(57)【要約】      （修正有）【課題】胃腸の疾患、障害および状態の予防、制御、および治療のための、並びに総体的な栄養上の健康のための組成物の提供。【解決手段】非病原性の発芽能を有する細菌芽胞を含有する治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願  本出願は、２０１３年２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７６０，５８４号、および２０１３年２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７６０，５８５号、および２０１３年２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７６０，５７４号、および２０１３年２月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７６０，６０６号、および２０１４年１月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／９２６，９１８号に基づく優先権を主張する。これらの出願は全て、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照  本願は、４，１００，０００バイトのサイズを有する、２０１４年２月２日に作成された、２５９７０ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられた、テキストファイルとして電子的に提出された、配列表を含む。配列表は参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
哺乳類は、微生物によって胃腸（ＧＩ）管内に、皮膚上に、並びに口腔、眼の表面および腟等の他の上皮および組織の適所にコロニー形成される。胃腸管は豊富で多様な微生物群落を内包する。微生物群落は複雑な系であり、環境または適所に、多様な細菌株を含む多くの様々な種または生物の共同体を与える。健常人の胃腸管内には数百の様々な種が片利共生群落を形成している場合があり、生物のこの補完体（complement）は、誕生時から発達し、最終的にはおよそ３歳までに機能的に成熟した微生物個体群を形成する。これら個体群における微生物系間の相互作用、並びに微生物および宿主間の相互作用（例えば、宿主免疫系）は、微生物の分布に影響を及ぼす資源の利用能および競合によって群落構造を形づくる。このような資源は、食物、場所および生育するための空間、すなわち微生物が付着し得る身体構造の利用可能性であり得る。例えば、宿主の食事は胃腸管細菌叢の形成に関与している。
【０００４】
健康な微生物叢は、宿主に複数の利益、例えば、広範な病原体に対するコロニー形成耐性、必須栄養素の生合成および吸収、並びに健康な腸上皮および適切に制御された全身性免疫を維持する免疫刺激を与える。「腸内菌共生バランス失調」、すなわち崩壊した共生関係の環境においては、微生物叢機能が喪失または混乱し、その結果、病原体に対する感受性の増加、代謝プロフィールの変化、または局所もしくは全身性の炎症もしくは自己免疫を生じ得る炎症誘発シグナルの誘導がもたらされる可能性がある。それ故、腸管内の微生物叢は、腸の種々の病原性感染を含む、多くの疾患および障害の病因において重要な役割を演じている。例えば、対象は、正常な腸管内微生物叢が広域性抗生物質の使用により撹乱されている場合、病原性感染に対しより感受性が高くなる。これらの疾患および障害の多くは、対象の生活の質を著しく減少させ究極的には致命的となり得る、慢性的な状態である。
【０００５】
プロバイオティクスの製造者は、それらの細菌調製物が、胃腸管内の天然ミクロフローラを保存し、異常な免疫応答に対する正常な制御を強化することにより、哺乳類の健康を促進すると主張してきた（例えば、米国特許第８，０３４，６０１号を参照）。しかし、プロバイオティクスは、非常に狭い属群および同様に数の限られた種に限定されており；そのため、プロバイオティクスでは、多くの状況で、胃腸管の消失した天然ミクロフローラの十分な代替とはならない。
【０００６】
このように、実施者は、腸内菌共生バランス失調を変質させるために、微生物叢の多様且つ有用な選択によって、対象の胃腸管内で個体群形成させる方法を必要としている。
【０００７】
従って、微生物叢機能の回復または増強を通じてＧＩ疾患を治療するための永続的、効率的且つ有効な組成物および方法の必要性に応じて、我々は、対象を治療するための組成物および方法を提供することによって、従来技術のこれらおよび他の欠点に取り組む。
【発明の概要】
【０００８】
胃腸の疾患、障害および状態の予防、制御、および治療のための、並びに総体的な栄養上の健康のための、非病原性の発芽能を有する細菌芽胞を含有する治療用組成物が本明細書で開示される。これらの組成物は、ヒトおよび他の哺乳類対象への安全な投与に適しており、且つ、多数の胃腸の疾患、障害および状態、並びに総体的な栄養上の健康において効果的であるという点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の模式図であり、超可変領域１〜９（Ｖ１〜Ｖ９）の座標を示している。Ｖ１〜Ｖ９の座標は、Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene(16S rRNA) from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)によって定義された命名法の大腸菌系を用いた番号付けに基づき、それぞれ６９〜９９、１３７〜２４２、４３３〜４９７、５７６〜６８２、８２２〜８７９、９８６〜１０４３、１１１７〜１１７３、１２４３〜１２９４、および１４３５〜１４６５である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Brosius et al.によって記述された、例示的な参照である大腸菌１６Ｓ配列内の、各々の超可変領域のヌクレオチド配列を太字で強調している。
【図２】図２は、他の残留環境物質からの芽胞の分離を示す、ＣｓＣｌ勾配の写真を示している。
【図３】図３は、糞便懸濁液からの芽胞の段階的な濃縮；エタノール処理、ＣｓＣｌ精製された芽胞調製物；およびエタノール処理、ＣｓＣｌ精製、スクロース精製された芽胞調製物を示す、３枚の位相差画像を示している。
【図４】図４は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のマウス予防モデルにおける前記芽胞個体群の有効性を示す、一連の生存曲線を示している。
【図５】図５は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のハムスター再発予防モデルにおける芽胞個体群の有効性を示す、一連の生存曲線を示している。
【図６】図６は、様々な長さの時間の種々のエタノール処理および加熱処理下での細胞生存率を示している。
【図７】図７は、６０Ｃ、５分間の加熱処理後の、４つのドナー糞便試料から得られた細胞生存能を示している。
【図８】図８は、エタノールが嫌気細菌種および好気細菌種の両方を数秒以内に何桁も減少させることを示している。
【図９】図９は、長期にわたる、複数のドナーからの糞便提供物の芽胞濃度を示している。
【図１０】図１０は、共役蛍光アッセイによるＤＰＡ濃度の測定値と生存芽胞コロニー形成単位との間の強い相関および直線一致を示している。
【図１１】図１１は、芽胞個体群から栄養細菌を培養する能力に対する種々の発芽処理に対する影響を示している。
【図１２】図１２は、発芽処理を用いて芽胞個体群から栄養細菌を成長させることによる、細菌多様性の増加を示している。
【図１３】図１３は、３つの異なるドナー糞便試料からの芽胞に対する、種々の温度での熱活性化の役割を示している。
【図１４】図１４は、熱活性化を伴うリゾチーム処理が、ほとんどの温度で発芽を向上させることを示している。
【図１５】図１５は、種々の培地上で育成された、糞便試料中に存在する芽胞濃度を示している。
【図１６】図１６は、芽胞個体群が種々の培地を含むプレート上で発芽した後、２日間および７日間プレートをインキュベートすることから得られた、同様の芽胞生産を示している。
【図１７】図１７は、実験過程におけるマウスの重量変化によって測定される、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）に暴露されたマウスにおける、芽胞個体群の予防効果を示している。各プロットは、実験過程における、−１日目に対する個々のマウスの重量変化を追っている。実験過程における死亡数は、図表上部に示され、６日目より前の線の終結によって示される。上段のパネル（左から右）は、ビヒクル対照群（arm）、糞便懸濁液群、および処置していない未処理対照群であり、一方、下段のパネルは、エタノール処理、勾配精製した芽胞調製物；エタノール処理、勾配精製した、「発芽可能な」芽胞調製物、およびエタノール処理、勾配精製した、「芽胞形成可能な」調製物である。
【図１８】図１８は、エタノール処理芽胞処置試料、並びに処置前患者試料および処置後患者試料において測定された、微生物の多様性を示している。全体としての微生物の多様性は、Ｃｈａｏ１α多様性指数（Chao1 Alpha-Diversity Index）を用いて定義され、同一のゲノムサンプリング深度（genomic sampling depth）で測定されることで、標的試料中のマイクロバイオームをアッセイするのに十分な配列包括度が確認される。処置前患者（紫）は、エタノール処理芽胞処置（赤）、並びに５日目（青）、１４日目（オレンジ）、および２５日目（緑色）の処置後患者と比較して、全体の多様性が有意に減少したマイクロバイオームを有していた。
【図１９】図１９は、共生バランスが崩れた状態（dysbiotic state）から健康状態まで、エタノール処理芽胞処置による処置によって患者の微生物生態環境がどのように変化するかを示している。処置前患者および処置後患者の全体の多様性並びにマイクロバイオームの構造（ブレイ・カーティスβ多様性（Bray Curtis Beta Diversity））に基づく主座標分析（principle coordinates analysis）は、芽胞処置からのＯＵＴの生着および患者の微生物生態環境の増大の組み合わせが、処置前マイクロバイオームともエタノール処理芽胞処置の生態環境とも異なる微生物生態環境をもたらすことを示している。
【図２０】図２０は、芽胞個体群で処置された患者におけるバクテロイデス属種の増加を示している。処置前および処置後４週目の糞便懸濁液から得られたバクテロイデス属のコロニー数の比較は、４対数以上の増加を示している。コロニーは、連続希釈し、バクテロイデス・フラジリス（B. fragilis）群に対し高度に選択的なバクテロイデス胆汁エスクリン寒天培地上に播種することにより、計数した。種は１６Ｓ完全長配列同定によって決定した。
【図２１】図２１は、エタノール処理した芽胞個体群で処置された後の、患者のマイクロバイオーム内で生着している種および増加している種の数の増加を示している。記載される生着または増加した種の相対的存在量は、１６Ｓ配列リードの数に基づいて決定された。各プロットは、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のエタノール処理芽胞個体群で処置された異なる患者から得られる。
【００１０】
図面は例示のみを目的として本発明の種々の実施形態を示している。以下の考察から、本明細書において例示される構造および方法の別の実施形態が、本明細書に記載される本発明の原理から逸脱することなく使用され得ることは、当業者によって容易に理解される。
【００１１】
表の説明  表１．  属、種、および系統発生クレイド（Phylogenetic Clade）に対してなされた分類学的割当を伴う、操作的分類単位（ＯＴＵ）の一覧表。細菌ＯＴＵのクレイドの帰属関係は、１６Ｓ配列データに基づいている。クレイドは、系統学の当業者によく知られている最尤法を用いて完全長１６Ｓ配列から構築される系統樹の形態に基づいて定義される。クレイドが構築されることで、所与のクレイド内の全てのＯＴＵが、（ｉ）互いに、特定の数のブートストラップにより裏付けされたノードの範囲内であること、および（ｉｉ）５％の遺伝子類似度以内であることが確かめられる。同一クレイド内のＯＴＵは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて、異なるクレイド内のＯＴＵとは遺伝子および系統的に別個のものと区別することができ、一方、同一クレイド内に含まれるＯＴＵは近縁関係にある。同一クレイド内に含まれるＯＴＵは進化的に近縁関係にあり、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いに区別可能であってもなくてもよい。同一クレイドの構成要素は、それらの進化上の関連性により、ヒト腸内に存在するもの等の微生物生態環境内で類似の機能的役割を果たす。ある種を同一クレイド由来の別の種で代用する組成物は保存された生態学的機能を有する可能性が高く、従って本発明において有用である。全てのＯＴＵは、それらの推定上の芽胞形成能、およびそれらが病原体であるか病原性共生生物（pathobiont）であるかに関して表記されている（「病原性共生生物」の記述の定義を参照）。ＮＩＡＩＤ優先病原体は「カテゴリーＡ」、「カテゴリーＢ」、または「カテゴリーＣ」と表記され、日和見病原性菌は「ＯＰ」と表記されている。病原性ではない、または病原体として存在するためのそれらの能力が未知であるＯＴＵは、「Ｎ」と表記されている。「配列ＩＤ番号」は配列表ファイル内でのＯＴＵの識別子を表記しており、「公開ＤＢ受入番号（Public DB Accession）」は公開配列保管庫内でのＯＴＵの識別子を表記している。
【００１２】
表２は、ＣｓＣｌ勾配精製の前および後のエタノール処理芽胞個体群の１６ｓ解析から同定された細菌ＯＴＵを含んでいる。
【００１３】
表３は、種々の希釈倍率での、ドナー糞便懸濁液で処置されたマウス並びにエタノール処理および／または熱処理された芽胞調製物で処置されたマウスの死亡率および重量変化を含んでいる。
【００１４】
表４は、種々の加熱処理を含む、芽胞調製物からコロニーをピッキングすることにより作製された芽胞形成種から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００１５】
表５は、未処理糞便スラリー内では同定されなかったが、エタノール処理または熱処理した芽胞個体群において同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００１６】
表６は、ドナーＡから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００１７】
表７は、ドナーＢから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００１８】
表８は、ドナーＣから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００１９】
表９は、ドナーＤから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００２０】
表１０は、ドナーＥから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００２１】
表１１は、ドナーＦから得られたマイクロバイオーム試料から単離されたエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００２２】
表１２は、様々な種類の培地上で生育中のエタノール処理芽胞個体群から同定されたＯＴＵを含んでいる。
【００２３】
表１３．
コロニーピッキング法によって「発芽可能」および「芽胞形成可能」であると確認された種。
【００２４】
表ＹＹＹ．  １６Ｓ−Ｖ４  ＮＧＳアプローチを用いて「発芽可能な」であると確認された種。
【００２５】
表ＺＺＺ．
１６ｓ−Ｖ４  ＮＧＳアプローチを用いて「芽胞形成可能」であると確認された種。
【００２６】
表ＡＣは、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染を患う３人の患者の治療を成功させるために使用された、３つの異なるエタノール処理芽胞調製物から得られた芽胞含量データを示している。
【００２７】
表ＡＤ．
４×１０５ＳＣＦＵ／用量に対し正規化された場合の、表ＡＣにおけるＤＰＡ用量
【００２８】
表ＧＢ．
少なくとも１つのエタノール処理芽胞調製物（全マイクロバイオーム）において最小限の１０個の１６Ｓ−Ｖ４配列リードによって検出されたＯＴＵ。処置患者内に生着するＯＴＵおよびそれらが生着する患者の割合が表記されており、クレイド、芽胞形成状態、およびキーストーンＯＴＵ状態も同様に表記される。アスタリスク付きのＯＴＵは８０％以上のエタノール調製物中に生じ、５０％以上の処置患者内に生着する。
【００２９】
表ＧＣは、ＯＴＵがコア生態環境（core ecology）の一成分とみなされるために生着することが示されなければならないというさらなる要件と共に、ＣＥＳによって、上位２０種のＯＴＵを順位付けしている。
【００３０】
表ＧＤ：クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）マウスモデルにおいて試験されたコア生態環境の一部
【００３１】
表ＧＥ：クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）マウスモデルにおいて試験された細菌組成物の結果。
【００３２】
表ＧＦ．
インビトロ阻害アッセイにおける結果を含む、三元組み合わせ（ternary combination）で試験されたＯＴＵおよびそれらのクレイド割当
【００３３】
表ＺＡ．
−１日目に強制経口投与によって投与された微生物組成物
【００３４】
表ＴＡＢ．
微生物組成物の投与後２、３および４日目のＯＴＵの生息数
【００３５】
表ＴＡＣ．
微生物組成物の投与後２、３および４日目のクレイドの生息数
【００３６】
表ＴＡＤ．
０日目に１０４．５クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）芽胞に暴露されたマウスにおける実験群毎の死亡率
【発明を実施するための形態】
【００３７】
概要  胃腸の疾患、障害および状態の予防、制御、および治療のための、並びに総体的な栄養上の健康のための、非病原性の発芽能を有する細菌芽胞を含有する治療用組成物が本明細書で開示される。これらの組成物は、ヒトおよび他の哺乳類対象への安全な投与に適しており、且つ、多数の胃腸の疾患、障害および状態、並びに総体的な栄養上の健康において効果的であるという点で有利である。芽胞をベースとした組成物が知られているが、これらは一般的には液体細菌培養物の凍結乾燥または噴霧乾燥等の種々の手法によって調製され、その結果として、不十分な有効性、不安定性、相当な変異性並びに十分な安全性および有効性の欠如に繋がる。
【００３８】
現在、細菌芽胞の個体群が、ヒトを含む哺乳類対象から得られる生物学的材料から入手可能であることが分かっている。これらの個体群は、本明細書で提供されるような組成物に製剤化され、本明細書で提供されるような方法を用いて哺乳類対象に投与される。
【００３９】
定義  「微生物叢」とは、動物対象、典型的にはヒト等の哺乳動物の中および表面上に（持続的または一時的に）生じる微生物の群集を指し、例えば、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス（例えば、細菌ウイルス、すなわち、ファージ）が含まれる。
【００４０】
「マイクロバイオーム」とは、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス（例えば、細菌ウイルス（すなわち、ファージ））を含む、人体の中および表面上に持続的および一時的に生息する微生物の群集の遺伝学的内容物を指し、ここで、「遺伝学的内容物」には、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（リボソームＲＮＡ等）、エピゲノム、プラスミド、および他の全ての種類の遺伝情報が含まれる。
【００４１】
「微生物保菌（microbial carriage）」または単に「保菌（carriage）」とは、ヒトの内部または表面上の適所に生息する微生物の個体群を指す。保菌はしばしば相対的存在量によって定義される。例えば、ＯＴＵ１が総微生物保菌の６０％を構成するということは、ＯＴＵ１が測定が行われた試料中で他のＯＴＵと比較して６０％の相対的存在量を有することを意味する。保菌はほとんどの場合、ゲノム配列決定データに基づいており、単一のＯＴＵまたはＯＴＵ群の相対的存在量または保菌は、試料の配列決定リードの総数に対するそのＯＴＵ／ｓに割り当てられる配列決定リード（sequencing read）の数によって定義される。
【００４２】
「微生物の増加」または単に「増加」とは、（ｉ）投与された治療的微生物組成物において、存在しないまたは検出不可能であり（標準的なゲノム科学的手法および微生物学的手法の使用によって決定される）、（ｉｉ）微生物組成物の送達の前に、宿主適所（例として、胃腸管、皮膚、前鼻孔、または腟）において、存在しない、検出不可能である、または低頻度で存在し、（ｉｉｉ）微生物組成物の投与後に見出される、または低頻度で存在した場合は有意に増加する（例えば、２倍、５倍、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、または１×１０８超）、微生物の個体群の定着または有意な増加を指す。増大した生態環境を構成する微生物は、食物および環境等の外来性の供給源から生じたものであるか、またはそれらが低頻度に存在する宿主内の微小適所から生じたものである可能性がある。
【００４３】
治療的微生物組成物の投与は、これらの共生微生物の生育に好都合な条件を促進する、標的適所における環境変化を誘発する。治療的微生物組成物による処置が無い場合、宿主はこれらの微生物に絶えず暴露され得るが；持続的な生育、および増大した生態環境を構成するレベルの増加した微生物の安定な個体群と関連する正の健康効果は観察されない。
【００４４】
「微生物の生着」または単に「生着」とは、処置前には処置宿主内に存在しない治療的微生物組成物を構成するＯＴＵの、標的適所における定着を指す。生着した生態環境を構成する微生物は、治療的微生物組成物中に存在し、処置後に宿主の微生物生態環境の構成物として定着する。生着したＯＴＵは、一時的に定着するか、または治療的微生物組成物による処置後の宿主内で個体群形成（populate）する、微生物生態環境における長期間の安定性を示し得る。生着した生態環境は、共生バランスが崩れた生態環境から健康状態を代表する生態環境への変化を刺激することが可能な共生微生物の生育に好都合な条件を促進する標的適所内の環境変化を誘発し得る。
【００４５】
「環境適所」または単に「適所」とは、１つの生物または生物群が占有する環境空間を指す。適所によって、１つの生物または個体群または生物（population or organisms）が、資源、物理的パラメータ（例えば、宿主の組織間隙）および競合者（例えば、資源が豊富で、且つ、捕食者、寄生虫および病原体が少ない場合に生育することによる）の分布によってどのように影響を受けるか、並びに、それがまたどのように前記要因を変化させるか（例えば、捕食者の食糧源および餌食の消費者として振る舞うことで、他の生物による資源への接触を限定する）が説明される。
【００４６】
「腸内菌共生バランス失調」とは、生態ネットワークの正常な多様性および／または機能が崩壊した、対象における腸または他の身体領域（例えば粘膜表面または皮膚表面）の微生物叢の状態を指す。この不健全状態は、多様性の減少、ある特定の遺伝子的および／もしくは環境的条件が対象に存在する場合にのみ疾患を引き起こし得る一つもしくは複数の病原体もしくは病原性共生菌、共生生物の異常増殖、または宿主対象に対し必要不可欠な機能を提供せずに、その結果健康を促進しない生態学的微生物ネットワークへの変化に起因し得る。
【００４７】
「病原性共生生物」または「日和見病原性菌」とは、ある特定の遺伝子的および／または環境的条件が対象に存在する場合にのみ疾患を引き起こし得る共生生物を指す。
【００４８】
「系統樹」とは、決められた一連の系統学的再構築アルゴリズム（例えば、最節約、最尤、またはベイズ）を用いて作成される、ある遺伝子配列の別の遺伝子配列に対する進化的関係のグラフ図を指す。系統樹内のノードは、別々の祖先の配列を表し、いずれのノードの信頼度も枝の不確定度を計るブートストラップまたはベイズ事後確率によって与えられる。
【００４９】
「操作的分類単位」、「ＯＴＵ」（あるいは複数形の「ＯＴＵｓ」）とは、系統樹における末端の葉を指し、核酸配列（例えば、ゲノム全体、または特定の遺伝子配列）、および種のレベルでこの核酸配列と配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。いくつかの実施形態では、前記特定の遺伝子配列は、１６Ｓ配列または１６Ｓ配列の一部であり得る。他の実施形態では、２つの存在物（entity）のゲノム全体が配列決定され、比較される。別の実施形態では、選択領域、例えば、多座位配列タグ（multilocus sequence tag）（ＭＬＳＴ）、特定の遺伝子、または一連の遺伝子が遺伝学的に比較され得る。１６Ｓの実施形態では、１６Ｓ全体または１６Ｓのいくつかの可変領域にわたって９７％以上の平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵは同一のＯＴＵとみなされる（例えば、Claesson MJ, Wang Q, O’Sullivan O, Greene-Diniz R, Cole JR, Ros RP, andO’Toole PW. 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies forresolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA generegions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis KT, Ramette A, and Tiedje JM.2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 361: 1929-1940を参照）。全ゲノム、ＭＬＳＴ、特定の遺伝子、または一連の遺伝子を含む実施形態では、９５％以上の平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵは同一のＯＴＵとみなされる（例えば、Achtman M, and Wagner M. 2008. Microbial diversity and the genetic natureof microbial species. Nat. Rev. Microbiol. 6: 431-440. Konstantinidis KT, RametteA, and Tiedje JM. 2006. The bacterial species definition in the genomic era. PhilosTrans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940を参照）。ＯＴＵは、生物間で配列を比較することによって頻繁に定義される。一般的に、９５％未満の配列同一性を有する配列は、同一ＯＴＵの一部を形成するとみなされない。ＯＴＵはまた、あらゆる組み合わせのヌクレオチドマーカーまたは遺伝子、具体的には高度に保存された遺伝子（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子）、またはこれらの組み合わせによって特徴付けられ得る。このような特徴付けでは、例えば、ＷＧＳデータまたは全ゲノム配列が使用される。
【００５０】
「残存生息環境産物（residual habitat product）」とは、ヒトまたは動物の内部または体表上の微生物叢の生息環境に由来する物質を指す。例えば、微生物叢は、胃腸管内の糞便中、皮膚それ自体の表面上、唾液中、気道の粘液中、または尿生殖路の分泌物中（すなわち、微生物群集に関連する生物学的物質）に生息している。残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、細菌組成物がヒトまたは動物対象の体表上または内部の微生物環境に関連する生物学的物質を含有しておらず、微生物群集に関連するあらゆる混入性生物学的物質を１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、または９５％含有していないことを意味する。残存生息環境産物は非生物的物質（例えば、未消化の食物）を含むことがあり、あるいは、望まれない微生物を含むことがある。残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、細菌組成物がヒトまたは動物由来の検出可能な細胞を含有していないこと、且つ、微生物細胞のみが検出可能であることを意味する場合もある。一実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、細菌組成物が検出可能なウイルス性混入物（例えば、細菌ウイルス（すなわち、ファージ））、真菌性混入物、マイコプラズマ混入物を含有していないことを意味する場合もある。別の実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、微生物細胞と比較して、細菌組成物中の１×１０−２％未満、１×１０−３％未満、１×１０−４％未満、１×１０−５％未満、１×１０−６％未満、１×１０−７％未満、１×１０−８未満の生細胞がヒト細胞または動物細胞であることを意味する。この純度を達成するための多数の方法が存在しており、そのいずれも限定するものではない。このように、固体培地上の単一コロニーに対して、連続的な単一コロニーからのレプリケート（例えば、限定はされないが、２本）条痕がただ１つのコロニー形態を示すまで画線培養する複数のステップにより所望の構成物を単離することによって、混入は減少し得る。あるいは、混入の減少は、単一の所望の細胞に対する、複数回の１０倍連続希釈等による複数回の連続希釈（例えば、１０−８または１０−９の希釈）によって、達成され得る。これは、複数の単離コロニーが類似の細胞形態およびグラム染色挙動を有することを示すことによって、さらに確認され得る。十分な純度を確認するための他の方法には、遺伝子解析（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定法）、血清学的分析および抗原分析、酵素学的分析および代謝分析、並びに所望の構成物を混入物と区別する試薬を用いるフローサイトメトリー等の計測手段を用いる方法が含まれる。
【００５１】
「クレイド」とは、系統樹において統計学的に妥当なノードの下流にある、系統樹のＯＴＵまたは構成要素を指す。クレイドは、別個の単系統性進化単位でありある程度の配列類似性を共有する系統樹内の一連の末端葉を包含する。
【００５２】
微生物学において、「１６Ｓ配列決定」または「１６Ｓ−ｒＲＮＡ」または「１６Ｓ」とは、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を構成するヌクレオチドを特徴付けすることによって得られる配列を指す。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、およそ１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを用いてある細菌分離株の他の細菌分離株に対する進化的関係および配列類似性を再構築する際に使用される。１６Ｓ配列は、通常は高度に保存されているが、大部分の細菌の属および種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を有する特定の超可変領域を含有しているため、系統学的再構築に使用される。
【００５３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの「Ｖ１〜Ｖ９領域」は、細菌試料のジェノタイピングに用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１番目から９番目の超可変領域を指す。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系命名法（Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA genefrom Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)）に基づく番号付けを用いて、それぞれ、ヌクレオチド６９〜９９、１３７〜２４２、４３３〜４９７、５７６〜６８２、８２２〜８７９、９８６〜１０４３、１１１７〜１１７３、１２４３〜１２９４および１４３５〜１４６５によって定義される。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、およびＶ９領域のうちの少なくとも１つがＯＴＵの特徴付けに使用される。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ４領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。当業者は、候補配列を参照配列と比較し、参照超可変領域に対する類似性に基づいて超可変領域を特定することにより、候補１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定の超可変領域を特定することができ、あるいは、微生物または微生物群集の全ゲノム・ショットガン法（ＷＧＳ）による配列特徴付けを使用することができる。
【００５４】
用語「対象」は、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス）、家畜（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ、およびニワトリ）、およびペット（例えば、イヌ、ネコ、およびげっ歯類）を含むあらゆる動物対象指す。対象は、胃腸内病原菌による感染症を含むがこれに限定はされない、腸内菌共生バランス失調を患っている場合があり、あるいは、胃腸内病原菌による感染症を発症する危険性、またはそれを他者に伝染させる危険性を有する場合がある。
【００５５】
用語「表現型」は、個々の独立体の一連の観察可能な特徴を指す。例として、個々の対象は、「健康」または「病気」の表現型を有し得る。表現型は独立体の状態を説明しており、ある表現型に含まれる全ての独立体は、表現型を説明する、同一の一連の特徴を共有する。個体の表現型は、部分的または全体的に、独立体のゲノムおよび／またはマイクロバイオームと環境との相互作用によってもたらされる。
【００５６】
用語「ネットワーク生態環境（Network Ecology）」は、いくつかの対象において同時に生じるＯＴＵの共同体を指す。本明細書で使用される場合、「ネットワーク」は、ＯＴＵの共同体の構造的生態環境（structural ecology）を定義するために、特定のノード（すなわちＯＴＵ）およびエッジ（特定のＯＴＵ間の接続）が互いにどのように関連し合っているかを表すグラフによって、数学的に定義される。いかなる所与のネットワーク生態環境も、固有の系統的多様性および機能特性を有する。例えば、ノードが、限定はされないが、酵素、オルソログ群クラスター（clusters of orthologous groups）（ＣＯＧＳ；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21090/）、またはＫＥＧＧパスウェイ（KEGG pathway）（www.genome.jp/kegg/）等の要素から構成される場合、ネットワーク生態環境は機能によっても定義することができる。
【００５７】
「ネットワーククラス（network class）」、「コアネットワーク（core network）」および「コアネットワーク生態環境（core network ecology）」という用語は、類似の系統的特徴および／または機能的特徴を有する生態環境を含むことが計算によって決定された、ネットワーク生態環境の一群を指す。このことから、コアネットワークは、関連するネットワーク生態環境の一群（すなわち、クラスター）の、系統または機能によって決定される、重要な生物学的特徴を含む。コアネットワーク生態環境という１つの表現は、多くの様々な対象に見られる系統的または機能的に関連した一連のネットワーク生態環境のコアとなる特徴を示す、微生物（典型的には非病原菌）の設計共同体である。多くの場合、コアネットワークは、本明細書に記載のように設計されると同時に、一つまたは複数の対象で観察されるネットワーク生態環境として存在する。コアネットワーク生態環境は、根底にある関連ネットワーク生態環境が崩壊している、対象における腸内菌共生バランス失調を回復または低減させるのに有用である。
【００５８】
用語「キーストーンＯＴＵ（Keystone OTU）」は、多くのネットワーク生態環境に共通であり、且つ多くの対象に生じるネットワーク生態環境の構成要素である（すなわち、普及した）、一つまたは複数のＯＴＵを指す（図１）。キーストーンＯＴＵは、その遍在的性質により、健常な対象におけるネットワーク生態環境の機能の中心となり、疾患を有する対象においてはしばしば、欠損しているかレベルが減少している。キーストーンＯＴＵは、対象において、低量、中程度の量、または多量に存在し得る。
【００５９】
用語「非キーストーンＯＴＵ（non-Keystone OTU）」は、ネットワーク生態環境に観察される、キーストーンＯＴＵではないＯＴＵを指す。
【００６０】
用語「系統的多様性」は、所与のネットワーク生態環境またはコアネットワーク生態環境に存在する、これらのネットワークを構成するＯＴＵに基づく生物多様性を指す。系統的多様性は相対的な語であり、比較的に別のネットワークよりも系統的に多様であるネットワーク生態環境またはコアネットワークが、より多数の独特な種、属、および分類学上の科を含有することを意味する。種、属、または分類学上の科の特有性は、一般的には、互いと比較して全ての種、属、または分類学上の科  遺伝的多様性を表す系統樹を用いて決定される。別の実施形態では、系統的多様性は、系統樹の枝の長さの合計または枝の長さの平均を用いて計測され得る。
【００６１】
「芽胞」または「内生胞子」とは、休眠期、非栄養成長期且つ非繁殖期の独立体、特に細菌の独立体を指す。芽胞は一般的に放射線、乾燥、酵素処理、温度変化、栄養枯渇、および化学的消毒剤等の環境ストレスに耐性がある。
【００６２】
「芽胞個体群」とは、組成物中に存在する複数の芽胞を指す。本明細書で使用される同義語には、芽胞組成物、芽胞調製物、エタノール処理芽胞画分および芽胞生態環境（spore ecology）が含まれる。芽胞個体群は、例えば、エタノール処理もしくは加熱処理、もしくは密度勾配分離、または試料中の芽胞の純度、力価および／もしくは濃度を増加させる本明細書に記載の方法のあらゆる組み合わせによって、糞便提供物から精製され得る。あるいは、芽胞個体群は、栄養形態または芽胞形態にある、単離された芽胞形成性種または芽胞形成性ＯＴＵから、またはこれらの種の混合物から開始される培養法を通じて派生され得る。
【００６３】
一実施形態では、芽胞調製物は芽胞形成種を含み、芽胞調製物において、残留する非芽胞形成性種はエタノール、界面活性剤、熱、超音波処理等を含む化学的もしくは物理的処理によって不活性化されている；または、非芽胞形成性種は密度勾配、遠心分離、濾過および／もしくはクロマトグラフィーを含む種々の分離ステップによって芽胞調製物から除去されている；または、不活性化法および分離法が組み合わされて芽胞調製物が作製されている。さらに別の実施形態では、芽胞調製物は、生存可能な非芽胞形成体または芽胞形成体の栄養形態を超えて富化されている芽胞形成種を含む。この実施形態では、芽胞は、細菌の全栄養形態と比較して、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１０，０００倍超富化されている。さらに別の実施形態では、芽胞調製物中の芽胞は処理および製剤の間に部分的な発芽を起こし、その結果、最終組成物は芽胞および芽胞形成種由来の栄養細菌を含む。
【００６４】
「発芽誘起物質（germinant）」とは、宿主生物内および／またはインビトロにおいて、直接的または間接的に、休眠芽胞形態の細菌、または芽胞形態の細菌群の栄養成長を誘導することが可能な、物質または組成物または物理的化学的処理のことである。
【００６５】
「芽胞形成誘導剤」とは、宿主生物内および／またはインビトロにおいて、直接的または間接的に、細菌において芽胞形成を誘導することが可能な、物質または物理的化学的処理のことである。
【００６６】
「細菌芽胞の生産を増加させる」ことには、活性化または芽胞形成誘導剤が含まれる。「生産」には、栄養細菌細胞の芽胞への変換およびこのような変換速度の増加、並びに芽胞形態の細菌の発芽の減少、インビボもしくはエキソビボにおける芽胞腐食速度の減少、または芽胞の総生産量の増加（例えば、糞便物質の体積測定による生産量の増加による）が含まれる。
【００６７】
宿主生物の「コロニー形成」には、細菌または他の微生物の一過性でない定着が含まれる。本明細書で使用される場合、病原性細菌による宿主対象の胃腸管（またはあらゆる他の微生物叢の適所）の「コロニー形成を減少させること」には、胃腸管内での病原体の滞留時間の減少、並びに胃腸管内の、または胃腸管の管腔表面に付着した、病原体の数（または濃度）の減少が含まれる。付着した病原体の減少の測定は、例えば、生検標本によって示され得、あるいは、減少は間接的に、例えば哺乳類宿主の便中の病原性負荷を測定することによって測定され得る。
【００６８】
２つ以上の細菌の「組み合わせ」には、同一の物質もしくは産物内での、または物理的に連結された産物内での、２つの細菌の物理的な共存、並びに２つの細菌の時間的な同時投与または共局在が含まれる。
【００６９】
「細胞傷害性の」活性または細菌は、病原性細菌細胞等の細菌細胞を殺傷する能力を含む。「細胞増殖抑制性の」活性または細菌は、病原性細菌細胞等の細菌細胞の成長、代謝、および／または増殖を部分的または完全に阻害する能力を含む。
【００７０】
「食用に適さない産物」を含まないことは、本明細書で提供される細菌組成物または他の物質が、ヒト対象への投与（例えば、経口投与）に適した産物中に、相当量の食用に適さない産物、例えば、非食用の、有害の、または望まれない産物または物質を有さないことを意味する。食用に適さない産物は、しばしば、従来技術から得られた細菌調製物中に見られる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「ビタミン」は、身体の正常な成長および活動に微量に必要とされ、植物性食品および動物性食品から天然に得られる、またはプロビタミン、誘導体、類似体から合成によってつくられる、種々の脂溶性または水溶性の有機物質（非限定例として、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシンまたはナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、またはピリドキサミン、または塩酸ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、およびビタミンＢ１２（種々のコバラミン類；一般的には、ビタミン補填剤中のシアノコバラミン）、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、Ｋ１およびＫ２（すなわち、ＭＫ−４、ＭＫ−７）、葉酸並びにビオチンが挙げられる）のいずれをも含むと理解される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「ミネラル」は、ホウ素、カルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ニッケル、リン、カリウム、セレン、ケイ素、スズ、バナジウム、亜鉛、またはこれらの組み合わせを含むと理解される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「抗酸化剤」は、活性酸素種（「ＲＯＳ」）並びに他のラジカル種および非ラジカル種によって促進される酸化または反応を阻害する、βカロチン（ビタミンＡ前駆物質）、ビタミンＣ、ビタミンＥ、およびセレン）等の種々の物質のうちのいずれか一つまたは複数を含むと理解される。さらに、抗酸化剤は、他の分子の酸化を遅くするまたは防止することが可能な分子である。抗酸化剤の非限定例としては、アスタキサンチン、カロテノイド類、補酵素Ｑ１０（「ＣｏＱ１０」）、フラボノイド類、グルタチオン、ゴージ（Goji）（ウルフベリー（wolfberry））、ヘスペリジン、ラクトウルフベリー（lactowolfberry）、リグナン、ルテイン、リコピン、ポリフェノール類、セレン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ゼアキサンチン、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７４】
本発明の組成物  胃腸の疾患、障害および状態の予防、制御、および治療のための、並びに総体的な栄養上の健康のための、非病原性の発芽能を有する細菌芽胞を含有する治療用組成物が本明細書で開示される。これらの組成物は、ヒトおよび他の哺乳類対象への安全な投与に適しており、且つ、多数の胃腸の疾患、障害および状態、並びに総体的な栄養上の健康において効果的であるという点で有利である。芽胞をベースとした組成物が知られているが、これらは一般的には液体細菌培養物の凍結乾燥または噴霧乾燥等の種々の手法によって調製され、その結果として、不十分な有効性、不安定性、相当な変異性並びに十分な安全性および有効性の欠如に繋がる。
【００７５】
現在、細菌芽胞の個体群が、ヒトを含む哺乳類対象から得られる生物学的材料から入手可能であることが分かっている。これらの個体群は、本明細書で提供されるような組成物に製剤化され、本明細書で提供されるような方法を用いて哺乳類対象に投与される。
【００７６】
精製された細菌芽胞個体群を含有する治療用組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製された」および「精製すること（purifying）」という用語は、一つまたは複数の精製過程、例えば、本明細書に記載されるような、所望の細菌芽胞の選別もしくは富化、または残存生息環境産物の排除もしくは減少を経た、ある生息数（例えば、複数の既知または未知の量および／または濃度）の所望の細菌芽胞の状態を指す。いくつかの実施形態では、精製された個体群は検出可能な望まれない活性を有さず、あるいは、望まれない活性のレベルまたは量が許容できるレベルまたは量であるか、またはそれ未満である。他の実施形態では、精製された個体群は、許容できる量および／または濃度であるかそれ未満である、ある量および／または濃度の所望の細菌芽胞を有する。他の実施形態では、望まれない活性に対する所望の活性（例えば、栄養細菌と比較した芽胞）の比は、２−、５−、１０−、３０−、１００−、３００−、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、または１×１０８超変化した。他の実施形態では、細菌芽胞の精製個体群は、その個体群が得られる出発物質（例えば、糞便物質）と比較して富化される。この富化は、出発物質と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９９９％超であり得る。
【００７７】
ある実施形態では、細菌芽胞の精製個体群は、減少したまたは検出不可能なレベルの一つまたは複数の病原性活性、例えば、毒性、哺乳類レシピエント対象の感染症を引き起こす能力、望まれない免疫調節活性、自己免疫応答、代謝反応、または炎症反応もしくは神経反応等を有する。このような病原活性の低減は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。他の実施形態では、細菌芽胞の精製個体群は、糞便物質と比較して、低減された匂い、味、外見、およびうま味等の、低減された感覚的成分を有する。
【００７８】
残存生息環境産物を実質的に含んでいない、精製された細菌芽胞個体群が提供される。ある実施形態では、このことは、細菌芽胞組成物が、ヒトまたは動物対象の体表または体内に生息する間の微生物群集に関連する相当量の生物学的物質を含有しておらず、精製された芽胞個体群が、微生物群集に関連する生物学的物質のいかなる混入も１００％非含有、９９％非含有、９８％非含有、９７％非含有、９６％非含有、または９５％非含有であり得ることを意味する。残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、細菌芽胞組成物がヒトまたは動物由来の検出可能な細胞を含有していないこと、且つ、微生物細胞のみが検出可能であること、具体的には、所望の微生物細胞のみが検出可能であることを意味する場合もある。別の実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、微生物細胞と比較して、細菌組成物中の１×１０−２％未満、１×１０−３％未満、１×１０−４％未満、１×１０−５％未満、１×１０−６％未満、１×１０−７％未満、１×１０−８％未満の細胞がヒト細胞または動物細胞であることを意味する。別の実施形態では、精製個体群中に存在する残存生息環境産物は、哺乳類ドナー対象から得られた糞便物質から、少なくともある特定のレベルに減少され、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超減少される。
【００７９】
一実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいない、または検出可能なレベルの病原性物質を実質的に含んでいないとは、細菌組成物が、検出可能なウイルス性混入物（例えば、細菌ウイルス（すなわち、ファージ））、真菌性混入物、またはマイコプラズマ混入物もしくはトキソプラズマ混入物、または蠕虫等の真核生物性寄生虫を含有していないことを意味する。あるいは、精製された芽胞個体群は、無細胞性物質、例えば、ＤＮＡ、ウイルス外被物質、または生育不能な細菌性物質を実質的に含んでいない。あるいは、精製された芽胞個体群は、ノロウイルス、ポリオウイルスまたはＡ型肝炎ウイルスを含む腸内ウイルス等の、一つまたは複数の特定の望ましくないウイルスを殺傷、不活性化、または排除する方法によって処理され得る。
【００８０】
本明細書に記載されるように、精製された芽胞個体群は、遺伝子解析（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定法）、血清学的分析および抗原分析、顕微分析、微生物分析（例えば、発芽および培養）、並びに所望の細菌芽胞を望まれない混入物質と区別する試薬を用いるフローサイトメトリー等の計測手段を用いる方法によって証明される。
【００８１】
例示的な生物学的材料としては、糞便物質、例えば、糞便または小腸および大腸の種々の区域から単離された物質等が挙げられる。糞便物質は哺乳類ドナー対象から入手されるか、または２以上のドナー対象、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００もしくは１０００超のドナーから入手され得、ここで、このような物質は所望の細菌芽胞の精製の前に貯蔵される。別の実施形態では、糞便物質は、単一のドナー対象から複数回にわたって入手され、単一ドナーからの複数個の試料、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３２、３５、４０、４５、４８、５０、１００個の試料から貯蔵され得る。
【００８２】
別の実施形態では、所望の細菌芽胞は、単一のドナーから得られた単一の糞便物質試料から精製され、このような精製の後、異なる時点での同一のドナーからの、もしくは１もしくは複数の異なるドナーからの、または両方からの他の精製から得られた精製された芽胞個体群と組み合わされる。
【００８３】
哺乳類ドナー対象は、概して良好な健康状態であり、このような良好な健康状態と調和した微生物叢を有する。多くの場合、ドナー対象は、糞便物質採取前のある特定の期間内に、抗生物性化合物を投与されていない。ある実施形態では、ドナー対象は、肥満でも過体重でもなく、２５未満（例えば、１８．５〜２４．９）の肥満度指数（ＢＭＩ）スコアを有し得る。他の実施形態では、ドナー対象は、精神障害者ではなく、あるいは、不安障害、鬱病、双極性障害、自閉症スペクトラム障害、精神分裂病、パニック障害、注意欠陥（機能亢進）障害、摂食障害または気分障害等の精神疾患の病歴または家族歴も有していない。他の実施形態では、ドナー対象は、過敏性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、過敏性腸症候、セリアック病、結腸直腸がんまたはこれら疾患の家族歴を有していない。他の実施形態では、ドナーは、当業者に公知の標準的な技術（例えば、核酸検査、血清検査、抗原検査、培養技術、酵素試験、感受性の高い細胞培養基質上での毒素を検査する細胞非含有糞便濾液のアッセイ）を用いて、血液媒介病原菌および糞便伝播性病原体についてスクリーニングされたものである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ドナーはまた、これらの属または種を含有する治療用組成物の有効性を増加させるある特定の属および／または種の存在についても選択される。他の実施形態では、他のドナーよりも比較的高い濃度の糞便物質中芽胞を生産するドナーが好ましい。さらなる実施形態では、有効性が増加された芽胞が精製される糞便物質を提供するドナーが好ましく；この有効性の増加は、下記のようなインビトロ試験または動物試験を用いて測定される。いくつかの実施形態では、ドナーは、糞便物質中の望まれない物質を減少させるため、および／または所望の芽胞個体群を増加させるために、一つまたは複数の提供前処置を受け得る。
【００８５】
糞便物質採取の前、および糞便物質採取の１回または複数回の後に、ドナー対象の健康をスクリーニングすることは有益である。このようなスクリーニングによって、ウイルス（ＨＩＶ、肝炎、ポリオ）および病原菌等の病原性物質を保有するドナーが特定される。採取後、ドナーは、およそ１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヶ月、１年または１年より長くスクリーニングされ、このようなスクリーニングの頻度は、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、年２回または毎年であり得る。提供の前もしくは後または前後にスクリーニングされて陽性反応を示さないドナーは、「有効な」ドナーとみなされる。
【００８６】
溶媒処理
細菌芽胞を精製するために、糞便物質は一つまたは複数の溶媒処理を受ける。溶媒処理は混和溶媒処理（部分的混和性または完全混和性）または非混和性溶媒処理である。混和性は、２つの液体が互いに混合して均一溶液を形成する能力である。例えば、水およびエタノールは完全混和性であるため、水およびエタノールをいかなる比率で含有する混合物も、ただ１つの相を示す。混和性は、ｗｔ／ｗｔ％、すなわち、１００ｇの最終溶液中の一方の溶媒の重量として与えられる。２つの溶媒が全ての比率において完全混和性である場合、それらの混和性は１００％である。水との完全混和性溶液として提供されるものは、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、プロパンジオール、ブタンジオール等である。水と既に混合されたこれらのアルコール、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８９％、８５％、９０％、９５％または９５％超を含有する溶液が提供され得る。他の溶媒は部分的にしか混和性でなく、これは、一部のみが水に溶解することを意味する。例えば、ジエチルエーテルは水と部分的混和性である。最大７グラムのジエチルエーテルが９３ｇの水に溶解して、７％（ｗｔ／ｗｔ％）溶液が得られる。より多くのジエチルエーテルが加えられた場合、水の上にジエチルエーテル相を別々に有する２相溶液が得られる。他の部分的混和性物質としては、エーテル、プロパン酸、ブタン酸、クロロホルム、ジメトキシエタン、またはテトラヒドロフランが挙げられる。対照的に、アルカン等の油および水は不混和性であり、２相を形成する。さらに、不混和性処理は所望により、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤のいずれかの界面活性剤と組み合わされる。例示的な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、プルロニック、またはポリオールが挙げられる。溶媒処理段階は、非芽胞形成性細菌種の生存率を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、または９９．９９９９％減少させ、所望により、混入している原生生物、寄生虫および／またはウイルスの生存率を減少させ得る。
【００８７】
クロマトグラフィー処理
芽胞個体群を精製するため、糞便物質は一つまたは複数のクロマトグラフィー処理を順次または同時に受ける。クロマトグラフィー処理では、糞便物質を含有する溶液は、疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）媒体またはアフィニティークロマトグラフ媒体を含有する固形媒体と接触される。別の実施形態では、糞便物質中に存在する残存生息環境産物を吸収することが可能な固形媒体は、残存生息環境産物を吸着する固形媒体と接触している。ある実施形態では、ＨＩＣ媒体は、セファロースまたはブチルセファロース、オクチルセファロース、フェニルセファロース、もしくはブチル−ｓセファロース等の誘導体化セファロースを含有する。他の実施形態では、アフィニティークロマトグラフ媒体は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型ムチンにより誘導体化された物質、またはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型ムチンのそれらから派生した、もしくはそれらに類似したオリゴ糖を含有する。あるいは、アフィニティークロマトグラフ媒体は、芽胞形成性細菌を認識する抗体により誘導体化された物質を含有する。
【００８８】
機械的処理
特に、混合（blending）、混合（mixing）、振盪、ボルテックス、衝撃粉砕、および超音波処理等の一つまたは複数の機械的処理による糞便物質の物理的破壊が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるように、機械的破壊処理によって、糞便物質中に存在する非芽胞性物質が実質的に破壊され、糞便物質中に存在する芽胞は実質的に破壊されず、あるいは、機械的破壊処理によって、非芽胞性物質よりも少ない、例えば、２倍少ない、５倍少ない、１０倍少ない、３０倍少ない、１００倍少ない、３００倍少ない、１０００倍少ない、もしくは１０００倍超少ない、芽胞物質が破壊され得る。さらに、機械的処理によって、前記物質は後の試料採取、試験、および処理のためにホモジナイズされる。機械的処理には、所望により濾過処理が含まれ、濾過処理では、所望の芽胞個体群がフィルター上に保持され、一方、望ましくない（非芽胞）糞便成分は通過し、その後、芽胞画分が濾過材から回収される。あるいは、望ましくない微粒子物および真核細胞がフィルター上に保持され、一方、芽胞を含む細菌細胞が通過する場合もある。いくつかの実施形態では、濾過材上に保持された芽胞画分はダイアフィルトレーションステップにかけられ、そこで、保持された芽胞は、望ましくない糞便成分をさらに減少または除去するために、洗液、典型的には無菌の食塩水含有溶液または低分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液を含む水相溶性ポリマー等の他の希釈剤と接触される。
【００８９】
熱処理
糞便物質の熱破壊が本明細書で提供される。一般的には、糞便物質は、効率的な熱伝達が加熱された環境と糞便物質との間で起こるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の食塩水含有溶液中に混合され、温室（warm room）、恒温器または水浴等の加熱された環境に曝される。糞便物質溶液は、熱伝導度を増強し特定の凝集物を破壊するために、インキュベーション中は混合されることが好ましい。熱処理は、環境の温度および／または熱処理の時間によって調節することができる。例えば、糞便物質または糞便物質を含む液体は、加熱された環境、例えば、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃または１００℃超の熱水浴に、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、４５秒間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０分間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間もしくは１０時間超、暴露される。ある実施形態では、熱処理は、１００℃環境で３０秒間、続いて５０℃環境で１０分間等、２つの異なる温度で起こる。好ましい実施形態では、熱処理の温度および期間は、病原性物質は殺傷または排除するが、芽胞の発芽能は実質的に損なわないまたは減少させないのに十分なものである。他の好ましい実施形態では、熱処理の温度および期間は、芽胞個体群の発芽を減少させるのに十分なほど短い。
【００９０】
照射処理
病原性物質は殺傷するが所望の芽胞個体群を実質的に傷害しないのに十分なエネルギー準位で与えられる、電離放射線、典型的にはγ線照射、紫外線照射または電子ビーム照射で、糞便物質または分離された糞便物質内容物を処理する方法が提供される。例えば、約２２，０００μＷ・ｓ／ｃｍ２未満のエネルギー準位で与えられる２５４ｎｍの紫外線照射は、通常、芽胞を破壊しない。
【００９１】
遠心分離処理および密度分離処理
遠心分離によって所望の芽胞個体群を糞便物質の他の成分から分離する方法が提供される。糞便物質を含有する溶液が、例えば、約２００×ｇ、１０００×ｇ、２０００×ｇ、３０００×ｇ、４０００×ｇ、５０００×ｇ、６０００×ｇ、７０００×ｇ、８０００×ｇまたは８０００×ｇ超での一つまたは複数の遠心分離処理にかけられる。分画遠心法によって所望の芽胞が望まれない非芽胞性物質から分離され；低い力では芽胞が溶液中に保持され、一方、より高い力では、芽胞がペレット化されるが、より小さな不純物（例えば、ウイルス粒子、ファージ、顕微鏡レベルの繊維、遊離タンパク質、核酸および脂質等の生体高分子）は溶液中に保持される。例えば、第一の低力遠心分離によって繊維状物質がペレット化され；第二の、より高い力の遠心分離によって望まれない真核細胞がペレット化され、第三の、さらにより高い力の遠心分離によって、所望の芽胞がペレット化され、一方より小さな混入物は懸濁液中に保持される。いくつかの実施形態では、ＣｓＣｌ勾配、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ勾配またはスクロース勾配等の、密度勾配もしくは移動度勾配またはクッション（例えば、段階クッション）が、所望の芽胞個体群を糞便物質中の他の物質から分離するために用いられる。
【００９２】
所望の芽胞を相乗的に精製するが、芽胞個体群から望まれない物質および／または活性を殺傷または排除するために、本明細書に記載される処理のうちの２つ以上を組み合わせた、芽胞個体群を生産する方法もまた本明細書で提供される。芽胞個体群中に存在する病原菌の成長を最小限にし、芽胞の栄養細菌細胞への発芽を最小限にするためのに、非発芽性且つ非成長促進性の条件および培地下に芽胞個体群を保持することが通常望ましい。
【００９３】
精製された芽胞個体群
本明細書に記載されるように、精製された芽胞個体群は、哺乳類対象に投与された場合に健常な微生物叢の機能を有意に提供する能力を有する、ヒト腸内微生物叢の複合共生細菌を含有する。特定の機序に限定するものではないが、このような組成物によって、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）、サルモネラ菌種、腸病原性大腸菌、フソバクテリウム菌種、クレブシエラ菌種およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス菌種等の病原体の成長が阻害されることで、健常で多様な保護的微生物叢が維持され、あるいは、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症等の病原性細菌感染症の場合では、腸管腔内で個体群再形成（repopulate）がなされて潜在的病原体全体に対する生態的防除が再建され得ると考えられる。一実施形態では、精製された芽胞個体群は、宿主内に生着し、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２５日間、３０日間、６０日間、９０日間、または９０日間より長く存在し続けることができる。さらに、精製された芽胞個体群は、精製された芽胞個体群中に存在しない、または低レベルで存在する、健常な腸内に存在する他の健常な共生細菌を、宿主内に生着するように誘導することができるため、これらの種は、送達された芽胞個体群を「増大させる」とみなされる。このように、レシピエントの腸内での精製された芽胞個体群の共生種増大は、腸微生物叢のより多様な個体群をもたらし、その後（then）最初に存在する。
【００９４】
好ましい細菌属としては、アセタナエロバクテリウム（Acetanaerobacterium）、アセチビブリオ、アリシクロバチルス、アルカリフィルス、アナエロフスチス（Anaerofustis）、アナエロスポロバクター（Anaerosporobacter）、アナエロスチペス（Anaerostipes）、アナエロツルンカス（Anaerotruncus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、バチルス、バクテロイデス、ブラウチア（Blautia）、ブラキスピラ、ブレビバシラス、ブリアンテラ（Bryantella）、ブレイディア（Bulleidia）、ブチリシコッカス（Butyricicoccus）、ブチリビブリオ、セテニバクテリウム（Catenibacterium）、クラミジアーレス、クロストリジアセエ、クロストリジアーレス、クロストリジウム、コリンゼラ（Collinsella）、コプロバチルス（Coprobacillus）、コプロコッカス、コクシエラ、デフェリバクテレス（Deferribacteres）、デスルフィトバクテリウム、デスルフォトマキュラム、ドレア（Dorea）、エガセラ（Eggerthella）、エリシペロスリクス、エリシペロトリカセアエ（Erysipelotrichaceae）、エタノリゲネンス（Ethanoligenens）、ユーバクテリウム、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、フィリファクター（Filifactor）、フラボニフラクター（Flavonifractor）、フレキシスチペス（Flexistipes）、フルビモナス（Fulvimonas）、フソバクテリウム、ゲムミゲル（Gemmiger）、ゲオバチルス（Geobacillus）、グロエオバクター（Gloeobacter）、ホルデマニア（Holdemania）、ヒドロゲノアナエロバクテリウム（Hydrogenoanaerobacterium）、コクリア、ラクノバクテリウム（Lachnobacterium）、ラクノスピラ、ラクスノピラセアエ（Lachnospiraceae）、ラクトバチルス、ラクトニファクター（Lactonifactor）、レプトスピラ、ルチスポラ（Lutispora）、リシニバチルス（Lysinibacillus）、モリクテス、ムーレラ、ノカルジア、オシリバクター、オスシロスピラ、パエニバシラス、パピリバクター（Papillibacter）、シュードフラボニフラクター（Pseudoflavonifractor）、ロビンソニエラ（Robinsoniella）、ロゼブリア、ルミノコッカセアエ（Ruminococcaceae）、ルミノコッカス、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、サルシナ、ソロバクテリウム（Ｓolobacterium）、スポロバクター（Sporobacter）、スポロラクトバチルス、ストレプトマイセス、スブドリグラヌルム（Subdoligranulum）、スッテレラ（Sutterella）、シントロフォコッカス（Syntrophococcus）、サーモアナエロバクター、サーモビフィダ（Thermobifida）、ツリキバクター（Turicibacter）属が挙げられる。
【００９５】
好ましい細菌種は、表１に記載されており、芽胞形成体として区分されている。種の特定の系統が提供される場合、その種の他の系統が指名された系統と置換可能であることが当業者によって理解される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、芽胞形成性細菌は、芽胞形成を調節する核酸配列の存在によって特定される。具体的には、サイン芽胞形成遺伝子（signature sporulation gene）が、クロストリジウム属およびバチルス属を含む遠縁の属の構成要素にわたって高度に保存されている。伝統的な方法論である順遺伝学によって、全てではないが多くの、芽胞形成（ｓｐｏ）に必須の遺伝子が同定された。芽胞形成の発生プログラムは、４つのコンパートメント特異的シグマ因子（σＦ、σＥ、σＧおよびσＫの順で現れる）の逐次作用によって部分的に支配されており、それらの活性は前芽胞（σＦおよびσＧ）または母細胞（σＥおよびσＫ）に限局している。他の実施形態では、芽胞形成性細菌は、ＤＰＡ生成酵素の生化学的活性によって、または培地のＤＰＡ含量を分析することによって、特定される。細菌芽胞形成の一環として、大量のＤＰＡが生成され、芽胞の質量の５〜１５％を構成する。全ての生存芽胞が既知の培地条件下で発芽および成長するわけではないため、細菌個体群中の総芽胞含量を評価することは困難である。このように、ＤＰＡ含量の測定値は、芽胞含量と高度に相関しており、細菌個体群中の総芽胞含量を特徴付けるのに適した基準となる。
【００９７】
２種以上の細菌を含有する芽胞個体群が提供される。本明細書で使用される場合、１「種類」または２「種類」以上の細菌は、属レベル、種、レベル（species, level）、亜種レベル、系統レベルで、または本明細書に記載のような、あるいは当該技術分野において公知のあらゆる他の分類学的方法によって、区別され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、精製された個体群中に存在する細菌芽胞は、全てまたは本質的に全て、本明細書に記載されるような、あるいは当該技術分野において公知の処理を受けた糞便物質から得られる。別の実施形態では、１以上の細菌芽胞または細菌芽胞の種類は、培養液中で生産され、組み合わされて精製された芽胞個体群を形成する。他の実施形態では、これらの培養によって生産された芽胞個体群のうちの一つまたは複数が、糞便物質由来芽胞個体群と組み合わされて、混成芽胞個体群が生産される。細菌組成物は、少なくとも２種のこれらの好ましい細菌（前記種の株を含む）を含有し得る。例えば、細菌組成物は、種またはそのような種を含む操作的分類単位（ＯＴＵ）によって定義される、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、または少なくとも２０種または２０種超の細菌を含み得る。
【００９９】
従って、治療的投与を必要とする哺乳類対象に対する治療的投与に適した、細菌芽胞個体群を含有する組成物を作製する方法が提供される。前記組成物は、概して、以下のステップに従って作製される：（ａ）哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質を用意するステップ；および（ｂ）前記糞便物質を、細菌芽胞個体群が糞便物質から生産されるような条件下で少なくとも１つの精製処理または精製ステップにかけるステップ。前記組成物は、１回経口投与量が少なくとも約１×１０４コロニー形成単位の細菌芽胞を含有し、１回経口投与量が約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、または１×１０１５超の細菌芽胞ＣＦＵを通常含有するように、製剤化される。所与の種類の細菌芽胞の存在および／または濃度は、所与の精製された芽胞個体群中で既知であっても未知であってもよい。例えば、既知である場合は、所与の系統または全系統の凝集物の芽胞の濃度は、例えば、組成物１グラム当たりまたは投与される用量当たり１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、または１×１０１５超の生存可能な細菌芽胞である。
【０１００】
いくつかの製剤において、前記組成物は、質量基準で少なくとも約０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超の芽胞を含有する。いくつかの製剤において、投与される用量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ミリグラムまたは１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、もしくは１．９グラム（質量）を超過しない。
【０１０１】
細菌芽胞組成物は、概して、通常は哺乳類対象に対する経口投与用または胃内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、前記組成物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、または菓子錠剤の形態等の、固体、半固体、ゲル、または液体形態として、経口投与用に製剤化される。芽胞は一般的には胃および小腸に対して耐性があるが、いくつかの実施形態では、このような製剤は、胃および小腸を通じて細菌を保護するための腸溶コーティングを含有するか、それによって被膜されている。他の実施形態では、生着または有効性を増強するための発芽誘起物質を含有する細菌芽胞組成物が製剤化され得る。さらに別の実施形態では、細菌芽胞組成物は、生着または有効性を増強するために、前生物的物質と一緒に同時製剤化または同時投与され得る。
【０１０２】
細菌芽胞組成物は、単回投与において、または複数回の投与にわたって、所与の哺乳類対象において有効であるように製剤化され得る。例えば、単回投与は、前記組成物が投与される哺乳類対象においけるクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）の毒素含量を減少させるのに実質的に有効である。実質的に有効であるとは、前記組成物の投与後に、対象内のクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）毒素含量が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９％超減少されることを意味する。あるいは、有効性は、２日間、４日間、１週間、２週間、４週間、８週間または８週間超の後の、下痢症状がないこと、またはクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）もしくはクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）毒素の保因がないことによって計られ得る。
【０１０３】
細菌組成物
哺乳類宿主に投与された場合に健常な微生物叢の機能を有意に提供する能力を有する、ヒト腸微生物叢の細菌および細菌の組み合わせが提供される。特定の機序に限定されるものではないが、このような組成物によって、共生バランスが崩れた微生物叢適所における１つまたは複数の病原菌の成長、増殖、および／またはコロニー形成が阻害されることで、健常、多様且つ保護的な微生物叢がコロニー形成し、腸管腔内で個体群形成して、病原体または潜在的病原体（例えば、いくつかの細菌は共生バランスが崩れた環境に存在する場合にのみ病原菌となる）に対する生態的防除が確立または再確立されると考えられる。病原体の阻害には、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）、サルモネラ菌種、腸管病原性大腸菌、多剤耐性菌（例えば、クレブシエラ、および大腸菌等）、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）、基質特異性拡張型βラクタム（extended spectrum beta-lactam）耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）、並びにバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）等の病原体が含まれる。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、１「種類」または２「種類」以上の細菌は、属レベル、種、レベル（species, level）、亜種レベル、系統レベルで、または本明細書に記載のような、あるいは当該技術分野において公知のあらゆる他の分類学的方法によって、区別され得る。
【０１０５】
細菌組成物は、２種類の細菌（「２種組み合わせ（binary combination）」または「２種対（binary pair）」と呼ばれる）または３種類以上の細菌を含み得る。例えば、細菌組成物は、種もしくは操作的分類単位（ＯＴＵ）によって定義される、または本明細書で提供されるような、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または少なくとも４０、少なくとも５０または５０種超の細菌を含み得る。
【０１０６】
別の実施形態では、細菌組成物中に存在する細菌の種類の数は、既知の値以下である。例えば、そのような実施形態では、細菌組成物は、５０種類以下の細菌、例えば、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０種類以下、または９種類以下の細菌、８種類以下の細菌、７種類以下の細菌、６種類以下の細菌、５種類以下の細菌、４種類以下の細菌、または３種類以下の細菌を含む。別の実施形態では、細菌組成物は、２〜４０種類以下、２〜３０種類以下、２〜２０種類以下、２〜１５種類以下、２〜１０種類以下、または２〜５種類以下の細菌を含む。
【０１０７】
種を用いて記述される細菌組成物  表１中の種から選択される少なくとも２種類の単離細菌を含む細菌組成物が調製され得る。
【０１０８】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（旧名：大便連鎖球菌（Streptococcusfaecalis））、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaoiotaomicron）、大腸菌（Escherichiacoli）（１１０９および１１０８−１）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridum bifermentans）、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcusproductus））。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１０９】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（旧名：大便連鎖球菌（Streptococcusfaecalis））、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaoiotaomicron）、大腸菌（Escherichiacoli）（１１０９および１１０８−１）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridum bifermentans）、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcusproductus））。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１０】
別の実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：アシダミノコッカス・インテスチナリス（Acidaminococcus intestinalis）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の２系統、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の２系統、ブラウチア・プロダクタ（Blautiaproducta）、クロストリジウム・コクレアータム（Clostridium cocleatum）、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ドレア・ロンギカテナ（Dorea longicatena）の２系統、大腸菌（Escherichia coli）、ユーバクテリウム・デスモランス（Eubacteriumdesmolans）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、ユーバクテリウム・リモスム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacteriumrectale）の４系統、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Eubacterium ventriosumi）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、ラクノスピラ・ペクチノシザ（Lachnospirapectinoshiza）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・カゼイ／パラカゼイ（Lactobacillus casei/paracasei）、パラカテロイデス・ディスタソニス（Paracateroides distasonis）、ラオウルテラ属種、ロゼブリア属の１系統（ロゼブリア・ファエカリス（Roseburia faecalis）またはロゼブリア・ファエキス（Roseburia faecis）から選択される）、ロゼブリア・インテスティナーリス（Roseburia intestinalis）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcustorques）の２系統、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcus obeum）の２系統、およびストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１１】
さらに別の実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バルネシエッラ・インテスチニホミニス（Barnesiella intestinihominis）；ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillusreuteri）；エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococus faecium）、またはエンテロコッカス・デューランス（Enterococcusdurans）の１つとして特徴付けられる種；アナエロスチペス・カカエ（Anaerostipes caccae）またはクロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）の１つとして特徴付けられる種；スタフィロコッカス・ワーネリ（Staphylococcus warneri）またはスタフィロコッカス・パステウリ（Staphylococcuspasteuri）の１つとして特徴付けられる種；およびアドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutziaequolifaciens）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１２】
他の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：クロストリジウム・アブソヌム（Clostridium absonum）、クロストリジウム・アルゲンチネンセ（Clostridiumargentinense）、クロストリジウム・バラティイ（Clostridium baratii）、クロストリジウム・バルトレッティイ（Clostridium bartlettii）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・カダヴェリス（Clostridiumcadaveris）、クロストリジウム・カミス（Clostridium camis）、クロストリジウム・セラツム（Clostridium celatum）、ショウベイ菌（Clostridium chauvoei）、クロストリジウム・クロストリディオフォルメ（Clostridium clostridioforme）、クロストリジウム・コクレアリウム（Clostridium cochlearium）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridiumdifficile）、クロストリジウム・ファラックス（Clostridium fallax）、クロストリジウム・フェルシネウム（Clostridium felsineum）、クロストリジウム・ゴニー（Clostridiumghonii）、クロストリジウム・グリコリクム（Clostridium glycolicum）、溶血クロストリジウム（Clostridium haemolyticum）、クロストリジウム・ハスチフォルメ（Clostridiumhastiforme）、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridiuminnocuum）、クロストリジウム・イッレグラレ（Clostridium irregulare）、クロストリジウム・リモスム（Clostridium limosum）、クロストリジウム・マレノミナツム（Clostridiummalenominatum）、ノーヴィ菌（Clostridium novyi）、クロストリジウム・オロチクム（Clostridium oroticum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridiumparaputrificum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・ピリフォルメ（Clostridium piliforme）、クロストリジウム・プトレファキエンス（Clostridiumputrefaciens）、クロストリジウム・プトリフィクム（Clostridium putrificum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・サルディニエンセ（Clostridiumsardiniense）、クロストリジウム・サルタゴフォルメ（Clostridium sartagoforme）、クロストリジウム・スキンデンス（Clostridium scindens）、クロストリジウム・セプティカム（Clostridiumsepticum）、クロストリジウム・ソルデリ（Clostridium sordellii）、クロストリジウム・スペノイデス（Clostridium sphenoides）、クロストリジウム・スピロフォルメ（Clostridiumspiroforme）、スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・スプテルミナレ（Clostridium subterminale）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridiumsymbiosum）、クロストリジウム・テルチウム（Clostridium tertium）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ウェルチ菌（Clostridium welchii）、およびクロストリジウム・ヴィッロスム（Clostridium villosum）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１３】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridumbifermentans）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroidesthetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、大腸菌（Escherichia coli）の３系統、およびラクトバチルス属種。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１４】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridiuminnocuum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、大腸菌（Escherichia coli）の３系統、バクテロイデス属の３系統、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１５】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バクテロイデス属種、大腸菌（Escherichia coli）、および非病原性クロストリジウム属、例えば、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）およびクロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１６】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バクテロイデス属種、大腸菌（Escherichia coli）および非病原性クロストリジウム属、例えば、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）およびクロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１７】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バクテロイデス・カッカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・カピッロスス（Bacteroidescapillosus）、バクテロイデス・コアグランス（Bacteroides coagulans）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス・エッゲルティイ（Bacteroideseggerthii）、ババクテロイデス・フォルシュトゥス（Bacteroides forsythus）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・フラジリス‐リフム（Bacteroides fragilis-ryhm）、バクテロイデス・グラキリス（Bacteroidesgracilis）、バクテロイデス・レヴィイ（Bacteroides levii）、バクテロイデス・マカカエ（Bacteroides macacae）、バクテロイデス・メルダエ（Bacteroidesmerdae）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・プネウモシンテス（Bacteroides pneumosintes）、バクテロイデス・プトレディニス（Bacteroidesputredinis）、バクテロイデス・ピオゲネス（Bacteroides pyogenes）、バクテロイデス・スプランクニカス（Bacteroides splanchnicus）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroidesstercoris）、バクテロイデス・テクツム（Bacteroides tectum）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・ウレオリティクス（Bacteroidesureolyticus）、およびバクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１８】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バクテロイデス、真正細菌、フソバクテリウム、プロピオニバクテリウム、乳酸桿菌、嫌気性球菌、ルミノコッカス、大腸菌（Escherichia coli）、ゲムミゲル（Gemmiger）、デスルホモナス、およびペプトストレプトコッカス。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１１９】
一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を含む：バクテロイデス・フラギリス亜種ヴルガトゥス（Bacteroides fragilis ss. Vulgatus）、ユーバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium aerofaciens）、バクテロイデス・フラギリス亜種テタイオタオミクロン（Bacteroides fragilis ss. Thetaiotaomicron）、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツスＩＩ（Peptostreptococcusproductus II））、バクテロイデス・フラジリス亜種ディスタソニス（Bacteroides fragilisss. Distasonis）、フソバクテリウム・プラウスニッチィイ（Fusobacterium prausnitzii）、コプロコッカス・エウタクツス（Coprococcus eutactus）、ユーバクテリウム・アエロファシエンスＩＩＩ（Eubacteriumaerofaciens III）、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツスＩ（Peptostreptococcus productus I））、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bronii）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacteriumadolescentis）、ゲムミゲル・フォルミキリス（Gemmiger formicilis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユーバクテリウム・シラエウム（Eubacteriumsiraeum）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｈ（Eubacterium rectale III-H）、ユーバクテリウム・レクタレＩＶ（Eubacteriumrectale IV）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、バクテロイデス・エッゲルティイ（Bacteroides eggerthii）、クロストリジウム・レプタム（Clostridiumleptum）、バクテロイデス・フラジリス亜種Ａ（Bacteroides fragilis ss. A）、ユーバクテリウム・ビフォルメ（Eubacterium biforme）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacteriuminfantis）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｆ（Eubacterium rectale III-F）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、バクテロイデス・カピッロスス（Bacteroidescapillosus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、ユーバクテリウム・フォルミキゲネランス（Eubacterium formicigenerans）、ユーバクテリウム・ハッリイ（Eubacteriumhallii）、ユーバクテリウム・ヴェントリオスムＩ（Eubacterium ventriosum I）、フソバクテリウム・ルッシイ（Fusobacterium russii）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcusobeum）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩ（Eubacterium rectale II）、クロストリジウム・ラモーサムＩ（Clostridium ramosum I）、ラクトバチルス・レイクマニイ（Lactobacillusleichmanii）、ルミノコッカス・カイリダス（Ruminococcus cailidus）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Acidaminococcusfermentans）、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・フラジリス亜種フラジリス（Bacteroides fragilis ss. fragilis）、バクテロイデスＡＲ（Bacteroides AR）、コプロコッカス・カタス（Coprococcus catus）、ユーバクテリウム・ハドルム（Eubacterium hadrum）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Eubacteriumcylindroides）、ユーバクテリウム・ルミナンチウム（Eubacterium ruminantium）、ユーバクテリウムＣＨ−１（Eubacterium CH-1）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ペプトストレプトコッカスＢＬ（Peptostreptococcus BL）、ユーバクテリウム・リモスム（Eubacteriumlimosum）、バク��ロイデス・プラエアクタス（Bacteroides praeacutus）、バクテロイデスＬ（Bacteroides L）、フソバクテリウム・モルティフェラムＩ（Fusobacteriummortiferum I）、フソバクテリウム・ナビフォルメ（Fusobacterium naviforme）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridiumramosum）、ざ瘡菌（Propionibacterium acnes）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）、ルミノコッカスＡＴ（RuminococcusAT）、ペプトコッカスＡＵ−１（Peptococcus AU-1）、ユーバクテリウムＡＧ（Eubacterium AG）、−ＡＫ、−ＡＬ、−ＡＬ−１、−ＡＮ；バクテロイデス・フラジリス亜種オバトス（Bacteroides fragilis ss. ovatus）、亜種ｄ（-ss. d）、亜種ｆ（-ss. f）；バクテロイデスＬ−１（Bacteroides L-1）、Ｌ−５；フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、フソバクテリウム・モルティフェラム（Fusobacteriummortiferum）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトコッカス・モルビロルム（Streptococcus morbiliorum）、ペプトコッカス・マグヌス（Peptococcusmagnus）、ペプトコッカスＧ（Peptococcus G）、ＡＵ−２；ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcuslactaris）、ルミノコッカスＣＯゲムミゲルＸ（Ruminococcus CO Gemmiger X）、コプロコッカスＢＨ（Coprococcus BH）、−ＣＣ；ユーバクテリウム・テヌエ（Eubacteriumtenue）、ユーバクテリウム・ラムルス（Eubacterium ramulus）、ユーバクテリウムＡＥ（Eubacterium AE）、−ＡＧ−Ｈ、−ＡＧ−Ｍ、−ＡＪ、−ＢＮ−１；バクテロイデス・クロストリディイフォルミス亜種クロストリドリフォルミス（Bacteroides clostridiiformis ss. clostridliformis）、バクテロイデス・コアグランス（Bacteroides coagulans）、バクテロイデス・オライルス（Bacteroidesorails）、バクテロイデス・ルミニコラ亜種ブレビス（Bacteroides ruminicola ss. brevis）、亜種ルミニコラ（-ss. ruminicola）、バクテロイデス・スプランクニカス（Bacteroidessplanchnicus）、デスイフォモナス・ピグラ（Desuifomonas pigra）、バクテロイデスＬ−４（Bacteroides L-4）、−Ｎ−ｉ；フソバクテリウムＨ（FusobacteriumH）、ラクトバチルスＧ（Lactobacillus G）、およびサクシニビブリオＡ（Succinivibrio A）。別の実施形態では、上記の種のうちの少なくとも１つが細菌組成物中に実質的に存在しない。
【０１２０】
操作的分類単位（ＯＴＵ）を用いて記述される細菌組成物  表１中の種から選択される少なくとも２種類の単離細菌を含む細菌組成物が調製され得る。
【０１２１】
一実施形態では、ＯＴＵは、１６Ｓ配列の可変領域（Ｖ１〜Ｖ９）のうちの一つまたは複数によって特徴付けられ得る。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系命名法（例えば、Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA genefrom Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)を参照）に基づく番号付けを用いて、それぞれ、ヌクレオチド６９〜９９、１３７〜２４２、４３３〜４９７、５７６〜６８２、８２２〜８７９、９８６〜１０４３、１１１７〜１１７３、１２４３〜１２９４および１４３５〜１４６５によって定義される。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、およびＶ９領域のうちの少なくとも１つがＯＴＵの特徴付けに使用される。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ４領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。
【０１２２】
ある特定の細菌種または細菌系統を含まない細菌組成物  一実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（旧名：大便連鎖球菌（Streptococcusfaecalis））、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaoiotaomicron）、大腸菌（Escherichiacoli）（１１０９および１１０８−１）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridum bifermentans）、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcusproductus））。
【０１２３】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：アシダミノコッカス・インテスチナリス（Acidaminococcus intestinalis）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）の２種類、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）の２種類、コリンゼラ・アエロファシエンス（Collinsellaaerofaciens）、ドレア・ロンギカテナ（Dorea longicatena）の２種類、大腸菌（Escherichia coli）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacteriumeligens）、ユーバクテリウム・リモスム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）の４種、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Eubacteriumventriosumi）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillusparacasei）、パラカテロイデス・ディスタソニス（Paracateroides distasonis）、ラオウルテラ属種、ロゼブリア属の１種（ロゼブリア・ファエカリス（Roseburia faecalis）またはロゼブリア・ファエキス（Roseburia faecis）から選択される）、ロゼブリア・インテスティナーリス（Roseburia intestinalis）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcustorques）の２種、およびストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）。
【０１２４】
さらに別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：バルネシエッラ・インテスチニホミニス（Barnesiella intestinihominis）；ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillusreuteri）；エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcus hirae）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococus faecium）、またはエンテロコッカス・デューランス（Enterococcusdurans）の１つとして特徴付けられる種；アナエロスチペス・カカエ（Anaerostipes caccae）またはクロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）の１つとして特徴付けられる種；スタフィロコッカス・ワーネリ（Staphylococcus warneri）またはスタフィロコッカス・パステウリ（Staphylococcuspasteuri）の１つとして特徴付けられる種；およびアドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutziaequolifaciens）。
【０１２５】
他の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：クロストリジウム・アブソヌム（Clostridium absonum）、クロストリジウム・アルゲンチネンセ（Clostridiumargentinense）、クロストリジウム・バラティイ（Clostridium baratii）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、ボツリヌス菌（Clostridiumbotulinum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・カダヴェリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム・カミス（Clostridiumcamis）、クロストリジウム・セラツム（Clostridium celatum）、ショウベイ菌（Clostridium chauvoei）、クロストリジウム・クロストリディオフォルメ（Clostridiumclostridioforme）、クロストリジウム・コクレアリウム（Clostridium cochlearium）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ファラックス（Clostridiumfallax）、クロストリジウム・フェルシネウム（Clostridium felsineum）、クロストリジウム・ゴニー（Clostridium ghonii）、クロストリジウム・グリコリクム（Clostridiumglycolicum）、溶血クロストリジウム（Clostridium haemolyticum）、クロストリジウム・ハスチフォルメ（Clostridium hastiforme）、ヒストリチクス菌（Clostridiumhistolyticum）、クロストリジウム・インドリス（Clostridium indolis）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・イッレグラレ（Clostridiumirregulare）、クロストリジウム・リモスム（Clostridium limosum）、クロストリジウム・マレノミナツム（Clostridium malenominatum）、ノーヴィ菌（Clostridiumnovyi）、クロストリジウム・オロチクム（Clostridium oroticum）、クロストリジウム・パラプトリフィカム（Clostridium paraputrificum）、ウェルシュ菌（Clostridiumperfringens）、クロストリジウム・ピリフォルメ（Clostridium piliforme）、クロストリジウム・プトレファキエンス（Clostridium putrefaciens）、クロストリジウム・プトリフィクム（Clostridiumputrificum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）、クロストリジウム・サルディニエンセ（Clostridium sardiniense）、クロストリジウム・サルタゴフォルメ（Clostridiumsartagoforme）、クロストリジウム・スキンデンス（Clostridium scindens）、クロストリジウム・セプティカム（Clostridium septicum）、クロストリジウム・ソルデリ（Clostridiumsordellii）、クロストリジウム・スペノイデス（Clostridium sphenoides）、クロストリジウム・スピロフォルメ（Clostridium spiroforme）、スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・スプテルミナレ（Clostridium subterminale）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridiumsymbiosum）、クロストリジウム・テルチウム（Clostridium tertium）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ウェルチ菌（Clostridium welchii）、およびクロストリジウム・ヴィッロスム（Clostridium villosum）。
【０１２６】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Clostridumbifermentans）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroidesthetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、大腸菌（Escherichia coli）の３系統、およびラクトバチルス属種。
【０１２７】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridiuminnocuum）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、大腸菌（Escherichia coli）の３系統、バクテロイデス属の３系統、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcusproductus））。
【０１２８】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：バクテロイデス属種、大腸菌（Escherichia coli）、および非病原性クロストリジウム属、例えば、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）およびクロストリジウム・ラモーサム（Clostridium ramosum）。
【０１２９】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：バクテロイデス属種、大腸菌（Escherichia coli）および非病原性クロストリジウム属、例えば、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）およびクロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）。
【０１３０】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：バクテロイデス・カッカエ（Bacteroides caccae）、バクテロイデス・カピッロスス（Bacteroidescapillosus）、バクテロイデス・コアグランス（Bacteroides coagulans）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス・エッゲルティイ（Bacteroideseggerthii）、ババクテロイデス・フォルシュトゥス（Bacteroides forsythus）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・フラジリス‐リフム（Bacteroides fragilis-ryhm）、バクテロイデス・グラキリス（Bacteroidesgracilis）、バクテロイデス・レヴィイ（Bacteroides levii）、バクテロイデス・マカカエ（Bacteroides macacae）、バクテロイデス・メルダエ（Bacteroidesmerdae）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）、バクテロイデス・プネウモシンテス（Bacteroides pneumosintes）、バクテロイデス・プトレディニス（Bacteroidesputredinis）、バクテロイデス・ピオゲネス（Bacteroides pyogenes）、バクテロイデス・スプランクニカス（Bacteroides splanchnicus）、バクテロイデス・ステルコリス（Bacteroidesstercoris）、バクテロイデス・テクツム（Bacteroides tectum）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、バクテロイデス・ウレオリティクス（Bacteroidesureolyticus）、およびバクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）。
【０１３１】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない：バクテロイデス、真正細菌、フソバクテリウム、プロピオニバクテリウム、乳酸桿菌、嫌気性球菌、ルミノコッカス、大腸菌（Escherichia coli）、ゲムミゲル（Gemmiger）、デスルホモナス、およびペプトストレプトコッカス。
【０１３２】
別の実施形態では、細菌組成物は以下のうちの少なくとも１つを含まない:バクテロイデス・フラギリス亜種ヴルガトゥス（Bacteroides fragilis ss. Vulgatus）、ユーバクテリウム・アエロファシエンス（Eubacterium aerofaciens）、バクテロイデス・フラギリス亜種テタイオタオミクロン（Bacteroides fragilis ss. Thetaiotaomicron）、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツスＩＩ（Peptostreptococcusproductus II））、バクテロイデス・フラジリス亜種ディスタソニス（Bacteroides fragilisss. Distasonis）、フソバクテリウム・プラウスニッチィイ（Fusobacterium prausnitzii）、コプロコッカス・エウタクツス（Coprococcus eutactus）、ユーバクテリウム・アエロファシエンスＩＩＩ（Eubacteriumaerofaciens III）、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ペプトストレプトコッカス・プロダクツスＩ（Peptostreptococcus productus I））、ルミノコッカス・ブロミイ(Ruminococcus bromii)、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacteriumadolescentis）、ゲムミゲル・フォルミキリス（Gemmiger formicilis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユーバクテリウム・シラエウム（Eubacteriumsiraeum）、ルミノコッカス・トルクエス（Ruminococcus torques）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｈ（Eubacterium rectale III-H）、ユーバクテリウム・レクタレＩＶ（Eubacteriumrectale IV）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、バクテロイデス・エッゲルティイ（Bacteroides eggerthii）、クロストリジウム・レプタム（Clostridiumleptum）、バクテロイデス・フラジリス亜種Ａ（Bacteroides fragilis ss. A）、ユーバクテリウム・ビフォルメ（Eubacterium biforme）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacteriuminfantis）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｆ（Eubacterium rectale III-F）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、バクテロイデス・カピッロスス（Bacteroidescapillosus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、ユーバクテリウム・フォルミキゲネランス（Eubacterium formicigenerans）、ユーバクテリウム・ハッリイ（Eubacteriumhallii）、ユーバクテリウム・ヴェントリオスムＩ（Eubacterium ventriosum I）、フソバクテリウム・ルッシイ（Fusobacterium russii）、ルミノコッカス・オベウム（Ruminococcusobeum）、ユーバクテリウム・レクタレＩＩ（Eubacterium rectale II）、クロストリジウム・ラモーサムＩ（Clostridium ramosum I）、ラクトバチルス・レイクマニイ（Lactobacillusleichmanii）、ルミノコッカス・カイリダス（Ruminococcus cailidus）、ブチリビブリオ・クロッソタス（Butyrivibrio crossotus）、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Acidaminococcusfermentans）、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム（Eubacterium ventriosum）、バクテロイデス・フラジリス亜種フラジリス（Bacteroides fragilis ss. fragilis）、バクテロイデスＡＲ（Bacteroides AR）、コプロコッカス・カタス（Coprococcus catus）、ユーバクテリウム・ハドルム（Eubacterium hadrum）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Eubacteriumcylindroides）、ユーバクテリウム・ルミナンチウム（Eubacterium ruminantium）、ユーバクテリウムＣＨ−１（Eubacterium CH-1）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ペプトストレプトコッカスＢＬ（Peptostreptococcus BL）、ユーバクテリウム・リモスム（Eubacteriumlimosum）、バクテロイデス・プラエ��クタス（Bacteroides praeacutus）、バクテロイデスＬ（Bacteroides L）、フソバクテリウム・モルティフェラムＩ（Fusobacteriummortiferum I）、フソバクテリウム・ナビフォルメ（Fusobacterium naviforme）、クロストリジウム・イノキューム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・ラモーサム（Clostridiumramosum）、ざ瘡菌（Propionibacterium acnes）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）、ルミノコッカスＡＴ（RuminococcusAT）、ペプトコッカスＡＵ−１（Peptococcus AU-1）、ユーバクテリウムＡＧ（Eubacterium AG）、−ＡＫ、−ＡＬ、−ＡＬ−１、−ＡＮ；バクテロイデス・フラジリス亜種オバトス（Bacteroides fragilis ss. ovatus）、亜種ｄ（-ss. d）、亜種ｆ（-ss. f）；バクテロイデスＬ−１（Bacteroides L-1）、Ｌ−５；フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、フソバクテリウム・モルティフェラム（Fusobacteriummortiferum）、大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトコッカス・モルビロルム（Streptococcus morbiliorum）、ペプトコッカス・マグヌス（Peptococcusmagnus）、ペプトコッカスＧ（Peptococcus G）、ＡＵ−２；ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ruminococcuslactaris）、ルミノコッカスＣＯゲムミゲルＸ（Ruminococcus CO Gemmiger X）、コプロコッカスＢＨ（Coprococcus BH）、−ＣＣ；ユーバクテリウム・テヌエ（Eubacteriumtenue）、ユーバクテリウム・ラムルス（Eubacterium ramulus）、ユーバクテリウムＡＥ（Eubacterium AE）、−ＡＧ−Ｈ、−ＡＧ−Ｍ、−ＡＪ、−ＢＮ−１；バクテロイデス・クロストリディイフォルミス亜種クロストリドリフォルミス（Bacteroides clostridiiformis ss. clostridliformis）、バクテロイデス・コアグランス（Bacteroides coagulans）、バクテロイデス・オライルス（Bacteroidesorails）、バクテロイデス・ルミニコラ亜種ブレビス（Bacteroides ruminicola ss. brevis）、亜種ルミニコラ（-ss. ruminicola）、バクテロイデス・スプランクニカス（Bacteroidessplanchnicus）、デスイフォモナス・ピグラ（Desuifomonas pigra）、バクテロイデスＬ−４（Bacteroides L-4）、−Ｎ−ｉ；フソバクテリウムＨ（FusobacteriumH）、ラクトバチルスＧ（Lactobacillus G）、およびサクシニビブリオＡ（Succinivibrio A）。
【０１３３】
病原性微生物の阻害
いくつかの実施形態では、細菌組成物は、一つまたは複数の目的のＧＩ病原体による感染に対する保護効果または治療効果を与える。
【０１３４】
病原体の状態によって示される、例示的な病原性微生物の列挙が表１に提供される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、病原性細菌は、以下からなる群から選択される：エルシニア、ビブリオ、トレポネーマ、連鎖球菌、ブドウ球菌属、赤痢菌、サルモネラ、リケッチア、オリエンティア、シュードモナス、ナイセリア、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、リステリア、レプトスピラ、レジオネラ、クレブシエラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス、フランシセラ、大腸菌類、エーリキア、エンテロコッカス、コクシエラ、コリネバクテリウム、クロストリジウム、クラミジア、クラミドフィラ、カンピロバクター、バークホルデリア、ブルセラ、ボレリア、ボルデテラ、ビフィドバクテリウム、バチルス、多剤耐性菌、基質特異性拡張型βラクタム（extended spectrum beta-lactam）耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、これらの病原体には、限定はされないが、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacterfetus）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、セレウス菌（Bacillus cereus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacterjejuni）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、腸管凝集性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管組織侵入性大腸菌、毒素原性大腸菌（例えば、限定はされないが、ＬＴおよび／またはＳＴ）、大腸菌０１５７（Escherichia coli 0157）：Ｈ７、ピロリ菌（Helicobacter pylori））、肺炎桿菌（Klebsiellia pneumonia）、リステリア菌（Lysteria monocytogenes）、プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、サルモネラ菌種、チフス菌（Salmonellatyphi）、パラチフス菌（Salmonella paratyphi）、シゲラ菌種、ブドウ球菌種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス菌種、ビブリオ菌種、コレラ菌、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・バルニフィカス（Vibriovulnificus）、およびエンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）が含まれる。
【０１３７】
一実施形態では、目的の病原体は、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridiumdifficile）、サルモネラ菌種、病原性大腸菌、バンコマイシン耐性エンテロコッカス菌種、および基質特異性拡張型βラクタム（extended spectrum beta-lactam）耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）から選択される少なくとも１つの病原体である。
【０１３８】
精製された芽胞個体群
いくつかの実施形態では、細菌組成物は精製された芽胞個体群を含む。精製された芽胞個体群は、哺乳類対象に投与された場合に健常な微生物叢の機能を有意に提供する能力を有する、ヒト腸内微生物叢の複合共生細菌を含有する。特定の機序に限定するものではないが、このような組成物によって、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）、サルモネラ菌種、腸病原性大腸菌、およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス菌種等の病原体の成長が阻害されることで、健常で多様な保護的微生物叢が維持され、あるいは、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症等の病原性細菌感染症の場合では、腸管腔内で個体群再形成がなされて潜在的病原体全体に対する生態的防除が再建され得ると考えられる。いくつかの実施形態では、酵母胞子および他の真菌芽胞も精製され、治療用途に選択される。
【０１３９】
胃腸の疾患、障害および状態の予防、制御、および治療のための、並びに総体的な栄養上の健康のための、非病原性の発芽能を有する細菌芽胞を含有する治療用組成物が本明細書で開示される。これらの組成物は、ヒトおよび他の哺乳類対象への安全な投与に適しており、且つ、多数の胃腸の疾患、障害および状態、並びに総体的な栄養上の健康において効果的であるという点で有利である。芽胞をベースとした組成物が知られているが、これらは一般的には液体細菌培養物の凍結乾燥または噴霧乾燥等の種々の手法によって調製され、その結果として、不十分な有効性、不安定性、相当な変異性および十分な安全性の欠如に繋がる。
【０１４０】
現在、細菌芽胞の個体群が、ヒトを含む哺乳類対象から得られる生物学的材料から入手可能であることが分かっている。これらの個体群は、本明細書で提供されるような組成物に製剤化され、本明細書で提供されるような方法を用いて哺乳類対象に投与される。
【０１４１】
精製された細菌芽胞個体群を含有する治療用組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「精製する」、「精製された」および「精製すること（purifying）」という用語は、一つまたは複数の精製過程、例えば、本明細書に記載されるような、所望の細菌芽胞の選別もしくは富化、または残存生息環境産物の排除もしくは減少を経た、ある生息数（例えば、複数の既知または未知の量および／または濃度）の所望の細菌芽胞の状態を指す。いくつかの実施形態では、精製された個体群は検出可能な望まれない活性を有さず、あるいは、望まれない活性のレベルまたは量が許容できるレベルまたは量であるか、またはそれ未満である。他の実施形態では、精製された個体群は、許容できる量および／または濃度であるかそれ未満である、ある量および／または濃度の所望の細菌芽胞を有する。他の実施形態では、前記精製細菌芽胞個体群は、個体群が得られる出発物質（例えば、糞便物質）と比較して富化される。この富化は、出発物質と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。
【０１４２】
ある実施形態では、細菌芽胞の精製個体群は、減少したまたは検出不可能なレベルの一つまたは複数の病原性活性、例えば、毒性、哺乳類レシピエント対象の感染、免疫調節活性、自己免疫応答、代謝反応、または炎症反応もしくは神経反応等を有する。このような病原活性の低減は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。他の実施形態では、細菌芽胞の精製個体群は、糞便物質と比較して、低減された匂い、味、外見、およびうま味等の、低減された感覚的成分を有する。
【０１４３】
残存生息環境産物を実質的に含んでいない、精製された細菌芽胞個体群が提供される。ある実施形態では、このことは、細菌芽胞組成物が、ヒトまたは動物対象の体表または体内に生息する間の微生物群集に関連する相当量の生物学的物質を含有しておらず、精製された芽胞個体群が、微生物群集に関連する生物学的物質のいかなる混入も１００％非含有、９９％非含有、９８％非含有、９７％非含有、９６％非含有、または９５％非含有であり得ることを意味する。残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、細菌芽胞組成物がヒトまたは動物由来の検出可能な細胞を含有していないこと、且つ、微生物細胞のみが検出可能であること、具体的には、所望の微生物細胞のみが検出可能であることを意味する場合もある。別の実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいないとは、微生物細胞と比較して、細菌組成物中の１×１０−２％未満、１×１０−３％未満、１×１０−４％未満、１×１０−５％未満、１×１０−６％未満、１×１０−７％未満、１×１０−８％未満の細胞がヒト細胞または動物細胞であることを意味する。別の実施形態では、精製個体群中に存在する残存生息環境産物は、哺乳類ドナー対象から得られた糞便物質から、少なくともある特定のレベルに減少され、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超減少される。
【０１４４】
一実施形態では、残存生息環境産物を実質的に含んでいない、または検出可能なレベルの病原性物質を実質的に含んでいないとは、細菌組成物が、検出可能なウイルス性混入物（例えば、細菌ウイルス（すなわち、ファージ））、真菌性混入物、またはマイコプラズマ混入物もしくはトキソプラズマ混入物、または蠕虫等の真核生物性寄生虫を含有していないことを意味する。あるいは、精製された芽胞個体群は、無細胞性物質、例えば、ＤＮＡ、ウイルス外被物質、または生育不能な細菌性物質を実質的に含んでいない。
【０１４５】
本明細書に記載されるように、精製された芽胞個体群は、遺伝子解析（例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡ塩基配列決定法）、血清学的分析および抗原分析、および所望の細菌芽胞を望まれない混入物質と区別する試薬を用いるフローサイトメトリー等の計測手段を用いる方法によって証明される。
【０１４６】
例示的な生物学的材料としては、糞便物質、例えば、糞便または小腸および大腸の種々の区域から単離された物質等が挙げられる。糞便物質は哺乳類ドナー対象から入手されるか、または２以上のドナー対象、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００もしくは１０００超のドナーから入手され得、ここで、このような物質は所望の細菌芽胞の精製の前に貯蔵される。
【０１４７】
別の実施形態では、所望の細菌芽胞は、単一のドナーから得られた単一の糞便物質試料から精製され、このような精製の後、異なる時点での同一のドナーからの、もしくは１もしくは複数の異なるドナーからの、または両方からの他の精製から得られた精製された芽胞個体群と組み合わされる。
【０１４８】
好ましい細菌属としては、アセトネマ（Acetonema）、アルカリフィルス、アリシクロバチルス、アンフィバチルス、アムモニフェクス（Ammonifex）、アナエロバクター（Anaerobacter）、アナエロフスチス、アナエロスチペス（Anaerostipes）、アナエロツルンカス（Anaerotruncus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、バチルス、ブラウチア（Blautia）、ブレビバシラス、ブリアンテラ（Bryantella）、カルディセルロシラプター（Caldicellulosiruptor）、カロラマター（Caloramator）、候補属（Candidatus）、カルボキシジブラチウム（Carboxydibrachium）、カルボキシドセルマス（Carboxydothermus）、クロストリジウム、コフネラ（Cohnella）、コプロコッカス、デンドロスポロバクター（Dendrosporobacter）  デスルフィトバクテリウム、デスルホスポロシヌス（Desulfosporosinus）、デスルフォトマキュラム、ドレア（Dorea）、ユーバクテリウム、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、フィリファクター（Filifactor）、ゲオバチルス（Geobacillus）、ハロバクテロイデス、ヘリオバチルス、ヘリオバクテリウム、ヘリオフィルム、ヘリオレスティス、ラクノアナエロバクラム（Lachnoanaerobaculum）、リシニバチルス（Lysinibacillus）、ムーレラ、オセアノバチルス（Oceanobacillus）、オレニア（Ｓ．）、オキサロファーガス、オキソバクター、パエニバシラス、ペロスポラ、ペロトマキュラム（Pelotomaculum）、プロピオニスポラ（Propionispora）、ロゼブリア、ルミノコッカス、サルシナ、スポロバクテリウム（Sporobacterium）、スポロハロバクター（Sporohalobacter）、スポロラクトバチルス、スポロムサ（Sporomusa）、スポロサルシナ、スポロトマキュラム、スブドリグラヌルム（Subdoligranulum）、シムビオバクテリウム（Symbiobacterium）、シントロフォボツラス、シントロフォスポラ（Syntrophospora）、テリバチルス（Terribacillus）、サーモアナエロバクター、およびサーモシナス（Thermosinus）が挙げられる。
【０１４９】
好ましい細菌種は、表Ｘ４に記載されている。種の特定の系統が提供される場合、その種の他の系統が指名された系統と置換可能であることが当業者によって理解される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、芽胞形成性細菌は、芽胞形成を調節する核酸配列の存在によって特定される。具体的には、サイン芽胞形成遺伝子が、クロストリジウム属およびバチルス属を含む遠縁の属の構成要素にわたって高度に保存されている。伝統的な方法論である順遺伝学によって、全てではないが多くの、芽胞形成（ｓｐｏ）に必須の遺伝子が同定された。芽胞形成の発生プログラムは、４つのコンパートメント特異的シグマ因子（σＦ、σＥ、σＧおよびσＫの順で現れる）の逐次作用によって部分的に支配されており、それらの活性は前芽胞（σＦおよびσＧ）または母細胞（σＥおよびσＫ）に限局している。
【０１５１】
２種以上の細菌を含有する芽胞個体群が提供される。本明細書で使用される場合、１「種類」または２「種類」以上の細菌は、属レベル、種、レベル（species, level）、亜種レベル、系統レベルで、または本明細書に記載のような、あるいは当該技術分野において公知のあらゆる他の分類学的方法によって、区別され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、精製された個体群中に存在する細菌芽胞は、全てまたは本質的に全て、本明細書に記載ような、あるいは当該技術分野において公知の処理を受けた糞便物質から得られる。別の実施形態では、１以上の細菌芽胞または細菌芽胞の種類は、培養液中で生産され、組み合わされて精製された芽胞個体群を形成する。他の実施形態では、これらの培養によって生産された芽胞個体群のうちの一つまたは複数が、糞便物質由来芽胞個体群と組み合わされて、混成芽胞個体群が生産される。細菌組成物は、少なくとも２種のこれらの好ましい細菌（前記種の株を含む）を含有し得る。例えば、細菌組成物は、種またはそのような種を含む操作的分類単位（ＯＴＵ）によって定義される、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、少なくとも１６種、少なくとも１７種、少なくとも１８種、少なくとも１９種、または少なくとも２０種または２０種超の細菌を含み得る。
【０１５３】
従って、治療的投与を必要とする哺乳類対象に対する治療的投与に適した、細菌芽胞個体群を含有する組成物を作製する方法が提供される。前記組成物は、概して、以下のステップに従って作製される：（ａ）哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質を用意するステップ；および（ｂ）前記糞便物質を、細菌芽胞個体群が糞便物質から生産されるような条件下で少なくとも１つの精製処理または精製ステップにかけるステップ。前記組成物は、１回経口投与量が少なくとも約１×１０４コロニー形成単位の細菌芽胞を含有し、１回経口投与量が約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、または１×１０１５超の細菌芽胞ＣＦＵを通常含有するように、製剤化される。所与の種類の細菌芽胞の存在および／または濃度は、所与の精製された芽胞個体群中で既知であっても未知であってもよい。例えば、既知である場合は、所与の系統または全系統の凝集物の芽胞の濃度は、例えば、組成物１グラム当たりまたは投与される用量当たり１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、または１×１０１５超の生存可能な細菌芽胞である。
【０１５４】
いくつかの製剤において、前記組成物は、質量基準で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超の芽胞を含有する。いくつかの製剤において、投与される用量は、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ミリグラムまたは１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、もしくは１．９グラム（質量）を超過しない。
【０１５５】
細菌芽胞組成物は、概して、通常は哺乳類対象に対する経口投与用または胃内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、前記組成物は、丸剤、錠剤、カプセル剤、または菓子錠剤の形態等の、固体、半固体、ゲル、または液体形態として、経口投与用に製剤化される。芽胞は一般的には胃および小腸に対して耐性があるが、いくつかの実施形態では、このような製剤は、胃および小腸を通じて細菌を保護するための腸溶コーティングを含有するか、それによって被膜されている。
【０１５６】
細菌芽胞組成物は、単回投与において、または複数回の投与にわたって、所与の哺乳類対象において有効であるように製剤化され得る。例えば、単回投与は、前記組成物が投与される哺乳類対象においけるクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）の毒素含量を減少させるのに実質的に有効である。実質的に有効であるとは、前記組成物の投与後に、対象内のクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）および／またはクロストリジウム・ディフィシル（Cl. difficile）毒素含量が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９％超減少されることを意味する。
【０１５７】
本発明の方法
１６Ｓ配列を決定するための方法  ＯＴＵは、ｒＲＮＡ遺伝子の完全１６Ｓ配列決定によって、この遺伝子の特定の超可変領域（すなわち、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、またはＶ９）の配列決定によって、またはこの遺伝子から得られる超可変領域のあらゆる組み合わせ（例えば、Ｖ１〜３またはＶ３〜５）の配列決定によって、定義することができる。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、およそ１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを用いてある細菌分離株の他の細菌分離株に対する進化的関係および配列類似性を再構築する際に使用される。ＯＴＵはまた、あらゆる組み合わせのヌクレオチドマーカーまたは遺伝子、具体的には高度に保存された遺伝子（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子）、またはこれらの組み合わせによって特徴付けられ得る。
【０１５８】
周知の技術を用いて、完全１６Ｓ配列または１６Ｓ配列のあらゆる超可変領域の配列を決定するために、ゲノムＤＮＡを細菌試料から抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（完全領域または特定の超可変領域）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、ＰＣＲ産物を精製（clean）し、ヌクレオチド配列を線引きして１６Ｓ遺伝子または前記遺伝子のサブドメインの遺伝子組成物を決定する。完全１６Ｓ配列決定が行われる場合、使用される配列決定法は、限定はされないが、サンガー配列決定法であり得る。一つまたは複数の超可変領域（例えば、Ｖ４領域）が使用される場合、配列決定は、限定はされないが、サンガー法を用いて、または次世代シークエンシング法（例えば、複合的な反応を可能にするバーコード付き（barcoded）プライマーを用いるＩｌｌｕｍｉｎａ（合成による配列決定）法）を用いて、行われ得る。
【０１５９】
ＯＴＵは、あらゆる組み合わせのヌクレオチドマーカーまたは遺伝子、具体的には高度に保存された遺伝子（例えば、「ハウスキーピング」遺伝子）、またはこれらの組み合わせ、完全長ゲノム配列、または増幅された遺伝子産物を用いて作製される部分ゲノム配列、または全ゲノム配列（whole genome sequence：ＷＧＳ）によって特徴付けられ得る。詳細に明らかにされた方法を用いることで、ＰＣＲを用いて増幅され、配列決定により増幅産物のヌクレオチド配列が決定された特定のゲノム領域を、細菌試料から抽出されるＤＮＡは有することになる。全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）法では、抽出されたＤＮＡは、増幅無しで直接的に配列決定されることになる。配列データは、サンガー法、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＡＢＩ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、および／またはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅを含むがこれらに限定はされないあらゆる配列決定技術を用いて作成することができる。
【０１６０】
対象に投与するための細菌組成物の調製法  細菌組成物を作製するための方法は、一つまたは複数の混合ステップと組み合わされた３つの主な処理ステップを含み得る。これらのステップには、生物の貯蔵（organism banking）、生物の生産（organism production）、および保存が含まれる。
【０１６１】
貯蔵について、細菌組成物中に含まれる系統は、（１）検体から直接単離されるかまたは貯蔵ストックから取り出され、（２）所望により、成長を補助する栄養寒天またはブロス状で培養されることで生存可能なバイオマスが生産され得、（３）前記バイオマスは所望により長期保存において複数の分割量で保存され得る。
【０１６２】
培養ステップを用いる実施形態において、寒天またはブロスは、成長を可能にする必須元素および特定の因子を提供する栄養分を含有している場合がある。２０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ大豆ペプトン、２ｇ／Ｌクエン酸、１．５ｇ／Ｌ第一リン酸ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、８０ｍｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、１０ｍｇ／Ｌ塩化ヘミン、２ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム、１ｍｇ／Ｌメナジオンから構成される培地が一例となるだろう。種々の微生物的培地および変形形態が当該技術分野において周知である（例えば、R.M. Atlas, Handbook of Microbiological Media (2010) CRC Press）。培地は開始時に培養物に加えることができ、あるいは、培養中に加えてもよいし、または断続的／継続的に培養物に流されてもよい。細菌組成物中の系統は、細菌組成物の一部として、または細菌組成物を構成する全体集合として、単独で培養され得る。一例として、第一の系統は、第二の系統と一緒に、混合型連続培養において、培養物が培養から洗い流されることを防ぐためにいずれかの細胞の最大増殖率よりも低い希釈率で、培養され得る。
【０１６３】
播種された培養物は好ましい条件下でバイオマスを構築するのに十分な時間培養される。ヒトに使用するための細菌組成物において、前記条件は多くの場合、正常なヒト適所に類似した値を有する３７℃の温度、ｐＨ、および他のパラメータである。前記環境は、能動制御するか、受動制御（例えば、緩衝液を介して）するか、または変動させることができる。例えば、嫌気的細菌組成物（例えば、腸微生物叢）には、無酸素／還元環境が採用され得る。無酸素／還元環境は、システイン等の還元剤をブロスに添加することによって、および／または酸素をブロスから取り除くことによって、達成することができる。一例として、細菌組成物の培養物は、３７℃、ｐＨ７、１ｇ／ＬシステインＨＣｌで予め還元された上記の培地中で増殖し得る。
【０１６４】
培養物は、十分なバイオマスを産生した場合、貯蔵用に保存され得る。前記生物は、凍結（「凍結保護物質」を添加）、乾燥（「リオプロテクタント」）、および／または浸透圧ショック（「浸透圧保護剤」）から保護する化学的環境中に置かれ、複数（所望により同一の）容器内に分注されて均一なバンクが作製され、その後前記培地に保存のための処理がなされ得る。容器は一般的には、不浸透性であり、且つ、環境からの分離を確実にする密封を有するものである。凍結保存処理は、液体を超低温（例えば、−８０℃以下）で凍結することによって達成される。乾燥保存では、蒸発（噴霧乾燥または「冷却乾燥」の場合）によって、または昇華（例えば、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥において）によって、培養物から水が除去される。水の除去は、低温貯蔵以上に上昇した温度での、細菌組成物の長期の貯蔵安定性を向上させる。細菌組成物が芽胞形成種を含み、芽胞の生産が結果として起こった場合、最終組成物は密度勾配遠心等のさらなる手段によって精製され、上記手法を用いて保存され得る。細菌組成物の貯蔵は、系統を個々に培養および保存することによって、または系統を混合して混合バンクを作製することによって、行われ得る。凍結保存の一例として、細菌組成物の培養物が培地から細胞をペレット化するための遠心分離によって収集され、上清がデカントされて１５％グリセロールを含有する新鮮な培養ブロスと置換され得る。次に、培養物が１ｍＬクライオチューブに分注され、密封され、長期間の生存率維持のために−８０℃に置かれ得る。この手順によって、凍結貯蔵からの回復後の、許容できる生存率が達成される。
【０１６５】
生物生産は、貯蔵と同様の培養ステップ（例えば、培地組成および培養条件）を用いて、実行され得る。生物生産は、特に臨床開発または営業生産のために、より大きな実施規模で実行され得る。より大きな規模では、最終培養の前に、細菌組成物の数回の継代培養が行われ得る。培養の終わりに、培養物は、投与用剤形へのさらなる製剤化を可能にするために回収される。これには、濃縮、望ましくない培地成分の除去、および／または細菌組成物を保存し、選択された経路を介した投与用に許容できるものにする化学的環境内への導入が含まれ得る。例えば、細菌組成物は、１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで培養され、次に、接線流精密濾過（tangential flow microfiltration）によって２０倍に濃縮され得；消耗した培地は、２％ゼラチン、１００ｍＭトレハロース、および１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液から成る保存用培地でのダイアフィルトレーション（diafiltering）によって交換され得る。次に、その懸濁液は粉末に凍結乾燥され、滴定され得る。
【０１６６】
乾燥後、前記粉末は、適切な作用強度まで混合され、他の培養物並びに／または稠度および操作性のための微結晶性セルロース等の賦形剤と混合され、本明細書で提供されるように、細菌組成物が製剤化される。
【０１６７】
細菌組成物の投与
本発明の細菌組成物は、それを必要とする哺乳動物および非哺乳動物への投与に適している。ある実施形態では、哺乳類対象は、一つまたは複数の腸内菌共生バランス失調症状、例えば、限定はされないが、望まれない病原性共生菌もしくは病原体の過剰増殖、バクテロイデス門もしくはフィルミクテス門もしくはその属もしくは種等の重要な細菌分類群の提示（representation）の減少、または健常人と比較した場合の微生物種の多様性の減少、または嫌気性細菌の全体的存在量の減少を有するヒト対象である。
【０１６８】
哺乳類対象が疾患、異常な微生物叢によって特徴付けられる障害または状態を患っている場合、本明細書に記載の細菌組成物がその治療に適している。いくつかの実施形態では、哺乳類対象は細菌組成物による処置以前に抗生物質を摂取していない。例えば、哺乳類対象は、治療用組成物の投与前の１週間以内に少なくとも２回用量のバンコマイシン、メトロニダゾールおよび／または類似の抗生物質化合物を投与されていない。他の実施形態では、哺乳類対象は、治療用組成物の投与前の１ヵ月以内に、抗生物質化合物を予め摂取していない。他の実施形態では、哺乳類対象は、一つまたは複数の異なる抗生物質化合物による一回または複数回の処置を受けたことがあり、係る処置は症状の改善も悪化ももたらさなかった。いくつかの実施形態では、芽胞組成物が抗生物質の過程が成功した後に投与されることで、腸内菌共生バランス失調が防止され、多様で健常な微生物叢の回復が強化される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、胃腸の疾患、障害または状態は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）によって引き起こされる下痢、例えば、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病、または過敏性腸疾患である。前記治療用組成物は、前記疾患、障害または状態の改善に先立って１回のみ投与されるのが有利である。いくつかの実施形態では、前記治療用組成物は、２日間より長い間隔を置いて、例えば、３、４、５もしくは６日間に１回、または毎週もしくは毎週より低頻度に、投与される。あるいは、前記調製物は、組まれたスケジュールに従って断続的に、例えば、１日１回、週１回、月１回、または対象が基礎疾患から再発した際に、投与され得る。別の実施形態では、前記調製物は、これらの病原体による感染のリスクを有する、もしくはこれらの病原体の保菌者であり得る個人、例えば、侵襲的医療処置（外科手術等）を受けることになる個人、入院することになる個人、長期間介護施設もしくはリハビリテーション施設で生活している個人、自身の専門職（家畜および動物の加工従事者）が原因で病原体に曝される個人、または病原体の保菌者である可能性がある個人（例えば、医師、看護師、および他の医療専門家等の病院従事者）に、長期的に投与され得る。
【０１７０】
また、本明細書において提供される治療用組成物を用いて、糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満症、心疾患、自己免疫疾患、肝疾患、および自閉症からなる群から選択される代謝性の疾患、および障害または状態を患っている、またはそれをを発症する危険性がある哺乳類対象を、治療または予防する方法も提供される。
【０１７１】
実施形態では、細菌芽胞組成物は経腸投与される。これには、優先的に、経口投与、すなわち経口管または経鼻管（例えば、経鼻胃管、経鼻空腸管、経口胃管、または経口空腸管）による投与が含まれる。他の実施形態では、投与には、直腸内投与（例えば、浣腸、坐剤、または大腸内視鏡検査）が含まれる。細菌組成物は、胃腸管の少なくとも１つの領域、例えば、口、食道、胃、小腸、大腸、および直腸に投与され得る。いくつかの実施形態では、細菌組成物は胃腸管の全領域に投与される。細菌組成物は、散剤、カプセル剤、錠剤、ゲル剤または液剤等の薬剤形態で経口投与され得る。また細菌組成物は、経口経路によって、もしくは経鼻胃管を通じて、ゲル状もしくは液状で投与されてもよく、または大腸内視鏡を通じたまたは坐剤による浣腸もしくは点滴注入によって、ゲル状もしくは液状で経直腸経路によって投与されてもよい。
【０１７２】
前記組成物が大腸鏡検査によって投与される場合、および、所望により、細菌組成物が他の経直腸経路（例えば、浣腸または坐剤）によって投与される場合、さらには対象が経口投与される場合でさえ、対象は結腸洗浄処置を受ける場合がある。結腸洗浄処置は、大腸内視鏡または他の投与装置の適切な使用を促すことができるが、結腸洗浄処置は、それが機械の目的に適わない場合であっても、対象の胃腸管に以前から生息している他の生物に対する、細菌組成物の比率を最大化することもできる。対象が大腸内視鏡検査を受ける際に典型的に提供されるもの等の、通常許容できるいかなる結腸洗浄処置も、使用され得る。
【０１７３】
対象を評価するために、腸内菌共生バランス失調の症状が、精製された芽胞個体群の投与後の１日〜６ヵ月間の範囲の処置後に、評価される。この期間中に糞便物質が採取され、胃腸管内に存在する微生物が、１６Ｓ  ｒＤＮＡまたはメタゲノム配列決定解析または当業者によって一般的に用いられる他の解析によって評価され得る。芽胞個体群によってもたらされる種の再増殖、並びに芽胞個体群中に存在しない共生微生物の増大は、芽胞個体群が腸内生態環境の健常な生命形（biosis）への再形成を触媒したときに生じることになる。本明細書は、本明細書内で引用される参考文献の教示に照らし合わせることで、最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は実施形態の例示を提供するものであって、範囲を限定するものと解釈されるべきではない。他の多くの実施形態が包含されることは、当業者によって容易に理解される。本開示において引用される全ての刊行物および特許は、それらの全体が参照によって組み込まれる。参照によって組み込まれる資料が本明細書と矛盾する、または本明細書と一致しない範囲内において、本明細書はあらゆるそのような資料に優先する。本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が先行技術であることを承認するものではない。
【０１７４】
対象を治療する方法
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される組成物は、患者または使用者（集合的に「対象」と称される場合がある）に投与される。本明細書で使用される場合、「投与する」および「投与」には、ある者が別の者に、ある特定の様式で、および／またはある特定の目的のために、細菌組成物を消費するように命令する実施形態が包含され、さらに、使用者が、第二者から受け取ったいかなる指示にも無関係にまたはそれと不一致に、ある特定の様式で、および／またはある特定の目的のために、細菌組成物を使用する状況も包含される。ある者が別の者に、ある特定の様式で、および／またはある特定の目的のために、細菌組成物を消費するように命令する実施形態の非限定例には、医師が一連の行為および／または処置を患者に処方する場合、親が未成年使用者（例えば小児）に細菌組成物を消費するよう命令する場合、トレーナーが使用者（例えば運動選手）に特定の一連の行為および／または処置に従うように助言する場合、並びに製造業者、配給業者、またはマーケッターが、例えば、広告または包装上もしくは製品の販売もしくはマーケティングに関連して与えられた他の材料上の標識を介して、エンドユーザーに使用の状態を推奨する場合が含まれる。
【０１７５】
細菌組成物は、一つまたは複数の目的のＧＩ病原体による感染に対する予防効果および／または治療効果を提供し、細菌組成物が前記抗生物質に対してＧＩ病原体ほど感受性が高くない場合の抗生物質療法の補完物として、急性感染症例中の再発を防止するために、または感染を防止するためもしくは保菌者からの伝染を減少するために、急性感染症例が解消された後に投与され得る。
【０１７６】
本発明の細菌組成物は種々の臨床的症状において有用であり得る。例えば、細菌組成物は、患者が急性感染症を患っている場合に急性感染症が沈静した後の再発の危険性を減少させるために、または患者が重篤な胃腸感染症を有するもしくはその危険性がある他者（医師、看護師、病院従事者、罹患しているまたは入院している者の家族）のすぐそばにいる場合に、抗生物質の補完的処置として投与され得る。
【０１７７】
本発明の細菌組成物は、動物、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス）、家畜（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ、ニワトリ）、およびペット（例えば、イヌ、ネコ、げっ歯類）に投与され得る。
【０１７８】
本発明の方法では、細菌組成物は、腸内に、言い換えれば、胃腸管へのアクセス経路によって、投与され得る。これには、本明細書により完全に記述されるような、経口管または経鼻管（例えば、経鼻胃管、経鼻空腸管、経口胃管、または経口空腸管）による、経口投与、直腸内投与（例えば、浣腸、坐剤、または大腸内視鏡検査）が含まれる。
【０１７９】
前処置プロトコル
細菌組成物の投与に先立ち、患者は所望により、胃腸管に細菌組成物を受け入れる準備をさせるための処置前プロトコルを受け得る。患者が高度に順応性のある（resilient）病原体による急性感染症を有する場合等、ある特定の実施形態では、処置前プロトコルは望ましいものである。感染症を引き起こしている病原体に順応性が無い場合、または患者が治療が成功済みである急性感染症を有していたことがあるが、前記感染が再発し得ると医師が懸念している場合等、他の実施形態では、処置前プロトコルは完全に任意である。これらの場合では、処置前プロトコルは、細菌組成物が患者のマイクロバイオームに影響を与える能力を増強し得る。
【０１８０】
患者に微生物生態系の投与の準備をさせる１つの方法として、患者内の細菌を変化させるための、少なくとも１つの抗生物質が投与され得る。患者に微生物生態系の投与の準備をさせる別の方法として、患者に大腸内視鏡検査（colonscopy）の準備をさせる等のために用いられる、結腸の内容物を実質的に空にするための、標準的な結腸洗浄処置が患者に施行され得る。「結腸の内容物を実質的に空にする」とは、本願では、通常体積の結腸内容物から、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％の内容物を除去することを意味する。抗生物質処置は結腸洗浄プロトコルの前に行われることがある。
【０１８１】
患者が感染症の治療のための抗生物質を摂取している場合、または患者が特定の処置前プロトコルの一部として抗生物質を摂取している場合、一実施形態では、細菌組成物が投与される前に、前記抗生物質が腸内濃度において実質的に減少されるのに十分な時間、抗生物質は中断され得る。一実施形態では、抗生物質は、細菌組成物の投与前に１、２、または３日間中断され得る。別の実施形態では、抗生物質は、細菌組成物の投与前に３、４、５、６、または７回分の抗生物質半減期の間、中断され得る。別の実施形態では、細菌組成物中の構成物が腸内の抗生物質の濃度よりも高いＭＩＣ５０を有するように、抗生物質が選択され得る。
【０１８２】
細菌組成物または前記組成物中の成分のＭＩＣ５０は、当該技術分野において周知の方法によって決定され得る（Reller et al., Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of GeneralPrinciples and Contemporary Practices, Clinical Infectious Diseases 49(11):1749-1755(2009)）。そのような実施形態では、抗生物質の投与と細菌組成物の投与との間に、追加の時間は必要とされない。処置前プロトコル急性感染症の治療の一部である場合、感染症が抗生物質に対して感受性があるが、細菌組成物中の構成物が前記抗生物質に対して感受性がないように、抗生物質が選択され得る。
【０１８３】
投与経路
本発明の細菌組成物は、それを必要とする哺乳動物および非哺乳動物への投与に適している。ある実施形態では、哺乳類対象は、一つまたは複数の腸内菌共生バランス失調症状を有するヒト対象である。
【０１８４】
哺乳類対象が疾患、異常な微生物叢によって特徴付けられる障害または状態を患っている場合、本明細書に記載の細菌組成物がその治療に適している。いくつかの実施形態では、哺乳類対象は細菌組成物による処置以前に抗生物質を摂取していない。例えば、哺乳類対象は、治療用組成物の投与前の１週間以内に少なくとも２回用量のバンコマイシン、メトロニダゾールおよび／または類似の抗生物質化合物を投与されていない。他の実施形態では、哺乳類対象は、治療用組成物の投与前の１ヵ月以内に、抗生物質化合物を予め摂取していない。他の実施形態では、哺乳類対象は、一つまたは複数の異なる抗生物質化合物による一回または複数回の処置を受けたことがあり、係る処置は症状の改善も悪化ももたらさなかった。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、胃腸の疾患、障害または状態は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）によって引き起こされる下痢、例えば、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病、または過敏性腸疾患である。前記治療用組成物は、前記疾患、障害または状態の改善に先立って１回のみ投与されるのが有利である。いくつかの実施形態では、前記治療用組成物は、２日間より長い間隔を置いて、例えば、３、４、５もしくは６日間に１回、または毎週もしくは毎週より低頻度に、投与される。他の実施形態では、前記調製物は、組まれたスケジュールに従って断続的に、例えば、１日１回、週１回、月１回、または対象が基礎疾患から再発した際に、投与され得る。別の実施形態では、前記調製物は、これらの病原体による感染のリスクを有する、もしくはこれらの病原体の保菌者であり得る対象、例えば、侵襲的医療処置（外科手術等）を受けることになる対象、入院することになる対象、長期間介護施設もしくはリハビリテーション施設で生活している対象、自身の専門職（家畜および動物の加工従事者）が原因で病原体に曝される対象、または病原体の保菌者である可能性がある対象（例えば、医師、看護師、および他の医療専門家等の病院従事者）に、長期的に投与され得る。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、細菌組成物は経腸投与される。これには、優先的に、経口投与、すなわち経口管または経鼻管（例えば、経鼻胃管、経鼻空腸管、経口胃管、または経口空腸管）による投与が含まれる。他の実施形態では、投与には、直腸内投与（例えば、浣腸、坐剤、または大腸内視鏡検査）が含まれる。細菌組成物は、胃腸管の少なくとも１つの領域、例えば、口、食道、胃、小腸、大腸、および直腸に投与され得る。いくつかの実施形態では、細菌組成物は胃腸管の全領域に投与される。細菌組成物は、散剤、カプセル剤、錠剤、ゲル剤または液剤等の薬剤形態で経口投与され得る。また細菌組成物は、経口経路によって、もしくは経鼻胃管を通じて、ゲル状もしくは液状で投与されてもよく、または大腸内視鏡を通じたまたは坐剤による浣腸もしくは点滴注入によって、ゲル状もしくは液状で経直腸経路によって投与されてもよい。
【０１８７】
前記組成物が大腸鏡検査によって投与される場合、および、所望により、細菌組成物が他の経直腸経路（例えば、浣腸または坐剤）によって投与される場合、さらには対象が経口投与される場合でさえ、対象は結腸洗浄処置を受ける場合がある。結腸洗浄処置は、大腸内視鏡または他の投与装置の適切な使用を促すことができるが、結腸洗浄処置は、それが機械の目的に適わない場合であっても、対象の胃腸管に以前から生息している他の生物に対する、細菌組成物の比率を最大化することもできる。対象が大腸内視鏡検査を受ける際に典型的に提供されるもの等の、通常許容できるいかなる結腸洗浄処置も、使用され得る。
【０１８８】
投与量および投与スケジュール
いくつかの実施形態では、細菌および細菌組成物は投与形態で提供される。ある実施形態では、投与形態は、本明細書で開示される少なくとも１つのＯＴＵまたはそれらの組み合わせの投与用に設計され、投与される細菌組成物の総量は、０．１ｎｇ〜１０ｇ、１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜０．１ｇ、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、または１０〜１５ｍｇから選択される。他の実施形態では、細菌組成物は、０．１ｎｇ〜１０ｇ／日、１０ｎｇ〜１ｇ／日、１００ｎｇ〜０．１ｇ／日、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ／日、１ｍｇ〜１００ｍｇ／日、または１０〜１５ｍｇ／日、またはそれより多い速度で消費される。
【０１８９】
ある実施形態では、治療期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年間である。いくつかの実施形態では、治療期間は、１日〜１週間、１週間〜４週間、１ヵ月〜、〜３ヵ月、３ヵ月〜６ヵ月、６ヵ月〜１年間、または１年間より長い。
【０１９０】
一実施形態では、合計で１０５個および１０１２個の微生物が所与の剤形で患者に投与され得る。別の実施形態では、有効量は、１ｍｌ当たりもしくは１グラム当たり１０７〜１０１１個の細菌を有する１〜５００ｍｌもしくは１〜５００グラムの細菌組成物、または１０７〜１０１１個の細菌を含有する１ｍｇ〜１０００ｍｇの凍結乾燥粉末を含有するカプセル剤、錠剤もしくは坐剤の形態で与えられ得る。急性処置を受けている者は、慢性投与を受けている者（例えば、病院従事者または長期介護施設へ入ることが許された者）よりも、高い投与量を与えられ得る。
【０１９１】
本明細書に記載される調製物のいずれも、一度の機会に１回または複数の機会に１回、例えば、数日間の間１日１回または投与日に１日１回より多く（例えば、１日２回、１日３回、または１日最大５回）、投与され得る。別の実施形態では、前記調製物は、組まれたスケジュールに従って断続的に、例えば、週１回、月１回、または患者が基礎疾患から再発した際に、投与され得る。一実施形態では、前記調製物は、これらの病原体による感染のリスクを有する、もしくはこれらの病原体の保菌者であり得る個人、例えば、侵襲的医療処置（外科手術等）を受けることになる個人、入院することになる個人、長期間介護施設もしくはリハビリテーション施設で生活している個人、自身の専門職（家畜および動物の加工従事者）が原因で病原体に曝される個人、または病原体の保菌者である可能性がある個人（例えば、医師、看護師、および他の医療専門家等の病院従事者）に、長期的に投与され得る。
【０１９２】
患者の選択
個々の患者に対して、または特定のプロファイルを有する患者に対して、特定の細菌組成物が選択され得る。例えば、１６Ｓ配列決定が所与の患者に対して行われることにより、前記患者の微生物叢内に存在する細菌が同定され得る。配列決定は、１６Ｓ配列決定を用いることにより患者のマイクロバイオーム全体の（科、属、または種レベルまで）、１６Ｓ配列決定を用いることで患者のマイクロバイオームの一部の、概要を掴むことができ、または配列決定を用いることで、多剤耐性生物、もしくは大腸菌類等の懸念となる特定の属のマーカー等の、健康もしくは特定の病状の生物マーカーである特定の候補細菌の有無を検出することができる。健康を回復するために、または疾患を治療もしくは予防するために、生物マーカーデータに基づき、特定の組成物が患者への投与のために選択されて、患者の微生物叢が補充または補完され得る。別の実施形態では、患者をスクリーニングすることで、患者の微生物叢の組成が決定され、治療が成功する可能性が決定され得る。
【０１９３】
併用療法
細菌組成物は、併用療法の様式で他の作用剤（例えば、抗微生物剤およびプレバイオティクス）と一緒に投与され得る。投与は、数時間もしくは数日の期間にわたる連続投与であってもよいし、同時投与であってもよい。
【０１９４】
一実施形態では、細菌組成物は、一つまたは複数の抗微生物剤と共に併用療法に含まれ、前記抗微生物剤には、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤および抗寄生虫剤が含まれる。
【０１９５】
抗細菌剤には、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、およびセフトビプロール）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ（cipro）、レバクイン（Levaquin）、フロキシン、テクイン、アベロックス、およびノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、およびメチシリン）；およびカルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネム）が含まれ得る。
【０１９６】
抗ウイルス剤には、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドホビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、ホスカルネット、ホミビルセン、ガンシクロビル、インジナビル、イドクスウリジン、ラミブジン、ロピナビル  マラビロック、ＭＫ−２０４８、ネルフィナビル、ネビラピン、ペンシクロビル、ラルテグラビル、リルピビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノホビル  トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、イバシタビン、アマンタジン、オセルタミビル、リマンタジン（Rimantidine）、チプラナビル、ザルシタビン、ザナミビルおよびジドブジンが含まれ得る。
【０１９７】
抗真菌化合物の例としては、限定はされないが、ナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシン、およびハマイシン等のポリエン系抗真菌剤；ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、およびチオコナゾール等のイミダゾール系抗真菌剤；フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール、およびアルバコナゾール等のトリアゾール系抗真菌剤；アバファンジン（abafungin）等のチアゾール系抗真菌剤；テルビナフィン、ナフチフィン、およびブテナフィン等のアリルアミン系抗真菌剤；並びにアニデュラファンギン、カスポファンギン、およびミカファンギン等のエキノキャンディン抗真菌剤が挙げられる。抗真菌特性を有する他の化合物としては、限定はされないが、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロクス、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、およびハロプロジンが挙げられる。
【０１９８】
一実施形態では、細菌組成物は、以下の一つまたは複数と共に併用療法に含まれる：副腎皮質ステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン剤、糖質コルチコイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン薬、鼻炎用抗コリン薬、抗コリン鬱血除去薬、肥満細胞安定化薬、抗ＩｇＥモノクローナル抗体、ワクチン、およびこれらの組み合わせ。
【０１９９】
プレバイオティクスは、宿主の幸福および健康に恩恵を与える、胃腸管微生物叢の組成および／または活性の両方における特異的な変化を可能にする、選択的に発酵させた成分である。プレバイオティクスには、複合糖質、アミノ酸、ペプチド、または細菌組成物の生存のための他の必須栄養成分が含まれ得る。プレバイオティクスとしては、限定はされないが、アミノ酸、ビオチン、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、ラクツロース、マンナンオリゴ糖、オリゴフルクトース強化イヌリン、オリゴフルクトース、オリゴデキストロース、タガトース、トランス−ガラクトオリゴ糖、およびキシロオリゴ糖が挙げられる。
【０２００】
個体群形成効果について細菌組成物を試験するための方法細菌組成物が対象の胃腸管内で個体群を形成するかどうかを決定するためのインビボアッセイ  細菌組成物が対象の胃腸管内で個体群を形成することを決定するために、マウスモデル等の動物モデルが用いられ得る。前記モデルは、マウスの微生物叢を評価することから開始され得る。定性的評価は、正常マウスの糞便中の微生物群集の１６Ｓプロファイリングを用いて達成され得る。定性的評価はまた、完全ゲノム配列決定、全ゲノムショットガン配列決定（ＷＧＳ）、または伝統的な微生物学的手法によって達成され得る。定量的評価は、下記の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて、または伝統的な微生物学的手法を用いコロニー形成を計数することによって、実行され得る。
【０２０１】
所望により、前記マウスは腸内菌共生バランス失調の状態を模倣するために抗生物質処置を受け得る。抗生物質処置は、前記群集の分類学的な豊かさ、多様性、および均一性を減少させ得る（例えば、有意な数の細菌分類群の存在量の減少）(Dethlefsen et al., The pervasive effects of an antibiotic on the humangut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing, PLoS Biology 6(11):3280(2008))。少なくとも１つの抗生物質が使用され得、抗生物質は周知のものである。抗生物質には、アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン、アルベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、およびアプラマイシン）、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン（アモキシシリン／クラブラン酸カリウム配合物）、セファロスポリン（セファクロル、セファドロキシル（defadroxil）、セファゾリン、セフィキシム、セフォキシチン（fefoxitin）、セフプロジル、セフタジジム（ceftazimdime）、セフロキシム、セファレキシン）、クラブラン酸カリウム、クリンダマイシン、コリスチン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メトロニダゾール、またはバンコマイシンが含まれ得る。個々の非限定的な具体例として、マウスは、それぞれ４０ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、２１．５ｍｇ／ｋｇ、および４．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｇ／平均マウス体重）のカナマイシン、コリスチン、ゲンタマイシン、メトロニダゾールおよびバンコマイシン抗生物質の混合物を含有する飲料水を、７日間与えられ得る。あるいは、マウスはシプロフロキサシンを１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（ｍｇ／平均マウス体重）の用量で７日日間投与され得る。マウスが抗生物質を与えられた場合、抗生物質処置も細菌組成物処置も無い１日〜３日間の休薬期間が与えられる。
【０２０２】
その後、試験細菌組成物が強制経口投与によってマウスに投与される。試験細菌組成物は、細菌組成物中の細菌の各種類を１０４ＣＦＵ含有する０．２ｍｌの体積で投与され得る。用量反応は、ある範囲の用量、例えば、限定はされないが、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、および／または１０１０を用いることにより評価され得る。
【０２０３】
マウスを、１６Ｓ配列決定、完全ゲノム配列決定、全ゲノムショットガン配列決定（ＷＧＳ）、または伝統的な微生物学的手法を用いて評価することで、試験細菌組成物がマウスの胃腸管内で個体群を形成したかどうかが評価され得る。単なる例としてであるが、マウスへの細菌組成物の投与の１日後、３日後、１週間後、２週間後、および１ヶ月後に、１６Ｓプロファイリングが行われて、試験細菌組成物がマウスの胃腸管内で個体群を形成したかどうかが決定される。ｑＰＣＲおよびコロニー計数法等の伝統的な微生物学的手法を含む定量的評価が、追加でまたは代替として、同じ時間間隔で行われ得る。
【０２０４】
さらに、長期にわたって細菌組成物中に存在するものと正確に一致する配列計数の数が評価されることで、細菌組成物のどの成分が特定の期間にわたって胃腸管内に生息するかを具体的に決定することができる。一実施形態では、細菌組成物の系統は、所望の期間生存する。別の実施形態では、細菌組成物の成分は、所望の期間生存し、同時に、他の微生物（環境、食物等の中に存在するもの等）が胃腸管内で個体群を形成する能力も増加させ、さらに、以下で考察されるように、全体的な多様性を増加させる。
【０２０５】
胃腸管の様々な領域内で個体群形成する細菌組成物の能力  本発明の細菌組成物は、胃腸管上の様々な領域内で個体群を形成するそれらの能力についても評価され得る。一実施形態では、細菌組成物は、胃、小腸（十二指腸、空腸、および回腸）、大腸（盲腸、結腸（上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸）、および直腸）を含むがこれらに限定はされない、胃腸管の１つまたは２つ以上の領域内で個体群を形成するその能力で選択され得る。
【０２０６】
インビボ試験を行うことで、胃腸管のどの領域内で所与の細菌組成物が個体群を形成するかを決定することができる。マウスによって生産された糞便を評価する代わりに、胃腸管の特定の領域が取り出されて個々に研究され得ることを除いて、上記マウスモデルに類似したマウスモデルが実行され得る例えば、胃腸管の少なくとも１つの特定の領域が取り出され得、胃腸管のその領域の内容物に対して定性または定量が行われ得る。別の実施形態では、前記内容物が所望により除去され得、マウスから取り出された組織に対して定性または定量が行われ得る。
【０２０７】
ｑＰＣＲ
細菌組成物が胃腸管内で個体群を形成するかどうかを決定するための１つの定量法として、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が行われ得る。細菌組成物の成分の全てについて、まとめて、個々に、または一部として（妥当な場合）、目的の細菌組成物の検量線を作成するための、標準的な手法が続いて行われ得る。ゲノムＤＮＡが、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）−ｈｔｐ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社（Mo Bio Laboratories）、カリフォルニア州カールズバッド）、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）、またはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）等の市販のキットを製造業者の取扱説明書に従って用いて、試料から抽出され得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲが、ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）および目的の細菌組成物に特異的なプライマーを用いて実行され得、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｂａｒｃｏｄｅ（０．１ｍＬ）（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）上で実行され得、ＦＡＭチャネルおよびＲＯＸチャネルの蛍光読み取りと共に、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を備えたＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００（商標）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ上で実行され得る。ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア（バージョン２．１）によって、ＦＡＭチャネル上の各ウェルのＣｑ値が決定される。検量線ウェルのＣｑ値をそれらの試料の既知のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）と比較している検量線から作成された線形回帰モデルに所与の試料のＣｑ値を入力することによって、各実験試料のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）が算出される。当業者によって別のｑＰＣＲ様式が採用され得る。
【０２０９】
細菌組成物の特徴付けのための方法
ある実施形態では、細菌組成物のある特定の特徴を試験するための方法が提供される。例えば、例えば、所与の組成物、製剤および／または用途において特定の望ましい特徴について選別するために、細菌組成物のある特定の環境変数に対する感受性が決定される。例えば、細菌組成物中の構成物は、構成物毎に個々に、または複数の細菌性構成物から構成される細菌組成物（本節では集合的に細菌組成物と称される）として集合的に、ｐＨ耐性、胆汁酸耐性、および／または抗生物質感受性について、試験され得る。
【０２１０】
ｐＨ感受性試験
細菌組成物が結腸または直腸以外に投与される場合（すなわち、例えば、経口経路）、所望によりｐＨ耐性について試験することで、胃腸管の異なる領域の種々のｐＨ環境を通じて可能である最も高い収率で生存する細菌組成物の選択が強化される。細菌組成物が胃腸管のｐＨにどのように反応するかの理解は、製剤においても助けとなり、その結果、投与形態における細菌の数は有益であれば増加され得、および／または、前記組成物は、腸溶カプセルまたは腸溶錠中で、もしくは緩衝組成物もしくは保護組成物と共に、投与され得る。胃のｐＨが、短い時間での高タンパク質の食事の後にｐＨ１〜２まで下がり、その後生理機構によってｐＨ３〜４に調整され、多くの場合ｐＨ４〜５に維持され得ることから、および小腸のｐＨがｐＨ６〜７．４の範囲であり得ることから、これらの種々のｐＨ範囲を生存する（具体的には、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはほぼ１００％の細菌が、種々のｐＨ範囲を通じた腸通過時間を生存できる）細菌組成物が調製され得る。これは、細菌組成物を種々のｐＨ範囲に、それらのｐＨ範囲を通じた予想腸通過時間の間暴露することによって試験され得る。従って、単なる非限定的な例として、細菌組成物の１８時間培養物は、腸微生物叢培地（gut microbiota medium)(「GMM」、Goodman et al., Extensive personal human gut microbiota culture collectionscharacterized and manipulated in gnotobiotic mice, PNAS 108(15):6252-6257 (2011)）を参照）、または別の動物性産物非含有培地等の標準的な培地中で、ｐＨ１〜２については３０分間、ｐＨ３〜４については１時間、ｐＨ４〜５については１〜２時間、およびｐＨ６〜７．４については２．５〜３時間、ｐＨ調整剤を添加することによって、増殖し得る。酸に対する安定性を試験するための別の方法が、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。細菌の生存は、細菌を適切な選択的培地または非選択培地上で培養しコロニーを計数することによって決定され得る。
【０２１１】
胆汁酸感受性試験
さらに、いくつかの実施形態では、胆汁酸耐性についての試験によって、胃腸管を通過する間の胆汁酸への暴露を生存する細菌組成物の選択が強化される。胆汁酸は小腸に分泌され、ｐＨと同様、細菌組成物の生存に影響を与え得る。これは、細菌組成物を胆汁酸に、予想される胆汁酸への腸内暴露時間、暴露することによって試験され得る。例えば、胆汁酸溶液は、ｐＨ９の０．０５ｍＭ  Ｔｒｉｓを溶媒として用いて所望の濃度に調製され得る。胆汁酸が溶解した後、溶液のｐＨは、１０％ＨＣｌを用いて７．２に調整され得る。細菌組成物は、患者における胆汁酸の濃度および種類を模倣する２．２ｍｌの胆汁酸組成物、１．０ｍｌの１０％無菌フィルター処理糞便培地、並びに０．１ｍｌの所与の細菌系統の１８時間培養物の中で培養され得る。インキュベーションは２．５〜３時間またはそれよりも長く行われ得る。胆汁酸に対する安定性を試験するための別の方法が、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。細菌の生存は、細菌を適切な選択的培地または非選択培地上で培養しコロニーを計数することによって決定され得る。
【０２１２】
抗生物質感受性試験
さらなる任意の感受性試験として、細菌組成物は抗生物質に対する感受性について試験され得る。一実施形態では、細菌組成物は、必要であればそれらを、細菌組成物を標的とする少なくとも１つの抗生物質によって患者の胃腸管から排除する、または実質的に減少させることができるように、細菌性構成物が抗生物質に対して感受性であるように、選択され得る。
【０２１３】
胃腸細胞への付着
細菌組成物は所望により、胃腸細胞に付着する能力について試験され得る。胃腸細胞への付着を試験するための方法は、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。
【０２１４】
芽胞を精製するための方法
溶媒処理  細菌芽胞を精製するために、糞便物質は一つまたは複数の溶媒処理を受ける。溶媒処理は混和溶媒処理（部分的混和性または完全混和性）または非混和性溶媒処理である。混和性は、２つの液体が互いに混合して均一溶液を形成する能力である。例えば、水およびエタノールは完全混和性であるため、水およびエタノールをいかなる比率で含有する混合物も、ただ１つの相を示す。混和性は、ｗｔ／ｗｔ％、すなわち、１００ｇの最終溶液中の一方の溶媒の重量として与えられる。２つの溶媒が全ての比率において完全混和性である場合、それらの混和性は１００％である。水との完全混和性溶液として提供されるものは、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等である。水と既に混合されたこれらのアルコール、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８９％、８５％、９０％、９５％または９５％超を含有する溶液が提供され得る。他の溶媒は部分的にしか混和性でなく、これは、一部のみが水に溶解することを意味する。例えば、ジエチルエーテルは水と部分的混和性である。最大７グラムのジエチルエーテルが９３ｇの水に溶解して、７％（ｗｔ／ｗｔ％）溶液が得られる。より多くのジエチルエーテルが加えられた場合、水の上にジエチルエーテル相を別々に有する２相溶液が得られる。他の混和性物質としては、エーテル、ジメトキシエタン、またはテトラヒドロフランが挙げられる。対照的に、アルカン等の油および水は不混和性であり、２相を形成する。さらに、不混和性処理は所望により、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤のいずれかの界面活性剤と組み合わされる。例示的な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、プルロニック、またはポリオールが挙げられる。
【０２１５】
クロマトグラフィー処理
芽胞個体群を精製するため、糞便物質は一つまたは複数のクロマトグラフィー処理を順次または同時に受ける。クロマトグラフィー処理では、糞便物質を含有する溶液は、疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）媒体またはアフィニティークロマトグラフ媒体を含有する固形媒体と接触される。別の実施形態では、糞便物質中に存在する残存生息環境産物を吸収することが可能な固形媒体は、残存生息環境産物を吸着する固形媒体と接触している。ある実施形態では、ＨＩＣ媒体は、セファロースまたはブチルセファロース、オクチルセファロース、フェニルセファロース、もしくはブチル−ｓセファロース等の誘導体化セファロースを含有する。他の実施形態では、アフィニティークロマトグラフ媒体は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型ムチンにより誘導体化された物質、またはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、もしくはＶＩ型ムチンのそれらから派生した、もしくはそれらに類似したオリゴ糖を含有する。あるいは、アフィニティークロマトグラフ媒体は、芽胞形成性細菌を認識する抗体により誘導体化された物質を含有する。
【０２１６】
機械的処理
特に、混合（blending）、混合（mixing）、振盪、ボルテックス、衝撃粉砕、および超音波処理等の一つまたは複数の機械的処理による糞便物質の物理的破壊が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるように、機械的破壊処理によって、糞便物質中に存在する非芽胞性物質が実質的に破壊され、糞便物質中に存在する芽胞は実質的に破壊されない。機械的処理には、所望により濾過処理が含まれ、濾過処理では、所望の芽胞個体群がフィルター上に保持され、一方、望ましくない（非芽胞）糞便成分は通過し、その後、芽胞画分が濾過材から回収される。あるいは、望ましくない微粒子物および真核細胞がフィルター上に保持され、一方、芽胞を含む細菌細胞が通過する場合もある。いくつかの実施形態では、濾過材上に保持された芽胞画分はダイアフィルトレーションステップにかけられ、そこで、保持された芽胞は、望ましくない糞便成分をさらに減少または除去するために、洗液、典型的には無菌の食塩水含有溶液または他の希釈剤と接触される。
【０２１７】
熱処理
糞便物質の熱破壊が本明細書で提供される。一般的には、糞便物質は、効率的な熱伝達が加熱された環境と糞便物質との間で起こるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の食塩水含有溶液中に混合され、温室（warm room）、恒温器または水浴等の加熱された環境に曝される。糞便物質溶液は、熱伝導度を増強し特定の凝集物を破壊するために、インキュベーション中は混合されることが好ましい。熱処理は、環境の温度および／または熱処理の時間によって調節することができる。例えば、糞便物質または糞便物質を含む液体は、加熱された環境、例えば、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００℃または１００℃超の熱水浴に、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、４５秒間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０分間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０時間もしくは１０時間超、暴露される。ある実施形態では、熱処理は、１００℃環境で３０秒間、続いて５０℃環境で１０分間等、２つの異なる温度で起こる。好ましい実施形態では、熱処理の温度および期間は、病原性物質は殺傷または排除するが、芽胞の発芽能は実質的に損なわないまたは減少させないのに十分なものである。
【０２１８】
照射処理
病原性物質は殺傷するが所望の芽胞個体群を実質的に傷害しないのに十分なエネルギー準位で与えられる、電離放射線、典型的にはγ線照射、紫外線照射または電子ビーム照射で、糞便物質または分離された糞便物質内容物を処理する方法が提供される。例えば、約２２，０００μＷ・ｓ／ｃｍ２未満のエネルギー準位で与えられる２５４ｎｍの紫外線照射は、通常、芽胞を破壊しない。
【０２１９】
遠心分離処理および密度分離処理
遠心分離によって所望の芽胞個体群を糞便物質の他の成分から分離する方法が提供される。糞便物質を含有する溶液が、例えば、約１０００×ｇ、２０００×ｇ、３０００×ｇ、４０００×ｇ、５０００×ｇ、６０００×ｇ、７０００×ｇ、８０００×ｇまたは８０００×ｇ超での一つまたは複数の遠心分離処理にかけられる。分画遠心法によって所望の芽胞が望まれない非芽胞性物質から分離され；低い力では芽胞が溶液中に保持され、一方、より高い力では、芽胞がペレット化されるが、より小さな不純物（例えば、ウイルス粒子、ファージ）は溶液中に保持される。例えば、第一の低力遠心分離によって繊維状物質がペレット化され；第二の、より高い力の遠心分離によって望まれない真核細胞がペレット化され、第三の、さらにより高い力の遠心分離によって、所望の芽胞がペレット化され、一方小さな混入物は懸濁液中に保持される。いくつかの実施形態では、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ勾配、Ｈｉｓｔｏｄｅｎｚ勾配またはスクロース勾配等の、密度勾配もしくは移動度勾配またはクッション（例えば、段階クッション）が、所望の芽胞個体群を糞便物質中の他の物質から分離するために用いられる。
【０２２０】
所望の芽胞を相乗的に精製するが、芽胞個体群から望まれない物質および／または活性を殺傷または排除するために、本明細書に記載される処理のうちの２つ以上を組み合わせた、芽胞個体群を生産する方法もまた本明細書で提供される。芽胞個体群中に存在する病原菌の成長を最小限にし、芽胞の栄養細菌細胞への発芽を最小限にするためのに、非発芽性且つ非成長促進性の条件および培地下に芽胞個体群を保持することが通常望ましい。
【０２２１】
本発明の医薬組成物および製剤
製剤
必要とするヒトおよび他の対象への投与のための製剤が提供される。概して、細菌組成物は、最終産物を作製するために、追加の活性物質および／または不活性物質と組み合わされ、最終産物は、１回投与単位であっても複数回投与形式であってもよい。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１つ炭水化物を含む。「炭水化物」は糖または糖類の重合体を指す。用語「糖類」、「多糖類」、「炭水化物」、および「オリゴ糖」は、同義的に使用される場合がある。大部分の炭水化物は、多くのヒドロキシル基（分子の各炭素原子上に通常１つ）を有するアルデヒドまたはケトンである。炭水化物は一般的には分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、または多糖類であり得る。大部分の基本炭水化物は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、およびフルクトース等の単糖である。二糖類は２つの連結した単糖類である。例示的な二糖類としては、スクロース、マルトース、セロビオース、およびラクトースが挙げられる。典型的には、オリゴ糖は３〜６個の単糖ユニット（例えば、ラフィノース、スタキオース）を含み、多糖類は６個以上の単糖ユニットを含む。例示的な多糖類としては、デンプン、グリコーゲン、およびセルロースが挙げられる。炭水化物は、修飾糖類ユニット、例えば、ヒドロキシル基が除去された２’−デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素と置換された２’−フルオロリボース、またはＮ−アセチルグルコサミン、グルコースの窒素含有形態（例えば、２’−フルオロリボース、デオキシリボース、およびヘキソース）を含有し得る。炭水化物は多くの異なる形態（例えば、配座異性体、環式形態、非環式形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、および異性体）で存在し得る。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１つの脂質を含む。本明細書で使用される場合、「脂質」には、脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸を含むあらゆる形態の脂肪酸が含まれる。脂質、油および脂肪酸は、飽和、不飽和（シスまたはトランス）または部分不飽和（シスまたはトランス）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、およびテトラコサン酸（２４：０）から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。他の実施形態では、前記組成物は、少なくとも１つの修飾脂質（例えば、調理によって変性された脂質）を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１つの追加のミネラルまたはミネラル源を含む。ミネラルの例としては、限定はされないが、塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、およびセレンが挙げられる。上記ミネラルのいずれかの適切な形態には、可溶性無機塩、難溶性無機塩、不溶性無機塩、キレートミネラル、無機複合体、非反応性ミネラル、例えば、カルボニルミネラル、および還元型ミネラル、並びにこれらの組み合わせが含まれる。
【０２２５】
ある実施形態では、前記組成物は少なくとも１つの追加のビタミンを含む。少なくとも１つのビタミンは脂溶性ビタミンまたは水溶性ビタミンであり得る。適切なビタミンとしては、限定はされないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、およびビオチンが挙げられる。上記のいずれかの適切な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンの同一または類似の活性を有する化合物、およびビタミンの代謝産物である。
【０２２６】
他の実施形態では、前記組成物は賦形剤を含む。適切な賦形剤の非限定例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧密剤（compaction agent）、滑沢剤、分散増強剤（dispersion enhancer）、崩壊剤、香味剤、甘味料、および着色料が挙げられる。
【０２２７】
別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、賦形剤は保存剤を含む。適切な保存剤の非限定例としては、αトコフェロールおよびアスコルビン酸塩等の抗酸化剤、並びにパラベン、クロロブタノール、およびフェノール等の抗菌剤が挙げられる。
【０２２９】
他の実施形態では、前記組成物は賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定例としては、デンプン、アルファ化でんぷん、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrolidone）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン（polyvinyloxoazolidone）、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２３０】
別の実施形態では、前記組成物は賦形剤として滑沢剤を含む。適切な滑沢剤の非限定例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス（sterotex）、ポリオキシエチレンモノステアレート、滑石、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、および軽油が挙げられる。
【０２３１】
他の実施形態では、前記組成物は賦形剤として分散増強剤を含む。適切な分散剤の非限定例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製された木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファス（isoamorphous）ケイ酸塩、および高ＨＬＢ乳化界面活性剤（emulsifier surfactant）としての微結晶性セルロースが挙げられる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、前記組成物は賦形剤として崩壊剤を含む。他の実施形態では、崩壊剤は非発泡性崩壊剤である。適切な非発泡性崩壊剤の非限定例としては、デンプン、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、そのアルファ化デンプンおよび加工デンプン、甘味料、粘土、例えば、ベントナイト、微結晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム質、例えば、寒天、ガウア、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン（pecitin）、およびトラガントが挙げられる。別の実施形態では、崩壊剤は発泡性崩壊剤である。適切な発泡性崩壊剤の非限定例としては、クエン酸と組み合わされた炭酸水素ナトリウム、および酒石酸と組み合わされた炭酸水素ナトリウムが挙げられる。
【０２３３】
別の実施形態では、賦形剤は香味剤を含む。香味剤は、合成香味油および香味芳香族化合物；天然油；植物、葉、花、および果実からの抽出物；並びにこれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、香味剤は、ケイヒ油；ウィンターグリーン油；ハッカ油；クローバ油；乾草油；アニス油；ユーカリ属；バニラ属；レモン油、オレンジ油、ブドウおよびグレープフルーツ油等の柑橘油；並びにリンゴ、モモ、セイヨウナシ、イチゴ、キイチゴ、サクランボ、セイヨウスモモ、パイナップル、およびアンズを含む果実エッセンスから選択される。
【０２３４】
他の実施形態では、賦形剤は甘味料を含む。適切な甘味料の非限定例としては、グルコース（コーンシロップ）、ブドウ糖、転化糖、フルクトース、およびこれらの混合物（担体として使用されない場合）；サッカリンおよびその種々の塩（例えば、ナトリウム塩）；アスパルテーム等のジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリジン；ステビア（Stevia Rebaudiana）（ステビオシド）；スクラロース等のスクロースのクロロ誘導体；並びにソルビトール、マンニトール、シリトール（sylitol）等の糖アルコール等が挙げられる。硬化デンプン加水分解物および合成甘味料３，６−ジヒドロ−６−メチル−１，２，３−オキサチアジン（oxathiazin）−４−オン−２，２−ジオキシド、特に、カリウム塩（アセスルファムＫ）、並びにそのナトリウム塩およびカルシウム塩も企図される。
【０２３５】
さらに他の実施形態では、前記組成物は着色料を含む。適切な着色料の非限定例としては、食品医薬品化粧品着色剤（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品化粧品着色剤（Ｄ＆Ｃ）、および外用医薬品化粧品着色剤（Ｅｘｔ．  Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色料は色素またはこれらの対応するレーキ顔料として使用され得る。
【０２３６】
製剤中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、通常、前記組成物の総重量の約９９％以下、例えば、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下である。
【０２３７】
本明細書で開示される細菌組成物は、種々の形態に製剤化され、いくつかの異なる手段で投与され得る。前記組成物は、経口的に、経直腸的に、または非経口的に、通常許容できる所望の担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する製剤の形態で、投与され得る。本明細書で使用される用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内の注射および点滴が含まれる例示的な実施形態では、細菌組成物は経口的に投与される。
【０２３８】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、トローチ、菓子錠剤、散剤、および粒剤が挙げられる。カプセルは典型的に、細菌組成物およびコア材料を内部に閉じ込めるシェル壁を含むコア材料を含む。いくつかの実施形態では、コア材料は固体、液体、およびエマルジョンのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、シェル壁材料は、軟質ゼラチン、硬質ゼラチン、およびポリマーのうちの少なくとも１つを含む。適切なポリマーとしては、限定はされないが：ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセテートトリメリテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシネートおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロースポリマー；アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アンモニオメチルアクリレート、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよび／またはメタクリル酸エチルから形成されるもの等のアクリル酸ポリマーおよびアクリル酸コポリマー（例えば、商品名「Ｅｕｄｒａｇｉｔ」で販売されいるこれらのコポリマー）；ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアセテートフタレート、酢酸ビニル‐クロトン酸コポリマー、およびエチレン−酢酸ビニルコポリマー等のビニルポリマーおよびビニルコポリマー；並びにシェラック（精製されたラック）が挙げられる。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのポリマーが矯味剤として機能する。
【０２３９】
錠剤、丸剤等は、圧縮型、多重圧縮型、多重積層型、および／または被覆型であり得る。コーティングは１回または複数回であり得る。一実施形態では、コーティング材料は、植物、真菌、および微生物のうちの少なくとも１つから抽出された糖類、多糖類、および糖タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。非限定例としては、コーンスターチ、コムギデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン、アラビアゴム、イナゴマメゴム、メスキートゴム、グアーガム、カラヤゴム、ガッチゴム、トラガカントゴム、フノリ、カラゲナン、寒天、アルギン酸、キトサン、またはゲランガムが挙げられる。いくつかの実施形態では、コーティング材料はタンパク質を含む。別の実施形態では、コーティング材料は脂肪および油のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは高温融解である。さらに別の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、水素化または部分的に水素化される。一実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは植物由来である。他の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、グリセリド、遊離脂肪酸、および脂肪酸エステルのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、コーティング材料は少なくとも１つの食用ロウを含む。食用ロウは動物、昆虫、または植物由来であり得る。非限定例としては、蜜蝋、ラノリン、シロヤマモモロウ、カルナウバロウ、および米糠ロウが挙げられる。錠剤および丸剤はさらに、腸溶コーティングと共に調製され得る。
【０２４０】
あるいは、本明細書で開示される細菌組成物を包含する散剤または粒剤は、食品中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、前記食品は経口投与用の飲料である。適切な飲料の非限定例としては、果汁、果実飲料、人工風味飲料、人工甘味飲料、炭酸飲料、スポーツドリンク、液体乳製品（liquid diary product）、シェーク（shake）、アルコール飲料、カフェイン含有飲料、調製粉乳等が挙げられる。他の適切な経口投与のための手段には、適切な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味料、着色料、および香味剤のうちの少なくとも１つを含有する、非発泡性粒剤から再構築された、水性および非水性の溶液、乳液、懸濁液並びに溶液および／または懸濁液が含まれる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、前記食品は固形食料品であり得る。固形食料品の適切な例には、限定はされないが、フードバー（food bar）、スナックバー（snack bar）、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッカー、アイスクリームバー、フローズンヨーグルトバー等が含まれる。
【０２４２】
他の実施形態では、本明細書で開示される組成物は、治療食に組み込まれる。いくつかの実施形態では、治療食は、所望により一部または全ての必須の多量養素および微量栄養素を含有する既製食品である。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物は、目下の食事に混合されるように設計されている補助食品に組み込まれる。一実施形態では、補助食品は一部または全ての必須の多量養素および微量栄養素を含有する。別の実施形態では、本明細書で開示される細菌組成物は、食品のタンパク栄養を強化するために、既存の食品と混合される、またはそれに添加される。例としては、主食（穀物、塩、糖、食用油、マーガリン）、飲料（コーヒー、茶、ソーダ、ビール、アルコール飲料、スポーツドリンク）、スナック、甘い物および他の食品が挙げられる。
【０２４３】
一実施形態では、前記製剤は経口投与のためのゼラチンカプセルに充填される。適切なカプセルの一例は、１０（〜最大１００ｍｇ）の凍結乾燥粉末（１０８〜１０１１個の細菌）、１６０ｍｇの微結晶性セルロース、７７．５ｍｇのゼラチン、および２．５ｍｇのステアリン酸マグネシウムを含有する２５０ｍｇのゼラチンカプセルである。別の実施形態では、１０５〜１０１２個の細菌（１０５〜１０７、１０６〜１０７、または１０８〜１０１０）が、必要であれば賦形剤による調節を伴って、使用され得る。別の実施形態では、腸溶性のカプセルまたは錠剤が、あるいは緩衝組成物または保護組成物を伴って、使用され得る。
【実施例】
【０２４４】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本発明の範囲を如何様にも限定することを意図していない。使用された数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを確実にするための努力は為されたが、いくらかの実験誤差および偏差は当然許容されるべきである。
【０２４５】
本発明の実施では、特に記載がない限り、当業者の技能の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の常法が使用される。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freemanand Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., currentaddition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition,1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack PublishingCompany, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rdEd.(Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。
【０２４６】
実施例１．
糞便物質の提供
新鮮な糞便試料を、全体的な良好な健康状態および感染症の非存在についてスクリーニングされた、選択規準および除外規準を満たす健常ヒトドナーから得た。選択規準には、良好な全体的健康であること、重大な病歴、理学的検査所見、または臨床検査異常を有していないこと、ブリストル排便スケール（Bristol Stool Scale）で典型的に２型、３型、４型、５型または６型の糞便形状での規則的な便通、並びに１８ｋｇ／ｍ２以上２５ｋｇ／ｍ２以下のＢＭＩを有することが含まれる。除外基準には、概して、腎臓、肝臓、肺、胃腸管、心血管、尿生殖器、内分泌、免疫、代謝、神経もしくは血液の疾患を含む重大な慢性または急性の医学的状態、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、過敏性腸症候、結腸、胃もしくは他の胃腸悪性腫瘍、もしくは胃腸管ポリポーシスの家族歴、または生物が主成分であるヨーグルトもしくは市販生菌材料の最近の使用が含まれた。試料は、便座に接して配置されたプラスチック支持体および前記支持体に接して存在する収集容器を有する室内用便器（commode）検体収集システムを用いて、直接収集された。糞便は容器内に堆積され、その後、蓋が容器上に設置され、密封された。その後試料を、１〜４時間以内に、処理のために氷上で搬送した。試料を無菌の使い捨てツールを用いて混合し、２〜４ｇの分割量を計り取り、管の中に入れ、ドライアイス／エタノール浴中で急速冷凍した。分割量は使用まで−８０℃で凍結される。
【０２４７】
所望により、糞便物質を溶液中に懸濁し、および／または、繊維状且つ／もしくは粒子状物質を除去した。既知の重量の糞便を含有する凍結された分割量を−８０℃の貯蔵庫から取り出し、室温で解凍した。無菌の１×ＰＢＳを加えて１０％ｗ／ｖ懸濁液を作製し、激しいボルテックスを行って、糞便物質が均一に見えるようになるまで糞便物質を懸濁させた。次に、前記物質を室温で１０分間放置し、繊維状および微粒子状物質を沈降させた。次に、沈降物上の懸濁液を新しい管の中に慎重に取り出した。懸濁液は精製された芽胞個体群を含有する。次に、所望により、懸濁液を低速（例えば、１０００×ｇ）で５分間遠心して、繊維を含む微粒子状物質をペレット化した。ペレットを廃棄し、栄養生物および芽胞を含有する上清を新しい管に取り出した。次に、上清を６０００×ｇで１０分間遠心して、栄養生物および芽胞をペレット化した。次に、ペレットを、前記物質が均一に見えるようになるまで、激しいボルテックスによって１×ＰＢＳ中に懸濁した。
【０２４８】
実施例２．
糞便物質のアルコール処理による芽胞精製
ＰＢＳ中のヒト糞便物質の１０％ｗ／ｖ懸濁液を、無水エタノールと１：１比で混合し、ボルテックスして、１分間混合した。懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して、芽胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを等量のＰＢＳ中に再懸濁した。グリセロールを１５％の最終濃度となるように添加し、その後、精製された芽胞画分は−８０℃で貯蔵される。
【０２４９】
実施例２Ａ．
糞便物質のアルコール処理による芽胞調製物の作製
ＰＢＳ中のヒト糞便物質の１０％ｗ／ｖ懸濁液を、無水エタノールと１：１比で混合し、ボルテックスして、１分間混合した。懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して、芽胞を、精製された芽胞含有調製物を含有するペレットに濃縮する。上清を廃棄し、ペレットを等量のＰＢＳ中に再懸濁した。グリセロールを１５％の最終濃度となるように添加し、その後、精製された芽胞調製物を−８０℃で貯蔵した。
【０２５０】
実施例３．
糞便物質の熱処理による芽胞精製
ＰＢＳ中のヒト糞便物質の１０％ｗ／ｖ懸濁液を水浴中、８０℃で３０分間インキュベートした。グリセロールを１５％の最終濃度となるように添加し、その後、濃縮された芽胞含有物質を−８０℃で貯蔵した。
【０２５１】
実施例４．
糞便物質のアルコール処理および熱処理による芽胞精製
ＰＢＳ中のヒト糞便の１０％ｗ／ｖ懸濁液を、無水エタノールと１：１比で混合し、ボルテックスして、１分間混合した。懸濁液を、水浴中、好気条件下、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して芽胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを等量のＰＢＳ中に再懸濁した。次に、エタノール処理芽胞個体群を水浴中、８０℃で３０分間インキュベートした。グリセロールを１５％の最終濃度となるように添加し、精製された芽胞画分を−８０Ｃで貯蔵した。
【０２５２】
実施例５．
糞便物質の界面活性剤処理による芽胞精製
ＰＢＳ中のヒト糞便の１０％ｗ／ｖ懸濁液を、０．５〜２％の最終濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するように調製する。振盪しながら２５〜３７℃で３０分間インキュベーションした後、試料を１０００ｇで５〜１０分間遠心して、微粒子状物質および大型細胞をペレット化する。細菌芽胞を上清画分中に回収し、実施例４等において、精製された芽胞個体群は所望によりさらに処理される。理論に制限されるものではないが、界面活性剤の糞便混合物への添加は、少なくとも部分的に、微粒子物からの芽胞の分離を強化することにより、芽胞のより高い収量をもたらすことによって、より良好な芽胞個体群を生成する。
【０２５３】
実施例６．
糞便物質のクロマトグラフ分離による芽胞精製
上記実施例１〜５から得られたもの等の芽胞濃縮個体群を、最終濃度４Ｍの全塩となるようにＮａＣｌと混合し、ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗと接触させて、疎水性芽胞画分と結合させる。前記樹脂を４Ｍ  ＮａＣｌで洗浄して疎水性が低い成分を除去し、芽胞を蒸留水で溶出させ、所望の濃縮芽胞画分をＵＶ吸光度によって収集する。
【０２５４】
実施例７．
糞便物質の濾過による芽胞精製
上記実施例１〜６から得られたもの等の芽胞濃縮個体群をＰＢＳで１：１０希釈し、接線流精密濾過システム（tangential flow microfiltration system）のリザーバー容器に入れる。０．２μｍ孔径の混合セルロースエステル親水性接線流フィルターを、ループ状配管（tubing loop）等によりリザーバーに接続する。希釈した芽胞調製物をポンピングによってループ内を再循環させ、マイクロフィルターの壁にかけられる圧力勾配によって、上清液がフィルター孔を通して押し出される。フィルター孔径の適切な選択によって、所望の細菌芽胞は保持され、一方、壊死細胞片等のより小さな混入物、およびバクテリオファージ等の糞便中の他の混入物はフィルターを通過する。新鮮なＰＢＳ緩衝液を定期的にリザーバーに添加して、混入物の洗い長しを強化する。ダイアフィルトレーションの終わりに、芽胞は元の濃度のおよそ１０倍に濃縮される。精製された芽胞をリザーバーから収集し、本明細書で提供されるように貯蔵する。
【０２５５】
実施例８．
精製された芽胞個体群の特徴付け
生存芽胞の数を、ＰＢＳ中１０倍連続希釈を行い、ブルセラ血液寒天ペトリ皿または適用可能な固体培地に播種することによって決定する。プレートを３７℃で２日間インキュベートする。５０〜４００個のコロニーを有する希釈プレートからコロニーを計数し、個体群中の生存芽胞の数を逆算するのに用いる。栄養細菌へと発芽する能力も示される。目視による計数は位相差顕微鏡観察によって決定される。芽胞調製物をＰＢＳ中で希釈または遠心分離で濃縮し、５マイクロリットルの分割量を、４００×の拡大率で視覚化するためにＰｅｔｒｏｆｆ  Ｈａｕｓｅｒ計数チャンバ内に入れる。１０個の０．０５ｍｍ×０．０５ｍｍ格子内の芽胞を計数し、格子当たりの平均芽胞数を決定し、調製物１ｍｌ当たりの芽胞数を算出するために用いる。精製された芽胞個体群中のリポ多糖類（ＬＰＳ）の減少を、市販のＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ジェンスクリプト社（GenScript）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）等のリムルスアメーバ様細胞溶解質（ＬＡＬ）アッセイまたは当業者に公知の他の標準方法を用いて測定する。
【０２５６】
実施例９．
精製された芽胞個体群中の病原性微生物の決定
精製された芽胞個体群中に存在する病原性微生物を、以下のような特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるｑＰＣＲによって決定する。
【０２５７】
検量線作成
検量線を、目的の病原体を既知の濃度で含有するウェル、または選択的スポット播種（selectivespot plating）によって同時に定量化されたウェルから作成する。２連の培養物の連続希釈を無菌リン酸緩衝食塩水中で行った。次に、ゲノムＤＮＡを、その他の試料と一緒に、検量線試料から抽出する。
【０２５８】
ゲノムＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡは、以下の２つを除外して製造業者の取扱説明書に従って、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）−ｈｔｐ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、１００μｌの糞便試料、糞便由来試料、または精製芽胞調製物から抽出され得る：ビーズ破砕（beadbeating）が、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（バイオスペック・プロダクツ社（BioSpec Products）、オクラホマ州バートルズビル）を用いて、２×４：４０分間行われ、ＤＮＡが５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ６中に溶出される。あるいは、ゲノムＤＮＡは、製造業者の取扱説明書に従って、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ（商標）Ｐｌａｎｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、単離され得る。
【０２５９】
ｑＰＣＲの組成および条件  クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を検出するためのｑＰＣＲ反応物は、１×ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｆ（ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｒ（ＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、２５０ｎＭのＷｅ−ｔｃｄＢ−Ｐ（６ＦＡＭ−ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡ−ＭＧＢ、ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、およびＰＣＲ  Ｗａｔｅｒ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）を１８μｌまで含有する（Wroblewski, D. et al. Rapid MolecularCharacterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficilein Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology 47:2142-2148 (2009)から適合されたプライマー）。この反応混合物を、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｂａｒｃｏｄｅのウェル（０．１ｍＬ）（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）に分注する。この反応混合物に、２μｌの抽出したゲノムＤＮＡを添加する。ｑＰＣＲを、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを備えたＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上で行う。熱サイクル条件は、９５℃２分間、続いて４５サイクルの、９５℃３秒間、６０℃３０秒間、およびＦＡＭチャネルおよびＲＯＸチャネルの蛍光読み取りである。目的の病原体に特異的なプライマーおよびプローブを用いて、他の病原性微生物が検出さる可能性がある。
【０２６０】
データ解析
ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア（バージョン２．１）によって、ＦＡＭチャネル上の各ウェルのＣｑ値が決定される。検量線ウェルのＣｑ値をそれらの試料の既知のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）と比較している検量線から作成された線形回帰モデルに所与の試料のＣｑ値を入力することによって、各実験試料のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）が算出される。
【０２６１】
精製された芽胞個体群中に存在するウイルス性病原体は、本明細書に記載される、または当該技術分野において公知のｑＰＣＲによって決定される。
【０２６２】
実施例１０：種の同定
複合画分から成長した芽胞形成性種の同一性が、複数の方法において決定され得る。最初に、個々のコロニーが、９６ウェル型の液体培地中にピッキングされ、増殖され、−８０Ｃでの１５％グリセロールストックとして保存される。前記培養物の一定分量が細胞溶解緩衝液中に入れられ、コロニーＰＣＲ法が用いられて、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子が増幅および配列決定され得る（実施例２）。あるいは、コロニーは、固体培地上で、数回の継代において、純度のために画線培養され得る。十分に分離されたコロニーを同様の新しいプレート上で画線培養し、３７Ｃで４８〜７２時間インキュベートする。純度を確実にするためにこの過程を複数回反復する。純粋な培養物は、実施例１１および１２に記載されるような１６Ｓ  ｒＤＮＡの増幅および配列決定を含む、表現型または配列に基づく方法によって解析され得る。純粋単離物または混合群集（例えば、プレートをスクレイピングしたもの（plate scrape）および芽胞画分）の配列特徴付けには、全ゲノムショットガン配列決定が含まれ得る。全ゲノムショットガン配列決定は、芽胞形成、抗生物質耐性、病原性、およびビルレンスと関連する遺伝子の存在を決定するのに役立つ。また、コロニーがまとめてプレートからスクレイピングされ、実施例１１および１２に記載されるような超並列配列決定法を用いて配列決定されることで、個々の１６Ｓサイン（signature）が混合物中で同定され得る。所望により、試料は、発芽可能な種の多様性を芽胞試料中の種の総数と比較するために、発芽前に配列決定され得る（適切であれば、ＤＮＡ単離法が用いられてＤＮＡが芽胞から溶解（lsye）および放出される）。１６Ｓ解析の代替的または補完的なアプローチとしては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃも種の同定に用いられ得る（Anaerobe 22:123において概説される）。
【０２６３】
実施例１１：操作的分類単位（ＯＴＵ）を決定するための１６ｓ配列決定
１６Ｓ配列を決定するための方法  ＯＴＵは、ｒＲＮＡ遺伝子の完全１６Ｓ配列決定によって、この遺伝子の特定の超可変領域（すなわち、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、またはＶ９）の配列決定によって、またはこの遺伝子から得られる超可変領域のあらゆる組み合わせ（例えば、Ｖ１〜３またはＶ３〜５）の配列決定によって、定義することができる。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、およそ１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを用いてある細菌分離株の他の細菌分離株に対する進化的関係および配列類似性を再構築する際に使用される。１６Ｓ配列は、通常は高度に保存されているが、大部分の微生物の属および種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を有する特定の超可変領域を含有しているため、系統学的再構築に使用される。
【０２６４】
周知の技術を用いて、完全１６Ｓ配列または１６Ｓ配列のあらゆる超可変領域の配列を決定するために、ゲノムＤＮＡを細菌試料から抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（完全領域または特定の超可変領域）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、ＰＣＲ産物を精製（clean）し、ヌクレオチド配列を線引きして１６Ｓ遺伝子または前記遺伝子のサブドメインの遺伝子組成物を決定する。完全１６Ｓ配列決定が行われる場合、使用される配列決定法は、限定はされないが、サンガー配列決定法であり得る。一つまたは複数の超可変領域（例えば、Ｖ４領域）が使用される場合、配列決定は、限定はされないが、サンガー法を用いて、または次世代シークエンシング法（例えば、複合的な反応を可能にするバーコード付き（barcoded）プライマーを用いるＩｌｌｕｍｉｎａ（合成による配列決定）法）を用いて、行われ得る。
【０２６５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の他に、ＯＴＵの所与の種または分類群のマーカー遺伝子であることが知られている選択された遺伝子群を配列決定することによって、ＯＴＵは定義され得る。あるいは、これらの遺伝子は、ＰＣＲに基づくスクリーニング戦略を用いてアッセイされ得る。例として、病原性大腸菌の種々の系統は、熱不安定性毒素（ＬＴＩ、ＬＴＩＩａ、およびＬＴＩＩｂ）および熱安定性毒素（ＳＴＩおよびＳＴＩＩ）、ベロ毒素１型、２型、および２ｅ型（それぞれＶＴ１、ＶＴ２、およびＶＴ２ｅ）、細胞傷害性壊死因子（cytotoxic necrotizing factor）（ＣＮＦ１およびＣＮＦ２）、付着および削除機構（attaching and effacing mechanism）（ｅａｅＡ）、腸管凝集機構（enteroaggregative mechanism）（Ｅａｇｇ）、および腸管侵入機構（enteroinvasive mechanism）（Ｅｉｎｖ）をコードする遺伝子からのＤＮＡを用いて区別され得る。マーカー遺伝子の使用によるＯＴＵの分類学的割当に利用するのに最適な遺伝子は、配列に基づく分類学的同定の当業者によく知られている。
【０２６６】
ゲノムＤＮＡ抽出
熱アルカリ溶解法を用いて、ゲノムＤＮＡが純粋な微生物培養物から抽出される。１μｌの微生物培養物が９μｌの溶解バッファー（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に加えられ、その混合物が９５℃で３０分間インキュベートされる。続いて、試料が４℃に冷却され、１０μｌの中和バッファー（４０ｍＭトリス塩酸）の添加によって中和され、次に溶出バッファー（１０ｍＭトリス塩酸）中で１０倍希釈される。あるいは、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）等の市販のキットを用いて、または当業者に公知の標準方法によって、純粋な微生物培養物からゲノムＤＮＡが抽出される。
【０２６７】
下流サンガー配列決定法のための１６Ｓ配列の増幅  細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ（図１Ａ）を増幅するために、２μｌの抽出ｇＤＮＡを２０μｌの最終体積のＰＣＲ反応物に加える。完全長１６配列決定のために、ＰＣＲ反応物はまた、１×ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）、２５０ｎＭの２７ｆ（ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、および２５０ｎＭの１４９２ｒ（ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）を、体積のバランスのためのＰＣＲ  Ｗａｔｅｒ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）と共に含有する。あるいは、当業者に公知の他の一般的な細菌プライマーまたは熱安定性ポリメラーゼが使用される。例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡの「Ｖ１〜Ｖ９領域」（図１Ａ）の配列決定のためのプライマーが、当業者に利用可能である。これらの領域は、細菌試料のジェノタイピングに用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第一から第九の超可変領域を指す。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系命名法（Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA genefrom Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)）に基づく番号付けを用いて、それぞれ、ヌクレオチド６９〜９９、１３７〜２４２、４３３〜４９７、５７６〜６８２、８２２〜８７９、９８６〜１０４３、１１１７〜１１７３、１２４３〜１２９４および１４３５〜１４６５によって定義される。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８、およびＶ９領域のうちの少なくとも１つがＯＴＵの特徴付けに使用される。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。別の実施形態では、Ｖ４領域がＯＴＵの特徴付けに使用される。当業者は、候補配列を参照配列（図１B）と比較し、参照超可変領域に対する類似性に基づいて超可変領域を特定することにより、候補１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定の超可変領域（図１A）を特定することができる。
【０２６８】
ＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）等の市販のサーモサイクラー上で行われる。反応は、９４℃で２分間、続いて、９４℃３０秒間、５１℃３０秒間、および６８℃１分３０秒間を３０サイクル、続いて、７２℃で７分間の延長および４℃での不定の固定で実行される。ＰＣＲに続いて、約１．５ｋｂ産物の増幅の成功を確認するために、反応産物の一部のゲル電気泳動が用いられる。
【０２６９】
ＰＣＲ産物からヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを除去するために、２μｌのＨＴ  ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（アフィメトリクス社、カリフォルニア州サンタクララ）が、５μｌのＰＣＲ産物に加えられ、その後、３７℃１５分間のインキュベーション、続いて８０℃１５分間の不活性化が行われる。
【０２７０】
超並列配列決定技術による下流の特徴付けのための１６Ｓ配列の増幅  Ｉｌｌｕｍｉｎａ等の短リード（short read）技術による下流配列決定のために行われる増幅は、配列に基づくバーコードタグを追加で含む当業者に公知のプライマーを用いた増幅を必要とする。例として、細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの１６ｓ超可変領域Ｖ４領域を増幅するために、２μｌの抽出ｇＤＮＡが２０μｌの最終体積のＰＣＲ反応物に加えられる。ＰＣＲ反応物はまた、１×ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）、２００ｎＭのＶ４＿５１５ｆ＿ａｄａｐｔ（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、および２００ｎＭのバーコード付き８０６ｒｂｃ（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ＿１２ｂｐＧｏｌａｙＢａｒｃｏｄｅ＿ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）を、体積のバランスのためのＰＣＲ  Ｗａｔｅｒ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）と共に含有する。これらのプライマーは、合成によるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定のためのバーコード付きのアダプターを組み込んでいる。所望により、同一の２連、３連、または４連の反応が行われ得る。あるいは、当業者に公知の他の一般的な細菌プライマーまたは熱安定性ポリメラーゼを用いることで、異なる増幅および配列決定エラー率並びに別の配列決定技術の結果が得られる。
【０２７１】
ＰＣＲ増幅は、ＢｉｏＲａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）等の市販のサーモサイクラー上で行われる。反応は、９４℃で３分間、続いて、９４℃４５秒間、５１℃１分間、および７２℃１分３０秒間を２５サイクル、続いて、７２℃で１０分間の延長および４℃での不定の固定で実行される。ＰＣＲに続いて、約１．５ｋｂ産物の増幅の成功を確認するために、反応産物の一部のゲル電気泳動が用いられる。ＰＣＲ精製は、上記実施例に詳細に述べたように行われる。
【０２７２】
純粋均一試料からの標的単位複製配列のサンガー配列決定  各試料において核酸を検出するために、２つの配列決定反応が行われて、順方向配列決定リードおよび逆方向配列決定リードが作製される。完全長の１６ｓ配列決定のために、プライマー２７ｆおよび１４９２ｒが用いられる。４０ｎｇのＥｘｏＳａｐ−ＩＴ−精製ＰＣＲ産物が、２５ｐｍｏｌの配列決定プライマーおよびＭｏ  Ｂｉｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒａｄｅ  Ｗａｔｅｒ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）と混合され、１５μｌの総体積にされる。この反応物は、サンガー配列決定法のための、ジーンウィズ社（Ｇｅｎｅｗｉｚ）（ニュージャージー州サウスプレインフィールド）等の商業的配列決定機構に寄託される。
【０２７３】
不均一試料からの標的単位複製配列の超並列配列決定
ＤＮＡ定量化およびライブラリー構築
精製したＰＣＲ増幅産物が、製造業者の取扱説明書に従って、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて、定量化される。定量化の後、バーコード付き精製ＰＣＲ産物が、それぞれの異なるＰＣＲ産物が等モル比となるように混合され、調製されたＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーが作製される。
【０２７４】
核酸検出
調製されたライブラリーがＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑ配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）上で配列決定され、クラスター生成、テンプレートハイブリダイゼーション、等温増幅、直線化、ブロッキングおよび変性、並びに配列決定プライマーのハイブリダイゼーションが製造業者の取扱説明書に従って行われる。１６ＳＶ４ＳｅｑＦｗ（ＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ）、１６ＳＶ４ＳｅｑＲｅｖ（ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ）、および１６ＳＶ４Ｉｎｄｅｘ（ＡＴＴＡＧＡＷＡＣＣＣＢＤＧＴＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ）（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）が配列決定に用いられる。限定はされないが、ゲノム配列決定の当業者に標準的なプロトコルを用いる、４５４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、およびＮａｎｏｐｏｒｅ等の他の配列決定技術が用いられ得る。
【０２７５】
実施例１２：配列リードのアノテーション
【０２７６】
一次リードのアノテーション  核酸配列が解析され、アノテーションによって、配列類似性および系統学的位置付け法またはこれら２つの戦略の組み合わせを用いて、分類学的割当が定められる。タンパク質名、転写因子名、および核酸配列のあらゆる他の分類スキーマをアノテートするために、類似のアプローチが用いられ得る。配列類似性に基づく方法には、当業者によく知られている方法、例えば、限定はされないが、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ、ＲＤＰ−ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ、ＤＮＡｃｌｕｓｔ、およびＱｉｉｍｅまたはＭｏｔｈｕｒ等のこれらのアルゴリズムの種々の実行が含まれる。これらの方法は、参照データベースへの配列リードのマッピング、および最良のスコアおよびｅ値との一致の選択に依存する。一般的なデータベースとしては、限定はされないが、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ＮＣＢＩ非重複データベース、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ、ＲＤＰ、およびＳｉｌｖａが挙げられる。アノテーションまたは分類学的割当のコール精度を向上させるために、系統学的方法は配列類似性法と組み合わされて用いられ得る。ここで、解析の鮮明度を洗練させるために、樹形およびノード構造が用いられる。このアプローチでは、多数の配列類似性アプローチのうちの１つおよび当業者に周知のレバレッジ系統学的方法（leverage phylogenetic method）、例えば、限定はされないが、最尤系統学的再構築（maximum likelihood phylogenetic reconstruction）を用いて、核酸配列が解析される（例えば、Liu K, Linder CR, and Warnow T. 2011. RAxML and FastTree: Comparing TwoMethods for Large-Scale Maximum Likelihood Phylogeny Estimation. PLoS ONE 6: e27731.McGuire G, Denham MC, and Balding DJ. 2001. Models of sequence evolution for DNAsequences containing gaps. Mol. Biol. Evol 18: 481-490. Wrobel B. 2008. Statisticalmeasures of uncertainty for branches in phylogenetic trees inferred from molecularsequences by using model-based methods. J. Appl. Genet. 49: 49-67を参照されたい）。配列リードが、適切な参照配列から構成される参照系統樹内に置かれる。系統樹内のリードの配置に基づいてアノテーションが行われる。参照核酸配列に対するＯＴＵの配列類似性および系統樹内の一つまたは複数の参照配列に対するＯＴＵ配列の近接に基づいて、ＯＴＵアノテーションの確実性または有意性が定められる。一例として、科、属、種、または系統のレベルにおける信頼度によって分類学的割当の特異性が定められ、この信頼度は、調査中のＯＴＵ配列の位置と比較した、参照系統樹内でのブートストラップによって裏付けられた枝の位置に基づいて決定される。
【０２７７】
クレイド割当
【０２７８】
１６Ｓ−Ｖ４  ＯＴＵ同定がＯＴＵを特定の種に割り当てる能力は、特定の種または種の群の１６Ｓ遺伝子の１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能に部分的に依存している。系統樹の様々な領域における利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、並びに様々な種の間での１６Ｓ遺伝子における固有の変異性の両方によって、分類学的アノテーションの明確性（definitiveness）は決定される。系統樹の形態的性質、および系統樹がＯＴＵの互いの階層関係を、それらの配列類似性および根底にある進化モデルに基づいて表しているという事実を前提として、あるリードの分類学的アノテーションは、クレイドに基づく割当法を用いて、より高いレベルにロールアップされ得る（表１）。このアプローチを用いることで、クレイドは、系統学の当業者によく知られている最尤または他の系統学的モデルを用いて完全長１６Ｓ配列から構築された系統樹の形態に基づいて定義される。クレイドが構築されことにより、所与のクレイド内の全てのＯＴＵが、（ｉ）互いに、特定の数のブートストラップによって裏付けられたノード以内であること（一般的には、１〜５のブートストラップ）、および（ｉｉ）５％遺伝子類似度以内であることが確実となる。同一クレイド内のＯＴＵは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて、異なるクレイド内のＯＴＵとは遺伝的および系統学的に異なるものとして区別され得る。同一クレイドに含まれるＯＴＵは進化的に近縁関係にあり、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いに区別可能である場合も区別可能でない場合もある。クレイドに基づく解析の能力は、同一クレイドの構成要素が、それらの進化的関連性に起因して、微生物環境（例えば、ヒトの腸内で見られるもの）において類似の機能的役割を果たす可能性があるということである。ある種を同一クレイド由来の別の種と置換する組成は、保存された生態学的機能を有する可能性が高く、それ故、本発明において有用である。
【０２７９】
特に、所与のＯＴＵの単離物の１６Ｓ配列は、先行の１６Ｓに基づく割当を有し得る種および属の微生物学に基づく割当と時に矛盾して、それらのそれぞれのクレイド内に系統学的に配置される。微生物学的特性に基づく分類学的割当と遺伝子配列決定に基づく分類学的割当の間の矛盾は、文献から存在が知られている。
【０２８０】
実施例１３：芽胞の発芽  芽胞画分の発芽は、様々な培地種上で成長する生存芽胞の数を増加させる。芽胞の個体群を発芽させるために、試料を嫌気性チャンバーに移し、前還元ＰＢＳ中に再懸濁し、３７Ｃで１時間で混合およびインキュベートすることで、発芽を可能とさせる。発芽誘起物質（germinant）は、アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン）、糖類（例えば、フルクトース）、ヌクレオシド（例えば、イノシン）、胆汁酸塩（例えば、コール酸塩およびタウロコール酸塩）、金属カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋）、脂肪酸、および長鎖アルキルアミン（例えば、ドデシルアミン、Germination of bacterial spores with alkyl primary amines” J. Bacteriology,1961.）を含み得る。これらの混合物または第一胃液もしくはウシ胆汁等のより複雑な天然混合物を用いることで、発芽が誘導され得る。ウシ胆汁は、脂肪酸、胆汁酸、無機塩、硫酸塩、胆汁色素、コレステロール、ムチン、レシチン、グリクロン酸、ポルフィリン、および尿素から構成される脱水したウシ胆汁である。また、発芽は前還元ＢＨＩＳ／ウシ胆汁発芽培地のような増殖培地中でも行うことができ、前記培地中では、ＢＨＩＳ（脳‐心臓浸出物粉末（３７ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、Ｌ−システインＨＣｌ（１ｇ／Ｌ））が複合ＢＨＩ中のペプチド、アミノ酸、無機イオンおよび糖類を供給し、酵母抽出物混合物およびウシ胆汁が追加の胆汁酸発芽誘起物質を供給する。
【０２８１】
さらに、芽胞を発芽させるために圧力が用いられ得る。発芽誘起物質の選択は、求められる微生物によって異なり得る。異なる種は異なる発芽誘起物質を必要とし、同一種の異なる単離体は最適な発芽のために異なる発芽誘起物質を必要とし得る。最後に、いくつかの発芽誘起物質は栄養状態の微生物の成長にとって阻害的であるため、播種の前に前記混合物を希釈することが重要である。例えば、アルキルアミンは、最適な成長を促進するために、陰イオン性脂溶性物質（lipophile）で中和されなければならないことが示されている。胆汁酸も、いくつかの生物の成長を、それらの発芽を促進するにもかかわらず、阻害する可能性があり、生細胞に播かれる前に希釈されなければならない。
【０２８２】
例えば、ＢＨＩＳ／ウシ胆汁溶液は発芽誘起物質として用いられ、０．２５％ウシ胆汁（脱水したウシ胆汁）と共に０．５×ＢＨＩＳ培地を含有しており、ここで、１×ＢＨＩＳ培地は、溶液１Ｌ当たりに以下を含有する：６ｇの固形物由来脳‐心臓浸出物、７ｇの動物組織のペプシン消化物、１４．５ｇの膵液カゼイン消化物、５ｇの酵母抽出物、５ｇの塩化ナトリウム、２ｇのグルコース、２．５ｇのリン酸二ナトリウム、および１ｇのシステイン。さらに、Ｃａ−ＤＰＡは発芽誘起物質であり、４０ｍＭのＣａＣｌ２、および４０ｍＭのジピコリン酸（ＤＰＡ）を含有する。第一胃液（バー・ダイアモンド社（Bar Diamond, Inc.））も発芽誘起物質である。模擬胃液（リッカ・ケミカル社（Ricca Chemical））は発芽誘起物質であり、０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中の０．２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムである。ムチン培地は発芽誘起物質であり、以下の物品を１Ｌの蒸留滅菌水に加えることによって調製される：０．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５３ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．３ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．１１ｇのＣａＣｌ２、１ｍｌのアルカリ性微量元素溶液、１ｍｌの酸性微量元素溶液、１ｍｌのビタミン溶液、０．５ｍｇのレザズリン、４ｇのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇのＮａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏ。微量元素溶液およびビタミン溶液は以前に記述（Stamset al., 1993）の通りに調製される。ビタミンを除く全ての化合物をオートクレーブにかけ、ビタミンはフィルター滅菌した。基本培地に、以前の記述（Miller & Hoskins, 1981）の通りに、エタノール沈殿によって精製した０．７％（ｖ／ｖ）の清澄無菌第一胃液および０．２５％（ｖ／ｖ）の市販雄ブタ胃ムチン（ＩＩＩ型；シグマ社）を添加した。この培地を本明細書ではムチン培地と称する。
【０２８３】
ウシ胎児血清（ギブコ社）は、発芽誘起物質として用いることができ、０．１３７Ｍ塩化ナトリウム、０．００２７Ｍ塩化カリウム、０．０１１９Ｍリン酸緩衝液を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、フィッシャー・サイエンティフィック社）中に熱不活化した５％ＦＢＳを含有する。チオグリコレートは、以前に記述されたような（Kamiya et al Journal of Medical Microbiology 1989）発芽誘起物質であり、０．２５Ｍ（ｐＨ１０）チオグリコール酸ナトリウムを含有する。ＰＢＳ中に１ｍＭドデシルアミンを含有するドデシルアミン溶液は発芽誘起物質である。糖液は発芽誘起物質として使用することができ、０．２％フルクトース、０．２％グルコース、および０．２％マンニトールを含有する。アミノ酸溶液も発芽誘起物質として使用することができ、５ｍＭアラニン、１ｍＭアルギニン、１ｍＭヒスチジン、１ｍＭリジン、１ｍＭプロリン、１ｍＭアスパラギン、１ｍＭアスパラギン酸、１ｍＭフェニルアラニンを含有する。本明細書でＧｅｒｍｉｘ３と称される発芽誘起物質混合物は、発芽誘起物質であり得、５ｍＭアラニン、１ｍＭアルギニン、１ｍＭヒスチジン、１ｍＭリジン、１ｍＭプロリン、１ｍＭアスパラギン、１ｍＭアスパラギン酸、１ｍＭフェニルアラニン、０．２％タウロコール酸、０．２％フルクトース、０．２％マンニトール、０．２％グルコース、１ｍＭイノシン、２．５ｍＭ  Ｃａ−ＤＰＡ、および５ｍＭ  ＫＣｌを含有する。ＢＨＩＳ培地＋ＤＰＡは、発芽誘起物質混合物であり、ＢＨＩＳ培地および２ｍＭ  Ｃａ−ＤＰＡを含有する。本明細書でＥｃＳＮと称される大腸菌（Escherichia coli）に消費された培地上清は発芽誘起物質であり、大腸菌ＭＧ１６５５をＳｗｅｅｔＢ／Ｆｏｓイヌリン培地中で嫌気的に４８時間増殖させ、細胞を２０，０００ｒｃｆで２０分間遠心沈殿させ、上清を収集し、４０分間かけて６０Ｃに加熱することによって調製される。最後に、前記培地はフィルター滅菌され、発芽誘起物質溶液として使用される。
【０２８４】
実施例１４：  増殖用培地の選択
増殖を補助するのに適した培地（例えば、好ましい炭素源）を選択することは重要である。例えば、いくつかの生物は、単糖よりもセロビオース等の複合糖類を好む。芽胞形成性生物の単離で使用される培地の例には、ＥＹＡ、ＢＨＩ、ＢＨＩＳ、およびＧＡＭ（完全名称および参考文献については以下を参照されたい）が含まれる。いくつかのプレートが解析用に十分に単離されたコロニーをその上に有するようにするために、複数回希釈物が播種され、あるいは、密なコロニーを有するプレートがスクレーピングされ、ＰＢＳ中に懸濁されて、混合された多様な群集が作製される。
【０２８５】
プレートを嫌気的または好気的に３７Ｃで４８〜７２時間またはより長い時間インキュベートすることで、それぞれ、嫌気的芽胞形成体または好気的芽胞形成体が標的化される。
【０２８６】
固体プレート培地には以下が含まれる：
フラクトオリゴ糖／イヌリン（０．４％）、マンニトール（０．４％）、イヌリン（０．４％）、もしくはフルクトース（０．４％）、またはこれらの組み合わせを添加した、ブドウ糖を含有しない、Ｇｉｆｕ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ、ニッスイ社）。  グルコース、セロビオース、マルトース、Ｌ−アラビノース、フルクトース、フラクトオリゴ糖／イヌリン、マンニトールおよび乳酸ナトリウム）を添加した、改変されたＳｗｅｅｔ  ＧＡＭ［Ｇｉｆｕ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ、ニッスイ社）］  Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ（ＢＢＡ、アトラス社（Atlas）、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press, 2010）  ＰＥＡヒツジ血液（アナエローブ・システムズ社（AnaerobeSystems）；フェニルエチルアルコールを含有する５％ヒツジ血液寒天）  Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ  Ａｇａｒ（ＥＹＡ）（アトラス社、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ、第４版、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１０）  スルファイトポリミキシン牛乳寒天（Mevissen-Verhage et al., J. Clin. Microbiol. 25:285-289 (1987)）  ムチン寒天（Derrien et al., IJSEM 54: 1469-1476 (2004)）  ポリガラクツロ酸寒天（Jensen & Canale-Parola, Appl. Environ. Microbiol. 52:880-997 (1986)）  Ｍ２ＧＳＣ（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）  デンプン（１％）、マンニトール（０．４％）、乳酸（１．５ｇ／Ｌ）またはラクトース（０．４％）を添加した、Ｍ２寒天（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）  酵母抽出物（０．５％）、ヘミン、システイン（０．１％）、マルトース（０．１％）、セロビオース（０．１％）、可溶性デンプン（シグマ社、１％）、ＭＯＰＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を添加した、Ｓｗｅｅｔ  Ｂ−Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）  ＰＹ−サリシン（サリシンを添加したペプトン−酵母抽出物寒天）（アトラス社、Handbook of MicrobiologicalMedia、第４版、ASM Press, 2010）。  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（Ｍ−ＢＨＩ）［［甘味および酸味（sweet and sour）］］は、１Ｌ当たりに以下を含有する：３７．５ｇのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ粉末（レメル社（Remel））、５ｇの酵母抽出物、２．２ｇの肉エキス、１．２ｇの肝臓抽出物、１ｇのシステインＨＣｌ、０．３ｇのチオグリコール酸ナトリウム、１０ｍｇのヘミン、２ｇの可溶性デンプン、２ｇのＦＯＳ／イヌリン、１ｇのセロビオース、１ｇのＬ−アラビノース、１ｇのマンニトール、１  Ｎａ−乳酸塩、１ｍＬのＴｗｅｅｎ  ８０、０．６ｇのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．６ｇのＣａＣｌ２、６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、３３ｍＭの酢酸、９ｍＭのプロピオン酸、１ｍＭのイソ酪酸、１ｍＭのイソ吉草酸、１５ｇの寒天、並びにオートクレーブ後に添加される５０ｍＬの８％ＮａＨＣＯ３溶液および５０ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７）。  Ｎｏａｃｋ−Ｂｌａｕｔ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ寒天（Noack et al. J. Nutr. (1998) 128:1385-1391を参照）  ＢＨＩＳ  ａｚ１／ｇｅ２  −  ＢＨＩＳ  ａｚ／ｇｅ寒天（Reeves et. al. Infect. Immun. 80:3786-3794 (2012)）［��母抽出物０．５％、システイン０．１％、０．１％セロビオース、０．１％イヌリン、０．１％マルトース、アズトレオナム１ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン２ｍｇ／Ｌを添加した、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）］  ＢＨＩＳ  ＣＩｎＭ  ａｚ１／ｇｅ２−  ＢＨＩＳ  ＣＩｎＭ［酵母抽出物０．５％、システイン０．１％、０．１％セロビオース、０．１％イヌリン、０．１％マルトース、アズトレオナム１ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン２ｍｇ／Ｌを添加した、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）］
【０２８７】
実施例１５：糞便からの芽胞形成画分の精製および単離
有効な芽胞を糞便物質から精製し選択的に単離するために、提供物が最初に、均質化装置（例えば、実験室混合機）を用いて食塩水と混合されて、２０％スラリー（ｗ／ｖ）が作製される。不活性化処理のために１００％エタノールが加えられ、１０秒〜１時間継続される。最終アルコール濃度は、３０〜９０％、好ましくは５０〜７０％の範囲であり得る。高速遠心分離（３２００ｒｃｆ、１０分間）が行われて溶媒が除去され、ペレットが残り、洗浄される。次に、洗浄されたペレットが再懸濁された後、低速遠心分離ステップ（２００ｒｃｆ、４分間）が行われて大型で粒状の栄養性物質が除去され、芽胞を含有する上清が残留する。上清に対し高速遠心分離（３２００ｒｃｆ、１０分間）が行われて、芽胞物質が濃縮される。次に、ペレットが洗浄され、再懸濁されて、２０％スラリーが作製される。これが、エタノール処理芽胞調製物である。次に、濃縮されたスラリーは、密度に基づく勾配（例えば、ＣｓＣｌ勾配、スクロース勾配またはその２つの組み合わせ）によって分離され、エタノール処理された勾配精製芽胞調製物が作製される。例えば、ＣｓＣｌ勾配は、２０％体積の芽胞懸濁液を、８０％体積の、６４％、５０％、４０％ＣｓＣｌ（ｗ／ｖ）の段階を含有する段階的ＣｓＣｌ勾配（ｗ／ｖ）の上部に添加し、３２００ｒｃｆで２０分間遠心することによって実行される。次に、芽胞画分が、６７％、５０％、４０％、および３０％（ｗ／ｖ）の段階を有するスクロース段階勾配にかけられる。遠心の際は、スイングバケットローター中で、３２００ｒｃｆで１０分間である。芽胞は、おおよそ、３０％スクロース画分および４０％スクロース画分に移動する。次に、下部の芽胞画分（図２）が取り出され、洗浄されて、濃縮、エタノール処理、勾配精製された芽胞調製物が作製される。位相差顕微鏡によって観察される芽胞の屈折特性（芽胞は明るく屈折性であるが、発芽した芽胞および栄養細胞は暗色である）を利用することで、エタノール処理、ＣｓＣｌ勾配精製した芽胞調製物（図３、中央）、およびエタノール処理、ＣｓＣｌ勾配精製、スクロース勾配精製した芽胞調製物（図３、右）と比較した、糞便細菌細胞懸濁液（図３、左）からの芽胞画分の濃縮を見ることができる。
【０２８８】
さらに、発芽誘起物質による処理後の芽胞の成長も、生存芽胞個体群を定量化するのに用いられ得る。簡潔に説明すると、試料を発芽誘起物質（ウシ胆汁、０．２５％、最長１時間）と一緒にインキュベートし、希釈し、ＢＢＡ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒ）または類似の培地（例えば、実施例４および５を参照）上に嫌気的に播種した。個々のコロニーをピッキングし、完全長１６Ｓ配列決定用にＤＮＡを単離して、種の組成を特定した（例えば、実施例２および３を参照）。解析によって、合計で２２種が観察され（表２）、大多数が勾配を用いて精製された物質および勾配を用いなかった物質の両方の中に存在することが明らかとなり、このことは、勾配精製の結果としての生態環境における変化が無い、またはわずかであることを示している。芽胞収率を算出すると、ＢＢＡ上の芽胞の発芽および播種または試料中のＤＰＡ数の測定によって測定される、開始糞便物質からの３８％の芽胞の効率的な回収が示される。
【０２８９】
実施例１６：細菌組成物はマウスモデルにおいてクロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）感染を予防する
細菌組成物の治療上の可能性を試験するために、クロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）感染の予防的マウスモデル（Chen, et al., A mouse model of Clostridiumdifficile associated disease, Gastroenterology 135(6):1984-1992に基づくモデル）を使用した。それぞれ５匹のマウスが入った２つのケージを、各実験部門（arm）について試験した。全てのマウスは、マウスの飲料水中の１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）から成る抗生物質混合物を、−１４日目から−５日目まで摂取し、強制経口投与による１０ｍｇ／ｋｇクリンダマイシンの１回の投与を−３日目に受けた。−１日目に、マウスは強制経口投与によって被験物質またはビヒクル対照を摂取した。０日目に、マウスは、強制経口投与による、およそ４．５ｌｏｇ１０ｃｆｕのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）（ＡＴＣＣ４３２５５）の投与によって暴露された。所望により、陽性対照群は、上記の抗菌プロトコルおよびクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）暴露に加えて、バンコマイシンを−１日目から３日目まで摂取した。細菌保菌の分析のために糞便をケージから回収し、死亡率を０日目から６日目まで毎日評価し、前記動物の重量および後の重量変化を、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染と関連付けられる体重減少によって評価した。ビヒクルと比較した被験物質の死亡率および体重減少低減を用いて、被験物質の成否を評価した。さらに、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）症状のスコア化を−１日目から６日目まで毎日行った。臨床スコアは、外見（正常、猫背、立毛、または嗜眠に基づいて０〜２ポイント）、および臨床徴候（正常、濡れた尾、触ると冷たい（cold-to-the-touch）、または他の動物からの隔離に基づいて０〜２ポイント）についてのスコアを組み合わせることによる、０〜４の段階に基づくものであった。
【０２９０】
無処置対照部門では、動物をクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）に暴露した。バンコマイシン陽性対照部門では、動物にクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を投与し、−１日目から３日目までバンコマイシンで処置した。負の対照には胃管栄養によってＰＢＳ単独を与え、細菌は与えなかった。実験の試験部門では、単一のドナーのエタノール処理芽胞調製物（例えば、実施例６を参照）または２０％スラリーを８０Ｃで３０分間処理することで調製された熱処理糞便から得られた１倍、０．１倍、０．０１倍希釈物が試験された。ＣＦＵ数の投与は、最終エタノール処理芽胞から決定し、全芽胞の希釈物は、エタノール処理画分については芽胞混合物の１倍、０．１倍、０．０１倍で、熱処理画分については１倍用量で投与した。
【０２９１】
体重減少および死亡率を３日目に評価した。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のみで処置された負の対照は、３日目に２０％の死亡率および体重減少を示し、一方、１０％ヒト糞便懸濁液の陽性対照は、３日目に死亡または体重減少を示さない（表３）。ＥｔＯＨ処理糞便は、３つの希釈において死亡および体重減少を防止したが、熱処理画分は試験された用量でのみ予防性であった。これらのデータは、芽胞画分が、マウスにおけるクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染の予防に効果的であることを示している。
【０２９２】
実施例１７：予防的ハムスターモデルおよび再発防止ハムスターモデル
クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の毒素産生株および非毒素産生株を用いたハムスターでの以前の研究において、抗生物質処置後再発を検査する際のハムスターモデルの有用性、並びにクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染（Wilson et al. 1981, Wilson etal. 1983, Borriello et al. 1985）における、より広くは胃腸感染症における、盲腸細菌叢を用いた予防処置の効果が実証された。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染を改善するための被験物質の予防的使用を実証するため、以下のハムスターモデルが用いられる。予防的モデルでは、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ、皮下）が−５日目に与えられ、被験物質または対照が−３日目に投与され、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）暴露が０日目に行われる。陽性対照部門では、その後、バンコマイシンが１〜５日目に投与される（ビヒクル対照は−３日目に送達される）。糞便が−５、−４、−１、１、３、５、７、９日目に回収され、糞便試料は、微生物学的方法、１６Ｓ配列決定アプローチまたは当業者に使用される他の方法によって、病原体保菌および減少について評価される。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）暴露後の２１日間の実験全体を通して、死亡率が評価される生存割合曲線は、エタノール処理芽胞およびエタノール処理、勾配精製した芽胞が、バンコマイシン対照、およびビヒクル対照と比較して、ハムスターをより良好に保護することを示している。
【０２９３】
図４を参照：エタノール処理芽胞調製物およびエタノール処理、勾配精製した芽胞調製物を用いた予防モデル。
【０２９４】
再発予防モデルにおいて、ハムスターは、０日目に毒素産生性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）株に暴露され、１日目に強制経口投与によってクリンダマイシンで処置され、２〜６日目にバンコマイシンを投与される。その後、試験処置または対照処置を７、８、および９日目に行った。各部門のハムスター群は１群当たり８匹のハムスターから成る。糞便物質が−１、１、３、５、７、１０および１３日目に回収され、ハムスターの死亡率が全体を通して評価される。被験物質の成否を評価するために生存曲線が用いられる（例えば、ハムスターの死亡阻止における、エタノール処理した芽胞またはエタノール処理、勾配精製した芽胞と、対照処置との比較）。生存曲線は、エタノール処理、勾配精製した芽胞において最大の有効性を示しており、エタノール処理芽胞がそれに続く。両方の処置が、バンコマイシン処置単独よりも生存割合を向上させた。
【０２９５】
図５を参照：エタノール処理した芽胞およびエタノール処理、勾配精製した芽胞を用いた再発予防モデル
【０２９６】
実施例１８：患者における再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の臨床治療
ヒト患者における再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を治療するための、被験物質（例えば、エタノール処理芽胞調製物、実施例１５を参照）の有効性を評価するために、以下の手順を実行して、糞便を健常ドナーから回収し、下記のエタノール処理芽胞調製プロトコルによって不活性化し、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の徴候を示す患者における再発性クロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）を治療した。無関連ドナーを、便提供に先立ち、慢性医学的状態（例えば、炎症性腸疾患；過敏性腸症候；セリアック病；または胃腸管悪性腫瘍もしくはポリープ症のあらゆる病歴）の非存在、感染性感染症の危険因子の非存在、６ヵ月以前の抗生物質の非使用、並びに血液媒介病原菌（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、ＨＡＶおよび梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ））および糞便内病原性微生物（サルモネラ、赤痢菌、エルシニア、カンピロバクター、大腸菌０１５７）、卵および寄生虫、並びに他の感染体（ジアルジア属、クリプトスポリジウム属  シクロスポラ属、イソスポラ属）についての実験室アッセイでの陰性結果についての全体的な健康歴について、スクリーニングした。
【０２９７】
ドナーの便を提供直後に凍結し、試験用にサンプリングした。使用時に、およそ７５ｇのドナー便を解凍し、５００ｍＬの非静菌性生理食塩水中に懸濁し、使い捨てのガラスまたはプラスチック製の混合機内で混合した。その後、得られたスラリーを、６００、３００および２００ミクロンサイズの粒子を除去する無菌の使い捨てメッシュスクリーンに通した。次に、スラリーを短時間遠心（２００ｒｃｆで４分間）して、繊維状物質および粒子状物質を分離し、上清（細菌細胞および芽胞を含有する）を新しい容器に移した。エタノールを最終濃度が５０％となるように加え、得られた約１５００ｍｌのスラリーを室温で１時間、継続的に混合しながらインキュベートして、栄養細菌細胞を不活性化させた。不活性化の途中で、エタノールとの完全な接触を確実にするために、スラリーを新しいビンに移した。前記固形物を遠心機においてペレット化し、生理食塩水で３回洗浄して、残留エタノールを除去した。最終ペレットを最小量の１００％無菌ＵＳＰグリセロール中に懸濁させ、およそ３０個のサイズ０遅延放出カプセル（ヒプロメロースＤＲｃａｐｓ、カプスゲル社）に、それぞれ０．６５ｍＬの懸濁液で、充填した。直ちに、カプセルに蓋をし、ドライアイスで−８０℃に維持されたアルミニウム製凍結ブロック上に載せて、凍結した。次に、凍結したカプセルを、サイズ００のＤＲｃａｐｓでさらにカプセル化してカプセル安定性を強化し、標識し、直ちに、−６５℃未満の貯蔵庫に移した。最終産物は使用の日時まで−６５℃未満で保存した。カプセルに包まれた産物は−６５℃未満で無期限に保存され得る。投与日に、カプセルを濡れた氷の上で１〜２時間温めて忍容性を向上させ、その後、適宜の水と一緒に投与した。
【０２９８】
患者１は、処置前の少なくとも１年間にクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染および下痢の病歴を有する、４５歳の女性である。患者１は、以前に複数回の抗生物質過程で処置を受けたことがあり、その後毎回、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）と関連する下痢の再発を起こしていた。
【０２９９】
患者２は、それぞれの再発後の適切な抗生物質療法にもかかわらず、治療前の６ヵ月間、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染を経験している、８１歳の高齢の女性である。
【０３００】
経口処置を開始する２４時間前に、ＣＤＡＤ抗生物質療法を中断した。各患者は、胃腸管内の競合的微生物負荷を減少させ、治験薬中の芽胞形成生物による再増殖を促進することを目的とする、結腸準備手順を受けた。
【０３０１】
治療初日の朝に、患者は、治験薬を含有する遅延放出カプセル剤の投与を、適宜の水と共に受けた。患者はその後１時間、食事を避けることを要求された。次の日、患者は診療所に戻って追加の投与を受けた。患者は、２回目の投与を受ける前の４時間、および投与後の１時間、食事を避けることを要求された。
【０３０２】
両方の患者は、治療後の再発または有害症状の形跡について、注意深く経過観察された。患者は２日目、４日目、並びに１、２および４週間目に電話による連絡を受け、毎回、自身の全身状態並びに自身のＣＤＡＤおよび関連症状の状態についての質問を受けた。便試料を処置後の当日（baseline）並びに１、２、４および８週間目に回収して、前述の方法（例えば、実施例１１および１２を参照）を用いる１６Ｓ配列決定および芽胞数によって、腸内微生物叢における変化を評価した。処置後の４週間を通して、各患者は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）再発の形跡を生じずに、徐々に改善していった。
【０３０３】
再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）関連の下痢を有する６人の他の患者を同様に処置したところ、ＣＤＩ再発も抗生物質の再開要求も生じなかった（合計８人の患者）。さらに、処置に関連する重大な有害事象は起こらなかった。
【０３０４】
実施例１９：エタノールまたは熱による糞便懸濁液の処理は、栄養細胞の数を大幅に減少させ、芽胞形成種の濃縮をもたらす
試料中に存在する実質的に全ての栄養形態細菌を不活性化または殺傷するような、試料、好ましくはヒト糞便試料の処理は、芽胞画分の選別および濃縮をもたらす。不活性化するための方法には、加熱、超音波処理、界面活性剤による溶解、酵素消化（リゾチームおよび／またはプロテアーゼＫ等）、エタノールもしくは酸による処理、溶媒（テトラヒドロフラン、１−ブタノール、２−ブタノール、１，２プロパンジオール、１，３プロパンジオール、ブタン酸、プロパン酸、クロロホルム、ジメチルエーテルおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ジエチルエーテルのような界面活性剤）への暴露、またはこれらの方法の組み合わせが含まれ得る。エタノールによって誘導される栄養細胞の不活性化の有効性を実証するために、１０％糞便懸濁液を無水エタノールと１：１比で混合し、１分間ボルテックス混合した。この懸濁液を、室温で３０分間、１時間、４時間または２４時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心して、芽胞をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを等体積のＰＢＳ中に再懸濁した。生細胞を下記のように測定した。
【０３０５】
栄養細胞不活性化に対する加熱処理の有効性を実証するために、１０〜２０％糞便懸濁液を７０Ｃ、８０Ｃ、９０Ｃまたは１００Ｃで１０分間または１時間インキュベートした。
【０３０６】
エタノール処理または加熱処理後、２４時間のプレートのインキュベーションの後に、処理および時間の関数の関数としてＢｒｕｃｅｌｌａ血液寒天（ＢＢＡ）上で細菌力価を決定することにより、残った生細胞を測定した（図６参照）。１時間および２５時間のエタノール処理は類似の効果を有し、生細胞の数をおよそ４対数減少させ、一方、温度の上昇および高温での時間の延長は、生存可能な細胞数のより多くの減少をもたらし、１００℃、１０分または１時間時点での検出可能なコロニーは存在しなかった。この実験では、発芽誘起物質を使用しなかった。プレート上でのさらなる増殖の数日後、いくつかのコロニーをこれらの処理試料からピッキングし、１６Ｓ  ｒＤＮＡ解析（例えば、実施例１１および１２を参照）によって同定した。これらは、既知の芽胞形成性クロストリジウム属菌種、並びに芽胞形成体であることが以前に報告されていない種、例えば、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、およびアナエロツルンカス・コリホミニス（Anaerotruncuscolihominis）（Lawson, et al 2004）、並びにユーバクテリウム属種（表４）を含んでいた。図６を参照：熱処理およびエタノール処理は細胞生存率を減少させる
【０３０７】
栄養細胞がエタノール処理によって大いに減少されることを実証するために、既知の非芽胞形成性細菌を前述（例えば、実施例１５を参照）の通りにエタノール処理し、嫌気的条件でＢＢＡ上に播種することにより生存率を決定した（例えば、実施例１４を参照）。４人の独立ドナーから得られた糞便物質を６０Ｃに５分間暴露し、その後、好気的条件（＋Ｏ２）または嫌気的条件（−Ｏ２）下で３種類の選択培地（ＢＢＡ＋好気的、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース＋好気的、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｂｉｌｅエスクリン＋嫌気的）上に播種して、既知の非芽胞形成性腸内細菌（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上での生存細菌）およびバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）群種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｂｉｌｅエスクリンプレート上での生存細菌）を同定した。これらのアッセイの検出可能限界はおおよそ２０ｃｆｕ／ｍＬであった。発芽誘起物質はこの実験に使用しなかった（図７）。エタノール不活性化および熱不活性化は共に、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース寒天およびＢＢＥ寒天の使用下で、糞便物質からの細胞生存率を検出限界まで大いに減少させる。嫌気的条件で増殖したＢＢＡ培地上で同定された残りの細胞は、発芽誘起物質非依存性の芽胞形成種を含む。図７参照：６０℃、５分間の処理による非芽胞形成性栄養細胞の減少
【０３０８】
さらに、エタノール処理は、富栄養（ＢＢＡ）培地上に播種することにより決定される、１０％糞便懸濁液中の好気的コロニー形成単位および非芽胞形成性の嫌気的コロニー形成単位の両方を迅速に殺傷することが示された。播種されたＣＦＵの減少は、図８に示すように、数秒で４桁減少させる。
【０３０９】
図８参照：エタノールが嫌気的細菌ＣＦＵおよび好気的細菌ＣＦＵの両方を減少させることの、時間経過による実証
【０３１０】
実施例２０：種の同定およびエタノール処理による芽胞形成体としての単離  芽胞形成性種が熱処理法またはエタノール処理法によって濃縮されることを実証するために、７０００個超のコロニー単離物の比較を行って、５０％エタノールまたは加熱処理で処理された糞便懸濁液のみから単離される、および未処理糞便懸濁液からは単離されない種を、再現可能な様式（例えば、複数の調製物において独立して同定、実施例１、２、および３参照）で同定した（表５）。これらのデータは、糞便物質から芽胞形成種を選別する能力、および以前に文献において芽胞形成体であると記述されていない生物を芽胞形成体として同定する能力を示している。いずれの場合にも、生物を単離コロニーとしてピッキングし、嫌気的に増殖させた後、種の同一性を割り当てるために完全長１６Ｓ配列決定にかけた。
【０３１１】
芽胞形成体をさらに同定するために、ドナーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦから得られたエタノール処理した糞便試料を種々の固体培地種に播種し、単一コロニーをピッキングし、９６ウェル型内のブロス中で増殖させた（表６〜１１）。次に、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、直接サイクル配列決定（direct cycle sequencing）を行った（実施例１１および１２参照）。ＩＤは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の直接サイクル配列決定から得られた順方向リードに基づく。
【０３１２】
マイクロバイオームには個体によって驚くべき不均一性が存在し（Clemente etal., 2012）、このことにより、有用な芽胞組成物を作製するために種々のドナーの潜在的な有効性を決定することが重要である。下記の方法は、例えば、特定の量または多様性の芽胞形成生物が、抗生物質処置後にマイクロバイオームを再増殖させるのに、または特定の疾患もしくは状態を治療するのに有用または望ましい場合、ドナーをスクリーニングするのに有用である。さらに、そのようなスクリーニングは、芽胞形成が可能な微生物を単離する目的のためにドナーをスクリーニングする必要がある場合に、または特定のドナーから得られた芽胞形成生物の精製調製物が望ましい場合に、有用である。
【０３１３】
全芽胞数は、特定の提供物または精製された芽胞調製物の効力の尺度でもあり、所望の服用レベルを達成するために要求される物質の含量を決定するのに重要である。総芽胞含量における変動性を理解するために、ドナー試料を回収し、先の実施例に記載されるように処理した。次に、提供物の芽胞含量を決定するために、種々の漸増漸減で培地プレート上で増殖させることにより、ドナー芽胞数（ＣＦＵ／ｇ）を決定した。さらに、実施例２１に記載されるように、ＤＰＡアッセイを用いて、芽胞含量（芽胞等価量（spore equivalent）として表される）を評価した。図９で分かるように、個々のドナーには時間経過に伴って２対数もの差異があり、ドナー間では最大３対数の差異が存在し得る。芽胞含量測定値における差異に対する１つの可能性のある理由は、非生存芽胞および非発芽可能芽胞が、播種によって観察されないが、測定可能なＤＰＡ含量を有するということである。別の可能性は、芽胞内のＤＰＡ含量の種の間の変動性であり、これによって、いくつかの混合物には多量のＤＰＡ芽胞が含有され、一方、他の混合物には低量のＤＰＡ含量芽胞が含有されることになる。高い芽胞数を有するドナーを選択することは、好ましいドナーを特定することによって糞便提供物から芽胞を単離する生産力を決定するのに重要である。
【０３１４】
図９参照：臨床ドナーから得られた提供物の芽胞濃度
【０３１５】
ドナーＦから得られた新鮮な糞便試料を実施例１５に記載されるように処理してエタノール処理芽胞画分を作製し、記載（例えば、実施例１３参照）のように１時間のＢＨＩＳ／ウシ胆汁で発芽させた後、種々の培地に播種した（例えば、実施例１４参照）。各プレート上の形態学的に異なるコロニーの各種類のいくつかをピッキングして可能な限りの多様性を得ることに重点を置いて、コロニーをピッキングした。コロニーは、１ｍｌ当たりのコロニー形成単位の数を算出することができるように、十分に単離されたコロニーを有する各培地種のプレート上でカウントされる（表１２）。コロニーをいくつかの液体培地の１つにピッキングし、上記のように、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列（例えば、実施例１１および１２参照）を決定し、解析した。各培地における独特なＯＴＵの数は、最も独特なＯＴＵを有する培地を最上段に置いて、以下に示される（表１２）。上から５つの培地種のうちの３つから５つを組み合わせることで多様性が得られ、他のいくつかも、目的の特定種を標的とするために選択され得る。コロニー形成単位は１６Ｓデータを用いて所与の種について算出され得、十分なレベルの所与の生物が存在するかどうかを決定するのに用いられ得る。この実験において決定されたドナーＦから得られた芽胞補足物（complement）には、１６Ｓ配列決定によって決定されたこれらの５２種が含まれる（表１２）。
【０３１６】
芽胞形成性細菌の多様性の存在および／または特定の芽胞形成性細菌についてヒトドナーをスクリーニングするために、糞便試料を発芽誘起物質および選択的播種条件を用いて準備し、コロニーをピッキングし（例えば、実施例１３および１４参照）、前述（実施例１１および１２参照）の通りに１６Ｓ多様性について解析した。ドナー多様性の評価には、所与の培地種上のエタノール耐性細胞のｃｆｕ／ｍｌ、または所与の種のｃｆｕ／ｍｌが含まれ得、その培地からピッキングされたコロニーの１６Ｓ解析を用いることで、目的の所与の種の芽胞のレベルが決定される。この種の培地に基づく解析は、目的の種もしくは属に特異的なプローブを用いるｑＰＣＲ、または芽胞調製物のメタゲノム配列決定、またはＩｌｌｕｍｉｎａ１６Ｓ可変領域配列決定アプローチを用いる芽胞調製物の１６Ｓプロファイリング（例えば、実施例１１および１２参照）等の、培地に非依存的な方法によって補完され得る。
【０３１７】
実施例２１：ＤＰＡアッセイを用いた芽胞濃縮物の定量化  混合物中の芽胞濃度を評価するための方法は、典型的には、芽胞の分離および選択、並びにコロニー形成単位を決定するためのその後の個々の種の増殖を必要とする。この技術分野では、適切な発芽誘起物質が特定されていない多くの種が存在するために、混合物中の全ての芽胞を定量的に発芽させる方法は教示されていない。さらに、芽胞形成は、進化的淘汰の結果としての確率過程であると考えられており、これは、発芽誘起物質濃度、時間および他の環境条件に対する同一の反応によって単一種由来の全ての芽胞が発芽するわけではないことを意味している。あるいは、細菌芽胞の重要な代謝産物であるジピコリン酸（ＤＰＡ）が、試料中の芽胞粒子を定量し、糞便中の混入物からの干渉を回避するために、開発された。このアッセイは、ＤＰＡがテルビウム３＋をキレート化して発光複合体を形成するという事実を利用している（Fichtel et al, FEMS Microbiology Ecology, 2007; Kort et al, Applied andEnvironmental Microbiology, 2005; Shafaat and Ponce, Applied and Environmental Microbiology,2006; Yang and Ponce, International Journal of Food Microbiology, 2009; Hindle andHall, Analyst, 1999）。時間分解蛍光アッセイによって、ＤＰＡ存在下でのテルビウム発光が検出され、溶液中のＤＰＡ濃度の定量的測定値が得られる。
【０３１８】
アッセイを行うために、測定されるのに標準的な１ｍＬの芽胞を、２ｍＬ微量遠心管に移した。試料を１３０００ＲＣＦで１０分間遠心した。試料を１ｍＬ無菌脱イオンＨ２Ｏ中で洗浄する。遠心分離を繰り返すことにより、さらなる回数の洗浄を行う。１ｍＬ溶液をハンゲイト管（hungate tube）に移し、試料を蒸気サイクル上で、２５０Ｃで３０分間、オートクレーブする。１００μＬの３０μＭ  ＴｂＣｌ３溶液（４００ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、３０μＭ  ＴｂＣｌ３）を試料に加える。オートクレーブした物質の連続希釈を行い、２７５ｎｍ光で励起し、１．２５ｍｓの積分時間および０．１ｍｓの遅延の間、５４３ｎｍの放出波長を測定することにより、各試料の蛍光を測定する。
【０３１９】
精製芽胞を先の記述の通りに作製する（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ＭＢ−２８−００．ｐｄｆを参照）。クロストリジウム・ビファーメンタンス（C. bifermentans）、クロストリジウム・スポロゲネス（C. sporogenes）、およびクロストリジウム・ブチリクム（C. butyricum）培養物から得られた精製芽胞の連続希釈物を作製し、ＢＢＡ培地上に播種し３７Ｃで一晩インキュベートすることにより測定して、ＣＦＵ／ｍｌを決定した。図１０は、数対数にわたり、異なる芽胞生産性細菌にわたる直線的な一致を示しており、このことは、ＤＰＡアッセイが芽胞含量を評価するための手段であることを示している。
【０３２０】
図１０参照：ＣＦＵ数／ｍｌと比較したＤＰＡアッセイの直線範囲
【０３２１】
発芽可能芽胞ＣＦＵによって測定された芽胞数と、ＤＰＡによって測定された芽胞数との間の複合芽胞個体群についての不一致は、臨床用のエタノール処理芽胞調製物の効力を決定することにおいて、重要な意味を有する。表ＡＣは、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症を患う３人の患者の治療を成功させるために用いられた、３つの異なるエタノール処理芽胞調製物から得られた芽胞含量データを示している。各芽胞調製物の芽胞含量は、前記２つの方法を用いて特徴付けられる。
【０３２２】
【表１】
2019116488.tif 000002
【０３２３】
芽胞含量が３０個のカプセル剤ごとに大きく変動することがすぐに明らかにされる。発芽可能なＳＣＦＵによって測定された場合、芽胞含量は１０，０００倍超変動する。ＤＰＡによって測定された場合、芽胞含量は１００倍超変動する。ＤＰＡアッセイの非存在下では、患者への投与のための最小用量を設定することは困難であろう。例えば、ＤＰＡアッセイから得られるデータ無しでは、ＳＣＦＵアッセイを用いて芽胞の最小有効量が４×１０５個以下であると結論付けられるであろう（例えば、調製１、表ＡＣ）。しかし、そのＳＣＦＵ用量が臨床背景における投与の正規化に用いられた場合、患者に与えられる実際の芽胞用量は、ＤＰＡアッセイによって測定された他のエタノール処理芽胞調製物に対して、ずっと低くなるだろう（表ＡＤ）。
【０３２４】
【表２】
2019116488.tif 000003
【０３２５】
種々の提供物にわたるＳＣＦＵ数およびＤＰＡ数の変動性から、効力の尺度としてのＳＣＦＵの使用がある特定の場合において重大な用量不足をもたらすであろうことが明らかとなる。例えば、調製物３の作製のために４×１０５ＳＣＦＵ（ドナー調製物１からの見掛けの有効量）の用量規格（dosespecification）を設定することで、１００倍超の潜在的用量不足がもたらされるであろう。これは、エタノール処理芽胞調製物中の総芽胞含量をより良好に反映するＤＰＡアッセイに基づく効力規格（potency specification）を設定することだけで、修正され得る。本研究の予期しない発見は、ＤＰＡアッセイが、効力を設定し、エタノール処理芽胞調製物の投薬を決定するのに唯一適しているということである。
【０３２６】
実施例２２：発芽誘起物質による増殖増強の実証
エタノール処理芽胞の発芽能を増強し芽胞生存率を実証するために、３人の異なるドナーから得られた芽胞を種々の処理によって発芽させ、種々の培地上に播種した。嫌気的条件下、３７Ｃで１時間のＢＨＩＳ／ウシ胆汁（ＢＨＩＳ雄ウシ）、Ｃａ−ＤＰＡ、第一胃液（ＲＦ）、疑似胃液（ＳＧＦ）、ムチン培地（Ｍｕｃ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、またはチオグリコレート（Ｔｈｉ）による発芽を、２人の独立したドナーから得られた試料を用いて、先の記述の通りに（例えば、実施例１３および１４参照）行った（図１１）。芽胞−発芽誘起物質混合物を段階希釈し、ＢＢＡ、Ｓｗｅｅｔ  Ｂ、Ｓｗｅｅｔ  Ｂ＋リゾチーム（２μｇ／ｍｌ）、Ｍ２ＧＳＣおよびＭ２ＧＳＣ＋リゾチーム（２μｇ／ｍｌ）を含む異なるプレート培地上に前述（例えば、実施例１３および１４）の通りに播種して、芽胞発芽を決定した。コロニー形成単位を計数し、当業者による標準的な技術を用いて力価を決定した。図１１が示すように、最大のコロニー形成単位は、ＢＨＩ−ウシ胆汁処理から得られる。この発芽処理は、発芽ステップ無しの播種と比較して、試料が１６Ｓ配列決定（例えば、実施例１１および１２参照）を受けた場合に同定されるＯＴＵの数によって測定される多様性も大いに増加させる（図１２）。図１１に示すように、異なる発芽処理はドナーＡ（上段左）およびドナーＢ（下段右）からのＣＦＵ計数に一様でない効果を与える。Ｙ軸は芽胞ＣＦＵ／ｍｌである。図１２に示すように、発芽誘起物質（germinate）は培養された芽胞形成ＯＴＵの多様性を大いに増加させる。
【０３２７】
熱活性化の発芽を促進する効果を試験するため、３人の異なるドナーから得られたエタノール処理糞便試料を、室温、５５Ｃ、６５Ｃ、７５Ｃまたは８５Ｃで１５分間処理し、続いて、３７Ｃで１時間のＢＨＩＳ＋ウシ胆汁で発芽させた後、前述（例えば、実施例１３および１４）の通りにＢＢＡ培地上に播種した（図１３）。室温での前処理は、３人全てのドナーにおいて、高温と比較して少なくとも等量の芽胞を生成した。また、発芽の温度を、ＢＢＡ上に播種する前に試料を嫌気的条件下で室温または３７Ｃで１時間インキュベートすることによって調べた。この２つの条件の間で、ＣＦＵの数に差異は観察されなかった。また、プレートへのリゾチーム添加（２ｕｇ／ｍｌ）を、単一ドナー試料に対して、種々の活性化温度とその後のリゾチーム存在下または非存在下でのインキュベーションの試験によって、試験した。リゾチームの添加は、Ｓｗｅｅｔ  Ｂ培地またはＭ２ＧＳＣ培地上に播かれた場合にわずかな影響を与えたが、リゾチーム無しでのＢＨＩＳウシ胆汁による１時間の処理よりも小さなものであった（図１４）。
【０３２８】
図１３を参照：ＢＨＩＳ＋ウシ胆汁を用いた発芽処理としての熱活性化。図１４を参照：リゾチームの効果は発芽をわずかに増強する。
【０３２９】
また、ＢＨＩＳ、タウロコール酸塩、ウシ胆汁、またはゲルミックス（germix）中で０、１５、３０、または６０分間インキュベートした後にＢＨＩＳ培地、ＥＹＡ培地、またはＢＢＡ培地上に播種（例えば実施例１３および１４参照）した、単一ドナーのエタノール処理糞便の１０％懸濁液（例えば、実施例１５参照）を試験することによって、発芽時間を試験した。６０分間が、試験された発芽体およびプレート培地の種々の組み合わせの全てにおいて最大のＣＦＵ単位をもたらした。
【０３３０】
実施例２３：エタノール処理芽胞の発芽可能画分および芽胞形成可能画分の有効性の実証
特徴付けおよび精製のための方法を定義し、糞便提供物由来の活動性芽胞形成性生態環境を改善（例えば、組成物の多様性を調節する等により）するため、エタノール処理芽胞個体群（実施例１５に記載されるような）をさらに分画した。「発芽可能画分」は、エタノール処理芽胞調製物をウシ胆汁で処理し、種々の固体培地に播種し、続いて、２日間または７日間の増殖の後、全ての細菌増殖物をプレートからスクレーピングし５ｍＬのＰＢＳ／プレートに移して、細菌懸濁液を作製することによって得られた。「芽胞形成可能画分」は、細胞を固体培地上で２日間または７日間（芽胞形成プロトコルにおいては典型的なことであるが、この時間は芽胞形成を可能にするために延長された）増殖させ、得られた細菌懸濁液を５０％エタノールで処理して、「芽胞形成可能な」芽胞、または芽胞を形成することが可能であった種の個体群を得たことを除き、上記のようにして得られた。これらの画分を作製する際、ドナーＡから得られた糞便物質を用いて実施例１５における前述の通りにエタノール処理芽胞調製物を作製し；次に、芽胞含量を、前述（実施例２１参照）の通りの種々の培地上で増殖させるＤＰＡアッセイおよびＣＦＵ／ｍｌによって決定した（図１５）。図１５参照：特定の培地上で増殖されたＤＰＡおよびＣＦＵ／ｍｌによって決定されたエタノール処理芽胞調製物中に最初に存在する芽胞。
【０３３１】
芽胞形成可能である画分を特徴付けるために、２日目および７日目の「発芽可能」画分を、芽胞画分を作製するためのエタノール処理の前後のＣＦＵおよびＤＰＡ含量について評価した。細菌懸濁剤をエタノールで処理し、ウシ胆汁で発芽させ、「発芽可能」画分が増殖された同種の培地上に播種した。ＤＰＡデータは、２日間および７日間のプレート上での増殖が同量の総芽胞を生成したことを示している。いくつかの種類の培地上のコロニーを１６Ｓ配列解析用にピッキングして、存在する芽胞形成細菌を同定した（表１３）。
【０３３２】
２日目の「発芽可能」画分および７日目の「芽胞形成可能」画分を、記載されたような（例えば、実施例１６参照）マウス予防アッセイにおける処置として用いた。対照として、ドナー（ドナーＢ）から調製された１０％糞便懸濁液も、糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）をモデル化するためにマウスに投与した。本研究の種々の試験および対照部門の体重減少および死亡率が図１７にプロットされ、表１５に要約されており、表１５には投薬情報も含まれている。データは、「発芽可能」画分および「芽胞形成可能」画分の両方が、予防マウスモデル（例えば、実施例１６参照）においてクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）暴露に対する保護を与えるのに効果的であることを明らかに示している。これらの分画の有効性はさらに、分画が元の芽胞調製物由来のあらゆる潜在的な混入物をさらに希釈するため、存在する種が芽胞画分の有効性に関与していることを示している。
【０３３３】
図１６参照：２日後の「発芽可能」画分（左）および芽胞形成可能画分（右）のＤＰＡおよびＣＦＵ／ｍｌによる力価。７日間の増殖の後に作成された「芽胞形成可能」画分を、発芽および増殖アッセイまたは前述（実施例２１参照）の通りのＤＰＡ含量を用いて、前述の通りに測定した。
【０３３４】
「発芽可能」画分および「芽胞形成可能」画分中に存在する種を、ピッキングしたコロニーの完全長１６Ｓ配列決定によって、および画分自体の１６Ｓ  ＮＧＳ配列決定によって、決定した。ピッキングしたコロニーのデータは、クロストリジウム属種が両方の画分中で非常に豊富であることを示しており、一方、ＮＧＳデータは、エタノール処理芽胞調製物中に典型的に存在する他の芽胞形成性生物が存在することを明らかにしている。
【０３３５】
結果を以下に示す：表１３参照。コロニーピッキング法によって「発芽可能」であると確認された種および「芽胞形成可能」であると確認された種。表ＹＹＹ参照。１６Ｓ−Ｖ４  ＮＧＳアプローチを用いて「発芽可能」であると確認された種。表ＺＺＺを参照。１６ｓ−Ｖ４  ＮＧＳアプローチを用いて「芽胞形成可能」であると確認された種。図１７を参照：マウス予防モデルは、「発芽可能」調製物および「芽胞形成可能な」調製物がクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）暴露に対して保護的であることを示している。各プロットは、実験過程における、−１日目に対する個々のマウスの重量の変化を追っている。実験過程における死亡数は、図表の最上段に示され、６日目前の線の終結によって示される。上段パネル（左から右）は、ビヒクル対照部門、糞便懸濁液部門、および無処置（untreated naive）対照部門であり、一方、下段パネルは、エタノール処理、勾配精製した芽胞調製物；エタノール処理、勾配精製した「発芽可能な」調製物、およびエタノール処理、勾配精製した「芽胞形成可能な」調製物である。表１５参照：予防マウスモデルの結果および投薬情報
【０３３６】
実施例２４：予防マウスにおけるドナー貯蔵の有効性
貯蔵されたドナー試料の有効性および投薬を試験するために、前述の２つ以上のドナー試料から混合された提供物と共に、クロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）予防マウスモデル（例えば、実施例１６参照）が用いられる。種々の投薬においての、単一ドナーから得られた芽胞産物と比較した、混合された芽胞産物による体重減少および死亡率によって、これら２つの処置計画が等価であるかどうか、または一方がもう一方よりも有意により良好であるかどうかが決定される。
【０３３７】
単一のドナーまたは複数のドナーから得られた芽胞産物の投薬は、１Ｅ４〜１Ｅ１０ＣＦＵ／ｍｌである。芽胞産物は、１〜１０の範囲のあらゆる数のドナーから得られた産物から、等濃度または異なる既知の濃度で混合される。
【０３３８】
さらに、この方法を用いることで、生産を目的として芽胞画分を増殖させることができる。生産を目的として、濃縮芽胞画分（例えば、精製およびＥｔＯＨ処理された糞便試料画分）が、複数の分割量で保存されて、生存芽胞形成性生物のバンクが形成される。次に、このバンクの１つの分割量が、発芽処理と、その後の培地中、および芽胞形成性生物に対し広く許容的であり芽胞形成を促進する条件下での培養によって回復される。適切な増幅時間の後、芽胞を含む増幅された細菌が回収され、この調製物が溶媒処理または熱処理されて、芽胞画分が単離される。この画分は、非芽胞形態および培養液構成物からさらに精製され得る。増幅、芽胞単離および所望による精製の過程は、規模を増加させながら繰り返されて、さらなる使用のための大きな量が作製され得る。十分な発芽可能／芽胞形成可能物質が増幅によって蓄積された場合、それはさらに精製、濃縮もしくは希釈、および／またはさらなる使用（例えば、臨床投薬）に適した状態に保存され得る。
【０３３９】
上記の過程に特徴が組み込まれることで、さらなる有用性、特に、臨床使用等の産物の適用に適したものにされ得る。開始芽胞画分の生成が、（ｃＧＭＰの）制御条件下で行われ、非芽胞生物を高度に除去することが確認され得る。発芽は、ウシ胆汁等の天然物よりも標準化可能な試薬（例えば、胆汁酸塩の合成混合物）を用いて行われ得る。増幅は、臨床における安全性のために好ましい成分（例えば、適格な動物から供給、または非動物から供給）を含む培地を用いて行われ得る。条件は、芽胞形成生物の一貫した組成が、混入の傾向が少なくなるように、およびスケールアップにより適したもの（例えば、フィードバック調節ループを有する密閉撹拌された発酵槽）となるように、整えられ得る。前記プロセスから得られた芽胞形成生物は、単独または組み合わされて非芽胞および他のプロセス残留物（例えば、溶媒処理）を厳密に除去する手順、水性二相抽出、並びに／または６０℃超時間加熱処理を用いて単離され得る。保存には、長期の棚貯蔵に適した好ましい剤形への変換を可能にするための賦形剤の添加および／または条件の調整、例えば、トレハロースの添加、その後の凍結乾燥または噴霧乾燥、前記粉末と微結晶性セルロースとのさらなる混合、およびゼラチンカプセル内への封入による経口投与可能な産物の形成が含まれ得る。
【０３４０】
実施例２５：芽胞組成物で処置された患者における病原体保菌の生着、増大および減少  相補的ゲノム法（complementary genomic method）および微生物学的方法を用いて、処置前および処置後４週間目までの、患者１、２、３、４、および５、６、７、８、９、および１０から得られた微生物叢の組成を特徴付けした。
【０３４１】
患者におけるエタノール処理芽胞調製物による処置から生着するＯＴＵ、および患者のマイクロバイオームがそれに応じてどのように変化するかを決定するために、マイクロバイオームを、エタノール処理芽胞調製物による処置前および処置を受けてから２５日後までの１６Ｓ−Ｖ４配列決定によって特徴付けした。例として、エタノール処理芽胞調製物による患者１の処置は、芽胞処置からのＯＴＵの生着および患者のマイクロバイオームにおける増大をもたらした（図１８および図１９）。処置後２５日目までに、総微生物保菌は以下の分類群の種によって占められた：バクテロイデス、スッテレラ（Sutterella）、ルミノコッカス、ブラウチア（Blautia）、ユーバクテリウム、ゲムミゲル（Gemmiger）／フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）、および非芽胞形成性ラクトバチルス（特定のＯＴＵについては表１６および表２を参照）。最初の２つの属は芽胞を形成しないＯＴＵを表し、一方、後者の分類群は芽胞を形成すると考えられているＯＴＵを表す。
【０３４２】
エタノール処理芽胞調製物による患者処置は、処置前よりも大きな多様性を有する微生物生態環境の確立に繋がる（図１８）。ゲノムに基づくマイクロバイオームの特徴付けにより、処置前患者には存在していなかったある範囲のＯＴＵの生着が確認された（表１６）。これらのＯＴＵは、芽胞形成可能な細菌種および芽胞形成不可な細菌種の両方、並びに複数の系統的クレイドを表すＯＴＵを含む。処置前の患者１に存在しなかった生物は、エタノール処理芽胞画分から直接生着するか、または健康で多様な微生物叢に有利な腸内環境の構築によって増大される。さらに、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）群種は、患者１および患者２において４対数および６対数増加した（図２０）。
【０３４３】
増大した生態環境を構成するＯＴＵは、処置前の患者内に存在していない、および／または極端に低い頻度で存在するため、それらは、総微生物保菌の重要な画分を構成しておらず、ゲノムアッセイ法および／または微生物検定法では検出不可である。生着中および増加された生態環境の構成要素であるＯＴＵを、処置後の相対的存在量が増加し、且つ、それぞれ、（ｉ）エタノール処理芽胞調製物中に存在し、処置前患者には存在しないＯＴＵ、または（ｉｉ）エタノール処理芽胞調製物中に存在しないが、処置による好ましい増殖条件の形成によって、前記調製物による処置後の時間を通して相対的存在量が増加するＯＴＵを特徴付けることによって、同定した。注目すべきことに、後者のＯＴＵは、患者内で低頻度蓄積から増殖し得る、または食事等の外来供給源から導入され得る。増大または生着した生態環境の「コア」を構成するＯＴＵは、それらが生着および／または増大することが確認された合計患者の割合によって定義され得；この割合が大きいほど、共生バランスが崩れた生態環境からの変化の触媒に関与するコア生態環境の一部である可能性が高い。生態環境において最も優勢なＯＴＵは、いくつかの方法を用いて、例えば、限定はされないが、増加した生態環境または生着した生態環境内で最も大きな相対的存在量を有するＯＴＵを定義すること、および相対的存在量閾値の定義することで、同定され得る。例として、患者１の増大した生態環境内で最も優勢なＯＴＵは、この患者の増大した生態環境内の微生物保菌の６０％を共に構成する、最も大きな相対的存在量を有するＯＴＵを定義することによって同定された。
【０３４４】
図１８参照：エタノール処理芽胞処置試料並びに処置前患者試料および処置後患者試料において測定された微生物の多様性。全体としての微生物の多様性は、Ｃｈａｏ１α多様性指数を用いて定義され、様々なゲノムサンプリング深度で測定されることで、標的試料中のマイクロバイオームをアッセイするのに十分な配列包括度が確認される。処置前患者（紫）は、エタノール処理芽胞処置（赤）、並びに５日目（青）、１４日目（オレンジ）、および２５日目（緑色）の処置後患者と比較して、全体の多様性が有意に減少したマイクロバイオームを有していた。
【０３４５】
図１９参照：患者の微生物生態環境は、共生バランスが崩れた状態から健康状態まで、エタノール処理芽胞処置による処置によって変化する。処置前患者および処置後患者の全体の多様性並びにマイクロバイオームの構造（ブレイ・カーティスβ多様性）に基づく主座標分析は、芽胞処置からのＯＵＴの生着および患者の微生物生態環境の増大が、処置前マイクロバイオームともエタノール処理芽胞処置の生態環境とも異なる微生物生態環境をもたらすことを示している（表１６）。
【０３４６】
図２０参照：患者におけるバクテロイデス属種の増大。糞便処置前および処置後４週目のバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）群種の１ｃｆｕ／ｇ当たりの数の比較は、４対数以上の増加を示している。１６Ｓ−Ｖ４  ＯＴＵ同定がＯＴＵを特定の種に割り当てる能力は、特定の種または種の群の１６Ｓ遺伝子の１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能に部分的に依存している。系統樹の様々な領域に対する利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、並びに様々な種の間での１６Ｓ遺伝子における固有の変異性の両方によって、所与の配列リードに対する分類学的アノテーションの明確性は決定される。系統樹の形態的性質、および系統樹がＯＴＵの互いの階層関係を、それらの配列類似性および根底にある進化モデルに基づいて表しているということを前提として、あるリードの分類学的アノテーションは、クレイドに基づく割当法を用いて、より高いレベルにロールアップされ得る（表１）。このアプローチを用いることで、クレイドは、系統学の当業者によく知られている最尤または他の系統学的モデルを用いて完全長１６Ｓ配列から構築された系統樹の形態に基づいて定義される。クレイドが構築されことにより、所与のクレイド内の全てのＯＴＵが、（ｉ）互いに、特定の数のブートストラップによって裏付けられたノード以内であること（一般的には、１〜５のブートストラップ）、および（ｉｉ）５％遺伝子類似度以内であることが確実となる。同一クレイド内のＯＴＵは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて、異なるクレイド内のＯＴＵとは遺伝的および系統学的に異なるものとして区別され得る。同一クレイドに含まれるＯＴＵは進化的に近縁関係にあり、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いに区別可能である場合も区別可能でない場合もある。クレイドに基づく解析の能力は、同一クレイドの構成要素が、それらの進化的関連性に起因して、微生物環境（例えば、ヒトの腸内で見られるもの）において類似の機能的役割を果たすということである。ある種を同一クレイド由来の別の種と置換する組成は、保存された生態学的機能を有する可能性が高く、それ故、本発明において有用である。
【０３４７】
便試料を等分し、１００％エタノール（ゲノムの特徴付け用）または１５％グリセロールを含有するＰＢＳ（微生物の単離用）中で１０×体積／重量で再懸濁し、次に、使用が必要になるまで−８０℃で貯蔵した。ゲノムの１６Ｓ配列解析のために、プレート単離物からピッキングされたコロニーは、実施例１１および１２に記載されるように特徴付けられた完全長１６Ｓ配列を有していた。一次便試料を、実施例１０の不均一試料に対する方法を用い１６Ｓ−Ｖ４領域を標的として作製した。
【０３４８】
特に、所与のＯＴＵの単離物の１６Ｓ配列は、種および属の実際の分類学的割当が、それらが収まるクレイドの他の構成要素と分類学的に異なることを示唆している場合があっても、それらのそれぞれのクレイド内に系統学的に配置される。微生物学的特性に基づいてＯＴＵに与えられた分類学的名称と遺伝子配列決定に基づいてＯＴＵに与えられた分類学的名称の間の矛盾は、文献から存在が知られている。この表における注釈のＯＴＵは、分類学的名称を割り当てる異なる方法の間で相違することが知られている。
【０３４９】
患者内へのエタノール処理芽胞調製物処置からのＯＴＵの生着および結果としての常在性マイクロバイオームの増大は、患者におけるクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）以外の病原性種の保菌の有意な減少および排除をもたらした。一次便試料の１６Ｓ−Ｖ４配列決定は、処置前において、２０％のリードがクレブシエラ属由来であってこと、およびさらに１９％がフソバクテリウム属に割り当てられたことを示した。これらの注目すべきデータは、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染および慢性的な抗生物質の使用に関連する深刻に共生バランスが崩れた微生物叢の証拠である。健常人において、クレブシエラはＨＭＰデータベース（www.hmpdacc.org）の解析に基づくと約２％のみの対象におけるヒトマイクロバイオームの常在菌であり、クレブシエラの平均相対的存在量はこれらのヒトの便において約０．０９％のみである。処置前の患者１における２０％の相対的存在量でのクレブシエラの驚くべき存在は、「病原性共生菌」が、腸内に通常存在する共生生物よりも過剰に増殖し、それらを排除することを可能にする、炎症誘発性腸内環境の指標である。同様に、フソバクテリウム属の劇的な過剰増殖は、深刻に共生バランスが崩れた腸内微生物叢を示している。フソバクテリウム属の１種であるフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（１６Ｓ−Ｖ４に基づきフソバクテリウム属種３＿１＿３３と系統学的に区別可能なＯＴＵ）は、ヒトにおけるＩＢＤ、クローン病、および結腸直腸がんとのその関連性並びに動物モデルにおける結腸直腸がんの発生での実証されたその原因的役割に基づいて、「新興腸内病原体」と称されている［Allen-Vercoe, Gut Microbes (2011) 2:294-8］。重要なことに、クレブシエラ属もフソバクテリウム属も、２５日目までには１６Ｓ−Ｖ４リードにおいて検出されなかった（表１８）。
【０３５０】
クレブシエラおよび他の腸内細菌科による腸のコロニー形成をさらに特徴付けするため、並びにこれらの生物を種分化させるために、ＰＢＳ−グリセロール懸濁液として−８０Ｃに保存された処置前および２５日目の糞便試料を、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース培地（グラム陰性腸内細菌に対し選択的）およびＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ培地（クレブシエラ種に対し選択的）を含む種々の選択培地上に播種した［Van Cregten et al, J. Clin. Microbiol. (1984) 20: 936-41］。患者試料内で同定された腸内細菌には、肺炎桿菌（K. pneumoniae）、クレブシエラ属種Ｃｏ＿９９３５および大腸菌（E. coli）が含まれていた。著しいことに、それぞれのクレブシエラ属種は２〜４対数減少したが、一方、健常な微生物叢内に存在する通常の共生生物である大腸菌は、１対数未満減少した（表１９）。クレブシエラ菌種保菌におけるこの減少は複数の患者にわたって一致している（表１９）。４人の別々の患者を、処置前および処置の４週間後にクレブシエラ菌種の存在について評価した。前述の選択的なＳｉｍｍｏｎｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ培地上での増殖によって、クレブシエラ菌種を検出した。連続希釈および播種、その後の形態学的に異なる種のｃｆｕ／ｍＬ力価の決定、並びにそれらの異なる形態学的クラスの代表の１６Ｓ完全長配列同定によって、特定の種の力価の算出が可能とされた。
【０３５１】
バクテロイデス属は胃腸管内微生物叢の重要な構成要素であり；Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔから得られた便試料の１００％が、バクテロイデス属の少なくとも１つの種を、０．９６％〜９３．９２％の範囲のこれらの試料中の全体的相対存在量で、５２．６７％の相対的存在量中央値で、含有している（ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ参照データセットＨＭＳＭＣＰ）。腸内のバクテロイデス属は、アミノ酸発酵および複合多糖類の分解と関連付けられている。腸内におけるその存在は、典型的な西洋の食事において見られる動物由来産物が豊富な食事によって増強される［David, L. A. et al, Nature (2013) doi:10.1038/nature12820］。著しいことに、処置前に、バクテロイデス属にマッピングされた患者１由来の１６Ｓ−Ｖ４リードのうち０．００８％未満が、バクテロイデス属種が不在であること、または生存可能なバクテロイデス属が患者の腸内マイクロバイオームの非常に微量な成分に対して減少されていることを、強く示唆している。処置後、１６Ｓ−Ｖ４リードの４２％以上が処置の５日以内にバクテロイデス属に割り当てられ得、処置後２５日目までに、患者の腸内マイクロバイオームの５９．４８％はバクテロイデス属から構成されていた。これらの結果は、２つの異なるバクテロイデス属選択培地：バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）群種に対して選択的なＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  Ｂｉｌｅ  Ｅｓｃｕｌｉｎ（ＢＢＥ）寒天［Livingston, S.J.et al J. Clin. Microbiol (1978). 7: 448-453］およびＰｏｌｙａｍｉｎｅ  Ｆｒｅｅ  Ａｒａｂｉｎｏｓｅ（ＰＦＡ）寒天［Noack et al. J. Nutr. (1998) 128: 1385-1391；グルコースをアラビノースと置換することによって改変］上に播種された処置前試料中の検出可能なバクテロイデス属の非存在によって、微生物学的に確認された。高度に選択的なＢＢＥ寒天は、２×１０３ｃｆｕ／ｇ未満という検出限界を有していたが、一方、ＰＦＡ寒天上でのバクテロイデス属の検出限界は、その培地上での処置前試料中の複数の非バクテロイデス属種の増殖に起因して、およそ２×１０７ｃｆｕ／ｇであった。２５日目のバクテロイデス属種のコロニー計数は最大２×１０１０ｃｆｕ／ｇであったが、これは、１６Ｓ−Ｖ４配列決定と一致して、患者１内の腸内微生物叢の大規模な再構築を示している（表２０）。
【０３５２】
２５日目（および１６Ｓ−Ｖ４配列決定によって示される５日目ほども早期）の患者１におけるバクテロイデス属の有意な存在量は注目すべきものである。生存可能なバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）群種は、部生物学的播種（１０ｃｆｕ／ｍｌの検出限界）に基づいて、エタノール処理芽胞個体群中に存在しなかった。従って、患者１へのエタノール処理芽胞個体群の投与は、芽胞形成性種の生着だけでなく、バクテロイデス属種の再増殖を可能にする適所の構築を通じて、健常人内に通常存在する高レベルの非芽胞形成性種の再建ももたらした。これらの生物は、患者1の胃腸管内に非常に低い存在量で存在したか、またはそれから高力価まで回復し得る胃腸管内の貯蔵所内に存在した可能性が最も高かった。それらの種は、処置後の食事から経口摂取によっても再接種され得る。これは、エタノール処理芽胞個体群中に存在しないＯＴＵによる腸の健康な再増殖、「増大」と称される。増大は、エタノール処理芽胞個体群それ自体の中の実際の成分生物を超えて、多様なアレイまたは共生生物を播種することによって健常な微生物叢を再建するためにエタノール処理芽胞生態環境を用いる能力を示すという点で重要な現象であり；特に、芽胞処置それ自体および芽胞組成物からのＯＴＵの生着は、共生バランスが崩れたマイクロバイオームを健康に関連する微生物生態環境へ変化させるために必要とされるＯＴＵの増殖を可能にする適所を構築する。患者１の腸内のバクテロイデス属種の多様性およびそれらのおおよその相対的存在量は表２１に示され、少なくとも８種の異なる種が含まれる。
【０３５３】
図２１参照：エタノール処理芽胞個体群で処置された後の、患者のマイクロバイオーム内での種の生着と種の増大の比較。記載される生着または増加した種の相対的存在量は、１６Ｓ配列リードの数に基づいて決定された。各プロットは、再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のエタノール処理芽胞個体群で処置された異なる患者から得られる。
【０３５４】
イミペネム耐性腸内細菌科の保菌に対するエタノール処理芽胞個体群処置の影響を、患者２、４および５から得られた処置前および２８日目の臨床試料をＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース＋１μｇ／ｍＬのイミペネム上に播種することで評価した。耐性生物を形態によってスコア化し、列挙し、上記のようにＤＮＡを完全長１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列決定法にかけた。単離物は、モルガン菌（Morganella morganii）、プロビデンシア・レットゲリ（Providenciarettgeri）およびプロテウス・ペンネリ（Proteus pennerii）と同定された。これらはそれぞれ腸内共生生物であり；過剰増殖は、侵襲的な抗生物質処置および、場合によっては、入院を必要とする、菌血症および／または尿路感染症をもたらし得る［Kim, B-N, et al Scan J. Inf Dis (2003) 35: 98-103; Lee, I-K and Liu,J-W J. Microbiol Immunol Infect (2006) 39: 328-334; O’Hara et al, Clin MicrobiolRev (2000) 13: 534］。患者による処置前および２８日目における生物の力価を表２２に示す。重要なことに、エタノール処理芽胞調製物の投与は、複数のイミペネム耐性生物の腸内細菌科保菌の５症例のうち４症例において、１００倍超の減少をもたらした（表２２）。
【０３５５】
種分化および増大に加えて、患者４からの各生物の複数の単離物を、抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を定量的に決定するために、イミペネムの２倍希釈系列を含有する９６ウェルトレー内で一晩増殖させた。生物の増殖は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅプレートリーダー上での６００ｎｍにおける光散乱によって検出した。臨床背景において、これらの種は、それらが１μｇ／ｍＬ以上のＭＩＣを有する場合に、イミペネムに対して耐性であるとみなされる。患者Ｄから得られた処置前試料からのモルガン菌（M. morganii）単離物は、２〜４μｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、プロテウス・ペンネリ（P. pennerii）単離物は４〜８μｇ／ｍＬのＭＩＣを有していた。従って、患者４に投与されたエタノール処理芽胞個体群は、２つのイミペネム耐性生物の排除を引き起こした（表１６）。
【０３５６】
実施例２６．
細菌の濃縮および精製
個々の菌種を精製するため、その密度が単一コロニーの別々の分離を可能にする希釈プレートを選択した。コロニーを無菌器具（無菌のループまたはつまようじ）でピッキングし、ＢＢＡまたは他の固体培地に再画線培養した。プレートを３７℃で３〜７日間インキュベートした。一つまたは複数の十分に単離された、主要な形態型の単一コロニーを、再画線培養した。この過程を、単一の安定なコロニー形態が観察されるまで、少なくとも３回繰り返した。次に、単離された微生物を液体培地中で２４時間以上嫌気的に培養して、１０６〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌの純粋培養物を得た。液体増殖培地には、酵母抽出物、ヘミン、システイン、および炭水化物（例えば、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン）を添加した、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎに基づく培地（アトラス社、Handbook of Microbiological Media, 4th ed, ASM Press, 2010）、または前述（例えば、実施例１４を参照）の他の培地が含まれ得る。培養物を１０，０００×ｇで５分間遠心して細菌をペレット化し、消費された培地を除去し、細菌を無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。無菌７５％グリセロールを、２０％の最終濃度となるように加えた。グリセロールストックの分割量を連続希釈および播種によって滴定した。ストックの残りをドライアイス上で１０〜１５分間凍結した後、長期貯蔵のために−８０Ｃに置いた。
【０３５７】
実施例２７．
細胞バンク調製。
菌種の細胞バンク（ＲＣＢ）を以下の通りに作製した。菌種を、−８０℃凍結グリセロールストックからヘミンまたはビタミンＫを含有するＢｒｕｃｅｌｌａ血液寒天（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press,2010）、Ｍ２ＧＳＣ（アトラス社、Handbook of Microbiological Media、第４版、ASM Press, 2010）または他の固体増殖培地に移し、１０：１０：８０のＨ２：ＣＯ２：Ｎ２のガス混合物を含む嫌気性チャンバー内で３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートした。次に、単一コロニーをピッキングし、それを用いて、２５０ｍｌ〜１ＬのＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎブロス、Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎブロス、Ｍ２ＧＳＣブロスまたは他の増殖培地に接種し、増殖の、中〜後期の対数期まで、または静止期まで増殖させた。あるいは、単一コロニーを１０ｍｌの試験的培養の接種に用いてもよく、これを次に、大容量培養の接種に用いた。回収時の増殖培地および増殖期は、所望のインビトロまたはインビボと関連し得る、細胞力価、芽胞形成（所望であれば）および表現型を増強するように選択した。所望により、培養物を静的にまたは振盪させながら、どちらが最大の細胞力価を生み出すかに応じて、増殖させた。次に、培養物を５０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により１０倍以上に濃縮し、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋１５％グリセロール中に懸濁した。１ｍｌの分割量を１．８ｍｌクライオバイアルに移し、次にこれをドライアイス上で凍結し、−８０Ｃで保存した。所与の細胞バンクの同一性を、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅、その後のＳａｎｇｅｒ直接サイクル配列決定、および精選されたｒＤＮＡデータベースとの比較によって確認して、分類学的ＩＤを決定した。各バンクは、Ｂｒｕｃｅｌｌａ血液寒天またはＭ２ＧＳＣ寒天への画線培養後に単一形態のコロニーを生み出すことを確認された。２つ以上の形態が観察された場合、コロニーは、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲおよび配列決定解析によって、予想された種であることを確認された。異なるコロニー形態が純粋な培養物内で観察され得、種々の細菌において、異なるコロニー形態の機構は十分に説明されており（van der Woude, Clinical Microbiology Reviews, 17:518, 2004）、例えば、クロストリジウム属種（Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual, 6th Ed, Jousimie-Somer,et al 2002）において説明されている。偏性嫌気性菌について、ＲＣＢは１０ｃｆｕ／ｍｌの検出限界で好気的コロニー形成単位を欠くことが確認された。
【０３５８】
実施例２８．力価決定
新しく回収し、洗浄および濃縮した培養物の１ｍｌ当たりの生細胞の数を、ＲＣＢの連続希釈物をＢｒｕｃｅｌｌａ血液寒天または他の固体培地に播種することにより決定したところ、１０６から１０１０ｃｆｕ／ｍｌまで変動した。生存率に対する凍結の影響を、ドライアイス上または−８０℃と、その後の室温の嫌気性チャンバー内での解凍による１回または２回の凍結解凍サイクルの後にバンクを滴定することによって、決定した。いくつかの系統が、１回目および／または２回目の凍結解凍の後に生存可能なｃｆｕ／ｍｌにおいて１〜３対数の減少を示したが、他の生存率は影響されなかった。
【０３５９】
実施例２９．細菌組成物の作製
個々の系統を通常、氷上で解凍し、嫌気性チャンバーの中で混合して混合物を作製し、その後、−８０℃で２回目の凍結を行って、混合試料を保存する。インビトロまたはインビボアッセイのための系統の組み合わせを作製する場合、個々の系統の２回目の凍結解凍力価に基づいて最終混合物中のｃｆｕを評価した。例えばげっ歯類では、１系統あたり１ｅ４〜１ｅ１０を送達するために、系統が同数で組み合わせられ得る。さらに、いくつかの細菌は、全ての細菌が１ｅ１０で存在する組成物の生産を可能にする細胞バンクを得るのに十分な力価にまで増殖しなくてもよい。
【０３６０】
実施例３０．キーストーンＯＴＵおよび機能の同定
人体は、微生物叢、およびマイクロバイオームがヒトシステム（例えば、代謝システム、免疫システム、および神経システム）の基礎的健康機能における重要な役割を担っている生態系である。微生物叢および結果として生じるマイクロバイオームは、互いとそれらの宿主（すなわち、哺乳類対象）と相互作用して固有の生物多様性および機能的特徴を有する動的単位を形成する単一対象内に共存する微生物の生態環境を含む。相互作用する微生物のこれらのネットワーク（すなわち生態環境）の中では、特定の構成要素は他よりも有意に貢献する可能性があり；従って、これらの構成要素は多くの様々な生態環境内にも存在し、生態環境からのこれらの微生物の減少は、特定の生態環境の機能的能力に対して重大な影響をもたらし得る。Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐａｉｎｅは、１９６９年に「キーストーン種」という概念を造り出して（Paine RT. 1969. A note on trophic complexity and community stability.The American Naturalist 103: 91-93を参照）、生態群集内でのそれらの存在量にかかわらず所与の生態系に不可欠なそのような要となる種の存在を説明した。Ｐａｉｎｅは、海洋システムにおけるピサステル・オクラセウス（Pisaster ochraceus）というヒトデの役割を最初に説明しており、それ以後、この概念は多数の生態系において実験によって実証されている。
【０３６１】
キーストーンＯＴＵおよび／または機能は、特定の表現型を共有する定義済みの一連の試料から明らかにされる、ネットワーク生態環境の解析によって計算的に得られる。キーストーンＯＴＵおよび／または機能は、以下の判定基準のうちの２つ以上を満たす、定義済みの一連のネットワーク内の全てのノードと定められる。判定基準１を用いて、ノードがネットワーク内に頻繁に観察され、そのノードが観察されるネットワークが多数の個々の対象内に存在すると；ネットワーク内でのこれらのノードの出現頻度および個体におけるネットワークの広播性は、これらのノードが多くの個体において重要な生物学的機能を実行していることを示している。判定基準２を用いて、ノードがネットワーク内で頻繁に観察され、ノードが観察されるそのようなネットワークが多数のノードを含有すると；これらのノードは、従って、「スーパーコネクター（super-connector）」であり、これは、それらが多数のネットワークの核を形成し、従って、所与の生態環境に対するそれらの機能的寄与に関して高度な生物学的重要性を有していることを意味している。判定基準３を用いて、ノードが多数のノードを含有するネットワーク内に存在し（すなわち、それらが巨大なネットワークである）、ノードが存在するネットワーク多数の対象に生じていると；多くの個体に生じている巨大なネットワークが偶然に単独で生じることはあり得ず、生物学的関連性を強力に示唆しているため、これらのネットワークは潜在的に高度に重要である。所望により、ノードがネットワーク生態環境内で観察される頻度、所与のネットワークが対象試料にわたって観察される頻度、およびキーストーンノードとみなされる所与のネットワークのサイズの所望の閾値は、これらの変数の分布．の５０、７０、８０、または９０パーセンタイル値によって定義される。所望により、必要な閾値は、統計的有意性の標準的なパラメトリックまたはノンパラメトリックな基準を用いて所与の変数の平均値または中央値と有意に異なる所与の変数の値によって定義される。別の実施形態では、キーストーンノードは、限定はされないが「健康」等の、目的の試料表現型で生じ、同時に、限定はされないが「疾患」等の、目的でない試料表現型では生じない、ノードと定義される。所望により、キーストーンノードは、有意性を測定するために置換試験データセットを用いて観察されるものと有意に異なることが示されるノードと定義される。
【０３６２】
実施例３１．エタノール処理芽胞調製物からのコア生態環境の同定
６人の異なるドナーから１０個の異なるエタノール処理芽胞調製物を作製した（実施例１５に記載されるように）。芽胞調製物を用いて、各々が再発性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症を患っている、１０人の患者を処置した。実施例１８に記載される包含／除外規準を用いて患者を特定し、実施例１に記載される判定基準を用いてドナーを特定した。どの患者も処置後の４週間の経過観察においてクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の再発を経験しなかったが、文献では、７０〜８０％の対象が抗生物質の休止の後に再発を経験するだろうと予測された［Van Nood, et al, NEJM (2013)］。このことから、複数の異なるドナーおよび提供物から得られたエタノール処理芽胞調製物は、注目すべき臨床効果を示した。
【０３６３】
エタノール処理芽胞調製物の注目すべき臨床効果の根底にあるコア生態環境を定義するため、以下の解析を行った。芽胞調製物のＯＴＵ組成を、１６Ｓ−Ｖ４  ｒＤＮＡ塩基配列決定法および実施例１２によるＯＴＵの計算的割当によって決定した。エタノール処理芽胞調製物中の少なくとも１０個の配列リードを検出するための必要量を保存的閾値として設定して、増幅または配列決定の間のエラーから全く生じそうになかったＯＴＵのみを定義した。ゲノムに基づくマイクロバイオーム特徴付けの当業者によって通例使用される方法は、０．００５％のリード相対的存在量閾値を用い（例えば、Bokulich, A. et al. 2013. Quality-filtering vastly improves diversityestimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods 10: 57-59を参照）、これは、１０以上のリードよりも実質的に低いカットオフがこの解析に用いられたため、この実施例において解析された試料のために得られた配列決定深度を所与として、２以上のリードと同じである。全ての分類学的割当およびクレイド割当を、実施例１２に記載されるように各ＯＴＵに対して行った。得られたＯＴＵ、クレイド割当、および芽胞調製物中の検出頻度のリストは表ＧＢに示される。処置患者内に生着するＯＴＵおよびそれらが生着する患者の割合が表記されており、クレイド、芽胞形成状態、およびキーストーンＯＴＵ状態も同様に表記される。アスタリスク付きのＯＴＵは８０％以上のエタノール調製物中に生じ、５０％以上の処置患者内に生着する。
【０３６４】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【０３６５】
次に、芽胞調製物のコア生態環境の構成要素とみなされているＯＴＵについて、そのＯＴＵは患者内に生着することを示されなければならないと推論された。生着は２つの理由で重要である。第一に、生着は、マイクロバイオームを形成し直し、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のコロニー形成を排除する機構の必要条件である。より高い頻度で生着するＯＴＵは、芽胞調製物のコア生態環境の成分である可能性が高い。第二に、芽胞調製物を配列決定することにより検出されたＯＴＵ（表ＧＢにあるような）は、生育不能な芽胞または芽胞と関係ない他の混入ＤＮＡ分子を含み得る。ＯＴＵは患者内に生着することを示されなければならないという必要条件は、生育不能な芽胞または混入配列を表すＯＴＵを排除する。表ＧＢはまた、少なくとも１人の処置後患者にも生着することが示された芽胞調製物中で検出された全てのＯＴＵを同定している。分析されたエタノール芽胞調製物の大きな割合で存在し、多数の患者に生着するＯＴＵは、共生バランスが崩れた疾病性生態環境から健常マイクロバイオームへの変化を触媒する可能性が高い、コア生態環境の一部である。
【０３６６】
第三のレンズ（lens）が、芽胞調製物のコア生態環境への洞察をさらに正確にするために適用された。計算に基づいたネットワーク解析は、健常人の広範な個体群の微生物叢内に存在する微生物生態環境の描写を可能にしている。これらのネットワーク生態環境は複数のＯＴＵから構成され、そのいくつかはキーストーンＯＴＵと定義される。キーストーンＯＴＵは、実施例３０に記載されるように、計算的に定義される。キーストーンＯＴＵは、それらが存在し、それ自体が健常対象内のネットワーク生態環境の機能の中心となるという点で、微生物生態環境の基礎を形成する。健常対象と関連する微生物生態環境と関連するキーストーンＯＴＵはしばしば、疾患を有する対象においては欠損しているかまたは低下したレベルで存在する。キーストーンＯＴＵは、対象において、低存在量、中程度の存在量、または高存在量で存在し得る。表ＧＢはさらに、芽胞調製物中のどのＯＴＵが、健常であり疾患を有していない個体ともっぱら関連しているキーストーンＯＴＵであるかを記述している。
【０３６７】
このデータからはいくつかの重要な発見がある。６人のドナーおよび１０個の提供物から得られた芽胞調製物の全てに、合計１６の比較的少数の種が検出される。ＨＭＰデータベース（www.hmpdacc.org）によって健常人にわたって共生種の極端な変動性が説明されていることから、これは驚くべきことである。少数の一致したＯＴＵの存在は、コア生態環境の概念を支持するものである。生着データはさらにこの結論を支持している。回帰分析は、芽胞調製物中の検出の頻度およびドナーにおける生着の頻度の間で有意な相関を示している：Ｒ＝０．４３（ｐ＜０．００１）。芽胞調製物中に頻繁に検出されるＯＴＵは生着する、または生着すべきであるという、演繹的な必要条件は存在しない。例えば、１０個全ての芽胞調製物中に存在する芽胞形成体であるルチスポラ・テルモピラ（Lutispora thermophila）は、いずれの患者にも生着しなかった。グラム陰性嫌気性菌であるバイロフィラ・ワーズワーシア（Bilophila wadsworthia）は、１０個中９個の提供物の中に存在したが、いずれの患者にも生着せず、このことは、このグラム陰性嫌気性菌が、エタノール処理芽胞調製物中の生育不能な混入物である可能性が高いことを示している。最後に、芽胞調製物中で最も頻度の高いＯＴＵの中で先に定義されたキーストーンＯＴＵが高度に優勢であることは注目に値する。
【０３６８】
個々のＯＴＵを順位付けするための「コア生態環境スコア」（ＣＥＳ）の作成を可能にする、３つの要素：芽胞調製物の普及率（prevalence）、生着の頻度、およびキーストーンＯＴＵとしての指名、が存在する。ＣＥＳは以下の通りに定義される：
芽胞調製物中のＯＴＵの存在に対して４０％の増量
１〜３個の芽胞調製物中の存在に対して１の乗数
４〜８個の芽胞調製物中の存在に対して２．５の乗数
９個以上の芽胞調製物中の存在に対して５の乗数
１人の患者における生着に対して４０％の増量
１〜４人の患者における生着に対して１の乗数
５〜６人の患者における生着に対して２．５の乗数
７人以上の患者における生着に対して５の乗数
キーストーンＯＴＵに対して２０％の増量
キーストーンＯＴＵに対して１の乗数  非キーストーンＯＴＵに対して０の乗数
【０３６９】
この指針を用いて、ＣＥＳは５の最大可能スコアおよび０．８の最小可能スコアを有する。一例として、３人の患者に生着し、キーストーンＯＴＵである、１０個中８個の芽胞調製物中に存在するＯＴＵは、以下のＣＥＳを割り当てられるだろう：ＣＥＳ＝（０．４×２．５）＋（０．４×１）＋（０．２×１）＝１．６
【０３７０】
表ＧＣは、ＯＴＵがコア生態環境の一成分とみなされるために生着することが示されなければならないというさらなる要件と共に、ＣＥＳによって、上位２０種のＯＴＵを順位付けしている。
【０３７１】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【０３７２】
実施例３２．コア生態環境の効果的な一部の定義
ヒト胃腸管内の生物の数、および健常人の間での多様性は、健常な腸内マイクロバイオーム生態環境の機能的冗長性を示している（The Human Microbiome Consortia. 2012. Structure, function and diversityof the healthy human microbiome. Nature 486: 207-214を参照）。この冗長性は、コア生態環境の一部がエタノール処理芽胞調製物の治療的に有益な成分を説明すること、およびその生態環境が機能的特徴であることを前提として、そのような一部がそれ自体、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染症の治療に有用な組成であり得ることを、可能性の高いものにしている。ＣＥＳを用いて、個々のＯＴＵは、コア生態環境の効果的な一部としての評価について、優先順位をつけられ得る。
【０３７３】
機能的冗長性の別の態様は、進化的に関連した生物（すなわち、系統樹上で互いに近接した生物、例えば、単一のクレイド内に分類された生物）も、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を治療するための、コア生態環境またはその一部における有効な代替になることである。
【０３７４】
当業者にとって、インビトロ（例えば、以下の実施例３３参照）またはインビボ（例えば、実施例１６または１７参照）で試験するための適切なＯＴＵの一部の選択は、簡単である。一部は、より高いＣＥＳを有するＯＴＵ（例えば、表ＧＣに記載されるＯＴＵ）に特に重点を置いて、表ＧＢから任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個以上のＯＴＵを選択することによって、選択され得る。さらに、上記の実施例１２および表１で定義されたクレイド関連性を用いて、関連したＯＴＵが許容できるＣＥＳ値を有するＯＴＵの代替として選択され得る。これらの生物は、適切な培地（上記の実施例１４に記載された培地から選択される）を用いて嫌気的にインビトロで培養され、その後、所望の比で混合され得る。マウスのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）モデルにおける典型的な実験は、少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０９超のコロニー形成単位の各微生物を、組成物中で利用する。培養物収率における変動は、時に、生物が、不等な比（例えば１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００、または１：１００，０００よりも大きい）で組み合わされていることを意味する場合がある。これらの組成物において重要なことは、コア生態環境の一部の有効性に対する系統の寄与が測定可能であるように、各系統が最小量で提供されていることである。本明細書に記載される原理および指示を用いることで、コア生態環境の一部の有効性を試験するために、クレイドに基づく置換を行うことは、当業者にとって簡単である。表ＧＢは、芽胞調製物中で検出された各ＯＴＵのクレイドを記載しており、表１は、クレイド関連性に基づく置換に使用することができるＯＴＵを記載している。
【０３７５】
実施例３３．マウスモデルにおけるコア生態環境の一部の試験
コア生態環境のいくつかの一部を、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）マウスモデルにおいて試験した。負の対照はリン酸緩衝食塩水であり、陽性対照は１０％ヒト糞便懸濁液であった。前記一部は表ＧＤに記載される。
【０３７６】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【０３７７】
それぞれ５匹のマウスが入った２つのケージを、各実験部門（arm）について試験した。全てのマウスは、マウスの飲料水中の１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）から成る抗生物質混合物を、−１４日目から−５日目まで摂取し、強制経口投与による１０ｍｇ／ｋｇクリンダマイシンの１回の投与を−３日目に受けた。−１日目に、マウスは強制経口投与によって被験物質または対照物品を摂取した。０日目に、マウスは、強制経口投与による、およそ４．５ｌｏｇ１０ｃｆｕのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）（ＡＴＣＣ４３２５５）の投与によって暴露された。死亡率を０日目から６日目まで毎日評価し、前記動物の重量および後の重量変化を、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染と関連付けられる体重減少によって評価した。空ビヒクルと比較した被験物質の死亡率および体重減少低減を用いて、被験物質の成否を評価した。さらに、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）症状のスコア化を−１日目から６日目まで毎日行った。症状スコアは、外見（正常、猫背、立毛、または嗜眠に基づいて０〜２ポイント）、呼吸（正常、速い、または腹式呼吸を伴って浅いに基づいて0〜2ポイント）、および臨床徴候（正常、濡れた尾、触ると冷たい（cold-to-the-touch）、または他の動物からの隔離に基づいて０〜２ポイント）に基づくものであった。
【０３７８】
各部門についての累積的死亡率を集めることに加えて、−１日目に対する各マウスの最小重量の平均値としての平均最小相対重量が算出され、平均最大臨床スコアが各マウスの最大組み合わせ臨床スコアの平均値として算出され、死亡の場合には４のスコアが割り当てられる。結果を表ＧＥに報告する。
【０３７９】
【表６】
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【０３８０】
実施例３４．インビトロでのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）阻害アッセイにおけるコア生態環境の一部の定義
−８０℃グリセロールストックバンクのバイアルを解凍し、１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。選択された系統、およびそれらのクレイド割当は表ＧＦに記載される。次に、各系統を、９６ウェルプレートのウェル内の２００μＬのＰＢＳ＋１５％グリセロール中に、１０倍希釈した（各系統の１ｅ７ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度まで）。次に、プレートを−８０℃で凍結した。アッセイに必要な場合、プレートを−８０℃から取り出し、インビトロでのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）阻害アッセイ（ＣｉｖＳｉｍ）で試験する場合は嫌気条件下で、室温で解凍した。
【０３８１】
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）の一晩培養物を、嫌気条件下、ＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎまたはクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の増殖に適した他の培地中で、増殖させる。ＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎは、脳‐心臓浸出物、酵母抽出物、システイン、セロビオース、マルトース、可溶性デンプン、およびフラクトオリゴ糖／イヌリン、並びにヘミンから構成される複合培地であり、ＭＯＰで緩衝される。２４時間の増殖後、培養物を、種々様々な嫌気性細菌種の増殖に適したＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎ等の複合培地中で１００，０００倍希釈する。次に、希釈されたクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）混合物を、９６ウェルプレートのウェルに分注する（各ウェルに１８０μＬ）。次に、２０μＬの一部コア生態環境を、各種１ｅ６ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに加える。あるいは、前記アッセイは、各種異なる初期濃度（１ｅ９ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ７ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ５ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ４ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ３ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ２ＣＦＵ／ｍＬ）で試験され得る。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のみを播種された対照ウェルが、阻害無しのクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の増殖に対する比較のために含まれる。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の増殖を阻害する、または阻害しない対照のために、追加のウェルを用いる。増殖を阻害する陽性対照の一例は、ブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridiumbifermentans）および大腸菌（Escherichia coli）の組み合わせである。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）増殖の阻害減少を示す対照の一例は、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・オバータス（Bacteroidesovatus）およびバクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）の組み合わせである。プレートをパラフィルムでラップし、３７℃、嫌気条件下で２４時間インキュベートする。２４時間後、クロストリジウム・ディフィシル（C.difficile）のみを含有するウェルを段階希釈し、播種して、力価を決定する。次に、９６ウェルプレートを−８０Ｃで凍結し、その後、ｑＰＣＲアッセイによりクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を定量化する。
【０３８２】
ＳｗｅｅｔＢ  ＋  ＦｏｓＩｎ培地中で増殖され、選択的スポット播種によって定量化された、病原性クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のみを含有する各アッセイプレート上のウェルから、検量線を作成する。培養物の連続希釈を無菌リン酸緩衝食塩水中で行う。ゲノムＤＮＡを、その他のウェルと一緒に、検量線試料から抽出する。
【０３８３】
ゲノムＤＮＡを、希釈、凍結／解凍、および熱溶解プロトコルを用いて、５μｌの各試料から抽出する。５μＬの解凍試料を４５μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ｗａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）に加え、ピペッティングによって混合する。希釈試料を含むプレートを、増幅の前に加熱溶解ステップを含むｑＰＣＲのための使用まで、−２０℃で凍結する。あるいは、ゲノムＤＮＡは、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）−ｈｔｐ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）、またはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の取扱説明書に従って用いて、単離する。
【０３８４】
ｑＰＣＲ反応混合物は、１×ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｆプライマー（ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｒプライマー（ＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡ、ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、２５０ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｐプローブ（６ＦＡＭ−ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡ−ＭＧＢ、ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒａｄｅ  Ｗａｔｅｒ（モー・バイオ・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州カールズバッド）を１８μｌまで含有する（Wroblewski, D. et al. Rapid MolecularCharacterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficilein Stool Specimens. Journal of Clinical Microbiology 47:2142-2148 (2009)から適合されたプライマー）。この反応混合物を、Ｈａｒｄ−ｓｈｅｌｌ  Ｌｏｗ−Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｔｈｉｎ  Ｗａｌｌ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｓｋｉｒｔｅｄ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）のウェルに分注する。この反応混合物に、２μｌの希釈、凍結、および解凍した試料を加え、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ  ‘Ｂ’  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｓｅａｌ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で密封する。ｑＰＣＲを、ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを備えたＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）上で行う。熱サイクル条件は、９５℃１５分間、続いて４５サイクルの、９５℃５秒間、６０℃３０秒間、およびＦＡＭチャネルの蛍光読み取りである。あるいは、当業者に公知の他の標準方法を用いてｑＰＣＲを行う。
【０３８５】
ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（商標）3.0ソフトウェアによって、ＦＡＭチャネル上の各ウェルのＣｑ値を決定する。検量線ウェルのＣｑ値をそれらの試料の既知のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）と比較している検量線から作成された線形回帰モデルに所与の試料のＣｑ値を入力することによって、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）各実験試料のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）が算出される。追加されたさらなる細菌を有していない検量線の作成のために使用された各アッセイプレート上の試料中のクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）から、試料中のクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）を減算することによって、各試料における対数阻害を算出する。各組成物の全てのレプリケートについて、平均対数阻害を算出する。
【０３８６】
各組成物の範囲および標準偏差のヒストグラムをプロットする。全体分布と異なる対数阻害の範囲または標準偏差を、可能な異常値として調べる。ヒストグラム中に確認されるバイナリーペアの１つからの１つの対数阻害データの除去によって、範囲または標準偏差が試料の大部分からの値を含む線上に乗せられる場合、そのデータは異常値として除去され、平均対数阻害が再度算出される。
【０３８７】
前記アッセイにおいて評価された全試料の併合分散が、試料の自由度によって加重される試料分散の平均として評価される。次に、併合標準誤差が、試料数の平方根によって除算される併合分散の平方根として算出される。帰無仮説のための信頼区間が、併合標準誤差を所与の割合閾値に対応するｚスコアに乗算することによって、決定される。信頼区間外の平均対数阻害は、使用された区間に対応する信頼度％を伴って、正であれば阻害性であるとみなされ、あるいは負であれば刺激性とみなされる。０．３１２よりも大きな平均対数阻害を有する三元組み合わせは、＋＋＋＋（帰無仮説の９９％以上の信頼区間（Ｃ．Ｉ．））として報告され、０．２２１〜０．３１２の平均対数阻害を有するものは＋＋＋（９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％）、０．１７１〜０．２２１の平均対数阻害を有するものは＋＋（９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％）、０．１１３〜０．１７１の平均対数阻害を有するものは＋（８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％）、−０．１１３〜−０．１７１の平均対数阻害を有するものは−（８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％）、−０．１７１〜−０．２２１の平均対数阻害を有するものは−−（９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％）、−０．２２１〜−０．３１２の平均対数阻害を有するものは− − −（９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％）、および−０．３１２未満の平均対数阻害を有するものは−− − −（９９％＜Ｃ．Ｉ．）と報告される。
【０３８８】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【０３８９】
ＣｉｖＳｉｍは、多くの三元組み合わせがクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を阻害することを示している。５６中３９の組み合わせが８０％超の信頼区間で阻害を示し；５６中３６の組み合わせが９０％超のＣ．Ｉ．で阻害を示し；５６中３６の組み合わせが９５％超のＣ．Ｉ．で阻害を示し；５６中２９の組み合わせが９９％超のＣ．Ｉ．で阻害を示す。非限定的であるが例示的な三元組み合わせには、０．１７１を超える平均対数減少を有するもの、例えば、コリンゼラ・アエロファシエンス（Colinsella aerofaciens）、コプロコッカス・コメス（Coprococcuscomes）、およびブラウチア・プロダクタ（Blautia producta）等の、＋＋＋＋のスコアを有する表６に示されるあらゆる組み合わせが含まれる。等しく重要なことに、ＣｉｖＳｉｍアッセイは、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）を効果的に阻害しない三元組み合わせを説明している。５６中５の組み合わせが８０％超の信頼度で増殖を促進し、；５６中２の組み合わせが９０％超の信頼度で増殖を促進し；５６中１、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridiumsymbiosum）およびユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）が、９５％超の信頼度で増殖を促進する。５６中１２の組み合わせはアッセイにおいて中間的であり、これは、それらが測定の限界まで、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の増殖を促進も阻害もしないことを意味している。
【０３９０】
ヒトにおけるクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の治療に効果的であることが示される、エタノール処理芽胞画分から得られるコア生態環境の効果的な一部を決定するために、ＣｉｖＳｉｍ法を用いることは当業者にとって簡単である。
【０３９１】
実施例ＡＡＺＡ：マウスモデルの腸内で個体群を形成する細菌組成物
２つの細菌組成物をマウスモデルにおいて評価して、胃腸管内で個体群を形成する能力を決定した。細菌を、＊＊＊実施例１４に記載されるように増殖させた。組成物を嫌気条件下で予め作製し、ＰＢＳ＋１５％グリセロール中に懸濁し、先立って、−７０℃以上で保存した。
【０３９２】
マウス群（１０匹雌／群；５匹／ケージ）を、マウスの飲料水中の１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）から成る抗生物質混合物で、−１４日目〜−５日目に前処置した。−３日目に、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンを強制経口投与で与えた。−１日目に、マウスに微生物組成物を０．２ｍＬの体積の強制経口投与で投与した（表ＺＡ）。微生物組成物はおよそ同じ数の各ＯＴＵを含んでおり、各組成物についておよそ１×１０９、１×１０８および１×１０７／ＯＴＵで投与された（例えば、１５系統を含む微生物組成物１はおよそ１．５×１０１０、１．５×１０９、および１．５×１０８全ＣＦＵで投与された）。糞便試料を各ケージから、−１日目（投与のおよそ１時間前）および投与後２、３および４日目に回収した。処理および配列決定の前に糞便を凍結保存した。いずれかの微生物組成物で処置されたマウスの体重増加は、未処置対照マウスの体重増加と同様であった。
【０３９３】
並行して、−１日目に同一の微生物組成物で処置された動物群を、０日目に、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）のおよそ１０４．５個の芽胞（ＡＴＣＣ４３２５５）に強制経口投与で暴露した。クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）に暴露した動物の死亡率を、０日目から６日目まで毎日評価し、動物の重量およびその後の重量変化を評価したところ、体重減少はクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）感染と関連していた。空ビヒクルと比較した被験物質の死亡率および体重減少低下を用いて、被験物質の成否を評価した。
【０３９４】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【０３９５】
糞便試料を、＊＊＊実施例１１および１２に従って、単離およびＤＮＡの配列決定によって処理した。−１、２、３および４日目からの糞便試料のＯＴＵ割当を、＊＊＊実施例１１に記載されるような、１６Ｓ−Ｖ４配列リードの解析およびＯＴＵの割当によって決定した。＊＊＊実施例１１に記載されるように、クレイドを割り当てた。同一実験群のケージから得られた結果を合計することにより、各ＯＴＵまたは各クレイドについて全リード数を決定した。所与のＯＴＵまたはクレイドについて１０以下の配列リードを有する試料は、バックグラウンド未満であるとみなし、合計プロセスにおいて含めなかった。結果をＯＴＵ（表ＴＡＢ）およびクレイド（表ＴＡＣ）毎に示す。
【０３９６】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【０３９７】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０３９８】
表ＴＡＢ中のＯＴＵデータを調べると、いくつかのパターンが出現する。第一に、−１日目には配列リードを有さず、後の２、３、または４日目に多数の配列リードを示すＯＴＵ群が存在し；この群には、クロストリジウム・ブチリクム（Cl. butyricum）、クロストリジウム・ハイレモンアエ（Cl. hylemonae）、クロストリジウム・オルビスシンデンス（Cl. orbiscindens）、クロストリジウム・シンビオサム（Cl. symbiosum）、およびラクノスピラ菌（L. bacterium）＿５＿１＿５７ＦＡＡが含まれる。クロストリジウム・ジスポリクム（Cl. disporicum）は、バックグラウンドに非常に近い−１日目の配列リード（組成物１および組成物２中にそれぞれ１０および２９）を有し、その後２、３または４日目には１０００倍にも増加することから、この群に匹敵する。第二に、−１日目の試料またはその後の試料中でＯＴＵレベルで検出不可な、コリンゼラ・アエロファシエンス（Co. aerofaciens）、コプロコッカス・コメス（C. comes）、ルミノコッカス・ブロミイ（R. bromii）、ブラウチア・プロダクタ（B. producta）、クロストジリウム・ボルテアエ（Cl. bolteae）、クロストリジウム・マヨムベイ（Cl. mayombei）、クロストリジウム・イノキューム（Cl. Innocuum）、クロストリジウム・テルチウム（Cl. tertium）およびルミノコッカス・グナヴス（R. gnavus）等のＯＴＵが存在する。組成物２において、コリンゼラ・アエロファシエンス（Co. aerofaciens）は、１×１０８および１×１０７用量群において２日目に一時的に検出され；同一実験群中のユーバクテリウム・レクタレ（E. rectale）は３日目に検出され、このことは、これらのマウス群における、コリンゼラ・アエロファシエンス（Co. aerofaciens）およびその後のユーバクテリウム・レクタレ（E. rectale）による、一過性の個体群の間の関連性の可能性を示唆している。観察されたＯＴＵ配列リードの数はそれほど用量依存的でないことは、印象的な知見である。全体的に見て、前記データは、ＯＴＵが経口投与後に急速に個体群を形成するモデルと一致している。
【０３９９】
表ＴＡＣにおけるクレイドに基づく解析を実行して、胃腸管の個体群をより徹底的に評価した。クレイドに基づく解析は、ＯＴＵ解析によって与えられる詳細のいくつかを不明瞭にする。例えば、クロストリジウム・テルチウム（Cl. tertium）およびクロストリジウム・ブチリクム（Cl. butyricum）は、同一クレイドの構成要素であるため、クレイドに基づく解析はこれらの個々のＯＴＵの動態を区別することができない。しかし、クレイドに基づく解析は、ＯＴＵに基づく解析では見過ごされ得る個体群変化を測定するのに鋭敏であるという、代償的な利点を有する。あるＯＴＵを特定の種に割り当てる１６Ｓ−Ｖ４ＯＴＵ同定の能力は、特定の種または種の群の１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能に部分的に依存している。系統樹の様々な領域における利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、並びに様々な種の間での１６Ｓ遺伝子における固有の変異性の両方によって、分類学的アノテーションの明確性は決定される。そのため、場合によっては、ＯＴＵに基づく検出が複合個体群において非感受性である場合に、種の個体群は、クレイドに基づく割当の使用を伴い得る。例えば、表２Ｂにおけるクレイドに基づく解析は、ルミノコッカス・ブロミイ（R. bromii）、ブラウチア・プロダクタ（B. producta）、クロストリジウム・イノキューム（Cl. Innocuum）、およびルミノコッカス・グナヴス（R. gnavus）が、各ＯＴＵが微生物組成物中のクレイドの唯一の構成要素であり、配列リードが、−１日目の検出不可から、２、３または４日目のバックグラウンドをかなり上回るまでに移行したことから、個体群を形成可能であったことを裏付けている。１６Ｓ  Ｖ４配列決定およびクレイドに基づく解析は、クロストリジウム・テルチウム（Cl. tertium）またはクロストジリウム・ボルテアエ（Cl. bolteae）のクレイドの他の構成要素（それぞれ、クロストリジウム・ブチリクム（Cl. butyricum）およびクロストリジウム・シンビオサム（Cl. symbiosum））が存在し、マウス内でＯＴＵレベルで個体群を形成することが示されたという事実に起因して、クロストリジウム・テルチウム（Cl. tertium）またはクロストジリウム・ボルテアエ（Cl. bolteae）が個体群を形成したかどうかを決定することができなかった。
【０４００】
クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）に同時に暴露されたマウスにおいて、動物は、表ＴＡＤに示されるように、有意に保護された。ビヒクル（リン酸緩衝食塩水）の胃管栄養を受けたマウスは、１００％の死亡率を経験し、一方、微生物組成物１および２は、実験の最終日である６日目までに０〜１０％の死亡率で、全ての服用レベルで保護した。さらに、微生物組成物１および２で処置された動物における体重減少は、ビヒクル胃管栄養を受けている動物と比較して最小であった。これらのデータによって、微生物組成物による胃腸管の個体群が、動物が病原体による感染に抵抗できるように、腸内菌共生バランス失調の状態を回復することによって臨床的利点を与えることが確認される。
【０４０１】
【表１１】
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【０４０２】
実施例３６：バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＶＲＥ）コロニー形成のマウスモデルにおける予防的な使用および処置  高度に抗生物質耐性である細菌の出現および蔓延は、臨床における主要な問題である（Snitkin et al Science Translational Medicine, 2012）。近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、カルバペネム耐性腸内細菌科、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属（ＶＲＥ）、およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）等の生物によって引き起こされる感染の数は著しく増加しており、これらの系統の多くは、残り少ない活性抗生物質に対する耐性を獲得しつつある。高度抗生物質耐性細菌によってもたらされるほとんどの感染は、入院中に獲得され、これらの病原体の患者から患者への伝染の防止は、病院および診療所が直面している主要な課題の一つである。ほとんどの高度抗生物質耐性菌種は、粘膜表面に通常は低密度でコロニー形成する属に属している。粘膜表面に通常コロニー形成する高度に複雑な微生物叢は、腸内細菌科およびエンテロコッカス科等の細菌による増大および支配を阻害する。しかし、抗生物質投与によるその常在菌叢の破壊は、これらの細菌科の抗生物質耐性構成要素の阻害を抑制し、これにより、非常に高密度へのそれらの増大がもたらされる（Ubeda et al Journal of Clinical Investigation 2010）。これらの生物による高密度コロニー形成は、感受性患者にとって悲惨なものとなり、菌血症および敗血症をもたらし得る（Taur et al, Clinical Infectious Disease, 2012）。
【０４０３】
細菌組成物被験物質（例えば、芽胞個体群）の予防的な使用および処置を試験するため、以前の記述の通りにＶＲＥ感染マウスモデルが用いられる（Ubeda et al, Infectious Immunity 2013, Ubeda et al, Journal of clinicalinvestigation, 2010）。簡潔に説明すると、ジャクソン研究所から購入され、照射食品と共に収容され、酸性化水を供給された、７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを用いて、実験は行われる。マウスは個々に収容されて、食糞によるマウス間の混入が回避される。ＶＲＥによる実験感染のために、マウスは、マウスの飲料水中のアンピシリン（０．５ｇ／リットル）で処置され、この飲料水は３日毎に交換される。
【０４０４】
処置モデルにおいて、１日目に、マウスは、ＡＴＣＣから購入された、１０８ＣＦＵのバンコマイシン耐性フェシウム菌（Enterococcus faecium）株（ＡＴＣＣ７００２２１）の強制経口投与によって感染される。感染から１日後（１日目）、抗生物質処置を止めて、糞便ペレットの連続希釈物を、バンコマイシン（８μｇ／ｍｌ；シグマ社）と共にエンテロコッコセル寒天板（ディフコ社）上に播種することによって、ＶＲＥレベルが様々な時点で決定される。ＶＲＥコロニーが外見によって同定され、グラム染色または前述の他の方法（例えば、実施例１、２および３を参照）によって確認される。さらに、以前の記述の通り（Ubeda et al Journal of Clinical Investigation 2010）、バンコマイシンに対する耐性を与えるｖａｎＡ遺伝子のＰＣＲによって、感染マウスにおけるＶＲＥの存在が確認される。被験物質（例えば、細菌組成物、またはエタノール処理、勾配精製した芽胞調製物（本明細書に記載のような）、糞便懸濁液、または抗生物質処置）が、１〜３日目にＰＢＳ中で送達され、一方、負の対照はＰＢＳのみを含有し、また、強制経口投与によって１〜３日目に送達される。新鮮な糞便ペレットが、−７日目から１０日目までの実験の期間、毎日得られる。これらの試料は即座に凍結され、−８０℃で貯蔵される。ＤＮＡが、標準的な技術を用いて抽出され、１６Ｓまたは類似の方法（例えば、実施例２および３を参照）を用いて解析された。
【０４０５】
コロニー形成モデルにおいて、アンピシリンは−７日目から１日目まで上記のように投与され、被験物質またはビヒクル対照による処置は０日目〜２日目に実施され、１０８ＣＦＵのＶＲＥ耐性細菌が１４日目に投与される。糞便試料は実験の全体を通じて−７日目から２１日目まで毎日回収され、前述のような（例えば、実施例２および３を参照）１６Ｓ配列決定にかけられる。
【０４０６】
両方モデルにおいて、負の対照と比較した被験物質の成否を評価するために、糞便中のＶＲＥの力価が用いられる。さらに、健常なマイクロバイオームを誘導する被験物質の能力について、微生物叢組成が評価される。
【０４０７】
実施例３７：カルバペネム耐性クレブシエラ（ＣＲＫＢ）コロニー形成のマウスモデルの予防的な使用および処置
カルバペネム系薬剤に対する感受性の低下に伴う肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）株の出現は、入院患者にとって重大な脅威である。これらの生物におけるカルバペネム系薬剤に対する耐性は、クラスＡ  βラクタマーゼである、肺炎桿菌カルバペネマーゼ（K. pneumoniae carbapenemase：ＫＰＣ）によって最も頻繁に仲介され、これは、広域性セファロスポリン系抗生物質および市販のβ−ラクタム／βラクタマーゼ阻害剤の組み合わせに対する耐性も付与する（Queenan et al, Clinical Microbiology Review, 2007）。ＫＰＣ産生肺炎桿菌（K. pneumoniae）（ＫＰＣ−Ｋｐ）株はしばしば、アミノグリコシド系抗生物質およびフルオロキノロン系抗生物質を含むいくつかの他の抗菌剤クラスに対する耐性決定因子を保有し、これによって、真に多剤耐性（ＭＤＲ）の生物が生じる（Hirsch et al, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2009）。抗菌剤の選択肢を限定することを考慮すると、ＫＰＣ−Ｋｐによって引き起こされる感染は、多大な治療上の課題を提起し、不良臨床成績と関連付けられる。
【０４０８】
以前の記述（例えば、Perez et al, Antimicrobial AgentsChemotherapy, 2011）の通りのマウスモデルにおける処置プロトコルが用いらることで、被験物質（例えば、細菌組成物）が、カルバペネム耐性クレブシエラの治療および胃腸管内の保菌の減少について評価される。雌ＣＦ１マウス（ハーラン・スプラグ‐ドーレイ社、インディアナ州インディアナポリス）が使用され、個々に収容され、これらは２５〜３０ｇの重さである。
【０４０９】
徹底的な特徴付けがなされた肺炎桿菌（K. pneumoniae）株、ＶＡ−３６７（８、９、２５）が本研究に用いられる。この臨床分離株は、アメリカ東部に流布しているＫＰＣ−Ｋｐ株と遺伝的に関連している。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列解析による肺炎桿菌（K. pneumoniae）ＶＡ−３６７における耐性機構の特徴付けは、ｂｌａＫＰＣ−３、ｂｌａＴＥＭ−１、ｂｌａＳＨＶ−１１、およびｂｌａＳＨＶ−１２並びにｑｎｒＢ１９およびａａｃ（６’）−ｌｂの存在を明らかにした。さらに、ＰＣＲおよびＤＮＡ塩基配列決定法は、以下の外膜タンパク質遺伝子のコード配列における破損を明らかにした：ｏｍｐＫ３５、ｏｍｐＫ３６、およびｏｍｐＫ３７。抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）が寒天希釈法を用いて行われ、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）からの現在の推奨に従って解釈された。改変ホッジ試験（modified Hodge test）が、以前の記述（例えば、Anderson et al,Journal of Clinical Microbiology, 2007を参照）の通りの方法に従って、エルタペネム、メロペネム、およびイミペネムを用いて、行われた。チゲサイクリンおよびポリミキシンＥが、Ｅｔｅｓｔ感受性アッセイ（ビオメリュー株式会社（AB bioM Merieux）、スウェーデン、ソルナ）によって評価された。チゲサイクリンの結果は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による提案の通りに、ポリミキシンＥについてのＣＬＳＩ推奨（シュードモナスに対する判定基準）に従って、解釈された。
【０４１０】
マウス（１０匹／群）は、被験物質、例えば、細菌組成物、エタノール処理した芽胞調製物（例えば、実施例６を参照）、抗生物質クリンダマイシン、ピペラシリン−タゾバクタム、チゲサイクリン、エルタペネム、セフェピム、シプロフロキサシン、またはこれらの組み合わせ、またはビヒクルのみを与えられる対照群のいずれかに割り当てられる。マウスは、−１０日目から０日目まで毎日、被験物質を投与される。０日目に、０．５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で希釈された１０３ＣＦＵのＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７が、ステンレス鋼栄養管（Ｐｅｒｆｅｋｔｕｍ；ポッパー＆サンズ社（Popper & Sons）、ニューヨーク州ニューハイド・パーク）を用いて強制経口投与によって投与された。カルバペネム耐性肺炎桿菌（K. pneumoniae）の濃度を測定するために、便試料がＫＰＣ−Ｋｐの投与の１、４、６、および１１日後に回収された。便試料（８００ｍｌのＰＢＳ中に希釈された１００ｍｇ）が、０．５μｇ／ｍｌのイミペネムを含むＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天およびそれを含まないＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上に播種され、１グラムの便当たりのＣＦＵの数が決定された。あるいは、カルバペネム耐性肺炎桿菌（K. pneumoniae）のレベルを測定するために、当業者が実行できるような他の方法（例えば、ｐｃｒ、抗原検査）が用いられてもよい。
【０４１１】
便試料が処置の５日後に回収されて、便ミクロフローラに対する抗生物質の影響が評価され、便中の抗生物質レベルが測定された。ミクロフローラに対する影響を評価するために、前述（例えば、実施例２および３を参照）の通りの新鮮な便試料。被験物質（例えば、細菌組成物）の投与がＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７によるコロニー形成の排除または持続をもたらしたかどうかを試験するために、追加の実験が行われる。
【０４１２】
マウスは、正常腸管内菌叢を減少させるために、強制経口投与によって１０４ＣＦＵのＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７を摂取する１日前に皮下クリンダマイシンで処置され、マウスは、一日おきに７日間、皮下クリンダマイシンを摂取し続けた。同時に、ＫＰＣ−Ｋｐの強制経口投与後の７日間、マウスは、生理食塩水（対照群）、または指定の細菌組成物の強制経口投与を受けた。皮下クリンダマイシンの追加用量が、ＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７の投与の２０日後に投与されて、嫌気的ミクロフローラの排除によって増加し得る、低レベルのカルバペネム耐性肺炎桿菌（K. pneumoniae）が存在したかどうかが評価された。ＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７が胃管栄養によって与えられた当日（baseline）および３、６、８、１１、１６、および２１日後に、便試料が回収された。細菌組成物は糞便中のＣＲＫＢの減少によって試験される。
【０４１３】
特に記載がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される、成分の含量、反応条件等を表す全ての数字は、全ての例において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、特に記載がない限り、数値パラメーターは近似であり、獲得を求められる所望の特性に依存して変動し得る。最低限でも、且つ、特許請求の範囲への均等の原則の適用を限定する試みとしてではなく、各々の数値パラメーターは、有効数字の数および通常の丸め手法（rounding approach）に照らし合わせて解釈されるべきである
【０４１４】
特に記載がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すものと理解されるべきである。
【０４１５】
本発明は好ましい実施形態および種々の代替となる実施形態を参照して具体的に示され、記載されたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更がその中で実行可能であることは、当業者には理解される。
【０４１６】
本明細書の本文の中で引用された全ての参考文献、交付済み特許および特許出願は、全ての目的において、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４１７】
追加の表
表１．属、種、および系統発生クレイドに対してなされた分類学的割当を伴う、操作的分類単位（ＯＴＵ）の一覧表。
細菌ＯＴＵのクレイドの帰属関係は、１６Ｓ配列データに基づいている。クレイドは、系統学の当業者によく知られている最尤法を用いて完全長１６Ｓ配列から構築される系統樹の形態に基づいて定義される。クレイドが構築されることで、所与のクレイド内の全てのＯＴＵが、（ｉ）互いに、特定の数のブートストラップにより裏付けされたノードの範囲内であること、および（ｉｉ）５％の遺伝子類似度以内であることが確かめられる。同一クレイド内のＯＴＵは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて、異なるクレイド内のＯＴＵとは遺伝子および系統的に別個のものと区別することができ、一方、同一クレイド内に含まれるＯＴＵは近縁関係にある。同一クレイド内に含まれるＯＴＵは進化的に近縁関係にあり、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いに区別可能であってもなくてもよい。同一クレイドの構成要素は、それらの進化上の関連性により、ヒト腸内に存在するもの等の微生物生態環境内で類似の機能的役割を果たす。ある種を同一クレイド由来の別の種で代用する組成物は保存された生態学的機能を有する可能性が高く、従って本発明において有用である。全てのＯＴＵは、それらの推定上の芽胞形成能、およびそれらが病原体であるか病原性共生生物（pathobiont）であるかに関して表記されている（「病原性共生生物」の記述の定義を参照）。ＮＩＡＩＤ優先病原体は「カテゴリーＡ」、「カテゴリーＢ」、または「カテゴリーＣ」と表記され、日和見病原性菌は「ＯＰ」と表記されている。病原性ではない、または病原体として存在するためのそれらの能力が未知であるＯＴＵは、「Ｎ」と表記されている。「配列ＩＤ番号」は配列表ファイル内でのＯＴＵの識別子を表記しており、「公開ＤＢ受入番号（Public DB Accession）」は公開配列保管庫内でのＯＴＵの識別子を表記している。
【０４１８】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
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【表１２−８】
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【表１２−９】
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【表１２−１０】
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【表１２−１１】
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【表１２−１２】
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【表１２−１３】
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【表１２−１４】
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【表１２−１５】
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【表１２−１６】
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【表１２−１７】
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【表１２−１８】
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【表１２−１９】
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【表１２−２０】
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【表１２−２１】
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【表１２−２２】
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【表１２−２３】
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【表１２−２４】
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【表１２−２５】
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【表１２−２６】
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【表１２−２７】
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【表１２−２８】
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【表１２−２９】
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【表１２−３０】
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【表１２−３１】
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【表１２−３２】
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【表１２−３３】
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【表１２−３４】
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【表１２−３５】
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【表１２−３６】
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【表１２−３７】
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【表１２−３８】
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【表１２−３９】
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【表１２−４０】
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【表１２−４１】
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【表１２−４２】
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【表１２−４３】
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【表１２−４４】
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【表１２−４５】
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【表１２−４６】
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【表１２−４９】
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【表１２−５０】
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【表１２−５２】
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【表１２−６０】
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【表１２−６２】
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【表１２−６３】
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【表１２−６４】
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【表１２−６５】
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【表１２−６６】
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【表１２−６７】
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【表１２−６８】
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【表１２−６９】
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【表１２−７０】
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【表１２−７２】
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【表１２−７３】
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【表１２−７４】
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【表１２−７５】
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【表１２−７６】
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【表１２−７７】
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【表１２−７８】
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【表１２−７９】
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【表１２−８０】
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【表１２−８１】
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【表１２−８２】
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【表１２−８３】
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【表１２−８４】
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【表１２−８５】
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【表１２−８６】
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【表１２−８７】
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【表１２−８８】
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【表１２−８９】
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【表１２−９０】
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【表１２−９１】
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【表１２−９２】
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【表１２−９３】
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【表１２−９４】
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【表１２−９５】
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【表１２−９６】
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【表１２−９７】
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【表１２−９８】
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【表１２−９９】
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【表１２−１００】
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【表１２−１０１】
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【表１２−１０２】
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【表１２−１０３】
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【表１２−１０４】
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【表１２−１０５】
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【表１２−１０６】
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【表１２−１０７】
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【表１２−１０８】
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【表１２−１０９】
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【表１２−１１０】
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【表１２−１１１】
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【表１２−１１２】
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【表１２−１１３】
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【表１２−１１４】
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【表１２−１１５】
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【表１２−１１６】
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【表１２−１１７】
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【表１２−１１８】
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【表１２−１１９】
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【表１２−１２０】
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【表１２−１２１】
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【表１２−１２２】
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【表１２−１２３】
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【表１２−１２４】
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【表１２−１２５】
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【表１２−１２６】
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【表１２−１２７】
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【表１２−１２８】
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【表１２−１２９】
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【表１２−１３０】
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【表１２−１３１】
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【表１２−１３２】
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【表１２−１３３】
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【表１２−１３４】
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【表１２−１３５】
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【表１２−１３６】
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【表１２−１３７】
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【表１２−１３８】
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【表１２−１３９】
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【表１２−１４０】
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【表１２−１４１】
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【表１２−１４２】
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【表１２−１４３】
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【表１２−１４４】
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【表１２−１４５】
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【表１２−１４６】
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【表１２−１４７】
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【表１２−１４８】
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【表１２−１４９】
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【表１２−１５０】
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【表１２−１５１】
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【０４１９】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【０４２０】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【０４２１】
【表１５】
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【０４２２】
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【０４２３】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【０４２４】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【０４２５】
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【０４２６】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２０−３】
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【０４２７】
【表２１】
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【表２２】
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【０４２８】
【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２３−３】
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【表２３−４】
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【０４２９】
【表２４−１】
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【表２４−２】
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【０４３０】
【表２５−１】
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【表２５−２】
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【０４３１】
表１５：予防マウスモデルの結果、並びに発芽可能画分、および芽胞形成可能画分についての投与情報
臨床スコアは、外見（正常、猫背、立毛、または嗜眠に基づいて０〜２ポイント）、および臨床徴候（正常、濡れた尾、触ると冷たい（cold-to-the-touch）、または他の動物からの隔離に基づいて０〜２ポイント）を含む、いくつかの領域における、０〜４の段階での、マウスの健康の組み合わされた表現型評価に基づくものである。
【０４３２】
【表２６】
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【０４３３】
【表２７−１】
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【表２７−２】
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【表２７−３】
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【表２７−４】
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【表２７−５】
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【表２７−６】
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【表２７−７】
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【表２７−８】
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【表２７−９】
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【０４３４】
【表２８】
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【０４３５】
【表２９】
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【０４３６】
【表３０】
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【０４３７】
【表３１】
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【０４３８】
【表３２】
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【０４３９】
【表３３−１】
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【表３３−２】
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【０４４０】
【表３４−１】
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【表３４−２】
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【表３４−３】
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本発明の好適な実施形態は以下の通りである。
〔１〕
ａ）糞便物質を用意し、ｂ）上記物質を芽胞形成性細菌の精製をもたらす処置段階にかける段階によって作製される精製された芽胞形成性細菌個体群を含む治療用組成物であって、上記治療用組成物が投与される哺乳類レシピエント対象における腸内菌共生バランス失調を治療または予防するために、上記精製個体群が胃腸管内で生着および／または増加するのに有効な量で存在する、上記治療用組成物。
〔２〕
上記個体群が胃腸管内菌共生バランス失調を治療するのに有効である、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔３〕
上記個体群が胃腸管内菌共生バランス失調の少なくとも１つの症状の重症度を低減するのに有効である、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔４〕
上記個体群が哺乳類レシピエント内に存在する微生物叢の多様性を調節するのに有効である、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔５〕
上記個体群が細菌芽胞の個体群を含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔６〕
上記糞便物質が健常な単一の哺乳類ドナー対象または複数の哺乳類ドナー対象から得られる、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔７〕
上記処置段階が上記物質を２５℃超で少なくとも３０秒間加熱することを含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔８〕
上記処置段階が上記物質を溶媒と接触させることを含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔９〕
上記処置段階が上記物質の化学的または物理的処置と接触させることを含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１０〕
糞便物質の無細胞成分の少なくとも一部を除去することにより、芽胞形成性細菌を無細胞性物質から分離することを含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１１〕
上記個体群が単一の細菌芽胞調製物または細菌芽胞調製物の組み合わせを含み、各々の細菌芽胞調製物が単一の哺乳類ドナー対象から得られた糞便物質から精製される、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１２〕
上記個体群が単一の細菌芽胞調製物または細菌芽胞調製物の組み合わせを含み、各々の細菌芽胞調製物が哺乳類ドナー対象から得られた糞便物質から精製される、〔１〕に記載の治療用組成物
。〔１３〕
上記腸内菌共生バランス失調が、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridiumdifficile）によって誘導される下痢、過敏性腸症候（ＩＢＳ）、病原体または病原性共生菌によるコロニー形成、薬剤耐性の病原体または病原性共生菌による感染、大腸炎、およびクローン病からなる群から選択される胃腸の疾患、障害または状態を含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１４〕
上記処置段階が病原性物質を枯渇または不活性化させることを含む、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１５〕
上記精製個体群が検出可能なレベルの第一病原性物質を実質的に枯渇している、〔１４〕に記載の治療用組成物。
〔１６〕
上記第一病原性物質がウイルス、細菌、真核生物性寄生虫、蠕虫、ファージ、マイコプラズマ属、トキソプラズマ属、および真菌からなる群から選択される、〔１５〕に記載の治療用組成物。
〔１７〕
上記精製個体群が残存生息環境産物を実質的に枯渇している、〔１〕に記載の治療用組成物。
〔１８〕
上記残存生息環境産物が無細胞性物質を含む、〔１７〕に記載の治療用組成物。
〔１９〕
上記無細胞性物質が残存する繊維、ＤＮＡ、ウイルス外被物質、もしくは生育不能物質、または哺乳類ドナー対象由来の真核細胞を含む、〔１８〕に記載の治療用組成物。
〔２０〕
芽胞から本質的に成る芽胞個体群および栄養細胞から本質的に成る芽胞形成菌個体群を含む、１に記載の治療用組成物。
〔２１〕
ｉ）腸内菌共生バランス失調を治療もしくは予防し、および／またはｉｉ）治療用組成物が投与される哺乳類レシピエント対象内で治療用組成物中に存在しない細菌のうちの少なくとも１種を増加させ、および／またはｉｉｉ）治療用組成物中に存在するが処置前に哺乳類対象内に存在しない細菌のうちの少なくとも１種を生着させるのに有効な量で、精製された芽胞形成性細菌個体群を含む、治療用組成物。
〔２２〕
上記個体群が胃腸管内菌共生バランス失調を治療するのに有効である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２３〕
上記個体群が胃腸管内菌共生バランス失調の少なくとも１つの症状の重症度を低減するのに有効である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２４〕
上記個体群が哺乳類レシピエント内に存在する微生物叢の多様性を増大させるのに有効である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２５〕
上記個体群が細菌芽胞の個体群を含む、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２６〕
上記個体群が哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から精製される、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２７〕
上記個体群が複数の哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から精製される、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔２８〕
上記複数の哺乳類ドナー対象が約２５、２６、２７、２８、２９または３０未満の肥満度指数（ＢＭＩ）をそれぞれ有する少なくとも２人の健常なヒト対象を含む、〔２７〕に記載の治療用組成物。
〔２９〕
上記個体群が細菌芽胞調製物の組み合わせを含み、各々の細菌芽胞調製物が哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から独立して精製される、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔３０〕
上記哺乳類ドナー対象が検出可能なレベルの病原体または病原性共生菌を有していないことを糞便物質の生産前に確認される、〔２６〕に記載の治療用組成物。
〔３１〕
哺乳類ドナー対象が糞便物質の生産の少なくとも１時間前に確認される、〔３０〕に記載の治療用組成物。
〔３２〕
哺乳類ドナー対象が検出可能なレベルの病原体または病原性共生菌を有していないことを糞便物質の生産後に確認される、〔３０〕に記載の治療用組成物。
〔３３〕
哺乳類ドナー対象が糞便物質の生産の少なくとも１時間後に確認される、〔３０〕に記載の治療用組成物。
〔３４〕
上記腸内菌共生バランス失調が、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridiumdifficile）によって誘導される下痢、過敏性腸症候（ＩＢＳ）、病原体または病原性共生菌によるコロニー形成、薬剤耐性の病原体または病原性共生菌による感染、大腸炎、およびクローン病からなる群から選択される胃腸の疾患、障害または状態を含む、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔３５〕
上記精製個体群が検出可能なレベルの第一病原性物質を実質的に含んでいない、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔３６〕
上記第一病原性物質がウイルス、細菌、真核生物性寄生虫、蠕虫、ファージ、マイコプラズマ属、トキソプラズマ属、および真菌からなる群から選択される、〔３５〕に記載の治療用組成物。
〔３７〕
上記精製個体群が残存生息環境産物を実質的に含んでいない、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔３８〕
上記残存生息環境産物が無細胞性物質を含む、〔３７〕に記載の治療用組成物。
〔３９〕
上記無細胞性物質がＤＮＡ、ウイルス外被物質、または生育不能な細菌性物質を含む、〔３８〕に記載の治療用組成物。
〔４０〕
残存生息環境産物が哺乳類ドナー対象由来の真核細胞を含む、〔３８〕に記載の治療用組成物。
〔４１〕
残存生息環境産物が哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％超減少される、〔３８〕に記載の治療用組成物。
〔４２〕
上記精製個体群が検出可能なレベルの第一病原性物質の病原活性を実質的に含んでいない、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔４３〕
上記第一病原性物質がウイルス、細菌、真核生物性寄生虫、蠕虫、ファージ、マイコプラズマ属、トキソプラズマ属、および真菌からなる群から選択され、病原活性が生存可能な力価の上記病原体、哺乳類レシピエント対象の感染、免疫調節活性、自己免疫応答、および炎症反応からなる群から選択される、〔４２〕に記載の治療用組成物。
〔４４〕
上記精製個体群が第一病原性物質の実質的に減少されたレベルの病原活性を有する、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔４５〕
糞便物質中に存在する細菌芽胞の濃度より少なくとも１０％高い濃度で存在する精製された細菌芽胞個体群を含む、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔４６〕
上記精製個体群が糞便物質の混和溶媒処理または部分的混和溶媒処理から入手可能である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔４７〕
上記混和溶媒がアルコールである、〔４６〕に記載の治療用組成物。
〔４８〕
上記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはブタノールである、〔４７〕に記載の治療用組成物。
〔４９〕
上記部分的混和溶媒がエーテル、ジメトキシエタン、またはテトラヒドロフランである、〔４７〕に記載の治療用組成物。
〔５０〕
ｉ）哺乳類レシピエント内に存在する微生物叢の多様性を増大させ、および／またはｉｉ）治療用組成物を投与される哺乳類レシピエント対象における腸内菌共生バランス失調を治療もしくは予防するのに有効な量で精製された芽胞形成性細菌個体群を含み、上記精製個体群が、１または複数の哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質中の少なくとも１つの残存生息環境産物から上記個体群を分離することにより得られる、治療用組成物。
〔５１〕
上記精製個体群が糞便物質またはその画分もしくは派生物の混和溶媒処理から得られる、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５２〕
上記精製個体群が糞便物質中に存在する実質的に富化された細菌芽胞を含み、所望により発芽誘起物質を含む、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５３〕
上記発芽誘起物質が、ＢＨＩＳウシ胆汁、ＣａＤＰＡ、一つまたは複数のアミノ酸、糖、ヌクレオシド、胆汁酸塩、金属もしくは金属カチオン、脂肪酸、および長鎖アルキルアミン、またはこれららの組み合わせから選択される、〔５２〕に記載の治療用組成物。
〔５４〕
上記精製個体群が、ｉ）糞便物質中に存在する一つまたは複数の非芽胞形成性生物の量および／もしくは生存率の実質的な減少、またはｉｉ）糞便物質中に存在する病原体活性および／もしくは病原性共生菌活性の実質的な低減、またはこれらの組み合わせを含む、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５５〕
上記精製個体群が、糞便物質または上記糞便物質の全てもしくは一部を含む液体を、ｉ）約１％、２％、３％、４％、５％から約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％までのアルコール、またはｉｉ）酸、またはｉｉｉ）酵素を含む溶液と、少なくとも約２０℃の温度で少なくとも１分間接触させることにより得られる、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５６〕
上記精製個体群が、糞便物質中に存在する、ｉ）非芽胞形成性細菌、並びにｉｉ）病原体活性および／または病原性共生菌活性のうちの少なくとも１つを実質的に減少させるのに適した条件下で、糞便物質または上記糞便物質の全てもしくは一部を含む液体を、アルコールを含む溶液と接触させることにより得られる、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５７〕
上記精製個体群が、糞便物質またはその画分もしくは派生物の分画遠心法から得られる、〔５０〕に記載の治療用組成物。
〔５８〕
上記分画遠心法が速度勾配遠心分離または平衡密度沈降を含む、〔５７〕に記載の治療用組成物。
〔５９〕
上記精製個体群が、糞便物質中に存在する無細胞性物質から少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％超精製されている、〔５７〕に記載の治療用組成物。
〔６０〕
上記精製個体群が固形媒体に吸着された芽胞の溶出から入手可能である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔６１〕
上記固形媒体が疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）媒体またはアフィニティークロマトグラフ媒体を含む、〔６０〕に記載の治療用組成物。
〔６２〕
上記精製個体群が、糞便物質を、残存生息環境産物および芽胞個体群を区別して吸着する固形媒体と接触させることにより入手可能である、〔６０〕に記載の治療用組成物。
〔６３〕
上記精製個体群が糞便物質を機械的破壊処理にかけることにより入手可能である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔６４〕
上記機械的破壊処理が非芽胞性物質を実質的に破壊し、芽胞を実質的に破壊しない、〔６３〕に記載の治療用組成物。
〔６５〕
上記精製個体群が糞便物質を熱破壊処理にかけることにより入手可能である、〔２１〕に記載の治療用組成物。
〔６６〕
上記熱破壊処理が、糞便物質または糞便物質を含む液体を少なくとも約３０℃の加熱環境に少なくとも約１０分間曝すことを含む、〔６５〕に記載の治療用組成物。
〔６７〕
治療的投与を必要とする哺乳類対象への治療的投与に適した細菌芽胞個体群を含む組成物を作製するための方法であって、（ａ）哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質を用意する段階；および（ｂ）上記糞便物質を、精製された芽胞形成性細菌個体群が糞便物質から得られるような条件下で少なくとも１つの精製段階にかける段階を含む、方法。
〔６８〕
上記哺乳類ドナー対象が健常なヒト対象である、〔６７〕に記載の方法。
〔６９〕
糞便物質またはその画分もしくは派生物を混和溶媒と接触させることを含む、〔６７〕に記載の方法。
〔７０〕
混和溶媒処理、不混和性溶媒抽出、固形媒体からの溶出、熱破壊処理、放射線処理、濾過処理、クロマトグラフ分離処理、遠心分離処理、機械的破壊処理、またはこれらの組み合わせを含む、〔６７〕に記載の方法。
〔７１〕
ヒト対象における腸内菌共生バランス失調を治療または予防する方法であって、２１または〔５０〕に記載の治療用組成物をヒト対象に投与することを含む、方法。
〔７２〕
治療的投与が、組成物１用量当たり少なくとも約１×１０４コロニー形成単位の細菌芽胞を含む組成物の経口投与を含む、〔７１〕に記載の方法。
〔７３〕
細菌芽胞が表１に提供される属由来の細菌を含む、７１に記載の方法。
〔７４〕
組成物が質量基準で少なくとも約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または５０％超の芽胞を含む、〔７１〕に記載の方法。
〔７５〕
組成物が１グラムまたは１用量当たり少なくとも約１×１０４個の芽胞を含む、〔７１〕に記載の方法。
〔７６〕
組成物が１グラムまたは１用量当たり少なくとも約１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、または１×１０１０超の芽胞を含む、〔７１〕に記載の方法。
〔７７〕
少なくとも約１×１０３、１×１０４、１×１０５、または１×１０６個の芽胞を含む精製された細菌芽胞個体群を含む治療用組成物であって、約１グラム重量を超過せず、治療または予防を必要とする哺乳類レシピエント対象における腸内菌共生バランス失調を治療または予防するための経口投与用に製剤化された、治療用組成物。
〔７８〕
治療または予防を必要とする哺乳類レシピエント対象における胃腸の疾患、障害または状態を治療または予防するために製剤化された、〔７７〕に記載の治療用組成物。
〔７９〕
細菌芽胞が哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から精製される、〔７７〕に記載の治療用組成物。
〔８０〕
治療用組成物を投与される、障害に罹患しているまたはそれを発症する危険性がある哺乳類レシピエント対象における障害を単回投与として治療または予防するのに有効な量の、〔７７〕に記載の治療用組成物。
〔８１〕
上記細菌芽胞個体群が少なくとも１の哺乳類ドナー対象から得られる糞便物質から精製され、上記少なくとも１の哺乳類ドナー対象が代謝障害の臨床歴を有していない、〔８０〕に記載の治療用組成物。
〔８２〕
精製された芽胞形成性細菌個体群を作製するための糞便物質採取器具および溶剤溶液、並びにその使用説明書を一つまたは複数の容器内に含む、キット。
〔８３〕
上記溶剤溶液が界面活性剤を含む、〔８２〕に記載のキット。
〔８４〕
上記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、プルロニック、またはポリオールである、〔８３〕に記載のキット。
〔８５〕
ヒト対象の胃腸管内の微生物叢個体群を調節する方法であって、ｉ）胃腸管内に存在する微生物個体群、および／またはｉｉ）胃腸管外に存在する微生物個体群が調節されるような条件下で、精製された芽胞形成性細菌個体群を含む治療用組成物をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
〔８６〕
上記調節が、治療用組成物が投与される際に胃腸管内に存在する少なくとも１種の病原体および／または病原性共生菌の減少または排除を含む、〔８５〕に記載の方法。
〔８７〕
上記調節が、治療用組成物中に存在する少なくとも１種の芽胞形成性細菌の生着を含む、〔８５〕に記載の方法。
〔８８〕
上記調節が、治療用組成物中に存在しない少なくとも１種の細菌の増加を含む、〔８５〕に記載の方法。
〔８９〕
治療用組成物が投与される際に、上記少なくとも１種の芽胞形成性細菌が胃腸管内に検出可能な程度に存在しない、〔８７〕に記載の方法。
〔９０〕
上記調節が治療用組成物中に存在しない少なくとも１種の芽胞形成性細菌または非芽胞形成性細菌の増加を含む、〔８５〕に記載の方法。
〔９１〕
上記少なくとも１種の芽胞形成性細菌または非芽胞形成性細菌が治療用組成物の投与後に少なくとも２倍に増加される、〔９０〕に記載の方法。
〔９２〕
上記調節が、ｉ）治療用組成物が投与される際に胃腸管内に存在する少なくとも１種の病原体および／または病原性共生菌の減少または排除；ｉｉ）治療用組成物中に存在する少なくとも１種の芽胞形成性細菌の生着；並びにｉｉｉ）治療用組成物中に存在しない少なくとも１種の芽胞形成性細菌または非芽胞形成性細菌の増加のうちの少なくとも２つを含む、〔８５〕に記載の方法。
〔９３〕
上記調節が、治療用組成物が投与される際に胃腸管内に存在する少なくとも１種の病原体および／または病原性共生菌の減少または排除、並びにｉ）治療用組成物中に存在する少なくとも１種の芽胞形成性細菌の生着；およびｉｉ）治療用組成物中に存在しない少なくとも１種の細菌の増加のうちの少なくとも１つを含む、〔８５〕に記載の方法。
〔９４〕
組成物が投与される際に、少なくとも１種の病原体および／または病原性共生菌が胃腸管内に病原性のある量で存在する、〔９２〕に記載の方法。
〔９５〕
哺乳類対象が細菌過剰症候群（ＢＯＳ）に罹患している、またはそれを発症する危険性がある、〔９３〕に記載の方法。
〔９６〕
上記調節がＢＯＳに関連する少なくとも１種の病原体および／または病原性共生菌の減少または排除を含む、〔９４〕に記載の方法。
〔９７〕
上記調節が少なくとも１種の薬剤耐性の病原体および／または病原性共生菌の減少または排除を含む、〔８５〕に記載の方法。
〔９８〕
ヒト対象の胃腸管内の細菌個体群の生着を誘導する方法であって、少なくとも、ｉ）芽胞形成性細菌の一部が胃腸管内に持続的に生着するような、またはｉｉ）治療用組成物中に存在しない少なくとも１種の細菌が胃腸管内で増加するような条件下で、精製された芽胞形成性細菌個体群を含む治療用組成物をヒト対象に投与する段階を含む、方法。
〔９９〕
上記芽胞形成性細菌個体群が芽胞から本質的に成り、上記芽胞が胃腸管内で発芽する、〔９８〕に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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