(57)【要約】【課題】ライソゾーム病の各疾患に対応するより多くの酵素を迅速に検出する。【解決手段】  分析方法は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、この４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、分離された反応生成物を質量分析により検出することとを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、  
前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、
分離された前記反応生成物を質量分析により検出することと
を備え、
前記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である分析方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の分析方法において、
前記酵素は、４以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素を含む分析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の分析方法において、
前記酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される３以上の酵素を含む分析方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の分析方法において、
前記酵素は、５以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素を含む分析方法。
【請求項６】
請求項５に記載の分析方法において、
前記酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む分析方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の分析方法において、
生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、
前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される分析方法。  
【請求項８】
請求項７に記載の分析方法において、
前記液体クロマトグラフィにおいて、少なくとも一つの前記反応生成物の保持時間は、対応する前記基質の保持時間より短い分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の分析方法において、
前記少なくとも一つの反応生成物は、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される少なくとも一つの酵素による反応生成物を含む分析方法。
【請求項１０】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記液体クロマトグラフィにおいて、前記反応生成物を分離するカラムの長さは５０ｍｍ未満である分析方法。
【請求項１１】
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記液体クロマトグラフィが終了するときの保持時間は３分より短い分析方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低かった酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力することをさらに備える分析方法。
【請求項１３】
ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得された試料に含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物を含む分析用試料を液体クロマトグラフに導入する試料導入部と、
導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物を分離する液体クロマトグラフと、
前記液体クロマトグラフにより分離された前記反応生成物を質量分析により検出する質量分析部と
を備え、
前記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む分析装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の分析装置において、
前記分析用試料は、前記反応生成物および前記基質を備え、
前記液体クロマトグラフは、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物および前記基質を分離する分析装置。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の分析装置において、
前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力する出力部をさらに備える分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析方法および分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライソゾーム病は、タンパク質、脂肪および糖等を分解する酵素が、遺伝的原因により減少または欠損したり、正常に働かなくなることで、ライソゾームにおいて分解されるべき物質が蓄積し、細胞死や臓器等の組織の機能不全を起こす病気である。例えば、ムコ多糖症では、ライソゾーム内で働く加水分解酵素の欠損等により、ライソゾームにムコ多糖であるグリコサミノグリカンが蓄積する。ムコ多糖症の患者は骨および関節の異常や、知能障害等の様々な症状により、成人までに死亡する例も少なくない。
【０００３】
ライソゾーム病は、酵素補充療法や造血幹細胞移植等により治療がなされるが、予後をよくするためには早期の発見が重要である。従って、新生児に対してライソゾーム病の原因遺伝子に対応する酵素が十分に産生されているかを調べるスクリーニング検査を行うことが提案されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
このようなスクリーニング検査において、血液試料に各ライソゾーム病と関連する酵素の基質を加え、酵素反応による反応生成物をタンデム質量分析計や液体クロマトグラフ−質量分析計を用いて検出し、生体内での酵素の活性を測定することが行われている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国特表２０１７−５２６９２３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Michael H. Gelb, C. Ronald Scott, and Frantisek Turecek. "New born screening for lysosomal storage diseases," Clinical chemistry,（米国）, American Association for Clinical Chemistry, 2015年1月、Volume 61, Issue 2, pp.335-346
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、質量分析において、質量分析用試料に含まれる、ライソゾーム病に関連する酵素の基質がイオン化された後に解離を起こし、解離されたイオンが反応生成物と区別が難しくなってしまう等の理由で、反応生成物を十分に分離して検出することができない問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、分離された前記反応生成物を質量分析により検出することとを備え、前記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、４以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される３以上の酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、５以上のムコ多糖症の病型のそれぞれにおいて、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼを含む。
さらに好ましい実施形態では、生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される。
さらに好ましい実施形態では、前記液体クロマトグラフィにおいて、少なくとも一つの前記反応生成物の保持時間は、対応する前記基質の保持時間より短い。
さらに好ましい実施形態では、前記少なくとも一つの反応生成物は、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される少なくとも一つの酵素による反応生成物を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記液体クロマトグラフィにおいて、前記反応生成物を分離するカラムの長さは５０ｍｍ未満である。
さらに好ましい実施形態では、前記液体クロマトグラフィが終了するときの保持時間は３分より短い。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低かった酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力することをさらに備える。
本発明の好ましい実施形態による分析装置は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得された試料に含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物を含む分析用試料を液体クロマトグラフに導入する試料導入部と、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物を分離する液体クロマトグラフと、前記液体クロマトグラフにより分離された前記反応生成物を質量分析により検出する質量分析部とを備え、前記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む。
さらに好ましい実施形態では前記分析用試料は、前記反応生成物および前記基質を備え、前記液体クロマトグラフは、導入された前記分析用試料に含まれる前記反応生成物および前記基質を分離する。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素のうち、前記試料における活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応する前記ライソゾーム病についての情報を出力する出力部をさらに備える。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ムコ多糖症等のライソゾーム病に関連する４以上の酵素の活性を、迅速に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、一実施形態の分析方法を説明するための概念図である。
【図２】図２は、一実施形態に係る分析装置の概略構成を示す概念図である。
【図３】図３（Ａ）は、反応生成物と基質とが液体クロマトグラフから略同時に溶出する場合の検出強度を模式的に示すグラフであり、図３（Ｂ）は、反応生成物が基質の前に液体クロマトグラフから溶出する場合の検出強度を模式的に示すグラフである。
【図４】図４は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図５】図５は、ライソゾーム病関連酵素が含まれていない試料を分析した場合のクロマトグラムである。
【図６】図６は、ライソゾーム病関連酵素を含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。
【図７】図７は、ライソゾーム病関連酵素が含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。
【図８】図８は、ライソゾーム病関連酵素を含む試料を分析した場合のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態では、ライソゾーム病の各疾患において、遺伝的原因により患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない酵素を、ライソゾーム病関連酵素と呼ぶ。ここで、「疾患」とは、ライソゾーム病関連酵素ごとに対応して定義され、例えばムコ多糖症における病型のそれぞれを指すものとする。
【００１２】
図１は、本実施形態の分析方法を説明するための概念図である。本実施形態の分析方法は、所定の数のライソゾーム病の疾患、特にムコ多糖症の病型に対応するライソゾーム病関連酵素の基質と、試料に含まれている酵素とを反応させ、得られた反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離するものである。
【００１３】
生体から採取された血液等の試料Ｓｐに含まれるライソゾーム病関連酵素と、これらのライソゾーム関連酵素の基質とを反応させる操作が行われる。ここで、試料Ｓｐは、健常者とライソゾーム病患者との間でライソゾーム病関連酵素の活性が統計等において異なる試料であれば、特に血液に限定されない。以下では、試料Ｓｐは、人間の被検者から採取されたものとするが、特に限定されない。被検者は、５歳以下、３歳以下等の子供または新生児であることが、早期発見によりライソゾーム病の治療による予後をよくするために好ましい。
【００１４】
以下では、試料Ｓｐを血液とし、乾燥血液スポット（Ｄｒｉｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｐｏｔ；ＤＢＳ）を用いて試料Ｓｐと基質とを反応させる例を説明する。乾燥血液スポットは、全血をそのまま使用することができるため、遠心分離が不要で操作が少なくて済み、採血量も少なくて済む等の利点がある。試料Ｓｐは、ピペットＰ１等の分注用器具または分注装置を用い、ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄ全体に試料Ｓｐがしみ込むようにろ紙Ｃに滴下される。ろ紙Ｃに滴下された試料Ｓｐは、数時間等乾燥に供される（矢印Ａ１１）。
【００１５】
乾燥した試料Ｓｐは、ろ紙Ｃ上における乾燥血液スポット（ＤＢＳ）となる。ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄは、パンチ等によりろ紙Ｃ本体から取り外しが容易となるように形成されている。取り外し可能部分Ｄは、例えば直径３ｍｍ〜６ｍｍ等の円板状の部分である。試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄが取り外されると、分注用チューブまたはウェルプレート等の分注用容器Ｗに配置される（矢印Ａ１２）
【００１６】
分注用容器Ｗに配置された、試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄに、複数のライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂと、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物に対応する所定の量の不図示の内部標準を含む基質溶液が加えられる。内部標準は、内部標準に対応する検出強度が当該所定の量に対応することにより反応生成物に対応するイオンの定量を行うための物質であり、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物の一部の原子を重水素等の安定同位体で置換した置換体等が適宜用いられる。
なお、乾燥血液スポットを用いずに、予め定められた量の血液を分注等して得られた溶液と基質溶液を接触させることにより酵素反応を行ってもよい。
【００１７】
基質溶液が加えられた後、酵素反応のために数時間〜数日等、分注用容器Ｗがインキュベーションされる。以下の実施形態で「酵素反応」とはライソゾーム関連酵素と基質Ｓｂとの酵素反応を指し、「反応溶液」とは酵素反応により得られた溶液を指す。その後、反応溶液から酵素反応の反応生成物Ｐを含む成分が抽出され分析用試料Ｓａが調製される（矢印Ａ１３）。反応生成物Ｐの抽出方法は特に限定されないが、液液抽出が液体クロマトグラフィの分析カラムやイオン源等を保護する上で好ましく、酢酸エチルを用いる液液抽出が、分析用試料Ｓａにおける基質Ｓｂの量を減少させることができるためより好ましい。分析用試料Ｓａには、各ライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂが残っていてもよく、基質Ｓｂが含まれているものとして以下の説明を行う。
【００１８】
調製された分析用試料Ｓａは、液体クロマトグラフに導入され、液体クロマトグラフィにより反応生成物Ｐと対応する基質Ｓｂとが分離される。液体クロマトグラフから溶出された溶出試料は、タンデム質量分析計に導入される。異なるライソゾーム病関連酵素に対応する複数の反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィおよび／または質量分離により分離される。分離された反応生成物Ｐはタンデム質量分析計の検出部により検出される（矢印Ａ１４）。各反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により、同時並行に（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）測定される。ここで、「同時並行に測定される」とは液体クロマトグラフに一度に導入された分析用試料Ｓａに含まれる複数の物質が分離されて検出されることを示す。
【００１９】
本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、以下の表１に挙げられたムコ多糖症の各病型に関連するライソゾーム病関連酵素（以下、ムコ多糖症関連酵素と呼ぶ）から選択されたものを含むことが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、ムコ多糖症のいずれかの病型を含む、各ライソゾーム関連酵素に対応するライソゾーム病に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂが、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
【表１】
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【００２０】
活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、４以上が好ましく、５以上がより好ましい。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多い程、より多くのライソゾーム病の診断のための情報を迅速に提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多すぎると、液体クロマトグラフィおよび質量分析での分離が難しくなるため、活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、適宜５０以下、２０以下、１０以下等に設定されることが好ましい。
【００２１】
本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、ムコ多糖症関連酵素から選択されることが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、各ムコ多糖症に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。この場合、活性を測定するムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂが、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
【００２２】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される４以上のムコ多糖症関連酵素から選択されることがより好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型から選択されるムコ多糖症の病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
【００２３】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα−Ｌ−イズロニダーゼおよび／またはイズロン酸−２−スルファターゼを含むことがさらに好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が特に高いムコ多糖症Ｉ型および／若しくはＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
【００２４】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたイズロン酸−２−スルファターゼを含むことが一層好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して、特定の地域や性別において発症率が特に高いムコ多糖症ＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。ムコ多糖症ＩＩ型は、人間においてＸ染色体劣性遺伝により発症するため、男性において多く発症する。男の新生児に対するスクリーニング検査にはムコ多糖症ＩＩ型についての検査を含めることが好ましい。
【００２５】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられたα−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼであるか、これら５つの酵素を含むことが最も好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。
【００２６】
本実施形態の分析方法において用いるムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂは、液体クロマトグラフィにより反応生成物Ｐの分離が可能であれば特に限定されないが、例えば以下の化学式（１）で示されるものを用いることができる。
【化１】
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…（１）
【００２７】
ここで、上記化学式（１）におけるＸ、Ｒ１、Ｒ２およびｎに対応する官能基の一例は、以下の表２に示される。
【表２】
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【００２８】
図２は、本実施形態の分析方法に係る分析装置の構成を示す概念図である。分析装置１は、測定部１００と、制御部４０とを備える。測定部１００は、液体クロマトグラフ１０と、質量分析計２０とを備える。
【００２９】
液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１ａ，１１ｂと、送液ポンプ１２ａ，１２ｂと、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入する管２１２と、イオンガイド２２２を備える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。
【００３０】
情報処理部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３とを備える。
【００３１】
液体クロマトグラフ（ＬＣ）１０は、移動相と分析カラム１４の固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して、各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離し異なる保持時間で溶出させる。液体クロマトグラフ１０は、質量分析計２０により反応生成物Ｐを検出することが可能な、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特にその種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。
【００３２】
移動相容器１１ａおよび１１ｂは、バイアル等の液体を格納可能な容器を備え、それぞれ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。移動相Ａおよび移動相Ｂは、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができればその組成は特に限定されず、溶媒として水、アセトニトリル等、添加剤としてギ酸等を用いることができる。
【００３３】
送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂを所定の流量になるように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ出力された移動相Ａおよび移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。
【００３４】
分析用試料Ｓａの導入等の分析の開始に対応する時点からの各時間における、移動相の組成を示すデータをグラジエントデータと呼ぶ。グラジエントデータに基づいて送液ポンプ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入される。移動相の組成の時間変化は、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、１０分未満の保持時間で反応生成物Ｐの全てを分析カラム１４から溶出することが好ましく、７分未満がより好ましく、３分未満がさらに好ましく、２分未満が一層好ましく、１．５分未満がより一層好ましい。反応生成物Ｐの保持時間が短い程、多くの被検者、特に人間の新生児に対して迅速にライソゾーム病のスクリーニング検査を行うことができる。液体クロマトグラフィが停止により終了する際の保持時間を分析時間と呼ぶ。分析時間は、分析カラム１４等の条件を調整することにより、３分未満とすることができ、より好ましくは２．５分未満とすることができる点が、発明者らにより見出された。これにより、効率よく分析を行うことができる。分析時間が短すぎると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析時間は、適宜３０秒以上または１分以上等とすることができる。
【００３５】
試料導入部１３は、オートサンプラー等の試料導入装置を備え、分析用試料Ｓａを移動相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された分析用試料Ｓａは、適宜不図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。
【００３６】
分析カラム１４は、固定相を備え、導入された分析用試料Ｓａに含まれる各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを、移動相と固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して異なる時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、逆相カラムが取扱いの容易さや質量分析でのイオン化の容易さの観点から好ましい。分析カラム１４の固定相は、例えばシリカゲル等の担体に担持された、Ｃ１８等の直鎖炭化水素が結合されたシランが好ましい。
【００３７】
分析カラム１４の長さは、５０ｍｍ未満が好ましく、４０ｍｍ未満がより好ましく、３０ｍｍ以下がさらに好ましい。分析カラム１４が短いほど、分析にかかる時間が短くなり、効率よく分析を行うことができるため好ましい。分析カラム１４が短すぎると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析カラム１４は、３ｍｍより長いことが好ましく、１０ｍｍより長いことがさらに好ましく、２０ｍｍより長いことが一層好ましく、２５ｍｍより長いことがより一層好ましい。
【００３８】
分析カラム１４は、各ライソゾーム病関連酵素について、基質Ｓｂが切断されて得られた反応生成物Ｐを、当該基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも先に、すなわち短い保持時間で溶出させることが好ましい。
【００３９】
図３（Ａ）は、従来の例として、反応生成物Ｐと基質Ｓｂとが略同時に液体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラムである。以下の実施形態では、一例として、プリカーサーイオンとして分離したイオンを解離させて生成イオンを生成し、この生成イオンを分離して検出する、多重反応モニタリング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）により反応生成物Ｐを検出する例を示す。
【００４０】
基質Ｓｂは、質量分析計２０のイオン化部２１でイオン化された後、インソース分解により反応生成物Ｐのｍ／ｚと略等しいｍ／ｚを有するイオンとなる場合がある。この場合に、反応生成物Ｐのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムが図３（Ａ）上部のグラフである。このクロマトグラムでは、基質Ｓｂがインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピークＰｓ（以下、インソース分解された基質ｓｂに対応するピークＰｓと呼ぶ）と、反応生成物ＰのフラグメントイオンのピークＰｐ（以下、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと呼ぶ）とが重なったピークＰｐ＋Ｐｓが観察される。
【００４１】
基質Ｓｂのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、基質Ｓｂのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムが図３（Ａ）下部である。このクロマトグラムに示されるように、基質ＳｂのフラグメントイオンのピークＰｓｂは、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐよりも、大きく、また長い保持時間の範囲にわたって検出され得る。従って、基質Ｓｂが液体クロマトグラフ１０から溶出を始めた後に、反応生成物Ｐが溶出すると、反応生成物Ｐとインソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとが重なり、反応生成物Ｐの検出を正確に行うことができない。
【００４２】
図３（Ｂ）は、本実施形態の分析方法において、反応生成物Ｐが基質Ｓｂよりも前に液体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラムである。プリカーサーイオンとして反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンおよび基質Ｓｂのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマトグラムをそれぞれ図３（Ｂ）の上部および下部に示す。基質ＳｂのフラグメントイオンのピークＰｓｂの検出（図３（Ｂ）下部）と略同時にインソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓが反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚについてのクロマトグラムに観察される（図３（Ｂ）上部）。しかし、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと、インソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとは重ならず、反応生成物Ｐを正確に検出および定量することができる。
【００４３】
分析カラム１４は、好ましくは、特にムコ多糖症ＩＩ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型にそれぞれ対応する、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは３つを含む酵素の酵素反応の反応生成物Ｐを当該酵素反応の基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも前に溶出させる。これらの酵素の基質Ｓｂは、インソース分解を特に起こしやすいため、より多くのこれらの酵素の反応生成物Ｐを対応する基質Ｓｂより先に溶出させることでより正確に反応生成物Ｐの検出を行うことができる。
なお、分析条件に応じてより正確に反応生成物Ｐの検出を行う観点から、任意のライソゾーム病関連酵素の反応生成物Ｐを基質Ｓｂよりも先に溶出させることができる。
【００４４】
図２に戻って、分析カラム１４から溶出された反応生成物Ｐを含む溶出試料は、質量分析計２０のイオン化部２１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユーザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。
【００４５】
質量分析計２０は、分析カラム１４から導入された溶出試料に対してタンデム質量分析を行い反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準を検出する。イオン化された溶出試料Ｓｅの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。
なお、質量分析計２０の種類や質量分析の方法は、各反応生成物Ｐに由来するイオンを所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。
【００４６】
質量分析計２０のイオン化部２１は、導入された反応生成物Ｐを含む溶出試料Ｓｅをイオン化する。イオン化の方法は、所望の精度で反応生成物Ｐが検出される程度に反応生成物Ｐがイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行うものとして説明する。イオン源２１１から出射されイオン化された溶出試料Ｓｅは、不図示の電極に印加された電圧により移動し、管２１２を通過して第１真空室２２ａに入射する。
【００４７】
第１真空室２２ａ、第２真空室２２ｂおよび第３真空室２２ｃは、この順に真空度が高くなっており、第３真空室２２ｃでは例えば１０−２Ｐａ以下等の高真空まで排気されている。第１真空室２２ａに入射したイオンは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射したイオンは、イオンガイド２２２の間を通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入されたイオンは、第１質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレンズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過するイオンを電磁気学的作用により収束させる。
【００４８】
第１質量分離部２３は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定されたｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、イオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準をプリカーサイオンとして選択的に通過させる。
【００４９】
コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０によりイオンの移動を制御しながら、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）によりイオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準を解離させ、フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際にイオンが衝突させられるアルゴンや窒素等を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるようにＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンは、第２質量分離部２５に向けて出射される。
【００５０】
第２質量分離部２５は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定されたｍ／ｚを有するフラグメントイオンを選択的に通過させて検出部３０に向けて出射する。第２質量分離部２３は、反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンを選択的に通過させる。
【００５１】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症Ｉ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４２５．８〜４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして４２５．８〜４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３１６．８〜３１７．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００５２】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６４３．９〜６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６４３．９〜６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３５８．９〜３５９．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００５３】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４１９．８〜４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして４１９．８〜４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３１０．９〜３１１．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００５４】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＶ−Ａ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６８４．９〜６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６８４．９〜６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３７２．７〜３７３．７の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
【００５５】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＶＩ型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６５６．９〜６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカーサイオンとして６５６．９〜６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イオンを３４４．９〜３４５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが好ましい。
なお、質量分析計２０において選択的に分離するｍ／ｚの値は、イオン化された反応生成物Ｐおよび検出する反応生成物Ｐのフラグメントイオンに応じて適宜設定され、上記の例に限定されない。
【００５６】
検出部３０は、二次電子増倍管や光電子増倍管等のイオン検出器を備え、入射した反応生成物Ｐと反応生成物Ｐの内部標準とのフラグメントイオンを検出する。検出モードは正イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでもよい。フラグメントイオンを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に入力される（矢印Ａ４）。
【００５７】
情報処理部４０は、電子計算機等の情報処理装置を備え、適宜ユーザーとのインターフェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う処理装置となる。
なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および／または質量分析計２０と一体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデータの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行ってもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
【００５８】
情報処理部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出するイオンのｍ／ｚの値等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。
【００５９】
情報処理部４０の通信部４２は、インターネット等のネットワークを介して無線や有線の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
【００６０】
情報処理部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、測定部１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。
【００６１】
情報処理部４０の出力部４４は、出力制御部５３により制御され、液晶モニタ等の表示装置および／またはプリンターを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、解析部５２の解析結果等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。
【００６２】
情報処理部４０の制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成される。制御部５０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
【００６３】
処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１を介した入力等に応じて設定された分析条件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。装置制御部５１は、送液ポンプ１２ａおよび１２ｂの流量を制御したり、試料導入部１３による試料導入を制御したり、第１質量分離部２３および第２質量分離部２５で選択的に通過させるイオンのｍ／ｚ値を制御したり等する。
【００６４】
解析部５２は、測定部１００から出力された測定データに基づいて反応生成物Ｐの定量等の解析を行う。解析部５２は、検出部３０から出力された測定データから各反応生成物Ｐおよびその内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度を取得して記憶部４３等に記憶させる。
【００６５】
解析部５２は、各反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応する検出強度を、当該反応生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度で割った比に、当該内部標準の既知の量を掛けた値を、各反応生成物Ｐの量として算出する。解析部５２は算出した各反応生成物Ｐの量と、血液量等の試料Ｓｐの体積と、酵素反応のためのインキュベーションに供した時間等とから、各反応生成物Ｐに対応する試料Ｓｐ中の酵素の活性を算出する。また、解析部５２は、保持時間と検出強度とを対応させたクロマトグラムに対応するデータを作成する。
【００６６】
解析部５２は、記憶部４３に記憶された基準値に基づいて、被検者が、ライソゾーム病である程度に、またはライソゾーム病の疑いが有る程度に各ライソゾーム病関連酵素の活性が低いか否かを判定する。当該基準値は、健常者と各ライソゾーム病患者におけるライソゾーム関連酵素の活性の値に基づいて予め設定されたものを用いることが好ましい。解析部５２は、適宜統計値のばらつき等を考慮して、上記判定を行うことができる。
【００６７】
出力制御部５３は、測定部１００の測定条件および／または解析部５２の解析結果等から各ライソゾーム関連酵素の活性、各反応生成物Ｐの量、クロマトグラム、被検者が罹患しているか、罹患している疑いのあるライソゾーム病についての情報等を含む出力画像を作成し、出力部４４に出力させる。医師等は、出力画像に含まれる情報に基づいて、被検者がライソゾーム病に罹患しているか否かの診断等を行うことができる。
【００６８】
図４は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、医療従事者等により、人間の新生児等の被検者から、血液等の試料Ｓｐが取得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。
【００６９】
ステップＳ１００３において、医療従事者やユーザー等により、所定の数以上の種類のライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂを含む基質溶液が調製される。ここで、所定の数は、例えば４、５等である。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。ステップＳ１００５において、医療従事者やユーザー等により、試料Ｓｐと基質溶液とを接触させることにより、試料Ｓｐに含まれているライソゾーム病関連酵素と基質Ｓｂとを反応させ、反応生成物Ｐが生成される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。
【００７０】
ステップＳ１００７において、医療従事者やユーザー等により、反応生成物Ｐと、基質Ｓｂとを含む反応溶液から分析用試料Ｓａが調製される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、試料導入部１３は分析用試料Ｓａを液体クロマトグラフ１０に導入し、分析カラム１４は反応生成物Ｐと基質Ｓｂとを分離する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。
【００７１】
ステップＳ１０１１において、質量分析計２０は、分離された反応生成物Ｐを質量分析により分離して検出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。ステップＳ１０１３において、解析部５２は、検出された反応生成物Ｐのデータに基づいて、試料Ｓｐにおいてライソゾーム関連酵素の活性が基準値より減少しているかについて解析する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。
【００７２】
ステップＳ１０１５において、出力部４４は、ライソゾーム病関連酵素のうち、試料Ｓｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病および／またはムコ多糖症の病型についての情報を出力する。ステップＳ１０１５が終了したら、処理が終了される。
【００７３】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態に係る分析装置１は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質Ｓｂと、この４以上の酵素のうち生体から取得された試料Ｓｐに含まれている酵素とを反応させて得られた反応生成物Ｐを含む分析用試料Ｓａが導入される試料導入部と、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成物Ｐを液体クロマトグラフィにより分離する液体クロマトグラフ１０と、液体クロマトグラフ１０により分離した反応生成物Ｐを質量分析により検出する質量分析計２０とを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼを含む。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型から選択される病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。さらに、男性や特定の地域においてさらに発症率の高いムコ多糖症ＩＩ型についても同様の情報を迅速に提供することができる。
【００７４】
（２）本実施形態に係る分析装置において、分析用試料Ｓａは、反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを備え、液体クロマトグラフ１０は、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを液体クロマトグラフィにより分離する。これにより、インソース分解が起こる場合でも基質Ｓｂを正確に検出することができる。
【００７５】
（３）本実施形態に係る分析装置は、ライソゾーム関連酵素のうち、試料Ｓｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病についての情報を出力する出力部４４をさらに備える。これにより、医師等に、ライソゾーム病の診断のための情報を迅速に伝えることができる。
【００７６】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
以下の実施例では、それぞれムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型に対応するα−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼおよびＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼの５種類の酵素の活性を上述の分析方法を用いて分析した実験結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。
【００７８】
試料と基質との反応
上記５種類の酵素が含まれていない試料（コントロール試料）、上記５種類の酵素が含まれている試料（所定の濃度の試料）、および、健常者から取得した試料（健常者試料）のそれぞれをろ紙に滴下した後、乾燥させ、ＤＢＳ様のスポットを作成した。当該スポットをパンチにより直径３ｍｍの円盤状に切り取り、９６ウェルのウェルプレートに配置した。当該スポットが配置されたウェルに、上記５種類の酵素の基質と、当該基質から酵素反応により生成される反応生成物Ｐの内部標準とを含む３０μＬの基質溶液を加え、３７℃で１６時間インキュベーションした。
【００７９】
基質および内部標準
基質溶液に含まれる基質は、表２に示されたものを用いた。内部標準は、反応生成物Ｐが表２に示されたものとし、表２に示された反応生成物Ｐを置換した以下の置換体を用いた。
Ｉ型：表２のムコ多糖症Ｉ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩ型：表２のムコ多糖症ＩＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩＩＢ型：表２のムコ多糖症ＩＩＩＢ型の反応生成物のＲ２を３つの重水素で置換した置換体。
ＩＶ−Ａ型：表２のムコ多糖症ＩＶ−Ａ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＶＩ型：表２のムコ多糖症ＶＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
【００８０】
分析用試料の調製
インキュベーションが終了した後、得られた反応溶液から反応生成物を含む成分を酢酸エチルを用いて抽出した。抽出された反応生成物を含む酢酸エチルを別の容器に配置した後、乾燥させた。その後、０．１％のギ酸が添加された水５５％／アセトニトリル４５％溶液を加え分析用試料とした。
【００８１】
液体クロマトグラフィの条件
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
分析カラム：  Kinetex XB-C18（Phenomenex）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径１．７μｍ）
注入量：  １μＬ
カラム温度：  ４０℃
移動相：
（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
（Ｂ）０．１％ギ酸（アセトニトリルに溶解）
流速：  ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分）        移動相Ｂの濃度（％）
０                ３０
０．５            ３０
３．５            １００
５．０            １００
５．０１          ３０
６．０            停止
【００８２】
質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
イオン化の方法：  エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード：  多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度：  ２５０℃
ヒートブロック温度：  １００℃
インターフェース温度：  −
ガス流量：
ネブライザーガス流量：  ３Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量：  ５Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量：  １５Ｌ／ｍｉｎ
【００８３】
溶出試料の保持時間と、ＭＲＭの測定条件（ＣＥはコリジョンエネルギー電圧）とは以下の表３に示した。
【表３】
2019184612.tif 000006
【００８４】
コントロール試料についてのクロマトグラムを図５に、所定の濃度の試料についてのクロマトグラムを図６に、健常者試料についてのクロマトグラムを図７にそれぞれ示した。各ムコ多糖症の病型に対応するクロマトグラムにおいて、上段は、反応生成物に対応するトランジションであり、下段は内部標準に対応するトランジション（表３）のクロマトグラムである。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークをそれぞれＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓとした。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークをそれぞれＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓとした。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークをそれぞれＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐとした。
【００８５】
コントロール試料では、反応生成物のフラグメントイオンのピークは観察されなかったが、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質にそれぞれ対応するピークＰ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓが観察された（図５）。
【００８６】
所定の濃度の試料（図６）および健常者試料（図７）においては、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐが観察された。このうち、ＩＩ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ２ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐは、対応するインソース分解された基質のピークＰ２ｓ、Ｐ４ｓおよびＰ６ｓよりも短い保持時間で溶出された。５種類のムコ多糖症関連酵素について、液体クロマトグラフィおよび質量分析により反応生成物が分離されて検出された。
【００８７】
（実施例２）
以下のように液体クロマトグラフィの条件を変え、さらに、ムコ多糖症Ｉ型の基質を、反応生成物を質量分離する際の条件とは別の質量分離の条件で直接検出した他は、実施例１と同様の条件で、コントロール試料（酵素なし）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
カラム：Kinetex XB-C18（Phenomenex）(内径２．１ｍｍ、長さ３０ｍｍ、粒径１．７μｍ)
グラジエントプログラム：
時間（分）        移動相Ｂの濃度（％）
０                ３０
０．０１          ３０
１．３０          １００
１．５０          １００
１．５１          ３０
２．５０          停止
【００８８】
図８は、実施例２で得られたマスクロマトグラムを示す図である。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓがそれぞれ観察された。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ−Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓは、上記基質とは時間的に分離されて検出された。従って、分析時間を２．５０分とする条件でも、液体クロマトグラフィによる反応生成物および基質の分離が可能であることが示された。
【符号の説明】
【００８９】
１…分析装置、１０…液体クロマトグラフ、１４…分析カラム、２０…質量分析計、２１…イオン化部、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、３０…検出部、４０…情報処理部、５０…処理部、５１…装置制御部、５２…解析部、５３…出力制御部、１００…測定部、Ｃ…ろ紙、Ｄ…取り外し可能部分、ＤＢＳ…乾燥血液スポット、Ｐ…反応生成物、Ｐ１，Ｐ２…ピペット、Ｐ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓ，Ｐ６ｉｓ…反応生成物の内部標準のフラグメントイオンのピーク、Ｐｐ，Ｐ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐ，Ｐ６ｐ…反応生成物のフラグメントイオンのピーク、Ｐｓ，Ｐ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓ，Ｐ６ｓ…基質イオンがインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピーク、Ｐｓｂ…基質イオンのフラグメントイオンのピーク、Ｓａ…分析用試料、Ｓｂ…基質、Ｓｐ…試料。
【図１】
2019184612.tif 000007
【図２】
2019184612.tif 000008
【図３】
2019184612.tif 000009
【図４】
2019184612.tif 000010
【図５】
2019184612.tif 000011
【図６】
2019184612.tif 000012
【図７】
2019184612.tif 000013
【図８】
2019184612.tif 000014