(57)【要約】【課題】ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織に含まれる細胞を適正に取得できる細胞取得方法および細胞取得装置を提供する。【解決手段】ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する方法において、細胞取得方法は、組織を力学的に破砕することにより、組織に含まれる細胞をフローサイトメーターで測定するために分散させる分散工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する方法であって、
前記組織を力学的に破砕することにより、前記組織に含まれる前記細胞をフローサイトメーターで測定するために分散させる分散工程を含む、細胞取得方法。
【請求項２】
前記分散工程において、回転する破砕部材を用いて前記組織を力学的に破砕する、請求項１に記載の細胞取得方法。
【請求項３】
前記組織が、容器に収容され、
前記分散工程における前記組織の力学的な破砕は、前記容器内で行われる、請求項２に記載の細胞取得方法。
【請求項４】
前記容器と前記破砕部材との間に間隙が設けられる、請求項３に記載の細胞取得方法。
【請求項５】
前記破砕部材および前記容器の内面の少なくともいずれか一方が、タンパク質および界面活性剤の少なくともいずれか一方で予め処理されている、請求項３または４に記載の細胞取得方法。
【請求項６】
前記破砕部材の回転速度が、５０００ｒｐｍ以下である、請求項２ないし５の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項７】
前記破砕部材は、前記組織を力学的に破砕するための刃を備える、請求項２ないし６の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項８】
前記破砕部材が、回転中心から外側の第１破砕部材と、内側の第２破砕部材を含む、請求項２ないし７の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項９】
前記第１破砕部材と前記第２破砕部材との間に間隙が設けられる、請求項８に記載の細胞取得方法。
【請求項１０】
前記破砕部材が、ポリマー樹脂を素材として含む、請求項２ないし９の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１１】
前記破砕部材が、ディスポーザブル部品である、請求項２ないし１０の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１２】
前記破砕部材に付着した細胞を、遠心により回収する回収工程をさらに含む、請求項２ないし１１の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１３】
前記分散工程により分散された前記細胞の所定部位を染色する染色工程をさらに含む、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１４】
前記分散工程により分散された前記細胞の光学的情報を前記フローサイトメーターにより取得する測定工程をさらに含む、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１５】
前記測定工程で取得された前記細胞の前記光学的情報に基づいて、前記細胞を解析する解析工程をさらに含む、請求項１４に記載の細胞取得方法。
【請求項１６】
前記解析工程において、前記細胞の割合を所定の閾値と比較し、前記組織が陽性検体および陰性検体のいずれであるかを判定する、請求項１５に記載の細胞取得方法。
【請求項１７】
前記ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、薄切された切片である、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の細胞取得方法。
【請求項１８】
前記切片の厚みが、２５μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１７に記載の細胞取得方法。
【請求項１９】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する細胞取得装置であって、
容器に収容された組織に接触した状態で回転して前記組織を力学的に破砕することにより、前記組織に含まれる前記細胞をフローサイトメーターで測定するために分散させる破砕部材と、
前記破砕部材を回転させる回転駆動部と、を備える、細胞取得装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞取得方法および細胞取得装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体から採取された病変組織などによれば、疾患の鑑別や病状の把握に有用な情報を得ることができる。一般に、生体から採取された組織は、そのままの状態で長く保存できないため、ホルマリンなどの固定剤により固定され、パラフィンなどの包埋剤で包埋される。これにより、採取後に時間が経過した場合でも、固定および包埋された組織から包埋剤を除去し、組織に含まれる細胞を分散することにより、細胞を取得できる。細胞の分散方法として、たとえば、特許文献１に記載の方法を用いることができる。この方法では、包埋剤を除去した病理組織を酵素処理することにより、個々の細胞が分散される。こうして得られた細胞を解析することにより、細胞の形態や細胞における分子マーカーの発現などの情報を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−１９０９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
固定および包埋された組織に基づいて細胞を解析するためには、包埋剤を除去した組織から適正に細胞を分散して取得することが重要である。しかしながら、固定および包埋された組織から細胞を取得する方法はまだ少なく、さらなる方法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する方法に関する。本態様に係る細胞取得方法は、組織を力学的に破砕することにより、組織に含まれる細胞をフローサイトメーター（４００）で測定するために分散させる分散工程（Ｓ１、Ｓ１４）を含む。
【０００６】
本態様に係る細胞取得方法によれば、組織に含まれる細胞をフローサイトメーターで測定するために組織が力学的に破砕される。このように力学的な破砕が行われ細胞が分散されると、フローサイトメーターでの測定が可能となるように組織に含まれる細胞を適正に取得できる。これにより、酵素処理により細胞が分散される場合に比べて、取得した細胞に基づいて精度よく細胞を解析できる。
【０００７】
本態様に係る細胞取得方法において、分散工程において、回転する破砕部材（１１）を用いて組織を力学的に破砕する。こうすると、円滑に力学的な破砕を行うことができる。
【０００８】
本態様に係る細胞取得方法において、組織が、容器（１１０）に収容され、分散工程（Ｓ１、Ｓ１４）における組織の力学的な破砕は、容器（１１０）内で行われる。こうすると、効率よく力学的な破砕を行うことができる。
【０００９】
本態様に係る細胞取得方法において、容器（１１０）と破砕部材（１１）との間に間隙（１１０ａ、１１０ｂ）が設けられる。こうすると、容器と破砕部材との間で細胞が破砕されてしまうことを抑制できる。
【００１０】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）および容器（１１０）の内面の少なくともいずれか一方が、タンパク質および界面活性剤の少なくともいずれか一方で予め処理される。脱パラフィン処理を経て得られた組織は、破砕部材および容器の内面に対する吸着性が高い。破砕部材および容器の内面がタンパク質や界面活性剤により予め処理されると、破砕部材および容器の内面に組織が吸着することを抑制できるため、細胞の回収率を高めることができる。
【００１１】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）の回転速度が、５０００ｒｐｍ以下とされる。破砕部材の回転速度を上げ過ぎると、いわゆるキャビテーションの発生により細胞自体が破砕され、細胞の核が破砕されてしまう。回転速度が上記のように規定されると、細胞が壊れない程度に組織が破砕されながら、細胞の不要な破砕を抑制できる。
【００１２】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）は、組織を力学的に破砕するための刃（２２１、３２１）を備える。こうすると、効率的に力学的な破砕を行うことができる。
【００１３】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）が、回転中心から外側の第１破砕部材（１１ａ）と、内側の第２破砕部材（１１ｂ）を含むよう構成され得る。こうすると、第１破砕部材と第２破砕部材とを回転軸まわりに相対的に回転させることで、効果的に組織を破砕できる。
【００１４】
この場合に、第１破砕部材（１１ａ）と第２破砕部材（１１ｂ）との間に間隙（１１ｃ）が設けられる。こうすると、第１破砕部材と第２破砕部材との間で細胞が破砕されてしまうことを抑制できる。
【００１５】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）が、ポリマー樹脂を素材として含むよう構成され得る。こうすると、破砕部材の強度を維持しながら、安価に破砕部材を構成できる。
【００１６】
本態様に係る細胞取得方法において、破砕部材（１１）が、ディスポーザブル部品とされる。こうすると、破砕部材が洗浄されることにより繰り返し用いられる場合とは異なり、破砕部材を介したコンタミネーションを防ぐことができる。
【００１７】
本態様に係る細胞取得方法は、破砕部材（１１）に付着した細胞を、遠心により回収する回収工程（Ｓ１５）をさらに含む。こうすると、破砕により泡が生じたとしても、泡に含まれる細胞を回収できるため、細胞の回収率を高めることができる。
【００１８】
本態様に係る細胞取得方法は、分散工程（Ｓ１４）により分散された細胞の所定部位を染色する染色工程（Ｓ１６）をさらに含む。こうすると、所定部位に関して細胞を詳細に解析できる。
【００１９】
本態様に係る細胞取得方法は、分散工程（Ｓ１４）により分散された細胞の光学的情報をフローサイトメーター（４００）により取得する測定工程（Ｓ１７）をさらに含む。こうすると、多量の細胞を効率よく測定できる。
【００２０】
この場合に、測定工程（Ｓ１７）で取得された細胞の光学的情報に基づいて、細胞を解析する解析工程（Ｓ１８）をさらに含む。
【００２１】
また、解析工程（Ｓ１８）において、細胞の割合を所定の閾値と比較し、組織が陽性検体および陰性検体のいずれであるかを判定する。こうすると、組織が陽性と陰性の何れであるかを取得できるため、組織を採取した被検者に対して適切な治療や投薬を行うことができる。
【００２２】
本態様に係る細胞取得方法において、ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、薄切された切片とされる。こうすると、分散工程において円滑に細胞を分散できる。
【００２３】
この場合に、切片の厚みが、２５μｍ以上１００μｍ以下とされる。切片の厚みが小さ過ぎると細胞の回収率が低下し、切片の厚みが大き過ぎると貴重な組織の消費が大きくなってしまう。切片の厚みが上記のように規定されると、細胞回収率の低下と、組織の消費とを抑制できる。
【００２４】
本発明の第２の態様は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する細胞取得装置に関する。本態様に係る細胞取得装置（１０）は、容器（１１０）に収容された組織に接触した状態で回転して組織を力学的に破砕することにより、組織に含まれる細胞をフローサイトメーター（４００）で測定するために分散させる破砕部材（１１）と、破砕部材（１１）を回転させる回転駆動部（１２）と、を備える。
【００２５】
本態様に係る細胞取得装置によれば、第１の態様と同様の効果が奏される。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織に含まれる細胞を適正に取得できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施形態の概要に係る細胞取得方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態の概要に係る細胞取得装置の構成を示すブロック図である。
【図３】図３は、実施形態に係る細胞分析方法を示すフローチャートである。
【図４】図４（ａ）は、実施形態に係る細胞取得装置の外観構成を示す斜視図である。図４（ｂ）は、実施形態に係る破砕部材、回転駆動部、および吸収部の近傍の構成を示す側面図である。
【図５】図５（ａ）は、実施形態に係る第１破砕部材および第２破砕部材の構成を示す側面図である。図５（ｂ）は、実施形態に係る破砕部材および容器を回転軸を含む平面で切断したときの構成を示す断面図である。
【図６】図６（ａ）は、実施形態に係る破砕部材が最も下方まで移動された状態を示す側面図である。図６（ｂ）は、実施形態に係る破砕部材が分散対象組織に押されて上方に押し返された状態を示す側面図である。
【図７】図７は、実施形態に係るフローサイトメーターおよび解析装置の構成を示すブロック図である。
【図８】図８（ａ）は、実施形態に係る力学的分散と酵素的分散の比較検討において陽性と判定するための閾値を示すグラフである。図８（ｂ）は、実施形態に係る力学的分散と酵素的分散の比較検討において取得された陽性率を示すグラフである。
【図９】図９（ａ）は、実施形態に係る力学的分散に用いる装置の検討において取得されたＤＡＰＩシグナル強度のヒストグラムである。図９（ｂ）は、実施形態に係る力学的分散に用いる装置の検討において取得された形態の正常な細胞の比率を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施形態に係る力学的分散条件の検討において取得された細胞数を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施形態に係る容器等への吸着抑制の検討において取得された細胞数を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａ）は、実施形態に係る薄切切片の厚みの検討において薄切切片の取得を説明するための模式図である。図１２（ｂ）は、実施形態に係る薄切切片の厚みの検討において取得された細胞数を示すグラフである。図１２（ｃ）は、実施形態に係る薄切切片の厚みの検討において取得された細胞回収率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施形態に係る診断または検査に必要な細胞数を取得できるか否かの検討において取得された推定細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
図１、２を参照して、実施形態の概要について説明する。
【００２９】
図１に示すフローチャートは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する処理を示している。ホルマリン固定パラフィン包埋組織は、ＦＦＰＥ組織（Formalin-fixed paraffin-embedded tissue）とも呼ばれる。ＦＦＰＥ組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織を、以下「分散対象組織」と称する。図１の処理は、図２に示す細胞取得装置１０によって実行される。
【００３０】
図２に示すように、細胞取得装置１０は、破砕部材１１と回転駆動部１２を備える。破砕部材１１は、容器に収容された分散対象組織に接触した状態で回転して分散対象組織を力学的に破砕することにより、フローサイトメーターで測定するために分散対象組織を分散させる。回転駆動部１２は、破砕部材１１を回転させる。
【００３１】
図１に戻り、オペレータは、ステップＳ１の処理の前に、ＦＦＰＥ組織に対して脱パラフィン処理を行って分散対象組織を取得する。そして、ステップＳ１の分散工程において、オペレータは、分散対象組織を力学的に破砕することにより、フローサイトメーターで測定するために分散対象組織に含まれる細胞を分散させる。具体的には、ステップＳ１において、オペレータは、取得した分散対象組織を細胞取得装置１０にセットして、細胞取得装置１０による処理を開始させる。細胞取得装置１０は、開始指示を受け付けると、回転する破砕部材１１を用いて分散対象組織を力学的に破砕することにより、フローサイトメーターで測定するために分散対象組織に含まれる細胞を分散させる。これにより、容器内において細胞が取得される。
【００３２】
このように力学的な破砕が行われ細胞が分散されると、フローサイトメーターによる測定が可能となるように組織に含まれる細胞を適正に取得できる。これにより、酵素処理により細胞が分散される場合に比べて、取得した細胞に基づいて精度よく細胞を解析できる。
【００３３】
なお、分散された細胞とは、複数の細胞が凝集せずに、複数の細胞がそれぞれ分離された状態にあることを意味する。ただし、「分散対象組織に含まれる細胞を分散する」とは、分散対象組織中の細胞全てを分離することに限らず、分散対象組織中の一定数の細胞を分離させることをも含む概念である。
【００３４】
ＩＨＣ法による病理診断でのＫｉ６７の評価では、５００個〜１０００個の細胞を評価することが推奨されている。したがって、病理診断と同等以上の精度で細胞を評価するためには、フローサイトメーターによる１回の測定で５００個〜１０００個以上の細胞が検出されるよう、分散工程において力学的な破砕が行われるのが好ましい。
【００３５】
力学的な細胞分散は、回転する破砕部材１１を用いて行われることに限らない。また、分散工程において、力学的な細胞分散に加えて、酵素的な細胞分散が合わせて行われてもよい。
【００３６】
ＦＦＰＥ組織に含まれる組織としては、たとえば、固形腫瘍の組織（腫瘍組織）、非腫瘍病変組織、正常組織などが挙げられる。
【００３７】
「固形腫瘍」とは、腫瘍細胞と、線維芽細胞、細胞外基質などとからなる塊を作るものをいう。固形腫瘍の具体例としては、喉頭癌、食道癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、腎臓癌、肝臓癌、胸腺癌、脾臓癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、骨癌、皮膚癌、肉腫、骨肉腫、黒色腫、芽細胞腫、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、脳腫瘍、口腔癌、癌腫、リンパ腫、線維腫、髄膜腫、胆道癌、褐色細胞腫、膵島細胞癌、リー・フラウメニ（Ｌｉ−ｆｒａｕｍｅｎｉ）腫瘍、下垂体部腫瘍、多発性神経内分泌Ｉ型およびＩＩ型腫瘍、頭頸部癌、睾丸癌などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３８】
「非腫瘍病変組織」とは、腫瘍以外の病変組織をいう。非腫瘍病変組織の具体例としては、良性前立腺肥大、口腔白板症、大腸ポリープ、食道前、癌性増殖、良性病変などが挙げられるが、特に限定されない。「正常組織」とは、腫瘍組織および非腫瘍病変組織以外の組織をいう。正常組織の具体例としては、胃、肝臓、乳房、乳腺、肺、膵臓、膵臓腺、子宮、皮膚食道、喉頭、咽頭、舌、甲状腺などの器官から得られる組織などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３９】
次に、図３を参照して、実施形態の細胞分析方法について説明する。細胞分析方法は、細胞を取得する工程と、細胞取得の前後に行われる工程とを含む。
【００４０】
ステップＳ１１の切片作製工程において、オペレータは、ミクロトームを用いてＦＦＰＥ組織を薄切し、薄切切片を作製する。薄切切片を作製することにより、後段の分散工程において円滑に細胞を分散できる。薄切切片の厚みは、２５μｍ以上１００μｍに設定される。なお、薄切切片の厚みとして好ましい範囲については、追って実施形態の条件の検討で説明する。
【００４１】
続いて、ステップＳ１２の脱パラフィン処理および親水化工程において、オペレータは、ステップＳ１１で作製したＦＦＰＥ切片に対して脱パラフィン処理を行って分散対象組織を取得する。さらに、ステップＳ１２において、オペレータは、分散対象組織に対して親水化処理を行う。
【００４２】
ステップＳ１３の抗原賦活化工程において、オペレータは、ステップＳ１２の処理を経た分散対象組織に対して抗原賦活化処理を行う。これにより、後段の染色工程において、抗体に対する抗原の反応性が高められる。続いて、ステップＳ１４の分散工程において、オペレータは、細胞取得装置１０を用いて、ステップＳ１３の処理を経た分散対象組織に含まれる細胞を分散させる。ステップＳ１４の分散工程は、図１のステップＳ１の分散工程に対応する。
【００４３】
ここで、図４（ａ）〜図６（ｂ）を参照して、細胞取得装置１０の詳細な構成について説明する。
【００４４】
図４（ａ）に示すように、細胞取得装置１０は、本体１０１と、カバー１０２と、保冷庫１０３と、４つの破砕部材１１と、を備える。
【００４５】
本体１０１は、直方体形状を有している。カバー１０２は、本体１０１の前面の一部を覆っており、本体１０１に対して上下にスライド可能である。カバー１０２が上下にスライドすることにより、本体１０１の内部が開閉される。図４（ａ）には、カバー１０２が開いた状態が図示されている。
【００４６】
保冷庫１０３は、本体１０１の内部に形成された窪みの底面部分に設けられている。保冷庫１０３の上面には、４つの開口１０３ａが設けられている。保冷庫１０３は、４つの開口１０３ａの真下位置において、４つの容器１１０を保持する。容器１１０には、細胞取得装置１０の処理が開始される前に、あらかじめステップＳ１３で取得された分散対象組織が収容される。破砕部材１１は、開口１０３ａの真上位置において、本体１０１の内部に形成された窪みの天井部分に配置される。
【００４７】
容器１１０は、ディスポーザブルな容器であり、コンタミネーションを防止するために細胞の分散処理ごとに交換される。容器１１０は、ポリマー樹脂を素材として含み、たとえば、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどにより構成される。実施形態の容器１１０は、ポリプロピレンにより構成される。容器１１０がポリマー樹脂を素材として含むことにより、容器１１０の強度を維持しながら、容器１１０を安価に構成できる。
【００４８】
図４（ｂ）に示すように、細胞取得装置１０は、破砕部材１１と、回転駆動部１２と、吸収部１３と、取付部１２１と、軸部１２２と、ストッパ１２３と、支持部材１２４と、支持ブロック１２５と、昇降機構部１２６と、昇降用モータ１２７と、を備える。
【００４９】
破砕部材１１は、ディスポーザブルな容器であり、コンタミネーションを防止するために分散処理ごとに交換される。これにより、共通の破砕部材が洗浄され繰り返し用いられる場合とは異なり、破砕部材１１を介したコンタミネーションを防ぐことができる。破砕部材１１は、いわゆるブレンダである。破砕部材１１は、二重構造となっており、外側に位置する第１破砕部材１１ａと、内側に位置する第２破砕部材１１ｂとを備える。破砕部材１１は、ポリマー樹脂を素材として含み、たとえば、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどにより構成される。実施形態の破砕部材１１は、ポリカーボネートにより構成される。破砕部材１１がポリマー樹脂を素材として含むことにより、破砕部材１１の強度を維持しながら、破砕部材１１を安価に構成できる。
【００５０】
取付部１２１は、下端に破砕部材１１を着脱可能に構成されている。図４（ｂ）には、取付部１２１の下端に破砕部材１１が装着された状態が示されている。回転駆動部１２は、取付部１２１の上方に設けられている。回転駆動部１２は、破砕部材１１を回転させるためのモータである。取付部１２１は、円柱状の軸部１２２を有している。ストッパ１２３は、円盤形状を有し、回転駆動部１２の下方に設けられている。ストッパ１２３から下方に延びるように軸部１２２が設けられている。回転駆動部１２が駆動されることにより、取付部１２１に装着された破砕部材１１の第２破砕部材１１ｂが回転する。
【００５１】
支持ブロック１２５は、円環形状を有し、板形状の支持部材１２４に設置されている。軸部１２２は、支持ブロック１２５の中央に設けられた孔を介して、支持ブロック１２５を上下方向に貫通している。吸収部１３は、バネである。吸収部１３の上端は支持部材１２４の下面に設置され、吸収部１３の下端は取付部１２１の上端面に設置されている。昇降機構部１２６は、ベルトおよびプーリ等から構成されている。支持部材１２４は、昇降機構部１２６のベルトに接続されている。昇降用モータ１２７は、昇降機構部１２６のプーリを回転させる。昇降用モータ１２７が駆動されることにより、支持部材１２４が上下に移動し、破砕部材１１が上下に移動する。
【００５２】
図５（ａ）に示すように、第１破砕部材１１ａは、胴部２１０と、８つの刃２２１と、一対の突部２２２と、鍔部２２３と、を備える。胴部２１０は、筒形状を有する。胴部２１０には、上下方向に貫通する貫通孔２１１が形成されている。貫通孔２１１の上部付近の内側面には、段差部２１１ａが設けられている。８つの刃２２１は、胴部２１０の下端において周方向に並ぶように設けられている。８つの刃２２１は、分散対象組織を力学的に破砕する。一対の突部２２２は、胴部２１０の上端付近に設けられている。鍔部２２３は、突部２２２よりも下方の胴部２１０の側面に設けられている。
【００５３】
径方向に向かい合う２つの刃２２１の内側面の間隔Ｌ１、すなわち貫通孔２１１の下端部分の直径は、１０．０ｍｍである。貫通孔２１１の周方向における刃２２１の幅Ｌ２は、３．５ｍｍである。貫通孔２１１の径方向における刃２２１の厚みは、１．０ｍｍである。
【００５４】
第２破砕部材１１ｂは、胴部３１０と、刃３２１と、鍔部３２２、３２３と、を備える。胴部３１０は、円柱形状を有する。刃３２１は、胴部３１０の下端に設けられている。刃３２１は、分散対象組織を力学的に破砕する。鍔部３２２は、胴部３１０の上端から上方向に突出しており、板形状を有する。鍔部３２３は、胴部３１０の上端の側面に設けられている。
【００５５】
刃３２１の幅Ｌ３、すなわち刃３２１を水平面で切断したときの切断面の長手方向の長さは、９．９ｍｍである。刃３２１の厚み、すなわち刃３２１を水平面で切断したときの切断面の短手方向の長さは、２．０ｍｍである。
【００５６】
破砕部材１１が取付部１２１に装着される場合、まず第１破砕部材１１ａの貫通孔２１１の上方から第２破砕部材１１ｂが挿入され、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとが組合わされる。このとき、第２破砕部材１１ｂの鍔部３２３が、第１破砕部材１１ａの段差部２１１ａに当たることにより、第２破砕部材１１ｂの下方への移動が制限される。第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとが組合わされた状態で、破砕部材１１が取付部１２１に下から装着される。これにより、第１破砕部材１１ａの突部２２２が取付部１２１に支持され、第２破砕部材１１ｂの鍔部３２２が、軸部１２２に接続される。
【００５７】
図５（ｂ）に示すように、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとが組合わされた状態において、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとの間に間隙１１ｃが設けられるよう、破砕部材１１が構成されている。Ｌ１が１０．０ｍｍ、Ｌ３が９．９ｍｍであることから、間隙１１ｃの幅は０．０５ｍｍである。このように間隙１１ｃが設けられることで、細胞の分散を行いながら、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとの間に細胞が挟まり、細胞が破砕されてしまうことを抑制できる。したがって、細胞の核も破砕されることが抑制されるため、後段の解析工程において適正に細胞を解析できる。
【００５８】
なお、間隙１１ｃの幅が０．０５ｍｍに設定されている理由は、２０μｍ程度の細胞が破砕されることを防ぎながら、間隙１１ｃにおいて乱流を生じさせて細胞を円滑に分散させるためである。間隙１１ｃが０．０５ｍｍより狭い場合には、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂに挟まれて細胞の破砕が起こり得るため、間隙１１ｃは０．０５ｍｍ以上に設定されるのが好ましい。一方、間隙１１ｃが広すぎる場合には、間隙１１ｃにおいて乱流が生じにくくなるため、間隙１１ｃは、第１破砕部材１１ａの刃２２１の内側面の間隔Ｌ１の２０％以下に設定されるのが好ましい。実施形態の場合、Ｌ１が１０．０ｍｍであることから、間隙１１ｃは、２ｍｍ以下に設定されるのが好ましい。
【００５９】
また、破砕部材１１が容器１１０に挿入されたとき、破砕部材１１の側面と容器１１０の内側面との間に間隙１１０ａが設けられ、破砕部材１１の下端と容器１１０の底面部分との間に間隙１１０ｂが設けられる。これにより、容器１１０と破砕部材１１との間で細胞が破砕されてしまうことを抑制できる。
【００６０】
容器１１０の底面部分には、上方向に突出した突部１１１が設けられている。破砕部材１１が分散対象組織１１２を力学的に破砕する際には、図５（ｂ）に示すように、破砕部材１１の下端と容器１１０の突部１１１との間に分散対象組織１１２が挟まれ、この状態で、第２破砕部材１１ｂのみが回転軸を中心として回転される。これにより、刃２２１、３２１により分散対象組織１１２が効率的に破砕される。このように、分散対象組織１１２の力学的な破砕が容器１１０内で行われると、効率よく破砕を行うことができる。また、第１破砕部材１１ａと第２破砕部材１１ｂとを回転軸まわりに相対的に回転させることで、効果的に組織を破砕できる。
【００６１】
なお、破砕部材１１の回転速度、すなわち第２破砕部材１１ｂの回転速度は、１００００ｒｐｍ未満であるのが好ましく、５０００ｒｐｍ以下であるのがより好ましい。破砕部材１１の回転速度として好ましい範囲については、追って実施形態の条件の検討で説明する。
【００６２】
また、容器１１０および破砕部材１１は、分散工程の前に、細胞の吸着を抑制するための試薬により処理されるのが好ましい。こうすると、分散工程において容器１１０および破砕部材１１への細胞の吸着が抑制されるため、細胞の回収率を高めることができる。細胞の吸着を抑制するための試薬による処理は、分散工程の直前に行われてもよく、容器１１０および破砕部材１１の出荷前にあらかじめ行われてもよい。細胞の吸着を抑制するための試薬および処理については、追って実施形態の条件の検討で説明する。
【００６３】
図６（ａ）に示すように、破砕部材１１が容器１１０に挿入されるとき、破砕部材１１の鍔部２２３が容器１１０の上端に当たることにより、破砕部材１１の下端と容器１１０の底面との間に隙間が設けられる。
【００６４】
図６（ａ）の状態では、吸収部１３の伸長しようとする力により、分散対象組織１１２が破砕部材１１により上から押さえ付けられている。一方、図６（ｂ）に示すように、分散対象組織１１２の大きさなどにより、破砕部材１１が上方向に受ける力が大きい場合は、吸収部１３が縮められ破砕部材１１の下端が上方向に移動する。すなわち、破砕部材１１が組織に押し付けられる押付力を吸収部１３が吸収するため、破砕部材１１が過剰な力で組織に押し付けられることを防止できる。これにより、細胞が壊れることを抑制できるため、解析工程において細胞を適正に解析できる。
【００６５】
なお、破砕部材は、回転することにより、分散対象組織をすり潰して分散対象組織を力学的に破砕してもよい。
【００６６】
図３に戻り、ステップＳ１５の回収工程において、オペレータは、破砕部材１１と容器１１０とが繋がった状態で、分散工程後の破砕部材１１と容器１１０を、細胞取得装置１０から取り外す。そして、オペレータは、破砕部材１１と容器１１０とが繋がった状態で、容器１１０の底面を外側に向けて破砕部材１１と容器１１０を遠心分離器にセットし、遠心分離を開始させる。これにより、破砕部材１１に付着した細胞が、遠心により容器１１０に回収される。こうすると、破砕により容器１１０内に泡が生じていたとしても、泡に含まれる細胞をも容器１１０に回収できるため、細胞の回収率を高めることができる。
【００６７】
ステップＳ１６の染色工程において、オペレータは、ステップＳ１５において回収された細胞の所定部位を染色する。所定部位は、たとえば細胞内の核や所定のマーカーである。細胞が染色されることにより、後段の解析工程において所定部位に関して細胞を詳細に解析できる。
【００６８】
なお、染色工程における染色は、オペレータにより手動で行われてもよく、装置により自動で行われてもよい。また、染色工程は省略されてもよい。
【００６９】
ステップＳ１７の測定工程において、オペレータは、染色工程を経た細胞を、フローサイトメーターにセットし、細胞の光学的情報をフローサイトメーターにより取得する。光学的情報とは、細胞から生じた前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、および蛍光（ＦＬ）の強度に関する情報や、細胞および細胞の所定部位を撮像した撮像情報などである。ステップＳ１７において、具体的には、染色された細胞を含む測定試料がフローセルに流され、フローセルを流れる測定試料に対して光が照射される。そして、細胞から生じた光が光検出器により受光されるとともに、カメラにより撮像される。このようにフローサイトメーターを用いて細胞から光学的情報が取得されると、多量の細胞を効率よく測定できる。
【００７０】
ステップＳ１８の解析工程において、解析装置は、ステップＳ１７においてフローサイトメーターにより取得された細胞の光学的情報に基づいて、細胞を解析する。具体的には、解析装置は、フローサイトメーターで測定された細胞の数Ｎ１と、フローサイトメーターで測定された細胞のうち所定部位が染色された細胞の数Ｎ２とを取得する。
【００７１】
なお、細胞の数Ｎ１は、たとえば、光検出器に基づく前方散乱光の強度が所定値以上の粒子の数や、カメラの撮像画像の解析により細胞と判定された粒子の数として取得される。染色された細胞の数Ｎ２は、たとえば、細胞と判定された粒子のうち、光検出器に基づく蛍光の強度が所定値以上の粒子の数や、カメラの撮像画像の解析により蛍光が生じていると判定された粒子の数として取得される。
【００７２】
そして、解析装置は、Ｎ２／Ｎ１により染色された細胞の割合を算出し、算出した細胞の割合を所定の閾値と比較して、組織が陽性検体または陰性検体のいずれであるかを判定する。これにより、染色対象の部位が所定の疾患に関係するマーカーである場合、採取された組織が、所定の疾患に関して陽性検体および陰性検体のいずれであるかを判定できる。よって、組織を採取した被検者に対して適切な治療や投薬を行うことができる。
【００７３】
図７に示すように、フローサイトメーター４００は、フローセル４０１と、照射部４０２と、測定部４０３と、を備える。フローサイトメーター４００は、ステップＳ１７の測定工程における処理を実行する。
【００７４】
フローセル４０１には、ステップＳ１６の染色工程を経た細胞を含む測定試料が流される。照射部４０２は、フローセル４０１を流れる測定試料に光を照射する。照射部４０２は、たとえば、半導体レーザ光源である。測定部４０３は、複数の光検出器４０３ａと、カメラ４０３ｂと、を備える。測定部４０３は、測定試料中の細胞から生じた前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、および蛍光（ＦＬ）を光検出器４０３ａにより受光して、受光強度に応じた検出信号を取得する。光検出器４０３ａは、たとえば、フォトダイオードやアバランシェフォトダイオードである。また、測定部４０３は、測定試料中の細胞から生じた蛍光（ＦＬ）および測定試料中の細胞を透過した光をカメラ４０３ｂにより撮像して、撮像信号を取得する。カメラ４０３ｂは、たとえば、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラである。
【００７５】
解析装置５００は、制御部５０１と、記憶部５０２と、表示部５０３と、入力部５０４と、を備える。解析装置５００は、ステップＳ１８の解析工程における処理を実行する。
【００７６】
制御部５０１は、たとえば、ＣＰＵである。記憶部５０２は、たとえば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスクなどである。記憶部５０２は、制御部５０１に実行させるためのコンピュータのプログラムを記憶している。制御部５０１は、フローサイトメーター４００により取得された細胞の光学的情報に基づいて、細胞を解析する。具体的には、制御部５０１は、組織が陽性検体または陰性検体のいずれかであるかを判定する。表示部５０３は、たとえば、液晶ディスプレイである。入力部５０４は、マウスおよびキーボードである。
【００７７】
＜実施形態の条件の検討＞
発明者らは、図３に示した工程をどのような条件下で行えばよいかを検討した。
【００７８】
１．共通の手順
まず、各検討における共通の手順（１）〜（８）について説明する。以下の（１）〜（８）の工程は、図３のステップＳ１１〜Ｓ１８に対応する。
【００７９】
（１）切片作製工程
がんＦＦＰＥ試料をミクロトームで薄切し、薄切切片を作成した。薄切切片を１．５ｍＬチューブに採取した。
【００８０】
（２）脱パラフィンおよび親水化工程
切片作製工程で得られた薄切り切片に対して、下記表１に示す順序と繰り返し回数で、溶液添加、静置、および上清除去を順次行い、脱パラフィン処理および親水化処理を行った。
【００８１】
【表１】
2019207201.tif 000003
【００８２】
（３）抗原賦活化工程
９８℃に予備加熱した賦活化溶液（１／２００イムノセイバー希釈溶液）を添加し、９８℃で６０分間静置した。室温で１０分間除冷したのち、上清を除去した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加後、１分間静置し上清を除去する工程を２回実施した。
【００８３】
（４）分散工程
破砕処理用の容器に試料を移送し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを４ｍＬ添加した。氷冷しながら所定の回転速度で所定の時間、破砕装置の破砕部材により細胞の分散を行った。
【００８４】
（５）回収工程
破砕部材と容器を破砕装置から取り出し、２０００ｇで３分間遠心分離処理を行った。上清を除去して０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。セルストレイナーII（４０μｍメッシュ）と卓上遠心機によるメッシュ処理を実施し、未破砕の残渣を除去した。フィルタ通過物を遠心処理し、上清を除去した。４％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して懸濁し、３０分間静置した。
【００８５】
なお、後述の検討において酵素処理により細胞を分散させる場合には、上記（４）、（５）の工程に代えて、以下の酵素的分散工程を行った。
【００８６】
酵素的分散工程において、親水化済みの試料に対して、１２．８Ｕ／ｍＬのDispaseI+II(GIBCO)溶液を、薄切試料断面積８０ｍｍ２あたり６．４Ｕ、４Ｕ、１Ｕとなるように添加し、時折タッピングにより攪拌を行いながら３７℃で１０分間処理した。終濃度ＥＤＴＡ１ｍＭ、０．５％ＢＳＡ、ＰＢＳとなるように調製し反応を停止させた。試料を遠心処理し、上清を除去した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加後、１分間静置し上清を除去する工程を２回実施した。４％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して懸濁し、３０分間静置した。
【００８７】
（６）染色工程
はじめに、細胞内の抗体の染色を行った。上記懸濁試料を９６ウェルＶボトムプレート（染色用容器）に分注した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。続いて、１次抗体処理を行った。１次抗体処理において、１次抗体溶液（抗体濃度は１／１００、希釈バッファは１０％ normal goat serum、４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を添加して懸濁し、室温で一時間静置した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して懸濁し、遠心分離処理を行い、上清を除去した。このような工程を合計２度実施した。続いて２次抗体処理を行った。２次抗体処理において、２次抗体溶液（抗体濃度は１／１０００、希釈バッファは５％ normal goat serum、４％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を添加して懸濁し、室温暗所で３０分間静置した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して懸濁し、遠心分離処理を行い、上清を除去した。このような工程を合計２度実施した。こうして、細胞内の抗体が染色された。
【００８８】
続いて、細胞内の核酸の染色を行った。上記試料にＤＡＰＩ ５μｇ／ｍＬ ０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を添加して懸濁し、３分間静置した。こうして、細胞内の核酸が染色された。
【００８９】
（７）測定工程
フローサイトメトリー法に基づいて細胞から生じた光を光検出器またはカメラで受光し、光検出器の検出信号に基づく光強度またはカメラの撮像信号に基づく撮像画像を取得した。光検出器による光強度の取得を行う場合には、フローサイトメーターとしてFACverse（BD）を用いた。この場合のフローサイトメーターを、以下「第１フローサイトメーター」と称する。カメラによる撮像画像の取得を行う場合には、フローサイトメーターとしてAmnis ImageStream（Merck）を用いた。この場合のフローサイトメーターを、以下「第２フローサイトメーター」と称する。
【００９０】
（８）解析工程
測定工程において第１フローサイトメーターを用いた場合には、解析装置としてFlowjo（トミーデジタルバイオロジー）を用いた。測定工程において第２フローサイトメーターを用いた場合には、解析装置としてIDEAS Application version 6.0（Merck）を用いた。
【００９１】
２．条件の検討
次に、発明者らは、上記共通の手順に対し所定の手順を変更および追加して、条件の検討を行った。
【００９２】
（１）力学的分散と酵素的分散の比較検討
この検討では、２つの異なる乳がんＦＦＰＥ試料を用いた。上記共通の手順の（４）分散工程において力学的な細胞の分散と酵素的な細胞の分散とをそれぞれ別々に行って、Ｋｉ６７（Ｋｉ−Ｓ５、ＭＩＢ−１）染色およびアイソタイプコントロール（ＩＣ、mouse G3A1 IgG）染色を実施し、上記共通の手順の（７）測定工程において第１フローサイトメーターによる光強度の取得を行った。そして、ＦＳＣ、ＳＳＣ、ＤＡＰＩの検出信号に基づいて細胞を抽出し、抽出した細胞の抗体染色に基づく検出信号をヒストグラムにより評価した。力学的分散においては、破砕部材を５０００ｒｐｍで５分間動作させた。酵素的分散においては、DispaseI+II(GIBCO)溶液を６．４Ｕ、４Ｕ、１Ｕとなるように添加した。
【００９３】
図８（ａ）に示すように、各ＦＦＰＥ試料において、アイソタイプコントロール（mouse G3A1 IgG）の９９パーセンタイルに相当するシグナル強度に閾値を設定し、閾値よりも大きなシグナルを示した細胞を陽性と判定した。そして、陽性細胞数を測定した細胞数で除算して陽性率を算出した。
【００９４】
図８（ｂ）において、白および黒の棒グラフは、２つの異なる乳がんＦＦＰＥ試料に対応する。図８（ｂ）に示すように、Ｋｉ−Ｓ５染色およびＭＩＢ−１染色のいずれにおいても、酵素的分散を行った場合には、１％程度の陽性率にとどまっており、抗体認識由来のシグナルが得られていない。一方、力学的分散を行った場合には、４．９％〜６．８％程度の陽性率となり、細胞の標的となる抗原が維持されていると考えられる。
【００９５】
以上のことから、力学的な破砕により細胞が分散されると、酵素処理により細胞が分散される場合に比べて、適正な染色が可能になり、上記共通の手順の（８）解析工程において細胞をより適正に解析できることが分かった。
【００９６】
なお、このように適正な染色が可能となると、陽性率が所定の閾値より大きい場合に、元となる組織すなわちＦＦＰＥ試料が陽性検体であると判定でき、陽性率が所定の閾値以下の場合に、元となる組織すなわちＦＦＰＥ試料が陰性検体であると判定できる。
【００９７】
（２）力学的分散に用いる装置の検討
次に、発明者らは、力学的分散に用いる装置の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下の表２に示すように２種類の破砕装置を用いて力学的分散を行った。
【００９８】
【表２】
2019207201.tif 000004
【００９９】
第１破砕装置は、上記実施形態の細胞取得装置１０に対応する。第２破砕装置は、Miltenyi Biotec社のgentleMACSである。第１破砕装置では、上述したように回転刃の回転により分散が行われ、第２破砕装置では、すり潰しにより分散が行われる。
【０１００】
発明者らは、市販の肺がんＦＦＰＥ検体に対して、これらの破砕装置を用いて力学的分散と、Dispaseによる酵素的分散とを並行して行った。第１破砕装置は、破砕部材の回転速度が５０００ｒｐｍおよび１００００ｒｐｍとなるよう駆動された。発明者らは、第２フローサイトメーターを用いて、分散工程後の試料から撮像画像を取得し、取得した撮像画像に基づいてＤＡＰＩの検出強度を算出し、算出した検出強度をヒストグラムにより評価した。なお、この検討では、上記共通の手順の（６）染色工程において、抗体の染色が省略された。
【０１０１】
図９（ａ）は、粒子画像のＤＡＰＩシグナル強度のヒストグラムである。図９（ａ）において、各装置においてヒストグラムは正規化されており、各装置のヒストグラムが、便宜上、縦方向に並べられている。
【０１０２】
Dispaseによる酵素的分散の場合、分散細胞由来の強度範囲に、分散細胞に由来する明確なピークが確認された。一方、力学的分散の場合、第１破砕装置の分散細胞由来の強度範囲にピークが確認された。第２破砕装置では、分散細胞由来の強度範囲に明確なピークが現れなかった。
【０１０３】
以上のことから、力学的分散に用いる装置としては、第１破砕装置、すなわち上記実施形態で説明した細胞取得装置１０が好適であることが分かった。このように、力学的に細胞の分散を行った場合も、第１破砕装置によれば、酵素的分散と同様に、分散細胞由来の強度範囲においてピークが現れることから、適正に細胞を分散できることが分かった。
【０１０４】
さらに、発明者らは、上記表２に示した装置を用いた場合に取得した撮像画像を参照して細胞の変形状態を判定し、細胞の分散が適正か否かを検討した。
【０１０５】
この検討において、発明者らは、核が凝集または変形した状態を判定するために、核画像の核領域のアスペクト比を算出した。アスペクト比は、短径／長径である。そして、発明者らは、算出したアスペクト比が０．６未満である場合に、当該細胞を核が凝集または変形した変形細胞であると判定し、算出したアスペクト比が０．６以上の場合に、当該細胞を正常に分散された正常細胞であると判定した。
【０１０６】
図９（ｂ）は、全細胞のうち正常細胞の比率を示すグラフである。第１破砕装置の場合に、比率が５０％を越えていることから、細胞が凝集および変形せずに正常な形態を維持していると言える。したがって、細胞の形態の観点からも、第１破砕装置が好適であることが分かった。
【０１０７】
（３）力学的分散条件の検討
次に、発明者らは、力学的分散条件の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
【０１０８】
上記共通の手順の（６）染色工程において、細胞内の抗体の染色を省略し、ＤＡＰＩ染色の際に、濃度既知のカウンティングビーズを添加した。そして、上記第１破砕装置を用いて、図１０に示す破砕部材の回転速度および回転時間の条件で、細胞の分散を行い、第１フローサイトメーターを用いて取得したカウンティングビーズの数と、使用したＦＦＰＥ試料中の細胞数とから、測定した細胞数すなわち検出細胞数を取得した。
【０１０９】
ここで、ＦＦＰＥ試料中の細胞数を、以下の手順で取得した。第１フローサイトメーターによる測定に用いたＦＦＰＥ試料の薄切切片と平行な３μｍの薄切切片を取得し、取得した薄切切片をスライドガラスに貼付した。貼付状態の薄切切片に、上記共通の手順の（２）脱パラフィンおよび親水化工程を実施した後に、ＤＡＰＩ ５μｇ／ｍＬによる染色を行った。切片はカバーガラスにより封入した後、NanoZoomer（浜松ホトニクス社製）を用いて、ＤＡＰＩ染色シグナルを４０倍の倍率で標本画像として撮像した。試料断面部位より４０倍画像を１０視野選択し、画像解析により細胞数を計数することで、面積当たりの細胞密度の平均を算出した。そして、同じく画像解析により試料断面積を算出し、上記の算出した細胞密度を乗じて３μｍの厚み当たりの細胞数とし、同時に単位厚みあたりの細胞数を算出した。単位厚み当たりの細胞数に、第１フローサイトメーターによる測定で用いた薄切切片の厚みを乗じることで、使用したＦＦＰＥ試料中の細胞数を取得した。
【０１１０】
図１０は、２つのＦＦＰＥ試料に対する力学的分散を、１００００ｒｐｍおよび１分の条件で行う場合と、５０００ｒｐｍおよび１分の条件で行う場合と、５０００ｒｐｍおよび５分で行う場合とで検出細胞数を比較した結果である。図１０に示すように、１つの条件に対して２回の検出細胞数の取得を行った。また、検討を行ったＦＦＰＥ試料は全て同一である。
【０１１１】
１００００ｒｐｍおよび１分の条件と、５０００ｒｐｍおよび１分の条件との比較結果から、第１破砕装置の破砕部材の回転速度は、５０００ｒｐｍの方が好ましいことが分かった。５０００ｒｐｍに比べて１００００ｒｐｍにおいて検出細胞数が低下する理由としては、破砕部材の高速回転によるキャビテーションが細胞を粉砕するためと推察される。したがって、破砕部材の回転速度が５０００ｒｐｍ以下に設定されると、細胞が壊れない程度に組織が破砕されながら、細胞の不要な破砕を抑制できる。
【０１１２】
また、５００００ｒｐｍおよび１分の条件と、５０００ｒｐｍおよび５分の条件との比較結果から、第１破砕装置の破砕部材の回転時間は、５分の方が好ましいことが分かった。
【０１１３】
（４）容器等への吸着抑制の検討
次に、発明者らは、事前の検討により、脱パラフィン処理を経て得られた組織は、破砕部材や容器に対する吸着性が高いことを見いだした。そこで、発明者らは、以下のように容器等への細胞の吸着抑制の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
【０１１４】
上記共通の手順の（３）抗原賦活化工程および（４）分散工程において、条件１〜３を設定し、各条件に従って検出細胞数を取得した。条件１では、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳに代えてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を添加して検出細胞数を取得した。条件２では、上記共通の手順どおりに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して検出細胞数を取得した。条件３では、上記共通の手順の（３）抗原賦活化工程および（４）分散工程の前に、使用する容器および破砕部材に、Lipidure-BL206によるプレコート処理を行い、上記共通の手順どおりに０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを添加して検出細胞数を取得した。Lipidure-BL206によるプレコート処理では、容器および破砕部材をLipidure-BL206 ２．５％水溶液に１分間浸けた後、溶液から取り出し、余分の溶液を除去したのち乾燥させた。
【０１１５】
いずれの条件でも、力学的分散に用いる第１破砕装置の回転速度および回転時間は、５０００ｒｐｍおよび１分である。その他の手順は、上記（３）力学的分散条件の検討と同じである。
【０１１６】
図１１は、条件１〜３の場合の検出細胞数を比較した結果である。図１１に示すように、１つの条件に対して２〜３回の検出細胞数の取得を行った。また、検討を行ったＦＦＰＥ試料は全て同一である。
【０１１７】
条件１、２を比較すると、条件２の検出細胞数が多いことから、ＢＳＡの添加により細胞の回収量を向上できることが分かった。また、条件２、３を比較すると、プレコート処理を実施することで、細胞の回収量を向上できることが分かった。以上の結果から、上記共通の手順の（３）抗原賦活化工程および（４）分散工程において、ＢＳＡの添加を行うことが好ましく、ＢＳＡの添加およびプレコート処理の両方を行うことがより好ましいことが分かった。このように使用する容器および破砕部材への細胞の吸着を抑制することにより、細胞の回収率を高めることができる。
【０１１８】
このような細胞の吸着を抑制する処理には、タンパク質および界面活性剤の少なくともいずれか一方が用いられればよい。この場合のタンパク質としては、たとえば、上記のウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、BSA）や、スキムミルク、ゼラチンなどが挙げられる。この場合の界面活性剤としては、たとえば、上記のLipidure-BL206や、TritonX-100、Tween 20、NP-10などが挙げられる。
【０１１９】
なお、条件１では、第１破砕装置の破砕部材に薄切切片が付着し、分散不良となっている例が見られた。したがって、容器や破砕部材に対する吸着を抑制することは、吸着による細胞の損失を低減するだけでなく、吸着による分散不良をも解消できる効果があると考えられる。
【０１２０】
（５）薄切切片の厚みの検討
次に、発明者らは、薄切切片の厚みの検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
【０１２１】
上記共通の手順の（１）切片作製工程において、第１のＦＦＰＥ試料および第２のＦＦＰＥ試料から、１００μｍ、５０μｍ、２５μｍのＦＦＰＥ試料を薄切した。ＦＦＰＥ試料の薄切においては、図１２（ａ）に示すように、厚みごとに２つの切片を取得した。すなわち、第１の１００μｍ切片、第２の１００μｍ切片、第１の５０μｍ切片、第２の５０μｍ切片、第１の２５μｍ切片、第２の２５μｍ切片を取得した。そして、取得した薄切切片に基づいて検出細胞数を取得した。その他の手順は、上記（３）力学的分散条件の検討と同じである。
【０１２２】
図１２（ｂ）に示すように、検出細胞数は、薄切切片の厚みが小さくなるにしたがって、僅かに低下する傾向が見られた。この理由としては、薄い切片を用いる場合、上記共通の手順の（２）脱パラフィンおよび親水化工程において沈殿性が悪くなり、切片の一部が失われてしまうためと考えられる。
【０１２３】
続いて、発明者らは、ＦＦＰＥ試料中の細胞数を、上記（３）力学的分散条件の検討において示した手順により取得した。そして、検出細胞数をＦＦＰＥ試料中の細胞数で除算することにより、細胞回収率を取得した。図１２（ｃ）に示すように、細胞回収率は、検出細胞数と同様に、薄切切片の厚みが小さくなるにしたがって、僅かに低下する傾向が見られた。いずれの厚みにおいても、細胞回収率は０．１％〜１．０％の範囲の値となり、切片の厚みが２５μｍ、５０μｍ、１００μｍの平均回収率は、それぞれ０．３３２％、０．４４０％、０．５１８％となった。
【０１２４】
上記の結果から、切片の厚みが小さ過ぎると、検出細胞数および細胞回収率が低下することが示唆された。一方、切片の厚みが大き過ぎると貴重な組織の消費が大きくなってしまう。これに対し、上記のように薄切切片の厚みが２５μｍ以上１００μｍ以下に設定される場合、検出細胞数および細胞回収率は適正であると考えられる。したがって、切片の厚みが上記のように規定されると、検出細胞数および細胞回収率の低下と、組織の消費とを抑制できる。
【０１２５】
（６）診断または検査に必要な細胞数を取得できるか否かの検討
次に、発明者らは、実際に第１フローサイトメーターで測定されると推定される推定細胞数を取得し、推定細胞数が診断または検査に必要な細胞数以上であるか否かの検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
【０１２６】
共通の手順の（１）切片作製工程において、１７個の乳がんＦＦＰＥ試料と、１７個の正常乳房ＦＦＰＥとを薄切し、それぞれ５０μｍの薄切切片を作成した。作成した３４個の薄切切片を用いて、それぞれ、上記（３）力学的分散条件の検討で説明したように、スライドガラスを用いたＦＦＰＥ試料中の細胞数の取得を行った。取得した３４個のＦＦＰＥ試料に基づく細胞数に、それぞれ、上記（５）薄切切片の厚みの検討で算出した５０μｍの薄切切片の平均回収率０．４４％を乗算し、実際に第１フローサイトメーターで測定されると推定される推定細胞数を、ＦＦＰＥ試料ごとに取得した。
【０１２７】
図１３は、１７個の乳がんＦＦＰＥ試料と、１７個の正常乳房ＦＦＰＥ試料とに基づいて取得した推定細胞数を示すグラフである。ＩＨＣ法による病理診断でのＫｉ６７の評価では、５００個〜１０００個の細胞を評価することが推奨されている。この検討によれば、図１３に示すように推定細胞数が推奨値に対して十分に多く、細胞数の観点では、病理診断と同等以上の精度で細胞を評価できると言える。
【符号の説明】
【０１２８】
１０  細胞取得装置
１１  破砕部材
１１ａ  第１破砕部材
１１ｂ  第２破砕部材
１１ｃ  間隙
１２  回転駆動部
１１０  容器
１１０ａ、１１０ｂ  間隙
２２１、３２１  刃
４００  フローサイトメーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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