(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物細胞を培養しベバシズマブまたはその断片を生成する際に使用するための細胞培養培地、および、該培地を用いてベバシズマブもしくはその断片を生成する方法の提供。【解決手段】ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、前記細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、かつ、前記細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、前記細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法。
【請求項２】
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地が約２５ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回前記細胞培養培地に加えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回前記細胞培養培地に加えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回前記細胞培養培地に加えられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４０】
追加量のインスリンが、約１５ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項３１から３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項４１】
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４２】
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１から４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項１から４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項１から４９の何れか一項に記載の方法
【請求項５１】
細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む、請求項１から５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１から請求項５１の何れか一項に記載の方法によって生成される、ベバシズマブもしくはその断片。
【請求項５３】
（ｉ）請求項１から請求項５１の何れか一項に記載の方法によって生成されるベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項５４】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法。
【請求項５５】
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、請求項５４から請求項５８の何れか一項に記載の方法。
【請求項６０】
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６３】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６４】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６５】
細胞培養培地が約２５ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項５４から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、請求項５４から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６７】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、請求項５４から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、請求項５４から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、請求項５４から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、請求項５４から６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項５４から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項５４から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項５４から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７４】
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項５４から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７５】
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項５４から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７６】
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項５４から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７７】
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項５４から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７８】
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項５４から７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項５４から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項５４から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８１】
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項５４から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８２】
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項５４から７８の何れか一項に記載の方法。
【請求項８３】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項５４から８２の何れか一項に記載の方法。
【請求項８４】
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項５４から８３の何れか一項に記載の方法。
【請求項８５】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項８９】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９０】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９１】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９２】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９３】
追加量のインスリンが、約１５ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項８４から８７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９４】
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項５４から９３の何れか一項に記載の方法。
【請求項９５】
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項５４から９６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９８】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項５４から９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項５４から１００の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
細胞が、約２８℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項５４から１００の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項５４から１０３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
哺乳動物細胞が、細胞の増殖期中に細胞培養培地と接触させられる、請求項５４から１０４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
哺乳動物細胞が、細胞の産生期中に細胞培養培地と接触させられる、請求項５４から１０５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を補給するためのキットであって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）前記細胞培養培地中の約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリン；（ｉｉ）前記細胞培養培地中の約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを提供する量にあるシスチン；（ｉｉｉ）及び前記細胞培養培地中の約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅を提供する量にある銅のうちの少なくとも２つを含む、キット。
【請求項１０８】
キットが、植物由来加水分解物をさらに含む、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
キットは、細胞培養培地中の約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物を提供する量にある植物由来加水分解物を含む、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
キットが、動物由来加水分解物をさらに含む、請求項１０７−１０９の何れか一項に記載のキット。
【請求項１１１】
キットが、細胞培養培地中の約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物を提供する量にある動物由来加水分解物を含む、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンのうちの少なくとも２つを含む、細胞培養培地。
【請求項１１３】
細胞培養培地が：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；及び（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅を含む、請求項１１２に記載の細胞培養培地。
【請求項１１４】
細胞培養培地が：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを含む、請求項１１２に記載の細胞培養培地。
【請求項１１５】
細胞培養培地が：（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを含む、請求項１１２に記載の細胞培養培地。
【請求項１１６】
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含む、請求項１１２から１１５の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１１７】
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物をさらに含む、請求項１１２から１１６の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１１８】
細胞培養培地が：
約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ；
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；及び
約１０．０ｍｇ／Ｌから成る群から選択される濃度にあるインスリンを含む、請求項１１２から１１７の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１１９】
細胞培養培地が：
約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭ；
約３００ｎＭ−約４００ｎＭ；
約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ；
約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ；
３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つ；及び
約３３９ｎＭから成る群から選択される濃度にある銅を含む、請求項１１２から１１８の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１２０】
細胞培養培地が：
約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ；
約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭ；
約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ；
約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭ；及び
約１．３ｍＭから成る群から選択される濃度にあるシスチンを含む、請求項１１２から１１９の何れか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項１２１】
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）請求項１１２から１２０の何れか一項に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
【請求項１２２】
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）請求項１１２から１２０の何れか一項に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
【請求項１２３】
ベバシズマブもしくはその断片が、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞によって培地中に分泌される、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を強化する方法であって、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程を含み、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養することに比較して前記哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量が強化される方法。
【請求項１２５】
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２９】
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、請求項１２４から１２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
細胞培養培地が約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１２４から１２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１２４から１３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１２４から１３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１２４から１３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、請求項１２４から１３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１２４から１３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１２４から１４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１２４から１４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１２４から１４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１２４から１４０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１２４から１４８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項１２４から１５２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１２４から１５３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６３】
追加量のインスリンが、約１５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項１５４から１５７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１２４から１６３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１２４から１６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１２４から１６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項１２４から１６９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項１２４から１７２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項１２４から１７３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７５】
インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞から生成されたベバシズマブもしくはその断片の量がインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して強化される方法。
【請求項１７６】
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７９】
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、請求項１７５から１７９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８１】
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８５】
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８６】
細胞培養培地が約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項１７５から１８０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１７５から１８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１７５から１８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８９】
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１７５から１８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、請求項１７５から１８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、請求項１７５から１８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１７５から１９１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９３】
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１７５から１９１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１７５から１９１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項１７５から１９１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９７】
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９８】
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９９】
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２００】
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項１７５から１９９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項１７５から２０３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１７５から２０４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０９】
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１２】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１３】
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
追加量のインスリンが、約１５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、請求項２０５から２０８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１７５から２１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１７】
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、請求項２１５に記載の方法。
【請求項２１８】
方法が、シスチンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項１７５から２１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２１】
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項１７５から２２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２２】
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項１７５から２２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２４】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項１７５から２２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２５】
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項１７５から２２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する、方法。
【請求項２２７】
初期細胞培養培地が（１）銅及びインスリン；（２）銅及びシスチン；（３）インスリン及びシスチン；又は（４）銅、インスリン及びシスチンを含む、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
初期細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項２２６から２２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
初期細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
初期細胞培養培地が１０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つの濃度でインスリンを含む、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３１】
初期細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、請求項２２６から２３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３２】
初期細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、請求項２２６から２３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
初期細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭ及び３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、請求項２２６から２３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
初期細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項２２６から２３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
初期細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、請求項２２６から２３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３６】
初期細胞培養培地が１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ及び１．６ｍＭのうちのおよそ何れか１つの濃度でシスチンを含む、請求項２２６から２３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３７】
初期細胞培養培地が動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３８】
初期細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３９】
初期細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４０】
初期細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４１】
初期細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４２】
初期細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２４１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４４】
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２４３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４５】
初期細胞培養培地が約２．５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、請求項２２６から２４４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４６】
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、請求項２２６から２４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４７】
初期細胞培養培地がインスリンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項２２６から２４６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４８】
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
各時点に加えられるインスリンが、約５ｍｇ／Ｌ−約２５ｍｇ／Ｌである、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
各時点に加えられるインスリンが、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つである、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５１】
細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量が、約２０ｍｇ／Ｌ−約１００ｍｇ／Ｌである、請求項２４８から２５０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量が、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ及び８５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つである、請求項２５１に記載の方法。
【請求項２５３】
初期細胞培養培地がシスチンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のシスチンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、請求項２２６から２５２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５４】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる、請求項２５３に記載の方法。
【請求項２５５】
シスチンが、細胞培養培地中に約０．４−約０．７ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる、請求項２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
シスチンが細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる、請求項２５３から２５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５７】
方法が、細胞培養サイクル中に少なくとも１バッチフィードをさらに含む、請求項２２６から２５６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５８】
方法が、細胞培養サイクル中に２、３もしくは４バッチフィードを含む、請求項２５７に記載の方法。
【請求項２５９】
バッチフィード培地はが、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む、請求項２５７又は２５９に記載の方法。
【請求項２６０】
細胞培養サイクル中に、培地の温度が、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる、請求項２２６から２５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６１】
培地の温度が、細胞培養サイクル中に少なくとも１回又は少なくとも２回低下させられる、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
温度が、培養する工程の開始後の第８日及び第１０日に低下させられる、請求項２６１に記載の方法。
【請求項２６３】
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、請求項２２６から２６２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６４】
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、請求項２６３に記載の方法。
【請求項２６５】
細胞が、約７．０−約７．３のｐＨを有する培地中で培養される、請求項２２６から２６４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６６】
方法が、（ａ）約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの銅及び約１．３ｍＭのシスチンを含む初期細胞培養培地中で細胞を培養する工程；（ｂ）培養する工程の開始後の第３日に約１５ｍｇ／Ｌの濃度の追加のインスリンを提供するために細胞培養培地に第１バッチフィード及びインスリンフィードを提供する工程；及び（ｃ）培養する工程の開始後の第６日に約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭの濃度の追加のシスチンを提供するために細胞培養培地にシスチンを含む第２バッチフィードを提供する工程を含み、このとき細胞は約３５℃の初期温度で培養され、温度は第８日に約３３℃へ低下させられ、培養する工程の開始後の第１０日に約３１℃へさらに低下させられる、請求項２２６から２６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６７】
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、請求項２２６から２６６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６８】
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、請求項２２６から２６７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６９】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項２２６から２６８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７０】
請求項２２６から２６９の何れか一項に記載の方法によって生成される、ベバシズマブもしくはその断片。
【請求項２７１】
（ｉ）請求項２２６から２６９の何れか一項に記載の方法によって生成されるベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、その全内容が本明細書に出典明示により援用される２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８０１２４７号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む細胞培養培地、及びベバシズマブ生産においてその培地を使用する方法並びに本明細書に提供した方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片を含む組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養製造技術は、医薬製剤において使用するための、タンパク質ベースの治療薬、例えば抗体を生成するために広く使用されている。タンパク質ベースの生成物、例えば抗体生成物の商業的生産には、製造需要を満たすために十分なタンパク質生成物を細胞が生成できるために細胞培養パラメーターの最適化が必要である。しかし、タンパク質生成物の生産性を向上させるために細胞培養パラメーターが最適化される場合は、グリコシル化プロファイル、凝集体レベル、電荷不均質性及びアミノ酸配列完全性等の生成物の所望の品質特性を維持することもまた必要である（Li等, 2010, mAbs., 2(5):466-477）。
【０００４】
「Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）」としても公知であるベバシズマブは、インビトロ及びインビボアッセイ系内で血管内皮増殖因子に結合する組換え型ヒト化モノクローナル抗体であり（米国特許第７２２７００４号；同第６８８４８７９号；同第７０６０２６９号；同第７１６９９０１号；同第７２９７３３４号）、癌の治療において使用されるが、この場合にベバシズマブは新規血管の形成をブロックすることにより腫瘍増殖を阻害する。ベバシズマブは、１４９，０００ダルトンの近似分子量を有し、グリコシル化されており、栄養細胞培養培地中の哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）発現系内で生成される。
【０００５】
ベバシズマブもしくはその断片の改良された費用効率的な生成方法が望ましい。細胞がベバシズマブもしくはその断片の許容される生成物品質特性を維持しながら所望量のベバシズマブもしくはその断片を生成することを可能にする成分を含む細胞培養培地があれば有益であろう。製造規模の量のベバシズマブもしくはその断片を生成する際に使用するための細胞培養培地があれば特に好都合であろう。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に提供した発明は、特に、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む、及び任意選択的に動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片を生成する方法を開示する。さらに提供されるのは、本明細書に提供した細胞培養培地を使用して、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を培養するための方法である。本明細書でさらに開示されるのは、細胞培養中の哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を強化する（例えば、力価を強化する）細胞培養培地組成物並びに本明細書に記載した方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片を含む組成物である。
【０００７】
したがって、１つの態様では、本発明は、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、及び細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法を提供する。また別の実施態様では、細胞培養培地は銅及びインスリンを含む。さらにまた別の実施態様では、細胞培養培地は銅及びシスチンを含む。さらになおまた別の実施態様では、細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む。またさらに別の実施態様では、細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地はさらに、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含むことができる。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は表１に列挙した濃度から選択される濃度で銅を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は表１に列挙した濃度から選択される濃度でインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は表１に列挙した濃度から選択される濃度でシスチンを含む。銅、インスリン及び／又はシスチンの量、例えば表１に提供した量の任意の組合せは、ありとあらゆる量の組合せが明確及び個別に列挙された場合と同一であると企図されると理解されている。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含むことができる。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は基底細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はフィード細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも１つを含む基底細胞培養培地であり、このとき基底細胞培養培地には（例えば、細胞培養サイクル開始後のある期間に、例えば細胞培養サイクルの少なくとも１回、２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等）、インスリン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含むフィード細胞培養培地が補給される。別の変形では、フィード細胞培養培地は、インスリン、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物、システイン及びシスチンのうちの何れか１つ以上を含む。別の変形では、フィード細胞培養培地は、インスリン、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物及びシステインを含む。別の変形では、フィード細胞培養培地は、インスリン、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物及びシスチンのうちの何れか１つ以上を含む。フィード細胞培養培地は、インスリン、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物、システイン及びシスチンのうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量で含んでいてよい。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリンを含み、本方法はさらに細胞培養培地に追加量のインスリンを（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。一部の実施態様では、追加量のインスリンは、表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回細胞培養培地に加えられる。また別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる。さらにまた別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。本明細書の実施態様の一部では、追加量のインスリンは、約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞（例えば、ベバシズマブもしくはその断片を生成できるＣＨＯ細胞）は、約２８℃−約３７℃又は約３１℃−約３７℃の範囲内の温度で培養できる。本明細書の実施態様の何れかでは、ベバシズマブもしくはその断片は、細胞培養培地中に分泌させることができる。本明細書の実施態様の何れかでは、本方法は、細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含むことができる。特定の変形では、回収されたベバシズマブが精製される。
【０００８】
さらに本明細書で提供されるのは、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物並びに任意選択的に銅、インスリン及び／又はシスチンを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片を生成する方法である。１つのそのような態様では、動物由来加水分解物は、植物由来加水分解物より多い量で存在する。１つのそのような変形では、動物由来加水分解物は、細胞培養培地中に約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約３５．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌもしくは約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ又は５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌもしくは５０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌもしくは１２ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する。別の変形では、植物由来加水分解物は、細胞培養培地中に約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約３．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約２．５ｇ／Ｌもしくは約１．７５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌもしくは約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌもしくは約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ又は約１．７５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．２５、３．５ｇ／Ｌ、３．７５ｇ／Ｌもしくは４．０ｇ／Ｌのうちの何れか１つ、又は２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌもしくは３．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は約２．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の量のありとあらゆる組合せはありとあらゆる組合せが明確及び個別に列挙されたのと同様に記載されていると理解される。
【０００９】
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載した方法の何れかにより生成されたベバシズマブもしくはその断片を提供する。
【００１０】
他の態様では、本発明は：（ｉ）本明細書に記載した方法の何れかにより生成されたベバシズマブもしくはその断片、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
一部の態様では、本発明は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法をさらに提供する。また別の実施態様では、細胞培養培地は銅及びインスリンを含む。さらにまた別の実施態様では、細胞培養培地は銅及びシスチンを含む。さらになおまた別の実施態様では、細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む。またさらに別の実施態様では、細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はさらに、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は基底細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はフィード細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも１つを含む基底細胞培養培地であり、このとき基底細胞培養培地には（例えば、細胞培養サイクル開始後のある期間に、例えば細胞培養サイクルの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等）、インスリン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含むフィード細胞培養培地が補給される。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリンを含み、本方法は追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回細胞培養培地に加えられる。また別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる。さらにまた別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。一部の実施態様では、追加量のインスリンは、約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、細胞は、約２８℃−約３７℃又は約３１℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される。本明細書の実施態様の何れかでは、ベバシズマブもしくはその断片は、細胞培養培地中に分泌させることができる。本明細書の一部の実施態様では、哺乳動物細胞は細胞の増殖期中に細胞培養培地と接触させられる。本明細書の一部の実施態様では、哺乳動物細胞は細胞の産生期中に細胞培養培地と接触させられる。
【００１２】
他の態様では、本発明は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を補給するためのキットであって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）細胞培養培地中の約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリン；（ｉｉ）細胞培養培地中の約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンを提供する量にあるシスチン；及び（ｉｉｉ）細胞培養培地中の約２５．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を提供する量にある銅のうちの少なくとも２つを含むキットを提供する。一部の実施態様では、キットは植物由来加水分解物をさらに含む。また別の実施態様では、キットは、細胞培養培地中の約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの植物由来加水分解物を提供する量にある植物由来加水分解物を含む。本明細書の実施態様の何れかでは、キットは、動物由来加水分解物をさらに含む。一部の実施態様では、キットは、細胞培養培地中の約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物を提供する量にある動物由来加水分解物を含む。キットは、細胞培養培地を補給する際に使用するための説明書等の使用説明書を追加して含有していてよい。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリン；（ｉｉ）約２５．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地を提供する。一部の実施態様では、細胞培養培地は、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリン；及び約２５．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリン及び約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は、約２５．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅；及び約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンを含む。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は、約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は、約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物をさらに含むことができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）本明細書に提供した何れかの細胞培養培地を含む組成物をさらに提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）本明細書に提供した何れかの細胞培養培地を含む組成物を提供する。また別の実施態様では、ベバシズマブもしくはその断片は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞によって培地中に分泌される。
【００１６】
一部の態様では、本明細書にさらに提供されるのは、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞由来のベバシズマブもしくはその断片の力価を強化する方法であって、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を含み、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して力価が強化させられる方法である。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅及びインスリンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅及びシスチンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地はさらに、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含むことができる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含むことができる。一部の実施態様では、細胞培養培地は基底細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はフィード細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも１つを含む基底細胞培養培地であり、このとき基底細胞培養培地には（例えば、細胞培養サイクル開始後のある期間に、例えば細胞培養サイクルの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等）、インスリン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含むフィード細胞培養培地が補給される。一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリンを含み、本方法は追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回細胞培養培地に加えられる。また別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる。さらにまた別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。本明細書の一部の実施態様では、追加量のインスリンは、約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞は、約２８℃−約３７℃又は約３１℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養されてよい。本明細書の実施態様の何れかでは、ベバシズマブもしくはその断片は、細胞培養培地中に分泌させることができる。本明細書の実施態様の何れかでは、本方法は、細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含むことができる。別の態様では、回収されたベバシズマブもしくはその断片は精製される。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本明細書ではインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、ベバシズマブもしくはその断片の力価がインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して強化される方法を提供する。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅及びインスリンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅及びシスチンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地はさらに、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は基底細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地はフィード細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも１つを含む基底細胞培養培地であり、このとき基底細胞培養培地には（例えば、細胞培養サイクル開始後のある期間に、例えば細胞培養サイクルの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等）、インスリン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含むフィード細胞培養培地が補給される。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地はインスリンを含むことができ、本方法は追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程をさらに含むことができる。別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回細胞培養培地に加えられる。また別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる。さらにまた別の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。本明細書の実施態様の一部では、追加量のインスリンは、約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。本明細書の実施態様の一部では、細胞は、約２８℃−約３７℃又は約３１℃−約３７℃の範囲にわたる温度、例えば約３１℃、３３℃もしくは３５℃の温度で培養される。温度は、細胞培養工程を通して、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度内で（上又は下の何れかに）変動してよいと理解されている。１つの態様では、細胞は、第１期間（例えば約１−１０もしくは１−８もしくは１−７日間）は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間（例えば約１−５もしくは１−４もしくは１−３もしくは１−２日間）は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間（例えば約１−５もしくは１−４もしくは１−３もしくは１−２日間）は約３１℃の第３温度で培養される。本明細書の実施態様の何れかでは、ベバシズマブもしくはその断片は、細胞培養培地中に分泌させることができる。一部の実施態様では、本方法は、細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む。１つの態様では、回収されたベバシズマブもしくはその断片は精製される。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地は、約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、（１）銅及びインスリン；（２）銅及びシスチン；（３）インスリン及びシスチン；又は（４）銅、インスリン及びシスチンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭ及び３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ及び１．６ｍＭのうちのおよそ何れか１つの濃度でシスチンを含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は約２．５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、動物由来加水分解物は植物由来加水分解物より多い量で存在する。一部の実施態様では、初期細胞培養培地はインスリンを含み、本方法は細胞培養サイクル中に追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。一部の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。一部の実施態様では、各時点に加えられるインスリンは、約５ｍｇ／Ｌ−約２５ｍｇ／Ｌである。一部の実施態様では、各時点に加えられるインスリンは、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つである。一部の実施態様では、細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量は、約２０ｍｇ／Ｌ−約１００ｍｇ／Ｌである。一部の実施態様では、細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量は、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、８５ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、９５ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つである。一部の実施態様では、初期細胞培養培地はシスチンを含み、本方法は細胞培養サイクル中に追加量のシスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。一部の実施態様では、シスチンは、細胞培養培地中に約０．１ｍＭ−約１．５ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる。一部の実施態様では、シスチンは、細胞培養培地中に約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭ（例えば、約０．４ｍＭ−約０．６ｍＭ、約０．４ｍＭ−約０．５ｍＭ）の追加のシスチンを提供する量で加えられる。一部の実施態様では、シスチンは細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる。一部の実施態様では、本方法は細胞培養サイクル中に少なくとも１バッチフィードをさらに含む。一部の実施態様では、１バッチフィードは第３日（例えば、１４日間細胞培養サイクル中において）に行われる。一部の実施態様では、本方法は細胞培養サイクル中に少なくとも２、３もしくは４バッチフィードを含む。一部の実施態様では、本方法は、第３日の第１バッチフィード及び第６日の第２バッチフィード（例えば、１４日間細胞培養サイクル中において）を含む。一部の実施態様では、バッチフィード培地は、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む。一部の実施態様では、細胞培養サイクル中に、培地の温度は、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる。一部の実施態様では、培地の温度は、細胞培養サイクル中に少なくとも１回又は少なくとも２回低下させられる。一部の実施態様では、温度は培養する工程の開始後の第８日及び第１０日に低下させられる。一部の実施態様では、細胞は、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される。一部の実施態様では、細胞は、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される。一部の実施態様では、細胞は約７．０−約７．３のｐＨを有する培地中で培養される。一部の実施態様では、本方法は、（ａ）約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの銅及び約１．３ｍＭのシスチンを含む初期細胞培養培地中で培養する工程；（ｂ）培養する工程の開始後の第３日に約１５ｍｇ／Ｌの濃度の追加のインスリンを提供するために細胞培養培地に第１バッチフィード及びインスリンフィードを提供する工程；及び（ｃ）培養する工程の開始後の第６日に約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭの濃度の追加のシスチンを提供するために細胞培養培地にシスチンを含む第２バッチフィードを提供する工程を含み、このとき細胞は約３５℃の初期温度で培養され、温度は第８日に約３３℃へ低下させられ、培養する工程の開始後の第１０日に約３１℃へさらに低下させられる。一部の実施態様では、細胞培養サイクルは１４日間細胞培養サイクルである。一部の実施態様では、ベバシズマブもしくはその断片は、細胞培養培地中に分泌させられる。一部の実施態様では、本方法は、細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む。別の態様では、本発明は、本明細書に記載した方法の何れかにより生成されたベバシズマブもしくはその断片を提供する。他の態様では、本発明は、（ｉ）上述の方法の何れかにより生成されたベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本明細書に記載した様々な実施態様の１つ、一部もしくは全部は本発明の他の実施態様を形成するために結合されてよいと理解すべきである。
【００１９】
本明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考えられる。本明細書に示して記載した実施態様に加えて本発明の様々な修飾は、上記の説明から当業者には明白になり、添付の特許請求の範囲内に含まれるであろう。本明細書に言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全内容が本明細書に出典明示により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】インスリンが補給された細胞培養培地中で培養されたベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞からの抗体力価収率の増加を示す一連のグラフである。図１Ａ及び図１Ｂは、ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞の１４日間細胞培養中に評価された６種の細胞培養手順の実験における抗体力価を示す図である。抗体産生は力価（ｍｇ／Ｌ）として表示した。図１Ａは、第３日の１バッチフィードの結果を示している。図１Ｂは、第３日の１バッチフィード及び第６日の第２バッチフィードの結果を示している。
【図２】細胞齢との関係としての１４日間細胞培養サイクル中の１もしくは２バッチフィードが提供された細胞培養による細胞バイオマス蓄積及び抗体産生に及ぼす作用を示す一連のグラフである。図２Ａは、第３日の１バッチフィード及び第６日の第２バッチフィードが提供されたベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞と比較して、第３日の１バッチフィードが提供されたベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞中での細胞バイオマス蓄積を示す図である。１フィード工程に対してｐ＜０．００４＊；２フィード工程に対してｐ＜０．０１８＊。図２Ｂは、第３日の１バッチフィード及び第６日の第２バッチフィードが提供されたベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞と比較して、第３日の１バッチフィードが提供されたベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞からの抗体産生を示す図である。１フィード工程に対してｐ＜０．０４２＊；２フィード工程に対してｐ＜０．８２。*は有意値を示す。「１」は第３日に１バッチフィードが供給された細胞を示す；「２」は第３日に１バッチフィード及び第６日に２バッチフィードが供給された細胞を示す。
【図３】新規細胞培養工程において増殖したベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞からの抗体収率の増加を示すグラフである。手順１（三角形）は手順２の細胞培養工程とは異なる細胞培養工程を示す；手順２（ダイアモンド形）は新規の細胞培養工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ベバシズマブもしくはその断片の改良された費用効率的な生成方法が提供される。細胞がベバシズマブもしくはその断片の許容される生成物の品質特性を維持しながら所望量のベバシズマブもしくはその断片を生成することを可能にする成分を含む細胞培養培地について記載する。本明細書に提供した細胞培養培地は、製造規模の量のベバシズマブもしくはその断片を生産する際に利用することができる。
【００２２】
（ｉ）ベバシズマブもしくはその断片を生産する方法；（ｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法；及び（ｉｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞からベバシズマブもしくはその断片の生成を強化する（例えば、ベバシズマブもしくはその断片の力価収率を強化する）方法を含む本明細書に提供した方法は、１つの態様では、銅、インスリン及びシスチンのうちの２つ以上を含む細胞培養培地（例えば銅及びインスリンを含む細胞培養培地、又は銅及びシスチンを含む細胞培養培地、又はインスリン及びシスチンを含む細胞培養培地、又は銅、インスリン及びシスチンを含む細胞培養培地）を利用する。本明細書に詳述した方法の何れかによって生成されたベバシズマブもしくはその断片もまた、ベバシズマブもしくはその断片を含む組成物と同様に提供される。１つの態様では、本明細書に詳述した方法の何れかによって生成されたベバシズマブもしくはその断片は、例えばＮ−グリコシル化プロファイル、電荷不均質性及び配列完全性等のベバシズマブもしくはその断片の許容される製品品質特性を示す。特定の変形では、ベバシズマブもしくはその断片の製品品質特性は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地を使用しない方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片に実質的に類似する場合は許容される。銅、インスリン及びシスチンのうちの２つ以上を含む細胞培養培地（例えば、（ｉ）銅及びインスリン；（ｉｉ）銅及びシスチン；（ｉｉｉ）インスリン及びシスチン；又は（ｉｖ）銅、インスリン及びシスチンを含む細胞培養培地）もまた提供される。１つの変形では、銅、インスリン及びシスチンのうちの２つ以上を含む細胞培養培地は、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程に比較して、培地中で培養された哺乳動物細胞によってベバシズマブもしくはその断片を強化する（例えば、ベバシズマブもしくはその断片の力価収率を強化する）。本明細書にさらに提供されるのは、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ並びに（ｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞及び／又は（ｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片を含む細胞培養培地を含む組成物である。本明細書に提供した細胞培養培地の何れかを含む培養容器が提供される。１つの態様では、培養容器は、細胞培養から製造規模量のベバシズマブを生成するために必要とされるように、少なくとも２Ｌ（リットル）、少なくとも１０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも２，５００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも７，５００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１２，０００Ｌ以上の本明細書に提供した細胞培養培地を含有することができる培養容器等の製造規模の培養容器である。そこで、本明細書に提供した方法は、ベバシズマブもしくはその断片を製造規模生産する際に利用することができる。
【００２３】
Ｉ．  用語の定義
用語「ベバシズマブ」は、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」もしくは「ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）」としても公知である、Presta等, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599にしたがって生成された組換え型ヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を意味する。ベバシズマブは、突然変異ヒトＩｇＧｌフレームワーク領域及びヒトＶＥＧＦのその受容体への結合をブロックするマウス抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域を含む。フレームワーク領域の大半を含むベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％はヒトＩｇＧｌに由来し、この配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１に由来する。ベバシズマブは、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって生成されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同一エピトープに結合する。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、さらに米国特許第６８８４８７９号に記載されている。
【００２４】
用語「培地」及び「細胞培養培地」は、細胞を増殖又は維持するために使用される栄養源を意味する。当業者であれば理解できるように、栄養源は、細胞が増殖及び／又は生存のために必要とする成分を含有していてよい、又は細胞の増殖及び／又は生存に役立つ成分を含有していてよい。ビタミン類、必須もしくは非必須アミノ酸（例えば、システイン及びシスチン）並びに微量元素（例えば、銅）は、培地成分の例である。本明細書に提供した任意の培地には、さらにまたインスリン、植物性加水分解物及び動物性加水分解物のうちの１つ以上が補給されてよい。
【００２５】
細胞を「培養する工程」は、細胞の生存及び／又は成長及び／又は増殖に適合する条件下で、細胞を細胞培養培地と接触させる工程を意味する。
【００２６】
「バッチ培養」は、細胞培養のための全成分（細胞及び全培養栄養素を含む）が培養工程の開始時に培養容器に供給される培養を意味する。
【００２７】
本明細書で使用する「フェドバッチ細胞培養」は、細胞及び培養バッチが最初に培養容器に供給され、追加の培養栄養素が連続的に、もしくは個々に少しずつ、培養終了前に定期的な細胞及び／又は生成物回収を行いながら、又は行わずに、培養工程中の培養に供給されるバッチ培養を意味する。
【００２８】
「潅流培養」は、細胞が培養中に、例えば、濾過、カプセル封入、マイクロキャリアへの固定によって拘束され、培養培地は連続的もしくは間欠的に培養容器に導入され、培養容器から取り出される培養である。
【００２９】
「培養容器」は、細胞を培養するために使用される容器を意味する。培養容器は、細胞を培養するために有用である限り、任意のサイズであってよい。
【００３０】
本明細書で使用する用語「力価」は、所定量の培地容積で分割された細胞培養により生成された組換え発現抗体の総量を意味する。力価は、典型的には抗体／培地（ｍｇ／ｍＬ）の単位で表示される。力価は、様々な培養条件下でタンパク質性生物を得る工程に比較した力価の増加率（％）等の相対測定によって表示もしくは評価することができる。
【００３１】
「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／又はそれらのアナログ、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマー内に組み込むことのできる任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含んでいてよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリの前もしくは後に付与されてよい。
【００３２】
「単離核酸」は、通常の状況の外側にある、又は分離されている非天然型、組換え型もしくは天然型配列を意味して含んでいる。単離核酸分子は、実際はその中で見いだされる形態もしくは状況以外にある。このため単離核酸分子は、自然細胞中に存在するような核酸分子とは識別される。しかし、単離核酸分子は、通常は、例えばその中では核酸分子が自然細胞の位置とは異なる染色体位置にあるタンパク質を発現する細胞中に含有される核酸分子を含む。
【００３３】
「単離」タンパク質（例えば、単離抗体）は、その自然環境の成分から同定及び分離及び／又は回収されているタンパク質である。その自然環境の汚染物質成分は、タンパク質についての研究、診断もしくは治療使用を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含んでいてよい。単離タンパク質は、組換え細胞内のインサイチュータンパク質を含むが、それはタンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないであろうからである。しかし通常は、単離タンパク質は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００３４】
「精製」タンパク質（例えば、抗体）は、タンパク質が自然環境内に存在する場合より、及び／又は実験室条件下で最初に生成された、及び／又は合成された、及び／又は増幅させられた場合より純粋である形態で存在するように、純度が増加させられていることを意味する。純度は相対語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。
【００３５】
「汚染物質」は、所望のタンパク質産物とは異なる（例えば、抗体産物とは異なる）物質を意味する。汚染物質には、制限なく、宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；核酸；所望のタンパク質の変異体、断片、凝集体もしくは誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性汚染物質；細胞培養培地成分等が含まれてよい。
【００３６】
本明細書の用語「抗体」は、極めて広い意味で使用され、詳細にはモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を包含する。抗体は、ヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟であってよい。
【００３７】
本明細書で使用する用語「全長抗体」、「完全抗体」及び「全抗体」は、本明細書では下記に規定する抗体断片ではなく実質的に完全な形態にある抗体を意味するために互換的に使用される。これらの用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を意味する。
【００３８】
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、完全抗体の一部分を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３９】
抗体のパパイン消化は、それらの名称は容易に結晶化する能力を反映している、各々が単一抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片及び残留「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋結合できるＦ（ａｂ’）２断片を産生する。Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、さらに軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の添加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書でのその中で定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はそれらの間にヒンジシステインを有する対のＦａｂ’断片として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた公知である。
【００４０】
「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。１つの実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合している１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインのダイマーから成る。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１本の重鎖可変ドメイン及び１本の軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種内の構造に類似する「ダイマー」構造に会合できるように柔軟性ペプチドリンカーによって共有結合させることができる。この構成において、各可変ドメインの３つのＨＶＲｓは相互作用してＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＨＶＲｓは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし単一可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲｓだけを含むＦｖの半分）さえ、全結合部位より低い親和性ではあるが抗原を認識して結合する能力を有する。
【００４１】
「一本鎖Ｆｖ」もしくは「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、このときこれらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨ及びＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概要については、例えば、Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994を参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、例えば、集団を含む個別抗体は、少量で存在する可能性がある、可能性のある突然変異、例えば、天然型突然変異を除いて同一である。そこで、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性が別個の抗体の混合物ではないことを指示する。所定の実施態様では、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体であって、標的結合ポリペプチド配列は複数のポリペプチド配列からの単一標的結合ポリペプチド配列の選択を含む工程によって得られた抗体を含む。例えば、選択工程は、複数のクローンから、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローンもしくは組換えＤＮＡクローンのプールからの独特の固有のクローンの選択であってよい。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改良する、標的結合配列をヒト化する、細胞培養における生産を改良する、インビボ免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を作製する等のためにさらに変化させられること、及び変化した標的結合配列を含む抗体もまた本発明のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。典型的には様々な決定因子（エピトープ）に向けられた様々な抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定因子に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体製剤は、それらが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有益である。
【００４３】
修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の特性を意味しており、何れかの特定方法による抗体の生成を必要とすると見なすべきではない。例えば、本発明によって使用できるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling等, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えDNA法（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照）、ファージディスプレイテクノロジー（例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を含む様々な技術並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座もしくはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部もしくは全部を有する動物においてヒトもしくはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号;国際公開第１９９６／３４０９６号;国際公開第１９９６／３３７３５号;国際公開第１９９１／１０７４１号;Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 2551 (1993); Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993);米国特許第５５４５８０７号;同第５５４５８０６号;同第５５６９８２５号;同第５６２５１２６号;同第５６３３４２５号;及び同第５６６１０１６号;Marks等, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg等, Nature368: 856-859 (1994); Morrison, Nature368: 812-813 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996);及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照されたい）によって作製されてよい。
【００４４】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／又は本明細書に開示したようなヒト抗体を作製するための何れかの技術を使用して作製されている抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む当分野において公知の様々な技術を使用して生成できる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991). ヒトモノクローナル抗体を調製するためにさらに利用可能であるのは、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載された方法である。さらにvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原投与に応答してそのような抗体を生成するように組み換えられているが、内因性遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物、例えば、ｘｅｎｏｍｉｃｅに抗原を投与する工程によって調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照されたい）。さらに、例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマテクノロジーによって生成されるヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照されたい。
【００４５】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」もしくは「ＨＶ」は、本明細書で使用する場合は、配列内で超可変性である、及び／又は構造的に明確なループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内及び３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内にある６つのＨＶＲｓを含む。自然抗体内では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲｓの極めて大きな多様性を提示し、Ｈ３は特に、抗体に素晴らしい特異性を付与することに独特の役割を果たすと考えられている。例えば、Xu等, Immunity13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, N.J., 2003)を参照されたい。実際に、重鎖のみから成る天然型ラクダ科（camelid）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的及び安定性である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993); Sheriffら, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照されたい。
【００４６】
多数のＨＶＲの概要説明が現在使用されており、本明細書に含まれている。カバット相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。Chothiaは、その代わりに構造的ループの場所について言及している（Chothia and Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶＲｓは、カバットＨＶＲｓとコチア構造的ループとの折衷を表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアに使用されている。「接触」ＨＶＲｓは、入手可能である複雑な結晶構造の分析に基づいている。これらのＨＶＲｓの各々からの残基を下記に記載した。
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【００４７】
ＨＶＲｓは、以下のような「伸展したＨＶＲｓ」：ＶＬ内では２４−３６もしくは２４−３４（Ｌ１）、４６−５６もしくは５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７もしくは８９−９６（Ｌ３）並びにＶＨ内では２６−３５（Ｈ１）、５０−６５もしくは４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２もしくは９５−１０２（Ｈ３）を含んでいてよい。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々についてKabat等, 上記にしたがって番号付けされる。
【００４８】
「フレームワーク」もしくは「ＦＲ」残基は、本明細書で定義したＨＶＲ以外の可変ドメイン残基である。
【００４９】
用語「カバットにおけるような可変ドメイン残基番号付け」もしくは「カバットにおけるようなアミノ酸位置番号付け」及びそれらの変形は、Kabat等, 上記における抗体の寄せ集めの重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインに対して使用される番号付けシステムを意味する。この番号付けシステムを用いると、現実の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮又は可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲ内への挿入に対応するより少数もしくは追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後の単一アミノ酸インサート（カバットによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２後の挿入残基（例えば、カバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃ等）を含んでいてよい。残基のカバット番号付けは、所定の抗体について抗体の配列と「標準」カバット番号付け配列との相同性の領域でのアラインメントによって決定することができる。
【００５０】
カバット番号システムは、一般には可変ドメイン内の残基（軽鎖のおよそ残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）について言及する場合に使用される（例えば、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。「ＥＵ番号付けシステム」もしくは「ＥＵ指数」は、一般に免疫グロブリン重鎖定常領域内の１つの残基について言及する場合に使用される（例えば、Kabat等、上記参照に報告されたＥＵ指数）。「カバットにおけるようなＥＵ指数」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
【００５１】
用語「医薬製剤」は、有効成分の生物活性が有効であることを許容するような形態にある、及びその製剤が投与されるであろう被験者にとって許容されないほど毒性である追加の成分を含有していない調製物を意味する。そのような製剤は無菌である。
【００５２】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤もしくは安定剤は、使用される用量及び濃度でそれらに曝露させられる細胞もしくは哺乳動物にとって非毒性である担体、賦形剤もしくは安定剤である（Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition)編, A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例には、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリン類を含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）が含まれる。
【００５３】
「無菌」製剤は、無菌である、又は全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まない、もしくは本質的に含まない。
【００５４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する単数形の「１つの」及び「この」は、状況が明確に他のことを指示しない限り、複数形を含む。そこで、例えば、「１つの化合物」との言及は、２つ以上のそのような化合物の組合せ等を含んでいてもよい。
【００５５】
本明細書に記載した本発明の態様及び実施態様は、「含む」、「から成る」及び「本質的に〜から成る」態様及び実施態様を含む。
【００５６】
本明細書における「約」値又はパラメーターとの言及には、当該値又はパラメーター自体に向けられている実施態様を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、範囲を定義する数を含めている。
【００５７】
本発明の態様もしくは実施態様がマーカッシュグループもしくは他の代替物のグループ分けによって記載された場合は、本発明は全体として列挙したグループ全体だけではなく、グループの各メンバーを個別的に及び主要グループの全ての可能性のあるサブグループを、さらにまたグループメンバーの１つ以上が存在しない主要グループも包含する。本発明はさらに、請求の範囲に記載された発明におけるグループメンバーの何れか１つ以上の明示的排除もまた想定している。
【００５８】
ＩＩ．  細胞培養培地
本明細書に提供した細胞培養培地は、本明細書に詳述する方法（例えば、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法；ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法；及び／又は例えばベバシズマブをコードする核酸を含む哺乳動物細胞からのベバシズマブの力価収率を強化することによる等、ベバシズマブもしくはその断片の生産を強化する方法）並びに組成物（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ並びに（ｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞及び／又は（ｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片を含む細胞培養培地を含む組成物）において利用することができる。
【００５９】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、ベバシズマブもしくはその断片を培養する際に使用できる成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ）を含むが、このとき細胞は、培地成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ）の存在下で培養された場合、培地成分を含有していない細胞培養培地（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含有していない細胞培養培地）中で培養された細胞によって生成されるベバシズマブの量より多い量であってよい所望の量でベバシズマブもしくはその断片を生成する。１つの態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、ベバシズマブもしくはその断片を生成する細胞を培養する際に使用されるが、このとき細胞は、培地成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ）の存在下で培養された場合、例えば所望量で許容される分子量等の許容される品質特性を有するベバシズマブもしくはその断片を生成する。本明細書で使用するベバシズマブの「許容される品質特性」は、ベバシズマブの規制当局の許可もしくは市販のために必要とされる化学的及び／又は物理的特性を意味することができ、細胞によって生成されるベバシズマブもしくはその断片のバッチのロット間一貫性を評価する際に使用される化学的及び／又は物理的特性であってよい。
【００６０】
本発明の他の態様では、細胞培養培地成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ）は、ベバシズマブを生成する、及びそれらの成分を含有していない細胞培養培地（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含有していない細胞培養培地）中で培養される細胞に比較してベバシズマブのより高度の生産に寄与する（例えば、ベバシズマブのより高い力価を生じさせる）改良された、もしくは許容される品質特性を有する抗体産生細胞を提供できると同定されている。所定の同定された培地成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つ）は、１つの態様では、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する場合に得られる力価より高い、許容される力価を有するベバシズマブもしくはその断片を生成する能力を有する抗体産生細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を提供するために使用することができる。本明細書で使用する培養細胞から生成された抗体（例えば、ＣＨＯ細胞から生成されたベバシズマブ）の「許容される力価」は、非限定的例として、抗体の製造規模生産を満たすために必要とされる抗体の量又は抗体産物のロット間バッチにおける一貫性を評価するために必要とされる抗体の量を意味することができる。本明細書に提供した細胞培養培地は、様々な培地中で培養された細胞から生成されたベバシズマブの量に比較してベバシズマブをコードする核酸を含む細胞から生成されるベバシズマブの量を改良できる。
【００６１】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地が提供されるが、このとき細胞培養培地は（ａ）銅;（ｂ）インスリン；（ｃ）シスチン;（ｄ）動物由来加水分解物；及び（ｅ）植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のうちの２つもしくは３つもしくは４つもしくは５つを含む。本明細書に提供した細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の何れかの組合せを、あたかもありとあらゆる組合せが詳細及び個別に列挙されたかのように含有していてよいと理解されている。例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のうちの３つを含む細胞培養培地は、これらの成分のうちの少なくとも３つが存在する限り（例えば、成分（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、又は成分（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む、又は成分（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む細胞培養培地が企図されている）成分の任意の組合せを含んでいてよいと理解されている。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、成分（ａ）及び（ｂ）を含む。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、成分（ａ）及び（ｃ）を含む。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、成分（ｂ）及び（ｃ）を含む。
【００６２】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、表１に記載した量で銅、インスリン、シスチンから成る群から選択される１つ以上の培地成分を含有する。一部の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で動物由来加水分解物をさらに含む。他の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で植物由来加水分解物をさらに含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方をさらに含む。
【００６３】
さらに、本明細書に提供した細胞培養培地は、表１の細胞培養培地成分の何れか１つ以上（銅、インスリン、シスチン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上）を表１に列挙した何れかの量で、あたかも成分及び量のありとあらゆる組合せが詳細及び個別に列挙されたかのように含んでいてよいことも理解されている。１つの変形では、本明細書に提供した細胞培養培地は、表１に列挙した何れかの量で銅、インスリン、シスチン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの２つもしくは３つもしくは４つもしくは各々を、あたかも成分及び量のありとあらゆる組合せが詳細及び個別に列挙されたかのように含む。１つの態様では、細胞培養培地は、表１に列挙した何れかの量で銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含み、並びに別の変形では、表１に列挙した何れかの量で動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物をさらに含む。
【００６４】
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【００６５】
１つの変形では、インスリンは細胞培養培地中に約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌもしくは約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌもしくは約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌもしくは約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌもしくは約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌもしくは約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌもしくは約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌもしくは約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌの濃度で、又は５．０ｍｇ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つの濃度で、又は７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つの濃度で存在する。
【００６６】
１つの変形では、銅は細胞培養培地中に約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭもしくは約８０ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約１００ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約１２５ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約１５０ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約２００ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約２５０ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約３００ｎＭ−約４００ｎＭもしくは約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭもしくは約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で、又は約１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、２７５ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３７５ｎＭもしくは４００ｎＭのおよそ何れか１つの濃度又は３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのおよそ何れか１つの濃度又は約３３５ｎＭ、３３６ｎＭ、３３７ｎＭ、３３８ｎＭ、３３９ｎＭもしくは４００ｎＭの濃度又は約３３９ｎＭの濃度で存在する。
【００６７】
１つの変形では、シスチンは細胞培養培地中に約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭもしくは約０．８ｍＭ−約２．０ｍＭもしくは約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭもしくは約０．８ｍＭ−約１．５ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約１．５ｍＭもしくは約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度で、又は０．８ｍＭもしくは０．９ｍＭもしくは１．０ｍＭもしくは１．１ｍＭもしくは１．２ｍＭもしくは１．３ｍＭもしくは１．４ｍＭもしくは１．５ｍＭのおよそ何れか１つの濃度で、又は１．１ｍＭ、１．３ｍＭもしくは１．５ｍＭのおよそ何れか１つの濃度で、又は約１．３ｍＭの濃度で存在する。
【００６８】
１つの変形では、動物由来加水分解物は、細胞培養培地中に約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約３５．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌもしくは約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌもしくは約７．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ又は５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌもしくは５０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌもしくは１２ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は約１０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００６９】
１つの変形では、植物由来加水分解物は、細胞培養培地中に約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約３．５ｇ／Ｌもしくは約１．５ｇ／Ｌ−約２．５ｇ／Ｌもしくは約１．７５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌもしくは約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌもしくは約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ又は１．７５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．２５、３．５ｇ／Ｌ、３．７５ｇ／Ｌもしくは４．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌもしくは２．５ｇ／Ｌもしくは３．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ、又は約２．５ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【００７０】
また別の変形では、システインが細胞培養培地中に存在する。システインは、１つの態様では、基底細胞培養培地に（例えば、基底細胞培養培地にシステインを含むフィード培地を補給することによって）加えられてよい。１つの変形では、細胞培養培地は、システイン（システインを含まない基底細胞培養培地にシステインを含むフィード培地を介して加えられてよい）を約０．５ｍＭ−約５．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約８．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約８．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約３．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約４．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約５．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約８．０ｍＭの濃度又は０．５ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭもしくは９．０ｍＭのおよそ何れか１つの濃度で含む。１つの態様では、システインは、基底細胞培養培地に（その添加は細胞培養サイクルの何れかの時点に行われてよい、及び同一であっても相違していてもよい１つ以上の量にあってよい）、システインが約７．５ｍＭの濃度で細胞培養培地中に存在するような量で加えられる。
【００７１】
また別の変形では、シスチンが細胞培養培地中に存在する。シスチンは、１つの態様では、基底細胞培養培地に（例えば、シスチンを既に含んでいてよい、もしくは含んでいなくてもよい基底細胞培養培地にシスチンを含むフィード培地を補給することによって）加えられてよい。１つの変形では、細胞培養培地は、シスチンを（基底細胞培養培地にシスチンを含むフィード培地を介して加えられてよい）、例えば細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量にある約０．５ｍＭ−約５．０ｍＭの濃度で含む。
【００７２】
所定の実施態様では、細胞培養培地は、シスチンを含むがシステインを含まない。
【００７３】
細胞培養培地（例えば、基底細胞培養培地）には、追加の細胞培養培地成分が（例えば、フィード細胞培養培地を介して）さらに補給されてよい。１つの態様では、追加の細胞培養培地成分はインスリンを含む。別の態様では、追加の細胞培養培地成分はインスリン及びシステインを含む。本明細書に提供した細胞培養培地には、細胞を培養するために適合する何れかの量のインスリン及び／又はシステインが補給されてよい。１つの態様では、インスリンは、細胞培養培地に細胞培養中で約１５ｍｇ／Ｌもしくは約２５ｍｇ／Ｌのインスリン濃度を提供する量で加えられる（例えば、基底細胞培養培地に細胞培養サイクルにおける１回以上の時点に加えられる）。１つの態様では、インスリンは細胞培養培地に約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌ；約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ；約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ；約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ；約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌ；５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つ；７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ及び１１．０ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つから成る群から選択される細胞培養中のインスリン濃度を提供する量で加えられる（例えば、基底細胞培養培地に細胞培養サイクルにおける１回以上の時点に加えられる）。別の態様では、システインは細胞培養培地に、約１．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約８．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約８．０ｍＭもしくは約２．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約３．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約４．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約５．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約１２．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約１０．０ｍＭもしくは約６．０ｍＭ−約８．０ｍＭ、又は５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、６．５ｍＭ、７．０ｍＭ、７．５ｍＭ、８．０ｍＭ、８．５ｍＭもしくは９．０ｍＭから成る群から選択される細胞培養中のシステイン濃度を提供する量で細胞培養培地中に加えられる（例えば、基底細胞培養培地に細胞培養サイクルの１回以上の時点に加えられる）。別の態様では、シスチンは、細胞培養培地に細胞培養中でシスチンの約０．１ｍＭ−約１．５ｍＭ、例えば約２ｍＭの濃度を提供する量で加えられる（例えば、基底細胞培養培地に細胞培養サイクルの１回以上の時点に加えられる）。
【００７４】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、約５．０ｍｇ／Ｌ−約１４．０ｍｇ／Ｌ、約５．５ｍｇ／Ｌ−約１３．０ｍｇ／Ｌ、約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ、約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌもしくは約８．５ｍｇ／Ｌ−約１４．０ｍｇ／Ｌのインスリンを含む。インスリンを含む細胞培養培地は、銅及びシスチンのうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量でさらに含んでいてよいことは理解されている。例えば、約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌのインスリンを含む細胞培養培地は、約７０ｎＭ−約４００ｎＭの銅及び／又は約０．５ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンをさらに含んでいてよく、さらに動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物、例えば約５．５ｇ／Ｌ−約４０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物及び／又は約１．５ｇ／Ｌ−約６．５ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含んでいてよいことは理解されている。
【００７５】
他の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、約６５ｎＭ−約４００ｎＭ、約７０ｎＭ−約３７５ｎＭ、約７５ｎＭ−約３５０ｎＭ、約８０ｎＭ−約３２５ｎＭ、約８５ｎＭ−約３００ｎＭもしくは約９０ｎＭ−約２７５ｎＭの銅を含む。銅を含む細胞培養培地は、インスリン及びシスチンのうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量でさらに含んでいてよいことは理解されている。例えば、約８５ｎＭ−約３００ｎＭの銅を含む細胞培養培地は、約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭのシスチン及び／又は約８．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌのインスリンをさらに含んでいてよく、さらに動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物、例えば約５．５ｇ／Ｌ−約４０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物及び／又は約１．５ｇ／Ｌ−約６．５ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含んでいてよいことは理解されている。
【００７６】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭ、約０．９ｍＭ−約１．５０ｍＭ、約１．０ｍＭ−約１．４０ｍＭもしくは約１．０ｍＭ−約１．３０ｍＭのシスチンを含む。シスチンを含む細胞培養培地は、インスリン及び銅のうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量でさらに含んでいてよいことは理解されている。例えば、約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭのシスチンを含む細胞培養培地は、約７０ｎＭ−約３７５ｎＭの銅及び／又は約８．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌのインスリンをさらに含んでいてよく、さらに動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物、例えば約５．５ｇ／Ｌ−約４０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物及び／又は約１．５ｇ／Ｌ−約６．５ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含んでいてよいことは理解されている。
【００７７】
一部の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で動物由来加水分解物をさらに含む。他の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で植物由来加水分解物をさらに含む。一部の実施態様では、細胞培養培地は、表１に記載した量で動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方をさらに含む。
【００７８】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、約１．５ｇ／Ｌ−約６．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ−約５．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌ又は約３．５ｇ／Ｌ−約４．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物を含む。植物由来加水分解物を含む細胞培養培地は、シスチン、インスリン及び銅のうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量でさらに含んでいてよいことは理解されている。例えば、約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭのシスチンを含む細胞培養培地は、約７０ｎＭ−約３７５ｎＭの銅及び／又は約８．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌのインスリンをさらに含んでいてよく、さらに動物由来加水分解物、例えば約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物をさらに含んでいてよいことは理解されている。
【００７９】
一部の態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、約６．０ｇ／Ｌ−約３５．０ｇ／Ｌ、約７．０ｇ／Ｌ−約３０．０ｇ／Ｌ、約８．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌ、約９．０ｇ／Ｌ−約２０ｇ／Ｌ又は約１０．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物を含む。動物由来加水分解物を含む細胞培養培地は、シスチン、インスリン及び銅のうちの何れか１つ以上を本明細書に提供した何れかの量でさらに含んでいてよいことは理解されている。例えば、約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭのシスチンを含む細胞培養培地は、約７０ｎＭ−約３７５ｎＭの銅及び／又は約８．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌのインスリンをさらに含んでいてよく、さらに植物由来加水分解物、例えば約１．５ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含んでいてよいことは理解されている。
【００８０】
本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約０．９ｍＭ−約１．５ｍＭのシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は、約１．４ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリンもしくは約１．４４ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌのインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は約２６．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を含む。一部の態様では、細胞培養培地は：（ａ）約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅、（ｂ）約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリンもしくは約１．４４ｍｇ／Ｌ−約６６ｍｇ／Ｌのインスリン、及び（ｃ）約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンから選択された２つ以上の成分を含む。
【００８１】
本明細書に提供した細胞培養培地成分（例えば、銅、インスリン、シスチン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含む細胞培養培地）は、例えば塩、水化物もしくはそれらの組合せ等の当分野において公知である形態で細胞培養培地に加えられてよい。細胞培養培地成分は、さらに溶液、抽出物として、もしくは固体形で細胞培養培地に提供することができる。一部の実施態様では、銅は、細胞培養培地にＣｕＳＯ４として提供される。非限定的例として、シスチンは、細胞培養培地に二ナトリウム塩一水和物粉末として提供されてよい。ペプトンとしても公知であるタンパク質加水分解物は、典型的には例えば動物組織、乳汁由来生成物、微生物もしくは植物等の様々な生物学的出発物質の酵素消化によって製造される。本明細書に提供した細胞培養培地中で使用される加水分解物は、植物もしくは動物に由来してよい（例えば、植物由来加水分解物及び／又は動物由来加水分解物）。本明細書に記載する植物性加水分解物は、小麦グルテン、トウモロコシ、シリアル、大豆もしくは綿実に由来してよいがそれらに限定されない。本明細書に記載した動物性加水分解物は、ウシ、ニワトリ、ヤギ、ウマ、ヒト、ヒツジ、ブタもしくはウサギ又は他の動物に由来してよいがそれらに限定されない。
【００８２】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を調製する方法であって、細胞培養のために適切な組成物中の銅、インスリン及びシスチンのうちの何れか２つ以上を組み合わせる工程を含む方法もまた提供される。１つの態様では、本方法は、銅、インスリン及びシスチンのうちの何れか２つ以上を細胞培養のために適合する組成物に加える工程を含むが、このとき銅、インスリン及びシスチンのうちの２つ以上は逐次的もしくは同時に加えられてよい。また別の変形では、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を調製する方法であって、第１期間に細胞培養のために適切な組成物中の銅、インスリン及びシスチンのうちの何れか２つ以上を組み合わせる工程を含み、さらに第２期間、例えば細胞増殖サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等にある量のインスリンを加える工程をさらに含む方法が提供される。一部の実施態様では、細胞増殖サイクルは、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間もしくは任意の日数であるが、このとき細胞は依然として生存性のままで細胞培養中に留まることができる。細胞培養培地を調製する方法の１つの変形では、シスチンは、細胞培養培地中に約０．９ｍＭ−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる。細胞培養培地を調製する方法のまた別の変形では、インスリンは、細胞培養培地中で１．４ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリンもしくは約１．４４ｍｇ／Ｌ−約６６．０ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量で加えられる。細胞培養培地を調製する方法のまた別の変形では、銅は、細胞培養培地中に約２６．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を提供する量で加えられる。一部の態様では、細胞培養培地は：（ａ）細胞培養培地中に約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を提供する量にある銅、（ｂ）細胞培養培地中に約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌもしくは約１．４４ｍｇ／Ｌ−約６６ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリン、及び（ｃ）細胞培養培地中に約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンを提供する量にあるシスチンから選択される２つ以上の成分を組み合わせる工程によって調製される。
【００８３】
本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は基底細胞培養培地である。本明細書の他の実施態様では、細胞培養培地はフィード細胞培養培地である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも１つを含む基底細胞培養培地であり、このとき基底細胞培養培地には（例えば、細胞培養サイクル開始後のある期間に、例えば細胞培養サイクルの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回等の何れか１つ）、インスリン、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含むフィード細胞培養培地が補給される。
【００８４】
本明細書に提供した個別の培地成分は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む細胞を培養するため及び／又は細胞培養からのベバシズマブ生産のための１つ以上の有益な特性を生じさせる量で存在してよい。有益な特性には、細胞生存性の増加、細胞から生成されるベバシズマブの量の増加（例えば、ベバシズマブ力価の強化）及び／又は細胞培養中のベバシズマブの酸化の減少が含まれるがそれらに限定されない。本明細書に提供した細胞培養培地の有益な特性は、ベバシズマブもしくはその断片のＮ−グリコシル化プロファイル、電荷不均質性及び／又はアミノ酸配列完全性を維持しながら細胞によって生成されるベバシズマブの量（例えば、抗体力価）を維持もしくは強化する工程をさらに含むことができる。これらの有益な特性は、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む細胞を培養する方法及び本明細書に記載した細胞培養中でベバシズマブもしくはその断片を生成する方法に適用できる。
【００８５】
本明細書に提供した細胞培養培地は、１つの態様では、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法において使用された場合に１つ以上の好都合の製品品質特性又は有益な特性を生じる。１つの変形では、本明細書に提供した細胞培養培地の使用は、異なる細胞培養培地中でベバシズマブ産生細胞を培養することによって生成されるベバシズマブもしくはその断片の量に比較して、細胞によって生成されるベバシズマブの量を増加させる（例えば、抗体力価を強化する）。
【００８６】
当業者であれば理解されるように、本明細書に詳述した細胞培養培地は、細胞培養のために有用である他の成分（例えば、銅、インスリン及びシスチンの１つ以上の他に、並びに任意選択的にペプトン加水分解物）を含んでいてもよい。例えば、細胞培養培地は、追加の成分、例えばアミノ酸（例えば、グルタミン、アルギニンもしくはアスパラギン）、ビタミン類（ビタミンＢ類、例えばビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９もしくはビタミンＢ１２のうちの何れか１つ以上を含むがそれらに限定されない）、微量元素、遷移金属（ニッケル、鉄（例えば、第二鉄もしくは第一鉄）もしくは亜鉛を含む）及び他の培地成分を含んでいてよいことは理解されている。本明細書に提供した何れかの培地には、さらにホルモン剤及び／又は他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンもしくは表皮増殖因子）、イオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン及びチミジン）、微量元素及びグルコースもしくは等価のエネルギー源が補給されてよい。追加の細胞培養培地成分、例えば本明細書に列挙した成分は、細胞培養培地中に当業者には公知であろう適切な濃度で含まれてよい。
【００８７】
ＩＩＩ．  本発明の方法及び使用
本明細書で提供されるのは、ベバシズマブもしくはその断片の生産において使用される細胞を培養する方法並びに銅、インスリン及びシスチンのうちの１つ以上を含む細胞培養培地の使用である。一部の態様では、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養するための方法であって、哺乳動物細胞を銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地と接触させる工程を含み、細胞培養培地は、植物由来加水分解物、動物−植物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を追加して含んでいてよい方法が提供される。一部の実施態様では、細胞培養培地はインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は銅を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地はシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は銅及びシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地は銅及びインスリンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養培地中の成分の量（例えば、銅、インスリン、シスチン、植物由来加水分解物及び／又は動物由来加水分解物の量）は、表１に提供した数値から選択される量にある。一部の実施態様では、本方法は、追加量のインスリンを培地に加える工程をさらに含む。追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも３回、少なくとも６回又は少なくとも１２回細胞培養培地に加えることができる。本明細書の実施態様の一部では、追加量のインスリンは、例えば約１ｍｇ／Ｌ−約４４ｍｇ／Ｌ等の表１から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。一部の態様では、細胞培養培地は、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物又は動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方をさらに含む。
【００８８】
一部の他の態様では、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養するための方法であって、細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法が提供される。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリン及び約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅及び約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は、約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン、約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅及び約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は、表１から選択される量でシスチン、インスリン及び／又は銅を含んでいてよい。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに、本明細書に提供した細胞培養培地に追加量のインスリンを（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも６回、少なくとも９回、少なくとも１２回又は少なくとも１４回細胞培養培地に加えることができる。本明細書の実施態様の一部では、追加量のインスリンは、細胞培養培地に例えば約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６ｍｇ／Ｌ等の表１から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。一部の態様では、細胞培養培地はさらに、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物又は動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含む。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物は、表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を提供する量で細胞培養に加えられる。
【００８９】
別の態様では、本明細書で提供されるのはベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、ベバシズマブもしくはその断片を生成できる細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法である。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの濃度で銅を含む。本明細書の一部の実施態様では、細胞培養培地は約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭの濃度でシスチンを含む。本明細書の実施態様の何れかでは、細胞培養培地は、表１から選択される量でシスチン、インスリンもしくは銅を含んでいてよい。本明細書の実施態様の一部では、本方法は、追加量のインスリンを本明細書に提供した細胞培養培地に加える工程をさらに含む。インスリンは、細胞培養のために適合する何れかの量で細胞培養培地に加えられてよい。１つの態様では、インスリンは、表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で細胞培養培地に加えられる。１つの特定態様では、インスリンは：約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３０．０ｍｇ／Ｌ；約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ；約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ；約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ；約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ及び約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌから成る群から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で細胞培養培地に加えられる。また別の態様では、インスリンは、約５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で細胞培養培地に加えられる。また別の態様では、インスリンは、７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つの濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で細胞培養培地に加えられる。追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中の任意の時点に細胞培養培地に加えることができる。例えば、インスリンは、第１−２０日の２０日間の細胞培養サイクル中の何れか１日以上（例えば、第１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日もしくは２０日のうちの何れか１日以上）に加えられてよい。追加量のインスリンが加えられる場合、インスリンは何れかの量で加えられてよく、その量は、インスリンが細胞培養サイクル中に１回より多く加えられる場合に同一であっても相違していてもよい。このため、１４日間細胞培養サイクルについては、インスリンは第１−１４日間のうちの何れか１日以上に（例えば、第１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３もしくは１４日の何れか１日以上に）、インスリンが細胞培養サイクル中の２回以上加えられる場合に同一であっても相違していてもよい何れかの量で加えられてよいと理解されている。追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも６回、少なくとも９回、少なくとも１２回又は少なくとも１４回細胞培養培地に加えることができる。本明細書の実施態様の一部では、追加量のインスリンは、例えば約５．６ｍｇ／Ｌ−約６６ｍｇ／Ｌ等の表１から選択される濃度にある細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる。一部の態様では、細胞培養培地はさらに、動物由来加水分解物、植物由来加水分解物又は動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含む。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。
【００９０】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地は、約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する方法である。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、（１）銅及びインスリン；（２）銅及びシスチン；（３）インスリン及びシスチン；又は（４）銅、インスリン及びシスチンを含んでいる。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、銅、シスチン及び／又はインスリンを表１に記載した濃度から選択される濃度で含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を表１に記載した濃度から選択される濃度で含む。一部の実施態様では、初期細胞培養培地はインスリンを含み、本方法は細胞培養サイクル中に追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。一部の実施態様では、追加量のインスリンは、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は少なくとも６回細胞培養培地に加えられる。一部の実施態様では、各時点に加えられるインスリンは、約５ｍｇ／Ｌ−約２５ｍｇ／Ｌ（例えば、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つ）である。一部の実施態様では、細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量は、約２０ｍｇ／Ｌ−約１００ｍｇ／Ｌ（例えば、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、８５ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、９５ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌのおよそ何れか１つ）である。一部の実施態様では、初期細胞培養培地はシスチンを含み、本方法は細胞培養サイクル中に追加量のシスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む。例えば、シスチンは細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭの追加のシスチンを提供する量（例えば、細胞培養培地中の約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約１ｍＭもしくは約１．５ｍＭの追加のシスチン）で加えられる。一部の実施態様では、シスチンは細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる。一部の実施態様では、本方法は、細胞培養サイクル中の少なくとも１バッチフィード（例えば、細胞培養サイクル中の２、３もしくは４バッチフィード）をさらに含む。一部の実施態様では、バッチフィード培地は、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を（例えば、表１に記載した濃度から選択される濃度で）さらに含む。一部の実施態様では、細胞培養サイクル中に、培地の温度は、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる。一部の実施態様では、培地の温度は、細胞培養サイクル中に少なくとも１回又は少なくとも２回低下させられる。一部の実施態様では、温度は培養する工程の開始後の第８日及び第１０日に低下させられる。一部の実施態様では、細胞は、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される。一部の実施態様では、細胞は、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される。一部の実施態様では、細胞は約７．０−約７．３のｐＨを有する培地中で培養される。
【００９１】
本明細書で使用する用語「初期細胞培養培地」は、細胞培養サイクルの開始時の細胞培養培地を意味する。一部の実施態様では、初期細胞培養培地は、細胞が基底培地中に接種された後の細胞培養培地である。
【００９２】
本明細書で使用する用語「累積」は、特定成分又は細胞培養サイクルの開始時に加えられる成分及び引き続いて加えられる成分を含む、細胞培養サイクルの間に加えられる成分の総量を意味する。一部の実施態様では、累積量は、添加後の細胞培養培地中で測定もしくは計算されるような細胞培養培地中に加えられた１つ又は複数の成分の総濃度である。一部の実施態様では、１つ又は複数の成分は、濃縮された１つ又は複数の成分を含有するフィード溶液によって細胞培養培地中に加えられる。例えば、初期培養培地が１０ｍｇ／Ｌのインスリンを有し、及び１５ｍｇ／Ｌの追加量のインスリンが細胞培養培地中の１５ｍｇ／Ｌの増加を達成するために細胞培養サイクル中に加えられる場合は、細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量は２５ｍｇ／Ｌである。
【００９３】
一部の実施態様では、細胞培養サイクルは、細胞によって発現されるポリペプチドを生成するために基底細胞培養培地中に細胞を接種する工程から産生期間の終了時までの期間を意味する。一部の実施態様では、細胞培養サイクルは、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、少なくとも２２日間、少なくとも２３日間もしくは細胞によって発現されるポリペプチドを生産するために細胞が生存性のままでいる任意の日数である。
【００９４】
本明細書の実施態様の一部では、本方法は、表１に列挙した１つ又は複数の成分を含んでいない細胞培養培地中で培養した場合に哺乳動物細胞が生成するベバシズマブもしくはその断片の量に比較して哺乳動物細胞によって生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を増加させる。一部の実施態様では、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で培養された細胞によって生成されたベバシズマブもしくはその断片の量は、銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で培養された細胞によって生成されたベバシズマブもしくはその断片の量に比較して少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％もしくは５０％増加する。
【００９５】
本明細書に提供した細胞培養培地は、基底細胞培養培地及び／又はフィード細胞培養培地として使用できる。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、細胞の増殖期中に細胞を培養するための方法において使用される。一部の実施態様では、本明細書に提供した細胞培養培地は、細胞の産生期中に細胞を培養するための方法において使用される。
【００９６】
（ｉ）ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法；（ｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法；及び（ｉｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞からのベバシズマブもしくはその断片の生産を強化する（例えば、ベバシズマブもしくはその断片の力価収率を強化する）方法の何れかを包含する本明細書に詳述した方法の何れかは、任意の適切なスケールで実施されてよい（例えば、ベバシズマブもしくはその断片を生成する何れかのスケール）。１つの態様では、本明細書に詳述した方法の何れもベバシズマブもしくはその断片の商業生産と釣り合う規模で実施される。例えば、１つの変形では、ベバシズマブを生成できる細胞は本明細書に提供した細胞培養培地中で培養されてよいが、このとき培養する工程は商業的バッチのベバシズマブを保持できる培養容器中、例えば少なくとも１０，０００Ｌの細胞培養を保持できる培養容器中で行われる（例えば、本法は、１つの態様では少なくとも１０，０００Ｌの細胞培養規模、例えば１２，０００Ｌの細胞培養スケールで実施される）。
【００９７】
本明細書に提供した方法のまた別の実施態様では、ベバシズマブもしくはその断片は細胞培養物から回収される。回収されたベバシズマブもしくはその断片を含む組成物は、例えば、品質特性の評価前に少なくとも１つの精製工程にかけることができる。また別の実施態様では、組成物はベバシズマブもしくはその断片及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
【００９８】
その他の方法及び細胞培養培地は、例えば本発明の概要及び他の場所における等、全体を通して提供される。
【００９９】
ポリペプチドの生成
本明細書に詳述した細胞培養培地は、ベバシズマブもしくはその断片を生成するために細胞を培養する方法において使用できる。培地は、バッチ培養、フェドバッチ培養又は潅流培養によってであろうと、ベバシズマブもしくはその断片を生成できる細胞を培養する方法において使用されてよい。１つの実施態様では、ベバシズマブもしくはその断片は、宿主細胞によって培地中に直接的に分泌させられる。別の実施態様では、ベバシズマブもしくはその断片は、抗体もしくはその断片をコードする核酸を含む細胞の溶解によって培地中に放出される。
【０１００】
宿主細胞内で発現可能であるベバシズマブもしくはその断片は、本開示にしたがって生成することができ、提供された組成物中に存在する可能性がある。
【０１０１】
細胞培養中で抗体及びその断片を生成する方法は、当分野において周知である。本明細書で提供されるのは、細胞培養中で抗体（例えば、全長抗体、抗体断片及び多重特異性抗体）を生成するための非限定的な代表的方法である。例えば、抗体（例えば、ベバシズマブ）を生成するための一般に明確に理解されていて一般に使用される技術及び方法については、全体として出典明示により全てが本明細書に組み込まれるMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook等, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等編, 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel等編, J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill等, 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane編, 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)を参照されたい。
【０１０２】
細胞培養及び抗体産生
一般に、細胞は本明細書に記載した細胞培養培地の何れかと、細胞の増殖、維持及び／又は抗体産生のうちの何れかを促進する１つ以上の条件下で組み合わされる（接触させられる）。細胞を培養して抗体を産生する方法は、細胞及び細胞培地を含有するための培養容器（バイオリアクター）を使用する。培養容器は、ガラス、プラスチックもしくは金属を含む、細胞を培養するために適合する任意の材料から構成することができる。典型的には、培養容器は、少なくとも１Ｌであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００Ｌ以上（例えば、１２，０００Ｌの容器）であってよい。１つの態様では、培養容器は、細胞培養から製造規模量のベバシズマブを生成するために必要とされるように、少なくとも２Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、少なくとも２，５００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも７，５００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１２，０００Ｌ以上の本明細書に提供した細胞培養培地を含有することができる。そこで、本明細書に提供した組成物及び方法は、ベバシズマブもしくはその断片を製造規模生産に利用することができる。例えば温度、ｐＨ等の培養条件は、発現させるために選択された宿主細胞とともに以前に使用された培養条件であり、当業者には明白であろう。培養工程中に調整されてよい培養条件には、ｐＨ及び温度が含まれるがそれらに限定されない。本明細書の実施態様の一部では、ｐＨは、少なくとも７．０、７．１５、７．２、７．２５、７．３０、７．３５、７．４、７．４５もしくは７．５０以上であるが、８．０未満である。本明細書に提供した細胞培養培地中に接種できるベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む細胞の数は、当業者には明白であろう。例えば、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む約１．０×１０６−約２．０×１０６個の（約１．１×１０６個、約１．２×１０６個、約１．３×１０６個、約１．４×１０６個、約１．５×１０６個、約１．６×１０６個、約 １．７×１０６個、約１．８×１０６もしくは約１．９×１０６個の何れかを含む）細胞は、細胞培養サイクルを開始するために本明細書に提供した培地中に接種することができる。１つの態様では、本明細書に提供した培地中に接種することができるベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む細胞の数は、約１．２×１０６−約１．８×１０６個もしくは約１．３×１０６−約１．７×１０６個もしくは約１．５×１０６−約１．７×１０６個である。
【０１０３】
細胞培養は、一般に初期増殖期においては細胞培養の生存、増殖及び生存性（維持）を誘導する条件下で維持される。正確な条件は、細胞タイプ、それに細胞が由来する生体、及び発現抗体もしくはその断片の性質及び形質に依存して変動することになる。
【０１０４】
初期増殖期における細胞培養の温度は、主として細胞培養が生存性のままである温度の範囲に基づいて選択されることになる。例えば、初期増殖期中には、ＣＨＯ細胞は３７℃で良好に増殖する。一般に、大多数の哺乳動物細胞は、約２５℃−４２℃の範囲内で良好に増殖する。好ましくは、哺乳動物細胞は、約３５℃−４０℃の範囲内で良好に増殖する。当業者であれば、細胞及び生産要件の必要に依存して、その中で細胞を増殖させるために適切な温度（一又は複数）を選択することができるであろう。
【０１０５】
本発明の１つの実施態様では、初期増殖期の温度は、単一の一定温度で維持される。また別の実施態様では、初期増殖期の温度は、ある範囲の温度内で維持される。例えば、温度は、初期増殖期中に一様に上昇又は低下させられてよい。又は、温度は、初期増殖期中の様々な時点に離散量で上昇又は低下させられてよい。当業者であれば、単一もしくは複数の温度を使用すべきかどうか、及び温度を一様に、もしくは離散量ずつ調整すべきかどうかを決定することができよう。
【０１０６】
細胞は、初期増殖期中により長いもしくは短い時間にわたり培養されてよい。１つの変形では、細胞は、平穏に増殖することが許容されれば最終的には達するであろう所定のパーセンテージの最大生存性細胞密度である生存性細胞密度を達成するために十分な期間にわたり培養される。例えば、細胞は、最大生存性細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％の生存性細胞密度を達成するために十分な期間にわたり培養されてよい。
【０１０７】
また別の実施態様では、細胞は既定の期間にわたり増殖させられる。例えば、細胞培養の出発濃度、細胞が培養される温度及び細胞の内因性増殖速度に依存して、細胞は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間以上にわたり培養されてよい。一部の場合には、細胞は１カ月以上にわたり増殖させられてよい。
【０１０８】
細胞培養は、酸素化及び栄養素の細胞への分散を増加させるために初期培養期中に攪拌もしくは振盪されてよい。本発明によると、当業者であれば、ｐＨ、温度、酸素化等を含むがそれらに限定されない初期増殖期中のバイオリアクターの所定の内部条件を制御もしくは調節するために有益な可能性があることを理解するであろう。例えば、ｐＨは、適切な量の酸もしくは塩基を供給することによって制御することができ、酸素化は当分野において周知であるスパージングデバイスを用いて制御することができる。
【０１０９】
初期培養工程は増殖期であるが、このときバッチ細胞培養条件は、シードトレイン（seed train）を生成するために組換え細胞の増殖を強化するために修飾される。増殖期は、一般に、細胞が一般に迅速に分割する、例えば増殖する指数増殖期を意味する。この期間中、細胞は、通常は１−４日間、例えば１、２、３もしくは４日間の期間にわたり、及び細胞増殖が最適であるような条件下で培養される。宿主細胞についての増殖サイクルの決定は、特定宿主細胞に対して、当業者には公知の方法によって決定することができる。
【０１１０】
増殖期には、本明細書に提供した基底培養培地及び細胞は、培養容器にバッチ式で補給されてよい。１つの態様での培養培地は、約５％未満もしくは１％未満もしくは０．１％未満の血清及び植物もしくは動物に由来する他のタンパク質（例えば、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物）を含有する。一部の実施態様では、基底培地は、動物由来もしくは植物由来加水分解物を含んでいない。しかし、血清及び動物由来タンパク質は、所望であれば使用できる。それらの増殖における特定時点には、細胞は、産生期における培養の開始時に培養培地に接種するための接種材料を形成することができる。又は、産生期は増殖期と連続していてよい。細胞増殖期には、一般にポリペプチド産生期（例えば、抗体産生期）が続く。
【０１１１】
ポリペプチド産生期中には、細胞培養は（増殖期に比較して）細胞培養の生残及び生存性を誘導する、及び所望のポリペプチド（例えば、ベバシズマブもしくはその断片）の発現のために適切な第２セットの培養条件下で維持されてよい。例えば、その後の産生期中には、ＣＨＯ細胞は、２５℃−３５℃の明確に範囲内で組換えポリペプチドを良好に発現する。複数の離散温度シフトは、細胞密度もしくは生存性を増加させるため、又は組換えポリペプチドの発現を増加させるために使用されてよい。１つの実施態様では、ポリペプチド生産を増加させる（例えば、ベバシズマブもしくはその断片の生産を増加させる）方法は、ポリペプチド産生期中に１つ以上の温度シフト工程を含む。また別の実施態様では、１つ以上の温度シフト工程は、３７℃から３５℃へ、３５℃から３３℃へ、又は３３℃から３１℃への温度のシフトを含む。本明細書の実施態様の一部では、１つ以上の温度シフト工程は、第０日の約３７℃から第１日の３５℃から第８日の３３℃へ、及び第１０日の３１℃への温度のシフトを含む。本明細書の実施態様の一部では、３つ以上の温度シフト工程は、第０日の約３７℃から第１日の３５℃から第８日の３３℃へ、及び第１０日の３１℃への温度のシフトを含む。本明細書の一部の実施態様では、１つ以上の温度シフト工程は、第０日の約３７℃から第２．５日の３４℃への温度のシフトを含む。
【０１１２】
細胞は、その後の産生期において所望の細胞密度もしくは生産力価に到達するまで維持されてよい。１つの実施態様では、細胞は、その後の産生期には組換えポリペプチド（例えば、ベバシズマブもしくはその断片）の力価が最大値に達するまで維持される。他の実施態様では、培養はこの時点の前に回収されてよい。例えば、細胞は、最大生存性細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは９９％の生存性細胞密度を達成するために十分な期間にわたり維持されてよい。一部の場合には、生存性細胞密度が最大値に達することを許容する、及びその後に培養を回収する前に生存性細胞密度が一部のレベルへ低下するのを許容するのが所望の場合がある。
【０１１３】
所定の場合には、その後の産生期中には細胞によって枯渇もしくは代謝されている栄養素もしくは他の培地成分を細胞培養に補給するのが有益又は必要な場合がある。例えば、細胞培養には栄養素もしくは細胞培養の開始中に枯渇していると観察された他の培地成分を補給するのが有益な場合がある。又は、もしくは追加して、その後の産生期の前に細胞培養を補給するのが有益もしくは必要な場合がある。非限定的例として、細胞培養にホルモン及び／又は増殖因子、特定イオン（例えばナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は極めて低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質もしくはグルコース又は他のエネルギー源を補給するのが有益もしくは必要な場合がある。１つの態様では、基底細胞培養には、本明細書に詳述したインスリン及び／又は植物由来加水分解物及び／又は動物由来加水分解物が補給される。
【０１１４】
本明細書の一部の実施態様では、本発明の方法は、細胞産生期中における細胞培養中への追加量のインスリンの補給を含む。例えば、追加の１５ｍｇ／Ｌのインスリンは、細胞培養サイクルの産生期の日に細胞培養に加えられてよい。別の実施例では、追加の５ｍｇ／Ｌのインスリンは、細胞培養サイクルの産生期中に少なくとも３回細胞培養に加えられてよい。さらに別の実施例では、追加の５ｍｇ／Ｌのインスリンは、細胞培養サイクルの産生期中に少なくとも６回細胞培養に加えられてよい。細胞培養サイクルは、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間もしくは１４日間の長さであってよい。一部の実施態様では、細胞培養サイクルは２０日間までの長さである。一部の実施態様では、細胞培養は少なくとも２０日間の長さである。一部の実施態様では、細胞は、１より多い細胞培養サイクルにわたり培養されてよい。本明細書の実施態様の一部では、本方法はさらに本明細書に提供した細胞培養培地に追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を（例えば、細胞培養サイクルの開始後のある期間に基底細胞培養培地に導入されたフィード培地を介して等で）加える工程を含む。本明細書の実施態様の一部では、細胞培養に加えられる追加量の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物は表１に列挙した濃度から選択される濃度にある細胞培養培地中の動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物を提供する量で加えられる。
【０１１５】
抗体の精製
ベバシズマブもしくはその断片は、好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるが、ベバシズマブもしくはその断片は分泌シグナルを伴わずに直接発現した場合は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。
【０１１６】
培養培地もしくは溶解物は、粒子状細胞残屑を除去するために遠心分離されてよい。ベバシズマブもしくはその断片はその後に、適切な精製方法の代表である以下の：イムノアフィニティーもしくはイオン交換カラム上での分別法；エタノール沈降法；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上もしくはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降法：例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用するゲル濾過法；及び例えばＩｇＧ等の汚染物質を除去するためのプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの方法を用いて汚染性可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製することができる。プロテアーゼ阻害剤、例えばフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）もまた、精製中のタンパク質分解を阻害するために有用な可能性がある。当業者であれば、当該の抗体もしくはその断片のために適合する精製方法が組換え細胞培養において発現後に抗体もしくはその断片の形質における変化の原因となる修飾を必要とする可能性があることを理解できるであろう。抗体もしくはその断片は、一般にクロマトグラフィー技術（例えば、工程不純物を除去するための低ｐＨ溶出工程を用いるアフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィー）を使用して精製できる。精製ベバシズマブもしくはその断片は、例えば、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度又は約１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する濃縮タンパク質組成物を提供するために濃縮させられてよい。濃縮ポリペプチド生成物は、濃縮条件下で容認できるレベルまで、例えば、ポリペプチドが溶液中ではもはや可溶性ではない濃度まで濃縮されてよいと理解されている。薬物製剤のための抗体を生成及び精製するための方法の非限定的例は、出典明示により全体として本明細書に援用されるKelley, B. MAbs., 2009, 1(5):443-452に記載されている。
【０１１７】
ＩＶ．  医薬製剤
本明細書に提供した細胞培養培地及び１つ以上の他の成分、例えば細胞又は所望の抗体もしくはその断片（例えば、ベバシズマブもしくはその断片）を含む組成物もまた提供される。ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞は、細胞培養中の本発明の細胞培養培地中に抗体もしくはその断片を分泌できる。したがって、本発明の組成物は、ベバシズマブもしくはその断片を生成する哺乳動物細胞及びその中にベバシズマブもしくはその断片が分泌される本明細書に提供した細胞培養培地を含んでいてよい。ベバシズマブもしくはその断片及び本明細書に提供した細胞培養培地を含む組成物もまた企図されている。本発明の一部の態様では、組成物は、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）本明細書に提供した何れかの細胞培養培地を含む。一部の態様では、組成物は、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）本明細書に提供した何れかの細胞培養培地を含むが、このとき抗体もしくはその断片はベバシズマブもしくはその断片をコードする単離核酸を含む哺乳動物細胞によって培地中に分泌される。他の態様では、組成物は：（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）本明細書に提供した何れかの細胞培養培地を含むが、このときベバシズマブもしくはその断片はベバシズマブもしくはその断片をコードする単離核酸を含む哺乳動物細胞の溶解によって培地中に放出される。組成物の哺乳動物細胞は、本明細書に詳述した任意の哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であってよく、組成物の培地は本明細書に詳述した任意の培地、例えば表１に詳述した１つ以上の化合物を含む培地であってよい。
【０１１８】
本明細書に記載した方法の何れかによって生成されたベバシズマブもしくはその断片の組成物（例えば、医薬製剤）は、所望の純度を有するベバシズマブもしくはその断片を凍結乾燥製剤もしくは水性液剤の形態にあってよい１つ以上の任意選択的な薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合する工程によって調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される用量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、バッファー、酸化防止剤、保存料、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質；親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類；二糖類、及び他の炭水化物、キレート剤、糖類、塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）及び／又は非イオン性界面活性剤が含まれるがそれらに限定されない。一部の実施態様では、医薬製剤は、哺乳動物、例えばヒトに投与される。ベバシズマブもしくはその断片の医薬製剤は、非経口、肺内及び鼻腔内、及び所望であれば局所治療のために病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投与する工程は、任意の適切な経路によって、例えば注射によって、例えば一部には投与が短期間もしくは慢性的の何れであるかに依存して、静脈内もしくは皮下注射によってでよい。したがって、本明細書に提供した抗体含有製剤は、例えば個体への皮下注射（例えば、ヒトへの皮下注射）等の注射のために適切な場合がある。インビボ投与のために使用できる医薬製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通しての濾過によって容易に実施することができる。
【０１１９】
一部の態様では、本明細書に提供した組成物（例えば、医薬製剤）は、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬもしくは２５０ｍｇ／ｍＬの濃度、又は約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬもしくは約２００ｍｇ／ｍＬの濃度のベバシズマブもしくはその断片を含む。他の態様では、本明細書に提供した組成物（例えば、医薬製剤）は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬの濃度、又は約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬもしくは約７５ｍｇ／ｍＬの濃度のベバシズマブもしくはその断片を含む。
【０１２０】
Ｖ．  製造品及びキット
細胞培養培地に銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つを補給するためのキットが提供される。銅、インスリン及びシスチンのうちの少なくとも２つは、表１に提供した濃度の成分を提供する量で存在してよい。キットは、再構成される乾燥構成要素を含有していてよく、さらに（例えば、培地にキット構成要素を補給する際に使用するための）使用説明書を含有していてよい。キットは、本明細書に提供した構成要素を、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地に補給するために適合する量で含有していてよい。１つの態様では、キットは、細胞培養培地中に約０．９ｍＭ−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量でシスチンを含む。本明細書の一部の実施態様では、キットは、細胞培養培地中の約１．４ｍｇ／Ｌ−約１１ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリンをさらに含む。本明細書の一部の実施態様では、キットは、細胞培養培地中の約２６ｎＭ−約４００ｎＭの銅を提供する量にある銅をさらに含む。一部の実施態様では、キットは、細胞培養培地中の約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリン、細胞培養培地中の約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭのシスチンを提供する量にあるシスチン及び細胞培養培地中の約２５．０ｎＭ−約４００．０ｎＭの銅を提供する量にある銅から成る群から選択される２つ以上の構成要素を含む。
【０１２１】
本明細書の態様の何れかでは、キットは、動物由来加水分解物もしくは植物由来加水分解物又は動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方をさらに含んでいてよい。本明細書の実施態様の一部では、キットは、細胞培養培地中の約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌの植物由来加水分解物を提供する量にある植物由来加水分解物をさらに含む。本明細書の実施態様の一部では、キットは、細胞培養培地中の約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物を提供する量にある動物由来加水分解物をさらに含む。
【０１２２】
本発明のまた別の態様では、本発明の細胞培養培地を保持し、及び任意選択的に使用説明書を提供する容器を含む製造品が提供される。適切な容器には、例えば、ボトル及びバッグが含まれる。容器は、例えばガラスもしくはプラスチック等の様々な材料から形成されてよい。容器は、細胞培養培地及びその上もしくはそれに関連しているラベルを保持し、容器は（例えば、細胞を培養する際に使用するための）使用説明書を指示していてよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤及び使用説明書を含む添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から所望である他の材料をさらに含んでいてよい。
【０１２３】
本明細書に詳述した方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片を保持する、及び任意選択的に使用説明書を提供する容器を含む製造品もまた提供される。
【０１２４】
実施態様
本発明の様々な実施態様及び態様は、本明細書において全体を通して詳述されている。実施態様には、制限なく以下が含まれる。
【０１２５】
方法１：  ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養培地は、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、及び細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法。
【０１２６】
方法２：  ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法。
【０１２７】
方法３：  ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を強化する方法であって、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を含み、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量が強化される方法。
【０１２８】
方法４：  インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞から生成されたベバシズマブもしくはその断片の量がインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して強化される方法。
【０１２９】
方法１−４の何れかについて、本方法は、以下の特徴（ｉ）−（ｘｖｉｉｉ）もしくはそのサブ特徴：
（ｉ）細胞培養培地は銅及びインスリンを含む
（ｉｉ）細胞培養培地は銅及びシスチンを含む
（ｉｉｉ）細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む
（ｉｖ）細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む
（ｖ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｉｖ）の何れかを含有する培地を含む）はさらに、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含む
（ｖｉ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、インスリンを、
ａ．約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｂ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｃ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｄ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ
ｅ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｆ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ
ｇ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ
ｈ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｉ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｊ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｋ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｌ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｍ．約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ
ｎ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ
ｏ．約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ
ｐ．約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ
ｑ．約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌ
ｒ．５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌもしくは３１．０ｍｇ／Ｌ又は３２ｍｇ／Ｌもしくは３３ｍｇ／Ｌもしくは３４ｍｇ／Ｌもしくは３５ｍｇ／Ｌもしくは３６ｍｇ／Ｌもしくは３７ｍｇ／Ｌもしくは３８ｍｇ／Ｌもしくは３９ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｓ．７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｔ．約２５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｖｉｉ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、銅を、
ａ．約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭ
ｂ．約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭ
ｃ．約８０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｄ．約１００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｅ．約１２５ｎＭ−約４００ｎＭ
ｆ．約１５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｇ．約２００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｈ．約２５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｉ．約３００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｊ．約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ
ｋ．約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ
ｌ．１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、２７５ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３７５ｎＭもしくは４００ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｎ．約３３５ｎＭ、３３６ｎＭ、３３７ｎＭ、３３８ｎＭ、３３９ｎＭもしくは４００ｎＭ
ｏ．約３３９ｎＭのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｖｉｉｉ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、シスチンを、
ａ．約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｂ．約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭ
ｃ．約０．８ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｄ．約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭ
ｅ．約０．８ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｆ．約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｇ．約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｈ．約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭ
ｉ．０．８ｍＭもしくは０．９ｍＭもしくは１．０ｍＭもしくは１．１ｍＭもしくは１．２ｍＭもしくは１．３ｍＭもしくは１．４ｍＭもしくは１．５ｍＭのおよそ何れか１つ
ｊ．１．１ｍＭ、１．３ｍＭもしくは１．５ｍＭのおよそ何れか１つのうちのおよそ何れか１つの濃度で含む
（ｉｘ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、動物由来加水分解物を、
ａ．約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌ
ｃ．約７．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌ
ｄ．約７．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｅ．約７．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌ
ｆ．約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌ
ｇ．約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｈ．約７．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｉ．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌもしくは５０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｊ．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌもしくは１２ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｋ．約１０ｇ／Ｌ
ｌ．約１３ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｘ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｉｘ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、植物由来加水分解物を、
ａ．約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約１．４ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｃ．約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌ
ｄ．約１．５ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌ
ｅ．約１．５ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌ
ｆ．約１．５ｇ／Ｌ−約３．５ｇ／Ｌ
ｇ．約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌ
ｈ．約１．５ｇ／Ｌ−約２．５ｇ／Ｌ
ｉ．約１．７５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｊ．約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｋ．１．７５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．２５、３．５ｇ／Ｌ、３．７５ｇ／Ｌもしくは４．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｌ．２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌもしくは３．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．約２．５ｇ／Ｌ
ｎ．約３．１ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｘｉ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、動物由来加水分解物は植物由来加水分解物より多い量で存在する
（ｘｉｉ）細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）はインスリンを含み、本方法は追加量のインスリンを細胞培養培地に加える工程を含み、追加量のインスリンは：（ａ）細胞培養培地に細胞培養サイクル中に１回もしくは少なくとも３回もしくは少なくとも６回加えられてよく、（ｂ）細胞培養培地中に、
ａ．約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｂ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｃ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｄ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ
ｅ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｆ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ
ｇ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ
ｈ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｉ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｊ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｋ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｌ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｍ．約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ
ｎ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ
ｏ．約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ
ｐ．約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ
ｑ．約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌ
ｒ．５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌもしくは３１．０ｍｇ／Ｌ又は３２ｍｇ／Ｌもしくは３３ｍｇ／Ｌもしくは３４ｍｇ／Ｌもしくは３５ｍｇ／Ｌもしくは３６ｍｇ／Ｌもしくは３７ｍｇ／Ｌもしくは３８ｍｇ／Ｌもしくは３９ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｓ．７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｔ．約２５ｍｇ／Ｌ
ｕ．約１５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度のインスリンを提供する量で加えられてよい
（ｘｉｉｉ）本方法は、 細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）にシステインを加える工程をさらに含み、システインは細胞培養培地に（ａ）システインを含まない基底培地に加えられるバッチフィードの１つの成分として加えられてよい、及び／又は（ｂ）約０．５−約５．０ｍＭもしくは約０．５−約２．０ｍＭもしくは約０．５−約２．０ｍＭ（０．８ｍＭの濃度等）もしくは約７．０−約８．０ｍＭ（約７．５ｍＭの濃度等）の濃度にある細胞培養培地中のシステインを提供する量で加えられてよい
（ｘｉｖ）本方法は、 細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）にシスチンを加える工程をさらに含み、シスチンは基底培地に加えられるバッチフィードの１つの成分として細胞培養培地に加えられてよい、及び約０．１−約１．５ｍＭの濃度（０．２ｍＭの濃度等）にある細胞培養培地中のシスチンを提供する量で加えられてよい
（ｘｖ）細胞は、（例えば特徴（ｉ）−（ｘｉｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む何れかの細胞培養培地中で）約２８℃−約３７℃もしくは約３１℃−約３５℃の範囲内の温度で培養される
（ｘｖｉ）細胞は、（例えば特徴（ｉ）−（ｘｉｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む何れかの細胞培養培地中で）第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、及び第３期間は約３１℃の第３温度で培養される
（ｘｖｉｉ）ベバシズマブもしくはその断片は、 細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｖｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）中に分泌される
（ｘｖｉｉｉ）本方法は、 細胞培養（特徴（ｉ）−（ｘｖｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む）のうちの何れか１つ以上又は特徴もしくはサブ特徴の何れかの組合せを含んでいてよい。
【０１３０】
さらに本明細書で提供されるのは、方法１−４の何れかを制限なく含む本明細書に提供した任意の方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片であり、その方法は、特徴（ｉ）−（ｘｖｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部又はそれらのサブ特徴もしくは上記の何れかの組合せをさらに含んでいてよい。
【０１３１】
さらに提供されるのは、（ｉ）方法１−４の何れかを制限なく含む本明細書に提供した任意の方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片であり、その方法は、特徴（ｉ）−（ｘｖｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部又はそれらのサブ特徴もしくは上記の何れかの組合せをさらに含んでいてよいベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１３２】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を補給するためのキットであって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：
（ｉ）
ａ．約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｂ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｃ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｄ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ
ｅ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｆ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ
ｇ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ
ｈ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｉ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｊ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｋ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｌ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｍ．約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ
ｎ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ
ｏ．約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ
ｐ．約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ
ｑ．約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌ
ｒ．５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌもしくは３１．０ｍｇ／Ｌ又は３２ｍｇ／Ｌもしくは３３ｍｇ／Ｌもしくは３４ｍｇ／Ｌもしくは３５ｍｇ／Ｌもしくは３６ｍｇ／Ｌもしくは３７ｍｇ／Ｌもしくは３８ｍｇ／Ｌもしくは３９ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｓ．７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｔ．約２５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にあるインスリン
（ｉｉ）
ａ．約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｂ．約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭ
ｃ．約０．８ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｄ．約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭ
ｅ．約０．８ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｆ．約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｇ．約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｈ．約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭ
ｉ．０．８ｍＭもしくは０．９ｍＭもしくは１．０ｍＭもしくは１．１ｍＭもしくは１．２ｍＭもしくは１．３ｍＭもしくは１．４ｍＭもしくは１．５ｍＭのうちのおよそ何れか１つ
ｊ．１．１ｍＭ、１．３ｍＭもしくは１．５ｍＭのうちのおよそ何れか１つのうちの何れか１つの濃度を提供する量にあるシスチン
（ｉｉｉ）
ａ．約６９．０ｎＭ−約１，０００ｎＭ
ｂ．約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭ
ｃ．約８０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｄ．約１００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｅ．約１２５ｎＭ−約４００ｎＭ
ｆ．約１５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｇ．約２００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｈ．約２５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｉ．約３００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｊ．約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ
ｋ．約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ
ｌ．１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、２７５ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３７５ｎＭもしくは４００ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｎ．約３３５ｎＭ、３３６ｎＭ、３３７ｎＭ、３３８ｎＭ、３３９ｎＭもしくは４００ｎＭ
ｏ．約３３９ｎＭの何れか１つの濃度にある銅のうちの少なくとも２つを含むキットもまた提供される。
【０１３３】
キットは、
ｉ．例えば、
ａ．約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約５．６ｇ／Ｌ−約３８．０ｇ／Ｌ
ｃ．約７．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌ
ｄ．約７．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｅ．約７．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌ
ｆ．約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌ
ｇ．約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｈ．約７．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｉ．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌもしくは５０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｊ．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌもしくは１２ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｋ．約１０ｇ／Ｌ
ｌ．約１３ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にある動物由来加水分解物、
ｉｉ．例えば、
ａ．約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約１．４ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｃ．約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌ
ｄ．約１．５ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌ
ｅ．約１．５ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌ
ｆ．約１．５ｇ／Ｌ−約３．５ｇ／Ｌ
ｇ．約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌ
ｈ．約１．５ｇ／Ｌ−約２．５ｇ／Ｌ
ｉ．約１．７５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｊ．約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｋ．１．７５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．２５、３．５ｇ／Ｌ、３．７５ｇ／Ｌもしくは４．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｌ．２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌもしくは３．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．約２．５ｇ／Ｌ
ｎ．約３．１ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にある植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含む他の成分をさらに含んでいてよい。
【０１３４】
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：
（ｉ）
ａ．約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｂ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ
ｃ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｄ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ
ｅ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｆ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約８０．０ｍｇ／Ｌ
ｇ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約６０．０ｍｇ／Ｌ
ｈ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｉ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｊ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｋ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ
ｌ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約４０．０ｍｇ／Ｌ
ｍ．約１５．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ
ｎ．約５．０ｍｇ／Ｌ−約１５．０ｍｇ／Ｌ
ｏ．約６．０ｍｇ／Ｌ−約１２．０ｍｇ／Ｌ
ｐ．約７．０ｍｇ／Ｌ−約１１．０ｍｇ／Ｌ
ｑ．約８．０ｍｇ／Ｌ−約１０．０ｍｇ／Ｌ
ｒ．５．０ｍｇ／Ｌ、６．０ｍｇ／Ｌ、７．０ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１１．０ｍｇ／Ｌ、１２．０ｍｇ／Ｌ、１３．０ｍｇ／Ｌ、１４．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、１６．０ｍｇ／Ｌ、１７．０ｍｇ／Ｌ、１８．０ｍｇ／Ｌ、１９．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ、２１．０ｍｇ／Ｌ、２２．０ｍｇ／Ｌ、２３．０ｍｇ／Ｌ、２４．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、２６．０ｍｇ／Ｌ、２７．０ｍｇ／Ｌ、２８．０ｍｇ／Ｌ、２９．０ｍｇ／Ｌもしくは３０．０ｍｇ／Ｌもしくは３１．０ｍｇ／Ｌ又は３２ｍｇ／Ｌもしくは３３ｍｇ／Ｌもしくは３４ｍｇ／Ｌもしくは３５ｍｇ／Ｌもしくは３６ｍｇ／Ｌもしくは３７ｍｇ／Ｌもしくは３８ｍｇ／Ｌもしくは３９ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｓ．７ｍｇ／Ｌ、８．０ｍｇ／Ｌ、９．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌもしくは１１．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｔ．約２５ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にあるインスリン
（ｉｉ）
ａ．約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｂ．約０．８ｍＭ−約２．５ｍＭ
ｃ．約０．８ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｄ．約０．８ｍＭ−約１．７５ｍＭ
ｅ．約０．８ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｆ．約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｇ．約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｈ．約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭ
ｉ．０．８ｍＭもしくは０．９ｍＭもしくは１．０ｍＭもしくは１．１ｍＭもしくは１．２ｍＭもしくは１．３ｍＭもしくは１．４ｍＭもしくは１．５ｍＭのうちのおよそ何れか１つ
ｊ．１．１ｍＭ、１．３ｍＭもしくは１．５ｍＭのうちのおよそ何れか１つのうちの何れか１つの濃度を提供する量にあるシスチン
（ｉｉｉ）
ａ．約６９．０ｎＭ−約１，０００ｎＭ
ｂ．約６９．０ｎＭ−約４００．０ｎＭ
ｃ．約８０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｄ．約１００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｅ．約１２５ｎＭ−約４００ｎＭ
ｆ．約１５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｇ．約２００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｈ．約２５０ｎＭ−約４００ｎＭ
ｉ．約３００ｎＭ−約４００ｎＭ
ｊ．約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ
ｋ．約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ
ｌ．１００ｎＭ、１２５ｎＭ、１５０ｎＭ、１７５ｎＭ、２００ｎＭ、２２５ｎＭ、２５０ｎＭ、２７５ｎＭ、３００ｎＭ、３２５ｎＭ、３５０ｎＭ、３７５ｎＭもしくは４００ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つ
ｎ．約３３５ｎＭ、３３６ｎＭ、３３７ｎＭ、３３８ｎＭ、３３９ｎＭもしくは４００ｎＭ
ｏ．約３３９ｎＭの何れか１つの濃度にある銅のうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地もまた提供される。
【０１３５】
細胞培養培地は、
１）例えば、
ａ．約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約５．６ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌ
ｃ．約７．０ｇ／Ｌ−約２５．０ｇ／Ｌ
ｄ．約７．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｅ．約７．０ｇ／Ｌ−約１５．０ｇ／Ｌ
ｆ．約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌ
ｇ．約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｈ．約７．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｉ．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌもしくは２５ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｊ．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌもしくは１２ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｋ．約１０ｇ／Ｌ
ｌ．約１３ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にある動物由来加水分解物
２）例えば下記：
ａ．約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約１．４ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｃ．約１．４ｇ／Ｌ−約６．２ｇ／Ｌ
ｄ．約１．５ｇ／Ｌ−約５．５ｇ／Ｌ
ｅ．約１．５ｇ／Ｌ−約４．５ｇ／Ｌ
ｆ．約１．５ｇ／Ｌ−約３．５ｇ／Ｌ
ｇ．約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌ
ｈ．約１．５ｇ／Ｌ−約２．５ｇ／Ｌ
ｉ．約１．７５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｊ．約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｋ．１．７５ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ、３．２５、３．５ｇ／Ｌ、３．７５ｇ／Ｌもしくは４．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｌ．２．０ｇ／Ｌ、２．２５ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌもしくは３．０ｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つ
ｍ．約２．５ｇ／Ｌ
ｎ．約３．１ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度を提供する量にある植物由来加水分解物のうちの何れか１つ以上を含む他の成分をさらに含んでいてよい。
【０１３６】
細胞培養培地には、追加の細胞培養培地成分がさらに補給されてよいが、このとき追加の細胞培養培地成分は、例えばインスリン及び／又はシステイン、例えば本実施態様に列挙した濃度（１５ｍｇ／Ｌ等）を含む本明細書に提供したインスリンの何れかの濃度を提供する量にあるインスリン及び／又は本実施態様に列挙した濃度を含む本明細書に提供したシステインの何れかの濃度（例えば０．８ｍＭ）を提供する量にあるシステインを含んでいてよい。
【０１３７】
細胞培養培地には、追加の細胞培養培地成分がさらに補給されてよいが、このとき追加の細胞培養培地成分は、例えばインスリン及び／又はシステイン及び／又はシスチン、例えば本実施態様に列挙した濃度（１５ｍｇ／Ｌ等）を含む本明細書に提供したインスリンの何れかの濃度を提供する量にあるインスリン及び／又は本実施態様に列挙した濃度を含む本明細書に提供したシステインの何れかの濃度（例えば０．８ｍＭ）を提供する量にあるシステイン及び／又は本実施態様に列挙した濃度を含む本明細書に提供シスチンの何れかの濃度（例えば０．２ｍＭ）を提供する量にあるシスチンを含んでいてよい。
【０１３８】
本明細書にさらに提供されるのは、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）本実施態様に提供した細胞培養培地を制限なく含む本明細書に詳述した細胞培養培地を含む組成物である。さらに提供されるのは、（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）本実施態様に提供した細胞培養培地を制限なく含む本明細書に詳述した細胞培養培地を含む組成物である。
【０１３９】
本明細書にさらに提供されるのは、ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地は、約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する方法である。
【０１４０】
一部の実施態様では、制限なく、本方法は、以下の特徴（ｉ）−（ｘｘｉｉｉ）もしくはそのサブ特徴の何れかの組合せ：
（ｉ）初期細胞培養培地は銅及びインスリンを含む
（ｉｉ）初期細胞培養培地は銅及びシスチンを含む
（ｉｉｉ）初期細胞培養培地はインスリン及びシスチンを含む
（ｉｖ）初期細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンを含む
（ｖ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｉｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、インスリンを下記：
ａ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ
ｂ．約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌ
ｃ．１０．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌもしくは２５．０ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｖｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、銅を下記：
ａ．約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ
ｂ．約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ
ｃ．３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭ及び３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｖｉｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、シスチンを下記：
ａ．約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ
ｂ．約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ
ｃ．１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ及び１．６ｍＭのうちのおよそ何れか１つのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｖｉｉｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉｉ）の何れかを含有する培地を含む）は、植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む
（ｉｘ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｖｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、動物由来加水分解物を下記：
ａ．約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌ
ｃ．約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌ
ｄ．約１３ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｘ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｉｘ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、植物由来加水分解物を下記：
ａ．約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌ
ｂ．約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌ
ｃ．約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌ
ｄ．約２．５ｇ／Ｌのうちの何れか１つの濃度で含む
（ｘｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、動物由来加水分解物は植物由来加水分解物より多い量で存在する
（ｘｉｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、インスリンを含み、本方法は、細胞培養サイクル中の細胞培養培地に追加量のインスリンを加える工程をさらに含み、及び任意選択的にａ）追加量のインスリンは細胞培養培地に細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、もしくは少なくとも６回加えられてよい；及び／又はｂ）各時点に加えられるインスリンは、約５．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ又は５．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌ、１５．０ｍｇ／Ｌ、２０．０ｍｇ／Ｌ及び２５．０ｍｇ／Ｌのうちの何れか１つである；及び／又はｃ）細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量は、下記の：約２０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ、又は２０．０ｍｇ／Ｌ、２５．０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ及び８５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つである
（ｘｉｉｉ）初期細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）は、シスチンを含み、本方法は、細胞培養サイクル中の細胞培養培地に追加量のシスチンを加える工程をさらに含み、及び任意選択的に、ａ）シスチンは、細胞培養培地中の約０．１ｍＭ−約１．５ｍＭのシスチン又は細胞培養培地中の約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭ（例えば、約０．４ｍＭ−約０．６ｍＭ、約０．４ｍＭ−約０．５ｍＭ）の追加のシスチンを提供する量で加えられる；及び／又はｂ）シスチンは細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる
（ｘｉｖ）本方法はさらに：細胞培養サイクル中の少なくとも１バッチフィード、又は細胞培養サイクル中の２、３もしくは４バッチフィードのうちの何れか１つを加える工程をさらに含む；及び任意選択的にバッチフィード培地は植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方を含む
（ｘｖ）細胞培養サイクル中に、培地（特徴（ｉ）−（ｘｉｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）の温度は、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる
（ｘｖｉ）細胞培養サイクル中に、培地（特徴（ｉ）−（ｘｖ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）の温度は、ａ）細胞培養サイクル中に少なくとも１回もしくは少なくとも２回低下させられる；及び／又はｂ）温度は培養の開始時後の第８日及び第１０日に低下させられる
（ｘｖｉｉ）細胞は、（例えば特徴（ｉ）−（ｘｖｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む何れかの細胞培養培地中で）約３１℃−約３５℃の範囲内の温度で培養される
（ｘｖｉｉｉ）細胞は、（例えば特徴（ｉ）−（ｘｖｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む何れかの細胞培養培地中で）、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、及び第３期間は約３１℃の第３温度で培養される。
（ｘｉｘ）細胞は、約７．０−約７．３のｐＨを有する培地中（例えば特徴（ｉ）−（ｘｖｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む何れかの細胞培養培地中）で培養される。
（ｘｘ）本方法は、（ａ）約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの銅及び約１．３ｍＭのシスチンを含む初期細胞培養培地中で細胞を培養する工程；（ｂ）培養する工程の開始後の第３日に約１５ｍｇ／Ｌの濃度の追加のインスリンを提供するために細胞培養培地に第１バッチフィード及びインスリンフィードを提供する工程；及び（ｃ）培養する工程の開始後の第６日に約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭの濃度の追加のシスチンを提供するために細胞培養培地にシスチンを含む第２バッチフィードを提供する工程を含み、このとき細胞は約３５℃の初期温度で培養され、温度は第８日に約３３℃へ低下させられ、培養する工程の開始後の第１０日に約３１℃へさらに低下させられる
（ｘｘｉ）ベバシズマブもしくはその断片は、 細胞培養培地（特徴（ｉ）−（ｘｘ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）中へ分泌される
（ｘｘｉｉ）本方法は、 細胞培養（特徴（ｉ）−（ｘｘｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部を含有する培地を含む）からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む
（ｘｘｉｉｉ）哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、の何れか1つ以上を含んでいてよい。
【０１４１】
さらに本明細書で提供されるのは、本明細書に提供した任意の方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片であり、その方法は、特徴（ｉ）−（ｘｘｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部又はそれらのサブ特徴もしくは上記の何れかの組合せをさらに含んでいてよい。
【０１４２】
さらに提供されるのは、（ｉ）本明細書に提供した任意の方法によって生成されたベバシズマブもしくはその断片であり、その方法は、特徴（ｉ）−（ｘｘｉｉｉ）のうちの何れか１つ以上もしくは全部又はそれらのサブ特徴もしくは上記の何れかの組合せをさらに含んでいてよいベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１４３】
下記の実施例は、本発明を限定するためではなく例示するために提供する。
【実施例】
【０１４４】
実施例１：  細胞培養培地成分が哺乳動物細胞系によって生成されるベバシズマブの量に及ぼす影響
ベバシズマブを産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、様々な量のインスリンを含有する細胞培養培地中で培養し、インスリンが産生したベバシズマブの量に及ぼす影響を評価した。ベバシズマブの産生は、細胞培養中に３３９ｎＭの銅、１％の動物性加水分解物及び０．２５％の植物性加水分解物を含有する基底培地中に細胞を接種する工程によって開始し、バッチフィード培地はバイオリアクター内で１４日間細胞培養サイクルの間の第３日に加えた。コントロール細胞培養の基底細胞培養培地には、１０ｍｇ／Ｌ未満のインスリンを補給したが、細胞培養サイクル中には追加のインスリンを補給しなかった。２つの代表的な実験ケース（ケース１及びケース２）では、基底細胞培養培地中のインスリンレベルは１０ｍｇ／Ｌであった。追加のインスリンは、１４日間細胞培養サイクル中の終了時に各々２５ｍｇ／Ｌ及び４０ｍｇ／Ｌの最終量を用いる細胞培養ケース１及び細胞培養ケース２を提供できるように細胞培養サイクル中に３−６回加えた（表Ａ）。細胞は第１日に３７℃で培養し、温度はその後第１日に３５℃へ、第８日に３３℃へ、及び第１０日に３１℃へ下方シフトさせた。力価の改善は、コントロールに比較した増加率によって定量した。細胞培養サイクル中のインスリンの１０ｍｇ／Ｌ未満から２５ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌの全添加は、コントロールと比較して各々約１６％もしくは約１８％の力価改善をもたらした（表Ａ）。
【０１４５】
2019193643.tif 000007
【０１４６】
ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞を、様々な起源由来の様々な量の加水分解物を含有する細胞培養培地中で培養し、特定加水分解物が産生したベバシズマブの量に及ぼす影響を評価した。２つの代表的な手順では、ベバシズマブの産生は細胞培養中で、３３９ｎＭの銅を含有する基底細胞培養培地中で細胞を接種する工程によって開始し、バッチフィード培地はバイオリアクター内で１４日間細胞培養サイクルの間の第３日に加えた。手順１のための基底細胞培養培地は植物由来加水分解物を含まず１％の動物由来加水分解物を有したが、手順２は、０．２５％の植物由来加水分解物と組み合わせて０．７５％の動物由来加水分解物が補給された基底細胞培養培地を有した（表Ｂ）。２つの手順によって生成された抗体力価の分析は、手順２は、手順１を使用して培養された細胞によって生成されるベバシズマブの量に比較して細胞から生成されるベバシズマブの量における２７％増加を提供することを証明した（表Ｂ）。
【０１４７】
2019193643.tif 000008
【０１４８】
実施例２：  細胞培養培地成分が哺乳動物細胞系によって生成されるベバシズマブの量に及ぼす影響
ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞は、モノマー形（Ｃｙｓ、システイン）もしくはダイマー形（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ、シスチン）内のどちらかのアミノ酸システインを含む基底培地中で培養した（表Ｃ）。ベバシズマブの産生は、細胞培養中に３３９ｎＭの銅、１％の動物性加水分解物及び０．２５％の植物性加水分解物を含有する基底培地中に細胞を接種する工程によって開始し、バッチフィードはバイオリアクター内で１４日間細胞培養サイクルの間の第３日に加えた。基底培地中のインスリンレベルは、１０ｍｇ／Ｌ未満もしくは１０ｍｇ／Ｌのどちらかの濃度であった。実験細胞培養の２つ（システイン＋インスリン及びシスチン＋インスリン）は、２５ｍｇ／Ｌもしくは４０ｍｇ／Ｌの最終量を提供できるように細胞培養サイクル中に３回もしくは６回加えられた追加のインスリンを有した（表Ｃ）。細胞は第１日に３７℃で培養し、温度はその後第１日に３５℃へ、第８日に３３℃へ、及び第１０日に３１℃へ下方シフトさせた。力価の改善は、コントロールに比較した増加率によって定量した。システイン（Ｃｙｓ）のシスチン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）による置換は、コントロールに比較して力価を１１％改善した。インスリン添加の影響は、シスチン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を使用して作製された基底培地中でもまた観察された。
【０１４９】
2019193643.tif 000009
【０１５０】
実施例３：  インスリン添加が哺乳動物細胞系によって生成されるベバシズマブの量に及ぼす影響
ベバシズマブを産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、様々な量のインスリンを含有する細胞培養培地中で培養し、インスリン添加が産生したベバシズマブの量に及ぼす影響を評価した。ベバシズマブの産生は、基底培地中に細胞を接種する工程によって細胞培養中で開始された。接種後、培地（即ち、初期細胞培養培地）は３００ｎＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、１％の動物性加水分解物及び０．２５％の植物性加水分解物及び１．３ｍＭのシスチンを含有していた。培地はさらに、接種後に１０ｍｇ／Ｌもしくは２０ｍｇ／Ｌのインスリンも含有していた（表Ｄ）。バイオリアクター内の１４日間細胞培養サイクルの間に、１バッチフィード培地は第３日に加え、又は２バッチフィード培地は第３日に（１バッチフィードは第３日及び第２バッチフィードは第６日に）加えた。一部の細胞培養は、１４日間細胞培養サイクル中の終了時に細胞培養に２５ｍｇ／Ｌ−８５ｍｇ／Ｌの累積量を提供できるように細胞培養サイクル中に追加のインスリンを１−６回添加された（表Ｄ）。細胞は第１日に３７℃で培養し、温度はその後第１日に３５℃へ、第８日に３３℃へ、及び第１０日に３１℃へ下方シフトさせた。力価の改善を２件の代表的実験における様々な培養にわたって比較し、２５ｍｇ／ｍＬの累積量のインスリンについては第３日にインスリンが添加された初期細胞培養培地中の１０ｍｇ／ｍＬのインスリンが最高力価収率を生成すると決定された（図１Ａ（１バッチフィード）及び１Ｂ（２バッチフィード））。追加のインスリン補給を行わなかった初期細胞培養培地中に２０ｍｇ／Ｌのインスリンを含有する細胞培養は、初期細胞培養培地中の１０ｍｇ／Ｌのインスリン及び細胞培養サイクル中に加えられた追加のインスリンを有した培養と匹敵する力価収率を証明したが、これは初期細胞培養培地中のインスリンが力価収率を増加させるための重要な因子であることを指摘していた（表Ｄ、図１Ａ及び１Ｂ)。
【０１５１】
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【０１５２】
実施例４：  追加のバッチ培地フィードが哺乳動物細胞系によって生成されるベバシズマブの量に及ぼす影響
ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞の４種のサンプルを細胞培養培地中で培養し、生成されるベバシズマブの量に及ぼす影響を決定するために１もしくは２バッチ培地フィードを供給した。ベバシズマブの産生は、基底培地中に細胞を接種する工程によって細胞培養中で開始された。接種後、培地（即ち、初期細胞培養培地）は３００ｎＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、１％の動物性加水分解物及び０．２５％の植物性加水分解物及び１．３ｍＭのシスチンを含有していた。１つの手順では、バッチフィード培地はバイオリアクター内の１４日間細胞培養サイクルの間の第３日に加えた。第２手順では、バッチフィード培地はバイオリアクター内の１４日間細胞培養サイクルの間の第３日及び第６日に加えた（表Ｅ）。第３日に送達されたバッチフィード培地は、２．５％の動物性加水分解物及び０．６２５％の植物性加水分解物を含有し、１２５ｍＬ／Ｌの用量で細胞培養内に加えた。第６日に送達されたバッチフィード培地は、７．５ｍＭのシステイン及び７．５ｍＭのシスチンを含有し、９０ｍＬ／Ｌの用量で細胞培養内に加えた。したがって、細胞培養はフィード後にシスチン濃度における０．６２ｍＭの上昇を有した。細胞は第１日に３７℃で培養し、温度はその後第１日に３５℃へ、第８日に３３℃へ、及び第１０日に３１℃へ下方シフトさせた。力価改善は、平均力価を示す１フィードだけを添加された培養を有する第２フィードを第６日に添加された細胞培養内で観察され、２フィード工程は０．３ｇ／Ｌへの力価上昇をもたらした（約２０％の力価上昇）。第１４日のバイオマス蓄積（図２Ａ）及び力価（図２Ｂ）は、第６日の第２フィードが収率を改善すること、及びこの第２フィードはより高度の増殖及び変動性におけるより早期の低下が観察されるより高い細胞齢を有する培養についてはより有意であったことを指摘した。
【０１５３】
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【０１５４】
上記に記載した結果の分析は、ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞を培養するための新規な工程の開発を提供した。新規な工程は、１０ｍｇ／Ｌのインスリン並びにシステインの代わりにシスチンを含有する初期細胞培養培地、細胞培養サイクル中の第３日及び第６日のバッチフィード並びに細胞培養の第３日のインスリンの添加の使用を組み入れた（表Ｆ、手順２）。細胞培養工程へのこれらの成分の添加は、約６０％までの力価増加を生じさせた。例えば、図３及び表Ｆ、手順１に比較した手順２を参照されたい。
【０１５５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月17日(2019.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
上記に記載した結果の分析は、ベバシズマブを産生するＣＨＯ細胞を培養するための新規な工程の開発を提供した。新規な工程は、１０ｍｇ／Ｌのインスリン並びにシステインの代わりにシスチンを含有する初期細胞培養培地、細胞培養サイクル中の第３日及び第６日のバッチフィード並びに細胞培養の第３日のインスリンの添加の使用を組み入れた（表Ｆ、手順２）。細胞培養工程へのこれらの成分の添加は、約６０％までの力価増加を生じさせた。例えば、図３及び表Ｆ、手順１に比較した手順２を参照されたい。
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］ 
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、前記細胞培養培地は銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくはその断片を生成する方法。 
［実施態様２］ 
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様３］ 
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様４］ 
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様５］ 
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、実施態様１に記載の方法。 
［実施態様６］ 
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、実施態様１から５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７］ 
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１１］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１２］ 
細胞培養培地が約２５ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１から６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３］ 
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６］ 
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７］ 
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１から１２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８］ 
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１から１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９］ 
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１から１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０］ 
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１から１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１］ 
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１から１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２］ 
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１から２１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３］ 
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１から２１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４］ 
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１から２１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５］ 
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１から２１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６］ 
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２７］ 
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２８］ 
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２９］ 
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３０］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様１から２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３１］ 
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１から３０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３２］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回前記細胞培養培地に加えられる、実施態様３１に記載の方法。 
［実施態様３３］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回前記細胞培養培地に加えられる、実施態様３１に記載の方法。 
［実施態様３４］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回前記細胞培養培地に加えられる、実施態様３１に記載の方法。 
［実施態様３５］ 
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３６］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３７］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３８］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様３９］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４０］ 
追加量のインスリンが、約１５ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様３１から３４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４１］ 
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１から４０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４２］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４３］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様４１に記載の方法。 
［実施態様４４］ 
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１から４３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４５］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様４４に記載の方法。 
［実施態様４６］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様４４に記載の方法。 
［実施態様４７］ 
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様１から４６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様４８］ 
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様４７に記載の方法。 
［実施態様４９］ 
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、実施態様１から４６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様５０］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、実施態様１から４９の何れか一に記載の方法 
［実施態様５１］ 
細胞培養からベバシズマブもしくはその断片を回収する工程をさらに含む、実施態様１から５０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様５２］ 
実施態様１から実施態様５１の何れか一に記載の方法によって生成される、ベバシズマブもしくはその断片。 
［実施態様５３］ 
（ｉ）実施態様１から実施態様５１の何れか一に記載の方法によって生成されるベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む組成物。 
［実施態様５４］ 
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞を、銅、インスリン及びシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法。 
［実施態様５５］ 
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、実施態様５４に記載の方法。 
［実施態様５６］ 
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、実施態様５４に記載の方法。 
［実施態様５７］ 
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、実施態様５４に記載の方法。 
［実施態様５８］ 
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、実施態様５４に記載の方法。 
［実施態様５９］ 
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、実施態様５４から実施態様５８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６０］ 
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６１］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６２］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６３］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６４］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６５］ 
細胞培養培地が約２５ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様５４から５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６６］ 
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様５４から６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６７］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様５４から６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６８］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様５４から６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様６９］ 
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、実施態様５４から６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７０］ 
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様５４から６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７１］ 
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様５４から７０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７２］ 
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様５４から７０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７３］ 
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様５４から７０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７４］ 
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様５４から７０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７５］ 
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７６］ 
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７７］ 
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７８］ 
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様７９］ 
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８０］ 
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８１］ 
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８２］ 
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様５４から７８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８３］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様５４から８２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８４］ 
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様５４から８３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８５］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、実施態様８４に記載の方法。 
［実施態様８６］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、実施態様８４に記載の方法。 
［実施態様８７］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、実施態様８４に記載の方法。 
［実施態様８８］ 
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様８９］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９０］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９１］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９２］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９３］ 
追加量のインスリンが、約１５ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様８４から８７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９４］ 
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様５４から９３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９５］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様９４に記載の方法。 
［実施態様９６］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様９４に記載の方法。 
［実施態様９７］ 
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様５４から９６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様９８］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様９７に記載の方法。 
［実施態様９９］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様９７に記載の方法。 
［実施態様１００］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様５４から９９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０１］ 
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様５４から１００の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０２］ 
細胞が、約２８℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様１０１に記載の方法。 
［実施態様１０３］ 
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、実施態様５４から１００の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０４］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、実施態様５４から１０３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０５］ 
哺乳動物細胞が、細胞の増殖期中に細胞培養培地と接触させられる、実施態様５４から１０４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０６］ 
哺乳動物細胞が、細胞の産生期中に細胞培養培地と接触させられる、実施態様５４から１０５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１０７］ 
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地を補給するためのキットであって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）前記細胞培養培地中の約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリンを提供する量にあるインスリン；（ｉｉ）前記細胞培養培地中の約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを提供する量にあるシスチン；（ｉｉｉ）及び前記細胞培養培地中の約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅を提供する量にある銅のうちの少なくとも２つを含む、キット。 
［実施態様１０８］ 
キットが、植物由来加水分解物をさらに含む、実施態様１０７に記載のキット。 
［実施態様１０９］ 
キットは、細胞培養培地中の約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物を提供する量にある植物由来加水分解物を含む、実施態様１０８に記載のキット。 
［実施態様１１０］ 
キットが、動物由来加水分解物をさらに含む、実施態様１０７−１０９の何れか一に記載のキット。 
［実施態様１１１］ 
キットが、細胞培養培地中の約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物を提供する量にある動物由来加水分解物を含む、実施態様１１０に記載のキット。 
［実施態様１１２］ 
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する際に使用するための細胞培養培地であって、成分（ｉ）−（ｉｉｉ）：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンのうちの少なくとも２つを含む、細胞培養培地。 
［実施態様１１３］ 
細胞培養培地が：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；及び（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅を含む、実施態様１１２に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１４］ 
細胞培養培地が：（ｉ）約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌのインスリン；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを含む、実施態様１１２に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１５］ 
細胞培養培地が：（ｉｉ）約６９．０ｎＭ−約１，０００．０ｎＭの銅；及び（ｉｉｉ）約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭのシスチンを含む、実施態様１１２に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１６］ 
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの植物由来加水分解物をさらに含む、実施態様１１２から１１５の何れか一に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１７］ 
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの動物由来加水分解物をさらに含む、実施態様１１２から１１６の何れか一に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１８］ 
細胞培養培地が： 
約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ； 
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌ； 
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌ； 
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌ； 
約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌ；及び 
約１０．０ｍｇ／Ｌから成る群から選択される濃度にあるインスリンを含む、実施態様１１２から１１７の何れか一に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１１９］ 
細胞培養培地が： 
約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭ； 
約３００ｎＭ−約４００ｎＭ； 
約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭ； 
約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭ； 
３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つ；及び 
約３３９ｎＭから成る群から選択される濃度にある銅を含む、実施態様１１２から１１８の何れか一に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１２０］ 
細胞培養培地が： 
約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭ； 
約１．０ｍＭ−約２．０ｍＭ； 
約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭ； 
約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭ；及び 
約１．３ｍＭから成る群から選択される濃度にあるシスチンを含む、実施態様１１２から１１９の何れか一に記載の細胞培養培地。 
［実施態様１２１］ 
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞；及び（ｂ）実施態様１１２から１２０の何れか一に記載の細胞培養培地を含む、組成物。 
［実施態様１２２］ 
（ａ）ベバシズマブもしくはその断片；及び（ｂ）実施態様１１２から１２０の何れか一に記載の細胞培養培地を含む、組成物。 
［実施態様１２３］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞によって培地中に分泌される、実施態様１２２に記載の組成物。 
［実施態様１２４］ 
ベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量を強化する方法であって、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養する工程を含み、インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞を培養することに比較して前記哺乳動物細胞から生成されるベバシズマブもしくはその断片の量が強化される方法。 
［実施態様１２５］ 
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、実施態様１２４に記載の方法。 
［実施態様１２６］ 
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、実施態様１２４に記載の方法。 
［実施態様１２７］ 
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、実施態様１２４に記載の方法。 
［実施態様１２８］ 
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、実施態様１２４に記載の方法。 
［実施態様１２９］ 
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、実施態様１２４から１２８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３０］ 
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３１］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３２］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３３］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３４］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３５］ 
細胞培養培地が約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１２４から１２９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３６］ 
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１２４から１３５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３７］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１２４から１３５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３８］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１２４から１３５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１３９］ 
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、実施態様１２４から１３５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４０］ 
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１２４から１３５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４１］ 
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１２４から１４０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４２］ 
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１２４から１４０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４３］ 
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１２４から１４０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４４］ 
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１２４から１４０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４５］ 
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４６］ 
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４７］ 
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４８］ 
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１４９］ 
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５０］ 
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５１］ 
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５２］ 
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１２４から１４８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５３］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様１２４から１５２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５４］ 
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１２４から１５３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５５］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、実施態様１５４に記載の方法。 
［実施態様１５６］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、実施態様１５４に記載の方法。 
［実施態様１５７］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、実施態様１５４に記載の方法。 
［実施態様１５８］ 
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１５９］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６０］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６１］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６２］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６３］ 
追加量のインスリンが、約１５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様１５４から１５７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６４］ 
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１２４から１６３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６５］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様１６４に記載の方法。 
［実施態様１６６］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様１６４に記載の方法。 
［実施態様１６７］ 
方法が、シスチンを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１２４から１６６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１６８］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様１６７に記載の方法。 
［実施態様１６９］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様１６７に記載の方法。 
［実施態様１７０］ 
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様１２４から１６９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７１］ 
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様１７０に記載の方法。 
［実施態様１７２］ 
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、実施態様１２４から１６９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７３］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、実施態様１２４から１７２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７４］ 
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、実施態様１２４から１７３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１７５］ 
インスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含む細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する方法であって、哺乳動物細胞から生成されたベバシズマブもしくはその断片の量がインスリン、銅及びシスチンのうちの少なくとも２つを含まない細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する方法に比較して強化される方法。 
［実施態様１７６］ 
細胞培養培地が銅及びインスリンを含む、実施態様１７５に記載の方法。 
［実施態様１７７］ 
細胞培養培地が銅及びシスチンを含む、実施態様１７５に記載の方法。 
［実施態様１７８］ 
細胞培養培地がインスリン及びシスチンを含む、実施態様１７５に記載の方法。 
［実施態様１７９］ 
細胞培養培地が銅、インスリン及びシスチンを含む、実施態様１７５に記載の方法。 
［実施態様１８０］ 
細胞培養培地が植物由来加水分解物、動物由来加水分解物又は植物由来加水分解物及び動物由来加水分解物の両方をさらに含む、実施態様１７５から１７９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８１］ 
細胞培養培地が約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８２］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８３］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８４］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８５］ 
細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８６］ 
細胞培養培地が約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様１７５から１８０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８７］ 
細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１７５から１８６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８８］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１７５から１８６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１８９］ 
細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１７５から１８６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９０］ 
細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭもしくは３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、実施態様１７５から１８６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９１］ 
細胞培養培地が約３３９ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様１７５から１８６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９２］ 
細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１７５から１９１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９３］ 
細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１７５から１９１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９４］ 
細胞培養培地が約１．２ｍＭ−約１．４ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１７５から１９１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９５］ 
細胞培養培地が約１．３ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様１７５から１９１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９６］ 
細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９７］ 
細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９８］ 
細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様１９９］ 
細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２００］ 
細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０１］ 
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０２］ 
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０３］ 
細胞培養培地が約３．１ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様１７５から１９９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０４］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様１７５から２０３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０５］ 
細胞培養培地がインスリンを含み、方法は追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１７５から２０４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２０６］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に１回細胞培養培地に加えられる、実施態様２０５に記載の方法。 
［実施態様２０７］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも３回細胞培養培地に加えられる、実施態様２０５に記載の方法。 
［実施態様２０８］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、実施態様２０５に記載の方法。 
［実施態様２０９］ 
追加量のインスリンが、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１０］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１１］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１２］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約３５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１３］ 
追加量のインスリンが、約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１４］ 
追加量のインスリンが、約１５．０ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養培地中のインスリンを提供する量で加えられる、実施態様２０５から２０８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１５］ 
方法が、システインを細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１７５から２１４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１６］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．５−約２．０ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様２１５に記載の方法。 
［実施態様２１７］ 
システインが、細胞培養培地中に約０．８ｍＭのシステインを提供する量で加えられる、実施態様２１５に記載の方法。 
［実施態様２１８］ 
方法が、シスチンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様１７５から２１７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２１９］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様２１８に記載の方法。 
［実施態様２２０］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．２ｍＭのシスチンを提供する量で加えられる、実施態様２１８に記載の方法。 
［実施態様２２１］ 
細胞が、約２８℃−約３７℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様１７５から２２０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２２］ 
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様２２１に記載の方法。 
［実施態様２２３］ 
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、実施態様１７５から２２０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２４］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、実施態様１７５から２２３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２５］ 
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、実施態様１７５から２２３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２６］ 
ベバシズマブもしくはその断片を生成する方法であって、細胞培養培地中でベバシズマブもしくはその断片をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程を含み、細胞培養サイクル中の初期細胞培養培地が約６９ｎＭ−約１，０００ｎＭの濃度の銅、約１．０ｍｇ／Ｌ−約１００．０ｍｇ／Ｌの濃度のインスリン及び約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度のシスチンから成る群から選択される２つ以上の成分を含み、且つ前記細胞がベバシズマブもしくは断片を生成する、方法。 
［実施態様２２７］ 
初期細胞培養培地が（１）銅及びインスリン；（２）銅及びシスチン；（３）インスリン及びシスチン；又は（４）銅、インスリン及びシスチンを含む、実施態様２２６に記載の方法。 
［実施態様２２８］ 
初期細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約５０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様２２６から２２７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２２９］ 
初期細胞培養培地が約１０．０ｍｇ／Ｌ−約２０．０ｍｇ／Ｌの濃度でインスリンを含む、実施態様２２８に記載の方法。 
［実施態様２３０］ 
初期細胞培養培地が１０．０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つの濃度でインスリンを含む、実施態様２２８に記載の方法。 
［実施態様２３１］ 
初期細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３７５ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様２２６から２３０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３２］ 
初期細胞培養培地が約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの濃度で銅を含む、実施態様２２６から２３０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３３］ 
初期細胞培養培地が３３０ｎＭ、３３５ｎＭ、３３９ｎＭ、３４０ｎＭ、３４５ｎＭ及び３５０ｎＭのうちのおよそ何れか１つの濃度で銅を含む、実施態様２２６から２３０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３４］ 
初期細胞培養培地が約０．７ｍＭ−約２．０ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様２２６から２３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３５］ 
初期細胞培養培地が約１．０ｍＭ−約１．６ｍＭの濃度でシスチンを含む、実施態様２２６から２３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３６］ 
初期細胞培養培地が１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ及び１．６ｍＭのうちのおよそ何れか１つの濃度でシスチンを含む、実施態様２２６から２３３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３７］ 
初期細胞培養培地が動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２３６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３８］ 
初期細胞培養培地が約６．０ｇ／Ｌ−約２０．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２３６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２３９］ 
初期細胞培養培地が約８．０ｇ／Ｌ−約１２．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２３６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４０］ 
初期細胞培養培地が約９．０ｇ／Ｌ−約１１．０ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２３６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４１］ 
初期細胞培養培地が約１３ｇ／Ｌの濃度で動物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２３６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４２］ 
初期細胞培養培地が約１．０ｇ／Ｌ−約１０．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２４１の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４３］ 
細胞培養培地が約２．０ｇ／Ｌ−約３．０ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２４２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４４］ 
細胞培養培地が約２．２５ｇ／Ｌ−約２．７５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２４３の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４５］ 
初期細胞培養培地が約２．５ｇ／Ｌの濃度で植物由来加水分解物を含む、実施態様２２６から２４４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４６］ 
細胞培養培地が動物由来加水分解物及び植物由来加水分解物の両方を含み、且つ前記動物由来加水分解物は前記植物由来加水分解物より多い量で存在する、実施態様２２６から２４５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４７］ 
初期細胞培養培地がインスリンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のインスリンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様２２６から２４６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２４８］ 
追加量のインスリンが、細胞培養サイクル中に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回又は少なくとも６回細胞培養培地に加えられる、実施態様２４７に記載の方法。 
［実施態様２４９］ 
各時点に加えられるインスリンが、約５ｍｇ／Ｌ−約２５ｍｇ／Ｌである、実施態様２４８に記載の方法。 
［実施態様２５０］ 
各時点に加えられるインスリンが、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ及び２５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つである、実施態様２４８に記載の方法。 
［実施態様２５１］ 
細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量が、約２０ｍｇ／Ｌ−約１００ｍｇ／Ｌである、実施態様２４８から２５０の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５２］ 
細胞培養サイクル中に加えられるインスリンの累積量が、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ及び８５ｍｇ／Ｌのうちのおよそ何れか１つである、実施態様２５１に記載の方法。 
［実施態様２５３］ 
初期細胞培養培地がシスチンを含み、方法は細胞培養サイクル中に追加量のシスチンを前記細胞培養培地に加える工程をさらに含む、実施態様２２６から２５２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５４］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．１−約１．５ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる、実施態様２５３に記載の方法。 
［実施態様２５５］ 
シスチンが、細胞培養培地中に約０．４−約０．７ｍＭの追加のシスチンを提供する量で加えられる、実施態様２５４に記載の方法。 
［実施態様２５６］ 
シスチンが細胞培養サイクル中にバッチフィードで加えられる、実施態様２５３から２５５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５７］ 
方法が、細胞培養サイクル中に少なくとも１バッチフィードをさらに含む、実施態様２２６から２５６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２５８］ 
方法が、細胞培養サイクル中に２、３もしくは４バッチフィードを含む、実施態様２５７に記載の方法。 
［実施態様２５９］ 
バッチフィード培地はが、動物由来加水分解物及び／又は植物由来加水分解物を含む、実施態様２５７又は２５９に記載の方法。 
［実施態様２６０］ 
細胞培養サイクル中に、培地の温度が、培養の開始時の温度に比較して、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃もしくは少なくとも約５℃低下させられる、実施態様２２６から２５９の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６１］ 
培地の温度が、細胞培養サイクル中に少なくとも１回又は少なくとも２回低下させられる、実施態様２６０に記載の方法。 
［実施態様２６２］ 
温度が、培養する工程の開始後の第８日及び第１０日に低下させられる、実施態様２６１に記載の方法。 
［実施態様２６３］ 
細胞が、約３１℃−約３５℃の範囲にわたる温度で培養される、実施態様２２６から２６２の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６４］ 
細胞が、第１期間は約３５℃の第１温度で培養され、第２期間は約３３℃の第２温度で培養され、第３期間は約３１℃の第３温度で培養される、実施態様２６３に記載の方法。 
［実施態様２６５］ 
細胞が、約７．０−約７．３のｐＨを有する培地中で培養される、実施態様２２６から２６４の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６６］ 
方法が、（ａ）約１０ｍｇ／Ｌのインスリン、約３２５ｎＭ−約３５０ｎＭの銅及び約１．３ｍＭのシスチンを含む初期細胞培養培地中で細胞を培養する工程；（ｂ）培養する工程の開始後の第３日に約１５ｍｇ／Ｌの濃度の追加のインスリンを提供するために細胞培養培地に第１バッチフィード及びインスリンフィードを提供する工程；及び（ｃ）培養する工程の開始後の第６日に約０．４ｍＭ−約０．７ｍＭの濃度の追加のシスチンを提供するために細胞培養培地にシスチンを含む第２バッチフィードを提供する工程を含み、このとき細胞は約３５℃の初期温度で培養され、温度は第８日に約３３℃へ低下させられ、培養する工程の開始後の第１０日に約３１℃へさらに低下させられる、実施態様２２６から２６５の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６７］ 
ベバシズマブもしくはその断片が、細胞培養培地中に分泌される、実施態様２２６から２６６の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６８］ 
ベバシズマブもしくはその断片を細胞培養物から回収する工程をさらに含む、実施態様２２６から２６７の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２６９］ 
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、実施態様２２６から２６８の何れか一に記載の方法。 
［実施態様２７０］ 
実施態様２２６から２６９の何れか一に記載の方法によって生成される、ベバシズマブもしくはその断片。 
［実施態様２７１］ 
（ｉ）実施態様２２６から２６９の何れか一に記載の方法によって生成されるベバシズマブもしくはその断片及び（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。 
【外国語明細書】
2019193643000001.pdf