(57)【要約】      （修正有）【課題】ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対して抵抗性であるトランスジェニックブタの提供。【解決手段】ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、かつ／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタ。【選択図】図１
2019193660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項２】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項３】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている、請求項１または２に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項４】
ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項５】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項６】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
ブタ卵母細胞を除核することと、
前記卵母細胞を、ドナーブタ線維芽細胞と融合させることであって、前記線維芽細胞のゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む、融合させることと、
前記卵母細胞を活性化して、胚を産生すること。
【請求項７】
胚を代理母ブタの生殖器系に移植することをさらに含む方法によって産生される、請求項６に記載の遺伝子的に改質されたブタであって、前記代理母ブタは発情を開始しているがまだ排卵は完了しておらず、前記胚の妊娠および満期出産により、ゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む遺伝子的に改質されたブタが産生される、ブタ。
【請求項８】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
ブタ卵母細胞を除核することと、
前記卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合することであって、前記線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含むことと、
前記卵母細胞を活性化して胚を産生すること。
【請求項９】
前記胚を代理母ブタの生殖器系に移植することをさらに含む方法によって産生される、請求項８に記載の遺伝子的に改質されたブタであって、前記代理母ブタは発情を開始しているがまだ排卵は完了しておらず、妊娠および満期出産により、ゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含む遺伝子的に改質されたブタが産生される、ブタ。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの対立遺伝子が、部分的または完全な欠失によって不活性化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの対立遺伝子が、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用して不活性化されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１２】
前記ＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子が、エキソン１の一部ならびにエキソン２および３の全部の欠失によって不活性化されている、請求項１、３〜７、１０、および１１のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１３】
前記ＣＤ１６３対立遺伝子が、ＣＤ１６３Ｌのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン８を用いてのエキソン７の置換によって不活性化されている、請求項２〜５および８〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１４】
前記除核は、顕微操作培地においてマイクロピペットを用いて行なわれる、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１５】
前記融合が、融合培地において行なわれる、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１６】
前記卵母細胞の活性化が、チメロサールの存在下において前記卵母細胞をインキュベーションすることを含む、請求項６〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１７】
前記移植が、前記胚を、前記代理母の卵巣采を通して輸卵管へと移植することを含む、請求項７および９〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項１８】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
請求項１、６および７のいずれか一項に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項１、６および７のいずれか一項に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項１９】
前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
請求項２、８および９のいずれか一項に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２、８または９のいずれか一項に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項２０】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
請求項１、６または７に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２、８または９に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタと交配するか、あるいは請求項１、６または７に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２、８または９に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタを特定することと、
前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを、互いに交配して、Ｆ２子孫を産生することと、
前記Ｆ２子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項２１】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
請求項３または１８に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項４または１９に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタと交配するか、あるいは請求項３または１８に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項４または１９に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫を交配して、Ｆ２子孫を産生することと、
前記Ｆ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項２２】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタであって、以下を含む方法によって産生される、ブタ：
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている別の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項２３】
前記スクリーニングが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはサザンブロットを使用することを含む、請求項１８または１９に記載の遺伝子的に改質されたブタ。
【請求項２４】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項２５】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項２６】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項２７】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項２８】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む、方法：
ブタ卵母細胞を除核することと、
前記卵母細胞を、ドナーブタ線維芽細胞と融合させることであって、前記線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含むことと、
前記卵母細胞を活性化して胚を産生すること。
【請求項２９】
前記胚を代理母ブタの生殖器系に移植することをさらに含む、請求項２８に記載の方法であって、前記代理母ブタは発情を開始しているがまだ排卵は完了しておらず、妊娠および満期出産により、ゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む遺伝子的に改質されたブタが産生される、方法。
【請求項３０】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
ブタ卵母細胞を除核することと、
前記卵母細胞を、ドナーブタ線維芽細胞と融合させることであって、前記線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含むことと、
前記卵母細胞を活性化して、胚を産生すること。
【請求項３１】
前記胚を代理母ブタの生殖器系に移植することをさらに含む、請求項３０に記載の方法であって、前記代理母ブタは発情を開始しているがまだ排卵は完了しておらず、そして妊娠および満期出産により、ゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含む遺伝子的に改質されたブタが産生される、方法。
【請求項３２】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
請求項２８または２９に記載の方法によって産生された雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２８または２９に記載の方法によって産生された雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項３３】
ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
請求項３０または３１に記載の方法によって産生された雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項３０または３１に記載の方法によって産生された雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの対立遺伝子が部分的または完全な欠失によって不活性化されている、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの対立遺伝子がＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用して不活性化されている、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子が、エキソン１の一部ならびにエキソン２および３の全部の欠失によって不活性化されている、請求項２８、２９、３２、３４および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＤ１６３対立遺伝子が、ＣＤ１６３Ｌのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン８を用いてのエキソン７の置換によって不活性化されている、請求項３０、３１および３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記除核が、顕微操作培地においてマイクロピペットを用いて行なわれる、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合が融合培地において行なわれる、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記卵母細胞の活性化は、前記卵母細胞をチメロサールの存在下でインキュベーションすることを含む、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記移植が、前記胚を、前記代理母の卵巣采を通して輸卵管へと移植することを含む、請求項２９および３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
請求項１、６または７に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２、８または９に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタと交配するか、あるいは請求項１、６または７に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項２、８または９に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定することと、
前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている前記遺伝子的に改質されたブタを、互いに交配して、Ｆ２子孫を産生することと、
前記Ｆ２子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項４３】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
請求項３または１８に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタを、請求項４または１９に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタと交配するか、あるいは請求項３または１８に記載の雄の遺伝子的に改質されたブタを、請求項４または１９に記載の雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫を交配して、Ｆ２子孫を産生することと、
前記Ｆ２子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項４４】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法であって、以下を含む方法：
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ  １６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている別の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生することと、
前記Ｆ１子孫をスクリーニングして、前記ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子および前記ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている遺伝子的に改質されたブタを特定すること。
【請求項４５】
前記スクリーニングが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはサザンブロットを使用することを含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されている、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項４７】
ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項４８】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【請求項４９】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されており、前記ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、請求項２８〜４５のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子的に改質されたブタの子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、米国農務省によって付与された契約番号（ＵＳＤＡ／ＡＲＳ）５８−１９４０−８−８６８の下で政府の支援により行なわれた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１２年５月１５日に作成された「ＵＭＯ  １１０５３、ＷＯ  ＳＥＱ＿ＳＴ２５」と題された配列表を含み、これはその全体が参照により取り込まれる。
【０００３】
本発明は、一般に、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された、遺伝子的に改質されたブタに関する。このようなトランスジェニックブタを産生するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、ブタの最も経済学的に重要な疾病の１つである。この疾病は初めて米国で１９８７年に（Ｋｅｆｆａｂｅｒ  １９８９）および欧州で１９９０年に（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）検出された。プロトタイプＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＶＲ−２３３２およびレリスタッド（それぞれ、米国および欧州単離株）の分子分析は、多岐に進化した株が、おそらくブタの管理慣行の同じような変化に因り、２つの大陸にほぼ同時に出現したことを示唆した（Ｍｕｒｔａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｎｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。その最初の出現以来、このウイルスは世界中に広がり、そして欧州遺伝子型のＰＲＲＳＶが、米国のブタの群れに検出された（Ｒｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。ＰＲＲＳは重度で時に致命的な呼吸器疾病および生殖不全によって特徴付けられるが、また感染ブタを細菌病原体ならびに他のウイルス病原体へと罹りやすくさせ（Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）、そして経済的に意義のあるブタ呼吸器複合病（ＰＲＤＣ）の重要な成分である。急性感染中にＰＲＲＳＶによって引き起こされる最も一貫した病理学的病変は、間質性肺炎および軽度なリンパ球性脳炎である（Ｐｌａｇｅｍａｎｎ  １９９６）。ウイルス血症および臨床疾病によって典型的に特徴付けられるＰＲＲＳＶ感染の急性期後、多くのブタは完全に回復するが、依然として低いレベルのウイルス感染を長い期間におよび有する。これらの「キャリア」ブタは、持続的にＰＲＲＳＶに感染し、そしてウイルスを断続的にまたは連続的にのいずれかで排出し、そして直接的または間接的な接触後にナイーブなブタを感染し得る。実験条件下で、ＰＲＲＳＶによる持続的感染は、十分に文書化されている（Ａｌｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４、Ａｌｌｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｈｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。最も顕著には感染性ウイルスは感染から１５７日後まで回収されている（Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。組織マクロファージおよび単球は、急性および持続性感染の両方の間における主要な標的細胞であるが（Ｍｏｌｉｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、肺細胞および精巣の上皮胚細胞もまた感染されていることが示された（Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）
【０００５】
ＰＲＲＳの病原体は、アルテリウイルス科、ニドウイルス目のメンバーであるエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。アルテリウイルスの他のメンバーとしては、マウスの乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が挙げられる。ゲノム配列データの分析により、ＰＲＲＳＶの株間に広範な多様性だけでなく、十分に保存されたドメインも判明する（Ａｎｄｒｅｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９７、Ｍｅｎｇ  ２０００、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ＰＲＲＳＶのゲノム構造は、他のアルテリウイルスのゲノム構造と類似し、ゲノムＲＮＡは、ＯＲＦ１ａレプリカーゼタンパク質のためのメッセンジャーＲＮＡとして機能する（Ｐｌａｇｅｍａｎｎ  １９９６）。ＯＲＦ１ａおよび１ｂはウイルスゲノムの約８０％を成し、そしてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼならびに他の非構造タンパク質へとプロセシングされるポリタンパク質をコードする（ＳｎｉｊｄｅｒおよびＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  １９９８）。レリスタッドウイルスを使用して、ＯＲＦ２〜７は、ウイルス構造タンパク質をコードすることが決定された。ＯＲＦ５（ＧＰ５）およびＭによってコードされるタンパク質は（Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂ）、ＰＲＲＳＶによるアポトーシスの誘導において役割を果たし得（Ｓｕａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、そして密接に関連した乳酸脱水素酵素上昇ウイルスにおけるウイルス付着タンパク質であると考えられている。ＰＲＲＳＶの微量エンベロープ糖タンパク質ＧＰ２ａおよびＧＰ４は、ＣＤ１６３と相互作用する（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ＳＩＧＬＥＣ−１（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１）への結合が、細胞への進入に必要であり、そして事実ＳＩＧＬＥＣ−１およびＣＤ１６３の両方への二重の結合が、ウイルス感染にとって必要であるように思われることを示唆するデータがある（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０００６】
ＰＲＲＳＶ病理発生（特に分子レベルで）および動物流行病学の両方の多くの特徴は、あまりよく解明されておらず、したがって、制御する努力を困難としている。より良好な理解を得るために、ＰＲＲＳＶの感染クローンが開発された（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。今日、手順は、しばしば、改質された生弱毒化株または死滅ウイルスワクチンを用いてＰＲＲＳＶに対してブタをワクチン接種する。しかしながら、現在のワクチンは、しばしば、株の変異および免疫系の不適切な刺激の両方に因り、満足な防御を与えない。ブタをＰＲＲＳＶの相同株を用いてチャレンジした場合に、以前の曝露により完全な防御を与えることができたことが実証されているため、防御免疫応答は可能である。（Ｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。しかしながら、防御免疫は、異種株を用いてのチャレンジについては一貫して実証されなかった。利用可能なＰＲＲＳＶワクチンの効力に関する懸念に加えて、現在使用されている改質された生ワクチンは、個々のブタ（ｐｉｇｓ）およびブタ（ｓｗｉｎｅ）の群れにおいて持続することができ、そして突然変異を蓄積でき（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、これはブタの実験的感染後のウイルス性野外単離株を用いて実証されている（Ｒｏｗｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。さらに、ワクチンウイルスは、ワクチン接種された成熟雄の精液に排出されていることが示された（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｈｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。ワクチン接種の代替手段として、幾人かの専門家は、群れの飼育において「試験および除去」の戦略を提唱している（ＤｅｅおよびＭｏｌｉｔｏｒ  １９９８）。この戦略の成功裏の使用は、ＰＲＲＳＶを用いて急性的にまたは持続的にのいずれかで感染させた全てのブタの除去に依存し、その後、ウイルスの再導入を防ぐために厳しくコントロールする。この戦略に関連する困難および多額の費用は、持続的なＰＲＲＳＶ感染の病理発生に関して殆ど知られていないことであり、したがって、持続感染したブタを特定するための信頼できる技術が全くないことである。
【０００７】
ＰＲＲＳＶの推定細胞受容体がモノクローナル抗体によって特定され、精製され、そして配列決定され（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｗｉｓｓｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、そしてＳＩＧＬＥＣ−１と命名されている。この分子はシアロアドヘシンと類似性を有し、そして非感受性細胞へのＰＲＲＳＶの進入を媒介することが示されたが、この受容体を発現している組換え細胞株は、ＰＲＲＳＶの生産的複製を支持することができなかった（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。重要なことには、ＰＲＲＳＶ表面上に存在するシアル酸分子が、肺胞マクロファージの感染にとって必要であることが示された。この受容体へのウイルスの結合後、ＰＲＲＳＶの進入は、受容体により媒介されるエンドサイトーシスによって起こる（Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ＰＲＲＳＶ進入についてのシアロアドヘシンの重要な役割は、ウイルス取り込みが、クローン化ブタシアロアドヘシンを用いてトランスフェクトされたＰＫ１５細胞（ＰＲＲＳＶ複製に対して非許容的な細胞株）において実証されたが、トランスフェクトされていない対照ＰＫ１５細胞においては実証されなかった実験によって確立された（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。この同じグループによるさらなる研究は、ＰＲＲＳＶビリオン表面上のシアル酸とシアロアドヘシン分子との間の相互作用が、肺胞マクロファージのＰＲＲＳＶ感染にとって必須であることを実証した（ＤｅｌｐｕｔｔｅおよびＮａｕｗｙｎｃｋ  ２００４）。逆の戦略、すなわちＰＲＲＳＶの表面上のシアル酸の除去またはシアル酸特異的レクチンとのプレインキュベーションによっても、感染の遮断が認められた（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４、ＤｅｌｐｕｔｔｅおよびＮａｕｗｙｎｃｋ  ２００４、Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂ）。ＰＲＲＳＶ進入に関する特定の研究とは独立的に、部位特異的突然変異誘発を使用して、マウスシアロアドヘシンによるシアル酸結合に必要とされる６個の重要なアミノ酸残基を特定し（Ｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、これはブタシアロアドヘシンと６９％同一である。重要なことには、マウスシアロアドヘシンにおいて特定された６個全てのアミノ酸がまたブタ分子においても保存されている。
【０００８】
ＳＩＧＬＥＣ−１は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチンのファミリーの膜貫通受容体である。それは初めてマウスマクロファージのヒツジ赤血球結合受容体として記載された（ＣｒｏｃｋｅｒおよびＧｏｒｄｏｎ  １９８６）。それは造血組織およびリンパ組織のマクロファージ上に発現されている。ＳＩＧＬＥＣは、シアル酸結合部位を含むＮ末端Ｖセットドメイン、続いて種々の数のＣ２セットドメイン、その後、膜貫通ドメインおよび細胞質側末端からなる。他のＳＩＧＬＥＣとは対照的に、ＳＩＧＬＥＣ−１は細胞質側末端においてチロシンベースのモチーフを有さない（Ｏｅｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。シアル酸結合部位は、Ｎ末端免疫グロブリン様Ｖセットドメインに位置づけられた（Ｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。Ｒ１１６残基は、シアル酸結合にとって重要なアミノ酸の１つであるようである（Ｃｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９、Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。したがって、インタクトなＮ末端ドメインは、ＳＩＧＬＥＣ−１へのＰＲＲＳＶの結合にとって必要かつ十分である（Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ）。マウスにおけるＳＩＧＬＥＣ−１  のノックアウトが報告され、これにより生存可能で生殖可能なマウスが得られ、そして発達上の異常は全く示されなかった（Ｏｅｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。しかしながら、これらのマウスは、Ｂ細胞集団およびＴ細胞集団における僅かな変化、ならびに低下した免疫グロブリンＭレベルを示した。
【０００９】
ＰＲＲＳＶの感染プロセスは、肺胞マクロファージの表面上へのヘパラン硫酸への最初の結合により始まる。その後、シアロアドヘシンに対する確実な結合が起こる（ＳＩＧＬＥＣ−１、ＣＤ１６９またはＳＮとも呼ばれる）。その後、ウイルスは、クラスリンにより媒介されるエンドサイトーシスを介して内部移行する。別の分子であるＣＤ１６３は、その後、エンドソームにおけるウイルスの脱コートを容易にする（Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ）。ウイルスゲノムが放出されそして細胞は感染する。
【００１０】
ＣＤ１６３は１７個のエキソンを有し、そしてタンパク質は９個のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＰＣＲ）ドメインを有する細胞外領域、膜貫通セグメント、および短い細胞質側末端から構成される。いくつかの異なる変異体が、単一の遺伝子の異なるスプライシングにより得られる（Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９ａ、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９ｂ）。この変異の多くは、細胞質側末端の長さによって説明される。  
【００１１】
ＣＤ１６３は、ハプトグロビン−ヘモグロビンスカベンジャー受容体として作用することを含む、多くの重要な機能を有する。ヘム基は非常に毒性がある可能性があるため、血中の遊離ヘモグロビンの除去は、ＣＤ１６３の重要な機能である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。ＣＤ１６３は、エンドサイトーシスを容易にする細胞質側末端を有する。この末端の突然変異により、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の取り込みが減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。Ｃ１６３の他の機能としては、赤芽球接着（ＳＲＣＲ２）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＳＲＣＲ１〜４および６〜９）であること、細菌受容体（ＳＲＣＲ５）であること、アフリカブタウイルス受容体（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００３）であること、および免疫モデュレーターとしての可能性がある役割（（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ）において考察）が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタであり、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタである。
【００１３】
本発明の別の態様は、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化ＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して胚を産生することを含む方法によって産生される、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタである。
【００１４】
本発明はまた、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して胚を産生することを含む方法によって産生される、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタに関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雄の遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングしてＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む方法によって産生された、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタである。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雄の遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雌の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングしてＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む方法によって産生された、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを提供することである。
【００１７】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタに関し、これは３つのいずれかの方法によって産生される。最初のこのような方法は、少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する遺伝子的に改質されたブタを、少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を有する遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されそしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。この方法はさらに、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されそしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを互いに交配して、Ｆ２子孫を産生し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００１８】
第２のこのような方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、Ｆ１子孫を交配してＦ２子孫を産生し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００１９】
第３のこのような方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された別の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２０】
本発明はまた、（１）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されているか、（２）少なくとも、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されているか、（３）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されているか、または（４）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されている、上述のいずれかの遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。ＣＤ１６３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化されたこのような子孫において、不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる。
【００２１】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法に関する。この方法は、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して、胚を産生することを含む。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法である。この方法は、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して、胚を産生することを含む。
【００２３】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法に関する。この方法は、少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する雌の遺伝子的に改質されたブタを、少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２４】
本発明はまた、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ＰＲＲＳＶに結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法に関する。この方法は、少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を有する雌の遺伝子的に改質されたブタを、少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を有する雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法である。この方法は、少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する遺伝子的に改質されたブタを、少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を有する遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。この方法はさらに、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを互いに交配して、Ｆ２子孫を産生し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２６】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するための別の方法に関する。この方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、Ｆ１子孫を交配してＦ２子孫を産生し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２７】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを産生するためのさらに別の方法に関する。この方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された別の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、上のいずれかの方法によって産生された遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。
【００２９】
他の目的および特徴は、一部には明確であり、そして一部には本明細書において以後指摘される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、シアロアドヘシン遺伝子の構成および標的化ベクターの設計を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ヒト（図１Ａ）およびマウス（図１Ｂ）のシアロアドヘシン遺伝子がそれぞれ、２１個のエキソンからなり、そして約２０ｋｂにおよぶことを示す図解である。図１Ｃは、エキソン２のマウス突然変異分析を示す（図１Ｃに示したようなエキソン２のＤＮＡ配列は配列番号７であり、そして図１Ｃに示されるようなエキソン２によってコードされるアミノ酸配列は配列番号８である）。突然変異分析により、リガンドへのシアロアドヘシンの結合に寄与した６個のアミノ酸が判明した（四角で囲んだ／太文字の文字で示される）。図１Ｄは、ＳＩＧＬＥＣ−１のエキソン１の一部ならびにエキソン２および３を、終止コドンを用いて置換するために使用された標的化ベクター設計を示す。ベクターはまた、ＰＧＫプロモーターによって駆動されるネオマイシン（ｎｅｏ）選択カセットを含んでいた。
【図２】図２は、標的化ベクター設計、シアロアドヘシン遺伝子の構成、および変化させたシアロアドヘシン遺伝子の構成を示す。
【図３】図３は、シアロアドヘシン遺伝子の標的化を特定するためのＰＣＲスクリーニングを示すゲルの写真である。
【図４】図４は、野生型および標的化シアロアドヘシン対立遺伝子の両方の等価な存在を特定するためのＰＣＲスクリーニングを示すゲルの写真である。
【図５】図５は、９個の細胞外ＳＲＣＲドメイン、２個のプロリン、セリン、およびトレオニン（ＰＳＴ）リッチドメイン、膜貫通領域および細胞内細胞質側末端を含む、野生型ＣＤ１６３（左）の構造ドメイン構成を示す。遺伝子的に改質されたＣＤ１６３は右に示される。構造ドメイン構成は依然として、ＳＲＣＲドメイン５を、ＣＤ１６３リガンド（ＣＤ１６３Ｌ）のＳＲＣＲドメイン８を用いて置換した以外は同じである。
【図６】図６は、ＣＤ１６３標的化ベクターを示し、ベクターの腕は、天然または野生型ＣＤ１６３と同じ配列を有するＤＮＡの区分であり、よってベクターは、細胞にすでに存在するＣＤ１６３にアニーリングすることができる。ＣＤ１６３の２つの腕の間に横たわる改質されたＤＮＡは、その後、相同的組換えによって細胞のＤＮＡに挿入されることができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
「ノックアウトブタ」は、遺伝子の一方または両方の対立遺伝子の機能が、例えば、部分的または完全な遺伝子の欠失によって変化された、遺伝子的に改質されたブタである。遺伝子の一方の対立遺伝子がノックアウトされていれば、ブタは、その遺伝子ノックアウトに関してヘテロ接合性であり、もし両方の対立遺伝子がノックアウトされていれば、ブタは遺伝子ノックアウトに対してホモ接合性である。
【００３２】
「ドナー細胞」という用語は、核への移植に使用するために核またはクロマチン材料を得た細胞を指す。本明細書の他の箇所で考察するように、核への移植は、ドナー細胞から単離されたような核またはクロマチンのみの移植、あるいはこのような核またはクロマチン材料を含む全ドナー細胞の移植を含み得る。
【００３３】
「遺伝子的改質」という用語は、遺伝子の発現または活性を変化させる、遺伝子配列（コード配列および非コード配列、例えばイントロン、プロモーター配列、ならびに５’および３’非翻訳配列などを含む）における１つ以上の変化を指す。このような改質としては、例えば、挿入（例えば、異種配列、例えば選択マーカー、および／または終結シグナルの）、欠失、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、点突然変異、またはその組合せが挙げられる。
【００３４】
「レシピエント細胞」という用語は、ドナー細胞、ドナー細胞核、またはドナー細胞クロマチンが導入された細胞を指す。レシピエント細胞は、核への移植前に適切に除核されている。レシピエント細胞の例としては、卵母細胞、接合体、および２細胞期胚の細胞が挙げられる。
【００３５】
「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、タンパク質発現と特異的に干渉する能力を有する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡは、一般的に、約１０から約３０ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ分子の長さは、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖の長さに基づく。
【００３６】
好適な実施形態の説明
本発明は、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による感染に抵抗性である遺伝子的に改質されたブタに関する。ＰＲＲＳＶへの感染性は、３つの特定の進入メディエーターから生じる：（１）最初のヘパラン硫酸との結合、（２）シアロアドヘシン（ＳＩＧＬＥＣ−１）による結合／内部移行、および（３）ＣＤ１６３によるウイルスの内部移行／脱コート。したがって、ＰＲＲＳＶとＳＩＧＬＥＣ−１および／またはＰＲＲＳＶとＣＤ１６３との相互作用の防御により、ＰＲＲＳＶは、宿主において感染を確立できなくなる。したがって、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタに関する。これらのブタはまた、ＳＩＧＬＥＣ−１および／またはＣＤ１６３についてのブタノックアウトとも呼ばれ得る。
【００３７】
本発明は、標的化遺伝子（ＳＩＧＬＥＣ−１および／またはＣＤ１６３）の唯一つの対立遺伝子が不活性化され、他方の対立遺伝子は依然として影響を受けていない、ブタを含む。これらの動物は、本明細書において「ヘテロ接合性」または「ヘミ接合性」動物と呼ばれるが、これらを繁殖アプローチに使用してホモ接合性突然変異体を生成することができる。また本発明には、ホモ接合性突然変異ブタも含まれ、標的化遺伝子の両方の対立遺伝子が同じまたは異なるアプローチのいずれかによって不活性化されている。したがって、本発明は、（１）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方の対立遺伝子が不活性化されているか、（２）ＣＤ１６３遺伝子の一方の対立遺伝子が不活性化されているか、（３）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されているか、（４）ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されているか、（５）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の一方の対立遺伝子が不活性化されているか、（６）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されているか、（７）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の一方の対立遺伝子が不活性化されているか、または（８）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された、遺伝子的に改質されたブタを含む。これらの各々の場合および本出願の内容において一般的にＣＤ１６３対立遺伝子（複数を含む）の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる。
【００３８】
本発明の動物を作製するために行なわれた遺伝子標的化により、標的遺伝子配列の破壊、除去、改質、または置換による遺伝子の不活性化が行なわれ得る。遺伝子の不活性化のための方法は当技術分野において周知である。例えば、標的遺伝子を、標的遺伝子への異種配列（例えば選択マーカーおよび／または終止コドン）の挿入、遺伝子の一部または全遺伝子の欠失、遺伝子の改質（例えばフレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、点突然変異、一部または全部の遺伝子を別の核酸配列を用いて置換することにより）、または上のいずれかの組合せによって不活性化させることができる。
【００３９】
挿入配列は、標的化構築物の設計に応じて、遺伝子中の以前に存在していた配列を置換することができるか、またはこのような配列に付け加えることができる。標的化構築物の設計は、遺伝子の機能を完全にノックアウトすることが望ましいか、またはいくらか低下したレベルの機能を維持することが望ましいかに応じて、変化させることができる。ＳＩＧＬＥＣ−１の場合、機能の完全なノックアウトが望ましい。例としてであって、制限するものではないが、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子は、エキソン１の一部ならびにエキソン２および３の全部の欠失によって、例えば、エキソン１の一部ならびにエキソン２および３の全部をネオマイシン選択カセットを用いて置換することによってノックアウトさせることができる。いくつかの実施形態において、改質はまた、突然変異しようとするＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の配列のいずれかの側へのＬｏｘＰ部位の付加を含み得る。いくつかの場合では、標的化構築物は、挿入しようとする配列に隣接するｌｏｘＰ部位およびＣＲＥリコンビナーゼの両方を含み得る。他の場合では、２ベクター（ｔｗｏ−ｖｅｃｔｏｒ）システムを使用することができ、標的化構築物は挿入しようとする配列に隣接するｌｏｘＰ部位を含み、そして第２ベクターはＣＲＥリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む。ＣＲＥリコンビナーゼのための導入遺伝子は、組織特異的プロモーターの影響下に配置することができ、したがって、その発現によって、特異的細胞系統においてＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子は機能しなくなる。同様に、抗生物質選択カセットは、ｌｏｘＰ部位に隣接させることができ、よってＣｒｅリコンビナーゼを使用してより後の段階で欠失させることができる。
【００４０】
ＣＤ１６３の場合、ＣＤ１６３の他の機能に最小限の影響を及ぼすかまたは影響を及ぼさずに、ＰＲＲＳＶの結合および／またはその脱コートに関連したその機能だけを不活性化することが望ましい。任意の特定の理論に固めたくはないが、完全なＣＤ１６３のノックアウトは、生存不可能である可能性があるか、またはヘモグロビン−ハプトグロビン複合体の結合および内部移行におけるＣＤ１６３の役割に因り深刻に感染の危険にさらされ得ると考えられる。したがって、ＰＲＲＳＶ感染において主要な役割を果たしていることが以前に示された（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）ＣＤ１６３の第５のＮ末端スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを破壊し、他のドメインに影響を与えないままにしておくことによって、ＣＤ１６３を不活性化させることができる。ＳＲＣＲドメイン５は、例えば、このドメインの構造を変化させる点突然変異を導入することによって、またはこのドメインを別のドメインと交換することによって、遺伝子的に改質させることができる。例えば、ＳＲＣＲドメイン５を、ＣＤ１６３リガンド（ＣＤ１６３Ｌ）由来のＳＲＣＲドメイン８と置換することができる。なぜなら、このドメイン「交換」は、培養細胞において相対的なＰＲＲＳＶ感染性を０％まで低下させることが示されているからである。
【００４１】
他のアプローチにおいて、標的遺伝子のコード配列は、変化させないか、または最小限に変化させ、そしてむしろ、標的遺伝子の配列に影響を及ぼす配列、例えばプロモーター配列に標的化する。いずれの場合においても、選択マーカー挿入は、標的化が起こった細胞の特定を容易にするためにしばしば望ましい。所望される場合、このようなマーカーまたは他の挿入配列は、後に、例えばＣｒｅ−Ｌｏｘまたは類似の系によって除去することができる。
【００４２】
標的化遺伝子改質は、標的遺伝子（例えばＳＩＧＬＥＣ−１またはＣＤ１６３）と、または標的遺伝子の隣接領域と相同性の領域を有する核酸構築物を使用し、よって、ゲノムへの構築物の組込みは、遺伝子の配列を変化させることによって、および／または遺伝子の発現レベルを変化させることによってのいずれかによって、遺伝子の発現を変化させる。したがって、遺伝子を変化させるために、標的構築物は、一般に、３つの主な領域を含むように設計されている：（ｉ）標的化しようとする遺伝子座（例えばＳＩＧＬＥＣ−１またはＣＤ１６３遺伝子、またはその隣接配列）に相同である第１領域、（ｉｉ）標的化遺伝子座の一部を特異的に置換する、または標的遺伝子座に挿入される、（例えば選択マーカー、例えば抗生物質耐性タンパク質をコードする）異種ポリヌクレオチド配列である第２領域、および（ｉｉｉ）第１領域のように、標的遺伝子座と相同であるが、典型的には構築物の第１領域と連続的ではない、第３領域。標的構築物と標的野生型遺伝子座との間の相同的組換えにより、標的ベクター中に示される２つの相同領域間の任意の遺伝子座配列の欠失、および、異種配列（例えば選択マーカーをコードする異種配列）を用いてのその配列の置換、またはその配列への異種配列の挿入が起こる。このような標的化改質を実施するための例示的構築物およびベクターは、実施例１に記載されている、しかしながら、このようなアプローチに使用され得る他のベクターは当技術分野において公知であり、そして本発明における使用のために容易に適応させることができる。
【００４３】
相同的組換えを容易にするために、標的化ベクターの第１および第３領域（上を参照）は、標的化しようとする遺伝子（または隣接領域）に対して実質的な配列同一性を示す配列を含む。例えば、標的化ベクターの第１および第３領域は、標的化遺伝子または隣接領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である配列を有し得る。配列同一性は、典型的には、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）またはＢＬＡＳＴ（登録商標）２を使用してそこに明記されたデフォールトパラメーターを用いて（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０，１９９９）測定される。したがって、標的化遺伝子座に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはさらには約１００％の配列同一性を有する配列を、本発明において使用して、相同的組換えを容易にすることができる。
【００４４】
２つの相同性領域の全サイズは（すなわち、上述の第１および第３領域）は、例えば、約２キロベース（ｋｂ）から約２５ｋｂ（例えば約４ｋｂから約２０ｋｂ、約５ｋｂから約１５ｋｂ、または約６ｋｂから約１０ｋｂ）であり得る。標的化遺伝子座の一部を置換するか、または標的遺伝子座に挿入される領域のサイズは（上述のような第２領域）、例えば、約０．５ｋｂから約５ｋｂであり得る（例えば約１ｋｂから約４ｋｂまたは約３から約４ｋｂ）。
【００４５】
種々のタイプの標的化構築物送達法を使用することができる。リン酸カルシウム、リポフェクション、電気穿孔法および核への注入を含む、細胞トランスフェクション法を使用して、標的化構築物を送達することができる。遺伝子が、使用する細胞型において転写的に活性であるならば、その後、プロモーターを含まない選択マーカー戦略を使用することができ、よって転写単位による組換え事象を行なった細胞においてのみ抗生物質耐性が認められる。あるいは、遺伝子が、使用される細胞型において転写的に不活性であるならば、誘導性である、組織特異的であるまたはマトリックス結合領域（ＭＡＲ）などのインスレーターを含むプロモーターを使用することができる。
【００４６】
あるいは、ｓｉＲＮＡ技術を使用して、ＳＩＧＬＥＣ−１の転写物を「サイレンス」させることができる。アンチセンス技術は、当技術分野において周知である。簡潔に言えば、ＳＩＧＬＥＣ−１のセンスｍＲＮＡ配列に対して相補的である約１９から約２９ヌクレオチドを一般的に含むヌクレオチド配列を使用する。相補性の程度は、一般的に、約７０％から約１００％の範囲である。好ましくは、相補性は約８０％を超え、より好ましくは約９０％を超え、そしてさらにより好ましくは約９５％を超える。ｓｉＲＮＡを用いての標的化に適したＳＩＧＬＥＣ−１  ｍＲＮＡの領域は、ＳＩＧＬＥＣ−１タンパク質の産生を防ぐためにＳＩＧＬＥＣ−１  ｍＲＮＡの種々の領域に対して相補性であるように設計されたいくつかのアンチセンス配列の効力を比較することによって容易に決定することができる。このような実験は、当技術分野において公知の技術のいずれかによって過度な実験を行なうことなく容易に実施することができる。
【００４７】
ｓｉＲＮＡ発現のために使用されるベクターは、当技術分野において周知である。ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれるか、またはエピソーム形態で維持されるかのいずれかである、任意の環状または線形長のＤＮＡであり得る。一般的に、ｓｉＲＮＡ発現カセットは、ＤＮＡ導入ベクター、例えばプラスミド、またはレンチウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルスまたは他のウイルスベクターにライゲーションされ得る。例示的な哺乳動物ウイルスベクター系としては、アデノウイルスベクター、１型アデノ随伴（「ＡＡＶ−１」）または２型アデノ随伴（「ＡＡＶ−２」）ウイルスベクター、デルタ型肝炎ベクター、生弱毒化デルタウイルス、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）が挙げられる。
【００４８】
哺乳動物細胞の形質転換は、当技術分野において公知の標準的な技術に従って実施することができる。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順のいずれかを、少なくともｓｉＲＮＡ構築物を宿主細胞に成功裏に導入する限りにおいて使用することができる。これらの手順は、ウイルス形質導入（例えば、場合により感染効率を増強するためのポリブレンの存在下において、前の段落において列挙されたウイルスベクターのいずれかの使用による、例えばレトロウイルス感染による）、リン酸カルシウムトランスフェクション、電気穿孔法、微粒子銃粒子送達システム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（すなわち遺伝子銃）、リポソーム、マイクロインジェクション、およびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞に導入するための他の公知の方法のいずれかの使用が挙げられる。本発明において、ＳＩＧＬＥＣ−１に対して指向されるｓｉＲＮＡは、ドナーブタ線維芽細胞に導入され、これは続いて本発明のトランスジェニック的に改質されたブタを産生するために使用される。
【００４９】
本発明のトランスジェニック動物は、以下の一般的な体細胞核移植手順を使用して作製され得る。簡潔に言うと、ブタ体細胞（例えば胎児線維芽細胞）のゲノムを、上述のような遺伝子標的化によって遺伝子的に改質して、ドナー細胞を作る。このような遺伝子的に改質されたドナー細胞の核（または核を含む全ドナー細胞）をその後、レシピエント細胞に、例えば除核した卵母細胞に移植する。ドナー細胞を除核された卵母細胞と融合させることができるか、またはドナー核もしくはドナー細胞自体をレシピエント細胞に注入することができるか、または卵母細胞膜に隣接する囲卵腔に注入することができる。
【００５０】
したがって、標的遺伝子が標的化された（上記したような一方または両方の対立遺伝子）体細胞を得ると、核の移植を実施することができる。場合により、遺伝子的に改質されたドナー細胞を、核移植前に凍結保存することができる。使用することのできるレシピエント細胞としては、卵母細胞、受精した接合体、または２細胞期胚の細胞が挙げられ、それらは全て除核されていてもされていなくてもよい。
【００５１】
レシピエント卵母細胞は、当技術分野において公知の方法を使用して得ることができるか、または商業的供給源（例えばＢｏＭｅｄ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）から購入することができる。卵母細胞は、子孫を持ったことがない雌ブタである「雌ブタ（ｇｉｌｔ）」）または以前に子孫を産生したことがある雌ブタである「雌ブタ（ｓｏｗ）」から得ることができる。
【００５２】
従って、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して、胚を産生することによって産生することができる。同様に、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタは、ブタ卵母細胞を除核すること、卵母細胞をドナーブタ線維芽細胞と融合させること（この線維芽細胞のゲノムは少なくとも１つの不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を含む）、そして卵母細胞を活性化して、胚を産生することによって産生することができる。両方の方法はさらに、胚を代理母ブタの生殖器系に移植し、代理母ブタは発情を開始しているがまだ排卵は完了しておらず、そして胚の妊娠および満期出産により、ゲノムが少なくとも１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１および／またはＣＤ１６３対立遺伝子を含む遺伝子的に改質されたブタが産生されることを含む。本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、このような遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。
【００５３】
ブタ卵母細胞を除核するための方法は当技術分野において公知であり、そして除核は、標準的な方法のいずれかによって達成することができる。例えば、卵母細胞の除核は、顕微操作培地においてマイクロピペットを用いて行なうことができる。
【００５４】
ドナーブタ細胞の膜に結合した核を、除核されたレシピエントブタ卵母細胞へと導入して、ドナー核を含む卵母細胞を形成することは、ドナー哺乳動物細胞の膜に結合した核の膜を、除核されたレシピエント哺乳動物卵母細胞の膜と一緒に融合して、ドナー哺乳動物細胞からの核を含む卵母細胞を形成することによって実施することができる。あるいは、このような導入は、哺乳動物ドナー細胞の膜に結合した核を、除核されたレシピエント哺乳動物卵母細胞へとマイクロインジェクションして、ドナー哺乳動物細胞の核を含む卵母細胞を形成することによって実施することができる。例えば、ドナー細胞（または核）を、除核されたレシピエント卵母細胞の透明帯下の空間にまたは囲卵腔に導入して、続いて膜融合を実施して、その細胞質内にドナー核を含む卵母細胞を産生することができる。当業者には公知である除核されたレシピエント哺乳動物卵母細胞にドナー核材料を導入する全ての手段が、本明細書において開示された方法において有用である。
【００５５】
例えば、融合工程は、融合培地中で行なうことができる。あるいは、不活性化ウイルスまたは膜融合誘導剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して融合を促進することができる。例えば、ウイルスの使用についてはＧｒａｈａｍ（１９６９）Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．９：１９−３３、およびＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２０：１３００−１３０２、化学的に誘導された細胞融合についてはＦｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｔｅｃｈ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１：１−３６、および電気的に誘導された細胞融合についてはＢｅｒｇ（１９８２）Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．９：２２３−２２８、およびＲｏｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６４：６４２−６４７を参照されたい。
【００５６】
米国特許第６，２１１，４２９Ｂ１号（その内容は参照により本明細書に取り込まれる）は、インビトロおよびインビボにおける活性化卵母細胞の発達のための方法を記載する。「活性化された」または「活性化」という用語は、卵母細胞改質剤および還元剤を用いて処理した後に、少なくとも前核段階またはそれを超えて発達する未受精卵母細胞の能力を指す。一般的に言えば、前核段階は、このような処理の約３から７時間後に達成される。「卵母細胞改質剤」という用語は、卵母細胞上または卵母細胞中の基質、例えばチオール（−ＳＨ）基（これはタンパク質のチオール基であり得る）と反応することのできる薬剤を指し、この反応の効果により、続いて卵母細胞を、米国特許第６，２１１，４２９Ｂ１号に開示された方法に従って還元剤を用いて処理する場合に、哺乳動物卵母細胞の活性化が起こる。
【００５７】
−ＳＨまたは卵母細胞改質剤（例えばチメロサール）と、−ＳＨ還元剤（例えばジチオトレイトール）の組合せ使用は、哺乳動物卵母細胞の完全な活性化を誘導することができる。ＤＴＴなどの還元剤を用いての処理の前に、チメロサールを用いての短い処理と、ただ１つのカルシウム透過剤を合わせることは、活性化を達成する上で特に効果的である。チメロサールは哺乳動物卵母細胞において一連のＣａ２＋スパイクをトリガーし、続いて、ＤＴＴなどの還元剤とのインキュベーションを行うと、前核形成を刺激することができる。従って、チメロサールを洗浄除去した後、その後、ＤＴＴを加えてチメロサールの作用を逆行させ、それを洗浄除去して、胚が発達を続けることを可能とする。チメロサール／ＤＴＴの組合せ処理はまた、表層粒エキソサイトーシス、その後の透明帯の硬化、および活性化卵母細胞の胚盤胞段階への発達を誘導する。
【００５８】
チメロサールに加えて、他の卵母細胞改質剤、例えばｔ−ブチルヒドロペルオキシド、チオ尿素、フェニレフリン、Ｎ−アルキルマレイミド（例えばＮ−エチルマレイミド）、酸化グルタチオン、α−ハロ酸（例えばヨード酢酸、クロロアセテート、およびブロモアセテート）、ヨードアセトアミド、ｐ−水銀安息香酸、ｐ−クロロ第２水銀安息香酸、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、（２−トリメチルアンモニウム）エチルメタンチオスルホネート（ＭＴＳＥＴ）、および（２−スルホナトエチル）メタンチオスルホネート（ＭＴＳＥＳ）も使用することができる。有用な還元剤、例えばチオール（−ＳＨ）基還元剤としては、ＤＴＴに加えて、限定されないが、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール、システイン、還元グルタチオン、還元チオ尿素、チオグリコレート、およびアスコルビン酸が挙げられる。
【００５９】
卵母細胞を卵母細胞改質剤と接触させる期間は、続いて還元剤を用いて処理した場合に、卵母細胞の活性化をもたらすに効果的な期間である。このような期間は、約５分間から約２０分間、好ましくは約５分間から約１５分間、またはより好ましくは約５分間から約１２分間の範囲であり得る。卵母細胞を還元剤と接触させる期間は、適切には、卵母細胞改質剤を用いての処理を先に行なった場合に、卵母細胞の活性化をもたらすのに十分な長さである。このような期間は、約５分間から約１時間、好ましくは約１０分間から約４５分間、より好ましくは約２０分間から約４０分間の範囲、さらにより好ましくは約３０分間であり得る。
【００６０】
卵母細胞改質剤と接触させた後に除核卵母細胞を還元剤と接触させることは、実質的に直ちに行なわれ得るか、または卵母細胞改質剤への卵母細胞の曝露後約５秒間から約５分間の範囲の時間内に行なわれ得る。卵母細胞改質剤で処理された卵母細胞を、中間の洗浄工程を行なうことなく、還元剤を含む培地に移すことができる。あるいは、卵母細胞改質剤で処理された卵母細胞を、対照培地または還元剤を含む培地中で洗浄して、還元剤を含む培地中で卵母細胞を培養する前に卵母細胞改質剤を実質的に除去することができる。別の代替手段として、還元剤を直接的に卵母細胞に加えることができ、これは後者（卵母細胞）が依然として卵母細胞改質剤を含む培地中に存在している間に行われ得る。
【００６１】
あるいは、卵母細胞の活性化はまた、カルシウムを含まない多くの他の化学的処理、例えばプロテインキナーゼ阻害（Ｍａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５３：２７０−２７５）またはタンパク質合成阻害（Ｎｕｓｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４１：７０−７５）を用いて達成することもできる。
【００６２】
活性化後、卵母細胞は、典型的には、インビトロで短い期間で培養される。得られた胚は、その後、代理雌に移植され、そして胚の発達は代理母において進行する。例えば、胚を約１週間かけて培養することができ、そしてその後、代理母の生殖器系に手術的にまたは非手術的に移植することができる。胚を、代理母の卵巣采を通して輸卵管へと移植することができる。あるいは、胚を、輸卵管の壁を貫通するカテーテルを使用することによって代理母の輸卵管へと移植することができる。胚を移植する別の方法は、胚盤胞段階までそれらを培養し、続いて代理母ブタの生殖器系に導入することを含む。これらの方法は当技術分野において周知であり、そして本発明の遺伝子的に改質されたブタの産生に容易に適用することができる。
【００６３】
遺伝子的に改質されたブタおよび他の大型動物を作製するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、そしてまた、本発明においても使用することができる（例えば、米国特許第２００５／０１２０４００  Ａｌ号、米国特許第５，９９５，５７７号、国際公開第９５／１６６７０号、国際公開第９６／０７７３２号、国際公開第９７／００６６９号、国際公開第９７  ００６６８号、国際公開第２００５／１０４８３５号、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１：８２，２００３、Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１５：７３９−７５０，２００６、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ７５：２２６−２３０，２００６、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４（４）：４３５−４３６，２００６、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５４（２）：１４９−１６３，２００４、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ５（４）：２３３−２４１，２００３、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｉｍａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（２）：１７３−１８１，２００１、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１０８９−１０９２，２００２、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ６５：１６８１−１６８５，２００１参照、その各々の内容は参照により本明細書に取り込まれる）。
【００６４】
遺伝子的に改質されたブタを産生するための他の実行可能な方法としては、ヌクレアーゼ（対象の遺伝子を標的化するであろうジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴａｌヌクレアーゼ）を体細胞に注入または形質導入し、その後、体細胞核移植および代理母への胚の移植を行なうことを含む。さらに、精子または細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）により媒介される遺伝子改質も使用することができる。簡潔に言えば、ＩＣＳＩにより媒介される改質において、標的化構築物を精子と混合し、そして両方を卵母細胞に注入する。精子により媒介される改質において、構築物を精子と混合し、そして体外受精（ＩＶＦ）または精子注入を使用して代理母を妊娠させる。当業者は容易にこれらの方法を本発明のノックアウトブタの産生へと調整することができる。マウスについて開発されているように、ブタのためには完全に開発されてはいないが、胚幹細胞技術または人工多能性細胞は、遺伝子的に改質され得、そして体細胞核移植のためのまたはキメラ動物の産生のためのいずれかのドナー細胞として使用され得る。
【００６５】
上述したように、本発明はまた、（１）ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化され、（２）ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化されて、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じるか、または（３）ＳＩＧＬＥＣ−１の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３の両方の対立遺伝子が不活性化された、遺伝子的に改質されたブタに関する。遺伝子不活性化についてホモ接合性である遺伝子的に改質されたブタは、遺伝子活性化についてヘテロ接合性であるブタを交配し、そして子孫をスクリーニングして、遺伝子（複数を含む）の不活性化についてホモ接合性である動物を特定することによって産生することができる。本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３対立遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、このような遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。
【００６６】
従って、本発明は、ＳＩＧＬＥＣ−１の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雌の遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することによって、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法に関する。同様に、本発明は、ＣＤ１６３の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雌の遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された雄の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することによって、ＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法に関する。
【００６７】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法を提供する。１つのこのような方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、Ｆ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されそしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定し、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化されそしてＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを互いに交配して、Ｆ２子孫を産生し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００６８】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子および／またはＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための方法は、前述の章に開示されている。子孫のスクリーニングは、当技術分野において標準的であるように、例えばＰＣＲまたはサザンブロットを使用することによって実施され得る。
【００６９】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するための別の方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１不活性化についてホモ接合性である遺伝子的に改質されたブタを、ＣＤ１６３不活性化についてホモ接合性である遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、Ｆ１子孫を交配してＦ２子孫を生成し、そしてＦ２子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１およびＣＤ１６３の両方の不活性化についてホモ接合性である動物を特定することを含む。
【００７０】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを産生するためのさらに別の方法は、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が不活性化された別の遺伝子的に改質されたブタと交配して、Ｆ１子孫を産生し、そしてＦ１子孫をスクリーニングして、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の両方の対立遺伝子およびＣＤ１６３遺伝子の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタを特定することを含む。
【００７１】
本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、上のいずれかの方法によって産生された遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。
【００７２】
ヘテロ接合性動物を含む繁殖アプローチによって得ることができることに加えて、ホモ接合性突然変異動物はまた、上で要約した方法を使用して産生された動物から得られた細胞などの、１つの対立遺伝子に１つの突然変異を含む細胞（例えば胎児線維芽細胞）を、相同的組換えによって遺伝子標的化にかけて、残りの対立遺伝子の改質を達成するアプローチを使用して得ることもできる。その後、得られたドナー細胞は、除核卵母細胞などのレシピエント細胞への核移植のための改質された核の源として使用することができ、これによりホモ接合性突然変異胚が形成され、これを代理雌に移植すると、ホモ接合性突然変異動物へと発達する。ＳＩＧＬＥＣ−１および／またはｃＤ１６３遺伝子（複数を含む）の両方の対立遺伝子が不活性化された遺伝子的に改質されたブタはまた、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴａｌヌクレアーゼ（遺伝子の両方の対立遺伝子に同時に標的化することができる）を体細胞に注入または形質導入し、その後、代理母への体細胞核移植（ＳＣＮＴ）または胚移植を行ない、このようなブタを産生することによって産生することができる。本発明はまた、ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、そして／またはＣＤ１６３遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が不活性化され、ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、このような遺伝子的に改質されたブタの子孫に関する。  
【００７３】
本発明を詳細に記載したが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく修正および変更が可能である。
【００７４】
実施例
以下の非制限的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【実施例１】
【００７５】
ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の改質
シアロアドヘシン遺伝子を切除するために使用されたアプローチは、タンパク質をコードするエキソンを除去し、そしてシアロアドヘシン遺伝子の残りのコード配列に中途終止を導入するために相同的組換えを使用した。ブタシアロアドヘシン遺伝子（ＳＩＧＬＥＣ−１、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＭ＿２１４３４６）は、５，１９３塩基のｍＲＮＡ転写物からの２１０ｋＤａのタンパク質をコードする（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。シアロアドヘシン遺伝子周辺の領域からのブタゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＵ４６７６０９）を使用して、オリゴヌクレオチドを生成して、標的化構築物の生成のために高忠実度ＰＣＲ［ＡｃｃｕＴａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］によってゲノム断片を増幅した。１つの断片（「上腕」）は、第１コードエキソンおよび翻訳開始から３３０４ｂｐ上流を含んでいた。第２（「下腕」）断片は、４７５３ｂｐ長であり、そして第３コードエキソンの下流のイントロンの大部分を含み、そして第６イントロンまで及んでいた（第４、第５および第６コードエキソンを含む）。マウスおよびヒトシアロアドヘシンゲノム配列との比較に基づいて、ブタシアロアドヘシン遺伝子は、２１個のエキソンから構成されると予測された（図１Ａ、図１Ｂ）。エキソン２は、ブタ、マウスおよびヒトの間で保存されている。エキソン２のアミノ酸アラインメントにより、シアル酸結合活性と関連していることが知られるマウスシアロアドヘシンにおける６個のアミノ酸が、ブタシアロアドヘシンにおいて保存されていたことが判明した（図１Ｃ）。最初の標的化戦略は、シアロアドヘシン遺伝子に変化を作ることに焦点を当て、よって、突然変異遺伝子からは機能的タンパク質が得られることは全く期待されなかった。他の不活性化戦略は、シアロアドヘシン遺伝子のエキソン２において選択された残基の標的化改質、またはＰＲＲＳウイルス結合を妨げると予測されるように免疫グロブリンドメインを変化（おそらく、その順序を変化させることによって、またはそれらを、他の種の同等なドメインで置換することによって）することを含み得る。さらなる改質は、ネオマイシンカセットまたは免疫グロブリン様ドメインの１つを、ｌｏｘＰ部位と隣接させて、所望される場合には誘導性または組織特異性除去を可能とすることを含み得る。
【００７６】
現在の遺伝子破壊において、エキソン１の一部ならびにエキソン２および３の全部を、ネオマイシン選択カセットを用いて、置換型ベクター（図１Ｄ）（Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）を使用することによって置換した。プラスミド構築物において、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを使用して、ネオマイシンカセットの発現を駆動して、トランスフェクトされたコロニーの陽性選択を可能とした。
【００７７】
ドナー細胞調製
妊娠３５日目の雄の胎児線維芽初代細胞株を、大型市販白ブタ（Ｌａｎｄｒａｃｅ）から単離した。細胞を培養し、そして５ｍＭグルタミン、重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１ｇ／Ｌのｄ−グルコースを含み、そして１５％Ｈｙｃｌｏｎｅウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、および２．５ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（Ｓｉｇｍａ）の補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間かけて８０％コンフルエンスとなるまで増殖させた。培地を除去し、そしてトランスフェクションの４時間前に新しい培地と交換した。線維芽細胞を、１０ｍｉｓのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて洗浄し、そして１ｍｌの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて７５ｃｍ２のフラスコから取り出した。細胞をＤＭＥＭに再懸濁し、そして６００×ｇで１０分間かけての遠心分離によって収集した。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて洗浄し、そして再度６００×ｇで１０分間かけて遠心分離にかけた。サイトソルト（Ｃｙｔｏｓａｌｔｓ）（７５％サイトソルト［１２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］）および２５％Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍを使用してペレットを懸濁した（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。細胞を血球計を用いて計測し、そして１×１０６個の細胞／ｍｌに調整した。
細胞の電気穿孔を、１×１０６個の細胞／ｍｌを含む２００μｌのトランスフェクション培地中において、４μｇの一本鎖標的化ＤＮＡ（熱変性によって達成）を用いて実施した。細胞を、２５０Ｖの３回の１ｍ秒パルスを使用することによって、ＢＴＸ  ＥＣＭ２００１エレクトロセルマニュピュレーターにおいて電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、１３ｃｍプレートあたり１０，０００個の細胞でＤＭＥＭ／ＦＢＳ／ＦＧＦに希釈した。電気穿孔した細胞を選択圧力なしでで一晩かけて培養した。翌日、培地を、Ｇ４１８（０．６ｍｇ／ｍｌ）を含む培養培地と交換した。１０日間の選択後、Ｇ４１８耐性コロニーを単離し、そして増殖のために２４ウェルプレートに移した。２４ウェルプレートにおいて増殖させた後、細胞を６ウェルプレートに分割した（約半分をゲノムＤＮＡ単離のために使用した）。ＰＣＲを使用して、シアロアドヘシン遺伝子の標的化が成功したかどうかを決定した。反応は、ホスホグルコキナーゼ（ＰＧＫ）カセット（Ｎｅｏを含む）にアニーリングするオリゴヌクレオチドを使用し、標的化腕の領域を超えたシアロアドヘシン遺伝子座にあるゲノムＤＮＡにアニーリングするものとあわせて使用した（図２参照）。両方の「腕」の成功裏な標的化をこのように評価した。標的化された線維芽細胞クローン（４〜１８）を特定し、そして培養液中の細胞のいくつかを、核移植のために使用し（以下参照）、他方はさらなる使用のために凍結した。相同的組換えのサザンブロットによる確認を使用して、成功裏な標的化のさらなる確認が提供された。
【００７８】
卵母細胞の収集およびインビトロでの成熟（ＩＶＭ）
ブタ卵母細胞をＡＲＴ  Ｉｎｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、そして製造業者の指示に従って成熟させた。インビトロで４２〜４４時間成熟させた後、卵母細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのヒアロニダーゼ中で穏やかにボルテックスをかけることによって、その卵丘細胞から剥がした。卵丘細胞の除去後、良好な形態および眼に見える極体（中期ＩＩ）を有する卵母細胞を選択し、そして核移植まで３８．５℃で顕微操作培地中に保持した。
【００７９】
体細胞核移植、核移植複合体卵母細胞の融合／活性化、およびインビトロでの発達培養
顕微鏡下で、卵丘を含まない卵母細胞を、７．５μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを補充されそして鉱油で覆われた顕微操作培地の液滴中でホールディングマイクロピペットを用いて保持した。透明帯は、第一極体の近くで微細ガラス注入用マイクロピペットを用いて貫通され、そして第一極体および隣接する細胞質（おそらく中期ＩＩ染色体を含む）をピペットに吸引し、ピペットから引き出し、そして内容物を廃棄した。滑らかな表面を有する単一で丸いそして明るいドナー細胞を選択し、そして卵母細胞膜に隣接する囲卵腔に移植した（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【００８０】
核移植複合体（卵母細胞＋線維芽細胞）を、融合培地中で、低濃度カルシウム（０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ６Ｈ２Ｏおよび０．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を用いて融合した。その後、融合した卵母細胞を、暗闇における２００μＭのチメロサールを用いての１０分間かけての処理によって、続いて８ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて３０分間かけて濯ぎおよび処理することによって活性化し、その後、卵母細胞を再度濯いで、ＤＴＴを除去した（ＭａｃｈａｔｙおよびＰｒａｔｈｅｒ  ２００１、Ｍａｃｈａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。融合／活性化後、卵母細胞を３回、４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００４）の補充されたブタ接合体培地３（ＰＺＭ３）を用いて洗浄し、そして３８．５℃で５％Ｏ２、９０％Ｎ２および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３０分間かけて培養した。成功裏に融合したこのような複合体を、代理母への手術的な胚の移植まで１５〜２１時間かけて培養した。
【００８１】
代理母調製、胚移植、妊娠診断および出産
代理雌ブタ（ｇｉｌｔ）を、発情周期の段階に依存したスキームを使用して、１４日間かけて、食物に混合した１８〜２０ｍｇのＲＥＧＵ−ＭＡＴＥ（アルトレノジスト０．２２％溶液）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＤＥ）を投与することによって同期化した。最後のＲＥＧＵ−ＭＡＴＥによる処理後（１０５時間）、１０００単位のｈＣＧの筋肉内注射を投与して、発情を誘導した。適切な日に天然の周期に従っていた他の代理母もまた、代理母プールに含めた。持続的発情日（０日目）すなわち持続的発情後の最初の日に代理母を使用した（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。代理母を無菌的に調製し、そして尾側腹側の切開を行ない、生殖器系を曝露した。胚を、卵巣采を通して１つの輸卵管へと移植した。代理母を、約３０日目に腹部超音波検査によって妊娠について確認し、そしてその後、妊娠期間中には１週間に１回確認した。ブタにおける出産は一般的に妊娠から１１４日目である。
【００８２】
胎児線維芽細胞のトランスフェクションおよびスクリーニング後、候補ドナー細胞を特定し、そして体細胞核移植（ＳＣＮＴ）のために使用した。６６６個のＳＣＮＴの胚を２つの代理母に移植した。１つは、妊娠から１１５日目に６匹の正常な雄の子ブタを出産し、そして他方の代理母では妊娠から１１７日目に帝王切開を実施し、表１に示されたような２匹の正常な雄の子ブタが得られた。
［表１］ＳＩＧＬＥＣ−１＋／−雄のドナー細胞を使用した胚の移植結果
【表１】
2019193660.tif 000003
【００８３】
図２は、シアロアドヘシン（ＳＩＧＬＥＣ−１）遺伝子の構成、標的化ベクターおよび予期される組換え遺伝子型を示す。図２の上のパネルは、相同的組換えに使用された標的化構築物を示す。上述したように、標的化構築物の作製に使用された「上の」ＤＮＡ断片は、エキソン１の上流約３．５ｋｂを含み、そしてエキソン１の一部を含んでいた（開始コドンの後）。「下の」ＤＮＡ断片は、イントロン３中で始まり、そしてエキソン４、５および６ならびにエキソン７の一部を含んでいた。エキソン１の大半ならびにエキソン２および３の全部を、ネオマイシン（ｎｅｏ）カセットを用いて置換し、チミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットは、必要であれば陰性選択マーカーとしての使用のための下腕のすぐ下流で利用可能であった。図２の下のパネルは、相同的組換え後の突然変異したシアロアドヘシン遺伝子を示す。矢印は、標的化細胞株およびクローン化ブタのＰＣＲをベースとしたクローニングのために使用されるオリゴヌクレオチド結合部位を示す。上腕および下腕による標的化は、プライマー「上部シアロ標的化Ｃ」および「ＰＧＫポリＡ逆方向」（配列番号１および３）および「ＰＧＫプロモーター順方向」および「７Ｒｗｌ」（配列番号４および６）をそれぞれ示す矢印によって示されるオリゴヌクレオチドのアニーリングによって実施された。オリゴヌクレオチド配列は、以下の表２に列挙されている。さらなるチェックＰＣＲは、切除領域／Ｎｅｏカセットに隣接するオリゴヌクレオチドを使用した（プライマー「エキソン１末端ｃｋ」および「イントロン３  ｃｋ逆方向」（それぞれ配列番号２および５））。破壊された対立遺伝子と野生型対立遺伝子との間には産物のサイズに約５００ｂｐの差異がある。
［表２］計画に使用されたプライマー名および配列
【表２】
2019193660.tif 000004
表２のプライマーは、左から右へと図２の下のパネルの矢印の位置に基づいた配列ＩＤ番号を割り当てられた。従って、図２の下のパネルの最も左の矢印は、「上部シアロ標的化Ｃ」プライマー（配列番号１）の位置を示し、右の次の矢印は、「エキソン１末端ｃｋ」プライマー（配列番号２）を示し、その右の次の矢印は、「ＰＧＫポリＡ逆方向」プライマー（配列番号３）を示し、以下同様である。
【００８４】
ＳＩＧＬＥＣ−１不活性化についてのスクリーニング
ゲノムＤＮＡを子ブタから単離し、そしてこれを使用して標的化事象を確認した。ＳＩＧＬＥＣ−１遺伝子の成功裏な標的化は、Ｎｅｏカセット内にアニーリングするオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用し、標的化構築物内に含まれる領域を超えたＳＩＧＬＥＣ−１ゲノムＤＮＡにアニーリングするオリゴヌクレオチドとあわせて使用することによって決定された。図３の上のパネルにおいて、「上」腕による標的化を、「ＰＧＫポリＡ逆方向」および「上部シアロ標的化Ｃオリゴヌクレオチド」（それぞれ配列番号３および１、図２に示す）を使用することによって調べた。予期されたサイズ（約４５００ｂｐ）の産物が産生された。下のパネルにおいては、「下」腕による成功裏の標的化が、「ＰＧＫプロモーター順方向」および「７Ｒｗｌ」オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号４および６、図２に示す）を使用することによって決定された。予期されたサイズ（約５０００ｂｐ）の産物が産生された。「下腕のプラスミド」対照は、イントロン３の大半およびエキソン７の大半を示すシアロアドヘシン遺伝子断片を有するＮｅｏカセットを含む部分的構築物であった。７Ｒｗｌオリゴヌクレオチドは、プラスミド中に存在するエキソン７配列とアニーリングすることができ、そしてＰＧＫプロモーター順方向オリゴヌクレオチドと共に、成功裏な標的化事象から産生されるであろうものと同一である産物を産生することができた。両方のパネルは、４〜１８個の標的化胎児線維芽細胞株から生成された８個の子ブタクローンから抽出されたゲノムＤＮＡにおいて実施された標的化ＰＣＲ反応を示す。
【００８５】
野生型および標的化シアロアドヘシン対立遺伝子の両方の検出を、シアロアドヘシン遺伝子の標的化領域に隣接するＤＮＡにアニーリングするオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを使用することによって実施した。「エキソン１末端ｃｋ」および「イントロン３  ｃｋ逆方向」オリゴヌクレオチドを使用した（それぞれ配列番号２および５、図２に示す）。生成された産物は、野生型対立遺伝子については約２４００ｂｐであり、そして標的化対立遺伝子については約２９００ｂｐであった。図４においては、左のパネル（図４Ａ）は、野生型ゲノムＤＮＡに対して実施された試験反応、トランスフェクションに使用された標的化プラスミド、成功裏に標的化された線維芽細胞クローンからのゲノムＤＮＡ（４〜１８）（２つのバンドを記載）および非標的化線維芽細胞クローンからのゲノムＤＮＡ（４〜３）を示す。右のパネル（図４Ｂ）は、４〜１８の標的化胎児線維芽細胞株から生成された８個の子ブタクローンから抽出されたゲノムＤＮＡに対して実施された反応を示す。各レーンに予期されたサイズの２つのＰＣＲ産物があり、一方、野生型ＤＮＡおよび標的化プラスミド鋳型は、ただ１つのバンドしか有していなかった。従って、ＳＣＮＴによって産生された全ての子ブタは、意図した突然変異についてヘテロ接合性、すなわちＳＩＧＬＥＣ＋／−であった。
【００８６】
ホモ接合性動物の産生
ＳＩＧＬＥＣ−１不活性化についてヘテロ接合性と特定された雄の遺伝子的に改質されたブタは、雄の創設者として使用され（Ｆ０世代）、そして野生型の雌と交配されて、１つの不活性化されたＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する雄および雌の動物を産生した（Ｆ１）。その後、Ｆ１の雄をＦ１の雌と交配して、Ｆ２子孫を産生し、これは不活性化された両方のＳＩＧＬＥＣ−１対立遺伝子を有する。このような動物は、ＳＩＧＬＥＣ−１について上述したＰＣＲによってまたは代替的にサザンブロットによって出生後に特定され得る。
【実施例２】
【００８７】
ＣＤ１６３標的化構築物の生成
すでに確立されているように、ＣＤ１６３の細胞質ドメインの欠失は、ＳＲＣＲドメイン５の欠失または改質がそうであるように、ＰＲＲＳＶの感染性を排除する。ＣＤ１６３のＳＲＣＲドメインのいくつかは、動物の生存にとって重要な機能（例えば、ヘモグロビン除去）を有するので、これらの他の機能がインタクトであり続けるような遺伝子の改質は、ＰＲＲＳＶに対して抵抗性であるブタを作るための信頼できる戦略を示す。以前の研究によりまた、ＳＲＣＲ５ドメインをＣＤ１６３Ｌドメイン８と置換することにより、感染性が遮断されることが示唆されている（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ）。従って、標的化構築物を、図６に示したように設計して、ＣＤ１６３のＳＲＣＲ５を、ＳＲＣＲドメインＣＤ１６３Ｌと交換することができる。
【００８８】
一旦標的化構築物が作製されると、不活性化ＣＤ１６３についてヘテロ接合性であり、ＣＤ１６３遺伝子の不活性化により、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に結合および／またはそれを脱コートすることができないＣＤ１６３タンパク質を生じる、遺伝子的に改質されたブタを、実施例１に記載のものと一般的に同じである方法によって産生することができる。第一に、標的化ベクターをドナー細胞に挿入し、そこで内因性ＣＤ１６３遺伝子と組み換えることができる。その後、この特異的な改質を有するドナー細胞を選択し、そして体細胞核移植のために使用して、遺伝子的に改質された胚を作る。その後、胚を妊娠満期のために代理母に移植する。ＰＣＲまたはサザンブロットのいずれかによって、不活性化されたＣＤ１６３対立遺伝子を有するトランスジェニックブタを特定した後、これらの動物を性成熟に達するようにさせ、そしてその後、自然交配のために使用して、遺伝子を胎児または子孫に伝達する。
【００８９】
参考文献
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Ｌａｉ  Ｌ，  Ｋａｎｇ  ＪＸ，  Ｌｉ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｗｉｔｔ  Ｗ，  Ｙｏｎｇ  ＨＹ，  Ｈａｏ  Ｙ，  Ｗａｘ  Ｄ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＣＮ，  Ｒｉｅｋｅ  Ａ，  Ｓａｍｕｅｌ  Ｍ，  Ｌｉｎｖｉｌｌｅ  ＭＬ，  Ｋｏｒｔｅ  ＳＷ，  Ｅｖａｎｓ  Ｒ，  Ｓｔａｒｚｌ  ＴＥ，  Ｐｒａｔｈｅｒ  ＲＳ，  Ｄａｉ  Ｙ．  ２００６．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｉｇｓ  ｒｉｃｈ  ｉｎ  ｏｍｅｇａ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：４３５−４３７．  
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Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＭＪ，  Ｍａｄｓｅｎ  Ｍ，  Ｍｏｌｌｅｒ  ＨＪ，  Ｍｏｅｓｔｒｕｐ  ＳＫ．  ２００６．  Ｔｈｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ  １６３：  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７９（４）：８３７−８４５．  
Ｏｅｔｋｅ  Ｃ，  Ｖｉｎｓｏｎ  ＭＣ，  Ｊｏｎｅｓ  Ｃ，  Ｃｒｏｃｋｅｒ  ＰＲ．  ２００６．  Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｓｕｂｔｌｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｂ−  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６（４）：  １５４９−１５５７．  
Ｐｌａｇｅｍａｎｎ  ＰＧＷ．  １９９６．  Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌｅｖａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄ，  Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄ：  １１０５−１１２０．  
Ｒｉｔｔｅｒ  Ｍ，  Ｂｕｅｃｈｌｅｒ  Ｃ，  Ｌａｎｇｍａｎｎ  Ｔ，  Ｏｒｓｏ  Ｅ，  Ｋｌｕｃｋｅｎ  Ｊ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｇ．  １９９９ａ．  Ｔｈｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ  １６３：  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６７（５−６）：２５７−２６１．  
Ｒｉｔｔｅｒ  Ｍ，  Ｂｕｅｃｈｌｅｒ  Ｃ，  Ｌａｎｇｍａｎｎ  Ｔ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｇ．  １９９９ｂ．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ  １６３  （Ｍｌ  ３０）  ｇｅｎｅ：  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６０（２）：４６６−４７４．  
Ｒｏｐｐ  ＳＬ，  Ｗｅｅｓ  ＣＥＭ，  Ｆａｎｇ  Ｙ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＥＡ，  Ｒｏｓｓｏｗ  ＫＤ，  Ｂｉｅｎ  Ｍ，  Ａｒｎｄｔ  Ｂ，  Ｐｒｅｓｚｌｅｒ  Ｓ，  Ｓｔｅｅｎ  Ｐ，  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ  Ｊ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＪＥ，  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  ＤＡ，  Ｆａａｂｅｒｇ  ＫＳ．  ２００４．  
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８（７）：３６８４−３７０３．  
Ｒｏｗｌａｎｄ  ＲＲ，  Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｍ，  Ａｃｋｅｒｍａｎ  Ｔ，  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ  ＤＡ．  １９９９．  Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ：  ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ＶＲ−２３３２．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５９：２６２−２６６．  
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ  Ｃ，  Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ  Ｐ，  Ｇｏｍｅｚ−ｄｅｌ−Ｍｏｒａｌ  Ｍ，  Ａｌｏｎｓｏ  Ｆ，  Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ  ＪＭ，  Ｅｚｑｕｅｒｒａ  Ａ，  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  Ｊ．  ２００３．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ＣＤ  １６３  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４８（１２）：２３０７−２３２３．  
Ｓｎｉｊｄｅｒ  ＥＪ，  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ＪＪＭ．  １９９８．  ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  
ＡＲＴＥＲＩＶＩＲＵＳＥＳ  ［Ｒｅｖｉｅｗ］．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９（Ｐａｒｔ  ５）：９６１−９７９．  
Ｓｕａｒｅｚ  Ｐ，  Ｄｉａｚｇｕｅｒｒａ  Ｍ，  Ｐｒｉｅｔｏ  Ｃ，  Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｍ，  Ｃａｓｔｒｏ  ＪＭ，  Ｎｉｅｔｏ  Ａ，  Ｏｒｔｉｎ  Ｊ．  １９９６．  Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  ５  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０（５）：２８７６−２８８２．  
Ｓｕｒ  ＪＨ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＶＬ，  Ｇａｌｅｏｔａ  ＪＡ，  Ｈｅｓｓｅ  ＲＡ，  Ｄｏｓｔｅｒ  ＡＲ，  Ｏｓｏｒｉｏ  ＦＡ．  １９９６．  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｎａ  ｂｙ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔｉｍｅｓ  Ｐｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３４（９）：２２８０−２２８６．  
Ｓｕｒ  ＪＨ，  Ｄｏｓｔｅｒ  ＡＲ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ＪＳ，  Ｇａｌｅｏｔａ  ＪＡ，  Ｗｉｌｌｓ  ＲＷ，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＪ，  Ｏｓｏｒｉｏ  ＦＡ．  １９９７．  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｉｎ  Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌｓ，  Ａｌｔｅｒｓ  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｂｙ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（１２）：９１７０−９１７９．  
Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  Ｗ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，  Ｍｉｓｉｎｚｏ  Ｇ，  Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  Ｎ，  Ｄｕａｎ  Ｘ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２０１０ａ．  Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９１（Ｐｔ  ７）：  １６５９−１６６７．  
Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  Ｗ，  Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，  Ｚｈａｎｇ  ＪＱ，  Ｃｒｏｃｋｅｒ  ＰＲ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２０１０ｂ．  Ｔｈｅ  Ｍ／ＧＰ（５）  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｓ  ｔｈｅ  ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６（ｌ）：ｅｌ０００７３０．  
ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｆｆ  ＭＪ，  Ｍｏｏｒｍａｎ  ＡＦ，  Ｌａｍｅｒｓ  ＷＨ．  １９９２．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  
’ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ’  ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０（１１）：２９０２．  
Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２０１０ａ．  Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ１６３，  ａ  Ｊａｃｋ−ｏｆ−ａｌｌ−ｔｒａｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４７（７−８）：  １６５０−１６６０．  
Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，  Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  Ｗ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２００８．  Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  ａｎｄ  ＣＤ１６３  ｊｏｉｎ  ｆｏｒｃｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（Ｐｔ  １２）：２９４３−２９５３．  
Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｈ，  Ｖａｎ  Ｂｒｅｅｄａｍ  Ｗ，  Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｓｓｅｌａｅｒｅ  Ｊ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２０１０ｂ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ  １６３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８４（６）：３１０１−３１０５．  
Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  Ｎ，  Ｄｅｌｐｕｔｔｅ  ＰＬ，  Ｆａｖｏｒｅｅｌ  ＨＷ，  Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ  Ｊ，  Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｗｏｅｎｓｅｌ  ＰＡ，  Ｎａｕｗｙｎｃｋ  ＨＪ．  ２００３．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  ｉｎ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｏ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７７（１５）：８２０７−８２１５．  
Ｖｉｎｓｏｎ  Ｍ，  Ｖａｎｄｅｒｍｅｒｗｅ  ＰＡ，  Ｋｅｌｍ  Ｓ，  Ｍａｙ  Ａ，  Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ，  Ｃｒｏｃｋｅｒ  ＰＲ．  １９９６．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ｉｎ  Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ  ｂｙ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１（１６）：  ９２６７−９２７２．  
Ｗｅｌｃｈ  ＳＫＷ，  Ｃａｌｖｅｒｔ  ＪＧ．  ２０１０．  Ａ  ｂｒｉｅｆ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＤ１６３  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＰＲＲＳＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５４：９８−１０３．  
Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  Ｇ，  Ｔｅｒｐｓｔｒａ  Ｃ，  Ｐｏｌ  ＪＭＡ，  ｔｅｒ  Ｌａａｋ  ＥＡ，  Ｂｌｏｅｍｒａｄ  Ｍ，  ｄｅ  Ｋｌｕｙｅｒ  ＥＰ，  Ｋｒａｇｔｅｎ  Ｃ，  ｖａｎ  Ｂｕｉｔｅｎ  Ｌ，  ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ  Ａ，  Ｗａｇｅｎａａｒ  Ｆ，  Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ  ＪＭ，  Ｍｏｏｎｅｎ  ＰＬＪＭ，  Ｚｅｔｓｔｒａ  Ｔ，  ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＥＡ，  Ｔｉｂｂｅｎ  ＨＪ，  ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＭＦ，  ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｌｄ  Ｐ，  Ｇｒｏｅｎｌａｎｄ  ＧＪＲ，  ｖａｎ  Ｇｅｎｎｅｐ  ＪＡ，  Ｖｏｅｔｓ  ＭＴＨ，  Ｖｅｒｈｅｉｊｄｅｎ  ＪＨＭ，  Ｂｒａａｍｓｋａｍｐ  Ｊ．  １９９１．  Ｍｙｓｔｅｒｙ  ｓｗｉｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ：  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  １３：  １２１−１３０．  
Ｗｉｌｌｓ  ＲＷ，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＪ，  Ｙｏｏｎ  ＫＪ，  ＭｃＧｉｎｌｅｙ  ＭＪ，  Ｈｉｌｌ  ＨＴ，  Ｐｉａｔｔ  ＫＢ，  
Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｈｅｎｎｉｎｇｓ  Ｊ，  Ｎｅｌｓｏｎ  ＥＡ．  １９９７．  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  −  ａ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５５（ｌ−４）：２３１−２４０．  
Ｗｉｓｓｉｎｋ  ＥＨＪ，  ｖａｎ  Ｗｉｊｋ  ＨＡＲ，  Ｐｏｌ  ＪＭＡ，  Ｇｏｄｅｋｅ  ＧＪ，  ｖａｎ  Ｒｉｊｎ  ＰＡ，  Ｒｏｔｔｉｅｒ  ＰＪＭ，  Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ＪＪＭ．  ２００３．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  
１４８（１）：  １７７−１８７．  
Ｙｏｏｎ  ＩＬ，  Ｊｏｏ  ＨＳ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ＷＥ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＲＢ，  Ｄｉａｌ  ＧＤ．  １９９３．  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｒｓｅｒｙ  ｐｉｇｓ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＰＲＲＳ  ｖｉｒｕｓ．  Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １：５−８．
【００９０】
本発明のエレメントまたはその好ましい実施形態（複数を含む）を導入する場合に、「ひとつの（ａ）」、「ひとつの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および「上述の（ｓａｉｄ）」という冠詞は、１つ以上のエレメントが存在することを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包含的であることを意図し、そして列挙されたエレメント以外のさらなるエレメントがあり得ることを意味する。
【００９１】
上記を考慮して、本発明のいくつかの目的が達成され、そして他の有益な結果が得られることが分かる。
【００９２】
本発明の範囲から逸脱することなく上の産物および方法に種々の変更を行なうことができ、上述の記述に含まれそして添付図面（複数を含む）に示された全ての事柄は説明的なものであり制限する意味はないことと解釈される。
【図１】
2019193660.tif 000005
【図２】
2019193660.tif 000006
【図３】
2019193660.tif 000007
【図４】
2019193660.tif 000008
【図５】
2019193660.tif 000009
【図６】
2019193660.tif 000010
【配列表】
2019193660000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。