(57)【要約】【課題】ホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）に結合する抗体の提供、並びに形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の検出、同定、又は単離、並びにｐＤＣの活性の調節。【解決手段】ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片を活性成分として含む自己免疫疾患またはアレルギー性疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
ホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片を活性成分として含むヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に起因する病気症状を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３】
ホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片を活性成分として含むヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）により産生されるサイトカインに起因する病気症状を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物であって、前記サイトカインがタイプ１ＩＦＮである医薬組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含む断片が、
（Ａ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＷＭＨ（配列番号：２）、ＣＤＲ２として配列ＤＩＹＰＧＳＤＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号：３）及びＣＤＲ３として配列ＧＧＷＬＤＡＭＤＹ（配列番号：４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号：５）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨ（配列番号：６）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＧＮＴＬＰＷ（配列番号：７）を有する；
（Ｂ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＹＷＭＨ（配列番号：８）、ＣＤＲ２として配列ＡＩＹＰＧＮＳＥＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号：９）及びＣＤＲ３として配列ＧＹＳＤＦＤＹ（配列番号：１０）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＨＡＳＱＧＩＲＳＮＩＧ（配列番号：１１）、ＣＤＲ２として配列ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号：１２）及びＣＤＲ３として配列ＶＱＹＶＱＦＰ（配列番号：１３）を有する；
（Ｃ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＤＹＮＬＨ（配列番号：１４）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＹＰＹＮＧＮＴＧＹＮＱＫＦＫＲ（配列番号：１５）及びＣＤＲ３として配列ＧＧＩＹＤＤＹＹＤＹＡＩＤＹ（配列番号：１６）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＨＩＡ（配列番号：１７）、ＣＤＲ２として配列ＧＡＴＮＬＡＨ（配列番号：１８）及びＣＤＲ３として配列ＱＨＦＷＧＴＰ（配列番号：１９）を有する；
（Ｄ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＹＬＹ（配列番号：２０）、ＣＤＲ２として配列ＬＩＮＰＴＮＳＤＴＩＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号：２１）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＧＹＧＹＧＰＦＡＹ（配列番号：２２）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＳＳＱＴＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号：２３）、ＣＤＲ２として配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：２４）及びＣＤＲ３として配列ＨＳＴＨＶＰ（配列番号：２５）を有する；
（Ｅ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＭＳ（配列番号：２６）、ＣＤＲ２として配列ＴＩＳＳＧＧＳＹＩＹＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号：２７）及びＣＤＲ３として配列ＬＹＧＧＲＲＧＹＧＬＤＹ（配列番号：２８）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＤＧＩＴＹＬＹ（配列番号：２９）、ＣＤＲ２として配列ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号：３０）及びＣＤＲ３として配列ＡＱＮＬＥＬ（配列番号：３１）を有する；
（Ｆ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＨＹＹＷＴ（配列番号：３２）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号：３３）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＰＬＹＹＧＮＰＹＷＹＦＤＶ（配列番号：３４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＤＮＹＬＮ（配列番号：３５）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：３６）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＦＮＴＬＰ（配列番号：３７）を有する；
或いは
（Ｇ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＨＹＹＷＳ（配列番号：３８）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号：３９）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＰＬＹＹＧＮＰＹＷＹＦＤＶ（配列番号：４０）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＤＮＹＬＮ（配列番号：４１）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：４２）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＦＮＴＬＰ（配列番号：４３）を有する；
請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含む断片が、
（Ａ）配列番号７５のアミノ酸番号３６乃至１５３に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号９５のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｂ）配列番号７７のアミノ酸番号２０乃至１３５に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号９７のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｃ）配列番号７９のアミノ酸番号２０乃至１４２に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号９９のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の配列の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｄ）配列番号８１のアミノ酸番号２０乃至１４２に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１０１のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｅ）配列番号８３のアミノ酸番号２０乃至１３９に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１０３のアミノ酸番号２０乃至１３１に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｆ）配列番号８５のアミノ酸番号２０乃至１４０に記載の配列の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１０５のアミノ酸番号２１乃至１３１に記載の配列の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｇ）配列番号８７のアミノ酸番号２０乃至１４０に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１０７のアミノ酸番号２１乃至１３１に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｈ）配列番号８９のアミノ酸番号１９乃至１４２に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１０９のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｉ）配列番号９１のアミノ酸番号１９乃至１４２に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１１１のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の配列の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
（Ｊ）配列番号９３のアミノ酸番号１９乃至１４２に記載の可変領域の配列を重鎖の可変領域として有し、配列番号１１３のアミノ酸番号２１乃至１２７に記載の可変領域の配列を軽鎖の可変領域として有する；
請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１４として寄託されたハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４及びｍｐ１３Ｈ１１のいずれかが産生するモノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片を活性成分として含む、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体がさらにキメラ化、ヒト化を受けている、モノクローナル抗体、又はその抗原結合領域を含む断片を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒト形質細胞様樹状細胞表面のヒトホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載するポリヌクレオチドであって、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合領域を含む断片が、
（Ａ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＷＭＨ（配列番号：２）、ＣＤＲ２として配列ＤＩＹＰＧＳＤＳＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号：３）及びＣＤＲ３として配列ＧＧＷＬＤＡＭＤＹ（配列番号：４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号：５）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨ（配列番号：６）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＧＮＴＬＰＷ（配列番号：７）を有する；
（Ｂ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＹＷＭＨ（配列番号：８）、ＣＤＲ２として配列ＡＩＹＰＧＮＳＥＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号：９）及びＣＤＲ３として配列ＧＹＳＤＦＤＹ（配列番号：１０）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＨＡＳＱＧＩＲＳＮＩＧ（配列番号：１１）、ＣＤＲ２として配列ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号：１２）及びＣＤＲ３として配列ＶＱＹＶＱＦＰ（配列番号：１３）を有する；
（Ｃ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＤＹＮＬＨ（配列番号：１４）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＹＰＹＮＧＮＴＧＹＮＱＫＦＫＲ（配列番号：１５）及びＣＤＲ３として配列ＧＧＩＹＤＤＹＹＤＹＡＩＤＹ（配列番号：１６）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＨＩＡ（配列番号：１７）、ＣＤＲ２として配列ＧＡＴＮＬＡＨ（配列番号：１８）及びＣＤＲ３として配列ＱＨＦＷＧＴＰ（配列番号：１９）を有する；
（Ｄ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＹＬＹ（配列番号：２０）、ＣＤＲ２として配列ＬＩＮＰＴＮＳＤＴＩＦＮＥＫＦＫＳ（配列番号：２１）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＧＹＧＹＧＰＦＡＹ（配列番号：２２）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＴＳＳＱＴＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号：２３）、ＣＤＲ２として配列ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号：２４）及びＣＤＲ３として配列ＨＳＴＨＶＰ（配列番号：２５）を有する；
（Ｅ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＹＧＭＳ（配列番号：２６）、ＣＤＲ２として配列ＴＩＳＳＧＧＳＹＩＹＹＰＥＳＶＫＧ（配列番号：２７）及びＣＤＲ３として配列ＬＹＧＧＲＲＧＹＧＬＤＹ（配列番号：２８）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＤＧＩＴＹＬＹ（配列番号：２９）、ＣＤＲ２として配列ＱＭＳＮＬＡＳ（配列番号：３０）及びＣＤＲ３として配列ＡＱＮＬＥＬ（配列番号：３１）を有する；
（Ｆ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＨＹＹＷＴ（配列番号：３２）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号：３３）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＰＬＹＹＧＮＰＹＷＹＦＤＶ（配列番号：３４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＤＮＹＬＮ（配列番号：３５）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：３６）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＦＮＴＬＰ（配列番号：３７）を有する；
或いは
（Ｇ）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＳＨＹＹＷＳ（配列番号：３８）、ＣＤＲ２として配列ＹＩＳＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＮ（配列番号：３９）及びＣＤＲ３として配列ＥＧＰＬＹＹＧＮＰＹＷＹＦＤＶ（配列番号：４０）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列ＲＡＳＱＤＩＤＮＹＬＮ（配列番号：４１）、ＣＤＲ２として配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：４２）及びＣＤＲ３として配列ＱＱＦＮＴＬＰ（配列番号：４３）を有する；
ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１４として寄託されたハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４及びｍｐ１３Ｈ１１のいずれかが産生するモノクローナル抗体がさらにキメラ化、ヒト化を受けている、モノクローナル抗体、又はその抗原結合領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ヒトｐＤＣに起因する病気症状を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）により産生されるサイトカインに起因する病気症状を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物であって、前記サイトカインがタイプ１ＩＦＮである医薬組成物。
【請求項１５】
前記病気症状が自己免疫疾患である、請求項２〜８、１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記病気症状がアレルギー性疾患である、請求項２〜８、１２〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＤ４に結合する抗体に関する。以下、「ホスホリパーゼＤ」をＰＬＤと、また「ホスホリパーゼＤ４」等をＰＬＤ４等と略記することもある。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（以下「インターフェロン」をＩＦＮと略記することがある）は、抗ウイルス免疫応答における最も重要なサイトカインである。ヒトの血中のインターフェロン産生細胞（ＩＰＣ：ＩＰＣは、樹状細胞（dendritic cell：DC）の前駆細胞に位置付けられる未分化のリンパ球系樹状細胞である。ＩＰＣは、形質細胞様樹状細胞またはプラズマ細胞様樹状細胞（plasmacytoid dendritic cell：ｐＤＣ）と呼ばれることもある。以下、本願明細書ではＩＰＣとｐＤＣは同義であるとし、以下原則としてｐＤＣと言う用語で統一する。）は、ＣＤ４と主要組織適合複合体クラスＩＩタンパク質を発現する。しかし、このような細胞の数は少なく、急速にアポトーシスを起こし、さらにリニエージ（系統）マーカーを欠いていることから、それらの細胞の単離や詳しい特徴づけは今まで行われていなかった。ｐＤＣは、ＣＤ４＋ＣＤ１１ｃ−２型樹状細胞前駆細胞であることが判明しており、またｐＤＣは微生物による刺激後、他の血液細胞よりも、２００〜１０００倍多いＩＦＮを産生することが明らかにされている。したがって、ｐＤＣは抗ウイルス／抗腫瘍免疫応答において決定的な免疫系エフェクター細胞である。
ＩＦＮα、およびＩＦＮβは、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を有するＩ型ＩＦＮとして知られている。一方で、ＩＦＮαは自己免疫疾患に関連していることも明らかにされている。たとえば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチのような自己免疫疾患患者においてＩＦＮαの異常産生が報告されている。さらに組み換えＩＦＮα２やＩＦＮの投与によって自己免疫疾患症状が発現または悪化した症例が報告されている。そしてＩＦＮαの中和によって自己免疫症状が緩和される可能性も示唆されている。
【０００３】
またＩＦＮαが、樹状細胞（ＤＣ）の分化を誘導していることも明らかにされている。樹状細胞は抗原提示細胞であることから、樹状細胞の分化誘導は、自己免疫疾患における重要なメカニズムを構成していると考えられている。実際、ＩＦＮαの樹状細胞の分化誘導は全身性エリテマトーデスの発症と深い関連性があることが示唆されている。上述のように抗腫瘍活性と同様、自己免疫疾患とＩＦＮαの密接な関連性が指摘されている。またＩＦＮαは乾癬の発症にも深く関わっている。
【０００４】
ｐＤＣはほんのわずかだけ血中に存在している。末梢血リンパ球に占めるｐＤＣの割合は、１％以下と考えられている。しかしｐＤＣは、きわめて高いＩＦＮの産生能を有する。ｐＤＣのＩＦＮ産生能は、たとえば３０００ｐｇ／ｍＬ／１０４ｃｅｌｌｓに達する。つまり、細胞の数は少ないが、ウイルス感染時に産生される血中ＩＦＮαまたはＩＦＮβの大部分は、ｐＤＣによってもたらされていると言ってよい。
【０００５】
ｐＤＣは、ウイルス刺激によって樹状細胞に分化し、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γやインターロイキン（ＩＬ）−１０の産生を誘導する。またｐＤＣは、ＩＬ−３刺激によっても樹状細胞に分化する。ＩＬ−３刺激によって分化した樹状細胞は、Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０）の産生を誘導する。上述のようにｐＤＣは、刺激の違いによって異なる樹状細胞に分化する性質を有している。
【０００６】
したがってｐＤＣは２つの側面、１つはＩＦＮ産生細胞としての側面、もう１つは樹状細胞の前駆細胞としての側面を有する細胞である。いずれの細胞も、免疫システムにおいて重要な役割を担っている。つまりｐＤＣは、様々な面で免疫システムを支える重要な細胞の一つである。
【０００７】
ＩＦＮのような液性因子の活性調節には、当該因子を認識する抗体の投与が有効である。たとえばＩＬ−１、またはＩＬ−４に対する抗体によって自己免疫疾患を治療する試みが実用化された。またＩＦＮにおいても同様に、中和抗体が自己免疫疾患の治療薬と思われている。同様のアプローチがＩＦＮ産生ｐＤＣに有効であろうことは予想できる。しかしこのようなアプローチは、産生された後の液性因子の作用の阻害に基づいている。目的とする液性因子の産生を直接的に制御することができれば、より本質的な治療効果を達成することができる。
【０００８】
ヒトｐＤＣを認識する抗体が報告されている。たとえば、抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣ特異的なモノクローナル抗体である(Dzionek, A. et al. J.Immunol.165:6037-6046,2000）。抗ＢＤＣＡ−２モノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣのＩＦＮ産生を抑制する作用を有することが明らかにされている（J.Exp.Med.194:1823-1834,2001）。またマウスのインターフェロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体が、インターフェロンの産生を抑制することも報告されている（Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec)。マウスｐＤＣに対するモノクローナル抗体により樹状細胞の数が減少することも報告されている(J.Immunol.2003,171:6466-6477)。
【０００９】
同様にヒトｐＤＣを認識し、その活性を調節しうる抗体が提供されれば有用である。たとえば本発明者らは、既にＬｙ４９Ｑを認識する抗体がマウスｐＤＣに特異的に結合することを明らかにした。しかしＬｙ４９Ｑに対する抗体は、マウスｐＤＣの活性には干渉しなかった(Blood,1 April 2005,Vol.105,No.7,pp.2787-2792)。
【００１０】
ＰＬＤはホスファチジルコリンを加水分解してホスファチジン酸とコリンを産生する反応を触媒し、様々な細胞内シグナル伝達を引き起こす酵素である。産生されたホスファチジン酸が脂質性のシグナル分子として機能するものと考えられている。
従来から知られている２種類の哺乳類ＰＬＤとしてＰＬＤ１とＰＬＤ２が知られており、そのＮ末端領域にはホスファチジルイノシチドに結合しうるＰｈｏｘホモロジードメイン（ＰＸドメイン）およびプレクストリンホモロジードメイン（ＰＨドメイン）を含んでいる。両ドメインともＰＬＤの膜ターゲッティングに関与している。
ＰＬＤ１とＰＬＤ２はさらに、二つのＨｉｓ−ｘ−Ｌｙｓ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ａｓｐ配列（ＨＫＤモチーフ）を含んでいる。このＨＫＤモチーフはＰＬＤ活性に必須のドメインである。
ＰＬＤ１とＰＬＤ２により産生されたホスファチジン酸は、細胞骨格の再構成、エキソサイトーシス、食作用、癌化、細胞接着、走化性等に関与し、神経系や免疫系等を中心に作用していると考えられる。
【００１１】
ヒトＨｕ−Ｋ４とマウスＳＡＭ９は今では公式にＰＬＤ３と名づけられているが、ＰＸおよびＰＨドメインを欠き、２つのＨＫＤモチーフを有しているにもかかわらずＰＬＤ活性を示さない。さらに３つのＰＬＤファミリーメンバー、ＰＬＤ４、ＰＬＤ５およびＰＬＤ６があるが、これらの非古典的ＰＬＤ類についてはほとんど分かっていない。
【００１２】
マウス小脳発達における遺伝子発現パターンについて小脳発達トランスクリプトームデータベース（ＣＤＴ−ＤＢ）をサーチし、その結果、発達時において制御された転写産物であったＰＬＤ４が同定された（Tao et al., Nat.Methods 2(8),591-598(2005)参照）。ＰＬＤ４の基本特性は報告されていない。ＰＬＤ４が酵素活性を示すかどうか、またＰＬＤ４の脱グリコシル化した形態がＰＬＤ活性を有するかどうかは今後決定されるべき事項であるとされている。
【００１３】
ＰＬＤ４は、配列番号：１に示す５０６アミノ酸配列である（Tao et al., Nat.Methods 2(8),591-598(2005)およびClark et al.,Genome Res.13(10),2265-2270(2003)）。ＰＬＤ４タンパク質はＣ末端領域に保存された２つのＨＫＤモチーフ(Ｈｉｓ−x−Ｌｙｓ−x−x−x−x−Ａｓｐアミノ酸配列、xはその他のアミノ酸)で構成される２つの暫定的なＰＤＥ領域(ホスホジエステラーゼモチーフ)と、推定的なリン酸化部位（Ｔｈｒ  ４７２）を有する。ＰＬＤ４タンパク質の構造はII型一回膜貫通タンパク質と予測される。また、ＰＬＤ４タンパク質のＮ末端領域には古典的なＰＬＤファミリーであるＰＬＤ１とＰＬＤ２が有するＰＸ領域とＰＨ領域を持っていない（図１および２）。
一方ＰＬＤ４は２つのＨＫＤモチーフを有していることからＰＬＤファミリーに属するものではあるが、ＰＸドメインやＰＨドメインを欠く代わりに推定上の膜貫通ドメイン（トランスメンブランドメイン）を有している。
【００１４】
低レベルから中レベルで特徴的なＰＬＤ４ｍＲＮＡの発現は、生後1週間の、マウスの脳梁や小脳白質を含む白質領域周辺に優先的に局在化した細胞小集団に見出だされた。これらのＰＬＤ４ｍＲＮＡ発現細胞は、Ｉｂａ１陽性ミクログリアとして同定されている（Tao et al., Nat.Methods 2(8),591-598(2005)参照）。
生後1週間の時期は、マウスの脳梁や小脳白質ではミエリンの形成が活発化し始める時期である。この時期に白質内に存在するアメボイド（活性化状態）ミクログリアにおいてＰＬＤ４が高発現する。これらの事実から、白質内におけるＰＬＤ４発現細胞がこの時期にミエリンの形成に関与している可能性も考えられる。特にＰＬＤ４が食胞に集積することも明らかとなっており、ＰＬＤ４発現細胞が貪食に関与している可能性も示唆されている。活性化状態にあるアメボイドミクログリアから様々なサイトカインや成長因子が分泌されるとともに貪食作用が活発化している。発達期の脳の白質では、余分なオリゴデンドロサイト（軸索に巻きついてミエリンを形成する中枢神経系グリア細胞）がアポトーシスを起こしていると考えられる。アメボイドミクログリアで余分なオリゴデンドロサイトが分解除去され、シグナル分子を分泌することにより白質内のミエリン形成環境を整えている可能性が考えられる。ＰＬＤ４はミエリン形成を含むこれらの過程に関与していることが示唆されている。
【００１５】
非神経組織においてもＰＬＤ４ｍＲＮＡ発現は広く見られるが、主として脾臓に分布している。強いＰＬＤ４発現が脾赤色髄の境界域周辺に検出され、細胞内膜フラクションから回収された脾ＰＬＤ４タンパクは高度にＮ−グリコシル化されている。ＰＬＤ４を異種細胞系で発現させたところ、小胞体とゴルジ体に局在化した。異種発現したＰＬＤ４はＰＬＤ酵素活性を示さなかった（Plos ONE www.plosone.org, November 2010, Volume 5, Issue 11, e13932）。
ＰＬＤ４の時間的にも場所的にも制限されたその発現パターンから、ＰＬＤ４は生後初期の脳の発達時のミクログリアや脾臓境界領域細胞の間で共通する機能において役割を演じているであろうことが示唆される。
【００１６】
以上神経組織および非神経組織におけるＰＬＤ４ｍＲＮＡ発現とＰＬＤ４の分布を概説したが、後述のように細胞種レベルにおいて静止期のｐＤＣ細胞（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐＤＣ）においてＰＬＤ４ｍＲＮＡが特異的に高発現していることを本発明者らは見出した。
全長ヒトＰＬＤ４タンパク質に対するマウス抗ヒトＰＬＤ４ポリクローナル抗体は市販されている(Abnova社、ＰＬＤ４ purified MaxPab mouse polyclonal antibody(B01P)、カタログ番号 H00122618-B01P)。しかし、ＰＬＤ４の特定の部位にのみ結合するモノクローナル抗体や、ＰＬＤ４に特異的に結合し得るモノクローナル抗体は得られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
（１）Tao et al., Nat.Methods 2(8),591-598(2005)
（２）Clark et al., Genome Res.13(10),2265-2270(2003)
（３）Plos ONE www.plosone.org,November 2010,Volume 5,Issue 11,e13932
（４）全長ヒトＰＬＤ４タンパク質に対するマウスＰＬＤ４ポリクローナル抗体のカタログ(Abnova社、カタログ番号: H00122618-B01P)
（５）Dzionek,A.et al. J.Immunol.165:6037-6046,2000
（６）J.Exp.Med.194:1823-1834,2001
（７）Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206.Epub 2003 Dec
（８）J.Immunol.2003,171:6466-6477
（９）Blood,1 April 2005,Vol.105,No.7,pp.2787-2792
（１０）Nat.Methods 2(8),591-598(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明により解決される課題は、ＰＬＤ４に結合する抗体の提供、並びにｐＤＣの検出、同定、または単離である。また本発明より解決される課題は、ｐＤＣの活性の調節である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、ＰＬＤ４に関する研究を通じて、ＰＬＤ４の発現がｐＤＣ、特に活性期のｐＤＣに加えて静止期のｐＤＣにおいて特異的に亢進していることを確認した。そこで本発明者は、ＰＬＤ４の抗体の作製と、その作用の解明を試みた。
【００２０】
生体由来の微量のタンパク質を認識する抗体を得るためには、一般に、遺伝子組み換え技術によって作製されたタンパク質が免疫原として利用される。本発明者らは、既に明らかにされているＰＬＤ４のｃＤＮＡの塩基配列とそれによってコードされるアミノ酸配列(GenBank Accession No. NM_138790.2)の情報（Nat.Methods 2(8),591-598(2005)）を基に、ＰＬＤ４の発現を試みた。
【００２１】
タンパク質の抗体を得るために、天然のタンパク質の部分アミノ酸配列を免疫原として利用することもしばしば試みられる。しかし、抗体が細胞表面の分子を認識するためには、細胞表面においてエピトープとして抗体に認識される部分を構成している領域を選択することが必要である。したがって、断片アミノ酸配列を免疫原としてＰＬＤ４に特異的な抗体を得ることは、現実的でないと考えられた。
【００２２】
このような状況の下で、本発明者らは、特殊な免疫原を利用することによってｐＤＣに結合する抗体が得られることを明らかにした。さらに本発明者らは、こうして得られた抗体がヒトｐＤＣを特異的に認識し、さらにその活性を調節する作用を有することを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の抗ＰＬＤ４抗体、その製造方法、並びにその用途に関する。
本発明は以下の通りである。
（１）ホスホリパーゼＤ４（ＰＬＤ４）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYWMH（配列番号：２）、ＣＤＲ２として配列DIYPGSDSTNYNEKFKS（配列番号：３）およびＣＤＲ３としてGGWLDAMDY（配列番号：４）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（３）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDISNYLN（配列番号:５）、ＣＤＲ２として配列YTSRLHS（配列番号:６）およびＣＤＲ３として配列QQGNTLPW（配列番号:７）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（４）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYWMH（配列番号：２）、ＣＤＲ２として配列DIYPGSDSTNYNEKFKS（配列番号：３）およびＣＤＲ３として配列GGWLDAMDY（配列番号：４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDISNYLN（配列番号:５）、ＣＤＲ２として配列YTSRLH（配列番号:６）およびＣＤＲ３として配列QQGNTLPW（配列番号:７）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（５）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列TYWMH（配列番号：８）、ＣＤＲ２として配列AIYPGNSETSYNQKFKG（配列番号：９）および配列ＣＤＲ３としてGYSDFDY（配列番号：１０）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（3B4抗体）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（６）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列HASQGIRSNIG（配列番号:１１）、ＣＤＲ２として配列HGTNLED（配列番号:１２）およびＣＤＲ３として配列VQYVQFP（配列番号:１３）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（７）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列TYWMH、ＣＤＲ２として配列AIYPGNSETSYNQKFKGおよびＣＤＲ３として配列GYSDFDYを有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列HASQGIRSNIG、ＣＤＲ２として配列HGTNLEDおよびＣＤＲ３として配列VQYVQFPを有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（８）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列DYNLH（配列番号：１４）、ＣＤＲ２として配列YIYPYNGNTGYNQKFKR（配列番号：１５）および配列ＣＤＲ３としてGGIYDDYYDYAIDY（配列番号：１６）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（5B7抗体）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（９）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASENIYSHIA（配列番号:１７）、ＣＤＲ２として配列GATNLAH（配列番号:１８）およびＣＤＲ３として配列QHFWGTP（配列番号:１９）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１０）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列DYNLH（配列番号：１４）、ＣＤＲ２として配列YIYPYNGNTGYNQKFKR（配列番号：１５）およびＣＤＲ３として配列GGIYDDYYDYAIDY（配列番号：１６）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASENIYSHIA（配列番号:１７）、ＣＤＲ２として配列GATNLAH（配列番号:１８）およびＣＤＲ３として配列QHFWGTP（配列番号:１９）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１１）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYYLY（配列番号：２０）、ＣＤＲ２として配列LINPTNSDTIFNEKFKS（配列番号：２１）およびＣＤＲ３としてEGGYGYGPFAY（配列番号：２２）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（8C11抗体）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１２）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列TSSQTLVHSNGNTYLH（配列番号:２３）、ＣＤＲ２として配列KVSNRFS（配列番号:２４）およびＣＤＲ３として配列HSTHVP（配列番号:２５）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１３）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYYLY（配列番号：２０）、ＣＤＲ２として配列LINPTNSDTIFNEKFKS（配列番号：２１）およびＣＤＲ３としてEGGYGYGPFAY（配列番号：２２）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列TSSQTLVHSNGNTYLH（配列番号:２３）、ＣＤＲ２として配列KVSNRFS（配列番号:２４）およびＣＤＲ３として配列HSTHVP（配列番号:２５）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１４）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYGMS（配列番号：２６）、ＣＤＲ２として配列TISSGGSYIYYPESVKG（配列番号：２７）およびＣＤＲ３としてLYGGRRGYGLDY（配列番号：２８）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（10C3抗体）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１５）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RSSKSLLHSDGITYLY（配列番号:２９）、ＣＤＲ２として配列QMSNLAS（配列番号:３０）およびＣＤＲ３として配列AQNLEL（配列番号:３１）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１６）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SYGMS（配列番号：２６）、ＣＤＲ２として配列TISSGGSYIYYPESVKG（配列番号：２７）およびＣＤＲ３として配列LYGGRRGYGLDY（配列番号：２８）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RSSKSLLHSDGITYLY（配列番号:２９）、ＣＤＲ２として配列QMSNLAS（配列番号:３０）およびＣＤＲ３として配列AQNLEL（配列番号:３１）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１７）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SHYYWT（配列番号：３２）、ＣＤＲ２として配列YISYDGSNNYNPSLKN（配列番号：３３）およびＣＤＲ３としてEGPLYYGNPYWYFDV（配列番号：３４）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（13D4抗体）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１８）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDIDNYLN（配列番号:３５）、ＣＤＲ２として配列YTSRLHS（配列番号:３６）およびＣＤＲ３として配列QQFNTLP（配列番号:３７）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（１９）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SHYYWT（配列番号：３２）、ＣＤＲ２として配列YISYDGSNNYNPSLKN（配列番号：３３）およびＣＤＲ３として配列EGPLYYGNPYWYFDV（配列番号：３４）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDIDNYLN（配列番号:３５）、ＣＤＲ２として配列YTSRLHS（配列番号:３６）およびＣＤＲ３として配列QQFNTLP（配列番号:３７）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２０）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SHYYWS（配列番号：３８）、ＣＤＲ２として配列YISYDGSNNYNPSLKN（配列番号：３９）およびＣＤＲ３としてEGPLYYGNPYWYFDV（配列番号：４０）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体（13H11）、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２１）軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDIDNYLN（配列番号:４１）、ＣＤＲ２として配列YTSRLHS（配列番号:４２）およびＣＤＲ３として配列QQFNTLP（配列番号:４３）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２２）重鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列SHYYWS（配列番号：３８）、ＣＤＲ２として配列YISYDGSNNYNPSLKN（配列番号：３９）およびＣＤＲ３として配列EGPLYYGNPYWYFDV（配列番号：４０）を有し、軽鎖の可変領域にＣＤＲ１として配列RASQDIDNYLN（配列番号:４１）、ＣＤＲ２として配列YTSRLHS（配列番号:４２）およびＣＤＲ３として配列QQFNTLP（配列番号:４３）を有する前記（１）に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２３）受託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１４として寄託されたハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４およびｍｐ１３Ｈ１１のいずれかが産生するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片。
（２４）前記（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマ。
（２５）受託番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１４として寄託されたハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４またはｍｐ１３Ｈ１１。
（２６）前記（２５）に記載のハイブリドーマを培養し、培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
（２７）次の工程を含む、ＰＬＤ４に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞の製造方法；
１）ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするリコンビナント ＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を免疫動物に投与する工程、および
２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ＰＬＤ４に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程。
（２８）ＰＬＤ４を発現する細胞が、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードする外来性のポリヌクレオチドを発現可能に保持する細胞である前記（２７）に記載の方法。
（２９）前記細胞が動物細胞である前記（２８）に記載の方法。
（３０）前記細胞がヒト由来の細胞である前記（２９）に記載の方法。
（３１）前記ヒト由来の細胞が、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である前記（３０）に記載の方法。
（３２）得られた抗体産生細胞をクローン化する工程を付加的に含む、前記（２７）〜（３１）のいずれか一項に記載の方法。
（３３）前記（２９）に記載の方法によって得られた抗体産生細胞を培養し、その培養物からモノクローナル抗体を採取する工程を含む、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体の製造方法。
（３４）下記の工程によって得ることができる、ＰＬＤ４を認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片：
１）ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするリコンビナント ＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を免疫動物に投与する工程、
２）前記免疫動物の抗体産生細胞から、ＰＬＤ４に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、および
３）工程２）で選択された抗体産生細胞を培養しその培養物からＰＬＤ４を認識する抗体を回収する工程。
（３５）（ａ）ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを外来性に発現可能に保持する動物細胞、またはその細胞膜分画を含む、ＰＬＤ４に結合する抗体を製造するための免疫原。
（３６）動物細胞がヒト由来の細胞である前記（３５）に記載の免疫原。
（３７）ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を被検細胞と接触させ、該細胞に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を検出する工程を含む、形質細胞様樹状細胞の検出方法。
（３８）ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、形質細胞様樹状細胞の検出用試薬。
（３９）次の成分のいずれかを形質細胞様樹状細胞に接触させる工程を含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
（ａ）ＰＬＤ４に結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）モノクローナル抗体（ａ）の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（４０）次の成分のいずれかを生体に投与する工程を含む、生体中の形質細胞様樹状細胞の活性抑制方法：
（ａ）ＰＬＤ４に結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）モノクローナル抗体（ａ）の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（４１）形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である前記（３９）または前記（４０）に記載の方法。
（４２）次の成分のいずれかを有効成分として含む、形質細胞様樹状細胞の活性抑制剤：
（ａ）ＰＬＤ４に結合し、形質細胞様樹状細胞の活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）モノクローナル抗体（ａ）の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
（４３）形質細胞様樹状細胞の活性が、インターフェロン産生活性およびインターフェロン産生細胞の生存のいずれか、または両方である前記（４２）に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、ＰＬＤ４を特異的に認識する抗体、その抗体の製造に有用な免疫、およびその免疫原を利用する抗ＰＬＤ４抗体の製造方法を提供する。ＰＬＤ４は、ＰＬＤ４ファミリーに属する膜タンパク質である。本発明者らは、ＰＬＤ４を特異的に認識する抗体を容易に得られることを明らかにした。本発明によって得ることができる抗ＰＬＤ４抗体は、他のＰＬＤファミリーを発現している細胞と、ヒトｐＤＣを識別する、高い特異性を有する抗体である。
【００２４】
好ましい態様において、本発明によって提供された抗ＰＬＤ４抗体は、ヒトｐＤＣと結合する。また本発明の抗体は、ヒトｐＤＣを特異的に認識する。したがって本発明の抗体はｐＤＣの検出や単離に有用である。ｐＤＣは、タイプ１ＩＦＮの大部分を産生する細胞である。したがってその検出や単離は、自己免疫疾患のような、ｐＤＣが関与する疾患の診断や研究において重要である。
【００２５】
さらに、好ましい態様において、本発明によって提供された抗ＰＬＤ４抗体は、ヒトｐＤＣの活性を調節する作用を有する。したがって、本発明の抗ＰＬＤ４抗体は、ｐＤＣの活性抑制に利用することができる。したがって、本発明の抗体を用いたｐＤＣの活性抑制を利用すれば、ＩＦＮαの発現が亢進した自己免疫疾患の患者においても、治療効果を期待することができる。
【００２６】
ｐＤＣは、わずかな細胞で多量のＩＦＮを産生する。ＩＦＮの中和には、ＩＦＮの分子数に応じた抗体が必要である。しかし本発明においては、産生細胞の活性が直接抑制される。その結果、抗ＩＦＮ抗体による中和と比較して、より少量の抗体で強力なＩＦＮの抑制効果を期待できる。さらに、持続的にＩＦＮが産生されている場合には、ＩＦＮの抗体による中和は一過的な抑制に留まると予想される。しかし本発明においては、ｐＤＣの活性が抑制され、このことから長期間にわたるＩＦＮ産生抑制効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ヒトＰＬＤ４（Ｃ１４ｏｒｆ１７５）タンパク質のアミノ酸配列（５０６残基）を示す図である。Ｎ末端から３１〜５３残基は膜貫通領域予測システムである「SOSUI program(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)」を使用した解析により、トランスメンブランドメインであると考えられる。５４〜５０６残基は二つのホスホジエステラーゼモチーフを含んでおり、このタンパク質はＩＩ型のトランスメンブランタンパク質であることが予想される。
【図２】図２は、ヒトＰＬＤ４タンパク質の予想される構造を示す模式図である。アミノ酸５０６残基中に二つのＨＫＤ（ＨｘＫｘｘｘｘＤ）モチーフを有し、スレオニン４７２の残基がリン酸化部位である可能性がある。
【図３】図３は、異種動物におけるヒトＰＬＤ４タンパク質の相同分子種と相同性を示すグラフである。マウスからヒトまでＰＬＤ４タンパク質が進化の過程で保存されている。
【図４】図４は、ヒトＰＬＤ４タンパク質ファミリー（パラロガス）と相同性を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒト免疫担当細胞におけるＰＬＤ４遺伝子のヒトｐＤＣ特異的発現を示すグラフである。ＰＬＤ４遺伝子の発現は静止期のｐＤＣでは発現が高く、ＣＤ１９＋Ｂ細胞では発現が低い。
【図６】図６は、ヒトＰＬＤ４ｍＲＮＡの組織発現パターンを示すグラフである。脾臓と末梢血白血球では発現が高い。
【図７】図７は、組換えヒトＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質の構造を示す模式図である。ヒトＰＬＤ４の細胞外ドメイン（５６−５０６アミノ酸）に対応するｃＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。この断片を、Ｎ末端にマウスＩｇκリーダーセグメントとマウスＩｇＧ２ａ重鎖定常Ｆｃ領域（ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３）とを含むＮ−Ｆｌａｇ  ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩクローニング部位に、挿入した。２９３Ｆ細胞をプラスミドで一時的にトランスフェクトし、培養上清を集めた。
【図８】図８は、ヒトＰＬＤ４への結合特異性を示すＦＡＣＳ解析図である。ｍｐ１１Ｇ９．６およびｃｈ１１Ｇ９．６抗体はヒトＰＬＤ４を特異的に認識するが、ヒトＰＬＤ３−２９３ＴやＰＬＤ５−２９３Ｔトランスフェクタントは認識しなかった。
【図９】図９は、カニクイザルＰＬＤ４への交差反応性を示すＦＡＣＳ解析図である。ｍｐ１１Ｇ９．６およびｃｈ１１Ｇ９．６抗体は２９３Ｔトランスフェクタント上でカニクイザルＰＬＤ４を認識することができた。
【図１０】図１０は、ヒトＰＢＭＣのｍｐ１１Ｇ９．６抗体による染色を示すＦＡＣＳ測定図である。ｍｐ１１Ｇ９．６抗体はヒトＰＢＭＣにおいてＢＤＣＡ２＋ｐＤＣを強く認識した。
【図１１】図１１は、ＣＡＬ−１細胞の精製抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。
【図１２】図１２は、ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５安定細胞株の抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。
【図１３】図１３は、ヒトＰＢＭＣの抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。すべての抗ＰＬＤ４抗体はヒトＰＢＭＣにおいてＢＤＣＡ２＋ｐＤＣを認識することができた。
【図１４】図１４は、ヒトＰＬＤ，カニクイザルＰＬＤ４，アカゲザルＰＬＤ４，マウスＰＬＤ４タンパク質のmultiple allignmentと相同性を表した図である。
【図１５】図１５は、ヒトＰＬＤ４−２９３Ｔ細胞にＦｌａｇタグ  カニクイザルＰＬＤ４発現ベクターを一過性遺伝子導入して、抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。抗Ｆｌａｇ抗体でカニクイザルＰＬＤ４タンパク質の細胞表面発現を確認した。
【図１６】図１６は、カニクイザルＰＬＤ４−ＣＴ１２５細胞の抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ測定図である。抗ＰＬＤ４抗体のうち７つ(３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６)はカニクイザルＰＬＤ４−ＣＴ１２５安定トランスフェクタントに結合することができる。
【図１７】図１７は、ヒトＰＬＤ４−２９３Ｔ細胞にＦｌａｇタグ  アカゲザルＰＬＤ４発現ベクターを一過性遺伝子導入して、抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。抗Ｆｌａｇ抗体でアカゲザルＰＬＤ４タンパク質の細胞表面発現を確認した。
【図１８−１】図１８−１および図１８−２は、アカゲザルＰＢＭＣの抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。抗ＰＬＤ４抗体のうち５つ（５Ｂ７、７Ｂ４、１３Ｄ４、１３Ｈ１１および１４Ｃ１）はアカゲザルＰＢＭＣにおいてカニクイザルのｐＤＣ細胞群（Lineage-CD123+ HLA-DR+）に特異的に結合した。
【図１８−２】図１８−１および図１８−２は、アカゲザルＰＢＭＣの抗ＰＬＤ４抗体での染色を示すＦＡＣＳ解析図である。抗ＰＬＤ４抗体のうち５つ（５Ｂ７、７Ｂ４、１３Ｄ４、１３Ｈ１１および１４Ｃ１）はアカゲザルＰＢＭＣにおいてカニクイザルのｐＤＣ細胞群（Lineage-CD123+ HLA-DR+）に特異的に結合した。
【図１９】図１９は、ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５安定細胞株に対する抗ＰＬＤ４抗体の乖離定数モル濃度（ｎＭ単位，Ｋｄ値）を示すグラフである。
【図２０】図２０は、１０種類の抗ＰＬＤ４抗体のＣＤＣ活性を示すグラフである。標的細胞：ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５（マウス２Ｂ４  Ｔ細胞リンパ球）安定トランスフェクタント抗体濃度：１０μｇ／ｍＬエフェクター：１％幼若ウサギ補体
【図２１】図２１は、抗ＰＬＤ４抗体（ｍｐ１１Ｇ９．６抗体とｃｈ１１Ｇ９．６抗体）のＣＤＣ活性を示すグラフである。標的細胞：ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５（マウス２Ｂ４  Ｔ細胞リンパ球）安定トランスフェクタント抗体濃度：０．１μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬエフェクター：１％幼若ウサギ補体
【図２２】図２２は、抗ＰＬＤ４キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。標的細胞：ヒトＰＬＤ４−ＣＨＯ安定トランスフェクタント抗体濃度：１０μｇ／ｍＬ
【図２３】図２３は、３人の健常人から分離したヒトＰＢＭＣにおける抗ＰＬＤ４キメラ抗体（ｃｈ１１Ｇ９．６）での処理によるＩＦＮ−α分泌阻害をＥＬＩＳＡで測定したグラフである。
【図２４】図２４は、抗ＰＬＤ４キメラ抗体での処理後のヒトｐＤＣ消失を示す図である。
【図２５】図２５は、ヒト初期ｐＤＣに対する抗ＰＬＤ４キメラ抗体のＡＤＣＣ試験の結果である。
【図２６】図２６は、抗ＰＬＤ４キメラ抗体の存在下での、ＣｐＧ２２１６によるＰＢＭＣからのＩＦＮα産生である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らはＰＬＤ４が、静止期のプラズマ細胞様樹状細（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐＤＣ）においてｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで特異的に発現している分子であることを見出した。ＰＬＤ４を認識する抗体の製造方法は確立されていない。
【００２９】
マウスＰＬＤ４は生後初期の小脳や脳梁における発達期のアメボイド（活性化状態）ミクログリアに発現する分子であるという報告があるが、ヒトＰＬＤ４の発現については今までまったく知られていない。特に、免疫系においてヒトＰＬＤ４の発現、細胞内局在、構造、機能などは今までまったく報告がなかった。本発明により、今まで細胞質内にしか発現しないと考えられたヒトＰＬＤ４はtype II膜貫通タンパク質としてヒトプラズマ細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に発現する細胞表面マーカーであることが確認された。したがって、ＰＬＤ４抗体がｐＤＣに結合することが可能になり、Ｂ細胞、ｐＤＣ細胞の機能調節を目的とする治療用抗体の分子ターゲットとして有用であることが証明された。
【００３０】
本発明者らは遺伝子発現解析によって、ＰＬＤ４がヒトｐＤＣにおいて特異的に発現していることを確認した。ＰＬＤ４を他の分子と免疫学的に識別できる抗体が得られれば、ｐＤＣの研究に有用であろうと考えた。ところがＰＬＤ４を含むＰＬＤファミリーには、構造の良く似た多くの分子が存在する。ＰＬＤ４であるＰＬＤを含め、ＰＬＤ１、ＰＬＤ２、ＰＬＤ３、ＰＬＤ５などの分子は、特に相同性の高いアミノ酸配列を含む（図４）。したがって、ＰＬＤ４(または細胞外ドメイン)を構成するアミノ酸配列（部分配列）を使ったペプチドを免疫原として使い、これらの分子を相互に識別することができる抗体を得ることは困難であると考えられた。そこで本発明者らは、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードするリコンビナントＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を免疫原として、ＰＬＤ４に対する抗体の取得を試みた。
【００３１】
本発明者らはＰＬＤ４を認識する抗体を取得するために研究を重ね、リコンビナントＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を免疫原として使うことによって、目的とする抗体を得られることを明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片に関する。
【００３２】
本発明において、ＰＬＤ４はヒトｐＤＣに発現している天然の分子であり、またはヒトｐＤＣに発現しているＰＬＤ４と免疫学的に同等な分子である。本発明において、抗体がＰＬＤ４に結合することは、たとえば次のようにして確認することができる。
・ヒト細胞との反応性に基づく確認：
本発明者らの得た知見によれば、ＰＬＤ４は、ヒトｐＤＣに特異的な発現が見られることから、ｐＤＣのマーカーとして利用できると考えられる。
【００３３】
このようなＰＬＤ４の発現プロファイルに基づけば、まず、ｐＤＣの少なくとも一部のサブセットとの結合活性は、本発明におけるＰＬＤ４に結合する抗体の重要な特徴の一つである。ある細胞がｐＤＣであることは、各細胞群に固有の細胞表面マーカーによって確認することができる。たとえば、目的とする細胞に対して結合することは、細胞表面マーカーに結合する抗体と、結合活性を確認すべき抗体による二重染色によって確認される。すなわち、本発明におけるｐＤＣは、たとえばＢＤＣＡ２を発現する細胞を含む。
【００３４】
・ＰＬＤ４遺伝子を発現する形質転換細胞との反応性に基づく確認：
本発明者らは、特定の条件でＰＬＤ４遺伝子を発現させたときに、ヒトｐＤＣで発現しているＰＬＤ４の免疫学的特徴が再構成されることを確認した。したがってＰＬＤ４をコードする遺伝子を人為的に導入した細胞に対する抗体の反応性に基づいて、ＰＬＤ４との反応性を確認することもできる。すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列を細胞外ドメインとして含む分子と結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片に関する。なお細胞外ドメインとは、配列番号１に示したアミノ酸配列のＮ末端から配列番号１（図１）における５４〜５０６に相当するアミノ酸配列によって構成される。
例えば、ＰＬＤ４をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した細胞においては、ヒトｐＤＣで発現しているＰＬＤ４の免疫学的特徴が維持される。したがって、ＰＬＤ４を発現する形質転換細胞は、本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインに対する抗体の結合性を確認するための細胞として好ましい。本発明において、形質転換細胞によって抗体の反応性を確認するときには、対照として、形質転換されていない細胞を利用するのが望ましい。
【００３５】
次に、本発明におけるＰＬＤ４に結合する抗体は、ＰＬＤ４以外のＰＬＤファミリーを発現していることが知られている細胞群との交差性が見られる抗体であっても、また見られない抗体であってもよい。当該交差性が見られない抗体は本発明におけるＰＬＤ４に結合する抗体として好ましい。具体的には、ｐＤＣに対する結合を確認した条件と同じ条件の下で、ＰＬＤ４以外のＰＬＤファミリーを発現していることが知られている細胞群との結合が確認できない抗体は、本発明におけるＰＬＤ４に結合する抗体として好ましい。
【００３６】
すなわち本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体とは、好ましくは、以下の免疫学的特徴を有するモノクローナル抗体を含む。
a) ヒトｐＤＣと結合する、
b) ヒトｐＤＣと結合する条件下で、単球、マクロファージ、ＣＤ３４陽性細胞並びにこれらの細胞に由来する樹状細胞からなる群から選択される１または複数種の細胞との結合が確認できない。
特に、ヒトｐＤＣと結合する条件下で、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＣＤ３４陽性細胞およびこれらの細胞に由来する樹状細胞との結合が確認できない抗体は、本発明のモノクローナル抗体として好ましい。
【００３７】
あるいは本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体とは、好ましくは、以下の免疫学的特徴を有するモノクローナル抗体を含む。
c) ＰＬＤ４をコードするＤＮＡを発現可能に保持した発現ベクターで形質転換された形質転換細胞と結合する、
d) c)の形質転換細胞と結合する条件下で、c)の形質転換される前の宿主細胞との結合が確認できない。
【００３８】
本発明において、抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体が、ＰＬＤファミリーの他の分子と交差しないことは、各ＰＬＤファミリーを強制発現させた細胞を使って確認することができる。すなわち、各ＰＬＤファミリーのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な宿主細胞に導入して強制発現させる。得られた形質転換細胞に対して、交差性を確認すべき抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体を接触させる。そして、ＰＬＤ４以外のＰＬＤファミリー分子を発現する細胞に対する結合が見られなければ、その抗体がＰＬＤ４を他のＰＬＤファミリー分子と免疫学的に識別できることが確認できる。例えば後に述べる実施例においては、本発明によって得られた抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体のほとんどが、特にＰＬＤ４との相同性の高かったＰＬＤ３およびＰＬＤ５、さらにはＰＬＤ１やＰＬＤ２とも交差しないことが確認されている。したがって、ＰＬＤ４と結合し、同じ条件においてＰＬＤ３、ＰＬＤ５、ＰＬＤ１、ＰＬＤ２との結合が検出できないモノクローナル抗体は、本発明における好ましいモノクローナル抗体である。これらＰＬＤファミリー分子をＰＬＤ４と免疫学的に識別することができる抗体を利用すれば、ＰＬＤ４の発現の変化を特異的に検出することができる。
【００３９】
結合活性を確認すべきモノクローナル抗体と、各種の細胞との結合は、たとえばフローサイトメトリーの原理で確認することができる。フローサイトメトリーの原理による抗体の反応性の確認のためには、抗体は検出可能なシグナルを生成する分子または原子団で標識しておくと有利である。一般的には、蛍光標識や発光標識が利用される。蛍光標識した抗体と細胞との結合をフローサイトメトリーの原理で解析するために、蛍光標示式細胞分取器(fluorescence-activated cell sorter；ＦＡＣＳ)を利用することができる。ＦＡＣＳを利用することによって、複数の抗体と細胞との結合を効率的に確認することができる。
【００４０】
具体的には、たとえばｐＤＣを同定することができることが予め明らかな抗体Ａと、ｐＤＣとの結合特性を解析すべき抗体Ｂを同時にｐＤＣを含む細胞群に反応させる。抗体Ａと抗体Ｂには互いに識別できる蛍光シグナルを標識しておく。両者のシグナルが同じ細胞群から検出されれば、それらの抗体が同じ細胞群に結合していることが確認できる。すなわち、抗体Ａと抗体Ｂが同じ結合特性を有していることがわかる。もしも抗体Ａと抗体Ｂが異なる細胞群に結合したときは、両者の結合特性が異なることが明らかである。
【００４１】
本発明における好ましいモノクローナル抗体として、たとえば、
ハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４、ｍｐ１３Ｈ１１
が産生するモノクローナル抗体を示すことができる。
ハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４、ｍｐ１３Ｈ１１
は、２０１２年１月２７日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構内特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に対して、
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１４
として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（１）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  製品評価技術基盤機構産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ）
あて名：日本国千葉県茨城県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）
（２）寄託日：２０１２年１月２７日
（３）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１１（ハイブリドーマｍｐ５Ｂ７）
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１２（ハイブリドーマｍｐ７Ｂ４）
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１３（ハイブリドーマｍｐ１３Ｄ４）
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１４（ハイブリドーマｍｐ１３Ｈ１１）
【００４２】
本発明のモノクローナル抗体は、その抗原結合領域を含む断片であってもよい。たとえばＩｇＧの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインまたはペプシンによる消化によって、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２などの抗体断片を得ることができる。また、あるモノクローナル抗体のcomplementarily-determining region（ＣＤＲ）を移植された可変領域を含むイムノグロブリンの断片も抗原結合領域を含む断片に含まれる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体の例としては、たとえばキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、シングルチェインＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体等を示すことができる。モノクローナル抗体、またはそれを産生する抗体産生細胞をもとに、これらの抗体を得る方法は公知である。
【００４３】
本発明のモノクローナル抗体は、リコンビナント ＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質、あるいはヒトＰＬＤ４を発現する形質転換細胞を免疫原とすることによって得ることができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を産生する細胞の製造方法に関する。
（１）ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含む外来性のタンパク質を免疫動物に投与する工程、および
（２）その免疫動物の抗体産生細胞から、ＰＬＤ４に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程。
このようにして得られた抗体産生細胞、または当該抗体産生細胞の不死化された細胞を培養し、その培養物から目的とするモノクローナル抗体を回収することができる。抗体産生細胞を不死化するための方法については種々の方法が公知である。
【００４４】
本発明において免疫原とする形質転換細胞は、たとえば下記のＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列をコードする外来性のポリヌクレオチド（ａ）を発現可能に保持した細胞を調製することによって得ることができる。
本発明において、外来性のポリヌクレオチドとは、当該ポリヌクレオチドが人為的に宿主細胞に導入されたものであることを言う。細胞としてヒト細胞を用いる場合には、ヒトの細胞にヒトの遺伝子が導入される。このような組み合わせにおいても、人為的に導入されたポリヌクレオチドは、外来性のポリヌクレオチドと言う。したがって、ＰＬＤ４の異所性の発現は、外来性のポリヌクレオチドの発現に含まれる。
【００４５】
本発明において、ＰＬＤ４の細胞外ドメインとは、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、その細胞外ドメインに相当する５４−５０６位のアミノ酸配列を言う。例えば、Ｎ末端側から、以下の順にしたがって各領域のそれぞれを含むアミノ酸配列は、本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列として好ましい。
［細胞内領域＋膜貫通ドメイン＋細胞外ドメイン］
あるいは、下記のように細胞内領域を部分的に欠くアミノ酸配列も、本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列に含まれる。
［細胞内領域の一部＋膜貫通ドメイン＋細胞外ドメイン］
さらに、下記のように細胞内領域を欠いた構造も、本発明におけるＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列に含まれる。
［膜貫通ドメイン＋細胞外ドメイン］
【００４６】
前記構造において、細胞外ドメイン以外の領域は、配列番号１に示すアミノ酸配列から選択された配列であることもできるし、その他の相同なアミノ酸配列を組み合わせることもできる。たとえば、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内領域を構成するアミノ酸配列は、ＰＬＤ４以外のＰＬＤファミリー分子のアミノ酸配列とすることもできる。あるいは、ヒト以外の種のＰＬＤファミリーのアミノ酸配列を組み合わせることもできる。さらに、細胞外ドメイン以外の領域を構成するアミノ酸配列には、各領域の機能を維持できる範囲で、変異を含むことができる。また、各領域の間に、その他の領域を介在させることもできる。たとえば、シグナル配列と細胞外ドメインの間に、ＦＬＡＧなどのエピトープタグを挿入することもできる。特にシグナル配列は、タンパク質に翻訳された後、細胞膜表面に移送される段階でプロセシングされて除去される領域である。したがって、翻訳されたタンパク質の細胞膜の通過を誘導する任意のアミノ酸配列を、シグナル配列として利用することができる。より具体的には、ＰＬＤ４のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列として好ましい。
【００４７】
したがって、本発明において、前記ポリヌクレオチド(a)は、前記構造［細胞内領域＋膜貫通ドメイン＋細胞外ドメイン］を構成するアミノ酸配列をコードする任意の塩基配列とできる。たとえば配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号４４に記載のｃＤＮＡ塩基配列によってコードされている。
【００４８】
本発明において、免疫原とするリコンビナント ＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を得るには、適当な宿主細胞に、上記ポリヌクレオチドを発現可能に保持した発現ベクターを導入すればよい。該リコンビナント ＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１２５に、アミノ酸配列を配列番号１２６に示す。
【００４９】
本発明において、好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞である。具体的には、ヒト、サル、マウス、またはラットに由来する細胞を宿主細胞として利用することができる。特にヒト由来の細胞は、宿主細胞として好ましい。例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、本発明における宿主細胞として利用することができる好ましいヒト胚由来の腎細胞株である。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ATCC CRL-11268として入手することができる。その他、免疫動物に由来する細胞も、宿主細胞として利用することができる。免疫動物に由来する細胞を免疫原として利用すれば、宿主細胞に対する免疫応答が少ない。そのため、外来性に発現しているＰＬＤ４の細胞外ドメインに対する抗体を効率的に得ることができる。したがって、たとえば、マウスを免疫動物とするときには、マウス由来の細胞を宿主細胞として利用することもできる。
【００５０】
前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞において発現を誘導できるベクターに搭載して細胞に形質転換することができる。哺乳動物細胞において発現を誘導できる市販のベクターを利用すればよい。例えば、pCMV-Script(R) Vector、pSG5 Vector（Stratagene製）、pcDNA3.1（Invitrogen製）、pMXs-IP retroviral vector(Cell BioLabs製）などの発現ベクターを本発明に利用することができる。
【００５１】
こうして得られた形質転換細胞は、必要に応じてアジュバント等の付加的な成分とともに免疫動物に投与される。アジュバントとしては、フロインドのコンプリートアジュバントなどを利用することができる。マウスを免疫動物に利用する場合、BALB/cマウスに、精製リコンビナントＰＬＤ４−Ｉｇ融合タンパク質を投与する。アジュバントには、Freund's Adjuvant, CompleteおよびIncomplete(SIGMA製)を用い、初回は２００μg/匹、２回目以降４回目までは５０μg/匹を投与した。一般に、免疫原は、抗体価が上昇するまで間隔をあけて複数回投与される。たとえば、短期間免疫法の場合は、２〜４日、より具体的には３日間隔で形質転換細胞を投与し、２〜３回の投与の後に抗体産生細胞を回収することができる。また週１回程度の間隔で５〜６回投与した後に抗体産生細胞を回収することもできる。
【００５２】
本発明においては、モノクローナル抗体を得るために、回収された抗体産生細胞がクローニングされる。クローニングのために、抗体産生細胞を不死化するのが好ましい。たとえばハイブリドーマ法に代表される細胞融合法や、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）による形質転換を、抗体産生細胞を不死化するための方法として利用することができる。
【００５３】
抗体産生細胞は、１つの細胞が１種類の抗体を産生している。したがって、１つの細胞に由来する細胞集団を確立すること（すなわちクローニング）ができれば、モノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマ法とは、抗体産生細胞を適当な細胞株と融合させ、不死化した後にクローニングする方法を言う。不死化された抗体産生細胞は、限界希釈法などの手法によりクローニングすることができる。ハイブリドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝マーカーを有している。さらに抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生能を欠落した細胞株を用いることもできる。
【００５４】
例えばマウスミエローマP3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580)やP3x63Ag8U.1(ATCC CRL-1597)は、マウスやラットの細胞融合法に有用な細胞株として広く用いられている。一般にハイブリドーマは、同種の細胞の融合によって作成されるが、近縁の異種間でのヘテロハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００５５】
細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の抗体産生細胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。抗体産生細胞には、脾細胞、リンパ節から採取されたリンパ球細胞、末梢血Ｂ細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法が用いられる。
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえばＨＡＴ感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、ＨＡＴ培地において成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。さらに選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。
【００５６】
各ハイブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、先に述べたような方法によって、ＰＬＤ４に結合する抗体を産生するハイブリドーマが選択される。好ましくは、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、最終的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
【００５７】
具体的には、ヒト細胞との反応性、またはＰＬＤ４遺伝子を発現する形質転換細胞との反応性に基づいて、目的とするハイブリドーマを選択することができる。細胞に結合する抗体は、イムノアッセイの原理によって検出することができる。たとえば、細胞を抗原として利用するＥＬＩＳＡを、目的とする抗体の検出に利用することができる。具体的には、ヒトｐＤＣ、または免疫原として利用した形質転換細胞を固定化した担体に、ハイブリドーマの培養上清を接触させる。培養上清が目的とする抗体を含む場合には、抗体が担体に固定化された細胞に捕捉される。次いで、固相を培養上清から分離し、必要に応じて洗浄した後に、固相に捕捉された抗体を検出することができる。抗体の検出には、抗体を認識する抗体を利用することができる。たとえば、マウスの抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出することができる。抗体を認識する抗体を標識しておけば、その検出が容易である。標識には、酵素、蛍光色素、発光色素などを利用することができる。
一方、細胞を固定化する担体としては、粒子や、マイクロタイタープレートの内壁を利用することができる。プラスチック製の粒子や容器の表面には、細胞を物理吸着によって固定することができる。たとえばポリスチレン製のビーズや反応容器を、細胞を固定するための担体として利用することができる。
【００５８】
ハイブリドーマの選択において、ＰＬＤ４に対する抗体の産生ではなく、免疫原に用いた形質転換細胞の宿主細胞に対する抗体の産生が予測される場合がある。例えば、実施例に示したように、ヒト細胞を免疫原としマウスを免疫動物に利用すると、ヒト細胞が異物として認識され、それに結合する抗体の産生が予測される。本発明においては、ＰＬＤ４を認識する抗体の取得を目的とする。したがって、ＰＬＤ４以外のヒト細胞抗原を認識する抗体を取得する必要はない。このような抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングで排除するために、抗体の反応性の確認に先立ち、目的としない抗体を予め吸収することができる。
【００５９】
目的としない抗体は、存在が予測される抗体が結合する抗原によって吸収することができる。具体的には、例えばＰＬＤ４以外のヒト細胞抗原に対する抗体は、ＰＬＤ４の発現が検出できない細胞によって吸収することができる。本発明において、免疫原に用いた宿主細胞は、目的としない抗体を吸収するための抗原として好ましい。
【００６０】
抗原に対する結合活性が確認されたモノクローナル抗体は、必要に応じて実際にｐＤＣの活性に与える影響が確認される。ｐＤＣに対する影響は、たとえば後に述べるような方法によって確認することができる。
【００６１】
本発明のモノクローナル抗体は、それを産生するハイブリドーマを培養し、その培養物から回収することができる。ハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養することができる。in vitroにおいては、ＲＰＭＩ１６４０などの公知の培地を用いて、ハイブリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイブリドーマが分泌したイムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には、血清を添加しない方が、イムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイブリドーマのより迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、１０％程度のウシ胎児血清を培地に加えることもできる。
【００６２】
ハイブリドーマは、in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウスの腹腔にハイブリドーマを接種することにより、腹腔内でハイブリドーマを培養することができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られたモノクローナル抗体は、目的に応じて適宜、修飾、または加工することができる。
【００６３】
本発明のモノクローナル抗体は、当該ハイブリドーマから抗体の抗原結合領域をコードするｃＤＮＡを取得し、これを適当な発現ベクターに挿入することによって発現させることができる。抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡを取得し、適当な宿主細胞に発現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。例えば、可変領域の遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびヒトＩｇ  ｋａｐｐａ軽鎖定常領域をコードする遺伝子を結合することにより、キメラ抗体とすることができる。さらに、可変領域を構成するＣＤＲを他のイムノグロブリン分子のフレーム領域に組み込むことにより、モノクローナル抗体の抗原結合活性を他のイムノグロブリンに移植できることが知られている。これを利用して異種のイムノグロブリンが有する抗原結合活性をヒトイムノグロブリンに移植する方法が確立されている。例えば、ＣＤＲを支持しているフレーム領域の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト抗体可変領域をヒト抗体定常領域に連結すれば、ヒト化抗体を得ることができる。
【００６４】
本発明における好ましいモノクローナル抗体の例として、例えば、
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１１、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１２、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１３、ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−１２１４としてそれぞれ寄託された、ハイブリドーマｍｐ５Ｂ７、ｍｐ７Ｂ４、ｍｐ１３Ｄ４、ｍｐ１３Ｈ１１）などが産生するモノクローナル抗体を示すことができる。
前記可変領域を含むキメラ抗体、または可変領域を構成するＣＤＲを移植したヒト化抗体として、ＩｇＧまたはＩｇＭ由来の定常領域を有する抗体は、本発明における好ましい抗体に含まれる。特に、可変領域を構成するＣＤＲの配列として、
重鎖  ＣＤＲ１：DYNLH，ＣＤＲ２：YIYPYNGNTGYNQKFKR，ＣＤＲ３：GGIYDDYYDYAIDY，
軽鎖  ＣＤＲ１：RASENIYSHIA，ＣＤＲ２：GATNLAH，ＣＤＲ３：QHFWGTP，
の組み合わせをもつ抗体、可変領域を構成するＣＤＲの配列として、
重鎖  ＣＤＲ１：SHYYWT，ＣＤＲ２：YISYDGSNNYNPSLKN，ＣＤＲ３：EGPLYYGNPYWYFDV，
軽鎖  ＣＤＲ１：RASQDIDNYLN，ＣＤＲ２：YTSRLHS，ＣＤＲ３：QQFNTLP，
の組み合わせをもつ抗体、可変領域を構成するＣＤＲの配列として、
重鎖  ＣＤＲ１：SHYYWS，ＣＤＲ２：YISYDGSNNYNPSLKN，ＣＤＲ３：EGPLYYGNPYWYFDV，
軽鎖  ＣＤＲ１：RASQDIDNYLN，ＣＤＲ２：YTSRLHS，ＣＤＲ３：QQFNTLP，
の組み合わせをもつ抗体はより好ましい抗体である。
本発明者らは、ＰＬＤ４に対するモノクローナル抗体がＰＬＤ４発現細胞に対するＣＤＣ作用を有することを確認している。したがって、ＩｇＧまたはＩｇＭ由来の定常領域を有する抗体は、ＣＤＣ作用によるＰＬＤ４発現細胞に対する細胞障害作用を有する。このような抗体は、ｐＤＣなどのＰＬＤ４発現細胞の細胞数の抑制に有用である。
ＰＬＤ４を認識するキメラ抗体、またはヒト化抗体は、それをコードするポリヌクレオチドを利用して遺伝子工学的に製造することができる。
【００６５】
ＰＬＤ４を特異的に認識できる抗体は得られていない。本発明の免疫原によって、初めてＰＬＤ４を認識する抗体が提供された。すなわち本発明は、下記の工程によって得ることができる、ＰＬＤ４を認識する抗体を提供した。
（１）ＰＬＤ４の細胞外ドメインを含むタンパク質を免疫動物に投与する工程、
（２）その免疫動物の抗体産生細胞から、ＰＬＤ４に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、および
（３）（２）で選択された抗体産生細胞を培養しその培養物からＰＬＤ４を認識する抗体を回収する工程。
【００６６】
ＰＬＤ４は、ヒトｐＤＣにおいて特異的に発現していることが明らかにされている。本発明者らのＳＡＧＥによる遺伝子発現解析においても、ヒトｐＤＣにおける特異的な発現が確認された。しかし過去の報告においては、ＰＬＤ４の発現レベルはいずれもｍＲＮＡに基づいて解析されていた。また、ＰＬＤ４タンパク質は細胞質内でほんのわずかだけ発現することが知られている。本発明によりＰＬＤ４は細胞表面にも発現することが明らかになった。ＰＬＤ４の検出が可能な抗体が提供されていなかったため、タンパク質の発現状態を解析することは従来行われなかった。本発明によって提供されたＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体は、ＰＬＤ４タンパク質の解析を実現した。
【００６７】
実際に本発明者らが確認したところ、本発明に基づくＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体は、ヒトｐＤＣを特異的に検出した。すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を被検細胞に接触させ、細胞に結合したモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を検出する工程を含む、形質細胞様樹状細胞の検出方法に関する。
【００６８】
本発明に基づいてＰＬＤ４を検出することによって、ある細胞がｐＤＣであるかどうかを確認することができる。すなわち本発明は、ＰＬＤ４を指標として用いるｐＤＣの同定方法を提供する。あるいは本発明に基づいてＰＬＤ４が検出された細胞を分離することによって、ヒトｐＤＣを分離することができる。すなわち本発明は、ＰＬＤ４を指標とするｐＤＣの分離方法を提供する。
【００６９】
本発明において、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片は、標識しておくことができる。たとえば、発光色素や蛍光色素によって標識することにより、抗体を容易に検出することができる。より具体的には、蛍光色素標識抗体をｐＤＣを含む可能性のある細胞集団と接触させ、本発明の抗体が結合した細胞を蛍光色素を指標として検出することができる。さらに、蛍光色素が検出された細胞を分離すれば、ｐＤＣを分離することができる。一連の工程は、ＦＡＣＳの原理により容易に実施することができる。
【００７０】
あるいは本発明の抗体を磁性粒子などの固相担体に結合しておくこともできる。固相担体に結合した抗体がＰＬＤ４を認識し、ｐＤＣが固相担体に捕捉される。その結果、ｐＤＣを検出または分離することができる。
【００７１】
本発明に基づくｐＤＣの検出方法に必要な抗体は、ｐＤＣ検出用試薬として供給することができる。すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片を含む、ｐＤＣの検出用試薬を提供する。本発明のｐＤＣの検出用試薬には、抗体のほか、陽性対照、または陰性対照を組み合わせることができる。たとえば、免疫原に利用したＰＬＤ４の細胞外ドメインを発現する形質転換細胞や、ヒトから採取されたｐＤＣなどを陽性対照として利用することができる。通常、ヒトｐＤＣは末梢血からはわずかしか得ることができない。したがって、特に形質転換細胞は、本発明の試薬における陽性対照として好ましい。一方、陰性対照には、ＰＬＤ４を発現しない任意の細胞を利用することができる。
【００７２】
すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片とを含む、ヒトｐＤＣの検出用キットを提供する。
【００７３】
また本発明者らは、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体がｐＤＣに与える影響を解析した。その結果、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体は、ｐＤＣの活性を抑制することが確認された。すなわち本発明は、次の成分のいずれかをｐＤＣに接触させる工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性抑制方法に関する。
（ａ）ＰＬＤ４に結合し、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、および
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
【００７４】
あるいは本発明は、次の成分のいずれかを生体に投与する工程を含む、生体中のｐＤＣの活性抑制方法に関する。
（ａ）ＰＬＤ４に結合し、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）のモノクローナル抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の成分をコードするポリヌクレオチド。
【００７５】
本発明においてｐＤＣは、ＩＦＮ産生能を有し、かつ細胞表面にＰＬＤ４を発現する細胞をいう。以下、特に断りの無い場合には、ｐＤＣは、樹状細胞の前駆細胞である細胞のみならず、ＩＦＮ産生能を有し、かつ細胞表面にＰＬＤ４を発現する細胞を含む。このようなｐＤＣの同定方法は公知である。例えばいくつかの細胞表面マーカーを指標として用い、ｐＤＣを他の血液細胞と識別することができる。具体的には、ヒトｐＤＣの細胞表面マーカーのプロファイルは次のとおりである(Shortman, K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002)。近年になって、ＢＤＣＡ―２陽性細胞をｐＤＣと位置づける報告もある(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000)。
［ヒトｐＤＣの細胞表面抗原のプロファイル］
ＣＤ４陽性、ＣＤ１２３陽性、
Ｌｉｎｅａｇｅ(ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６)陰性、ＣＤ１１ｃ陰性
したがって、これらの公知のマーカーの発現プロファイルを持ち、ＩＦＮ産生能を持つ細胞をｐＤＣということもできる。さらに、これらのマーカーの発現プロファイルの発現パターンとは異なるプロファイルを持つ細胞群であっても、ＩＦＮ産生能を有する生体中の細胞はｐＤＣに含まれる。
さらに、ヒトｐＤＣに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を示すことができる。
［細胞の形態上の特徴］
・プラズマ細胞に似ている
・細胞表面が平滑な丸い細胞
・核が比較的大きい
［細胞の機能的な特徴］
・ウイルス感染時に、短期間に大量のＩ型ＩＦＮを産生する
・ウイルス感染後、樹状細胞に分化する
【００７６】
本発明において、ｐＤＣの活性抑制とは、ｐＤＣが有する機能の少なくとも一つを抑制することを言う。ｐＤＣの機能の例として、ＩＦＮの産生と細胞生存が含まれる。細胞の生存は、細胞数と言い換えることもできる。したがって、これらの機能のいずれかまたは両方を抑制することを、ｐＤＣの活性を抑制するという。ｐＤＣによって産生されるＩ型ＩＦＮが種々の疾患の原因となっていることが明らかにされている。したがって、ｐＤＣの細胞数やＩＦＮの産生を抑制することは、それらの疾患の治療戦略として有用である。
例えば、自己免疫性の疾患の病態とＩＦＮαの関連性が指摘されている。ＩＦＮαの大部分がｐＤＣによって産生されている。したがってその産生を抑制すれば、ＩＦＮαによってもたらされる病態を緩和することができる。なお本発明において、ｐＤＣによるＩＦＮ産生抑制とはｐＤＣが産生するＩＦＮの少なくとも１種類のＩＦＮ産生を抑制することを言う。本発明における好ましいＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮである。中でもＩＦＮαは重要である。
【００７７】
すなわち本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体を有効成分として含有する、ＩＦＮ産生抑制剤に関する。あるいは本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体を投与する工程を含む、ＩＦＮの産生抑制方法を提供する。さらに本発明は、ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体の、ＩＦＮの産生を抑制するための医薬組成物の製造における使用に関する。
【００７８】
ｐＤＣには、少数の細胞で大量のＩＦＮを産生する細胞が含まれる。例えば、ウイルスなどで刺激を受けた樹状細胞の前駆細胞は、生体が産生するＩＦＮの大部分を産生する。大量のＩＦＮを産生するｐＤＣの細胞数を抑制することは、結果としてＩＦＮの産生量を抑制することになる。したがって、ｐＤＣの細胞数の抑制によっても、ＩＦＮαによってもたらされる病態を緩和することができる。
本発明の好ましい態様において、抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体は、ＰＬＤ４発現細胞に結合し、補体依存性の細胞障害（ＣＤＣ）作用によって細胞障害作用を与えることが確認された。ＣＤＣ作用は、抗体医薬の重要な作用機序の一つである。本発明の抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体も、そのＣＤＣ作用により、ｐＤＣなどのＰＬＤ４発現細胞に対する強力な細胞障害作用を有する。つまり、抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体は、好ましい態様において、ＩＦＮ産生の抑制機構に加えて、ｐＤＣに対する細胞障害作用によっても、ＩＦＮ産生抑制効果を期待することができる。
【００７９】
本発明に用いられるＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識する抗体は、先に述べたような方法に基づいて得ることができる。本発明における抗体は、任意のクラスであってよい。また抗体が由来する生物種も限定されない。さらに、抗体の抗原結合領域を含む断片を抗体として用いることができる。たとえばＩｇＧの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインまたはペプシンによる消化によって、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’)２などの抗体断片を得ることができる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しうることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築された抗体の例には、たとえばキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、シングルチェインＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体等が含まれる。モノクローナル抗体を基に、これらの抗体を得る方法は公知である。
【００８０】
本発明において、抗体は、必要に応じて修飾することができる。本発明によれば、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識する抗体は、ｐＤＣの活性を抑制する作用を有する。すなわち、抗体そのものがｐＤＣに対する細胞障害作用を有している可能性が考えられた。強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。あるいは、抗体を細胞障害物質によって修飾することによって、ｐＤＣの活性抑制効果をさらに増強することができる。細胞障害物質の例には、以下のような物質が含まれる。
トキシン類：緑膿菌毒素（ＰＥ）、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素：Tc99m、Sr89、I131、Y90
抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
タンパク質からなるトキシン類は、２官能性試薬によって抗体またはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合タンパク質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。さらに抗癌剤は、糖鎖または２官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。
【００８１】
本発明においては、人為的に構造を改変された抗体を有効成分として利用することもできる。例えば、抗体の細胞障害作用や安定性を改善するための様々な修飾方法が公知である。具体的には、重鎖の糖鎖が改変されたイムノグロブリンが知られている(Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem.278:3466-3473. 2003.)。糖鎖の改変によって、イムノグロブリンの抗体依存性の細胞障害（ＡＤＣＣ）活性が増強された。
【００８２】
ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体は、抗体をｐＤＣに接触させるとｐＤＣの活性を抑制する。したがってこれらの抗体を、ｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法に利用することができる。すなわち本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を有効成分として含む、ｐＤＣの活性抑制剤を提供する。あるいは本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を投与する工程を含むｐＤＣの活性抑制方法に関する。さらに本発明は、下記（ａ）−（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１種類の成分のｐＤＣ活性調節剤の製造における使用に関する。
（ａ）ＰＬＤ４の細胞外ドメインに結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片、
（ｂ）（ａ）の抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片。
本発明において、ｐＤＣの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を利用することができる。本発明においては、１種類または複数種類のモノクローナル抗体を利用することができる。たとえば、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識する複数種のモノクローナル抗体を配合して、本発明に利用することができる。
【００８３】
抗体がｐＤＣのＩＦＮ産生活性の抑制作用を有することは次のようにして確認することができる。ｐＤＣはウイルスの刺激によってＩＦＮを大量に産生する。ｐＤＣに対するウイルス刺激の前、後、またはウイルス刺激と同時に抗体を与え、抗体を与えないｐＤＣを対照として、ＩＦＮの産生能を比較する。ＩＦＮ産生能は、ｐＤＣの培養上清中に含まれるＩＦＮ−αやＩＦＮ−βを測定することによって評価することができる。比較の結果、抗体の添加によって、上清中のＩＦＮの量が有意に低下すれば、試験された抗体は、ＩＦＮ産生能を抑制する作用を有することが確認できる。これらＩＦＮの測定方法は公知である。ｐＤＣは、生体におけるＩＦＮの大部分を産生する細胞である。したがって、ｐＤＣのＩＦＮ産生能の抑制によって、生体のＩＦＮの産生状態を調節することができる。
【００８４】
本発明において、ｐＤＣの活性にはｐＤＣの細胞数の維持が含まれる。したがって本発明におけるｐＤＣの活性の抑制は、ｐＤＣの細胞数の抑制を含む。ｐＤＣの細胞数が、抗体の存在下で抑制されることを確認すれば、当該抗体がｐＤＣの活性を抑制していることがわかる。比較対照としては、ＩＦＮ産生と同様に、活性を確認すべき抗体と同じ動物種に由来する不活性なイムノグロブリンを用いることができる。ｐＤＣの細胞数は、細胞の計数によって定量的に比較することができる。細胞数は、ＦＡＣＳや顕微鏡によって計数することができる。
【００８５】
また、ｐＤＣはウイルスなどの感染の結果Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ２（ＤＣ２）というＴｈ２を誘導する細胞へ分化するとも言われている。ウイルス刺激によるＩＦＮ産生ｐＤＣを抑制できれば、Ｔｈ２への分化も抑制できる可能性がある。したがって、ＩＦＮ産生を抑制する本発明のモノクローナル抗体は、各種アレルギー疾患の治療効果も期待できる。
【００８６】
ＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識する抗体を、その抗体が由来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識されにくい形に抗体を加工するのが望ましい。たとえば、次のような分子に加工することにより、イムノグロブリンを異物として認識されにくくすることができる。イムノグロブリン分子を以下のように加工する手法は公知である。
・定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
・モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年（石田 功、安東 民衛 編）)
・宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）をモノクローナル抗体のＣＤＲに置換したＣＤＲ置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年（石田 功、安東 民衛 編）)
【００８７】
あるいは、ファージディスプレー法(McCafferty J. et al., Nature 348:552-554,1990; Kretzschmar T et.al., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598-602.)によって、ヒトのイムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することもできる。ファージディスプレー法においては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組み込まれる。多様なイムノグロブリン遺伝子をソースとして用い、ファージライブラリーを作成することもできる。ファージは自身を構成するタンパク質の融合タンパク質として、当該可変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原との結合活性を維持している。したがって、抗原または抗原を発現した細胞などに結合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、目的とする結合活性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。さらに、こうして選択されたファージ粒子の中には、目的とする結合活性を有する可変領域をコードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、可変領域の結合活性を指標として、目的とする結合活性を有する可変領域をコードしている遺伝子を取得することができる。
【００８８】
本発明によるｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法において、ＰＬＤ４の細胞外ドメインを認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片は、タンパク質として、あるいはそれをコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを投与するには、目的とするタンパク質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下に目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが望ましい。ベクターには、エンハンサーやターミネーターを配置することもできる。イムノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、イムノグロブリン分子を発現することができるベクターが公知である。イムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるベクターはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる(ex vivo)。
【００８９】
本発明に基づくｐＤＣの活性抑制剤、または抑制方法において、生体に投与されるモノクローナル抗体の量は、イムノグロブリンとして体重１ｋｇあたり、通常０．５ｍｇ〜１００ｍｇ、たとえば１ｍｇ〜５０ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜１０ｍｇである。生体への抗体の投与間隔は、治療期間中の生体内におけるイムノグロブリンの有効濃度が維持できるように適宜調節することができる。具体的には、例えば、１〜２週間間隔で投与することができる。投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適宜選択することができる。具体的には、投与経路の例として、経口的に、または非経口的な投与が挙げられる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または皮下注射等により、全身または局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投与に適当な製剤の例として、注射剤、座剤、噴霧剤などが挙げられる。またイムノグロブリンを細胞に与える場合には、培養液中に通常１μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上のイムノグロブリンを与える。
【００９０】
本発明のｐＤＣの活性抑制剤または抑制方法において、モノクローナル抗体は、任意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体と配合される。モノクローナル抗体には、必要に応じて増粘剤、安定剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体または添加剤の例としては、ラクトース、クエン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、スクロース、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどが挙げられる。「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認されているか、または各国の薬局方若しくは一般的に認知されている薬局方に動物、哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることをいう。本発明のｐＤＣの活性抑制剤は、１回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、さらに、投与の前に該組成物を所望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または緩衝液を組み合わせることもできる。
【００９１】
さらに、イムノグロブリンを発現するベクターとして本発明のｐＤＣの活性抑制剤を投与する場合には、重鎖と軽鎖を別のプラスミドとしてコトランスフェクトするとして、体重１ｋｇあたり各プラスミドを０．１〜１０ｍｇ、例えば１〜５ｍｇを投与することができる。また in vitro において細胞に導入するためには、１〜５μｇ／１０６ｃｅｌｌのベクターが用いられる。以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１
Ａ．ＰＬＤ４の発現解析
Ａ−１）ＳＡＧＥライブラリーを用いた解析
Ｒｅｓｔｉｎｇ  ｐＤＣ細胞、ヒト単球、および不活性ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）を処理した活性化ｐＤＣ細胞における遺伝子の発現を、ＳＡＧＥTM（Serial Analysis of Gene Expression）法により比較した。解析方法は次のとおりである。
ヒト末梢血より、単球をＣＤ１４陽性細胞として、ヒトｐＤＣ細胞をＢＤＣＡ−４陽性細胞としてBDCA-4+ isolation kit(Miltenyi Biotec社)とMACS system(Miltenyi Biotec社)で分離した。さらに、ヒトｐＤＣ細胞を不活性ＨＳＶ−１存在下で１２時間培養して活性化ｐＤＣ（pDC+HSV）を調製した。それぞれの細胞より全 ＲＮＡを抽出し、I-SAGETMkit（Invitrogen社）を用いて、ＳＡＧＥライブラリーを作製した。得られた約１０万タグの塩基配列データを、SAGE2000 Analysis Software（Invitrogen社）で解析した。その結果、単球/pDC/pDC＋HSVのスコア値が0/9/0の遺伝子、すなわちｒｅｓｔｉｎｇ ｐＤＣ細胞特異的な発現を示す遺伝子として、既知の遺伝子であるＰＬＤ４（Phospholipase D family, member 4, C14orf175; GenBank Accession Number: NM_138790.2）が見出された（図１、Tao et al., Nat. Methods 2(8), 591-598(2005); Clark et al., Genome Res. 13(10), 2265-2270(2003)。ＰＬＤ４は、配列番号：４４に示す塩基配列によってコードされる５０６アミノ酸配列（配列番号：１）である。ＰＬＤ４タンパク質はＣ末端領域に保存された２つのＨＫＤモチーフ（His-x-Lys-x-x-x-x-Aspアミノ酸配列, xはその他のアミノ酸）で構成される２つの暫定的なＰＤＥ領域(Phosphodiestrase motif)と、暫定的なリン酸化部位（Thr 472）を有する。ＰＬＤ４タンパク質の構造はｔｙｐｅ II型一回膜貫通タンパク質と予測される。また、ＰＬＤ４タンパク質はＮ末端領域には古典的なＰＬＤファミリーであるＰＬＤ１とＰＬＤ２が有するＰＸ領域(Phoxホモロジードメイン)とＰＨ領域（Pleckstrinホモロジードメイン）を持っていない（図１および２）。
【００９３】
Ａ−２）定量リアルタイムＰＣＲによるＰＬＤ４ ｍＲＮＡのヒト各種免疫担当細胞における発現解析
ＰＬＤ４ ｍＲＮＡの血球細胞での発現をより詳細に検討した。ヒト末梢血から、セルソーターによって各細胞を分取した。分取した各細胞群からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、定量リアルタイムＰＣＲを行い、ＰＬＤ４ ｍＲＮＡの発現レベルを解析した。
定量リアルタイムＰＣＲ反応はPlatinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG kit（Invitrogen社）を用いて、ABI PRISM 7000により定量ＰＣＲを行った。データ解析にはSequence Detection System Software（Applied Biosystem社）を用いた。ＰＣＲ反応条件と使用したプライマーの塩基配列は下記である。
ＰＬＤ４用フォワードプライマー: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（配列番号：４５）
ＰＬＤ４用リバースプライマー: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（配列番号：４６）
ＧＡＰＤＨ用 フォワードプライマー: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（配列番号：４７）
ＧＡＰＤＨ用リバースプライマー: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（配列番号：４８）
58℃ 2分を１サイクル、
95℃10分を１サイクル、
[95℃15秒、60℃ 60秒]を50サイクル、
ｐＤＣ、ＨＳＶで刺激したｐＤＣ（pDC+HSV）、Ｂ細胞（CD19+細胞）、活性化Ｂ細胞（CD19+細胞）、Ｔ細胞（CD3+細胞）、ＩｎｏｍｙｃｉｎとＰＭＡ(Phorbol 12-myristate 13-acetate)で刺激した活性化Ｔ細胞、について検討した。その結果、ＰＬＤ４発現が静止期のｐＤＣ特異的に高く、ＣＤＩ９＋Ｂ細胞では発現が低いことが示された。その他のヒト血液分画ｃＤＮＡはBDTM MTC Multiple Tissue cDNA Panels（Cat.No.636750 、Takara Bio社）を用いた（図５）。
【００９４】
Ａ−３）定量リアルタイムＰＣＲによるヒト組織におけるＰＬＤ４ ｍＲＮＡの発現解析
さらに、その他の臓器、組織における発現をABI PRISM 7000（Applied Biosystem社）を用いた定量ＰＣＲにより検討した。ｃＤＮＡパネルとして、BDTM MTC multiple tissue cDNA panel(Human I; Cat.No.636742, Human immune; Cat.No.636748；いずれもTakara Bio社)を用いた。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
ＰＬＤ４用フォワードプライマー: 5' ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（配列番号：４９）
ＰＬＤ４用リバースプライマー: 5' TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（配列番号：５０）
ＧＡＰＤＨ用 フォワードプライマー: 5' AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（配列番号：５１）
ＧＡＰＤＨ用リバースプライマー: 5' GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（配列番号：５２）
Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG kit（Invitrogen社）を用いて、ABI PRISM 7000により定量ＰＣＲを行った。解析にはSequence Detection System Software（Applied Biosystem社）を用いた。反応条件は次のとおりである。
ステップ1：50℃, 2分を1サイクル
ステップ2：95℃, 10分を1サイクル
ステップ3：95℃, 15秒、60℃, 1分を50サイクル
恒常的に発現していることが知られているＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子の発現レベルで標準化することにより、ＰＬＤ４遺伝子の発現を各組織間で比較した。その結果、ＰＬＤ４ ｍＲＮＡは脾臓と末梢血白血球に比較的高い発現を示していた。また、他の組織にも広範囲にＰＬＤ４ ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。ただし、そのＰＬＤ４ ｍＲＮＡの発現レベルはｒｅｓｔｉｎｇ ｐＤＣ細胞の発現レベルの１００倍以下であった（図６）。
【００９５】
ヒトＰＬＤ４発現ベクターの作製
ヒトＰＬＤ４タンパク質を発現させるため、ＰＬＤ４遺伝子の発現ベクターの作製を行った。pCR4-TOPOクローニングベクターに組み込まれたPLD4 cDNA clone(Open Biosystem, Cat. No. MHS4771-99610856)からＰＬＤ４遺伝子のみをEcoRI酵素で取り出し、pcDNA3.1発現ベクターに組み込んだ（PLD4-pcDNA3.1 ベクター）。得られたヒトPLD4-pcDNA3.1プラスミドを鋳型として用い、EcoRI、Not I、およびKozak sequence（GCC GCC ACC）を含むプライマーでＰＬＤ４遺伝子を増幅した（プライマーの情報は下記に示す）。ＰＣＲ産物はpMX-IP レトロウイルスベクターにEcoRIとNot Iサイトでクローニングされた(ヒトPLD4-pMX-IP レトロウイルスベクター)。ＰＣＲ反応にはKOD Plus DNA polymerase（TOYOBO社）１ユニットを用い、反応条件としては、９４℃２分を１サイクル行った後、［９４℃１５秒、６８℃ １分３０秒］を２５サイクルとした。
フォワードプライマー（配列番号：５３）: 5' ttt GAA TTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3' (30-mer)
リバースプライマー（配列番号：５４）: 5' aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3' (34-mer)
シークエンス解析とともに、HEK(Human Embryoinc Kidney)-293T細胞(以下、２９３Ｔ細胞)にヒトPLD4-pMX-IP レトロウイルスベクターを一過性トランスフェクションし、ヒトＰＬＤ４が２９３Ｔ細胞の表面に発現するかを細胞染色後に、ＦＡＣＳ方法で確認した。
実施例２
抗ヒトＰＬＤ４抗体の特異性の検討
抗ＰＬＤ４モノクローナル抗体が、ＰＬＤファミリーの他の分子と交差しないことは、各ＰＬＤファミリーを強制発現させた細胞を使って確認することができる。ヒトＰＬＤ４はＰＬＤファミリーに属し、相同性の高い分子が複数存在し、ヒトＰＬＤ４はヒトＰＬＤ３と約４１％，ヒトＰＬＤ５とは約２９．３％の相同性を示す（図４）。
１）ヒトＰＬＤ３とヒトＰＬＤ５の発現ベクター作製
ヒトＰＬＤ３（ｃＤＮＡ  配列番号：５５、アミノ酸  配列番号：１２７）およびヒトＰＬＤ５（ｃＤＮＡ  配列番号：５６、アミノ酸  配列番号：１２８）については、pCMV-SPORT6 vectorに取り込まれたhuman PLD3 clone(K.K. DNAFORM社, Cat. No. 5189261)とpCR-Blunt II-TOPO vectorに取り込まれたhuman PLD5 clone(K.K. DNAFORM社, Cat. No. 40025860)からＰＬＤ３とＰＬＤ５遺伝子のみをＰＣＲで増幅させ、それぞれの遺伝子をFlag tagged付きでpcDNA3.1（Invitrogen社）のHindIII、EcoRI部位にクローニングされ、発現ベクターを作製した（primerの情報は下記に示す）。
（ヒトＰＬＤ３用）
フォワードプライマー : huPLD3-IF(HindIII)
配列 : 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG AAG CCT AAA CTG ATG TAC 3' (39-mer)（配列番号：５７）
リバースプライマー : huPLD4-1518R(EcoRI)
配列 : 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3' (57-mer)（配列番号：５８）
（ヒトＰＬＤ５用）
フォワードプライマー : huPLD5-IF(HindIII)
配列 : 5' ttt AAG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3' (39-mer)（配列番号：５９）
リバースプライマー : huPLD5-1383R(EcoRI)
配列 : 5' ttt gaa ttc TCA ctt atc gtc gtc atc ctt gta atc TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' (57-mer)（配列番号：６０）
上記のプライマー配列のうち、下線部は付加したＦＬＡＧタグをコードする塩基配列を示し、斜体は制限酵素HindIIIの切断部位あるいはEcoRIの部位を示す。
シークエンス解析とともに、２９３Ｔ細胞にヒトPLD3-pcDNA3.1ベクターあるいはヒトPLD5-pcDNA3.1ベクターを一過性トランスフェクションし、ヒトＰＬＤ４が２９３Ｔ細胞の表面に発現するかを細胞染色後に、ＦＡＣＳ方法で確認した。
その結果、ヒトＰＬＤ３あるいはヒトＰＬＤ５が発現していると思われる細胞には抗体が反応しなかったことから、これらの抗ＰＬＤ４抗体はヒトＰＬＤ４分子を特異的に認識することが示唆された（図８）。
【００９６】
ヒトＰＬＤ４発現細胞安定株の作製
作製したヒトPLD4-pMX-IP ベクターをretrovirus packaging vectorであるpCL-Eco ベクター(IMGENEX, Cat. No. 10045P)と共に、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、遺伝子導入をした。遺伝子導入実験は、FuGENE(登録商標) HD Transfection Reagent(Roche)をトランスフェクション試薬として使用した。２日後に、ヒトＰＬＤ４遺伝子を含むレトロウイルスが分泌されている細胞培養上清を回収し、ＣＴ１２５細胞株（２Ｂ４マウスＴ細胞リンパ腫細胞系）に感染させた。pMX-IP レトロウイルスベクターはｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含むことから、感染させたＣＴ１２５細胞をｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で培養することで、ヒトＰＬＤ４を発現する細胞のみが生存できるようになり、セレクションが可能になる。セレクションされたヒトＰＬＤ４発現ＣＴ１２５細胞(以下、ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５)はＦＡＣＳソーティングによって、より高いヒトＰＬＤ４発現をするＣＴ１２５細胞のみを選択し、培養した。ヒトＰＬＤ４の発現を確認するため、ＣＴ１２５細胞は５μg/mlで調整した市販のマウス抗ヒトＰＬＤ４ ポリクローナル抗体(Abnova, Cat # : HOO122618-B01P)で染色し、ＦＡＣＳ解析を行った。その結果、ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５細胞安定株が樹立され、ハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニングに使用した。
【００９７】
カニクイザルとアカゲザルＰＬＤ４発現ベクターの構築、およびヒトＰＬＤ４発現細胞安定株の作製
カニクイザルとアカゲザルＰＬＤ４タンパク質を発現させるため、サルＰＬＤ４遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの構築を行った。
１）カニクイザルＰＬＤ４とアカゲザルＰＬＤ４遺伝子のクローニング
アカゲザルＰＬＤ４のｃＤＮＡ配列はGenbank database（XM_002805227.1）などに報告されているが、一部であり全長のｃＤＮＡは報告されていない。さらに、カニクイザル(cynomolgus monkey)ＰＬＤ４の遺伝子配列はまだ報告されていないため、カニクイザルとアカゲザルのＰＢＭＣ（それぞれ10 ml; 新日本科学）から遺伝子のクローニングを行った。
サル末梢血よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、その５μgより、オリゴｄＴプライマーおよびSuperScript Choice System for cDNA Synthesis kitを用いてｃＤＮＡを合成した。
作製したｃＤＮＡを鋳型として、次の塩基配列のプライマーを用いてカニクイザルＰＬＤ４とアカゲザルＰＬＤ４遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。
フォワードプライマー(cynoPLD4-32F): 5' AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3'（配列番号：６１）
リバースプライマー(cynoPLD4-1554R: 5' TCA GCC CTG CCA AAC GCA GTC CTG G3'（配列番号：６２）
増幅された約１５２１ base pairのカニクイザルＰＬＤ４と１５２１塩基対のアカゲザルPLD4 cDNA断片を、１％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離、回収し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit（Invitrogen社）を用いてpCR4Blunt-TOPO plasmid vector（Invitrogen社）にクローニングした。得られた遺伝子の塩基配列を解析し、配列番号：６３および配列番号：１２４に示す。目的のカニクイザルＰＬＤ４とアカゲザルＰＬＤ４遺伝子がクローニングできたことを確認した。
ヒトＰＬＤ４タンパク質はカニクイザルＰＬＤ４（配列番号：１２９）と約９４．４．％のタンパク質配列の同一性、アカゲザルＰＬＤ４（配列番号：１３０）に対しては約９４％のタンパク質配列の同一性を示す。図１４はヒトＰＬＤ４とカニクイザルＰＬＤ４、アカゲザルＰＬＤ４、およびマウスＰＬＤ４（ｃＤＮＡ  配列番号：１３１、アミノ酸  配列番号：１３２）のタンパク質配列間の相同性を示す。
２）カニクイザルＰＬＤ４発現細胞安定株の作製
作製したカニクイザルPLD4-pMX-IPベクターをヒトＰＬＤ４発現細胞安定株の作製方法と同じ方法で、レトロウイルスベクターを感染させたＣＴ１２５細胞をｐｕｒｏｍｙｃｉｎ存在下で培養することで、カニクイザルＰＬＤ４発現細胞安定株を樹立した。
カニクイザルＰＬＤ４の発現を確認するため、細胞をサルＰＬＤ４にも交差反応性を示す市販のマウス抗ヒトＰＬＤ４ ポリクローナル抗体(Abnova, Cat # : H00122618-B01P)で染色し、ＦＡＣＳ解析を行った。その結果、カニクイザルＰＬＤ４-ＣＴ１２５細胞安定株が樹立され、ハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニングに使用した（図１６）。
【００９８】
ヒトＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質の作製
抗ヒトＰＬＤ４モノクローナル抗体作製の免疫原に使用するため，ヒトＰＬＤ４タンパク質の細胞外領域（５６−５０６  ａ．ａ）とマウスIgG2a Fcフラグメント(重鎖のヒンジ部分とCH2, CH3を含む234 a.a.)を融合させた２１４２  ｂｐのＤＮＡ断片を２段階のＰＣＲ方法で増幅し，ヒトPLD4-Ig pcDNA3.1とヒトPLD4-Ig pEE14.4 の発現ベクタープラスミドを構築した（ｃＤＮＡとタンパク質配列は配列表に明記）。
培養上清からタンパク質を得るため，マキシプレップＤＮＡをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（以下２９３Ｆ細胞、カタログ番号R790-07；Invitrogen）へ一過性トランスフェクションした。トランスフェクション後、７日目に，コトランスフェクションした２９３Ｆ細胞の培養液を５０mLチューブに回収し，２，０７０g，４℃条件で５分間遠心分離を行った。上清をポアサイズ０．４５μmのシリンジフィルター（カタログ番号431220；CORNING）でろ過し、培養上清をひとつにまとめた。
回収した細胞培養上清をAKTA-FPLCシステムのprotein A affinity columnで精製し、組換えヒトＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質のタンパク質を精製した（図７）。
【００９９】
実施例３
Ａ．抗ヒトＰＬＤ４モノクローナル抗体の作製
Ａ−１）免疫
免疫原として、上記の組換えＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質を用いた。BALB/cマウス３匹の背部皮下に、ＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質を投与した。アジュバントには、Freund's Adjuvant, CompleteおよびIncomplete(SIGMA)を用い、初回は２００μg/匹、２回目以降４回目までは５０μg/匹を投与した。
Ａ−２）抗血清力価の確認
３回目および、４回目免疫後に採血し、血清中の抗ＰＬＤ４−Ｉｇの力価をＥＬＩＳＡで評価した。
９６wellマイクロタイタープレートに、ＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質を固相化した。抗血清は１０００倍から３倍ずつ段階希釈し、７２９０００倍までの希釈系列を調製した。各サンプルは、抗原固相化プレートに５０μLずつ添加し、一次反応を行った。洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ(κ，λ)抗体で二次反応を行い、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）で発色検出(４９０nm)した。
【０１００】
Ａ−３）細胞融合
抗血清力価の上昇が認められたマウスから脾細胞を摘出した。摘出した脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を、ＰＥＧ法で融合させ、ＨＡＴ培地により融合脾細胞の選択培養を行った。
【０１０１】
ＣＡＬ−１細胞を用いたハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニング
ＨＡＴ選択培養により得られた融合脾細胞各クローンの産生抗体について、ＦＡＣＳで評価した。ヒトのｐＤＣ様細胞株ＣＡＬ−１細胞は２x１０5を下記各ハイブリドーマの培養上清５０μlで１５分間４℃で反応させた。ＦＡＣＳバッファー(１% FBS+ PBS)で２回洗浄した後、遠心し、上清を除去した。２次抗体としてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BD Bioscience: 550589）を用いて、２０分間４℃で反応させた。各クローンの培養上清はＨＡＴ選択培養開始後１０日目の培養液を原倍で用いた。その結果、ハイブリドーマ培養上清の３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１、１１Ｇ９．６はＣＡＬ−１細胞に良く反応した（図１１）。
【０１０２】
ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５安定細胞株を用いたハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニング
ＨＡＴ選択培養により得られた融合脾細胞各クローンの産生抗体について、ＦＡＣＳで評価した。ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５は２x１０5を下記各ハイブリドーマの培養上清５０μlで１５分間 ４℃で反応させた。ＦＡＣＳバッファー(１% FBS+ PBS)で２回洗浄した後、遠心し、上清を除去した。２次抗体としてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BD Bioscience: 550589）を用いて、２０分間４℃で反応させた。その結果、ハイブリドーマ培養上清の３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６はヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５細胞に良く反応した（図１２）。
【０１０３】
Ａ−５）ヒト末梢血ｐＤＣを用いたＦＡＣＳスクリーニング
［ヒトＰＢＭＣの単離］
健常人２０ml末梢血を回収し、HISTOPAQUE-1077(SIGMA社)を用いた比重遠心で末梢血単核球(ＰＢＭＣ)を分離した。１ｘ１０6のＰＢＭＣをサンプルごとに染色した。ＦＡＣＳ バッファーで細胞を洗浄した後、Fc block reagent(Militenyi社)を５倍希釈で２５μl加え、４℃で１５分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、各ハイブリドーマの細胞培養上清５０μl、およびマウスＩｇＧ２ｂ，κを加え、４℃で２０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄後、ＰＥラベルされた抗マウス ＩｇＧ抗体を加え、４℃で２０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄後、ＡＰＣラベルされた抗ＢＤＣＡ２抗体を１０倍希釈の５０μl加え、４℃で２０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄後、３００μlのＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁し、FACS Calibur(BD)にて解析した。ｍｐ１１Ｇ９．６抗体はｐＤＣに結合を示した。（図１０）。
また、３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１の９種類のＰＬＤ４抗体はＢＤＣＡ２陽性細胞であるｐＤＣ細胞群に対して特異的な結合反応を示した（図１３）。
【０１０４】
Ａ−６）抗ＰＬＤ４抗体のサルへの交差反応性
カニクイザルＰＬＤ４−ＣＴ１２５安定細胞株とアカゲザルＰＬＤ４−２９３Ｔ一過性トランスフェクタント（transient transfectant）細胞を用いたハイブリドーマのＦＡＣＳスクリーニング
ＨＡＴ選択培養により得られた融合脾細胞各クローンの産生抗体をＦＡＣＳで評価した。ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５は２x１０5を下記各ハイブリドーマの培養上清５０μlで１５分間４℃で反応させた。ＦＡＣＳバッファー(１% FBS+ PBS)で２回洗浄した後、遠心し、上清を除去した。２次抗体としてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BD Bioscience: 550589）を用いて、２０分間４℃で反応させた。その結果、１０種類のＰＬＤ４抗体のうち３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１、１１Ｇ９．８抗体の７種類の抗体はカニクイザルＰＬＤ４−ＣＴ１２５細胞とアカゲザルＰＬＤ４−２９３Ｔ細胞に良く反応した（図１５，図１６，図１７）。
Ａ−７）抗ＰＬＤ４抗体のサルＰＢＭＣへの交差反応性
アカゲザルのＰＢＭＣは末梢血（１０ ml; 新日本科学）より９６％ Ficoll-Paque(商標) PLUS(GE Healthcare社、Cat No. 17-1440-02)を用いた比重遠心で分離した。ＦＡＣＳには、１サンプルあたり５x１０5の細胞を使用した。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーで希釈した１０％のカニクイザルの血清を１０μl加え、４℃で２０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄後、各ハイブリドーマの細胞培養上清１００μl、１０μg/ mlのマウスＩｇＧ２ａ，κまたはマウスＩｇＧ１，κを加え、４℃で１５分間反応させた。ＦＡＣＳバッファーで洗浄後、１μg/ mlのＡＰＣラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体を加え、４℃で２０分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄後、ＦＩＴＣラベルされた抗Ｌｉｎｅａｇｅ１抗体、ＰＥラベルされた抗ＣＤ１２３抗体、およびPerCP-Cy5.5でラベルされた抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を１０倍希釈の２５μlで４℃で１５分間反応させた。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄後、３００μlのＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁し、FACS caliburにて解析した。使用したハイブリドーマ培養上清は、ＰＬＤ４特異的で、ＣＡＬ−１細胞やヒトｐＤＣによく結合する３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６の１０種類を選択した。その結果、５Ｂ７、７Ｂ４、１３Ｄ４、１３Ｈ１１および１４Ｃ１の５種類のハイブリドーマ細胞培養上清はカニクイザルのｐＤＣ細胞群(Lineage-CD123+ HLA-DR+)に特異的に結合した（図１８）。
【０１０５】
Ａ−８）限界希釈方法によるハイブリドーマのクローニング
１）限界希釈方法によるクローニングおよび２ｎｄスクリーニング
１１Ｇ９．６ハイブリドーマを除いて、選択された９種類（３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１）のハイブリドーマをクローニングに供するクローン化するため、限界希釈を行った。限界希釈は９６wellプレート２枚に播種し、播種６日後に細胞を顕微鏡下で観察し、モノクローン由来かつ良好な増殖を示す全てのウェルの培養上清を回収した。回収した培養上清をサンプルとしてＦＡＣＳ解析を行った。
ＦＡＣＳ解析は、細胞株ＣＡＬ−１表面抗原を、各クローンの培養上清と２次抗体としてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（BD Bioscience: 550589）を用いて染色した。各クローンの培養上清は限界希釈に播種後７日目の培養液を原倍で用いた。
２）クローニングおよび３ｒｄスクリーニング
２ｎｄスクリーニングのＦＡＣＳ解析結果および、各ウェルの細胞の状態に基づき、各クローンから１ウェルを選択して、再度の限界希釈を行った。限界希釈は２）と同様に行い、回収した培養上清をサンプルとしてＦＡＣＳ解析(３ｒｄ)を行った。ＦＡＣＳ解析データ等に基づき、以下の９種類（３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１）のクローンが限界希釈方法によりクローニングされ、抗ヒトＰＬＤ４抗体産生ハイブリドーマが安定細胞株として確立された。
【０１０６】
３）１１Ｇ９．６ハイブリドーマのシングル化
上記の９種類以外の１１Ｇ９．６のハイブリドーマを回収し、ソーティングバッファー(１%FBS/PBS)で１×１０5 cells/mlになるように懸濁した。FACS Aria(BD)を用いてsingle cell sortingを行った。データを取り込み、取り込んだデータをＸ軸:ＦＳＣとＹ軸:ＳＳＣの２次元ドットプロットで展開した。そのドットプロット上で生細胞をゲートで囲んだ。生細胞ゲート内の細胞からダブレットを除くためのゲートをかけ、その細胞集団を９６穴平底プレートに１cell/wellとなるよう分取した。Single cell sortingした細胞は、ＨＡＴ培地(RPMI1640+２mM L-Glutamine,１０Unit/ml Penicillin-Streptomycin,１０mM HEPES,１mM Sodium Pyruvate,５０μM 2-ME) + ハイブリドーマ成長サプリメントＨＦＣＳ(Roche社)で培養した。その後、ハイブリドーマの細胞培養上清を用い、ＣＡＬ−１細胞、ヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５発現安定細胞株、ヒトＰＢＭＣ、およびサルＰＬＤ４−ＣＴ１２５発現安定細胞株を染色し、シングルハイブリドーマの１１Ｇ９．６を選択した。
【０１０７】
４）凍結細胞バイアルの作製と培養上清の回収
以上のＦＡＣＳ解析結果および、各ウェルの細胞の状態に基づき、各クローンから１ウェル選択した。選択したウェルは５０mLスケールで拡大培養を行った。培地は１０%FCS，ペニシリンストレプトマイシンを含むRPMI1640とした。細胞はサブコンフルエントまで培養し、細胞数１×１０6 cell/tubeで凍結保存した。凍結保存液としては、バンバンカー（日本ジェネティクス）を用いた。また、この時の培養上清を回収保存した。
【０１０８】
実施例４
抗体精製
プロテインＡアフィニティーカラム(rProteinA Sepharose Fast Flow(カタログ番号17-1279-01, GE Healthcare社)を用いた精製により、ハイブリドーマの培養上清から１０種類(３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６)の精製抗体を得た。Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit(Thermo Fisher Scientific社)を用いてアイソタイプを確認した。その結果、３Ｂ４と１４Ｃ１はマウスＩｇＧ１，κで、１０Ｃ３はマウスＩｇＧ２ａ，κで、その他はマウスＩｇＧ２ｂ，κであった。精製抗体にエンドトキシンが含まれていると、性質決定試験の結果に影響を与えることがあるため、エンドトキシン濃度の測定を行った。使用したKitはエンドスペシー ES-50Mセット、トキシカラー DIA-MPセット、およびエンドトキシン標準品 CSE-Lセット（いずれも生化学バイオビジネス社）である。その結果、いずれの精製抗体のエンドトキシン濃度も基準値である０．３EU/mg Ab以下であった。
【０１０９】
精製抗体の反応性の検討
精製抗体の結合能をヒトｐＤＣ様細胞株であるＣＡＬ−１細胞で確認した。その結果、いずれの抗体も細胞表面上のヒトＰＬＤ４に対する結合能を維持していることが確認できた（図１１）。また、ヒト末梢血のｐＤＣ細胞群（BDCA2+）に対しても特異的に結合した（図１３）。
【０１１０】
精製ＰＬＤ４抗体のＫｄ値算出
精製抗体の結合能をヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５発現安定細胞株を精製ＰＬＤ４抗体の濃度を低濃度から高濃度まで（０．００１μg/ml〜３０μg/ml）、陽性染色率が１００％近くまで反応させた。細胞の陽性染色率と抗体をGraph Pad Prism version 5 sofwareを利用してデータ解析し、乖離定数モル濃度(Kd value)をnM単位で計算した。抗ＰＬＤ４抗体のＫｄ値（nM）は３Ｂ４と１４Ｃ１の２ cloneを除いて、全部１nM以下あるいは１nM近くのＫｄ値を示すことから、非常に強くヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５細胞に結合した（図１９）。
【０１１１】
実施例５
抗ＰＬＤ４抗体のヒトＰＬＤ４−ＣＴ１２５発現細胞への捕体依存的細胞障害活性
幼若ウサギ血清を補体源として、ヒトＰＬＤ４を発現するＣＴ１２５細胞安定株（以下HuPLD4-CT-125とする）に対する抗ＰＬＤ４抗体の補体依存性細胞障害活性(以下ＣＤＣ活性とする)を測定した。活性の指標は細胞から放出された乳酸脱水素酵素(Lactase dehydrogenase:ＬＤＨ)の測定値より算出した細胞毒性とした。各細胞を２×１０4cells/５０μl/wellずつ９６穴U底プレートに分注した。ＣＤＣ培地(RPMI1640+ ０．１%BSA+１０mM HEPES+２mM L-Glutamine+１% Pen-Strep)で１% Baby rabbit complement(CEDARLANE社)を調製した。１０μg/mlのマウスアイソタイプコントロール抗体(マウス ＩｇＧ２ｂ，κ)と１０種類の抗ＰＬＤ４マウス精製抗体(３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６)を添加し、１時間反応させた。アッセイ系にはCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega社)のKitを用いた。その結果、HuPLD4-CT-125のターゲット細胞に対し、重鎖のアイソタイプがマウスＩｇＧ１である３Ｂ４と１４Ｃ１の２種類のＰＬＤ４抗体を除いて、８種類のＰＬＤ４抗体(５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１および１１Ｇ９．６)は１０μg/mlの抗体濃度で約３３．５％から７１．１％までのＣＤＣ活性を示した（図２０）。
実施例６
抗ＰＬＤ４抗体（１１Ｇ９．６）の濃度依存的な捕体依存的細胞障害活性マウスアイソタイプコントロール抗体(マウスＩｇＧ２ｂ，κ)、抗ＰＬＤ４マウス抗体(ｍｐ１１Ｇ９．６Ａｂ)、ヒトアイソタイプコントロール抗体(ヒトＩｇＧ１,κ)、抗ＰＬＤ４キメラ抗体(ｃｈ１１Ｇ９Ａｂ)を０．１μg/mlから３０μg/mlまでの計６点の抗体濃度で調整した。アッセイ系にはCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega社)のキットを用いた。その結果、HuPLD4-CT-125のターゲット細胞に対し、ｍｐ１１Ｇ９．６Ａｂは濃度依存的に３μg/mlの抗体濃度で約７０％のＣＤＣ活性を示した。一方、キメラ化抗体であるｃｈ１１Ｇ９Ａｂは３０μg/mlの高濃度でも１０％以下のＣＤＣ活性を示した（図２１）。
【０１１２】
実施例７
キメラ化抗体の作製
マウス抗ＰＬＤ４抗体を産生するハイブリドーマとして１０種類作製し、使用した。
１．定常領域のアイソタイプ確認
抗ＰＬＤ４抗体を産生するハイブリドーマより産生されたマウス抗ＰＬＤ４抗体の定常領域のアイソタイプを確認した。１０種類(３Ｂ４、５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１０Ｃ３、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１、１４Ｃ１および１１Ｇ９．６)のハイブリドーマの培養上清からPierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit(Thermo Fisher Scientific社)を用いてアイソタイプを確認した。その結果、３Ｂ４と１４Ｃ１はマウスＩｇＧ１, マウスＩｇ ｋａｐｐａで、１０Ｃ３はマウスＩｇＧ２ａ, マウスＩｇ ｋａｐｐａで、その他はマウスＩｇＧ２ｂ, マウスＩｇ ｋａｐｐａであった。
【０１１３】
２．マウス抗ＰＬＤ４抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
２−１）全ＲＮＡの単離
市販のキット「RNeasy Mini Kit」（Qiagen社、カタログ番号：74106）を用いてキット添付の指示書に従い、１１Ｇ９．６ハイブリドーマから全ＲＮＡを単離した。５×１０6細胞数のハイブリドーマ細胞株から調製して、約７９μｇの全ＲＮＡが得られた。
【０１１４】
２−２）マウス重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
２−１）で単離した全ＲＮＡのうち５μgを使用し、5’RACE PCR法によって、マウス重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。増幅にあたっては、市販キット「5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2.0 Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：18374-058）を用いた。詳細は以下の通りである。まず、２−１）で得られた全ＲＮＡから逆転写酵素によって、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。このとき、アンチセンスプライマー（ＧＳＰ１）は以下のものを用いた。ｃＤＮＡの増幅に使用するＧＳＰ１プライマーはそれぞれのマウス重鎖のアイソタイプにより使い分けされる。
たとえば、マウスＩｇＧ１重鎖を有する３Ｂ４と１４Ｃ１ハイブリドーマの重鎖可変領域クローニングには以下のアンチセンスプライマーを使用する。
ＧＳＰ１プライマー : mu IgG1 VH-GSP1
配列: 5'-CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3' (36-mer)（配列番号：６４）
ＧＳＰ２プライマー : mu IgG1 VH-GSP2
配列: 5'-GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3' (32-mer)（配列番号：６５）
マウスＩｇＧ２ａ重鎖を有する１０Ｃ３ハイブリドーマの重鎖可変領域クローニングには以下のアンチセンスプライマーを使用する。
ＧＳＰ１プライマー : muIgGHγ1-GSP1
配列: 5' TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3' (24-mer)（配列番号：６６）
ＧＳＰ２プライマー : muIgGHγ1-GSP2
配列: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3' (24-mer)（配列番号：６７）
そして、マウスＩｇＧ２Ｂ重鎖を有する５Ｂ７、７Ｂ４、８Ｃ１１、１１Ｄ１０、１３Ｄ４、１３Ｈ１１および１１Ｇ９．６)ハイブリドーマの重鎖可変領域クローニングには以下のアンチセンスプライマーを使用する。
ＧＳＰ１プライマー : muIgGHγ2B-GSP1
配列: 5' TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3' (24-mer)（配列番号：６８）
ＧＳＰ２プライマー : muIgGHγ2B-GSP2
配列 : 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3' (24-mer)（配列番号：６９）
さらに、第1鎖ｃＤＮＡの３’-末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、ヌクレオチドホモポリマーであるｄＣを付加した。そして、ｄＣ（アンカー配列）に相補的なヌクレオチドポリマーを３’-末端に有しているアンカープライマー（配列番号：７０）と、アンチセンスプライマー（ＧＳＰ２）を用いて、ＰＣＲ法によってｃＤＮＡを増幅した。さらに、得られたＰＣＲ産物をテンプレートとし、ＡＵＡＰプライマー（配列番号：７１）と表１に示すアンチセンスプライマー（ＧＳＰ２）を用いて、Nested PCR法によりｃＤＮＡを増幅した。さらに、このＰＣＲ産物を１．５％低融点アガロース法によって精製した。
【０１１５】
５'ＲＡＣＥ用アンカープライマー（配列番号：７０）
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' 36-mer)
５'ＲＡＣＥ用ＡＵＡＰプライマー（配列番号：７１）
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' 20-mer)
【０１１６】
２−３）マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅および断片化
２−１）で単離した全ＲＮＡから、２−２）と同様にして、マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。このとき、ｃＤＮＡの増幅に使用するＧＳＰ１プライマーはそれぞれのマウス軽鎖のアイソタイプにより使い分けされる。
【０１１７】
１０種類のＰＬＤ４抗体はマウスＩｇ  ｋａｐｐａ軽鎖を有するため、軽鎖クローニング用として、以下のアンチセンスプライマーを使用する。
ＧＳＰ１プライマー : mu IgG VL kappa-GSP1
配列 : 5'-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3' (31-mer)（配列番号：７２）
ＧＳＰ２プライマー : mu IgG VL kappa-GSP2
配列 : 5'-GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3' (23-mer)（配列番号：７３）
得られたＰＣＲ産物を１．５％低融点アガロース法によって精製した。
【０１１８】
２−４）ｃＤＮＡの塩基配列の確認とＣＤＲ領域の決定
２−２）で得られた重鎖可変領域、および２−３）で得られた軽鎖可変領域のｃＤＮＡ断片を、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書にしたがってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体からプラスミドを得て、配列解析のために、プラスミドDNA試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。配列の解析には「Sequencher DNA sequence assembly and analysis software version 4.2.2(Gene Codes Corporation)」と「GENETYX-MAC Version.11.1.1” software(GENETYX CORPORATION)」ソフトウェアを用いた。
【０１１９】
相補性決定領域（以下「ＣＤＲ領域」と記す）周辺に、フレームシフト、ナンセンス変異等を生じているために不活性ＲＮＡとなったものの転写物は除外し、正しい配列のものを抽出した。さらに、当該プラスミド中に含まれるｃＤＮＡ塩基配列について、Immunoglobulins データベース(IgBLAST, URL:www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)と相同性を確認し、各々の可変領域内のＣＤＲ領域(CDRs; CDR1, CDR2, CDR3)、ＦＷ領域(Frame work regions)と可変領域の配列をKabat numbering system(Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242, 5th ed., United States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD)の解析方法にしたがって決定した。
得られたマウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７４、アミノ酸配列は配列番号：７５である。マウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４である。
得られたマウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７６、アミノ酸配列は配列番号：７７である。マウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０である。
得られたマウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７８、アミノ酸配列は配列番号：７９である。マウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６である。
得られたマウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８０、アミノ酸配列は配列番号：８１である。マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６である。７Ｂ４抗体は、５Ｂ７抗体と重鎖と軽鎖の可変領域ＣＤＲ配列が同じである抗体である。
得られたマウス８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８２、アミノ酸配列は配列番号：８３である。マウス８ｃ１１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２である。
得られたマウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８４、アミノ酸配列は配列番号：８５である。マウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８である。
得られたマウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８６、アミノ酸配列は配列番号：８７である。マウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８である。１１Ｄ１０抗体は、１０Ｃ３抗体と重鎖と軽鎖の可変領域ＣＤＲ配列が同じ抗体である。ただし、重鎖のｉｓｏｔｙｐｅ（１０Ｃ３はマウスＩｇＧ２ａで、１１Ｄ１０はマウスＩｇＧ２ｂの定常領域）の違いがある。
得られたマウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８８、アミノ酸配列は配列番号：８９である。マウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４である。
得られたマウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９０、アミノ酸配列は配列番号：９１である。マウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０である。
得られたマウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９２、アミノ酸配列は配列番号：９３である。マウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０である。１４Ｃ１抗体は、１３Ｈ１１抗体と重鎖と軽鎖の可変領域ＣＤＲ配列が同じ抗体である。ただし、重鎖のｉｓｏｔｙｐｅ（１３Ｈ１１はマウスＩｇＧ２ｂで、１４Ｃ１はマウスＩｇＧ１の定常領域）の違いがある。
【０１２０】
マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９４、アミノ酸配列は配列番号：９５である。マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７である。
マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９６、アミノ酸配列は配列番号：９７である。マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３である。
マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９８、アミノ酸配列は配列番号：９９である。マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９である。
マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１００、アミノ酸配列は配列番号：１０１である。マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９である。
マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０２、アミノ酸配列は配列番号：１０３である。マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５である。
マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０４、アミノ酸配列は配列番号：１０５である。マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１である。
マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０６、アミノ酸配列は配列番号：１０７である。マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１である。
マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０８、アミノ酸配列は配列番号：１０９である。マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７である。
マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１００、アミノ酸配列は配列番号：１１１である。マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３である。
マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１１２、アミノ酸配列は配列番号：１１３である。マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３である。
【０１２１】
３．キメラ化抗体１１Ｇ９．６の発現ベクターの作製
３−１．ヒトＩｇＧ定常領域をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＢＭＣの全ＲＮＡから、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とヒトＩｇ  ｋａｐｐａ軽鎖定常領域のｃＤＮＡをクローニングし、それぞれ、市販キット「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（インビトロジェン社、カタログ番号：1325137）を用い、キット添付の指示書にしたがってpCR4Blunt-TOPO ベクターにクローニングし、大腸菌コンピテント細胞に導入して大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体からプラスミドを得て、配列解析のために、プラスミドＤＮＡ試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。
【０１２２】
３−２．キメラ化ＰＬＤ４抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡの調製
キメラ化ＰＬＤ４抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、２−２で得られたマウス１１Ｇ９．６抗体重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を持っているpEE6.4 ベクター発現ベクターに融合させて作製した。マウス１１Ｇ９．６抗体重鎖可変領域をＰＣＲ方法で増幅し、約４５０塩基の長さのＰＣＲ産物を得た。このとき、プライマーは、表１に示すとおりである。得られたＰＣＲ産物を１．５％低融点アガロース法によって精製した。
【表１】
2019048874.tif 000002
【０１２３】
２−２で得られたマウス１１Ｇ９．６抗体重鎖可変領域をＰＣＲ法によって「１１Ｇ９．６重鎖可変領域をコードするPCR product」を得た。１１Ｇ９．６重鎖可変領域をコードするPCR productをHind IIIとApa I制限酵素で消化し、１．５％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
得られたｃＤＮＡを、Hind IIIとApa Iをクローニングサイトとして、キメラ化１１Ｇ９．６のVHコード領域を、pEE6.4 ベクター(Lonza Biologics, Slough製, UK)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびApaI)ならびに理想的Kozak配列(GCCGCCACC)を導入した、プライマーchi11G9VH-IF(HindIII)およびchi11G9VL-408Rを用いて、１１Ｇ９．６のVH領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi11G9VH-pEE6.4ベクターは、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。VHPCR断片を、HindIIIおよびApaIを用いて、インフレームで、pEE6.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べた。配列解析のために、プラスミドＤＮＡ試料をOperon Biotechnology Co. Ltd社(東京)に送付して、プラスミド中のｃＤＮＡ塩基配列を確認した。
【０１２４】
３．３  キメラ化ＰＬＤ４抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡの調製
キメラ化ＰＬＤ４抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡを調製するために、２−３で得られたマウス１１Ｇ９．６抗体軽鎖可変領域と、３−２で得られたヒトＩｇ  ｋａｐｐａ軽鎖定常領域を融合したＰＣＲフラグメントを重複伸長ＰＣＲ方法（overlap extension PCR）法に基づく手法によって約７３０塩基の長さでＰＣＲ産物を増幅した。
１１Ｇ９．６軽鎖可変領域をコードするPCR productをHind IIIとEcoR I制限酵素で消化し、１．５％アガロースゲル法で精製した。これをddH2Oで溶解し、軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ断片の溶液とした。
【０１２５】
得られたキメラ化１１Ｇ９のVLコードするｃＤＮＡを、pEE14.4 ベクター(Lonza Biologics製)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびEcoRI)ならびに理想的Kozak配列を導入した、プライマーchi11G9VL-IF(Hind)およびchi11G9VL-726R(RI)を用いて、１１Ｇ９．６のVL領域を含むpCR4Blunt-TOPOプラスミドクローンからＰＣＲで増幅した。Chi11G9VL-pEE14.4ベクターは、ｋａｐｐａ軽鎖定常領域を含む。VLPCR断片を、HindIIIおよびEcoRIを用いて、インフレームで、pEE14.4ベクターに挿入した。コンストラクトをｃＤＮＡ塩基配列解析によって調べた。
【０１２６】
3.4  キメラ化ＰＬＤ４抗体（ｃｈ１１Ｇ９ＶＨ／ＶＬ）ダブルジーンLonza 発現ベクター構築
キメラ化ＰＬＤ４抗体の重鎖発現ベクター（chi11G9VH-pEE6.4）、およびキメラ化ＰＬＤ４抗体の軽鎖のベクター(chi11G9VL-pEE14.4)を、標準的なクローニング技術によって、１つの２遺伝子ベクター中で組み合わせたキメラ化ＰＬＤ４抗体（chi11G9DG ベクター）Lonza 発現ベクターを構築した。
【０１２７】
４．２９３Ｆ細胞における一過性発現
一過性発現ベクタープラスミドである chi11G9DG Lonza ベクター DNA,８０μgを使用した。
２９３Ｆ細胞をトランスフェクション前日に２５０mLのErlenmyer flask(カタログ番号431144；CORNING製)に８×１０5cells/mLで８０mLに合わせて３７℃，ＣＯ2濃度８％の条件で振とう７日間培養した。
７日間培養後に，トランスフェクションを行った２９３Ｆ細胞の培養液を５０mLチューブに回収し、２，０７０g，４℃条件で５分間遠心分離を行った。上清をポアサイズ０．４５μmのシリンジフィルター（カタログ番号431220；CORNING製）でろ過を行い，培養上清を抗体精製のためまとめた。
【０１２８】
５．抗ＰＬＤ４キメラ化抗体の精製
回収した培養上清を用いてAKTA-FPLC（GEヘルスケア・ジャパン製）とソフトウエアUnicorn5.0を用いて抗体精製を行った。
キメラ化１１Ｇ９．６抗体精製用のカラムはHiTrap MabSelect SuRe １mL(カタログ番号11-0034-93, Lot No.10032458 ; GEヘルスケア・ジャパン製)を使用した。カラム条件は以下の通りである。結合バッファー（２０mM Sodium phosphate,０．１５M NaCl , pH ７．４）、溶出バッファー（２０mM Sodium citrate , pH３．４）を用いてアフィニティー精製した。精製後の抗体のバッファーをＰＢＳに置換するために，Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit 10kMWCO を用いてバッファーの交換を行った。
精製抗体の濃度は２８０nmの吸光度を測定し、１mg／mlを１．３８ODとして算出した。
精製した抗ＰＬＤ４キメラ化抗体のｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂはフローサイトメトリー方法とＳＤＳ−ＰＡＧＥで、タンパク質の品質を分析した。
【０１２９】
実施例８
作製した抗ヒトＰＬＤ４キメラ抗体(ｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂ)の抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ活性)を測定した。活性は細胞から放出された乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)の測定値より算出した細胞毒性を指標として用いた。エフェクター細胞となるヒト末梢血単核球はHISTOPAQUE-1077を使った比重遠心で精製した。ターゲットとなる細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株(チャイニーズハムスター卵巣細胞株)を使ったヒトＰＬＤ４遺伝子の強制形質転換細胞(以下、HuPLD4-CHO)を用いた(２ｘ１０4/ well)。エフェクターとターゲット細胞の割合が、１０：１、２０：１、４０：１および８０：１になるように混合し、ｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂまたはアイソタイプコントロール抗体(ヒトＩｇＧ１, κ)を１０mg/ mlを加えて、４時間３７℃で培養し、抗体の細胞障害活性効果を評価した。その結果、抗hＰＬＤ４キメラ抗体のｃｈ１１Ｇ９Ａｂはエフェクター細胞依存的にターゲットであるHuPLD4-CHO細胞を最大約５０％程度のＡＤＣＣ活性を示した（図２２）。この結果は、作製した抗ＰＬＤ４キメラ抗体が、ＰＬＤ４を発現する細胞を選択的に傷害することが証明された。
【０１３０】
抗ＰＬＤ４抗体のｐＤＣへの効果を検討した。ヒト末梢血からＰＢＭＣを精製し、１０μg/ mlの抗ヒトＰＬＤ４キメラ抗体と混合し２４時間培養した。その後、ｐＤＣに発現しているToll-like receptor 9のリガンドであるＣｐＧ２２１６で２４時間刺激し、ＩＦＮα産生を誘導した。ＣｐＧ刺激後、ＩＦＮαの産生量を試験すると、抗ＰＬＤ４キメラ抗体のch11G9Ab処理によってＩＦＮα産生が完全に阻害されていることを確認した（図２３）。このメカニズムは、ch11G9Ab処理した24時間後に細胞を回収し、ｐＤＣ細胞を抗ＣＤ１２３抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と抗Ｌｉｎｅａｇｅ１抗体の三重染色で確認すると、ｐＤＣ細胞群がアイソタイプコントロール抗体(ヒトＩｇＧ１,κ)処理よりも減少していることがわかった（図２４）。これらの結果は、抗ＰＬＤ４キメラ抗体がＰＬＤ４を特異的に発現するｐＤＣを傷害し、その結果、ＣｐＧ２２１６刺激によるＩＦＮα産生を阻害したことを示した。
ｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂに加え、ｃｈ３Ｂ４Ａｂ、ｃｈ５Ｂ７Ａｂ、ｃｈ８Ｃ１１Ａｂ、ｃｈ１０Ｃ３Ａｂ、ｃｈ１３Ｄ４Ａｂ、ｃｈ１３Ｈ１１Ａｂ等のキメラ化抗ＰＬＤ４抗体の生物学的機能をヒトプライマリｐＤＣで調査した。ｐＤＣのＡＤＣＣ活性を調査するために、全ヒトＰＢＭＣをｃｈ３Ｂ４Ａｂ、ｃｈ５Ｂ７Ａｂ、ｃｈ８Ｃ１１Ａｂ、ｃｈ１０Ｃ３Ａｂ、ｃｈ１３Ｄ４Ａｂ、ｃｈ１３Ｈ１１Ａｂ、ｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂ、アイソタイプＡｂを加え１４時間培養した。細胞を採取し、ＢＤＣＡ２およびＢＤＣＡ４染色し、フローサイトメトリーでｐＤＣを確認した。キメラ化ＰＬＤ４抗体との処理は、アイソタイプ抗体と処理されたＰＢＭＣと比較してｐＤＣを完全に消失させた（図２５）。ＩＦＮα産生もまた、キメラ化抗ＰＬＤ４抗体とＰＢＭＣとの培養で測定した。全ヒトＰＢＭＣをｃｈ３Ｂ４Ａｂ、ｃｈ５Ｂ７Ａｂ、ｃｈ８Ｃ１１Ａｂ、ｃｈ１０Ｃ３Ａｂ、ｃｈ１３Ｄ４Ａｂ、ｃｈ１３Ｈ１１Ａｂ、ｃｈ１１Ｇ９．６Ａｂ、アイソタイプＡｂで処理した。２４時間後、ＩＦＮα誘発性のＣｐＧ２２１６を培養に加え、さらに細胞を２４時間培養した。培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮαの産生を測定した。キメラ化ＰＬＤ４抗体処理されたＰＢＭＣはすべてアイソタイプ抗体処理ＰＢＭＣと比較して完全にIFNα産生を抑えた（図２６）。これらの結果は、キメラ化抗ＰＬＤ４抗体がＡＤＣＣ活性を通じてｐＤＣを消失させることにより、大量のＩＦＮα産生などのｐＤＣの機能を抑えることを示した。
１．得られた抗ＰＬＤ４マウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７４、アミノ酸配列は配列番号：７５である。マウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４である。
【０１３１】
抗ＰＬＤ４マウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域の核酸配列(５０４ｂｐ) [大文字: マウス１１Ｇ９．６ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域](配列番号：７４)
ATGAGATCACAGTTCTCTATACAGTTACTGAGCACACAGAACCTCACCTTGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAAATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
【０１３２】
マウス１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１６８ａ．ａ．) [大文字: マウス１１Ｇ９．６ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す(配列番号：７５)。
2019048874.tif 000003
【０１３３】
１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域のCDR1
SYWMH (配列番号：２)
１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域のCDR2
DIYPGSDSTNYNEKFKS (配列番号：３)
１１Ｇ９．６抗体の重鎖可変領域のCDR3
GGWLDAMDY (配列番号：４)
【０１３４】
得られた抗ＰＬＤ４マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：３８、アミノ酸配列は配列番号：３９である。マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２である。
【０１３５】
抗ＰＬＤ４マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４２１ｂｐ)[大文字: マウス１１Ｇ９．６ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域] (配列番号：９４)
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcaagggcgaat
【０１３６】
マウス１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１４０ａ．ａ．) [大文字: マウス１１Ｇ９．６ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す(配列番号：９５)。
2019048874.tif 000004
【０１３７】
１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASQDISNYLN (配列番号：５)
１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域のCDR2
YTSRLHS (配列番号：６)
１１Ｇ９．６抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QQGNTLPW (配列番号：７)
２．得られた抗ＰＬＤ４マウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７６、アミノ酸配列は配列番号：７７である。マウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０である。
抗ＰＬＤ４マウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４３７ｂｐ) [大文字: マウス３Ｂ４ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ１重鎖定常領域]
ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTCCTCAGAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGTCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGACGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCGACAGCTTTACCACCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATCTATCCTGGAAATAGTGAAACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTATATGGAGTTCACTAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACGGGGGGTTATTCCGACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccact
マウス３Ｂ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１４５ａ．ａ．) [大文字: マウス３Ｂ４ＶＨ 可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ１ 重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000005
３Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR1
TYWMH
３Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR2
AIYPGNSETSYNQKFKG
３Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR3
GYSDFDY
得られた抗ＰＬＤ４マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９６、アミノ酸配列は配列番号：９７である。マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３である。
抗ＰＬＤ４マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４５９ｂｐ)[大文字: マウス３Ｂ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGATGGTCCTTGCTCAGTTTCTTGCATTCTTGTTGCTTTGGTTTCCAGGTGCAGGATGTGACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATGCAAGTCAGGGCATTAGAAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAAACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTTTCATGGAACCAACTTGGAAGATGGAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGAGGATCTGGAGCAGATTATTCTCTCACCATCAACAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGTTCAGTTTCCTCCAACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAGAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtg
マウス３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１５３ａ．ａ．) [大文字: マウス３Ｂ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000006
３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR1
HASQGIRSNIG
３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR2
HGTNLED
３Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR3
VQYVQFP
３．得られた抗ＰＬＤ４マウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：７８、アミノ酸配列は配列番号：７９である。マウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６である。
抗ＰＬＤ４マウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４７５ｂｐ) [大文字: マウス５Ｂ７ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGATTACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcgaat
マウス５Ｂ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５８ａ．ａ．) [大文字: マウス５Ｂ７ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000007
５Ｂ７抗体の重鎖可変領域のCDR1
DYNLH
５Ｂ７抗体の重鎖可変領域のCDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
５Ｂ７抗体の重鎖可変領域のCDR3
GGIYDDYYDYAIDY
得られた抗ＰＬＤ４マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９８、アミノ酸配列は配列番号：９９である。マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９である。
抗ＰＬＤ４マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４６７ｂｐ)[大文字: マウス５Ｂ７ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCATATAGCATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTTCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctt
マウス５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１５５ａ．ａ．) [大文字: マウス５Ｂ７ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000008
５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASENIYSHIA
５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域のCDR2
GATNLAH
５Ｂ７抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QHFWGTP
４．得られた抗ＰＬＤ４マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８０、アミノ酸配列は配列番号：８１である。マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６である。
抗ＰＬＤ４マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列(470bp) [大文字: マウス７Ｂ４ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGCGTCCACTCTGAGGTCCAGCTTCAGCAGTCAGGACCTGAACTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACAACTTGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGGTAATACTGGCTACAACCAGAAGTTCAAGAGGAAGGCCACATTGACTGTAGACAATTCCTCCGGCACAGTCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGATCTATGATGATTACTACGACTATGCTATCGACTATTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaaggg
マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５６ａ．ａ．) [大文字: マウス ７Ｂ４ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000009
７Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR1
DYNLH
７Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR2
YIYPYNGNTGYNQKFKR
７Ｂ４抗体の重鎖可変領域のCDR3
GGIYDDYYDYAIDY
得られた抗ＰＬＤ４マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１００、アミノ酸配列は配列番号：１０１である。マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９である。
抗ＰＬＤ４マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４５４ｂｐ)[大文字: マウス７Ｂ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCCAGATGTGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCGCCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTCATATAGCATGGTATCAGCAGAAAGAGGGAAAATCTCCTCAGCGCCTGGTCTATGGTGCAACAAACTTAGCACATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTTCAGTCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGGGTACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcag
マウス７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１５１ａ．ａ．) [大文字: マウス７Ｂ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000010
７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASENIYSHIA
７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR2
GATNLAH
７Ｂ４抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QHFWGTP
５．得られた抗ＰＬＤ４マウス８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８２、アミノ酸配列は配列番号：８３である。マウス８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２である。
抗ＰＬＤ４マウス８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４６２ｂｐ) [大文字: マウス８Ｃ１１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGGGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCGGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATTTGTACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGACTGATTAATCCTACCAATAGTGATACTATCTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACACGAGAGGGGGGATATGGTTACGGCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
マウス７Ｂ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５４ａ．ａ．) [大文字: マウス８Ｃ１１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000011
８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域のCDR1
SYYLY
８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域のCDR2
LINPTNSDTIFNEKFKS
８Ｃ１１抗体の重鎖可変領域のCDR3
EGGYGYGPFAY
得られた抗ＰＬＤ４マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０２、アミノ酸配列は配列番号：１０３である。マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５である。
抗ＰＬＤ４マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４５７ｂｐ)[大文字: マウス８Ｃ１１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCACATCTAGTCAGACCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCACAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggag
マウス８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１５２ａ．ａ．) [大文字: マウス８Ｃ１１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000012
８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR1
TSSQTLVHSNGNTYLH
８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR2
KVSNRFS
８Ｃ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR3
HSTHVP
６．得られた抗ＰＬＤ４マウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８４、アミノ酸配列は配列番号：８５である。マウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８である。
抗ＰＬＤ４マウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４５０ｂｐ) [大文字: マウス１０Ｃ３ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域]
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCAGAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacagccccatcggtctatcca
マウス１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５０ａ．ａ．) [大文字: マウス１０Ｃ３ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ａ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000013
１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域のCDR1
SYGMS
１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域のCDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
１０Ｃ３抗体の重鎖可変領域のCDR3
LYGGRRGYGLDY
得られた抗ＰＬＤ４マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０４、アミノ酸配列は配列番号：１０５である。マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１である。
抗ＰＬＤ４マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４２３ｂｐ)[大文字: マウス１０Ｃ３ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGATCCACTGCGGAAATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatc
マウス１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１４１ａ．ａ．) [大文字: マウス１０Ｃ３ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000014
１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のCDR2
QMSNLAS
１０Ｃ３抗体の軽鎖可変領域のCDR3
AQNLEL
7. 得られた抗ＰＬＤ４マウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８６、アミノ酸配列は配列番号：８７である。マウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８である。
抗ＰＬＤ４マウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４５０ｂｐ) [大文字: マウス１１Ｄ１０ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAGGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAGCTATGGCATGTCTTGGTTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACATCTACTATCCAGAAAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTATTGTGTAAGACTCTACGGTGGTAGGAGAGGCTATGGTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatcca
マウス１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５０ａ．ａ．) [大文字: マウス１１Ｄ１０ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000015
１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域のCDR1
SYGMS
１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域のCDR2
TISSGGSYIYYPESVKG
１１Ｄ１０抗体の重鎖可変領域のCDR3
LYGGRRGYGLDY
得られた抗ＰＬＤ４マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０６、アミノ酸配列は配列番号：１０７である。マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１である。
抗ＰＬＤ４マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４２３ｂｐ)[大文字: マウス１１Ｄ１０ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGAGGTTCTCTGCTCAGCTTCTGGGGCTGCTTGTGCTCTGGATCCCTGGATCCACTGCGGAAATTGTGATGACGCAGGCTGCATTCTCCAATCCAGTCACTCTTGGAACATCAGCTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTGATGGCATCACTTATTTGTATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATTTATCAGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTAGCAGTGGGTCAGGAACTGATTTCACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTGCTCAAAATCTAGAACTTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatc
マウス１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１４１ａ．ａ．) [大文字: マウス１１Ｄ１０ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000016
１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RSSKSLLHSDGITYLY
１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域のCDR2
QMSNLAS
１１Ｄ１０抗体の軽鎖可変領域のCDR3
AQNLEL
8. 得られた抗ＰＬＤ４マウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：８８、アミノ酸配列は配列番号：８９である。マウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４である。
抗ＰＬＤ４マウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４７２ｂｐ) [大文字: マウス１３Ｄ４ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAATCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTCATTATTACTGGACCTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggcg
マウス１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５７ａ．ａ．) [大文字: マウス１３Ｄ４ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000017
１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域のCDR1
SHYYWT
１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域のCDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
１３Ｄ４抗体の重鎖可変領域のCDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
得られた抗ＰＬＤ４マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１０８、アミノ酸配列は配列番号：１０９である。マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７である。
抗ＰＬＤ４マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４０４ｂｐ)[大文字: マウス１３Ｄ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATGTTGCCACTTACTTTTGCCAGCAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgt
マウス１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１３４ａ．ａ．) [大文字: マウス１３Ｄ４ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000018
１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASQDIDNYLN
１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域のCDR2
YTSRLHS
１３Ｄ４抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QQFNTLP
９．得られた抗ＰＬＤ４マウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９０、アミノ酸配列は配列番号：９１である。マウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０である。
抗ＰＬＤ４マウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４７１ｂｐ) [大文字: マウス１３Ｈ１１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGAGTTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctaagggc
マウス１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５７ａ．ａ．) [大文字: マウス１３Ｈ１１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000019
１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域のCDR1
SHYYWS
１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域のCDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
１３Ｈ１１抗体の重鎖可変領域のCDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
得られた抗ＰＬＤ４マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１１０、アミノ酸配列は配列番号：１１１である。マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３である。
抗ＰＬＤ４マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４１４ｂｐ)[大文字: マウス１３Ｈ１１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttc
マウス１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１３８ａ．ａ．) [大文字: マウス１３Ｈ１１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000020
１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASQDIDNYLN
１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR2
YTSRLHS
１３Ｈ１１抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QQFNTLP
１０．得られた抗ＰＬＤ４マウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域の核酸配列は配列番号：９２、アミノ酸配列は配列番号：９３である。マウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０である。
抗ＰＬＤ４マウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域の核酸配列(４７０ｂｐ) [大文字: マウス１４Ｃ１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ１重鎖定常領域]
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTGATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCTCCAGTCATTATTACTGGAGTTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAGACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATAACTGTGCAAGAGAGGGCCCGCTCTACTATGGTAACCCCTACTGGTATTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctaaggg
マウス１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(１５６ａ．ａ．) [大文字: マウス１４Ｃ１ＶＨ可変領域, 小文字: マウスＩｇＧ１重鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000021
１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域のCDR1
SHYYWS
１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域のCDR2
YISYDGSNNYNPSLKN
１４Ｃ１抗体の重鎖可変領域のCDR3
EGPLYYGNPYWYFDV
得られた抗ＰＬＤ４マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列は配列番号：１１２、アミノ酸配列は配列番号：１１３である。マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域内のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３である。
抗ＰＬＤ４マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域の核酸配列(４６５ｂｐ)[大文字: マウス１４Ｃ１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGGGGCAGCGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTGACAATTATTTAAACTGGTATCAGCAAAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGTTTAATACGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttc
マウス１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列(１５５ａ．ａ．) [大文字: マウス１４Ｃ１ＶＬ可変領域, 小文字: マウスＩｇκ軽鎖定常領域]下線の配列はシグナル配列、二重下線はＣＤＲ領域(CDR1, CDR2, CDR3)を示す。
2019048874.tif 000022
１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のCDR1
RASQDIDNYLN
１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のCDR2
YTSRLHS
１４Ｃ１抗体の軽鎖可変領域のCDR3
QQFNTLP
【０１３８】
作製されたキメラ１１Ｇ９抗体の重鎖、および軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ次の配列番号の通りである。
重鎖
配列番号：１２０（塩基配列）
配列番号：１２１（アミノ酸配列）
軽鎖
配列番号：１２２（塩基配列）
配列番号：１２３（アミノ酸配列）
【０１３９】
１１．抗ＰＬＤ４キメラ１１Ｇ９抗体の重鎖の核酸配列 (１４０１ｂｐ) [大文字:キメラ１１Ｇ９ＶＨ可変領域, 小文字: ヒトＩｇＧ１重鎖 定常領域]（配列番号：１２０）
ATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTcagGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAAATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCGGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGATAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGGAGGGTGGTTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
【０１４０】
１２．抗ＰＬＤ４キメラ１１Ｇ９抗体の重鎖のアミノ酸配列 (４６６ａ．ａ．) [大文字:キメラ１１Ｇ９ＶＨ可変領域, 小文字: ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域]（配列番号：１２１）
MKVLSLLYLLTAIPGILSQVQLQQPGAELVKPGTSVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSDSTNYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGWLDAMDYWGQGTSVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
【０１４１】
１３．抗ＰＬＤ４キメラ１１Ｇ９抗体の軽鎖の核酸配列 (７０５ｂｐ) [大文字:キメラ１１Ｇ９ＶＬ可変領域, 小文字: ヒトＩｇκ軽鎖定常領域]（配列番号：１２２）
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctag
【０１４２】
１４．抗ＰＬＤ４キメラ１１Ｇ９抗体の軽鎖のアミノ酸配列 (２３４ａ．ａ．) [大文字:キメラ１１Ｇ９ＶＬ可変領域, 小文字: ヒトＩｇκ軽鎖定常領域] （配列番号：１２３）
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
【０１４３】
ＰＬＤ４関連分子のｃＤＮＡとタンパク質配列
> ヒトＰＬＤ４ ｃＤＮＡ(１５２１ｂｐ)（配列番号：４４）
ATGCTGAAGCCTCTTTGGAAAGCAGCAGTGGCCCCCACATGGCCATGCTCCATGCCGCCCCGCCGCCCGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGCGCTGGCTGTGCTGTGGCTGGGCTCCGTGGCTCTTATCTGCCTCCTGTGGCAAGTGCCCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGGGAGCCCCTGGAAGCAGAGGCCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATCTGCAGCCGGCAGCCCCTCTGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGGTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATCCACCGACCTGCAGGTTCTGGCTGCCCGAGGTGCCCATGTACGACAGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGTGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGACCTGGAGGCGCTGCTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCGCTTCAGCCACCCCCCGAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCGGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGGCGGGGGTGGGCTTGGTGGTCACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
>ヒト ＰＬＤ４ タンパク質 (５０６アミノ酸) （配列番号：１）
MLKPLWKAAVAPTWPCSMPPRRPWDREAGTLQVLGALAVLWLGSVALICLLWQVPRPPTWGQVQPKDVPR
SWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLVESIPQDLPSAAGSPSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYW
SLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVLAARGAHVRQVPMGRLTR
GVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQ
NFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSH
PPRYWPVLDNALRAAAFGKGVRVRLLVGCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSN
IPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYA
VGLDGQAPGQDCVWQG
> カニクイザル ＰＬＤ４ ｃＤＮＡ(１５２１ｂｐ) （配列番号：６３）
ATGCTGAAGCCTCTTCGGAGAGCgGCAGTGACCCCCATGTGGCCGTGCTCCATGCTGCCCCGCCGCCTGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAGTGCGCCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCCAGCTCTGGAGCCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATTTGCAGCCGGCAGCCTCTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCATCTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCTTGGCTGTGGCCACCAGCAGTCCAACACTGGCCAGGAAGTCCACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACgGCACATATACATGGGCAGTGCcAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCcGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGACCTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACgCGCTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGACGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
> カニクイザル ＰＬＤ４ タンパク質 (５０６アミノ酸) （配列番号：１２９）
MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWDREAGTLQVLGVLAMLWLGSMALTYLLWQVRRPPTWGQVQPKDVPRSWGHGSSPALEPLEAEVRKQRDSCQLVLVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARKSTDLQVLAARGAQVRRVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPRRYWPVLDNALRAAAFSKGVRVRLLVSCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTTGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
> アカゲザル ＰＬＤ４ ｃＤＮＡ(１５２１ｂｐ) （配列番号：１２４）
ATGCTGAAGCCTCTTCGGAGAGCGGCAGTGACCCCCATGTGGCCGTGCTCCATGCTGCCCCGCCGCCTGTGGGACAGAGAGGCTGGCACGTTGCAGGTCCTGGGAGTGCTGGCTATGCTGTGGCTGGGCTCCATGGCTCTTACCTACCTCCTGTGGCAAGTGCGCTGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAGGGACGTGCCCAGGTCCTGGGGGCATGGTTCCAGCCTAGCTCTGGAGCCCCTGGAAGCGGAGGTCAGGAAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATTTGCAGCCGGCAGCCTCTCCGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCCGACATTGGGGTCAACGACTCATCTTCCCAGCTGGGAGAGGCCCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCTTGGCTGTGGCCACCAGCAGTCCAACACTGGCCAGGAAGTCCACCGACCTGCAGGTCCTGGCTGCCCGAGGTGCCCAGGTACGACGGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGCGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCCCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTGCTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACATCAACCGTTTCCAGCCCTTCCAGGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCATCGCCACCCGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCCTGACCTGGAGGCGCTGTTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCGCTTCAGCCACCCCCGCAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCAGCAAGGGTGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCAGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTATCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGACGGGGGTGGGCCTGGTGGTCACCCAGAGCCCCGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTACAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
> アカゲザル ＰＬＤ４ タンパク質 (５０６アミノ酸) （配列番号：１３０）
MLKPLRRAAVTPMWPCSMLPRRLWDREAGTLQVLGVLAMLWLGSMALTYLLWQVRCPPTWGQVQPRDVPRSWGHGSSLALEPLEAEVRKQRDSCQLVLVESIPQDLPFAAGSLSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARKSTDLQVLAARGAQVRRVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHINRFQPFQGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTPDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPRRYWPVLDNALRAAAFSKGVRVRLLVSCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTTGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
> マウス ＰＬＤ４ ｃＤＮＡ(１５１２塩基対) （配列番号：１３１）
ATGGACAAGAAGAAAGAGCACCCAGAGATGCGGATACCACTCCAGACAGCAGTGGAGGTCTCTGATTGGCCCTGCTCCACATCTCATGATCCACATAGCGGACTTGGCATGGTACTGGGGATGCTAGCTGTACTGGGACTCAGCTCTGTGACTCTCATCTTGTTCCTGTGGCAAGGGGCCACTTCTTTCACCAGTCATCGGATGTTCCCTGAGGAAGTGCCCTCCTGGTCCTGGGAGACCCTGAAAGGAGACGCTGAGCAGCAGAATAACTCCTGTCAGCTCATCCTTGTGGAAAGCATCCCCGAGGACTTGCCATTTGCAGCTGGCAGCCCCACTGCCCAGCCCCTGGCCCAGGCTTGGCTGCAGCTTCTTGACACTGCTCGGGAGAGCGTCCACATTGCCTCGTACTACTGGTCCCTCACTGGACTGGACATTGGAGTCAATGACTCGTCTTCTCGGCAGGGAGAGGCCCTTCTACAGAAGTTCCAACAGCTTCTTCTCAGGAACATCTCTGTGGTGGTGGCCACCCACAGCCCAACATTGGCCAAGACATCCACTGACCTCCAGGTCTTGGCTGCCCATGGTGCCCAGATACGACAAGTGCCCATGAAACAGCTTACTGGGGGTGTTCTACACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGGCGACACGTCTACGTGGGCAGCGCCAACATGGACTGGCGGTCCCTGACTCAGGTGAAGGAACTTGGTGCAATCATCTACAACTGCAGCAACCTGGCTCAAGACCTTGAGAAAACATTCCAGACCTACTGGGTGCTAGGGACTCCCCAAGCTGTTCTCCCTAAAACCTGGCCTCGGAACTTCTCATCCCACATCAACCGCTTCCATCCCTTGCGGGGTCCCTTTGATGGGGTTCCCACCACGGCCTATTTCTCGGCCTCCCCTCCCTCCCTCTGCCCGCATGGCCGGACCCGGGATCTGGACGCAGTGTTGGGAGTGATGGAGGGTGCTCGCCAGTTCATCTATGTCTCGGTGATGGAGTATTTCCCTACCACGCGCTTCACCCACCATGCCAGGTACTGGCCCGTGCTGGACAATGCGCTACGGGCAGCGGCCCTCAATAAGGGTGTGCATGTGCGCTTACTGGTCAGCTGCTGGTTCAACACAGACCCCACCATGTTCGCTTATCTGAGGTCCCTGCAGGCTTTCAGTAACCCCTCGGCTGGCATCTCAGTGGATGTGAAAGTCTTCATCGTGCCTGTGGGAAATCATTCCAACATCCCGTTCAGCCGCGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACAGACAAGACAGCCTATGTAGGCACCTCTAACTGGTCAGAAGACTACTTCAGCCACACCGCTGGTGTGGGCCTGATTGTCAGCCAGAAGACCCCCAGAGCCCAGCCAGGCGCAACCACCGTGCAGGAGCAGCTGAGGCAACTCTTTGAACGAGACTGGAGTTCCCACTATGCTATGGACCTAGACAGACAAGTCCCGAGCCAGGACTGTGTCTGGTAG
> マウス ＰＬＤ４ タンパク質 (５０３アミノ酸) （配列番号：１３２）
MDKKKEHPEMRIPLQTAVEVSDWPCSTSHDPHSGLGMVLGMLAVLGLSSVTLILFLWQGATSFTSHRMFPEEVPSWSWETLKGDAEQQNNSCQLILVESIPEDLPFAAGSPTAQPLAQAWLQLLDTARESVHIASYYWSLTGLDIGVNDSSSRQGEALLQKFQQLLLRNISVVVATHSPTLAKTSTDLQVLAAHGAQIRQVPMKQLTGGVLHSKFWVVDGRHVYVGSANMDWRSLTQVKELGAIIYNCSNLAQDLEKTFQTYWVLGTPQAVLPKTWPRNFSSHINRFHPLRGPFDGVPTTAYFSASPPSLCPHGRTRDLDAVLGVMEGARQFIYVSVMEYFPTTRFTHHARYWPVLDNALRAAALNKGVHVRLLVSCWFNTDPTMFAYLRSLQAFSNPSAGISVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTDKTAYVGTSNWSEDYFSHTAGVGLIVSQKTPRAQPGATTVQEQLRQLFERDWSSHYAMDLDRQVPSQDCVW
> ヒト ＰＬＤ３ ｃＤＮＡ配列（配列番号：５５）
ATGAAGCCTAAACTGATGTACCAGGAGCTGAAGGTGCCTGCAGAGGAGCCCGCCAATGAGCTGCCCATGAATGAGATTGAGGCGTGGAAGGCTGCGGAAAAGAAAGCCCGCTGGGTCCTGCTGGTCCTCATTCTGGCGGTTGTGGGCTTCGGAGCCCTGATGACTCAGCTGTTTCTATGGGAATACGGCGACTTGCATCTCTTTGGGCCCAACCAGCGCCCAGCCCCCTGCTATGACCCTTGCGAAGCAGTGCTGGTGGAAAGCATTCCTGAGGGCCTGGACTTCCCCAATGCCTCCACGGGGAACCCTTCCACCAGCCAGGCCTGGCTGGGCCTGCTCGCCGGTGCGCACAGCAGCCTGGACATCGCCTCCTTCTACTGGACCCTCACCAACAATGACACCCACACGCAGGAGCCCTCTGCCCAGCAGGGTGAGGAGGTCCTCCGGCAGCTGCAGACCCTGGCACCAAAGGGCGTGAACGTCCGCATCGCTGTGAGCAAGCCCAGCGGGCCCCAGCCACAGGCGGACCTGCAGGCTCTGCTGCAGAGCGGTGCCCAGGTCCGCATGGTGGACATGCAGAAGCTGACCCATGGCGTCCTGCATACCAAGTTCTGGGTGGTGGACCAGACCCACTTCTACCTGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGTTCACTGACCCAGGTCAAGGAGCTGGGCGTGGTCATGTACAACTGCAGCTGCCTGGCTCGAGACCTGACCAAGATCTTTGAGGCCTACTGGTTCCTGGGCCAGGCAGGCAGCTCCATCCCATCAACTTGGCCCCGGTTCTATGACACCCGCTACAACCAAGAGACACCAATGGAGATCTGCCTCAATGGAACCCCTGCTCTGGCCTACCTGGCGAGTGCGCCCCCACCCCTGTGTCCAAGTGGCCGCACTCCAGACCTGAAGGCTCTACTCAACGTGGTGGACAATGCCCGGAGTTTCATCTACGTCGCTGTCATGAACTACCTGCCCACTCTGGAGTTCTCCCACCCTCACAGGTTCTGGCCTGCCATTGACGATGGGCTGCGGCGGGCCACCTACGAGCGTGGCGTCAAGGTGCGCCTGCTCATCAGCTGCTGGGGACACTCGGAGCCATCCATGCGGGCCTTCCTGCTCTCTCTGGCTGCCCTGCGTGACAACCATACCCACTCTGACATCCAGGTGAAACTCTTTGTGGTCCCCGCGGATGAGGCCCAGGCTCGAATCCCATATGCCCGTGTCAACCACAACAAGTACATGGTGACTGAACGCGCCACCTACATCGGAACCTCCAACTGGTCTGGCAACTACTTCACGGAGACGGCGGGCACCTCGCTGCTGGTGACGCAGAATGGGAGGGGCGGCCTGCGGAGCCAGCTGGAGGCCATTTTCCTGAGGGACTGGGACTCCCCTTACAGCCATGACCTTGACACCTCAGCTGACAGCGTGGGCAACGCCTGCCGCCTGCTCTGA
> ヒト ＰＬＤ３ タンパク質 (４９０アミノ酸) （配列番号：１２７）
MKPKLMYQELKVPAEEPANELPMNEIEAWKAAEKKARWVLLVLILAVVGFGALMTQLFLWEYGDLHLFGPNQRPAPCYDPCEAVLVESIPEGLDFPNASTGNPSTSQAWLGLLAGAHSSLDIASFYWTLTNNDTHTQEPSAQQGEEVLRQLQTLAPKGVNVRIAVSKPSGPQPQADLQALLQSGAQVRMVDMQKLTHGVLHTKFWVVDQTHFYLGSANMDWRSLTQVKELGVVMYNCSCLARDLTKIFEAYWFLGQAGSSIPSTWPRFYDTRYNQETPMEICLNGTPALAYLASAPPPLCPSGRTPDLKALLNVVDNARSFIYVAVMNYLPTLEFSHPHRFWPAIDDGLRRATYERGVKVRLLISCWGHSEPSMRAFLLSLAALRDNHTHSDIQVKLFVVPADEAQARIPYARVNHNKYMVTERATYIGTSNWSGNYFTETAGTSLLVTQNGRGGLRSQLEAIFLRDWDSPYSHDLDTSADSVGNACRLL
> ヒト ＰＬＤ５ ｃＤＮＡ(1338塩基対) （配列番号：５６）
ATGGGAGAGGATGAGGATGGACTCTCAGAAAAAAATTGCCAAAATAAATGTCGAATTGCCCTGGTGGAAAATATTCCTGAAGGCCTTAACTATTCAGAAAATGCACCATTTCACTTATCACTTTTCCAAGGCTGGATGAATTTACTCAACATGGCCAAAAAGTCTGTTGACATAGTGTCTTCCCATTGGGATCTCAACCACACTCATCCATCAGCATGTCAGGGTCAACGTCTTTTTGAAAAGTTGCTCCAGCTGACTTCGCAAAATATTGAAATCAAGCTAGTGAGTGATGTAACAGCTGATTCAAAGGTATTAGAAGCCTTGAAATTAAAGGGAGCCGAGGTGACGTACATGAACATGACCGCTTACAACAAGGGCCGGCTGCAGTCCTCCTTCTGGATCGTGGACAAACAGCACGTGTATATCGGCAGTGCCGGTTTGGACTGGCAATCCCTGGGACAGATGAAAGAACTCGGTGTCATCTTCTACAACTGCAGCTGCCTGGTCCTAGATTTACAAAGGATATTTGCTCTATATAGTTCATTAAAATTCAAAAGCAGAGTGCCTCAAACCTGGTCCAAAAGACTCTATGGAGTCTATGACAATGAAAAGAAATTGCAACTTCAGTTGAATGAAACCAAATCTCAAGCATTTGTATCGAATTCTCCAAAACTCTTTTGCCCTAAAAACAGAAGTTTTGACATAGATGCCATCTACAGTGTGATAGATGATGCCAAGCAGTATGTGTACATCGCTGTCATGGACTACCTGCCTATCTCCAGCACAAGCACCAAAAGGACTTACTGGCCAGACTTGGATGCAAAAATAAGAGAAGCATTAGTTTTACGAAGCGTTAGAGTTCGACTCCTTTTAAGCTTCTGGAAGGAAACTGATCCCCTTACGTTTAACTTTATTTCATCTCTTAAAGCGATTTGCACTGAAATAGCCAACTGCAGTTTGAAAGTTAAATTTTTTGATCTGGAAAGAGAGAATGCTTGTGCTACAAAAGAACAAAAGAATCACACCTTTCCTAGGTTAAATCGCAACAAGTACATGGTGACAGATGGAGCAGCTTATATTGGAAATTTTGATTGGGTAGGGAATGATTTCACTCAGAATGCTGGCACGGGCCTTGTTATCAACCAGGCAGATGTGAGGAACAACAGAAGCATCATTAAGCAACTTAAAGATGTGTTTGAAAGGGACTGGTATTCACCGTATGCCAAAACCTTACAGCCAACCAAACAGCCGAACTGCTCAAGCCTGTTCAAACTCAAACCCCTCTCCAACAAAACTGCCACAGACGACACAGGCGGAAAGGATCCCCGGAACGTATGA
> ヒト ＰＬＤ５ タンパク質 (４４５アミノ酸) （配列番号：１２８）
MGEDEDGLSEKNCQNKCRIALVENIPEGLNYSENAPFHLSLFQGWMNLLNMAKKSVDIVSSHWDLNHTHPSACQGQRLFEKLLQLTSQNIEIKLVSDVTADSKVLEALKLKGAEVTYMNMTAYNKGRLQSSFWIVDKQHVYIGSAGLDWQSLGQMKELGVIFYNCSCLVLDLQRIFALYSSLKFKSRVPQTWSKRLYGVYDNEKKLQLQLNETKSQAFVSNSPKLFCPKNRSFDIDAIYSVIDDAKQYVYIAVMDYLPISSTSTKRTYWPDLDAKIREALVLRSVRVRLLLSFWKETDPLTFNFISSLKAICTEIANCSLKVKFFDLERENACATKEQKNHTFPRLNRNKYMVTDGAAYIGNFDWVGNDFTQNAGTGLVINQADVRNNRSIIKQLKDVFERDWYSPYAKTLQPTKQPNCSSLFKLKPLSNKTATDDTGGKDPRNV
> ヒト ＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質 ｃＤＮＡ(２１４２ｂｐ) （配列番号：１２５）
ATGGAGTTTCAGACCCAGGTCTTTGTATTCGTGTTGCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAgattacaaggatgacgacgataaaGGATCCcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaaCGTCCTCCCACCTGGGGCCAGGTGCAGCCCAAGGACGTGCCCAGGTCCTGGGAGCATGGCTCCAGCCCAGCTTGGGAGCCCCTGGAAGCAGAGGCCAGGCAGCAGAGGGACTCCTGCCAGCTTGTCCTTGTGGAAAGCATCCCCCAGGACCTGCCATCTGCAGCCGGCAGCCCCTCTGCCCAGCCTCTGGGCCAGGCCTGGCTGCAGCTGCTGGACACTGCCCAGGAGAGCGTCCACGTGGCTTCATACTACTGGTCCCTCACAGGGCCTGACATCGGGGTCAACGACTCGTCTTCCCAGCTGGGAGAGGCTCTTCTGCAGAAGCTGCAGCAGCTGCTGGGCAGGAACATTTCCCTGGCTGTGGCCACCAGCAGCCCGACACTGGCCAGGACATCCACCGACCTGCAGGTTCTGGCTGCCCGAGGTGCCCATGTACGACAGGTGCCCATGGGGCGGCTCACCAGGGGTGTTTTGCACTCCAAATTCTGGGTTGTGGATGGACGGCACATATACATGGGCAGTGCCAACATGGACTGGCGGTCTCTGACGCAGGTGAAGGAGCTTGGCGCTGTCATCTATAACTGCAGCCACCTGGCCCAAGACCTGGAGAAGACCTTCCAGACCTACTGGGTACTGGGGGTGCCCAAGGCTGTCCTCCCCAAAACCTGGCCTCAGAACTTCTCATCTCACTTCAACCGTTTCCAGCCCTTCCACGGCCTCTTTGATGGGGTGCCCACCACTGCCTACTTCTCAGCGTCGCCACCAGCACTCTGTCCCCAGGGCCGCACCCGGGACCTGGAGGCGCTGCTGGCGGTGATGGGGAGCGCCCAGGAGTTCATCTATGCCTCCGTGATGGAGTATTTCCCCACCACGCGCTTCAGCCACCCCCCGAGGTACTGGCCGGTGCTGGACAACGCGCTGCGGGCGGCAGCCTTCGGCAAGGGCGTGCGCGTGCGCCTGCTGGTCGGCTGCGGACTCAACACGGACCCCACCATGTTCCCCTACCTGCGGTCCCTGCAGGCGCTCAGCAACCCCGCGGCCAACGTCTCTGTGGACGTGAAAGTCTTCATCGTGCCGGTGGGGAACCATTCCAACATCCCATTCAGCAGGGTGAACCACAGCAAGTTCATGGTCACGGAGAAGGCAGCCTACATAGGCACCTCCAACTGGTCGGAGGATTACTTCAGCAGCACGGCGGGGGTGGGCTTGGTGGTCACCCAGAGCCCTGGCGCGCAGCCCGCGGGGGCCACGGTGCAGGAGCAGCTGCGGCAGCTCTTTGAGCGGGACTGGAGTTCGCGCTACGCCGTCGGCCTGGACGGACAGGCTCCGGGCCAGGACTGCGTTTGGCAGGGCTGA
> ヒト ＰＬＤ４−Ｉｇ 融合タンパク質(７１３アミノ酸) （配列番号：１２６）
MEFQTQVFVFVLLWLSGVDGDYKDDDDKGSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKRPPTWGQVQPKDVPRSWEHGSSPAWEPLEAEARQQRDSCQLVLVESIPQDLPSAAGSPSAQPLGQAWLQLLDTAQESVHVASYYWSLTGPDIGVNDSSSQLGEALLQKLQQLLGRNISLAVATSSPTLARTSTDLQVLAARGAHVRQVPMGRLTRGVLHSKFWVVDGRHIYMGSANMDWRSLTQVKELGAVIYNCSHLAQDLEKTFQTYWVLGVPKAVLPKTWPQNFSSHFNRFQPFHGLFDGVPTTAYFSASPPALCPQGRTRDLEALLAVMGSAQEFIYASVMEYFPTTRFSHPPRYWPVLDNALRAAAFGKGVRVRLLVGCGLNTDPTMFPYLRSLQALSNPAANVSVDVKVFIVPVGNHSNIPFSRVNHSKFMVTEKAAYIGTSNWSEDYFSSTAGVGLVVTQSPGAQPAGATVQEQLRQLFERDWSSRYAVGLDGQAPGQDCVWQG
【受託番号】
【０１４４】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１１
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１２
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１３
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１２１４
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号４５：フォワードプライマー
配列番号４６：リバースプライマー
配列番号４７：フォワードプライマー
配列番号４８：リバースプライマー
配列番号４９：フォワードプライマー
配列番号５０：リバースプライマー
配列番号５１：フォワードプライマー
配列番号５２：リバースプライマー
配列番号５３：フォワードプライマー
配列番号５４：リバースプライマー
配列番号７０：アンカープライマー
配列番号７０：ｎはデオキシイノシンである
配列番号７１：ＡＵＡＰプライマー
配列番号７２：プライマー
配列番号７３：プライマー
配列番号１１４：プライマー
配列番号１１５：プライマー
配列番号１１６：プライマー
配列番号１１７：プライマー
配列番号１１８：プライマー
配列番号１１９：プライマー
【図１】
2019048874.tif 000023
【図２】
2019048874.tif 000024
【図３】
2019048874.tif 000025
【図４】
2019048874.tif 000026
【図５】
2019048874.tif 000027
【図６】
2019048874.tif 000028
【図７】
2019048874.tif 000029
【図８】
2019048874.tif 000030
【図９】
2019048874.tif 000031
【図１０】
2019048874.tif 000032
【図１１】
2019048874.tif 000033
【図１２】
2019048874.tif 000034
【図１３】
2019048874.tif 000035
【図１４】
2019048874.tif 000036
【図１５】
2019048874.tif 000037
【図１６】
2019048874.tif 000038
【図１７】
2019048874.tif 000039
【図１８−１】
2019048874.tif 000040
【図１８−２】
2019048874.tif 000041
【図１９】
2019048874.tif 000042
【図２０】
2019048874.tif 000043
【図２１】
2019048874.tif 000044
【図２２】
2019048874.tif 000045
【図２３】
2019048874.tif 000046
【図２４】
2019048874.tif 000047
【図２５】
2019048874.tif 000048
【図２６】
2019048874.tif 000049
【配列表】
2019048874000001.app