(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫療法及びウイルス療法生物学的製剤として臨床試験に用いられている、天然に存在するニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の、抗がん剤としての新規形態、及び新生物を治療するための使用方法の提供。【解決手段】家禽に対しては非病原性（長潜伏期性）であるが、腫瘍溶解性を発揮する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）由来のＦタンパク質切断部位（Ｓ１１６）を含む弱毒化ニューカッスル病ウイルス。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）由来のＦタンパク質切断部位（Ｓ１１６）を含む弱毒化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）。
【請求項２】
前記修飾Ｆタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）が、以下：
【化１】
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からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項３】
前記弱毒化ウイルス株が、修飾７３Ｔ株である、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項４】
前記弱毒化ＮＤＶウイルスが、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ウイルスである、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスが、増大したＨＮ−Ｌ遺伝子間領域を有する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項６】
前記ＨＮ−Ｌ遺伝子間領域が、少なくとも約５０〜３００アミノヌクレオチドの長さの非コード配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項７】
前記非コード配列が、パラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）又はランダム配列から得られる、請求項６に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項８】
前記ＨＮ及びＬ遺伝子間非コード配列が、６０、１０２、１４４、１９８又は３１８ｎｔの長さである、請求項６に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項９】
前記ウイルスが、前記Ｐ−Ｍ結合部及び／又はＨＮ−Ｌ結合部に挿入された１つ又は複数の異種ポリヌクレオチド配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１０】
前記ウイルスが、２つ以上の異種ポリヌクレオチド配列を含み、ここで、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列が前記Ｐ−Ｍ結合部に挿入されると共に、少なくとも１つが前記ＨＮ−Ｌ結合部に挿入されている、請求項９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１１】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記ウイルスの腫瘍溶解性を増強するポリペプチドをコード化するトランスジーンである、請求項９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１２】
前記トランスジーンが、サイトカイン、細胞表面リガンド、及び／又はケモカインをコード化する、請求項１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１３】
前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１２ｐ７０からなる群から選択される、請求項１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１４】
前記サイトカインが、ヒトＧＭ−ＣＳＦである、請求項１３に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１５】
前記異種ポリヌクレオチド配列が、検出可能な部分をコード化するトランスジーンである、請求項９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１６】
前記検出可能な部分の発現レベルが、ウイルス複製と相関する、請求項１５に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１７】
ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子が、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）の対応する細胞外ドメインによって置換される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１８】
前記ウイルスが、７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦである、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項１９】
前記弱毒化ウイルスが、９０時間を超えるか、又は約９０〜１５６時間の鶏卵中平均致死時間（ＭＤＴ）を有する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２０】
前記弱毒化ウイルスが、約０〜０．７の脳内病原性インデックスを有する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２１】
前記弱毒化ウイルスが、約０の脳内病原性インデックスを有する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２２】
前記弱毒化ウイルスが、ＨＴ１０８０細胞において約１５％未満の細胞傷害性を有する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２３】
前記弱毒化ウイルスが、少なくとも１０又は１５％の殺傷効率で、腫瘍細胞を選択的に殺傷する、請求項１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞殺傷効率が、約７５％〜１００％である、請求項２３に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項２５】
腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法であって、腫瘍細胞を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
【請求項２６】
被験者における腫瘍退縮を誘導する方法であって、腫瘍細胞を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
【請求項２７】
腫瘍細胞生存又は増殖を低減する方法であって、腫瘍細胞を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
【請求項２８】
前記細胞が、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、並びに黒色腫癌細胞からなる群から選択される癌細胞である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
被験者における新生物を治療する方法であって、有効量の請求項１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスを前記被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記弱毒化ニューカッスル病ウイルスが、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記弱毒化ニューカッスル病ウイルスが、全身、腹腔内、又は腫瘍内に送達される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスが、約１０7ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕの用量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスが、約１０9ｐｆｕ〜約１０11ｐｆｕの用量で静脈内投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者が、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、並びに黒色腫癌からなる群から選択される新生物を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
抗ＮＤＶ免疫応答を発生した被験者における新生物を治療する方法であって、有効量の請求項１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化キメラニューカッスル病ウイルスを前記被験者に投与するステップを含み、前記ウイルスが、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）のＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含むキメラウイルスであり、前記キメラニューカッスル病ウイルスが、ＮＤＶとは抗原が異なる方法。
【請求項３６】
前記方法が、抗ＮＤＶ免疫応答を発生しているが、キメラニューカッスル病ウイルスを受けていない対照被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルと比較して、前記被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルを増大させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
７３Ｔの完全長ｃＤＮＡを含む核酸であって、前記核酸が、以下：
【化２】
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からなる群から選択される修飾Ｆタンパク質切断配列をコード化する核酸。
【請求項３８】
７３Ｔの完全長ｃＤＮＡを含むベクターであって、前記ベクターが、以下：
【化３】
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からなる群から選択される修飾Ｆタンパク質切断配列をコード化するベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載の核酸を含む、ビルレント粒子。
【請求項４０】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスに感染した宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４２】
前記ニューカッスル病ウイルス株が、７３Ｔである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【請求項４３】
前記トランスジーンが、表５に記載のトランスジーンから選択される、請求項１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月３日に提出された米国仮出願第６１／８７３，０３９号明細書の利益を主張する。尚、上記出願は、その内容を参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、多くの家禽及び野生鳥類が罹患するトリ伝染病を引き起こすトリウイルスである。感染した鳥にヒトが曝露されると（例えば、食鳥処理施設で）、軽度の結膜炎及びインフルエンザ様症状を引き起こし得るが、そうでなければＮＤＶは人の健康に害を及ぼすことはなく、大部分の人は、ＮＤＶに対して血清反応陰性である。ニワトリにおけるウイルス病原性に基づき、ＮＤＶ病原性は、脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）により決定されるように、高（短潜伏期性）、中（亜病原性）又は低（長潜伏期性）として分類される。農業に関する懸念のために、ニワトリビルレンス（ＩＣＰＩ＞０．７）を有する亜病原性及び短期潜伏性ＮＤＶは、ＵＳＤＡによって、２００８年以降「指定生物剤（ｓｅｌｅｃｔ  ａｇｅｎｔ）」として分類されている。指定生物剤及び毒素リスト（Ｓｅｌｅｃｔ  Ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｎ  Ｌｉｓｔ）は、ヒト及び動物の健康、植物の健康、又は動物及び植物製品に重大な脅威をもたらす可能性を有する生物由来物質を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
天然に存在するＮＤＶの形態は、免疫療法及びウイルス療法生物学的製剤として臨床試験に用いられている。ＮＤＶは、正常細胞に対する毒性が限定的で、ヒト腫瘍細胞を選択的に殺傷するウイルスの能力によって、抗がん剤として有望である。しかし、ＮＤＶが指定生物剤として再分類されたため、抗がん剤としてのＮＤＶの開発は進まなかった。他の腫瘍溶解性ウイルスは、臨床試験においてかなり有望であることが明らかにされている。癌療法としてのＮＤＶの開発を促進するためには、このウイルスの新しい形態が必要である。理想的には、このような新規の形態は、腫瘍細胞をターゲティングする能力を保持するが、トリにおいてもはや疾患を引き起こさないものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以下に記載するように、本発明は、新生物の治療のための組成物及び方法を特徴とする。
【０００５】
一態様において、本発明は、概して、ＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）（Ｓ１１６）のＦタンパク質切断部位を有する弱毒化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を提供する。本発明の一実施形態では、修飾されたＦタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）は、以下の配列修飾の１つを含む：
【化１】
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別の実施形態では、弱毒化ウイルス株は、修飾７３Ｔ株である。また別の実施形態では、弱毒化ＮＤＶウイルスは、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ウイルスである。別の実施形態では、ウイルスは、増大したＨＮ−Ｌ遺伝子間領域を有する。また別の実施形態では、ＨＮ−Ｌ遺伝子間領域は、長さが少なくとも約５０〜３００アミノヌクレオチドの非コード配列である。別の実施形態では、非コード配列は、パラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）又はランダム配列から得られる。また別の実施形態では、ＨＮ及びＬ遺伝子間非コード配列は、長さが６０、１０２、１４４、１９８又は３１８ｎｔである。別の実施形態では、ウイルスは、Ｐ−Ｍ結合部及び／又はＨＮ−Ｌ結合部に挿入された１つ又は複数の異種ポリヌクレオチド配列を有する。さらに別の実施形態では、ウイルスは、２つ以上の異種ポリヌクレオチド配列を有し、ここで、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列がＰ−Ｍ結合部に挿入されると共に、少なくとも１つがＨＮ−Ｌ結合部に挿入されている。他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、ウイルスの腫瘍溶解性を増強するポリペプチドをコード化するトランスジーンである。また別の実施形態では、トランスジーンは、サイトカイン、細胞表面リガンド、及び／又はケモカインをコード化する。他の実施形態では、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１２ｐ７０からなる群から選択される。特定の実施形態では、サイトカインは、ヒトＧＭ−ＣＳＦである。他の実施形態では、異種ポリヌクレオチド配列は、検出可能な部分をコード化するトランスジーンである。特定の実施形態では、検出可能な部分の発現レベルは、ウイルス複製と相関する。また別の実施形態では、ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子は、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）の対応する細胞外ドメインによって置換される。別の具体的実施形態では、ウイルスは、７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦである。他の実施形態では、弱毒化ウイルスは、９０時間を超えるか、又は約９０〜１５６時間の鶏卵中平均致死時間（ＭＤＴ）を有する。別の実施形態では、弱毒化ウイルスは、約０〜０．７の脳内病原性インデックスを有する。別の実施形態では、弱毒化ウイルスは、約０の脳内病原性インデックスを有する。また別の実施形態では、弱毒化ウイルスは、ＨＴ１０８０細胞において約１５％未満の細胞傷害性を有する。別の実施形態では、弱毒化ウイルスは、少なくとも１０又は１５％の殺傷効率で、腫瘍細胞を選択的に殺傷する。別の実施形態では、腫瘍細胞殺傷効率は、約７５％〜１００％である。
【０００６】
本発明の別の態様は、概して、腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法を特徴とし、これは、腫瘍細胞を本明細書に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む。本発明の別の態様では、腫瘍細胞は、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌の細胞、並びに黒色腫癌細胞である。また別の実施形態では、本方法は、有効量の本明細書に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスを被験者に投与するステップを含む。さらに別の実施形態では、弱毒化ニューカッスル病ウイルスは、全身に、腹腔内、又は腫瘍内に送達される。別の実施形態では、ウイルスは、約１０7ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕの用量で投与される。さらなる実施形態では、ウイルスは、約１０9ｐｆｕ〜約１０11ｐｆｕの用量で静脈内投与される。別の実施形態では、被験者は、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌、並びに黒色腫癌からなる群から選択される癌を有する。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は概して、抗ＮＤＶ免疫応答を発生した被験者における新生物を治療する方法を特徴とし、本方法は、有効量の本明細書に記載の弱毒化キメラニューカッスル病ウイルスを被験者に投与するステップを含み、前記ウイルスは、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）のＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含むキメラウイルスであり、キメラニューカッスル病ウイルスは、ＮＤＶとは抗原が異なる。本発明の一実施形態では、本方法は、抗ＮＤＶ免疫応答を発生しているが、キメラニューカッスル病ウイルスを受けていない対照被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルと比較して、被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルを増大させる。
【０００８】
定義
別に定義されていない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語は全て、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されている意味を有する。以下の参照文献は、当業者に、本発明で使用する多数の用語の一般的定義を提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で用いる場合、以下の用語は、別に記載されていない限り、各用語に付与される下記の意味を有する。
【０００９】
「弱毒化ニューカッスル病ウイルス」とは、腫瘍細胞を選択的に殺傷するが、家禽に脅威を及ぼさないニューカッスル病ウイルスを意味する。一実施形態では、弱毒化ニューカッスル病ウイルスは、約０．４又は０．７未満のＩＣＰＩを有する。他の実施形態では、弱毒化ニューカッスル病ウイルスは、約０〜０．１のＩＣＰＩを有する。
【００１０】
「異種ポリヌクレオチド配列」とは、野生型の状態には存在しない組換えポリヌクレオチドを意味する。
【００１１】
「検出可能な標識」とは、目的の分子に結合すると、分光学、光化学、生化学、免疫化学、又は化学的手段によって、該分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般的に用いられているものなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンが挙げられる。
【００１２】
「剤（物質）」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、若しくはポリペプチド、又はこれらの断片を意味する。
【００１３】
「改変」又は「変化」とは、増加又は減少を意味する。改変は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％という低い程度であっても、あるいは４０％、５０％、６０％程度、又は７０％、７５％、８０％、９０％、若しくは１００％という高い程度であってもよい。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、抗原の抗原決定基の特徴と相補的な内部表面形状及び電荷分布を備えた３次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインからなるポリペプチド又はポリペプチド群を指す。抗体は、典型的に四量体を有し、これは、２つの同じポリペプチド鎖ペアを含み、各ペアは、１本の「軽鎖」と１本の「重鎖」を有する。各軽／重鎖ペアの可変領域、又は可変鎖ポリペプチドは、抗体結合部位を形成する。
【００１５】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。本発明の抗体は、限定はしないが、全ネイティブ抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単一鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、及び特殊抗体を含む。
【００１６】
「生体サンプル」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｓｉｔｕで取得又は採取される生体組織若しくは体液由来のサンプルなど、被験者から取得したサンプルを意味する。具体的実施形態では、生体サンプルは、生物に由来するあらゆる細胞、組織、体液、又はその他の物質を含む。
【００１７】
「捕捉試薬」とは、核酸分子又はポリペプチドを選択若しくは単離するために、核酸分子又はポリペプチドに特異的に結合する試薬を意味する。
【００１８】
「臨床的攻撃力」とは、新生物の重症度を意味する。攻撃性新生物は、低攻撃性新生物より転移する可能性が高い。組織保存的方法は、低攻撃性新生物に適しているが、より攻撃性の新生物には、より積極的な治療レジメンが必要である。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「決定する（こと）」、「評価する（こと）」、「アッセイする（こと）」、「測定する（こと）」及び「検出する（こと）」という用語は、定量及び定性決定の両方を指し、そのため、用語「決定する（こと）」は、本明細書において、「アッセイする（こと）」、「測定する（こと）」などと置き換え可能に用いられる。定量決定が意図される場合、被検物質などの「量を決定する（こと）」というフレーズが用いられる。定量及び／又は定性決定が意図される場合、被検物質の「レベルを決定する（こと）」又は被検物質を「検出する（こと）」というフレーズが用いられる。
【００２０】
「被験者」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物を指す。あくまでも例として、被験者は、限定はしないが、ヒト又はヒト以外の動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、若しくはネコなどの動物を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２１】
「減少する」又は「増加する」という用語は、それぞれマイナス又はプラスに変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％程度であっても、又は１００％であってもよい。
【００２２】
「標準」とは、比較の標準を意味する。
【００２３】
「定期的な」とは、規則的間隔で起こることを意味する。患者の定期的モニタリングは、例えば、毎日、週２回、月２回、毎月、年２回、又は毎年実施される試験のスケジュールを含む。
【００２４】
「新生物の重症度」とは、病理の程度を意味する。新生物の重症度は、例えば、新生物の病期又は等級が増すにつれて高くなる。
【００２５】
本発明の方法に有用な核酸分子は、本発明のポリペプチド又はその断片をコード化する任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には、実質的同一性を呈示するものである。内在性配列と「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、多様なストリンジェンシー条件下、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載する遺伝子）、又はその部分の間で、二本鎖分子を形成するペアを意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照のこと）。
【００２６】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、並びにより好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満である。低ストリジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアルデヒドの非存在下で得られるのに対し、高ストリジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。それ以外の変動するパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、デタージェント（例：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、及び担体ＤＮＡの含有又は除外は、当業者には周知である。必要に応じてこれらの多様な条件を組み合わせることにより、様々なレベルのストリジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中、３０℃で実施される。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で実施される。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００．ｍｕ．ｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で実施される。これらの条件に対する有用な変更は、当業者には容易に明らかであろう。
【００２７】
大部分の用途について、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップも、ストリジェンシーが変動し得る。洗浄ストリジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって決定することができる。前述のように、洗浄ストリジェンシーは、塩濃度を低下させるか、又は温度を高くすることにより、高めることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ  ＮａＣｌ及び３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらに好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、２５℃で実施される。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、４２℃で実施される。さらに好ましい実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、６８℃で実施される。これらの条件に対する上記以外の変更は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者には周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；並びにＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００２８】
「実質的に同一」とは、標準アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載するアミノ酸配列のいずれか１つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載する核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために用いられる配列に対して、アミノ酸レベル又は核酸で、少なくとも６０％、より好ましくは８０％若しくは８５％、さらに好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは、９９％以上同一である。
【００２９】
配列同一性は、典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定する。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、及び／又はその他の修飾に様々な程度の相同性を割り当てることによって、同一若しくは類似配列をマッチングする。保存的置換は、典型的に、下記の基における置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的手法では、ＢＬＡＳＴプログラムを用いてよく、その場合、ｅ-3〜ｅ-100の確率スコアは、極めて関連する配列を示す。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」とは、対象の種が、存在する優勢な（すなわち、モル基準で、組成物中の他のあらゆる個別種より多量に存在する）種であることを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象の種が、存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、及び９９％超を占める。最も好ましくは、組成物が、単一の高分子種から実質的に構成される場合には、対象の種を実質的な均質性（従来の検出方法では混入種を組成物中に検出することができない）まで精製する。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「治療する」、「治療する（こと）」、「治療」という用語、及び類似用語は、障害及び／又はそれに関連する症状を軽減若しくは改善することを指す。予め排除してはいないが、障害又は状態を治療することは、障害、それに関連する状態若しくは症状を完全に取り除くことを必要としないことが理解されよう。従って、治療の成功は、患者の生存を延長するか、又は望ましくない症状を緩和することであってもよい。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「予防する」、「予防する（こと）」、「予防」、「予防的処置」という用語、及び類似用語は、障害若しくは状態を有していないが、それを発症するリスクを有するか、又は発症しやすい被験者において、障害若しくは状態を発症する可能性を低減することを指す。
【００３３】
１用量は、治療組成物の単回投与を指す。投薬量は、１用量中の治療活性分子の量を指す。治療レジメンは、１つ又は複数の用量の投与の投薬量、スケジュール、及び方法を指す。サイクルとは、治療レジメン内の１又は複数回用量の反復可能な単位を指す。一部の治療レジメンでは、投薬量は、各用量について均一である。別の治療レジメンでは、投薬量は、均一ではなくてもよい。例えば、患者において要望されるレベルまで治療分子の濃度を上げるために、１又は複数回の負荷用量を用いてもよい。負荷用量の投与は、１又は複数回の維持用量の後に実施してよく、維持用量は、一般に、患者において、要望される治療分子の濃度を維持するのに十分な、より低い投薬量（例えば、負荷用量の半分以下）を含む。患者における治療分子の濃度を徐々に下げるために、１又は複数回の漸減用量を用いてもよい。
【００３４】
「特異的に結合する」とは、分子（例えば、ポリペプチド）を認識して、これに結合するが、他の分子を実質的に認識して、結合することはない化合物（例えば、抗体）を意味する。
【００３５】
本明細書で用いる場合、特に記載されているか、又は文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当分野で一般的誤差の範囲内、例えば、平均値の２つの標準偏差の範囲内として理解される。「約」は、表示した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、若しくは０．０１％の範囲内として理解することができる。文脈から別の趣旨が明らかでない限り、本明細書に記載する数値は全て、「約」という用語により修正される。
【００３６】
本明細書に記載する範囲は、前記範囲内の値の全てを簡潔にしたものと理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むことが理解される。
【００３７】
本明細書に記載する任意の化合物、組成物、又は方法は、本明細書に記載する他の組成物及び方法のいずれかの１つ又は複数と組み合わせることができる。
【００３８】
本明細書で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別の意味に解すべきでない限り、複数形を包含する。従って、例えば、「１つのバイオマーカ」への言及は、２つ以上のバイオマーカへの言及を包含する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、特に記載されているか、又は文脈から明らかでない限り、「又は」という用語は、包括的であると理解される。
【００４０】
「含む」という用語は、本明細書では、「限定はしないが、〜を含む」を意味するために用いられ、このフレーズと置き換え可能に用いられる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「含む」、「含んでいる（こと）」、「含有する（こと）」、「有する（こと）」という用語、及び類似用語は、米国特許法においてそれらに付与された意味を有し、「含む」、「含んでいる（こと）」、及び類似語を意味し得る；「から実質的に構成される（こと）」又は「実質的に構成される」などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有し、この用語は制約がなく、記載されているものの基本的又は新規の特徴が、記載されているものより多くの存在によって変えられない限り、記載されているものより多くの存在を許容するが、従来技術の実施形態は除外する。
【００４２】
配列
完全長ＮＤＶウイルス７３Ｔの例示的ヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
2019193662.tif 000008
【化７】
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【００４３】
ｗｔＦタンパク質の例示的ヌクレオチド配列は、以下の通りであり、下線を引いた配列は、Ｆタンパク質切断部位のヌクレオチド配列を表す。
【化８】
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【００４４】
野生型Ｆタンパク質の例示的アミノ酸配列（下線を引いた配列は、Ｆタンパク質切断部位のアミノ酸配列を表す）。
【化９】
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【００４５】
マウスＧＭ−ＣＳＦの例示的ヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【化１０】
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【００４６】
マウスＧＭ−ＣＳＦの例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【化１１】
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【００４７】
ヒトＧＭ−ＣＳＦの例示的ヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【化１２】
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【００４８】
ヒトＧＭ−ＣＳＦの例示的アミノ酸配列は、以下の通りである。
【化１３】
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ＮＤＶ７３ＴアンチゲノムｃＤＮＡ株７３Ｔの構築を示す。ウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲのためのＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する目的で、共通配列を取得するために、ＧｅｎＢａｎｋのＮＤＶ配列をアラインメントした。高忠実度ＲＴ−ＰＣＲにより作製した６つのサブゲノムｃＤＮＡオーバーラップ断片をｐＵＣ１９ベクターにアセンブリングした。ＮＤＶ７３Ｔ株の完全長アンチゲノムｃＤＮＡをｐ７３Ｔと称した。７３ＴにおけるＦタンパク質切断部位（ＦＰＣＳ）のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を、ＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株（長潜伏期性、ｌｅｎｔｏ）の配列又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖ｇＢの配列（Ｓ１１６）として修飾した。ダブルスラッシュは、Ｆタンパク質の切断部位を示す。さらに、７３Ｔ株ｃＤＮＡプラスミド（ｐ７３Ｔ）は、５’末端に２７ヌクレオチド（ｎｔ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータを、３’末端に１８９ｎｔ含有のＨＤＶアンチゲノムリボザイム配列及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写終結シグナルを含む。非ビルレントＮＤＶを作製するために、融合タンパク質のプロテアーゼ切断部位をコード化する配列を、部位指定突然変異誘発により、非ビルレントＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株（長潜伏期性、ｌｅｎｔｏ）の配列又はサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の配列（Ｓ１１６）として修飾した。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、ＮＤＶ７３Ｔゲノムへのトランスジーンカセットの挿入を示す。図２Ａは、Ｐ−Ｍ結合部へのトランスジーンの挿入を示す。ＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片を含有するサブクローンプラスミドのｎｔ３１４８に、ＡｆｅＩ制限部位を導入した。コドン最適化ヒト若しくはマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はインターロイキン（ＩＬ−２）をコード化するｃＤＮＡ。挿入した遺伝子カセットは、トランスジーンの遺伝子終止（ＧＥ；５’−ＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡ−３’）、遺伝子間ヌクレオチド（Ｔ）、遺伝子開始配列（ＧＳ；５’−ＡＣＧＧＧＴＡＧＡ−３’）及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。さらに、Ｋｏｚａｋ配列を導入するために、１０のヌクレオチド（５’−ｃｇｃｃｇｃｃａｃｃ−３’）を開始部位の上流に挿入した。得られたプラスミドからのＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片をプラスミドｒ７３Ｔにシャッフルして、ｐ７３Ｔ−Ｐ１と名付けた。さらに、図２Ａは、ＨＮ  ＯＲＦとＨＮの遺伝子終止シグナル（ＧＥ）配列との間のＨＮ−Ｌ結合部へのトランスジーンの挿入を示し、ＡｇｅＩ−ＸｂａＩ断片を含むプラスミドのｎｔ８２３１にＡｆｅＩ制限部位が導入された。リン酸センス及びアンチセンスプライマーのペアを用いたＰＣＲにより遺伝子カセットを作製し（表３）、ＡｆｅＩ部位に挿入した。得られたプラスミドからのＡｇｅＩ−ＸｂａＩ断片をプラスミドｐ７３Ｔにシャッフルして、ｐ７３Ｔ−ＨＮ１を取得した。Ｐ−Ｍ又はＨＮ−Ｌ結合部にトランスジーンを含む完全長（ＦＬ）ｐ７３ＴｃＤＮＡをそれぞれｐ７３Ｔ−Ｐ１又はｐ７３Ｔ−ＨＮ１と称した。図２Ｂは、Ｐ−Ｍ結合部への２つのトランスジーンカセットの挿入を示す。ＧＭ−ＣＳＦのＯＲＦの終端（ｎｔ３１６９）にＡｆｅＩ部位を導入した。ＧＥ及びＧＳ配列を含有するリン酸センス及びアンチセンスプライマーのペアを用いて、ＩＬ−２  ＯＲＦを増幅した後、ＡｆｅＩ部位に挿入した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２転写カセットを含む、得られたプラスミドからのＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片をプラスミドｒ７３Ｔに戻して置換し、ｐ７３Ｔ−Ｐ２を取得した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、修飾ＦＰＣＳを含む感染性組換えＮＤＶ株７３Ｔ（ｒ７３Ｔ）の回収を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦタンパク質切断及び融合活性を表示する。図３Ａは、どのようにしてＮＤＶ７３ＴＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及び抗原ｃＤＮＡ（ｐ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ又はｐ７３Ｔ−Ｓ１１６）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ及びターミネータの制御下でクローン化したかを示す。４つのプラスミドを、細胞株を発現するＲＮＡポリメラーゼ発現細胞株に同時トランスフェクトした。回収したウイルスをｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ又はｒ７３Ｔ−Ｓ１１６と称した。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ及びｒ７３Ｔ−Ｓ１１６を、トリプシン補充を含む、若しくは含まない培地を用いて、ベロ細胞において継代させた。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏの増殖はトリプシン依存的であるのに対し、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６は、トリプシン補充なしの培地中で増殖することができる。ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６におけるＦＰＣＳ及びトランスジーンの遺伝的安定性を評価するために、Ｐ−Ｍ結合部にｈＧＭ−ＣＳＦを有する、又は有していないｒ７３Ｔ−Ｓ１１６を、トリプシン補充有り、又はなしの培地において、ＭＯＩ０．００１で、ベロ細胞及びヒト線維肉腫ＨＴ１０８０にて１０継代にわたりさらに継代させた。ＦＰＣＳにおける突然変異（Ｒ１１３Ｋ及び／又はＱ１１４Ｍ）が継代７で出現し、Ｓ１１６Ｒ突然変異が継代９で検出された。継代１０で、Ｆ、ＨＮ及びトランスジーンを配列決定したが、それ以上の突然変異は認められなかった。
【図３Ｂ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、修飾ＦＰＣＳを含む感染性組換えＮＤＶ株７３Ｔ（ｒ７３Ｔ）の回収を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦタンパク質切断及び融合活性を表示する。図３Ｂ及び３Ｃは、細胞融合及びＦタンパク質切断部位に対するＦタンパク質切断部位（ＦＰＣＳ）突然変異の作用を示す。２つのトランスジーン、ＧＦＰ及びＮＤＶ  Ｆ又はＨＮ遺伝子を同時発現するプラスミドの構築のために、ＮＤＶ  Ｆ又はＨＮ遺伝子のタンパク質オープンリーディングフレームをＰＣＲにより増幅して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの制御下で、プラスミドｐＶｉｔｒｏ２−ｎｅｏ−ＭＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。翌日、２９３Ｔ細胞をトランスフェクションのために６ウェルプレートに５×１０5細胞／ウェルで接種した。図３Ｂは、２μｇのＮＤＶ  ＦプラスミドＤＮＡで１日かけてトランスフェクトした後、抗ＮＤＶ  Ｆ特異的ポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット分析のためにタンパク質溶解バッファー中で採取した細胞を示す。長潜伏期性切断部位及びＳ１１６を有するＮＤＶ  Ｆタンパク質は切断されず、Ｆ０のみが検出された。Ｒ１１６及びＳ１１６−ＫＭのＦタンパク質は、Ｆ１タンパク質バンドの出現によって示されるように部分的に切断された。図３Ｃは、ｗｔＨＮプラスミドと一緒に異なるＦプラスミドで同時トランスフェクトし、蛍光顕微鏡により融合物形成を検査した細胞を示す。ｗｔＦタンパク質が、融合物形成において最も効率的であった。
【図４】図４は、ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ及びｒ７３Ｔ−Ｓ１１６誘導体の特徴をまとめた表である。a全てのウイルスが、Ｐ−Ｍ結合部にｈＧＭ−ＣＳＦを含む。bＦＰＣＳ−１１６とは異なるＦＰＣＳ中のアミノ酸は、下線で示す。c３６時間のインキュベーション後のオーバーレイ中のトリプシンなしのベロ細胞におけるプラーク形成であり、１０倍率で視覚化したもの。d鶏卵中の平均致死時間（ＭＤＴ）。e脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）による１日齢病原体除去ニワトリにおけるＮＤＶの病原性。ＩＣＰＩアッセイは、国立獣医学検査機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＶＳＬ）（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）で実施した。f感染後７２時間時点での、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１での感染後のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞に対するウイルスの細胞傷害作用。１００％生存性と認められた非処置細胞と各サンプルを比較することにより、生存細胞の相対パーセンテージを決定する。表に示すデータは、死細胞の相対パーセンテージである。g０．０１のＭＯＩでの感染後のベロ細胞中で増殖させ、トリプシン補充なしのＯＰＴＩ−ＭＥＭにおいて３７℃で３〜５日間培養したウイルス。h孵化鶏卵中で増殖させたウイルス。１０〜１１日齢孵化鶏卵を１，０００ｐｆｕのｒ７３Ｔに感染させた。３７℃で７２時間のインキュベーション後に尿膜液を採取した。感染性ウイルス力価をベロ細胞においてプラークアッセイにより決定した。
【図５Ａ】図５Ａ及び５Ｂは、ニワトリにおいてｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ウイルスビルレンスを弱毒化するための戦略を示す。図５Ａは、Ｐ−Ｍ結合部（１）及びＨＮ−Ｌ結合部（２）へのトランスジーンの挿入、並びに非コード配列（３）の挿入によるＨＮ−Ｌ遺伝子間領域の伸長を示す。Ｐ−Ｍ結合部へのトランスジーンカセットの挿入は、図２Ａに示したものと同じである。第２トランスジーンカセットは、トランスジーンのＬ遺伝子開始配列（ＧＳ；５’−ＡＣＧＧＧＴＡＧＡ−３’）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、Ｌ遺伝子の３’非翻訳領域からの配列（斜体で強調）及びＬ遺伝子終止配列（ＧＥ；５’−ＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡ−３’）を含む。ＨＮ−Ｌ結合部を伸長するために用いた非コード配列は、パラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）又はいずれの既知配列とも相同性のないランダム配列から取得した。挿入配列は、６０〜３１８ｎｔの範囲内であってよい。ＨＮ−Ｌへの第２トランスジーンの挿入により、ウイルスは、２つのトランスジーン（例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦ及びＧＦＰ）を発現することが可能になった。
【図５Ｂ】図５Ａ及び５Ｂは、ニワトリにおいてｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ウイルスビルレンスを弱毒化するための戦略を示す。図５Ｂは、ＨＮ−Ｌ結合部に挿入された配列を表示する（図５Ｂ）。
【図６Ａ】図６Ａは、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６誘導体の特徴をまとめた表である。a全てのウイルスが、Ｐ−Ｍ結合部にｈＧＭ−ＣＳＦを含む。b図５Ｂに示すようにＨＮ−Ｌ結合部に挿入された配列。c３６時間のインキュベーション後のオーバーレイ中のトリプシンなしベロ細胞におけるプラーク形成であり、１０倍率で視覚化したもの。d鶏卵中の平均致死時間（ＭＤＴ）。e脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）による１日齢病原体除去ニワトリにおけるＮＤＶの病原性。ＩＣＰＩアッセイは、国立獣医学検査機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＶＳＬ）（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）で実施した。f感染後７２時間時点での、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感染後のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞に対するウイルスの細胞傷害作用。１００％生存性と認められた非処置細胞と各サンプルを比較することにより、生存細胞の相対パーセンテージを決定する。表に示すデータは、死細胞の相対パーセンテージである。g０．０１のＭＯＩでの感染後のベロ細胞中で増殖させ、トリプシン補充なしのＯＰＴＩ−ＭＥＭにおいて３７℃で３〜５日間培養したウイルス。h孵化鶏卵中で増殖させたウイルス。１０〜１１日齢孵化鶏卵を１０００ｐｆｕのｒ７３Ｔに感染させた。３７℃で７２時間のインキュベーション後、尿膜液を採取した。感染力価をベロ細胞においてプラークアッセイにより決定した。
【図６Ｂ−６Ｅ】図６Ｂ〜６Ｅは、ＤＦ−１細胞及びベロ細胞における組換えＮＤＶの増殖動態を示すグラフである。６ウェルプレート中のＤＦ−１細胞及びベロ細胞を感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）５．０（単一サイクル、図６Ｂ及びＣ）又は０．０１（複数サイクル、図６Ｃ及びＤ）で各表示ウイルスに感染させた。感染した細胞培養上清を、感染から５０時間後まで１０時間毎に採取し、ウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。
【図６Ｆ−６Ｇ】図６Ｆ及び６Ｇは、ＤＦ−１細胞におけるウイルスＲＮＡ及びタンパク質合成を示す。ＤＦ−１細胞を５．０のｍ．ｏ．ｉで各表示ウイルスに感染させ、２０時間インキュベートした後、全細胞内ＲＮＡをノーザンブロット分析のために抽出し（図６Ｆ）、第２セットの感染細胞を、タンパク質合成についてウエスタンブロッティングにより調べた（図６Ｇ）。ＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル中の電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に移してから、ＨＮ、ＮＰ、Ｐ、及びＬ遺伝子に対して特異的なビオチン標識ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。Ｌ遺伝子の陽性ＲＮＡプローブを用いて、ウイルスゲノムＲＮＡを検出した。全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗ＮＰ、Ｆ、ＨＮ及びＬ血清と一緒にブロッティングした。ゲル上にロードした全タンパク質をアクチン特異的抗体により検出した。ＨＮ及びＬ遺伝子間配列の間に１９８ｎｔを有する組換えＮＤＶ  Ｒ１１６ｉは、ＤＦ−１細胞において全体的に低減したＲＮＡ及びタンパク質合成を示した。
【図６Ｈ−６Ｉ】図６Ｈ及び６Ｉは、ベロ細胞におけるウイルスＲＮＡ及びタンパク質合成を示す。図６Ｈは、ＲＮＡ合成のノーザンブロット分析を示す。ベロ細胞を５．０のｍ．ｏ．ｉでウイルスに感染させ、２０時間インキュベートした後、全細胞内ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル中の電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に移してから、ＮＰ及びＬ遺伝子に対して特異的なビオチン標識ＲＮＡプローブ、又は陽性センスＬ遺伝子ＲＮＡとハイブリダイズさせて、ゲノムＲＮＡを検出した。図６Ｉは、感染ベロ細胞におけるウイルスタンパク質合成のウエスタンブロット分析を示す。全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移してから、抗ＮＰ、Ｆ、ＨＮ及びＬ血清と一緒にブロッティングした。ゲル上にロードした全タンパク質をアクチン特異的抗体により検出した。１９８ｎｔ挿入を有するＲ１１６ｉウイルスは、Ｓ１１６及びｗｔＮＤＶと比較して、ゲノムＲＮＡを減少させたが、ＮＰｍＲＮＡを大幅に増加した。ＬｍＲＮＡレベルは低すぎて、差がわからなかった。ベロ細胞において、Ｌ遺伝子上流のタンパク質は上方制御されたが、Ｌタンパク質レベルは低下した。
【図６Ｊ−６Ｋ】図６Ｊ及び６Ｋは、ウエスタンブロット分析による、低感染多重度での感染ＤＦ−１細胞及びベロ細胞におけるタンパク質合成の比較を示す。ＤＦ−１細胞及びベロ細胞を０．００１のｍ．ｏ．ｉで各表示ウイルスに感染させ、７２時間インキュベートした後、タンパク質溶解バッファー中で採取した。全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移してから、抗ＮＰ、Ｆ、ＨＮ及びＬ血清と一緒にブロッティングした。ゲル上にロードしたタンパク質をアクチンに対する抗体によって検出した。Ｌタンパク質のレベルは、両細胞株で低下したものの、Ｌ遺伝子上流のタンパク質は、ＤＦ−１細胞において下方制御されたが、ベロ細胞においては上方制御された。
【図６Ｌ】図６Ｌは、ＤＦ−１細胞と比較した、感染ヒト細胞におけるウイルスタンパク質合成を示す。ヒトＨＴ１０８０、ヒーラ細胞及びＤＦ−１細胞を５．０のｍ．ｏ．ｉで各表示ウイルスに感染させ、２０時間インキュベートした後、タンパク質溶解バッファー中で採取した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移してから、抗ＮＰ及び抗Ｌ血清と一緒にブロッティングした。ＨＮ及びＬ結合部の間に１９８ｎｔを有するＲ１１６ｉのＨＮタンパク質発現は、ＨＴ１０８０及びヒーラ細胞において増大するが、ＤＦ−１細胞において低減する。Ｌタンパク質は、Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶに感染した３つの細胞株全てにおいて減少した。
【図７】図７は、孵化鶏卵におけるｒ７３Ｔウイルスの増殖動態を示すグラフである。ｒ７３Ｔウイルスの増殖状態を決定するために、鶏卵において増殖動態試験を実施した。孵化鶏卵を卵当たり１００、１０００、１０，０００又は１００，０００ＰＦＵの表示ウイルスに感染させ、２、３若しくは４日にわたってインキュベートした（上方左が、７３Ｔｗｔ；上方右が、Ｒ１１６；中央左が、Ｒ１１６ｉ−３１８；中央右が、Ｒ１１６ｉ−１９８−ＲＳＶ；下方左が、Ｒ１１６ｉ−１９８−ランダム；下方右が、Ｓ１１６−ＫＭ）。尿膜液を採取し、ウイルス力価をＦＦＡによって決定した。１００ＦＦＵ／卵の接種は、１日目に低い力価を有したが、２日目にはピーク力価に達する。全体として、ほとんどのウイルスが、用いた接種材料の用量に関係なく、２日目に約８ｌｏｇ／ｍＬのピーク力価に到達した。Ｒ１１６ｉ−１９８は、最も低い力価を有し、低い接種材料用量で２日目に最高収量を産生したが、これは、欠損粒子の蓄積があり得ることを示している。Ｒ１１６ｉ−３１８−ＡＰＭＶ挿入も、約７ｌｏｇというより低いピーク力価を有した。Ｒ１１６ｉ−１９８−ＲＳＶは、７．５ｌｏｇのピーク力価に達した。逆遺伝学によって再誘導したＳ１１６は、鶏卵においてウイルス産生の低下を全く示さなかった。従って、Ｒ１１６誘導体の中でも、ＲＳＶ−１９８ｎｔ挿入を有するウイルスが、鶏卵における増殖性に関して、腫瘍溶解性ウイルスの第１位の候補であった。
【図８】図８は、ベロ細胞におけるｒ７３Ｔウイルスの増殖動態を示すグラフである。ウイルスはまた、無血清ベロ細胞クローン５１Ｄ１１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅにより作製された専売細胞株）においても評価した。全てのウイルスが、両方のｍｏｉ条件（高：０．００１；低：０．０００１）下で同様に良好に複製した。７３Ｔ  ＦＰＣＳの修飾並びにＲ１１６のＨＮ−Ｌ結合部における遺伝子間挿入は、ベロ細胞におけるウイルス増殖に影響を与えなかった。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ｒＴ３Ｔウイルスが腫瘍細胞において選択的に複製し、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を有することを示す。データは、７２時間にわたる１〜１００，０００ＰＦＵの範囲の様々な用量のｒ７３Ｔ誘導体による感染後に取得した。図９Ａは、非処置対照細胞と比較した、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０における細胞殺傷についてのｒＴ３Ｔ及びその誘導体の評価を示すグラフである。ＨＴ１０８０癌細胞において、長潜伏期性ＦＰＣＳを有するウイルスは、最小殺傷を有し、ＦＰＣＳにＳ１１６を有するウイルスは中程度であり、また、ＦＰＣＳにＲ１１６を有するウイルスは、ｒ７３Ｔｗｔウイルスと同じくらい効率的な細胞殺傷を呈示した。図９Ｂは、非処置対照細胞と比較した、正常ヒト皮膚線維芽ＣＣＤ１１２２Ｓｋ細胞における細胞殺傷についてのｒＴ３Ｔ及びその誘導体の評価を示すグラフである。正常ＣＣＤ１１２２ＳＫ細胞の場合、全てのウイルスが、癌細胞ほど効率的に細胞を殺傷せず、殺傷効率の低下は、約１００倍であった。ＦＰＣＳ配列とは関係なく、全てのウイルスが、正常細胞において同様の殺傷効率を示したが、これは、恐らく単一サイクルの複製によると考えられる（ウイルス拡散なし）。図９Ｃは、Ｐｒｉｓｍ６．０を用いて用量応答曲線から補間した５０％有効濃度（ＥＣ50）として表した癌及び正常細胞における細胞殺傷効率を示す表である。Ｒ１１６誘導体は、ｒ７３Ｔｗｔと同様のＥＣ50値（ＥＣ50：１０ＰＦＵ）を有したが、これは、ＦＰＣＳの修飾が、癌細胞におけるウイルス複製及び細胞殺傷に影響を与えなかったことを示している。図９Ｄは、感染後３日目の、ＭＯＩ０．０１でのＨＴ１０８０及びＣＣＤ１１２２ＳＫ細胞におけるウイルスの複製を示すグラフである。全てのウイルスは、約１．５〜２．０ｌｏｇの差で、正常細胞よりも癌細胞において優先的に複製した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｒ７３Ｔ誘導体が、局所又は全身で投与したとき、腫瘍退縮に有効であることを示すグラフである。ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍溶解活性を評価するために、５〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃ無胸腺ヌードマウスに、５×１０6細胞／０．１ｍｌの濃度でＨＴ１０８０細胞を皮下注射することにより、ＨＴ１０８０異種移植片モデルを樹立した。図１０Ａは、腫瘍内（ｉｔ）又は静脈内（ｉｖ）投与したＲ１１６ｉ−３１８−ｈＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフである。データは、Ｒ１１６ｉ−３１８−ｈＧＭ−ＣＳＦ誘導体が、ヒト腫瘍異種移植片を保有する免疫欠損マウスに全身又は腫瘍内のいずれかで送達したとき、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有したことを示す。腫瘍増殖速度を処置及び対照群の間で比較した。２つの投与経路によって誘導した腫瘍退縮は、いずれも対照群とは有意に相違した。腫瘍体積が約６５ｍｍ3に達したとき、マウスを表示のようにランダムに群分けした（ｎ＝１０）。マウスは、ＰＢＳ又は腫瘍内（ＩＴ）投与した２×１０7Ｐｆｕ若しくは尾静脈注射により静脈内（ＩＶ）投与した１×１０8ＰＦＵのｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−１９８いずれかの単回用量を受けた。＊Ｐ＜０．０５、独立スチューデントＴ検定。図１０Ｂは、１×１０8ＰＦＵのＩＴ注射による、ＨＴ１０８０異種移植片におけるｒ７３Ｔ誘導体の腫瘍溶解活性を比較するグラフである。２用量のｒ７３Ｔ誘導体は、有効性に差はあったものの、有意な腫瘍退縮を誘導することができた。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏが、腫瘍退縮において最も有効性が低かったのに対し、ｒ７３Ｔｗｔは、腫瘍退縮において最も有効であった。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、Ｓ１１６ウイルスと同等の効果を有したが、Ｓ１１６ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺傷について１０倍低いＥＣ50を有した（図９Ａを参照）。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−３１８は、２回目用量から９日後（腫瘍移植後１９日目）まで、腫瘍増殖の阻害において、７３Ｔｗｔと同じくらい強力であり、腫瘍は、その後Ｒ１１６ｉ処置マウスで再び増殖したが、７３Ｔｗｔ処置群ではそれはなかった。腫瘍体積が約１８０ｍｍ3に達したとき、マウスをランダムに群分けした（ｎ＝７）。マウスは、ＰＢＳ又は１×１０8ＰＦＵのｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ｌｅｎｔｏ（ｌｅｎｔｏ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｓ１１６Ｋ１１３Ｍ１１４（Ｓ１１６  ＫＭ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−３１８ｎｔＡＰＭＶ−Ｎ（Ｒ１１６ｉ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ７３Ｔｗｔ）のいずれかをＩＶ投与により受けた。３〜４日毎に腫瘍サイズを測定した。＊ｐ＜０．０５、独立スチューデントＴ検定。これらのデータは、ｒ７３Ｔ誘導体が、ヒト腫瘍異種移植片を保有する免疫欠損マウスに全身又は腫瘍内のいずれで送達したときも、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有することを立証するものであった。Ｆタンパク質の効率的な切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製にとって重要である。ＦＰＣＳにＲ１１６を有するウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞殺傷において、より強力であった。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｇは、静脈内送達後のｒ７３Ｔ誘導体の組織生体内分布及び腫瘍増殖阻害に対するマウス対ヒトＧＭ−ＣＳＦの作用を示す。腫瘍溶解性ＮＤＶウイルスが、腫瘍組織において選択的に複製するか否か、並びにウイルスクリアランスを決定するために、様々な臓器内でのウイルス分布を決定した。サイズ約２５０ｍｍ3の皮下ＨＴ１０８０腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウスを、用量１×１０8ＰＦＵのＲ１１６ｉ（ｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−３１８ｎｔＡＰＭＶ−Ｎ）で処置し、１、４、又は８日目に死なせた（１時点につきｎ＝３）。血清、肺、脾臓、卵巣及び腫瘍を採取し、ウイルスの存在を定量した。腫瘍及び臓器におけるウイルス複製を感染後１、４、及び８日目に評価した。図１１Ａは、ベロ細胞におけるプラークアッセイによる組織中のウイルスの定量を表すグラフである。ウイルスは、臓器では１日目にしか検出されず（卵巣には全ての時点でウイルスは全く検出されなかった；データは示していない）、腫瘍組織中のウイルス負荷は、肺及び脾臓より約１００倍高かった。腫瘍中のウイルスの存在は、少なくとも８日間持続したが、これは、ウイルスが腫瘍組織において選択的に複製したことを示している。    図１１Ｂは、ｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーンのＥＬＩＳＡアッセイによる、組織中にウイルスによって発現されたＧＭ−ＣＳＦの定量を表すグラフである。プラークアッセイにより得られたウイルス複製データと一致して、ｈＧＭ−ＣＳＦのレベルが最も高く、８日を超えて腫瘍組織中に持続した。これらのデータによって、ＮＤＶウイルスが、腫瘍組織において有効に複製し、トランスジーンが局所腫瘍組織に有効に送達されることが立証された。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルにおける腫瘍阻害に対する、ｍＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフを表す。７匹の群における５〜６週齢の無胸腺ヌードマウスに、５×１０6ＨＴ１０８０細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積約１１０ｍｍ3に達したとき（６日目）、腫瘍に、単一用量：１×１０8ｐｆｕのｒＮＤＶ、ｍＧＭ−ＣＳＦ又はｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶを注射した。３〜４日毎に腫瘍サイズを測定した。ｍＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは、ｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーンより腫瘍増殖阻害力が低かった。しかし、ｍＧＭ−ＣＳＦ又はｈＧＭ−ＣＳＦのいずれかを有するＳ１１６について腫瘍増殖阻害に差は認められなかった。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルにおける腫瘍からのウイルスクリアランスに対する、ｍＧＭ−ＣＳＦの作用を示すグラフを表す。３匹の群における無胸腺ヌードマウスに、５×１０6ＨＴ１０８０細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積１８０ｍｍ3に達したとき（１０日目）、マウスに、１用量：１×１０8ｐｆｕのＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ又はＳ１１６ＫＭを静脈内処置した。腫瘍を４日目又は７日目に採取し、腫瘍組織中のウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。ｍＧＭ−ＣＳＦ又はｈＧＭ−ＣＳＦのいずれかを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ及びＳ１１６ＫＭは両方とも、４日目に同等の力価を示した。７日目に、ｍＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは、ｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶと比較して、大幅に減少した。比較すると、Ｓ１１６ｍＧＭ−ＣＳＦ及びｈＧＭ−ＣＳＦの力価は同等であった。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルにおける腫瘍中への免疫細胞浸潤に対する、Ｒ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ又はＳ１１６ＫＭの作用を示すグラフである。３匹の群における無胸腺ヌードマウスに、５×１０6ＨＴ１０８０細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積１８０ｍｍ3に達したとき（１０日目）、マウスを、１用量：１×１０8ｐｆｕの表示ウイルスで静脈内処置した。腫瘍を４日目に採取し、ＦＡＣＳ分析により、組織を好中球、ＮＫ細胞及びマクロファージ染色について処理した。Ｒ：Ｒ１１６ｉ−１９８−ＲＳＶ、Ｓ：Ｓ１１６−ＫＭ。ｍＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは、より多くの免疫細胞浸潤を示した。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルにおいて、サイトカイン及びケモカインが上方制御されたことを示す表である。３匹の群における無胸腺ヌードマウスに、５×１０6ＨＴ１０８０細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積１８０ｍｍ3に達したとき（１０日目）、マウスを、１用量：１×１０8ｐｆｕのｍＧＭ−ＣＳＦ若しくはｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ又はＳ１１６ＫＭで静脈内処置した。腫瘍を４日目に採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘ分析により、組織をサイトカイン及びケモカインのレベルについて処理した。ウイルス感染は、局所腫瘍組織においてサイトカイン及びケモカインの産生を誘導し、そのレベルは、ウイルス骨格及びヒト又はマウスＧＭ−ＣＳＦに応じて変動した。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルの腫瘍増殖阻害において、Ｒ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ−ｈＧＭ−ＣＳＦ及びＲ１１６ｉ−３１８ＡＰＭＶ−ｈＧＭ−ＣＳＦが同等であったことを示すグラフを表す。７匹の群における無胸腺ヌードマウスに、５×１０6ＨＴ１０８０細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積約１１０ｍｍ3に達したとき（６日目）、単一用量：１×１０8ｐｆｕのウイルスを腫瘍内注射した。３〜４日毎に腫瘍サイズを測定し、グラフ化した。１９８及び３１８ｎｔの挿入長さは、Ｒ１１６ｉ腫瘍溶解活性に影響しなかった。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは、キメラＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含む７３ＴのアンチゲノムｃＤＮＡの構築及びその特性決定を示し、図１２Ｃでは、ＲＮＡポリメラーゼ複合体活性の機能を比較する。ウイルス表面糖タンパク質は、ニワトリにおける免疫原性及びビルレンスにとって重要な抗原である。個別に又は組み合わせて、ニワトリにおいてビルレントではない他のパラミクソウイルスの対応する細胞外（エクト（ｅｃｔｏ））ドメインによって、ＮＤＶのＦ及び／又はＨＮ遺伝子を置換した。パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）は、イヌパラミクソウイルスであり、ヒトには疾患を引き起こさず、また、ハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）は、ニワトリにおいて非ビルレントであることが証明されている。図１２Ａは、完全長アンチゲノムＮＤＶ７３Ｔ  ｃＤＮＡのＦ及び／又はＨＮ糖タンパク質エクトドメインを、ＰＰＭＶ−１及び／又はＰＩＶ５で置換したことを示す。ＮＤＶ、ＰＩＶ５及びＰＰＭＶ−１配列は、それぞれ、青、紫又は緑で色付けしたボックスで表示する。個別のタンパク質又はタンパク質ドメインのアミノ酸長さを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは、キメラＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含む７３ＴのアンチゲノムｃＤＮＡの構築及びその特性決定を示し、図１２Ｃでは、ＲＮＡポリメラーゼ複合体活性の機能を比較する。ウイルス表面糖タンパク質は、ニワトリにおける免疫原性及びビルレンスにとって重要な抗原である。個別に又は組み合わせて、ニワトリにおいてビルレントではない他のパラミクソウイルスの対応する細胞外（エクト（ｅｃｔｏ））ドメインによって、ＮＤＶのＦ及び／又はＨＮ遺伝子を置換した。パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）は、イヌパラミクソウイルスであり、ヒトには疾患を引き起こさず、また、ハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）は、ニワトリにおいて非ビルレントであることが証明されている。図１２Ｂは、キメラＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含む７３Ｔ誘導体の特性決定を示す表である。ベロ細胞におけるプラーク形成、相対ＨＴ１０８０細胞殺傷及びＭＤＴを既述のように実施した。ＰＩＶ−５  Ｆ−ＨＮを除いて、キメラウイルスを回収し、外性トリプシンの非存在下、細胞において増殖させた。３つのウイルスは全て良好な大きさのプラークを形成し、効率的な細胞間拡散を示した。ＰＰＭＶ−１  Ｆ−ＨＮ又はＦキメラウイルスは、それぞれ、７９及び８４時間のＭＤＴ値を有し、ニワトリにおいて可能性のあるビルレンスを示した。いずれのＰＰＭＩ−１キメラウイルスも、７１及び６１％のレベルで、効率的にＨＴ１０８０細胞を殺傷した。ＰＩＶ５−Ｆキメラは、卵では増殖しなかったため、ニワトリにおいてビルレントではなく、ＨＴ１０８０細胞を４７％で殺傷した。２用量の１×１０8ＰＦＵのｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉをＩＶ投与したマウスから採取した血清を用いた中和アッセイにより、ＮＤＶとＰＰＭＶ−１又はＰＩＶ５キメラとの間の血清交差反応性を調べた。ｒ７３Ｔウイルスは、ＮＤＶ感染血清（力価９６０）により中和することができるが、ＰＰＭＶ−１及びＰＩＶ５キメラは中和されなかった（力価＜４）ため、ＮＤＶとＰＰＭＶ−１又はＰＩＶ５キメラとの間に交差反応性はないことが確認された。異なる抗原性を有するキメラウイルスは、過去のＮＤＶ治療の際に抗ＮＤＶ免疫応答を発生した患者のための追加腫瘍溶解性ウイルスとして役立つ可能性を有する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ミニゲノムアッセイによる他のパラミクソウイルスとのＮＤＶ  ＲＮＡポリメラーゼ活性の比較を示す。Ｔ７を発現する細胞を、ＮＤＶのＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質を発現する３つのプラスミド、並びにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＧＦＰ遺伝子をコード化するＮＤＶアンチミニゲノムｃＤＮＡをコード化するプラスミド、又は麻疹ウイルス（ＭＶ）若しくはＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子をコード化するプラスミド及びそれぞれのＲＳＶ若しくはＭＶ  ＧＦＰアンチミニゲノムｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから２又は３日後に、ＧＦＰタンパク質の発現により示されるミニゲノム複製を蛍光顕微鏡で調べた。ＮＤＶは、麻疹ウイルス及びＲＳＶと比較して、最も強力なポリメラーゼ活性を有した。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ及び１３Ｂは、ｒＮＤＶ変異体に対する癌細胞株の感受性を示す。様々な組織に由来する癌細胞株をＭＯＩ０．１でＮＤＶＳ１１６又はＮＤＶＲ１１６ｉに感染させ、感染から７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、細胞生存性を評価した。ＮＤＶに対する感受性は、感染から７２時間後、３０％超の細胞殺傷率として定義される。図１３Ａは、少なくとも１６の多様な適応症についてのＮＤＶ感受性ヒト癌細胞株のパーセンテージのグラフを表す。各群内の細胞株の数を数字で示し、表に記載する。図１３Ｂは、ＮＤＶ変異体に対応する２２の癌細胞株の感受性のグラフを表す。細胞殺傷率（％）は、非処置対照細胞のパーセンテージとして決定する。
【図１４】図１４は、ｒｅｃＮＤＶGM-CSFに対する癌細胞株の許容度を示すグラフである。代表的腫瘍細胞株におけるＲ１１６ｉ−ＧＭ−ＣＳＦの細胞殺傷率を図１４に示す。最大殺傷率（％）は、ＭＯＩ０．１で、腫瘍細胞株の感染から３日後に、非感染対照に対して決定した。いくつかの細胞株は、同じ腫瘍タイプ、例えば、膀胱、胃、前立腺、黒色腫、乳房、膵臓及び肺癌などに由来するが、ウイルス殺傷に対して異なる感受性を示した。＞５０％の割合でＲ１１６ｉ−ＧＭ−ＣＳＦにより殺傷され得る各腫瘍適応症からの細胞株の数を表１にまとめる。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｆは、ＮＤＶ誘導体が、様々なマウス癌モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することを示すグラフである。図１５Ａ及び１５Ｂは、ｒｅｃＮＤＶGM-CSF株が、同一遺伝子マウス黒色腫モデルにおいて腫瘍増殖を阻害することを示すグラフである（Ｂ１６Ｆ１０  ＡＰ３）。７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（図１５Ａ左側）及びＲ１１６ｉ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（図１５Ａ右側）を、予備実験において、Ｂ１６黒色腫モデルにおけるその腫瘍溶解作用について評価した。Ｂ１６マウスにおけるウイルス耐容性を評価する場合、群のサイズは小さかった（ｎ＝３）。各ウイルスを１１日目及び１４日目に２回２×１０7ｐｆｕで静脈内（ｉ．ｖ）；１１日目及び１４日目に２回２×１０7ｐｆｕで腹腔内（ｉ．ｐ）；又は１１日目に１回１×１０7ｐｆｕで腫瘍内（ｉ．ｔ）投与した。３つの投与経路によりＲ１１６−ｈＧＭ−ＣＳＦ又はｍＧＭ−ＣＳＦで処置した群は、非処置群と比較して低速の腫瘍増殖速度を示した。腫瘍阻害率は、対照群と有意に相違した。図１５Ｂは、１×１０8ｐｆｕのＳ１１６ＮＤＶ変異体の腫瘍内投与によるＢ１６Ｆ１０同一遺伝子黒色腫モデルにおける効力試験を示す。腫瘍増殖阻害を左側パネルに、個別のマウス測定値を中央のパネルに、生存プロットを右側に示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＮＤＶが、免疫応答性マウスＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有することを示す。特に、図１５Ｃは、１×１０8ｐｆｕのヒトＧＭ−ＣＳＦコード化ＮＤＶ変異体の腫瘍内投与によるＣＴ２６同一遺伝子結腸直腸腫瘍モデルにおける効率試験を提供する。腫瘍増殖阻害を右側パネルに示し、残る腫瘍のＩＨＣ分析をＨ＆Ｅ及びＮＤＶ染色を用いて、右側に示す。腫瘍の壊死領域、すなわち多核合胞体のエビデンス及び生存領域を示す。
【図１５Ｄ−５Ｆ】図１５Ｄ〜５Ｆは、卵巣異種移植片モデルにおける腫瘍増殖阻害を示す。無胸腺ヌードマウスに、Ｏｖｃａｒ４細胞を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が体積１００ｍｍ3に達したとき、マウスを、ランダムに処理群に分けた。樹立した腫瘍に、毎週１回２．５×１０7ｐｆｕのｒＮＤＶ、ｍＧＭ−ＳＦ若しくはｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−３１８を注射した。腫瘍曲線（図１５Ｄ）及び腫瘍の組織学的分析（図１５Ｅ及び図１５Ｆ）を示す。
【図１６】図１６は、ＮＤＶ構築物の特徴をまとめた表である。３６時間のインキュベーション後のオーバーレイ中のトリプシンなしベロ細胞におけるプラーク形成であり、１０倍率で視覚化したもの。感染後７２時間時点での、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感染後のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞に対するウイルスの細胞傷害作用。１００％生存性と認められた非処置細胞と各サンプルを比較することにより、生存細胞の相対パーセンテージを決定する。表に示すデータは、死細胞の相対パーセンテージである。脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）による１日齢病原体除去ニワトリにおけるＮＤＶの病原性。ＩＣＰＩアッセイは、国立獣医学検査機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＮＶＳＬ）（Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）で実施した。
【図１７】図１７は、鶏卵及びヒト細胞株から産生されたＮＤＶが、補体媒介不活性化に対して様々な感受性を呈示したことを示すグラフである。確認された補体（Ｃ’）活性（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を有するヒト血清をＰＢＳで階段希釈し、１００ｐｆｕのＮＤＶと一緒に３７℃で１時間インキュベートした後、プラークアッセイのためにベロ細胞を感染させた。３７℃で６日間のインキュベーション後、プラークをクリスタルバイオレットにより視覚化し、スコア付けした。孵化鶏卵中に増殖したウイルスは、１：１０〜１：４０で希釈した血清により大部分が不活性化した。２９３増殖ウイルスは、鶏卵増殖ウイルスよりもＣ’に対して耐性であり、約４０％感染率を１：４０の血清濃度で保持した。しかし、ヒーラ細胞増殖ウイルスが、Ｃ’媒介不活性化に対して最も耐性であった。約９０％の生存ウイルスが、１：４０の血清濃度で感染性であった。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ及び１８Ｂは、２９３細胞及びヒーラ細胞中のＲＣＡタンパク質レベル並びにこれらの２つの細胞株から産生されたウイルス中のレベルの比較を示すウエスタンブロットである。図１８Ａの場合、等量の２９３細胞及びヒーラＳ３細胞をウエスタンブロットのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。ヒーラ細胞は、２９３細胞より高レベルのｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５及びｈＣＤ５９タンパク質を含有していた。図１８Ｂは、感染性した２９３細胞又はヒーラ細胞由来のウイルス中のタンパク質量を調べるために実施したウエスタンブロットを示す。非感染細胞（モック）は対照として使用した。３つのＣＤ分子が、２９３細胞由来のものより高レベルで感染ヒーラ細胞由来のウイルス中に検出された。
【図１９】図１９は、Ｃ’媒介不活性化における膜結合Ｃ’調節物質（ＲＣＡ）タンパク質の評価を示す。ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９及びｈＣＤ４６をコード化するｃＤＮＡを、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成した。各遺伝子カセットをＮＤＶアンチゲノムｃＤＮＡのＰ−Ｎ遺伝子間領域に挿入し、逆遺伝額により組換えウイルスを作製した。組換えウイルスを鶏卵中で増幅し、１５〜６０％スクロース勾配により精製した後、ウイルスバンドを遠心分離によりペレット化した。組換えＮＤＶによる各ＲＣＡタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより確認した。
【図２０】図２０は、ＣＤ５５が、ＮＤＶのＣ’不活性化を阻止するための主要ＲＣＡタンパク質であることを示すグラフである。ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５及びｈＣＤ５９を有するＮＤＶを鶏卵中で増幅し、スクロース勾配により精製してから、１：１０〜１：４０で希釈したヒト血漿で１時間インキュベートした後、ベロ細胞中のプラークアッセイによりウイルス感染度を調べた。鶏卵中に産生されたｈＣＤ５５を有するＮＤＶは、ヒーラ細胞中に産生されたＮＤＶと比較して、Ｃ’に対し同様の耐性を有し、１：２０の血漿濃度で約６５％の生存ウイルス及び１：４０の血漿濃度で約８０％の生存ウイルスであった。ｈＣＤ４６は、１：４０希釈ヒト血漿とインキュベートしたとき、ＮＤＶ対照と比較して、Ｃ’媒介不活性化にウイルスの耐性をわずかに、又は最低限改善し、生存ウイルスが約２０％高かった。これより低い血漿希釈度では、差は認められなかった。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、弱毒化ニューカッスル病ウイルスを含む組成物並びに新生物の治療のために該ウイルスを使用する方法を特徴とする。
【００５１】
本発明は、少なくとも一部が、低減したニワトリビルレンスを有する腫瘍溶解性ＮＤＶの発見に基づく。以下に詳しく記載するように、ＮＤＶ７３Ｔ株は、１９４８年に初めて市販された商業的家禽ワクチン（亜病原性）である、ＮＤＶ  ＭＫ−１０７に由来するものであった。ＮＤＶ  ＭＫ−１０７株は、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水腫瘍細胞において７３継代を通して維持された（Ｃａｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．１９６５  Ｊｕｌ；１８：８６３−８）。ＮＤＶ  ＭＫ−１０７は、１９７０年代に、第１相及び第２相臨床試験のシリーズで用いられた。ＮＤＶ  ＭＫ−１０７はまた、１９８０年代に、後期黒色腫患者を治療するための免疫療法薬としても用いられた（Ｃａｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．１９８３  １；５２：８５６−８６０；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ．１９７７．４０：６８０−６８６）。
【００５２】
ニワトリビルレンスが低減した腫瘍溶解性ＮＤＶを生成するために、組換えＮＤＶ７３Ｔ株は、いくつかの遺伝子修飾を含む。特に、Ｆタンパク質切断配列が改変され、ＨＮ−Ｌ遺伝子間配列の長さが増加した。有利には、目的のトランスジーンを発現させるために、修飾ウイルスを用いることができる。一実施形態では、ＮＤＶ７３Ｔ株は、組換えＮＤＶの腫瘍溶解性を増強するポリペプチドをコード化するトランスジーンを含む。別の実施形態では、ＮＤＶ７３Ｔ株は、ウイルス複製をモニターする上で有用な読取りを提供するバイオマーカをコード化するトランスジーンを含む。要望されれば、ＮＤＶ７３Ｔ株は、標準ゲノムの正常な転写極性を破壊して、ニワトリにおけるウイルスビルレンスをさらに低減すると予想される追加遺伝情報を組み込むように修飾することもできる。従って、本発明は、その選択的癌細胞殺傷能力を維持しながら、ニワトリにおけるその病原性を低減するために逆遺伝学を用いて生産された組換えニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、並びにそのようなウイルスを生産する方法を提供する。本発明はまた、癌治療の増強のための異種遺伝子産物を送達及び発現させるためのウイルスベクターとしてのＮＤＶの構築及び使用も提供する。ＮＤＶにより送達することができる例示的治療薬をコード化するトランスジーンについては、以下に記載する。本明細書において以下に記載する実施例では、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する新規のＮＤＶウイルス構築物は、癌細胞を選択的に殺傷したが、正常細胞は殺傷しなかった。この選択的な癌細胞殺傷作用は、いくつかの癌細胞株、並びに異種移植片ＨＴ１０８０腫瘍モデルで試験した際、ｉｎ  ｖｉｖｏでも観察された。また、組換え弱毒化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の効力及び選択性は、黒色腫モデルでも立証されており、この場合、腫瘍退縮が観察された。要約すると、本発明は、組換え弱毒化ＮＤＶベクターへの特定のトランスジーンの挿入、及び腫瘍環境でのコード化タンパク質の効率的な発現を可能にする。
【００５３】
ニューカッスル病ウイルス
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、線状、一本鎖、非分節性、マイナス鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。ＮＤＶのマイナス鎖、一本鎖ゲノムは、ＲＮＡ指令ＲＮＡポリメラーゼ、融合（Ｆ）タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、基質タンパク質、リンタンパク質及び核タンパク質をコード化する。ゲノムＲＮＡは、次の順：３’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌで遺伝子を含有する。ＮＤＶ  ＲＮＡゲノムの組織については、以下により詳細に説明する。ゲノムＲＮＡは、３’末端にリーダ配列も含有する。
【００５４】
ビリオンの構造要素は、細胞膜に由来する脂質二重層であるウイルスエンベロープを含む。糖タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）は、エンベロープから突き出ており、ウイルスがヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ活性の両方を含有することを可能にする。内在性膜タンパク質である、融合糖タンパク質（Ｆ）は、不活性前駆体として最初に生成された後、翻訳後に切断されて、２つのジスルフィド結合ポリペプチドを生成する。活性Ｆタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合を促進することによって、宿主細胞へのＮＤＶの貫通に関与する。基質タンパク質（Ｍ）は、ウイルス構築に関与し、ウイルス膜並びにヌクレオカプシドタンパク質のいずれとも相互作用する。
【００５５】
ヌクレオカプシドの主要タンパク質サブユニットは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、これは、カプシドの螺旋対称を付与する。ヌクレオカプシドと関連しているのは、Ｐ及びＬタンパク質である。リン酸化を受けるリンタンパク質（Ｐ）は、転写において調節の役割を果たすと考えられており、メチル化、リン酸化及びポリアデニル化にも関与し得る。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコード化するＬ遺伝子は、Ｐタンパク質と共に、ウイルスＲＮＡ合成に必要である。ウイルスゲノムのコード能力のほぼ半分を取り込むＬタンパク質は、ウイルスタンパク質の中で最大であり、転写及び複製の両方で重要な役割を果たす。
【００５６】
ＮＤＶを含む全てのマイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製は、ＲＮＡを複製するのに必要な細胞機構がないために、複雑化する。さらに、マイナス鎖ゲノムは、タンパク質に直接翻訳することができないが、まずプラス鎖（ｍＲＮＡ）コピーに転写されなければならない。そのため、宿主細胞に侵入すると、ゲノムＲＮＡは、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを単独で合成することができない。Ｌ、Ｐ及びＮＰタンパク質が、感染時にゲノムと一緒に細胞に侵入しなければならない。
【００５７】
特定の理論に束縛されるわけではないが、ＮＤＶｍＲＮＡを転写するウイルスタンパク質の大部分又は全部は、複製も実施することが仮定される。タンパク質の同じ補体の代替使用（すなわち、転写又は複製）を調節する機構はまだ明らかにされていない。ウイルスの貫通直後に、ヌクレオカプシド中のマイナス鎖ＲＮＡを鋳型として用いて、Ｌタンパク質により転写が開始される。ウイルスＲＮＡ合成は、転写中にモノシストロン性ｍＲＮＡを生成するように調節される。転写に続いて、ウイルスゲノム複製が、マイナス鎖ＲＮＡウイルスによる細胞の感染時に起こる２番目のイベントである。他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のウイルスゲノム複製は、ウイルス特異的タンパク質により媒介される。複製ＲＮＡ合成の最初の産物は、ＮＤＶゲノムＲＮＡの相補的コピー（すなわち、プラス極性）（ｃＲＮＡ）である。これらのプラス鎖コピー（アンチゲノム）は、その末端の構造が、プラス鎖ｍＲＮＡ転写物とは異なる。ｍＲＮＡ転写物とは異なり、抗ゲノムｃＲＮＡは、５’末端でキャッピング及びメチル化されておらず、かつ３’末端で切断及びポリアデニル化されていない。ｃＲＮＡは、それらのマイナス鎖鋳型と共末端（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）であり、相補的形態の各ゲノムＲＮＡセグメントに全遺伝子情報を含んでいる。ｃＲＮＡは、ＮＤＶマイナス鎖ウイルスゲノム（ｖＲＮＡ）の合成のための鋳型として役立つ。
【００５８】
ＮＤＶマイナス鎖ゲノム（ｖＲＮＡ）及びアンチゲノム（ｃＲＮＡ）のいずれも、ヌクレオカプシドタンパク質によって包膜され；唯一包膜されないＲＮＡ種は、ウイルスｍＲＮＡである。ＮＤＶの場合、細胞質は、それが転写の部位であるのと全く同じように、ウイルスＲＮＡ複製の部位でもある。ウイルス成分の構築は、恐らく宿主細胞膜で起こると思われる。その後、成熟ウイルスが出芽により細胞から放出される。
【００５９】
腫瘍溶解性ウイルス
ウイルスは、腫瘍細胞に対して、腫瘍溶解作用を及ぼすことが知られており、治療薬としての腫瘍溶解性ウイルスの使用が報告されている。一部では、その天然の宿主に対して中度から高度の病原性を示す非ヒトウイルスを癌患者の治療に使用する取組みがなされている。本発明は、ヒト被験者において腫瘍の退縮を誘導する方法を開示し、該方法は、修飾されたＦタンパク質切断部位を有するニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の修飾亜病原性株を使用し、これは、家禽に対しては非病原性（長潜伏期性）であるが、腫瘍溶解性を発揮する。開示する方法は、それを必要とする個体の腫瘍の退縮を誘導する安全、有効かつ信頼できる手段を提供する。これらの方法によって、ヒトの治療法のためにウイルスの病原性株を使用する問題点が解消される。
【００６０】
従って、一態様では、本発明は、被験者における腫瘍の退縮を誘導する方法を提供し、この方法は、治療に有効な量の長潜伏期性腫瘍溶解性ＮＤＶ株を含む医薬組成物を被験者に投与するステップを含む。一実施形態によれば、長潜伏期性腫瘍溶解性ＮＤＶ株は、ＮＤＶｒ７３Ｔ−Ｒ１１６である。
【００６１】
腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞にほとんど若しくは全く作用することなく、腫瘍細胞に対して細胞傷害性又は殺傷作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで及ぼすことができる。「腫瘍溶解活性」という用語は、腫瘍細胞をターゲティングするウイルスの細胞傷害性又は殺傷活性を指す。いずれの作用機構にも束縛される意図はないが、長潜伏期性ＮＤＶ株（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）により及ぼされる腫瘍溶解活性は、恐らく、主として細胞アポトーシス、より低い程度で原形質膜溶解によるものであり、後者は、細胞環境への生存子孫の放出を伴い、それらが、その後隣接細胞に感染する。特定の理論に束縛される意図はないが、ＮＤＶは、癌細胞に対して直接的細胞溶解活性を有すると考えられる。また、ＮＤＶは、正常の健全な細胞から癌細胞を特異的に分化させることができるとも考えられている。結果から、癌細胞に悪性挙動を付与することが知られるいくつかの癌遺伝子（Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ及びＮ−ｍｙｃ）は、ＮＤＶによる殺傷に対する細胞の感受性を増強することが判明した。Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｅｉｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｃａｓｃｉｎｏ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３３，３９８；Ｒｅｉｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｃａｓｃｉｎｏ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｕｒｇ．Ｆｏｒｕｍ，４３，６０３−６０６を参照されたい。さらに、レチン酸（ビタミンＡ）による細胞の処理によっても、ＮＤＶによる癌細胞の溶解を増強することが観察されている。Ｒｅｉｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｗ．，Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｋａｔｕｂｉｇ，Ｂ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．，２８，１２２１。
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ条件下での細胞傷害作用は、例えば、細胞増殖の阻害、ガドリニウム増強ＭＲＩスキャニングを用いた腫瘍サイズの検出、腫瘍の放射性標識などにより、当分野では公知の多様な手段によって検出することができる。
【００６３】
臨床試験の場合、ウイルス均質性を確実にするように、クローンウイルスを取得することが望ましい。クローンウイルスは、当業者が利用可能な任意の方法に従って生産することができる。例えば、クローンウイルスは、限界希釈又はプラーク精製によって生産することができる。
【００６４】
ＮＤＶ培養
本発明で使用するウイルスは、様々な方法によって調製することができる。例えば、ＮＤＶは、８〜１０日齢の受精鶏卵（ＳＰＡＦＡＳ，Ｉｎｃ．，Ｒｏａｎｏｋｅ，Ｉｌｌ．）を用いて調製することができる。ウイルスを単離する方法は、当分野において公知であり、例えば、Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｒ．＆Ｂｒａｔｔ，Ｍ．Ａ．（１９７４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１３，１２２０−１２３０を参照されたい。この方法は、以下の実施例１でさらに説明する。単離方法を用いて、約９０〜９５％純度のＮＤＶを取得することができる。
【００６５】
あるいは、ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物中で調製してもよい。好ましくは、細胞培養物は、哺乳動物細胞を含み、より好ましくは、細胞は、ベロ細胞などのウイルス製造に用いることができる。ウイルスは、クロマトグラフ又はその他の適切な方法により精製する。細胞は、足場依存性又は足場非依存性のいずれでもよい。
【００６６】
ウイルス調製に使用することができる細胞培養技術は、当分野において公知であり、表面積の大きい静置培養フラスコ又はローラ式フラスコの使用を含み得る。好ましくは、選択する培養システムのタイプは、比較的多数の細胞を支持することができる。大量のウイルスを生産するためには、バイオリアクタ法を実施し、ウイルス感染及び生産のためには、細胞をミクロキャリアビーズに増殖させる。
【００６７】
ウイルス生産に使用することができる細胞培地は、当業者には周知である。培地は、典型的に、栄養供給源、抗生物質及びアルブミン、又は増殖因子を含有する血清供給源を含む。培養に使用される細胞に好適な具体的培地及び培地成分を選択することは、当業者の技能の範囲内である。特定の実施形態では、トリプシンが増殖培地に含まれる。他の実施形態では、トリプシンは含まれない。
【００６８】
培養条件は、典型的に、要望される温度（例えば、３７℃）、並びに選択される濃度の酸素及び二酸化炭素でのインキュベーションを含む。選択される特定の培養条件は、培養に使用される細胞に応じて決定することができ、こうした条件の決定は、当業者の技能の範囲内である。
【００６９】
細胞を培養容器中に配置し、選択した培養容器条件下でインキュベート及び増殖させる。好ましくは、足場依存性細胞を密集又はピーク増殖まで増殖させる。増殖に必要な時間は、培養容器に添加した最初の細胞接種材料のサイズ、及び使用中の細胞株の倍加時間に応じて変動し得る。好ましくは、ｃｍ2当たり約３×１０3〜約３×１０5個の細胞を平板培養し、１〜５日にわたって増殖させる。細胞培養物のウイルス接種のために、細胞から培地を除去（接着細胞の場合には、培地の吸引により；懸濁液中で増殖させた細胞の場合には、細胞懸濁液の遠心分離及び細胞上清の吸引により）した後、脱水を予防するために、最小量の培地又は食塩水（例えば、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｇｉｂｃｏ）中の細胞にウイルス（再構成後）を添加する。好ましくは、この量は、培養容器表面積ｃｍ2又は細胞１０5個当たり約１０〜約２５００マイクロリットルの範囲である。ウイルス接種材料の好ましい希釈度は、細胞当たり約０．００１〜約１０感染単位であり、最適な比率は具体的ウイルス及び細胞株によって変動する。続いて、ウイルスを約１〜７日かけて増殖させるが、時間の長さは、主として細胞株の残存によって決定される。ＮＤＶの場合、最適な採取時点は、ウイルス接種から１〜５日後である。
【００７０】
次に、上澄みを除去し、これを１２〜４８時間の間隔で新鮮な培地若しくは新鮮な細胞を含む新鮮な培地と取り替えるか、又は細胞を凍結−解凍して、ウイルスを上清中に放出させることによって、ウイルスを採取することができる。続いて、上清を遠心分離及び超遠心分離して、比較的純粋な形態でウイルスを回収するか、又はクロマトグラフィー法に付すことができる。ウイルス調製物の純度をタンパク質定量及び／又は電気泳動により試験してもよい。次に、以下に詳しく記載する薬学的に許容される担体にウイルスを添加することができる。
【００７１】
療法
療法は、癌療法が実施されるあらゆる場所：自宅、医院、診療所、病院の外来診療部門、又は病院で施すことができる。一実施形態では、本発明は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）の使用を可能にする。
【００７２】
治療は、一般に、病院で開始し、これにより、医者が治療の効果をつぶさに観察し、必要な調整を加えることができるようにする。治療の期間は、治療対象の癌の種類、患者の年齢及び状態、患者の疾患の病期及びタイプ、並びに治療に対して患者の身体がどのように応答するかに応じて変動する。投薬は、様々な間隔（例えば、毎日、毎週、又は毎月）で実施してよい。治療は、オン−オフサイクルで実施してもよく、これは、患者の身体が新しい健康な細胞を形成し、その力を回復するように、休息時間を含む。
【００７３】
癌のタイプ及びその発生段階に応じて、癌の広がりを遅らせる、癌の増殖を遅らせる、原発腫瘍から身体の他の部分に広がった可能性のある癌細胞を殺傷若しくは停止させる、癌によって生じた症状を軽減する、又はそもそも癌を予防するために、本療法を用いることができる。癌増殖は、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないか、又はその停止を引き起こすような条件下で起こる。
【００７４】
前述したように、要望されれば、本発明の組成物による治療を増殖性疾患の治療のための様々な療法（例えば、放射線療法、手術、又は化学療法）と組み合わせてもよい。
【００７５】
医薬組成物の製剤化
腫瘍の治療用の本発明のウイルス（例えば、ＮＤＶｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）の投与は、他の成分と併用して、腫瘍の予防、改善、又は軽減に有効な治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によって行うことができる。薬剤は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有させてよく、一般に、組成物の全重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内）投与経路に好適な投薬形態で提供してよい。医薬組成物は、慣行的薬局業務規範（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、ほぼ投与直後、又は投与からの予定時点若しくは予定時間後に、活性化合物を放出するように製剤化することができる。後者のタイプの組成物は、一般に、制御放出製剤として知られ、これは、（ｉ）長期間にわたり身体内に実質的に一定の薬物濃度を形成する製剤；（ｉｉ）予定ラグタイム後に、長期間にわたり身体内に実質的に一定の薬物濃度を形成する製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿レベルの変動に伴う望ましくない副作用を最小限に抑えながら、身体中に比較的一定の有効なレベルを維持することによって予定期間にわたり作用を持続する製剤（鋸歯状動力学パターン）；（ｉｖ）例えば、肉腫に隣接した、若しくは肉腫内での制御放出組成物の空間的配置により、作用を局在化する製剤（ｖ）用量が、例えば、毎週又は２週間に１回投与されるように、好都合な投薬を可能にする製剤；並びに（ｖｉ）肉腫細胞に治療薬を送達するために担体若しくは化学誘導体を用いることにより、増殖する新生物細胞をターゲティングする製剤を含む。一部の用途について、制御放出製剤は、血漿レベルを治療レベルに維持するために日中頻繁に投薬する必要がなくなる。
【００７７】
放出速度が、当該化合物の代謝速度を上回る制御放出を達成するために、いくつかの戦略のいずれを遂行してもよい。一例では、制御放出は、多様な製剤パラメータ及び成分、例えば、各種制御放出組成物及びコーティングの適切な選択によって達成される。従って、治療薬を適切な賦形剤と一緒に、医薬組成物に製剤化することができ、この組成物は、投与後、治療薬を制御された様式で放出する。例として、単一若しくは複数単位錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子錯体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、単位投与形態で、薬学的に許容される希釈剤、担体、若しくは賦形剤を用いて投与してもよい。過剰な細胞増殖を原因とする疾患に罹患した患者に化合物を投与する上で好適な製剤又は組成物を提供するために、慣行的薬局業務規範を使用してもよい。投与は、患者が症状を示す前に開始してもよい。
【００７９】
任意の好適な投与経路を使用してよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、肝臓内、嚢内、鞘内、槽内、腹腔内、鼻内、エアロゾル、座薬、又は経口投与であってよい。例えば、治療製剤は、溶液又は懸濁液の形態であってもよく；経口投与の場合には、製剤は、錠剤若しくはカプセルの形態であってよく；鼻内製剤の場合には、粉末、点鼻薬、若しくはエアロゾルの形態であってよい。前述した適用方法のいずれについても、本発明の組成物は、望ましくは静脈内に投与するか、又はアポトーシスイベントが必要な部位に適用する（例えば、注射により）。
【００８０】
製剤を製造するための当分野で公知の方法は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”Ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｕｒｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２０００にみいだされる。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、又は食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、又は水添ナフタレンを含有してもよい。化合物の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いてもよい。薬剤を送達するための他の有用と見込まれる非経口送達系として、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み型注入装置、及びリポソームが挙げられる。吸入のための製剤は、賦形剤、例えば、ラクトースを含有してもよいし、又は例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリコール酸塩及びデオキシコール酸塩を含有する水溶液であってもよいし、あるいは、点鼻薬の形態での、又はゲルとしての投与の場合には、油性溶液であってよい。
【００８１】
製剤は、疾患又は状態に対する療法を提供するために、治療に有効な量（例えば、病的状態を予防、排除、又は軽減する量）でヒト患者に投与することができる。本発明の組成物の好ましい投与量は、障害のタイプ及び程度、具体的患者の全体的健康状態、化合物賦形剤の製剤化、及びその投与経路などの変数に応じて変動する可能性がある。
【００８２】
本明細書に記載する任意の療法についてのヒト投与量は、当業者が、動物モデルと比較してヒトに対する投与量を変更することはルーチンであると認識されるように、マウスに用いた化合物の量から外挿することによって、初めに決定することができる。特定の実施形態では、投与量は、約１０7ｐｆｕ〜約１０11ｐｆｕ；又は約１０8ｐｆｕ〜約１０10ｐｆｕ；又は約１０9ｐｆｕ〜約１０11ｐｆｕに変動し得ることが考慮される。他の実施形態では、この用量は、約１０7ｐｆｕ、１０8ｐｆｕ、１０9ｐｆｕ、１０10ｐｆｕ、１０11ｐｆｕであってよい。もちろん、こうした治療プロトコルではルーチン的になされているように、初期臨床試験の結果及び具体的患者のニーズに応じて、投与量を上下に調節してもよい。
【００８３】
治療方法の選択
被験者が新生物を有すると診断されたら、治療方法を選択する。例えば、新生物の場合、いくつかの標準的治療レジメンが利用可能である。治療方法を選択する際、新生物のマーカプロフィールを用いる。一実施形態では、ＮＤＶ（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）による細胞殺傷に応答性の新生物細胞。
【００８４】
低攻撃性の新生物は、伝統的治療方法に対して感受性であると考えられる。より攻撃性の新生物（例えば、転移性新生物）は、伝統的治療方法に対して感受性が低いため、再発する傾向がある。本発明の方法によって、新生物が極めて攻撃性であることを示す場合、積極的な治療方法を選択すべきである。積極的治療レジメンは、典型的に、以下の療法：外科的切除、放射線療法、又は化学療法の１つ又は複数を含む。
【００８５】
細胞生存性を測定するアッセイ
本発明の方法に有用な薬剤（例えば、ＮＤＶ）は、新生物細胞の死を誘導し、及び／又は新生物細胞生存、すなわち生存性を低下させるものを含む。
【００８６】
細胞生存性を測定するためのアッセイは当分野では公知であり、例えば、Ｃｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０，８１−８）；Ｋａｎｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．６２，３３８−４３，１９８４）；Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３，２７−４２，１９８６）；Ｐｅｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．１０，２９_３４，．１９９５）；及びＣｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ６：３９８−４０４，１９９５）により記載されている。細胞生存性は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を含む、様々な方法を用いてアッセイすることができる（Ｂａｒｌｔｒｏｐ，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１：６１１，１９９１；Ｃｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍ．３，２０７_１２，１９９１；Ｐａｕｌｌ  Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．２５，９１１，１９８８）。細胞生存性のアッセイは、市販のものも入手可能である。これらのアッセイとして、限定はしないが、ルシフェラーゼ技術を用いて、ＡＴＰを検出し、培養中の細胞の健康状態又は数を定量するＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害性アッセイであるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。
【００８７】
新生物細胞死を誘導又は増大する（例えば、アポトーシスを増大し、細胞生存を低減する）候補化合物は、抗新生物治療薬としても有用である。細胞アポトーシスを測定するためのアッセイは、当業者には周知である。アポトーシス細胞は、特有の形態学的変化、例えば、クロマチン凝縮、細胞萎縮及び膜泡形成などを特徴とし、これらは、光学顕微鏡検査によりはっきりと観察することができる。アポトーシスの生化学的特徴としては、ＤＮＡ断片化、特定の位置でのタンパク質切断、ミトコンドリア膜透過性増大、及び細胞膜表面上へのホスファチジルセリンの出現が挙げられる。アポトーシスのアッセイは、当分野では公知である。例示的アッセイとして、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ、カスパーゼ活性（具体的には、カスパーゼ−３）アッセイ、並びにｆａｓリガンド及びアネキシＶについてのアッセイが挙げられる。アポトーシスを検出するための市販の製品として、例えば、以下のものが挙げられる：Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ、ＦｒａｇＥＬ  ＴＵＮＥＬキット（ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＡｐｏＢｒｄＵ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＢＩＯＶＩＳＩＯＮ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、及びＱｕｉｃｋ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯＶＩＳＩＯＮ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。
【００８８】
新生物細胞は、その発生位置から全身にわたる遠位まで転移、又は拡散する傾向を有する。転移の可能性又は侵入力についてのアッセイは、当業者には周知である。こうしたアッセイとして、接触阻害の消失についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０１：１６２５１−６，２００４）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軟寒天コロニー形成アッセイ（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２４（６）：１５７３−９，２００４）、肺転移モデル（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ，１６：４５１−７，２００２）及びマトリゲルベースの細胞侵入アッセイ（Ｈａｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２５：１５４３−１５４９，２００４）が挙げられる。細胞侵入力についてのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング方法も当分野において公知であり、例えば、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍原性スクリーニングがある。転移を評価するために一般に用いられているｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、マトリゲルベースの細胞侵入アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）である。
【００８９】
必要であれば、本明細書に記載するスクリーニング方法のいずれかを用いて選択した候補化合物を、新生物の動物モデルを用い、その効力について試験する。一実施形態では、マウスに新生物ヒト細胞を注射する。次に、新生物細胞を含むマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）又は候補化合物を毎日、実験により決定した時間にわたって注射（例えば、腹腔内）する。続いて、マウスを安楽死させ、新生物の組織を採取し、本明細書に記載する方法を用いて、ＮＤＶ、ＮＤＶポリペプチド、及び／又はＮＤＶマーカ（例えば、検出可能な部分をコード化するトランスジーン）のレベルについて分析する。対照レベルと比較して、ＮＤＶ、ＮＤＶポリペプチド、又はＮＤＶマーカレベルｍＲＮＡ若しくはタンパク質発現を低減する化合物は、被験者（例えば、ヒト患者）における新生物の治療に有効であると予想される。別の実施形態では、腫瘍負荷に対する候補化合物の作用を、ヒト新生物細胞を注射したマウスにおいて分析する。新生物細胞を増殖させて塊を形成させる。次に、候補化合物又はビヒクル（ＰＢＳ）で、実験により決定した時間にわたり、毎日マウスを処置する。マウスを安楽死させ、新生物組織を採取する。選択した候補化合物で処置したマウスにおける新生物組織の塊を、対応する対照マウスに存在する新生物組織の塊と比較する。
【００９０】
キット
本発明は、肉腫の治療又は予防のためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、単位投与形態に有効量のＮＤＶ（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）を含有する治療又は予防組成物を含む。別の実施形態では、キットは、単位投与形態に有効量のＮＤＶ（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）を含有する治療又は予防組成物を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、キットは、治療又は予防組成物を含有する滅菌容器を含み；このような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当分野では公知の他の好適な容器形態であってよい。こうした容器は、プラスチック、ガラス、積層加工紙、金属ホイル、又は薬剤を保持するのに適したその他の材料から製造することができる。
【００９２】
必要であれば、本発明の抗体は、新生物を有するか、それを発症するリスクがある被験者にＮＤＶ（例えば、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６）を投与する上での指示と一緒に提供される。これらの指示は、一般に、新生物の治療又は予防のための組成物の使用に関する情報を含む。他の実施形態では、指示は、以下に挙げるものの少なくとも１つを含む：治療薬の説明；投薬スケジュール及び新生物又はその症状の治療又は予防のための投与；使用上の注意；警告；適応症；禁忌；過量についての情報；有害な反応；動物薬理学；臨床試験；及び／又は備考。指示は、容器に直接印刷してもよいし（存在する場合）、又は容器に貼り付けたラベル、又は容器内若しくは容器と一緒に提供される個別の用紙、パンフレット、カード、若しくはフォルダの形態であってもよい。
【００９３】
本発明の実施では、別に示されていない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用し、これらは、十分に当業者の技能の範囲内である。こうした技術は、以下のような文献に十分に説明されている：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの生成に適用可能であり、そのため、本発明を実現及び実施する際に考慮してもよい。具体的実施形態に特に有用な技術については、以下のセクションで詳述する。
【００９４】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、及び治療方法をどのようにして実施及び使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載するものであり、本発明者らがその発明として考慮する範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００９５】
実施例１．ＮＤＶ株７３ＴのアンチゲノムｃＤＮＡの構築
高忠実度ＲＴ−ＰＣＲにより作製した６つのサブゲノムｃＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターに構築した。ＮＤＶ７３Ｔの完全長ｃＤＮＡをｐ７３Ｔと称した。７３ＴにおけるＦタンパク質切断部位（ＦＰＣＳ）のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を、ＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株（長潜伏期性、ｌｅｎｔｏ）の配列又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の配列（Ｓ１１６）に修飾した（図１；ダブルスラッシュは、Ｆタンパク質の切断部位を示す）。ウイルス配列を確認するために、ｃＤＮＡを完全に配列決定した。Ｆタンパク質切断部位：Ｗｔ：ｇｇｇ  ａｇｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ａａａ  ｃｇｃ  ｔｔｔ；Ｌｅｎｔｏ：ｇｇｇ  ｇｇｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ｇａａ  ｃｇｃ  ｃｔｔ；  Ｓ１１６：ｃａｔ  ａａｔ  ａｇａ  ａｃｇ  ａａａ  ｔｃｃ  ｔｔｔ；Ｓ１１６ＫＭ：ｃａｔ  ａａｔ  ａａａ  ａｔｇ  ａａａ  ｔｃｃ  ｔｔｔ；Ｒ１１６：ｃａｔ  ａａｔ  ａｇａ  ａｃｇ  ａａａ  ｃｇｃ  ｔｔｔ。
【００９６】
実施例２．ＮＤＶ７３Ｔゲノムへのトランスジーン挿入
トランスジーンをｐ７３Ｔの２つの位置：Ｐ及びＭの間の遺伝子間配列又はＨＮ及びＬ結合部の間の遺伝子間配列に挿入した（図２Ａ）。Ｐ−Ｍ又はＨＮ−Ｌ結合部に単一のトランスジーンカセットを挿入するために、Ｐ−Ｍ又はＨＮ−Ｌ結合部にトランスジーンを含有するｐ７３ＴｃＤＮＡの構築を、Ｐ及びＭ遺伝子間（ｎｔ３１４８）又はＨＮ及びＬ遺伝子間（ｎｔ８２３１）に形成したＡｆｅＩ部位にトランスジーンカセットを挿入することによって実施した。挿入した遺伝子カセットは、トランスジーンの遺伝子終止
【化１４】
2019193662.tif 000016
、遺伝子間ヌクレオチド（Ｔ）、遺伝子開始配列（ＧＳ；５’−ＡＣＧＧＧＴＡＧＡ  −３’）、及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。さらに、Ｋｏｚａｋ配列を導入するために、１０のヌクレオチド（５’−ｃｇｃｃｇｃｃａｃｃ−３’）を開始部位の上流に挿入した。Ｐ−Ｍ又はＨＮ−Ｌ結合部にトランスジーンを含有する完全長（ＦＬ）７３ＴｃＤＮＡをそれぞれｐ７３Ｔ−Ｐ１又はｐ７３Ｔ−ＨＮ１と称した。単一ゲノムにおいてＰ−Ｍ及びＨＮ−Ｌ結合部に２つの個別のトランスジーンを含有する完全長ｃＤＮＡを構築し、ｐ７３Ｔ−Ｐ１−ＨＮ１と称した（図２Ｂ）。同じ結合部（例えば、Ｐ−Ｍ）に２つのトランスジーンカセットを挿入するために、第１トランスジーン（＃１）のＯＲＦの終端にＡｆｅＩ部位を導入した（ｎｔ３１６９）。第２トランスジーンＯＲＦを、ＧＥ及びＧＳ配列を含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、ＡｆｅＩ部位に挿入した。Ｐ−Ｍ結合部に２つのトランスジーンカセットを含有するアンチゲノムｃＤＮＡをｐ７３Ｔ−Ｐ２と称した。
【００９７】
実施例３．修飾ＦＰＣＳを含む感染性組換えＮＤＶ株７３Ｔ（ｒ７３Ｔ）の回収
ＮＤＶ７３ＴＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質及び抗原ｃＤＮＡ（ｐ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ又はｐ７３Ｔ−Ｓ１１６）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ及びターミネータの制御下でクローン化した。４つのプラスミドを、ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞株に同時トランスフェクトした（図３Ａ）。回収したウイルスをｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ又はｒ７３Ｔ−Ｓ１１６と称した。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏ及びｒ７３Ｔ−Ｓ１１６を、トリプシン補充有り、又はなしの培地を用いて、ベロ細胞において継代させた。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏの増殖はトリプシン依存的であるのに対し、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６は、トリプシン補充なしの培地中で増殖することができる。Ｐ−Ｍ結合部にｈＧＭ−ＣＳＦを有する、又は有していないｒ７３Ｔ−Ｓ１１６におけるＦタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）を評価した。７３Ｔ−Ｓ１１６株は、トリプシン補充なしの培地中、ＭＯＩ０．０１でベロ細胞及びヒト線維肉腫ＨＴ１０８０において１０継代にわたりさらに継代させた。ＦＰＣＳにおける突然変異（Ｒ１１３Ｋ及び／又はＱ１１４Ｍ）が継代７で出現した。Ｓ１１６Ｒ突然変異は、継代９で検出された。継代１０で、Ｆ、ＨＮ及びトランスジーンを配列決定したが、それ以上の突然変異は認められなかった。
【００９８】
実施例４：異なるＦタンパク質切断配列を有する組換え７３Ｔ株の特性決定
新規の修飾Ｆタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）を有する組換え７３Ｔ株は、以下の配列を含んだ：
【化１５】
2019193662.tif 000017
【００９９】
異なるＦＰＣＳを有する組換え７３Ｔ株を、ＭＤＴ、ＩＣＰＩ、相対ＨＴ１０８０細胞殺傷、ベロ細胞における複製、及び卵における複製に関して特性決定した（図４）。
【０１００】
ＮＤＶのビルレンスは、主に、Ｆタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）によって決定される。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、非ビルレント株ＬａＳｏｔａのＦＰＣＳを含むように改変した。Ｆタンパク質を切断することができないため、組織培養物におけるＬａＳｏｔａウイルスの複製はトリプシン依存性である。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、トリプシン補充がない場合、ベロ細胞中に小さなプラークを形成するが、これは、Ｆタンパク質が切断されず、ウイルスが細胞から細胞へと効率的に拡散することができないことを示している。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、ベロ細胞においては低レベル（７．５×１０3ｐｆｕ／ｍｌ）で複製したが、内在性トリプシン様酵素を含む卵中では効率的に（５．７×１０8ｐｆｕ／ｍｌ）複製した。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、ウイルスを接種した胚の平均致死時間（ＭＤＴ）（ＭＤＴ＞１５６時間）により、並びに脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ；ＩＣＰＩ＝０．００）により決定されるように、ニワトリにおいてビルレントではなく、また、ＨＴ１０８０細胞において低細胞傷害性（１３％細胞殺傷）を有する。
【０１０１】
ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６は、比較的大きなプラークを形成することができ、ベロ細胞中で４．４×１０6ｐｆｕ／ｍｌの力価に到達する。これは、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６をトリプシン補充のベロ細胞において増殖させたときに得られた力価と同等であった。このデータから、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６の融合タンパク質切断部位（ＦＰＣＳ）が、組織培養物において外性トリプシンなしで切断され得ることがわかった。これは、ニワトリにおいてビルレントではなく、ＨＴ１０８０細胞では３１％細胞殺傷を示した。ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞継代によりその遺伝的安定性について調べた。
【０１０２】
ベロ細胞又はＨＴ１０８０細胞における１０継代後に、ＦＰＣＳにアミノ酸置換：Ｒ１１３Ｋ、Ｑ１１４Ｍ、及び／又はＳ１１６Ｒが認められた。さらなる配列変化がウイルスゲノムに起こった可能性を排除するために、組換えｒ７３Ｔ−Ｓ１１６突然変異型ウイルスを逆遺伝子学により構築して、評価した。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６を除いて、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６及びその誘導体は、それらの突然変異型ウイルスがニワトリにおいてビルレントではなく、同等レベルのＨＴ１０８０細胞殺傷が可能であった点で、親Ｓ１１６と類似していた。ＨＴ１０８０細胞殺傷は、単一突然変異の場合、２９％〜３１％であり、二重突然変異では４８％であった。
【０１０３】
Ｍ１１４及びＫ１１３Ｍ１１４のプラークサイズは、Ｓ１１６より有意に大きかった。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６突然変異体は、ＦＰＣＳにおいて残基１１６（Ｓ１１６Ｒ）に１つのアミノ酸変化を獲得した。切断部位に隣接するＲ１１６は、Ｆタンパク質の効率的な切断にとって重要であることがわかっている。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６は、ベロ細胞に大きなプラークを形成し、トリプシン補充有り無しの両方で同様の力価まで増殖し、効率的にＨＴ１０８０細胞を殺傷した（８０％）。Ｒ１１６は、ＭＤＴアッセイによって示されるように、ニワトリビルレンスを増大した（７２、８０時間）。一試験においてＩＣＰＩ値（０．６５）は＜０．７であったが、そのニワトリビルレンスをさらに低減することが好ましい。
【０１０４】
実施例５：ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６誘導体は、ニワトリビルレンスを低減した。
Ｐ−Ｍ結合部にトランスジーン（１）を、ＨＮ−Ｌ結合部に第２トランスジーン（２）を、そして、非コード配列（３）の挿入により伸長される増大したＨＮ−Ｌ遺伝子間領域を発現するように、ウイルスを改変することができる（図５Ａ）。Ｐ−Ｍ結合部でのトランスジーンカセットの挿入のために図２Ａと同じ設計をここで用いる。第２トランスジーンカセットは、トランスジーンのＬ遺伝子開始配列（ＧＳ；５’−ＡＣＧＧＧＴＡＧＡ−３’）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、Ｌ遺伝子の３’非翻訳領域からの配列（斜体で強調）及びＬ遺伝子終止配列（ＧＥ；５’−ＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＡ−３’）を含む。ＨＮ−Ｌ結合部を増大するために用いた非コード配列は、パラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）又はいずれの既知配列とも相同性のないランダム配列から取得した。挿入は、６０〜３１８ｎｔの範囲内であってよい。ＨＮ−Ｌでの第２トランスジーンの挿入により、ウイルスは、２つのトランスジーン、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦ及びＧＦＰを発現することが可能になった。ＨＮ−Ｌ結合部に挿入された配列を列挙する（図５Ｂ）。
【０１０５】
実施例６：ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６の修飾及びｒ７３Ｔ−Ｒ１１６誘導体の特性決定
ニワトリにおけるｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ビルレンスを低減するために、様々な長さの配列の挿入によって、ＨＮ及びＬ遺伝子間配列を増大するように、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６を修飾した。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６誘導体を、細胞及び卵におけるプラーク形成及び複製を調べることにより、感染性について；ＭＤＴ及びＩＣＰＩを調べることにより、トリ病原性について、並びに腫瘍細胞殺傷について評価した（図６Ａ）。
【０１０６】
ＡＰＭＶからの３１８ｎｔ、ＲＳＶからの１９８ｎｔ及び１９８ランダム配列の遺伝子間挿入によって、ニワトリにおけるビルレンスが確かに低減し、ＭＤＴ＞１５６時間、並びにＩＣＰＩはそれぞれ、０．２７、０．０３７５及び０であった。長い挿入（ランダム１９８ｎｔ）は、短い挿入（ランダム６０ｎｔ）よりもビルレンスの低減に対し大きな作用を有した。１４４、１０２及び６０ｎｔの挿入は、ニワトリにおいてある程度のビルレンスを有したが、ＭＤＴ時間は短くなった。１４４、１０２及び６０ｎｔの挿入についてのＩＣＰＩ値は、それぞれ、０．７４、０．５１及び０．７８であった。非ウイルス配列（ランダム１９８ｎｔ）の挿入は、ウイルス配列（ＲＳＶ−１９８ｎｔ）の挿入よりも有効にビルレンスを低減した。ＨＮ−Ｌ結合部への第２トランスジーンカセット（ＥＧＦＰ）の挿入は、ニワトリビルレンスを低減しなかった（ＭＤＴ：８６時間及びＩＣＰＩ：０．８２）。全ての挿入が、卵での複製をやや低減した（最大４倍）が、ベロ細胞でのウイルス複製には作用しなかった（約１０6ｐｆｕ／ｍｌ）。突然変異型ウイルスは、ニワトリにおいて、より弱毒化されたが、腫瘍細胞殺傷機能は影響を受けなかった。全てのｒ７３Ｔ−Ｒ１１６誘導体は、感染３日目に７５％〜８６％の範囲の腫瘍細胞殺傷効率を有した。
【０１０７】
実施例７：鶏卵及びベロ細胞におけるｒ７３Ｔウイルスの増殖動態
ｒ７３Ｔウイルスの増殖状態を決定するために、増殖動態試験を鶏卵（図７）及びベロ細胞（図８）において実施した。孵化鶏卵を１００、１０００、１０，０００又は１００，０００ＦＦＵ／卵の表示ウイルスに感染させ、２、３若しくは４日にわたってインキュベートした。尿膜液を採取し、ウイルス力価をＦＦＡによって決定した。図７に示すように、１００ＦＦＵ／卵は、１日目に低い力価を有したが、２日目にはピーク力価に達した。全体的に、ほとんどのウイルスが、用いた接種材料用量に関係なく、２日目に約８ｌｏｇ／ｍＬのピーク力価に到達した。Ｒ１１６ｉ−１９８は、最も低い力価を有し、低い接種材料用量で２日目に最高収量を産生したが、これは、欠損粒子の蓄積があり得ることを示している。Ｒ１１６ｉ−３１８−ＡＰＭＶ挿入も、約７ｌｏｇというより低いピーク力価を有した。Ｒ１１６ｉ−１９８−ＲＳＶは、７．５ｌｏｇのピーク力価に達した。逆遺伝学によって構築したＳ１１６は、卵でのウイルス産生の低減を全く示さなかった。従って、Ｒ１１６誘導体の中でも、ＲＳＶ−１９８ｎｔ挿入を有すウイルスが、卵における増殖性に関して、腫瘍溶解性ウイルスの第１位の候補であった。
【０１０８】
ウイルスはまた、無血清ベロ細胞クローン５１Ｄ１１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅにより作製された専売細胞株）においても評価した。全てのウイルスが、両方のＭＯＩ条件（０．００１及び０．０００１）下で十分に複製した（図８）。７３Ｔ  ＦＰＣＳの修飾並びにＲ１１６のＨＮ−Ｌ結合部における遺伝子間挿入は、ベロ細胞におけるウイルス増殖に影響を与えなかった。
【０１０９】
実施例８：正常細胞と比較した癌細胞におけるｒ７３Ｔ及び誘導体の選択的細胞殺傷
ｒＴ３Ｔ及びその誘導体を、非処置対照細胞に対し、正常ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ１１２２Ｓｋ細胞と比較したヒト線維肉腫ＨＴ１０８０におけるその細胞殺傷について評価した（図９Ａ及び９Ｂ）。データは、７２時間にわたる１〜１００，０００ＰＦＵの範囲の様々な用量のｒ７３Ｔ誘導体による感染後に取得した。ＨＴ１０８０癌細胞において、長潜伏期性ＦＰＣＳを有するウイルスは、最小殺傷、ＦＰＣＳにＳ１１６を有するウイルスは中間、また、ＦＰＣＳにＲ１１６を有するウイルスは、ｒ７３Ｔｗｔウイルスと同じくらい効率的な細胞殺傷を呈示した。正常ＣＣＤ１１２２ＳＫ細胞の場合、全てのウイルスの細胞殺傷が、癌細胞の場合ほど効率的ではなかった。殺傷効率の低下は、約１００倍であった。ＦＰＣＳ配列とは関係なく、全てのウイルスは、正常細胞において同様の殺傷効率を示した。癌及び正常細胞における細胞殺傷効率は、Ｐｒｉｓｍ６．０を用いた用量応答曲線から補間した５０％有効濃度（ＥＣ50）として表した（図９Ｃ）。Ｒ１１６誘導体は、ｒ７３Ｔｗｔと同様のＥＣ50値（ＥＣ50：１０ＰＦＵ）を有したが、これは、ＦＰＣＳの修飾が、癌細胞におけるウイルス複製及び細胞殺傷に影響を与えなかったことを示している。ＭＯＩ０．０１でのＨＴ１０８０及びＣＣＤ１１２２ＳＫ細胞におけるこれらウイルスの複製を感染後３日目に決定した（図９Ｄ）。全てのウイルスは、約１．５〜２．０ｌｏｇの差で、正常細胞に対し、癌細胞において優先的に複製した。
【０１１０】
実施例９：ｒ７３Ｔ誘導体は、ヒト腫瘍異種移植片を保有する免疫欠損マウスに全身又は腫瘍内のいずれかで送達したとき、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有した。
ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍溶解活性を評価するために、５〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃ無胸腺ヌードマウスに、５×１０6細胞／０．１ｍｌの濃度でＨＴ１０８０細胞を皮下注射することにより、ＨＴ１０８０異種移植片モデルを作製した。ｈＧＭ−ＣＳＦは、マウスにおいて交差反応性がないため、この試験は、トランスジーンの評価ではなく、各種ｒ７３Ｔ構築物の腫瘍溶解能力を評価することを目標とする。Ｒ１１６−３１８ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦを腫瘍内（ｉｔ）又は静脈内（ｉｖ）に投与して、腫瘍増殖速度を処置及び対照群の間で比較した（図１０Ａ）。
【０１１１】
腫瘍体積が約６５ｍｍ3に達したとき、マウスを表示のようにランダムに群分けした（Ｎ＝１０）。マウスは、ＰＢＳ又は腫瘍内（ＩＴ）投与した２×１０7Ｐｆｕのｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−１９８若しくは尾静脈注射により静脈内（ＩＶ）投与した１×１０8ＰＦＵいずれかの単回用量を受けた。３〜４日毎に腫瘍サイズを測定した。図１０Ａに示すように、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉは、ＩＶ又はＩＴのいずれを投与した場合にも、有意な腫瘍退縮を誘導することができた。２つの経路により誘導された腫瘍退縮の量は同等であり、対照群とは有意な差があった。
【０１１２】
ｒ７３Ｔ誘導体の腫瘍溶解活性を１×１０8ＰＦＵのＩＴ注射によりＨＴ１０８０異種移植片において比較した（図１０Ｂ）。腫瘍体積が約１８０ｍｍ3に達したとき、マウスをランダムに群分けした（Ｎ＝７）。マウスは、ＰＢＳ又は１×１０8ＰＦＵのｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−ｌｅｎｔｏ（ｌｅｎｔｏ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｓ１１６Ｋ１１３Ｍ１１４（Ｓ１１６  ＫＭ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−３１８ｎｔＡＰＭＶ−Ｎ（Ｒ１１６ｉ）若しくはｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ（ｒ７３Ｔｗｔ）のいずれかを受けた。３〜４日毎に腫瘍サイズを測定した（＊ｐ＜０．０５、独立スチューデントｔ検定）。２用量のｒ７３Ｔ誘導体は、有効性に差はあったものの、有意な腫瘍退縮を誘導することができた。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏが、最も有効性が低かったのに対し、ｒ７３Ｔｗｔは、腫瘍退縮において最も有効であった。ｒ７３Ｔ−ｌｅｎｔｏは、Ｓ１１６ウイルスと同等の効果を有したが、Ｓ１１６ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺傷について１０倍低いＥＣ50を有した（図９Ａ）。ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−３１８は、２回目用量後９日目（腫瘍移植後１９日目）まで、腫瘍増殖の阻害において、７３Ｔｗｔと同じくらい強力であり、腫瘍は、その後Ｒ１１６ｉ処置マウスで再び増殖したが、７３Ｔｗｔ処置群ではそれはなかった。これらのデータは、ｒ７３Ｔ誘導体が、ヒト腫瘍異種移植片を保有する免疫欠損マウスに全身又は腫瘍内のいずれで送達したときも、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有することを立証するものであった。Ｆタンパク質の効率的な切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製にとって重要である。ＦＰＣＳにＲ１１６を有するウイルスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞殺傷において、より強力であった。
【０１１３】
実施例１０：静脈内送達後のｒ７３Ｔ誘導体の組織生体内分布
腫瘍溶解性ＮＤＶウイルスが、腫瘍組織において、選択的に複製するか否か、並びにウイルスクリアランスを決定するために、様々な臓器内でのウイルス分布を決定した。サイズ約２５０ｍｍ3の皮下ＨＴ１０８０腫瘍を保有する無胸腺ヌードマウスを、用量１×１０8ＰＦＵのＲ１１６ｉ（ｒ７３Ｔ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ１１６ｉ−３１８ｎｔＡＰＭＶ−Ｎ）で静脈内処置し、１、４、又は８日目に死なせた（１時点につきｎ＝３）。血清、肺、脾臓、卵巣及び腫瘍を収集した。
【０１１４】
ウイルスの存在をベロ細胞においてプラークアッセイにより定量した後、ｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーン発現をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。腫瘍及び臓器におけるウイルス複製を感染後１、４、及び８日目に評価した。ウイルスは、臓器では１日目にしか検出されず（卵巣には全ての時点でウイルスは全く検出されなかった）、腫瘍組織中のウイルス負荷は、肺及び脾臓より約１００倍高かった（図１１Ａ）。腫瘍中のウイルスの存在は、少なくとも８日間持続したが、これは、ウイルスが腫瘍組織において選択的に複製したことを示している。ウイルス複製データと一致して、ｈＧＭ−ＣＳＦのレベルが最も高く、８日超持続した（図１１Ｂ）。これらのデータによって、ＮＤＶウイルスが、腫瘍組織において有効に複製し、トランスジーンを局所腫瘍組織に有効に送達することができることが立証された。
【０１１５】
実施例１１．キメラＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含有する７３ＴのアンチゲノムｃＤＮＡ
ウイルス表面糖タンパク質は、ニワトリにおける免疫原性及びビルレンスに対する重要な抗原である。個別に又は組み合わせて、ニワトリにおいてビルレントではない他のパラミクソウイルスの対応する細胞外（エクト（ｅｃｔｏ））ドメインによってＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子を置換するために、様々な戦略を探究した。パラミクソウイルス５（ＰＩＶ５）は、イヌパラミクソウイルスであり、ヒトには疾患を引き起こさない。ハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）変異体は、以前報告されているように、ＩＣＰＩが０．０２５で、ニワトリにおいて非ビルレントであることが証明されており、ＮＤＶとは抗原が異なる（Ｄｏｒｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏ．１４３，ｐａｇｅ１３９−１４４．）。同一の短潜伏期性融合タンパク質切断部位を有するが、ビルレンスが極めて対照的な２つの遺伝子的に極めて関連するハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）が存在する（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１４３：１３９−１４４）。Ｆ及び／又はＨＮ糖タンパク質エクトドメインが、ＰＰＭＶ−１及び／又はＰＩＶ５で置換されたＮＤＶ７３Ｔの完全長アンチゲノムｃＤＮＡを作製した（図１２Ａ）。ＮＤＶ、ＰＩＶ５及びＰＰＭＶ−１配列は、それぞれ、青、紫又は緑で色付けしたボックスで示す）。
【０１１６】
個別のタンパク質又はタンパク質ドメインのアミノ酸長さを示す。ベロにおけるプラーク形成、相対ＨＴ１０８０細胞殺傷及びＭＤＴを既述のように実施した（図１２Ｂ）。ＰＩＶ−５Ｆ−ＨＮを除いて、キメラウイルスが回収され、外性トリプシンの非存在下、細胞において増殖することができた。３つのウイルスは全て十分な大きさのプラークを形成したが、これは、効率的な細胞間拡散を示している。ＰＰＭＶ−１Ｆ−ＨＮ又はＦキメラウイルスは、それぞれ、７９及び８４時間のＭＤＴ値を有し、ニワトリにおいて可能性のあるビルレンスを示した。いずれのＰＰＭＩ−１キメラも、７１及び６１％のレベルで、効率的にＨＴ１０８０細胞を殺傷した。ＰＩＶ５−Ｆキメラは、卵では増殖しなかったため、ニワトリにおいてビルレントではなく、ＨＴ１０８０細胞を４７％で殺傷した。２用量の１×１０8ＰＦＵのｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉを静脈内で受けたマウスから採取した血清を用いた中和アッセイにより、ＮＤＶとＰＰＭＶ−１又はＰＩＶ５キメラとの間の血清交差反応性を調べた。ｒ７３Ｔウイルスは、ＮＤＶ感染血清（力価９６０）によって中和されたが、ＰＰＭＶ−１又はＰＩＶ５キメラは中和されなかった（力価＜４）。この結果から、ＮＤＶとＰＰＭＶ−１又はＰＩＶ５との間に交差反応性はないことが確認された。異なる抗原性を有するキメラウイルスは、以前のＮＤＶ治療の際に抗ＮＤＶ免疫応答を発生した患者のための追加腫瘍溶解性ウイルスとして役立つ可能性を有する。
【０１１７】
ミニゲノムアッセイによる他のパラミクソウイルスとのＮＤＶＲＮＡポリメラーゼ活性の比較（図１２Ｃ）。Ｔ７を発現する細胞を、ＮＤＶのＮＰ、Ｐ、Ｌタンパク質を発現する３つのプラスミド、並びにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＧＦＰ遺伝子をコード化するＮＤＶアンチミニゲノムｃＤＮＡをコード化するプラスミド、又は麻疹ウイルス（ＭＶ）若しくはＲＳウイルス（ＲＳＶ）のＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子をコード化するプラスミド及びそれぞれのＲＳＶ若しくはＭＶ  ＧＦＰアンチミニゲノムｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後２又は３日目に、ＧＦＰタンパク質の発現により示されるミニゲノム複製を蛍光顕微鏡で調べた。ＮＤＶは、麻疹ウイルス及びＲＳＶと比較して、最も強力なポリメラーゼ活性を有した。
【０１１８】
実施例１２．ＮＤＶに対して感受性の癌細胞を細胞パネルスクリーニングにより同定した。
どの腫瘍タイプがＮＤＶ腫瘍溶解性に対して感受性であり得るかを理解するために、多種多様な腫瘍タイプ及び適応症を含む１８０の癌細胞株を、組換えＮＤＶ及びその変異体に対する感受性について試験した。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）又はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から取得し、供給者により推奨される条件下で培地中に培養した。１０，０００個の癌細胞株を９６ウェルプレートに接種し、６時間後ウイルスに感染させた。ウイルス濃度は、ＭＯＩ１０〜０．０００１（又はウェル当たり１〜１００，０００ｐｆｕ）の範囲であった。感染から４８〜９６時間後に細胞生存性を決定した。０．１のＭＯＩのウイルスによる感染から７２時間後、＞３０％細胞殺傷率のカットオフを用いて、感受性を決定した。図１３Ａ及び１３Ｂは、腫瘍タイプによる感受性の概要を示す。造血系癌細胞株（白血病及びリンパ腫）は、ＮＤＶ腫瘍溶解性に対して比較的非感受性であったが、試験した黒色腫、卵巣及び膵臓細胞株の大部分は、ＮＤＶに対して感受性であった。試験した全ヒト癌細胞株の約５８％が、ＦＰＣＳでのＮＤＶ  Ｒ１１６ｉに対して感受性であったのに対し、試験した細胞株の４％が、Ｓベースのウイルスに対して感受性であった。これは、恐らくプロテアーゼによるＦタンパク質の切断によるものと考えられる。Ｒ１１６ｉウイルスは、遍在性フリン様プロテアーゼにより切断される可能性が高いのに対し、Ｓ１１６Ｆタンパク質を切断する傾向があるプロテアーゼは、不明瞭であり、恐らくそれほど遍在的に発現されないと思われる。再誘導したＳ１１６−ＫＭ変異体は、より大きなプラークサイズをもたらし、オリジナルのＳ１１６変異体に対して腫瘍溶解能を増強した。これをさらに試験するために、ＮＤＶＲ１１６ウイルスに対して様々な感受性を有することが判明した２２の癌細胞株の小さな群をＧＦＰ発現変異体に感染させて、感染から７２時間後に細胞生存性を決定した。前述と同じ感受性カットオフを用いたところ、試験細胞株の４１％がＲ１１６ｉに対して感受性で、４％がＳ１１６に対し感受性であり、再誘導Ｓ−ＫＭは、試験細胞株の２７％が感受性と、Ｓ１１６ＮＤＶより強力であった。
【０１１９】
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【０１２０】
実施例１３．ｒ７３Ｔ誘導体は、同一遺伝子黒色腫モデルにおいて腫瘍殺傷及び／又は腫瘍増殖阻害活性を有した。
腫瘍モデル精製の後、Ｓ１１６−ＲＤ  ＮＤＶコード化ヒト又はマウスＧＭ−ＣＳＦを、精製Ｂ１６Ｆ１０同一遺伝子モデルにおける効力について試験した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。１×１０8ｐｆｕを３回の用量で腫瘍内に注射し、１群当たり最低８匹のマウスがいた。有意な腫瘍増殖阻害は、＞８０％腫瘍増殖阻害で明らかにされる（図１５Ｂ）。短期腫瘍退縮が、反復腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与により達成され、これは、処置群の４２日に対する対照の生存期間１８日にも有意な増加をもたらした。３回の用量後に処置を停止すると、腫瘍の再増殖が起こった。５０日目にＳ１１６−ｍＧＭ−ＣＳＦ群において残留腫瘍のエビデンスがなかった唯１匹の動物を、いずれか一方の脇腹でのＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞の移植により再攻撃した。腫瘍増殖は遅延したが、阻害されなかったことから、このモデルでは、この唯１匹の動物において十分な免疫記憶応答が達成されなかったことを示唆している。
【０１２１】
腫瘍増殖に対する腫瘍溶解及び免疫の作用を評価するために、それぞれｈＧＭ−ＣＦ又はｍＧＭ−ＣＳＦをコード化するＮＤＶ変異体Ｒ１１６ｉ及びＳ１１６を、マウス同一遺伝子免疫応答性ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける効力について試験した。各ウイルスは、１×１０8ＰＦＵのウイルスを４用量腫瘍内に投与した。投与開始前に、腫瘍は、最小１００ｍｍ3であった。ウイルスで処置したマウスは全て、単剤療法として強力な抗腫瘍活性を示した。ヒトＧＭ−ＣＳＦをコード化するＲ１１６で処置後、１２匹のマウスのうち１１匹は腫瘍がなくなり、これは、９２％の完全奏効率である。より低溶解性の再誘導Ｓ１１６−ＫＭウイルスは、腫瘍増殖阻害が低く、５３％ＴＧＩを達成し、３６％の完全奏効率であった。しかし、ヒトＧＭ−ＣＳＦとは異なり、マウスモデルにおいて活性化するマウスＧＭ−ＣＳＦの存在下では、この奏効率は、５４％に増加し、腫瘍増殖阻害は７５％であった。従って、Ｓ１１６ウイルスにＧＭ−ＣＳＦを賦与することにより、抗腫瘍活性を増強し得ると考えられる。
【０１２２】
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【０１２３】
残った腫瘍を組織学的分析のために採取し、ヘマトキシリン及びエオシン染色剤（Ｈ及びＥ）により、ＮＤＶ検出のための免疫組織化学法を用いて染色した（図１５Ｃ）。ＮＤＶ発現の明らかなエビデンスが存在し、これは、腫瘍の壊死領域の周囲に濃縮していると思われ、ＮＤＶが、腫瘍細胞死及び壊死に寄与していることを示唆している。また、腫瘍及び壊死領域への免疫細胞浸潤の明らかなエビデンスも認められる。ＮＤＶの強度の染色を有する領域には、多核細胞合胞体形成も認めることができる。さらに、ごくわずかな生存腫瘍しか残っていないようであり、腫瘍増殖阻害データが、このモデルにおけるＮＤＶの活性を過小評価している可能性があることを示している。
【０１２４】
図１５Ｃは、ＮＤＶが、免疫応答性マウスＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有することを示す。腫瘍増殖に対する腫瘍溶解及び免疫の作用を評価するために、ＮＤＶ変異体（それぞれｈＧＭ−ＣＦ又はｍＧＭ−ＣＳＦをコード化するＲ１１６ｉ及びＳ１１６を、マウス同一遺伝子免疫応答性ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける効力について試験した。各ウイルスは、１×１０8ＰＦＵのウイルスを４用量腫瘍内に投与した。投与開始前に、腫瘍は、最小１００ｍｍ3であった。ウイルスで処置したマウスは全て、単剤療法として強力な抗腫瘍活性を示した。ヒトＧＭ−ＣＳＦをコード化するＲ１１６で処置後、１２匹のマウスのうち１１匹は腫瘍がなくなり、これは、９２％の完全奏効率である。より低溶解性の再誘導Ｓ１１６−ＫＭウイルスは、腫瘍増殖阻害が低く、５３％ＴＧＩを達成し、３６％の完全奏効率であった。しかし、ヒトＧＭ−ＣＳＦとは異なり、マウスモデルにおいて活性化するマウスＧＭ−ＣＳＦの存在下では、この奏効率は、５４％に増加し、腫瘍増殖阻害は７５％であった。従って、Ｓ１１６ウイルスにＧＭ−ＣＳＦを賦与することにより、抗腫瘍活性を増強する。
【０１２５】
図１５Ｄ〜Ｆは、ｒＮＤＶＲ１１６ｉの複数回投与によって、腫瘍増殖阻害が起こり、免疫細胞動員を卵巣癌（ＯＶＣＡＲ４）異種移植片モデル中に推進したことを示す。ｉｎ  ｖｉｖｏでのｒＮＤＶ腫瘍溶解活性をさらに評価するために、ヒト卵巣癌異種移植片モデル（ＯＶＣＡＲ４）を使用した。このモデルは、増殖が遅く、未分化細胞形態及び腹水様液体で満ちた大きな領域を有するヒト卵巣癌を暗示する大まかな病理を有する。腫瘍が１００ｍｍ3に達したら、マウスに対しランダムに、マウス若しくはヒトＧＭ−ＣＳＦのいずれかをコード化するＲ１１６ｉＮＤＶを８用量又は対照としてＰＢＳを投与した。マウス遺伝子配列からの産物のみがマウスモデルにおいて生体活性であるはずである。２．５×１０7ｐｆｕを週１回５０μｌ未満の量で腫瘍内注射した。腫瘍増殖曲線を図１５Ｄに示す。長期腫瘍阻害が、いずれのＮＤＶ変異体で処置した腫瘍保有マウスにおいても達成された。試験の終了時（最後の用量から２４時間後）に腫瘍内に、ＲＴ−ＰＣＲを用いてウイルスゲノムのエビデンスも認められた。組織学的分析の後、残留腫瘍において、免疫浸潤並びに他の組織学的変化の明らかなエビデンスが認められる（図１５Ｅ及びＦ）。処置した腫瘍は、対照処置マウスよりはるかに脱分化が少なく、腹水に満ちた領域も少ないようである。残留腫瘍に隣接するいくつかの処置済腫瘍に高レベルの炎症性浸潤が認められ、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析から、これらの免疫浸潤が、ＮＤＶタンパク質について陽性であることが明らかにされている。ＮＤＶ処置群において腫瘍への強度の先天性免疫細胞動員が存在する。これらのデータは、直接の腫瘍溶解及び先天性免疫動員及び活性化によって引き起こされ得る形態学的に関連する卵巣癌モデルにおける強力な抗腫瘍効果を立証するものである。
【０１２６】
実施例１４．ＮＤＶウイルスは、腫瘍退縮を誘導した。
Ｂ１６黒色腫モデルにおける腫瘍溶解効果について、７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦ及び７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｍＧＭ−ＣＳＦを評価した。この試験では、Ｂ１６マウスにおいてウイルス耐容性を評価した。各ウイルスは、１１日目及び１４日目に２×１０7ｐｆｕで２回静脈内（ｉ．ｖ）若しくは腹腔内（ｉ．ｐ）に、又は１１日目に１．１×１０7ｐｆｕで１回腫瘍内（ｉ．ｔ）に投与した。３つの異なる投与経路によりＲ１１６−ｈＧＭ−ＳＣＦ又はｍＧＭ−ＳＣＦで処置した群は、非処置群と比較して遅い腫瘍増殖速度を有した（図１５Ａ）。各群は３匹のマウスを含んだ。腫瘍阻害速度は、対照群から統計的に有意であった。従って、本発明のｒ７３Ｔ誘導体は、有利には低いトリ病原性、高い腫瘍溶解活性を有し、鶏卵において高い力価まで複製した。これらの結果に基づき、本発明のウイルスは、腫瘍退縮を誘導し、癌患者治療成果を高める上で有用である（図１６）。
【０１２７】
ＧＭ−ＣＳＦのほかに、腫瘍殺傷を増強するために、いくつかのトランスジーン（表２）をＮＤＶ７３Ｔ株に挿入してもよい。これらのトランスジーンは、以下を含む：
（１）サイトカイン又はサイトカインの改変された変異体、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びＩＬ−１２ｐ７０
（２）ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、Ｆｌｔ３：、Ｂ．１（ＣＤ８０）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９などの細胞表面リガンド及びケモカイン。（３）Ｍｙｃ阻害物質：Ｏｍｏｍｙｃ。（４）例えば、放射線ウイルス療法（ｒａｄｉｏｖｉｒｏｔｈｅｒａｐｙ）のためのヨウ化ナトリウムシンポータ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ  ｓｙｍｐｏｒｔｅｒ）（ＮＩＳ）媒介放射線ウイルス療法などのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを目的とするトランスジーン。（５）腫瘍殺傷を増強するための腫瘍細胞生存のさらなる調節物質（例えば、限定はしないが、細胞周期進行の阻害物質、抗アポトーシスタンパク質の阻害、アポトーシス促進性タンパク質の増強、悪性形質転換の重要な発癌ドライバの阻害など）。これらは、腫瘍細胞における選択的ＮＤＶ複製後のタンパク質のトランスジーン送達、選択的若しくは広範な活性ｓｉＲＮＡの生成、ｍｉＲＮＡの送達又は選択されたｍｉＲＮＡの阻害を含み得る。（６）Ｅ６、Ｅ７などの腫瘍抗原、癌・精巣抗原、癌胎児抗原、人工若しくは過剰発現タンパク質、例えば、単独又は他のトランスジーンと組み合わせた新規の腫瘍抗原。（７）負の調節を阻止するか、又はＴ細胞機能を増強するアゴニスト作用シグナルを提供するために、免疫調節タンパク質をターゲティングする抗体又は組換え融合タンパク質。このような抗体の例として、限定はしないが、以下：ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３、ＣＤ７３、ＰＤ−１、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴが挙げられ得る。（８）タンパク質をｒｅｃＮＤＶ上に輸送する細胞においてｒｅｃＮＤＶを改変又は発現することよって、補体によるクリアランスを低減するか、又はＮＤＶに対する適応免疫応答を低減することによる、ｒｅｃＮＤＶの薬力学／薬動態活性の増大。
【０１２８】
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【０１２９】
実施例１５．免疫調節ｍＡｂと組み合わせた腫瘍溶解性ＮＤＶの投与を含む癌療法
ＮＤＶ腫瘍溶解性ウイルスは、必要に応じて、治療抗体又はアゴニスト作用融合タンパク質（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＴＩＭ−３、抗ＰＤ−１及び抗ＩＣＯＳ）と同時に、又は順次投与することができる。本明細書に記載する新規のＮＤＶ構築物と組み合わせて、腫瘍モデルにおけるＮＤＶの活性を増強する分子の最も有効な用量及びスケジュールを確立する前臨床データを取得する。トランスジーンは、例えば、新規のＮＤＶ変異体により誘導される腫瘍細胞死を増強するために、複数のモードの活性を送達するように、単独で又は組み合わせて、発現用の組換えＮＤＶに挿入することができる。免疫調節アプローチと組み合わせた腫瘍細胞抗原の放出の増大は、これらの遊離した腫瘍抗原に対する適応免疫応答を増大する能力を有する。
【０１３０】
実施例１６．Ｆタンパク質切断効率及び融合活性は、Ｆタンパク質切断部位にＲ、Ｓ又はＳ−ＫＭ突然変異を有するＦタンパク質において低減した。
Ｆタンパク質切断部位の差が、感染細胞におけるＦタンパク質切断及び融合活性へのその影響に作用するかどうかを理解するために、Ｆタンパク質プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトして、Ｆタンパク質切断を調べた。さらに、Ｆ及びＨＮタンパク質のいずれも融合形成に必要であるため、Ｆ及びＨＮプラスミドを同時トランスフェクトして、トランジェントアッセイで融合活性を調べた（図３Ｂ及び３Ｃ）。ｗｔＦタンパク質は、宿主プロテアーゼによって、Ｆタンパク質切断部位にＲ、Ｓ又はＳ−ＫＭ突然変異を有するＦタンパク質よりも効率的に切断され、Ｓ切断部位を有するＦにはＦタンパク質切断産物（Ｆ１）がほとんど検出されず、また、長潜伏期性Ｆプラスミドトランスフェクト細胞には切断産物が全く検出されなかった。Ｒ及びＳ構築物のＦタンパク質は、切断部位にＮ結合グリコシル化部位（ＮＸＴ）を有することから、ＫＭ突然変異がグリコシル化部位を無効にしたために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動運動性がｌｅｎｔｏ及びＳ−ＫＭより遅くなる。これらのデータは、Ｆタンパク質切断部位でのＲ及びＳ突然変異が、Ｆタンパク質切断に作用して、Ｓ−ＫＭが、Ｓより効率的になることを立証した。Ｆ及びＨＮ遺伝子は各々、ＥＧＦＰ遺伝子をコード化するｐＶｉｔｒｏ２−ｎｅｏ−ＭＣＳベクターにクローン化されたことから、融合した緑色細胞により、合胞体形成を視覚化することができる。ｗｔＦ及びＨＮプラスミドトランスフェクト２９３細胞に、大きな合胞体形成が観察された。Ｆタンパク質切断部位にＲ、Ｓ又はＳ−ＫＭ残基を有するＦ突然変異体は全て、合胞体形成を大幅に減少させた。
【０１３１】
実施例１７．１９８ｎｔ挿入を有するｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉウイルスは、ベロ細胞と比較して、ＤＦ−１細胞において低速の増殖と、差次的なＲＮＡ及びタンパク質合成プロフィールを示した。
ＨＮ−Ｌ結合部間に１９８ｎｔが挿入されたＲ１１６ｉウイルスは、図６Ｂ及び６Ｄに示すように、高いｍｏｉ条件下で、ニワトリＤＦ−１細胞において、より低速の増殖動態を示した。１９８ｎｔ挿入を有するＲ１１６ｉの増殖の差は、ｗｔ及びＲウイルス（感染の早期時点（１０〜２０時間）で遺伝子間挿入を含まない）と比較して、小さくなった。ベロ細胞では、これらのウイルス同士の増殖の差は、あまりはっきりとしなかった（図６Ｃ及び６Ｅ）。Ｒ１１６ｉウイルスにおける遺伝子間挿入が、ウイルスＲＮＡ転写及び複製に影響を及ぼしたかどうかを理解するために、感染ＤＦ−１細胞におけるウイルスＲＮＡ及びタンパク質合成を、それぞれ、ノーザン及びウエスタンブロッティング分析により調べた（図６Ｆ及び６Ｇ）。１９８ｎｔ挿入を有するＲ１１６ｉのＲＮＡ及びタンパク質合成は、感染ＤＦ−１細胞において大幅に低減した。対照的に、感染ベロ細胞においては、ＮＰｍＲＮＡのような上流遺伝子転写物は、Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶ感染細胞において大幅に増加したが、これら２つのウイルスのゲノムＲＮＡは減少した。これら２つのウイルスのＬタンパク質のレベルは低下したが、図６Ｈ及びＩに示すように、ＮＰ、Ｆ及びＨＮなどの他のウイルスタンパク質産物は増加した。図６Ｆ〜Ｉにおいて得られたデータは、高いｍｏｉ条件（ｍｏｉ＝５）で実施した。さらに、ＲＮＡ及びタンパク質合成は、低いｍｏｉ条件（ｍｏｉ＝０．００１）で実施した。ここでも、Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶは、ＤＦ−１及びベロ細胞において差次的なＲＮＡ及びタンパク質合成プロフィールを有した。Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶのＲＮＡ及びタンパク質合成のいずれも、ニワトリＤＦ−１細胞において低減した（図６Ｊ）。対照的に、上流のＲＮＡ及びタンパク質は、ベロ細胞において増加したが、ＬｍＲＮＡ及びＬタンパク質のレベルは、１９８ｎｔ配列の遺伝子間挿入のために低下した（図６Ｋ）。ウイルスＲＮＡ及びタンパク質合成をさらに、ヒト細胞、ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０及びヒーラ細胞、及びＤＦ−１細胞の場合と比較した（図６Ｌ）。これらのデータによって、Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶが差次的発現を有しており、上流のＲＮＡ及びタンパク質合成は増大したのに対し、Ｌタンパク質発現は下方制御されたことが確認された。これらのデータは、Ｒ１１６ｉ−１９８又は１９８ＲＳＶウイルスが、何故ベロ、ヒトＨＴ１０８０及びヒーラ細胞などの哺乳動物細胞株において良好に複製したのに、孵化鶏卵及びニワトリＤＦ−１細胞では良好に増殖しなかったのかを説明するものであった。これはまた、その低い脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）によって示されるように、これらのＲ１１６ｉウイルスのニワトリ病原性低減の根拠も提供した。
【０１３２】
実施例１８．マウスＧＭ−ＣＳＦトランスジーン発現は、Ｒ１１６ｉ−１９８ＲＳＶにおいて、ヒトＧＭ−ＣＳＦトランスジーン発現より低い腫瘍増殖阻害効果を有したが、Ｓ１１６−ＫＭにおいてはそうでなかった。
図１１Ｃでは、ＨＴ１０８０異種移植片マウス腫瘍モデルにおけるＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ及びＳ１１６−ＫＭの腫瘍溶解活性に対する、ｍＧＭ−ＣＳＦの寄与をｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーン発現と比較した。ｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーンは、ｍＧＭ−ＣＳＦと交差反応しないため、対照として使用した。腫瘍内投与されたＲ１１６ｉ−１９８におけるｍＧＭ−ＣＳＦトランスジーンは、ｈＧＭ−ＣＳＦと比較して、腫瘍増殖阻害に低い効力を示した。ｍＧＭ−ＣＳＦ及びｈＧＭ−ＣＳＦの同様の腫瘍増殖阻害が、Ｓ１１６ウイルスについて観察された。ウイルス処置腫瘍増殖阻害におけるウイルス力価をプラークアッセイにより決定した（図１１Ｄ）。腫瘍注射後４日目に、ペアとしてｍＧＭ−ＣＳＦ又はｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ及びＳ１１６−ＫＭについて同様の力価が検出された。しかし、注射後７日目に、ｍＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは検出されなかったが、ｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは、ウイルス力価：約４．５ｌｏｇ／ｇ組織を有した。ｈＧＭ−ＣＳＦ又はｍＧＭ−ＣＳＦを有するＳ１１６のウイルス力価に差はなかった。これらのデータは、Ｒ１１６ｉによるｍＧＭ−ＣＳＦの発現が、ウイルスクリアランスを促進したことを示している。
【０１３３】
ウイルス感染腫瘍細胞中の免疫細胞浸潤を調べた（図１１Ｅ）。ｍＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶは、ｈＧＭ−ＣＳＦを有するＲ１１６ｉ−１９８ＲＳＶ、並びにＳ１１６ｈＧＭ−ＣＳＦとｍＧＭ−ＣＳＦのペアと比較して、処置腫瘍において最多数の好中球、ＮＫ及びマクロファージ細胞を有した。ウイルス処置腫瘍中のサイトカイン及びケモカインは、ルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイにより決定した（図１１Ｆ）。４つのウイルスは全て、非処置腫瘍組織と比較して、何倍もサイトカイン及びケモカイン産生を刺激した。Ｒ１１６ｉによるｍＧＭ−ＣＳＦの発現は、Ｓ１１６の約１０倍高い（１０６．７対９．９倍）。
【０１３４】
図１１Ｇは、ＨＴ１０８０異種移植マウス腫瘍モデルにおいて、同じｈＧＭ−ＣＳＦトランスジーンを含む、ＨＮ−Ｌ結合部の間に挿入された１９８又は３１８ｎｔを有するＲ１１６ｉの同様の腫瘍増殖阻害活性を示す。ＨＮ−Ｌ結合部における３１８ヌクレオチド挿入は、ウイルス腫瘍溶解性ウイルス活性を低減しなかった。
【０１３５】
実施例１９．補体媒介ＮＤＶ不活性化の評価及び補体回避における調節タンパク質の役割  補体（Ｃ’）系は、宿主において微生物侵入に対する主要な防御系である。ヒトの補体系には約３０の異なる糖タンパク質があり、そのうちの２０が、血漿において作用し、１０が細胞膜に対する調節物質又は受容体である。膜結合Ｃ’調節物質（ＲＣＡ）は、４つの十分に特性決定された分子：ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９及びｈＣＤ３５を含む。これらの主要な機能は、外来因子を排除するＣ’の役割に作用することなく、オートロガス補体攻撃からヒト細胞を防御することである。これらのＲＣＡタンパク質は、宿主種特異的である。過去にウイルス療法のために用いられたＮＤＶは、一般に、孵化鶏卵において生産された。癌患者に対し静脈内注射により投与されたＮＤＶ腫瘍溶解性ウイルスは、急速に排泄されるため、有効なウイルス用量が低下すると予想される。ヒト細胞から産生されるエンベロープウイルスは、感染細胞からのその放出中に、ＲＣＡタンパク質を取り込むことから、Ｃ’媒介のウイルス溶解又は不活性化を低減するようにヒト細胞培養物中にＮＤＶを生産することが望ましい。
【０１３６】
Ｃ’媒介ウイルス不活性化に対するＮＤＶの感受性は、孵化鶏卵、ヒト２９３及びヒーラＳ３懸濁細胞株において生産されたＮＤＶを調べることにより評価した（図１７）。鶏卵中に増殖するウイルスは、Ｃ’不活性化に対して感受性であったため、血清の熱処理（５６℃で３０分）により血清阻害を無効にした。モルモット補体は、同様のレベルのウイルス不活性化を有し（データは、示していない）、ウイルス不活性化がＣ’に起因することを確認した。さらに、ヒーラ細胞から産生されるウイルスは、２９３細胞及び鶏卵よりも、ヒトＣ’媒介ウイルス不活性化に耐性であった。従って、データは、ヒーラ細胞が、ＮＤＶ腫瘍溶解性ウイルス生産について、２９３細胞より優れており、恐らくそのために、より低速のウイルスのクリアランスが起こり、従って、治療インデックスが増加したことを示唆している。
【０１３７】
ヒーラＳ３細胞から産生されるＮＤＶが、何故Ｃ’に対して、より耐性であるかを説明するために、２９３及びヒーラＳ懸濁細胞株を、４つの十分に特性決定されたヒトＲＣＡタンパク質：ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９及びｈＣＤ３５のレベルについて評価した。ウェスタン分析により、ｈＣＤ３５は、２９３細胞及びヒーラ細胞中に検出されなかったため、データは、図１８に示していない。ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、及びｈＣＤ５９は、２９３細胞よりヒーラＳ３細胞においてより多量に検出された。従って、ＲＣＡタンパク質のレベルは、Ｃ’に対するウイルス感受性と逆に相関する。
【０１３８】
３つのＲＣＡタンパク質の全てがＣ’機能を調節するかどうかを決定するために、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９又はｈＣＤ４６トランスジーンを逆遺伝学によりＮＤＶゲノムに挿入し、３つのＲＣＡタンパク質の各々を発現する組換えウイルスを生産した。ウエスタンブロット分析により、これらのＲＣＡタンパク質の各々が、ウイルスによって発現され、ビリオンに組み込まれたことが明らかにされた（図１９）。ｈＣＤ５５は、Ｃ’不活性化機能に付与する主要ＲＣＡタンパク質であることが判明した（図２０）。ビリオンに組み込まれたｈＣＤ５５を有する鶏卵に産生されるｈＣＤ５５発現ウイルスが、Ｃ’媒介不活性化に対して最も耐性であり、これは、ヒーラ細胞に産生されるウイルスと酷似している。比較すると、ｈＣＤ４６は、Ｃ’不活性化に対するウイルス耐性に関して最低限の改善を有し、ｈＣＤ５９は、Ｃ’調節において検出可能な役割を呈示しなかった。
【０１３９】
結論として、腫瘍溶解性ウイルス療法についてのウイルスクリアランスを低減すると共に、ＮＤＶ治療インデックスを向上させるためには、ヒーラ細胞が、ウイルス生産に最適な細胞株であると考えられる。
【０１４０】
本明細書に記載する結果は、以下の材料及び方法を用いて得られた。
【０１４１】
細胞及びウイルス：
以下の細胞株及び対応する培地を用いた：アフリカミドリザル腎臓ベロ細胞株（ＡＴＣＣ）及びヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０、ＡＴＣＣ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）；ベロクローン５１Ｄ１１株（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、１％グルタミンを含む無血清培地（ＳＦＭＭｅｇａＶｉｒ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）；正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ１１２２Ｓｋ、ＡＴＣＣ）、１０％ＦＢＳを含むＡＴＣＣ製剤化イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＥＭ）。組換えニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を１０〜１１日齢特定病原体除去（ＳＰＦ）孵化鶏卵の尿膜腔、ベロ細胞、又はベロクローン５１Ｄ１１細胞において増殖させた。
【０１４２】
ＮＤＶアンチゲノムｃＤＮＡ及び支持プラスミドＮＰ、Ｐ及びＬの構築
ＮＤＶ株７３ＴのウイルスＲＮＡは、Ｍａｒｋ  Ｐｅｅｌｅｓ博士（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から取得した。ウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ用のＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する目的で、共通配列を取得するために、ＮＤＶ配列（ＧｅｎＢａｎｋ）をアラインメントした。ＮＤＶゲノム全体にわたる６つのサブゲノムｃＤＮＡオーバーラップ断片を高忠実度ＲＴ−ＰＣＲにより生成した（図１）。ＮＤＶ７３Ｔ株の完全長アンチゲノムｃＤＮＡの連続的アセンブリのために、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に導入された制限部位を含有する８８ｎｔオリゴヌクレオチドリンカーを含むように、ｐＵＣ１９ベクターを修飾した。さらに、７３Ｔ株ｃＤＮＡプラスミド（ｐ７３Ｔ）は、５’末端に２７ヌクレオチド（ｎｔ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータを、３’末端にＨＤＶアンチゲノムリボザイム配列を有する１８９ｎｔと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写終結シグナルを含む。非ビルレントＮＤＶを作製するために、融合タンパク質のプロテアーゼ切断部位をコード化する配列を、部位指定突然変異誘発により、非ビルレントＮＤＶ  ＬａＳｏｔａ株（長潜伏期性、ｌｅｎｔｏ）又はサイトメガロウイルス（Ｓ１１６）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の配列に修飾した。ＮＰの構築のために、Ｐ及びＬ発現プラスミド、タンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＲＴ−ＰＣＲにより増幅してから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下でプラスミドｐＣＩＴＥ２ａにクローン化した。
【０１４３】
ＮＤＶへのトランスジーンの挿入
Ｐ−Ｍ結合部でのトランスジーンの挿入のために、ＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片を含有するサブクローンプラスミドのｎｔ３１４８に、ＡｆｅＩ制限部位を導入した（図２Ａ）。ヒト若しくはマウス顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はインターロイキン（ＩＬ−２）をコード化するｃＤＮＡをコドン最適化した後、ＤＮＡ２．０により合成した。遺伝子カセットは、Ｎの遺伝子終止（ＧＥ）、Ｐの遺伝子開始（ＧＳ）及びトランスジーンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、これをＡｆｅＩ部位に挿入した。得られたプラスミドからのＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片をプラスミドｒ７３Ｔにシャッフルして、ｐ７３Ｔ−Ｐ１と名付けた。
【０１４４】
ＨＮ  ＯＲＦとＨＮの遺伝子終止シグナル（ＧＥ）配列との間のＨＮ−Ｌ結合部にトランスジーンを挿入するために、ＡｇｅＩ−ＸｂａＩ断片を含有するプラスミドのｎｔ８２３１にＡｆｅＩ制限部位を導入した（図２Ａ）。リン酸センス及びアンチセンスプライマーのペアを用いたＰＣＲにより遺伝子カセットを作製し（表３）、ＡｆｅＩ部位に挿入した。
【０１４５】
2019193662.tif 000021
【０１４６】
得られたプラスミドからのＡｇｅＩ−ＸｂａＩ断片をプラスミドｐ７３Ｔにシャッフルして、ｐ７３Ｔ−ＨＮ１を取得した。ＨＮ−Ｌ結合部に配列を挿入する別の戦略は、ｎｔ８３５９に導入されたＡｆｅＩ部位において、ＨＮの遺伝子終止シグナル（ＧＥ）とＬの遺伝子開始シグナル（ＧＳ）との間（図４）に、トランスジーンカセット配列又は他のパラミクソウイルス由来の配列を挿入することである。ＦＬｃＤＮＡプラスミドは、ｐ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉと称した。ＮＤＶゲノムの長さは、６ヌクレオチドの倍数でなければならない（６の法則）ため、様々な構築物のアンチゲノムｃＤＮＡが６の法則を順守するようにした。
【０１４７】
２つの転写カセットをＰ−Ｍ結合部に挿入するために、ＧＭ−ＣＳＦのＯＲＦの終点（ｎｔ３６１９）にＡｆｅＩ部位を導入した（図２Ｂ）。ＧＥ及びＧＳ配列を含むリン酸センス及びアンチセンスプライマーのペアを用いて、ＩＬ−２ＯＲＦを増幅してから、ＡｆｅＩ部位に挿入した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２転写カセットを含む、得られたプラスミドからのＳａｃＩＩ−ＰｍｌＩ断片をプラスミドｒ７３Ｔに戻して置換し、ｐ７３Ｔ−Ｐ２を取得した。
【０１４８】
他のパラミクソウイルスのエクトドメインを含むｒ７３Ｔキメラウイルスの作製
ＮＤＶのＦ及びＨＮをハトパラミクソウイルス１（ＰＰＭＶ−１）のそれらで置換することにより、キメラＮＤＶゲノムＤＮＡを作製した。ＮＤＶ７３ＴＦの細胞質尾部及び膜貫通部分のＣ末端コード配列（アミノ酸残基５０３〜５５３）をＰＰＭＶ−１のエクトドメインＦタンパク質コード配列（残基１〜５０２）と連結し、ＮＤＶ  ＨＮのＮ末端コード配列（アミノ酸配列残基１〜４５）を、ＧｅｎｅＡｒｔ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたオーバーラップＰＣＲ反応により、ＨＮ（残基４６〜５７７）と融合させた。増幅した断片を消化し、ＰｍｌＩ−ＡｇｅＩ消化ＮＤＶ  ｃＤＮＡにクローン化した。同様のクローン化戦略により、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ−５）Ｆ又はＨＮをＮＤＶ７３ＴアンチゲノムｃＤＮＡに導入した。ＰＩＶ５Ｆ（残基１〜４８６）エクトドメインをＮＤＶ７３ＴＦの膜貫通部分及び細胞質尾部（残基５０３〜５５３）と融合させた。ＮＤＶ  ＨＮ（残基１〜４５）をＰＩＶ５  ＨＮエクトドメイン（残基３６〜５６５）と連結させた。ｃＤＮＡ断片をＰｍｌＩ−ＡｇｅＩ消化ＮＤＶアンチゲノムｃＤＮＡにクローン化した。
【０１４９】
トランスフェクトｃＤＮＡプラスミドからの組換えＮＤＶの回収
ＢＨＫ−Ｔ７細胞などのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する哺乳動物細胞株を、ＮＤＶ  ＮＰ、Ｐ及びＬタンパク質を発現する３つのプラスミド（それぞれ、６ウェルディッシュのウェル当たり０．４μｇ、０．４μｇ、および０．２μｇ）並びにＮＤＶアンチゲノムｃＤＮＡをコード化するプラスミド（１．６μｇ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後に、細胞培養物上清を１０〜１１日齢のＳＰＦ孵化鶏卵の尿膜腔に注入するか、又はベロ細胞中で継代させて、レスキューされたウイルスを増幅した。ウイルスの回収は、１％ニワトリ赤血球（ＲＢＣ）を用いた血球凝集反応アッセイによって確認した。ウイルスのレスキューは、以前記載されているように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドと一緒に、ＮＰ、Ｐ、Ｌ、アンチゲノムｃＤＮＡプラスミドをベロ細胞にエレクトロポレーションすることによっても実施することができる（Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｏｎｌｙ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｒｉａｌｓ．２００８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５３：１９６−２０２）。回収したウイルスをＲＴ−ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡの配列決定により確認した。
【０１５０】
安定したＦタンパク質切断部位を有するウイルスを選択するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代  Ｆタンパク質切断部位（ＦＰＣＳ）が安定しているかどうか、並びに組織培養物中での継代後にいずれかの安定化突然変異を選択することができるかどうかを調べるために、ＭＯＩ：０．０１で、ベロ及びヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞においてｒ７３Ｔ−Ｓ１１６を連続的に１０回継代させた。２〜３継代毎に、ウイルスＲＮＡを培地から単離し、ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅して、Ｆ及び／又はＨＮ遺伝子を配列決定した。
【０１５１】
ベロ細胞におけるウイルスプラーク形態学及びプラークアッセイによる力価定量
６ウェルプレート上のベロ細胞を、階段希釈したウイルスに感染させた後、ウイルス力価定量用のトリプシン（ＴｒｐｙＬＥ（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でプラーク形態学のために、１％メチルセルロースオーバーレイの下、３７℃で３日又は６日にわたりインキュベートした。細胞単層をメタノールで固定し、全不活性化ＮＤＶウイルスに対してニワトリ抗ＮＤＶポリクローナル抗体で染色した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ニワトリ抗体（Ｄａｋｏ）に暴露した。
【０１５２】
鶏卵平均致死時間（ＭＤＴ）によるウイルスニワトリ病原性試験及び脳内病原性インデックス（ＩＣＰＩ）アッセイ
１０日齢ＳＰＦ孵化鶏卵における平均致死時間（ＭＤＴ）により、ｒ７３Ｔウイルスの病原性を決定した。１日齢ＳＰＦニワトリにおけるＩＣＰＩ試験は、ＵＳＤＡ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＶＳＬ，Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ）で実施した。ＭＤＴ試験のために、１０-6〜１０-9の１０倍希釈シリーズの０．１ｍｌを、希釈物当たり８〜１０個の９〜１０日齢鶏卵の尿膜腔に接種した後、３７℃でインキュベートした。７日間にわたって鶏卵を毎日２回検査し、胚致死時間を記録した。ＭＤＴは、ウイルスの最小致死用量が、全ての接種胚を死滅させるのにかかる平均時間（ｈｒ）として計算した。ＭＤＴアッセイは、ウイルスの病原性の妥当な予測を提供する。ＭＤＴ＜６０時間のウイルスは、通常短潜伏期性（ビルレント）株であり；ＭＤＴ＝６０〜９０時間のウイルスは、亜病原性（中間）株であり；＞９０時間は、長潜伏期性（非ビルレント）株である。ＩＣＰＩ試験のために、各ウイルスについて、新鮮な感染尿膜液の１：１０希釈物を０．０５ｍｌずつ、１０羽の１日齢のＳＰＦニワトリの群に脳内経路により接種した。８日間にわたり、８時間ごとに１回臨床的症状及び死亡についてニワトリを観察した。観察のたびに、ニワトリを次のようにスコア付けした：正常であれば、０、病的状態であれば、１、致死は２。ＩＣＰＩは、８日間にわたる観察毎の１羽当たりのスコアの平均値である。ＩＣＰＩ値は、０．０〜２．０の範囲である。低ビルレント（ＬｏＮＤ）：ＩＣＰＩ＜０．７；ビルレント（ｖＮＤ）：ＩＣＰＩ≧０．７。
【０１５３】
細胞生存性アッセイにより評価したウイルス細胞殺傷
細胞を５×１０3細胞／ウェルで９６ウェルプレートに塗布し、様々なＭＯＩでｒ７３Ｔに一晩感染させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、製造者のマニュアルに従って細胞生存性を決定した。各試験サンプルのＡＴＰレベルを、１００％生存の非処置サンプル対照と比較することにより、生存細胞の相対パーセントを決定した。表に示すデータは、死滅細胞の相対パーセントである。
【０１５４】
皮下ＨＴ１０８０異種移植モデルにおいて評価したＮＤＶ腫瘍殺傷の効果
無胸腺ＮＣＲ均質ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、５×１０6ＨＴ１０８０細胞（１００μＬのＰＢＳ中）を一方の脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）移植した。腫瘍が６５〜３００ｍｍ3の体積に達したら、ウイルス処置を開始した。１００μＬ中の組換え７３Ｔを様々な用量で、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により局所的に、又は尾静脈への腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射により全身に、のいずれかでそれぞれ投与した。対照マウスには、１００μＬのＰＢＳのみを注射した。デジタルノギスを用いて、腫瘍増殖を測定し、腫瘍体積を０．５×（高さ）×幅×長さ（ｍｍ3）として計算した。体重が元の体重の２０％減少するか、又は腫瘍体積が２０００ｍｍ3を超えたら、マウスを死なせた。
【０１５５】
ＨＴ１０８０異種移植マウスにおけるウイルス生体分布
ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫異種移植片皮下腫瘍を担持する９匹のヌードマウスに、１０8ｐｆｕのｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦをｉ．ｖで注射した。注射から１、４及び８日後に３匹のマウスを死なせた。ＰＢＳを注入した１匹のマウスは８日目に死なせた。腫瘍、肺、脾臓、卵巣及び血清サンプルを収集した。組織ホモジネートの感染性ウイルス力価をプラークアッセイにより定量した。
【０１５６】
ＥＬＩＳＡによるＧＭ−ＣＳＦタンパク質レベルの定量
ｇｅｎｔｌｅ  ＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、製造者の指示に従い、ＰＢＳにおけるＮＤＶ感染及びＰＢＳ注入マウスからの腫瘍を均質化した。マウスから収集した均質化組織又は血清の上清を、Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）により、ＧＭ−ＣＳＦのレベルについて試験した。
【０１５７】
統計的分析
統計的分析は全て、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアを用いて実施した。独立ｔ検定を用いて、群同士の腫瘍退縮の差を評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアは、正常及び腫瘍細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺傷についてｒＮＤＶ７３ＴのＩＣ５０を計算するのにも用いた。
【０１５８】
その他の実施形態
以上の説明から、様々な用途及び条件に合わせて、本明細書に記載した本発明に変更及び修正を加え得ることは明らかであろう。こうした実施形態も、以下に示す特許請求の範囲に含まれる。
【０１５９】
本明細書における変数の任意の定義において要素を列挙した記載は、列挙した要素のいずれか単一の要素又はそれらの組合せ（若しくは部分的組合せ）としてのその変数の定義を包含する。本明細書におけるある実施形態の記載は、任意の単一実施形態、又はいずれか他の実施形態若しくはその一部との組合せとしてのその実施形態を包含する。
【０１６０】
本明細書に挙げた全ての特許、刊行物、ＣＡＳ、及びアクセッション番号は、あたかも各々独立した特許、刊行物、及びアクセッション番号が、具体的かつ個別に、参照により組み込まれることが示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）由来のＦタンパク質切断部位（Ｓ１１６）を含む弱毒化ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）。
[項目２]
前記修飾Ｆタンパク質切断配列（ＦＰＣＳ）が、以下：
[化１]
2019193662.tif 000022
からなる群から選択される配列を含む、項目１に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目３]
前記弱毒化ウイルス株が、修飾７３Ｔ株である、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目４]
前記弱毒化ＮＤＶウイルスが、ｒ７３Ｔ−Ｒ１１６ウイルスである、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目５]
前記ウイルスが、増大したＨＮ−Ｌ遺伝子間領域を有する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目６]
前記ＨＮ−Ｌ遺伝子間領域が、少なくとも約５０〜３００アミノヌクレオチドの長さの非コード配列である、項目１〜５のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目７]
前記非コード配列が、パラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）又はランダム配列から得られる、項目６に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。[項目８]
前記ＨＮ及びＬ遺伝子間非コード配列が、６０、１０２、１４４、１９８又は３１８ｎｔの長さである、項目６に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目９]
前記ウイルスが、前記Ｐ−Ｍ結合部及び／又はＨＮ−Ｌ結合部に挿入された１つ又は複数の異種ポリヌクレオチド配列を有する、項目１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１０]
前記ウイルスが、２つ以上の異種ポリヌクレオチド配列を含み、ここで、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド配列が前記Ｐ−Ｍ結合部に挿入されると共に、少なくとも１つが前記ＨＮ−Ｌ結合部に挿入されている、項目９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１１]
前記異種ポリヌクレオチド配列が、前記ウイルスの腫瘍溶解性を増強するポリペプチドをコード化するトランスジーンである、項目９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１２]
前記トランスジーンが、サイトカイン、細胞表面リガンド、及び／又はケモカインをコード化する、項目１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１３]
前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１２ｐ７０からなる群から選択される、項目１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１４]
前記サイトカインが、ヒトＧＭ−ＣＳＦである、項目１３に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１５]
前記異種ポリヌクレオチド配列が、検出可能な部分をコード化するトランスジーンである、項目９に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１６]
前記検出可能な部分の発現レベルが、ウイルス複製と相関する、項目１５に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１７]
ＮＤＶのＦ及びＨＮ遺伝子が、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）の対応する細胞外ドメインによって置換される、項目１〜１６のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１８]
前記ウイルスが、７３Ｔ−Ｒ１１６ｉ−ｈＧＭ−ＣＳＦである、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目１９]
前記弱毒化ウイルスが、９０時間を超えるか、又は約９０〜１５６時間の鶏卵中平均致死時間（ＭＤＴ）を有する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２０]
前記弱毒化ウイルスが、約０〜０．７の脳内病原性インデックスを有する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２１]
前記弱毒化ウイルスが、約０の脳内病原性インデックスを有する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２２]
前記弱毒化ウイルスが、ＨＴ１０８０細胞において約１５％未満の細胞傷害性を有する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２３]
前記弱毒化ウイルスが、少なくとも１０又は１５％の殺傷効率で、腫瘍細胞を選択的に殺傷する、項目１又は２に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２４]
前記腫瘍細胞殺傷効率が、約７５％〜１００％である、項目２３に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目２５]
腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法であって、腫瘍細胞を項目１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
[項目２６]
被験者における腫瘍退縮を誘導する方法であって、腫瘍細胞を項目１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
[項目２７]
腫瘍細胞生存又は増殖を低減する方法であって、腫瘍細胞を項目１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスと接触させるステップを含む方法。
[項目２８]
前記細胞が、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、並びに黒色腫癌細胞からなる群から選択される癌細胞である、項目２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２９]
被験者における新生物を治療する方法であって、有効量の項目１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスを前記被験者に投与するステップを含む方法。[項目３０]
前記弱毒化ニューカッスル病ウイルスが、ｒ７３Ｔ−Ｓ１１６である、項目２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
[項目３１]
前記弱毒化ニューカッスル病ウイルスが、全身、腹腔内、又は腫瘍内に送達される、項目２６に記載の方法。
[項目３２]
前記ウイルスが、約１０7ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕの用量で投与される、項目２６に記載の方法。
[項目３３]
前記ウイルスが、約１０9ｐｆｕ〜約１０11ｐｆｕの用量で静脈内投与される、項目２６に記載の方法。
[項目３４]
前記被験者が、膀胱癌、卵巣癌、脳腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨、肝臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、腎臓癌、黒色腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、並びに黒色腫癌からなる群から選択される新生物を有する、項目２９に記載の方法。
[項目３５]
抗ＮＤＶ免疫応答を発生した被験者における新生物を治療する方法であって、有効量の項目１〜２２のいずれか一項に記載の弱毒化キメラニューカッスル病ウイルスを前記被験者に投与するステップを含み、前記ウイルスが、イヌパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）又はハトパラミクソウイルス１型（ＰＰＭＶ−１）のＦ及び／又はＨＮ遺伝子を含むキメラウイルスであり、前記キメラニューカッスル病ウイルスが、ＮＤＶとは抗原が異なる方法。
[項目３６]
前記方法が、抗ＮＤＶ免疫応答を発生しているが、キメラニューカッスル病ウイルスを受けていない対照被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルと比較して、前記被験者に存在する腫瘍溶解性ウイルスのレベルを増大させる、項目２９に記載の方法。
[項目３７]
７３Ｔの完全長ｃＤＮＡを含む核酸であって、前記核酸が、以下：
[化２]
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からなる群から選択される修飾Ｆタンパク質切断配列をコード化する核酸。
[項目３８]
７３Ｔの完全長ｃＤＮＡを含むベクターであって、前記ベクターが、以下：
[化３]
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からなる群から選択される修飾Ｆタンパク質切断配列をコード化するベクター。
[項目３９]
項目３７に記載の核酸を含む、ビルレント粒子。
[項目４０]
項目１〜２４のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルスに感染した宿主細胞。
[項目４１]
項目３７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
[項目４２]
前記ニューカッスル病ウイルス株が、７３Ｔである、項目１〜２４のいずれか一項に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
[項目４３]
前記トランスジーンが、表５に記載のトランスジーンから選択される、項目１０に記載の弱毒化ニューカッスル病ウイルス。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｅ】
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【図６Ｆ−６Ｇ】
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【図６Ｈ−６Ｉ】
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【図６Ｊ−６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ−５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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