(57)【要約】      （修正有）【課題】混合器内で混合される各溶液の体積を正確に定量可能な溶液混合器、該溶液混合器を備えた流体デバイスおよび溶液の混合方法を提供する。【解決手段】本発明の溶液混合器２０は、溶液が循環する主流路２１と、前記主流路に接続する溶液導入流路４２と、前記主流路に接続する溶液排出流路３２と、を備え、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブ３３を有し、前記主流路中には主流路バルブ２３ａ，２３ｂを有することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液導入流路と、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液排出流路と、を含み、
前記主流路は、少なくとも２つの主流路バルブを有し、
前記主流路バルブは、いずれか２つの該主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されており、
前記主流路の部分領域の全てに、前記少なくとも１つの溶液導入流路と前記少なくとも１つの溶液排出流路が接続し、
前記溶液排出流路のそれぞれが溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路の部分領域のそれぞれに、前記溶液導入流路から溶液を導入する工程と、
前記主流路バルブをすべて開放して、前記溶液を回転混合する工程と、を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの前記主流路バルブが前記溶液導入流路及び／又は前記溶液排出流路の近傍に配置されている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記主流路は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、を含み、
前記主流路バルブは、前記第一の結合流路及び／又は前記第二の結合流路に配置されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
更に、前記主流路に溶液を循環させるポンプを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポンプは、少なくとも３つのポンプバルブを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記主流路は、溶液中の物質の検出部を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液中の物質は生体分子であり、
前記検出部は、前記生体分子に親和性を有する物質が固定された基板を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
溶液混合器を用いて、２種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は２つの主流路バルブを有し、前記溶液導入流路及び前記溶液排出流路は、前記２つの主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域以外の領域で前記主流路に接続しており、
前記２つの主流路バルブは、それらを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されており、
前記２つの主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ａと、
前記２つの主流路バルブを閉じる工程ｂと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ｃと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程ｄと、
前記２つの主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程ｅと、
を含む方法。
【請求項９】
溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路を連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液導入流路及び第二の溶液導入流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液排出流路及び第二の溶液排出流路と、
前記第一の溶液排出流路及び前記第二の溶液排出流路にそれぞれ配置された第一の溶液排出流路バルブ及び第二の溶液排出流路バルブと、
前記第一の結合流路及び前記第二の結合流路にそれぞれ配置された第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブであって、それらを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されている第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブとを有し、
前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを閉じ、前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第一の溶液導入流路から前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の溶液導入流路から前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程ａと、
前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程ｂと、
を含む方法。
【請求項１０】
前記溶液混合容器は、更に、
第三の流路と、
前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液導入流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液排出流路と、
前記第三の溶液排出流路に配置された第三の溶液排出流路バルブと、
前記第三の結合流路及び前記第四の結合流路にそれぞれ配置された第三の主流路バルブ及び第四の主流路バルブと、
を有し、
前記工程ｂの前又は後に、前記第三の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第三の溶液導入流路から前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程ｃと、
前記工程ｂ及び前記工程ｃの後に、前記第三の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の主流路バルブ及び前記第四の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の混合溶液と、第三の溶液とを循環させて混合する工程ｄと、を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記混合容器は、溶液が循環する主流路を含み、
前記主流路は、第一の流路と、第二の流路と、第三の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、を含み、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも１つの溶液導入流路と、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも１つの溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路は少なくとも１つの溶液排出流路バルブを有し、
前記第一の結合流路、前記第二の結合流路、第三の結合流路及び第四の結合流路は、それぞれ少なくとも１つの主流路バルブを有し、
前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブは、前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じることによって区画される前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路それぞれの部分領域が所定の体積を有するよう配置され、
前記第一の流路及び前記第二の流路が、相互に、且つ、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程ａと、
前記第一の流路と前記第二の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程ｂと、
前記第三の流路が、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程ｃと、
前記第一の流路及び前記第二の流路と前記第三の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、第一の溶液及び第二の溶液の混合溶液と第三の溶液とを循環させて混合する工程ｄと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液混合器、流体デバイス及び溶液の混合方法に関する。
本願は、２０１３年９月２５日に、日本に出願された特願２０１３−１９９０７１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、体外診断分野における試験の高速化、高効率化、および集積化、又は、検査機器の超小型化を目指したμ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)の開発などが注目を浴びており、世界的に活発な研究が進められている。
【０００３】
μ−ＴＡＳは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストで使い捨てが可能なこと等、従来の検査機器に比べて優れている。
更に、高価な試薬を使用する場合や少量多検体を検査する場合において、有用性が高い方法として注目されている。
【０００４】
μ−ＴＡＳの構成要素として、ループ状流路と、該流路上に配置されるポンプとを備えた回転式混合器が報告されている（非特許文献１）。この回転式混合器では、該ループ状の流路へと複数の溶液を注入し、ポンプを作動させることで、複数の溶液をループ状流路内で混合する。前記複数の溶液は、ループ状流路に連結する注入流路内に蓄積された後、ループ状流路へと注入される。この注入流路上にはバルブが設けられており、当該流路内で各溶液の体積が定量される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jong Wook Hong, Vincent Studer, Giao Hang, W French Anderson and Stephen R Quake、Nature Biotechnology 22, 435 - 439 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１に記載の方法では、上述したように、ループ状流路内で混合される複数の溶液は、一旦、注入流路内に蓄積および定量された後にループ状流路内へと注入される。
一般的に、流路へと溶液を注入する際、空気等の混入のないように流路内を完全に溶液で満たそうとすれば、空気の排出完了と同時に注入を停止しない限り、流路内の体積よりも多くの溶液を注入する必要がある。これは非特許文献１に記載の回転混合器の構成においても同様であり、上記ループ状流路内で混合される複数の溶液は、ループ状流路内の体積よりも多くの溶液が注入されなければならない。したがって、混合に用いる溶液の体積は、注入流路内で定量されてはいても、ループ状流路内で実際に混合される際には、必ずしも正確ではないという恐れがあった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、混合器内で混合される各溶液の体積を正確に定量可能な溶液混合器、該溶液混合器を備えた流体デバイスおよび溶液の混合方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、任意の体積を有する主流路を、バルブにより定量区画させることで、主流路内に注入された溶液を定量且つ混合することが可能となることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（６）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液導入流路と、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液排出流路と、を含み、
前記溶液排出流路は少なくとも１つの溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路は少なくとも１つの主流路バルブを有する。
（２）本発明の一実施態様における流体デバイスは、先に記載の溶液混合器を備えることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合器を用いて、２種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は少なくとも１つの主流路バルブを有し、少なくとも１つの前記主流路バルブは、前記溶液排出流路の近傍に配置されており、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも１つの前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ａと、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも１つの前記主流路バルブを閉める工程ｂと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ｃと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程ｄと、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも１つの前記主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程ｅと、を含む方法である。
（４）本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合器を用いて、２種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は２つの主流路バルブを有し、前記溶液導入流路及び前記溶液排出流路は、前記２つの主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域以外の領域で前記主流路に接続しており、
前記２つの主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ａと、
前記２つの主流路バルブを閉じる工程ｂと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程ｃと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程ｄと、
前記２つの主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程ｅと、
を含む方法である。
（５）本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路を連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液導入流路及び第二の溶液導入流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液排出流路及び第二の溶液排出流路と、
前記第一の溶液排出流路及び前記第二の溶液排出流路にそれぞれ配置された第一の溶液排出流路バルブ及び第二の溶液排出流路バルブと、
前記第一の結合流路及び前記第二の結合流路にそれぞれ配置された第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブと、
を有し、
前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを閉じ、前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第一の溶液導入流路から前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の溶液導入流路から前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程ａと、
前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程ｂと、
を含む方法である。
（６）本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記混合容器は、溶液が循環する主流路を含み、
前記主流路は、第一の流路と、第二の流路と、第三の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、を含み、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも１つの溶液導入流路と、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも１つの溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路は少なくとも１つの溶液排出流路バルブを有し、
前記第一の結合流路、前記第二の結合流路、第三の結合流路及び第四の結合流路は、それぞれ少なくとも１つの流路バルブを有し、
前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブは、前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じることによって区画される前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路それぞれの部分領域が所定の体積を有するよう配置され、
前記第一の流路及び前記第二の流路が、相互に、且つ、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程ａと、
前記第一の流路と前記第二の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程ｂと、
前記第三の流路が、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程ｃと、
前記第一の流路及び前記第二の流路と前記第三の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、第一の溶液及び第二の溶液の混合溶液と第三の溶液とを循環させて混合する工程ｄと、
を含む方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、溶液混合器内において、複数の溶液の体積が正確に定量された状態で、該複数の溶液を混合できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図２】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図３】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図４】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図５】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図６】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図７】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図８】本実施形態における溶液混合器の一態様の模式図である。
【図９】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図１０】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図１１】本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。
【図１２Ａ】本実施形態における溶液の混合方法の一態様の模式図である。
【図１２Ｂ】本実施形態における溶液の混合方法の一態様の模式図である。
【図１２Ｃ】本実施形態における溶液の混合方法の一態様の模式図である。
【図１２Ｄ】本実施形態における溶液の混合方法の一態様の模式図である。
【図１２Ｅ】本実施形態における溶液の混合方法の一態様の模式図である。
【図１３Ａ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ａ）の一態様の模式図である。
【図１３Ｂ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｂ）の一態様の模式図である。
【図１４Ａ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｃ、工程Ｄ）の一態様の模式図である。
【図１４Ｂ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｅ）の一態様の模式図である。
【図１５Ａ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｆ）の一態様の模式図である。
【図１５Ｂ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｇ）の一態様の模式図である。
【図１６Ａ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｈ）の一態様の模式図である。
【図１６Ｂ】本実施形態における溶液の混合方法（工程Ｉ）の一態様の模式図である。
【図１７】実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの定量結果である。
【図１８】実施例における精製したｍｉＲＮＡの定量結果である。
【図１９】実施例におけるｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板を備えた検出部、を有する流体デバイスを用いたｍｉＲＮＡ検出結果である。
【図２０】実施例における溶液混合器を用いた溶液の混合の結果を示す画像である。
【図２１Ａ】実施例における流体デバイス中のバルブの制御の詳細を示した結果である。
【図２１Ｂ】実施例における流体デバイス中のバルブの制御の詳細を示した結果である。
【図２２】本実施形態における流体デバイスの基板の一態様の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪溶液混合器≫
［第１実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する溶液導入流路と、
前記主流路に接続する溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路中には前記溶液排出流路を開閉するための溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路中には前記主流路を定量区画するための第一の主流路バルブを有し、
前記第一の主流路バルブは溶液排出流路の近傍に配置され、
前記主流路を定量区画するための第二の主流路バルブを備え、
前記第二の主流路バルブは溶液導入流路の近傍に配置されたものである。
図１は、本実施形態の溶液混合器２０の基本構成を示す模式図である。本実施形態の溶液混合器は、溶液が循環する主流路２１と、前記主流路に接続する溶液導入流路４２と、前記主流路に接続する溶液排出流路３２と、を備え、前記溶液排出流路３２中には前記溶液排出流路３２を開閉するための溶液排出流路バルブ３３を有し、前記主流路２１中には前記主流路２１を定量区画するための第一の主流路バルブ２３ｂを有し、前記第一の主流路バルブ２３ｂは溶液排出流路３２の近傍に配置され、さらに、前記主流路２１を定量区画するための第二の主流路バルブ２３ａを備え、前記第二の主流路バルブ２３ａは溶液導入流路４２の近傍に配置されたものである。溶液導入流路４２および溶液排出流路３２の数は特に制限されないが、図１に示される溶液混合器２０は、それぞれ溶液導入流路４２および溶液排出流路３２を１つずつ備えている。
【００１２】
本実施形態の溶液混合器２０は主流路バルブ２３を有しており、これらを閉じた状態とすることで、主流路バルブ２３により区画された主流路２１は、それぞれ独立の体積を有する流路となる。また、溶液排出流路バルブ３３の開閉を操作することで、主流路２１内の空気等の排出及び溶液の充填を制御できる。
本実施形態の溶液混合器２０は、予め流路内の体積が定められた主流路２１を有しているので、主流路バルブ２３により区画された主流路２１内に充填された溶液の体積が正確に把握された状態で溶液を混合することができる。当該流路内に溶液が送液され、溶液の体積が定量された後、主流路バルブ２３を開くことで、区画された流路同士が連通され、溶液の混合が可能となる。
このように、主流路２１は、定量のみならず混合にも用いることが可能であるので、混合器への溶液の注入と定量を同時に行うことが可能であり、操作の効率化が実現される。
【００１３】
［第２実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、
先の第一実施形態の溶液混合器の構成に、前記溶液導入流路を開閉するための溶液導入流路バルブをさらに有し、前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路と、第二の溶液を導入する第二の導入流路と、を備えるものである。図２は、本実施形態の溶液混合器３０の基本構成を示す模式図である。溶液混合器３０は、前記溶液導入流路４２を開閉するための溶液導入流路バルブ４３をさらに有し、前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路４２ａと、第二の溶液を導入する第二の導入流路４２ｂと、を備えている。溶液導入流路バルブ４３を設けたことにより、溶液導入流路バルブ４３及び溶液排出バルブ３３によって、主流路２１が完全に区画化され得る。したがって、溶液導入流路バルブ４３及び溶液排出流路バルブ３３を閉じ、主流路バルブ２３を開けた場合、溶液導入流路バルブ４３及び溶液排出流路バルブ３３によって閉鎖された主流路２１内では、より効率的に溶液混合が実現される。
また、溶液混合器３０が前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路４３ａと、第二の溶液を導入する第二の導入流路４３ｂとを備えることで、主流路バルブ２３により区画された主流路２１内へと異なる溶液を個別に導入できる。したがって、図２に示されるように、第二の主流路バルブ２３ａは、第一の導入流路４２ａと、第二の溶液を導入する第二の導入流路４２ｂとの間に配置されることが好ましい。
【００１４】
［第３実施形態］
本実施形態の溶液混合器３０’の構成を図３に示す。本実施形態の溶液混合器３０’は、先の第２実施形態の溶液混合器３０の構成に、前記溶液排出流路３２として、第一の溶液を排出する第一の排出流路３２ａと、第二の溶液を排出する第二の排出流路３２ｂと、を備えるものである。また、図３に示すように、第一の主流路バルブ２３ｂは、第一の溶液を排出する第一の排出流路３２ａと、第二の溶液を排出する第二の排出流路３２ｂとの間に配置されることが好ましい。このような構成を有する本実施形態の溶液混合器３０’は、溶液排出流路バルブ３３ａ又は３３ｂの開閉を操作することで、主流路バルブ２３によって区画された主流路２１内へと導入された第一の溶液とおよび第二の溶液のそれぞれに対して個別に、主流路内の空気等の排出前記溶液の充填等を制御することができる。
【００１５】
［第４実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、
前記主流路を定量区画するための第三の主流路バルブを備え、前記第三の主流路バルブは溶液排出流路の近傍にあって、前記第一の主流路バルブと前記第三の主流路バルブとの間に前記溶液排出流路は接続する。本実施形態の溶液混合器を模式的に示した図を図４に示す。本実施形態の溶液混合器４０は、主流路２１を定量区画するための第三の主流路バルブ２３ｂ’を備え、第三の主流路バルブ２３ｂ’は溶液排出流路３２の近傍であって、第一の主流路バルブ２３ｂと第三の主流路バルブ２３ｂ’との間に溶液排出流路３２が接続する。このような構成を有する混合器４０は、主流路バルブ２３によって区画された主流路２１内の溶液に対して個別に、主流路内の空気等の排出前記溶液の充填等を制御することができる。例えば、主流路２１内に溶液が充填されている状態にあるとき、第一の主流路バルブ２３ｂ及び第二の主流路バルブ２３ａを閉じ、第三の主流路バルブ２３ｂ’及び溶液排出バルブ３３を開くことで、主流路２１内に充填された溶液のうち、主流路バルブ２３ａと、２３ｂ’によって区画された流路内の溶液を、溶液排出流路３２を通じて排出できる。
【００１６】
［第５実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、
前記主流路が、第一の流路と、第二の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路を連通させる結合流路と、を備え、前記結合流路は前記第一の主流路バルブを有するものである。
本実施形態の溶液混合器の基本構成を示す模式図を図５に示す。溶液混合器５０は、主流路２１が、第一の流路２１ａと、第二の流路２１ｂと、第一の流路２１ａと第二の流路２１ｂとを連通させる結合流路２２と、を備え、結合流路２２は第一の主流路バルブ２３ｂを有するものである。また、本実施形態の溶液混合器５０は、図５に示されるように、第二の主流路バルブ２３ａおよび第三の主流路バルブ２３ｂ’を備えていることが好ましい。
第一の流路２１ａと、第二の流路２１ｂとして表される複数の流路が、結合流路２２によって連通されることで、後述の≪溶液の混合方法≫の第２実施形態において詳述するように、複数種の溶液を順次混合することが容易となる。
【００１７】
［第６実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、先に記載の第５実施形態の溶液混合器５０に、更に、ポンプを備えるものである。また、前記ポンプは、バルブの開閉により溶液の送液が可能なポンプバルブであることが好ましい。図６は、本実施形態の溶液混合器を模式的に表した図である。溶液混合器６０は、ポンプバルブ２４を備え、ポンプは３つのポンプバルブ２４からなる。ポンプバルブ２４の数は、４つ以上でもよい。主流路２１中にポンプが配置されることで、より効率的な回転混合が実現される。なお、主流路バルブ２３をポンプバルブとして使用してもよい。
【００１８】
［第７実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、前記第一の溶液と前記第二の溶液との混合液の検出部を備えたものである。図７は、本実施形態の溶液混合器を模式的に表した図である。溶液混合器７０は、先に記載の第５実施形態の溶液混合器５０に、更に検出部４ｃを備えている。
溶液混合器７０の主流路２１内において溶液を回転混合させることで、検出部４ｃは当該溶液に含まれる分子との接触の機会が促進される。
【００１９】
本実施形態の流体デバイスが有する検出部４ｃは、前記分子（生体分子）に親和性を有する物質が固定されてなる基板を備えていることが好ましく、前記生体分子が核酸である場合には、検出部４ｃは、標的となる当該核酸に相補的なプローブが固定されてなる基板１３６を備えていることが好ましい。生体分子をｍｉＲＮＡとする場合には、標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板１３６を備えていることが好ましく（図２２参照）、生体分子をタンパク質とする場合には、基板１３６はプロテインアレイであることが好ましい。標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板としては、従来公知のＤＮＡチップが挙げられる。
【００２０】
更に、特異的にかつ高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出するという観点から、検出部４ｃは、以下の構成を備えていることが好ましい。
図２２に示すように、検出部４ｃは、標的ｍｉＲＮＡ１３３を第一の部分１３１と第二の部分１３２に分割した場合に、第一の部分１３１とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ１３４が固定されてなる基板を備えていることが好ましい。
検出プローブ１３５は、二本鎖を形成する二つのステム部１３５ｃ，１３５ｄと、該二つのステム部１３５ｃ，１３５ｄ間の領域であり、標識物質１３５ａにより標識されているループ部１３５ｅと、標的ｍｉＲＮＡ１３３を第一の部分１３１と第二の部分１３２に分割した場合に、第二の部分１３２とハイブリダイズし得る配列１３５ｂとを有し、且つ５’突出末端又は３’突出末端を有する。
【００２１】
捕捉プローブ１３４及び検出プローブ１３５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ１３３の第一の部分１３１及び第二の部分１３２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第一の部分１３１及び第二の部分１３２の長さは、５〜１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７〜１５塩基がより好ましい。
本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ１３３の５’側の部分を第一の部分１３１とし、ｍｉＲＮＡ１３３の３’側の部分を第二の部分１３２とする。
【００２２】
尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる捕捉プローブ及び検出プローブの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
【００２３】
捕捉プローブ１３４は、５’末端領域に、ｍｉＲＮＡ１３３の第一の部分１３１とハイブリダイズし得る配列を含む。
ｍｉＲＮＡ１３３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ１３４は、ｍｉＲＮＡ１３３の第二の部分１３２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ１３３の第二の部分１３２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板１３６に固定された捕捉プローブ１３４が、ｍｉＲＮＡ１３３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ１３４は、基板１３６と結合する３’末端にスペーサー１３４ａを有していることが好ましい。スペーサー１３４ａの長さとしては、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー１３４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
捕捉プローブ１３４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第一の部分１３１及びスペーサー１３４ａの塩基数を勘案し、３〜５０塩基が好ましく、５〜４０塩基がより好ましい。
【００２４】
捕捉プローブ１３４は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡ１３３との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、捕捉プローブ１３４は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
【００２５】
捕捉プローブ１３４を固定するために用いられる基板１３６としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ１３４を基板１３６上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
【００２６】
本実施形態において、検出プローブ１３５は、３’末端領域に、ｍｉＲＮＡ１３３の第二の部分１３２とハイブリダイズし得る配列１３５ｂを含む。
ｍｉＲＮＡ１３３を高精度に定量する観点から、検出プローブ１３５は、ｍｉＲＮＡ１３３の第一の部分１３１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ１３３の第一の部分１３１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
【００２７】
検出プローブ１３５は、ステムループ構造を形成する。ステムループ構造とは、一本鎖核酸において、分子内で離れた二箇所の領域に相補的な配列がある場合、核酸の塩基対間の相互作用によって二本鎖（ステム構造）を形成するとともに、その二箇所の領域に狭まれた配列がループ構造を形成するものをいい、ヘアピンループとも称される。
本実施形態において、検出プローブ１３５は、５’末端側から、二本鎖を形成する二つのステム部１３５ｃ，１３５ｄと、該２つのステム部１３５ｃ，１３５ｄ間の領域であるループ部１３５ｅと、第二の部分１３２とハイブリダイズし得る配列１３５ｂとからなる。即ち、検出プローブ１３５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
【００２８】
検出プローブ１３５におけるステム部の長さは、ループ部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ１３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２０塩基がより好ましい。
検出プローブ１３５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ１３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３〜２００塩基が好ましく、５〜１００塩基がより好ましい。
検出プローブ１３５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第二の部分１３２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４〜２００塩基が好ましく、２４〜１５０塩基がより好ましい。
【００２９】
検出プローブ１３５は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、検出プローブ１３５は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
捕捉プローブ１３４及び検出プローブ１３５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ１３４及び検出プローブ１３５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
【００３０】
検出プローブ１３５は、標識物質１３５ａにより標識されている。標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを検出することができる。
【００３１】
本実施形態によれば、検出部と接触させる溶液が正確に定量されているので、正確な解析が実現される。
【００３２】
［第８実施形態］
本実施形態の溶液混合器は、前記主流路が撹拌構造を含む。撹拌構造として曲率を有する構造が挙げられる。曲率を有する構造においては流路内の流路壁面と溶液の相互作用（摩擦）により、壁面周辺の流速は遅く、流路中央の流速は速くなる。その結果、液体の流速に分布ができるため、溶液の混合が促進される。当該流路の内径は一例には0.01〜3mmであり、例えば0.5〜1mmである。
また前記曲率を有する構造は、折り返し構造に含まれていてもよい。図８は、本実施形態の溶液混合器８０を模式的に表した図である。溶液混合器８０は、主流路が折り返し構造３１を含む。ここで、「折り返し構造」とは、基準となる流路の長軸方向に対して略直角に、流路がほぼ１８０度折り返す構造をいう。
折り返し数は、流路の伸びる方向が変更された回数で数えられ、図８に示される折り返し構造３１における折り返し数は８である。折り返し構造においては、上記流速の差が繰り返し生じるので、溶液の混合がさらに促進される。
【００３３】
≪流体デバイス≫
［第１実施形態］
本実施形態の流体デバイスは、先に記載の溶液混合器を備えるものである。
本実施形態の流体デバイスは、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出するデバイスであることが好ましい。エキソソームは、直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、マイクロＲＮＡなどを発現している。そして、体液中に分泌されるエキソソームも、分泌元の細胞由来のマイクロＲＮＡなどを発現している。そのため、体液中のエキソソームの膜内部に存在する生体分子を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。
【００３４】
［第２実施形態］
図９に示すように、本実施形態の流体デバイス１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部２と、生体分子精製部３と、溶液混合器４と、検出部４ｃと、エキソソーム精製部２と生体分子精製部３を繋ぐ第一の流路５と、生体分子精製部３と溶液混合器４を繋ぐ第二の流路６と、を備えている。
【００３５】
分析に用いるサンプルによる二次感染を防止する観点から、本実施形態の流体デバイス１は、更に廃液槽を備えていることが好ましい。一例として、図１０に示すように、本実施形態のマイクロ流路デバイス（流体デバイス１）は、第一の廃液槽７、第二の廃液槽８、第三の廃液槽９を備え、第一の廃液槽７とエキソソーム精製部２を繋ぐ第三の流路１０、第二の廃液槽８と生体分子精製部３を繋ぐ第四の流路１１、第三の廃液槽９と溶液混合器４を繋ぐ第五の流路１２を備えたものであることが好ましい。尚、図１０においては三つの廃液槽を示しているが一つ又は二つの廃液槽にまとめたものであってもよい。
後述するように、エキソソーム精製部２からの廃液が第三の流路１０を通って第一の廃液槽７に送られる。生体分子精製部３からの廃液が第四の流路１１を通って第二の廃液槽８に送られる。溶液混合器４からの廃液が第五の流路１２を通って第三の廃液槽９に送られる。
【００３６】
本実施形態の流体デバイス１における各構成の一例について、図１１を用いて説明する。エキソソーム精製部２は、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部２ｄを備える。図１１に示すように、エキソソーム精製部２は、導入する試薬別にインレットを備えることが好ましい。即ち、エキソソーム精製部２は、サンプル導入用インレット２ｂと破砕液導入用インレット２ｃを備えることが好ましく、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
【００３７】
エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。係る化合物を用いることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に脂質二重膜を有するエキソソームを固定することができる。
尚、本明細書において、「エキソソーム固定部２ｄ上にエキソソームを固定する」とは、エキソソーム固定部にエキソソームを吸着させることも意味する。
【００３８】
疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。
飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数６〜２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。
中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
【００３９】
親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、ＰＥＧが好ましい。
係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を有することが特に好ましい。
【００４０】
即ち、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、脂質−ＰＥＧ誘導体が好ましい。
脂質−ＰＥＧ誘導体は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ａｎｃｈｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる。ＢＡＭとしては、例えば下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００４１】
【化１】
2019193931.tif 000003
【００４２】
［式中、ｎは１以上の整数である。］
エキソソーム固定部２ｄの層として用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、３−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
【００４３】
本実施形態の流体デバイス１における液体の駆動は、外部吸引ポンプによってなされ、液体の流れは空圧式バルブの開閉によって制御される。バルブの開閉は、流体デバイス１に連結した外部空圧装置によって駆動・制御される。
【００４４】
図１１に示すように、エキソソームの分析において、まず上述したエキソソーム精製部において、サンプル導入用インレット２ｂにサンプルを注入し、流路２ｉのバルブ２ｆを開き、吸引によりサンプルをエキソソーム固定部２ｄに導入する。
分析に用いられるサンプル量としては、１ｍＬ程度が好ましい。
【００４５】
サンプルとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエキソソームを含有するものであれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、エキソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エキソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。
また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
【００４６】
検出対象の細胞としては、エキソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよいが、本実施形態においては、エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
【００４７】
エキソソーム固定部２ｄにエキソソームを特異的に結合させる観点から、エキソソーム固定部２ｄに非特異的吸着抑制部を設けることが好ましい。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理することが挙げられる。
【００４８】
エキソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエキソソームは、上述した疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、サンプルをエキソソーム固定部２ｄに静置する必要はなく、連続的にエキソソーム固定部２ｄ上をサンプルが通過すると同時にサンプル中のエキソソームがエキソソーム固定部２ｄ上に捕捉される。
一例として、エキソソーム捕捉時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、捕捉に要する時間は１５秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
【００４９】
本実施形態の流体デバイス１において、エキソソーム固定部２ｄの天井高を低く設計しておくことが好ましい。これにより、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物と、エキソソームとの接触の機会を増し、エキソソームの捕捉効率を高めることができる。
【００５０】
血液中には、エキソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞もエキソソーム固定部２ｄに固定される可能性がある。エキソソーム固定部２ｄからこれらの細胞外小胞を除去する観点から、エキソソーム固定部２ｄ上のエキソソームを洗浄することが好ましい。
一例として、図１１に示すように、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、エキソソーム固定部２ｄに導入する。
本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエキソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、ＰＢＳ洗浄液５００μＬを吸引圧力１〜３０ｋＰａで１５秒程度送液することにより洗浄される。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
【００５１】
次いで、エキソソーム固定部２ｄに固定されたエキソソームを破砕する。図１１に示すように、流路２ｊ上のバルブ２ｇを開き、破砕液導入用インレット２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエキソソーム固定部２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
破砕液がエキソソーム固定部２ｄを通ることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される生体分子が放出される。
一例として、エキソソーム破砕時の吸引圧力は、１〜３０ｋＰａであり、破砕に要する時間は３０秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
【００５２】
図１１に示すように、生体分子精製部３は、生体分子回収液導入用インレット３ｂと、生体分子固定部３ｃとを備えることが好ましく、更に生体分子洗浄液導入用インレット３ａを備えることがより好ましい。
生体分子固定部３ｃは、生体分子を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エキソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。近年、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
本実施形態において、生体分子固定部３ｃが固定する生体分子はｍｉＲＮＡであることが好ましい。生体分子固定部３ｃとしては、上述したように、流路上に埋め込まれたシリカメンブレンが挙げられる。
生体分子固定部３ｃをエキソソーム破砕液が通過することにより、生体分子固定部３ｃ上に生体分子が捕捉される。
一例として、エキソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。
【００５３】
生体分子固定部３ｃに生体分子を固定した後、生体分子固定部３ｃを洗浄し、目的とする生体分子以外の夾雑物を取り除くことが好ましい。
図１１に示すように、流路３ｅ上のバルブ３ｄを開き、生体分子洗浄液導入用インレット３ａに洗浄液を注入し、吸引により洗浄液を生体分子固定部３ｃへ導入する。洗浄液としては、例えば７０％〜８０％程度のエタノールが挙げられる。
一例として、洗浄時の洗浄液使用量は１ｍＬ程度であり、吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、洗浄液の送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
【００５４】
溶液混合器への生体分子洗浄液の持ち込みを防止するために、生体分子固定部３ｃを洗浄した後、生体分子固定部３ｃを乾燥させることが好ましい。
図１１に示すように、生体分子洗浄液導入用インレット３ａから空気を吸引し、生体分子固定部３ｃを通過させることにより乾燥させる。
一例として、生体分子固定部３ｃ乾燥時の吸引圧力は、５０〜７０ｋＰａであり、乾燥に要する時間は２分程度である。
【００５５】
次いで、生体分子固定部３ｃに固定された生体分子を溶出させる。生体分子の回収率を向上させるために、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入した後、一定時間保持させることが好ましい。
図１１に示すように、流路３ｇのバルブ３ｆを開け、生体分子回収液導入用インレット３ｂに生体分子回収液を注入し、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入する。
一例として、生体分子回収液は、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒであり、該回収液の使用量は３０μＬであり、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで回収液を吸引し、回収液が生体分子固定部３ｃに到達した時点で吸引を停止させ、３分程度保持する。
【００５６】
次いで、生体分子固定部３ｃから生体分子を回収する。一例として、吸引圧力５０〜７０ｋＰａで回収液を３０秒かけて回収する。
生体分子は第二の流路６を通り、溶液混合器４へ送られる。一例として、溶液混合器４への生体分子の吸引圧力は、６ｋＰａ以下であり、３０秒程度かけて送液する。
【００５７】
生体分子の溶液混合器４への送液は、図１１中のバルブ４ｇ、４ｈを閉じて行うことが好ましい。こうすることで、溶液混合器の流路内で、生体分子を含む溶液が定量される。
なお、流路６は、一例として、バルブ４eと４ｇの間につなぐ。また、溶液排出流路としての流路１２は、先に記載の≪溶液混合器≫の第５〜７実施形態で示すように、主流路バルブ２３ｂと主流路バルブ２３ｂ’との間につなぐようにしてもよい。
【００５８】
生体分子が溶液混合器４へ送られた後、バルブ４ｄを開け、検出プローブ導入用インレット４ａに検出プローブ溶解液を注入し、検出プローブ溶解液を溶液混合器４へと送液する。検出プローブ溶解液の溶液混合器４への送液は、図１１中のバルブ４ｇ、４ｈを閉じて行う。こうすることで、溶液混合器の流路内で、検出プローブ溶解液が定量される。なお、排出用流路の位置は、先に記載の≪溶液混合器≫の第５〜７実施形態のようにしてもよい。
一例として、検出プローブ溶解液の組成は、１００〜２００ｎＭ検出プローブ、１００〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０〜３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５〜２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０〜３０ｍＭ  ＤＴＴ、５〜２０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅであり、係る検出プローブ溶解液を吸引圧力６ｋＰａ以下、３０秒程度かけて送液する。
【００５９】
次いで、バルブ４ｄ、４ｅ、４ｆ、１２ａを閉じ、バルブ４ｇ、４ｈを開けて、生体分子と検出プローブ溶解液を溶液混合器内で循環させ、混合する。一例として図示略のポンプバルブの開閉を１０分間程度継続させる。液を循環させることにより短時間で効率よく複合体（ｍｉＲＮＡ１３３―検出プローブ１３５−捕捉プローブ１３４複合体）が基板上に形成される（図２２参照）。また、溶液を循環するためのポンプは溶液混合器の流路内に配置された、バルブ４ｇ、４ｈを含む少なくとも三つのポンプバルブから成る。例えば、この三つのポンプバルブは、一つのバルブ４ｇと、二つのバルブ４ｈである。あるいは、この三つのポンプバルブは、二つのバルブ４ｇと、一つのバルブ４ｈである。ポンプバルブは、バルブ４ｇと、バルブ４ｈと、不図示のバルブとである。
【００６０】
次いで、捕捉プローブが固定されてなる基板を洗浄し、該基板上の非特異的吸着物を取り除くことが好ましい。したがって、図１１に示すように、溶液混合器４は、更に洗浄液導入用インレット４ｂを備えていることが好ましい。バルブ４ｅを開け、洗浄液導入用インレット４ｂに洗浄液を注入し、基板に導入する。
一例として、洗浄液は０．２×ＳＳＣバッファーであり、使用量は５００μＬであり、該洗浄液を吸引圧力６ｋＰａ以下、１分かけて送液して洗浄を行う。洗浄液は溶液混合器内で循環させることが好ましい。洗浄液を循環させることにより短時間で効率よく基盤の洗浄が行われる。基板を通過した廃液は、バルブ１２ａを介して第五の流路１２を通り、第三の廃液槽９へ送られる。
【００６１】
次いで、基板上に形成された複合体の標識物質の強度を測定する。標識物質の強度は、生体分子の存在量を反映するため、本実施形態によれば、サンプル中に含まれる生体分子の量を定量することができる。
標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
【００６２】
本実施形態によれば、従来は１日以上要したエキソソームの分析をわずか一時間程度で迅速に行うことができる。更には、検出部と接触させる溶液が正確に定量されているので、正確な解析が実現される。
【００６３】
≪溶液の混合方法≫
［第１実施形態］
本実施改訂の溶液の混合方法は、先に記載の溶液混合器を用いた溶液の混合方法であって、溶液導入流路から第一の溶液を送液する工程と、
主流路を定量区画して第一の溶液を定量切り出しするように、主流路バルブを閉める工程と、
溶液導入流路から第二の溶液を送液する工程と、
溶液排出バルブを閉じる工程と、
第一の溶液と第二の溶液を回転混合して第三の溶液を得る工程と、
前記第三の溶液を検出する工程と、
前記第三の溶液を検出する工程の後に、主流路に洗浄液を送液し、主流路を洗浄する工程と、
を有する。
【００６４】
本実施形態の溶液の混合方法を、以下、図１２を参照して説明する。図１２に示す混合器２０’は、先に記載の≪溶液混合器≫の第１実施形態の溶液混合器２０に、先に記載の≪溶液混合器≫の第７実施形態の溶液混合器７０が備える検出部４ｃをさらに備えたものである。まず、当該溶液混合器２０’の、主流路バルブ２３および排出流路バルブ３３が開かれた状態で（図１２Ａ参照）、溶液導入流路から第一の溶液９１を送液する（図１２Ｂ参照）。次いで、主流路２１を定量区画して第一の溶液を定量切り出しするように、主流路バルブ２３を閉める（図１２Ｃ参照）。そして、溶液導入流路４２から第二の溶液９２を送液する（図１２Ｄ参照）。溶液排出バルブ３３を閉じ、主流路バルブ２３を開け、第一の溶液９１と第二の溶液９２とを回転混合して第三の溶液９３を得る（図１２Ｅ参照）。次いで、溶液排出流路バルブ３３を開け、第三の溶液９３を排出した後、溶液導入流路４２から、洗浄液を主流路２１へと送液し、主流路を洗浄する。洗浄液を上記と同様の方法により回転混合されることにより、効率の良い洗浄が達成される。
【００６５】
［第２実施形態］
本実施形態の溶液の混合方法は、先に記載の溶液混合器を用いた溶液の混合方法であって、
前記主流路が有する複数の流路（主流路）のうち隣接する二つの流路（主流路）を選択する工程Ａと、
前記二つの流路（主流路）及び該二つの流路（主流路）に隣接する結合流路が定量区画されるように、前記流路（主流路）に隣接するバルブを閉める工程Ｂと、
前記二つの流路（主流路）のうち、第一の流路（主流路）に第一の溶液を送液する工程Ｃと、
前記二つの流路（主流路）のうち、第二の流路（主流路）に第二の溶液を送液する工程Ｄと、
前記二つの流路（主流路）同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブを開け、第一の溶液及び第二の溶液を回転混合して第三の溶液を得る工程Ｅと、
を有し、更に前記工程Ｅの後、前記二つの流路（主流路）に隣接する第三の流路（主流路）を選択する工程Ｆと、
前記第三の流路（主流路）及び該第三の流路（主流路）に隣接する結合流路が定量区画されるように、前記第三の流路（主流路）に隣接するバルブを閉める工程Ｇと、
前記第三の流路（主流路）に第四の溶液を送液する工程Ｈと、
これら三つの流路（主流路）同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブを開け、第三の溶液及び第四の溶液を回転混合して第五の溶液を得る工程Ｉと、
を有する。
【００６６】
本実施形態の溶液の混合方法を、以下、図１３〜１６を参照して説明する。図１３〜１６は、上述した溶液混合器の第３実施形態において示された溶液混合器３０’および第５実施形態において示された溶液混合器５０の変形例である。当該溶液混合器が備える結合流路で連通された流路の数は２つであったが、図１３〜１６における溶液混合器５０’は、主流路として４つの並列する流路２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄを備えている。各流路には、各溶液導入流路４２および溶液導入流路バルブ４３ａ、４３ｂ、４３ｃ、４３ｄ、並びに、各溶液排出流路３２および溶液排出流路バルブ３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、３３ｄ、を備える。また、溶液混合器５０’は、各流路同士を連通させる結合流路２２と、結合流路２２上に配置される主流路バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆとを備える。
溶液混合器５０’を用いた溶液の混合方法について、以下に説明する。工程Ａ〜Ｂは図１３Ａ〜１３Ｂを、工程Ｃ〜Ｅは図１４Ａ〜１４Ｂを、工程Ｆ〜工程Ｇは図１５Ａ〜１５Ｂを、工程Ｈ〜工程Ｉは図１６Ａ〜１６Ｂをそれぞれ参照されたい。
（工程Ａ）：まず、主流路２１のうち隣接する二つの流路（主流路）２１ａ、２１ｂを選択する。
（工程Ｂ）：前記二つの流路（主流路）２１ａ、２１ｂ及び該二つの流路（主流路）に隣接する結合流路２２が定量区画されるように、前記流路（主流路）に隣接する主流路バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄおよび溶液排出流路バルブ３３ａ、３３ｂを閉める。
（工程Ｃ/Ｄ）：前記第一の流路（主流路）２１ａに第一の溶液９１を、前記第二の流路（主流路）２１ｂに第二の溶液９２をそれぞれ送液する。
（工程Ｅ）：前記流路（主流路）２１ａと流路（主流路）２１ｂ同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブ２３ａ、２３ｂを開け、第一の溶液９１及び第二の溶液９２を回転混合して第三の溶液９３を得る。
（工程Ｆ）：二つの流路（主流路）２１ａ、２１ｂに隣接する第三の流路（主流路）２１ｃを選択する。
（工程Ｇ）：流路（主流路）２１ｃ及び流路（主流路）２１ｃに隣接する結合流路が定量区画されるように、流路（主流路）２１ｃに隣接する主流路バルブ２３ｅ、２３ｆ及び溶液排出流路バルブ３３ｃを閉める。
（工程Ｈ）：流路（主流路）２１ｃに第四の溶液９４を送液する。
（工程Ｉ）：これら三つの流路（主流路）２１ａ、２１ｂ、２１ｃ同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄを開け、第三の溶液及び第四の溶液を回転混合して第五の溶液９５を得る。
【００６７】
本実施形態で示したように、溶液混合器５０’が備える並列する複数の流路を順次選択することにより、溶液を所望の溶液同士を回転混合することができる。また同様に前記工程Ｆから前記工程Ｉを繰り返し、回転混合を行ってもよい。
【００６８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
［エキソソームの精製］
ガラス表面に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（以下、ＡＰＴＥＳともいう。）を修飾し、ＡＰＴＥＳ末端にエキソソームを固定化する前記式（１）で表されるＰＥＧ脂質誘導体、非特異吸着を抑制するメトキシＰＥＧを修飾した。次に、ポリメタクリルスチレンを切削加工することで、精製デバイスを作製した。乳がん細胞株ＭＣＦ−７の培養上清を超遠心し回収したエキソソーム懸濁液およびヒト血清中のエキソソームをデバイス内で固定した後、ＡＦＭで固定粒子密度を計測した。
デバイス内で固定化されたエキソソームのＡＦＭ像と固定密度を図１７に示す。まず、ＡＦＭ像より３０−２００ｎｍの直径を持つ粒子が固定化されていることを確認した。
次に、固定層からの距離に対し、固定密度が指数関数的に減少することを確認した。また、ヒト血清から直接固定化した場合の固定量が、精製済みエキソソームを固定した場合の７４%であることから、メトキシＰＥＧが非特異吸着の抑制に寄与していると考えられる。
【００７０】
［ｍｉＲＮＡ精製］
流路内に小型化したシリカメンブレンを固定したデバイスを作製し、ｍｉＲＮＡの精製を行った。ｍｉＲＮＡをエキソソーム破砕液に懸濁し、吸引操作によりシリカメンブレンを通過させた。続いてシリカメンブレンの洗浄、乾燥を行った後、ｍｉＲＮＡ溶出液を導入しｍｉＲＮＡを回収した。ｍｉＲＮＡ回収量は定量リアルタイムＰＣＲにより求めた。
また、一般的なスピンカラム法との比較として、ＱＩＡＧＥＮ社ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
ｍｉＲＮＡの回収結果を図１８に示す。本ユニットではシリカメンブレンのサイズを小型化することによって、所要時間の短縮と使用試薬の低減が達成された。また、サイズの小型化に伴い、少量の溶出液でｍｉＲＮＡを回収することできるようになり、ｍｉＲＮＡ溶液の濃縮が可能となった。
【００７１】
［ｍｉＲＮＡ検出］
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−２１、ｌｅｔ−７ａ，ｌｅｔ−７ｂ，ｌｅｔ−７ｄ，ｌｅｔ−７ｆ、ｍｉＲ−３９の配列を有するＲＮＡを合成した。また、それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する検出プローブ合計１２種の核酸プローブを設計・合成した。一方、それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する捕捉プローブをガラス基板上で合成し、スポット状に配置した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ１：ｍｉＲ−１４１
［配列：５’−ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ−３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ２：ｍｉＲ−１４３
［配列：５’−ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣ−３’］ （配列番号２：２１ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ３：ｍｉＲ−１２７５
［配列：５’− ＧＵＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＵＧＵＣ−３’］ （配列番号３：１７ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ４：ｍｉＲ−１０７
［配列：５’− ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡ−３’］ （配列番号４：２３ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ５：ｍｉＲ−１８１ａ−２＊
［配列：５’− ＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣ−３’］ （配列番号５：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ６：ｍｉＲ−４８４
［配列：５’− ＵＣＡＧＧＣＵＣＡＧＵＣＣＣＣＵＣＣＣＧＡＵ−３’］ （配列番号６：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ７：ｍｉＲ−２１
［配列：５’− ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ−３’］ （配列番号７：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ８：ｌｅｔ−７ａ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号８：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ９：ｌｅｔ−７ｂ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ−３’］ （配列番号９：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１０：ｌｅｔ−７ｄ
［配列：５’− ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号１０：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１１：ｌｅｔ−７ｆ
［配列：５’− ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ−３’］ （配列番号１１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ１２：ｍｉＲ−３９
［配列：５’− ＵＣＡＣＣＧＧＧＵＧＵＡＡＡＵＣＡＧＣＵＵＧ−３’］ （配列番号１２：２２ｍｅｒ）
【００７２】
（２）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’−ｐ−Ｘ１−ｆＳ−３’］
Ｘ１は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−フルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１３：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ２（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ１：ＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号１４：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ３（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ１：ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１５：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ４（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ１：ＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１６：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ５（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ１：ＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１７：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ６（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ１：ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１８：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ７（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ１：ＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１９：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ８（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２０：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ９（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ１：ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２１：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１０（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１１（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ１：ＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２３：６０ｍｅｒ）
捕捉プローブ１２（Ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ１：ＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２４：６０ｍｅｒ）
【００７３】
（３）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’−ｐ−Ｘ２−Ａｌ−Ｘ３−３’］
Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７−ＡｍｉｎｏＣ６−ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号２６：２６ｍｅｒ）
検出プローブ２（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡ（配列番号２７：２６ｍｅｒ）
検出プローブ３（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号２８：２６ｍｅｒ）
検出プローブ４（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＴＡＧＣＣ（配列番号２９：２６ｍｅｒ）
検出プローブ５（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴ（配列番号３０：２６ｍｅｒ）
検出プローブ６（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＣＧＧＧＡＧ（配列番号３１：２６ｍｅｒ）
検出プローブ７（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＣＡＴＣ（配列番号３２：２６ｍｅｒ）
検出プローブ８（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣ（配列番号３３：２６ｍｅｒ）
検出プローブ９（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号３４：２７ｍｅｒ）
検出プローブ１０（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣ（配列番号３５：２６ｍｅｒ）
検出プローブ１１（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：)ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣＡ（配列番号３６：２７ｍｅｒ）
検出プローブ１２（Ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡ（配列番号３７：２６ｍｅｒ）
【００７４】
上述した捕捉プローブを固定したＤＮＡマイクロアレイ基板を株式会社Ａｇｉｌｅｎｔ社から購入し、表１の溶液に接触させながら室温で９０分放置した。ＤＮＡマイクロアレイ基板を超純水で洗浄・乾燥後、当該溶液混合器に設置した。
表１中、Ｔａｋａｒａ  １０×ｂｕｆｆｅｒの組成は、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴである。
【００７５】
【表１】
2019193931.tif 000004
【００７６】
さらに、任意の濃度のｍｉＲＮＡ溶液を表２のように調整し、検出プローブを含有するハイブリダイゼーション反応溶液を表３のように調製した。
【００７７】
【表２】
2019193931.tif 000005
【００７８】
【表３】
2019193931.tif 000006
【００７９】
調製したｍｉＲＮＡ溶液を溶液混合器のインレット１から、ハイブリダイゼーション反応溶液をインレット２から導入し、１０分間循環させてハイブリダイゼーションさせた。
【００８０】
ハイブリダイゼーション反応終了後、インレット３から０．３Ｍ  ＮａＣｌと３０ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含む洗浄液を５００μｌ流してＤＮＡマイクロアレイ基板を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した上で、蛍光強度を測定した。
結果を図１９に示す。図１９（ａ）は、ｍｉＲＮＡ検出結果を示す基板の画像である。
図１９（ｂ）は、図１９（ａ）に対応しており、網掛けで示したスポットが、標的ｍｉＲＮＡに対応するスポットで、蛍光が観察されるべきスポットである。各アルファベットは下記のｍｉＲＮＡに対応している。
A：141、B：143、C：1275、D：107、E：181a-2*、F：484、S：let-7a、T：let-7b、U：let-7d。
導入したｍｉＲＮＡに対応するプローブを固定した各スポットにおいて、Ａｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察された。なお、「C」のｍｉＲ-１２７５は、検出限界濃度を確認するため他のｍｉＲＮＡの１０００分の１の濃度で入れたため、蛍光が暗くなっている。また、プローブの配列ごとに明るさが異なるのは、プローブの親和性が異なるためである。
このことから、該溶液混合器を用いてｍｉＲＮＡを配列依存的に検出できることが確認された。
【００８１】
［溶液の定量と回転混合］
溶液混合器の主流路２１上のバルブ２３ａ、２３ｂを閉じた状態で、バルブ４３ａを開け、第一の溶液９１を溶液混合器へと送液した（図２０（２））。バルブ３３を閉じた状態で、バルブ４３ｂを開け、第二の溶液９２を溶液混合器へと送液した（図２０（３））。次いで、バルブ４３ａ、４３ｂ、３３が閉じた状態で、２３ａ、２３ｂを開き、ポンプバルブ（２３ａ）からなるポンプを始動させ、第一の溶液９１と第二の溶液９２とを回転混合させ、第三の溶液９３を得た（図２０（４），図２０（５））。第一の溶液９１と第二の溶液９２とは、十分に混合されていた。
【００８２】
［流体デバイスにおけるバルブの開閉］
図２１Ｂに示す流体デバイスを作製した。図２１Ａの表に示すような各工程におけるバルブの開閉制御により、流体の流れを制御できることが確認された。
【００８３】
以上の結果から、本実施形態によれば、エキソソームが内包する標的ｍｉＲＮＡを含む溶液と、検出プローブを含む溶液とを、流路上に検出部を有する溶液混合器によって定量混合できる。また、エキソソームの迅速な分析を自動化できる。
【符号の説明】
【００８４】
１…流体デバイス、２…エキソソーム精製部、２ａ…洗浄液導入用インレット、２ｂ…サンプル導入用インレット、２ｃ…破砕液導入用インレット、２ｄ…エキソソーム固定部、２ｅ，２ｆ，２ｇ，３ｄ，３ｆ，４ｆ，４ｇ，４ｈ，５ａ，１０ａ，１１ａ，…バルブ、２ｈ，２ｉ，２ｊ，３ｅ，３ｇ…流路、３…生体分子精製部、３ｂ…生体分子回収液導入用インレット、３ｃ…生体分子固定部、４…溶液混合器、４ｃ…検出部、５…第一の流路、６…第二の流路、７…第一の廃液槽、８…第二の廃液槽、９…第三の廃液槽、１０…第三の流路、１１…第四の流路、１２…第五の流路、  ２０，２０’，３０，３０’，４０，５０，５０’，６０，７０，８０…溶液混合器、２１ａ，２１ｂ，２１ｃ，２１ｄ（２１）…主流路、３１…折り返し構造、２２…結合流路、３２…溶液排出流路、２３ａ，２３ｂ，２３ｃ，２３ｄ，２３ｅ，２３ｆ（２３）…主流路バルブ、２４…ポンプバルブ、３３ａ，３３ｂ，３３ｃ，３３ｄ（３３）…溶液排出流路バルブ、４３ａ，４３ｂ，４３ｃ，４３ｄ，（４３）…溶液導入流路バルブ、９１…第一の溶液、９２…第二の溶液、９３…第三の溶液、９４…第四の溶液、９５…第五の溶液、  １３３…ｍｉＲＮＡ、１３１…第一の部分、１３２…第二の部分、１３４…捕捉プローブ、１３４ａ…スペーサー、１３５…検出プローブ、１３５ａ…標識物質、１３５ｂ…配列、１３５ｃ，１３５ｄ…ステム部、１３６…基板。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月7日(2019.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内の体積が定められた主流路と、
前記主流路をそれぞれ独立した体積を有する流路に区画する、少なくとも２つの主流路バルブと、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液導入流路と、
前記主流路に接続する少なくとも１つの溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、
前記区画された主流路のそれぞれに前記溶液導入流路から溶液が充填され、
前記溶液は、前記主流路バルブが開放され、前記区画された主流路が連通されて混合される、溶液混合容器。
【請求項２】
前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブが開放された状態で、第一の溶液が前記溶液導入流路から前記主流路に送液され、
前記主流路バルブが閉じられ、
第二の溶液が前記溶液導入流路から前記主流路に送液され、
前記溶液排出流路バルブが閉じられ、
前記主流路バルブが開けられ、前記第一の溶液と前記第二の溶液とが循環されて混合されるよう前記主流路バルブが駆動する、請求項１に記載の溶液混合容器。
【請求項３】
前記主流路の区画された領域の全てに、少なくとも１つの溶液導入流路と少なくとも１つの溶液排出流路が接続する、請求項１又は２に記載の溶液混合容器。
【請求項４】
前記主流路の区画された領域のそれぞれに、前記溶液導入流路から溶液が導入され、
前記主流路バルブをすべて開放することにより、前記溶液が循環されて混合されるよう前記主流路バルブが駆動する、請求項３に記載の溶液混合容器。
【請求項５】
前記主流路は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、を含み、
前記主流路バルブは、前記第一の結合流路及び／又は前記第二の結合流路に配置されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の溶液混合容器。
【請求項６】
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液導入流路及び第二の溶液導入流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液排出流路及び第二の溶液排出流路と、
前記第一の溶液排出流路及び前記第二の溶液排出流路にそれぞれ配置された第一の溶液排出流路バルブ及び第二の溶液排出流路バルブと、を備え、
前記主流路バルブは、前記第一の結合流路及び前記第二の結合流路にそれぞれ配置された第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブを有し、それら第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の区画された領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置され、
前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを閉じ、前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第一の溶液導入流路から前記第一の流路に第一の溶液が導入され、前記第二の溶液導入流路から前記第二の流路に第二の溶液が導入され、
前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブが閉じられ、前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブが開放され、前記第一の溶液及び前記第二の溶液が循環されて混合されるよう前記第一の主流路バルブ又は前記第二の主流路バルブが駆動する、請求項５に記載の溶液混合容器。
【請求項７】
前記溶液混合容器は、更に、
第三の流路と、
前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液導入流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液排出流路と、
前記第三の溶液排出流路に配置された第三の溶液排出流路バルブと、
前記第三の結合流路及び前記第四の結合流路にそれぞれ配置された第三の主流路バルブ及び第四の主流路バルブと、
を有し、
前記第一の溶液及び前記第二の溶液が循環されて混合される前又は後に、前記第三の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第三の溶液導入流路から前記第三の流路に第三の溶液が導入され、
第三の溶液導入流路から前記第三の流路に第三の溶液が導入された後に、前記第三の溶液排出流路バルブが閉じられ、前記第三の主流路バルブ及び前記第四の主流路バルブが開放されて、前記第一の溶液及び前記第二の溶液と、又は前記第一の溶液及び前記第二の溶液の混合溶液と、第三の溶液とが循環されて混合されるよう前記第一の主流路バルブから前記第四の主流路バルブのいずれか１つ以上が駆動する、請求項６に記載の溶液混合容器。
【請求項８】
前記主流路バルブが前記溶液導入流路及び前記溶液排出流路の近傍に配置されている請求項１〜７のいずれか一項に記載の溶液混合容器。
【請求項９】
前記主流路は、溶液中の物質の検出部を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の溶液混合容器。
【請求項１０】
前記溶液中の物質は生体分子であり、
前記検出部は、前記生体分子に親和性を有する物質が固定された基板を含む、請求項９に記載の溶液混合容器。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の溶液混合容器を備える、流体デバイス。