自己免疫疾患発症予備群と健常動物群における免疫状態を明確に区別することができる。自己免疫疾患発症予備者および自己免疫疾患発症予備動物を捉えることにより、寛解や完全治癒までの可能性を大いに高めることが可能になる。本発明の検査方法は簡便であることより、一般健康診断項目に加えることも可能であり、自己免疫疾患とは無縁と考え、早期診断の機会を失う人々や動物を救うことが出来るようになる。
【図１】
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【図２】
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