(57)【要約】【課題】肝前駆細胞を含む様々な分化段階の細胞が共存するヘパトブラストヘテロ細胞集団が存在する培地から、肝幹細胞様細胞を調製するための培地を提供すること。【解決手段】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地においてヘパトブラストヘテロ細胞集団を培養したところ、上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団とは明らかに異なる形態的特徴を有するコロニーを単離することができ、かかるコロニーは、ヘパトブラストヘテロ細胞集団とは明らかに異なるマーカー発現を示す肝幹細胞様細胞であることを確認した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｅ）を順次備えるヘパトブラストヘテロ細胞集団から肝幹細胞様細胞を調製する方法。
（ａ）多能性幹細胞から公知の方法によりヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）において調製されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した肝幹細胞様細胞調製培地に播種する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、前記肝幹細胞様細胞調製培地に２回以上継代する工程；
（ｄ）前記肝幹細胞様細胞調製培地に産生した肝幹細胞様細胞コロニーを前記肝幹細胞様細胞調製培地から単離する工程；
（ｅ）工程（ｄ）において単離された肝幹細胞様細胞コロニーを前記肝幹細胞様細胞調製培地において培養し、肝幹細胞様細胞を調製する工程；
【請求項２】
ヘパトブラスト培地が、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地に、サプリメントを構成する培地成分を添加することにより作製される培地であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
肝幹細胞様細胞調製培地を培養容器の内側にコートされたフィブロネクチン上に調製することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の肝幹細胞様細胞を調製する方法で調製された肝幹細胞様細胞を、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地で培養する工程を備える肝前駆細胞様細胞を調製する方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載の方法で調製された肝幹細胞様細胞。
【請求項６】
請求項４記載の方法で調製された肝前駆細胞様細胞。
【請求項７】
ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した肝幹細胞様細胞調製培地。
【請求項８】
ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地。
【請求項９】
ヘパトブラスト培地が、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地に、サプリメントを構成する培地成分を添加することにより作製される培地であることを特徴とする請求項７又は８記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパトブラストヘテロ細胞集団から肝幹細胞様細胞を調製する方法や、かかる肝幹細胞様細胞から肝前駆細胞様細胞を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、肝硬変、劇症肝炎、肝がん等の重篤な肝臓疾患患者の治療には肝移植が有効とされ、肝臓の臓器そのものの一部をドナーからレシピエントへ移植することが広く行われているが、ドナー不足の問題や、また、移植後に免疫抑制療法が生涯必要になる場合がある等レシピエント側の負担が大きい等の問題がある。
【０００３】
したがって、近年、細胞レベルでの移植が注目されているが、移植細胞としてヒト肝細胞そのものの利用を試みる場合、臓器から酵素的に分離することにより採取された細胞は、インビトロにおいて通常増殖能をほとんど有さず、また、培養や凍結保存することにより、肝細胞としての機能が通常急速に失われることが知られており、実用化は今のところ難しいとされている。肝臓臓器移植に代わる新しい治療法の開発が模索されており、中でも、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導した肝実質細胞の再生医療への応用に期待が高まっている。
【０００４】
他方、肝臓は、薬を解毒する主要な臓器であることから、医薬品の毒性評価をする場合の主要な標的臓器の一つとされている。従来、実験動物を使って毒性の予測が行われているが、「種差の壁」の限界があり、ヒトにおける毒性についての予測性は十分とはいえない。また、利便性・汎用性の観点から、また実験動物使用制限の観点からも、ヒト培養細胞を用いた、よりよい安全性予測系・有効性評価系の開発や移植用細胞の開発が期待されてきた。しかし、現行のヒト肝臓由来初代培養細胞は、インビトロにおいて通常増殖能をほとんど有さず、また、培養や凍結保存することにより、肝細胞としての機能が通常急速に失われることが知られている。さらに、多大な費用をかけて毒性評価を行い、治験を経て市場に流通し始めた薬剤においても、薬剤性肝障害が起きること等を原因として早々に市場から撤退した例が報告されている。
【０００５】
そのため、均一な機能を有し、ロット毎の管理が可能である細胞を大量に、比較的安価に供給できる、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来する肝実質細胞を毒性評価に用いることに注目が集まってきており、かかる目的においても多能性幹細胞から肝細胞への高効率に分化誘導するための方法の研究がすすんでいる。
【０００６】
これまで、多能性幹細胞から肝実質細胞へ分化させるための方法として、多能性幹細胞からアクチビンと酪酸ナトリウムを含む培地で内胚葉細胞を誘導し、次にＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)を含む培地で培養することにより分化が進み、ＡＦＰ(alpha-fetoprotein)等が強く発現するヘパトブラストが誘導され、さらに、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）を含む培地において成熟肝細胞へ誘導する方法が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、多能性幹細胞からアクチビンを含む培地で内胚葉細胞を誘導し、ＦＧＦ４（fibroblast growth factor-4）とＢＭＰ２（bone morphogenetic protein-2）を含む培地でＡＦＰ等を発現するヘパトブラストを誘導し、さらにＨＧＦ（hepatocyte growth factor）を含む培地やＯＳＭを含む培地において培養を続けることにより、肝細胞を誘導する方法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。そしてまた、ｉＰＳ細胞からＦＯＸＡ２(forkhead box a2)とＨＮＦ４α（hepatocyte nuclear factor 4：肝細胞核因子４）とＡＦＰとが発現するヘパトブラストと称される肝前駆細胞を誘導した後、ＨＧＦを含む培地やＯＳＭを含む培地において培養を続けることにより、肝細胞を誘導する方法が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。さらに、多能性幹細胞からＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地にアクチビンとＷｎｔ３ａとＨＧＦとを添加した培地で内胚葉を誘導し、ＫＯ−ＤＭＥＭ２０％ＫＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で培養することにより肝前駆細胞が誘導され、さらに、ＯＳＭとデキサメタゾンを添加した培地で培養することにより、肝細胞を誘導する方法が報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００７】
しかしながら、上記多能性幹細胞から誘導されたヘパトブラストや、肝前駆細胞（以下、単に「ヘパトブラストヘテロ細胞集団」ともいう）は、ＡＦＰ等の共通するマーカーの発現はあるものの、実際には分化の程度が多岐にわたっており、分化が十分に進まない細胞、増殖能が不十分な細胞、分化が進んだ場合にも肝細胞としての機能を果たすことができない細胞、肝細胞としての機能が長続きしない細胞等、様々な細胞が混在する細胞集団であって、実際に肝細胞等として機能できる細胞に誘導された細胞は、多能性幹細胞の多くとも１０〜３０％にとどまっているとされる。また、上記文献におけるヘパトブラストヘテロ細胞集団は、肝細胞への分化途上の段階にあることが確認されている細胞であるが、各分化段階で増殖や保存をすることは困難であるとされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Stem Cells 2008;26:894-902
【非特許文献２】Hepatology 2007;45:1229-1239
【非特許文献３】Hepatology 2010;51:297-305
【非特許文献４】Hepatology 2012;55:1193-1203
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、化学合成培地である基礎培地の適切な組成と、サプリメント成分の様々な組合せについて検討を続けており、カルシウムイオンと、グルコースと、ピルビン酸イオンとを含む基礎培地に、インスリン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、２‐エタノールアミン、セレン酸、脂肪酸不含アルブミン、ヘパリン、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、及びＨＧＦからなるサプリメントを添加した培地が、増殖能や分化能を保持したままの肝前駆細胞を培養し、保存することができることを確認している（特開２０１５−６１３７号公報）。しかしながら、かかる培地においては、肝前駆細胞を培養及び保存するという目的は達成したものの、様々な分化段階の肝前駆細胞が共存するため、機能性の高い肝細胞に分化することができる肝前駆細胞を効率よく選抜することは難しい場合があった。 
【００１０】
本発明の課題は、従前の肝前駆細胞を含む様々な分化段階の細胞が共存するヘパトブラストヘテロ細胞集団が存在する培地から、肝幹細胞様細胞を調製するための培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から分化誘導されたヘパトブラストヘテロ細胞集団について種々の培地を用いて培養することにより検討を行ってきたが、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地を用いて培養を行ったところ、驚くべきことに、上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団とは明らかに異なる形態的特徴を有し、コロニーとして単離することができる細胞を培地上に見いだした。かかるコロニーを単離し、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地上で培養を続け、発現マーカーについて解析したところ、ヘパトブラストヘテロ細胞集団とは明らかに異なるマーカー発現を示した。かかる単離された細胞は、形態学的特徴及びマーカーの発現状況から、ヒト肝臓に存在し、自己複製能を有し、肝臓が損傷を受けた際に肝臓修復に寄与する能力があるとされる肝幹細胞に極めて近い、インビトロで作製された肝幹細胞様細胞であることが確認された。
【００１２】
さらに、上記単離された肝幹細胞様細胞は、そのままＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地において培養を続けることができることを確認したうえで、さらにもう一段階分化を進めることを試みた。上記肝幹細胞様細胞をＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地に培地交換して培養したところ、肝前駆細胞様細胞に分化することが確認された。上記肝幹細胞様細胞や肝前駆細胞様細胞は増殖能や分化能が維持されており、肝実質細胞様細胞や胆管様細胞への分化も容易であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の工程（ａ）〜（ｅ）を順次備えるヘパトブラストヘテロ細胞集団から肝幹細胞様細胞を調製する方法。
（ａ）多能性幹細胞から公知の方法によりヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製する工程；
（ｂ）工程（ａ）において調製されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した肝幹細胞様細胞調製培地に播種する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、前記肝幹細胞様細胞調製培地に２回以上継代する工程；
（ｄ）前記肝幹細胞様細胞調製培地に産生した肝幹細胞様細胞コロニーを前記肝幹細胞様細胞調製培地から単離する工程；
（ｅ）工程（ｄ）において単離された肝幹細胞様細胞コロニーを前記肝幹細胞様細胞調製培地において培養し、肝幹細胞様細胞を調製する工程；
［２］ヘパトブラスト培地が、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地に、サプリメントを構成する培地成分を添加することにより作製される培地であることを特徴とする上記［１］記載の方法。
［３］肝幹細胞様細胞調製培地を培養容器の内側にコートされたフィブロネクチン上に調製することを特徴とする上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］上記［１］〜［３］のいずれか記載の肝幹細胞様細胞を調製する方法で調製された肝幹細胞様細胞を、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地で培養する工程を備える肝前駆細胞様細胞を調製する方法。
［５］上記［１］〜［３］のいずれか記載の方法で調製された肝幹細胞様細胞。
［６］上記［４］記載の方法で調製された肝前駆細胞様細胞。
［７］ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した肝幹細胞様細胞調製培地。
［８］ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地。
［９］ヘパトブラスト培地が、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地に、サプリメントを構成する培地成分を添加することにより作製される培地であることを特徴とする上記［７］又は［８］記載の培地。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、肝幹細胞様細胞を単離するための培地を用いることにより、ヘパトブラストヘテロ細胞集団から、肝幹細胞様コロニーを単離することにより、同一コロニー由来の肝幹細胞様細胞や肝前駆細胞様細胞を効率的に調製することが可能となり、したがって均一な機能を有する肝実質細胞様細胞や胆管様細胞を大量に比較的安価に供給できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｈ９細胞由来のヘパトブラストヘテロ細胞集団の位相差画像を示す。
【図２】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地での１回目の継代後の細胞集団における蛍光免疫染色の画像を示す。（ａ）ＦＯＸＡ２（ｂ）ＨＮＦ４α（ｃ）ＡＦＰ（ｄ）Ｍｅｒｇｅ(ＦＯＸＡ２＋ＨＮＦ４α＋ＡＦＰ)である。
【図３】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地中のコロニーから単離された細胞の位相差画像である。
【図４】ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の肝前駆細胞様細胞の位相差画像を示す。
【図５】ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の細胞における蛍光免疫染色の画像を示す。（ａ）ＦＯＸＡ２（ｂ）ＨＮＦ４α（ｃ）ＡＦＰ（ｄ）Ｈｏｅｃｈｓｔ（ｅ）Ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔである。
【図６】Ｄｏｔｃｏｍ株由来のヘパトブラストヘテロ細胞集団の位相差画像を示す。
【図７】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地中のコロニーの位相差画像を示す。
【図８】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地中のＤｏｔｃｏｍ株由来細胞のコロニーから単離された細胞の位相差画像を示す。
【図９】ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の肝前駆細胞様細胞の位相差画像を示す。
【図１０】ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地で培養された肝幹細胞様細胞と、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地で培養された肝前駆細胞様細胞のマーカー発現のグラフである。Undiffは、未分化細胞である。
【図１１】肝実質細胞様細胞の蛍光免疫染色の画像を示す。（ａ）ＡＬＢ（ｂ）ＡＡＴ（Alpha-1 antitrypsin）（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ（ｄ）Ｂｒｉｇｈｔ Ｆｉｅｌｄ（ｅ）Ｍｅｒｇｅ(ＡＬＢ＋ＡＡＴ)である。
【図１２】肝前駆細胞様細胞が７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地で培養された後の分化誘導マーカー発現のグラフである。
【図１３】コラーゲンゲル培養により誘導された胆管様細胞の画像を示す。
【００１６】
本発明のヘパトブラストヘテロ細胞集団から肝幹細胞様細胞を調製する方法としては、多能性幹細胞から公知の方法によりヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製する工程（ａ）；工程（ａ）において調製されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した肝幹細胞様細胞調製培地に播種する工程（ｂ）；工程（ｂ）において播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、前記肝幹細胞様細胞調製培地に２回以上継代する工程（ｃ）；前記肝幹細胞様細胞調製培地に産生した肝幹細胞様細胞コロニーを前記肝幹細胞様細胞調製培地から単離する工程（ｄ）；工程（ｄ）において単離された肝幹細胞様細胞コロニーを肝幹細胞様細胞調製培地において培養し、肝幹細胞様細胞を調製する工程（ｅ）；を順次備える方法であれば特に制限されず、上記肝幹細胞様細胞をヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地で培養することにより、肝前駆細胞様細胞を調製することもできる。なお、本発明における多能性幹細胞、ヘパトブラストヘテロ細胞集団、肝幹細胞様細胞コロニー、肝幹細胞様細胞、肝前駆細胞様細胞、肝実質細胞様細胞、胆管様細胞は、ヒト細胞である。
【００１７】
上記工程（ａ）において、ヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製する方法としては、多能性幹細胞から公知の方法を用いて調製する方法であれば特に制限されず、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ＥＳ細胞）や、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：ＥＧ細胞）（例えばProc Natl AcadSci U S A. 1998, 95:13726-31参照）や、出生直後の精巣から単離される生殖細胞系列幹細胞（germline stem cells：ＧＳ細胞）（例えば、Nature. 2008, 456:344-9参照）や、腸骨骨髄、顎骨骨髄等の骨髄由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞などの間葉系幹細胞、及び皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入することで、被検体自身の体細胞の脱分化を誘導し、ＥＳ細胞同様の多能性を有する体細胞由来人工多能性幹細胞（若しくは、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; ｉＰＳ細胞））を挙げることができるが、具体的には、ヒトＥＳ細胞Ｈ９株（ＷＡ０９）、ヒトＥＳ細胞Ｈ１（ＷＡ０１）株（ウィスコンシン大学樹立、WISC Bank分譲）や、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３（いずれも京大再生研付属幹細胞医学研究センター樹立、理研バイオリソースセンター分譲）や、ＨＥＳ３、ＨＥＳ４、及びＨＥＳ６（モナッシュ大学樹立、WISC Bank分譲）などのヒトＥＳ細胞や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（京都大学樹立、理研バイオリソースセンター分譲）や、Ｔｉｃ(ＪＣＲＢ１３３１株)、Ｄｏｔｃｏｍ（ＪＣＲＢ１３２７株)、Ｓｑｕｅａｋｙ(ＪＣＲＢ１３２９株)、及びＴｏｅ（ＪＣＲＢ１３３８株)、 Ｌｏｌｌｉｐｏｐ（ＪＣＲＢ１３３６株)（以上成育医療センター樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所・ＪＣＲＢ細胞バンク分譲）や、ＵＴＡ−１株及びＵＴＡ−１−ＳＦ−２−２株（いずれも東京大学樹立、医薬基盤・健康・栄養研究所・ＪＣＲＢ細胞バンク分譲）や、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等のｉＰＳ細胞を例示することができる。発現マーカーにおいては、ＯＣＴ−３／４やＮＡＮＯＧ等の未分化マーカーを強く発現していることが特徴である。
【００１８】
上記多能性幹細胞からヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製する公知の方法としては、多能性幹細胞に遺伝子導入する方法や多能性幹細胞の分化を誘導する成分を添加した培地において培養する方法を挙げることができる。
【００１９】
上記多能性幹細胞に遺伝子導入する方法としては、以下の１）及び２）の方法、並びにこれらの方法に改良を加えた方法を例示することができる。
１）ＨＥＸ遺伝子、ＨＮＦ４α遺伝子、ＨＮＦ６遺伝子及びＳＯＸ１７遺伝子から選択されるいずれか１又は複数の遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込むことにより、ヒト多能性幹細胞に導入することを特徴とする、幹細胞からヘパトブラスト細胞集団を分化誘導する方法（国際公開ＷＯ２０１１／０５２５０４号パンフレット参照）；
２）ＦＯＸＡ２遺伝子を、アデノウイルスベクターを用いてヒト多能性幹細胞に導入し、次いで、ＦＯＸＡ２遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターとＨＮＦ１α遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターとを、前記ヒト多能性幹細胞に導入することにより、ヘパトブラスト細胞集団を調製する方法；
【００２０】
上記ヒト多能性幹細胞の分化を誘導する成分を添加した培地において培養する方法としては、以下の３）〜９）の方法、並びにこれらの方法に改良を加えた方法を例示することができる。
【００２１】
３）肝幹細胞や肝前駆細胞の調製方法としては、マトリゲル上のＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（−インスリン）培地に１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、及び１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を添加した培地にヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地交換を毎日行い培養を２日間行った後、３日目に、培地を、ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（−インスリン）培地に１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加した培地へ交換し、更に２〜５日間培養し、決定内胚葉になったと判断された細胞について、培地を、ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（＋インスリン）培地に１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、及び２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を添加した培地に変更、毎日培地を交換してさらに３〜８日間培養し、肝細胞へ分化する肝幹細胞様の形態になった細胞について、ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（＋インスリン）培地に２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加したものに変更し、さらに数日培養をすることにより、ヘパトブラスト細胞集団を調製する方法（ＮＩＨセンター法）；
なお、上記ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（−インスリン）培地は、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute medium）１６４０培地に、２％のインスリン不含Ｂ−２７サプリメントを添加した培地を例示することができる。ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（＋インスリン）培地は、上記ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（−インスリン）培地において、インスリン不含Ｂ−２７サプリメントの代わりに、２％のＢ２７サプリメント（５０×）を添加した培地である。
【００２２】
４）ＢＤマトリゲル上のＲＰＭＩ１６４０培地に１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び１ｍＭのＮａＢを添加した培地にヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を播種し、培地交換を毎日行い培養を１〜３日間行った後、培地を、ＲＰＭＩ１６４０培地に１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び０．５ｍＭのＮａＢを添加した培地へ交換し、更に２〜５日間培養し、決定内胚葉になったと判断された細胞について、２０％ ＫＳＲ（Knockout Serum Replacement）を添加したノックアウト−ＤＭＥＭ培地（Knockout-Dulbecco’s modified Eagle’s medium）に１％のＤＭＳＯを添加した培地に変更し、５〜１０日さらに培養をすることにより、ヘパトブラスト細胞集団を調製する方法（ＷｅｉＣｕｉ法）；
【００２３】
５）フィブロネクチンでコートした１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと１２ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を添加したＣＤＭ（化学合成培地）に、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞を播種し、１〜３日培養し、培地を、ＰＶＡを添加したＣＤＭ培地に、１×１０−６ＭのＬｙ２９４００２（2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び１２ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を添加した培地に変更して、さらに１〜５日培養し、内胚葉分化を誘導し、内胚葉細胞の特徴が現われた細胞について、培地を、ＰＶＡを添加したＣＤＭ培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０を添加した培地に変更してさらに１〜４日培養し、さらに培地をＰＶＡを添加したＣＤＭ培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０と、１×１０−７Ｍのレチノイン酸と、１×１０−６ＭのＳＢ４３１５４２を添加した培地に変更してさらに１〜３日培養することにより、ヘパトブラスト細胞集団を調製する方法（Ｖａｌｌｉｅｒ法）；
【００２４】
６）多能性細胞をアクチビンとナトリウムを含む培地で内胚葉細胞を誘導し、次にＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)を含む培地で培養することにより分化が進み、ＡＦＰ等が強く発現するヘパトブラスト細胞集団を誘導する方法（例えば、非特許文献１参照）；
７）多能性細胞をアクチビンを含む培地で内胚葉細胞を誘導し、ＦＧＦ４（fibroblast growth factor-4）とＢＭＰ２（bone morphogenetic protein-2）を含む培地でＡＦＰ等を発現するヘパトブラスト細胞集団を誘導する方法（例えば、非特許文献２参照）；
８）多能性細胞をからＦＯＸＡ２とＨＮＦ４αとＡＦＰとが発現するヘパトブラストと称される肝前駆細胞を誘導する方法（例えば、非特許文献３参照）；
９）多能性幹細胞からＲＰＭＩ＋Ｂ２７培地にアクチビンとＷｎｔ３ａとＨＧＦとを添加した培地で内胚葉を誘導し、ＫＯ−ＤＭＥＭ２０％ＫＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で培養することによりヘパトブラスト細胞集団を誘導する方法（例えば、非特許文献４参照）；
【００２５】
上記工程（ｂ）において、ヘパトブラストヘテロ細胞集団を播種する肝幹細胞様細胞調製培地としては、ヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とを添加した培地であれば特に制限されず、ヘパトブラスト培地としては、例えば、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地に、サプリメントを構成する培地成分を添加することにより作製される培地を挙げることができる。上記基礎培地は、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培地が好ましい。ここで「培地」とは、「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。
【００２６】
上記ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）としては、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができるＨＧＦや、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製したＨＧＦを挙げることができ、また、本発明の効果を奏する限りにおいて、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が欠失又は置換されている誘導体を含めることができる。かかるＨＧＦは、例えば、０．１〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１２ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記ヘパトブラスト培地に添加することにより、上記肝幹細胞様細胞調製培地を調製することができる。
【００２７】
上記ＦＧＦ７（Fibroblast Growth Factor-７）としては、ＦＧＦ７を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製したＦＧＦ７を挙げることができ、また、本発明の効果を奏する限りにおいて、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が欠失又は置換されている誘導体を含めることができる。かかるＦＧＦ７は、０．１〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１２ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、上記ヘパトブラスト培地に添加することにより、上記肝幹細胞様細胞調製培地を調製することができる。
【００２８】
上記肝幹細胞様細胞調製培地は、細胞と培養容器との接着性を高めるために培養容器の内側にコートされたフィブロネクチン上に調製することが好ましく、フィブロネクチンをコートして用いる方法としては、物理的に吸着させたり、培養容器の細胞接着領域に反応性の官能基を導入して化学結合により容器表面に細胞接着因子を固定化する等の周知の方法を用いることができるが、具体的には、培養容器にフィブロネクチンを含む溶液を添加し、１時間から１２時間、好ましくは２時間から８時間、より好ましくは３時間から５時間、例えば３７℃にて乾燥させないように静置し、細胞を播種する直前に上記溶液を吸引除去する方法を例示することができる。フィブロネクチンの濃度としては、０．５〜５μｇ／ｃｍ２、好ましくは１〜３μｇ／ｃｍ２、より好ましくは１．５〜２．５μｇ／ｃｍ２を例示することができる。
【００２９】
上記基礎培地には、さらに１又は２種類、好ましくは３種類以上の無機塩（類）や、１又は２種類以上、好ましくは５種類以上、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは１５種類以上のアミノ酸（類）や、１又は２種類以上、好ましくは３種類以上、より好ましくは６種類以上、さらに好ましくは９種類以上のビタミン（類）や、１又は２種類以上、好ましくは３種類以上の微量成分（類）などを含むことが好ましく、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。
【００３０】
上記無機塩類としては、具体的には、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、硫酸マグネシウム（無水物）、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸水素二ナトリウム（無水物）、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、硫酸亜鉛七水和物、硫酸マンガン、硝酸カルシウム、硝酸カルシウム四水和物、硝酸鉄、硝酸鉄（III）九水和物、炭酸水素ナトリウム、モリブデン酸アンモニウム四水和物、塩化ニッケル(II)六水和物、ケイ酸ナトリウム、塩化スズ(II)二水和物、メタバナジウム酸アンモニウム、硫酸亜鉛七水和物、硫酸銅(II)五水和物等を挙げることができる。
【００３１】
上記アミノ酸類としては、具体的には、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、シスチン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン等を挙げることができ、上記各アミノ酸にはそれぞれ、Ｌ−体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物が含まれる。例えば、上記アルギニンの派生物としては、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等を挙げることができ、上記アスパラギン酸の派生物としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等を挙げることができ、上記システインの派生物としては、Ｌ−システイン二塩酸塩、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物等を挙げることができ、上記Ｌ−リジンの派生物としては、Ｌ−リジン塩酸塩等を挙げることができ、上記グルタミン酸の派生物としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等を挙げることができ、上記アスパラギンの派生物としては、Ｌ−アスパラギン一水和物等を挙げることができ、上記チロシンの派生物としては、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等を挙げることができ、上記ヒスチジンの派生物としては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等を挙げることができる。
【００３２】
上記ビタミン類としては、公知のビタミンの他、ビタミン様物質を含み、具体的には、ビオチン、コリン、パントテン酸、葉酸、ナイアシン、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、イノシトール等を挙げることができ、上記各ビタミンにはそれぞれ、これらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物が含まれる。例えば、上記コリンの派生物としては、塩化コリン等を挙げることができ、上記ナイアシンの派生物としては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等を挙げることができ、上記パントテン酸の派生物としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等を挙げることができ、上記ピリドキシンの派生物としては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等を挙げることができ、上記チアミンの派生物としては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等を挙げることができる。
【００３３】
上記微量成分としては、増殖能を維持したままヘパトブラストヘテロ細胞集団を培養するにあたり、有利に作用する成分であることが好ましく、リポ酸、プトレシン、チミジン、アデニン、グルタチオン、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、フェノールレッド等、通常培地成分として用いられている成分及びこれらの誘導体並びにそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができ、かかる派生物としては、グルタチオン還元型やグルタチオン酸化型、プトレシン二塩酸塩、アデニン硫酸塩等を挙げることができる。
【００３４】
前記５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとしては、８００ｍｇ／Ｌ〜２０００ｍｇ／Ｌのグルコースが好ましく、１１００ｍｇ／Ｌ〜１５００ｍＬのグルコースがより好ましい。また、糖（類）として、ラクトース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類から選ばれる１又は２以上の糖類をさらに添加することもできる。
【００３５】
前記０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンは、上記糖（類）、無機塩（類）、アミノ酸（類）、ビタミン（類）、微量成分（類）等の構成成分を含む基礎培地の成分に水を添加することにより培地中に生じるカルシウムイオンの合計濃度であり、０．０５〜０．８ｍＭのカルシウムイオンが好ましく、０．１〜０．６ｍＭのカルシウムイオンがより好ましく、０．２〜０．５ｍＭのカルシウムイオンがより好ましく、カルシウムイオンを生じさせる基礎培地の構成成分としては、上記パントテン酸カルシウム、硝酸カルシウム、塩化カルシウムを例示することができるが、これらに限定されない。
【００３６】
上記基礎培地としては、以下の表１に示される組成の基礎培地を具体的に例示することができるが、市販のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Iscove's Modified Dulbecco's Medium：）、ＭＣＤＢ培地、Ｆ１２ＮＵＴ−ＭＩＸ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等の化学合成培地の組成を改変し、及び／又は、これらの培地のいずれか２以上を適当な割合で混合し、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、及び、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンとを含む培地とすることもできる。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
また、上記基礎培地の好適な例としては、以下表２に示される組成のＨｅｐＳＣＦ基礎培地を好適に挙げることができる。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
前記サプリメントを構成する培地成分としては、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミン、セレン酸、脂肪酸不含アルブミン、ヘパリンを挙げることができ、サプリメントの使用形態としては、１又は２以上の上記成分からなるサプリメントを複数個に分別しておいてもよいし、多数の上記成分を含む一つのサプリメントとしてまとめておくこともできる。
【００４１】
前記ピルビン酸ナトリウムとしては、例えば０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０７５〜０．２５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．０８〜０．１５ｍｇ／ｍＬの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４２】
前記インスリンとしては、ブタ由来インスリン、ウシ由来インスリン、ヒト由来インスリン等の天然由来のインスリンや、アニマルプロダクトフリーグレードのインスリンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のインスリンを挙げることができ、特にヒト型の遺伝子組換え体インスリン（リコンビナントヒトインスリン）を好適に例示することができ、例えば１〜２０μｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１５μｇ／ｍＬ、より好ましくは７．５〜１２．５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９〜１１μｇ／ｍＬの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４３】
前記トランスフェリンとしては、ブタ由来トランスフェリン、ウシ由来トランスフェリン、ヒト由来トランスフェリン等の天然由来のトランスフェリンや、アニマルプロダクトフリーグレードのインスリンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のトランスフェリンを挙げることができ、さらに鉄低含有のａｐｏ型のトランスフェリンが、鉄と結合しているｈｏｌｏ型のトランスフェリンよりも好ましく、特にヒト型の遺伝子組換え体アポトランスフェリン（リコンビナントヒトａｐｏトランスフェリン）を好適に例示することができ、例えば０．１〜５０μｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜８μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは３〜７μｇ／ｍＬの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４４】
前記２−メルカプトエタノールとしては、常法により合成された化学合成品を例示することができ、例えば０．０１〜１５μＭ、好ましくは５〜１３μＭ、より好ましくは７．５〜１２．５μＭ、さらに好ましくは９〜１１μＭの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４５】
前記エタノールアミンとしては、２−アミノエタノール、又はモノエタノールアミンとも呼ばれ、常法により合成された化学合成品をアニマルプロダクトフリーグレードとして好適に例示することができ、例えば１〜３０μＭ、好ましくは５〜２０μＭ、より好ましくは７．５〜１２．５μＭ、さらに好ましくは９〜１１μＭの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４６】
前記セレン酸としては、セレン酸とその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含むことができ、常法により化学合成されたセレン酸、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸水素ナトリウム等を例示することができ、セレン酸ナトリウム換算で例えば１〜４５ｎＭ、好ましくは１０〜３５ｎＭ、より好ましくは１５〜３０ｎＭ、さらに好ましくは２０〜２６ｎＭの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４７】
前記脂肪酸不含アルブミンとしては、卵白アルブミン、ブタ由来アルブミン、ウシ由来アルブミン、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、アニマルプロダクトフリーグレードのアルブミンとしてウシ型、ブタ型、又はヒト型等の遺伝子組換え体のアルブミンであって、脂肪酸を含有していないアルブミンを挙げることができ、特にウシ血清由来アルブミンであって脂肪酸を含んでいないウシ血清由来の脂肪酸不含アルブミンを好適に例示することができ、例えば０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２５〜１ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬの終濃度になるように上記サプリメントの一構成成分として、前記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４８】
前記ヘパリンとしては、ウロン酸とアミノグリコシドからなるグリコサミノグリカンの構造を有する、抗血液凝固作用を有する因子を挙げることができ、天然物、合成品にかかわらず、本発明の効果を奏する限りにおいて、ヘパリンとその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物を含むことができ、常法により化学合成されたヘパリンナトリウム塩やヘパリンカルシウム塩を好適に例示することができ、例えば１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは８０〜１２０ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、前記サプリメントの一構成成分として、上記基礎培地に添加することにより、ヘパトブラスト培地を調製することができる。
【００４９】
上記ヘパトブラスト培地の具体例としては、以下の表３に示されるＨｅｐＳＣＦ培地を好適に挙げることができる。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
上記肝幹細胞様細胞調製培地の具体例としては、以下の表４に示されるＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地を好適に挙げることができる。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団において発現する分化誘導マーカーとしては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４α、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule：上皮細胞接着分子）、ＮＣＡＭ（Neural Cell Adhesion Molecule：神経細胞接着分子）、ＩＣＡＭ（intercellular adhesion molecule：細胞間接着分子）、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、ＡＦＰ、ＡＬＢ（アルブミン）等を挙げることができる。
【００５４】
上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団の形態的特徴としては、顕微鏡観察下においてやや大きい上皮様細胞の様相を呈するものや、やや小さい上皮様細胞、あるいは、間葉系細胞様の様相を呈する細胞などヘテロな細胞集団として観察されることを挙げることができる。
【００５５】
前記工程（ｃ）において、工程（ｂ）において播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を肝幹細胞様細胞調製培地に継代する方法としては、従来公知の継代方法であれば特に制限されず、例えば、培地交換後１２時間〜２０日、好ましくは３〜１５日、より好ましくは４〜６日に行うことを例示することができるが、培養されている細胞集団の状況によっては、５５〜９９％コンフルエント、好ましくは６５〜９５％コンフルエント、さらに好ましくは７０〜９０％コンフルエントに達した場合等、コンフルエンシーによって判断することもできる。継代回数としては、例えば２回以上、好ましくは３回以上、より好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上を挙げることができる。
【００５６】
前記工程（ｄ）において肝幹細胞様細胞調製培地に産生した肝幹細胞様細胞コロニーとしては、肝幹細胞様細胞調製培地上に産生する単一の細胞から増殖した細胞群を挙げることができ、上記コロニーの形態としては、実体顕微鏡下で観察したときに、高く盛り上がっている形態や、細胞がやや小さく、細胞と細胞の間隙が非常に狭いコロニーの形態等を挙げることができる。また、肝幹細胞様細胞コロニーを単離する方法としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、顕微鏡下又は目視にて、先端の細いプラスチックパスツールの先端や、マイクロピペットのチップの先端を用いてコロニーを培地から剥離する方法を挙げることができる。コロニーを肝幹細胞様細胞調製培地から単離する前に、ディスパーゼ等の分散酵素により処理することもできる。
【００５７】
前記工程（ｅ）における肝幹細胞様細胞を調製する方法としては、工程（ｄ）において単離された肝幹細胞様細胞コロニーを上記肝幹細胞様細胞調製培地において培養する方法であれば特に制限されず、２以上のコロニーから肝幹細胞様細胞を調製する場合は、コロニー毎に、肝幹細胞様細胞を調製することが好ましく、コロニー毎に処理することによりロット管理が容易となり、肝実質細胞様細胞や胆管様細胞へ分化誘導率が５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上となる肝幹細胞様細胞を取得し、保存することができる。
【００５８】
上記肝幹細胞様細胞は、例えば、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地等において培養を続け、適宜継代することにより、増殖させることができ、また、上記肝幹細胞様細胞の保存方法としては、ディスパーゼ等の剥離溶液を用いて細胞剥離し、次いで、肝幹細胞様細胞調製培地にＤＭＳＯ溶液を添加した凍結保存液に上記剥離細胞を浮遊させ、適切な容器に封入した後マイナス７０℃〜８０℃に凍結させた後、液体窒素中で保存する方法を挙げることができる。かかる方法により半永久的に保存することができ、解凍後に適切に分化誘導された肝実質様細胞や胆管様細胞は、細胞移植療法における有力なツールとなり、またインビトロにおいて薬剤や化合物の毒性や代謝を評価するためのツールとなりうる。
【００５９】
上記肝幹細胞様細胞としては、ヒト肝臓に存在するヒト肝幹細胞と同等の特性を有する細胞を挙げることができ、ヒト肝幹細胞と同等の特性としては、ヒト肝幹細胞と同等の分化誘導マーカー発現や、肝前駆細胞様細胞への分化能を有すること等を挙げることができる。
【００６０】
上記ヒト肝幹細胞と同等の分化誘導マーカー発現としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４α、ＫＲＴ１９、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule：上皮細胞接着分子）、ＮＣＡＭ、Ｎ−ｃａｄ（Ｎ−cadherin：Ｎ−カドヘリン）、ＩＣＡＭ、ＣＤ１３、ＣＤ１３３等が発現することを挙げることができる。
【００６１】
さらにまた、ＯＣＴ−３／４やＮＡＮＯＧ等の未分化マーカーを発現しないことや、ＡＦＰやＡＬＢ（アルブミン）が発現しない又はほとんど発現しないことをヒト肝幹細胞と同等の特性として含めることができ、具体的には、肝細胞様細胞前駆細胞との比較において、ＡＦＰやＡＬＢの発現が肝細胞様細胞前駆細胞と比較するとそれぞれ２分の１以下、好ましくは３分の１以下、より好ましくは５分の１以下、特に好ましくは１０分の１以下であることを例示することができる。
【００６２】
上記肝幹細胞様細胞が、肝前駆細胞様細胞への分化能を有するか否かは、上記肝幹細胞様細胞から肝前駆細胞様細胞を調製することができるか否かによって決定することもでき、前述のとおり肝幹細胞様細胞をヘパトブラスト培地にＨＧＦとＦＧＦ７とＳＢ４３１５４２とＹ−２３６７２とを添加した肝前駆細胞様細胞調製培地で培養することにより、肝前駆細胞様細胞を調製することができる。
【００６３】
上記ＨＧＦとしては、例えば、０．１〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１２ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、また、ＦＧＦ７としては、例えば、０．１〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは７〜１２ｎｇ／ｍＬの終濃度になるように、それぞれ上記ヘパトブラスト培地に添加することにより肝前駆細胞様細胞調製培地を調製することができる。
【００６４】
上記ＳＢ４３１５４２としては、ＴＧＦ‐βのＴｙｐｅＩレセプターであるＡＬＫ５の強力で選択的な阻害物質であることが知られている、ＣＡＳＮｏ．３０１８３６−４１−９の化合物又はその誘導体を挙げることができ、例えば、０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは５〜１５μＭ、さらに好ましくは７〜１２μＭの終濃度になるように肝前駆細胞様細胞調製培地に添加することにより、また、上記Ｙ−２７６３２としては、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であることが知られている、ＣＡＳＮｏ．３３１７５２−４７−７の化合物又はその誘導体を挙げることができ、例えば、０．１〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは５〜１５μＭ、さらに好ましくは７〜１２μＭの終濃度になるように肝前駆細胞様細胞調製培地に添加することにより調製することができる。
【００６５】
上記肝前駆細胞様細胞調製培地の具体例としては、以下の表５に示されるＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地を好適に挙げることができる。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
上記肝前駆細胞様細胞としては、ヒト肝臓に存在するヒト肝前駆細胞と同等の特性を有する細胞を挙げることができ、ヒト肝前駆細胞と同等の特性としては、ヒト肝前駆細胞と同等の形態や、ヒト肝前駆細胞と同等の分化誘導マーカー発現や、肝実質細胞様細胞や胆管様細胞へ、必要に応じて即座に分化する能力を有すること等を挙げることができる。
【００６８】
上記ヒト肝前駆細胞と同等の形態としては、肝幹細胞よりは大きく、扁平であり、細胞と細胞の間隙が明瞭なコロニーを形成する等を挙げることができる。
【００６９】
上記肝前駆細胞様細胞は、例えば、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地等において培養・継代することにより、適宜増殖させることができ、また、肝前駆細胞様細胞の保存方法としては、ディスパーゼ等の剥離溶液を用いて細胞剥離し、次いで、肝幹細胞様細胞調製培地にＤＭＳＯ溶液を添加した凍結保存液に上記剥離細胞を浮遊させ、適切な容器に封入した後マイナス７０℃〜８０℃に凍結させた後、液体窒素中で保存する方法を挙げることができる。かかる方法により半永久的に保存され、解凍後に適切に分化誘導された肝実質様細胞や胆管様細胞は、細胞移植療法における有力なツールとなりえ、またインビトロにおいて薬剤や化合物の毒性や代謝を評価するためのツールとなりうる。
【００７０】
上記ヒト肝前駆細胞と同等の分化誘導マーカー発現としては、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４α、ＫＲＴ１９、ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、ＡＦＰ、ＡＬＢ等が発現することを挙げることができる。
【００７１】
上記肝前駆細胞様細胞が肝実質細胞様細胞や胆管様細胞への分化能を有するか否かは、上記肝前駆細胞様細胞から、肝実質細胞様細胞や胆管様細胞を調製することができるか否かによって決定することもできる。
【００７２】
上記肝前駆細胞様細胞から肝実質細胞様細胞の調製方法としては、公知の方法であれば特に制限されないが、肝前駆細胞様細胞をＨｅｐＳＣＦ培地で洗浄し細胞を剥離後、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地に懸濁し、コンフルエントになった肝前駆細胞様細胞をＨｅｐＳＣＦにＨＧＦ、ＳＢ４３１５４２、Ｙ４３１５４２、ニコチンアミド、デキサメタゾン、アスコルビン酸、ＯＳＭ、Ｗｎｔ３ａ、ＤＡＰＴを添加した培地に培地交換し、さらに培地交換を１〜１５日毎に行いながら培養する方法を例示することができる。
【００７３】
また、以下の（ａ）〜（ｃ）の方法により肝前駆細胞様細胞から肝実質細胞様細胞へ誘導することもできる。
（ａ）肝前駆細胞様細胞を、市販の肝細胞専用培地に、肝細胞培養用添加因子セットからｈＥＧＦ（組換えヒト上皮細胞成長因子）を除いたものを添加し、２０ｎｇ／ｍＬオンコスタチンＭを添加した培地に、肝前駆細胞様細胞を播種し、２〜８日間、好ましくは４〜７日間培養することにより、肝実質細胞様細胞へ分化する方法（ＮＩＨセンター肝細胞分化方法）；
（ｂ）肝前駆細胞様細胞を、８．３％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＬ１５培地に、１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのオンコスタチンＭを添加した培地を用い、肝前駆細胞様細胞を播種し、３〜１０日間、好ましくは５〜９日間培養することにより、肝前駆細胞様細胞を、肝実質細胞様細胞へ分化する方法（ＷｅｉＣｕｉ肝細胞分化方法）；
（ｃ）肝前駆細胞様細胞を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を添加したＣＤＭ培地に、３０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４、５０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを添加した培地を用い、肝前駆細胞様細胞を播種し、５〜１５日間、好ましくは８〜１２日間培養することにより、肝前駆細胞様細胞を、肝実質細胞様細胞へ分化する方法（Ｖａｌｌｉｅｒ肝細胞分化方法）；
【００７４】
上記肝実質細胞様細胞としては、ヒト肝臓に存在するヒト肝実質細胞と同等の特性を有する細胞を挙げることができ、ヒト肝実質細胞と同等の特性としては、ヒト肝実質細胞と同等の形態や、ヒト肝実質細胞と同等の分化誘導マーカー発現を有することを挙げることができる。
【００７５】
上記ヒト肝実質細胞と同等の形態としては、細胞がかなり大きく、扁平な形態をもち、多核の細胞も存在する点を挙げることができる。
【００７６】
上記ヒト肝実質細胞と同等の分化誘導マーカー発現としては、ＡＬＢ、ＡＡＴ、ＴＴＲ（Transthyretin）、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９等が発現することを挙げることができ、特に肝前駆細胞様細胞と比べて２倍以上発現している、ＡＡＴ、ＴＴＲ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９等が発現することを好ましく挙げることができる。
【００７７】
上記肝前駆細胞様細胞から胆管様細胞の調製方法としては、従来公知の方法であれば特に制限されず、コラーゲンゲル培養法を挙げることができる。
【００７８】
上記胆管様細胞としては、ヒト肝臓に存在するヒト胆管細胞と同等の特性を有する細胞を挙げることができ、ヒト胆管細胞と同等の特性としては、ヒト胆管細胞と同等の形態を有すること等を挙げることができる。
【００７９】
上記ヒト胆管細胞と同等の形態としては、細胞群が管状の分岐構造を形成していることを挙げることができる。
【００８０】
本発明における分化誘導マーカーの発現を確認する方法としては、各マーカーの発現を、遺伝子レベルで確認する方法や、タンパク質レベルで確認する方法等を挙げることができる。上記各マーカーの発現を遺伝子レベルで確認する場合には、各マーカー遺伝子に対する特異的プライマー対を用いた遺伝子発現解析法、特異的プローブを用いたノーザンブロッティング方等によって確認することができる。これらの方法に用いられるプローブやプライマーは、各遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて適宜作製することができる。上記各マーカーの発現をタンパク質レベルで確認する方法としては、各マーカーの特異抗体を用いた、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。
【００８１】
上記免疫染色法としては、本発明の方法で培養した細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定後、ＦＢＳでブロッキングを行った後、各対象マーカータンパク質の抗体と標識抗体とを用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡観察により判定する方法を例示することができる。
【００８２】
上記遺伝子発現解析法としては、本発明の方法で培養した細胞を溶解・破砕後精製したＲＮＡから、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、プライマーや適切な試薬を用いてリアルタイムＰＣＲ法を行い、その結果から遺伝子発現を評価する方法を挙げることができる
【００８３】
本発明は、ヒト肝幹細胞様細胞を単離するための培地を作製するためのキットを提供する。本発明のキットは、水に添加して調製した場合に、０．０３ｍＭ〜１ｍＭのカルシウムイオンと、５００ｍｇ／Ｌ〜４５００ｍｇ／Ｌのグルコースとを含む基礎培地を構成する成分群とピルビン酸ナトリウム、インスリン、トランスフェリン、２−メルカプトエタノール、２−エタノールアミン、セレン酸、脂肪酸不含アルブミン、ヘパリンからなるサプリメントを構成する成分群と、ＨＧＦとＦＧＦ７とを備え、上記基礎培地又はサプリメントを構成する成分は、一部の又は全部の成分を個別に包装され、２以上の組成物を混合して包装される。上記キットは、さらに培養細胞について、ヒト肝幹細胞の特性の有無を判定するための、分化マーカータンパク質に対する抗体や、分化マーカー遺伝子を検出するためのプライマー、プローブや、添付文書等を含むこともできる。
【００８４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例において用いられる多能性幹細胞であるＥＳ細胞株やｉＰＳ細胞株については、政府指針に従い分与を受け実験に供した。他の細胞株についても国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所に保管されており、一定条件下で分譲可能である。
【実施例】
【００８５】
［参考例１］
［ヒトＥＳ細胞由来ヘパトブラストヘテロ細胞集団の作製］
上記非特許文献３を参考に、以下のとおり、ヒトＥＳ細胞株Ｈ９（以下、「Ｈ９細胞」ともいう）から、ヘパトブラストヘテロ細胞集団を調製した。
【００８６】
Ｈ９細胞をフィーダーフリーにて、以下に示すｈＥＳＦ−ＦＸ培地（和光純薬工業社製）を用いてＴ２５フラスコで培養した。細胞剥離液アキュターゼ（Merck Millipore社製）１ｍＬを添加し、室温で２〜３分間静置した。１０ｍＬのｍＴｅＳＲ培地（STEMCELL Technologies社製）をＴ２５フラスコに添加し、Ｈ９細胞をスクレーパーで剥離した。剥離したＨ９細胞をＴ２５フラスコから１５ｍＬ遠沈管に回収し、さらにＴ２５フラスコを２ｍＬのｍＴｅＳＲ培地を用いてリンスすることにより、Ｈ９細胞を遠沈管に再回収した。遠沈管に回収及び再回収されたＨ９細胞を含むｍＴｅＳＲ培地を８００ｒｐｍにて２分間遠心した。遠沈管から上清を除き、タッピングをすることにより細胞を分散させた後、１０ｍＬのｍＴｅＳＲ培地を遠沈管に添加し、再度、８００ｒｐｍにて２分間遠心した。遠沈管から上清を除き、ｍＴｅＳＲ培地を遠沈管に添加して細胞を懸濁し、６０００００個細胞／ウェルになるようにＨ９細胞をＧｅｌｔｒｅｘ（ThermoFisher Scientific社製）をコーティングした２４ウェルプレートに播種した。
【００８７】
播種されたＨ９細胞は、３７℃にて、５％ＣＯ２存在下にてインキュベーターを用いて２４時間培養された。２４時間後、５００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ThermoFisher Scientific社製）／Ｂ２７（−インスリン）（ThermoFisher Scientific社製）にnon-essential amino acidと１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２とを添加した培地に交換し、２日間培養した。
【００８８】
２日後、上記培養細胞をＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７（−インスリン）にnon-essential amino acidと１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡとを添加した培地に交換し、３日間培養した。３日後、上記培養細胞をＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７にnon-essential amino acidと２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２とを添加した培地に交換し、５日間培養した。５日後、ＲＰＭＩ１６４０／Ｂ２７に非必須アミノ酸と２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）とを添加した培地に交換し、２日間培養した。
【００８９】
上述の手順で得られたＨ９細胞由来の細胞の位相差画像を図１に示す。かかる位相差画像は、位相差顕微鏡（Ｍ１２５ Leica社製）により撮影された。画像から明らかなとおり、上皮様細胞や間葉系細胞様細胞が混在する一方で、へパトブラストの形態に似たコロニーも確認できた点で、ヘテロなヘパトブラスト細胞集団であるといえる。
【００９０】
［実施例１］
［ヒトＥＳ細胞由来肝幹細胞様細胞の単離］
上記Ｈ９細胞由来ヘパトブラストヘテロ細胞集団を２日間培養後に培地を除き、ヘパトブラストヘテロ細胞集団に０．５ｍＬのディスパーゼ（Roche社製）を添加し、３７℃にて４分間静置した。静置後ディスパーゼを除き、３ｍＬの前記ＨｅｐＳＣＦ培地で洗浄後、２ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地を添加し、スクレーパーで細胞を剥離した。
【００９１】
（ヘパトブラストヘテロ細胞集団のＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地での培養）
上記剥離された細胞は、１５ｍＬの遠沈管に回収され、１０００ｒｐｍにて１分間遠心後、遠沈管から上清を除き、ＨｅｐＳＣＦ培地に１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦと１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加することにより調製されたＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地に懸濁し、２μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチン（Sigma Aldrich社製）をコーティングした６ウェルプレートに播種した。播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、３７℃にて５％ＣＯ２存在下にてインキュベーターを用いて４日間培養後、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地に１回目の継代を行った。
【００９２】
（ヘパトブラストヘテロ細胞集団の蛍光免疫染色）
【００９３】
上記蛍光免疫染色の具体的な手順は以下のとおりである。６ウェルプレートに細胞を播種し（０日）、６〜８日後に、培養上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（和光純薬工業社製）を移し、室温で１５分間静置して、細胞をウェルに固定した。４％ＰＦＡを除き、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。固定した細胞を洗浄後３％ＦＢＳを添加し、室温にて３０分間ウシ血清を用いてブロッキングした。３％ＦＢＳを除き、一次抗体を加えた後４℃にて一晩反応させた後、一次抗体を除きＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳでの洗浄後二次抗体を加え、室温にて１時間反応させ、二次抗体を除いてＰＢＳで１回洗浄した後、蛍光顕微鏡下に観察を行った。結果を図２（ａ）〜（ｄ）に示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、各抗体による染色画像をオーバーレイしたものである。
【００９４】
図２から明らかなとおり、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地での１回目の継代後の細胞集団においては、ＦＯＸＡ２（ａ）は全体的に強く発現しており、ＨＮＦ４α（ｂ）は、発現が強い細胞と発現が弱い細胞が観察され、ＡＦＰ（ｃ）は、全体的に発現しているが、発現が特に強い細胞と発現が弱い細胞が見受けられた。Ｍｅｒｇｅ（ｄ）において、矢印の部分が、ＡＦＰの発現が弱まっていることから肝幹細胞コロニーとなるのではないかと予想した。
【００９５】
（肝幹細胞様細胞の位相差画像）
前記第１回目の継代後のヘパトブラストヘテロ細胞集団は、２日間毎にさらにＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地で継代を行い、顕微鏡下又は目視にて観察を続けた。２継代目にそれまでのヘテロな細胞集団とは明らかに形態の異なるコロニーを見いだしたため、マイクロピペットのチップの先端を用いてかかるコロニーを培地から剥離することにより単離した。コロニーから単離された細胞群の位相差画像を図３に示す。実体顕微鏡下で観察したときに、高く盛り上がっている形態や、細胞がやや小さく、細胞と細胞の間隙が非常に狭いコロニーを形成することから肝幹細胞の特徴を示していることが確認された。
【００９６】
［ＥＳ細胞由来肝幹細胞様細胞の肝前駆細胞様細胞への分化］
上記ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地において増殖しているＥＳ細胞由来の肝幹細胞様細胞を、ＨｅｐＳＣＦに１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、１０μＭのＳＢ４３１５４２（TOCRIS社製）、１０μＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業社製）を添加した培地（ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地）で培養したところ、上記単離された肝幹細胞コロニー由来の細胞が、さらに肝前駆細胞様細胞に分化していることが確認された。上記ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の肝前駆細胞様細胞の位相差画像を図４に示す。顕微鏡による観察により、肝幹細胞より大きく扁平な形態であり、細胞と細胞の間隙が明瞭なコロニーが確認されたことから、肝前駆細胞様細胞であることがわかる。
【００９７】
上記ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中で肝幹細胞様細胞から誘導された細胞群について、ＦＯＸＡ２、ＡＦＰ、ＨＮＦ４αをマーカーとして用いて、蛍光免疫染色により細胞の陽性率を解析した。具体的な手順は、上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団の蛍光免疫染色の手順にしたがった。なお、核を染色するためにヘキスト３３３４２を用いて染色を行った（「Ｈｏｅｓｃｈｓｔ」）。「Ｂｒｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ」は位相差画像を撮影したものでしたものである。結果を図５に示す。
【００９８】
（結果）
図５（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）から明らかなとおり、上記ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の肝幹細胞から誘導された細胞群は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４αとともにＡＦＰを強く発現していることが確認され、肝幹細胞からさらに分化した肝前駆細胞様細胞であることが確認された。
【００９９】
［参考例２］
［ヒトｉＰＳ細胞由来ヘパトブラストヘテロ細胞集団の作製］
ｉＰＳ細胞を遺伝子導入によりヘパトブラストヘテロ細胞集団に誘導した。ヒトｉＰＳ細胞として、ヒトｉＰＳ細胞Ｄｏｔｃｏｍ株（ＪＣＲＢ１３２７）（医薬基盤研・ＪＳＣＢ細胞バンク）（以下「Ｄｏｔｃｏｍ株」ともいう）を使用した。中内胚葉（mesoendoderm）分化を促進するために、上記ヒトｉＰＳ細胞を、細胞分離試薬アキュターゼ（ミリポア社製）を用いて単細胞に分離した。ＢＤマドリゲル（登録商標）上に、ヒトＥＳ細胞分化誘導用基礎培地ｈＥＳＦ−ＤＩＦ（細胞科学研究所製）に、１０μｇ／ｍＬのヒトリコンビナントインスリン（シグマ社製）、５μｇ／ｍＬのヒトアポトランスフェリン（シグマ社製）、１０μＭの２−メルカプトエタノール（シグマ社製）、１０μＭのエタノールアミン（シグマ社製）、１０μＭのセレン酸ナトリウム（シグマ社製）、０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（シグマ社製）（ＰＢＳ（phosphate-buffered saline）にて調製）、及び１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）をサプリメントとして添加した培地に、上記分離単細胞を播種した。この日を分化０日目とする。２日間培養し、ヒトｉＰＳ細胞由来中内胚葉様細胞（mesoendoderm cells）を得た。
【０１００】
２日後、内胚葉細胞を作製するため、上記Ｄｏｔｃｏｍ株由来中内胚葉様細胞を、ＨＯＸＡ２遺伝子を挿入したＡｄベクター（Ａｄ‐ＦＯＸＡ２）に、１５００ＶＰ(vector particle)／細胞に１．５時間感染させた。Ａｄ-ＦＯＸＡ２感染細胞を、ＢＤマトリゲル上に、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したｈＥＳＦ−ＤＩＦ培地において、分化６日目まで培養を続けることにより、内胚葉細胞を得た。
【０１０１】
上記内胚葉細胞からヘパトブラストヘテロ細胞集団への分化をさらに進めるため、分化６日目に、上記内胚葉細胞に、上記Ａｄ-ＦＯＸＡ２と、ＨＮＦ４α遺伝子を挿入したＡｄベクター（Ａｄ‐ＨＮＦα）とを、１，５００ＶＰ(vector particle)／細胞にて１．５時間感染させた。Ａｄ‐ＦＯＸＡ２・Ａｄ‐ＨＮＦα感染細胞を、ＢＤマトリゲル上に、骨形成タンパク質４（bone morphogenetic protein 4：（ＢＭＰ４）、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）及び２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ社製)を添加した肝細胞培養培地（hepatocyte culture medium：ＨＣＭ）（Lonza社製）において、３日間培養した。
【０１０２】
上述の手順で得られたＤｏｔｃｏｍ株由来の細胞の位相差画像を図６に示す。画像から明らかなとおり、上皮系様の細胞や間葉系細胞様細胞が存在する一方で、へパトブラストの形態に似たコロニーも確認できた点で、ヘパトブラストヘテロ細胞集団であるといえる。
【０１０３】
［実施例２］
［ヒトｉＰＳ細胞由来肝幹細胞様細胞の単離］
上記Ｄｏｔｃｏｍ株由来ヘパトブラストヘテロ細胞集団を２日間培養後に上記ＨＣＭ培地を除き、ヘパトブラストヘテロ細胞集団に０．５ｍＬのディスパーゼを添加し、３７℃にて４分間静置した。静置後ディスパーゼを除き、３ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地で洗浄後、２ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地を添加し、スクレーパーで細胞を剥離した。
【０１０４】
（ヘパトブラストヘテロ細胞集団のＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地での培養）
上記剥離された細胞は、１５ｍＬの遠沈管に回収され、１０００ｒｐｍにて１分間遠心後、遠沈管から上清を除き、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地に懸濁し、２μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンがコーティングされた６ウェルプレートに播種した。播種されたヘパトブラストヘテロ細胞集団を、３７℃にて５％ＣＯ２存在下にてインキュベーターを用いて培養を起こった。４日から７日間毎にＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地で数回継代を行い、顕微鏡下又は目視にて観察を続けたところ、２継代から３継代目にそれまでのヘテロな細胞集団ではなく、コロニーとして増殖している細胞を見いだした（図７参照）。マイクロピペットのチップの先端を用いてかかるコロニーを培地から剥離することにより単離した。コロニーから単離された細胞の位相差画像を図８に示す。細胞が小さく、強くパッキングされたコロニーを形成する点でヒト肝幹細胞の特徴を示していた。
【０１０５】
［ｉＰＳ細胞由来肝幹細胞様細胞の肝前駆細胞様細胞への分化］
上記ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地において増殖しているＤｏｔｃｏｍ株由来の肝幹細胞様細胞を、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地で培養したところ、上記単離されたコロニー由来の細胞が、さらに肝前駆細胞様細胞に分化し、増殖が行われることが確認された。ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地中の肝前駆細胞様細胞の位相差画像を図９に示す。肝幹細胞よりやや大きく扁平な形態であることから、肝前駆細胞様細胞であることがわかる。
【０１０６】
前記ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地で培養された肝幹細胞様細胞と上記ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地で培養された肝前駆細胞様細胞とについて、リアルタイムＰＣＲ法により、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４α、ＫＲＴ１９、ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、ＡＦＰ、ＡＬＢの各マーカーについて発現解析を行った。
【０１０７】
細胞溶解液ＲＬＴバッファーを用いて、肝幹細胞様細胞及び肝前駆細胞様細胞をそれぞれ溶解後、各細胞溶解液をＱｉａｓｈｕｌｅｄｄｅｒカラムに回収し、１３０００ｒｐｍにて２分間遠心して、細胞を破砕した。破砕された各細胞からＲＮｅａｓｙキットを使用して、ＲＮＡを精製し、精製した各ＲＮＡ２５０ｎｇと逆転写酵素を含むＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯＴＭｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ、標的プライマーセット、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑＩＩを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、リアルタイムＰＣＲの結果から、遺伝子発現を評価した。結果を図１０に示す。
【０１０８】
図１０から明らかなとおり、ＨｅｐＳＣＦ＋２Ｆ培地で培養された肝幹細胞様細胞、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地で培養された肝前駆細胞様細胞いずれにおいても、未分化のｉＰＳ細胞と比較して、肝実質細胞への分化が進んでいることを示すＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４α、ＫＲＴ１９、ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ１３、ＣＤ１３３が強く発現していた。なお、肝幹細胞様細胞においては、肝前駆細胞様細胞よりもＮＣＡＭの発現が２倍以上であり、ＣＤ１３３の発現も肝前駆細胞様細胞に比べて顕著に多い一方、ＡＦＰとＡＬＢの発現が顕著に低く（ＡＦＰは、肝前駆細胞様細胞の１/１６の発現量）、肝幹細胞としての特徴が強く示されていることが確認された。
【０１０９】
［参考例２］
［ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞の肝実質細胞様細胞への分化誘導］
上記Ｄｏｔｃｏｍ株由来肝前駆細胞様細胞の肝実質細胞様細胞へ分化を誘導した。上記６ウェルプレートで培養しているｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞からＨｅｐＳＣＦ+４Ｆ培地を除き、１ｍＬのディスパーゼを移して、３７℃にて１分間静置した。静置後ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞を７ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地で洗浄し、さらに５ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地を添加し、スクレーパーで細胞を剥離した。剥離した肝前駆細胞様細胞を１５ｍＬの遠沈管に回収し、プレートをさらにＨｅｐＳＣＦ培地を用いてリンスすることにより、肝前駆細胞様細胞を遠沈管に再回収した。遠沈管に回収及び再回収された肝前駆細胞様細胞を含むＨｅｐＳＣＦ培地を１０００ｒｐｍにて１分間遠心した。上清を除き、タッピングで細胞を分散させた後、ＨｅｐＳＣＦ培地に１０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７、１０μＭのＳＢ４３１５４２、及び１０μＭのＹ４３１５４２を添加したＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地で懸濁し、２×１０４〜４×１０４個／ウェルの細胞を２μｇ／ｃｍ２のフィブロネクチンがコートされた４８ウェルプレートに播種した。
【０１１０】
ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地において、８０〜９０％コンフルエントになった肝前駆細胞様細胞は、ＨｅｐＳＣＦに２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、１０μＭのＳＢ４３１５４２、１０μＭのＹ４３１５４２、１０ｍＭのニコチンアミド、１μＭのデキサメタゾン、０．１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、１０μＭのＤＡＰＴを添加した７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地を肝実質細胞様細胞調製培地として用い、８日毎に培地を交換して培養を続けた。
【０１１１】
上記７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地での培養３０日目の細胞について、ＡＬＢ及びＡＡＴをマーカーとして用いて、蛍光免疫染色により細胞の陽性率を解析した。具体的な手順は、上記ヘパトブラストヘテロ細胞集団の蛍光免疫染色の手順にしたがった。結果を図１１に示す。
【０１１２】
図１１から明らかなとおり、７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地で培養された肝前駆細胞様細胞は、培養後ＡＬＢとＡＡＴの発現が非常に強く、肝実質細胞様細胞に分化していることが確認された。
【０１１３】
上記７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地での培養３０日目の細胞において、肝細胞で発現することが知られている、ＡＬＢ、ＡＡＴ、ＴＴＲ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＳＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９の１０種類のマーカー発現についてＲＮＡ解析を行い、マーカー発現を評価した。結果を図１２に示す。
【０１１４】
（結果）
図１２から明らかなとおり、肝細胞で発現することが知られている、ＡＬＢや、ＡＡＴ、ＴＴＲ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＳＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ２Ｃ１９等の成熟肝細胞マーカーの１０種類のマーカーのいずれもが、肝前駆細胞様細胞を、ＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地にニコチンアミドとデキサメタゾンを加えた培地（ネガティブコントロール用培地）よりも、７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎを加えた培地（分化誘導用培地）で培養された細胞が顕著に強く発現しており、７Ｆ＋Ｄａ＋Ｗｎ培地において、肝前駆細胞様細胞から肝実質細胞用培養に分化したことが示されている。
【０１１５】
［参考例３］
［ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞の胆管様細胞への分化誘導］
上記Ｄｏｔｃｏｍ株由来肝前駆細胞様細胞を胆管様細胞へ分化を誘導した。上記６ウェルプレートで培養されているｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞からＨｅｐＳＣＦ＋４Ｆ培地を除き、１ｍＬのディスパーゼを移して、３７℃にて１分間静置した。静置後ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞様細胞を７ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地で洗浄し、さらに５ｍＬのＨｅｐＳＣＦ培地を添加し、スクレーパーで細胞を剥離した。剥離した肝前駆細胞様細胞を１５ｍＬの遠沈管に回収し、プレートをさらにＨｅｐＳＣＦ培地を用いてリンスすることにより、肝前駆細胞様細胞を遠沈管に再回収した。遠沈管に回収及び再回収された肝前駆細胞様細胞を含むＨｅｐＳＣＦ培地を１０００ｒｐｍにて１分間遠心した。上清を除き、タッピングで細胞を分散させた後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ThermoFisher Scientific社製）に、１０μｇ／ｍＬのヒトインシュリン、５μｇ／ｍＬのヒトアポトランスフェリン、１０μＭの２−アミノエタノール、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｎＭのセレン酸ナトリウム、４ｍｇ／ｍＬの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを添加した培地で培養して，胆管細胞誘導用細胞懸濁液を調製した。
【０１１６】
０．２４％のタイプ１コラーゲン、１×ＤＭＥＭ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．２２％のＮａＨＣＯ３、及び５ｍＭのＮａＯＨを含むコラーゲンゲル溶液と上記胆管細胞誘導用細胞懸濁液を１：２で混合して混合溶液とし、４８ウェルプレートに播種し、３７℃にて３０分間ＣＯ２インキュベーターでゲル化させた。３０分後、コラーゲンゲル化した混合溶液の上に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０μｇ／ｍＬのヒトインシュリン、５μｇ／ｍＬのヒトアポトランスフェリン、１０μＭの２−アミノエタノール、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｎＭのセレン酸ナトリウム、４ｍｇ／ｍＬの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを添加した胆管誘導用培地１を移して、３７℃にてＣＯ２インキュベーターで培養した。
【０１１７】
１日後から、２日毎にＤＭＥＭ／Ｆ１２に１０μｇ／ｍＬのヒトインシュリン、５μｇ／ｍＬのヒトアポトランスフェリン、１０μＭの２−アミノエタノール、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１０ｎＭのセレン酸ナトリウム、４ｍｇ／ｍＬの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、及び１％ＦＢＳを添加した胆管誘導用培地２に培地交換し、１０日間コラーゲンゲル培養を行った。
【０１１８】
上記コラーゲンゲル培養を行った培地において、顕微鏡により観察を行ったところ明らかな胆管分化細胞が現れたので４％ＰＦＡで３０分間固定し、０．５％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ溶液で、細胞のパーミライズを行った。３％のＦＢＳを含むＰＢＳ溶液でブロッキングを室温にて３０分間行った。抗ＣＫ１９抗体で４℃にて一晩反応させた後ＰＢＳＴで３回洗浄した。二次抗体ＡＰ（アルカリフォスファターゼ）を添加して４℃にて一晩反応させた後ＰＢＳＴ（Phosphate Buffered Saline with Tween（登録商標）20）で３回洗浄した。ＡＰの基質を加えて反応させ、発色後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。顕微鏡で観察して、画像を撮影した。結果を図１３に示す。
【０１１９】
図１３より明らかなとおり、細胞は、管状の分岐構造であり、胆管細胞と同等の構造を有する胆管様細胞であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、医療分野において非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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