(57)【要約】【課題】ハンター病の治療薬を開発するために、患者内における変異型ＩＤＳのグリコサミノグリカン加水分解活性を回復する薬物をスクリーニングできるようにする。【解決手段】本発明の変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法は、細胞に変異型イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現させるステップと、前記ＩＤＳを第１蛍光標識するステップと、前記細胞内のリソソームを第２蛍光標識するステップと、前記細胞に候補薬剤を処理するステップと、前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップとを含む。【選択図】図８
2019200186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に変異型イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現させるステップと、
前記変異型ＩＤＳを第１蛍光標識するステップと、
前記細胞内のリソソームを第２蛍光標識するステップと、
前記細胞に候補薬剤を処理するステップと、
前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップとを含むことを特徴とする変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞に前記第１蛍光標識された前記変異型ＩＤＳを発現することによって、前記変異型ＩＤＳを発現させるステップと前記変異型ＩＤＳを第１蛍光標識するステップとを同時に行うことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記リソソームを第２蛍光標識するステップにおいて、前記細胞に抗リソソームマーカータンパク質抗体を処理することを特徴とする請求項１又は２に記載のスクリーニング方法
【請求項４】
前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップにおいて、細胞イメージング装置を用いて前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップにおいて、細胞当たりの前記オーバーラップする面積を測定することにより評価することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型イズロン酸−２−スルファターゼの機能回復薬のスクリーニング方法に関し、特に変異型イズロン酸−２−スルファターゼの機能回復機序に基づいたスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症は、リソソーム内の加水分解酵素の欠損又は異常によりグリコサミノグリカンが蓄積するリソソーム病の一種であり、日本では特定疾患に指定されている。ムコ多糖症はI型〜IX型の病型に分けられているが、このうちII型はハンター病ともいわれ、その患者数は日本におけるムコ多糖症患者の約半数を占めている。ハンター病の大半は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子の変異が原因である。ＩＤＳの遺伝子変異によりグリコサミノグリカン分解活性（酵素活性）が低下又は消失することでグリコサミノグリカンが体内に異常に蓄積して疾患が発症する。ハンター病は、１〜２歳ごろから特徴的な身体機能低下や異常（特徴的な顔貌、骨変化、関節の可動性低下）が観察されはじめ、精神発達遅滞も伴う。現在のところ、ハンター病の治療は、骨髄移植か酵素補充療法による対症療法のみが選択肢となっている。
【０００３】
上記ハンター病の酵素補充療法をより効果的にするための方法として、特許文献１には酵素活性が向上した組換えＩＤＳタンパク質を製造する方法が開示されている。特許文献１では、上記方法により製造されたＩＤＳタンパク質は、酵素活性が高いためハンター病の治療に特に有用であるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１６−１０５７３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示の方法により製造されたＩＤＳタンパク質をハンター病患者に用いるとしても、結局は従来と同様に酵素補充療法であり、根本的な治療とはならない。根本治療を実現するには、患者内における変異型ＩＤＳのグリコサミノグリカン加水分解活性を回復させることができる薬物が求められる。
【０００６】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ハンター病の治療薬を開発するために、患者内における変異型ＩＤＳのグリコサミノグリカン加水分解活性を回復する薬物をスクリーニングできるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、通常の野生型ＩＤＳは小胞体内で折り畳まれた後、ゴルジ体で活性化フォームに変換されて、最終的にリソソームに運ばれ、一方、変異型ＩＤＳは小胞体内で構造異常な分子として認識され、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）によって速やかに分解を受けていることを見出した。さらに、変異型ＩＤＳは、ＥＲＡＤから回避させることによりリソソームにまで移送されるようになり、そのグリコサミノグリカン分解酵素活性が回復することも見出した。これらにより、変異型ＩＤＳをＥＲＡＤから回避させて、小胞体からリソソームにまで移送させることができる薬物は、ＩＤＳのグリコサミノグリカン分解活性を回復させてムコ多糖症の治療に効果を発揮できると考えられる。以上の知見に基づいて、本発明者らは本発明に係る以下のスクリーニング方法を構築した。
【０００８】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞に変異型イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現させるステップと、前記ＩＤＳを第１蛍光標識するステップと、前記細胞内のリソソームを第２蛍光標識するステップと、前記細胞に候補薬剤を処理するステップと、前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップとを含むことを特徴とする変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法である。
【０００９】
本発明に係るスクリーニング方法によると、変異型ＩＤＳが候補薬剤の作用によって、ＥＲＡＤの影響を受けずにリソソームにまで送達されたか否かを、第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するといった簡便な方法で確認することができる。このため、本発明に係るスクリーニング方法は、変異型ＩＤＳをリソソームに送達して、グリコサミノグリカンを分解できるように作用する薬剤、すなわち変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法として極めて有用である。その結果、本発明に係るスクリーニング方法は、ハンター病の治療薬剤のスクリーニング方法として有用である。
【００１０】
本発明に係るスクリーニング方法は、前記細胞に前記第１蛍光標識された前記変異型ＩＤＳを発現することによって、前記変異型ＩＤＳを発現させるステップと前記変異型ＩＤＳを第１蛍光標識するステップとを同時に行うことが好ましい。
【００１１】
このようにすると、１つの工程を省略できるため本発明に係るスクリーニング方法をより簡便にすることができる。但し、このような方法の他に、蛍光標識されていないＩＤＳを細胞に発現させた後に、抗ＩＤＳ抗体を用いてＩＤＳを第１蛍光標識しても構わない。
【００１２】
本発明に係るスクリーニング方法は、前記リソソームを第２蛍光標識するステップにおいて、前記細胞に抗リソソームマーカータンパク質抗体を処理することが好ましい。
【００１３】
このようにすると、リソソームに発現するリソソームマーカータンパク質を標識できるため、簡便に、細胞内のリソソームを第２蛍光標識することができる。
【００１４】
本発明に係るスクリーニング方法は、前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップにおいて、細胞イメージング装置を用いて前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価することが好ましい。
【００１５】
このようにすると、簡便に、第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価することができる。
【００１６】
本発明に係るスクリーニング方法は、前記第１蛍光標識と前記第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップにおいて、細胞当たりの前記オーバーラップする面積を測定することにより評価することが好ましい。
【００１７】
このようにすると、候補薬剤による変異型ＩＤＳのリソソームへの移送効果を定量的に評価することが可能となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るスクリーニング方法によると、変異型ＩＤＳがＥＲＡＤの影響を受けずにリソソームにまで移行できるようにする薬剤のスクリーニングに極めて有用である。また、その結果、本発明に係るスクリーニング方法は、ハンター病の治療薬剤のスクリーニングとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】野生型ＩＤＳと変異型ＩＤＳとの細胞内局在の差異を説明するための図である。
【図２】野生型ＩＤＳ又は変異型ＩＤＳが導入されたＨｅＬａ細胞に対して、ＩＤＳとＣａｌｎｅｘｉｎ又はＩＤＳとＬＡＭＰ２を標識して、野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳの細胞内局在の差異を示した顕微鏡写真である。
【図３】野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳのＥＲＡＤによる分解速度を比較した結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝３、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図４】野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳの酵素活性を比較した結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝３、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図５】各種ＥＲＡＤ関連ユビキチンＥリガーゼに対するｓｉＲＮＡによる変異型ＩＤＳのＥＲＡＤ抑制効果を検討したウェスタンブロット法の結果を示す写真である。
【図６】変異型ＩＤＳとＬＡＭＰ２との共局在におけるＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡの効果を検討した結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝１０、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図７】変異型ＩＤＳの酵素活性におけるＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡの効果を検討した結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝３、＊：Ｐ＜０．０５）。
【図８】本発明に係るスクリーニング方法の概略を示す図である。
【図９】野生型ＩＤＳを用いた本発明に係るスクリーニング方法を利用したコントロール試験の結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝１０、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１０】ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを用いた本発明に係るスクリーニング方法の試験結果を示すグラフである（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、ｍｅａｎ±ＳＤ、Ｎ＝１０、＊：Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００２１】
本発明は、変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法である。具体的には、細胞に変異型イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を発現させるステップと、変異型ＩＤＳを第１蛍光標識するステップと、細胞内のリソソームを第２蛍光標識するステップと、細胞に候補薬剤を処理するステップと、第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量について評価するステップとを含むスクリーニング方法である。
【００２２】
ＩＤＳ（野生型）は、グリコサミノグリカンを基質とする酵素であり、図１に示すように、細胞内の小胞体で合成された後にゴルジ体で活性化フォームに変換され、リソソームに移送される。そして、リソソームにおいて、移送されたＩＤＳがグリコサミノグリカンを分解する。グリコサミノグリカンは、硫酸基が付加したアミノ糖とウロン酸との繰り返し構造からなり、ＩＤＳは、特にグリコサミノグリカンのうちヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の硫酸基を切断することにより分解する。
【００２３】
一方、変異型ＩＤＳは、野生型ＩＤＳと比較して特定のアミノ酸位置においてアミノ酸置換（例えばＡ８５Ｔ、Ｐ８６Ｌ、Ｓ３３３Ｌ、Ｒ４６８Ｑ等）が生じており、上記野生型ＩＤＳのようなグリコサミノグリカンを分解する作用が小さい又は示さないことが知られている。その原因について、本明細書の実施例においても説明するが、本発明者らは、変異型ＩＤＳは、小胞体においてＥＲＡＤによって速やかに分解を受けていることを見出した（図１を参照）。すなわち、変異型ＩＤＳはリソソームにまで移送されないため、結果として、変異型ＩＤＳはリソソームにおけるグリコサミノグリカンの分解を行うことができない。その一方で、本発明者らは当該変異型ＩＤＳがリソソームにまで移送されれば、変異型ＩＤＳがグリコサミノグリカンに作用して、分解できることも見出した。すなわち、変異型ＩＤＳのＥＲＡＤによる分解を阻害して、リソソームへ移送させることができる薬剤を発見することが、ハンター病の治療薬の開発につながると言える。
【００２４】
上記知見に基づいて、変異型ＩＤＳのリソソームへの移送の可否を基準としたスクリーニング系を構築し、上記本発明を完成した。本発明は、上記の通り、細胞内に発現され、第１蛍光標識された変異型ＩＤＳが、当該細胞に対する候補薬剤処理によってリソソームに移送されるか否かを評価するものである。そのために、リソソームを第２蛍光標識して、上記第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量を評価する。
【００２５】
本発明において、用いられる細胞としては種々の細胞を用いることができ、以下のものに限られないが、例えばＨｅＬａ細胞等の通常用いられるヒト由来の種々の株化細胞を用いることができる。また、細胞内への変異型ＩＤＳの発現は、例えば通常用いられる周知の方法により変異型ＩＤＳがコードされた核酸分子を発現プラスミド等に導入し、当該プラスミドを細胞内に導入することにより行うことができる。また、変異型ＩＤＳを第１蛍光標識するためには、例えば商業的に入手可能な抗ＩＤＳ抗体及びＧＦＰ等の蛍光標識された二次抗体を用いた免疫染色法を利用することができるが、これに限らず、本分野において通常用いられる他の方法を用いることが可能である。さらに、第１蛍光標識のためのＧＦＰ等の蛍光タンパク質が融合された変異型ＩＤＳを細胞内に発現させることにより、別途、変異型ＩＤＳを第１蛍光標識することを省略してもよい。
【００２６】
また、リソソームを第２蛍光標識する方法としては、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＣＴＳＤ等のリソソームマーカーを認識する抗体等の結合分子を利用してリソソームを第２蛍光標識することができる。具体的には、抗ＬＡＭＰ２抗体を一次抗体として用い、当該一次抗体を認識する蛍光標識二次抗体として用いた免疫染色によりリソソームを第２蛍光標識することができる。但し、この方法に限られず、本分野において通常用いられる他の方法を用いることも可能である。なお、第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップを検知できるようにするために、第１蛍光標識と第２蛍光標識とは異なる色の蛍光標識が用いられる。
【００２７】
本発明において、第１蛍光標識と第２蛍光標識とのオーバーラップの有無又はその量は、共焦点レーザ顕微鏡等の細胞内の蛍光標識の局在を検出できる装置を用いることにより評価できる。特に、本発明では短時間で多数の候補薬剤を評価するために、多検体の細胞イメージングを可能とするＯｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（パーキンエルマー社）のようなハイスループット細胞イメージング装置を用いることが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下に、本発明に係る変異型ＩＤＳの機能回復薬剤のスクリーニング方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【００２９】
まず、野生型ＩＤＳと変異型ＩＤＳとの細胞内局在及び酵素活性を比較した。そのための試験及び結果を以下に示す。なお、以下に示す試験において、変異型ＩＤＳとしては、８５番目のアミノ酸がアラニンからトレオニンに置換された変異型ＩＤＳ（Ａ８５Ｔ）を用いた。ＨｅＬａ細胞に野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳをそれぞれ発現させるために、具体的に、野生型ＩＤＳのオープンリーディングフレーム（配列番号１）あるいは変異型ＩＤＳのオープンリーディングフレーム（配列番号２）をｐＣＤＮＡ３．１＋ベクター（Thermo Fisher Scientific）にクローニングした。構築できたプラスミドを精製後、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ  Ａ（wako）を用いてＨｅＬａ細胞に遺伝子導入した。なお、配列番号１及び２のそれぞれの配列によって得られる野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳのアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号３及び４に示される。
【００３０】
その後、野生型ＩＤＳ又は変異型ＩＤＳが発現されたＨｅＬａ細胞に対して、ＩＤＳ、小胞体マーカーであるＣａｌｎｅｘｉｎ、及びリソソームマーカーであるＬＡＭＰ２について免疫染色を行った。具体的に、ＨｅＬａ細胞に野生型ＩＤＳあるいは変異型ＩＤＳを導入した７２時間後に４％ＰＦＡで１０分固定しメタノールでｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ処理を行った。５％ＢＳＡで３０分間ブロッキングを行った後、ｇｏａｔＩｇＧ ａｎｔｉ ＩＤＳ抗体（R & D systems）とオルガネラマーカーであるｍｏｕｓｅ ＩｇＧａｎｔｉ ｃａｌｎｅｘｉｎ抗体（小胞体マーカー）(EMD Millipore)、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｎｔｉ Ｌａｍｐ２抗体（リソソームマーカー）（BD Biosciences）で一次抗体反応を行った。二次抗体はｇｏａｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ｍｏｕｓｅＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Invitrogen）を用い蛍光シグナルを観察した。
【００３１】
その結果を図２に示す。図２に示すように、野生型ＩＤＳでは、ＩＤＳの赤色のシグナルとＣａｌｎｅｘｉｎの緑色のシグナルとはほとんど重なることはなかったが、ＩＤＳの赤色のシグナルとＬＡＭＰ２の緑色のシグナルとは広い範囲で重なって黄色のシグナルが認められた（図２の野生型ＩＤＳのＭｅｒｇｅ）。これに対して、変異型ＩＤＳでは、ＩＤＳの赤色のシグナルとＣａｌｎｅｘｉｎの緑色のシグナルとは広い範囲でそれらのシグナルが重なって黄色のシグナルが認められたが、ＩＤＳの赤色のシグナルとＬＡＭＰ２の緑色のシグナルとはほとんど重ならなかった（図２の変異型ＩＤＳのＭｅｒｇｅ）。以上の結果から、野生型ＩＤＳはリソソームへ移送されるが、変異型ＩＤＳはリソソームに移送されず、小胞体に局在することが確認された。
【００３２】
次に、野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳの細胞内における分解について以下の通り検討した。まず、上記試験と同様にＨｅＬａ細胞に対して野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳのいずれかを発現させ、プロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２を前処理せずに又は前処理し、その３時間後にタンパク質翻訳抑制剤であるｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（ＣＨＸ）５０μｇ／ｍｌで処理した０時間、６時間、１２時間及び２４時間後の細胞内における野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳの量をウェスタンブロット法により評価した。具体的に、上記プラスミドを用いて、ＨｅＬａ細胞に野生型ＩＤＳあるいは変異型ＩＤＳをＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡ（wako）を用い発現させた。遺伝子導入から４５時間後にＭＧ１３２を５０μＭの濃度で処理した。遺伝子導入後４８時間後にＣＨＸ５０μｇ／ｍｌを加え、０、６、１２、２４時間でサンプル回収した。その後、１０μｇ量のサンプルを用いＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。ｍｏｕｓｅＩｇＧ ａｎｔｉ ＩＤＳ抗体（R & D systems）で一次抗体反応を行い、二次抗体としてｍｏｕｓｅＩｇＧ−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体（Jackson）を用いＩＤＳを検出した。
【００３３】
その結果を図３に示す。図３に示すように、野生型ＩＤＳでは、ＭＧ１３２を処理した細胞の方がＭＧ１３２を処理していない細胞と比較してＩＤＳ量の低下が抑えられているが、いずれの場合も時間の経過と共にＩＤＳ量の緩やかな減少が見られた。一方、変異型ＩＤＳでは、野生型ＩＤＳよりもその量が急速に低下し、ＭＧ１３２処理により、その低下の遅延が認められた。これらの結果から、変異型ＩＤＳは、細胞内においてプロテアソームによって、より具体的には、小胞体におけるユビキチン−プロテアソーム分解経路である小胞体関連分解によって急速に分解されていることが示唆された。
【００３４】
次に、野生型ＩＤＳと変異型ＩＤＳとの酵素活性を比較した。そのために、上記試験と同様にＨｅＬａ細胞に対して野生型ＩＤＳ及び変異型ＩＤＳのいずれかを発現させ、グリコサミノグリカンに対する酵素活性を測定した。具体的に、上記プラスミドを用いてＨｅＬａ細胞に野生型ＩＤＳあるいは変異型ＩＤＳをＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡ（wako）を用い発現させた。その７２時間後に細胞回収し超純水に溶かして超音波処理を行った後に、タンパク質を抽出し、タンパク質量１０μｇ／１０μｌに調整した。１０μｇのタンパク質と人工基質である１．２５ｍＭの4-methylumbelliferylalpha-iduronide-2-sulfate (MU-αIdu-2S) (Toronto Research Chemicals)を含む２０μｌのＢｕｆｆｅｒ（0.1 M Na-acetate buffer (pH5.0), containing 10 mM lead-acetate and 0.02%sodium azide）とを混合し３７℃で４時間反応した。その後２５０ｎｇ／１０μＬのpurifiedrecombinant human IDUA (R&D systems)及びＭｃｌｌｖａｉｎ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．５）(0.4 M Na-phosphate containing 0.2 M citrate)４０μｌを加えさらに２４時間、３７℃で反応させた。反応停止後、光蛍光光度計を用い３５５ｎｍで励起し４６０ｎｍの蛍光波長を検出し酵素活性測定を行った。
【００３５】
その結果を図４に示す。図４に示すように、野生型ＩＤＳと比較して変異型ＩＤＳの酵素活性は著しく低いことが明らかとなった。
【００３６】
以上の結果から、図１に示したように、野生型ＩＤＳは、リソソームに移送されて、グリコサミノグリカンを分解することができるが、変異型ＩＤＳは、小胞体においてＥＲＡＤによって速やかに分解を受け、また、その酵素活性自体も野生型ＩＤＳと比較して極めて低いことが明らかとなった。
【００３７】
次に、変異型ＩＤＳの分解を阻害することで生じる変異型ＩＤＳの細胞内局在及びその酵素活性に対する影響について検討した。そのためにまず、ユビキチン−プロテアソーム経路による変異型ＩＤＳの分解に対して、種々のＥＲＡＤ関連ユビキチンＥ３リガーゼ（ＨＲＤ１、ＲＮＦ５、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦ１８５、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ６、ＴＭＲＭ１２９）に対するｓｉＲＮＡを用いて、その分解が阻害できるか評価した。具体的に、ＨｅＬａ細胞に上記野生型ＩＤＳあるいは変異型ＩＤＳ発現ベクターとともにｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｉＲＮＡ(Thermo Fisher Scientific)、又は上記ＥＲＡＤ関連ユビキチンＥ３リガーゼ（ＨＲＤ１、ＲＮＦ５、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦ１８５、ＡＭＦＲ、ＭＡＲＣＨ６、ＴＭＲＭ１２９）に対するｓｉＲＮＡとしてのｓｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｏｒ  ＨＲＤ１(Dharmcon. Lafayette)、ＲＮＦ５(Thermo Fisher Scientific)、ＲＮＦ１４５  (ThermoFisher Scientific)、ＲＮＦ１８５(Thermo Fisher Scientific)、ＡＭＦＲ  (Thermo Fisher Scientific)、ＭＡＲＣＨ６(ThermoFisher Scientific)、ＴＭＥＭ１２９  (Thermo Fisher Scientific)を、ＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔＡ（wako）を用いトランスフェクションした。遺伝子導入後７２時間後にサンプル回収し、１０μｇ量のサンプルを用いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ｍｏｕｓｅＩｇＧ ａｎｔｉ ＩＤＳ抗体（R & D systems）で一次抗体反応を行い、二次抗体としてｍｏｕｓｅＩｇＧ−ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗体（Jackson）を用いてＩＤＳを検出した。
【００３８】
その結果を図５に示す。図５に示すように、ＥＲＡＤ関連ユビキチンＥ３リガーゼに対するｓｉＲＮＡを処理していないｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡで処理した場合は、ＩＤＳのタンパク質量が顕著に増加した。他のＥＲＡＤ関連ユビキチンＥ３リガーゼに対するｓｉＲＮＡを用いた場合では、顕著な増加は認められなかった。従って、変異型ＩＤＳのＥＲＡＤの阻害のためにＨＲＤ１のｓｉＲＮＡが有効であることが明らかとなった。
【００３９】
そこで、次に、ＨＲＤ１のｓｉＲＮＡを用いて変異型ＩＤＳの分解を抑制した際の変異型ＩＤＳの細胞内局在について評価した。そのために、上記試験と同様にＨｅＬａ細胞に変異型ＩＤＳを発現させ、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、その７２時間後に上記と同様にＩＤＳ及びＬＡＭＰ２について免疫染色を行った。具体的に、ＨｅＬａ細胞に上記プラスミドを用いてＩＤＳとともにｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（Dharmcon. Lafayett）もしくはｓｉＨＲＤ１（Dharmcon.Lafayett）をＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ（wako）を用いトランスフェクションした。遺伝子導入して７２時間後に４％ＰＦＡで１０分固定しメタノールでｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ処理を行った。５％ＢＳＡで３０分間ブロッキングを行った後、ｇｏａｔＩｇＧ ａｎｔｉ ＩＤＳ抗体（R & D systems）とオルガネラマーカーであるｍｏｕｓｅ ＩｇＧａｎｔｉ Ｌａｍｐ２抗体（リソソームマーカー）（BD Biosciences）で一次抗体反応を行った。二次抗体はｇｏａｔＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Invitrogen）を用い蛍光シグナルを観察した。
【００４０】
その結果を図６に示す。図６に示すように、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入していないｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入して変異型ＩＤＳの分解を抑制した場合、ＩＤＳのシグナルとＬＡＭＰ２のシグナルとが共局在している領域が有意に増大した。すなわち、変異型ＩＤＳの分解を抑制することにより、変異型ＩＤＳはリソソームに移送されることが示唆された。
【００４１】
次に、上記試験と同様にＨＲＤ１のｓｉＲＮＡを用いて変異型ＩＤＳの分解を抑制した場合における変異型ＩＤＳの酵素活性について評価した。そのために、上記試験と同様にＨｅＬａ細胞に変異型ＩＤＳを発現させ、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、その７２時間後にその酵素活性を測定した。具体的に、ＨｅＬａ細胞に上記プラスミドを用いてＩＤＳとともにｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡ（Dharmcon. Lafayett）もしくはｓｉＨＲＤ１（Dharmcon.Lafayett）をＳｃｒｅｅｎＦｅｃｔ Ａ（wako）を用いトランスフェクションした。７２時間後に細胞回収し超純水で細胞をＬｙｓｉｓＳｏｎｉｃａｔｉｏｎ行いタンパク質を抽出し、タンパク質量１０μｇ／１０μｌに調整した。１０μｇのタンパク質と人工基質である１．２５ｍＭの4-methylumbelliferylalpha-iduronide-2-sulfate (MU-αIdu-2S) (Toronto Research Chemicals)を含む２０μｌのＢｕｆｆｅｒ（0.1 M Na-acetate buffer (pH5.0), containing 10 mM lead-acetate and0.02% sodium azide）とを混合し３７℃で４時間反応した。その後２５０ｎｇ／１０μＬpurified recombinant human IDUA (R&D systems)及びＭｃｌｌｖａｉｎ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ pH 4.5 (0.4 M Na-phosphate containing 0.2 M citrate)４０μｌを加えさらに２４時間、３７℃で反応させた。反応停止後、光蛍光光度計を用い３５５ｎｍで励起し４６０ｎｍの蛍光波長を検出し酵素活性測定を行った。
【００４２】
その結果を図７に示す。図７に示すように、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入していないｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを導入して変異型ＩＤＳの分解を抑制した場合、変異型ＩＤＳの酵素活性が有意に上昇した。すなわち、変異型ＩＤＳの低減した酵素活性は、その分解を抑制することにより回復できることが示唆された。
【００４３】
以上の結果から、図８に示すように、細胞に変異型ＩＤＳを発現し、その変異型ＩＤＳ及びリソソームを蛍光標識した上で、所定の候補薬剤を細胞に処理し、リソソームと変異型ＩＤＳとが共局在が認められるか否かを評価することによって、変異型ＩＤＳの機能回復薬剤をスクリーニングできることが期待される。特に、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ（パーキンエルマー社）のようなハイスループット細胞イメージング装置を用いることによってのハイスループットスクリーニングも可能と考えられる。
【００４４】
そこで、次に、図８に示すようなスクリーニング系についての可能性を検証した。まず、コントロール試験として、上記図２や図６の試験と同様に、ＨｅＬａ細胞に上記プラスミドを用いて野生型ＩＤＳ又は変異型ＩＤＳを発現させてＩＤＳ及びＬＡＭＰ２について免疫染色を行った。当該細胞について、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘを用いて細胞全体の面積のうち、ＬＡＭＰ２シグナルとＩＤＳシグナルとが共局在する領域（二重陽性領域の面積）の割合を算出した。その結果、図９に示すように、野生型ＩＤＳと比較して変異型ＩＤＳは、ＬＡＭＰ２とのオーバーラップ領域は顕著に小さかった。
【００４５】
次に、候補薬剤の代わりに、上述の通り変異型ＩＤＳをリソソームにまで移送して酵素活性を回復できるＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡである上記ｓｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｏｒ  ＨＲＤ１(Dharmcon. Lafayette)を用いて本発明に係るスクリーニング方法を行った。そのために、上記図２や図６の試験と同様に、ＨｅＬａ細胞に上記プラスミドを用いて変異型ＩＤＳを発現させて、細胞にＨＲＤ１に対する上記ｓｉＲＮＡを処理し、ＩＤＳ及びＬＡＭＰ２について免疫染色を行った。そして、当該細胞について、Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘを用いて細胞全体の面積のうち、ＬＡＭＰ２シグナルとＩＤＳシグナルとが共局在する領域（二重陽性領域の面積）の割合を算出した。その結果、図１０に示すように、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを処理していないコントロールと比較して、ＨＲＤ１に対するｓｉＲＮＡを処理した場合は、変異型ＩＤＳは、ＬＡＭＰ２とのオーバーラップ領域が有意に増大した。すなわち、変異型ＩＤＳのリソソームへの移送が促進された。
【００４６】
以上の結果から、本発明に係るスクリーニング方法によると、変異型ＩＤＳをリソソームへ移送させて酵素活性を回復させることができる候補薬剤を簡便にスクリーニングすることが可能となる。従って、本発明に係るスクリーニング方法を用いることにより、ハンター病の治療薬の開発に極めて有用となる。
【図１】
2019200186.tif 000003
【図２】
2019200186.tif 000004
【図３】
2019200186.tif 000005
【図４】
2019200186.tif 000006
【図５】
2019200186.tif 000007
【図６】
2019200186.tif 000008
【図７】
2019200186.tif 000009
【図８】
2019200186.tif 000010
【図９】
2019200186.tif 000011
【図１０】
2019200186.tif 000012
【配列表】
2019200186000001.app