(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞などの細胞を安定に保存することができる細胞の保存方法およびこれに用いられる細胞懸濁液の提供を目的とする。【解決手段】細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度下において保持する工程を含む、細胞の保存方法であって、上記緩衝液中における細胞の濃度が、６×１０５個／ｍＬ以上である、細胞の保存方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度下において保持する工程を含む、細胞の保存方法であって、前記緩衝液中における細胞の濃度が、６×１０５個／ｍＬ以上である、細胞の保存方法。
【請求項２】
前記細胞が幹細胞である請求項１に記載の保存方法。
【請求項３】
前記細胞が間葉系幹細胞である請求項１または２に記載の保存方法。
【請求項４】
前記細胞が動物由来である請求項１から３の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項５】
前記細胞が哺乳類由来である請求項１から４の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項６】
前記細胞の濃度が１×１０６個／ｍＬ以上である請求項１から５の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項７】
前記細胞の濃度が４×１０６個／ｍＬ以上である請求項１から６の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項８】
前記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である請求項１から７の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項９】
前記緩衝液として、リンゲル液、Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液、５％ぶどう糖加乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、５％ぶどう糖加酢酸リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、生理食塩水、グッド緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、またはそれらの組合せを用いる請求項１から８の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項１０】
前記緩衝液が生理食塩水である請求項９に記載の保存方法。
【請求項１１】
前記緩衝液が、電解質と栄養素を含む、請求項１から１０の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項１２】
細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度に保持した細胞懸濁液であって、前記細胞を緩衝液中に６×１０５個／ｍＬ以上の濃度で含有する細胞懸濁液。
【請求項１３】
緩衝液が栄養素を含む請求項１２に記載の細胞懸濁液。
【請求項１４】
前記緩衝液として、リンゲル液、Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液、５％ぶどう糖加乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、５％ぶどう糖加酢酸リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、生理食塩水、グッド緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、またはそれらの組合せを用いる請求項１２または１３に記載の細胞懸濁液。
【請求項１５】
前記細胞の濃度が１×１０６個／ｍＬ以上である、請求項１４に記載の細胞懸濁液。
【請求項１６】
前記細胞の濃度が４×１０６個／ｍＬ以上である、請求項１４または１５に記載の細胞懸濁液。
【請求項１７】
前記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である、請求項１４から１６の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
【請求項１８】
細胞が、ほ乳類由来間葉系幹細胞である、請求項１４から１７の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
【請求項１９】
細胞が、犬脂肪由来間葉系幹細胞である、請求項１４から１８の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の保存方法および細胞懸濁液に関する。特に、本発明は、哺乳類由来の間葉系幹細胞などの細胞の効果的な保存方法およびこれに用いられる細胞懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、哺乳類の生体内に存在する体性幹細胞であり、体外で簡便に培養して細胞数を増幅できること、さらには、間葉系幹細胞の持つ造血管性、免疫抑制、抗炎症作用などの作用から、生体由来の免疫抑制剤や、難治性の自己免疫疾患に対する治療剤として臨床研究や治験が行われており、細胞治療の重要なソースとして注目されている。
間葉系幹細胞は、具体的には骨髄、皮下脂肪、滑膜などの組織や、周産期組織である臍帯、羊膜、に存在しており、組織に偏在する細胞の供給や血管形成などに寄与することで、組織の代謝、維持、新生や再生に関わる細胞として重要な役割を担っている。
【０００３】
間葉系幹細胞は細胞の集団として表現型不均一性を示し、細胞表面に存在するマーカーで間葉系幹細胞特異的なものは見つかってはいないが、マーカーの表現型としては、陽性マーカーとしてＣＤ９０，ＣＤ４４，ＣＤ１０５，ＣＤ７３を発現し、陰性マーカーとしてＣＤ１４，ＣＤ１９，ＣＤ４５，ＭＨＣ  ＣＬＡＳＳＩＩを発現しない。
【０００４】
さらに間葉系幹細胞の特徴として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における細胞接着性を有し、線維芽細胞様の形態を示して増殖する。分化能としては脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞への分化が間葉系幹細胞の特徴付けとされており、それ以外にニューロン様細胞、肝臓細胞への分化能も有する（非特許文献１）。
【０００５】
間葉系幹細胞の臨床利用として、ホルモン療法非感受性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を適用疾患として、骨髄由来の間葉系幹細胞が、カナダ、米国、そして日本国内でも販売承認されている（非特許文献２〜５）。また臨床研究においても、クローン病をはじめとする免疫介在性疾患において、臨床治験が進められている（非特許文献６）。
【０００６】
上記の通り、間葉系幹細胞について広く研究やその応用が試みられてきているのは主に骨髄由来の間葉系幹細胞であるが、２００２年にヒトの皮下脂肪組織にも間葉系幹細胞の存在することが報告されて以来、骨髄と比較して脂肪組織を採材することが比較的容易なこと、また組織の単位量あたりに含まれている間葉系幹細胞の量が骨髄に含まれているものよりも数百倍のオーダーで高いことなどの理由から皮下脂肪の採材後、体外での大規模な増殖を提供することが可能になり、細胞治療を実施する上で重要な量の確保を満たす間葉系幹細胞のリソースとして有用であると期待されている（非特許文献７）。
【０００７】
また、間葉系幹細胞治療は、人の医療に限らず、犬や猫などの小動物を扱う獣医療においても、犬の乾燥性角結膜炎（ＫＣＳ）、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、変形性関節症、猫の非ウイルス性口内炎に対し、間葉系幹細胞を用いた臨床研究においても奏功が報告されており、人医療分野だけでなく、獣医療全般においても難治性疾患に対する新たな治療法として期待されている（非特許文献８〜１２）。従来、間葉系幹細胞などの幹細胞は、保存時においては−８０℃において凍結保存されており、移植などに使用する際には、凍結保存された細胞を３７℃の湯浴において融解してから使用するのが一般的である。間葉系幹細胞などの幹細胞を、０〜１０℃の温度下において所定の時間だけ保持するという作業は、本発明者の知る限り、報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dominici M1, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E.(2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.8(4):315-317.
【非特許文献２】Le Blanc, K., Rasmusson, I., Sundberg, B., Gotherstrom, C., Hassan, M., Uzunel, M., Ringden, O. (2004) Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet, 363(9419):1439-1441.
【非特許文献３】Le Blanc, K., Frassoni, F., Ball, L., Locatelli, F., Roelofs, H., Lewis, I., Lanino, E., Sundberg, B., Bernardo, M.E., Remberger, M., et al.(2008) Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet,371(9624):1579-1586.
【非特許文献４】Kebriaei, P., Isola, L., Bahceci, E., Holland, K., Rowley, S., McGuirk, J., Devetten, M., Jansen, J., Herzig, R., Schuster, M.,et al. (2009) Adult human mesenchymal stem cells added to corticosteroid therapy for the treatment of acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant. 15(7):804-811.
【非特許文献５】毛利 善一（2016）ヒト間葉系幹細胞製剤「テムセルHS注」の開発と承認. 医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス 7(11) 780-786.
【非特許文献６】Panes,J., Garcia-Olmo,D., Van Assche,G.A., Colombel,J.F. Reinisch, W., Baumgart, D.C., Nachury, M., Ferrante,M.,  Kazemi-Shirazi, L., Grimaud, J., et al. (2017) CX601, Allogeneic Expanded Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells (EASC), for Complex Perianal Fistulas in Crohn's Disease: Long-Term Results from a Phase III Randomized Controlled Trial. Gastroenterology. 152(5):Supplement 1, S187.
【非特許文献７】Zuk PA1, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH(2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. Dec;13(12):4279-4295
【非特許文献８】Perez-Merino, E.M., Uson-Casaus J.M., Zaragoza-Bayle C., Duque-Carrasco, J., Marinas-Pardo L., Hermida-Prieto M., Barrera-Chacon, R., Gualtieri, M.(2015) Safety and efficacy of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for treatment of dogs with inflammatory bowel disease: Clinical and laboratory outcomes. Vet J. 206(3):385-390.
【非特許文献９】Villatoro, A.J., Fernandez, V., Claros, S., Rico-Llanos, G.A., Becerra, J., Andrades, J.A.(2015) Use of adipose-derived mesenchymal stem cells in keratoconjunctivitis sicca in a canine model. Biomed Res Int. 2015;2015:527926.
【非特許文献１０】Harman, R., Carlson, K., Gaynor, J., Gustafson, S., Dhupa S., Clement, K., Hoelzler, M., McCarthy, T., Schwartz, P., Adams, C. (2016) A Prospective, randomized, masked, and placebo-controlled efficacy study of intraarticular allogeneic adipose stem cells for the treatment of osteoarthritis in dogs. Front Vet Sci. 16;3:81.
【非特許文献１１】Arzi, B., Mills-Ko, E., Verstraete, F.J., Kol, A., Walker, N.J., Badgley, M.R., Fazel, N., Murphy, W.J., Vapniarsky, N., Borjesson, D.L.(2015) Therapeutic efficacy of fresh, autologous mesenchymal stem cells for severe refractory Gingivostomatitis in Cats. Stem Cells Transl Med. 5(1):75-86.
【非特許文献１２】Hoffman A.M., Dow, S.W.（2016） Concise Review: Stem Cell Trials Using Companion Animal Disease Models. Stem Cells. 34(7):1709-1729.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一般的に、間葉系幹細胞を細胞治療に用いるためには、細胞の製造施設から治療に使用する病院やクリニックまで輸送する必要があり、細胞の生存率や品質を維持するためには、液体窒素（−１９６℃）内で細胞を凍結し、液体窒素輸送装置やドライアイス（−７８℃）で保存凍結したまま輸送する方法が一般的である。すなわち、病院・クリニックなどの臨床現場においては、凍結した細胞を受領後、専用施設等のクリーンベンチやクリーンな環境下において、専門職員が細胞を解凍し、輸液等に細胞を溶解して製剤化するプロセスが存在している。この細胞の凍結状態から製剤化のプロセスにおいては、溶解する直前の凍結細胞までの品質等は保たれているものの、解凍プロセスを行うことで煩雑性が増えることのコスト、またコンタミネーション（細菌汚染）のリスク、あるいは病院によって解凍・製剤化作業に従事する人によって細胞の品質がバラバラになる不均一性、が存在していることも否めない。また、解凍や製剤化プロセスにおいて一方で、細胞を生存させたまま臨床現場に輸送を行うためには、長時間にわたり細胞の生存や活性を維持する技術が必要であり、現状では細胞に対するそのような報告はほとんど存在しない。
【００１０】
したがって、間葉系幹細胞などの細胞を一定の間、生存した状態で維持し、同時に幹細胞としての活性を安定的に維持することが可能な環境を作出することができれば、製造施設で製造した細胞を臨床現場において煩雑な解凍作業等を行うことなく、医療者がそのまま生存している細胞を患者へ投与することが可能になる。すなわち、細胞治療の実用化において生産者から利用者への細胞の流通過程におけるコストやリスクを低減しうることになる。
本発明は、間葉系幹細胞などの細胞を安定に保存することができる細胞の保存方法およびこれに用いられる細胞懸濁液を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題の下、本発明者らは効果的な細胞の保存方法について実験確認を介して鋭意研究を重ねた。特に、細胞の保存安定性に与える影響を考慮し、細胞の種類、濃度、緩衝液の種類、緩衝剤の成分組成、保存温度等について細かく変えて細胞の死滅数の変化や活性の変化等を確認していった。その結果、緩衝液に細胞を含有させて特定の温度で保存する場合に、細胞を高濃度にすることにより、より安定に保存できることが分かった。本発明はこの新たな発見に基づいて完成されたものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
【００１２】
＜１＞細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度下において保持する工程を含む、細胞の保存方法であって、上記緩衝液中における細胞の濃度が、６×１０５個／ｍＬ以上である、細胞の保存方法。
＜２＞上記細胞が幹細胞である＜１＞に記載の保存方法。
＜３＞上記細胞が間葉系幹細胞である＜１＞または＜２＞に記載の保存方法。
＜４＞上記細胞が動物由来である＜１＞から＜３＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜５＞上記細胞が哺乳類由来である＜１＞から＜４＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜６＞上記細胞の濃度が１×１０６個／ｍＬ以上である＜１＞から＜５＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜７＞上記細胞の濃度が４×１０６個／ｍＬ以上である＜１＞から＜６＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜８＞上記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である＜１＞から＜７＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜９＞上記緩衝液として、リンゲル液、Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液、５％ぶどう糖加乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、５％ぶどう糖加酢酸リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、生理食塩水、グッド緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、またはそれらの組合せを用いる＜１＞から＜８＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜１０＞上記緩衝液が生理食塩水である＜９＞に記載の保存方法。
＜１１＞上記緩衝液が、電解質と栄養素を含む＜１＞から＜１０＞の何れか１項に記載の保存方法。
＜１２＞細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度に保持した細胞懸濁液であって、上記細胞を緩衝液中に６×１０５個／ｍＬ以上の濃度で含有する細胞懸濁液。
＜１３＞緩衝液が栄養素を含む＜１２＞に記載の細胞懸濁液。
＜１４＞上記緩衝液として、リンゲル液、Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液、５％ぶどう糖加乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、５％ぶどう糖加酢酸リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、生理食塩水、グッド緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）、またはそれらの組合せを用いる＜１２＞または＜１３＞に記載の細胞懸濁液。
＜１５＞上記細胞の濃度が１×１０６個／ｍＬ以上である、＜１４＞に記載の細胞懸濁液。
＜１６＞上記細胞の濃度が４×１０６個／ｍＬ以上である、＜１４＞または＜１５＞に記載の細胞懸濁液。
＜１７＞上記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である、＜１４＞から＜１６＞の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
＜１８＞細胞が、ほ乳類由来間葉系幹細胞である、＜１４＞から＜１７＞の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
＜１９＞細胞が、犬脂肪由来間葉系幹細胞である、＜１４＞から＜１８＞の何れか１項に記載の細胞懸濁液。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により幹細胞等の有用な細胞の保存方法およびその方法に用いる細胞懸濁液を提供することができる。また、本発明により、必要により保存した状態で細胞を輸送し臨床現場等に送ることができ、速やかに医療行為等に必要な細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＭＳＣの懸濁溶媒と細胞生存率の変化を示すグラフである。
【図２】図２は、生食中に溶解したＭＳＣ生存率の細胞濃度依存性を示すグラフである。
【図３】図３は、異なる個体由来脂肪から培養したＭＳＣにおける細胞濃度と生存率を示すグラフである。
【図４】図４は、高濃度細胞懸濁液中のＭＳＣにおける間葉系幹細胞マーカーの発現解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、高濃度細胞懸濁液中に分泌されるサイトカインの変化を示すグラフである。
【図６】図６は、同種他組織由来ＭＳＣにおける高濃度細胞懸濁液中の生存率の変化を示すグラフである。
【図７】図７は、他種生物由来ＭＳＣにおける高濃度細胞懸濁液中の生存率の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の保存方法は、細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度下で保持する工程を含み、上記輸液中での細胞の濃度は６×１０５個／ｍＬ以上である。その好ましい実施形態に関する着想について言うと、次のとおりである。本発明者らは、医療用輸液として用いられる緩衝剤として一般的である生理食塩水（塩化ナトリウム０．９％含有）に溶解した犬由来の間葉系幹細胞において、まず、一定環境下において細胞の生存率が細胞濃度依存的に維持されることを見いだした。さらには、冷蔵環境下において高濃度の細胞懸濁液を形成することで、間葉系幹細胞を死滅させることなく安定的に生存させ、かつ安定的に活性状態を維持する条件を見出すことにより、本発明を完成する端緒をなした。かかる知見に基づき完成したのが本発明の保存方法であり、細胞懸濁液である。以下に、その好ましい実施形態を中心に本発明について説明するが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。
【００１６】
＜緩衝液（輸液）＞
緩衝液は緩衝剤と溶媒とを含んでなることが好ましい。緩衝液としては、リンゲル液、Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液、５％ぶどう糖加乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、５％ぶどう糖加酢酸リンゲル液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、生理食塩水、グッド緩衝液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液、トリエタノールアミン塩酸塩緩衝液（ＴＥＡ）等が挙げられる。
溶媒としては水または水性溶媒を用いることができる。水性媒体としては、水と低級アルコールとを任意の割合で混和した溶液が挙げられる。
上記のグッド緩衝液としては、例えば、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳなどの緩衝剤の水溶液が挙げられる。
緩衝液はなかでも生理食塩水であることが好ましい。
緩衝液に栄養素を含ませることも好ましい。栄養素としてはブドウ糖などが挙げられる。
【００１７】
＜濃度＞
本発明においては、緩衝液中の細胞の濃度を６×１０５個／ｍＬ以上とするが、さらに１×１０６個／ｍＬ以上とすることが好ましく、４×１０６個／ｍＬ以上とすることがより好ましく、１×１０７個／ｍＬ以上とすることがさらに好ましく、１．６×１０７細胞／ｍＬ以上、２．０×１０７細胞／ｍＬ以上、又は６．４×１０７細胞／ｍＬ以上でもよい。上限は特にないが、１×１０１０個／ｍＬ以下であることが実際的である。
【００１８】
＜温度＞
本発明においては、保存する細胞を含む緩衝液の温度を０〜１０℃とするが、保存温度はさらに０〜８℃であることが好ましく、１〜６℃であることがより好ましく、２〜５℃であることがさらに好ましい。
【００１９】
＜保存期間＞
保存時間は保存対象となる細胞の種類や状態に応じて適宜定めればよいが、例えば、細胞の健全性を考慮し、７日以下であることが好ましく、５日以下であることがより好ましく、３日以下であることがさらに好ましく、４８時間以下であることが一層好ましく、３６時間以下であることがより一層好ましく、２４時間が一つの目安となる。保存する時間に下限値は特にないが、輸送なども考慮すると、１０分以上が好ましく、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、または４時間以上がより好ましく、６時間以上がより一層好ましく、８時間以上がさらに好ましく、１２時間以上が特に好ましい。
【００２０】
＜細胞＞
本発明に適用される細胞は特に限定されず入手可能なものを適宜用いることができる。保存の付加価値が高く発明の効果が発揮できる点で医療用途において有用性の高い細胞であることが好ましい。かかる観点から、幹細胞であることが好ましい。
【００２１】
細胞には、胚を使用する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞、誘導万能細胞（ｉＰＳ細胞）がある。これらに対し、体内の様々な組織には、組織の成長、維持を支える幹細胞が存在しており、これらは、成体幹細胞、体性幹細胞、組織幹細胞などと呼ばれ、組織が老化したり、環境に応答したり、損傷をうけたりする際に、新たな組織に必要な細胞を供給する役割をもつ。一般的によく知られている成体幹細胞は、血液中の赤血球や免疫細胞をなどの血球成分を造成する造血幹細胞、中枢神経を構成するニューロン（神経細胞）に分化する神経幹細胞、心臓を構成する心筋細胞に分化する心筋幹細胞、身体の発生過程で脂肪や骨に分化する間葉系幹細胞などが知られ、基礎研究と共に、臨床応用が進められている。間葉系幹細胞は、骨髄間質細胞などが分化誘導されることにより、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）になる。最近では、さらにグリア細胞（外胚葉由来）、肝臓（内胚葉由来）など、中胚葉性でない組織にまで分化できる可能性があることが示唆されている。間葉系幹細胞は成体幹細胞の一つで、人の骨髄、脂肪、臍帯、滑膜（関節の周囲にある組織）などに含まれている。上記の分化能力のため、移植によって治療できる病気の数や患者数は多く、その臨床応用が強く期待されている。具体的な臨床例または研究例としては、冒頭に述べたように、ホルモン療法非感受性の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療薬が販売され、慢性大腸炎や免疫介在性疾患において臨床治験が進められている。また、獣医療においても、犬の乾燥性角結膜炎（ＫＣＳ）、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、変形性関節症、猫の非ウイルス性口内炎に対し奏功していることを述べた。脂肪組織から培養、増殖される脂肪由来間葉系幹細胞は、分化により組織再生に参画、あるいは成長因子を分泌して組織再生を促進する。脂肪由来間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、細胞増殖が速い、再生促成因子を多く分泌する、免疫抑制能が高い、という有利な特徴を有する。さらに、脂肪由来間葉系幹細胞は、腹部又は臀部の脂肪組織から得られるため、骨髄を採取する必要のある骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、安全に十分量確保しやすいという有利な特徴も有する。また、患者の自己脂肪組織由来の間葉系幹細胞を患者の治療に用いることは、倫理的な問題がない、免疫拒絶反応がない、感染症等の問題が少ない、静脈投与で治療効果がある等の点で優れている。本発明の保存方法は上記間葉系幹細胞に好適に適用することができる。
また、幹細胞以外の細胞としては、分化した細胞、株化細胞などが挙げられる。分化した細胞とは、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるが、特に限定されない。株化細胞としては、哺乳動物由来の株化細胞が挙げられ、例えば、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２２】
本発明の保存方法が適用される細胞は、幹細胞に限らず、どのような生物由来であってもよい。好ましくは動物由来であり、より好ましくは脊椎動物由来であり、さらに好ましくは哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット動物、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。中でもヒト由来であることが特に好ましい。
【００２３】
本発明の保存方法が好適に適用できるｉＰＳ細胞としては以下の細胞を使用することができる。
（１）健常者由来ｉＰＳ細胞、又は筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、先天的免疫不全症、ゴーシェ病、パーキンソン病、ハンチントン病、若年性糖尿病、若しくは自立神経失調症などの疾患を有する患者由来の疾患特異的ｉＰＳ細胞
（２）皮膚細胞ないし線維芽細胞、骨髄細胞、肝細胞、胃上皮細胞、膵臓細胞、神経幹細胞、リンパ球、毛包細胞（角化細胞）、血液前駆細胞、白血球、口腔内粘膜上皮細胞などから作製されたｉＰＳ細胞
（３）４つの初期化因子（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，及びＭｙｃファミリー（ｃ−Ｍｙｃ，Ｌ−Ｍｙｃ，又はＮ−Ｍｙｃ）の遺伝子又は遺伝子産物やＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，及びＬｉｎ２８の遺伝子又は遺伝子産物）、３つの初期化因子（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，及びＫｌｆ４の遺伝子又は遺伝子産物）、２つ以下の初期化因子と低分子化合物との組合せ（例えば、Ｏｃｔ３／４とＳｏｘ２の２遺伝子又は遺伝子産物＋バルプロ酸ナトリウム）、又は１種以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉｒ−３０２）を用いて作製されたｉＰＳ細胞、さらには前述の初期化因子にＧｌｉｓファミリーのメンバー及びＺｓｃａｎファミリーのメンバーを加えた群から選択される様々な初期化因子の組合せ（例えば、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，Ｌ−Ｍｙｃ，Ｌｉｎ２８及びＧｌｉｓ１の遺伝子又は遺伝子産物やＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，Ｚｓｃａｎ４，及びＧｌｉｓ１の遺伝子又は遺伝子産物）を用いて作製されたｉＰＳ細胞
（４）初期化因子を体細胞へ導入するベクターとして、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、センダイウィルスベクター、プラスミドベクター、又はエピソーマルベクターを用いて作製されたｉＰＳ細胞
【００２４】
本発明においては、幹細胞以外の細胞を用いることを妨げるものではない。例えば、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む浮遊系免疫細胞、肝細胞、臍帯血、有核細胞、膵ランゲルハンス島細胞、血管内皮細胞、腎臓細胞、神経細胞、下垂体細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、骨髄細胞、副腎皮質細胞、及びマクロファージなどの動物遊離細胞や神代細胞などを例示することができる。さらに、これらの細胞を株化したものや、遺伝子組み換えや細胞融合などの操作により人為的に変成させた細胞などが含まれる。
【００２５】
本発明で扱われる細胞は幹細胞であることが好まく、間葉系幹細胞であることが好ましい。また、細胞が動物由来であることが好ましく、哺乳類由来であることがより好ましい。
本発明で扱われる細胞としては、動物由来細胞が好ましく、ほ乳類由来細胞がより好ましく、ほ乳類由来幹細胞がさらに好ましく、ほ乳類由来間葉系幹細胞がさらに好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞がさらに好ましく、犬脂肪由来間葉系幹細胞が特に好ましい。
【００２６】
＜輸送＞
本発明の保存方法ないし細胞懸濁液は輸送に供することが好ましい。この輸送を通じて緊急医療が必要な患者のところへ少しでも早く健全な細胞を提供することが望ましい。輸送手段としては、徒歩（ヒト）、二輪、車両、鉄道、航空機、船舶等を挙げることができるが、特に制限されるものではない。本発明により安定な輸送が可能となれば、０〜１０℃という十分に人の手で運搬が可能なサイズ・重量の保冷装置で運ぶことができる。また、その温度であれば、低コストで、高濃度の細胞を容器に密封して安全に運ぶことができる。より多くの患者に対応することができることはもとより、危険な状態にある患者でも、細胞のストックが多数あるということは手術等の治療を円滑に行うことができる大きな要素となりうる。輸送者が手で抱えてヘリコプターで移動することも十分に考慮される保冷装置の大きさとすることができる。本発明の保存方法により、必要な細胞を、きわめて遠隔にまで、きめ細かくかつ迅速に供給することができる。
【００２７】
＜細胞の準備＞
上記では本発明の細胞の保存方法およびそれに用いる細胞懸濁液の好ましい実施形態について述べたが、保存される細胞は調達される段階ですでに準備（培養、選択、回収、凍結、解凍等の操作）が終わっていることが好ましい。次の項ではその準備手順の詳細について説明する。具体的には、皮下脂肪由来間葉系幹細胞を、哺乳類に含まれる脂肪組織から分離して、取得する工程の一実施態様を示す。以下の説明では、これを４つの工程に沿って述べるが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。
【００２８】
（１）脂肪組織からの細胞集団の調製
脂肪組織は、臨床オペ時に伴う局所、全身麻酔下において切除などの手段で採取される。ここでの「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物（犬や猫などのペット動物、家畜、実験動物を含む。）を含む。採取した脂肪組織は、７０％エタノールで短時間暴露を実施し、組織に付着している細菌・ウイルス等の洗浄殺菌を行い、緩衝液や培養液に浸漬後、以下の酵素処理に供される。殺菌処理については、１０％ヨード液等などの公知の殺菌剤を使用して組織の殺菌を実施することも含まれる。
【００２９】
酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼＴｙｐｅＩの酵素溶液（０．１〜５ｍｇ／ｍＬ・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）によって３７℃、３０〜１２０分間で酵素消化することにより間葉系幹細胞が含まれる細胞集団（溶液）を取得する。なお脂肪組織の分解に使用する酵素については、トリプシン、ディスパーゼ、その他市販の脂肪組織用の消化酵素を用いて公知の条件・方法で実施することも含まれる。
【００３０】
間葉系幹細胞を含む細胞集団を分画するために、遠心処理を行う。５０ｍＬ容の遠心チューブに上記酵素処理を行った溶液を分注し、７５０〜１５００Ｇ（１．０Ｇ＝９．８０６６５ｍ／ｓ２）の速度で遠心処理を行い、チューブ底の沈殿画分に関して間葉系幹細胞を含まれる細胞集団として回収する。遠心の速度については、由来動物、脂肪組織量の違いに依存して異なる遠心速度で実施することも含まれる。沈殿画分をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）の入った新たな遠心チューブに分画し、残存した油脂成分その他夾雑物を除去するためにリンス洗浄する。間葉系幹細胞を含む溶液に対し、ポアサイズ７０〜１００μｍのセルストレイナーを用いて濾過を行い、脂肪組織中のＥＣＭ、未分解の脂肪組織等を除去し、細胞を含む溶液を調製する。夾雑物の除去については、各種緩衝液、培地等での洗浄、各種口径のポアサイズを有する市販の濾過膜、装置を使用することも含まれる。
【００３１】
（２）接着性線芽様細胞の選択的培養及び細胞（Ｐ０）の回収
上記の細胞を含む溶液について、７５０〜１５００Ｇの速度で遠心処理を行い、チューブ底の沈殿画分に関して間葉系幹細胞を含まれる細胞集団として回収する。ここに適当な培地を加え懸濁した後、２２５ｃｍ２の培養用フラスコに懸濁液を移し、３−４日毎の洗浄、培地交換を繰り返しながら７−１０日間培養を行う。培養インキュベータの培養環境は、３７℃、５％  二酸化炭素濃度で行う。培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社等）、α−ＭＥＭ（富士フイルム富士フイルム和光純薬株式会社）、ＤＭＥＤ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）（富士フイルム和光純薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（富士フイルム富士フイルム和光純薬株式会社等）などを使用することも含む。培地に添加する血清（ＦＢＳ）ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など由来のものを用いる。血清又は血清代替物の添加量は例えば５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内で培地に加えて培養することも含まれる。
【００３２】
尚、本培養法により選択的に増殖する細胞はＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ陰性である（Bourin, P., Bunnell, B.A., Casteilla, L., Dominici, M., Katz, A.J., March, K.L., Redl, H., Rubin, J.P., Yoshimura, K., Gimble, J.M.(2013) Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy.15(6):641-648；Vieira, N.M., Brandalise, V., Zucconi, E., Secco, M., Strauss, B.E., Zatz, M.(2010)；およびIsolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Cell Transplant. 19(3):279-289）。
【００３３】
増殖した細胞を回収するために、回収操作はフラスコ底面に接着した細胞の剥離の常法に準じ、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞を剥離することによって容易に回収することができる。剥離した細胞は、ウシ胎児血清を含む培地に懸濁してトリプシン活性の阻害を行った後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）により洗浄し、５００〜１５００Ｇの速度で遠心処理を行って、含有している培地成分を洗い流す。その後、細胞集団をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で再度洗浄した後、Ｐａｓｓａｇｅ  ０（Ｐ０）の間葉系幹細胞懸濁液とした。
【００３４】
（３）間葉系幹細胞の選択的培養及び細胞（Ｐ１）の回収
Ｐ０の間葉系幹細胞を  ３〜５×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で細胞を準備し、ここに適当な培地を加え懸濁した後、２２５ｃｍ２の培養用フラスコに懸濁液を移し、３−４日毎の洗浄、培地交換を繰り返しながら７−１０日間培養を行う。培養インキュベータの培養環境は、３７℃、５％  二酸化炭素濃度で行う。培養用の培地には、通常の動物細胞培養用の培地を使用することができる。例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社等）、α−ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＤＭＥＤ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）（富士フイルム和光純薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（富士フイルム和光純薬株式会社等）などを使用することも含む。培地に添加する血清（ＦＢＳ）ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など由来のものを用いる。血清又は血清代替物の添加量は例えば５％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内で培地に加えて培養することも含まれる。
【００３５】
尚、本培養法により選択的に増殖する細胞はＣＤ２９、ＣＤ４４及びＣＤ９０陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＭＨＣ  ＣｌａｓｓＩＩ陰性である（Bourin, P., Bunnell, B.A., Casteilla, L., Dominici, M., Katz, A.J., March, K.L., Redl, H., Rubin, J.P., Yoshimura, K., Gimble, J.M.(2013) Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy.15(6):641-648；Vieira, N.M., Brandalise, V., Zucconi, E., Secco, M., Strauss, B.E., Zatz, M.(2010)；およびIsolation, characterization, and differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Cell Transplant. 19(3):279-289）。
【００３６】
増殖した細胞（Ｐ１）を回収するために、回収操作はフラスコ底面に接着した細胞の剥離の常法に準じ、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞を剥離することによって容易に回収することができる。剥離した細胞は、ウシ胎児血清を含む培地に懸濁してトリプシン活性の阻害を行った後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）により洗浄し、５００〜１５００Ｇの速度で遠心処理を行って、含有している培地成分を洗い流す。その後、細胞集団をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で再度洗浄した後、Ｐａｓｓａｇｅ  １（Ｐ１）の間葉系幹細胞懸濁液とした。
【００３７】
（４）細胞の凍結保存法、及び細胞の解凍法
Ｐ０及びＰ１の細胞について、細胞凍結法の常法に準じ、１×１０６〜１×１０７細胞の濃度で凍結保存液に懸濁してクライオチューブに分注し、緩速凍結器中において−８０℃フリーザーにて緩速的に凍結を行う。凍結保存液は、通常の動物細胞凍結用の保存液を使用することができる。市販のジメチルスルホキシド含有／非含有の細胞凍結液、例えばＣＥＬＬ  ＢＡＮＫＥＲ  Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ）、ＣＯＳ  ＢＡＮＫＥＲ（コスモバイオ株式会社）、バンバンカー（日本ジェネティクス）等を使用することも含む。凍結液に含有しているジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）添加量は例えば０％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲内で保存液に添加された状態で凍結することも含まれる。
【００３８】
凍結したＰ０及びＰ１の細胞について、細胞解凍法の常法に準じ、−８０℃〜−１５０℃または液体窒素中（−１９６℃）で凍結している細胞凍結チューブを３７℃のウォーターバスにて急速にチューブ内温度を０℃付近まで上昇させることで細胞凍結液を解凍し、さらに３７℃の培地を添加して完全に溶解する。遠心し、５００〜１５００Ｇの速度で遠心処理を行って、含有しているＤＭＳＯ含有の細胞凍結液及び培地成分を洗い流す。その後、細胞集団をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で再度洗浄した後、再度Ｄ−ＰＢＳで細胞を懸濁し、細胞懸濁液とする。凍結チューブの解凍法として、例えば自動解凍装置である細胞凍結融解ステーションＴｈａｗｓｔａｒ（ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ社）を用いた急速解凍の方法も含まれる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態のさらなる応用形態として、犬やヒト由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞保存形態として、生理食塩水を溶媒とした高濃度細胞懸濁液を用いることで、非凍結の状態で細胞を非活性化、または死滅させることなく生存率を維持する方法を示すことができる。
間葉系幹細胞を用いた細胞治療において、投与する細胞の活性及び生存率は、投与する細胞の力値と言い換えてもよく、疾患に対する奏功に大きく関わる要素である。現状においては、細胞の品質、すなわち細胞の活性及び生存率を維持する方法としては、凍結した細胞を医療現場まで輸送し、現地において解凍作業を行い、製剤化して投与、というスキームが一般的であるが、その間に生存率や活性を損なうリスクも大きく、また操作の煩雑性やコストの観点からも、問題が多い状況である。
本発明の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞の高濃度細胞懸濁液用いることで、冷蔵状態のまま、間葉系幹細胞マーカーの発現やサイトカイン分泌などの細胞活性を維持しながら、２４時間まで維持可能になり、かつ、生理食塩水という医療的には一般的な溶媒を用いることで、細胞投与時の緩衝液交換などをすることなしに、そのまま点滴や局所投与などに簡便に応用できることが可能であることを示す。
【実施例】
【００４０】
参考例１：細胞の培養と回収、凍結、解凍
（１）脂肪組織からの細胞集団の調製
脂肪組織は、健康犬から採取を行った。採取した脂肪組織は、７０％エタノールで短時間暴露による殺菌を行い、緩衝液や培養液に浸漬後、脂肪組織をコラゲナーゼＴｙｐｅＩの酵素溶液（０．１〜５ｍｇ／ｍＬ・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）によって３７℃、６０分間で酵素消化することにより間葉系幹細胞が含まれる細胞集団（溶液）を取得した。
【００４１】
間葉系幹細胞を含む細胞集団を分画するために、５０ｍＬ容の遠心チューブに上記酵素処理を行った溶液を分注し、７５０〜１５００Ｇ（１．０Ｇ＝９．８０６６５ｍ／ｓ２）の速度で遠心処理を行い、油脂成分を含む層を廃棄すると共に、チューブ底の沈殿画分に関して間葉系幹細胞を含まれる細胞集団として回収した。沈殿画分をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）の入った新たな遠心チューブに分画し、残存した油脂成分その他夾雑物を除去するためにリンス洗浄した。間葉系幹細胞を含む溶液に対し、ポアサイズ７０μｍのセルストレイナーを用いて濾過を行い、脂肪組織中のＥＣＭ、未分解の脂肪組織等を除去し、細胞を含む溶液を調製した。
【００４２】
（２）接着性線芽様細胞の選択的培養及び細胞（Ｐ０）の回収
上記の細胞を含む溶液について、１５００Ｇの速度で遠心処理を行い、チューブ底の沈殿画分に関して間葉系幹細胞を含まれる細胞集団として回収した。ここに適当な培地を加え懸濁した後、２２５ｃｍ２の培養用フラスコに懸濁液を移し、３−４日毎の洗浄、培地交換を繰り返しながら７−１０日間培養を行った。培養インキュベータの培養環境は、３７℃、５％  二酸化炭素濃度で行う。培養用の培地には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社等）を用いた。培地に添加する血清は牛胎児血清（ＦＢＳ）を用い、血清の添加量は１０％（ｖ／ｖ）として培地に加えて培養を行った。
【００４３】
増殖した細胞を回収するために、回収操作はフラスコ底面に接着した細胞の剥離の常法に準じ、０．０５％（ｖ／ｖ）トリプシンを３７℃、５分で反応させることで細胞を回収した。剥離した細胞は、ウシ胎児血清を含む培地に懸濁してトリプシン活性の阻害を行った後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）により洗浄し、５００〜１５００Ｇの速度で遠心処理を行って、含有している培地成分を洗い流した。その後、細胞集団をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で再度洗浄した後、Ｐａｓｓａｇｅ  ０（Ｐ０）の間葉系幹細胞懸濁液とした。
【００４４】
（３）間葉系幹細胞の選択的培養及び細胞（Ｐ１）の回収
Ｐ０の間葉系幹細胞を  ３×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で細胞を準備し、ここに適当な培地を加え懸濁した後、２２５ｃｍ２の培養用フラスコに懸濁液を移し、３−４日毎の洗浄、培地交換を繰り返しながら７−１０日間培養を行った。培養インキュベータの培養環境は、３７℃、５％  二酸化炭素濃度で行った。培養用の培地には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（富士フイルム和光純薬株式会社等）、α−ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬株式会社）を使用した。培地に添加する血清は牛胎児血清（ＦＢＳ）を用い、血清の添加量は１０％（ｖ／ｖ）として培地に加えて培養を行った。
【００４５】
（４）細胞の凍結保存法、及び細胞の解凍法
Ｐ０及びＰ１の細胞について、細胞凍結法の常法に準じ、１〜５×１０６細胞の濃度で凍結保存液に懸濁してクライオチューブに分注し、緩速凍結器中において−８０℃フリーザーにて緩速的に凍結を行った。凍結保存液は、市販のジメチルスルホキシド含有の細胞凍結液を使用した。その後、−８０℃〜−１５０℃または液体窒素中（−１９６℃）で保存した。
【００４６】
凍結したＰ０及びＰ１の細胞について、細胞解凍法の常法に準じ、−８０℃〜−１５０℃または液体窒素中（−１９６℃）で凍結している細胞凍結チューブを、自動解凍装置である細胞凍結融解ステーションＴｈａｗｓｔａｒ（ｂｉｏｃｉｓｉｏｎ社）を用いた急速解凍の方法で解凍し、さらに３７℃の培地を添加して完全に溶解した。遠心し、１５００Ｇの速度で遠心処理を行って、含有しているＤＭＳＯ含有の細胞凍結液及び培地成分を洗い流した。その後、細胞集団をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で再度洗浄した後、再度Ｄ−ＰＢＳで細胞を懸濁し、Ｐａｓｓａｇｅ  １（Ｐ１）の間葉系幹細胞懸濁液とした。
【００４７】
実施例１：細胞の至適点滴用製剤の検討
解凍したＰａｓｓａｇｅ１（Ｐ１）の犬皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）について、医療分野で頻用されている点滴用製剤について４℃冷蔵保存の状態で生存率を測定した。ＭＳＣはＰａｓｓａｇｅ  １（Ｐ１）を用い、−８０℃で凍結した細胞を溶解後、各溶媒に懸濁（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）し、４℃保存で計時的に測定した。生存率は、細胞懸濁液に０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  溶液（ＷＡＫＯ純薬株式会社）を１：１の割合で添加し、顕微鏡下での観察により、生細胞と死細胞の生存率を生存率＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００（％）の計算式に則り、算出した。
【００４８】
ＭＳＣを溶解する点滴用製剤（緩衝剤）としては下記のものを用い、それぞれ間葉系幹細胞を２×１０５細胞／ｍＬの濃度に懸濁した。
リンゲル液                      （×）
Ｌ乳酸ナトリウムリンゲル液      （■）
５％  ぶどう糖加乳酸リンゲル液  （△）
酢酸リンゲル液                  （○）
５％  ぶどう糖加酢酸リンゲル液  （□）
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水  （●）
生理食塩水                      （▲）
【００４９】
冷蔵状態（４℃）で、２４時間までの生存率を算出したところ、乳酸リンゲル液、Ｄ−ＰＢＳ、生理食塩水においては６時間までは７５％以上の生存率を維持することがわかった。一方で他の点滴用製剤においては、保存後１時間から７５−８０％低下し、乳酸リンゲル液、Ｄ−ＰＢＳ、生理食塩水と比較しても２４時間までに低い生存率を示した（図１）。
これらの結果から、人医療また獣医療の病院やクリニックを含む医療・治療施設において一般的に扱われる生理食塩水をもって細胞の安定的な保存用の溶媒とした。
【００５０】
実施例２：細胞濃度と生存率
解凍したＰ１のＭＳＣのＭＳＣについて、生理食塩水に懸濁して任意の細胞濃度の細胞懸濁液を作製し、２４時間までの４℃保存維持における生存率の変化を測定した。細胞懸濁液の細胞濃度は下記のものを作製した。
６．４×１０７細胞／ｍＬ（○）
１．６×１０７細胞／ｍＬ（△）
４×１０６細胞／ｍＬ    （□）
１×１０６細胞／ｍＬ    （×）
２．５×１０５細胞／ｍＬ（◇）
測定は、ＭＳＣを生理食塩水に懸濁後０、１、２、４、６、８、２４時間に行った。細胞生存率は、細胞懸濁液に０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  溶液（ＷＡＫＯ純薬株式会社）を加え、測定した。各保存時間における実際の細胞生存率の実測値（実測値）、及び０時間を基準にした各測定時間の相対値（相対値）を算出した。
【００５１】
上記の通り、生理食塩水を溶媒として、解凍したＰ１の犬皮下脂肪由来間葉系幹細胞の各細胞濃度（２．５×１０５、１×１０６、４×１０６、１．６×１０７、６．４×１０７細胞／ｍＬ）の細胞懸濁液を作製し、保存後２４時間までの生存率の変化を検討した。４×１０６、１．６×１０７、６．４×１０７細胞／ｍＬの細胞濃度の懸濁液においては、相対的細胞生存率が２４時間まで生存率８５〜９０％程度まで維持していることに対し、１×１０６、２．５×１０５細胞／ｍＬと細胞濃度が低くなるにつれて経時的に生存率が下がることが示された（図２）。
このことから、生理食塩水への懸濁、冷蔵の条件において、間葉系幹細胞の生存率は細胞濃度依存的に変化し、高濃度細胞溶液では、細胞の生存率が安定的に維持されることがわかった。
【００５２】
実施例３：異なる個体由来のＭＳＣにおける細胞濃度と生存率の検討
生理食塩水に溶解した高濃度細胞懸濁液で観察できたＭＳＣ生存率の維持が、異なる犬個体由来の皮下脂肪から培養したＭＳＣにおいても同様に観察できるかを検討した。
異なる犬個体由来の皮下脂肪から培養した３種類（ロットＡ，  Ｂ，  Ｃ）のＭＳＣ（Ｐ１）について、生理食塩水に懸濁して任意の細胞濃度の細胞懸濁液を作製し、７２時間までの４℃保存維持における生存率の変化を測定した。それぞれのロット由来のＭＳＣにおける細胞懸濁液の細胞濃度は：
２．５×１０５細胞／ｍＬ（ロットＡ（●）、ロットＢ（■）、ロットＣ（▲））及び
２．０×１０７細胞／ｍＬ（ロットＡ（○）、ロットＢ（□）、ロットＣ（△））とした。
測定は、ＭＳＣを生理食塩水に懸濁後、０、４、８、１２、６、２４、４８、７２時間に行った。細胞生存率は、細胞懸濁液に０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  溶液（ＷＡＫＯ純薬株式会社）を加え、測定した。各保存時間における実際の細胞生存率の実測値（実測値）、及び０時間を基準にした各測定時間の相対値（相対値（％））を算出した。
【００５３】
上記の通り、３種類の脂肪由来（ロットＡ，  Ｂ，  Ｃ）のＭＳＣ（Ｐ１）について、生理食塩水に懸濁して任意の細胞濃度の細胞懸濁液を作製し、７２時間までの４℃保存維持における生存率の変化を測定したところ、３ロット全てのＭＳＣにおいて、細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬでの細胞懸濁液は、冷蔵後４時間から生存率が低下し始める一方で、細胞濃度２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液では、保存後４８時間まで相対的生存率９０％を維持することがわかった（図３）。
【００５４】
実施例４：高濃度時の細胞活性特性
生理食塩水に高濃度で溶解しているＭＳＣの細胞活性特性を確認するために、間葉系幹細胞に特異的な表面抗原（ＣＤ９０及びＣＤ４４）の発現をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により測定した。溶解後、生理食塩水に４×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でＭＳＣを溶解し、冷蔵保存で０時間のＣＤ９０及びＣＤ４４を発現している細胞数（イベント数）を基準とし、７２時間までの各測定時間における：
ＣＤ４４陽性細胞数（黒塗）、
ＣＤ４４（網掛）陽性細胞数
から相対値（相対値（％））を算出した。
【００５５】
上記の通り、生理食塩水を溶媒とした高濃度細胞懸濁液中のＭＳＣについて、その細胞活性特性を確認するために、間葉系幹細胞に特異的な表面抗原（ＣＤ９０及びＣＤ４４）の発現をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）法により測定した。間葉系幹細胞マーカーとしてＣＤ９０とＣＤ４４を発現している陽性細胞についてのカウント数を測定した結果、冷蔵保存後１２時間以降からＣＤ９０及びＣＤ４４の陽性細胞が減少していることがわかった（図４）。
【００５６】
このことから、高濃度細胞懸濁液において細胞の生存率は４８時間まで維持されているものの、間葉系幹細胞マーカーの発現は、１２時間以降で低下するため、医療用としては生理食塩水に懸濁して１２時間以内で使用することが望ましい。
【００５７】
実施例５：高濃度細胞懸濁液中に分泌されるサイトカイン
高濃度細胞懸濁液中で保存されるＭＳＣの細胞活性特性の測定として、細胞から分泌されるサイトカインの定性・定量化を行った。溶解後、生理食塩水に４×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でＭＳＣを溶解し、冷蔵保存で０時間から７２時間まで保存した上清をそれぞれ採取した。上清中に分泌されるサイトカインであるＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、の分泌量をＥＬＩＳＡ法により測定した。通常のシャーレにおいて接着培養したＭＳＣ（１．０×１０６細胞）の培養上清に分泌される各サイトカイン量も測定した（ｃＭＳＣ  ＳＰ）。
【００５８】
上記の通り、高濃度細胞懸濁液中で保存されるＭＳＣの細胞活性特性の測定として、細胞から分泌されるサイトカインの定性・定量化を行ったところ、上清中に分泌されるサイトカインであるＨＧＦ、ＴＧＦ−β１の分泌が、保存後４〜８時間で増え始め、その後分泌量が維持されることがわかった。一方でＭＳＣの特徴的な分泌サイトカインであるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）については、高濃度での保存においては分泌されていないことがわかった（図５）。
【００５９】
実施例６：同種多組織由来の細胞濃度と生存率
生理食塩水に溶解した高濃度細胞懸濁液で観察できたＭＳＣ生存率の維持が、同種他組織由来のＭＳＣにおいても同様に観察できるかを検討した。
同種他組織由来のＭＳＣにおいて、生理食塩水を溶媒とし、冷蔵状態の条件で間葉系幹細胞の高濃度溶液中での生存率変化を解析した。犬の骨髄由来のＭＳＣについては、健常犬から単離した骨髄液より、皮下脂肪由来のＭＳＣと同様の培養法を用いて、犬の骨髄由来のＭＳＣを取得した。犬の骨髄由来のＭＳＣのＰ１細胞を用いて：
細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ（■破線）、及び
２．０×１０７細胞／ｍＬ（■実線）の細胞懸濁液を作製した。
対照実験として、犬の皮下脂肪由来のＭＳＣのＰ１細胞を用いて、
細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ（●破線）、及び
２．０×１０７細胞／ｍＬ（●実線）の細胞懸濁液を作製した。
【００６０】
生存率測定は、ＭＳＣを生理食塩水に懸濁後、０、４、８、１２、６、２４、４８、７２時間に行った。細胞生存率は、細胞懸濁液に０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  溶液（ＷＡＫＯ純薬株式会社）を加え、測定した。保存時間における実際の細胞生存率の実測値（実測値）、及び０時間を基準にした各測定時間の相対値（相対値（％））を算出した。
【００６１】
上記の通り、犬の骨髄由来のＭＳＣ及び皮下脂肪由来のＭＳＣ（Ｐ１）を用いて、それぞれ細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ、２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製し、冷蔵における計時的な生存率の変化を測定したところ、骨髄由来ＭＳＣの２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液では、皮下脂肪由来と同様に、冷蔵保存４８時間まで相対的生存率８０〜９０％を維持することがわかった。一方で２．５×１０５細胞／ｍＬでの細胞懸濁液では骨髄由来のＭＳＣの生存率は冷蔵保存４時間から低下しはじめ、４８時間後には５０％まで低下した（図６）。
【００６２】
このことから、生理食塩水での冷蔵下において高濃度における生存率の維持は、皮下脂肪由来のＭＳＣと同様に、同種他組織由来である骨髄由来のＭＳＣでも起こることがわかった。
【００６３】
実施例７：他種生物由来の細胞濃度と生存率
次に、他種生物由来ＭＭＳＣにおける高濃度細胞懸濁液でのＭＳＣ生存率の維持を測定した。
他種生物由来ＭＭＳＣにおいて、生理食塩水を溶媒とし、冷蔵状態の条件で間葉系幹細胞の高濃度溶液中での生存率変化を解析した。
ヒト皮下脂肪由来のＭＳＣのＰ１細胞を用いて：
細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ（□破線）、及び
２．０×１０７細胞／ｍＬ（□実線）の細胞懸濁液を作製した。
また、ヒト骨髄由来のＭＳＣのＰ１細胞を用いて：
細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ（○破線）、及び
２．０×１０７細胞／ｍＬ（○実線）の細胞懸濁液を作製した。
【００６４】
生存率測定は、ＭＳＣを生理食塩水に懸濁後、０、４、８、１２、６、２４、４８、７２時間に行った。細胞生存率は、細胞懸濁液に０．４％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  溶液（ＷＡＫＯ純薬株式会社）を加え、測定した。保存時間における実際の細胞生存率の実測値（実測値）、及び０時間を基準にした各測定時間の相対値（相対値（％））を算出した。
【００６５】
上記の通り、ヒト皮下脂肪由来およびヒト骨髄由来のＭＳＣのＰ１細胞（ＲＯＮＺＡ）について、それぞれ細胞濃度２．５×１０５細胞／ｍＬ、及び２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製し、冷蔵における計時的な生存率の変化を測定した。ヒト由来の皮下脂肪由来及び骨髄由来ＭＳＣの両者において、２．０×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液では、冷蔵保存２４時間まで相対的生存率８０〜９０％を維持し、４８時間で生存率６０％に低下した。一方２．５×１０５細胞／ｍＬでの細胞懸濁液では皮下脂肪由来及び骨髄由来のＭＳＣの生存率は冷蔵保存４時間から低下しはじめ、２４時間後に時間後には５０〜６０、４８時間後には３０％まで低下した（図７）。
【００６６】
このことから、生理食塩水での冷蔵下において高濃度における生存率の維持は、犬由来のＭＳＣだけでなく、他種生物であるヒト皮下脂肪または骨髄由来のＭＳＣにおいても起こることがわかった。
【００６７】
上記の各実施例の結果から、犬の皮下脂肪または骨髄由来あるいはヒト皮下脂肪または骨髄由来の間葉系幹細胞等の細胞を、輸液として用いられる緩衝液に懸濁し、その際の細胞濃度を６×１０５細胞／ｍＬ以上に維持することにより、細胞の高い生存率を維持することができることが分かる。
【００６８】
実施例８：ネコ由来間葉系幹細胞における細胞濃度と生存率
ネコ由来の間葉系幹細胞を、参考例１と同様の手順により調整する。
得られたネコ由来の間葉系幹細胞を用いて、実施例２及び実施例３と同様の方法により、２４時間までの４℃保存維持における生存率の変化、並びに７２時間までの４℃保存維持における生存率の変化を測定する。
緩衝液中における細胞の濃度が、６×１０５個／ｍＬ以上である場合には、細胞の生存率が安定的に維持される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月6日(2019.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む緩衝液を０〜１０℃の温度下において保持する工程を含む、細胞の保存方法であって、前記細胞が間葉系幹細胞であり、前記緩衝液中における細胞の濃度が、４×１０６個／ｍＬ以上であり、前記緩衝液が生理食塩水からなり、動物細胞用の培地成分を含まない、細胞の保存方法。
【請求項２】
前記細胞が脊椎動物由来である請求項１に記載の保存方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳類由来である請求項１又は２に記載の保存方法。
【請求項４】
前記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である請求項１から３の何れか１項に記載の保存方法。
【請求項５】
細胞を緩衝液中に含む０〜１０℃の細胞懸濁液であって、前記細胞が間葉系幹細胞であり、前記緩衝液中における細胞の濃度が、４×１０６個／ｍＬ以上であり、前記緩衝液が生理食塩水からなり、動物細胞用の培地成分を含まない、細胞懸濁液。
【請求項６】
前記細胞の濃度が１×１０７個／ｍＬ以上である、請求項５に記載の細胞懸濁液。
【請求項７】
細胞が、ほ乳類由来間葉系幹細胞である、請求項５又は６に記載の細胞懸濁液。
【請求項８】
細胞が、犬脂肪由来間葉系幹細胞である、請求項５から７の何れか１項に記載の細胞懸濁液。