(57)【要約】【課題】コンジュゲーションのためのＣＨＯ細胞培養物からの抗体の調製を提供すること。【解決手段】ＣＨＯ細胞酸化酵素、特に、ＱＳＯＸ１が、一見すると厳しい抗体精製プロセス後に残存して、その後の抗体と薬物のコンジュゲーション効率を低下させる可能性があるという知見に一部基づく。酸化酵素が精製手順後に残存するかどうかは、どの精製技法を使用するかに左右され、これは、１つの抗体と別の抗体で変動し得る。ＣＨＯ細胞酸化酵素による夾雑がその後のコンジュゲーションに関する潜在的な問題であるという知見を用いて、ＣＨＯ酸化酵素（複数可）を排除するまたは少なくとも許容されるレベルまで低下させる適切な精製スキームを任意の抗体に対して考案することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年１１月２５日に出願された米国仮出願第６１／９０８，５６８号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表
３１００−００１１１ＰＣ−ＳＴ２５．ｔｘｔと指定された、２０１４年１１月２１日に作成された１１ＫＢの配列表が、参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
数百の臨床試験の後、これまでに約３０種のモノクローナル抗体が、がん、自己免疫疾患および感染性因子を含めた種々の適応症の処置に関してＦＤＡにより認可されてきた。多くの抗体が認可されていない１つの理由は、エフェクター機能または遮断性受容体−リガンド相互作用などの、抗体単独によりもたらされる作用の機構が実質的な治療効果を有するには十分に強力でない場合があることである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）により、付加的な機構、特に、抗体とカップリングした毒性部分の細胞内部への送達がもたらされ、それにより、細胞が死滅し、またはそうでなければその増殖を阻害する。現在、ＡＤＣはブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）およびトラスツズマブエムタンシン（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）の２種が販売されている。多くの他のＡＤＣが種々の開発段階にある。ＡＤＣの生成には、抗体の発現および精製、その後、通常はリンカーを介した抗体と薬物の化学的コンジュゲーションが伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
定義
単離された抗体またはＡＤＣは、一般には、その生成または精製により生じる干渉タンパク質および他の夾雑物から少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であるが、モノクローナル抗体に、その使用を容易にするのに意図される薬学的に許容される担体（複数可）または他のビヒクルを過剰量で組み合わせる可能性は排除されない。時には、モノクローナル抗体またはＡＤＣは、生成または精製に由来する干渉タンパク質および夾雑物から少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５または９９％ｗ／ｗ純粋である。
【０００５】
モノクローナル抗体単独の、またはＡＤＣの成分としての、その標的抗原への特異的結合とは、親和性が少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１であることを意味する。特異的結合は、少なくとも１つの無関係の標的に対して生じる非特異的結合よりも検出可能に大きく、かつそれと区別可能である。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成または特定の空間的な適合（例えば、錠と鍵の型）の結果であり得るが、一方、非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合とは、必ずしもモノクローナル抗体がただ１つの標的のみに結合することを意味するものではない。
【０００６】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の対を２つ含み、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は最初、切断可能なシグナルペプチドと連結して発現する。シグナルペプチドを伴わない可変領域は、時には、成熟可変領域と称される。したがって、例えば、軽鎖成熟可変領域とは、軽鎖シグナルペプチドを伴わない軽鎖可変領域である。各鎖のカルボキシ末端部分により定常領域が定義される。重鎖定常領域は、エフェクター機能に主に関与する。
【０００７】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これにより抗体のアイソタイプが、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖の中で、可変領域および定常領域は約１２個またはそれ超のアミノ酸の「Ｊ」領域によってつながっており、重鎖は約１０個またはそれ超のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（一般に、全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、第７章を参照されたい）。
【０００８】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域が抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は結合部位を２つ有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によってつながった、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖由来のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列し、それにより、特異的なエピトープに結合することが可能になる。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖はどちらも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９８７年および１９９１年）、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従う。Ｋａｂａｔは、広く使用されている番号付け慣習（Ｋａｂａｔ番号付け）も提供し、それによると、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基に同じ数字が割り当てられる。
【０００９】
「抗体」という用語は、インタクトな抗体およびその結合性断片を含む。一般には、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｄａｂ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、およびＦｖを含めた抗体断片は、それらが由来するインタクトな抗体と、標的への特異的結合について競合する。断片は、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的または化学的分離によって生成することができる。「抗体」という用語は、ダイアボディ（ホモ二量体Ｆｖ断片）またはミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（ＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３）、二重特異性抗体なども含む。二特異性抗体または二機能性抗体は２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である（例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９巻：３１５〜３２１頁（１９９０年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：１５４７〜５３頁（１９９２年）を参照されたい）。「抗体」という用語は、抗体単独（ネイキッド抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））または細胞傷害薬もしくは細胞増殖抑制薬とコンジュゲートした抗体を含む。
【００１０】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、１種または複数種のタンパク質の三次元フォールディングによって並べられた連続したアミノ酸または連続していないアミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸で形成されたエピトープは、一般には、変性溶媒に曝露した際に保持されるが、三次元フォールディングによって形成されたエピトープは、一般には、変性溶媒を用いて処理すると失われる。エピトープは、一般には、独特の空間的コンフォメーションにある少なくとも３アミノ酸、より通常には、少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ編、（１９９６年）を参照されたい。
【００１１】
同じまたは重複するエピトープを認識する抗体を、１つの抗体の、標的抗原への別の抗体の結合と競合する能力を示す単純なイムノアッセイで同定することができる。抗体のエピトープを、その抗原と結合した抗体のＸ線結晶構造解析によって定義して、接触残基を同定することもできる。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低下させるまたは排除する、抗原における全アミノ酸変異の全てにより、他方の結合が低下するまたは排除される場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低下させるまたは排除するアミノ酸変異の一部によって他方の結合が低下するまたは排除される場合、重複するエピトープを有する。
【００１２】
抗体間の競合は、試験される抗体により、共通の抗原への参照抗体の特異的結合が阻害されるアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０巻：１４９５頁、１９９０年を参照されたい）。競合結合アッセイにおいて測定して、過剰量の試験抗体（例えば、少なくとも２×、５×、１０×、２０×または１００×）により、参照抗体の結合が少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％または９９％阻害される場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および参照抗体が結合したエピトープに対して立体障害が生じるのに十分に近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。
【００１３】
「患者」という用語は、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の被験体を含む。
【００１４】
アミノ酸置換を保存的なものか非保存的なものかに分類する目的のために、アミノ酸を、以下の通り群分けする：Ｉ群（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；ＩＩ群（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；ＩＩＩ群（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；ＩＶ群（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｖ群（鎖の方向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびＶＩ群（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を伴う。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のもののメンバーの交換を構成する。
【００１５】
配列同一性の百分率は、Ｋａｂａｔ番号付け慣習によって最大限に整列した抗体配列によって決定される。整列後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）を参照抗体の同じ領域と比較すると、対象抗体領域と参照抗体領域の間の配列同一性の百分率は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方を同じアミノ酸が占める位置の数を、ギャップは計数せずに２つの領域の整列した位置の総数で割り、１００を掛けて百分率に変換したものである。
【００１６】
１つまたは複数の記載された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を含む組成物は、抗体を単独で含有してもよく、他の成分と組み合わせて含有してもよい。
【００１７】
値の範囲の指定は、範囲内または範囲を画定する全ての整数を含む。
【００１８】
抗体エフェクター機能とは、ＩｇのＦｃドメイン（複数可）が寄与する機能を指す。そのような機能は、例えば、抗体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用または補体依存性細胞傷害であり得る。そのような機能は、例えば、食作用活性または溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体へのＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によって、または補体系の成分へのＦｃエフェクタードメイン（複数可）の結合によってもたらされ得る。一般には、Ｆｃ−結合性細胞または補体成分によって媒介される作用（複数可）により、標的化された細胞の阻害および／または枯渇がもたらされる。抗体のＦｃ領域により、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）発現細胞が動員され、それらが抗体で覆われた標的細胞と並列する。ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ６４）を含めた、ＩｇＧに対する表面ＦｃＲを発現する細胞は、ＩｇＧで覆われた細胞を破壊するためのエフェクター細胞としての機能を果たし得る。そのようなエフェクター細胞としては、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球および好酸球が挙げられる。ＩｇＧがＦｃγＲと会合することにより、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）が活性化される。ＡＤＣＣは、ＣＤ１６＋エフェクター細胞により、メンブレン孔形成タンパク質およびプロテアーゼの分泌を通じて媒介され、一方、食作用は、ＣＤ３２＋およびＣＤ６４＋エフェクター細胞によって媒介される（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｐａｕｌ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｎ．Ｙ．、１９９７年、第３章、第１７章および第３０章；Ｕｃｈｉｄａら、２００４年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９巻：１６５９〜６９頁；Ａｋｅｗａｎｌｏｐら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１巻：４０６１〜６５頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９９年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ．  ５３巻：１９９〜２０７頁を参照されたい）。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰに加えて、細胞に結合した抗体のＦｃ領域は、補体古典経路を活性化して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）も引き出し得る。補体系のＣ１ｑは、抗原と複合体を形成している場合、抗体のＦｃ領域と結合する。Ｃ１ｑと細胞に結合した抗体の結合により、Ｃ３転換酵素が生じるＣ４およびＣ２のタンパク質分解性の活性化を伴う事象のカスケードが開始され得る。Ｃ３転換酵素によるＣ３からＣ３ｂへの切断により、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９を含めた終末補体成分の活性化が可能になる。集合的に、これらのタンパク質は、抗体に覆われた細胞上にメンブレン侵襲複合体孔を形成する。これらの孔により細胞膜完全性が破壊され、標的細胞が死滅する（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６版、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．  Ｙ．、２００５年、第２章を参照されたい）。
【００１９】
「抗体依存性細胞傷害」またはＡＤＣＣという用語は、抗体に覆われた標的細胞と溶解活性を保有する免疫細胞（エフェクター細胞とも称される）の相互作用に依存する、細胞死を誘導するための機構である。そのようなエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージおよび好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、標的細胞にそれらの抗原結合部位を介して結合したＩｇのＦｃエフェクタードメイン（複数可）に付着する。抗体に覆われた標的細胞の死滅は、エフェクター細胞活性の結果として起こる。
【００２０】
「抗体依存性細胞食作用」またはＡＤＣＰという用語は、抗体に覆われた細胞が、ＩｇのＦｃエフェクタードメイン（複数可）に結合する食作用性免疫細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）によって全体的にまたは部分的に内部移行するプロセスを指す。
【００２１】
「補体依存性細胞傷害」またはＣＤＣという用語は、標的に結合した抗体のＦｃエフェクタードメイン（複数可）により一連の酵素反応が活性化され、結果的に標的細胞膜に穴が形成される、細胞死を誘導するための機構を指す。一般には、抗体に覆われた標的細胞上のものなどの抗原抗体複合体が補体成分Ｃ１ｑに結合し、それを活性化し、それにより今度は補体カスケードが活性化され、それにより標的細胞死がもたらされる。補体の活性化により、白血球上の補体受容体（例えば、ＣＲ３）への結合によりＡＤＣＣを促進する、標的細胞表面への補体成分の沈着ももたらされ得る。
【００２２】
「細胞傷害効果」とは、標的細胞の枯渇、排除および／または死滅を指す。「細胞傷害性薬剤」とは、細胞に対する細胞傷害効果を有する薬剤を指す。細胞傷害性薬剤は、抗体とコンジュゲートすることもでき、抗体と組み合わせて投与することもできる。
【００２３】
「細胞増殖抑制効果」とは、細胞増殖の阻害を指す。「細胞増殖抑制剤」とは、細胞に対する細胞増殖抑制効果を有し、それにより、細胞の特定のサブセットの成長および／または増大を阻害する薬剤を指す。細胞増殖抑制剤は、抗体とコンジュゲートすることもでき、抗体と組み合わせて投与することもできる。
【００２４】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦もしくは州政府の規制当局により認可されたもしくは認可され得る、または米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。「薬学的に適合性の成分」という用語は、抗体またはＡＤＣを組み合わせる、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【００２５】
「薬学的に許容される塩」という句は、抗体もしくはそのコンジュゲートまたは抗体と一緒に投与される薬剤の薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２ヒドロキシ３ナフトエート））が挙げられる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子の包含を伴い得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化する任意の有機部分または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に荷電原子を２つ以上有し得る。多数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部になっている例は、多数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つもしくは複数の荷電原子および／または１つもしくは複数の対イオンを有し得る。
【００２６】
ＣＨＯ細胞とは、チャイニーズハムスター卵巣細胞を指し、例えば、ＤＧ４４、Ｄｘｂ１１、ＣＨＯ−Ｋ、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｓを含めた種々の株を含む。
【００２７】
「薬物負荷量（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄ）」または「コンジュゲーション比」という句は、ＡＤＣ溶液もしくは組成物または反応混合物中の抗体当たりの薬物の平均数を指す。
【００２８】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、明示された値の標準偏差の範囲内の値を包含する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
（ａ）精製スキームの精製ステップを少なくとも１つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を、前記抗体を発現するＣＨＯ細胞の培養物から得るステップと、
（ｂ）前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、ステップ（ａ）と（ｂ）を、異なる精製ステップを用いて繰り返すステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記調製物中に許容されるレベルのＣＨＯ細胞酸化酵素が存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、同じ培養物または前記抗体を発現するＣＨＯ細胞の第２の培養物に対して、検出されるＣＨＯ細胞酸化酵素が許容されるレベルになるまたはＣＨＯ細胞酸化酵素が検出されなくなる精製ステップを少なくとも１つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を得るステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記少なくとも部分的に精製された抗体を、１つまたは複数のスルフヒドリル基を介して薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップ（ｅ）をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＣＨＯ細胞酸化酵素がＱＳＯＸ１である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
ステップ（ｄ）の前記第２の培養物がステップ（ａ）の前記培養物よりも体積が大きい培養物である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ｄ）の前記第２の培養物の体積が、ステップ（ａ）の培養物よりも少なくとも１０００倍大きい、項目４に記載の方法。
（項目６）
ステップ（ｄ）および（ｅ）を、前記抗体の異なる培養物に対して少なくとも１年の期間にわたって複数回実施する、項目２に記載の方法。
（項目７）
検出される酵素が許容されるレベルになるまたは酵素が検出されなくなる前記精製スキームが、１５０〜５００ｍＭのＮａＣｌの濃度での塩洗浄を用いてプロテインＡカラムを洗浄するステップ、深層濾過を使用するステップ、第四級アンモニウムイオンカラムを用いた陰イオン交換を使用するステップ、またはフェニルメンブレン濾過を使用するステップの少なくとも１つを含む、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記試験するステップが、ゲル上の６５ｋＤａ〜７５ｋＤａのバンドを同定するステップを含む、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記バンドをウェスタンブロットまたは銀染色によって同定する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記試験するステップが、ＱＳＯＸ１活性についての機能試験を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記機能試験により、前記活性の指標として過酸化水素が生成される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記活性が亜鉛イオンによって阻害され、その阻害がＥＤＴＡによって逆転される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記抗体がブレンツキシマブではない、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
細胞傷害性薬物が、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、化学療法感作物質およびピロロベンゾジアゼピン二量体から選択される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
ＣＨＯ細胞培養物から抗体を精製するための方法を決定する方法であって、
（ａ）精製方法を実施して、抗体を発現するＣＨＯ細胞の培養物から前記抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を得るステップと、
（ｂ）前記調製物をＣＨＯ酵素ＱＳＯＸ１の存在について試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、ステップ（ａ）と（ｂ）を、異なる精製方法を用いて繰り返すステップと
を含む、方法。
（項目１６）
コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
プロテインＡカラムを２５〜１００ｍＭのＮａＣｌの濃度で洗浄するステップ、深層濾過を使用するステップ、第四級アンモニウムイオンカラムを用いた陰イオン交換を使用するステップ、またはフェニルメンブレン濾過を使用するステップの少なくとも１つを含む精製方法によってＣＨＯ細胞の培養物から抗体を精製するステップであって、前記抗体は、前記培養物中のＱＳＯＸ１酵素から分離される、ステップと、
前記精製された抗体を、１つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。
（項目１７）
コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
（ａ）精製スキームの精製ステップを少なくとも１つ実施して、抗体の少なくとも部分的に精製された調製物を、前記抗体を発現するＣＨＯ細胞の培養物から得るステップと、
（ｂ）前記少なくとも部分的に精製された抗体を、前記コンジュゲートした抗体を生成する条件下で、１つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートするステップであって、ここで許容されない低レベルのコンジュゲートした抗体が生成される、ステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の前記精製された調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において許容されないレベルの前記ＣＨＯ細胞酸化酵素が存在することが検出された場合に、ステップ（ｃ）において前記ＣＨＯ細胞酸化酵素が存在しなくなるまでまたは許容されるレベルになるまで、ステップ（ａ）および（ｃ）を、異なる精製ステップを用いて実施するステップと、
（ｅ）前記抗体を発現するＣＨＯ細胞の第２の培養物に対して、検出されるＱＳＯＸ１酵素が許容されるレベルになるまたはＱＳＯＸ１酵素が検出されなくなる少なくとも１つの前記精製ステップを実施して、精製された抗体を得るステップと、
（ｆ）前記精製された抗体を、１つまたは複数のスルフヒドリル基を介して細胞傷害性薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。
（項目１８）
コンジュゲートした抗体を生成する方法であって、
（ａ）抗体の調製物を得るステップと、
（ｂ）前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、精製ステップを実施して、前記ＣＨＯ細胞酸化酵素を許容されるレベルまで除去するステップと、
（ｄ）少なくとも部分的に精製された抗体を、１つまたは複数のスルフヒドリル基を介して薬物とコンジュゲートして、前記コンジュゲートした抗体を生成するステップと
を含む、方法。
（項目１９）
抗体調製物の、医薬品として使用するための適合性を決定する方法であって、
前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
前記抗体調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、前記調製物を、コンジュゲーションに適さないものとして同定し、さらなる精製を必要とするステップと、
前記抗体調製物中に酵素が許容されるレベルで存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、前記調製物をコンジュゲーションに適するものとして同定するステップとを含む、方法。
（項目２０）
抗体調製物の薬物とのコンジュゲーションに対する適合性を決定する方法であって、
前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップと、
前記抗体調製物中に許容されないレベルの前記酵素が存在することが検出された場合に、前記調製物を、コンジュゲーションに適さないものとして同定し、さらなる精製を必要とするステップと、
前記抗体調製物中に酵素が許容されるレベルで存在するかまたは存在しないことが検出された場合に、前記調製物をコンジュゲーションに適するものとして同定するステップとを含む、方法。
（項目２１）
抗体調製物の、医薬品として使用するための適合性を決定する方法であって、
前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップ
を含む、方法。
（項目２２）
抗体調製物の薬剤（例えば、薬物）とのコンジュゲーションに対する適合性を決定する方法であって、
前記調製物をＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験するステップ
を含む、方法。
（項目２３）
前記抗体がＣＨＯ細胞において産生された抗体である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体調製物が、すでに少なくとも１つの精製ステップに供されている、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記精製ステップがクロマトグラフィー精製ステップである、項目２４に記載の方法。（項目２６）
抗体がコンジュゲーション前にＣＨＯ細胞酸化酵素の存在について試験された、抗体薬物コンジュゲート。
（項目２７）
前記試験するステップが、ゲル上の６５ｋＤａ〜７５ｋＤａのバンドを同定するステップを含む、項目１５または項目１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記バンドがウェスタンブロットまたは銀染色によって同定される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記試験するステップが、ＱＳＯＸ１活性についての機能試験を含む、項目１５または項目１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記機能試験により、前記活性の指標として過酸化水素が生成される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記活性が亜鉛イオンによって阻害され、その阻害はＥＤＴＡによって逆転される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記試験するステップが、対照試料中の遊離のチオール基とＤＴＮＢの間の反応および試験試料中の遊離のチオール基とＤＴＮＢの間の反応をモニタリングするステップと、その２つを比較するステップを伴う、項目１から７、項目１５または項目１７から２６のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、酸化性不純物の薬物負荷量に対する影響を示す。示されている時点で試料を還元し、コンジュゲートした。時間と共にコンジュゲーションレベルが低下する傾向により、酸化性不純物の存在が示される。
【図２Ａ】図２ａは、ＳＥＣ分離後の画分における抗体調製物（ロットＤＥＶＮＫＢ−１）における酸化活性を示す。
【図２Ｂ】図２ｂおよび図２ｃは、それぞれ抗ＡＬＲ（肝臓再生の活性化因子）および抗ＱＳＯＸ１抗体を用いて染色したＳＥＣ画分のウェスタンブロットを示す。
【図２Ｃ】図２ｂおよび図２ｃは、それぞれ抗ＡＬＲ（肝臓再生の活性化因子）および抗ＱＳＯＸ１抗体を用いて染色したＳＥＣ画分のウェスタンブロットを示す。
【図３Ａ】図３ａは、Ｐｏｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムでの抗体調製物（ロットＤＥＶＮＫＢ−１）の分画を示す。図３ｂは、各画分における酸化活性を示し、図３ｃは、プールした画分３および４のタンパク質含有量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。矢印は、７０ｋＤａのＱＳＯＸ１および７６ｋＤａのＱＳＯＸ２と一致する分子量を示す。
【図３Ｂ】図３ａは、Ｐｏｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムでの抗体調製物（ロットＤＥＶＮＫＢ−１）の分画を示す。図３ｂは、各画分における酸化活性を示し、図３ｃは、プールした画分３および４のタンパク質含有量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。矢印は、７０ｋＤａのＱＳＯＸ１および７６ｋＤａのＱＳＯＸ２と一致する分子量を示す。
【図３Ｃ】図３ａは、Ｐｏｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムでの抗体調製物（ロットＤＥＶＮＫＢ−１）の分画を示す。図３ｂは、各画分における酸化活性を示し、図３ｃは、プールした画分３および４のタンパク質含有量を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。矢印は、７０ｋＤａのＱＳＯＸ１および７６ｋＤａのＱＳＯＸ２と一致する分子量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
Ｉ．一般
本発明は、ＣＨＯ細胞酸化酵素、特に、クイエシン（ｑｕｉｅｓｃｉｎ）Ｑ６スルフヒドリルオキシダーゼ１（ＱＳＯＸ１）が、一見すると厳しい抗体精製プロセス後に残存し、抗体調製物中に、その後の抗体と薬物のコンジュゲーション負荷効率を低下させるのに十分な量で存在する可能性があるという知見に一部基づく。精製プロセスにより、抗体に対して許容される低い割合のバックグラウンド夾雑物／不純物を有する抗体がもたらされると思われ得るが、それにもかかわらず、抗体の還元後に抗体のスルフヒドリル基が酸化され、したがって、薬物とのコンジュゲーションに利用できなくなるのに十分な量の酸化酵素が存在し得る。本発明の実施は機構の理解に依存しないが、精製抗体産物にまでＱＳＯＸ１が存続することは、一部の精製条件下での抗体とＱＳＯＸ１の間の相互作用の結果であり得る。酸化酵素が精製手順後に残存するかどうかは、どの精製技法を使用するかに左右され、これは１つの抗体と別の抗体で変動し得る。少ないが有意である量のＣＨＯ細胞酸化酵素を伴う一見すると純粋な抗体の調製物が存在する潜在性が同定される前は、不十分なコンジュゲーション負荷効率（不適切な薬物と抗体の平均比に反映される）は、不正確に、多数の原因のいずれかに帰するものとされていた可能性がある。しかし、ＣＨＯ細胞酸化酵素による夾雑は、その後のコンジュゲーションに関する潜在的な問題であるという知見を用いて、ＣＨＯ酸化酵素（複数可）を排除するまたは少なくとも許容されるレベルまで低下させる適切な精製スキームを任意の抗体に対して考案することができる。
【００３１】
ＩＩ．ＣＨＯ細胞酸化酵素（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ）
ＱＳＯＸ１は、ヒトＱＳＯＸ１、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ０００３９１のチャイニーズハムスターホモログである。この酵素は、酸素の還元を伴うスルフヒドリル基のジスルフィドへの酸化を触媒する。ＱＳＯＸ１への言及は、全長ＱＳＯＸ１酵素（シグナルペプチドを伴うまたは伴わない）、および、ＣＨＯ細胞によって天然に放出されるか抗体精製プロセスの結果として放出されるかにかかわらず、スルフヒドリル酸化能力を保持する、天然に存在するそのバリアントを含めた任意のその断片を指す。ＣＨＯ細胞培養培地中のＱＳＯＸ１により、見かけのサイズ範囲６５〜７５ｋＤａ、またはより詳細には、６８〜７２ｋＤａのバンドがもたらされる。例示的なＱＳＯＸ１断片は、細胞外ドメイン、チオレドキシンドメインおよび／またはＥＲＶ／ＡＬＲスルフヒドリルオキシダーゼドメインを含み得る。予測されるＱＳＯＸ１アイソフォームＸ１タンパク質配列は、配列番号１に記載されているものとして以前に同定されており、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００３５００１７４．１として見出すことができる。ＱＳＯＸ１予測アイソフォームＸ１タンパク質配列は、以来更新されている。更新された配列は、配列番号２に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００７６３９０３７．１として見出すことができる。一部の態様では、ＱＳＯＸ１とは、配列番号２に対して９０％またはそれ超（９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または１００％）の配列同一性を有し、スルフヒドリル酸化能力を保持するＣＨＯ細胞酸化酵素を指す。一部の態様では、ＱＳＯＸ１とは、配列番号２の９４番目のアミノ酸から５７１番目のアミノ酸までにわたるアミノ酸配列を含み、スルフヒドリル酸化能力を保持するＣＨＯ細胞酸化酵素を指す。
【００３２】
不純物として存在する可能性がある他のＣＨＯ細胞酵素としては、ＱＳＯＸ２（ヒトＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ６ＺＲＰ７のＣＨＯホモログ）およびＡＬＲ（肝臓再生の活性化因子）スルフヒドリルオキシダーゼが挙げられる。簡潔のために、以下の説明は、主にＱＳＯＸ１を指すが、その代わりにまたはそれに加えて、ＱＳＯＸ２、ＡＬＲまたは精製後に残存する他のＣＨＯ細胞酸化酵素を指すものと理解されるべきである。
【００３３】
ＩＩＩ．ＱＳＯＸ１および他のＣＨＯ細胞酸化酵素を除去するための精製方法
本出願は、ＱＳＯＸ１およびＱＳＯＸ２またはＡＬＲなどの他のＣＨＯ細胞酸化酵素を同定するため、および除去するための利用可能ないくつかの技法を提供する（さらなる詳細については実施例を参照されたい）。１つの技法は、抗体の調製物をプロテインＡカラムにローディングし、中〜高塩濃度条件（例えば、少なくとも１５０ｍＭのＮａＣｌ、または１５０〜５００ｍＭのＮａＣｌ）の下で洗浄することである。ＱＳＯＸ１はカラムから溶出するが、抗体は結合したまま残る。別の技法は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｘ０ＨＣメンブレンを使用した深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。抗体はフィルターを通過するが、ＱＳＯＸ１はフィルターに捕捉される。別の技法は、第四級アンモニウム基を有する強力な陰イオン交換体を使用することが好ましい陰イオン交換クロマトグラフィーである。ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＣａｐｔｏ−Ｑカラムが適している。適切な条件下で（例えば、ｐＨ約８および導電率約５〜７ｍＳ／ｃｍ）、抗体はカラムを流れるが、ＱＳＯＸ１は結合したまま残る。別の技法はフェニルメンブレン濾過である。この種のメンブレンは、疎水性相互作用に基づいて分離する。適切な条件下で（例えば、ｐＨ６〜８およびクエン酸ナトリウム０．３５〜０．４Ｍ）、抗体は通過し、ＱＳＯＸ１はメンブレンに結合する。
【００３４】
ＩＶ．除去に関する試験
ＱＳＯＸ１は、ＱＳＯＸ１に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットを含めた、実施例においてさらに記載されている種々のアッセイによって検出することができる。ＱＳＯＸ１は、ゲルから切り出された適切な分子量のバンド（グリコシル化の状態に応じて約６５〜７０ｋＤａ）に対するペプチド配列解析またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出することもできる。ＱＳＯＸ１は、機能アッセイによって検出することもできる。ＱＳＯＸ１活性により過酸化水素が生じ、それを今度はキシレノールオレンジの存在下でＦｅ２＋の酸化によって生じる単純な色の変化によって検出することができる。ＱＳＯＸ１の特徴的な機能活性は、Ｚｎ２＋（例えば、少なくとも９０％）によって特異的に阻害されるが、ＥＤＴＡおよび多くの他の塩（ＫＩ、ＭｎＳＯ４、ＮａＣｌ）または尿素によっては阻害されない。ＱＳＯＸ１は、実施例２において実証されている通り、ＤＴＮＢアッセイによって検出することもできる。
【００３５】
ＱＳＯＸ１は、下にまたは実施例において記載されているアッセイのいずれかにおいて、陰性対照レベルを上回って（実験誤差を超えて）検出可能であれば、存在すると考えられる。一部の態様では、１μｇ／ｍｌまたは６６ｐｐｍほど低いＱＳＯＸ１のレベルで抗体薬物負荷効率が阻害され得る。したがって、一部の態様では、許容されるレベルとは、０．５μｇ／ｍｌまたは３３ｐｐｍ未満、好ましくは０．１μｇ／ｍｌまたは６ｐｐｍ未満、または０．０１μｇ／ｍｌまたは０．６ｐｐｍ未満を意味し得る。ＱＳＯＸ１のレベルは、実施例に記載のアッセイ形式のいずれかによって決定して陰性対照レベルの範囲内であることが好ましい。
【００３６】
その代わりにまたはそれに加えて、ＱＳＯＸ１の許容されるレベルは、得ることができる許容される薬物と抗体のコンジュゲーション比またはそれ未満のレベルと定義することができる。許容されるコンジュゲーション比は、標的コンジュゲーション比の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以内の比であることが好ましい。コンジュゲーション比に影響を及ぼす可能性があり、標的コンジュゲーション比を実現するために制御することができるパラメータとしては、例えば、抗体の還元条件（例えば、還元体（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）の型および抗体濃度に対する濃度）、抗体に対する薬物−リンカーの濃度、コンジュゲーション反応時間、およびコンジュゲーション反応温度が挙げられる。ＱＳＯＸ１のレベルは、（ａ）抗体還元反応の間に妥当な還元の程度が実現されるのを妨げず、かつ／または（ｂ）還元の直後だが、コンジュゲーション前に還元型チオールを再酸化しないようなレベルであることが好ましい。言い換えれば、ＱＳＯＸ１のレベルは、抗体の還元または還元された抗体の安定性に干渉しないようなレベルであることが好ましい。
【００３７】
その代わりにまたはそれに加えて、ＱＳＯＸ１の許容されるレベルは、ＤＴＮＢアッセイまたは鉄酸化キシレノールオレンジアッセイにおいて０．１またはそれ未満の吸光度単位の値を生じるレベルと定義することができる。簡単に述べると、ＤＴＮＢアッセイは、対照試料における遊離のチオール基間の反応と試験試料における遊離のチオール基間の反応を測定し、比較するものである。例えば、実施例２を参照されたい。鉄酸化キシレノールオレンジアッセイでは、過酸化水素を活性の指標として測定する。例えば、実施例１を参照されたい。
【００３８】
Ｖ．ワークフロースキーム
ＣＨＯ細胞を、発現させる抗体の鎖をコードするベクター（複数可）で形質転換し、培養して抗体を発現させる。発現は、通常、精製スキームを決定するために十分な抗体をもたらす目的のために、最初は比較的小さな培養体積（例えば、１〜５０Ｌ）で行う。次いで、発現した抗体を含有する培養培地を少なくとも１つの抗体精製スキームのステップに供して、化学的コンジュゲーションまたは医薬用途に適したレベルの純度を得る（例えば、高分子夾雑物／不純物に対して少なくとも９０％ｗ／ｗ、９５％ｗ／ｗ、９７％ｗ／ｗ、９８％ｗ／ｗまたは９９％ｗ／ｗの抗体）。精製スキームは、通常、少なくとも２つのカラムクロマトグラフィーステップ、少なくとも１回、通常は複数回の濾過ステップ、ウイルス不活化ステップ、ならびに濃縮および再懸濁／希釈ステップを含む。任意の１つまたは全ての精製ステップが完了した後、抗体調製物をＱＳＯＸ１の存在について試験することができる。ＱＳＯＸが、陰性対照アッセイのバックグラウンドを超えて（実験誤差を超えて）検出された場合、またはその後のコンジュゲーションに許容されないとみなされるレベルを超えて検出された場合、最初の培養物（または入手可能な最初の培養物の量が不十分である場合には別の同様の培養物）の精製を第２の（異なる）精製ステップおよび／またはスキームを用いて繰り返す。第２の精製ステップおよび／またはスキームは、第１のステップと、他のバリエーションの中でも、精製の型（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオンイオン交換クロマトグラフィー、濾過のために使用されるメンブレンの型）、またはローディングまたは溶出に使用する緩衝液が異なってよい。
【００３９】
第２の精製ステップ／スキームの実行後またはその間、生じた抗体調製物をＱＳＯＸ１について試験することができる。ＱＳＯＸ１が、バックグラウンドを超えてまたは他の点で許容されると決定されたレベルを超えて検出された場合、ＱＳＯＸ１酵素についてのさらなる試験を伴って、または伴わずに、さらなる精製スキームを用いて精製を実施する。第１の精製スキーム、第２の精製スキームまたはその後の精製スキームのいずれの後かにかかわらず、ＱＳＯＸ１がバックグラウンドを超えて検出されないまたは検出されるが許容されるとみなされるレベルである抗体の調製物を最終的に得る。
【００４０】
ＱＳＯＸ１を、検出限界を超えてまたは少なくとも許容されるレベルまで低下させる精製スキームが決定されたら、ＣＨＯ細胞の、時には産生培養と称される第２の培養を実施する。培養培地を、抗体を精製し、ＱＳＯＸ１を除去するために有効であることがすでに決定された精製ステップ／スキームに供する。生じた精製された抗体を還元し、その後、薬剤、例えば、薬物とコンジュゲートする。
【００４１】
第２の培養または産生培養は、一般には、精製スキームを決定するために使用される初代培養よりも大規模である。例えば、産生培養は、体積が初代培養の少なくとも１００倍または１０００倍であり得る。産生培養は、一般には、抗体がＱＳＯＸ１を伴わずに首尾よく精製されることが予め決定されている精製スキームによるその培養物からの抗体の精製と同様に、繰り返して実施されるか（回分培養）、または少なくとも１年にわたって（例えば、少なくとも５年にわたって）連続的に実施する。
【００４２】
代替ワークフローでは、ＣＨＯ細胞からの培養培地を、必ずしもＱＳＯＸ１酵素について試験することなく抗体精製手順に供し、精製された調製物を薬物との化学的コンジュゲーションに供する。コンジュゲーション負荷効率（平均薬物／抗体）が予想外に低い（すなわち、抗体に対する薬物分子の数が標的未満である）場合には、精製された調製物をＱＳＯＸ１の存在について試験する。酵素がバックグラウンドレベルを超えてまたは許容されるとみなされるレベルを超えて存在する場合には、抗体をＣＨＯ細胞培養培地から異なる精製方法によって精製し、その後、ＱＳＯＸ１酵素について試験する。次いで、必要であれば、異なる方法による精製、その後のＱＳＯＸ１についての試験を、精製方法によって抗体が夾雑物／不純物から一般に精製されて許容される純度がもたらされるとともに、ＱＳＯＸ１がバックグラウンドレベルまたはコンジュゲーションのために他の点で許容されるとみなされるレベルまで除去されることが見出されるまで繰り返し実施する。そのような精製方法が見出されたら、その方法を、ＣＨＯ細胞の第２の培養物から抗体を調製するために使用することができる。次いで、精製された抗体を、１つまたは複数の遊離のスルフヒドリル基を介して薬物にコンジュゲートする。
【００４３】
ＶＩ．抗体と薬物のコンジュゲーション
抗体を細胞傷害性部分または細胞増殖抑制性部分（薬学的に適合性のその塩を含む）とコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成することができる。抗体は、薬物以外の薬剤、例えば、安定剤（例えば、ＰＥＧ部分）とコンジュゲートすることができる。抗体とのコンジュゲーションに特に適する部分は、細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法薬（ｃｈｅｍｏｄｒｕｇ））、プロドラッグ変換酵素、放射性同位元素もしくは化合物、または毒素（これらの部分は、集合的に薬物と称される）である。例えば、抗体は、化学療法薬などの細胞傷害性薬剤、または毒素（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素など）とコンジュゲートすることができる。
【００４４】
本発明の目的に関して、薬物を、抗体のスルフヒドリル基を介して抗体とコンジュゲートする。スルフヒドリル基は、システイン側鎖のスルフヒドリル基であってよい。システイン残基は、抗体に天然に存在するもの（例えば、鎖間ジスルフィド）であってもよく、他の手段、例えば、変異誘発によって導入されたものであってもよい。薬物を抗体のスルフヒドリル基とコンジュゲートする方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第７，６５９，２４１号、同第７，４９８，２９８号、および国際公開第ＷＯ２０１１／１３０６１３号を参照されたい）。抗体は、スルフヒドリル基をコンジュゲーションに利用可能にするために、コンジュゲーション前に還元する。抗体は、当技術分野において公知の条件を使用して還元することができる。還元条件は、一般には抗体のいかなる実質的な変性も引き起こさず、かつ一般に抗体の抗原結合親和性に影響を及ぼさないものである。一態様では、還元ステップにおいて使用する還元剤はＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）であり、過剰量のＴＣＥＰを室温で３０分にわたって添加する。例えば、ＴＣＥＰの１０ｍＭ溶液、ｐＨ７．４、２５０μＬにより、抗体１〜１００μｇの鎖間ジスルフィドが室温で３０分以内に容易に還元される。しかし、他の還元剤および条件を使用することができる。反応条件の例としては、ｐＨ５〜８の範囲で５℃〜３７℃の温度が挙げられる。本発明者らは、還元剤による還元後にＱＳＯＸ１などの酸化酵素によってスルフヒドリルがジスルフィドに酸化されることにより、スルフヒドリル基がコンジュゲーションに利用できなくなる可能性があることを見出した。
【００４５】
薬物は、抗体から切断されなければ（例えば、加水分解によって、抗体分解によって、または切断剤によって）その活性が低下する様式で抗体とコンジュゲートすることができる。そのような薬物は、標的細胞の細胞内環境における切断には感受性であるが、細胞外の環境には実質的に感受性でない切断可能なリンカーを用いて抗体に付着させ、したがって、ＡＤＣが標的細胞によって内部移行すると（例えば、エンドソーム内に、例えば、ｐＨ感受性またはプロテアーゼ感受性によって、リソソーム環境に、またはカベオラ環境に）、薬物が抗体から切断される。
【００４６】
一般には、ＡＤＣは、薬物と抗体の間にリンカーを含む。上記の通り、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり得、したがって、リンカーの切断により、薬物が抗体から細胞内環境内（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に放出される。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含めた細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであってよい。一般には、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸の長さ、または少なくとも３アミノ酸の長さである。切断剤としては、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを挙げることができる（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁を参照されたい）。標的細胞内に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーが最も典型的である。例えば、がん性組織において高度に発現するチオール依存性プロテアーゼであるカテプシン−Ｂによって切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕペプチドまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙペプチドを含むリンカー）。他のそのようなリンカーは、例えば、ＵＳ６，２１４，３４５に記載されている。細胞内プロテアーゼによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓジペプチドを含む（例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを用いたドキソルビシンの合成について記載されているＵＳ６，２１４，３４５を参照されたい）。薬物の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、コンジュゲートすると薬剤が一般には弱毒化されること、およびコンジュゲートの血清中安定性が一般には高いことである。
【００４７】
切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、ある特定のｐＨ値で加水分解に対して感受性であり得る。一般には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム内で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号；同第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４巻：１４６５３〜１４６６１頁を参照されたい）。そのようなリンカーは、血液中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。
【００４８】
他のリンカーは、還元性条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。ジスルフィドリンカーとしては、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成することができるものが挙げられる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７巻：５９２４〜５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．  Ｗ．  Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年を参照されたい。米国特許第４，８８０，９３５号も参照されたい）。
【００４９】
リンカーはマロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５巻：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．  ３巻（１０号）：１２９９〜１３０４頁）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．  ３巻（１０号）：１３０５〜１２頁）であってもよい。
【００５０】
リンカーは、薬物（例えば、薬物）に直接付着しており、抗体の分解によって放出されるマレイミド−アルキレンリンカーまたはマレイミド−アリールリンカーなどの切断不可能なリンカーであってもよい。
【００５１】
リンカーは、抗体に存在する基に対して反応性の官能基を含むものである。一部の態様では、リンカーは、リンカーの硫黄原子と抗体の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗体に連結する。他の態様では、リンカーは、リンカーのマレイミド基を介して抗体の硫黄原子と結合を形成する。一部の態様では、硫黄原子は、鎖間ジスルフィドのシステイン残基に由来するものまたは抗体の導入されたシステイン残基（例えば、ＥＵ指標に従って２３９位において）に由来する。
【００５２】
抗体とのコンジュゲートに有用なクラスの細胞傷害性薬剤としては、例えば、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤（ＤＮＡ  ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ＤＮＡ複製阻害剤、化学療法感作物質、ピロロベンゾジアゼピン二量体などが挙げられる。他の例示的なクラスの細胞傷害性薬剤としては、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、メイタンシノイドおよびビンカアルカロイドが挙げられる。いくつかの例示的な細胞傷害性薬剤としては、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝結合物質（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ））、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、メイタンシノイド、ベンゾジアゼピン（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、ビンカアルカロイド、ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ−ドキソルビシンが挙げられる。
【００５３】
細胞傷害性薬剤は、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣまたはエトポシドなどの化学療法剤であってよい。薬剤は、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアマイシン、マイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、またはパリトキシンであってもよい。
【００５４】
細胞傷害性薬剤は、アウリスタチンであってもよい。アウリスタチンは、例えば、アウリスタチンＥとケト酸の間で形成されるエステルである、アウリスタチンＥ誘導体であってよい。例えば、アウリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢが生じ得る。他のアウリスタチンとしては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが挙げられる。種々のアウリスタチンの合成および構造は、例えば、ＵＳ２００５−０２３８６４９およびＵＳ２００６−００７４００８に記載されている。
【００５５】
細胞傷害性薬剤は、ＤＮＡ副溝結合剤であってよい（例えば、ＵＳ６，１３０，２３７を参照されたい）。例えば、副溝結合剤は、ＣＢＩ化合物またはエンジイン（例えば、カリケアマイシン）であってよい。
【００５６】
細胞傷害性剤または細胞増殖抑制剤は、抗チューブリン剤であってよい。抗チューブリン剤の例としては、タキサン（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋｙｌｏｉｄ）（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびアウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の適切な抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、およびエリュテロビンが挙げられる。
【００５７】
細胞傷害性薬剤は、抗チューブリン剤の別の群であるメイタンシノイドであってよい。例えば、メイタンシノイドは、マイタンシンまたはＤＭ−１またはＤＭ−４などの薬物リンカーを含有するマイタンシンであってよい（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２巻：１２７〜１３１頁も参照されたい）。
【００５８】
例示的な抗体薬物コンジュゲートとしては、以下のｖｃＭＭＡＥおよびｍｃＭＭＡＦ抗体薬物コンジュゲート（式中、ｐは、薬物負荷量を示し、そして１〜２０の範囲であり、Ａｂは抗体である）：
【００５９】
【化１】
2019048888.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。
【００６０】
ＶＩＩ．抗体精製方法
ＣＨＯ上清からのタンパク質の精製に関して、技法の大きなレパートリーが公知である。これらの技法としては、遠心分離、濾過、沈殿、ウイルス不活化、ならびに、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、陰イオン交換、陽イオン交換、混合方式、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除クロマトグラフィー、および標的アフィニティークロマトグラフィーを含めた多数の型のカラムクロマトグラフィーが挙げられる。クロマトグラフィーステップでは、通常、少なくとも２種の緩衝液を使用し、１種はローディング用であり、１種は溶出用である。緩衝液は、他の因子の中でも、ｐＨおよびイオン強度が変動し得る。例示的な抗体精製は、少なくとも１つの濾過ステップ、少なくとも１つのウイルス不活化ステップ、プロテインＡカラムおよび少なくとも１つの他のカラムを含む。緩衝液、ｐＨ、ならびにローディング溶液および溶出溶液中の他の賦形剤に関する異なる技法および可能性の数を考慮すると、異なる精製手順の数は非常に大きい。したがって、多くの場合、異なる抗体に対する適切な精製手順を経験的に決定して、抗体が医薬用途のために許容されるレベルまで精製されるとともに（一般に抗体と高分子夾雑物／不純物の比によって決定される）、ＱＳＯＸ１および／または他のＣＨＯ細胞酸化酵素が検出可能なレベルを下回るまでまたは少なくとも許容されるレベルまで低下する手順を同定する。
【００６１】
硫酸アンモニウム沈殿を使用して、抗体を血清、腹水または細胞培養上清から富化および濃縮することができる。試料中のこのリオトロピック塩の濃度が上昇するに従い、タンパク質および他の巨大分子の可溶性が次第に低くなり、沈殿に至る。抗体は、他の大多数のタンパク質および血清の成分よりも低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿する。沈殿の選択性、収量、純度および再現性は、時間、温度、ｐＨおよび塩含有量を含めたいくつかの因子に左右される。
【００６２】
抗体の細胞性夾雑物は、酸性または陽イオン性高分子電解質を使用して凝結させることができる。高分子電解質は、通常、粒子に吸着して逆に荷電したパッチを表面上に作り出すことによって働く。次いで、このパッチが静電引力により反対側の粒子表面上の裸のパッチに接着する。
【００６３】
細胞培養ブロスの清澄化において、メンブレンフィルターでの容量を維持するため、またはクロマトグラフィーカラムもしくはウイルスフィルターを保護するためにデプスフィルターを使用することができる。デプスフィルターは、一般には、セルロース、珪藻土などの多孔質濾過助剤、およびイオン性荷電樹脂結合剤から作製される。デプスフィルターでは、分離をもたらすためにサイズ排除および吸着性結合のどちらも使用することができる。
【００６４】
メンブレンクロマトグラフィーまたはメンブレン吸着体は、充填クロマトグラフィーカラムと同様であるが、従来の濾過モジュールの形式で機能する。メンブレンクロマトグラフィーでは、メンブレン構造全体を通して内部孔表面に付着した機能的リガンドを含有する微孔性メンブレンを、通常は多数の層にして使用する。市販のＱメンブレンとしては、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）（Ｐａｌｌ）およびＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）が挙げられる。およそ中性〜わずかに塩基性のｐＨおよび低導電率で、ウイルス、ＤＮＡ、内毒素、宿主細胞タンパク質の大きな集団および浸出したプロテインＡはＱメンブレンに結合するが、一般には、塩基性の抗体分子は結合せずにメンブレンマトリックスを流れる。
【００６５】
限外濾過は、抗体の濃縮および緩衝液の交換のために広く使用されている、圧力に駆動されるメンブレンプロセスである。限外濾過は、メンブレン孔よりも大きな種は保持され、より小さな種は自由に通過する、サイズに基づく分離である。限外濾過での分離は、所与の圧力駆動性の力の下でメンブレンを横切る異なる成分の濾過速度の差異によって実現される。緩衝液の交換は、最終的な所望の組成の緩衝液を、濾液が取り出されるのと同じ速度で保持液系（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）に添加し、したがって、一定の保持液体積が維持される、ダイアフィルトレーションモードを使用して実現される。１ｎｍから２０ｎｍまでにわたるメンブレン孔を用いた限外濾過により、５００ダルトンから１，０００キロダルトンまでにわたる分子量の種の分離がもたらされ得る。
【００６６】
高性能接線流濾過（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＨＰＴＦＦ）は、精製および分離の目的でサイズの差異と電荷の差異の両方を利用する２次元単位操作である。タンパク質の濃縮および緩衝液の交換は、同じ単位操作で達成することができる。
【００６７】
ウイルスは、低ｐＨで処理することによって不活性することができ、かつ／または、濾過を含めた種々の方法によって除去することができる。現行のウイルス保持フィルターは、限外濾過器または非常に小さな孔を有するマイクロフィルターである。ウイルス濾過メンブレンは、親水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、親水性ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）および再生セルロースから作製される。
【００６８】
イオン交換クロマトグラフィーでは、所与の緩衝系においてタンパク質をそれらの正味の電荷に基づいて結合させるために正または負に荷電した樹脂を使用する。標的抗体を高い程度の特異性で結合し、放出させる条件（例えば、ｐＨおよびイオン強度）が決定され得る。逆に、抗体以外のほぼ全ての他の試料成分が結合する条件を見出すことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）などの、弱塩基性であり得る正荷電群、または、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）または四級アミノエチル（ＱＡＥ）などの、強塩基性であり得る正荷電群を使用する。
【００６９】
陽イオン交換クロマトグラフィーでは、負荷電官能基を用いて修飾した樹脂を使用する。陽イオンクロマトグラフと陰イオンクロマトグラフは相補的な技法であり、一方に強力に結合する分子は、他方には結合するとしても弱く結合する。
【００７０】
陽イオン交換カラムは、スルホプロピル基、スルホエチル基およびスルホイソブチル基などの強酸性リガンドであってもよく、カルボキシル基などの弱酸性リガンドであってもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、およそ中性またはわずかに下回る（例えば、約６）から塩基性までにわたるｐＩ値を有する多くのｍＡｂに対する精製プロセスに適用されている。大多数のヒト化ＩｇＧ１サブクラスおよびＩｇＧ２サブクラスは、陽イオン交換クロマトグラフィーの良い候補であり、抗体はローディングステップの間に樹脂に結合し、導電率の上昇またはｐＨの上昇のいずれかによって溶出緩衝液中に溶出する。ＤＮＡ、いくつかの宿主細胞タンパク質、浸出したプロテインＡおよび内毒素などの負荷電プロセスに関連する不純物は、ローディングおよび洗浄画分中に取り除かれる。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、脱アミド産物、酸化種およびＮ末端短縮形態、ならびに高分子量種を所望の抗体から分離することもできる。陽イオン交換樹脂への抗体の結合は、ｐＨおよび導電率、ならびに樹脂の型に依存する。ＳＰセファロースＦＦおよびＳＰセファロースＸＬは一般的な市販の樹脂の２つである。
【００７１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、タンパク質をそれらの疎水性に基づいて分離するための有用なツールであり、タンパク質を電荷、サイズまたは親和性に基づいて分離する他の技法と相補的である。試料を、一般には、高塩濃度緩衝液中、ＨＩＣカラムにローディングする。緩衝液中の塩は、水分子と相互作用して溶液中のタンパク質分子の溶媒和を低下させ、それにより、試料タンパク質分子内の疎水性領域を露出させ、したがって、試料タンパク質分子がＨＩＣ樹脂に結合する。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要な塩が少なくなる。
【００７２】
固定化金属キレートクロマトグラフィーでは、キレートに固定化した二価金属イオン（例えば、銅、コバルトまたはニッケル）を使用して、３つまたはそれ超の連続したヒスチジン残基のクラスターを含有するタンパク質またはペプチドを結合させる。この戦略は、ほとんどの場合、末端６×Ｈｉｓ融合タグを含有するように作出された組換えタンパク質を精製するために使用される。ＩｇＧは、固定化ニッケルによって結合され得るヒスチジンクラスターを保有する、血清（またはモノクローナルハイブリドーマ細胞培養上清）中の少数の豊富なタンパク質のうちの１つである。結合および溶出の条件を特定の試料に対して最適化して、穏やかで信頼できる抗体精製をもたらすことができる。
【００７３】
プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬは、それらの組換えバージョンも含め、重要な抗体型を種々の種からアフィニティー精製するために常套的に使用される例示的なタンパク質である。プロテインＡクロマトグラフィーは、一般には、清澄化した細胞培養上清を、抗体はカラムに結合し、宿主細胞タンパク質および細胞培養培地成分などの望ましくない成分ならびにウイルスはカラムを流れる条件下で、ｐＨ６〜８でカラムを通過させることを伴う。場合によって中間洗浄ステップを行って非特異的に結合した不純物をカラムから除去し、その後、ｐＨ２．５〜４で産物の溶出を行うことができる。現在、プロテインＡ樹脂は、それらの樹脂骨格組成に基づいて分類される３種の主要な型が存在する：ガラスまたはシリカに基づくもの、例えば、Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ、Ｐｒｏｓｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；アガロースに基づくもの、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；および有機ポリマーに基づくもの、例えば、ポリスチレン−ジビニルベンゼンＰｏｒｏｓ  ＡおよびＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。酢酸、クエン酸、リン酸、アルギニンＨＣｌおよびグリシンＨＣｌなどのいくつかの溶出緩衝液成分を抗体に応じて使用することができる。同様に溶出ｐＨの選択は抗体の樹脂に対する結合親和性に左右され、結合親和性が高い抗体には低溶出ｐＨが求められる。
【００７４】
セラミックヒドロキシアパタイト（Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ）２は、抗体を、他の夾雑物の中でも二量体、凝集体および浸出したプロテインＡから分離するために、多くの場合リン酸ナトリウム勾配溶出と共に使用することができるリン酸カルシウムの形態である。
【００７５】
特にＱＳＯＸ１を除去するための技法は、本明細書および実施例の項に記載されており、上記の方法のいずれかに加えて、またはそれと組み合わせて使用することができる。
【００７６】
ＶＩＩＩ．例示的な抗体
記載されている精製方法およびワークフローは、非ヒト、ヒト化、ヒト、キメラ、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、ナノボディ、ｄＡｂ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂなどを含めた任意の抗体に対して使用することができる。本方法は、診断または治療に使用するための薬剤とコンジュゲートされる抗体に対して最も有用である。例えば、方法は、治療的に使用するための薬物とコンジュゲートされる抗体に対して有用である。いくつかのそのような抗体は、がん細胞抗原、好ましくは、細胞表面上にある、抗体が結合すると細胞内に内部移行可能な抗原に対して免疫特異性である。抗体が対象とし得る標的としては、がん細胞上の受容体およびそれらのリガンドまたは対抗受容体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２  ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、Ｈｅｒ−２、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＬＩＶ−１、およびネクチン−４）が挙げられる。
【００７７】
本方法は、自己免疫疾患の処置または予防法のためのＡＤＣを作製するために使用する抗体を精製するためにも有用である。
【００７８】
本方法は、活性化されたリンパ球上に発現する受容体または受容体複合体に結合する抗体を精製するためにも有用である。
【００７９】
本方法は、ウイルス抗原または微生物抗原に特異的な抗体を精製するためにも有用である。
【００８０】
本方法の適用に適した市販の抗体およびそれらの標的のいくつかの例としては、アレムツズマブ、ＣＤ５２、リツキシマブ、ＣＤ２０、トラスツズマブＨｅｒ／ｎｅｕ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ＥＧＦＲ、ベバシズマブ、ＶＥＧＦ、パリビズマブ、ＲＳＶ、アブシキシマブ、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ  ＴＮＦ−アルファ、バシリキシマブ（ｂａｃｉｌｉｘｉｍａｂ）、ダクリズマブ、ＩＬ−２、オマリズマブ、ＩｇＥ、ゲムツズマブ、ＣＤ３３、ナタリズマブ、ＶＬＡ−４、ベドリズマブアルファ４ベータ７、ベリムマブ、ＢＡＦＦ、オテリキシズマブ、テプリズマブＣＤ３、オファツムマブ、オクレリズマブＣＤ２０、エプラツズマブ  ＣＤ２２、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍｕｍａｂ）ＣＤ５２、エクリズマブＣ５、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｍｕｍａｂ）ＩＬ−１ベータ、メポリズマブＩＬ−５、レスリズマブ、トシリズマブＩＬ−６Ｒ、ウステキヌマブ、およびブリアキヌマブＩＬ−１２が挙げられる。場合によって、抗体はブレンツキシマブではない。
【００８１】
ＩＸ．処置方法および医薬組成物
上記の方法に従って生成したＡＤＣを、上記の任意の適応症を含めた、がん、自己免疫疾患または感染症などの、処置が意図された疾患の発症を遅延させ、重症度を低下させ、さらなる悪化を阻害し、かつ／または少なくとも１つの徴候または症状を改善させる投薬量、投与経路および投与頻度を意味する有効なレジメンで投与する。患者がすでに疾患に罹患している場合、レジメンは、治療的に有効なレジメンと称することができる。患者が、一般的な集団と比較して疾患のリスクが上昇しているが、まだ症状を経験していない場合、レジメンは、予防的に有効なレジメンと称することができる。いくつかの場合には、治療的または予防的有効性は、個々の患者において、歴史的な対照または同じ患者の過去の経験と比較して観察することができる。他の場合では、治療的または予防的有効性は、前臨床試験または臨床試験において、処置された患者の集団において処置されていない患者の対照集団と比較して実証することができる。
【００８２】
ＡＤＣの投薬量は、一般には、ＡＤＣの薬物成分に応じて変動する。例示的な用量としては、例えば、被験体の体重１ｋｇ当たり１．０μｇ〜７．５ｍｇ、もしくは２ｍｇ〜７．５ｍｇ、もしくは３ｍｇ〜７．５ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、または０．５ｍｇ〜５ｍｇ（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ）または固定された投薬量として１０〜１５００ｍｇもしくは２００〜１５００ｍｇを挙げることができる。一部の方法では、患者に少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも３ｍｇ／ｋｇの用量を３週間またはそれ超ごとに１回投与する。投薬量は、他の因子の中でも、投与の頻度、患者の状態、および、もしあれば、処置が予防的なものであるか治療的なものであるかにかかわらず、また障害が急性であるか慢性であるかにかかわらず以前の処置に対する応答に左右される。
【００８３】
投与は、非経口投与、静脈内投与、経口投与、皮下投与、動脈内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、局所投与、鼻腔内投与または筋肉内投与であってよい。投与はまた、腫瘍内へなど、直接局在化されていてもよい。静脈内投与または皮下投与による全身循環中への投与が好ましい。静脈内投与は、例えば、３０〜９０分などの期間にわたる注入によるものであってもよく、単回のボーラス注射によるものであってもよい。
【００８４】
投与の頻度は、他の因子の中でも、循環中のＡＤＣの半減期、患者の状態および投与経路に左右される。頻度は、毎日、毎週、毎月、年に４回、または、患者の状態の変化もしくは処置されるがんの進行に応答した不規則な間隔であってよい。静脈内投与の例示的な頻度は、継続的な処置の過程にわたって週２回から年に４回の間であるが、それよりも高頻度または低頻度の投薬も可能である。静脈内投与の他の例示的な頻度は、継続的な処置の過程にわたって毎週または４週間ごとに３回の間であるが、それよりも高頻度または低頻度の投薬も可能である。皮下投与に関しては、例示的な投薬頻度は、毎日〜毎月であるが、それよりも高頻度または低頻度の投薬も可能である。
【００８５】
投与する投薬量の数は、疾患の性質（例えば、急性の症状を示すか慢性の症状を示すか）および処置に対する障害の応答に左右される。急性障害または慢性障害の急性増悪に対しては、１用量から１０用量の間が十分であることも多い。時には、場合によって分割した形態での単回ボーラス用量が、急性障害または慢性障害の急性増悪に対して十分である。処置は、急性障害または急性増悪の再発に対して繰り返すことができる。慢性障害に対しては、抗体は、定期的な間隔で、例えば、毎週、２週間に１回、毎月、年に４回、６ヶ月毎に、少なくとも１年、５年もしくは１０年、または患者の生涯にわたって投与することができる。
【００８６】
非経口投与用の医薬組成物は、滅菌されており、実質的に等張性であり（２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）、ＧＭＰ条件下で製造されたものであることが好ましい。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与用の投薬量）でもたらすことができる。医薬組成物は、１種または複数種の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択される投与経路に左右される。注射に関しては、ＡＤＣは、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩水または酢酸緩衝液（注射部位の不快感を軽減するため）などの生理的に適合性の緩衝液中に製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してよい。あるいは、抗体は、使用する前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成するための凍結乾燥した形態であってよい。液体製剤中の抗体の濃度は、例えば、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば、１０ｍｇ／ｍｌなどであってよい。
【００８７】
本発明のＡＤＣを用いた処置は、化学療法、照射、幹細胞処置、外科手術、抗ウイルス薬、抗生物質、免疫抑制薬もしくは刺激薬、または処置される障害に対して有効な他の処置と組み合わせることができる。がんまたは自己免疫疾患を処置するためにＡＤＣと一緒に投与することができる有用なクラスの他の薬剤としては、例えば、がん性細胞上に発現する他の受容体に対する抗体、抗チューブリン剤（例えば、アウリスタチン）、ＤＮＡ副溝結合物質、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金（ｔｒｉ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｌａｔｉｎｕｍ）複合体ならびにカルボプラチンなどの白金複合体）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法感作物質、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌ）、予備形成化合物（ｐｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線感作物質、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。
【００８８】
一部の態様では、ＡＤＣを用いた処置により、腫瘍を有する患者の無増悪生存期間または全生存期間の中央値が、特に再発したものまたは不応性である場合に、ＡＤＣを伴わない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して少なくとも３０％もしくは４０％、好ましくは５０％、６０％〜７０％またはさらには１００％もしくそれを超えて上昇し得る。一部の態様では、処置（例えば、標準の化学療法）により、腫瘍を有する患者の完全奏効率、部分奏効率、または客観的奏効率（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ）（完全＋部分）が、ＡＤＣを伴わない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して少なくとも３０％もしくは４０％、好ましくは５０％、６０％〜７０％またはさらには１００％上昇し得る。
【００８９】
一般には、臨床試験（例えば、第ＩＩ相試験、第ＩＩ／ＩＩＩ相試験または第ＩＩＩ相試験）において、上述の、標準の療法およびＡＤＣで処置された患者の無増悪生存期間の中央値および／または奏効率における、標準の療法を単独（またはそれに加えてプラセボ）で受けた患者の対照群と比較した上昇は、例えばｐ＝０．０５もしくは０．０１またはさらには０．００１レベルで統計的に有意である。完全奏効率および部分奏効率は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅおよび／またはＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって列挙または承認されている通り、がんの臨床試験において一般に使用される客観的な基準によって決定される。
【実施例】
【００９０】
実施例１：ＣＨＯ細胞培養物から精製された抗体調製物中にＱＳＯＸ１が存在する証拠
ＣＨＯ細胞において発現させた抗体を精製することにより得られたロットＤＥＶＮＫＢ−１では、予想外に乏しい薬物コンジュゲーションが示された。対照的に、ロットＬ２２０４２／Ｅでは、望ましいレベルの薬物コンジュゲーションが示された。抗体への薬物コンジュゲーションは遊離のスルフヒドリル基によって媒介されるので、ロットＤＥＶＮＫＢ−１では酸化活性を有する不純物の存在が疑われた。図１は、抗体への薬物コンジュゲーションの有効性に対する酸化性不純物の影響を示す。ロットＤＥＶＮＫＢ−１由来の抗体（菱形の記号）では、還元の時間が５０分を超えて延長すると薬物負荷量の減少が示されるが、ロットＬ２２０４２／Ｅ由来の抗体（正方形の記号）では、還元の経過にわたって一貫した予測されたレベルの薬物負荷量が示される。
【００９１】
ＣＨＯ細胞において産生された他の抗体のある特定の調製物は、ロットＤＥＶＮＫＢ−１の酸化活性と同様の酸化活性を有することが観察されており、酸化活性の供給源が関心事項であった。酸化活性の供給源を決定するために、ロットＤＥＶＮＫＢ−１を、スルフヒドリルオキシダーゼの存在について、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング、ならびに液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。
【００９２】
ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離および銀染色後のロットＤＥＶＮＫＢ−１とＬ２２０４２／Ｅの比較では、酸化活性に明らかに対応するいかなるタンパク質バンドも示されなかった（データは示していない）。より良好な分解能を実現するために、ロットＤＥＶＮＫＢ−１をサイズ排除クロマトグラフィーによって分画した。画分を、実施例２に記載の通り酸化活性についてアッセイした。図２ａを参照されたい。ピーク活性に対応する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、次いで、ＱＳＯＸ１、ＱＳＯＸ２、およびＡＬＲ（肝臓再生の増強因子）を含めた候補スルフヒドリルオキシダーゼタンパク質に対する抗体を用いて染色した。図２ｂおよび図２ｃは、それぞれ抗ＡＬＲ一次抗体および抗ＱＳＯＸ１一次抗体、その後、ウサギ抗ヤギＩｇＧ二次抗体を使用したウェスタンブロット分析の結果を示す。ブロットにより、二次抗体と多くの産物関連種の間の広範囲にわたる交差反応性が明らかになった。それにもかかわらず、抗ＱＳＯＸ１ブロットにおいて６５ｋＤから７０ｋＤの間の分子量に対応するピーク活性画分２７〜２９のバンドが検出され（図２ｃ）、これは、ハムスターＱＳＯＸ１の予測された重量（７０，３５６ダルトン）と一致する。
【００９３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
抗ＱＳＯＸ１ウェスタンブロットにおいて検出された６５〜７０ｋＤのタンパク質を同定するために、ロットＤＥＶＮＫＢ−１をＰｏｒｏｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムでアフィニティークロマトグラフィーによって分画した。図３ａを参照されたい。画分を実施例２に記載の通り酸化活性についてアッセイした。図３ｂ参照のこと。酸化活性の本質的に全てが画分３および４に現れた。一連の３回の試行からの画分３および４をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図３ｃを参照されたい。最も顕著なバンドは６５〜７０ｋＤの範囲にあり、拡散した単一のバンドまたは二重線を形成し、これはウェスタンブロットと一致した。ゲル消化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、バンドはＱＳＯＸ１と陽性に同定された。
【００９４】
酸化剤の特徴付け
さらにロットＤＥＶＮＫＢ−１における酸化活性を特徴付けるために、ロットを、鉄酸化キシレノールオレンジ（ＦＯＸ）アッセイを使用してスルフヒドリル酸化活性について試験した。スルフヒドリルオキシダーゼは以下の反応を触媒する：
２Ｒ−ＳＨ＋Ｏ２→Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｈ２Ｏ２
反応が進行するに従い、酸素が消費され、過酸化水素が生成される。過酸化水素副産物は容易にかつ確実に検出することができ、したがって、スルフヒドリルオキシダーゼ活性の代理としての機能を果たす。ＦＯＸアッセイでは、過酸化水素により二価鉄（Ｆｅ２＋）が酸化され、三価鉄（Ｆｅ３＋）を生成する。次いで、二価鉄がキシレノールオレンジと複合体を形成して、５６０ｎｍの光を吸収する化合物が形成される。したがって、５６０ｎｍの光の吸収をモニターすることによって（例えば、分光光度計を使用して）、試料中のスルフヒドリル酸化活性の量を決定することができる。陰性対照の値と試験試料の値を、５６０ｎｍにおける読み取りの差異を決定することによって比較する。得られた値が０．１吸光度単位よりも大きければ、試料は酸化性不純物について陽性である。表１に示されている通り、ＤＥＶＮＫＢ−１の存在によりもたらされた５６０ｎｍの吸光度は０．７０〜０．８０であった。しかし、ＤＥＶＮＫＢ−１と１ｍＭのＺｎ２＋の両方を添加すると、わずか０．００８であった。このデータにより、１ｍＭのＺｎ２＋によりロットＤＥＶＮＫＢ−１の酸化活性が本質的に排除され得ることが示される。これは、ＱＳＯＸ１などのフラビン依存性スルフヒドリルオキシダーゼドメインを有する酸化剤と一致する。
【００９５】
【表１】
2019048888.tif 000003
ＥＤＴＡによりロットＤＥＶＮＫＢ−１の酸化活性のＺｎ２＋依存性排除が逆転され得るかどうかを確認するために、さらなるアッセイを実施した。これらの実験では、Ｚｎ２＋を、ＥＤＴＡを伴ってまたは伴わずにアッセイ緩衝液に添加した。さらに、ＥＤＴＡを有するアッセイ緩衝液を評価した。表２に示されている通り、ロットＤＥＶＮＫＢ−１に付随する酸化活性は、Ｚｎ２＋の存在により、追加的なＥＤＴＡを含有するアッセイ緩衝液と比較して９５％低下した。しかし、Ｚｎ２＋と追加的なＥＤＴＡの両方を添加することによる酸化活性の低下はわずか６％であった。したがって、ＥＤＴＡにより、酸化活性のＺｎ２＋依存性阻害が有効に逆転する。さらに、これは、ＱＳＯＸ１などのフラビン依存性スルフヒドリルオキシダーゼドメインを有する酸化剤について予測されることである。
【００９６】
【表２】
2019048888.tif 000004
ウェスタンブロットデータ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ（示されていない）、および酸化活性の特徴付けに基づいて、ロットＤＥＶＮＫＢ−１の酸化活性はＱＳＯＸ１スルフヒドリルオキシダーゼであることが決定された。
【００９７】
実施例２：ＣＨＯ細胞培養物におけるＱＳＯＸ１を検出するためのアッセイ
抗体調製物における酸化活性の検出をもたらすために（例えば、抗体が、薬物とのコンジュゲーションが意図されたものである場合）、部分的に還元されたＳＧＮ−３０（ｃＡＣ１０抗体、ブレンツキシマブベドチンの抗体成分）を基質として使用するアッセイを開発した。ＳＧＮ−３０を基質として選択したのは、ｃＡＣ１０抗体が一貫してＱＳＯＸ１の夾雑を伴わずに精製されているからである。ＳＧＮ−３０の代わりに、他のよく特徴付けられた、遊離のチオールを有する基質を使用することができる。
【００９８】
アッセイは、基質（例えば、ＳＧＮ−３０）を試験試料と一緒に固定された時間量にわたってインキュベートし、次いで、ＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、エルマン試薬としても公知）を使用して基質内の遊離のスルフヒドリル基の量を検出することを伴う。
【００９９】
【化２】
2019048888.tif 000005
基質内の遊離のチオール基がＤＴＮＢと反応し、ジスルフィド結合が切断され、２−ニトロ−５−チオベンゾエート（ＮＴＢ−）が生成し、これは、水中、中性およびアルカリ性のｐＨでイオン化してＮＴＢ２−になる。ＮＴＢ２−は黄色であり、分光光度計を使用し、４１２ｎｍにおける可視光線の吸光度を測定して迅速に定量化することができる。酸化性不純物が試験試料中に存在すると、基質の遊離のスルフヒドリル基（例えば、まだジスルフィド結合に関与していないシステイン残基内のもの）が酸化されてジスルフィド結合が生じ、それにより、遊離のチオールが少なくなる。したがって、基質とＤＴＮＢの間の反応が少なくなり、それにより、生成する黄色が減少し、対応して試料による４１２ｎｍの光の吸光度が減少する。
【０１００】
ＤＴＮＢと遊離のチオール基の間の反応は急速かつ化学量論的なものである。したがって、所望であれば、基質内の遊離のスルフヒドリル基の量を、モル吸光係数１４，１５０Ｍ−１ｃｍ−１（希釈緩衝溶液に適する）を使用して定量化することができる。
【０１０１】
このアッセイで使用した材料には、分光光度計（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ８４５３）；石英キュベット（例えば、Ｓｔａｒｎａ、１６．５０−Ｑ−１０／Ｚ１５）；１ＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；リン酸一カリウム；リン酸二カリウム；ポリソルベート８０；ＤＴＮＢ（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｄ２１８２００）が含まれる。
【０１０２】
アッセイは、少なくとも陰性対照試料、陽性対照、試験試料、および分光光度計ブランクの分光光度的分析を伴う。必要に応じて追加的な対照試料および／または試験試料を分析することができる。対照試料および試験試料の組成は表３に示されている通りである。このアッセイで使用する緩衝液は、１０ｍＭのリン酸カリウム、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．０である。しかし、分析する試験試料の緩衝液に応じて、他の希釈緩衝液も適切である。アッセイする試料の最終的な体積は１５０μＬであるが、これは必要に応じて調整することができる。アッセイを単純化するために、緩衝液、ＥＤＴＡ、水、および基質（例えば、部分的に還元されたｃＡＣ１０）を含有するマスターミックス反応混液を調製し、マスターミックス反応混液１００μＬに試料５０μＬを添加してアッセイを開始することができる。
【０１０３】
【表３】
2019048888.tif 000006
試料の調製および分析を以下の通り実施する。微量遠心管チューブを、分析する試料および対照に対応して標識する。マスターミックス反応混液１００μＬを各チューブに入れる。各試料５０μＬを対応する対照試料／試験試料チューブに添加する。チューブをボルテックスすることによって混合する。チューブを３７℃のウォーターバスまたはインキュベーターに入れ、２時間インキュベートする。各試料について第２の微量遠心管チューブを標識し、１ｍＭのＤＴＮＢ  １００μＬを各チューブに入れる。２時間のインキュベーションの終わりに、試料をウォーターバス／インキュベーターから取り出し、試料１００μＬを、ＤＴＮＢ  １００μＬを含有する対応する微量遠心管チューブに移す。チューブをボルテックスすることによって混合する。試料を室温で少なくとも５分インキュベートし、次いで、吸光度を決定する。４１２ｎｍにおける吸光度を測定し、７００ｎｍにおける吸光度に対して補正する（すなわち、Ａ４１２−Ａ７００を決定する）。２００ｎｍから７００ｎｍまでのスペクトルを収集することができる。
【０１０４】
試験試料中の酸化性不純物の存在を評価するために、陰性対照（緩衝液）の値（４１２ｎｍ−７００ｎｍ）と試験試料の値を、４１２ｎｍの読み取りの差異を決定することによって比較する。得られた値が０．１吸光度単位より大きければ、試料は酸化性不純物について陽性である。
【０１０５】
抗体培養物からの培養培地を試験すると、アッセイにより、一般には、高い値（約０．５ＡＵ）が生じ、これにより、酸化剤が高レベルであることが示唆される。しかし、アッセイ読み取りは色に基づき、細胞培養培地における色がアッセイ読み取りに干渉する傾向がある。したがって、清澄化した回収物中の酸化性不純物を、このアッセイを使用して決定的に測定することは難しい。酸化性不純物は、少なくとも１つの精製ステップの後、例えば、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップの後（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはＨＩＣクロマトグラフィー）に測定することが好ましい。
【０１０６】
このアッセイでは、一般に、ＱＳＯＸ１、ＱＳＯＸ２、ＡＬＲ、および他の酵素から生じる活性を含めたスルフヒドリルオキシダーゼ活性を測定する。例えば、実施例１に記載の通り特異的なスルフヒドリルオキシダーゼに対するより特異的なアッセイを使用することもできる。
【０１０７】
実施例３：ＱＳＯＸ１を除去する方法
プロテインＡで塩洗浄を実施することによる酸化性不純物の減少
本明細書では抗体２と称される第２の抗体の調製物は、許容できない高レベルの酸化活性を有することが見出された（遠心分離および濾過による清澄化の後）。酸化性不純物を除去するために、強度を変動させた塩洗浄を伴うプロテインＡクロマトグラフィーを評価した。
【０１０８】
直径３．２ｃｍ、ベッド高２３．２ｃｍ（ベッド体積１９３．２ｍＬ）のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを、２５ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて平衡化し、次いで、充填ベッド１Ｌ当たり２５ｇのｍＡｂをローディングした。ローディング後、カラムを表４に示されている通り種々のレベルのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス緩衝溶液を用いて洗浄した。抗体の溶出を、２５ｍＭの酢酸塩、ｐＨ３．４を使用して実施した。流量を滞留時間４分で一定に保持した。
【０１０９】
実施例２のアッセイを使用してカラム溶出液中の酸化性不純物のレベルを分析した。データ（表４参照）により、中程度の濃度の塩（１５０ｍＭのＮａＣｌ）または高濃度の塩（５００ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄すると、プロテインＡ溶出液中に酸化性不純物が含有されないことが示された。低濃度の塩を含有する洗浄（５０ｍＭのＮａＣｌ）は、酸化性不純物のレベルを０．１吸光度閾値未満まで低下させることに効力がなかった。高濃度の塩からの洗浄液は高レベルの酸化性不純物を含有し、これは、高濃度塩洗浄により不純物がカラム樹脂またはｍＡｂから脱離したことを実証している。
【０１１０】
結果により、一般に、酸化性不純物のプロテインＡリガンド、樹脂骨格、および／またはｍＡｂに対する親和性が高イオン強度の溶液により妨害され、イオン相互作用と一致することが示される。
【０１１１】
【表４】
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深層濾過
深層濾過も、酸化性不純物を除去するその能力について試験した。デプスフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｘ０ＨＣフィルターを５０〜１００Ｌ／ｍ２の水で湿らせ、少なくとも１５Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液（例えば、ｐＨ７．５〜８およびＮａＣｌ濃度５０〜１００ｍＭ）で平衡化した。濾過を、２３０Ｌ／ｍ２／時間（ＬＭＨ）、標的ローディング係数２０〜６０Ｌ／ｍ２で実施した。産物を回収するために、フィルターを十分な体積の平衡化緩衝液で洗い流して、標的ピーク収集に達することを確実にした。濾液を２８０ｎｍにおける吸光度によって収集した。そのような条件を使用して、酸化性不純物を除去した。
【０１１２】
陰イオン交換−Ｃａｐｔｏ  Ｑ
Ｃａｐｔｏ  Ｑ強力陰イオン交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−５３１６）を、ｐＨ８．０の緩衝液および導電率＜８ｍＳ／ｃｍ（例えば、５〜７ｍＳ／ｃｍ）を用いてフロースルーモードで操作すると、酸化性不純物が除去されることが観察された。これらの条件により、Ｃａｐｔｏ  Ｑカラムを使用して酸化性不純物の除去を評価するための出発点がもたらされる。抗体１について、酸化性不純物の有効なクリアランスのためには低導電率および高ｐＨを有する緩衝液が必要であることが実証された。Ｃａｐｔｏ  Ｑカラムをフロースルーモードで操作した。適切な条件で、ｍＡｂは樹脂に保持されないが、酸化性不純物は樹脂に吸着する。後に、高塩濃度の緩衝液を使用して酸化性不純物を樹脂から剥がす。第２の抗体、抗体２については、表５に示されている通り、緩衝液の導電率が１１ｍＳ／ｃｍという条件で（１１未満またはそれと同等の導電率が必要である）、ｐＨ７．５で有効なクリアランスが実証された（７．５〜８が有効である）。ｐＨ７、および１１ｍＳ／ｃｍから１５ｍＳ／ｃｍまでにわたる導電率を有する緩衝液は、フロースルーモードでｍＡｂから不純物を分離するのに有効ではなく、ｐＨ７．５および導電率１５ｍＳ／ｃｍを有する緩衝液も同様であった。
【０１１３】
【表５】
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フェニルメンブレン
Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ（登録商標）も、フロースルーモードで操作すると、ＣＨＯ細胞において産生された抗体調製物から酸化性不純物を有効に除去することが見出されている。適切な条件下で、酸化性不純物はメンブレンに保持されるが、ｍＡｂは保持されない。後に、低塩緩衝液を使用して酸化性不純物を樹脂から剥がすことができる。ローディングは、抗体を標的クエン酸塩モル濃度（一般には、０．３〜０．４Ｍのクエン酸ナトリウム）およびｐＨ（一般には、６〜８）まで希釈することによって調製する。メンブレンを、希釈した抗体ローディングに適合するように選択された、５メンブレン体積（ＭＶ）の平衡化緩衝液中で平衡化する。次いで、希釈したローディングをメンブレンに適用し、メンブレンを１０ＭＶの平衡化緩衝液で洗浄する。酸化性不純物を含まない抗体調製物がフロースルー中に現れる。結合した材料を、例えば、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８を用いて溶出させ、メンブレンを、例えば、５ＭＶの２５ｍＭのリン酸ナトリウム、２０％ＩＰＡ、ｐＨ６．５を用いて再生させる。プロセスは、１０ｍＬ／分または３．３ＭＶ／分で操作する。フロースルーのピーク全体、例えば、２ｍｍの流路を使用して２８０ｎｍにおいて０．１〜０．１ＡＵを収集する。
【０１１４】
表６は、フェニルメンブレンでの精製ステップからのデータを提供する。フェニルフロースルーにおいて測定された酸化性不純物のレベルは、０．１吸光度単位から０．０４吸光度単位までにわたった。
【０１１５】
【表６】
2019048888.tif 000009
フェニルメンブレンの使用に関して操作上の頑健性を決定するために、抗体２、調製物に存在する酸化性不純物を、フェニルメンブレン精製ステップを異なるｐＨおよびクエン酸塩モル濃度の条件で適用した後に評価した。表７を参照されたい。フロースルー中の酸化性不純物のレベルを低下させるために、クエン酸塩のモル濃度を上限０．４Ｍで操作することが好ましい。
【０１１６】
【表７】
2019048888.tif 000010
上記または下記で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、あらゆる目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間に受託番号に関連づけられている場合、本出願の有効な出願日において受託番号に関連づけられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、受託番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は明瞭さおよび理解の図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
【０１１７】
【化３】
2019048888.tif 000011
【図１】
2019048888.tif 000012
【図２Ａ】
2019048888.tif 000013
【図２Ｂ】
2019048888.tif 000014
【図２Ｃ】
2019048888.tif 000015
【図３Ａ】
2019048888.tif 000016
【図３Ｂ】
2019048888.tif 000017
【図３Ｃ】
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【配列表】
2019048888000001.app
【外国語明細書】
2019048888000001.pdf