(57)【要約】【課題】  接着性細胞の培養に用いることができる培養容器を容易に形成可能なポリオレフィン系材料からなる培養容器基材を提供する。【解決手段】  接着性細胞の培養に用いる、ポリオレフィン系材料からなる培養容器の基材であって、前記培養容器の培養面に用いられる、当該基材の表面の少なくとも一部が、表面処理されており、表面処理された前記表面の静的水接触角が８０°より大きく、かつ、後退接触角が５３°未満である培養容器基材とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性細胞の培養に用いる、ポリオレフィン系材料からなる培養容器の基材であって、前記培養容器の培養面に用いられる、当該基材の表面の少なくとも一部が、表面処理されており、表面処理された前記表面の静的水接触角が８０°より大きく、かつ、後退接触角が５３°未満である
ことを特徴とする培養容器基材。
【請求項２】
前記表面処理がコロナ処理又はエキシマ処理であることを特徴とする請求項１記載の培養容器基材。
【請求項３】
前記ポリオレフィン系材料がポリエチレンであることを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器基材。
【請求項４】
前記静的水接触角が９５°より大きいことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器基材。
【請求項５】
前記後退接触角が４４°未満であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器基材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の培養容器基材における表面処理された前記表面が培養面として形成されたことを特徴とする培養容器。
【請求項７】
接着性細胞の培養に用いる、ポリオレフィン系材料からなる培養容器の基材の製造方法であって、
前記培養容器の培養面に用いられる、前記基材の表面の少なくとも一部に、表面処理を施す親水化工程と、
前記基材を改質させる変性工程と、を含み、
前記親水化工程及び前記変性工程によって、表面処理された前記表面の静的水接触角を８０°より大きく、かつ、後退接触角を５３°未満にする
ことを特徴とする培養容器基材の製造方法。
【請求項８】
前記変性工程を４５℃〜５５℃で行うことを特徴とする請求項７記載の培養容器基材の製造方法。
【請求項９】
前記変性工程を３日間〜３ヶ月間行うことを特徴とする請求項７又は８記載の培養容器基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着性細胞を培養する培養容器を形成するための基材、及びこの基材からなる培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
【０００３】
このような細胞の大量培養に用いる培養容器を形成するための基材としては、ガス透過性に優れ、袋状の培養容器を容易に形成可能なポリオレフィン系材料を好適に用いることができる。
また、ｉＰＳ細胞などの接着性細胞を培養する方法としては、培養容器内の培養面に細胞を接着させて培養する方法や、培養容器内の培養面に細胞を接着させることなく、スフェア（細胞凝集塊）を形成させて、このスフェアを培養容器内で浮遊させて培養する方法がある。
【０００４】
ここで、接着性細胞を培養容器内の培養面に接着させて培養する場合に、ポリオレフィン系材料をそのまま用いて培養容器を形成すると、培養容器内の培養面が疎水性となることから、接着性細胞は培養容器内の培養面に接着することができず、培養することができない。
このため、ポリオレフィン系材料の基材を用いて接着性細胞を培養するための培養容器を形成する場合には、その基材に表面処理を施して、基材表面の濡れ性を上げる（親水化する）必要があった。
具体的には、例えば、培養容器内の培養面の静的水接触角が６０〜８０°となるように培養面を親水化して、接着性細胞を培養面に接着可能とし、接着性細胞を培養できるようにする方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３６２５１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ポリオレフィン系材料からなる基材に親水化処理を施して、基材表面の静的水接触角を６０〜８０°にすると、培養容器の形成が困難になるという問題があった。
すなわち、基材の接着性が向上する一方で、基材表面が貼り合わさって密着するために、剥がれ難くなるという問題あった。また、これを無理矢理に剥がすと、基材表面が白濁して、容器を形成するために使用することができなくなり、このような親水化処理を施した基材を用いて袋状の培養容器を形成することは、非常に困難であった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、ポリオレフィン系材料からなる基材を、接着性細胞を接着することができ、かつ培養容器の形成を容易に行えるものにするべく鋭意研究して、これを実現し得る基材を開発することに成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、接着性細胞の培養に用いることができる培養容器を容易に形成可能なポリオレフィン系材料からなる基材、この基材を用いて形成された培養容器、及び培養容器基材の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の培養容器基材は、接着性細胞の培養に用いる、ポリオレフィン系材料からなる培養容器の基材であって、前記培養容器の培養面に用いられる、当該基材の表面の少なくとも一部が、表面処理されており、表面処理された前記表面の静的水接触角が８０°より大きく、かつ、後退接触角が５３°未満である構成としてある。
【００１０】
また、本発明の培養容器は、上記培養容器基材における表面処理された前記表面が培養面として形成された構成としてある。
【００１１】
また、本発明の培養容器基材の製造方法は、接着性細胞の培養に用いる、ポリオレフィン系材料からなる培養容器の基材の製造方法であって、前記培養容器の培養面に用いられる、前記基材の表面の少なくとも一部に、表面処理を施す親水化工程と、前記基材を改質させる変性工程とを含み、前記親水化工程及び前記変性工程によって、表面処理された前記表面の静的水接触角を８０°より大きく、かつ、後退接触角を５３°未満にする方法としてある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、接着性細胞の培養に用いることができる培養容器を容易に形成可能なポリオレフィン系材料からなる基材、この基材を用いて形成された培養容器、及び培養容器基材の製造方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】静的水接触角及び後退接触角についての説明図である。
【図２】試験１におけるポリエチレンフィルムの静的水接触角（未処理、コロナ処理直後、５０℃で１ヶ月変性処理後、５０℃で２ヶ月変性処理後）を示す図である。
【図３】試験１におけるポリエチレンフィルムの静的水接触角と後退接触角（未処理、コロナ処理直後、５０℃で１ヶ月変性処理後、５０℃で２ヶ月変性処理後）を示す図である。
【図４】試験２におけるコロナ処理直後のポリエチレンフィルムを貼り合わせた後、剥がした状態の写真を示す図である。
【図５】試験３におけるコロナ処理を行ったポリエチレンフィルムを用いて形成した培養容器による接着性細胞の培養試験（ラミニンコート法）の結果の写真を示す図である。
【図６】試験４におけるコロナ処理を行ったポリエチレンフィルムを用いて形成した培養容器による接着性細胞の培養試験（ラミニン添加法）の結果の写真を示す図である。
【図７】試験５におけるポリエチレンフィルムの静的水接触角と後退接触角（未処理、エキシマ処理直後、５０℃で１時間処理後、５０℃で３日間変性処理後、５０℃で１ヶ月変性処理後、５０℃で２ヶ月変性処理後）を示す図である。
【図８】試験６におけるエキシマ処理直後のポリエチレンフィルムを貼り合わせた後、剥がした状態の写真を示す図である。
【図９】試験６におけるエキシマ処理後、５０℃で１時間処理したポリエチレンフィルムを貼り合わせた後、剥がした状態の写真を示す図である。
【図１０】試験６におけるエキシマ処理後、５０℃で３日間変性処理したポリエチレンフィルムを貼り合わせた後、剥がした状態の写真を示す図である。
【図１１】試験７におけるエキシマ処理を行ったポリエチレンフィルムを用いて形成した培養容器による接着性細胞の培養試験（ラミニンコート法）の結果の写真を示す図である。
【図１２】試験８におけるエキシマ処理を行ったポリエチレンフィルムを用いて形成した培養容器による接着性細胞の培養試験（ラミニン添加法）の結果の写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の培養容器基材、この基材を用いて形成された培養容器、及び培養容器基材の製造方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態、及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態の培養容器基材は、接着性細胞の培養に用いる培養容器の形成に使用するための基材であり、ポリオレフィン系材料からなる。
この基材の表面の少なくとも一部が表面処理され、表面処理された表面の静的水接触角が８０°より大きく、かつ、後退接触角が５３°未満となっている。そして、この表面処理された表面が、培養容器の形成に際して、培養容器の培養面として使用される。
【００１６】
ここで、静的水接触角とは、静止した液体の表面が固体壁の表面に接するところで、液面と固体面がなす角（図１のθｓ）を意味する。静的水接触角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強く、静的水接触角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強いという関係がある。
具体的には、培養容器の培養面における静的水接触角が６０°〜８０°の場合に、接着性細胞は培養面に好適に接着して、効率的に培養できることが知られている。
【００１７】
例えば、ポリオレフィン系材料の一種であるポリエチレンフィルムの表面の静的水接触角は、未処理の状態では９５°以上を示し、疎水性が強いために、接着性細胞は接着することができない。このため、ポリエチレンフィルムをそのまま用いて培養容器を形成しても、接着性細胞を培養することはできない。
【００１８】
そこで、ポリエチレンフィルムの表面に対して、コロナ処理などの表面処理を行い、その表面の静的水接触角が６０°〜８０°になるように表面を親水化することが行われている。得られたポリエチレンフィルムを用いてディッシュ形状などの培養容器を形成すれば、接着性細胞を培養容器内に接着させて培養することが可能である。
しかしながら、このようにして得られたポリエチレンフィルムは、接着性が向上する結果、表面が密着して剥がれ難くなるため、取り扱いが難しく、袋状の培養容器の基材として用いることは、非常に困難である。
【００１９】
また、後退接触角（以下、単に後退角と称する場合がある）とは、水滴が固体壁の表面を滑落するときの後方の接触角（図１のθr）を意味する。すなわち、水平に支持した固体壁の表面に水滴を摘下し、固体壁を徐々に傾けて、液滴が転落を開始するときの後方の接触角である。
後退角は、固体壁の表面の動的な濡れ性（親水性）を示す指標として用いることができる。すなわち、後退角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強く、後退角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強いという関係がある。
【００２０】
本実施形態の培養容器基材における表面処理された表面の静的水接触角は、８０°より大きく、同表面の後退接触角は、５３°未満である。
すなわち、この基材は、同表面の静的水接触角が、８０°より大きく、疎水性が強いため、一般的には、接着性細胞を培養できないと考えられる。
ところが、実際には、この基材の同表面を培養面として形成した培養容器は、接着性細胞を培養面に接着させることができ、培養することが可能である。
【００２１】
その理由は、本実施形態の培養容器基材が、表面処理による親水化工程を行った後、後述する変性工程を行うことによって、静的水接触角が疎水性に戻される一方で、後退角が５３°未満の親水性の状態のままになったものであることによると考えられる。
すなわち、後退角は、水中での固体壁の表面の分子の配向変化を反映するものであるため、液体である培養液が充填された培養容器内の培養面における細胞の接着性を、静的水接触角よりも適切に示す指標であると考えられる。具体的には、後退角は、水中での界面の親水基の個数と負の相関を示すために、後退角が大きいと、固体壁の表面の疎水性が相対的に強くなり、後退角が小さいと、固体壁の表面の親水性が相対的に強くなるという関係を示す。
【００２２】
本実施形態の培養容器基材は、表面処理された表面の静的水接触角が８０°より大きく疎水性を示すものの、同表面の後退角が５３°未満であり親水性を示すため、培養液が充填された培養容器内の培養面に接着性細胞を接着することが可能になったと考えられる。
【００２３】
また、本実施形態の培養容器基材は、同表面の静的水接触角が、８０°より大きく疎水性を示すため、その表面が密着しても容易に剥がすことができ、培養容器の形成は、容易に行うことが可能になっている。
このように、本実施形態の培養容器基材によれば、これを用いて形成された培養容器に対する接着性細胞の接着性と、培養容器の形成の容易性を、同時に実現することが可能になっている。
【００２４】
本実施形態の培養容器基材を形成するポリオレフィン系材料としては、ポリエチレン（ＰＥ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、エチレン-酢酸ビニル共重合体、アイオノマー等を用いることが好ましく、ポリエチレン（ＰＥ）を用いることが特に好ましい。
また、本実施形態の培養容器基材を用いて培養容器を形成し、得られた培養容器を用いて接着性細胞を培養することから、同基材のガス透過率（酸素透過率など）が、高いことが好ましく、例えば、同基材の密度は、０．８７ｇ／ｃｃ以上、０．９３ｇ／ｃｃ以下であることが好ましい。また、同基材の酸素透過率は、４００ｍｌ・ｍｍ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ（３７℃−８０％ＲＨ）以上であることが好ましい。
【００２５】
本実施形態の培養容器基材は、以下の方法により製造することが好ましい。
まず、ポリオレフィン系材料からなる基材の表面の少なくとも一部に、表面処理を施す親水化工程を行う。親水化工程により表面処理を施した表面は、培養容器の形成にあたり、培養容器内の培養面として用いられる。
表面処理としては、コロナ処理やエキシマ処理、プラズマ処理などを用いることが好ましく、コロナ処理又はエキシマ処理を用いることが特に好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
次に、この培養容器基材を改質させる変性工程により、変性処理を行う。
変性工程は、４５℃〜５５℃で培養容器基材を静置させて改質させることが好ましい。また、変性工程を４３℃〜６０℃で行っても良い。
また、変性工程は、３日間〜３ヶ月間行うことが好ましく、２週間〜３ヶ月間とすることがより好ましく、１〜２ヶ月間とすることがさらに好ましい。なお、変性工程を３ヶ月以上とすることもできる。
【００２７】
上記の親水化工程及び変性工程を行うことによって、基材における表面処理された表面の静的水接触角を８０°より大きく、後退接触角を５３°未満にすることができる。
このとき、同表面の静的水接触角を、８８°より大きくすることがより好ましく、８９°より大きくすることがさらに好ましく、９０°より大きくすることがさらにまた好ましく、９１°より大きくすることがさらにまた好ましく、９５°より大きくすることがさらにまた好ましい。
また、このとき、同表面の後退角を、５０°未満にすることがより好ましく、４６°未満にすることがさらに好ましく、４４°未満にすることがさらにまた好ましく、４３°未満にすることがさらにまた好ましい。
【００２８】
本実施形態の培養容器は、上記の方法を用いて製造された培養容器基材における表面処理された表面を、培養面として形成される。
このとき、本実施形態の培養容器は、本実施形態の培養容器基材をヒートシールすることによって、好適に形成することが可能である。また、本実施形態の培養容器を、少なくとも一方の内側面に複数の凹部（ウェル）を形成したものとしてもよい。
【００２９】
本実施形態の培養容器における培養面に使用される表面は、静的水接触角が８０°より大きく、かつ、後退接触角が５３°未満となっている。
このように、培養面に使用される表面の静的水接触角が８０°より大きいため、表面が密着して剥がれ難くなることがなく、容器化（製袋）を容易に行うことが可能である。
また、培養面に使用される表面の後退接触角が５３°未満であるため、培養液を充填した培養容器内において、接着性細胞を培養面に適切に接着させることができ、好適に培養することが可能になっている。
【００３０】
本実施形態において、接着性細胞としては、例えば多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞など）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、及びそれらが分化した骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、肝細胞、上皮細胞、膵細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、腎細胞等を好適に用いることができる。また、活性化時のリンパ球など、浮遊系細胞であっても、接着して培養されるものは、本実施形態における接着性細胞に含まれる。
【００３１】
以上説明したように、上記の実施形態によれば、接着性細胞の培養に用いることができる培養容器を容易に形成可能なポリオレフィン系材料からなる基材、この基材を用いて形成された培養容器、及び培養容器基材の製造方法を提供することが可能になっている。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明の実施形態に係る培養容器基材、及びこの基材を用いて形成された培養容器の効果を確認するために行った試験について詳細に説明する。
【００３３】
［試験１］
まず、本実施形態の培養容器基材における表面処理を施した表面の静的水接触角及び後退角を確認するための試験を行った。
培養容器基材としては、ポリエチレン（ＰＥ，宇部丸善ポリエチレン株式会社製，ユメリット１２５ＦＮ）をフィルムに成膜したものを用意した。
そして、ポリエチレンフィルムに表面処理を施していない状態、表面処理を施した直後の状態、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理した状態、及び表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理した状態において、表面（表面処理を施したポリエチレンフィルムについては、表面処理を施した当該表面）の静的水接触角と後退角をそれぞれ測定した。
【００３４】
すなわち、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例１）の表面、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例１）の当該表面、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例１）の当該表面、及び表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例２）の当該表面の静的水接触角と後退角をそれぞれ測定した。
【００３５】
表面処理としては、バッチ式コロナ処理装置（春日電機株式会社製）を使用して、親水化処理工程を行った。本試験では、電極間距離５ｍ、出力５２０Ｗ、処理速度５０ｍｍ／ｓの条件で、コロナ処理を行った。
静的水接触角及び後退角の測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ  ７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。このとき、各ポリエチレンフィルム上に、純水３μｌを滴下して、これらの接触角を測定した。
【００３６】
図２に示されるように、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例１）の表面の静的水接触角は、９６．７°を示していた。この静的水接触角のポリエチレンフィルムは、疎水性が強いため、接着性細胞を接着することはできない。
また、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例１）の表面の静的水接触角は、６４．６°を示していた。したがって、このポリエチレンフィルムは、親水化されており、接着性細胞を接着させて培養することができる。
【００３７】
また、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例１）の表面と、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例２）の表面の静的水接触角は、それぞれ９１．２°、８８．９°を示していた。
これらのポリエチレンフィルムの静的水接触角は、表面処理を施す前の、元の状態に近い数値に戻っており、疎水性が強いことを示している。したがって、一般的には、これらの培養容器基材では、接着性細胞を培養することができないと認識され得る。
【００３８】
図３には、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例１）の表面、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例１）の当該表面、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例１）の当該表面、及び表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例２）の当該表面の静的水接触角と後退角とを併せて示している。
【００３９】
図３に示されるように、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例１）の表面の後退角は、９３．１°を示していた。また、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例１）の表面の後退角は、３２．７°を示していた。すなわち、参考例１では、表面化処理を施すことによって後退角が大きく低減しており、表面が親水化されたことが示されている。
【００４０】
また、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例１）の表面と、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例２）の表面の後退角は、それぞれ４３．４°、４３．３°を示していた。
すなわち、これらの変性工程を経ても、後退角は、静的水接触角とは異なり、表面処理を施す前の、元の状態に近い数値に大きく戻ることはなく、表面処理を施した直後の状態の数値に近いままであったことが示されている。
【００４１】
そして、後述する試験３及び試験４で示されるように、このような後退角が親水性を示すポリエチレンフィルムによれば、静的水接触角が疎水性を示す場合であっても、このポリエチレンフィルムを用いて形成された培養容器内の培養面に接着性細胞を接着することができ、接着性細胞を培養できることが明らかとなった。
【００４２】
また、このような実施例１及び実施例２のポリエチレンフィルムは、表面処理を施した表面の静的水接触角が、上記の通り、表面処理を施す前の、元の状態に近い数値に戻っており、疎水性が強い状態を示している。
そして、後述する試験２で示されるように、このようなポリエチレンフィルムによれば、表面処理を行った表面が貼り付いて剥がれ難くなることがなく、培養容器を容易に形成できることが明らかとなった。
【００４３】
［試験２］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて、培養容器を容易に形成可能であることを確認するための試験を行った。
培養容器基材としては、試験１の実施例２で使用した、コロナ処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルムを用いた。
そして、このポリエチレンフィルムを、インパルスシーラーを使用して溶着することにより、袋状の培養容器を形成した。
その結果、培養容器基材における表面処理を施した表面が密着したりすることがなく、培養容器を容易に形成できることが分かった。
【００４４】
一方、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例１）における表面処理を施した表面を貼り合わせると、密着して剥がし難くなった。そして、これを無理矢理に剥がすと、図４に示すようにポリエチレンフィルムが白濁した。このように、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（変性処理を行っていないもの）によれば、袋状の培養容器の形成が、非常に困難であることが明らかとなった。
【００４５】
［試験３］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて形成された培養容器によって、接着性細胞を培養可能であることを確認するための試験を行った。
具体的には、試験１と同様にして、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（静的水接触角８８．９°、実施例２のもの）を、インパルスシーラーにて溶着して、ディッシュ型の培養容器を形成した。
【００４６】
また、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（静的水接触角６４．６°、参考例１のもの）をインパルスシーラーにて溶着して、ディッシュ型の培養容器を形成した。
さらに、これらの培養容器の培養面に、０．５ｍｇ／ｍｌのラミニン５１１−Ｅ８（品番８９２０１２、株式会社ニッピ製）を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコートした。そして、得られたそれぞれの培養容器を用いて、接着性細胞の培養試験を行った（ラミニンコート法）。
【００４７】
接着性細胞としては、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を使用した。また、培地として、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（品番ＲＣＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）を使用した。
そして、各培養容器に、１０ｍＭ Ｙ−２７６３２（品番２５３−００５１１、和光純薬工業株式会社製）を含む上記培地を注入した。
その後、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で７日間培養を行った。このとき、培地は１．５ｍｌ、細胞懸濁液５μlであった。播種した細胞数は、およそ１．３×１０４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に、培地をＹ−２７６３２不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
【００４８】
そして、培養７日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察し、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
その結果、図５に示すように、本実施形態の培養容器（培養容器内の培養面の静的水接触角が８８．９（疎水性の値）を示し、かつ後退角が４３．３（親水性の値）を示すもの）によれば、静的水接触角が親水性を示す培養容器と遜色なく、接着性細胞を接着して、培養できることが明らかとなった。
【００４９】
［試験４］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて形成された培養容器によって、接着性細胞を培養可能であることを確認するための試験を、試験３とは異なる培養方法で行った。
具体的には、試験１と同様にして、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（静的水接触角８８．９°、実施例２のもの）を用いてディッシュ型の培養容器を形成すると共に、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（静的水接触角６４．６°、参考例１のもの）を用いてディッシュ型の培養容器を形成して、ラミニン添加法により、接着性細胞の培養試験を行った。
【００５０】
接着性細胞としては、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を使用した。また、培地として、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（品番ＲＣＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）を使用した。
そして、各培養容器に、１０ｍＭ Ｙ−２７６３２（品番２５３−００５１１、和光純薬工業株式会社製）を含む上記培地を注入すると共に、０．５ｍｇ／ｍｌのラミニン５１１−Ｅ８（品番８９２０１２、株式会社ニッピ製）を各培養容器に０．１２５μｇ／ｃｍ２となるように添加した。
その後、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で７日間培養を行った。このとき、培地は１．５ｍｌ、細胞懸濁液５μlであった。播種した細胞数は、およそ１．３×１０４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に、培地をＹ−２７６３２不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
【００５１】
そして、培養７日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察し、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
その結果、図６に示すように、本実施形態の培養容器（培養容器内の培養面の静的水接触角が８８．９°（疎水性の値）を示し、かつ後退角が４３．３°（親水性の値）を示すものによれば、静的水接触角が親水性を示す培養容器と遜色なく、接着性細胞を接着して培養できることが明らかとなった。
【００５２】
［試験５］
次に、本実施形態の培養容器基材における表面処理として、エキシマ処理を施した表面の静的水接触角及び後退角を確認するための試験を行った。
培養容器基材としては、ポリエチレン（ＰＥ，宇部丸善ポリエチレン株式会社製，ユメリット１２５ＦＮ）をフィルムに成膜したものを用意した。
そして、ポリエチレンフィルムに表面処理を施していない状態、表面処理を施した直後の状態、表面処理を施して５０℃で１時間処理した状態、表面処理を施して５０℃で３日間変性処理した状態、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理した状態、及び表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理した状態において、表面（表面処理を施したポリエチレンフィルムについては、表面処理を施した当該表面）の静的水接触角と後退角をそれぞれ測定した。
【００５３】
すなわち、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例２）の表面、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例２）の当該表面、表面処理を施して５０℃で１時間処理したポリエチレンフィルム（参考例３）の当該表面、表面処理を施して５０℃で３日間変性処理したポリエチレンフィルム（実施例３）の当該表面、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例４）の当該表面、及び表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例５）の当該表面の静的水接触角と後退角をそれぞれ測定した。
【００５４】
表面処理としては、エキシマ照射装置（株式会社エム・ディ・コム製）を使用して、親水化処理を行った。本試験では、電圧１２Ｖ、照射距離４ｍｍ、照射速度２ｍｍ／ｓ×３回の条件で、エキシマ処理を行った。
静的水接触角及び後退角の測定には、固液界面解析システムＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ  ７００（協和界面科学株式会社製）を使用した。このとき、各ポリエチレンフィルム上に、純水３μｌを滴下して、これらの接触角を測定した。
【００５５】
図７に示されるように、表面処理を行っていないポリエチレンフィルム（比較例２）の表面の静的水接触角は９６．７°を示しており、後退角は９３．１°を示していた。また、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例２）の表面の静的水接触角は７２．４°を示しており、後退角は４３．０°を示していた。すなわち、参考例２では、表面化処理を施すことによって静的水接触角と後退角が大きく低減しており、表面が親水化されたことが示されている。したがって、このポリエチレンフィルムは、親水化されており、接着性細胞を接着させて培養することができる。
しかしながら、後述する試験６で示されるように、このようなポリエチレンフィルムによれば、表面処理を行った表面が貼り付いて剥がれ難くなり、培養容器を容易に形成できなかった。
【００５６】
また、表面処理を施して５０℃で１時間処理したポリエチレンフィルム（参考例３）の静的水接触角は７６．２°を示しており、後退角は４１．１°を示していた。すなわち、参考例３では、表面化処理を施すことによって静的水接触角と後退角は表面が親水化された値を示している。したがって、このポリエチレンフィルムは、接着性細胞を接着させて培養することができる。
しかしながら、後述する試験６で示されるように、このようなポリエチレンフィルムによれば、表面処理を行った表面が貼り付いて剥がれ難くなり、培養容器を容易に形成できなかった。
【００５７】
また、表面処理を施して５０℃で３日間変性処理したポリエチレンフィルム（実施例３）の静的水接触角は８９．２°を示しており、後退角は４５．７°を示していた。すなわち、実施例３では、表面化処理を施すことによって後退角は大きく低減しており、表面が親水化されたことが示されているが、静的水接触角は疎水性の値を示している。したがって、このポリエチレンフィルムは、液中においては親水化された状態であり、接着性細胞を接着させて培養することができる。
そして、後述する試験６で示されるように、このようなポリエチレンフィルムによれば、表面処理を行った表面が貼り付いて剥がれ難くなることがなく、培養容器を容易に形成できることが明らかとなった。
【００５８】
また、表面処理を施して５０℃で１ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例４）の表面と、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（実施例５）の表面の静的水接触角はそれぞれ９５．２°、９５．５°を示しており、後退角は、それぞれ４９．１°、５２．６°を示していた。
すなわち、表面化処理を施すことによって後退角は大きく低減しており、表面が親水化されたことが示されているが、静的水接触角は疎水性の値を示している。したがって、このポリエチレンフィルムは、液中においては親水化された状態であり、接着性細胞を接着させて培養することができる。
また、このようなポリエチレンフィルムによれば、表面処理を行った表面が貼り付いて剥がれ難くなることがなく、培養容器を容易に形成することが可能である。
【００５９】
［試験６］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて、培養容器を容易に形成可能であることを確認するための試験を行った。
培養容器基材としては、試験５の実施例５で使用した、エキシマ処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルムを用いた。
そして、このポリエチレンフィルムを、インパルスシーラーを使用して溶着することにより、袋状の培養容器を形成した。
その結果、培養容器基材における表面処理を施した表面が密着したりすることがなく、培養容器を容易に形成できることが分かった。
【００６０】
一方、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（参考例２）における表面処理を施した表面を貼り合わせると、密着して剥がし難くなった。そして、これを無理矢理に剥がすと、図８に示すようにポリエチレンフィルムが白濁した。このように、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルムによれば、袋状の培養容器の形成が、非常に困難であることが明らかとなった。
【００６１】
また、表面処理を施して５０℃で１時間処理したポリエチレンフィルム（参考例３）における表面処理を施した表面を貼り合わせると、密着して剥がし難くなった。そして、これを無理矢理に剥がすと、図９に示すようにポリエチレンフィルムが白濁した。このように、表面処理を施して５０℃で１時間処理したポリエチレンフィルムでは、袋状の培養容器の形成が、非常に困難であることが明らかとなった。
これに対して、表面処理を施して５０℃で３日間変性処理したポリエチレンフィルム（実施例３）における表面処理を施した表面を貼り合わせても、図１０に示すように表面が密着したりすることがなかった。このように、表面処理を施して５０℃で３日間以上変性処理したポリエチレンフィルムによれば、袋状の培養容器を容易に形成可能であることが明らかとなった。
【００６２】
［試験７］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて形成された培養容器によって、接着性細胞を培養可能であることを確認するための試験を行った。
具体的には、試験５と同様にして、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（静的水接触角９５．５°、実施例５のもの）を、インパルスシーラーにて溶着して、ディッシュ型の培養容器を形成した。
【００６３】
また、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（静的水接触角７２．４°、参考例２のもの）をインパルスシーラーにて溶着して、ディッシュ型の培養容器を形成した。
さらに、これらの培養容器の培養面に、０．５ｍｇ／ｍｌのラミニン５１１−Ｅ８（品番８９２０１２、株式会社ニッピ製）を０．５μｇ／ｃｍ２となるようにコートした。そして、得られたそれぞれの培養容器を用いて、接着性細胞の培養試験を行った（ラミニンコート法）。
【００６４】
接着性細胞としては、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を使用した。また、培地として、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（品番ＲＣＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）を使用した。
そして、各培養容器に、１０ｍＭ Ｙ−２７６３２（品番２５３−００５１１、和光純薬工業株式会社製）を含む上記培地を注入した。
その後、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で７日間培養を行った。このとき、培地は１．５ｍｌ、細胞懸濁液５μlであった。播種した細胞数は、およそ１．３×１０４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に、培地をＹ−２７６３２不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
【００６５】
そして、培養７日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察し、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
その結果、図１１に示すように、本実施形態の培養容器（培養容器内の培養面の静的水接触角９５．５°（疎水性の値）を示し、かつ後退角が５２．６°（親水性の値）を示すものによれば、静的水接触角が親水性を示す培養容器と遜色なく、接着性細胞を接着して、培養できることが明らかとなった。
【００６６】
［試験８］
次に、本実施形態の培養容器基材を用いて形成された培養容器によって、接着性細胞を培養可能であることを確認するための試験を、試験７とは異なる培養方法で行った。
具体的には、試験５と同様にして、表面処理を施して５０℃で２ヶ月変性処理したポリエチレンフィルム（静的水接触角９５．５°、実施例５のもの）を用いてディッシュ型の培養容器を形成すると共に、表面処理を施した直後のポリエチレンフィルム（静的水接触角７２．４°、参考例２のもの）を用いてディッシュ型の培養容器を形成して、ラミニン添加法により、接着性細胞の培養試験を行った。
【００６７】
接着性細胞としては、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を使用した。また、培地として、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ（品番ＲＣＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）を使用した。
そして、各培養容器に、１０ｍＭ Ｙ−２７６３２（品番２５３−００５１１、和光純薬工業株式会社製）を含む上記培地を注入すると共に、０．５ｍｇ／ｍｌのラミニン５１１−Ｅ８（品番８９２０１２、株式会社ニッピ製）を各培養容器に０．１２５μｇ／ｃｍ２となるように添加した。
その後、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液を注入して、３７℃で７日間培養を行った。このとき、培地は１．５ｍｌ、細胞懸濁液５μlであった。播種した細胞数は、およそ１．３×１０４ｃｅｌｌｓであった。また、培養開始から１日経過後に、培地をＹ−２７６３２不含有の培地に交換して、その後毎日培地交換を行った。
【００６８】
そして、培養７日後における細胞の接着状態を顕微鏡にて観察し、細胞の接着・伸展が見られるか否かを基準として、細胞の接着性を評価した。
その結果、図１２に示すように、本実施形態の培養容器（培養容器内の培養面の静的水接触角が９５．５°（疎水性の値）を示し、かつ後退角が５２．６°（親水性の値）を示すものによれば、静的水接触角が親水性を示す培養容器と遜色なく、接着性細胞を接着して培養できることが明らかとなった。
【００６９】
以上のように、本実施形態の培養容器基材によれば、容易に培養容器を形成できることが分かった。また、この培養容器基材を用いて形成した培養容器によれば、接着性細胞を好適に培養できることが明らかとなった。
【００７０】
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、表面処理としてコロナ処理とエキシマ処理を用いたが、その他の表面処理を用いても良い。また、接着性細胞として、ｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株）を使用したが、その他の接着性細胞を使用するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、ｉＰＳ細胞や活性化時におけるリンパ球等を含むその他の接着性細胞を培養するための培養容器を製造するために、好適に利用することが可能である。
【図１】
2019193604.tif 000002
【図２】
2019193604.tif 000003
【図３】
2019193604.tif 000004
【図４】
2019193604.tif 000005
【図５】
2019193604.tif 000006
【図６】
2019193604.tif 000007
【図７】
2019193604.tif 000008
【図８】
2019193604.tif 000009
【図９】
2019193604.tif 000010
【図１０】
2019193604.tif 000011
【図１１】
2019193604.tif 000012
【図１２】
2019193604.tif 000013