(57)【要約】【課題】凝集性ペプチドのオリゴマーを単離する技術を提供する。【解決手段】タンパク質ケージを構成するタンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側のうち、前記タンパク質ケージの内腔に位置する側の末端に凝集性ペプチドが結合した融合タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ケージを構成するタンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側のうち、前記タンパク質ケージの内腔に位置する側の末端に凝集性ペプチドが結合した融合タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質ケージが、フェリチン、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、Ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）、Ｃｏｗｐｅａ  Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＣＭＶ）、シャペロニン、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ又はＬｕｍａｚｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記凝集性ペプチドが、アミロイドβ、α−シヌクレイン、タウ、ポリグルタミンタンパク質又はβシート形成ペプチドである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーが自己組織化したタンパク質ケージ。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることを含み、その結果、前記タンパク質ケージの内腔で前記凝集性ペプチドがオリゴマーを形成する、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造方法。
【請求項７】
凝集性ペプチドが２〜１８０個凝集した、凝集性ペプチドのオリゴマー。
【請求項８】
凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることと、
前記凝集性ペプチドのオリゴマーの形成量を測定することと、を含み、
前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの形成量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項９】
凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、請求項５に記載のタンパク質ケージをインキュベートすることと、
前記タンパク質ケージの内腔における前記凝集性ペプチドのオリゴマーの存在量を測定することと、を含み、
前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの存在量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの存在量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造用キット。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤、又は、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質及びその使用に関する。より詳細には、融合タンパク質、核酸、タンパク質ケージ、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造方法、凝集性ペプチドのオリゴマー、スクリーニング方法、オリゴマーの製造用キット及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、神経細胞が死滅する進行性疾患である。神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病等が知られている。これら神経変性疾患の一因は凝集性ペプチドの蓄積である。
【０００３】
凝集性ペプチドは細胞内で凝集し、神経細胞の機能障害を引き起こし、最終的には細胞死を誘発する。このような性質を持つ凝集性ペプチドとして、アミロイドβ（以下、「Ａβ」という場合がある。）、タウ、α−シヌクレイン等が知られている。
【０００４】
例えば、Ａβペプチドは、オリゴマーを形成した後、ファイバーを形成する。Ａβペプチドの凝集機構を解明するためには、Ａβオリゴマーの形成過程を解析する必要がある。例えば、非特許文献１には、Ａβファイバーの形状には直線型と螺旋型の２種類があり、これらの形状は初期に形成されるファイバーの形状により影響を受けることが記載されている。
【０００５】
ところで、複数のタンパク質分子が規則正しく配列することにより、籠（ケージ）状の３次元構造（タンパク質ケージ）を形成する場合がある。タンパク質ケージとしては、例えば、鉄イオンを内包するフェリチン、ＲＮＡを内包するウイルスのキャプシド等が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Watanabe-Nakayama T., et al., High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of amyloid β1-42 aggregates., Proc Natl Acad Sci U S A., 113(21), 5835-40, 2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
凝集性ペプチドの凝集機構を解明するためには、凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することが有用である。しかしながら、凝集性ペプチドのオリゴマーは迅速にファイバーを形成してしまうため、従来、凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することは不可能であった。そこで、本発明は、凝集性ペプチドのオリゴマーを単離する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］タンパク質ケージを構成するタンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側のうち、前記タンパク質ケージの内腔に位置する側の末端に凝集性ペプチドが結合した融合タンパク質。
［２］前記タンパク質ケージが、フェリチン、ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ（ＤＰＳ）、Ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＳＰ）、Ｃｏｗｐｅａ  Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  Ｍｏｔｔｌｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＣＭＶ）、シャペロニン、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ又はＬｕｍａｚｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅである、請求項１に記載の融合タンパク質。
［３］前記凝集性ペプチドが、アミロイドβ、α−シヌクレイン、タウ、ポリグルタミンタンパク質又はβシート形成ペプチドである、［１］又は［２］に記載の融合タンパク質。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［５］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーが自己組織化したタンパク質ケージ。
［６］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることを含み、その結果、前記タンパク質ケージの内腔で前記凝集性ペプチドがオリゴマーを形成する、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造方法。
［７］凝集性ペプチドが２〜１８０個凝集した、凝集性ペプチドのオリゴマー。
［８］凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることと、前記凝集性ペプチドのオリゴマーの形成量を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの形成量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤であることを示す、スクリーニング方法。
［９］凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、［５］に記載のタンパク質ケージをインキュベートすることと、前記タンパク質ケージの内腔における前記凝集性ペプチドのオリゴマーの存在量を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの存在量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの存在量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤であることを示す、スクリーニング方法。
［１０］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造用キット。
［１１］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤、又は、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、凝集性ペプチドのオリゴマーを単離する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）は、実験例２におけるフェリチンタンパク質ケージ及びフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージのゲル濾過カラムによる各溶出画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す写真である。また、（ｂ）は、実験例２におけるフェリチンタンパク質ケージ及びフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージのゲル濾過カラムによる各溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図２】（ａ）は、実験例３におけるフェリチンタンパク質ケージの透過型電子顕微鏡写真であり、（ｂ）は、実験例３におけるフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージの透過型電子顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例３におけるフェリチンタンパク質ケージとフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージの電子顕微鏡観察像から得られた粒子径についてのヒストグラムである。
【図３】実験例４におけるフェリチンタンパク質ケージとフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージのチオフラビンＴアッセイによる蛍光スペクトルを測定した結果である。
【図４】（ａ）は、実験例４におけるフェリチンタンパク質ケージのＨＰＬＣによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。（ｂ）はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージのＨＰＬＣによるクロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。
【図５】（ａ）は、実験例４におけるフェリチンタンパク質ケージとフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージのフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）による解析の結果を示すスペクトルである。（ｂ）は、実験例４におけるフェリチンタンパク質ケージのＦＴＩＲスペクトルを二次微分した結果を示すグラフである。
【図６】実験例５におけるフェリチン−Ａβペプチド変異体融合タンパク質のチオフラビンＴアッセイによる蛍光スペクトルを測定した結果である。
【図７】実験例６におけるフェリチン−α−シヌクレイン融合タンパク質ケージの結晶の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［融合タンパク質］
１実施形態において、本発明は、タンパク質ケージを構成するタンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側のうち、前記タンパク質ケージの内腔に位置する側の末端に凝集性ペプチドが結合した融合タンパク質を提供する。
【００１２】
タンパク質ケージとは、規則正しく配列した複数のタンパク質分子からなる、籠（ケージ）状の構造物である。タンパク質ケージとしては、フェリチン、ＤＰＳ、ＨＳＰ、ＣＣＭＶキャプシド、シャペロニン、Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎ、Ｌｕｍａｚｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ等が挙げられる。
【００１３】
フェリチンは、藻類、細菌、植物、ヒト、非ヒト動物を含むほぼ全ての生物が合成するタンパク質である。フェリチンは２４量体からなるケージを形成し、鉄イオンを内包することにより、生体内鉄貯蔵を担う。外径は約１２ｎｍである。
【００１４】
フェリチンとしては特に限定されないが、ウマ由来フェリチンやヒト由来フェリチンなどのフェリチンをタンパク質ケージとして利用することができる。例えば、実施例で示すように、ウマ由来フェリチンＬ鎖は生体外でタンパク質ケージを形成する。配列番号４にウマ由来フェリチンＬ鎖のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
ＤＰＳは、多くのバクテリアが合成する、フェリチンスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＤＰＳは１２量体からなるケージを形成し、染色体ＤＮＡを内包することにより、染色体ＤＮＡを酸化ストレス等から守る。外径は約９ｎｍである。
【００１６】
ＨＳＰは、ほぼ全ての生物に普遍的に認められるタンパク質である。ＨＳＰは２４量体からなるケージを形成し、タンパク質シャペロンとして機能する。外径は約１２ｎｍである。
【００１７】
ＣＣＭＶは、マメ科ササゲに特異的に感染するウイルスである。ＣＣＭＶキャプシドは、複数種のサブユニットが形成する１８０量体からなるケージから成り、ＲＮＡを内包する。外径は約２８ｎｍである。
【００１８】
シャペロニンは、ほぼ全ての生物に普遍的に認められるタンパク質ケージである。変性したタンパク質や、新たに合成された未成熟タンパク質のフォールディングを促進することにより、細胞内の恒常性を維持している。
【００１９】
Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎは、多くのバクテリアが合成するタンパク質である。Ｅｎｃａｐｓｕｌｉｎはタンパク質ケージを形成し、様々な代謝や酸化ストレスからの防御にかかわる。外径は、約３０ｎｍである。
【００２０】
Ｌｕｍａｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅは、ビタミンＢ２の生合成に関わるタンパク質である。外径は、約１０ｎｍである。
【００２１】
タンパク質ケージモノマーとは、上述したタンパク質ケージを構成するモノマータンパク質を意味する。例えば、タンパク質ケージがフェリチン２４量体であり、タンパク質ケージモノマーがフェリチンであってもよい。タンパク質ケージは、ＤＰＳ１２量体、ＨＳＰ２４量体、ＣＣＭＶ１８０量体等であってもよい。
【００２２】
タンパク質ケージモノマーは、互いに接触することにより、自己組織化してタンパク質ケージを形成するものであることが好ましい。
【００２３】
ここで、自己組織化とは、自律的に秩序を持つ構造を作り出す現象のことである。タンパク質ケージモノマーは、適切な条件下であれば、再現性良く規則正しい立体的な構造をもつタンパク質ケージを形成する。
【００２４】
本明細書において、凝集性ペプチドとは、凝集性ペプチド同士が会合し、凝集体を形成するペプチドを意味する。
【００２５】
前記凝集性ペプチドとしては、Ａβ、α−シヌクレイン、タウ、ポリグルタミンタンパク質、βシート形成ペプチド、これらの変異体等が挙げられる。Ａβのアミノ酸配列を配列番号１に示し、α−シヌクレインのアミノ酸配列を配列番号２に示す。これらペプチドの凝集体は細胞毒性を有する場合がある。
【００２６】
例えば、Ａβやタウの凝集体は神経細胞を損傷してアルツハイマー病の原因となり、α−シヌクレインの凝集体はドパミン作動性神経細胞を損傷してパーキンソン病を引き起こす。また、ポリグルタミンタンパク質の凝集体は神経細胞を損傷してハンチントン病を引き起こす。
【００２７】
βシートはタンパク質分子内あるいは分子間に形成され、一般にその構造は安定である。そのため、βシート形成ペプチドは凝集体を形成する場合がある。例えば、Ａβ線維は分子間βシートにより安定化される。
【００２８】
凝集性ペプチドの変異体としては、上述した凝集性ペプチドの部分断片であって、凝集性を有するペプチド、上述した凝集性ペプチドにおいて１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ凝集性を有するペプチド、上述した凝集性ペプチドのアミノ酸配列と配列同一性８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ凝集性を有するペプチド等が挙げられる。ここで、１又は数個としては、例えば１〜５個、１〜３個、１〜２個等が挙げられる。
【００２９】
また、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸のアミノ酸数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００  （１）
【００３０】
タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質を発現することにより、凝集性ペプチドを内包するタンパク質ケージを製造することができる。タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドとの間にはリンカー配列が配置されていてもよい。
【００３１】
自己組織化したタンパク質ケージにおいては、タンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側が内腔に位置することになる。本明細書においては、凝集性ペプチドをタンパク質ケージの内側に閉じ込める。
【００３２】
凝集性ペプチドがタンパク質ケージの内側へ入るように、凝集性ペプチドをタンパク質ケージモノマーのＮ末端側又はＣ末端側に融合させる。例えば、フェリチンタンパク質ケージモノマーを用いた場合、フェリチンモノマーのＣ末端側がケージの内腔に位置する。
【００３３】
［核酸］
１実施形態において、本発明は、上述の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。本実施形態の核酸から上述した融合タンパク質を製造することができる。
【００３４】
タンパク質ケージモノマーをコードする核酸の具体例としては、実施例で後述するように、配列番号３で示されるウマ由来フェリチンＬ鎖をコードするＤＮＡ配列等が挙げられる。
【００３５】
また、凝集性ペプチドをコードする核酸としては、例えば、配列番号５で示されるヒト由来ＡβをコードするＤＮＡ配列、又は配列番号６で示されるヒト由来α−シヌクレインをコードするＤＮＡ配列等が挙げられる。
【００３６】
［タンパク質ケージ］
１実施形態において、本発明は、上述の融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーが自己組織化したタンパク質ケージを提供する。
【００３７】
本実施形態のタンパク質ケージは、凝集性ペプチドを内包している。ここで、凝集性ペプチドをタンパク質ケージが内包するとは、凝集性ペプチドをタンパク質ケージの内部に完全に収容することである。
【００３８】
（第１実施形態）
第１実施形態のタンパク質ケージは、上述した融合タンパク質のみから構成されたものである。この結果、タンパク質ケージの内部には、タンパク質ケージを構成する融合タンパク質と同数の凝集性ペプチドが内包されることになる。
【００３９】
例えば、融合タンパク質を構成するタンパク質ケージモノマーがフェリチンである場合、１個のタンパク質ケージを構成する融合タンパク質は２４個であり、タンパク質ケージに内包される凝集性ペプチドも２４個となる。この結果、タンパク質ケージの内部に凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することができる。
【００４０】
同様に、例えば、融合タンパク質を構成するタンパク質ケージモノマーがＤＰＳである場合、１個のタンパク質ケージを構成する融合タンパク質は１２個であり、タンパク質ケージに内包される凝集性ペプチドも１２個となる。この結果、タンパク質ケージの内部に凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することができる。
【００４１】
（第２実施形態）
第２実施形態のタンパク質ケージは、上述した融合タンパク質とタンパク質ケージモノマーの双方を含むものである。この結果、タンパク質ケージの内部には、タンパク質ケージに含まれる融合タンパク質と同数の凝集性ペプチドが内包されることになる。
【００４２】
例えば、融合タンパク質を構成するタンパク質ケージモノマーがフェリチンであり、タンパク質ケージが４個の融合タンパク質と２０個のタンパク質ケージモノマーから構成される場合、タンパク質ケージに内包される凝集性ペプチドは４個となる。この結果、タンパク質ケージの内部に凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することができる。
【００４３】
［製造方法］
１実施形態において、本発明は、上述した融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることを含み、その結果、前記タンパク質ケージの内腔で前記凝集性ペプチドがオリゴマーを形成する、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により上述したタンパク質ケージを製造することができる。
【００４４】
本実施形態の製造方法において、大腸菌に限られない様々な宿主を用いてタンパク質ケージを製造することができる。宿主としては、酵母等の細菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。
【００４５】
また、宿主を使用せず、無細胞翻訳系を用いてタンパク質ケージを製造することもできる。無細胞翻訳系としては、特に限定されず、例えば、ウサギ網状赤血球を用いた翻訳系、コムギ胚芽を用いた翻訳系、大腸菌を用いた再構成翻訳系等が挙げられる。
【００４６】
（第１実施形態）
第１実施形態の製造方法によれば、上述した第１実施形態のタンパク質ケージを製造することができる。第１実施形態の製造方法では、上述のフェリチン、ＤＰＳ、ＨＳＰ、ＣＣＭＶキャプシド等のタンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質のみを用いてタンパク質ケージを形成させる。この結果、タンパク質ケージの内部には、タンパク質ケージモノマーに固有の個数の凝集ペプチドをケージに内包させることができる。
【００４７】
例えば、実施例において後述するように、フェリチン、リンカー、Ａβ１−４２からなる融合タンパク質のみを大腸菌内で発現させると、自己組織化により、２４個のＡβ１−４２がフェリチンタンパク質ケージに内包されることになる。この融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号７に示し、この融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００４８】
（第２実施形態）
第２実施形態の製造方法によれば、上述した第２実施形態のタンパク質ケージを製造することができる。第２実施形態の製造方法では、上述のフェリチン、ＤＰＳ、ＨＳＰ、ＣＣＭＶキャプシド等のタンパク質ケージモノマーと、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質の混合物を用いてタンパク質ケージを形成させる。この結果、タンパク質ケージの内部には、タンパク質ケージに含まれる融合タンパク質と同数の凝集性ペプチドが内包されることになる。
【００４９】
タンパク質ケージモノマーと、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質を、例えば、大腸菌等の宿主中で共発現させて作製してもよい。
【００５０】
あるいは、タンパク質ケージモノマーと、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質を、別々に作製し、混合し、自己組織化させてタンパク質ケージを形成させてもよい。
【００５１】
第２実施形態の製造方法では、様々な個数の凝集性ペプチドを内包したタンパク質ケージの混合物が得られる。そこで、これらの混合物を分離精製し、同数のペプチドを含むケージを回収してもよい。分離精製の方法としては、密度勾配超遠心法等が挙げられる。
【００５２】
例えば、アミノ酸配列が配列番号４に示されるフェリチンタンパク質モノマーと、アミノ酸配列が配列番号８に示されるフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質を、任意の量比で混合し、自己組織化させると、タンパク質ケージに２４個以下のＡβ１−４２が内腔に内包されることになる。
【００５３】
［凝集性ペプチドのオリゴマー］
１実施形態において、本発明は、凝集性ペプチドが２〜１８０個凝集した、凝集性ペプチドのオリゴマーを提供する。
【００５４】
凝集性ペプチドは、Ａβ、α−シヌクレイン、タウ、ポリグルタミンタンパク質、βシート形成ペプチド等であってもよい。α−シヌクレインのアミノ酸配列を配列番号２に示し、タウのアミノ酸配列を配列番号９に示す。これらの凝集性ペプチドは、速やかに凝集してファイバーを形成してしまうため、従来これらの凝集性ペプチドのオリゴマーを単離することはできなかった。
【００５５】
これに対し、上述した製造方法により、本実施形態のオリゴマーを製造することができる。すなわち、ファイバーを形成する以前の、２〜１８０個の凝集性ペプチドからなるオリゴマーを単離することができる。
【００５６】
凝集性ペプチドのオリゴマーとは、一般には、例えば２〜６０個、例えば２〜４０個、例えば２〜３０個程度の凝集性ペプチドのオリゴマーを指すが、ウイルスのキャプシドといったタンパク質ケージを用いると、６０、１２０、１８０個の凝集性ペプチドのオリゴマーを形成することも可能である。
【００５７】
［スクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、前記融合タンパク質を含むタンパク質ケージモノマーを自己組織化させてタンパク質ケージを形成させることと、前記凝集性ペプチドのオリゴマーの形成量を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの形成量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの形成量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤であることを示す、スクリーニング方法である。
【００５８】
実施例において後述するように、タンパク質ケージに内包された凝集性ペプチドはタンパク質ケージの内部で凝集体を形成する。そこで、凝集性ペプチドの形成を有意に抑制する被験物質は、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤であるということができる。
【００５９】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等に由来する物質が挙げられる。
【００６０】
オリゴマーの形成量は、例えば、βシートの存在量を測定することにより測定することができる。βシートの存在量は、実施例で後述するように、例えば、チオフラビンＴアッセイ、フーリエ変換赤外分光法により測定することができる。
【００６１】
被験物質の存在下でタンパク質ケージを形成させることは、例えば、被験物質の存在下で、大腸菌等の宿主に上述した融合タンパク質を発現させることにより行うことができる。この結果、被験物質の存在下において、宿主内で発現した融合タンパク質が自己組織化してタンパク質ケージが形成される。
【００６２】
被験物質の存在下でタンパク質ケージを形成させることは、次の方法によって行うこともできる。タンパク質ケージは、ｐＨを変化させることにより解離させ、またｐＨを元に戻すことにより再会合させることができる場合がある。そこで、被験物質の存在下でタンパク質ケージを解離させ、再会合させることにより、被験物質の存在下でタンパク質ケージを形成させることができる。
【００６３】
（第２実施形態）
第２実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、凝集性ペプチドのオリゴマーを内包する上述したタンパク質ケージをインキュベートすることと、前記タンパク質ケージの内腔における前記凝集性ペプチドのオリゴマーの存在量を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記オリゴマーの存在量が、前記被験物質の非存在下における前記オリゴマーの存在量と比較して減少することが、前記被験物質が、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤であることを示す、スクリーニング方法である。
【００６４】
第２実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては、第１実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様のものを用いることができる。また、オリゴマーの存在量についても、第１実施形態のスクリーニング方法におけるオリゴマーの形成量と同様にして測定することができる。
【００６５】
第２実施形態のスクリーニング方法では、まず、被験物質の存在下で、凝集性ペプチドのオリゴマーを内包する上述したタンパク質ケージをインキュベートする。インキュベートの時間は特に限定されず、例えば１分間であってもよいし、例えば１時間であってもよいし、例えば２４時間であってもよい。
【００６６】
続いて、第１実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様の測定方法により、凝集性ペプチドのオリゴマーの存在量を測定する。その結果、被験物質の存在下におけるオリゴマーの存在量が、被験物質の非存在下におけるオリゴマーの存在量と比較して減少していた場合、被験物質は凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤であるということができる。
【００６７】
［キット］
１実施形態において、本発明は、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの製造用キットを提供する。
【００６８】
例えば、本実施形態のキットに付属した、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質をインキュベートすることにより、自己組織化させて、上述した、凝集性ペプチドのオリゴマーを内包するタンパク質ケージを容易に製造することができる。
【００６９】
あるいは、上述した融合タンパク質を、大腸菌等の宿主内で発現させること等によっても、タンパク質ケージを合成することができる。
【００７０】
本実施形態のキットにおいて、タンパク質ケージモノマーは、上述したものと同様であり、例えば、フェリチンであってもよい。また、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質の発現ベクターとしては、例えば、フェリチンと凝集性ペプチドの融合タンパク質の発現ベクターであってもよい。
【００７１】
より具体的には、発現ベクターは、例えば、プロモーターの下流に、フェリチンと凝集性ペプチドの融合タンパク質をコードする遺伝子断片を導入したものが挙げられる。
【００７２】
発現ベクターは、例えば次のようにして作製してもよい。まず、タンパク質モノマー及び凝集性ペプチドをコードする配列をＰＣＲ反応によりそれぞれ増幅する。続いて、ＰＣＲ反応により得られた、タンパク質モノマー及び凝集性ペプチドをコードする遺伝子断片を、例えば、ギブソン・アッセンブリー法により連結し、融合タンパク質を発現させる発現ベクターを作製することができる。ギブソン・アッセンブリー法とは、両端に相同な配列を持つＤＮＡ断片を、連結させる簡便な方法である。
【００７３】
１実施形態において、本発明は、タンパク質ケージモノマーと凝集性ペプチドの融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする核酸を含む、凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤、又は、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング用キットを提供する。
【００７４】
本実施形態のキットを用いることにより、上述した凝集性ペプチドのオリゴマーの形成を阻害する薬剤、又は、凝集性ペプチドのオリゴマーの分解を促進する薬剤のスクリーニング等を行うことができる。
【００７５】
本実施形態のキットにより、凝集性ペプチドのオリゴマーを内包するタンパク質ケージを容易に製造することができる。得られたタンパク質ケージを利用して、上述したスクリーニングに使用することができる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７７】
［実験例１］
（発現ベクターの作製）
タンパク質ケージモノマーとして、フェリチンを使用した。フェリチンとしては、ウマ由来フェリチンＬ鎖を使用した。使用したフェリチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示す。また、凝集性タンパク質として、４２残基のアミノ酸からなるＡβペプチド（Ａβ１−４２）を使用した。使用したＡβペプチド（Ａβ１−４２）をコードするＤＮＡ配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号１に示す。さらに、リンカー配列として、グリシントリペプチドを使用した。
【００７８】
フェリチンタンパク質、グリシントリペプチド、Ａβ１−４２をコードする遺伝子をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、ギブソン・アッセンブリー法により、これらＤＮＡ断片を連結し、発現ベクターに導入した。
【００７９】
上述の方法により、配列番号７で示されるＤＮＡ断片がベクターに挿入された。このＤＮＡ断片によりコードされるフェリチン−グリシントリペプチド−Ａβ１−４２融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００８０】
［実験例２］
（融合タンパク質の発現と精製）
フェリチン遺伝子が導入された発現ベクター、及び、実験例１で作製したフェリチン−Ａβ１−４２発現ベクターを用いて大腸菌株ＮｏｖａＢｌｕｅ（ノバジェン社）を形質転換した。
【００８１】
形質転換した大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１６時間培養した。続いて、培養液を遠心分離して大腸菌体を沈殿させた。
【００８２】
続いて、得られた菌体を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０に懸濁し、超音波破砕機を用いて菌体を溶菌させた。細胞破片を遠心分離により取り除き、上清を６５℃で１５分間熱処理し、フェリチンタンパク質もしくはフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質を除く不純物を変性させた。
【００８３】
《陰イオン交換クロマトグラフィーカラムによる精製》
続いて、溶液を遠心分離して得られた上清を１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥヘルスケア）に添加した。続いて、１００ｍＭ〜４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０でタンパク質を溶出した。
【００８４】
溶出したタンパク質は分画して回収した。続いてＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミド電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）により、融合タンパク質を含む画分を特定した。
【００８５】
《ゲル濾過クロマトグラフィーカラムによる精製》
続いて、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを含む画分を、全量１０ｍＬ以下になるまで濃縮した。続いて、濃縮した溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＳ−３００ＨＲカラム（ＧＥヘルスケア）に添加した。
【００８６】
各溶出画分に含まれるタンパク質を、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【００８７】
図１（ａ）は、Ｓ−３００ＨＲカラムによる各溶出画分をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す写真である。また、図１（ｂ）は各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。図１（ａ）中、「２４量体  Ｃａｌｃ．４７５６６８」はフェリチンタンパク質ケージの分子量を示し、図１（ｂ）中、「単量体  Ｃａｌｃ．１９８２０」はフェリチンタンパク質モノマーの分子量を示し、「単量体  Ｃａｌｃ．２４４８７」はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質の分子量を示す。
【００８８】
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果から、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージは、フェリチン２４量体タンパク質ケージとほぼ同じ移動度を示すことが明らかになった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、各タンパク質単量体の分子量から予測される位置に各タンパク質のバンドが検出されることが確認された。
【００８９】
以上の結果から、各タンパク質の単量体は当初の目的通りのアミノ酸配列からなり、各タンパク質ケージは２４量体であることが明らかになった。
【００９０】
［実験例３］
（タンパク質ケージの電子顕微鏡観察）
実験例２で精製したフェリチンタンパク質ケージ及びフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを電子顕微鏡で観察した。図２は、代表的な電子顕微鏡写真である。倍率は１２万倍である。図２（ａ）は精製したフェリチンタンパク質ケージの電子顕微鏡写真であり、図２（ｂ）はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージの電子顕微鏡写真である。図２（ａ）および（ｂ）中、四角で囲まれた図は、フェリチンタンパク質ケージおよびフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージの拡大図である。
【００９１】
電子顕微鏡観察の結果から、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージは、フェリチンタンパク質ケージと同様に、球状構造を保持していることが明らかになった。また、図中の拡大図から、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージはフェリチンタンパク質ケージに比べて、タンパク質ケージ内腔の電子密度が高いことが明らかになった。この結果から、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージはＡβ１−４２を内包していると考えられた。
【００９２】
図２（ｃ）は、電子顕微鏡観察像から得られた粒子径についてヒストグラムである。図２（ｃ）中、「Ｆｒ  ＷＴ」はフェリチンタンパク質ケージを示し、「Ｆｒ−Ａβ１−４２」はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを示す。
【００９３】
ヒストグラムを解析した結果、フェリチンタンパク質ケージは平均粒子径が１２ｎｍであり、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージの平均粒子径は１３ｎｍであった。これはフェリチンタンパク質ケージが伸長したアミノ酸（Ａβ１−４２）を内包してケージを膨張させたためであると考えられた。
【００９４】
［実験例４］
（タンパク質ケージ内のＡβ１−４２によるβシート形成の評価）
実験例で精製した各タンパク質ケージを、チオフラビンＴアッセイ、ＨＰＬＣ、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ分光法）により分析した。
【００９５】
《チオフラビンＴアッセイによる解析》
5μＭ  チオフラビンＴ  ５０ｍＭ  グリシン緩衝液ｐＨ８．５に、最終濃度が２８μｇ／ｍＬとなるようにフェリチンタンパク質ケージもしくはフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを添加した。図３は、この溶液について励起波長を４４５ｎｍとして蛍光スペクトルを測定した結果である。図３中、「Ｆｒ  ＷＴ」はフェリチンタンパク質ケージを示し、「Ｆｒ−Ａβ１−４２」はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを示し、「ｂｌａｎｋ（ＴｈＴ）」はタンパク質を含まないブランクを示す。
【００９６】
蛍光スペクトルを解析した結果、フェリチンタンパク質ケージは蛍光を発しなかったが、フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージは蛍光を発することが明らかとなった。チオフラビンＴはペプチドのβシート構造に結合することが知られている。この結果から、Ａβ１−４２はβシートを形成していると考えられた。
【００９７】
《高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による解析》
フェリチンタンパク質ケージ又はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージについて、ＨＰＬＣ解析とチオフラビンＴアッセイを同時に行い、紫外吸収と波長４８５ｎｍの蛍光を同時に検出した。蛍光検出では励起波長を４４５ｎｍとした。図４（ａ）はフェリチンタンパク質ケージについての結果であり、図４（ｂ）はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージについての結果である。図４（ａ）及び（ｂ）中、ＵＶは紫外吸収を示し、蛍光は波長４８５ｎｍの蛍光の強度を示す。
【００９８】
フェリチンタンパク質ケージ由来のＵＶと蛍光の最大ピークが一致することから、フェリチンタンパク質ケージ内でＡβ１−４２がβシートを形成していることが分かった。
【００９９】
《ＦＴＩＲ分光法による解析》
フェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージ及びフェリチンタンパク質ケージをＦＴＩＲ分光法により解析した。図５（ａ）はＦＴＩＲスペクトルである。図５（ｂ）はＦＴＩＲスペクトルを二次微分したグラフである。図５中、「Ｆｒ  ＷＴ」はフェリチンタンパク質ケージを示し、「Ｆｒ−Ａβ１−４２」はフェリチン−Ａβ１−４２融合タンパク質ケージを示す。
【０１００】
スペクトルを解析した結果、図５（ａ）より１６３５ｃｍ−１付近にピークが観測された。また、図５（ｂ）より、このピークをさらに明確に確認できた。このピークはβシートに由来するピークであることから、Ａβ１−４２はβシートを形成していると考えられた。
【０１０１】
小括すると、チオフラビンＴアッセイ、ＨＰＬＣ、ＦＴＩＲ分光法による解析の結果から、フェリチンタンパク質ケージ内部でＡβ１−４２はβシートを形成していることが明らかになった。
【０１０２】
［実験例５］
（Ａβペプチド変異体のβシート形成の評価）
フェリチンとＡβペプチド変異体との融合タンパク質を発現、精製し、これらについてチオフラビンＴアッセイにより、βシート形成を評価した。Ａβペプチド変異体として、Ａβ１−４０、Ａβ１１−４２、Ａβ１５−３７を用いた。
【０１０３】
使用したＡβペプチド（Ａβ１−４０）をコードするＤＮＡ配列を配列番号１０に示し、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。使用したＡβペプチド（Ａβ１１−４２）をコードするＤＮＡ配列を配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示す。使用したＡβペプチド（Ａβ１５−３７）をコードするＤＮＡ配列を配列番号１２に示し、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１０４】
図６は、Ａβペプチド変異体について励起波長を４４５ｎｍとして蛍光スペクトルを測定した結果である。図６中、「ｗｔ」はフェリチンタンパク質ケージを示し、「ａｂｅｔａ１−４２」はＡβ１−４２を示し、「ａｂｅｔａ１−４０」はＡβ１−４０を示し、「ａｂｅｔａ１１−４２」はＡβ１１−４２を示し、「ａｂｅｔａ１５−３７」はＡβ１５−３７を示し、「ｂｌａｎｋ」はタンパク質を含まないブランクを示す。
【０１０５】
チオフラビンＴアッセイの結果から、Ａβ１−４０、Ａβ１１−４２、Ａβ１５−３７においても蛍光が検出され、これらもβシートを形成することが明らかになった。
【０１０６】
［実験例６］
（フェリチン−α−シヌクレイン融合タンパク質ケージの結晶の作製）
フェリチンとα−シヌクレインの融合タンパク質を発現するベクターを作製した。当該融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１６に示し、発現する当該融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。発現した当該融合タンパク質を、実験例２と同様に精製し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにより、フェリチン−α−シヌクレイン融合タンパク質ケージが形成されたことを確認した。
【０１０７】
４４．１μＭの融合タンパク質と、０．６Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４と、１７．５ｍＭ  ＣｄＳＯ４とを含む溶液を調製し、静置することにより、融合タンパク質ケージの結晶を得た。図７は、フェリチン−α−シヌクレイン融合タンパク質ケージの結晶の写真を示す。倍率は６０倍である。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明によれば、凝集性ペプチドのオリゴマーを単離する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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