(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸改変反応における酵素的活性を制御するための方法の提供。【解決手段】（ｉ）ａ．少なくとも１種の酵素であって、該酵素の活性が、反応組成物における二価カチオンの存在に依存する、酵素、ｂ．二価カチオン、ｃ．キレート剤であって、該カチオンの該キレート剤への結合が、該反応組成物のｐＨおよび／または温度に依存している、キレート剤、ｄ．酸解離定数が温度依存性であり、それにより温度における変化が該反応組成物のｐＨの変化をもたらす、緩衝系、ｅ．該酵素のための基質を含む反応組成物を提供する工程、および、（ｉｉ）該反応組成物において温度を変化させる工程であって、それによりキレート剤に結合する二価カチオンが、これらの錯体から放出され、ここで、該酵素は、これにより活性化されるか、またはその活性が上昇される、工程、の工程を含む、反応組成物における酵素活性の制御のための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、核酸化学の分野に関連する。より詳細には、本発明は、核酸改変反応の分野における酵素活性の制御に関連する。
【背景技術】
【０００２】
背景
核酸改変反応は、学究的背景と産業的背景との両方における現代の生物学的研究および薬学的研究において中心的な役割を担う。そのような反応は、核酸増幅反応から、制御されかつ特異的な核酸の切断にまで及ぶ、広い範囲の応用をカバーする。これらは、過去数十年の間に広範に研究された酵素によって媒介される。
【０００３】
標的核酸配列の増幅は、現代の生物学的産業および薬学的産業に重要である。産業的研究において使用される大規模なロボット設備は、標的配列が下流の応用のために正確に増幅されることを保証するために、増幅条件の精確かつ効率的な制御に依存する。
【０００４】
しかしながら、そのような酵素の活性の制御は、些末な課題ではない。ポリメラーゼの場合において、効率的な増幅は、プライマーの長さ、プライマー配列と標的配列との両方のＧＣ含量ならびに反応緩衝剤のイオン強度および組成などのパラメーターの複雑な相互作用に依存している。更に、プライマーの非特異的結合は、増幅サイクルの間により低い温度でしばしば観察される。これは、非特異的な副産物の画分を増大させ、全体としての増幅反応の効率を低下させる。
【０００５】
これに対処するために、ポリメラーゼの分野における最近の展開は、「ホットスタート」ポリメラーゼを記載する。このクラスの酵素は、化学的に不活性化されているか、または特異的な抗体もしくはアプタマーの結合によってブロックされた活性部位を有するかのいずれかである。高温での活性化工程の後、化学修飾は切断され、酵素が活性化される。
【０００６】
「ホットスタート」ポリメラーゼに加えて、いわゆる「ホットスタート」プライマーおよび「ホットスタート」ヌクレオチドもまた開発された。これらは、化学的に修飾されたプライマーであって、当該修飾は、高温で切断され、それにより当該プライマーは、機能的になり、そしてその標的配列にハイブリダイズできる。しかしながら、そのようなプライマーの合成は、高価でありかつ標準的なプライマーよりも多くの時間を必要とする。「ホットスタート」プライマーと「ホットスタート」ポリメラーゼとの両方の場合において、熱で誘導される化学修飾の除去が非可逆性であるため、ブロックする特性は一度しか利用可能でない。
【０００７】
酵素および基質の精巧な修飾を含まずに、酵素的活性の制御を可能にする方法についての必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の簡潔な記載
本発明は、反応組成物において二価カチオンの濃度を調整することによって、酵素的活性を制御する方法に関連する。
【０００９】
反応組成物は、少なくとも１種の酵素（前記酵素の活性は、二価カチオンに依存している）、キレート剤、二価カチオン（前記カチオンの前記キレート剤への結合は、反応組成物のｐＨおよび／または温度に依存している）、緩衝系（酸解離定数は温度依存性であり、それにより、温度における変化が水性溶液のｐＨの変化をもたらす）および前記酵素の基質を含む。加えて、反応組成物において温度を変化させることは、キレート剤に結合する二価イオンが、これらの錯体から放出されることをもたらし、それによって当該酵素は活性化されるか、または活性を上昇させる。前記カチオンをキレートすることは、構造についての影響を有しない（前記カチオンを選択的に錯体化することは、活性を調節する）。活性における変化は、可逆性である（キレートすることによる不活性化は、温度上昇で前記カチオンを放出することによって逆転され得る）。
【００１０】
本発明はまた、核酸改変反応を行うためのキットに関連し、緩衝系、キレート剤、核酸改変酵素および前記酵素のための二価カチオンを含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ａ．少なくとも１種の酵素であって、該酵素の活性が、反応組成物における二価カチオンの存在に依存する、酵素、
ｂ．二価カチオン、
ｃ．キレート剤であって、該カチオンの該キレート剤への結合が、該反応組成物のｐＨおよび／または温度に依存している、キレート剤、
ｄ．酸解離定数が温度依存性であり、それにより温度における変化が該反応組成物のｐＨの変化をもたらす、緩衝系、
ｅ．該酵素のための基質
を含む反応組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）該反応組成物において温度を変化させる工程であって、それによりキレート剤に結合する二価カチオンが、これらの錯体から放出され、ここで、該酵素は、これにより活性化されるか、またはその活性が上昇される、工程、
の工程を含む、反応組成物における酵素活性の制御のための方法。
（項目２）
前記酵素が、核酸改変酵素である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記核酸改変酵素が、ポリメラーゼ、逆転写酵素およびヌクレアーゼを含む群から選択される、項目１〜３に記載の方法。
（項目４）
前記核酸改変酵素の活性が、基質結合および基質プロセシングを含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記核酸改変酵素からの前記二価カチオンの除去が、低下した活性または活性の消失をもたらす、項目１〜４に記載の方法。
（項目６）
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（アミノエチル）Ｎ，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）およびニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を含む群から選択される、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記二価カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋を含む群から選択される、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記キレート剤が、ＥＤＴＡであり、前記カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋から選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記キレート剤がＥＧＴＡであり、前記カチオンがＣａ２＋および／またはＭｇ２＋である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記キレート剤がＮＴＡであり、前記カチオンがＣａ２＋および／またはＣｕ２＋および／またはＣｏ２＋である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記反応組成物が、緩衝系、好ましくはＴｒｉｓ緩衝系を含み、前記二価カチオンが、好ましくは０．０１と２０ｍＭとの間の濃度の、Ｍｇ２＋であり、前記キレート剤が、０．０５と５０ｍＭとの間の濃度のＥＧＴＡであり、前記核酸改変酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはホットスタートポリメラーゼである、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記反応組成物が、緩衝系、好ましくはＴｒｉｓ緩衝系を含み、前記二価カチオンが、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋の群から選択され、前記キレート剤が、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡおよびＮＴＡの群から選択され、前記核酸酵素が、ヌクレアーゼである、前記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
ｉ．緩衝系
ｉｉ．キレート剤
ｉｉｉ．核酸改変酵素
ｉｖ．前記酵素のための二価カチオン
を含む、核酸改変反応を行うためのキット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】キレート剤の選択。  ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびＮＴＡのｐＫ値のｐＨ依存性。ｐＫ値の対数値が、ｐＨ値に対してプロットされる。
【図２】ＨｕｇＩ  ＰＣＲ増幅実験のアガロースゲル。  レーンは、以下のように注釈を付けられる：１：ＤＮＡラダー、２：ＭＭＡ＋５ｍＭ  Ｍｇ、３：ＭＭＡ＋６ｍＭ  Ｍｇ、４：ＭＭＡ＋７ｍＭ  Ｍｇ、５：ＭＭＡ＋８ｍＭ  Ｍｇ、６：ＭＭＡ＋９ｍＭ  Ｍｇ、７：ＭＭＡ＋１０ｍＭ  Ｍｇ、８：ＤＮＡラダー、９：ＤＮＡラダー、１０：ＭＭＢ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、１１：ＭＭＢ＋１ｍＭ  Ｍｇ、１２：ＭＭＢ＋２ｍＭ  Ｍｇ、１３：ＭＭＢ＋３ｍＭ  Ｍｇ、１４：ＭＭＢ＋４ｍＭ  Ｍｇ、１５：ＤＮＡラダー。  Ｍｇ濃度における上昇は、標的産物「特異的ＰＣＲ産物」の成功裡の増幅を導くが、多くの非特異的産物が見える（レーン１０〜レーン１２）。Ｍｇ濃度の更なる上昇は、非特異的ＰＣＲ産物の生成を導く（レーン１４、４ｍＭ  Ｍｇ  Ｃｌ２）。対照的に、５〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下での５ｍＭ  ＥＧＴＡの添加は、特異的ＰＣＲ産物をもたらすが（レーン２〜レーン７）、非特異的副産物（ｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の量は、Ｍｇ濃度が上昇されるのと同時に上昇する。
【図３Ａ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｂ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｃ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｄ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｅ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｆ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｇ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図３Ｈ】融解曲線（ＥＧＴＡ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｄ：０．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｅ：１ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｆ：１．５ｍＭ、Ｇ：２ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｈ：４〜１０ｍＭ。
【図４Ａ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｂ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｃ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｄ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｅ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｆ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｇ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図４Ｈ】融解曲線（Ｍｇ滴定実験）。  曲線は、以下のように注釈を付けられる：Ａ：添加剤なし、Ｂ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ、Ｃ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０，１ｍＭ  Ｍｇ、Ｄ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．２ｍＭ  Ｍｇ、Ｅ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．３ｍＭ  Ｍｇ、Ｆ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．４ｍＭ  Ｍｇ、Ｇ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．５ｍＭ  Ｍｇ、Ｈ：５ｍＭ  ＥＧＴＡ＋０．６ｍＭ  Ｍｇ。
【図５】異なる温度でのＤＮａｓｅアッセイおよびＥＧＴＡの影響のアガロースゲル解析。  レーンは、以下のように注釈を付けられる：レーン２〜７におけるサンプルに相当する反応は氷上で行われ、それ故「氷上」とラベルされることに留意のこと。同様に、レーン８〜１３におけるサンプルに相当する反応は４２℃で行われ、したがって「４２℃」とラベルされる。両方の温度での反応は、１００μＭ  ＥＧＴＡの非存在下および存在下（それぞれ「０μＭ  ＥＧＴＡ」および「１００μＭ  ＥＧＴＡ」）で行った。  レーンＭ：ＧｅｌＰｉｌｏｔ  Ｈｉｇｈ  Ｒａｎｇｅ  Ｌａｄｄｅｒ（６μｌ）、レーン１：１μｇ  ＷＧＡ  ｇＤＮＡ（ＤＮａｓｅを添加していない）、  レーン２およびレーン３：１μｌ  ＤＮａｓｅ（１Ｕ）５分および１５分、レーン４およびレーン５：０．１μｌ  ＤＮａｓｅ（０．１Ｕ）５分および１５分、レーン６およびレーン７：０．０１μｌ  ＤＮａｓｅ（０．０１Ｕ）５分および１５分、レーン８およびレーン９：１μｌ  ＤＮａｓｅ（１Ｕ）５分および１５分、レーン１０およびレーン１１：０．１μｌ  ＤＮａｓｅ（０．１Ｕ）５分および１５分、レーン１２およびレーン１３：０．０１μｌ  ＤＮａｓｅ（０．０１Ｕ）５分および１５分。
【図６】異なる温度でのＤＮａｓｅアッセイおよびＥＤＴＡの影響のアガロースゲル解析。  レーン１〜６におけるサンプルに相当する反応は氷上で行われ、それ故「氷上」とラベルされる。レーン７〜１２におけるサンプルに相当する反応は４２℃で行われ、したがって「４２℃」とラベルされる。レーンは、以下のように注釈を付けられる：レーンＫ：１μｇ  ＷＧＡ  ｇＤＮＡ。  レーン１：１Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン２：０．５Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン３：０．１Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン４：１Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ、レーン５：０．５Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ、レーン６：０．１Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ。  レーン７：１Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン８：０．５Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン９：０．１Ｕ  ＤＮａｓｅ、レーン１０：１Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ、レーン１１：０．５Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ、レーン１２：０．１Ｕ  ＤＮａｓｅ＋１００μＭ  ＥＤＴＡ、レーンＭ：ＧｅｌＰｉｌｏｔ  １ｋｂ  Ｌａｄｄｅｒ（３μｌ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の詳細な記載
本発明は、反応組成物における酵素活性の制御のための方法に関連する。反応組成物は、少なくとも１種の酵素（前記酵素の活性は、二価カチオンに依存している）、キレート剤、二価カチオン（前記カチオンの前記キレート剤への結合は、反応組成物のｐＨおよび／または温度に依存している）、緩衝系（酸解離定数は温度依存性であり、それにより、温度における変化が水性溶液のｐＨの変化をもたらす）および前記酵素の基質を含む。加えて、反応組成物において温度を変化させることは、キレート剤に結合する二価イオンが、これらの錯体から放出されることをもたらし、それによって当該酵素は活性化されるか、または活性を上昇させる。前記カチオンをキレートすることは、構造についての影響を有しない（前記カチオンを選択的に錯体化することは、活性を調節する）。活性における変化は、可逆性である（キレートすることによる不活性化は、温度上昇で前記カチオンを放出することによって逆転され得る）。
【００１３】
好ましい実施形態において、本発明は、反応組成物における酵素活性の制御のための方法に関連する。反応組成物は、少なくとも１種の酵素（前記酵素の活性は、二価カチオンに依存している）、キレート剤、二価カチオン（前記カチオンの前記キレート剤への結合は、反応組成物のｐＨに依存している）、緩衝系（酸解離定数は温度依存性であり、それにより、温度における変化が水性溶液のｐＨの変化をもたらす）および前記酵素の基質を含む。加えて、反応組成物において温度を変化させることは、キレート剤に結合する二価イオンが、これらの錯体から放出されることをもたらし、それによって当該酵素は活性化されるか、または活性を上昇させる。前記カチオンをキレートすることは、構造についての影響を有しない（前記カチオンを選択的に錯体化することは、活性を調節する）。活性における変化は、可逆性である（キレートすることによる不活性化は、温度上昇で前記カチオンを放出することによって逆転され得る）。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、酵素は、核酸改変酵素である。
【００１５】
１つの実施形態において、核酸改変酵素の活性は、基質結合活性および基質プロセシング活性を含む。
【００１６】
好ましい実施形態において、核酸改変酵素は、ポリメラーゼ、転写酵素およびカチオン依存性ヌクレアーゼの群から選択される。
【００１７】
より好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｄｉｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｃｈｅｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓおよび非好熱菌を含む生物の群から選択される。好ましくは、ウイルス性逆転写酵素は、ＭＭＬＶ、ＡＭＶ、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ由来であり、かつ／またはヌクレアーゼは、ウシＤＮａｓｅである。
【００１８】
最も好ましい実施形態において、ポリメラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａを含む生物の群から選択される。
【００１９】
特に、本発明はまた、前記二価カチオンの除去が前記核酸改変酵素の低下した活性または活性の消失をもたらす、方法を記載する。
【００２０】
これは、反応組成物における二価カチオンの濃度のレベルで、酵素的活性および基質結合を制御するための選択肢を表す。例えば、ポリメラーゼおよび多数のヌクレアーゼの場合において、マグネシウム、カルシウムおよびその他などの二価イオンの濃度は、酵素の活性に決定的である。低減したレベルの前記カチオンは、大いに低下した活性を導くか、または酵素的活性を廃しさえする。ポリメラーゼの場合、プライマーの標的配列へのハイブリダイゼーションの安定性が大きく低減される。多くのヌクレアーゼは、基質のプロセシングに決定的である活性部位に、二価カチオンを保持する。イオン濃度のレベルで酵素的活性を制御する方法は、酵素的反応混合物において慣用的に使用される緩衝剤のｐＨ値とキレート剤がイオンに結合する能力との両方が、温度依存性であるという事実を活用する。ポリメラーゼに加えて、ヌクレアーゼなどの他の核酸改変酵素もまた、それらの活性部位で二価イオンに依存し、それゆえ上で記載されるように制御され得る。
【００２１】
本発明はまた、前記核酸改変酵素の活性は、増幅、逆転写、等温増幅、シークエンシングおよびエステル結合の加水切断（好ましくは、増幅、逆転写およびエステル結合の加水切断）を含む群から選択される、方法に関連する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（アミノエチル）Ｎ，Ｎ’−四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｂｉｓ（ａｍｉｎｏ  ｅｔｈｙｌ）Ｎ，  Ｎ’−ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびニトリル酢酸（ｎｉｔｒｉｌｅ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＮＴＡ）を含む群から選択される。特に好ましくは、ＥＧＴＡである。
【００２３】
１つの実施形態において、二価カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋を含む群から選択される。好ましい実施形態において、キレート剤は、ＥＤＴＡであり、カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＣｏ２＋から選択される。
【００２４】
１つの実施形態において、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋を含む群から選択される数種のカチオンが、当該反応において存在する。
【００２５】
１つの実施形態において、キレート剤は、ＥＧＴＡであり、カチオンは、Ｃａ２＋および／またはＭｇ２＋である。
【００２６】
１つの実施形態において、キレート剤は、ＮＴＡであり、カチオンは、Ｃａ２＋および／またはＣｕ２＋および／またはＣｏ２＋である。
【００２７】
本発明の別の実施形態において、緩衝剤は酵素的反応に適切である。好ましくは、緩衝剤は表４から選択される。Ｔｒｉｓ緩衝剤が、酵素的反応において使用される（好ましくはＰＣＲ実験において）。Ｔｒｉｓ緩衝剤のｐＨ値は、温度依存性である。室温で、当該ｐＨは約８．７である。１℃あたり０．０３ｐＨ単位のｐＨにおけるシフトが観察される。それゆえ、９５℃で当該ｐＨは６．６である。
【００２８】
１つの実施形態において、緩衝系の濃度は、０．０１ｍＭと１００ｍＭとの間であり、好ましくは０．１ｍＭと５０ｍＭとの間であり、より好ましくは１ｍＭと３０ｍＭとの間であり、最も好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間である。
【００２９】
１つの実施形態において、反応における二価カチオンの濃度は、０．０１ｍＭと２０ｍＭとの間であり、好ましくは０．１ｍＭと１０ｍＭとの間であり、最も好ましくは１ｍＭと８ｍＭとの間である。
【００３０】
１つの実施形態において、キレート剤の濃度は、０．０５ｍＭと５０ｍＭとの間であり、より好ましくは０．１ｍＭと２０ｍＭとの間であり、さらにより好ましくは０．５ｍＭと１０ｍＭとの間であり、最も好ましくは１ｍＭと８ｍＭとの間である。
【００３１】
１つの実施形態において、ｐＨは、反応の間に温度変化に応答して、少なくとも０．０５ｐＨ単位、好ましくは少なくとも０．１ｐＨ単位、より好ましくは少なくとも０．５ｐＨ単位、さらにより好ましくは少なくとも１ｐＨ単位、最も好ましくは少なくとも２ｐＨ単位で変化する。
【００３２】
本発明は、反応組成物が緩衝系（好ましくはＴｒｉｓ緩衝系）を含み、ここで、二価カチオンがＭｇ２＋であって（好ましくは０．０１ｍＭと２０ｍＭとの間の濃度で）、キレート剤がＥＧＴＡであって（０．０５ｍＭと５０ｍＭとの間の濃度で）、核酸改変酵素がＤＮＡポリメラーゼである（好ましくはホットスタートポリメラーゼ）、方法に関連する。好ましいＥＧＴＡ濃度は、０．１ｍＭと２０ｍＭとの間であり、より好ましくは０．５ｍＭと１０ｍＭとの間である。
【００３３】
本発明はまた、反応組成物が緩衝系（好ましくはＴｒｉｓ緩衝系）を含み、ここで、二価カチオンがＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋およびＣｏ２＋を含む群から選択され、キレート剤がＥＧＴＡ、ＥＤＴＡおよびＮＴＡの群から選択され、核酸酵素がヌクレアーゼである、方法に関連する。
【００３４】
更に、本発明は、緩衝系、キレート剤、核酸改変酵素および前記酵素のための二価カチオンを含む、核酸改変反応を行うためのキットに関連する。
【実施例】
【００３５】
キレート剤の選択
Ｔｒｉｓ緩衝剤は、ＰＣＲ緩衝剤において慣用的に使用される。室温で、Ｔｒｉｓに基づくＰＣＲ緩衝剤のｐＨは、８．７である。Ｔｒｉｓは、１℃あたり０．０３ｐＨ単位のｐＨ値における温度依存性のシフトを示す。これは、９５℃でｐＨ値が６．６であることを意味する。ＰＣＲ実験のためのキレート剤を選択するために、３種の異なるキレート剤、ＮＴＡ、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの結合定数のｐＨ依存性を調べた。それぞれのキレート剤についての文献から公知であるｐＫ値を使用し、錯体形成のｐＨ依存性を決定した（図１）。ＥＧＴＡについての相関曲線は、ｐＨ値と結合定数との間の強力な相関を示す。それゆえ、ＥＧＴＡをこの後の実験のために選択した。
【００３６】
エンドポイントＰＣＲ
増幅実験を、非特異的な副産物をもたらす傾向のあることが公知である試験系を使用して行った。１．２ｋｂのゲノムＤＮＡ配列が、標的配列であった。プライマーＨｕｇＡおよびプライマーＨｕｇＢを使用した。
プライマー配列は、次の通りである：
【表１】
2019193655.tif 000002
【００３７】
ＥＧＴＡを含む反応およびＥＧＴＡを含まない反応を並列に行った。セットＡにおいて、マグネシウム濃度を１ｍＭステップで変化させた（開始点および最終点はそれぞれ５ｍＭおよび１０ｍＭであった）。セットＢにおいて、開始点は０．５ｍＭであり、最終点は４ｍＭ  Ｍｇであった。当該セットアップは、表２に記載される。
【表２】
2019193655.tif 000003
増幅プログラムは、以下の通りであった（表３）：
【表３】
2019193655.tif 000004
【００３８】
３５サイクルを行った。
アガロースゲルでのＰＣＲ反応の解析（図２）は、キレート剤としてＥＧＴＡを含有する反応が、ＥＧＴＡを含まない反応と比較して少ない副産物を有することから、より特異的であることを示す。酵素的反応において慣用的に使用される他の緩衝剤は、表４に列挙される。
【表４−１】
2019193655.tif 000005
【表４−２】
2019193655.tif 000006
【表４−３】
2019193655.tif 000007
【表４−４】
2019193655.tif 000008
【００３９】
ＥＧＴＡ／ＥＤＴＡを使用して化学的に不活性化されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの残存活性の調節
以下の実験は、残存活性を有するＴａｑポリメラーゼ分子を使用して、ＰＣＲ反応混合物におけるプライマーダイマーの形成を検出するための系を使用した。ここでは、重亜硫酸処理したＤＮＡが、鋳型として使用される。重亜硫酸処理（非メチル化シトシンのウラシルへの化学的修飾を伴う）の結果として、前記鋳型は、３種の塩基のみからなる。重亜硫酸処理は一本鎖ＤＮＡを使用する場合でのみはたらくため、前記重亜硫酸処理の完了後の大部分のＤＮＡは、一本鎖である。そのようなＤＮＡ配列の増幅のために使用されるプライマーは、３種の塩基のみからなるため、低減した複雑性により特徴付けられる。それゆえ、これらのプライマーは、ダイマー形成の傾向があり、前記重亜硫酸処理したＤＮＡに１００．０００倍超結合できる可能性が非常に高い。
【００４０】
ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＥＰＬＩ  ｇ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを使用して、製造者のプロトコルに従って増殖した。その後、１μｇの前記ゲノムＤＮＡを、当該ＤＮＡをＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔを使用する重亜硫酸処理、次いで精製に供する、１０の独立した反応において使用した。各反応の結果として生じるＤＮＡをプールし、その後の増幅反応において使用した。プライマー配列は、表５に示される。
【表５】
2019193655.tif 000009
【表６】
2019193655.tif 000010
【００４１】
最終のＥＧＴＡ濃度は、０．２５ｍＭと１０ｍＭとの間であった。
【００４２】
２つの反応からなるサンプルの１セットを氷上で１２０分間インキュベートし、一方で同様に２つの反応からなる他のサンプルのセットを、室温で１２０分間インキュベートした。その後、両方のサンプルのセットを、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して解析した。サイクルプログラムは、表７に示される。
【表７】
2019193655.tif 000011
【００４３】
Ｃｔ値は表８にまとめられ、図３はそれぞれの融解曲線を示す。
【表８】
2019193655.tif 000012
【００４４】
氷上でＥＧＴＡの添加なしでインキュベートされたサンプルは、２５．２８のＣｔ値および特異的な融解曲線を示したが（図３Ａ）、一方で室温でインキュベートされたサンプルの場合におけるＣｔ値は、右へシフトされる（２４．９２）。この場合において、特異的な産物は、観察されなかった。０．７５ｍＭの最終濃度までのＥＧＴＡの添加は、Ｃｔ値に影響を及ぼさずに特異性の上昇をもたらした。特異的な産物の量は、急速に上昇した。２ｍＭを上回ったＥＧＴＡ濃度の場合において、成功裡の増幅は阻害された（図３Ｈ）。
【００４５】
引き続いての実験において、前記プライマーおよび前記重亜硫酸処理したＤＮＡを増幅反応において使用し、マグネシウム依存性を解析した。反応混合物の組成は、表９に示される。
【表９】
2019193655.tif 000013
【００４６】
ＥＧＴＡの最終濃度は、５ｍＭであった。ＨＲＭ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘに０．１  ０．６ｍＭマグネシウムを追加した。
【００４７】
同じものからなる反応の２セットを、増幅実験において使用した。サンプルの１セットを氷上で１２０分間インキュベートし、一方でサンプルの他のセットを室温で１２０分間インキュベートした。その後、当該サンプルをＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して解析した。サイクルプログラムは、表６に示されるものと同一であった。結果は、表９および図４に示される。室温および氷上でそれぞれインキュベートされたサンプルに相当するＣｔ値は、表１０に示される。図４は、それぞれの融解曲線を示す。
【表１０】
2019193655.tif 000014
【００４８】
当該実験は、氷上でＥＧＴＡの添加なしでインキュベートされたサンプルの場合において、２５．４６のＣｔ値および特異的な融解曲線が得られたが、一方で室温でのインキュベーションはＣｔ値のシフトをもたらし（２２．６２）、かつ特異的な増幅産物が観察されなかったことを示した。５ｍＭの最終濃度までのＥＧＴＡの添加は、上昇した特異性を導いた。５ｍＭ  ＥＧＴＡを使用する場合のＣｔ値は、それぞれ２８．７７および２８．８２であった。マグネシウム濃度を上昇させることは、特異性を維持すると同時に、より低いＣｔ値をもたらした。
【００４９】
ＤＮａｓｅ活性の調節
このセットの実験において、ＤＮａｓｅ（ウシ膵臓から単離されたヌクレアーゼ）の活性を調節する手段を調べた。
【００５０】
ヒトゲノムＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ  ｇ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の指示に従って増殖した。ＤＮａｓｅ活性を、１０μｌ反応において解析した。各反応は、反応緩衝剤として５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．２、約１μｇゲノムＤＮＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０μＭ  ＣａＣｌ２を含有した。３種の異なる量のＤＮａｓｅ（０．０１、０．１および１Ｕ）を使用した。当該サンプルを、４２℃および氷上の２つの異なる温度で、それぞれ５分間および１５分間インキュベートした。ＤＮＡ分解は、ＥＤＴＡを８．３３ｍＭの最終濃度まで添加することによって終わらせ、サンプルは、０．５％アガロースゲルを使用する反応産物の解析の前に、氷上でインキュベートした。その結果は、図５に示される。当該ゲルは、ＤＮａｓｅが、氷上で活性を有することを示す。反応時間およびＤＮａｓｅの量は、酵素的消化の完全性に強く影響を及ぼす。１Ｕ  ＤＮａｓｅを使用して氷上で１５分間前記ゲノムＤＮＡをインキュベートすることは、当該サンプルの完全な分解を導いた（レーン３）。４２℃でのインキュベーションは、いずれの量の酵素を使用する場合にも、５分後には既に完全な分解を導いた（レーン８〜１３「４２℃」）。
【００５１】
１００μＭの最終濃度までのＥＧＴＡの添加は、使用されたいずれの量のＤＮａｓｅについて分解のほぼ完全な阻害を導いた（レーン２〜７「氷上」「１００μＭ  ＥＧＴＡ）。これから免れるものは、１Ｕ  ＤＮａｓｅを使用する１５分間の反応だけである（レーン３「氷上」「１００μＭ  ＥＧＴＡ）。しかしながら、この場合において、分解は、ＥＧＴＡを含まないサンプルと比較して有意に低減した。４２℃まで温度を上昇させることは、ＤＮａｓｅ活性を大きく回復した（レーン８〜１３「４２℃」「１００μＭ  ＥＧＴＡ」）。
【００５２】
引き続いての実験において、ＥＤＴＡをキレート剤として使用した。ゲノムＤＮＡ増殖の手順ならびに緩衝剤および反応条件は、上に記載される実験と等価であった。
【００５３】
反応産物を、０．５％アガロースゲルを使用して解析した（図６）。レーン１〜６は、反応が氷上で行われたサンプルに相当する。レーン１〜３とレーン４〜６との比較は、ＥＤＴＡの添加が酵素的活性を大きく低減させたことを示す。反応温度における４２℃までの上昇は、結合したＣａ２＋イオンが、ＥＤＴＡを含む錯体から放出され、これにより酵素的活性を回復させることをもたらす。完全なＤＮＡ分解は、レーン７〜１２において観察され得る。
【００５４】
要約すると、両方の実施例は、キレート剤がＤＮａｓｅ活性を阻害するために使用され得ること、および反応温度をシフトすることが酵素的活性を回復させることを示しており、これにより前記活性制御の系を実証している。
【図１】
2019193655.tif 000015
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019193655.tif 000018
【図３Ｃ】
2019193655.tif 000019
【図３Ｄ】
2019193655.tif 000020
【図３Ｅ】
2019193655.tif 000021
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2019193655.tif 000023
【図３Ｈ】
2019193655.tif 000024
【図４Ａ】
2019193655.tif 000025
【図４Ｂ】
2019193655.tif 000026
【図４Ｃ】
2019193655.tif 000027
【図４Ｄ】
2019193655.tif 000028
【図４Ｅ】
2019193655.tif 000029
【図４Ｆ】
2019193655.tif 000030
【図４Ｇ】
2019193655.tif 000031
【図４Ｈ】
2019193655.tif 000032
【図５】
2019193655.tif 000033
【図６】
2019193655.tif 000034
【配列表】
2019193655000001.app
【外国語明細書】
2019193655000001.pdf