(57)【要約】      （修正有）【課題】血液試料を振動下および／または血液試料が凍らない低温下で保存しても、安定に保存可能な血液試料の作製方法を提供する。【解決手段】目的細胞、抗血小板剤及び抗凝固剤を含む、血液試料の作製方法。ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、方法。抗血小板剤と抗凝固剤とを血液試料に添加した後、低温において保存する工程を含む、方法。親水性高分子化合物を血液試料に添加する工程をさらに含む、方法。水溶性ビタミンＥ類似物質を血液試料に添加する工程をさらに含む、方法。抗凝固剤がキレート剤である、方法。抗血小板剤が血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的細胞、抗血小板剤及び抗凝固剤を含む、血液試料の作製方法。
【請求項２】
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗血小板剤と抗凝固剤とを血液試料に添加した後、低温において保存する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
親水性高分子化合物を血液試料に添加する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
水溶性ビタミンＥ類似物質を血液試料に添加する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗凝固剤がキレート剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗血小板剤が血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ホルムアルデヒドドナー化合物が、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、及びメテンアミンの中から選ばれる一以上の化合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
親水性高分子化合物がポリエチレングリコールである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
低温が、０℃以上２５℃未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
以下の（１）〜（３）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法。
（１）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で血液試料を作製する工程、
（２）得られた血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程、
（３）（２）の工程を行なった後の血液試料から目的細胞を検出する工程
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法で目的細胞を検出した後、当該検出した細胞を採取する、血液試料中に含まれる目的細胞の採取方法。
【請求項１３】
目的細胞、抗血小板剤、および抗凝固剤を含む、血液試料。
【請求項１４】
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、請求項１３に記載の血液試料。
【請求項１５】
抗血小板剤、抗凝固剤を含む、低温保存用の血液試料保存剤。
【請求項１６】
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、請求項１５に記載の血液試料保存剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定に保存可能な血液試料の作製方法に関する。特に本発明は、血液試料が凍らない低温から室温環境下で、振動や温度変化などに対して安定に保存可能な血液試料の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液などの体液や、臓器などの組織を溶液に懸濁もしくは分散して得られる組織標本試料や、細胞培養液などから細胞を選択的に分離回収し、当該分離回収した細胞を基礎研究や臨床診断、治療へ応用する研究が進められている。例えば、がん患者より採取した血液から腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下ＣＴＣ）を採取し、当該細胞について形態学的分析、組織型分析や遺伝子分析を行ない、これら分析により得られた知見に基づき治療方針を判断する研究が進められている。
【０００３】
しかしながらがん患者より血液を採取してから前述した細胞の分離回収を実施するまでに長い時間を要することがある。分離回収を実施するまでの時間が長いと、溶液中に含まれる細胞が劣化し、当該細胞の形状崩壊ならびにそれに伴う当該細胞内の核酸およびタンパク質が放出するおそれがあり、そのような現象が生じると、溶液中に含まれる目的細胞の回収率の低下や、目的細胞中に含まれる核酸やタンパク質の解析能力の低下につながるおそれがあった。
【０００４】
また、試料を採取する場所と試料に含まれる細胞の分離回収および検出を行なう場所とが異なる場合、当該試料の輸送が求められるが、輸送の際、前述した作業（すなわち試料採取や、細胞の分離回収および検出）を行なう施設で一般的に保たれている温度環境下（２５℃近傍）とは異なる環境下となる可能性があり、かつ振動も加わる。従って、溶液中に含まれる細胞の劣化のおそれがさらに高まる。
【０００５】
これまでに知られている血液試料を保存するための保存剤および方法として、特許文献１には、ホルムアルデヒドドナーを含む安定化剤と抗凝固剤とを含む保存剤を開示しており、当該保存剤を希少細胞を含む血液試料に添加することで、長期間保管した血液試料中に含まれる希少細胞の分離回収を実現している。しかしながら特許文献１に記載の方法を用いても、振動下および／または血液試料が凍らない低温下（例えば０℃から２０℃）で保存すると、前述した作業を行なう際は、目的細胞の高効率な分離回収が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５０１２３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、血液試料を振動下および／または血液試料が凍らない低温下で保存しても、安定に保存可能な血液試料、その作製方法、および保存剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明は以下の通り例示できる。
［１］
目的細胞、抗血小板剤及び抗凝固剤を含む、血液試料の作製方法。
［２］
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］
抗血小板剤と抗凝固剤とを血液試料に添加した後、低温において保存する工程を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
親水性高分子化合物を血液試料に添加する工程をさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
水溶性ビタミンＥ類似物質を血液試料に添加する工程をさらに含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
抗凝固剤がキレート剤である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
抗血小板剤が血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
ホルムアルデヒドドナー化合物が、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、及びメテンアミンの中から選ばれる一以上の化合物である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
親水性高分子化合物がポリエチレングリコールである、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
低温が、０℃以上２５℃未満である、［３］に記載の方法。
［１１］
以下の（１）〜（３）に示す工程を含む、血液試料中に含まれる目的細胞の検出方法。
（１）［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法で血液試料を作製する工程、
（２）得られた血液試料中に含まれる赤血球を破砕または除去する工程、
（３）（２）の工程を行なった後の血液試料から目的細胞を検出する工程
［１２］
［１１］に記載の方法で目的細胞を検出した後、当該検出した細胞を採取する、血液試料中に含まれる目的細胞の採取方法。
［１３］
目的細胞、抗血小板剤、および抗凝固剤を含む、血液試料。
［１４］
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、請求項１３に記載の血液試料。
［１５］
抗血小板剤、抗凝固剤を含む、低温保存用の血液試料保存剤。
［１６］
ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含む、［１５］に記載の血液試料保存剤。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明において血液試料とは、目的細胞並びに血小板および／または血小板から放出された細胞外小胞を少なくとも含んだ試料のことをいい、具体的には、血液（全血）、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液などの試料や、尿、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水などの血液由来成分を含み得る試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前述した試料または組織懸濁液より分離して得られる、試料または組織由来の細胞を含む画分、などがあげられる。このうち試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。本発明における目的細胞は、血中に存在し得る細胞が好ましい。血中に存在し得る細胞とは、元来血液に含まれる細胞だけでなく、他の組織から血液に混入しうる細胞も含む。本発明における目的細胞の一例としては、血液循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍細胞、循環血液内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞（ＣＦＣ）、各種幹細胞があげられる。
【００１２】
本発明の一実施態様に係る血液試料は、目的細胞と抗血小板剤と抗凝固剤とを少なくとも含むことが好ましい。血液試料を、当該試料の採取や、当該試料中に含まれる目的細胞の分離回収もしくは検出を行なう際の温度環境である、２５℃近傍で保存する場合は、血液試料に特許文献１に例示される保存剤を添加することで安定に保存できた。しかしながら、特許文献１に例示される保存剤を添加した血液試料を、当該試料が凍らない低温下（例えば１５℃近傍）で保存するとゲル状物質が生成し、当該試料中に含まれる目的細胞の分離回収が困難となった。そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、血液試料に抗血小板剤および抗凝固剤を添加することで前記ゲル状物質の生成が抑制され、当該試料中に含まれる目的細胞の分離回収効率が向上することを見出した。
【００１３】
本発明の一実施態様に係る血液試料に含まれる抗血小板剤は、血小板および血小板から放出された細胞外小胞の凝集を抑制する物質のことをいい、血小板ＡＤＰ受容体を遮断し、血小板セロトニン２受容体を遮断し、血小板シクロオキシゲナーゼを阻害し、または血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を遮断することにより、血小板機能に直接の影響を与えて、血小板の凝集を阻害する物質が挙げられる。血小板ＡＤＰ受容体を遮断し、血小板セロトニン２受容体を遮断し、血小板シクロオキシゲナーゼを阻害する阻害剤は、主に血小板膜表面の受容体を阻害、または受容体からのシグナル経路の阻害剤として働き、血小板凝集に関わる血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の発現に寄与している血小板内のカルシウムイオン濃度の上昇を抑制するために適用される。一方、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤は、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子や、フィブリノーゲンなどを介した、血小板間の血小板膜表面に発現した血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体同士の結合による凝集を抑制する働きを有する。中でも、様々な経路で血小板内のカルシウム濃度が上昇することから、血小板凝集に直接作用する血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤を抗血小板剤として用いるとよい。血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤の一例として、チロフィバン（ｔｉｒｏｆｉｂａｎ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）があげられる。これらは、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。本発明の保存剤に含まれる抗血小板剤として、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤であるチロフィバンを用いる場合は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として０．２４μｇ／ｍＬ以上となるよう、本発明の保存剤に含ませることができ、終濃度として２４μｇ／ｍＬ以上となるよう、本発明の保存剤に含ませるとより好ましい。
【００１４】
本発明の一実施態様に係る血液試料には、血小板に発現しているインテグリンの一種であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ以外に対するインテグリン阻害剤をさらに添加してもよい。インテグリン阻害剤とは、インテグリン発現細胞および当該細胞から放出された細胞外小胞の凝集を抑制する物質のことをいい、細胞膜表面に存在するインテグリンに結合可能な物質が挙げられる。当該インテグリンの種類に限定は無いが、インテグリンは大別してラミニン結合性インテグリン、コラーゲン結合性インテグリン、ＲＧＤ配列認識インテグリンおよびＬＤＶ配列認識インテグリンが挙げられ、それぞれに結合可能な物質をインテグリン阻害剤として添加するとよい。例えばがん患者血液試料には血管新生やがん組織の増殖時に発現量が増えるインテグリンαｖβ３を代表とするＲＧＤ配列認識インテグリンを細胞膜上に保有する細胞外小胞が多く存在するため、当該インテグリンを阻害すると当該細胞外小胞の凝集を抑制することができる。ＲＧＤ配列認識インテグリンの阻害剤としては、アミノ酸配列としてＲＧＤを少なくとも含むペプチドもしくは当該インテグリンに結合可能な小分子化合物を用いるとよい。
【００１５】
本発明の一実施態様に係る血液試料に含まれる抗凝固剤の一例として、血液凝固の要因となるカルシウムイオンを配位することで前記血液凝固を抑制するキレート剤や、血液凝固の要因となるトロンビン活性を抑制するヘパリンを含む抗トロンビン剤があげられる。中でもキレート剤が好ましく、その具体例として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＣＴＡ（１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス−２−アミノエチルエーテル四酢酸）、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（Ａｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）があげられる。これらは、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
本発明の一実施態様に係る血液試料には、ホルムアルデヒドドナー化合物をさらに含ませてもよい。ホルムアルデヒドドナー化合物は、それ自体は直接細胞に作用しないが、分解を受けることでホルムアルデヒドを放出し、細胞を安定化させることが可能な化合物のことをいう。ホルムアルデヒドドナー化合物の具体例として、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、メテンアミン、パラホルムアルデヒドがあげられる。これらは、１種のみを用いてもよく、２種以上を併用してもよい。中でもパラホルムアルデヒドよりもホルムアルデヒドを緩慢に放出できる安定化剤が好ましく、具体的には、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、ブロノポール（２−ブロモ−２−ニトロプロペイン−１，３−ジオール）、ジアゾリジニル尿素、ＤＭＤＭヒダントイン（１，３−ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、クオタニウム−１５（メセナミン  ３−クロロアリロクロリド）、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、アミンやアミドのメチロール、ヒドロキシメチル誘導体、メチロール、メテンアミン、があげられるがこれらに限定されない。特にイミダゾリジニル尿素が最も好ましい安定化剤の一つといえる。
【００１７】
本発明の一実施態様に係る保存剤に含まれるホルムアルデヒドドナー化合物の濃度は、当該化合物が有する、血液試料中に含まれる目的細胞の固定化強度や固定化速度を考慮して適宜決定すればよい。例えばホルムアルデヒドドナー化合物として、イミダゾリジニル尿素を用いる場合は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として０．０１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間であってよく、０．２５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．３％（ｗ／ｖ）から１．５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．５％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。
【００１８】
なお本発明の一実施態様に係る保存剤は、前述したホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤に加え、親水性高分子化合物をさらに含ませてもよい。親水性高分子化合物は電荷を持たない親水性高分子であるとよく、一例としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（ヒドロキシアルキル）メタクリレート、ポリアクリルアミド、ホスホリルコリン基を側鎖に有するポリマー、多糖類、ポリペプチドがあげられ、特にポリエチレングリコールが親水性が高く好ましい。本発明の保存剤に含ませる親水性高分子化合物としてポリエチレングリコールを用いた場合の濃度は、保存剤添加後の血液試料の終濃度として０．００１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間であってよく、０．０１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の間とすると好ましく、０．０１％（ｗ／ｖ）から０．２５％（ｗ／ｖ）の間とするとさらに好ましく、０．０２％（ｗ／ｖ）から０．２％（ｗ／ｖ）の間とするとさらにより好ましい。さらに、本発明の保存剤に含ませるポリエチレングリコールの分子量としては、平均分子量として１００以上であればよく、２００から２万の間とすると好ましく、６００から２０００の間とするとさらに好ましい。親水性高分子化合物は細胞の安定性向上のために添加するが、親水性高分子化合物を血液試料に添加することにより、前記試料内のエントロピーが低下することで、血液試料に含まれる細胞外小胞を含む粒子の分散安定性が低下して凝集を引き起こす要因となる。特に低温においては系内のエントロピーが低下し、ゲル状物質を含む凝集体が形成されやすいため、親水性高分子化合物添加によるエントロピーの低下を抑えることができる低分子量の当該化合物を用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の一実施態様に係る保存剤の浸透圧を、あらかじめ任意の値に調製してもよい。生理的浸透圧よりも高い浸透圧に調製することで、細胞が収縮することにより、保存処理後の遠心など細胞と溶液との比重の違いに基づく分離濃縮を行う際の、細胞の当該分離濃縮効率が向上するためよい。なお、生理的浸透圧より非常に高い浸透圧に調製した保存剤を用いると、細胞に対する損傷や構造の崩壊が発生することで細胞の前記分離濃縮効率が低下する。ここで生理的浸透圧とは、浸透圧調整前の目的細胞を含む溶液（例えば血液試料など）が有する浸透圧のことをいい、一般的には２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから３００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲に入る。保存剤を添加した血液試料の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから１００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であればよく、０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから６０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であればさらに好ましく、１０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから３０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であればさらにより好ましい。例えば、血液試料に添加する保存剤の添加量が１５０μｌ／ｍｌ血液試料の場合、保存剤の浸透圧は、生理的浸透圧に対し０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから９００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であればよく、０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから６００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であればさらに好ましく、５０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏから４００ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏまでの範囲であれば特に好ましい。
【００２０】
本発明の一実施態様に係る保存剤に水溶性ビタミンＥ類似物質をさらに含ませてもよい。水溶性ビタミンＥ類似物質とは、ビタミンＥの抗酸化作用を有する官能基を含む水溶性の化合物である。前記化合物は、抗酸化作用の他に細胞のアポトーシスの阻害や好中球特有の細胞死（ネトーシス）に対する阻害剤としての機能を有する。当該化合物を添加することにより、血液試料に含まれる細胞、特に白血球の細胞死を抑制することができ、白血球を構成する物質の損傷を防ぐことができるため、白血球に対して特異的に結合可能な物質との結合効率を高めることができる。そのため、当該白血球に対して特異的に結合可能な磁性粒子等を結合させることで、白血球の血液試料からの分離効率が向上する。水溶性ビタミンＥ類似物質として、トロロックスがあげられる。トロロックスはＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶解させた後、保存剤に添加するとよく、ＤＭＳＯの液量は血液試料に対して、１０μｌ／ｍｌ血液試料以下であればよく、４μｌ／ｍｌ血液試料以下であれば好ましい。また、トロロックスの添加量は血液試料に対して、１０から１０００μｇ／ｍｌ血液試料添加すればよく、２０から３００μｇ／ｍｌ血液試料添加すると好ましく、１００から２５０μｇ／ｍｌ血液試料添加するとさらに好ましい。
【００２１】
本発明の一実施態様に係る保存剤は血液試料に添加する物質のことをいう。本発明の保存剤を血液試料に添加する際は、本発明の保存剤を構成する全ての物質を一度に血液試料に添加する態様でもよく、本発明の保存剤を構成する一部の物質を血液試料に添加後、前記構成する残りの物質を血液試料に添加する態様としてもよい。後者の場合、添加する物質の順に制限はないが、あらかじめ抗凝固剤を血液試料に添加してから他の構成物質（少なくとも、ホルムアルデヒドドナー化合物および抗血小板剤）を血液試料に添加すると、血液試料の凝固を抑制できるため好ましい。前述した抗凝固剤を血液試料に添加する操作の一例として、抗凝固剤が入った採血管（ＥＤＴＡ採血管やクエン酸採血管など）に採血することで抗凝固剤を血液試料に添加する態様があげられる。
【００２２】
本発明の一実施態様に係る保存剤を添加して保存処理をした血液試料（以下単に、保存処理した血液試料ともいう）の保存温度は、当該試料が凍結すると凍結時および解凍時に目的細胞に損傷を与える一方、高温環境下では細胞を構成するタンパク質等の物質が変性されることにより、細胞を標識する際の標的とする物質以外の部位に非特異的に標識物質が結合する非特異吸着の発生頻度が増加するため、血液試料の凍らない低温以上室温未満の温度で保存することが好ましい。ここで血液試料の凍らない低温とは０℃近傍のことをいい、室温とは２５℃から４０℃までの温度をいう。なお本発明の保存剤を添加した血液試料は、０℃から３７℃の温度環境下で保存すると好ましく、０℃から２０℃の温度環境下で保存するとより好ましく、４℃近傍の温度環境下で保存するとさらにより好ましい。
【００２３】
保存処理した血液試料は、静置して保存してもよく、振動を与えて保存してもよい。振動とは、回転撹拌、振幅撹拌、輸送による上下往復動撹拌および不規則的な撹拌も含む。
【００２４】
保存処理した血液試料から目的細胞を分離回収および検出する場合、あらかじめ前記血液試料中に含まれる（または含まれ得る）赤血球を破砕もしくは除去すると、目的細胞の効率的な分離回収および明瞭な検出ができるためよい。赤血球を破砕する場合には、塩化アンモニウム、界面活性剤、低張溶液などを用いて破砕すればよいが、中でも塩化アンモニウムを用いた破砕は目的細胞に対する損傷が少ないためよい。また、赤血球を除去する場合には、赤血球と細胞とのサイズの違いを利用した濾過や、比重の違いを利用した分離などにより除去すればよい。
【００２５】
保存処理した血液試料（または前述した赤血球の破砕／除去処理をした血液試料）に含まれる目的細胞の検出は、例えば、スライドに塗布して顕微鏡や光学検出器などで観察したり、フローサイトメトリーを用いたりして検出すればよい。なお顕微鏡や光学検出器などで観察して目的細胞の検出を行なう場合、前記細胞を含む懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察するとよい。保持部の例として、前記細胞を収納可能な孔や、前記細胞を固定可能な材料（例えば、ポリ−Ｌ−リジン）で覆われた面があげられる。なお保持部の大きさを前記細胞を一つだけ保持可能な大きさとすると、特定細胞の採取および解析（形態学的分析、組織型分析、遺伝子分析など）が容易に行なえる点で好ましい。また細胞を保持部に保持させる際、誘電泳動力を用いると、保持部に細胞を効率的に保持できる点で好ましい。誘電泳動力を用いる場合、具体的には、交流電圧を印加することで誘電泳動を発生させ、保持部内へ細胞を導入すればよい。印加する交流電圧は、保持部内の細胞の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧であると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚの間とし、電界強度を１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２−０１３５４９号公報参照）。
【００２６】
以下、本発明の一実施態様に係る保存剤を利用した、血液試料中に含まれる目的細胞の検出および採取方法の一例として、血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出および採取する方法を用いて詳細に説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。
【００２７】
（１）がんの疑いのある患者から血液試料を採取する。なお血液試料を採取する際、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤に代表される抗凝固剤を添加すると好ましい。
【００２８】
（２）（１）で採取した血液試料（または希釈した血液試料）に、ＣＴＣを安定化させるための保存剤であるホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤を添加する。なお、（１）で抗凝固剤を添加せずに血液試料を採取した場合は抗凝固剤も添加する。前記添加の際、本発明の保存剤を構成する全ての物質を一度に添加してもよく、各成分を含む溶液をそれぞれ添加してもよい。また、血液保存剤として、ポリエチレングリコールをさらに入れるとＣＴＣの形体安定化に寄与するためよい。さらに（１）で抗凝固剤が添加される状態で血液試料を採取し、本工程でホルムアルデヒドドナー化合物および抗血小板剤を含む溶液を血液試料に添加する場合、血液試料中に含まれる抗凝固剤の濃度を維持するために、本工程で抗凝固剤を追加してもよい。血液試料への保存剤の添加量は、血液試料１ｍＬあたり０．０１ｍＬから１０ｍＬの間であればよく、０．０４ｍＬから２ｍＬの間であればより好ましい。アルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加した血液試料は、低温から室温で少なくとも７日間は安定に保存が可能である。
【００２９】
（３）血液保存剤を添加した血液試料（保存処理した血液試料）に含まれる赤血球を、塩化アンモニウムを用いて破砕する。塩化アンモニウムでの赤血球の破砕は、赤血球と他の細胞とのイオン取り込み能の違いを利用した破砕方法であり、他の細胞への損傷を抑えながら赤血球を破砕できるため、好ましい赤血球破砕方法である。
【００３０】
（４）赤血球破砕処理後、遠心分離することで血液成分を除去し、血液試料中に含まれるＣＴＣをペレット状にした後、適切な溶液を用いてＣＴＣを懸濁させる。なおＣＴＣを懸濁させる溶液に、親水性高分子を結合したタンパク質（例えば、ポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ）を含ませてもよい。当該タンパク質を含ませるとＣＴＣの回収効率が向上するため好ましい。親水性高分子を結合したタンパク質の濃度は、懸濁液でのタンパク質の終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）から２５％（ｗ／ｖ）の間であればよく、０．０２％（ｗ／ｖ）から５％（ｗ／ｖ）の間であれば好ましく、０．０５％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）の間であればより好ましい。
【００３１】
（５）（４）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお必要に応じ、前記回収したペレットを親水性高分子を結合したタンパク質を含む溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。
【００３２】
（６）（５）で得られたＣＴＣを含む細胞懸濁液を、前記細胞を保持可能な保持部を有した細胞保持手段に導入し、前記保持部に前記細胞を保持した後、顕微鏡や光学検出器などで観察することで血液試料中に含まれるＣＴＣを検出する。ＣＴＣの検出は、例えば、明視野像によるＣＴＣと夾雑細胞（例えば、白血球などの血液成分）との大きさや形状の違いに基づき検出してもよく、サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などＣＴＣで発現するタンパク質に対する標識抗体および／または夾雑細胞で発現するタンパク質（夾雑細胞が白血球の場合はＣＤ４５など）に対する標識抗体で細胞を染色し当該染色結果に基づき検出してもよい。
【００３３】
（７）（６）で検出したＣＴＣを採取手段で採取する。採取手段の一例として、ノズルによる吸引吐出により採取する手段があげられ、具体例として特開２０１６−１４２６１６号に開示の装置があげられる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、抗血小板剤と抗凝固剤とを少なくとも含む、血液試料を作製する方法を特徴としている。本発明により、作製した血液試料を振動および／または血液試料の凍らない低温条件下で保存しても血液試料を安定に保存することができる。また本発明の血液試料は、室温環境下においても血液試料を安定に保存できる。したがって本発明の血液試料の保存方法は、特に振動や保存温度環境が変化する血液試料の輸送時において有用な方法である。また本発明の保存方法は、血液試料に含まれる目的細胞量が非常に少ない場合にも有用な方法である。さらに、本発明の方法では、低温において細胞を標識する際の非特異的な結合を抑制することができるため、細胞を精度よく検出する上で有用な方法である。
【００３５】
一例として本発明を、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分離回収に適用することで、安定にまた高効率にＣＴＣを分離回収できるため採血量を少なくすることができ、患者への負担を低減させることができる。また、がんの診断をＣＴＣの存在により行なう場合、ＣＴＣの有無の判断結果に対する信頼性が向上するため、精度高くがんを診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の検出方法で利用可能な、細胞保持装置の一例を示す図である。
【図２】図１に示す装置の正面図である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００３８】
実施例１
（１）一方の末端がメトキシ基であり、もう一方の末端がＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル基である、分子量５０００のポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）と、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とを、炭酸水素ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、１５ｍＬ）に溶解させ、当該溶液を２５℃近傍で３時間撹拌することでポリエチレングリコールを結合したＢＳＡ（ＰＥＧ−ＢＳＡ）を調製した。なお調製する際、ｍＰＥＧ−ＮＨＳとＢＳＡとのモル比（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ／ＢＳＡ）を２となるようにした。調製後、分画分子量１００００の透析膜を用いて、純水への溶液置換を３日間行なった。
【００３９】
（２）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、分子量６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２．３ｇ、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）３０ｍｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【００４０】
（３）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離し、蛍光染色色素（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所社製）で標識した。蛍光標識されたＰＣ９細胞を目的とする細胞とした。
【００４１】
（４）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（２）で調製した溶液０．７５ｍＬ、（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個、および０．５ｍｇ／ｍＬチロフィバン水溶液２４０μＬを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００４２】
（５）希釈血液試料を２５℃または１５℃で５日間放置した。
【００４３】
（６）放置後の希釈血液試料のうち、血液３ｍＬに相当する懸濁液に対して、０．９％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウムと０．１％（ｗ／ｖ）炭酸水素カリウムとを含む溶血液で９０ｍＬまでメスアップ後、９００×ｇで１０分間、２５℃で遠心分離した。当該操作により赤血球が破壊され、分離回収したＰＣ９細胞の観察が良好になる。
【００４４】
（７）遠心後の上清を除去した後、ＰＣ９細胞を含むペレットを、（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３０ｍＬで再懸濁した。
【００４５】
（８）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、抗ＣＤ４５抗体修飾磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加後、磁石を用いてＣＤ４５を発現している白血球を除去した。
【００４６】
（９）（８）で白血球を除去したＰＣ９細胞を含む懸濁液を、（１）に記載の方法で調製したＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および２８０ｍＭスクロースを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。
【００４７】
（１０）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去し、再度、ＰＣ９細胞を含むペレットを、ＰＥＧ−ＢＳＡ（ＢＳＡとして０．１％（ｗ／ｖ））および３００ｍＭスクロースを含む溶液３０ｍＬで再懸濁した。当該操作は、血小板を含む血液成分を除去し、目的とするＰＣ９細胞を濃縮するための操作である。
【００４８】
（１１）再懸濁液を６００×ｇで５分間、２５℃で遠心分離後、上清を除去したＰＣ９細胞を含む懸濁液を図１および２に示す細胞保持装置１００に導入し、信号発生器５０から電極基板３１・３２に交流電圧（１ＭＨｚ、２０Ｖｐ−ｐ）を３分間印加することで前記装置が有する保持部６０にＰＣ９細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞保持装置１００は、直径３０μｍの貫通孔１２ａを複数有した絶縁体１２と直径３０μｍの貫通孔１１ａを複数有した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と電極基板３１とを上から絶縁体１２−遮光部材１１−電極基板３１の順に密着して設け、さらに絶縁体１２の上面に試料の導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する厚さ１ｍｍのスペーサー２０を、スペーサー２０の上面に電極基板３２を、それぞれ密着して設けてなる装置である。なお貫通孔１１ａ／１２ａおよび電極基板３１により、直径３０μｍ、深さ３０μｍからなる細胞７０を保持可能な保持部６０が形成されている。
【００４９】
（１２）保持部６０に保持されたＰＣ９細胞数を計測し、（４）で添加したＰＣ９細胞数で除することで回収率を算出した。
【００５０】
比較例１
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００５１】
（２）希釈血液試料を２５℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５２】
比較例２
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（２）で調製した溶液０．７５ｍＬ、および実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００５３】
（２）希釈血液試料を２５℃または１５℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５４】
実施例１ならびに比較例１および２での回収率の結果をまとめて表１に示す。目的細胞の分離回収工程において、ホルムアルデヒドドナー化合物（イミダゾリジニル尿素）、抗血小板剤（チロフィバン）および抗凝固剤（ＥＤＴＡ）を添加し５日間保存した血液試料（実施例１）を用いたときのＰＣ９細胞の回収率は、保存温度２５℃で８９．１％、保存温度１５℃で８５．４％であり、保存温度による影響を受けず高い回収率を示した。一方、抗凝固剤を添加しホルムアルデヒドドナー化合物および抗血小板剤は添加せずに２５℃で保存した血液試料（比較例１）を用いたときのＰＣ９細胞の回収率は、２日間放置しただけで３３．０％と実施例１と比較し大幅に低下した。またホルムアルデヒドドナー化合物および抗凝固剤を添加し抗血小板剤は添加せずに２日間保存した血液試料（比較例２）を用いたときのＰＣ９細胞の回収率は、保存温度２５℃では７６．７％と比較例１よりは向上したが、保存温度１５℃では１．５％と殆ど回収できなかった。なお比較例２では、１５℃で２日間保存後の血液試料においてゲル状物質が発生しており、塩化アンモニウムでの赤血球破砕処理や溶液置換操作において、当該ゲル状物質内に細胞が入り込み、ＰＣ９細胞の回収が妨げられたと考えられる。一方、ホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加し保存した血液試料（実施例１）では、ゲル状物質の発生が大幅に抑えられており、結果、ＰＣ９細胞の回収率が向上していると考えられる。
【００５５】
【表１】
2019207229.tif 000002
【００５６】
実施例２
（１）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に４ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（２）で調製した溶液０．６ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個、および０．５ｍｇ／ｍＬチロフィバン水溶液１９２μＬを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００５７】
（２）希釈血液試料を神奈川県から山口県までの約１０００ｋｍを陸路で往復輸送した。当該輸送により希釈血液試料には振動が与えられており、希釈血液試料の温度は、最低７．６℃、最高２６．８℃、平均１４．５℃であった。
【００５８】
（３）希釈血液試料を（２）の輸送を含め５日間保存後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００５９】
実施例３
インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に４ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（２）で調製した溶液０．６ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個、０．５ｍｇ／ｍＬチロフィバン水溶液１９２μＬ、および３．６ｍｇ／ｍＬヘパリンＰＢＳ溶液７４μＬを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした他は、実施例２と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００６０】
比較例３
インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に１０ｍＬ採血後、前記採血管に実施例１（２）で調製した溶液１．５ｍＬ、および実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした他は、実施例２と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００６１】
実施例２および３ならびに比較例３での回収率の結果をまとめて表２に示す。目的細胞の分離回収工程において、ホルムアルデヒドドナー化合物（イミダゾリジニル尿素）、抗血小板剤（チロフィバン）および抗凝固剤を添加し保存した血液試料（実施例２および３）を用いたときのＰＣ９細胞の回収率は、７０．５％（実施例２）および３７．１％（実施例３）と、ホルムアルデヒドドナー化合物および抗凝固剤を添加し抗血小板剤は添加せずに保存した血液試料（比較例３）を用いたとき（３．６％）と比較し、向上した。したがって、血液試料にホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加することで、輸送時の振動および温度変化（７．６から２６．８℃まで）による、血液試料中に含まれる目的細胞回収への影響が抑えられることがわかる。なお抗凝固剤としてＥＤＴＡおよびヘパリンを添加した血液試料（実施例３）では、抗凝固剤としてＥＤＴＡのみを添加した血液試料（実施例２）と比較し、ＰＣ９細胞の回収率が低下した（実施例２：７０．５％、実施例３：３７．１％）ことから、抗凝固剤を添加する際、ＥＤＴＡなど血液試料中のカルシウムイオンをキレートできる物質（キレート剤）のみを添加したほうが好ましいことがわかる。なお比較例３の条件で保存した血液試料は、比較例２において１５℃で保存した血液試料と比較してゲル状の物質が多く生成していた。一方、ホルムアルデヒドドナー化合物、抗血小板剤および抗凝固剤を添加し保存した血液試料（実施例２および３）では、ゲル状物質の発生が抑えられており、結果、ＰＣ９細胞の回収率が向上していると考えられる。
【００６２】
【表２】
2019207229.tif 000003
【００６３】
実施例４
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、分子量６０００のＰＥＧ２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｅ）に示すいずれかの重量のチロフィバンを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
（ａ）９．６ｍｇ
（ｂ）４．８ｍｇ
（ｃ）２．４ｍｇ
（ｄ）０．１２ｍｇ
（ｅ）０．０４８ｍｇ
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｅ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００６４】
（３）希釈血液試料を１５℃で５日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
比較例４
実施例４（１）においてチロフィバンを添加しなかった他は、実施例４と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００６５】
実施例４ならびに比較例４での回収率の結果をまとめて表３に示す。チロフィバンの添加量を０．０４８ｍｇから９．６ｍｇへと増やすことでがん細胞回収率が７．４％から８５．２％へと向上した。保存処理後の血液試料において、チロフィバンの添加量０．０４８ｍｇから０．１２ｍｇではゲル状物質の発生が確認でき、２．４ｍｇでは小さいもののゲル状物質の発生が確認でき、４．８ｍｇ以上のチロフィバン添加量においてはゲル状物質の形成は確認されなかったことから、ゲル状物質の形成ががん細胞回収率低下の要因になっていると考えられる。チロフィバン添加量０．０４８ｍｇにおいてゲル状物質の形成が認められたものの、がん細胞回収率はチロフィバン未添加（０％）と比較して高い値を示していたことから、ゲル状物質が形成されてもチロフィバンを添加することでがん細胞回収率が向上することがわかる。さらに、ゲル状物質の形成が確認されなかったチロフィバン添加量４．８ｍｇ（７０．８％）と９．６ｍｇのがん細胞回収率を比較すると、添加量の多い方が前記回収率が向上しており、ゲル状物質の形成抑制以外にもチロフィバンが前記回収率向上に寄与していることがわかる。
【００６６】
【表３】
2019207229.tif 000004
【００６７】
実施例５
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの抗血小板剤を、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
（ａ）チロフィバン９．６ｍｇ
（ｂ）エプチフィバチド４ｍｇ
（ｃ）エプチフィバチド０．４ｍｇ
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｃ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００６８】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
比較例５
実施例５（１）において抗血小板剤を添加しなかった他は、実施例５と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００６９】
実施例５ならびに比較例５での回収率の結果をまとめて表４に示す。抗血小板剤であるチロフィバンおよびエプチフィバチドを添加することで、未添加時（６２．９％）と比較してがん細胞回収率が約８５％と向上した。このことから、チロフィバンとエプチフィバチドはがん細胞回収率向上にどちらも効果があることがわかる。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
実施例６
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、分子量６０００のＰＥＧ０．２３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの量のホルマリンを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
（ａ）５６μｌ
（ｂ）５．６μｌ
（ｃ）未添加
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｃ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００７２】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００７３】
実施例６での回収率の結果を表５に示す。ホルマリンを入れなかった（ｃ）の回収率（７３．６％）と比較して、ホルマリンを添加した（ａ）および（ｂ）の回収率はそれぞれ１７．１％、６９．１％と低下した。このことから、ホルムアルデヒドを保存剤に添加するとがん細胞回収率が低下することがわかる。
【００７４】
【表５】
2019207229.tif 000006
【００７５】
実施例７
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｆ）に示すいずれかの量の分子量６０００のＰＥＧを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
（ａ）２．３ｇ
（ｂ）１．１５ｇ
（ｃ）０．５７５ｇ
（ｄ）０．２３ｇ
（ｅ）０．０２３ｇ
（ｆ）未添加
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｆ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００７６】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００７７】
実施例７での回収率の結果を表６に示す。ＰＥＧを高濃度で添加した（ａ）および（ｂ）では、ゲル状物質が形成したことでがん細胞回収率が１０％以下となった。一方、（ｂ）より少ないＰＥＧ添加量である（ｃ）および（ｄ）では、ゲル状物質は形成せずがん細胞回収率はそれぞれ６６．７％および７８．６％を示した。さらに、（ｄ）より少ないＰＥＧ添加量である（ｅ）では、ゲル状物質は形成しないもののがん細胞回収率は１９．９％となり（ｃ）および（ｄ）と比較して低下した。ＰＥＧを添加しなかった（ｆ）では、ゲル状物質は形成しないもののがん細胞回収率は８．５％となり、（ｅ）と比較して低い値となった。この結果から、ＰＥＧの添加がゲル状物質の形成に関与していることがわかり、高濃度の添加はがん細胞回収率を低下させるが、一方でＰＥＧの添加量が少ないもしくは添加しないとゲルの形成とは異なった要因によりがん細胞回収率が低下することもわかる。ＰＥＧは細胞の安定化剤の役割をしており、一定量入れることで細胞の保存安定性が上がりがん細胞回収率が向上すると考えられる。
【００７８】
【表６】
2019207229.tif 000007
【００７９】
実施例８
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量６０００のＰＥＧ２．３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【００８０】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００８１】
（３）希釈血液試料を４、１０、２５、３７℃でそれぞれ５日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００８２】
実施例９
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量６０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【００８３】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００８４】
（３）希釈血液試料を４、２５℃でそれぞれ２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００８５】
実施例８および９での回収率の結果をまとめて表７に示す。ＰＥＧ添加量２．３ｇの場合、保存温度１０から３７℃においてはゲル状物質の形成はなく、保存温度１０℃ではがん細胞回収率６２．８％と保存温度２５℃および３７℃での回収率８９％と比較してわずかに低いものの回収できることが確認された。保存温度４℃ではゲルの形成が確認され、がん細胞回収率も２．３％と保存温度１０℃以上での回収率と比較して低い値となった。一方、ＰＥＧ添加量０．２３ｇの場合、保存温度４℃から２５℃では回収率は約８０％となり、温度に依存せず安定して回収できることがわかった。
【００８６】
【表７】
2019207229.tif 000008
【００８７】
実施例１０
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｄ）に示すいずれかの分子量のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
（ａ）分子量２０００
（ｂ）分子量４０００
（ｃ）分子量６０００
（ｄ）分子量２００００
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｄ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００８８】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００８９】
実施例１０での回収率の結果を表８に示す。ＰＥＧの分子量を２００００、６０００、４０００、２０００と下げていくことでがん細胞回収率がそれぞれ６６．０％、７３．６％、７４．５％、８２．７％となり向上していく結果となった。どの分子量でもゲル状物質の形成は確認されず、ＰＥＧによる細胞の安定性が向上した結果がん細胞回収率が向上したと考えられる。
【００９０】
【表８】
2019207229.tif 000009
【００９１】
実施例１１
（１）ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇ、および以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの量のイミダゾリジニル尿素を、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
（ａ）１．１５ｇ
（ｂ）２．３ｇ
（ｃ）４．６ｇ
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｃ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００９２】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００９３】
実施例１１での回収率の結果を表９に示す。イミダゾリジニル尿素添加量が（ａ）および（ｂ）の時、濃度の高い（ｃ）のがん細胞回収率１８．２％と比較して、がん細胞回収率が約６０％と高い値を示した。この結果からイミダゾリジニル尿素添加量が多いとがん細胞回収率が低下することがわかる。
【００９４】
【表９】
2019207229.tif 000010
【００９５】
実施例１２
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、以下の（ａ）から（ｄ）に示すいずれかの溶媒で溶解した。
（ａ）超純水
（ｂ）ＰＢＳ
（ｃ）０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を溶解させたＰＢＳ
（ｄ）１．８％ＮａＣｌを溶解させたＰＢＳ
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｄ）いずれかの溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【００９６】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【００９７】
実施例１２での回収率の結果を表１０に示す。溶媒を超純水からＰＢＳにすることで、がん細胞回収率が８３．９％から９４．０％に向上した。一方、ＰＢＳにさらにＮａＣｌを０．９％および１．８％溶かした溶液を保存剤の溶媒として使用すると、がん細胞回収率がそれぞれ５２．８％および９．２％と低下した。この結果から、血液の浸透圧（約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ・Ｈ２Ｏ）に近い（ａ）よりも、高張である（ｂ）の方ががん細胞回収率が向上し、さらに高い浸透圧である（ｃ）、（ｄ）では細胞質内の浸透圧と大きく異なるため細胞が一部損傷を受けることで回収率が低下したと考えられる。
【００９８】
【表１０】
2019207229.tif 000011
【００９９】
実施例１３
（１）ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１００】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１０１】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
比較例６
実施例１３（１）においてチロフィバンを添加しなかった他は、実施例１３と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１０２】
実施例１３ならびに比較例６での回収率の結果をまとめて表１１に示す。ホルムアルデヒドドナーを添加しなかった場合、ホルムアルデヒドドナーを添加した実施例１２（ｂ）の回収率（９４．０％）と比較して、６６．４％となり低下した。このことからホルムアルデヒドドナーを添加することで、細胞の保存安定性が向上することがわかる。一方、ホルムアルデヒドドナーを添加せず、さらに抗血小板剤を添加しなかった場合、抗血小板剤を添加した場合のがん細胞回収率（６６．４％）と比較して、３．２％と大きく減少し、さらにゲル状物質の形成も確認された。この結果から、ホルムアルデヒドドナーを添加しなかった場合においても抗血小板剤を添加することで、ゲル状物質の形成が抑制され、がん細胞回収率が向上することがわかる。
【０１０３】
【表１１】
2019207229.tif 000012
【０１０４】
参考例１
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇもしくは未添加、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、ＰＢＳ５ｍＬで希釈した前記血液を３００×ｇで１０分間、２５℃で遠心分離した。上清である血漿１ｍＬをエッペンチューブに回収し、前記エッペンチューブに（１）で調製した溶液０．１５ｍＬを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、ゲル状物質の形成有無を観察した。
【０１０５】
チロフィバンを添加した溶液ではゲル状物質の形成は確認されなかったが、一方でチロフィバンを添加しなかった溶液からはゲル状物質の形成が確認された。血漿には細胞および血小板の大部分が含まれていないにも関わらずゲル状物質の形成が確認されたことから、当該ゲル状物質は細胞および血小板の凝集物でないことがわかる。
【０１０６】
実施例１４
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１０７】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、以下の（ａ）もしくは（ｂ）に示すいずれかの溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
（ａ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ
（ｂ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１１）と同様な方法で、懸濁液に含まれる細胞を保持部６０に保持させた
（４）保持部６０に保持されたＰＣ９細胞数および白血球を計測し、計数したＰＣ９細胞数を（２）で添加したＰＣ９細胞数で除することで回収率を算出し、また計数した白血球数を（２）の血液に含まれる白血球数で除することで白血球残存率を算出した。
【０１０８】
実施例１４での回収率の結果を表１２に示す。トロロックスを添加した場合、トロロックス未添加と比較して、がん細胞回収率はどちらも８８％であったのに対して、白血球残存率が７．４％から３．８％へと減少した。白血球残存率の低下は血液処理後のがん細胞の濃縮度が向上していることを意味する。トロロックスは白血球の細胞死を抑制する効果もあるため、白血球に結合して白血球を除去する磁性粒子での処理工程において、白血球の保存安定性が向上したことで、白血球細胞膜表面のタンパク質が保持され、高効率に磁性粒子が白血球と結合できたことで白血球を除去することができたと考えらえる。
【０１０９】
【表１２】
2019207229.tif 000013
【０１１０】
実施例１５
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【０１１１】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
（ａ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ
（ｂ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびＤＭＳＯ１１．５μＬの混合溶液
（ｃ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびＤＭＳＯ４６μＬの混合溶液
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１１２】
実施例１５での回収率の結果を表１３に示す。血液にＤＭＳＯを添加した場合、未添加でのがん細胞回収率（７２．８％）と比較して、（ｃ）では６．６％と減少したのに対して（ｂ）では６８．５％と未添加時とほぼ差はなかった。この結果から、少量のＤＭＳＯを血液に添加してもがん細胞回収率には影響しないことがわかる。
【０１１３】
【表１３】
2019207229.tif 000014
【０１１４】
実施例１６
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【０１１５】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
（ａ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．１４４ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液
（ｂ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液
（ｃ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス１．１５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１１６】
実施例１５（ａ）および１６での回収率の結果を表１４に示す。トロロックスを０．１４４ｍｇから１．１５ｍｇの範囲で添加したが、がん細胞回収率は未添加時（７２．８％）と比較して、６９．１％から７６．７％となり変化が見られなかった。この結果から、トロロックスの添加はがん細胞回収率に影響を与えないことがわかる。
【０１１７】
【表１４】
2019207229.tif 000015
【０１１８】
実施例１７
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、超純水で溶解した。
【０１１９】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびアスコルビン酸０．１ｍｇを超純水１０μＬで溶解した溶液の混合溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１２０】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１２１】
抗酸化剤であるアスコルビン酸を添加すると、がん細胞回収率は１２．９％となり、実施例１５（ａ）の抗酸化剤を添加しなかった結果（７２．８％）と比較して、大幅に低下した。この結果から、抗酸化剤の中でもアスコルビン酸はがん細胞回収率低下の要因になるため、血液保存剤として適さないことがわかる。
【０１２２】
実施例１８
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１２３】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
（ａ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬ（血液保存剤）
（ｂ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液を混合後１０分以内の溶液
（ｃ）（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液を混合後４週間の溶液
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１１）と同様な方法で、懸濁液に含まれる細胞を保持部６０に保持させた
（４）保持部６０に保持されたＰＣ９細胞数および白血球を計測し、計数したＰＣ９細胞数を（２）で添加したＰＣ９細胞数で除することで回収率を算出し、また計数した白血球数を（２）の血液に含まれる白血球数で除することで白血球残存率を算出した。
【０１２４】
実施例１８での回収率の結果を表１５に示す。トロロックスを血液保存剤に添加した後４週間経った溶液を用いた時のがん細胞回収率および白血球残存率は、当該１０分以内の溶液を用いた時と比較して、回収率９０％および残存率２．６から２．９％となりほぼ変化はなかった。一方、トロロックス未添加の条件と比較すると、がん細胞回収率に変化はないが、白血球残存率は未添加条件の５．４％からどちらも低下しており、水溶液である血液保存剤にトロロックスを添加してから長時間経っても、血液前処理により白血球除去効率を向上させる効果は維持されていることがわかる。
【０１２５】
【表１５】
2019207229.tif 000016
【０１２６】
実施例１９
（１）ヒト肺がん細胞（ＰＣ９細胞）を、５％ＣＯ２環境下、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて３７℃で２４から９６時間培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離した。剥離したＰＣ９細胞を目的とする細胞とした。
【０１２７】
（２）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１２８】
（３）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、（２）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液と、（１）で剥離したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１２９】
（４）希釈血液試料を４℃で７日間放置後、実施例１（６）から（１１）と同様な方法で、懸濁液に含まれる細胞を保持部６０に保持させた
（５）実施例１（１１）の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（６）５０％（ｖ／ｖ）エタノールと１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、「細胞膜透過試薬」と称する）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部にＣＴＣを含めた細胞を標本化した。
（７）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（８）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液（以下、標識試薬）を導入し、３０分間静置した。なお、前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体と、ＰＣ９細胞の細胞質内で発現しているサイトケラチン（ＣＫ）に対する抗体を用いている。
（９）標識試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬を除去した。
（１０）（９）で標識したＰＣ９細胞を含む細胞保持手段を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行った。これにはコンピューター制御式電動ステージ、ＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０；浜松ホトニクス社製）を装備した蛍光顕微鏡（ＩＸ８３；オリンパス社製）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた。
（１１）（１０）で撮像した細胞の中から、細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されており（ＤＡＰＩ陽性）、白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体では染色されず（ＣＤ４５陰性）、ＣＫに対する抗体で染色されている（ＣＫ陽性）細胞を、目的とする細胞（ＰＣ９細胞）として検出した。
【０１３０】
（１２）検出されたＰＣ９細胞数を計測し、（３）で添加したＰＣ９細胞数で除することで検出率を算出した。
ＰＣ９細胞の検出率は８７．９％となり、抗体による標識を行わなかった実施例１８（ｂ）のＰＣ９細胞の回収率９０．３％と比較しても、変化は見られなかった。この結果は、７日間保存してもＰＣ９細胞で発現している抗原が安定に保持・保存されていることを示し、抗体等による標識を行う場合でも精度よく目的とする細胞を標識できることがわかる。
実施例２０
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン９．６ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１３１】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１３２】
（３）希釈血液試料を氷冷（０℃）、４、２５、３７℃でそれぞれ２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１３３】
実施例２０での回収率の結果を表１６に示す。保存温度約０から３７℃においてゲル状物質の形成はなく、がん細胞回収率は７２．６％から８０．５％となり、保存温度に依存せず安定して回収できることがわかる。
【０１３４】
【表１６】
2019207229.tif 000017
【０１３５】
実施例２１
（１）実施例１９（３）においてＰＣ９細胞を添加せず、実施例１９（４）の保存条件を氷冷（０℃）、４、１５、２０、２５、３７℃でそれぞれ２日間放置した他は、実施例１９（２）から（１０）と同様な方法で標識した細胞を撮像した。
【０１３６】
（２）（１）で撮像した細胞の中から、細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されており（ＤＡＰＩ陽性）、白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体で染色された（ＣＤ４５陽性）細胞を白血球として検出した。
【０１３７】
（３）検出された白血球に対して、ＣＫ抗体の非特異吸着による当該白血球への標識の程度を、ＣＫ抗体に修飾された蛍光色素により得られた輝度を２５６階調において検出し、約３００個の白血球を対象として平均ＣＫ抗体輝度を求めた。
【０１３８】
実施例２１での回収率の結果を表１７に示す。保存温度約０℃から４℃では白血球へのＣＫ抗体結合による輝度は約１０であるのに対して、１０℃から２０℃においては前記輝度が約１３、２５℃から３７℃においては前記輝度が約１５となり、保存温度が上がるに従い白血球へのＣＫ抗体の結合が増加する傾向が得られた。白血球はＣＫ抗原を発現していないため、ＣＫ抗体の白血球への結合量の増加は抗体の非特異吸着量の増加である。一般的な実験室の温度（約２５℃）より低い保存温度（＜２５℃）であれば、細胞への非特異吸着を低下させることができるため、抗体の特異的な結合と非特的な結合との差が広がり特定の細胞の検出精度を向上させることが可能となる。
【０１３９】
【表１７】
2019207229.tif 000018
【０１４０】
実施例２２
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン１９．２ｍｇ、および分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
【０１４１】
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に、（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１４２】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１４３】
チロフィバン１９．２ｍｇを添加した実施例２２のがん細胞回収率は９０．７％となり、チロフィバンを９．６ｍｇ添加した実施例１８（ｂ）のがん細胞回収率（９０．３％）と比較して変わらない結果となり、さらにどちらもゲル状物質の形成は確認されなかった。この結果から、高い濃度のチロフィバンを添加してもがん細胞回収率およびゲル状物質の形成には影響を与えないことがわかる。
実施例２３
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン１９．２ｍｇ、および以下の（ａ）から（ｃ）に示すいずれかの分子量のＰＥＧ０．２３ｇもしくは（ｄ）エチレングリコール０．２３ｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
（ａ）分子量１５４０
（ｂ）分子量６００
（ｃ）分子量２００
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した（ａ）から（ｄ）いずれかの溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液と、実施例１（３）で蛍光標識したＰＣ９細胞約１００個とを添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１４４】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置後、実施例１（６）から（１２）と同様な方法で、ＰＣ９細胞の分離回収および回収率の算出を行なった。
【０１４５】
実施例２３での回収率の結果を表１８に示す。ＰＥＧの分子量を１５４０、６００、２００およびエチレングリコールと添加物を変えることで、がん細胞回収率はそれぞれ９２．０％、９０．３％、５３．８％、４６．０％となり、実施例１８（ｂ）のＰＥＧの分子量２０００を添加した条件でのがん細胞回収率（９０．３％）と比較してＰＥＧの分子量１５４０および６００では変わらない結果となった。一方で、ＰＥＧの分子量２００およびエチレングリコールではがん細胞回収率の低下が確認された。ＰＥＧは細胞の安定性向上のために添加しているが、ＰＥＧの分子量６００未満およびエチレングリコールでは当該安定性維持の効果が低下するため、がん細胞回収率が低下したと考えられる。
【０１４６】
【表１８】
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【０１４７】
実施例２４
（１）イミダゾリジニル尿素２．３ｇ、ＥＤＴＡ３０ｍｇ、チロフィバン１９．２ｍｇ、分子量２０００のＰＥＧ０．２３ｇ、および以下のＲＧＤ配列を含むペプチド１３．３ｍｇを、溶液として３０ｍＬになるよう、ＰＢＳで溶解した。
（ａ）ＧＲＧＤＮＰ配列のペプチド
（ｂ）環状ＲＧＤ配列のペプチドであるＣｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ
（ｃ）未添加
（２）インフォームドコンセントを得た健常人から血液をＥＤＴＡ−２Ｋ採血管（ＶＰ−ＤＫ０５０Ｋ、テルモ社製）に５ｍＬ採血後、前記採血管に（１）で調製した溶液０．７５ｍＬおよびトロロックス０．５７５ｍｇをＤＭＳＯ１１．５μＬで溶解した溶液の混合溶液を添加し、得られた溶液を希釈血液試料とした。
【０１４８】
（３）希釈血液試料を４℃で２日間放置し、血液試料の流動性を確認した後、実施例１（６）と同様な方法で、溶血を行いゲルの形成の有無を確認した。
【０１４９】
実施例２４を行った結果、ＲＧＤペプチド未添加の（ｃ）と比較して、ＲＧＤペプチドを添加した（ａ）および（ｂ）では、血液試料の流動性が低下し、粘性の増加が確認された。一方、（ａ）から（ｃ）のどの条件でも溶血後のゲルの形成は確認されなかった。この結果から、ＲＧＤペプチドを添加することで当該ペプチドと結合可能なインテグリンの働きが阻害され、血液試料の物性が変化したことがわかる。
【符号の説明】
【０１５０】
１００：細胞保持装置
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ・１２ａ：貫通孔
２０：スペーサー
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
【図１】
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【図２】
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