(57)【要約】【課題】アミノ酸の定量に有用な手段および方法を提供すること。【解決手段】以下を含む、アミノ酸の定量方法：（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに（２）シグナルを検出すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、アミノ酸の定量方法：
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること。
【請求項２】
アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸またはグリシンであり、
ＡＴＰ依存性酵素が、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、およびグリシンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
請求項２記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
ＡＴＰ依存性酵素が、Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼである、
請求項１記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸が、Ｄ−アルギニン、Ｄ−システイン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン、Ｄ−リジン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−アラニンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するＤ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼである、
請求項４記載の方法。
【請求項６】
反応（ｉ）が、２０〜９０℃で行われる、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
シグナルが、蛍光シグナルまたは発光シグナルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
シグナルが、発光シグナルであり、反応（ｉｉ）が、ＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＡＴＰを基質とする発光酵素が、ルシフェラーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
１００ｍＭ以下のアミノ酸が分析される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
以下を含む、アミノ酸分析用キット：
（ａ）ＡＴＰ依存性酵素；
（ｂ）ＡＴＰ；ならびに
（ｃ）ＡＴＰを基質とする発光酵素およびその発光素基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中アミノ酸濃度は、健康状態の指標となり得ることが知られている（例えば、非特許文献１）。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ−ＭＳなどの機器を用いた方法、蛍光分析法（例えば、特許文献１）が知られている。
【０００３】
別のアミノ酸定量技術として、アミノ酸と作用する酵素を用いる方法が知られている（特許文献２〜４）。アミノ酸と作用する酵素としては、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）が挙げられる。ＡＡＲＳは、ほとんどすべての生物が保有している酵素であり、以下の反応式１および２に従ってタンパク質合成に関与する。それぞれ１９種類のＬ−アミノ酸またはグリシンを特異的に認識するＡＡＲＳが存在するので、個々のＬ−アミノ酸またはグリシンの選択的検出が可能であると考えられている。
【０００４】
【化１】
2019193633.tif 000002
【０００５】
特許文献１には、ヒスチジンを蛍光試薬と結合させて蛍光分析することによるヒスチジンの分析方法が記載されている。
【０００６】
特許文献２には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を定量することによるアミノ酸の定量方法が記載されている。特許文献２の方法では、上記反応式１で生成するアミノアシルＡＭＰ−ＡＡＲＳ複合体をアミン類（求核剤）の添加により分解させ、反応全体により得られる生成物を定量することにより、アミノ酸が定量される。アミノアシルＡＭＰ−ＡＡＲＳ複合体では、アミノアシルＡＭＰがＡＡＲＳに強く結合しているので、ｔＲＮＡもしくはアミン等の求核剤を加えて複合体を分解しない限り、反応式２は進行しないと考えられている。特許文献２の方法によるアミノ酸の定量範囲は５μＭ〜２００μＭであると考えられており、低濃度のアミノ酸を定量することができない。さらにこの方法では反応式１および２によって生成したピロリン酸を２段階の酵素反応によって検出しているため、煩雑であるとともに測定試料中の夾雑物やその他の外部要因による影響が懸念される。
【０００７】
特許文献３には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を定量することによるアミノ酸の定量方法が記載されている。特許文献３では、低濃度のアミノ酸を定量するために、ＡＡＲＳ反応系にヌクレオチドを添加してアミノアシルＡＭＰ−ＡＡＲＳ複合体を分解することで遊離したアミノ酸およびＡＡＲＳを再利用することによって高感度化したことを特徴としている。この方法のアミノ酸定量方法では、測定対象のアミノ酸の再利用によって、試料中に含まれているアミノ酸よりも多くのモル数の反応生成物が産生することによりアミノ酸量が増幅されるので、アミノ酸の検出には適用可能であるが、定量性の著しい低下が懸念される。そのため、アミノ酸濃度を正確に定量する必要がある場面においては使用が困難と考えられる。
【０００８】
特許文献４には、上記反応式１を含む、ＡＡＲＳを用いた反応経路により得られた反応生成物を検出することによるアミノ酸の検出方法が記載されている。
【０００９】
非特許文献１には、血漿アミノ酸プロファイルを健康状態の指標として用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００１−２４２１７４号公報
【特許文献２】特許第５３０５２０８号公報
【特許文献３】国際公開第２０１７／１７０４６９号
【特許文献４】国際公開第２００２／０１２８５５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｇｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来の方法では大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体を多段階で分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。また、従来の方法は、５μＭ未満の濃度のアミノ酸の正確な定量には困難であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＡＡＲＳ等のＡＴＰ依存性酵素をアミノ酸に作用させた触媒反応の際にアミノ酸量依存的に消費されるＡＴＰの量を測定することにより、アミノ酸を定量できること、および、ルシフェラーゼ等のＡＴＰ依存的に基質を発光性物質に変換する能力を有する変換酵素を用いることにより、ＡＴＰの量を触媒反応の生成物よりも高精度で測定できることを着想し、さらに、Ｄ−アミノ酸を基質とするＡＴＰ依存性酵素を用いることによりＤ−アミノ酸の定量も可能となることを着想し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、アミノ酸の定量方法：
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること。
〔２〕アミノ酸が、Ｌ−アミノ酸またはグリシンであり、
ＡＴＰ依存性酵素が、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
〔１〕の方法。
〔３〕アミノ酸が、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、およびグリシンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素である、
〔２〕の方法。
〔４〕アミノ酸が、Ｄ−アミノ酸であり、
ＡＴＰ依存性酵素が、Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼである、
〔１〕の方法。
〔５〕アミノ酸が、Ｄ−アルギニン、Ｄ−システイン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−バリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン、Ｄ−リジン、Ｄ−チロシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤ−アラニンからなる群から選ばれ、
ＡＴＰ依存性酵素が、前記アミノ酸に対応するＤ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼである、
〔４〕の方法。
〔６〕反応（ｉ）が、２０〜９０℃で行われる、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕シグナルが、蛍光シグナルまたは発光シグナルである、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕シグナルが、発光シグナルであり、反応（ｉｉ）が、ＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる、〔７〕の方法。
〔９〕ＡＴＰを基質とする発光酵素が、ルシフェラーゼである、〔８〕の方法。
〔１０〕１００ｍＭ以下のアミノ酸が分析される、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕以下を含む、アミノ酸分析用キット：
（ａ）ＡＴＰ依存性酵素；
（ｂ）ＡＴＰ；ならびに
（ｃ）ＡＴＰを基質とする発光酵素およびその発光素基質。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、従来法と比較してアミノ酸を迅速かつ高感度に測定することができる。本発明の方法はまた、Ｌ体のみならずＤ体アミノ酸を特異的に測定することができる。本発明の方法はさらに、種々のＤ体、Ｌ体アミノ酸を測定できるため汎用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、チロシルｔＲＮＡ合成酵素（ＴｙｒＲＳ）を用いた各濃度のＬ−チロシンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−チロシンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９９２３である。
【図２】図２は、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＩｌｅＲＳ）を用いた各濃度のＬ−イソロイシンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−イソロイシンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９９０９である。
【図３】図３は、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素（ＬｅｕＲＳ）を用いた各濃度のＬ−ロイシンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−ロイシンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９９３５である。
【図４】図４は、バリルｔＲＮＡ合成酵素（ＶａｌＲＳ）を用いた各濃度のＬ−バリンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−バリンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９９５０である。
【図５】図５は、リジルｔＲＮＡ合成酵素（ＬｙｓＲＳ）を用いた各濃度のＬ−リジンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−リジンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９８７７である。
【図６】図６は、Ｄ−Ａｌａ  ｌｉｇａｓｅを用いた各濃度のＤ−アラニンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＤ−アラニンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９８１５である。
【図７】図７は、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素（ＨｉｓＲＳ）を用いた各濃度のＬ−ヒスチジンに対する検量線を示す図である。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−ヒスチジンの最終濃度を示す（Ｎ＝３）。Ｒ２値は０．９９３４である。
【図８】図８は、各反応温度に対するＩｌｅＲＳの検量線を示す図である（Ｎ＝３）。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−イソロイシンの最終濃度を示す。３７、４５、５５、６５、７５℃での各検量線のＲ２値はそれぞれ０．９８２５、０．９９０２、０．８５１５、０．９９９７、０．９９５３である。
【図９】図９は、各反応温度に対するＶａｌＲＳの検量線を示す図である（Ｎ＝３）。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−バリンの最終濃度を示す。３７、４５、５５、６５、７５℃での各検量線のＲ２値はそれぞれ０．９８８７、０．９９２３、０．８９５８、０．９９９７、０．９９４４である。
【図１０】図１０は、各反応温度に対するＬｅｕＲＳの検量線を示す図である（Ｎ＝３）。縦軸は発光強度、横軸は反応系に混合した際のＬ−ロイシンの最終濃度を示す。３７、４５、５５、６５、７５℃での各検量線のＲ２値はそれぞれ０．９４３８、０．９１９１、０．９７４３、０．９９１０、０．９８０８である。
【図１１】図１１は、Ｌ−チロシンに対する活性を基準とした各アミノ酸（グリシンを除き、いずれもＬ−アミノ酸）に対するＴｙｒＲＳの相対活性を示す図である（Ｎ＝３）。縦軸は相対活性（％）、横軸は各アミノ酸を示す。
【図１２】図１２は、Ｌ−バリンに対する活性を基準とした各アミノ酸（グリシンを除き、いずれもＬ−アミノ酸）に対するＶａｌＲＳの相対活性を示す図である（Ｎ＝３）。縦軸は相対活性（％）、横軸は各アミノ酸を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、アミノ酸の定量方法を提供する。本発明の方法は、以下を含む：
（１）以下の反応（ｉ）および（ｉｉ）を行うこと：
（ｉ）アミノ酸およびＡＴＰをＡＴＰ依存性酵素に接触させて、アミノ酸量依存的にＡＴＰを消費させる反応；および
（ｉｉ）ＡＴＰ量依存的にシグナルを発生する反応；ならびに
（２）シグナルを検出すること。
【００１８】
本発明の方法で定量されるアミノ酸は、そのアミノ酸を基質とするＡＴＰ依存性酵素が存在するアミノ酸であればいずれでもよい。アミノ酸としては、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、およびγ−アミノ酸が挙げられる。α−アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。β−アミノ酸としては、例えば、β−アラニンが挙げられる。γ−アミノ酸としては、例えば、γ−アミノ酪酸が挙げられる。アミノ酸のアミノ基は、窒素原子が２個の水素原子と結合したアミノ基、窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基、および窒素原子が水素原子と結合していないアミノ基のいずれであってもよい。窒素原子が１個の水素原子と結合したアミノ基を含有するアミノ酸としては、例えば、サルコシン、Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−メチルタウリン、プロリンが挙げられる。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明の方法で定量されるアミノ酸の量は、本発明の方法で検出することができる限り特に限定されないが、反応（ｉ）におけるアミノ酸の濃度として、例えば１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００μＭ以下、なおさらにより好ましくは１０μＭ以下、特に好ましくは５μＭ未満、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、または１μＭ以下であってもよい。また、このようなアミノ酸の濃度としては、例えば１ｎＭ以上、好ましくは２ｎＭ以上、より好ましくは２．５ｎＭ以上、さらにより好ましくは３ｎＭ以上、なおさらにより好ましくは４ｎＭ以上、特に好ましくは、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、または１０００ｎＭ以上であってもよい。より具体的には、このようなアミノ酸の濃度としては、例えば、１ｎＭ〜１００ｍＭ、好ましくは２ｎＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは２．５ｎＭ〜１ｍＭ、さらにより好ましくは３ｎＭ〜１００μＭ、なおさらにより好ましくは４ｎＭ〜１０μＭ、特に好ましくは５ｎＭ〜４μＭ、１０ｎＭ〜３μＭ、または１００ｎＭ〜２μＭであってもよい。
【００２０】
反応（ｉ）は、ＡＴＰ依存性酵素の触媒作用により、定量されるアミノ酸がＡＴＰ依存的に変換される反応である。逆の視点では、反応（ｉ）では、ＡＴＰ依存性酵素の触媒作用により、ＡＴＰが、定量されるアミノ酸の量に依存的に消費される。ＡＴＰ消費量はアミノ酸量の指標となり、後述する反応（ｉｉ）を利用して検出することができる。
【００２１】
反応（ｉ）では、例えば上記反応式１のように、アミノアシルＡＭＰと酵素の複合体が形成する場合が考えられる。しかし、本発明は、ＡＴＰの消費量を指標としてアミノ酸を定量することを特徴とするので、複合体を分解させる工程がなくても、アミノ酸を定量することができる。
【００２２】
本発明の方法で用いられるＡＴＰ依存性酵素は、定量されるアミノ酸をＡＴＰ依存的に変換する酵素であればよく、アミノ酸の種類に応じて公知のものから適宜選択することができる。定量されるアミノ酸がＬ−アミノ酸またはグリシンである場合は、ＡＴＰ依存性酵素として、例えば、そのアミノ酸を基質とするアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）を用いることができる。定量されるアミノ酸がＤ−アミノ酸である場合は、ＡＴＰ依存性酵素として、例えば、そのアミノ酸を基質とするＤ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼを用いることができる。
【００２３】
Ｌ−アミノ酸またはグリシンに対応するＡＡＲＳは、公知のものから適宜選択することができる。ＡＡＲＳは、タンパク質合成に関与する、生物に必須の酵素である。したがって、ＡＡＲＳは、微生物（例、好熱菌）、植物、魚類、動物（例、哺乳動物）、または昆虫等の任意の生物に広く見出されるため、これらの生物由来の天然酵素を利用することができる。また、ＡＡＲＳとしては、変異体を利用してもよい。このような変異体としては、ＡＡＲＳ活性を維持する限り、１以上のアミノ酸残基が修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）されていてもよい。例えば、変異体は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）が付加されていてもよい。このような他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）が挙げられる。
【００２４】
ＡＡＲＳとしては、上述したような種々のＡＡＲＳを用いることができるが、好ましくは、好熱菌由来ＡＡＲＳまたはその変異体を用いてもよい。好熱菌由来ＡＡＲＳとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属（例、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＡＡＲＳまたはその変異体が挙げられる。より具体的には、以下の表１に示される好熱菌由来ＡＡＲＳまたはその変異体を用いてもよい。
【００２５】
ＡＡＲＳは、構造および機能に基づいて、２つのクラス（クラスＩおよびＩＩ）さらに６つのサブクラス（クラスＩａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩｃ）に分類することができる（日本結晶学会誌４８、３２７−３３６（２００６））。ＡＡＲＳのクラスおよびサブクラスの分類を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2019193633.tif 000003
【００２７】
Ｄ−アミノ酸に対応するＤ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼは、公知のものから適宜選択することができる。Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼは、微生物の細胞壁の合成に関与する必須の酵素である。したがって、Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼは、様々な微生物（例、好熱菌）に広く見出されるため、微生物由来の天然酵素を利用することができる。また、ＡＡＲＳとしては、変異体を利用してもよい。このような変異体としては、Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼ活性を維持する限り、１以上のアミノ酸残基が修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）されていてもよい。例えば、変異体は、Ｃ末端またはＮ末端に、上述したような他のペプチド成分（例、タグ部分）が付加されていてもよい。
【００２８】
Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼとしては、上述したような種々のＤ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼを用いることができるが、好ましくは、好熱菌由来Ｄ−アミノ酸リガーゼもしくはＤ−アミノ酸キナーゼまたはそれらの変異体を用いてもよい。好熱菌由来Ｄ−アミノ酸リガーゼまたはＤ−アミノ酸キナーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属（例、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属（例、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＤ−アミノ酸リガーゼもしくはＤ−アミノ酸キナーゼまたはその変異体が挙げられる。より具体的には、以下の表２に示される好熱菌由来Ｄ−アミノ酸リガーゼもしくはＤ−アミノ酸キナーゼまたはその変異体を用いてもよい。
【００２９】
【表２】
2019193633.tif 000004
【００３０】
ＡＴＰ依存性酵素は、同酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。ＡＴＰ依存性酵素を発現する形質転換体は、例えば、同酵素の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。
【００３１】
ＡＴＰ依存性酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
【００３２】
ＡＴＰ依存性酵素を回収するには、以下の方法などがある。ＡＴＰ依存性酵素は、本発明の形質転換体を培養し、回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、ＡＴＰ依存性酵素を得ることができる。ＡＴＰ依存性酵素は、精製タンパク質が好ましい。
【００３３】
反応（ｉ）におけるＡＴＰ依存性酵素の濃度は、本発明の方法でアミノ酸を定量することができる限り特に限定されず、反応系に含まれるアミノ酸が十分に変換される濃度が好ましい。このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば０．００１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ以上であってもよい。また、このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば１０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。より具体的には、このようなＡＴＰ依存性酵素の濃度としては、例えば０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００３４】
反応（ｉ）におけるＡＴＰの濃度は、本発明の方法でアミノ酸を定量することができる限り特に限定されない。このようなＡＴＰの濃度は、反応系に含まれるアミノ酸が十分に変換されるために、反応系に含まれるアミノ酸のモル数に対して過剰量であることが好ましい。また、このようなＡＴＰの濃度は、反応（ｉ）におけるＡＴＰの変化量が検出可能となる程度であることが好ましい。このようなＡＴＰの濃度としては、例えば０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらにより好ましくは１μＭ以上、なおさらにより好ましくは５μＭ以上であってもよい。また、このようなＡＴＰの濃度としては、例えば１００００μＭ以下、好ましくは５０００μＭ以下、より好ましくは１０００μＭ以下、さらにより好ましくは５００μＭ以下、なおさらにより好ましくは２００μＭ以下であってもよい。より具体的には、このようなＡＴＰの濃度としては、例えば０．００１〜１００００μＭ、好ましくは０．０１〜５０００μＭ、より好ましくは０．１〜１０００μＭ、さらにより好ましくは１〜５００μＭ、なおさらにより好ましくは５〜２００μＭであってもよい。
【００３５】
反応（ｉ）を行う反応系としては、水溶液が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｇｌｙ―ＫＣｌ―ＫＯＨ緩衝液が挙げられる。ｐＨは、例えば２〜１２、好ましくは４〜１２、より好ましくは５〜１１であってもよい。
【００３６】
ＡＴＰ依存性酵素が補因子要求性である場合、反応（ｉ）を行う反応系は、ＡＴＰ依存性酵素の補因子を含んでいてもよい。ＡＡＲＳおよびＤ−アミノ酸リガーゼもしくはＤ−アミノ酸キナーゼは、補因子としてマグネシウムイオン要求性である場合が多いので、ＡＴＰ依存性酵素がＡＡＲＳまたはＤ−アミノ酸リガーゼもしくはＤ−アミノ酸キナーゼである場合、反応（ｉ）を行う反応系は、マグネシウムイオン供給源（例、塩化マグネシウム）を含んでいてもよい。反応（ｉ）におけるマグネシウムイオン供給源の濃度は、ＡＴＰ依存性酵素が十分に活性化する限り特に限定されないが、例えば１μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらにより好ましくは１０００μＭ以上であってもよい。また、このようなマグネシウムイオン供給源の濃度としては、例えば１００ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１０ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、このようなマグネシウムイオン供給源の濃度としては、例えば１μＭ〜１００ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１００μＭ〜２０ｍＭ、さらにより好ましくは１０００μＭ〜１０ｍＭであってもよい。
【００３７】
反応（ｉ）を行う反応系は、ＡＴＰ依存性酵素による反応を促進するために求核剤を含んでいてもよい。求核剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、メチルアミン等のアミン類が挙げられる。反応（ｉ）における求核剤の濃度は、ＡＴＰ依存性酵素が十分に活性化する限り特に限定されないが、例えば１μＭ以上、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上、さらにより好ましくは１０００μＭ以上であってもよい。また、このような求核剤の濃度としては、例えば５０００ｍＭ以下、好ましくは２０００ｍＭ以下、より好ましくは１０００ｍＭ以下、さらにより好ましくは５００ｍＭ以下であってもよい。より具体的には、このような求核剤の濃度としては、例えば１μＭ〜５０００ｍＭ、好ましくは１０μＭ〜２０００ｍＭ、より好ましくは１００μＭ〜１０００ｍＭ、さらにより好ましくは１０００μＭ〜５００ｍＭであってもよい。
【００３８】
反応（ｉ）は、ＡＴＰ依存性酵素による反応が進行し、反応系に含まれる各成分が変質せず、かつ反応系が凍結または蒸発しない限りにおいていずれの温度で行ってもよい。高温ではＡＴＰ依存性酵素の反応性が高いこと、および、検量線の直線性が良好になる傾向となることにより、反応（ｉ）は、高温で行うことが好ましい。反応（ｉ）は、例えば２０℃以上、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上、さらにより好ましくは５０℃以上、なおさらにより好ましくは５５℃以上で行ってもよい。また、反応（ｉ）は、例えば９０℃以下、好ましくは８５℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらにより好ましくは７７℃以下、なおさらにより好ましくは７５℃以下で行ってもよい。より具体的には、反応（ｉ）は、例えば２０〜９０℃、好ましくは３０〜８５℃、より好ましくは４０〜８０℃、さらにより好ましくは５０〜７７℃、なおさらにより好ましくは５５〜７５℃で行ってもよい。
【００３９】
反応（ｉｉ）で発生するシグナルは、ＡＴＰ量を反映するパラメータを有し、そのパラメータを評価することによりＡＴＰ量を測定することができるシグナルである限り特に限定されない。反応（ｉｉ）で発生するシグナルとしては、例えば、発光シグナルおよび蛍光シグナルが挙げられる。発光シグナルおよび蛍光シグナルにおいて、ＡＴＰ量を反映するパラメータとしては、例えば、発光量（例、相対発光量；ＲＬＵ）、蛍光波長（例、相対蛍光量；ＲＦＵ）が挙げられる。
【００４０】
反応（ｉｉ）で発生するシグナルが発光シグナルまたは蛍光シグナルである場合、反応（ｉｉ）は、ＡＴＰ量依存的に化学発光または生物発光を引き起こす反応であってもよい。ＡＴＰ量依存的に化学発光または生物発光を引き起こす反応としては、例えば、ＡＴＰを基質とする発光酵素、蛍光プローブ、蛍光標識ヌクレオチド、蛍光タンパク質、または会合誘起発光化合物を用いた反応が挙げられる。反応（ｉｉ）は、ＡＴＰを基質とする発光酵素により行われることが好ましい。
【００４１】
ＡＴＰを基質とする発光酵素とは、ＡＴＰを補酵素として、発光素基質を発光性物質に変換する反応を触媒する酵素をいう。変換酵素としては、例えば、ルシフェラーゼが挙げられる。発光素基質とは、ＡＴＰを基質とする発光酵素の触媒作用により発光性物質に変換される基質をいう。発光素基質としては、例えば、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンが挙げられる。
【００４２】
ＡＴＰを基質とする発光酵素の反応機構として、例えば、ルシフェラーゼは、ＡＴＰ量依存的にルシフェリンを発光性物質であるオキシルシフェリンに変換する反応を触媒する。
【００４３】
反応（ｉｉ）がＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる場合、反応（ｉｉ）は、変換酵素の触媒作用により、反応（ｉ）での残存ＡＴＰ量依存的に基質が発光性物質に変換される反応である。例えば、ルシフェラーゼが触媒する反応は、残存ＡＴＰ量依存的にルシフェリンを発光性物質であるオキシルシフェリンに変換する反応である。この反応機構により、発光性物質の生成量を、反応（ｉ）でのＡＴＰ消費量（残存ＡＴＰ量と表裏一体となる値）の指標とすることができ、結果として、アミノ酸量の指標とすることができる。
【００４４】
反応（ｉｉ）は、変換酵素の一般的な反応条件下で行ってもよい。
【００４５】
反応（ｉ）および（ｉｉ）は、共役して行ってもよく、逐次行ってもよい。反応（ｉ）および（ｉｉ）を共役して行う場合、反応（ｉ）および（ｉｉ）は、これらの反応に必要な構成要素が混合された単一の反応系で行ってもよい。
【００４６】
（２）では、反応（ｉｉ）で発生したシグナルが検出される。シグナルの検出において、ＡＴＰ量を反映するパラメータを評価され、評価されたパラメータに基づいてＡＴＰ量が測定される。例えば、反応（ｉｉ）がＡＴＰを基質とする発光酵素により行われる場合、ＡＴＰに依存して生成された発光性物質の量が、発光シグナルとして検出される。発光シグナルは、例えば、発光量（例、相対発光量；ＲＬＵ）、蛍光波長（例、相対蛍光量；ＲＦＵ）として検出される。検出された発光シグナルは、アミノ酸量の指標となる。
【００４７】
シグナルが蛍光シグナルまたは発光シグナルである場合、シグナルの検出は、例えば、光検出装置（例、ルミノメーター、フォトセンサー、プレートリーダー）を用いて行うことができる。
【００４８】
本発明の方法で定量されるアミノ酸は、被検試料に含まれる。被検試料は、アミノ酸を含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙）、食品（例、栄養ドリンク、アミノ酸飲料）、培養液（例、菌体、細胞）が挙げられる。被検試料中のアミノ酸は、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。本発明の方法は、アミノ酸標準試料を用いて作成された検量線を用いて行ってもよい。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、以下を含む、アミノ酸分析用キットを提供する：
（ａ）ＡＴＰ依存性酵素；
（ｂ）ＡＴＰ；ならびに
（ｃ）ＡＴＰを基質とする発光酵素およびその発光素基質。
【００５０】
本発明のキットは、ＡＴＰ依存性酵素による触媒反応を進行させるために、緩衝液、金属イオン、および求核剤の少なくとも一つをさらに含むことができる。緩衝液、ＡＴＰ依存性酵素の補因子、および求核剤の種類および濃度の例としては、上述したものが挙げられる。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕各酵素の発現用プラスミドの構築
大腸菌を用いた各酵素の組換え発現系を構築した。ここではＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ＴｙｒＲＳの組換え発現用プラスミドの構築法を示す。ｐＥＴ−２８ａの相補配列として５’末端にＤＮＡ（ＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧ）および３’末端にＤＮＡ（ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴ）を付加したＴｙｒＲＳ（配列番号１）の遺伝子断片を化学合成にて作成した。ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）およびＢａｍＨＩ（タカラバイオ株式会社）にて制限酵素消化したｐＥＴ−２８ａベクター（Ｍｅｒｃｋ社）をＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物とＴｙｒＲＳの遺伝子断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＣ社）を用いてライゲーションし、ライゲーション産物による大腸菌ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ−１０  Ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、ＤＮＡ配列を解析することで、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。
【００５３】
目的遺伝子が挿入されたプラスミドを、以後、ｐＥＴ−２８ａ−ＴｙｒＲＳと呼び、ｐＥＴ−２８ａ−ＴｙｒＲＳによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ−２８ａ−ＴｙｒＲＳ−ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。表３に示す他の酵素も上記の方法に従ってプラスミドを構築した。
【００５４】
【表３】
2019193633.tif 000005
【００５５】
〔実施例２〕各酵素の調製
ＴｙｒＲＳの調製は、下記のようにして行った。まず、実施例１で取得したｐＥＴ−２８ａ−ＴｙｒＲＳ−ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地５０ｍＬを２５０ｍＬ容量のフラスコに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩培養した。２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ液体培地２Ｌに上記培養液２０ｍＬを添加し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。２５℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍＬチューブに集菌した。
【００５６】
破砕用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ、久保田商事株式会社）を用いて破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで３０分間遠心し上清を回収した後、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて精製を行った。精製において、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）、および溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を使用した。溶出画分を回収し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＨｉ  ｐｒｅｐ  ２６／１０  ｄｅｓａｌｔｉｎｇを用いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶液交換した。その後、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０ＳとＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ６ｍＬを用いて陰イオン交換カラムによる精製を４℃にて実施した。平衡化にはＡバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、および溶出にはＢバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いてＮａＣｌ濃度グラジエントで溶出を行った。ＬｙｓＲＳは上記の精製方法に従って調製した。
【００５７】
他の酵素（ＩｌｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＶａｌＲＳ、Ｄ−Ａｌａ  ｌｉｇａｓｅ）も上記の方法に従って調製したが、各バッファーとして、破砕用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）、Ａバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）およびＢバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ）を使用した。
【００５８】
〔実施例３〕活性の評価
実施例２で調製した各酵素の活性の評価は下記手順にて行った。ここではＴｙｒＲＳの活性評価法を示す。ＴｙｒＲＳを２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＴｙｒＲＳに対して１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１０μＬ、７５０μＭ  ＡＴＰを１μＬ、１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２を０．５μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を１０μＬ、超純水４８．５μＬ、表４に示す各濃度のチロシン溶液１０μＬを加え混合した反応溶液を６５℃、１５分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む基質溶液（ＡＴＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレート（コーニング社）に５０μＬ分注し、プレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  ＬＵＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＣ社）にて発光強度を測定した。図１にＴｙｒＲＳを用いた各濃度のＬ−チロシン溶液に対する検量線を示す（Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表４に示す。
【００５９】
他の酵素（ＩｌｅＲＳ、ＬｅｕＲＳ、ＶａｌＲＳ、ＬｙｓＲＳ、Ｄ−Ａｌａ  ｌｉｇａｓｅ、ＨｉｓＲＳ）も活性評価を行った。各酵素を５．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、上述した組成に基づいて反応溶液を調製し、反応および発光強度の検出を行った。図２にＩｌｅＲＳを用いたＬ−イソロイシン溶液に対する検量線、図３にＬｅｕＲＳを用いたＬ−ロイシン溶液に対する検量線、図４にＶａｌＲＳを用いたＬ−バリン溶液に対する検量線、図５にＬｙｓＲＳを用いたＬ−リジン溶液に対する検量線、図６にＤ−Ａｌａ  ｌｉｇａｓｅを用いたＤ−アラニンに対する検量線、図７にＨｉｓＲＳを用いたＬ−ヒスチジン溶液に対する検量線を示す（いずれも、Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表４に示す。
【００６０】
【表４】
2019193633.tif 000006
【００６１】
実施例で用いた酵素はいずれも、検量線において良好な線形を示した。この結果は、本発明の方法が、Ｌ体およびＤ体を含めたアミノ酸の高精度な定量に適していることを示す。また、この結果は、１００ｎＭ〜５μＭのような比較的低濃度のアミノ酸についても正確な定量ができることを示す。
【００６２】
〔実施例４〕反応温度の評価
実施例２で調製した酵素の反応温度の評価は下記手順にて行った。ここではＩｌｅＲＳについて記載する。ＩｌｅＲＳを５．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＩｌｅＲＳに対して２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１０μＬ、１０ｍＭ  ＡＴＰを１μＬ、１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２を０．５μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を１０μＬ、超純水４８．５μＬ、表５に示す各濃度のＬ−イソロイシン溶液１０μＬを加え混合した反応溶液を３７、４５、５５、６５、７５℃で、１５分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼ溶液を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレートに５０μＬ分注し、発光強度を測定した。図８にＩｌｅＲＳの各温度における検量線を示す（Ｎ＝３）。上記の方法に従って作成したＶａｌＲＳおよびＬｅｕＲＳの各温度における検量線を図９および１０に示す（いずれも、Ｎ＝３）。検量線のＲ２値を表５に示す。
【００６３】
【表５】
2019193633.tif 000007
【００６４】
実施例で用いた酵素は、いずれの反応温度においても検量線において良好な線形を示した。この結果は、本発明の方法が、２０〜９０℃の反応温度での高精度なアミノ酸の定量に適していることを示す。
【００６５】
〔実施例５〕基質特異性の評価
実施例２で調製した酵素の基質特異性の評価は下記手順にて行った。ここではＴｙｒＲＳについて記載する。ＴｙｒＲＳを２．０ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、２０μＬのＴｙｒＲＳに対して０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を１００μＬ、２０００μＭ  ＡＴＰを２μＬ、１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２を１μＬ、２．０Ｍヒドロキシルアミン溶液、ｐＨ７．５を２０μＬ、超純水３７μＬ、１５０μＭの各アミノ酸溶液（グリシンを除き、いずれもＬ−アミノ酸）またはブランク２０μＬを加え混合した反応溶液を３７℃、６０分間インキュベートした。この溶液９０μＬに対して界面活性剤（ＡＴＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、アブカム社）を４５μＬ添加し、５分インキュベート後、ルシフェラーゼ溶液を４５μＬ添加し、５分インキュベートした。Ｎ＝３となるように３８４ウェルプレートに５０μＬ分注し、発光強度を測定した。各アミノ酸溶液において、ブランクに対する発光強度の減少量を活性の指標とした。Ｌ−チロシンに対する活性を基準とした各アミノ酸に対するＴｙｒＲＳの相対活性を図１１に示す（Ｎ＝３）。上記の方法に従ってＶａｌＲＳの基質特異性を評価した結果を図１２に示す（Ｎ＝３）。
【００６６】
実施例で用いた酵素はいずれも、極めて高い基質特異性を示した。この結果は、本発明の方法が、特異性の高いアミノ酸の分析に適していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の方法は、例えば、生体研究、健康栄養、医療、食品製造など広範な分野において応用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＴｙｒＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＩｌｅＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＬｅｕＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＶａｌＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＬｙｓＲＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｄ−Ａｌａ  ｌｉｇａｓｅのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＨｉｓＲＳのアミノ酸配列を示す。
【図１】
2019193633.tif 000008
【図２】
2019193633.tif 000009
【図３】
2019193633.tif 000010
【図４】
2019193633.tif 000011
【図５】
2019193633.tif 000012
【図６】
2019193633.tif 000013
【図７】
2019193633.tif 000014
【図８】
2019193633.tif 000015
【図９】
2019193633.tif 000016
【図１０】
2019193633.tif 000017
【図１１】
2019193633.tif 000018
【図１２】
2019193633.tif 000019
【配列表】
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