(57)【要約】      （修正有）【課題】変性疾患のリスクを減少または治療する、あるいは他の医学的症状または審美的症状を改善する方法及び組成物の提供。【解決手段】神経変性疾患、脱ミエリン化疾患、または両方を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、神経変性疾患および／または脱ミエリン化疾患を治療するために十分な量で、投与する工程を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患、脱ミエリン化疾患、または両方を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、神経変性疾患および／または脱ミエリン化疾患を治療するために十分な量で、投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
脱ミエリン化疾患が、多発性硬化症：特発性炎症性脱ミエリン化疾患；ビタミンＢ１２不全；橋中央ミエリン溶解；脊髄ろう；横断性脊髄炎；デビック病；進行性多巣性白質脳症；視神経炎；白質ジストロフィーからなる群より選択される中枢神経系の脱ミエリン化疾患、または：ギランバレー症候群、慢性炎症性脱ミエリン化ポリニューロパシー；抗ＭＡＧ末梢ニューロパシー；シャルコー−マリー・トゥース病；および銅欠乏からなる群より選択される末梢神経系の脱ミエリン化疾患である、請求項１の方法。
【請求項３】
神経変性疾患が：アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症（ピック病）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
神経変性疾患が、ミエリンを攻撃する自己免疫疾患である、請求項１の方法。
【請求項５】
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死、視神経変性、または両方を阻害する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、ＲＧＣ死、視神経変性、または両方を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
腎不全を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、腎機能を増加させるか、または腎臓損傷を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項７】
組成物を、ｋｇ体重あたり、およそ０．０１−１ｘ１０６細胞の用量で腎内投与を通じて局所投与する、請求項６の方法。
【請求項８】
ＩＤＰＳＣを投与する工程を１〜３週間の間隔で、腎機能が回復するまで、続いて反復する、ここで、ＩＤＰＳＣの投与間隔を１〜６ヶ月に増加させる、請求項６の方法。
【請求項９】
禿頭を治療するかまたは白髪を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、毛髪増殖を増加させ、そして／または被験体の全体の白髪の割合を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
組成物を、皮下、局所で、またはシャワー法によって、投与して、毛包幹細胞ニッチを回復させる、請求項９の方法。
【請求項１１】
組成物が細胞シートを生じる、請求項９の方法。
【請求項１２】
細胞シートが移植され、そして移植前に予め除去された毛髪皮膚によって覆われている、請求項１１の方法。
【請求項１３】
他の毛髪回復または白髪減少幹細胞因子または薬剤と組み合わせて組成物を投与する工程をさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１４】
皮膚創傷および／または皮膚美容的特徴を治療するための皮膚治療法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、皮膚創傷治癒を増加させそして／または皮膚美容的特徴を改善するのに十分な量で投与する工程を含む、前記治療法。
【請求項１５】
皮膚創傷が、糖尿病、虚血およびコラーゲン疾患または火傷傷害から生じる難治性皮膚潰瘍である、請求項１４の皮膚治療法。
【請求項１６】
組成物を、皮膚の硬さを増加させ、しわを減少させ、皮膚加齢プロセスを遅延させ、新規血管形成を増加させ、免疫学的反応を誘導せずにコラーゲン再生を増加させるのに十分な量で投与する、請求項１４の皮膚治療法。
【請求項１７】
脊髄傷害を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、脊髄傷害を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
心臓疾患を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の幹細胞、または両方を含む組成物を、心臓疾患を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
精子形成を増加させる方法であって、、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を被験体における精子形成を誘導するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
心臓疾患が心筋梗塞である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
治療が、心筋細胞アポトーシスを阻害し、そして／または組成物を動脈注射を通じて投与する、請求項１９の方法。
【請求項２２】
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、ｐ７５神経上皮マーカー、ｐ５３腫瘍抑制因子マーカー、または両方を発現する、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
組成物が、ＩＤＰＳＣおよび／またはＩＤＰＳＣ由来の幹細胞を、少なくとも１ｘ１０６  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０７  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０８  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０９  ＩＤＰＳＣ、または少なくとも１ｘ１０１０  ＩＤＰＳＣで含む、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ｐ７５神経上皮マーカーまたはｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ１３マーカー、ＣＤ３１マーカー、または両方を発現する、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５マーカーに関して陰性である、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、およびニューロトロフィン
−５（ＮＴ５）より選択される神経栄養因子を生じる、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項２８】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択される神経栄養因子を生じる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がネスチンを発現する、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項３０】
ＩＤＰＳＣの少なくとも９５％がネスチンを発現する、請求項２９の方法。
【請求項３１】
ＩＤＰＳＣの２０％未満がＯｃｔ３／４を発現する、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項３２】
ＩＤＰＳＣが、以下の多機能分子プロファイル：
（ａ）ＩＤＰＳＣの少なくとも８０％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｂ）ＩＤＰＳＣの２０％未満がＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｃ）集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ｐ５３、および１型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｄ）ＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｅ）ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
によって特徴付けられる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む、請求項１〜２１のいずれか一項の方法。
【請求項３３】
ＩＤＰＳＣの集団が、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含み、ヒト出生後ＩＤＰＳＣの前記集団が、低酸素条件下で少なくとも１０採取サイクルに関して培養されたＤＰのアウトグロース（outgrowth）として得られる、請求項１〜
２１のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
低酸素条件が：
（ｉ）約０．５％〜１％の間の最大値、または約０．５％〜１５％酸素（Ｏ２）の間の最大値；
（ｉｉ）約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または２％または５％の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉｉ）約０．１〜２％酸素（Ｏ２）の間；あるいは
５〜７％ＣＯ２を伴う、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの前記集団の採取工程が、酵素処理を伴わず、ＤＰを保持し、そしてＩＤＰＳＣの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、機械的トランスファーによって起こる、請求項３３の方法。
【請求項３６】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質とともに培養される、請求項３３の方法。
【請求項３７】
ＥＣＭ基質がＭａｔｒｉｇｅｌである、請求項３６の方法。
【請求項３８】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、少なくとも２０採取サイクル、少なくとも３０採取サイクル、少なくとも４０採取サイクル、少なくとも５０採取サイクル、または少なくとも６０採取サイクルで培養されるＤＰからのアウトグロースとして単離される、請求項３３の方法。
【請求項３９】
ＩＤＰＳＣの単離集団を産生する方法であって：
（ａ）歯からＤＰを摘出し；
（ｂ）ＤＰを無菌容器中に入れ、そして抗生物質を含む無菌溶液でＤＰを洗浄し；
（ｃ）場合によって、抗生物質を含む無菌溶液を取り除き、そしてＤＰを基本培地中で細かく刻み；
（ｄ）ＤＰを、培地を含有する別の容器内に、機械的にトランスファーするか、または容器内の培地を交換し；
（ｅ）ＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着が観察されるまでＤＰを培養し；そして
（ｆ）ＤＰ内の多数ニッチからＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着を可能にするように、少なくとも５回、工程（ｄ）および（ｅ）を反復する
工程を含む、前記方法。
【請求項４０】
ＤＰ培養を少なくとも３日間進める、請求項３９の方法。
【請求項４１】
ＤＰ培養を少なくとも５日間、少なくとも１０日間または少なくとも１５日間進める、請求項４０の方法。
【請求項４２】
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、請求項３９の方法。
【請求項４３】
工程（ｄ）および（ｅ）が、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、または少なくとも６０回反復される、請求項３９の方法。
【請求項４４】
ＤＰ内の多数のニッチの完全性が、ＤＰ外植片の機械的トランスファーによって保持される、請求項３９の方法。
【請求項４５】
ＤＰ外植片を培地を含む別の容器内に機械的にトランスファーする前に、ＤＰを凍結保存し、そして融解する、請求項３９の方法。
【請求項４６】
（ｇ）ＩＤＰＳＣを継代培養に継代する
工程をさらに含む、請求項３９の方法。
【請求項４７】
ＩＤＰＳＣを継代中にプロテアーゼで処理しない、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ＩＤＰＳＣを継代中にプロテアーゼで処理する、請求項４６の方法。
【請求項４９】
ＩＤＰＳＣの継代培養への継代を最大５回反復する、請求項４６の方法。
【請求項５０】
ＩＤＰＳＣの継代培養への継代を最大４回、３回、２回、または１回反復する、請求項４９の方法。
【請求項５１】
ＤＰを約３日間培養すると、少なくとも１ｘ１０５  ＩＤＰＳＣの単離集団を生じる、請求項３９の方法。
【請求項５２】
ＤＰを約３日間培養すると、少なくとも２ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも３ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも４ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも５ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも６ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも７ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、または少なくとも８ｘ１０５  ＩＤＰＳＣの単離集団を生じる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
培地がＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＭＥＭ−アルファ培地である、請求項３９の方法。
【請求項５４】
培地に、約５％〜約２０％のウシ胎児血清、約１％の非必須アミノ酸、約１％のＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミン置換物、および約１％の抗生物質が補充されている、請求項５３の方法。
【請求項５５】
神経幹細胞および／または分化した神経細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じさせる方法であって：
歯髄（ＤＰ）の少なくとも１０サイクルの機械的トランスファーによって維持されたＤＰ外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を単離し；
細胞の集密に到達することなくＩＤＰＳＣを培養し、ここで、これらの細胞を培地中で１週間、追加培養し、
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し、そして
レチノイン酸の存在下で、さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
【請求項５６】
集密が、２５ｃｍ２の培地中、２ｘ１０６  ＩＤＰＳＣに等しい、請求項５５の方法。
【請求項５７】
ＤＰ外植片培養が、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル、少なくとも２５サイクル、または少なくとも３０サイクルのＤＰの機械的トランスファーによって維持される、請求項５６の方法。
【請求項５８】
サイクルが、ＤＰの機械的トランスファー前の、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間の外植片培養である、請求項５５の方法。
【請求項５９】
集密前の未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣの前記培養が、この段階で、ニューロスフェアまたは一次スフェアまたはスフェア様構造形成を回避する、請求項５５の方法。
【請求項６０】
集密前が、ＩＤＰＳＣの基本培地中に維持される、２５ｃｍ２中、２ｘ１０６  ＩＤＰＳＣに等しい、請求項５９の方法。
【請求項６１】
ＩＤＰＳＣ基本培地の前記置換が、いかなる他の成長因子も含まず、２％のＢ２７を補充した神経基本培地（ＮＢ＋Ｂ２７）への置換である、請求項６０の方法。
【請求項６２】
ＩＤＰＳＣの前記インキュベーションが、酵素消化または細胞再植え付けを伴わず、１
週間の間、ＮＢ＋Ｂ２７中でインキュベーションすることである、請求項６１の方法。
【請求項６３】
ＮＢ＋Ｂ２７培地の前記交換が、各３〜４日間である、請求項６２の方法。
【請求項６４】
請求項５５記載の方法によって生じる、単離された神経幹細胞。
【請求項６５】
前記の１週間後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでの２〜３分間の処理後に、細胞を採取し、ＮＢ＋Ｂ２７で中和する、請求項６２の方法。
【請求項６６】
８００ｇ、５分間の遠心分離後、細胞ペレットを得て、そして上清を廃棄する、請求項６２の方法。
【請求項６７】
ＩＤＰＳＣペレットをＮＢ＋Ｂ２７中で穏やかに脱凝集し、そして拡大のため、各々、平方９．６ｃｍ２を有する６枚のペトリ皿上に植え付ける、請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記レチノイン酸を、０．１μＭを超えない最終濃度で２４時間で添加しなければならず、そして４８時間後、神経分化細胞を産生するニューロスフェアを得ることが可能である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
ＩＤＰＳＣの前記分化が、同じ培養プレート中、同時に、ニューロンおよびグリア細胞に分化するものである、請求項１の方法。
【請求項７０】
請求項１にしたがった方法によって生じる、脱ミエリン化疾患を治療し、そして治癒させることが可能な、ＩＤＰＳＣ。
【請求項７１】
網膜幹細胞および／または分化した網膜細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで生成する方法であって：
歯髄（ＤＰ）の少なくとも１０サイクルの機械的トランスファーによって、維持されたＤＰ外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を単離し；
半集密に到達するまで、ＩＤＰＳＣを培養し；
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し；そして
さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
【請求項７２】
分化した網膜細胞が、桿体細胞、錐体細胞、および／または神経節細胞である、請求項７１の方法。
【請求項７３】
増加した多系譜潜在力を所持するＬＰ  ＩＤＰＳＣを含む組成物であって、前記ＩＤＰＳＣをロバストな神経上皮マーカーの発現を可能にする条件下で培養し、前記発現が、前記ＬＰ  ＩＤＰＳＣの多機能再生潜在力を生じる、前記組成物。
【請求項７４】
ＤＰの長期培養後、遠位ニッチにアクセスさせることを通じて、ＩＤＰＳＣを誘導することによって、そして／または採取したＩＤＰＳＣを低継代数で培養して、核型突然変異を防止し、そしてそれによって腫瘍原性のリスクを防止する低酸素非酵素的採取条件下で、特に、神経外胚葉系譜へのＩＤＰＳＣの潜在力を増加させ、そして腫瘍原性潜在力を減少させる方法。
【請求項７５】
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の単離集団を含む組成物であって、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する、前記組成物。
【請求項７６】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する、請求項７５の組成物。
【請求項７７】
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、ＩＤＰＳＣの単離集団を含む組成物。
【請求項７８】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、請求項３の組成物。
【請求項７９】
ＩＤＰＳＣの５０％未満がＣＤ１３マーカーを発現する、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８０】
ＩＤＰＳＣの５０％未満がＣＤ３１マーカーを発現する、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８１】
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ１３およびＣＤ３１より選択されるマーカーを発現し、そしてＩＤＰＳＣがＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５マーカーに関して陰性であるる、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８２】
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、およびニューロトロフィン−５（ＮＴ５）より選択される神経栄養因子を産生する、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８３】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択される神経栄養因子を産生する、請求項８２の組成物。
【請求項８４】
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がネスチンを発現する、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８５】
ＩＤＰＳＣの少なくとも９５％がネスチンを発現する、請求項８４の組成物。
【請求項８６】
ＩＤＰＳＣの２０％未満がＯｃｔ３／４を発現する、請求項７５〜７８のいずれか一項の組成物。
【請求項８７】
（ａ）ＩＤＰＳＣの少なくとも８０％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｂ）ＩＤＰＳＣの２０％未満がＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｃ）集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ｐ５３、および１型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｄ）ＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１
−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｅ）ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
の多機能分子プロファイルによって特徴付けられる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む、組成物。
【請求項８８】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの集団が、低酸素条件下で少なくとも１０採取サイクルに渡って培養されたＤＰのアウトグロースとして得られる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む組成物。
【請求項８９】
低酸素条件が：
（ｉ）約０．５％〜１％の間の最大値、または約０．５％〜１５％酸素（Ｏ２）の間の最大値；
（ｉｉ）約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または２％または５％の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉｉ）約０．１％〜２％酸素（Ｏ２）の間；あるいは
５〜７％ＣＯ２を伴う、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、請求項８８の組成物。
請求項８９
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの集団の採取工程が、ＤＰを保持し、そしてＩＤＰＳＣの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、酵素処理を伴わない機械的トランスファーによって起こる、請求項８８の組成物。
【請求項９０】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質とともに培養される、請求項８８の組成物。
【請求項９１】
ＥＣＭ基質がＭａｔｒｉｇｅｌである、請求項９０の組成物。
【請求項９２】
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、少なくとも２０採取サイクル、少なくとも３０採取サイクル、少なくとも４０採取サイクル、少なくとも５０採取サイクル、または少なくとも６０採取サイクルに渡って培養されるＤＰからのアウトグロースとして単離される、請求項８８〜９１のいずれか一項の組成物。
【請求項９３】
ＩＤＰＳＣが歯由来の歯髄（ＤＰ）から単離される、請求項７５〜９２のいずれか一項の組成物。
【請求項９４】
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、請求項９３の組成物。
【請求項９５】
ＳＯＸ−１およびＳＯＸ−２を同時発現し、そして神経冠幹細胞である、ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む細胞培養組成物。
【請求項９６】
長期（ＬＴ）細胞培養から得られ、そして転写因子の濃縮が、ＬＰ培養に向かって増加し、それによって、神経分化への高い潜在能力を保持し、そして正常核型を有する、請求項９５の細胞培養組成物。
【請求項９７】
ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）の均質な集団を得るための方法であって：
少なくとも２５サイクルの長期（ＬＴ）機械的／非酵素的採取サイクルを通じて、均質な集団を得て；
採取された細胞を培養して細胞培養を形成し、そして
細胞培養からプラスチック接着細胞を継代し、ここでプラスチック接着細胞は、（ｉ）自己再生し、（ｉｉ）内胚葉、中胚葉、または外胚葉系譜の細胞に分化し、（ｉｉｉ）マーカー、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２および３−ベータ−チューブリンを発現する
工程を含む、前記方法。
【請求項９８】
最終段階にまだ拘束されていない、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２およびベータ−３−チューブリンなどのマーカーを含む（同時発現する）、有糸分裂的に活性である均質な神経前駆組成物。
【請求項９９】
分化前未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の実質的に均質な集団を得るための方法であって：
非接着性懸濁条件でＩＤＰＳＣを培養し、その後、プラスチックプレートに接着させて神経ロゼットを形成することによって、ＩＤＰＣＳ由来ニューロスフェアを得る、ここで、ロゼット内の細胞は、ＩＤＰＳＣよりわずかにより分化した、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２およびＢｒｄＵおよびベータ−３−チューブリンに関して陽性である神経芽細胞の細胞集団を移行（ｔｒａｎｓｉｔ）増幅させることによって提示され、神経芽細胞は、外部ｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ誘導性微小環境に際して、神経前駆体、星状細胞、オリゴデンドロサイト、および神経節細胞を含む、中枢神経系および末梢神経系のニューロン系譜に最終的に分化することが可能である
工程を含む、前記方法。
【請求項１００】
請求項１１６の方法によって得られる分化前ＩＤＰＳＣ、およびＣＮＳ疾患を治療する細胞療法に適した薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
【請求項１０１】
癌を治療するための、請求項１００の薬学的組成物の使用。
【請求項１０２】
癌が神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫より選択される、請求項１０１の使用。
【請求項１０３】
ＩＤＰＳＣの実質的に均質なＬＰが、Ｓｏｘ−１；Ｓｏｘ−２；およびベータ−３−チューブリンを含む群より選択される、少なくとも２つのマーカーを同時発現する、請求項９９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願に関するクロスリファレンス
本文書は、２０１３年３月１５日に出願された、Ｋｅｒｋｉｓに対する「ロバストな長期培養系によって得られた多機能未成熟歯髄幹細胞」と題される米国仮特許出願６１/７
９１，５９４の恩典、およびまた２０１３年３月１５日に出願された、Ｋｅｒｋｉｓに対する「多機能未成熟歯髄幹細胞の療法適用」と題される米国仮特許出願６１/８００，２
４５の恩典を請求し、各出願の全内容は、すべての目的のため、本明細書に援用される。
【０００２】
電子出願された文書の援用
本明細書にその全体が援用されるのは、本明細書と同時に提出され、そして２０１４年３月１４日に生成された「Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ」と称される１つの１０，８６５バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして同定される、コンピュータ読み取り可能ヌクレオチド/アミノ酸配列表である。
【０００３】
発明の分野
本発明は、多機能未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の組成物、こうして得られた幹細胞を幹細胞療法において使用するため、その「幹細胞性」を失うリスクが最小限である早期継代時に、患者または単一のドナーの歯髄（ＤＰ）から、臨床的に有用な量のＩＤＰＳＣを生成するための方法、ならびに変性疾患、および医学的および審美的症状を防止し、そして治療するための、ＩＤＰＳＣ多系譜志向療法組成物の臨床的および審美的使用に関する。本明細書に提示する方法によって、神経上皮マーカーが特に濃縮された、多機能ＩＤＰＳＣの混合集団を得る。これらの細胞は、主に（優先的に）非血管周囲ニッチから生じ、そして酵素的に処理されていないＤＰ外植片を長期培養するだけで得られる。
【背景技術】
【０００４】
最近数十年間で、特定の組織細胞に分化する能力を維持している細胞、特に幹細胞（ＳＣ）の誘導に対して、科学コミュニティはかなりの注意を向けてきている。この関心は、弱った体を治癒させ、そして罹患し、そして損傷を受けた体の組織および部分の細胞および機能を再確立する、新規組織および細胞置換アプローチを発展させようとする、強い必要性および要望によってさらに高まっている。
【０００５】
ＳＣは、すべての多細胞生物に見られる。これらは、自己再生し、そして異なる特殊細胞に発展する能力を有する。哺乳動物幹細胞は、２つの一般的なタイプ、初期胚発生中に見られる胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ならびにより後の段階および生涯に渡って生物の組織中に見られる成体幹細胞（ＡＳＣ）に分類される。
【０００６】
ＡＳＣはまた、体性幹細胞とも呼ばれ、すべてのＳＣの同じ基本的特性を所持する。すなわち、これらは、ときに動物の全生涯の間に、不定に自己再生可能であり、そして特殊な細胞タイプに分化することが可能である。哺乳動物において、ＡＳＣの重要なタスクは、これらが位置する組織を維持し、そして治癒させることである。これらは未分化細胞のままであり、組織損傷または多数の細胞タイプを形成する他の条件に際して活性化され、そして組織損傷を修復することも可能である（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ  Ａら（１９７４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニーアッセイ法によって検出されるような、造血細胞の異なる集団中の線維芽細胞前駆体。Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２：８３−９２）。
【０００７】
さらに、ＡＳＣは、細胞微小環境の炎症反応を調節し、組織修復プロセスに関与する血管新生および細胞の増殖を制御することによって作用し、そしてしたがって、周皮細胞と
しても知られる（Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ（２００９）ＭＳＣはなぜ療法性か？  新規データ：新規洞察。Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１７：３１８−３２４）。
【０００８】
しかし、ＡＳＣは、多能性胚性幹細胞と比較した際、分化に関して限定された能力しか持たず、そして通常、その起源組織の特定の細胞タイプのみを形成するように分化可能である。胚性幹細胞とは対照的に、成体幹細胞は全生物を構築することが不可能である。
【０００９】
こうした細胞をすべての胚葉に由来する細胞へと分化させうる真に高い可塑性および多能性を所持するのが、胚性発生の初期段階（例えば胚盤胞段階）中に存在するＥＳ細胞である（Ｅｖａｎｓ，  Ｍ．およびＫａｕｆｍａｎ，  Ｍ．（１９８１）マウス胚由来の多能性細胞の培養中の樹立。Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，  １５４−６）。胚盤胞内への再導入に際して、ＥＳ細胞は、通常の発生を再開し、そして出芽組織およびさらなる胚組織へとコロニー形成することも可能である。
【００１０】
培養ＥＳ細胞は、長期間および多くの細胞分裂に渡って、未分化状態を保持しうる。一方、培養ＥＳ細胞をまた、分化するよう誘導することも可能である。例えば、懸濁中で培養される際、懸濁中で培養されるＥＳ細胞は、「胚様体」（Ｅｂ）として知られる多能性ＥＳ細胞の三次元凝集物を形成し、これがすべての三胚葉の細胞への細胞特定を経る（Ｌｉｎｇ，  Ｖ．およびＮｅｂｅｎ，  Ｓ．（１９９７）胚性幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化：培養胚様体の免疫表現型分析。Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １７１，１０４−５）。
【００１１】
高い多能性を考えると、胚性幹細胞は、理論的には、多数の新規医学的適用において使用される理想的な細胞であろう。しかし、ＥＳ細胞の使用は、多大な論争を呼んでおり、そして幹細胞療法における使用は、重大な倫理的および法的懸念によって妨害される。ＡＳＣに基づく治療は、ヒト胚の破壊を必要としないため、論争がより少ない。さらに、ＡＳＣは奇形腫瘍を生じず、そして免疫原性が低い。
【００１２】
これらの理由から、非胚性ＡＳＣは、多くの研究および作業の焦点となってきている。単離し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大した後、ＡＳＣは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として知られる。ＭＳＣは多分化能を有し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、骨、軟骨および筋肉などのいくつかの細胞タイプに分化するｉｎ  ｖｉｖｏ能力を保持する。
【００１３】
残念なことに、療法において成体幹細胞を実際的に使用するための困難は無数にある。これらは最低限の数でしか見られず、そして有用な量でこれらを単離するのは極端に困難である。さらに、これらの増殖能は比較的低く、そしてこれらは多くのＤＮＡ異常を含有する可能性もある。
【００１４】
療法においてＭＳＣを使用するための別の本質的な困難および課題は、その分化能が、適切な単離および培養条件に非常に依存することである。したがって、ＭＳＣが多数の壊滅的な疾患を治療する潜在能力を満たすためには、大規模産生セッティングに対する制御を達成する必要があることが明らかである。
【００１５】
スケールアップの異なる方法があるが、幹細胞がその環境に対する生得的な感受性を有するため、一般的なルールとして、臨床的な品質特性を維持するために、大規模プロセスは、元来の小規模プロセスと実質的に類似のままである必要がある。Ｄａｖｉｅ，  Ｎ．Ｌ．ら（２０１２）臨床規模から商業規模の細胞療法製造の合理化。ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １０（３），  ２４−２９。したがって、早期臨床研究のために増殖させた細胞が平面（例えばＴフラスコまたはトレイ）上で培養される場合、大規模実行に到達する際には、これらの細胞は、同様に培養される必要があるであろう。
しかし、これは実行が困難である可能性もあり、そしてその後の産生能力を制限する可能性もある。同様に、スケールアッププロセスの望ましい終点が、マイクロキャリアー上で細胞を培養することである場合、早期研究で用いる産物は、やはり、懸濁培養を用いて産生されている必要がある。そうでなければ、最終産物細胞は、おそらく、臨床において後に用いられるものと匹敵しないであろう。
【００１６】
歴史的に予測可能なスケールアップ戦略（例えば小さいものからより大きいＮｕｎｃ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙへのもの）すら、いくつかの望ましくない細胞変化、例えば特定のマーカーの喪失または獲得、あるいは特定のサイトカインの分泌停止または活性化を与える可能性もある。しかし、時に、スケールアップ方法論から生じるこうした変化が産物の臨床機能には適さないことは事実である。所定の変化が作用の提唱される機構に影響を及ぼさないか、または副作用を引き起こさない場合、新規プロセスは監査官によって認可される可能性が高い。監督官庁は、これを認識し、これが製品が「匹敵する」と示される必要があり、「同一」ではない理由である。
【００１７】
実際、未分化ＭＳＣを単離し、そして増殖させるための改善された方法は、新規成体幹細胞療法および再生医学の発展に必須であると見なされる。
【００１８】
異なる組織から多数のＭＳＣを得る一方、分化に関するその能力を保持するための多数のプロセスが、以前知られている（Ｋｕｅｈｌｅ，  Ｉ．およびＧｏｏｄｅｌｌ，  Ｍ．Ａ．（２００２）成体由来の幹細胞の療法潜在能力。Ｂ．Ｍ．Ｊ．  ３２５，  ３７２−３７６；  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎ，  ＢＪ．（２００４）間葉系幹細胞および心臓療法剤としてのその潜在能力。Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９５，  ９−２０）
にもかかわらず、これらの方法は、分化能が限定されたＭＳＣの単離を生じ、限定された多様性の細胞タイプしか生じさせない。さらに、組織中のＡＳＣの数は、非常に少ないため、これらの方法は、不均質な培養を生じ、幹細胞ではない多数の細胞を含有する。
【００１９】
医学において現在用いられるＭＳＣの主な供給源は、骨髄および臍帯である。しかし、これらの組織から、多能性ＳＣの純粋な集団をそして多量に単離するのは困難である。非常に多能性で、そして均質な幹細胞の単離のための別の供給源が必要であり、こうした供給源は、いくつかの疾患の治療有効性を有意に増加させるであろう。
【００２０】
１つのこうしたありうる供給源には、歯および歯科組織から得られるＭＳＣが含まれる。歯は、組織再生および修復に有用なＭＳＣを得るために容易にアクセス可能な供給源を提示する。ヒトの体内の他の臓器と同様、歯およびその周囲組織は、細胞の混合集団によって構成され、これには、多分化能ＭＳＣ／周皮細胞、前駆体および分化した細胞が含まれる（Ａｒｔｈｕｒら（２００８）成体ヒト歯髄幹細胞は、適切な環境合図のもとで、機能的に活性なニューロンに向かって分化する。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１７８７−１７９５；  Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｇら（２０１１）口腔ニッチ由来の幹細胞：概説。Ａｎｎ  Ｓｔｏｍａｔｏｌ（Ｒｏｍａ）２：３−８）。
【００２１】
幹細胞療法を行うためには、ヒト疾患を治療するために十分な量のこれらの細胞を生じるため、幹細胞の有意なｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大が必要である。現時点では、培養中の比較的純粋な歯髄幹細胞集団を多量に効率的に生成する信頼性がある方法は知られていない。
【００２２】
この１つの理由は、年齢とともに再生潜在能力が減少することであり、そしてこれは、成体幹細胞の機能障害に帰因している。培養中の細胞は、特定の数の細胞分裂後、老化を経て、それによって細胞が肥大し、そして最終的に増殖を停止する（Ｗａｇｎｅｒ  Ｗら（２００９）加齢および複製性老化は、ヒト幹細胞および前駆細胞に対して、関連する影
響を有する。ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ４：ｅ５８４６）。
【００２３】
歯髄幹細胞を大規模産生するのが困難である別の重要な理由は、拡大プロセス自体が幹細胞の老化、ならびに増殖および分化能の減少によって示されるような、幹細胞性の喪失を誘導することである。Ｂａｘｔｅｒらは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの振る舞いと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大中のテロメア喪失率を相関させることによって、ＭＳＣの複製能に対するｉｎ
ｖｉｔｒｏ拡大の影響を示した。これらは、最小限の拡大を伴うプロトコルであってさえ、ＭＳＣの迅速な加齢を誘導し、喪失は総複製寿命の約半分と同等であることを示した（Ｂａｘｔｅｒ  ＭＡら（２００４）テロメア長の研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大後のヒト骨髄間質細胞の迅速な加齢を明らかにする。Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２，６７５−６８２）。
【００２４】
さらに、幹細胞の長期培養は、遺伝的変化の可能性増加と相関し、これは臨床試験および将来の療法における安全な使用に弊害をもたらす。例えば、Ｗａｎｇらは、動物および細胞培養では、テロメアが決定的に短くなった際、テロメア完全性を維持する手段として、ゲノム再編成を行う能力が異なることを示唆する（Ｗａｎｇ  Ｙら（２００５）決定的に短くなったテロメアを所持するネズミ胚性幹細胞におけるテロメア姉妹染色分体交換の増加。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  Ｊｕｌ  １９；１０２（２９）：１０２５６−６０）。
【００２５】
幹細胞療法成功の鍵は、細胞採取およびその拡大のプロセスに関連することが明らかである。このプロセスは、同時に、分化のための最大能力を維持しながら、理想的には、非常に多量の患者自身の幹細胞の産生を可能とするはずである。この方式で、小児期に乳歯から幹細胞を凍結保存するか、または人生のより遅い段階で、智歯または臼歯から幹細胞を提供する患者は、これらの貴重な細胞の完全な療法能によって利益を得ることも可能である。
【００２６】
ＡＳＣを多数回継代する間に獲得される遺伝的異常による腫瘍原性のリスクを減少させるであろう、ＤＳＣのためのプロトコルを発展させることが非常に重要である。いくつかの前臨床研究において、幹細胞移植の成功および効率は、幹細胞タイプ、その増殖能および遊走能、ならびに注射部位に応じることが示された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ  Ａら（１９７４）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２：８３−９２
【非特許文献２】Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ（２００９）Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１７：３１８−３２４
【非特許文献３】Ｅｖａｎｓ，  Ｍ．およびＫａｕｆｍａｎ，  Ｍ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，  １５４−６
【非特許文献４】Ｌｉｎｇ，  Ｖ．およびＮｅｂｅｎ，  Ｓ．（１９９７）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １７１，１０４−５
【非特許文献５】Ｄａｖｉｅ，  Ｎ．Ｌ．ら（２０１２）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １０（３），  ２４−２９
【非特許文献６】Ｋｕｅｈｌｅ，  Ｉ．およびＧｏｏｄｅｌｌ，  Ｍ．Ａ．（２００２）Ｂ．Ｍ．Ｊ．  ３２５，  ３７２−３７６
【非特許文献７】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎ，  ＢＪ．（２００４）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９５，  ９−２０
【非特許文献８】Ａｒｔｈｕｒら（２００８）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：１７８７−１７９５
【非特許文献９】Ｇｉｏｒｄａｎｏ  Ｇら（２０１１）Ａｎｎ  Ｓｔｏｍａｔｏｌ（Ｒｏｍａ）２：３−８
【非特許文献１０】Ｗａｇｎｅｒ  Ｗら（２００９）ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ４：ｅ５８４６
【非特許文献１１】Ｂａｘｔｅｒ  ＭＡら（２００４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２，６７５−６８２
【非特許文献１２】Ｗａｎｇ  Ｙら（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  Ｊｕｌ  １９；１０２（２９）：１０２５６−６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
したがって、優れた品質であり、そして同じドナーから得られた早期継代での腫瘍原性のリスクが減少している、非常に強力なＡＳＣの限定されないそして一貫した大規模産生のための方法が、成体幹細胞療法の発展のために望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の目的は、非腫瘍原性および非免疫原性ＩＤＰＳＣの多系譜志向多機能の療法組成物およびその使用法を提供することであり、前記多系譜志向および非腫瘍原性は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで証明される。多系譜志向のｉｎ  ｖｉｔｒｏ証明は、多機能マーカー発現および多様な細胞系譜に向かう多機能性によって証明され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで証明される多系譜性は、多様な組織へのＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ生着潜在能力に基づき、そして組織特異的機能性によって特徴付けられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ多機能性の強い証明は、腫瘍原性および免疫原性を伴わない、多数の組織内へのＩＤＰＳＣ子宮内移植に基づく。非腫瘍原性のさらなる証明は、腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３がＬＰ−ＩＤＰＳＣにおいて発現していることであり、そしてＬＰ採取後、継代数が少ない必要があるため、これが核型突然変異を防止し、そしてしたがってまた腫瘍原性リスクを減少させる。ＩＤＰＳＣ組成物による治療の開示する方法のさらなる利点は、免疫原性潜在能力が減少していることであり、これは前記ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性であり、したがって同種移植が可能になるためである。
【００３０】
本発明のＩＤＰＳＣの多機能性および強い神経上皮細胞系譜志向は、再生医学のため、特にＣＮＳ疾患（限定されるわけではないが、神経変性障害を含む）の治療および防止、腎障害、膵臓障害（糖尿病）、皮膚疾患（創傷治癒によって限定されない）、脱毛症候群の治療、ならびに女性（子宮内機能を改善）および男性（精子形成を改善）の生殖機能補助において、多数の使用を提供する。子宮内で証明されたＩＤＰＳＣの多機能性は、限定されるわけではないが、神経変性疾患、心不全、心筋虚血、四肢虚血、生殖障害、審美的症状、免疫障害、糖尿病、脳卒中、ならびに皮膚、肝臓および腎臓疾患を含む、多様な病理学的または生理学的状態の症状を、単一活性生物学的成分として、あるいは限定されるわけではないが、細胞、活性薬学的または生物学的、または天然成分剤などのさらなる療法成分に対する付属物として、ＩＤＰＳＣ濃縮物、懸濁物、混合物を含む療法組成物を投与することによって、治療するか、または軽減するための方法を提供する。
【００３１】
本開示の側面は、２つのアプローチに基づく：薬剤、療法物質および生物学的剤の毒性効果の評価のための、発癌性アッセイのための、そして／または感受性試験のための、以前から知られ、そして用いられる臓器および組織外植片の培養である。しかし、組み合わせた両技術は、歯髄からの幹細胞の単離のために、本発明において最初に用いられ、これはＥＳ細胞の培養に用いられる細胞培養条件と組み合わせて、ＩＤＰＳＣ集団の新規非酵素的単離法の発見を可能にした。
【００３２】
本開示に提示するいくつかの方法の利点は、以下の説明を通じて理解可能である。
【００３３】
臓器の一部または臓器全体をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養するための１つの目的は、臓器培養組織構造を維持することである。例えば、実質および間質が構造および機能の両方に関して保存され、そしてしたがって、臓器培養は、問題のｉｎ  ｖｉｖｏ臓器とよく似ている。臓器培養は、ヒトドナー角膜の保存のために選択される方法として、眼科学において広く用いられる。第二のアプローチは、細胞単離のために用いられる外植片を培養することである。組織を無菌条件下で単離し、細かく刻み、そして培地を含有する細胞培養プレートに片を入れる。外植片培養は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境をより正確に模倣する、細胞が周囲の細胞外マトリックス中に残っている培養であり、そして時間とともに、前駆細胞が組織外に遊走して、そして培養プレート表面に付着する。
【００３４】
どちらのアプローチも、環境および幹細胞ニッチを保持するため、類似性を有する。しかし、組織は、培養時間中に低酸素に曝露され、これは幹細胞の未分化状態を維持する大きな利点を提示する。したがって、小さい臓器である歯髄、およびＤＰ片、外植片の機械的トランスファーは、単離後にその始原特性を未変化状態で維持するＭＳＣを連続して単離する戦略である。
【００３５】
神経冠起源の細胞であるＩＤＰＳＣ（外植片）の単離のために選択される戦略をまた、神経管から、遊走性「真正」神経冠幹細胞を単離するため用いたことに注目する価値がある。神経冠起源の細胞であるＣＴＩＰＤ（外植片）の単離のために選択される戦略がまた、神経管外植片を用いた遊走性体幹神経冠細胞の単離のために採用されたことにもまた注目する価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、歯髄中の幹細胞ニッチ（左）、および未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）で単離される遊走幹／前駆細胞の混合集団の産生を示す。
【図２】図２は、乳歯における歯科幹細胞（ＤＳＣ）のニッチを示す。Ａ）乳歯は歯冠および歯根で構成される。Ａ１）乳歯の長軸割面は、矢印によって示される血管周囲ニッチ（ａ）を示す。Ｂ）乳歯における歯根の吸収を示す。Ｂ１）Ｂ）で示す歯冠の長軸割面は、象牙芽細胞下の細胞リッチゾーン（ｂ）および無髄神経線維および線維芽細胞を含有する、細胞が少ないゾーン（ｃ）にあり、そして毛細血管が横断する、ＤＳＣの２つの他のニッチを示す。Ｃ）Ｂ１）由来のＤＳＣニッチの拡大を示す。
【図３】図３は、神経系譜に向かうＩＤＰＳＣの分化を立証する、位相差顕微鏡で捉えた画像を示す。Ａ）およびＣ）は、乳歯（ＤＤ）から単離された、分化したＩＤＰＳＣを示す。Ｂ）およびＤ）は、成体の歯（すなわち永久歯）（ＤＡ）から単離された分化したＩＤＰＳＣを示す。ニューロンの形態学的多様性に注目されたい。２０Ｘ対物レンズ。
【図４】図４は、光学顕微鏡で捕捉され、そしてヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）染色によって示された、神経分化後のＩＤＰＳＣの画像を示す。Ａ）４０Ｘ対物レンズ。スケールバー５０μｍ。（Ｂ）１００ｘ対物レンズ。（Ｃ）ニューロン様形態を持つ分化したＩＤＰＳＣ。典型的な樹状突起棘が観察可能である。樹状突起棘は、神経の樹状突起由来の小さい膜状の突出であり、典型的には軸索の単一のシナプスから入力を受け取る。６０Ｘ対物レンズ。スケールバー４０μｍ。（Ｄ〜Ｆ）ニューロン中のニッスル顆粒（暗褐色染色で示される）。２０Ｘ対物レンズ。スケールバー４０μｍ。
【図５】図５は、ＩＤＰＳＣニューロン分化中の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を示す。染色体２１に対する赤色蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いた。核はＤＡＰＩで染色され、そして青く見える。倍数体細胞（４ｎおよび６ｎ）および正常核（２ｎ）の存在に注目されたい。対物レンズ：Ａ）、Ｄ）およびＥ）４０Ｘ；Ｂ）２０Ｘ；Ｃ）６３Ｘ。
【図６】図６は、ＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏニューロン分化中の倍数体細胞の定量化を示す。２つ、４つおよび６つのハイブリダイゼーションプローブシグナルを持つ細胞核の割合を示す。
【図７】図７は、分化したＩＤＰＳＣにおけるニューロン系譜マーカーの発現を示す。Ａ）未分化ＩＤＰＳＣにおけるネスチン（ネスチナとしても知られる）の発現。Ｂ）分化誘導後のＩＤＰＳＣにおけるネスチンの発現。Ｃ）〜Ｅ）ニューロン形態を獲得したＩＤＰＳＣにおけるベータ−チューブリン（ベータ−チューブリナとしても知られる）の発現。Ｆ）分化したＩＤＰＳＣにおけるグリアマーカー、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現。Ｊ）およびＨ）分化したＩＤＰＳＣにおける成熟神経細胞マーカー、ＮｅｕＮの発現。核視覚化のため、ＤＡＰＩ（青色）を用いた。Ａ）〜Ｂ）２０Ｘ対物レンズ。Ｃ）〜Ｈ）４０Ｘ対物レンズ。
【図８】図８は、分化したＩＤＰＳＣから形成されるニューロスフェア様構造の顕微鏡画像を示す。Ａ）およびＢ）は、位相差顕微鏡を用いた画像を示す。Ｃ）は、ネスチンの陽性免疫蛍光を示す。対物レンズは、Ａ）およびＢ）に関しては４０Ｘ、そしてＣ）に関しては６３Ｘであった。
【図９】図９は、分化した（レーン１）および未分化（レーン２）ＩＤＰＳＣにおけるニューロン遺伝子の発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーン１は、ベータ−チューブリンＩＩＩ、中分子量ニューロフィラメント、およびＧＦＡＰに対するｍＲＮＡの存在を示す。レーン２は、中分子量ニューロフィラメントの発現を示す。グルタルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）は、装填対照として用いたハウスキーピング遺伝子である。
【図１０】図１０は、グリアＩＤＰＳＣ由来前駆体のスペクトルを示す。未分化ＩＤＰＳＣはビメンチンを発現する。星状細胞分化後、細胞は、ビメンチン、ＣＤ４４およびネスチンなどのマーカーサブセットを発現する。成熟星状細胞はＧＦＡＰを発現する。
【図１１】図１１は、ＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来ニューロン様細胞のスペクトルを示す。ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、神経上皮系譜の初期マーカーであるネスチンを発現する。分化後、ＩＤＰＳＣは形態を変化させ、そしてネスチンおよびベータ−チューブリンＩＩＩを発現し始める（ニューロン前駆体）。未成熟ニューロンは、ベータ−チューブリンＩＩＩを発現する一方、より成熟したニューロンは、成熟期間中、ＮｅｕＮおよびニューロフィラメントを発現する。
【図１２】図１２は、残った（ｓｐａｒｅｄ）白質の定量化を示す。Ａ）白質定量化に用いたＬｕｘｏｌファーストブルー（ＬＦＢ）染色面積。Ｂ）グラフは、ヒト未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）群において、より高い値を示す、残った白質の平均値を示す（＊ｐ＜０．０５）。Ｃ）Ｔ９レベルでの脊髄傷害圧迫の図（図の上部部分）、および連続切片の定量化に用いた脊髄のセグメント（図の下部部分）。Ｄ）およびＥ）亜急性＋ＤＭＥＭ（Ｄ）および亜急性＋ＩＤＰＳＣ（Ｅ）群由来の、残った白質の定量化に用いた、ＬＦＢによって染色した脊髄切片を例示する画像（ＤＭＥＭ、ダルベッコの修飾イーグル培地）。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは、免疫標識栄養因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子ベータ（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）の定量化を示す。ＤＭＥＭ処置動物に比較して、すべての分析した栄養因子、特にＢＤＮＦおよびＮＧＦに関して、ＩＤＰＳＣ（ヒト歯髄幹細胞またはＨＰＤＣとしても知られる）で処置した動物において、より強い染色が見られ、亜急性および慢性群の両方で、より強い免疫標識領域を示したことに注目されたい（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。亜急性群は白いバーによって示され、一方、慢性群は黒いバーによって示される。
【図１４】図１４は、亜急性ＤＭＥＭ処置動物Ａ）〜Ｃ）およびＬＰ  ＩＤＰＳＣ処置動物Ｄ）〜Ｉ）由来の脊髄の半薄および超薄切片を示す。Ａ）、半薄切片において、いくつかの空洞化がある（短い赤い矢印）。Ｂ）において、典型的な基底層（挿入図）を含むシュワン細胞（実線の白い矢印）を示し、そしてＣ）において、星状細胞突起（矢じり）、およびいくつかの微小空洞化（アステリスク）を示す。Ｄ）は、より保存された形態を持つＩＤＰＳＣ処置動物由来の半薄切片を示す。Ｅ）は、多くの保持された線維（長い白い矢印）およびマクロファージ（黒い短い矢印）を示す。Ｆ）において、シュワン細胞（実線の矢印）およびオリゴデンドロサイト（長い黒い矢印）ミエリン化軸索が見られる。Ｇ）は、再生島の例を示し、そしてＨ）は、細胞体でシナプス接触を形成する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）末端を持つ、保持された健康に見えるニューロンを示し、これはＩ）においてより高い倍率で示される。ＤＭＥＭ：ダルベッコの修飾イーグル培地。
【図１５】図１５は、慢性ＤＭＥＭ（Ａ、Ｃ、およびＥ）、およびＬＰ  ＩＤＰＳＣ処置（Ｂ、Ｄ、およびＦ）動物由来の脊髄の半薄および超薄切片を示す。Ａ）マクロファージ（赤い実線の矢印）。Ｂ）白質（長い矢印）およびマクロファージ（赤い短い矢印）における保持された線維。Ｃ）シュワン細胞（星）および多くの空洞化（アステリスク）。Ｄ）いくつかの保持された線維（白い矢印）。Ｅ）慢性病変に典型的な、激しい星状細胞増加（矢じり）。Ｆ）ここで終結する多くのシナプス接触を含む、保持された神経細胞体（長方形の領域）。ＤＭＥＭ：ダルベッコの修飾イーグル培地。
【図１６】図１６は、ＤＭＥＭ処置群およびＬＰ  ＩＤＰＳＣ処置群の機能分析を示す。広範囲移動性試験は、処置３５日後の亜急性群および慢性群の広範囲移動性の進行を示した。ＩＤＰＳＣ処置動物（ＢおよびＥ）は、評価期間中、ＤＭＥＭ処置動物（ＡおよびＤ）よりも、オープンフィールドにおいて、より長い距離（青い線）を歩いた。
【図１７】図１７は、ＬＰ  ＩＰＤＳＣ移植後の、ウイルス疾患である犬ジステンパーの軽い症例の治療における進歩を示す。Ａ）およびＢ）は、ＩＤＰＳＣ移植前を示す。Ｃ）およびＤ）は、ＩＤＰＳＣ単回適用の１ヶ月後を示す。
【図１８】図１８は、ＬＰ  ＩＰＤＳＣ移植後の、ウイルス疾患である犬ジステンパーの重度の症例の治療における進歩を示す。Ａ）およびＢ）は、ＩＤＰＳＣ移植前を示す。Ｃ）およびＤ）は、ＩＤＰＳＣ単回適用の１ヶ月後を示す。
【図１９】図１９は、ＬＰ  ＩＤＰＳＣから得た心筋細胞（ＣＭ）様細胞を示す。Ａ）分化したＩＤＰＳＣの自発的融合。Ｂ〜Ｃ１）分化したＩＤＰＳＣのＣＭ様表現型および形態。
【図２０】図２０は、他の細胞タイプとの共培養を通じた、ＬＰ  ＩＤＰＳＣ自発的細胞融合を示す。Ａ）、Ａ１）、およびＡ２）は、ＩＤＰＳＣと交差させたマウス骨髄を示す。Ａ）合併画像。Ａ１）ＩＤＰＳＣ。Ａ２）マウス骨髄細胞。Ｂ）、Ｂ１）およびＢ２）は、ＩＤＰＳＣと交差させたヒト線維芽細胞を示す。Ｂ）合併画像。Ｂ１）ＩＤＰＳＣ。Ｂ２）ヒト線維芽細胞。
【図２１】図２１は、冠動脈結紮による心筋梗塞のラットモデルにおける、心筋のＬＰ  ＩＤＰＳＣ（緑色）ホーミングを示す。
【図２２】図２２は、ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌにおける、ＬＰ  ＩＤＰＳＣの筋原潜在能力および自発的融合の分析結果を示す。異なるマーカー、例えば抗ヒト核、抗ヒト・ジストロフィン抗体およびヒトＹ染色体に対するＤＮＡ蛍光プローブは、イヌ筋肉におけるＬＰ  ＩＤＰＳＣホーミングの証拠を提供する。
【図２３】図２３は、マウス骨髄内へのＬＰ  ＩＤＰＳＣの生着を示す。ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、特異的抗体によって認識され、そして骨髄中の細胞は、親油性膜染色剤であるＤｉｌで同定された。
【図２４】図２４は、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおけるＣＫ１８およびインテグリン・ベータ１（ＣＤ２９）セルトリ細胞の発現を示す。
【図２５】図２５は、マウス精巣内へのＬＰ  ＩＰＤＳＣ移植の模式図を示す。
【図２６】図２６は、繁殖性マウスの精巣内へのＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植を示す。ＩＤＰＳＣ形態（Ａ）。Ｖｙｂｒａｎｔで染色したＩＤＰＳＣ（Ｂ）。（Ｃ、Ｄ）移植１日後、ＩＤＰＳＣは、主に、通常、ライディッヒ細胞が位置する細胞区画で検出された（Ｅ）。スケールバー：（Ａ、Ｂ、Ｅ）２０μｍ；（Ｃ）１００μｍ；（Ｄ）５０μｍ。
【図２７】図２７は、繁殖性マウスの精巣内へのＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植を示す。（Ａ、Ｂ）移植９日後、ＩＰＤＳＣ（赤色）は、繁殖性マウス精巣において、管内（ＩＴ）および管領域（ＴＳ）で検出された。Ａ）共焦点顕微鏡：落射蛍光およびデジタル干渉コントラスト（ＤＩＣ）、（Ｂ）落射蛍光。ＤＡＰＩ（青色）を核視覚化に用いた。（Ｃ）陰性対照；生理食塩水を注射したマウス。バー（Ａ）２０μｍ；（Ｂ、Ｃ）１００μｍ。
【図２８】図２８は、繁殖性マウスの精巣内へのＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植を示す。（Ａ、Ｂ）第９日、これらの細胞は、中央管腔で観察される異なる形態を伴う細胞を含有する蛍光群を形成した（Ｂ）。マウスの精子を赤い矢印で示す（Ｂ、Ｃ）。これらのいくつかは、ヒト精子と似た形態を示す（白い矢印）（Ｂ、Ｃ）。バー（Ａ〜Ｃ）２０μｍ。
【図２９】図２９は、ＬＰ  ＩＤＰＳＣを移植した不妊マウス由来の精巣の画像を示す。ＩＤＰＳＣの局在は、ＴＳ周辺で観察され、これらは薄膜中に移植されている（Ａ、Ｂ）。（Ｃ）白い矢印は、推定上の丸い精子細胞を示し、一方、赤い矢印は、始原生殖細胞を示す。（Ｄ）において、４つの精子細胞の４つ組の存在がＶｉｂｒａｎｔ（ＩＤＰＳＣ染色剤）で示される。（Ｄ１）において、陰性対照としての同じマウス精巣から単離された別の４つ組を示す。核視覚化に用いた、ＰＩ（赤色）（Ｃ）およびＤＡＰＩ（青色）（Ｄ、Ｄ１）。バー（Ａ、Ｂ）２０μｍ、（Ｃ）１０μｍ。
【図３０】図３０は、繁殖性マウスにおける成熟の異なる段階で、赤色で示すＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来精子細胞様細胞を示す（Ａ〜Ｄ）。（Ａ）丸い精子細胞。（Ｂ〜Ｃ）伸張した精子細胞。バー１０μｍ。
【図３１】図３１は、ヒトおよびマウス精子における表現型同定を示す。ヒト精子と形態学的に非常に類似のいくつかの蛍光標識された精子細胞（赤色で示す）が検出された（Ａ〜Ｃ）。（Ｄ）ヒト精子様形態。（Ｅ）マウス精子の形態。バー１０μｍ。
【図３２】図３２は、細胞遺伝学的分析を示す。ヒトＸ染色体に特異的なプローブを用いたＦＩＳＨ分析は、いくつかの細胞内で、１つのみのＸシグナルの存在を確認し、これは、減数分裂中に起こる染色体減少を示唆する。細胞が対を形成し、これは倍数体細胞が分裂する際、半数体細胞が互いに近くに位置するであろう事実と一致することに注目されたい。スケールバー５μｍ。
【図３３】図３３は、細胞融合を示す。（ＡおよびＡ１）ＬＰ  ＩＤＰＳＣ細胞質をＶｙｂｒａｎｔで赤く染色した：（Ａ１）における核（ＤＡＰＩ、青色）の形態に注目されたい。マウス生殖細胞細胞質は、緑に染色され（Ｂ）、核小体がより大きく増加する（Ｂ１）。（Ｃ）２つの融合した核および緑に染色された細胞質を含む細胞。（Ｄ）２つの融合した核および赤く染色された細胞質を含む細胞。（Ｅ）（Ｃ）および（Ｄ）の間の重ね合わせ。
【図３４】図３４は、時間ポイント４、７、および９で生じるＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植経過中の尿素レベルの増減を示す。
【図３５】図３５は、時間ポイント４、７、および９で生じるＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植経過中のクレアチニンレベルの増減を示す。
【図３６】図３６は、時間ポイント４、７、および９で生じるＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植経過中の電解質レベル（カリウム、カルシウム、およびリン）の増減を示す。
【図３７】は、ヒトＩＤＰＳＣ療法を受けたネコ腎臓の巨視的提示を示す。Ａ）ＩＤＰＳＣを受けた左（大サイズ）、および右の腎臓の間のサイズの相違。Ｂ）左の腎臓では、不規則に出現する新生物が明らかである。
【図３８】図３８は、左（Ａ〜Ａ２）および右（Ｂ〜Ｂ２）腎臓の組織学的提示を示す。スケールバー；Ａ〜Ｂ２＝２００μｍ。Ｂ１およびＢ２では、血液浸潤（赤色）もまた観察可能である。Ｂ２において、糸球体内皮細胞の保持が可視である。
【図３９】図３９は、ネコ腎臓におけるＩＤＰＳＣの存在を示す。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ抗体で陽性免疫染色された糸球体（赤色）。Ｂ）〜Ｃ）尿細管において、抗ＩＤＰＳＣ抗体は、尿細管細胞と反応する（赤色）。共焦点顕微鏡合併画像：デジタル干渉コントラスト＋蛍光顕微鏡。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。スケールバー：Ａ＝２００μｍ、ＢおよびＣ＝１００μｍ。
【図４０】図４０は、マッソンの三色染色によって示される皮膚リモデリングの組織学的提示を示す：Ａ）〜Ａ２）ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣを投与された動物由来の代表的な画像。Ｂ）〜Ｂ２）ＰＢＳのみを投与された動物由来の代表的な画像。対物レンズ２０Ｘ。
【図４１】図４１は、損傷を受けた皮膚における、ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣ（緑色）の生着を示す。核はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（赤色）で染色された。共焦点顕微鏡：蛍光顕微鏡（Ｆｍ）、ＤＩＣおよびＤＩＣ＋Ｆｍ。組織学的提示、Ｈ＆Ｅ染色。スケールバー＝１００μｍ。
【図４２】図４２は、ＰＢＳのみを投与された動物由来の代表的な画像を示す。核はＰＩ（赤色）で染色された。共焦点顕微鏡：蛍光顕微鏡（Ｆｍ）、ＤＩＣおよびＤＩＣ＋Ｆｍ。組織学的提示、Ｈ＆Ｅ染色。スケールバー＝１００μｍ。
【図４３】図４３は、ＥＰおよびＬＰ  ＩＤＰＳＣの分化の神経および網膜潜在能力を示す。ＥＰ  ＩＤＰＳＣは、神経分化にしたがうことのみが可能であり、網膜分化にはしたがわず、神経分化の初期マーカーであるネスチンおよびベータ−チューブリンＩＩＩを発現する。ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、神経分化および網膜分化両方の初期マーカー（Ｐａｘ６およびＣｈｘ−１０）を発現する。Ｃｒｘ、Ｎｒｌ、およびロドプシンは、後期網膜神経マーカーであり、これらは分化したＬＰ  ＩＤＰＳＣによって発現されるが、ＥＰ  ＩＤＰＳＣには発現されない。
【図４４】図４４は、網膜細胞に向かうＬＰ  ＩＤＰＳＣ分化を示す。Ａ）〜Ｆ）分化の段階。Ｆ）において、網膜細胞分化の最後の段階は、光受容体によって優先的に提示される。分化後、細胞数は有意に減少する。Ｇ）分化のタイムライン。
【図４５】図４５は、接着性ニューロスフェアであるＥＰ  ＩＤＰＳＣが、網膜分化を進行不能であることを示す。Ａ）１０Ｘ；Ｂ）〜Ｄ）４０Ｘ。
【図４６】図４６は、接着性ニューロスフェアであるＬＰ  ＩＤＰＳＣが、網膜分化を進行可能であることを示す。Ａ）１０Ｘ；Ｂ）〜Ｄ）４０Ｘ。
【図４７】図４７は、ＥＰ  ＩＤＰＳＣの神経分化を示す。Ａ）〜Ｂ）グリア様形態を持つ細胞を示す位相差−１０Ｘ対物レンズ。Ｃ）〜Ｄ）β−ＩＩＩ−チューブリンの発現を示す免疫蛍光。Ｃ）１０Ｘ対物レンズ。Ｄ）６０Ｘ対物レンズ。Ｅ）〜Ｈ）ＧＦＡＰの発現−４０Ｘ。Ｅ）細胞体および細胞核のＧＦＡＰ免疫染色。Ｆ）ＤＡＰＩで染色された核。Ｇ）グリア様細胞の形態を示す明視野。Ｈ）すべてのフィルター（ＤＡＰＩ＋ローダミン、明視野）の重ね合わせ。
【図４８】図４８は、未分化ＩＤＰＳＣによるＣＤ７３（Ａ、Ｂ）およびビメンチン（Ｄ、Ｅ）の発現を示す。Ｃ〜Ｆ）二次抗体対照。核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。
【図４９】図４９は、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける、免疫蛍光、ならびに網膜細胞の特異的マーカー、例えばＰａｘ−６、Ｃｈｘ−１０、Ｃｒｘ、Ｎｒｌ、カルビンディンおよびロドプシンの発現の欠如を示す。
【図５０】図５０は、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける、フローサイトメトリー、ならびに網膜細胞の特異的マーカー、例えばＰａｘ−６、Ｃｈｘ−１０、Ｃｒｘ、Ｎｒｌ、カルビンディンおよびロドプシンの発現の欠如を示す。
【図５１】図５１は、異なるタイプの神経形態、例えばニューロンおよび神経節様細胞を示す、分化したＬＰ  ＩＤＰＳＣを示す。
【図５２】Ａ）〜Ｂ）懸濁中の二次ニューロスフェア−２０Ｘ対物レンズ。Ｃ）〜Ｄ）接着した二次ニューロスフェア−対物レンズ１０Ｘ。Ｅ）〜Ｆ）ロゼット様形態−２０Ｘ対物レンズ。
【図５３】図５３は、分化したＬＰ  ＩＤＰＳＣニューロスフェアおよび遊走性ニューロンにおけるＣＤ７３の発現を示す（Ａ〜Ｆ）。（Ｂ）において、このマーカーに関して陰性であるいくつかの細胞が観察可能である。
【図５４】図５４は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、Ｐａｘ６の発現を示す。抗Ｐａｘ−６抗体は、分化した細胞の５０％で陽性免疫染色を示した。
【図５５】図５５は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、Ｃｈｘ１０の発現を示す。抗Ｃｈｘ−１０抗体は、分化した細胞の８０％で陽性免疫染色を示した。
【図５６】図５６は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、Ｃｒｘの発現を示す。より高い倍率によって、このタンパク質の核局在が示された。抗Ｃｒｘ抗体は、分化した細胞の８０％で陽性免疫染色を示した。
【図５７】図５７は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、ＮＲＬ（核および核周囲局在）の発現を示す。抗ＮＲＬ抗体は、分化した細胞の２０％で陽性免疫染色を示した。
【図５８】図５８は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、カルビンディン（細胞質局在）の発現を示す。抗カルビンディン抗体は、分化した細胞の２０％で陽性免疫染色を示した。
【図５９】図５９は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、リカバリン（細胞質局在）の発現を示す。抗リカバリン抗体は、分化した細胞の２０％で陽性免疫染色を示した。
【図６０】図６０は、ニューロスフェア様構造に編成されるＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来網膜前駆細胞における、ロドプシン（細胞質局在）の発現を示す。抗ロドプシン抗体は、分化した細胞の２０％で陽性免疫染色を示した。
【図６１】図６１は、実験モデルの子宮角を例示するスキーム１を示す：処置した胎児の群は、右子宮角の１、３、４および５にあった（Ｃｕｄ）；これらの胎児にＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの移植を行った。胎児の対照群は、左子宮角の２および７であった（Ｃｕｅ）；これらを実験対照のために収集した。
【図６２−１】図６２は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）肺組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（５２．８％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（５０．２％）抗体。Ｃ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｄ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６２−２】図６２は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）肺組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（５２．８％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（５０．２％）抗体。Ｃ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｄ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６３】図６３は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）筋組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（５２．８％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（５０．２％）抗体。Ｃ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｄ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６４】図６４は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）腎組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（４２．３％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（３１．３％）抗体。Ｃ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｄ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６５】図６５は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）脳組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（１３．１％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（１３．４％）抗体。Ｃ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｄ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６６】図６６は、フローサイトメトリーによって行われる、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植の定量化、および移植後のこれらの細胞増殖の評価を示す。Ａ、Ｂ）胎盤母性組織断片における移植ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化。Ａ）抗ＩＤＰＳＣ（６４．８％）およびＢ）抗ＨｕＮｕ（６５．６％）抗体。Ｃ、Ｄ）イヌ胎児内への移植後、細胞周期の異なる相にあるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの模式的評価。Ｅ、Ｆ）細胞周期の異なる相でのＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量的および比較分析。
【図６７】図６７は、胎児イヌ心筋の筋線維の間に移植された、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ（緑色）におけるヒトタンパク質ＯＣＴ３／４（赤色）の発現を示す（Ａ１〜Ａ３）。Ａ１−Ｏｃｔ３／４およびＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの間の重複は、核および細胞質局在を立証する。Ａ２）ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおけるＥＧＦＰタンパク質の発現。Ａ３）Ｏｃｔ３／４に関する陽性免疫染色は、心筋細胞様局在を示す。Ａ１〜Ａ２＝Ｆｃｍ、Ａ３−Ｆｃｍ＋ＣＩＤ。スケールバー：Ａ１〜Ａ３＝５μｍ。
【図６８】図６８は、フローサイトメトリー分析を示す。心筋に移植したＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける、未分化細胞（ＭＳＣおよびＥＳ細胞）のマーカーの発現。Ａ）細胞体積の対照。Ｂ〜Ｄ）Ｏｃｔ３／４の発現−２１．５％（Ｃ）ＣＤ１４６−０．０％および（Ｄ）β１−インテグリン−０．０％。
【図６９】図６９は、フローサイトメトリー分析を示す。骨格筋組織−二頭筋に移植したＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける、未分化細胞（ＭＳＣおよびＥＳ細胞）のマーカーの発現。Ａ）Ｏｃｔ３／４の発現（４５．４％）（Ｂ）ＣＤ１４６の発現（０．４％）および（Ｃ）β１−インテグリンの発現（３６．７％）。
【図７０】図７０は、フローサイトメトリー分析を示す。心臓組織における、分化した細胞のマーカーの発現。心臓タンパク質の陽性発現：ミオゲニン（Ａ）、カルジオチン（Ｃ）、およびＣＫ−１８に関する陰性（Ｂ）。本発明者らは、ＣＤ４５＋の陽性発現を観察し、この量は、心筋（Ｄ）および大動脈弓（Ｅ）において多様である。
【図７１】図７１は、フローサイトメトリー分析を示す。骨格筋組織−大腿二頭筋における、分化した細胞のマーカーの発現。筋肉タンパク質の陽性発現：（Ａ）Ｍｙｏ  Ｄ１、（Ｂ）７．５％ミオゲニン、（Ｃ）７．７％のＣＫ−１８および（Ｄ）１２．０％のＣＤ４５。
【図７２】図７２は、母性胎児胎盤イヌ組織に移植されたＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ（緑色）における、ヒトＯｃｔ３／４（赤色）タンパク質の発現を示す（Ａ１〜Ａ３）。Ａ１）Ｏｃｔ３／４に関する陽性免疫染色。Ａ２）ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて観察される直接ＧＦＰ蛍光、Ａ３）観察される、Ｏｃｔ３／４およびＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの間の重複。ＦＣＭ  ＣＩＤ＝Ａ１＋、Ａ２〜Ａ３＝ＦＣＭ；スケールバー：Ａ１〜Ａ３＝１０μｍ。
【図７３】図７３は、フローサイトメトリー分析を示す。胎盤組織におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける未分化細胞（ＭＳＣおよびＥｓ細胞）のマーカーの発現。Ａ）対照細胞体積（Ｂ）１２．６％のタンパク質Ｏｃｔ３／４、（Ｃ）２．５％のＣＤ１４６、および（Ｄ）１８．３％のβ−インテグリンの発現。
【図７４】図７４は、ＩＤＰＳＣのスケールアップを示す。水平方向に、ＤＰ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏプレーティング（第０日、Ｐ０）のプロセス後、ＤＰ接着および細胞アウトグロース（outgrowth）（第３〜４日）を示す。このプロセス後、細胞の酵素処理（Ｐ１）および多数コロニーの形成が続く（ＣＦＵ−ｆ：コロニー形成単位−線維芽細胞）。５日後、酵素処理を行って、多コロニー由来ＩＤＰＳＣの集団を採取する（Ｐ２）。次に、ＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大（Ｐ３）を行う。図の上記の各プレートの上の数字は、各継代において採取されるＩＤＰＳＣのおよその量を示す。垂直方向に、ＤＰの多数回の機械的トランスファー後であるが、同じプロセスを示す。
【図７５】図７５は、ＳＨＥＤおよびＩＤＰＳＣの単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大、およびバンキングの戦略を示す。ＤＰの酵素的処理によるＳＨＥＤ単離、ＳＨＥＤ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏプレーティング（第０日、Ｐ１）、および異種集団における多数のコロニーの形成のプロセスを左に示す。右に示すＩＤＰＳＣ単離プロセスには、ＤＰ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏプレーティング（第０日、Ｐ０）後、ＤＰ接着および細胞アウトグロース（第３〜４日）が含まれる。ＩＤＰＳＣのスケールアップは、細胞の酵素処理（Ｐ１）および多数コロニーの形成（ＣＦＵ−ｆ：コロニー形成単位−線維芽細胞）を含むプロセスである。約５日後、酵素処理を行って、多コロニー由来ＩＤＰＳＣ（Ｐ２）集団を採取する。次に、ＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大（Ｐ３）を行う。図の細胞培養フラスコの上の数字は、各継代において採取されるＩＤＰＳＣのおよその量を示す。垂直方向に、ＤＰの多数回の機械的トランスファー後であるが、同じプロセスを示す。
【図７６】図７６は、歯髄およびＩＤＰＳＣを示す。Ａ）摘出直後の非常に血管形成された（黒い矢印）ＤＰ。Ｂ）アウトグロース中（outgrowing）のＩＤＰＳＣを含む、ＤＰの外植片培養。Ｃ）最初の継代時のＩＤＰＳＣ培養。Ｄ）大きな核を持つ、ＥＳ様細胞形態を示すＩＤＰＳＣ。Ｅ）いくつかの仮足を持つ、ＭＳＣ様形態を示すＩＤＰＳＣ。Ｆ）ＥＳ細胞およびＭＳＣに似た、均質な形態を示すＩＤＰＳＣ。Ｇ）対の染色体を示し、そして大きさおよび位置の順に並べたＩＤＰＳＣ（ＬＰ）の核型分析は、ルーチンのＧバンド形成分析によって示されるように、染色体数のいかなる数値変化も明らかにしなかった。図３Ａ〜３Ｃおよび３Ｇは、光学顕微鏡で生成され、一方、図３Ｄ〜３Ｆは、透過型電子顕微鏡から生じた。図３Ａに関する倍率＝２０Ｘおよび図３Ｇ＝６３Ｘ；図３Ｂのスケールバー＝２０ｍｍ；図３Ｃおよび３Ｆ＝１０ｍｍ；ならびに図３Ｄおよび３Ｅ＝３ｍｍ。
【図７７】図７７は、ＤＰのＢｒｄＵ免疫染色を示す。Ａ）培地中にプレーティングした約６時間後のＤＰ。Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の約４８時間後のＤＰ。Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の約７２時間後のＤＰ。Ｄ）酵素処理を行わないＤＰ。Ｅ）酵素処理を行ったＤＰ、ＤＰの外部細胞層がこうした処理によって破壊されていることが示される。すべての画像のため、光学顕微鏡を用いた。図４Ａ〜４Ｃのスケールバー＝２０μｍ、および４Ｄ〜４Ｅ＝５０μｍ。
【図７８】図７８は、ＤＰにおける、ネスチン、ＳＴＲＯ−１、ビメンチン、およびＯｃｔ３／４の発現を示す。図５Ａ〜５Ｈは、細胞リッチゾーン（図５Ａから５Ｃ）、細胞不含ゾーン（図５Ｄ〜５Ｆ）および象牙芽細胞層（図５Ｇ〜５Ｈ）におけるネスチン発現を示す。Ａ）多数のネスチン陽性細胞が観察可能である。ここで、および以下で、黒い矢印は、免疫陽性を示し、そして白い矢印は、免疫陰性細胞を示す。Ｂ）見かけ上、分化していないＭＳＣが、ネスチン細胞質局在を示す。Ｃ）２つの別個の形態を持つネスチン陽性細胞：丸い上皮様（ＥＳ様）および線維芽細胞様細胞。Ｄ）神経叢における中間径フィラメント染色を示すネスチン。Ｅ）２つの強く染色されたネスチン陽性細胞を含む小さい毛細管。Ｆ）毛細管側面にネスチン陽性細胞（矢印）を持つ、Ｅ）と同じもの。Ｇ）およびＨ）ネスチン陽性象牙芽細胞が観察可能である。Ｉ）陰性対照：二次抗体のみを用いた。Ｊ）毛細管内部（血管周囲ニッチ）の細胞不含領域におけるＳＴＲＯ−１陽性細胞。Ｋ）細胞不含ゾーンの神経叢内では非常に少数のＳＴＲＯ−１免疫染色しか確認されなかった。Ｌ）およびＭ）細胞リッチ（Ｌ）および細胞不含（Ｍ）ゾーンにおけるビメンチン陽性（黒い矢印）細胞局在。Ｎ）〜Ｑ）細胞リッチ（Ｎ）および細胞不含（Ｏ〜Ｑ）ゾーンにおけるＯｃｔ３／４陽性細胞局在。光学顕微鏡を用い、５Ａ、５Ｄ、および５Ｆ〜５Ｐのスケールバー＝２０μｍ；ならびに５Ｂ、５Ｃ、および５Ｑ＝５μｍ。
【図７９】図７９は、ＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰの特徴付けを示す。図６Ａ１〜６Ｆ１）ＩＤＰＳＣのＥＰを示すフローサイトメトリー、これらはＳＨ２／ＣＤ１０５（Ａ１）：ＳＨ３／ＣＤ７３（Ｂ１）；ネスチン（Ｃ１）：ビメンチン（Ｄ１）；フィブロネクチン（Ｅ１）などのマーカーを高発現した。Ｆ１）ＥＰにおけるＯｃｔ３／４の低発現；Ａ２〜Ｆ２）ＩＤＰＳＣのＬＰを示すフローサイトメトリー、ＥＰと同じマーカーを発現した。Ｆ２）Ｆ１におけるよりも、ＬＰにおけるＯｃｔ３／４のより高い発現。Ａ３〜Ｆ３）（Ａ２〜Ｅ２）におけるものと同じマーカーを用いる、ＩＤＰＳＣのＬＰの免疫蛍光。Ｆ３）Ｏｃｔ３／４の核局在が観察可能である。Ａ３〜Ｆ３）落射蛍光、ＤＡＰＩ（青色）で染色された核。Ａ３、Ｂ３、Ｅ３、およびＦ３に関するスケールバー＝５μｍ、ならびにＣ３、およびＤ３に関するもの＝１０μｍ。
【図８０】図８０Ａ〜Ｄは、関連しない４人のドナーから各々単離されたＩＤＰＳＣ集団におけるＯｃｔ３／４の発現を示す。各集団におけるＯｃｔ３／４陽性細胞の比率は、それぞれ、Ａ）２５％；Ｂ）４７％；Ｃ）１２％；Ｄ５％であった。
【図８１】図８１は、３つの別個の培地中での培養後の、ＩＤＰＳＣの増殖率および遺伝子発現を示す。Ａ）凍結保存前のＬＰの増殖曲線。Ｂ）凍結保存後のＬＰの増殖曲線。Ｃ）凍結保存後のＬＰの遺伝子発現。
【図８２】図８２は、ＩＤＰＳＣのフローサイトメトリー発現プロファイルを示す。Ａ〜Ｂ）ヒトＥＳ細胞マーカーに関するＣＤ１０５およびＣＤ７３のＩＤＰＳＣ陽性免疫染色。Ｃ）〜Ｄ）適切な陰性ＩｇＧ１対照。Ｅ）〜Ｇ）ＩＤＰＳＣによる、内皮および造血マーカー、例えばＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ４３の発現の欠如。Ｈ）ＣＤ１３に関する陽性免疫染色。フィコエリトリン（ＰＥ）およびＦＩＴＣコンジュゲート化二次抗体を用いた。
【図８３】図８３は、ＩＤＰＳＣのフローサイトメトリー発現プロファイルを示す。Ａ〜Ｂ）ＩＤＰＳＣによるＨＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＡＢＣ発現の欠如。Ｃ〜Ｈ）ＣＤ４４（８６％）、ＣＤ１１７（８０％）、ＣＤ９０（１００％）、ＣＤ２９（９９．５％）、ネスチン（９９．２％）、およびビメンチン（９５．６％）に関する陽性免疫染色。
【図８４】図８４は、ＩＤＰＳＣのフローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。Ａ〜Ｅ）神経栄養因子ＢＮＤＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＮＤＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ＮＧＦ−β（神経成長因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４／５（ニューロトロフィン−４／５）に関するフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｆ）ＩＤＰＳＣによるｐ７５のフローサイトメトリー発現プロファイル。Ｇ）ＩＤＰＳＣにおける神経栄養因子およびｐ７５の発現の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析。レーン１−ｃＤＮＡテンプレート；レーン２−陰性対照、逆転写酵素なし；レーン３−陰性対照、テンプレートなし。Ｈ）ｐ７５発現のＲＴ−ＰＣＲ分析；ＧＡＰＤ−ハウスキーピング遺伝子。
【図８５】図８５は、角膜縁幹細胞および角膜上皮に対するヒト特異的抗体での陽性免疫染色を示す、未分化ヒトＩＤＰＳＣを示す。Ａ）ｈＩＤＰＳＣ核局在におけるｐ６３（緑色）での免疫陽性反応；Ｂ）ＤＡＰＩで染色した核とｐ６３染色の合併画像；Ｃ）インテグリンβ１は膜における局在を示す；Ｄ）中間径フィラメントであるビメンチンの染色；Ｅ）細胞膜におけるコネキシン４３の染色；Ｆ）形質膜におけるＡＢＣＧ２染色；Ｇ）Ｋ３／１２抗体での染色は、弱い陽性免疫染色を示した；Ｈ）ｈＩＤＰＳＣの陰性対照の一次抗体でのインキュベーションを省略し、そしてｈＩＤＰＳＣを二次抗体とインキュベーションした。Ａ）に関して共焦点顕微鏡を用い、Ｄ）〜Ｇ）に関して蛍光顕微鏡（Ｆｃｍ）を用い、そしてＨ）に関して、Ｆｃｍ＋示差干渉コントラスト（Ｅｐｉ＋ＤＩＣ）を用いた。ＤＡＰＩで染色された核は青色で示される。スケールバー＝５０μｍ。Ｉ）ｈＩＤＰＳＣにおける角膜縁幹細胞マーカーの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析：レーン１、ラダー１００ｂｐ；レーン２、ヒト角膜組織；レーン３、ヒト角膜縁組織；レーン４、ｈＩＤＰＳＣ。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｈＩＤＰＳＣにおけるＡＢＣＧ２、コネキシン４３およびＫ１２  ｍＲＮＡの存在を立証し、Ｋ３のものはｈＩＤＰＳＣ中には見出されなかった。
【図８６】図８６は、ＩＤＰＳＣにおけるＥＳ細胞マーカーの発現を示す。Ａ）Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、およびｐ５３の発現の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析。Ｂ〜Ｃ１）核局在を伴う、ｈＩＤＰＳＣにおけるＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（緑色）との免疫陽性反応；Ｂ１およびＣ１）ＤＡＰＩで染色された核を示す、合併画像。倍率１００Ｘ。Ｄ）ヒト上皮幹細胞（ｈＥＳＣ）に比較した、ＩＤＰＳＣにおけるＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２の相対的発現パーセントを示す、定量的ＰＣＲアッセイ。
【図８７−１】図８７Ａは、乳歯（ＤＬ−１およびＤＬ−４）および第三大臼歯（ＤＬ−２）から単離されたｈＩＤＰＳＣより増幅されるビメンチン、テネシン−Ｃ、１型コラーゲン、およびフィブロネクチンに関する、ＲＴ−ＰＣＲ産物を含む、アガロースゲルの画像を示す。
【図８７−２】図８７Ｂは、図８７Ａに示すバンドの密度計分析を示す。
【図８８】図８８は、ＤＬ−１細胞（乳歯から単離されたｈＩＤＰＳＣ）における（Ａ）ビメンチン、（Ｂ）１型コラーゲン、（Ｃ）フィブロネクチン、および（Ｄ）テネシン−Ｃの代表的な免疫蛍光画像を示す。（Ａ）ビメンチンは、中心体から分岐して、細胞の末梢ドメインに到達する、フィラメントの波打つ束のように見える。（Ｂ）Ｉ型コラーゲンは、細胞質全体に広がるドットとして現れ、核周囲領域の周りでより高い濃度を持つ。フィブロネクチン（Ｃ）ならびに、テネシン−Ｃ（Ｄ）は、細胞質全体に均質に分布する小さいドットとして現れる（元来の倍率：４００Ｘ）。
【図８９】異なるドナーから単離された２つの独立のＩＤＰＳＣ集団において、図８９Ａ〜Ｂは、ｐ５３発現の定量化を示し、そして図８９Ｃ〜Ｄは、ＣＤ４４発現の定量化を示す。ｐ５３は、２つの集団のＩＤＰＳＣ細胞の９９．５％および９９．４％で発現され、一方、ＣＤ４４は、２つの集団のＩＤＰＳＣ細胞の９８．５％および９８．６％で発現された。
【図９０】図９０は、多様なサイクル後の、ＩＤＰＳＣにおけるＳＯＸ２タンパク質発現を示す。図９０ａは、１５サイクルの機械的トランスファー後、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後、継代２（Ａ）および５（Ｂ）の、ＩＤＰＳＣにおけるＳＯＸ２タンパク質発現を示す。図９０Ａ１および９０Ｂ１は、ＳＯＸ２の細胞継代依存性細胞内局在を示す：Ａ１−核、Ａ２−核周囲。図９０ｂは、４５サイクルの機械的トランスファー後、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後、継代２（Ａ）および５（Ｂ）の、ＩＤＰＳＣにおけるＳＯＸ２タンパク質発現を示す。
【図９１】図９１ａは、ｈＩＤＰＳＣ由来ニューロンの後期集団（ＬＰ）におけるＳＯＸ１およびβ−チューブリンタンパク質の発現を示す。Ａ．ＤＡＰＩで染色されたニューロンの核（白い矢印）；Ａ２．ニューロンの核（白い矢印）において観察されたＳＯＸ１の陽性免疫染色；Ａ３、β−チューブリンに関する陽性免疫染色；Ａ３．合併画像Ａ〜Ａ２；Ａ４．Ａ３における挿入図の大拡大によって、ニューロンの核（白い矢印）中のＤＡＰＩおよびＳＯＸ１の重ね合わせを示す。落射蛍光、スケールバー＝５μｍ。図９１ｂ〜ｅは、１５、３０および４５サイクルの歯髄機械的トランスファーおよび神経分化誘導後の、神経前駆体およびニューロンで、ｈＩＤＰＳＣのＬＰの濃縮を示す。Ａ．ＳＯＸ１陰性細胞の割合、ＤＡＰＩ（青色）のみで染色された核。ＳＯＸ１陽性細胞は緑色で示される。Ｂ．β−チューブリン陰性細胞の割合、ＤＡＰＩ（青色）のみで染色された核。β−チューブリン陽性細胞は赤色で示される。
【図９２】図９２ａは、抗ＢｒｄＵ抗体で陽性に免疫染色されるＩＤＰＳＣ神経芽細胞の核、およびβ−チューブリン・クラスＩＩＩと陽性に反応するニューロン体を示す。図９２ｂ〜ｃは、ＤＰ機械的トランスファーの増大するサイクル数後、わずかに分化した神経芽細胞を含む、分化したＩＤＰＳＣ集団の濃縮を示す。
【図９３】図９３ａは、１５、３０および４５サイクルの歯髄機械的トランスファーおよび神経分化誘導後の、神経前駆体およびニューロンを含む、ｈＩＤＰＳＣのＬＰの濃縮を示す。ＢｒｄＵ陽性細胞は赤色を示し、そしてＳＯＸ２は緑色の核を示し、ＤＡＰＩ（青色）でもまた染色される。図９２ｂは、ＤＡＰＩ（青色）で染色された核に関連づけて示される、ＢｒｄＵおよびＳＯＸ２陽性細胞の割合を示す。
【図９４】図９４ａは、Ｃｉｍａｄａｍｏｒｅら、２０１１の図解の要約を示す。図９４ｂは、本明細書に開示する態様の要約を示す。
【図９５】図９５は、ニューロスフェアおよびロゼットを形成する、ＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞における神経マーカーの同時発現を示す。Ａ）神経分化の方に向かうように誘導された、ＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞内のＲＡＲ−アルファ発現（緑色）。Ｂ）およびＣ）は、それぞれニューロスフェアおよび分化したニューロンにおけるＣＤ２７１（Ｐ７５）の発現。Ｄ）ベータ−３−チューブリナ発現。Ｃ）ＮｅｕＮ抗体、ニューロスフェアにおける核局在。Ｆ）、Ｇ）およびＨ）ダイニン−Ｌｉｓ１−Ｎｄｅ１複合体発現。Ｉ）およびＪ）それぞれ、ミエリンＰ２およびＯ４発現。Ｋ）シナプトフィジン発現。Ｌ）ＣＤ１４６発現およびＭ）対照。スケールバー＝１０μｍ、ＤＡＰＩで染色した核（青色）。
【図９６】図９６は、初期および後期継代で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されたＬＰ  ＩＤＰＳＣの雄性核型を示す。
【図９７】図９７は、病原性が異なるＭｔｂおよびウシ結核菌（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ）にｉ．ｔ．感染させたＣ５７Ｂｌ／６マウスの肺細胞によるサイトカイン産生に対するＩＤＰＳＣ  ｉ．ｐ．接種の影響を示す。
【図９８】図９８は、智歯歯髄組織およびＣＤ１０５に関する免疫組織化学染色を示す。Ａ．組織の全体の側面、ＨＥ染色；矢印は血管周囲ニッチを示し、そして星は神経叢を示す。陰性対照反応では、二次抗体のみを用いた。Ｂ．血管周囲（黒い矢印）および血管叢（オレンジ色の矢印）で観察されるＣＤ１０５に関する陽性染色。Ｃ、Ｄ、ＦおよびＧ、さらにはＢにおいて、より高い倍率である。Ｈ．ＣＤ１０５に関する陽性染色−神経叢。ヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）での対比染色。
【図９９】図９９は、智歯歯髄組織、ならびにＣＤ７３−ＳＨ３およびＳＨ４に関する免疫組織化学染色。Ａ．組織の全体の側面、ＨＥ染色、矢印は血管周囲ニッチを示す。Ｂ、Ｃ．血管（黒い矢印）および血管周囲（オレンジ色の矢印）で観察されるＳＨ３に関する陽性染色、Ｄ−神経叢、神経細胞は同様である。Ｅ、Ｆ−ＳＨ−４に関する非常に弱い染色。
【図１００】図１００は、智歯歯髄組織、およびＮ−カドヘリン（ＡＣ）、ＡＢＣＧ２（Ｄ、Ｅ）およびＮａｎｏｇ（Ｆ）に関する免疫組織化学染色を示す。Ａ．組織の全体の側面、ＨＥ染色、Ｎ−カドヘリンに関する陽性染色。Ｂ、Ｃ．血管周囲ニッチ（黒い矢印）（Ｂ）および周皮細胞の部位（オレンジ色の矢印）（Ｃ）で観察されるＮ−カドヘリンに関する最大に増加した陽性染色。Ｄ、Ｅ、ＡＢＣＧ２の陽性発現は、膜上の位置を示す（黒い矢印）。Ｆ．  Ｎａｎｏｇ−転写因子に対する陽性染色、ＡＢＣＧ２、細胞質局在と比較してより強くはない（黒い矢印）。
【図１０１】図１０１は、ＣＤ１０５＋および＋ＣＤ７３／ＳＨ３およびＮ−カドヘリンに関する免疫組織化学染色の歯髄組織智歯比較分析を示す。Ａ．組織の全体の外見、ＨＥ染色、ＣＤ１０５＋をマークする。Ｂ．ファブリックの全体の外見、ＨＥ染色、ＣＤ７３／ＳＨ３＋をマークする。Ｃ．（Ａ）におけるのと同じ、より大きい増加。血管周囲ニッチ：黒い矢印は内皮細胞を示し、赤い矢印は周皮細胞を示す。Ｄ．Ｃ．においてさえ、（Ｂ）の増加がより大きい。血管周囲ニッチ：黒い矢印は内皮細胞を示す。そしてＮ−カドヘリンに関しては陽性発現。赤い矢印は周皮細胞の位置を示し、黒い矢印は内皮細胞を示す。
【図１０２】図１０２は、ＣＤ１０５に関して免疫陽性である細胞の線維芽細胞様形態（Ａ）、および複製された（ｆａｃｓｉｍｉｌｅ）ＣＤ７３／ＳＨ３＋に関して免疫陽性である神経細胞を示す。黒い矢印。
【図１０３】図１０３は、ヒトＩＤＰＳＣの皮下適用後、細胞塊および／または奇形腫の形成を伴わない、ヌードマウスの背側領域を示す。
【図１０４】図１０４は、第三大臼歯を示す。
【図１０５】図１０５は、多数の患者投薬のため、臨床的に適切な量を得るための、ＬＰ法によるｈＩＰＤＳＣの産業的スケールアップのためのバッチ放出プロセスの例示的なフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
すべての刊行物、特許および特許出願は、いかなる図および付録も含めて、各個々の刊行物または特許出願が、特に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いで、本明細書に援用される。
【００３８】
以下の説明には、開示の側面を理解する際に有用でありうる情報が含まれる。本明細書に提供する情報のいずれも、先行技術であるかまたは現在請求される発明に適切であるとの、あるいは特にまたは暗に言及されるいかなる刊行物も先行技術であるとの、承認ではない。
【００３９】
本文書において、本明細書にそして請求項に用いられるような、動詞「含む」およびその活用は、限定されない意味で用いられ、その語に続く項目が含まれるが、特に言及され
ない項目が排除されないことを意味する。さらに、不定詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、１つの、そして１つのみの要素が存在することを、文脈が明らかに必要としない限り、要素の１より多くが存在する可能性を排除しない。不定詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００４０】
本明細書において、用語「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似せる、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン性タンパク質混合物を指す。
【００４１】
「採取サイクル」は、ＩＤＰＳＣの接着およびアウトグロース（outgrowth）後、新規
細胞培養容器へのＤＰのトランスファー、その後の保存（例えば凍結保存）および／またはＩＤＰＳＣのアウトグロース物の継代培養を構成する。
【００４２】
本明細書において、「低酸素条件」は：
（ｉ）最大約０．５％〜１％、または最大約０．５％〜１５％の間の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉ）約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または２％または５％の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉｉ）約０．１％〜２％の間の酸素（Ｏ２）；あるいは
５〜７％のＣＯ２を含む（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか
を含むかまたはこれらに同等の培養条件下で、細胞を培養することを含む。
【００４３】
本明細書において、用語「幹細胞」は、未成熟の非特殊化細胞であって、特定の条件下で、成熟した機能性細胞に分化可能である前記細胞を指す。
【００４４】
本明細書において、用語「ｈＩＤＰＳＣ」は、限定されるわけではないが、中枢および末梢神経系由来の細胞、例えばニューロン、星状細胞、神経節細胞、および／またはオリゴデンドロサイトを含む、広範囲の細胞タイプに分化可能な、未分化幹細胞を指す。
【００４５】
本明細書において、用語「ＬＰ」は、少なくとも１５サイクルの多数回ＤＰトランスファー後のＩＤＰＳＣを指す。用語「ＥＰ」は、ＤＰ摘出直後に単離されたＩＤＰＳＣを指す。
【００４６】
本明細書において、用語「細胞培養」または「培養細胞」は、人工的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境において維持され、培養され、または増殖される、細胞または組織を指す。
【００４７】
本明細書において、用語「多能性」は、任意の成体細胞を形成する能力を有する、前駆細胞を指す。
【００４８】
本明細書において、用語「未分化」は、分化した細胞から区別する、未分化細胞の形態学的特徴を示す培養細胞を指す。
【００４９】
本明細書において、用語、細胞の「実質的に均質な」集団は、細胞総数の大部分（例えば約５０％〜約９０％）が関心対象の明記する特性（例えばＳＯＸ１、ＳＯＸ２、およびベータ・チューブリンの発現）を有する細胞集団を指す。
【００５０】
本明細書において、用語「同時発現」は、同じ細胞集団における、好ましくは同じ細胞中／上の、２またはそれより多い分子マーカー、例えばＳＯＸ１およびＳＯＸ２、およびベータ−３−チューブリンの同時検出を指す。
【００５１】
本明細書において、用語「（細胞）培養維持」、「増殖」、「伝播」、「拡大」、およ
び「成長」は、細胞数の増加を伴う、細胞または細胞集団の連続した生存を指す。
【００５２】
本明細書において、歯髄（ＤＰ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、ＩＤＰＳＣ単離および拡大に関して、用語「長期」（ＬＴ）は、１５より多い、好ましくは＞２５のＩＤＰＳＣの多数回の採取サイクル、より好ましくは２５〜６０サイクル、そしてより好ましくは１５〜４５サイクルおよびそれより多くに関するＤＰの培養、すなわち「後期集団」（ＬＰ）を指す。
【００５３】
本明細書において、細胞培養および拡大に関して、用語「大規模」は、ＤＰからの単離、および少なくとも、各非酵素的採取サイクル後に細胞が倍加することを可能にする条件下でのＳＣの培養を指す。
【００５４】
本明細書において、用語「神経前駆細胞」は、ＣＮＳおよびＰＮＳの１より多い細胞タイプに分化することが可能な子孫を産生可能な、幹細胞由来の細胞を指す。
【００５５】
本明細書において、用語「神経保護因子」、「神経成長因子」、または「ニューロトロフィン」は、限定されるわけではないが、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４より選択される、神経発生を支持する因子を指す。
【００５６】
本明細書において、用語「神経バイオマーカー」ＳＯＸ１（性決定領域Ｙ−ボックス１を指す）は、初期中枢神経系発生に関与する転写因子を指す。ＳＯＸ１は、特に、腹側線条体で発現されうる。
【００５７】
本明細書において、用語「ＳＯＸ２」は、胚性神経上皮の自己再生性および多分化能幹細胞によって発現される転写因子である、神経前駆体および幹細胞性マーカーを指す（９）。ＳＯＸ２は、成体ラット脳において、神経発生領域において、活発に分裂中の神経前駆細胞によって発現される可能性があり、そしてまた、脳実質に広く分布する、グリア線維性酸性タンパク質免疫陽性アストログリアによってもまた発現されうる（１０）。ＳＯＸ２はまた、Ｏｃｔ４と組み合わせて、多能性のための必須転写因子としても知られる（Ｉｖａｎｏｎａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４４２：５５３０５３８（２００６）；マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法もまた知られる（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，  ２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導には、典型的には、Ｓｏｘファミリー由来の少なくとも１つのメンバーおよびＯｃｔファミリー由来の少なくとも１つのメンバーの発現またはこうしたメンバーへの曝露が必要である。
【００５８】
本明細書において、用語「クラスＩＩＩ  β−チューブリン」、「ベータ３−チューブリン」、「微小管会合タンパク質２（ＭＡＰ２）、またはニューロフィラメント」は、初期ニューロン前駆体のニューロン表現型マーカーに特徴的な、ニューロンにおいてもっぱら発現され、そして特異的ニューロンプロモーターとして働く微小管要素を指す。
【００５９】
本明細書において、用語「ブロモデオキシウリジン」（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン、ＢｒｄＵ）は、生存組織において、増殖中の細胞の検出に用いられる合成ヌクレオシドを指す。ＢｒｄＵは、複製中の細胞の新規に合成されるＤＮＡ内に取り込まれうる（細胞周期のＳ期中）。次いで、ＢｒｄＵに特異的な抗体を用いて、取り込まれた化学薬品を検出し、こうして、ＤＮＡを活発に複製している細胞を示すことも可能である。ＢｒｄＵは、複製に際して娘細胞に渡されうる。ＢｒｄＵは、注入後、２年に渡って検出可能であることが示されてきている。
【００６０】
本明細書において、用語「行動試験」および／または「認知機能」は、情報収集および／またはプロセシング；情報および／またはアイディアの理解、類推、および／または適
用；情報の特定；問題解決に関連する動物またはヒト被験体の精神機能、ならびにアイディアおよび／または情報の学習、知覚、および／または認知などの精神機能を指す。認知機能は、認知機能に関する１またはそれより多い試験またはアッセイ、例えば妥当な診断試験および／またはコンピュータ化認知試験を通じて定義されうる。
【００６１】
本明細書において、用語「変性障害」には、細胞死または機能不全が存在するいかなる疾患も含まれる。変性障害の例には、限定されるわけではないが、神経変性障害、心臓機能不全、不妊、腎不全、皮膚疾患、自己免疫疾患、糖尿病、網膜および他の眼科学的疾患、ならびに過剰増殖性障害、例えば癌が含まれる。
【００６２】
本明細書において、用語「神経形成」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経細胞の増殖、遊走、分化、および／または生存を指す。
【００６３】
いくつかの開示の文脈において、用語「神経変性障害」は、中枢または末梢神経系の細胞が失われる疾患と定義される。神経学的および／または神経変性障害の例は、脊髄傷害、頭蓋内または椎間病変であり、これには限定されるわけではないが、脊髄の打撲、貫通、剪断、圧迫または裂傷病変、あるいは鞭打ち様揺さぶられっ子症候群が含まれる。
【００６４】
本明細書に提示する開示の文脈において、神経学的障害にはまた、虚血事象、あるいは虚血または虚血性障害が含まれ、これらは、細胞または組織における低酸素の任意の局所的または局部的状態と定義可能であり、通常、例えばこの領域の血管の遮断または閉塞によって引き起こされる、不適切な血液供給（循環）によるものである。
【００６５】
低酸素症は、低酸素症および／または虚血におけるような急性傷害を引き起こす可能性もあり、これには、限定されるわけではないが、脳血管機能不全、脳虚血または脳梗塞（塞栓性閉塞および血栓症から生じる脳虚血または梗塞を含む）、網膜性虚血（糖尿病またはその他）、緑内障、網膜変性、多発性硬化症、虚血性視覚性ニューロパシー、急性脳虚血後の再灌流、周産期低酸素虚血傷害、または任意のタイプの頭蓋内出血（限定されるわけではないが、硬膜外、硬膜下、クモ膜下または脳内出血）が含まれる。
【００６６】
いくつかの側面にしたがって、本明細書の開示のＩＤＰＳＣは、新規タイプの、本明細書において、「混合最大能力」と称する能力を示した。混合最大能力は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の多分化能特性（ＩＤＰＳＣの約９９％がＭＳＣマーカーを所持する）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の多能性特性（最大３０％）、神経上皮（ｎｅｕｒｏｐｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）幹細胞マーカー濃縮（９０％、ネスチン発現は細胞の９５％にある）、および他の方法によって得られるＤＰＳＣと対照的な比較的低いＳＴＲＯ発現の混合である。長期培養（ＬＰ）下で得られる単離ＩＤＰＳＣ集団のこうした混合最大能力組成物は、神経上皮分化に向かう再生特性の相乗効果を生じる。さらに、ＩＤＰＳＣ集団のこうした混合最大能力組成物は、高い拡張可能性および安全性（免疫適合性および腫瘍形成の低リスク）によって特徴付けられる。
【００６７】
本明細書に記載するのは、巨大な神経幹および血管を含有する、歯冠歯髄および歯根歯髄の中央領域に位置するニッチから単離された、ヒト未成熟歯髄幹細胞の混合集団の特徴的なパターンおよび特性である。より具体的には、この領域は、歯髄層の最も内部であると同定可能であり、これは細胞リッチゾーンであり、そして血管と密接に関連する線維芽細胞および未分化幹細胞を含有する。新規未成熟歯髄幹細胞表現型を記載し、そしてこれは、胚性、間葉系、角膜縁およびニューロン／神経上皮幹細胞の目印の発現によって特徴付けられる。ＩＤＰＳＣは、三胚葉である内胚葉、外胚葉および中胚葉の派生物を産生することも可能である。
【００６８】
発生中、および成体生物において、幹細胞は、幹細胞ニッチと呼ばれる、特殊な微小環境に見出されうる。ニッチは、特殊な解剖学的部位であり、幹細胞と相互作用する。幹細胞ニッチは分化を防止し、そしてこうしてその運命を制御すると仮定される。胚発生中、ニッチ因子が胚性幹細胞に対して作用して、増殖または分化を誘導する。これらの変化は、遺伝子改変および特異的タンパク質発現のために起こり、胎児の発生および全生物の形成を導く。ヒトの人生の出生後の期間中、特に小児期、幹細胞ニッチは、完全な発生に必要な特殊化細胞を連続して産生する。成体生物において、ニッチは、成体幹細胞を静止状態で維持する。幹細胞活性化は、組織傷害に反応して、周囲の微小環境が幹細胞にシグナルを送り、自己再生、増殖、および分化を促進して、損傷を受けた組織を回復する際に起こる。ニッチ内の幹細胞の振る舞いを制御する際には、いくつかの因子が関与する。第一に、幹細胞間の細胞−細胞相互作用、ならびに幹細胞および隣接する分化した細胞の間の相互作用、幹細胞および接着分子の間の相互作用、細胞外マトリックス構成要素、酸素圧、成長因子、サイトカイン、ならびにｐＨ、イオン強度（例えばＣａ２＋濃度）、およびＡＴＰのような代謝産物を含む環境の物理化学的性質もまた重要である。幹細胞およびニッチの間のこうした相互作用は、発生中に起こり、そして成人期の間、維持される。
【００６９】
成体生物において、骨髄の造血幹細胞は、骨内膜下（ｓｕｂｅｎｄｏｏｓｔｅａｌ）骨芽細胞、類洞内皮細胞および骨髄間質細胞、例えば線維芽細胞、単球および脂肪細胞で構成されるニッチを有する。腸内幹細胞ニッチは、上皮下線維芽細胞／筋線維芽細胞ネットワークによって構成され、腸内陰窩を取り巻く。こうした幹細胞ニッチはすべての成体組織中に見出されうる。ｉｎ  ｖｉｖｏの幹細胞ニッチに関する知識は、細胞培養ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件を発展させ、そして単離後の細胞幹細胞性を保持するのを補助するため、非常に関連する。異なる組織内のこうしたニッチの同定、ならびにその構成要素および機能の発見は、再生療法に必須である。この知識は、多様な構成要素に関する情報を提供し、これは、療法のために患者に再度導入する前に、十分な量の適切な細胞タイプを提供するため、フラスコ中またはプレート中で制御しなければならない、幹細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖、拡大および分化中の細胞増殖および分化に重要である。成体幹細胞は、成体の一生の間、未分化状態で維持される。しかし、これらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する際、これらはしばしば、形態が変化し、そして増殖能が減少する「加齢」プロセスを経る。成体幹細胞が、長期に渡って幹細胞性を維持可能であるように、成体幹細胞の正しい培養条件を改善することが必要である。
【００７０】
歯冠は歯冠歯髄を含有する。歯冠歯髄は、６つの表面：咬合面、近心面、遠位面、頬側面、舌面、および床面を有する。象牙質が連続して沈着するため、歯髄は年齢とともに小さくなる。これは、歯冠歯髄全体で均質ではなく、上部（ｒｏｏｆ）または側壁よりも床面でより迅速に進行する。歯冠および歯根歯髄の中央領域は、大きな神経幹および血管を含有する。この領域は、末梢で、特殊な象牙質生成領域によって裏打ちされ、この領域は３つの層（最も内部から最も外部）を有する。最も内部の歯髄層は、細胞リッチゾーンであり、血管と緊密に関連する、線維芽細胞および未分化間葉系幹細胞を含有する。
【００７１】
幹細胞ニッチの同定はまた、ヒト胚性幹細胞に類似のユニークな特性を持つ、成体幹細胞の均質な集団の単離を補助し、したがって、その単離にいかなる倫理的な考慮も伴わない。こうした成体幹細胞は、再生医学の有望な供給源であり、そしてこれらが単離のために遺伝子操作または前選択法の使用を必要としない正常な細胞であるため、最近記載される人工多能性幹細胞に比較した際に利点を有する。
【００７２】
１つの態様において、組成物は、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の単離集団を含み、ここで、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する。いくつかの態様において、ＩＤＰＳＣの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なく
とも９０％、または少なくとも９５％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する。
【００７３】
別の態様において、本発明は、ＩＤＰＳＣの単離集団を含む組成物を提供し、ここで、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ５３腫瘍抑制マーカーを発現する。いくつかの態様において、ＩＤＰＳＣの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がｐ５３腫瘍抑制マーカーを発現する。
【００７４】
１つの側面において、ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ１３およびＣＤ３１より選択されるマーカーを発現する。別の側面において、ＩＤＰＳＣの４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、ＣＤ１３およびＣＤ３１より選択されるマーカーを発現する。１つの態様において、ＩＤＰＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５マーカーに関して陰性である。
【００７５】
ＣＤ１３は、骨髄系譜に拘束される細胞の初期マーカーの１つであり、そして正常な造血および骨髄細胞機能には不要である。血管形成に重要な機能性の役割を果たし、そして血管形成の必須の制御因子と同定される。非造血細胞において、ＣＤ１３は、内皮細胞、上皮細胞、特定の腎領域、脳細胞、骨髄、破骨細胞に見られた。細胞外ペプチダーゼとして、ＣＤ１３は、小さいペプチドのＮ末端から単一の中性アミノ酸を切断するよう機能する。例えば、脳において、ＣＤ１３はオピオイドペプチドおよびエンケファリンを切断して、神経シグナル伝達を制御し、そして腸において、ペプチドを切断してアミノ酸吸収を促進する。ＣＤ３１はまた、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）としても知られる。
【００７６】
別の態様において、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、およびニューロトロフィン−５（ＮＴ５）より選択される神経栄養因子を産生する。あるいは、ＩＤＰＳＣの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択される神経栄養因子を産生する。
【００７７】
脳において特異的に発現され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経発生に影響を及ぼす成長因子には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が含まれる。ＢＤＮＦは、ＮＳＣ、ヒト上衣下細胞、およびニューロン前駆体のニューロンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化を促進し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで海馬（ｈｉｐｐｏｃａｒｎａｌ）幹細胞の神経突起アウトグロースを促進する、神経成長因子ファミリーのメンバーである。ＢＤＮＦおよびＥＧＦのチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンへの排他的分化が見られてきている。ＧＤＮＦは、ＴＧＦスーパーファミリーのメンバーである。初期神経形成において、ＧＤＮＦは、前側神経外胚葉において発現され、神経発生において、重要な役割を果たしうることが示唆される。ＧＤＮＦは、末梢神経および筋肉における運動ニューロンの生存を促進し、そして神経栄養および分化能を有する。
【００７８】
特定の側面において、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、ネスチンを発現する。他の側面において、ＩＤＰＳＣの２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満がＯｃｔ３／４を発現する。
【００７９】
１つの態様において、表現型的に均質な、単離ヒト出生後ＩＤＰＳＣの多系譜集団は：
（ａ）ＩＤＰＳＣの少なくとも８０％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｂ）ＩＤＰＳＣの２０％未満が、ＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｃ）集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ｐ５３、および１型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｄ）ＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｅ）ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ
の多機能分子プロファイルによって特徴付けられる。
【００８０】
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は、元来、ＨＬＡミスマッチドナーにおいて組織移植拒絶を生じる移植片対宿主病を仲介する、細胞表面抗原と定義された。テネシンは、胚性組織において、そして組織修復プロセス中に豊富である。
【００８１】
いくつかの態様において、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する。
【００８２】
他の態様において、ＩＤＰＳＣの２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が、ＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する。いくつかの側面において、ＩＤＰＳＣの２％〜３０％またはその中の任意の範囲（例えば５％〜３０％、１０％〜３０％、２％〜１０％、２％〜２０％）は、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される、少なくとも１つのマーカーを発現する。
【００８３】
別の側面において、組成物は、単離ヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含み、ここで、ヒト出生後ＩＤＰＳＣの前記集団は、低酸素条件下で、少なくとも１０の採取サイクルに渡って培養したＤＰからのアウトグロースとして得られる。
【００８４】
特定の態様において、酵素処理を伴わずに、ＬＰ  ＩＤＰＳＣを機械的にトランスファーする。これは、ＤＰを保持し、そしてＩＤＰＳＣの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする。
【００８５】
いくつかの態様において、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン
、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質と、ＩＤＰＳＣを培養する。ＥＣＭ基質はＭａｔｒｉｇｅｌであってもよい。
【００８６】
ＩＤＰＳＣは、少なくとも５回の採取サイクル、少なくとも１０回の採取サイクル、少なくとも１５回の採取サイクル、少なくとも２０回の採取サイクル、少なくとも２５回の採取サイクル、少なくとも３０回の採取サイクル、少なくとも３５回の採取サイクル、少なくとも４０回の採取サイクル、少なくとも４５回の採取サイクル、少なくとも５０回の採取サイクル、少なくとも５５回の採取サイクルまたは少なくとも６０回の採取サイクルで培養したＤＰからのアウトグロースとして単離可能である。
【００８７】
ＩＤＰＳＣは、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される歯由来の歯髄（ＤＰ）から単離可能である。
【００８８】
いくつかの側面にしたがって、本開示はまた、ＩＤＰＳＣの単離集団を産生する方法も提供する。この方法によって提供されるユニークな利点は、ＩＤＰＳＣの産生をスケールアップする能力、およびその結果のＩＤＰＳＣの臨床的有用性に関する。幹細胞を用いた中枢神経系（ＣＮＳ）臨床試験で用いられる細胞の公表される療法用量は、用量あたり、１０ｘ１０６〜１０ｘ１０９細胞の範囲である。
【００８９】
１つの態様において、ＩＤＰＳＣの５〜１０継代後に生成される細胞の平均数は、以下の通りである。
【００９０】
５ｘ１０５細胞から出発し、酵素消化した後、５継代後に、３ｘ１０８  ＩＤＰＳＣが産生され、そして１０継代の後、ＩＤＰＳＣの５ｘ１０９細胞が生じるであろう。１つの歯髄（ＤＰ）は、１５採取サイクル後（採取サイクルが約３日ごとに１回生じた場合、約１．５ヶ月）、酵素処理を伴って培養したＥＰ  ＩＤＰＳＣを用いて、５回目の継代で５ｘ１０１２  ＩＤＰＳＣを生じるであろう。ＬＰ  ＩＤＰＳＣおよび酵素処理を伴わない機械的トランスファーを用いると、１５回の採取サイクル後、５回目の継代で約３ｘ１０１３  ＩＤＰＳＣが生じるであろう。ＬＰ  ＩＤＰＳＣおよび酵素処理を伴わない機械的トランスファーを用いると、３０回の採取サイクル後、さらに３ｘ１０１３  ＩＤＰＳＣが生じ、そして５０回の採取サイクル後、さらに５ｘ１０１３  ＩＤＰＳＣが生じるであろう。
【００９１】
該方法のさらなる利点は、外植片培養によってＤＰから単離される細胞の増殖率が一定に維持され、そして通常、各３〜４日間で４倍になることである。酵素処理を用いてＤＰから単離される細胞の増殖率は、通常、各３〜４日間で３倍である。
【００９２】
１つの態様において、本開示は：
（ａ）歯からＤＰを摘出し；
（ｂ）無菌容器中にＤＰを入れ、そして抗生物質を含む無菌溶液でＤＰを洗浄し；
（ｃ）場合によって、抗生物質を含む無菌溶液を取り除き、そしてＤＰを基本培地中で細かく刻み；
（ｄ）ＤＰを、培地を含む別の容器内に、機械的にトランスファーし；
（ｅ）ＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着が観察されるまでＤＰを培養し；そして
（ｆ）ＤＰ内の多数ニッチからＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着を可能にするように、少なくとも５回、工程（ｄ）および（ｅ）を反復する
工程を含むＩＤＰＳＣの単離集団を産生する方法を提供する。
【００９３】
ＤＰの培養は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも
４日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間または少なくとも１５日間続けてもよい。工程（ｄ）および（ｅ）を少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、少なくとも４５回、少なくとも５０回、少なくとも５５回または少なくとも６０回反復してもよい。
【００９４】
ＤＰ外植片を、培地を含む別の容器内に機械的にトランスファーする前に、ＤＰを凍結保存し、そして融解してもよい。いくつかの側面において、コロニー形成能は、凍結保存前および後の両方で保持される。凍結保存の前および／または後のコロニー形成能の効率は、７５％より大きく、８０％より大きく、８５％より大きく、９０％より大きく、９５％より大きく、９６％より大きく、９７％より大きく、９８％より大きく、または９９％より大きい。
【００９５】
本開示の方法は、プロテアーゼ処理を伴いまたは伴わず、ＩＤＰＳＣの継代培養への継代を含むことも可能である。継代培養を最大１０回、最大９回、最大８回、最大７回、最大６回、最大５回、最大４回、最大３回、最大２回、または最大１回、反復してもよい。
【００９６】
いくつかの態様において、約３日間のＤＰの培養は、少なくとも１ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも２ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも３ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも４ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも５ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも６ｘ１０５
ＩＤＰＳＣ、少なくとも７ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも８ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも９ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、または少なくとも１ｘ１０６  ＩＤＰＳＣの単離集団を生じる。
【００９７】
特定の側面において、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＭＥＭ−アルファ培地である。培地に約５％〜約２０％のウシ胎児血清、約１％の非必須アミノ酸、約１％のＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミン代替物、および約１％の抗生物質を補充してもよい。
【００９８】
本開示の側面はまた、本明細書に開示する方法いずれかによって生成されるＩＤＰＳＣの単離集団も含む。
【００９９】
いくつかの態様において、開示する方法の幹細胞は、歯髄幹細胞である。歯髄幹細胞は、歯の象牙質内部の歯髄組織中に存在し、そして歯髄、象牙質等に分化することが可能である（主に象牙芽細胞に分化可能）、体性幹細胞の一種である。（ｉ）歯科矯正治療において便宜上、摘出された歯から、または歯周疾患等のため摘出された歯から、あるいは（ｉｉ）歯科矯正治療において、便宜上、または智歯歯周炎等の治療で摘出された智歯（第三大臼歯としても知られる）から、歯髄組織を摘出することによって、歯髄幹細胞を得ることも可能である。
【０１００】
歯髄組織を保持する任意の歯を、歯髄幹細胞の供給源として用いることも可能であるが、高い増殖能を持つ歯髄幹細胞が豊富な歯を選択することが好ましい。
【０１０１】
歯髄幹細胞の１つの適切な供給源は、歯科矯正の目的のために摘出される智歯を有する若者（例えばヒトにおいて、約１２〜１６歳）の智歯に由来する歯髄組織である。これらの年齢の智歯はなお、歯科分化の最初の段階中の歯根形成のただ中にあり、そして高い存在量の歯髄組織、比較的高密度の歯髄幹細胞、およびこれらの増殖の非常に高い潜在能力によって特徴付けられる。
【０１０２】
智歯は、ときに、他の年齢群で歯科矯正目的のために摘出されるため、そしてまた、歯髄組織は、便宜上、摘出される智歯以外の歯からも得られうるため、これらの摘出歯の利
用可能性は高い。
【０１０３】
歯髄幹細胞の他の潜在的な供給源には、歯周病の治療のために摘出される歯、智歯歯周炎のために摘出される歯等が含まれる。この場合、混入のリスクが増加し、そして得られる歯髄組織の量がより少ないという不都合な点がある。しかし、成人（特に高齢者）から、これらの歯を得るのが容易であるため、これらの細胞から分化させる細胞または組織の自家移植が望ましい場合、これらの材料は、歯髄幹細胞の主要供給源として働きうる。
【０１０４】
本発明で使用可能な歯髄幹細胞は、哺乳動物を含む、任意の動物種に由来してもよい。歯髄幹細胞は任意の動物種から収集可能であるが、得た幹細胞をヒト再生医薬のために用いる場合は、移植拒絶が存在しないため、患者から、または同じタイプのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を共有する別のヒトから、歯髄幹細胞を収集することが特に好ましい。幹細胞をヒトに投与（すなわち移植）せず、例えば患者の薬剤感受性および不都合な薬剤反応の存在または非存在を決定するスクリーニングのための細胞供給源として用いる場合、患者から、または薬剤感受性および不都合な薬剤反応に相関する、同じ遺伝子多型を共有する別のヒトから、歯髄幹細胞を収集しなければならない。
【０１０５】
歯科組織からＭＳＣ／周皮細胞を単離し、そして乳歯および他の歯科供給源から幹細胞を保持するためのこの新規および革新的アプローチの潜在能力を活用するため、多様な企業が歯のバンキングを設定している。米国において、ＳｔｅｍＳａｖｅ、ＢｉｏＥｄｅｎおよびＳｔｏｒｅ−Ａ−Ｔｏｏｔｈが歯の幹細胞バンキングに関与する企業である。日本において、最初の歯のバンクが広島大学および名古屋大学に設立された。
【０１０６】
本明細書に記載する本開示の側面は、歯胚（歯胚は、歯の前駆体である原始的胚細胞である）、乳歯、第三大臼歯および永久歯の初代歯髄から得られる、ユニークで、そして以前単離されなかったヒト成体幹細胞の混合集団を誘導するための方法に関する（Ｌｉｚｉｅｒら（２０１２）ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  ７：ｅ３９８８５を参照されたい）。
【０１０７】
前記の混合集団は、ＭＳＣ／周皮細胞／神経上皮／内胚葉、外胚葉および中胚葉胚性胚葉に分化可能な多能性幹細胞を含む。
【０１０８】
より具体的には、前記混合集団は、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＦ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ１、２、９、シンデカン１、２、３、４、ｐ５３、１型コラーゲンによって特徴付けられる少なくとも９６％〜９９％の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ならびに５２％のＣＤ１３とともにＣＤ４５−、ＣＤ３４−およびＨＬＡ  ＡＢＣ（低）、ＨＬＡ  ＤＲ−発現シグニチャーで構成される。前記バイオマーカーが定義する細胞シグニチャー・フィンガープリントは、古典的な多分化能細胞タイプ特性を持つＭＳＣの典型である。
【０１０９】
さらに、前記混合集団は、ＳＴＲＯ−１によって特徴付けられる少なくとも２４％、ならびに少なくとも３６％のＣＤ１４６（ＭＵＣ１８）発現シグニチャーによって特徴付けられるＭＳＣ／周皮細胞を含む。前記バイオマーカーに定義される細胞シグニチャー・フィンガープリントは、血管周囲ニッチ由来多能性細胞タイプ特性を持つＭＳＣの典型である。
【０１１０】
さらに、前記混合集団は、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４発現シグニチャーによって特徴付けられる少なくとも２％〜３０％のＭＳＣ／多能性幹細胞を含む。前記バイオマーカーに定義される細胞シグニ
チャー・フィンガープリントは、多能性細胞タイプ特性の典型である。
【０１１１】
予期せぬことに、前記混合集団は、少なくとも９５％のネスチン、少なくとも８５％のｐ７５（神経成長因子受容体、ＣＤ２７１／ｐ７５（ＮＴＲ）は、間葉系幹細胞が、骨形成性、脂肪形成性、軟骨形成性、および筋肉形成性系譜に分化することを阻害する）、ＡＢＣＧ２（ＡＢＣＧ２は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体のメンバーであり、幹細胞増殖を促進し、そして幹細胞表現型を維持する際に重要な役割を果たす）、ｐ６３（ｐ６３は、重層上皮中の幹細胞の増殖潜在能力に必須；角強膜角膜縁においてｐ６３およびＡＢＣＧ２発現：幹細胞精製に関与）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、５、少なくとも２０％のβ−チューブリンＩＩＩ（弱）、コネキシン４３およびサイトケラチン−Ｋ１２発現シグニチャーのＭＳＣ／神経上皮幹細胞を含む。前記のバイオマーカーが定義する細胞集団シグニチャー・フィンガープリントを有する混合集団ＩＤＰＳＣの濃縮は、ユニークであり、そして予期されなかった。この細胞集団は、有望で多大な研究および療法適用を保持する。
【０１１２】
したがって、これらの態様の側面にしたがって、ＭＳＣ／神経上皮バイオマーカー、好ましくは多様な神経保護因子、例えばｐ７５およびｐ６３、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４／５によって特徴付けられる濃縮幹細胞を含むＩＤＰＳＣ細胞集団を提供する。
【０１１３】
さらなる態様は、多数回の採取サイクルを通じて、歯科ＤＰ外植片のｅｘ  ｖｉｖｏでの長期培養からＩＤＰＳＣを連続して誘導する方法に関する。
【０１１４】
前記方法は、予期されない、そしてほぼ限定されない数の採取／誘導サイクルを可能にし、そしてしたがって、先に報告される方法と同様の数の細胞を得るために、ＩＤＰＳＣの継代数を減少させることも可能である。
【０１１５】
前記の開示する方法は、実行が容易であり、そして歯髄の酵素的消化を用いてＩＤＰＳＣを誘導するための伝統的な方法で生じる、幹細胞における多数回継代中に生じうる、自発的ゲノム突然変異および最終的な核型異常の可能性を減少させる。
【０１１６】
さらに、本開示の側面は、前記細胞およびこれらの細胞を含有する濃縮物から実現される分化のためのプロセス、ならびに前記プロセスから得られる分化した細胞およびこれらの細胞を含有する濃縮物を指す。
【０１１７】
ＭＳＣ／周皮細胞表現型を提示する幹細胞の数は、歯科組織由来のＭＳＣの異なる集団で多様であり、そしてこれは個体の変動を提示する。したがって、多数のバッチを得るために単一ドナーから培養すると有意な利点があり、これには減少した可変性、一貫性および再現可能性を含まれる。
【０１１８】
例として、前記方法を用いて、保存するかまたは保持し、そして必要に応じて使用することも可能な、少なくとも１つの乳歯または場合によって４つの上の歯および４つの下の「乳」歯から得られうる、単一ドナーのＤＰから得られる、療法的に十分な量の低継代ＩＤＰＳＣを得ることが可能である。
【０１１９】
周皮細胞を血管周囲ニッチから単離することは一般的に認められ；このニッチはまた、歯髄中にも見出されてきている（ＳｈｉおよびＧｒｏｎｔｈｏｓ、２００２）。本明細書において驚くべき知見は、非血管周囲ニッチおよび血管周囲ニッチの両方からＩＤＰＳＣが誘導されることである。非血管周囲から得られる神経上皮マーカーが濃縮されたＩＤＰ
ＣＳは、本明細書において初めて、長期培養法を用いて得られる。
【０１２０】
さらなる態様は、血管周囲幹細胞ニッチからＩＤＰＳＣを誘導するための低酸素条件下で、ＤＰ外植片を長期培養する方法に関する。
【０１２１】
さらなる態様は、非血管周囲幹細胞ニッチからＩＤＰＳＣを誘導するための栄養供給減少条件下で、ＤＰ外植片を長期培養する方法に関する。
【０１２２】
やはり本明細書に開示するのは、長期培養中に１０％から＜２％に減少しうる、Ｏｃｔ３／４発現の核局在によって立証されるような、多能性能力を持つ細胞集団である。
【０１２３】
凍結保存のための、または患者において使用するための幹細胞を増殖させる際、ＦＤＡは、これらの細胞を１５継代より長く継代しないように推奨している。
【０１２４】
これは、高い継代数に関連する核型突然変異および腫瘍原性のリスクを低下させ、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ分化可塑性を減少させるためである。したがって、凍結保存後、必要な方法に応じて、臨床投与前に、２〜５のさらなる継代を拡大可能である。継代数のこの限界は、臨床適用のために収集可能な幹細胞の数を限定する。
【０１２５】
さらなる態様は、臨床的に十分な数のＩＤＰＳＣが低い継代数で得られうる方法に関する。
【０１２６】
さらなる態様において、単一ドナー外植片を最長６ヶ月またはそれより長く培養中で生体保存して、生存、単一クローン性コロニーが形成されるまで、３日間、Ｐ０のＩＤＰＳＣを誘導することが好ましい。前記外植片を次いで、次の連続採取誘導サイクルのために置き換えて、こうした連続培養は、１ヶ月あたり１０サイクルで少なくとも５ヶ月、Ｐ０の総数５０トランスファーおよび誘導サイクルを導くことも可能である。各トランスファーおよび誘導サイクルから、ＩＤＰＳＣを増殖させ、そして凍結保存または使用の前に最大５回継代する。
【０１２７】
上述のように、本明細書に提示する開示の側面は、部分的に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）が、歯に存在する幹細胞ニッチから単離可能であるという驚くべき発見に基づく。これらのニッチは、乳歯由来の歯髄に見られうるが、ユニークではない。さらなるニッチが細胞不含ゾーンの神経ネットワーク、細胞リッチゾーンの最も内部の歯髄層、および細胞不含ゾーン中、象牙芽細胞を含有する最も外側の層に位置することが見出されてきている（図１および２を参照されたい）。これらのニッチの存在は、歯科幹細胞（ＤＳＣ）の神経冠起源と一致し、そしてＩＤＰＳＣにおける神経上皮および間葉系幹細胞の混合集団の単離と一致する。
【０１２８】
再生医薬のために単離ＩＤＰＳＣを用いる重要な利点は、これらが腫瘍原性のより少ないリスクを提示するという事実である。本発明者らは、ＩＤＰＳＣ単離、操作、および凍結保存の新規戦略を開発し、これはこれらの細胞の、限定されない数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代での長期培養を導く。この戦略を用いて、早期継代（５またはそれ未満）の実質的に限定されない数のＩＤＰＳＣが産生可能である。Ｌｉｚｉｅｒら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３９８８５を参照されたい。
【０１２９】
脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を産生するアフィニティを有することが示されてきている。ＡＳＣのこのアフィニティは、血管周囲ニッチからの単離と相関するようである（Ｚｈａｎｇら、２０１０）。ＩＤＰＳＣは、歯髄の異なるニッチから単離可能であり、したがって、腫瘍形成のリスクは最小限である。Ｌｉｚｉｅｒら（２
０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３９８８５。本開示において、本発明者らは、乳歯由来のＤＳＣの新規系譜（ｈＩＤＰＳＣ）が、歯髄における異なる（非血管周囲）特徴的なニッチから、あるいはＤＰ外植片の虚血／血管栄養／酸素枯渇内部組織から、単離可能であり、したがって、推定上、腫瘍形成リスクを最小限にすることを開示する。
【０１３０】
いくつかの態様のＩＤＰＳＣ組成物を、薬学的に有効な量で投与する。本明細書において、句「薬学的に有効な量」は、疾患、状態、または障害を治療するために十分な量を指す。疾患の重症度；患者の年齢、体重、健康状態、および性別；患者における薬剤感受性；投与時間、経路および放出速度；治療期間；またはいくつかの態様の組成物とともに、ブレンドしてもしくは同時に用いる薬剤を含む要素、あるいは医学分野に周知の他の要素にしたがって、有効投薬量のレベルを決定することも可能である。例えば、ＩＤＰＳＣの投薬量は広い範囲内で多様であり、そして特定の場合で、個体の必要にしたがって決定される。一般的に、非経口投与の場合、ＩＤＰＳＣは、通常、約１ｘ１０６、約１ｘ１０７、約１ｘ１０８、約１ｘ１０９、または約１ｘ１０１０細胞／個体のｋｇ体重の量で投与される。さらに、いくつかの態様の組成物および当該技術分野に知られる他の疾患治療物質の組成物を、個体に同時にまたは連続して投与してもよい。
【０１３１】
いくつかの態様のＩＤＰＳＣ組成物を局所的または全身性に投与してもよく、こうした組成物は、局所効果（例えば細胞増殖／細胞死、組織完全性および機能性に影響を及ぼす、変性組織と接触したＩＤＰＳＣの直接再生効果）を誘導するため、および／または全身性の影響により（例えば、防御性栄養因子を放出し、そして炎症促進性サイトカインレベルを減少させることによって）、療法活性を得るために、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ操作を必要とする可能性もある。
【０１３２】
変性、生殖、臨床性または審美的損傷を治療し、そして／または被験体、組織、細胞の将来の損傷を防止する、既知の医学的方法から、ＩＤＰＳＣ投与経路を選択する。ＩＤＰＳＣ治療は、本明細書において、状態の進行を抑止するか、実質的に阻害するか、遅延させるかまたは逆転させるか、状態の臨床的または審美的症状を実質的に寛解させるか、あるいは状態の臨床的または審美的症状の外見を実質的に防止するかまたは減少させることを含む。別の側面にしたがって、変性臨床的または審美的損傷、または組織、細胞機能の喪失から被験体を保護し、あるいは本明細書に記載する実施例には限定されないが、本明細書に言及する任意の疾患の存在する症状および／または将来の症状の軽減のための、別の療法細胞または別の薬剤と組み合わせた、ＩＤＰＳＣ組成物の使用を提供する。
【０１３３】
いくつかの態様において、「ロバストな長期培養系によって得られる多機能未成熟歯髄幹細胞」と題され、そして米国第６１／７９１，５９４号を有する、本発明者らが同時出願した仮特許出願に記載するような方法および／または治療のいずれかと一致して、組成物の投与が行われ、該出願の内容はその全体が本明細書に援用される。より具体的には、本開示の側面は、ＤＰの長期培養における組織外植片培養および機械的（非酵素的）トランスファーに基づく、異常な遺伝的および生物学的変化を伴わずに、患者自身のＤＴＳＣを臨床的に十分な数で得るための方法に関する。
【０１３４】
１つの態様にしたがって、ＤＰは、機械的トランスファー後に数ヶ月間、培養中で維持される。以下の特性を評価した：ＤＰ摘出直後（初期集団、ＥＰ）および多数回のＤＰトランスファー後（後期集団、ＬＰ）のＩＤＰＳＣの形態、特定のＭＳＣ表現型およびＥＳ細胞タンパク質および遺伝子の発現、核型、増殖速度、ならびに分化能。これらのパラメータのうちいくつかを凍結保存後に、そして３つの別個の培地中で培養したＩＤＰＳＣで、評価した。プレーティング直後、およびＤＰ培養３日後のＤＰにおいて取り込まれるＢｒｄＵに対する抗体を用いると、外植片培養による、ＩＤＰＳＣ生成の機構に関する洞察が得られた。さらに、ＤＰにおけるＳＣを区別するため、ネスチン、ビメンチン、Ｏｃｔ
３／４およびＳＴＲＯ−１に対する免疫組織化学染色を行った。
【０１３５】
やはり本明細書に開示するのは、典型的なＭＳＣの純粋な集団を得る方法であり、該集団はまた、神経冠幹細胞（ＮＣＳＣ）および神経上皮幹細胞に関してほぼ純粋である。この集団の一部（約２４％を超えない）を、ＳＨＥＤとして提示し、そして別の部分をＭＳＣ＋ＮＣＳＣ＋多能性幹細胞によって提示する。フローサイトメトリーおよび磁気ビーズなどの方法では、これらの集団を分離することは不可能である。
【０１３６】
別の態様は、ＬＰ法にしたがって、よりロバストなアプローチによって、そして伝統的なＤＰ酵素解離技術またはＥＰ  ＤＰアウトグロース法を用いるよりも多い細胞数で、ＳＨＥＤ細胞を分離する可能性を提供する。
【０１３７】
顕著なことに、神経上皮集団の濃縮は、採取サイクル後、進行性に、これらのマーカーで濃縮される。
【０１３８】
ＤＰはまた、こうした細胞を得る代替法として、いくつかの機械的処理、例えば穿孔またはミンチ処理などのいくつかの機械的処理を克服することも可能である。通常、最初の細胞は、ＤＰプレーティングの約１週間後にアウトグロースして現れ；神経叢から、細胞が後に遊走し、これは血管よりもＤＰ内のより深部にあるためであると仮定される。一方、やはりこれらの細胞を産生可能である象牙質細胞下ニッチは、末梢に位置し、そして酵素処理はこれを破壊可能である。ＤＰミンチ処理のような機械的治療は、歯髄が巨大である場合には、特に有用である。
【０１３９】
さらに、「ストレス」／低酸素細胞培養条件を誘導して、外部細胞培地配合構成要素またはガス平衡によって神経上皮マーカーを誘導することも可能である。例えば、多能性幹細胞マーカー発現を低酸素によって誘導することも可能である。
【０１４０】
さらなる態様は、血管周囲および非血管周囲起源の多数のニッチから得られるＤＰＳＣの新規系譜を産生する、開示する方法の使用に関する。培養延長／低酸素条件中、内部ＤＰニッチに対する栄養分および酸素の枯渇のため、非血管周囲起源からの誘導が誘導され、そしてしたがって、内部ニッチ細胞は表面へと遊走する。こうした細胞は、ＯＣＴ４の核発現、ならびに外胚葉／ＮＰＣマーカー、例えばネスチン、ｐ７５、ｐ６３およびその他のロバストな発現によって特徴付けられる。
【０１４１】
いくつかの側面にしたがって、変性損傷または疾患あるいは審美的症状の減少を生じるために十分な療法的有効量の本開示のＩＤＰＳＣ組成物を、局所（皮膚、および眼内）、限局、経粘膜（頬側、舌下を含む）、非経口／全身性（皮下、皮内、筋内、静脈内、および動脈内）を含む多様な投与経路を通じて投与することも可能であり、そして好ましくは非経口投与を通じる。
【０１４２】
未分化の、または特殊な分化を経るよう誘導されたＩＤＰＳＣ（前駆細胞）を、変性疾患を有する被験体に投与してもよく、例えば、疾患部位／腔／環境内に直接注入し、体の別の場所に移植してもよいし、あるいは足場または送達ビヒクルに接着させて、そして体の許容されうる位置に、外科的に挿入／移植／グラフト処理してもよい。ｈＩＤＰＳＣは、免疫原性でなく、そして大部分の場合、免疫抑制プロトコルの使用を必要としないが、いくつかの免疫過剰反応性または感受性症例において、免疫調節が必要である可能性があるか、または免疫マッチしたドナーが優先的に用いられる。年齢、外傷、好ましくは（神経）変性疾患の結果として得られるものを含めて、任意の方式で得られた、異常なまたは変性症状を有する被験体に、ＩＤＰＳＣを投与してもよい。本発明者らは、ＩＤＰＳＣが、他の病気の中でも神経学的疾患を治療するために非常に有効であることを見出してきて
いる。
【０１４３】
被験体において、変性障害、限定されるわけではないが、例えば神経変性障害、生殖障害、外胚葉性、または糖尿病などを治療するため、分化したまたは分化していないＩＤＰＳＣの療法的有効量を投与することによって、ＩＤＰＳＣを被験体に局所的にまたは全身性に導入してもよい。
【０１４４】
米国特許出願第２００３／０２１９８９８号、２００３／０１４８５１３は、神経変性条件の異なる療法的治療のための幹細胞の移植を解説する。ＩＤＰＳＣは、好ましくは、外科的方法または注入を通じて、クモ膜下腔内、または脳室内を通じて投与される。米国特許第５，７６２，９２６号；第５，６５０，１４８号；第５，０８２，６７０号は、中枢神経系内、または心室腔内、または宿主脳の表面上に硬膜下的な（すなわち実質外移植）、細胞移植を伴う神経移植またはグラフティングの方法を解説する。さらなる脳内送達法には、注入によって達成される、実質内移植が含まれる。多数回の注射が、この方法で用いられうる。多数の移植片は、細胞タイプの混合からなり、そして／または、細胞内に挿入される導入遺伝子を組み合わせることも可能である。脊髄グラフティングには、腔内への移植が好ましい可能性もある。脳内に移植される細胞をグラフティングするには、腔の吸引またはクリーニング、あるいは病変の充填等が必要であろう。最も好ましい非経口投与は、クモ膜下腔内投与である。糖尿病を治療するため、未分化またはベータ様細胞に分化したＩＤＰＳＣを、注射、皮下注射、腹腔内注射、腎臓被膜下の注射、門脈を通じた注射、および脾臓内への注射、あるいは肝臓の門脈を通じた腎臓被膜下への移植、または脾臓内への移植によって投与してもよい。送達ビヒクル／足場または被包技術を用いて、ＩＤＰＳＣを移植してもよい。
【０１４５】
いくつかの態様のＩＤＰＳＣ組成物を、局所（頬側、舌下、皮膚、および眼内）、非経口（皮下、皮内、筋内、静脈内、および動脈内を含む）、および経皮投与を通じて投与可能であり、そして好ましくは非経口投与を通じる。最も好ましい非経口投与は、クモ膜下腔内投与である。本発明者らは、ＩＤＰＳＣが、他の病気の中でも、神経学的疾患を治療するために、非常に有効であることを見出してきている。
【０１４６】
毛再生および回復
毛包は、成長する際、３つの相：成長相（成長期）、後退相（退行期）、および休止相（休止期）を通過する。毛成長は連続したプロセスであり、生物の生涯を通じて続く。したがって毛包は幹細胞ニッチを有しているはずであり、これは常に活性であり、そして特に、毛包再生時に活性である。現在の知識によれば、神経冠から生じる毛包幹細胞は、皮脂腺の近くの毛包の膨らんだ領域に常在する。これらの細胞は、未分化状態でネスチンを発現し、これは神経および毛包幹細胞のマーカーである。毛包の膨らんだ領域に見られるこうしたネスチン発現幹細胞は、成長期中に、毛包の外部および内部経路外筒を形成することになっていた。これらの幹細胞は、毛包を産生可能であるだけでなく、表皮中の創傷を再生するかまたは少なくとも治癒させることが可能であることが示されてきている。さらに、毛包幹細胞は、ニューロンに変換可能である。これらはニューロスフェアを形成し、これが次に、ニューロン、グリア細胞、角化細胞、平滑筋細胞、および他の細胞タイプを形成した。毛包幹細胞をマウスに皮下注射すると、これらはニューロンを形成した。マウスに移植した後、毛包の膨らんだ領域において、これらは血管を生じさせ、毛包幹細胞が内皮細胞を形成する潜在能力を有することが示された。毛包幹細胞はまた、神経再生および神経機能回復の速度を非常に増進させることも可能である。これらの結果は、毛包幹細胞の多能性、および再生医学におけるその潜在的な使用を示す。これらの幹細胞は、胚性および成体幹細胞のいくつかの利点を組み合わせる特性を有する。胚性幹細胞と同様に、これらは高い度合いの可塑性を有し、高レベルの純度で単離可能であり、そして培養中で拡大可能である。
【０１４７】
ヒト未成熟歯髄幹細胞もまた、神経冠から生じる。胚性幹細胞および毛包幹細胞で、ネスチンおよび他の胚性幹細胞マーカーを発現する、類似の特性を共有することが示されてきている。これらは、ニューロスフェアを形成し、そしてニューロン、グリア細胞、上皮、角化細胞、平滑筋細胞、および他の細胞タイプを形成可能であり、高い度合いの可塑性を提示する。これらはまた、歯冠および歯根歯髄の中央領域から、特に最も内部の歯髄層の未分化幹細胞リッチゾーンとして同定可能である領域から、豊富な量で単離可能であり、高レベルの純度を提示し、そして培養中で容易に拡大可能である。これらのヒト未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を発生中の胚内に再導入すると、キメラ胎児が形成され、そして異なる組織および臓器への寄与が示され、特に上皮への高密度の生着がある。驚くべきことに、ＬＰ培養ＩＤＰＳＣは凍結保存後もまた、その幹細胞性を維持する。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現しているＩＤＰＳＣをマウス皮下に移植した後、これらは毛包に集合し、そしていくつかのＧＦＰを発現する糸状の毛を生じた。
【０１４８】
これらの細胞は、容易にアクセス可能であり、そして胚性幹細胞の議論または医学的問題を伴わずに、禿頭の場合の療法の供給源として、患者自身の歯を用いることにつながりうる。これらの知見に基づいて、ＩＤＰＳＣはまた、パーキンソン病、多発性硬化症、ヒルシュスプルング病、脳卒中、末梢ニューロパシーおよびＡＬＳを治療するために有用でありうる。心臓の特定の欠陥、および骨の欠陥（変性、頭蓋顔面誕生時欠陥）もまた、神経冠幹細胞置換療法を通じて治療可能である。これらをまた、幹細胞マーカーを失わずに、数百万の細胞に培養中で拡大することも可能である。
【０１４９】
ＩＤＰＳＣは、選択される幹細胞となり、将来、再生医学のため、上皮神経冠幹細胞の他の供給源を置換することも可能であり、それは、（１）これらが本質的に誰からでも容易に入手可能であり、（２）これらが容易に培養され、そして拡大され、（３）これらが非常に多能性であり、（５）これらが、胚性幹細胞および胎児幹細胞が持つ倫理的な問題を持たず、（６）これらが奇形腫を産生せず、（７）これらが免疫適合性であるためである。
【０１５０】
皮膚再生
幹細胞に基づく療法は、傷害および疾患後の皮膚再生に新たな道を開く。皮膚にはいくつかの機能性幹細胞ニッチがあり、これらは集合的に、物理的および化学的微小環境の合図の原因であることが知られており、これらが、すべての層のヒト皮膚再生潜在能力を可能にする。前臨床研究によって、傷害部位に局所送達された後、幹細胞によって分泌されるパラクリン因子が、慢性創傷治癒を改善可能であり、そしてこれが幹細胞が修復を増進可能な主要な機構であることが立証されてきている。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来の馴化培地でさえ、宿主細胞の活性化を通じて創傷治癒を促進することが示されてきている。
【０１５１】
ＩＤＰＳＣは、すでにいくつかのマーカーを発現しており、これらは、皮膚幹細胞ニッチと関連する。したがって、膨らみ由来の上皮幹細胞およびＩＤＰＳＣは、共通の特徴を有し、これには、サイトケラチン、インテグリンおよびｐ６３の発現が含まれる。一方、最近の研究によって、毛包の毛乳頭内の細胞集団は成体幹細胞として機能しうる。この皮膚幹細胞ニッチは、前駆細胞のユニークな集団を含有し、ＩＤＰＳＣによってもまた発現される転写因子ＳＯＸ２を発現する。したがって、ＩＤＰＳＣに基づく療法は、火傷および他の皮膚変性障害を含む創傷治癒を克服する際に将来有望である可能性がある。ＩＤＰＳＣの再生（自己再生および分化可塑性）およびパラクリン（防御因子放出）の効果は、皮膚リモデリング進行を促進しうる。適切な微小環境の生成は、幹細胞が生存し、そして皮膚組織の再生および修復に関与するための重要な課題である。組織再生の成功は、最適な局所血管形成および細胞外マトリックス内への移植物の組み込み成功および抗瘢痕形成効果に応じる。
【０１５２】
１つの態様において、ＩＤＰＳＣを用いて、創傷治癒および皮膚リモデリング課題、例えば以下のようなものを克服する：
１．  創傷治癒、例えば糖尿病から生じる難治性皮膚潰瘍、虚血およびコラーゲン疾患は、ほとんど解決策がない重大な問題に相当する。
【０１５３】
２．  火傷創傷は、非常に困難な課題であり、火傷傷害は、世界的に、罹患率および死亡率の重要な原因であると報告されてきている。
【０１５４】
３．  皮膚の堅固さを改善し、しわを減少させ、ならびに加齢プロセスが加齢組織を生じさせるのを遅延させて、若い皮膚に似た外見、成長および分化を有する、バイオ皮膚美容（ｂｉｏ−ｄｅｒｍｏｃｏｓｍｅｔｉｃ）療法。
【０１５５】
本明細書に開示するのは、これらの細胞の血管への生着が、組織リモデリングプロセスに必須である新規血管形成を支持可能であることを示唆する驚くべき結果である。さらに、コラーゲン再生は、創傷を受けた、または／および加齢した皮膚の完全性の喪失の潜在的な治療を示す。免疫学的反応が欠如していることから、免疫学的障害（例えば白斑）の治療への、または皮膚火傷患者へのＩＤＰＳＣ使用が示唆される。
【０１５６】
１つの態様において、開示するＩＤＰＳＣ療法を、細胞移植として適用することも可能であるし、あるいは自己または同種ＩＤＰＳＣの局所送達または全身注入を通じて不全組織の生存または機能を回復することも可能である。
【０１５７】
精子形成
繁殖性マウス由来の精原幹細胞を不妊レシピエントマウスの精巣に移植すると、ドナー由来精子形成が生じ、そしてまた、ドナーから子孫レシピエント動物への遺伝物質の伝達が生じることが示されてきている。生殖細胞移植は、雄性生殖細胞発生系の生物学を研究するバイオアッセイを提供し、精子形成における欠陥を調べ、そして雄性不妊を治療する、精原幹細胞の単離および培養の系を発展させる。生殖細胞の移植は、齧歯類において最も広く研究されているが、より大きな哺乳動物に適用された。ブタ、ヤギおよびウシを含む家畜動物、ならびに霊長類において、精巣中の超音波カニューレ挿入によって導かれ、生殖細胞をレシピエント精巣内に移植可能である。生殖細胞移植は、関連のない種（ブタおよびヤギ）間で成功し、そして免疫抑制プロトコルを用いる必要がない一方、齧歯類における移植は、同系または免疫適合性パートナーである動物を使用する必要がある。
【０１５８】
しかし、ＳＳＣはマウスにおいてより徹底的に性質決定されており、そしてヒトＳＳＣの生物学は未知であり、その研究に利用可能な方法はない。組織起源にかかわらず、ヒトが関与する移植および操作の実験は倫理的に問題が多いため、ヒト幹細胞の性質決定は、困難である。
【０１５９】
この意味で、ヒト幹細胞の移植における実験動物の使用が、これらの細胞の生物学を研究する現実的な代替法として用いられている。例えば、ヒト骨髄由来の造血細胞の免疫不全マウスにおける異種移植が実行され、そしてＨＳＣヒト起源のマーカーの同定、ならびにＨＳＣによるヒト遺伝子トランスファーの効率の同定に用いられた。実験動物を用いた異種移植は、幹細胞の生物学および幹細胞臨床適用の発展を理解するための強力なアプローチであり、ヒトにおける実験に関連する倫理的懸念を最小限にする。
【０１６０】
近年、ヒト生殖細胞をマウス精巣内に移植する試みが報告されてきている。結果は、ヒト生殖細胞がマウス精巣中でまったく生存しないことを示し、これらの細胞がおそらく、ヒト生殖細胞および動物精巣環境間の不適合、または免疫学的拒絶のために死ぬことを示
唆した。対照的に、以前の研究は、霊長類（ヒヒ（ｂａｂｏｏｎ））の生殖系列幹細胞が、少なくとも６ヶ月間、免疫不全マウスの精巣で、コロニー形成可能であることを立証してきている。これらの細胞は、精子形成によってのみ分化したが、この結果は、霊長類の幹細胞がマウスの精巣において生存するだけでなく、増殖可能であることも示した。
【０１６１】
哺乳動物の出生後の期間に見られる精原幹細胞（ＳＳＣ）と呼ばれる生殖系列幹細胞は、精子形成（精子産生プロセス）に必須であり、そして雌性卵母細胞とともに、種の連続に必須である。ＳＳＣは、精巣の輸精管基底膜に常在し、そして体細胞性セルトリ細胞によって囲まれており、微小環境またはニッチを形成する。ニッチ内部で、成長因子および細胞外シグナルが、ＳＳＣの自己再生または拡大のための分化、および精子形成分化プロセスの開始を制御し、マウスにおいては４０日後、そしてヒトにおいては６４日後に、成熟精子の産生を生じる（Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、１９９７、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９８０）。精子形成における連続工程のタイミングは、生殖細胞および分化プロセスを支えるセルトリ細胞の遺伝子によって緊密に制御される。
【０１６２】
さらに、動物精巣における幹細胞の移植は、幹細胞が雄性配偶子に分化する生物学的能力を研究し、このプロセスに影響を及ぼす因子を評価し、精巣機能性および不妊を引き起こす理由を調べるための強力なツールである。これらの研究は、精巣機能性の理解を非常に増加させ、そして雄性繁殖性を制御し、そして保持する能力を非常に増加させるであろう。
【０１６３】
開示する結果は、ｈＩＤＰＳＣが生殖細胞および胚運命支持細胞に分化する潜在能力を示唆する。これらのデータは、例えば、化学療法適用のための不妊をしばしば導く癌の後のヒト繁殖性の回復におけるＩＤＰＳＣのありうる使用を示す。このデータは、ＩＤＰＳＣが異なる区画のマウス輸精管に生着可能であることを示唆する。ＩＤＰＳＣ分化は、繁殖性マウスにおいてより迅速であるようであり、細胞生着および幹細胞分化には環境が重要であることが示唆される。マウス精巣内に移植されると、ＩＤＰＳＣはマウス精上皮の分化の連続した命令にしたがい、そして低い効率ではあるが、丸い精子細胞、伸張した細胞、および精子に似た細胞さえ観察可能である。本発明者らのデータはまた、動物の輸精管の環境を用いて、ドナーマッチしたヒト精子細胞を達成するモデルツールとしうることも示唆する。本発明者らは、マウス細胞およびヒト細胞の間の融合が起こりうるが、核間の融合は検出されないことを見出した。
【０１６４】
本発明者らは、異種移植（不妊動物モデル）における精子形成の再構築のため、まず、環境を回復しなければならないと仮定する。精子形成を補助する細胞は、ＳＳＣ進行に影響を及ぼし、そして精子形成を促進する、ヒトタンパク質を産生する。公表されたデータを分析して、本発明者らは、今日まで、科学者の努力は主に、ＳＳＣが精子形成に入る能力をチェックするためにＳＳＣを使用することに向けられていたと結論づけ可能である。ＳＳＣは、精子形成に拘束された細胞であり、そしてしたがって、分化においては失敗であり、そしてこれらの細胞は移植された環境の正常なシグナルを受けなかった。
【０１６５】
セルトリ細胞は、支持細胞であり、すなわち、該細胞は、輸精管末梢に位置する「育てる」細胞である。これらはまた、精原細胞のための栄養および機械的支持を提供すれば、「幹細胞」とも呼ばれる。これらはまた、生殖系列幹細胞のニッチを確立し、そして維持する際にも関与し、その再生および成熟精原細胞への分化を確実にし、精子の放出において完了する進行を制御する。
【０１６６】
ｈＩＤＰＳＣは、免疫原性ではなく、そして免疫抑制プロトコルの使用を必要としない。これらは遊走細胞であり、そしてマウス精巣中に広く分布可能であり、一方、ＳＳＣは遊走不能である。
【０１６７】
腎不全
腎不全（ＲＦ）（腎不全または腎臓機能不全とも）は、腎臓が血液から廃棄産物を適切に濾過することに失敗する医学的状態である。高レベルの外胚葉性マーカー発現が、ネコＲＦ獣医学的患者に対するＩＤＰＳＣ療法を可能にするかどうかを試験するため（ＲＦ代表的症例は、獣医学的専門家の書面の治療／症状分析に基づいて記載され、何匹かのペットにおいては、飼い主によるリクエスト／通知された懸念（ｉｎｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｎｃｅｒｎ）を通じて、本明細書に記載しない他の例がＲＦ疾患を治療するために適用された）。
【０１６８】
本発明者らは、ＩＤＰＳを含むＩＤＰＳＣ細胞療法組成物、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、好ましくはＬＰ由来ＩＤＰＳＣを用いて、ヒトを含む哺乳動物種においてＲＦ疾患を治療する方法を開示する。顕著なことに、ＩＤＰＳＣは、腎不全のラットモデルに移植した後、ＣＤ１４６およびＶＥＧＦを発現することが示され、内皮マーカーの重要性が示される。総合すると、これらの両研究は、急性（ラット）および慢性（ネコ）腎疾患において、ＩＤＰＳＣ移植の腎保護効果および臨床的利点を立証する。
【０１６９】
１つの態様において、局所腎内投与が提唱可能である。他の態様において、緩衝生理食塩水中のｉ．ｖ．注入によって、または全身投与のための当該技術分野に知られる他の任意の適切なビヒクル中で、ｋｇ体重あたりおよそ０．０１〜１ｘ１０６細胞の用量で、ＩＤＰＳＣをｉ．ｖ．／全身性に投与する。続いて、腎機能の有意な改善があるまで、例えば１〜３週間ごとに、療法的に活性なレベルで、注入を反復し、その後、患者の状態に応じて、注入間隔を１〜６ヶ月に増加させる。さらなる態様において、組成物には、ＲＦ患者を治療するために送達しようとする他の細胞、または／および活性療法剤または／および遺伝子が含まれてもよい。
【０１７０】
腎不全は、イヌおよびネコにおいて高い発生率を示し、これらの種で、かなりの罹患率および死亡率を引き起こす（Ｌｅｅｓ，  ＧＥ、２００４）。慣用的な療法を用いていても、構造的な傷害が起こり、損なわれた代謝に関連する腎質量の減少およびその結果の腎臓の生理学的機能の喪失が支持され、したがって結果として臓器不全に至る。慣用的な医学的療法、液体および食餌カウンセリング、ならびに疾患を引き起こす医学的合併症に対する修正は、血清クレアチニンが６ｍｇ／ｄｌを超え、そして尿素が９０ｍｇ／ｄｌを超えた際には、通常、無効であり、この時点で、動物の生活の質の重大な損傷につながる（Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｊｒ．ら、２００４）。
【０１７１】
本発明者らは、本明細書において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大同種ヒトＩＤＰＳＣを用いて、ネコ、ならびにイヌおよびヒトを含む他の種における慢性腎疾患を治療する、ＩＤＰＳＣ含有組成物、および方法を記載する。この意味で、幹細胞療法は、大きな見込みがある可能性を示し、これは損傷を受けた組織の再生が、この疾患のありうる永続的な治癒を予期させるためである。
【０１７２】
神経前駆体およびニューロンを含む、ｈＩＤＰＳＣの後期集団の濃縮
本開示の他の側面は、歯髄機械的トランスファーおよび神経分化の誘導の１５、３０および４５サイクル後、神経前駆体およびニューロンを用いた、ｈＩＤＰＳＣの後期集団の濃縮に関する。ＣＮＳは、外胚葉から生じ、より正確には、多分化能神経上皮幹細胞（ＮＳＣ）のプールから生じる。この細胞集団は、神経前駆体の２つの異なる群によって少なくとも構成され：第一の群は、単層培養で成長することが可能であり；第二の群は、一般的にニューロスフェアを形成する（すなわち懸濁培養中で増殖する）。この相違にもかかわらず、どちらの細胞タイプも同じ分化潜在能力を示す（Ｎｏｂｌｅら、２０１１、Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ、２０１１）。
【０１７３】
ＮＳＣは、全身性に分裂し、そして適切な条件下で、神経芽細胞に迅速に変換され、これは非対称に分裂する前駆体であり、遊走期後に、ニューロンに発展可能である。神経芽細胞は、ＮＳＣよりわずかにより分化しており、そして移行（ｔｒａｎｓｉｔ）増幅する細胞集団を産生可能である。分裂能力は、神経芽細胞およびニューロンの間の主な相違であり、後者は分裂終了細胞である。神経芽細胞は、ニューロンに分化しそして成熟するが、他の細胞タイプにはならない。
【０１７４】
ＮＳＣの運命は、他の機構の中でも、周囲組織から生じるシグナルを通じて制御される。ＮＳＣは、いわゆる幹細胞ニッチと呼ばれる、幹細胞増殖、自己再生および分化を制御する微小環境の合図を提供する、特定の領域中に見られる。
【０１７５】
今日知られるのは、分化の神経潜在能力を持つ幹細胞の２つの潜在的な供給源である：第一に、中絶から得られる胎児神経前駆体、および第二に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経前駆体に分化するよう誘導された多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳＣ）。胎児神経前駆体は、多くの倫理的問題を生じさせ、一方、ＥＳおよびｉＰＳＣのヒト使用に関連する特定の安全性リスクがあり、療法適用は遅れている。神経学的疾患の治療のための細胞療法の使用を開発するには、幹細胞の他のヒトタイプによる神経変性療法の代替法が必要である。幹細胞および前駆細胞を移植するための方法が、米国特許第５，９２８，９４７号；第５，８１６，７７３号、およびＰＣＴ公報第ＷＯ  ０１／１７６５０７号に記載されている。これらの方法には、細胞培養における拡大および未分化神経保護幹細胞の移植、および／または神経前駆細胞または／および完全に分化した神経細胞の移植によるものが含まれる。細胞療法介入は、細胞移植および内因性神経前駆細胞の刺激の両方を伴いうる。慣用的な方法は、多数の不都合な点および限界を有し、そして幹細胞神経保護／神経再生療法のための細胞の新規供給源が必要である。やはり重要なのは、分子マーカーを用いた幹細胞療法のための細胞の神経保護潜在能力を予測することである。
【０１７６】
歯髄由来の幹細胞は、Ｇｒｏｎｔｈｏｓら、２０００、Ｓｈｉら、ＷＯ  ０２／０７６７９によって単離されてきている。Ｓｈａｒｐｅ（ＷＯ  ０１／６０９８１）は、胚性幹細胞または成体幹細胞または組織培養からの、歯の前駆細胞の産生を請求した。米国特許公報２００２／０１１９１８０は、第三大臼歯歯胚からの生物学的歯の産生法を請求した（Ｙｏｕｎｇら  ２００２）。米国特許第８，１９２，９８７号に開示される発明は、一般的に、多能性幹細胞に関し、歯に由来する胚性多能性幹細胞が含まれる。
【０１７７】
本明細書に提示する開示の側面は、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２およびベータ−３−チューブリンマーカーを同時発現するｈＩＤＰＳＣの組成物に関し、そして特に、神経学的状態を治療する方法に関する。やはり本明細書に開示するのは、ＬＴ  ｈＩＤＰＳＣ細胞培養中に共発現されたマーカーの濃縮の組成物および方法であって、したがってこうしたＬＰ  ｈＩＤＰＳＣの神経外胚葉系譜拘束が増加したものである。本明細書に開示するのは、ＬＴ採取サイクルを通じて得られ、そして特定の神経バイオマーカー、例えば限定されるわけではないが、ＳＯＸ１、およびＳＯＸ２、ベータ−３−チューブリンが濃縮されているｈＩＤＰＳＣを用いて、神経変性疾患を治療する新規方法である。この方法は、ｈＩＤＰＳＣの神経系譜拘束に影響を及ぼし、そしてＣＮＳおよびＰＮＳ疾患を治療するより高い潜在能力を保持する一方、正常核型を維持し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで奇形腫形成がまったく検出されないマーカーに関してスクリーニングするために有用である。さらに、意図される態様は、前記幹細胞性ニューロンマーカー（ＳＯＸ１、ＳＯＸ２およびベータ−３−チューブリン）を同時発現する一方、正常核型を維持し、そして奇形腫形成のリスクを所持しない、実質的に均質な濃縮された細胞集団を提供する。均質な集団は、ヒト（哺乳動物）において疾患を治療するために好適である可能性が高い。本明細書に開示する、細胞に基づく療法の他の利点には、限定されるわけではないが、中枢神経系組織、末梢神経系
組織の取り込みが含まれる。こうして取り込まれた細胞は、ニューロン、グリアまたは他の細胞に分化するかまたは発展する潜在能力を有し、損傷を受けたか、外傷を受けたかまたは変性した組織を置換するかまたはその修復を促進して、それによって変性、急性傷害、外傷性、神経学的状態のより永続的な治療を生じる。
【０１７８】
本文書に援用されるのはまた、その内容が全体として本明細書に援用される、米国仮特許出願６１／７９１，５９４において、ｈＩＤＰＳＣと呼ばれる幹細胞の限定されない数を産生するため、歯髄（ＤＰ）組織を長期ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養する、開示する方法である。酸素は、正常組織ホメオスタシス下で、幹細胞特性に影響を及ぼしうる決定的なシグナルの１つである。興味深いことに、低い酸素レベル、または低酸素は、幹細胞ニッチの特徴である（Ｐａｎｃｈｉｓｉｏｎ、２００９）。
【０１７９】
驚くべきことに、ｈＩＤＰＳＣの長期／ＬＴ細胞培養中に保存される生物学的試料に関して、このプロセス中に、歯科組織が次第に縮み、歯髄組織内部に低酸素が生じることが観察された。より驚くべきことに、３０回の機械的トランスファー／採取サイクル後にＤＰから単離され（ＩＤＰＳＣの後期集団（ＬＰ））、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロンを産生する能力に関して試験された未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）が、機械的トランスファー／採取の１５または２５サイクル後に単離されたＩＤＰＳＣ（早期集団（ＥＰ））に比較した際、神経分化能力増加、ならびに神経前駆体を含むあらかじめ拘束されたＬＰ  ＩＤＰＳＣ集団の濃縮を示した。
【０１８０】
いくつかの側面にしたがって、本発明者らは、あらかじめ拘束されたＩＤＰＳＣ神経前駆体中の活発に増殖しているニューロン前駆体（神経芽細胞）の数が、ＤＰトランスファーサイクルの数に関連することを発見した。
【０１８１】
ＳＯＸ１およびＳＯＸ２バイオマーカー
ＳＯＸ１（性決定領域Ｙ−ボックス１を示す）タンパク質は、初期中枢神経系発生に関与する転写因子である。ＳＯＸ１は、発達中の中枢神経系に特徴的な既知のマーカー特性である。神経板および神経管におけるＳＯＸ１の発現は、まだ最終段階に拘束されていない有糸分裂的に活性である前駆体と相関するようである。ＳＯＸ１は、胚性ＣＮＳの分裂中の神経前駆体を定義し、そして特に腹側線条体で発現する（Ｐｅｖｎｙら、１９９８；Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎら、２００３）。
【０１８２】
ＳＯＸ２は、発生中の神経管中で発現される最も初期に知られた転写因子の１つであり、そして成体脳の特定の細胞において発現される。ＳＯＸ２は、一般的に、中枢神経系において重要な役割を果たすことが知られる。近年、Ｔｅｒｓｋｉｋｈおよび同僚ら（２０１１）は、末梢神経系におけるＳＯＸ２の役割を解明した。彼らは、遊走細胞が上皮から間葉系転移（ＥＭＴ）を経て、神経冠（ＮＣ）細胞の特性を獲得する、ｈＥＳＣに基づくモデルを開発した。彼らは、遊走性ＮＣ前駆体がＳＯＸ２を下方制御するが、次いで、分化するにつれてＳＯＸ２を再発現し始め、神経原性後根神経節（ＤＲＧ）様クラスターを形成することを見出した。ＳＯＸ２下方制御は、ＥＭＴを誘導するのに十分であり、そしてニューロン分化が誘導された際、激しいアポトーシスを生じた。彼らはまた、ＳＯＸ２がＮＧＮ１（ニューロゲニン（ｎｅｏｒｏｇｅｎｉｎ）１）およびＭＡＳＨ１プロモーターに直接結合し、そしてこれらの発現に必要であることも示した。神経冠幹細胞がＳＯＸ２再発現を防止されると、細胞は死ぬか、あるいはグリアまたは平滑筋細胞を生じさせうる。したがって、ＳＯＸ２の機能は、後の発生でニューロンになるために、細胞を多分化能または多能性に維持することである。
【０１８３】
神経変性疾患モデルにおけるＳＯＸ２：ハンチントン病（ＨＤ）モデル
Ｍｏｌｅｒｏおよび同僚ら（２００９）は、ＨＤモデルを概説した。このモデルにおい
て、９ヶ月齢で進行性認知障害が発展し、ありうる海馬機能不全が示唆される（Ｋａｎｄａｓａｍｙら、２０１０）。彼らは、後期胚性段階で、ＮＳＣ自己再生、多系譜潜在能力、および神経形成を仲介する因子である高レベルのＳＯＸ２とともに、ＮＳＣ自己再生の増進を観察した。他のグループは、ハンチントン病のトランスジェニックラットモデルの海馬神経幹細胞ニッチにおいて、疾患に関連する海馬前駆細胞増殖の進行性の減少に、トランスジェニック動物における５−ブロモ−２−デオキシウリジン標識保持ＳＯＸ２陽性休止幹細胞プールの拡大が付随することを示した。
【０１８４】
発生中の脳に移植すると、これらは広範に宿主脳内に入り込み、広範囲の分布を示し、確立された宿主脳遊走トラックに沿って遊走し、領域特異的方式で、３つの基本的な神経系譜の子孫に分化し、局所の合図に応じ、そして生存する宿主の発生および組織形成に関与することが示される。
【０１８５】
定義特性のこの組み合わせは、単離のために用いた方法に関わらず、本発明の神経前駆細胞株を同定するであろう。１つの方法は、神経前駆細胞に分化可能であり、そして次いで完全に分化したニューロン（ニューロン、アストログリア、またはオリゴデンドロサイトを含む）に分化可能である、未分化幹細胞を移植することである。別の方法は、神経系の影響を受けた領域に神経保護因子を放出可能な未分化のまたは分化前のＩＤＰＳＣを移植することである。さらに、記載する神経再生のｈＩＤＰＳＣ移植法の使用は、患者に、分化前のｅｘ  ｖｉｖｏニューロン前駆体を、または完全に分化したニューロンを、またはその組み合わせを投与することに基づいてもよい。
【０１８６】
いくつかの側面にしたがって、細胞培養組成物は、神経冠幹細胞である、（同時発現）ＳＯＸ１およびＳＯＸ２陽性ｈＩＤＰＳＣを含む。ＳＯＸ１およびＳＯＸ２は、ＬＴ細胞培養を通じて得られてもよい。転写因子の濃縮は、ＬＰ培養に向かって増加し、これはニューロン分化に向かう高い潜在能力を保持し、核型を正常に維持し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで奇形腫のリスクを持たない。
【０１８７】
別の側面にしたがって、ｈＩＤＰＳＣの均質集団を得るための方法は、ＬＴ機械的／非酵素的採取サイクルを通じて集団を得る工程を含む。採取サイクル数は、２５を超えるサイクル、約４５サイクル、または４５より多いサイクルを含んでもよい。方法の態様は、さらに、採取した細胞を培養し、そして細胞培養からプラスチック接着細胞を継代する工程をさらに含んでもよい。プラスチック接着細胞は、典型的には（ｉ）自己再生し、（ｉｉ）内胚葉、中胚葉、または外胚葉系譜の細胞に分化し、そして（ｉｉｉ）マーカーＳＯＸ１、ＳＯＸ２および３−ベータ−チューブリンを発現する。方法の態様は、さらに、ＣＮＳ疾患を治療する細胞療法のため、薬学的に認められるキャリアー／ビヒクル中に、薬学的組成物として患者に産物を投与する工程をさらに含んでもよい。
【０１８８】
別の側面にしたがって、有糸分裂的に活性である均質な神経前駆体（神経芽細胞）組成物は、最終段階にまだ拘束されていない、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、およびベータ−３−チューブリンなどのマーカーを含む（同時発現する）。
【０１８９】
別の側面にしたがって、分化前のＩＤＰＳＣの均質な集団を得るための方法は、以下の工程の１またはそれより多くを含む。非接着性条件（懸濁）において、ＩＤＰＳＣを培養することによって、ＩＤＰＳＣ由来ニューロスフェアを得る。神経ロゼットを形成するため、プラスチックプレートに接着させた後、ロゼット内の細胞は、（ｉ）ＩＤＰＳＣよりわずかにより分化した、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、およびＢｒｄＵおよびベータ−３−チューブリンに関して陽性である神経芽細胞の移行増幅細胞集団；（ｉｉ）外部ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ誘導性微小環境に際して、中枢および末梢神経系のニューロン系譜（ニューロン前駆体、アストログリアおよびオリゴデンドロサイトおよび神経節細胞）
に最終的に分化する神経芽細胞；（ｉｉｉ）患者に投与することによって、ＣＮＳ疾患を治療する細胞療法のための薬学的に許容されうるキャリアー／ビヒクル中での薬学的組成物としての使用；および／または（ｉｖ）神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫を治療するが、これらの腫瘍タイプに限定されない腫瘍を治療するための遺伝子療法を含む、抗癌療法のための薬学的に許容されうるキャリアー／ビヒクル中の薬学的組成物としての使用によって提示される。
【０１９０】
別の側面にしたがって、ｈＩＤＰＳＣの実質的に均質なＬＰは、限定されるわけではないが、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、またはベータ−３−チューブリンを含む群より選択されるマーカーを同時発現する細胞を含む。
【０１９１】
意図される開示の多様な態様を、限定と見なしてはならない以下の実施例にさらに例示する。本出願全体に引用する、すべての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図は、その全体がすべての目的のため、本明細書に援用される。
【実施例】
【０１９２】
実施例１．  ＩＤＰＳＣの神経分化
ＩＤＰＳＣを、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の前まで培養したが、これは基本培地中、２５ｃｍ２に２ｘ１０６に等しい。次に、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、そして基本培地を、２％  Ｂ２７を補った神経基本培地（ＮＢ＋Ｂ２７）に交換した。培地を３〜４日で交換しなければならない。１週間後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで２〜３分処理した後に、細胞を採取し、そして同じ培地で中和した。８００ｘｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットを得て、そして上清を取り除いた。次に、ＮＢ＋Ｂ２７中で、ＩＤＰＳＣを穏やかに脱凝集させ、そして６つのペトリ皿９．６ｃｍ２上に植え付けた。レチノイン酸を０．１μＭの最終濃度で２４時間添加し、その後、成熟ニューロンを得た。
【０１９３】
神経分化にこのプロトコルを用いると、同じ培養プレート中、同時に、ニューロンおよびグリア細胞へのＩＤＰＳＣ分化が観察された（図３）。
【０１９４】
実施例２．  ニューロン表現型分析
さらに、ニューロン形態を研究するため、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いた（図４）。分化中の細胞およびニューロン表現型を獲得するプロセスのものの形態を示す細胞によって形成されるネットワークの両方が観察可能であった（図４Ａ〜４Ｃ）。神経中のニッスル顆粒の染色のためにニュートラルレッドを用い（図４Ｄ〜４Ｆ）、これは、遊離リボソームのロゼットを含む粗面小胞体であり、そしてタンパク質合成部位である。
【０１９５】
実施例３．  四倍体網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の下位集団の場合による支持のために重要な特徴としての、異数性および細胞融合の同定
神経分化のプロセス中、いくつかの細胞は、二核（または多核）であることが見出された。この事実は、細胞融合が分化中のＩＤＰＳＣにおいて起こる指標であろう。図４Ｅにおいて、多数の核を持つニューロンが観察可能である。これらの細胞学的データは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で確認された（図５）。
【０１９６】
分化したＩＤＰＳＣの核中のヒト染色体２１に関するハイブリダイゼーションシグナルのカウントは、ＦＩＳＨによって行われ、そして２つより多くのハイブリダイゼーションプローブシグナルを持つ細胞核が約２５％と概算される細胞融合率と立証された（図６）。全部で２５０の核を数えた。
【０１９７】
ＦＩＳＨ分析を実行するため、ダウン症候群と関連する染色体２１の領域に対する特異
的プローブＬＳＩ２１（Ｖｙｓｉｓ）を用いた。以下に簡潔に記載するように、製造者の指示（Ｖｙｓｉｓ−Ａｂｂｏｔｔ）にしたがってＦＩＳＨプロトコルを用いた。
【０１９８】
ＰＢＳでカバースリップを洗浄した後、これらの分化した細胞を４％ホルムアルデヒド中で１週間固定し、そして４℃で保存した。次に、カバースリップ上の材料を一連のアルコール（７０％、９０％および１００％、Ｍｅｒｃｋ）で各３分間、室温で脱水し、そしてカバースリップを風乾した。変性溶液（２ｘＳＳＣ、ＮａＣｌ／クエン酸ナトリウム中、７０％ホルムアミド；Ｓｉｇｍａ）で材料を７２℃で変性した。材料を一連のアルコール中で、各３分間、氷中で再び脱水し、そして風乾した。この材料にプローブを添加し、そしてカバースリップをハイブリダイゼーションのため、１６時間の期間に渡って（一晩）、加湿チャンバー中、３７℃で維持した。この期間の後、２ＸＳＳＣ中、５０％ホルムアミドを含有する溶液中で、カバースリップを２回洗浄し、その後、２ＸＳＳＣおよび４ＸＳＳＣ中で希釈した１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｍｅｒｃｋ）中で２回、各洗浄に関して３分間洗浄した。最後に、カバースリップにＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄをマウントし、そして蛍光顕微鏡下で分析を行った。
【０１９９】
実施例４．  分化プロトコルにしたがったニューロンバイオマーカーの発現
ＩＤＰＳＣ由来ニューロンにおける、ニューロン分化の初期マーカー、ネスチンに対する抗体（図７Ａ〜７Ｂ）；神経細胞のマーカー、ベータ−チューブリンに対する抗体（図７Ｃ〜７Ｅ）；グリアタンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗体（図７Ｆ）；および成熟神経細胞のマーカー、ＮｅｕＮに対する抗体（図７Ｊ〜７Ｈ）を用いた免疫蛍光を用いて、神経分化の特異的タンパク質の発現を実行した。これらのマーカーのすべてが、ＩＤＰＳＣニューロン様細胞において発現された。
【０２００】
本発明者らは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入したマウス・モノクローナル・ネスチンおよびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体、ならびにＣｈｅｍｉｃｏｎのβ−チューブリンＩＩＩを用いた。以下の免疫染色プロトコルを用いた：カバースリップ上で増殖するＩＤＰＳＣをリンス緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、希釈した一次抗体と細胞を、室温で１時間インキュベーションした。一次抗体を１：１００に希釈した。リンス緩衝液中で３回洗浄した後、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはＣｙ３標識した適切な二次抗体を１：１００希釈で３０分間添加した。顕微鏡スライドを、ＤＡＰＩを含むまたは含まないＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でマウントした。冷却ＣＣＤカメラ（ＰＣＯ、ＶＣ４４）で得て、ＩＳＩＳソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍ、米国マサチューセッツ州ベルモント）でプロセシングしたデジタル画像で分析を行った。
【０２０１】
ＩＤＰＳＣ神経分化中、ニューロスフェア様構造の形成もまた観察された（図８Ａ〜８Ｂ）。本発明者らが、ネスチンに対する免疫蛍光を実行した際、これらの構造の内部は、ネスチン陽性であることが見出され（図８Ｃ）、これは、これらのスフェア内に神経前駆体が存在することを示す。
【０２０２】
神経分化はまた、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ベータ−チューブリン、中分子量ニューロフィラメント、およびＧＦＡＰなどの神経遺伝子の発現によって確認された（図９）。
【０２０３】
ＩＤＰＳＣが神経細胞に分化する能力に関する結果を、星状細胞および神経細胞運命に関して、それぞれ、図１０および１１に要約する。
【０２０４】
実施例５．  脊椎傷害のマウスモデルにおけるＩＤＰＳＣの療法的使用
先に、Ｍａｒｑｕｅｓおよび同僚ら（２００９）によって記載されるように、成体雌マウス６〜８週齢をケタミンおよびキシラジン（それぞれ、１００および１５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、そして３０ｇ血管クリップ（Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、コネチカット州トリングトン）によって、Ｔ９レベルで１分間圧迫傷害に供した。術後、温パッド上で動物を回復させ、そして１ｍＬの生理食塩水溶液を投与して、脱水および血液の喪失を補償し、そしてエンロバイトリル（ｅｎｒｏｂａｙｔｒｉｌ）（２．５ｍｇ／ｋｇ／日ＳＣ）を注射した。自発的な尿機能が戻るまで、膀胱を１日２回、手動で絞った（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）。
【０２０５】
ＩＤＰＳＣ移植を以下のように行った。亜急性および慢性病変の間の回復を比較するため、２つの異なる時点で、細胞を移植した。亜急性群は、傷害７日後に処置を受けた：総体積４μＬの培地（亜急性＋ＤＭＥＭ、ｎ＝８）またはＩＤＰＳＣ（４μＬ中、８ｘ１０５、ｎ＝８、亜急性＋ＩＤＰＳＣ）の注射。慢性群は、病変２８日後に、（慢性＋ＤＭＥＭ、ｎ＝８）またはＩＤＰＳＣ（慢性＋ＩＤＰＳＣ、ｎ＝８）、同じ濃度および体積で処置を受けた。すべての群で、１０μＬハミルトンシリンジを用いて、病変の発生部位内に細胞を注射した。細胞をまったく投与されないが、すべての外科処置に供される偽群を対照として含んだ。
【０２０６】
白質保持を以下のように測定した。この定量化の分析は、ＤＭＥＭ群におけるよりもＩＤＰＳＣ群において、白質領域のよりよい保持を示した（図１２）。偽群は、正常分布の病変群に比較して、正常のおよび優れた値（６３．２３−１．２％）を示した。ＩＤＰＳＣ処置動物は、亜急性に関して、ほぼ４６．８５−１．９７％、および慢性群に関して４３．４９−２．８９％の値を示し、一方、処置としてＤＭＥＭのみを投与された動物は、亜急性および慢性群に関して、それぞれ、約３８．０３−４．２８％および３９．００−２．５４％のより低い値を示した。白質保持を、傷害領域の残された白質パーセントに関して計算した。すべての値を図１２に例示し、これはまた、この定量化に用いた傷害部位および脊髄試料の模式図も示す（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。
【０２０７】
免疫標識栄養因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子ベータ（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）の定量化もまた、脊髄切片に対して行った（図１３Ａ〜１３Ｄ）。用いた一次抗体は：ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ（１：１００、ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）、ウサギ抗ヒトＮＧＦ（１：１００；ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ヤギ抗マウスＮＴ−３（１：１００；ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ）、またはヤギ抗マウスＮＴ−４（１：１００；ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ）であった。一次インキュベーション後、スライドを洗浄し、そして適切な抗体：Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギ（１：６００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＡｌｅｘａ  ４８８ウサギ抗ヤギ（１：６００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、室温で２時間インキュベーションした後、３回洗浄し、そしてＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でカバースリップ処理した。定量化研究のため、１２匹の動物（群あたり３匹）を用いた。染色領域および総視野領域の間の比を評価することによって、免疫蛍光画像をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（バージョン６．０）で分析した。各動物由来の６つの切片を用い、そしてこれらの切片は１００μｍ離れていた。すべての脊髄横断面を含むため、各切片から、１０Ｘ対物レンズを用いて、２枚の写真を撮った。その後、これらの画像を用いて、栄養因子ＢＤＮＦ、ＮＧＦ−ｂ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４を定量化した。一方向ＡＮＯＶＡおよびチューキー法を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、データを統計的に分析した。
【０２０８】
栄養因子が可溶性であり、そしてしたがって、組織中に非常に迅速に分散するため、栄
養因子染色は低い免疫反応性を示すが、群間の染色パターンの相違が観察可能であった（データ未提示）。一般的に、ＩＤＰＳＣ処置群は、特に、分析した栄養因子すべてのより高いレベルを示した亜急性群において、ＤＭＥＭ処置群に比較して、領域あたり、増加した免疫反応を示した。慢性群に関して、本発明者らは、ＢＤＮＦおよびＮＧＦ定量化に関して、ＩＤＰＳＣ処置群およびＤＭＥＭ処置群間の相違を観察したのみであった。ＤＭＥＭ処置動物に比較した際、すべての分析した栄養因子に関して、特に亜急性および慢性群両方において、有意により高い免疫標識領域を示したＢＤＮＦおよびＮＧＦに関して、ＩＤＰＳＣ処置動物において、より強い染色が観察された（図１３Ａ〜１３Ｄ）。
【０２０９】
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０で、すべての統計分析を行った。結果を平均−ＳＥＭとして示し、そしてｐ値≦０．０５を有意と見なした。
【０２１０】
電子顕微鏡に関しては、動物に細胞移植を行った８週後、上述のように、ケタミンおよびキシラジンで麻酔し、そして０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタルアルデヒド溶液で、心臓内灌流した。脊髄を摘出し、３つの異なるセグメント（病変の発生部位、ならびにその頭側および尾側）に分け、そして０．８％フェロシアン化カリウムを含むカコジル酸緩衝液中の１％四酸化オスミウム中に、室温で６時間、浸すことによって、後固定した。試料を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、段階的なアセトンシリーズで脱水し、樹脂中に包埋し、そして６０℃で４８時間、重合させた。ＲＭＣウルトラマイクロトームを用いて、半薄（５００ｎｍ）および超薄切片を作製した。半薄切片をトルイジンブルーで染色し、そしてＺｅｉｓｓ顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐ  ２  Ｐｌｕｓ）下で観察し、そしてＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎプログラム・バージョン４．５（Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を獲得した。超薄切片を銅グリッド上に収集し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、そしてＺｅｉｓｓ  ９００透過型電子顕微鏡中で観察した。
【０２１１】
図１４および１５は、すべての群由来の半薄および超薄切片を示す。本発明者らは、一般的に、亜急性相（図１４Ａ〜１４Ｃ）または慢性相（図１５Ａ、１５Ｃ、および１５Ｅ）において、ＤＭＥＭを投与された動物の超構造分析が、多くの空洞化（図１４Ａにおいて短い赤い矢印、ならびに図１４Ｃおよび１５Ｃにおいてアステリスク）を伴う組織崩壊、および強い星状細胞増加（図１５Ｅの矢じり）、ほとんど保持されない線維（図１４Ｂおよび１４Ｃ）、および典型的な基底膜を伴う、いくつかのミエリン化シュワン細胞（図１４Ｂにおいて実線の矢印、および図１５Ｃにおいて星）を明らかにしたことを観察した。
【０２１２】
ＩＤＰＳＣ移植を受けた亜急性群および慢性群はどちらも、より優れた組織保持を示した。ＩＤＰＳＣ亜急性群（図１４Ｄ〜１４Ｉ）において、本発明者らは、白質内部に多数の保持された線維（図１４Ｅの大きな矢印）、ならびに内部に多くの細胞質封入、ミエリン破片、および脂質を含むかなりの数のマクロファージ（図１４Ｅの黒い矢印）を観察可能であった。損なわれていないシュワン細胞（図１４Ｆの実線の矢印）およびオリゴデンドロサイト再ミエリン化軸索（図１４Ｆの黒い矢印）；再生島（図１４Ｇ）、およびいくつかの保持されたニューロンもまた観察された。これらのニューロンのいくつかは、いくつかの保持されたシナプス接触（図１４Ｈの人工的に着色された部分）を示した。ＩＤＰＳＣ慢性群（図１５Ｂ、１５Ｄ、および１５Ｆ）の超構造分析は、多くの保持された線維（図１５Ｂの長い矢印）、いくつかのシュワン細胞ミエリン化軸索（図１５Ｄの矢印）、およびシナプス接触を含む保持されたニューロン（図１５Ｆの長方形）を示した。
【０２１３】
行動分析を以下のように行った。傷害前、傷害１日後、および毎週、細胞移植後、最長８週まで、動物を評価した。回復を分析するため、オープンフィールドで１分間、ｗｅｂｃａｍ（１秒あたり５フレーム）で動物を記録することによって、自発運動改善を評価す
る、Ｍａｒｑｕｅｓおよび同僚らによって記載される広域移動試験（２００９）を用いた。その後、１分間の期間中に動物が到達する速度（ｃｍ／秒）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定した。Ｂａｓｓｏマウススケール（ＢＭＳ）試験もまた行い（Ｂａｓｓｏら、２００６）、これは、かかとの動き、足の位置、体重支持、足底ステップ、後肢および前肢の協調、および体幹安定性などの自発運動能力および自発運動特徴を示す、９ポイントスケールである。統計分析のため、左および右後肢（ＨＬ）から得られるスコアの平均を用いて、動物あたり単一のスコアを確立した。事後比較のための一方向ＡＮＯＶＡおよびチューキー試験を決定した。
【０２１４】
広域移動試験に関して、偽処置動物は、自発運動にいかなる改変も示さず、そしてほぼ１６．２１−１．７３ｃｍ／秒の正常値を示した。ＩＤＰＳＣを投与された亜急性群（６．９４−１．８５ｃｍ／秒）は、ＤＭＥＭ群（３．７１−０．９５ｃｍ／秒）に比較して、より高い値を示し、そして自発運動の改変は、細胞移植の７日後（すなわち脊髄傷害（ＳＣＩ）の１４日後）から始まり、そして研究の続く週の間、維持された。慢性動物は、処置７日後にわずかな改善を示した。しかし、細胞移植１４日後、これらは、ＤＭＥＭ群における４．１５−１．０７ｃｍ／秒に対して、ほぼ６．６−２．０３ｃｍ／秒の平均の、より高い自発運動速度を示した。ＩＤＰＳＣを投与された群はどちらも、動物は、通常の速度には到達しなかったが、これらは、より優れた探索パターンを示し、はるかに多く歩き、そしてオープンフィールドを試験中に数回横断した。図１６は、ＩＤＰＳＣ移植３５日後のこれらの動物の置換を例示する。
【０２１５】
ＩＤＰＳＣ処置動物によって示される機能的改善はまた、これらの細胞による神経栄養因子の放出に帰因しうる。これは、病変領域をバイパスし、そして新規シナプス接触を作製して、機能転帰を増進させうる、側枝出芽を刺激することによって作用する可能性もある（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００５）。これは、多くの健康なニューロン、損なわれていないシナプス接触、および保存された軸索が超構造分析において見られるため、もっともらしい説明である。この研究によって、マウス包括的ＳＣＩの亜急性および慢性段階の両方において適用されるような、ＩＤＰＳＣ移植の重要な療法的潜在能力が立証された。ＩＤＰＳＣは、近い将来、ヒト試験において用いられるべき幹細胞に基づく治療のための優れた候補であるようであった。
【０２１６】
実施例６．  イヌ・ジステンパーおよび硬蹠症の臨床的症例における、ＩＤＰＳＣの神経学的潜在能力の前臨床研究
イヌ・ジステンパーは、イヌのウイルス性疾患であり、そしてこのウイルスは、パラミクソウイルス群に属する。ヒトにおいて、麻疹ウイルスもまたこの群のメンバーである。症例のおよそ半分は致死性である。イヌ・ジステンパーは、治癒が不可能であり、あらゆる面でイヌの体を攻撃する深刻なウイルス性疾患である。該ウイルスは、イヌの中枢神経系の持続性感染を引き起こし、進行性の多病巣性脱ミエリン化疾患を生じる。動物がひとたび、該疾患の神経学的症状、例えば発作または麻痺を発展させたら、生存の可能性は低く、そして生活の質は、次第に悪くなっていく運命である。したがって、これらの動物は、通常、安楽死となる。
【０２１７】
病歴
動物の飼い主によってサインされたインフォームドコンセントを得た後、そして国際動物飼育指針にしたがって、動物を実験処置に登録した。また、飼い主にはいかなる費用も負担させずに治療を実現し、そして動物は治療後、長期追跡調査を受けた。
【０２１８】
年齢４〜６歳の間、そして体重８ｋｇ〜１６ｋｇの間の、イヌ・ジステンパーと診断され、そして嘔吐、下痢、および発熱等の症状を提示した、多様な犬種の８匹のイヌを登録した。細胞移植前に、これらのイヌには、咳および肺炎と戦うため、抗生物質を投与し、
これらはいかなる臨床的寛解も提供しなかった。イヌ自身がウイルスの影響をかわす能力にしたがって、イヌは、この疾患の神経型の症状、例えば後足の麻痺または後足および前足両方の麻痺を得た。
【０２１９】
ウイルスの影響が終わった後、初めて、異種ＩＤＰＳＣ移植を行った。継代３〜５回で凍結保存した未分化ＩＤＰＳＣを用いた。移植直前に細胞を融解し、そしてあらかじめ温めた（３７℃）無菌ＰＢＳで２回洗浄した後、８００ｘｇで５分間遠心分離した。その際に、トリパンブルー染色を用いて、細胞生存度を試験し、そしてこれはおよそ９８％の生存細胞だった。各適用で用いる細胞数をイヌの体重にしたがって確立し、そしてこれは２ｘ１０６（８ｋｇ）〜４ｘ１０６（１６ｋｇ）の間で多様であった。細胞を、続く静脈内注射のため、平均体積±０．５ｍＬの無菌生理学的溶液中に懸濁した。イヌに注射可能麻酔剤を投与し、この用量はイヌの体重および麻酔に対する特定の犬種の感度にしたがって計算された。疾患重症度にしたがって、イヌに単回または複数回（３回より多くない）適用を投与した。いかなる免疫抑制プロトコルも伴わずにＩＤＰＳＣを移植した。動物はいずれも、単回または複数回ＩＤＰＳＣ移植後、免疫拒絶の徴候を示さなかった。
【０２２０】
最初のＩＤＰＳＣ適用後まもなく、すべての動物は、イヌ・ジステンパーの神経学的型の症状の有意な寛解を示した。這うことしかできなかった動物が、半分起き上がり始め、半分起き上がることが可能であった動物が、起き上がって歩き始めた。這うことしかできなかった動物が、起き上がり始め、起き上がることが可能であった動物が、ゆっくりと歩き始めた。各動物は、治癒の自身の動力学を有し、そして筋系がより強いものは、寛解の加速された動力学を有した。より進行した臨床的症状を提示し、そして這うことしかできなかったイヌは、３回目のＩＤＰＳＣ適用後に有意な寛解を示し、そして困難を伴いながらであったが、歩くことが可能であった。次に、最適な臨床結果を得るため、これらを理学療法に供した。
【０２２１】
代表的な図１７および１８において、イヌ・ジステンパーの穏やかなおよび重度の神経学的型を示す２匹の動物（細胞適用前）および治癒の進行（細胞適用後）を示す。穏やかな神経学的型を伴う動物は、後足の麻痺を示し（図１７Ａおよび１７Ｂ）、これは単回のＩＤＰＳＣ適用後、完全に回復し（図１７Ｃおよび１７Ｄ）、そして十分な期間中、動物は、歩き、そして立つことが可能であった。重度の神経学的型を伴う動物は、発作ならびに前足および後足の麻痺の両方を示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。発作は、最初のＩＤＰＳＣ適用後に消え、そしてイヌは足を正しく動かすことが不可能である、疾患症状を提示しながらではあったが、短い距離を歩くことが可能であった（図１８Ｃおよび１８Ｄ）。このイヌは、３回目のＩＤＰＳＣ適用後、すべての運動をほぼ完全に回復させた。
【０２２２】
４ヶ月後の追跡調査時、すべての動物は、運動を回復させ、そして走る能力さえ回復させた。２年後の追跡調査時、動物は、ＩＤＰＳＣ移植が安全であり、そしてイヌの身体能力を維持することが可能であり、見かけ上、健康であることを示した。動物はいずれも、幹細胞移植によって引き起こされうると言われる、腫瘍形成を示さなかった。
【０２２３】
実施例７．  ＩＤＰＳＣの筋原性分化
さらに、心筋細胞（ＣＭ）様細胞へのＩＤＰＳＣの分化を観察した（図１９）。ＩＤＰＳＣは、融合（図１９Ａ）または分化（図１９Ｂ〜１９Ｃ１）後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＭ様表現型および形態を採用しうる。
【０２２４】
心筋細胞アポトーシスは、結果的に鬱血性心不全を生じる進行性心臓機能不全に非常に重要である。骨髄細胞は、心筋細胞との融合を通じて、虚血後に心臓機能を回復することを補助し、こうして心臓細胞をアポトーシスから救出するのを補助することが可能である。細胞融合は、心筋梗塞後、心筋細胞をアポトーシスから保護し、こうしてターゲティン
グ心臓再生療法の新規アプローチを提供する（Ｙａｎｇら、２０１２）。ＩＤＰＳＣはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで立証されうる天然の自発的な融合能のため、心不全において使用する優れたオプションである可能性もある（図２０）。初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＰＨＳＦ）、マウス骨髄細胞（ＭＢＭＣ）およびＩＤＰＳＣを単離し、そしてカルシウムおよびマグネシウム不含ダルベッコのリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、そして０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離させた。懸濁物を遠心分離し、そして緑色（Ｄｉｏ）蛍光色素（Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＭ−Ｄｉｏ細胞標識溶液；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に細胞ペレットを再懸濁し、一方、赤色（Ｄｉｌ）蛍光色素を含有する同じ溶液中に、ＩＤＰＳＣ懸濁物を再懸濁した。細胞を３７℃で１５分間インキュベーションし、ＤＰＢＳ中で２回洗浄し、そして混合細胞ＩＤＰＳＣ：ＰＨＳＦおよびＩＤＰＳＣ：ＭＢＭＣを１：１比で植え付けた。どちらの実験でも、効率的で自発的な細胞融合が観察された（図２０）。
【０２２５】
これらの未分化ＩＤＰＳＣ（１０６）をまた、記載されるように（Ｓｅｌｙｅ  Ｈ，  Ｂａｊｕｓｚ  Ｅ，  Ｇｒａｓｓｏｓ  Ｓ，  Ｍｅｎｄｅｌｌ  Ｐ．  ラットにおける冠血管の外科閉塞のための単純な技術。  Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ．（１９６０）１１：３９８−４０７）誘導した、冠状動脈結紮による心筋梗塞のラットモデルにも移植した。すべての方法は、動物飼育および使用における倫理的実行のための国際ガイドラインにしたがって実行した。５匹の若いＷｉｓｔａｒ雄を用い、体重は２００〜２５０グラムの間であった。心筋梗塞の誘導直後、直接心筋内注射によって、細胞を投与した。１ヶ月後、心筋中にＩＤＰＳＣホーミングがあった（図２１）。Ｋｅｒｋｉｓら（２００６）Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １８４：１０５−１１６に記載されるように得た抗ＩＤＰＳＣ抗体を用いて、ＩＤＰＳＣホーミングを分析した。
【０２２６】
レシピエント細胞および筋組織と、ＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ筋原性潜在的および自発的融合能をまた、ゴールデンレトリバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）犬でも立証した。ＧＲＭＤで以前観察された、家族間の変動の影響を最小限にするため、同腹仔由来のイヌを用いた。人工授精を通じて、罹患した雄とキャリアーの雌を交配させた後に生まれた、６匹（３匹の雄および３匹の雌）の罹患した動物を用いた。各性別に動脈注射を通じて、６ｘ１０７  ＩＤＰＳＣを投与した。１匹の未注射の雄および１匹の未注射の雌を、年齢マッチ対照として分析した。ＩＤＰＳＣでの長期治療の潜在的な影響を検証するため、４４日齢から開始して、動物を毎月治療した。異なる時点で、生検を得て、そしてＩＤＰＳＣのホーミングおよび分化を研究した。図２２に見られるように、ＩＤＰＳＣは、イヌ筋肉中のヒトジストロピン染色によって示されるように、注射ＧＲＭＤ犬の筋細胞に分化し、そしてこれらと融合した。
【０２２７】
実施例８．  マウス骨髄におけるＩＤＰＳＣホーミング
各試験株（ｎ＝４）１０６細胞でＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝１５）の腹腔内注射後、生着する能力によって、ＩＤＰＳＣをさらに性質決定した。ＩＤＰＳＣ注射の２週間後にマウスを屠殺した際、これらの細胞の高密度の生着がマウス骨髄において観察された（図２３）。
【０２２８】
実施例９．  マウス精巣における精子形成の支持細胞および精原細胞様細胞へのＩＤＰＳＣの分化
ＩＤＰＳＣが未分化である際、セルトリ細胞の重要なマーカー、例えばデスミン、ビメンチンおよびサイトケラチン−１８およびＣＤ２９（インテグリン・ベータ１）を発現するのは興味深いことであった（図２４）。このデータから、これらの細胞は、セルトリ細胞および精原細胞の他のタイプに分化する能力を試験することを正当化する、すべての利
点を有する可能性が高いようであった。パイロット実験において、図２５に概略するように、ヒトＩＤＰＳＣ（ｈＩＤＰＳＣ）の２つの培養を、繁殖性および不妊（放射線照射による）マウス精巣内に移植した。
【０２２９】
細胞懸濁物（１０５細胞）を蛍光色素Ｖｙｂｒａｎｔ（図２６Ａ〜２６Ｂ）で染色し、そして正常マウス精巣またはガンマ照射によって不妊にしたマウス精巣（系統ＣＤ−１）に注射した。照射（１５０ラド）を３回（１ヶ月）行い、そして照射１ヶ月後、細胞を適用した。対照マウスには生理食塩水溶液を注射した。注射３日後および９日後に動物を屠殺した。ルーチンのプロトコルを用いて、薄層凍結切片（５μｍ）を用意した。色素Ｖｙｂｒａｎｔによって放出される蛍光によって、マウス精巣中のＩＤＰＳＣの存在を評価した。
【０２３０】
繁殖性マウスにおいて、注射１日後、細胞は主に、ライディッヒ区画およびセルトリ細胞中で検出された（図２６Ｃ〜２６Ｅ）。３日後および９日後、ＩＤＰＳＣは、管腔近くで見出され、ここには通常、より分化した精原細胞が位置する（図２７および２８）。ＩＤＰＳＣは、これらの区画内にクラスター分布を示し、そして蛍光は、いくつかの管領域（ＴＳ）でのみ観察され、ＩＤＰＳＣの存在を示した；が、マウスにおいてＴＳの大部分は、細胞の徴候をまったく示さなかった。対照マウスにおいて、生理食塩水を注入したＴＳでは、蛍光シグナルはまったく観察されなかった（図２７Ｃ）。不妊マウスにおいて、ＩＤＰＳＣを照射精巣に注射した９日後、ＩＤＰＳＣは主に、高密度の結合組織で構成される白膜の移植したＴＳの末梢部分で観察された（図２９）。
【０２３１】
ＩＤＰＳＣの注射９日後、ヒト生殖様細胞の形成が観察された。ＩＤＰＳＣを特異的に認識する抗ＩＤＰＳＣ抗体（緑色）を用いて分析を行った（図２９Ｃ）。四分染色体の存在が観察され、減数分裂の発生が示された（図２９Ｄ〜２９Ｄ１）。
【０２３２】
Ｖｙｂｒａｎｔ（赤色）で染色されたＩＤＰＳＣからの発生の異なる段階での生殖様細胞の形成もまた観察された（図３０および３１）。ヒトＸ染色体プローブを用いたＦＩＳＨ分析は、関心対象の区画でのヒトＸ染色体の存在を示す（図３２）。しかし、ヒトおよびマウス細胞間の融合も発生する可能性があり、そして四倍体細胞が減数分裂を通じてどう進行するかを想像することは困難である（図３３）。
【０２３３】
本発明者らは、Ｖｙｂｒａｎｔ染色ＩＤＰＳＣ（赤色）および緑色に染色されるマウス精巣から単離された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した際、これらの間の融合を観察した。これらの細胞の間の融合は、細胞質の二重染色で、またヒトおよびマウス細胞に対応する別個の形態を示す核を含む、二核細胞の存在で観察された（図３３Ａ〜３３Ｂ１）。
【０２３４】
さらに、本発明者らは、ｈＩＤＰＳＣが、不妊マウスにおいて、６０日後、セルトリ、ライディッヒおよび筋様細胞の部位に、集合することが可能であり、前述の形態学的特性を示すことを示した（データ未提示）。
【０２３５】
実施例１０．  ＩＤＰＳＣを用いた、ネコにおける腎不全の治療
雄のペルシャ猫、年齢１１歳が、中程度の脱水、多尿、多飲、食欲喪失、無感情、および体重喪失の症状を提示したことによって、臨床ケアのため、動物病院を訪れた。バイタルパラメータの身体検査によって、水和の度合いの変化が示され、これはほぼ７％であった。腎機能の評価を行い、尿素＞２５０ｍｇ／ｄｌ、クレアチニン１１．１ｍｇ／ｄｌ、尿比重１０１２と測定され、そして腎臓の超音波評価によって、どちらも皮髄境界部の部分的喪失、小さいサイズ、皮質エコー輝度増進を示した。腎臓の測定値は、それぞれ左および右で、幅１．７ｃｍ、長さ２．０ｃｍ、および幅２．０ｃｍ、長さ２．５ｃｍであった。組織学的変化は観察されなかった。
【０２３６】
慢性腎不全（ＣＲＦ）の臨床診断が記載された後、電解質（Ｎａ）１５５ｍｇ／ｄｌ、（Ｋ）３．０ｍｇ／ｄｌ、（Ｃａ）イオン化８．４ｍｇ／ｄｌ、および（Ｐ）７．７ｍｇ／ｄｌと測定された。３．５ｍｌの塩化カリウム（１９．１％のＫＣｌ溶液）、２ｍＬの化合物Ｂおよび０．５ｍＬのラニチジンを加えた２５０ｍｌのリンゲル乳酸（ＲＬ）の静脈内注射によって、即時支援治療を開始した。カリウム以外は、この療法を最初の１２日間維持し、そして次いで、０．５ｍＬの皮下（ＳＣ）ラニチジン投与を開始した。この期間中、支持療法開始の５日後に、臨床的改善が観察され始め、そして尿素およびクレアチニンの濃度は、それぞれ、最小限１７４．１ｍｇ／ｄｌおよび５．３ｍｇ／ｄｌに到達した。動物は、走り去って遊び、そして正常酸素圧（ｎｏｒｍｏｒｅｘｉａ）を示したが、なお多尿／多飲を有した。
【０２３７】
ＩＤＰＳＣ療法
最初のヒトＩＤＰＳＣ療法は、療法支持開始の２７日後に行い、第二および第三は４１日後および５０日後であった。最初の細胞療法中、動物には、１ｍＬの無菌リン酸溶液中で希釈した未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣの２ｘ１０６を投与し；０．６ｍＬは腎内（右腎臓のみ）に適用し、そして０．４ｍＬは皮下適用した。この方法のため、動物に５ｍｇ／ｋｇモルヒネの鎮痛剤を投与し、そして水槽中、吸入麻酔剤、イソフルランで誘導した。
【０２３８】
ＩＤＰＳＣ療法後の１２日間の間、そして上述の支持治療をなお受けながら、動物は、変化なく、そしていかなる他の特定の治療も受けずに、臨床像を有した。ＩＤＰＳＣ療法の１ヶ月後、８０％の改善が観察された。動物は、尿排出および水摂取の減少を示した。この期間中、尿素およびクレアチニンの濃度は、それぞれ、最低値の１７２ｍｇ／ｄｌおよび４．４ｍｇ／ｄｌに到達した。
【０２３９】
第二のＩＤＰＳＣ療法は、最初のものの４３日後に、同じ条件下で行われた。第二の細胞療法の２９日後、動物はよい状態のままだった。第二の療法の３０日後、ＣＴスキャンは、無感情および正球性／正色素性の図を示し、再生性でないことを示した。
【０２４０】
第三の細胞療法を、第二の細胞療法の５０日後に、同じ条件で行い、そして動物はよい状態であった。第三の細胞療法の７日後、動物は元気で、よく遊び、体重を増やし、正常酸素状態であり、そして正常尿（ｎｏｒｍｕｒｉａ）正常飲量（ｎｏｒｍｏｄｉｐｓｉａ）であった。この期間中、尿素およびクレアチニン濃度は、それぞれ、最低値の１３６．２ｍｇ／ｄｌおよび３．８ｍｇ／ｄｌに到達した。
【０２４１】
第三の細胞療法の４ヶ月および１２日後、動物は、それぞれ、１９８．１ｍｇ／ｄｌおよび４．４ｍｇ／ｄｌの尿素およびクレアチニン濃度を示した。この期間後、動物は無感情を示し始め、しばしば、嘔吐および蒼白色の粘膜のエピソードを示したが、多尿／多飲は示さず、そして体重は安定なままであった。エリスロポエチンでの処置は、２０００ＩＵ用量の１００ＩＵ／ｋｇを週３回で開始され、そして新規の推奨があるまで、Ｃｏｍｂｉｒｏｍを２４ｍｇ／ｍＬおよび１／２ｍＬ  ＢＩＤを処方された。処置１６日後、血球数は正常に戻り、そして動物は元気であった。
【０２４２】
図３４〜３６において、細胞療法中の尿素、クレアチニンおよび電解質の変動を要約する。測定を１２回行い、そして数字４、７および９は、ＩＤＰＳＣ移植に相当する。図３５は、ＩＤＰＳＣ細胞療法が、クレアチニンレベルを安定化させ、これは低く、そして安定に維持されることを示す。尿素のレベルは、この期間中、変動を示したが、長期にわたって減少する傾向を示し（図３４）、電解質も同様である（図３６）。
【０２４３】
さらに１ヶ月後、動物は、筋肉の脱力感および腹頸部屈曲および嘔吐を示して受診した
。静脈内リンゲル乳酸、０．３ｍＬのＰｌａｓｉｌ、およびカリウム補充液３ｍＬ（１９．１％  ＫＣｌ溶液）で、０．５ｍＥｑ／ｋｇ／時間の速度を超えずに、液体療法を開始した。４時間後、動物は、発作を起こし、そして死亡した。動物が到着した際に検査を行い、カリウム４．１ｍｇ／ｄｌ、尿素１５６ｍｇ／ｄｌおよびクレアチニン４．４ｍｇ／ｄｌが示され、全処置中に値を維持する処置を取ったため、死亡のありうる原因は腎不全ではないことが示された。
【０２４４】
死亡後まもなく、飼い主の許可を得て、腎臓を取り除き、そして１０％ホルムアルデヒド中で固定した。巨視的には、右および左の腎臓のサイズに有意な相違があり（図３７Ａ）、左の腎臓は、不規則な外見の新生物が顕著であり（図３７Ｂ）、そしてコンシステンシーは左の腎臓と類似であった。この相違は、超音波によって先に観察された。
【０２４５】
組織学的評価によって、腎内注射を通じてＩＤＰＳＣ移植を受けた右の腎臓、および左の腎臓の間に、有意な相違が示された（図３８）。左の腎臓は、糸球体の基底膜肥厚および糸球体の糸球体間質増殖（図３８Ａ２）を伴う、広範な線維症（図３８Ａ〜３８Ａ１）を示す。右の腎臓は、最小限の線維症（図３８Ｂ１）および保持された糸球体（図３８Ｂ２）を伴う、より保持された形態（図３８Ｂ）を示す。ＩＤＰＳＣ移植の他の陽性の効果の中で、右の腎臓における血液浸潤（赤色）は、図３８Ｂ１および３８Ｂ２で観察されるように明らかであった。さらに、図３８Ｂ２は、図３８Ａ２では見られない、糸球体内皮細胞の保存を示す。
【０２４６】
ネコ腎臓におけるＩＤＰＳＣの存在は、抗ＩＤＰＳＣ抗体を用いた免疫蛍光分析によって確認された（図４９Ａ〜３９Ｃ）。
【０２４７】
実施例１１．  迅速な皮膚リモデリングおよび瘢痕形成の防止におけるＩＤＰＳＣの影響
ＬＰ増進緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグ化ＩＤＰＳＣ（ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣ）を記載されるように培養した（Ｌｉｚｉｅｒら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３９８８５）。Ｓｗｉｓｓマウス（８週齢；雌；体重２０〜２３ｇ）を用いた。動物をランダムに３つの群に分け、そして切除創傷副子固定モデルを生成した。簡潔には、１２匹のマウスにおいて、腹部表面から毛を除去し、そして麻酔した後、２つの５ｍｍの完全な厚さの切開皮膚創傷を、正中線の各側に生成した。各創傷に、１００μＬのＰＢＳ中に希釈した１０５細胞（ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣ）を投与し、そして細胞を４つの注射部位で、創傷周囲に皮内注射した。対照群はＰＢＳのみを投与された。免疫抑制プロトコルは適用されなかった。切開をナイロン（４−０）で縫合した（ｓａｔｕｒａｔｅｄ）。動物を個々に飼育した。本発明者らは、本実験前に、マウスの皮膚に対して接着剤を試験し、そしていかなる皮膚刺激またはアレルギー反応も観察されなかった。動物を７日後に安楽死させた。
【０２４８】
組織学的検査を以下のように行った。組織標本を３％パラホルムアルデヒド中、２４時間固定し、そして最適切断温度を確実にする、凍結組織に用いる包埋媒体、ＯＣＴ中に包埋した。光学顕微鏡用に、厚さ６ミクロンの切片をＨ＆Ｅおよびマッソンの三色染色剤で染色した。ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣ生着におけるＧＦＰ発現の分析を、共焦点顕微鏡によって行った。
【０２４９】
組織学的に、最適な側面は、局所送達を通じて、ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣを投与された群で観察された。この群では、よく組織化された組織が、上皮、真皮、および皮下組織を形成することが観察された。生着免疫拒絶の徴候は検出されなかった。
【０２５０】
伸張した原線維の形のコラーゲンが、通常、皮膚に見られうる。マッソンの三色染色剤
による染色は、皮膚におけるコラーゲンの存在を立証し、これは、傷害を受けた部位にＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣを局所送達することによってリモデリングされた。対照的に、対照群は、皮膚リモデリングを示さなかった（図４０）。
【０２５１】
共焦点顕微鏡は、小さい血管、毛包の膨らみの周囲、および皮脂腺中に、ＬＰ  ＥＧＦＰ−ＩＤＰＳＣのロバストな生着を示した（図４１）。ＰＢＳのみで処理した皮膚細胞の共焦点顕微鏡検査で得られる画像を、比較のため、図４２に示す。
【０２５２】
実施例１２．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ網膜分化
神経網膜は、外胚葉細胞、ならびにＤＰおよびＤＰ由来ＩＤＰＳＣと同じ起源のものからなるため、これらの細胞、網膜およびＩＤＰＳＣのどちらも、ＩＤＰＳＣを中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンだけでなく、網膜幹細胞および網膜ニューロン様細胞に生じさせることを可能にしうる、共通の胚性「記憶」を保持しうる。
【０２５３】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣの神経原潜在能力の研究によって、これらの細胞がより制御されたタイプの分化の必要性を提示し、そしてレチノイン酸で神経原性誘導を誘導すると、適切に反応することが示された。誘導されたＬＰ  ＩＤＰＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏでプレーティングすると、さらなる分化が観察され、そして細胞の大部分は、未成熟ニューロンのマーカーであるβ−チューブリンＩＩＩを発現した。さらに、多くのプレーティングされた細胞は、成熟ニューロンまたはグリア細胞のマーカーを発現した。
【０２５４】
脊椎動物において、網膜は、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部と見なされる。しかし、網膜は神経細胞の特殊なクラスであり、そしてシナプスによって相互連結されたニューロンのいくつかの層を含む重層構造である。網膜は光受容体細胞を生じ、これらは光に直接感受性であるニューロンである。３つのタイプの網膜ニューロンは：桿体細胞、錐体細胞、および神経節細胞と同定されうる。桿体細胞は、白黒の視覚を提供し、錐体細胞は、日中の視覚および色の知覚を補助し、そして光感受性神経節細胞は、明るい昼光に対する反射反応に重要である。
【０２５５】
ニューロンおよび網膜細胞は、広い範囲の特異的なマーカーが異なり、そして網膜細胞は、初期神経細胞マーカーを発現可能であり、神経細胞は神経マーカー（例えばネスチンおよびβ−チューブリンＩＩＩ）のみの発現によって限定されない（図４３）。ＥＰ  ＩＤＰＳＣは、神経細胞に分化することのみが可能であり、一方、ＬＰ  ＩＤＰＳＣは神経および網膜分化の両方を示した（図４５〜４７）。
【０２５６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで網膜細胞に向かうＬＰ  ＩＤＰＳＣ分化のプロトコル
ＬＰ  ＩＤＰＳＣを維持し、そしてＬｉｚｉｅｒら、２０１２に記載されるようにｉｎ
ｖｉｔｒｏ拡大した。ＬＰ  ＩＤＰＳＣからニューロスフェアを得て、これを２５ｃｍ２の培養フラスコ中、７０％の半集密に到達するまで増殖させた。次いで、細胞をトリプシン処理し、そして２つの３５ｍｍペトリ皿に分け、１％アガロース（Ｓｉｇｍａ）であらかじめ処理し、これはプレートの底に薄層を形成した。３％Ｂ２７を補った神経基本培地（どちらもＧｉｂｃｏ）を用いた。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、加湿大気中、３７℃で３日間、インキュベーションした。ひとたび形成されたら、ニューロスフェアを他のプレートに移し、そしてＩＤＰＳＣ基礎培地中で接着させるため、カバースリップ上にプレーティングし、翌日、ＮＢ＋Ｂ２７に交換した。接着したニューロスフェアを、ニューロスフェアから細胞がアウトグロースを開始するまで、ＮＢ＋Ｂ２７＋０．５μＭレチノイン酸培地に５日間、維持した。次に、０．２５％トリプシンを用いて、酵素消化を行い、そして細胞を３５ｍｍの新規ペトリ皿に植え付け、同じ培地であるが５μＭレチノイン酸添加を伴わずにさらに１０日間維持し、そして培地を３日ごとに交換した。細胞培養をさらに５日間維持し、そして次いで、４％ホルムアルデヒド中で固定した。
要約したプロトコルを図４４Ａ〜４４Ｆに示し、そして分化のタイムラインを図４４Ｇに示す。
【０２５７】
分化の第１５日、ＥＰおよびＬＰの間の網膜細胞に向かう分化の相違を観察し、そして図４５および４６に示す。ＥＰ  ＩＤＰＳＣはロバストなニューロン分化を示し、主なマーカー、例えばベータ−チューブリンＩＩＩおよびＧＦＡＰを発現する（図４７）。
【０２５８】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣのＣＤ７３（エクト−５’ヌクレオチダーゼ）の発現を、免疫蛍光によって評価し、これもまた網膜細胞の前駆体と近年報告された。ＭＳＣのマーカーであるビメンチンの発現もまた評価した。どちらのマーカーもＬＰ  ＩＤＰＳＣで陽性であった（図４８）。
【０２５９】
提唱されるＩＤＰＳＣの神経冠胚性起源を考慮すると、網膜細胞の特異的マーカー、例えばＰａｘ−６、Ｃｈｘ−１０、Ｃｒｘ、Ｎｒｌ、カルビンディンおよびロドプシンの発現もまた、免疫蛍光（図４９）およびフローサイトメトリー（図５０）によって決定した。これらのマーカーは、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいては発現されなかった。
【０２６０】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣによって形成される接着ニューロスフェアは、続いて、多量に細胞を放出し、この中のいくつかは、ニューロンに類似の形態を持つ細胞を有した。約５日間培養した後、本発明者らは、接着ニューロスフェアが、スフェア周囲の細胞の非常に濃縮された領域を提示することを観察した。本発明者らは、細胞を継代し、そしてプレートで網膜様細胞が濃縮されるように、ＮＢ＋Ｂ２７およびＲＡ中、これらの細胞をさらに１０日間培養した。細胞は、異なるタイプの神経細胞に類似の形態を示した（図５１）。
【０２６１】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣの量および酵素的解離の時間を変化させると、本発明者らは、この変動に応じて、結果が非常に異なりうることを観察した。本発明者らは、短時間の酵素消化下、ＣＮＳ自体の神経細胞または胚性幹細胞由来のものと非常に類似の形態を示す、二次ニューロスフェアの形成が起こることを観察した（図５２）。
【０２６２】
分化した細胞を評価するため、本発明者らは、免疫蛍光アッセイを行い、まず、細胞外アデノシン５’−一リン酸のアデノシンへの変換を触媒する、エクト−５’−ヌクレオチダーゼとしても知られるＣＤ７３の発現をチェックした。これは錐体および桿体両方の前駆体の細胞表面マーカーである（ＫＯＳＯら、２００９）。図５３は、ニューロスフェアおよび分化細胞におけるＣＤ７３の発現を立証する。
【０２６３】
次に、本発明者らは、転写因子であり、その局在が主に、細胞の核および核周辺領域である、ＰＡＸ−６を分析した。この分化段階に特徴的である、核および細胞質の間の高い比のため、前駆細胞上で、細胞質発現を視覚化することも可能である。このマーカーの発現は、すべての細胞では起こらなかった。到達した成熟段階に応じて、このマーカーに関して陰性である多くの細胞がある（５０％）（図５４）。
【０２６４】
Ｐａｘ−６同様、Ｃｈｘ−１０もまた、網膜初期発生の前駆体の分化に関与する転写因子である。本発明者らは、Ｃｈｘ−１０陽性細胞の数が、Ｐａｘ−６よりも多く、そしてほぼ８０％のＣｈｘ−１０陽性細胞に到達することを観察した（図５５）。Ｃｈｘ−１０は、転写因子Ｃｒｘを活性化する。遺伝子Ｃｒｘは、光受容体発現と協調する転写因子をコードし、そして光受容体前駆体のマーカーと見なされ、そして核および核周辺領域に発現される（図５６）。
【０２６５】
遺伝子Ｃｒｘは、別の転写因子Ｎｒｌを活性化し（図５７）、この分子は網膜ニューロンにおいて発現され、そしてロドプシン遺伝子プロモーターに連結することによって、ロ
ドプシンの発現を促進する。発生中、中枢神経および末梢系全体で発現されるが、成体期には、新皮質および網膜ニューロンに制限される。網膜細胞で発現される次のマーカーはカルビンディンであり、これは、カルシウム結合ビタミンＤ依存性タンパク質としても知られ、そして神経組織および水平網膜細胞において発現される。リカバリンは、カルシウムリガンド光受容体タンパク質であり、そして発光適応に必要な酵素であるロドプシンキナーゼ活性の制御に関与する。本発明者らは、このタンパク質を発現するいくつかの細胞を見出した。カルビンディンおよびリカバリンはどちらも、細胞質に局在する（図５８〜５９）。
【０２６６】
最後に、光受容体の視覚色素であるロドプシンは、光子の吸収に、より具体的には、明／暗の適応に関与する。その局在は、細胞質により多く、また、コアでも見られうる。このタンパク質を発現する細胞の量はまた、網膜前駆体ではるかにより低かった（図６０）。
【０２６７】
したがって、本発明者らは、網膜前駆体および成熟細胞における、ＬＰ  ＩＤＰＳＣのブレークスルーｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化に到達したと結論づけ可能である。
【０２６８】
免疫蛍光およびフローサイトメトリーは、他の実施例、ならびにＫｅｒｋｉｓら、２００６およびＬｉｚｉｅｒら、２０１２に用いられるものと同じである。用いた抗体のリストを以下の表１〜３に示す。
【０２６９】
表１．  分化したＩＤＰＳＣ細胞の画像化に用いた抗体。
【０２７０】
【表１】
2019116490.tif 000002
【０２７１】
表２．  分化したＩＤＰＳＣ細胞の画像化に用いた抗体。
【０２７２】
【表２】
2019116490.tif 000003
【０２７３】
表３．  分化したＩＤＰＳＣ細胞の画像化に用いた抗体。
【０２７４】
【表３】
2019116490.tif 000004
【０２７５】
実施例１３．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣからの膵臓細胞前駆体の産生
外胚葉起源である膵臓β細胞は、外胚葉、神経冠起源であるニューロンと共通の特徴を共有することが、以前示されてきている（Ｙａｎｇら、１９９９；ＴｅｉｔｅｌｍａｎおよびＬｅｅ、１９８７；Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら、１９９０；Ｄｅ  Ｖｒｏｅｄｅら、１９９０）。これらのデータによって、歯科組織は、インスリン産生細胞の生成のための幹細胞のありうる供給源でありうることが示唆される。したがって、酵素消化を用いて得られた乳歯由来のＤＰＳＣが、膵臓様β細胞に分化可能であることが報告された（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら、２０１１）。したがって、この研究は、いくつかの疑問を生じた。ランゲルハンス島は、内分泌（すなわちホルモン産生）細胞を含有する膵臓領域であり、膵臓質量のおよそ１％〜２％を構成する。これらの島は、ホルモンを産生する５つの異なる細胞タイプで構成される。
【０２７６】
ＥＳ細胞を用いる、現在使用される分化プロトコルの大部分は、それぞれのリガンドでの処理を通じた、胚性シグナル経路の連続活性化または阻害に頼る。細胞シグナル伝達分子を機能的に模倣しうる、生物学的に活性な低分子量化学化合物を同定する、別のアプローチが取られてきている。
【０２７７】
本発明者らは、ＬＰ  ＩＤＰＳＣが、異なる神経マーカーセット、例えばＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ならびに低アフィニティ受容体、ｐ７５ＮＴＲ（ＣＤ２７１）を発現することを立証した。したがって、正常な膵臓神経組織はまた、ニューロトロフィンのいくつかも発現する（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら  ２００１）。あるいは、ＮＧＦは、インスリン分泌膵臓ベータ細胞株のニューロン様分化を誘導することも可能である（Ｐｏｌａｋら、１９９３）。膵臓ベータ細胞が、胚性内胚葉から生じると、ＮＧＦによるインスリン分泌性膵臓β細胞の分化の誘導は、内分泌および神経細胞が、発生経路を共有することを示す。ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、神経および網膜細胞へのロバストな分化を示し、これは膵臓細胞へのＬＰ  ＩＤＰＳＣ集団の潜在的な能力を強く支持する。
【０２７８】
表４において、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣおよび異なる膵臓細胞におけるいくつかのニューロトロフィンおよび初期神経マーカーの発現パターンを提示する。膵臓細胞およびＬＰ
ＩＤＰＳＣにおけるこれらのマーカーの発現パターンの間の重複が明らかである。これは、ＬＰ  ＩＤＰＳＣが、幹細胞の潜在的に限定されない供給源であり、インスリン産生内分泌細胞ならびに外分泌細胞（導管／小導管）および膵臓ニューロンへの拘束を示すことを示す。
【０２７９】
何人かの著者らは、解剖学的起源が別個であるため、膵臓β−細胞およびニューロンの間の類似性に関する言及を認めなかった（Ｈｅｂｒｏｋ、２０１２）。この仮定に反して、胎児発生中に、内胚葉組織を含む３つの胚葉に寄与するＬＰ  ＩＤＰＳＣを、以下の実施例１５で立証し、そして提示した（ＬＰ  ＩＤＰＳＣの子宮内移植）。ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、インスリン産生（内分泌）細胞を産生するか、または外分泌細胞のための細胞基礎を提供するかまたは両方が可能である。これら、またはニューロトロフィンが豊富なこれらの細胞の上清を、ＥＳ細胞と組み合わせて用いて、適切な細胞ニッチを生成する膵臓細胞分化に有用な多様な因子を提供することも可能である。ＥＳ細胞に勝るＬＰ  ＩＤＰＳＣのさらなる利点は、これらがＭＳＣであり、そしてまた、多数のパラクリン機構を通じて作用可能であることである。
【０２８０】
総合すると、これらの事実は、島細胞の増殖性分化を誘導することによって、糖尿病のいくつかのタイプの療法的治療の基礎を形成することを示す。
【０２８１】
表４．ＬＰ  ＩＤＰＳＣおよび膵臓細胞において観察される一般的なマーカーの発現
【０２８２】
【表４】
2019116490.tif 000005
【０２８３】
−−−−陰性；＋弱い；＋＋中程度；＋＋＋強い；ｎ／ａ−未分析
実施例１４．  子宮内幹ＩＤＰＳＣ移植（ＩＵＳＣＴ）
本発明者らは、本明細書において、ひとたびＩＤＰＳＣを子宮中の胎児内に移植すると、胎児全体に分布しながら、未分化型および分化型で生存し続けることを示し、そして他の実施例において、多組織特異的分子マーカーおよびロバストな分化潜在能力で特徴付けられる、ユニークな多系譜志向のため、多数の細胞タイプに発展することを示す。
【０２８４】
やはり驚くべきことに、ＩＤＰＳＣおよびその分化した子孫は、免疫適格宿主によって拒絶されず、そして不適切な分化に変化せず、適切な宿主ニッチ協調方式で適宜、分化した。したがって、本発明者らは、ＩＤＰＳＣの多系譜志向が、ｉｎ  ｖｉｖｏ分布、ならびに多数の組織および臓器内でのＩＤＰＳＣ生着によって証明されると結論づける。
【０２８５】
開示する結果によって、子宮内経路を通じて、治療のための有効量で、胎児に投与することによって、細胞療法のためのＩＤＰＳＣの使用が支持される。
【０２８６】
驚くべきことに、トランスフェクションされたＧＦＰタグ化ＩＤＰＳＣは、胎児および
胎盤組織に分布する。１つの態様において、本開示は、外因性遺伝物質をＩＤＰＳＣに形質導入する工程を含む、遺伝子修飾されたＩＤＰＳＣを得る方法、および遺伝した遺伝子障害および／または獲得障害の治療のため、外因性遺伝子によってコードされる療法タンパク質のための送達系としての、修飾ｈＩＤＰＳＣ送達系の使用に関する。
【０２８７】
骨髄から単離されるが、続いて、脳、筋肉、および臍帯血を含む他の組織において確立可能であるが歯髄では確立されない前駆体である、多分化能成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）は、子宮中でリソソーム障害を治療することが示されてきている（米国特許第７，９２７，５８７号を参照されたい）。ＭＡＰＣおよびＬＰ  ＩＤＰＳＣの間の驚くべき異なる特性には、以下が含まれる：
・ＩＤＰＳＣはＲｅｘ１を決して発現しない。
【０２８８】
・ＭＡＰＣはまた、ＣＤ４４に関して陰性である。
【０２８９】
・ＭＡＰＣは、ネスチン、およびＬＰ  ＩＤＰＳＣが特徴付けられる多くの他の因子を発現しない。
【０２９０】
・ＭＡＰＣ純度は、ＩＤＰＳＣにおけるような高純度の集団を得るために、細胞選択法の使用を必要とするが、この工程は、ＩＤＰＳＣでは不要である。
【０２９１】
・ＩＤＰＳＣが、精製法の必要性を伴わずに、十分な多系譜志向を有することは、重要な相違である。
【０２９２】
・さらに、ＭＡＰＣを用いると、あらかじめ分化した細胞のみが用いられ、そしてＭＡＰＣ生着の匹敵するレベルは低い。
【０２９３】
・ＩＤＰＳＣは、いかなる選択も伴わずに高レベルの生着を示し、これはこれらが「幹細胞」であることを意味する。例えば、本明細書に開示するのは、幹細胞ニッチ、例えばその起源の組織（ＤＰ）ではない、例えば筋組織にホーミングする能力を有する、サテライト細胞である、未分化ＩＤＰＳＣの使用である。言い換えると、これらは「真の」幹細胞である！
顕著なことに、本発明者らは、子宮中の実験中、分化および未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣの分布および生着を検出した。これらが分化する際、これらはこれを適切に行い、例えば心臓組織において、これらは適切なマーカーを発現するが、上皮のマーカーであるＣＫ１８を発現しない。これらは、ＣＤ４５を発現するヒトリンパ球に分化することが示された。本明細書に開示するのは、ロバストな多臓器生着および組織にマッチした分化である。比較すると、ＭＡＰＣは、分化する、より限定された能力を示す：
・ＭＡＰＣのＩＵＴトランスファーは、上皮細胞タイプへの分化を生じなかった。
【０２９４】
・肺生着同様、ＭＡＰＣは、腸に存在した；しかし、サイトケラチン染色もまた陰性であり、ＭＡＰＣが腸上皮に分化しなかったことを示す。
【０２９５】
・ＭＡＰＣはまた、心臓および骨格筋でも見られ、ならびに脾臓および皮膚にも見られたが、いかなる分化も示さなかった。
【０２９６】
・脳において、ＭＡＰＣは、星状細胞およびオリゴデンドロサイトに分化したが、ニューロンには分化せず、そして神経栄養因子を発現しなかった。対照的に、ＩＤＰＳＣを用いるとプルキニエ細胞および脳血管が観察された。
【０２９７】
要約すると、本明細書に開示するのは、多系譜志向ＩＤＰＳＣ、または分化したその子
孫を、単回または組み合わせた生物学的治療（すなわち、これらは他の再生または療法剤と混合してもよい）として、薬学的キャリアー中で投与して、好ましい細胞タイプへの分化を促進する、ロバストな方法である。これはまた、生着または遺伝子送達が、胎児における臓器系の発生進行にしたがって望ましい場合に好適でありうる。
【０２９８】
いくつかのモデルにおいて、子宮内移植のため、異なる起源の細胞が用いられてきている。イヌモデルにおける、１ｘ１０８／ｋｇ  ＣＤ３４＋父性イヌ骨髄由来細胞の子宮内移植は、多様な組織において、低レベルの微小キメラ化（１％）を達成した（Ｂｌａｋｅｍｏｒｅら、２００４）。ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋濃縮幹細胞を４５〜６０日齢のヒツジ胎児腹腔内に移植すると、生後１〜３ヶ月で１８％の生着が達成された（Ｙｏｕｎｇら、２００３）。妊娠第１３日または第１４日に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重症複合免疫不全症）マウスに移植されたヒト胎児肝臓単核細胞または胎児骨髄由来ＣＤ３４＋細胞は、それぞれ、８週齢のレシピエントの１２％で多系譜ヒト造血生着を生じた（Ｔｕｒｎｅｒら、１９９８）。ヒト胎児間葉系幹細胞を第１４日〜第１６日のデュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウス胎児に移植すると、多数の臓器で、広範囲の長期（１９週間）移植が生じた（Ｃｈａｎら、２００７）。ネズミ胎児に移植された胚性幹細胞は、低レベル（０．４％）のキメラ化を達成した（Ｍｏｕｓｔａｆａら、２００４）。妊娠末期胎盤由来のヒト胎盤由来羊膜および漿膜細胞もまた、新生ブタおよびラットにおける移植に成功し、移植後、低レベルのキメラ化を示した（Ｂａｉｌｏら、２００４、Ｃｈｅｎら、２００９）。
【０２９９】
Ｌｉｅｃｈｔｙおよび同僚ら（２０００）は、妊娠開始時のヒツジにおいて、ヒト骨髄間葉系幹細胞のＩＵＴを行った。この研究は、いくつかの組織において、異種ＭＳＣ生着を示し、これは、移植後１３ヶ月間持続した。移植された細胞は、分化を経て、移植部位で、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞、および心筋細胞、骨髄および胸腺間質細胞になった。この研究によって、ＭＳＣは、その多分化能を維持することが可能であり、そしてさらに、免疫学的拒絶を伴わない、そのユニークな免疫学的特性が示された（Ａｌｍｅｉｄａ−Ｐｏｒａｄａら、１９９６、ｂ、２００２；ＬＩＥＣＨＴＹら  ２０００）。続いて、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＆  Ｆｌａｋｅ（２００１ａ、ｂ  ２００２）はこれらの結果を確立した。しかし、どちらの研究においても低レベルのキメラ化が観察された。
【０３００】
別のグループは、妊娠第１４日に、ヒツジ子宮において、同種ＭＳＣ移植を行い、これはまた低レベルのキメラ化を生じたが、多数の臓器における生着を示した（ＳＣＨＯＥＢＥＲＬＥＩＮら、２００５）。
【０３０１】
妊娠第１４日にヒト骨髄ＭＳＣをマウス子宮に移植した際、これらは、三胚葉由来のすべての組織に生着を示し、これは４ヶ月後まで維持された。ＣＤ４５＋細胞（ヒトリンパ球マーカー）が、マウス末梢血において検出されたことに言及することが重要である（Ｃｈｏｕら、２００６）。この研究によって、ＭＳＣの集団が、適切な環境において血液細胞に分化可能な前駆細胞を含有しうることが示唆される。
【０３０２】
哺乳動物において、心臓発生のための骨髄ＭＳＣの有用性を調べるため、胎児および成体起源のこれらの細胞をヒツジ胎児中に腹腔内注射した。成体骨髄または胎児肝臓および脳から単離されたＭＳＣの移植片の間で、相違はまったく観察されなかった。大部分のヒト細胞は、プルキニエ線維に移植された。およそ４３．２％のプルキニエ線維がヒト起源であり、対照的に、わずか０．０１％の心筋細胞がＭＳＣのものであった（Ａｉｒｅｙら
２００４）。
【０３０３】
妊娠の最初の三半期に、末梢血から単離されたヒト胎児ＣＴＭを、多発性骨折を生じ、そして現在対照療法的にしか治療されない骨形成不全（ＨＩ）のホモ接合性マウスの子宮
に適用した。ドナー細胞は、動物骨において見られ、そして細胞外構造タンパク質、骨オステオポンチンを産生する骨芽細胞系譜の遺伝子を発現する。治療後、骨折および骨格異常の顕著な減少が観察された（ＧＵＩＬＬＯＴら、２００８）。
【０３０４】
ヒト羊膜および胎盤から得たＭＳＣもまた、ＩＵＴの動物モデルにおいて用い、多様な臓器における遊走および局在が明らかであったが、移植は低レベルのままであった（Ｈａｎら、２００８、Ｃｈｅｎら）。脂肪組織由来ＭＳＣは同様の低い生着を示した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、２０１２）。
【０３０５】
羊水から得たＭＳＣの自家移植を、ＧＦＰ陽性幹細胞を用いてヒツジにおいて実行し、細胞は、心臓、肝臓、胎盤膜、臍帯、副腎および筋肉を含む胎児組織中で検出された（Ｓｈａｗら  ２０１０）。
【０３０６】
ウサギ胎児肝臓から得た同種ＭＳＣを、２つの投与経路：肝臓内および羊膜内によって行った。移植片を、１０日後および１６日後に研究し、そしてこれらの細胞の低い移植が観察され、これらは、にもかかわらず、１６週間持続した（Ｍｏｒｅｎｏら、２０１１）。
【０３０７】
ヒトＥＳ細胞が機能するニューロンにｉｎ  ｖｉｖｏで分化する能力をチェックするため、これらの細胞を、妊娠第１４日のマウス胚の側脳室中に移植した。この研究によって、ＥＳ細胞がマウス脳内に組み込まれ、そして主に、実質および機能性ニューロンに位置する星状細胞を産生することが可能であることが示され、これらは、顔の流れに沿って脳室下で遊走することが見出され、そしてまた嗅球にも見られたが、脳におけるこれらの移植片は、＞０．１％と低かった（Ｍｕｏｔｒｉら  ２００５）。
【０３０８】
歯髄幹細胞の利点は、歯髄が胚性起源であることによる。頭蓋顔面組織は、神経冠から生じ、これは、一過性の胚性構造である。現在の知識によれば、神経冠幹細胞（ＮＣＳＣ）は、ＥＳ細胞に類似の高い自己再生能および分化潜在能力を有する。
【０３０９】
遊走後ＮＣＳＣは、末梢神経系を生じる大部分の細胞および組織、ならびに多様な非神経細胞タイプ、例えば心臓血管系の平滑筋細胞、皮膚の上皮細胞、頭蓋顔面骨、軟骨および結合組織、角膜上皮および歯髄、その他を生じる（ＬＥ  ＤＯＵＡＲＩＮ、ＤＵＰＩＮ、２００３；  ＤＯＵＡＲＩＮ  ＬＥら、２００４、２００８）。
【０３１０】
子宮内幹細胞移植（ＩＵＳＣＴ）は、遺伝的、先天的、血液学的、および免疫学的疾患の治療のための方法である。基本的研究において、異なるタイプの幹細胞の遊走、移植および機能状態の動力学を研究するためのモデルを提供する。機能的には同等ではない４つに分けられうる妊娠期間の異なる瞬間に、細胞を移植することも可能である。細胞、および幹細胞を適用する４つの期の選択は、細胞の振る舞いおよび移植の結果に影響を及ぼしうる。胎児および成体造血または骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、主にＩＵＳＣＴに用いられた。本発明者らは以前、ヒト未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を得て、これは多能性潜在能力および免疫適合特性を示した。
【０３１１】
本発明者らの目的は、イヌにおける第三胎生期中、ＩＵＳＣＴ後のＩＤＰＳＣの遊走能、増殖、ホーミングおよび分化を評価することであった。すべての実験法は、サンパウロ大学の獣医学動物科学部倫理委員会によって認可され、そして適切な麻酔下で行われた。１ｘ１０６の未分化ＧＦＰ陽性ヒトＩＤＰＳＣを、妊娠第４５日、５つの胎児内に、術中超音波制御下で、開腹手術、および腹腔内注射にしたがって移植した。ＩＤＰＳＣを投与されない５つの胎児を対照として用いた。胎児を収集する前に、超音波分析を毎日行った。７日後、卵巣子宮切除術を行い、胎児を収集した：臓器および組織を単離し、そして４
％パラホルムアルデヒド中で固定するかまたは凍結保存した。
【０３１２】
臓器および組織内のＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの生体分布を、共焦点顕微鏡下で、凍結切片に対して分析した。ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣのホーミングは、三胚葉である、内胚葉、外胚葉および中胚葉由来の臓器で観察された。胃および腸において、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、腺内空間、ならびに粘膜筋板で見られた。肝臓において、これらは、肝実質に見られ；心臓においては心筋に、そして脳においては血管に、小脳においてはプルキニエ細胞内に見られる。フローサイトメトリーアッセイを用いると、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植片が定量化された。異なる臓器の中で、心臓の心筋（〜５０％）中に、脾臓および肝臓に、明らかなホーミングが観察された。ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣはまた、イヌ胎盤、特に血管にも見られた。これらのデータは、抗ヒト核（ＨｕＮｕ）、抗ＧＦＰおよび抗ＩＤＰＳＣ抗体を用いて確認された。ヒトＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、イヌ胎児においてＩＵＳＣＴ後、高い遊走能および増殖潜在能力を示した。未分化ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、胎児造血性（胎盤）、上皮（胃腺）および血管周囲幹細胞ニッチにおけるホーミングも示した。本発明者らのデータは、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣがＩＵＳＣＴを通じてこれらの疾患のための遺伝的、先天的、血液学的、および免疫学的治療のための新規の有望な供給源であることを示唆する。
【０３１３】
実験群−動物
本発明者らは、イヌモデル（イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒ））、ＳＲＤ（雑種）、雌、３〜４歳、妊娠ほぼ４３日の妊娠動物を用いた。
【０３１４】
胎児年齢を概算するための腹部超音波
外科処置の３日、２日、および１日前に、トランスデューサー：７．５ＭＨｚリニア、コンベックス５．０ＭＨｚおよび別の腔内装置（ｅｎｄｏｃａｖｉｔａｒｙ）を備えた、ハンドセットＧＥ（登録商標）ブランド、モデルＬｏｇｉｃ  １００ＭＰ超音波検査を行った。画像をデジタル文書化した。
【０３１５】
７．５ＭＨｚリニアアレイトランスデューサーを臓器および子宮の臨床的評価のためのすべての試験で用い、一方、５ＭＨｚトランスデューサーは、長さおよび寸法において、胎児の体を評価するために、特に帯状胎盤の限界を超える場合に有用であり、例えばＣＲ（体の長さ−頭殿長）を、最も吻側の頭蓋骨から尾の付け根までの間の距離から測定し、ＤＴＣ（胎児の横径）を、胎児の背側および腹側外側外側（ｖｅｎｔｒａｌ−ｌａｔｅｒａｌ−ｌａｔｅｒａｌ）の距離から得た。膜と関連する構造を定義する際に、ＰＥ（胎盤の厚さ）の測定値を得た。
【０３１６】
胎児年齢を決定して、胎児が４３日齢未満であることを確認するために、肺および肝臓のエコー輝度（ｅｃｏｇｅｎｉｃｉｄａｄｅ）の評価を通じて、年齢を得た。本発明者らはまた、心拍（ＨＲ）を測定し、細胞移植前および後の胎児生存性を確認した。
【０３１７】
子宮胎盤ベルトのマッピングおよび位置決定
スキーム１は、実験モデルの子宮角を例示する：治療群胎児１、３、４および５の右の子宮角（Ｃｕｄ）は、ＧＦＰタグ化ＩＤＰＳＣを投与された。胎児対照群は左の子宮角（Ｃｕｅ）の２および７中にあり；これらを実験対照のために収集した（図６１）。
【０３１８】
イヌ胎児モデルにおける子宮内移植のための方法
本発明者らは、３つの異なる回で、この研究において使用する外科処置を分けた：
初回は外科処置１の３日前に始まる
１−妊娠した雌の臨床的評価
２−年齢および胎児生存性を決定する腹部超音波（ＵＳ）
３−ＣＢＣのための血液収集
４−術前１２時間絶食および４時間水分遮断（ｆｌｕｉｄ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）
５−両方の外科処置における麻酔技術
メペリジン（Ｃｒｉｓｔａｌｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、イタピラ）５ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ（筋内）とともに、０．１ｍｇ／ｋｇの用量のアセプロマジン（Ｕｎｉｖｅｔ、サンパウロ、ＳＰ）の前麻酔を１５分間行い、その後、ジアゼパム５ｍｇ／ｋｇとともに、７．５ｍｇ／ｋｇ用量のケタミンで麻酔の誘導に進み、次いで、腰仙を通じて、皮下注射針４０ｘ８で、血管収縮剤を伴わない２％リドカイン（Ｃｒｉｓｔａｌｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、イタピラ）とともに、１．０ｍｇ／３ｋｇの用量のモルヒネでの硬膜外麻酔を用いた。手術中には、４．４ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ（静脈内を通じる）の用量のフェンタニル（疼痛緩和剤）（Ｈｉｐｏｌａｂｏｒ、サバラ）およびアンピシリンナトリウム（抗生物質）２０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶを用いた。
【０３１９】
１−外科処置Ｉ−試験開腹（Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  Ｌａｐａｒｏｍｉａ）
２−子宮胎児を計数するためのマッピング、および胎盤近傍（ｐａｒａｐｌａｃｅｎｔａｒｙ）右子宮角（ＣＵＤ）の胎児の同定
３−ＵＳ−腔内プローブに導かれた、胎児の腹腔の同定
４−腹腔内胎児１、３、４および５  Ｃｕｄへの、１．０ｍｌ無菌生理食塩水中に再懸濁された子宮内ＩＤＰＳＣ  １ｘ１０６細胞の移植
５−毎日のケア：ＡＴＢ（抗生物質療法）療法、５．０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ（皮下）ＢＩＤ（１２時間ごと）の用量のエンロフロキサシン１０％、ならびに第１日に０．２ｍｇ／ｋｇ、そして２日目および３日目に０．１ｍｇ／ｋｇの用量のＳＣ後、ＳＩＤ（２４時間ごと）の抗炎症（Ａｎｔｉ−ｆｌａｍａｔｏｒｉｏ）メロキシカム０．２％、ならびに液体ヨウ素およびＤａｋｉｍポルビジン（ｐｏｌｖｉｄｉｎｅ）での領域のドレッシング。
【０３２０】
６−動物に自由に食物および水を与えて犬小屋で飼育し、そして動物の機械的制限としてエリザベスカラーを用いた。
【０３２１】
２回目を、子宮ＧＦＰタグ化ＩＤＰＳＣの移植７日後に行った
１−胎児生存性を決定するための腹部超音波（心拍−ＨＲ、蠕動胎児運動）
２−ＣＢＣのための母親血液収集
３−術前１２時間絶食および４時間水分遮断
外科処置ＩＩ−３日以内に卵巣卵管子宮摘出術（ｏｖａｒｉｏｓａｌｐｉｎｇｏｈｉｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）を行い、続いて：
１−臨床評価のため、術後１日目、２日目、および３日目の腹部超音波
２−先に記載するものと同様の毎日の術後ケア（ＡＴＢ、治癒および抗炎症部位）
３−動物に自由に食物および水を与え、そしてエリザベスカラーをつけて、３日間犬小屋で飼育した。
【０３２２】
４−動物を飼い主に高率で返した（Ｈｉｇｈ  ｒｅｔｕｒｎ）
子宮除去を行った直後の３回目
胎児剖検−胎児１、３、４および５（治療群−ＣＵＤ）、ならびに胎児２および７対照群−ＣＵＥ＋２  ＣＵＤ胎児の臓器および組織を、後の異種移植の分析のために収集した。
【０３２３】
胎児の剖検直後、以下の臓器を収集した：舌、食道、胸腺、肺、心臓、横隔膜、腹大動脈、胃、小腸（Ｊｕｊｕｎｏ）、脾臓、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｌａｗ）、性腺（卵巣または精巣）、脳、小脳、胎盤を以下のように収集した：
試料１−１／３の臓器を１０％パラホルムアルデヒドに先に入れ、そしてパラフィンに
浸した。
【０３２４】
試料２−１／３は、やはり１０％に設定されたパラホルムアルデヒドに入れたが、ＯＣＴ中に入れる（「最適カッティング化合物」Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標））
試料３−１／３の臓器を、凍結試験管中、−８０℃の冷凍庫で凍結保存した。
【０３２５】
フローサイトメトリー分析
トリプシン処理によって細胞を採取し、そしてウシ胎児血清でトリプシンを不活性化し、細胞を１５ｍｌ試験管に入れた。次いで、材料を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞ペレットを形成した。遠心分離後、上清を廃棄し、そして５ｍｌの０．９％生理食塩水溶液中に再懸濁して、１５００ＲＰＭで１０分間洗浄遠心分離し、そして再び上清を廃棄し、そしてＦＡＣＳ緩衝液フローを添加して、懸濁物をサイトメトリー用の試験管に移し、そしてすべての特異的抗ヒト抗体、例えば抗ＨｕＮｕ、抗ＩＤＰＳＣ、ＣＤ４５、ＣＫ１８、ＣＤ１４６、ＯＣＴ３／４、β１インテグリン、カルジオチン、ＭｙｏＤ１およびミオゲニン、ヒトを添加し、４℃で１５分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で、１０，０００事象に関して、発現分析を行い、そして獲得プログラムＭｄｉ  Ｗｉｎ  ２．８によって分析した。ＦＩＴＣ非特異的蛍光色素で標識したアイソタイプ対照と比較することによって、マーカー発現を決定した。
【０３２６】
細胞質および核マーカー、抗ＩＤＰＳＣ抗ＨｕＮｕおよびＯｃｔ３／４の発現評価。細胞をあらかじめ１０μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％）で３０分間透過処理した後、特異的一次抗体を添加した。
【０３２７】
細胞周期分析
多様な臓器から細胞を単離した後、これらを注意深く、１ｍｌの７０％エタノールＲＮアーゼに再懸濁し、微量遠心管に移し、そして−２０℃の温度で保存した。固定した試料をあらかじめ２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして保存した。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌサイトメトリー緩衝液中に再懸濁し、そして再び遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、そして細胞をＰＩ溶液中に再懸濁し、５ｍｌのＰＢＳから調製して、これに５μｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  １００（０．０１％  ｖ／ｖ）、５０ｍＬのＲＮアーゼＡ（２ｍｇ／ｍｌ）および２０μｌのヨウ化プロピジウム（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。次いで、フローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒでデータフローを１０，０００事象に関して獲得し、そして分析プログラム、Ｍｄｉ  Ｗｉｎ  ２．８を用いた。
【０３２８】
細胞集団の獲得後、ゲートまたは象限に含有されるＥＧＦＰタンパク質に関して陽性である細胞を選択し、そしてＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を取り込んだＧＦＰ＋細胞の定量化のため、ＦＬ−２チャネルを用いて細胞周期相を決定した。
【０３２９】
結果の解釈
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＤＮＡの二本鎖に散在する（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｓ）化学量論蛍光色素である。蛍光はＦＬ−２で捕捉され、そしてこれは細胞中のＤＮＡ含量に比例する。複製していない（細胞周期のＧ０／Ｇ１期）二倍体細胞は、２ｎ細胞含量を有し、ＤＮＡ含量の増加がある間のＳ期に位置する細胞よりも、より低い強度のシグナルを放出する。Ｓ期の細胞は、続いて、４ｎへのＤＮＡ含量の完全な複製が完了するまで、Ｇ２／Ｍに位置するものより低い強度のシグナルを生成し、これは、Ｇ２期から減数分裂まで、このままであり、減数分裂時で各母細胞は、２つの娘細胞を生じる。
【０３３０】
ピーク低二倍体（ｈｉｐｏｄｉｐｌｏｉｄｅ）（下位Ｇ１）に位置する細胞は、２ｎより少ないＤＮＡ含量を所持し、そしてこれは、細胞死事象に特徴的である細胞破片および断片化ＤＮＡの発生増加に相当しうる。
【０３３１】
生じたシグナルをすべて増幅し、そして装置によってパルスに変換し、細胞周期における細胞の分布グラフの構築を可能にする。一方、ＤＮＡ含量の増加および生じるパルスの面積の間には、比例関係がある。
【０３３２】
免疫組織化学
免疫組織化学分析には、スライド上にマウントされたパラフィン切片を用いた。この方法のため、材料をあらかじめ４％のパラホルムアルデヒドに入れ、パラフィン包埋し、そして５．４μｍ（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、ＬＥＩＣＡ）に切断した。
【０３３３】
ＩＰを通じて注射したＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＳＰＣの追跡を、抗体：抗ＩＤＰＳＣ：ヒト歯髄のマーカー、および抗ヒト核−ＨｕＮｕを用いて行った。
【０３３４】
免疫組織化学技術を達成するため、ブレードを５０℃で３０分間、キシレンに浸し、そして次いで、室温で２０分間、キシレンに浸した。組織の自然蛍光を最小限にするため、スライドをメタノール＋アセトン中に「一晩」浸す必要があった。このプロセス後、一連の減少するアルコール（１００％、９５％および７５％）で２分間、材料を水和し、そして残ったホルマリンを除去するため、水酸化アンモニウム溶液中で１０分間インキュベーションした。
【０３３５】
固定の間、組織において抗原マスキングプロセスが起こり、検出がより困難になる可能性もある。抗原曝露を増加させるため、抗原回収のために、材料をクエン酸緩衝液中に浸し、そして水槽に３５分間入れる、加湿熱を用いた。
【０３３６】
次の工程において、ブレードの内因性ペルオキシダーゼをメタノールおよび過酸化水素（１：１）の溶液でブロッキングした。この工程後、加湿チャンバー中、一次抗体と組織を、４℃で「一晩」インキュベーションした。この工程後、材料をＤａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎキットで明らかにし、そして上昇する一連のアルコール（５０％、７５％、９５％および１００％）中で脱水した。用いた色素原はＤＡＢ（Ｄａｋｏ（登録商標））であり、スライドを、マイヤーのヘマトリキシナ（Ｈｅｍａｔｏｌｉｘｉｎａ）で対比染色し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔで密封し、そして光学顕微鏡によって視覚化した。
【０３３７】
ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化、ならびに子宮内移植後の増殖および分化の測定
三胚葉由来の多様な組織において、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの移植に関して多くの証拠を提供した後、本発明者らは、レシピエント組織内のありうる増殖および分化を評価した。
【０３３８】
内胚葉由来組織の分析−肺
肺組織は、赤色免疫陽性染色によって測定されるように（図Ｘ  Ａ、Ｂ）、高率のＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植を示した。ローダミン二次抗体の選択は、緑色ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣによって放出される蛍光シグナルの干渉を回避するためであった。移植率は、抗ＩＤＰＳＣの発現によって観察した際は５２．８％、そして抗ＨｕＮｕ抗体では５０．２％であった（図６２Ａ〜６２Ｂ）。次いで、フローサイトメトリーによって、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣに関して、増殖を分析し（図６２Ｃ〜６２Ｄ）、そして５３．１７％のＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣがＤＮＡ断片化を有し、２９．８８％がＧ０／Ｇ１期にあり（静止細胞そしてＤＮＡ合成の準備中）、８．５３％がＤＮＡ合成のＳ期で見られ、そして８．６５％が細胞分裂のＧ２期にあった。
【０３３９】
中胚葉由来の組織の分析−横紋筋組織−大腿二頭筋
中胚葉中のＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの定量化を、骨格筋組織（大腿二頭筋）（図６
３Ａ〜６３Ｄ）および腎組織（図６４Ａ〜６４Ｄ）を用いて行った。抗ＩＤＰＳＣおよび抗ＨｕＮｕの発現によって測定されるような移植率は、それぞれ、３４．２９％および３６．８６％であった。大腿二頭筋に移植されたＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの細胞周期の分析によって、２２．２８％が断片化ＤＮＡを有し、８．８２％がＧ０／Ｇ１期（静止細胞そしてＤＮＡ合成の準備中）にあり、そして２．６４％がＤＮＡ合成のＳ期であり、そして３１．７０％が細胞分裂のＧ２期にあることが明らかになった（図６３Ｃ〜６３Ｄ）。
【０３４０】
腎組織
腎組織において、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植率は、４２．３％（抗ＩＤＰＳＣ）および３１．３％（抗ＨｕＮｕ）（図６４Ａ〜６４Ｂ）であった。大腿二頭筋におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの細胞周期の分析によって、５０．０７％が断片化ＤＮＡを有し、１５．９２％がＧ０／Ｇ１期にあり、８．９７％がＳ期にあり、そして２５．２５％がＧ２期にあることが明らかになった（図６４Ｃ〜６４Ｄ）。
【０３４１】
外胚葉由来の組織の分析−脳および小脳
脳組織試料において、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植率は１３．１％（抗ＩＤＰＳＣ）および１３．４％（抗ＨｕＮｕ）と観察された（図６５Ａ〜６５Ｂ）。脳におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの細胞周期分析によって、８．５２％の細胞が断片化ＤＮＡを有し、３．２４％がＧ０／Ｇ１期にあり、２９．１％がＳ期にあり、そしてＧ２期が６６．５９％にあることが明らかになった（図６５Ｃ〜６５Ｄ）。
【０３４２】
胚外組織の分析−胎盤材料および胎盤血腫
本発明者らは、胎盤材料および胎盤血腫におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの移植を検出した。本発明者らは、胎盤ベルトにおけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ移植のみ定量化し、そしてこの移植が６４．８％（抗ＩＤＰＳＣ）および６５．６％（抗ＨｕＮｕ）であることを見出した（図６６Ａ〜６６Ｂ）。次いで、本発明者らは、胎盤ベルト、胎盤血腫におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ生存度および増殖を別個に分析し、これは胎児構造とは異なっていた。本発明者らのデータは、胎盤組織の環境および機能が、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの生存度および増殖に対する影響を有しうることを示唆する。胎盤中央ベルトにおける細胞周期の分析によって、２１．９６％のＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣが断片化ＤＮＡを有し、１０．８３％がＧ０／Ｇ１期にあり、３．５９％がＳ期にあり、そして３８．６４％がＧ２期にあることが明らかになった（図６６Ｃ〜６６Ｄ）。中央胎盤ベルトに関して、挫傷周辺部または側部ポケットにおいて、より高率の断片化ＤＮＡ３１．８２％、そしてより低いＧ１／Ｇ２期、Ｓ期およびＧ２期の、それぞれ、７．４０％、１．６３％および１３．１３％が示された。
【０３４３】
心臓組織
筋組織におけるＯｃｔ３／４およびＭＳＣマーカーの発現
Ｏｃｔ３／４を発現しながら分化していないＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣが知られる（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６）。本研究により、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣがイヌ胎児心筋において、高い移植を示すため、本発明者らは、この組織においてこのマーカーの発現を分析した。免疫蛍光分析によって、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて、このタンパク質の発現が示され、そして核内に位置することが示された（図６７Ａ１〜６７Ａ３）。これらの細胞のサイズは５μｍ未満であり、これによって、これらが、サテライト細胞とも呼ばれる筋細胞の特性および局在を示すことが示唆される。フローサイトメトリーによって、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ率の定量化が可能であり、これは抗Ｏｃｔ３／４抗体を発現し、これは２１．３％に等しかった（図６８Ａ〜６８Ｂ）。同時に、ＭＳＣマーカーの発現率に関しては：同じ組織中のＣＤ１４６（周皮細胞）およびβ１−インテグリンは非常に低く、そしてそれぞれ、０．１％および０．５％であった。
【０３４４】
さらに、本発明者らは、大腿二頭筋の骨格筋におけるこれらのマーカーの発現を分析した。本発明者らは、高率のタンパク質発現Ｏｃｔ３／１、ＣＤ１４６、β１−インテグリンを観察し、これらはそれぞれ、４５．４％、０．４％および３６．７％であった（図６８Ｃ〜６８Ｄ）。
【０３４５】
骨格筋組織−大腿二頭筋
本発明者らは、ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣが心筋の筋組織において、分化プロセスを経るかどうかを評価した。ミオゲニンおよびカルジオチン（ｃａｒｄｉｏｔｉｎ）タンパク質は、それぞれ２９．７％および４９．１％の率で、これらの細胞において発現され（図６９）、一方、上皮細胞マーカーであるＣＫ１８の発現は、予期されるとおり、筋組織において４．７％と低かった。異なるタイプの造血細胞のマーカーであるタンパク質ＣＤ４５は、移植心臓組織中のＥＦＧＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて発現された。この結果を検証するため、本発明者らは、心筋および異なると予期される動脈において、このマーカーの発現を比較した。予期されるように、心筋上のＣＤ４５の発現は、９．６％であり、それに対して動脈では１９．５％であった（図６９）。大腿二頭筋の横紋筋における分化した筋細胞のマーカーの発現研究によって、分析細胞のそれぞれ３３．８７％および７．５％でのＭｙｏＤ１およびミオゲニンの存在が明らかになった（図６９）。ＣＫ１８は細胞の７．７％で陽性であり、一方、ＣＤ４５は分析細胞の１２％で陽性であった。
【０３４６】
心臓組織
心臓組織中の分化したＩＤＰＳＣのマーカー発現は、心臓タンパク質ミオゲニンおよびカルジオチンの陽性発現、ならびにＣＫ−１８に関する陰性を示した。本発明者らは、ＣＤ４５＋の陽性発現を観察し、その量は、心筋および動脈弓で多様である（図７０）。
【０３４７】
骨格筋組織−大腿二頭筋
ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、Ｏｃｔ３／４に関する陽性の免疫染色を示し、これは核および核周囲局在を示す（図７２）。ＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ  Ｏｃｔ３／４の率もまたフローサイトメトリーによって評価し、そしてこれは１２．６％であった。ＭＳＣマーカー、例えばＣＤ１４６（周皮細胞）およびβ１−インテグリンは、それぞれ、２．５％および１８．３％であった（図７３）。
【０３４８】
胎盤組織において、本発明者らは、それぞれ、細胞の９．４％および２．３％でＣＤ４５およびＣＫ１８のタンパク質発現を観察した。ミオゲニンの発現は、おそらく胎盤血管を覆う平滑筋組織におけるＥＧＦＰ  ＬＰ  ＩＤＰＳＣの生着に対応する細胞の１６．６％で登録された。
【０３４９】
実施例１５．  ＩＤＰＳＣの単離およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
ヒト歯髄（ＤＰ）は、Ｋｅｒｋｉｓら（Ｋｅｒｋｉｓら（２００６）ＯＣＴ−４および他の胚性幹細胞マーカーを発現している未成熟歯髄幹細胞集団の単離および性質決定。Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １８４：１０５−１１６）に以前記載されるように、メスを用いて、歯の尖端部分の除去を通じて、１０人の健康な被験体（６〜９歳の範囲）の１０の乳歯から摘出された。
【０３５０】
次に、ＤＰをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で穏やかにリンスし、わずかに切開し、そして３５ｍｍプラスチック組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、米国ニューヨーク州コーニング）内に入れた。
【０３５１】
５％ＣＯ２加湿大気中、３７℃で、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国ユタ州ローガン）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシ
ン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および２ｍＭ非必須アミノ酸（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ＨａｍのＦ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社−米国カリフォルニア州カールスバッド）中で、ＤＰ組織外植片を培養した。
【０３５２】
３または４日の期間後、線維芽細胞様細胞を、接着性外植片から生成した。多数のＩＤＰＳＣを生成するため、外植片を同じ培養条件下で別のペトリ皿に移し、そして図７４に示すように、この方法を数回反復した。ＩＤＰＳＣを生成するこのプロセスは、ヒト剥脱乳歯由来の幹細胞（ＳＨＥＤ）を培養するものとは異なる（図７５を参照されたい）。単離後、ＳＨＥＤは直ちに酵素消化に供され、これによって、ｐ５３およびｐ７５バイオマーカーを発現するものなどの幹細胞の特定の集団の生成が防止される。
【０３５３】
単層で増殖する線維芽細胞様細胞を、ＰＢＳでさらに２回洗浄し、そして０．５ｇ／Ｌトリプシンおよび０．５３ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３７℃で３〜５分間供した。
【０３５４】
継代１を最初の酵素消化後にカウントした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した培地を添加することによって、トリプシン活性を不活性化した。およそ５ｘ１０５細胞を２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れた。継代培養を３〜４日ごとに行い、そして培地を毎日交換した。
【０３５５】
単離および拡大後、乳歯由来の幹細胞を、図７５に示すように凍結保存した（ＣＲＹＯＰ）。凍結保存のため、９０％ＦＢＳおよび１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を凍結媒体として用いた。凍結細胞を密封バイアル中で−１９６℃に維持した。
【０３５６】
実施例１６．  歯髄（ＤＰ）の長期ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
新鮮に抽出された歯髄（ＤＰ）は、歯冠および歯根歯髄の中央領域に大きな神経幹および血管を含有する（図７６Ａ）。線維芽細胞様細胞の最初のアウトグロースは、ＤＰプレーティング３〜４日後の間に現れた（図７６Ｂ）。酵素処理の使用を伴わずに、新規培養プレート内にＤＰを機械的にトランスファーすることによって、長期培養を行った。各トランスファー後、ＤＰは、３または４日ごとに、多数のアウトグロースする（outgrowing）細胞を産生し、したがって継代ゼロ（Ｐ０）で幹細胞（ＳＣ）の一定の産生が可能であった（図７４および７５を参照されたい）。本発明者らは、少なくとも６ヶ月の間、各３〜５日間のＤＰの多数回の機械的トランスファーを行った。本発明者らは、乳歯のすべての試料（ｎ＝１０）での単離に成功した。
【０３５７】
実施例１７．  ＤＰの長期培養後のＩＤＰＳＣ形態（表現型）
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）用に、ＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰを２．５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）中で４８時間固定し、１％リン酸緩衝四酸化オスミウム溶液（ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ）中で４℃で２時間、後固定し、そしてＳｐｕｒｒの樹脂（Ｓｉｇｍａ）中に包埋した。自動ウルトラマイクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｒ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）を用いて、超薄層切片を得た。切片を、酢酸ウラニル（Ｓｉｇｍａ）およびクエン酸鉛（Ｓｉｇｍａ）（それぞれ、２％および０．５％）で二重染色し、そしてＴＥＭ（Ｍｏｒｇａｇｎｉ  ２６８Ｄ、ＦＥＩ社、オランダ；Ｍｅｇａ）を用いて分析した。
【０３５８】
ＤＰの長期培養中、ＩＤＰＳＣの初期集団（ＥＰ）（すなわち、摘出２週間後またはそれより短い、ＤＰの初期機械的トランスファー中の細胞のアウトグロースから単離されたＩＤＰＳＣ）および後期集団（ＬＰ）（すなわち、摘出２週間後より長期で、ＤＰのより
後の機械的トランスファー中の細胞アウトグロースから単離したＩＤＰＳＣ）両方の形態が保持された（図７６Ｃを参照されたい）。ＴＥＭは、２つのタイプのＩＤＰＳＣ形態を明らかにした：
１．  低い細胞質対核比、低い細胞質密度、および少ない細胞内小器官を持つＥＳ様細胞（図７６Ｄ）；ならびに
２．  ＥＳ様ＩＤＰＳＣに比較して、より多い細胞質および細胞内小器官を持ち、基盤探査で作用する伸張した仮足を多数有するＭＳＣ様細胞ＩＤＰＳＣ（図７６Ｅ）。
【０３５９】
図７６Ｆは、ＩＤＰＳＣが、これらの２つの細胞タイプの形態に関して、比較的均質な集団を示したことを記述する。
【０３６０】
実施例１８．  核型分析
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養するＩＤＰＳＣの集密未満のＥＰおよびＬＰの核型決定を継代３で行った。採取前、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのデメコルシン（Ｓｉｇｍａ）を１時間添加した。細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして０．５ｍｌの培地中に再懸濁し、そして０．０７５Ｍ  ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）と１０ｍｌの体積まで混合した。室温で２０分間インキュベーションした後、細胞を４００ｇで５分間遠心分離して、そしてペレットを５ｍｌ中で３倍（３：１）の冷メタノール／酢酸（Ｓｉｇｍａ）中で固定した。スライドあたり細胞懸濁物３滴を固定した。染色体計数のため、ギムザ中でスライドを１５分間染色し、そして；細胞株あたり＞２００細胞を分析し、そしてヒト細胞遺伝学命名のための国際的システムにしたがって、Ｚｅｉｓｓ  ＩＩ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ・イエナ）上で報告した。
【０３６１】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣ核型は、本明細書において、不変であることが確認され、培養中、数のおよび全体構造の染色体異常は、ルーチンのＧバンディング技術によって示されるように、起こらなかったことが示唆される（図７６Ｇ）。
【０３６２】
実施例１９．  歯髄内の幹細胞遊走：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中のＤＰにおけるＢｒｄＵ陽性細胞の局在
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中のＤＰにおけるＢｒｄＵ陽性細胞を調べるため、歯髄をＰＢＳで穏やかにリンスし、そしてスライスした。各スライスを異なる培養プレートに入れた。次に、５−ブロモ−２９−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ）を基本培地内に直接添加した。最初の歯髄スライスを固定し、そしてＢｒｄＵで６時間処理した後にプロセシングした。歯髄スライスを含む第二の培養プレートにおいて、ＢｒｄＵを４２時間後に添加し、そして第三のプレートにおいて、６６時間後に添加した。
【０３６３】
ＢｒｄＵで６時間処理した後、すべてのスライスを１０％ホルマリン溶液中で４８時間固定した。標本をパラフィンブロック中に包埋し、そして１０ｍｍの切片を得た。上記標本をすべて、以下のように免疫組織化学法によって処理した。１０ｍｍのパラフィン切片を脱パラフィン処理し、そして次いで水和した。切片を過酸化水素０．１％溶液（Ｓｉｇｍａ）中で３０分間インキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を測定した。抗原回収のため、切片をトリプシンと３７℃で１０分間、インキュベーションした。非特異的抗原結合を阻害するため、切片をブロッキング血清（５％ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１０分間インキュベーションした。次いで、一次抗体と切片を加湿チャンバー中、４℃で１２〜１６時間インキュベーションした。
【０３６４】
一次抗体は、ＩＤＰＳＣの免疫表現型決定で用いたものと同じもの、そしてさらに抗ヒトＳＴＲＯ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびマウス抗ＢｒｄＵ  ＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）であった。一次抗体の最適希釈は、１：１０であることが見出された。スライドを再び、ＰＢＳでリンスし、そして次いで、１：２００希釈のビオチン化二次抗体（ＤＡ
ＫＯ、デンマーク・グロストラップ）で３０分間インキュベーションした。試料をＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、そしてＳｔｒｅｐＡＢＣｏｍｐｌｅｘ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）と１：１００希釈で３０分間インキュベーションした。さらに１回ＰＢＳＴで洗浄した後、色素原３（３−ジアミノベンジジンＤＡＢキット、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）で５分間、発色させ、その後、ＰＢＳＴ洗浄し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンで４５秒間、核対比染色し、脱水し、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔ中でマウントした。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、切片の観察を行った。一次抗体をＰＢＳによって置換した以外は、陰性対照切片を同様に処理した。
【０３６５】
ＩＤＰＳＣ生成の連続プロセスを理解するため、ＤＰを摘出し、そしてびｉｎ  ｖｉｔｒｏプレーティングした直後に、ＢｒｄＵで処理した（図７７Ａ〜７７Ｃ）。６時間後、ＤＰの中央部分に数個の抗ＢｒｄＵ抗体陽性細胞のみが見られた（図７７Ａ）。４８時間後、ＢｒｄＵ陽性細胞がＤＰ周辺に観察され（図７７Ｂ）、一方、７２時間後、ＢｒｄＵ陽性細胞数が増加し、そしてＩＤＰＳＣアウトグローイングゾーン（outgrowing zone）
に近い尖端部分のＤＰ周辺でもまた見られた（図７７Ｃ）。
【０３６６】
実施例２０．  酵素処理後のＤＰ組織
組織特異的幹細胞単離には少なくとも２つの方法：酵素処理および外植片培養が使用可能である。幹細胞単離のため、柔組織を小片に切り、そして組織脱凝集後、酵素で処理した。
【０３６７】
本発明者らは、酵素処理（コラゲナーゼ／ディスパーゼ）を伴いおよび伴わず、ＤＰの形態学的特徴を比較した（図７７Ｄ〜７７Ｅ）。いかなる処理も行わないＤＰは、ＢｒｄＵ陽性細胞が観察される領域で、特にその完全性を維持した（図７７Ｄ）。しかし、酵素消化後、この領域は破壊された（図７７Ｅ）。したがって、本発明者らは、ＤＰ幹細胞（ＳＣ）の単離のために、ＤＰ外植法を選択した。比較形態分析によって、先のＳＣ単離酵素処理が、おそらくＳＣ「ニッチ」を破壊するため、ＤＰに関して推奨されないことが示された。
【０３６８】
実施例２１．  歯髄幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫表現型
ＩＤＰＳＣ免疫表現型決定は、免疫蛍光に基づき、そして抗ヒト特異的抗体：ビメンチン、ネスチン、フィブロネクチン、およびＯｃｔ３／４（すべてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズより）；ならびにＣＤ１０５／ＳＨ−２およびＣＤ７３／ＳＨ−３（どちらも、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、米国オハイオ州より）を用いることによって、フローサイトメトリー分析を行った。ＦＩＴＣコンジュゲート化二次抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国カリフォルニア州テメキュラ）を用いて、そしてそれぞれのアイソタイプマッチ対照を用いた。ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）中で細胞固定し、そしてＰＢＳ中の０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）中で透過処理した後、前述の抗体を用いて、免疫蛍光を分析した。ＩＤＰＳＣを５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションし、ＰＢＳ中で３０分間希釈し、そしてＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１：５００の最終希釈で、ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と、室温で１時間、さらにインキュベーションした。
【０３６９】
顕微鏡スライドを、４９，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング媒体中でマウントし、そしてＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡（ＬＳＭ  ４１０、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ・イエナ）またはＮｉ
ｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ１０００（Ｎｉｋｏｎ、日本・神奈川）を用いて、免疫蛍光を検出した。ＣＣＤカメラ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇｍｏｄｅｌ  ＥＲ  ３３９）でデジタル画像を獲得し、そして用いたドキュメンテーションシステムは、Ｃｙｔｏｖｉｓｉｏｎ  ｖ．２．８（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ社−米国カリフォルニア州サンタクララ）であった。
【０３７０】
継代３でＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰを用いて、フローサイトメトリーを行った。ＰＢＳ  ０．０２％ＥＤＴＡで、３７℃で１０分間の処理を用いることによって、細胞を剥離させ、ペレットにし（４００ｇで１０分間）、そして０．１Ｍ  ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中、４℃で洗浄した。次に、１０５細胞／ｍｌの濃度の細胞を飽和濃度の前述の抗体（１０ｍｌ）で染色した。暗所中、室温で４５分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして０．２５ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ；Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）上でフローサイトメトリー分析を行った。フローサイトメトリーおよび／または免疫蛍光分析をすべての試料（ｎ＝１０）で反復し、そして代表的な実験を図に提示する。少なくとも３つ組で、すべての実験を行った。
【０３７１】
これらの免疫組織化学アッセイを用いて、ＤＰ内のニッチのネスチン、ビメンチン（ＭＳＣのマーカー）およびＯｃｔ３／４（ＥＳ細胞マーカー）細胞（図７８Ａ〜７８Ｑ）を同定した。ネスチン陽性細胞は、ＤＰのすべてのゾーン；細胞リッチゾーン（線維芽細胞および未分化間葉系細胞を含有する最も内部の歯髄層）（図７８Ａ〜７８Ｃ）；細胞不含ゾーンで見られ、ネスチン発現は、毛細管および神経系の両方（図７８Ｄ〜７８Ｆ）；ならびに象牙芽細胞層（象牙芽細胞を含有し、そして前象牙質および成熟象牙質の隣にある、最も外側の層）（図７８Ｇ〜７８Ｈ）で観察された。細胞リッチゾーンにおけるネスチン陽性細胞は、線維芽細胞様ならびにＥＳ様細胞形態を示した（図７８Ｂ〜７８Ｃ）。細胞不含ゾーンにおいて、ネスチンタンパク質は、神経叢由来の細胞において、中間径フィラメントにおいて発現されることが見出された（図７８Ｄ）。さらに、ネスチン陽性細胞は、小さい毛細管の壁に包埋され（図７８Ｅ）、そしてこれらの毛細管の隣接領域にあった（図７８Ｆ）。
【０３７２】
象牙芽細胞層において、いくつかの丸いＥＳ細胞様および巨大円柱状細胞もまた、ネスチン陽性であった（図７８Ｇ〜７８Ｈ）。ＳＴＲＯ−１は、ＤＰ由来の幹細胞／周皮細胞の特異的マーカーである。したがって、ＳＴＲＯ−１抗体を対照として用いた。ＳＴＲＯ−１の発現は主に、小さい毛細管および中程度のサイズの血管で観察され（図７８Ｊ）、ならびに細胞不含ゾーンの神経叢中でも観察された（図７８Ｋ）。本発明者らはまた、ＤＰにおけるビメンチン発現細胞の局在も検証した。予期されるように、ビメンチン陽性細胞は、毛細管および最も内側の歯髄層中に位置し、この部位ではネスチン陽性細胞もまた見出された（図７８Ｌ〜７８Ｍ）。
【０３７３】
本発明者らはまた、ＤＰにおけるＯｃｔ３／４の発現も調べた。最初に、少ない割合の細胞のみ（〜０．７５％）がＯｃｔ３／４陽性であった。この割合は、ＤＰ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の時間とともに増加した。Ｏｃｔ３／４の強い発現がＤＰ毛細管および最も内部の歯髄層中に位置する細胞の核で観察された（図７８Ｎ〜７８Ｑ）。
【０３７４】
実施例２２．  ＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰの免疫表現型決定
ＳＨ２／ＣＤ１０５、ＳＨ３／ＣＤ７３（ＭＳＣマーカー）およびＯｃｔ３／４（ＥＳ細胞マーカー）を含むいくつかのマーカーを用いて、初期集団（ＥＰ）および後期集団（ＬＰ）幹細胞を性質決定した。さらに、ＭＳＣマーカー、例えばビメンチン、ネスチン、フィブロネクチンの発現をＥＰおよびＬＰの両方で評価した。代表的な図７９（Ａ１〜Ｅ
１、Ａ２〜Ｅ２）は、すべてのＭＳＣマーカーが両方の集団（ＥＰおよびＬＰ）で発現され、そして多数回のＤＰトランスファーサイクル６ヶ月後、Ｏｃｔ３／４を例外として、ＬＰ  ＳＣでわずかに減少したことを示す（図７９Ａ２〜７９Ｅ２）。
【０３７５】
これらのマーカーに関して陽性免疫染色を示したＩＤＰＳＣの割合を、フローサイトメトリーによって評価した。結果は：ＳＤ２／ＣＤ１０５に関して、ＥＰに対して９９．１０％、およびＬＰに対して９６．６０％；ＳＨ３／ＣＤ７３に関して、ＥＰに対して９９．６０％およびＬＰに対して９８．４０％；ネスチンに関して、ＥＰに対して９７．７６％およびＬＰに対して９４．５６％；ビメンチンに関して、ＥＰに対して９９．４５％およびＬＰに対して９５．６０％；フィブロネクチンに関して、ＥＰに対して９７．１０％およびＬＰに対して９６．３０％（図７９Ａ１〜７９Ｅ１および７９Ａ２〜６Ｅ２）であった。
【０３７６】
興味深いことに、この特定のＩＤＰＳＣ集団において、非常に低い割合のＯｃｔ３／４陽性細胞０．７５％がＥＰにおいて観察された。この割合は、ＬＰ細胞において、１０．０３％に増加した（図７９Ｆ１および７９Ｆ２）。
【０３７７】
同じＭＳＣおよびＥＳ細胞マーカーに対する抗体を用いた細胞の免疫染色によって、フローサイトメトリーデータを確認した。発現は、ＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰ両方で観察された。図７９において、ＬＰ中のＭＳＣマーカーの発現が提示される（図７９Ａ３〜７９Ｅ３）。予期されるように、Ｏｃｔ−３／４タンパク質発現が細胞核において観察された（図７９Ｆ３）。Ｏｃｔ−３／４の場合を除き、ＬＰにおけるこれらのマーカーすべての発現は、ＥＰと同様であった（データ未提示）。４つの関連しないドナーから単離されたＬＰ  ＩＤＰＳＣは、５％〜４７％のＯｃｔ−３／４陽性細胞の多様な比率を示した（図８０Ａ〜Ｄ）。
【０３７８】
実施例２３．  培地はＥＰおよびＬＰ増殖速度に影響を及ぼす
細胞増殖に対する異なる培地の影響を評価するため、新鮮に単離し、そして同じＩＤＰＳＣ凍結融解物を３つの群（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、ＤＭＥＭ低グルコース（１０００ｍｇ／ｍｌ；ＤＭＥＭ−ＬＧ）、および最小必須培地（ＭＥＭ）アルファ培地（ＭＥＭ−アルファ）に等しく分けた。すべての培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および２ｍＭ非必須アミノ酸（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補った。細胞を１０５／ｃｍ２の密度で植え付け、そして少なくとも連続１５日間カウントして、増殖率および凍結保存の影響を評価した。ＤＰ組織外植片が凍結保存および融解の連続周期後にＩＤＰＳＣを産生する能力もまた検証した。すべての実験を３つ組で行った。
【０３７９】
細胞株、継代数（Ｐ２〜Ｐ１５）、凍結保存、および増殖培地からのデータを用いて、増殖曲線を構築した。チューキー事後多重比較検定によって補完した二元配置分散分析（「凍結保存」および「増殖培地」）を用いることによって、細胞数データを分析した。有意性レベルを５％に設定した（ＳＰＳＳ  １９．０、米国イリノイ州シカゴ）。
【０３８０】
また、３つの異なる培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ−ＬＧ、およびＭＥＭ−アルファを用いて、凍結保存前および後にＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰの増殖能を研究した。Ｐ２から始めて、酵素的解離後、非凍結保存細胞を採取し、そして連続１５継代中、毎日計数した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭＥＭ−アルファ培地中で培養したＩＤＰＳＣは、最初の継代中、一定の増殖速度を示し、これは継代５±２でピーク増殖を達成した（図８２Ａ、表５）。図８１に示す増殖曲線に基づいて、継代３〜７の細胞数を考慮して、統計分析を行った（表５）。同じパラメータを用いて、融解後にＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭＥＭ−
アルファ培地中で培養したＥＰおよびＬＰの増殖率を評価し、そして凍結保存前のものと比較した際、類似の増殖潜在能力を示した（図８１Ｂ、表５）。ＤＭＥＭ−ＬＧ中で培養したＩＤＰＳＣの非凍結保存ＥＰおよびＬＰは、骨原性系譜への自発的な分化を示し（データ未提示）、そして増殖潜在能力の迅速な減少を示した（図８１Ａ、表５）。興味深いことに、融解後、ＤＭＥＭ−ＬＧ中で培養したＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰは、増殖状態を維持した（図８１Ｂ、表６）。ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＭＥＭ−アルファ培地は、ＩＤＰＳＣの非凍結保存および凍結保存ＥＰおよびＬＰにおいて、いかなる自発的な分化も誘導しなかった。
【０３８１】
表５．  凍結保存前および後の３つの異なる増殖培地中および異なる継代で培養したＩＤＰＳＣの数
【０３８２】
【表５】
2019116490.tif 000006
【０３８３】
表６．  凍結保存前および後、異なる増殖培地中で培養したＩＤＰＳＣ（継代範囲Ｐ３〜Ｐ７）の細胞数（ｘ１０３）
【０３８４】
【表６】
2019116490.tif 000007
【０３８５】
実施例２４．  培地は、ＥＰおよびＬＰ遺伝子発現に影響を及ぼす
ＩＤＰＳＣのＥＰおよびＬＰを、３つの異なる培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ−アルファ、およびＤＭＥＭ−ＬＧ）中、７回の継代中で培養した。遺伝子発現に対するこれらの異なる培地の影響を評価するため、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡを抽出した：ＩＤＰＳＣをＰＢＳ中で洗浄し、そしてＲＮＡ抽出を製造者の支持にしたがって行った。１μｇの総ＲＮＡから、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写
酵素およびオリゴ（ｄＴ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国ニューヨーク州アムハースト）を用いて、製造者の指示にしたがって逆転写して、ｃＤＮＡを合成した。試薬の最終濃度は以下の通りであった：２０μｌのＰＣＲ反応物を、２μｌ  ｃＤＮＡ、０．２μＭの各プライマー、１単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭの塩化マグネシウムおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で調製した。プライマー配列（順方向および逆方向）、および増幅産物の長さを要約する：ネスチンＦＷ  ５’−ＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＴ−３’（配列番号ｌ）およびＲＶ  ５’−ＧＡＣＧＣＴＧＡＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＡＴ−３’（配列番号２）（３０２ｂｐ／５４℃）；ビメンチンＦＷ  ５’−ＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣ−３’（配列番号３）、およびＲＶ  ５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣ−３’（配列番号４）（２０５ｂｐ／５５℃）；フィブロネクチンＦＷ  ５’−ＧＧＡＴＣＡＣＴＴＡＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号５）およびＲＶ  ５’−ＧＡＴＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＴ−３’（配列番号６）（３８６ｂｐ／５６℃）；  ＯＣＴ３／４  ＦＷ  ５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号７）；およびＲＶ  ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号８）（１２０ｂｐ／６１℃）；  ＳＨ２／ＣＤ１０５  ＦＷ  ５’−ＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＡＴＡＣ−３’（配列番号９）、およびＲＶ  ５’−ＧＡＧＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＡＧＡＣＡＡＴ−３’（配列番号１０）（１７１ｂｐ／５６℃）；  ＳＨ３／ＣＤ７３  ＦＷ  ５’−ＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＴ−３’（配列番号１１）、およびＲＶ  ５’−ＡＧＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＧＣＡ−３’（配列番号１２）（３９１ｂｐ／５６℃）。軟骨原性および筋原性分化に関しては、以下のプライマー配列を用いた：  ＣＯＭＰ
ＦＷ  ５’−ＣＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＴＣＴＴ−３’（配列番号１３）、およびＲＶ  ５’−ＣＡＧＧＴＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１４）（９１ｂｐ／５３℃）；  ＡＣＴＢ  ＦＷ  ５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１５）、およびＲＶ  ５’ＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣ−３’（配列番号１６）（３９５ｂｐ／５９℃）；  ＭＹＯＤ１  ＦＷ  ５’−ＧＣＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）、およびＲＶ  ５’−ＴＡＧＴＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＡＧＣ−３’（配列番号１８）（２８０ｂｐ／５３℃）。ＧＡＤＰＨ遺伝子ＦＷ  ５’ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号１９）、およびＲＶ  ５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号２０）（４６３ｂｐ／６１℃）を対照として用いた。未分化ＩＤＰＳＣを陰性対照として、分化特異的プライマーに関して調べた。以下の条件下で、ＰＣＲ反応を行った：９４℃５分間の１周期、その後、９４℃１分間、１分間のアニーリング温度、および７２℃１分間の３５周期。１．５％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）上の電気泳動によって、増幅産物を分離し、そしてエチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）染色を用いて視覚化した。
【０３８６】
融解後のＥＰおよびＬＰにおいて、ＲＴ−ＰＣＲによって、多能性ＥＳ細胞およびＭＳＣマーカーの遺伝子発現パターンを分析した。総合すると、ＥＰおよびＬＰはどちらも、ビメンチン、ＳＨ２／ＣＤ１０５およびＳＨ３／ＣＤ７３の類似の発現パターンを示した（図８１Ｃ）。類似の発現パターンは、ＩＤＰＳＣをＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＤＭＥＭ−ＬＧ中で培養した際、フィブロネクチン、ネスチンおよびＯｃｔ３／４に関して観察された。しかし、ＭＥＭ−アルファ中で培養した場合は異なり、この際は、これらの遺伝子のうち３つ（フィブロネクチン、ネスチンおよびＯｃｔ３／４）は、いかなる発現も示さなかった（図８１Ｃ）。
【０３８７】
実施例２５．  未成熟歯髄幹細胞におけるＭＳＣマーカーの発現パターン
フローサイトメトリー分析のため、細胞表面分子に対する以下の抗体およびそのそれぞれのアイソタイプ対照を用いた：モノクローナル抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ１３（Ｓｉｇｍａ
）、ＣＤ４３、およびＣＤ３４（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）およびＣＤ１０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ、英国オックスフォード）。ＳＨ−２、ＳＨ−３、およびＳＨ−４は、Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（米国オハイオ州クリーブランド）から、マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＣＤ９０、ＣＤ１４６（ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ）、ＣＤ２９（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１１７／ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ４４／Ｈｃａｍ（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）。約１０６細胞を一次抗体と氷上で３０分間、インキュベーションし、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳおよび１Ｍアジ化ナトリウム（緩衝剤）中で洗浄し、その後、二次ＦＩＴＣまたはフィコエリトリン・コンジュゲート化抗体を添加した。細胞内抗原を染色するため、細胞を固定し、そして透過処理プロトコルにしたがった。ペレットを１ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０溶液（ＰＢＳ中、０．２％）に室温で再懸濁し、そして混合物を３７℃の水槽で１５分間インキュベーションした。ＣＥＬＬ  Ｑｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州サンノゼ）上でフローサイトメトリー分析を行った。
【０３８８】
フローサイトメトリーによって、ＤＰからのアウトグロース細胞は、ヒトＭＳＣ特異的抗原、例えばＳＨ−２（ＣＤ１０５）、ＳＨ−３、およびＳＨ−４（ＣＤ７３）および造血前駆体のＣＤ１３マーカーに関して均質に陽性であり（図８２Ａ、８２Ｂ、および８２Ｈ）、一方、ヒト初代線維芽細胞は、これらのマーカーすべてに関して陰性であることが明らかになった（データ未提示）。ＤＰから単離されたこれらの細胞はまた、ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ４５に関して陰性であり、造血細胞および内皮細胞の混入は排除された（図８２Ｅ〜８２Ｇ）。
【０３８９】
さらに、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原の発現をＦＡＣＳによって調べた。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は元来、移植片対宿主病を仲介する細胞表面抗原として定義され、これは、ＨＬＡ−ミスマッチドナーにおける組織移植片拒絶を生じた。骨髄由来のＭＳＣと同様に、これらのタンパク質両方の発現は、ＩＤＰＳＣ（図８３Ａ〜８３Ｂ）では観察されなかった。本発明者らはまた、ＭＳＣ性質決定に一般的に用いられるマーカーセットを分析した：
ｉ）ＣＤ４４は、８０〜２５０ｋＤａ  Ｉ型（細胞外Ｎ末端）膜貫通糖タンパク質であり、そして該ヒアルロナン受容体は、ＭＳＣ遊走において重要な役割を果たし、そして組織再生の課題のため、ＭＳＣの創傷部位への補充に非常に重要であるようである（Ｚｈｕら、２００６）；
ｉｉ）幹細胞因子／ｃ−ｋｉｔ（チロシンプロテインキナーゼＫｉｔ）またはＣＤ１１７；
ｉｉｉ）ＣＤ９０またはＴｈｙ−１は、多様な幹細胞および成熟ニューロンの軸索突起のマーカーとして、使用可能である；
ｉｖ）ＣＤ２９−表面抗原発現は、神経冠様および間葉系免疫表現型を明らかにした（Ｐｒｕｓｚａｋら、２００９）；
ｖ）ネスチンは、多分化能神経幹細胞のマーカーであり、そしてまた、毛包芽幹細胞においても発現される；そして
ｖｉ）ビメンチンは、神経幹細胞マーカーであり、これはまた、のちにより特殊化されたネットワークで置き換えられる前に、未成熟細胞において発現される（Ｌａｎｇａら、２０００）。
【０３９０】
すべてのこれらのマーカーは、ＩＤＰＳＣ中で均質に陽性であった（図８３Ｃ〜８３Ｈ）。
【０３９１】
実施例２６．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける神経上皮幹細胞マーカーの発現
ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４に関してフローサイトメトリーを行った。上述の同じプロトコルにしたがい、そして用いた一次抗体は：ウサギ抗ヒトＢＤＮＦ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、１：１００）、ウサギ抗ヒトＮＧＦ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、１：１００）、ヤギ抗マウスＮＴ−３（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、１：１００）、ヤギ抗マウスＮＴ−４（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、１：１００）であった。ｐ７５タンパク質の発現を、Ａｂ３１２５マウス・モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）またはアイソタイプ対照を用いて、ＦＡＣＳ分析によって監視した。一次インキュベーション後、スライドを洗浄し、そして適切な抗体、Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｓｉｇｍａ、１：６００）またはＡｌｅｘａ  ４８８ウサギ抗ヤギ（Ｓｉｇｍａ、１：６００）と、室温で２時間インキュベーションした後、３回洗浄し、そしてＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｓｉｇｍａ）でカバースリップ処理した。
【０３９２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析のため、製造者の指示にしたがって、総ＲＮＡを、歯髄幹細胞培養からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出した。オリゴ（ｄＴ）１５とともにＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｃＤＮＡを合成し、そして逆転写酵素を伴わない対照反応もまた行った。ＰＣＲは、以下のプライマー対を用いて、９４℃４５秒間、５５℃４５秒間、および７２℃１分間の３５周期からなった：  ＢＤＮＦ−Ｆ（５’−ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧＡＣＡ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  Ｇ−３’）（配列番号２１）、ＢＤＮＦ−Ｒ（５’−ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＡＣＴ  ＡＣＴ
ＧＡＧ  ＣＡＴ  Ｃ−３’）（配列番号２２）；  ＧＤＮＦ−Ｆ（５’−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＧＣ−３’）（配列番号２３）、ＧＤＮＦ−Ｒ（５’−ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  Ｇ−３’）（配列番号２４）；  ＮＧＦ−β−Ｆ（５’−ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  Ｇ−３’）（配列番号２５）、ＮＧＦ−β−Ｒ（５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  Ｃ−３’）（配列番号２６）；  ＮＴ−３−Ｆ（５’−ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＡＣ−３’）（配列番号２７）、ＮＴ−３−Ｒ（５’−ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ
ＣＣ−３’）（配列番号２８）；  ＮＴ−４／５−Ｆ（５’−ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＣＡＣ
ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＧＡ−３’）（配列番号２９）、ＮＴ−４／５−Ｒ（５’−ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＡ−３’）（配列番号３０）。それぞれ、ゲノムＤＮＡからの増幅の非存在および混入の非存在に関して、逆転写酵素を含まず、そしてテンプレートを含まない反応を、陰性対照として行った。アンプリコンは、１４７ｂｐ（脳由来神経栄養因子、ヒト−ＢＤＮＦ）、３３５ｂｐ（グリア細胞由来神経栄養因子、ヒト−ＧＤＮＦ）、１７４ｂｐ（神経成長因子、ベータポリペプチド、ヒト−ＮＧＦ−β）、２０１ｂｐ（ニューロトロフィン３、ヒト−ＮＴ−３）、１９８ｂｐ（ニューロトロフィン４／５、ヒト−ＮＴ−４／５）を有した。
【０３９３】
ｐ７５のｍＲＮＡ発現を特異的プライマー（順方向プライマー：５’−ｔｃｇｔｇｇａｇａｇｔｃｔｇｔｇｃａｇｔ−３’（配列番号３１）、逆方向プライマー：５’−ｔｇｇａｃａｇｇａａｇｔｇｔｇｇｔｃａｇ−３’（配列番号３２））を用いたＲＴ−ＰＣＲによって分析した。総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）で抽出し、逆転写し、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ増幅系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、ＰＴＣ−１００プログラム可能サーマルコントローラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォータータウン）上で２０周期に渡って増幅した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして２％エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で染色した。ＧＡＰＤをハウスキーピング遺伝子として同時増幅して、ｐ７５発現レベルを規準化した。
【０３９４】
いかなる理論にも束縛されることは望まないが、成体歯髄幹細胞は、神経冠幹細胞（Ｎ
ＣＳＣ）から生じる可能性があり、そしてＮＣＳＣ特徴を持つこれらの歯髄幹細胞は、成人期まで持続し、環境に応じて、非常に多様な細胞を生成可能である。本発明者らは、初めて、ＬＰ  ＩＤＰＳＣが、感覚および運動軸索成長を促進することが知られる、高レベルの神経栄養因子、例えばＢＮＤＦ（脳由来神経栄養因子）、ＧＮＤＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ＮＧＦ−β（神経成長因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）、ＮＴ−４／５（ニューロトロフィン−４／５）（図８４Ａ〜８４Ｅおよび８４Ｇ）、ならびにｐ７５（ニューロトロフィン受容体およびＮＣＳＣのマーカー）（図８４Ｆおよび８４Ｈ）を天然に、恒常性に発現することを示した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析（図８４Ａ〜Ｆ）は、ＬＰ  ＩＤＰＳＣ集団において、ＢＤＮＦ（１００％）、ＧＮＤＦ（９９％）、ＮＧＦ−β（９９％）、ＮＴ−３（７０％）、ＮＴ−４／５（８０％）およびｐ７５（９０％）の比率を示した。
【０３９５】
実施例２７．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける角膜縁幹細胞および角膜上皮マーカーの発現
ＬＰ  ＩＤＰＳＣはまた、上皮細胞運命に、そして特に目の表面の上皮に重要であるマーカーサブセットを発現することも示された。免疫組織化学分析を用いて、いくつかの角膜縁幹細胞および上皮タンパク質の存在を、未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて評価した。以下の抗体を用いた：マウス抗ヒトモノクローナル抗体：抗インテグリンベータ１（インテグリンβ１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）、コネキシン４３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＡＢＣＧ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびビメンチン（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、米国カリフォルニア州フレモント）、ならびに細胞質／核モノクローナル抗体：マウス抗サイトケラチン３／１２（Ｋ３／１２）（ＲＤＩ、米国ニュージャージー州フランダース）はヒトおよびウサギと反応、ならびにマウス抗ヒト抗ｐ６３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。細胞をガラスカバースリップ上、最大７０％集密まで増殖させ、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、そして４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で一晩固定した。カバースリップを、２０ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（Ｖｅｔｅｃ、ブラジル・リオデジャネイロ州ドゥケ・デ・カシアス）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｄｉｎａｍｉｃａ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ブラジル・サンパウロ州サンパウロ）、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で３回洗浄した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて、透過処理を１５分間行った（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。細胞を３回洗浄し、そしてＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）中、５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）中で３０分間インキュベーションした。一次抗体を、異なる希釈で（コネキシン４３、ＡＢＣＧ２、ビメンチン、インテグリンβ１およびＫ３／１２（１：１００）、ｐ６３（１：２００）および抗ｈＩＤＰＳＣ（１：１０００））、各スライド上に１時間添加し、これを室温でインキュベーションした。ＴＢＳ中で洗浄した後（３回）、細胞を暗所で１時間、二次抗マウス抗体コンジュゲート化イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）と１：５００希釈でインキュベーションした。顕微鏡スライドを褪色防止溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング媒体、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州ハーキュルス）中、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）中でマウンティングし、そして共焦点顕微鏡を用いて分析した。対照反応を、一次抗体の代わりにＰＢＳとインキュベーションし、その後、洗浄し、そしてそれぞれの二次抗体とインキュベーションした。
【０３９６】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいて、角膜縁幹細胞マーカーの発現分析に用いたプライマーは、以下の通りであり、遺伝子センスプライマー、アンチセンスプライマーおよびアニーリング温度を明記する：ＡＢＣＧ２（３７９ｂｐ）ＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＧＴＡＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＡＧＧ（配列番号３３）．５５℃；コネキシン４３（１５４ｂｐ）ＣＣＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＣ（配列番号３４）ＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴ（配列番号３５）５５℃；Ｋ３（１４５ｂｐ）ＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＴＧＴＣ（配列番号３６）ＧＴＣＡＴＣＣＴＴＣＧＣ
ＣＴＧＣＴＧＴＡＧ（配列番号３７）５８℃；Ｋ１２（１５０ｂｐ）ＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＴＣＡ（配列番号３８）５８℃；β−アクチン（２０８ｂｐ）ＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣ（配列番号３９）；ＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＣ（配列番号４０）５５℃。ヒト角膜縁および角膜上皮の試料は、インフォームドコンセントの後、サンパウロの連邦大学眼科学科の患者によって供与され、そして本研究において対照として用いられた。これらのヒト角膜縁、角膜上皮、およびＬＰ  ＩＤＰＳＣ由来の総ｍＲＮＡは、製造者のプロトコルにしたがって、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出された。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第一鎖合成系およびオリゴｄＴ２０プライマー（どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。反応あたり約２μｌのｍＲＮＡを用いた。試薬の最終濃度は、１ｘＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、各０．２μｍのプライマー（上記）；１．５ｍｍのＭｇＣｌ２、および２単位の白金Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、最終濃度は５０μｌであった。ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、ＰＣＲを行った。以下の条件下でＰＣＲを行った：１周期の９４℃５分間、その後、３５周期の９４℃１分間、アニーリング温度の１分間、および７２℃１分間。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画し、そして２％エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて染色した。ヒトβ−アクチン遺伝子を対照として用いた。
【０３９７】
ヒト特異的抗体、例えばｐ６３、インテグリンβ−１（ＣＤ２９）、ビメンチン、コネキシン４３およびＡＢＣＧ２は、ＬＰ  ＩＤＰＳＣで陽性免疫染色を示し、一方、抗Ｋ３／１２抗体は、いくつかの細胞における弱い陽性免疫染色しか示さなかった（図８５Ａ〜８５Ｇ）。免疫蛍光タンパク質を用いて、以前分析したいくつかの遺伝子発現もまた、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、ＡＢＣＧ２、コネキシン４３およびＫ１２の発現を示し、一方、Ｋ３の発現は見られなかった（図８５Ｉ）。予期されるように、ＡＢＣＧ２、コネキシン４３およびＫ１２は、対照として用いられるヒト角膜縁組織で発現されたが、Ｋ３のｍＲＮＡは検出不能であった（図８５Ｉ、レーン３）。ヒト角膜対照試料には、コネキシン４３、Ｋ１２およびＫ３  ｍＲＮＡが存在した（図８５Ｉ、レーン２）。予測可能であるように、ＡＢＣＧ２の発現は、ヒト対照角膜では検出されなかった（図８５Ｉ、レーン２）。
【０３９８】
実施例２８．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおける胚性幹細胞マーカーの発現
一次抗体Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国カリフォルニア州テメキュラ）を１：４０で希釈した。適切なＦＩＴＣ二次抗体を１：１００希釈で、室温で４０分間添加した。顕微鏡スライドを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を含みまたは含まず、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング媒体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でマウンティングした。冷却ＣＣＤカメラ（ＰＣＯ、ＶＣ４４）で獲得し、そしてＩＳＩＳソフトウェア（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍ、米国マサチューセッツ州ベルモント）でプロセシングしたデジタル画像を用いて、視覚化を達成した。総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製し、そしてＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ不含キット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州オースティン）で処理して、ゲノムＤＮＡ混入を取り除いた。ヒトＥＳ細胞を対照として用いた。製造者の指示にしたがって、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ−αおよびｄＴ２０プライマーでの逆転写反応に、１マイクログラムの総ＲＮＡを用いた。ＰＣＲをＥｘＴａｑで行った。ＲＴ−ＰＣＲプライマー配列は以下の通りである：（５’から３’）  Ｏｃｔ３／４（Ｅｎｄ−Ｓ）  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＧ、（配列番号４１）；（Ｅｎｄ−ＡＳ）  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＣ（配列番号  ４２）；  ＳＯＸ２（Ｅｎｄ−Ｓ）  ＧＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  Ａ
ＧＡ  ＧＧ（配列番号４３）、（Ｅｎｄ−ＡＳ）  ＴＴＧ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＴＧＧ  ＴＧ（配列番号４４）；  Ｎａｎｏｇ（Ｓ）  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  Ｃ（配列番号４５）、（ＡＳ）  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＧＴＴ  ＣＡＣ  Ｃ（配列番号４６）；  ＧＡＰＤＨ（Ｓ）  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣ（配列番号４７）、（ＡＳ）  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  Ａ（配列番号４８）。
【０３９９】
Ｉ型コラーゲン
プライマー：５’−ＡＡＴＧＡＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４９）および
５’−ＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号５０）
産物サイズ：１９８ｂｐ
アニーリング温度：６１℃
定量的ＰＣＲを用いて、ヒト上皮幹細胞（ｈＥＳＣ）に対する発現パーセントを決定した。
【０４００】
ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、およびｐ５３とＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの核局在化を伴う発現を示した（図８６Ａ〜８６Ｃ１）。定量的ＰＣＲは、Ｏｃｔ３／４が、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＯＸ２の間で、最高相対的レベルの発現を有することを示した。ＬＰ  ＩＤＰＳＣにおけるＯｃｔ３／４の相対発現は、非関連ドナーの間で多様であった（図８０Ａ〜８０Ｄ）。さらに、２つの関連しないドナー由来のＬＰ  ＩＤＰＳＣにおけるｐ５３陽性細胞の比率もまた定量化した（図８９Ａ〜８９Ｂ）。ｐ５３陽性細胞はまた、ＣＤ４４に関して陽性であり、これは上述のＭＳＣのマーカーであり（図１０Ｃ）、そして同様の量でＬＰ  ＩＤＰＳＣで見られた（図８９Ｃ〜８９Ｄ）。
【０４０１】
実施例２９．  ＲＴ−ＰＣＲによるＬＰ  ＩＤＰＳＣにおけるバイオマーカーの分析
製造者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・デュッセルドルフ）で、乳歯（ＤＬ−１およびＤＬ−４）から、そして第三大臼歯（ＤＬ−２）から単離したＬＰ  ＩＤＰＳＣの細胞試料から、総ＲＮＡを調製した。ＱＩＡＧＥＮ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって、〜８００ｎｇの総ＲＮＡに対して、相補的ＤＮＡ合成を実行し、そして以下に示す遺伝子特異的プライマーを用いて、生じたｃＤＮＡ産物を増幅した。
【０４０２】
Ｉ型コラーゲン
プライマー：５’−ＡＡＴＧＡＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣ−３’および
５’−ＣＣＡＧＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＣＡＣ−３’
産物サイズ：１９８ｂｐ
アニーリング温度：６１℃
フィブロネクチンＩＩＩＡ
プライマー：５’−ＧＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＣＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５１）および
５’−ＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号５２）
産物サイズ：２２３ｂｐ
アニーリング温度：６１℃
テネシン−Ｃ
プライマー：５’−ＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号５３）および
５’−ＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣ−３’（配列番号５４）
産物サイズ：２８５ｂｐ
アニーリング温度：６１℃
ビメンチン
プライマー：５’−ＡＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号５５）および
５’−ＴＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＴＣ−３’（配列番号５６）
産物サイズ：３２７ｂｐ
アニーリング温度：６１℃
Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアｖ．０．４．０を用いることによって、プライマーを設計した。産物を１．５％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロミドで染色し、そしてソフトウェアＫｏｄａｋ  １Ｄ  ｖ．３．６．５Ｋ２（Ｋｏｄａｋ）を用いて、トランスルミノメーターＧｅｌ  Ｌｏｇｉｃ  １００画像化系（Ｋｏｄａｋ、コネティカット州ニューヘブン）で視覚化した。ソフトウェアＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｃｈｏｐ  ＣＳ２で、バンドの比較密度測定を得た。
【０４０３】
図８７Ａおよび８７Ｂは、アガロースゲルの画像および分析した４つの遺伝子に関するバンドの対応する光学密度のグラフを示す。研究したＬＰ  ＩＤＰＳＣはすべて、ビメンチン、テネシン−Ｃ、Ｉ型コラーゲン、およびフィブロネクチン遺伝子を発現した。ＬＰ
ＩＤＰＳＣの３つの集団は、ビメンチン、テネシン、およびフィブロネクチン遺伝子の類似の発現を示した。密度測定分析は、ＤＬ−２細胞におけるＩ型コラーゲンに関して、総ＲＮＡが、他のｈＩＤＰＳＣにおいて観察されてきているものより有意により少ないことを示した（ｐ＜０．０５）。
【０４０４】
細胞を一次抗体とインキュベーションして、ビメンチン、Ｉ型コラーゲン、フィブロネクチン、およびテネシン−Ｃを検出した。すべての抗体をＰＢＳＡ中の５％ウシ血清アルブミン溶液中で希釈した。最適抗体濃度は、ＤＬ−１、ＤＬ−２、およびＤＬ−４細胞を用いた実験に対して、以前決定された。ビメンチンは、１：２５０に希釈されたＮｅｏｍａｒｋｅｒｓ（ＬａｂＶｉｓｉｏｎ社、カリフォルニア州フレモント）のマウス・モノクローナル抗体によって、検出された。Ｉ型コラーゲンは、１：２５に希釈されたＣｈｅｍｉｃｏｎのマウス・モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、オーストラリア・ビクトリア）によって検出された。フィブロネクチンは、１：５０に希釈されたＣａｌｂｉｏｃｈｅｍのマウス・モノクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）によって検出された。テネシン−Ｃは、１：１００に希釈されたＮｅｏｍａｒｋｅｒｓのマウス・モノクローナル抗体によって検出された。二次抗体は、室温の、ＰＢＳＡ中に希釈された（１：５００）、フルオレセインにコンジュゲート化されたマウス由来抗免疫グロブリンＧであった。すべてのインキュベーションは室温で６０分間行い、そして一次抗体の省略は、陰性対照として働いた。蛍光顕微鏡（ＬＳＭ  ４１０  Ｚｅｉｓｓ；ドイツ・バーデン−ビュルテンブルグ州オーバーコッヘン）上で、観察および写真記録を行った。各反応に関して、少なくとも１００の細胞を観察した。
【０４０５】
試験したすべての抗体に対する陽性反応が、分析したＬＰ  ＩＤＰＳＣとは独立に、観察された。ＬＰ  ＩＤＰＳＣ集団は、細胞骨格タンパク質、ビメンチンを、間葉系細胞から発現した。ビメンチンは、中心体から細胞の末梢ドメインに到達するために分岐した波打つ束のフィラメントとして現れた（図８８Ａ）。Ｉ型コラーゲンは、細胞質全体に広がり、核周辺領域周囲でより高濃度であるドットとして現れた（図８８Ｂ）。フィブロネクチン（図８８Ｃ）ならびにテネシン（図８８Ｄ）は、細胞質全体に均質に分布する小さい点として現れた。Ｉ型コラーゲンは、他のｈＩＤＰＳＣにおけるよりも、ＤＬ−２第三大臼歯系譜においてより明らかでなく、一方、乳歯から単離されるＤＬ−４は、フィブロネクチンおよびテネシン抗体に対するより顕著でない反応を示した。表７は、ＤＬ−１、ＤＬ−２、およびＤＬ−４細胞における４つのバイオマーカーの発現分析を要約する。
【０４０６】
表７．ｈＩＤＰＳＣにおけるバイオマーカーの免疫蛍光染色
【０４０７】
【表７】
2019116490.tif 000008
【０４０８】
＋＋＋：強い発現；＋＋：中程度の発現；＋：弱い発現
実施例３０．  ＳＯＸ２発現細胞が濃縮された未分化ＩＤＰＳＣ集団
ＩＤＰＳＣは、若い生物から単離される神経冠幹細胞である。したがって、本発明者らは、低酸素環境を考慮して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、そして機械的ＤＰトランスファー後に、複数回の継代のこれらの細胞におけるＳＯＸ２の発現を検証した。１５サイクルのＤＰトランスファー後に得た未分化ＥＰ  ＩＤＰＳＣは、継代２のＳＯＸ２タンパク質のロバストな発現を示し（図９０ａ、Ａ〜Ａ１）、一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後、ＳＯＸ２発現は次第に減少した。継代５で、ＳＯＸ２発現は、いくつかのＥＰ  ＩＤＰＳＣでしか観察されなかった（図９０ａ、Ｂ〜Ｂ１）。
【０４０９】
驚くべきことに、転写因子（ＴＦ）の細胞内局在は、ＴＦ機能状態のマーカーであることが見出された。したがって、継代２では、ＳＯＸ２の細胞内局在は核であり、一方、継代５では、核周辺空間で主に観察可能である。これによって、細胞質へのＳＯＸ２トラフィッキング（図９０ａ、Ａ１、Ｂ１）が示唆される。４５周期のＤＰトランスファー後に得られた未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、継代２（図９０ｂ、Ａ）および継代５（図９０ｂ、Ｂ）でＳＯＸ２タンパク質のロバストな発現を示す。継代２および５で、ＳＯＸ２の免疫染色のわずかな減少が検出され、そしてＳＯＸ２の細胞内局在は、核であった（図９０ｂ、Ａ、Ｂ）。これらの結果は、低酸素培養条件後、ＥＰ  ＩＤＰＳＣよりもＬＰ  ＩＤＰＳＣにおいてＳＯＸ２タンパク質発現に機能的利点があることを確認する。
【０４１０】
実施例３１．  神経前駆細胞−ＩＤＰＳＣより得られた神経芽細胞
ＩＤＰＳＣは、遊走神経冠幹細胞であり、ニューロスフェアに凝集可能である。発生中、ＳＯＸ２は、神経になる運命の細胞によってのみ、再獲得されることが知られる。ＳＯＸ２不含のままである神経冠幹細胞は、他の細胞タイプに分化し、ニューロンには決してならない。
【０４１１】
いくつかの側面にしたがって、ＤＰの長期間の機械的トランスファーが、ＩＤＰＳＣがＳＯＸ２を発現し、そしてニューロンに分化する能力にどのように影響を及ぼすか検証した。ＩＤＰＳＣの神経分化を本明細書記載のプロトコルにしたがって誘導した。まず、ＳＯＸ１タンパク質発現が、最終段階にまだ拘束されていない有糸分裂活性前駆細胞と相関し、そしてまたβ−チューブリン・クラスＩＩＩが初期ニューロンで排他的に発現される微小管要素であることを検証する。このマーカーをＢｒｄＵ標識と組み合わせて、ＤＰトランスファーサイクル数、および神経分化に強く拘束された細胞を含むＩＤＰＳＣ集団の濃縮の間の相関の証拠として用いた。
【０４１２】
図９１ａ、Ａ〜Ａ４は、核におけるＳＯＸ１の発現を立証し、一方、β−チューブリンは、ニューロスフェアに組織されたＩＤＰＳＣのＬＰ由来の神経前駆体における細胞質局
在を示す。より具体的には、図９１ａは、ニューロン由来のｈＩＤＰＳＣの後期集団（ＬＰ）中、Ｓｏｘ１およびβ−チューブリンタンパク質の発現を示す。以下もまた、図９１ａで示される：Ａ．ＤＡＰＩ染色されたニューロンの核（白い矢印）；Ａ１．ニューロンの核（白い矢印）で観察されたＳＯＸ１に関する陽性免疫染色；Ａ２．β−チューブリンに関する陽性免疫染色；Ａ３．Ａ〜Ａ２の合併画像；およびＡ４．Ａ３の挿入図の高倍率は、ニューロンの核におけるＤＡＰＩおよびＳＯＸ１の重ね合わせ（白い矢印）を示す。図９１ｂ〜ｅは、歯髄機械的トランスファーおよび神経分化誘導の１５、３０および４５サイクル後に、神経前駆体およびニューロンのｈＩＤＰＳＣのＬＰの濃縮を示す。図９１ｂ−Ａにおいて、ＳＯＸ１陰性細胞、核がＤＡＰＩ（青色）でしか染色されない核の割合を示す；ＳＯＸ１陽性細胞は緑色を提示する。図９１ｄ−Ｂにおいて、核がＤＡＰＩ（青色）でしか染色されないβ−チューブリン陰性細胞の割合；β−チューブリン陽性細胞を赤色で示す。
【０４１３】
ＩＤＰＳＣのニューロンに向かう分化後に得た初期神経芽細胞の増殖潜在能力もまた確認した。図９２ａは、抗ＢｒｄＵ抗体で正に免疫染色されたＩＤＰＳＣ神経芽細胞の核、およびβ−チューブリン・クラスＩＩＩと正に反応するニューロン体を示す。図９２ｂ〜ｃは、サイクル数を増やしていくＤＰ機械的トランスファー後、わずかに分化した神経芽細胞が分化ＩＤＰＳＣ集団で明らかに濃縮されていることを示す。
【０４１４】
驚くべきことに、わずかに分化した神経芽細胞の移行増幅ＩＤＰＳＣ集団を得た。これは、ＢｒｄＵ、Ｓｏｘ１およびβ−チューブリンの同時発現によって確証され、これは以前には、成体幹細胞に関しても、または胚性幹細胞に関しても立証されてこなかった。
【０４１５】
さらにより驚くべきことは、ＩＤＰＳＣから進行した継代（５〜１０）で得られた、すでにＳＯＸ２の発現を欠いている神経前駆細胞（図９０ａ、Ｂ、Ｂ１）が、ニューロスフェア形成中にＳＯＸ２を再発現し始めた（図９３ａ）という知見であった。これらの細胞の神経細胞への分化の効率は、しかし、継代１〜３のＩＤＰＳＣより低い。ＳＯＸ２の再発現は、ＤＰから得られたＩＤＰＳＣにおいてより効率的であり、これは、多数（≧３０）の機械的トランスファーサイクルを経ていた（図９３ｂ、ｃ）。
【０４１６】
これらの知見は、初期および後期胚性段階で単離可能なＩＤＰＳＣおよび神経冠幹細胞の間の同一性に関する強い証拠を提供する。さらに、神経拘束の効率は、ＤＰ機械的トランスファー後に増加し、ＩＤＰＳＣを単離し、そしてその自己再生および分化潜在能力を維持するためには、低い酸素大気が重要であることに関する本発明者らの以前の観察を支持した（Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２）。したがって、ＬＰ  ＩＤＰＳＣは、神経拘束に関してＥＰ  ＩＤＰＳＣより利点を有し、これは、神経変性疾患における将来の幹細胞使用のための重要な結論である。
【０４１７】
実施例３１．  新規方法の単純性および利点。
【０４１８】
図９４ａは、Ｃｉｍａｄａｍｏｒｅら、２０１１からの図解の要約であり、これは、ヒトＥＳ細胞からのＳＯＸ２細胞の単離法を示唆した。このプロトコルは、上皮間葉系遷移を誘導するため、ＳＯＸ２＋細胞の単離およびその遊走能の誘導から始まる。この時点で、ＩＤＰＳＣと対照的に細胞はＳＯＸ２発現を欠き、これは、これらの細胞がニューロンに分化する間に再発現される。このプロトコルは、ニューロン分化中のＳＯＸ２発現の制御機構を研究する多大な学術的興味を提示し、洗練されている。このプロトコルが、細胞療法のための神経細胞を単離するために用いられる可能性は、より低い。
【０４１９】
図９４ｂは、示唆される方法の単純性を明らかに示し、同時に神経変性疾患の治療のためのＩＤＰＳＣ組成物有用性を強調する、本開示の側面の限定されない態様を示す。
【０４２０】
いくつかの側面にしたがって、ユニークなバイオマーカーがｈＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞および初期ニューロンを鑑別する。膜貫通タンパク質のスーパーファミリーの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）メンバーであるＰ７５ＮＴＲ（またはＣＤ２７１）の発現は、本文書の別の箇所に記載される。ＣＤ２７１のリガンドはニューロトロフィンであり、これらは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ４／５）である。未分化ＩＤＰＳＣにおけるこれらの発現もまた、本文書の別の箇所に示され、そして記載される。最近の研究は、ＣＤ２７１がまた、これらのニューロトロフィンのプロ型の受容体として働く証拠を提供した（Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＬ，  Ｂｅａｒｅ  Ａ，  Ｚｏｌａ  Ｈ，  Ｒｕｓｈ  ＲＡ．  ＣＤ２７１（ｐ７５ニューロトロフィン受容体）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ．  ２００８  Ｊａｎ−Ｍａｒ；２２（１）：１−６）。
【０４２１】
やはり本明細書に開示する驚くべき最近の知見は、ＣＤ２７１マーカーがまた、ニューロスフェア（胚性神経前駆体の３次元クラスター）およびロゼット（初期神経管を暗示する神経上皮構造−３Ｄ神経島）を形成する、ｈＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞においても発現されることである。予期せぬことに、ロゼット内の細胞はまた、元来、神経毛細管に由来する周皮細胞のマーカーと見なされる、ＣＤ１４６も発現した。一方、生物学および病理学におけるこの分子の多機能性の役割は、最近認識されたばかりであった。ＣＤ１４６は、発生、シグナル伝達、細胞遊走、間葉系幹細胞分化、血管形成および免疫反応に能動的に関与することが示されてきている。さらにより最近、神経系の発生および維持におけるＣＤ１４６の関与が立証された。さらに、ＣＤ１４６神経系ノックアウトマウスは、野生型に比較した際、より軽い体重およびより少ない食物摂取を示した（Ｔｕら、２０１３）。
【０４２２】
図９５は、ニューロスフェアおよびロゼットを形成するＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞における神経マーカーの同時発現を示す。より具体的には、以下を図９５に示す：Ａ）神経分化に向かって誘導されるＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞内のＲＡＲ−アルファ発現（緑色）；Ｂ）およびＣ）それぞれ、ニューロスフェアおよび分化したニューロンにおける、ＣＤ２７１（Ｐ７５）の発現；Ｄ）ベータ−３−チューブリナ発現；Ｅ）ＮｅｕＮ抗体、ニューロスフェアにおける核局在；Ｆ）、Ｇ）、およびＨ）ダイニン−Ｌｉｓｌ−Ｎｄｅｌ複合体発現；Ｉ）およびＪ）それぞれ、ミエリンＰ２およびＯ４発現；Ｋ）シナプトフィジン発現、Ｌ）ＣＤ１４６発現；およびＭ）対照。スケールバー＝１０μｍ、ＤＡＰＩ（青色）で染色された核。
【０４２３】
ｈＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ベータ−３−チューブリン、および初期ニューロンの免疫表現型：ＣＤ２７１＋、ベータ−３−チューブリン＋、ＮｅｕＮ＋、ダイニン＋、Ｌｉｓ１＋、ＮＤＥＬ＋、ミエリンＰ２＋、Ｏ４＋、ＧＦＡＰ＋、シナプトフィジン＋およびＣＤ１４６＋。驚くべきことに、神経冠起源の出生後細胞のＬＰ  ＩＤＰＳＣ培養が、ユニークな特性によって性質決定されることが発見された。これらのユニークな特性は、通常、胎児脳由来、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経分化に誘導されるＥＳまたはｉＰＳ細胞由来の神経前駆体に典型である。
【０４２４】
実施例３２．  ＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞のさらなる分化および成熟
ＩＤＰＳＣ由来神経芽細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経成熟にしたがって、神経の重要なマーカーを発現し始める：
１．  ニューロンの遊走およびシグナル伝達、アウトグロースおよび維持ならびに軸索内輸送に関与、例えばダイニン、Ｌｉｓ１、Ｎｄｅｌ１；
２．  ミエリン鞘の生成に関与：ミエリンＰ２、Ｏ４；
３．  神経特定および分化に関与：ＲＡＲ−アルファ
４．  神経伝達因子放出の制御に関与：シナプシンＩａ／ｂ
ダイニンはマイナス端定方向モータータンパク質であり、細胞において、ＡＴＰに含有される化学エネルギーを運動の機械エネルギーに変換する。逆行性軸索内輸送を通じて、ダイニンは、細胞体に向かってニューロンの軸索に沿って、細胞内小器官、小胞、およびおそらく微小管断片を運ぶ。
【０４２５】
Ｌｉｓ１、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼＩＢサブユニットアルファは、ヒトにおいて、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子にコードされる酵素である。Ｌｉｓ１は、ヒト・ニューロン遊走欠陥、脳回欠損において突然変異する遺伝子のタンパク質産物であり、細胞においてダイニンに結合し、そしてダイニン運動機能を制御する。
【０４２６】
ＮＤＥＬ−１、核分布タンパク質ｎｕｄＥ様１は、ヒトにおいて、細胞骨格組織化、細胞シグナル伝達およびニューロン遊走、アウトグロースおよび維持を含めて、神経系発生に役割を果たすタンパク質である。
【０４２７】
Ｓａｓａｋｉ  Ｓ，  Ｓｈｉｏｎｏｙａ  Ａ，  Ｉｓｈｉｄａ  Ｍ，  Ｇａｍｂｅｌｌｏ  ＭＪ，  Ｙｉｎｇｌｉｎｇ  Ｊ，  Ｗｙｎｓｈａｗ−Ｂｏｒｉｓ  Ａ，  Ｈｉｒｏｔｓｕｎｅ  Ｓ．  発生中および成体の神経系におけるＬＩＳ１／ＮＵＤＥＬ／細胞質ダイニン重鎖複合体。  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２０００  Ｄｅｃ；２８（３）：６８１−９６．
Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  Ａ，  Ａｎｄｏ  Ｒ，  Ｓａｐｉｒ  Ｔ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ．  神経形態形成における、微小管動力学。  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ．  ２０１３  Ｊｕｌ
１７；３（７）：１３００６１．  ｄｏｉ：  １０．１０９８／ｒｓｏｂ．１３００６１．
ミエリンＰ２タンパク質およびミエリン塩基性タンパク質は、ともに、末梢神経系ミエリンタンパク質の主要な部分を構成する。これらは、ミエリン鞘の生成に親密に関与する。これらはまた、いくつかの神経学的疾患にも関与し、これには、中枢および末梢神経系両方の自己免疫疾患が含まれる。
【０４２８】
Ｏ４、モノクローナル抗オリゴデンドロサイト・マーカーＯ４は、オリゴデンドロサイトマーカーＯ４を認識する。オリゴデンドロサイトは、迅速な神経伝達を支持する軸索のミエリン鞘を形成する、中枢神経系（ＣＮＳ）のミエリン化細胞である。
【０４２９】
レチノイン酸受容体−アルファ（ＲＡＲ−アルファ）は、すべてのトランスレチノイン酸に高いアフィニティを有し、そして甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ３受容体およびエクジソン受容体として同じクラスの核転写因子に属する。
【０４３０】
シナプシンＩａ／ｂは、シナプシンＩａおよびシナプシンＩｂと称される、２つの選択的スプライシングアイソフォームとして存在し、神経末端における主要リンタンパク質の１つと性質決定され、そして神経伝達物質放出の制御に関与すると考えられる。
【０４３１】
表８は、多様な一次抗体のタイプ、起源、希釈および購入元を提示する。
【０４３２】
表８．
【０４３３】
【表８】
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【０４３４】
実施例３３．  ＬＰ  ＩＤＰＳＣ  Ｇバンドの核型分析
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したＩＤＰＳＣの集密以下のＬＰの核型決定を継代３および１０で行った。採取前に、０．１μｇ／ｍｌの最終濃度のデメコルシン（Ｓｉｇｍａ）を１時間添加した。細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして０．５ｍｌの培地中に再懸濁し、そして０．０７５Ｍ  ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）と１０ｍｌの体積に混合した。室温で２０分間インキュベーションした後、細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、そしてペレットを５ｍｌの３倍（３：１）の冷メタノール／酢酸（Ｓｉｇｍａ）中で固定した。スライドあたり、細胞懸濁物３滴を固定した。染色体計数のため、スライドをギムザで１５分間染色し、そして；細胞株あたり＞２００細胞を分析し、そしてヒト細胞遺伝学命名に関する国際システムにしたがって、Ｚｅｉｓｓ  ＩＩ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ・イエナ）上で報告した。
【０４３５】
ＩＤＰＳＣの核型を初期（Ｐ３）および後期（Ｐ１０）継代で分析した。核型は、安定性を示し、そして構造または数の改変は観察されなかった。
【０４３６】
図９６は、初期および後期継代のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養ＬＰ  ＩＤＰＳＣの雄性核型の代表的な図を示す。
【０４３７】
実施例３４．  ＩＤＰＳＣの使用を用いた、ラットの頤神経の再生
一般体性求心性（感覚）神経である頤神経の再生の評価を行った。この神経は、顎および下唇の前方局面ならびに下顎前歯および小臼歯の頬側歯肉への感覚を提供する。これは、下歯槽神経の後幹の枝であり、該神経はこれ自体、三叉神経（ＣＮＶ）下顎分枝の枝である。
【０４３８】
３６匹の雄Ｗｉｓｔａｒラットを本実験に用い、そしてラットは圧迫によって右側頤神経の傷害を受ける。各ラットの左側神経を陽性対照として用いた。次いで、右側頤神経を２つの研究群に分けた：圧迫を伴い、そして治療なしの対照群（ｎ＝１８）ならびに圧迫による傷害を受け、そしてＩＤＰＳＣの治療を受ける実験群（ｎ＝１８）（２ｘ１０６細胞）。動物を異なる研究時点：病変の１、３、７、１４、２１および４２日後に安楽死させ、そして透過型電子顕微鏡分析のため、頤神経および三叉神経節を除去した。ミエリン線維の外周およびミエリン層の厚さの測定のため、神経線維の画像を得た。治療１４日後、神経は、損なわれていない神経と類似の形態学的側面を示した。頤神経再生のためのＩＤＰＳＣの使用は、治療２週後、単回適用で有効であった。
【０４３９】
実施例３５．  奇形腫形成
奇形腫形成は、任意の多能性細胞、例えば胚性または人工多能性幹細胞（ＥＳおよびｉ
ＰＳ細胞）の多能性を決定する際に必須のツールである。細胞の奇形腫形成能の評価のための一定のプロトコルが確立され、そして次いで、研究に用いられた。いくつかの近年公開された本発明者の方法は、定義される数の未分化ＩＤＰＳＣおよびＭａｔｒｉｇｅｌの免疫不全マウス内への皮下同時移植に基づく。方法は、マウスおよびヒトの多能性細胞の１０６細胞を用いた際に、非常に再現性であり、そして効率的であることが示された。症例の１００％で、本発明者らは、多数の動物において、そして長期追跡調査（最長６ヶ月）で、奇形腫形成を観察した。この方法は、他の成体／間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、例えば乳歯の歯髄、臍帯および脂肪組織およびその他に由来するものなどの生物安全性分析のためのものである。
【０４４０】
やはり評価するのは、奇形腫アッセイ感度および定量性のための次の判断基準であった：
Ａ．  最終的な細胞数および単細胞懸濁物産生；多能性細胞マーカー発現および核型に関する研究細胞の免疫表現型決定；Ｍａｔｒｉｇｅｌを伴う研究細胞の同時移植；奇形腫発展の単純な監視を可能にする皮下（ｓ．ｃ．）細胞移植；細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内に移植した。
【０４４１】
Ｂ．  腫瘍の発展を４ヶ月（およそ１６週間）監視した。多能性細胞に関して、奇形腫の組織学的基準は、三胚葉層すべてに由来する組織の発展であった。この分析は病理学者によって行われた。
【０４４２】
Ｃ．  ＩＤＰＳＣに関して、細胞注入部位における正常組織完全性に関する任意のタイプまたは任意の変化を考慮した。
【０４４３】
実験系（単数または複数）：
Ａ．  初期（ｎ＝１０）および後期継代（ｎ＝１０）での、３つの異なるＬＰ  ＩＤＰＳＣ培養
Ｂ．  ヒト初代線維芽細胞（陰性対照）
ＩＤＰＳＣは、多能性マーカーを発現する多様な数の幹細胞（細胞の１〜２５％）を含む集団によって構成される（Ｋｅｒｋｉｓら、２００６；Ｌｉｚｉｅｒら、２０１２）。これらの細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝２０）に移植し、そして腫瘍の発展を４ヶ月から監視した（およそ１６週）。細胞注入部位における正常組織完全性に関する任意のタイプの変化を考慮した。
【０４４４】
このプロトコルを、ＩＤＰＳＣの集団に、特に用いる細胞数に関して適応させ、これは、ＩＤＰＳＣの２０％が多能性マーカーを発現することに基づいて計算された。ＥＳおよびｉＰＳ細胞を用いた、本発明者らの先の研究において、本発明者らは１０６細胞を用い、一方、ＩＤＰＳＣおよび対照細胞催奇性を試験するため、５ｘ１０６細胞を用いた。
【０４４５】
４ヶ月後、巨視的に腫瘍が観察されない場合であっても、マウスを屠殺し、そして脳、肺、腎臓、脾臓、肝臓などの多様な臓器から凍結切片を得て、そして病理学者によって分析させた。
【０４４６】
結論：研究した臓器すべてにＩＤＰＳＣのＤＮＡの存在が見られたが、腫瘍形成または巨視的形態変化はまったく観察されなかった。
【０４４７】
実施例３６．  ＬＰ  ｈＩＤＰＳＣＳのパラクリン効果：ＩＤＰＳＣの抗炎症、免疫調節および抗微生物特性
ＭＳＣは、パラクリン機構を通じて補助し、そして抗炎症および免疫調節機構を通じて再生環境を調節する。病原性が異なるＭｔｂおよびウシ結核菌にｉ．ｔ．感染させたＣ５
７Ｂｌ／６マウスの肺細胞によるサイトカイン産生に対するＩＤＰＳＣ  ｉ．ｐ．接種の効果を観察した。ＢＩＯＰＬＥＸ試験データを図９７に提供する。ＩＤＰＳＣ接種によって、感染肺細胞によるサイトカイン産生が減少した。炎症促進性（ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＭＩＰ−２、ＩＬ−１７）および抗炎症性（ＩＬ−１０）サイトカインの強い減少が、非常に悪性のＭｔｂ株に感染した肺で観察された。ＩＦＮ−ｇおよびＫＣ産生の減少はより顕著でなかった。ＩＬ−４産生の誘導は、ＩＤＰＳＣを接種されたマウスにおいてのみ観察された。
【０４４８】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、カケキシン、またはカケクチン、および以前には、腫瘍壊死因子アルファまたはＴＮＦαとして知られた）は、全身炎症に関与するアディポカインである。ＴＮＦの主な役割は、免疫細胞の制御におけるものである。ＴＮＦは、内因性発熱物質であり、発熱、アポトーシス細胞死、悪液質、炎症を誘導することが可能であり、そして腫瘍原性およびウイルス複製を阻害することが可能であり、そしてＩＬ１およびＩＬ６産生細胞を通じて敗血症に反応する。ＴＮＦ産生の調節不全は、アルツハイマー病を含む、多様なヒト疾患に関連づけられてきている。
【０４４９】
インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）は、ＩＩ型インターフェロン・クラスの唯一のメンバーである二量体化可溶性サイトカインであり、ウイルスおよび細胞内細菌感染に対する自然免疫および獲得免疫のため、ならびに腫瘍制御のため、非常に重要な免疫インターフェロン、サイトカインとして知られる。ＩＦＮγは、マクロファージの重要な活性化因子である。異常なＩＦＮγ発現は、いくつかの自己炎症性および自己免疫疾患と関連する。免疫系におけるＩＦＮγの重要性は、部分的に、ウイルス複製を直接阻害する能力、そして最も重要なことに、その免疫刺激性および免疫調節性効果から生じる。
【０４５０】
インターロイキン１７は、インターフェロン・ガンマ同様、多様な組織において、ケモカイン産生を増加させ、単球および好中球を炎症部位に補充することによって、遅延型反応における強力な仲介因子として作用するサイトカインである。ファミリーとしてのインターロイキン１７は、細胞外病原体による免疫系の侵入に反応して、そして病原体の細胞マトリックスの破壊を誘導する、炎症促進性サイトカインとして機能する。
【０４５１】
インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）はまた、カタボリンとしても知られ、炎症性反応の重要な仲介因子であるサイトカインタンパク質であり、そして細胞増殖、分化、およびアポトーシスを含む、多様な細胞活性に関与する。ＩＬ−１７の最も顕著な役割は、炎症促進性反応を誘導し、そして仲介する際の関与である。ＩＬ−１７は、一般的に、アレルギー反応に関連する。
【０４５２】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）はまた、ヒト・サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られる、抗炎症性サイトカインである。ＩＬ−１０は、免疫制御および炎症における多面的な効果を持つサイトカインである。
【０４５３】
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＸＣＬ２）はまた、マクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２）とも呼ばれ、神経栄養炎症性反応を仲介する主要な役割を果たし、そして敗血症の発展における仲介因子である。ＫＣおよびマクロファージ炎症性タンパク質−２（ＭＩＰ−２）は、外科的傷害後、皮膚における別個の時間的発現パターンを示すＣＸＣケモカインである。ＫＣおよびＭｉｐ２は、好中球化学誘因遺伝子である。どちらのケモカインも広範囲の急性および慢性炎症性設定で発現されることが知られ、そして後に続く炎症性反応の性質および度合いの非常に重要な決定要因であると考えられる。
【０４５４】
実施例３７．  第三大臼歯（智歯）から単離されたＩＤＰＳＣ
図１０４は、摘出された第三大臼歯、智歯を示す。ＣＤ１０５は、ＭＳＣの主なマーカーである。ＭＳＣの分布を検証し、そして歯髄におけるそのニッチを同定するために、該マーカーを用いた。本発明者らは、このマーカーを発現するＭＳＣが、血管周囲の多数のニッチ、血管または神経のネットワーク中の血管叢および神経叢に位置することを立証する（図９８）。血管叢および神経叢は、非常に似た構造であるが、この定義は、より小さいネットワーク（血管叢）と大きいもの（神経叢）を区別するために含まれた。本発明者らが観察するように、ＣＤ１０５＋細胞は、血管周囲ニッチ（図９８Ｂ、Ｃ、Ｆ、黒い矢印）、血管叢（図９８Ｂ、Ｃ、Ｇ、オレンジの矢印）、および神経叢（図９８Ｈ、星）に位置する。
【０４５５】
ＭＳＣおよびそのニッチの同定に非常に重要な別のマーカーは、ＣＤ７３であり、これは２つの抗体で構成される：ＭＳＣ上の異なるエピトープを認識する、ＳＨ−３およびＳＨ−４。本発明者らは、両方の抗体を用いて、そしてこれらの間の認識可能な相違を観察した。ＳＨ３は、歯髄組織全体および血管周囲位置に分布する陽性染色を示した（図９９Ａ）。本発明者らは、内皮細胞層に位置する血管中のＳＨ３陽性細胞（図９９Ｂ、Ｃ）、ならびに周皮細胞の位置に存在するいくつかのＳＨ３＋細胞に注目した。解剖学的に同じ部位に位置するＣＤ１０５＋細胞（図９８Ｈ）と比較した際、驚くべきことに、ＳＨ３＋細胞は、別個のニューロン様（図９９Ｄ）形態を示す細胞における神経叢に見られた。抗体発現に関しては、ＳＨ４は、ＳＨ３（図９９Ａ〜Ｄ）および対照（図９８Ａ）と比較した際、非常にかすかなマーク（図９９Ｅ、Ｆ）を示した。
【０４５６】
さらに、本発明者らは、神経細胞の接着分子であり、そして胚形成中、神経冠細胞の重要な分子と見なされる、Ｎ−カドヘリンの発現を試験した。第三大臼歯の歯髄において、Ｎ−カドヘリンの発現は、主に、血管周囲ニッチにおいて視覚化されたが、より小さい径の血管周囲であった（図１００Ａ〜Ｃ）。さらに、染色はすべての血管周囲では観察されなかった（図１００Ａ）。さらに、図１００Ｃは、周皮細胞の解剖学的部位におけるＮ−カドヘリンの位置を示す。
【０４５７】
ＡＢＣＧ２は、内部および外部細胞膜に渡って、多様な分子を輸送する、細胞膜タンパク質と関連する。ＡＢＣＧ２はまた、幹細胞マーカーと見なされ、そして胎盤で豊富に発現される。本発明者らは、ＳＨ−３に関して観察されるもの（図９９）と同様に、このマーカーの強力な発現（図１００Ｄ、Ｅ）を示す、歯髄結合組織に分布する細胞を観察した。本発明者らはまた、血管周囲領域および血管叢でその発現が観察される転写因子である、Ｎａｎｏｇの発現を検証した（図１００Ｆ）が、細胞質および核局在を示さなかった。
【０４５８】
２つの主なマーカーをマークする比較分析によって、ＭＳＣ陽性細胞およびＣＤ１０５＋＋ＣＤ７３／ＳＨ３は、歯髄組織ニッチの位置においても、形態においても両方が異なることが示された。歯髄組織、神経叢に見られる場合、ＣＤ１０５＋細胞は、ＣＴＭに典型的な線維芽細胞の形態を示す（図１０１）。結合組織に見られるＣＤ７３／ＳＨ３＋細胞は、丸く、そしてＣＤ１０５＋に比較した際より小さい（図１０１Ｂ）。ＣＤ１０５＋および＋ＣＤ７３／ＳＨ３抗体両方に関するマークアップが血管周囲ニッチにおいて観察されたが、明らかに、ＣＤ１０５＋細胞は、周皮細胞の解剖学的部位で見られ、ＣＤ７３／ＳＨ３＋細胞は内皮細胞で見られる（図１０１Ｃ、Ｄ）。陽性転換細胞では、Ｎ−カドヘリンは、主に、周皮細胞の解剖学的部位に位置する（図１０１Ｅ）が、内皮細胞ニッチには位置しない（図１０１Ｃ、Ｄ）。ＣＤ７３／ＳＨ３＋およびＣＤ１０５＋の間の主要な相違が、神経叢で観察され、ここで、ＣＤ７３／ＳＨ３＋細胞は、ニューロン形態を複製する（ｆａｃｓｉｍｉｌｅ）（図１０２Ａ、Ｂ）。
【０４５９】
このデータは、ＩＤＰＳＣと類似の分子シグニチャーを持つ単離幹細胞の可能性を立証し、ならびに神経叢に位置する幹細胞の神経拘束を確認する。
【０４６０】
実施例３８．  ＩＤＰＳＣの催奇潜在性の評価
ＩＤＰＳＣの催奇潜在性を評価するため、１ｘ１０６細胞を１５匹の免疫抑制マウスの背中に皮下注射した。４０日後、細胞塊および／または奇形腫の形成が巨視的に観察された（図１０４）。
【０４６１】
実施例３９．  ＬＰ法によるｈＩＤＰＳＣの産業的スケールアップのためのバッチ放出プロセス
図１０５は、多数回の患者投薬のための臨床的に適切な量を得るため、ＬＰ法によるｈＩＤＰＳＣの産業的スケールアップのためのバッチ放出プロセスのための例示的フローチャートを示す。いくつかの側面にしたがって、乳歯由来の歯髄を、細胞培養フラスコ上にプレーティングする。歯髄（ＤＰ）由来の細胞を、各採取サイクル（Ｈ）で、継代１（Ｐ１）〜継代３（Ｐ３）まで、酵素解離試薬によって継代する。各採取（ｈ１〜Ｈ３５）で、ＤＰを非酵素的方法によってトランスファーする。
【０４６２】
Ｐ３で、各採取サイクルにおいて、１〜１０の歯髄由来の細胞をプールし、そしてＰ４で凍結プロセスを経る。その後、細胞を融解し、そして５０％の細胞をｐ％で単一バッチとして放出する。その後、細胞を凍結し、そしてこれは、療法的投与の準備ができており、好ましくは直接神経生成を誘導し、限定されるわけではないが、クモ膜下腔内（ＩＴ）または脊髄内注射（産物１−ＩＴ）による。
【０４６３】
静脈内（ＩＶ）／全身性または局部／局所投与のため、多数の細胞を得るために、さらに５０％の細胞をＰ４で融解し、そして継代１５まで増殖させ、そしてＰ１５で単一バッチとして放出してもよい。次いで、細胞をプールし、そして静脈内投与のために凍結する（産物２−ＩＶ）。
【０４６４】
表９は、上記に、および図１０５に示すバッチ放出プロセスに関して行った分析の多様な方法を提示する。
【０４６５】
表９
【０４６６】
【表９】
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【０４６７】
Ｐ３およびＰ１５で、選択した品質管理試験を行った。認証分析を行い、そしてこれを以下の表１０に提供する。認証分析は、クモ膜下腔内投与に関する本開示の１つの側面にしたがったｈＩＤＰＳＣ産物に関するものである。この特定の分析のためのバッチ番号は＃００１Ｈ１−３０／Ｐ１−５／Ｆであった。
【０４６８】
表１０．
【０４６９】
【表１０】
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【０４７０】
多様な関連する方法もまた、本開示の一部として意図される。方法には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：
歯髄単離。試料採取直前の歯の調製に関して、異なる方法がある。ヒト歯髄から単離される幹細胞は、神経冠によって産生される間葉系細胞に由来する。ヒト歯髄から幹細胞を単離するため、歯が健康であり、そして歯髄および口腔の間にいかなる連絡もないことが必要である。
【０４７１】
細胞培養。分化誘導に用いる培養系のタイプに応じて、生じた集団の性質は、推測的に決定可能である。使用のための共通の培養系は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む培養マトリックスを含む。１つの態様にしたがって、ＥＣＭは、限定されることなく、フィブロネクチン、ラミニンおよびゼラチンから選択される。培養系にはさらに、抗細菌剤を
補充することも可能である。抗細菌剤は、限定されることなく、ペニシリンおよびストレプトマイシン、好ましくはゲンタマイシン（微量での、ペニシリンアレルギー性集団への移植のリスクを減少させるため）から選択されることも可能である。
【０４７２】
培養系にさらに、また、持続放出成長因子を用いて、均質な未分化状態に細胞を維持する、Ｓｔｅｒｎらによって、米国特許第８，４８１，３０８号において記載されるような、成長因子を補ってもよい。
【０４７３】
徹底的に発展され、そして用いられる別の代替培養系は、ノックアウト血清置換物（ＫＯＳＲ）および成長因子、例えばＦＧＦ２を補充したノックアウト（ＫＯ）培地が含まれる、血清不含系である。ノックアウト血清置換物（ＫＯＳＲ）（Ｇｉｂｃｏ）は、化学的に定義された血清不含培地補充物であり、増殖する幹細胞のためのＫＯ−ＤＭＥＭに基づく培養系中の動物に基づく血清の置換物として用いられ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）での補充を置換することも可能である。別の場合による培養は、神経細胞の増殖のために特に配合される基本培地であるＮｅｕｒｏｂａｓａｌＴＭ培地を含み、そしてＦＢＳ、またはＢ２７、またはＮ２血清置換およびレチノイン酸（ＲＡ）を補充される。
【０４７４】
未分化または分化細胞株は、保存法、例えば凍結保存によって保存される。
【０４７５】
いくつかの側面にしたがって、意図される開示は、未分化ｈＩＤＰＳＣを提供し、ここで、細胞は、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳＯＸ２を含むヒト多能性幹細胞のマーカーと免疫反応性であり、そして前記細胞は、神経細胞に分化する条件下で、分化することも可能である。好ましくは、細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって立証されるように、転写因子ＳＯＸ１；ＳＯＸ２およびチューブリンを発現する。前記細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの長期培養中、安定した二倍体核型を維持する。ＳｏｘおよびＯｃｔ３／４転写因子は、ＥＳ細胞同一性を特定する転写制御ヒエラルキーの中心的となると考えられる。ｈＩＤＰＳＣは、ＬＰまでの細胞培養全体のＩＤＰＳＣのおよそ約２０％で、Ｏｃｔ４（Ｉｎｓｅｒｔ
ｒｅｆ  ２００６；およびＬｉｅｓｅｒら  ２０１２）を発現することが以前示されてきている。したがって、ＯＣＴファミリーおよびＳＯＸファミリーマーカーの両方の共存は、ｈＩＤＰＳＣの高い幹細胞性および多能性を示す。しかし、ＳＯＸおよびベータ−チューブリンマーカーの濃縮は、神経運命への強いアフィニティを示す。
【０４７６】
やはり本明細書に開示するのは、ＬＰ採取法を用いた、未分化ｈＩＤＰＳＣの調製であり、ここで、ＬＰにおける、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＢｒｄＵ、ベータ−３−チューブリン分子マーカーの濃縮は、これらのＬＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、そして神経前駆細胞、神経細胞および／またはグリア細胞および神経節細胞に分化する（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ）能力を示す。好ましくは、未分化ｈＩＤＰＳＣ細胞は、分化条件またはｉｎ  ｖｉｖｏ微小環境に供された際、神経前駆細胞、神経細胞および／またはグリア細胞に分化する潜在能力を有する。
【０４７７】
治療法。本開示の側面の同種異系の性質は、ｈＩＤＰＳＣが通常、非ＨＬＡタイピングであるため、免疫毒性の懸念を実質的に緩和する。患者への移植のためにｈＩＤＰＳＣの組成物を提供する工程を含む方法が意図される。こうしたｈＩＤＰＳＣは、開示にしたがって、未分化ｈＩＤＰＳＣを含むＬＴ培養系に由来し、その後、選択された体細胞へのＳＣの定方向分化を補助する培養系において、未分化ＳＣをインキュベーションし、好ましくは強い神経内皮拘束を維持する。
【０４７８】
１つの態様において、体細胞の選択される集団は、本質的に神経前駆細胞からなる。別の態様にしたがって、体細胞の選択される集団は、本質的にドーパミン作動性神経細胞からなる。体細胞の特に望ましいタイプ、例えば神経前駆細胞またはドーパミン作動性神経
細胞へのＳＣの定方向分化を支持する培養系は、当該技術分野に周知である。
【０４７９】
神経前駆細胞、神経細胞およびグリア細胞に分化可能な未分化細胞株があり、そして好ましくは本発明の方法によって産生される。長期間培養可能であり、そして多量の前駆細胞を生じさせうる、分化し、拘束された前駆細胞株を提供する。成熟ニューロンおよび／またはグリア細胞に分化可能な、分化し、拘束された前駆細胞株を提供する。成熟神経細胞およびグリア細胞を生じさせることが可能な拘束された神経前駆細胞もまた提供する。レシピエント脳において移植片を確立可能であり、神経系の組織生成に関与し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでニューロン系譜、星状細胞系譜およびオリゴデンドロサイト系譜を構成する、分化し、拘束された前駆細胞株を提供する。
【０４８０】
やはり提供するのは、全身性、クモ膜下腔内、鼻内または局所の細胞移植を通じて、細胞療法および遺伝子療法のための薬学的組成物中で使用可能な、未分化ｈＩＤＰＳＣ、ｈＩＤＰＳＣ由来神経前駆細胞−神経芽細胞、神経細胞およびグリア細胞である。開示する／予期される療法的神経保護作用は、防御抗炎症および／または神経成長因子の放出、ならびに／あるいは神経生成の発現および／または修復、ならびに／あるいは機能的転帰、例えば運動および／または認知転帰の改善を通じて、活性化されることも可能である。
【０４８１】
こうした神経保護法は、直接補充し、置換し、そして／または損傷を受けたまたは機能不全の神経細胞（すなわちニューロン／グリア／オリゴデンドロサイト）を補充することによって、そして／または存在する神経細胞の増殖および／または生存を増進することによって、そして／または神経変性状態において、こうした細胞の損失を遅延させるかまたは逆転させることによって、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳ疾患の治療を提供する。
【０４８２】
本明細書にやはり開示するのは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患、状態および傷害の予防および治療のためのｈＩＤＰＳＣを含む組成物および方法である。開示するｈＩＤＰＳＣ移植によって治療可能な疾患および状態の限定されないさらなる実施例は、神経変性障害および神経疾患、例えば神経変性障害（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン障害、ハンチントン病（ハンチントン舞踏病）、ルー・ゲーリック病、多発性硬化症、ピック病、パーキンソン認知症症候群）、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、視床変性症候群、遺伝性失語症、筋萎縮性側索症候群、シャイ・ドレーガー症候群、およびレビー小体病；血管状態（例えば梗塞、出血、心臓障害）；混合血管およびアルツハイマー病；細菌性髄膜炎；クロイツフェルツ・ヤコブ病；およびクッシング病である。
【０４８３】
やはり本明細書に意図されるのは、急性脳傷害と称される神経変性障害の治療である。これらには、限定されるわけではないが：脳卒中、頭部外傷、および窒息が含まれる。脳卒中は、脳血管疾患を指し、そしてまた、脳血管事象としてもまた称される可能性があり、そして急性血栓塞栓性脳卒中が含まれる。脳卒中には、限局性虚血および全虚血の両方が含まれる。他の事象は、頭部外傷、脊髄外傷、または全身無酸素、低酸素、低血糖、低血圧からの傷害、ならびに塞栓（ｅｍｂｏｌｅ）、過灌流（ｈｙｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、および低酸素からの処置中に見られる類似の傷害である。
【０４８４】
ｈＩＤＰＳＣ細胞は、典型的には、単位投薬量注射可能型、例えば溶液、懸濁物、またはエマルジョンで配合される。細胞／培地の水性懸濁物の投薬型／薬学的配合物は、典型的には、約０．１〜０．２に等張性であるように、懸濁物のイオン強度を、そして約ｐＨ６．８〜７．５の生理学的ｐＨに調節することを伴うであろう。前記配合物はまた、典型的には、液体潤滑剤も含有するであろう。
【０４８５】
細胞および／または馴化培地の注入に適した薬学的配合物は、典型的には、無菌水溶液
および分散物である。注射可能配合物のキャリアーは、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または他の適切なビヒクル、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることも可能である。技術を持つ薬学専門家は、本発明の方法において投与されるべき組成物中の細胞、ならびに場合によるキャリアーおよび添加剤を決定することも可能である。典型的には、ｈＩＤＰＳＣ細胞に対する任意の添加剤／賦形剤または活性化合物は、リン酸緩衝生理食塩水中、０．００１〜５０重量％の量で存在する。
【０４８６】
医学業および薬学業における当業者に周知の投薬量および技術によって、前記組成物を投与することも可能である。医師によって、不要な実験を伴わずに、本開示、本明細書に引用する文書、および当該技術分野における知識から、ヒト／哺乳動物のための用量を決定することも可能である。
【０４８７】
専門家／医師は、被験体が、例えば脳卒中に罹患しているか、またはそのリスクがある、ならびに本発明に記載するように、ｈＩＤＰＳＣの全身、クモ膜下腔内、または局所の投与のため、脳卒中に罹患している、適切な状態を決定することが可能であろう。
【０４８８】
側面はまた、ｈＩＤＰＳＣ投与が、神経変性障害のための療法的化学薬品または生物活性または／および薬学的化合物剤と組み合わされる併合療法の療法的使用にも関する。
【０４８９】
意図される組成物および方法を用いて、上述のような神経変性疾患と診断された患者における医学的状態を緩和し、そして／または軽減し、そして／または改善することも可能である。さらなる態様において、驚くべきことにＣ２７１およびＰ５７を発現する、ユニークなバイオマーカ−・フィンガープリントを持つｈＩＤＰＳＣ神経前駆体神経芽細胞の使用法が意図される。培養中で増殖するこれらの細胞は、将来の神経変性医学および薬剤発見のために非常に興味深い。
【０４９０】
さらに、本明細書に最初に開示するのは、ｈＩＤＰＳＣのユニークなパラクリン特性、例えば（ｉ）免疫調節特性、（ｉｉ）抗炎症性特性、そしてさらに（ｉｉｉ）抗微生物特性である。こうした特性は、ＩＤＰＳＣの使用の新規分野を開く。例えば、多重臨床適用の治療が意図される：（ｉ）免疫抑制性疾患、例えば移植片対宿主病；ＡＩＤＳ；癌化学療法副作用に対する免疫保護として；（ｉｉ）例えば関節炎、またはＩＢＤ−炎症性腸疾患に対する抗炎症療法としてのｈＩＤＰＳＣの使用；ならびに／あるいは（ｉｉｉ）敗血症および耐性院内感染等の感染性疾患。
【０４９１】
本明細書に開示するのは、単一療法として、あるいは組み合わせてまたは相乗的に、他の治療様式と、または／そして防御療法として（例えば、院内感染またはＡＩＤＳの高いリスクにある患者において）、使用可能な治療法である。
【０４９２】
本明細書において、本開示の多様な態様に示すように、適切な修飾を行って、にもかかわらず意図する開示の範囲内に留まるであろうことが予期される。本発明は、したがって、以下の請求項にしたがってのみ、解釈されるものとする。
【０４９３】
参考文献
【０４９４】
【化１−１】
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【０４９５】
【化１−２】
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【０４９６】
【化１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図５０】
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【図５１】
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【図６０】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６９】
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【図７０】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７−１】
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【図８７−２】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月26日(2019.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の単離集団を産生する方法であって：
（ａ）０．５％〜１５％の間の酸素（Ｏ２）を含む低酸素条件下で培地中で歯髄（ＤＰ）を培養し、それによりＤＰからのＩＤＰＳＣのアウトグロースおよびＩＤＰＳＣの接着を可能にし；
（ｂ）培地を交換するか、または酵素処理を伴わずにＤＰを機械的にトランスファーし；
（ｃ）少なくとも５回、工程（ａ）および（ｂ）を反復し；そして
（ｄ）接着したＩＤＰＳＣを継代し、ＩＤＰＳＣの単離集団を得る
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ａ）および（ｂ）が、少なくとも９回反復される、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ａ）および（ｂ）が、少なくとも２０回反復される、請求項２の方法。
【請求項４】
工程（ａ）および（ｂ）が、少なくとも３０回反復される、請求項３の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が、ＤＰを少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、または少なくとも１５日間培養することを含む、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
工程（ａ）が、ＤＰを約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間培養することを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、ＤＰを少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、または少なくとも１５日間培養することを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
ＩＤＰＳＣの単離集団が、ｐ７５、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、ベータ−３−チューブリン、またはそれらの組み合わせを発現する、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
ＩＤＰＳＣの単離集団が、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２と、ｐ７５、ベータ−３−チューブリン、または両方とを同時発現する、請求項８の方法。
【請求項１０】
ＩＤＰＳＣの単離集団にレチノイン酸を添加することをさらに含み、それによりＩＤＰＳＣの単離集団を神経幹細胞、分化した神経細胞、または両方へと分化させる、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
網膜幹細胞、分化した網膜細胞、または両方を生成する方法であって、
（ａ）０．５％〜１５％の間の酸素（Ｏ２）を含む低酸素条件下で培地中で歯髄（ＤＰ）を培養し、それによりＤＰからのＩＤＰＳＣのアウトグロースおよびＩＤＰＳＣの接着を可能にし；
（ｂ）培地を交換するか、または酵素処理を伴わずにＤＰを機械的にトランスファーし；
（ｃ）少なくとも９回、工程（ａ）および（ｂ）を反復し；そして
（ｄ）接着したＩＤＰＳＣが半集密に達した時に、接着したＩＤＰＳＣを継代する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
分化した網膜細胞が、桿体細胞、錐体細胞、神経節細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の単離集団を含む組成物であって、
ＩＤＰＳＣは、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を同時発現する細胞を含み、かつ該集団の少なくとも８０％は、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、および１型コラーゲンからなる群より選択されるマーカーを発現するか、またはＩＤＰＳＣの少なくとも５０％は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、およびＮＴ５からなる群より選択される神経栄養因子を産生するか、またはＩＤＰＳＣの少なくとも５０％は、ネスチン、ｐ５３、ｐ７５（ＣＤ２７１）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、およびｐ６３からなる群より選択されるマーカーを発現する；
ＩＤＰＳＣは、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を同時発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの２０％未満は、Ｏｃｔ３／４、ＳＴＲＯ−１、およびＣＤ１４６からなる群より選択されるマーカーを発現する；
ＩＤＰＳＣは、Ｓｏｘ−１を発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの２％〜３０％は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、およびＴＲＡ１−８１からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する；または
それらの組み合わせ
である、前記組成物。
【請求項１４】
ＩＤＰＳＣが、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を発現する細胞を含み、かつ該集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、ＡＬＰ、ＡＦＰ、テネシン−Ｃ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、および１型コラーゲンからなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
ＩＤＰＳＣが、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５からなる群より選択される神経栄養因子を産生するか、またはＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、ネスチン、ｐ５３、ｐ７５、ＡＢＣＧ２、およびｐ６３より選択されるマーカーを発現する、請求項１３の組成物。
【請求項１６】
ＩＤＰＳＣが、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５からなる群より選択される神経栄養因子を産生するか、またはＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ネスチン、ｐ５３、ｐ７５、ＡＢＣＧ２、およびｐ６３からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
ＩＤＰＳＣが、Ｓｏｘ−１およびＳｏｘ−２を同時発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの２０％未満が、Ｏｃｔ３／４、ＳＴＲＯ−１、およびＣＤ１４６からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項１３の組成物。
【請求項１８】
ＩＤＰＳＣが、Ｓｏｘ−１を発現する細胞を含み、かつＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０、およびＴＲＡ１−８１からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、請求項１３の組成物。
【請求項１９】
ＩＤＰＳＣの単離集団が、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、請求項１３〜１８のいずれか一項の組成物。
【請求項２０】
ＩＤＰＳＣの単離集団が、ヒトＩＤＰＳＣである、請求項１３〜１９のいずれか一項の組成物。
【請求項２１】
禿頭、癌、心臓疾患、ＣＮＳ疾患、脱ミエリン化疾患、白髪、神経変性疾患、精子形成の減少、腎不全、皮膚美容的特徴、皮膚創傷、脊髄傷害の治療のための、視神経変性、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死を阻害するための、またはそれらの組み合わせのための医薬の製造における、請求項１３〜２０のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項２２】
禿頭、癌、心臓疾患、ＣＮＳ疾患、脱ミエリン化疾患、白髪、神経変性疾患、精子形成の減少、腎不全、皮膚美容的特徴、皮膚創傷、脊髄傷害の治療における使用のための、視神経変性、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死を阻害するための、またはそれらの組み合わせのための、請求項１３〜２０のいずれか一項の組成物。
【請求項２３】
癌が、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫からなる群より選択され；
心臓疾患が、心筋梗塞を含み；
脱ミエリン化疾患が、抗ＭＡＧ末梢ニューロパシー、橋中央ミエリン溶解、シャルコー−マリー・トゥース病、慢性炎症性脱ミエリン化ポリニューロパシー、銅欠乏、末梢神経系の脱ミエリン化疾患、デビック病、ギランバレー症候群、特発性炎症性脱ミエリン化疾患、白質ジストロフィー、多発性硬化症、視神経炎、進行性多巣性白質脳症、脊髄ろう、横断性脊髄炎、およびビタミンＢ１２不全からなる群より選択され；
神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、ミエリンを攻撃する自己免疫疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭型認知症（ピック病）、ハンチントン病、パーキンソン病、およびプリオン病からなる群より選択され；そして
皮膚創傷が、火傷傷害、および糖尿病、虚血、またはコラーゲン疾患から生じる難治性皮膚潰瘍からなる群より選択される、
請求項２１の使用または請求項２２の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９６】
【化１−３】
2019116490.tif 000122
一態様において、本発明は以下であってよい。
［態様１］
神経変性疾患、脱ミエリン化疾患、または両方を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、神経変性疾患および／または脱ミエリン化疾患を治療するために十分な量で、投与する工程を含む、前記方法。
［態様２］
脱ミエリン化疾患が、多発性硬化症：特発性炎症性脱ミエリン化疾患；ビタミンＢ１２不全；橋中央ミエリン溶解；脊髄ろう；横断性脊髄炎；デビック病；進行性多巣性白質脳症；視神経炎；白質ジストロフィーからなる群より選択される中枢神経系の脱ミエリン化疾患、または：ギランバレー症候群、慢性炎症性脱ミエリン化ポリニューロパシー；抗ＭＡＧ末梢ニューロパシー；シャルコー−マリー・トゥース病；および銅欠乏からなる群より選択される末梢神経系の脱ミエリン化疾患である、態様１の方法。
［態様３］
神経変性疾患が：アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症（ピック病）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）からなる群より選択される、態様１の方法。
［態様４］
神経変性疾患が、である、態様１の方法。
［態様５］
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死、視神経変性、または両方を阻害する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、ＲＧＣ死、視神経変性、または両方を阻害するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様６］
腎不全を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、腎機能を増加させるか、または腎臓損傷を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様７］
組成物を、ｋｇ体重あたり、およそ０．０１−１ｘ１０６細胞の用量で腎内投与を通じて局所投与する、態様６の方法。
［態様８］
ＩＤＰＳＣを投与する工程を１〜３週間の間隔で、腎機能が回復するまで、続いて反復する、ここで、ＩＤＰＳＣの投与間隔を１〜６ヶ月に増加させる、態様６の方法。
［態様９］
禿頭を治療するかまたは白髪を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、毛髪増殖を増加させ、そして／または被験体の全体の白髪の割合を減少させるのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様１０］
組成物を、皮下、局所で、またはシャワー法によって、投与して、毛包幹細胞ニッチを回復させる、態様９の方法。
［態様１１］
組成物が細胞シートを生じる、態様９の方法。
［態様１２］
細胞シートが移植され、そして移植前に予め除去された毛髪皮膚によって覆われている、態様１１の方法。
［態様１３］
他の毛髪回復または白髪減少幹細胞因子または薬剤と組み合わせて組成物を投与する工程をさらに含む、態様９の方法。
［態様１４］
皮膚創傷および／または皮膚美容的特徴を治療するための皮膚治療法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を、皮膚創傷治癒を増加させそして／または皮膚美容的特徴を改善するのに十分な量で投与する工程を含む、前記治療法。
［態様１５］
皮膚創傷が、糖尿病、虚血およびコラーゲン疾患または火傷傷害から生じる難治性皮膚潰瘍である、態様１４の皮膚治療法。
［態様１６］
組成物を、皮膚の硬さを増加させ、しわを減少させ、皮膚加齢プロセスを遅延させ、新規血管形成を増加させ、免疫学的反応を誘導せずにコラーゲン再生を増加させるのに十分な量で投与する、態様１４の皮膚治療法。
［態様１７］
脊髄傷害を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の神経幹細胞、または両方を含む組成物を、脊髄傷害を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様１８］
心臓疾患を治療する方法であって、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団、ＩＤＰＳＣ由来の幹細胞、または両方を含む組成物を、心臓疾患を治療するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様１９］
精子形成を増加させる方法であって、、その必要がある被験体に、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の未分化集団を含む組成物を被験体における精子形成を誘導するのに十分な量で投与する工程を含む、前記方法。
［態様２０］
心臓疾患が心筋梗塞である、態様１９の方法。
［態様２１］
治療が、心筋細胞アポトーシスを阻害し、そして／または組成物を動脈注射を通じて投与する、態様１９の方法。
［態様２２］
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、ｐ７５神経上皮マーカー、ｐ５３腫瘍抑制因子マーカー、または両方を発現する、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２３］
組成物が、ＩＤＰＳＣおよび／またはＩＤＰＳＣ由来の幹細胞を、少なくとも１ｘ１０６  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０７  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０８  ＩＤＰＳＣ、少なくとも１ｘ１０９  ＩＤＰＳＣ、または少なくとも１ｘ１０１０  ＩＤＰＳＣで含む、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２４］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ｐ７５神経上皮マーカーまたはｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２５］
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ１３マーカー、ＣＤ３１マーカー、または両方を発現する、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２６］
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５マーカーに関して陰性である、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２７］
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、およびニューロトロフィン−５（ＮＴ５）より選択される神経栄養因子を生じる、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様２８］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択される神経栄養因子を生じる、態様２７の方法。
［態様２９］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がネスチンを発現する、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様３０］
ＩＤＰＳＣの少なくとも９５％がネスチンを発現する、態様２９の方法。
［態様３１］
ＩＤＰＳＣの２０％未満がＯｃｔ３／４を発現する、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様３２］
ＩＤＰＳＣが、以下の多機能分子プロファイル：
（ａ）ＩＤＰＳＣの少なくとも８０％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｂ）ＩＤＰＳＣの２０％未満がＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｃ）集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ｐ５３、および１型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｄ）ＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｅ）ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
によって特徴付けられる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様３３］
ＩＤＰＳＣの集団が、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含み、ヒト出生後ＩＤＰＳＣの前記集団が、低酸素条件下で少なくとも１０採取サイクルに関して培養されたＤＰのアウトグロース（outgrowth）として得られる、態様１〜２１のいずれか一項の方法。
［態様３４］
低酸素条件が：
（ｉ）約０．５％〜１％の間の最大値、または約０．５％〜１５％酸素（Ｏ２）の間の最大値；
（ｉｉ）約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または２％または５％の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉｉ）約０．１〜２％酸素（Ｏ２）の間；あるいは
５〜７％ＣＯ２を伴う、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、態様３３の方法。
［態様３５］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの前記集団の採取工程が、酵素処理を伴わず、ＤＰを保持し、そしてＩＤＰＳＣの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、機械的トランスファーによって起こる、態様３３の方法。
［態様３６］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質とともに培養される、態様３３の方法。
［態様３７］
ＥＣＭ基質がＭａｔｒｉｇｅｌである、態様３６の方法。
［態様３８］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、少なくとも２０採取サイクル、少なくとも３０採取サイクル、少なくとも４０採取サイクル、少なくとも５０採取サイクル、または少なくとも６０採取サイクルで培養されるＤＰからのアウトグロースとして単離される、態様３３の方法。
［態様３９］
ＩＤＰＳＣの単離集団を産生する方法であって：
（ａ）歯からＤＰを摘出し；
（ｂ）ＤＰを無菌容器中に入れ、そして抗生物質を含む無菌溶液でＤＰを洗浄し；
（ｃ）場合によって、抗生物質を含む無菌溶液を取り除き、そしてＤＰを基本培地中で細かく刻み；
（ｄ）ＤＰを、培地を含有する別の容器内に、機械的にトランスファーするか、または容器内の培地を交換し；
（ｅ）ＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着が観察されるまでＤＰを培養し；そして
（ｆ）ＤＰ内の多数ニッチからＩＤＰＳＣのアウトグロースおよび接着を可能にするように、少なくとも５回、工程（ｄ）および（ｅ）を反復する
工程を含む、前記方法。
［態様４０］
ＤＰ培養を少なくとも３日間進める、態様３９の方法。
［態様４１］
ＤＰ培養を少なくとも５日間、少なくとも１０日間または少なくとも１５日間進める、態様４０の方法。
［態様４２］
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、態様３９の方法。
［態様４３］
工程（ｄ）および（ｅ）が、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、または少なくとも６０回反復される、態様３９の方法。
［態様４４］
ＤＰ内の多数のニッチの完全性が、ＤＰ外植片の機械的トランスファーによって保持される、態様３９の方法。
［態様４５］
ＤＰ外植片を培地を含む別の容器内に機械的にトランスファーする前に、ＤＰを凍結保存し、そして融解する、態様３９の方法。
［態様４６］
（ｇ）ＩＤＰＳＣを継代培養に継代する
工程をさらに含む、態様３９の方法。
［態様４７］
ＩＤＰＳＣを継代中にプロテアーゼで処理しない、態様４６の方法。
［態様４８］
ＩＤＰＳＣを継代中にプロテアーゼで処理する、態様４６の方法。
［態様４９］
ＩＤＰＳＣの継代培養への継代を最大５回反復する、態様４６の方法。
［態様５０］
ＩＤＰＳＣの継代培養への継代を最大４回、３回、２回、または１回反復する、態様４９の方法。
［態様５１］
ＤＰを約３日間培養すると、少なくとも１ｘ１０５  ＩＤＰＳＣの単離集団を生じる、態様３９の方法。
［態様５２］
ＤＰを約３日間培養すると、少なくとも２ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも３ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも４ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも５ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも６ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、少なくとも７ｘ１０５  ＩＤＰＳＣ、または少なくとも８ｘ１０５  ＩＤＰＳＣの単離集団を生じる、態様５１の方法。
［態様５３］
培地がＤＭＥＭ／Ｆ１２培地またはＭＥＭ−アルファ培地である、態様３９の方法。
［態様５４］
培地に、約５％〜約２０％のウシ胎児血清、約１％の非必須アミノ酸、約１％のＬ−グルタミンまたはＬ−グルタミン置換物、および約１％の抗生物質が補充されている、態様５３の方法。
［態様５５］
神経幹細胞および／または分化した神経細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じさせる方法であって：
歯髄（ＤＰ）の少なくとも１０サイクルの機械的トランスファーによって維持されたＤＰ外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を単離し；
細胞の集密に到達することなくＩＤＰＳＣを培養し、ここで、これらの細胞を培地中で１週間、追加培養し、
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し、そして
レチノイン酸の存在下で、さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
［態様５６］
集密が、２５ｃｍ２の培地中、２ｘ１０６  ＩＤＰＳＣに等しい、態様５５の方法。
［態様５７］
ＤＰ外植片培養が、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル、少なくとも２５サイクル、または少なくとも３０サイクルのＤＰの機械的トランスファーによって維持される、態様５６の方法。
［態様５８］
サイクルが、ＤＰの機械的トランスファー前の、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間の外植片培養である、態様５５の方法。
［態様５９］
集密前の未分化ＬＰ  ＩＤＰＳＣの前記培養が、この段階で、ニューロスフェアまたは一次スフェアまたはスフェア様構造形成を回避する、態様５５の方法。
［態様６０］
集密前が、ＩＤＰＳＣの基本培地中に維持される、２５ｃｍ２中、２ｘ１０６  ＩＤＰＳＣに等しい、態様５９の方法。
［態様６１］
ＩＤＰＳＣ基本培地の前記置換が、いかなる他の成長因子も含まず、２％のＢ２７を補充した神経基本培地（ＮＢ＋Ｂ２７）への置換である、態様６０の方法。
［態様６２］
ＩＤＰＳＣの前記インキュベーションが、酵素消化または細胞再植え付けを伴わず、１週間の間、ＮＢ＋Ｂ２７中でインキュベーションすることである、態様６１の方法。
［態様６３］
ＮＢ＋Ｂ２７培地の前記交換が、各３〜４日間である、態様６２の方法。
［態様６４］
態様５５記載の方法によって生じる、単離された神経幹細胞。
［態様６５］
前記の１週間後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでの２〜３分間の処理後に、細胞を採取し、ＮＢ＋Ｂ２７で中和する、態様６２の方法。
［態様６６］
８００ｇ、５分間の遠心分離後、細胞ペレットを得て、そして上清を廃棄する、態様６２の方法。
［態様６７］
ＩＤＰＳＣペレットをＮＢ＋Ｂ２７中で穏やかに脱凝集し、そして拡大のため、各々、平方９．６ｃｍ２を有する６枚のペトリ皿上に植え付ける、態様６６の方法。
［態様６８］
前記レチノイン酸を、０．１μＭを超えない最終濃度で２４時間で添加しなければならず、そして４８時間後、神経分化細胞を産生するニューロスフェアを得ることが可能である、態様６７の方法。
［態様６９］
ＩＤＰＳＣの前記分化が、同じ培養プレート中、同時に、ニューロンおよびグリア細胞に分化するものである、態様１の方法。
［態様７０］
態様１にしたがった方法によって生じる、脱ミエリン化疾患を治療し、そして治癒させることが可能な、ＩＤＰＳＣ。
［態様７１］
網膜幹細胞および／または分化した網膜細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで生成する方法であって：
歯髄（ＤＰ）の少なくとも１０サイクルの機械的トランスファーによって、維持されたＤＰ外植片培養から、未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）を単離し；
半集密に到達するまで、ＩＤＰＳＣを培養し；
酵素的消化を用いて、これらの細胞を採取し；そして
さらなる拡大のため、ペトリ皿上に植え付ける
工程を含む、前記方法。
［態様７２］
分化した網膜細胞が、桿体細胞、錐体細胞、および／または神経節細胞である、態様７１の方法。
［態様７３］
増加した多系譜潜在力を所持するＬＰ  ＩＤＰＳＣを含む組成物であって、前記ＩＤＰＳＣをロバストな神経上皮マーカーの発現を可能にする条件下で培養し、前記発現が、前記ＬＰ  ＩＤＰＳＣの多機能再生潜在力を生じる、前記組成物。
［態様７４］
ＤＰの長期培養後、遠位ニッチにアクセスさせることを通じて、ＩＤＰＳＣを誘導することによって、そして／または採取したＩＤＰＳＣを低継代数で培養して、核型突然変異を防止し、そしてそれによって腫瘍原性のリスクを防止する低酸素非酵素的採取条件下で、特に、神経外胚葉系譜へのＩＤＰＳＣの潜在力を増加させ、そして腫瘍原性潜在力を減少させる方法。
［態様７５］
未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の単離集団を含む組成物であって、ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する、前記組成物。
［態様７６］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がｐ７５神経上皮マーカーを発現する、態様７５の組成物。
［態様７７］
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％がｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、ＩＤＰＳＣの単離集団を含む組成物。
［態様７８］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がｐ５３腫瘍抑制因子マーカーを発現する、態様３の組成物。
［態様７９］
ＩＤＰＳＣの５０％未満がＣＤ１３マーカーを発現する、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８０］
ＩＤＰＳＣの５０％未満がＣＤ３１マーカーを発現する、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８１］
ＩＤＰＳＣの５０％未満が、ＣＤ１３およびＣＤ３１より選択されるマーカーを発現し、そしてＩＤＰＳＣがＣＤ３４、ＣＤ４３、およびＣＤ４５マーカーに関して陰性であるる、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８２］
ＩＤＰＳＣの少なくとも５０％が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、およびニューロトロフィン−５（ＮＴ５）より選択される神経栄養因子を産生する、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８３］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％が、ＢＤＮＦ、ＧＮＤＦ、ベータ−ＮＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択される神経栄養因子を産生する、態様８２の組成物。
［態様８４］
ＩＤＰＳＣの少なくとも７５％がネスチンを発現する、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８５］
ＩＤＰＳＣの少なくとも９５％がネスチンを発現する、態様８４の組成物。
［態様８６］
ＩＤＰＳＣの２０％未満がＯｃｔ３／４を発現する、態様７５〜７８のいずれか一項の組成物。
［態様８７］
（ａ）ＩＤＰＳＣの少なくとも８０％が、ネスチン、ｐ７５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２（ＡＢＣＧ２）、ｐ６３、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＮＤＦ）、神経成長因子−ベータ（ベータ−ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＮＴ４、およびＮＴ５より選択されるマーカーを発現する、神経上皮幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｂ）ＩＤＰＳＣの２０％未満がＳＴＲＯ−１およびＣＤ１４６より選択されるマーカーを発現する、周皮細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｃ）集団の少なくとも８０％が、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１１７、ビメンチン、フィブロネクチン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テネシン−Ｃ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、シンデカン１（ＳＤＣ１）、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ｐ５３、および１型コラーゲンより選択されるマーカーを発現する、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
（ｄ）ＩＤＰＳＣの２％〜３０％が、Ｏｃｔ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＳＳＥＡ４より選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、多能性幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；ならびに
（ｅ）ＩＤＰＳＣがＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原に関して陰性である、間葉系幹細胞プロファイルＩＤＰＳＣ；
の多機能分子プロファイルによって特徴付けられる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む、組成物。
［態様８８］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの集団が、低酸素条件下で少なくとも１０採取サイクルに渡って培養されたＤＰのアウトグロースとして得られる、単離されたヒト出生後ＩＤＰＳＣの表現型的に均質な多系譜集団を含む組成物。
［態様８９］
低酸素条件が：
（ｉ）約０．５％〜１％の間の最大値、または約０．５％〜１５％酸素（Ｏ２）の間の最大値；
（ｉｉ）約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％または２％または５％の酸素（Ｏ２）；
（ｉｉｉ）約０．１％〜２％酸素（Ｏ２）の間；あるいは
５〜７％ＣＯ２を伴う、（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか
を含むかまたはこれらと同等である培養条件下で細胞を培養する工程を含む、態様８８の組成物。
態様８９
ヒト出生後ＩＤＰＳＣの集団の採取工程が、ＤＰを保持し、そしてＩＤＰＳＣの低酸素誘導性多系譜志向を可能にする、酵素処理を伴わない機械的トランスファーによって起こる、態様８８の組成物。
［態様９０］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリリジン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、またはその組み合わせを含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）基質とともに培養される、態様８８の組成物。
［態様９１］
ＥＣＭ基質がＭａｔｒｉｇｅｌである、態様９０の組成物。
［態様９２］
ヒト出生後ＩＤＰＳＣ集団が、少なくとも２０採取サイクル、少なくとも３０採取サイクル、少なくとも４０採取サイクル、少なくとも５０採取サイクル、または少なくとも６０採取サイクルに渡って培養されるＤＰからのアウトグロースとして単離される、態様８８〜９１のいずれか一項の組成物。
［態様９３］
ＩＤＰＳＣが歯由来の歯髄（ＤＰ）から単離される、態様７５〜９２のいずれか一項の組成物。
［態様９４］
歯が、乳歯、永久歯、および第三大臼歯より選択される、態様９３の組成物。
［態様９５］
ＳＯＸ−１およびＳＯＸ−２を同時発現し、そして神経冠幹細胞である、ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）を含む細胞培養組成物。
［態様９６］
長期（ＬＴ）細胞培養から得られ、そして転写因子の濃縮が、ＬＰ培養に向かって増加し、それによって、神経分化への高い潜在能力を保持し、そして正常核型を有する、態様９５の細胞培養組成物。
［態様９７］
ヒト未成熟歯髄幹細胞（ｈＩＤＰＳＣ）の均質な集団を得るための方法であって：
少なくとも２５サイクルの長期（ＬＴ）機械的／非酵素的採取サイクルを通じて、均質な集団を得て；
採取された細胞を培養して細胞培養を形成し、そして
細胞培養からプラスチック接着細胞を継代し、ここでプラスチック接着細胞は、（ｉ）自己再生し、（ｉｉ）内胚葉、中胚葉、または外胚葉系譜の細胞に分化し、（ｉｉｉ）マーカー、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２および３−ベータ−チューブリンを発現する
工程を含む、前記方法。
［態様９８］
最終段階にまだ拘束されていない、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２およびベータ−３−チューブリンなどのマーカーを含む（同時発現する）、有糸分裂的に活性である均質な神経前駆組成物。
［態様９９］
分化前未成熟歯髄幹細胞（ＩＤＰＳＣ）の実質的に均質な集団を得るための方法であって：
非接着性懸濁条件でＩＤＰＳＣを培養し、その後、プラスチックプレートに接着させて神経ロゼットを形成することによって、ＩＤＰＣＳ由来ニューロスフェアを得る、ここで、ロゼット内の細胞は、ＩＤＰＳＣよりわずかにより分化した、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２およびＢｒｄＵおよびベータ−３−チューブリンに関して陽性である神経芽細胞の細胞集団を移行（ｔｒａｎｓｉｔ）増幅させることによって提示され、神経芽細胞は、外部ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ誘導性微小環境に際して、神経前駆体、星状細胞、オリゴデンドロサイト、および神経節細胞を含む、中枢神経系および末梢神経系のニューロン系譜に最終的に分化することが可能である
工程を含む、前記方法。
［態様１００］
態様１１６の方法によって得られる分化前ＩＤＰＳＣ、およびＣＮＳ疾患を治療する細胞療法に適した薬学的に許容されうるキャリアーを含む、薬学的組成物。
［態様１０１］
癌を治療するための、態様１００の薬学的組成物の使用。
［態様１０２］
癌が神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫より選択される、態様１０１の使用。
［態様１０３］
ＩＤＰＳＣの実質的に均質なＬＰが、Ｓｏｘ−１；Ｓｏｘ−２；およびベータ−３−チューブリンを含む群より選択される、少なくとも２つのマーカーを同時発現する、態様９９の方法。