(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫原性組成物を調製するための糖コンジュゲートの提供。【解決手段】（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む下式の糖コンジュゲート、前記糖コンジュゲートの製造方法及び前記糖コンジュゲートを含有する免疫原性組成物。2019001790.tif 000037【選択図】図１
2019001790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、
一般式（Ｉ）
【化１】
2019001790.tif 000033
［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
Ｒは、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、もしくは（ＣＨ２）１０からなる群から選択されるか、または
Ｒが、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される］を有する、
但し、前記スペーサーが（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではない、
糖コンジュゲート。
【請求項２】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＩ）
【化２】
2019001790.tif 000034
［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項３】
ｎが、３、４、５、または６である、請求項２に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１０】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2019001790.tif 000035
［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項５】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＶ）
【化４】
2019001790.tif 000036
［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項６】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、
オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された糖、または
オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された糖、を含む、糖コンジュゲート。
【請求項７】
糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖である、請求項１から６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項８】
前記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項７に記載の糖コンジュゲート。
【請求項９】
糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ
Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）に由来する莢膜糖である、請求項１から６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１０】
担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合体、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群において選択されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１１】
担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、請求項１から９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種の糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
【請求項１４】
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によってチオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
【請求項１５】
医薬品として使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ワクチンとして使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲートまたは請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、一般式（Ｉ）：
【０００２】
【化１】
2019001790.tif 000003
［式中、Ｂ、Ａ、およびＲは、下記に示す意味を有する］を有する、（（２−オキソエチ
ル）チオ）（下記では「オキソ−ｅＴ」）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質
に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート、そのような糖コンジュゲ
ートを含む免疫原性組成物、ならびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物
を調製および使用するための方法に関する。
【０００３】
一実施形態では、上記スペーサーは、（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カ
ルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではない。
【背景技術】
【０００４】
免疫原性が不十分な分子の免疫原性を、これらの分子を「担体」分子にコンジュゲート
することによって増大させる手法は、数十年にわたって利用され、成功を収めてきた（例
えば、Ｇｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３を参照されたい）。
例えば、この「担体効果」を利用することによって、より有効な免疫原性組成物を得るた
めに、精製された莢膜状ポリマーが担体タンパク質にコンジュゲートされた多くの免疫原
性組成物が記載されている。（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍ
ｍｕｎ．４５：５８２〜５９１）。コンジュゲーションによって、遊離多糖で免疫化され
た場合に乳児において通常観察される不十分な抗体応答が回避されることも示されている
（Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１０７：３４６；Ｉｎｓｅｌら
（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：２９４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ホモ二官能性、ヘテロ二官能性、またはゼロ長架橋剤などの様々な架橋またはカップリ
ング試薬を使用してコンジュゲートを生成することに成功している。糖、タンパク質、お
よびペプチドなどの免疫原性分子をペプチドまたはタンパク質担体にカップリングするた
めに、現在、多くの方法が利用可能である。大部分の方法が、アミン、アミド、ウレタン
、イソチオ尿素、もしくはジスルフィド結合、または場合によってはチオエーテルを生ず
る。反応性部位を担体および／または免疫原性分子上の反応性アミノ酸分子の側鎖に導入
する架橋またはカップリング試薬を使用する欠点は、中和されなければ、反応性部位が遊
離であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（したがって、コンジュゲートの官能性または安定性に不利
な影響を及ぼす可能性がある）、またはｉｎ  ｖｉｖｏ（したがって、その調製物で免疫
化されたヒトまたは動物において有害事象の潜在的なリスクをもたらす）のいずれかで、
何らかの望ましくない分子と反応することである。これらの部位を不活性化させるように
、様々な公知の化学反応を利用して、そのような過剰な反応性部位を反応させるか、また
は「キャッピングする」ことができるが、これらの反応は他の点で、コンジュゲートの官
能性に対して破壊的であり得る。このことは特に、担体分子のより大きなサイズおよびよ
り複雑な構造（免疫原性分子と比較して）によって、担体分子が化学的処理の破壊的作用
に対してより脆弱になり得るので、反応性部位を担体分子に導入することによってコンジ
ュゲートを得ようとする場合には問題となり得る。したがって、担体の官能性が維持され
、コンジュゲートが所望の免疫応答を誘発する能力が保持されるように適切にキャッピン
グされた担体タンパク質コンジュゲートを調製する新たな方法が依然として必要とされて
いる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は概して、（（２−オキソエチル）チオ））を含有するスペーサー（下記では、
「オキソ−ｅＴ」とも名づけられる）を介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲー
トされた糖を含む糖コンジュゲートに関する。
【０００７】
一態様では、本発明は、一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化２】
2019001790.tif 000004
［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり
得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであ
り、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２
、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、または
プロピルから選択される］を有する、（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサ
ーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート
に関する。
【０００９】
上記一般式（Ｉ）において、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレンは、２〜１６個の炭素原子を含有
する直鎖を示す。適切な（Ｃ２〜Ｃ１６）アルキレンラジカルの例は、（ＣＨ２）２、（
ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８
、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０である。
【００１０】
上記一般式（Ｉ）において、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞ
れ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される同じかまたは異なるヘテロ原子で置き換えら
れている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態で
は、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ、酸素原子で置き換えら
れている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態で
は、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１、２、３、または４個がそれぞれ、酸素原子で置
き換えられている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。適切なＣ２
〜Ｃ１６ヘテロアルキレンの例は、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−
Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−
Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ
２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、
ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２である。
【００１１】
好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、もしくはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレンで
あり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、上記アルキレンおよびヘテロアルキレ
ンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２、もしくは３個の基によって置換されてい
てもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、もしくはプロピルから選択されるか、または
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｃ２〜Ｃ１０アルキレン、もしくはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１０ヘテロアルキレンで
あり、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＨによって置換されていてもよ
い。
【００１２】
他の好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または
Ｒは、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（
ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０からなる群から選択さ
れる。
【００１３】
他の好ましい実施形態では、
Ｂは、Ｏであり、かつＡは、Ｃ（＝Ｏ）であるか、または
Ｂは、ＣＨ２であり、かつｍは、０であるか、または
Ｂは、Ｃ（＝Ｏ）であり、かつｍは、０であり、かつ／または、
Ｒは、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−
ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−
ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−
ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ
−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される。
【００１４】
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートは、（（２−オキソエチル）チオ）（下記
では「オキソ−ｅＴ」とも呼ばれる）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共
有結合でコンジュゲートされた糖を含むが、ただし、上記スペーサーが、（２−（（２−
オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサー（すなわち、−Ｃ（
Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）ではないことを条件とする。
【００１５】
本発明はさらに、そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物、ならびにそのよ
うな糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を調製および使用するための方法に関する。
【００１６】
一態様では、本発明は、（（２−オキソエチル）チオ）または「オキソ−ｅＴ」スペー
サーと本明細書において称される二価ヘテロ二官能性リンカーを介して担体タンパク質に
共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法を対象とする
。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、次の式を有する
１．式（ＩＩ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキ
ソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲート：
【００１８】
【化３】
2019001790.tif 000005
［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］。
２．次の式（ＩＩＩ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート
（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲート：
【００１９】
【化４】
2019001790.tif 000006
［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、Ｎ
ＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）
ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
３．式（ＩＶ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅ
ＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲート：
【００２０】
【化５】
2019001790.tif 000007
［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯ
Ｈ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２
、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
４．式（Ｖ）を有する（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴ
ＡＡＤ）連結糖コンジュゲート：
【００２１】
【化６】
2019001790.tif 000008
［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯ
Ｈ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２
、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｒが、
（ＣＨ２）ｎ（ｎは、３〜１０から選択される）、
（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１〜３から選択される）、
ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、
ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１または２である）、
ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ（ｎは、１〜８から選択される）、または
−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２（ｍは、１または２である）
から選択される、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）（ＩＶ）、または（Ｖ）の糖コンジュ
ゲートに関する。
【００２３】
糖と担体タンパク質またはペプチドとの間の構造的連結部の一部として（（２−オキソ
エチル）チオ）を含有するスペーサーを含む、上記で定義した糖コンジュゲートにおいて
、上記スペーサーは、安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。
【００２４】
本発明の糖コンジュゲートは、糖と担体タンパク質またはペプチドとの間の構造的連結
部の一部として（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを含み、上記スペー
サーは、安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。加えて、コンジュゲートのス
ペーサー部分に対して免疫応答が生じるリスクを低下させるように、上記スペーサーは、
比較的短いことが好ましい。コンジュゲートのスペーサー部分に対する免疫応答は望まし
くなく、短いスペーサーは、上記リスクを最小化する利点を有する。したがって、一実施
形態では、本発明の糖コンジュゲートは、そのスペーサーの原子数（例えば、式Ｉ、ＩＩ
、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）が原子２５個以下である（（２−オ
キソエチル）チオ）を含有するスペーサーを含む。好ましくは、そのスペーサーの原子数
（例えば、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）は、原子２１
、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、
または６個である。なおより好ましくは、そのスペーサーの原子数（例えば、式Ｉ、ＩＩ
、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶの中央枠内に含有される）は、１５個以下である（原子１４、
１３、１２、１１、１０、９、８、７、または６個など）。
【００２５】
本発明はさらに、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲート、それを含む免疫原性組成物、な
らびにそのような糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物を使用するための方法を提供す
る。
【００２６】
一態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジ
ュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、カルバマート連結を介し
てオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエー
テルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された糖コ
ンジュゲートを提供する。一実施形態では、上記オキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、（２−
（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサー（すなわち
、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）ではない。
【００２７】
一態様では、コンジュゲートにおいてオキソ−ｅＴＡＣスペーサーを生成するために、
本明細書において使用する好ましいリンカーは、メルカプトプロピオニルヒドラジド（Ｍ
ＰＨ、ｎ＝２）、Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリド（ｎ＝１）、および２
−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ、ｎ＝２）、および４−アミ
ノ−１−ブタンチオールヒドロクロリド（ｎ＝４）である。
【００２８】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、アミン連結を介して
オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエー
テルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された糖
コンジュゲートを提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、アミド連結を介して
オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結され、その担体タンパク質が、チオエー
テルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結された糖
コンジュゲートを提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、糖は、細菌に、特に病原細菌に由来する莢膜多糖細菌などの多糖
である。他の実施形態では、糖は、オリゴ糖または単糖である。
【００３１】
本発明の糖コンジュゲートに組み込まれる担体タンパク質は、本明細書においてさらに
記載されているか、または当業者に知られているとおりの、そのような目的に一般に適し
た担体タンパク質の群から選択される。特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ
１９７である。
【００３２】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコン
ジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖を、炭酸誘
導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）活性化
糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカー（保護されたまたは遊離
チオール形態、例えば、ＤＬ−シスチンもしくはＤＬ−システインもしくはその塩、また
はメルカプトプロピオニルヒドラジド、もしくは２−（２−アミノエトキシ）エタン−１
−チオール、もしくは４−アミノ−１−ブタンチオールもしくはその塩として）と反応さ
せて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤
（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル
残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個
または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオー
ル化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体
タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハ
ロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／ま
たは（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッ
ピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それに
よって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。
【００３３】
多くの実施形態では、ステップａ）を有機溶媒中で行う。
【００３４】
多くの実施形態では、炭酸誘導体は、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリ
アゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジス
クシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホ
ルマートである。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであり、有機溶媒は、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、チオー
ル化糖を、活性化糖をヘテロ二官能性チオアルキルアミン試薬またはその塩と反応させる
ことによって生成する。本発明の方法によって生成されるオキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジ
ュゲートは、一般式（ＩＩおよびＩＩＩ）によって表され得る。
【００３５】
多くの実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質のリシン残基上の非
コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基と反応して、チオエーテル連結を介して活性化
リシン残基に共有結合で連結されたＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）残基を形
成するＮ−アセチル−Ｌ−システインである。他の実施形態では、第２のキャッピング試
薬は、活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル基と反応して、キャ
ッピングされたチオアセトアミドをもたらすヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である。多く
の場合に、ステップｅ）は、第１のキャッピング試薬および第２のキャッピング試薬の両
方を用いるキャッピングを含む。ある種の実施形態では、ステップｅ）は、第１のキャッ
ピング試薬としてＮ−アセチル−Ｌ−システイン、および第２のキャッピング試薬として
ＩＡＡを用いるキャッピングを含む。
【００３６】
一部の実施形態では、キャッピングステップｅ）はさらに、第１および／または第２の
キャッピング試薬との反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプ
トエタノールとの反応を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、ステップｄ）はさらに、活性化チオール化糖を活性化担体タンパ
ク質と反応させる前に、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タン
パク質を得ることを含む。多くの実施形態では、活性化担体タンパク質は、１個または複
数のα−ブロモアセトアミド基を含む。
【００３８】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）糖を、アル
デヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、ｂ）
活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたま
たは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によって
チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオ
ールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を
含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または
複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖
−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパ
ク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセ
トアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（
ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピング
することができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって
、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。本発明の方法に
よって生成されたオキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートは、一般式（ＩＶ）によって
表され得る。
【００３９】
チオール化多糖を生成するための上記の好ましい実施形態では、ｅＴＡＡＮリンカーの
アミノ末端とさらに反応させる前に、多糖の第一級ヒドロキシル基を、２，２，６，６−
テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）／Ｎ−クロロスクシンイミド（Ｎ
ＣＳ）試薬系によって酸化させる（図２またはその全体が記載されている場合と同様に参
照によって本明細書に組み込まれる出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１３／０６０９３３を参照
されたい）。
【００４０】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされたカルボキシル含有糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって
、ａ）活性化糖を生成するためのカルボキシル基含有糖を、カルボジイミドまたはその誘
導体と初めに反応させるステップと、ｂ）活性化糖を、アミノ末端においてアミンおよび
チオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有するヘテロ二官能性リンカーと
反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）チオール化糖を脱保護剤または還
元剤（保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を
含む活性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または
複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖
−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパ
ク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセ
トアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（
ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピング
することができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって
、オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを生成する方法を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされたカルボキシル官能化糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法を提供
する。例として、糖の第一級ヒドロキシルを初めに、ＴＥＭＰＯ／次亜塩素酸ナトリウム
との反応によってカルボキシルに変換することができた。
【００４２】
多くの実施形態では、カルボジイミド誘導体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（ＤＣＣ）または１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド
である。好ましくは、カルボジイミド誘導体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。好ましい実施形態では、活性化糖を、アミン
およびチオール官能基を含有する二官能性リンカーと反応させることによって、チオール
化糖を生成する。本発明の方法によって生成されるオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲ
ートは、一般式（Ｖ）によって表され得る。カルボキシル含有糖を反応させるための上記
の好ましい実施形態では、当初の活性化ステップを、ヘテロ二官能性ｅＴＡＡＤリンカー
のアミノ末端との反応の前に、カルボジイミドおよびチアゾリジノンチオンによって達成
する。別の実施形態では、当初のカルボン酸活性化ステップを、二官能性ｅＴＡＡＤリン
カーのアミノ末端との反応前にＮ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウム−３’−ス
ルホナート（Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ）によって達成する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示する方法のいずれかによって生成され
た、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むオ
キソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
【００４４】
本発明の態様のそれぞれで、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態では
、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、細菌莢膜多糖、特に、病原細菌に由来する莢膜
多糖である糖を含む。
【００４５】
例として、多糖は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａ
ｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａｅ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラカタラーリス（Ｍｏｒａ
ｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ）、ポルフィロモナス−Ａ−ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ−
Ａ−ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、腸チ
フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈ
ｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｄ群赤痢菌（Ｓｈｅｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅ
ｉ）、およびビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）からなる群から選択され
るグラム陰性細菌に由来し得る。多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバク
テリウム結核（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、黄色ブドウ
球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されるグラム陽性細菌に由来し
得る。
【００４６】
一部の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する肺炎球菌（Ｐｎ）莢膜多糖を含
む。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、
６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ
、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３
５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ
−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４
、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群
から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５
Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００４７】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する髄膜炎菌（Ｍｎ）莢膜糖（オリ
ゴ糖または多糖）を含む。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ
、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｍｎ
莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜多糖である。
【００４８】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（
Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）に由来する莢膜多糖を含む。
具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ
莢膜多糖からなる群から選択される。
【００４９】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な
実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
【００５０】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
【００５１】
特に好ましい実施形態では、糖は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共
有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖
である。
【００５２】
本明細書に記載の組成物および方法は、様々な用途において有用である。例えば、本発
明の糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物の生
成において使用することができる。そのような免疫原性組成物は、受容者を、例えば、肺
炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
）またはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）などの病原細菌による細菌感染から防御するために使用することができる
。
【００５３】
したがって、別の態様では、本発明は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的
に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物であって、その糖コン
ジュゲートが、本明細書に記載のとおりオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質
に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む免疫原性組成物を提供する。
【００５４】
多くの実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学
的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含み、糖コンジュゲートは、細菌莢膜多
糖を含む。
【００５５】
一部のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部
の具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、
１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５
Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−
血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、
１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群か
ら選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ
、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００５６】
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部
の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢
膜多糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清
型Ｘ莢膜多糖である。
【００５７】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（
Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）に由来する莢膜多糖を含む。
具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ
莢膜多糖からなる群から選択される。
【００５８】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な
実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
【００５９】
他のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
【００６０】
好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１
９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球
菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌
莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
【００６１】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一部のそのような実施
形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アル
ミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形
態では、本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、
改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含
み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖コン
ジュゲートを含む方法を提供する。
【００６３】
一実施形態では、感染症、疾患、または状態は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、
疾患、または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に関連し、糖コンジュ
ゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、Ｂ群
連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関連し、糖コンジュゲート
は、ＧＢＳ莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、黄色ブド
ウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）莢膜多糖を含む。別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、エンテロ
コッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテ
ロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）に関連し、糖コ
ンジュゲートはそれぞれ、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖を含む。
【００６４】
他の態様では、本発明は、それぞれの場合に、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、
薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を
対象に投与することにより、病原細菌に対する免疫応答を誘発するための方法；病原細菌
に起因する疾患または状態を予防、処置、または改善するための方法；および病原細菌に
起因する感染症、疾患、状態の少なくとも１つの症状の重症度を低下させるための方法で
あって、糖コンジュゲートが、病原細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む方
法を提供する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、オキソ−ｅ
Ｔ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免
疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、糖コンジュゲートが、細菌莢膜
多糖などの細菌抗原を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、上記方法は、本明細
書においてさらに記載するとおり、対象において防御免疫応答を生じさせることを伴う。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本明細書においてさらに記載するとおり、対象において防御
免疫応答を生じさせるために、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫学的有効量
の免疫原性組成物を対象に投与する方法を提供する。
【００６７】
さらなる一態様では、本発明は、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲート、または
そのような糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物に応答して産生される抗体を提供する
。そのような抗体は、細菌検出および血清型判定などの研究および臨床検査室アッセイに
おいて使用することができるか、または受動免疫を対象に付与するために使用することが
できる。
【００６８】
また別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏ
ｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ま
たは腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａ
ｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉ
ｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善する際に使用するための本発明のオ
キソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ
Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または
腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉ
ｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ
）など）による感染症を予防、処置、または改善するための医薬品を調製するための、本
発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
【００７０】
上記の治療および／または予防方法ならびに使用のある種の好ましい実施形態では、免
疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結され
た細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法
および使用の多くの実施形態では、細菌莢膜多糖は、Ｐｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖ま
たはＧＢＳ莢膜多糖または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖または腸球菌多糖（
エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）また
はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）
である。一部のそのような実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５
、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９
Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。具体的
な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ
、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、
１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多
糖からなる群から選択される。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１
、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、
１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択さ
れる。具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ
、２０、２３Ａ、２３Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのよ
うな実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖
からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、血清型Ｉ
ａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
【００７１】
上記の治療および／または予防方法および使用のある種の実施形態では、免疫原性組成
物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜
多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法および使用
のある種の実施形態では、細菌莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多
糖である。他のそのような実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖
は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
【００７２】
上記の治療および／または予防方法および使用のある種の実施形態では、免疫原性組成
物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜
多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法および使用
のある種の実施形態では、細菌莢膜多糖は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多
糖である。他のそのような実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖
は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）
またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢
膜多糖である。
【００７３】
ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。特に好ましい
実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有
結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａ
ｕｒｅｕｓ）または腸球菌多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖
コンジュゲートを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲー    トについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを調製するための一般    スキームである。
【図２】ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲー    トについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを調製するための一    般スキームである。
【図３】ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲー    トについて、本発明のオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを調製するための一    般スキームである。
【図４】ＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた多糖を含む糖コンジュゲー    トについて、チアゾリジノンチオン誘導体を使用して本発明のオキソ−ｅＴＡＡＤ連    結糖コンジュゲートを調製するための一般スキームである。
【図５】肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型３３Ｆ（Ｐｎ−３３Ｆ）莢    膜多糖の繰り返し多糖構造である。
【図６】肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型２２Ｆ（Ｐｎ−２２Ｆ）莢    膜多糖の繰り返し多糖構造である。
【図７】肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）莢    膜多糖の繰り返し多糖構造である。
【図８】肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）血清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）莢    膜多糖の繰り返し多糖構造である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本発明の好ましい実施形態の次の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照す
ることによって、本発明はより容易に理解され得る。別段に定義しない限り、本明細書に
おいて使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって
共通して理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記載したものと同様また
同等の任意の方法および材料を本発明の実行および試験において使用することができるが
、いくつかの好ましい方法および材料を本明細書において記載する。実施形態を記載し、
かつ本発明を特許請求する際には、いくつかの専門用語を、下記に提示する定義に従って
使用することとする。
【００７６】
本明細書において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、およ
び「その（ｔｈｅ）」は、別段に示さない限り、複数の言及を含む。したがって、本開示
を読めば当業者には明らかであろうとおり、例えば、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ（方法）」
という言及は、本明細書に記載の種類の１つまたは複数の方法および／またはステップを
含み、「ａｎ  ｏｘｏ−ｅＴ  ｓｐａｃｅｒ（オキソ−ｅＴスペーサー）」という言及は
、１個または複数のｅＴスペーサーを指している。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「約」という用語は、述べられている濃度範囲、時間
枠、分子量、温度、またはｐＨなどの値の統計的に有意な範囲内であることを意味する。
そのような範囲は、指示値または範囲のある程度の範囲内、典型的には２０％以内、より
典型的には１０％以内、なおより典型的には５％以内であり得る。時には、そのような範
囲は、所与の値または範囲を測定または決定するために使用される標準的な方法に典型的
な実験誤差の範囲内であり得る。「約」という用語に包含される許容できる変化は、研究
中の特定の系に依存するはずであり、当業者には容易に認められ得る。範囲が本出願内に
おいて列挙されている場合には常に、その範囲内の全整数のそれぞれも、本発明の実施形
態として企図される。
【００７８】
本開示において、「含む」、「含まれる」、「含むこと」、「含有する」、「含有する
こと」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得ることに注意す
る；例えば、それらは、「含む」、「含まれる」、「含むこと」などを意味し得る。その
ような用語は、任意の他の構成要素を排除することなく、特定の構成要素または構成要素
のセットを含むことを指す。「本質的に〜からなること」および「本質的に〜からなる」
などの用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し、例えば、それらは、本
発明の新規または基本的な特性を損なうことがない追加の構成要素またはステップの包含
を許容し、すなわち、それらは、本発明の新規または基本的な特性を損なう追加の列挙さ
れていない構成要素またはステップを排除する。「からなる」および「からなること」と
いう用語は、米国特許法においてそれらに帰属する意味を有する；すなわち、これらの用
語は、閉鎖型（ｃｌｏｓｅｄ  ｅｎｄｅｄ）である。したがって、これらの用語は、特定
の構成要素または構成要素のセットの包含と、他の構成要素すべての排除とを指す。
【００７９】
「糖」という用語は、本明細書において使用する場合、多糖、オリゴ糖、または単糖を
指し得る。多くの場合に、糖に対する言及は、細菌莢膜多糖、特に、肺炎連鎖球菌（Ｓ．
Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＧＢＳま
たは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（エンテロコッカス・フェカーリ
ス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウ
ム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの病原細菌に由来する莢膜
多糖を指す。
【００８０】
「コンジュゲート」または「糖コンジュゲート」という用語は、担体タンパク質に共有
結合でコンジュゲートされた糖を指すために、本明細書において互換的に使用される。本
発明の糖コンジュゲートは時折本明細書において、「オキソ−ｅＴ連結」糖コンジュゲー
トと称され、これは、少なくとも１個のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質
に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む。本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲー
ト、およびそれを含む免疫原性組成物は、多少の量の遊離糖を含有し得る。
【００８１】
「遊離糖」という用語は、本明細書において使用する場合、担体タンパク質に共有結合
でコンジュゲートしていない糖、または高い糖／タンパク質比（＞５：１）で結合した非
常に少ない担体タンパク質に共有結合で結合しているが、それにも関わらず、糖コンジュ
ゲート組成物中に存在する糖を意味する。遊離糖は、コンジュゲートされた糖−担体タン
パク質糖コンジュゲートと非共有結合で会合し得る（すなわち、非共有結合で結合するか
、それに吸着されるか、またはそれに捕捉され得る）。本明細書において、「遊離多糖」
および「遊離莢膜多糖」という用語が、糖がそれぞれ多糖または莢膜多糖である糖コンジ
ュゲートに関して同じ意味を伝えるために使用されることがある。
【００８２】
本明細書において使用する場合、「コンジュゲートする」、「コンジュゲートされる」
、および「コンジュゲートすること」は、糖、例えば、細菌莢膜多糖を担体分子または担
体タンパク質に共有結合で結合するプロセスを指す。本発明の方法において、糖は、少な
くとも１個のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲー
トされている。コンジュゲーションは、下記の方法によって、または当技術分野で公知の
他のプロセスによって行うことができる。担体タンパク質へのコンジュゲーションは、細
菌莢膜多糖の免疫原性を増強する。
【００８３】
糖コンジュゲート
本発明は、１個または複数のオキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結
合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、その糖が、カルバマート
またはアミンまたはアミド連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合でコンジュゲ
ートされ、その担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴ
スペーサーに共有結合でコンジュゲートされた糖コンジュゲートに関する。
【００８４】
１個または複数のオキソ−ｅＴスペーサーの存在に加えて、本発明の糖コンジュゲート
の新規の特徴には、糖および得られたオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートの分子量プロフ
ァイル、担体タンパク質１個当たりのコンジュゲートされたリシンとオキソ−ｅＴスペー
サー（複数可）を介して多糖に共有結合で連結されたリシンとの比、糖の繰り返し単位を
関数とした担体タンパク質と糖との間の共有結合連結の数、および糖の全体量と比較した
遊離糖の相対量が含まれる。
【００８５】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、下記で例示されるとおり、一般式（Ｉ
）によって表され得る：
【００８６】
【化７】
2019001790.tif 000009
［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり
得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであ
り、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２
、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、または
プロピルから選択される］。
【００８７】
上記一般式（Ｉ）において、Ｃ２〜Ｃ１０アルキレンは、２〜１０個の炭素原子を含有
する直鎖または分枝基を示す。適切な（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキレンラジカルの例は、（Ｃ
Ｈ２）２、（ＣＨ２）３、ＣＨ２−（ＣＨ−ＣＨ３）−ＣＨ２、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２
）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、（ＣＨ２）１０、（ＣＨ２）２−（
ＣＨ−ＣＨ３）−（ＣＨ２）２である。
【００８８】
上記一般式（Ｉ）において、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞ
れ独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮから選択される同じかまたは異なるヘテロ原子で置き換えら
れている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。好ましい実施形態で
は、ヘテロアルキレンは、炭素原子の１個または複数がそれぞれ酸素原子で置き換えられ
ている、本明細書において定義するとおりのアルキレン基を指す。適切なＣ２〜Ｃ２０ヘ
テロアルキレンの例は、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２
−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２
−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２である。
【００８９】
一実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、
Ｒ＝（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２（ｎ＝１〜５）または
Ｒ＝（ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ（ｎ＝１〜４）または
Ｒ＝Ｏ（ＣＨ２）ｎ（ｎ＝１〜１０）または
Ｒ＝Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ（ｎ＝１〜４）である、上記一般式（Ｉ）によっ
て表され得る。
【００９０】
オキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、糖と担体タンパク質との間の安定なカルバマート、チ
オエーテル、およびアミド結合をもたらす。オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートの合
成は、糖へのカルバマート連結を形成してチオール化糖をもたらす、糖の活性化ヒドロキ
シル基とチオアルキルアミン試薬のアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スル
フヒドリル基の生成を還元剤との反応によって達成して、活性化チオール化糖（チオール
が保護されている場合）を得る。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン
含有残基上に１個または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質と
の反応はチオエーテル結合を生成して、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド結
合を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
【００９１】
ｅＴスペーサーのサブグループの１つであるオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーは、糖と担
体タンパク質との間に安定なアミン、チオエーテル、およびアミド結合をもたらす。糖を
初めに、過ヨウ素酸塩でビシナルなジオール基を酸化させるか、またはＴＥＭＰＯおよび
酸化剤の組合せで第一級ヒドロキシル基を酸化させることによって活性化させて、アルデ
ヒド基を生成する。第一級ヒドロキシル基の酸化が、過ヨウ素酸塩酸化よりも好ましい。
これは、鎖切断を伴わず、それによって、軽微なエピトープ改変をもたらすためである。
オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートの合成は、糖へのアミン連結を形成してチオー
ル化糖をもたらす、活性化糖アルデヒドと、アミンおよびチオール官能基を含有する二官
能性リンカーのアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スルフヒドリル基の生成
を、還元剤との反応によって達成して、活性化チオール化糖を得る（チオールが保護され
ている場合）。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１個
または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応は、チオエ
ーテル結合を生成して、担体タンパク質がチオエーテルおよびアミド結合を介してオキソ
−ｅＴＡＡＮスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
【００９２】
オキソ−ｅＴスペーサーのサブグループの１つであるオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーは
、糖と担体タンパク質との間に安定なチオエーテルおよびアミド結合をもたらす。オキソ
−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートの合成は、糖へのアミド連結を形成して、チオール化
糖をもたらす、糖の活性化カルボキシル基と、アミンおよびチオール官能基を含有する二
官能性リンカーのアミノ基との反応を伴う。１個または複数の遊離スルフヒドリル基の生
成を、還元剤との反応により達成して、活性化チオール化糖を得る（チオールが保護され
ている場合）。活性化チオール化糖の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１個
または複数のα−ハロアセトアミド基を有する活性化担体タンパク質との反応は、チオエ
ーテル結合を生成して、担体タンパク質がチオエーテルおよびアミド結合を介してオキソ
−ｅＴＡＡＤスペーサーに結合しているコンジュゲートを生ずる。
【００９３】
本発明の糖コンジュゲートにおいて、糖は、多糖、オリゴ糖、または単糖であってよく
、担体タンパク質は、本明細書においてさらに記載するとおりか、または当業者に知られ
ている任意の適切な担体から選択され得る。多くの実施形態では、糖は、細菌莢膜多糖で
ある。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。
【００９４】
一部のそのような実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、肺炎連鎖球菌
（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、Ｐ
ｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１
１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ
莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型
１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１
４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ
、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では
、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３Ｂ、お
よび３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される。他の実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−
血清型１０Ａ、１１Ａ、２２Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。その
ような一実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−３３Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施
形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−２２Ｆ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢
膜多糖は、Ｐｎ−１０Ａ莢膜多糖である。また別のそのような実施形態では、莢膜多糖は
、Ｐｎ−１１Ａ莢膜多糖である。
【００９５】
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖
は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される。その
ような一実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ａ莢膜多糖である。別のそのような実施形態
では、莢膜多糖は、Ｍｎ−Ｃ莢膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は
、Ｍｎ−Ｗ１３５莢膜多糖である。また別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ
−Ｙ莢膜多糖である。別の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜
多糖である。
【００９６】
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ
Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖を含む。具体的な実施形
態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多
糖からなる群から選択される。そのような一実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｉａ莢
膜多糖である。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｉｂ莢膜多糖である
。別のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−ＩＩ莢膜多糖である。別のそのよ
うな実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−ＩＩＩ莢膜多糖である。また別のそのような実
施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−Ｖ莢膜多糖である。
【００９７】
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態で
は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）血清型５または８莢膜多糖である。
【００９８】
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）に由来する莢膜多糖を含む。具体的な実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
【００９９】
特に好ましい実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペ
ーサーを介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎ細菌莢膜
多糖、例えば、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１
１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３
Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはＧＢＳ
−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖を含む。
【０１００】
他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサーを
介してＣＲＭ１９７に共有結合でコンジュゲートされた黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ）血清型５もしくは８莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス
（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウ
ム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴス
ペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含み、その糖は
、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他のそのような実施形態では、
糖は、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。さらにそのような実施形態
では、糖は、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；
５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜
７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの
間；１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；１０
０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ
〜７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤ
ａの間；２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；
２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；２００ｋ
Ｄａ〜７５０ｋＤａの間；または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間の分子量を有する。一
部のそのような実施形態では、糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、
８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、
２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢
膜多糖、またはＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＶ莢膜多糖などの細
菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は、上記のとおりの分子量範囲のいずれかに該当する分
子量を有する。一部の他の実施形態では、糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からの莢膜多糖（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ
）血清型５または８莢膜多糖）、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの莢膜
多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）
莢膜多糖など）などの細菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は、上記のとおりの分子量範囲
のいずれかに該当する分子量を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、５０ｋＤａ〜２
０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジ
ュゲートは、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他の実施形態で
は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分
子量を有する。なお他の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、１，００
０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間の分子量を有する。
【０１０３】
さらなる実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、２００ｋＤａ
〜２０，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１
０，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜５，００
０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ
の間；５００ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間
；５００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間；５
００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；５００ｋＤ
ａ〜５，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜３，
０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；５００ｋＤａ〜１，５００ｋ
Ｄａの間；５００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａ；
７５０ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａおよび１２，５００ｋＤａの間；
７５０ｋＤａおよび１０，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａおよび７，５００ｋＤａの間
；７５０ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；７５０
ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜
２，０００ｋＤａの間；７５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜１５
，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜
１０，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ
〜６，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ
〜４，０００ｋＤａの間；１，０００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ
〜１５，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜１２，５００ｋＤａの間；２，０００ｋ
Ｄａ〜１０，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａの間；２，０００
ｋＤａ〜６，０００ｋＤａの間；２，０００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの間；２，０００
ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの間；または２，０００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａの間の分子
量を有する。
【０１０４】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを特徴づける別の方法は、オキソ−ｅＴス
ペーサーを介して糖にコンジュゲートされることとなった担体タンパク質中のリシン残基
の数による方法であり、これは、コンジュゲートされたリシンの範囲として特徴づけられ
得る。
【０１０５】
多くの実施形態では、担体タンパク質は、担体タンパク質上のリシン残基の１個または
複数のε−アミノ基へのアミド連結を介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合でコンジ
ュゲートされる。一部のそのような実施形態では、担体タンパク質は、糖に共有結合でコ
ンジュゲートされた２〜２０個のリシン残基を含む。他のそのような実施形態では、担体
タンパク質は、糖に共有結合でコンジュゲートされた４〜１６個のリシン残基を含む。
【０１０６】
好ましい実施形態では、担体タンパク質は、３９個のリシン残基を含有するＣＲＭ１９
７を含む。一部のそのような実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち４〜１６個の
リシン残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で
表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約１０％〜約４１％が糖に共有結合で連結されている、と
なる。別のそのような実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち２〜２０個のリシン
残基を、糖に共有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと
、ＣＲＭ１９７リシンの約５％〜約５０％が糖に共有結合で連結されている、となる。
【０１０７】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートはまた、糖と担体タンパク質との比（重量
／重量）によって特徴づけられ得る。一部の実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／
ｗ）は、０．２〜４の間である。他の実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は
、１．０〜２．５の間である。さらなる実施形態では、糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）
は、０．４〜１．７の間である。一部のそのような実施形態では、糖は細菌莢膜多糖であ
り、かつ／または担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【０１０８】
糖コンジュゲートはまた、糖の繰り返し単位の関数として、担体タンパク質と糖との間
の共有結合連結の数によって特徴づけられ得る。一実施形態では、本発明の糖コンジュゲ
ートは、多糖の糖繰り返し単位４個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との
間の共有結合連結を含む。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連
結は、多糖の糖繰り返し単位１０個ごとに少なくとも１回起こる。別の実施形態では、担
体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１５個ごとに少なく
とも１回起こる。さらなる一実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結
は、多糖の糖繰り返し単位２５個ごとに少なくとも１回起こる。
【０１０９】
多くの実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、オキソ−ｅＴスペーサー
を介してのＣＲＭ１９７と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位４、１０
、１５、または２５個ごとに少なくとも１回起こる。
【０１１０】
コンジュゲーションについての重要な検討事項は、糖エピトープの一部を形成し得るＯ
−アシル、ホスファート、またはグリセロールホスファート側鎖などの個々の構成要素の
潜在的に感受性の非糖置換基官能基の保持を可能にする条件の開発である。
【０１１１】
一実施形態では、糖コンジュゲートは、１０〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有す
る糖を含む。一部のそのような実施形態では、糖は、５０〜１００％の間のＯ−アセチル
化度を有する。他のそのような実施形態では、糖は、７５〜１００％の間のＯ−アセチル
化度を有する。さらなる実施形態では、糖は、７０％以上（≧７０％）のＯ−アセチル化
度を有する。
【０１１２】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質
に共有結合でコンジュゲートされていないが、それにも関わらず、糖コンジュゲート組成
物中に存在する遊離糖を含有し得る。遊離糖は、糖コンジュゲートと非共有結合で会合し
得る（すなわち、非共有結合で結合するか、それに吸着されるか、またはそれに捕捉され
得る）。
【０１１３】
一部の実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、糖の合計量に対して、遊
離糖約４５％未満、遊離糖約４０％未満、遊離糖約３５％未満、遊離糖約３０％未満、遊
離糖約２５％未満、遊離糖約２０％未満、遊離糖約１５％未満、遊離糖約１０％未満、ま
たは遊離糖約５％未満を含む。好ましくは、糖コンジュゲートは、遊離糖１５％未満、よ
り好ましくは遊離糖１０％未満、いっそうより好ましくは、遊離糖５％未満を含む。
【０１１４】
ある種の好ましい実施形態では、本発明は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タン
パク質に共有結合でコンジュゲートされた莢膜多糖、好ましくは、ＰｎまたはＭｎ莢膜多
糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートであって、単独か、または組み合わせで、次
の特徴の１つまたは複数を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する：多糖が
、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有し；糖コンジュゲートが、５００ｋＤ
ａ〜１０，０００ＫＤａの間の分子量を有し；担体タンパク質が、糖に共有結合で連結さ
れた２〜２０個のリシン残基を含み；糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の
間であり；糖コンジュゲートが、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ご
とに、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結を含み；糖が、７５
〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有し；コンジュゲートが、多糖の合計に対して、遊
離多糖約１５％未満を含み；担体タンパク質がＣＲＭ１９７であり；莢膜多糖が、Ｐｎ−
血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、
１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、または３３Ｆ莢膜多糖から選択され
るか、または莢膜多糖が、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ莢膜多糖から選択さ
れる。
【０１１５】
ある種の好ましい実施形態では、本発明は、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タン
パク質に共有結合でコンジュゲートされた莢膜多糖、好ましくは、ＰｎまたはＭｎ莢膜多
糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートであって、単独か、または組み合わせで、次
の特徴の１つまたは複数を有するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する：多糖が
５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有し；糖コンジュゲートが５００ｋＤａ〜
１０，０００ＫＤａの間の分子量を有し；担体タンパク質が、糖に共有結合で連結された
２〜２０個のリシン残基を含み；糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２〜４の間で
あり；糖コンジュゲートが、多糖の糖繰り返し単位４、１０、１５、または２５個ごとに
、少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結を含み；糖が、７５〜１
００％の間のＯ−アセチル化度を有し；コンジュゲートが、多糖の合計に対して、遊離多
糖約１５％未満を含み；担体タンパク質がＣＲＭ１９７であり；莢膜多糖が、ＧＢＳ−血
清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＶ莢膜多糖、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）血清型５もしくは８莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖から選択される。
【０１１６】
オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、それらの分子サイズ分布（Ｋｄ）によっても特
徴づけられ得る。コンジュゲートの分子サイズは、セファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ
排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）媒体によって、高圧液体クロマトグラフィー系（ＨＰ
ＬＣ）を使用して決定される。Ｋｄ決定では、クロマトグラフィーカラムを初めに、ボイ
ド体積または合計排除体積を表すＶ０、および粒子間体積としても知られている、試料中
で最小の分子が溶離する体積を表すＶｉを決定するために較正する。すべてのＳＥＣ分離
は、Ｖ０からＶｉの間で起こる。収集された各画分でのＫｄ値は、次の式によって決定さ
れる：Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）[式中、Ｖｅは、化合物の保持体積を表す
］。≦０．３を溶離する画分％（主なピーク）が、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布
）を定義する。一部の実施形態では、本発明は、≧３５％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有
するオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。他の実施形態では、本発明は、≧１
５％、≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、≧４５％、≧５０％、≧６
０％、≧７０％、≧８０％、または≧９０％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有するオキソ−
ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
【０１１７】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、遊離スルフヒド
リル残基を含有し得る。一部の事例では、本明細書において提供する方法によって形成さ
れる活性化チオール化糖は、複数の遊離スルフヒドリル残基を含有するはずであり、その
一部は、コンジュゲーションステップ中に担体タンパク質に共有結合でコンジュゲーショ
ンされ得ない。潜在的に反応性の官能基をキャッピングするために、そのような残留遊離
スルフヒドリル残基を、チオール反応性キャッピング試薬、例えば、ヨードアセトアミド
（ＩＡＡ）との反応によってキャッピングする。他のチオール反応性キャッピング試薬、
例えば、マレイミド含有試薬なども企図される。
【０１１８】
加えて、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物は、キャッ
ピングプロセスステップ中に改変を施されている活性化担体タンパク質を含み得る残留非
コンジュゲート担体タンパク質を含有し得る。
【０１１９】
本発明の糖コンジュゲートは、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）また
は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの病原細菌による細菌感染症から受容者を防御するた
めの免疫原性組成物の生成において使用することができる。したがって、別の態様では、
本発明は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、ま
たは希釈剤とを含む免疫原性組成物であって、その糖コンジュゲートが、本明細書に記載
のとおり、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲート
された糖を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１２０】
多くの実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、薬学
的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含み、その糖コンジュゲートは、細菌莢
膜多糖を含む。
【０１２１】
一部のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部
の具体的な実施形態では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、
７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２
２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１２２】
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部
の具体的な実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢
膜多糖からなる群から選択される。
【０１２３】
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジ
ュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ
、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実
施形態では、免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖を含むオ
キソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態では、黄色ブドウ球菌
（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または
８莢膜多糖である。
【０１２４】
他のそのような実施形態では、免疫原性組成物は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
）莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。一部の具体的な実施形態で
は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖は、エンテロコッカス・フェカーリス
（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム
（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である。
【０１２５】
特に好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲ
Ｍ１９７に共有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳ莢膜多糖などの
細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一部のそのような実施
形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アル
ミニウムからなる群から選択されるアルミニウムベースのアジュバントである。一実施形
態では、免疫原性組成物は、アジュバントリン酸アルミニウムを含む。
【０１２７】
本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよびそれらを含む免疫原性組成物は、多
少の量の遊離糖を含み得る。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、多糖の合計量と比
較して、遊離多糖約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％
未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満を含む。好ましく
は、免疫原性組成物は、遊離糖１５％未満、より好ましくは遊離糖１０％未満、いっそう
より好ましくは遊離糖５％未満を含む。
【０１２８】
別の態様では、本発明の糖コンジュゲートまたは免疫原性組成物は、動物有効性モデル
における、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に
機能的である抗体を生成するために使用することができる。細菌莢膜多糖を含む本発明の
糖コンジュゲートは、そのような細菌莢膜多糖に対する抗体の生成において使用すること
ができる。続いて、そのような抗体を、細菌検出および血清型判定などの研究および臨床
検査室アッセイにおいて使用することができる。そのような抗体は、受動免疫を対象に付
与するために使用することもできる。一部の実施形態では、細菌多糖に対して生成された
抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン作用性死滅アッセイのいずれかにおいて機能
的である。
【０１２９】
本明細書に記載のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよび免疫原性組成物はまた、対
象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善するための様々な治
療方法または予防方法において使用することができる。特に、病原細菌からの細菌莢膜多
糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを、病原細菌に起因する、対
象における細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善するために使用する
ことができる。
【０１３０】
したがって、一態様では、本発明は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予
防、処置、または改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に
投与することを含み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖を含むオキソ−ｅＴ連結糖コ
ンジュゲートを含む方法を提供する。
【０１３１】
一実施形態では、感染症、疾患、または状態は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｐｎ莢膜多糖を含む。一部のそのような実施形態で
は、感染症、疾患、または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、
胸膜蓄膿症、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎
、蜂巣炎、軟部組織感染症、および脳腫瘍からなる群から選択される。
【０１３２】
別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、Ｍｎ莢膜多糖を含む。一部のそのような実施形
態では、感染症、疾患、または状態は、髄膜炎、髄膜炎菌血症、菌血症、および敗血症か
らなる群から選択される。
【０１３３】
別の実施形態では、感染症、疾患、または状態は、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に関連し、糖コンジュゲートは、ＧＢＳ莢膜多糖を含む。
【０１３４】
別の態様では、本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、オキソ−ｅ
Ｔ連結糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免
疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含み、その糖コンジュゲートが細菌莢
膜多糖を含む方法を提供する。
【０１３５】
また別の態様では、本発明は、対象において、病原細菌に起因する疾患または状態を予
防、処置、または改善するための方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、
薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を
対象に投与すること含み、糖コンジュゲートが細菌莢膜多糖を含む方法を提供する。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、病原細菌の感染に起因する疾患または状態の少なくとも１つ
の症状の重症度を低減するための方法であって、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと、
薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物を
対象に投与することを含み、その糖コンジュゲートが、細菌莢膜多糖、例えば、Ｐｎまた
はＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖を含む方法を提供する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫有効
量の免疫原性組成物を対象に投与して、本明細書においてさらに記載するとおり、対象に
おいて防御免疫応答を生じさせる方法を提供する。
【０１３８】
また別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏ
ｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ま
たは腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善する
際に使用するための、本明細書に記載のとおりの本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲ
ートを含む免疫原性組成物を提供する。
【０１３９】
別の態様では、本発明は、細菌感染症、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ
Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または
腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）による感染症を予防、処置、または改善するため
の医薬品を調製するための、本明細書に記載のとおりの本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コン
ジュゲートを含む免疫原性組成物の使用を提供する。
【０１４０】
上記の治療および／または予防方法および使用では、免疫原性組成物は多くの場合に、
オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合で連結された細菌莢膜多糖を
含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。本明細書に記載の方法の多くの実施形態
では、細菌莢膜多糖は、Ｐｎ莢膜多糖またはＭｎ莢膜多糖またはＧＢＳ莢膜多糖または黄
色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）
莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌ
ｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕ
ｍ）など）である。一部のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、
４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ
、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢
膜多糖からなる群から選択される。他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、ＧＢＳ−
血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１４１】
他のそのような実施形態では、莢膜多糖は選択され、莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ
．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜
多糖である。
【０１４２】
他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜
多糖である。他のそのような実施形態では、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多
糖は、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）
莢膜多糖である。
【０１４３】
ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。特に好まし
い実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共
有結合でコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．
ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖などの細菌莢膜多糖
を含むオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む。
【０１４４】
加えて、本発明は、それぞれの場合に、対象に、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートと
、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫有効量の免疫原性組成物
を投与することによる、対象において肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄
膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）など）に対する免疫応答を誘発するための方法、対象において肺炎連
鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ま
たはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球
菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス
・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカ
ス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）に起因する感染症
、疾患、または状態を予防、処置、または改善するための方法、および対象において肺炎
連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ
球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカ
ス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッ
カス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）の感染に起因す
る感染症、疾患、または状態の少なくとも１つの症状の重症度を低減するための方法であ
って、糖コンジュゲートが、それぞれ肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄
膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）など）に由来する細菌莢膜多糖を含む方法を提供する。
【０１４５】
糖
糖には、多糖、オリゴ糖、および単糖が含まれ得る。多くの実施形態では、糖は、多糖
、特に、細菌莢膜多糖である。莢膜多糖は、当業者に公知の標準的な技術によって調製さ
れる。
【０１４６】
本発明では、莢膜多糖を、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）のＰｎ−
血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、
１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆから調製することがで
きる。一実施形態では、各肺炎球菌多糖血清型を、大豆ベースの培地中で増殖させること
ができる。個々の多糖を、遠心分離、沈殿、限外濾過、および／またはカラムクロマトグ
ラフィーによって精製する。本明細書においてさらに記載するとおり、精製多糖を、オキ
ソ−ｅＴスペーサーと反応し得るように活性化させ、次いで、本発明の糖コンジュゲート
に組み込むことができる。
【０１４７】
莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物において使用するための検討事項である。高分子
量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープの比較的高い価によって、確実な抗体免
疫応答を誘発し得る。高分子量莢膜多糖の単離および精製が、本発明のコンジュゲート、
組成物、および方法において使用するために企図される。
【０１４８】
一部の実施形態では、糖は、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。他
のそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する
。さらなるそのような実施形態では、糖は、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；５０ｋ
Ｄａ〜１，５００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜１，０
００ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；１０
０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ
〜１，５００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜１，０
００ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；１００ｋＤａ〜５００ｋＤａの間；
２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａの間；２００ｋ
Ｄａ〜１，５００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜１
，０００ｋＤａの間；２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａの間；または２００ｋＤａ〜５００ｋ
Ｄａの間の分子量を有する。一部のそのような実施形態では、糖は、Ｐｎ−血清型１、３
、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８
Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多糖、またはＭｎ−血清型Ａ
、Ｃ、Ｗ１３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ
、およびＶ莢膜多糖、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖、または腸球
菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）などの細菌莢膜多糖であり、その莢膜多糖は
、上記の分子量範囲の１つに該当する分子量を有する。
【０１４９】
一部の実施形態では、本発明の糖をＯ−アセチル化する。一部の実施形態では、糖コン
ジュゲートは、１０〜１００％の間、２０〜１００％の間、３０〜１００％の間、４０〜
１００％の間、５０〜１００％の間、６０〜１００％の間、７０〜１００％の間、７５〜
１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０
％、または８０〜９０％の間のＯ−アセチル化度を有する糖を含む。他の実施形態では、
Ｏ−アセチル化度は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、
≧７０％、≧８０％、または≧９０％、または約１００％である。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明の莢膜多糖、糖コンジュゲート、または免疫原性組成物を
、動物有効性モデル、または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン作用性死
滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使
用する。
【０１５１】
莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して、細菌から直接得ることができ
る。例えば、その全体が記載されている場合と同様に、それぞれ参照によって本明細書に
組み込まれるＦｏｕｒｎｉｅｒら（１９８４）、前出；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９８７）
Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１〜５６７；米
国特許出願公開第２００７／０１４１０７７号；および国際特許出願ＷＯ００／５６３５
７を参照されたい。加えて、これらは、合成プロトコルを使用して生成することができる
。さらに、莢膜多糖を、同じく当業者に知られている遺伝子操作手順を使用して組換えに
よって生成することができる（その全体が記載されている場合と同様に、それぞれ参照に
よって本明細書に組み込まれるＳａｕら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４３
：２３９５〜２４０５；および米国特許第６，０２７，９２５号を参照されたい）。
【０１５２】
本発明の糖コンジュゲートにおいて使用される個々の多糖を作製するために使用される
肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ
球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカ
ス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッ
カス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）の菌株は、確立
された培養物収集または臨床試料から得ることができる。
【０１５３】
担体タンパク質
本発明の糖コンジュゲートの別の構成要素は、糖がコンジュゲートされた担体タンパク
質である。「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」という用語は、
本明細書において互換的に使用され得る。担体タンパク質は好ましくは、非毒性および非
反応誘導性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量および純度で得ること
ができるタンパク質である。担体タンパク質は、標準的コンジュゲーション手順のために
修正可能であるべきである。本発明の新規の糖コンジュゲートでは、担体タンパク質は、
オキソ−ｅＴスペーサーを介して糖に共有結合で連結されている。
【０１５４】
担体へのコンジュゲーションによって、抗原、例えば、細菌莢膜多糖などの細菌抗原の
免疫原性が増強し得る。抗原のための好ましいタンパク質担体は、破傷風、ジフテリア、
百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ
球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
）からの毒素、類毒素、または毒素の任意の変異交差反応性物質（ＣＲＭ）である。一実
施形態では、特に好ましい担体は、ＣＲＭ１９７タンパク質を産生するジフテリア菌（Ｃ
．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株Ｃ７（β１９７）に由来するジフテリア毒素ＣＲＭ１９７
である。この株は、ＡＴＣＣ受入番号５３２８１を有する。ＣＲＭ１９７を生成するため
の方法は、その全体が記載されている場合と同様に参照によって本明細書に組み込まれる
米国特許第５，６１４，３８２号において記載されている。
【０１５５】
別法では、タンパク質担体または他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使
用することができる。例えば、ハプテン抗原を、細菌毒素、類毒素、またはＣＲＭのＴ細
胞エピトープにカップリングさせることができる。その全体が記載されている場合と同様
に参照によって本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒ
ｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｓ  ａ  Ｃａｒｒｉｅ
ｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆｏｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」と題された１
９８８年２月１日出願の米国特許第１５０，６８８号を参照されたい。他の適切な担体タ
ンパク質には、コレラ類毒素（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載
）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素が含
まれる。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニュー
モリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ
）、またはヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）タンパク質Ｄなどの細菌外膜タンパク質も使用することができる。オボアルブミン、
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、または
ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク
質として使用することができる。
【０１５６】
一実施形態では、好ましい担体は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風トキソイド
）もしくはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性だが、抗原としては同
一のバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈ
ｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８；３８３８〜３８４４、１９７３）、ＣＲＭ
９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、またはＣＲＭ１０７；およびＮｉｃｈｏ
ｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによってＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏ
ｘｉｎｓ、Ｅｄ：Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ、１９９２にお
いて記載された他の変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒおよび／
またはＡｌａ１５８からＧＩｙへの欠失または変異、および米国特許第４７０９０１７号
または米国特許第４９５０７４０号において開示された他の変異；少なくとも１個以上の
残基Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０、および／またはＬｙｓ５３４の変異、
ならびに米国特許第５９１７０１７号または米国特許第６４５５６７３号において開示さ
れた他の変異；または米国特許第５８４３７１１号において開示された断片など）、いく
つかの様式で無毒化されたｐｌｙを含む肺炎球菌ニューモリシン（Ｋｕｏら（１９９５）
Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ  ６３；２７０６〜１３）、例えば、ｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（Ｗ
Ｏ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）、ｄＰＬＹ−ホルモール、
ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥを含むＰｈｔＸ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、Ｐｈｔ
Ｄ、またはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９におい
て開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えば、ＰｈｔＤＥ融合体、Ｐｈ
ｔＢＥ融合体、Ｐｈｔ  Ａ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２
００９／０００８２６）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌外膜タンパク質、通常、髄膜炎菌（Ｎ．ｍ
ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出、欧州特許第０３７２５０１号）、ＰｏｒＢ
（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエン
ザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質、例えば、欧州特許第
０  ５９４  ６１０  Ｂ号を参照されたい）、またはその免疫学的機能性同等体、合成ペ
プチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタン
パク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８
／５８６６８、欧州特許第０４７１  １７７号）、サイトカイン、リンホカイン、成長因
子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来の抗原からの複数のヒト
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ  
Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１；３８１６〜３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒ
ａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ  ７２；４８８４〜７）、肺炎球菌
表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／
７２３３７）、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ０
０／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌付着タンパク質（Ｐｓａ
Ａ）、組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に
、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を有する外毒素Ａなど（Ｕｃｈｉｄａ  
Ｃａｍｅｒｏｎ  ＤＭ、ＲＪ  Ｃｏｌｌｉｅｒ．１９８７．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６９：４９６７〜４９７１））からなる群において選択される。オボアルブミン、キーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベル
クリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も、担体タンパク質とし
て使用することができる。他の適切な担体タンパク質には、コレラ類毒素（例えば、国際
特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）
由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素が含まれる。
【０１５７】
一実施形態では、担体は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフ
ルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ
融合体（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／５４００７において記載のもの）
、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディ
フィシレ（Ｃ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群にお
いて選択される。
【０１５８】
好ましい実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテ
リア毒素）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体タンパク質は、
ＴＴ（破傷風トキソイド）である。別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートの担体
タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、例えば、欧州特許第０  ５９４  ６１０  Ｂ号を参照され
たい）である。
【０１５９】
最も好ましい実施形態では、本発明の莢膜糖を、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲ
ートする。
【０１６０】
したがって、多くの実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートは、ＣＲＭ１９
７を担体タンパク質として含み、莢膜多糖は、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴス
ペーサーに共有結合で連結され、ＣＲＭ１９７は、タンパク質の活性化アミノ酸残基によ
って形成されるアミド連結、典型的には、１個または複数のリシン残基のε−アミン基を
介してオキソ−ｅＴスペーサーに共有結合で連結されている。
【０１６１】
糖にコンジュゲートされることとなった担体タンパク質中のリシン残基の数を、コンジ
ュゲートされたリシンの範囲として特徴づけることができる。例えば、免疫原性組成物の
一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち４〜１６個のリシン残基を、糖に共
有結合で連結された形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７
リシンの約１０％〜約４１％が糖に共有結合で連結されている、となる。他の実施形態で
は、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち２〜２０個のリシン残基を、糖に共有結合で連結され
た形で含み得る。このパラメーターを別の方法で表すと、ＣＲＭ１９７リシンの約５％〜
約５０％が糖に共有結合で連結されている、となる。
【０１６２】
担体タンパク質上のリシンへの糖鎖の結合頻度は、本発明の糖コンジュゲートを特徴づ
けるための別のパラメーターである。例えば、一部の実施形態では、多糖の糖繰り返し単
位４個ごとに、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は少なくとも１個である。別
の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位
１０個ごとに少なくとも１回起こる。別の実施形態では、担体タンパク質と多糖との間の
共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位１５個ごとに少なくとも１回起こる。さらなる実
施形態では、担体タンパク質と多糖との間の共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位２５
個ごとに少なくとも１回起こる。
【０１６３】
多くの実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との
間のオキソ−ｅＴスペーサーを介しての共有結合連結は、多糖の糖繰り返し単位４、１０
、１５、または２５個ごとに少なくとも１回起こる。一部のそのような実施形態では、多
糖は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）もしくは髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ）もしくはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）も
しくは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖、または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ）多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａ
ｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉ
ｕｍ）など）に由来する細菌莢膜多糖である。
【０１６４】
他の実施形態では、コンジュゲートは、糖繰り返し単位５〜１０個ごとに；糖繰り返し
単位２〜７個ごとに；糖繰り返し単位３〜８個ごとに；糖繰り返し単位４〜９個ごとに；
糖繰り返し単位６〜１１個ごとに；糖繰り返し単位７〜１２個ごとに；糖繰り返し単位８
〜１３個ごとに；糖繰り返し単位９〜１４個ごとに；糖繰り返し単位１０〜１５個ごとに
；糖繰り返し単位２〜６個ごとに、糖繰り返し単位３〜７個ごとに；糖繰り返し単位４〜
８個ごとに；糖繰り返し単位６〜１０個ごとに；糖繰り返し単位７〜１１個ごとに；糖繰
り返し単位８〜１２個ごとに；糖繰り返し単位９〜１３個ごとに；糖繰り返し単位１０〜
１４個ごとに；糖繰り返し単位１０〜２０個ごとに；または糖繰り返し単位４〜２５個ご
とに、少なくとも１個の担体タンパク質と糖との間の共有結合連結を含む。
【０１６５】
別の実施形態では、多糖の糖繰り返し単位２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、または２５個ごとに、少なくとも１個の担体タンパク質と糖との間の連結が起こる。
【０１６６】
オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡ
Ｃ）スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキ
ソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。安定なカルバマート、チ
オエーテル、およびアミド結合を含むオキソ−ｅＴＡＣスペーサーは、糖および担体タン
パク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＣスペーサーの一方の末端は
、カルバマート連結を介して糖のヒドロキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴ
ＡＣスペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、
典型的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
【０１６７】
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コン
ジュゲートを調製する代表的な経路を図１に示す。
【０１６８】
オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを作製するための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）
スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−
ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＮスペー
サーは、安定なアミン、チオエーテル、およびアミドを含有し、糖および担体タンパク質
を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーの一方の末端は、ア
ミン連結を介して糖の炭素原子に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサー
の他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型的にはε−
リシン残基に共有結合で結合される。
【０１６９】
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コン
ジュゲートを調製する代表的な経路を図２に示す。
【０１７０】
オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）
スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−
ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＤスペー
サーは、安定なアミド、チオエーテル、およびアミド結合を含有し、糖および担体タンパ
ク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの一方の末端は
、アミド連結を介して糖のカルボキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＤ
スペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型
的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
【０１７１】
活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた多糖を含む本発明の糖コン
ジュゲートを調製する代表的な経路を図３に示す。
【０１７２】
チアゾリジノン活性化経路を介してオキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する
ための方法
本発明は、（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）
スペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含むオキソ−
ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを作製する方法を提供する。オキソ−ｅＴＡＡＤスペー
サーは、安定なアミド、チオエーテル、およびアミド結合を含有し、糖および担体タンパ
ク質を共有結合で連結するために役立つ。オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーの一方の末端は
、アミド連結を介して糖のカルボキシル基に共有結合で結合される。オキソ−ｅＴＡＡＤ
スペーサーの他方の末端は、アミド連結を介して担体タンパク質のアミノ含有残基、典型
的にはε−リシン残基に共有結合で結合される。
【０１７３】
チアゾリジノン活性化を介して、活性化担体タンパク質ＣＲＭ１９７にコンジュゲート
された多糖を含む本発明の糖コンジュゲートを調製する代表的な経路を、図４に示す。
【０１７４】
オキソ−ｅＴスペーサープロセスを使用して改変され得る部位を有する、肺炎連鎖球菌
（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する代表的な細菌莢膜多糖、肺炎球菌血清型３３Ｆ、
１０Ａ、１１Ａ、および２２Ｆ多糖の化学構造を、それぞれ図５、図６、図７、および図
８に示す。
【０１７５】
一態様では、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを作製する方法は、ａ）糖を、有
機溶媒中で１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）または
１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）などの炭酸誘導体と反応させて、活性化
糖を生成するステップと、ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を有するヘテロ
二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、ｃ）
チオール化糖を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活
性化チオール化糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数の
α−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体
タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コ
ンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミ
ド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）
活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングするこ
とができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップとを含み、それによって、オキ
ソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する。
【０１７６】
特に好ましい実施形態では、上記方法は、ａ）Ｐｎ−３３Ｆ莢膜多糖を、有機溶媒中で
ＣＤＴまたはＣＤＩと反応させて、活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｂ）
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、アミンおよびチオール官能基を有するヘテロ二官能性リンカ
ーまたはその塩と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｃ）
チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリ
ル残基を含む活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を生成するステップと、ｄ）活性化チオ
ール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化Ｃ
ＲＭ１９７担体タンパク質と反応させて、チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コ
ンジュゲートを生成するステップと、ｅ）チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７コ
ンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ブロモアセトア
ミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−
Ｌ−システイン；および（ｉｉ）活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の非コンジュゲート
化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬とし
てのヨードアセトアミドと反応させるステップとを含み、それによって、オキソ−ｅＴＡ
Ｃ連結Ｐｎ−３３Ｆ多糖−ＣＲＭ１９７糖コンジュゲートを生成する。
【０１７７】
多くの実施形態では、炭酸誘導体は、ＣＤＴまたはＣＤＩまたはＤＳＣまたはＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジルクロロホルマートである。好ましくは、炭酸誘導体はＣＤＴであ
り、有機溶媒はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶媒である。
チオール化および／またはコンジュゲーションステップの前に、活性化糖の凍結乾燥は必
要ない。
【０１７８】
好ましい実施形態では、チオール化糖を、活性化糖を二硫化物形態、またはその塩での
二官能性対称チオアルキルアミン試薬と反応させることによって生成する。この試薬の潜
在的な利点は、二硫化物形態の対称チオアルキルアミンリンカーが活性化糖の２個の分子
と反応することができ、したがって、ジスルフィド結合を還元すると、チオアルキルアミ
ンの分子１個当たりチオール化糖の分子２個を形成することである。別法では、活性化糖
をモノマー形態のチオアルキルアミンまたはその塩と反応させることによって、チオール
化糖を形成することができる。本発明の方法によって生成されたオキソ−ｅＴ連結糖コン
ジュゲートは、一般式（Ｉ）によって表され得る。
【０１７９】
この態様の一部の実施形態では、ステップｄ）は、チオール化糖−担体タンパク質コン
ジュゲートを生成するために活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前
に、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることを
さらに含む。多くの実施形態では、活性化担体タンパク質は、１個または複数のα−ブロ
モアセトアミド基を含む。
【０１８０】
チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートは、反応混合物中に存在する残留活性化
官能基と反応し得る１種または複数のキャッピング試薬で処理することができる。そのよ
うな残留反応性基は、不完全なコンジュゲーションによるか、または反応混合物中に構成
要素の一方が過剰に存在することから、未反応の糖または担体タンパク質構成要素上に存
在し得る。その場合、キャッピングは、糖コンジュゲートの精製または単離の際に助けと
なり得る。場合によっては、残留活性化官能基は、糖コンジュゲート中に存在し得る。
【０１８１】
例えば、活性化担体タンパク質上の過剰なα−ハロアセトアミド基を、完全なキャッピ
ングを保証するために過剰に使用することができるＮ−アセチル−Ｌ−システインなどの
低分子量チオールとの反応によって、キャッピングすることができる。Ｎ−アセチル−Ｌ
−システインでのキャッピングはまた、キャッピングされた部位にあるシステイン残基か
ら独特のアミノ酸Ｓ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）を検出することによる、コ
ンジュゲーション効率の確認を可能にし、これは、コンジュゲーション生成物の酸性加水
分解およびアミノ酸分析によって決定することができる。このアミノ酸の検出によって、
反応性ブロモアセトアミド基が成功裏にキャッピングされたこと、したがって、それらが
、あらゆる望ましくない化学反応について利用不可能となったことが確認される。共有原
子価およびキャッピングの許容されるレベルは、ＣＭＣＡ／Ｌｙｓでは約１〜１５の間、
およびＣＭＣ／Ｌｙｓでは約０〜５の間である。同様に、過剰の遊離スルフヒドリル残基
を、ヨードアセトアミドなどの低分子量求電子試薬と反応させることによってキャッピン
グすることができる。ＣＭＣＡの一部は、担体タンパク質のハロアシル基とのコンジュゲ
ーションに関係していない、ヨードアセトアミドによって直接キャッピングされた多糖チ
オールに由来し得る。したがって、コンジュゲーションに直接に関係しているチオールの
正確なレベルを決定するために、コンジュゲーション後の反応試料（ヨードアセトアミド
によるキャッピングの前）をアミノ酸分析（ＣＭＣＡ）によって検査する必要がある。１
０〜１２個のチオールを含有するチオール化糖では、典型的には５〜６個のチオールが、
多糖チオールとブロモアセチル化タンパク質との間のコンジュゲーションに直接関係して
いると決定され、４〜５個のチオールは、ヨードアセトアミドによってキャッピングされ
る。
【０１８２】
好ましい実施形態では、第１のキャッピング試薬は、担体タンパク質上の非コンジュゲ
ート化α−ハロアセトアミド基と反応するＮ−アセチル−Ｌ−システインである。他の実
施形態では、第２のキャッピング試薬は、活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離
スルフヒドリル基と反応するヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である。多くの場合に、ステ
ップｅ）は、第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システインおよび第２
のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャッピングすることを含む。一部の実施形態では
、キャッピングステップｅ）は、第１および／または第２のキャッピング試薬との反応の
後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応をさら
に含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、上記方法は、例えば、限外濾過／透析濾過によって、オキソ−ｅ
Ｔ連結糖コンジュゲートを精製するステップをさらに含む。
【０１８４】
好ましい実施形態では、二官能性対称チオアルキルアミン試薬は、シスタミンまたはそ
の塩であり、これを、活性化糖と反応させて、ジスルフィド部分を含有するチオール化糖
またはその塩を得る。
【０１８５】
そのようなチオール化糖誘導体を還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒ
ドリル残基を含む活性化チオール化多糖を生成する（チオールが保護されている場合）。
そのような活性化チオール化糖は、例えば、限外濾過／透析濾過によって単離および精製
することができる。別法では、活性化チオール化糖は、例えば、標準的なサイズ排除クロ
マトグラフィー（ＳＥＣ）方法または当技術分野で知られているＤＥＡＥなどのイオン交
換クロマトグラフィー方法によって単離および精製することができる。
【０１８６】
シスタミン由来のチオール化糖の場合には、還元剤との反応は、ジスルフィド結合を切
断して、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖をもたらす
。システアミン由来のチオール化糖では、還元剤との反応は任意選択であり、試薬または
生成物の酸化によって形成されるジスルフィド結合を還元するために使用することができ
る。
【０１８７】
本発明の方法において使用する還元剤には、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）
ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはメルカプトエタノール
が含まれる。しかしながら、任意のジスルフィド還元剤を使用することができる。
【０１８８】
一部の実施形態では、上記方法は、１個または複数のα−ハロアセトアミド基、好まし
くは１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ること
をさらに含む。
【０１８９】
活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド部分を含む活性化担体
タンパク質と反応させると、活性化チオール化糖の１個または複数の遊離スルフヒドリル
基による活性化担体タンパク質のα−ハロ基の求核性置換が生じて、オキソ−ｅＴスペー
サーのチオエーテル結合を形成する。
【０１９０】
担体タンパク質のα−ハロアセチル化アミノ酸残基は典型的には、担体タンパク質の１
個または複数のリシン残基のε−アミノ基に結合する。多くの実施形態では、担体タンパ
ク質は、１個または複数のα−ブロモアセチル化アミノ酸残基を含有する。一実施形態で
は、担体タンパク質を、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮ
Ｓ）などのブロモ酢酸試薬で活性化させる。
【０１９１】
一実施形態では、上記方法は、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化
担体タンパク質を得るステップと、活性化チオール化多糖を活性化担体タンパク質と反応
させて、チオール化多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップとを含み、
それによって、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた
多糖を含む糖コンジュゲートを生成する。
【０１９２】
本明細書に記載の方法の一部の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌
（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するＰｎ莢膜多糖である。一部のそのような実施形態
では、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１
０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、およ
び３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。ある種の好ましい実施形態では、担体タン
パク質はＣＲＭ１９７であり、Ｐｎ莢膜多糖は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６
Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ
、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１９３】
本明細書において提供する方法の他の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、髄膜炎
菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するＭｎ莢膜多糖である。一部のそのような
実施形態では、Ｍｎ莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖から
なる群から選択される。ある種の好ましい実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７
であり、莢膜多糖は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から
選択される。
【０１９４】
本明細書において提供する方法の他の好ましい実施形態では、細菌莢膜多糖は、Ｂ群連
鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するＧＢＳ莢膜多糖であ
る。一部のそのような実施形態では、ＧＢＳ莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。ある種の好ましい実施形態で
は、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、莢膜多糖は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖からなる群から選択される。
【０１９５】
本明細書において提供する方法のそれぞれの一部の実施形態では、糖をイミダゾールま
たはトリアゾールと配合し、次いで、水約０．２％ｗ／ｖを含有する有機溶媒（例えば、
ＤＭＳＯ）中で、ＣＤＴなどの炭酸誘導体と反応させて、活性化糖を生成した。活性化ス
テップにおいて配合糖を使用すると、有機溶媒中での糖の溶解性が上昇する。典型的には
、糖を、多糖１グラム当たり１，２，４−トリアゾール添加剤１０グラムと配合し、続い
て、周囲温度で混合して、配合糖を得る。
【０１９６】
したがって、ある種の実施形態では、上記方法は、活性化ステップａ）の前に、糖をト
リアゾールまたはイミダゾールと配合して、配合糖を得るステップをさらに含む。一部の
そのような実施形態では、配合糖を、シェル凍結（ｓｈｅｌｌ−ｆｒｏｚｅｎ）し、凍結
乾燥し、有機溶媒（ＤＭＳＯなど）中で復元して、炭酸誘導体、例えば、ＣＤＴで活性化
させる前に、水約０．２％ｗ／ｖを添加する。
【０１９７】
一実施形態では、チオール化糖反応混合物を場合によって、Ｎ−アセチル−リシンメチ
ルエステルで処理して、いずれの未反応活性化糖もキャッピングする。一部のそのような
実施形態では、キャッピングされたチオール化糖混合物を限外濾過／透析濾過によって精
製する。
【０１９８】
多くの実施形態では、チオール化糖を還元剤と反応させて、活性化チオール化糖を生成
する。一部のそのような実施形態では、還元剤は、トリス（−２−カルボキシエチル）ホ
スフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはメルカプトエタノールで
ある。一部のそのような実施形態では、活性化チオール化糖を、限外濾過／透析濾過によ
って精製する。
【０１９９】
一実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを生成する方法は、活性化チオー
ル化糖および担体タンパク質の反応混合物のｐＨを約５℃で約２０時間、約８〜約９のｐ
Ｈに調整および維持するステップを含む。
【０２００】
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法は、生成した後に、チオー
ル化糖−担体タンパク質コンジュゲートを単離するステップを含む。多くの実施形態では
、糖コンジュゲートを限外濾過／透析濾過によって単離する。
【０２０１】
別の実施形態では、本発明のオキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを生成する方法は、生
成した後に、単離された糖−担体タンパク質コンジュゲートを単離するステップを含む。
多くの実施形態では、糖コンジュゲートを限外濾過／透析濾過によって単離する。
【０２０２】
また別の実施形態では、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含
む反応混合物の水濃度を、約０．１〜０．４％の間に調整するステップを含む。一実施形
態では、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物の水濃度を約０．２％に調整する
。
【０２０３】
一実施形態では、糖を活性化させるステップは、多糖を、有機溶媒中に莢膜多糖および
ＣＤＴを含む反応混合物中に存在する多糖の量に対して約５モル過剰である量のＣＤＴと
反応させることを含む。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法は、糖を含む反応混合物
の水濃度を決定するステップを含む。そのような一実施形態では、糖を活性化させるため
に反応混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混
合物中に存在する水の量と等モルであるＣＤＴの量で与える。
【０２０５】
別の実施形態では、糖を活性化させるために反応混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ
、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物中に存在する水の量と比較して約０．５
：１のモル比であるＣＤＴの量で与える。一実施形態では、糖を活性化させるために反応
混合物に添加されるＣＤＴの量をほぼ、有機溶媒中に糖およびＣＤＴを含む反応混合物中
に存在する水の量と比較して約０．７５：１のモル比であるＣＤＴの量で与える。
【０２０６】
一実施形態では、上記方法は、透析濾過によってチオール化多糖を単離するステップを
含む。別の実施形態では、上記方法は、透析濾過によって活性化チオール化多糖を単離す
るステップを含む。
【０２０７】
一実施形態では、単離Ｐｎ莢膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法に
おいて使用する担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７を含む。別の実施形態では、単離Ｍｎ莢
膜多糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成する方法において使用する担体タンパク質
は、ＣＲＭ１９７を含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．２〜４の間であ
る。他の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、１．０〜２．５の間
である。さらなる実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、０．４〜１
．７の間である。他の実施形態では、糖：活性化担体タンパク質比（ｗ／ｗ）は、約１：
１である。一部のそのような実施形態では、糖は細菌莢膜多糖であり、活性化担体タンパ
ク質をＣＲＭ１９７の活性化（ブロモアセチル化）によって生成する。
【０２０９】
別の実施形態では、活性化糖を生成する方法は、有機溶媒の使用を含む。多くの実施形
態では、有機溶媒は極性非プロトン性溶媒である。一部のそのような実施形態では、極性
非プロトン性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、アセ
トニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジ
ノン（ＤＭＰＵ）、およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれらの混
合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、有機溶媒はＤＭＳＯである。
【０２１０】
多くの実施形態では、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートの単離は、限外濾過／透析濾
過のステップを含む。
【０２１１】
一実施形態では、本発明の糖コンジュゲートを生成する方法において使用する糖は、約
１０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤａの間の分子量を有する。別の実施形態では、本発明の糖
コンジュゲートを生成する方法において使用する糖は、約５０ｋＤａ〜約２，０００ｋＤ
ａの間の分子量を有する。
【０２１２】
一実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成する方法において
生成する糖コンジュゲートは、およそ５０ｋＤａ〜約２０，０００ｋＤａの間のサイズを
有する。別の実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成する方法
において生成する糖コンジュゲートは、およそ５００ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの間
のサイズを有する。一実施形態では、莢膜多糖−担体タンパク質糖コンジュゲートを生成
する方法において生成する糖コンジュゲートは、およそ１，０００ｋＤａ〜約３，０００
ｋＤａの間のサイズを有する。
【０２１３】
別の態様では、本発明は、本明細書において開示する方法のいずれかによって生成され
た、オキソ−ｅＴスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含むオ
キソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートを提供する。
【０２１４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって生成されたオキソ
−ｅＴ連結糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
【０２１５】
糖のＯ−アセチル化度は、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、プ
ロトンＮＭＲ（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９６；８３〜９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎ
ｉｅｒ（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３０；１２３３〜１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８、またはＷＯ
００／５６３５７）によって決定することができる。別の一般的に使用される方法は、Ｈ
ｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０；２４９〜２６１によって記
載されている。また別の方法は、ＨＰＬＣイオン排除クロマトグラフィーに基づく。Ｏ−
アセチル化度は、試料中に存在する遊離アセタートの量を推定し、その値を弱塩基加水分
解後に放出されるアセタートの量と比較することによって決定される。アセタートは試料
の他の構成要素から分解され、２１０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）検出で定量される。別の方
法は、ＨＰＬＣイオン排除クロマトグラフィーに基づく。Ｏ−アセチルは、試料中に存在
する遊離アセタートの量を推定し、その値を弱塩基加水分解後に放出されるアセタートの
量と比較することによって決定される。アセタートは試料の他の構成要素から分解され、
２１０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）検出で定量される。
【０２１６】
アミノ酸分析によって決定されるコンジュゲーション度
ブロモアセチル活性化化学作用を使用して生成された「ＩＡＡキャッピング前の」コン
ジュゲート試料の酸性加水分解は、コンジュゲートされた部位からの酸安定なカルボキシ
メチルチオアルキルアミン（ＣＭＴＡ）、およびキャッピングされた部位にあるシステイ
ンからの酸安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした。ブロ
モアセチル活性化化学作用を使用して生成された「ＩＡＡキャッピング後の」コンジュゲ
ート（最終）の酸性加水分解はまた、コンジュゲートされた部位およびＩＡＡキャッピン
グされた部位からの酸安定な（ＣＭＴＡ）、さらには、キャッピングされた部位にあるシ
ステインからの酸安定なＳ−カルボキシメチルシステイン（ＣＭＣ）の形成をもたらした
。コンジュゲートされておらず、かつキャッピングされていないリシンはすべて、リシン
に再び変換されて、リシンとして検出される。他のアミノ酸はすべて、加水分解条件によ
って破壊されるトリプトファンおよびシステインを除いて、遊離アミノ酸に再び加水分解
された。アスパラギンおよびグルタミンはそれぞれ、アスパラギン酸およびグルタミン酸
に変換された。
【０２１７】
各加水分解試料および対照のアミノ酸を、イオン交換クロマトグラフィーを使用して分
離し、続いて、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ  ＮｉｎＲＸ溶液と１３５℃で反応
させた。次いで、誘導体化アミノ酸を５７０ｎｍ〜４４０ｎｍの可視範囲で検出した（表
１を参照されたい）。各アミノ酸５００ピコモルを含有するアミノ酸の標準セット［Ｐｉ
ｅｒｃｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｈ］を、各分析セットで試料およ
び対照と共に流した。Ｓ−カルボキシメチルシステイン［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］
を標準に添加した。
【０２１８】
【表１】
2019001790.tif 000010
【０２１９】
システインおよびシステアミンへのその共有結合、ならびに予測される同様の加水分解
に基づく評価のために、リシンを選択した。次いで、得られたアミノ酸のモル数を、タン
パク質のアミノ酸組成と比較し、ＣＭＣ、ＣＭＴＡ、またはＣＭＣＡ（システアミンリン
カーの場合）での値と共に報告した。ＩＡＡ−ＣＭＴＡ前の値を、コンジュゲーション度
の評価のために直接使用し、ＣＭＣ値を、第１のキャッピング度の評価のために直接使用
し、ＩＡＡ−ＣＭＴＡ後の値を、ＩＡＡ（第２）キャッピング度の評価のために使用した
。
【０２２０】
一実施形態では、糖コンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴づけ
る。コンジュゲートの分子サイズを、セファロースＣＬ−４Ｂ固定相サイズ排除クロマト
グラフィー（ＳＥＣ）媒体によって、高圧液体クロマトグラフィー系（ＨＰＬＣ）を使用
して決定する。Ｋｄ決定では、クロマトグラフィーカラムを初めに、ボイド体積または合
計排除体積を表すＶ０、および粒子間体積としても知られている、試料中で最小の分子が
溶離する体積を表すＶｉを決定するために較正する。すべてのＳＥＣ分離は、Ｖ０からＶ
ｉの間で起こる。収集された各画分でのＫｄ値は、次の式によって決定される：Ｋｄ＝（
Ｖｅ−Ｖｉ）／（Ｖｉ−Ｖ０）［式中、Ｖｅは、化合物の保持体積を表す］。≦０．３を
溶離する画分％（主なピーク）が、コンジュゲートＫｄ（分子サイズ分布）を定義する。
【０２２１】
免疫原性組成物
「免疫原性組成物」という用語は、対象において免疫応答を誘発するために使用するこ
とができる抗原（例えば、微生物またはその構成要素）を含有する任意の医薬組成物に関
する。
【０２２２】
本明細書において使用する場合、「免疫原性」は、哺乳動物などのホスト対象において
体液性もしくは細胞性、またその両方で媒介される免疫応答を誘発する、細菌莢膜多糖、
または細菌莢膜多糖を含む糖コンジュゲートもしくは免疫原性組成物などの抗原（または
抗原のエピトープ）の能力を意味する。
【０２２３】
糖コンジュゲートは、細胞表面のＭＨＣ分子と関連して抗原を提示することによって、
ホストを感作するために役立ち得る。加えて、免疫ホストを将来的に防御するために、抗
原特異的Ｔ細胞または抗体を生成することができる。したがって、糖コンジュゲートは、
ホストを、細菌による感染に関連する１種または複数の症状から防御することができるか
、またはホストを、莢膜多糖に関連する細菌での感染による死亡から防御することができ
る。糖コンジュゲートはまた、受動免疫を対象に付与するために使用することができるポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。糖コン
ジュゲートは、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細
菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用することもでき
る。
【０２２４】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１個の抗原認識部位
によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのターゲットに特異的
に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書において使用する場合、内容によって
別段に示さない限り、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗
体だけではなく、操作抗体（例えば、エフェクター機能、安定性、および他の生物学的活
性を改変するためのキメラ、ヒト化、および／または誘導体化）およびその断片（Ｆａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（サメ
およびラクダ抗体を含む）、ならびに本明細書に記載の、抗体部分を含む融合タンパク質
、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限り、二重特異性抗体
）および抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変配
置も包含することが意図されている。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（または
そのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は、いずれか特定のクラスの
抗体である必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロ
ブリンは、異なるクラスに帰属し得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ
、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらの数種は、ヒトにおいて、サ
ブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ
１、およびＩｇＡ２にさらに区別され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重
鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼
ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および立体配置はよく知られ
ている。
【０２２５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみを含み、その部分は好ましくは、イン
タクトな抗体が存在する場合に通常はその部分が関連する機能の少なくとも１つ、好まし
くは大部分または全部を保持する。
【０２２６】
「抗原」という用語は一般に、対象に注射または吸収される組成物を含めて、対象にお
いて、抗体の産生もしくはＴ細胞応答、またはその両方を刺激し得る免疫原性組成物中の
生物学的分子、通常は、タンパク質、ペプチド、多糖、もしくはコンジュゲート、または
免疫原性物質を指す。免疫応答は、全分子に対して、または分子の様々な部分（例えば、
エピトープまたはハプテン）に対して生じ得る。この用語は、個々の分子、または抗原分
子の均質もしくは不均質な集団を指すために使用され得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体
、または特異的な体液性もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。「抗原」に
は、すべての関連抗原エピトープも含まれる。所与の抗原のエピトープは、当技術分野で
よく知られている多くのエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例
えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒ
ｉｓ，  Ｅｄ．，１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊを参照さ
れたい。例えば、直鎖エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド、タンパク
質分子の部分に対応するペプチドを同時に合成し、ペプチドをまだ支持体に結合させたま
まで、それらのペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。そのよ
うな技術は、当技術分野で知られており、例えば、その全体が記述されている場合と同様
にそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅ
ｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９
８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９
〜７１５に記載されている。同様に、配座異性エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および
二次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸の空間構造を決定することによって同定するこ
とができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を
参照されたい。さらに、本発明の目的では、「抗原」は、そのタンパク質が免疫応答を誘
発する能力を維持する限り、天然配列に対して欠失、付加、および置換（一般に、天然で
は保存的であるが、非保存的であってもよい）などの改変を含むタンパク質を指すために
も使用され得る。これらの改変は、特定部位の突然変異誘発によって、または特定の合成
手順によって、または遺伝子操作手法によってなど、計画的であってもよいし、または抗
原を産生するホストの変異によってなど、偶然であってもよい。さらに、抗原は、微生物
、例えば、細菌に由来するか、それから得るか、もしくはそれから単離することもできる
し、または生体全体であってもよい。同様に、核酸免疫化用途においてなど、抗原を発現
するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義に含まれる。合成抗原、例
えば、ポリエピトープ、隣接する諸エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原
も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７
７７  ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４
２〜３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７
５：４０２  ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  
Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎ．２８  ｔｏ  
Ｊｕｌ．３、１９９８）。
【０２２７】
「防御」免疫応答は、体液もしくは細胞媒介性、または両方の免疫応答を誘発し、感染
から対象を防御するために役立つ免疫原性組成物の能力を指す。得られる防御は、絶対的
である必要はなく、すなわち、対象の対照集団、例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物
を投与されていない感染動物と比較して、統計的に有意な改善が存在するならば、感染は
、完全に防御または撲滅される必要はない。防御は、感染の症状の重症度またはその発症
の速度の緩和に限定され得る。一般に、「防御免疫応答」は、各抗原に対する測定可能な
あるレベルの機能抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的
な抗体レベルの上昇の誘発を含む。特定の状況では、「防御免疫応答」には、各抗原に対
する測定可能なあるレベルの機能抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定
の抗原に特異的な抗体レベルの２倍の上昇または抗体レベルの４倍の上昇の誘発が含まれ
得るであろう。ある種の実施形態では、オプソニン作用性抗体は、防御免疫応答と相関す
る。したがって、防御免疫応答は、オプソニン化貪食作用アッセイ、例えば、下記のもの
における細菌数の低下率を測定することによってアッセイすることができる。好ましくは
、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％以上の細菌数の低下が存在する。
【０２２８】
本明細書において互換的に使用される「免疫原性量」および「免疫有効量」という用語
は、細胞（Ｔ細胞）もしくは体液（Ｂ細胞または抗体）応答、またはその両方であってよ
い免疫応答を誘発するために十分な抗原または免疫原性組成物の量を指し、そのような免
疫応答は、当業者に知られている標準的なアッセイによって測定することができる。典型
的には、免疫有効量は、対象において防御免疫応答を誘発するはずである。
【０２２９】
本発明の免疫原性組成物は、免疫原性組成物を全身、皮膚、または粘膜経路を介して投
与することによって、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａ
ｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａ
ｅｃｉｕｍ）など）による細菌感染症に罹患しやすい対象を防御または処置するために予
防的または治療的に使用することができるか、または受動免疫を別の対象に付与するため
に使用することができるポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成するため
に使用することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路に
よる注射；または経口／消化器、呼吸器、もしくは尿生殖路への粘膜投与を含み得る。免
疫原性組成物は、動物有効性モデルにおける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの
細菌の死滅によって測定した場合に機能的である抗体を生成するために使用することもで
きる。
【０２３０】
特定の免疫原性組成物のための構成要素の最適な量は、対象における適切な免疫応答の
観察を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種の後に、対
象は、適切に間隔を空けて１回または複数回の追加免疫化を受けることができる。
【０２３１】
ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含む。本
明細書において定義するとおり、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原
性を増強するために役立つ物質である。したがって、アジュバントは多くの場合に、免疫
応答を増強するために投与され、当業者によく知られている。組成物の有効性を増強する
ために適したアジュバントには、これらだけに限定されないが、
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム
塩（ミョウバン）；
（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（下記で定義）または細菌細胞壁成
分などの他の特異的な免疫刺激剤を含むか、または含まない）、例えば、
（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎ
ｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に
製剤化された、スクアレン５％、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．５％、およびＳｐａｎ  ８５  
０．５％（様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、下記を参照されたい）を場合によ
って含有）を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）サブミクロン乳剤にマイクロ流動化されているか、またはより大きな粒径の乳剤を
生成するためにボルテックス処理されている、スクアレン１０％、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０
．４％、プルロニックブロックされたポリマーＬｌ２１  ５％、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（
下記を参照されたい）を含有するＳＡＦ、ならびに
（ｃ）スクアレン２％、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．２％、ならびに米国特許第４，９１２，
０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載の３−Ｏ−脱アシル化されたモノホスホリ脂質Ａ（ｍｏ
ｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ、ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（Ｔ
ＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標）
）からなる群からの１種または複数の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュ
バント系（ＲＡＳ）、（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；
（３）サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）Ｑ
Ｓ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ．Ｍａｓｓ．）（米国特許第５
，０５７，５４０号）を使用することができるか、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）
などのそれから生成される粒子；
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されて
いるアミノアルキルグルコサミンホスファート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もし
くは類似体などの細菌リポ多糖、合成脂質Ａ類似体；そのようなＡＧＰの１種は、水性形
態または安定な乳剤として製剤化されている５２９としても知られている（以前はＲＣ５
２９として知られていた）２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル
アミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−［（Ｒ）−３−テトラデカノイル
オキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイ
ルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＣｐＧモチーフ（複数可）を含有するオリゴヌ
クレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）である；
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６
、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、
ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子
Ｂ７−１およびＢ７−２などのサイトカイン；
（６）例えば、公開国際特許出願番号ＷＯ００／１８４３４（ＷＯ０２／０９８３６８お
よびＷＯ０２／０９８３６９も参照されたい）によってアミノ酸位２９のグルタミン酸が
別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンによって置き換えられている野生型または変異体型
のコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性
毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１
２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい）など
の細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化変異体；ならびに
（７）組成物の有効性を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質
が含まれる。
【０２３２】
ムラミルペプチドには、これらだけに限定されないが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ト
レオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−ア
ラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリル
オキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが含まれる。
【０２３３】
ある種の実施形態では、アジュバントは、アルミニウム塩などのアルミニウムベースの
アジュバントである。具体的な実施形態では、アルミニウムベースのアジュバントは、リ
ン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムからなる群から選択さ
れる。具体的な実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【０２３４】
免疫原性組成物は任意選択により、薬学的に許容できる担体を含むことができる。薬学
的に許容できる担体には、米国連邦政府、州政府の規制当局、または他の規制当局によっ
て承認されているか、またはヒトを含む対象、さらに非ヒト哺乳動物において使用するた
めに米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙されている担体が含まれる
。担体という用語は、医薬組成物をそれと共に投与する希釈剤、添加剤、またはビヒクル
を指すために使用することができる。水、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグ
リセロール水溶液を、特に、注射用液剤のための液体担体として使用することができる。
適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。製剤は、投与様
式に適合すべきである。
【０２３５】
本発明の免疫原性組成物は、複数の莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加えて、１
種または複数の防腐剤をさらに含んでよい。ＦＤＡは、いくつかの例外だけを除いて、複
数回投与（多回投与）用バイアル中の生物学的生成物が防腐剤を含有することを要求して
いる。防腐剤を含有するワクチン製品には、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキ
シエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎、
チフス（非経口）、ワクシニア）、およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、Ｈｅｐ
Ｂ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜炎、肺炎、狂犬病）を含有するワクチンが含ま
れる。注射用薬物において使用するために承認された防腐剤には、例えば、クロロブタノ
ール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール
、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノ
ール、チメロサールおよび、硝酸フェニル水銀が含まれる。
【０２３６】
ある種の実施形態では、非経口投与と適合性である本発明の製剤は、これらだけに限定
されないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔ
ｗｅｅｎ  ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０）、ポリソルベート−４０
（Ｔｗｅｅｎ  ４０）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、これらだけ
に限定されないが、Ｂｒｉｊ  ５８、Ｂｒｉｊ  ３５を含むポリオキシエチレンアルキル
エーテル、さらには、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ＮＰ４０
、Ｓｐａｎ  ８５、およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）などの他のものを含む１種または複数の非イオン性界面活性
剤を含み、好ましい構成要素は、約０．００１％〜約２％（最高約０．２５％が好ましい
）の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜１％（最高約０．５％が好まし
い）の濃度のポリソルベート−４０である。
【０２３７】
包装および投与形態
対象への本発明の免疫原性組成物の直接送達は、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮内、
皮下、静脈内、または組織の間質腔）；または口／消化管、呼吸器、もしくは尿生殖路へ
の粘膜投与を介して；または局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺、または他の粘膜投与によ
って達成することができる。
【０２３８】
一実施形態では、非経口投与は、例えば、対象の大腿または上腕への筋肉内注射による
。注射は、針（例えば、皮下針）によってよいが、別法では、無針注射を使用することも
できる。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍＬである。別の実施形態では、肺炎または中耳
炎を処置するために、鼻腔内投与を使用する（肺炎球菌の鼻咽頭通過がより有効に防御さ
れ得るので、その初期段階で感染が減弱される）。
【０２３９】
本発明の組成物を、様々な形態で、例えば、注射のために、液体溶液または懸濁液とし
て調製することができる。ある種の実施形態では、組成物を、肺投与用の散剤または噴霧
剤として、例えば、吸入器において調製することができる。他の実施形態では、組成物を
、坐剤もしくは膣坐剤として、または経鼻、耳、もしくは眼投与のために、例えば、噴霧
剤、滴剤、ゲル剤、もしくは散剤として調製することができる。
【０２４０】
各免疫原性組成物用量中の糖コンジュゲートの量は、重大な有害作用を伴うことなく免
疫防御応答を誘発する量として選択される。そのような量は、糖コンジュゲート中に存在
する細菌血清型に依存して様々であり得る。一般に、各用量は、多糖０．１〜１００μｇ
、特に０．１〜１０μｇ、より詳細には１〜５μｇを含むであろう。
【０２４１】
本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、オキソ−ｅＴリンカーを介してＣＲ
Ｍ１９７に個々にコンジュゲートされたＰｎまたはＭｎ莢膜多糖の滅菌液体製剤であり、
各０．５ｍＬ用量を、多糖１〜５μｇを含有するように製剤化するが、これは、アルミニ
ウム元素０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント；および塩化ナ
トリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝剤を添加剤としてさらに含有してもよい。
【０２４２】
特定の免疫原性組成物での構成要素の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察
を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種の後に、対象は
、適切に間隔を空けて１回または複数回の追加免疫化を受けることができる。
【０２４３】
本発明の免疫原性組成物は、単位用量または多回用量形態（例えば、２回用量、４回用
量以上）で包装することができる。多回用量形態では、典型的であって、必ずしもではな
いが、バイアルが、プレフィルドシリンジよりも好ましい。適切な多回用量形式は、これ
らだけに限定されないが：１用量当たり０．１〜２ｍＬで容器１個当たり２〜１０用量を
含む。ある種の実施形態では、用量は、０．５ｍＬ用量である。例えば、本明細書に参照
によって組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。
【０２４４】
組成物を、バイアルまたは他の適切な貯蔵容器で提供することができるか、または針を
有するか、もしくは有さずに供給され得るプレフィルド送達デバイス、例えば、単一また
は複数構成要素シリンジ中で提供することができる。必ずしも必須ではないが典型的には
、シリンジは、単回用量の本発明の防腐剤含有免疫原性組成物を含有するが、多回用量プ
レフィルドシリンジも企図される。同様に、バイアルは、単回用量を含み得るが、別法で
は、複数回用量を含み得る。
【０２４５】
有効な投薬体積は、常套的に樹立することができるが、注射用組成物の典型的な用量は
、０．５ｍＬの体積を有する。ある種の実施形態では、ヒト対象への投与用に用量を決定
する。ある種の実施形態では、用量を、成人、十代、青年、幼児、または乳児（すなわち
、１歳以下）ヒト対象に投与するために製剤化し、好ましい実施形態では、注射によって
投与することができる。
【０２４６】
本発明の液体免疫原性組成物は、凍結乾燥形態で提供される他の免疫原性組成物を復元
するためにも適している。免疫原性組成物を、そのような即時復元のために使用すべき場
合、本発明は、２個以上のバイアル、２個以上のすぐに充填されるシリンジ、またはそれ
ぞれ１個もしくは複数を備えたキットを提供し、シリンジの内容物を、注射の前にバイア
ルの内容物を復元するために、またはその逆で使用する。
【０２４７】
また別の実施形態では、多回用量形式の容器は、これらだけに限定されないが、一般的
な実験室用ガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクタ
ー、管、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアルクロージャー（例えば、ゴムスト
ッパー、スクリューキャップ）、アンプル、シリンジ、二室または多室シリンジ、シリン
ジストッパー、シリンジプランジャー、ゴムクロージャー、プラスチッククロージャー、
ガラスクロージャー、カートリッジ、および使い捨てペンなどからなる群の１つまたは複
数から選択される。本発明の容器は、製造材料によって限定されず、ガラス、金属（例え
ば、鋼、ステンレス鋼、アルミニウムなど）、およびポリマー（例えば、熱可塑性プラス
チック、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料が含まれる。特定の実施形態
では、上記形式の容器は、ブチルストッパーを備えた５ｍＬ  Ｓｃｈｏｔｔ  Ｔｙｐｅ  
１ガラスバイアルである。当業者は、上記形式が、網羅リストでは全くなく、本発明で利
用可能な様々な形式に関する当業者のためのガイダンスとして単に役立つものであること
を認めるであろう。本発明において使用するために企図されている追加の形式は、Ｕｎｉ
ｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの
実験室装置供給者および製造者から公開されているカタログにおいて見出すことができる
。
【０２４８】
感染に対して免疫応答を誘発し、防御するための方法
本発明はまた、オキソ−ｅＴ連結糖コンジュゲートおよびそれを含む免疫原性組成物を
予防的または治療的に使用するための方法を含む。例えば、本発明の一態様は、病原細菌
、例えば、肺炎球菌または髄膜炎菌細菌に対して免疫応答を誘発する方法であって、病原
細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む免疫有効量の本明細書に記載の免疫原
性組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。本発明の一実施形態は
、病原細菌による感染に対して対照を防御する方法、または病原細菌に関連する感染疾患
または状態を予防、処置、もしくは改善する方法、または病原細菌に起因する感染に関連
する少なくとも１つの症状の重症度を低減するか、もしくはその発症を遅延させる方法で
あって、それぞれの場合に、病原細菌に由来する細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含む免疫
有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象に投与することを含む方法を
提供する。
【０２４９】
本発明の一実施形態は、対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、ま
たは改善する方法であって、免疫有効量の本発明の免疫原性組成物を対象に投与すること
を含み、上記免疫原性組成物が、細菌莢膜多糖などの細菌抗原を含むオキソ−ｅＴ連結糖
コンジュゲートを含む方法を提供する。
【０２５０】
一部の実施形態では、細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方
法は、ヒト、家畜、動物、または農業処置を含む。別の実施形態は、対象において、病原
細菌に関連する細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法であっ
て、本明細書に記載の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製
物を生成することと、受動免疫を対象に付与するために上記抗体調製物を使用することと
を含む方法を提供する。本発明の一実施形態は、外科手術を受ける対象において、細菌感
染症を予防する方法であって、外科手術の前に、予防有効量の本明細書に記載の免疫原性
組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２５１】
上述の方法のそれぞれの好ましい実施形態では、病原細菌は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などの肺炎球菌また
は髄膜炎菌細菌である。一部のそのような実施形態では、細菌抗原は、Ｐｎ−血清型１、
３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１
８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択され
る莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、細菌抗原は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ
１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実
施形態では、細菌抗原は、ＧＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖
からなる群から選択される莢膜多糖である。他のそのような実施形態では、莢膜多糖は、
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からの莢膜多糖（例え
ば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖）、または腸球菌（
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの莢膜多糖（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖など）である。
【０２５２】
抗原または免疫原性組成物に対する免疫応答は、その抗原または免疫原性組成物中に存
在する分子に対する体液性および／または細胞媒介性免疫応答の対象における発生によっ
て特徴づけられる。本発明の目的では、「体液性免疫応答」は、抗体媒介性免疫応答であ
り、本発明の免疫原性組成物中の抗原を認識し、それに対する多少の親和性で結合する抗
体の誘発および発生に関係し、「細胞媒介性免疫応答」は、Ｔ細胞および／または他の白
血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合性複合体
（ＭＨＣ）のクラスＩもしくはクラスＩＩ分子、ＣＤ１、または他の非古典的ＭＨＣ様分
子と関連して抗原エピトープの提示によって誘発される。これは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ
ヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化させる。Ｃ
ＴＬは、古典的または非古典的ＭＨＣによってコードされ、細胞表面上に発現されるタン
パク質と関連して提示されるペプチド抗原について特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微
生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発および促進する
ために役立つ。細胞性免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答に関係す
る。ヘルパーＴ細胞は、それらの表面上の古典的または非古典的ＭＨＣ分子に関連して、
ペプチドまたは他の抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能を刺激
し、かつその活性に焦点を当てるための助けとなるように作用する。「細胞媒介性免疫応
答」はまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化Ｔ細胞および／
または他の白血球によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および他のそのような
分子の産生を指す。細胞媒介性免疫応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リ
ンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、感作対象
において抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって、または抗原での
再刺激に応じたＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によってなど、いくつかのアッセイ
によって決定することができる。そのようなアッセイは、当技術分野でよく知られている
。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９〜４
１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９〜２
３７６を参照されたい。
【０２５３】
本発明の免疫原性組成物および方法は、下記の１つまたは複数のために有用であり得る
：（ｉ）従来のワクチンにおいてのとおり、感染もしくは再感染の予防、（ｉｉ）症状の
重症度の低減、もしくはその除去、および／または（ｉｉｉ）病原体または障害の実質的
または完全な除去。したがって、処置は、予防的に（感染前）、または治療的に（感染後
）行うことができる。本発明では、予防処置が好ましい様式である。本発明の特定の実施
形態では、ホスト対象を、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜
炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ
ｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）など）による細菌感染症に対して処置（予防
的および／または治療的免疫化を含む）する組成物および方法を提供する。本発明の方法
は、予防および／または治療免疫を対象に付与するために有用である。本発明の方法をま
た、生物医学的研究用途のために、対象で実行することができる。
【０２５４】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を意味
する。より詳細には、対象は、ヒト、これらだけに限定されないが、ウシ、ヒツジ、フェ
レット、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどを含む家畜および牧場動物、ならび
に研究用、動物園、スポーツ用、ならびに家庭用ペットおよび他の飼い慣らした動物など
のペットコンパニオン動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好まし
いコンパニオン動物は、イヌおよびネコである。好ましくは、対象はヒトである。
【０２５５】
組成物中の特定のコンジュゲートの量は一般に、そのコンジュゲートでコンジュゲート
された多糖およびコンジュゲートされていない多糖の両方の合計量に基づき計算される。
例えば、遊離多糖２０％を有するコンジュゲートは、多糖用量１００μｇ中にコンジュゲ
ートされた多糖約８０μｇおよびコンジュゲートされていない多糖約２０μｇを有するは
ずである。コンジュゲートの用量を計算する場合に、コンジュゲートに対するタンパク質
寄与率は通常、考慮されない。コンジュゲートまたは免疫原性組成物の免疫原量は、細菌
血清型に応じて様々であり得る。一般に、各用量は、多糖０．１〜１００μｇ、特には０
．１〜１０μｇ、より詳細には１〜１０μｇを含むはずである。免疫原性組成物中の異な
る多糖構成要素の免疫原量は異なってよく、それぞれ、いずれかの特定の多糖抗原１μｇ
、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５
μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０
μｇ、または約１００μｇを含んでよい。
【０２５６】
「侵襲性疾患」という用語は、疾患の関連臨床徴候／症状が存在する、通常無菌部位か
らの細菌の単離に関する。通常無菌身体部位には、血液、ＣＳＦ、胸膜液、心膜液、腹膜
液、滑液／関節液、骨、身体内部部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎
臓、膵臓、卵巣）、または他の通常無菌部位が含まれる。侵襲性疾患を特徴づける臨床状
態には、菌血症、肺炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックなどが含まれる。
【０２５７】
免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイか、その特異的ターゲット細胞を溶解す
るＴ細胞の能力を測定するためのクロム放出アッセイなどの細胞溶解性アッセイか、また
は血清中での、抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレ
ベルを測定することによって測定することができる。免疫応答はまた、本明細書に記載の
とおりに、抗原の投与後に誘発された抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによっ
て、かつより具体的には、そうして誘発された抗体の、特定の白血球のオプソニン作用能
力を増強する能力を測定することによって検出することができる。免疫応答の保護レベル
は、免疫化ホストを、投与された抗原で攻撃することによって測定することができる。例
えば、免疫応答が望ましい抗原が、細菌であれば、抗原の免疫原量によって誘発される保
護レベルは、その細菌細胞で動物を攻撃した後の生存率または死亡率を検出することによ
って測定される。一実施形態では、保護量は、細菌感染症に関連する少なくとも１つの徴
候、例えば、感染症に関連する発熱を測定することによって測定することができる。多抗
原もしくは多成分ワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原のそれぞれの量は、他の構成要
素のそれぞれに関して変わるはずであり、当業者に知られている方法によって決定され得
る。そのような方法は、免疫原性および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を測定するための
手順を含むであろう。
【０２５８】
別の態様では、本発明は、本発明の莢膜多糖または糖コンジュゲートに特異的および選
択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部のそのような実施形態では、本発
明は、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、もしくは３３Ｆ莢膜多
糖、またはそれを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体
組成物を提供する。他のそのような実施形態では、本発明は、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１
３５、もしくはＹ莢膜多糖、またはそれを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に
結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのような実施形態では、本発明は、Ｇ
ＢＳ−血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ莢膜多糖、それを含むまたは糖コンジ
ュゲートに特異的および選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。他のそのよ
うな実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５もしくは８
莢膜多糖、またはエンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅ
ｃａｌｉｓ）もしくはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａ
ｅｃｉｕｍ）莢膜多糖、またはそれらを含む糖コンジュゲートに特異的および選択的に結
合する抗体および抗体組成物を提供する。一部の実施形態では、抗体を、対象に、本発明
の莢膜多糖または糖コンジュゲートを投与することで生成する。一部の実施形態では、本
発明は、本発明の莢膜多糖または糖コンジュゲートの１種または複数を対象とする精製ま
たは単離抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗体は、動物有効性モデルにお
ける、またはオプソニン作用性死滅アッセイでの細菌の死滅によって測定した場合に機能
的である。本発明の抗体または抗体組成物は、対象において、病原細菌、例えば、肺炎連
鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ま
たはＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｕｓ）または黄色ブドウ球菌（
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に関連する細菌感染症、
疾患、または状態を処置または予防する方法であって、ポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体調製物を生成することと、受動免疫を対象に付与するために上記抗体または抗体
組成物を使用することとを含む方法において使用することができる。本発明の抗体はまた
、診断方法、例えば、莢膜多糖またはその糖コンジュゲートの存在を検出するか、または
そのレベルを定量するのに有用であり得る。例えば、本発明の抗体はまた、ＰｎまたはＭ
ｎまたはＧＢＳまたは黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖またはその糖コンジュゲートの存在を検出するか、またはそのレ
ベルを定量するために有用であり得、その糖コンジュゲートは、オキソ−ｅＴスペーサー
を介して担体タンパク質にコンジュゲートされた細菌莢膜多糖を含む。
【０２５９】
当技術分野で知られているいくつかのアッセイおよび動物モデルを、本明細書に記載の
免疫原性組成物のいずれか１つの有効性を評価するために使用することができる。例えば
、Ｃｈｉａｖｏｌｉｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００８）、２
１（４）：６６６〜６８５）は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）疾患の動物モ
デルを記載している。Ｇｏｒｒｉｎｇｅら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＭＥＤＩＣＩＮＥ、ｖｏｌ．６６（２００１）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １７、Ｐｏｌｌａｒ
ｄおよびＭａｉｄｅｎ編（Ｈｕｍａｎａａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）は、髄膜炎菌疾患の
ための動物モデルを記載している。
【０２６０】
オプソニン作用活性（ＯＰＡ）アッセイ
ＯＰＡアッセイ手順は、Ｈｕら（Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２
００５；１２（２）：２８７〜９５）によって以前記載された方法に基づくが、次の変更
を伴った。熱不活化血清を緩衝液中で２．５倍連続希釈した。ターゲット細菌をアッセイ
プレートに添加し、振盪機上、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、子ウサギ
補体（３〜４週齢、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ、最終濃度１２．５％）および分化ＨＬ−６０細
胞を各ウェルに、およそ２００：１のエフェクターとターゲットとの比で添加した。アッ
セイプレートを振盪機上、３７℃で４５分間インキュベートした。反応を停止させるため
に、０．９％ＮａＣｌ８０μＬをすべてのウェルに添加し、混合し、１０μＬアリコート
を、水２００μＬを含有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ  ＨＶ
フィルタープレートのウェルに移した。液体を、真空下でプレートを通して濾過し、Ｈｙ
Ｓｏｙ培地１５０μＬを各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３
７℃、５％ＣＯ２で終夜インキュベートし、次いで、Ｄｅｓｔａｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で固定した。次いで、プレートをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染
色し、一度脱染した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  
Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で数え
た。ＯＰＡ抗体力価を、免疫血清を含有しなかった対照ウェルと比較した場合に細菌コロ
ニーの数の５０％低減ポイントを挟む２つの血清希釈の逆数から内挿した。
【０２６１】
本発明の特定の実施形態を、ナンバリングした次のパラグラフにおいて述べる：
１．（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有
結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲート。
２．一般式（Ｉ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
【０２６２】
【化８】
2019001790.tif 000011
［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり
得、
Ｒは、Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレン、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−
Ｃ２〜Ｃ１６アルキレン、またはＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンであ
り、上記アルキレンおよびヘテロアルキレンは、ＣＯＯＲ’から独立に選択される１、２
、または３個の基によって置換されていてもよく、Ｒ’は、Ｈ、メチル、エチル、または
プロピルから選択される］。
３．Ｘが、Ｏであり、ｍが、１である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
４．Ｘが、Ｓであり、ｍが、１である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
５．ｍが、０である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート。
６．Ｂが、結合である、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
７．Ｂが、Ｏである、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
８．Ｂが、ＣＨ２である、パラグラフ２から５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート
。
９．ｍが、０であり、Ｂが、（Ｃ＝Ｏ）である、パラグラフ２に記載の糖コンジュゲート
。
１０．Ｒが、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６
、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０からなる群から選
択される、パラグラフ２から９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１１．Ｒが、Ｃ２〜Ｃ１６ヘテロアルキレンである、パラグラフ２から９のいずれか１つ
に記載の糖コンジュゲート。
１２．Ｒが、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、
Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−
Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ
２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２
−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される、パラグラフ２から９のいずれか１つに
記載の糖コンジュゲート。
１３．上記スペーサーが（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅ
ＴＥＣ）スペーサーではないことを条件とする、パラグラフ１から１２のいずれか１つに
記載の糖コンジュゲート。
１４．一般式（ＩＩ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
【０２６３】
【化９】
2019001790.tif 000012
［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］。
１５．ｎが３である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１６．ｎが４である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１７．ｎが５である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１８．ｎが６である、パラグラフ１４に記載の糖コンジュゲート。
１９．一般式（ＩＩＩ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
【０２６４】
【化１０】
2019001790.tif 000013
［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、Ｎ
ＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）
ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］。
２０．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パ
ラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２１．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
１９に記載の糖コンジュゲート。
２２．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
１９に記載の糖コンジュゲート。
２３．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、
パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２４．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択
される、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２５．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される
、パラグラフ１９に記載の糖コンジュゲート。
２６．ｎが、１〜５である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
２７．ｎが、１〜４である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
２８．ｎが、１〜３である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
２９．ｎが、１または２である、パラグラフ１９から２２のいずれか１つに記載の糖コン
ジュゲート。
３０．ｍが、１〜３である、パラグラフ１９から２３のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
３１．ｍが、１または２である、パラグラフ１９または２３から２５のいずれか１つに記
載の糖コンジュゲート。
３２．ｍが、１である、パラグラフ１９または２３から２５のいずれか１つに記載の糖コ
ンジュゲート。
３３．一般式（ＩＶ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
【０２６５】
【化１１】
2019001790.tif 000014
［式中、Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯ
Ｈ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２
、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
３４．Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ３
３に記載の糖コンジュゲート。
３５．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パ
ラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３６．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
３３に記載の糖コンジュゲート。
３７．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
３３に記載の糖コンジュゲート。
３８．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、
パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
３９．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択
される、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
４０．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される
、パラグラフ３３に記載の糖コンジュゲート。
４１．ｎが、１〜５である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
４２．ｎが、１〜４である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
４３．ｎが、１〜３である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
４４．ｎが、１または２である、パラグラフ３３から３７のいずれか１つに記載の糖コン
ジュゲート。
４５．ｍが、１〜３である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記載の
糖コンジュゲート。
４６．ｍが、１または２である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記
載の糖コンジュゲート。
４７．ｍが、１である、パラグラフ３３または３８から４０のいずれか１つに記載の糖コ
ンジュゲート。
４８．一般式（Ｖ）を有する、パラグラフ１に記載の糖コンジュゲート：
【０２６６】
【化１２】
2019001790.tif 000015
［式中、Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯ
ＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ
２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］。
４９．Ｒが、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ４
８に記載の糖コンジュゲート。
５０．Ｒが、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パ
ラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５１．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
４８に記載の糖コンジュゲート。
５２．Ｒが、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎであり、ｎが、１〜１０から選択される、パラグラフ
４８に記載の糖コンジュゲート。
５３．Ｒが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される、
パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５４．Ｒが、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択
される、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５５．Ｒが、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２であり、ｍが、１〜４から選択される
、パラグラフ４８に記載の糖コンジュゲート。
５６．ｎが、１〜５である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
５７．ｎが、１〜４である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
５８．ｎが、１〜３である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コンジュ
ゲート。
５９．ｎが、１または２である、パラグラフ４８から５２のいずれか１つに記載の糖コン
ジュゲート。
６０．ｍが、１〜３である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記載の
糖コンジュゲート。
６１．ｍが、１または２である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記
載の糖コンジュゲート。
６２．ｍが、１である、パラグラフ４８または５３から５５のいずれか１つに記載の糖コ
ンジュゲート。
６３．糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結さ
れ、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペー
サーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６４．糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、
担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサ
ーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６５．糖が、アミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーに共有結合で連結され、
担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＤスペーサ
ーに共有結合で連結された、オキソ−ｅＴＡＡＤスペーサーを介して担体タンパク質にコ
ンジュゲートされた糖を含むパラグラフ１に記載の糖コンジュゲート。
６６．糖が、多糖またはオリゴ糖である、パラグラフ１から６５のいずれか１つに記載の
糖コンジュゲート。
６７．糖が、細菌に由来する莢膜多糖である、パラグラフ１から６５のいずれか１つに記
載の糖コンジュゲート。
６８．上記莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する、パラグラ
フ６７に記載の糖コンジュゲート。
６９．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ
、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１
９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる
群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７０．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型  ２、９Ｎ、１５Ａ、１７Ｆ、２０、２３Ａ、２３
Ｂ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジ
ュゲート。
７１．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、８、９Ｖ、９Ｎ、１２Ｆ、および
２２Ｆからなる群から選択される、パラグラフ６８に記載の糖コンジュゲート。
７２．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖
コンジュゲート。
７３．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型２２Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖
コンジュゲート。
７４．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１０Ａ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖
コンジュゲート。
７５．上記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１１Ａ莢膜多糖である、パラグラフ６８に記載の糖
コンジュゲート。
７６．糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜糖である、パラ
グラフ１から６５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
７７．糖が、多糖である、パラグラフ７５に記載の糖コンジュゲート。
７８．糖が、オリゴ糖である、パラグラフ７５に記載の糖コンジュゲート。
７９．莢膜糖が、Ｍｎ−血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜糖からなる群、好ましく
はＭｎ−血清型Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜糖からなる群から選択される、パラグラフ７
５から７８に記載の糖コンジュゲート。
８０．莢膜糖が、Ｍｎ−血清型Ｘ莢膜糖である、パラグラフ７５から７８に記載の糖コン
ジュゲート。
８１．上記莢膜多糖が、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８２．上記Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖が、
血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＶ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグ
ラフ８１に記載の糖コンジュゲート。
８３．上記莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
）に由来する、パラグラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８４．上記黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓ）血清型５または８莢膜多糖である、パラグラフ８３に記載の糖コンジュゲート
。
８５．上記莢膜多糖が、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）に由来する、パラグラフ６
７に記載の糖コンジュゲート。
８６．上記腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）莢膜多糖が、エンテロコッカス・フェカ
ーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）またはエンテロコッカス・フェ
シウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）莢膜多糖である、パラグラフ８５
に記載の糖コンジュゲート。
８７．上記莢膜多糖が、シアル酸および／またはウロン酸含有細菌多糖に由来する、パラ
グラフ６７に記載の糖コンジュゲート。
８８．糖が、１０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ１から８
７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
８９．多糖が、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パラグラフ８８に
記載の糖コンジュゲート。
９０．糖コンジュゲートが、５０ｋＤａ〜２０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、パ
ラグラフ１から８９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９１．糖コンジュゲートが、５００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの間の分子量を有する、
パラグラフ９０に記載の糖コンジュゲート。
９２．多糖が、７５〜１００％の間のＯ−アセチル化度を有する、パラグラフ１から９１
のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９３．担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフル
エンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融
合体、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．
ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群
において選択される、パラグラフ１から９２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９４．担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、およびＨ．インフルエンザ（Ｈ．
ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄからなる群において選択される、パラグラフ１から
９２のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９５．担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、パラグラフ１から９２のいずれか１つに
記載の糖コンジュゲート。
９６．ＣＲＭ１９７が、オキソ−ｅＴスペーサーを介して多糖に共有結合で連結された２
〜２０個のリシン残基を含む、パラグラフ９５に記載の糖コンジュゲート。
９７．ＣＲＭ１９７が、オキソ−ｅＴスペーサーを介して多糖に共有結合で連結された４
〜１６個のリシン残基を含む、パラグラフ９５に記載の糖コンジュゲート。
９８．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２から４の間である、パラグラフ１から
９７のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
９９．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．４から１．７の間である、パラグラフ９
８に記載の糖コンジュゲート。
１００．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位２５
個ごとに起こる、パラグラフ１から９９のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０１．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位１５
個ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０２．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位１０
個ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０３．担体タンパク質と糖との間の少なくとも１個の連結が、糖の糖繰り返し単位４個
ごとに起こる、パラグラフ１００に記載の糖コンジュゲート。
１０４．上記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、パラグラフ９８から１０３のいずれ
か１つに記載の糖コンジュゲート。
１０５．糖の合計量と比較して、遊離糖１５％未満を含む、パラグラフ１から１０４のい
ずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０６．≦０．３で、≧３５％の分子サイズ分布（Ｋｄ）を有する、パラグラフ１から１
０５のいずれか１つに記載の糖コンジュゲート。
１０７．パラグラフ１から１０６のいずれか１つにおいて定義したとおりの少なくとも１
つの糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物。
１０８．パラグラフ１から１０６のいずれか１つにおいて定義したとおりの少なくとも１
つの糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫
原性組成物。
１０９．追加の抗原をさらに含む、パラグラフ１０７または１０８に記載の免疫原性組成
物。
１１０．追加の抗原が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来するタンパク質
抗原または莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組成
物。
１１１．追加の抗原が、Ｐｎ−血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１
０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、およ
び３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグ
ラフ１１０に記載の免疫原性組成物。
１１２．追加の抗原が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来するタンパク
質抗原または莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組
成物。
１１３．追加の抗原が、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹ莢膜多糖からなる群から選択
される莢膜多糖の糖コンジュゲートを含む、パラグラフ１０９に記載の免疫原性組成物。
１１４．アジュバントをさらに含む、パラグラフ１０７から１１３のいずれか1つに記載
の免疫原性組成物。
１１５．アジュバントが、アルミニウムベースのアジュバントである、パラグラフ１１４
に記載の免疫原性組成物。
１１６．アジュバントが、リン酸アルミニウムである、パラグラフ１１４に記載の免疫原
性組成物。
１１７．アジュバントが、水酸化アルミニウムである、パラグラフ１１４に記載の免疫原
性組成物。
１１８．パラグラフ１０７から１１７のいずれか１つで定義した免疫原性組成物のいずれ
かを充填されている容器。
１１９．バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵槽、バイオリアクター、バッグ、ジャー、
アンプル、カートリッジ、および使い捨てペンからなる群から選択される、パラグラフ１
１８に記載の容器。
１２０．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）
スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを
作製する方法であって、
ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステッ
プと、
ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーまたはその塩
と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフ
ヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体
タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステ
ップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非
コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッ
ピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スル
フヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるス
テップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１２１．ステップａ）の炭酸誘導体が、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリ
アゾール）（ＣＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはジス
クシンイミジルカルボナート（ＤＳＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホ
ルマートである、パラグラフ１２０に記載の方法。
１２２．ステップａ）の炭酸誘導体が、１，１’−カルボニル−ジ−（１，２，４−トリ
アゾール）（ＣＤＴ）である、パラグラフ１２１に記載の方法。
１２３．ステップａ）を有機溶媒中で行う、パラグラフ１２０から１２２のいずれか１つ
に記載の方法。
１２４．上記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶
媒である、パラグラフ１２３に記載の方法。
１２５．活性化糖を、ヘテロ二官能性チオアルキルアミン試薬またはその塩と反応させる
ことによって、チオール化糖を生成する、パラグラフ１２０から１２４のいずれか１つに
記載の方法。
１２６．第１のキャッピング試薬が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインである、パラグラフ
１２０から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．第２のキャッピング試薬が、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）である、パラグラフ
１２０から１２６のいずれか１つに記載の方法。
１２８．ステップｅ）が、第１のキャッピング試薬および第２のキャッピング試薬の両方
でキャッピングすることを含む、パラグラフ１２０から１２７のいずれか１つに記載の方
法。
１２９．ステップｅ）が、第１のキャッピング試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイ
ンおよび第２のキャッピング試薬としてのＩＡＡでキャッピングすることを含む、パラグ
ラフ１２０から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１３０．キャッピングステップｅ）が、第１および／または第２のキャッピング試薬との
反応の後に、還元剤、例えば、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはメルカプトエタノールとの反応
をさらに含む、パラグラフ１２０から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．ステップｄ）が、活性化チオール化糖を活性化担体タンパク質と反応させる前に
、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質を得ることをさ
らに含む、パラグラフ１２０から１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３２．活性化担体タンパク質が、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含む、
パラグラフ１３１のいずれか１つに記載の方法。
１３３．上記活性化担体タンパク質が、１個または複数のα−ブロモアセトアミド基を含
む活性化ＣＲＭ１９７担体タンパク質である、パラグラフ１２０から１３２のいずれか１
つに記載の方法。
１３４．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペ
ーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製
する方法であって、
ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するス
テップと、
ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護され
たまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によ
ってチオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応さ
せて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するス
テップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体
タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステ
ップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非
コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッ
ピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スル
フヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるス
テップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１３５．ステップａ）の糖を、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ
（ＴＥＭＰＯ）／Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）試薬系によって酸化する、パラグ
ラフ１３４に記載の方法。
１３６．（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）スペ
ーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされたカルボキシル含有糖を含む糖コン
ジュゲートを作製する方法であって、
ａ）活性化糖を生成するためのカルボキシル基含有糖を、カルボジイミドまたはその誘導
体と初めに反応させるステップと、
ｂ）活性化糖を、アミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊
離の形態で）を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させて、チオール化糖を生成する
ステップと、
ｃ）チオール化糖を脱保護剤または還元剤（保護されている場合）と反応させて、１個ま
たは複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体
タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステ
ップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非
コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッ
ピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スル
フヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるス
テップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＤ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
１３７．カルボジイミド誘導体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
、または１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドである、パ
ラグラフ１３６に記載の方法。
１３８．カルボジイミド誘導体が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＣ）である、パラグラフ１３６に記載の方法。
１３９．ステップａ）を有機溶媒中で行う、パラグラフ１３６から１３８のいずれか１つ
に記載の方法。
１４０．上記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン性溶
媒である、パラグラフ１３９に記載の方法。
１４１．カルボン酸活性化ステップａ）を、カルボジイミドおよびチアゾリジノンチオン
によって達成する、パラグラフ１３６から１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４２．カルボン酸活性化ステップａ）を、Ｎ−エチル−３−フェニルイソオキサゾリウ
ム−３’−スルホン酸塩（Ｗｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ）によって達成する、パラグラフ１３
６から１４０のいずれか１つに記載の方法。
１４３．ステップｃ）において生成されたチオール化多糖の精製をさらに含み、精製ステ
ップが透析濾過を含む、パラグラフ１２０から１４２のいずれか１つに記載の方法。
１４４．担体タンパク質を、活性化ブロモ酢酸誘導体で活性化させる、パラグラフ１２０
から１４３のいずれか１つに記載の方法。
１４５．ブロモ酢酸誘導体が、ブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂ
ＡＡＮＳ）である、パラグラフ１４４に記載の方法。
１４６．透析濾過によって糖コンジュゲートを精製することをさらに含む、パラグラフ１
２０から１４５のいずれか１つに記載の方法。
１４７．ステップａ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、
アセトニトリル、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリ
ミジノン（ＤＭＰＵ）、およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、またはそれら
の混合物からなる群から選択される極性非プロトン性溶媒中で行う、パラグラフ１２０か
ら１４６のいずれか１つに記載の方法。
１４８．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．２から４の間である、パラグラフ１２
０から１４７のいずれか１つに記載の方法。
１４９．糖：担体タンパク質比（ｗ／ｗ）が、０．４から１．７の間である、パラグラフ
１４８に記載の方法。
１５０．糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖である、パ
ラグラフ１２０から１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５１．莢膜多糖が、肺炎球菌（Ｐｎ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、
９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３
Ｆ、および３３Ｆ莢膜多糖からなる群から選択される、パラグラフ１５０に記載の方法。
１５２．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型３３Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方
法。
１５３．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型２２Ｆ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方
法。
１５４．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１０Ａ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方
法。
１５５．莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１１Ａ莢膜多糖である、パラグラフ１５０に記載の方
法。
１５６．糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する莢膜多糖である、
パラグラフ１２０から１４９のいずれか１つに記載の方法。
１５７．担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、パラグラフ１２０から１５６のいずれか
１つに記載の方法。
１５８．パラグラフ１２０から１５７のいずれか１つに記載の方法によって生成された糖
コンジュゲート。
１５９．パラグラフ１５８に記載の糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担
体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
１６０．アジュバントをさらに含む、パラグラフ１５９に記載の免疫原性組成物。
１６１．アルミニウムベースのアジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム
、および水酸化アルミニウムからなる群から選択される、パラグラフ１６０に記載の免疫
原性組成物。
１６２．パラグラフ１０７から１１７または１５９から１６１のいずれか１つに記載の免
疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において細菌感染症、疾患
、または状態を予防、処置、または改善する方法。
１６３．パラグラフ１０７から１１７または１５９から１６１のいずれか１つに記載の免
疫有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において防御免疫応答を誘
発する方法。
１６４．医薬品として使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の
糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれ
か１つに記載の免疫原性組成物。
１６５．ワクチンとして使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載
の糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいず
れか１つに記載の免疫原性組成物。
１６６．対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法
において使用するための、パラグラフ１から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲ
ート、またはパラグラフ１０７から１１７もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記
載の免疫原性組成物。
１６７．対象において細菌感染症を予防する方法において使用するための、パラグラフ１
から１０６のいずれか１つに記載の糖コンジュゲートまたはパラグラフ１０７から１１７
もしくは１５９から１６１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【０２６７】
上記の開示は概括的に本発明を説明している。次の具体的な実施例を参照することによ
って、より完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、単に説明の目的で記載さ
れており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０２６８】
（実施例１）
ｅＴＥＣ連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
糖の活性化および二塩酸シスタミンでのチオール化
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カール
フィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含
水率に達するように調整する。
【０２６９】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１０
０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル
当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣ
によって決定することができる。二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬ
の濃度で新たに調製する。活性化糖を、１モル当量の二塩酸シスタミンと反応させる。別
法では、活性化糖を１モル当量の塩酸システアミンと反応させる。チオール化反応を、２
３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、Ｃ
ＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
【０２７０】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定
し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
【０２７１】
活性化チオール化糖の還元および精製
チオール化糖反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク
酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈し、５μｍフィルターを通
して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積のＷＦＩに対して行う。１０
％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０による希釈の後に、残余分に、ト
リス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加す
る。この還元反応を、５±３℃で２０±２時間を進行させる。活性化チオール化糖の精製
を、好ましくは事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対
する限外濾過／透析濾過によって行う。別法では、チオール化糖を、標準的なサイズ排除
クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフィー方法によって精
製する。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出して、糖濃度およびチオール含
有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定する。
【０２７２】
活性化チオール化糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、活性化チオール化糖をまた、下記のとおり精製した。
【０２７３】
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
、５〜１０モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応
混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ
６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。４０倍
透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用し
て、チオール化糖の透析濾過を行った。活性化チオール化糖残余分のアリコートを取り出
して、糖濃度およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定した。
【０２７４】
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の適切な試薬などのブロモアセチル
化剤との反応によってブロモアセチル化する。
【０２７５】
活性化前に、担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を
先ず、８±３℃、約ｐＨ７に保持する。そのタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ-ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をストックのジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として、０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／
ｗ）の比で添加する。反応物を、５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。得られた
ブロモアセチル化（活性化）タンパク質を例えば、限外濾過／透析濾過によって、１０ｋ
Ｄａ  ＭＷＣＯ膜を使用し、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝液を使用して精製する
。精製の後に、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙタンパ
ク質アッセイによって推定する。
【０２７６】
活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィー（イオ
ンクロマトグラフィー）による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化ブロモアセ
チル化タンパク質上に結合されたブロミドを、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切
断し、存在し得るあらゆる遊離ブロミドと共に定量する。アルカリ性２−メルカプトエタ
ノール中で試料を加熱することによって、タンパク質上に残った共有結合で結合した臭素
はいずれも、イオンのブロミドへの変換によって放出される。
【０２７７】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／
ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７
．０を作製した。２０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡ
ＡＮＳを、１：０．３５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比で添加した。反応混合
物を、３℃〜１１℃の間で３０分〜１時間インキュベートし、次いで、限外濾過／透析濾
過によって、１０Ｋ  ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、
ｐＨ、７．０を使用して精製した。精製した活性化ＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイ
によってアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いで、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈
した。スクロースを、５％ｗｔ／ｖｏｌまで凍結保護物質として添加し、活性化タンパク
質を凍結し、コンジュゲーションのために必要になるまで、−２５℃で貯蔵した。
【０２７８】
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、非常に安定しており、利用可能な３
９個のリシンのうち、１５〜２５個のリシンの活性化が生じた。反応は、活性化タンパク
質の高い収率をもたらした。
【０２７９】
活性化チオール化糖とブロモアセチル化担体タンパク質とのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予備冷却する。続いて、ブ
ロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００ｒｐ
ｍの撹拌速度で混合する。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを
、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、５℃で
２０±２時間進行させる。
【０２８０】
残留反応性官能基のキャッピング
キャッピング試薬としての２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５℃で３時間
反応させることによって、担体タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基をクエンチす
る。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５℃で
２０時間キャッピングする。
【０２８１】
ｅＴＥＣ連結糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルタ
ーを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０
．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、糖コンジュゲート残余分を、０．
２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートをアッセイのために
取り出す。残りの糖コンジュゲートを５℃で貯蔵する。
【０２８２】
（実施例２）
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無
水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含
水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／
ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
【０２８３】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を
、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３
±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決
定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応
溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を
決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにする。反応を２３±２℃で１時間進行
させた。
【０２８４】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１モル当量の二塩酸シスタミン
を活性化多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオ
ール化糖溶液を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム
、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルタ
ーを通して濾過した。チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限
外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）を使用して実施した。
【０２８５】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残
余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を
添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化３３Ｆ多糖
の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、事前冷
却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化３３Ｆ
多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出し
た。
【０２８６】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、３３Ｆ活性化チオール化糖を、次のとおりに精製した。
【０２８７】
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
の溶液、５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物
を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０
を添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖
の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム
、ｐＨ４．３を使用し、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。チオー
ル化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のため
に取り出した。
【０２８８】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１において記載したとおり、ブロモアセチル化
によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３
Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予備冷
却した。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器
中で、１５０〜２００ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±
０．１であった。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を５
℃で２０±２時間進行させた。
【０２８９】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピ
ング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチ
ル−Ｌ−システインと５℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チ
オール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセト
アミド（ＩＡＡ）で５℃で２０時間キャッピングした。
【０２９０】
ｅＴＥＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。
３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施し
た。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。
次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、５℃で貯蔵した。
【０２９１】
結果
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのいくつかのバッチでの反応パラメーターお
よび特性決定データを表２において示す。二塩酸シスタミンでのＣＤＴ活性化−チオール
化は、糖収率６３〜９０％および遊離糖＜１％〜１３％を有する糖コンジュゲートを生成
した。
【０２９２】
【表２】
2019001790.tif 000016
【０２９３】
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのＯＰＡ力価
マウスにおけるＰｎ−３３Ｆ  ＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した。４週目およ
び７週目でのＯＰＡ力価（ＣＩ９５％を有するＧＭＴ）を表３において示すが、これは、
血清型３３Ｆ  Ｐｎ糖コンジュゲートが、マウス免疫原性モデルにおいて、ＯＰＡ力価を
誘発したことを実証している。
【０２９４】
【表３】
2019001790.tif 000017
【０２９５】
（実施例３）
Ｐｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ−２２Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−２２Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した２２Ｆ多糖を無
水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥２２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含
水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩをＰｎ−２
２Ｆ／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
【０２９６】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ−２２Ｆ多糖
を、様々な量のＣＤＴで活性化させ、続いて、１モル当量の二塩酸シスタミンでチオール
化した。ＣＤＴ活性化を、２３±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ
２２０／Ａ２０５）によって決定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．
０溶液を添加して、活性化反応溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行っ
て、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにする。
反応を２３±２℃で１時間進行させた。
【０２９７】
活性化Ｐｎ−２２Ｆ多糖のチオール化
二塩酸シスタミンを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、反応溶液に添加した。反応を、
２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオール化糖溶液を、事前冷却しておいた０．９
％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍
希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化Ｐｎ−２２
Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）を
使用して実施した。
【０２９８】
活性化チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残
余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５〜１０モル
当量を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化２２
Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、
事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化
２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取
り出した。
【０２９９】
Ｐｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのコンジュゲーション、キャッピング、および
精製
活性化チオール化Ｐｎ２２Ｆ多糖と活性化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション、キャ
ッピング、およびＰｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの精製を、実施例２に記載の
プロセスによって行った。
【０３００】
結果
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−２２Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およ
びプロセスデータを表４において示す。
【０３０１】
【表４】
2019001790.tif 000018
【０３０２】
（実施例４）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌莢膜多糖血
清型１０Ａ（Ｐｎ−１０Ａ）を含む糖コンジュゲートを、実施例２において記載したプロ
セスによって調製した。
【０３０３】
Ｐｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの特性決定
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およ
びプロセスデータを表５において示す。
【０３０４】
2019001790.tif 000019
【０３０５】
Ｐｎ−１０Ａ  ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１０Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰ
Ａ力価を、標準的な条件下で決定した。用量を関数としてのＯＰＡ力価を表６において示
す。ＯＰＡ力価は、非コンジュゲート血清型１０Ａ多糖に関して、このコンジュゲートで
有意に高かった。
【０３０６】
【表６】
2019001790.tif 000020
【０３０７】
（実施例５）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
Ｐｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの調製
ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌莢膜多糖血
清型１１Ａ（Ｐｎ−１１Ａ）を含む糖コンジュゲートを、実施例２において記載したプロ
セスによって調製した。
【０３０８】
Ｐｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートの特性決定
ＣＲＭ１９７との代表的なＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定および
プロセスデータを表７において示す。
【０３０９】
【表７】
2019001790.tif 000021
【０３１０】
Ｐｎ−１１Ａ  ＯＰＡ力価
マウスにおけるＣＲＭ１９７とのＰｎ−１１Ａ  ｅＴＥＣコンジュゲートに対するＯＰ
Ａ力価を、標準的な条件下で決定した。用量を関数としたＯＰＡ力価を表８に示す。
【０３１１】
【表８】
2019001790.tif 000022
【０３１２】
（実施例６）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性コンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性糖コンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートを、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために
成功裏に適用されている水性相での還元的アミノ化（ＲＡＣ／水性）を使用して調製した
（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。この手法は、２ステップを含
む。第１のステップは、ビシナルなジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖
の酸化である。第２のステップは、活性化多糖をＣＲＭ１９７のリシン（Ｌｙｓ）残基に
コンジュゲートすることである。
【０３１３】
簡単には、凍結多糖を解凍し、酸化を、リン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ６．０で、種
々の量の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加することによって実施した。活性化
多糖の濃縮および透析濾過を実施し、精製した活性化多糖を４℃で貯蔵した。活性化多糖
を、ＣＲＭ１９７タンパク質と配合した。多糖およびＣＲＭ１９７の十分な混合を行い、
その後、ボトルをドライアイス／エタノール浴中に入れ、続いて、多糖／ＣＲＭ１９７混
合物を凍結乾燥した。凍結乾燥した混合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で復元し
た。１．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、２３℃で２０時間、およ
びさらに３７℃で４４時間インキュベートすることによって、コンジュゲーション反応を
開始した。反応物を、１倍体積の０．９％生理食塩水で希釈し、２Ｍ当量のホウ水素化ナ
トリウムを使用して２３℃で３時間キャッピングした。反応混合物を１倍体積の０．９％
生理食塩水で希釈し、次いで、精製する前に、０．４５μｍフィルターを通して濾過した
。コンジュゲートの濃縮および透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＵＦ膜カセットを使用
して実施した。
【０３１４】
上記プロセスを使用し、種々のパラメーター（例えば、ｐＨ、反応の温度、および多糖
の濃度）を変えることによって、数種のコンジュゲートを得た。
【０３１５】
典型的な多糖収率は、２０００〜３５００ｋＤａの範囲のコンジュゲートＭＷで、これ
らのコンジュゲート約５０％および遊離糖１５％であった。
【０３１６】
しかしながら、天然の血清型３３Ｆ多糖は、５−ガラクトフラノシル残基のそのＣ２上
にＯ−アセチル基を有し、アセチル官能基の約８０％が、水性相での還元的アミノ化を使
用するコンジュゲーションプロセスの間に除去されることが見出された。５員環構造（５
−ガラクトフラノシド）上のＯ−アセチル基は移動して、水性相プロセスでの還元的アミ
ノ化化学作用の使用で容易に除去され得ることが観察された。
【０３１７】
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／水性糖コンジュゲート安定性の評価
上記プロセスによって調製された代表的なＲＡＣ／水性コンジュゲートのアリコートを
ポリプロピレン管に分配した。これらの管を、２５℃または３７℃のいずれかで貯蔵し、
安定性を最高３．５カ月モニターした。各安定性時点で、遊離糖％レベルを評価した。両
方の温度での安定性データを表９にまとめる。表９において示すとおり、遊離糖％レベル
は、２５℃および３７℃でかなり上昇した。貯蔵中の遊離糖％レベルの上昇は、コンジュ
ゲートにおける多糖分解の有望なインジケーターである。
【０３１８】
【表９】
2019001790.tif 000023
【０３１９】
血清型３３Ｆ多糖を、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって成功裏に活性化させ、続
いて、水性還元的アミノ化化学作用を利用してＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたが、
促進条件下での遊離糖％安定性結果は、コンジュゲーション中にアセチル官能基（免疫原
性のための重要な多糖エピトープ）を維持することができないことと合わせて、ＲＡＣ／
水性プロセスが、血清型３３Ｆコンジュゲーションのための最適なプロセスではないこと
を示唆した。
【０３２０】
（実施例７）
ＣＲＭ１９７とのＰｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの調製
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯ糖コンジュゲートの調製
ＲＡＣ／水性プロセスと比較して、ＤＭＳＯ（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ
化によって行われたコンジュゲーションは一般に、脱Ｏ−アセチル化の可能性がかなり低
い。実施例６において記載したＲＡＣ／水性プロセスを使用してのＯ−アセチル官能基の
維持に関連した問題を考慮して、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生成するために成功
裏に適用されているＲＡＣ／ＤＭＳＯ溶媒を使用する代替の手法（例えば、ＷＯ２００６
／１１０３８１を参照されたい）を評価した。
【０３２１】
活性化多糖１グラム当たりスクロース２５グラムの比を使用して、活性化多糖を、スク
ロース（ＷＦＩ中５０％ｗ／ｖ）と配合した。構成要素を十分に混合し、その後、ドライ
アイス／エタノール浴中でシェル凍結した。次いで、配合した混合物のシェル凍結ボトル
を、乾燥するまで凍結乾燥した。
【０３２２】
凍結乾燥した活性化多糖をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。復元のた
めに、ＤＭＳＯを、凍結乾燥したＣＲＭ１９７に添加した。復元された活性化多糖を、復
元されたＣＲＭ１９７と反応容器中で合わせた。ＮａＣＮＢＨ３を反応混合物に加えるこ
とによって、コンジュゲーションを開始した。反応物を２３℃で２０時間インキュベート
した。コンジュゲーション（キャッピング）反応の終了を、ＮａＢＨ４の添加によって達
成し、反応をさらに３時間継続した。反応混合物を４倍体積の５ｍＭコハク酸塩−０．９
％生理食塩水、ｐＨ６．０緩衝液で希釈し、次いで、精製の前に、５μｍフィルターを通
して濾過した。コンジュゲートの濃縮および透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用し
て実施した。透析濾過を、４０倍透析体積の５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐ
Ｈ６．０緩衝液に対して行った。残余分を、０．４５および０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、分析した。
【０３２３】
上記プロセスを使用し、種々のパラメーター（例えば、糖−タンパク質投入比、反応濃
度、シアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭ当量、および含水率）を変えることによって、数
種のコンジュゲートを得た。ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって調製されたコンジュゲー
トから生じた全データは、ＲＡＣ／水性プロセスと比較して優れていることを実証するも
のであり、良好なコンジュゲーション収率、低い遊離糖％（＜５％）、およびより高いコ
ンジュゲーション度（コンジュゲートされたリシン）でのコンジュゲートの調製を可能に
した。加えて、ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲーションプロセスを通じて、アセチル官能基
の８０％超を維持することが可能であった。
【０３２４】
Ｐｎ−３３Ｆ  ＲＡＣ／ＤＭＳＯ糖コンジュゲート安定性の評価
上記プロセスによって調製された代表的なＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートのアリコー
トをポリプロピレン管に分配し、これらの管を、４℃または２５℃のいずれかで貯蔵し、
安定性を遊離糖について３カ月間モニターした。表１０に示すとおり、４℃で貯蔵された
試料は、３カ月で４．８％の遊離糖の上昇を示した。しかしながら、２５℃で貯蔵された
試料は、３カ月で１５．４％の遊離糖％の上昇を示した。ＲＡＣコンジュゲート中の遊離
糖％の上昇は、特に２５℃では、コンジュゲートの分解による。
【０３２５】
【表１０】
2019001790.tif 000024
【０３２６】
ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの別のロットの安定性を、４℃、２５℃、および３７
℃でも研究した。アリコートをポリプロピレン管に分配し、遊離糖％の潜在的な傾向につ
いてモニターした。表１１において示すとおり、４℃で貯蔵した試料は、２カ月で遊離糖
％の４．７％の上昇を示した。遊離糖の上昇は、２５℃および３７℃でかなり高く、コン
ジュゲートの潜在的な分解を示した。
【０３２７】
【表１１】
2019001790.tif 000025
【０３２８】
ＲＡＣ／ＤＭＳＯプロセスによって生成されたコンジュゲートはＯ−アセチル基を維持
していたが、特に２５℃超で観察された遊離糖％の上昇は、この経路を使用する潜在的な
不安定性を示した。ＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートの潜在的な不安定性のこの観察を考
慮して、ＲＡＣ／ＤＭＳＯは、血清型３３Ｆコンジュゲーションのために最適とは考えら
れず、代替の化学作用経路を、より安定なコンジュゲート（ｅＴＥＣコンジュゲート）を
生成するために開発した。
【０３２９】
（実施例８）
追加のＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
追加のＰｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣコンジュゲートを、実施例２に記載のプロセスを使用し
て生成した。Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲートのこれらの追加のバッチのための
反応パラメーターおよび特性決定データを表１２において示す。
【０３３０】
【表１２】
2019001790.tif 000026
【０３３１】
表１２において示したとおり、数種のＰｎ３３Ｆコンジュゲートを、上記のｅＴＥＣコ
ンジュゲーションを使用して得た。ｅＴＥＣ化学作用は、高い収率、低い遊離糖％、およ
び高いコンジュゲーション度（コンジュゲートされたリシン）でのコンジュゲートの調製
を可能にした。加えて、ｅＴＥＣコンジュゲーションプロセスを使用すると、アセチル官
能基８０％超を維持することが可能であった。
【０３３２】
（実施例９）
Ｐｎ−３３Ｆ  ｅＴＥＣ糖コンジュゲート安定性：遊離糖％の傾向の評価
コンジュゲートバッチ３３Ｆ−２Ｂ（表２を参照されたい）のアリコートをポリプロピ
レン管に分配し、それぞれ４℃、２５℃、および３７℃で貯蔵し、％遊離糖％の傾向につ
いてモニターした。データ（遊離糖％）を表１３において示す。この表において示すとお
り、遊離糖％の有意な変化はなかった。
【０３３３】
【表１３】
2019001790.tif 000027
【０３３４】
別のコンジュゲートロット（バッチ３３Ｆ−３Ｃ）の促進安定性も、３７℃で最高１カ
月行った。表１４において示すとおり、３７℃で最高１カ月は、遊離糖％に有意な変化は
なかった。
【０３３５】
【表１４】
2019001790.tif 000028
【０３３６】
ｅＴＥＣコンジュゲートの安定性をさらに確認するために、４℃で貯蔵された追加のコ
ンジュゲートバッチ（３３Ｆ−３Ｃおよび３３Ｆ−５Ｅ（表２および表１２を参照された
い））を最高約１年、遊離糖％の潜在的な傾向についてモニターした。表１５において示
すとおり、４℃で最高約１年の長期間貯蔵されたコンジュゲートについて、遊離糖％レベ
ルの有意な変化はなかった。
【０３３７】
【表１５】
2019001790.tif 000029
【０３３８】
ＲＡＣ／水性およびＲＡＣ／ＤＭＳＯコンジュゲートと対照的に、３３Ｆ  ｅＴＥＣ化
学作用によって生成された血清型３３Ｆコンジュゲートは、様々な温度での遊離糖傾向（
実時間および加速）によってモニターされたとおり、顕著な分解を伴うことなく、有意に
より安定であることが実証された。
【０３３９】
（実施例１０）
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）連結糖コ
ンジュゲートを調製するための一般プロセス
糖の活性化およびメルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）スペーサーでのチオール
化
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カール
フィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含
水率に達するように調整する。
【０３４０】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１０
０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル
当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣ
によって決定することができる。ＭＰＨを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新
たに調製する。活性化糖を、１〜３モル当量のＭＰＨと反応させる。チオール化反応を、
２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、
ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
【０３４１】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定
し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
【０３４２】
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
、１〜５モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混
合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６
．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール
化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度お
よびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
【０３４３】
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の適切な試薬などのブロモアセチル
化剤との反応によってブロモアセチル化する。
【０３４４】
活性化前に、担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム中、ｐＨ８．０±０．２）を
先ず、８±３℃、約ｐＨ７に保持する。そのタンパク質溶液に、ブロモ酢酸のＮ-ヒドロ
キシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）をストックのジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）として、０．２５〜０．５のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／
ｗ）の比で添加する。反応物を、５±３℃で３０〜６０分間穏やかに混合する。得られた
ブロモアセチル化（活性化）タンパク質を例えば、限外濾過／透析濾過によって、１０ｋ
Ｄａ  ＭＷＣＯ膜を使用し、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）緩衝液を使用して精製する
。精製の後に、ブロモアセチル化担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙタンパ
ク質アッセイによって推定する。
【０３４５】
活性化の程度を、抑制伝導率検出と連動したイオン交換液体クロマトグラフィー（イオ
ンクロマトグラフィー）による全ブロミドアッセイによって決定する。活性化ブロモアセ
チル化タンパク質上に結合されたブロミドを、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切
断し、存在し得るあらゆる遊離ブロミドと共に定量する。アルカリ性２−メルカプトエタ
ノール中で試料を加熱することによって、タンパク質上に残った共有結合で結合した臭素
はいずれも、イオンのブロミドへの変換によって放出される。
【０３４６】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７（ＰＢＳ）で５ｍｇ／
ｍＬに希釈し、次いで、１Ｍストック溶液を使用して、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７
．０を作製した。２０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を使用して、ＢＡ
ＡＮＳを、１：０．３５（ｗ：ｗ）のＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比で添加した。反応混合
物を、３℃〜１１℃の間で３０分〜１時間インキュベートし、次いで、限外濾過／透析濾
過によって、１０Ｋ  ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、
ｐＨ、７．０を使用して精製した。精製した活性化ＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイ
によってアッセイして、タンパク質濃度を決定し、次いで、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈
した。スクロースを、５％ｗｔ／ｖｏｌまで凍結保護物質として添加し、活性化タンパク
質を凍結し、コンジュゲーションのために必要になるまで、−２５℃で貯蔵した。
【０３４７】
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は、非常に安定しており、利用可能な３
９個のリシンのうち、１５〜２５個のリシンの活性化が生じた。反応は、活性化タンパク
質の高い収率をもたらした。
【０３４８】
活性化チオール化糖とブロモアセチル化担体タンパク質とのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃±３℃に予備冷却する。続い
て、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２０
０ｒｐｍの撹拌速度で混合する。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応
ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を、
５±３℃℃で２０±２時間、進行させる。
【０３４９】
残留反応性官能基のキャッピング
キャッピング試薬としての２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインヒドロクロリド
と５℃で３時間反応させることによって、担体タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残
基をクエンチする。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードアセトアミド（Ｉ
ＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングする。
【０３５０】
オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、０．４５μｍフィルタ
ーを通して濾過する。糖コンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０
．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次いで、糖コンジュゲート残余分を、０．
２μｍフィルターを通して濾過する。糖コンジュゲートのアリコートをアッセイのために
取り出す。残りの糖コンジュゲートを５±３℃で貯蔵する。
【０３５１】
（実施例１１）
糖の活性化およびＬ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーでのチオー
ル化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ
）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カール
フィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含
水率に達するように調整する。
【０３５２】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１０
０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル
当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣ
によって決定することができる。Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを、無
水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量の
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドと反応させる。チオール化反応を、２３
±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤ
Ｔ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
【０３５３】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定
し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
【０３５４】
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
、５〜１０モル当量の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応
混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ
６．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオー
ル化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナト
リウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度
およびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
【０３５５】
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャ
ッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一
般手順に従う。
【０３５６】
（実施例１２）
糖の活性化および２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペー
サーでのチオール化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オ
キソ−ｅＴＡＣ）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カール
フィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含
水率に達するように調整する。
【０３５７】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１０
０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル
当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣ
によって決定することができる。ＡＥＥＴを、無水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で
新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量のＡＥＥＴと反応させる。チオール化反応
を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベル
を、ＣＤＴ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
【０３５８】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定
し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
【０３５９】
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混
合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６
．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール
化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度お
よびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
【０３６０】
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャ
ッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一
般手順に従う。
【０３６１】
（実施例１３）
糖の活性化および４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドスペーサーでのチオー
ル化による（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ
）連結糖コンジュゲートの調製
糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。溶液の含水率を、カール
フィッシャー（ＫＦ）分析によって決定し、０．１〜０．４％、典型的には０．２％の含
水率に達するように調整する。
【０３６２】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液をＤＭＳＯ中で１０
０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。糖を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１〜１０モル
当量）で活性化させ、反応を２３±２℃で１時間進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣ
によって決定することができる。４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを、無
水ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍＬの濃度で新たに調製する。活性化糖を、１〜２モル当量の
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドと反応させる。チオール化反応を、２３
±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化糖を生成する。チオール化レベルを、ＣＤ
Ｔ／ＣＤＩの添加量によって決定する。
【０３６３】
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭテトラホウ酸ナトリウム、ｐＨ
９．０溶液の添加によってクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定
し、合計水分最高１〜２％であるように最終含水率を調整する。
【０３６４】
活性化チオール化糖の精製
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混
合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６
．０に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール
化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリ
ウム、ｐＨ４．３を使用して行う。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度お
よびチオール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出す。
【０３６５】
ブロモアセチル化担体タンパク質との活性化チオール化糖のコンジュゲーション、キャ
ッピング、およびｅＴＡＣコンジュゲートの精製は、上記実施例１０において記載した一
般手順に従う
【０３６６】
（実施例１４）
メルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）を使用するＰｎ−３３Ｆオキソ−ｅＴＡＣ
コンジュゲートの調製
活性化プロセス
メルカプトプロピオニルヒドラジド（ＭＰＨ）スペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無
水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含
水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定する。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／
ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成する。
【０３６７】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）をＤＭＳＯ中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製する。Ｐｎ３３Ｆ多糖を、チオ
ール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させる。ＣＤＴ活性化を２３±２℃で
１時間実施する。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決定する。
テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中の
残留ＣＤＴをいずれもクエンチする。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を決定し、
最終含水率が、合計水分１．２％であるようにする。反応を、２３±２℃で１時間進行さ
せる。
【０３６８】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
ＭＰＨを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１〜２モル当量のＭＰＨを活性化多糖反応
溶液に添加する。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させる。反応混合物に、トリス
（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２
３±２℃で３±１時間進行させる。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％
生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈
し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化糖の透析濾過を、４０倍透析体積の
事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、１００
Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行う。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度および
チオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出す。
【０３６９】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで
、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させる。コンジュゲー
ション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却する。ブロモアセチル化ＣＲ
Ｍ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの
撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、８
．０〜９．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させ
る。
【０３７０】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピ
ング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセ
チル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッ
ピングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モ
ル当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
【０３７１】
オキソ−ｅＴＡＣ−連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過する。
３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施す
る。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行う。次
いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通し
て濾過し、５±３℃で貯蔵する。
【０３７２】
（実施例１５）
Ｌ−シスチンジメチルエステルを使用するＰｎ−３３Ｆ  オキソ−ｅＴＡＣコンジュゲー
トの調製
活性化プロセス
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭ１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を無
水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の含
水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ／
ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
【０３７３】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を
、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３
±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決
定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応
溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を
決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行
させた。
【０３７４】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、
１モル当量のＬ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドを活性化多糖反応溶液に添
加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。チオール化糖溶液を、事前冷却
しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加するこ
とによって１０倍希釈した。希釈反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオ
ール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで、注射
用水（ＷＦＩ）を使用して実施した。
【０３７５】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残
余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５モル当量を
添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化３３Ｆ多糖
の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施した。透析濾過を、事前冷
却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。チオール化３３Ｆ
多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出し
た。
【０３７６】
活性化チオール化Ｐｎ−３３Ｆ多糖の代替の還元および精製
上記の精製手順の代替として、３３Ｆ活性化チオール化糖をまた、次のとおりに精製し
た。
【０３７７】
チオール化糖反応混合物に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）
の溶液、５モル当量を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物
を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０
に添加することによって５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖
の透析濾過を、４０倍透析体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム
、ｐＨ４．３を使用し、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて行った。チオー
ル化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のため
に取り出した。
【０３７８】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで
、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲー
ション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲ
Ｍ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの
撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、
８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行さ
せた。
【０３７９】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピ
ング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量の塩酸システ
アミンと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて、チオール化
３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードアセトアミド（
ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
【０３８０】
オキソ−ｅＴＥＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。
３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施し
た。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。
次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
【０３８１】
結果
Ｌ−シスチンジメチルエステルジヒドロクロリドスペーサーを使用する代表的なＰｎ−
３３Ｆ  オキソ−ｅＴＥＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１６
において示す。
【０３８２】
（実施例１６）
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）を使用するＰｎ−３３Ｆ
オキソ−ｅＴＡＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーでのＰｎ３３
Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して
、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノー
ル浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を
無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の
含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ
／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
【０３８３】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を
、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３
±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決
定する。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応
溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を
決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行
させた。
【０３８４】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
ＡＥＥＴを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、１〜２モル当量のＡＥＥＴを活性化多糖
反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。反応混合物に、ト
リス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し
、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．
９％生理食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍
希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析
体積の事前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、
１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃
度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
【０３８５】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで
、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲー
ション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲ
Ｍ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの
撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応ｐＨを、
８．０〜９．０に調整する。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行さ
せた。
【０３８６】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピ
ング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチ
ル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピ
ングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル
当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
【０３８７】
オキソ−ｅＴＡＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。
３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施し
た。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。
次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
【０３８８】
結果
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーを使用する
代表的なＰｎ−３３Ｆ  オキソ−ｅＴＡＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセス
データを表１６において示す。
【０３８９】
（実施例１７）
４−アミノ−１−ブタンチオール（ＡＢＴ）を使用するＰｎ−３３Ｆ  オキソ−ｅＴＡＣ
コンジュゲートの調製
活性化プロセス
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドスペーサーでのＰｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ−３３Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して
、多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得た。混合物をドライアイス−エタノー
ル浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥した。凍結乾燥した３３Ｆ多糖を
無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元した。凍結乾燥３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の
含水率をカールフィッシャー（ＫＦ）分析によって決定した。含水率を、ＷＦＩを３３Ｆ
／ＤＭＳＯ溶液に添加することによって調整して、０．２％の含水率を達成した。
【０３９０】
活性化を開始するために、１，１’−カルボニル−ジ−１，２，４−トリアゾール（Ｃ
ＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中で１００ｍｇ／ｍＬとして新たに調製した。Ｐｎ３３Ｆ多糖を
、チオール化ステップの前に、様々な量のＣＤＴで活性化させた。ＣＤＴ活性化を、２３
±２℃で１時間実施した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）によって決
定した。テトラホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応
溶液中の残留ＣＤＴのいずれもクエンチした。計算を行って、テトラホウ酸塩の添加量を
決定し、最終含水率が全水分１．２％であるようにした。反応を２３±２℃で１時間進行
させた。
【０３９１】
活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖のチオール化
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で新たに調製し、
１〜２モル当量の４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリドを活性化多糖反応溶液
に添加した。反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させた。反応混合物に、トリス（２
−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５モル当量を添加し、２３±
２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理
食塩水中の５ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって５倍希釈し、
５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析体積の事
前冷却しておいた１０ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３を使用して、１００Ｋ
ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで行った。チオール化３３Ｆ多糖残余分を、糖濃度および
チオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り出した。
【０３９２】
コンジュゲーションプロセス
チオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ブロモアセチル化によって別個に活性化させ、次いで
、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲー
ション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。ブロモアセチル化ＣＲ
Ｍ１９７およびチオール化３３Ｆ多糖を一緒に、反応容器中で、１５０〜２００ｒｐｍの
撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１である。反応ｐＨを、８
．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５±３℃で２０±２時間進行させ
た。
【０３９３】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピ
ング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチ
ル−Ｌ−システインヒドロクロリドと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピ
ングし、続いて、チオール化３３Ｆ−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル
当量のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
【０３９４】
オキソ−ｅＴＡＣ連結Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。
３３Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施し
た。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。
次いで、Ｐｎ−３３Ｆ糖コンジュゲート３００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルターを通
して濾過し、５±３℃で貯蔵した。
【０３９５】
結果
４−アミノ−１−ブタンチオールヒドロクロリド（ＡＢＴ）スペーサーを使用する代表
的なＰｎ−３３Ｆ  オキソ−ｅＴＡＣ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデー
タを表１６において示す。
【０３９６】
【表１６】
2019001790.tif 000030
【０３９７】
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベル、および
低い遊離タンパク質レベルを含む良好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲ
ートが生成された。
【０３９８】
（実施例１８）
第一級ヒドロキシル酸化を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オ
キソ−ｅＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
多糖の第一級ヒドロキシル基の酸化
多糖中の第一級アルコールの酸化を、水性または有機溶媒中でＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ系を
使用して達成した。ＮＣＳ共酸化剤の量を調整することによって、様々な酸化度（ＤＯ）
まで、多糖を酸化させた。一般に、０．５〜２．５モル当量のＮＣＳを、ターゲットの酸
化度を達成するために使用した。酸化反応を典型的には、炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（０
．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．６）、またはｐＨ６
．５、７．０、７．５、および８．０のリン酸ナトリウム緩衝液中で行い、２時間で完了
する。一部の活性化実験では、糖の過剰酸化を回避するために、ｎ−プロパノールなどの
第一級アルコールを使用して、試薬をクエンチした。
【０３９９】
具体的な例では、血清型３３Ｆ多糖を反応容器に、４．０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、
炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液
、ｐＨ８．６）と１：１ｖ／ｖの比で混合した。撹拌混合物に、≦０．１モル当量のＴＥ
ＭＰＯを添加した。０．６〜１．０モル当量のＮ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を添
加することによって、反応を開始した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、活性
化多糖を、透析濾過によってＷＦＩで、３０Ｋ限外濾過膜を使用して精製した。精製した
多糖を収集し、アルデヒド（３−メチル−２−ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）
アッセイを使用）および多糖（アントロンアッセイを使用）の定量的測定によって、酸化
度（ＤＯ）を決定した。
【０４００】
還元的アミノ化化学作用を使用する酸化多糖のチオール化
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）スペーサーを使用する活
性化（表１７の第３欄）
酸化および精製された血清型３３Ｆ多糖を反応容器に添加し、続いて、０．５Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を０．１Ｍの最終緩衝液濃度まで添加した。この溶液に
、１Ｍ当量の２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ
２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ）（ＡＥＥＴ）を添加し、均一な溶液を得るために十分に
混合した。希ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。こ
れに、１．５モル当量のＮａＣＮＢＨ３の添加を続けた。反応混合物を、室温で（２３℃
）４８時間撹拌した。次いで、反応混合物を１倍０．９％生理食塩水で希釈し、未反応の
アルデヒド基を、２モル当量のホウ水素化ナトリウムで「キャッピング」した。ホウ水素
化ナトリウムも、反応中に形成したジスルフィドのいずれも還元するための還元剤として
機能する。キャッピング反応時間は典型的には、３時間であった。
【０４０１】
シスタミンスペーサー（表１７の第２欄）を使用しての活性化
酸化および精製血清型３３Ｆ多糖を反応容器に添加し、続いて、０．５Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．５）を０．１Ｍの最終緩衝液濃度まで添加した。この溶液に、１Ｍ
当量の二塩酸シスタミン溶液を添加し、均一な溶液を得るために十分に混合した。希ＨＣ
ｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを６．８に調整した。これに、１．５モル
当量のＮａＣＮＢＨ３の添加を続けた。反応混合物を、室温で（２３℃）４８時間撹拌し
た。別法では、活性化糖を１Ｍ当量の塩酸システアミンと反応させた。次いで、反応混合
物を１倍０．９％生理食塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を、２モル当量のホウ水素
化ナトリウムで「キャッピング」した。ホウ水素化ナトリウムも、反応中に形成したジス
ルフィドのいずれも還元するための還元剤として機能する。キャッピング反応時間は典型
的には、３時間であった。
【０４０２】
活性化チオール化糖の精製
糖中に存在する残りのジスルフィド結合をいずれも、（２−カルボキシエチル）ホスフ
ィン（ＴＣＥＰ）またはジチオエリトリトール（ＤＴＴ）などの適切な還元剤を使用して
還元した。チオール化糖反応混合物を、事前冷却しておいた０．９％生理食塩水中の５ｍ
Ｍコハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０に添加することによって１０倍希釈し、５μｍフィル
ターを通して濾過した。チオール化糖の透析濾過を、４０倍の透析体積のＷＦＩに対して
行った。１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後
に、残余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、１〜５
モル当量を添加した。この還元反応を、５±３℃で２０±２時間進行させた。活性化チオ
ール化糖の精製を、好ましくは限外濾過／透析濾過によって、事前冷却しておいた１０ｍ
Ｍ一塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行った。別法では、チオール化糖を、
標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフ
ィー法によって精製した。活性化チオール化糖残余分のアリコートを、糖濃度およびチオ
ール含有率（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを決定するために取り出した。
【０４０３】
別の例では、糖鎖の末端の還元を利用してアミノチオール試薬と反応させるために、低
分子量糖を使用する。低分子量糖は、高分子量多糖の化学的加水分解または機械的均質化
によって調製する。
【０４０４】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのチオール化３３Ｆのコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予備冷却した。続いて
、ブロモアセチル化担体タンパク質および活性化チオール化糖を添加し、１５０〜２００
ｒｐｍの撹拌速度で混合した。糖／タンパク質投入比は、０．９±０．１であった。反応
ｐＨを、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で８．０〜９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、
５℃で２０±２時間進行させた。タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、キャッ
ピング試薬として、２モル当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインと５±３℃で３時間反応
させることによってクエンチした。残留遊離スルフヒドリル基を、４モル当量のヨードア
セトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングした。
【０４０５】
コンジュゲーション反応（ＩＡＡ−キャッピング後）混合物を、５μｍフィルターを通
して濾過し、次いで、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜を使用して、５ｍＭコハク酸塩−０
．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して精製した。次いで、精製コンジュゲートを、０．
４５／０．２２μｍフィルターを通して濾過して、原末コンジュゲートを得た。
【０４０６】
結果
２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）またはシスタミンのい
ずれかをスペーサーとして使用し、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせた代表的なＰｎ−
３３Ｆ  ｅＴＡＡＮでの特性決定およびプロセスデータを表１７に示す。
【０４０７】
【表１７】
2019001790.tif 000031
【０４０８】
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベルを含む良
好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲートが生成された。
【０４０９】
（実施例１９）
多糖のビシナルなジオールの酸化を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）ア
ミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）連結糖コンジュゲートを調製するための一般プロセス
別法では、糖を、過ヨウ素酸塩を使用してビシナルなシスジオールを酸化させることに
よって活性化させることができる。具体的な例では、血清型３３Ｆ多糖を１００ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に、２５ｍＭ緩衝液中で２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで
溶かした。０．２Ｍ当量の過ヨウ素酸ナトリウム（水中の５０ｍｇ／ｍＬ溶液）を添加す
ることによって、反応を開始した。１８時間後に、活性化多糖をＷＦＩで、３０Ｋ限外濾
過膜を使用して、透析濾過によって精製した。精製した多糖を収集し、アルデヒド（３−
メチル−２−ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）アッセイを使用）および多糖（ア
ントロンアッセイを使用）の定量的測定によって、酸化度（ＤＯ）を決定した。
【０４１０】
酸化多糖のチオール化およびコンジュゲーションを、上記のとおり実施例１８において
記載した手順によって実施した。
【０４１１】
結果
スペーサーとして２−（２−アミノエトキシ）エタン−１−チオール（ＡＥＥＴ）また
はシスタミンのいずれかを使用して、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた代表的なＰｎ
−３３Ｆ  ｅＴＡＡＮ糖コンジュゲートでの特性決定およびプロセスデータを表１８に示
す。
【０４１２】
【表１８】
2019001790.tif 000032
【０４１３】
これらのリンカーのそれぞれを用いて、分子量、高い収率、低い遊離糖レベル、および
低い遊離タンパク質レベルを含む良好な品質系数値を有する多糖−タンパク質コンジュゲ
ートが生成された。
【０４１４】
（実施例２０）
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド（オキソ−ｅＴＡＡＤ）連結糖コンジ
ュゲートを調製するためのプロセス
Ｐｎ−２Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥したＰｎ−２２Ｆ多
糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。この溶液に、塩酸シスタミン
（１．０ｍ当量）を、続いて、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ
ジイミドヒドロクロリド（１．１ｍ当量）およびＨＯＢｔ（１．１ｍ当量）を添加する。
次いで、混合物を２３±２℃で１８±２時間撹拌し、その後、事前冷却しておいたリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０に注ぐことによって１０倍希釈する。希釈溶液を５μｍフ
ィルターを通して濾過する。誘導体化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣ
Ｏ限外濾過膜カセットで、注射用水（ＷＦＩ）に対して実施する。残余分を収集する。
【０４１５】
活性化チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖の還元および精製
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残
余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの溶液（ＴＣＥＰ、５モル当量）を
添加する。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させる。チオール化Ｐｎ−２２
Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、
事前冷却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行う。チオール化Ｐ
ｎ−２２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のため
に取り出す。
【０４１６】
チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１において記載したとおり、ブロモアセチル化
によって別個に活性化させ、次いで、コンジュゲーション反応のための活性化Ｐｎ−２２
Ｆ多糖と反応させる。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５±３℃に予
備冷却する。ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖を一緒に
、反応容器中で、０．９±０．１の糖／タンパク質投入比を使用して、１５０〜２００ｒ
ｐｍの撹拌速度で混合する。反応ｐＨを、８．０〜９．０に調整する。コンジュゲーショ
ン反応を、５±３℃で２０±２時間進行させる。
【０４１７】
ブロモアセチル化ＣＲＭ１９７およびチオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖上の反応性基のキャッ
ピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応ブロモアセチル化残基を、２モル当量のＮ−アセチ
ル−Ｌ−システインと５±３℃で３時間反応させることによってキャッピングし、続いて
、チオール化Ｐｎ８−多糖の残留遊離スルフヒドリル基を完全に、４モル当量のヨードア
セトアミド（ＩＡＡ）で５±３℃で２０時間キャッピングする。
【０４１８】
ｅＴＡＡＤ連結Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過する。
Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで
実施する。透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩−０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行
う。次いで、Ｐｎ−２２Ｆ糖コンジュゲート１００Ｋ残余分を、０．２２μｍフィルター
を通して濾過し、５±３℃で貯蔵する。
【０４１９】
（実施例２１）
チアゾリジノン活性化経路を介して（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミド
（オキソ−ｅＴＡＡＤ）連結糖コンジュゲートを調製するプロセス
Ｐｎ−２２Ｆ多糖の誘導体化
Ｐｎ−２Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４−トリアゾール（ＷＦＩ中）と配合して、
多糖１グラム当たりトリアゾール１０グラムを得る。混合物をドライアイス−エタノール
浴中でシェル凍結し、次いで、乾燥するまで凍結乾燥する。凍結乾燥したＰｎ−２２Ｆ多
糖を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元する。この溶液に、ＤＭＳＯ中のチ
アゾリジン−２−チオン（ＴＴ）（０．３Ｍ当量）および１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（０．３ｍ当量）溶液を添加する。次
いで、混合物を２３±２℃で１８±２時間撹拌する。この溶液に、０．２Ｍ当量のシスタ
ミンヒドロクロリドを添加し、反応をさらに１８時間継続する。チオール化多糖を水で緩
衝液交換する。
【０４２０】
１０％体積の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によって希釈した後に、残
余分に、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンの溶液（ＴＣＥＰ、５モル当量）を
添加する。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させる。チオール化Ｐｎ８多糖
の透析濾過を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットで実施する。透析濾過を、事前冷
却しておいた１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して行う。チオール化Ｐｎ−２
２Ｆ多糖残余分を、糖濃度およびチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取り
出す。
【０４２１】
チオール化Ｐｎ−２２Ｆ多糖とブロモアセチル化ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
Ｐｎ−２２Ｆチオール化多糖のコンジュゲーションを、上記の実施例２０において概説
したとおりに実施する。
【０４２２】
明細書において上述した刊行物および特許出願はすべて、本発明が関する分野の当業者
のレベルを示すものである。刊行物および特許出願はすべて、それぞれ個々の刊行物およ
び特許出願が具体的に、かつ個別に、参照によって組み込まれると示されている場合と同
程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４２３】
上述の発明を、理解を明確にする目的で、多少詳細に説明および例示によって記載して
きたが、添付の特許請求の範囲内で、ある種の変化および変更を実施することもできる。
【図１】
2019001790.tif 000038
【図２】
2019001790.tif 000039
【図３】
2019001790.tif 000040
【図４】
2019001790.tif 000041
【図５】
2019001790.tif 000042
【図６】
2019001790.tif 000043
【図７】
2019001790.tif 000044
【図８】
2019001790.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、
一般式（Ｉ）
【化１】
2019001790.tif 000046
［式中、
Ａは、基（Ｃ＝Ｘ）ｍであり、Ｘは、ＳまたはＯであり、ｍは、０または１であり、
Ｂは、結合、Ｏ、またはＣＨ２であり、ｍが０である場合、Ｂは、（Ｃ＝Ｏ）でもあり得、
Ｒは、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、もしくは（ＣＨ２）１０からなる群から選択されるか、または
Ｒが、Ｏ−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｎ−ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２、およびＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２からなる群から選択される］を有する、
但し、前記スペーサーが（２−（（２−オキソエチル）チオ）エチル）カルバマート（ｅＴＥＣ）スペーサーではない、
糖コンジュゲート。
【請求項２】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＩ）
【化２】
2019001790.tif 000047
［式中、Ｒは、（ＣＨ２）ｎであり、ｎは、３〜１０である］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項３】
ｎが、３、４、５、または６である、請求項２に記載の糖コンジュゲート。
【請求項４】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2019001790.tif 000048
［式中、Ｒは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎは、１〜１０から選択され、ｍは、１〜４から選択される］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項５】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、一般式（ＩＶ）
【化４】
2019001790.tif 000049
［式中、Ｒは、ＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎ、ＮＨＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２（ＣＨ２）ｎ、またはＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２から選択され、
ｎが、１〜１０から選択され、ｍが、１〜４から選択される］を有する、
糖コンジュゲート。
【請求項６】
（（２−オキソエチル）チオ）を含有するスペーサーを介して担体タンパク質に共有結合でコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートであって、
オキソ−ｅＴＡＣスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、カルバマート連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＣスペーサーに共有結合で連結された糖、または
オキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖であって、糖が、アミン連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結され、担体タンパク質が、チオエーテルおよびアミド連結を介してオキソ−ｅＴＡＡＮスペーサーに共有結合で連結された糖、を含む、糖コンジュゲート。
【請求項７】
糖が、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）に由来する莢膜多糖である、請求項１から６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項８】
前記莢膜多糖が、Ｐｎ−血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、３３Ｆ、および３５Ｂ莢膜多糖からなる群から選択される、請求項７に記載の糖コンジュゲート。
【請求項９】
糖が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ
Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃｉｕｍ）に由来する莢膜糖である、請求項１から６のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１０】
担体タンパク質が、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合体、無毒化ニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ、およびＰｓａＡからなる群において選択されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１１】
担体タンパク質が、ＣＲＭ１９７である、請求項１から９のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の少なくとも１種の糖コンジュゲートと、薬学的に許容できる添加剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）カルバマート（オキソ−ｅＴＡＣ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、炭酸誘導体またはシアノゲン誘導体と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、アミンおよびチオール官能基を含有する二官能性リンカーまたはその塩と反応させて、チオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＣ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
【請求項１４】
（（（２−オキソエチル）チオ）アルキル）アミン（オキソ−ｅＴＡＡＮ）スペーサーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされた糖を含む糖コンジュゲートを作製する方法であって、
ａ）糖を、アルデヒド基を生成するための酸化試薬と反応させて、活性化糖を生成するステップと、
ｂ）活性化糖を、リンカーのアミノ末端においてアミンおよびチオール官能基（保護されたまたは遊離の形態で）を含有する二官能性リンカーと反応させて、還元的アミノ化によってチオール化糖を生成するステップと、
ｃ）チオール化糖を、脱保護剤または還元剤（チオールが保護されている場合）と反応させて、１個または複数の遊離スルフヒドリル残基を含む活性化チオール化糖を生成するステップと、
ｄ）活性化チオール化糖を、１個または複数のα−ハロアセトアミド基を含む活性化担体タンパク質と反応させて、チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを生成するステップと、
ｅ）チオール化糖−担体タンパク質コンジュゲートを、（ｉ）活性化担体タンパク質の非コンジュゲート化α−ハロアセトアミド基をキャッピングすることができる第１のキャッピング試薬；および／または（ｉｉ）活性化チオール化糖の非コンジュゲート化遊離スルフヒドリル残基をキャッピングすることができる第２のキャッピング試薬と反応させるステップと
を含み、それによって、オキソ−ｅＴＡＡＮ連結糖コンジュゲートを生成する方法。
【請求項１５】
医薬品として使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ワクチンとして使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲート、または請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
対象において細菌感染症、疾患、または状態を予防、処置、または改善する方法において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の糖コンジュゲートまたは請求項１２に記載の免疫原性組成物。