(57)【要約】【課題】毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する簡便な方法を提供する。【解決手段】毛髪において複数の断面が形成されるように上記毛髪を切断するか、または当該毛髪を切り欠く切断工程と、上記切断工程によって生じた複数の断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程と、を含む測定方法とする。【選択図】図３
2019007834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、
上記毛髪の少なくとも一部を上記毛髪の成長軸方向に沿って切断する切断工程と、
上記切断によって生じた断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、
上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程とを含む測定方法。
【請求項２】
毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、
上記毛髪において複数の断面が形成されるように上記毛髪を切断するか、または当該毛髪を切り欠く切断工程と、
上記切断工程によって生じた複数の断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、
上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程とを含む測定方法。
【請求項３】
上記切断工程において、上記毛髪が包埋されている包埋剤を完全には切断せずに、上記毛髪に由来する複数の断面を、１枚の切片上に露出させる請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
上記断面に対して、上記生理活性物質とは異なる第２の生理活性物質を特異的に認識する第２の抗体を反応させる第２反応工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
上記生理活性物質と結合した上記抗体に対して、当該抗体を特異的に認識する二次抗体を反応させる二次反応工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
上記毛髪は、頭髪または髭である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
上記抗体は、コルチゾールを特異的に認識するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法において用いられる測定キットであって、
毛髪を包埋するための包埋剤と、
上記毛髪に含まれる生理活性物質を特異的に認識する抗体を含んでいる抗体反応剤と、
を備えている測定キット。
【請求項９】
上記抗体は、コルチゾールを特異的に認識するものである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法において用いられる測定装置であって、
上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体に依存して発生した蛍光を検出する測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する測定方法、測定キットおよび測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検体から採取した毛髪中に含まれる物質を測定し、上記被験体の生理状態を判断する技術が存在する。例えば、非特許文献１は、新生児の毛髪をサンプルとして、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）法によりコルチゾールのレベルを決定したことを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Yamada J et al (2007) "Hair Cortisol as a Potential Biologic Marker of Chronic Stress in Hospitalized Neonates", Neonatology, Vol.92 (No.1), pp.42-49
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような従来技術は、毛髪中の生理活性物質の測定に必要な工程数が多くなり、装置の大型化を招きがちである。
【０００５】
本開示の一態様は、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本開示の一態様に係る測定方法は、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、上記毛髪の少なくとも一部を上記毛髪の成長軸方向に沿って切断する切断工程と、上記切断によって生じた断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程と、を含む。
【０００７】
また、本開示の他の態様に係る測定方法は、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、上記毛髪において複数の断面が形成されるように上記毛髪を切断するか、または当該毛髪を切り欠く切断工程と、上記切断工程によって生じた複数の断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本開示の一態様によれば、従来法よりも簡便な、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施形態１に係る方法において、毛髪を切断する切断工程を表す模式図である。（ａ）は、包埋剤２に包埋されている毛髪１を表す。（ｂ）は、（ａ）を複数箇所で切断して得られる、複数の毛髪サンプル１０を表す。
【図２】上記切断工程において、毛髪の切断面を規定する座標を表す図である。
【図３】実施形態１に係る方法において、毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程の、各ステップを表す模式図である。
【図４】実施形態１に係る方法において、生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程に用いられる光学系を表す模式図である。
【図５】実施形態２に係る方法において、毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程の、各ステップを表す模式図である。
【図６】実施形態２に係る方法によって、実際に生理活性物質（コルチゾール）の蓄積量の経時的変化の測定を行った、実験結果を表す図である。（ａ）は、包埋剤２に包埋された毛髪１において、複数の部位を設定したことを表す模式図である。（ｂ）は、それぞれの部位におけるコルチゾールの蓄積量を表す抗体染色像である。（ｃ）は、それぞれの部位における蛍光強度を表すグラフである。
【図７】実施形態２に係る方法によって、実際に生理活性物質（コルチゾール）の蓄積量の経時的変化の測定を行った、他の実験結果を表す図である。（ａ）は、包埋剤２に包埋された毛髪１における切断箇所を表す模式図である。（ｂ）は、それぞれの切断箇所におけるコルチゾールの蓄積量を表す抗体染色像である。
【図８】実施形態３に係る方法において、毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程の、各ステップを表す模式図である。
【図９】実施形態３に係る方法によって、実際に生理活性物質（コルチゾール）の蓄積量の測定を行った、実験結果を表す抗体染色像である。
【図１０】（ａ）は、実施形態５に係る方法において、毛髪を成長軸方向に切断する切断方法の一例を表す模式図である。（ｂ）は、実施形態４に係る方法において、毛髪を成長軸方向に切断する切断方法の他の例を表す模式図である。
【図１１】実施形態５に係る方法によって、実際に生理活性物質（コルチゾール）の蓄積量の経時的変化の測定を行った、実験結果を表す図である。（ａ）は、成長軸方向に切断された毛髪断面を表す顕微鏡像である。（ｂ）は、成長軸方向に切断された毛髪断面における蛍光強度分布を、成長軸に沿って分析したグラフである。（ｃ）は、上記蛍光強度分布をヒートマップで表した図である。
【図１２】（ａ）は、実施形態６に係る方法において、毛髪１を切り欠き、毛髪断面１１を露出させる切断方法の一例を表す模式図である。（ｂ）は、実施形態６に係る方法において、毛髪１を切り欠き、毛髪断面１１を露出させる切断方法の他の例を表す模式図である。（ｃ）は、実施形態６に係る方法において、毛髪１を切り欠き、毛髪断面１１を露出させる切断方法のさらに他の例を表す模式図である。
【図１３】実施形態７に係る方法において、毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程の、各ステップを表す模式図である。
【図１４】実施形態７に係る方法によって、実際に生理活性物質（コルチゾールおよびＤＨＥＡ）の蓄積量の測定を行った、実験結果を表す図である。
【図１５】実施形態８に係る方法において、毛髪を切断する切断工程を表す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本開示の実施の形態の一例について詳細に説明する。しかし本開示は、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００１２】
以下、実施形態の説明に先立って、本明細書において広く用いられる用語について説明する。
【００１３】
本明細書における「被検体」の範囲には、ヒトに加えて、非ヒト哺乳類も含まれる。非ヒト哺乳動物の例としては、霊長類（サル、類人猿など）、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。上述の非ヒト哺乳動物は、家畜または愛玩動物であってもよく、野生動物であってもよい。
【００１４】
本明細書において「毛髪」とは、「被検体に生える毛」を意図する。被検体がヒトの場合、毛髪の例として、頭髪、髭、眉毛、睫毛、鼻毛、耳毛、腋毛、陰毛、体毛が挙げられる。このうち、本開示の方法においては、頭髪または髭を用いることが、採取が容易であるため好ましい。さらに、頭髪は成長期が長いため、長期間（数箇月（例えば、１〜１２箇月）〜数年（例えば、１〜９年））にわたる生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定できる可能性がある。また、髭は太い毛髪であるため、毛髄質に蓄積している生理活性物質を検出しやすい。
【００１５】
ここで、生体サンプルとして毛髪を用いることには、生体サンプルとして血液や唾液などを用いることに対して、以下に例示される利点が存在する。
（１）毛髪の採取は非侵襲性であり、容易である。このため、医師または医療関係者でない者でも、毛髪サンプルを採取できる。
（２）他の種類のサンプルに汚染される危険性が低い。例えば、唾液を採取する際に血液が混入すると、唾液中と血液中では生理活性物質のレベルが異なるのが通常であるから、上記生理活性物質のレベルを正確に測定できない。しかし、採取された毛髪は、洗浄により容易に他の種類のサンプル（血液、唾液など）の混入を防ぐことができる。
（３）生理活性物質の「蓄積量」を測定するのに適している。すなわち、血液、唾液などから測定された生理活性物質のレベルは、サーカディアンリズム、急性の生体反応などが原因となり、サンプル採取時の生体条件および環境条件に左右されがちである。これに対し、毛髪の成長速度は頭髪で１ｃｍ／月程度であるため、毛髪をサンプルとすることにより、「特定の期間に分泌された生理活性物質の蓄積量」を反映した測定値を得ることができる。
【００１６】
本明細書において、「生理活性物質」とは、生命活動および生理機能の維持、調節などに関わる物質を意図する。生理活性物質の具体例としては、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ビタミン、酵素、タンパク質、ペプチドなどが挙げられる。
【００１７】
本開示の方法は、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法である。したがって、上記毛髪を採取された被験体の生命活動および生理機能の経時的変化を判断する方法でありうる。
【００１８】
例えば、毛髪におけるストレス関連生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することにより、上記被験体が慢性的に経験したストレスの経時的変化を知ることができる。このようなストレス関連生理活性物質の例としては、コルチゾール（ヒドロコルチゾン；１１β，１７α，２１−トリヒドロキシプレグナ−４−エン−３，２０−ジオン）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン；３β−ヒドロキシアンドロスタ−５−エン−１７−オン）、ＤＨＥＡ−Ｓ（硫酸結合型DHEA；DHEA-sulfate; DHE-S）、テストステロン、カテコールアミン（アドレナリン、ノルアドレナリン）、クロモグラニンＡ、Neuropeptide Yなどが挙げられる。このうち、コルチゾール、アドレナリン、クロモグラニンＡは、蓄積量の増加と慢性ストレスの増加とが関連付けられる。一方、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ−Ｓは、蓄積量の増加と慢性ストレスの減少とが関連付けられる。
【００１９】
また、例えば、ストレス関連疾患である鬱病の患者においては、コルチゾールの蓄積量が高く、ＤＨＥＡの蓄積量が低いことが判っている。このような場合に、複数の生理活性物質の蓄積量の比（上記の例では、「コルチゾールの蓄積量／ＤＨＥＡの蓄積量」の値）の経時的変化を求めることも、本開示の範囲に含まれる。
【００２０】
以上に例示した他にも、種々の生理活性物質の蓄積量の経時的変化と、対応する生命活動および生理機能の経時的変化との関係は、医学・生理学分野における技術常識を用いて解釈することができる。
【００２１】
なお、毛髪中にはステロイド骨格を有する物質が蓄積されやすいことが知られている。このため、毛髪におけるステロイド骨格を有する物質の蓄積量の経時的変化を測定することは、本開示の方法の好ましい態様の一つである。ステロイド骨格を有する物質の例としては、コルチゾール、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ−Ｓ、テストステロンなどが挙げられる。
【００２２】
本明細書中における「抗体」には、免疫グロブリンが含まれる。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および、これらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメントなどが含まれる。より具体的には、全てのクラスのポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、遺伝子組換えによるヒト型化抗体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本明細書中における「抗体」には、特定の生理活性物質を特異的に認識する限り、抗体断片および抗体修飾物も含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを挙げることができる。
【００２３】
特定の生理活性物質を特異的に認識する抗体の産生方法は、周知技術である。例えば、［Harlow (Ed.), "Antibodies: a laboratory manual", New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988］、［岩崎辰夫 他『単クローン抗体: ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ』、講談社、１９９１年］などを参照することができる。もちろん、市場に流通している抗体を購入して用いてもよい。
【００２４】
〔実施形態１〕
実施形態１では、（１）毛髪において複数の断面が形成されるように上記毛髪を切断する切断工程と、（２）上記切断工程によって生じた複数の断面に対して、生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、（３）上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程とを含む、測定方法について説明する。実施形態１に係る構成によれば、上記毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化に関するデータを取得することができる。以下、毛髪サンプルの作製から抗体の検出までを、図１〜４に基づいて順に説明する。
【００２５】
まず、反応工程に先立って、被検体から毛髪を採取し（採取工程）、上記毛髪に切断面を形成する（切断工程）。そこで、毛髪の採取および切断について、簡潔に説明する。
【００２６】
毛髪を採取するために用いる道具としては、特に限定されず、公知の道具（ハサミ、髭剃りなど）が用いられうる。
【００２７】
採取工程で被検体から採取される毛髪は、頭髪または髭が好ましい。上述した通り、頭髪または髭は、特殊な器具を用いることなく、容易に採取できるためである。
【００２８】
採取工程で被検体から採取される毛髪の数は、１本以上であれば特に限定されない。より正確な生理活性物質の蓄積量を測定するという観点からは、複数本の毛髪を採取することが好ましい。このときに採取する毛髪の本数は、統計的解釈が可能な本数であれば特に限定されない。毛髪として頭髪を用いる場合、約２０本を包埋して毛髪サンプルを作製することができれば、本開示の方法を実施するために充分である。
【００２９】
皮膚や血液などの混入を防ぐ観点から、毛髪の採取に際しては、毛根を含まない部位を採取することが好ましい。一方、長い毛髪を採取できれば、それだけ長い期間に及ぶ生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる。この観点からは、毛髪を根元の近くから採取することが好ましい。
【００３０】
採取された毛髪１は、適宜洗浄などの工程を経た後、包埋剤２に包埋される（図１の（ａ））。包埋剤の主成分としては、パラフィン、セロイジン、ゼラチン、カーボワックス、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、シアノアクリレート、氷などを用いることができる。
【００３１】
次に、包埋された毛髪１を、ミクロトーム、カッター、治具などを用いて切断し、複数の毛髪サンプル１０を得る（図１の（ｂ））。毛髪サンプル１０の厚さは特に限定されないが、１０ｎｍ〜５００μｍ程度を目安とすることができる。また、作製される毛髪サンプル１０の形状は薄片に限定されず、毛髪１を複数箇所で切断した断面が得られれば充分である。
【００３２】
毛髪サンプル１０を得る間隔（ｌ）は、必要となる時間分解能に応じて適宜設定すればよい。例えば、毛髪が頭髪である場合は、１箇月間に約１ｃｍ伸長する。このため、ｌ＝１ｃｍで毛髪サンプル１０を切り出せば、時間分解能が１箇月である生理活性物質の経時的変化を表すデータが得られる。
【００３３】
ここで、毛髪サンプル１０は、生理活性物質の蓄積量を測定する直前に作製されたものであってもよいし、事前に作製されたものであってもよい。しかし、毛髪に含まれる生理活性物質のうち、その存在量が毛髪採取からの時間経過により変化しやすいものに関しては、生理活性物質を正確に測定するという観点から、測定の直前に作製した毛髪サンプル１０用いることが好ましい。
【００３４】
毛髪１を切断するときの方向は特に限定されず、毛髪の成長軸に対して、垂直であってもよく、斜交していてもよく、平行であってもよい。このことを、図２に基づいて説明する。図２は、毛髪１の切断面を規定する座標を表す図である。上記座標において、Ｙ軸は毛髪１の成長軸であり、太い矢印は切断面の法線ベクトル（すなわち、切断面に対して垂直な方向ベクトル）である。このとき、上記法線ベクトルは、０°≦θ≦１８０°および０°≦φ≦１８０°の範囲で、任意に定めうる。
【００３５】
また、切断工程においては、毛髪を完全に切断する代わりに、毛髪の一部を切り欠いて毛髪断面を露出させてもよい。毛髪の一部を切り欠く切断工程に関する説明は、実施形態６にて後述する。
【００３６】
反応工程では、切断工程において形成された毛髪の断面に対して、生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる。上記工程について、まず、使用する抗体に関する一般的な説明を行い、次いで図３に基づいて説明する。
【００３７】
反応工程では、免疫染色に関する公知の手法を用いることができる。このような手法は、例えば、［高田邦昭、斎藤尚亮、川上速人 編『染色・バイオイメージング実験ハンドブック』羊土社、２００６年（実験医学別冊）］を参照することができる。
【００３８】
実施形態１では、生理活性物質を認識する一次抗体と結合している標識を検出する方法（直接法）を採用する。上記一次抗体と結合している標識は、例えば、色素、蛍光色素、放射性同位体、酵素、マイクロ・ナノ微粒子（金属微粒子（金微粒子、銀微粒子など）、量子ドット（組成がＣｄＳｅである量子ドットなど）、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズなど）でありうる。標識として色素または蛍光色素を用いる場合は、当該色素または蛍光色素から放出される光を検出すればよい。標識として放射性同位体を用いる場合は、当該放射性同位体から放出される放射線を検出すればよい。標識として酵素を用いる場合は、当該酵素が関わる反応を利用した検出を行えばよい。標識としてマイクロ・ナノ微粒子を用いる場合は、当該微粒子の表面に結合している、または当該微粒子に内包されている標識物質（色素、蛍光色素、放射性同位体、酵素など）に応じた検出を行えばよい。あるいは、上記微粒子の物理的性質を利用した方法により検出を行えばよい（例えば、表面プラズモン共鳴などによる光散乱、吸光度などを検出することができる）。
【００３９】
検出機器の小型化が可能であるとの観点からは、標識として蛍光色素を用いることが好ましい。これは、蛍光色素の検出に用いる光検出素子（フォトダイオード、フォトトランジスタ、ＣＭＯＳ（complementary metal-oxide semiconductor）撮像素子、ＣＣＤ（charge-coupled device）撮像素子など）や励起光源素子（半導体レーザー、高輝度ＬＥＤなど）は、小型で安価なものが工業的に広く用いられているためである。また、蛍光色素標識は、放射性同位体とは異なり、取り扱うための特別な施設も必要としない点においても好ましい。さらに、蛍光色素標識は、研究室レベルで普及している蛍光顕微鏡で検出することも可能である点においても好ましい。
【００４０】
なお、実施形態１では、一次抗体と標識抗体とを直接結合した標識（コンジュゲート）を作製し、抗原を染色する方法を用いてもよい。
【００４１】
免疫染色に用いる一次抗体は、当該一次抗体が認識する抗原（生理活性物質）に応じて、適宜決定すればよい。例えば、コルチゾールを抗原とする場合は、抗コルチゾール抗体を用いればよい。
【００４２】
抗体と蛍光色素とは、公知の技術により結合させられる。耐光性の観点からは、抗体と反応して結合を形成しうる官能基を有する蛍光粒子中に、蛍光色素が内包されている状態が好ましい。このとき、上記蛍光色素は、ナノ粒子によって内包されて蛍光粒子を形成し、上記ナノ粒子と抗体との間に結合が形成される。上記ナノ粒子の成分の例としては、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、メラミン樹脂など、安定的に蛍光色素を内包できるものが挙げられる。
【００４３】
上記ナノ粒子に内包される蛍光色素の例としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などが挙げられる。あるいはAlexa Fluor（登録商標、Invitrogen社製）系色素分子、BODIPY（登録商標、Invitrogen製）系色素分子、Cy（登録商標、GE Healthcare製）系色素分子、DY系色素分子（登録商標、DYOMICS製）、HiLyte（登録商標、AnaSpec製）系色素分子、DyLight（登録商標、Thermo Fisher Scientific製）系色素分子、ATTO（登録商標、ATTO-TEC製）系色素分子、MFP（登録商標、Mobitec社製）系色素分子などを用いてもよい。
【００４４】
蛍光粒子と抗体との結合は、公知の手法が用いられる。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化などを用いることができる。
【００４５】
以下、図３に基づいて、反応工程をＳ１〜Ｓ４のステップに分けて説明する。Ｓ１〜Ｓ４は、毛髪サンプル１０のうち、１つの毛髪の断面近傍を拡大した模式図である。毛髪サンプル１０には、毛髪断面１１（内部に毛髄質断面１１ａを有する）の他に、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３が含まれている（Ｓ１）。
【００４６】
Ｓ２では、抗体用ブロッキング剤１２ａを毛髪サンプル１０に滴下し、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２をブロッキングする。これにより、一次抗体１４ａと、抗体が非特異的に結合しうる箇所１２と、の非特異的な結合を防止する。
【００４７】
Ｓ３では、蛍光色素用ブロッキング剤１３ａを毛髪サンプル１０に滴下し、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３をブロッキングする。これにより、蛍光色素１５と、蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所１３と、の非特異的な結合を防止する。
【００４８】
抗体用ブロッキング剤１２ａの例としては、人工合成ポリマー、正常血清、動物血清（ウサギ血清、ヤギ血清、ラット血清など）、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。蛍光色素用ブロッキング剤１３ａの例としては、FX signal enhancer（Thermo Fisher Scientific製）などバックグラウンド染色を低減させる試薬が挙げられる。また、サンプルにより蛍光色素用ブロッキング剤による処理を省略しても問題ないと判断できる場合は、上記の蛍光色素用ブロッキング剤による処理を省略してもよい。
【００４９】
Ｓ４では、特定の生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該生理活性物質と結合させる。ここで、一次抗体１４ａは、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記生理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａを介して、蛍光色素１５が結合することとなる。
【００５０】
なお、反応工程後の毛髪サンプル１０には、検出工程に必要な処理（例えば封入工程）を適宜施す。封入工程の具体例を挙げると、以下の通りである。
１．ＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）などの水性洗浄液で洗浄し風乾させる。
２．毛髪サンプル１０をスライドガラス上に載置し、封入剤を滴下する。
３．毛髪サンプルの上にカバーガラスを載置する。
【００５１】
封入工程で用いられる封入剤は、蛍光色素１５を光退色させることがなければ、特に限定されない。封入工程で用いられるカバーガラスおよびスライドガラスも、特に限定されない。
【００５２】
検出工程では、反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する。以下、検出工程で用いられる光学系の一例について、図４に基づいて説明する。
【００５３】
図４では、カバーグラス２１およびスライドグラス２２に挟まれて封入されている毛髪サンプル１０が、ステージ２３上に載置されている。毛髪サンプル１０に励起光３１が照射されることにより、中に含まれる蛍光色素１５から蛍光３２が発せられる。
【００５４】
このとき、励起光３１は、ダイクロイックミラー２５により反射され、光学レンズ２４を経由して毛髪サンプル１０に照射される。また、蛍光３２は、ダイクロイックミラー２５を透過して、フィルタ２６により特定波長成分のみが取り出される。
【００５５】
以上の構成を取ることにより、蛍光色素１５から発せられた蛍光３２を、少ないノイズで検出することができる。蛍光色素１５は、一次抗体１４ａに結合しており、一次抗体１４ａは生理活性物質に結合しているから、蛍光３２を検出することは、生理活性物質に結合している一次抗体１４ａを検出することになる。
【００５６】
蛍光３２は、蛍光顕微鏡の鏡筒から観察してもよいし、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラなどに検出させた結果を、モニターなどの表示手段に表示させてもよい。また、ＣＣＤカメラで撮像した画像（毛髪の断面における一次抗体１４ａの分布を蛍光によって表す画像）に対して画像解析を行い、蛍光分布を示す数値データを得てもよい。当該画像の解析方法については、実施形態５にて説明する。
【００５７】
もっとも、図４で説明されているのは、検出工程に用いることのできる光学系の一例に過ぎない。本開示の方法における検出工程は、反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出すれば足りるのであるから、蛍光３２を検出しているならば、検出工程として充分である。
【００５８】
なお、上記の説明は、標識として蛍光色素を用いる場合について成されている。他の種類の標識を用いる場合は、適宜、顕微鏡観察に関する技術常識により、上記の説明を読み換えればよい。
【００５９】
〔実施形態２〕
実施形態２では、生理活性物質と結合している抗体に対して、当該抗体を特異的に認識する二次抗体を反応させる二次反応工程をさらに含んでいる測定方法について説明する。実施形態２に係る構成によれば、生理活性物質をより高感度に検出することができる。
【００６０】
実施形態２では、免疫染色の方法として間接法を用いる。間接法とは、標識していない一次抗体を用いて１回目の抗原抗体反応を行い、次に一次抗体を特異的に認識する標識二次抗体を反応させる方法である。一般的に、実施形態１で説明した直接法に比べて、間接法の方が検出感度は高い。
【００６１】
以下、図５に基づいて、実施形態２に係る測定方法を説明する。なお、被検体から毛髪を採取する工程（採取工程）、上記毛髪に切断面を形成する工程（切断工程）および生理活性物質と結合した抗体を検出する工程（検出工程）については、実施形態１に記載の通りである。また、上記毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる工程（反応工程）に係る抗体および蛍光色素に関する説明も、実施形態１に記載の通りである。
【００６２】
抗体を反応させる前の状態（Ｓ１ａ）、抗体用ブロッキング剤を作用させる工程（Ｓ２ａ）、蛍光色素用ブロッキング剤を作用させる工程（Ｓ３ａ）は、それぞれ、実施形態１（図３）におけるＳ１、Ｓ２、Ｓ３と同じである。
【００６３】
Ｓ４ａでは、特定の生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該生理活性物質と結合させる。実施形態１と異なり、実施形態２では、一次抗体１４ａに蛍光色素が結合されていない。
【００６４】
Ｓ５ａでは、一次抗体１４ａを特異的に認識する二次抗体１４ｂを、毛髪サンプル１０に滴下し、一次抗体１４ａと結合させる。ここで、二次抗体１４ｂは、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記生理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａおよび二次抗体１４ｂを介して、蛍光色素１５が結合することとなる。
【００６５】
＜実験例１＞
実施形態２に係る測定方法により、毛髪に含まれるコルチゾールの蓄積量の経時的変化を測定した。
【００６６】
まず、保護具（ゴーグルおよび手袋）を着用し、毛髪採取に用いる器具（実験台、医療用はさみ、クリップ、鏡など）に対し、非感染性処理を実施した。上記非感染性処理には、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（自家調製）を用いた。
【００６７】
その後、被験者自らが、頭髪を根元付近から採取した（５０〜１５０本程度）。
【００６８】
得られた毛髪のうち２０本程度を５０ｍＬ遠沈管へ入れ、当該遠沈管へ２−プロパノールを約４０ｍＬ注入した。次に、上記遠沈管を攪拌機（Thermo Fisher Scientific製）１０ｒｐｍにて３分間、転倒撹拌した。撹拌後、２−プロパノールを除去した。その後、上記と同じ条件で、再度毛髪を洗浄した。こうして処理された毛髪を、ペーパータオル上に置き、３０〜６０分間ほど風乾させた。
【００６９】
次に、包埋・切断工程について説明する。実験の前日に、LR White Acrylic Resin（Sigma Aldrich製）１９．８ｇと過酸化ベンゾイル（Sigma Aldrich製）８．０ｇとを混合し、室温にて一晩転倒撹拌させた。以下、上記の操作により調製された樹脂を、包埋用樹脂と称する。
【００７０】
２５ｍＬチューブへ、上記包埋用樹脂を５ｍＬ注入し、LR accelerator（Sigma Aldrich製）を約１００μＬ加え、即座に転倒撹拌した。毛髪をシリンジにセットし、そこへ上記包埋用樹脂を流し込み、包埋した。具体的には、以下の手順で行った。
１．２ｍＬシリンジ（テルモ製、テルモシリンジ）を２本用意し、これらの先端を樹脂製チューブ（Saint-Gobain製、TYGON（登録商標）チューブ）で連結した。
２．一方のシリンジのプランジャーを抜き去り、シリンジ内部に毛髪を挿入した。
３．上記シリンジ内部に包埋用樹脂を充填させた後、プランジャーを挿入した。
４．毛髪が入っているシリンジのプランジャーを押し、シリンジ内の余分な気泡や樹脂を、連結された他方のシリンジへ押し出した。
５．即座に氷水内へつけて冷却しながら、１時間ほどかけて上記包埋樹脂を硬化させた。
【００７１】
なお、包埋用樹脂を注入した際に気泡が混入した場合は、以下のように対処すればよい。
１．包埋用樹脂が注入されているシリンジの先端が上になるように、上記シリンジを鉛直方向に立てる。これにより、気泡をシリンジ先端へ移動する。
２．１の状態で、さらにプランジャーを押し込むことにより、もう一方のシリンジ側へ気泡を移動させる。
【００７２】
このようにして得られた包埋された毛髪を、図６の（ａ）に模式図で表す。包埋された毛髪に対して、根元に近い側から５ｍｍ間隔で、７つの部位を設定した（図６の（ａ）中、第１〜第７の部位）。その後、設定された７つの部位のそれぞれから、ミクロトーム（または治具（自作）およびカッターナイフ）を用いて２つずつ薄片状の毛髪サンプルを切り出した。上記薄片の厚さは、約３００μｍであった。
【００７３】
得られた薄片をマイクロチューブに入れ、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。
【００７４】
毛髪サンプルをマイクロチューブ内へ入れ、さらに一次抗体用ブロッキング剤として、１０％ゼラチン−ＰＢＳ（ｗ／ｖ）（Sigma Aldrich製ゼラチン（from cold water fish）を、和光純薬工業製１０×ＰＢＳ（−）により希釈したもの）を１ｍＬ、上記マイクロチューブへ注入した。上記マイクロチューブをタッピングした後、約１時間かけて上記一次抗体用ブロッキング剤を反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。
【００７５】
次に、蛍光色素用ブロッキング剤として、FX signal enhancer（Thermo Fisher Scientific製）を３滴程度（毛髪サンプルが浸漬する量）上記マイクロチューブへ注入し、約１時間かけて反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。
【００７６】
次に、１０％ゼラチン−ＰＢＳにて２００倍に希釈した抗コルチゾール抗体（Anti-Cortisol antibody XM210 ab1949、abcam製）を２００μＬ程度（毛髪サンプルが浸漬する量）、マイクロチューブへ注入し、約１時間かけて反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。
【００７７】
次に、１０％ゼラチン−ＰＢＳにて１００倍に希釈した蛍光標識二次抗体（ヤギ抗マウス抗体、Alexa Fluor（登録商標）488 Goat Anti-Mouse SFX kit（Thermo Fisher Scientific製）に附属）を２００μＬ程度（毛髪サンプルが浸漬する量）、マイクロチューブへ注入し、約１時間かけて反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。さらに、乾燥時にＰＢＳに含まれる塩が析出するのを防ぐため、および、蛍光検出の際のバックグラウンドを低減させるために、同様の洗浄操作を１．０ｍＬ程度の純水で１回行った。
【００７８】
次に、スライドガラス上へ毛髪サンプルを移し、毛髪サンプルが乾燥するまで風乾させた（３０〜６０分程度）。最後に、毛髪サンプル上へ褪色防止剤（ProLong（登録商標）Diamond、Thermo Fisher Scientific製）を滴下し、カバーガラスを被せた。
【００７９】
検鏡用に調製した毛髪サンプルを、蛍光顕微鏡下で観察し、コルチゾールの蓄積量の経時的変化を測定した。このとき、蛍光顕微鏡として、ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ（ニコン製）を用いた。励起光源として、AURA Light Engine（Lumencor製）を用い、中心波長４７５ｎｍ（半値全幅２８ｎｍ）の光線を照射した。ダイクロイックミラー（ニコン製、Ｂ−１Ａ）は、５０５ｎｍよりも短波長を反射させる設計とした。検出側に、フィルタ（ニコン製、Ｂ−１Ａ）を使用し、５３５ｎｍ未満の波長を遮断した。蛍光の検出にはＥＭ−ＣＣＤ（浜松ホトニクス製）を使用した。
【００８０】
顕微鏡観察の結果を、図６の（ｂ）および（ｃ）に示す。図６の（ｂ）は、１〜７のそれぞれの部位から切り出した毛髪サンプルの蛍光顕微鏡像（サンプルの一部を撮像したもの）である。それぞれの顕微鏡像について、黒い毛髪断面の中央に明部が認められることから、毛髄質にコルチゾールが局在していることが示された。
【００８１】
図６の（ｃ）は、第１〜第７の部位からそれぞれ切り出した毛髪サンプルにおける蛍光強度（輝度）を表すグラフである。各毛髪サンプルに含まれる複数の毛髪断面のそれぞれについて、毛髄質部分の蛍光強度のピーク値を測定し、第１〜第７の各部位ごとに、毛髪断片１つ当たりの蛍光強度の平均値を算出した。グラフより、第５の部位におけるコルチゾール濃度が高いことが判った。このことから、第５の部位に対応する時期（すなわち、毛髪の採取から２．５箇月前）において、被検体の経験した慢性ストレスが高かったことが示唆される。
【００８２】
＜実験例２＞
実験例１と同様の手順により、毛髪として「途中から黒染めされている白髪」を用いて、毛髪中のコルチゾールの蓄積量の経時的変化を測定した。包埋された毛髪に対し、実験例１と同様に、根元に近い側から５ｍｍ間隔で、第１〜第７の部位を設定した。このうち第１〜第４の部位は白髪であり、第５〜第７の部位は黒く染髪されていた。
【００８３】
顕微鏡観察の結果を、図７の（ｂ）に示す。それぞれの顕微鏡像について、毛髪断面の中央に明部が認められることから、毛髄質にコルチゾールが局在していることが示された。また、白髪という内因的な毛髪の変化、および染髪という外因的な毛髪の変化にもかかわらず、実施形態２に係る方法により、コルチゾールの存在を確認することができた。
【００８４】
〔実施形態３〕
実施形態３では、一次抗体および／または二次抗体に対する、他の化合物との反応を含む測定方法について説明する。実施形態３に係る構成によれば、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化に関するデータを取得する際に、さらに生理活性物質を高感度に検出することができる。
【００８５】
他の化合物との反応を含む測定方法の例としては、ＡＢＣ（Avidin-Biotin Complex）増感法、ＴＳＡ（Thyramide signal amplification）増感法が挙げられる。ＡＢＣ増感法は、アビジンとビオチンとが複合体を形成する現象を利用して、免疫染色の感度を向上させる方法である。ＴＳＡ増感法は、過酸化水素存在下にてＨＲＰの触媒作用により近傍の芳香族分子に結合する、というチラミドの性質を利用して、免疫染色の感度を向上させる方法である。以下、例として、ＡＢＣ増感法による免疫染色の工程を、図８に基づいて説明する。
【００８６】
Ｓ４ｂより前の工程（抗体用ブロッキングおよび蛍光色素用ブロッキング）までは、実施形態１と同様である。
【００８７】
Ｓ４ｂでは、まず、特定の生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該生理活性物質と結合させる。このとき、実施形態２と同様に、一次抗体１４ａには蛍光色素が結合されていない。
【００８８】
Ｓ５ｂでは、一次抗体１４ａを特異的に認識する二次抗体１４ｂを、毛髪サンプル１０に滴下し、一次抗体１４ａと結合させる。ここで、二次抗体１４ｂは、ビオチン１６と予め結合されている。
【００８９】
Ｓ６ｂでは、ビオチン１６と特異的に結合するアビジン１７を、毛髪サンプル１０に滴下し、ビオチン１６と結合させる。ここで、ビオチン１６は、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記生理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａ、二次抗体１４ｂ、ビオチン１６およびアビジン１７を介して、蛍光色素１５が結合することとなる。
【００９０】
ここで、アビジン１７は、ビオチン１６に対して高度の親和性および特異性をもって結合することによって機能的に定義される、一連のタンパク質（アビジン類）である。アビジン類の例としては、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが挙げられる。
【００９１】
＜実験例３＞
実施形態３に係る測定方法（ＡＢＣ増感法）により、毛髪に含まれるコルチゾールの蓄積量を測定した。
【００９２】
毛髪を採取、包埋、切断して毛髪サンプルを作製する手順は、実験例１に記載の通りである。
【００９３】
また、一次抗体として１０％ゼラチン−ＰＢＳにて２００倍に希釈した抗コルチゾール抗体（Anti-Cortisol antibody XM210 ab1949、abcam製）を使用し、実験例２と同様の手順で反応させ、洗浄した。ネガティブコントロールとしては、上記抗体の代わりに、１０％ゼラチン−ＰＢＳを使用した以外は、同様に処理した。
【００９４】
次に、１０％ゼラチン−ＰＢＳにて２００倍に希釈したビオチン化抗体（Thermo Fisher Scientific製、Biotin-XX goat anti-mouse IgG(H+L)）を１５０μＬ程度（毛髪サンプルが浸漬する量）、マイクロチューブへ注入し、約１時間かけて反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。
【００９５】
次に、１０％ゼラチン−ＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに希釈した蛍光標識ストレプトアビジン（Thermo Fisher Scientific製、Streptavidin, Alexa Fluor（登録商標）488 conjugate）を１００μＬ程度（毛髪サンプルが浸漬する量）、マイクロチューブへ注入し、約１時間かけて反応させた。そして、１×ＰＢＳを１．０ｍＬ、精密ピペットおよびディスポーザブルピペットチップを用いて量り取り、上記マイクロチューブ内へ注入、タッピングした。その後、吸引によりＰＢＳを除いた。この工程を３回繰り返し、毛髪サンプルを洗浄した。さらに、同様の洗浄操作を１．０ｍＬ程度の純水で行った。
【００９６】
次に、スライドガラス上へ毛髪サンプルを移し、毛髪サンプルが乾燥するまで風乾させた（３０〜６０分程度）。最後に、毛髪サンプル上へ褪色防止剤（ProLong（登録商標）Diamond、Thermo Fisher Scientific製）を滴下し、カバーガラスを被せた。
【００９７】
検鏡用に調製した毛髪サンプルを、蛍光顕微鏡下で観察し、コルチゾールの存在を確認した。このとき、蛍光顕微鏡として、ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ（ニコン製）を用いた。励起光源として、AURA Light Engine（Lumencor製）を用い、中心波長４７５ｎｍ（半値全幅２８ｎｍ）の光線を照射した。ダイクロイックミラー（ニコン製、Ｂ−１Ａ）は、５０５ｎｍよりも短波長を反射させる設計とした。検出側に、フィルタ（ニコン製、Ｂ−１Ａ）を使用し、５３５ｎｍ未満の波長を遮断した。蛍光の検出にはＥＭ−ＣＣＤ（浜松ホトニクス製）を使用した。
【００９８】
結果を表す顕微鏡像を、図９に示す。図９の上段は一次抗体による反応を行った毛髪サンプル、下段はネガティブコントロールである。図９に示されている通り、毛髄質において最も強い蛍光が認められた。すなわち、毛髄質にコルチゾールが局在していることが示された。この手法を用いることにより、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化に関するデータを取得できる。
【００９９】
〔実施形態４〕
実施形態４では、生理活性物質の蓄積量を定量する定量工程を含む測定方法について説明する。実施形態４に係る構成によれば、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化に関するデータを取得する際に、検出された蛍光強度に応じて生理活性物質の蓄積量を定量することができる。
【０１００】
定量工程とは、免疫染色された毛髪サンプルから得られる蛍光強度と、上記毛髪に含まれる生理活性物質の蓄積量の絶対量とを、関連付ける工程である。この関連付けのために、予め、測定対象となる毛髪（対象毛髪）と類似した別の毛髪（比較毛髪）における生理活性物質の濃度を、抗体を用いた蛍光染色とは別の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）で定量的に測定しておく。上記比較毛髪とは、対象毛髪とほぼ同じ量の生理活性物質を蓄積していると推定される毛髪であり、例えば、対象毛髪の近傍に生えている毛髪である。
【０１０１】
比較毛髪の特定部位における生理活性物質の濃度と、対象毛髪の、上記特定部位に対応する部位における蛍光強度とを対応付けるという処理を、複数の蛍光強度について行うことにより、免疫染色による蛍光強度と、実際の生理活性物質の濃度とを対応付ける検量線を作成することができる。
【０１０２】
または、比較毛髪の代わりに、既知の濃度の生理活性物質を含む人工的なサンプルを作製し、当該サンプルに対して、対象毛髪に施す免疫染色と同様の免疫染色を行うことにより、免疫染色における蛍光強度と生理活性物質の濃度との関係を示す検量線を得ることができる。上記人工的なサンプルを作製する方法として、ドットプロット法が挙げられる。
【０１０３】
このように導出された検量線は、以降の毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化の測定に流用することもできる。
【０１０４】
以下、ＥＬＩＳＡ法およびドットプロット法について順に説明する。
【０１０５】
ＥＬＩＳＡは、サンプルに含まれる特定の生理活性物質を測定する一般的な手法であり、濃度既知の希釈系列を用いることによって、測定結果を定量することができる。具体的な操作手順は、例えば、ＥＬＩＳＡ用キットに添付のプロトコールに従うことができる。
【０１０６】
実施形態４において、蛍光強度と生理活性物質の蓄積量（濃度）との関係を表す検量線を、ＥＬＩＳＡによって導出するためには、（１）毛髪中の特定部分（免疫染色用の毛髪サンプルを切り出す部分と対応する部分）における生理活性物質の蓄積量をＥＬＩＳＡで測定し、次いで（２）生理活性物質の蓄積量と蛍光強度との相関を求めればよい。以下、生理活性物質をコルチゾールとして、具体的な操作手順の一例を示す。
【０１０７】
１．ＥＬＩＳＡ用に被検体から毛髪を採取する（より具体的な方法は、実験例１を参照）。上記毛髪は、免疫染色用に被検体から採取した毛髪と、同じ部分に生えているものとすることが好ましい。
【０１０８】
２．採取したＥＬＩＳＡ用の毛髪を、適当な長さに切り出す。このとき、ＥＬＩＳＡ用の毛髪から切り出す部分は、免疫染色用の毛髪から毛髪サンプルを作製する部分に対応している。例えば、免疫染色用の毛髪の根元側から０〜１ｃｍの部分を切り出して、毛髪サンプルを作製する場合は、ＥＬＩＳＡ用の毛髪の根元側から０〜１ｃｍの部分を切り出して、ＥＬＩＳＡによる測定を行う。
【０１０９】
３．切り出した毛髪をマイクロチューブに（トミー精工製、ＴＭ−６２５Ｓ）３ｍｇ入れ、イソプロピルアルコール（キシダ化学製、２−プロパノール  高速液体クロマト用、製品番号１４０−６４７８１）１ｍＬを加える。攪拌機（アズワン製、ＡＣＲ−１００）にセットし、１０ｒｐｍにて３分間攪拌した後、イソプロピルアルコールを除く。以上の工程を３回程度繰り返し、毛髪を洗浄する。
【０１１０】
４．ビーズ式細胞破砕機（トミー精工製、ＭＳ−１００Ｒ）およびジルコニア製ビーズ（トミー精工製、ＺＢ−２０、直径２．０ｍｍ）を用いて、回転数４０００ｒｐｍ、破砕時間６０秒間の条件で毛髪を粉砕する。冷却時間を１分間以上空けて、毛髪が充分に粉砕されるまで、上記の条件による粉砕を繰り返す。
【０１１１】
５．マイクロチューブに、４で粉砕された毛髪を入れ、メタノール（和光純薬工業製、メタノール（ＬＣ／ＭＳ用）、製品番号１３８−１４５２１）１．５ｍＬを加える。これを、室温において１０ｒｐｍにて１６〜２４時間、転倒攪拌しながらコルチゾールを抽出する。
【０１１２】
６．コルチゾールの抽出工程の終了後、遠心分離機（日立工機製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ−１５ＲＸ）により、６５００Ｇにて５分間遠心分離する。固液分離後の上澄み液を取り出し、遠心濃縮機（トミー精工製、ＭＶ−１００）を用いて、メタノールを蒸発させる。これにより、コルチゾールを含む固形物が乾固する。
【０１１３】
７．コルチゾール濃度の決定には、唾液用ＥＬＩＳＡ測定キット（Salimetrics製、Cortisol EIA Kit）を転用して用いる。以下のサンプルを、２ウェルずつ、１ウェルあたり２５μＬを加える。
・６で得た固形物を、２００μＬのASSAY diluentに希釈した溶液
・コントロール溶液（既知濃度のコルチゾール溶液）
・コルチゾール標準溶液（キット附属、６系列、検量線作成用）
・Assay diluent（キット附属、ゼロコントロールおよび非特異的結合用）
８．最終濃度に希釈した酵素コンジュゲート（ＨＲＰとコルチゾールの複合体）溶液を２００μＬ、各ウェルに加える。５分間攪拌し、室温にて１時間かけて反応させる。このとき、サンプル溶液、コントロール溶液および標準溶液中のコルチゾールは、上記酵素コンジュゲートと競争的に抗コルチゾール抗体に結合する。
【０１１４】
９．３００μＬの洗浄バッファー（ＰＢＳを主成分とする）でウェルを４回洗浄する。抗コルチゾール抗体に結合していないコルチゾールは、この段階で洗い流される。
【０１１５】
１０．テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに２００μＬずつ加える。ＴＭＢは酵素コンジュゲートに含まれるＨＲＰと反応し、呈色する。その後、STOP solution（キット附属のメタンスルホン酸）５０μＬを滴下し、酵素反応を停止させる。
【０１１６】
１１．プレートリーダー（PerkinElmer製、ARVO-MX）を用いて、４５０ｎｍおよび４９０ｎｍの吸光度を測定する。
【０１１７】
１２．以下の手順により、毛髪中のコルチゾール濃度を算出する。
・同じサンプルを含んでいる、２つのウェルの平均光強度を算出する。
・ゼロコントロール、標準溶液、コントロール溶液、毛髪サンプルの各光学強度から、非特異的結合の光強度を差し引く。
・各ウェル光学強度（Ｂ）を、ゼロコントロールの平均光学強度（Ｂ０）で除す。これにより、規格化された抗コルチゾール抗体に対する酵素コンジュゲートの結合率（Ｂ／Ｂ０）を算出する。
・得られた標準溶液の吸光度から検量線を作成する。４−パラメータ非線形回帰曲線を推奨されるため、逆シグモイド関数（４−パラメータ）でフィットする。
・得られた検量線から、毛髪サンプルのコルチゾール濃度を定量する。コントロール溶液の濃度も定量し、測定の精度を確認する。
【０１１８】
以上の過程を経ることにより、実験例１〜３の方法により測定された蛍光強度と、毛髪に含まれるコルチゾール濃度とを関連付けることができる。すなわち、毛髪サンプルから測定された蛍光強度（既知量）と、上記毛髪サンプルに対応する毛髪の部分におけるコルチゾール濃度（既知量、ＥＬＩＳＡにて定量）が判明しているため、蛍光強度と上記毛髪サンプルに含まれるコルチゾール濃度との相関を表す式が得られる。したがって、このような相関を表す式を一度作成したならば、以降はＥＬＩＳＡを伴わなくとも、免疫染色の結果からコルチゾール濃度を算出することができる。
【０１１９】
次に、ドットプロット法により、毛髪サンプルの発する蛍光強度から、毛髪サンプルに含まれる生理活性物質の蓄積量（濃度）を定量する方法について、以下に一例を示す。
１．目的とする生理活性物質の希釈系列（濃度既知）を、膜上にドットプロットする。
２．毛髪サンプルに施す免疫染色と同条件で（例えば、実施形態１〜３に記載の条件で）、上記膜上のドットプロットを免疫染色する。
３．ドットプロットした膜の蛍光強度（単位面積あたりの蛍光強度）を測定する。ドットプロットは濃度既知の生理活性物質溶液であるから、蛍光強度と生理活性物質濃度との相関を示す検量線が得られる。
４．３で得られた検量線に基づいて、毛髪サンプルの発する蛍光強度から、毛髪サンプルに含まれる生理活性物質の濃度を算出する。
【０１２０】
上記膜はＰＶＤＦ膜、ニトロセルロース膜など公知のものが使用可能である。また、目的の生理活性物質の希釈系列の濃度範囲は、適宜定めうる。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡを用いる方法と同様に、蛍光強度と生理活性物質濃度との相関を示す検量線が一度得られれば、以降はドットプロットを伴わなくとも、免疫染色の結果から生理活性物質濃度を算出することができる。
【０１２２】
〔実施形態５〕
実施形態５では、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、（１）上記毛髪の少なくとも一部を上記毛髪の成長軸方向に沿って切断する切断工程と、（２）上記切断によって生じた断面に対して、上記生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる反応工程と、（３）上記反応工程にて上記生理活性物質と結合した抗体を検出する検出工程と、を含む測定方法について説明する。実施形態５に係る測定方法によれば、生理活性物質の蓄積量の経時的変化を、連続的なデータとして得ることができる。
【０１２３】
以下、図１０に基づいて、実施形態５に関わる測定方法の、切断工程を説明する。なお、被検体から毛髪を採取する工程（採取工程）、上記毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる工程（反応工程）および生理活性物質と結合した抗体を検出する工程（検出工程）については、実施形態１に記載の通りである。
【０１２４】
図１０の（ａ）は、毛髪を成長軸方向に切断する切断方法の一例を表す模式図である。同図は、成長軸方向に切断された毛髪１を、横側から（切断面の正面から）見た図である。毛髪１は成長軸方向に切断されているので、毛髪断面１１は毛髪１の成長軸に沿って形成されており、毛髄質断面１１ａも同様に毛髪１の成長軸に沿って形成されている。
【０１２５】
このため、Ａに近い毛髪断面からは、より新しい時期に蓄積された生理活性物質の蓄積量が測定される。逆に、Ｂに近い毛髪断面からは、より古い時期に蓄積された生理活性物質の蓄積量が測定される。このような毛髪断面１１は、図２において、例えばφ＝０°とした場合に得られる。
【０１２６】
図１０の（ｂ）は、毛髪を成長軸方向に切断する切断方法の一例を表す模式図である。同図では、毛髪１は成長軸と斜交する平面に沿って切断されており、楕円形の毛髪断面１１および楕円形の毛髄質断面１１ａが形成されている。
【０１２７】
このため、Ｃに近い毛髪断面からは、より新しい時期に蓄積された生理活性物質の蓄積量が測定される。逆に、Ｄに近い毛髪断面からは、より古い時期に蓄積された生理活性物質の蓄積量が測定される。このような毛髪断面１１は、図２において、例えば、（φ＝９０°，θ＝７０〜８５°）とした場合に得られる。
【０１２８】
他にも、θ＝４５°とするなど、上記に説明した以外にも、測定系（毛髪の形状、検出系の光学配置など）や所望の時間分解能に応じて、適宜φおよびθの値を設定することができる。
【０１２９】
実施形態５に係る方法において、形成される断面の大きさは、必要とされる経時的変化の測定期間に応じて適宜設定すればよい。例えば、頭髪は１箇月に１ｃｍ程度伸長するから、ＡＢ間（ＣＤ間）が１ｃｍならば、１箇月間にわたる生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる。上記生理活性物質が毛髄質に蓄積しやすい物質（例えばコルチゾール）である場合は、毛髄質断面１１ａの大きさを、上記と同様に設定すればよい。
【０１３０】
＜実験例４＞
実施形態５に係る測定方法により、毛髪に含まれるコルチゾールの蓄積量の経時的変化を測定した。毛髪を成長軸方向に沿って切断した以外は、実験例１と同様の手順により、毛髪断面を免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１３１】
顕微鏡観察の結果を、図１１に示す。図１１の（ａ）は、観察した毛髪の断面を表す顕微鏡像である。約１００μｍ（０．１箇月の伸長に相当）にわたり、成長軸に沿った毛髪断面が得られた。図１１の（ｂ）は、上記成長軸に沿った毛髪断面のうち、約７０μｍの部分について、蛍光強度の推移を表したグラフ（下段）である。蛍光強度の推移は、毛髪中におけるコルチゾール蓄積量の推移を反映しており、被検体の経験したストレスの度合いの推移に相関があると考えられる。図１１の（ｃ）は、上記蛍光強度分布をヒートマップで表した図である。同図によっても、蛍光強度が成長軸に沿って変化している（画面左側が概ね高く、画面右側が概ね低い）ことが判る。
【０１３２】
このように、実施形態５に係る測定方法により、毛髪に含まれるコルチゾールの蓄積量の経時的変化が、連続的に測定できることが示された。
【０１３３】
〔実施形態６〕
実施形態６では、毛髪に切断面を形成する工程（切断工程）における毛髪の切断方法について、実施形態１、５とは異なる例を説明する。
【０１３４】
図１２の（ａ）は、毛髪１の複数箇所をＶ字型に切り欠いている。また、毛髪１が包埋されている包埋剤２を完全に切断していない（Ｖ字型の谷間部分より下部にある樹脂は、切断されずにつながっている）。このため、同じ毛髪１に由来する複数の毛髪断面１１が、１つの切片上に露出していることになる。
【０１３５】
これによって、同じ毛髪１に由来する複数の毛髪断面１１を扱うにあたり、実施形態１〜５のように各々の薄片状の切片を異なるチューブで反応させるのではなく、１枚の切片として扱うことができる。その結果、以下のような利点が生じる。
１．毛髪１における生理活性物質の蓄積量を１回のスキャンで観測できるため、所望の時間分解能で測定することが容易になる。
２．複数のチューブで並行して操作を行う必要がなくなるため、作業の迅速化・省力化・高速化が達成できる。
３．１枚の切片を操作することになるため、免疫染色に関する条件を揃えることが容易になり、測定の正確性・精度が向上する（チューブ間の誤差を除くことができる）。
４．切片の操作性が向上する。逆に、実施形態１〜５のような切断方法では、操作中（ピンセットで掴む、チューブ内で反応させる、など）に薄片状の切片が砕ける場合がある。
【０１３６】
なお、包埋剤２を完全には切断せずに切り欠く切断工程と、包埋剤２を完全に切断する切断工程とを組み合わせてもよい。この場合、１本または複数本の毛髪１から、「同じ毛髪１に由来する複数の毛髪断面１１が、１つの切片上に露出している」サンプルを、複数個作製することができる。
【０１３７】
図１２の（ｂ）は、図１２の（ａ）に示されている切断方法の変形例である。図１２の（ｂ）においては、毛髪１を完全には切断せずに、毛髪断面１１を露出させている点において、図１２の（ａ）とは異なる。このような毛髪断面１１を形成することによっても、図１２の（ａ）と同様の効果を得ることができる。
【０１３８】
図１２の（ｃ）は、毛髪１の短い部位を、さらに複数箇所で切断している。このような毛髪断面１１は、例えば、図２においてφ=９０°、θ＝８０°とすることにより得られる。このように切断することにより、同程度の成長期間に相当する毛髪断面１１が複数得られる。このため、毛髪１の上記部位における生理活性物質の蓄積量を複数回測定できることになるため、より正確に測定することができ、信頼性も向上する。
【０１３９】
このことを、図１２の（ｃ）に基づいて、より具体的に説明する。同図において、点Ａおよび点Ｂは、同じ伸長期間Ｔ（破線によって表されている）に相当する部位であると見做せる。しかし、点Ａと点Ｂとは、互いに異なる毛髪断面１１上に位置する。このため、伸長期間Ｔに相当する部位における、生理活性物質の蓄積量を、点Ａおよび点Ｂの２箇所で測定できることになり、測定値のサンプル数が増える。
【０１４０】
さらに、それぞれの薄片の厚さを、切断により得られる複数の毛髪断面１１が、毛髪１において同程度の伸長期間（Ｔ±ｔ）に相当するように設定することができる。例えば、全ての薄片を１箇月の伸長期間に相当する部分（頭髪の場合は、長さ１ｃｍに含まれる部分）から得ることができる。これにより、所定の伸長期間（Ｔ±ｔ）における、生理活性物質の蓄積量の測定値のサンプル数を、１本の毛髪１から多く確保することができる。
【０１４１】
なお、測定しようとする生理活性物質が毛髄質に蓄積する傾向がある場合は、上記点Ａおよび点Ｂが毛髄質断面１１ａ上に生じるように、毛髪１を切断すればよい。また、同じ伸長期間Ｔに相当すると見做せる部位は、点Ａおよび点Ｂの２点以外にも設定することができる。
【０１４２】
〔実施形態７〕
実施形態７では、毛髪における生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定する方法であって、上記毛髪の断面に対して、上記生理活性物質とは異なる第２の生理活性物質を特異的に認識する第２の抗体を反応させる第２反応工程をさらに含む測定方法について、説明する。実施形態７の構成によれば、２種類以上の生理活性物質の蓄積量を同時に測定することが可能である。
【０１４３】
以下、図１３に基づいて、実施形態７に係る測定方法を説明する。なお、被検体から毛髪を採取する工程（採取工程）、上記毛髪に切断面を形成する工程（切断工程）および生理活性物質と結合した抗体を検出する工程（検出工程）については、実施形態１に記載の通りである。また、上記毛髪の断面に対して生理活性物質を特異的に認識する抗体を反応させる工程（反応工程）に係る抗体および蛍光色素に関する説明も、実施形態１に記載の通りである。抗体を反応させる前の状態、抗体用ブロッキング剤を作用させる工程、蛍光色素用ブロッキング剤を作用させる工程は、実施形態１（図３）におけるＳ１〜Ｓ３と同じであるため、図１３からは省略する。
【０１４４】
抗体を反応させる工程には、（１）２種類以上の抗体を混合して反応させる方法と、（２）２種類の抗体を１種類ずつ反応させる方法とがある。作業工程数を減らせるという観点からは、（１）の方法が好ましい。一方、（１）では染色が弱い場合または染色にむらが生じる場合などには、（２）の方法を採用するとよい。なお、例えば間接法により免疫染色を行う場合に、一次抗体の反応は（１）の方法で行い、二次抗体の反応は（２）の方法で行うというように、（１）および（２）の方法を併用してもよい。以下、（１）および（２）の方法について、順に説明する。
【０１４５】
図１３の（ａ）は、（１）２種類以上の抗体を混合して反応させる方法を示す模式図である。Ｓ４ｃでは、生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａ、および第２の生理活性物質を特異的に認識する第２の一次抗体１４ｃを、毛髪サンプル１０に混合状態で滴下し、当該生理活性物質および当該第２の生理活性物質とそれぞれ結合させる。
【０１４６】
Ｓ５ｃでは、一次抗体１４ａを特異的に認識する二次抗体１４ｂ、および第２の一次抗体１４ｃを特異的に認識する第２の二次抗体１４ｄを、毛髪サンプル１０に滴下し、一次抗体１４ａおよび第２の一次抗体１４ｃと結合させる。ここで、二次抗体１４ｂは、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａおよび二次抗体１４ｂを介して、蛍光色素１５が結合することとなる。同様に、第２の二次抗体１４ｄは、第２の蛍光色素１５ａと予め結合されているため、上記第２の生理活性物質の存在箇所には、第２の一次抗体１４ｃおよび第２の二次抗体１４ｄを介して、第２の蛍光色素１５ａが結合することとなる。
【０１４７】
図１３の（ｂ）は、（２）２種類の抗体を１種類ずつ反応させる方法を示す模式図である。Ｓ４ｄ１では、生理活性物質を特異的に認識する一次抗体１４ａを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該生理活性物質と結合させる。
【０１４８】
Ｓ４ｄ２では、第２の生理活性物質を特異的に認識する第２の一次抗体１４ｃを、毛髪サンプル１０に滴下し、当該第２の生理活性物質と結合させる。
【０１４９】
Ｓ５ｄ１では、一次抗体１４ａを特異的に認識する二次抗体１４ｂを、毛髪サンプル１０に滴下し、一次抗体１４ａと結合させる。ここで、二次抗体１４ｂは、蛍光色素１５と予め結合されているため、上記生理活性物質の存在箇所には、一次抗体１４ａおよび二次抗体１４ｂを介して、蛍光色素１５が結合することとなる。
【０１５０】
Ｓ５ｄ２では、第２の一次抗体１４ｃを特異的に認識する第２の二次抗体１４ｄを、毛髪サンプル１０に滴下し、第２の一次抗体１４ｃと結合させる。ここで、第２の二次抗体１４ｄは、第２の蛍光色素１５ａと予め結合されているため、上記第２の生理活性物質の存在箇所には、第２の一次抗体１４ｃおよび第２の二次抗体１４ｄを介して、第２の蛍光色素１５ａが結合することとなる。
【０１５１】
このようにして２種類の蛍光色素で異なる生理活性物質を免疫染色した場合、蛍光色素１５と第２の蛍光色素１５ａとして、互いに異なる蛍光の波長を呈する蛍光色素を用いることにより、同じ毛髪サンプル１０に含まれる生理活性物質および第２の生理活性物質の蓄積量を測定することができる。
【０１５２】
＜実験例５＞
実施形態７に係る測定方法により、毛髪中に含まれるコルチゾールおよびＤＨＥＡの蓄積量を測定した。
【０１５３】
コルチゾールの染色には、一次抗体として２００倍希釈した抗コルチゾール抗体（Anti-Dehydroepiandrosterone Antibody, Rabbit-Polyclonal （ab35062）、abcam製）を、二次抗体として１００倍希釈したヤギ抗マウス抗体（Alexa Fluor（登録商標）488 Goat Anti-Mouse Antibody、Thermo Fisher Scientific製）を用いた。
【０１５４】
ＤＨＥＡの染色には、一次抗体として２００倍希釈した抗ＤＨＥＡ抗体（Anti-Dehydroepiandrosterone Antibody, Rabbit-Poly、Gene Tex製、カタログ番号：GTX10999）を、二次抗体として１００倍希釈したヤギ抗ウサギ抗体（Alexa Fluor（登録商標）647 GoatAnti-rabbit Antibody、Thermo Fisher Scientific製）を用いた。
【０１５５】
その他に用いた試薬は実験例１に準じており、下記表１に記載の通りである。なお、表中、「ＮＣ」はネガティブコントロール（Negative Control）を表す。
【０１５６】
【表１】
2019007834.tif 000003
【０１５７】
検鏡には、ＥＣＬＩＰＳＥ  ＴＥ２０００−Ｕ（ニコン製）を用いた。励起光源として、AURA Light Engine（Lumencor製）を用い、コルチゾールの検出には中心波長４７５ｎｍ（半値全幅２８ｎｍ）の光線を、ＤＨＥＡの検出には中心波長６４０ｎｍ（半値全幅３０ｎｍ）の光線を照射した。コルチゾールの検出には５０５ｎｍよりも短波長を反射させるダイクロイックミラー（ニコン製、Ｂ−１Ａ）を用い、ＤＨＥＡの検出には６６０ｎｍよりも短波長を反射させるダイクロイックミラー（Chroma製、41008）を用いた。また、コルチゾールの検出側には５３５ｎｍ未満の波長を遮断するフィルタ（ニコン製、Ｂ−１Ａ）、ＤＨＥＡの検出側には６６２ｎｍ未満の波長を遮断するフィルタ（Chroma製、41008）を配置した。その他の光学系の構成は、実験例１と同様である。
【０１５８】
免疫染色の結果を図１４に示す。図１４は、コルチゾールおよびＤＨＥＡの二重免疫染色の結果を示す像である。それぞれ、上段は一次抗体を反応させたサンプル、下段はネガティブコントロールに対応する。また、左列は５２０ｎｍの蛍光（コルチゾール用二次抗体が発する蛍光のピーク波長）、右列は６６９ｎｍの蛍光（ＤＨＥＡ用二次抗体が発する蛍光のピーク波長）を検出した結果である。
【０１５９】
上段の顕微鏡像から、コルチゾールに起因する蛍光およびＤＨＥＡに起因する蛍光が確認された。すなわち、同一のサンプルから、多種類の生理活性物質を同時に検出できることが示された。この手法を用いることにより毛髪における多種類の生理活性物質の蓄積量の経時的変化に関するデータを取得できる。
【０１６０】
〔実施形態８〕
実施形態８では、毛髪に蓄積された生理活性物質の蓄積量を測定する際に、毛髪として特に髭を用いる場合の測定方法について説明する。実施形態８に係る構成によれば、公知の脱毛用機器を用いて、毛髪をより容易に入手することができる。また、一般的に髭は太い毛髪であるため、毛髄質も太いと予想され、毛髄質に蓄積する傾向のある生理活性物質（例えば、コルチゾール）を検出しやすいという利点もある。
【０１６１】
毛髪として髭を用いる場合、髭の採取には電動髭剃り、手動髭剃り（剃刀）などを用いることができる。電動髭剃りには、脱毛処理後に当該電動髭剃りの刃を洗浄するものがある。この場合、脱毛処理後に電動髭剃りの刃を市販の電動髭剃り用洗浄液などで洗浄することにより、髭を含む粉末が得られる。
【０１６２】
その後、洗浄液を除き、免疫染色に適した緩衝液（ＰＢＳなど）による洗浄を経た後は、実施形態１と同様に包埋する（図１５。包埋剤２に髭１ａが包埋されている）。図１５に示される包埋状態の髭からは、切断して毛髪サンプルを作製することができ、実施形態１と同様にして生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定することができる。
【０１６３】
〔実施形態９〕
実施形態９では、実施形態１〜８において、毛髪中の生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定するときに用いられる、キットについて説明する。
【０１６４】
実施形態９に係るキットは、（１）毛髪を包埋するための包埋剤、および（２）上記毛髪に含まれる生理活性物質を特異的に認識する抗体を含んでいる抗体反応剤、を備えている。以下、順に説明する。
【０１６５】
包埋剤は、毛髪を切断して毛髪サンプルを作製する際に用いられる（図１、１５を参照）。包埋剤の主成分としては、パラフィン、セロイジン、ゼラチン、カーボワックス、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、シアノアクリレート、氷（凍結固定に適した精製水の氷）などを用いることができる。
【０１６６】
抗体反応剤は、毛髪に含まれる生理活性物質（例えば、コルチゾール）を特異的に認識する抗体を含んでいる。例えば、実施形態１のように、上記抗体として標識付けされた抗体を用いることにより、毛髪中に含まれる生理活性物質を検出することができる（直接法）。また、実施形態２のように、上記抗体反応剤に含まれている抗体を特異的に認識する二次抗体として標識付けされた抗体を用いることにより、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる（間接法）。さらに、実施形態３のように、ＡＢＣ増感法やＴＳＡ増感法などと組み合わせることによっても、毛髪中に含まれる生理活性物質をより高い感度で検出することができる。
【０１６７】
実施形態９に係るキットは、包埋剤および抗体反応剤の他に、キットの使用に必要となる薬剤（試薬、溶媒、緩衝液、洗浄剤など）、器具、容器（ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）、説明書などを備えていてよい。上述した薬剤、器具、容器、説明書などは、市場または通信回線などを通じて、別途使用者に入手させる態様を取ってもよい。
【０１６８】
〔実施形態１０〕
実施形態１０では、実施形態１〜８において、毛髪中の生理活性物質の蓄積量の経時的変化を測定するときに用いられる、装置について説明する。
【０１６９】
実施形態１０に係る装置は、反応工程にて生理活性物質と結合した抗体に依存して発生した蛍光を検出する。このため、上記装置は、蛍光を検出する部材（ＣＣＤ撮像素子、ＣＭＯＳ撮像素子、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタなど）を備えている。また、上記装置は、任意構成として、蛍光を励起する部材（レーザー、ＬＥＤ、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプなど）を備えていてもよい。
【０１７０】
その他の光学部材・素子を組み合わせた光学系の一例が、図４に示されている。図４に示されている光学系に関する説明は、実施形態１に記載の通りである。
【０１７１】
なお、放射線標識された抗体を用いて免疫染色を行う場合は、反応工程にて生理活性物質と結合した抗体に依存して発生した放射線を検出する構成とすればよい。このような装置は、当該分野における公知技術によって、適宜組み立てることができる。
【０１７２】
また、酵素標識された抗体を用いて免疫染色を行う場合は、当該酵素が関わる反応（例えば呈色反応）を検出する構成とすればよい。このような装置は、当該分野における公知技術によって、適宜組み立てることができる。
【０１７３】
さらに、微粒子標識された抗体を用いて免疫染色を行う場合は、当該微粒子に含まれる標識物質（色素、蛍光色素、放射性同位体、酵素など）を検出する構成とすればよい。あるいは、上記微粒子の物理的性質（表面プラズモン共鳴など）を利用する検出を行う構成とすればよい。このような装置は、当該分野における公知技術によって、適宜組み立てることができる。
【０１７４】
〔変形例１〕
実施形態１〜３は、実施形態４〜７と任意に組み合わせうる。すなわち、本明細書に記載されている測定方法は、直接法によっても、間接法によっても、実施することができる。より具体的には、蛍光色素は、一次抗体と連結されていてもよいし、二次抗体と連結されていてもよいし、アビジンなど他の化合物に連結されていてもよい。
【０１７５】
また、実施形態３は、実施形態１、２のいずれとも組み合わせうる。すなわち、例えばＡＢＣ増感法において、ビオチン化される抗体（ビオチンと結合している抗体）は、一次抗体であってもよいし、二次抗体であってもよい。ＴＳＡ増感法など他の方法に関しても同様である。
【０１７６】
さらに、本開示の方法は、放射線標識された抗体、酵素標識された抗体、微粒子標識された抗体にも援用可能である。放射線標識された抗体を用いる場合は、検出工程で当該抗体が発する放射線を検出すればよい。酵素標識された抗体を用いる場合は、当該酵素が関わる反応を利用して、生理活性物質と結合した抗体を検出すればよい。微粒子標識された抗体を用いる場合には、当該微粒子が有する物理的な性質が関わる現象を利用した検出、または、当該微粒子に含まれる標識物質（色素、蛍光色素、放射性同位体、酵素など）に応じた検出をすればよい。
【０１７７】
〔変形例２〕
実施形態１、５、６における毛髪の切断方法は、他の実施形態と任意に組み合わせうる。すなわち、２〜４、７、８において、毛髪に形成される切断面は、実施形態１のように成長軸に対して垂直に近いものでも、実施形態５のように成長軸方向のものでも、実施形態６のように特殊な形状のものでもよい。
【０１７８】
〔変形例３〕
より精密な測定のためには、各毛髪サンプル１０に対してネガティブコントロールを用意し、毛髪サンプル１０における蛍光強度からネガティブコントロールにおける蛍光強度（バックグラウンド値）を減じた値を、測定値とすることができる。ここで、ネガティブコントロールは、一次抗体１４ａとの反応工程において、一次抗体１４ａを用いずに処理（例えば、一次抗体１４ａの希釈液（１０％ゼラチン−ＰＢＳなど）のみに、切断工程を経た毛髪断面を浸漬させる）する以外は、上述の毛髪サンプル１０の作製工程と同じ工程によって作製される。毛髪サンプル１０における蛍光強度と、バックグラウンド値とは、同じ条件で測定・処理される（例えば、いずれも毛髄質における蛍光強度の平均値を算出する、など）ことが好ましい。
【０１７９】
本開示の方法は、従来法よりも、ネガティブコントロールの条件を、実験群の条件と揃えやすい。例えば、以下の方法によれば、ネガティブコントロールと実験群との条件を揃えることができる。
１．包埋されている毛髪を、１つの平面に沿って切断する。このとき、毛髪の断面が２つ生じるため、一方を実験群、他方をネガティブコントロールとして使用する。
２．毛髪サンプルに対して、ネガティブコントロールの条件で反応させ、１回目の観察を行う。次に、同じ毛髪サンプルに対して、一次抗体との反応（および、任意で二次抗体との反応）を施し、２回目の観察を行う。
【０１８０】
なお、上述したネガティブコントロールを用いる測定は、上述したいずれの実施形態および変形例と組み合わせることができる。
【０１８１】
〔従来技術との比較〕
上記に説明した通り、本開示の方法は、従来技術と比較して簡便であることを特徴とする。一例を挙げると、本開示の方法は、毛髪の断面を作製すれば分析が可能なのであって、毛髪に対して破壊的な処理を加える必要がない。この点において、本開示の方法は、質量分析や液体クロマトグラフィを用いる方法とは異なっており、また優れている。
【０１８２】
本開示は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本開示の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【符号の説明】
【０１８３】
１：包埋された毛髪
１ａ：包埋された髭
１０：毛髪サンプル
１１：毛髪断面
１１ａ：毛髄質断面
１２：抗体が非特異的に結合しうる箇所
１２ａ：抗体用ブロッキング剤
１３：蛍光色素が非特異的に結合しうる箇所
１３ａ：蛍光色素用ブロッキング剤
１４ａ：一次抗体
１４ｂ：二次抗体
１４ｃ：第２の一次抗体
１４ｄ：第２の二次抗体
１５：蛍光色素
１５ａ：第２の蛍光色素
１６：ビオチン
１７：アビジン
２１：カバーガラス
２２：スライドガラス
２３：ステージ
２４：光学レンズ
２５：ダイクロイックミラー
２６：フィルタ
３１：励起光
３２：蛍光
【図１】
2019007834.tif 000004
【図２】
2019007834.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019007834.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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