(57)【要約】【課題】  急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  急性肺傷害惹起物質によってＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つとして出現するＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制作用を指標にして行うことによる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性肺傷害惹起物質によってＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つとして出現するＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制作用を指標にして行うことによる急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
急性肺傷害治療剤がＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害する薬剤である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害する薬剤を有効成分とする急性肺傷害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性肺傷害（ＡＬＩ：Ａｃｕｔｅ  Ｌｕｎｇ  Ｉｎｊｕｒｙ）は、急性発症の低酸素血症と胸部画像上両側性の肺浸潤影を特徴とする病態である。感染症や外傷など原因は様々であるが、肺内のみならず肺外病変にもしばしば続発する。年発症率は１０万人あたり１．８〜６４人とばらつきがあるが、その重症型である成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ：Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の報告によると、発症後３０日死亡率が２５％前後であり予後不良である。現在、急性肺傷害に対する治療法としてステロイドや好中球エラスターゼ阻害剤などの投与が行われているが（例えば非特許文献１）、明らかな死亡率の改善を示したというエビデンスはないことから、急性肺傷害に対する治療剤の開発が急務となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＡＲＤＳ診療ガイドライン２０１６（一般社団法人日本呼吸器学会ほか発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、急性肺傷害惹起物質として知られているグラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を実験動物に投与すると、Ｍ−ＣＳＦＲ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）陽性の単球サブセットの１つとしてＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞が出現すること、このサブセットの出現に対する抑制作用が急性肺傷害治療剤をスクリーニングするための指標となることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法は、請求項１記載の通り、急性肺傷害惹起物質によってＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つとして出現するＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制作用を指標にして行うことによる。
また、請求項２記載のスクリーニング方法は、請求項１記載のスクリーニング方法において、急性肺傷害治療剤がＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害する薬剤である。
また、本発明の急性肺傷害治療剤は、請求項３記載の通り、ＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害する薬剤を有効成分とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例の（１）におけるＬｙ６ＣとＣＤ１１ｃに対する一次抗体を用いたＦＡＣＳ  ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙの展開図である。末梢血中のＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つであるＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞は、リポ多糖投与の１日後に顕著に出現し、その後は急激に減少することを示している。
【図２】実施例の（２）において、リポ多糖投与の１日後にＢＡＬ中の全細胞数および好中球数が顕著に多いこと、および、可溶性ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｃ遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクターを事前投与することでそれらの数が減少することを示すグラフである（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。
【図３】同、ＳＡＲ１３１６７５を事前投与することでリポ多糖投与の１日後に顕著に多いＢＡＬ中の全細胞数および好中球数が減少することを示すグラフである（ｎ＝５、＊ｐ＜０．０５）。
【図４】同、ＳＡＲ１３１６７５を事前投与することでリポ多糖投与の１日後におけるＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現が抑制されることを示すＦＡＣＳ  ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙの展開図とグラフである（ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５）。
【図５】実施例の（３）において、リポ多糖投与の１日後にＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＸＣＲ７の発現が顕著であることを示すＦＡＣＳヒストグラムである。
【図６】同、ＳＡＲ１３１６７５を事前投与することでリポ多糖投与の１日後のＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＸＣＲ７の発現が低下することを示すＦＡＣＳヒストグラムとグラフである（ｎ＝７、＊ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法は、急性肺傷害惹起物質によってＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つとして出現するＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制作用を指標にして行うことによるものである。
【００１０】
本発明の急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）などで実施することができる。
【００１１】
本発明の急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法をインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で実施する場合、例えばグラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖を急性肺傷害惹起物質として実験動物に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与することで急性肺傷害を惹起させる（投与は例えば気道注入によって行えばよい）。実験動物としては、例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（Ｂ６Ｊマウス）やＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ｃｓｆ１ｒ−ＥＧＦＰ−ＮＧＦＲ／ＦＫＢＰ１Ａ／ＴＮＦＲＳＦ６）２Ｂｃｋ／Ｊマウス（Ｍａｆｉａマウス）を用いることができる。とりわけＭａｆｉａマウスは、単球系細胞に発現するＭ−ＣＳＦＲ遺伝子の下流にｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子が挿入されており、単球性細胞の陽性選択に有用である。
【００１２】
被験物質は、急性肺傷害惹起物質を投与することによって実験動物に急性肺傷害を惹起させる例えば５〜１日前に、実験動物に予め０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与する。被験物質の実験動物への投与方法としては、例えば腹腔内投与や経口投与が挙げられる。
【００１３】
急性肺傷害惹起物質を投与することによって実験動物に急性肺傷害を惹起させると、Ｍ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットとして、Ｌｙ６Ｃ−細胞、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ−細胞、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ細胞、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の４つが末梢血中に出現する。本発明者は、この４つのサブセットの１つであるＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現の経時的変化が、急性肺傷害の経過に相関していることを見出した。具体的には、このＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞は、急性肺傷害を惹起させる前には末梢血中にほとんど存在しないが、炎症初期において（例えば急性肺傷害を惹起させた１日±６時間後）顕著に出現し、その後は急激に減少する。従って、このＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の炎症初期における顕著な出現に対して被験物質が抑制作用を有するか否かで、急性肺傷害治療剤のスクリーニングを行うことができる（抑制作用を有する場合に急性肺傷害に対して有効と判断し得る）。
【００１４】
末梢血中のＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制の分析は、例えば自体公知のデジタル波形処理が可能なフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリーによって行えばよい。
【００１５】
また、本発明の急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法をエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）やインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で実施する場合、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制の分析は、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に発現するＳＤＦ−１（Ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１）受容体であるＣＸＣＲ７（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ７）をマーカーとして行うことができることが期待される。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
（１）急性肺傷害を惹起させた実験動物の末梢血中のＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの分析
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社より購入した凍結胚からの雄および雌のＭａｆｉａマウス（以下、単に「マウス」と略称）を実験動物として用い、リポ多糖を１．９ｍｇ／ｋｇ気道注入して急性肺傷害を惹起させた。急性肺傷害を惹起させる前（Ｄａｙ０）、惹起させた１日後（Ｄａｙ１）、３日後（Ｄａｙ３）、５日後（Ｄａｙ５）、７日後（Ｄａｙ７）のそれぞれにおいて、マウスを解剖して心臓から末梢血を採取し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２倍希釈した上で、比重１．０８４のｐｅｒｃｏｌｌを用いて４００×ｇで３０分間の遠心分離を行った後、単核球層をピペットでエッペンドルフｔｕｂｅに採取した。採取した単核球層は、１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁し、再度１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行って細胞成分を沈殿させた。その後、沈殿させた細胞成分に対して、デジタル波形処理が可能なフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔＩＩ：Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いたフローサイトメトリーを下記の（１）〜（７）の手順で行い、末梢血中のＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットを分析した。
（１）前方散乱光パルス面積（ＦＳＣ−Ａ）と側方散乱光パルス面積（ＳＳＣ−Ａ）で展開し、単球、リンパ球からなる白血球領域にゲーティングする。
（２）前方散乱光パルス幅（ＦＳＣ−Ｗ）と前方散乱光パルス高（ＦＳＣ−Ｈ）で展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外するようゲーティングする。
（３）側方散乱光パルス幅（ＳＳＣ−Ｗ）と側方散乱光パルス高（ＳＳＣ−Ｈ）で展開し、電気信号的に細胞集団から著しくずれている細胞を除外するようゲーティングする。
（４）７−ＡＡＤ（７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）陽性細胞を除外するようゲーティングする。
（５）細胞構造の複雑性と大きさから類推される末梢血単球領域をＭ−ＣＳＦＲ−（ＦＩＴＣ）−ＡおよびＳＳＣ−Ａによる展開図を用いでＭ−ＣＳＦＲ陽性単球をゲーティングする。
（６）Ｌｙ６Ｃ−（ＰＥ）−ＡおよびＣＤ１１ｃ−（ＡＰＣ／Ｃｙ７）−Ａによる等高線展開図において、まず、Ｌｙ６Ｃ−領域に認められるサブセットにｇａｔｅ１を設定する。次に、Ｌｙ６Ｃ−領域の右隣下のＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ−領域に認められるサブセットにｇａｔｅ２を設定する。さらに、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ−領域の右隣のＬｙ６Ｃｈｉｇｈ領域に認められるサブセットにｇａｔｅ３を設定する。その際、ｇａｔｅ２およびｇａｔｅ３のＣＤ１１ｃの上縁は等高線分布が途絶えるほぼ同じ高さのレベルに設定する。その上で、ｇａｔｅ１よりも強Ｌｙ６Ｃレベルであって、かつ、ｇａｔｅ２およびｇａｔｅ３よりも強ＣＤ１１ｃレベルに位置する細胞集団のサブセット（Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞）に対してｇａｔｅ４を設定する。
【００１８】
結果を図１に示す。図１から明らかなように、ｇａｔｅ４によって形成された領域に位置するサブセットであるＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞は、Ｄａｙ０には末梢血中にほとんど存在しないが、Ｄａｙ１において顕著に出現し、その後は急激に減少した。
【００１９】
（２）Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現の経時的変化と急性肺傷害の経過の相関
図２から明らかなように、自体公知の方法によって調製したＬａｃＺ遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクター１．０×１０９ｐ．ｆ．ｕをマウスに腹腔内投与した３日後に、リポ多糖を０．３５ｍｇ／ｋｇ気道注入して急性肺傷害を惹起させたところ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の全細胞数および好中球数は、急性肺傷害を惹起させた１日後（Ｄａｙ１）に顕著に多いが、４日後（Ｄａｙ４）には減少した（コントロール）。このＢＡＬ中の全細胞数および好中球数の経時的変化は、末梢血中のＭ−ＣＳＦＲ陽性の単球サブセットの１つであるＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現の経時的変化と一致していることから、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現の経時的変化と急性肺傷害の経過は相関していることがわかった。また、自体公知の方法によって調製した可溶性ＶＥＧＦＲ−３（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３）／Ｆｃ遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクター１．０×１０９ｐ．ｆ．ｕをマウスに腹腔内投与することでＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害した３日後に、リポ多糖を０．３５ｍｇ／ｋｇ気道注入して急性肺傷害を惹起させたところ、急性肺傷害を惹起させた１日後におけるＢＡＬ中の全細胞数および好中球数がコントロールに比較して有意に減少したことから、ＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害することによる肺傷害の軽減を確認することができた（肺傷害の程度はＢＡＬ中の全細胞数および好中球数で評価可能）。よって、このＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の炎症初期における出現に対して被験物質が抑制作用を有するか否かで急性肺傷害治療剤のスクリーニングを行うことができることがわかった。さらに、この実験から、ＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害することで急性肺傷害を改善することができることがわかった。このことは、マウスにリポ多糖を０．３５ｍｇ／ｋｇ気道注入して急性肺傷害を惹起させる２日前に、ＶＥＧＦＲ−３シグナルを阻害する低分子化合物であるＳＡＲ１３１６７５を２ｍｇ／ｋｇ経口投与すると、急性肺傷害を惹起させた１日後において、ビヒクルに比較して、ＢＡＬ中の全細胞数および好中球数が有意に減少すること（図３）、および、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞の出現が有意に抑制されること（図４）で確認することができた。ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ管内皮細胞に発現し、リガンドであるＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄシグナルによってリンパ管内皮細胞を増殖させることでリンパ管の新生を亢進させることが知られているが、近年、リンパ管内皮細胞のみならず単球系細胞にも発現し、リンパ管の新生への関与とは別に病態形成に重要な役割を果たしていることが報告されている（Ｚｈａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１４；４０：５０１−１４）。
【００２０】
（３）Ｍ−ＣＳＦＲ陽性の４つの単球サブセットのＣＸＣＲ７の発現性
（１）において、Ｌｙ６Ｃ−細胞、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ−細胞、Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ細胞、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞のリポ多糖投与の１日後におけるＣＸＣＲ７の発現性を調べたところ、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞のみに顕著な発現が認められた（図５）。また、（２）において、ＳＡＲ１３１６７５を事前投与することで、リポ多糖投与の１日後のＬｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＸＣＲ７の発現が有意に低下した（図６）。以上の結果から、Ｌｙ６ＣＩＮＴＣＤ１１ｃ＋細胞に対する出現抑制の分析を、ＣＸＣＲ７をマーカーとして行うことができることが期待された。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、急性肺傷害治療剤のスクリーニング方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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