(57)【要約】【課題】新規なα４β７ペプチド二量体拮抗薬を提供すること。【解決手段】本発明は、粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）へのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるα４β７の結合を阻害し、α４β１の結合を選択しない高い選択性を示すジスルフィドに富んだ二量体分子に関する。本発明は、インテグリン拮抗薬活性を示す、新規なクラスのペプチド化合物に関する。本発明はさらに、α４β７インテグリンに対する高い特異性を示す、新規なクラスのペプチド化合物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリン結合により発症または悪化する状態の処置に有用な活性を有する新規な化合物、該化合物を含む医薬組成物、該化合物を使用する処置方法およびインテグリン結合をブロックまたは破壊する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞接着および遊走から遺伝子制御に及ぶ多数の細胞過程に関与するα／βヘテロ二量体細胞表面受容体と、非共有結合的に会合する（Ｄｕｂｒｅｅら、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  α４β７  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｔｓ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２、４５、３４５１−３４５７）。インテグリンの差次的発現は、細胞の接着特性を制御でき、さまざまな炎症シグナルに応答して、さまざまな白血球集団を特定の器官に補充させることができる。放置された場合、インテグリン媒介性接着過程は、慢性炎症および自己免疫疾患につながり得る。
【０００３】
α４インテグリン、α４β１およびα４β７は、消化管を通してのリンパ球遊走において基本的な役割を果たす。これらは、ＢおよびＴリンパ球を含む大部分の白血球において発現され、これらは、それぞれ、これらの個別の第１リガンド、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）および粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）に結合することにより細胞接着を媒介する。これらのタンパク質は、ＶＣＡＭは、α４β１およびそれより程度は低いがα４β７の両方に結合するが、ＭＡｄＣＡＭはα４β７に高度に特異的であるという点で、結合特異性が異なる。α４サブユニットとの対合に加えて、β７サブユニットもまた、αＥサブユニットとヘテロ二量体複合体を形成して、αＥβ７を形成し、これは主に腸、肺および泌尿生殖路内の上皮内リンパ球（ＩＥＬ）において発現される。αＥβ７もまた、腸内の樹状細胞において発現される。αＥβ７ヘテロ二量体は、上皮細胞においてＥ−カドヘリンと結合する。ＩＥＬ細胞は、上皮区画内で免疫監視の機序を提供すると考えられる。したがって、αＥβ７およびα４β７を一緒にブロックすることが、腸の炎症状態の処置にとって有用な方法になり得る。
【０００４】
特定のインテグリン−リガンド相互作用の阻害剤は、さまざまな自己免疫疾患の処置のための抗炎症剤として有効であることが示されている。例えば、α４β７に対する高い結合親和性を表すモノクローナル抗体は、胃腸の自己炎症疾患／自己免疫疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎に対して治療利益を表した。同書。しかし、これらの療法は、α４β１インテグリン−リガンド相互作用に干渉し、それによって患者に危険な副作用をもたらす。小分子拮抗薬を利用する療法は、動物モデルにおいて同様な副作用が示されており、それによってこれらの技術のさらなる開発を妨げている。
【０００５】
したがって、さまざまな胃腸自己免疫疾患に対する療法として、当分野において、α４β７インテグリンに対する高い親和性およびα４β１インテグリンを選択しないような（ａｇａｉｎｓｔ）高い選択性を有するインテグリン拮抗薬分子の必要性がある。
【０００６】
このようなインテグリン拮抗薬分子を、本明細書において開示する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｕｂｒｅｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００２）４５、３４５１頁〜３４５７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、当分野の現状に応じて、特に、α４β７に対して選択的な、現在利用可能なインテグリン拮抗薬により完全に解決されていない、当分野の問題および必要性に応じて開発された。したがって、本発明は、抗炎症剤および／または免疫抑制剤としての使用のための、α４β７拮抗薬二量体ペプチドを提供する。さらに本発明は、ＭＡｄＣＡＭを発現する組織に対するα４β７の生物学的機能に関連する状態の処置に使用するための、α４β７拮抗薬（ａｎｔｏｇｏｎｉｓｔ）二量体ペプチドを提供する。
【０００９】
本発明は、インテグリン拮抗薬活性を示す、新規なクラスのペプチド化合物に関する。本発明はさらに、α４β７インテグリンに対する高い特異性を示す、新規なクラスのペプチド化合物に関する。本発明の化合物は、連結部分を介してＣ末端またはＮ末端により一緒に連結された、対合された２つのサブユニットを含む。本発明の各サブユニットは、結合して環化構造を形成できる、天然または非天然の２つのアミノ酸をさらに含む。したがって、本発明の化合物は、二量体の各サブユニットが、ジスルフィド塩架橋、アミド結合または等価連結の少なくとも１つにより環化構造を形成する、二量体化ペプチドを含む。この特徴は、治療薬として経口投与された場合、化合物に安定性の増加を提供する。この特徴はさらに、非環化類似体と比較して特異性および効力の増加を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は、２つの連結された、式（Ｉ）：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５、（Ｉ）（配列番号１）
のサブユニットを含む二量体化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を提供し、
式（Ｉ）は、連結されて、本発明に従った二量体分子を形成するホモ−またはモノマーであり、式中、Ｘａａ１は不在であるか、Ｘａａ１は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ１は、水素、Ａｃ−、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ２は不在であるか、Ｘａａ２はＡｃ−であるか、Ｘａａ２はＮＨ２であるか、Ｘａａ２は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ３は不在であるか、Ｘａａ３はＡｃ−であるか、Ｘａａ３はＮＨ２であるか、Ｘａａ３は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ３は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔおよびＴｈｒ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ４は、Ｃｙｓ、Ｐｅｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、β−Ａｓｐ、β−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ５は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−（Ｍｅ）ｓｙｍ、Ａｒｇ−（Ｍｅ）ａｓｙｍ、４−Ｇｕａｎ、Ｃｉｔ、Ｃａｖ、および適切な同配体代替物からなる群より選択され；Ｘａａ６は、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔおよび適切な同配体代替物からなる群より選択され；Ｘａａ７は、Ａｓｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐおよび適切なＡｓｐに対する同配体代替物からなる群より選択され；Ｘａａ８は、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔおよびＮ−Ｍｅ−Ｔｈｒを含むＮ−メチルアミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ９は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ホモ−Ｌｅｕ、ｎ−ブチルＡｌａ、ｎ−ペンチルＡｌａ、ｎ−ヘキシルＡｌａ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ、および適切な同配体代替物からなる群より選択され；Ｘａａ１０は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、β−Ａｓｐ、β−Ｇｌｕ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択され；Ｘａａ１１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｓ���ｒ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｈＰｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｏ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、ジヒドロ−Ｔｒｐ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｄａｂ（Ａｃ）、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ  Ｂｉｐ、Ａｌａ（３，３ジフェニル）、ビフェニル−Ａｌａ、芳香環置換Ｐｈｅ、芳香環置換Ｔｒｐ、芳香環置換Ｈｉｓ、ヘテロ芳香族アミノ酸、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）、４−Ｍｅ−Ｐｈｅ、および対応するＤ−アミノ酸ならびに適切な同配体代替物からなる群より選択され；Ｘａａ１２は不在であるか、Ｘａａ１２は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ１２は、Ｇｌｕ、アミド、Ｌｙｓ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ１３は不在であるか、Ｘａａ１３はＡｃであるか、Ｘａａ１３は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ１３は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ１４は不在であるか、Ｘａａ１４は適切なリンカー部分であるか、またはＸａａ１４は、天然アミノ酸、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、適切な同配体代替物、対応するＤ−アミノ酸および対応するＮ−メチルアミノ酸からなる群より選択され；Ｘａａ１５は、本明細書において定義された適切なリンカー部分であるか、Ｘａａ１５は、ＤＩＧ、ＤＩＧ−ＯＨ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、トリフルオロ酪酸、２−Ｍｅ−トリフルオロ酪酸、トリフルオロペンタン酸、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、およびドデカンジオン酸からなる群より選択され；式（Ｉ）は、ＤＩＧ、ＤＩＧ−ＯＨ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、適切な芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールからなる群より選択される適切なＣ末端またはＮ末端リンカーにより接合される、２つのサブユニットから形成される二量体を含む。���業者は、本明細書に開示のＣおよびＮ末端リンカー部分が、適切な限定されない例であり、本発明が任意の適切なリンカー部分を含み得ることを理解していると思われる。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、配列番号１−１３６により表されるペプチド分子から選択される２つのモノマーサブユニットから構成されるホモまたはヘテロ二量体分子を含み、代表的モノマーのＣまたはＮ末端は、任意の適切なリンカー部分により連結され、インテグリン拮抗薬活性を有する二量体分子を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、インテグリン拮抗薬療法を必要とする患者を処置するための、式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む、組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、α４β７特異的拮抗薬療法を必要とする患者を処置するためのα４β７インテグリンに対する高い選択性を有する式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、α４β７−特異的拮抗薬療法を必要とする患者を処置するための、α４β１インテグリンを選択しないようにα４β７インテグリンに対して高い選択性を有する式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、α４β７−特異的拮抗薬療法を必要とする患者を処置するための、αＥβ７インテグリンを選択しないようにα４β７インテグリンに対して高い選択性を有する式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む組成物を提供する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、α４β７特異的拮抗薬療法を必要とする患者を処置するための、αＥβ７インテグリンを選択しないようにα４β７インテグリンに対して低い選択性を有する式（Ｉ）の化合物を、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、インテグリン−拮抗薬療法を必要とする患者を処置するための、患者に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
また、本発明のさらに別の態様は、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病（非熱帯性スプルー）、血清反応陰性関節症に伴う腸症、顕微鏡的またはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、放射線療法もしくは化学療法または直腸結腸切除術および回腸肛門吻合術後にもたらされる回腸嚢炎ならびにさまざまな形態の胃腸癌由来の疾患の処置のための組成物を提供する。別の実施形態において、状態は、膵炎、インスリン依存性真性糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、ぜんそくまたは移植片対宿主病である。加えて、現在利用可能な療法、医療手技および治療薬と組み合わせて使用した場合、これらの化合物は、これらの疾患の予防または逆転にも有用であり得る。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、疾患の可視化および診断のための、キレート基および非侵襲診断手順のためのｉｎ  ｖｉｖｏイメージング剤として使用するための検出可能な標識の少なくとも１つによりさらに標識された、経口的に安定な式（Ｉ）の化合物を投与するステップを含む診断方法を提供する。
【００１９】
本発明の上記および他の特徴および利点が得られる様式が容易に理解されるために、上で簡単に記載した本発明のより具体的説明を、添付の図面に例示したこれらの特定の実施形態を参照することによって表すものである。これらの図面は、本発明の典型的実施形態だけを表すものであり、したがってその範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本発明は、添付の図面の使用により、さらに特定され、詳細に記載および説明されることを理解されたい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
式（Ｉ）Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５、（Ｉ）の２つのペプチドモノマーサブユニットを含むペプチド二量体化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｘａａ１は、適切なリンカー部分、不在、水素、Ａｃ−、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体、対応するＤ−アミノ酸および適切なリンカー部分からなる群より選択され；
Ｘａａ２は、Ａｃ−、ＮＨ２、適切なリンカー部分、不在、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体、適切なリンカー部分および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ３は、Ａｃ−、ＮＨ２、適切なリンカー部分、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体、適切なリンカー部分および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ４は、Ｃｙｓ、Ｐｅｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ５は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−（Ｍｅ）ｓｙｍ、Ａｒｇ−（ｍｅ）ａｓｙｍ、４−Ｇｕａｎ、Ｃｉｔ、Ｃａｖ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ６は、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、適切な同配体代替物および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ７は、Ａｓｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ、Ａｓｐに対する適切な同配体代替物および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ８は、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｎ−メチルアミノ酸；適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ９は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ホモ−Ｌｅｕ、ｎ−ブチルＡｌａ、ｎ−ペンチルＡｌａ、ｎ−ヘキシルＡｌａ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ１０は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＧｌｕＤａｐ、Ｄａｂ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ１１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＣＯＮＨ２、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｓａｒ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｈＰｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｏ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、ジヒドロ−Ｔｒｐ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｄａｂ（Ａｃ）、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｂｉｐ、Ａｌａ（３，３ジフェニル）、ビフェニル−Ａｌａ、芳香環置換Ｐｈｅ、芳香環置換Ｔｒｐ、芳香環置換Ｈｉｓ、ヘテロ芳香族アミノ酸、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）、４−Ｍｅ−Ｐｈｅ、対応するＤ−アミノ酸；適切な同配体；および適切なリンカー部分からなる群より選択され；
Ｘａａ１２は、Ｇｌｕ、アミド、Ｌｙｓ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、適切な同配体、適切なリンカー部分および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ１３は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２、不在、適切なリンカー部分、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択され；
Ｘａａ１４は、天然アミノ酸、不在、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＮＨ２、適切な同配体、適切なリンカー、対応するＤ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸からなる群より選択され；ならびに
Ｘａａ１５は、適切なリンカーおよび不在からなる群より選択される、
ペプチド二量体化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
（項目２）
Ｘａａ１が不在であり、Ｘａａ２がＡｃ、ＮＨ２および適切なリンカーからなる群より選択される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目３）
Ｘａａ１およびＸａａ２が不在の場合、Ｘａａ３がＡｃ、ＮＨ２および適切なリンカーからなる群より選択される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目４）
Ｘａａ１０が、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択される場合、Ｘａａ４がＡｓｐ、ＧｌｕおよびｈＧｌｕからなる群より選択され、Ｘａａ１０がＡｓｐ、Ｇｌｕ、およびｈＧｌｕからなる群より選択される場合、Ｘａａ４が、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目５）
Ｘａａ４およびＸａａ１０がＣｙｓおよびＰｅｎからなる群より選択される場合、Ｘａａ４およびＸａａ１０が、ジスルフィド結合により環化される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目６）
Ｘａａ４がＬｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択される場合、およびＸａａ１０が、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびｈＧｌｕからなる群より選択される場合、Ｘａａ４およびＸａａ１０がアミド結合により環化される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目７）
前記適切なリンカーが、ＤＩＧ、ＤＩＧ−ＯＨ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、適切な芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールからなる群より選択される、項目１に記載のペプチド二量体化合物。
（項目８）
患者において炎症性腸疾患を処置するための方法であって、前記患者に、有効量の項目１に記載のペプチド二量体化合物を投与するステップを含む、方法。
（項目９）
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記炎症性腸疾患がクローン病である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ペプチド二量体化合物が、α４β７のＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害する、項目８に記載の方法。
（項目１２）
炎症性腸疾患を有するヒトを処置するための方法であって、前記ヒトに、項目１に記載の組成に従った有効量のペプチド二量体を投与するステップを含む、方法。
（項目１３）
前記ペプチド二量体を初期用量として投与し、次いで１以上の後続用量を投与するステップをさらに含み、任意の２回の用量の間の最低間隔が１日未満の期間であり、前記用量の各々が有効量の前記ペプチド二量体を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記有効量のペプチド二量体が、以下：
ａ）α４β７インテグリン分子のＭＡｄＣＡＭ結合部位の約５０％以上の飽和；ｂ）細胞表面におけるα４β７インテグリン発現の約５０％以上の阻害；ならびにｃ）α４β７分子のＭＡｄＣＡＭ結合部位の約５０％以上の飽和および細胞表面におけるα４β７インテグリン発現の約５０％以上の阻害
からなる群より選択されるもののうちの少なくとも１つを達成するために十分であり、ここで
ｉ）前記飽和が、１日２回以下の投薬頻度に一致する期間の間維持されるか；
ｉｉ）前記阻害が１日２回以下の投薬頻度に一致する期間の間維持されるか；または
ｉｉｉ）前記飽和および前記阻害が、それぞれ、１日２回以下の投薬頻度に一致する期間の間維持される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ペプチド二量体が経口投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ペプチド二量体が非経口投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記ペプチド二量体が局所投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記ペプチド二量体が配列番号３９−１３６からなる群より選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記ペプチド二量体を、前記炎症性腸疾患を改善するために十分な間隔で前記ヒトに投与するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
α４β７の生物学的機能が関係する状態を患うヒトを処置するための方法であって、項目１に記載の組成に従ったペプチド二量体を前記ヒトに投与するステップを含む、方法。
（項目２１）
前記ペプチド二量体を、前記状態を改善するために十分な間隔で前記ヒトに投与するステップを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記間隔が、絶え間なく、１時間ごと、４時間ごと、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日おき、毎週、週に２回および毎月からなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
項目１に記載のペプチド二量体化合物を安定化させるための方法であって、Ｘａａ４およびＸａａ１０を、ＣｙｓおよびＰｅｎからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換するステップを含み、ここでＸａａ４およびＸａａ１０が、ジスルフィド結合により環化構造を形成する、方法。
（項目２４）
式（ＩＩ）Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２（ＩＩ）のペプチド二量体化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を安定化させるための方法であって、Ｘａａ４およびＸａａ１０を、アミド結合およびジスルフィド結合の少なくとも１つにより環化構造を形成できる、適合性のアミノ酸残基で置換するステップを含む、方法。
（項目２５）
前記適合性アミノ酸が、ＣｙｓおよびＰｅｎからなる群より選択され、Ｘａａ４およびＸａａ１０が、ジスルフィド結合により環化構造を形成する、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
Ｘａａ４が、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択される場合、およびＸａａ１０が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、β−Ａｓｐおよびβ−Ｇｌｕからなる群より選択される場合、Ｘａａ４およびＸａａ１０がアミド結合により環化される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の少なくとも１つに従ったペプチド二量体化合物を含む医薬組成物。
（項目２８）
腸溶コーティングをさらに含む、項目２７に記載の組成物。
（項目２９）
前記腸溶コーティングが、被験体の下部胃腸系で前記医薬組成物を保護および放出する、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
被験体において状態を処置するための方法であって、項目２７に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含み、前記状態が、前記被験体においてα４β７の活性を（部分的または完全に）低下させることによって処置可能である、方法。
（項目３１）
前記被験体がヒトである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記状態が、前記胃腸系の炎症性状態である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
α４β７の生物学的機能に関連する状態を患うヒトを処置するための方法であって、式（Ｉ）のペプチド二量体を、ＭＡｄＣＡＭを発現する組織に対するα４β７の前記生物学的機能を、（部分的または完全に）阻害するために十分な量で個体に投与するステップを含む、方法。
（項目３４）
α４β７の生物学的機能に関連する状態を患うヒトを処置するための方法であって、ＭＡｄＣＡＭを発現する組織に対するα４β７の前記生物学的機能を、少なくとも部分的に阻害するために十分な有効量で式（Ｉ）のペプチド二量体を個体に投与するステップを含む、方法。
（項目３５）
前記状態が炎症性腸疾患である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記状態が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病（非熱帯性スプルー）、血清反応陰性関節症に伴う腸症、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、放射線療法、化学療法、直腸結腸切除術および回腸肛門吻合術後にもたらされる回腸嚢炎、胃腸癌、膵炎、インスリン依存性真性糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、ぜんそくおよび移植片対宿主病からなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記ペプチド二量体が、経口、静脈内、腹膜、皮内、皮下、筋肉内、髄腔内、吸入、蒸気療法、噴霧療法、舌下、口腔内、非経口、直腸、膣および局所からなる群より選択される投与形態により前記個体に投与される、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
式（Ｉ）および式（ＩＩ）の少なくとも１つに従ったα４β７インテグリン拮抗薬二量体分子により個体を処置するための方法であって、前記α４β７インテグリン拮抗薬二量体分子が延長された半減期を備える、方法。
（項目３９）
前記延長された半減期が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて少なくとも１日である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記半減期が、ｉｎ  ｖｉｖｏで１日２回以下の投薬頻度に一致する期間と同じかそれより長い場合、前記α４β７インテグリン拮抗薬二量体分子が、経口投与される医薬調製物を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記半減期が、ｉｎ  ｖｉｖｏでおよそ１２時間から２４時間より長い場合、前記α４β７インテグリン拮抗薬二量体分子が、非経口投与される医薬調製物を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
半減期がｉｎ  ｖｉｖｏでおよそ１２時間から２４時間より長い場合、前記α４β７インテグリン拮抗薬二量体分子が、局所投与される医薬調製物を含む、項目３６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＣおよびＮ末端二量体化を示す模式図である。
【図２】図２は、配列番号５８に従ったインテグリン拮抗薬モノマーサブユニットのペアを示す模式図であり、このサブユニットは整列され、それらの各々のＣ末端において、本発明の代表的実施形態に従ったＤＩＧリンカーにより連結される。
【図３】図３は、本発明のさまざまな代表的実施形態に従った配列番号３９、５７、８２、１０２および１２１により表されるインテグリン拮抗薬ホモ二量体分子に関する安定性データを実証するチャートである。
【図４】図４は、本発明のさまざまな代表的実施形態の代表的選択に従った、配列番号７１、４９．６３、５９、６１、６３、６５、６６および８３により表されるインテグリン拮抗薬モノマーおよびホモ二量体分子に関する効力および選択性を実証するチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表
添付の配列表に記載のアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義された、アミノ酸の３文字コードを使用して示す。モノマーサブユニットだけを示したが、本教示に従い、図１および２に大まかに示したように、モノマーサブユニットが二量体化されて、ペプチド二量体分子を形成することは理解されよう。モノマーサブユニットは、本明細書において定義したような適切なリンカー部分により二量体化することができる。モノマーサブユニットのいくつかは、両方が遊離のアミンを有するＣおよびＮ末端を有することが示される。したがって、使用者は、モノマーサブユニットを修飾して、ＣまたはＮ末端のどちらかの遊離アミンを除去して、それによって、残りの遊離アミンにおいて二量体化を可能にしなければならない。したがって、モノマーサブユニットのいくつかは、遊離のカルボキシ末端および遊離のアミノ末端の両方を含み、そのため、使用者は、サブユニットを選択的に修飾して、所望の末端において二量体化を達成することができる。したがって、当業者は、本発明のモノマーサブユニットが、選択的に修飾され、所望の二量体化のための特定の単一アミンを達成可能であることを理解されると思われる。
【００２２】
本明細書に開示のモノマーサブユニットのＣ末端残基は、特に他のことが明記されない限りアミドであることもさらに理解されると思われる。さらに、Ｃ末端における二量体化は、当分野において一般的に理解されるように、アミン官能性を有する側鎖を含む適切なアミノ酸を使用することによって容易になることも理解されている。Ｎ末端残基に関しては、二量体化は、当分野において一般的に理解されるように、末端残基の遊離アミンにより達成することができるか、または遊離アミンを有する適切なアミノ酸側鎖を使用することによって達成することができることも理解されている。
【００２３】
添付の配列表において、
配列番号１は、式（Ｉ）の二量体化合物モノマーサブユニットを示す。
【００２４】
配列番号２は、式（ＩＩ）の二量体化合物モノマーサブユニットを示す。
【００２５】
配列番号３−３８、４９、５７−７１、７６−１１７および１２４−１３６は、二量体化され、本発明に従ったさまざまな二量体化合物を形成するモノマーサブユニットのアミノ酸配列を示し、これらの配列は、Ｎ−メチル化アルギニンにより置換されている。
【００２６】
配列番号３９−４４、５８−６５、６７−７１、７４−７６、８２、８３、８５、８６、１００−１１４および１１６−１３６は、それらの各々のＣ末端において二量体化され、本発明に従ったさまざまな二量体化合物を形成するモノマーサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号４５−５７、６６、７２−７３、７７−８１、８４、８７−９９および１１５は、それらの各々のＮ末端において二量体化され、本発明に従ったさまざまな二量体化合物を形成するモノマーサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００２８】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書において使用する場合、「ａ」および「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他のことを明記しない限り、複数の言及を含む。
【００２９】
本明細書において使用する場合、下記の用語は示された意味を有する。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により一緒に接合された２以上のアミノ酸の配列を、広い意味で指す。この用語が、アミノ酸のポリマーの特定の長さを暗示することはなく、ポリペプチドが、組み換え技術、化学的もしくは酵素的合成を使用して作製されたか、または天然に存在するものであるかどうかを暗示または区別する意図のものでもないことを理解するべきである。
【００３１】
本明細書において使用する場合「ＤＲＰ」という用語は、ジスルフィドに富んだペプチドを指す。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「二量体」という用語は、２以上のサブユニットを含み、該サブユニットが、それらのＣまたはＮ末端において連結されたＤＲＰであるペプチドを、広い意味で指す。本発明の二量体は、ホモ二量体およびヘテロ二量体ならびにインテグリン拮抗薬としての機能を含み得る。
【００３３】
本明細書において使用する場合、「Ｌ−アミノ酸」という用語は、ペプチドの「Ｌ」異性体形態を指し、逆に、「Ｄ−アミノ酸」という用語は、ペプチドの「Ｄ」異性体形態を指す。本明細書に記載のアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であることが好ましいが、所望の機能性がペプチドにより保持されている限り、「Ｄ」異性体形態の残基を任意のＬ−アミノ酸残基の代わりにすることができる。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「ＮＨ２」という用語は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。本明細書において使用する場合、「ＯＨ」という用語は、ペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。さらに、本明細書において使用する場合、「Ａｃ」という用語は、ポリペプチドのＣまたはＮ末端のアシル化によるアセチル保護を指す。
【００３５】
本明細書において使用する場合、「カルボキシ」という用語は、−ＣＯ２Ｈを指す。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「同配体代替物（ｉｓｏｓｔｅｒｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」という用語は、指定されたアミノ酸と類似の化学的および／または構造的特性を有する任意のアミノ酸または他の類似体部分を指す。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「環化された」という用語は、ポリペプチド分子の一部分がポリペプチド分子の別の部分に連結し、例えばジスルフィド架橋または他の類似の結合を形成することによって、閉環を形成する反応を指す。
【００３８】
本明細書において使用する場合、「サブユニット」という用語は、ＣまたはＮ末端において接合され、二量体ペプチド組成物を形成するポリペプチドモノマーのペアの一方を指す。
【００３９】
本明細書において使用する場合、「二量体」という用語は、末端結合および／または末端リンカーにより接合された、２つの構造的に類似のモノマーからなる化学的実体を指す。
【００４０】
本明細書において使用する場合、「リンカー」という用語は、複数のＤＲＰモノマーサブユニットを一緒に連結して、二量体を形成可能な化学構造を、広い意味で指す。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「受容体」という用語は、特定の化学基または分子に対する親和性を有する、細胞表面または細胞内部にある分子の化学基を指す。二量体ペプチドと標的化されたインテグリンとの間の結合は、有用な診断ツールを提供できる。
【００４２】
本明細書において使用する場合、「インテグリン関連疾患」という用語は、インテグリン結合の結果として発現し、インテグリン拮抗薬の投与により処置され得る適応症を指す。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、水または油に可溶性または分散性であり、過度の毒性、刺激およびアレルギー反応を起こさずに疾患の処置に適切であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合っており、それらの意図される使用に有効である、本発明の化合物の塩または両性イオン形態を表す。塩は、化合物の最終的単離および精製の間、またはアミノ基と適切な酸とを反応させることによって別々に調製することができる。代表的酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩（ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、３−フェニルプロプリオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。また、本発明の化合物中のアミノ基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルの硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステリルの塩化物、臭化物およびヨウ化物；ならびにベンジルおよびフェネチルの臭化物により四級化することができる。治療的に許容される付加塩の形成に用いることができる酸の例としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸ならびに有機酸、例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸が挙げられる。
【００４４】
全てのペプチド配列は、一般的に認められている慣習に従って書かれており、α−Ｎ末端アミノ酸残基が左であり、α−Ｃ末端が右である。本明細書において使用する場合、「α−Ｎ末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−アミノ基を指し、「α−Ｃ末端」という用語は、ペプチド中のアミノ酸の遊離α−カルボン酸末端を指す。
【００４５】
大部分は、本明細書において使用される、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノアシル残基の名称は、ＩＵＰＡＣ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにより提唱された命名規則および「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  α−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ、１９７４）」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４（２）、（１９７５）に述べられたＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに従っている。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられるアミノ酸およびアミノアシル残基の名称および略称が、それらの提唱と異なる程度まで、それらを読者に明らかにするものである。本発明の記載に有用ないくつかの略称は、下記の表１において以下に定義される。
【００４６】
【表１−１】
2019001825.tif 000002
【００４７】
【表１−２】
2019001825.tif 000003
【００４８】
本発明は概して、インテグリン拮抗薬活性を有することが示されているＤＲＰに関する。特に、本発明は、それぞれが、ジスルフィド結合により環化構造を形成する、ヘテロ−またはホモ−モノマーサブユニットを含むさまざまなペプチド二量体に関する。モノマーサブユニットは、図１に示すようにそれらのＣまたはＮ末端のどちらかにおいて連結される。各サブユニットの環化構造は、以下に述べるように二量体分子の効力および選択性を増加させることが示されている。環化構造の限定されない、代表的な例示を、図２に示す。
【００４９】
本発明のリンカー部分は、本明細書の教示に適合する任意の構造、長さおよび／またはサイズを含み得る。少なくとも一実施形態において、リンカー部分は、ＤＩＧ、ＰＥＧ４、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、Ｂｏｃ−ＩＤＡ、グルタル酸、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、１，２−フェニレン二酢酸、トリアジン、Ｂｏｃ−トリアジン、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有する、ポリエチレングリコール系リンカーからなる限定されない群より選択される。適切なリンカー部分の限定されない例を、表２に提供する。
【００５０】
【表２−１】
2019001825.tif 000004
【００５１】
【表２−２】
2019001825.tif 000005
【００５２】
本発明は、さまざまなアミノ酸で置換された、さまざまなＤＲＰをさらに含む。例えば、いくつかのペプチドは、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｐｅｎ、Ｓａｒ、Ｃｉｔ、Ｃａｖ、４−ｇｕａｎおよびさまざまなＮ−メチル化アミノ酸を含む。当業者は、さらなる置換が為され、同様の所望の結果を得ることができること、およびこのような置換が本発明の教示および精神の範囲内であることを理解していると思われる。
【００５３】
一態様において、本発明は、二量体化合物の各サブユニットが構造Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５（Ｉ）
を含む二量体化合物に関し、
式（ＩＩ）  Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２、（ＩＩ）（配列番号２）またはこれらの薬学的に許容される塩は、ホモまたはヘテロ二量体分子のサブユニットをさらに表し、各サブユニットは９アミノ酸を含む。ノナペプチドのＮ末端は、式（Ｉ）のＸａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３により表される、１から３の適切な基により修飾することができる。式（Ｉ）の基Ｘａａ１３、Ｘａａ１４およびＸａａ１５は、ペプチドのＣ末端を修飾するために適切な１から３の基を表す。
【００５４】
いくつかの実施形態において、Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ３は不在である。他の実施形態において、Ｘａａ１は不在であり、Ｘａａ２およびＸａａ３は、ノナペプチドのＮ末端を修飾するために適切な基を表す。さらに、いくつかの実施形態において、Ｘａａ１およびＸａａ２は不在であり、Ｘａａ３は、ノナペプチドサブユニットのＮ末端を修飾するための単一の適切な基を表す。
【００５５】
Ｘａａ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択される、アミノアシル残基である。いくつかの実施形態において、Ｘａａ１はＮ末端であり、したがって、Ａｃまたは遊離ＮＨ２のいずれかである。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１はＳｅｒである。他の一実施形態において、Ｘａａ１は不在である。さらに、少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ２０，０００ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択される、Ｎ末端リンカー部分である。本発明の範囲内にある化合物のＮ末端を修飾するための好ましいＸａａ１基は、遊離ＮＨ２、Ａｃ、Ｌｙｓ、ｄＬｙｓである。
【００５６】
Ｘａａ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔおよびＴｈｒからなる群より選択されるアミノアシル残基である。いくつかの実施形態において、Ｘａａ２はＴｈｒまたは対応するＤ−アミノ酸である。Ｘａａ１が不在である場合、Ｘａａ２はＮ末端であり、したがって、Ａｃ、遊離ＮＨ２または適切なリンカー部分のいずれかである。さらに、少なくとも一実施形態において、Ｘａａ２は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるＮ末端リンカー部分である。他の一実施形態において、Ｘａａ２は不在である。本発明の範囲内にある化合物のＮ末端を修飾するための好ましいＸａａ２基は、Ａｃ、ＮＨ２、Ｌｙｓ、ｄＬｙｓおよび適切なリンカー部分である。
【００５７】
Ｘａａ３は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒおよび対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択されるアミノアシル残基である。Ｘａａ１およびＸａａ２が不在である場合、Ｘａａ３はＮ末端であり、したがって、Ａｃまたは遊離ＮＨ２のいずれかである。さらに、少なくとも一実施形態において、Ｘａａ３は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸，適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ２０，０００ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるＮ末端リンカー部分である。他の一実施形態において、Ｘａａ３は不在である。本発明の範囲内にある化合物のＮ末端を修飾するための好ましいＸａａ３基は、Ａｃ、Ｌｙｓ、ｄＬｙｓ、ＮＨ２．および適切なリンカー部分である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、Ｘａａ４は、Ｃｙｓ、Ｐｅｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕ、β−Ａｓｐ、β−Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択される、アミノアシル残基または類似体である。Ｘａａ１０がＬｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂである場合、Ｘａａ４に適切な基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕである。Ｘａａ１０がＡｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕである場合、Ｘａａ４に適切な基は、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐおよびＤａｂである。Ｘａａ４およびＸａａ１０がＣｙｓまたはＰｅｎのいずれかである場合、二量体の各サブユニットは、Ｘａａ４とＸａａ１０との間のジスルフィド結合により環化される。Ｘａａ４がＬｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂである場合、およびＸａａ１０がＡｓｐ、Ｇｌｕ、ｈＧｌｕである場合、二量体の各サブユニットは、Ｘａａ４とＸａａ１０との間のアミド結合により環化される。好ましくは、一実施形態において、Ｘａａ４はＣｙｓである。別の実施形態において、好ましくは、Ｘａａ４はＰｅｎである。
【００５９】
Ｘａａ５は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−（Ｍｅ）ｓｙｍ、Ａｒｇ−（ｍｅ）ａｓｙｍ、４−Ｇｕａｎ、Ｃｉｔ、Ｃａｖおよび適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基または類似体である。好ましくは、Ｘａａ５はＮ−Ｍｅ−Ａｒｇである。別の実施形態において、好ましくは、Ｘａａ５はＡｒｇである。
【００６０】
Ｘａａ６は、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔおよび適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基または類似体である。好ましくは、Ｘａａ６はＳｅｒ、Ｇｌｙである。
【００６１】
Ｘａａ７は、Ａｓｐ、Ｎ−Ｍｅ−ＡｓｐおよびＡｓｐに対する適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基または類似体である。好ましくは、Ｘａａ７はＡｓｐである。
【００６２】
Ｘａａ８は、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、ＭｅｔおよびＮ−Ｍｅ−Ｔｈｒを含むＮ−メチルアミノ酸ならびにＴｈｒに対する適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基または類似体である。好ましくは、Ｘａａ８はＴｈｒである。
【００６３】
Ｘａａ９は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ホモ−Ｌｅｕ、ｎ−ブチルＡｌａ、ｎ−ペンチルＡｌａ、ｎ−ヘキシルＡｌａ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ、疎水性側鎖を有するアミノ酸および適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基または類似体である。好ましくは、Ｘａａ９はＬｅｕである。
【００６４】
Ｘａａ１０は、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｅｎ、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、ＤａｐおよびＤａｂからなる群より選択されるアミノアシル残基である。いくつかの実施形態において、Ｘａａ４がＬｙｓ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、ホモ−ＬｙｓまたはＯｒｎである場合、Ｘａａ１０は、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびｈＧｌｕからなる群より選択される。他の一実施形態において、Ｘａａ４がＡｓｐ、ＧｌｕまたはｈＧｌｕである場合、Ｘａａ１０は、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂからなる群より選択される。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１０はＰｅｎである。Ｘａａ１０およびＸａａ４が両方ともＣｙｓまたはＰｅｎのいずれかである場合、二量体の各サブユニットは、Ｘａａ４とＸａａ１０との間のジスルフィド結合により環化される。Ｘａａ１０がＡｓｐ、ＧｌｕまたはｈＧｌｕである場合、およびＸａａ４がＬｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｐまたはＤａｂである場合、二量体の各サブユニットは、Ｘａａ４とＸａａ１０との間のアミド結合により環化される。Ｘａａ１１が不在であり、Ｘａａ１０がサブユニットのＣ末端である場合、Ｘａａ１０はＣＯＯＨまたはアミドＣＯＮＨ２のいずれかである。好ましくは、一実施形態において、Ｘａａ１０はＰｅｎである。別の実施形態において、Ｘａａ１０は、好ましくはＣｙｓである。
【００６５】
Ｘａａ１１は、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｓａｒ、１Ｎａｌ、２Ｎａｌ、ｈＰｈｅ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｏ−Ｍｅ−Ｔｙｒ、ジヒドロ−Ｔｒｐ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｄａｂ（Ａｃ）、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、Ｂｉｐ、Ａｌａ（３，３ジフェニル）、ビフェニル−Ａｌａ、芳香環置換Ｐｈｅ、芳香環置換Ｔｒｐ、芳香環置換Ｈｉｓ、ヘテロ芳香族アミノ酸、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ、Ｎ−Ｍｅ−Ｌｙｓ（Ａｃ）、４−Ｍｅ−Ｐｈｅおよび対応するＤ−アミノ酸ならびに適切な同配体代替物からなる群より選択されるアミノアシル残基である。Ｘａａ１２およびＸａａ１３が不在であり、Ｘａａ１１がサブユニットのＣ末端である場合、Ｘａａ１１はＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２のいずれかである。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１１およびＸａａ１２は不在である。Ｘａａ１２およびＸａａ１３が不在である場合、Ｘａａ１１は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるリンカー部分である。好ましくは、Ｘａａ１１はＴｒｐである。他の一実施形態において、Ｘａａ１１は、Ｌｙｓ、ｄＬｙｓおよびＮ−Ｍｅ−Ｌｙｓからなる群より選択される。
【００６６】
Ｘａａ１２は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、適切な同配体（ｉｓｏｓｔｅｒｓ）および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択されるアミノアシル残基である。Ｘａａ１３からＸａａ１５が不在であり、Ｘａａ１２がサブユニットのＣ末端である場合、Ｘａａ１２はＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２のいずれかである。いくつかの実施形態において、Ｘａａ１２は不在である。好ましくは、Ｘａａ１２は、Ｌｙｓ、ｄＬｙｓおよびＮ−Ｍｅ−Ｌｙｓからなる群より選択される。
【００６７】
Ｘａａ１３は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｙｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｇｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｄａｐ、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｏｒｎ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｐ、Ｎ−Ｍｅ−Ｄａｂ、Ｎ−Ｍｅ  Ｌｙｓ、Ｄ−Ｄａｐ、Ｄ−Ｄａｂ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、適切な同配体および対応するＤ−アミノ酸からなる群より選択されるアミノアシル残基である。いくつかの実施形態において、Ｘａａ１４およびＸａａ１５が不在である場合、Ｘａａ１２はＣ末端であり、Ｘａａ１３は、ＤＩＧ、ＤＩＧ−ＯＨ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物、およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるリンカー部分を含む。他の一実施形態において、二量体分子はＮ末端リンカーを含み、したがって、Ｘａａ１４およびＸａａ１５が不在である場合、Ｘａａ１３はＣ末端であり、したがって、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２のいずれかである。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１３はＬｙｓである。他の一実施形態において、Ｘａａ１３は不在である。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１４はＣ末端リンカーである。Ｃ末端を修飾するための好ましいＸａａ１３基は、遊離ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２および適切なリンカー部分である。
【００６８】
Ｘａａ１４は、天然アミノ酸、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、適切な同配体代替物、対応するＤ−アミノ酸および対応するＮ−メチルアミノ酸からなる群より選択されるアミノアシル残基である。いくつかの実施形態において、Ｘａａ１５が不在である場合、Ｘａａ１３はＣ末端であり、Ｘａａ１４は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるリンカー部分を含む。他の一実施形態において、二量体分子はＮ末端リンカーを含み、したがって、Ｘａａ１５が不在である場合、Ｘａａ１４はＣ末端であり、したがって、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２のいずれかである。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１４は不在である。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１４はＣ末端リンカーである。Ｃ末端を修飾するための好ましいＸａａ１４基は、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２または適切なリンカー部分である。
【００６９】
Ｘａａ１５は、ＤＩＧ、ＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５、ＰＥＧ１Ｋ、ＰＥＧ２Ｋ、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧ４Ｋ、ＰＥＧ５Ｋ、ＩＤＡ、ＩＤＡ−Ｐａｌｍ、ＩＤＡ−Ｂｏｃ、ＩＤＡ−イソ吉草酸、トリアジン、トリアジン−Ｂｏｃ、イソフタル酸、１，３−フェニレン二酢酸、１，４−フェニレン二酢酸、グルタル酸、アゼライン酸、ピメリン酸、ドデカンジオン酸、適切な脂肪族化合物、芳香族化合物、ヘテロ芳香族化合物およびおよそ４００Ｄａからおよそ４０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール系リンカーからなる群より選択されるリンカー部分である。少なくとも一実施形態において、Ｘａａ１５は不在である。好ましくは、Ｘａａ１５はＤＩＧである。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態は、二量体分子の各サブユニットが、配列番号１−１３６の少なくとも１つにより表されるアミノ酸配列を含む、ＤＲＰホモ二量体またはヘテロ二量体分子をさらに含む。他の実施形態は、二量体分子の各サブユニットが、配列番号１−３８、４９、５７−７１、７５−１１７および１２４−１３６の少なくとも１つにより表される、Ｎ−メチル化アルギニン残基を含むアミノ酸配列を含む、ＤＲＰホモ二量体またはヘテロ二量体分子を含む。さらに、本発明のいくつかの実施形態は、二量体分子の各サブユニットが、配列番号１−１３６の少なくとも１つにより表されるように、ジスルフィド結合により環化される、ＤＲＰホモ二量体またはヘテロ二量体分子を含む。他の一実施形態において、二量体分子の各サブユニットが、配列番号１および２の少なくとも１つにより表されるように、アミド結合により環化され、Ｘａａ４およびＸａａ１０が、Ｌｙｓ、ホモ−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ  ＤａｐまたはＤａｂ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびｈＧｌｕからなる群より選択される、ＤＲＰホモまたはヘテロ二量体分子を提供する。
【００７１】
二量体構造および生物学的活性
本発明は、さまざまな新規な拮抗薬ジスルフィドペプチド二量体を提供する。これらの化合物は、α４β７結合に対する親和性の増加、α４β１を選択しないような選択性の増加および模擬腸液（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）（ＳＩＦ）における安定性の増加をより明確に特徴付けるために試験されている。これらの新規な拮抗薬分子は、α４β７との高い結合親和性、それによって、α４β７とＭＡｄＣＡＭリガンドとの間の結合を妨げることを実証している。したがって、これらの拮抗薬ペプチドは、さまざまな実験における炎症過程の除去および／または減少において有効であることが示されている。
【００７２】
本発明は、したがって、血清およびＳＩＦにおいてα４β７インテグリンと結合または会合して、α４β７とＭＡｄＣＡＭリガンドとの間の結合を破壊またはブロックする、さまざまな二量体ペプチド化合物を提供する。本発明のさまざまなペプチド化合物は、単に天然アミノ酸だけで構築することができる。または、ペプチド化合物は、限定するものではないが、修飾アミノ酸を含む非天然アミノ酸を含んでもよい。修飾アミノ酸は、アミノ酸に天然には存在しない基（複数可）または化学的部分を含むように化学的に修飾された、天然アミノ酸を含む。本発明のペプチド化合物は、Ｄ−アミノ酸をさらに含んでもよい。その上さらに、本発明のペプチド化合物は、アミノ酸類似体を含んでもよい。
【００７３】
いくつかの拮抗薬ジスルフィド二量体は胃腸において安定であり、α４β７インテグリンに対する高レベルの特異性および親和性を提供することが示されている。本発明のいくつかの実行は、模擬腸液（ＳＩＦ）に曝露した場合、６０分を超える半減期を含むジスルフィド二量体を提供する。いくつかの実行は、およそ１分からおよそ６３分の半減期を含むＤＲＰをさらに提供する。
【００７４】
本発明の化合物は、２つのサブユニットモノマーを、それらのＣまたはＮ末端において連結することによって形成されるホモまたはヘテロ二量体である。配列番号１−１３６により表されるモノマーサブユニットの二量体化は、それらの非二量体化モノマー類似体を超える効力の増加を実証する。本発明のいくつかの二量体化合物は、さまざまな天然アミノアシル残基を、Ｎ−メチル化類似体残基で置換した結果として、効力のさらなる増加を実証した。例えば、配列番号１−３８、４９、５７−７１、７５−１１７および１２４−１３６はＮ−Ｍｅ−Ａｒｇで置換されたサブユニットモノマー配列を表す。さらにまた、本発明のいくつかの二量体化合物は、独立した環化を受け、それによって、環化構造が、それらの非環化モノマーおよび二量体アナログを超える安定性の増加を実証するモノマーサブユニットを含む。これらの改善を例示する特定の例およびデータを、図３および４に提供する。
【００７５】
ここで図３を参照すると、本発明に従った、さまざまな限定されないホモ二量体分子試料に関する、安定性の増加を例示するさまざまなデータを含むチャートが提供されている。模擬腸液（ＳＩＦ）安定性アッセイを、配列番号３９−１３６により表される、すべてのモノマーペプチドおよびそれらの個々のホモ二量体分子に関して実施した。これらの結果の選択的サンプリングを、図３に提供する。
【００７６】
本明細書に述べたプロトコルに従って、出願人は、配列番号３９−１３９により表されるすべてのインテグリン拮抗薬二量体分子を合成、精製および二量体化して、ホモ二量体を形成することに成功した。
【００７７】
モノマージスルフィドペプチドサブユニットの二量体化は概して、モノマージスルフィドサブユニットペプチドと比較して、安定性の増加を実証した。さらに、Ａｒｇを有する配列番号３９と比較した場合、配列番号５７により実証されるように、アルギニンにおけるＮ−Ｍｅ−Ａｒｇによる置換が、ＳＩＦにおいて半減期を実質的に延長した。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓを含む配列番号３９と比較して、配列番号８２、１０２および１２１により実証されるように、Ｃｙｓのペニシラミン（Ｐｅｎ）による置換は、模擬腸液（ＳＩＦ）において安定性を有意に増加させた。ＣｙｓのＰｅｎによる置換もまた、胃における安定性の改善の指標である、還元条件（ＤＴＴ）下での安定性を増加させた。
【００７８】
ここで図４を参照すると、本発明に従った、さまざまな限定されないホモ二量体分子試料に関する、効力および選択性の増加を例示するさまざまなデータを含むチャートが提供されている。効力および選択性アッセイを、配列番号３９−１３６により表される、すべてのモノマーペプチドおよびそれらの個々のホモ二量体に関して実施した。これらの結果の選択的サンプリングを、図４に提供し、ホモ二量体ペプチドは、試料２、４、５、７、９、１１、１３、１５、１７−１９および２１により表され、個々のモノマーサブユニット分子は試料１、３、６、８、１０、１２、１４、１６および２０により表される。二量体化により、α４β７に関してＥＬＩＳＡおよび細胞接着アッセイにおいて、効力の有意な改善が達成された。加えて、二量体化は、α４β７に対する効力の改善により、α４β１を選択しないような選択性において達成された有意な改善につながる。ペプチドはまた、α４β７と比較した場合α４β１に対して有効性が低く、α４β７を選択しないような選択性を示した。
【００７９】
本明細書に述べたプロトコルに従って、出願人は、配列番号３９−１３６により表されるすべてのインテグリン拮抗薬二量体分子を合成、精製および二量体化して、ホモ二量体を形成することに成功した。これらの分子はそれぞれ、α４β７−ＭＡｄＣＡＭ競合ＥＬＩＳＡアッセイ、α４β１−ＶＣＡＭ競合ＥＬＩＳＡアッセイ、α４β７−ＭａｄＣＡＭ細胞接着アッセイに供された。多くの配列に関して、これらのアッセイもまた、モノマーサブユニットおよび二量体分子の両方について実施した。これらの結果の小標本を、図４に提供する。
【００８０】
モノマージスルフィドペプチドサブユニットの二量体化は概して、モノマージスルフィドサブユニットペプチドと比較して、ａ４ｂ７に対する親和性の増加および／またはａ４ｂ１に対する親和性の低下を実証し、ａ４ｂ１を選択しないような選択性の増加につながる。
【００８１】
ＣおよびＮ末端二量体化において、α４β７に対する効力の有意な改善もまた観察された。加えて、二量体化はさらに、α４β１に対する効力の喪失につながり、ＥＬＩＳＡおよび細胞接着アッセイにおいて、α４β７に対する選択性の増加につながる。ＡｒｇをＮ−Ｍｅ−Ａｒｇで置き換えた場合、α４β７に対する効力が、ＥＬＩＳＡおよび細胞接着アッセイの両方において有意に改善された。
【００８２】
組成物
上記のように、インテグリンは、細胞接着分子として機能するヘテロ二量体である。α４インテグリン、α４β１およびα４β７は、消化管の間のリンパ球の遊走において基本的な役割を果たす。これらは、ＢおよびＴリンパ球を含む多数の白血球、単球および樹状細胞において発現され、これらは、それらの個々の第１リガンド、すなわち血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）および粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）との結合により細胞接着を媒介する。ＶＣＡＭおよびＭＡｄＣＡＭは、ＶＣＡＭがα４β１およびα４β７の両方に結合するが、一方、ＭＡｄＣＡＭはα４β７に対して高度に特異的であるという点で、結合特異性において異なる。
【００８３】
ＶＣＡＭおよびＭＡｄＣＡＭの発現プロファイルの違いは、炎症性疾患におけるそれらの役割について多数の有力な証拠を提供する。これら両方は、腸において構成的に発現されるが、ＶＣＡＭの発現は末梢器官に広がり、一方、ＭＡｄＣＡＭの発現は、消化管の器官に留まる。加えて、腸におけるＭＡｄＣＡＭの発現の上昇は、現在クローン病、潰瘍性大腸炎およびＣ型肝炎を含む、いくつかの腸関連炎症性疾患と関係づけられている。
【００８４】
限定するものではないが、実施例において指定されている化合物を含む本発明の化合物は、インテグリン拮抗薬活性を保有している。一実施形態において、状態または医学的適応症は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病（非熱帯性スプルー）、血清反応陰性関節症に伴う腸症、顕微鏡的またはコラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性胃腸炎、放射線療法および化学療法または直腸結腸切除術および回腸肛門吻合術後にもたらされる回腸嚢炎ならびにさまざまな形態の胃腸癌、骨粗しょう症、関節炎、多発性硬化症、慢性疼痛、体重増加およびうつ病の少なくとも１つを含む。別の実施形態において、状態は、膵炎、インスリン依存性真性糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、ぜんそくまたは移植片対宿主病である。加えて、現在利用可能な療法、医療手技および治療薬と組み合わせて使用した場合、これらの化合物は、これらの疾患の予防または逆転にも有用であり得る。
【００８５】
本発明の化合物は、疾患の処置のための他の組成物および手技と組み合わせて使用することができる。さらに、本発明の化合物は、薬学的に許容される賦形剤および場合により徐放性マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【００８６】
処置方法
いくつかの実施形態において、本発明は、インテグリン結合により特徴付けられる状態または適応症を患う個体を処置するための方法を提供し、該方法は、個体に、式（Ｉ）または（ＩＩ）に従ったインテグリン拮抗薬二量体分子を投与するステップを含む。一実施形態において、α４β７を発現する細胞の、ＭＡｄＣＡＭを発現する細胞を含む組織への不適切な輸送により特徴付けられる状態または適応症を患う個体を処置するための方法であり、個体に、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の少なくとも１つに従ったα４β７−拮抗薬二量体分子を、α４β７を発現する細胞の、ＭＡｄＣＡＭを発現する細胞を含む組織への輸送を（部分的または完全に）阻害するために十分な量で投与するステップを含む方法を提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明は、式（Ｉ）に従ったインテグリン拮抗薬二量体分子を含む医薬組成物を、第１の処置として患者に投与する方法を提供する。別の実施形態において、この方法は、第２の処置を被験体に投与するステップをさらに含む。別の実施形態において、第２の処置は、医薬組成物を患者に投与する前および／またはそれと同時および／またはその後に被験体に投与される。他の実施形態において、第２の処置は、抗炎症剤を含む。別の実施形態において、第２の医薬組成物は、非ステロイド系抗炎症薬、ステロイドおよび免疫調節剤からなる群より選択される薬剤を含む。別の実施形態において、この方法は、被験体に第３の処置を投与するステップを含む。
【００８８】
一実施形態において、α４β７インテグリン結合により特徴付けられる状態または適応症を患う個体を処置するための方法を提供し、この方法は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の少なくとも１つに従った有効量のα４β７インテグリン拮抗薬二量体分子を個体に投与するステップを含む。場合により、α４β７に対して高い特異性を有する、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の少なくとも１つに従ったα４β７インテグリン拮抗薬二量体分子は、α４β７インテグリン結合により特徴付けられる状態または適応症のための治療的処置の一部として個体に投与される。本発明のいくつかの実施形態は、徐放性マトリックス中に懸濁されるα４β７インテグリン拮抗薬二量体分子により個体を処置するための方法をさらに提供する。本明細書において使用する場合、徐放性マトリックスは、普通はポリマーである材料で作られたマトリックスであり、このマトリックスは、酵素的もしくは酸−塩基加水分解により、または溶解により分解可能である。ひとたび体内に挿入されると、マトリックスは、酵素および体液により作用を受ける。徐放性マトリックスは、望ましくは、生体適合性材料、例えば、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコ−グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンから選択される。好ましい生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）のいずれか１つのマトリックスである。
【００８９】
いくつかの態様において、本発明は、経口送達のための医薬組成物を提供する。本発明のさまざまな実施形態および二量体組成物は、本明細書に記載の方法、技術および／または送達ビヒクルのいずれかに従った経口投与のために調製され得る。さらに、当業者は、本発明の二量体組成物が修飾され得るか、または本明細書に開示されていない系または送達ビヒクルに組み込まれ得、さらに当分野において周知であり、小型二量体ペプチド分子の経口送達への使用に適合性であることを理解していると思われる。
【００９０】
本発明の二量体ペプチドの使用に適合性である経口剤形または単位用量は、二量体ペプチドの活性薬物成分と、非薬物成分または賦形剤の混合物および原料または包装のいずれかと見なすことができる他の再使用不可材料を含むことができる。経口組成物として、液体、固体および半固体の剤形の少なくとも１つを挙げることができる。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）に従った有効量の二量体ペプチドを含む経口剤形が提供され、該剤形は、丸薬、錠剤、カプセル、ゲル、ペースト、ドリンクおよびシロップの少なくとも１つを含む。場合により、被験体の小腸においてペプチド二量体の放出の遅延を達成するために設計および構成された経口剤形が提供される。
【００９１】
一実施形態において、式（Ｉ）に従った経口医薬組成物は、小腸においてペプチド二量体の放出を遅延するように設計された腸溶コーティングを含む。少なくともいくつかの実施形態において、式（Ｉ）に従ったペプチド二量体化合物およびプロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニンを遅延放出医薬製剤中に含む医薬組成物が提供される。場合により、本発明の医薬組成物は、約５．０以上のｐＨの胃液に可溶性である腸溶コーティングを含むことが好ましい。少なくとも一実施形態において、解離可能なカルボキシル基を有するポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタル酸セルロースおよびトリメリト酸酢酸セルロースを含むセルロース誘導体ならびにセルロースの類似の誘導体ならびに他の炭水化物ポリマーを含む腸溶コーティングを含む医薬組成物が提供される。
【００９２】
一実施形態において、腸溶コーティング中の式（Ｉ）に従った医薬組成物が提供され、該腸溶コーティングは、医薬組成物を被験体の下部胃腸系内において制御された様式で保護および放出し、全身性副作用を回避するように設計されている。腸溶コーティングに加えて、本発明の二量体ペプチドは、任意の適合性の経口薬物送達系または成分内にカプセル化、コーティング、関与（ｅｎｇａｇｅ）またはその他の方法で会合され得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の二量体ペプチドは、ポリマーヒドロゲル、ナノ粒子、ミクロスフィア、ミセルおよび他の脂質系の少なくとも１つを含む脂質キャリア系中に提供される。
【００９３】
小腸におけるペプチドの分解を克服するために、本発明のいくつかの実行は、本発明に従ったペプチド二量体が含有されるヒドロゲルポリマーキャリア系を含み、ヒドロゲルポリマーが、ペプチド二量体を、小腸におけるタンパク質分解から保護する。本発明のペプチド二量体は、二量体ペプチドの溶解動力学を増加し、腸管吸収を強化するように設計されたキャリア系との使用に適合可能に製剤化することができる。これらの方法は、リポソーム、ミセルおよびナノ粒子を使用して、ペプチドのＧＩ管への浸透を増加させることを含む。
【００９４】
さまざまな生体応答系もまた、本発明の１以上のペプチド二量体と組み合わせて、経口送達用の医薬品を提供することができる。いくつかの実施形態において、本発明のペプチド二量体は、生体応答系、例えばヒドロゲルおよび水素結合性基を有する粘膜付着性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリ（メタクリル）酸［ＰＭＡＡ］、セルロース、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）、キトサンおよびアルギン酸塩）と組み合わせて使用し、経口投与用の治療薬を提供することができる。他の実施形態は、ペプチド二量体表面の表面が、水素結合、連結されたムチンを有するポリマーまたは／および疎水性相互作用により粘膜付着性を含むように修飾された、本明細書に開示のペプチド二量体の薬物滞留時間を最適化または延長するための方法を含む。これらの修飾された二量体分子は、本発明の所望の特徴に従って、被験体内の薬物滞留時間の増加を実証することができる。さらに、標的化された粘膜付着系は、腸細胞およびＭ細胞表面において受容体に特異的に結合でき、それによって、二量体ペプチドを含有する粒子の取込みをさらに増加することができる。
【００９５】
他の実施形態は、二量体ペプチドを、傍細胞または経細胞透過を増加することにより、腸粘膜を横切る二量体ペプチドの輸送を促進する透過エンハンサーと組み合わせて使用する、式（Ｉ）に従った二量体ペプチドの経口送達のための方法を含む。例えば、一実施形態において、長鎖脂肪酸、胆汁酸塩、両親媒性界面活性剤およびキレート剤の少なくとも１つを含む透過エンハンサーを、式（Ｉ）に従った二量体ペプチドと組み合わせる。一実施形態において、Ｎ−［ヒドロキシベンゾイル）アミノ］カプリル酸ナトリウムを含む透過エンハンサーを使用して、本発明の二量体ペプチドと弱い非共有結合性会合を形成し、透過エンハンサーは、ひとたび血液循環に到達すると、膜輸送およびさらなる解離を促進する。別の実施形態において、本発明のペプチド二量体はオリゴアルギニンに結合体化され、それによって、さまざまな細胞型への、二量体ペプチドの細胞浸透を増加させる。さらに、少なくとも一実施形態において、非共有結合が、式（Ｉ）に従った二量体ペプチドと、シクロデキストリン（ＣＤ）およびデンドリマーからなる群より選択される透過エンハンサーとの間に提供され、透過エンハンサーは、ペプチド凝集を減少させ、ペプチド二量体分子の安定性および溶解度を増加させる。
【００９６】
本発明の他の実施形態は、半減期が増加したα４β７インテグリン拮抗薬二量体分子により個体を処置するための方法を提供する。一態様において、本発明は、治療有効量の毎日（ｑ．ｄ．）または１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）の投薬に十分な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、ヒト被験体に投与する場合）の少なくとも数時間から１日の半減期を有するインテグリン拮抗薬二量体分子を提供する。別の実施形態において、二量体分子は、治療有効量の１週間に１回（ｑ．ｗ．）の投薬に十分な、３日以上の半減期を有する。さらに、別の実施形態において、二量体分子は、治療有効量の隔週（ｂ．ｉ．ｗ．）または毎月の投薬に十分な、８日以上の半減期を有する。別の実施形態において、二量体分子は、誘導体化されていないまたは修飾されていない二量体分子と比較して長い半減期を有するように誘導体化または修飾される。別の実施形態において、二量体分子は、１以上の化学的修飾を含有して、血清半減期を延長する。
【００９７】
本明細書に記載の処置または送達系の少なくとも１つにおいて使用する場合、治療有効量の１つの本発明の化合物は、純粋な形態で用いられても、またはこのような形態が存在する場合、薬学的に許容される塩の形態で用いられてもよい。本明細書において使用する場合、本発明の化合物の「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な所望のベネフィット／リスク比で、インテグリン関連疾患を処置する（例えば、ＩＢＤに伴う炎症を減少させる）のに十分な量のペプチド二量体化合物を記載することを意味する。しかし、本発明の化合物および組成物の１日の合計使用量が、妥当な医学的判断の範囲内で、主治医により決定されるものであることは理解されるものと思われる。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベルは、下記を含むさまざまな要因に依存するものである：ａ）処置される障害および障害の重症度；ｂ）用いる特定の化合物の活性；ｃ）用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的健康、性別および食事；ｄ）投与の時間、投与の経路および用いる特定の化合物の排出速度；ｅ）処置期間；ｆ）用いる特定の化合物と組み合わせて、または同時に使用する薬物、および当医療分野において周知の要因など。例えば、化合物の用量は、所望の治療効果を得るために必要な用量より低いレベルで開始し、所望の効果を達成するまで徐々に投薬量を増加することは、十分に当該分野の技術の範囲内である。
【００９８】
または、本発明の化合物は、目的の化合物を、１以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含有する医薬組成物として投与することができる。薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体または液体の、充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を指す。組成物は、非経口、槽内、膣内、腹腔内、直腸内、局所的（散剤、軟膏、液滴、坐薬または経皮パッチとして）、直腸的または口腔内投与することができる。本明細書において使用する場合、「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、皮内および関節内への注射および点滴を含む投与様式を指す。
【００９９】
非経口注射用医薬組成物は、薬学的に許容される滅菌の水性または非水性の溶液、分散物、懸濁物またはエマルジョンおよび使用直前に滅菌の注射可能な溶液または分散物に再構成するための滅菌粉末を含む。適切な水性または非水性のキャリア、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１００】
これらの組成物は、アジュバント、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をさらに含有してもよい。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確保することができる。等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むこともまた望ましいと思われる。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含によりもたらすことができる。
【０１０１】
注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）およびＰＥＧなどの（ポリ）グリコール中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いる特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を調節することができる。デポー注射可能製剤もまた、薬物を、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによって調製される。
【０１０２】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持性フィルター（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｌｔｅｒ）を介するろ過、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射可能媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態への滅菌剤の組み込みにより滅菌することができる。
【０１０３】
局所投与は、皮膚または肺および眼の表面を含む粘膜への投与を含む。吸入投与および鼻内投与のための組成物を含む、局所肺投与のための組成物は、水性および非水性の製剤中の溶液および懸濁物を含み得、加圧されても加圧されなくてもよい乾燥粉末として調製することができる。加圧されない粉末組成物において、微粉化形態の活性成分を、例えば直径１００マイクロメーターまでのサイズを有する粒子を含む、より大きなサイズの薬学的に許容される不活性キャリアと混合して使用することができる。適切な不活性キャリアとしては、糖、例えばラクトースが挙げられる。
【０１０４】
または、組成物は加圧され、圧縮ガス、例えば窒素または液化ガス噴霧体を含有してもよい。液化噴霧体媒体および実際に全組成物は、いかなる実質的範囲でも、活性成分がその中に溶解しないことが好ましい。加圧組成物はまた、表面活性剤、例えば液体または固体の非イオン性表面活性剤を含有してもよく、または固体の陰イオン性表面活性剤であってもよい。固体陰イオン性表面活性剤をナトリウム塩の形態で使用することが好ましい。
【０１０５】
局所投与のさらなる形態は眼への投与である。本発明の化合物は、化合物を、角膜および眼の内部領域、例えば、前眼房、後眼房、硝子体、眼房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜に浸透させるために十分な時間の間、化合物が眼の表面への接触を維持するように、薬学的に許容される眼科用ビヒクル中で送達される。薬学的に許容される眼科用ビヒクルは、例えば、軟膏、植物油またはカプセル化材料であってよい。または、本発明の化合物は、硝子体液および眼房水内に直接注射されてもよい。
【０１０６】
直腸または膣投与のための組成物は、本発明の化合物と、適切な非刺激性の賦形剤またはキャリア、例えばココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬用ワックスとを混合することによって調製できる坐薬であることが好ましく、これらの賦形剤またはキャリアは、室温において固体であるが、体温において液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解して活性化合物を放出する。
【０１０７】
本発明の化合物はまた、リポソームの形態で投与することもできる。当分野において公知であるように、リポソームは、一般的にリン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体中に分散された単層または多層の水和液晶により形成される。任意の非毒性の、生理学的に許容される、リポソームを形成できる代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、防腐剤、賦形剤などを含有する。好ましい脂質は、天然および合成両方の、リン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームの形成方法は当分野において公知である。
【０１０８】
ヒトまたは他の哺乳動物宿主に単回または分割用量で投与される本発明の組成物の合計一日用量は、例えば、１日に０．０００１から３００ｍｇ／ｋｇ体重、より普通には１から３００ｍｇ／ｋｇ体重の量であってよい。
【０１０９】
腸の炎症の非侵襲検出
本発明のペプチドは、非侵襲診断手順の一部としてキレート基および検出可能な標識の少なくとも１つによりさらに標識された、経口的に安定な式（Ｉ）の化合物を使用して、ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングにより腸の炎症の検出、評価および診断に使用することができる。一実施形態において、インテグリン拮抗薬二量体分子は、二官能性キレート剤と結合体化されて、経口的に安定な二量体分子を提供する。別の実施形態において、インテグリン拮抗薬二量体分子は放射標識され、経口的に安定な二量体分子を提供する。経口的に安定な、キレート化または放射標識された二量体分子はその後、経口的または直腸的に被験体に投与される。一実施形態において、経口的に安定な二量体分子は、飲料水に含まれる。二量体分子の取込み後、ｍｉｃｒｏＰＥＴイメージングを使用して、被験体の腸および消化管全体の炎症を可視化する。
【０１１０】
ペプチドサブユニットの合成
本発明のモノマーペプチドサブユニットは、当業者に公知の多数の技術により合成することができる。新規および固有のモノマーサブユニットを、本明細書に提供される技術を使用して、合成、精製および二量体化した。
【０１１１】
本発明のペプチドを、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成技術を使用し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’ｓ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙマルチチャネル合成機において合成した。ペプチドを、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）カップリング条件を使用して組み立てた。Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（１００−２００メッシュ、０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｃ末端にアミドを含むペプチドに使用し、Ｎ−ａ−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を前負荷されたＷａｎｇ  Ｒｅｓｉｎを、Ｃ末端に酸を含むペプチドに使用する。カップリング試薬（ＨＢＴＵおよびＤＩＥＡ予備混合）を、１００ｍｍｏｌ濃度で調製した。同様に、アミノ酸溶液を、１００ｍｍｏｌ濃度で調製した。ペプチドを、標準的シンフォニープロトコルを使用して組み立てた。
【０１１２】
組立て
ペプチド配列を下記のように組み立てた：各反応バイアル中の樹脂（２５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、４ｍｌのＤＭＦで２回洗浄し、次いで、２．５ｍｌの２０％  ４−メチルピペリジンで１０分間処理した（Ｆｍｏｃの脱保護）。その後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（４ｍｌ）で２回洗浄し、Ｎ−メチルピペリジン（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｐｅｒｉｆｉｎｅ）でさらに３０分間再処理した。樹脂を再度ＤＭＦ（４ｍｌ）で３回洗浄し、次いで２．５ｍｌのアミノ酸および２．５ｍｌのＨＢＴＵ−ＤＩＥＡ混合物を加えた。４５分の頻繁な撹拌後、樹脂をろ過し、ＤＭＦ（各４ｍｌ）で３回洗浄した。本発明の典型的なペプチドに関して、二重カップリングを、最初の２５アミノ酸に実施し、三重カップリングを残りの残基に実施した。カップリング反応の完了後、樹脂をＤＭＦ（各４ｍｌ）で３回洗浄し、その後、次のアミノ酸カップリングに進んだ。
【０１１３】
切断
ペプチド組立ての完了後、ペプチドを、切断試薬、例えば試薬Ｋ（８２．５％  トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｇｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、５％  水、５％  チオアニソール、５％  フェノール、２．５％  １，２−エタンジチオール）を用いた処理により、樹脂から切断した。切断試薬は、樹脂および残りすべての側鎖保護基からペプチドを切断することに成功できた。
【０１１４】
切断されたペプチドを、冷ジエチルエーテル中に沈殿させ、次いで、エチルエーテルで２回洗浄した。ろ液を捨て、冷エーテルの第２のアリコートを加え、この手順を反復した。粗ペプチドを、アセトニトリル：水（７：３および１％  ＴＦＡ）の溶液に溶解して、ろ過した。その後、線形ペプチドの品質を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱ）を使用して検証し、その後精製した。
【０１１５】
酸化によるジスルフィド結合の形成
５０ｍｇの粗切断ペプチドを、２０ｍｌの水：アセトニトリルに溶解した。その後、酢酸中飽和ヨウ素を、撹拌しながら黄色が持続するまで滴加した。この溶液を１５分間撹拌し、反応を、分析的ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳによりモニターした。反応が完了した時、固体アスコルビン酸を、溶液が透明になるまで加えた。溶媒混合物をその後、まず水で希釈し、その後、逆相ＨＰＬＣ機器（Ｌｕｎａ  Ｃ１８  ｓｕｐｐｏｒｔ、１０ｕ、１００Ａ、移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ含有水、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル（ＡＣＮ）、勾配を５％  Ｂから開始して、流量１５ｍｌ／分で６０分かけて５０％  Ｂまで変化）に負荷することによって精製した。純粋生成物を含有する画分を、その後、凍結乾燥器においてフリーズドライした。
【０１１６】
ラクタム結合の形成
１００ｍｇの粗切断ペプチド（およそ０．１２ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解した。ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）（０．２４ｍｍｏｌ、２当量）を加え、次いでＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１．２ｍｍｏｌ、１０当量）およびＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）（０．２４ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣに反応を供した。反応が完了した時、ジクロロメタンを蒸発させ、水およびアセトニトリルで希釈し、その後逆相ＨＰＬＣ機器（Ｌｕｎａ  Ｃ１８  ｓｕｐｐｏｒｔ、１０ｕ、１００Ａ、移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ含有水、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル（ＡＣＮ）、勾配を５％
Ｂから開始して、流量１５ｍｌ／分で６０分かけて５０％  Ｂまで変化）に負荷した。純粋生成物を含有する画分を、その後、凍結乾燥器においてフリーズドライした。
【０１１７】
精製
分析的逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において実施した。半分取逆相ＨＰＬＣをＧｅｍｉｎｉ  １０μｍ  Ｃ１８カラム（２２ｍｍ×２５０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）またはＪｕｐｉｔｅｒ  １０μｍ、３００Ａo  Ｃ１８カラム（２１．２ｍ
ｍ×２５０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）において実施した。分離を、バッファーＢ／Ａ（移動相Ａ：０．１５％  ＴＦＡ含有水、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル（ＡＣＮ））の線形勾配、流量１ｍＬ／分（分析的）および１５ｍＬ／分（分取）を使用して達成した。分離を、バッファーＢ／Ａ（移動相Ａ：０．１５％ＴＦＡ含有水、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル（ＡＣＮ））の線形勾配、流量１ｍＬ／分（分析的）および１５ｍＬ／分（分取）を使用して達成した。
【０１１８】
リンカーの活性化および二量体化
小規模なＤＩＧリンカーの活性化手順：５ｍＬのＮＭＰを、ＩＤＡ二酸（３０４．２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２５３．２ｍｇ、２．２当量、２．２ｍｍｏｌ）および撹拌子を含有するガラスバイアルに加えた。混合物を室温において撹拌し、固体出発材料を完全に溶解した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、４５３．９ｍｇ、２．２当量、２．２ｍｍｏｌ）をその後、混合物に加えた。１０分以内に沈殿が出現し、反応混合物を室温において一晩さらに撹拌した。反応混合物をその後ろ過し、沈殿したジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を除去した。活性化されたリンカーを、二量体化に使用する前に密閉バイアルに保持した。活性化リンカーの名目上の濃度はおよそ０．２０Ｍであった。
【０１１９】
ＰＥＧリンカーを使用する二量体化に関して、含まれた予備活性化ステップは存在しない。市販品として利用可能な予備活性化二官能性ＰＥＧリンカーを使用した。
【０１２０】
二量体化手順：２ｍＬの無水ＤＭＦを、ペプチドモノマー（０．１ｍｍｏｌ）を含有するバイアルに加えた。ペプチドのｐＨを８から９にＤＩＥＡで調整した。活性化リンカー（ＩＤＡまたはＰＥＧ１３、ＰＥＧ２５）（モノマーに対して０．４８当量、０．０４８ｍｍｏｌ）を、その後モノマー溶液に加えた。反応混合物を、室温において１時間撹拌した。二量体化反応の完了を、分析的ＨＰＬＣを使用してモニターした。二量体化反応の完了にかかる時間は、リンカーに依存して変動した。反応の完了後、ペプチドを、冷エーテル中に沈殿させ、遠心分離にかけた。上清のエーテル層を廃棄した。沈殿ステップを２回反復した。粗二量体をその後、逆相ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ  Ｃ１８  ｓｕｐｐｏｒｔ、１０ｕ、１００Ａ、移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ含有水、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ含有アセトニトリル（ＡＣＮ））、１５％  Ｂを６０分かけて４５％  Ｂに変化させる勾配、流量１５ｍｌ／分）を使用して精製した。純粋生成物を含有する画分を、その後、凍結乾燥器においてフリーズドライした。
【０１２１】
模擬腸液（ＳＩＦ）安定性アッセイ
研究を模擬腸液（ＳＩＦ）において実施し、本発明の二量体分子の胃腸における安定性を評価した。ＳＩＦを、６．８ｇのリン酸二水素カリウムおよび１０．０ｇのパンクレアチンを１．０Ｌの水に加えることによって調製した。溶解後、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して６．８に調整した。ＤＭＳＯストック（２ｍＭ）を、試験化合物のためにまず調製した。ＤＭＳＯ溶液のアリコートを、６つの個別のチューブに分け、それぞれが、あらかじめ３７℃に温められていた０．５ｍＬのＳＩＦを含有した。
【０１２２】
試験化合物の最終濃度は、２０μＭであった。バイアルを、実験の間ベンチトップＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）に保持した。各時点で（０、５、１０、２０、４０および６０分）、１％ギ酸を含有する１．０ｍＬのアセトニトリルを１つのバイアルに加え、反応を終了させた。試料を、実験終了まで４℃に保存した。最終時点のサンプリング後、チューブを混合し、その後、３，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離にかけた。上清のアリコートを除去し、内部標準を含有する蒸留水に１：１で希釈し、ＬＣＭＳ／ＭＳにより分析した。各時点の残留パーセントを、化合物に対する試験と、内部標準とのピーク面積応答比に基づき計算した。０時を１００％に設定し、残りすべての時点を０時に対して計算した。半減期を、一次指数関数的減衰方程式に適合させ、ＧｒａｐｈＰａｄを使用することによって計算した。これらの研究結果の小標本を提供し、図３と関連させて考察する。
【実施例】
【０１２３】
α４β７−ＭＡｄＣＡＭ競合ＥＬＩＳＡ
ニッケルコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃１５４４２）を、組換えヒトインテグリンα４β７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃５３９７−Ａ３０）により８００ｎｇ／ウェルでコーティングし、室温において振とうしながら１時間インキュベートした。その後、溶液を振とうすることによって除去し、アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％  ＢＳＡ）により２５０ｕｌ／ウェルでブロックした。プレートをその後、室温において１時間インキュベートした。各ウェルを洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。各ウェルに、２０μＭから出発した２５ｕｌのペプチドの段階希釈液（アッセイバッファーで３倍希釈）を加えた。２５ｕｌの組換えヒトＭＡｄＣＡＭ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃６０５６−ＭＣ）を、その後、２０ｎＭの固定濃度で各ウェルに加えた。最終出発ペプチド濃度は１０μＭであり、最終ＭＡｄＣＡＭ−１濃度は１０ｎＭであった。その後、プレートを室温において１時間、結合が平衡に達するまでインキュベートした。その後、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイバッファーで１：２０００希釈した５０ｕｌのマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ１０６４８）を、各ウェルに加えた。ウェルを、室温において４５分間、振とうしながらインキュベートした。その後、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、１００ｕｌのＴＭＢを各ウェルに加え、発色時間の間、綿密に観察した。反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１２４】
α４β１−ＶＣＡＭ競合ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ｒｈ  ＶＣＡＭ−１／ＣＤ１０６  Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  ＃８６２−ＶＣ）により、５０ｕｌの１×ＰＢＳ／ウェル中４００ｎｇ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートした。この溶液を振とうすることによって除去し、２５０ｕｌの１×ＰＢＳ中１％  ＢＳＡ／ウェルでブロックした。その後、ウェルを室温において１時間、振とうしながらインキュベートした。その後、各ウェルを洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＮａＣＬ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。アッセイバッファー（Ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中２００μＭから出発した２５ｕｌのペプチドの段階希釈液を、各ウェルに加えた。さらに、２５ｕｌのα４β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃５６６８−Ａ４）を、各ウェルに１２０ｎＭの固定濃度で加えた。最終のペプチドおよびα４β１の濃度は、それぞれ、１００μＭおよび６０ｎＭであった。その後、プレートを３７℃において２時間インキュベートした。その後、溶液を振とうすることによって除去し、各ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、５０ｕｌの９Ｆ１０抗体を４ｕｇ／ｍｌ（精製マウス抗ヒトＣＤ４９ｄ、ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号５５５５０２）で各ウェルに加え、プレートを室温において１時間、振とうしながらインキュベートした。溶液を、再度振とうすることによって除去し、各ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。アッセイバッファーで１：５０００に希釈した５０ｕｌのペルオキシダーゼ結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１１５−０３５−００３）を各ウェルに加えた。プレートを、室温において３０分間、振とうしながらインキュベートした。その後、各ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。その後、１００ｕｌのＴＭＢを各ウェルに加え、発色時間の間、綿密に観察した。反応を２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止（ｓｔｅｐｐｅｄ）させ、吸光度を４５０ｎｍにおいて読み取った。
【０１２５】
実施例３：α４β７−ＭＡｄＣＡＭ細胞接着アッセイ
ＲＰＭＩ８８６６細胞（Ｓｉｇｍａ  ＃９５０４１３１６）を、１０％血清（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１６１４０−０７１）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１３６０−０７０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２５０３０−０８１）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０−１２２）をペニシリン１００単位および１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌで添加したＲＰＭＩ１６４０  ＨＥＰＥＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２２４００−０８９）において培養する。細胞を、０．１％  ＢＳＡ、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加したＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００２）で２回洗浄する。細胞を、添加済みＤＭＥＭ培地に４×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。
【０１２６】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ｒｈ  ＭＡｄＣＡＭ−１／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  ＃６０６５−ＭＣ）により、５０ｕｌの１×ＰＢＳ／ウェル中２００ｎｇ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートした。その後、溶液を振とうすることによって除去し、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳを２５０ｕｌ／ウェルでブロックし、３７℃において１時間インキュベートした。溶液を振とうすることによって除去した。ペプチドを、最終体積５０ｕｌ／ウェル（２倍濃度）で段階希釈により希釈する。各ウェルに、５０ｕｌの細胞（２００，０００細胞）を加え、プレートを、３７℃、５％
ＣＯ２において３０−４５分インキュベートし、細胞を接着させる。ウェルを、添加済みＤＭＥＭで３回（１００ｕｌ／洗浄）手作業で洗浄する。最終洗浄の後、１００ｕｌ／ウェルの添加済みＤＭＥＭおよび１０ｕｌ／ウェルのＭＴＴ試薬（ＡＴＴＣ  カタログ番号３０−１０１０Ｋ）を加える。プレートを、３７℃、５％  ＣＯ２において２−３時間、紫の沈殿が見えるまでインキュベートする。１００ｕｌのＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＡＴＴＣ  カタログ番号３０−１０１０Ｋ）を各ウェルに加える。プレートを光から遮り、蒸発を防止するためにパラフィルムで包み、室温において暗所で一晩放置する。プレートを５分間振とうし、吸光度を５７０ｎｍにおいて測定する。用量応答を計算するために、細胞を含有しない対照ウェルの吸光度値を、各試験ウェルから差し引く。
【０１２７】
実施例４：α４β１−ＶＣＡＭ細胞接着アッセイ
Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１細胞（Ｓｉｇｍａ  ＃８８０４２８０３）を、１０％  血清（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１６１４０−０７１）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１１３６０−０７０）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２５０３０−０８１）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０−１２２）をペニシリン１００単位および１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌで添加したＲＰＭＩ１６４０  ＨＥＰＥＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃２２４００−０８９）において培養する。細胞を、０．１％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を添加したＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ  ＃３０−２００２）で２回洗浄する。細胞を、添加済みＤＭＥＭ培地に４×１０６細胞／ｍｌの密度で再懸濁する。
【０１２８】
Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、ｒｈ  ＶＣＡＭ−１／ＣＤ１０６  Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  ＃８６２−ＶＣ）により、５０ｕｌの１×ＰＢＳ／ウェル中４００ｎｇ／ウェルでコーティングし、４℃において一晩インキュベートした。その後、溶液を振とうすることによって除去し、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳを２５０ｕｌ／ウェルでブロックし、３７℃において１時間インキュベートした。溶液を振とうすることによって除去した。ペプチドを、最終体積５０ｕｌ／ウェル（２倍濃度）で段階希釈により希釈する。各ウェルに、５０ｕｌの細胞（２００，０００細胞）を加え、プレートを、３７℃、５％  ＣＯ２において３０−４５分インキュベートし、細胞を接着させる。ウェルを、添加済みＤＭＥＭで３回（１００ｕｌ／洗浄）手作業で洗浄する。最終洗浄の後、１００ｕｌ／ウェルの添加済みＤＭＥＭおよび１０ｕｌ／ウェルのＭＴＴ試薬（ＡＴＴＣカタログ番号３０−１０１０Ｋ）を加える。プレートを、３７℃、５％  ＣＯ２において２−３時間、紫の沈殿が見えるまでインキュベートする。１００ｕｌのＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＡＴＴＣ  カタログ番号３０−１０１０Ｋ）を各ウェルに加える。プレートを光から遮り、蒸発を防止するためにパラフィルムで包み、室温において暗所で一晩放置する。プレートを５分間振とうし、吸光度を５７０ｎｍにおいて測定する。用量応答を計算するために、細胞を含有しない対照ウェルの吸光度値を、各試験ウェルから差し引く。
【０１２９】
本発明は、他の特定の形態で、本明細書およびこれ以降の特許請求の範囲に広範に記載のその構造、方法または他の基本的特徴から逸脱することなく具体化することができる。記載の実施形態は、あらゆる点で、単に例示的であるとみなされるべきであり、制限的であるとみなすべきではない。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲により示される。特許請求の範囲の意味および等価の範囲内にあるすべての変更は、本発明の範囲内に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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