(57)【要約】【課題】遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬をスクリーニングする技術を提供する。【解決手段】遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を培養することと、前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率が、前記被験物質の非存在下における前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下及び非存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株をそれぞれ培養することと、
前記被験物質の存在下における前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株の生存率をそれぞれ測定することと、を含み、
前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率が、前記野生型株の生存率と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項２】
遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することを含み、
前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項３】
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする前記遺伝子が、ＤＮＡ２、ＥＸＯ１、ＦＡＮ１、ＦＡＮＣＭ、ＭＲＥ１１、ＭＵＳ８１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、ＢＬＭ、ＳＲＳ２、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ６、ＦＥＮ１、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＰＣＮＡ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＰＥＸ１、ＰＡＲＰ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＰＮＫ、ＮＴＨＬ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＥＲＣＣ１、ＲＴＥＬ１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−２、ＤＳＳ１、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２−ａｌｐｈａ、ＴＯＰ３−ａｌｐｈａ及びＳＦＲ１からなる群より選択される遺伝子である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
乳癌細胞又は卵巣癌細胞のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤に対する耐性解除剤のスクリーニング方法であって、
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株をＰＡＲＰ阻害剤耐性にする変異遺伝子を特定することと、
被験物質の存在下で、前記変異遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することと、を含み、
前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤であることを示す、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法、及び、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤に対する耐性解除剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌や卵巣癌の５〜１０％は、遺伝的な要因が強く関与して発症していると考えられている。遺伝的な要因としては、遺伝性乳癌卵巣癌症候群（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ、ＨＢＯＣ）が最も多い。
【０００３】
遺伝性乳癌卵巣癌症候群は、ＢＲＣＡ１遺伝子又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異が原因で乳癌や卵巣癌を高いリスクで発症する遺伝性腫瘍の１つである。また、癌を発症する場合には、乳癌及び卵巣癌の両方を発症する場合が多い。
【０００４】
例えば非特許文献１には、ＢＲＣＡ１遺伝子又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異を有するヒトのうち、５５〜６５％が７０歳までに乳癌を発生すると報告されている。卵巣癌も同程度の割合である。乳癌又は卵巣癌の予防のためにタモキシフェンを投与する場合もあるが、タモキシフェン投与は子宮癌の発生リスクを上昇させてしまう。また、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の癌患者に通常の抗癌剤を安易に投与すると、白血球や好中球が減少する場合がある。
【０００５】
ところで、ＲＡＤ５１タンパク質は、ＤＮＡ二重鎖切断の相同組換え修復機構における重要な酵素である。そして、ＢＲＣＡ１タンパク質及びＢＲＣＡ２タンパク質は、ＲＡＤ５１タンパク質の補助因子として機能していると考えられている。ＢＲＣＡ１タンパク質又はＢＲＣＡ２タンパク質の欠損だけでは致死とはならないが、相同組換え修復機構の機能が低下することにより、ゲノム不安定化がおこり、その結果として癌が発症すると考えられている。
【０００６】
ＤＮＡ代謝の細胞内分子機構は、生物種間で保存されている。例えば、ヒトＲＡＤ５１タンパク質と酵母Ｒａｄ５１タンパク質は８７％の配列同一性を有しており、酵母における研究がヒトの分子機構の解明に直接貢献している。
【０００７】
しかしながら、基礎研究に用いられる出芽酵母（サッカロミセス・セレビシエ）や分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ）は、ＢＲＣＡ１遺伝子及びＢＲＣＡ２遺伝子を有していない。このため、従来、酵母を用いて、ＢＲＣＡ１遺伝子又はＢＲＣＡ２遺伝子の機能解析を行うことや、ＢＲＣＡ１遺伝子又はＢＲＣＡ２遺伝子の変異株の薬剤応答試験等を行うことができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】A. Antoniou, et al., Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies., Am. J. Hum. Genet. 72, 1117-1130, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況のもと、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬が求められている。最近開発された遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬としてオラパリブ（ＣＡＳ番号：７６３１１３−２２−０）が知られている。オラパリブは、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（以下、「ＰＡＲＰ」という場合がある。）阻害薬である。
【００１０】
しかしながら、オラパリブを使用すると、オラパリブに対する耐性を有する癌細胞が出現することが知られている。したがって、癌細胞がオラパリブに対する耐性を獲得する機構を解明することが必要である。また、オラパリブに代わる治療薬又はオラパリブと併用することにより、オラパリブに対する耐性を解除する薬剤の開発が必要である。
【００１１】
ところで、トウモロコシ黒穂病の原因菌であるウスチラゴ・メイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）は、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のホモログを持つことが知られている。しかしながら、ウスチラゴ・メイディスがヒトＰＡＲＰタンパク質のホモログを有しているか否かは報告されていない。このため、ウスチラゴ・メイディスを用いてオラパリブに代わる治療薬又はオラパリブに対する耐性を解除する薬剤の開発を行うことができるか否かは不明である。
【００１２】
本発明は、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬をスクリーニングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、クリプトコッカス属菌が、ＢＲＣＡ２遺伝子のホモログ（以下、「ＢＲＨ２」という。）を持つことを見出した。発明者らはまた、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株が、ＢＲＣＡ２−／−ヒト細胞と同様にＤＮＡ損傷に感受性を示すことを明らかにした。発明者らはまた、クリプトコッカス属菌が、ヒトＰＡＲＰ遺伝子のホモログを持つことを見出した。
【００１４】
本発明は以下の態様を含む。
［１］遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下及び非存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株をそれぞれ培養することと、前記被験物質の存在下における前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株の生存率をそれぞれ測定することと、を含み、前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率が、前記野生型株の生存率と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法。
［２］遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することを含み、前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法。
［３］クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする前記遺伝子が、ＤＮＡ２、ＥＸＯ１、ＦＡＮ１、ＦＡＮＣＭ、ＭＲＥ１１、ＭＵＳ８１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、ＢＬＭ、ＳＲＳ２、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ６、ＦＥＮ１、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＰＣＮＡ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＰＥＸ１、ＰＡＲＰ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＰＮＫ、ＮＴＨＬ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＥＲＣＣ１、ＲＴＥＬ１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−２、ＤＳＳ１、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２−ａｌｐｈａ、ＴＯＰ３−ａｌｐｈａ及びＳＦＲ１からなる群より選択される遺伝子である、［２］に記載のスクリーニング方法。
［４］乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤のスクリーニング方法であって、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株をＰＡＲＰ阻害剤耐性にする変異遺伝子を特定することと、被験物質の存在下で、前記変異遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することと、を含み、前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤であることを示す、スクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬をスクリーニングする技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）は、実験例２における、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質、ウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）は、実験例２において、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のＢＲＣリピートと、クリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質のＢＲＣリピートのアミノ酸配列を、それぞれアライメントした図である。（ｃ）は、実験例２において、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のＣＣＲ、ウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲ及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲのアミノ酸配列を、それぞれアライメントした図である。
【図２】（ａ）は、実験例３における、ヒトＰＡＲＰ１タンパク質及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＰａｒｐタンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）は、クリプトコッカス・リクエファシエンスＰａｒｐタンパク質のアミノ酸配列である。
【図３】（ａ）は、実験例６において、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。（ｂ）は、実験例７において、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。（ｃ）は、実験例８において、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。
【図４】（ａ）は、実験例９及び１０における、対照のクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。（ｂ）は、実験例９において、紫外線照射を行ったクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。（ｃ）は、実験例１０において、ブレオマイシンに暴露したクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。（ｄ）は、実験例１０において、フィレオマイシンに暴露したクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書において、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、酵母（クリプトコッカス属菌、ウスチラゴ属菌を含む）の遺伝子は大文字のアルファベットで表し、タンパク質は先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。
【００１８】
［遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
（第１実施形態）
第１実施形態に係る遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法は、被験物質の存在下及び非存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株をそれぞれ培養することと、前記被験物質の存在下における前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株及び野生型株の生存率をそれぞれ測定することと、を含み、前記ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率が、前記野生型株の生存率と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法である。
【００２０】
第１実施形態のスクリーニング方法において、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【００２１】
クリプトコッカス属菌としては、ヒトＢＲＣＡ２遺伝子のホモログを有する菌であれば特に限定されず、例えば、クリプトコッカス・リクエファシエンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉ）等が挙げられる。
【００２２】
ＢＲＨ２遺伝子とは、発明者らが見出した、クリプトコッカス属菌におけるヒトＢＲＣＡ２遺伝子のホモログである。クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子の塩基配列を配列番号６１に示し、Ｂｒｈ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６２に示す。
【００２３】
第１実施形態のスクリーニング方法において、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株としては、例えば、実施例において後述するような、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子破壊株を用いることができる。あるいは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡを導入することにより、ＢＲＨ２遺伝子の発現を低下させたクリプトコッカス属菌を用いてもよい。
【００２４】
被験物質の存在下におけるＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率の測定方法は、特に制限されず、酵母の実験で通常用いられる方法を用いて測定することができる。例えば、次のような方法が挙げられる。まず、被験物質の存在下及び非存在下でＢＲＨ２遺伝子欠損株を培養し、それぞれ生菌数を測定する。続いて、下記式（１）により、生存率を算出する。
生存率＝被験物質の存在下における生菌数／被験物質の非存在下における生菌数  （１）
【００２５】
また、被験物質の存在下における野生型株の生存率も上記と同様にして求めることができる。具体的には、まず、被験物質の存在下及び非存在下で野生型株を培養し、それぞれ生菌数を測定する。続いて、上記式（１）により、生存率を算出する。
【００２６】
その結果、被験物質の存在下における、ＢＲＨ２遺伝子欠損株の生存率が、野生型株の生存率と比較して低かった場合、被験物質は、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を特異的に死滅させる活性が高く、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬の候補であると判断することができる。
【００２７】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することを含み、前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であることを示す、スクリーニング方法である。
【００２８】
第２実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、クリプトコッカス属菌、及び、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株は、第１実施形態のスクリーニング方法におけるものと同様である。
【００２９】
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死にする遺伝子とは、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株が、更に欠損することにより致死となる遺伝子を意味する。また、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成感受性にする遺伝子は、ＤＮＡ損傷修復機構の機能低下により、ＤＮＡ損傷に対する感受性を上昇させる遺伝子であってもよい。ここで、ＤＮＡ損傷は、例えば紫外線照射によるものであってもよいし、例えば抗癌剤の投与によるものであってもよい。
【００３０】
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子は、１つの遺伝子であってもよく、２つ以上の遺伝子の組み合わせであってもよい。
【００３１】
ＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死にする遺伝子は、例えば、ＢＲＨ２遺伝子欠損株の温度感受性を上昇させるような変異株を取得し、その原因となる遺伝子（仮に、「遺伝子Ｘ」とする。）を特定すること等により、同定することができる。
【００３２】
この場合、変異した遺伝子Ｘにコードされるタンパク質は、低温では通常の機能を有し、高温では機能不全となるものである。そして、高温時に、変異した遺伝子Ｘにコードされるタンパク質のみが機能不全となっても菌は生存可能であるが、変異した遺伝子Ｘを有するＢＲＨ２遺伝子欠損株が高温で死滅する場合、遺伝子ＸはＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死にする遺伝子であるということができる。
【００３３】
また、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成感受性にする遺伝子は、例えば、ＢＲＨ２遺伝子欠損株のＤＮＡ損傷に対する感受性を上昇させる変異株を取得し、その原因となる遺伝子を特定すること等により同定することができる。
【００３４】
第２実施形態のスクリーニング方法では、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の阻害剤を、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬であると判断する。すなわち、このような阻害剤をＢＲＨ２遺伝子欠損株に投与すると、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子が欠損した状態と同様の状態になり、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を特異的に死滅させるか、あるいはＤＮＡ損傷に対する感受性を上昇させることができる。
【００３５】
ＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の活性は、当業者であれば、遺伝子に応じて予測し、測定することができる。
【００３６】
被験物質の存在下で、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定した結果、被験物質の存在下における上記タンパク質の活性が、被験物質の非存在下における上記タンパク質の活性と比較して低かった場合、当該被験物質は、上記タンパク質の阻害剤であるということができる。このような被験物質は、ＢＲＨ２遺伝子欠損株を特異的に死滅させる活性が高く、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬候補であると判断することができる。
【００３７】
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株を合成致死又は合成感受性にする遺伝子としては、例えば、ＤＮＡ２、ＥＸＯ１、ＦＡＮ１、ＦＡＮＣＭ、ＭＲＥ１１、ＭＵＳ８１、ＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５４Ｂ、ＢＬＭ、ＳＲＳ２、ＸＲＣＣ３、ＸＲＣＣ６、ＦＥＮ１、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＰＣＮＡ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＡＰＥＸ１、ＰＡＲＰ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＰＮＫ、ＮＴＨＬ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１、ＥＲＣＣ１、ＲＴＥＬ１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−１、ＳＭＡＲＣＡＤ１−２、ＤＳＳ１、ＴＯＰ１、ＴＯＰ２−ａｌｐｈａ、ＴＯＰ３−ａｌｐｈａ、ＳＦＲ１等が挙げられる。ここで、上記の各遺伝子は、それぞれ、クリプトコッカス属菌におけるヒト遺伝子のホモログ又はオルソログを意味する。
【００３８】
下記表１及び２に上記各遺伝子の塩基配列の対応を示す。例えば、クリプトコッカス属菌におけるヒトＡＰＥＸ１遺伝子のホモログの塩基配列は、配列番号１３に記載の塩基配列の第６４２０９２番目〜第６４４６７６番目に対応し、以下同様である。
【００３９】
【表１】
2019184500.tif 000002
【００４０】
【表２】
2019184500.tif 000003
【００４１】
［乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤のスクリーニング方法であって、クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株をＰＡＲＰ阻害剤耐性にする変異遺伝子を特定することと、被験物質の存在下で、前記変異遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定することとを含み、前記被験物質の存在下における前記タンパク質の活性が、前記被験物質の非存在下における前記タンパク質の活性と比較して低いことが、前記被験物質が乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。
【００４２】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質、クリプトコッカス属菌は、上述したものと同様である。また、ＰＡＲＰ阻害剤としては、オラパリブ、イニパリブ（ＢＳＩ２０１）、ＡＢＴ−８８８（ベリパリブ）、ＡＧ０１４６９９、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＬＴ−６７３、３−アミノベンズアミド、Ａ−９６６４９２、ＡＺＤ２４６１等が挙げられる。
【００４３】
上述したように、癌の治療にオラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤を使用した場合、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性を有する癌細胞が出現することが知られている。本実施形態のスクリーニング方法によれば、乳癌細胞又は卵巣癌細胞の、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤をスクリーニングすることができる。
【００４４】
クリプトコッカス属菌のＢＲＨ２遺伝子欠損株をＰＡＲＰ阻害剤耐性にする変異遺伝子は、例えば、次のようにして特定することができる。まず、ＢＲＨ２遺伝子欠損株から、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性菌を単離する。これは、ＢＲＨ２遺伝子欠損株に変異原処理を行い、ＰＡＲＰ阻害剤に耐性となった菌（以下、「ＰＡＲＰ阻害剤耐性株」という場合がある。）を分離することによって行うことができる。
【００４５】
あるいは、ＢＲＨ２遺伝子及びＰＡＲＰ遺伝子の二重欠損株のＤＮＡ損傷剤に対する高感受性が低感受性となった変異株（三重変異株、以下、「ＰＡＲＰ阻害剤耐性株」という場合がある。）を分離することによって行うことができる。ここで、ＤＮＡ損傷剤としては、例えば、オパラリブ、シスプラチン等が挙げられる。
【００４６】
続いて、ＰＡＲＰ阻害剤耐性株で変異した遺伝子を特定する。これにより特定された変異遺伝子は、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性獲得に関与していると考えられる。
【００４７】
そこで、この変異遺伝子にコードされるタンパク質の阻害剤を、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤であると判断する。すなわち、このような阻害剤をＰＡＲＰ阻害剤耐性株に投与すると、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性獲得に関与するタンパク質の活性が阻害されてＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性が解除され、ＤＮＡ損傷に対する感受性を再び上昇させることができる。
【００４８】
上記変異遺伝子にコードされるタンパク質の活性は、当業者であれば、遺伝子に応じて予測し、測定することができる。被験物質の存在下で、上記変異遺伝子にコードされるタンパク質の活性を測定した結果、被験物質の存在下における上記タンパク質の活性が、被験物質の非存在下における上記タンパク質の活性と比較して低かった場合、当該被験物質は、上記タンパク質の阻害剤であるということができる。このような被験物質は、乳癌細胞又は卵巣癌細胞のＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性を解除することができ、ＰＡＲＰ阻害剤に対する耐性解除剤の候補であると判断することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
［実験例１］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスの全ゲノムＤＮＡの塩基配列の決定）
クリプトコッカス・リクエファシエンスＮ６株をＹＰＤ培地で培養した。続いて、クリプトコッカス・リクエファシエンスＮ６株からゲノムＤＮＡを抽出し、シーケンス用ライブラリを調製した。ライブラリの調製には、市販のキット（型式「ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲ−Ｆｒｅｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」、イルミナ社、及び、型式「Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｍａｔｅ  Ｐａｉｒ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」、イルミナ社）を用いた。
【００５１】
続いて、調製したライブラリを次世代シーケンサー（型式「Ｍｉｓｅｑ」、イルミナ社）に供し、３００塩基ずつのペアエンドシーケンスを行った。
【００５２】
続いて、得られたシーケンスデータを、ゲノムアセンブリ用プログラム（名称「Ｐｌａｔａｎｕｓ」、http://platanus.bio.titech.ac.jp/）を用いてアセンブルすることにより、全ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００５３】
下記表３に、決定したスキャホールドの塩基配列の配列番号を示す。また、配列番号５９は、ミトコンドリアゲノムの塩基配列である。
【００５４】
【表３】
2019184500.tif 000004
【００５５】
また、クリプトコッカス・リクエファシエンスＮ６株のｍＲＮＡ−ｓｅｑも行った。具体的には、培養したクリプトコッカス・リクエファシエンスＮ６株からｍＲＮＡを抽出し、シーケンス用ライブラリを調製した。ライブラリの調製には、市販のキット（型式「ＫＡＰＡ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ」、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）を用いた。
【００５６】
続いて、調製したライブラリを次世代シーケンサー（型式「Ｍｉｓｅｑ」、イルミナ社）に供し、３００塩基ずつのペアエンドシーケンスを行った。
【００５７】
［実験例２］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスにおけるＢＲＣＡ２ホモログの同定）
実験例１で決定した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡの塩基配列から予想されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、相同性検索を行い、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のホモログを探索した。その結果、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質に相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を見出し、ＢＲＨ２遺伝子と命名した。
【００５８】
ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６０に示す。また、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子の塩基配列を配列番号６１に示し、Ｂｒｈ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６２に示す。また、ウスチラゴ・メイディスのＢＲＣＡ２ホモログ（以下、「ＢＲＨ２遺伝子」又は「Ｂｒｈ２タンパク質」という。）の塩基配列を配列番号６３に示し、アミノ酸配列を配列番号６４に示す。
【００５９】
図１（ａ）は、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質、ウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の構造を示す模式図である。ヒトＢＲＣＡ２タンパク質はＢＲＣリピートと呼ばれるモチーフとＣＣＲと呼ばれるモチーフを有することが知られている。図１（ａ）において、黒いボックスで各タンパク質におけるＢＲＣリピートを示し、灰色のボックスでＣＣＲを示す。
【００６０】
また、図１（ａ）中、「Ｈｓ  ＢＲＣＡ２」はヒトＢＲＣＡ２タンパク質を示し、「Ｕｍ  Ｂｒｈ２」はウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質を示し、「Ｃｌ  Ｂｒｈ２」はクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質を示す。
【００６１】
また、図１（ｂ）は、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質の第４番目のＢＲＣリピートとクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の第１番目のＢＲＣリピート、及び、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質の第７番目のＢＲＣリピートとクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の第２番目のＢＲＣリピートのアミノ酸配列を、それぞれアライメントした図である。
【００６２】
図１（ｂ）中、「Ｈｓ  ＢＲＣ４」はヒトＢＲＣＡ２タンパク質の第４番目のＢＲＣリピートを示し、「Ｈｓ  ＢＲＣ７」はヒトＢＲＣＡ２タンパク質の第７番目のＢＲＣリピートを示し、「Ｃｌ  ＢＲＣ１」はクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の第１番目のＢＲＣリピートを示し、「Ｃｌ  ＢＲＣ２」はクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質の第２番目のＢＲＣリピートを示す。また、図１（ｂ）中、黒いボックスは一致したアミノ酸を示し、灰色のボックスは性質の類似したアミノ酸を示す。
【００６３】
また、図１（ｃ）は、ヒトＢＲＣＡ２タンパク質のＣＣＲ、ウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲ及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲのアミノ酸配列を、それぞれアライメントした図である。
【００６４】
図１（ｃ）中、「Ｈｓ  ＣＣＲ」はヒトＢＲＣＡ２タンパク質のＣＣＲを示し、「Ｕｍ  ＣＣＲ」はウスチラゴ・メイディスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲを示し、「Ｃｌ  ＣＣＲ」はクリプトコッカス・リクエファシエンスＢｒｈ２タンパク質のＣＣＲを示す。また、図１（ｃ）中、黒いボックスは一致したアミノ酸を示し、灰色のボックスは性質の類似したアミノ酸を示す。
【００６５】
［実験例３］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスにおけるＰＡＲＰホモログの同定）
実験例１で決定した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡの塩基配列から予想されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、相同性検索を行い、ヒトＰＡＲＰタンパク質のホモログを探索した。その結果、ヒトＰＡＲＰタンパク質に相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を見出した。
【００６６】
ヒトＰＡＲＰ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６５に示す。また、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子の塩基配列を配列番号６６に示し、Ｐａｒｐタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６７に示す。
【００６７】
図２（ａ）は、ヒトＰＡＲＰ１タンパク質及びクリプトコッカス・リクエファシエンスＰａｒｐタンパク質の構造を示す模式図である。ヒトＰＡＲＰ１タンパク質はＺｉｎｃフィンガーモチーフとポリメラーゼの活性中心領域（ＨＹＥ配列）を有することが知られている。図２（ａ）中、「Ｈｓ  ＰＡＲＰ１」はヒトＰＡＲＰ１タンパク質を示し、「Ｃｌ  Ｐａｒｐ」はクリプトコッカス・リクエファシエンスＰａｒｐタンパク質を示す。また、黒いボックスで各タンパク質におけるＺｉｎｃフィンガーモチーフを示し、灰色のボックスでＨＹＥ配列を示す。
【００６８】
図２（ｂ）は、クリプトコッカス・リクエファシエンスＰａｒｐタンパク質のアミノ酸配列である。図２（ｂ）において、黒いボックスはＺｉｎｃフィンガーモチーフに存在するアミノ酸残基を示し、灰色のボックスはＨＹＥ配列中の特徴的なアミノ酸残基を示す。具体的には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の結合に重要なアミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈ）及びチロシン（Ｙ）、並びにポリメラーゼ活性に重要なアミノ酸残基であるグルタミン酸（Ｅ）を示す。また、四角で囲んだアミノ酸配列は、推測される核移行シグナルである。
【００６９】
［実験例４］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスにおけるＲＡＤ５１ホモログの同定）
実験例１で決定した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡの塩基配列から予想されるタンパク質のアミノ酸配列に対して、相同性検索を行い、ヒトＲＡＤ５１タンパク質のホモログを探索した。その結果、ヒトＲＡＤ５１タンパク質に相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を見出した。
【００７０】
ヒトＲＡＤ５１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６８に示す。また、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子の塩基配列を配列番号６９に示し、Ｒａｄ５１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７０に示す。
【００７１】
［実験例５］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスの形質転換技術の確立）
まず、酵母の遺伝学で広く使用されている薬剤である、ノーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ、ＮＡＴ）、ネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ、Ｎｅｏ）及びハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ、Ｈｙｇ）を、クリプトコッカス・リクエファシエンスにおける選択マーカーとして使用するため、各薬剤に対する耐性遺伝子の発現プラスミドを作製した。
【００７２】
具体的には、各薬剤に対して耐性となるタンパク質をコードする遺伝子である、ＮＡＴ耐性遺伝子、Ｎｅｏ耐性遺伝子及びＨｙｇ耐性遺伝子のコーディング領域に、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＴＥＦ１プロモーター及びＵＲＡ５ターミネーターをそれぞれ連結した発現プラスミドを作製した。以下、ＮＡＴ耐性遺伝子の発現プラスミドを「ｐＢＳ−ＮＡＴ」といい、Ｎｅｏ耐性遺伝子の発現プラスミドを「ｐＢＳ−Ｎｅｏ」といい、Ｈｙｇ耐性遺伝子の発現プラスミドを「ｐＢＳ−Ｈｙｇ」という。
【００７３】
クリプトコッカス・リクエファシエンスのＴＥＦ１プロモーターは、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲにより調製した。ｐＢＳ−ＮＡＴ用のＴＥＦ１プロモーターは、プライマーＰｍｐ１（配列番号７１）及びプライマーＰｍｐ２（配列番号７２）を用いたＰＣＲにより調製した。また、ｐＢＳ−Ｎｅｏ用のＴＥＦ１プロモーターは、プライマーＰｍｐ１（配列番号７１）及びプライマーＰｍｐ７（配列番号７７）を用いたＰＣＲにより調製した。また、ｐＢＳ−Ｈｙｇ用のＴＥＦ１プロモーターは、プライマーＰｍｐ１（配列番号７１）及びプライマーＰｍｐ１１（配列番号８１）を用いたＰＣＲにより調製した。
【００７４】
また、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＵＲＡ５ターミネーターも、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲにより調製した。ｐＢＳ−ＮＡＴ用のＵＲＡ５ターミネーターは、プライマーＰｍｐ５（配列番号７５）及びプライマーＰｍｐ６（配列番号７６）を用いたＰＣＲにより調製した。また、ｐＢＳ−Ｎｅｏ用のＵＲＡ５ターミネーターは、プライマーＰｍｐ６（配列番号７６）及びプライマーＰｍｐ８（配列番号７８）を用いたＰＣＲにより調製した。ｐＢＳ−Ｈｙｇ用のＵＲＡ５ターミネーターは、プライマーＰｍｐ６（配列番号７６）及びプライマーＰｍｐ１２（配列番号８２）を用いたＰＣＲにより調製した。
【００７５】
また、ＮＡＴ耐性遺伝子は、プラスミドｐＦＡ６ａ−ＮＡＴ（英国サセックス大学のＡｎｔｏｎｙ  Ｍ．  Ｃａｒｒ博士より分与して頂いた。）を鋳型として、プライマーＰｍｐ３（配列番号７３）及びプライマーＰｍｐ４（配列番号７４）を用いたＰＣＲにより調製した。また、Ｎｅｏ耐性遺伝子は、プラスミドｐｃＤＮＡ３（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を鋳型として、プライマーＰｍｐ９（配列番号７９）及びプライマーＰｍｐ１０（配列番号８０）を用いたＰＣＲにより調製した。また、Ｈｙｇ耐性遺伝子は、プラスミドｐＦＡ６ａ−ｈｐｈＭＸ６（英国サセックス大学のＡｎｔｏｎｙ  Ｍ．  Ｃａｒｒ博士より分与して頂いた。）を鋳型として、プライマーＰｍｐ１３（配列番号８３）及びプライマーＰｍｐ１４（配列番号８４）を用いたＰＣＲにより調製した。
【００７６】
下記表５に、ｐＢＳ−ＮＡＴ、ｐＢＳ−Ｎｅｏ及びｐＢＳ−Ｈｙｇの作製に用いたプライマーの塩基配列を示す。
【００７７】
【表４】
2019184500.tif 000005
【００７８】
続いて、ＴＥＦ１プロモーター、各薬剤耐性遺伝子、ＵＲＡ５ターミネーターを、それぞれフュージョンＰＣＲで連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）（アジレント・テクノロジー社）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩサイトにクローニングし、ｐＢＳ−ＮＡＴ、ｐＢＳ−Ｎｅｏ、ｐＢＳ−Ｈｙｇの各発現プラスミドを作製した。
【００７９】
また、条件検討を行った結果、クリプトコッカス・リクエファシエンスへの遺伝子導入は電気穿孔法で行い、遺伝子導入条件は次の通りとした。まず、クリプトコッカス・リクエファシエンスを指数増殖期まで培養し、３，５００×ｇで５分間遠心して集菌した。続いて、菌体をＥＢバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２７０ｍＭスクロース）で２回洗浄し、４ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むＥＢバッファーで懸濁した。続いて、菌体を氷上で１５分静置後、ＥＢバッファーで更に一回洗浄し、ＥＢバッファーに再度懸濁した。
【００８０】
１回の形質転換あたり、１．５×１０８個の細胞に３μｇのＤＮＡを加え、０．２ｃｍのキュベットにセットし、エレクトロポレーションシステム（型式「ジーンパルサー」、バイオラッド社）を用いて、０．６ｋＶ、１２５μＦ、１０００Ωの条件でパルス処理を行った。続いて、パルス処理した細胞を２ｍＬの完全培地に懸濁し、３０℃で２〜３時間培養した後、適切な選択培地上に播種し、３０℃で形質転換体が現れるまで３日間ほど培養した。
【００８１】
また、条件検討を行った結果、クリプトコッカス・リクエファシエンスの完全培地での薬剤耐性菌は以下の条件で選択した。すなわち、ノーセオスリシン耐性菌は１００μｇ／ｍＬのノーセオスリシンの存在下で選択した。また、ネオマイシン耐性菌は５０μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で選択した。また、ハイグロマイシン耐性菌は４０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンの存在下で選択した。
【００８２】
［実験例６］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子破壊株の作製）
スプリットマーカー法を用いて、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子破壊株を作製した。
【００８３】
まず、実験例１で決定した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子座の上流５０ｂｐ（以下、「ｌｅｆｔ配列」という場合がある。）及び下流５０ｂｐ（以下、「ｒｉｇｈｔ配列」という場合がある。）のゲノムＤＮＡの塩基配列を特定した。
【００８４】
続いて、実験例５で作製したｐＢＳ−ＮＡＴの、ＴＥＦ１プロモーター−ＮＡＴ耐性遺伝子−ＵＲＡ５ターミネーターを含む領域を増幅できる塩基配列のペア（TATCTGGCTCGATCGCAGCG（配列番号８５）、CCCCATCCCCAATCTTTCTT（配列番号８６））のそれぞれの５’末端に、上記のｌｅｆｔ配列、ｒｉｇｈｔ配列を付加した塩基配列を有するオリゴＤＮＡを合成した。
【００８５】
続いて、ｐＢＳ−ＮＡＴを鋳型とし、合成したオリゴＤＮＡのペアをプライマーに用いたＰＣＲにより、ｌｅｆｔ配列−ＴＥＦ１プロモーター−ＮＡＴ耐性遺伝子−ＵＲＡ５ターミネーター−ｒｉｇｈｔ配列の塩基配列を有するＤＮＡ断片を調製した。
【００８６】
続いて、スプリットマーカー法に用いる２種類のＤＮＡ断片を調製した。図３（ａ）は、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。図３（ａ）中、「ｌｅｆｔ」はｌｅｆｔ配列を示し、「ｒｉｇｈｔ」はｒｉｇｈｔ配列を示し、「ＴＥＦ１」はＴＥＦ１プロモーターを示し、「ＮＡＴ」はＮＡＴ耐性遺伝子を示し、「ＢＲＨ２」はＢＲＨ２遺伝子を示す。図３（ａ）において、ＵＲＡ５ターミネーターは図示されていない。
【００８７】
スプリットマーカー法では、２種類のＤＮＡ断片をクリプトコッカス・リクエファシエンスに導入し形質転換する。１方のＤＮＡ断片は、ｌｅｆｔ配列−ＴＥＦ１プロモーター−ＮＡＴ耐性遺伝子の５’側の塩基配列を有しており、ＮＡＴ耐性遺伝子の３’側は欠失していた。他方のＤＮＡ断片は、上記１方のＤＮＡ断片のＮＡＴ耐性遺伝子と約４００ｂｐ重複した、ＮＡＴ耐性遺伝子の３’側−Ｕｒａ５ターミネーター−ｒｉｇｈｔ配列の塩基配列を有しており、ＮＡＴ耐性遺伝子の５’側は欠失していた。
【００８８】
これらの２種類のＤＮＡ断片をクリプトコッカス・リクエファシエンスに導入して形質転換し、ＮＡＴ耐性株を取得することにより、ＢＲＨ２遺伝子破壊株を得た。
【００８９】
［実験例７］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子破壊株の作製）
ｌｅｆｔ配列及びｒｉｇｈｔ配列として、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子座の上流５０ｂｐ及び下流５０ｂｐのゲノムＤＮＡの塩基配列をそれぞれ用いた点以外は、実験例６と同様にして、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子破壊株を作製した。
【００９０】
図３（ｂ）は、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＰＡＲＰ遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。図３（ｂ）中、「ｌｅｆｔ」はｌｅｆｔ配列を示し、「ｒｉｇｈｔ」はｒｉｇｈｔ配列を示し、「ＴＥＦ１」はＴＥＦ１プロモーターを示し、「ＮＡＴ」はＮＡＴ耐性遺伝子を示し、「ＰＡＲＰ」はＰＡＲＰ遺伝子を示す。図３（ｂ）において、ＵＲＡ５ターミネーターは図示されていない。
【００９１】
［実験例８］
（クリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子破壊株の作製）
ｌｅｆｔ配列及びｒｉｇｈｔ配列として、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子座の上流５０ｂｐ及び下流５０ｂｐのゲノムＤＮＡの塩基配列をそれぞれ用いた点以外は、実験例６と同様にして、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子破壊株を作製した。
【００９２】
図３（ｃ）は、スプリットマーカー法によりクリプトコッカス・リクエファシエンスのＲＡＤ５１遺伝子を破壊した手順を説明する模式図である。図３（ｃ）中、「ｌｅｆｔ」はｌｅｆｔ配列を示し、「ｒｉｇｈｔ」はｒｉｇｈｔ配列を示し、「ＴＥＦ１」はＴＥＦ１プロモーターを示し、「ＮＡＴ」はＮＡＴ耐性遺伝子を示し、「ＲＡＤ５１」はＲＡＤ５１遺伝子を示す。図３（ｃ）において、ＵＲＡ５ターミネーターは図示されていない。
【００９３】
［実験例９］
（紫外線感受性の検討）
実験例６、７、８でそれぞれ作製した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子破壊株、ＰＡＲＰ遺伝子破壊株及びＲＡＤ５１遺伝子破壊株の紫外線感受性を検討した。
【００９４】
まず、各遺伝子破壊株を液体完全培地で一晩培養し、１０倍毎の希釈系列を作製した。続いて、寒天培地上に、各遺伝子破壊株の希釈系列をスポットした。続いて、紫外線ランプ（型式「ＧＬ１５」、東芝ライフテック社）を用いて３００Ｊ／ｍ２の紫外線を照射した。続いて、３０℃で３日間培養し、スポットを観察した。また、比較のために、野生型のクリプトコッカス・リクエファシエンスについても同様の実験を行った。
【００９５】
図４（ａ）は、対照として、紫外線照射を行わなかった点以外は、同様の操作を行ったクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。図４（ｂ）は、紫外線照射を行ったクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。
【００９６】
図４（ａ）及び（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型のクリプトコッカス・リクエファシエンスを示し、「ＲＡＤ５１Δ」はＲＡＤ５１遺伝子破壊株を示し、「ＢＲＨ２Δ」はＢＲＨ２遺伝子破壊株を示し、「ＰＡＲＰΔ」はＰＡＲＰ遺伝子破壊株を示す。
【００９７】
その結果、ＢＲＨ２遺伝子、ＰＡＲＰ遺伝子、ＲＡＤ５１遺伝子のいずれの破壊株も紫外線照射によるＤＮＡ傷害に感受性を示すことが明らかとなった。この結果は、クリプトコッカス・リクエファシエンスを、ヒトＢＲＣＡ２遺伝子、ヒトＰＡＲＰ遺伝子、ヒトＲＡＤ５１遺伝子の機能解析を行うモデル生物として使用することができることを示す。
［実験例１０］
（抗癌剤感受性の検討）
実験例６、７、８でそれぞれ作製した、クリプトコッカス・リクエファシエンスのＢＲＨ２遺伝子破壊株、ＰＡＲＰ遺伝子破壊株及びＲＡＤ５１遺伝子破壊株の抗癌剤に対する感受性を検討した。抗癌剤としては、ブレオマイシン及びフィレオマイシンを使用した。
【００９８】
まず、各遺伝子破壊株を液体完全培地で一晩培養し、１０倍毎の希釈系列を作製した。続いて、各希釈系列に終濃度０．５μＵ／ｍＬのブレオマイシン又は終濃度１．５μｇ／ｍＬのフィレオマイシンをそれぞれ添加し、寒天培地上にスポットした。続いて、３０℃で３日間培養し、スポットを観察した。また、比較のために、野生型のクリプトコッカス・リクエファシエンスについても同様の実験を行った。
【００９９】
図４（ａ）は、対照として、抗癌剤に暴露しなかった点以外は、同様の操作を行ったクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。図４（ｃ）は、ブレオマイシンに暴露したクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。図４（ｄ）は、フィレオマイシンに暴露したクリプトコッカス・リクエファシエンスのスポットの写真である。
【０１００】
図４（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型のクリプトコッカス・リクエファシエンスを示し、「Ｒａｄ５１Δ」はＲＡＤ５１遺伝子破壊株を示し、「Ｂｒｈ２Δ」はＢＲＨ２遺伝子破壊株を示し、「ＰａｒｐΔ」はＰＡＲＰ遺伝子破壊株を示す。
【０１０１】
その結果、ＢＲＨ２遺伝子、ＰＡＲＰ遺伝子、ＲＡＤ５１遺伝子のいずれの破壊株もブレオマイシン及びフィレオマイシンに感受性を示すことが明らかとなった。この結果は、クリプトコッカス・リクエファシエンスを、ヒトＢＲＣＡ２遺伝子、ヒトＰＡＲＰ遺伝子、ヒトＲＡＤ５１遺伝子の機能解析を行うモデル生物として使用することができることを更に支持するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、遺伝性乳癌卵巣癌症候群の治療薬をスクリーニングする技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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