(57)【要約】      （修正有）【課題】フラッシュクロマトグラフィーで分離能を向上した、リニアグラジェント方式のフラッシュクロマトグラフで、分取用高速液体クロマトグラフィーのように高価な装置でなく、部品が容易に調達出来、約４分の１程度の経費で組み立てられる装置を提供する。【解決手段】カラム下部からの吸引とカラム上部からの送液圧とで、溶離液濃度をリニアグラジェント的に変化させるグラジェント方式は２種の溶液を用いるが、１本目のボトルを引圧状態にして、２本目のボトルを微孔開放状態にする事で、良好なリニアグラジェント方式のフラッシュクロマトグラフィーを完成させた。また本装置で分画操作を行う際、カラム下部より、気泡が生じ測定の弊害となっていた。これを解決するためのカラム下部からの吸引とカラム上部からの送液圧の比率を精緻に調査し、吸引力０．８、送液圧１．０を見出した。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーにおける上部より送液圧力をかけ、カラム下部より吸引するフラッシュクロマトグラフ
【請求項２】
溶離液タンクの大きさを換える方法でリニアグラジェント溶離液を行うクロマトグラフィー
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】計測装置、分析装置の中のクロマトグラフに関する新規の装置開発。
現在、各種のクロマトグラフが市販されているが、本発明はその中の分取を主目的とするフラッシュクロマトグラフに関する最も適した装置の発明である。
【背景技術】
【０００２】精密用のクロマトグラフィーは専門メーカーにより数多く製品化され世界の研究機関に供給されている。
近年はクロマトグラフの活用は精密分析のみならず、成分の分離精製にも及んでいる。その分離精製法として、フラッシュクロマトグラフは適した装置である。各研究機関では市販装置の利用、あるいは実験者が組み立て、ワンパスあるいはステップグラジェント溶出法で分取作業を実施している。精密なリニアグラジェント装置を組み込んだ高価なフラッシュクロマトグラフは存在するが、研究者には高価で購入する箇所は限られているのが現状である。それに、その従来方式はカラム上部より送液の圧力をかけるのみで、カラム下部より吸引する方法はとられていない。先行特許にしてもカラム上部圧力を変化させるのみの、開発である。本実施例でも示しているように、従来のステップグラジェント方式による分離よりも、本ＬＧＦＣ方式のクロマトグラフィーが格段と分離度が上がっている。
要するに、本発明の新規のクロマトグラフの方が従来のステップグラジェント方式を含むクロマトグラフィーよりも分離能が優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１０−５３８２４０
【非特許文献１】
【０００４】従来のフラッシュクロマトグラフィーはカラム上部より送液の圧力をかけるのみで、カラム下部より吸引する方法はとられていないので参考にすべき非特許文献は存在しない。特に溶離液のボトル容量を変化させるのみで自在にリニアグラジエント溶離が出来るフラッシュクロマトグラフィーは現在の所、存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】従来のフラッシュクロマトグラフでは分離溶液を順次、濃度を変えて何回かにわたり、カラム上部から注入していた。本装置は分離溶液を自動的に濃度変化させる事が出来るので
分離途中で分離状況を止めることなく、濃度変化を可能にしてから分離能も向上する。
また、そのために分離操作が煩雑でなく、分離工程が終了するまで自動で成分を溶出出来るようになった。すなわち、課題としてはフラッシュクロマトグラフィーで分離能を向上させ、分取操作を簡略化することにあった。そのためにリニアグラジェント方式従来を採用する装置的工夫が必要であった。また、分取用高速液体クロマトグラフィーのように高価な装置でなくて、部品が容易に調達出来、約４分の１程度の経費で組み立てられることも目指した。
実験の課題をまとめてみると、
▲１▼フラッシュクロマトグラフィーで分離能を向上
▲２▼リニアグラジェント方式のフラッシュクロマトグラフ化の初
▲３▼分取用高速液体クロマトグラフィーのように高価な装置でなく、部品が容易に調達出来、約４分の１程度の経費で組み立てられる装置開発
【課題を解決する手段】
【０００６】フラッシュクロマトグラフは精密分離ではなく、グループ分離を主目的にした分取装置である。その分離度が低いと主目的に適合しない状況になる。
この問題点を解決するために、ステップグラジェント方式よりも、すぐれた分画装置を開発する必要があった。そのために、溶離液をリニアに変化させるグラジェント方式を開発する必要があった。そこで、我々は鋭利研究を重ね、カラム下部からの吸引とカラム上部からの送液圧とで、溶離液濃度をリニアグラジェント的に変化させる事に成功した。グラジェント方式は２種の溶液を用いるが、１本目のボトルを引圧状態にして、２本目のボトルを微孔開放状態にする事で、良好なリニアグラジェント方式のフラッシュクロマトグラフィーを完成させた。また本装置で分画操作を行う際、カラム下部より気泡が生じ、測定の弊害となっていた。これを解決するためのカラム下部からの吸引とカラム上部からの送液圧の比率を精緻に調査し、吸引力０．８、送液圧１．０を見出した。
また、複雑で高価なグラジエント装置を用いることなく、２種のボトルの大きさを変えることにより、自由に溶離液濃度をリニアに変化させることが出来た。
【発明の効果】
【０００７】▲１▼従来のフラッシュクロマトグラフよりも分離能が秀れている。
▲２▼ステップグラジェント方式の従来のフラッシュクロマトグラフィーに比べて、分離精製方法が煩雑にならず、短い時間で分離作業が可能になった。
▲３▼高価な精密グラジェント設備を付属しなくても、従来のフラッシュクロマトグラフィーよりも精度が上がる事が証明出来たので、各種研究機関に格段に普及していくと考えられる（現状段階で２００万円〜３００万円程度する精密リニアグラジュエントシステム付きフラッシュクロマトグラフィーに比べ格段と安く、概略２０〜３０万円程度で組み立てる事が出来る。）
▲４▼現状のフラッシュクロマトグラフは製造メーカーの設計で仕上げられているので、実験者が自由自在に組み直す事は難しいが、本発明ＬＧＦＣでは装置そのものを実験者が組み立てているので、簡単に組み立て直す事が可能である。例えば、送液用のテフロンホースを太くしたり、細くしたりして圧力を変化させたり、ペリスターポンプを駆動源としているので、吸引側の速度を上げ下げしたりして、カラム圧力の調整も自由自在にコントロール出来る。ポンプも高価なものを使用していないので、分離精度を上げたい際や、下げても十分な場合、適当な市販ポンプに換える事が出来る。現状の精密装置ポンプを入れ換える事は、実験者にはとても難しい作業になるし、そのポンプ自体が高価で通常、無理な変換である。
▲５▼従来のフラッシュクロマトグラフはカラム上部から送液してゆくので、カラム上部で圧力がかかり流量を上げてゆくと、もっと圧力が上がり配管部に圧の負荷がかかり、接続部から液漏れが生じたり、ホースが裂けたりする。しかし本発明のＬＧＦＣではカラム上部の圧力を低下させる事が可能になっている。この技法はある成分を工業的に分離精製する際に、その分離作業において、多量の送液を可能にするもので、ランニングコストを格段に下げる事が出来る。例えば１分間に５０ｍｌの流速で溶出する場合、従来のフラッシュクロマトグラフィーでは、圧損失が大となり最大２０ｍｌしか流せない。ところがＬＧＦＣではカラム下部の吸引速度をコントロールする事により、低圧下で分離精製工程が可能となる。この例は、短時間で分離精製作業が行え、ランニングコストの低下につながる事を証明している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】従来のフラッシュクロマトグラフの流路とほとんど変わりがないが、新規の特徴として、一台のチューブポンプで送液し、カラム下部より吸引する装置である。
▲１▼溶離液タンクＡ  ▲２▼溶離液タンクＢ（濃度変化のための溶液）  ▲３▼試料注入器
▲４▼チューブポンプ（送液と吸引）  ▲５▼分離カラム（成分の分画用）
▲６▼カラム下部からの吸引のための配管  ▲７▼成分分画用検出器（各種選択）
▲８▼分画する成分を取り出す装置（市販品）
【発明を実施するための形態】
【０００９】本発明のリニアグラジェントフラッシュクロマトグラフは精密分離ではなく、グループ分離を主目的にしているので、実験者が組み立てられるように仕上げられている。
具体的な図面、見取り図に示している器具を使用。いずれの器具も一般の化学実験室に備えられている廉価に手に入るものである。
具体的な器具と操作について記す。
▲１▼溶離液をボトル２本に入れる。２種の溶液は違いのある溶離液とする。（通常の分配クロマトグラフィーでは１液に水系溶媒、２液に有機溶媒系を使用）
▲２▼装置はチューブポンプを用い、インジェクター、カラムの入り口に送液ホースをつなぐ
▲３▼カラムの出口に吸引ホースをつなぐ（ポンプの吸引、送液量は同一か、もしくは吸引側を少し減量すると、より外部気泡が入り難い）
▲４▼リニアグラジェントの濃度変化は図の１のボトルと２のボトルの容量の大きさで実験者が自由に設定できる。
▲５▼チューブポンプより送液後、分析試料は上部のコックの開閉によりシリンジで注入する。
▲６▼分取は検出器等で確認しながら、フラクションコレクターあるいは試験管に手取りする。
【実施例１】
【００１０】「ＬＧＦＣ条件」
（１液）１％酢酸，５％メタノール水溶液
（２液）１％酢酸，９５％メタノール水溶液
（器具・装置）
クロマト管（内径１０ｍｍ，全長２００ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）と図面の装置―ＬＧＦＣ
５つの色素の分離度（Ｒｔ）の表を作成した。
【表１】
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ステップグラジェント方式に比べて、本装置は４つの分離度に関して上昇している。
ＤとＥではＲｔ３．４となり、１．７倍上がっている。特にＣとＤはＲｔ０．９５が１．５に上昇していて、従来のステップグラジェント方式では分離出来なかったＣとＤが本装置ではＲｔ１．５と完全に分離している。
５つの色素の分取時間は、従来のステップグラジェント方式では、約２５分かかっていたが、本装置では１５分間となり、１０分（４０％短縮）も短くなっている。
【実施例２】
【００１１】ブルーベリー中のアントシアニン類の分離実験
「ＬＧＦＣ条件」
（１液）１％酢酸，５％メタノール水溶液
（２液）１％酢酸，９５％メタノール水溶液
試料注入量―２５ｍｌ
（器具・装置）
クロマト管（内径１０ｍｍ，全長２００ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）
図面の装置―ＬＧＦＣ
１、  ブルーベリー中のアントシアニンの抽出方法
ブルーベリー果実５０ｇを水洗いし、２％酢酸，５０％エタノール水溶液５００ｍｌに１昼夜漬け込んだ。抽出液はロータリーエバポレーターで１００ｍｌに濃縮、その後ろ紙でろ過をして、これをＬＧＦＣ用試料とし、その２５ｍｌを注入し分取した。注入部の分析用ＨＰＬＣクロマトグラムを表にする。
アントシアニジン−３−グルコシドがきれいに分取されている。
（アントシアニン類は酸性域で赤色を示すので目視で分取）
【表２】
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クロマトグラム  （リテンションタイム３７＝アントシアニジン−３−グルコシド）
【実施例３】
【００１２】  上述の実験例の圧力変化測定
ブルーベリー抽出液を５ｍｌ注入した場合のカラム上部の圧力の変化を、流速を変化させて測定した。測定結果を表にする。
【表３】
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流速が低い２ｍｌ／分の場合、４ｋｇ／ｃｍ２から５ｋｇ／ｃｍ２と１．２５倍低下するのみであったが、流速を２０ｍｌ／分に上げると効果大で、ＬＧＦＣは従来のＦＣに比べて、４．５倍も圧力が低下している。この事はフラッシュクロマトグラフを工業的に利用する際の大きな利点となる。
【産業上の利用可能性】
【００１３】    本特許の説明のところでも出てきましたが、成分の分離精製法の装置である。図面でも示しましたが、従来のフラッシュクロマトグラフとシステム的にほとんど違わず、装置を設置することは簡単である。従来の大型分離精製装置では、大きな建屋と大きなポンプを必要としましたが、ＬＧＦＣではチューブポンプを新規に活用したフラッシュクロマトグラフであるので、設備費が格段に安く、現在
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と、概略５０万円〜１００万円で設置可能である。従来の装置だと上述と同条件で８００万円〜１０００万円かかるものと思われる。ゆえに本発明のＬＧＦＣはすぐにでも産業上有効に利用出来るものである。特に健康食品に有望な天然系の有効成分の分離精製には適している。
【符号の説明】
【００１４】Ａ．溶離液ボトル▲１▼
Ｂ．溶離液ボトル▲２▼
Ｃ．チューブポンプ
Ｄ．カラム
Ｅ．フラクション部
【図１】
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【図２】
2019128339.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月16日(2018.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】本発明の装置のダイアグラムである。従来のフラッシュクロマトグラフィー装置と流路は同じであるが、新規の特徴としては送液ポンプが一台のチューブポンプで送液すると共に、カラム下部より吸引する事が出来る装置である。      （１）溶離液タンクA  （２）溶離液タンクB（濃度変化のための溶液）（３）試料注入器（４）チューブポンプ（送液と吸引）（５）分離カラム(成分の分画用)（６）カラム下部からの吸引のための配管  （７）成分分画用検出器(各種選択)（８）分画する成分を取り出す装置(フラクションコレクター)
【図２】具体的な実験の模式図である。Ａ  溶離液タンク（１）Ｂ  溶離液タンク（２）Ｃ  チューブポンプＤ  分離カラムＥ  フラクションコレクター