(57)【要約】【課題】  ワクチン効果を高めることができる新規なアジュバントを提供すること。【解決手段】  ネオスポラ原虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）由来の蛋白であって、高密度顆粒６（ｄｅｎｓｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ６：ＮｃＧＲＡ６）、もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質を含むことを特徴とするアジュバント。ＮｃＧＲＡ６はニュークリアファクター−カッパーＢ(ＮＦ−κＢ)を誘導することによってアジュバント効果を発揮する。【選択図】図１
2019116454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネオスポラ原虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）由来の蛋白であって、高密度顆粒６（ｄｅｎｓｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ６：ＮｃＧＲＡ６ ）もしくはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ）を含むことを特徴とするアジュバント。
【請求項２】
ＮｃＧＲＡ６が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、あるいは
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴが、
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、あるいは
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項４】
ニュークリアファクター−カッパーＢ(ＮＦ−κＢ)を誘導することを特徴とする請求項１から請求項３に記載のアジュバント。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のアジュバントを含むワクチン製剤。
【請求項６】
アジュバント機能を持つ請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のアジュバント機能を持つＮｃＧＲＡ６、もしくはＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴを抗原とするネオスポラワクチン。
【請求項７】
さらに製薬上許容しうる担体を含む、請求項５もしくは請求項６に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
皮下、皮内、経口又は経鼻投与されるものである、請求項７に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアジュバント機能を持つネオスポラ原虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）由来の高密度顆粒６（ｄｅｎｓｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ６：ＮｃＧＲＡ６）とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは数々の感染症を予防するのに非常に有効な手段であり、アジュバントはその予防効果を増強する補助剤として用いられている。従ってワクチンの接種回数を少なくし、かつ長期間にわたって効果を持続させることのできるアジュバントの開発が重要である。
【０００３】
ワクチンの接種に際して、アジュバント機能を持つ組換え微生物やリポソームを用いる例が知られている。特許文献１はオリゴマンノース被覆したリポソームにネオスポラ原虫由来の高密度顆粒７（ＮｃＧＲＡ７）を封入したネオスポラワクチンを開示している。また非特許文献２はＮｃＧＲＡ６遺伝子を導入した組換えＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓをベクターに用いた場合のネオスポラワクチンの効果を報告している。しかしながら、ベクター自身の病原性やドラッグデリバリーシステムのコスト面が課題となっている。
【０００４】
ネオスポラ原虫は犬科動物を終宿主とし、牛、羊、山羊、鹿などを中間宿主とする細胞内寄生性原虫である。終宿主の糞便中に排出されるオーシストによる水平感染や中間宿主における垂直感染により伝搬される。特に牛には流産、死産或いは子牛の神経症状を主徴とする異常産を高率に引き起こす。欧米諸国の報告では、牛の流産の約４０％の原因はネオスポラ原虫感染によるものとされている。ネオスポラ原虫の垂直感染は何世代にも渡り成立し、このことが本原虫の感染拡大の最大の原因として挙げられる。実際、ネオスポラ原虫の感染例が世界中で報告されており、日本においてもその発生が深刻である。畜産業界では、ネオスポラ原虫が感染した母牛を搾乳に供することができない場合が多く、子牛と搾乳量の損耗などにより、その発生による経済的損失は極めて大きい。地球規模での被害額は年間約数十億ＵＳドルにのぼるとの試算もある。
【０００５】
妊娠時の感染は、母体特有の免疫応答により、流産や垂直感染を引き起こす。すなわち、妊娠初期にネオスポラ原虫が感染した場合、母体の免疫反応により流産が誘発される。また、母体が免疫抑制状態になっている妊娠中期にネオスポラ原虫が感染した場合、胎児への垂直感染が成立し、先天的にネオスポラ原虫に感染している個体が生まれてくる。
【０００６】
これまでに、牛のネオスポラ症を対象に、不活化ワクチンや生ワクチンを用いたネオスポラ原虫に対するワクチン開発がいくつか試みられてきた。不活化したネオスポラ原虫とアジュバントとしてＰＯＬＹＧＥＮを用いた場合、胎児への感染を防ぐことはできなかった。不活化したネオスポラ原虫とアジュバントとしてＨＡＶＬＯＧＥＮを用いた場合、ニュージーランドでは５．２％から５４％の予防効果、コスタリカでは４６％の予防効果が報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再表２０１０―０３２４０８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｕｂｅｙ  ＪＰ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．２００７，２０：３２３−３６７
【非特許文献２】Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ.Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２００７，３７：１５２１−１５２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ワクチンの機能、特にネオスポラワクチンの機能を増強させるアジュバントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＮｃＧＲＡ６が免疫反応の増強に必須なニュークリアファクター−カッパーＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ―ｋａｐｐａ Ｂ ：ＮＦ−κＢ)を誘導するとともに、ＮｃＧＲＡ６自体がネオスポラ原虫に対してワクチン効果のあることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
（１）ネオスポラ原虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）由来の蛋白であって、高密度顆粒６（ｄｅｎｓｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ６：ＮｃＧＲＡ６）もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ）を含むことを特徴とするアジュバント。
（２）ＮｃＧＲＡ６が、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、あるいは
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であることを特徴とする（１）に記載のアジュバント。
（３）ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴが、
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質、あるいは
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であることを特徴とする（１）に記載のアジュバント。
（４）ニュークリアファクター−カッパーＢ(ＮＦ−κＢ)を誘導することを特徴とする（１）から（３）に記載のアジュバント。
（５）（１）から（４）のいずれか１項に記載のアジュバントを含むワクチン製剤。
（６）アジュバント機能を持つ（１）から（４）のいずれか１項に記載のアジュバント機能を持つＮｃＧＲＡ６、もしくはＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴを抗原とするネオスポラワクチン。
（７）さらに製薬上許容しうる担体を含む、（５）もしくは（６）に記載のワクチン製剤。
（８）皮下、皮内、経口又は経鼻投与されるものである、（７）に記載のワクチン製剤。
【発明の効果】
【００１２】
ＮＦ−κＢは炎症性サイトカインの発現に関与する特異的な転写因子であって、免疫反応の増強に重要な役割を果たす。ネオスポラ原虫（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍ）由来の蛋白質であるＮｃＧＲＡ６ は免疫細胞でＮＦ−κＢを誘導し炎症性サイトカインの産生を誘導することから、このものはアジュバントとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＮｃＧＲＡ６遺伝の導入で活性化される因子
【図２】ＮｃＧＲＡ６の添加によるＩＬ−１２ｐ４０の産生
【図３】非妊娠感染マウスモデルにおける特異抗体の検出
【図４】マウス由来脾臓細胞の抗原刺激に対する応答（Ａ：吸光度、Ｂ：ＩＦＮ−γ、Ｃ：ＩＬ−４、Ｄ：ＩＬ−１０）
【図５】非妊娠感染マウスモデルにおける生存曲線、体重変動、臨床スコア、脳内原虫数の評価（Ａ：マウス生存曲線、Ｂ：新生マウスの脳内原虫数、Ｃ：臨床スコア、Ｄ：脳内原虫数）
【図６】妊娠感染マウスモデルにおける母親マウスの体重変動、臨床スコアの評価（Ａ：体重変化率、Ｂ：臨床スコア）
【図７】妊娠感染マウスモデルにおける新生マウスの生存曲線と脳内原虫数、母親マウスの脳及び子宮の原虫数（Ａ：新生マウスの生存曲線、Ｂ：新生マウスの脳内原虫数、Ｃ：母親マウスの脳内原虫数、Ｄ：子宮内原虫数）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＮｃＧＲＡ６が免疫反応の増強に必須なＮＦ−κＢを誘導することによってアジュバント機能を発揮するとともに、ネオスポラ原虫に対して細胞性免疫と液性免疫の両方を誘導することに関するものである。
以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１５】
（１）ルシフェラーゼアッセイによるＮＦ−κＢシグナル活性化の評価
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用い、ＮＦ−κＢシグナル活性化を空ベクター導入時 (Ｍｏｃｋ) とＮｃＧＲＡ６遺伝子導入時とで比較した。ＮｃＧＲＡ６遺伝子の導入により、ＮＦ−κＢの活性化が認められた（図１）。ＮＦ−κＢは免疫反応において中心的役割を果たす転写因子であり、各種のサイトカインを誘導することから、ＮｃＧＲＡ６のアジュバントとしての機能が推定された。
【００１６】
（２）マウス腹腔由来マクロファージのＩＬ−１２ｐ４０産生
ＮｃＧＲＡ６にグルタチオン S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をタグとして融合させたＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ組換え蛋白質およびＧＳＴ組換え蛋白質を２０時間作用させたマウス腹腔由来マクロファージの培養上清におけるＩＬ−１２ｐ４０濃度を図２に示した。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの処理により、マクロファージからのＩＬ−１２ｐ４０の産生が誘導された。ＩＬ−１２は細胞性免疫を誘導するサイトカインとして知られている。
【００１７】
（３）非妊娠感染マウスモデルにおける特異抗体の検出
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、オリゴマンノース被覆リポソーム封入ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ）、ＯＭＬ封入ＧＳＴ（ＧＳＴ−ＯＭＬ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した。それぞれの免疫日の２日前に血清を採取し、ＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体をＥＬＩＳＡ法により検出した。なおＯＭＬは抗原物質を抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子およびクラスII分子に効率良く提示させることができるリポソームとして開発されたものである（ＷＯ２００６／１０４１９９）。
【００１８】
本結果より、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬの免疫によりＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ１抗体の産生が確認され、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの免疫の方がより早期に抗体産生が誘導された。また、ネオスポラ原虫感染後には、ＧＳＴ−ＯＭＬ、ＰＢＳ接種群と比較して、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴおよびＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群においてＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ２ａ抗体の産生が確認され、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの免疫の方がより多くの抗体産生が誘導された（図３）。以上より、ＮｃＧＲＡ６は液性免疫を活性化させる機能を有することが明らかになった。
【００１９】
（４）マウス由来脾臓細胞の抗原刺激に対する応答
同様の処理をしたマウスの最終免疫から２週目に脾臓を採材し、脾臓細胞に対しコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ネオスポラ原虫ライセート（ＮＬＡ）、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＧＳＴを加え、４８時間培養した。陰性対象として、抗原刺激無しで培養した試験区を設定した（Ｍｅｄｉｕｍ）。結果を図４に示す。培養細胞の増殖（Ａ）を測定したところ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴおよびＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群由来脾臓細胞のＮｃＧＲＡ６抗原特異的な増殖が確認された。次に、培養上清中の（Ｂ）インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ−γ）、（Ｃ）インターロイキン４（ＩＬ−４）、（Ｄ）インターロイキン１０の産生量を測定した。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴおよびＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群由来脾臓細胞の培養上清からは、ＮｃＧＲＡ６抗原特異的なＩＦＮ−γの産生が確認された。本結果により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による抗原特異的なＴｈ１免疫応答が確認された。
【００２０】
（５）非妊娠感染マウスモデルにおける生存曲線、体重変動、臨床スコア、脳内原虫数の評価
同様に処理したマウスに対して、最終免疫から２週目にネオスポラ原虫（１×１０６）を腹腔内接種した。結果を図５に示す。図から明らかなように、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群において、感染後３２日目の生存率の上昇（Ａ）、２〜３２日の体重減少の抑制効果（Ｂ）、臨床スコア（身体的症状、行動、神経症状、脱水・食欲減退、その他の5項目に関しての合計値）が示す臨床症状の抑制効果（Ｃ）、が確認された。さらにネオスポラ原虫感染後３２日目に生存マウスの脳組織を採材し、脳組織ＤＮＡの５０ｎｇあたりに含まれる原虫量を定量したところ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群で脳内原虫数の少ない傾向が認められた（Ｄ）。これはＮｃＧＲＡ６の接種がネオスポラ原虫を排除していることを示すものである。
【００２１】
（６）妊娠感染マウスモデルにおける母親マウスの体重変動、臨床スコアの評価
同様に処理したマウスの最終免疫から７日後にオスマウスと交配させ、妊娠６〜１０日目にネオスポラ原虫（１×１０５）を腹腔内接種した。結果を図６に示す。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの接種群において、ネオスポラ原虫感染後の４〜４２日で、母親マウスの体重減少の抑制効果（Ａ）、臨床症状の抑制効果（Ｂ）が確認された。
【００２２】
（７）妊娠感染マウスモデルにおける出産率、平均出産数、新生マウスの生存数と生存率
前記妊娠マウスの出産率、平均出産数、新生マウスの生存数と生存率を表１に示した。本結果により、妊娠期感染でのＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による出産率の上昇傾向が確認された。
【表１】
2019116454.tif 000003
【００２３】
（８）妊娠感染マウスモデルにおける新生マウスの生存曲線と脳内原虫数、母親マウスの脳及び子宮の原虫数
前記のネオスポラ感染妊娠マウスが出産した新生マウスに対するＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種の効果を検証した（図７）。出生後３０日間の新生マウスの生存曲線を示した。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群では有意に生存率の上昇が確認された(Ａ)。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群において、新生マウスの生存個体での脳内原虫数が有意に減少していることが認められた(Ｂ)。母親マウス（出産後３０日、感染後４２日）の脳内原虫数に関しては、有意差は認められなかったものの、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群の母親マウスの脳内原虫数が低値を示す傾向が確認された（Ｃ)。上記の母親マウスのＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群では、子宮内原虫数は有意に減少していることが認められた（Ｄ）。
【００２４】
本結果により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの接種により、ネオスポラが排除され、垂直感染が抑止されることが確認された。以上のデータは、ＮｃＧＲＡ６はアジュバント機能に加えてネオスポラワクチンとしての機能も有することを示すものである。なおＧＳＴにはアジュバント機能やネオスポラに対するワクチン効果の無いことは明らかである。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２６】
サンプルの調整
ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴは、ＮｃＧＲＡ６をコードする配列番号１に記載の遺伝子をＧＳＴ融合蛋白発現ベクターであるｐＧＥＸ４Ｔ１（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社より購入）のＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトに導入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて得たものである。ＧＳＴはｐＧＥＸ４Ｔ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させて得たものである。組換え体の調整や目的蛋白質の精製は、納入業者が提供するプロトコールもしくは当業者が周知の方法で行うことができる。細胞の培養、ルシフェラーゼ活性やサイトカインの測定等もそれぞれの業者が提供するプロトコールあるいは成書に従えば実施可能である（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ.  ｅｔ.ａｌ.，２０１７. Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ１ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｉｎ  Ｍｉｃｅ.  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ.  １２：ｅ ０１７６３２４.）。組換え蛋白質のＯＭＬへの封入は特許第５４２９８２１号に記載の方法に従った。
【００２７】
ルシフェラーゼアッセイによるＮＦ−κＢシグナル活性化の測定(図１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用い、ＮＦ−κＢシグナルの活性化を空ベクター導入時 (Ｍｏｃｋ) とＮｃＧＲＡ６遺伝子導入時で比較した。ＮｃＧＲＡ６遺伝子（配列番号１）のＨＥＫ２９３Ｔ細胞への導入は業者が提供するプロトコールの方法に従った。ＮｃＧＲＡ６遺伝子の導入により、ＮＦ−κＢの活性化が認められた。
【００２８】
マウス腹腔由来マクロファージのＩＬ−１２ｐ４０産生(図２）
ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴおよびＧＳＴ組換え蛋白質を２０時間作用させたマウス腹腔由来マクロファージの培養上清におけるＩＬ−１２ｐ４０濃度の結果を示した。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの処理により、マクロファージからのＩＬ−１２ｐ４０の産生が誘導された。
【００２９】
非妊娠感染マウスモデルにおける特異抗体の検出(図３）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、オリゴ糖リポソーム封入ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ）、ＯＭＬ封入ＧＳＴ（ＧＳＴ−ＯＭＬ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から２週目にネオスポラ原虫（１×１０６）を腹腔内接種した。それぞれの免疫日の２日前に血清を採取し、ＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体をＥＬＩＳＡ法により検出した。１回の実験で１試験区６匹のマウスを使用し、同様の結果が得られた２回の実験のうち、代表的な１回の実験結果を示した。結果は、平均値    標準偏差で示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、同一免疫群において免疫前（ｄａｙ  ０）と有意差を示した。棒グラフに記載の異なるアルファベットは、採材日が同一のサンプル間での有意差を示した。本結果より、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬの免疫によりＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ１抗体の産生が確認され、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの免疫の方がより早期に抗体産生が誘導された。また、ネオスポラ原虫感染後には、ＧＳＴ−ＯＭＬ、ＰＢＳ接種群と比較して、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群においてＮｃＧＲＡ６特異的ＩｇＧ２ａ抗体の産生が確認され、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴの免疫の方がより多くの抗体産生が誘導された。
【００３０】
マウス由来脾臓細胞の抗原刺激に対する応答(図４）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、オリゴ糖リポソーム封入ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ）、ＯＭＬ封入ＧＳＴ（ＧＳＴ−ＯＭＬ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５  ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から２週目に脾臓を採材し、脾臓細胞に対しコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ネオスポラ原虫ライセート（ＮＬＡ）、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＧＳＴを加え、４８時間培養した。陰性対象として、抗原刺激無しで培養した試験区を設定した（Ｍｅｄｉｕｍ）。１試験区４匹のマウスを使用し、結果は平均値  ±  標準偏差で示した。（Ａ）脾臓細胞の増殖はＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  ｒｅａｇｅｎｔ  （ＣＣＫ−８，  Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）で測定し、吸光度４５０ｎｍで示した。ＥＬＩＳＡ法で測定した培養上清中のインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮーγ）濃度（Ｂ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）濃度（Ｃ）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）濃度（Ｄ）を示した。＃：  ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、同一接種群内で抗原刺激無しで培養した試験区（Ｍｅｄｉｕｍ）との有意差を示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、同一抗原刺激においてＰＢＳ接種群と有意差を示した。本結果により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群由来脾臓細胞の抗原特異的なＴｈ１免疫応答が確認された。
【００３１】
非妊娠感染マウスモデルにおける生存曲線、体重変動、臨床スコア、脳内原虫数の評価(図５）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、オリゴ糖リポソーム封入ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ（ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ）、ＯＭＬ封入ＧＳＴ（ＧＳＴ−ＯＭＬ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から２週目にネオスポラ原虫（１×１０６）を腹腔内接種した。１回の実験で１試験区６匹のマウスを使用し、合計２回の実験結果を示した（１試験区１２匹のマウス）。（Ａ）ネオスポラ原虫感染後３２日間のマウスの生存曲線を示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、感染後３２日目のマウス生存をＬｏｇ−ｒａｎｋ  （Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）ｔｅｓｔにより解析し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群とＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群はＧＳＴ−ＯＭＬ接種群とＰＢＳ接種群と有意差が認められ、生存率の上昇が確認された。（Ｂ）ネオスポラ原虫感染後、２〜３２日のマウスの体重変動を示した。結果は平均値    標準誤差で示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群とＰＢＳ接種群で有意差が（＊一つ）、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群とＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群で有意差が（＊二つ）認められ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種によるマウスの体重減少の抑制効果が確認された。（Ｃ）ネオスポラ原虫感染後、２〜３２日のマウスの臨床スコアを示した。臨床スコアは身体的症状、行動、神経症状、脱水・食欲減退、その他の５項目に関しての合計値を用い（Ｒｅｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ，  ２００９）、結果は平均値    標準誤差で示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群とＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種群はＰＢＳ接種群及びＧＳＴ−ＯＭＬ接種群と有意差が認められ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種あるいはＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ−ＯＭＬ接種による臨床症状の抑制効果が確認された。（Ｄ）ネオスポラ原虫感染後３２日目に生存マウスの脳組織を採材し、脳組織ＤＮＡの５０ｎｇあたりに含まれる原虫量を定量した。一元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、各試験区で有意差は認められなかったが、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群で脳内原虫数の少ない傾向が認められた。
【００３２】
妊娠感染マウスモデルにおける母親マウスの体重変動、臨床スコアの評価（図６）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＧＳＴ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から７日後にオスマウスと交配させ、妊娠６〜１０日目にネオスポラ原虫（１×１０５）を腹腔内接種した。（Ａ）ネオスポラ原虫感染後、４〜４２日の母親マウスの体重変動を示した。結果は平均値    標準誤差で示した。ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による母親マウスの体重減少の抑制効果が確認された。（Ｂ）ネオスポラ原虫感染後、４〜４２日の母親マウスの臨床スコアを示した。臨床スコアは身体的症状、行動、神経症状、脱水・食欲減退、その他の５項目に関しての合計値を用い（Ｒｅｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ，  ２００９）、結果は平均値    標準誤差で示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、二元配置のＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群はＰＢＳ接種群と有意差が認められ、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による臨床症状の抑制効果が確認された。妊娠後期と分娩前後は母親マウスへのストレス回避のため、体重及び臨床スコアの測定は実施しなかった（観察未実施期間）。
【００３３】
妊娠感染マウスモデルにおける出産率、平均出産数、新生マウスの生存数と生存率（表1）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＧＳＴ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から７日後にオスマウスと交配させ、妊娠６〜１０日目にネオスポラ原虫（１×１０５）を腹腔内接種した。出産率、平均出産数、新生マウスの生存数と生存率を表１に示した。本結果により、妊娠期感染でのＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による出産率の上昇傾向が確認された。
【００３４】
妊娠感染マウスモデルにおける新生マウスの生存曲線と脳内原虫数、母親マウスの脳及び子宮の原虫数(図7）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８週齢）に対し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ、ＧＳＴ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２週間隔で３回皮下接種した（１回あたり２５ｐｍｏｌ蛋白質）。最終免疫から７日後にオスマウスと交配させ、妊娠６〜１０日目にネオスポラ原虫（１×１０５）を腹腔内接種した。新生マウスの生存数と生存率を以下の表に示した。（Ａ）出生後３０日間の新生マウスの生存曲線を示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ  （Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）  ｔｅｓｔにより解析し、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群はＧＳＴ−ＯＭＬ接種群とＰＢＳ接種群とで有意差が認められ、生存率の上昇が確認された。（Ｂ）新生マウスの死亡個体及び生後３０日の生存個体での脳内原虫数を示した。＊：  ｐ  ＜  ０．０５、一元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群由来の生存新生マウスとＰＢＳ接種群で有意差が認められた。（Ｃ）母親マウス（出産後３０日、感染後４２日）の脳内原虫数を示した。一元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により各試験区で有意差は認められなかったが、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群の母親マウスの脳内原虫数が低値を示す傾向が確認された。（Ｄ）母親マウス（出産後３０日、感染後４２日）の子宮内原虫数を示した。＊：ｐ  ＜  ０．０５、一元配置のＡＮＯＶＡとチューキー・クレーマーの多重比較検定により、ＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種群とＰＢＳ接種群とで有意差が認められた。本結果により、妊娠感染マウスモデルにおけるＮｃＧＲＡ６＋ＧＳＴ接種による垂直感染抑止効果が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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