(57)【要約】      （修正有）【課題】特定の非天然アミノ酸を導入した人工タンパク質について、リボソームによる合成系による合成が可能であるか否か推測する方法の提供。【解決手段】以下のａ及びｂ工程を備える方法。（ａ工程）特定の式で表される非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、特定の式で表される任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡと、のペプチジル基転移反応における反応遷移状態を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）又はその遷移状態最適化構造を再現し得る近似計算を行う工程。（ｂ工程）前記ａ工程の結果得られる構造が遷移状態構造であることが想定できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。【選択図】図３０
2019048797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のａ及びｂ工程を備えることを特徴とする方法。
（ａ工程）
一般式（１）で表される前記非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（２−１）又は（２−２）で表される任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５））又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｂ工程）
前記ａ工程の結果得られる構造が遷移状態構造であることが確認できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【化１】
2019048797.tif 000095
（Ａａ１は前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ１は任意の基、又は前記Ａａ１と一体となりＢａ1−Ａａ１−Ｎｔ１の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ１は、３´末端においてＯａ１２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【化２−１】
2019048797.tif 000096
（ｔＲＮＡＰ１は、３´末端においてＯＰ１と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ１はペプチジル基を表す。）
【化２−２】
2019048797.tif 000097
（ｔＲＮＡＰ１２−ＯＰ１２−ＨＰ１２の構造部分は、一般式（２−１）におけるｔＲＮＡＰ１と同構造を表す。すなわち、ＯＰ１２はｔＲＮＡＰ１の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ１２はＯＰ１２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ１２はｔＲＮＡＰ１からＯＰ１２とＨＰ１２を除いた部分を表す。
その他一般式（２−２）中の記号の意は一般式（２−１）に同じ。）
【化３−１】
2019048797.tif 000098
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｔ１）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ１とＯｔ１の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（３−１）中の記号の意は一般式（１）及び（２−１）に同じ。）
【化３−２】
2019048797.tif 000099
（Ｈｔ１２は、段階的アミド化反応の第１段階において、カルボニル酸素であったＯｔ１をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｔ１２−Ｏｔ１部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ１２とＯｔ１の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ１とＣｔ１の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（３−２）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【化３−３】
2019048797.tif 000100
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｐ１）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（３−３）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【化３−４】
2019048797.tif 000101
（構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ１とＨｐ１２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（３−４）中の記号の意は一般式（１）及び（２−２）に同じ。）
【化３−５】
2019048797.tif 000102
（Ｈｓ１２−Ｏｓ１−Ｈｓ１１は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｓ１１−Ｏｓ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ１とＨｓ１２の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ１２とＯｓ１の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ１とＨｐ１２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（３−５）中の記号の意は一般式（１）、（２−２）に同じ。）
【請求項２】
前記一般式（３−１）が、下記一般式（３−１−１）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【化３−１−１】
2019048797.tif 000103
（一般式（３−１−１）中の記号の意は一般式（３−１）に同じ。）
【請求項３】
前記一般式（１）で表される構造が下記一般式（４）で表される構造であり、
前記一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）、（３−５）で表される構造が、それぞれ下記一般式（５−１）、（５−２）、（５−３）、（５−４）、（５−５）で表される構造であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【化４】
2019048797.tif 000104
（Ｃα１は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、Ｒａ１及びＲａ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、Ｒａ２は水素原子でもよい）。
その他の記号は一般式（１）に同じ。）
【化５−１】
2019048797.tif 000105
（Ｎｔ１とＣｔ１、Ｎｔ１とＨｔ１、Ｈｔ１とＯｔ１の距離は一般式（３−１）に同じ。
その他一般式（５−１）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）及び（４）に同じ。）
【化５−２】
2019048797.tif 000106
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−２）と同じ。）
【化５−３】
2019048797.tif 000107
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−３）と同じ。）
【化５−４】
2019048797.tif 000108
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−４）と同じ。）
【化５−５】
2019048797.tif 000109
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−５）と同じ。）
【請求項４】
リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｃ〜ｅ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｃ工程）
Ａ及びＰサイトにｔＲＮＡ又はその誘導体が結合したリボソームのＸ線構造解析により得られる三次元構造データを用意し、
該三次元構造データに、以下の条件のとおり、
一般式（１）で表される前記非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（２−１）又は（２−２）で表される任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５））を組み込む工程。
（条件１）前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
（条件２）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
（ｄ工程）
前記ｃ工程により得られた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｅ工程）
前記ｄ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【化１】
2019048797.tif 000110
（Ａａ１は前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ１は任意の基、又は前記Ａａ１と一体となりＢａ1−Ａａ１−Ｎｔ１の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ１は、３´末端においてＯａ１２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【化２−１】
2019048797.tif 000111
（ｔＲＮＡＰ１は、３´末端においてＯＰ１と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ１はペプチジル基を表す。）
【化２−２】
2019048797.tif 000112
（ｔＲＮＡＰ１２−ＯＰ１２−ＨＰ１２の構造部分は、一般式（２−１）におけるｔＲＮＡＰ１と同構造を表す。すなわち、ＯＰ１２はｔＲＮＡＰ１の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ１２はＯＰ１２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ１２はｔＲＮＡＰ１からＯＰ１２とＨＰ１２を除いた部分を表す。
その他一般式（２−２）中の記号の意は一般式（２−１）に同じ。）
【化３−１】
2019048797.tif 000113
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｔ１）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ１とＯｔ１の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（３−１）中の記号の意は一般式（１）及び（２−１）に同じ。）
【化３−２】
2019048797.tif 000114
（Ｈｔ１２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ１をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｔ１２−Ｏｔ１部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ１２とＯｔ１の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ１とＣｔ１の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（３−２）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【化３−３】
2019048797.tif 000115
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｐ１）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（３−３）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【化３−４】
2019048797.tif 000116
（構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ１とＨｐ１２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（３−４）中の記号の意は一般式（１）及び（２−２）に同じ。）
【化３−５】
2019048797.tif 000117
（Ｈｓ１２−Ｏｓ１−Ｈｓ１１は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｓ１１−Ｏｓ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ１とＨｓ１２の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ１２とＯｓ１の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ１とＨｐ１２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（３−５）中の記号の意は一般式（１）、（２−２）に同じ。）
【請求項５】
前記ｅ工程の後に、以下のｅ´工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
（ｅ´工程）
前記e工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部(一般式（３−４）又は一般式（３−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ１２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ１の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【請求項６】
前記ｃ工程で一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む際に、
遷移状態最適化構造が得られている類似構造化合物の構造の一部、又は
請求項１又は２に記載の方法により、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断される場合であって、前記ｂ工程で遷移状態構造であることが確認された、前記ａ工程の結果得られる構造の一部
を取り込むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
さらに以下のｆ工程を備えることを特徴とする、請求項４〜６の何れか一項に記載の方法。
（ｆ工程）
前記ｄ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが確認され、かつ、
前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、リボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間に立体障害無く収まる場合、
または、前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）以外のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕに対応する塩基により形成される空間に立体障害無く収まる場合、
に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【請求項８】
リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｇ及びｈ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｇ工程）
一般式（６）で表される任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（７−１）又は（７−２）で表される前記非天然アミノ酸のアミノ酸残基を構成として有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｈ工程）
前記ｇ工程の結果得られる構造が遷移状態構造であることが確認できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【化６】
2019048797.tif 000118
（Ａａ２は前記任意のアミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ２は任意の基、又は前記Ａａ２と一体となりＢａ２−Ａａ２−Ｎｔ２の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ２は、３´末端においてＯａ２２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【化７−１】
2019048797.tif 000119
（ＡＰは前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
ＢＰは任意の基、又は前記ＡＰと一体となりＢＰ−ＡＰ−ＮＰの環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡＰ２は、３´末端においてＯＰ２と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ２はペプチジル基を表す。）
【化７−２】
2019048797.tif 000120
（ｔＲＮＡＰ２２−ＯＰ２２−ＨＰ２２の構造部分は、一般式（７−１）におけるｔＲＮＡＰ２と同構造を表す。すなわち、ＯＰ２２はｔＲＮＡＰ２の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ２２はＯＰ２２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ２２はｔＲＮＡＰ２からＯＰ２２とＨＰ２２を除いた部分を表す。
その他一般式（７−２）中の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【化８−１】
2019048797.tif 000121
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ２とＯｔ２の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（８−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【化８−２】
2019048797.tif 000122
（Ｈｔ２２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ２をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ２―Ｏｐ２―Ｈｔ２２―Ｏｔ２部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ２２とＯｔ２の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ２とＣｔ２の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（８−２）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【化８−３】
2019048797.tif 000123
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｐ２）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（８−３）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【化８−４】
2019048797.tif 000124
（構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ２と  Ｏｐ２の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ２とＨｐ２２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（８−４）中の記号の意は一般式（６）及び（７−２）に同じ。）
【化８−５】
2019048797.tif 000125
（Ｈｓ２１―Ｏｓ２−Ｈｓ２２は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｓ２１−Ｏｓ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ２とＨｓ２１の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ２１とＯｓ２の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ２とＨｐ２２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（８−５）中の記号の意は一般式（６）、（７−２）に同じ。）
【請求項９】
前記一般式（８−１）が、下記一般式（８−１−１）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【化８−１−１】
2019048797.tif 000126
（一般式（８−１−１）中の記号の意は一般式（８−１）に同じ。）
【請求項１０】
前記一般式（７−１）又は（７−２）で表される構造が下記一般式（９−１）又は（９−２）で表される構造であり、
前記一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、（８−５）で表される構造がそれぞれ下記一般式（１０−１）、（１０−２）、（１０−３）、（１０−４）、（１０−５）で表される構造であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【化９−１】
2019048797.tif 000127
（Ｃα２は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、ＲＰ１及びＲＰ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、ＲＰ２は水素原子でもよい）。
その他の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【化９−２】
2019048797.tif 000128
（ｔＲＮＡｐ２２、ＯＰ２２、及びＨＰ２２は一般式（７−２）と同じ意。それ以外の記号の意は一般式（９−１）と同じ。）
【化１０−１】
2019048797.tif 000129
（（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分、Ｎｔ２とＣｔ２、Ｎｔ２とＨｔ２、  Ｈｔ２とＯｔ２の距離は一般式（８−１）に同じ。
その他一般式（１０−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【化１０−２】
2019048797.tif 000130
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じ。その他一般式（１０−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−２）と同じ。）
【化１０−３】
2019048797.tif 000131
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じ。その他一般式（１０−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−３）と同じ。）
【化１０−４】
2019048797.tif 000132
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じ。その他一般式（１０−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−４）と同じ。）
【化１０−５】
2019048797.tif 000133
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じ。その他一般式（１０−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−５）と同じ。）
【請求項１１】
リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｉ〜ｋ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｉ工程）
Ａ及びＰサイトにｔＲＮＡ又はその誘導体が結合したリボソームのＸ線構造解析により得られる三次元構造データを用意し、
該三次元構造データに、以下の条件のとおり、
一般式（６）で表される任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（７−１）又は（７−２）で表される前記非天然アミノ酸のアミノ酸残基を構成として有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））を組み込む工程。
（条件３）前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
（条件４）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
（ｊ工程）
前記ｉ工程により得られた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｋ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【化６】
2019048797.tif 000134
（Ａａ２は前記任意のアミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ２は任意の基、又は前記Ａａ２と一体となりＢａ２−Ａａ２−Ｎｔ２の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ２は、３´末端においてＯａ２２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【化７−１】
2019048797.tif 000135
（ＡＰは前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
ＢＰは任意の基、又は前記ＡＰと一体となりＢＰ−ＡＰ−ＮＰの環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡＰ２は、３´末端においてＯＰ２と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ２はペプチジル基を表す。）
【化７−２】
2019048797.tif 000136
（ｔＲＮＡＰ２２−ＯＰ２２−ＨＰ２２の構造部分は、一般式（７−１）におけるｔＲＮＡＰ２と同構造を表す。すなわち、ＯＰ２２はｔＲＮＡＰ２の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ２２はＯＰ２２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ２２はｔＲＮＡＰ２からＯＰ２２とＨＰ２２を除いた部分を表す。
その他一般式（７−２）中の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【化８−１】
2019048797.tif 000137
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ２とＯｔ２の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（８−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【化８−２】
2019048797.tif 000138
（Ｈｔ２２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ２をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ２―Ｏｐ２―Ｈｔ２２―Ｏｔ２部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ２２とＯｔ２の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ２とＣｔ２の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（８−２）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【化８−３】
2019048797.tif 000139
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｐ２）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（８−３）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【化８−４】
2019048797.tif 000140
（構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ２と  Ｏｐ２の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ２とＨｐ２２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（８−４）中の記号の意は一般式（６）及び（７−２）に同じ。）
【化８−５】
2019048797.tif 000141
（Ｈｓ２１―Ｏｓ２−Ｈｓ２２は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｓ２１−Ｏｓ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ２とＨｓ２１の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ２１とＯｓ２の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ２とＨｐ２２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（８−５）中の記号の意は一般式（６）、（７−２）に同じ。）
【請求項１２】
前記ｋ工程の後に、以下のｋ´工程を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
（ｋ´工程）
前記ｋ工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部(一般式（８−４）又は一般式（８−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ２２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ２の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【請求項１３】
前記ｉ工程で一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される想定構造を組み込む際に、
遷移状態最適化構造が得られている類似構造化合物の構造の一部、又は
請求項８又は９に記載の方法により、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断される場合であって、前記ｈ工程で遷移状態構造であることが確認された、前記ｇ工程の結果得られる構造の一部
を取り込むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに以下のｌ工程を備えることを特徴とする、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
（ｌ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが想定され、かつ、
前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、リボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間に立体障害無く収まる場合、
または、前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）以外のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕに対応する塩基により形成される空間に立体障害無く収まる場合、
に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【請求項１５】
前記一般式（７−１）で表される構造が、以下の一般式（９−１）で表される構造であり、
前記一般式（８−１）で表される構造が、以下の一般式（１０−１）で表される構造であり、
以下のｍ工程を備えることを特徴とする、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の方法。
（ｍ工程）
前記ｉ工程において一般式（１０−１）で表される構造を組み込み、前記ｊ工程の結果得られた構造におけるねじれ角∠Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｃα２−ＲＰ１が、０°〜１０８°である場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【化９−１】
2019048797.tif 000142
（Ｃα２は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、ＲＰ１及びＲＰ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、ＲＰ２は水素原子でもよい）。）
【化１０−１】
2019048797.tif 000143
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分、Ｎｔ２とＣｔ２、Ｎｔ２とＨｔ２、  Ｈｔ２とＯｔ２の距離は一般式（８−１）に同じ。
その他一般式（１０−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【請求項１６】
一般式（７−１）又は（７−２）中のＡＰに親水性原子が存在する場合に、以下のｎ工程を備えることを特徴とする、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
（ｎ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造において、前記親水性原子が一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）中のＨｔ２及び／又はＯｔ２と水素結合を形成可能であると推定される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【請求項１７】
以下のｏ〜ｑ工程を備えることを特徴とする、請求項１１〜１６の何れか一項に記載の方法。
（ｏ工程）
前記ｉ工程により得られた構造に、
さらに、リボソームによる生物学的合成方法の反応系に存在する、リボソームによるペプチジル基転移反応を促進する又は同反応を阻害しないことが確認又は予測される物質を、リボソーム内のペプチジル基転移反応の反応中心若しくはその周辺に配置してこれを加えた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として設定する工程
（ｐ工程）
前記ｏ工程により得られた初期構造について分子軌道法によるＴＳ最適化計算を行う工程。
（ｑ工程）
前記ｐ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、前記遷移状態構造をとることにより進行するペプチジル基転移反応が前記物質による立体障害で阻害されない場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【請求項１８】
さらに以下のｒ工程を備えることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
（ｒ工程）
前記ｐ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される遷移状態最適化構造の分子と、前記物質との間で水素結合を形成可能な場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【請求項１９】
前記三次元構造データが、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ４Ｖ５Ｃ又は４Ｖ５Ｄとして登録されている原子座標であることを特徴とする、請求項４〜６及び１１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記分子軌道法が、半経験的分子軌道法であることを特徴とする、請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質を製造する工程とを有する、人工タンパク質の製造方法。
【請求項２２】
タンパク質又はペプチドの性能の改良方法であって、
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質又はペプチドを製造する製造工程と、
前記製造工程で製造されたタンパク質又はペプチドの性能を評価する評価工程と、を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
リボソームによるタンパク質合成系によるタンパク質又はペプチドの生産性又は製造効率の向上方法であって、
請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質又はペプチドを製造する製造工程と、
前記製造工程におけるタンパク質又はペプチドの生産性又は製造効率を評価する評価工程と、を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
非天然アミノ酸が導入された人工タンパク質又は人工ペプチドからなる薬剤のドラッグデザイン方法であって、
Ｌｉｇａｎｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＬＢＤＤ）及び／又はＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＳＢＤＤ）によって、リード化合物であるタンパク質又はペプチドに導入することにより、薬効を向上又は副作用を低減せしめる非天然アミノ酸を選択する工程と、
請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、該非天然アミノ酸の前記タンパク質又はペプチドへの導入適性を推測する推測工程と、
を含むことを特徴とする、ドラッグデザイン方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工タンパク質のリボソームによる合成への適性を分子軌道法によって推測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は医療や各種産業分野で幅広く利用されている。その主な製造方法である大腸菌等による生物学的合成方法はタンパク質工学として近年大いに発展した。タンパク質工学では天然の20種のアミノ酸の配列順序を任意に設計し、それに従った非天然のタンパク質を製造することも可能である。このような非天然タンパク質を製造する技術により、タンパク質の機能や物性を優位に向上させることができる。
【０００３】
従来のタンパク質工学の手法では、素材として使用できるのは天然の20種のアミノ酸に限られている。しかし、近年、非天然のアミノ酸をタンパク質に組み込んだ人工タンパク質を合成する技術が開発されている。非天然アミノ酸を組み込んだ人工タンパク質を合成する技術によれば、人工のタンパク質に付与可能な物性や機能の多様性を更に飛躍的に増大させることが可能になる。
非天然アミノ酸を人工タンパク質に組み込む技術としては、終止コドンの一つであるアンバー・コドンに非天然型アミノ酸を対応させる方法（特許文献１）や、４塩基コドンを用いた方法（例えば特許文献２）、特定のコドンを空にして新たに非天然アミノ酸を割り当てる遺伝暗号のリプログラミング法（非特許文献１〜３）、非天然型塩基を用いて人工的なコドンを創出する方法（非特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１８０７０１号公報
【特許文献２】特開２００６−２８０２５０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｏｒｅｓｔｅｒ，  Ａ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．１００，  ｐ．６３５３−６３５７  （２００３）
【非特許文献２】Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｈａｒｔｍａｎ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｊ．  Ｗ．：  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｖｏｌ．  １２７，  ｐ．  １１７２７−１１７３５  （２００５）
【非特許文献３】Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔ．  Ｍａｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．３５７−３５９  （２００６）
【非特許文献４】Ｂａｉｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｎａｔｕｒｅ．  １９９２  ３５６（６３６９）：５３７−９．
【非特許文献５】Ｎ．  Ｂａｎ，  Ｐ．  Ｎｉｓｓｅｎ，  Ｊ．  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｐ．  Ｂ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｔ．  Ａ．  Ｓｔｅｉｔｚ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８９，  ９０５−９２０  （２０００）
【非特許文献６】Ｍ．  Ｓｅｌｍｅｒ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｄｕｎｈａｍ，  Ｆ．  Ｖ．  Ｍｕｒｐｈｙ  ＩＶ，  Ａ．  Ｗｅｉｘｌｂａｕｍｅｒ，  Ｓ．  Ｐｅｔｒｙ，  Ａ．  Ｃ．  Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｗｅｉｒ，  Ｖ．  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，  １９３５−１９４２  （２００６）
【非特許文献７】Ｒ．  Ｍ．  Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，  Ａ．  Ｗｅｉｘｌｂａｕｍｅｒ，  Ｄ．  Ｌｏａｋｅｓ，  Ａ．  Ｃ．  Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｖ．  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ．  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ５２８−５３３  （２００９）
【非特許文献８】Ｔ．  Ｏｉｅ，  Ｇ．  Ｈ．  Ｌｏｅｗ，  Ｓ．  Ｋ．  Ｂｕｒｔ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｂｉｎｋｌｅｙ，  Ｒ．  Ｄ．  ＭａｃＥｌｒｏｙ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  １０４，  ６１６９−６１７４  （１９８２）
【非特許文献９】Ｈ．  Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｓ．  ＹａｍａｂｅＨ，  Ｔ．  Ｉｎａｇａｋｉ．  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｏｒｂｉｔ．  Ｋａｇａｋｕ  Ｄｏｊｉｎ    （１９８６）
【非特許文献１０】Ｋａｔａｒｚｙｎａ  Ｓｗｉｄｅｒｅｋ，  Ｓｅｒｇｉｏ  Ｍａｒｔｉ，  Ｉｎａｋｉ  Ｔｕｎｏｎ，  Ｖｉｃｅｎｔ  Ｍｏｌｉｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｊｕａｎ  Ｂｅｒｔｒａｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１５，  １３７，  １２０２４−１２０３４
【非特許文献１１】Ｋａｔａｒｚｙｎａ  Ｓｗｉｄｅｒｅｋ，  Ｉｎａｋｉ  Ｔｕｎｏｎ，  Ｓｅｒｇｉｏ  Ｍａｒｔｉ，  Ｖｉｃｅｎｔ  Ｍｏｌｉｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｊｕａｎ  Ｂｅｒｔｒａｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１３，  １３５，  ８７０８−８７１９
【非特許文献１２】Ｃａｒｌｅｓ  Ａｃｏｓｔａ−Ｓｉｌｖａ，  Ｊｏａｎ  Ｂｅｒｔｒａｎ，  Ｖｉｃｅｎｉｃ  Ｂｒａｎｃｈａｄｅｌｌ，  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉ  Ｏｌｉｖａ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１２，  １３４，  ５８１７−５８３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、非天然アミノ酸をタンパク質に導入する技術は種々開発されている。
ここで、非天然アミノ酸は当然ながら天然アミノ酸とは構造が相違する。そのため、巨大な構造を側鎖に有するものなど、あまりにも天然アミノ酸の構造からかけ離れた非天然アミノ酸は、リボソームによるタンパク質合成系によっては合成できないことは想像に難くない。
【０００７】
このようにリボソームによるタンパク質合成系によって非天然アミノ酸をタンパク質に導入する場合、非天然アミノ酸の構造や特性にはある程度の制限がかかる。しかしながら、どのような構造の非天然アミノ酸であればリボソームによるタンパク質合成系で合成し得るのか予測は不可能であった。
【０００８】
このような問題に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、特定の非天然アミノ酸を導入した人工タンパク質をリボソームによる合成系による合成が可能であるか否か推測する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述したとおり、どのような構造の非天然アミノ酸であればリボソームによるタンパク質合成系で合成し得るのか予測は不可能であった。この予測不可能性の最も大きな理由は、リボソーム上でのアミド化反応の詳細が不明であることにある。
【００１０】
本発明者は、リボソームのＸ線解析による立体構造情報と、分子軌道計算によるアミド化反応遷移状態構造の知見により、リボソーム上でのアミド化反応機構の詳細を明らかにした。これより、リボソーム上でのアミド化反応と素材であるアミノ酸との関係が解明され、リボソームによるタンパク質合成系に適性のある非天然アミノ酸の条件を見出し、本発明に至った。
【００１１】
上記課題を解決する本発明は、以下のとおりである。
【００１２】
＜１＞リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のａ及びｂ工程を備えることを特徴とする方法。
（ａ工程）
一般式（１）で表される前記非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（２−１）又は（２−２）で表される任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５））又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｂ工程）
前記ａ工程の結果得られる構造が遷移状態構造であることが確認できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００１３】
【化１】
2019048797.tif 000003
（Ａａ１は前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ１は任意の基、又は前記Ａａ１と一体となりＢａ1−Ａａ１−Ｎｔ１の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ１は、３´末端においてＯａ１２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【００１４】
【化２−１】
2019048797.tif 000004
（ｔＲＮＡＰ１は、３´末端においてＯＰ１と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ１はペプチジル基を表す。）
【００１５】
【化２−２】
2019048797.tif 000005
（ｔＲＮＡＰ１２−ＯＰ１２−ＨＰ１２の構造部分は、一般式（２−１）におけるｔＲＮＡＰ１と同構造を表す。すなわち、ＯＰ１２はｔＲＮＡＰ１の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ１２はＯＰ１２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ１２はｔＲＮＡＰ１からＯＰ１２とＨＰ１２を除いた部分を表す。
その他一般式（２−２）中の記号の意は一般式（２−１）に同じ。）
【００１６】
【化３−１】
2019048797.tif 000006
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｔ１）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ１とＯｔ１の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（３−１）中の記号の意は一般式（１）及び（２−１）に同じ。）
【００１７】
【化３−２】
2019048797.tif 000007
（Ｈｔ１２は、段階的アミド化反応の第１段階において、カルボニル酸素であったＯｔ１をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｔ１２−Ｏｔ１部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ１２とＯｔ１の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ１とＣｔ１の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（３−２）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【００１８】
【化３−３】
2019048797.tif 000008
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｐ１）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（３−３）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【００１９】
【化３−４】
2019048797.tif 000009
（構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ１とＨｐ１２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（３−４）中の記号の意は一般式（１）及び（２−２）に同じ。）
【００２０】
【化３−５】
2019048797.tif 000010
（Ｈｓ１２−Ｏｓ１−Ｈｓ１１は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｓ１１−Ｏｓ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ１とＨｓ１２の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ１２とＯｓ１の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ１とＨｐ１２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（３−５）中の記号の意は一般式（１）、（２−２）に同じ。）
【００２１】
＜２＞前記一般式（３−１）が、下記一般式（３−１−１）であることを特徴とする、項１に記載の方法。
【００２２】
【化３−１−１】
2019048797.tif 000011
（一般式（３−１−１）中の記号の意は一般式（３−１）に同じ。）
【００２３】
＜３＞前記一般式（１）で表される構造が下記一般式（４）で表される構造であり、
前記一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）、（３−５）で表される構造が、それぞれ下記一般式（５−１）、（５−２）、（５−３）、（５−４）、（５−５）で表される構造であることを特徴とする、項１に記載の方法。
【００２４】
【化４】
2019048797.tif 000012
（Ｃα１は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、Ｒａ１及びＲａ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、Ｒａ２は水素原子でもよい）。
その他の記号は一般式（１）に同じ。）
【００２５】
【化５−１】
2019048797.tif 000013
（Ｎｔ１とＣｔ１、Ｎｔ１とＨｔ１、Ｈｔ１とＯｔ１の距離は一般式（３−１）に同じ。
その他一般式（５−１）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）及び（４）に同じ。）
【００２６】
【化５−２】
2019048797.tif 000014
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−２）と同じ。）
【００２７】
【化５−３】
2019048797.tif 000015
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−３）と同じ。）
【００２８】
【化５−４】
2019048797.tif 000016
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−４）と同じ。）
【００２９】
【化５−５】
2019048797.tif 000017
（記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じ。その他一般式（５−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−５）と同じ。）
【００３０】
＜４＞リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｃ〜ｅ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｃ工程）
Ａ及びＰサイトにｔＲＮＡ又はその誘導体が結合したリボソームのＸ線構造解析により得られる三次元構造データを用意し、
該三次元構造データに、以下の条件のとおり、
一般式（１）で表される前記非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（２−１）又は（２−２）で表される任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５））を組み込む工程。
（条件１）前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
（条件２）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
（ｄ工程）
前記ｃ工程により得られた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｅ工程）
前記ｄ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００３１】
【化１】
2019048797.tif 000018
（Ａａ１は前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ１は任意の基、又は前記Ａａ１と一体となりＢａ1−Ａａ１−Ｎｔ１の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ１は、３´末端においてＯａ１２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【００３２】
【化２−１】
2019048797.tif 000019
（ｔＲＮＡＰ１は、３´末端においてＯＰ１と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ１はペプチジル基を表す。）
【００３３】
【化２−２】
2019048797.tif 000020
（ｔＲＮＡＰ１２−ＯＰ１２−ＨＰ１２の構造部分は、一般式（２−１）におけるｔＲＮＡＰ１と同構造を表す。すなわち、ＯＰ１２はｔＲＮＡＰ１の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ１２はＯＰ１２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ１２はｔＲＮＡＰ１からＯＰ１２とＨＰ１２を除いた部分を表す。
その他一般式（２−２）中の記号の意は一般式（２−１）に同じ。）
【００３４】
【化３−１】
2019048797.tif 000021
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｔ１）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ１とＯｔ１の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（３−１）中の記号の意は一般式（１）及び（２−１）に同じ。）
【００３５】
【化３−２】
2019048797.tif 000022
（Ｈｔ１２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ１をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｔ１２−Ｏｔ１部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ１２とＯｔ１の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ１とＣｔ１の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（３−２）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【００３６】
【化３−３】
2019048797.tif 000023
（構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｐ１）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（３−３）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じ。）
【００３７】
【化３−４】
2019048797.tif 000024
（構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ１とＨｐ１２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（３−４）中の記号の意は一般式（１）及び（２−２）に同じ。）
【００３８】
【化３−５】
2019048797.tif 000025
（Ｈｓ１２−Ｏｓ１−Ｈｓ１１は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｓ１１−Ｏｓ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ１とＨｓ１２の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ１２とＯｓ１の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ１とＨｐ１２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（３−５）中の記号の意は一般式（１）、（２−２）に同じ。）
【００３９】
＜５＞前記ｅ工程の後に、以下のｅ´工程を含むことを特徴とする、項４に記載の方法。
（ｅ´工程）
前記e工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部(一般式（３−４）又は一般式（３−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ１２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ１の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【００４０】
＜６＞前記ｃ工程で一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む際に、
遷移状態最適化構造が得られている類似構造化合物の構造の一部、又は
項１又は２に記載の方法により、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断される場合であって、前記ｂ工程で遷移状態構造であることが確認された、前記ａ工程の結果得られる構造の一部
を取り込むことを特徴とする、項４又は５に記載の方法。
【００４１】
＜７＞さらに以下のｆ工程を備えることを特徴とする、項４〜６の何れか一項に記載の方法。
（ｆ工程）
前記ｄ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが確認され、かつ、
前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、リボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間に立体障害無く収まる場合、
または、前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）以外のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕに対応する塩基により形成される空間に立体障害無く収まる場合、
に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００４２】
＜８＞リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｇ及びｈ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｇ工程）
一般式（６）で表される任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（７−１）又は（７−２）で表される前記非天然アミノ酸のアミノ酸残基を構成として有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｈ工程）
前記ｇ工程の結果得られる構造が遷移状態構造であることが確認できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００４３】
【化６】
2019048797.tif 000026
（Ａａ２は前記任意のアミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ２は任意の基、又は前記Ａａ２と一体となりＢａ２−Ａａ２−Ｎｔ２の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ２は、３´末端においてＯａ２２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【００４４】
【化７−１】
2019048797.tif 000027
（ＡＰは前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
ＢＰは任意の基、又は前記ＡＰと一体となりＢＰ−ＡＰ−ＮＰの環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡＰ２は、３´末端においてＯＰ２と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ２はペプチジル基を表す。）
【化７−２】
2019048797.tif 000028
（ｔＲＮＡＰ２２−ＯＰ２２−ＨＰ２２の構造部分は、一般式（７−１）におけるｔＲＮＡＰ２と同構造を表す。すなわち、ＯＰ２２はｔＲＮＡＰ２の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ２２はＯＰ２２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ２２はｔＲＮＡＰ２からＯＰ２２とＨＰ２２を除いた部分を表す。
その他一般式（７−２）中の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【００４５】
【化８−１】
2019048797.tif 000029
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ２とＯｔ２の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（８−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【００４６】
【化８−２】
2019048797.tif 000030
（Ｈｔ２２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ２をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ２―Ｏｐ２―Ｈｔ２２―Ｏｔ２部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ２２とＯｔ２の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ２とＣｔ２の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（８−２）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【００４７】
【化８−３】
2019048797.tif 000031
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｐ２）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（８−３）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【００４８】
【化８−４】
2019048797.tif 000032
（構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ２と  Ｏｐ２の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ２とＨｐ２２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（８−４）中の記号の意は一般式（６）及び（７−２）に同じ。）
【００４９】
【化８−５】
2019048797.tif 000033
（Ｈｓ２１―Ｏｓ２−Ｈｓ２２は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｓ２１−Ｏｓ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ２とＨｓ２１の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ２１とＯｓ２の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ２とＨｐ２２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（８−５）中の記号の意は一般式（６）、（７−２）に同じ。）
【００５０】
＜９＞前記一般式（８−１）が、下記一般式（８−１−１）であることを特徴とする、項８に記載の方法。
【００５１】
【化８−１−１】
2019048797.tif 000034
（一般式（８−１−１）中の記号の意は一般式（８−１）に同じ。）
【００５２】
＜１０＞前記一般式（７−１）又は（７−２）で表される構造が下記一般式（９−１）又は（９−２）で表される構造であり、
前記一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、（８−５）で表される構造がそれぞれ下記一般式（１０−１）、（１０−２）、（１０−３）、（１０−４）、（１０−５）で表される構造であることを特徴とする、項８に記載の方法。
【００５３】
【化９−１】
2019048797.tif 000035
（Ｃα２は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、ＲＰ１及びＲＰ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、ＲＰ２は水素原子でもよい）。
その他の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【００５４】
【化９−２】
2019048797.tif 000036
（ｔＲＮＡｐ２２、ＯＰ２２、及びＨＰ２２は一般式（７−２）と同じ意。それ以外の記号の意は一般式（９−１）と同じ。）
【００５５】
【化１０−１】
2019048797.tif 000037
（（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分、Ｎｔ２とＣｔ２、Ｎｔ２とＨｔ２、  Ｈｔ２とＯｔ２の距離は一般式（８−１）に同じ。
その他一般式（１０−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【００５６】
【化１０−２】
2019048797.tif 000038
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じ。その他一般式（１０−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−２）と同じ。）
【００５７】
【化１０−３】
2019048797.tif 000039
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じ。その他一般式（１０−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−３）と同じ。）
【００５８】
【化１０−４】
2019048797.tif 000040
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じ。その他一般式（１０−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−４）と同じ。）
【００５９】
【化１０−５】
2019048797.tif 000041
（記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じ。その他一般式（１０−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−５）と同じ。）
【００６０】
＜１１＞リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｉ〜ｋ工程を備えることを特徴とする方法。
（ｉ工程）
Ａ及びＰサイトにｔＲＮＡ又はその誘導体が結合したリボソームのＸ線構造解析により得られる三次元構造データを用意し、
該三次元構造データに、以下の条件のとおり、
一般式（６）で表される任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、
一般式（７−１）又は（７−２）で表される前記非天然アミノ酸のアミノ酸残基を構成として有するペプチジルｔＲＮＡと、
のペプチジル基転移反応における想定される反応遷移状態（一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））を組み込む工程。
（条件３）前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
（条件４）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
（ｊ工程）
前記ｉ工程により得られた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として、分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う工程。
（ｋ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００６１】
【化６】
2019048797.tif 000042
（Ａａ２は前記任意のアミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ２は任意の基、又は前記Ａａ２と一体となりＢａ２−Ａａ２−Ｎｔ２の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ２は、３´末端においてＯａ２２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【００６２】
【化７−１】
2019048797.tif 000043
（ＡＰは前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
ＢＰは任意の基、又は前記ＡＰと一体となりＢＰ−ＡＰ−ＮＰの環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡＰ２は、３´末端においてＯＰ２と共有結合したｔＲＮＡを表す。
ＰＰ２はペプチジル基を表す。）
【化７−２】
2019048797.tif 000044
（ｔＲＮＡＰ２２−ＯＰ２２−ＨＰ２２の構造部分は、一般式（７−１）におけるｔＲＮＡＰ２と同構造を表す。すなわち、ＯＰ２２はｔＲＮＡＰ２の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ２２はＯＰ２２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ２２はｔＲＮＡＰ２からＯＰ２２とＨＰ２２を除いた部分を表す。
その他一般式（７−２）中の記号の意は一般式（７−１）に同じ。）
【００６３】
【化８−１】
2019048797.tif 000045
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ２とＯｔ２の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（８−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【００６４】
【化８−２】
2019048797.tif 000046
（Ｈｔ２２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ２をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ２―Ｏｐ２―Ｈｔ２２―Ｏｔ２部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ２２とＯｔ２の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ２とＣｔ２の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（８−２）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【００６５】
【化８−３】
2019048797.tif 000047
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｐ２）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（８−３）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じ。）
【００６６】
【化８−４】
2019048797.tif 000048
（構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ２と  Ｏｐ２の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ２とＨｐ２２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（８−４）中の記号の意は一般式（６）及び（７−２）に同じ。）
【００６７】
【化８−５】
2019048797.tif 000049
（Ｈｓ２１―Ｏｓ２−Ｈｓ２２は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｓ２１−Ｏｓ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ２とＨｓ２１の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ２１とＯｓ２の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ２とＨｐ２２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（８−５）中の記号の意は一般式（６）、（７−２）に同じ。）
【００６８】
＜１２＞前記ｋ工程の後に、以下のｋ´工程を含むことを特徴とする、項１１に記載の方法。
（ｋ´工程）
前記ｋ工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部(一般式（８−４）又は一般式（８−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ２２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ２の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【００６９】
＜１３＞前記ｉ工程で一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される想定構造を組み込む際に、
遷移状態最適化構造が得られている類似構造化合物の構造の一部、又は
項８又は９に記載の方法により、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断される場合であって、前記ｈ工程で遷移状態構造であることが確認された、前記ｇ工程の結果得られる構造の一部
を取り込むことを特徴とする、項１１又は１２に記載の方法。
【００７０】
＜１４＞さらに以下のｌ工程を備えることを特徴とする、項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
（ｌ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが想定され、かつ、
前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、リボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間に立体障害無く収まる場合、
または、前記三次元構造データが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）以外のリボソームのＸ線解析構造である場合に、前記非天然アミノ酸の側鎖が、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕに対応する塩基により形成される空間に立体障害無く収まる場合、
に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００７１】
＜１５＞
前記一般式（７−１）で表される構造が、以下の一般式（９−１）で表される構造であり、
前記一般式（８−１）で表される構造が、以下の一般式（１０−１）で表される構造であり、
以下のｍ工程を備えることを特徴とする、項１１〜１４の何れか一項に記載の方法。
（ｍ工程）
前記ｉ工程において一般式（１０−１）で表される構造を組み込み、前記ｊ工程の結果得られた構造におけるねじれ角∠Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｃα２−ＲＰ１が、０°〜１０８°である場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００７２】
【化９−１】
2019048797.tif 000050
（Ｃα２は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、ＲＰ１及びＲＰ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、ＲＰ２は水素原子でもよい）。）
【００７３】
【化１０−１】
2019048797.tif 000051
（構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分、Ｎｔ２とＣｔ２、Ｎｔ２とＨｔ２、  Ｈｔ２とＯｔ２の距離は一般式（８−１）に同じ。
その他一般式（１０−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じ。）
【００７４】
＜１６＞一般式（７−１）又は（７−２）中のＡＰに親水性原子が存在する場合に、以下のｎ工程を備えることを特徴とする、項１１〜１３の何れか一項に記載の方法。
（ｎ工程）
前記ｊ工程の結果得られた構造において、前記親水性原子が一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）中のＨｔ２及び／又はＯｔ２と水素結合を形成可能であると推定される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００７５】
＜１７＞以下のｏ〜ｑ工程を備えることを特徴とする、項１１〜１６の何れか一項に記載の方法。
（ｏ工程）
前記ｉ工程により得られた構造に、
さらに、リボソームによる生物学的合成方法の反応系に存在する、リボソームによるペプチジル基転移反応を促進する又は同反応を阻害しないことが確認又は予測される物質を、リボソーム内のペプチジル基転移反応の反応中心若しくはその周辺に配置してこれを加えた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として設定する工程。
（ｐ工程）
前記ｏ工程により得られた初期構造について分子軌道法によるＴＳ最適化計算を行う工程。
（ｑ工程）
前記ｐ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、前記遷移状態構造をとることにより進行するペプチジル基転移反応が前記物質による立体障害で阻害されない場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００７６】
＜１８＞さらに以下のｒ工程を備えることを特徴とする、項１５に記載の方法。
（ｒ工程）
前記ｐ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される遷移状態最適化構造の分子と、前記物質との間で水素結合を形成可能な場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する工程。
【００７７】
＜１９＞前記三次元構造データが、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ４Ｖ５Ｃ又は４Ｖ５Ｄとして登録されている原子座標であることを特徴とする、項４〜６及び１０〜１６の何れか一項に記載の方法。
【００７８】
＜２０＞前記分子軌道法が、半経験的分子軌道法であることを特徴とする、項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【００７９】
＜２１＞項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質を製造する工程とを有する、人工タンパク質の製造方法。
【００８０】
＜２２＞タンパク質又はペプチドの性能の改良方法であって、
項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質又はペプチドを製造する製造工程と、
前記製造工程で製造されたタンパク質又はペプチドの性能を評価する評価工程と、を有することを特徴とする方法。
【００８１】
＜２３＞リボソームによるタンパク質合成系によるタンパク質又はペプチドの生産性又は製造効率の向上方法であって、
項１〜２０の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する推測工程と、
推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質又はペプチドを製造する製造工程と、
前記製造工程におけるタンパク質又はペプチドの生産性又は製造効率を評価する評価工程と、を有することを特徴とする方法。
【００８２】
＜２４＞非天然アミノ酸が導入された人工タンパク質又は人工ペプチドからなる薬剤のドラッグデザイン方法であって、
Ｌｉｇａｎｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＬＢＤＤ）及び／又はＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＳＢＤＤ）によって、リード化合物であるタンパク質又はペプチドに導入することにより、薬効を向上又は副作用を低減せしめる非天然アミノ酸を選択する工程と、
項１〜１８の何れか一項に記載の方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、該非天然アミノ酸の前記タンパク質又はペプチドへの導入適性を推測する推測工程と、
を含むことを特徴とする、ドラッグデザイン方法。
【発明の効果】
【００８３】
本発明によれば、リボソームによるタンパク質合成系を利用した非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
以下、各図面の簡単な説明を加えるが、図面の左上に「Ｓ」の表記があるものは、三次元の図形（ステレオグラム）である。右目で左の画像を、左目で右の画像を見ることにより立体視する。
【００８５】
【図１】非特許文献６、７に記載の７０ｓリボソームのＸ線構造解析写真（ＰＤＢ  ４Ｖ５Ｃ）。中央左側にＡサイトのｔＲＮＡ、中央右側にＰサイトのｔＲＮＡ、中央下側にｍＲＮＡを空間充填モデルで表す。針金モデルでリボソームを表す。
【図２】リボソームの反応部位の周辺を表す画像である。（非特許文献６，７；ＰＤＢ  ４Ｖ５Ｃ））左側下方にＡサイトのｔＲＮＡ、右側下方にＰサイトのｔＲＮＡを棒モデルで表す。５０Ｓ  ＲＮＡを針金モデルで表す。
【図３】アミド化反応のＸ線解析構造（非特許文献６、７；ＰＤＢ  ４Ｖ５Ｃ）
【図４】アミド化反応のＸ線解析構造（非特許文献６、７；ＰＤＢ  ４Ｖ５Ｄ）
【図５】Ｘ線解析構造へＴ１´−２構造を接続した状態を表す。Ｘ線解析構造は棒モデル、Ｔ１´−２構造は球棒モデルで表す。
【図６】Ｘ線解析構造へＴ３構造を接続した状態を表す。Ｘ線解析構造は棒モデル、Ｔ３構造は球棒モデルで表す。
【図７】Ａｓ１Ｐｓ１型の初期構造を表す。
【図８】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ１Ｐｓ１型構造。
【図９】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ１Ｐｓ２型構造。
【図１０】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ１Ｐｓ３型構造。
【図１１】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ２Ｐｓ１型構造。
【図１２】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ２Ｐｓ２型構造。
【図１３】ＴＳ最適化計算により最適化された  Ａｓ２Ｐｓ３型構造。
【図１４】最適化された架橋構造を表す。
【図１５】リボソームにおける遷移状態構造最適化計算のための初期構造を生成する工程を表す図。
【図１６】Ａｓ２Ｐｓ１型の構造に対する、リボソーム上でのアミド化反応の初期構造を表す。
【図１７】Ａｓ１Ｐｓ１型の構造を表す。
【図１８】Ａｓ１Ｐｓ２型の構造を表す。
【図１９】Ａｓ１Ｐｓ３型の構造を表す。
【図２０】Ａｓ２Ｐｓ１型の構造を表す。
【図２１】Ａｓ２Ｐｓ２型の構造を表す。
【図２２】Ａｓ２Ｐｓ３型の構造を表す。
【図２３】Ａｓ１Ｐｓ１型の構造を表す。
【図２４】Ａｓ１Ｐｓ２型の構造を表す。
【図２５】Ａｓ１Ｐｓ３型の構造を表す。
【図２６】Ａｓ２Ｐｓ１型の構造を表す。
【図２７】Ａｓ２Ｐｓ２型の構造を表す。
【図２８】Ａｓ２Ｐｓ３型の構造を表す。
【図２９】Ａｓ２Ｐｓ１型の構造の反応中心及びその周囲に６つ水分子を配置した初期構造を表す。
【図３０】Ａｓ２Ｐｓ１型の構造の反応中心及びその周囲に６つ水分子を配置した構造を初期構造として、構造最適化計算を行った結果得られた構造を表す。
【図３１】構造最適化計算の結果得られた図３０の構造をＸ線解析構造と重ね合わせた様子を表す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明は、リボソームによるタンパク質合成系を利用した、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法である。
本発明において「リボソームによるタンパク質合成系」には、リボソームの触媒活性によるペプチジル基転移反応を利用した合成系が全て含まれ、ｉｎ  ｖｉｒｏ合成系とｉｎ  ｖｉｖｏ合成系の何れもが含まれる。
【００８７】
本発明は、ａ及びｂ工程を必須の工程として備える。以下、それぞれについて詳述する。
【００８８】
（ａ工程）
ａ工程では、タンパク質への導入適性を推測したい非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡとのペプチジル基転移反応における遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う。
【００８９】
前記非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡは一般式（１）に表される構造である。
【００９０】
【化１】
2019048797.tif 000052
【００９１】
（一般式（１）中、Ａａ１は前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ１は任意の基、又は前記Ａａ１と一体となりＢａ1−Ａａ１−Ｎｔ１の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ１は、３´末端においてＯａ１２と共有結合したｔＲＮＡを表す。）
【００９２】
一般式（１）に示すように、本発明の方法により導入適性を推測することができる非天然アミノ酸はαアミノ酸に限られない。当然、以下の一般式（４）に示すような構造を有するαアミノ酸の導入適性を推測することもできる。
【００９３】
【化４】
2019048797.tif 000053
【００９４】
一般式（４）中、Ｃα１は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、Ｒａ１及びＲａ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、Ｒａ２は水素原子でもよい）。
その他の記号の意は一般式（１）に同じである。
【００９５】
なお、本明細書において上付き文字が付されたＣ、Ｎ、Ｏ、Ｈはそれぞれ炭素原子、窒素原子、酸素原子、水素原子を表す。
【００９６】
一方、任意のアミノ酸配列を有するペプチジルｔＲＮＡは、一般式（２−１）又は（２−２）で表される。
【００９７】
【化２−１】
2019048797.tif 000054
【００９８】
（一般式（２−１）において、ｔＲＮＡＰ１は、３´末端においてＯＰ１と共有結合したｔＲＮＡを表す。ＰＰ１はペプチジル基を表す。）
【００９９】
【化２−２】
2019048797.tif 000055
【０１００】
一般式（２−２）において、ｔＲＮＡＰ１２−ＯＰ１２−ＨＰ１２の構造部分は、一般式（２−１）におけるｔＲＮＡＰ１と同構造を表す。すなわち、ＯＰ１２はｔＲＮＡＰ１の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ１２はＯＰ１２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ１２はｔＲＮＡＰ１からＯＰ１２とＨＰ１２を除いた部分を表す。
その他一般式（２−２）中の記号の意は一般式（２−１）に同じである。
【０１０１】
なお、本明細書において「ペプチジル基」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により重合して構成される基のことをいう。なお、ペプチジル基が他の構造（下の式のX）と結合する部分の結合様式は、下の式（ｉ）〜（ｖｉ）に示す６種が想定できる。この場合、下の式の一点鎖線で囲んだ部分がペプチジル基に該当する。
ただし、一般式（２−１）又は（２−２）、一般式（３−１）〜（３−５）及び一般式（５−１）〜（５−５）におけるＰＰ１は（ｖ）、一般式（７−１）又は（７−２）、一般式（８−１）〜（８−５）、一般式（９）及び一般式（１０−１）〜（１０−５）におけるＰＰ２は（ｉｖ）の様式で結合するペプチジル基である。
【０１０２】
【化１１】
2019048797.tif 000056
【０１０３】
（i）〜（ｖi）におけるＡは、ペプチジル基を構成するアミノ酸残基における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。Ｘはペプチジル基が結合する他の構造を表す。
【０１０４】
リボソームにおけるペプチジル基転移反応においては、リボソームのＰサイトに位置するペプチジルｔＲＮＡから、Ａサイトに位置するアミノアシルｔＲＮＡへのペプチジル基の転移が起こる。
ａ工程においては、一般式（２−１）又は（２−２）で表されるペプチジルｔＲＮＡから、一般式（１）で表されるアミノアシルｔＲＮＡへのペプチジル基転移反応における分子軌道法による遷移状態構造最適化計算（ＴＳ最適化計算）を行う。
【０１０５】
ＴＳ最適化計算を行うに当たっては一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）に表される構造を初期構造として用いる。
【０１０６】
【化３−１】
2019048797.tif 000057
【０１０７】
一般式（３−１）において、構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｔ１）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ１とＯｔ１の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（３−１）中の記号の意は一般式（１）及び（２−１）に同じである。
【０１０８】
なお、一般式（３−１）で表される構造については、以下の一般式（３−１―１）で表される立体異性体構造を用いることができる。なお、一般式（３−１−１）中の記号の意は一般式（３−１）に同じである。
【０１０９】
【化３−１−１】
2019048797.tif 000058
【０１１０】
【化３−２】
2019048797.tif 000059
【０１１１】
一般式（３−２）において、Ｈｔ１２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ１をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｔ１２−Ｏｔ１部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ１２とＯｔ１の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ１とＣｔ１の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（３−２）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じである。
【０１１２】
【化３−３】
2019048797.tif 000060
【０１１３】
一般式（３−３）において、構造Ｎｔ１（Ｈｔ１）−Ｃｔ１（Ｏｐ１）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（３−３）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）に同じである。
【０１１４】
【化３−４】
2019048797.tif 000061
【０１１５】
一般式（３−４）において、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ１とＨｐ１２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（３−４）中の記号の意は一般式（１）及び（２−２）に同じである。
【０１１６】
【化３−５】
2019048797.tif 000062
【０１１７】
一般式（３−５）において、Ｈｓ１２−Ｏｓ１−Ｈｓ１１は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ１−Ｃｔ１−Ｏｐ１−Ｈｓ１１−Ｏｓ１−Ｈｐ１２−Ｏｐ１２−Ｈｔ１部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ１とＣｔ１の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ１とＨｔ１の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ１とＯｐ１の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ１とＨｓ１２の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ１２とＯｓ１の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ１とＨｐ１２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ１２とＯｐ１２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ１２とＨｔ１との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（３−５）中の記号の意は一般式（１）、（２−２）に同じである。
【０１１８】
なお、非天然アミノ酸としてαアミノ酸を用いた場合には、特に以下の一般式（５−１）、（５−２）、（５−３）、（５−４）、（５−５）で表される構造が初期構造となる。
【０１１９】
【化５−１】
2019048797.tif 000063
【０１２０】
一般式（５−１）において、Ｎｔ１とＣｔ１、Ｎｔ１とＨｔ１、Ｈｔ１とＯｔ１の距離は一般式（３−１）に同じである。
その他一般式（５−１）中の記号の意は一般式（１）、（２−１）及び（４）に同じである。
【０１２１】
なお、一般式（５−１）で表される構造については、以下の一般式（５−１―１）で表される立体異性体構造を用いることができる。なお、一般式（５−１−１）中の記号の意は一般式（５−１）に同じである。
【０１２２】
【化５−１−１】
2019048797.tif 000064
【０１２３】
【化５−２】
2019048797.tif 000065
【０１２４】
一般式（５−２）において、記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じである。その他一般式（５−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−２）と同じである。
【０１２５】
【化５−３】
2019048797.tif 000066
【０１２６】
一般式（５−３）において、記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じである。その他一般式（５−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−３）と同じである。
【０１２７】
【化５−４】
2019048797.tif 000067
【０１２８】
一般式（５−４）において、記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じである。その他一般式（５−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−４）と同じである。
【０１２９】
【化５−５】
2019048797.tif 000068
【０１３０】
一般式（５−５）において、記号Ｒａ１、Ｃα１及びＲａ２の意は一般式（４）と同じである。その他一般式（５−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（３−５）と同じである。
【０１３１】
なお、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）、（３−５）、（５−１）、（５−２）、（５−３）、（５−４）又は（５−５）で表される構造はｔＲＮＡ構造を含むため、ＴＳ最適化計算を行う際に計算負荷が高くなることが予想される。そのため、本発明においては、これら一般式で表される構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造としてもよい。省略は常法により行うことができる。
【０１３２】
初期構造である一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）、（３−５）、（５−１）、（５−２）、（５−３）、（５−４）又は（５−５）で表される構造におけるより詳細なパラメータの設定については常法により行うことができる。例えば、ミニマムエネルギーパス計算により得られたエネルギープロファイルの極大点を、遷移状態近傍の構造であると仮定し、遷移状態の初期構造として利用することもできる。
また、公知のアミド化反応遷移状態構造（例えば、Ｏｉｅらの報告（非特許文献８））を参考に初期構造の詳細を設定してもよい。
【０１３３】
分子軌道法によるＴＳ最適化計算の手法は特に制限されず、半経験的分子軌道法、非経験的分子軌道法の何れを用いても構わない。簡便さ（計算時間）と精度のバランスから半経験的分子軌道法を用いることが好ましい。
【０１３４】
分子軌道計算ソフトは公知のものを制限なく用いることができる。例えば、非経験的分子軌道法によるＧａｕｓｓｉａｎやＨＯＮＤＯなどや、半経験的分子軌道法によるＭＯＰＡＣなどが挙げられる。
【０１３５】
（ｂ工程）
ｂ工程では、ａ工程のＴＳ最適化計算の結果得られる構造が、ペプチジル基転移反応（アミド化反応）の遷移状態構造であるか否か確認する。ａ工程のＴＳ最適化計算の結果得られる構造が遷移状態構造であることが確認できる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
【０１３６】
ここで、遷移状態構造であるか否か確認する方法は、振動計算やＩＲＣ計算またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３７】
本発明の好ましい実施の形態では、さらに以下のｃ〜ｅ工程を備える。
【０１３８】
また、本発明はリボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｃ〜e工程を備える形態の方法にも関する。
【０１３９】
（ｃ工程）
ｃ工程では、まず、Ａ及びＰサイトにｔＲＮＡ又はその誘導体が結合したリボソームのＸ線構造解析により得られる三次元構造データ（以下、単に三次元構造データともいう）を用意する。
【０１４０】
ここで、Ａ及びＰサイト上のｔＲＮＡの「誘導体」には、アミノアシルｔＲＮＡやペプチジルアミノアシルｔＲＮＡ、並びにこれらの誘導体が含まれる。
【０１４１】
三次元構造データとしてはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に登録されているものを用いることができる。具体的には、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ４Ｖ５Ｃ又は４Ｖ５Ｄとして登録されているデータを用いることができる。
なお、当該データは好熱菌（サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））のリボソームの解析結果であるが、リボソームの反応中心の構造は、種間の相違が少ない。そのため、本発明においては、このような好熱菌のデータであっても、タンパク質工学に用いる大腸菌等のリボソーム合成系における検討に用いることができる。
【０１４２】
ｃ工程においては、以下の条件のとおり、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される構造を組み込む。
【０１４３】
（条件１）三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
【０１４４】
（条件２）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（３−１）、（３−２）、（３−３）、（３−４）又は（３−５）で表される想定構造を組み込む。
【０１４５】
なお、ここでいう「近傍」とは１Å以内の距離のことをいう。
【０１４６】
三次元構造データへの原子の組み込みは、分子軌道計算ソフトの機能を利用して、常法に従い行うことができる。
なお、組み込みの際には、ｔＲＮＡａ１の３´末端の３´炭素とОａ１２との結合、また、ｔＲＮＡP１の３´末端の３´炭素とОP1との結合が、通常の結合状態に収束するように操作を加えてもよい。この操作は常法に従い、適宜、構造最適化計算を行うことで実行できる。
【０１４７】
また、組み込みの際には、遷移状態最適化構造が得られている類似構造化合物の構造の一部を取り込んでもよい。このような構造としては、Ｏｉｅらの報告（非特許文献８）による公知のアミド化反応遷移状態構造などが挙げられる。
【０１４８】
また、組み込みの際には、上述したａ工程とｂ工程を備える本発明の方法により、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断される場合であって、前記ｂ工程で遷移状態構造であることが確認された、前記ａ工程の結果得られる構造の一部を取り込んでもよい。
【０１４９】
なお、これらの構造を取り込む際には、ＴＳ最適化構造の電子データをそのまま入力してもよいし、また、マニュアル入力により調整してもよい。
【０１５０】
（ｄ工程）
ｄ工程は、ｃ工程において得られた構造を初期構造としてＴＳ最適化計算を行う工程である。
なお、ｄ工程における分子軌道計算は、アミノアシルｔＲＮＡやペプチジルｔＲＮＡだけでなく、巨大分子であるリボソームの構造を含むことになる。リボソーム分子は巨大であり、このリボソーム上でのペプチジル基転移反応における遷移状態構造を、リボソーム分子全体を含めてそのまま分子軌道計算で求めるのは困難である。そのため、ペプチジル基転移反応の真の様相をできるだけ損なわずに再現するには、リボソームの転移反応中心の周辺の可能な限り広く、かつ、計算が可能な範囲を取り出し、最適化計算の際に当該周辺構造が発散してしまわないような適度な拘束を掛ける等の工夫をすることが好ましい。
つまり、ｃ工程において得られた構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造としてよい。省略は上述したとおり常法により行うことができる。
【０１５１】
分子軌道法についての詳細は、上記ａ工程の説明で述べた事項を適用することができる。
【０１５２】
（ｅ工程）
ｅ工程は、前記ｄ工程でのＴＳ最適化計算の結果得られた構造を評価する工程である。すなわち、得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入の適性が高いと判断する。
遷移状態構造であるか否かの確認はｂ工程の説明で述べた事項を適用できる。
【０１５３】
また、ｅ工程の後に、以下のｅ´工程を含むことが特に好ましい。
（ｅ´工程）
前記e工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部（一般式（３−４）又は一般式（３−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ１２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ１の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ１の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【０１５４】
ｅ´工程は、遷移状態構造であることが確認できた構造が、リボソームの内部においてとり得る構造であることを確かめる工程である。ｅ´工程によれば、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性をより精度よく推測することができる。
【０１５５】
（ｆ工程）
サーマス・サーモフィルスのリボソーム中には、２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間が存在する。上述のとおり、リボソームの反応中心の構造は種間の相違が少ないため、サーマス・サーモフィルス以外の種のリボソーム中にも、当該空間に相当する空間が存在する蓋然性は高い。
本発明においては、ｃ〜ｅ工程に加えて、さらに、当該リボソーム中の空間に関する評価を行うｆ工程を備えることが好ましい。
【０１５６】
ｆ工程では、ｄ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが確認され、かつ、サーマス・サーモフィルスのリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間（または、これに相当する空間）に、非天然アミノ酸の側鎖が、立体障害無く収まる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入の適性が高いと判断する。
【０１５７】
立体障害の有無は、非天然アミノ酸のアミノ酸残基の側鎖と前記空間を形成する塩基との原子間距離を基準に評価する。
【０１５８】
ｆ工程は、同様にリボソーム中の空間に関する評価を行うｅ´工程と組み合わせて実行することが好ましい。これにより、さらに高い精度で非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を評価することができる。
【０１５９】
ところで、リボソームによるタンパク質合成反応においては、ペプチジル基転移反応後、トランスロケーションが起こる。つまり、反応前はＡサイトに位置していたアミノアシルｔＲＮＡがペプチジル基の転移を受けると、ｍＲＮＡごとＰサイトに移動する。
【０１６０】
上述したａ及びｂ、またｃ〜ｆ工程を備える本発明の方法は、非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡがＡサイトに位置している状態における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性の評価に関するものであった。
以下、Ａサイトに位置していた非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡがペプチジル基転移を受け、Ｐサイトにトランスロケーションした状態における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性の評価に関するｇ及びｈ工程を備える形態の発明について説明を加える。
【０１６１】
なお、非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡが、Ａサイトに位置している状態の評価（ａ工及びｂ工程）と、Ｐサイトに位置している状態の評価（ｇ及びｈ工程）を組み合わせて行うことにより、より精度よく非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推定することができる。
【０１６２】
（ｇ工程）
ｇ工程は、任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、非天然アミノ酸の残基を有するペプチジルｔＲＮＡとのペプチジル基転移反応におけるＴＳ最適化計算を行う工程である。
【０１６３】
上記任意のアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡは、一般式（６）で表される。
【０１６４】
【化６】
2019048797.tif 000069
【０１６５】
一般式（６）中、Ａａ２は任意の天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
Ｂａ２は任意の基、又は前記Ａａ２と一体となりＢａ２−Ａａ２−Ｎｔ２の環状構造を形成する基を表す。
ｔＲＮＡａ２は、３´末端においてＯａ２２と共有結合したｔＲＮＡを表す。
【０１６６】
一般式（６）はαアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡに限定していないが、当然、αアミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡであってもよい。
【０１６７】
一方、上記ペプチジルｔＲＮＡは一般式（７−１）又は（７−２）で表される。
【０１６８】
【化７−１】
2019048797.tif 000070
【０１６９】
一般式（７−１）において、ＡＰは前記非天然アミノ酸における、ペプチド結合に関与するアミノ基及びカルボキシル基以外の構造部分を表す。
ＢＰは任意の基、又は前記ＡＰと一体となりＢＰ−ＡＰ−ＮＰの環状構造を形成する基を表す。ｔＲＮＡＰ２は、３´末端においてＯＰ２と共有結合したｔＲＮＡを表す。ＰＰ２はペプチジル基を表す。
【０１７０】
【化７−２】
2019048797.tif 000071
【０１７１】
一般式（７−２）において、ｔＲＮＡＰ２２−ＯＰ２２−ＨＰ２２の構造部分は、一般式（７−１）におけるｔＲＮＡＰ２と同構造を表す。すなわち、ＯＰ２２はｔＲＮＡＰ２の３´末端糖の２´炭素に結合した酸素原子、ＨＰ２２はＯＰ２２に結合した水素原子、ｔＲＮＡＰ２２はｔＲＮＡＰ２からＯＰ２２とＨＰ２２を除いた部分を表す。
その他一般式（７−２）中の記号の意は一般式（７−１）に同じである。
【０１７２】
また、一般式（７−１）又は（７−２）では非天然アミノ酸がαアミノ酸であることを限定していないが、当然、非天然アミノ酸がαアミノ酸であってもよい。その場合には、一般式（７−１）又は（７−２）で表される構造は、一般式（９−１）又は（９−２）で表される。
【０１７３】
【化９−１】
2019048797.tif 000072
【０１７４】
一般式（９−１）において、Ｃα２は前記非天然アミノ酸のα炭素であり、ＲＰ１及びＲＰ２はそれぞれ独立して非天然アミノ酸の側鎖構造を表す（但し、ＲＰ２は水素原子でもよい）。
その他の記号の意は一般式（７−１）に同じである。
【０１７５】
【化９−２】
2019048797.tif 000073
【０１７６】
一般式（９−２）において、ｔＲＮＡｐ２２、ＯＰ２２、及びＨＰ２２は一般式（７−２）と同じ意である。それ以外の記号の意は一般式（９−１）と同じである。
【０１７７】
ｇ工程では、一般式（６）のアミノアシルｔＲＮＡと一般式（７−１）又は（７−２）のペプチジルｔＲＮＡとのペプチジル基転移反応におけるＴＳ最適化計算を行う。
なお、ＴＳ最適化計算の実施形態については、ａ工程で説明した事項を適用することができる。
【０１７８】
（ｈ工程）
ｈ工程では、ｇ工程のＴＳ最適化計算の結果得られる構造が、アミド化反応の遷移状態構造であるか否か確認する。ａ工程のＴＳ最適化計算の結果得られる構造が遷移状態構造であると確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
遷移状態構造であるか否か確認する方法については、ｂ工程での説明をそのまま適用することができる。
【０１７９】
また、本発明は、リボソームによるタンパク質合成系における、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測する方法であって、以下のｉ〜ｋ工程を備える方法にも関する。
【０１８０】
（ｉ工程）
ｉ工程では、ｃ工程と同様に三次元構造データを用意する。三次元構造データの詳細については、ｃ工程で説明した内容をそのまま適用できる。
【０１８１】
ｉ工程においては、以下の条件のとおり、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５）で表される構造を組み込む。
【０１８２】
【化８−１】
2019048797.tif 000074
【０１８３】
一般式（８−１）において、構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分は、段階的アミド化反応の第一段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．５３Å〜１．７７Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．１０Å〜１．３５Å、
Ｈｔ２とＯｔ２の距離は１．３５Å〜１．４５Åである。
その他一般式（８−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じである。
【０１８４】
なお、一般式（８−１）で表される構造として、下記一般式（８−１−１）で表される光学異性体構造のものを使用することもできる。一般式（８−１−１）の記号の意は一般式（８−１）と同じである。
【０１８５】
【化８−１−１】
2019048797.tif 000075
【０１８６】
【化８−２】
2019048797.tif 000076
【０１８７】
一般式（８−２）において、Ｈｔ２２は、段階的アミド化反応の第二段階において、カルボニル酸素であったＯｔ２をプロトン化せしめた水素原子である。
構造Ｃｔ２―Ｏｐ２―Ｈｔ２２―Ｏｔ２部分は、段階的アミド化反応の第二段階の反応遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４５Å〜１．７０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２２の距離は１．０５Å〜１．３０Å、
Ｈｔ２２とＯｔ２の距離は１．１０Å〜１．４０Å、
Ｏｔ２とＣｔ２の距離は１．２２Å〜１．４２Åである。
その他一般式（８−２）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じである。
【０１８８】
【化８−３】
2019048797.tif 000077
【０１８９】
一般式（８−３）において、構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｐ２）部分は４員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．６５Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２４Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．３５Å〜２．４０Å、
Ｏｐ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．８４Åである。
その他一般式（８−３）中の記号の意は一般式（６）、（７−１）に同じである。
【０１９０】
【化８−４】
2019048797.tif 000078
【０１９１】
一般式（８−４）において、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は６員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜２．１０Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２０Å、
Ｃｔ２と  Ｏｐ２の距離は１．３５Å〜２．３０Å、
Ｏｐ２とＨｐ２２の距離は１．００Å〜１．５６Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２の距離は１．００Å〜１．６７Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２の距離は１．２０Å〜１．９６Åである。
その他一般式（８−４）中の記号の意は一般式（６）及び（７−２）に同じである。
【０１９２】
【化８−５】
2019048797.tif 000079
【０１９３】
一般式（８−５）において、Ｈｓ２１―Ｏｓ２−Ｈｓ２２は溶媒水分子の一つであり、構造Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｏｐ２−Ｈｓ２１−Ｏｓ２−Ｈｐ２２−Ｏｐ２２−Ｈｔ２部分は８員環構造を有する協奏的アミド化反応の遷移状態構造における反応中心部であり、
Ｎｔ２とＣｔ２の距離は１．４０Å〜１．７９Å、
Ｎｔ２とＨｔ２の距離は１．００Å〜１．２６Å、
Ｃｔ２とＯｐ２の距離は１．４０Å〜２．２１Å、
Ｏｐ２とＨｓ２１の距離は１．１３Å〜１．４３Å、
Ｈｓ２１とＯｓ２の距離は１．００Å〜１．３７Å、
Ｏｓ２とＨｐ２２の距離は１．３０Å〜１．６９Å、
Ｈｐ２２とＯｐ２２との距離は０．９８Å〜１．２４Å、
Ｏｐ２２とＨｔ２との距離は１．１７Å〜１．７６Åである。
その他一般式（８−５）中の記号の意は一般式（６）、（７−２）に同じである。
【０１９４】
また、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、（８−５）では非天然アミノ酸がαアミノ酸であることを限定していないが、当然、非天然アミノ酸がαアミノ酸であってもよい。その場合には、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、（８−５）で表される構造は、それぞれ一般式（１０−１）、（１０−２）、（１０−３）、（１０−４）、（１０−５）で表される。
【０１９５】
【化１０−１】
2019048797.tif 000080
【０１９６】
一般式（１０−１）において、構造Ｎｔ２（Ｈｔ２）−Ｃｔ２（Ｏｔ２）部分、Ｎｔ２とＣｔ２、Ｎｔ２とＨｔ２、  Ｈｔ２とＯｔ２の距離は一般式（８−１）に同じである。
その他一般式（１０−１）中の記号の意は一般式（６）及び（７−１）に同じである。
【０１９７】
なお、一般式（１０−１）で表される構造については、以下の一般式（１０−１―１）で表される立体異性体構造を用いることができる。なお、一般式（１０−１−１）中の記号の意は一般式（１０−１）に同じである。
【０１９８】
【化１０−１−１】
2019048797.tif 000081
【０１９９】
【化１０−２】
2019048797.tif 000082
【０２００】
一般式（１０−２）において、記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じである。その他一般式（１０−２）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−２）と同じである。
【０２０１】
【化１０−３】
2019048797.tif 000083
【０２０２】
一般式（１０−３）において、記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−１）と同じである。その他一般式（１０−３）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−３）と同じである。
【０２０３】
【化１０−４】
2019048797.tif 000084
【０２０４】
一般式（１０−４）においては、記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じである。その他一般式（１０−４）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−４）と同じである。
【０２０５】
【化１０−５】
2019048797.tif 000085
【０２０６】
一般式（１０−５）においては、記号ＲＰ１、Ｃα２及びＲＰ２の意は一般式（９−２）と同じである。その他一般式（１０−５）中の記号の意、及び原子間距離は一般式（８−５）と同じである。
【０２０７】
（条件３）前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡａ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
【０２０８】
（条件４）前記三次元構造データにおけるＰサイト上のｔＲＮＡの位置に、少なくとも該ｔＲＮＡの３´末端炭素の近傍にｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素の原子座標が位置するように、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５））で表される想定構造を組み込む。
【０２０９】
三次元構造データへの一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）又は（８−５）で表される構造の組み込みについては、ｃ工程で説明した内容をそのまま適用できる。
【０２１０】
（ｊ工程）
ｊ工程では、ｉ工程において得られた構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造としてＴＳ最適化計算を行う工程である。
ｊ工程における分子軌道法による構造最適化計算については、ａ工程及びｄ工程の説明で述べた事項を適用することができる。
【０２１１】
（ｋ工程）
ｋ工程は、前記ｊ工程でのＴＳ最適化計算の結果得られた構造を評価する工程である。すなわち、得られた構造が遷移状態構造であることが確認される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入の適性が高いと判断する。
遷移状態構造であるか否かの確認はｂ工程の説明で述べた事項を適用できる。
【０２１２】
なお、ｋ工程の後に、以下のｋ´工程を含むことが好ましい。
（ｋ´工程）
前記ｋ工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、
その反応中心部を含む環状構造部(一般式（８−４）又は一般式（８−５）で表される構造を組み込む形態にあっては、該一般式のｔＲＮＡＰ２２を含む環状構造を含む）以外の部分の結合軸のねじれ角を、立体障害が発生しない範囲内で調整することにより、ｔＲＮＡａ２の３´末端炭素対応原子とｔＲＮＡＰ２の３´末端炭素対応原子が、それぞれ前記三次元構造データにおけるＡサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とＰサイト上のｔＲＮＡの末端３´炭素とのずれが０．３Å以内で前記三次元構造データにフィッティング可能な場合に、
前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性がより高いと判断する。
【０２１３】
ｋ´工程はｋ工程で遷移状態構造であることが確認された構造が、リボソーム内で取り得る構造であることを確認する工程である。そのため、ｋ´工程を行うことにより、非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性をより精度よく推定することができる。
【０２１４】
（ｌ工程）
サーマス・サーモフィルスのリボソーム中には、２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間が存在する。上述のとおり、リボソームの反応中心の構造は種間の相違が少ないため、サーマス・サーモフィルス以外の種のリボソーム中にも、当該空間に相当する空間が存在する蓋然性は高い。
本発明においては、ｈ〜ｋ工程に加えて、さらに、当該リボソーム中の空間に関する評価を行うｌ工程を備えることが好ましい。
【０２１５】
ｌ工程では、ｊ工程の結果得られた構造が、遷移状態構造であることが確認され、かつ、サーマス・サーモフィルスのリボソーム中の２４５１Ａ、２４５２Ｃ、２５０６Ｕ及び２５８５Ｕにより形成される空間（または、これに相当する空間）に、非天然アミノ酸の側鎖が、立体障害無く収まる場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入の適性が高いと判断する。
【０２１６】
立体障害の有無は、非天然アミノ酸のアミノ酸残基の側鎖と前記空間を形成する塩基との原子間距離を基準に評価する。
【０２１７】
ｌ工程は、同様にリボソーム中の空間に関する評価を行うｋ´工程と組み合わせて実行することが好ましい。これにより、さらに高い精度で非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を評価することができる。
【０２１８】
本発明の好ましい実施の形態では、さらに以下のｍ工程を備える。
【０２１９】
（ｍ工程）
ｍ工程では、前記ｉ工程において一般式（１０−１）で表される構造を組み込み、ｊ工程の結果得られた構造におけるねじれ角∠Ｎｔ２−Ｃｔ２−Ｃα２−ＲＰ１が、０°〜１０８°である場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
【０２２０】
また、一般式（７−１）又は（７−２）中のＡＰ、特にＡＰ中に含まれる非天然アミノ酸の側鎖に親水性原子が存在する場合には、以下のｎ工程を備えることが好ましい。
【０２２１】
（ｎ工程）
ｎ工程では、ｊ工程の結果得られた構造において、前記親水性原子が一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）中のＨｔ２及び／又はＯｔ２と水素結合を形成可能であると推定される場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
水素結合が形成可能か否かは、原子間の距離などに基づき推定することができる。例えば、上述の２原子間の距離が１．６５〜１．８５Åである場合に、該２原子間に水素結合が形成可能であると推定することができる。
【０２２２】
また、本発明においては、リボソームによるタンパク質合成反応系に存在する、リボソームによるペプチジル基転移反応を促進する又は同反応を阻害しないことが確認又は予測される物質がある場合には、当該物質を分子軌道計算の対象に加えることもできる。
すなわち、本発明は以下のｏ〜ｑ工程を備えていてもよい。
【０２２３】
（ｏ工程）
ｏ工程においては、ｉ工程と同様に、三次元構造データを用意し、これに一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される構造を組み込む。そして、上述の物質をリボソーム内のペプチジル基転移反応の反応中心若しくはその周辺に配置する。
【０２２４】
ｏ工程においては配置する物質としては、溶媒である水分子や反応系に存在する各種イオンなどが挙げられる。
水分子を配置する場合には、ペプチジル基転移反応の反応中心やその周辺に２〜８分子、より好ましくは４〜７分子、さらに好ましくは５〜７分子、さらに好ましくは６分子の水分子を配置する。この場合、水分子による水素結合のネットワークが反応中心又はその周辺に形成されるように配置することが好ましい。
【０２２５】
そして、上述した物質をリボソーム内のペプチジル基転移反応の反応中心若しくはその周辺に配置した構造又はその構造の反応中心から遠い部分を計算負荷を軽減させるために適宜省略した構造を初期構造として設定する。
【０２２６】
（ｐ工程）
ｐ工程では、ｏ工程で設定した初期構造について、分子軌道法による構造最適化計算を行う。
【０２２７】
分子軌道法についての詳細は、上記ａ、ｄ、ｊ工程の説明で述べた事項を適用することができる。
【０２２８】
（ｑ工程）
ｑ工程は、前記ｐ工程でのＴＳ最適化計算の結果得られた構造を評価する工程である。すなわち、得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、前記遷移状態構造をとることにより進行するペプチジル基転移反応が前記物質による立体障害で阻害されない場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
遷移状態構造であるか否かの確認はｂ工程の説明で述べた事項を適用できる。
【０２２９】
前記物質にペプチジル基転移反応が前記物質による立体障害で阻害されるか否かの判断は、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される分子と前記物質との間の距離などを指標とすることができる。
【０２３０】
ｑ工程においては、前記物質による立体障害でペプチジル基転移反応が阻害されるか否かを評価したが、前記物質がペプチジル基転移反応を促進し得るか否かを判断するｒ工程を備えていてもよい。ｒ工程は以下に説明するとおりである。
【０２３１】
（ｒ工程）
ｒ工程は、前記ｐ工程でのＴＳ最適化計算の結果得られた構造を評価する工程である。
すなわち、前記ｐ工程の結果得られた構造が遷移状態構造であることが確認され、かつ、一般式（８−１）、（８−２）、（８−３）、（８−４）、又は（８−５）で表される遷移状態最適化構造の分子と、前記物質との間で水素結合を形成可能な場合に、リボソームによるタンパク質合成系における、前記非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性が高いと判断する。
遷移状態構造であるか否かの確認はｂ工程の説明で述べた事項を適用できる。
【０２３２】
また、水素結合が可能か否かの判断は、ｎ工程の説明で述べた内容を適用することができる。
【０２３３】
また、本発明は人工タンパク質の製造方法にも関する。本発明の製造方法は推測工程とタンパク質を製造する工程を有する。
【０２３４】
推測工程は、リボソームによるタンパク質合成系によって、人工タンパク質への導入を検討している非天然アミノ酸の導入適性を評価する工程である。非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測は、上述した本発明の方法により行うことができる。
【０２３５】
次に、タンパク質を製造する工程では、推測工程において前記導入適性が高いと判断された非天然アミノ酸を原料として、リボソームによるタンパク質合成系によりタンパク質を製造する。
【０２３６】
また本発明は、タンパク質又はペプチドの性能の改良方法、生産性又は製造効率の向上方法にも関する。
これらの方法は、上述した実施態様の推測工程とタンパク質又はペプチドの製造工程を備える。
そして、製造工程で製造されたタンパク質又はペプチドの性能または、製造工程におけるタンパク質若しくはペプチドの生産性若しくは製造効率を評価する評価工程を有する。
【０２３７】
また、本発明は、非天然アミノ酸が導入された人工タンパク質製剤のドラッグデザイン方法に応用することができる。
【０２３８】
現在使用されているほとんどの医薬品はリード化合物を最適化することによって開発されている。リード化合物には、ホルモンや伝達物質を含め、植物、微生物、高等生物由来の天然タンパク質やペプチドも含まれる。
【０２３９】
近年ではこれらのリード化合物創薬の分子設計に際し、コンピュータ上で予測する仮想スクリーニング技術が一連の創薬スクリーニング研究において重要な項目を占めている。
その背景にはコンピュータの飛躍的な性能向上に加え、ハイスループットスクリーニングやコンビトナトリアル合成技術によって蓄積される構造活性相関の情報量が飛躍的に増大していることや、ゲノム研究の進展によって標的タンパク質の構造情報が飛躍的に増大していることなどが挙げられる。
【０２４０】
仮想スクリーニングを実現する分子設計技術を大別すると、既知の構造活性相関情報に基づくＬｉｇａｎｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＬＢＤＤ）と、標的タンパク質の立体構造情報を利用するＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（ＳＢＤＤ）の二つが挙げられる。
【０２４１】
特にＳＢＤＤ技術は、複数の薬物が標的タンパク質の活性部位近傍に結合する場合、いずれの薬物もタンパク質と相補的な関係にあるとともに、それぞれの結合過程における自由エネルギー変化量が薬理活性の強弱を表すという知見に基づいている。これは、標的タンパク質とリガンドとの結合状態とその薬理活性値をコンピュータ上で推定するものであり、構造活性相関の先見情報を必要としないにもかかわらず、精度の高い活性値予測を期待することができるという利点を有している。
【０２４２】
一方、共通の部位に結合している薬物間にはその物理化学的パラメータに相同性が見られることに着目した創薬技術であるＬＢＤＤ（重ね合わせ解析や定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）等）では、近似解ではあるが種々の対象系に対して高い正答率を有しており、またＳＢＤＤとは異なって受容体構造（結合モデル）を必要としない利点を有している。
【０２４３】
本発明のドラッグデザイン方法は、このような薬剤の薬効又は副作用の推定技術と組み合わせることを特徴とする。
第一段階において、ＬＢＤＤ及び／又はＳＢＤＤによって、リード化合物であるタンパク質又はペプチドに導入することにより、薬効を向上又は副作用を低減せしめる非天然アミノ酸を選択する。
【０２４４】
具体的にはリード化合物となるタンパク質又はペプチドのファーマコフォア部分へ非天然アミノ酸を導入したときの薬効又は副作用を推定する形態としてもよい。
【０２４５】
第二段階において、上述した本発明の推定方法による推定を行う。すなわち、上述の本発明の推定方法により、リボソームによるタンパク質合成系における、該非天然アミノ酸の前記タンパク質又はペプチドへの導入適性を推測する推測工程を実行する。
【０２４６】
このように、リード化合物創薬の分子設計技術と、本発明の推定方法とを組み合わせることによって、薬効又は副作用の観点とリボソーム合成系による合成可能性の観点から総合的に評価、スクリーニング可能なハイスループットなドラッグデザイン手法を提供することができる。
【実施例】
【０２４７】
以下、本発明が利用する自然法則を見出すに至った過程について詳述する。
【０２４８】
（１）試験の目的
文献（非特許文献６、７）（ＰＤＢ  ４Ｖ５Ｃ）には、リボソームにアミノアシルｔＲＮＡに対応したＲＮＡ及び、ペプチジルｔＲＮＡに対応したＲＮＡが夫々ＡサイトとＰサイトに結合し、更にｍＲＮＡが結合した状態のＸ線解析構造が記載されている（図１、図２）。
【０２４９】
しかしながら当該文献に記載された構造からは、ペプチジル基転移反応の反応機構についての具体的な議論を可能とするような、反応中心の詳細な情報は得られていない。
文献（非特許文献６、７）には図３、図４に示す２通りのＸ線解析構造が記載されている。
図３に示す構造はＰサイト側の末端ペプチジル基が欠けている。図４に示す構造はＰサイト側の末端にフェニルアラニン類似構造のぺプチジル末端類似構造があるが、図中に示されている様に、ＡサイトｔＲＮＡ末端のアミノ基に対してアミド化反応により結合すべきカルボニル基の炭素原子が３．３２Åと離れており、反応遷移状態を形成できる位置にはない。従ってリボソーム上でのアミド化反応の実際の様相を知る情報は得られていない。
【０２５０】
この欠けている構造の補足と、反応基質間の距離の矛盾の解消を合理的に行い、X線解析構造と矛盾しないアミド化反応機構の検討を行った。
【０２５１】
（２）ペプチジル基転移反応機構検討の問題点
Ｘ線解析構造と矛盾しないアミド化反応機構の検討を行うには解決を要する幾つかの問題点がある。
【０２５２】
（２−ａ）アミド化反応の基本となる反応機構の確認
ペプチジル基転移反応は、有機化学反応としてはアミノ基とエステル基によるアミド化反応である。リボソーム上でペプチジル基転移反応が進行する際も、基本的なアミド化反応と同様に反応は進行し、リボソームはこの時の遷移状態構造の形成を促進する構造を取る筈であり、この構造はＸ線解析構造と矛盾しない構造でなければならない。
【０２５３】
基本的なアミド化反応機構の知見としては、Ｏｉｅらにより報告されたアンモニア−ギ酸の段階的及び協奏的アミド化反応の分子軌道計算結果がある（非特許文献８、式１及び２参照）。
しかしながらこの結果は、ＭＮＤＯ法、ＳＴＯ−３Ｇ法、３−２１Ｇ法により得られたものであり、これらの計算法では、巨大なリボソーム上でのアミド化反応機構の検討は不可能である。
この結果を踏襲するも巨大なリボソーム上でのアミド化反応機構の検討には別の手段が必要である。
【０２５４】
【化１２】
2019048797.tif 000086
［式１］
ギ酸とアンモニアのアミド化反応機構（非特許文献８（Ｏｉｅら））
【化１３】
2019048797.tif 000087
［式２］
アミド化反応の遷移状態（非特許文献８（Ｏｉｅら））
【０２５５】
（２−ｂ）アンモニア−ギ酸のアミド化反応遷移状態構造とペプチジル基転移反応との整合
前記Ｏｉｅらにより報告されたアミド化反応遷移状態構造は、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の３種存在し、更にその各々には光学異性等の異性体も存在する。現実に進行しているペプチジル基転移反応と矛盾するものを除外してリボソーム上でのアミド化反応機構の検討をしなければならない。
【０２５６】
（２−ｃ）ペプチジル基転移反応への拡張
（２−ａ）、（２−ｂ）に於けるアミド化反応は単純な分子であるアンモニア−ギ酸のアミド化反応である。これとアミノ酸同士の反応、更にはリボソーム上での実際のペプチジル基転移反応との間に矛盾が無いか検討しなければならない。このためにはアミド化反応をアラニルアラニン等のペプチジル基転移反応へ拡張し、更にリボソーム上での実際のペプチジル基転移反応とできるだけ近い状態でのアミド化反応機構の検討をしなければならない。
【０２５７】
（３）アミド化反応機構の検討と検討結果
（３−ａ）  計算手法の選択
本研究では分子軌道計算にはＭＯＡＣ−ＰＭ３  ｓｅｍｉ−  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ＭＯ  ｍｅｔｈｏｄ：（以下ＭＯＡＣ−ＰＭ３と略す）を使用した。ＭＯＡＣ−ＰＭ３は炭素以外の原子を含む分子の再現性に劣る欠点を有するが以下の特徴を有する。
・多原子数の計算を行うことができる迅速性。
・計算対象構造の拡張への迅速・柔軟な対応力。
・反応中心から離れた広い範囲の構造に対応できる計算能力。
【０２５８】
本研究ではこの特徴を活かしつつ、Ｘ線解析により得られている構造と矛盾しない条件を選択することで上記欠点を克服した。その結果可能になった以下  ３−ｂ）〜３−ｆ）  のアミド化反応機構の検討を行った（計算手法ａ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）。
【０２５９】
（３−ｂ）文献記載遷移状態構造のＭＯＰＡＣ−ＰＭ３による再現
ＯｉｅらはＭＮＤＯ，ＳＴＯ−３Ｇ，３−２１Ｇ  を用いてアンモニアと蟻酸からホルムアミドが生成する反応（式１）を解析し、遷移状態構造を得ている（非特許文献８、式１、式２参照）。この遷移状態構造をＭＯＡＣ−ＰＭ３  により再現できるか検証した。
【０２６０】
まず、ＯｉｅらのＭＮＤＯの結果を初期構造として、ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  Ｗｉｎｍｏｓｔａｒ（ＧＥ）Ｖ４．０２４  ；Ｘ−Ａｂｉｌｉｔｙを用いてＴＳ最適化計算を行い、遷移状態構造；Ｔ１，  Ｔ２，  Ｔ３  の構造を若干の差異はあるものの基本的には再現できる事を確認した（Ｍｅｔｈｏｄ  ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ）。
【０２６１】
（３−ｃ）文献記載構造の検証
（３−ｃ−１）Ｘ線解析構造のアミド化反応部位としての検証
Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎらの非特許文献６に示されたＸ線解析構造の、特にアミド化反応部位であるｔＲＮＡの３´末端構造（図３、図４）と、上記（３−ｂ）の検討で得られた反応遷移状態構造との間に矛盾が無いか検証した。矛盾の有るものは除外し、矛盾の無いもののみを後述の解析に用いた。
【０２６２】
図３の方はＡサイトに結合したｔＲＮＡの３´末端にフェニルアラニン類似構造体がエステル結合の代わりにアミド結合している。Ｐサイトに結合したｔＲＮＡの３´末端にはこのようなフェニルアラニン類似構造体は結合していない。
【０２６３】
一方、図４の方はＡ、Ｐ両サイトにフェニルアラニン類似構造体が結合している。両サイトにフェニルアラニン類似構造体が結合しているのであるから、こちらの構造の方がより実際のアミド化反応遷移状態構造に近いと思われる。しかしながら、図４に示されているように、アミド結合を生成することになるＣ＝ＯはＮと距離が３．３２Åと離れ、また反応遷移状態を形成し易い向きを取っていない。反応遷移状態を形成するには、Ｐサイト側のフェニルアラニン類似構造体の立体配座が大きく変わらなければならず、Ｘ線解析構造と反応遷移状態の立体配座は大きく異なると考えられる。
【０２６４】
一方、図３、図４共にＡサイトのフェニルアラニン類似構造体についてはそのベンゼン環が、５０ｓ  ＲＮＡ  の  ２４５１Ａｄｅｎｉｎｅ−２４５２Ｃｙｔｉｄｉｎｅが形成するポケットに収まっている（図２）。またアミド結合を形成するＮがＰサイト側に向いていることから、反応遷移状態においてもこの立体配座と大きく変わることはないと考えられる。
【０２６５】
以上の結果に基づき、後述のＸ線解析構造にアラニルアラニンの反応遷移状態構造を接続する検討を行う際には、図３のＰサイト側のｔＲＮＡの３´末端の３´Ｏに遷移状態構造のエステル基をそのねじれ角についてＸ線解析構造に依拠せずに接続し、Ａサイト側との接続を検証することとする。
【０２６６】
（３−ｃ−２）  文献記載反応遷移状態構造の検証。
上記（３−ｂ）で得られた、可能性が複数ある反応機構それぞれに対応した反応遷移状態構造の妥当性を検証した。Ｘ線解析構造との矛盾が有った場合は、その遷移状態構造及びその反応機構を検討対象から除外した。
【０２６７】
リボソーム上のペプチジル基転移反応に於けるアミド化反応は、上記（２−ａ）で述べた反応機構の基本部分で共通していると考えられる。アミド化反応の実際の反応機構が段階的アミド化反応機構（Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）であるならば、リボソームのＸ線解析構造は最初の反応工程であるＴ１（式２）の構造と密接に関連していると考えられる。協奏的反応機構（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）であるならばＴ３（式２）の構造とより密接に関連していると考えられる。
【０２６８】
式２で示されたＴ１，Ｔ２及びＴ３の構造と、実際のペプチジル基転移反応と対応させるならば、遷移状態構造中のＮ原子に結合したＨ１ではない２つのＨ原子のどちらかが、ＡサイトのアミノアシルｔＲＮＡの末端アミノ酸のＣα原子（式３のＡ＊）に対応するはずである（式２、式３）。
【０２６９】
［式３］Ｔ１構造の他の候補
【化１４】
2019048797.tif 000088
Ａ＊；Ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｐａｒｔ
Ｐ＊；Ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐａｒｔ
Ｒ＊；ｔＲＮＡ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｔＲＮＡ
【０２７０】
また、遷移状態構造（式３）中のＣ原子に結合したＨ原子は、ＰサイトのペプチジルｔＲＮＡのペプチド末端のｔＲＮＡに結合したアミノ酸のＣα原子（式３中のＰ＊）に対応し、Ｏ２原子に結合したＨ原子はｔＲＮＡの末端糖の３´炭素原子（式３中のＲ＊）に対応するはずである。この式３中のＣ原子に結合したＨ原子とＯ２原子が反転した異性体；Ｔ１´（式３）も遷移状態構造の可能性として存在する。
【０２７１】
式１、式２に於いて、Ｏ２原子に結合したｔＲＮＡの末端糖の３´炭素原子に対応するＨ原子はＯｉｅらによる構造（非特許文献８）ではＴ１とＴ２で向きが反転している。
この構造を実際のペプチジル基転移反応と対応させるならば、Ａ、Ｐ両サイトの２つのｔＲＮＡの相対的な向きがＴ１とＴ２で大きく変わることになる。従って連続的にＴ１→四面体構造；ＴＨＩ→Ｔ２と推移した後にＯ２から先の部分が脱離する現実のペプチジル基転移反応と対応させることが出来ない。代わりにＴ１の構造が、式３のＴ１−２又はＴ１´−２の構造を取れば、この問題は解決される。
【０２７２】
Ｏｉｅらの論文（非特許文献８）に記載されている遷移状態の構造；Ｔ１及びＴ３を初期構造としてＸ−Ａｂｉｌｉｔｙを用いてＭＯＡＣ−ＰＭ３でＴＳ構造を確認し、次いでこのＴ１に於ける結果を初期構造としてＴ１のＣについての光学異性体であるＴ１´、更にはＴ１及びＴ１´のねじれ角；Ｎ−Ｃ−Ｏ２−Ｈを１８０°反転させた構造を初期構造とし同様にＴＳ最適化計算を行った。
【０２７３】
その結果、Ｔ１´については確認されたが、Ｔ１−２、Ｔ１´−２については構造最適化の結果として、夫々Ｔ１及びＴ１´の構造に戻ってしまい、Ｔ１−２とＴ１´−２を確認することができなかった。しかしながらＴ１を初期構造として、アンモニアとギ酸のアミド化反応をアンモニアとギ酸メチルエステルのアミド化反応に拡張したところ、Ｔ１−２及びＴ１´−２の遷移状態構造が得られ、ペプチジル基転移反応により近い状態での遷移状態の確認をすることができた（式４）。
【０２７４】
【化１５】
2019048797.tif 000089
［式４］ＭＯＰＡＣ−ＰＭ３により確認したＴ１最適化構造
【０２７５】
前記の確認された遷移状態Ｔ３の構造（式２）、更に、Ｔ１の構造から作成された前記Ｔ１−２とＴ１´−２の構造を前記Ｘ線解析構造の図３の構造のＰサイトのｔＲＮＡ  の末端糖の３´Ｃ原子に接続させた。３´Ｃ原子と３´Ｏ原子の夫々に、対応するＴ１−２、Ｔ１´−２のメチルの炭素原子、Ｏ２原子を重ね合わせて、ねじれ角；Ｎ−Ｃ−Ｏ２−３´Ｃ、及びＣ−Ｏ２−３´Ｃ−２´Ｃを種々の角度に回転させて検討した。その結果、Ｔ１構造のＮ原子とこれに結合すべき原子である、ＡサイトのｔＲＮＡの末端に結合しているフェニルアラニン類似構造のＣαに対応した炭素原子との距離は、Ｔ１´−２の場合のみ１．７３Åまで接近した構造を取り得ることが判明した（図５）。
【０２７６】
この構造であれば、ｔＲＮＡの末端の構造の微調整で、Ｘ線解析構造と矛盾しない構造が存在しうる可能性が示された。
Ｔ１−２についての同様な検討に於いては、Ｔ１−２構造中のＣ原子と結合したＨ原子とＰサイトｔＲＮＡの末端糖の２´Ｏ原子との立体障害により、Ｘ線解析構造と矛盾しないＡサイトのアミノアシルｔＲＮＡとのＴ１遷移状態構造を取り得ないことが判明した。
【０２７７】
同様に、Ｔ３及びその光学異性体について、Ｏ１原子をＰサトのｔＲＮＡの末端糖の３´Ｃ原子に上記Ｔ１−２、Ｔ１´−２と同様に接続してねじれ角Ｎ−Ｃ−Ｏ１−３´Ｃ及び、Ｃ−Ｏ１−３´Ｃ−２´Ｃを種々の角度に回転させて検証した。その結果、Ｔ３構造のＮ原子とこれに結合すべき原子であるＣαに対応した炭素原子との距離は、２．１７Åよりも近い距離を取り得ないことが判明した（図６）。またこの時Ｈ１原子とＡサイトｔＲＮＡの末端糖の２´Ｏ原子間の距離は１．５４Åしか無くこの立体障害を避けると、更に上記原子間距離が２．１７Åよりも大きくなることから、Ｘ線解析構造と矛盾しないＴ３構造は取り得ないことが判明した。
【０２７８】
Ｔ３のＣ原子の立体配置が反転した光学異性体についても全く同じ議論による結論が得られる。
このことから、Ｔ３を遷移状態構造とするｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍを、リボソーム上でのアミド化反応の検証からは除外することとする。
以上から、以降のＭＯＡＣ−ＰＭ３による、リボソーム上でのペプチジル基転移反応機構の検討を、段階的反応機構に於ける遷移状態構造  Ｔ１´−２  に的を絞って行った（式５）。
【０２７９】
［式５］
【化１６】
2019048797.tif 000090
【０２８０】
（３−ｄ）遷移状態Ｔ１´−２の  ＡｌａｎｙｌＡｌａｎｉｎｅ生成反応への拡張
（３−ｃ−２）の検討で絞られた遷移状態構造としてＴ１´−２構造（Ｆｉｇ．３−２）が得られた。この構造を元にＭＯＡＣ−  ＰＭ３  による計算でアミド化反応をアンモニア−ギ酸  からアミノ酸同士の反応へと拡張する際に矛盾が生じないか検討した。立体障害等の矛盾が生じた構造や立体配座については、検討対象から除外した。
【０２８１】
遷移状態Ｔ１´−２構造に於けるアンモニアをアラニンメチルエステルのアミノ基、ギ酸メチルエステルをアセチルアラニンメチルエステルとしたアミド化反応によるＡｌａｎｙｌ−ａｌａｎｉｎｅ  生成反応を検討した。検討にあたっては、リボソーム上での実際の反応場をできるだけ考慮して、以下（３−ｄ−１）〜（３−ｄ−３）の前提を置いて、ＴＳ最適化計算の初期構造を構築した（式６、式７、計算手法ａ，ｃ参照）。
【０２８２】
【化１７】
2019048797.tif 000091
［式６］Ｔ１´−２  構造からアラニルアラニンへの拡張
（Ｔ１´−２構造は式７を参照）
【０２８３】
（３−ｄ−１）アミンの置換基の置換位置には式７に示す２通り；Ａｓ１、Ａｓ２の可能性が考えられる。
【化１８】
2019048797.tif 000092
［式７］Ａ（ｔＲＮＡのアミノアシル部）の可能な置換位置
【０２８４】
（３−ｄ−２）Ｐサイトのペプチジル基に対応したアラニンメチルエステルはＸ線解析構造のデータが無いので、そのＣαのコンフォメーションを出来るだけ網羅的に検討するために、式８のＴ１´−２の構造におけるねじれ角；ＮＣ＊ＣαＣβを０°―１０８°、１０８°―２３５°、２３５°―３６０°のカテゴリーに分け、その各カテゴリーの代表として、５４°；Ｐｓ１、１７１°；Ｐｓ２、２９７°；Ｐｓ３をＣαのコンフォメーションの初期構造とした（式８）。
（ねじれ角  Ｎ−Ｃ＊−Ｃα−Ｃβ＝１０８°の時  ねじれ角Ｏ１−Ｃ＊−Ｃα−Ｃβ＝０°，ねじれ角Ｎ−Ｃ＊−Ｃα−Ｃ−β＝２３５°の時  ねじれ角Ｏ２−Ｃ＊−Ｃα−Ｃβ＝０°に夫々対応している。）
【化１９】
2019048797.tif 000093
［式８］可能なＰ（ペプチジル部）のＣαにおけるコンフォメーション
【０２８５】
（３−ｄ−３）ＡサイトのアミノアシルｔＲＮＡのアミノ酸に対応したアラニンメチルエステルのＣαのコンフォメーションは、ｔＲＮＡの末端に結合しているフェニルアラニン類似構造のＸ線解析構造のデータが有るので、これを参考にする（式９）。
【化２０】
2019048797.tif 000094
［式９］ＡのＣαコンフォメーション
【０２８６】
前記（３−ｄ−１）〜（３−ｄ−３）の前提で得られた６通り；Ａｓ１Ｐｓ１、Ａｓ１Ｐｓ２、Ａｓ１Ｐｓ３、Ａｓ２Ｐｓ１、Ａｓ２Ｐｓ２、Ａｓ２Ｐｓ３の初期構造を得た。そのうちのＡｓ１Ｐｓ１を図７に示す。
６通りの初期構造を基にＴＳ  構造の最適化計算を行い夫々に対応する遷移状態造；図８〜１３を得た（計算手法ａ、ｃ、ｅ、ｆ参照）。
【０２８７】
（４）リボソーム上での遷移状態Ｔ１の検討
（４−ａ）前記（３−ｄ）の検討によりアミド化反応によるアラニルアラニン生成反応の遷移状態構造が得られた。この結果を用い、リボソーム上での実際のペプチジル基転移反応に於けるアミド化反応機構の検討を行った。
【０２８８】
アラニルアラニンの反応遷移状態構造を、Ｘ線解析構造のＡ、Ｐ両サイトの３´末端に組み込んだ。この構造の反応中心部を除いた部分の、構造最適化計算を行い、反応中心部周辺近傍の構造の歪を除いた。得られた最適化構造を初期構造として、遷移状態構造を求めた（計算手法ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ）。
【０２８９】
（４−ａ−１）リボソーム分子は巨大であり、このリボソーム上でのアミド化反応の遷移筐体構造をそのまま計算で求めるのは不可能である。反応の真の様相をできるだけ損なわずに再現するには、反応遷移状態構造の周辺の出来るだけ広く且つ計算が可能な範囲を取り出し、最適化計算の際に周辺構造が発散してしまわないような適度な拘束を掛ける等の工夫が必要である。
【０２９０】
本研究では、上記（３−ｄ）の検討により得られたアラニルアラニン生成反応の遷移状態構造をリボソームに組み込むための土台として、以下の構造を作成した。
Ｘ線解析構造中のＡ、Ｐ両サイトに結合したｔＲＮＡのアミド化反応中心に最も近いリン酸エステルから反応中心の反対側の構造部分を削除し、残った２つのリン酸エステル部分の間に１０個のメチレン基を挿入して架橋する（計算手法ｃ）。
【０２９１】
さらにこの架橋構造に対して構造最適化計算（計算手法ｄ）を架橋構造部分以外を固定した状態で行う。最適化計算後の結果を図１４に示す。
なお、上記メチレン基を挿入せずに（４−ａ−３）の構造最適化計算を行うと、構造が発散してしまい、最適化構造は得られない。
【０２９２】
（４−ａ−２）前記（３−ｄ）の検討で得られたアミド化反応の６個のＴＳ最適化構造；図８〜１３の夫々の構造部分；−Ｏ＊−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）Ｈ−ＮＨ−−Ｃ（＝Ｏ１）Ｏ２−を上記（４−ａ−１）の構造（図１４）の対応部分に組み込み、フェニルアラニン類似構造部分を削除する（Ｆｉｇ．  ４−２−（ａ））。
【０２９３】
組み込みは、Ｏ２原子とＰサイト側  Ｃ３´原子と接続し、Ｃ３´−Ｏ２及び、Ｏ２−Ｃ結合のねじれ角度を調整し、Ｏ＊原子とＡサイト側Ｃ３´原子との距離が最短になった構造で、Ｏ＊−Ｃ３´間にボンドを形成させ（図１５（ｂ）中の黄色破線で示した部分）て行う。この構造を計算機負荷を考慮してＴＳ部分以外を最適化するための初期構造に用いる（図１５（ｂ））。
【０２９４】
（４−ａ−３）アミド化反応中心、リン酸エステル部分、架橋部分の構造を固定して（図１５（ｂ）中の桃色で示した部分）、それ以外の部分をフリーにして構造最適化計算を行う（計算手法ｄ、図１５（ｂ）→（ｃ））。
【０２９５】
（４−ａ−４）上記（４−ａ−３）で得られた構造からメチレン架橋部分を削除し、後のＴＳ最適化計算の際の計算機の負荷を軽減するために、ｔＲＮＡの塩基部分、Ａサイトのリン酸エステル部分を削除し、この構造をＴＳ最適化計算の初期構造とする（図１５（ｃ））。
【０２９６】
以上の操作により、上記（３−ｄ）の操作で得られた６通りの遷移状態構造；図８〜１３から夫々に対応するリボソームでのＴＳ最適化計算に用いる初期構造が得られた。そのうちの構造Ａｓ２Ｐｓ１において得られた初期構造を図１６に示す。
【０２９７】
（４−ｂ）リボソーム上でのＴＳ最適化計算結果の検証と考察
前記（４−ａ）で得られた初期構造を用いＴＳ最適化計算を行い（計算手法ａ、ｃ、ｅ、ｆ参照）、Ｘ線解析構造とほぼ矛盾しないリボソーム上のアミド化反応；アラニルアラニンの生成反応の遷移状態構造；図１７〜２２  を得た。
【０２９８】
これらの遷移状態構造の夫々を反応部位近傍のＸ線解析構造とを重ね合わせて見ると（図２３〜２８）、Ａサイトでの２種類のＣα−Ｎ結合（Ａｓ１、Ａｓ２）のうち、Ａｓ１構造（Ａｓ１Ｐｓ１、Ａｓ１Ｐｓ２、Ａｓ１Ｐｓ３）は、Ａサイト側のアミノアシル末端の立体配置がＸ線解析構造のアミノアシル末端のフェニルアラニン類似構造のＣα，Ｃβ対応位置と大きく異なっている（図２３）。一方、Ａｓ２構造（Ａｓ２Ｐｓ１，Ａｓ２Ｐｓ２，Ａｓ２Ｐｓ３）では良く一致している（図２６）。
【０２９９】
また、Ｐサイト側の立体構造；Ｐｓ１，Ｐｓ２，Ｐｓ３のうちＰｓ２ではペプチジル基転移反応におけるペプチド鎖の伸長方向が逆方向に向いており、Ａ、Ｐ両サイトに結合したｔＲＮＡの間に入り込んでしまうため、Ｐｓ２構造を取る可能性は低いと考えられる（図２４、２７）。
【０３００】
これらの結果から、実際のペプチジル基転移反応の遷移状態は、Ａｓ２Ｐｓ１又はＡｓ２Ｐｓ３の構造である可能性が高いことが示唆される（図２６、２８）。
【０３０１】
さらに、遷移状態構造のアミデーション反応部位は、Ｘ線解析構造におけるリボソーム分子の中で最も近い距離にある２４５１Ａｄｅｎｉｎｅ（５０ＳリボソームＡ鎖２４５１のアデニン）と水素結合可能な距離を取り得ないことが判明したので（図２３〜２８）、２４５１Ａｄｅｎｉｎｅのアミデーション反応への直接的な関与（反応部位原子への水素結合）は無いと思われる。
【０３０２】
その代わりに、Ｘ線解析構造のアミノアシル末端のフェニルアラニン類似構造における側鎖のベンゼン環周辺の構造とを考え合わせると、２４５１Ａｄｅｎｉｎｅは２４５２Ｃｙｔｉｄｉｎｅ（５０ＳリボソームＡ鎖２４５２のシチジン）と共に、Ａサイトに結合したアミノアシルｔＲＮＡの末端アミノ酸の側鎖が「鍵と鍵穴」のような厳密ではなく緩やかに収まるポケットを構成している。
【０３０３】
一方、Ｐサイトに結合したアミノアシルｔＲＮＡの末端アミノ酸の側鎖が収まるポケットに相当する構造はＸ線解析構造中には見られない。このことがリボソームという一つの酵素が２０種のアミノ酸（天然アミノ酸の場合）の反応に対応できるという特異な選択性を有するメカニズムと関わりが有る可能性が考えられる。
【０３０４】
（４−ｃ）溶媒水分子の影響の検証
アミド化反応中心周辺は広い空間が存在するが、この空間の中で、溶媒の水が反応に深く関わっている可能性がある。
このことを確認するために、可能性が高いと示唆された立体配座Ａｓ２Ｐｓ１の初期構造；図２０に、非特許文献９を参考にして、反応中心及びその周辺の親水性原子の周辺に水を６分子配置した（図２９）。これを初期構造としてＴＳ最適化計算を行い、水分子の存在下でのＴＳ構造を得た（図３０）。
【０３０５】
図３０の構造をＸ線解析構造と重ね合わせて見ると（図３１）、水分子を加えなかった図２６よりもＸ線解析構造との差異が殆ど僅かしか無い程の良い一致が見られた。
【０３０６】
さらに、図３１に示されているように、反応部位の窒素原子に結合している水素原子に水素結合している水分子が前記２４５１ＡｄｅｎｉｎｅのＮ３原子と水素結合が可能な位置に存在しており、２４５１Ａｄｅｎｉｎｅが水分子との水素結合を介してアミド化反応に関与している可能性が示された。
【０３０７】
図２９のＴＳ最適化計算の初期構造に於ける水分子の水素結合ネットワーク配置は他の可能性も多数存在するが、反応中心及びその周辺の親水性原子への水素結合の制約から、得られる計算結果のＴＳ構造間には大きな差異は見られない。このことから溶媒水分子の存在下でのアミド化反応の遷移状態の真の様相は図３０と大きく異なることは無いと思われる。
【０３０８】
（５）まとめ
本研究により、リボソーム上におけるペプチジル基転移反応（アミド化反応）においてアミノアシルｔＲＮＡとペプチジルｔＲＮＡがとる遷移状態構造の様相が明らかとなった。
すなわち、アミノアシルｔＲＮＡとペプチジルｔＲＮＡは遷移状態において、Ａｓ２Ｐｓ１構造（図２６、水分子の存在下においては図３０）をとっている可能性が非常に高い。
【０３０９】
つまり、天然アミノ酸により構成されるタンパク質は、リボソーム上でＡｓ２Ｐｓ１構造の遷移状態をとるペプチジル基転移反応により合成されているといえる。これを言い換えれば、非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡとペプチジルｔＲＮＡがリボソーム上でＡｓ２Ｐｓ１構造の遷移状態をとり得るのであれば、リボソーム合成系によって非天然アミノ酸をタンパク質に導入することも可能であるということができる。
【０３１０】
したがって、タンパク質への導入を検討している非天然アミノ酸のアミノアシルｔＲＮＡと、ペプチジルｔＲＮＡとのペプチジル基転移反応についてＴＳ最適化計算を行い、これがＡｓ２Ｐｓ１構造の遷移状態をとるか否かを判断することによって、リボソーム合成系による同非天然アミノ酸のタンパク質への導入適性を推測することができる。
【０３１１】
（６）計算方法
（ａ）  すべての計算はＴＯＳＨＩＢＡ  ｄｙｎａｂｏｏｋ  Ｒ７３１  ／  ３７Ｃ
コンピュータで行った。
【０３１２】
（ｂ）  ＭＯＡＣ−ＰＭ３による計算に必要な座標データは全てＰＤＢから入手した。計算結果の視覚化にはグラフィックインタフェース；ＲＡＳＭＯＬを使用した。
【０３１３】
（ｃ）  ＭＯＡＰＣ−ＰＭ３半経験的ＭＯ法は、Ｗｉｎｍｏｓｔａｒ（ＧＥ）Ｖ４．０２４（Ｘ−Ａｂｉｌｉｔｙ）の計算パッケージで遂行した。計算に必要な初期構造は、ＰＤＢのデータを基にＷｉｎｍｏｓｔａｒの視覚化とマニュアル機能で作成した。その過程で、構造中に立体障害が発生した場合は、Ｗｉｎｍｏｓｔａｒのアプリケーションに含まれるＭＭ２法により最適化した。
【０３１４】
（ｄ）  デフォルトの分子構造の最適化には、Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｏｕｔｉｎｅを使用した。
ＭＯＰＡＣキーワード；ＰＭ３  ＥＦ  ＰＲＥＣＩＳＥ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＭＭＯＫ
【０３１５】
（ｅ）  遷移状態のエネルギーの最適化は、ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｎｏｒｍ  が０．０５ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ  未満に達成されるまで行った。
ＭＯＰＡＣキーワード；ＰＭ３  ＴＳ  ＰＲＥＣＩＳＥ  ＭＭＯＫ
溶媒の影響を考慮しなかったが、別途水分子水素結合ネットワークを加えた最適化計算を行った。
【０３１６】
（ｆ）  ＴＳ最適化計算の後、遷移状態の確認は、振動計算で１つの負の振動数しか無いことにより確認した。
【産業上の利用可能性】
【０３１７】
本発明は非天然アミノ酸のアミノ酸残基を含む人工タンパク質の設計に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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