(57)【要約】【課題】本発明は、白斑の治療につながる、メラノサイトを保護できる外用剤を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の課題を解決するために、ショウガオールを含むメラノサイトを保護するための外用剤、ショウガオールを含む皮膚への光線照射と併用される外用剤、及びショウガのゴマ油抽出物及びトコフェロールを含む外用剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウガオールを含む、メラノサイトを保護するための外用剤。
【請求項２】
ショウガオールをショウガのゴマ油抽出物として含む、請求項１に記載の外用剤。
【請求項３】
前記外用剤が疎水性である、請求項１又は２に記載の外用剤。
【請求項４】
前記外用剤が白斑改善用である、請求項１から３のいずれか一項に記載の外用剤。
【請求項５】
ショウガオールを含む、皮膚への光線照射と併用される外用剤。
【請求項６】
ショウガオールをショウガのゴマ油抽出物として含む、請求項５に記載の外用剤。
【請求項７】
ショウガのゴマ油抽出物、及びトコフェロールを含む、外用剤。
【請求項８】
前記ショウガのゴマ油抽出物がメラノサイトに対して抗酸化作用を有する、請求項７に記載の外用剤。
【請求項９】
前記外用剤が白斑改善用である、請求項７又は８に記載の外用剤。
【請求項１０】
前記外用剤が疎水性である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトを保護するための外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる白斑は、医学的には尋常性白斑と呼ばれ、古くは旧約聖書にも記述があり、致命的ではないものの患者のＱＯＬを大きく損なう疾患である。発症率は１％程度と言われているが、人種間で発症率に差がある可能性もあり正確な数字は不明である。白斑は、旧約聖書およびそれを引用している新約聖書やコーランにも記述があることから、宗教的な差別を受ける原因となるため、中東や東南アジア地域では効果的な治療法が切望されている。日本においてはそれほど有名な疾患ではなかったが、近年化粧品に含まれる化合物が原因の白斑が発生し、商品回収となったことなどで認知度が上がった。日本においては宗教的な差別の原因にはならず、もともと肌の色が薄いためか、従来はそれほど治療に対する要求が強くはなかったが、発症率を勘案するならば、潜在的な治療への欲求は決して低くはないと予想される。
【０００３】
白斑の治療法としては、現在は光線治療が中心であり、タクロリムスやビタミンＤなどの薬剤も治療に使用される場合もある（非特許文献１）。また、メラニン生成を促進する化合物としてフラボン類が報告されており、その他天然物を利用した白斑の治療法（特許文献１〜４）や、いくつかの民間療法も存在する。
【０００４】
白斑は何らかの自己免疫反応によって引き起こされる、ないしは増悪することが知られているが、最近の研究によると、炎症性サイトカインにより活性化したＴ細胞が重要な役割をもっていることが分かってきている（非特許文献２）。また、白斑の患者のメラノサイトは、健常人のものと比べて酸化ストレスに対して脆弱であり、これが白斑の原因のひとつであると考えられている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許５７６９３８７号
【特許文献２】特開２００４−２２６４号
【特許文献３】特開平５−２７９２２５号
【特許文献４】特開平９−２６３５３４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】尋常性白斑診療ガイドライン．日皮会誌(2012), 122（7），1725-1740，
【非特許文献２】Pigment Cell Melanoma Res. (2011), Vol.25, 219-230
【非特許文献３】Journal of Investigative Dermatology (2014), 134, 2221-2230
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記白斑の治療法は、有効性は患者や疾患への特異性が高く効果的とは言い難い。現状の光線療法の問題点は大きく分けて２つある。ひとつは治療期間と設備の問題である。光線治療は専用の機械が必要であり、また治療期間は長い。したがって長期間の通院が必要となり、患者の治療に対するモチベーションを維持するのが難しい。特に低所得国においては、治療中のドロップアウトが頻繁に起こり改善に至らないケースが多い。もうひとつは局所的な“日焼け”の問題である。白斑病変の形状は正方形や円形では必ずしもないため、フォトマスクなどを用いても正常部位への光線の照射は完全には防げない。白斑治療している患者にしばしば見られる問題として、白斑周辺の正常部位が過剰に日焼けしてしまうことが挙げられる。
またフラボン類による治療法や民間療法も、有効性は不明である。したがって、現状、実用的に十分と言える治療薬はない。
【０００８】
上記のような課題から、白斑に対する効果的な治療法の開発が求められている。本発明は、白斑の治療につながる、メラノサイトを保護できる外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、ショウガオールにメラノサイトを保護する作用があることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．ショウガオールを含む、メラノサイトを保護するための外用剤。
項２．ショウガオールをショウガのゴマ油抽出物として含む、項１に記載の外用剤。
項３．外用剤が疎水性である、項１又は２に記載の外用剤。
項４．前記外用剤が白斑改善用である、項１から３のいずれか一項に記載の外用剤。
項５．ショウガオールを含む、皮膚への光線照射と併用される外用剤。
項６．ショウガオールをショウガのゴマ油抽出物として含む、項５に記載の外用剤。
項７．ショウガのゴマ油抽出物、及びトコフェロールを含む、外用剤。
項８．前記ショウガのゴマ油抽出物がメラノサイトに対して抗酸化作用を有する、項７に記載の外用剤。
項９．前記外用剤が白斑改善用である、項７又は８に記載の外用剤。
項１０．前記外用剤が疎水性である、項７〜９のいずれか一項に記載の外用剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、メラノサイトを保護することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】A：ケラチノサイトを６−ショウガオールで処理した際のHO-1、Gclc、Nqo1の発現を示す。B：メラノサイトを６−ショウガオールで処理した際のHO-1、Gclc、Nqo1の発現を示す。
【図２】A〜Cは、ケラチノサイトに酸化ストレスを負荷した場合のHO-1の発現を示す。Aは24時間後、Bは96時間後を示す。Cは、６−ショウガオール存在下で96時間酸化ストレスを負荷した場合のHO-1の発現を示す。D〜Fは、メラノサイトに酸化ストレスを負荷した場合のHO-1の発現を示す。Dは24時間後、Eは140時間後を示す。Fは、６−ショウガオール存在下で140時間酸化ストレスを負荷した場合のHO-1の発現を示す。
【図３】Aは、６−ショウガオールの非存在下、又は存在下で過酸化水素でメラノサイトに酸化ストレスを負荷した場合の生存率を示す。Bは、６−ショウガオールの非存在下、又は存在下でRhododendrolでメラノサイトに酸化ストレスを負荷した場合の生存率を示す。
【図４】Aは、６−ショウガオール非存在下で、過酸化水素処理されたメラノサイトの位相差顕微鏡像を示す。Bは、６−ショウガオール非存在下で、過酸化水素処理されたメラノサイトの位相差顕微鏡像を示す。
【図５】Aは、６−ショウガオールの非存在下、又は存在下で過酸化水素でメラノサイトに酸化ストレスを負荷した場合のチロシナーゼ遺伝子の発現を示す。Bは、６−ショウガオールの非存在下、又は存在下でRhododendrolでメラノサイトに酸化ストレスを負荷した場合のチロシナーゼ遺伝子の発現を示す。
【図６】６−ショウガオール、コウジ酸、Rhododendrolのチロシナーゼ阻害活性を示す。
【図７Ａ】生姜のゴマ油抽出物に含まれる生姜成分のHPLC−タンデム型質量分析の結果を示す。
【図７Ｂ】生姜のゴマ油抽出物に含まれる生姜成分のHPLC−タンデム型質量分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．外用剤
本発明にかかる外用剤は、ショウガオールを含む。ショウガオールとしては、６−ショウガオールが好ましい。ショウガオールは、単離されたものであってもよいが、ショウガオールを含む抽出液であってもよい。抽出液として好ましくは、生姜（生のもの、乾燥したものを含む）又は乾姜を原料（生姜及び乾姜を合わせて「生姜原料」と呼ぶ）とした溶媒抽出液を挙げることができる。生姜原料として、抽出効率から水分含有量の少ない乾燥生姜及び／又は乾姜を用いることが好ましい。抽出に用いる生姜原料は、粉末、顆粒、破砕物、スライス等の状態のものを使用することができる。乾燥生姜については、国内の漢方薬局から容易に調達することが可能である。
【００１３】
抽出のための溶媒は、ショウガオールを抽出できる限り制限されない。例えば、オリーブオイル、グレープシードオイル、ゴマ油等の植物油、ミネラルオイル等の疎水性溶媒を挙げることができる。皮膚との親和性や品質面での安定性の点からゴマ油が好ましい。ゴマ油としては、制限されないが、焙煎していないゴマ油を使用することが好ましい。焙煎したゴマ油は、加熱（１５０℃〜２２０℃程度）や脱臭の加工により成分が変性してしまうため、可能な限り搾油後の処置をしない油を選択するのが好ましい。
【００１４】
本発明においては、抽出操作を行う前に、使用する疎水性溶媒を８０〜１３０℃で３０分〜１時間程度加熱処理するのが好ましい。この処理により、刺激性のある揮発分を除去できることが期待される。
【００１５】
抽出液は、疎水性溶媒に生姜原料を浸漬し、３０分〜２４時間程度、好ましくは６〜８時間程度、常温（１５℃〜３５℃程度）で放置し、その後、濾過により原料して液層を回収することにより得ることができる。前記抽出液には、ジンゲロール（６−ジンゲロール、８−ジンゲロール、１０−ジンゲロール等）等のショウガオール以外の成分が含まれていてもよい。また、前記抽出物質は、抗酸化作用を有していることが好ましい。さらに、前記抽出物質は、チロシナーゼ阻害活性を有していないことが好ましい。抗酸化作用及びチロシナーゼ阻害活性は公知の方法にしたがって、測定することができる。
【００１６】
本発明の外用剤は、上記抽出液を希釈せずに用いるか、ショウガオールを下記基剤原料に混合するか、上記の抽出液を下記基剤原料と混合することにより調製することができる。本発明の外用剤の剤形として、クリーム、油状の液剤を挙げることができる。好ましくは、油状の液剤である。
【００１７】
基剤原料は、疎水性であることが好ましい。したがって、本発明の外用剤も疎水性であることが好ましい。本発明の外用剤は、ゴマ油によって有効成分の皮膚内への浸透が促進されることが期待される。また、疎水性基剤よって有効成分が皮膚のバリア機能を通過しやすくなることが期待される。このため、これらの作用を妨げないよう、本発明の外用剤には、過剰な水分や水分と疎水性の基剤原料を乳化させるような界面活性剤は用いないことが好ましい。
【００１８】
本発明の外用剤の基剤原料は、医薬品、医薬部外品及び化粧品を調製するために使用されるものであれば特に制限されない。
【００１９】
基剤原料としては、油脂類（アボガドオイル、ツバキ油、米ぬか油、サフラワーオイル、大豆油、コーン油、ナタネ油、杏仁油、パーシック油、ヒマワリ油、桃仁油、コットンシードオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、米胚芽油、月見草油、ハイブリットヒマワリ油、マカデミアナッツオイル、メドウファームオイル、ヘーゼルナッツオイル、オリーブオイル、ひまし油、ゴマ油、アーモンドオイル、グレープシードオイル、シアバター、パーム核油、パーム油、ヤシ油、カカオ脂、木ロウ、アルガンオイル、ローズヒップオイル、ミンク油、タートル油、卵黄油、牛脂、乳脂、豚脂、馬油等）、炭化水素類（植物性スクワレン、植物性スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワセリン、スクワレン、スクワラン、流動パラフィン、パラフィン、軟質イソパラフィン、流動イソパラフィン、流動ポリイソブチレン、水添ポリイソブチレン、オゾケライト、セレシン、合成スクワラン、α−オレフィンオリゴマー、ポリブテン、ポリエチレン等）、脂肪酸エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸エチル、パルミチン酸セチル、ミリスチン酸ミリスチル、ミスチリン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、ステアリン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、トリカプリリン、トリミリスチン、トリオクタノイン、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸エチル、エチルヘキサン酸セチル、エチルヘキサン酸ステアリル、トリエチルヘキサン酸グリセリル、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン等、テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、トリイソステアリン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトライソステアリン酸ペンタエリスリチル、イソステアリン酸イソセチル、ジメチルオクタン酸オクチルドデシル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、クエン酸トリオクチルドデシル、リンゴ酸ジイソステアリル等）、ロウ類（ミツロウ、ラノリン、還元ラノリン、ホホバ油、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウ、オレンジラフィー油、セラック、モンタンロウ等）、高級脂肪酸（ラウリル酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、エチルヘキサン酸、イソステアリン酸、イソパルミチン酸、イソトリデカン酸、イソノナン酸、ペンタデカン酸等）、高級アルコール（ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、セタノール、コレステロール、イソコレステロール、シトステロール、スチグマステロール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール、ヘキシルデカノール等）、シリコーンオイル等が挙げられる。
【００２０】
基剤原料として好ましくは、油脂類（アボガドオイル、ツバキ油、米ぬか油、マカデミアナッツオイル、ヘーゼルナッツオイル、オリーブオイル、ひまし油、ゴマ油、アーモンドオイル、グレープシードオイル、シアバター、パーム核油、パーム油、ヤシ油、カカオ脂、木ロウ、アルガンオイル、ローズヒップオイル）、炭化水素類（植物性スクワレン、植物性スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワセリン、スクワレン、スクワラン、合成スクワラン）、及びロウ類（ミツロウ、ラノリン、還元ラノリン、ホホバ油、カルナウバロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウ）からなる群から選択される少なくとも一種である。基剤原料としてより好ましくは、ゴマ油、スイートアーモンドオイル、植物性スクワラン、スクワラン、ワセリン、ミツロウ、シアバター、ホホバ油等である。基剤原料としてさらに好ましくは、ゴマ油であり、中でも低温で搾油したゴマ油が好ましい。低温搾油した（各製造メーカのプロトコールによる）ゴマ油を、適度に熱処理した油は浸透性が他のものと比較して非常によい。ゴマ油の熱処理条件は、８０〜１３０℃で３０分〜１時間程度であることが好ましい。
【００２１】
ショウガオールは高濃度では細胞毒性があり、低濃度では有効性が減少するためである。外用剤に含有可能なショウガオールの濃度は、有効濃度が存在しているため一定の範囲内とすることが好ましい。具体的には、外用剤に終濃度としてショウガオールが１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ程度含まれることが好ましい。ショウガオールの濃度は、高速液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析等の公知の方法により測定することができる。
【００２２】
抽出液を希釈せずに外用剤として用いる場合、抽出液に含まれる原料由来の抽出物の含有量は、上記ショウガオールの含有量の範囲内であって、抽出液全体を１００％とした場合に１％未満であることが好ましい。原料由来成分が多く含まれると、皮膚に塗布した際に刺激を感じるためである。抽出物の含有量は、抽出油の揮発分を揮発させた後の残留物の重量から、ゴマ油単独で揮発分を揮発させた場合の残留物の重量を差し引くことにより計算することができる。
【００２３】
抽出液を基剤原料で希釈する場合には、前記抽出物の含有量は、上記ショウガオールの含有量の範囲内であって、外用剤全体の量を１００重量％とした場合、０．００１〜５重量％の範囲で含まれればよい。前記抽出成分の含有量の下限値として、好ましくは０．０１重量％、より好ましくは０．０５重量％である。抽出物の含有量の上限として、好ましくは２重量％、より好ましくは１重量％である。
【００２４】
本発明の外用剤は、ビタミンＥ化合物を含むことが好ましい。ビタミンＥ化合物としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、トコフェリン、酢酸トコフェリン等を挙げることができる。ビタミンＥ化合物の含有量は、外用剤全体の量を１００重量％とした場合、同成分が０．０１〜５重量％の範囲で含まれればよく、同抽出成分の含有量の下限値として、好ましくは０．０５重量％、より好ましくは０．１重量％である。同抽出成分の含有量の上限として、好ましくは３重量％、より好ましくは２重量％、さらに好ましくは１重量％である。
【００２５】
本発明の外用剤は、抗炎症効果、抗菌効果、抗真菌効果、創傷治癒効果、肌荒れ防止効果、皮脂分泌抑制効果等を有するショウガ以外の植物抽出物（精油、浸出油、乾燥エキス等）、殺菌剤、防腐剤、酸化防止剤等の添加剤を含んでいてもよい。
【００２６】
生姜原料以外の植物抽出物としては、カレンデュラ抽出物（花の精油、浸出油、チンキ、エキス等）、アルニカ抽出物（花の浸出油等）、セージ抽出物（葉の精油、浸出油、チンキ、エキス等）、ローズマリー抽出物（葉の精油、浸出油、チンキ、エキス等）、ティートリー抽出物（葉の精油等）、ニーム抽出物（実の核から圧搾機で絞ったニームオイル等）、バードック抽出物（根の浸出油、エキス等）、ユーカリ抽出物（葉の精油等）、ラベンダー抽出物（花の精油、チンキ、エキス、芳香蒸留水等）、レモンバーム抽出物（葉の精油等）、ドクダミ抽出物（葉のチンキ、エキス等）、ハトムギ抽出物（実のエキス、チンキ等）、ヒース抽出物（花のエキス、チンキ等）、エキセアナ抽出物（全草のチンキ、エキス等）、ウスベニアオイ抽出物（花又は葉のエキス、チンキ等）、ジャーマンカモミール（抽出物花の精油、チンキ、エキス等）、マシュマロウ抽出物（根又は葉のエキス等）、ヤロー抽出物（花の精油、エキス、チンキ等）を挙げることができる。好ましくは、カレンデュラ抽出物（特にカレンデュラオイル）、ティートリー抽出物（葉の精油）、ドクダミ抽出物（特に葉のチンキ、エキス）、ハトムギ抽出物（実のエキス、チンキ等）であり、特に好ましくはカレンデュラオイルである。
【００２７】
これらの植物抽出物は、公知の方法に従って調製してもよいが、株式会社生活の木、ナチュラスサイコス（ハーバルインデックス有限会社）、株式会社ニールズヤードレメディーズ等から購入することができる。
【００２８】
殺菌剤又は防腐剤としては、安息香酸、デヒドロ酢酸、フェニルエタノール、フェノキシイソプロピルアルコール、ヒドロキシ安息香酸エステル類、クロルクレゾール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、プロピレングリコール、パラオキシ安息香酸エステル、ソルビテン酸、チモール等を挙げることができる。
【００２９】
酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、ルシノール、ビタミンＣ及びその誘導体、リノール酸等を挙げることができる。
【００３０】
生姜原料以外の植物抽出物の含有量は、抽出物が乾燥エキスの場合には、外用剤全体の量を１００重量％とした場合、当該乾燥エキスが０．００１〜５重量％の範囲で含まれればよく、当該乾燥エキスの含有量の下限値として、好ましくは０．０１重量％、より好ましくは０．０５重量％である。当該乾燥エキスの含有量の上限として、好ましくは２重量％、より好ましくは１重量％である。
【００３１】
生姜原料以外の植物抽出物が、浸出油の場合には、外用剤全体の量を１００容量とした場合、当該植物抽出物が５〜９０容量の範囲で含まれればよく、含有量は剤形の形状を維持できる範囲において調製することができる。当該植物浸出油の含有量の下限値として、好ましくは１０容量、より好ましくは２０容量、さらに好ましくは３０容量である。当該植物抽出物の含有量の上限として、好ましくは８０容量、より好ましくは６０容量、さらに好ましくは５０容量である。
【００３２】
生姜原料以外の植物抽出物が、精油の場合には、外用剤全体の量を１００容量とした場合、当該植物抽出物が０．０１〜１容量の範囲で含まれればよく、含有量は剤形の形状を維持できる範囲において調製することができる。当該植物浸出油の含有量の下限値として、好ましくは０．０４容量、より好ましくは０．０８容量、さらに好ましくは０．１容量である。当該植物抽出物の含有量の上限として、好ましくは０．８容量、より好ましくは０．５容量、さらに好ましくは０．３容量である。
【００３３】
このほかに添加剤として、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸及びその誘導体、ケイ皮酸及びその誘導体、ベンゾフェノン及びその誘導体、サリチル酸及びその誘導体等）、紫外線散乱剤（酸化チタン、酸化亜鉛等）、生体成分（コラーゲン、ヒアルロン酸、セラミド、ホルモン、胎盤抽出物等）を含んでいてもよい。
【００３４】
また、本発明の外用剤には、必要に応じて色材や香料（ローズ、ゼラニューム、ラベンダー、ハッカ、レモン、ネロリ、グレープフルーツ、オレンジ等の精油等）、pH調整剤（リン酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、乳酸、ジイソプロパノールアミン、酢酸、酢酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム等）を添加してもよい。
【００３５】
殺菌剤、防腐剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、生体成分等の添加剤は、外用剤の０．００００１〜１０重量％の範囲の間で適宜添加することができる。
各剤形の基剤に含まれる各原料の含有量は、調製しようとする剤形を維持できる範囲において適宜設定することができる。
【００３６】
２．外用剤の調製方法
本発明の外用剤は、公知の方法等によって調製することができる。例えば、前記基剤原料を約６０〜８０℃まで加熱して、原料あるいはその他の被抽出物を加え、室温まで冷却しながら、３０分〜２４時間程度の抽出後、冷却し、ビタミンＥ化合物、精油等の添加剤を加えて撹拌し、被抽出物の残渣を濾過すれば液剤を得ることができる。ミツロウなどの高融点基材を加えておけば、クリームなどの形態の外用組成物を調整可能である。
【００３７】
３．外用剤の用途及び治療方法
本発明の外用剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品として使用することができる。ここで、化粧品には、「医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律」に規定される薬用化粧品（有効成分が配合された化粧品）が含まれる。
【００３８】
本発明の外用剤は、メラノサイトを保護するために使用することができる。メラノサイトを保護するとは、メラノサイト自体が、あるいはメラノサイトの機能が細胞の死滅や細胞の活性低下等によって損なわれないことをいう。
【００３９】
また、本発明の外用剤は、白斑の改善のために使用することができる。好ましくは前記外用剤は、抗酸化作用を有していることが好ましい。さらに、前記外用剤は、チロシナーゼ阻害活性を有していないことが好ましい。抗酸化作用及びチロシナーゼ阻害活性は公知の方法にしたがって、測定することができる。
【００４０】
本発明の外用剤は、白斑等を発症した患部に、例えば１日に１〜６回、好ましくは１日に１〜３回直接塗布又はすり込むことができる。外用剤単独でも効果はあるが、紫外線をはじめとした光線照射の前後に使用することで、白斑の改善効果は高まる。本発明の外用剤は、光線治療を補助するために使用することができる。その際は、原料や添加剤等に光感作を起こすような材料を含まないことが好ましい。本発明の外用剤を使用する体の部位は特に限定されない。
【００４１】
光照射には、長波長紫外線（ＵＶＡ：３２０〜４００ｎｍ程度）、中波長紫外線（ＵＶＢ：２８０〜３２０ｎｍ程度）ナローバンドＵＶＢ（３１１±２ｎｍ）、エキシマライト光線（３０８ｎｍ程度）等を使用することができる。照射強度、照射時間及び照射回数は、上記光の種類に応じて公知の条件を採用することができる。好ましくは光照射は、白斑の光線治療の際に使用される条件を採用することができる。
【実施例】
【００４２】
以下本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
Ｉ．実験例１：ショウガオールのメラノサイトに対する効果
１．方法
６−ショウガオールは、Sigma-Aldrich社から入手した。また過酸化水素水はWako社から入手した。正常ヒト皮膚表皮ケラチノサイト（以下、単に「ケラチノサイト」と呼ぶことがある）及び正常皮膚表皮メラノサイト（以下、単に「メラノサイト」と呼ぶことがある）は、Thermo Fisher社より入手した。ケラチノサイトは、Thermo Fisher社のHKGSを添加したEpiLife培地で培養した、及びメラノサイトは、Thermo Fisher社のHMGSを添加したMedium 254培地で培養した。RNA抽出にはPromega社のMaxwell 16 Tissue LEV Total RNA Purification Kitを使用した。RNAをTOYOBO社のReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mixで逆転写した後、抗酸化及び解毒代謝遺伝子であるHO-1、Gclc、Nqo1、及び色素産生関連遺伝子であるチロシナーゼの発現量を定量的RT-PCRで測定した。増幅用のプライマーは、HO-1 (forward, 5’-3’: CTGCTGACCCATGACACCAA（配列番号１）; reverse, 5’-3’: AGTGTAAGGACCCATCGGAGA) （配列番号２）; Gclc （forward, 5’-3’: GAAGTGCCCGTCCACGCA（配列番号３）; reverse, 5’-3’: ATTCCAAGACATCTGGAAACTCCC（配列番号４））; Nqo1 （forward, 5’-3’: TGGCCAATTCAGAGTGGCAT（配列番号５）; reverse, 5’-3’: CCAGGCGTTTCTTCCATCCT（配列番号６））を使用した。細胞の生存率は、Nacalai tesque社のCell Count Reagent SFを使用して評価した。
【００４３】
２．結果
ケラチノサイト及びメラノサイトを５μMの６−ショウガオールでそれぞれ96時間及び140時間刺激した。その結果、６−ショウガオールの処理によりHO-1、Gclc、Nqo1の発現はいずれも上昇した。したがって、６−ショウガオールには細胞において抗酸化作用又は解毒作用を増強する作用があると考えられた（図１A及びB）。
【００４４】
次に、ケラチノサイト及びメラノサイトに酸化ストレスを負荷するため、0.1 mMの過酸化水素で24時間、及び96時間した。さらに、ケラチノサイト及びメラノサイトを５μMの６−ショウガオールの存在下で0.1mMの過酸化水素で処理した。
【００４５】
過酸化水素処理後のケラチノサイトについてHO-1の発現量を測定した結果、過酸化水素を添加してから24時間後にHO-1の発現量が未処理細胞（対照群）の2倍程度に上昇した（図２A）。また過酸化水素を添加してから96時間後にはHO-1の発現量が未処理細胞（対照群）の2／3程度に減少した（図２B）。これに対して、６−ショウガオールの存在下で過酸化水素でケラチノサイトを処理した場合には、処理開始から96時間後であってもHO-1の発現量は、対照群の200倍程度であり、高い発現量が維持されていた（図２C）。
【００４６】
過酸化水素処理後のメラノサイトについてHO-1の発現量を測定した結果、過酸化水素を添加してから24時間後にHO-1の発現量が未処理細胞（対照群）の5倍程度に上昇した（図２D）。また過酸化水素を添加してから140時間後にはHO-1の発現量が未処理細胞（対照群）と同程度に減少した（図２E）。これに対して、６−ショウガオールの存在下で過酸化水素でメラノサイトを処理した場合には、処理開始から140時間後であってもHO-1の発現量は、対照群の1.5倍程度であり、高い発現量が維持されていた（図２F）。
【００４７】
次に、酸化ストレスを負荷した時の細胞生存率にショウガオールが与える影響を観察した。メラノサイトを処理する過酸化水素濃度を0.1 mM、又は0.2 mMとし、５μMの６−ショウガオールの存在下、又は非存在下で140時間処理後の細胞生存率を比較した。また、メラノサイトを処理するRhododendrol（花王）を1000μM、1500μM、又は3000μM、とし、５μMの６−ショウガオールの存在下、又は非存在下で140時間処理後の細胞生存率を比較した。
【００４８】
図３Aには、過酸化水素によって酸化ストレスを負荷したメラノサイトの生存率を示す。図３Bには、Rhododendrolによって酸化ストレスを負荷したメラノサイトの生存率を示す。６−ショウガオール非存在下で、0.2 mMの過酸化水素で処理された細胞の生存率は、25％程度であった。６−ショウガオール存在下で、0.2 mMの過酸化水素で処理された細胞の生存率は85％程度であり、生存率が６−ショウガオール非存在下と比較して顕著に改善した（図３A）。3000μMのRhododendrolによって酸化ストレスを負荷した場合も、６−ショウガオール非存在下では、生存率が50％程度であったのに対して、６−ショウガオール存在下では、生存率が95％程度に改善した（図３B）。
【００４９】
図４Aには、６−ショウガオール非存在下で、0.2 mMの過酸化水素で48時間処理されたメラノサイトの位相差顕微鏡像を示す。また、図４Bには、５μMの６−ショウガオール非存在下で、0.2 mMの過酸化水素で48時間処理されたメラノサイトの位相差顕微鏡像を示す。６−ショウガオール非存在下で酸化ストレスを負荷された細胞は、死滅して浮き上がった細胞が多く認められるが、６−ショウガオール存在下で酸化ストレスを負荷された細胞は、その多くが接着していた。
【００５０】
また、酸化ストレス下で、メラノサイトの色素産生関連遺伝子の発現に６−ショウガオールがどのように影響を及ぼすか検討した。酸化ストレスは、0.1 mMの過酸化水素、1000μMのRhododendrolで負荷した。６−ショウガオール非存在下又は６−ショウガオール存在下で色素産生関連遺伝子であるチロシナーゼの発現を検討した。その結果を図５A及びBに示す。６−ショウガオール非存在下で、0.1 mMの過酸化水素、又は1000μMのRhododendrolで140時間処理したメラノサイトでは、チロシナーゼ遺伝子の発現が低下した。一方、６−ショウガオール存在下で酸化ストレスを負荷した場合には、チロシナーゼの発現低下はわずかであった。このことから、ショウガオールには、酸化ストレスによるメラニン産生機能の低下を抑制する作用があると考えられた。
【００５１】
以上の結果から、ショウガオールには、酸化ストレスによるメラノサイトの死滅及びメラニン産生能の低下を防ぐ作用があると考えられた。白斑は、酸化ストレスによるメラノサイトの死滅、又は機能不全が原因の１つと考えられていることから、ショウガオールには、白斑を改善する効果があると考えられた。
【００５２】
一方で、25μM以上の濃度の６−ショウガオールにメラノサイトを長期間暴露させると死滅してしまったため、６−ショウガオールには細胞毒性があり、適性用量が存在すると考えられる。
【００５３】
II．実験例２：チロシナーゼ阻害活性
６−ショウガオール、コウジ酸（Abcam,キットに含まれていた）及びRhododendrolのチロシナーゼ阻害活性を検討した。チロシナーゼ活性は、Tyrosinase Inhibitor Screening Kit （Abcam）で測定した。６−ショウガオールは、１，５、10、25、50、75及び100μMになるように調製した。コウジ酸は150、75、37.5μMとなるように調製した。Rhododendrolは、1500μMに調製した。
図６に示すようにコウジ酸は強いチロシナーゼ阻害活性を示すが、６−ショウガオールにチロシナーゼ阻害活性は認められなかった。
【００５４】
III．実施例１〜４．外用剤の調製
以下に記載の調整例１〜４に従い外用剤の配合を行った。使用した乾姜は漢方薬局、低温搾油ゴマ油はサミット精油（株）より購入した。トコフェロールおよび各種精油類は、一般的に化粧品原料として市販されているものを購入した。
【００５５】
実施例１
低温搾油ゴマ油９８９ｇを８０℃で３０分予備加熱を行った。その後加熱を止め、乾姜粉末１１ｇを加え、自然放冷を行いながら８時間放置した。得られた抽出液の上澄みを少量採取し、４００℃程度に加熱して加熱残渣の量を測定することで、おおよその抽出物の量を推定した。４００℃３０分の加熱試験の結果、乾姜由来の抽出物は約０．５重量％であった。この抽出液にトコフェロール３ｇを加え、室温で１時間撹拌し溶解させる。溶解後、１μｍの粒子をカットできるフィルターで抽残渣を除去し、外用剤１を得た。得られた外用剤１のショウガ由来成分の含有量を食品分析センターに依頼して分析した。その結果を図７に示す。６−ショウガオールの濃度は17ppmであった。他のショウガ由来の成分としては、６−ジンゲロールが20ppm、８−ジンゲロールが6ppm、１０−ジンゲロールが13ppmであった。６−ショウガオール以外の成分の有効性や有効用量は現在のところ不明であるが、管理の対象とする。
【００５６】
実施例２
得られた外用剤１を１００ｇ容器にうつし、メントール０．５ｇを配合して室温で３０分撹拌撹拌し、濾紙で濾過して外用剤２を得た。
【００５７】
実施例３
得られた外用剤２を１００ｇ容器にうつし、スイートオレンジ精油を０．１ｇ配合して３０分間撹拌し、外用剤３を得た。
【００５８】
実施例４
得られた外用剤１を７５ｇ容器にうつし、化粧品原料用オリーブオイル２５ｇを配合して３０分間撹拌し、外用剤４を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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