(57)【要約】      （修正有）【課題】プロセス、ならびに関連システム及びコンピュータプログラム（ソフトウェア）製品が、エタノール等の所望の最終生成物へのＣＯの生物学的変換のために、提供される。【解決手段】これらのプロセスのために使用される制御方法は、連続操作を達成する前に、バッチ操作または他の最初の操作期間のために必要な時間の短縮を有利にもたらすことができ、これは、定義された流量での新しい培養液の添加によって、または別のプロセス開始目標によってのいずれかで、境界を画定してもよい。制御方法は、代替的に、または組み合わせて、１０個のバッチ操作または他の最初の操作期間の間に、所望の最終生成物または細菌成長速度の生産性等のプロセス性能パラメータを改善し得る。【選択図】図１
2019193636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最終生成物へのＣＯの変換を開始及び実施するためのプロセスであって、
ＣＯ含有基質及び塩基性中和剤の両方を、カルボキシド栄養性細菌を含む培養液を備える
バイオリアクタに供給して、前記最終生成物及び酸性代謝物を生成することを含み、
塩基性中和剤の流量は、前記培養液の特性に基づいて制御され、前記特性は、酸性代謝物
の測定された濃度、酸性代謝物の測定された生産性、カルボキシド栄養性細菌の測定され
た濃度、カルボキシド栄養性細菌の測定された生産性、またはこれらの組み合わせからな
る群から選択される、プロセス。
【請求項２】
前記塩基性中和剤の流量は、前記培養液内の前記酸性代謝物の測定された濃度、または
前記培養液内の前記酸性代謝物の測定された生産性に基づいて制御される、請求項１に記
載のプロセス。
【請求項３】
前記塩基性中和剤の流量は、前記培養液内の前記酸性代謝物の測定された濃度に基づい
て制御される、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記酸性代謝物の測定された濃度は、前記バッチ操作期間の間に断続的または連続的に
判定される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記塩基性中和剤の流量は、前記培養液内の前記酸性代謝物の測定された濃度と、前記
培養液内の酸性代謝物の設定濃度との間の差異に基づいて制御される、請求項３に記載の
プロセス。
【請求項６】
前記酸性代謝物の設定濃度は、式：
【数７】
2019193636.tif 000009
に従って決定され、式中、ＢＩＯＣＯＮｍｖは、前記培養液内のカルボキシド栄養性細菌
の測定された濃度を表し、Ａ１及びＢ１は、定数である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記定数Ａ及びＢは、実験データから実験的に決定される、請求項６に記載のプロセス
。
【請求項８】
前記カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度は、断続的または連続的に判定される、
請求項６に記載のプロセス。
【請求項９】
前記バイオリアクタへの希釈剤流量は、前記培養液内のカルボキシド栄養性細菌の測定
された濃度に基づいて制御される、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１０】
希釈剤流量設定値は、式：
【数８】
2019193636.tif 000010
に従って決定され、式中、ＢＩＯＣＯＮｍｖは、前記培養液内のカルボキシド栄養性細菌
の測定された濃度を表し、Ｃ１は、実験データから実験的に決定された定数である、請求
項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
ＣＯ含有基質流量は、前記培養液の測定されたｐＨ値に基づいて制御される、請求項１
に記載のプロセス。
【請求項１２】
最終生成物へのＣＯの変換を開始及び実施するためのプロセスであって、
ＣＯ含有基質及び塩基性中和剤の両方を、カルボキシド栄養性細菌を含むバイオリアクタ
に供給することを含み、
塩基性中和剤の流量は、ＣＯ含有基質の測定された流量またはＣＯ含有基質の流量設定値
に基づいて制御される、プロセス。
【請求項１３】
塩基性中和剤の流量設定値は、前記ＣＯ含有基質の測定された流量または前記ＣＯ含有
基質の流量設定値と共に直線的に変化する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記塩基性中和剤の流量設定値は、式：
【数９】
2019193636.tif 000011
に従って決定され、式中、ＣＯＦＬＯｍｖ及びＣＯＦＬＯｓｐは、それぞれ前記ＣＯ含有
基質の測定された流量及び前記ＣＯ含有基質の流量設定値を表し、Ｙ及びＺは、実験デー
タから実験的に決定された定数である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記塩基性中和剤の流量は、前記ＣＯ含有基質の流量設定値に基づいて制御される、請
求項１２に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ＣＯ含有基質の流量設定値は、前記バイオリアクタ内に含まれる培養液の測定され
たｐＨ値から決定される、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記塩基性中和剤の流量は、前記ＣＯ含有基質の測定された流量に基づいて制御される
、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記プロセスは、バッチ操作期間の間に行われる、請求項１または請求項１２に記載の
プロセス。
【請求項１９】
連続プロセス開始目標を達成した後に、新しい培養液を前記バイオリアクタに添加し、
前記バイオリアクタから前記最終生成物を引き出すことをさらに含む、請求項１８に記載
のプロセス。
【請求項２０】
前記ＣＯ含有基質は、鋼製造プロセス、非鉄製品製造プロセス、石油精製プロセス、バ
イオ燃料生成プロセス、石炭ガス化プロセス、電力生産プロセス、カーボンブラック生成
プロセス、アンモニア生成プロセス、メタノール生成プロセス、有機物のガス化、炭化水
素の水蒸気改質、及びコークス製造プロセスからなる群から選択される産業プロセスから
得られる、請求項１または請求項１２に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記酸性代謝物は、酢酸である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記最終生成物は、エタノールである、請求項１または請求項１２に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記塩基性中和剤は、水酸化アンモニウム溶液である、請求項１または請求項１２に記
載のプロセス。
【請求項２４】
システムであって、
バイオリアクタと、
前記バイオリアクタから、培養液の試料を単離するように構成されたサンプリング装置と
、
前記試料を分析するように構成された分析装置と、
前記分析装置から受信された前記培養液の測定された特性に基づいて、前記バイオリアク
タへの塩基性中和剤の流量を制御するように構成された制御装置と、を備え、
前記測定された特性は、酸性代謝物の測定された濃度、酸性代謝物の測定された生産性、
カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度、カルボキシド栄養性細菌の測定された生産性
、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、システム。
【請求項２５】
システムであって、
バイオリアクタと、
前記バイオリアクタへのＣＯ含有基質の測定された流量またはＣＯ含有基質の流量設定値
に基づいて、前記バイオリアクタへの塩基性中和剤の流量を制御するように構成された制
御装置と、を備える、システム。
【請求項２６】
測定されたｐＨ値に基づいてＣＯ含有基質流量を制御するように構成された第２の制御
装置をさらに備える、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記バイオリアクタから、培養液の試料を単離するように構成されたサンプリング装置と
、
前記試料を分析し、前記制御装置に前記測定されたｐＨ値を入力するように構成された分
析装置と、をさらに備える、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
非一時的コンピュータ可読媒体上に具現化されたコンピュータプログラムを有する前記
非一時的コンピュータ可読媒体を備えたコンピュータプログラム製品であって、前記コン
ピュータプログラムは、プロセッサに、
バイオリアクタからの培養液の試料を分析するように構成された分析装置から、前記培養
液の測定された特性を受信するステップと、
前記バイオリアクタへの塩基性中和剤の流量を制御するように構成された制御装置に、制
御の基準として、前記培養液の前記測定された特性を入力するステップと、を行わせるた
めの命令を含み、
前記測定された特性は、酸性代謝物の測定された濃度、酸性代謝物の測定された生産性、
カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度、カルボキシド栄養性細菌の測定された生産性
、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、コンピュータプログラム製品。
【請求項２９】
非一時的コンピュータ可読媒体上に具現化されたコンピュータプログラムを有する前記
非一時的コンピュータ可読媒体を備えたコンピュータプログラム製品であって、前記コン
ピュータプログラムは、プロセッサに、
バイオリアクタへのＣＯ含有基質の測定された流量またはＣＯ含有基質の流量設定値を受
信するステップと、
前記バイオリアクタへの塩基性中和剤の流量を制御するように構成された制御装置に、制
御の基準として、前記ＣＯ含有基質の測定された流量または前記ＣＯ含有基質の流量設定
値を入力するステップと、を行わせるための命令を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項３０】
前記コンピュータプログラムは、前記プロセッサに
測定されたｐＨ値を受信するさらなるステップと、
ＣＯ含有基質流量を制御するように構成された第２の制御装置に、制御の基準として、前
記測定されたｐＨ値を入力するさらなるステップと、を行わせるための命令を含む、請求
項２９に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
前記測定されたｐＨ値は、前記バイオリアクタからの培養液の試料を分析するように構
成された分析装置から受信される、請求項２９に記載のコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月１１日出願の米国特許出願第１４／３２９，８８１号の利益
を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の態様は、例えば、連続及び定常状態操作を達成するための、エタノールへのＣ
Ｏ含有基質の微生物発酵のためのプロセスの開始に関する。特定の態様は、操作パラメー
タが制御され、有利な結果につながる様式に関する。
【背景技術】
【０００３】
化石燃料温室効果ガス（ＧＨＧ）放出に関する環境問題は、再生可能エネルギー源のま
すますの強調につながっている。結果として、エタノールが、世界中で急速に主要な水素
に富む液体輸送燃料になっている。燃料エタノール産業に対する世界市場における継続的
成長は、欧州、日本、及び米国、ならびにいくつかの発展途上国におけるエタノール生産
のさらなる強調に基づいて、近い将来見込まれている。例えば、米国では、エタノールが
、Ｅ１０、ガソリン中エタノールの１０％混合物を生産するのに使用されている。Ｅ１０
ブレンド中、エタノール構成成分は、酸素化剤の役割を果たし、燃焼の効率を改善し、大
気汚染物質の生成を減少させる。ブラジルでは、エタノールは、ガソリン中にブレンドさ
れた酸素化剤として、及びそれ自体で純粋な燃料としての両方で、輸送燃料要求のおおよ
そ３０％を満たしている。さらに、欧州連合（ＥＵ）は、その加盟国の各々に対して、バ
イオマス由来のエタノール等の持続可能な輸送燃料の消費の義務的目標を持っている。
【０００４】
燃料エタノールの大部分は、サトウキビから抽出されたスクロースまたは穀類作物から
抽出されたデンプン等の、作物由来の炭水化物を主な炭素源として使用する従来のイース
トベースの発酵プロセスを介して生産される。しかしながら、これらの炭水化物供給原料
のコストは、競合する用途のため、具体的に言えば、ヒト及び動物の両方のための食料源
としての、市場におけるこれらの価値によって影響を受ける。さらに、エタノール生成の
ためのデンプンまたはスクロースを生成する作物の栽培は、現地の地価及び気候の両方の
相関関係であるため、すべての地形で経済的に持続可能ではない。これらの理由のため、
特に注目されるのは、より低いコスト及び／またはより豊富な炭素源を燃料エタノールに
変換するための技術の開発である。その点、一酸化炭素（ＣＯ）は、石炭、油、及び油由
来生成物等の有機物質の不完全燃焼の主なエネルギーに富む副生成物である。ＣＯに富む
廃ガスは、様々な産業プロセスから生じる。例えば、豪州の鉄鋼産業は、年間５００，０
００メートルトンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出すると報告されている。
【０００５】
最近になって、工業規模でのＣＯからエタノールを生成するための微生物（細菌）ベー
スのプロセス代替手段が、商業的関心及び投資の対象になっている。ＣＯが唯一の炭素源
である、微生物培養物が成長する能力は、１９０３年に最初に発見された。この特質は、
独立栄養増殖のアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）生化学的経路（ウッド−リュングダ
ール（Ｗｏｏｄｓ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ）経路及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチ
ルＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても知られている）の生物の使用に存
することが断定された。以来、カルボキシド栄養性生物、光合成生物、メタン生成活性生
物、及び酢酸生成生物を含む多数の嫌気性生物が、ＣＯを代謝することが示されている。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌などの嫌気性細菌は、アセチルＣｏＡ生化学的経路を介
してＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２からエタノールを生成することが知られている。例えば、ガ
スからエタノールを生成する様々なＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの
株は、国際公開第００／６８４０７号、欧州特許第１１１７３０９Ａｌ号、米国第５，１
７３，４２９号、同第５，５９３，８８６号、同第６，３６８，８１９号、国際公開第９
８／００５５８号、及び同第０２／０８４３８号に記載されている。細菌のＣｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種もまた、ガスからエタノールを生成する
ことが知られている（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ＡＲＣＨＩＶＥＳ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯ
ＢＩＯＬＯＧＹ  １６１：３４５−３５１（１９９４））。
【０００６】
生物の各酵素が、本質的に完璧な選択性を用いてその指定された生物学的変換を促進す
るため、微生物合成ルートは、従来の触媒ルートと比較して、より低いエネルギーコスト
でより高い収率を達成することができる。例えば、非選択的副反応から生じた副生成物を
所望の生成物から分離するためのエネルギー必要量が、低減され得る。さらに、反応媒体
中の不純物に起因する触媒の中毒に関する懸念が、減少する。
【０００７】
しかしながら、これらの明白な利益にも関わらず、当該技術分野は、特に、生成率が他
の技術に対抗することを確実にすることに関して、ＣＯからのエタノールの微生物合成に
関わる特定の困難に対処しなければならない。ＣＯをこれらの炭素源として使用するとき
、上述の嫌気性細菌は、発酵によりエタノールを生成するが、嫌気性細菌は、少なくとも
１つの代謝物、例えば、ＣＯ２、Ｈ２、メタン、ｎ−ブタノール、及び／または酢酸も生
成する。これらの代謝物のうちのいずれかの形成は、利用可能な炭素が代謝物（複数可）
になって失われ、所望の最終生成物の生成効率が損なわれるため、所与のプロセスの生産
性及び経済的実行可能性全体に著しい影響を与える可能性がある。さらに、微生物発酵プ
ロセスのその場で代謝物（例えば、酢酸）自体に価値がない限り、廃棄物処理の問題を引
き起こし得る。エタノールを作成するためのＣＯ含有ガスの嫌気的発酵における所望の最
終生成物以外の生成物の形成に対処するための様々な提案が、国際公開第２００７／１１
７１５７号、同第２００８／１１５０８０号、及び同第２００９／０２２９２５号で論じ
られている。
【０００８】
所与の発酵プロセスが経済的に魅力的であるかどうかに関する主な決定要因であるエタ
ノール生成率は、細菌成長のための適切な条件の管理に大きく依存する。例えば、ＣＯ含
有基質が、最適な微生物成長及び／または所望の代謝物生成をもたらす速度で微生物培養
に提供されなければならないことは、国際公開第２０１０／０９３２６２号から知られて
いる。不十分な基質が提供された場合、微生物成長は遅くなり、発酵生成物の収率はエタ
ノールを犠牲にして酢酸に移行する。過剰な基質が提供された場合、微生物成長不良及び
／または細胞の死を生じ得る。これらのプロセスにおける操作パラメータ間の関係に関す
るさらなる情報は、国際公開第２０１１／００２３１８号に見出される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
操作パラメータの制御は、処理目標が、細胞培養を十分なレベルにまで成長させ、かつ
連続操作のための他の条件を確立することにだけでなく、生成物及び副生成物生産性の均
衡を保つことにも焦点を合わせる最初の操作の期間の間に、特に重要である。連続バイオ
リアクタ操作の前のバッチ培養操作を行うために必要な時間の低減は、プロセス経済性の
改善に重大な意味を持つ。これは、ＣＯ含有ガスで成長する能力のある微生物は、一般に
糖類を食料源として用いる競合する技術において使用される微生物よりも遅い速度で成長
するという事実の点から、特に正しい。発酵プロセスの操作の商業の点から見て、微生物
個体群が確立する、例えば、生成物の経済的に好ましいレベルの合成に十分に高い細胞密
度に達するのに必要な時間は、利益性全体に影響を与える重要な運転費を表す。例えば、
バッチ条件下での最初の操作期間の間の培養成長速度及び／または生産性を向上させ、こ
れにより、所望の細胞密度及び／または生成レベルに達するのに必要な時間を短縮させる
能力は、ＣＯ含有廃ガスからエタノールを生成するための生物学的プロセスの商業化にお
ける成功全体の重要な決定要因である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、利用可能なデータに基づいて生物学的ＣＯ変換プロセスの開始を制御
するための方法に関する。通常、そのようなプロセスの開始時に、バイオリアクタを、（
例えば、ＣＯからエネルギーを得る能力を有する）カルボキシド栄養性細菌を含む培養液
で満たす（植え付ける）。典型的なプロセスに従って、エタノールが、所望の最終生成物
であるのに対し、酢酸塩が酢酸の形態の望ましくない代謝物として生成される。上で論じ
られたように、ＣＯは、競合する目標を達成するために、慎重にバイオリアクタに供給さ
れなければならない。具体的には、ＣＯの供給不足が、エタノールを消費して過剰な酢酸
塩形成を生じ得るのに対し、ＣＯの供給過剰は、細菌成長に負の影響を与え得る。これら
の留意事項の点から、ＣＯまたはＣＯ含有ガスの経時的流量の特定のプロファイルが、バ
ッチ操作の間の予期される細菌成長に基づいて、他のプロセスから得られた情報と組み合
わせて、使用され得る。
【００１１】
最初の操作期間（例えば、バッチ操作期間）の間の最優先操作目標は、培養液内で細菌
（バイオマス）の濃度を上昇させることである。したがって、バッチ操作期間の間のガス
流プロファイルは、通常、控えめであり、ＣＯの供給過剰を避けるように努める。これは
、著しい量の酢酸の形成を生じ得、場合によっては、所望されるエタノール最終生成物の
量を超え得る。細菌変換プロセスをとおして生成されたあらゆる酢酸が培養液のｐＨ値を
下げるため、水酸化アンモニウム溶液等の塩基性中和剤が、導入されてもよい。中和剤が
、細菌成長に好適な培養液のｐＨ値（例えば、５．０のｐＨ）を維持するために、バイオ
リアクタに添加されてもよい。
【００１２】
本発明の実施形態は、ＣＯをエタノール等の所望の最終生成物に変換するための生物学
的発酵プロセスに対し、ＣＯ含有基質及び塩基性中和剤（例えば、水酸化アンモニウム溶
液）の両方を、カルボキシド栄養性細菌を含む培養液を備えるバイオリアクタに供給する
ことを含む。このプロセスは、培養液内の許容できないｐＨレベルを避けるために、所望
の最終生成物と、中和剤によって（例えば、酢酸アンモニウム等の塩に）変換される酸性
代謝物（例えば、酢酸）と、の両方を生成する。１つの代表的な実施形態に従って、塩基
性中和剤の流量は、培養液内のカルボキシド栄養性細菌または酸性代謝物の測定された濃
度または測定された生産性等の測定された特性に基づいて、制御されてもよい。あるいは
、そのような測定された特性が利用可能でない場合、例えば、好適なオンラインサンプリ
ング及び分析装置がない場合、塩基性中和剤の流量は、ＣＯ含有基質の測定された流量に
基づいて、またはさもなければこの基質の設定値に基づいて制御されてもよい。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、上述のように培養液の測定された特性に基づいて、もしくは
代替的には、ＣＯ含有基質の測定された流量に基づいて、またはさもなければこの基質の
設定値に基づいてのいずれかで、バイオリアクタ及びバイオリアクタへの塩基性中和剤の
流量を制御するように構成された制御装置を備えるシステムに対する。培養液の測定され
た特性に基づく制御の場合、システムは、単離された試料を分析するように構成された分
析装置に加えて、分析のためにバイオリアクタから培養液の試料を単離するように構成さ
れた必要なサンプリング装置をさらに備えてもよい。上記の制御方法代替手段のいずれか
において、典型的なシステムは、任意選択的に、測定されたｐＨ値に基づいてＣＯ含有基
質流量を制御するように構成された第２の制御装置、バイオリアクタから培養液の試料を
単離するように構成されたサンプリング装置、及び／または試料を分析し、次いで制御装
置に測定されたｐＨ値を入力するように構成された分析装置を含んでもよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、非一時的コンピュータ可読媒体上に具現化されたコンピ
ュータプログラムを有する非一時的コンピュータ可読媒体を備える、コンピュータプログ
ラム製品に対する。これらのコンピュータプログラムは、プロセッサに本明細書に記載さ
れる制御プロセスを実行するのに必要なステップを行わせるための命令を含む。これらの
プロセスには、バイオリアクタへの塩基性中和流量を制御するように構成された制御装置
への入力である情報の受信が含まれる。この様式で受信及び入力されてもよい情報には、
上述のように測定された特性に関してバイオリアクタからの培養液試料を分析するように
構成された分析装置から受信された情報が含まれる。あるいは、この情報は、この流れを
測定するように構成された流量センサまたは測定デバイスから受信された、ＣＯ含有基質
の測定された流量でもよい。この受信された情報は、ＣＯ含有基質の流量設定値も含んで
もよい。制御装置に受信及び入力された情報の種類に関わらず、典型的なプロセスは、例
えば、培養液のｐＨを直接、またはさもなければバイオリアクタからの培養液の試料のｐ
Ｈを測定するように構成されたｐＨ計または他の分析装置から、測定されたｐＨ値を受信
することをさらに含んでもよい。測定されたｐＨ値が制御の基準である測定されたｐＨ値
は、ＣＯ含有基質流量を制御するように構成された第２の制御装置に入力されてもよい。
【００１５】
本発明に関係するこれらの実施形態及び態様、ならびに他の実施形態及び態様は、以下
の発明を実施するための形態から明らかである。
【００１６】
本発明の例となる実施形態のより完全な理解及びその利益は、付属の図を考慮して以下
の説明を参照することにより得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの操作パラメータを制御するための代表的な方法のフローチャートである。
【図２】従来の制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、培養液内のエタノール、カルボキシド栄養性細菌、及び酢酸の経時的な測定された濃度のグラフである。
【図３】本明細書に記載される制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、培養液内のエタノール、カルボキシド栄養性細菌、及び酢酸の経時的な測定された濃度のグラフである。
【図４】従来の制御方法及び本明細書に記載される制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、経時的なＣＯ含有基質流量の比較グラフである。
【図５】従来の制御方法及び本明細書に記載される制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、経時的な培養液内のカルボキシド栄養性細菌濃度の比較グラフである。
【図６】本明細書に記載される代表的な制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、培養液内のエタノール、カルボキシド栄養性細菌、及び酢酸の経時的な測定された濃度、ならびに新しい培養液の測定された流量グラフである。
【図７】本明細書に記載される代替制御方法を使用した、ＣＯ含有基質をエタノールに変換するための生物学的プロセスの、培養液内の経時的なエタノール、カルボキシド栄養性細菌、及び酢酸の測定された濃度、ならびにＮＨ４ＯＨ中和剤溶液及びＣＯ含有基質の測定された流量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、カルボキシド栄養性細菌を含む培養液を備えるバイオリアクタにＣＯ含有基
質中のＣＯを供給することにより、エタノール等の所望の最終生成物を生成するためのプ
ロセスに関する。所望の最終生成物に加えて、典型的なプロセスは、望ましくない代謝物
またはより望ましくない代謝物をさらに生成する。エタノール等の所望の生成物に加えて
生成され得る酸性代謝物の例は、酢酸塩（例えば、酢酸の形態）である。典型的なカルボ
キシド栄養性細菌または微生物（例えば、ＣＯからエネルギー及び炭素を得る微生物）は
、Ｍｏｏｒｅｌｌａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅ
ｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ属、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒ
ｃｉｎａ属、及びＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属のものである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉａである細菌の特定の例には、Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｒａｇｓｄａｌｅｉ、及びＣ．ｂｅｉｊｅｒｅｎｃｋｅｉが含まれる。
【００１９】
代表的なＣＯ含有基質には、広く、成長及び／または発酵のために細菌の１つ以上の株
が一酸化炭素を利用できるあらゆるＣＯ含有ガス、または場合により液体が含まれる。そ
のようなＣＯ含有基質は、好ましくは、そのような汚染物質がカルボキシド栄養性細菌の
成長に悪影響を与え得る程度まで汚染物質を含まない（例えば、１つ以上の汚染物質（複
数可）が、成長速度が所与の一組の条件下で、同じ条件下だが汚染物質（複数可）を含ま
ない成長速度と比較して、１０％超減速されるような濃度または量で存在しない）。代表
的な気体ＣＯ含有基質は、典型的に、かなりの割合のＣＯ、好ましくは少なくとも５体積
％〜１００体積％のＣＯを含有する。そのような基質は、多くの場合、鋼製造プロセスま
たは非鉄製品製造プロセス等の産業プロセスの廃棄物として生成される。気体ＣＯ含有基
質が生成される他のプロセスには、メタン、エタン、プロパン、石炭、天然ガス、原油、
石油精製所（石油コークスもしくはペトコークス（ｐｅｔｃｏｋｅ）を含む）からの低価
値残渣、固形都市廃棄物、またはバイオマスなどの有機物のガス化が含まれる。バイオマ
スには、サトウキビからの砂糖、もしくはトウモロコシまたは穀物からのデンプン等の食
料品の抽出及び処理の間に得られる副生成物、または林業によって生成される非食品バイ
オマス廃棄物が含まれる。これらの炭素質物質のうちのいずれも、ガス化、例えば、酸素
で部分的に燃焼されて、合成ガス（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ）（かなりの量のＨ２及
びＣＯを含む合成ガス（ｓｙｎｇａｓ））を生成することができる。有利に、これらのプ
ロセスからのガス流は、本明細書に記載されるように、エタノール等の有用な最終生成物
の有益な生成のために使用され得る。他の実施形態において、ＣＯを含む基質は、炭化水
素の水蒸気改質から得ることができる。これらのプロセスは、米国特許出願公開第ＵＳ２
０１３／００４５５１７Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０２１００９６Ａ１号、同第ＵＳ２
０１３／０２０３１４３Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１３／０３１６４１１Ａ１号、ならび
に米国特許第ＵＳ８，３８３，３７６号にさらに詳細に記載され、これらのすべての内容
は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００２０】
ＣＯ含有基質が少しも水素を含有する必要はない一方で、Ｈ２の存在は、通常、所望の
最終生成物の形成に悪影響をもたらさない。特定の実施形態において、ＣＯ含有基質は、
低濃度のＨ２、例えば、１０体積％未満、５体積％未満、または１体積％未満のＨ２を含
んでもよい。ＣＯ含有基質は、いくらかのＣＯ２、例えば、１体積％〜８０体積％、１体
積％〜５０体積％、または１体積％〜３０体積％のＣＯ２も含有してもよい。気体ＣＯ含
有基質等のいずれかのＣＯ含有基質は、生物学的変換プロセスにおけるその使用の前に処
理されて、概してカルボキシド栄養性細菌または生物学的変換プロセスに悪影響をもたら
し得る、塵粒子または他の固体、液体、もしくは気体の汚染物質等のあらゆる望ましくな
い不純物を除去されてもよい。例えば、気体ＣＯ含有基質は、既知の方法を使用して、濾
過またはスクラブされてもよい。
【００２１】
酢酸である酸性代謝物の文脈において、「酢酸」または「酢酸塩」という用語は、その
アニオンの（解離）形態（例えば、酢酸塩イオンもしくはＣＨ３ＣＯＯ−として）または
遊離分子酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）の形態のいずれかで、これらの形態がシステムのｐＨに
依存する比率で、培養液中に存在する総酢酸塩を指す。「バイオリアクタ」という用語は
、本明細書に記載される生物学的プロセスを実行するために使用され得るカルボキシド栄
養性細菌の培養を含むための任意の好適な容器を含み、これはまた、発酵プロセスが一般
に嫌気的に実施される範囲において、発酵プロセスとも称され得る。好適なバイオリアク
タは、連続撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド
反応器（ＴＢＲ）、移動床生物膜反応器（ＭＢＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、中空
繊維膜バイオリアクタ（ＨＦＭＢＲ）等の膜反応器、静的ミキサーでもよいか、または、
（例えば、生物学的変換を実施するのに好ましい溶解及び物質輸送動態を用いて）ＣＯ含
有基質を細菌培養液に接触させるのに好適な他の容器またはデバイス（例えば、塔または
配管）を含み得る。
【００２２】
他の好適なプロセスの流れ、操作パラメータ、及び本明細書に記載される生物学的プロ
セスで使用するための装置は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２１２４３３号に記
載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本発明は、特にＣＯをエタノール等の価値のある最終生成物に変換するための、（ｉ）
規定の流量での新しい培養液の添加、もしくは目標を開始する別のプロセスのいずれかに
よって区別され得る連続操作を達成する前に、バッチ操作期間もしくは他の最初の操作期
間に必要な時間が、予想外に短縮され、かつ／または（ｉｉ）所望の最終生成物の生産性
もしくは別のプロセス性能パラメータ（例えば、細菌成長速度）が、このバッチ操作期間
もしくは他の最初の操作期間の間に予想外に改善された、生物学的プロセスの発見に関連
する。バッチ操作から連続操作への転換は、新しい培養液の本プロセスで使用されるバイ
オリアクタへの添加の開始によって区別される。あるいは、新しい培養液添加の速度が、
慎重な時点で開始されるよりもむしろ徐々に増加する場合、バッチから連続操作への転換
は、バイオリアクタへの新しい培養液添加の目標速度を達成することによって、及び／ま
たはバイオリアクタからの細菌含有培養液取り出しの目標速度を達成することによって区
別されてもよい。新しい培養液添加及び／または細菌含有培養液取り出しの目標速度は、
定常状態操作、例えば、条件が所望の最終生成物の生成の長い期間（例えば、少なくとも
３日、または少なくとも１０日）にわたって実質的に一定で維持される操作と関連した速
度でもよい。さもなければ、これらの目標速度は、定常状態操作と関連した速度の少なく
とも６０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％でもよい。
【００２４】
新しい培養液の目標速度以外に、最初の操作期間と定常状態または「稼働中の」操作期
間とを区別するために使用されてもよい他のプロセス開始目標は、所望の生成物（例えば
、エタノール）、カルボキシド栄養性細菌、または酸性代謝物の培養液濃度を含み得る。
プロセス開始目標は、所望の生成物、カルボキシド栄養性細菌、または酸性代謝物の生産
性も含んでもよい。プロセス開始目標は事前に決定、例えば、プロセスの始めから確立さ
れ、場合により、新しい培養液の添加の監視及び／または制御を含む、生物学的プロセス
の監視及び／または制御のために使用されるコンピュータプログラム（ソフトウェア）製
品を含む制御システムへの入力として使用されてもよい。
【００２５】
本発明の特定の実施形態は、自動化されてもよいある特定の制御方法が、ＣＯ含有基質
流量と培養液の測定された特性とを効果的に適合させることができるという研究結果に基
づく。これらの方法は、最初の操作期間（例えば、バッチ操作期間）に使用されるとき、
または一般的に使用されるとき、ＣＯの供給過剰の回避に加えて、酢酸または酢酸塩生成
の低減の点から、大幅に改善された平衡を有利に提供する。驚くべきことに、バッチ操作
期間または他の最初の操作期間の目標は、最初からＣＯ含有ガス流量プロファイルの確立
の従来と比較して、はるかにより早く、また、所望の最終生成物及び望ましくない代謝物
（複数可）の両方の生産性の点からはるかにより効率的に達成され得る。いくつかの実施
形態に従って、プロセス経済性全体が、連続操作への移行を可能にする培養液中の細菌濃
度を達成するための始動時間の短縮の結果として、大幅に改善され得る。例えば、バイオ
リアクタの植え付けから所与のバイオマス細菌濃度が達成されるまでの時間は、プロセス
パラメータを制御するための従来の行為を使用して達成される結果と比較して、少なくと
も２０％（例えば、２０％〜８０％）、典型的には、少なくとも３５％（例えば、３５％
〜７５％）、多くの場合少なくとも５０％（例えば、５０％〜７０％）まで短縮され得る
。
【００２６】
１つの特定の制御方法に従って、最初の操作期間（例えば、バッチ操作期間）の間、ま
たは何らかの他の操作期間（例えば、連続、定常状態、または通常操作期間）の間に測定
された培養液の特性は、塩基性中和剤（例えば、水酸化アンモニウム溶液）の流量の制御
の基準として使用される。代表的な特性には、酸性代謝物（例えば、酢酸または酢酸塩）
の濃度、酸性代謝物の生産性、カルボキシド栄養性細菌の濃度、カルボキシド栄養性細菌
の生産性、またはそのような特性の組み合わせが含まれる。一般に、これらの特性のうち
のいずれかの上昇は、一方向に塩基性中和剤の流量の増加をもたらす。１つの特定の実施
形態において、塩基性中和剤の流量は、培養液中の目標の酸性代謝物濃度に基づいて制御
され、次にこれは、カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度から決定される。このよう
に、制御方法は、塩基性中和剤の消費、具体的には、細菌培養物を培養することによる窒
素の増加した利用からなる。これは、好ましい生成物収率分布で細菌培養物を迅速に培養
させるという目標に特別に適合された始動の間（例えば、バッチ操作期間）の条件を有利
に提供する。
【００２７】
細胞培養液の特性は、連続的または断続的に、例えば、定期的に測定されてもよく、各
々の一連の測定間の期間は、一般に０．１秒〜１２０秒に１回、典型的には０．５秒〜６
０秒に１回、多くの場合１秒〜１０秒に１回である。測定された特性は、カルボキシド栄
養性細菌または酸性代謝物の培養液中の濃度のオンライン分析によって得られてもよい。
一連の測定間の時間間隔と共に（例えば、１リットル当たりのグラム数、ｇ／ｌでの）濃
度の一連の測定に基づいて、（例えば、１日当たりの１リットル当たりのグラム数、ｇ／
ｌ・日−１での）カルボキシド栄養性細菌または酸性代謝物の生産性を計算することがで
きる。例えば、カルボキシド栄養性細菌の濃度が連続する間隔で判定された場合、指定さ
れた時間１及び時間２、次いで、時間２の時点でのカルボキシド栄養性細菌の生産性は、
次のように表現され得る：（時間２の時点での濃度−時間１の時点での濃度）／（時間２
−時間１）。
【００２８】
一般に、酸性代謝物濃度は、濾過または膜分離の結果として、カルボキシド栄養性細菌
を含まないか、または実質的に含まない培養液試料中で測定される。例えば、（例えば、
０．０５μｍ〜１μｍの範囲の）細菌を除去するのに好適な細孔の大きさを有するフィル
タが、反応器の動作を自動的かつ別個に監視するために、異なる時間に細胞不含培養液を
単一の反応器から取り出すように構成されたか、あるいはさもなければ、そのような液体
を複数の反応器（例えば、直列もしくは並列で動作することができるか、またはさもなけ
れば独立して動作する４〜６個の反応器等の２〜１０個の反応器）から取り出すように構
成されたサンプリングシステムの試料ライン上に組み込まれてもよい。他の実施形態に従
って、培養液の細胞不含試料は、細胞に富む濃縮水流がバイオリアクタへと再循環される
膜分離システムからの透過水流として利用可能でもよい。透過水は、分析のために使用さ
れない場合、通常、（例えば、直列で動作する）第２のバイオリアクタへと流れてもよい
。バイオリアクタから得られた細胞不含濾液または透過水は、最終生成物（例えば、エタ
ノール）濃度または酸性代謝物（例えば、酢酸もしくは酢酸塩）濃度の特性のオンライン
測定のために使用される典型的な試料を提供することができる。これらの濃度は、クロマ
トグラフィー（例えば、高圧液体クロマトグラフィー、またはＨＰＬＣ）等の既知の分析
法によって判定されてもよい。
【００２９】
測定された特性としてカルボキシド栄養性細菌濃度の場合、培養液は、分析のために使
用されない場合、例えば、通常（例えば、直列で動作する）第２のバイオリアクタへ流れ
てもよいブリード流として、バイオリアクタから直接取り出されてもよい。細胞培養液の
取り出しのためのブリード流または他の流れからの試料ラインは、カルボキシド栄養性細
菌濃度の特性のオンライン測定のための好適な分析デバイスに流体接続されてもよい。代
表的なデバイスは、吸光度もしくは試料をとおした電磁エネルギーの伝達（例えば、分光
光度計）、試料のある特定の生物学的活動（例えば、プレートリーダー）、または使い捨
てもしくは再利用可能なプローブ（例えば、オンラインバイオマスプローブ）内の試料の
別の特性（例えば、電気抵抗／静電容量）を測定するものを含む。ブリード流または他の
流れからの試料ラインは、反応器の動作を自動的かつ別個に監視するために、異なる時間
に培養液を単一の反応器から取り出すように構成されたか、あるいはさもなければ、その
ような液体を複数の反応器（例えば、直列もしくは並列で動作することができるか、また
はさもなければ独立して操作される４〜６個の反応器等の２〜１０個の反応器）から取り
出すように構成されたサンプリングシステムの一部でもよい。
【００３０】
１つまたは複数のバイオリアクタからの培養液のオンライン分析のためのサンプリング
システムは、所望の時間に所望の反応器の自動サンプリングを可能にするための好適な導
管（例えば、管類またはパイプ）弁、ポンプ、及びアクチュエータと、正確な結果を得る
ために試料ラインをフラッシング（パージ）するための好適なデバイスと、を含む。例え
ば、エタノールもしくは酢酸塩の濃度を得るために細胞不含培養液を分析する場合、上述
のように、濾過した液体または膜透過水を、少なくとも断続的に、しかし好ましくは連続
的に、オンライン分析のために構成された好適な試料容器をとおして供給してもよい（例
えば、蠕動ポンプを使用して注入してもよい）。例えば、そのような試料容器（例えば、
試料バイアル）と流体連通している注入ライン及び送出ラインは、培養液の濾過された流
れを試料容器に、及び試料容器から連続的に導いてもよい。いくつかの実施形態に従って
、試料容器をとおした培養液の連続供給は、バイオリアクタの動作のある期間にわたって
、例えば、少なくとも３分、少なくとも５分、または少なくとも１０分にわたって、上述
のように、試料容器注入口から試料容器をとおり、試料容器出口に細胞不含透過水または
濾液流が流れることを伴う。特定の実施形態に従って、例えば、濾過された細胞不含培養
液は、フィルタの詰まりを防ぐために、試料容器をとおって９分間連続的に供給され、続
いて試料ライン上で１分のフィルタのバックフラッシュを行ってもよい。サンプリングさ
れず、試料容器出口をとおって流れる過剰培養液は、廃棄物として廃棄されてもよい。
【００３１】
このように、試料容器内に存在する液体は、試料容器内の細胞不含培養液の分析の時点
での、この細胞を含む培養液中の所望の最終生成物（例えば、エタノール）及び代謝物（
複数可）（例えば、酢酸または酢酸塩）の濃度の点から、バイオリアクタ内の細胞を含む
培養液を表す。試料ラインの長さは、バイオリアクタ内の最終生成物及び／または代謝物
（複数可）の実際の濃度（複数可）と、分析の時点での試料容器内の細胞不含培養液の測
定された濃度（複数可）との間のあらゆるオフセットを最小化するために、最短化されて
もよい。いくつかの実施形態に従って、最終生成物及び／または代謝物の実際の濃度と、
測定された濃度との間のオフセットは、１０％未満、５％未満、または２％未満になる。
したがって、細胞不含培養液の試料は、本質的にリアルタイムでバイオリアクタ内の最終
生成物及び代謝物（複数可）の濃度（複数可）を判定するために、試料容器から取り出さ
れ、分析されてもよい。例えば、自動サンプリングは、一定間隔で試料容器の上部上のゴ
ム封止体に突き刺し、細胞不含培養液の試料を取り出すためのサンプリング針の使用を伴
ってもよく、一連の測定間の期間は、上述のとおりである。自動サンプリング装置は、直
列もしくは並列で動作してもよいか、またはさもなければ独立して動作してもよい同数の
バイオリアクタからの培養液をサンプリングするための、例えば、４〜６個の試料容器等
の２〜１０個の試料容器を含んでもよい。
【００３２】
より一般的には、自動サンプリング装置は、好適な導管（例えば、管類またはパイプ）
弁、ポンプ、及びアクチュエータを使用して、上述のように反応器の動作を自動的かつ別
個に監視するために、異なる時間に複数の反応器（直列もしくは並列で動作するか、また
はさもなければ独立して動作してもよい、例えば、４〜６個の反応器等の２〜１０個の反
応器）の細胞培養液及び細胞不含培養液の両方の分析のために構成されてもよい。代謝物
（複数可）（例えば、酢酸もしくは酢酸塩）の濃度及び生産性、ならびに／またはカルボ
キシド栄養性細菌の濃度及び生産性を含む培養液の特性は、一定間隔で自動的に判別され
てもよく、一連の測定間の期間は、上述のとおりである。有利に、オンライン自動サンプ
リング及び分析の使用は、分析結果が、ヒトの介入なしに（例えば、塩基性中和剤の流量
を制御するための）関連制御装置に直接入力されることを可能にする。さらに、本明細書
に記載される自動サンプリング装置は、操作者が、例えば、希釈及び／またはピペット操
作を行うことによって、複数のバイオリアクタからの複数の液体試料を追跡及び取り扱う
必要なしに、基本的にリアルタイムで、バイオリアクタ培養液、または複数のバイオリア
クタ培養液の特性の監視を可能にする。これにより、信頼性及びデータ再現精度、ならび
にバイオリアクタ（複数可）の動作全体が、大幅に改善される。
【００３３】
好ましくは、本明細書に記載される制御方法は、自動化され、プロセッサにこれらの制
御方法を実施するために必要な信号を制御装置に送信させるための適切な命令を伴う、コ
ンピュータプログラムの使用を伴う。特定の制御方法に従って、培養液の測定された特性
は、塩基性中和剤（例えば、水酸化アンモニウム溶液、または他の無機塩基もしくは有機
塩基等の水酸化物化合物）の流量制御の基準として使用される。そのような制御方法は、
従来の制御方法と比較して、所望の最終生成物（例えば、エタノール）の定義済み取り出
し速度、または他の定義済み操作パラメータによって区別されてもよい、例えば、定常状
態または連続操作の期間前の、最初の操作期間（例えば、バッチ操作期間）の時間を有利
に短縮することができる。理論に束縛されるものではないが、時間の短縮は、カルボキシ
ド栄養性細菌が塩基性中和剤を利用または消費する（例えば、塩基性中和剤中の窒素を利
用する）という事実に、少なくとも部分的に起因し得る。したがって、一般に、本明細書
に記載される制御方法は、培養液への少なくとも２つの供給流（例えば、ＣＯ含有基質及
び塩基性中和剤の両方）が、その中に含まれる細菌によって消費されるか、代謝されるか
、またはさもなければ利用されるバイオリアクタプロセスにおいて、特に有利である。他
の実施形態において、本明細書に記載される制御方法は、バッチ操作期間及び連続操作期
間の両方、または連続操作期間のみに使用されてもよい。
【００３４】
代表的な特性としては、酸性代謝物（例えば、酢酸もしくは酢酸塩）、またはカルボキ
シド栄養性細菌の、（例えば、グラム／リットルもしくはグラム・リットル１等の質量／
体積の単位での）測定された濃度、または（例えば、グラム／（リットル・日）もしくは
グラム・リットル−１・日−１等の質量／（体積・時間）の単位での）測定された生産性
が挙げられる。好ましい実施形態に従って、測定された特性は、酸性代謝物の測定された
濃度または測定された生産性である。上記特性のうちのいずれかは、上述のように、ある
測定頻度を用いてサンプリング技術を使用して、最初の操作期間（例えば、バッチ操作期
間）または他の期間の間、連続的または断続的（例えば、定期的）に測定されてもよい。
例えば、細胞不含または少なくとも実質的に細胞不含である透過水流の試料は、ＨＰＬＣ
を使用して、酸性代謝物のその濃度を分析されてもよい。
【００３５】
塩基性中和剤の流量の制御は、より具体的には、上述の培養液の測定された特性のうち
のいずれかと、これらの対応する設定値との間の差異に基づいてもよい。例えば、酸性代
謝物の測定された濃度が制御の基準である場合には、塩基性中和剤の流量は、培養液中の
酸性代謝物の測定された濃度と、酸性代謝物の設定濃度との間の差異に基づいて制御され
てもよい。同様に、酸性代謝物の測定された生産性、カルボキシド栄養性細菌の測定され
た濃度、またはカルボキシド栄養性細菌の測定された生産性が制御の基準である場合には
、塩基性中和剤の流量は、（ｉ）酸性代謝物の測定された生産性と、酸性代謝物の設定生
産性との間の差異、（ｉｉ）カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度と、カルボキシド
栄養性細菌の設定濃度との間の差異、または（ｉｉｉ）カルボキシド栄養性細菌の測定さ
れた生産性と、カルボキシド栄養性細菌の設定生産性との間の差異に基づいて制御されて
もよい。
【００３６】
酸性代謝物の設定濃度が判定される場合、例えば、酸性代謝物の測定された濃度がこの
設定（または目標）濃度を超えた場合、この制御方法は、塩基性中和剤の流量の一方向の
減少をもたらし得る。これは、最終的に、塩基性中和剤の減少した流量が培養液のｐＨを
低下させるため、培養液中の酸性代謝物の濃度を減少させる。好適な実施形態に従って、
ＣＯ含有基質流量は、（例えば、オンラインｐＨ計を使用し得て得られた）培養液の測定
されたｐＨ値に基づいて制御されてもよい。したがって、（例えば、４．０、４．５、５
．０、５．５、または６．０等のｐＨ値の設定値または目標未満への）測定されたｐＨ値
の減少は、ＣＯ含有基質流量の増加をもたらし得る。培養液がＣＯ含有基質の増加した流
れで供給されるようになったとき、酸性代謝物生産性は、エタノール生産性に有利に減少
し、酸性代謝物濃度を、例えば、酸性代謝物の設定濃度に向かって一方向に減少させ、ｐ
Ｈ値を上昇させる。反対に、酸性代謝物の測定された濃度が決められた設定（または目標
）濃度未満に落ちた場合、制御方法は、塩基性中和剤の流量の一方向の増加をもたらし得
る。これは、最終的に、塩基性中和剤の上昇した流量が培養液のｐＨを上昇させるため、
培養液中の酸性代謝物の濃度を上昇させる。ＣＯ含有基質流量は、上述のように、培養液
の（例えば、オンラインｐＨ計を使用して得られた）測定されたｐＨ値に基づいて制御さ
れてもよい。したがって、（例えば、４．２、４．７、５．２、５．７、または６．２等
のｐＨ値設定値または目標超への）測定されたｐＨ値の上昇は、ＣＯ含有基質流量の減少
をもたらし得る。培養液がＣＯ含有基質の減少した流れで供給されるようになったとき、
酸性代謝物生産性は、エタノール生産性を犠牲にして増加し、酸性代謝物濃度を、例えば
、酸性代謝物の設定濃度に向かって一方向に上昇させ、ｐＨ値を減少させる。
【００３７】
類似した制御方法は、上述のように培養液の他の測定された特性に従って塩基性中和剤
の流れを制御することにより、可能である。例えば、（ｉ）酸性代謝物の測定された生産
性が対応する設定（または目標）生産性を超えた場合、この制御方法は、塩基性中和剤の
流量の一方向の減少をもたらし得るか、（ｉｉ）カルボキシド栄養性細菌の測定された濃
度が対応する設定（または目標）濃度を超えた場合、この制御方法は、塩基性中和剤の流
量の一方向の増加をもたらし得るか、または（ｉｉｉ）カルボキシド栄養性細菌の測定さ
れた生産性が対応する設定（または目標）濃度を超えた場合、この制御方法は、塩基性中
和剤の流量の一方向の増加をもたらし得る。図１は、塩基性中和剤、水酸化アンモニウム
溶液（ＮＨ４ＯＨ）の流量が、酸性代謝物、酢酸の測定された生産性に基づく代表的な制
御方法を描写する。次に、ＮＨ４ＯＨ流量は、培養液のｐＨに影響を与える。ＮＨ４ＯＨ
流量における何らかの変化に対する対応が培養液のｐＨの管理である（例えば、ｐＨが「
平坦」である）場合には、ＣＯ含有基質流量は、変わらないままである。しかしながら、
そのような対応が培養液のｐＨをその設定値を超えて上昇させた（例えば、ｐＨが「高い
」）場合には、ＣＯ含有基質の流れは減少され、酢酸生産性が増加し、ｐＨをその設定値
に戻す。そのような対応が培養液のｐＨをその設定値未満に減少させた（例えば、ｐＨが
「低い」）場合には、ＣＯ含有基質の流れは増加され、酢酸生産性が減少し、ｐＨをその
設定値に戻す。
【００３８】
次に、培養液の特性の設定値のうちのいずれか（例えば、酸性代謝物の設定濃度、酸性
代謝物の設定生産性、カルボキシド栄養性細菌の設定濃度、またはカルボキシド栄養性細
菌の設定生産性）が、バイオリアクタプロセスの１つ以上の他の測定された操作パラメー
タ（例えば、測定された流量、濃度、及び／もしくは生産性、またはｐＨ）に基づいて判
定されてもよい。例えば、カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度またはカルボキシド
栄養性細菌の測定された生産性が、設定値を判定するために使用されてもよい。特定の実
施形態に従って、かつ本発明に関係するある特定の発見に基づいて、設定値は、カルボキ
シド栄養性細菌の測定された濃度またはカルボキシド栄養性細菌の測定された生産性に比
例し得る。酸性代謝物の設定生産性は、例えば、式
【数１】
2019193636.tif 000003
【００３９】
によって独立して判定されてもよく、式中、Ａ１及びＡ２は、設定値と、カルボキシド
栄養性細菌の測定された濃度（ＢＩＯＣＯＮｍｖ）またはカルボキシド栄養性細菌の測定
された生産性（ＢＩＯＰＲＯＤｍｖ）との間の比例定数をそれぞれ表し、Ｂ１及びＢ２は
、オフセットを表す。定数Ａ１及びＢ１、またはＡ２及びＢ２は、実験データ、例えば、
同じバイオリアクタを使用して得られたか、またはさもなければ同じ変換プロセス（例え
ば、エタノールへのＣＯの変換）を実施するための微生物培養液を含むバイオリアクタを
使用して得られた以前のデータから実験的に決定されてもよく、より具体的には、これら
の定数はそのような以前のデータの回帰分析を行うことにより得られてもよい。ＢＩＯＣ
ＯＮｍｖまたはＢＩＯＰＲＯＤｍｖを決定する場合、カルボキシド栄養性細菌濃度を判定
するためのサンプリング及び分析は、上述のように行われてもよい。
【００４０】
したがって、例となる実施形態において、カルボキシド栄養性細菌の測定された濃度（
ＢＩＯＣＯＮｍｖ）またはカルボキシド栄養性細菌の測定された生産性（ＢＩＯＰＲＯＤ
ｍｖ）は、オンラインバイオマスプローブまたは他のサンプリングデバイス及び試料分析
装置を使用して得ることができる。ＢＩＯＣＯＮｍｖまたはＢＩＯＰＲＯＤｍｖの値から
、酸性代謝物の設定濃度（もしくは目標濃度）または酸性代謝物の設定生産性（もしくは
目標生産性）が、例えば、上記に提供される式に従って判定されてもよい。
【００４１】
新しい培養液等の希釈剤は、一般的に、最初でない場合には、生物学的変換プロセスの
間のある後の時点でバイオリアクタに添加される。希釈剤は、バイオリアクタへの１つ以
上の他の供給物（例えば、ＣＯ含有基質及び／または塩基性中和剤）が最初に導入される
ときに一緒に最初に導入、例えば、希釈剤流が開始されてもよい。さもなければ、希釈剤
は、バイオリアクタへの１つ以上の他の供給物（例えば、ＣＯ含有基質及び／または塩基
性中和剤）が最初に導入された後のある時点（例えば、少なくとも２時間後、少なくとも
６時間後、または少なくとも１２時間後）に、最初に導入されてもよい。新しい培養液流
は、上述のプロセス開始目標のうちのいずれかと同じでもよい好適な培養液開始目標を達
成した後に、開始されてもよい。そのような目標には、例えば、カルボキシド栄養性細菌
または酸性代謝物のいずれかの規定の濃度または生産性が含まれてもよい。一般に、所与
の質量流量または体積流量での新しい培養液等の希釈剤の添加は、同等の質量流量または
体積流量での、所望の最終生成物及び任意の代謝物を含む（例えば、同時の）培養液の取
り出しを伴う。取り出された培養液は、（ｉ）（例えば、濾過もしくは膜分離によって分
離される場合）カルボキシド栄養性細菌を含み得ないか、もしくは実質的に含み得ないか
、または（ｉｉ）（例えば、分離せずに取り出された場合）バイオリアクタ内に含まれる
培養液中と同じもしくは実質的に同じ濃度でカルボキシド栄養性細菌を含み得る。いくつ
かの事例では、取り出された培養液は、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の部分（例えば、別個
の流れ）を含み得る。いずれにしても、（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかまたは両方が、同
じ生物学的なＣＯからエタノールへの変換プロセスを実施するために、（例えば、第１の
バイオリアクタと一緒に直列で動作することによって）第２のバイオリアクタに供給され
てもよい。
【００４２】
好ましくは、希釈剤の流量は、本明細書に定義されるように、バッチ操作期間のすべて
または一部の間、徐々に増加される。しかしながら、希釈剤流が後の（例えば、連続）操
作期間の間にだけ添加されるように、またはバイオリアクタへの希釈剤の導入がバッチ操
作期間から連続操作期間への移行を区別するために使用されるように、何らかの希釈剤流
がこの期間の間に添加される必要はない。
【００４３】
塩基性中和剤の流量と同様に、希釈剤流量は、上述のように、培養液の測定された特性
のうちのいずれかに基づいて、制御方法のうちのいずれかを使用して制御されてもよい。
特定の実施形態に従って、バイオリアクタへの希釈剤流量は、培養液中のカルボキシド栄
養性細菌の測定された濃度またはカルボキシド栄養性細菌の測定された生産性に基づいて
、制御されてもよい。本発明に関するある特定の発見に基づいて、希釈剤流量設定値が、
指数関数に従って判定されてもよく、測定された濃度または測定された生産性が、指数で
ある。例えば、希釈剤流量設定値は、式
【数２】
2019193636.tif 000004
【００４４】
のうちの１つに従って判定されてもよく、式中、ＢＩＯＣＯＮｍｖ及びＢＩＯＰＲＯＤ
ｍｖは、それぞれカルボキシド栄養性細菌の測定された濃度及びカルボキシド栄養性細菌
の測定された生産性をそれぞれ表し、Ｃ１及びＣ２は、定数である。定数Ｃ１及びＣ２は
、実験データから、例えば、同じバイオリアクタを使用して得られたか、またはさもなけ
れば同じ変換プロセス（例えば、エタノールへのＣＯの変換）を実施するための微生物培
養を含むバイオリアクタを使用して得られた以前のデータから実験的に決定されてもよく
、ＢＩＯＣＯＮｍｖまたはＢＩＯＰＲＯＤｍｖを決定する場合、カルボキシド栄養性細菌
濃度を判定するためのサンプリング及び分析は、上述のように行われてもよい。
【００４５】
第２の特定の制御方法に従って、培養液の特性の測定は、必要ではない。むしろ、以前
のデータを使用して、カルボキシド栄養性細菌の濃度及び生産性、酸性代謝物の目標生産
性をもたらす所与の組成物のＣＯ含有ガス（または基質）の対応する流れ、及び培養液の
ｐＨを維持する塩基性中和剤流の変数間の関係を確立してもよい。以前のデータは、例え
ば、同じバイオリアクタを使用して、またはさもなければ同じ変換プロセス（例えば、エ
タノールへのＣＯの変換）を実施するための微生物培養を含むバイオリアクタを使用して
得ることができる。ＣＯ含有基質の対応する流量に加えて、カルボキシド栄養性細菌濃度
及び生産性を含む他の生物学的なＣＯからエタノールへの変換プロセスからの情報を使用
して、塩基性中和剤の流量を、所望の酸性代謝物生産性に関して推定してもよい。さらに
、そのような情報を使用して、ＣＯ含有基質流量が、所与のカルボキシド栄養性細菌濃度
を供給し、所望の酸性代謝物生産性を達成するために推定され得る。
【００４６】
プロセス変数間の特定の関係は、例えば、以下の等式：
【数３】
2019193636.tif 000005
【００４７】
に基づき得、式中、ＢＩＯＰＲＯＤ、ＭＥＴＰＲＯＤ、ＮＥＵＴＦＬＯ、及びＣＯＦＬ
Ｏは、それぞれ、カルボキシド栄養性細菌の生産性、酸性代謝物の生産性、バイオリアク
タへの塩基性中和剤の流量、及びバイオリアクタへのＣＯ含有基質流量を表し、Ｗ、Ｘ、
Ｙ、及びＺは、上述のように以前のデータに基づいて実験的に決定された定数である。よ
り具体的には、これらの定数はそのような以前のデータの回帰分析を行うことにより得ら
れてもよい。生産性は、（例えば、カルボキシド栄養性細菌濃度もしくは生産性の場合、
分光光度計、プレートリーダー、もしくはバイオマスプローブを使用して、かつ／または
酸性代謝物濃度もしくは生産性の場合、ＨＰＬＣを使用して）上述のように測定すること
ができる。
【００４８】
したがって、特定の実施形態に従って、バイオリアクタへのＣＯ含有基質及び塩基性中
和剤の両方を供給するバッチ操作期間、または他の操作期間の間、塩基性中和剤の流量は
、ＣＯ含有基質流量に基づいて制御される。例えば、塩基性中和剤の流量は、測定された
値（例えば、ＣＯ含有基質の測定された流量）またはさもなければ設定値（例えば、ＣＯ
含有基質の流量設定値）のいずれかに基づいて制御されてもよい。つまり、塩基性中和剤
の流量の設定値は、そのような測定された値または設定値に従って決定されてもよい。あ
る特定の実施形態に従って、上記のプロセス変数の関係から明らかなように、塩基性中和
剤の流量設定値は、ＣＯ含有基質の測定された流量またはＣＯ含有基質の流量設定値のい
ずれかと共に、直線的に変化し得る。さらにより具体的には、塩基性中和剤の流量設定値
は、式：
【数４】
2019193636.tif 000006
【００４９】
に従って決定されてもよく、式中、ＣＯＦＬＯｍｖ及びＣＯＦＬＯｓｐは、それぞれ、
ＣＯ含有基質の測定された流量及びＣＯ含有基質の流量設定値を表す。Ｙ及びＺは、定数
、具体的には、Ｙの場合、ＣＯＦＬＯｍｖまたはＣＯＦＬＯｓｐと塩基性中和剤の流量設
定値との間の比例定数、及びＺの場合、オフセットを表す。
【００５０】
特定の種類のこれらの制御方法において、次にＣＯ含有基質流量は、培養液のｐＨ値に
基づいて制御されてもよい。例えば、培養液のｐＨの測定された値がｐＨ設定値（例えば
、上に示される特定のｐＨ値のうちの１つ）未満に減少した場合、培養液が過度に酸性に
なり、それに応答して、より多くのＣＯを細菌培養液に供給し、酸性代謝物の生産性を減
少させるために、（例えば、ＣＯ含有基質注入ライン上の制御弁の開口率を自動的に上昇
させることによって）ＣＯ含有基質流量が増加される。反対に、培養液のｐＨの測定され
た値がこのｐＨ設定値を超えて上昇した場合、培養液が過度にアルカリ性になり、それに
応答して、より少量のＣＯを細菌培養液に供給し、酸性代謝物の生産性を上昇させるため
に、（例えば、ＣＯ含有基質注入ライン上の制御弁の開口率を自動的に減少させることに
よって）ＣＯ含有基質流量が減少される。
【００５１】
あるいは、ＣＯ含有流量設定値は、培養液の測定されたｐＨ値から決定してもよく、こ
の設定値は、ＣＯ含有流量の測定された値からの偏差を表す。これらの留意事項の点から
、培養液の測定されたｐＨ値が塩基性中和剤の流量に加えて、ＣＯ含有基質流量の両方の
設定値を生成することが可能であり得る。しかしながら、ＣＯ含有基質の測定された流量
、（流量設定値に対して）この測定された流量が塩基性中和剤の流量の設定値を決定する
ために使用されることが、一般に好まれる。培養液のｐＨ値は、例えば、オンラインｐＨ
分析装置を使用して、連続的または断続的のいずれかで（例えば、一定間隔で）測定され
てもよい。さもなければ、このｐＨ値は、手作業で測定されてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、本発明を代表するものとして記載される。これらの実施例は、これら
の実施形態及び他の同等の実施形態が本開示及び添付の特許請求の点から明らかになると
おり、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００５３】
実施例１
従来の「時間ベースの」始動と本発明の「自動」始動との比較
Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉを含む培養液を接種することによって、ＣＯからエタノール
への変換の生物学的プロセスを開始した。培養液のｐＨは、酢酸が生成されるに従い、低
下し始めた。培養液のｐＨが５．０に達したとき、バイオリアクタへのＣＯ含有基質及び
水酸化アンモニウム供給を開始した。始動の間中のＣＯ含有基質流量を、ＣＯ供給過剰の
回避が主な目標であった従来の規定の時間ベースのプロファイルによって管理した。比較
目的のため、水酸化アンモニウムの流量が培養液中の（酢酸の形態の）酢酸塩の濃度に基
づいて制御され、ＨＰＬＣによって自動的かつ定期的に測定された、本明細書に記載され
る制御方法を使用して同じプロセスを開始した。これらの比較始動の進捗を、２日の期間
にわたる培養液中のエタノール、細菌、及び酢酸の濃度を提供する図２及び図３に示す。
この情報は、本発明の代表的な実施形態に従った、従来の時間ベースの始動の場合（図２
−「時間ベースの制御」）、及び自動始動の場合（図３−「自動制御」）で提供される。
【００５４】
図２と図３との比較から明らかであるように、所望の生成物、エタノールの濃度は、時
間ベースの始動の１日目に２グラム／リットル（ｇ／ｌ）未満であり、この濃度は、自動
始動ではこの時点で既にほぼ８ｇ／ｌである。さらに、図４に図示されるように、時間ベ
ースの始動と比較して、自動始動がはるかに早いＣＯ含有基質流量の増加をもたらすこと
は明らかである。これは、細菌成長に悪影響をもたらす供給過剰をせずに、細菌培養液へ
の、エタノール生成のために必要な量のＣＯの連続供給に起因する。時間ベースのプロフ
ァイルの場合、ＣＯ含有基質流量は、ＣＯ供給過剰の回避を確実にするために、特徴的に
控えめであった。しかしながら、結果として、ＣＯ供給不足は避けられず、エタノールよ
りもむしろ酢酸が主な生成物である。図５は、これら２つの制御方法を使用したこれらの
始動プロセスの経時的な細菌の濃度を比較する。明らかであるように、自動始動の場合の
より多いＣＯ流量を用いてさえ、微生物成長は抑制されず、実際、高められた。
【００５５】
これらの結果に基づいて、本明細書に記載される制御方法は、特に、所望の酢酸濃度ま
たは細菌濃度等の所与のプロセス目標を達成するのに必要な時間の短縮に関して、大きな
プロセス利益をもたらすことができる。目標は、バッチ操作期間等の最初の始動期間の完
了と関連してもよく、その場合、連続操作への移行が、より迅速かつ効率的に達成され得
る。これは、材料消費の低減及び運営費全体の低減を含む重要な商業利益につながる。細
胞再循環システムを装備した２つの反応器を用いて動作するプロセスの場合、いずれのさ
らなる処理をせずに、例えば、試料濾過または遠心分離をせずに、反応器から細胞不含透
過水を直接サンプリングして、これらの試料を自動ＨＰＬＣに供給することが、可能であ
り得る。その一方、従来の試料調製方法は、ＨＰＬＣへの注入前に、特定の酸または塩基
の添加、続いて遠心分離または濾過が必要である。これは、複雑にし、結果により多くの
エラーを生じる手作業のピペット操作を伴う。
【００５６】
実施例２
自動始動−測定された濃度に基づいたＮＨ４ＯＨ流の制御
Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｎを含む培養液を接種することによって、ＣＯからエタノールへ
の変換の生物学的プロセスを開始した。培養液のｐＨは、酢酸が生成されるに従い、低下
し始めた。培養液のｐＨが５．０に達したとき、バイオリアクタへのＣＯ含有基質及び水
酸化アンモニウム供給を開始した。バイオリアクタ内の測定された細菌濃度に基づいて、
酢酸塩（酢酸）目標濃度及び希釈剤流量を以下の等式に従って決定し、
【数５】
2019193636.tif 000007
【００５７】
式中、Ａ１、Ｂ１、及びＣ１は、先のプロセスで得られた情報から、実験的に決定した
。オンラインＨＰＬＣを使用して測定した酢酸濃度に基づいて、水酸化アンモニウムの流
量を自動的に調節、例えば、細菌による酢酸生成を増加させるために増加させたか、また
は酢酸生成を減少させるために減少させた。培養液のｐＨを目標ｐＨ＝５．０に維持する
ように、気体ＣＯ含有基質の流れを自動的に増加または減少させた。希釈剤の流量に加え
て、経時的エタノール、細菌、及び酢酸の濃度を、図６に示す。
【００５８】
実施例３
自動始動−測定されたｐＨ及びＣＯ含有基質流量のみに基づく
生物学的プロセスの先の始動データに基づいて、Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉを含む培養
液にＣＯを供給することによりＣＯをエタノールに変換した実施例１に記載されるように
、反応器内の所与の細菌濃度と、目標酢酸生産性を得るためにそれを必要とした所与の組
成物のＣＯ含有基質の対応する流量と、培養液のｐＨを所与の目標に維持するために必要
な、必要とされる水酸化アンモニウム流量との間の関係を確立した。これらの関係は、以
下のとおりであった：
【数６】
2019193636.tif 000008
【００５９】
式中、ＢＩＯＰＲＯＤ、ＭＥＴＰＲＯＤ、ＮＥＵＴＦＬＯ、及びＣＯＦＬＯは、それぞ
れ、細菌（バイオマス）生産性、酢酸（酢酸塩）生産性、バイオリアクタへのＮＨ４ＯＨ
の流量、及びバイオリアクタへのＣＯ含有基質流量を表した。因数、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺ
を、細菌生産性測定が連続時間間隔で測定された濃度に基づいた以前のプロセスで得られ
た情報から、（線形回帰を使用して）実験的に決定した。つまり、測定された細菌生産性
を、時間２の時点での細菌濃度−時間１の時点での細菌濃度）／（時間２−時間１）で算
出した。これらの以前のプロセスで、細菌濃度を分光光度計またはプレートリーダーまた
はバイオマスプローブを使用して測定し、測定された酢酸生産性を、時間２の時点での酢
酸濃度−時間１の時点での酢酸濃度）／（時間２−時間１）で算出した。酢酸及びエタノ
ール濃度を、ＨＰＬＣによって測定した。これらの以前のプロセスから生成されたデータ
に従って、以下の因数を決定した：Ｗ＝１．２、Ｘ＝１．５、Ｙ＝１．４６、及びＺ＝３
．２１。
【００６０】
したがって、自動始動のために使用した関係は、ＮＥＵＴＦＬＯ＝１．４６・ＣＯＦＬ
Ｏ＋３．２１であった。培養液のｐＨを、ＰＩＤ制御装置を使用してＣＯ含有基質の流れ
を自動的に調節することによって、５．０に維持した。上記の関係を、ＣＯ含有基質の測
定された流量に基づいて水酸化アンモニウム流量を設定するために使用した。
【００６１】
水酸化アンモニウム及びＣＯ含有基質流量に加えて経時的エタノール、細菌、及び酢酸
の濃度を、図７に示す。有利に、１日目をとおして細菌成長は高く、２．９グラム／（リ
ットル・日）であり、酢酸生産性は低く、２．８グラム／（リットル・日）であった。エ
タノール生産性及び濃度を最大化した。これらの観察は、連続プロセスを確立する前に重
要である、生物学的ＣＯ変換プロセスの成功した始動と一致した。重要なことには、バイ
オリアクタ内の細菌及び酢酸の測定された濃度は、この制御方法で直接使用しなかった。
むしろ、作業の進捗を確認するためだが自動操作へのフィードバックがない範囲内におい
てのみ、これらの濃度を監視した。
【００６２】
全体的に、本発明の態様は、ＣＯ含有基質がエタノール等のより高い価値のある生成物
を生成するために使用される生物学的発酵プロセスの制御方法に対する。本制御方法は、
バイオリアクタの植え付け後、従来の制御方法（例えば、ＣＯ含有基質流の時間ベースの
プロファイル）を使用して必要とされる期間と比較して、より短い期間で（例えば、所与
のプロセス開始目標を達成したら）連続生成に到達できるように、これらのプロセスの開
始または始動を有利に短縮し得る。これらの制御方法は、代替的に、または加えて、所望
の最終生成物の生産性を向上させ得、かつ／または、開始もしくは始動の間、細菌の成長
速度を向上させ得る。本開示から得られた知識を有する当業者は、本発明の範囲から逸脱
することなく、様々な変更が制御方法、システム、及びコンピュータプログラム製品に加
えられ得ることを認識するであろう。
【図１】
2019193636.tif 000012
【図２】
2019193636.tif 000013
【図３】
2019193636.tif 000014
【図４】
2019193636.tif 000015
【図５】
2019193636.tif 000016
【図６】
2019193636.tif 000017
【図７】
2019193636.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月26日(2019.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019193636000001.pdf