(57)【要約】      （修正有）【課題】ＡｐｏＥ産生を促進するための手段を提供する。【解決手段】ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分を有効成分として含むアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物は、グリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するためのものであり、より好ましくはアストロサイトによるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するためのものである。また、当該組成物は、飲食品組成物又は医薬組成物であってもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分を有効成分として含むアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物。
【請求項２】
前記組成物が、グリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記グリア細胞がアストロサイトである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が飲食品組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が医薬組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、乳幼児に摂取されるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、アポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは細胞膜の重要な脂質構成成分であり、例えば細胞膜の流動性など、その物理化学的特性を調節し、細胞膜機能と恒常性に大きな役割を果たしている。ニューロン及びグリアなどの神経系細胞は、いずれも多数の突起をもった特異的な形態と広い細胞表面積を有していることから大量のコレステロールを含有する。ヒトでは体全体のコレステロールの実に約２５％が中枢神経組織に分布する。したがって、中枢神経組織は、コレステロール要求性の高い臓器である。例えば、培養系におけるニューロンは、コレステロール合成が阻害されると生存率が著しく低下する。
【０００３】
アポリポ蛋白Ｅ（Apolipoprotein E、以下「ＡｐｏＥ」ともいう）は、中枢神経組織、特に脳脊髄液における蛋白レベルの最も高いアポリポ蛋白質であり、ＨＤＬ（high density lipoprotein）粒子（ＡｐｏＥ／ＨＤＬ）として存在している。ＡｐｏＥは、脳内での細胞間コレステロール輸送において中心的な役割を担っている。脳内ＡｐｏＥはその大部分がアストロサイトによって産生及び分泌され、また、アストロサイトには多種のＡｐｏＥ受容体が存在することから、アストロサイトは脳のコレステロールホメオスタシスに重要な役割をもつ細胞と言える（非特許文献１）。
【０００４】
アストロサイトにおけるＡｐｏＥ産生は、正常な脳神経系の発達や再生に重要である。これまでに、アストロサイトにおけるＡｐｏＥを産生を促進する物質として、9−cisレチノイン酸が、アストロサイトのＡｋｔリン酸化を促進し、ＡｐｏＥの分泌を亢進したことが記載されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】伊藤仁一, 膜（MEMBRANE）, Vol.32, No.5, pp.259-265, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のとおり、ＡｐｏＥは中枢神経組織において重要な役割を果たす。そのため、ＡｐｏＥの産生を促進できる手段があれば、脳神経系の発達や再生に資すると考えられる。そこで、本技術は、ＡｐｏＥの産生を促進する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、乳由来の成分であるラクトフェリン及びその分解物がＡｐｏＥの産生を促進することを見出した。すなわち、本技術は以下を提供する。
【０００８】
［１］ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分を有効成分として含むアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物。
［２］前記組成物が、グリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するためのものである、［１］に記載の組成物。
［３］前記グリア細胞がアストロサイトである、［２］に記載の組成物。
［４］前記組成物が飲食品組成物である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］前記組成物が医薬組成物である、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］前記組成物が、乳幼児に摂取されるものである、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本技術によれば、アポリポ蛋白Ｅの産生を促進することができる。それ故に、本技術によって、例えばアポリポ蛋白Ｅが中心的な役割を果たす脳神経系の発達又は再生が、より望ましく行われる。
なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ラクトフェリン加水分解物存在下におけるＡｐｏＥ産生に関する試験の結果を表すグラフである。
【図２】ラクトフェリン存在下におけるＡｐｏＥ産生に関する試験の結果を表すグラフである。
【図３】配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの存在下におけるＡｐｏＥ産生に関する試験の結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１２】
＜アポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物＞
本技術のアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物は、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分を有効成分として含む。
本技術の組成物によって、アポリポ蛋白Ｅの産生が促進される。アポリポ蛋白Ｅは、例えば脳神経系の発達及び／又は再生にとって重要な成分である。そのため、本技術の組成物によりアポリポ蛋白Ｅの産生が促進されることで、脳神経系のより良い発達及び／又は再生を実現することができる。
また、本技術の組成物の有効成分は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分である。当該成分は、生体への安全性が高い。そのため、本技術の組成物は、安心してヒトに投与することができる。
【００１３】
アポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）は、リポ蛋白質を構成している主要なアポリポ蛋白の一つである。ＡｐｏＥは、細胞表面のＬＤＬレセプターファミリーのリガンドとして機能し、例えばキロミクロン及びＶＬＤＬなどのリポ蛋白質の細胞への取り込みや血漿からの除去において重要な役割を果たす。ＡｐｏＥは第１９番染色体上にその遺伝子がコードされている。ＡｐｏＥは、３１７個のアミノ酸からなる蛋白質として合成され、Ｎ末端の１８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切り離され、そして、２９９個のアミノ酸からなる成熟蛋白（分子量：約３４，０００）として細胞外に分泌される。
【００１４】
ＡｐｏＥは脳内では、脳脊髄液中のリポ蛋白（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬ）と結合し、神経細胞表面に存在するＡｐｏＥ受容体（ＶＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体、及びＬＲＰ受容体）を介して神経細胞内に取り込まれる。ＡｐｏＥの中枢神経系での機能としては、中枢神経系の発達時期や神経細胞損傷後の修復期に必要なコレステロールなどの脂質の神経細胞への輸送、及び、抗酸化作用などが報告されている。そのため、ＡｐｏＥ産生の促進によって、これらの機能が発揮されると考えられる。そこで、ＡｐｏＥ産生を促進することができる本技術の組成物は、ＡｐｏＥによるこれらの作用を増強するために用いることもできる。
例えば、本技術の組成物は、コレステロールなどの脂質の神経細胞へのＡｐｏＥによる輸送を促進するために用いられる。当該輸送は、中枢神経系の発達時期及び神経細胞損傷後の修復時期において特に重要である。そのため、本技術の組成物は、当該発達時期又は当該修復時期において、投与されることが好ましい。また、中枢神経系の発達時期（好ましくは乳幼児期）では、以下に述べるとおり、本技術の有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のペプチドはいずれも、そのままの状態で腸から吸収され、脳に到達することができる。そのため、本技術の組成物は、好ましくは中枢神経系の発達時期、好ましくは乳幼児期に投与されることが好ましい。
【００１５】
ラクトフェリンは、例えば乳、涙、唾液、及び血液などの体液中に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、哺乳動物、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトなどの乳に含まれる。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものであってよい。含有量及び入手容易性の観点から、例えばウシ又はヒトの乳が、ラクトフェリンを入手するための源として好ましい。すなわち、本技術において用いられるラクトフェリンとして、例えばウシ又はヒトの乳に由来するラクトフェリンが用いられてよい。乳は、初乳、移行乳、常乳、及び末期乳のいずれでもよい。本技術において、市販入手可能なラクトフェリンが用いられてもよい。
【００１６】
本技術において用いられるラクトフェリンは、哺乳動物の乳由来のものに限定されない。例えば、当該乳を処理して得られる脱脂乳又はホエーから常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、又はトランスジェニック動物から産生された組換えラクトフェリン、合成ラクトフェリン、又はそれらの混合物であってもよい。また、ラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
【００１７】
本技術において用いられる「ラクトフェリン分解物」として、例えばラクトフェリンの酵素分解物、酸分解物、及びアルカリ分解物を挙げることができる。本技術において、ラクトフェリン分解物は、ＡｐｏＥ産生促進作用を有する限りにおいて、いずれの分解物が用いられてもよい。
【００１８】
好ましくは、当該ラクトフェリン分解物は、酵素による加水分解によって得られる加水分解物である。当該酵素として、例えばプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、キモシン、プラスミン、ペプシン、パパイン、ペプチダーゼ、及びアミノペプチダーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。当該酵素は、細菌由来又は動物由来のいずれであってもよい。細菌由来の酵素として、例えばバシラス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、プロピオンバクター属、シュードモナス属、及びストレプトコッカス属に由来する酵素が挙げられる。動物由来の酵素として、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、及びヒトに由来する酵素を挙げることができる。本技術において用いられるラクトフェリン分解物を得るために、上述の酵素を、単独で又は２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
ラクトフェリン分解物を得るために用いられる酵素は、好ましくはペプシンである。すなわち、本技術において、ラクトフェリン分解物として、ラクトフェリンのペプシン分解物が用いられる。ラクトフェリンのペプシン分解物は、優れたＡｐｏＥ産生促進作用を有する。
【００２０】
ラクトフェリンの酵素加水分解物は、例えば特開２０１６−１２１１０９号公報に記載された方法により製造可能である。当該公報に記載されているとおり、当該方法は、ラクトフェリンを酵素により加水分解する酵素反応工程を含む。当該酵素反応工程における反応条件は、例えば酵素の種類などの要因によって当業者により適宜選択されてよい。例えば、ラクトフェリンの蛋白質換算質量１ｇ当たり１０００〜２００００単位（活性単位）の割合で酵素が用いられることが好ましい。また、酵素反応の温度は、例えば３０〜６０℃、好ましくは３５〜５０℃であってよい。酵素反応の反応時間は、例えば１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間、好ましくは１２〜３６時間、より好ましくは２０〜３０時間である。
酵素反応は、例えば酵素を失活することにより停止される。当該失活は、酵素反応溶液を、例えば８０℃で３０分〜１３０℃で２秒間保持することにより行われる。
当該酵素反応工程後、例えば反応溶液のｐＨ調整工程及び反応産物の精製工程が行われてもよい。当該ｐＨ調整工程では、反応溶液のｐＨが例えば弱酸性〜中性に調整される。当該精製工程では、（ａ）濾過、（ｂ）精密濾過及び限外濾過膜などの膜分離処理、及び（ｃ）樹脂吸着分離からなる群から選択される、いずれか１種又はこれらの２種以上の組合せの処理が行われてよい。当該精製工程により、当該失活液中に含まれる不溶物の除去、及び、脂肪及び乳糖などの不要な成分を低減することができる。その結果、溶液状態で透明であり、かつ、溶液状態での長期保存においても混濁、沈殿、凝集及び褐変等がほとんど生じない、いわゆる保存安定性に優れたラクトフェリン加水分解物を得ることができる。また、精製工程により、ラクトフェリン分解物の風味及び外観を向上させることができる。
【００２１】
（ａ）の濾過は、公知の方法により実施することができ、例えば、珪藻土を用い、公知の装置により実施することができる。濾過を行うことにより、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００２２】
（ｂ）の膜分離処理は、公知の装置を用いて行うことができる。当該装置として、例えば精密濾過モジュール、並びに、限外濾過モジュールを挙げることができる。限外濾過モジュールとしては、例えば分画分子量３，０００〜２０，０００、好ましくは３，０００〜１０，０００のものを挙げることができる。これらの濾過モジュールは、例えば旭化成社より、マイクローザＭＦシリーズ及びマイクロ―ザＵＦシリーズとして市販されている。この場合、膜分離処理後の膜透過画分としてラクトフェリン加水分解物を含有する溶液が得られる。膜分離処理を行うことにより、（ａ）の濾過と同様、加水分解失活液中に存在する加水分解反応時及び／又は酵素加熱失活時に生成した不溶物を除去できる。
【００２３】
（ｃ）の樹脂吸着分離は、公知の方法により実施することができ、例えば、樹脂をカラムに充填し、前記加水分解失活液を、当該カラムを通過させることにより実施することができる。樹脂としては、例えば商品名：ダイヤイオン（三菱化学社製）、セパビーズ（三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ（オルガノ社製）、ＨＳ（味の素ファインテクノ社製）等が挙げられる。樹脂吸着分離は、これらの樹脂をカラムに充填して前記加水分解失活液を連続的に流入させ、流出させることによる連続方式で行うこともでき、また、前記加水分解失活液中に樹脂を投入し、一定時間接触させた後、加水分解失活液と樹脂とを分離するバッチ方式で行うこともできる。加水分解失活液中には、保存期間中に混濁、沈殿、凝集及び褐変等を惹起する因子（例えば、疎水性アミノ酸を多く含むペプチド等）が残存している可能性があり、樹脂吸着分離を行うことにより、これらの因子を除去できる。
【００２４】
精製工程後、ラクトフェリン加水分解物を含有する溶液を殺菌してもよい。殺菌方法は、常法による加熱処理方法等を用いることができる。加熱処理は、例えば７０℃３０分〜１４０℃２秒間で行われる。
【００２５】
得られたラクトフェリン加水分解物を含有する溶液は、そのまま本技術において使用することもでき、また、必要に応じて、当該溶液を公知の方法により濃縮して得た濃縮液を本技術において使用することもできる。また、当該溶液又は当該濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末を得、当該粉末を本技術において使用してもよい。
【００２６】
好ましくは、前記ラクトフェリン分解物（好ましくはラクトフェリン加水分解物）は、配列番号１のアミノ酸配列（ＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦ）からなるペプチドを含む。
当該ペプチドは、ラクトフェリンを、ペプシンにより加水分解することによって得られる。すなわち、当該ペプチドを含むラクトフェリン分解物も、ラクトフェリンを、ペプシンにより加水分解して高速クロマトグラフィー等により精製することによって得られる。当該ペプシンによる加水分解は、例えばペプシンがその酵素機能を発揮する条件を考慮して適宜行われてよい。当該加水分解における反応溶液のｐＨは、例えば１．５〜４．５、好ましくは２〜４であることが好ましい。
本技術の効果を奏する限りにおいて、本技術の有効成分として、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドにアミノ酸が付加されたペプチドが用いられてもよい。例えば、配列番号１のＮ末端側及び／又はＣ末端側に１〜１２残基、好ましくは１〜１０残基、好ましくは１〜５残基、より好ましくは１〜３残基、さらにより好ましくは１又は２残基のアミノ酸が追加されたアミノ酸配列からなるペプチドが用いられてもよい。すなわち、本技術において、配列番号１のアミノ酸配列を含み、且つ、アミノ酸残基の数が例えば４０以下、好ましくは３５以下、より好ましくは３０以下のアミノ酸配列からなるペプチドが用いられてもよい。
また、本技術の効果を奏する限りにおいて、本技術の有効成分として、配列番号１のアミノ酸配列の一部を置換又は欠失されたペプチドが用いられてもよい。例えば、本技術において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、３アミノ酸残基以下、好ましくは２アミノ酸残基以下、より好ましくは１アミノ酸残基が、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるペプチドが用いられてもよい。また、本技術の効果を奏する限りにおいて、本技術の有効成分として、配列番号１のアミノ酸配列に、３アミノ酸残基以下、好ましくは２アミノ酸残基以下、より好ましくは１アミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドが用いられてもよい。
【００２７】
前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、化学合成によって合成ペプチドを製造する方法、例えばペプチド固相合成法など、又は、遺伝子組換え技術を利用した遺伝子工学的手法を用いて組換え体ペプチドを合成することによって製造する方法によっても調製することが可能である。例えば、遺伝子工学的手法を用いた方法は例えば以下のとおりに行われてよい。すなわち、まず前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を基に適当なプライマーを作製する。次に当該プライマーを用いて、目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅する。そして、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより、目的のペプチドを得ることができる。
【００２８】
本技術の組成物は、グリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するのに特に適している。そのため、本技術の組成物は、好ましくは、グリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するために用いられる。グリア細胞は、脳に存在する細胞であり、神経細胞をサポートする役割を果たしていると考えられている。グリア細胞は、さらにアストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアの３種類に分類することができる。本技術の組成物により脳内におけるグリア細胞によるアポリポ蛋白Ｅ産生が促進されることで、脳神経系のより良い発達及び再生を行うことが可能となる。
【００２９】
本技術の組成物は、アストロサイトによるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するのに特に適している。そのため、本技術の組成物は、好ましくは、アストロサイトによるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進するために用いられる。脳内のアポリポ蛋白Ｅの大部分は、前記３種類のグリア細胞のうちアストロサイトによって産生及び分泌される。本技術の組成物は、アストロサイトによるアポリポ蛋白Ｅ産生を促進できるので、脳内でのアポリポ蛋白Ｅ産生を効率的に促進でき、その結果、脳神経系のより良い発達及び／又は再生が可能となる。
【００３０】
本技術の有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、本技術の組成物の全質量に対して０．０１〜２質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜０．５質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜０．２質量％の範囲であることが更に好ましい。
【００３１】
本技術の組成物の適用対象者は、好ましくは乳幼児である。当該乳幼児は、例えば０歳〜５歳であり、好ましくは０歳〜４歳、より好ましくは０〜３歳、さらにより好ましくは０〜２歳である。乳幼児の腸管は、本技術において用いられる有効成分を、そのままの状態で吸収することができる。そのため、乳幼児が本技術の組成物を摂取した場合、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び前記ペプチドは、そのままの状態で腸から吸収され、脳に到達することができる。その結果、これら有効成分が脳組織、好ましくはグリア細胞、より好ましくはアストロサイトに作用し、その結果、アポリポ蛋白Ｅの産生をより効率的に促進することができる。
また、本技術のアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物は、乳幼児以外のヒトに対して投与されてもよい。例えば、当該組成物は、脳神経系の発達及び／又は再生を支援若しくは促進が必要なヒトに投与されてもよい。
【００３２】
本技術の組成物は、例えば医薬、飲食品、又は飼料として用いられてよい。本技術の組成物には、これらの用途に用いられる場合に含まれる追加成分が適宜含まれてよい。
また、本技術の組成物は、例えば脳神経系の発達及び／又は再生にとって有用な成分をさらに含んでもよい。当該成分として、例えば、コレステロール、レチノイン酸、好ましくは９−ｃｉｓレチノイン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、リン脂質、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸、スフィンゴミエリン、ビフィズス菌及び乳酸菌を挙げることができる。本技術の組成物は、これら成分の１つ又は２つ以上を含んでよい。これらの成分をさらに含むことで、より良い脳神経系の発達及び／又は再生に資することができる。
【００３３】
＜医薬組成物＞
本技術のアポリポ蛋白Ｅ産生促進用組成物は、医薬組成物として用いることができる。本技術の医薬組成物は、脳神経系の発達及び／又は再生を支援若しくは促進するために用いられてよい。好ましくは、本技術の医薬組成物は、乳幼児の脳神経系の発達及び／又は再生を支援若しくは促進するために用いられる。
【００３４】
本技術における有効成分は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、患者の疾患の種類に関係なく安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００３５】
本技術の組成物を医薬組成物として利用する場合、当該医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれでもよく、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、例えば胃ろうを介して投与されうる。
【００３６】
また、製剤化に際しては、本技術の医薬組成物には、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤などの種々の成分が含まれてよい。また、本技術の効果を損なわない限り、本技術の医薬組成物には、公知の又は将来的に見出される脳神経系の発達及び／又は再生のために用いられる医薬成分が含まれてよい。本技術の医薬組成物の製剤化は、剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３７】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分のみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３８】
なお、製剤担体を配合する場合、本技術の有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の含有量は、剤形に合わせて適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、医薬組成物の全質量に対して０．１〜５０質量％の範囲であることが好ましく、０．５〜２０質量％の範囲であることがより好ましく、１〜５質量％の範囲であることが更に好ましい。
【００３９】
本技術の医薬組成物の投与期間は、ＡｐｏＥ産生促進が必要とされる期間に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の医薬組成物は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の医薬組成物の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。また、本技術の医薬組成物は、例えば０歳から１００歳の間、好ましくは０歳から５歳の間、より好ましくは０歳から４歳の間、さらに好ましくは０歳から３歳の間、さらにより好ましくは０歳から２歳の間に継続して摂取されてよい。
本技術の医薬組成物は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の医薬組成物を摂取する場合、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの合計摂取量は、１日当たり例えば１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００４０】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体や基剤を用いることができる。本技術の組成物の製剤化のために用いられる成分として、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、及び矯味矯臭剤が挙げられる。
【００４１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００４２】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００４３】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００４４】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００４５】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００４６】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
【００４７】
＜飲食品＞
本技術の組成物は、飲食品組成物であってよい。すなわち、本技術は、ＡｐｏＥ産生促進用飲食品組成物を提供する。本技術の飲食品組成物は、好ましくは乳幼児用である。本技術の飲食品組成物は、乳幼児に摂取された場合に、ＡｐｏＥ産生促進作用を効果的に発揮することができる。
【００４８】
本技術の飲食品組成物の例として、例えば清涼飲料若しくは乳飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えば加工乳及び発酵乳などの乳製品；育児用調製粉乳；経腸栄養食；及び機能性食品が挙げられる。
また、本技術の飲食品組成物の例として、例えば炭酸飲料、栄養飲料、若しくは果実飲料などの飲料又は当該飲料の濃縮原液及び当該飲料を調製するために用いられる粉末；例えばアイスクリーム、アイスシャーベット、及びかき氷などの冷菓；例えばそば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、及び即席麺などの麺類；例えばキャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子などの菓子類；例えばかまぼこ、ハム、及びソーセージなどの水産又は畜産加工食品；例えばサラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、及びドレッシングなどの油脂及び油脂加工食品；例えばソース及びたれなどの調味料；例えばスープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、及びパンなどの調理された食品を挙げることができる。本技術の飲食品組成物は、例えば液状及びタブレット状のサプリメントであってもよい。
【００４９】
これらの飲食品は、当業者に既知の方法により製造されてよい。これらの飲食品の製造方法において、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分を添加する時点及び方法は、当業者により適宜選択されてよい。
【００５０】
また、本技術の飲食品組成物は、例えばＡｐｏＥ産生促進用という保健用途又はＡｐｏＥ産生促進作用に起因して奏される作用に関する保健用途が表示された飲食品として提供又は販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起又は類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、及び表示する対象物又は媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
本技術の飲食品は、例えば「乳児用」、「幼児用」、「乳幼児用」、「健全な脳の発達のために」、「脳の健康のために」又は「正常な精神活動のために」などの表示が付されてよい。
【００５１】
「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００５２】
表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ（Point of purchase advertising）等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００５３】
また、「表示」には、例えば健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、及び医薬用部外品などの製品であることを示す表示が含まれる。より具体的な表示の例として、好ましくは消費者庁によって認可される表示、例えば特定保健用食品制度又はこれに類似する制度にて認可される表示などが挙げられる。消費者庁によって認可される表示の例として、例えば特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、及び疾病リスク減少表示などを挙げることができる。より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が、典型的な例である。
【００５４】
本技術の飲食品に含まれるラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物の含有量は、当業者により適宜選択されてよい。本技術の有効成分であるラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の合計含有量は、飲食品組成物の全質量に対して０．０１〜２質量％の範囲であることが好ましく、０．０２〜０．５質量％の範囲であることがより好ましく、０．０５〜０．２質量％の範囲であることが更に好ましい。
【００５５】
本技術の飲食品の摂取期間は、ＡｐｏＥ産生促進が必要とされる期間に応じて適宜決定されてよい。例えば、本技術の飲食品は、例えば２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは２か月以上にわたって継続的に摂取されてよい。本技術の飲食品の摂取は、例えば摂取開始から例えば３か月後、好ましくは６か月後、より好ましくは１年後に終了されてもよい。また、本技術の飲食品は、例えば０歳から１００歳の間、好ましくは０歳から５歳の間、より好ましくは０歳から４歳の間、さらに好ましくは０歳から３歳の間、さらにより好ましくは０歳から２歳の間に継続して摂取されてよい。
本技術の飲食品は、例えば毎日摂取されてよく、又は、例えば１日おき又は２日おきなど所定の間隔で摂取されてもよい。
本技術の飲食品を摂取する場合、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの合計摂取量は、１日当たり例えば１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００５６】
＜アポリポ蛋白Ｅの製造方法＞
本技術は、アポリポ蛋白Ｅを産生する能力を有する細胞を、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の存在下で培養することを含む、アポリポ蛋白Ｅの製造方法も提供する。
ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドはアポリポ蛋白Ｅ産生を促進することができる。よって、本技術の製造方法によって、アポリポ蛋白Ｅをより効率的に製造することが可能となる。
【００５７】
本技術の製造方法において、アポリポ蛋白Ｅを産生する能力を有する細胞が用いられる。好ましくは、当該細胞として、例えば中枢神経系に存在する細胞、好ましくはグリア細胞が用いられる。グリア細胞には、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアが包含される。本技術の製造方法において、好ましくはアストロサイトが用いられる。アストロサイトを用いることにより、より効率的にアポリポ蛋白Ｅが産生される。
また、本技術の製造方法において、前記培養の条件は、アポリポ蛋白Ｅを産生する能力を有する細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。培養に用いる培地も、培養される細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。
【００５８】
＜スクリーニング方法＞
本技術は、アポリポ蛋白Ｅ産生促進作用を有する物質のスクリーニング方法も提供する。当該スクリーニング方法は、アポリポ蛋白Ｅを産生する能力を有する細胞を、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分の存在下で培養する第一培養工程と、前記細胞を、被検物質の存在下で培養する第二培養工程と、前記第一培養工程において産生されたアポリポ蛋白Ｅの量と前記第二培養工程において産生されたアポリポ蛋白Ｅの量とを比較して、当該被検物質のアポリポ蛋白Ｅ産生促進能を判定する判定工程と、を含む。
すなわち、本技術のスクリーニング方法では、ラクトフェリン、ラクトフェリン分解物、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる１又は２以上の成分が、アポリポ蛋白Ｅ産生促進能の指標となる物質として用いられる。本技術のスクリーニング方法によって、ある物質のアポリポ蛋白Ｅ産生促進能を判定することができる。
【００５９】
本技術のスクリーニング方法において用いられるアポリポ蛋白Ｅ産生能力を有する細胞として、例えば中枢神経系に存在する細胞、好ましくはグリア細胞が用いられる。当該細胞は、好ましくはアストロサイトである。アストロサイトを用いることにより、より効率的にアポリポ蛋白Ｅが産生されるので、前記第一培養工程と前記第二培養工程において産生されたアポリポ蛋白Ｅの量の比較をより容易に行うことができる。
また、前記第一培養工程と前記第二培養工程における培養条件は、アポリポ蛋白Ｅを産生する能力を有する細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。培養に用いる培地も、培養される細胞の種類に応じて当業者により適宜選択されてよい。
【００６０】
本技術は、以下の方法及び物も提供する。
［１］
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物を、ＡｐｏＥ産生促進用組成物の製造のために使用する方法。
［２］
ＡｐｏＥ産生促進のためのラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物。
［３］
ラクトフェリン及び／又はラクトフェリン分解物を投与することで、ＡｐｏＥ産生を促進する方法。
【実施例】
【００６１】
［試験例１］
【００６２】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本技術はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６３】
［試験例１］
（１）試料の調製
ウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水に溶解して５質量％のラクトフェリン溶液を得た。当該ラクトフェリン溶液のｐＨは、塩酸溶液により３．０に調整された。当該ラクトフェリン溶液を４５℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して５質量％のペプシンを添加して、攪拌しながら２４時間反応させて、加水分解を行った。加水分解終了後、反応液を８０℃に加温し、そして、１０分間８０℃で保持して酵素を失活させた。反応液を氷冷後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６．０に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物粉末を製造した。
【００６４】
（２）細胞培養試験
生まれて１日目のＷｉｓｔａｒラットから大脳皮質を採取し、当該大脳皮質から髄膜を除去して、脳組織を得た。当該脳組織を、メスを用いて細切した。細切した脳組織を、トリプシン（０．２５％）及びＤＮａｓｅＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地に入れ、３７℃で１５分間インキュベートし組織を破砕した。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心してから上清を吸引して除去し、沈殿物に１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を加えて、沈殿物を分散させた。分散物を培養フラスコに播き、培養を行った（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになり次第、恒温振とう機を用い３７℃、２００ｒｐｍの条件で１時間振とうし、接着力が弱いミクログリアを除去して、アストロサイトを得た。
【００６５】
次いで、１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ溶液を入れた６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０６個のアストロサイトを播き７２時間培養した後、血清を除去するために、細胞が、無血清のＤＭＥＭ培養液で１回洗浄された。当該洗浄後、当該細胞を、無血清ＤＭＥＭ培養液中で１、１０若しくは１００μｇ／ｍｌ濃度のラクトフェリン加水分解物の存在下又はラクトフェリン加水分解物の不在下でさらに２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を１．５ｍｌチューブに移し、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した。
【００６６】
次に、回収された上清に対して、抗ＡｐｏＥ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った。これにより培養液中に分泌されたＡｐｏＥレベルを測定した。
当該Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔは、以下のとおりに行われた。
１０％ポリアクリルアミドゲルに、各上清１０ｕｌに４ＸＳＤＳサンプルバッファー２．５ｕｌを加えた溶液を入れて電気泳動を行い蛋白質を分離した。分離された蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフロライド）メンブレンにトランスファーした後、室温で１時間ブロッキング（５％  ｓｋｉｍｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ−Ｔ）を行った。その後、メンブレンを洗浄バッファー（ＴＢＳ−Ｔ）で１０分間、３回洗浄した。洗浄後、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ （ＡｐｏＥ）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．ＡＢ９４７）をＴＢＳ−Ｔバッファーで１,０００倍希釈した抗体溶液をメンブレンと接触させ、４℃で１６時間反応を行った。反応後、メンブレンを洗浄バッファーで１０分間、３回洗浄した後、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識ｇｏａｔ二次抗体（２．５％  ｓｋｉｍｍｉｌｋ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で５，０００倍希釈）を入れて室温で１時間反応させた後、化学発光をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ−６００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で検出した。
ラクトフェリン加水分解物の存在下（１、１０、又は１００μｇ／ｍｌ）でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度を、ラクトフェリン加水分解物の不在下（０μｇ／ｍｌ）でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度により除した値（以下、相対発光強度という）を算出した。
以上の、細胞培養試験を３回（ｎ＝３）行い、３回の試験で得られた相対発光強度の平均値を算出した。
【００６７】
（３）結果
上記細胞培養試験の結果得られた平均値を以下の表１及び図１に示す。
【００６８】
【表１】
2019116444.tif 000002
【００６９】
表１及び図１に示されるとおり、ラクトフェリン加水分解物の存在下でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度の平均値は、当該加水分解物の濃度がいずれの場合においても、ラクトフェリン加水分解物の不在下の場合と比べて、より高かった。すなわち、ラクトフェリン分解物によってアストロサイトを処理することで、アストロサイトによるＡｐｏＥ産生が促進された。
また、ラクトフェリン加水分解物の濃度が、１０μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌの場合の前記平均値は、ラクトフェリン加水分解物の不在下の場合と比べて、有意により高かった。
【００７０】
以上の結果より、ラクトフェリン分解物はアストロサイトによるＡｐｏＥ産生を促進することができることが分かる。
［試験例２］
（１）試料の調製
上記試験例１にて述べたとおりに製造したラクトフェリン加水分解物粉末を、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、凍結乾燥して配列番号１のペプチド（ＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦのアミノ酸配列からなるペプチド）粉末を得た。
また、上記試験例１において用いたウシ・ラクトフェリン（森永乳業株式会社製）自体も、試料として用意した。
【００７１】
（２）細胞培養試験
上記試験例１にて述べたとおりにアストロサイトを得た。０、１、１０若しくは１００μｇ／ｍｌ濃度のウシ・ラクトフェリン又は０、１、１０若しくは１００μｇ／ｍｌ濃度の上記配列番号１のペプチドを前記ラクトフェリン加水分解物の代わりに用いたこと以外は試験例１と同じようにアストロサイトを培養し、そして、培養後に上清を回収した。当該上清に対して、試験例１で述べたとおりにＡｐｏＥレベルの測定を行い、相対発光強度を算出した。試験例２では、試験例１と異なり、細胞培養試験は１回（ｎ＝３）行われた。
【００７２】
（３）結果
上記細胞培養試験の結果を以下の表２並びに図２及び３に示す。
【００７３】
【表２】
2019116444.tif 000003
【００７４】
表２及び図２に示されるとおり、ラクトフェリンの存在下でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度の平均値は、当該試料の濃度がいずれの場合においても、ラクトフェリンの不在下の場合と比べて、より高かった。すなわち、ラクトフェリンによってアストロサイトを処理することで、アストロサイトによるＡｐｏＥ産生が促進された。
また、表２及び図３に示されるとおり、配列番号１のペプチドの存在下でアストロサイトを培養した場合に得られた発光強度の平均値は、当該試料の濃度がいずれの場合においても、配列番号１のペプチドの不在下の場合と比べて、有意により高かった。すなわち、配列番号１のペプチドによってアストロサイトを処理することで、アストロサイトによるＡｐｏＥ産生が促進された。
以上のことから、ラクトフェリン及び配列番号１のペプチドによっても、アストロサイトによるＡｐｏＥ産生を促進することができることが分かる。また、配列番号１のペプチドを用いた場合には、低濃度であっても有意にＡｐｏＥ産生が促進されることが分かる。
【図１】
2019116444.tif 000004
【図２】
2019116444.tif 000005
【図３】
2019116444.tif 000006
【配列表】
2019116444000001.app