(57)【要約】      （修正有）【課題】ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体の提供。【解決手段】天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする変異体を提供する。ＦｃＲｎに対する高い結合親和性により、免疫グロブリンＦｃ変異体は、生体内半減期がさらに延長されるので、タンパク質薬物の持続性製剤の製造に用いることができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体であって、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする、免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２】
前記アミノ酸修飾が、４２８Ｌ／４３４Ｓ、４３３Ｋ／４３４Ｓ、４２９Ｋ／４３３Ｋ、４２８Ｌ／４３３Ｋ、３０８Ｆ／３８０Ａ、３０７Ｓ／３８０Ｓ及び３８０Ｓ／４３４Ｓからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項４】
前記前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項５】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４３３位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号８０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２９位のヒスチジンがリジンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号９１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のメチオニンがロイシンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０８位のバリンがフェニルアラニンに置換され、３８０位のグルタミン酸がアラニンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１００で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７位のスレオニンがセリンに置換され、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１７】
前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１８】
前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１７に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項１９】
前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１８に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２０】
前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、免疫グロブリンの可変領域と軽鎖を含まない、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、動物細胞又は大腸菌で生産される、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、大腸菌で生産される、請求項２２に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントに比べて、ｐＨ７．４では低いＦｃＲｎ結合親和性を示すが、ｐＨ６．０では高いＦｃＲｎ結合親和性を示す、請求項１に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
【請求項２５】
生体内半減期が延長されたタンパク質結合体であって、生理活性ポリペプチドが、非ペプチド性重合体を介して請求項１〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結されることを特徴とする、タンパク質結合体。
【請求項２６】
前記非ペプチド性重合体が、ポリ（エチレングリコール）モノポリマー、ポリ（プロピレングリコール）モノポリマー、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載のタンパク質結合体。
【請求項２７】
前記非ペプチド性重合体が、ポリ（エチレングリコール）である、請求項２６に記載のタンパク質結合体。
【請求項２８】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、グルコセレブロシダーゼ、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮細胞成長因子、骨成長因子、骨促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、インスリン変異体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、受容体、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、及びウイルス由来ワクチン抗原からなる群から選択される、請求項２５に記載のタンパク質結合体。
【請求項２９】
生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法であって、請求項１〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリンＦｃ変異体を、非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦｃＲｎ（新生児（neonatal）Ｆｃ受容体）に対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体、及びそれを用いて生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法に関する。本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体は、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域内における３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
抗体とは、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。抗体は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとから構成される。各鎖は免疫グロブリンドメインで構成されており、それらは全て可変領域及び定常領域を含むものである。可変領域は、抗体間において高い配列多様性を示し、標的抗原への結合を担う。相対的に配列多様性が低い定常領域は、複数の天然タンパク質との結合を担い、重要な生化学的反応を誘発する。
【０００３】
抗体の構造、機能及びサブクラスについての詳細な説明は、公知の文献に詳細に記述されている（非特許文献１）。ＩｇＧにおけるＦｃドメイン間の部位は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を媒介する。ＦｃＲｎは、エンドサイトーシス（endocytosis）により細胞内に輸送されたＩｇＧを取り込み、それをエンドソーム（endosome）から血流に再利用させる（非特許文献２）。抗体自体のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と共に、この過程は１〜３週間の範囲に延長された抗体の血清半減期をもたらす。
【０００４】
ラット及びヒトＦｃドメインに関する研究において、ＦｃＲｎ結合に対する一部のＦｃ残基の重要性が証明された。マウス（murine）Ｆｃγドメインにおいて、Ｔ２５２、Ｔ２５４及びＴ２５６位におけるランダム突然変異（random mutation）及びファージディスプレイ選択によりＦｃＲｎ結合親和性が増加し、かつ血清半減期が延長された三重突然変異体Ｔ２５２Ｌ／Ｔ２５４Ｓ／Ｔ２５６Ｆが報告されている（非特許文献３）。Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５位における突然変異によるＦｃ／ＦｃＲｎ相互作用の破壊が生体内半減期を減少させることが報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
ヒトＦｃγドメインにおいては、ＦｃＲｎの結合に重要な一部の残基の突然変異が血清半減期を延長させることが証明されている。特に、ヒトＦｃγ１の場合、３個の残基をそれぞれ１９個の通常の他のアミノ酸に置換すると、一部の点突然変異体はＦｃＲｎ結合親和性が増加した（非特許文献５）。Ｆｃのアミノ酸のうち、Ｈ３１０とＨ４３５、及びＬ３０９とＩ２５３が、塩橋（salt bridge）及び疎水性結合によりＦｃＲｎとの結合に主に関与することが知られている。また、Ｔ２５０、Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｖ３０８、Ｅ３８０、Ｍ４２８及びＮ４３４における突然変異がＦｃＲｎ結合親和性を増加又は減少させることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
特許文献１はＦｃＲｎ結合親和性が増加したトラスツズマブ（Trastuzumab）（Herceptin, Genentech）変異体を開示しており、これらの変異体は２５７Ｃ、２５７Ｍ、２５７Ｌ、２５７Ｎ、２５７Ｙ、２７９Ｑ、２７９Ｙ、３０８Ｆ及び３０８Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。特許文献２はベバシズマブ（beacizumab）（Avastin, Genentech）変異体を提供しているが、前記変異体はＮ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｎ４３４Ｓ及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓにアミノ酸修飾を含むことにより生体内半減期が延長される。
【０００７】
治療剤として抗体タンパク質を投与する場合は、タンパク質の除去及び生体内半減期の特性を考慮して、規定された頻度の注射が求められる。より長い生体内半減期はより低い頻度の注射又はより少ない投与量を可能にするが、これは明らかに有利なことである。以前に報告されたＦｃドメイン内の突然変異は、ＦｃＲｎ結合親和性が増加し、かつ生体内半減期が延長された一部の抗体変異体を産生したが、これらの突然変異は最適でないことが確認されており、一部の変異体は生体内半減期を満足できるレベルに延長させることができなかった。
【０００８】
一方、生体内半減期を延長させる要求は、抗体タンパク質に限られた問題ではない。低分子量ポリペプチド、サイトカイン及びホルモンをはじめとする治療用タンパク質は、安定性が低いので容易に変性し、血液内のタンパク質分解酵素により分解され、最終的には腎臓又は肝臓の作用により除去される。よって、薬理学的活性成分としてポリペプチドを含むタンパク質薬物は、それらの至適血中濃度及び力価を維持するために、患者に頻繁に投与しなければならない。しかし、ほとんどのタンパク質薬物は注射製剤で患者に投与されるので、活性ポリペプチドの至適血中濃度を維持するための頻繁な注射は多大な苦痛を伴う。
【０００９】
上記問題を解決するために、ＰＥＧなどの重合体の付着や、ポリペプチド薬物の生体内半減期を延長させるためにアルブミンなどのタンパク質の融合が試みられた。しかし、ＰＥＧを付着したり、アルブミンを融合したにもかかわらず、ポリペプチド薬物は依然として相対的に低い生物学的活性を示し、その生体内半減期も満足すべきレベルには延長されなかった。特許文献３は、試験管内で免疫グロブリンフラグメントを非ペプチド性重合体と連結して作製した結合体を開示している。この方法では、免疫グロブリンフラグメントのみを大腸菌で生産し、その後非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに連結するが、これは活性減少を最小限に抑えることによりポリペプチドの半減期を延長させる結果をもたらす。この方法は、天然ペプチド及びタンパク質だけでなく、自然界に存在しない非天然又は合成生理活性物質にも適用できる汎用的な技術であることが認められている。しかし、ペプチド及びタンパク質をはじめとする治療用生理活性物質の生体内半減期の最大化は依然として求められている。
【００１０】
よって、本発明者らは、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントと比較して、ＦｃＲｎ結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体を開発した。また、本発明者らは、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体が非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結されたタンパク質結合体は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加することにより生体内半減期がさらに延長されることを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１０２７４２７号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２０１０−００９９１７９号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０５６７９０２号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０８２４５０５号公報
【特許文献５】韓国登録特許第１０−１０５８２９０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Burton DR: Immunoglobulin G: functional sites, Mol. Immunol. 22: 161-206, 1985
【非特許文献２】Raghavan et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 181-220, 1996
【非特許文献３】Ghetie et al., Nat. Biotech. 157: 637-640, 1997
【非特許文献４】Medesan et al., J. Immunol. 1585: 2211-2217, 1997
【非特許文献５】Hinton et al., J. Biol. Chem. 2798: 6213-6216, 2004
【非特許文献６】Roopenian et al., Nat. Rview Immunology 7: 715-725, 2007
【非特許文献７】Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766, 2000
【非特許文献８】Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991
【非特許文献９】Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd Ed., Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体を提供することである。
【００１４】
また、本発明のもう一つの目的は、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体を含むタンパク質結合体を提供することである。
【００１５】
さらに、本発明のもう一つの目的は、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体を用いて生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様では、生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結され、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の態様では、本発明による免疫グロブリンＦｃ誘導体を非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結する工程を含む、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が高いので、これらは生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させることができる。よって、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体が非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結され、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体は、投与頻度が著しく低いタンパク質薬物の持続性製剤の製造に効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性を分析したＥＬＩＳＡ結果であり、左のグラフはｐＨ６．０での結合親和性を示し、右のグラフはｐＨ７．４での結合親和性を示す。
【図２】本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性を分析したＥＬＩＳＡ結果であり、左のグラフはｐＨ６．０での結合親和性を示し、右のグラフはｐＨ７．４での結合親和性を示す。
【図３】本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性を分析したＥＬＩＳＡ結果であり、左のグラフはｐＨ６．０での結合親和性を示し、右のグラフはｐＨ７．４での結合親和性を示す。
【図４】免疫グロブリンＦｃ変異体と生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して連結された、本発明によるタンパク質結合体のＦｃＲｎ結合親和性を分析したＥＬＩＳＡ結果であり、左のグラフはｐＨ６．０での結合親和性を示し、右のグラフはｐＨ７．４での結合親和性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体に関する。
【００２２】
本発明における「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも部分的にはＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。ＦｃＲｎは、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含む任意の有機体由来のものであってもよい。当該分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば軽鎖や重鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ２マイクログロブリン（β-2-microglobulin）であり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。本発明において、特に断らない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質とは、ＦｃＲｎ重鎖とβ２マイクログロブリンの複合体を示すものである。
【００２３】
本発明における「天然（野生型）ポリペプチド」とは、変異体を生産するように修飾された非修飾ポリペプチドを意味する。天然ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又はその誘導体もしくは操作されたものである。天然ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体、それを含む組成物、又はそれをコード化するアミノ酸配列を示すものであってもよい。よって、本発明における「天然免疫グロブリン」とは、アミノ酸修飾により変異体を生成する非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味する。アミノ酸修飾により変異体を生成する非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味する「親（parent）免疫グロブリン」という用語を互換的に用いることもできる。
【００２４】
本発明における「アミノ酸修飾」とは、アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失、好ましくは置換を意味する。本発明における「アミノ酸置換」又は「置換」とは、天然ポリペプチド配列の特定の位置においてアミノ酸が他のアミノ酸に置換されることを意味する。例えば、Ｔ３０７Ｓ置換を含む免疫グロブリンＦｃ変異体とは、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントのアミノ酸配列において３０７位のスレオニンがセリンに置換されたものを意味する。
【００２５】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ変異体」とは、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことを意味する。本発明の好ましい実施態様において、免疫グロブリンＦｃ変異体とは、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させるために、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む変異体を意味する。
【００２６】
本発明は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が改善された、免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域における複数の突然変異に対する同定に基づくものである。本発明は、対応する天然免疫グロブリンＦｃフラグメントと比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加し、及び／又は生体内半減期が延長された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。抗体及び他の生理活性物質の生体内半減期（すなわち、被験者の血清又は他の組織における持続性）は、その投与用量及び頻度を決定する重要な臨床的指標である。よって、生体内半減期が延長された抗体をはじめとする生理活性分子は、薬学的に重要かつ有利である。
【００２７】
これに関して、免疫グロブリンの生体内半減期がＦｃＲｎに対するＦｃの結合と相関することが報告されている。免疫グロブリンＦｃフラグメントは、非特異的な飲作用（pinocytosis）により内皮細胞に取り込まれ、その後酸性エンドソームに取り込まれる。ＦｃＲｎは、エンドソームの酸性ｐＨ（＜６．５）では免疫グロブリンに結合し、血流の塩基性ｐＨ（＞７．４）では免疫グロブリンを放出する。よって、ＦｃＲｎは、免疫グロブリンをリソソーム分解からサルベージする。血清免疫グロブリンレベルが低下すると、増大した量の免疫グロブリンがサルベージされるように、より多くのＦｃＲｎ分子が免疫グロブリン結合のために利用されうる。逆に、血清免疫グロブリンレベルが上昇すると、ＦｃＲｎが飽和することにより、取り込まれて分解される免疫グロブリンの比率が増加する（非特許文献７）。
【００２８】
ＦｃＲｎに対する免疫グロブリンＦｃフラグメントの結合と免疫グロブリンの生体内半減期の密接な関係に基づいて、低ｐＨ環境ではＦｃＲｎに対する結合親和性が増加するが、高ｐＨ環境では実質的に変化を呈さない免疫グロブリンＦｃ変異体を開発するために、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域に複数の突然変異を導入した。その結果として、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、アミノ酸残基３０７、３０８、３８０、４２８、４２９、４３０、４３３及び４３４（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾がＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることが確認された。
【００２９】
よって、本発明は、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。
【００３０】
本発明の好ましい一実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８Ｌ／４３４Ｓ、４３３Ｋ／４３４Ｓ、４２９Ｋ／４３３Ｋ、４２８Ｌ／４３３Ｋ、３０８Ｆ／３８０Ａ、３０７Ｓ／３８０Ｓ及び３８０Ｓ／４３４Ｓからなる群から選択されるアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。
【００３１】
本発明の具体的な一実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。４２８Ｌ／４３４Ｓのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号７４で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１３で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ００２と命名する。
【００３２】
本発明の他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４３３位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。４３３Ｋ／４３４Ｓのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号８０で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１４で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ００８と命名する。
【００３３】
本発明のさらに他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２９位のヒスチジンがリジンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。４２９Ｋ／４３３Ｋのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号９１で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１５で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ０１９と命名する。
【００３４】
本発明のさらに他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のメチオニンがロイシンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。４２８Ｌ／４３３Ｋのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号９２で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１６で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ０２０と命名する。
【００３５】
本発明のさらに他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０８位のバリンがフェニルアラニンに置換され、３８０位のグルタミン酸がアラニンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。３０８Ｆ／３８０Ａのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号１００で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１７で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ０２８と命名する。
【００３６】
本発明のさらに他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７位のスレオニンがセリンに置換され、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。３０７Ｓ／３８０Ｓのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１８で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ０２９と命名する。
【００３７】
本発明のさらに他の具体的な実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。３８０Ｓ／４３４Ｓのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１９で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ０３１と命名する。
【００３８】
前述した免疫グロブリンＦｃ変異体の作製に用いられる親（parent）免疫グロブリンＦｃフラグメントは、特許文献４に記載された大腸菌形質転換体ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ−１０６６０Ｐ）から生産されたＨＭＣ００１であることが好ましい。ＨＭＣ００１は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＦｃフラグメントである。
【００３９】
本発明において、免疫グロブリンＦｃ変異体は親免疫グロブリンＦｃフラグメントに導入されたアミノ酸修飾により規定され、そのアミノ酸残基のナンバリングはカバットのＥＵインデックスによる（非特許文献８）。ここで、本発明において親免疫グロブリンＦｃフラグメントとして用いられたＨＭＣ００１は、大腸菌形質転換体から生産する際に一部のＮ末端が除去されて開始メチオニンが欠失した免疫グロブリンＦｃフラグメントであるので、カバットのナンバリングによるものではないことがある。本発明に親免疫グロブリンＦｃフラグメントとして用いられたＨＭＣ００１は１位のアミノ酸としてプロリンを有し、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のアミノ酸ナンバリングはそれによるものである。しかし、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体の突然変異部位はＨＭＣ００１に限定されるものではなく、カバットのナンバリングにより規定されてもよい。例えば、ＨＣＭ００１の「８１Ｔ」はカバットのナンバリングによる「３０７Ｔ」と同一である。
【００４０】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、低いｐＨ、例えばエンドソームのｐＨ６．０では結合親和性が増加するが、高いｐＨ、例えばｐＨ７．４では結合親和性が増加しない。また、エンドソームへの取り込みは増加するが、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体は正常速度で放出されることにより生体内半減期が延長される。
【００４１】
本発明において、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃフラグメントであってもよい。本発明において、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントは、好ましくは、ヒトＩｇＧ４由来のＦｃフラグメントであって、可変領域と重鎖を含まず、非グリコシル化されたものであってもよい。
【００４２】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、それにより異なるアミノ酸配列を有する。本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のアミノ酸配列は、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントのアミノ酸配列と実質的に相同である。例えば、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体のアミノ酸配列は、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントのアミノ酸配列と約８０％以上の相同性、好ましくは約９０％以上の相同性、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する。アミノ酸修飾は、分子生物学的方法を用いて遺伝的に行ってもよく、酵素的又は化学的方法を用いて行ってもよい。
【００４３】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、当該分野で公知の任意の方法で作製することができる。一実施態様において、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、特定のアミノ酸修飾を含むポリペプチド配列をコードし、必要に応じて、次に宿主細胞にクローニングされ、発現及び検定される核酸の形成に用いられる。様々な方法が関連文献に記載されている（非特許文献９）。
【００４４】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体をコードする核酸は、タンパク質の発現のために発現ベクターに導入することができる。発現ベクターは、一般に制御もしくは調節（regulatory）配列、選択可能マーカー、任意の融合パートナー、及び／又は追加的要素と作動可能に連結された、すなわち、機能的関係にあるタンパク質を含む。本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、核酸、好ましくは免疫グロブリンＦｃ変異体をコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、その発現を誘導するか又は引き起こすための適切な条件下で培養することにより生産される。多種多様な適切な宿主細胞には、これらに限定されるものではないが、哺乳動物細胞、バクテリア細胞、昆虫細胞及び酵母細胞が含まれる。外因性核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該分野で公知であり、用いられる宿主細胞により異なる。本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体を生産するための宿主細胞として、生産費が安価であることから産業的に有用な大腸菌を用いることが好ましい。
【００４５】
よって、本発明の範囲には、１）免疫グロブリンＦｃ変異体をコードする核酸が導入された宿主細胞をタンパク質の発現に適した条件下で培養する工程と、２）宿主細胞から発現した免疫グロブリンＦｃ変異体を精製又は分離する工程とを含む免疫グロブリンＦｃ変異体を作製する方法が含まれる。
【００４６】
抗体は、当該分野で公知の様々な方法で分離又は精製することができる。標準精製方法には、クロマトグラフィー技術、電気泳動、免疫沈殿、透析、濾過、濃縮及びクロマト分画（chromatofocusing）技術が含まれる。当該分野で公知のように、例えば細菌性タンパク質Ａ、Ｇ、Ｌなどの様々な天然タンパク質を抗体に結合することができるので、これらのタンパク質を抗体の精製に用いることができる。時には、特定の融合パートナーを用いて精製することもできる。例えば、ＧＳＴ融合の場合はグルタチオンレジンを用い、Ｈｉｓ−ｔａｇの場合はＮｉ+2アフィニティークロマトグラフィーを用い、ｆｌａｇ−ｔａｇの場合は固定化抗フラグ（flag）抗体を用いることにより、タンパク質を精製することができる。
【００４７】
本発明の他の態様では、生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結された、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体に関する。
【００４８】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、エンドソームの低いｐＨ、例えばｐＨ６．０では結合親和性が増加するのに対して、高いｐＨ、例えばｐＨ７．４では結合親和性がそれほど増加しない。よって、エンドソームへのこれらの取り込みは増加するが、これらが正常速度で放出されるので、生体内半減期は延長される（図１参照）。よって、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、タンパク質薬物をはじめとする生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させるためのキャリア（carrier）として用いることができる。よって、本発明のタンパク質結合体は、ＦｃＲｎに対する高い結合親和性により大幅に生体内半減期が延長された持続性製剤の製造に効果的に用いることができる。
【００４９】
また、本発明は、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体を非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結して持続性製剤を製造する方法を提供する。
【００５０】
本発明による製造方法は、１）末端反応基を有する非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ変異体を生理活性ポリペプチドに共有的に連結する工程と、２）生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ変異体が共有的に連結された結合体を分離する工程とを含んでもよい。
【００５１】
本発明に有用な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸, polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸, polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはポリエチレングリコールである。また、当該分野に知られたこれらの誘導体や、通常の技術を用いて容易に作製できるこれらの誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００５２】
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体に結合される生理活性ポリペプチドは、生体内半減期の延長を必要とするものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、ヒトの疾病を治療又は予防する目的で用いられるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質又は受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗物質などの様々な生理活性ポリペプチド、及びそれらの誘導体もしくは類似体を用いることができる。
【００５３】
本発明に有用な生理活性ポリペプチドの例としては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン及びインターフェロン受容体（例えば、インターフェロンα、β及びγ、可溶性Ｉ型インターフェロン受容体）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド（glucagon-like peptide）（ＧＬＰ−1）、Ｇタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptor）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体）、酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、αガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα、β、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（platelet-activating factor acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase））、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン（angiopoietin）、ヘモグロビン、トロンビン（thrombin）、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン（thrombomodulin）、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIIａ因子 、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、血液凝固第XIII因子、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン（hirudin）、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（angiostatin）、エンドスタチン（endostatin）アンジオテンシン（angiotensin）、骨成長因子（bone growth factor）、骨促進タンパク質（bone stimulating protein）、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（elcatonin）、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、ニュールツリン（neuturin））、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホル���ン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（autotaxin）、ラクトフェリン（lactoferrin）、ミオスタチン（myostatin）、受容体（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａ）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）、及びウイルス由来ワクチン抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体フラグメントは、特定の抗原に結合する能力を有するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｓｃＦｖからなる群から選択される。
【００５４】
生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結されたタンパク質結合体は、ＦｃＲｎに対する高い結合親和性により生体内半減期が著しく延長される（図４参照）。よって、本発明による免疫グロブリンＦｃフラグメントをキャリアとして用いて作製されたタンパク質結合体は、血中持続性が増加するので、投与頻度を著しく減少させることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は単に本発明を具体的に開示するために用いられるものと理解すべきであり、これらが本発明を特定の形態に限定するものと理解すべきではない。
【００５６】
実施例１：免疫グロブリンＦｃフラグメントを発現するベクターの作製
ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性に関与する部位を大腸菌形質転換体ＨＭ１１２０１（ＫＣＣＭ−１０６６０Ｐ，特許文献４）から生産されたＨＭＣ００１のアミノ酸配列（配列番号７３）から選択し、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させるために、当該部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する突然変異（mutagenesis）を誘導した。このために、ヌクレオチド置換用プライマーとクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（QuikChangeTM Site-directed Mutagenesis kit, Stratagene）を用いた。これに関して、部位特異的突然変異に用いられたプライマーを表１〜３に示す。
【００５７】
重合酵素連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）による部位特異的突然変異のために、ＰＣＲチューブに５０ｎｇのＨＭＣ００１発現ベクター、各プライマー対、ｄＮＴＰ及びＰｆｕＴｕｒｂｏTM重合酵素（Stratagene）を添加し、９５℃で３０秒間の変性、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１４分間の１６サイクル、６８℃で５分間の最終伸長の条件で反応を行った。前述したように増幅された約１．２ｋｂのＰＣＲ産物に対してＤＮＡシークエンシングにより塩基配列を分析し、その結果を表４に示す。表４に示すアミノ酸ナンバリングはＥＵインデックスによるものであり、括弧内の数字はＨＭＣ００１のアミノ酸配列（配列番号７３）に基づくアミノ酸ナンバリングである。
【００５８】
増幅された各ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、同じ制限酵素で処理しておいたプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Novagen）に挿入することにより、各免疫グロブリンＦｃ変異体を含む発現ベクターを得た。
【００５９】
【表１】
2019001793.tif 000003
【００６０】
【表２】
2019001793.tif 000004
【００６１】
【表３】
2019001793.tif 000005
【００６２】
【表４】
2019001793.tif 000006
【００６３】
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおける免疫グロブリンＦｃ変異体の生産
実施例１で作製された免疫グロブリンＦｃ変異体の発現ベクターをそれぞれ４２℃で１分間の熱ショックによりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞（competent cell）（Invitrogen）に形質転換し、その後アンピシリンを含むＬＢ固体培地で培養してアンピシリン抵抗性コロニーを選択した。
【００６４】
選択したコロニーを５００ｍｌの２×ＬＢ（アンピシリン含有）培地に接種し、振盪培養器にて３７℃、１２０ｒｐｍで１５時間培養した。１００ｍｌの培養液を５００ｍｌの新鮮な２×ＬＢ（アンピシリン含有）培地に移し、結果として得られた溶液を６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が４〜５となるまで培養した。２００ｍｌの培養液を１０％（ｖ／ｖ）の比率で５Ｌ発酵槽に移し、２×ＬＢ培地（アンピシリン含有）を注入し、３７℃、５００〜７００ｒｐｍ、１ｖｖｍの通気速度、４５時間の条件でセミｐＨスタット（semi-pH stat）流加培養（fed-batch）を行った。発酵中にＯＤ６００が９０以上になった場合は、タンパク質合成を誘導するために、誘導物質（inducer）として０．１ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧ（イソプロピル 1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド）を添加した。
【００６５】
実施例３：免疫グロブリンＦｃ変異体の分離及び精製
実施例２で発酵させた培養液を１２，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、細胞ペレットを回収した。こうして回収した細胞ペレットを１０×体積の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），０．２Ｍ ＮａＣｌ，０．５％トリトンＸ−１００）に懸濁させ、その後マイクロフルイダイザー（Microfluidizer, Microfluidics）を用いて１５，０００ｐｓｉの圧力で３回破砕した。こうして得られた細胞溶解液を６，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、大腸菌形質転換体から発現したタンパク質の封入体のみを得た。
【００６６】
前記封入体を０．５％トリトンＸ−１００と蒸留水を用いて洗浄し、１０×体積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含む８Ｍウレア溶液に２時間懸濁させ、これらを溶解した。不溶性固体不純物を分離するために、封入体が溶解した溶液を１２，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、上清を回収した。その後、Ｌ−システインを１ｍＭの最終濃度で上清に添加して室温で１時間培養することにより、タンパク質還元を誘導した。
【００６７】
還元されたタンパク質のリフォールディングのために、４℃で２４時間溶解した封入体を１００×体積のリフォールディング溶液（２Ｍウレア，０．２５Ｍアルギニン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５），０．５ｍＭ Ｃｙｓ）で希釈した。
【００６８】
こうしてリフォールディングしたタンパク質をアクタ精製機（Akta purifier, Amersham Pharmacia Biotech）でイオン交換カラム（IEX columns, GE Healthcare）を用いて精製することにより、９８％以上の純度で免疫グロブリンＦｃ変異体を得た。
【００６９】
実施例４：免疫グロブリンＦｃ変異体のヒトＦｃＲｎ結合親和性の評価
実施例３で分離及び精製した免疫グロブリンＦｃ変異体のＦｃＲｎ結合親和性を評価するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。下記実験において、ヒトＦｃＲｎ（hFcRn, human neonatal Fcγ receptor）は２９３Ｔ細胞で発現させて精製したものであり、ＧＳＴ抗体はメルクミリポア社（Merk Milipore）から購入したものである。対照群としてＨＭＣ００１と天然ＩｇＧを用いて、それぞれの免疫グロブリンＦｃ変異体において測定されたＦｃＲｎ結合親和性を比較した。
【００７０】
９６ウェルプレートを３０μｇ／ｍｌの天然ＩｇＧと、１０μｇ／ｍｌのＨＭＣ００１及び免疫グロブリンＦｃ変異体とでコーティングし、その後１００μｌの５μｇ／ｍｌ ＦｃＲｎを各ウェルに添加した。結合と解離を評価するために、ｐＨ６．０及び７．４で実験を行った。この実験に用いた分析緩衝液と洗浄緩衝液は表５に示す組成からなり、その結果を図１〜３に示す。
【００７１】
【表５】
2019001793.tif 000007
【００７２】
図１〜３に示すように、本発明により作製された免疫グロブリンＦｃ変異体は、ＨＭＣ００１及び天然ＩｇＧに比べて、ｐＨ７．４では低いＦｃＲｎ結合親和性を示し、ｐＨ６．０では高いＦｃＲｎ結合親和性を示すことが確認された。
【００７３】
実施例５：免疫グロブリンＦｃ変異体とエキセンディン−４とを含む結合体のヒトＦｃＲｎ結合親和性の評価
本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体において、タンパク質薬物と結合した形態でもヒトＦｃＲｎに対する結合親和性が増加するか否かを調査するために、実施例４で高いＦｃＲｎ結合親和性を示すことが確認されたＨＭＣ００２及びＨＭＣ００８を、両末端にアルデヒド反応基を有するＰＥＧを用いて、エキセンディン（exendin）−４に共有的に連結することにより、タンパク質結合体を作製した。タンパク質結合体の作製は、特許文献５に記載の方法により行った。こうして作製されたタンパク質結合体のヒトＦｃＲｎに対する結合親和性を評価するために、実施例４に記載の方法によりＥＬＩＳＡを行った。
【００７４】
図４に示すように、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体は、これらが非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに連結された場合も、高いＦｃＲｎ結合親和性を維持することが確認された。
【００７５】
よって、本発明による免疫グロブリンＦｃ変異体をキャリアとして用いて作製された薬物結合体は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加することにより、生体内半減期が非常に延長されるので、投与頻度を著しく減少させることのできる持続性製剤として用いることができる。
【００７６】
本発明に用いられた特定の用語は、単に特定の実施態様を示すために用いられたものであり、本発明を限定するものではない。本発明に用いられた単数形態は、これらが明らかに反対の意味を示さない限り、複数形態を含むものである。本発明における「含む」又は「有する」とは、特定の特性、領域、整数、工程、操作、要素及び／又は成分を具体化するためのものであり、他の特性、領域、整数、工程、操作、要素、成分及び／又は群を排除するためのものではない。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が高いので、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させることができる。よって、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体が非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結された、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体は、投与頻度が非常に低いタンパク質薬物の持続性製剤の製造に効果的に用いることができる。
【図１】
2019001793.tif 000008
【図２】
2019001793.tif 000009
【図３】
2019001793.tif 000010
【図４】
2019001793.tif 000011
【配列表】
2019001793000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性ポリペプチドが非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結されたタンパク質結合体であって、
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８Ｌ／４３４Ｓ（このナンバリングはＥＵインデックスによる）というアミノ酸修飾を含むことを特徴とする、タンパク質結合体。
【請求項２】
野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントを含むタンパク質結合体と比べて、生体内半減期が延長され、かつＦｃＲｎに対する結合親和性が増加している、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、前記野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のメチオニンがロイシンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含み、かつ、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項４】
前記非ペプチド性重合体が、ポリ（エチレングリコール）モノポリマー、ポリ（プロピレングリコール）モノポリマー、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項５】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、グルコセレブロシダーゼ、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮細胞成長因子、骨成長因子、骨促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、インスリン変異体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、受容体、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、及びウイルス由来ワクチン抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項６】
前記野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項７】
前記野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項６に記載のタンパク質結合体。
【請求項８】
前記野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントが、配列番号７３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、免疫グロブリンの可変領域と軽鎖を含まない、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、動物細胞又は大腸菌で生産される、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、前記野生型免疫グロブリンＦｃフラグメントに比べて、ｐＨ７．４では低いＦｃＲｎ結合親和性を示すが、ｐＨ６．０では高いＦｃＲｎ結合親和性を示す、請求項１に記載のタンパク質結合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明の具体的な一実施態様では、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のメチオニンがロイシンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換された免疫グロブリンＦｃ変異体を提供する。４２８Ｌ／４３４Ｓのアミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃ変異体は配列番号７４で表されるアミノ酸配列を有し、これは配列番号１１３で表される塩基配列を有するヌクレオチドによりコードされる。本発明においては、上記免疫グロブリンＦｃ変異体をＨＭＣ００２と命名する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
【表４】
2019001793.tif 000012
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体は、ＦｃＲｎに対する結合親和性が高いので、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させることができる。よって、本発明の免疫グロブリンＦｃ変異体が非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結された、生体内半減期が延長されたタンパク質結合体は、投与頻度が非常に低いタンパク質薬物の持続性製剤の製造に効果的に用いることができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ＦｃＲｎに対する結合親和性が増加した免疫グロブリンＦｃ変異体であって、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７Ｓ、３０８Ｆ、３８０Ｓ、３８０Ａ、４２８Ｌ、４２９Ｋ、４３０Ｓ、４３３Ｋ及び４３４Ｓ（上記ナンバリングはＥＵインデックスによる）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことを特徴とする、免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２〕前記アミノ酸修飾が、４２８Ｌ／４３４Ｓ、４３３Ｋ／４３４Ｓ、４２９Ｋ／４３３Ｋ、４２８Ｌ／４３３Ｋ、３０８Ｆ／３８０Ａ、３０７Ｓ／３８０Ｓ及び３８０Ｓ／４３４Ｓからなる群から選択される、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔３〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔４〕前記前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号７４で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔４〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔５〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４３３位のヒスチジンがリジンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔６〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号８０で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔５〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔７〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２９位のヒスチジンがリジンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔８〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号９１で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔７〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔９〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、４２８位のメチオニンがロイシンに置換され、４３３位のヒスチジンがリジンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１０〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号９２で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔９〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１１〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０８位のバリンがフェニルアラニンに置換され、３８０位のグルタミン酸がアラニンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１２〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１００で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔１１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１３〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３０７位のスレオニンがセリンに置換され、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１４〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１０１で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔１３〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１５〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントの定常領域において、３８０位のグルタミン酸がセリンに置換され、４３４位のアスパラギンがセリンに置換されたアミノ酸修飾を含む、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１６〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、配列番号１０３で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔１５〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１７〕前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＦｃフラグメントからなる群から選択される、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１８〕前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、前記〔１７〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔１９〕前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、前記〔１８〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２０〕前記天然免疫グロブリンＦｃフラグメントが、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を有する、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２１〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、免疫グロブリンの可変領域と軽鎖を含まない、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２２〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、動物細胞又は大腸菌で生産される、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２３〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、大腸菌で生産される、前記〔２２〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２４〕前記免疫グロブリンＦｃ変異体が、天然免疫グロブリンＦｃフラグメントに比べて、ｐＨ７．４では低いＦｃＲｎ結合親和性を示すが、ｐＨ６．０では高いＦｃＲｎ結合親和性を示す、前記〔１〕に記載の免疫グロブリンＦｃ変異体。
〔２５〕生体内半減期が延長されたタンパク質結合体であって、生理活性ポリペプチドが、非ペプチド性重合体を介して前記〔１〕〜〔２４〕のいずれかに記載の免疫グロブリンＦｃ変異体に共有的に連結されることを特徴とする、タンパク質結合体。
〔２６〕前記非ペプチド性重合体が、ポリ（エチレングリコール）モノポリマー、ポリ（プロピレングリコール）モノポリマー、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔２５〕に記載のタンパク質結合体。
〔２７〕前記非ペプチド性重合体が、ポリ（エチレングリコール）である、前記〔２６〕に記載のタンパク質結合体。
〔２８〕前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、グルコセレブロシダーゼ、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α１アンチトリプシン、アルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、エリスロポエチン、高グリコシル化エリスロポエチン、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニンインヒビター、コラゲナーゼインヒビター、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、表皮細胞成長因子、骨成長因子、骨促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、インスリン変異体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、受容体、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、及びウイルス由来ワクチン抗原からなる群から選択される、前記〔２５〕に記載のタンパク質結合体。
〔２９〕生理活性ポリペプチドの生体内半減期を延長させる方法であって、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれかに記載の免疫グロブリンＦｃ変異体を、非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに共有的に連結させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019001793000001.app
【外国語明細書】
2019001793000001.pdf