(57)【要約】      （修正有）【課題】組換えポリペプチドの産生において発現の増大を得るのに用いうる、発現カセットの提供。【解決手段】プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および発現増強エレメントを含む発現カセットであって、発現増強エレメントが、真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および発現増強エレメントを含む発現カセットであって、発現増強エレメントが、真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセット。
【請求項２】
真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列をさらに含み、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片を含まないという条件で、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセット。
【請求項４】
真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列をさらに含み、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項６】
ポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１０ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまたはその一部まで伸びる、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、前記真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位の下流で開始され、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオ
チドであり、その最長の場合で、ＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の開始コドンまで伸びる、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の開始コドンまで伸びる、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が哺乳動物に由来する、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が齧歯動物またはヒトに由来する、請求項１３に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項１６】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２または３に記載の発現カセット。
【請求項１９】
配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８またはその断片からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列が、５カ所以下の核酸修飾を含む、請求項１８に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項２または３に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む、請求項２または３に記載の発現カセット。
【請求項２２】
前記プロモーターと、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列とが、作動的に連結されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と同方向に配向している、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している、請求項１または４に記載の発現カセット。
【請求項２５】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と同方向に配向している、請求項２または３に記載の発現カセット。
【請求項２６】
前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している、請求項２または３に記載の発現カセット。
【請求項２７】
前記プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター、ＭＰＳＶプロモーター、マウスＣＭＶ、ヒトｔｋ、ヒトＣＭＶ、ラットＣＭＶ、ヒトＥＦ１アルファ、チャイニーズハムスターＥＦ１アルファ、ヒトＧＡＰＤＨ、ＭＹＣプロモーター、ＨＹＫプロモーター、およびＣＸプロモーターを組み入れたハイブリッドプロモーターからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、抗体、抗体断片、または抗体誘導体からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２９】
前記ポリアデニル化部位が、ＢＧＨ  ｐｏｌｙ（Ａ）およびＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）からなる群から選択される、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項３０】
さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、および選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項３１】
前記遺伝子エレメントが選択マーカーであり、前記選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列中に含有されるＣｐＧ部位の含量が４５以下である、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３２】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項３３】
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）プロモーター
ｃ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｄ）ポリアデニル化部位
ｅ）エンハンサー
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、または
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）エンハンサー
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、または
ａ）エンハンサー
ｂ）真核生物ＧＡＰＤＨの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を、ａ）またはｂ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合は、ｆ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列であり、ａ）またはｂ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合は、ｆ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列であるという条件で、順に含む発現ベクターであって、前記エンハンサーの組入れが任意選択であり、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、約１００〜約１５０００ヌクレオチドであり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現ベクター。
【請求項３４】
前記発現ベクターが、さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、複製起点、および選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む、請求項３２または３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
前記発現ベクターが複製起点および選択マーカーをさらに含み、前記複製起点および前記選択マーカーをコードする前記発現ベクターのポリヌクレオチド配列中に含有されるＣｐＧ部位の含量が２００以下である、請求項３２または３３に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
請求項１から３１のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項３２から３５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
障害を処置するための医薬として用いられる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項３２から３５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
遺伝子治療で使用するための、請求項１から３１のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項３２から３５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
ポリペプチドを発現させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、宿主細胞を、請求項１から３１のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項３２から３５のいずれか一項に記載の発現ベクターでトランスフェクトするステップと、前記ポリペプチドを回収するステップとを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項４０】
前記発現カセットまたは前記発現ベクターを、安定的にトランスフェクトする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記発現カセットまたは前記発現ベクターを、一過性にトランスフェクトする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物の宿主細胞から異種ポリペプチドを発現させるための、請求項１から３１のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項３２から３５のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる２０１１年１２月７日に出願された米国仮出願第６１／５６７，６７５号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現させるのに有用な発現カセットに関する。本発明はまた、発現カセットを含むベクターおよび宿主細胞、ならびにポリペプチドを宿主細胞から産生させるための発現カセットの使用も対象とする。
【背景技術】
【０００３】
組換えポリペプチドを産生するための発現系は、現況の技術水準においてよく知られており、例えば、Ｍａｒｉｎｏ  ＭＨ（１９８９）、Ｂｉｏｐｈａｒｍ、２：１８〜３３；Ｇｏｅｄｄｅｌ  ＤＶら（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５：３〜７；Ｗｕｒｍ  ＦおよびＢｅｒｎａｒｄ  Ａ（１９９９）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１０：１５６〜１５９により記載されている。医薬への適用において用いられるポリペプチドは、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞内で産生させることが好ましい。この目的で用いられる発現ベクターの不可欠なエレメントは通常、原核生物の複製起点および原核生物の選択マーカーを含む、原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉ、のプラスミド増殖ユニットから選択されるが、任意選択で、真核生物の選択マーカーからも選択され、対象の（１または複数の）構造遺伝子を発現させるための１または複数の発現カセットは各々、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、任意選択で、ポリアデニル化シグナルを含めた転写ターミネーターも含む。哺乳動物細胞における一過性発現では、ＳＶ４０  ＯｒｉまたはＳＶ４０  ＯｒｉＰなど、哺乳動物の複製起点も組み入れることができる。プロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを選択することができる。転写を最適化するには、５’側非翻訳領域にコザック配列を組み入れることができる。ｍＲＮＡのプロセシング、特に、ｍＲＮＡのスプライシングおよび転写終結のためには、構造遺伝子の構成（エクソン／イントロン構成）に応じて、ｍＲＮＡのスプライシングシグナルのほか、ポリアデニル化シグナルも組み入れることができる。遺伝子の発現は、一過性発現で行うか、または安定細胞系を用いて行う。産生細胞系における安定的で高度なポリペプチドの発現レベルは、組換えポリペプチド産生の全体的プロセスにとってきわめて重要である。タンパク質、とりわけ、抗体または抗体断片などの生物学的分子に対する需要は、最近数年間で著明に増大している。高額な費用および収率の低さは、生物学的分子の利用可能性における制限因子となっており、所望の生物学的分子の収率を産業的スケールで増大させる頑健なプロセスを開発することが、大きな課題となっている。したがって、組換えポリペプチドの産生において高度な発現を得るには、発現ベクターの効率を改善することが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は一般に、組換えポリペプチドの産生において発現の増大を得るのに用いうる、発現カセットおよび発現ベクターなどの発現系に関する。一態様では、本開示は、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、ＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわた
る領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、約１００〜約１５０００ヌクレオチドである発現カセットを提供する。
【０００５】
さらなる態様では、本開示は、発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片を含まないという条件で、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが１００〜約１５０００ヌクレオチドである発現カセットを提供する。さらなる態様では、本開示は、発現カセットおよび発現カセットまたは発現カセットを含む発現ベクターを含む宿主細胞を含む発現ベクターを提供する。
【０００６】
なおさらなる態様では、本開示は、ポリペプチドを発現させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、宿主細胞を、発現カセットまたは発現ベクターでトランスフェクトするステップと、ポリペプチドを回収するステップとを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、および哺乳動物の宿主細胞から異種ポリペプチドを発現させるための、発現カセットまたは発現ベクターの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、１番目のイントロンを含有するＩｇドナーアクセプター断片（ＩｇＤＡ）、ＩｇＧ１抗体の軽鎖（ＩｇＧ１  ＬＣ）、脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＩｇＧ１抗体の重鎖（ＩｇＧ１  ＨＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびサルウイルス４０ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ（Ａ））からなるレポーター発現構築物（ＲＥＰ）を示す図である。
【図２】トランスフェクションの５日後のＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＩｇＧ１抗体の一過性発現を示す図である（２回にわたる独立のトランスフェクションについて、ＩｇＧ力価の平均をプロットする）。ＧＡＰＤＨ＿ＡベクターおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂベクター（ＧＡＰＤＨ＿ＡおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂ）、ＧＡＰＤＨの上流および下流のエレメントを伴わない同じベクター（ＡおよびＢ）、ならびに対照としてのｐＧＬＥＸ４１ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）を用いて、細胞にトランスフェクトした。Ｏｃｔｅｔ測定器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、上清中に蓄積されたＩｇＧ１抗体の濃度を決定した。
【図３】ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞におけるＩｇＧ１抗体発現を示す図である。ＧＡＰＤＨ＿ＡベクターおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂベクター（ＧＡＰＤＨ＿ＡおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂ）ならびに対照としてのｐＧＬＥＸ４１ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）を用いて、細胞にトランスフェクトした。上清を採取し、トランスフェクションの１０日後に、Ｏｃｔｅｔ測定器を用いて解析した。データは、ＴｕｂｅＳｐｉｎベクター１つ当たりＮ＝３の独立のトランスフェクションを表す。
【図４】細胞プールを用いるバッチ産生についての発現レベル研究を示す図である。細胞にトランスフェクトし、ＧＡＰＤＨ＿ＡベクターおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂベクター（ＧＡＰＤＨ＿Ａ（１）、ＧＡＰＤＨ＿Ａ（２）、ＧＡＰＤＨ＿Ｂ（１）およびＧＡＰＤＨ＿Ｂ（２））、ＧＡＰＤＨの上流および下流のエレメントを伴わない同じベクター（Ａ（１）およびＡ（２））、ならびに対照としてのｐＧＬＥＸ４１ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）を用いて、安定細胞のプールを創出した。培養の７日後に、Ｏｃｔｅｔ測定器を用いて、上清中に蓄積された抗体について、上清を解析した。各プールについて、ＩｇＧ力価の平均を示す（μｇ／ｍｌ）。データは、プール１つ当たりＮ＝２のバッチを表す。
【図５】安定的トランスフェクションおよび限界希釈により創出した集団についての発現レベル研究を示す図である。ＧＡＰＤＨ＿ＡベクターおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂベクター（ＧＡＰＤＨ＿ＡおよびＧＡＰＤＨ＿Ｂ）、ＧＡＰＤＨの上流および下流のエレメントを伴わない同じベクター（ＡおよびＢ）、ならびに対照としてのｐＧＬＥＸ４１ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）を用いて、細胞にトランスフェクトした。クローンおよびミニプールにより安定的トランスフェクションから発現させたＧＦＰ蛍光の平均値は、トランスフェクションの１４日後に読み取った。細胞は、９６ウェルプレート内の選択圧下で培養した。データは、ベクター１つ当たりＮ＝４８のクローンまたはミニプールを表す。
【図６】培地添加物であるインスリンおよびＰＭＡ（フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート；フォルボールエステル）の、上清中のＩｇＧ１抗体発現に対する効果を示す図である。ＧＡＰＤＨ＿Ａベクター（ＧＡＰＤＨ＿Ａ）によるトランスフェクションおよび対照であるｐＧＬＥＸ４１ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）によるトランスフェクション後、細胞を、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２培地、４ｍＭのＧｌｎ±インスリン；およびＰｏｗｅｒＣＨＯ２、４ｍＭのＧｌｎ、ＰＭＡ±インスリンのいずれかに希釈した。ｐＧＬＥＸ４１（黒色バー）またはＧＡＰＤＨ＿Ａ（白色バー）については、基準培地と比較した発現の差違を観察することができなかった。
【図７】ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子座についての概観を示す図である。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、遺伝子であるＮＣＡＰＤ２とＩＦＦＯ１とに挟まれている。
【図８】ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子、ＧＡＰＤＨの上流の断片化研究の解析のために創出された、ＧＡＰＤＨの上流および下流のエレメントおよび断片についての詳細を示す図である。ＮｒｕＩ制限部位は、クローニングステップを容易にするために導入されたものであり、ゲノムの５’側ＧＡＰＤＨの上流の配列の部分ではない（したがって、アステリスクを用いて強調される）。断片のサイズは、断片１（配列番号９）：５１１ｂｐ、断片２（配列番号１０）：２６５３ｂｐ、断片３（配列番号１１）：１９６６ｂｐ、断片４（配列番号１２）：１１９８ｂｐ、断片８（配列番号１３）：２５９ｂｐ、断片９（配列番号１４）：１９４７ｂｐ、断片１１（配列番号１５）：１４３６ｂｐ、および断片１７（配列番号１６）：１１７７ｂｐである。
【図９】ＧＡＰＤＨの上流および下流のエレメントの断片化の発現結果を示す図である。発現結果は、トランスフェクションの１０日後のＣＨＯ細胞における、一過性トランスフェクションにより得られた。定量化は、Ｏｃｔｅｔ測定器を用いて行った。ベクターであるｐＧＬＥＸ４１は、陰性対照として用いられる。ｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡはまた、ＧＡＰＤＨフランキングエレメントを伴わないベクターの基底の発現を示す陰性対照でもある。ｐＧＬＥＸ４１−ｕｐ／ｄｏｗｎは、全長フランキング（上流および下流の）領域を含有し、陽性対照として用いられる。ｐＧＬＥＸ４１−ｕｐは、上流のフランキング領域だけを含有し、ｐＧＬＥＸ４１−ｄｏｗｎは、下流のフランキング領域だけを含有する。他の全ての構築物は、図８において記載される断片を含有する。断片２および３は、ＩｇＧ１  ＬＣおよびＩｇＧ１  ＨＣと同方向でクローニングされるか、またはＩｇＧ１  ＬＣおよびＩｇＧ１  ＨＣに対して逆方向でクローニングされた（ＡＳ）。
【図１０】トランスフェクションの８日後のＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＩｇＧ１抗体の一過性発現を示す図である（３回の独立のトランスフェクションについて、ＩｇＧ力価の平均をプロットする；エラーバー：ＳＤ±）。マウスＣＭＶプロモーター（Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ）またはチャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーター（Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ＿ＰＲ）と組み合わせて、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨの上流のエレメントを伴うベクターを用いて、細胞にトランスフェクトした。マウスＣＭＶプロモーター（Ａ）またはチャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーター（Ａ＿ＰＲ）だけを伴うプラスミドを、対照としてトランスフェクトした。Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ測定器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、上清中に蓄積されたＩｇＧ１抗体の濃度を決定した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットおよび発現ベクターであって、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセットおよび発現ベクターに関する。
【０００９】
本開示は、さらに、発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片を含まないという条件で、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセットに関する。
【００１０】
本明細書で用いられる「発現カセット」という用語は、発現させるポリペプチドと、シス作用型転写制御エレメントの任意の組合せを含めた、プロモーター、任意選択で、エンハンサー配列など、その発現を制御する配列とをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。遺伝子の発現、すなわち、その転写および転写産物の翻訳を制御する配列を一般に、調節単位と称する。調節単位の大部分は、遺伝子のコード配列の上流に位置し、それへと作動可能に連結されている。発現カセットはまた、ポリアデニル化部位を含む下流の３’側非翻訳領域も含有しうる。本発明の調節単位は、発現させる遺伝子、すなわち、転写単位に作動可能に連結されているか、または、例えば、異種遺伝子の５’側非翻訳領域によるなど、介在ＤＮＡによりそこから隔てられている。発現カセットのベクターへの挿入および／またはベクターからのその切出しを可能とするために、発現カセットを、適切な１または複数の制限部位で挟むことが好ましい。したがって、本発明に従う発現カセットは、発現ベクター、特に、哺乳動物の発現ベクターを構築するために用いることができる。本発明の発現カセットは、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターもしくはその断片の下流の、１もしくは複数の、例えば、２つ、３つ、もしくはこれをなお超える非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および／または真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターもしくはその断片の上流の、１もしくは複数の、例えば、２つ、３つ、もしくはこれをなお超える非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含みうる。本発明の発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片の下流および／または上流の複数のＤＮＡ配列を含む場合、これらのＤＮＡ配列は、直接連結することができる、すなわち、リンカー配列、例えば、５’端および３’端に付けられ、配列またはその断片の容易な逐次的クローニングを可能とする、制限部位を含有するリンカー配列を含みうる。代替的に、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片の下流および／または上流のＤＮＡ配列を直接連結しない場合もある、すなわち、介在ＤＮＡ配列と共にクローニングすることもできる。
【００１１】
本明細書で用いられる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチドを発現させる遺伝子、好ましくは、異種遺伝子をコードするＤＮＡを包含する。
【００１２】
「異種コード配列」、「異種遺伝子配列」、「異種遺伝子」、「組換え遺伝子」、また
は「遺伝子」という用語は、互換的に用いられる。これらの用語は、宿主細胞において、好ましくは、哺乳動物細胞において発現させ、採取することが求められる組換え産物、特に、組換え異種タンパク質産物をコードするＤＮＡ配列を指す。遺伝子産物は、ポリペプチドでありうる。異種遺伝子配列は、天然では宿主細胞内に存在せず、同じ種または異なる種の生物に由来し、遺伝子改変されている場合がある。
【００１３】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により他の残基に付けられる一連のアミノ酸残基を包含するように互換的に用いられる。
【００１４】
本明細書で用いられる「非翻訳ゲノムＤＮＡ配列」という用語は、生物の遺伝情報を構成するＤＮＡを包含する。ほとんど全ての生物のゲノムはＤＮＡであり、唯一の例外は、ＲＮＡゲノムを有する一部のウイルスである。大半の生物におけるゲノムＤＮＡ分子は、染色体と呼ばれるＤＮＡ−タンパク質複合体へと組織立てられている。染色体のサイズ、数、およびゲノムＤＮＡの性質は、異なる生物の間で変化する。ウイルスＤＮＡゲノムは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、直鎖状の場合もあり、環状の場合もある。他の全ての生物は、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。細菌は、単一の環状染色体を有する。真核生物では、大半のゲノムＤＮＡが、サイズの異なる複数の直鎖状染色体として核内に配置される（核ＤＮＡ）。真核細胞は、ゲノムＤＮＡを、ミトコンドリアにもさらに含有し、植物および下等真核生物では、葉緑体にもさらに含有する。このＤＮＡは通例環状分子であり、これらの細胞小器官内に複数のコピーとして存在する。非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通常、プロモーターに作動可能に連結されておらず、したがって、翻訳されない。非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、翻訳されない（１または複数の）遺伝子、したがって、例えば、発現しないタンパク質をコードする（１または複数の）遺伝子を含有する場合がある。
【００１５】
本明細書で用いられる「真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列」という用語は、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの３’側の非翻訳真核生物ゲノムＤＮＡに対応する。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通常、＋１近傍のヌクレオチド位置において、好ましくは、ヌクレオチド位置＋１において開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、すなわち、ＧＡＰＤＨをコードする真核生物遺伝子の転写開始起点に照らした位置である。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通例、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターと同じ由来である。例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターがヒト由来である場合、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列も同様にヒト由来であり、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターの下流の自然発生のヒトゲノムＤＮＡ配列に対応する。
【００１６】
本明細書で用いられる「真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列」という用語は、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’側の非翻訳真核生物ゲノムＤＮＡに対応する。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通常、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍のヌクレオチド位置において、好ましくは、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端にすぐ後続するヌクレオチド位置において開始される。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通例、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターと同じ由来である、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターがヒト由来である場合、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列も同様にヒト由来であり、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターの上流の自然発生のヒトゲノムＤＮＡ配列に対応する。
【００１７】
本明細書で示される真核生物ＧＡＰＤＨプロモーター、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および他のＤＮＡ配列の位置は、ＧＡＰ
ＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、例えば、とりわけ、別段に示されない限りにおいて、真核生物のＧＡＰＤＨの転写開始起点に照らした位置である。
【００１８】
「真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が〜まで伸びる」または「真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が〜まで伸びる」という用語は、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／または下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の全長のうち、始点から特定の遺伝子エレメントまでの伸長部分、例えば、イントロンまでの伸長部分を定義するのに用いられる。この伸長部分は、遺伝子エレメント、例えば、イントロンまたはその一部をコードするＤＮＡ配列の全長を包含する。
【００１９】
ヒト、ラット、およびマウスについては、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターならびにＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／または下流の真核生物ゲノムＤＮＡを、ＮＣＢＩ公開データバンクにおいて見出すことができ（ヒト、マウス、ラット、およびチャイニーズハムスターのＧＡＰＤＨ遺伝子のエントリーは、それぞれ、Ｇｅｎｅ  ＩＤ２５９７（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００２０４６．３）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ１４４３３（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００８０８４．２）、Ｇｅｎｅ  ＩＤ２４３８３（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿０１７００８．３）、およびＧｅｎｅ  ＩＤ１００７３６５５７（ｍＲＮＡ：ＮＭ＿００１２４４８５４．２）である；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子については、図７および８に例示的に示されている。
【００２０】
真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターは通例、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして、ｂｐ  −５００近傍〜＋５０近傍に及ぶと考えられている。ヒトＧＡＰＤＨプロモーターは、第１２染色体上に位置する。Ｇｒａｖｅｎら（Ｇｒａｖｅｎら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ、１４７：２０３〜２１８）は、断片化研究に基づき、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターが、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして、ｂｐ  −４８８〜＋２０に及ぶと考えている。ＮＣＢＩ公開データバンクに従うと、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターは、ＮＣＢＩ公開データバンクにより定義されるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして、ｂｐ  −４６２〜＋４６に及ぶ。とりわけ、別段に示されない限り、本明細書で言及されるヒトＧＡＰＤＨプロモーターは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして、−４６２〜＋４６位に及び、これは、配列番号１７のｂｐ  ４０７１〜４５７８に及ぶ配列に対応する。
【００２１】
本明細書で言及されるヒト、マウス、およびラット由来のＧＡＰＤＨ遺伝子、ＩＦＦ０１遺伝子、およびＮＣＡＰＤ２遺伝子のＤＮＡに用いられる番号付けは、ＮＣＢＩ公開データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）においてこれらの遺伝子に用いられる番号付けに対応する。
【００２２】
本明細書で用いられる「プロモーター」という用語は、一般に遺伝子の上流に位置する調節ＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合するように指示し、ＲＮＡの合成を誘発することにより転写の開始を媒介する、調節ＤＮＡ配列を定義する。
【００２３】
本明細書で用いられる「エンハンサー」という用語は、遺伝子の転写を強化するように作用するヌクレオチド配列であって、遺伝子の同一性、遺伝子に照らした配列の位置、または配列の配向とは独立のヌクレオチド配列を定義する。本発明のベクターは、任意選択で、エンハンサーを含む。
【００２４】
「機能的に連結された」という用語と「作動可能に連結された」という用語とは、互換的に用いられ、２つ以上のＤＮＡセグメント、特に、発現させる遺伝子配列とそれらの発現を制御する配列との間の機能的な関係を指す。例えば、それが適切な宿主細胞または他
の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節する場合は、シス作用型転写制御エレメントの任意の組合せを含めたプロモーター配列および／またはエンハンサー配列を、コード配列に作動可能に連結する。転写される遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーター調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する。
【００２５】
「配向」とは、所与のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を指す。例えば、別のＤＮＡ配列に対して逆方向にあるＤＮＡ配列の配向とは、別の配列に照らした、配列の５’側〜３’側の順序が、配列が得られたＤＮＡ中の基準点と対照して反転される配向である。このような基準点には、供給源であるＤＮＡの他の指定されたＤＮＡ配列の転写方向、および／またはこの配列を含有する複製可能なベクターの複製起点が含まれうる。
【００２６】
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞へとトランスフェクションされると、宿主細胞内で高レベルの組換え遺伝子産物を発現させる単離ＤＮＡ分子および精製ＤＮＡ分子を包含する。組換え遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に加えて、発現ベクターは、宿主細胞系における、ＤＮＡコード配列のｍＲＮＡへの効率的な転写およびｍＲＮＡのタンパク質への効率的な翻訳に要請される調節性ＤＮＡ配列を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる「宿主細胞」または「宿主細胞系」という用語は、任意の細胞、特に、培養物中で成長し、所望の組換え産物タンパク質を発現させることが可能な哺乳動物細胞を包含する。
【００２８】
本明細書で用いられる「断片」という用語は、それぞれのヌクレオチド配列の部分、例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の部分、またはプロモーターなど、特定の遺伝子エレメントをコードするヌクレオチド配列の部分を包含する。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の断片は、生物学的活性を保持することが可能であり、よって、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列の発現パターンを変化させる、例えば、増大させることが可能である。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約１００〜３０００ｂｐ近傍、好ましくは約２００〜２８００ｂｐ近傍、より好ましくは約３００〜２０００ｂｐ近傍のヌクレオチド、特に、約５００〜１５００ｂｐ近傍のヌクレオチドの範囲にわたりうる。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の断片を、本発明の発現カセット内にクローニングするためには、容易なクローニングを可能とする制限部位を含有するリンカー配列を、断片の５’端および３’端に付けるのが通例である。
【００２９】
本明細書で用いられる「ヌクレオチド配列の同一性」または「同一なヌクレオチド配列」という用語は、最大の配列同一性パーセントに達するように配列をアライニングし、必要な場合はギャップを導入した後における、例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列のヌクレオチド配列と同一な、候補配列中のヌクレオチドの百分率を包含する。したがって、配列同一性は、２つのヌクレオチド配列のヌクレオチド位置の類似性を比較するのに一般に用いられる標準的な方法により決定することができる。通例、候補配列の、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列との、ヌクレオチド配列の同一性は、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％を含め、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％であり、最も好ましくは、少なくとも９５％、特定すると９６％、より特定すると９７％、なおより特定すると９８％、最も特定すると９９％である。
【００３０】
本明細書で用いられる「ＣｐＧ部位」という用語は、直鎖状の塩基配列中のその長さに沿って、グアニンヌクレオチドの隣にシトシンヌクレオチドが現れるＤＮＡの領域を包含する。「ＣｐＧ」とは、「−Ｃ−リン酸−Ｇ−」、すなわち、１つのリン酸だけで隔てられたシトシンおよびグアニンの略称であり、リン酸により、任意の２つのヌクレオシドが、ＤＮＡ中で一体に連結されている。「ＣｐＧ」という表記は、この直鎖状配列を、シトシンとグアニンとによるＣＧ塩基対合から識別するのに用いられる。
【００３１】
本明細書で用いられる「代替的なコドン使用」という用語は、ＣｐＧ配列モチーフを回避するための、同じアミノ酸をコードする代替的なコドンの使用を包含する。この用語は、好ましくは、内部のＣｐＧ部位を有さないコドン（例えば、アラニンをコードし、ＣｐＧ部位を含有するＧＣＧは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、またはＧＣＡで置きかえることができる）を用いることのほか、２つのコドンが接続されて新たなＣｐＧ部位をもたらすのを回避することも包含する。
【００３２】
ＤＮＡ配列の長さに関して本明細書で用いられ、かつ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らしたヌクレオチド位置、例えば、真核生物のＧＡＰＤＨの転写開始起点に照らしたヌクレオチド位置に関しても本明細書で用いられる「約または近傍」という用語は、言明された値に対して最大で±５０％、通例は最大で±１０％の偏差を伴う値を包含し、例えば、「約３０００ヌクレオチド」には、２７００〜３３００ヌクレオチド、好ましくは２９００〜３１００ヌクレオチド、より好ましくは２９９５〜３００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約１００ヌクレオチド」には、５０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは９０〜１１０ヌクレオチド、より好ましくは９５〜１０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約１５０００ヌクレオチド」には、１３５００〜１６５００ヌクレオチド、好ましくは１４５００〜１５５００ヌクレオチド、より好ましくは１４９９０〜１５０１０ヌクレオチド、最も好ましくは１４９９５〜１５００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約２００ヌクレオチド」には、１５０〜２５０ヌクレオチド、好ましくは１９０〜２１０ヌクレオチド、より好ましくは１９５〜２０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約８０００ヌクレオチド」には、７２００〜８８００ヌクレオチド、好ましくは７５００〜８５００ヌクレオチド、より好ましくは７９９０〜８０１０ヌクレオチド、最も好ましくは７９９５〜８００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約５００ヌクレオチド」には、４５０〜５５０ヌクレオチド、好ましくは４７５〜５２５ヌクレオチド、より好ましくは４９０〜５１０ヌクレオチド、最も好ましくは４９５〜５０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約５０００ヌクレオチド」には、４５００〜５５００ヌクレオチド、好ましくは４７５０〜５２５０ヌクレオチド、より好ましくは４９９０〜５０１０ヌクレオチド、最も好ましくは４９９５〜５００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約１０００ヌクレオチド」には、９００〜１１００ヌクレオチド、好ましくは９５０〜１０５０ヌクレオチド、より好ましくは９９０〜１０１０ヌクレオチド、最も好ましくは９９５〜１００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約４５００ヌクレオチド」には、４０５０〜４９５０ヌクレオチド、好ましくは４２５０〜４７５０ヌクレオチド、より好ましくは４４９０〜４５１０ヌクレオチド、最も好ましくは４４９５〜４５０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約１５００ヌクレオチド」には、１３５０〜１６５０ヌクレオチド、好ましくは１４５０〜１５５０ヌクレオチド、より好ましくは１４９０〜１５１０ヌクレオチド、最も好ましくは１４９５〜１５０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約４０００ヌクレオチド」には、３６００〜４４００ヌクレオチド、好ましくは３８００〜４２００ヌクレオチド、より好ましくは３９９０〜４０１０ヌクレオチド、より好ましくは３９９５〜４００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約２０００ヌクレオチド」には、１８００〜２２００ヌクレオチド、好ましくは１９００〜２１００ヌクレオチド、より好ましくは１９９０〜２０１０ヌクレオチド、最も好ましくは１９９５〜２００５ヌクレオチドの値が含まれ、「約３５００ヌクレオチド」には、３１５０〜３８５０ヌクレオチド、好ましくは３３００〜３７００ヌクレオチド、より好ましくは３４９０〜３５１０ヌクレオチド、最も好ましくは３４９５〜３５０５ヌクレオチドの値が含まれ、「
約２７００ヌクレオチド」には、２４３０〜２９７０ヌクレオチド、好ましくは２６００〜２８００ヌクレオチド、より好ましくは２６９０〜２７１０ヌクレオチド、最も好ましくは２６９５〜２７０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約３３００ヌクレオチド」には、２９７０〜３６３０ヌクレオチド、好ましくは３１００〜３５００ヌクレオチド、より好ましくは３２９０〜３３１０ヌクレオチド、最も好ましくは３２９５〜３３０５ヌクレオチドの値が含まれ、「約３２００ヌクレオチド」には、２８８０〜３５２０ヌクレオチド、好ましくは３０００〜３４００ヌクレオチド、より好ましくは３１９０〜３２１０ヌクレオチド、最も好ましくは３１９５〜３２０５ヌクレオチドの値が含まれ、＋７０００近傍または＋７０００位近傍には、＋６３００〜＋７７００位、好ましくは＋６７００〜＋７３００位、より好ましくは＋６９９０〜＋７０１０位、最も好ましくは＋６９９５〜＋７００５位が含まれ、＋１近傍または＋１位近傍には、−１０〜＋１０位、好ましくは−５〜＋５位、より好ましくは−１〜＋２位が含まれ、−３５００近傍または−３５００位近傍には、−３１５０〜−３８５０位、好ましくは−３３００〜−３７００位、より好ましくは−３４９０〜−５０１０位、最も好ましくは−３４９５〜−３５０５位が含まれる。本明細書で言及されるヒト、マウス、およびラット由来のＧＡＰＤＨ遺伝子、ＩＦＦ０１遺伝子、およびＮＣＡＰＤ２遺伝子のＤＮＡに用いられる番号付けに関して本明細書で用いられるか、またはある配列番号の配列内の位置に関して本明細書で用いられる「近傍」という用語は、最大で±５００ｂｐ、好ましくは±１００ｂｐ、より好ましくは±１０ｂｐ、最も好ましくは±５ｂｐの偏差を伴う値を包含する。
【００３３】
一実施形態では、本開示は、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットであって、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセットを提供する。一実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまたはその一部まで伸びる。一実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる。
【００３４】
ヒトＩＦＦ０１遺伝子は、第１２染色体のｂｐ  ６６６５２４９〜６６４８６９４近傍のヒトＤＮＡに位置する（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：２５９００）。一実施形態では、その最長の場合で、ヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第１２染色体のｂｐ  ６６５０６７７（＋７０２１位）近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第１２染色体のｂｐ  ６６５７２３０（＋１３５７４位）近傍まで及ぶ。その最長の場合で、それぞれ、ヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、およびヒトにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、第１２染色体のｂｐ  ６６５７２３０〜６６３９１２５を示す配列番号１７に含まれている（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：２５９００）。最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１７により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １１５５３近傍まで
及び、最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１７により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １８１０６近傍まで及ぶ。
【００３５】
マウスＩＦＦ０１遺伝子（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：３２０６７８）は、第６染色体のｂｐ  １２５０９５２５９〜１２５１１１８００近傍のマウスＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、マウスにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、マウスにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第６染色体のｂｐ  １２５１０９２１１（＋６３９１位）近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、マウスにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、マウスにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第６染色体のｂｐ  １２５１０３５２１（＋１２０８１位）近傍まで及ぶ。その最長の場合で、マウスにおけるＩＦＦ０１遺伝子の、それぞれ、最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、第６染色体のｂｐ  １２５１０３５２１〜１２５１１９８３２を示す配列番号１８に含まれている（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：３２０６７８）。マウスにおけるＩＦＦＯ１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １０６２２近傍まで及び、マウスにおけるＩＦＦＯ１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １６３１２近傍まで及ぶ。
【００３６】
ラットＩＦＦ０１遺伝子（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：３６２４３７）は、第４染色体のｂｐ  １６１２６４９６６〜１６１２８２１５０近傍のラットＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第４染色体のｂｐ  １６１２８０９３７（＋５１５４位）近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードする第４染色体のｂｐ  １６１２７９４５１（＋６６４０位）近傍まで及ぶ。
【００３７】
その最長の場合で、それぞれ、ラットにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、第４染色体のｂｐ  １６１２７９４５１〜１６１２９０５０８を示す配列番号１９に含まれている（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：３６２４３７）。ＩＦＦＯ１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  ９５７２近傍まで及び、ＩＦＦＯ１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １１０５８近傍まで及ぶ。
【００３８】
チャイニーズハムスターＩＦＦＯ１遺伝子（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：１００７５３３８２）は、ｂｐ  ３５７７２９３〜３５９３６８３近傍のチャイニーズハムスターＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＩＦ
Ｆ０１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＩＦＦ０１遺伝子をコードするｂｐ  ３５７９０１４（＋６８８３位）近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＩＦＦＯ１遺伝子をコードするｂｐ  ３５８５０６１（＋１２９３０位）近傍まで及ぶ。ＮＣＢＩデータバンクでは、染色体の位置がいまだ注記されておらず、最新の配列情報も、多くの未知の塩基を含有する。したがって、境界についての精密な注記は、より正確な配列情報が入手可能となるのに従い変化する可能性がある。
【００３９】
その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＩＦＦ０１遺伝子のそれぞれ、最後のイントロンまで伸びる、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から２番目のイントロンまで伸びる、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、ｂｐ  ３５６７９３２〜３５８５０６１を示す配列番号２９に包含される。ＩＦＦＯ１遺伝子の最後のイントロンまで伸びる、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １１０８３近傍まで及び、ＩＦＦＯ１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １７１３０近傍まで及ぶ。
【００４０】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位において開始される、例えば、真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位をコードする最初のヌクレオチドにおいて開始される。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位の下流で開始される、例えば、真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位をコードする最後のヌクレオチドにすぐ後続して開始されることが好ましい。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位の下流で開始され、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さは、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＩＦＦ０１遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びることがなおより好ましい。
【００４１】
一実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋３８８１近傍のヌクレオチド位置〜＋５０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で、好ましくは＋３９３１近傍のヌクレオチド位置〜＋５０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で、より好ましくは＋４０７０近傍のヌクレオチド位置〜＋５０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置である。例えば、本発明で用いられる真核生物のＧＡＰＤＨのポリアデニル化部位の下流で開始される真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は通例、＋３９３１位近傍のヌクレオチド位置において、好ましくは＋４０７０近傍のヌクレオチド位置において開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置である。
【００４２】
ヒトでは、ヒトＧＡＰＤＨポリアデニル化部位の下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ヌクレオチド位置＋３９３１の近傍（配列番号１７に示されるｂｐ  ８４６３に対応するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始される。ＧＡＰＤＨポリアデニル化部位の下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列がヒトに由来する場合は、ＧＡＰＤＨポリアデニル化部位の下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋３９３１近傍（配列番号１７に示さ
れるｂｐ  ８４６３に対応するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始され、その長さが、配列番号１７に示されるｂｐ  ８４６３近傍〜１１８１９近傍の配列に対応する３３５７ｂｐ近傍であることが好ましく、ＧＡＰＤＨポリアデニル化部位の下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋４０７０近傍（配列番号１７に示されるｂｐ  ８６０２に対応するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始され、その長さが、配列番号１７に示されるｂｐ  ８６０２近傍〜１１８１９近傍の配列に対応する３２１８ｂｐ近傍であることがより好ましい。
【００４３】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、配列番号８および２１またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列が、５カ所以下、好ましくは４カ所以下、より好ましくは３カ所以下、最も好ましくは２カ所以下、特に、１カ所の核酸修飾を含み、（１または複数の）核酸修飾は、核酸置換であることが好ましい。
【００４７】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、好ましくは約２００〜約８０００ヌクレオチド、より好ましくは約５００〜約５０００ヌクレオチド、なおより好ましくは約１０００〜約４５００ヌクレオチド、最も好ましくは約１５００〜約４０００ヌクレオチド、特に、約２０００〜約３５００ヌクレオチド、より特定すると約２７００〜約３３００、なおより特定すると約３２００、最も特定すると３２１８ヌクレオチドである。本明細書で規定される真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さには、非翻訳ゲノムＤＮＡ配列へと付加されるリンカー配列を組み入れない。
【００４８】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と同方向に配向している。
【００４９】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している。
【００５０】
一部の実施形態では、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列をさらに含み、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、約１００〜約１５０００ヌクレオチドである。
【００５１】
別の実施形態では、発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはその断片
を含まないという条件で、発現カセットが、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが１００〜約１５０００ヌクレオチドである。
【００５２】
一部の実施形態では、発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列をさらに含み、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである。これらの実施形態では、用いられる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、例えば、前出で記載されている。
【００５３】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、好ましくは約２００〜約８０００ヌクレオチド、より好ましくは約５００〜約５０００ヌクレオチド、なおより好ましくは約１０００〜約４５００ヌクレオチド、最も好ましくは約１５００〜約４０００ヌクレオチド、特に、約２０００〜約３５００ヌクレオチド、より特定すると約２７００〜約３３００、なおより特定すると約３２００、最も特定すると３１５８ヌクレオチドの長さである。本明細書で規定される真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さには、非翻訳ゲノムＤＮＡ配列へと付加されるリンカー配列を組み入れない。
【００５４】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の開始コドンまで伸びる。さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる。さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる。さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、少なくとも約１００ヌクレオチドであり、その最長の場合で、ＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後のイントロンまで伸びる。
【００５５】
ヒトＮＣＡＰＤ２遺伝子（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：９９１８）は、第１２染色体のｂｐ  ６６０３２９８〜６６４１１３２近傍のヒトＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第１２染色体の６６４０２４３ｂｐ（配列番号１７におけるｂｐ  １１１９に対応するＧＡＰＤＨ遺伝子の転写開始点に照らした−３４１４位）近傍まで及ぶ。
【００５６】
一実施形態では、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第１２染色体の６６３９９８４ｂｐ（配列番号１７におけるｂｐ  ８６０に対応するＧＡＰＤＨ
遺伝子の転写開始点に照らした−３６７３位）近傍まで及ぶ。
【００５７】
一実施形態では、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第１２染色体の６６３９１２５ｂｐ（配列番号１７におけるｂｐ  １に対応するＧＡＰＤＨ遺伝子の転写開始点に照らした−４５３２位）近傍まで及ぶ。
【００５８】
その最長の場合で、ヒトにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の、それぞれ、最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、第１２染色体のｂｐ  ６６５７２３０〜６６３９１２５を示す配列番号１７に包含される（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：９９１８）。
【００５９】
マウスＮＣＡＰＤ２遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６８２９８）は、第６染色体の１２５１１８０２５〜１２５１４１６０４位近傍のマウスＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さ（転写開始点の上流において、５００ｂｐの長さであると推定される）が、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第６染色体のｂｐ  １２５１１８６０７近傍まで及ぶ。
【００６０】
一実施形態では、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第６染色体の１２５１１８８８０ｂｐ近傍まで及ぶ。
【００６１】
一実施形態では、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第６染色体の１２５１１９８３２ｂｐ近傍まで及ぶ。
【００６２】
その最長の場合で、マウスにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の、それぞれ、最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、第６染色体のｂｐ  １２５１０３５２１〜１２５１１９８３２を示す配列番号１８に包含される（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：６８２９８）。最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １２２６（マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−３００６）近傍まで及ぶ。最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  ９５３（マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−３２７９）近傍まで及ぶ。最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１８により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １（マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−４２３１）近傍まで及ぶ。
【００６３】
ラットＮＣＡＰＤ２遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３６２４３８）は、第４染色体の１６１
２８８６７１〜１６１３１０４１７位近傍の真核生物ＤＮＡに位置する。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第４染色体の１６１２８９１９１ｂｐ近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第４染色体の１６１２８９４４６ｂｐ近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子をコードする第４染色体の１６１２９０５０８ｂｐ近傍まで及ぶ。
【００６４】
その最長の場合で、ラットにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の、それぞれ、最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、第４染色体のｂｐ  １６１２７９４５１〜１６１２９０５０８を示す配列番号１９に包含される（ＮＣＢＩＧｅｎｅ  ＩＤ：３６２４３８）。最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １３１８（ラットＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−３１０１）近傍まで及ぶ。最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １０６３（ラットＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−３３５６位）近傍まで及ぶ。最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号１９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １（ラットＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−４４１８位）近傍まで及ぶ。
【００６５】
チャイニーズハムスターＮＣＡＰＤ２遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１００７５３０８７）は、３５４４１８４〜３５６９８７９位近傍の真核生物ＤＮＡに位置する。ＮＣＢＩデータベースでは、染色体の位置が検索可能でない。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおける３５６９３８０ｂｐ近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおける３５６９１３１ｂｐ近傍まで及ぶ。一実施形態では、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおける３５６７９３２ｂｐ近傍まで及ぶ。
【００６６】
その最長の場合で、チャイニーズハムスターにおけるＮＣＡＰＤ２遺伝子の、それぞれ、最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、および最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、ｂｐ  ３５６７９３２〜３５８５０６１を示す配列番号２９に包含される。最後のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２９により示されるヌ
クレオチド配列のｂｐ  １４４９（チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−２７５２）近傍まで及ぶ。最後から２番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １２００（チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−３００１位）近傍まで及ぶ。最後から３番目のイントロンまで伸びる真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、配列番号２９により示されるヌクレオチド配列のｂｐ  １（チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ
ｍＲＮＡの転写開始点に照らした−４２００位）近傍まで及ぶ。
【００６７】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が通例、−５００近傍のヌクレオチド位置〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で、好ましくは、−５７６近傍のヌクレオチド位置〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置である。
【００６８】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が通例、−５００位近傍のヌクレオチド位置において、好ましくは、−５７６近傍のヌクレオチド位置において開始され、ヌクレオチド位置は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置である。
【００６９】
ヒトでは、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ヌクレオチド位置−４６３の近傍（配列番号１７に示されるｂｐ  ４５３３に対応するＧＡＰＤＨ
ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始される。ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列がヒトに由来する場合は、ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、−５００近傍（配列番号１７に示されるｂｐ  ４５３３に対応するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始されることが好ましい。ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列がヒトに由来する場合は、ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、−５７６近傍（配列番号１７に示されるｂｐ  ４５３３に対応するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らして）において開始され、その長さが、配列番号１７に示されるｂｐ  ８００近傍〜３９５７近傍の配列に対応する約３１５８ｂｐであることがより好ましい。
【００７０】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列もしくはその断片、好ましくは、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列もしくはその断片、または配列番号２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列もしくはその断片を含む。配列番号１０、１２、１５、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片、より好ましくは、配列番号１０、１２、１５、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片であって、配列番号１０および／または１６を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して逆方向に配向し、配列番号１２および／または１５を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と同方向に配向しているヌクレオチド配列またはその断片がより好ましい。配列番号２３、２５、２８、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片、より好ましくは、配列番号２３、２５、２８、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその断片であって、配列番号２３および／または１６を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して逆方向に配向し、配列番号２５および／または２８を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列と同方向に配向しているヌクレオチド配列またはその断片も同様により好ましい。
【００７１】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、または配列番号２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。配列番号１０、１２、１５、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列がより好ましい。配列番号２３、２５、２８、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列も同様により好ましい。
【００７２】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列、または配列番号２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、および１６もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列を含む。配列番号１０、１２、１５、および１６またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１０、１２、１５、および１６またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列であって、配列番号１０および／または１６を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して逆方向に配向し、配列番号１２および／または１５を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と同方向に配向しているヌクレオチド配列またはその断片がより好ましい。配列番号２３、２５、２８、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列またはその断片、より好ましくは、配列番号２３、２５、２８、および１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一なヌクレオチド配列またはその断片であって、配列番号２３および／または１６を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して逆方向に配向し、配列番号２５および／または２８を含むヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と同方向に配向しているヌクレオチド配列またはその断片も同様により好ましい。
【００７３】
一部の実施形態では、配列番号７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８もしくはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列が、５カ所以下、好ましくは４カ所以下、より好ましくは３カ所以下、最も好ましくは２カ所以下、特に、１カ所の核酸修飾を含み、（１または複数の）核酸修飾は、核酸置換であることが好ましい。
【００７４】
一部の実施形態では、配列番号７、９、１１、１４、２０、２２、２４、および２７またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列が、５カ所以下、好ましくは４カ所以下、より好ましくは３カ所以下、最も好ましくは２カ所以下、特に、１カ所の核酸修飾を含み、（１または複数の）核酸修飾は、核酸置換であることが好ましい。
【００７５】
一部の実施形態では、配列番号７、９、１１、１４またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列が、配列番号７、９、１１、１４のヌクレオチド配列の開始点に照らした１６位において、１カ所の核酸置換を含む。ヌクレオチド配列の開始点に照らした１６位におけるＧを、Ｔで置きかえることが好ましい。
【００７６】
一部の実施形態では、配列番号２０、２２、２４、および２７またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列が、配列番号２０、２２、２４、および２７のヌクレオチド配列の開始点に照らした１３位において、１カ所の核酸置換を含む。ヌクレオチド配列の開始点に照らした１３位におけるＧを、Ｔで置きかえることが好ましい。
【００７７】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と同方向に配向している。
【００７８】
さらなる実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と逆方向に配向している。
【００７９】
好ましい実施形態では、発現カセットが、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに前出で記載した真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含む。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来と、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来とが同じである、すなわち、同じ種の由来であることが好ましい。真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来と、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来と、宿主細胞の由来とが、同じである、すなわち、同じ種の由来であることがより好ましい。例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来と、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の由来と、宿主細胞の由来とが、同じ哺乳動物由来、例えば、ヒト由来である。
【００８０】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、１つの種に由来する非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合、発現カセットのプロモーターは、同じ種に由来するＧＡＰＤＨプロモーターではない。
【００８１】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ヒト由来の下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合、発現カセットのプロモーターは、ヒトＧＡＰＤＨプロモーターではない。
【００８２】
一部の実施形態では、発現カセットのプロモーターが、ＧＡＰＤＨプロモーターではない。一実施形態では、発現カセットが、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドであり、発現カセットが真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列をさらに含み、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物
ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである場合、発現カセットのプロモーターは、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーター、好ましくは、哺乳動物ＧＡＰＤＨプロモーター、より好ましくは、齧歯動物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはヒトＧＡＰＤＨプロモーターでありうる。この実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始される、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターのすぐ上流に位置することが好ましく、この実施形態では、発現カセットが、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターを含み、−３５００近傍のヌクレオチド位置まで伸びる自然発生のゲノムＤＮＡ配列を含むことがより好ましく、ヌクレオチド位置は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置である。
【００８３】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、哺乳動物に由来する、例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターが、哺乳動物ＧＡＰＤＨプロモーターであり、哺乳動物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を、本明細書で記載される通りに用いる。
【００８４】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、齧歯動物またはヒトに由来する、例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターが齧歯動物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはヒトＧＡＰＤＨプロモーターであり、齧歯動物ＧＡＰＤＨプロモーターまたはヒトＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を本明細書で記載される通りに用いる。
【００８５】
真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、ヒト由来の配列、ラット由来の配列、またはマウス由来の配列から選択されることが好ましく、ヒト由来の配列またはマウス由来の配列から選択されることがより好ましく、ヒト由来の配列から選択されることが最も好ましい。
【００８６】
一部の実施形態では、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結していない。
【００８７】
一部の実施形態では、発現カセットが、ポリアデニル化部位を含む。ポリアデニル化部位は、ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）およびＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）ｐｏｌｙ（Ａ）からなる群から選択されることが好ましい。
【００８８】
一部の実施形態では、発現カセットのプロモーターとポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とが作動可能に連結している。
【００８９】
一部の実施形態では、発現カセットのプロモーターが、ＳＶ４０プロモーター、ヒトｔｋプロモーター、ＭＰＳＶプロモーター、マウスＣＭＶ、ヒトＣＭＶ、ラットＣＭＶ、ヒトＥＦ１アルファ、チャイニーズハムスターＥＦ１アルファ、ヒトＧＡＰＤＨ、ＭＹＣプロモーター、ＨＹＫプロモーター、およびＣＸプロモーターを組み入れたハイブリッドプロモーターからなる群から選択される。
【００９０】
一部の実施形態では、発現カセットによりコードされるポリペプチドが、非グリコシル化ポリペプチドおよびグリコシル化ポリペプチドでありうる。グリコシル化ポリペプチドとは、少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有するポリペプチドを指す。
【００９１】
非グリコシル化タンパク質の例は、例えば、非グリコシル化ホルモン；非グリコシル化酵素；神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー、上皮成長因子（ＥＧＦ）、および線維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）ファミリーの非グリコシル化成長因子；ならびにホルモンおよび成長因子の非グリコシル化受容体である。
【００９２】
グリコシル化タンパク質の例は、ホルモンおよびホルモン放出因子、凝血因子、抗凝血因子、ホルモンまたは成長因子の受容体、神経栄養因子、サイトカインおよびそれらの受容体、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、抗体、イムノアドヘシンなどのキメラタンパク質、およびグリコシル化タンパク質のうちのいずれかの断片である。ポリペプチドは、抗体、抗体断片、または抗体誘導体（例えば、Ｆｃ融合タンパク質および二重特異的抗体など、特定の抗体フォーマット）からなる群から選択されることが好ましい。本明細書で用いられる抗体断片には、（ｉ）ドメイン、（ｉｉ）Ｆａｂ’およびＦａｂ’−ＳＨを含めた、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインまたはＣＫドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）単一の可変ドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ＥＳら（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１（６２４２）：５４４〜６）、（ｖ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉ）２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーにより、ＶＨドメインとＶＬドメインとが連結された単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ＲＥら（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８７７）：４２３〜６；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら（１９８８）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８５（１６）：５８７９〜８３）、（ｖｉｉ）遺伝子融合により構築される「ダイアボディー」または「トリアボディー」、多価断片または多重特異的断片（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら（１９９３）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０（１４）：６４４４〜８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら（２０００）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６：４６１〜７９）、（ｖｉｉｉ）Ｆｃ領域へと融合させたｓｃＦｖ、ダイアボディー、またはドメイン抗体、および（ｉｘ）同じ抗体または異なる抗体へと融合させたｓｃＦｖが含まれるがこれらに限定されない。
【００９３】
一部の実施形態では、発現カセットが、さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、および選択マーカー、好ましくは、動物細胞内で発現する選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む。転写制御エレメントは、例えば、コザック配列または転写ターミネーターエレメントである。
【００９４】
一実施形態では、遺伝子エレメントが、選択マーカーであり、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列中に含有されるＣｐＧ部位の含量が４５以下、好ましくは４０以下、より好ましくは２０以下、特に、１０以下、より特定すると５以下、最も特定すると０である（ＣｐＧ部位は、完全に除去されている）。
【００９５】
さらなる態様では、本開示は、発現ベクター、好ましくは、前出で記載した発現カセットを含む哺乳動物の発現ベクターを提供する。一部の実施形態では、発現ベクターが、少なくとも２つの個別の転写単位を含む。２つの個別の転写単位を伴う発現ベクターはまた、二重遺伝子ベクターとも称する。その例は、第１の転写単位が、抗体またはその断片の重鎖をコードし、第２の転写単位が、抗体の軽鎖をコードするベクターである。別の例は、２つの転写単位が、酵素などのタンパク質の２つの異なるサブユニットをコードする二重遺伝子ベクターである。しかしまた、本発明の発現ベクターが、２つを超える個別の転写単位、例えば、それらの各々が、異なるポリペプチド鎖をコードする異なるヌクレオチド配列を含む、３つ、４つ、またはこれをなお超える個別の転写単位を含むことも可能である。したがって、例は、それらの各々が、４つの異なるサブユニットからなる酵素の１つのサブユニットをコードする異なるヌクレオチド配列を含有する、４つの個別の転写単位を伴うベクターである。
【００９６】
一部の実施形態では、発現ベクターが、さらなるプロモーター、エンハンサー、転写制御エレメント、複製起点、および選択マーカーからなる群から選択される遺伝子エレメントをさらに含む。
【００９７】
一部の実施形態では、発現ベクターが、複製起点および選択マーカーをさらに含み、複製起点および選択マーカーをコードする発現ベクターのポリヌクレオチド配列中に含有されるＣｐＧ部位の含量が２００以下、好ましくは１５０以下、特に、１００以下、より特定すると５０以下、最も特定すると３０以下である。
【００９８】
本発明の発現カセットまたは発現ベクターには、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ピューロマイシン、ネオマイシン、またはグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）など、一般に使用される任意の選択マーカーを用いることができる。本発明の発現ベクターはまた、本発明の異種タンパク質を分泌させるための発現のカセットを挿入するのに有用な限定数の制限部位も含むことが好ましい。特に、一過性／エピソーム発現だけに用いる場合、本発明の発現ベクターは、真核生物の宿主細胞における自己複製／エピソーム維持のために、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）またはＳＶ４０ウイルスに由来するｏｒｉＰなどの複製起点をさらに含みうるが、選択マーカーを欠いていてもよい。また、ベクターの複製を容易にする関与性の因子を欠く細胞における一過性発現も可能である。発現カセットを保有する発現ベクターは、蛍光マーカーをコードする発現カセット、ｎｃＲＮＡをコードする発現カセット、抗アポトーシスタンパク質をコードする発現カセット、または分泌経路の能力を増大させるタンパク質をコードする発現カセットをさらに含みうる。
【００９９】
さらなる態様では、本開示は、ａ）またはｂ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合は、ｆ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列であり、ａ）またはｂ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列である場合は、ｆ）が、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列であるという条件で、
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）プロモーター
ｃ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｄ）ポリアデニル化部位
ｅ）エンハンサー
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、または
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）エンハンサー
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、または
ａ）エンハンサー
ｂ）真核生物ＧＡＰＤＨの上流および／もしくは下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）真核生物ＧＡＰＤＨの下流および／もしくは上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターであって、エンハンサーの組入れが任意選択であり、ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが、ＧＡＰＤＨではなく、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、約１００〜約１５０００ヌクレオチドであり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの５’端近傍〜−３５００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが、約１００〜約１５０００ヌクレオチドである発現ベクターを提供する。
【０１００】
一部の実施形態では、本開示は、
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）プロモーター
ｃ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｄ）ポリアデニル化部位
ｅ）エンハンサー
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０１】
さらなる態様では、本開示は、
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）エンハンサー
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０２】
さらなる態様では、本開示は、
ａ）エンハンサー
ｂ）真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０３】
さらなる態様では、本開示は、
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）プロモーター
ｃ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｄ）ポリアデニル化部位
ｅ）エンハンサー
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０４】
さらなる態様では、本開示は、
ａ）真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｂ）エンハンサー
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０５】
さらなる態様では、本開示は、
ａ）エンハンサー
ｂ）真核生物ＧＡＰＤＨの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
ｃ）プロモーター
ｄ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
ｅ）ポリアデニル化部位
ｆ）エンハンサーの組入れが任意選択である、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列
を順に含む発現ベクターを提供する。
【０１０６】
発現ベクターの、真核生物ＧＡＰＤＨの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列、エンハンサー、プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ポリアデニル化部位、および真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、例えば、前出で記載した通りである。
【０１０７】
さらなる態様では、本開示は、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ヒト細胞の場合もあり、非ヒト細胞の場合もある。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の好ましい例には、ヒト胎児由来腎臓細胞（Ｇｒａｈａｍ  ＦＬら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７４）、ＭＲＣ５ヒト線維芽細胞、９８３Ｍヒト黒色腫細胞、ＭＤＣＫイヌ腎臓細胞、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離されたＲＦ培養ラット肺線維芽細胞、Ｂ１６ＢＬ６マウス黒色腫細胞、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞、ＭＴｌ  Ａ２マウス乳腺がん細胞、ＰＥＲ：Ｃ６細胞（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ細胞系（Ｐｕｃｋら、１９５８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１０８：９４５〜９５５）が含まれるがこれらに制約されない。
【０１０８】
特定の好ましい実施形態では、宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ細胞系である。適するＣＨＯ細胞系には、例えば、ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＨＯ  Ｋｌ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ  ｐｒｏ３−、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  Ｐ１２、またはｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞系であるＤＵＫ−ＢＩＩ（Ｃｈａｓｉｎら、ＰＮＡＳ  ７７、１９８０、４２１６〜４２２０）、ＤＵＸＢＩ  ｌ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、ＰＮＡＳ  ８０、１９８３、２４９５〜２４９９）、またはＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が含まれる。
【０１０９】
さらなる態様では、本開示は、ポリペプチドを発現させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、宿主細胞に、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターをトランスフェクトするステップと、ポリペプチドを回収するステップとを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供
する。ポリペプチドは、異種ポリペプチド、より好ましくは、ヒトポリペプチドであることが好ましい。
【０１１０】
発現カセットまたは発現ベクターを、本発明に従う宿主細胞へとトランスフェクトするために、所与の宿主細胞型に適切であれば、当技術分野で周知のトランスフェクション法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクションなど、任意のトランスフェクション法を使用することができる。本発明の発現カセットまたは発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞は、一過性にまたは安定的にトランスフェクトされた細胞系として見なされるべきことに注意されたい。したがって、本発明に従えば、本発現カセットまたは本発現ベクターは、エピソームとして維持する、すなわち、一過性にトランスフェクトすることもでき、宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込む、すなわち、安定的にトランスフェクトすることもできる。
【０１１１】
一過性トランスフェクションは、ベクターが保有する選択マーカーについての選択圧の非適用を特徴とする。一般に、トランスフェクション後２〜最大で１０日間にわたり続く一過性発現実験では、トランスフェクトされた発現カセットまたは発現ベクターを、エピソームエレメントとして維持し、いまだゲノムには組み込まない。すなわち、トランスフェクトされたＤＮＡは通例、宿主細胞ゲノムへと組み込まれない。一過性にトランスフェクトされた細胞プールを培養すると、宿主細胞は、トランスフェクトされたＤＮＡを喪失し、トランスフェクトされた細胞を集団内で過剰成長させる傾向がある。したがって、発現は、トランスフェクション直後の時期において最も強く、時間と共に低減される。本発明に従う一過性トランスフェクト細胞は、選択圧の非存在下にある細胞培養物中で、トランスフェクションの２〜１０日後の時点まで維持される細胞として理解されることが好ましい。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞、例えば、ＣＨＯ宿主細胞に、本発明の発現カセットまたは発現ベクターを安定的にトランスフェクトする。安定的トランスフェクションとは、ベクターＤＮＡなど、新たに導入された外来ＤＮＡが、通例では、ランダムな非相同組換えイベントによりゲノムＤＮＡへと組み込まれることを意味する。宿主細胞のＤＮＡへの組込み後にベクター配列が増幅された細胞系を選択することにより、ベクターＤＮＡのコピー数と遺伝子産物の量とを共時的に増大させることができる。したがって、このような安定的組込みは、遺伝子増幅についての選択圧のさらなる増大へと曝露されると、ＣＨＯ細胞において、微細な二重染色体をもたらすことが可能である。さらに、安定的トランスフェクションは、例えば、ゲノムへと組み込まれると余分なものとなる細菌性のコピー数制御領域など、組換え遺伝子産物の発現と直接には関連しないベクター配列部分の喪失を結果としてもたらしうる。したがって、トランスフェクトされた宿主細胞のゲノムには、発現カセットまたは発現ベクターの少なくとも一部分または異なる部分が組み込まれている。
【０１１３】
さらなる態様では、本開示は、哺乳動物の宿主細胞に由来する異種ポリペプチドを発現させるための、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターの使用、特に、哺乳動物の宿主細胞に由来する異種ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発現させるための、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターの使用を提供する。
【０１１４】
タンパク質の発現および回収は、当業者に公知の方法に従い実行することができる。
【０１１５】
ポリペプチドを発現させるためには、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターの、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列と、前出で記載した宿主細胞とを用いるが、これらは通例は同じ由来である。驚くべきことに、発現の増大は、発現カセットまたは発現ベクターの、真核生物ＧＡＰＤＨプロモ
ーターの下流および／または上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列と、宿主細胞とが異なる由来である場合、例えば、真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流および／または上流のヒトＤＮＡ配列が、ＣＨＯ細胞において用いられる場合に得られることが見出されている。
【０１１６】
さらなる態様では、本開示は、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターの、障害を処置するための医薬を調製するための使用を提供する。
【０１１７】
さらなる態様では、本開示は、障害を処置するための医薬として用いられる、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターを提供する。
【０１１８】
さらなる態様では、本開示は、遺伝子治療で使用するための、前出で記載した発現カセットまたは発現ベクターを提供する。
【実施例１】
【０１１９】
発現ベクターのクローニング
Ｉ．材料および方法
Ｉ．１  プラスミド構築物
Ｉ．１．１．ＬＢ培養プレート
５００ｍｌの水を混合し、１６ｇのＬＢ寒天（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）（１リットルのＬＢは、１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、および１０ｇのＮａＣｌを含有する）と共に煮沸した。冷却後、それぞれの抗生剤を溶液へと添加し、次いで、これを播種した（アンピシリンプレートには１００μｇ／ｍｌで播種し、カナマイシンプレートには５０μｇ／ｍｌで播種した）。
【０１２０】
Ｉ．１．２．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
全てのＰＣＲは、５０μｌの最終容量中に１μｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰにつき１０ｍＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２単位のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、２５ナノモルのプライマーＡ（Ｍｙｃｒｏｓｙｎｔｈ、Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、２５ナノモルのプライマーＢ（Ｍｙｃｒｏｓｙｎｔｈ、Ｂａｌｇａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１０μｌの５倍濃度のＨＦ緩衝液（７．５ｍＭのＭｇＣｌ2；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、１．５μｌのジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、および１〜３μｌの鋳型（１〜２μｇ）を用いて実施した。用いられる全てのプライマーを、表１に列挙する。
【０１２１】
ＰＣＲは、９８℃で３分間にわたる初期変性によって開始し、続いて、９８℃で３０秒間にわたる変性、プライマー特異的温度（ＣＧの含量に従う）で３０秒間にわたるアニーリング、および７２℃で２分間にわたる伸長による３５サイクルを行った。７２℃で１０分間にわたる最終伸長は、冷却および４℃における保存の前に実施した。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
Ｉ．１．３．制限消化
全ての制限消化では、約１μｇのプラスミドＤＮＡ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）で定量化した）を、１０〜２０単位の各酵素、４μｌの対応する１０倍濃度のＮＥＢｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）と混合し、無菌のＨ2Ｏで容量を４０μｌの満量とした。さらに表示しない限り、消化物は
、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。
【０１２４】
各骨格の調製的消化後、１単位のＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＰ；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を添加し、混合物を３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。ＮＥＢｕｆｆｅｒ３（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で消化を行った場合は、この酵素が、この緩衝液中で強力な活性を有し、また、ヌクレオチドの一部も末端で消化しうるために、ＣＩＰを添加する前に、緩衝液を、ＮＥＢ緩衝液４へと交換した。
【０１２５】
Ｉ．１．４．ＰＣＲ産物の精製およびアガロースゲルによる電気泳動
Ｉ．１．４．１．ＰＣＲ産物の清浄化
消化を可能とするために、制限消化の前に、製造元のマニュアルに従い、４０μｌの溶出緩衝液を用いるＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、全てのＰＣＲ断片を除去した。このプロトコールはまた、ＤＮＡ試料の緩衝液を交換するのにも用いた。
【０１２６】
Ｉ．１．４．２．ＤＮＡの抽出
ゲル電気泳動のために、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）Ａｇａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）および５０倍濃度のＴｒｉｓ  Ａｃｅｔｉｃ
Ａｃｉｄ  ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＡＥ、ｐＨ８．３；Ｂｉｏ  ＲＡＤ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１％のゲルを調製した。ＤＮＡを染色するために、１μｌのＧｅｌ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｔｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、１００ｍｌのアガロースゲルへと添加した。サイズマーカーとして、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）２μｇを用いた。電気泳動は、１２５ボルトで約１時間にわたり行った。対象のバンドをアガロースゲルから切り出し、製造元のマニュアルに従い、４０μｌの溶出緩衝液を用いるキットであるＥｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。
【０１２７】
Ｉ．１．５．ライゲーション
各ライゲーションのために、４μｌの挿入配列を、１０μｌの容量中に１μｌのベクター、４００単位のリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１μｌの１０倍濃度のリガーゼ緩衝液（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）へと混合した。混合物を、室温で１〜２時間にわたりインキュベートした。
【０１２８】
Ｉ．１．６．ライゲーション産物のコンピテント細菌への形質転換
ｐＧＬＥＸ４１−［ＲＥＰ］をクローニングし、基準の複製起点を含有するｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターを伴う構築物を作製するために、ＴＯＰ  １０（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ  １０  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた。
【０１２９】
Ｒ６Ｋ複製起点を含有するプラスミドの複製を開始させるには、ＰＩＲ配列によりコードされるπタンパク質の発現が要請される。πタンパク質は、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＰＩＲ１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に発現させる。これらの細菌を、Ｒ６Ｋ配列を含有する全てのベクターに用いた。
【０１３０】
コンピテント細菌に、ライゲーション産物を形質転換するために、２５〜５０μｌの細菌を、氷上で５分間にわたり融解させた。次いで、３〜５μｌのライゲーション産物を、コンピテント細菌へと添加し、氷上で２０〜３０分間にわたりインキュベートしてから、４２℃で１分間にわたる熱ショックにかけた。次いで、チューブを介して、５００μｌのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加し、撹拌下、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。最後に、細菌を、アンピシリンを伴うＬＢプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）上に置き、３７℃で一晩にわたりインキュベートした。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにおけるクローニングのためには、カナマイシンを伴うプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いた。
【０１３１】
Ｉ．１．７．小スケール（ミニ）および中程度スケール（ミディ）におけるプラスミドの調製
Ｉ．１．７．１．ミニプレパレーション
ミニプレパレーションのために、形質転換された細菌のコロニーを、２．５ｍｌのＬＢおよびアンピシリンまたはカナマイシン中、３７℃、２００ｒｐｍで６〜１６時間にわたり成長させた。ＤＮＡは、提供されるマニュアルに従い、Ｅ．ｃｏｌｉ用のプラスミド精製キット（ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により抽出した。
【０１３２】
ミニプレパレーションに由来するプラスミドＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）で、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、１．８〜２の間でなくてはならないＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍの比を評価することにより、１回定量化した。対照の消化は、配列を確認するために、試料をＦａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ（Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へと送付する前に実施した。
【０１３３】
ＢＡＣ抽出のためには、プロトコールを以下の通りに改変して、ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。１０ｍｌのＬＢおよびクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に、ｐＢＡＣｅ３．６ベクターを含有する細菌を播種した。振とうプラットフォーム上、３７℃で一晩にわたるインキュベーション後、培養物を、１３３００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離してから、５００μｌのＡ１緩衝液中に再懸濁させた。５００μｌのＡ２溶解緩衝液を添加し、溶液を、室温で５分間にわたりインキュベートした。次いで、溶液を、６００μｌのＡ３緩衝液で中和し、１３３００ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離した。上清をカラムに投入し、このステップ以降、ＱｕｉｃｋＰｕｒｅミニプレップキットの標準プロトコールを用いた。
【０１３４】
Ｉ．１．７．２．ミディプレパレーション
ミディプレパレーションのために、形質転換された細菌を、２００〜４００ｍｌのＬＢおよびアンピシリン（またはカナマイシン）中、３７℃で一晩にわたり成長させた。次いで、培養物を、７２５ｇで２０分間にわたり遠心分離し、製造元のマニュアルにおいて提示される低量プラスミドプロトコールに従い、市販のキット（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、プラスミドを精製した。
【０１３５】
ミディプレパレーションに由来するプラスミドＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで３回にわたり定量化し、制限消化により確認し、最後に、配列決定のために送付した（Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１３６】
ＩＩ．結果および考察
ＩＩ．１．ＧＡＰＤＨ発現カセットの上流および下流（ＧＡＰＤＨの５’側および３’側）におけるＤＮＡ領域のクローニング
ＢＡＣクローンであるＲＰＣＩＢ７５３Ｆ１１８４１Ｑを、Ｉｍａｇｅｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で注文した。このクローンは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するｐＢＡＣｅ３．６ベクター骨格内に、ヒトＧＡＰＤＨ配列を含有する。ミニプレパレーションによるＤＮＡの抽出後、ベクター濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、２７ｎｇ／μｌと決定した。
【０１３７】
プロモーターの上流およびポリアデニル化部位の下流において、ＧＡＰＤＨ発現カセットをじかに取り囲むＤＮＡ配列を、２７ｎｇの精製クローンであるＲＰＣＩＢ７５３Ｆ１１８４１Ｑを鋳型として用いるＰＣＲで増幅した。プロモーターの上流の３ｋｂの断片は、プライマーＧｌｎＰｒ１１７１（配列番号１）およびＧｌｎＰｒ１１７２（配列番号２）で増幅して、配列番号５を伴う単位複製配列をもたらした。プライマーＧｌｎＰｒ１１７２（配列番号２）は、鋳型配列に照らした塩基変化（ＧからＴへの）を保有するので、このＰＣＲ反応に由来する全ての配列もまた、この塩基変化を保有することになる。変化は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の転写開始点に照らした−３７２１位（配列番号１７のｂｐ  ８１２、配列番号５の始点に照らした２３位）に位置する。ポリアデニル化部位の下流の３ｋｂの断片は、プライマーＧｌｎＰｒ１１７３（配列番号３）およびＧｌｎＰｒ１１７４（配列番号４）で増幅して、配列番号６を伴う単位複製配列をもたらした（表１）。これらのＰＣＲに用いられたアニーリング温度は、７２℃であった。
【０１３８】
５’側および３’側のＧＡＰＤＨ断片（配列番号５および６）は、市販のＰＣＲ産物クローニングベクターであるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ＰＣＲ  Ｚｅｒｏ
Ｂｌｕｎｔクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でクローニングした。ライゲーション産物は、ＴＯＰ１０コンピテント細菌へと形質転換し、カナマイシンＬＢ寒天プレート上に播種した。コロニーを増幅し、プラスミドを、ミニプレップにより単離した。対照の消化を実施して、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−５’ＧＡＰＤＨ構築物およびｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−３’ＧＡＰＤＨ構築物をもたらす陽性クローンを同定した。
【０１３９】
ＩＩ．２．レポータータンパク質であるＧＦＰおよび組換えＩｇＧ１モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ断片（ＬＣ−ＩＲＥＳ−ＨＣ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）の調製
本研究において用いられるレポーター構築物（ＲＥＰ）：ＩｇＧ１モノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）−ＩＲＥＳ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）−ＩＲＥＳ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ポリシストロニック遺伝子内に存在させた。脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の存在（Ｇｕｒｔｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２２９（１）：２９５〜２９８、１９９６））は、３つのペプチドであるＩｇＧ１モノクローナル抗体の軽鎖（ＬＣ）、ＩｇＧ１モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）、およびＧＦＰの翻訳を可能とする（図１）。したがって、トランスフェクトされた細胞は、ＩｇＧ１モノクローナル抗体を分泌し、細胞内ＧＦＰを依存的な形で蓄積することになる。しかし、真核細胞では、ポリシストロニックのｍＲＮＡが一般的でなく、それらの翻訳は、それほど効率的でなく、比較的低力価のＩｇＧ１およびＧＦＰの発現をもたらす。
【０１４０】
ＲＥＰ構築物を含有するベクターは、制限酵素であるＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩを用いて（ＢｓｔＢＩは、６５℃で用いる）消化した。発現構築物を含有するＲＥＰ断片を切り出し、精製し、さらなるクローニングステップのために用いた。
【０１４１】
ＩＩ．３．発現ベクターのクローニング
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に由来する発現ベクターであるｐＧＬＥＸ４１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、安定的な細胞系を作製するために用いた。ｐＧＬＥＸ４１ベクターは、ＧＡＰＤＨ配列を伴う第２世代のベクターＡおよびＧＡＰＤＨ配列を伴わない第２世代のベクターＢを創出するように改変された初期骨格として用いた。全てのベクターに、同じプロモーター−イントロンの組合せ（ｍＣＭＶおよび１番目のイントロンをコードするドナー−アクセプター断片（ＩｇＤＡ））を用いた（Ｇｏｒｍａｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７：５４５９〜５４６３）。
【０１４２】
中間体ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＨＭ−ＭＣＳ−ａｍｐｉＡのクローニング：
ｐＧＬＥＸ４１から、新たなベクター世代の開発を開始した。アンピシリン耐性カセットを放出するために、このベクターを、制限酵素であるＮｒｕＩおよびＢｓｐＨＩを用いて切断した。骨格断片は、ＣＩＰ処理して、ゲル電気泳動により精製した。アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａプロモーターを含めた）のコドン最適化（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について）形をコードするＤＮＡ断片は、ＧｅｎｅＡｒｔから注文した。制限酵素であるＮｒｕＩおよびＢｓｐＨＩ（骨格のために用いた酵素と同じ酵素）を用いて、挿入配列を、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターである＃１０１３２３７から切り出し、精製し、骨格へとクローニングした。制限消化により、ミニプレップを解析した。クローンであるｐＧＬＥＸ４１−ＨＭ−ＭＣＳ−ａｍｐｉＡ＃２は、予測される制限プロファイルを有し、適正な断片の組込みは、配列決定により確認した。
【０１４３】
中間体ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡのクローニング
ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＨＭ−ＭＣＳ−ａｍｐｉＡ＃２の複製起点であるｐＵＣを交換するために、ベクターを、ＰｖｕＩおよびＢｓｐＨＩを用いて消化した。骨格断片は、ＣＩＰ処理して、精製した。新たな挿入配列断片は、Ｒ６Ｋ複製起点と、発現カセットの部分としての、改変ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）配列とを含有する。ＳＶ４０  ｐｏｌｙ（Ａ）近傍の不要な細菌性骨格配列またはウイルス性骨格配列は取り除いた（下記の表２を参照されたい）。挿入配列断片は、ＧｅｎｅＡｒｔから注文し、酵素であるＰｖｕＩおよびＢｓｐＨＩ（骨格のために用いた酵素と同じ酵素）を用いて、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターである＃１０１３２３８から切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、配列解析により確認した。クローンであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ＃１は、適正な配列を有した。
【０１４４】
【表２】
2019193659.tif 000004
【０１４５】
中間体ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢのクローニング
ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ＃１を、制限酵素であるＢｓｐＨＩを用いて切断し、アンピシリン耐性カセットを放出するためにＣＩＰ処理した。新たな挿入配列断片は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化されたアンピシリン耐性コドンは含有するが、代替的なコドン使用により取り除くことのできた全てのＣｐＧ配列は置きかえられていた（上記の表２を参照されたい）。この断片は、ＧｅｎｅＡｒｔで注文した。挿入配列断片を放出するために、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターである＃１０１６１３８を、ＢｓｐＨＩを用いて消化した。挿入配列および骨格断片のいずれも、ゲル電気泳動により精製した後でライゲーションし、ＰＩＲ１細菌へと形質転換した。ミニプレップは、配列決定のために直接送付した。ｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ＭＣＳ−ａｍｐｉＢ＃１は、適正な配列を有し、さらなるクローニングステップのために用いられた。
【０１４６】
ｐＧＬＥＸ４１から導出された発現ベクターにおけるレポーター構築物のクローニング
レポーター構築物であるＲＥＰを、発現ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡおよびｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢにおいてクローニングするために、制限酵素であるＮｈｅＩおよびＣｌａＩを用いて、ベクターを切断した。発現ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＨＭ−ＭＣＳを、制限酵素であるＮｈｅＩおよびＢ
ｓｔＢＩを用いて切断した（６５℃で）。消化後、全てのベクター骨格を、ＣＩＰで処理し、骨格を、ゲル電気泳動により精製した。骨格を、レポーター構築物であるＲＥＰをコードするＮｈｅＩ／ＢｓｔＢＩ（ＢｓｔＢＩは、ＣｌａＩと適合性である）断片とライゲーションした。ライゲーション産物は、ＰＩＲ１コンピテント細菌またはＴＯＰ  １０コンピテント細菌へと形質転換し、アンピシリンＬＢ寒天プレート上に播種した。コロニーを増幅し、プラスミドを、ミニプレップにより単離した。陽性クローンは、ミニプレップの制限消化およびＦａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡによるその後の配列確認を介して同定することができた。
【０１４７】
ｐＧＬＥＸ４１から導出した発現ベクターにおけるＧＡＰＤＨフランキング配列の付加
本段落の全ての制限消化は、８０μｌの最終容量中で実施し、３７℃で一晩にわたりインキュベートした。
【０１４８】
５’側ＧＡＰＤＨ配列（配列番号７）は、制限酵素であるＮｒｕＩを用いて、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−５’ＧＡＰＤＨから切り取られ、ＮｒｕＩを用いて直鎖化され、再環状化を回避するためにＣＩＰで処理された発現ベクターである、ｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−［ＲＥＰ］およびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−［ＲＥＰ］においてライゲーションした。ＰＩＲ１コロニー（ライゲーション産物の形質転換により得られる）の増幅後、制限消化により、ミニプレップを解析した。クローンであるｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−５’ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］＃２およびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−５’ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］＃１は、制限解析において、予測されるサイズのバンドを示したが、これは、その後、配列決定により確認され、さらなるクローニングステップのために用いられた。次いで、これらの新たなベクターを、ＳｃａＩで切断し、ＣＩＰで処理した。３’側ＧＡＰＤＨ断片（配列番号８）は、同じ酵素を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−３’ＧＡＰＤＨから切り取り、発現ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］およびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］を創出するために、２つの骨格へとライゲーションした。
【０１４９】
クローンであるｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］＃２およびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−ＧＡＰＤＨ−［ＲＥＰ］＃８に対する対照の消化は、制限解析において、予測されるサイズのバンドを示した。適正な配向における３’側ＧＡＰＤＨ断片の挿入は、その後、配列決定（Ｆａｓｔｅｒｉｓ）により確認した。
【０１５０】
ＩＩ．４．耐性ベクターのクローニング
耐性ベクターをクローニングするための出発点は、ベクターｐＧＬＥＸ−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ＃１であった。耐性遺伝子の発現については、弱いプロモーターで十分であり、ｍＣＭＶプロモーターを、ＳＶ４０プロモーターで置きかえた。耐性遺伝子をコードする遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＳＡ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から注文し、チャイニーズハムスターにおける発現について最適化（ピューロマイシン：ｐｕｒｏＡおよびネオマイシン：ｎｅｏＡ）するか、または選択的コドン使用によりＣｐＧ含量を低減（ピューロマイシン：ｐｕｒｏＢおよびネオマイシン：ｎｅｏＢ）した。
【０１５１】
ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ＡｍｐｉＡ−ＰｕｒｏＡ／ＰｕｒｏＢのクローニング：
発現カセットにおいてピューロマイシン耐性をクローニングするために、制限酵素であるＮｒｕＩおよびＸｂａＩを用いて、ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ＃１を切断した後、ＣＩＰで処理した。挿入配列断片をＧｅｎｅＡｒｔから注文し、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターである＃１０１３２３９における挿入配列として用意した。挿入配列は、ピューロマイシン耐性のためのＳＶ４０プロモーターおよびコドン最適化遺伝子（ＣＨＯ細胞によるコドン使用について）を含有する。挿入配列を、酵素であるＮｒｕＩおよびＸｂａＩ（骨格のために用いた酵素と同じ酵素）を用いて、Ｇ
ｅｎｅＡｒｔクローニングベクターから切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、制限消化により解析した。クローンであるｐＧＬＥＸ−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ｐｕｒｏＡ＃１は、適正なプロファイルを示し、これは、配列決定により確認することができた。
【０１５２】
このベクターを、ＳＶ４０プロモーターはそのままにして、コード領域をピューロマイシン耐性遺伝子と交換することにより、ベクターであるｐＧＬＥＸ−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ｐｕｒｏＢをクローニングするために用いた。新たな挿入配列断片は、代替的なコドン使用のために取り除くことのできた全てのＣｐＧ配列が置きかえられた、ピューロマイシン遺伝子のコドン最適化形を含有する。断片は、ＧｅｎｅＡｒｔから注文し、クローニングベクターである＃１０１６１３９内に送達した。挿入配列断片を放出するために、ＧｅｎｅＡｒｔベクターを、制限酵素であるＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。挿入配列断片を、ゲル電気泳動により精製し、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いる制限消化による、ピューロマイシンのオープンリーディングフレームを放出した後で、ｐＧＬＥＸ−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ｐｕｒｏＡの骨格へとクローニングした後、ＣＩＰで処理した。結果として得られるベクターであるｐＧＬＥＸ−ＭＣＳ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ｐｕｒｏＢ＃１は、配列解析により直接確認した。
【０１５３】
ベクターであるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ＮｅｏＡおよびｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＡ−ＮｅｏＢのクローニング
ネオマイシン耐性を、発現カセットにおいてクローニングするために、制限酵素であるＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて、ベクターであるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＡ＃１を切断した後、ＣＩＰで処理した。挿入配列断片は、ＧｅｎｅＡｒｔから注文し、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターである＃１０１３２４２（ｎｅｏＡ）および＃１０２６８９４（ｎｅｏＢ）における挿入配列として用意した。挿入配列断片はそれぞれ、ネオマイシン耐性のための、ＣＨＯ細胞によるコドン使用についてのコドン最適化遺伝子およびネオマイシン耐性のＣｐＧ低減形を含有する。挿入配列を、酵素であるＸｂａＩおよびＮｏｔＩ（骨格のために用いた酵素と同じ酵素）を用いて、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターから切り出し、精製し、骨格断片へとクローニングした。ミニプレップを調製し、クローンを配列決定により確認した。
【０１５４】
ベクターであるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−ＮｅｏＢおよびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−ｐｕｒｏＢのクローニング：
ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＢ＃１を、制限酵素であるＢｓｐＨＩを用いて切断し、その後、ＣＩＰ処理した。挿入配列断片は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現についてコドン最適化されたアンピシリン耐性遺伝子を含有する一方で、代替的なコドン使用のために取り除くことのできた全てのＣｐＧ配列が置きかえられていた。この断片は、ＧｅｎｅＡｒｔに注文され、クローニングベクターである＃１０１６１３８により着荷した。挿入配列断片を放出するために、ＧｅｎｅＡｒｔクローニングベクターを、ＢｓｐＨＩを用いて消化した。挿入配列および骨格断片のいずれも、ゲル電気泳動により精製した後でライゲーションし、ＰＩＲ１細菌へと形質転換した。ミニプレップは、配列決定のために直接送付し、確認することができた（ｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＢ−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＢ＃１）。
【０１５５】
骨格断片を創り出すために、制限酵素であるＢｓｐＨＩを用いて、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＡを切断することにより、ベクターであるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＢをもたらすクローニングを行った。同じ制限酵素の組合せを用いるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ａｍｐｉＢ−ｈｙｇｒｏＢの消化により、ａｍｐｉＢをコードする挿入配列断片がもたらされた。ａｍｐｉＢ挿入配列を、骨格であるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＡへとクローニングした。
【０１５６】
ＩＩ．５ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の上流および下流の配列の、耐性ベクターへの付加
５’側ＧＡＰＤＨ挿入配列（３１６４ｂｐ）を得るために、ベクターであるｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ−５’ＧＡＰＤＨを、ＮｒｕＩで消化した。耐性遺伝子をコードするベクターをＮｒｕＩで消化し、その後、骨格断片を調製するために、ＣＩＰ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で処理した。４つの異なる骨格断片（ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＡ−ａｍｐｉＡ、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＢ、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＡ−ａｍｐｉＡ、およびｐＧＬＥＸ−ｐｕｒｏＢ−ａｍｐｉＢ）を、３１６４ｂｐの５’側ＧＡＰＤＨ挿入配列とライゲーションし、ＰＩＲ１コンピテント細菌へと形質転換した。ＡｐａｌＩを用いるミニプレップの制限消化は、クローンであるｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＢ−５’ＧＡＰＤＨ＃５、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＡ−ａｍｐｉＡ−５’ＧＡＰＤＨ＃６、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＡ−ａｍｐｉＡ−５’ＧＡＰＤＨ＃１６、およびｐＧＬＥＸ−ｐｕｒｏＢ−ａｍｐｉＢ−５’ＧＡＰＤＨ＃５の同定を可能とした。
【０１５７】
次いで、ライゲーションのための骨格を調製するために、これらの中間体ベクターを、制限酵素であるＳｃａＩで切断し、ＣＩＰで処理した。ＧＡＰＤＨの下流のフランキング領域である、挿入配列断片（３２２４ｂｐ）を放出するために、ＳｃａＩを用いて、第２の挿入配列断片であるｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−３’ＧＡＰＤＨを保有するベクターを切断した。４つの異なる骨格分子を、精製された３２２４ｂｐの挿入配列断片とライゲーションし、ＰＩＲ１コンピテント細胞へと形質転換した。制限消化により、ミニプレップを解析した。予測されるサイズの制限断片を示すクローンは、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＢ−ａｍｐｉＢ−ＧＡＰＤＨ＃８、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｎｅｏＡ−ａｍｐｉＡ−ＧＡＰＤＨ＃１、ｐＧＬＥＸ−Ｒ６Ｋ−ｐｕｒｏＡ−ａｍｐｉＡ−ＧＡＰＤＨ＃１、およびｐＧＬＥＸ−ｐｕｒｏＢ−ａｍｐｉＢ−ＧＡＰＤＨ＃４であった。その後、クローンを配列決定解析により確認した（Ｆａｓｔｅｒｉｓ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１５８】
ＩＩ．１．５．トランスフェクション用にクローニングされたプラスミドのミディプレパレーション
十分量のプラスミドをもたらすために、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌキット（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ミディプレップを調製した。制限消化および配列決定による確認後、プラスミドを直鎖化し、ＣＨＯ−Ｓ細胞におけるトランスフェクションのために用いた。表３は、ミディプレパレーションにおいて得られるプラスミドＤＮＡバッチの濃度、トランスフェクション用に調製された直鎖化ＤＮＡプレップ、直鎖化のために用いた酵素、およびＦａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡによる、それぞれのプラスミドの同一性および配列情報を確認する配列ファイルについてまとめる。全てのミディプレップは、配列決定により確認してから、トランスフェクション用に用いた。
【０１５９】
【表３】
2019193659.tif 000005
【実施例２】
【０１６０】
発現ベクターによる細胞のトランスフェクション：
１．材料および方法
ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＨＥＫ２９３細胞
哺乳動物細胞は、組換えタンパク質の適正なフォールディング、アセンブリー、および
転写後修飾が可能であるために、タンパク質を発現させるのに好ましい宿主である。十分に特徴付けられており、大半のヒト病原性ウイルスの宿主として用いられないことから、安定的な治療用タンパク質の産生のための比較的安全な宿主となっているために、ＣＨＯ細胞系を用いた。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ−２  ＣＤ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）中に懸濁させて培養し、３７℃、５％のＣＯ2、および湿度
８０％の振とう（２．５ｃｍの環状ストロークを伴う２００ｒｐｍ）インキュベーター内でインキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクトするのが容易であり、組換えタンパク質の低グラム量までの迅速な産生を可能とするために用いる。用いられる細胞は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）であり、Ｅｘ−ｃｅｌｌ  ２９３培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＩ）中に懸濁させて日常的に培養される。
【０１６１】
ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の継代培養は、新鮮な培地中に１ｍｌ当たり０．５×１０6個の生細胞の播種密度を用いて、３〜４日間ごとに日常的に実行
した。細胞は、ガス交換を可能とする透過性フィルターを含有する５０ｍｌのバイオリアクターチューブ（ＴｕｂｅＳｐｉｎ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ５０；ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で１０ｍｌの培地を用いて培養した。細胞の生存可能性および細胞濃度は、トリパンブルー細胞除外法を用いて、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動式細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定した。細胞濃度は、ＣＨＯ−Ｓ細胞用のＰＣＶチューブ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ヘマトクリット値（ＰＣＶ）を決定することにより確認した。
【０１６２】
ヘマトクリット値（ＰＣＶ）
ＰＣＶ法は、ミニＰＣＶチューブ（ＰＣＶ  Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｔｕｂｅ；ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、５０００ｒｐｍで１分間にわたる、特定容量の培養液の遠心分離に基づく。遠心分離時において、細胞は、チューブ底部の目盛り付き毛細管内でペレット化する。次いで、ペレットの容量を、遠心分離された細胞培養物流体の量との関係で評価することにより、ヘマトクリット値の百分率を決定する。例えば、１％のＰＣＶは、１０μｌの細胞ペレットが１ｍｌの培養物流体中に存在することを示した。
【０１６３】
細胞に対して日常的な細胞カウンティングを施すため、２００μｌの各試料を、ＰＣＶチューブ内にピペティングし、対応するペレットの容量（μｌ単位）を、ルーラー（「読取りの容易な」測定デバイス；ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で読み取った。この容量に５を乗じて、１ｍｌに応じる値を求め、次いで、これに細胞特異的な相関係数を用いて乗算を施し、生細胞濃度の推定値（１ｍｌ当たりの細胞百万個の単位の）を得た。
【０１６４】
「自動式」細胞カウンティング
試料を同じ量のトリパンブルーと混合して、細胞濃度および細胞の生存可能性を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動式細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により決定した。次いで、溶液を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）のチャンバースライドへとピペティングしてから、測定器に読み取らせた。この測定器は、較正後に細胞の生存可能性ならびに死細胞および生細胞の濃度を決定するＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーの自動式読取りを可能とする。
【０１６５】
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリーとは、個別の細胞の複数のパラメータを解析するための技法である。この技法は、互いと表現型的に異なる細胞、例えば、生細胞と異なる死細胞（細胞のサイズおよび粒度に従う）の定量的解析および定性的解析を可能とする。フローサイトメトリーはまた、ＧＦＰなど、対象のタンパク質を発現させる細胞の定量化も可能とする。細胞は、３００μｌの試料の無菌のピペティングにより培養物から回収し、４８８ｎｍで発光する空冷式アルゴンレーザーを装備した蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）により解析した。解析は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアにより行った。ＧＦＰによる発光は、５３０／３０ｎｍのバンドパスフィルターを用いるＦＬ−１により検出した。
【０１６６】
第１のゲートでは、細胞破砕物のほか、均等目盛り上のＳＳＣ／ＦＳＣドットプロット内の死細胞を解析から除外した。次いで、生細胞によるＧＦＰ蛍光を、対数目盛り上のヒストグラムに表した。蛍光分布の中央値を用いて、解析された細胞集団のＧＦＰ発現レベルを評価した。
【０１６７】
ＩｇＧの定量化法：ＯＣＴＥＴ  ＱＫ
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、抗体、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、および他の生体分子に対する無標識の定量化を実行し、生体分子の結合相互作用についての速度論的特徴付けをもたらす。試料の結合率（ｎｍ）と蓄積されたＩｇＧ１濃度（μｇ／ｍｌ）との間の相関は、検量線によるＩｇＧ力価の定量化を可能とする。
【０１６８】
細胞試料を、３００ｇで５分間にわたり遠心分離した。次いで、上清を、９６ウェルプレート内でＯｃｔｅｔ緩衝液により希釈して（ＩｇＧ１抗体について１／５）から、プロテインＡバイオセンサー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＤＩＰ  ａｎｄ  ＲＥＡＤ（商標）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を用いるＯｃｔｅｔにより解析して、ウェル１つ当たりの抗体濃度を得た。
【０１６９】
ＪｅｔＰＥＩを用いる一過性トランスフェクション
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＪｅｔＰＥＩ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションおよび安定的トランスフェクションを実施した。ＰＥＩとは、ＤＮＡなど、負に帯電した分子と複合体化しうるカチオン性ポリマーである。正に帯電したＤＮＡ−ＰＥＩ複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスにより内部化される。ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体は、リソソームコンパートメントに到達し、そこから溶解により核へと放出される。ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体による高いトランスフェクション効率は、ＤＮＡをリソソーム分解から保護するＰＥＩの能力に起因する。細胞は、製造元により提供されるマニュアルに従ってトランスフェクトした。
【０１７０】
全てのプラスミドは、直鎖化してから、安定的トランスフェクションにかけた（１００μｌのトリス−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中に再懸濁させた１００μｇのＤＮＡ）。一過性トランスフェクションのためには、ミディプレパレーションＤＮＡに由来する環状プラスミドを直接用いた。本研究では、一過性トランスフェクションを、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ内で維持し、抗生剤は添加しなかった。
【０１７１】
ＩｇＧ１を発現させる安定的なＣＨＯ−ＳクローンおよびＧＦＰは、１つの発現ベクターと、２つの耐性ベクター（それぞれ、ピューロマイシン耐性またはネオマイシン耐性をコードする）を共トランスフェクトすることにより得た。
【０１７２】
安定プールおよび安定ミニプールの選択
フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒサイトメーター、＃１２９３）を介して細胞内ＧＦＰの発現を解析することにより、トランスフェクションの２４時間後におけるトランスフェクション効率を決定した。ＧＰＦ陽性細胞の百分率が、２０％より高い場合は、トランスフェクトされた細胞を、選択培地で希釈し、９６ウェルプレート（単離安定ミニプールを創出する限界希釈のために）、またはＴ型フラスコ（安定プールを創出するために）へと分配した。用いられた選択培地は、異なる濃度のジェネティシンおよびピューロマイシンを補充した、ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２、４ｍＭのグルタミンであった。
【０１７３】
トランスフェクションの７日後、選択培地を細胞へと添加することにより、選択の厳密性を更新した。９６ウェルプレート内のコロニーがコンフルエントになったらすぐに、蛍光リーダーを用いてプレートを読み取った。
【０１７４】
Ｔ型フラスコ内のプールは、抗生剤非含有ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２、４ｍＭのＬ−グルタミンを用いて、ＴｕｂｅＳｐｉｎスケールまで増やした。それらの生存可能性および濃度は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動式細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）により評価した。細胞密度によりそれが可能となったらすぐに、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ内（５％のＣＯ2、３７℃、および湿度８０％のシェーカ
ー（２００ｒｐｍ）内でインキュベートする）の１０ｍｌの培地中に、１ｍｌ当たりの細胞０．５×１０6個の密度で細胞を播種することにより、全てのプールについてシードト
レインを開始した。各シードトレインは、成長培地中に１ｍｌ当たりの細胞０．５×１０6個（ＰＣＶ解析により細胞濃度を決定した）で細胞を播種することにより、毎週２回継
代培養した。シードトレインは、全ての生産実施（バッチ）の接種のために用いた。
【０１７５】
続く４〜５週間にわたり、生産実施を、毎週１回２連で播種した。クローン集団について、プールの安定性を、上記の通り、ＦＡＣＳおよび  ＩｇＧ発現により評価した。
【０１７６】
生産実施（バッチ発酵）
バッチ実施の細胞プールを、接種のために、シードトレインを用いて、１ｍｌ当たりの細胞０．５×１０6個の濃度で播種し、次いで、Ｆｅｅｄ培地中で７日間にわたり細胞を
培養した。４および８日目において、２００μｌの細胞を、３００ｇで５分間にわたり遠心分離し、Ｏｃｔｅｔを用いて、上清を、蓄積されたＩｇＧについて解析した。加えて、各バッチのＧＦＰ発現を、ＦＡＣＳにより解析した。
【０１７７】
２．結果
２．１  ＣＨＯ細胞における一過性発現：
本研究で比較されるベクターは、主にそれらの骨格において異なる。発現カセットの全体（プロモーター、１番目のイントロン、発現構築物、ｐｏｌｙ（Ａ））は、全てのベクターについて全く同じである。ベクターは、実施例１で記載される通り、ベクターであるｐＧＬＥＸ４１から導出する。１つのベクターでは、アンピシリン耐性遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現についてコドン最適化し、細菌骨格を最小限まで低減した：ｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ＡｍｐｉＡ−［ＲＥＰ］（Ａと略称する）。第２のベクターでは、アンピシリン耐性遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現についてコドン最適化したが、代替的コドンを用いる（可能な場合）ことにより、全てのＣｐＧ配列を回避した：このベクターを、ｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ＡｍｐｉＢ−［ＲＥＰ］と呼ぶ（Ｂと略称する）。第３の改変には、ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ＡｍｐｉＡ−［ＲＥＰ］−ＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ＿Ａと略称する）、およびｐＧＬＥＸ４１−Ｒ６Ｋ−ＡｍｐｉＢ−［ＲＥＰ］−ＧＡＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ＿Ｂと略称する）をもたらすベクターＡおよびＢの発現カセットの上流および下流においてクローニングされた、ＧＡＰＤＨフランキング配列の使
用を組み入れた。
【０１７８】
発現したレポータータンパク質の発現レベルを、異なるプラスミド骨格の文脈で比較するために、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクション（２連の）は、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、１０ｍｌの最終培地容量を用いて実施し、トランスフェクションの５日後に、Ｏｃｔｅｔにより解析した（図２）。
【０１７９】
骨格を適正化された全てのベクター（ＡおよびＢ）は、対照ベクターであるｐＧＬＥＸ４１よりわずかに高い発現レベルを示す。ベクターＡとベクターＢとの間には、わずかな差違しか見られない。骨格内の唯一の差違が、一過性発現に対して影響を及ぼさないはずのアンピシリン耐性であるために、これは予測されたことである。
【０１８０】
最も目覚ましい観察は、ＧＡＰＤＨ配列の、発現に対する正の効果である。ＧＡＰＤＨフランキング配列を保有するプラスミドでは、ＧＡＰＤＨ配列を伴わないプラスミドと比較して２倍の発現レベルが得られる。これは、Ａ構築物およびＢ構築物のいずれにも当てはまる。ｐＧＬＥＸ４１ベクターと比較して、３倍の発現を観察することができる。プラスミドのサイズを考慮すると、これは、なおいっそう驚くべきことである。ベクターＡ（７０４８ｂｐ）は、ベクターであるＧＡＰＤＨ−Ａ（１３４３６ｂｐ）と比較してほとんど半分のサイズである。したがって、一過性トランスフェクションプロセスにおいて送達されるＤＮＡの量が全てのプラスミドについて同じであると仮定すると、核へと送達されるのは、ＧＡＰＤＨ−Ａのモル量のうちの半分だけとなる。
【０１８１】
２．２  ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現
発現したレポータータンパク質の発現レベルを、異なるプラスミド骨格の文脈で比較するために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクション（２連の）は、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で、１０ｍｌの最終培地容量を用いて実施し、トランスフェクションの１０日後に、Ｏｃｔｅｔにより解析した（図３）。
【０１８２】
図３に示される結果は、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞内でＧＡＰＤＨフランキング領域を用いて得ることのできる発現の有意な増大を示す。ＧＡＰＤＨ−Ｂベクターが、発現の３倍の増大を示す一方、ＧＡＰＤＨ−Ａベクターは、なおより大きな、発現の５倍の増大を示す。これらのベクターは、ｏｒｉＰエレメントを含有せず、したがって、なおより大きな力価への潜在的可能性を有しうるであろう。
【０１８３】
２．３  安定ＣＨＯ細胞系における発現
安定的にトランスフェクトされた細胞の確立
安定集団は、発現ベクターと耐性遺伝子をコードするベクターとを共トランスフェクトした後で、抗生剤により媒介される選択圧にかけることにより創出した。選択圧は、トランスフェクションの１４日後に除去した。これらのステップにより、異なる構築物のレポータータンパク質（ＩｇＧ１抗体、およびＧＦＰ）の発現レベルおよび発現の安定性を比較するための、生産実施において定期的な間隔で培養される安定ミニプールおよび安定プールの作製が可能となった。
【０１８４】
細胞プールを用いて行われる生産実施におけるレポータータンパク質発現研究
安定的トランスフェクションによりプールを創出した。選択手順時（トランスフェクション後の最初の１４日間）に、ＦＡＣＳによりプールを解析した。ＧＦＰ陽性細胞画分の増大を、培養物の生存可能性と併せて、時間経過にわたり観察することができた。抗生剤
により媒介される選択圧は、１４日後にプールから除去した。この手法を用いても、「Ｂ」プラスミドをトランスフェクトされた細胞プールを得ることはできなかった。創出したプールの発現レベルは、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ内で細胞を培養できたらすぐにアッセイした。バッチは、２連で行った。ＦＡＣＳにより、ＧＦＰの発現について細胞を解析し、発現の８日後に、Ｏｃｔｅｔにより、上清中のＩｇＧの蓄積についてアッセイした。
【０１８５】
プールのＩｇＧ力価とプールのＧＦＰ発現との間では、比例関係を観察することができた。したがって、図４には、ＩｇＧデータだけを示す。ＧＡＰＤＨ配列を含有するベクターをトランスフェクトされた全てのプールは、ベクターであるｐＧＬＥＸ４１またはＧＡＰＤＨ配列を伴わない同じベクターと比較してより高度な発現を示す（ＡとＡ−ＧＡＰＤＨとの間で２．８倍である。Ｂプールは生存しなかったので、ＢとＢ−ＧＡＰＤＨとの間では、結論を引き出すことはできなかった）。Ａ−ＧＡＰＤＨおよびＢ−ＧＡＤＰＨにより行われたトランスフェクションは、ｐＧＬＥＸ４１によるトランスフェクション（バッチ２について）より高度な（それぞれ、２．７および３．５倍の）ＩｇＧ発現を誘導した。したがって、プール内では、ＧＡＰＤＨフランキング配列が、タンパク質を産生させるのに好適であると考えられる。最後に、Ｂ−ＧＡＤＰＨベクターにより行われたトランスフェクションは、Ａ−ＧＡＰＤＨにより行われたトランスフェクションより高度なＩｇＧの（１．２５倍の）発現を誘導した。したがって、耐性遺伝子内のＣｐＧの低減もまた、タンパク質の安定的な産生に好適であると考えられる。
【０１８６】
クローン集団についての発現レベル研究
クローン集団またはオリゴクローン集団を得るために、細胞にトランスフェクトし、９６ウェルプレート内の選択培地中に分配した。７日後に、選択培地を細胞へと添加することにより、選択圧を更新した。ＧＦＰの発現は、トランスフェクションの１４日後に、ＥＬＩＳＡ−プレートリーダーを用いることにより、評価した。結果を図５に示す。
【０１８７】
細胞プール内で得られた結果を確認したところ、ＧＡＰＤＨフランキング配列を含有するベクターをトランスフェクトされた細胞は、ＧＦＰを、ＧＡＰＤＨの上流および下流の配列を伴わない同じ骨格（１．７〜２倍）または対照として用いられた他のベクター（ｐＧＬＥＸ４１：２．５倍）より著明に発現させた（図５）。加えて、ＣｐＧを低減した耐性配列を含有するベクター（Ｂ）を伴う集団は、コドン最適化だけを施された対応するベクター（Ａ）より高度な発現を誘導した。（ＡとＢとの間で１．５倍；ＢとＢ−ＧＡＰＤＨとの間で１．２倍）。
【０１８８】
発現研究からは、複数の結論を引き出すことができた。第１に、ＧＡＰＤＨの上流および下流の配列は、基準として用いられた基準ベクター（ｐＧＬＥＸ４１）より高度な発現を可能とする。また、細胞に、ＧＡＰＤＨ配列を伴わない同じベクター骨格をトランスフェクトしたところ、低い発現レベルが得られることから、発現に対する有益な効果が、挿入されたＧＡＰＤＨフランキング配列と関連することも確認される。加えて、発現プラスミドおよび選択プラスミドにおけるＣｐＧ数の低減もまた、発現にわずかに好適であると考えられる。
【実施例３】
【０１８９】
新たにデザインされたベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ  ＧＭＰ細胞の一過性発現レベル
文献では、ＧＡＰＤＨプロモーターの５’側領域が、潜在的なインスリン応答エレメントのほか、フォルボールエステル応答エレメントを保有することが記載されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｂｒｉｄｇｅｓら（１９９２）、Ａｄｖａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ、３２：１４９〜１５９）。フォルボールエステル応答エレメント（−１０４０〜−１
０１０ｂｐ）は、通例ＧＡＰＤＨプロモーター（−４８８〜＋２０）と称する配列の上流に位置する。安定Ｈ３５肝がん細胞系において実施された欠失研究において、著者らは、塩基対−１２００〜−４８８（転写開始点に照らした）の欠失の有意な効果を実証することができなかった。したがって、フォルボールエステル応答エレメントは、ＧＡＰＤＨプロモーターにより駆動される発現へと機能的に連結されていない可能性があろう。にもかかわらず、ＧＡＰＤＨフランキングエレメントを含有するプラスミドを用いて観察された一過性発現および安定的発現の増大における、インスリンおよびＰＭＡ（最も一般的なフォルボールエステルである、フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）の寄与を評価するために、一過性トランスフェクション実験を実施した。
【０１９０】
インスリン非含有成長培地を得るために、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２を、粉末培地から調製し、インスリンは添加しなかった。ＰＭＡは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（インスリンを伴う／伴わない）中に１．６μＭの最終濃度（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｂｒｉｄｇｅｓにより、Ｈ３５肝がん細胞系に対して用いられた濃度に対応する）で投与した。
【０１９１】
トランスフェクションは、既に記載されている通りに、５０ｍｌのバイオリアクターチューブ（ＴｕｂｅＳｐｉｎ、ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で実施した。インスリンの存在を回避するために、トランスフェクション培地を、４ｍＭのＧｌｎおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）へと交換した。トランスフェクション後、細胞を１２ウェルプレート内に分配し、１ｍｌずつの４つの異なる培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２、４ｍＭのＧｌｎ、インスリンを伴う／伴わない；ＰｏｗｅｒＣＨＯ２、４ｍＭのＧｌｎ、１．６μＭのＰＭＡ、インスリンを伴う／伴わない）を添加した。ここでもまた、２つのＩＲＥＳを用いる、ＩｇＧ１およびＧＦＰを発現させるレポーター構築物（実施例２において記載した）を用いた。このベクターは、トランスフェクション効率の検証を可能とした。トランスフェクトされた細胞の百分率および生存可能性は、全ての４つの異なる培地調製物において同様であることが見出された。
【０１９２】
図６において示される通り、この実験では、インスリン枯渇および／またはＰＭＡ添加の有意な効果を観察することができなかった。発現のために用いられた全ての培地において、同様な力価が得られた。これは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のフランキング配列に存在する潜在的なフォルボールエステル応答エレメントおよびインスリン応答エレメントが、一過性のトランス遺伝子の発現に影響を及ぼさないことを示唆する。
【実施例４】
【０１９３】
レポーター遺伝子の発現に対する効果を研究するための、プロモーターの上流にあり、かつ、ｐｏｌｙＡ部位の下流にある、ＧＡＰＤＨ発現カセットを挟むＤＮＡについての断片化解析
ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子座は、ヒトゲノムの第１２染色体上に位置する。ＧＡＰＤＨは、グルコースの代謝において鍵となる役割を果たすので、哺乳動物に由来する全ての細胞において構成的に活性であることが記載されている。プロモーターの上流において、ＧＡＰＤＨ遺伝子は、３００００ｂｐ超にわたり及ぶ遺伝子であるＮＣＡＰＤ２と隣接する。ポリアデニル化部位の下流において、ＧＡＰＤＨ遺伝子は、ＩＦＦＯ１と隣接する（詳細については、図７を参照されたい）。
【０１９４】
ＧＡＰＤＨおよびプロモーターだけでなく、フランキング領域もまた、異なる種の間で十分に保存されている（表４を参照されたい）。
【０１９５】
【表４】
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【０１９６】
齧歯動物とヒトとの間のＤＮＡ相同性の比較は、ＤＮＡ保存が最小の３８％であることを示す。プロモーター領域または遺伝子をコードする領域の外側に保存されたＤＮＡの連なりの存在は、細胞に対して、ＤＮＡ配列を維持するか、または特定の変化／わずかな変化だけを可能とする選択圧がかかっている可能性があることを示す。本発明者らの特定の場合において、ＧＡＰＤＨフランキング領域は、それらがＧＡＰＤＨ遺伝子の高度な発現レベルを維持するために、細胞にとって重要でありうる。発現の低減をもたらすＤＮＡ配列の変化は、選択により排除されるであろう。
【０１９７】
上流および下流のＧＡＰＤＨエレメントの、観察される発現の増大への寄与を評価するために、上流のＧＡＰＤＨフランキング領域（配列番号７）、上流のＧＡＰＤＨフランキング領域の断片、または下流のＧＡＰＤＨフランキング領域（配列番号８）だけを含有する構築物を産生した。レポーターＩｇＧ１型抗体は、ＩＲＥＳ構築物（軽鎖−ＩＲＥＳ−重鎖）を介して発現させ、これにより、複数のプラスミドの共トランスフェクションを回避した。ＧＡＰＤＨの上流における断片の断片化についての詳細を図８に示す。以下の上流におけるＧＡＰＤＨフランキング領域の断片：断片１（配列番号９）、断片２（配列番号１０）、断片３（配列番号１１）、断片４（配列番号１２）、断片８（配列番号１３）、断片９（配列番号１４）、断片１１（配列番号１５）、断片１７（配列番号１６）を用いた。
【０１９８】
用いられる上流のＧＡＰＤＨフランキング領域（配列番号７）は、ＮｒｕＩ制限部位の
２×３（合計で６）のヌクレオチドであって、そのうちの３つが、その５’端において、ゲノムＤＮＡへと連結され、３つが、その３’端において、ゲノムＤＮＡへと連結されるヌクレオチドを含有する。用いられる下流のＧＡＰＤＨフランキング領域（配列番号８）は、ＳｃａＩ制限部位の２×３（合計で６）のヌクレオチドであって、そのうちの３つが、その５’端において、ゲノムＤＮＡへと連結され、３つが、その３’端において、ゲノムＤＮＡへと連結されるヌクレオチドを含有する。それぞれの制限部位のヌクレオチドを伴わない、上流のＧＡＰＤＨフランキング領域および下流のＧＡＰＤＨフランキング領域を、配列番号２０（制限部位を伴わない上流のＧＡＰＤＨフランキング領域）、および配列番号２１（制限部位を伴わない下流のＧＡＰＤＨフランキング領域）に示す。用いられる上流のＧＡＰＤＨフランキング領域の断片の各々は、その５’端および／またはその３’端において、ゲノムＤＮＡへと連結された、それぞれの制限部位の３つずつのヌクレオチドを含有する（断片１は、その５’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片２は、その３’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片３は、その５’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片４は、その３’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片８は、その３’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片９は、その５’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し、その３’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有し；断片１１は、その３’端において、ＮｒｕＩ制限部位の３つのヌクレオチドを含有する）。断片１７は、制限部位のヌクレオチドを含有しない。それぞれの制限部位のヌクレオチドを伴わない、上流のＧＡＰＤＨフランキング領域の断片を、配列番号２２（制限部位を伴わない断片１）、配列番号２３（制限部位を伴わない断片２）、配列番号２４（制限部位を伴わない断片３）、配列番号２５（制限部位を伴わない断片４）、配列番号２６（制限部位を伴わない断片８）、配列番号２７（制限部位を伴わない断片９）、配列番号２８（制限部位を伴わない断片１１）に示す。
【０１９９】
上清中に分泌されるＩｇＧ１の量を定量化するために、トランスフェクションの１０日後に、Ｏｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、上流および下流のＧＡＰＤＨエレメントの発現に対する効果を評価した（図９を参照されたい）。元のベクターであるｐＧＬＥＸ４１は、骨格であるｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡにおいて用いられる、改善された新たなベクターデザインと比較して低度な発現結果（８０％）を示している。元の骨格であるｐＧＬＥＸ４１と比較して、新たなデザインでは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、アンピシリン耐性カセットに必要なａｍｐｉＡ遺伝子のコドン最適化、異なる複製起点（ｐＵＣ複製起点ではなく、Ｒ６Ｋ複製起点）、および細菌由来の不要なリンカー（またはスペーサー）配列の除去が組み入れられている。いずれのベクターも、ほぼ同じサイズを有する。
【０２００】
驚くべきことに、上流のエレメント（配列番号７）および下流のエレメント（配列番号８）を組み入れたｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡ（発現結果を示す図９では、ｐＧＬＥＸ４１−ｕｐ／ｄｏｗｎと称する）は、上流および下流の配列を伴わない同じベクターと比較して、より高度な（１．５倍）発現を示している。サイズの差違（ｕｐ／ｄｏｗｎ断片は、プラスミドのサイズを６０００ｂｐ近傍増大させる）を考慮し、したがって、トランスフェクション時において送達されるプラスミドコピーの差違を考慮する場合、効果は、プラスミド１つ当たりのベースでなおいっそう重要となりうる。
【０２０１】
上流の断片（ｕｐ）だけを含有するベクターは、元の発現構築物であるｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡと同様な発現レベルを示している。下流の断片（ｄｏｗｎ）だけを含有するベクターは、元の発現構築物であるｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡと比較した発現の有意な増大（１．２倍）を示している。上流および下流の断片の両方が存在する場合は、さらなる発現の増大を観察することができる。これは、上流の断片の断片化により確認される。
断片９およびプロモーター近位の断片８は、ｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡと比較した発現の差違を示さない。断片１、１１、および１７は、発現の増大を示す。最高の増大は、断片４について観察された。プロモーター近位の断片８が、効果を示していないことを強調すべきである。したがって、発現の増大を、既に公表されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｂｒｉｄｇｅｓら（１９９２）、Ａｄｖａｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ、３２：１４９〜１５９）；Ｇｒａｖｅｎら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ａｃｔａ、１４７：２０３〜２１８）配列によって説明することはできない。
【０２０２】
興味深いことに、断片２および３は、有意な発現の低減をもたらす。これは、とりわけ、逆方向（図９におけるアンチセンス（ＡＳ））でクローニングされたこれらの断片が、この効果を引き起こさないという事実に照らして予測外である。断片１、８、９、１１、および１７では、センス配向またはアンチセンス配向で組み込まれた断片（データは示さない）について発現の差違が観察されなかった。断片１１は、断片２の部分であるが、この効果を示さない。したがって、発現にとって有害であると考えられる配列エレメントは、少なくとも部分的に、断片１１を得るために、断片２において欠失させたＢｓｔＢＩ−ＢｓｔＢＩ断片上にあるはずである。
【０２０３】
加えて、負のエレメントがＢｓｔＢＩ−ＢｓｔＢＩ断片上に位置する（少なくとも部分的に）という仮説は、断片３（ＢｓｔＢＩ−ＢｓｔＢＩ断片を組み入れる）と断片１との間で観察される発現の増大により裏付けられている。
【０２０４】
この研究からは、負の効果を及ぼす断片（ＢｓｔＢＩ−ＢｓｔＢＩ）を位置特定することは容易であると考えられるが、断片２および３について観察されたこの負の効果が、完全な上流の断片において存在する配列エレメントによりいかにして補完されるのかは、それほど明らかでない。この負の効果が、断片１および断片４により観察された小さな正の効果（しかし、断片１で観察される発現の増大は、断片４の場合より小さい）により相殺されている可能性はあろう。にもかかわらず、断片４で観察される正の効果（１．２５倍）は、負の効果（０．４倍）と比較してそれほど重要ではないと考えられる。さらに、ＢｓｔＢＩ−ＢｓｔＢＩ断片を伴わない上流の領域全体である断片９は、ＧＡＰＤＨの上流のフランキング領域全体と比較した発現の増大を示さない（にもかかわらず、断片９は、断片２および３の部分であるＥｃｏＲＶ−ＢｓｔＢＩ断片を組み入れ、発現に対して負の効果を及ぼしうるであろう）。
【０２０５】
観察された効果の背後の機構について可能なのは推測に限られる。断片２および３について観察された、発現に対する負の効果の配向依存性は、１つの配向だけの発現を誘発しうるプロモーターが周囲に存在しないために、同定されていないオープンリーディングフレームの発現（例えば、ｎｃＲＮＡの発現）を除外する。発現が基底レベルを下回って低減されるという事実は、正の効果（例えば、エンハンサー活性）の非存在だけでなく、配向依存的な負の効果の存在も示す。
【０２０６】
まとめると、上流および下流の両方のフランキング領域が発現プラスミド内に存在する場合は、ＣＨＯ細胞における一過性発現の驚くべき増大が観察される。断片４は、発現に対する有意な正の効果を及ぼすと考えられるが、観察された発現の増大全体の原因となる単一の断片を同定することはできなかった。発現ベクターであるｐＧＬＥＸ４１−ａｍｐｉＡ（ｕｐ／ｄｏｗｎ）の発現の増大は、上流および下流のフランキング領域両方の総体的効果であると考えられる。
【実施例５】
【０２０７】
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列およびチャイニーズハムスタープロモーターのクローニング
１．１  チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の、発現ベクターへのクローニング
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより増幅した。ゲノムＤＮＡは、実施例１で記載した通りに抽出した。構築物は、実施例１において記載したレポーター遺伝子構築物［ＲＥＰ］を発現させるための、マウスＣＭＶプロモーターまたはチャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを用いて調製した。
【０２０８】
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列を、マウスＣＭＶプロモーターと組み合わせてクローニングするために、実施例１において記載したＰＣＲプロトコールを用いて３ｋｂの断片（配列番号２９のｂｐ  ６７２〜３６７１）を増幅するためのプライマーＧｌｎＰｒ１８９６およびＧｌｎＰｒ１８９７を用いて、配列番号３０を伴う単位複製配列をもたらした。単位複製配列は、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列と、プライマーにより導入された５’側および３’側の制限部位とを含有する。
【０２０９】
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列を、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーターと組み合わせてクローニングするために、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列と、ＧＡＰＤＨプロモーター（配列番号２９のｂｐ  ６７２〜４１７９）とを組み入れたゲノムＤＮＡ配列を含有する３５０８ｂｐの断片を増幅するためのプライマーＧｌｎＰｒ１９０２およびＧｌｎＰｒ１９０５を用いて、配列番号３１を伴う単位複製配列をもたらした。第２のＰＣＲでは、プロモーター領域（配列番号２９のｂｐ  ３６７２〜４１７９）だけを含有する５０８ｂｐの断片を増幅するためのＧｌｎＰｒ１９０１およびＧｌｎＰｒ１９０２を用いて、配列番号３２をもたらした。ベクター「Ａ」（実施例１において記載した）において用いられるイントロンは、プライマーＧｌｎＰｒ１９０３およびＧｌｎＰｒ１９０４を用いて増幅した。
【０２１０】
第１のフュージョンＰＣＲは、配列番号３２を伴う単位複製配列と、イントロン配列を伴う単位複製配列とを鋳型として用いるプライマーＧｌｎＰｒ１９０４およびＧｌｎＰｒ１９０１により実施した。単位複製配列は、プライマーにより導入された、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、イントロン、ならびに５’側および３’側の制限部位を含有する。全てのプライマーを表５に示す。
【０２１１】
第２のフュージョンＰＣＲは、配列番号３１を伴う単位複製配列と、イントロン配列を伴う単位複製配列とを鋳型として用いるプライマーＧｌｎＰｒ１９０５およびＧｌｎＰｒ１９０４により実施した。単位複製配列は、プライマーにより導入された、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーター、イントロン、ならびに５’側および３’側の制限部位を含有する。
【０２１２】
１％のアガロースゲル上における精製後、対象のバンドを切り出し、キットである「ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ」（Ｍａｃｈｅｒｅｙ
Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて精製した。精製された断片は、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、プラスミドであるｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔへとクローニングした。ライゲーション産物は、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ  １０  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）へと形質転換し、ミニプレップを制限解析することにより解析した。これにより、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列を含有するプラスミドであるｐＣＲ＿ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ
−ｕｐｓｔｒｅａｍＧＡＰＤＨ］、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列と、ＧＡＰＤＨプロモーターと、ベクター「Ａ」に由来するイントロンとを含有するｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ−ｕｐｓｔｒｅａｍＧＡＰＤＨ＿ＧＡＰＤＨプロモーター］、ならびにＧＡＰＤＨプロモーター、およびベクター「Ａ」に由来するイントロンを含有するｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ−ＧＡＰＤＨプロモーター］がもたらされた。
【０２１３】
単位複製配列を、それらの分泌される遺伝子の発現に対する効果について評価するために、ベクター「Ａ」（実施例１において記載した）を用いた。既に記載されている通り、このベクターにおいて用いられる発現カセットは、分泌されるＩｇＧ１およびＧＦＰをコードするポリシストロニック遺伝子を含有する（実施例１を参照されたい）。したがって、トランスフェクトされた細胞は、ＩｇＧ１モノクローナル抗体を分泌し、細胞内ＧＦＰを依存的な形で蓄積する。
【０２１４】
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流のゲノムＤＮＡ配列を含有する３ｋｂの挿入配列断片を放出するために、プラスミドｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ−ｕｐｓｔｒｅａｍＧＡＰＤＨ］を、制限酵素であるＮａｅＩを用いて消化した。この挿入配列を、「Ａ」の骨格内にクローニングし、制限酵素であるＮｒｕＩを用いて消化し、ＣＩＰ処理した（ＣＩＰ；ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）。骨格と挿入配列とを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて併せてライゲーションし、その後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＰＩＲ１へと形質転換した。ミニプレップ調製およびその後の制限解析のためにクローンを採取した。結果として得られるプラスミドを、「Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ」と称し、配列決定解析により確認し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ミディプレップスケールで産生した。
【０２１５】
チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーターを用いて、発現構築物をクローニングするために、制限酵素であるＮｈｅＩおよびＮｒｕＩを用いる消化により、挿入配列断片を、プラスミドｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ−ｕｐｓｔｒｅａｍＧＡＰＤＨ＿ＧＡＰＤＨプロモーター］およびｐＣＲ＿Ｂｌｕｎｔ［ＣＨＯ−ＧＡＰＤＨプロモーター］から放出させた。結果として得られる断片をベクター「Ａ」の骨格内にクローニングし、同じ酵素を用いて切断し、ＣＩＰ処理した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるライゲーションおよびコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＰＩＲ１への形質転換後、ミニプレップ制限解析のためにクローンを採取した。結果として得られるプラスミドを、「Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ＿Ｐｒｏｍ」（チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨおよびプロモーターの上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を伴うプラスミド）および「Ａ＿ＰＲ」（プロモーターだけを伴うプラスミド）と称し、配列決定解析により確認し、キットであるＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ミディプレップスケールで産生した。
【０２１６】
２．チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列のレポーター遺伝子構築物の発現に対する効果の評価
ＣＨＯ−Ｓ細胞を、ＴｕｂｅＳｐｉｎバイオリアクター内で、１０ｍｌの培地容量を用いてトランスフェクトした（実施例２で記載される通り）。トランスフェクトされた細胞は、３７℃で、５％のＣＯ２、および湿度８０％の、２００ｒｐｍの撹拌を伴う振とうインキュベーター内でインキュベートした。プロテインＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）を伴うＯｃｔｅｔ  ＱＫシステムを用いて、細胞の上清を、ＩｇＧ１の発現について解析した。結果を図１０に示す。
【０２１７】
マウスＣＭＶプロモーターを含有するプラスミド（Ａ）の発現レベルと比較して、ＧＡＰＤＨプロモーターを含有するプラスミド（「Ａ＿ＰＲ」）の発現レベルが５０％低減されることから、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーターは、ウイルス性プロモーターほど強力ではないことが示される。チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨプロモーターと組み合わせた、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含有するプラスミド（「Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ＿Ｐｒｏｍ」）は、ＧＡＰＤＨプロモーターだけを有する構築物（「Ａ＿ＰＲ」）と比較して、発現の２倍の増大を示す。チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列と、マウスＣＭＶプロモーターとを含有するプラスミド（「Ａ＿ＧＡＰＤＨ＿ＵＰ」）は、最高の発現を示し、マウスＣＭＶプロモーターだけを含有するプラスミド（「Ａ」）を４０％超える増大を示す。これにより、チャイニーズハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の上流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列は、レポータータンパク質の発現に対するエンハンサー効果を有することが確認される。
【０２１８】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および発現増強エレメントを含む発現カセットであって、発現増強エレメントが、真核生物グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み、前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記ポリペプチドがＧＡＰＤＨではなく、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列が、＋１近傍のヌクレオチド位置〜＋７０００近傍のヌクレオチド位置にわたる領域内で開始され、前記ヌクレオチド位置が、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの転写開始点に照らした位置であり、前記真核生物ＧＡＰＤＨプロモーターの下流の前記非翻訳ゲノムＤＮＡ配列の長さが約１００〜約１５０００ヌクレオチドである、発現カセット。