(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト骨格筋において見出される褐色脂肪細胞前駆細胞から、インビトロおよびインビボで褐色脂肪細胞を動員するための組成物および方法を提供する。また、代謝疾患を処置するための方法、加えて、低体温症を処置するための方法が提供される。【解決手段】褐色脂肪細胞動員因子としてヒトタンパク質またはヒトペプチドを用いる。他の実施形態において、褐色脂肪細胞動員因子は、非ヒトタンパク質または非ヒトペプチドであり得る。さらに他の実施形態において、褐色脂肪細胞動員因子として小分子または天然物である方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞を動員するための薬剤のインビトロでの使用であって、該ＢＡＴ前駆細胞はヒト骨格筋由来であり、該薬剤は、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２から選択されるプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
のうち１つまたはそれより多くから選択される、使用。
【請求項２】
前記薬剤が、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０、および
ＳＤＦ−１γ
のうち１つまたはそれより多くから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記薬剤が、インビトロ、インビボまたはその両方で、前記ＢＡＴ前駆細胞においてＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導することができる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が、
（ａ）以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原、ＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ２１、脂肪酸結合タンパク質７（ＦＡＢＰ７）、ＣＸＣＬ１２、非定型ケモカイン受容体３（ＡＣＫＲ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、アデニル酸シクラーゼ４（ＡＤＣＹ４）、細胞死活性化因子ＣＩＤＥ−Ａ（ＣＩＤＥＡ）、分泌型フリッツルド関連タンパク質１（ＳＲＦＰ１）、ＳＲＦＰ２、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｂ（ＰＤＥ４Ｂ）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）、高親和性ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）およびｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ｂ（ＰＤＥ７Ｂ）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こすこと、
（ｂ）褐色脂肪組織および／または骨格筋組織における熱生成の増大を引き起こすこと、（ｃ）骨格筋、白色脂肪組織または肝臓のインスリン感度の増大を引き起こすこと、
（ｄ）グルコース寛容の増大を引き起こすこと、
（ｅ）基礎呼吸、最大呼吸速度または非共役呼吸の増大を引き起こすこと、
（ｆ）代謝速度の増大を引き起こすこと、および
（ｇ）肝脂肪変性の減少を引き起こすこと
からなる群より選択される１つまたはそれより多くの生物学的活性を有する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤が、以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原およびＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こす、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が、被験体における代謝応答を調節すること、または被験体における代謝障害を予防することもしくは処置することができる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
前記代謝障害が、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
褐色脂肪生成を必要とする被験体において褐色脂肪生成を促進するための組成物であって、該組成物は、
９β、１１α−ＰＧＦ２または９α、１１β−ＰＧＦ２から選択されるプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
のうち１つまたはそれより多くから選択される薬剤を含む、組成物。
【請求項９】
前記薬剤が、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０、
アイソフォームＳＤＦ−１
のうち１つまたはそれより多くから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、前記被験体における代謝応答を調節することおよび／または前記被験体における代謝障害を予防もしくは処置することができる、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記代謝障害が、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が前記被験体の細胞と接触させられることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
前記接触させる工程の後に、前記細胞を前記被験体へ移植されることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞が、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞が、ＣＤ３４について陽性である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞が、ＣＤ３１について陰性である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
被験体における低体温症を予防する組成物であって、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２から選択されるプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０から選択される線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）
のうち１つまたはそれより多くから選択される薬剤を含む、組成物。
【請求項１８】
前記薬剤が、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０、
ＳＤＦ−１γ
のうち１つまたはそれより多くから選択される、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
これは、２０１４年２月２４日に出願された米国仮出願第６１／９６６，４９６号への優先権および利益を主張し、この開示全体が本明細書中に参照により援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症などの状態における褐色脂肪細胞および／または褐色脂肪細胞の量の向上に関連する組成物および方法に関連する。とりわけ、本開示は、骨格筋から単離した褐色脂肪組織（ＢＡＴ）前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を増大させるか、または促進する化合物を同定し、記載する。さらに、本開示は、褐色脂肪細胞分化および／または量の制御に関係する遺伝子産物と相互作用する化合物を同定し、記載する。またさらに、本開示は、２型糖尿病、肥満、インスリン抵抗性および脂質異常症の予防および処置のための化合物の同定および治療的使用のための方法を提供する。本開示は、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性および脂質異常症などの多様な代謝性疾患の研究、予防および処置のために有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景
肥満の蔓延は、糖尿病の有病率の増大、高血圧、冠動脈心疾患、がんおよび他の障害に密接に関連する。白色脂肪組織の役割は、脂質を蓄積することであり、これは、肥満に関連する。褐色脂肪組織（「ＢＡＴ」）の役割は、事実上反対である。これは、脂質燃焼および熱としてのエネルギーの消散に専門化される。実際に、褐色脂肪細胞は、多数のミトコンドリア（この中で細胞内燃焼が生じる）を含み、脱共役タンパク質１（「ＵＣＰ１」）を独自に発現する。ＵＣＰ１は、酸化的リン酸化の脱共役体として作用し、これは、エネルギーの熱としての消散をもたらす。交感神経系は、ミトコンドリア発生（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）ならびにＵＣＰ１の発現および活性を刺激する。げっ歯類におけるＢＡＴに関連した熱生成は、低温への曝露の際に増大し（例えば、低体温症を予防する）、または過食の結果として増大し、これは、過剰に吸収された脂肪を燃焼し、体重増加を予防する。ＢＡＴは、体重増加への感受性を改変すること、および多量のグルコースを消費することによってインスリン感度も改善する。それゆえ、これは、体温、エネルギーバランスおよびグルコース代謝の維持において重要な役割を担う。
【０００４】
トランスジェニック動物を用いた実験は、ＢＡＴの潜在的な抗肥満性質を支持する。例えば、ＢＡＴの遺伝学的切除は、肥満を引き起こすことが報告されているが、一方でＢＡＴ（および／もしくはＵＣＰ１発現）の量ならびに／または機能における遺伝学的増大は、報告によれば、痩せてかつ健康的な表現型を促進する。とりわけ、より高い量のＢＡＴを有するマウスは、対照マウスよりも低い体重に達し、高いインスリン感度である。最近、マウス筋肉における異所性ＢＡＴ蓄積が立証され、これは、体重増加およびメタボリックシンドロームからの防御の遺伝学的メカニズムを提供することが示されている。
【０００５】
ＵＣＰ１は、げっ歯類におけるエネルギーバランスの調節における役割を担い、ＵＣＰ１を発現するＢＡＴは、ヒト新生児において存在することが報告されているが、成人ヒトにおいて、生理学的に意義のあるＵＣＰ１発現はないと長らく考えられてきた。実際に、ＵＣＰ１を発現するＢＡＴは、一生における早期に消失すると考えられており、成人ヒトはＢＡＴを欠いていると考えられていた。しかしながら最近、数多くの研究が、ＢＡＴは、実際には、新生児および小児におけるものよりもかなり低いレベルではあるが、ほとんどの成人ヒトにおいて維持されていることを実証している。
【０００６】
このように、多様な代謝性疾患（肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症および１型糖尿病）の研究、予防および処置のために、成体体内においてより多くのＢＡＴを供給するためかつ／またはＵＣＰ１発現を刺激するための方法を、慎重に同定し、研究する必要性が存在する。
【０００７】
出願人らは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９１５１５４１およびＷＯ２０１３０７１０６３（これら両方の開示全体は、本明細書中に参照により援用される）において、褐色脂肪細胞に分化することのできる、多様な組織内の細胞の存在を以前に同定した。しかしながら、例えば、ＵＣＰ１遺伝子の発現を誘導すること、インビトロでＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進すること、インビボでＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進すること、またはこれらの活性の組み合わせ、が可能な薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物製剤など）についての必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５１５４１号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０７１０６３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、ヒト骨格筋において見出されるＢＡＴ前駆細胞からインビトロおよびインビボで褐色脂肪細胞を動員するかまたは産生するための組成物を提供する。これらの薬剤またはそれらの組み合わせは、インビトロ、インビボまたはその両方で、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導するために使用することができる。さらに、これらの薬剤は、患者における代謝性疾患（肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症および他の状態を含むが、これらに限定されない）を処置するために使用することができる。
【００１０】
本開示は、部分的に、多様なタンパク質、ペプチドおよび小分子（まとめると薬剤）が、ＢＡＴ前駆細胞の分化における重要な役割を担うという発見に基づく。特に、本明細書中で開示される多様な薬剤は、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞の成熟した、機能的な褐色脂肪細胞への分化を著しく誘導することが見出された。これらの多様な薬剤のうち１つまたはそれより多くを用いたこれらのＢＡＴ前駆細胞の処置は、これらの細胞の褐色脂肪細胞分化への傾倒を引き起こす。いくつかの場合において、脂肪生成培地の導入の前の期間（例えば、２、３時間、１日、２日、３日またはこれより短いかまたはこれより長い）にわたる薬剤を用いた処置は、褐色脂肪細胞分化をもたらす。他の場合において、脂肪生成培地の導入と同時および／または導入後の薬剤を用いた処置は、褐色脂肪細胞分化をもたらす。
【００１１】
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、エネルギー消費に専門化されるため、本明細書中で記載される薬剤は、肥満および関連障害（糖尿病など）の処置に有用である。この薬剤は、食用動物を含む被験体における脂肪蓄積を減少させるため（例えば、これらから得られた肉の品質を改良するため）にも使用することができる。
【００１２】
したがって、１つの態様において、本開示は、被験体を処置する（例えば、ヒトなどの被験体における脂肪蓄積または体重を減少させる）方法を特徴とする。この方法は、本明細書中で開示される有効量の薬剤または薬剤の組み合わせを被験体に投与する工程を含む。
【００１３】
さらなる態様において、本開示は、薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団を投与することによって、脂肪蓄積または体重を減少させる必要のある被験体を処置する方法を特徴とし、ここで、該薬剤で活性化された前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を経る。この方法は、必要に応じて脂肪蓄積または体重を減少させる必要のある被験体を同定する工程を含み得る。
【００１４】
さらなる態様において、本開示は、被験体（例えば、インスリン抵抗性である被験体）におけるインスリン感度を向上させる方法を含む。この方法は、薬剤および／または薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団を被験体に投与する工程を含み、ここで、該薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を経る。この方法は、必要に応じてインスリン感度を向上させる必要のある被験体を同定する工程を含み得る。
【００１５】
別の態様において、本開示は、被験体における褐色脂肪組織の機能または成長を調節する（例えば、ＢＡＴ脂肪生成を促進する）方法を特徴とする。この方法は、薬剤および／または薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団を被験体に投与する工程を含み、ここで、該薬剤で活性化された前駆細胞の集団は、褐色脂肪生成を経る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される方法は、薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団を被験体に移植する工程を含み得る。この薬剤で活性化された細胞は、直接移植され得るか、または細胞が付着することができる足場、マトリクスもしくは他の移植可能なデバイス（例としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、セルロースアセテート、ニトロセルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、自己組織化小ペプチドおよびそれらの組み合わせでできたキャリアが挙げられる）において投与され得る。一般的に、この方法は、被験体において褐色脂肪細胞量の増大を促進する（被験体における褐色脂肪細胞の量を、少なくとも１％、例えば、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％またはこれより多く増大させる）ために十分な数の細胞を含む、薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の集団を移植する工程を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、この方法は、被験体から単離されたＢＡＴ前駆細胞を本明細書中で開示される薬剤のうちの１つまたはそれより多くと接触させることによって、被験体におけるＢＡＴ脂肪生成のレベルを評価する工程を含む。ＢＡＴ分化は、例えば脱共役タンパク質（ＵＣＰ）などのＢＡＴマーカー（例えばＵＣＰ１発現）、ＢＡＴの形態学（細胞の視覚的な検査、例えば、顕微鏡検査を使用する）、またはＢＡＴの熱力学（例えば、シトクロムオキシダーゼ活性、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ酵素ユニット、またはＢＡＴ熱生成に関係する他の酵素）のいずれかを測定することによって評価することができる。
【００１８】
一般的に、被験体は哺乳類であり得る。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒト被験体（例えば肥満のヒト被験体）である。いくつかの実施形態において、被験体は、非ヒトの哺乳類（例えば、実験動物、コンパニオンアニマルまたは家畜、例えば、食用に飼育されるウシ、ブタもしくはヒツジ）である。一般的に、タンパク質またはペプチドが、ＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞を動員するために使用される場合、このタンパク質またはペプチドは、被験体（例えば、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ブタまたはヒツジ）と同種または関連した種からのものである。このタンパク質またはペプチドは、被験体に対して異種でもあり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、この方法は、体重、白色脂肪組織蓄積、褐色脂肪組織蓄積、脂肪組織の形態学、インスリンレベル、インスリン代謝、グルコースレベル、熱生成能および低温感度のうち１つまたはそれより多くについて被験体を評価する工程を含む。評価は、薬剤および／または薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の投与の前、間および／または後に行うことができる。例えば、評価は、投与の前および／または後の少なくとも１日、２日、４日、７日、１４日、２１日、３０日またはそれよりも長期もしくはそれよりも短期において行うことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、この方法は、１回またはそれより多くの追加的なラウンドの、薬剤を用いた処置または薬剤で活性化されたＢＡＴ前駆細胞の移植（例えば、褐色脂肪細胞の量を増大させるため、例えば、被験体における肥満を維持するか、またはさらに低減させるため）を含む。
【００２１】
タンパク質またはペプチド薬剤が使用される場合のいくつかの実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞は、増大したレベルのこのようなタンパク質またはペプチドを、安定または一過性のいずれかで発現するように、遺伝学的に操作され得る。細胞は、例えば、培養哺乳類細胞（例えばヒト細胞）であり得る。使用される発現させたリコンビナントタンパク質またはペプチドは、一般的に、ＢＡＴ前駆細胞と同種または関連した種のものである（例えば、ヒト細胞において発現させたヒトタンパク質またはペプチド）。リコンビナントタンパク質またはペプチドは、ＢＡＴ前駆細胞に対して異種でもあり得る。
【００２２】
さらなる態様において、本開示は、インビトロ、インビボまたはその両方で、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはＢＡＴ前駆細胞においてＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導するための、本明細書中で開示される１つまたはそれより多くの薬剤の使用を提供する。
【００２３】
また本明細書中で提供されるのは、過体重、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病から選択される１つまたはそれより多くの疾患もしくは状態の処置のための、本明細書中で開示される１つまたはそれより多くの薬剤の使用である。前述の疾患を処置する必要のある被験体に、本明細書中で開示される１つまたはそれより多くの薬剤を投与する工程を含む、前述の疾患を処置するための方法も提供される。
【００２４】
さらなる態様は、本明細書中で開示される１つもしくはそれより多くの薬剤および薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む薬学的組成物に関連する。
【００２５】
１つの特定の態様は、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞を動員するための薬剤の使用に関連し、該薬剤は、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンまたはスピペロンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０またはＦＧＦ１３などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、
メトホルミンなどのビグアニド、
シグアゾダンなどのＰＤＥ３阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤、
リオシグアトなどの可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、
ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
インターロイキン６（ＩＬ−６）、
オレキシンＢ、および
グアンファシン塩酸塩などのα２アドレナリン受容体アゴニスト
のうち１つまたはそれより多くから選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、薬剤は、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、および
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤
のうち１つまたはそれより多くから選択される。
【００２７】
ある実施形態において、薬剤は、インビトロ、インビボまたはその両方でＢＡＴ前駆細胞においてＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、薬剤は、
（ａ）以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原、ＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ２１、脂肪酸結合タンパク質７（ＦＡＢＰ７）、ＣＸＣＬ１２、非定型ケモカイン受容体３（ＡＣＫＲ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、アデニル酸シクラーゼ４（ＡＤＣＹ４）、細胞死活性化因子ＣＩＤＥ−Ａ（ＣＩＤＥＡ）、分泌型フリッツルド関連タンパク質１（ＳＲＦＰ１）、ＳＲＦＰ２、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｂ（ＰＤＥ４Ｂ）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）、高親和性ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）およびｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ｂ（ＰＤＥ７Ｂ）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こすこと、
（ｂ）褐色脂肪組織および／または骨格筋組織における熱生成の増大を引き起こすこと、（ｃ）骨格筋、白色脂肪組織または肝臓のインスリン感度の増大を引き起こすこと、
（ｄ）グルコース寛容の増大を引き起こすこと、
（ｅ）基礎呼吸、最大呼吸速度または非共役呼吸（ｕｎｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）の増大を引き起こすこと、
（ｆ）代謝速度の増大を引き起こすこと、および
（ｇ）肝脂肪変性の減少を引き起こすこと
からなる群より選択される１つまたはそれより多くの生物学的活性を有し得る。
【００２９】
ある実施形態において、薬剤は、以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原およびＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こし得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、薬剤は、被験体における代謝応答を調節すること、または被験体における代謝障害を予防もしくは処置することができる。いくつかの実施形態において、この代謝障害は、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くであり得る。
【００３１】
別の態様は、褐色脂肪生成の促進を必要とする被験体において、褐色脂肪生成を促進する方法に関連し、この方法は、本明細書中で開示される１つまたはそれより多くの薬剤から選択される薬剤を、被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態における方法は、被験体における代謝応答を調節することおよび／または被験体における代謝障害を予防または処置することをさらに含み得る。この代謝障害は、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くであり得る。ある実施形態において、この方法は、被験体の細胞を薬剤と接触させる工程、および必要に応じて該接触工程の後に該細胞の該被験体への移植工程をさらに含む。いくつかの実施形態における細胞は、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞であり得る。細胞は、ＣＤ３４について陽性かつ／またはＣＤ３１について陰性であり得る。
【００３２】
別段定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門的用語および科学的用語は、この開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料が、本開示における使用のために本明細書中で記載され、当該分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法および実施例は、単なる実例であり、限定されることを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、データベース登録および他の参考文献は、それらの全体が参照によって援用される。矛盾の場合において、定義を含め、本明細書が支配する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞から褐色脂肪細胞を動員するための薬剤の使用であって、該薬剤は、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンまたはスピペロンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０またはＦＧＦ１３などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、
メトホルミンなどのビグアニド、
シグアゾダンなどのＰＤＥ３阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤、
リオシグアトなどの可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、
ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
インターロイキン６（ＩＬ−６）、
オレキシンＢ、および
グアンファシン塩酸塩などのα２アドレナリン受容体アゴニスト
のうち１つまたはそれより多くから選択される、使用。
（項目２）
前記薬剤が、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、および
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤
のうち１つまたはそれより多くから選択される、項目１に記載の使用。
（項目３）
前記薬剤が、インビトロ、インビボまたはその両方で、前記ＢＡＴ前駆細胞においてＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導することができる、項目１または２に記載の使用。
（項目４）
前記薬剤が、
（ａ）以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原、ＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ２１、脂肪酸結合タンパク質７（ＦＡＢＰ７）、ＣＸＣＬ１２、非定型ケモカイン受容体３（ＡＣＫＲ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、アデニル酸シクラーゼ４（ＡＤＣＹ４）、細胞死活性化因子ＣＩＤＥ−Ａ（ＣＩＤＥＡ）、分泌型フリッツルド関連タンパク質１（ＳＲＦＰ１）、ＳＲＦＰ２、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｂ（ＰＤＥ４Ｂ）、ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）、高親和性ｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ａ（ＰＤＥ７Ａ）およびｃＡＭＰ特異的３’，５’−サイクリックホスホジエステラーゼ７Ｂ（ＰＤＥ７Ｂ）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こすこと、
（ｂ）褐色脂肪組織および／または骨格筋組織における熱生成の増大を引き起こすこと、（ｃ）骨格筋、白色脂肪組織または肝臓のインスリン感度の増大を引き起こすこと、
（ｄ）グルコース寛容の増大を引き起こすこと、
（ｅ）基礎呼吸、最大呼吸速度または非共役呼吸の増大を引き起こすこと、
（ｆ）代謝速度の増大を引き起こすこと、および
（ｇ）肝脂肪変性の減少を引き起こすこと
からなる群より選択される１つまたはそれより多くの生物学的活性を有する、項目１または２に記載の使用。
（項目５）
前記薬剤が、以下：ベータ３アドレナリン受容体（β３−ＡＲ）、溶質キャリアファミリー２、促進グルコース輸送体メンバー４（ＳＬＣ２Ａ４）、超長鎖脂肪酸伸長タンパク質３（ＥＬＯＶＬ３）、ＣＤ３６抗原およびＩＩ型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素（ＤＩＯ２）のうち１つまたはそれより多くの増大または減少を引き起こす、項目４に記載の使用。
（項目６）
前記薬剤が、被験体における代謝応答を調節すること、または被験体における代謝障害を予防することもしくは処置することができる、項目１または２に記載の使用。
（項目７）
前記代謝障害が、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くである、項目６に記載の方法。
（項目８）
褐色脂肪生成を必要とする被験体において褐色脂肪生成を促進するための方法であって、該方法は、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンまたはスピペロンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β、１１α−ＰＧＦ２または９α、１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０またはＦＧＦ１３などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、
メトホルミンなどのビグアニド、
シグアゾダンなどのＰＤＥ３阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤、
リオシグアトなどの可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、
ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
インターロイキン６（ＩＬ−６）、
オレキシンＢ、および
グアンファシン塩酸塩などのα２アドレナリン受容体アゴニスト
のうち１つまたはそれより多くから選択される薬剤を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目９）
前記薬剤が、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、および
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤
のうち１つまたはそれより多くから選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記被験体における代謝応答を調節する工程および／または前記被験体における代謝障害を予防もしくは処置する工程をさらに含む、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記代謝障害が、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病のうち１つまたはそれより多くである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体の細胞を前記薬剤と接触させる工程をさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記接触させる工程の後に、前記細胞を前記被験体へ移植する工程をさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞が、ヒト骨格筋から単離されたＢＡＴ前駆細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が、ＣＤ３４について陽性である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞が、ＣＤ３１について陰性である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
被験体における低体温症を予防する方法であって、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンまたはスピペロンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０またはＦＧＦ１３などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、
メトホルミンなどのビグアニド、
シグアゾダンなどのＰＤＥ３阻害剤などのホスホジエステラーゼ阻害剤、
リオシグアトなどの可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、
ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、
毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、
インターロイキン６（ＩＬ−６）、
オレキシンＢ、および
グアンファシン塩酸塩などのα２アドレナリン受容体アゴニスト
のうち１つまたはそれより多くから選択される薬剤を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１８）
前記薬剤が、
ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、
チアプリド塩酸塩またはチエチルペラジンなどの抗ドパミン剤、
コルヒチンなどのチューブリンのリガンド、
レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、
ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、
フェロジピンなどのカルシウムチャネルのアンタゴニスト、
プロベネシド、
９β，１１α−ＰＧＦ２または９α，１１β−ＰＧＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、
５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）遺伝子に由来するペプチド、
ケンフェロールなどのフラボノイド、
ＦＧＦ７またはＦＧＦ１０などの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、
メントールまたはイシリンなどの一過性受容器電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）リガンド、
ボンベシン、
アイソフォームＳＤＦ−１γなどのストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）、および
ジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤
のうち１つまたはそれより多くから選択される、項目１７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図２】図２は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図３】図３は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図４】図４は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図５】図５は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図６】図６は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図７】図７は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図８】図８は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図９】図９は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図１０】図１０は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７およびＦＧＦ１０（両方とも１００ｎＭ、−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図１１】図１１は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７およびＦＧＦ１０（両方とも１００ｎＭ、−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図１２】図１２は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７（１ｎＭ、ｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１３】図１３は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７（１ｎＭ、ｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１４】図１４は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ１０（１０ｎＭ、−３日からｄ０に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１５】図１５は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ１０（１０ｎＭ、−３日からｄ０に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１６】図１６は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７（１ｎＭ、ｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）またはＦＧＦ１０（１０ｎＭ、−３日からｄ０に、当該細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１７】図１７は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対するＦＧＦ７（１ｎＭ、ｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）またはＦＧＦ１０（１０ｎＭ、−３日からｄ０に、当該細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。ロシグリタゾン（ｒｏｓｉ、１μＭ）、骨形成タンパク質７（ｂｍｐ７、６ｎＭ）またはｒｏｓｉとｂｍｐ７との両方を、−３日からｄ０に当該細胞と共にインキュベートした。
【図１８】図１８は、ＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの発現に対する多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図１９】図１９は、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡの発現についての多様な薬剤（−３日からｄ０およびｄ０からｄ３に、褐色脂肪細胞前駆細胞と共にインキュベートした）の効果を示す。
【図２０ＡＢＣ】図２０Ａ〜２０Ｃは、ＵＣＰ１タンパク質発現（ＦＩＴＣ、緑）および細胞核数（ＤＡＰＩ、青）についての免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ結果を図示する蛍光顕微鏡画像を示す。ロシグリタゾン（１μＭ）への曝露後最小分化培地（ＭＤＭ）において８日間にわたって分化させたＣＤ３１−細胞は、高レベルのＵＣＰ１を発現する褐色脂肪細胞に大いに分化するが（図２０Ａ）、一方でロシグリタゾンに曝露しなかった細胞は、かなり低いレベルの分化およびＵＣＰ１発現を示す（図２０Ｂ）。増殖培地（ＥＧＭ−２）中で維持された細胞は、分化せず、ＵＣＰ１を発現しない（図２０Ｃ）。
【図２１】図２１は、多様な条件（ｒｏｓｉおよびＢＭＰ−７を−３日からｄ０まで使用した）において、褐色脂肪細胞前駆細胞を誘導して９日間の培養で分化させた後のＢＯＤＩＰＹ  ５００／５１０  Ｃ１，Ｃ１２蛍光シグナルを示す。
【図２２】図２２は、細胞内脂肪滴形成についてのＢＯＤＩＰＹアッセイの結果を図示する蛍光顕微鏡を示す（ＢＯＤＩＰＹ  ５００／５１０  Ｃ１，Ｃ１２、緑）。ＣＤ３１−細胞は、３日間（−３日から０日）にわたるロシグリタゾン（１μＭ）への曝露後、最小分化培地（ＭＤＭ）において８日間で分化した。
【図２３ＡＢＣ】図２３Ａ〜２３Ｈは、ＣＤ３１−細胞および褐色脂肪細胞形成を促進する数種の薬剤を用いた処理後に結果として生じる褐色脂肪細胞分化の光学顕微鏡写真を示す。図２３Ａ：ビヒクル（ＤＭＳＯ）。図２３Ｂ：ロシグリタゾン。図２３Ｃ：ＢＭＰ７。図２３Ｄ：ジフルニサル。図２３Ｅ：シロシンゴピン。図２３Ｆ：ケンフェロール。図２３Ｇ：プロベネシド。図２３Ｈ：チアプリド。
【図２３ＤＥＦ】同上。
【図２３ＧＨ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「薬剤で活性化された」は、ＢＡＴ前駆細胞（複数可）が、本明細書中に記載されるような１つまたはそれより多くの薬剤を用いて処置され、褐色脂肪細胞に分化することに、少なくとも部分的に傾倒されることを意味する。細胞は、自家、同種異系または異種であり得る。「褐色脂肪生成」は、インビボ、インビトロまたは部分的にインビボおよび部分的にインビトロでのＢＡＴ前駆細胞からの褐色脂肪細胞の生成を意味する。褐色脂肪生成は誘導され得る、すなわち、例えば本明細書中で開示される１つまたはそれより多くの薬剤による誘導の前の所謂「ＢＡＴ前駆細胞」は、褐色脂肪細胞への分化に必ずしも傾倒される必要はなく、幹細胞または体細胞から褐色脂肪細胞へリプログラミングまたは分化転換され得ることを特記すべきである。「褐色脂肪細胞を動員する」は、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進もしくは向上させること、ならびに／またはインビボおよび／もしくはインビトロで褐色脂肪細胞の量もしくは濃度を増大させることを意味する。
【００３５】
本明細書中で提供されるのは、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進することができ、かつ／またはインビトロ、インビボもしくはその両方でＵＣＰ１遺伝子の発現を誘導することのできる薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物製剤など）である。このような薬剤は、化合物、タンパク質、生物製剤などをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞（例えばヒト骨格筋から単離された細胞）は、ＵＣＰ１遺伝子の発現および／またはＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を誘導する能力についての薬剤をスクリーニングするために使用することができる。この態様で同定された薬剤は、多様な研究目的、診断目的および治療目的（例えば、肥満、２型糖尿病、インスリン抵抗性、脂質異常症などの代謝疾患の処置が挙げられる）のために使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示にしたがうアッセイによって同定された薬剤は、その物理化学的性質および／または薬物動態学的性質の改良のために最適化される。
【００３６】
インビトロならびにインビボでのＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現は、本開示において提供される方法にしたがい向上され得る。いくつかの実施形態において、脂肪生成培地への曝露は、ＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現増大を刺激するために使用され得る。
【００３７】
したがって、いくつかの実施形態において、以下の薬剤：ＰＤＥ３阻害剤（例えばシグアゾダン）、ＰＤＥ４阻害剤（例えばロリプラム）、９β，１１α−プロスタグランジンＦ２または９α，１１β−プロスタグランジンＦ２などのプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、５５ａａ（ａａ２５〜７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ、ＡＤＣＹＡＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔ
Ｐ１８５０９）遺伝子に由来するペプチド（例えば一部）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、オレアノール酸などのＴＧＲ５アゴニスト、ＢＭＰ−７、ケンフェロール（ＫＭＰ、ＣＡＳ番号５２０−１８−３）などのフラボノイド、リオシグアト（ＢＡＹ  ６３−２５２１、ＣＡＳ  ６２５１１５−５５−１）などの可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７、ＫＧＦ、ケラチノサイト増殖因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト増殖因子２）またはＦＧＦ１３（線維芽細胞増殖因子１３）など）、ＢＮＰ（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）、メントールまたはイシリンなどのＴＲＰＭ８（ＣＭＲＩ）リガンド、カエル由来などのボンベシンペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ８４２１４）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０５２３１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、オレキシンＢ、ＳＤＦ−１γ（ＣＸＣＬ１２）またはグアンファシン塩酸塩、またはこれらの組み合わせは、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはインビトロ、インビボまたはその両方でＢＡＴ前駆細胞においてＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導するために使用することができる。
【００３８】
さらに、他の実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはＵＣＰ１の発現を誘導するために使用することができる追加の薬剤またはそれらの組み合わせとしては、プロスタグランジンＪ２（ＰＧＪ２）、２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３または２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などのビタミンＤの形態およびジフルニサルなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００３９】
さらに他の実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはＵＣＰ１の発現を誘導するために使用することができる追加の薬剤またはそれらの組み合わせとしては、ＢＭＰ５（骨形成タンパク質５、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２００３）およびＢＭＰ６（骨形成タンパク質６、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２００４）などの骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子受容体様タンパク質（ＰＤＧＦＲＬ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１５１９８）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ、ＦＩＧＦ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ４３９１５）、ＣＹＴＬ１（サイトカイン様タンパク質１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＲＲ１）、ＳＣＧ２（セクレトグラニン２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１３５２１）、ＮＰＴＸ２（神経ペントラキシン２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４７９７２）、ＯＬＦＭＬ２Ｂ  （オルファクトメジン様タンパク質２Ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ６８ＢＬ８）、ＴＦＰＩ２（組織因子経路インヒビター２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８３０７）、ＩＦＮＥ（インターフェロンイプシロン、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ８６ＷＮ２）、プロスタグランジンＦ２などのプロスタグランジンＦ２−α受容体（ＰＴＧＦＲ、プロスタノイドＦＰ受容体、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４３０８８）リガンド、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、インターロイキン６（ＩＬ−６、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０５２３１）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４０９３３）、ＣＸＣＬ１２（（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２）、ストロマ細胞由来因子１、ＳＤＦ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１アイソフォームＳＤＦ−１ｇ／ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１−３）および／またはＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２）などの非定型ケモカイン受容体３のリガンド（ＡＣＫＲ３、ＣＭＫＯＲ１、ＣＸＣＲ７、ＧＰＲ１５９、ＲＤＣ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２５１０６）が挙げられる。
【００４０】
またさらなる実施形態において、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するため、および／またはＵＣＰ１の発現を誘導するために使用することができる他の薬剤またはそれらの組み合わせとしては、メトホルミンなどのビグアニド、ファモチジンなどの抗ヒスタミン剤、チアプリド塩酸塩、スピペロン、チエチルペラジンなどの抗ドパミン剤、コルヒチンなどの微小管調節剤、レセルピンもしくはシロシンゴピンなどのラウオルフィアアルカロイドまたは誘導体、ミノキシジルなどのカリウムチャネルリガンド、プロベネシド、またはフェロジピンなどのカルシウムチャネルアンタゴニストが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書で示される１つの薬剤または薬剤の組み合わせを用いた被験体（ヒト被験体を含む）の処置は、この被験体の骨格筋におけるＵＣＰ１  ｍＲＮＡまたはタンパク質の産生の増大をもたらす。例えば、いくつかの実施形態において、ロシグリタゾンを用いた被験体の処置は、骨格筋における褐色脂肪細胞の出現または分化を誘導するか、骨格筋内または骨格筋付近（骨格筋組織の表面および／または隣接した筋線維の間）に存在する褐色脂肪細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現を向上させるか、またはその両方が可能である。いくつかの実施形態において、骨格筋における褐色脂肪細胞の出現または分化は、代謝疾患に罹患した被験体において誘導され得る。褐色脂肪細胞は、高いミトコンドリア性呼吸および細胞内呼吸および脂肪酸酸化速度によってグルコースシンク（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｉｎｋ）を提供し得、熱としてエネルギーを消散させる（非共役型酸化的リン酸化）。被験体の代謝速度は、向上させることができ、体重の減少は、誘導することができる。褐色脂肪細胞の出現または分化の誘導は、インスリン感度、血中グルコース恒常性および心血管疾患危険因子の改善ももたらし得る。褐色脂肪細胞は、健常エネルギーバランスおよび低い体脂肪レベル、増大したインスリン感度および改善された血中グルコース恒常性または心血管健康に到達することに寄与する因子を、更に分泌し得る。
【００４２】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される薬剤またはそれらの組み合わせは、被験体（ヒト被験体を含む）の処置のために使用することができる。いくつかの態様において、これらの薬剤は、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進し得る。他の態様において、これらの薬剤は、インビトロ、インビボまたはその両方でＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／またはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導し得る。
【００４３】
いくつかの態様において、処置される代謝疾患は、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、高血圧、高脂血症、肝脂肪変性、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、高尿酸血症、多嚢胞性卵巣症候群、黒色表皮症、過食症、内分泌異常、トリグリセリド蓄積症、バルデー・ビードル症候群、ローレンス・ムーン症候群、プラダー・ウィリー症候群、神経変性疾患およびアルツハイマー病であり得る。
【００４４】
他の実施形態において、薬剤は、単離された自家のＢＡＴ前駆細胞を活性化させるために使用され得、当該細胞は次いで被験体（ヒト被験体を含む）の処置のために使用される。
【実施例】
【００４５】
分子経路の解明
ＣＤ３１−前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化および／またはＵＣＰ１の発現の誘導における役割を担う分子経路を解明するために、遺伝子チップ研究を行った。ＣＤ３１−細胞を、ＷＯ２０１３０７１０６３（本明細書中に参照により援用される）において以前に記載したように、ヒト骨格筋生検から単離し、２つの研究において使用した：（１）ｃＡＭＰ研究：ＣＤ３１−細胞を、ビヒクル（対照１サンプル）またはｃＡＭＰ（ｃＡＭＰサンプル）の添加を加えて（対照）、ＷＯ２０１３０７１０６３（本明細書中に参照により援用される）において記載されるように分化させた、および（２）ロシグリタゾン研究：ロシグリタゾンを脂肪生成培地（対照２サンプル）から除外することを除き、ＷＯ２０１３０７１０６３において以前に記載したように、ＣＤ３１−細胞を分化させた。ロシグリタゾンは、本研究における第２のサンプル（ロシグリタゾンサンプル）のみに添加した。上記で議論したように、これらの薬剤は、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化およびＵＣＰ１の発現を促進することが示されている。
【００４６】
総ＲＮＡをこれらのサンプルから精製し、転写プロファイルをＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  ＷＧ−６  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を用いて評価した。結果を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７．０（試用版）を用いて解析した。これらの結果を使用して、どの分子経路が、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化に関係するか、およびより重要なことに、どの分子標的を、褐色脂肪細胞の出現およびＵＣＰ１の発現を促進する薬剤の開発のために使用することができるかを決定した。
【００４７】
この取り組みに基づき、以下のメカニズムおよび薬剤：ＰＰＡＲγリガンド（例えばロシグリタゾン）、ＰＤＥ３阻害剤（例えばシグアゾダン）、ＰＤＥ４阻害剤（例えばロリプラム）、ＢＭＰ７（骨形成タンパク質７、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１８０７５）、ＢＭＰ５（骨形成タンパク質５、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２００３）、ＢＭＰ６（骨形成タンパク質６、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２２００４）、ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７、ＫＧＦ、ケラチノサイト増殖因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト増殖因子２）、ＢＮＰ（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）、ＦＧＦ１３（線維芽細胞増殖因子１３）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤（例えばリオシグアト（ＢＡＹ  ６３−２５２１、ＣＡＳ  ６２５１１５−５５−１）、ＴＲＰＭ８（ＣＭＲＩ）リガンド（例えばメントール、イシリン）、血小板由来増殖因子受容体様タンパク質（ＰＤＧＦＲＬ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１５１９８）、血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ、ＦＩＧＦ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ４３９１５）、ＣＹＴＬ１（サイトカイン様タンパク質１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＲＲ１）、ＳＣＧ２（セクレトグラニン２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１３５２１）、ＮＰＴＸ２（神経ペントラキシン２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４７９７２）、ＯＬＦＭＬ２Ｂ（オルファクトメジン様タンパク質２Ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ６８ＢＬ８）、ＴＦＰＩ２（組織因子経路インヒビター２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８３０７）、ＩＦＮＥ（インターフェロンイプシロン、ＵｎｉＰｒｏｔ
Ｑ８６ＷＮ２）およびプロスタグランジンＦ２などのプロスタグランジンＦ２−α受容体（ＰＴＧＦＲ、プロスタノイドＦＰ受容体、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４３０８８）リガンドは、ＢＡＴ前駆細胞からの褐色脂肪細胞成長を促進することが見出された。遺伝子チップデータに基づきＢＡＴ前駆細胞からの褐色脂肪細胞成長を促進することが見出された、さらに他のメカニズム／薬剤としては、：５５ａａ（ａａ２５−７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドなどの下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ、ＡＤＣＹＡＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１８５０９）遺伝子に由来するペプチド（２００ｎＭ〜２μＭ）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、インターロイキン６（ＩＬ−６、ＵｎｉＰｒｏｔ
Ｐ０５２３１）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４０９３３）、ＣＸＣＬ１２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２）、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１）アイソフォームＳＤＦ−１ｇ／ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ４８０６１−３）および／またはＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２）などの非定型ケモカイン受容体３（ＡＣＫＲ３、ＣＭＫＯＲ１、ＣＸＣＲ７、ＧＰＲ１５９、ＲＤＣ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２５１０６）のリガンドが挙げられる。
【００４８】
ヒトＵＣＰ１  ｍＲＮＡの可能性のあるモジュレーターのスクリーニング
ＣＤ３１−細胞は、これらの細胞の褐色脂肪細胞への分化を誘導するか、またはＵＣＰ１の発現を調節する薬剤（例えば、化合物、タンパク質、生物製剤など）を同定するためのツールとして使用することができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲに基づく方法は、ある薬剤によって影響され得るＵＣＰ１  ｍＲＮＡレベルを測定するために使用することができる。
【００４９】
これは、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化、ならびに／またはＵＣＰ１遺伝子の転写を向上させることおよび／もしくはＵＣＰ１転写産物を安定化させることによって、ＵＣＰ１の発現を向上させることができる薬剤の同定を可能にする。
【００５０】
例えば、ロシグリタゾンのようなＰＰＡＲγリガンドは、ＣＤ３１−前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進させるために使用することができる（図１〜１９、２０Ａ、２１、２２）。別の例は、リコンビナントタンパク質、ヒトＢＭＰ−７の使用である（図１〜１９、２１）。
【００５１】
褐色脂肪細胞マーカーＵＣＰ１、脂肪細胞マーカーＰＰＡＲγ２および内部対照として使用される「ハウスキーピング」遺伝子シクロフィリンＡに対応するｍＲＮＡ種を同時に定量することによる、ＷＯ２０１３０７１０６３において以前に開示され、本明細書中に参照により援用される確固とした方法を、褐色脂肪細胞へのＣＤ３１−細胞分化の検出のために使用した。
【００５２】
この方法は、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化を向上させる薬剤を同定するための、多数のサンプルの解析を可能にする。褐色脂肪細胞へ分化した場合、ＣＤ３１−細胞は、特定のレベルのシクロフィリンＡに対してかなり高いレベルのＵＣＰ１およびＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡを発現する。シクロフィリンＡ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化したＵＣＰ１  ｍＲＮＡレベルおよびＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡレベルは、サンプル中の細胞の総数に依存することなく、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化のレベルの指標を与える。
【００５３】
したがって、マルチプレックスＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１、ＰＰＡＲγ２およびシクロフィリンＡ  ｍＲＮＡの定量を、ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への分化を定量するために使用した。
【００５４】
この方法を使用して、以下の薬剤：ロシグリタゾンのようなＰＰＡＲγリガンド、シグアゾダンのようなＰＤＥ３阻害剤、ロリプラムのようなＰＤＥ４阻害剤、９β，１１α−プロスタグランジンＦ２のようなプロスタグランジンＦ２（ＰＧＦ２）の誘導体、５５ａａ（ａａ２５−７９）のＰＡＣＡＰプロペプチドのような下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ、ＡＤＣＹＡＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１８５０９）遺伝子に由来するペプチド、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、オレアノール酸のようなＴＧＲ５アゴニスト、ＢＭＰ−７、ケンフェロール（ＫＭＰ、ＣＡＳ番号５２０−１８−３）、リオシグアト（ＢＡＹ  ６３−２５２１、ＣＡＳ  ６２５１１５−５５−１）のような可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の刺激剤、ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７、ＫＧＦ、ケラチノサイト増殖因子）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０、ＫＧＦ−２、ケラチノサイト増殖因子２）、ＢＮＰ（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）、メントールまたはイシリンのようなＴＲＰＭ８（ＣＭＲＩ）リガンド、ボンベシン、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、オレキシンＢ、ＳＤＦ−１γ（ＣＸＣＬ１２）およびＦＧＦ１３（線維芽細胞増殖因子１３）が、ＢＡＴ前駆細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進すること、ならびに／またはインビトロ、インビボもしくはその両方でＢＡＴ前駆細胞におけるＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（ａＰ２）、ＰＰＡＲγ２、ｍｔＴＦＡ、ＰＧＣ−１αおよび／もしくはＣＯＸ  ＩＶの発現を誘導することが同定または確認された。
【００５５】
別途指示される場合を除き、分析グレードまたは分子生物学グレードの全ての有機薬品および無機薬品は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｒｏｓｐｅｃ、ＬｉｆｅＴｅｉｎ、ＡｎａＳｐｅｃから購入した。ロシグリタゾンは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（＃７１７４２）から購入し、リコンビナントヒトＢＭＰ７（ｒｈＢＭＰ７）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１００μｇ／ｍｌ、６．３μＭ、＃３５４−ＢＰ−０１０）からである。
【００５６】
細胞培養
細胞を０．２％ゼラチンコートプレート（４８ウェル組織培養、Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ＃ＣＬＳ−３５００−０４８）に１ｃｍ２あたり１０，０００個で播き、内皮細胞増殖培地２（ＥＧＭ２）（ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ増殖培地、Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−３１６２）中で３７℃でコンフルエントまで（２〜４日）および分化まで（１０〜１６日多い）培養した。ＥＧＭ２培地における２日または３日後、この培地を脂肪生成培地（これは、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．［２１］によって記載された脂肪生成培地の改変であり、分化誘導薬剤（例えばＰＰＡＲγアゴニスト）を含み得るか、または含まない可能性がある）で置換することによって、細胞を誘導して分化させた。上に記載されたＭＤＭは、ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ−１２  ５０／５０ミックス（３．１５１ｇ／ｌ、１７．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、３．６５１ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン）（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１０−０９０−ＣＶ）、５μｇ／ｍｌ（０．８６μＭ）インスリン、１μＭデキサメタゾン、１００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン、０．２ｎＭ  ３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、１０μｇ／ｍｌ（１２７ｎＭ）トランスフェリンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含む。ロシグリタゾンが分化誘導薬剤として使用される場合、これは、１μＭまたはＢＡＴ前駆細胞の脂肪細胞への分化を誘導するために十分な任意の他の濃度で供給され得る。
【００５７】
細胞増加研究のために、ＥＧＭ２培地のみで増殖させたコンフルエント細胞を、３７℃で３〜５分間のトリプシン−ＥＤＴＡを用いた処理によって剥がし、次いで１：３または１：４に分け、上に記載されるように培養した。
【００５８】
定量逆転写リアルタイムＰＣＲによるＵＣＰ１およびＰＰＡＲγ２  ｍＲＮＡの定量
総ＲＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１２１８３−０１６）を使用して細胞から調製し、第１鎖ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびランダムプライマーを使用して合成した。
【００５９】
定量リアルタイムＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ機器、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃４３６９０１６）およびカスタムのＴａｑＭａｎ遺伝子発現プローブならびにヒト脱共役タンパク質１「ＵＣＰ１」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１８３３）についてのプライマーおよびヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＡ「シクロフィリンＡ」（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０２１１３０）についてのプライマーを使用して行った。カスタムのＴａｑＭａｎ遺伝子発現試薬も多重様式における（ＵＣＰ１およびシクロフィリンＡと共に）ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ転写産物バリアント２（ＰＰＡＲγ２）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１５８６９）を同時測定するために開発した：ＵＣＰ１  ＦＡＭ−ＭＧＢプローブ：ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＧＧＴ
ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＣＣ（配列番号１）、センスプライマー：ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＧＧ（配列番号２）およびアンチセンスプライマー：ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＣＧＣ  ＡＡ（配列番号３）。シクロフィリンＡ  ＮＥＤ−ＭＧＢプローブ：ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＴＴ（配列番号４）、センスプライマー：ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡ（配列番号５）およびアンチセンスプライマー：ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡ（配列番号６）。ＰＰＡＲｇ２  ＶＩＣ−ＭＧＢプローブ：ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  Ｇ（配列番号７）、センスプライマー：ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  Ｃ（配列番号８）およびアンチセンスプライマー：ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＧＴ（配列番号９）。
【００６０】
シクロフィリンＡを、逆転写の効率に起因するいずれかの変動を説明するための対照として使用した。標的ｍＲＮＡレベルをシクロフィリンＡ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化することによって、任意の単位を決定した（Ｃｔに基づく）。
【００６１】
統計的解析
データは、平均±ＳＥＭとして表される。有意性は、独立スチューデントのｔ検定を使用して評価した。有意性は、ｐ＜０．０５で設定した。
【００６２】
細胞形態学のための写真
細胞の写真を、手持ちデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘ  ９５０）および細胞培養観察のために使用される倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ）を使用して撮影し、画像を、自動コントラストおよび自動レベルのためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ８の機能を使用して最適化した。
【００６３】
本明細書中で使用される節の見出しおよび小見出しは、構成目的のみのためであり、記載される対象物を何ら限定するものとして解釈されない。さらに、本教示は、多様な実施形態と併せて記載されるが、一方で本教示が、そのような実施形態に限定されることは意図されない。反対に、本教示は、当業者によって理解される多様な代替物、改変および等価物を含む。
【００６４】
ＵＣＰ１タンパク質の定量  褐色脂肪細胞前駆体の褐色脂肪細胞への分化は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＵＣＰ１タンパク質の定量を通じて検出することができる。
【００６５】
ＣＤ３１−細胞の褐色脂肪細胞への培養および分化を、１μＭロシグリタゾンを欠く脂肪生成分化培地（最小分化培地、ＭＤＭ）または含有する脂肪生成分化培地（参照分化培地、ＲＤＭ）を使用して行った。１５日間の分化後、細胞を４％パラホルムアルデヒド  ＰＢＳ  ｐＨ７．４を用いて固定し、標準的なプロトコルにしたがい相対的ＵＣＰ１レベル（緑）を定量するためにＵＣＰ１抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２３８４１）およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。細胞の固定の前に、核を５μＭ  ＤＡＰＩ（青）で１０分間標識した。各処理条件を、各データポイントについて合計でおよそ３６０〜４８０細胞に相当する９６ウェルプレートにおいてトリプリケートで評価した。ＩｎＣｅｌｌ  １０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェアを、ＵＣＰ１シグナル強度を測定するための自動化細胞検出スクリプトを開発するために使用した（核および細胞質検出アルゴリズムを使用する）。リードアウトとして、細胞内のＵＣＰ１シグナルの合計強度を使用し、細胞数を正規化した。
【００６６】
いくつかの実施形態において、この技術を使用して同定された薬剤またはその組み合わせとしては、ファモチジン、チアプリド塩酸塩、グアンファシン塩酸塩、レセルピン、ミノキシジル、スピペロン、ジフルニサル、シロシンゴピン、プロベネシド、メトホルミン、チエチルペラジン、コルヒチンおよびフェロジピンが挙げられる。
【００６７】
褐色脂肪細胞分化の検出
ＢＯＤＩＰＹ蛍光色素で標識された中性脂肪は、細胞質脂肪滴に組み込まれたものとなり、これは、蛍光細胞イメージングによる細胞の脂肪酸取り込みおよび脂肪細胞分化の解析を可能にする。マイクロプレートに基づくハイスループット、ハイコンテント、明視野および蛍光細胞イメージャーおよび分析器（Ｃｙｎｔｅｌｌｅｃｔ  Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）またはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）上でのイメージングの前に、細胞をＣ１−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５００／５１０  Ｃ１２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ＃Ｄ−３８２３）と共に３〜６時間培養する。
【００６８】
他の実施形態
本開示の多様な態様は、単独で、組み合わせで、または先に記載される実施形態において特に議論されない多様なアレンジにおいて使用され得るため、その適用において、その細部および先の記載に示される構成要素または図面において説明される構成要素のアレンジに限定されない。例えば、ある実施形態で記載される態様は、他の実施形態で記載される態様と任意の手段で組み合わされ得る。
【００６９】
特許請求の範囲における、請求項の要素を改変するための「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序を示す用語の使用は、それ自身によっていずれの優先順位、先行またはある請求項の要素の別のものに対する順序もしくは方法が行われる時間的順序を含まないが、請求項の要素を区別するために、特定の名称を有する１つの請求項の要素を、（順序を示す用語がなければ）同じ名称を有する別の要素から区別するためのただの標識として使用される。
【００７０】
また、本明細書中で使用される表現法および専門用語は、説明の目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。本明細書における「含む／挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関係する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびこれらのバリエーションの使用は、これらの後に列挙される項目およびこれらの等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【００７１】
本開示は、インビトロおよびインビボで褐色脂肪細胞を動員することができる、とりわけ新規の組成物を提供する。本開示の特定の実施形態が議論されているが、一方で上記の明細書は、例示的なものであり限定的なものではない。本開示の多くのバリエーションが、この明細書の検討に際し当業者に対して明らかとなる。本開示の全ての範囲は、全ての範囲の等価物を伴う特許請求の範囲、およびこのようなバリエーションを伴う本明細書への参照によって決定されるべきである。
【００７２】
参照による援用
本明細書中に参照される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が、その全体が全ての目的のために参照によって援用されることが具体的に指示されているのと同程度に、本明細書中に参照によってそのように援用される。
【化１−１】
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【化１−２】
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【化１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ＡＢＣ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ＡＢＣ】
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【図２３ＤＥＦ】
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【図２３ＧＨ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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