(57)【要約】【課題】２種類以上の細胞の混在状態を定量的に評価することができる評価方法等を提供する。【解決手段】少なくとも２つの細胞の混在状態を評価する評価方法は、少なくとも２つの細胞が混在する画像を取得する画像取得ステップと、取得した画像において、少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出する抽出ステップと、抽出ステップにおいて抽出された隣接関係から、少なくとも２つの細胞の混在度を算出する混在度算出ステップとを含み、抽出ステップは、画像を複数のクラスタに分割し、クラスタごとの少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出するクラスタリングを含む。【選択図】図２
2019128148.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの細胞の混在状態を評価する評価方法であって、
前記少なくとも２つの細胞が混在する画像を取得する画像取得ステップと、
取得した前記画像において、前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出する抽出ステップと、
前記抽出ステップにおいて抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出する混在度算出ステップとを含み、
前記抽出ステップは、前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出するクラスタリングを含む、
評価方法。
【請求項２】
前記クラスタリングは、階層型クラスタリングである、
請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記混在度算出ステップは、
前記クラスタごとの局所的な混在度である第１混在度を算出する第１混在度算出ステップと、
すべての前記第１混在度の重み付き平均を算出し、前記画像の全体の混在度である第２混在度を算出する第２混在度算出ステップとを含む、
請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記第１混在度算出ステップにおいて、前記第１混在度は、
【数１】
2019128148.tif 000007
により算出される、
請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記第２混在度算出ステップにおいて、前記第２混在度は、
【数２】
2019128148.tif 000008
により算出される、
請求項３または４に記載の評価方法。
【請求項６】
前記クラスタリングの前に、前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像を二値化する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
前記混在度算出ステップの後、前記クラスタに対する前記細胞の混在度をプロットし、
プロットした前記混在度の積分値である混在指数を算出する、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
前記混在指数は、
【数３】
2019128148.tif 000009
により算出される、
請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
少なくとも２つの細胞の混在状態を画像として取得する画像取得部と、
前記画像から前記細胞の混在度を算出する演算部とを備え、
前記演算部は、前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出するクラスタリングを行い、抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出する、
評価装置。
【請求項１０】
前記クラスタリングは、階層型クラスタリング法である、
請求項９に記載の評価装置。
【請求項１１】
前記演算部は、
前記クラスタごとの局所的な混在度である第１混在度と、
前記画像の全体の混在度である第２混在度を算出する、
請求項１０に記載の評価装置。
【請求項１２】
前記演算部は、前記クラスタに対する前記細胞の混在度をプロットし、プロットした前記混在度の積分値を算出する、
請求項９に記載の評価装置。
【請求項１３】
少なくとも２つの細胞の混在状態を評価するためのプログラムであって、
前記プログラムは、
前記少なくとも２つの細胞が混在する画像を取得させ、
前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出させ、
抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出させる、
プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の混在状態を評価する評価方法、評価装置およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡、２光子励起顕微鏡等により、細胞等の物質を観察する方法が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
特許文献１には、共焦点顕微鏡等により、時間の経過とともに形態が変化する細胞を観察する技術が開示されている。また、特許文献２には、細胞の形態変化を定量的に観察する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２５１６３０号公報
【特許文献２】特開２０１６−１８２１４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術に係る観察技術では、観察対象となる細胞の形態変化を観察することはできるが、２種類以上の細胞がどのように分布しているか、その混在状態を定量的に評価することは難しかった。
【０００６】
そこで、本発明は、２種類以上の細胞の混在状態を定量的に評価することができる評価方法、評価装置およびプログラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様に係る評価方法は、少なくとも２つの細胞の混在状態を評価する評価方法であって、前記少なくとも２つの細胞が混在する画像を取得する画像取得ステップと、取得した前記画像において、前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出する抽出ステップと、前記抽出ステップにおいて抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出する混在度算出ステップとを含み、前記抽出ステップは、前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出するクラスタリングを含む。
【０００８】
また、本発明の一態様に係る評価装置は、少なくとも２つの細胞の混在状態を画像として取得する画像取得部と、前記画像から前記細胞の混在度を算出する演算部とを備え、前記演算部は、前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出するクラスタリングを行い、抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出する。
【０００９】
また、本発明の一態様に係るプログラムは、少なくとも２つの細胞の混在状態を評価するためのプログラムであって、前記プログラムは、前記少なくとも２つの細胞が混在する画像を取得させ、前記画像を複数のクラスタに分割し、前記クラスタごとの前記少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出させ、抽出された前記隣接関係から、前記少なくとも２つの細胞の混在度を算出させる。
【００１０】
なお、これらの全般的または具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラムまたはコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の評価方法、評価装置およびプログラムは、２種類以上の細胞の混在状態を定量的に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施の形態１に係る評価装置の構成の一例を示す図である。
【図２】図２は、実施の形態１に係る評価装置における細胞の混在度の演算手順を示すフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与前の細胞の観測画像の一例を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与１週間後の細胞の観測画像の他の例を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与３週間後の細胞の観測画像の他の例を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与６週間後の細胞の観測画像の他の例を示す図である。
【図４】図４は、実施の形態１に係る評価装置で行われるクラスタリングの一例を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、実施の形態１に係る評価装置で行われる階層型クラスタリングの一例を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施の形態１に係る評価装置で行われる階層型クラスタリングの一例を示す図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施の形態１に係る評価装置で行われる階層型クラスタリングの一例を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、図５Ａのクラスタリングを行った場合の細胞の混在度を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図５Ｂのクラスタリングを行った場合の細胞の混在度を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図５Ｃのクラスタリングを行った場合の細胞の混在度を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与前の細胞の観測画像である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施の形態１に係る評価装置の画像取得部が取得した、ＰＴＨ投与６週間後の細胞の観測画像である。
【図８Ａ】図８Ａは、図７Ａに示した観測画像における細胞の混在度を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図７Ｂに示した観測画像における細胞の混在度を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、実施の形態２に係る評価装置の画像取得部が取得した細胞の観測画像の一例である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａに示した細胞の観測画像を二値化した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ｂに示した細胞の観測画像をピクセル表示化した図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施の形態３に係る評価装置において、図７Ａに示した観測画像における細胞の混在指数を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施の形態３に係る評価装置において、図７Ｂに示した観測画像における細胞の混在指数を示す図である。
【図１１】図１１は、実施の形態３に係る評価装置において、図３Ａ〜図３Ｄに示した観測画像における細胞の混在指数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１４】
（概要）
細胞などの２種類以上の物質が混在する様子は、光学顕微鏡、電子顕微鏡等で観測することができる。例えば、２種類以上の細胞として、骨を壊す機能を有する破骨細胞と骨を作る機能を有する骨芽細胞とがあり、破骨細胞と骨芽細胞に骨形成を引き起こす副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を投与して破骨細胞と骨芽細胞の数の変化および分布バランスの変化を観測することにより、ＰＴＨの骨代謝の恒常性への効果を評価することができる。
【００１５】
しかし、各細胞が混在する様子を顕微鏡等で観測することができても、混在状態を数値表現し、定量的に評価することは難しかった。そこで、本発明では、物質の混在状態を定量的に評価する評価方法および評価装置等について説明する。この評価方法および評価装置等では、観測画像をクラスタリングし、各クラスタにおける２種類以上の細胞の混在度（ＧＬＩ）を算出し、細胞の混在状態を定量的に評価している。
【００１６】
以下、本発明の一態様に係る評価方法および評価装置について、図面を参照しながら具体的に説明する。
【００１７】
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも本発明の一具体例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本発明を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００１８】
（実施の形態１）
［１．評価装置の構成］
まず、本実施の形態に係る評価装置１の構成について説明する。図１は、本実施の形態に係る評価装置１の構成の一例を示す図である。図１に示すように、評価装置１は、画像取得部２と演算部３とを備えている。
【００１９】
画像取得部２は、観測対象である細胞の形状、形態、分布等を観察する顕微鏡である。画像取得部２は、観測した細胞の形状、形態、分布等を画像として表示する。画像取得部２を構成する顕微鏡は、例えば、近赤外線励起レーザを用いた２光子励起顕微鏡等である。本実施の形態では、２光子励起顕微鏡を用いた観測例について説明する。
【００２０】
２光子励起顕微鏡は、蛍光分子に励起光を照射するとき２つの励起光子が同時に吸収される２光子励起を利用して、観測対象の細胞の形態等を観測することができる顕微鏡である。本実施の形態では、２光子励起顕微鏡を、画像取得部２として用いる。
【００２１】
２光子励起顕微鏡は、フェムト秒超短パルスレーザまたは近赤外線励起レーザ等の光源と、光源からのレーザ光を集光し、観測試料に照射させる対物レンズと、観測試料を載置する試料台と、光源または試料台をＸＹ方向に操作するスキャナと、観測画像を表示する表示画面とを備えている。レーザ光が対物レンズの焦点面に集光されると、その部分のみで２光子励起過程が引き起こされ、自動的に共焦点効果が得られる。２光子励起顕微鏡では、対物レンズを透過したレーザ光を観測試料に照射させながら、レーザ光と観測試料とを相対的にＸＹ方向に走査することにより、観測試料の形態等を観測し、２次元または３次元画像として表示画面に表示させる。
【００２２】
近赤外励起レーザを用いた２光子励起顕微鏡では、厚い観測試料にレーザ光を浸透させることが可能であるため、生きた細胞の時空間情報を取得し、組織および器官内の生きた細胞の形態および相互作用等を視覚化することができる。例えば、２光子励起顕微鏡を用いて、生体内の骨組織内の生細胞の観察を行うことができる。
【００２３】
なお、画像取得部２は、２光子励起顕微鏡に限らず、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡等その他の顕微鏡であってもよい。
【００２４】
演算部３は、画像取得部２で取得された画像から、観測対象である細胞の混在度を演算するコンピュータである。演算部３における演算については後に詳述する。
【００２５】
［２．評価方法］
次に、評価装置１の動作および細胞の混在度の演算方法について説明する。図２は、本実施の形態に係る評価装置１における細胞の混在度の演算手順を示すフローチャートである。
【００２６】
図２に示すように、はじめに、評価装置１において、画像取得部２により細胞の形状、形態、分布等の画像が取得される（画像取得ステップ）（ステップＳ１０）。
【００２７】
細胞の形状、形態、分布等の画像の取得は、詳細には以下の手順で行う。はじめに、観測試料を画像取得部２の試料台に載置する。ここでは、一例として、観測試料として破骨細胞と骨芽細胞観測試料として破骨細胞と骨芽細胞を用い、これらの混在状態および相互作用の観測を行うものとする。観測試料である破骨細胞と骨芽細胞には、染色液を投与して異なる色に染色する。また、これらの変化を観測するために、骨形成を引き起こす副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を間歇投与する。その後、２光子励起顕微鏡により、破骨細胞と骨芽細胞の観測を行う。観測した破骨細胞と骨芽細胞の分布は、画像取得部２に設けられたモニタ（図示せず）に表示される。
【００２８】
図３Ａ〜図３Ｄは、本実施の形態に係る評価装置１の画像取得部２が取得した観測画像の一例である。図３Ａは、ＰＴＨ投与前の細胞の観測画像、図３Ｂは、ＰＴＨ投与１週間後の細胞の観測画像、図３Ｃは、ＰＴＨ投与３週間後の細胞の観測画像、図３Ｄは、ＰＴＨ投与６週間後の細胞の観測画像の例である。図３Ａ〜図３Ｄにおいて、濃いグレーで示すＡは破骨細胞、薄いグレーで示すＢは骨芽細胞を示している。ＰＴＨ投与前、ＰＴＨ投与１週間後、ＰＴＨ投与３週間後、ＰＴＨ投与６週間後の観測画像を比較すると、破骨細胞と骨芽細胞とが混在していることが確認できる。また、ＰＴＨを投与してから１週間後では、破骨細胞が支配的になっており、その後骨芽細胞が増加していることが観測されている。
【００２９】
次に、評価装置１において、演算部３により、画像取得部２において取得された観測画像から観測試料における細胞の隣接関係が抽出される（抽出ステップ）（ステップＳ１１）。細胞の隣接関係の抽出には、例えばクラスタリング法を用いる。クラスタリング法は、分類対象の集合を，内的結合（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｈｅｓｉｏｎ）と外的分離（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）が達成されるような部分集合に分割することをいう。つまり、抽出ステップでは、画像取得部２で取得された観測画像を、隣接する細胞ごとに複数のクラスタに分割し、細胞領域間の接続性を抽出する。
【００３０】
クラスタリングには、例えば、最短距離にある細胞を結びつける最短距離法、最長距離法、群平均法、Ｗａｒｄ法等の階層型手法、ｋ平均法等の非階層型手法またはその他の手法を用いてもよい。本実施の形態に係る評価装置１では、一例として、隣接する最小単位の細胞の間の距離をユークリッド法で計算し、図４に示すように、階層型クラスタリング法を用いる。階層型クラスタリング法としては、例えばＷａｒｄ法を用いる。
【００３１】
Ｗａｒｄ法による階層型クラスタリング法では、クラスタリングの対象の細胞から、その細胞を含むクラスタの重心までの距離の二乗の総和を最小化することにより、細胞の隣接関係が抽出される。
【００３２】
図４は、本実施の形態に係る評価装置１で行われるクラスタリングの一例を示す図である。クラスタリングの開始時には、１つのクラスタには最小単位である１つの細胞が含まれている。そして、図４に示すように、隣接する最小単位の細胞同士を順次結合し、次第に大きなクラスタとなるように結合を繰り返す。この結合は、すべての最小単位の細胞が１つのクラスタになるまで行う。この結合は、クラスタ間の距離が近いものから結合していくものとする。また、形成された木構造を所定の閾値で切断することにより再びクラスタに分割し、クラスタごとの少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出してもよい。なお、このクラスタリングを行うときには、最小単位の細胞の種類（例えば、観測画像における細胞の種類（染色された色））は考慮しなくてもよい。
【００３３】
このように、クラスタによる木構造の形成および分割により、細胞の隣接関係が抽出される。
【００３４】
次に、演算部３により、上述したクラスタによる木構造を用いて少なくとも２つの細胞の混在度が算出される（混在度算出ステップ）（ステップＳ１２）。
【００３５】
演算部３は、任意の閾値によって木構造を切断してクラスタに分割し、得られた各クラスタにおける細胞の混在度を算出する。混在度とは、異なる細胞がクラスタに混在している度合いである。例えば、本実施の形態では、機械学習の分野で広く使用されているＧｉｎｉ−ｌｉｋｅの混在度（ＧＬＩ：Ｇｉｎｉ−ｌｉｋｅ  ｉｍｐｕｒｉｔｙ）を算出する。
【００３６】
ＧＬＩは、分割された各クラスタにおける局所的な混在度Ｉｃｉを算出し、すべての局所的な混在度Ｉｃｉの重み付き平均を計算して画像全体の混在度ＧＬＩとすることにより算出される。
【００３７】
ここで、ｍをクラスタ数、ＹｃｉとＲｃｉをそれぞれｉ番目のクラスタＣｉ中の細胞Ａと細胞Ｂの数とすると、ｉ番目のクラスタＣｉにおける細胞Ａと細胞Ｂとの混在度Ｉｃｉは式（１）で定義される。
【００３８】
【数１】
2019128148.tif 000003
【００３９】
また、ＧＬＩは、より詳細には、上述した木構造をクラスタに分割するときに、木構造を切断する閾値を複数変更してクラスタを細分化しながら、それぞれのクラスタ数ｍ＝１，２，３，・・・における細胞Ａと細胞Ｂとの面積比Ｂ／Ａを加算するものである。つまり、ＧＬＩは、クラスタの集合Ｃｍ＝｛Ｃ１，・・・，Ｃｍ｝に対して、細胞Ａと細胞Ｂとの面積比（混在度Ｉｃｉ）の加重平均であり、式（２）で定義される。
【００４０】
【数２】
2019128148.tif 000004
【００４１】
ここで、Ｎは細胞Ａと細胞Ｂの最小単位（例えば、二値化されたピクセル）の総数である。
【００４２】
ＧＬＩが最大となるのは、すべてのクラスタがそれぞれ同じ量の細胞Ａと細胞Ｂとを持つ場合である。この場合、ＧＬＩの値は０．５となる。また、全てのクラスタがそれぞれ細胞Ａまたは細胞Ｂの一種類からなる場合、ＧＬＩの値は０となる。
【００４３】
なお、上述したクラスタごとの局所的な混在度Ｉｃｉは第１の混在度、局所的な混在度Ｉｃｉを用いて重み付き平均を算出した画像全体の混在度ＧＬＩは第２の混在度である。また、局所的な混在度Ｉｃｉを算出するステップは第１混在度算出ステップ、画像全体の混在度ＧＬＩを算出するステップは第２混在度算出ステップである。
【００４４】
以下、クラスタ数が２、４、８となるように木構造を切断した場合について具体的に説明する。図５Ａ〜図５Ｃは、本実施の形態に係る評価装置１で行われる階層型クラスタリング（クラスタ数が２、４、８）の一例を示す図である。図６Ａ〜図６Ｃは、それぞれ図５Ａ〜図５Ｃのクラスタリングを行った場合の細胞の混在度を示す図である。
【００４５】
図５Ａに示すように、観測画像が２つのクラスタ＃１および＃２に分割され（クラスタ数ｍ＝２）、クラスタ＃１および＃２のそれぞれがほぼ同数の細胞Ａと細胞Ｂとを含んでいる場合には、細胞Ａおよび細胞Ｂの混在度Ｉｃｉは０．５に近い値となる。より詳細には、図６Ａに示すように、クラスタ＃１における混在度Ｉｃ１は０．４８、クラスタ＃２における混在度Ｉｃ２は０．４３である。したがって、このように２つのクラスタに分割したときの全体的な混在度（ＧＬＩ）も、ＧＬＩ（Ｃｍ＝２）＝０．４６８と０．５に近い値となる。
【００４６】
また、図５Ｂに示すように、木構造の分割数を増加し、観測画像が４つのクラスタ＃１〜＃４に分割された場合（クラスタ数ｍ＝４）には、一部のクラスタには細胞Ａおよび細胞Ｂが混在し、他のクラスタには細胞Ａまたは細胞Ｂのいずれかが多く存在する場合も発生する。図６Ｂに示すように、このときのクラスタ＃１における混在度Ｉｃ１は０．０９、クラスタ＃２における混在度Ｉｃ２は０．４８、クラスタ＃３における混在度Ｉｃ３は０．４６、クラスタ＃４における混在度Ｉｃ４は０．００である。このときの全体的な混在度（ＧＬＩ）は、ＧＬＩ（Ｃｍ＝４）＝０．２３０となり、クラスタ数がｍ＝２のときよりも低い値となる。
【００４７】
さらに、図５Ｃに示すように、木構造の分割数をさらに増加し、観測画像が８つのクラスタ＃１〜＃８に分割された場合（クラスタ数ｍ＝８）には、各クラスタの大きさがより小さくなり、細胞Ａおよび細胞Ｂのみが存在する場合も発生する。図６Ｃに示すように、このときのクラスタ＃１における混在度Ｉｃ１は０．３２、クラスタ＃２における混在度Ｉｃ２は０．４３、クラスタ＃３における混在度Ｉｃ３は０．１７、クラスタ＃４における混在度Ｉｃ４は０．０６、クラスタ＃５における混在度Ｉｃ５は０．００、クラスタ＃６における混在度Ｉｃ６は０．４８、クラスタ＃７における混在度Ｉｃ７は０．１２、クラスタ＃８における混在度Ｉｃ８は０．００である。また、このときの全体的な混在度（ＧＬＩ）は、ＧＬＩ（Ｃｍ＝８）＝０．１９４となり、クラスタ数がｍ＝４のときよりもさらに低い値となる。
【００４８】
以上のようにして算出されたＧＬＩにより、細胞Ａと細胞Ｂの混在度を定量的に評価することができる。細胞Ａと細胞Ｂの混在度の評価は、例えば、以下に示すように、各クラスタ数のときのＧＬＩの値をプロットして、そのグラフの曲率または傾きを比較したり、同一のクラスタ数におけるＧＬＩの値を比較したりすることにより、定量的に評価することができる。
【００４９】
［３．計測例］
以下、本実施の形態に係る評価装置１を用いた細胞の混在度の評価の具体例について説明する。ここでは、細胞Ａとして破骨細胞、細胞Ｂとして骨芽細胞を用い、骨形成を引き起こす副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を間歇投与したときの、骨形成時における破骨細胞と骨芽細胞との混在度を評価する例を挙げる。
【００５０】
図７Ａは、本実施の形態に係る評価装置１の画像取得部２が取得した、ＰＴＨ投与前の細胞の観測画像である。図７Ｂは、本実施の形態に係る評価装置１の画像取得部２が取得した、ＰＴＨ投与６週間後の細胞の観測画像である。
【００５１】
図７Ａに示すＰＴＨ投与前の観測画像と図７Ｂに示すＰＴＨ投与６週間後の観測画像を比較すると、ＰＴＨ投与前よりもＰＴＨを投与してから６週間後の方が、破骨細胞および骨芽細胞が増加し、破骨細胞と骨芽細胞とがより混在していることが観測されている。
【００５２】
また、ＰＴＨ投与前の細胞の観測画像とＰＴＨ投与６週間後の観測画像のそれぞれについて、上述した評価方法によりＧＬＩを算出し、クラスタ数ごとのＧＬＩをプロットし、破骨細胞と骨芽細胞の混在度の定量評価を行った。
【００５３】
図８Ａは、図７Ａに示した観測画像における細胞の混在度を示す図である。図８Ｂは、図７Ｂに示した観測画像における細胞の混在度を示す図である。
【００５４】
図８Ａに示すＰＴＨ投与前の混在度と図８Ｂに示すＰＴＨ投与６週間後のＧＬＩとを比較すると、ＰＴＨ投与前ではクラスタ数が増加するにつれてＧＬＩの値が急激に低下しているのに対し、ＰＴＨ投与６週間後では、クラスタ数が増加したときのＧＬＩの値の低下が緩やかであることが解る。つまり、クラスタ数の増加に伴ってＧＬＩが急激に減少しているＰＴＨ投与前では、クラスタ数の増加に伴って破骨細胞または骨芽細胞のみを含むクラスタが増加しており、観測画像全体においては破骨細胞と骨芽細胞が混在していないといえる。
【００５５】
また、クラスタ数の増加に伴ってＧＬＩが緩やかに減少しているＰＴＨ投与６週間後では、クラスタ数を増加しても、各クラスタでは破骨細胞および骨芽細胞が混在しており、観測画像全体においても破骨細胞と骨芽細胞が混在しているといえる。
【００５６】
つまり、観測画像全体では、ＰＴＨ投与前では破骨細胞と骨芽細胞の混在度は低く、ＰＴＨ投与６週間後では破骨細胞と骨芽細胞の混在度はＰＴＨ投与前よりも高いことがわかる。このことは、図７Ａおよび図７Ｂに示した観測画像の結果と合致している。
【００５７】
［４．効果など］
以上、本実施の形態に係る評価装置１および評価方法によれば、２種類以上の細胞の混在度を、局所的な混在度Ｉｃｉおよび画像全体の混在度ＧＬＩを算出することにより、少なくとも２つの細胞の混在度を定量的に評価することができる。
【００５８】
なお、上述した細胞の混在度は２つの細胞の混在度に限らず、３つ以上の細胞の混在度であってもよい。
【００５９】
また、混在度Ｉｃｉの算出式は、上述した式（１）に限られず、例えば、式（１）における（Ｙｃｉ２＋Ｒｃｉ２）／（Ｙｃｉ＋Ｒｃｉ）２を、細胞Ａおよび細胞Ｂの面積比Ｂ／Ａとしたものであってもよい。
【００６０】
また、上述した評価方法は、プログラムにより実現されてもよい。当該プログラムは、演算部３に、少なくとも２つの細胞が混在する観測画像を取得させ、取得した観測画像において、少なくとも２つの細胞の隣接関係を抽出させ、抽出された隣接関係から、少なくとも２つの細胞の混在度を算出させるものである。このプログラムでは、２種類以上の細胞の混在度を、局所的な混在度Ｉｃｉおよび画像全体の混在度ＧＬＩを算出することにより、少なくとも２つの細胞の混在度を定量的に評価することができる。
【００６１】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２に係る評価装置１および評価方法について説明する。本実施の形態に係る評価装置１および評価方法が実施の形態１に係る評価装置１および評価方法と異なる点は、上述した抽出ステップにおいて、クラスタリングを行う前に、画像取得部２で取得した観測画像を二値化する点である。観測画像を二値化することにより、混在する異なる種類の細胞のそれぞれをより区別することができるので、混在度をより簡便かつ精度よく算出することができる。
【００６２】
図９Ａは、本実施の形態に係る評価装置の画像取得部が取得した細胞の観測画像の一例である。図９Ｂは、図９Ａに示した細胞の観測画像を二値化した図である。図９Ｃは、図９Ｂに示した細胞の観測画像をピクセル表示化した図である。図９Ａ〜図９Ｃでは、細胞Ａおよび細胞Ｂとして破骨細胞と骨芽細胞を用いている。
【００６３】
二値化ステップでは、画像取得部２で取得された観測画像において、異なる色で表示された異なる細胞を、所定の閾値により二値に分離する。例えば、２つの異なる色で表示された観測画像において、２つの色のそれぞれの輝度分布のヒストグラムにおいて２つの色の輝度の間の輝度を閾値とし、閾値より輝度が大きい色の領域と、閾値より輝度が小さい色の領域とに二値化する。これにより、例えば、図９Ａに示した観測画像は、図９Ｂに示すように二値化される。これにより、観測画像において、細胞Ａが存在する領域と、細胞Ｂが存在する領域と、細胞が存在しない領域とがより明確に表される。
【００６４】
なお、閾値を自動的に決定するために、大津法を用いて二値化を行うことにより、２つの異なる細胞を自動的に抽出してもよい。
【００６５】
また、二値化された観測画像は、さらに、ピクセル化してもよい。例えば、細胞Ａよりも細胞Ｂの占める面積が大きいピクセルは、細胞Ｂのみのピクセルとする。これにより、観測画像をピクセル単位でクラスタリングすることが可能となる。
【００６６】
さらに、ピクセル化された観測画像は、異なるピクセル数の画像へリサイズ（サイズ変更）されてもよい。例えば、リサイズの倍率（スケーリングファクタ）を１／４とし、５１２ピクセル×５１２ピクセルの大きさの画像を１２８ピクセル×１２８ピクセルへリサイズしてもよい。図９Ｃは、二値化された図９Ｂの観測画像を、さらにスケーリングファクタを１／４としてリサイズした画像である。画像のリサイズを行うことにより、観測画像において、細胞Ａおよび細胞Ｂそれぞれの集団が存在する領域を強調して表すことができる。また、リサイズによってピクセル数を少なくすることにより、計算時間を短縮することができる。なお、混在度ＧＬＩおよび後述する混在指数（ＣＭＩ）は画像サイズの影響をほとんど受けないため、スケーリングファクタは１／４〜１／１６等任意に設定してもよい。
【００６７】
（実施の形態３）
次に、実施の形態３に係る評価装置１および評価方法について説明する。本実施の形態に係る評価装置１および評価方法が実施の形態１に係る評価装置１および評価方法と異なる点は、上述した混在度算出ステップの後、クラスタに対する細胞の混在度ＧＬＩをプロットし、プロットした混在度の積分値である混在指数（ＣＭＩ：Ｃｅｌｌ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｉｎｄｅｘ）を算出する点である。混在指数ＣＭＩを算出することにより、より２以上の細胞が混在する度合いを定量的に評価することができる。
【００６８】
図１０Ａは、本実施の形態に係る評価装置において、図７Ａに示した観測画像における細胞の混在指数ＣＭＩを示す図である。図１０Ｂは、本実施の形態に係る評価装置において、図７Ｂに示した観測画像における細胞の混在指数ＣＭＩを示す図である。図１１は、本実施の形態に係る評価装置において、図３Ａ〜図３Ｄに示した観測画像における細胞の混在指数ＣＭＩを示す図である。
【００６９】
実施の形態１に示した評価装置１および評価方法において、クラスタ数の増加に対して全体の混在度ＣＬＩが減少する過程は、上述したように観測画像中の細胞の混在度（強くまじりあっているか別々の集団を形成しているか）に依存する。 ２つの細胞の混在度を定量化するために、混在指数ＣＭＩを定義する。混在指数ＣＭＩは、クラスタごとの混在度ＧＬＩをプロットした曲線の下側の面積（積分値）により定義される。つまり、混在指数ＣＭＩは、以下の式（３）により定義される。
【００７０】
【数３】
2019128148.tif 000005
【００７１】
ここで、ＧＬＩ（Ｃｍ）は、クラスタ数がｍのときの混在度を表す指標であり、式（１）で定義したものである。Ｎは二値化されたピクセルの総数である。式（３）は、クラスタ数の対数を重みとした各ＧＬＩの値の加重平均である。階層型クラスタリングが２分木であるため、２を底とした対数を重み付けとして用いる。加えて、ＣＭＩの値を０から１の値域に収めるために２倍する。
【００７２】
ここで、ＣＭＩの算出を簡便化および高速化するため、式（３）を以下の式（４）のように近似する。
【００７３】
【数４】
2019128148.tif 000006
【００７４】
式（４）では、クラスタ数が２の累乗のときのみ（ただし２Ｎ’≦Ｎ）のＧＬＩの値を算出すればよい。この近似によって、ＣＭＩの値はほとんど変化しないが、計算コストを大幅に削減することができる。
【００７５】
また、上記定義より、混在度ＧＬＩおよび混在指数ＣＭＩは、クラスタ数の増加に対して単調に減少する特性を有する。どのようなパターンを入力とした場合でも、最終的にクラスタの数がピクセルの数と等しくなると、式（２）で表される各クラスタにおける混在度Ｉｃｉと式（３）で表される全体の混在度ＧＬＩの値は、ゼロに収束する。細胞の混在度の定量評価に重要なのは、全体の混在度ＧＬＩの値が下がり始めるタイミングである。
【００７６】
各細胞がそれぞれで集団を形成している場合、クラスタ数の増加に伴って全体の混在度ＧＬＩは急激に減少する。また、全体の混在度ＧＬＩが急激に減少している場合には、クラスタごとの混在度ＧＬＩをプロットした曲線の下側の面積は減少する。一方、細胞Ａおよび細胞Ｂのそれぞれが互いに混じり合ったような場合では、クラスタ数が増加しても全体の混在度ＧＬＩの値は高いままである。この場合には、クラスタごとの混在度ＧＬＩをプロットした曲線の下側の面積は増加する。したがって、ＣＭＩを求めることにより、細胞の混在度をより定量的に評価することができる。
【００７７】
さらに、ＣＭＩをプロットすることにより、細胞の混在度をより定量的に評価してもよい。図１１は、本実施の形態に係る評価装置において、図３Ａ〜図３Ｄに示した観測画像における細胞の混在指数を示す図である。すなわち、図１１では、ＰＴＨ投与前、ＰＴＨ投与１週間後、ＰＴＨ投与３週間後およびＰＴＨ投与６週間後の観測画像からＣＭＩを算出し、最大値、最小値、および平均値を算出したものである。
【００７８】
図１１に示すように、複数の観測試料のＣＭＩをプロットすることにより、複数の観測試料における細胞の混在度の傾向を、より定量的に評価することができる。
【００７９】
（その他の実施の形態）
以上、本発明の実施の形態に係る評価装置および評価方法について説明したが、評価装置および評価方法は上述した実施の形態に限らず、変更を加えてもよい。
【００８０】
例えば、上述した実施の形態１に係る評価装置１および評価方法では、画像を取得するステップと、細胞の隣接関係を取得するステップと、混在度を算出するステップとを含んでいたが、評価装置１および評価方法は、さらに、実施の形態２に示した観測画像の二値化、および混在指数ＣＭＩの算出も併せて行ってもよい。
【００８１】
また、評価装置における画像取得部は、上述した実施の形態に示した２光子励起顕微鏡に限らず、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡等その他の顕微鏡であってもよい。
【００８２】
また、クラスタリングには、上述した実施の形態に示したＷａｒｄ法に限らず、例えば、最短距離にある細胞を結びつける最短距離法、最長距離法、群平均法等の階層型手法、ｋ平均法等の非階層型手法またはその他の手法を用いてもよい。
【００８３】
また、上述した実施の形態では、演算部は、上述したプログラムを記憶しており、当該プログラムに基づいて上述した評価方法を行ってもよい。
【００８４】
また、観測画像の二値化を行う方法は、上述した実施の形態に示した大津法に限らず、他の方法を用いてもよい。
【００８５】
また、局所的な混在度Ｉｃｉ、画像全体の混在度ＧＬＩおよび混在指数ＣＭＩを算出する計算式は、上述した式（１）〜式（４）に限らず、他の計算式を用いてもよい。
【００８６】
以上、本発明の一つまたは複数の態様に係る評価方法および評価装置について、実施の形態に基づいて説明したが、本発明は、この実施の形態に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、本発明の一つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、細胞および他の物質の観察等において、物質の反応、相互作用などを観測する２光子励起顕微鏡、共焦点顕微鏡等の顕微鏡に有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１    評価装置
２    画像取得部
３    演算部
【図１】
2019128148.tif 000010
【図２】
2019128148.tif 000011
【図３Ａ】
2019128148.tif 000012
【図３Ｂ】
2019128148.tif 000013
【図３Ｃ】
2019128148.tif 000014
【図３Ｄ】
2019128148.tif 000015
【図４】
2019128148.tif 000016
【図５Ａ】
2019128148.tif 000017
【図５Ｂ】
2019128148.tif 000018
【図５Ｃ】
2019128148.tif 000019
【図６Ａ】
2019128148.tif 000020
【図６Ｂ】
2019128148.tif 000021
【図６Ｃ】
2019128148.tif 000022
【図７Ａ】
2019128148.tif 000023
【図７Ｂ】
2019128148.tif 000024
【図８Ａ】
2019128148.tif 000025
【図８Ｂ】
2019128148.tif 000026
【図９Ａ】
2019128148.tif 000027
【図９Ｂ】
2019128148.tif 000028
【図９Ｃ】
2019128148.tif 000029
【図１０Ａ】
2019128148.tif 000030
【図１０Ｂ】
2019128148.tif 000031
【図１１】
2019128148.tif 000032