(57)【要約】【課題】肌の老化現象、特にたるみを改善又は予防する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供する。【解決手段】低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とする。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とする、
低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞が脂肪細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗老化成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法であることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定することを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇を、低酸素条件で培養した細胞において低酸素応答が生じていることの指標とすることを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制剤。
【請求項９】
ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化抑制剤。
【請求項１０】
ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、加齢に伴うたるみの改善又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組織の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、加齢に伴う人体の各組織の機能低下、すなわち老化現象を抑制することを目的とするアンチエイジングに関する研究が盛んに行われている。特に美容、化粧料の技術分野においては加齢に伴う肌のしわ、たるみ、しみなどの老化現象を抑制する有効成分の探索がされている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、細胞における皮膚支帯成分の発現量を指標として、シワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止などの効果を有する有効成分をスクリーニングする方法が開示されている。
特許文献２には、細胞の核膜異常状態を指標として、シワの予防又は改善効果を有する成分をスクリーニングする方法が開示されている。
【０００４】
また、皮下組織に存在する皮下脂肪細胞に着目して、たるみの改善を狙う研究も行われている。特許文献３には、皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標としてたるみ改善成分をスクリーニングする方法が開示されている（特許文献３）。
【０００５】
ところで、血液ガス分析による解析により、動脈血のｐＯ２（酸素分圧）が低下することが知られている（非特許文献１）。これは加齢に伴い人体の各組織が低酸素の状態に置かれることを示している。
このような知見により、低酸素状態と老化現象の関連が示唆されているが、低酸素状況下でどのような生理学的変化が起こることで老化が起こるのか、そのメカニズムの全容は明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−１１２９１８号公報
【特許文献２】特開２０１３−２５７３４７号公報
【特許文献３】特開２０１６−１８７３２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】本老年医学会雑誌／１５巻（１９７８）１号、「健康老年者の動脈血ガス分析値」、田口悦子ら、１９７８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の解決しようとする課題は、肌の老化現象、特にたるみを改善又は予防する効果のある成分をスクリーニングするための新たな技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らの鋭意研究の結果、皮下脂肪層の相対的な粘弾性が加齢に伴い低下することが明らかとなった。この知見に基づき、さらに詳細な解析を行ったところ、皮下組織に存在する皮下脂肪細胞を包むコラーゲン線維が、加齢とともに線維化することが明らかとなった。加齢に伴い動脈血の酸素濃度が低下することが知られていることから（非特許文献１）、本発明らは皮下脂肪細胞の線維化は低酸素条件によって惹起されている可能性に着目した。そして、さらなる解析の結果、本発明者らは低酸素条件下に置かれた皮下脂肪細胞において、コラーゲン線維の架橋に関わる遺伝子であるｌｏｘの発現量の上昇が観察されることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とする、
低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法である。
【００１１】
本発明の方法によれば、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。
【００１２】
本発明の好ましい形態では、前記細胞が脂肪細胞である。これにより、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をより精度よくスクリーニングすることができる。
【００１３】
本発明は、抗老化成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい形態では、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞と比較して、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定する。
このように対照実験を行うことにより、より精度よくスクリーニングを行うことができる。
【００１６】
本発明の好ましい形態では、前記低酸素条件が、細胞培養雰囲気中の酸素濃度が５％以下の条件である。
このような条件下で細胞培養を行うことにより、より効果的にスクリーニングを行うことができる。
【００１７】
本発明の好ましい形態では、ｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇を、低酸素条件で培養した細胞において低酸素応答が生じていることの指標とする。
このような指標を置くことにより、試験系の適正性を確認することができ、より正確にスクリーニングを行うことができる。
【００１８】
また、本発明は上述のスクリーニング方法により見出された有効成分にも関する。具体的には、本発明はナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制剤及び皮下脂肪細胞の線維化抑制剤、並びに加齢に伴うたるみの改善又は予防剤にも関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、抗老化成分、具体的には低酸素条件及び／又は加齢による組織の線維化を抑制する成分を容易にスクリーニングすることができる。
また本発明のスクリーニング法でその有効性が確認されたナデシコ科サボンソウ属に属する植物の抽出物を有効成分として含む剤は、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制効果、皮下脂肪細胞の線維化抑制効果、並びに加齢に伴うたるみの改善効果又は予防効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】皮下脂肪細胞の線維化の程度を評価するために用いた、電子顕微鏡により取得された基準写真である。線維化の進行の程度が最も低いものがスコア１の写真であり、線維化の進行の程度が最も高いものがスコア５の写真である。
【図２】９名のドナーの皮下脂肪細胞を観察し、基準写真をもとにスコアをつけた結果を表す散布図である。
【図３】通常の酸素濃度条件、及び低酸素条件において培養した細胞における、皮下脂肪細胞の線維構造の相違を示す顕微鏡写真である。
【図４】通常の酸素濃度条件、及び低酸素条件において培養した細胞におけるｖｅｇｆ遺伝子、ｃｏｌ１ａ１遺伝子、ｃｏｌ３ａ１遺伝子、ｔｇｆ−β遺伝子、及びｌｏｘ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。
【図５】サボンソウ葉エキス又はブドウ葉エキスを添加し、低酸素条件において培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量を表す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は低酸素条件において進行する皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングする方法である。また、加齢に伴い組織が低酸素条件に置かれることから、本発明は、加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をもスクリーニングの対象とすることができる。
【００２２】
ここで、「線維化」とは、組織を取り巻くコラーゲンの異常な増加やコラーゲン線維同士が架橋することにより、組織が硬くなる現象のことをいう。
線維化の要因としてはコラーゲンそのものの発現量の増加や、コラーゲン線維構造の架橋反応に関わる遺伝子の発現量の増加が想定できるが、発明者の鋭意研究の結果、低酸素条件で生じる皮下脂肪細胞の線維化にはｌｏｘ遺伝子の発現量の上昇が深く関わっていることが明らかとなった。
【００２３】
ｌｏｘ遺伝子の産物であるＬＯＸ（リシンオキシダーゼ）は、コラーゲンとエラスチン前駆体のリシン残基にアルデヒド基を形成する反応を触媒する細胞外酵素である。これらアルデヒドは反応性が高く、他の酸化リシン由来アルデヒド基や無修飾のリシン残基と自発的な化学反応を起こす。その結果、コラーゲン線維の安定化や、成熟エラスチンの完全性と弾性に重要な、コラーゲンとエラスチンの架橋を生じさせる。
【００２４】
ｌｏｘ遺伝子自体は組織の安定化に重要な役割を果たすが、発現が亢進することによって線維化を生じさせる。上述したとおり、低酸素下における皮下脂肪細胞の線維化は、コラーゲンの発現上昇ではなく、ｌｏｘ遺伝子の発現上昇が要因である。そのため、低酸素条件下におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇を抑制する成分は、すなわち、低酸素条件や加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であるということができる。
【００２５】
以上より、本発明は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることを必須の構成とする。
【００２６】
上述したように、皮下脂肪細胞は、加齢（動脈血中の酸素濃度の低下）に伴い線維化が進行する。したがって、本発明は、低酸素条件及び／又は加齢による、皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分のスクリーニング方法に好適に応用することができる。
【００２７】
また、皮下脂肪層における脂肪細胞を包むコラーゲン線維構造の線維化が進むと、皮下組織の物理学的特性が悪化し、皮膚の重みを支えることが困難になり、皮膚のたるみに代表される老化が進む。
したがって、本発明は、抗老化成分、より具体的には、加齢に伴うたるみの改善又は予防成分のスクリーニング方法に応用することが好ましい。
【００２８】
以下、本発明の具体的な構成について説明を加える。
本発明に用いる細胞は、樹立された培養細胞株であってもよく、また、初代培養細胞であってもよい。
細胞の種類も特に限定されないが、脂肪細胞を用いることが好ましい。褐色脂肪細胞であっても白色脂肪細胞であってもよいが、好ましくは白色脂肪細胞を用いる。
皮下脂肪前駆細胞を分化させることで得た、成熟した皮下脂肪細胞を本発明に用いてもよい。
【００２９】
細胞培養に用いる培地は使用する細胞に適した公知のものを制限なく用いることができる。皮下脂肪前駆細胞を皮下脂肪細胞に分化させる場合に使用する増殖培地、分化培地、維持培地は公知の何れのものであってもよく、市販のキットを用いてもよい。
【００３０】
本発明においては低酸素条件で細胞を培養することが必須である。通常の細胞培養におけるＣＯ２インキュベーターにおいて酸素濃度は１８〜１９％程度であるので、これよりも低い酸素濃度で細胞を培養する。具体的には、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは７％以下、さらに好ましくは５％以下、さらに好ましくは３％以下の酸素濃度で細胞を培養する。
酸素濃度の下限は培養細胞が死滅しなければ特に制限されないが、好ましくは０．１％以上、より好ましくは０．５％以上の酸素濃度で細胞を培養する。
【００３１】
低酸素条件での細胞培養においては、炭酸ガスの他に窒素ガスや混合ガスなどのボンベを併設した低酸素濃度培養用ＣＯ２インキュベーター（例えば、池本理化工業社製）を用いてもよいし、ガス濃度調節剤を備えるガスバリア性パウチからなる低酸素培養器具（例えば、スギヤマ技研製）を用いてもよい。
【００３２】
本発明においては低酸素条件下で培養している細胞の培地に被検成分を添加し、所定の期間培養を継続した後にｌｏｘ遺伝子の発現量を測定する。
ｌｏｘ遺伝子の発現量の測定方法は限定されず、回収した細胞におけるｌｏｘ遺伝子のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲによって測定する方法が好ましく例示できる。
【００３３】
低酸素条件で細胞を培養するとｌｏｘ遺伝子の発現量が上昇する。本発明においては、被検成分を培地に添加したとき、低酸素条件におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の程度が低減した場合に、当該被検成分が低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分であると判定し選択する。
【００３４】
被検成分が低酸素条件におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を有しているか否か正確に判定するために対照実験も実施することが好ましい。
すなわち、被検成分の非存在下において低酸素条件で培養した細胞を対照として、被検成分の存在下において低酸素条件下で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現量を比較する。前者よりも後者の方がｌｏｘ遺伝子の発現量が低い場合に、該被検成分を低酸素条件及び／又は加齢による組織の線維化を抑制する成分であると判定することが好ましい。
【００３５】
ｌｏｘ遺伝子の発現量の測定に加え、細胞が低酸素応答反応を起こしていることを確認するために、低酸素応答反応のマーカーであるｖｅｇｆ遺伝子の発現量を測定することも好ましい。
ｖｅｇｆ遺伝子の発現量が、通常の酸素濃度で細胞を培養したときに比べて高いことが確認できれば、試験系が適正であると評価することができ、スクリーニングの正確性を向上させることができる。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法によれば、低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングすることができる。そして、本発明は、上記スクリーニング方法により見出された成分を有効成分として含む剤にも関する。
【００３７】
低酸素条件及び／又は加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分としては、ナデシコ科サボンソウ属（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ）に属する植物の抽出物を挙げることができる。
【００３８】
ナデシコ科サボンソウ属に属する植物としては、特に限定されないが、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）を例示することができる。
【００３９】
本発明における前記植物の抽出物は、日本又は外国において自生又は生育された植物、漢方生薬原料などとして販売されるものを用い抽出物を作製することもできるし、丸善株式会社などの植物抽出物を扱う会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することもできる。
【００４０】
植物抽出物は、植物抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物ないしは画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
【００４１】
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。
抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。
【００４２】
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００４３】
本発明の剤は、製剤化に用いられる任意の成分と適宜組み合わせて、外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。
外用剤としては、例えば、化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態が挙げられる。また、それらの剤形は特に制限されない。中でも、加齢に伴う皮膚のたるみを改善又は予防するという用途との関係から、継続的に使用可能な化粧料の形態が好ましく、中でも、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。
【００４４】
また、経口剤とする場合には、本発明の剤を有効成分として含む食品用組成物の形態とすることが好ましい。より具体的には、一般食品、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤等の剤形を有するサプリメントの形態とすることが好ましい。
【００４５】
外用剤における植物抽出物の含有量（抽出物の場合は乾燥質量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。
【００４６】
また、経口剤の場合には、剤形に応じて、１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上であり、通常２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。
【００４７】
化粧料の形態とする場合には、通常化粧料で使用される任意成分を含有していてもよい。任意成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩，ビタミンＢ６トリパルミテート，ビタミンＢ６ジオクタノエート，ビタミンＢ２又はその誘導体，ビタミンＢ１２，ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
＜試験例１＞加齢に伴うコラーゲン構造の変化の観察
２０才以上の９名のドナーより提供された皮下組織における皮下脂肪細胞を走査型電子顕微鏡により撮影した。この電子顕微鏡写真を熟練の評価者に評価させ、皮下脂肪細胞の線維化の程度について１〜５のスコアをつけさせた。評価は、線維化の進行度が異なる５段階の基準写真（図１）を基準として行わせた。結果を図２に示す。
【００４９】
図２に示すように、ドナーの年齢と皮下脂肪細胞の線維化の程度が有意に相関した。この結果は、加齢に伴い皮下脂肪細胞の線維化が進行することを示している。
加齢に伴い動脈血中の酸素濃度が低下することを考慮すると、加齢によって皮下脂肪組織が低酸素条件に置かれることが、加齢に伴う皮下脂肪細胞の線維化の進行の要因であると考えられる。
【００５０】
＜試験例２＞低酸素条件によるコラーゲン構造の変化の観察
ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、３日おきに分化培地を交換しながら１４日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。その後、維持培地に交換し、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、対照として脱酸素剤を除いた低酸素培養器具にプレートを封入し、培養を継続した細胞も用意した。培養後、コラーゲン線維の構造を走査型電子顕微鏡により撮影した。結果を図３に示す。
【００５１】
図３に示すように、低酸素条件で培養した細胞では、通常の酸素濃度で培養した細胞に比べ、コラーゲン線維の太さが不均一であり、不定形な構造を形成することがわかった。
【００５２】
＜試験例３＞低酸素条件における細胞培養
ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、３日おきに分化培地を交換しながら１４日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。その後、維持培地に交換し、脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。このとき、対照として脱酸素剤を除いた低酸素培養器具にプレートを封入し、培養を継続した細胞も用意した。維持培地への交換から１日後、培養を終了し、以下の手順によりｍＲＮＡを抽出した。
【００５３】
ＰＢＳによってウェル内の細胞を洗浄したのち、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＱＩＡｚｏｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加（１ｍＬ／ウェル）し、細胞からｍＲＮＡを抽出した。
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により、抽出したｍＲＮＡをｃＤＮＡとした。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ｃｏｌ１ａ１遺伝子、ｃｏｌ３ａ１遺伝子、ｔｇｆ−β遺伝子、及びｌｏｘ遺伝子の発現量を測定した。このとき低酸素応答のマーカーであるｖｅｇｆ遺伝子の発現量も併せて測定した。結果を図４に示す。
【００５４】
図４に示すように、低酸素条件で培養を行った細胞においてはｖｅｇｆ遺伝子の発現量の上昇が観察された。つまり、低酸素条件における培養により細胞が低酸素応答反応を起こしていることが確認できた。
【００５５】
また、図４に示すようにｃｏｌ１ａ１遺伝子及びｃｏｌ３ａ１遺伝子の発現量は、低酸素条件での培養では変化しないことがわかった。
一方、ｔｇｆ−β遺伝子及びｌｏｘ遺伝子の発現量は低酸素条件での培養により顕著に上昇した（図４）。
【００５６】
ｌｏｘ遺伝子の産物であるＬＯＸはコラーゲン線維の架橋に関わる酵素である。また、ＴＧＦ−βはコラーゲン線維の産生に関わる因子である。つまり、図４に示した結果は、低酸素条件においてはコラーゲン線維に関わるＬＯＸ及びＴＧＦ−βの生産量が増加し、線維化が促進されうることを示している。
【００５７】
＜考察＞
試験例１と試験例３の結果は、加齢によって皮下脂肪細胞が低酸素条件に置かれると、ｌｏｘ遺伝子の発現が上昇し、その遺伝子産物であるＬＯＸがコラーゲン線維の架橋を促進すること等によって、線維化が進行することを示している。これは、低酸素条件においてｌｏｘ遺伝子の発現上昇を抑制することができる成分は、皮下脂肪細胞の線維化を抑制できることを示している。
つまり、試験例１及び３の結果は、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングできることを示している。
【００５８】
＜試験例４＞スクリーニング試験
ヒト皮下脂肪前駆細胞（ＨＰＡｄ）を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種（１．５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）した。４８時間後に増殖培地を用いて培地交換を行った。
その４８時間後、分化培地に交換し、分化を開始した。２日に１回のペースで培地交換を実施しながら、１７日間の分化培養を行った。
維持培地に培地交換し、そこへスクリーニング対象であるサボンソウ葉エキス及びブドウ葉エキスを添加した。エキスを添加しないプレートを対照として用意した。
脱酸素剤を備えた低酸素培養器具（ＢＩＯＮＩＸ、スギヤマ技研製）にプレートを封入し、酸素濃度１％に調節したうえで培養を継続した。
７２時間培養後、試験例３と同様の方法でｍＲＮＡを回収し、逆転写によってｃＤＮＡライブラリーを作製したうえで、リアルタイムＰＣＲによりＬＯＸ遺伝子の発現量を解析した。結果を図５に示す。
【００５９】
図５に示すように、サボンソウ葉エキスは、低酸素条件下におけるｌｏｘ遺伝子の発現量の上昇を有意に抑制する効果を発揮した。一方、ブドウ葉エキスには、このような有意な効果が見られなかった。
本試験例により、低酸素条件で培養した細胞におけるｌｏｘ遺伝子の発現上昇の低減効果を指標とすることで、低酸素条件ないし加齢による皮下脂肪細胞の線維化を抑制する成分をスクリーニングできることが確認できた。
【００６０】
また、この結果は、ナデシコ科サボンソウ属に属する植物の抽出物を有効成分として含む剤は、低酸素条件及び／又は加齢によるｌｏｘ遺伝子の発現の上昇抑制効果、皮下脂肪細胞の線維化抑制効果、並びに加齢に伴うたるみの改善効果又は予防効果を発揮することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明はアンチエイジングに関する有効成分の探索に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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