(57)【要約】      （修正有）【課題】優れた抗シワ効果を奏する抗シワ皮膚外用組成物の提供。【解決手段】レチノール及びコラーゲンを含み、前記コラーゲンはテロペプチド除去コラーゲンであり、前記コラーゲンは前記レチノールとは結合しておらず、且つカルボン酸化合物によって修飾されていない、皮膚外用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ）含まれるアミノ基が、（ｉ）修飾されていないか、あるいは（ｉｉ）ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている、
皮膚外用組成物。
【請求項２】
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ−ｉｉ）含まれるアミノ基が、ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている、
皮膚外用組成物。
【請求項３】
前記コラーゲンが、ウシ、ブタ、又はサメ由来のコラーゲンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ−ｉ）含まれるアミノ基が、修飾されていない、
皮膚外用組成物。
【請求項５】
前記コラーゲンが、ポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン）を含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記コラーゲンが、３重らせん構造を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
抗シワ皮膚外用組成物である、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用組成物等に関する。
【０００２】
皮膚老化に伴って肌にはシワが増える。シワには、眼の下に細く横に入り、深さが表皮レベルのシワ（表皮性シワ）から、目尻や額などの表情筋の方向と垂直の細かいひだとして現れ、シワの深さが真皮レベルのシワ（真皮性シワ）や、目や口の周り、顔の輪郭などの大きなひだとして現れるシワ（老人性シワ）などがある。このような、表皮や真皮などの部位に総合的に作用してシワの形成防止や改善に多面的に作用する解決を目指して、研究がなされている。
【０００３】
コラーゲンまたはその誘導体は、あらゆる多細胞生物に見られる繊維状タンパク質であり、皮膚老化防止を目的として種々の化粧料に配合されている。 
【０００４】
レチノールおよびその誘導体は、視覚をはじめとする生体機能の維持や、皮膚および粘膜などの正常上皮組織の再生機能などに関与することが知られているビタミンの一種であり、尋常性魚鱗癬などの角化異常皮膚疾患の外用医薬品として知られ、また、レチノール誘導体は、上皮組織の活性を維持し、紫外光線のシグナル透過を遮断することによって皮膚の老化を抑制することが知られており、皮膚老化防止用の化粧料などとして広く利用されている。
【０００５】
またさらに、特定のアミノ酸配列を有するペプチドユニットを縮合して得られるポリペプチド（ポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン））にコハク酸を介してレチノールを結合した物質は細胞毒性が低く、表皮におけるヒアルロン酸産生を増大し、また、真皮におけるコラーゲンの合成を促進できることが見出されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１５８８６４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、優れた抗シワ効果（例えば、シワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果、又は肌質改善効果等の効果）を奏する抗シワ皮膚外用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の通り、ポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン）にコハク酸を介してレチノールを結合した物質（以下「レチノール−コハク酸−コラーゲン」ということがある）が開発され、当該物質を皮膚に適用した際の影響に関して検討が行われている（特許文献１）。ヒアルロン酸合成酵素であるＨＡＳ２及びＨＡＳ３にレチノール−コハク酸−コラーゲンが与える影響も検討されており、レチノールとコハク酸−コラーゲン（コハク酸修飾コラーゲン）との混合物は、レチノール単独よりもＨＡＳ２及びＨＡＳ３の遺伝子発現を亢進させる効果が低いことが示されている（特許文献１の図２）。すなわち、特許文献１により、レチノールとコハク酸修飾コラーゲンとの混合物のＨＡＳ２及びＨＡＳ３の遺伝子発現亢進効果は、レチノール−コハク酸−コラーゲンの当該効果に全く及ばないどころか、レチノール単独の当該効果にすら及ばないことが示唆されていた。
【０００９】
今回、本発明者らは、上記特許文献１の示唆とは裏腹に、レチノールに特定のコラーゲンを組み合わせて用いることにより、レチノール単独に比べて、顕著に高いＨＡＳ２及びＨＡＳ３の遺伝子発現亢進効果を得られることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。限定的な解釈を望むものではないが、上記特許文献１の示唆と異なる結果が得られたのは、特許文献１で用いたコラーゲンがコハク酸修飾コラーゲンであった一方、本願発明ではコラーゲンとして、含まれるアミノ基が（ｉ）修飾されていないか、あるいは（ｉｉ）ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている、特定のコラーゲンを選択したからであると推察される。
【００１０】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ）含まれるアミノ基が、（ｉ）修飾されていないか、あるいは（ｉｉ）ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている、
皮膚外用組成物。
項２．
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ−ｉｉ）含まれるアミノ基が、ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている、
皮膚外用組成物。
項３．
前記コラーゲンが、ウシ、ブタ、又はサメ由来のコラーゲンである、項２に記載の組成物。
項４．
レチノール及びコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが、
（Ａ）テロペプチド除去コラーゲンであり、
（Ｂ）前記レチノールとは結合しておらず、
（Ｃ−ｉ）含まれるアミノ基が、修飾されていない、
皮膚外用組成物。
項５．
前記コラーゲンが、ポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン）を含んでなる、項４に記載の組成物。
項６．
前記コラーゲンが、３重らせん構造を有する、項１〜５のいずれかに記載の組成物。
項７．
抗シワ皮膚外用組成物である、項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の皮膚外用組成物を用いることにより、優れた抗シワ効果（より具体的には、例えば、シワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果、又は肌質改善効果等）を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】レチノール（１０−６Ｍ又は１０−５Ｍ）及び／又はピュアコラーゲン（０．１％又は１％）がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ２）の発現に与える影響をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す。
【図１ｂ】レチノール（１０−６Ｍ）及び／又はピュアコラーゲン（０．１％又は１％）がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ３）の発現に与える影響をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す。
【図１ｃ】レチノール（１０−６Ｍ）及び／又はピュアコラーゲン（０．１％又は１％）が細胞増殖促進遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現に与える影響をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す。
【図２ａ】レチノール（１０−５Ｍ）及び／又はアテロコラーゲン（０．１％又は１％）がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ２）の発現に与える影響をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す。
【図２ｂ】レチノール（１０−５Ｍ）及び／又はアテロコラーゲン（０．１％又は１％）が細胞増殖促進遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現に与える影響をリアルタイムＰＣＲにより解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１４】
本発明に包含される皮膚外用組成物は、レチノール及びコラーゲンを含む。以下、当該組成物を本発明の皮膚外用組成物とよぶことがある。
【００１５】
レチノールは、次の構造式で表される化合物であり、上述の通り、皮膚老化防止用化粧品等に利用されている。
【００１６】
【化１】
2019116457.tif 000002
【００１７】
本発明の皮膚外用組成物におけるレチノールの含有量は、本発明の効果が損なわれない限り、特に制限されないが、例えば０．００５〜１質量％程度、０．０１〜０．５質量％程度、又は０．０２〜０．１質量％程度が好ましく挙げられる。また例えば組成物が液状である場合、１０−６〜１０−２Ｍ程度であることが好ましく、１０−５〜１０−２．５Ｍ程度であることがより好ましい。
【００１８】
本発明に用いるコラーゲンは、テロペプチド除去コラーゲンである（前記特徴（Ａ））。テロペプチド除去コラーゲンとしては、例えば、天然コラーゲンのＮ末端テロペプチド及びＣ末端テロペプチドを酵素処理（プロテアーゼ処理）することで、テロペプチドを除去したコラーゲンが挙げられる。プロテアーゼとしては、テロペプチドを除去できるものであれば、特に制限されない。例えば、ペプシン等が例示される。また、天然由来コラーゲンとしては、例えば、ウシ由来コラーゲン、ブタ由来コラーゲン、及びサメ由来（好ましくはフカヒレ由来）コラーゲンを挙げられる。これらの天然由来コラーゲンは、公知の方法又は公知の方法から容易に想到する方法により、各生物から抽出及び／又は精製することができる。
【００１９】
また、テロペプチド除去コラーゲンとして、例えば、合成コラーゲンを用いることもできる。合成コラーゲンは、例えば、コラーゲン様配列（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）からなるペプチドを重合して合成したポリペプチドから調製することができる。この場合、合成コラーゲンは、ポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）を含んでなる。下述するように、コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなるものが好ましい。また、３本のポリペプチドが３重らせん構造を形成しているものが好ましい。また、アミノ酸Ｘとアミノ酸Ｙとしては、同一又は異なって、グリシン、 アラニン、 バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、又はプロリン等であってよいが、特にプロリン又はヒドロキシプロリンであることが好ましい。中でも、アミノ酸Ｘがプロリンであり、アミノ酸Ｙがヒドロキシプロリンであることが、より好ましい。このようなポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）は、例えば上記特許文献１（ＷＯ２０１１／１５８８６４）に記載の方法に基づいて調製することができる。
【００２０】
また、本発明に用いるコラーゲンは、レチノールとは結合していない（前記特徴（Ｂ））。ここでいうコラーゲンとレチノールとの結合は、直接的又は間接的な結合を包含する。つまり、本発明に用いるコラーゲンは、レチノールとは直接的にも間接的にも結合していない。直接的結合とは、例えばコラーゲンとＯＨ基とレチノールのＯＨ基とが脱水縮合して結合した等、これらの２成分が直接反応して結合することをいい、間接的な結合とは、リンカーがこれら２成分の間に存在して結合することをいう。ここでのリンカーとしては、コラーゲン及びレチノールを架橋できるものであれば特に制限されないが、例えばジカルボン酸が挙げられる。ジカルボン酸の一方のＣＯＯＨ基とレチノールのＯＨ基とが反応し、ジカルボン酸のもう一方のＣＯＯＨ基がコラーゲンのＯＨ基と反応することで、リンカーとしてこれら２成分を結合させることができる。ジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸、マレイン酸等が挙げられる。
【００２１】
また、本発明に用いるコラーゲンは、含まれるアミノ基が、（ｉ）修飾されていないか、あるいは（ｉｉ）ジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている（前記特徴（Ｃ））。
【００２２】
つまり、本発明に用いるコラーゲンは、（ｉ）コラーゲンを形成するポリペプチド鎖の側鎖のアミノ基がそのまま残されているか、あるいは、（ｉｉ）コラーゲンを形成するポリペプチド鎖の側鎖のアミノ基の一部がジカルボン酸で修飾されており、且つ他の側鎖のアミノ基の一部が炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されている。
【００２３】
（ｉ）のコラーゲンとしては、例えば、上述したテロペプチド除去コラーゲン（天然由来コラーゲン及びポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）を含んでなるコラーゲン等）を好ましく挙げることができる。
【００２４】
また、（ｉｉ）のコラーゲンとしては、上述したテロペプチド除去コラーゲン（天然由来コラーゲン及びポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）を含んでなるコラーゲン等）を、さらにジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸と反応させて、調製することができる。なお、アミノ基がジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されているとは、アミノ基（−ＮＨ２）とジカルボン酸のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）及び炭素数１２〜１８の脂肪酸のカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）とが反応してアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）により結合していること包含し、好ましくはアミド結合により結合していることを意味する。
【００２５】
アミノ基を修飾するジカルボン酸としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸、マレイン酸等が挙げられ、特にコハク酸が好ましい。当該ジカルボン酸は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２６】
また、アミノ基を修飾する１２〜１８の脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等が挙げられ、特にミリスチン酸が好ましい。当該脂肪酸は１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２７】
以上のように、本発明に用いるコラーゲンは、上記（ｉ）のコラーゲン及び（ｉｉ）のコラーゲンともに、引用文献１に記載されるコハク酸修飾コラーゲンとは異なるものである。
【００２８】
また、コラーゲンの平均分子量は、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されないが、例えば１万〜５０万程度が好ましく、１０万〜４０万程度がさらに好ましい。コラーゲンの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーで測定する。
【００２９】
また、本発明に用いるコラーゲンは、３本のポリペプチド鎖からなる３重らせん構造を有することが好ましい。３重らせん構造であるかは、円二色性分散計測定により確認することができる。円二色性分散計測定により得られるＣＤスペクトルで、１８５〜２０５ｎｍの波長範囲のいずれかの波長に負のコットン効果を示し、２１０〜２３０ｎｍの波長範囲のいずれかの波長に正のコットン効果を示すことにより、ポリペプチドの少なくとも一部または全部が３重らせん構造を維持していることを確認することができる。なお、円偏光二色性とは、光学活性物質が、円偏光を吸収する際に左円偏光と右円偏光に対して吸光度に差が生じる現象のことをいう。また、円偏光二色性のコットン効果とは、特定の波長で左右の円偏光に対する吸光度および透過速度の相違が同時に起こる現象をいう。
【００３０】
また、３重らせん構造を形成するポリペプチドは、３アミノ酸ごとにグリシンが表れるポリペプチドであれば、特に制限はされない。例えば、コラーゲンを構成する公知のポリペプチド又はそれに類似するポリペプチドが好ましく挙げられる。好ましくは、α鎖であり、α１及びα２が挙げられる。α１としては、例えば、α１（Ｉ）、α１（ＩＩ）、及びα１（Ｅ）が挙げられる。また、α２としては、例えばα２（Ｉ）及びα２（ＩＩ）が挙げられる。α１（Ｉ）及びα１（ＩＩ）は、それぞれＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲンのα１鎖であり、α２（Ｉ）及びα２（ＩＩ）は、それぞれＩ型コラーゲン及びＩＩ型及びα２鎖である。また、α１（Ｅ）は、サメ（特にフカヒレ）由来のコラーゲンに見られるα鎖であり、α１（ＩＩ）よりもα１（Ｉ）に似ていることが知られている。
【００３１】
３重らせん構造を有するコラーゲンにおいて、３本のポリペプチドの組み合わせは、本発明の効果が損なわれない限り特に制限されないが、例えば２本がα１で１本がα２であるコラーゲンや、３本ともα（Ｅ）であるコラーゲンが例示され、特に、例えば２本がα１（Ｉ）で１本がα２（Ｉ）であるコラーゲンや、３本ともα１（Ｅ）であるコラーゲンが例示される。なお、２本がα１（Ｉ）で１本がα２（Ｉ）であるコラーゲンはＩ型コラーゲンとも呼ばれ、３本ともα１（Ｅ）であるコラーゲンはエラストイジンとも呼ばれる。
【００３２】
また、ポリペプチドとして、ポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）が用いられる場合には、３本のポリペプチドが全て同一のポリ（アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ−グリシン）からなるものが好ましく、中でも３本のポリペプチドが全てポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン）からなるものが好ましい。
【００３３】
なお、特に制限はされないが、コラーゲンは、等電点（ｐＩ）が、４．０〜５．０程度であることが好ましく、４．２〜４．７程度であることがより好ましい。
【００３４】
特に限定されるわけではないが、本発明の皮膚外用組成物に、アミノ基がジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されているコラーゲン（すなわち（ｉｉ）のコラーゲン）が含まれている場合、Ｉ型コラーゲンのアミノ基がジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されたもの（以下「（ｉｉ）のＩ型コラーゲン」ということがある）、及びエラストイジンのアミノ基がジカルボン酸及び炭素数１２〜１８の脂肪酸により修飾されているコラーゲン（以下「（ｉｉ）のエラストイジン」）が中でも好ましい。また、（ｉｉ）のＩ型コラーゲン及び（ｉｉ）のエラストイジンの質量比が、３０〜７０：７０〜３０程度であることが好ましく、４０〜６０：６０〜４０程度であることがより好ましい。また、組成物に含まれる（ｉｉ）のコラーゲン全量が（ｉｉ）のＩ型コラーゲン及び（ｉｉ）のエラストイジンであることが好ましい。このような（ｉｉ）のコラーゲンは、特にサメ（特にフカヒレ）由来のコラーゲンから調製することができる。また、市販品を購入して用いることもでき、例えばフカヒレアテロコラーゲンＭＳ、フカヒレアテロコラーゲンＳＳ（いずれも株式会社高研）等を挙げることができる。
【００３５】
本発明の皮膚外用組成物におけるコラーゲンの含有量は、本発明の効果が損なわれない限り、特に制限されないが、例えば０．０５〜５質量％程度が好ましく、０．１〜２質量％程度がより好ましく、０．１〜１質量％程度がさらに好ましい。
【００３６】
また、本発明の皮膚外用組成物には、皮膚外用組成物（特に外用医薬品組成物及び化粧品組成物）に使用される公知の成分をさらに含有していてもよい。このような成分としては、例えば、水、油剤、界面活性剤、保湿剤、高級アルコール、金属イオン封鎖剤、天然及び合成高分子、水溶性及び油溶性高分子、紫外線遮蔽剤、各種抽出液、有機染料等の色剤、防腐剤、酸化防止剤、色素、増粘剤、ｐＨ調整剤、香料、冷感剤、制汗剤、殺菌剤、皮膚賦活剤、各種粉体等の成分が挙げられる。これらの成分の配合量も、公知の皮膚外用組成物への配合量の情報に基づき、適宜設定することができる。例えば、５０〜９９．９質量％程度であり得る。
【００３７】
特に制限されるわけではないが、本発明の皮膚外用組成物は、液状組成物であることが好ましい。また、本発明の皮膚外用組成物の使用形態としては、例えば、フェイスパック、ペースト、軟膏、クリーム、ジェル、ローション、乳液、美容液、化粧水、スプレー剤などが挙げられる。
【００３８】
このような本発明の皮膚外用組成物は、公知の方法又は公知の方法から容易に想到される方法により製造することができる。
【００３９】
また、本発明の皮膚外用組成物は、レチノール及び上記特定のコラーゲンを含有することにより、優れたヒアルロン酸合成酵素遺伝子（特にＨＡＳ２及び／又はＨＡＳ３遺伝子）発現亢進効果、並びに／あるいは、細胞増殖促進遺伝子（特にＨＢ−ＥＧＦ遺伝子）発現亢進効果を奏する。
【００４０】
Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  （ＨＡＳ）はヒアルロン酸合成酵素であり、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３の発現が亢進することで、ヒアルロン酸合成が促進され、これにより抗シワ効果が好ましく奏される。また、ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ−ＥＧＦ）は、皮膚細胞増殖に関わっていること、特にＨＢ−ＥＧＦが増えれば皮膚ターンオーバーが早まり新しい皮膚に生まれ変わることが知られている。これにより、外傷や日焼け、あるいはシワやシミが解消され得る。
【００４１】
このため、本願発明は、レチノール及び上記特定のコラーゲンを含有するヒアルロン酸合成亢進用組成物、及び、レチノール及び上記特定のコラーゲンを含有する細胞（特に皮膚細胞）増殖促進用若しくは皮膚ターンオーバー用組成物をも包含する。これらの組成物に含まれる各成分については、上述の記載が好ましく当てはまる。
【００４２】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下、特に断らない限り、各種組成物中の成分含有割合を示す％は質量％（ｗ／ｗ％）を表す。ＣＯ２濃度の％はｖ／ｖ％である。
【００４４】
テロペプチド除去コラーゲン
以下の市販される２種のテロペプチド除去コラーゲンを購入して検討に用いた。
・ピュアコラーゲン（ＪＣＮ株式会社）
・アテロコラーゲン（株式会社高研）
なお、ピュアコラーゲンは、３本のポリ（プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシン）からなる３重らせん構造のコラーゲンである。当該ポリペプチドは、プロリン−ヒドロキシプロリン−グリシンの３アミノ酸からなるペプチドを縮合反応させて得られる。また、アテロコラーゲンは、天然由来（抽出物）のコラーゲンを酵素処理してテロペプチドを除去したものであり、本検討にはテロペプチドを除去したサメ（フカヒレ）由来コラーゲンをコハク酸及びミリスチン酸で修飾したミリストイルサクシニルアテロコラーゲン（等電点：４．４）を使用した。当該ミリストイルサクシニルアテロコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとエラストイジンとが約５０％ずつ含まれる、フカヒレアテロコラーゲンＭＳである。
【００４５】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子及び細胞増殖促進遺伝子の発現検討
ＮＨＥＫ細胞（正常ヒト表皮角化細胞；新生児由来）を用いて、テロペプチド除去コラーゲンによりヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ２及びＨＡＳ３）並びに細胞増殖促進遺伝子（ＨＢ−ＥＧＦ）の発現が変化するかを検討した。なお、細胞、培地及び培地関連試薬については、全て市販品を購入して用いた（倉敷紡績株式会社又はシグマアルドリッチ）。
【００４６】
＜増殖培地調製方法＞
３７℃に恒温化したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２培地  ５００ｍＬに同じく恒温化したインスリン  ０．５ｍｌ、ｈＥＧＦ  ０．５ｍｌ、ハイドロコ−チゾル  ０．５ｍｌ、ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）２ｍｌ、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ  ０．５ｍｌ（抗菌剤）を加えた。これを緩やかに混合した後、４℃に保存した。
【００４７】
＜凍結ＮＨＥＫ細胞の解凍及び培地交換方法＞
凍結ＮＨＥＫ細胞の入ったアンプル２本を３７℃の恒温槽で解凍した。解凍後、予め１５ｍｌチューブに分注した４℃のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地  ６ｍｌに細胞溶液を混合した。予め３７℃に恒温化したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地  ３９ｍｌを１３ｍｌずつ３つのフラスコに移した。混合した細胞溶液を接着細胞培養フラスコ（ＳＵＭＩＬＯＮ  ２５０ｍＬ）に２ｍｌずつ移し、細胞が均一になるように混合させてから、しばらく静置した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日以降、細胞密度が８０％コンフルエントになるまで１日１回培地交換を行なった。
【００４８】
＜ＮＨＥＫ細胞の継代培養方法＞
増殖培地を吸引し、３７℃に恒温化したＨＥＰＥＳ緩衝液を５ｍＬ加え、軽く細胞層を洗浄した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を吸引し、０．２５％トリプシン溶液を２ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分静置した。その後、フラスコ底面に接着している細胞をはがした（フラスコの淵を軽く叩き、細胞をはがす）。そこに３７℃に恒温化したトリプシン中和液を４ｍＬ加えてトリプシン酵素の反応を停止させた。細胞懸濁液を５０ｍｌファルコンに回収し、遠心した（ＲＴ、１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。上清を吸引し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地１０ｍｌに混合した後、血球計算盤で細胞数を計測した。その後、接着細胞２４ｗｅｌｌプレートに培地量９５０μＬ、細胞数が１．２×１０５個又は１．５×１０５個になるよう蒔いた（下記検討において、コラーゲンとしてピュアコラーゲンを用いた検討は細胞数１．５×１０５個で行い、コラーゲンとしてアテロコラーゲンを用いた検討は細胞数１．２×１０５個で行った）。翌日、培地交換を行なった。
【００４９】
＜試料添加方法＞
増殖培地を吸引し、ＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地  １ｍｌに混合した検討試料（レチノール及び／又はコラーゲン）を添加し、２４時間培養した。なお、レチノールは１０−６Ｍ又は１０−５Ｍの終濃度となるよう培地に添加した。コラーゲンは、０．１％又は１％の終濃度となるよう培地に添加した。レチノールのみ添加、コラーゲンのみ添加、あるいはレチノール及びコラーゲンを添加した。また、検討試料の代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を培地中で１／１０００に希釈される容量加えたものも同様に２４時間培養した。
【００５０】
＜細胞回収方法＞
Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地を吸引し、ＰＢＳ  １ｍｌで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、ＲＬＴ（細胞溶解液）  ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３ｍｉｎ振盪した。２４ｗｅｌｌプレートの周りをビニールテープで覆い、−８０℃へ保存した。
【００５１】
＜ｃＤＮＡの作製＞
−８０℃から２４ｗｅｌｌプレートを取り出し、恒温槽で解凍した。７０％  ＥｔＯＨ  ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３分振盪した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡサンプルはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ２０００  Ｓｐｅｃｔｒｉｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）でＲＮＡ濃度を測定し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、約５００ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
【００５２】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
Ｐｒｉｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）１０μｌにプライマー、ＲＯＸ  ＤｙｅＩＩとＲＮＡ  Ｆｒｅｅ水を加え、１８μｌの混液を調製し、２μｌ（約５０ｎｇ）のｃＤＮＡサンプルを加えて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ測定サンプルを各プライマーごとに調製した。内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ、ターゲット遺伝子としてＨＡＳ２、ＨＡＳ３、及びＨＢ−ＥＧＦを選択した。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｔａｎｄａｒｄ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ターゲット遺伝子の発現解析（相対定量）を行なった。検量線法による解析結果（ＤＭＳＯ添加時を１としたときの遺伝子発現割合）を図１ａ〜ｃ及び図２ａ〜ｂに示す。なお、ピュアコラーゲンを用いた場合には、ＨＡＳ２については、レチノール終濃度１０−６Ｍ又は１０−５Ｍの培地での検討を行い、ＨＡＳ３及びＨＢ−ＥＧＦについては、レチノール終濃度１０−６Ｍの培地での検討を行った（図１ａ〜ｃ）。アテロコラーゲンを用いた場合には、レチノール終濃度１０−５Ｍの培地でＨＡＳ２及びＨＢ−ＥＧＦ遺伝子について検討を行った（図２ａ〜ｂ：なおレチノールが「Ｒｅ」で示されている部分がある）。
【００５３】
また、図において、＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれ、ＤＭＳＯ添加と比較して有意差が有ることを示す（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。また、図において、棒グラフの上部の＊、＊＊、＊＊＊は、コントロール（ＤＭＳＯ添加）と比べて有意差があることを、横棒上部の＊＊、＊＊＊は、当該横棒の端部に位置するサンプルどうしを比較して有意差があることを、それぞれ示す。なお、ｎ．ｓ．は有意差は見られなかったことを示す。
【００５４】
なお、ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。（Ｆ：はフォワードプライマーを、Ｒ：はリバースプライマーを示す。）
β−ａｃｔｉｎ
Ｆ：ＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣ
Ｒ：ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧ
ＨＡＳ２
Ｆ：ＡＧＴＣＡＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡ
Ｒ：ＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＣ
ＨＡＳ３
Ｆ：ＴＣＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＴＧＧＡＣＴＡ
Ｒ：ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＣＴＣ
ＨＢ−ＥＧＦ
Ｆ：ＧＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＴＡ
Ｒ：ＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧ
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【配列表】
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