(57)【要約】【課題】植物由来の成分を含み安全でかつ効果の優れているエラスターゼ活性阻害剤を提供する。【解決手段】有効成分として、（ａ）ブドウ果実の抽出物及び（ｂ）式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンを含むエラスターゼ活性阻害剤：2019116446.tif 000010（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基を表す）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、（ａ）ブドウ果実の抽出物及び（ｂ）式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンを含むエラスターゼ活性阻害剤：
【化１】
2019116446.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基を表す）。
【請求項２】
（ａ）ブドウ果実が、種子を含むブドウ果実である請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
（ａ）ブドウ果実の抽出物が、水又は親水性有機溶媒の抽出物である請求項１又は２に記載の阻害剤。
【請求項４】
（ｂ）式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンが、３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン、５，６，７，８，３’，４’−へキサメトキシフラボン及び５，６，７，８，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項５】
（ａ）と（ｂ）の質量比（ａ）：（ｂ）が、５：１〜１：５である請求項１〜４のいずれか１項に記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてブドウ果実の抽出物とポリメトキシフラボンを含むエラスターゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のしわやたるみは皮膚の弾力低下が原因で形成され、その要因としては加齢、乾燥、酸化、紫外線などの影響が関与していると考えられている。具体的には真皮中のエラスチン、コラーゲン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス成分の質や量の変化があげられ、特にエラスチンの変化が重要であることが明らかとなっている。エラスチン線維は伸縮性に富み、皮膚に適度な柔軟性を与えているが、加齢や紫外線によりエラスチンの分解酵素であるエラスターゼが過剰に発現することで、エラスチンが分解されその量が減少し、皮膚の弾力性低下、たるみ及びしわを引き起こすと考えられている。そのため、エラスターゼ活性を阻害することは、皮膚の弾力性低下、しわ及びたるみを予防することができると考えられている。
【０００３】
エラスターゼ活性阻害剤としては、植物由来成分についてよく検討されており、例えばブドウに由来する成分としては、ブドウの皮から得られたレスベラトロール（特許文献１）、ブドウ種子抽出物（特許文献２）、アカブドウ葉抽出物（特許文献３）にエラスターゼ活性阻害効果があることが報告されている。
【０００４】
しかしながら、エラスターゼ活性阻害剤の効果としては未だ満足の得られているものは得られておらず、安全でかつ効果の優れているエラスターゼ活性阻害剤が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−０８８１２３号公報
【特許文献２】特開２００３−００２８２０号公報
【特許文献３】特開平２０１０−１２０５８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、植物由来の成分を含み安全でかつ効果の優れているエラスターゼ活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ブドウ果実の抽出物とポリメトキシフラボンとを組み合わせることでエラスターゼ活性阻害効果が相乗的に高まることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は以下の態様を含む。
［１］有効成分として、（ａ）ブドウ果実の抽出物及び（ｂ）式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンを含むエラスターゼ活性阻害剤：
【０００９】
【化１】
2019116446.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基を表す）。
［２］（ａ）ブドウ果実が、種子を含むブドウ果実である［１］に記載の阻害剤。
［３］（ａ）ブドウ果実の抽出物が、水又は親水性有機溶媒の抽出物である［１］又は［２］記載の阻害剤。
［４］（ｂ）式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンが、３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン、５，６，７，８，３’，４’−へキサメトキシフラボン及び５，６，７，８，４’−ペンタメトキシフラボンからなる群から選択される少なくとも１種である［１］〜［３］のいずれかに記載の阻害剤。
［５］（ａ）と（ｂ）の質量比（ａ）：（ｂ）が、５：１〜１：５である［１］〜［４］のいずれかに記載の阻害剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は、エラスチンの分解を抑制するので、皮膚の老化現象である、たるみやしわの予防・改善に使用することができる。
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は植物由来であるため、安全に長期間使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、（ａ）ブドウ果実の抽出物及び（ｂ）下記式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンを有効成分として含有するエラスターゼ活性阻害剤に関する。
【００１３】
【化２】
2019116446.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基を表す。）
【００１５】
（ａ）ブドウ果実の抽出物
本発明で用いられるブドウは、ブドウ科ブドウ属であり、ヨーロッパ系ブドウ（Ｖｉｔｉｓ Ｖｉｎｉｆｅｒａ）又はアメリカ系ブドウ（Ｖｉｔｉｓ Ｌａｂｒｕｓｃａ）などが挙げられる。なかでも優れたエラスターゼ活性阻害効果を有するという観点から、果実に種子を含むブドウが好ましく、例えば、ナイアガラ、巨峰、紅富士、紅伊豆、ロザリオ・ビアンコ、ロザリオ・ロッソ等の品種が挙げられる。
【００１６】
本発明の有効成分であるブドウ果実の抽出物は、果実から抽出した抽出物であるが、果実からジュースを搾った後の果実残渣（果実の果肉線維、果皮及び種子）から抽出した抽出物が好ましい。またブドウは、生、乾燥、冷凍ブドウを使用することができるが、保存の観点から乾燥ブドウが好ましい。
【００１７】
抽出に用いられる溶媒は、極性溶媒であり、例えば水及び親水性有機溶媒が挙げられる。
親水性有機溶媒としては、ヘキサン、ベンゼン等の炭化水素類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素類、低級アルコール、多価アルコール等のアルコール類などが挙げられる。中でも抽出効率の観点から、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコールが好ましく、水、エタノール、１，３−ブチレングリコールがより好ましい。
本発明においては、前記抽出溶媒は１種を選択して単独で用いてもよく、又は２種以上を併用してもよい。
【００１８】
溶媒での抽出処理は、ブドウ果実残渣１００重量部に対して、例えば抽出溶媒が水である場合には、通常１００〜２０００重量部、好ましくは２００〜１０００重量部で抽出することができる。同様に、抽出溶媒が低級アルコールの場合、通常１００〜５０００重量部、好ましくは５００〜２０００重量部で抽出することができる。
【００１９】
抽出温度は、使用する抽出溶媒の種類に応じて適宜決定される。例えば抽出溶媒が水である場合には、抽出温度は通常２０℃〜１２０℃程度であり、抽出溶媒が低級アルコールの場合、通常３０℃〜８０℃程度である。
【００２０】
抽出方法としては、ブドウの種子を含む果実残渣に抽出溶媒を加えて浸漬した後、ろ過することで抽出物を得ることができる。抽出溶媒に浸漬して撹拌等を行ってもよい。
【００２１】
抽出時間（浸漬時間）は、抽出効率の観点から、通常１時間以上であり、３時間以上が好ましく５時間以上がより好ましい。抽出時間の上限は、抽出効率の観点から、通常１０時間以下であり、８時間以下が好ましい。
【００２２】
抽出する回数は特に限定されないが、前記量の水又は親水性有機溶媒によって、１回抽出することが好ましい。
【００２３】
得られた抽出物は、そのまま用いてもよく、あるいは溶媒留去により濃縮し、必要に応じて、カラムクロマトグラフィーや溶媒分画等の処理により精製し、又は乾燥等を行って用いてもよい。なお、取り扱いの観点から、水、アルコール等の溶剤に溶解させても良い。前記希釈溶媒は１種を選択して単独で用いてもよく、又は２種以上を併用してもよい。
【００２４】
（ｂ）ポリメトキシフラボン
本発明で用いられる（ｂ）成分は式［Ｉ］で表されるポリメトキシフラボンである。式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ独立して水素原子又はメトキシ基を表す。
【００２５】
本発明の（ｂ）成分としては、以下の式［ＩＩ］〜式［IＶ］で示される３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン（ヘプタメトキシフラボン）、５，６，７，８，３’，４’−へキサメトキシフラボン（ノビレチン）、５，６，７，８，４’−ペンタメトキシフラボン（タンゲレチン）からなる群から選択される少なくとも１種のポリメトキシフラボンが好ましい。
【００２６】
【化３】
2019116446.tif 000004
【００２７】
【化４】
2019116446.tif 000005
【００２８】
【化５】
2019116446.tif 000006
【００２９】
式［ＩＩ］、式［ＩＩＩ］及び［ＩＶ］で表されるポリメトキシフラボンは、各種合成法によって得ることができ、植物から天然物として溶媒抽出することによっても得ることができる。
【００３０】
（ｂ）成分を植物から溶媒抽出にて得る方法としては、例えば、ミカン科ミカン属植物の果皮から抽出する方法が挙げられる。
ミカン科ミカン属植物として、例えば、ウンシュウミカン、シークワーサー、ポンカン、ハッサク、レモン、タチバナ、ユズ、スダチ、ザボン、タンジェリン、オレンジ、グレープフルーツなどが挙げられ、これらには、ポリメトキシフラボンが含有されている（Journal of Medicinal Plant Research Vol. ４６, １６２−１６６, （１９８２））。前記溶媒抽出に用いる植物としては、ポリメトキシフラボンの含有量の観点から、ウンシュウミカン、シークワーサー、タチバナ、ユズ、スダチ及びオレンジが好ましく、シークワーサー、オレンジ及びタチバナがより好ましい。
【００３１】
ポリメトキシフラボンの単離精製は、これらのミカン科ミカン属植物の果皮を溶剤で抽出し、抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分離することにより行なうことができる。以下、具体的に説明する。
【００３２】
まず、ミカン属植物の果皮を、溶媒を用いて抽出する。かかる溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の水溶性アルコール；アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム等の溶媒；もしくはそれらの混合溶媒が挙げられる。好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール及び酢酸エチルからなる群から選択される１種又は２種以上の溶媒である。より好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール及び酢酸エチルからなる群から選択される１種又は２種以上の溶媒である。
【００３３】
抽出に使用する溶媒の量は、ミカン属植物の果皮（乾燥物）に対して１〜１０倍質量、好ましくは２〜６倍質量である。抽出時の温度は、通常、室温（１〜３０℃）であり、好ましくは常温（１５〜２５℃）である。抽出期間は、例えば、１〜３０日間、好ましくは５〜２０日間である。
次に、抽出液を濃縮すると目的のポリメトキシフラボンを約１〜１５質量％含有する抽出物が得られる。この抽出物は、さらに乾固させてもよい。この抽出物を２倍質量以上、好ましくは３〜１０倍質量の酢酸エチルに溶解し、水を加えて撹拌・分層し、水層を除去してから酢酸エチルを留去して、乾固物を得ることができる。
【００３４】
なお、本発明においては、単離したヘプタメトキシフラボン、ノビレチン、タンゲレチンのいずれかを単独で用いてもよいし、これらの中から２種以上混合して用いてもよい。また、合成時の混合物のまま、あるいは植物抽出物等の複数の天然物を含む形態で用いてもよい。
【００３５】
得られた乾固物は、通常、適切な溶媒に再溶解されて液体カラムクロマトグラフィーに供され、ノビレチン、ヘプタメトキシフラボン、タンゲレチンが得られる。液体カラムクロマトグラフィーにおいては、例えば、シリカゲル又はアルミナを充填材とし、溶離液として、ヘキサン／エタノールを容積比７０／３０〜９７／３で混合した混合溶媒が用いられる。なお、取り扱いの観点から、水、アルコール等の溶剤に溶解させても良い。前記希釈溶媒は１種を選択して単独で用いてもよく、又は２種以上を併用してもよい。
【００３６】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は、（ａ）成分と（ｂ）成分とを組み合わせてなるもの（即ち、併用剤）である。
【００３７】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤における、（ａ）成分と（ｂ）成分の組合せの割合は、乾燥重量で、（ａ）：（ｂ）が５：１〜１：５（質量比）が好ましく、１：２〜２：１（質量比）がより好ましい。
【００３８】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤において、（ａ）成分の含有量は、乾燥重量で、当該阻害剤全量に対して、通常１０〜８０質量％であり、好ましくは１５〜７５質量％であり、より好ましくは３０〜６０質量％である。
また（ｂ）成分の含有量は、当該阻害剤全量に対して、通常１０〜８０質量％であり、好ましくは１５〜７５質量％であり、より好ましくは３０〜６０質量％である。
【００３９】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は、皮膚の弾力性低下を予防又は改善するので、しわ及びたるみの予防又は改善に用いられる。
【００４０】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品として利用することができるが、医薬部外品や化粧品としての利用が好ましい。本発明のエラスターゼ活性阻害剤には、（ａ）成分及び（ｂ）成分に加えて、医薬品、医薬部外品及び化粧品の分野で用いられる他の成分、例えば、溶媒や賦形剤などを含有することができる。
【００４１】
上記外用剤には、（ａ）成分及び（ｂ）成分の他に水溶性成分、油性成分、粉末成分、界面活性剤、高分子成分、増粘剤、粘着性改良剤、被膜形成剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、賦形剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、潤沢剤、鎮痒剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、化粧品や医薬部外品等に必要な添加剤等を必要に応じて配合することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４３】
（ａ）成分  ブドウ果実（種子有り）抽出物
種ありのブドウ（品種名はナイアガラ）の果実を収穫し、水で洗浄した後、果汁を得るために果実を圧搾して果実残渣を得た。その果実残渣の乾燥物５０ｇを抽出溶媒である５０質量％の１，３−ブチレングリコール（ＢＧ）水溶液５００ｇに６０℃で５時間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を５℃にて７日間静置保存した後、さらにろ紙を用いてろ過してブドウの種子を含む果実抽出液を得た。このブドウ果実抽出液中の抽出溶媒を除いた固形分の含有量は１．９質量％であり、これを５０質量％のＢＧ水溶液で希釈して固形分を１．０質量％に調整したものをブドウの種子を含む果実抽出物として試験に用いた。
【００４４】
（ａ’）成分  ブドウ果実（種子無し）抽出物
実施例１と同様の方法により得られた種子のないブドウ（品種名はピオーネ）果実残渣の乾燥物５０ｇを抽出溶媒である５０質量％のＢＧ水溶液５００ｇに６０℃で５時間浸漬した後、ろ紙（アドバンテック東洋社製、５Ｃ）を用いてろ過し、ろ液を得た。このろ液を５℃にて７日間静置保存した後、さらにろ紙を用いてろ過してブドウ果実（種子無）抽出液を得た。このブドウ果実（種子無し）抽出液中の抽出溶媒を除いた固形分の含有量は１．８質量％であり、これを５０質量％のＢＧ水溶液で希釈して固形分を１．０質量％に調整したものをブドウ果実（種子無し）抽出物として試験に用いた。
【００４５】
（ｂ）成分（ポリメトキシフラボン）の単離・精製について説明する。
ミカン科オレンジの乾燥果皮１００ｋｇをブレンダーにて粉砕し、５倍質量の９５％エタノールで５日間浸漬、抽出した。抽出液を濾過後、減圧濃縮してオレンジ果皮抽出物４５０ｇを得た。このオレンジ果皮抽出物を５倍質量の酢酸エチルに溶解し、酢酸エチルと等量の水を加えて撹拌し、静置した。分層後、水層を除去した。この操作を３回繰り返した後、酢酸エチルを留去し、乾固物２８０ｇを得た。
さらに、この乾固物を２倍質量のヘキサン／エタノール混合溶媒（容積比８５／１５）に溶解し、溶解液を得た。シリカゲルを充填したカラム（直径３０ｃｍ、長さ１ｍ）にこの溶解液を全量チャージした。このカラムにカラム容量の２倍容量のヘキサンを流した後、溶離液としてヘキサン／エタノール混合溶媒（容積比９０／１０）を使用し、溶出液を１Ｌずつ分画した。
この各分画液について、展開溶媒としてヘキサン／エタノール混合溶媒（容積比９０／１０）を使用したシリカゲル薄層クロマトグラフィーに供して分析したところ、上記式［ＩＩ］〜［ＩＶ］で示される３種の化合物の存在を確認した。そして、それぞれの化合物を含有する分画液を合一してから溶媒を留去し、式［ＩＩ］で示される化合物１、式［ＩＩＩ］で示される化合物２、式［ＩＶ］で示される化合物３を得た。化合物１〜３の各収量は、化合物１（ヘプタメトキシフラボン）が１３ｇ、化合物２（ノビレチン）が９．２ｇ、化合物３（タンゲレチン）が２．２ｇであった。このようにして、３種のポリメトキシフラボンが単離・精製された。
【００４６】
〔エラスターゼ活性阻害試験〕
エラスターゼ基質（Ｎ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、ＥＬＡＳＴＩＮ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯＭＰＡＮＹ社製）は、ＤＭＳＯを加え０．１Ｍ エラスターゼ基質ストック溶液を調製し、そのエラスターゼ基質ストック溶液１００μＬに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）９９００μＬを加え、１ｍＭエラスターゼ基質溶液を調製した。ブタ膵臓由来エラスターゼ（ＥＬＡＳＴＩＮ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯＭＰＡＮＹ社製）は、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を加え１０ｕｎｉｔｓ/ｍＬエラスターゼストック溶液とし、そのエラスターゼストック溶液５０μＬに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）４９５０ｕＬを加え０．１ｕｎｉｔｓ/ｍＬエラスターゼ溶液を調製した。希釈用９６穴プレートに試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて１／２段階希釈系列を調整した。試験用９６穴プレートの全ての穴に１ｍＭエラスターゼ基質溶液を１００μＬずつ加えた。次に希釈用９６穴プレートで調整した試料の段階希釈系列を試験用９６穴プレートに５０μＬずつ添加した。ただし、コントロールには０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）５０μＬを添加した。３７℃で１０分間インキュベートした後、試験用９６穴プレートに０．１ｕｎｉｔｓ/ｍＬエラスターゼ溶液を５０μＬずつ添加した。すぐに、マイクロプレートリーダーで開始時の４０５ｎｍ吸光度を測定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、３０分後の４０５ｎｍ吸光度を測定した。エラスターゼ活性阻害率（％）は下記の計算式にて求めた。結果は表１及び２に示した。
【００４７】
エラスターゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
Ａ：試料を添加した３０分後の吸光度
Ｂ：試料を添加した直後の吸光度
Ｃ：コントロールの３０分後の吸光度
Ｄ：コントロールの開始時の吸光度
【００４８】
【表１】
2019116446.tif 000007
【００４９】
【表２】
2019116446.tif 000008
【００５０】
ブドウの種子を含む果実抽出物とポリメトキシフラボンの一種である３，５，６，７，８，３'，４'−ヘプタメトキシフラボンとを組み合わせた実施例１〜３では、エラスターゼ活性阻害効果が知られているブドウの種子を含む果実抽出物単独の場合（比較例１〜３）に比べ、エラスターゼ活性阻害効果が飛躍的に向上することが確認された。また、ポリメトキシフラボンでは、５，６，７，８，３'，４'−へキサメトキシフラボン及び５，６，７，８，４'−ペンタメトキシフラボンもブドウの種子を含む果実抽出物を組み合わせた場合も同様にエラスターゼ活性阻害効果が飛躍的に向上することを確認した（実施例４〜５）。
【００５１】
一方、ポリメトキシフラボン単独（比較例４〜６）では、エラスターゼ活性阻害効果が確認されなかった。種無しのブドウ果実の抽出物とポリメトキシフラボンとを組み合わせた比較例７とエラスターゼ活性阻害効果が知られているブドウの皮に含まれるレスベラトロールとポリメトキシフラボンとを組み合わせた比較例８では、種子を含む果実抽出物とポリメトキシフラボンとを組み合わせた実施例２に比べ、優れたエラスターゼ活性阻害効果が確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のエラスターゼ活性阻害剤は、しわ及びたるみ予防目的の皮膚外用剤や化粧料として使用することができる。