(57)【要約】【課題】ＨＰＴＰβの活性を選択的に調節し、それにより血管新生シグナル伝達を亢進する、血管増殖（血管新生）を刺激する、及び／若しくは虚血組織の血流を増加させる、又は、血管新生シグナル伝達を低下させる、血管増殖を低下させる、及び／若しくは効果の出た組織への血流を減少させる抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体を開発すること。【解決手段】本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβ（ＨＰＴＰβ）に結合する抗体及びその抗原結合断片、並びにその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体またはその抗原結合断片、あるいは、使用、あるいは、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβ（ＨＰＴＰβ）に結合する抗体及びその抗原結合断片、並びにこれらの使用に関する。
本出願は、特願２００９−５０３７１９号の分割出願である特願２０１２−２２３１５７号の分割出願である。
【背景技術】
【０００２】
血管新生（既に存在する脈管構造からの新たな血管の出芽）は、広範囲の生理学的及び病理学的過程において重要な役割を果たす（グエン，Ｌ．Ｌ．（Nguyen,L.L.）ら（２０
０１年）『インターナショナル・レヴュー・オブ・サイトロジー（Int.Rev.Cytol.）』第２０４巻、１〜４８ページ（非特許文献１））。血管新生は、血管の内側を覆う内皮細胞とそれらを取り囲む環境との間の伝達により仲介される複雑な過程である。血管新生の初期段階では、組織又は腫瘍細胞は、低酸素のような環境刺激に応答して血管新生促進増殖因子を生産及び分泌する。これらの因子は、内皮細胞付近に拡散し、周囲の細胞外マトリクスを分解するプロテアーゼの産生及び分泌を誘導する受容体を刺激する。活性化した内皮細胞は、これらの増殖因子の供給源に向かって周辺組織に遊走及び増殖し始める（ブッソリーノ，Ｆ．（Bussolino,F.）（１９９７年）『トレンズ・オブ・バイオケミカルサイエンス（TrendsBiochem.Sci.）』第２２巻、２５１〜２５６ページ（非特許文献２））。次いで、内皮細胞は増殖を停止し、管状構造に分化するが、これは安定で成熟した血管形成の第一段階である。続いて、周皮細胞及び平滑筋細胞のような周辺内皮細胞は、血管成熟に向けてのさらなる段階で、新たに形成された血管に補充される。
【０００３】
血管新生は、天然に存在する血管新生促進因子及び抗血管新生因子のバランスにより調節される。血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及びアンジオポエチン（angiopoeitin）は、多くの潜在的血管新生促進増殖因子の数例を表す。これらのリガンドは、内皮細胞表面上のそれぞれの受容体チロシンキナーゼに結合し、細胞遊走及び増殖を促進するシグナルを伝達する。多くの調節因子が同定されている一方、この過程を動かす分子機構は依然として完全には理解されていない。
【０００４】
持続的に無調節な又は不適当に調節された血管新生により生じる疾病状態が多く存在する。かかる疾病状態では、無調節な又は不適当に調節された血管新生は、特定の疾患を引き起こす又は現存する病態を悪化させる場合がある。例えば、眼球の新血管新生は、失明の最も一般的な原因として関係づけられており、およそ２０種の眼疾患の病状の根底にある。関節炎のような、特定の既に存在する状態では、新たに形成される毛細血管が関節に侵入し、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜に形成される新しい毛細管が硝子体液に侵入し、出血及び失明を引き起こす。
【０００５】
固形腫瘍の増殖及び転移は両方とも、血管新生依存性である可能性もある（フォークマン（Folkman）ら「腫瘍の血管新生（Tumor Angiogenesis）」（メンデルゾーン（Mendelsohn）ら編Ｗ．Ｂ．サウンダース（Saunders）（１９９５年）『癌の分子的機序（TheMolecularBasisof Cancer）』第１０章、２０６〜２３２ページ）（非特許文献３））。直
径２ｍｍを超える大きさに肥大した腫瘍は、自ら血液供給を獲得しなければならず、新たな毛細血管の増殖を誘導することによりそれを行うことが示されている。これらの新たな血管が腫瘍中に組み込まれ始めた後、それらは腫瘍の増殖に必須である栄養素及び増殖因子、並びに、腫瘍細胞が循環血液中に入り、肝臓、肺又は骨のような遠位部位に転移する手段を供給する（ウィドナー（Weidner）（１９９１年）『ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（NewEng.J.Med.）第３２４巻、１号１〜８ページ（非特許
文献４））。担癌動物で薬剤として使用する際、天然の血管新生阻害剤は、小さな腫瘍の増殖を防ぐことができる（オライリー（O'Reilly）ら（１９９４年）『細胞学（Cell）』第７９巻、３１５〜３２８ページ（非特許文献５））。幾つかのプロトコルでは、かかる阻害剤の適用は、治療の休止後でさえ腫瘍退縮及び休眠を導く（オライリー（O'Reilly）ら（１９９７年）『細胞学（Cell）』第８８巻、２７７〜２８５ページ（非特許文献６））。さらに、血管新生阻害剤を特定の腫瘍に供給すると、他の治療レジメンに対するそれらの応答を高めることができる（例えば、テイスチャー（Teischer）ら（１９９４年）『インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J.Cancer）第５７巻、９２０〜９２５ページ（非特許文献７））。
【０００６】
多くの病状は、持続的に無調節な又は不適当に調節された血管新生により動かされているが、幾つかの病状は血管新生の亢進により治療することができる。組織増殖及び修復は、細胞増殖及び血管新生が生じる生物学的事象である。従って、創傷修復の重要な局面は、血管新生により損傷した組織の血管再生である。
【０００７】
慢性、難治性創傷は、老齢ヒト集団における病的状態の主な原因である。これは特に、重篤な、難治性皮膚潰瘍の発生した寝たきり又は糖尿病患者の場合である。これらの場合の多くでは、治癒の遅れは、持続的圧力又は血管閉塞のいずれかの結果としての不十分な血液供給の結果である。小さなアテローム性動脈硬化又は静脈うっ滞により毛細管循環が乏しくなることは、損傷組織の修復の失敗の一因となる。かかる組織は、病原体を効果的に除去するために良好な血管組織を必要とする体の先天的防御システムにより未処置である、増殖する微生物に感染する場合が多い。結果として、大部分の治療的介入は、虚血組織への血流を回復させ、それにより栄養素及び免疫因子の創傷部位への到達を可能にすることに重点を置いている。
【０００８】
大血管の動脈硬化病変は、患部組織への血管増殖を調節することにより改善し得る、組織虚血を引き起こす場合がある。例えば、冠動脈の動脈硬化病変は、側副動脈の増殖を刺激することにより血流を回復させることができる場合予防することができるアンギナ及び心筋梗塞を引き起こす場合がある。同様に、脚（leg）を供給する大動脈の動脈硬化病変は、可動性を制限する骨格筋の虚血を引き起こす場合があり、切断を必要とする一部の例では、それはまた血管新生治療で血流を改善することにより予防することができる。
【０００９】
糖尿病及び高血圧のような他の疾患は、細動脈及び毛細管のような小血管の数及び密度を減少させることを特徴とする。これらの小血管は、酸素及び栄養素の送達にとって重要である。これらの血管の数及び密度の減少は、高血圧、跛行を含む糖尿病、虚血性潰瘍、加速性高血圧及び腎不全の有害な結果をもたらす。これらの一般的な疾患及びビュルガー病のような多くの他の稀な病気は、血管新生治療を用いて小血管の数及び密度を増加させることにより改善することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／６５０８８号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００７７０６５号
【特許文献３】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献４】米国特許第５，２２５，５３９号
【特許文献５】米国特許第６，１６２，９６３号
【特許文献６】米国特許第６，１５０，５８４号
【特許文献７】米国特許第６，１１４，５９８号
【特許文献８】米国特許第６，０７５，１８１号
【特許文献９】米国特許第５，５４５，８０７号
【特許文献１０】同第５，５４５，８０６号
【特許文献１１】米国特許第５，６２５，８２５号
【特許文献１２】ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９３／１２２２７号
【特許文献１３】米国特許第４，３９９，２１６号
【特許文献１４】米国特許第４，９１２，０４０号
【特許文献１５】米国特許第４，７４０，４６１号
【特許文献１６】米国特許第４，９５９，４５５号
【特許文献１７】米国特許第４，５２２，８１１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】グエン，Ｌ．Ｌ．（Nguyen, L.L.）ら（２００１年）『インターナショナル・レヴュー・オブ・サイトロジー（Int.Rev.Cytol.）』第２０４巻、１〜４８ページ
【非特許文献２】ブッソリーノ，Ｆ．（Bussolino, F.）（１９９７年）『トレンズ・オブ・バイオケミカルサイエンス（Trends Biochem.Sci.）』第２２巻、２５１〜２５６ページ
【非特許文献３】フォークマン（Folkman）ら「腫瘍の血管新生（Tumor Angiogenesis）」（メンデルゾーン（Mendelsohn）ら編Ｗ．Ｂ．サウンダース（Saunders）（１９９５年）『癌の分子的機序（TheMolecularBasis of Cancer）』第１０章、２０６〜２３２ページ
【非特許文献４】ウィドナー（Weidner）（１９９１年）『ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（New Eng. J. Med.）第３２４巻、１号１〜８ページ
【非特許文献５】オライリー（O'Reilly）ら（１９９４年）『細胞学（Cell）』第７９巻、３１５〜３２８ページ
【非特許文献６】オライリー（O'Reilly）ら（１９９７年）『細胞学（Cell）』第８８巻、２７７〜２８５ページ
【非特許文献７】テイスチャー（Teischer）ら（１９９４年）『インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Int.J. Cancer）第５７巻、９２０〜９２５ページ
【非特許文献８】ヤンコポーロス（Yancopoulo）ら（２０００年）『ネイチャー（Nature）』第４０７巻、２４２〜２４８ページ
【非特許文献９】ファン（Huang）ら（１９９９年）『ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Journal of BiologicalChemistry）』第２７４巻、３８１８３〜３８１８５ページ
【非特許文献１０】スーリ（Suri）ら（１９９８年）『サイエンス（Science）』第２８２巻、４６８〜４７１ページ
【非特許文献１１】リン（Lin）ら（１９９７年）『ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（J Clin.Invest.）』第１００巻、２０７２〜２０７８ページ
【非特許文献１２】サーストン（Thurston）ら（２０００年）『ネイチャー・メディシン（Nature Medicine』第６巻、４６０〜４６３ページ
【非特許文献１３】クルーガー（Kruegar）ら（１９９０年）『ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）』第９巻
【非特許文献１４】ダニエルＰ．スタイトス（Daniel P. Stites）、アバＩ．テラ（Abba I. Terr）及びトリストラムＧ．パースロー（TristramG.Parslow）（編）（１９９４年）『基礎及び臨床免疫学（Basicand Clinical Immunology）第８版
【非特許文献１５】マイルダーマンズＳ．（Muyldermans, S.）（２００１年）『レヴューズ・イン・モルキュラー・バイオテクノロジー（Rev.Mol.Biotechnol.）』７４巻、２７７〜３０２ページ
【非特許文献１６】カバト（Kabat）ら（１９９１年）『タンパク質配列の免疫学的興味（Sequences of ProteinsofImmunologicalInterest）第５版』（公衆衛生局（Public Health Service）、国立衛生研究所（NationalInstitutesofHealth）（メリーランド州ベテスダ（Bethesda）
【非特許文献１７】クラックソン（Clackson）ら（１９９１年）『ネイチャー（Nature）』第３５２号、６２４〜６２８ページ
【非特許文献１８】モリソン（Morrison）ら（１９８４年）『米国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）』第８１巻、６８５１〜６８５５ページ
【非特許文献１９】ハドソン（Hudson）ら（２００３年）『ネイチャー・メディシン（Nature Med.）』第９巻、１２９〜１３４ページ
【非特許文献２０】キプリヤノフ（Kipriyanov）及びル・ガリ（Le Gall）（２００４年）『モルキュラー・バイオテクノロジー（MolecularBiotechnol）』第２６巻、３９〜６０ページ（ヒューマナ・プレス（HumanaPress）、ニュージャージー州トトワ（Totowa））
【非特許文献２１】ロー（Lo）（２００４年）『メソッズ・イン・モルキュラー・バイオロジー（Methods Mol.Biol.）』第２４８巻１３５〜１５９ページ（ヒューマナ・プレス（HumanaPress）ニュージャージー州トトワ（Totowa））
【非特許文献２２】ウー（Wu）ら（１９９９年）『ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol）』第２９４巻、１５１〜１６２ページ
【非特許文献２３】ゴアデル（Goeddel）編（１９９０年）『メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）』第１８５巻（アカデミック・プレス（AcademicPress）
【非特許文献２４】アウエルバッハ，Ｒ．（Auerbach,R.）ら（２００３年）『クリニカル・ケミストリー（Clin Chem）』第４９巻、３２〜４０ページ；
【非特許文献２５】ベイル，Ｂ．（Vailhe,B.）ら（２００１年）『ラボラトリー・インヴェスティゲーション（Lab Invest）』第８１巻４３９〜４５２ページ
【非特許文献２６】シモンズ（Simons）ら（２０００年）「冠状動脈血管新生の臨床試験（Clinical trialsincoronaryangiogenesis）」（『サーキュレーション（Circulation）』第１０２巻、７３〜８６ページ
【非特許文献２７】『ウェブスター大学生用辞典第９版（Webster's Ninth Collegiate Dictionary）』
【非特許文献２８】ホックフィールドＳ．（Hockfield, S.）ら（１９９３年）『免疫細胞化学（Immunocytochemistry）』第１巻、１１１〜２０１ページ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ColdSpringHabor Laboratory Press）
【非特許文献２９】ゴーディング（Goding）Ｊ．Ｗ．（１９９６年）『モノクローナル抗体：その原理及び実施（MonoclonalAntibodies:Principlesand Practices）』第３版、アカデミック・プレス社（Academic Press Limited.）１４５ページ
【非特許文献３０】スピッツ（Spitz），Ｍ．（１９８６年）『メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods In Enzymology）』第１２１巻（ジョン．Ｊ，ラゴン（JohnJ,Lagone）及びヘレン・ヴァン・ヴナキス（HelenVan Vunakis）編、３３〜４１頁（アカデミック・プレス（Academic Press）ニューヨーク州ニューヨーク）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、血管新生の調節因子を同定する持続的必要性が存在する。
【００１３】
上記内容を考慮して、血管新生仲介疾患の治療において生化学的標的を同定する必要性が存在する。しかしながら、血管新生は、複数の増殖因子及びそれらの同族の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）の作用に関与する（ヤンコポーロス（Yancopoulo）ら（２０００年）『ネイチャー（Nature）』第４０７巻、２４２〜２４８ページ（非特許文献８））。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞の、胚の脈管構造における発生期の血管への分化にとって重要である。さらに、ＶＥＧＦは、成体の脈管構造における血管発生を亢進する。外来性ＶＥＧＦの投与は、側副脈管構造の発生を亢進し、虚血組織への血流を改善する。
【００１４】
現在までに、ＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）及びＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ−４）という、３種のＶＥＧＦ  ＲＴＫが同定されている。これらの受容体は高度に保存されているが、生化学的特性及び生物活性に基づいて、それぞれが特異的であるとともに重複しない機能を有する。３種の受容体のうち、ＶＥＧＦＲ２は、脈管構造の発生及び成体の血管新生中のＶＥＧＦ作用の仲介において、主な役割を果たすと考えられている。しかしながら、ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ３はともに、胚の脈管構造の正常な発生に必要であり、成体組織における血管新生にとっても重要である場合がある。ＶＥＧＦが結合し二量体になると、ＶＥＧＦＲ２キナーゼドメインの構造変化によりそのキナーゼ活性が亢進し、特異的なチロシン残基での対におけるもう一方の要素の「自己リン酸化」をもたらす。これらの自己リン酸化現象は、キナーゼ活性をさらに亢進させ、細胞内シグナル分子の結合のためのアンカーポイントを提供する機能を有する。
【００１５】
しかしながら、１つの血管新生経路の活性化では、虚血組織に十分な灌流を供給する持続的及び機能的な血管を生産するには不十分である可能性がある。胚の脈管構造の構築に複数のＲＴＫが関与するという事実に加えて、これらの知見は、複数の血管新生経路を調節する生化学的標的が、１つの増殖因子の投与を超える利点を有することを示す。
【００１６】
タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、ホスホチロシン残基を含有するタンパク質を脱リン酸化する近縁酵素の大きなファミリーを含む。最近の証拠は、ＰＴＰの機能の１つがＲＴＫのリン酸化及び活性化を制限することであることを示している。例えば、ＨＣＰＴＰＡ（低分子量タンパク質チロシンホスファターゼ）は、ＶＥＧＦＲ２と結合して、培養内皮細胞におけるその活性化及び血管新生アッセイにおける生物活性を負に調節することが示された（ファン（Huang）ら（１９９９年）『ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー（Journalof BiologicalChemistry）』第２７４巻、３８１８３〜３８１８５ページ（非特許文献９））。
【００１７】
ＶＥＧＦＲ２に加えて、別のＲＴＫであるＴｉｅ−２（アンジオポエチン（Ａｎｇ１及びＡｎｇ２）の受容体）からのシグナル入力もまた重要である。マウスにおけるＡｎｇ１又はＴｉｅ−２のいずれかの遺伝子の欠失は、脈管構造の発達異常に伴って、胚の致死をもたらす可能性がある（ヤンコポーロス（Yancopoulos）ら（２０００年）『ネイチャー（Nature）』第４０７巻、２４２〜２４８ページ（非特許文献８））。さらに、皮膚でのＡｎｇ１の過剰発現は皮膚の血管増生を増加させ、外来性Ａｎｇ１の投与は虚血骨格筋への血流を増加させる（スーリ（Suri）ら（１９９８年）『サイエンス（Science）』第２８２巻、４６８〜４７１ページ（非特許文献１０））。さらに、癌の動物モデルにおいて、Ｔｉｅ−２の活性化阻害は、血管新生を阻害し、腫瘍進行を制限する（リン（Lin）ら（１９９７年）『ジャーナル・オブ・クリニカル・インヴェスティゲーション（JClin.Invest.）』第１００巻、２０７２〜２０７８ページ（非特許文献１１））。その血管新生活性に加えて、Ａｎｇ１の外来性投与によるＴｉｅ−２の活性化は、ＶＥＧＦ仲介血液漏出及び炎症促進効果をブロックするが、血管新生効果を亢進する（サーストン（Thurston）ら（２０００年）『ネイチャー・メディシン（NatureMedicine』第６巻、４６０〜４６３ページ（非特許文献１２））。それゆえ、ＶＥＧＦＲ２及びＴｉｅ−２シグナル伝達の両方を調節する生化学的標的は、優れた血管新生促進又は抗血管新生治療をもたらす可能性がある。
【００１８】
ＨＰＴＰβ（最初に、クルーガー（Kruegar）ら（１９９０年）『ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）』第９巻（非特許文献１３）に記載された）は、アンジオポエチン受容体型チロシンキナーゼＴｉｅ−２（例えば、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ００／６５０８８号（特許文献１））の活性を調節することが示唆されている。ＨＰＴＰβはまた、ＶＥＧＦＲ２の活性を調節することが示唆された（例えば、米国特許出願公開第２００４／００７７０６５号（特許文献２））。
【００１９】
ＨＰＴＰβの活性を選択的に調節し、それにより血管新生シグナル伝達を亢進する、血管増殖（血管新生）を刺激する、及び／若しくは虚血組織の血流を増加させる、又は、血管新生シグナル伝達を低下させる、血管増殖を低下させる、及び／若しくは効果の出た組織への血流を減少させる抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体を開発することが望ましい。本明細書では、ＨＰＴＰβに結合し、血管新生細胞のシグナル伝達を調節し、次に血管新生を調節する抗体及びその断片について記載する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβ（ＨＰＴＰβ）に結合し、それにより血管新生細胞シグナル伝達を調節し、次に血管新生を調節する抗体に関する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する単離した抗体又はその抗原結合断片であり、該抗体又はその抗原結合断片が血管新生細胞シグナル伝達を調節し、次に血管新生を調節する抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβのＮ−末端部分に結合する抗体に関する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβの第一ＦＮ３反復に結合する抗体に関する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβの第一ＦＮ３反復に結合する抗体であり、該ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβの第一ＦＮ３反復が配列番号１１に示した配列又はその一部を有する抗体に関する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体である抗体に関する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６（マウスのハイブリドーマ、Ｂａｌｂｃ脾臓細胞（Ｂ細胞）（２００６年５月４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（AmericanTypeCulture Collection）（ＡＴＣＣ）（郵便番号２０１０８米国バージニア州マナッサス（Manassas）私書箱１５４９）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７５８０に指定された）である抗体に関する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、Ｒ１５Ｅ６と同様の、又は実質的に同様の生物学的特性を有する抗体に関する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、抗体又は抗原結合断片がヒト化された抗体に関する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６由来の抗原結合領域残基を含み、ヒト化された抗体に関する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合断片に関する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びＦ（ａｂ’）2断片からなる群から選択される抗原結合断片に関する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、血管新生の調節を必要とする被験体を同定する工程と、有効量の、ＨＰＴＰβに結合し、血管新生を調節する抗体又はその抗原結合断片を被験体に投与する工程とを含む、被験体の血管新生調節疾患を治療する方法に関する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、血管新生調節疾患が、血管新生増加疾患であり、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、癌、鎌状赤血球性貧血、サルコイド、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎（vitritis）、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性紅斑性狼瘡（erythematosis）、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎の原因となる感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭小窩、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷及びレーザ後合併症、ルベオーシス関連疾患、及び増殖性硝子体網膜症から選択される、被験体の血管新生調節疾患の治療方法に関する。
【００３４】
別の実施形態では、血管新生調節疾患が、血管新生増加疾患であり、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、癌、リウマチ様関節炎、血管腫、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、又は遺伝性出血性末梢血管拡張症、及び固体若しくは血液媒介腫瘍の群から選択されるが、これらに限定されない、被験体の血管新生調節疾患の治療方法に関する。
【００３５】
別の実施形態では、血管新生調節疾患が、血管新生増加疾患であり、クローン病及び潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、リウマチ様関節炎、血管腫、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、又は遺伝性出血性末梢血管拡張症、固体若しくは血液媒介腫瘍、及び後天性免疫不全症候群からなる群から選択される、被験体の血管新生調節疾患の治療方法に関する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、血管新生調節疾患が、血管新生減少疾患であり、骨格筋又は心筋虚血、脳卒中、冠動脈疾患、末梢血管疾患、冠動脈疾患、脳血管疾患、糖尿病性ニューロパシー及び創傷治癒からなる群から選択されるが、これらに限定されない、被験体の血管新生調節疾患の治療方法に関する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、血管新生調節疾患が、血管新生減少疾患であり、骨格筋又は心筋虚血、脳卒中、冠動脈疾患、末梢血管疾患、冠動脈疾患からなる群から選択される、被験体の血管新生調節疾患の治療方法に関する。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、血管新生減少疾患が末梢血管疾患である、被験体の血管新生減少疾患の治療方法に関する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、血管新生減少疾患が冠動脈疾患である、被験体の血管新生減少疾患の治療方法に関する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する抗体又はその断片と、製薬上許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する抗体又はその断片であり、該抗体がモノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６である抗体又はその断片と、製薬上許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する抗体又はその断片であり、抗体がＲ１５Ｅ６と同様の、又は実質的に同様の生物学的特性を有するモノクローナル抗体である抗体又はその断片と、製薬上許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する、ヒト化された抗体又はその抗原結合断片と、製薬上許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼβに結合する抗体又はその抗原結合断片であり、該抗体がモノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６由来の抗原結合領域残基を含み、ヒト化された抗体又はその抗原結合断片と、製薬上許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４５】
配列表の説明
配列表の各ヌクレオチド及びタンパク質配列を、対応するＧｅｎｂａｎｋ又はＤｅｒｗｅｎｔ受入番号（適用可能な場合）及び由来種とともに表Ｉに示す。
【００４６】
【表１】
2019048896.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＨＰＴＰβＥＣＤタンパク質の設計及び作製（パネルＡ）完全長ＨＰＴＰβ及びＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６ｈｉｓ融合タンパク質の略図（パネルＢ）βＥＣＤ−６Ｈｉｓの発現を誘導するベクターで形質移入したＨＥＫ２９３細胞の上清を充填したＮｉ−ＮＴＡカラムからのイミダゾール溶出液の銀染色ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６ｈｉｓ融合タンパク質に一致する単一高分子量バンドが検出された。
【図２】Ｒ１５Ｅ６は内皮細胞の内因性ＨＰＴＰβを認識する。（パネルＡ）内皮細胞溶解物を対照抗体（レーン１）、Ｒ１５Ｅ６（レーン２）又は抗Ｔｉｅ２及び抗ＶＥＧＦＲ２抗体（レーン３）の混合物で免疫沈降する。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ｒ１５Ｅ６、抗Ｔｉｅ２及び抗ＶＥＧＦＲ２抗体の混合物でウエスタンブロットすることによりプローブする。ＨＰＴＰβに一致する１本の主な高分子量バンドがＲ１５Ｅ６（レーン２）で見られ、対照抗体（レーン１）又は抗Ｔｉｅ２及び抗ＶＥＧＦＲ２の混合物（レーン３）では見られなかった。（パネルＢ）内皮細胞を、Ｒ１５Ｅ６（白色ピーク）又は一次抗体なしの対照（黒色ピーク）とともにＦＡＣＳ分析に供する。蛍光の大きな変化は、Ｒ１５Ｅ６が、インタクトな内皮細胞のＨＰＴＰβに結合することを示す。
【図３】Ｒ１５Ｅ６はＨＵＶＥＣ中でのＴｉｅ２受容体活性化を亢進する。Ｔｉｅ２の活性化は、実施例４に記載したようにヒト内皮細胞で測定される。Ｒ１５Ｅ６は用量依存的に基準及びＡｎｇ１誘導Ｔｉｅ２活性化の両方を亢進。
【図４】Ｒ１５Ｅ６はＨＵＶＥＣの生存を亢進する。血清欠乏ヒト内皮細胞の生存は、実施例４に記載のように測定する。そのＴｉｅ２活性化効果に一致し、Ｒ１５Ｅ６は用量依存的に基準及びＡｎｇ１誘導性内皮細胞生存を亢進する（パネルＡ）。さらに、Ｒ１５Ｅ６はまた、用量依存的にＶＥＧＦ及びＦＧＦ仲介内皮細胞の生存を亢進する（パネルＢ及びＣ）。対照抗体は、内皮細胞の生存を亢進しない（パネルＤ）。
【図５】Ｒ１５Ｅ６は、ＨＵＶＥＣの遊走を亢進する。ヒト内皮細胞の遊走は、実施例４に記載のように測定する。Ｒ１５Ｅ６は、用量依存的に基準及びＶＥＧＦ誘導性内皮細胞遊走を亢進。
【図６】Ｒ１５Ｅ６は、ＨＵＶＥＣ／ビーズ出芽アッセイにおいて毛細管形態形成を亢進する。ヒト内皮細胞の毛細管形態形成は、実施例４に記載のようにビーズ出芽アッセイにおいて測定する。Ｒ１５Ｅ６は、基準及びＶＥＧＦ誘導性内皮細胞毛細管形態形成の両方を亢進。
【図７】ウエスタンブロット解析は、Ｒ１５Ｅ６結合エピトープが、ＨＰＴＰβ細胞外ドメインのＮ末端ＦＮ３反復に局在することを示す。（パネルＡ）ウエスタン解析により、Ｒ１５Ｅ６が全てのＣ末端切断変異体に結合することは、結合エピトープがＮ末端２ＦＮ３反復に位置することを示す。（パネルＢ）マウス／ヒトキメラタンパク質の解析でも、Ｒ１５Ｅ６結合エピトープはＨＰＴＰβＮ末端ＦＮ３反復に局在。
【図８】ＭＳＤ分析により、Ｒ１５Ｅ６結合エピトープのＨＰＴＰβ細胞外ドメインのＮ末端ＦＮ３反復への局在を確認する。（パネルＡ）ＭＳＤ分析により、Ｒ１５Ｅ６は、全てのＣ末端切断変異体に結合し、これにより結合エピトープがＮ末端２ＦＮ３反復に位置することが確認される。（パネルＢ）マウス／ヒトキメラタンパク質の解析により、さらに、Ｒ１５Ｅ６結合エピトープがＨＰＴＰβＮ末端ＦＮ３反復に局在することを確認。
【図９】ＭＳＤ分析は、単量体Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片もまた、ＨＰＴＰβのＮ末端ＦＮ３反復に結合することを示す。（パネルＡ）インタクトなＲ１５Ｅ６抗体と同様に、Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、全てのＣ末端切断変異体に結合し、これにより結合エピトープがＮ末端２ＦＮ３反復に位置することが確認される。（パネルＢ）マウス／ヒトキメラタンパク質の分析は、Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片がＨＰＴＰβＮ末端ＦＮ３反復に局在することを示す。
【図１０】単量体Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、Ｔｉｅ２活性化を亢進せず、インタクトなＲ１５Ｅ６のＴｉｅ２活性化をブロック。
【図１１】Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、内皮細胞の生存を強力に阻害する。（パネルＡ）対照Ｆａｂ断片に比べて、Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は内皮細胞の生存を強力に阻害する。（パネルＢ）Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片の阻害効果は、インタクトなＲ１５Ｅ６との競合により回復。
【図１２】Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、ＶＥＧＦ仲介内皮細胞遊走を阻害。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、ＨＰＴＰβに結合する抗体及びその使用に関する。
【００４９】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）には、標準的な技術を用いてもよい。酵素反応及び精製技術は、メーカーの説明書に従って、又は当該技術分野において一般的に達成されるように、又は本明細書で記載するように実施してもよい。技術及び手順は、一般に、当該技術分野において既知である従来の方法に従って、本明細書を通して引用及び議論される種々の一般的でより特異的な参照文献に記載したように実施する。特別に定義しない限り、本明細書で記載した分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び製薬化学に関連して利用される専門用語、並びにそれらの分野の実験手順及び技術は、当該技術分野において既知であり、一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、製剤、配合、送達、及び患者の治療には、標準的な技術を用いることができる。
【００５０】
以下の用語は、特に指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
「タンパク質」は、本明細書では、ペプチド及びポリペプチドと互換的に使用される。ＨＰＴＰβは、配列表で定義したようなヒトタンパク質チロシンホスファターゼである。幾つかの実施形態では、ＨＰＴＰβの種々の断片を使用する。以下に記載するような、ＨＰＴＰβタンパク質及び遺伝子の、ホモログ、オルソログ、断片、変異型、及び突然変異体は、用語「ＨＰＴＰβ」の範囲内であると見なす。
【００５１】
「断片」とは、ヌクレオチド又はタンパク質配列の一部を意図する。断片は、天然タンパク質の生物活性を保持することができる。ヌクレオチド配列の断片はまた、ハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとしても、又は、例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ若しくはマイクロＲＮＡのように遺伝子の発現調節にも有用である。生物活性のある部分は、本発明のヌクレオチド配列のうちの１つの一部を単離し、コード領域を発現させ（例えば、インビトロでの組み換え体発現により）、コードタンパク質の活性を評価することにより調製することができる。
【００５２】
当業者はまた、配列表に列挙した以外の種、特に脊椎動物種由来の遺伝子及びタンパク質が有用である場合があることも認識している。かかる種としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、サル、チンパンジー、ヒツジ、ハムスター及びゼブラフィッシュが挙げられるが、これらに限定されない。当業者はさらに、既知の種の配列由来のプローブを用いることにより、ｃＤＮＡ又は既知の配列と相同なゲノム配列を、既知のクローニング方法により同種又は代替種から得ることができることを認識している。かかるホモログ及びオルソログは、本発明の実施において有用であると考えられる。
【００５３】
「変異型」は、類似の配列を意図する。例えば、保存的変異型は、遺伝暗号の縮重のために、本発明のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む場合がある。天然に存在する対立遺伝子変異型及びスプライス変異型は、既知の技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、一塩基多型（ＳＮＰ）解析及びハイブリダイゼーション技術を使用することにより同定できる。オルソログ及びホモログを単離するために、一般に、特異的配列、配列長、グアニン＋シトシン（ＧＣ）含量及び他のパラメータにより決定される、厳しいハイブリダイゼーション条件が利用される。変異型ヌクレオチド配列はまた、合成的に誘導されたヌクレオチド配列、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することにより誘導されたものを含む。変異型は、ゲノム遺伝子座のみからの、又は他の配列と組み合わせた付加配列を含有してもよい。
【００５４】
本発明の分子はまた、リガンドの結合又はシグナル伝達に必要のないタンパク質領域が欠失又は改変されている、切断及び／又は突然変異型タンパク質も含む。同様に、それらは、突然変異が生じて、リガンド結合又はシグナル伝達活性が改変される場合がある。かかる突然変異は、アミノ酸又はタンパク質ドメインの非保存的突然変異、欠失、又は付加を含んでよい。変異型タンパク質は、生物活性を保持していてもよく、していなくてもよい。かかる変異型は、例えば、遺伝的多型又は人間による操作から得ることができる。
【００５５】
本明細書では、融合タンパク質もまた検討される。既知の方法を用いて、当業者は、本発明のタンパク質の融合タンパク質を作製することができ、それは、天然型とは異なるが、有用である場合がある。例えば、融合の相手は、翻訳と同時に又は翻訳後に、タンパク質の合成部位から別の部位への移動を導くシグナル（又はリーダー）ポリペプチド配列であってよい（例えば、酵母α−因子リーダー）。或いは、本発明のタンパク質の精製又は同定を容易にする工夫が加えられてもよい（例えば、ポリ−Ｈｉｓ、フラッグペプチド、又は蛍光タンパク質）。
【００５６】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤が結合することのできる分子又は分子の一部であり、さらに、動物の体内で用いて、抗原のエピトープに結合できる抗体を産生することができる分子又は分子の一部を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有する場合がある。
【００５７】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、任意の抗原決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖類、脂質類、ホスホリル又はスルホニルなどの化学的活性表面群を含み、特定の実施形態では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有してよい。エピトープは、抗体が結合する抗原領域である。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質の複合混合物及び／又は巨大分子中でその標的抗原を優先的に認識すると、特異的に抗原に結合すると言われている。抗体はまた、抗原に対して、他の関連及び／又は非関連分子よりも高い親和性を示す場合、特異的に抗原に結合すると言われている。
【００５８】
「抗体」（Ａｂ）という用語は、本明細書で使用する時、それらが所望の生物活性、例えば、抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（例えば、二選択性抗体）、一本鎖抗体（例えば、ラマ及びラクダ由来の抗体）、抗体断片（例えば、可変領域及び／又は定常領域断片）を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で「抗体」と互換的に使用される。
【００５９】
「単離した抗体」は、自然環境から、同定及び／又は分離及び／又は回収したものである。
【００６０】
基本の四鎖抗体ユニットは、２つの同一軽（Ｌ）鎖及び２つの同一重（Ｈ）鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加ポリペプチドに加えて、５つの基本のヘテロ四量体ユニットからなり、従って、１０個の抗原結合部位を含有し、一方、分泌ＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖に加えて２〜５つの基本の四鎖ユニットを含む多価集合を形成することができる）。ＩｇＧの場合は、四鎖ユニットは、一般に約２．４９Ｅ−１９ｇ（１５０キロダルトン（ｋＤａ））である。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合でＨ鎖に結合し、一方２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１以上のジスルフィド結合で互いに結合する。各Ｈ及びＬ鎖はまた、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、α及びγ鎖のそれぞれに対する３つの定常領域（ＣH）、並びにμ及びεアイソタイプに対する４つのＣHドメインに続く可変ドメイン（ＶH）を有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に、もう一方の末端部にある定常ドメイン（ＣL）が続く可変ドメイン（ＶL）を有する。ＶLは、ＶHと整列し、ＣLは重鎖の第一定常ドメイン（ＣH１）と整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。ＶHとＶLは対を形成し、ともに１つの抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造及び特性については、例えば、ダニエルＰ．スタイトス（DanielP.Stites）、アバＩ．テラ（Abba I. Terr）及びトリストラムＧ．パースロー（Tristram G.Parslow）（編）（１９９４年）『基礎及び臨床免疫学（BasicandClinical Immunology）第８版（非特許文献１４）』、アップルトン＆レンジ（Appleton& Lange）７１ページ及び６章を参照のこと。
【００６１】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２種の明らかに異なる型のうち１種に割り当ててもよい。重鎖の定常ドメイン（ＣH）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは様々なクラス又はアイソタイプに割り当てられうる。免疫グロブリンには５種のクラスが存在し、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと名付けられた重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭである。γ及びαクラスは、ＣH配列及び機能の比較的わずかな違いに基づいて、さらにサブクラスに分けられる（例えば、ヒトは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）。
【００６２】
ラクダ科の構成種、例えば、ラマ、ラクダ、及びヒトコブラクダは、軽鎖及びさらにＣH1ドメインが欠失しているという、独特な型の抗体を有する（マイルダーマンズＳ．（Muyldermans,S.）（２００１年）『レヴューズ・イン・モルキュラー・バイオテクノロジー（Rev.Mol.Biotechnol.）』７４巻、２７７〜３０２ページ（非特許文献１５））。これらの重鎖抗体の可変領域は、ＶHH又はＶＨＨと呼ばれ、機能的免疫グロブリン由来の最も小さな利用可能な完全抗原結合断片（２．５Ｅ−２０ｇ（１５ｋＤａ））を構成する。
【００６３】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定のセグメントの配列が、抗体間で大幅に異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を仲介し、その抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸からなる範囲にわたって不均一に分布する。代わりに、Ｖ領域は１５〜３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変的な伸長からなり、これはそれぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度な可変性を有する短い領域により分離される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、３つの超可変領域によって連結された、概してβシート形状をとる４つのＦＲを含み、これはβ−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲよりともに近接近に保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のように、種々のエフェクター機能を示す。
【００６４】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用する時、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」（例えば、ＶLの２４〜３４残基（Ｌ１）、５０〜５６残基（Ｌ２）及び８９〜９７残基（Ｌ３）、並びに、ＶHの１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）前後）からのアミノ酸残基を含み（カバト（Kabat）ら（１９９１年）『タンパク質配列の免疫学的興味（Sequencesof Proteins of ImmunologicalInterest）第５版』（公衆衛生局（Public HealthService）、国立衛生研究所（NationalInstitutes ofHealth）（メリーランド州ベテスダ（Bethesda）（非特許文献１６）））、及び／又は、「超可変ループ」からの残基を含む。
【００６５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する時、実質的に相同な抗体の集団から得られる抗体、即ち、微量存在する可能性のある、予想される自然発生的突然変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。様々なエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の調製に対して、各モノクローナル抗体は単一エピトープ、即ち、単一抗原決定基に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入せずに合成できる点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ手法により調製できる、又は細菌、真核動物若しくは植物細胞内で組み換えＤＮＡ方法を用いて製造できる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（特許文献３）を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、利用可能な技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる（例えば、クラックソン（Clackson）ら（１９９１年）『ネイチャー（Nature）』第３５２号、６２４〜６２８ページ（非特許文献１７））。
【００６６】
本明細書では、モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一である、又は対応配列と相同であり、一方、鎖の残部が、別の種由来の又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一である、又は対応配列と相同である、「キメラ」抗体、並びに、かかる抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号（特許文献３）及びモリソン（Morrison）ら（１９８４年）『米国科学アカデミー紀要（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）』第８１巻、６８５１〜６８５５ページ（非特許文献１８）を参照のこと）。
【００６７】
「抗体断片」は、多量体抗体、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ複合体の二量体及び三量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ミニボディ；ダイア−、トリア−及びテトラボディ；直鎖抗体が挙げられる（ハドソン（Hudson）ら（２００３年）『ネイチャー・メディシン（NatureMed.）』第９巻、１２９〜１３４ページ（非特許文献１９）を参照のこと
）。
【００６８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、緊密に非共有結合性会合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳み構造から、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が延びる。しかしながら、１つの可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有するため、Ｆｖの定義に含まれる。
【００６９】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖に結合するＶH及びＶL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶH及びＶLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これはｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。
【００７０】
「ダイア−、トリア−及びテトラボディ」とは、鎖間ではあるが鎖内ではないＶドメインの対形成を達成し、多価断片を得るように、ＶH及びＶLドメインの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片を構築することにより調製される小さな抗体断片を指す。
【００７１】
「ヒト化抗体」又は「ヒト抗体」とは、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖及び軽鎖可変領域を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に改変されている、即ち、ヒト生殖細胞系可変配列により類似した抗体を指す。ヒト化抗体の１種は、ＣＤＲ−グラフト化抗体であり、ここではヒトＣＤＲ配列を非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入し、対応する非ヒトＣＤＲ配列と置換する。キメラ、ＣＤＲ−グラフト化及びヒト化抗体の製造方法は、当業者に既知である（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び同第５，２２５，５３９号（特許文献３、４）を参照のこと）。ヒト抗体を作製する１つの方法は、トランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物を使用することである。これらのトランスジェニック動物は、それら自身のゲノムに挿入されたヒト抗体産生ゲノムのかなりの部分を含有し、抗体産生において動物自身の内因性抗体産生は欠失させられる。かかるトランスジェニック動物の製造方法は、当該技術分野において既知である。かかるトランスジェニック動物は、ゼノマウス（XenoMouse）（登録商標）技術を用いて、又は「ミニローカス（minilocus）」法を用いて製造することができる。ゼノマウス（XenoMouse）（登録商標）を製造する方法は、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号及び同第６，０７５，１８１号（特許文献５〜９）に記載されている。「ミニローカス（minilocus）」法を用いるトランスジェニック動物の製造方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号及び同第５，６２５，８２５号、並びにＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９３／１２２２７号（特許文献１０〜１２）に記載されている。
【００７２】
非ヒト抗体のヒト化は、近年日常化しており、現在は当業者の知識の範囲内である。例えば、ゾーマ（Xoma）、アリーズ（Aries）、メダレックス（Medarex）、ＰＤＬ及びケンブリッジ・アンチボディ・テクノロジーズ（CambridgeAntibodyTechnologies）等の幾つかの会社が、ヒト化抗体を製造するサービスを提供している。ヒト化プロトコルは、広範囲の技術文献、例えば、キプリヤノフ（Kipriyanov）及びル・ガリ（LeGall）（２００４年）『モルキュラー・バイオテクノロジー（MolecularBiotechnol）』第２６巻、３９〜６０ページ（ヒューマナ・プレス（HumanaPress）、ニュージャージー州トトワ（Totowa））；ロー（Lo）（２００４年）『メソッズ・イン・モルキュラー・バイオロジー（MethodsMol.Biol.）』第２４８巻１３５〜１５９ページ（ヒューマナ・プレス（HumanaPress）ニュージャージー州トトワ（Totowa））；ウー（Wu）ら（１９９９年）『ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol）』第２９４巻、１５１〜１６２ページ（非特許文献２０〜２２）に記載されている。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現することができる。特定の抗体をコードする配列は、例えば、ウイルス（又はウイルスベクター）にポリヌクレオチドをパッケージし、そのウイルス（又はベクター）を宿主細胞に形質導入させることを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための既知の方法により、又は、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号（特許文献１３〜１６）に例示されたような、当該技術分野において既知である形質移入方法により、好適な哺乳類宿主細胞の形質転換のために用いられる。使用する形質転換方法は、形質転換される宿主による場合がある。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、デキストラン仲介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、核酸と正荷電脂質との混合、及びＤＮＡの核への直接顕微注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、若しくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子、又は必要に応じて好適に組み合わせられたその断片は、標準的なライゲーション技術を用いて、適切な発現ベクターに挿入される。抗体の重鎖又は軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に付加することができ、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、典型的には、使用する特定の宿主細胞で機能的であるように選択される（即ち、ベクターは、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こり得るように、宿主細胞の機構と適合する）。発現ベクターの総説としては、ゴアデル（Goeddel）編（１９９０年）『メソッズ・オブ・エンザイモロジー（MethodsEnzymol.）』第１８５巻（アカデミック・プレス（AcademicPress）（非特許文献２３））を参照のこと。
【００７５】
本発明の抗体及びその断片は、ＨＰＴＰβに結合し、血管新生を調節する。上記で定義したように、抗体という用語は、抗原結合断片を意味するように使用される。かかる抗体及び抗原結合断片の使用については、以下でより詳細に記載する。
【００７６】
血管新生のインビトロ及びインビボモデルを用いたスクリーニングアッセイ
本発明の抗体は、当該技術分野において既知である血管新生アッセイでスクリーニングされてもよい。かかるアッセイとしては、培養細胞中の血管増殖又は組織外植片由来の血管構造の形成の代用物を測定するインビトロアッセイ、及び、血管増殖を直接又は間接的に測定するインビボアッセイが挙げられる（アウエルバッハ，Ｒ．（Auerbach,R.）ら（２００３年）『クリニカル・ケミストリー（ClinChem）』第４９巻、３２〜４０ページ；ベイル，Ｂ．（Vailhe,B.）ら（２００１年）『ラボラトリー・インヴェスティゲーション（LabInvest）』第８１巻４３９〜４５２ページ（非特許文献２４、２５））。
【００７７】
血管新生のインビトロモデル
これらのアッセイの大部分は、培養内皮細胞又は組織外植片を使用して、「血管新生」細胞応答又は毛細血管様構造の形成における剤の効果を測定する。インビトロ血管新生アッセイの例としては、内皮細胞遊走及び増殖、毛細管形成、内皮出芽、大動脈輪外植片アッセイ及びヒヨコ（chick）大動脈弓アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
血管新生のインビボモデル
これらのアッセイでは、剤又は抗体は、増殖因子（即ち、ＶＥＧＦ又はアンジオポエチン１）の存在下又は非存在下で、局所的又は全身的に投与され、直接観察により、又は、ヘモグロビン含有量若しくは蛍光指示薬のような代用マーカーを測定することにより、新たな血管増殖を測定する。血管新生の例としては、ヒヨコ絨毛尿膜アッセイ、角膜血管新生アッセイ、及びマトリゲル（MATRIGEL）（商標）プラグアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
血管新生調節疾患の治療
「調節」という用語は、その一般に認められた辞書の意味として定義される。従って、「調節」という用語の意味としては、上方制御若しくは下方制御する、固定する、秩序若しくは均一性をもたらす、支配する、又は種々の手段により方向づけることが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、抗体は、「血管新生増加疾患」又は「血管新生減少疾患」の治療方法に用いることができる。本明細書で使用する時、「血管新生増加疾患」は、疾病、疾患及び／若しくは状態の生物学的徴候において；疾患を誘導する生物学的カスケードにおいて；又は疾患の症状として、不要な血管新生又は血管新生の増加が関与するものである。同様に、「血管新生減少疾患」は、生物学的徴候において、必要な血管新生又は血管新生の減少が関与するものである。この、血管新生増加／減少疾患における、血管新生の「関与」として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
（１）遺伝的、感染、自己免疫、外傷、生体力学的原因、生活習慣、又は他の幾つかの原因による、血管新生のレベルの増加、減少にかかわらず、疾患又は生物学的徴候の「原因」としての血管新生。
（２）疾病又は疾患の観察可能な徴候の一部としての血管新生。つまり、疾病又は疾患が、血管新生の増加又は減少の点で測定可能である。臨床的観点から、血管新生は疾病の徴候であるが、疾病又は疾患の「ホールマーク（hallmark）」である必要はない。
（３）血管新生は、疾病又は疾患をもたらす生化学的又は細胞カスケードの一部である。この観点では、血管新生の調節はカスケードを中断させ、疾病を制御することができる。本発明により治療できる血管新生調節疾患の非限定的な例は、本明細書で以下に記載するものである。
【００８０】
本発明の抗体は、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、癌、鎌状赤血球性貧血、サルコイド、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染、ライム病、全身性紅斑性狼瘡（erythematosis）、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎の原因となる感染、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、視神経乳頭小窩、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷及びレーザ後合併症が挙げられるが、これらに限定されない網膜／脈絡膜新血管形成に関連する疾患を治療するために用いることができる。他の疾病としては、ルベオーシス（虹彩の新血管形成）に関連する疾病、及び糖尿病に関連するかどうかにかかわらず、増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む、線維性血管又は線維組織の異常増殖により引き起こされる疾病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明の抗体は、慢性炎症に関連する疾病を治療するために用いてもよい。慢性炎症の症状を伴う疾病としては、クローン病及び潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患、乾癬、サルコイドーシス、リウマチ様関節炎が挙げられる。血管新生は、これらの慢性炎症疾病が共通して有する鍵となる要素である。慢性炎症は、炎症性細胞の流入を維持するための毛細管出芽の持続的形成に依存する。炎症性細胞の流入及び存在は、肉芽腫を発生させ、従って、慢性炎症状態を維持する。本発明の組成物及び方法による血管新生の阻害は、肉芽種の形成を予防し、疾病を緩和させる。
【００８２】
クローン病及び潰瘍性大腸炎は、慢性炎症及び胃腸管の様々な部位における血管新生を特徴とする。クローン病は、炎症性細胞のシリンダにより取り囲まれる新たな毛細管出芽からなる、胃腸管全体にわたる慢性肉芽腫性炎症を特徴とする。血管新生の予防は、出芽の形成を阻害し、肉芽種の形成を防ぐ。クローン病は、最も一般的に遠位回腸及び結腸に発症する慢性経壁性炎症性疾病として生じるが、口から肛門及び肛門周辺部までの胃腸管の任意の部分に生じる場合もある。クローン病の患者は、一般に、腹痛、発熱、拒食症、体重低下及び腹部膨満に関連する慢性下痢を有する。潰瘍性大腸炎はまた、結腸粘膜に生じる慢性、非特異性、炎症性及び潰瘍性疾病であり、出血性下痢の存在を特徴とする。
【００８３】
炎症性腸疾患はまた、皮膚病変のような腸外の徴候も示す。かかる病変は炎症及び血管新生を特徴とし、胃腸管以外の多くの部位で生じる場合がある。本発明の抗体は、血管新生を予防することによりこれらの病変を治療し、従って炎症性細胞の流入及び病変形成を低下させることができる。
【００８４】
サルコイドーシスは、多システム肉芽種性疾患を特徴とする、別の慢性炎症性疾病である。この疾病の肉芽腫は、体のどこにでも生じる可能性があり、従って、症状は肉芽腫の部位及び疾病が活性状態であるかどうかによる。肉芽腫は、炎症性細胞の持続的供給をもたらす血管新生毛細管出芽により作製される。
【００８５】
本発明の抗体はまた、乾癬に関連する慢性炎症状態を治療することもできる。皮膚疾病である乾癬は、種々の大きさの丘疹及び斑を特徴とする、別の慢性及び再発性疾病である。新たな血管形成の予防は、症状の軽減を誘導する特徴的な病変を維持するために必要である。
【００８６】
リウマチ様関節炎は、末梢関節の非特異性炎症を特徴とする、慢性炎症性疾病である。関節の滑膜内層の血管が血管新生を起こすと考えられている。新たな血管網の形成に加えて、内皮細胞は、パンヌス増殖及び軟骨破壊を誘導する因子及び活性酸素種を放出する。血管新生に関与する因子は、リウマチ様関節炎の慢性的炎症状態に能動的に寄与し、その状態の維持を補助する場合がある。本発明により治療しうる他の疾病は、血管腫、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、又は遺伝性出血性末梢血管拡張症、固体若しくは血液媒介腫瘍、及び後天性免疫不全症候群である。
【００８７】
本発明の抗体はまた、「血管新生減少疾患」を治療するためにも用いることができる。本明細書で使用する時、「血管新生減少疾患」は、血管新生が疾病、疾患及び／又は状態の治療に有益であると考えられるものである。疾患は、虚血性障害、感染及び／又は不十分な治癒に苦しんでいる又はそれらに苦しむ危険のある組織を特徴とし、それは、組織が不十分な循環のために酸素を豊富に含んだ血液の十分な供給を奪われた時に起こる。本明細書で使用する時、「組織」は、広い意味で用いられ、心筋及び心室のような心臓組織；勃起組織；骨格筋；小脳由来のような神経組織；脳、心臓、膵臓、肝臓、脾臓及び肺のような内臓；又は肢全体、足、指若しくはつま先のような遠位付属器のような体の全身領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
虚血組織の血管新生方法
一態様では、抗体は虚血組織を血管新生化する方法で用いることができる。本明細書で使用する時、「虚血組織」は、十分な血流を奪われた組織を意味する。虚血組織の例としては、心筋及び脳梗塞、腸管膜若しくは肢虚血、又は血管閉塞若しくは狭窄の結果から生じる、十分な血液供給を欠く組織が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、酸素を豊富に含んだ血液の供給の中断は、血管閉塞により引き起こされる場合がある。かかる血管閉塞は、動脈硬化、外傷、外科手術、疾病及び／又は他の病因により引き起こされる場合がある。標準的な日常化技術は、組織が望ましくない血管閉塞による虚血性障害を患う危険があるかどうかを決定するために利用可能である。例えば、心筋疾病では、これらの方法は種々のイメージング技術（例えば、放射性トレーサ方法論、Ｘ線及びＭＲＩ）及び生理学的試験を含む。それゆえ、血管新生の誘導は、血管閉塞に侵された又は侵される危険のある組織の虚血を予防又は減衰させる有効な手段である。さらに、骨格筋及び心筋虚血、脳卒中、冠動脈疾患、末梢血管疾患、冠動脈疾患の治療は、十分に考慮される。
【００８９】
標準的な技術を使用する当業者であれば、組織の血管新生化を測定しうる。被験体の血管新生化を測定する非限定的な例としては、治療前及び後に組織への血流を測定することによる、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）；ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）；ＭＲＩ（磁気共鳴映像法）；及びこれらの組み合わせが挙げられる。血管造影法は、巨視的な血管分布のアセスメントとして使用することができる。組織学的評価は、小血管レベルで血管分布を定量化するために用いることができる。これらの及び他の技術は、シモンズ（Simons）ら（２０００年）「冠状動脈血管新生の臨床試験（Clinicaltrialsin coronaryangiogenesis）」（『サーキュレーション（Circulation）』第１０２巻、７３〜８６ページ（非特許文献２６））で論じられている。
【００９０】
組織の修復方法
一態様では、抗体は、組織の修復方法で用いることができる。本明細書で使用する時、「組織の修復」とは、組織の修復、再生、増殖及び／又は維持を促進することを意味し、創傷修復又は再生医療を含むが、これらに限定されない。当業者は、新たな血管形成が組織の修復に必要であることを認識している。一方で、組織は、関節炎、骨粗鬆症及び他の骨格疾患、並びに、火傷を含む外傷又は外傷性状態を含むが、これらに限定されないものにより損傷を受ける可能性がある。組織はまた、外科手術、放射線照射、裂傷、有毒化学物質、ウイルス感染若しくは細菌感染、又は火傷により傷害を受ける場合がある。修復を必要とする組織はまた、難治性創傷を含む。難治性創傷の例としては、糖尿病の症状から生じる難治性皮膚潰瘍；又は容易に治癒しない骨折が挙げられる。
【００９１】
抗体はまた、組織再生誘導（ＧＴＲ）法に関連して、組織の修復に使用することもできる。かかる方法は、侵襲的な外科治療後の創傷治癒を促進するために、当業者により現在用いられている。
【００９２】
抗体は、再生医療過程中、組織の増殖を亢進することを特徴とする、組織の修復促進方法で用いることができる。本明細書で使用する時、「再生医療」は、体内組織及び器官の増大又は置換のために、合成又は天然材料と組み合わせた、生物学的人工器官の創造、設計及び製作として定義される。従って、本方法は、病気の組織の修復又は置換における将来の移植のために、体外でヒト組織の設計及び増殖を増強するために用いることができる。例えば、抗体は、火傷の治療における療法として用いられる皮膚移植片代替物（skingraftreplacement）の増殖の促進に有用である可能性がある。
【００９３】
再生医療の別の態様では、本発明の抗体は、再生が必要な部位に移植する時、機能的ヒト組織の再生を誘導する、細胞を含有する又は細胞を含まないデバイスに含まれてもよい。上記で論じたように、生体材料組織再生誘導法は、骨の再生を促進するために、例えば、歯周病で用いてもよい。従って、抗体は、創傷した部位又はかかる修復を必要とする他の組織で、三次元形状に構築された、再構成された組織の増殖を促進するために用いてもよい。
【００９４】
再生医療の別の態様では、抗体は、病気の内部組織の機能を置換するように設計されたヒト組織を含有する外部又は内部デバイスに含むことができる。この方法は、体から細胞を単離し、それらを構造マトリクスとともに定置し、体内に新たな系を移植する、又は体外で系を使用することを含む。例えば、抗体は、移植片に含有される細胞の増殖を促進するために、細胞株化血管移植片に含んでもよい。本発明の方法は、軟骨及び骨、中枢神経系組織、筋肉、肝臓及び膵島（インスリン産生）細胞のような産物中で、組織の修復、再生及び再生医療を増強するために用いられる可能性があると想像できる。
【００９５】
製剤処方及び使用方法
本発明の抗体は、本発明の遺伝子及びタンパク質により調節される疾病又は疾患を治療又は予防するために投与されうる。「治療」という用語は、本明細書では、本発明の化合物の投与が、宿主の疾病又は疾患を軽減することを意味する。従って、「治療」という用語は、特に、宿主が病気にかかりやすいが、病気と診断されてはいない時に、宿主内で生じる疾患を予防すること、疾患を阻害すること、及び／又は疾患を緩和若しくは逆行させることを含む。本発明の方法が疾患を予防することを目的とする限り、「予防」という用語は疾病状態を完全に阻止する必要はないと理解される。（『ウェブスター大学生用辞典第９版（Webster'sNinthCollegiate Dictionary）』（非特許文献２７）を参照のこと。）むしろ、本明細書で使用する時、予防という用語は、当業者の、疾病の発症前に本発明の化合物を投与できるように、疾患にかかりやすい集団を特定する能力を指す。この用語は、疾病状態を完全に回避することを意味するものではない。本発明のスクリーニング方法により同定される化合物は、他の化合物と併用して投与することができる。
【００９６】
同定された化合物の安全性及び治療効果は、インビトロ又はインビボ技術を用いる標準的な方法により測定しうる。大きな治療指標を示す化合物が好ましい場合があるが、副作用の水準が許容可能である場合、治療指標の低い化合物が有用である場合もある。インビトロ又はインビボ毒物学及び薬理学的技術から得たデータは、投与量の範囲を処方するために用いられうる。
【００９７】
化合物の有効性は、血管新生が無調節である又は不適当に調節された、動物モデル又は患者の臨床試験のいずれかでさらに評価してもよい。
【００９８】
本明細書で使用する時、「製薬上許容できる担体」は、薬剤投与に適合した、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬剤的活性物質に対するかかる媒質及び剤の使用は、当該技術分野において既知である。従来の任意の媒質又は剤が活性化合物に適合しない場合を除いて、かかる媒質は本発明の組成物中に使用されてもよい。補足的活性化合物は、組成物に組み込まれてもよい。本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又は皮下用途のために使用される溶液又は懸濁液とは、以下の成分を含んでよい：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール若しくは他の合成溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコール若しくはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩のような緩衝剤及び塩化ナトリウム若しくはデキストロースのような張度調節剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムのような、酸又は塩基で調節されうる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで製造されたアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与バイアル内に入れてもよい。
【００９９】
注入可能な用途に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性である場合）、又は分散液、及び注入可能な無菌溶液若しくは分散液の即時調合のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォア（CREMOPHOR）ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシパニー（Parsippany））又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注入可能である程度に流動的であるべきである。それは、製造及び保管条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングを使用することにより、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、及び界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。微生物の活動の予防は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール及びソルビトールのような多価アルコール、並びに塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
【０１００】
無菌注入可能溶液は、必要な量の活性化合物を、上記成分の１種又は組み合わせとともに、適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することにより調製されうる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本の分散媒及び必要な他の成分を含有する無菌賦形剤に組み込むことにより調製される。無菌注入可能溶液の調製用無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その既に濾過済み無菌溶液から、任意の所望の追加成分に加えて活性成分の粉末を得る、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１０１】
全身投与はまた、経粘膜又は経皮的手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮的投与の場合、浸透する障壁に対して適切な浸透剤を製剤中に用いる。かかる浸透剤は、一般に当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧又は坐剤を用いて達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に既知であるように、膏薬、軟膏、ゲル、又はクリームに配合される。
【０１０２】
化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバター及び他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む）又は直腸送達のための停留浣腸の形態で調製してもよい。
【０１０３】
一実施形態では、活性化合物は、植込錠及びマイクロカプセル化送達系を含む、徐放性製剤のような、体からの急速な排泄に対して化合物を保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマー類が用いられうる。かかる製剤の調製方法は、当業者には明白である。材料は、アルザ社（AlzaCorporation）及びノバ・ファーマスーティカル社（NovaPharmaceuticals, Inc.）からも商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を移入させる細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、製薬上許容できる担体として使用してもよい。これらは、当業者に既知の方法に従って、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（特許文献１７）に記載のように調製してもよい。
【０１０４】
投与の容易さ及び投与量の均一性のために、経口又は非経口組成物を単位剤形（dosageunit form）で処方することは特に有利である。「単位剤形」は、本明細書で使用する時、治療される被験体に対する単位用量として好適な、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体に関連して所望の治療効果を生じさせるために算出された、所定の量の活性化合物を含有する。単位剤形の規格は、活性化合物の独自の特性、及び達成される特定の治療効果、及び個体の治療のためにかかる活性化合物を配合する当該技術分野において固有の制限により決定され、直接左右される。
【実施例】
【０１０５】
実施例１．ＨＰＴＰβの細胞外ドメインタンパク質の産生。
方法：完全長ＨＰＴＰβは、メーカー（オリゲネ（Origene））の説明書に従ってヒト胎盤ライブラリーからクローン化する。クローンは、ＦＮＩＩＩ反復＃５を欠損していることを除き、既に報告したｃＤＮＡクローン（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ５４１３１）と同一である。ＨＰＴＰβの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）全体をコードするｃＤＮＡは、ｃ末端にＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ（６Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）が付加されたＡＡ  １−１５３４（配列番号１）をコードする完全長ｃＤＮＡ（以下の配列を参照のこと）からＰＣＲすることによりクローン化する。得られるｃＤＮＡを、ＨＥＫ２９３細胞で一過的に（pShuttle-CMV）又は安定的に（ｐｃＤＮＡ３．１（−））発現させるために、哺乳類発現ベクターにクローン化する。精製ＨＰＴＰβＥＣＤ（βＥＣＤ）を得るために、βＥＣＤ発現ベクターで形質移入したＨＥＫ２９３細胞を、通常の増殖条件下で２４時間、ＯｐｔｉＭＥＭ−セラムフリー（ギブコ（Gibco））中でインキュベートする。次いで、馴化培地を回収し、遠心分離して残渣を除去し（１０００ｒｐｍ×５分）、１ｍＬの洗浄Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン（Qiagen））（５００μＬのパック入り材料）を、それぞれ１０ｍＬの清浄培地に添加し、４℃で一晩振動させる。次の日、混合物をカラムに充填し、２０ベッド体積の５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８）で洗浄する。次いで、精製したＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質（配列番号２）を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８）中で、２００μＬ／溶出物の６つの画分に溶出する。画分は、還元−変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてタンパク質含量を分析し、銀染色（インビトロゲン（Invitrogen））により検出し、質量分析により確認する。
結果：ＨＰＴＰβの細胞外ドメインに対する抗体を展開するための、６−Ｈｉｓタグ付きＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質（図１、パネルＡ）を発現させるための発現ベクターが展開される。その後、６−Ｈｉｓタグ付きＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質を、発現ベクターで形質移入したＨＥＫ２９３の培養馴化培地から精製し、ほぼ均一な状態にする（図１、パネルＢ）。
【０１０６】
実施例２．ＨＰＴＰβ細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の産生。
方法：ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン免疫原を作製するために、精製ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６Ｈｉｓタンパク質を、ＥＤＣカップリング化学を用いてブタチログロブリン（シグマ（Sigma））に結合させる（ホックフィールドＳ．（Hockfield,S.）ら（１９９３年）『免疫細胞化学（Immunocytochemistry）』第１巻、１１１〜２０１ページ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ColdSpringHabor Laboratory Press）（非特許文献２８）））。得られたＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−チログロブリン複合体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析する。成体Ｂａｌｂ／ｃマウスを、次いで、複合体（１００〜２００μｇ）及びフロイント完全アジュバントの１：１混合物で皮下免疫する。２〜３週間後、マウスに、フロイント不完全アジュバントと複合物の１：１混合物を腹腔又は皮下注射する。注射を４〜６週間繰り返す。３度目の注射の７日後、マウスから血清を収集し、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングにより、ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン抗原に対する免疫反応性を分析する。抗原に対して良好な応答を示すマウスには、５０ｍＬの精製ＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質とミョウバン水酸化物の１：１混合物を、３１ゲージ超長針（31gaugeextralong needle）を用いて、単回脾臓内投与により追加免役する（ゴーディング（Goding）Ｊ．Ｗ．（１９９６年）『モノクローナル抗体：その原理及び実施（MonoclonalAntibodies:Principlesand Practices）』第３版、アカデミック・プレス社（Academic Press Limited.）１４５ページ（非特許文献２９））。簡潔に言うと、２．５％アベルティン（avertin）でマウスに麻酔をかけ、皮膚を１ｃｍ切開し、斜筋体壁（obliquebodywall）を残す。長手方向注射で、脾臓の後部から前部へ針を挿入することにより、抗原混合物を投与する。体壁を縫合し、皮膚を２つの小さな金属クリップで塞ぐ。マウスが安全に回復するのを監視する。手術の４日後、マウスの脾臓を取り出し、ハイブリドーマ細胞株の作製のために、マウスの骨髄腫細胞と融合させるために単一細胞懸濁液を作製する（スピッツ（Spitz），Ｍ．（１９８６年）『メソッズ・イン・エンザイモロジー（MethodsInEnzymology）』第１２１巻（ジョン．Ｊ，ラゴン（John J, Lagone）及びヘレン・ヴァン・ヴナキス（HelenVan Vunakis）編、３３〜４１頁（アカデミック・プレス（AcademicPress）ニューヨーク州ニューヨーク）（非特許文献３０））。得られるハイブリドーマを、１５％ウシ胎児血清（ハイクローン（Hyclone））及びヒポキサンチン（hypoxathine）、アミノプテリン及びチミジンを添加したダルベッコ修飾培地（ギブコ（Gibco））で培養する。
【０１０７】
陽性ハイブリドーマのスクリーニングは、融合８日後に開始し、１５日間続ける。抗ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン抗体を産生するハイブリドーマは、２組の９６穴プレート（１組はヒスチジンタグ付きＨＰＴＰβ細胞外ドメインでコーティングされ、別の１組は陰性対照としてヒスチジンタグ付き細菌ＭｕｒＡタンパク質でコーティングされている）を用いたＥＬＩＳＡにより同定する。二次抗体は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＧＲＰ）（ジャクソン・イムノリサーチ（JacksonImmunoresearch）で標識したロバ抗マウスＩｇＧである。ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したＡＢＴＳ錠により開始される発色を使用して穴内の免疫反応性を監視する。個々のＨＲＰ反応混合物は、１００μＬの１％ＳＤＳを添加することにより終了し、分光光度計で４０５ｎｍにおける吸光度を読む。ＨＰＴＰβ細胞外ドメイン−６Ｈｉｓと相互作用し、ｍｕｒＡ−６Ｈｉｓタンパク質と相互作用しない抗体を産生するハイブリドーマを、さらなる分析に使用する。９９％を超える穴が陽性反応性を有するとして定義されるクローン性を有する、９６穴プレート中の陽性クローンを２度限界希釈（０．８細胞／穴）する。抗体のイソタイプを、イソ−ストリップ技術（iso-striptechnology）（ロシュ（Roche））を用いて決定する。さらなる評価のために精製抗体を得るために、組織培養上清はプロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いてアフィニティ精製する。
結果：ＨＰＴＰβ細胞外ドメインタンパク質に対して免疫反応性である５種のモノクローナル抗体を単離し、Ｒ１５Ｅ６、Ｒ１２Ａ７、Ｒ３Ａ２、Ｒ１１Ｃ３、Ｒ１５Ｇ２及びＲ５Ａ８と命名した。
【０１０８】
モノクローナル抗体Ｒ１５Ｅ６は、２００６年５月４日に郵便番号２０１０８米国バージニア州マナッサス（Manassas）私書箱１５４９のアメリカ培養細胞系統保存機関（AmericanTypeCulture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０１０９】
実施例３．Ｒ１５Ｅ６はヒト内皮細胞のＨＰＴＰβに結合する。
Ａ．Ｒ１５Ｅ６は、免疫沈降及びウエスタンブロットにより示されるように、内因性ＨＰＴＰβに結合する。
材料：ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ＥＧＭ培地、及びキャンブレックス（Cambrex）製トリプシン中和溶液；ＯＰＴＩＭＥＭ  Ｉ（ギブコ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；サンタクルーズ（SantaCruz））、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）を含む増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）、Ｔｉｅ２モノクローナル抗体（デューク大学（DukeUniversity）／Ｐ＆ＧＰ）、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリクローナル抗体（ホイッティカー（Whitaker）ら）、プロテインＡ／Ｇアガロース（サンタクルーズ）、トリス−グリシンプレキャストゲル（Tris-Glycinepre-castgel）電気泳動／転写系（６〜８％）（インビトロゲン）、ＰＶＤＦメンブレン（インビトロゲン）、溶解バッファ（lysisbuffer）（２０ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトン−Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭＮａＯＶ、１ｍＭＮａＦ、１ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬロイペプチン、１μｇ／ｍＬペプスタチン）。
方法：ＨＵＶＥＣを、抗体（ＯＰＴＩＭＥＭ中）とともに又はＯＰＴＩＭＥＭ  Ｉ単独で３０分間前処理する。前処理の除去後、細胞を、ＰＢＳ＋０．２％  ＢＳＡ中でＡｎｇ１（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに６分間処理し、溶解バッファに溶解する。溶解物をトリス−グリシンゲル上に直接流す、又は、２〜５μｇ／ｍＬのＴｉｅ−２抗体若しくは１０μｇ／ｍＬのＲ１５Ｅ６抗体及びプロテインＡ／Ｇアガロースで免疫沈降する。免疫沈降した試料を、１×溶解バッファでリンスし、１×試料バッファで５分間煮沸する。試料をトリス−グリシンゲル上で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、指標抗体（indicatedantibody）（ｐＴＹＲ  Ａｂ（ＰＹ９９、サンタクルーズ）、Ｔｉｅ−２、ＶＥＧＦＲ２及び／又はＲ１５Ｅ６）を使用して、ウエスタンブロットにより検出する。
結果：ＩＰ／ウエスタンブロッティングにより、Ｒ１５Ｅ６は、ＨＰＴＰβの大きさに一致する主要な、高分子量バンドを認識する（図２、パネルＡ、レーン２）。強度の低い、低分子量バンドは、恐らくＨＰＴＰβのあまりグリコシル化されていない前駆体を表す。対照である非免疫ＩｇＧの免疫沈降（ＩＰ）では、ＨＰＴＰβの分子量範囲にバンドは見られず（図２、パネルＡ、レーン１）、混合Ｔｉｅ２／ＶＥＧＦＲ２のＩＰでは、期待された分子量のバンドが見られた（図２、パネルＡ、レーン３）。この結果は、Ｒ１５Ｅ６がＨＰＴＰβを認識し、それに特異的であることを示す。
【０１１０】
Ｂ．Ｒ１５Ｅ６は、ＦＡＣＳ分析により示されるように、内因性ＨＰＴＰβに結合する。
材料：ＨＵＶＥＣ、ＥＧＭ培地、及びキャンブレックス製トリプシン中和溶液；モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）製二次アレックスフルーア（Alexfluor）４８８タグ付き抗体；ハンクス平衡塩類溶液（ギブコ）；ベクトン・ディッケンソン（BectonDickenson）製ＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター及びセルクエスト（CellQuest）ソフトウェア。
方法：ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、トリプシン中和溶液で処理し、ＨＢＳＳでリンスする。Ｒ１５Ｅ６抗体（０．６μｇ）を５０ｍＬのＨＢＳＳ中の２５０，０００細胞に添加し、氷上で２０分間インキュベートする。細胞を１ｍＬのＨＢＳＳでリンスし、続いて、２μｇの蛍光複合二次抗体を氷上で２０分間添加する。細胞をリンスし、１ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁し、次いで、セルクエスト・ソフトウェアを備えるＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーターで分析する。対照細胞を、蛍光複合二次抗体のみで処理する。
結果：ＦＡＣＳ分析により、インタクトなＨＵＶＥＣ、Ｒ１５Ｅ６は、二次抗体のみに比べて、蛍光シグナルの大きな変化（＞９０％の細胞）を引き起こした（図２、パネルＢ）。この結果は、Ｒ１５Ｅ６が、インタクトな内皮細胞の表面上にある内因性ＨＰＴＰβに結合することを示す。
【０１１１】
実施例４．Ｒ１５Ｅ６はＴｉｅ２の活性化を亢進し、複数の血管新生応答（内皮細胞の生存、遊走及び毛細管の形態形成）を促進する。
Ａ．Ｒ１５Ｅ６は、Ｔｉｅ２のリガンドであるアンジオポエチン１（Ａｎｇ１）の非存在下及び存在下で、Ｔｉｅ２のリン酸化を亢進する。
方法：ＨＵＶＥＣを、種々の濃度のＲ１５Ｅ６の存在下又は非存在下で、Ａｎｇ１を添加して又は添加せずに、上述のように無血清培地で培養する。溶解物を調製し、Ｔｉｅ２抗体で免疫沈降し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写する。メンブレンに結合した、免疫沈降したタンパク質を、次いで、抗ホスホチロシン抗体で連続的にウエスタンブロットし、Ｔｉｅ２のリン酸化、続いてＴｉｅ２抗体を定量化し、合計Ｔｉｅ２を定量化する。Ｔｉｅ２のリン酸化は、合計Ｔｉｅ２シグナルに比較した抗ホスホチロシンシグナルの比として表される。
結果：Ｒ１５Ｅ６は、Ａｎｇ１の非存在下及び存在下の両方でＴｉｅ２のリン酸化を亢進する（図３）。この結果は、内皮細胞の表面上でのＲ１５Ｅ６のＨＰＴＰβへの結合が、リガンドの非存在下又は存在下でＴｉｅ２の活性化を亢進する、その生物学的機能を調節することを示す。
【０１１２】
Ｂ．Ｒ１５Ｅ６は、内皮増殖因子の非存在下及び存在下で、内皮細胞の生存を亢進する。
材料：ＨＵＶＥＣ、ＥＧＭ培地、及びキャンブレックス製トリプシン中和溶液；ＤＭＥＭ（セルグロ（Cell Gro））、脱脂質化（Delipidized）ＢＳＡ（ＢＤファルコン（BDFalcon）、セルタイターグロ（CellTiterGlo）ＡＴＰアッセイ（プロメガ（Promega）、増殖因子（Ａｎｇ１、ＶＥＧＦ１６５及びＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ビクターＶマルチラベルプレートリーダー（VictorVMultilabelplate reader）（パーキンエルマーウォレス（Perkin Elmer Wallac）。
方法：ＨＵＶＥＣを、１０，０００細胞／穴にプレーティングし、ＤＭＥＭ／０．２％
ＢＳＡ中の血清を欠乏させ、増殖因子（Ａｎｇ１、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ）の存在下又は非存在下で、種々の濃度のＲ１５Ｅ６抗体あり又はなしで７２時間処理する。７２時間後、細胞をＤＭＥＭでリンスし、生存細胞を、メーカーの説明書（プロメガ）に従って、セルタイターグロ蛍光アッセイを用いてＡＴＰ濃度を測定することにより定量化する。
結果：Ｔｉｅ２活性化アッセイの結果と一致し、Ｒ１５Ｅ６は０．５〜５ｎＭの濃度で添加した増殖因子の非存在下で内皮細胞の生存を亢進する。同様に、Ｒ１５Ｅ６は、Ａｎｇ１仲介内皮細胞生存（図４、パネルＡ）、並びに、ＶＥＧＦ及びＦＧＦにより仲介される生存（図４、パネルＢ及びＣ）を亢進する。対照モノクローナル抗体では、生存亢進は見られなかった（図４、パネルＤ）。これらの結果は、内皮細胞表面上でＨＰＴＰβに結合するＲ１５Ｅ６は、基準の内皮細胞生存、及び、複数の血管新生経路（Ａｎｇ１、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ）により仲介される生存を亢進することを示す。
【０１１３】
Ｃ．Ｒ１５Ｅ６は、ＶＥＧＦの非存在下及び存在下で、内皮細胞の遊走を亢進する。
材料：ＨＵＶＥＣ、ＥＧＭ培地、及びキャンブレックス製トリプシン中和溶液；ＥＢＭフェノールレッドフリー（phenol red free）（ＰＲＦ−ＥＢＭ、キャンブレックス）、脱脂質化ＢＳＡ（ＢＤファルコン）、ＢＤファルコンバイオコート内皮細胞遊走系（ＢＤファルコン）、カルセイン（Calcein）ＡＭ（モレキュラー・プローブス）；増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）（Ｒ＆Ｄシステムズ）、ビクターＶマルチラベルプレートリーダー（パーキンエルマーウォレス）。
方法：ＨＵＶＥＣをＰＲＦ−ＥＢＭ＋０．１％  ＢＳＡに再懸濁し、５０，０００細胞／トランスウェル（ＢＤバイオサイエンス、孔経３μｍ）でプレーティングする。増殖因子／Ｒ１５Ｅ６を、トランスウェルチャンバのボトムウェルに定置し、４〜２２時間インキュベートする。膜を通過する細胞遊走を、４μｇ／ｍＬの９０’用カルセインＡＭで標識することにより検出する。蛍光は、ビクターＶ機器を用いて測定する（４８５／５３５）。
結果：生存研究の結果と一致し、Ｒ１５Ｅ６は、基準線及びＶＥＧＦ仲介内皮細胞遊走の双方を亢進する（図５）。
【０１１４】
Ｄ．Ｒ１５Ｅ６は、内皮増殖因子の非存在下及び存在下で、内皮細胞の出芽及び毛細管形態形成を亢進する。
材料：ＨＵＶＥＣ及びキャンブレックス製ＥＧＭ培地；シグマ（Sigma）製サイトデックスビーズ（Cytodex beads）及びＩ型コラーゲン；ギブコ製ダルベッコＰＢＳ及びＭ１９９培地；Ｒ＆Ｄ製ＶＥＧＦ。
方法：ＨＵＶＥＣパッセージ（passage）４（２×１０6細胞）を、時々回旋させながら４８時間、１００ｍｍの非組織培養処理した細菌ディッシュ（bacteriologicaldish）内の１０ｍＬＥＧＭで、５ｍｇのサイトデックスビーズとともに培養する。細胞でコーティングしたビーズを、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、３８０μＬのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。７１．４ｍＬの細胞でコーティングしたビーズを、２．８ｍＬの、０．００５ＮのＮａＯＨ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２６ｍＭのＮａＨＣＯ3を追加したＭ１９９培地中の３ｍｇ／ｍＬコラーゲンからなるマトリクス溶液に添加することにより、コラーゲンゲルを調製する。３５０μＬのビーズを、２４穴組織培養プレートに分配し、マトリクスを、３７℃／５％ＣＯ2で１時間固化させる。１穴当たり、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＲ１５Ｅ６（７．５μｇ／ｍＬ）を含む又は含まない１ｍＬのＥＧＭ培地を添加し、インキュベータに戻す。４８時間後、盲検観察者が、位相差顕微鏡で出芽を可視化し、３組の穴で、１穴当たり５０ビーズについて、内皮細胞の出芽の存在を観察する。結果は、ビーズ当たりの出芽数として表される。
結果：他のアッセイの結果と一致し、Ｒ１５Ｅ６はまた、内皮ビーズ出芽アッセイで基準線及びＶＥＧＦ仲介毛細管形態形成を亢進する（図６）。
【０１１５】
実施例５．Ｒ１５Ｅ６の結合エピトープは、ヒトＨＰＴＰβ細胞外ドメインのＮ末端ＦＮ３反復に存在する。
Ａ．組み換えｃ末端切断変異体及びマウス／ヒトキメラタンパク質のウエスタンブロット解析は、エピトープに結合するＲ１５Ｅ６がＨＰＴＰβ細胞外ドメインのＮ末端ＦＮ３反復に存在することを示す。
方法：ＨＥＫ２９３細胞は、望ましいＨＰＴＰβ切断変異体又はマウス／ヒトキメラをコードする発現ベクターで形質移入する。次いで、形質移入した細胞を、望ましいＨＰＴＰβ細胞外ドメインを含有する培養上清を回収し、将来の使用のために保存した又は即時にウエスタンブロット又はＥＣＬ（以下を参照のこと）研究に用いるために用いた後、ＯｐｔｉＭＥＭでさらに２４時間インキュベートする。ウエスタンブロット解析では、望ましいＨＰＴＰβタンパク質を含有する、又は組み換えタンパク質を含有しない（偽の空ベクターを形質移入した）２０μＬの培養上清をＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、Ｒ１５Ｅ６でプロープする。
結果：ウエスタンブロット解析により、Ｒ１５Ｅ６は、全てのＨＰＴＰβＣ末端欠失変異体に結合し（図７Ａ）、これは結合エピトープが最初の２つのＮ末端ＦＮ３反復内に存在することを示す。Ｒ１５Ｅ６がマウスのＨＰＴＰβ（配列番号７）細胞外ドメインに結合しないことは、ヒトタンパク質に対する特異性を示す（図７Ｂ、レーン６対レーン２）。マウスの第一又は第一及び第二Ｎ末端ＦＮ３反復をヒト配列と置換すると、Ｒ１５Ｅ６の結合が回復する（図７Ｂ、レーン３及び５）。逆に、マウスの第二ＦＮ３反復のみをヒト配列に置換しても、結合を回復させることはできない（図７Ｂ、レーン４）。総合すると、これらの知見は、Ｒ１５Ｅ６の結合エピトープがヒトＨＰＴＰβのＮ末端ＦＮ３反復（〜１００アミノ酸）に局在することを示す。
【０１１６】
Ｂ．末端切断変異体及びマウス／ヒトキメラタンパク質のＥＣＬ（電気化学発光）分析により、Ｒ１５Ｅ６の結合エピトープがヒトＨＰＴＰβ細胞外ドメインのＮ末端ＦＮ３反復に存在することを確認する。
方法：望ましいＨＰＴＰβタンパク質を含有する上清を、９６穴高結合ＭＳＤ（メソスケールディスカバリー（Meso Scale Discovery））プレート上にコーティングし、乾燥させ、３％ＢＳＡで１時間ブロックする。次いで、タンパク質をＲ１５Ｅ６モノクローナル抗体又はＲ１５Ｅ６Ｆａｂ断片（１０ｎＭ又は１．５μｇ／ｍＬ）とともに１時間インキュベートし、リンスし、ＭＳＤタグで標識したヤギ抗マウス抗体（１０ｎＭ）とともに１時間インキュベートする。過剰な抗体を洗い流し、ＭＳＤリードバッファを添加する。発光を、セクター２４００リーダー（Sector2400reader）（ＭＳＤ）を用いて測定する。ＭＳＤは、電気化学発光検出を利用し、模様付きアレイ（patternedarray）上の結合現象を検出する。メソスケールディスカバリー技術は、プレートの底部に電極を組み込んだ、独占権下にあるマルチアレイ（MULTI-ARRAY）（商標）及びマルチスポット（商標）マイクロプレートを使用する。炭素及び生物学的試薬で製造されたＭＳＤの電極は、受動的吸着により単純に炭素に付着し、生物活性を高水準に保持することができる。ＭＳＤアッセイは、超高感度検出のために電気化学発光標識を使用する。これらの電気化学発光標識は、電気化学的刺激を受けた時に光を放つ。検出プロセスは、ＭＳＤマイクロプレートの底部に位置する組み込み電極で開始され、電極付近の標識のみが励起され、６２０ｎｍで光が検出される。
結果：ウエスタンブロット研究に一致し、Ｒ１５Ｅ６はＭＳＤ分析によりＨＰＴＰβＣ末端切断タンパク質の全てに結合する（図８Ａ）。またウエスタンブロットに一致し、Ｒ１５Ｅ６はマウスＨＰＴＰβ細胞外ドメインに結合しないが、マウスＮ末端ＦＮ３反復をヒトＮ末端ＦＮ３ドメインに置換することにより結合は回復する（図８Ｂ）。これらのデータにより、Ｒ１５Ｅ６の結合エピトープは、ヒトＨＰＴＰβのＮ末端ＦＮ３反復に存在することが確認された。予期されたように、モノバレントなＲ１５Ｅ６Ｆａｂ断片の結合エピトープはまた、ヒトＨＰＴＰβのＮ末端の大部分のＦＮ３反復にマッピングされる（図９）。
【０１１７】
実施例６．モノバレントなＲ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、Ｒ１５Ｅ６仲介Ｔｉｅ２活性化をブロックし、内皮細胞の生存及び遊走を阻害する。
方法：Ｔｉｅ２の活性化、並びに、内皮細胞の生存及び遊走アッセイは、上述の実施例４のように実施する。単量体Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、上述のように調製する。精製Ｒ１５Ｅ６を、２ｍＭＥＤＴＡ及び１ｍＭジチオトレイトールを含有する０．１Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で透析する。１〜２ｍｇ／ｍＬのパパイン（ピアース（Pierce））を、３７℃で１５分間、上述のバッファ中で活性化する。１０ｍｇ／ｍＬのＲ１５Ｅ６を、１：１００の比の酵素：基質を用いて同一バッファ内でパパインとともに、３７℃で１時間インキュベートする。分解は、ヨードアセトアミド（最終濃度２０ｍＭ、氷上で１時間保持され、光から保護されている）の添加により終了する。パパイン分解物質を、リン酸緩衝食塩水で一晩透析し、ヨードアセトアミドを除去する。分解の程度は、γ重鎖（分子量９．１３２９Ｅ−１７Ｅｇ（５５，０００ｋＤａ））が消失、γのＦｃ断片（分子量４．４８３４Ｅ−１７ｇ（２７，０００ｋＤａ））及び軽鎖（分子量３．６５３２Ｅ−１７ｇ〜４．１５１３Ｅ−１７ｇ（２２，０００〜２５，０００ｋＤａ））が出現するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより監視する。
結果：インタクトなＲ１５Ｅ６抗体とは異なり、Ｆａｂ断片はＴｉｅ２の活性化を亢進しない（図１０）。さらに、過剰なＦａｂ断片の存在下で、Ｒ１５Ｅ６仲介Ｔｉｅ２活性化はブロックされる（図１０）。驚くべきことに、Ｒ１５Ｅ６Ｆａｂ断片は、対照Ｆａｂに比べて内皮細胞の生存を著しく阻害し（図１１Ａ）、この効果はインタクトなＲ１５Ｅ６の添加により回復する（図１１Ｂ）。内皮細胞生存における負の効果と一致し、Ｒ１５Ｅ６ＦａｂはまたＶＥＧＦ仲介内皮細胞遊走をブロックする（図１２）。これらの知見は、インタクトな二量体Ｒ１５Ｅ６が、血管新生シグナル伝達の亢進に必要であり、単量体Ｒ１５Ｅ６はこれらの作用をブロックし、実際に血管新生内皮細胞応答に対する負の効果を有する。
【０１１８】
特に示されない限り、分量、百分率、部分、及び比率を含む量は、全て「約」という言葉により修飾されると理解され、量は有効数字を示すことを意図しない。
【０１１９】
特に指定される場合を除き、冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は「１以上」を意味する。
【０１２０】
引用される全ての文献は、関連部分において参考として本明細書に組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを承認するものと解釈されるべきではない。この文書における用語のいずれかの意味又は定義が、参考として組み込まれる文献における用語のいずれかの意味又は定義と対立する範囲については、本文書におけるその用語に与えられた意味又は定義を適用するものとする。
【０１２１】
本発明の特定の実施形態を説明及び記載してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を行い得ることが当業者には明白であろう。従って、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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