(57)【要約】      （修正有）【課題】複数のサンプルの高解像の撮像データを高スループットで取得する顕微鏡を提供する。【解決手段】アレイ状に配列された複数のウエルＷを支持する可動ステージ３と、低倍対物レンズ２１を有する第１撮像部５と、低倍対物レンズ２１よりも高倍の高倍対物レンズ３９を有する第２撮像部７と、第１撮像部５により得られたスフェロイドＳの撮像データに基づき、スフェロイドＳごとに代表位置を決定するコンピュータ９と、制御器１１とを備え、制御器１１が、同一のウエルＷ内のスフェロイドＳに対して、第１撮像部５により撮像データを取得させた後に、その撮像データに基づいて決定されたスフェロイドＳの代表位置を可動ステージ３により高倍対物レンズ３９の光軸に合わせてから、第２撮像部７により撮像データを取得させ、かつ、第２撮像部７による撮像データの取得に同期して、第１撮像部５により別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを取得させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレイ状に配列された複数のサンプル容器を水平方向に移動可能に支持する可動ステージと、
第１対物レンズを有し、前記サンプル容器に収容されているサンプルの撮像データを取得する第１撮像部と、
前記第１対物レンズよりも倍率が高い第２対物レンズを有し、前記サンプル容器に収容されている前記サンプルの撮像データを取得する第２撮像部と、
前記第１撮像部により得られた前記サンプル容器ごとの前記サンプルの前記撮像データに基づき、前記サンプルごとに代表位置を決定する代表位置決定部と、
前記可動ステージにより前記第１撮像部および前記第２撮像部に対して複数の前記サンプル容器を移動させることによって、前記第１撮像部および前記第２撮像部により各前記サンプル容器内の前記サンプルの撮像データを順次取得させる制御部とを備え、
該制御部が、同一の前記サンプル容器内の前記サンプルに対して、前記第１撮像部により前記撮像データを取得させた後に、前記第１撮像部によって得られた前記撮像データに基づいて前記代表位置決定部により決定された前記サンプルの前記代表位置を前記可動ステージにより前記第２対物レンズの光軸に合わせてから、前記第２撮像部により前記撮像データを取得させ、かつ、前記第２撮像部による前記撮像データの取得に同期して、前記第１撮像部により別の前記サンプル容器内の前記サンプルの前記撮像データを取得させる顕微鏡。
【請求項２】
前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器間のピッチの整数倍の距離だけ前記アレイ状の配列方向に間隔をあけて配置される請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記サンプル容器が、ｍ個×ｎ個、かつ、ｍ＞ｎの２次元的な配列状態で前記可動ステージにより支持され、
前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器がｍ個配列される方向に間隔をあけて配置される請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記サンプルに照明光を照射することによって、前記第１撮像部に向けて前記第１対物レンズの光軸に沿って照明光を前記サンプルに透過させる透過照明装置を備える請求項２または請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記サンプルに照明光を照射することによって、前記第１撮像部に向けて前記第１対物レンズの光軸に沿って前記照明光を前記サンプルにおいて反射させる反射照明装置を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記第１対物レンズの光軸に対して角度をつけて前記サンプルに前記照明光を照射することによって、前記サンプルを偏射照明する請求項４または請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記第２対物レンズが鉛直上方に光軸を向けて配置される請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記第１対物レンズが鉛直下方に光軸を向けて配置される請求項７に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器の配列方向に該サンプル容器１つ分だけ距離をあけて配置される請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、互いに４．５ｍｍ、９ｍｍまたは１８ｍｍ離れて配置される請求項１から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記第２撮像部が、像倍率を変更する変倍機能を有する請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記第２撮像部が、前記サンプル上で照明光を走査させる走査部を備え、
該走査部が、前記照明光の走査域を変更することによって前記変倍機能を実現する請求項１１に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記第１撮像部により取得された前記撮像データに基づいて、前記水平方向に沿う平面内における前記サンプルの大きさ情報を取得し、取得した前記大きさ情報に基づいて、前記像倍率を調整する像倍率調整部を備える請求項１１または請求項１２に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記第２撮像部が、撮像画素数を変更する撮像画素数変更手段を備える請求項１から請求項１３のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記第１撮像部により取得された前記撮像データに基づいて、前記水平方向に沿う平面内における前記サンプルの大きさ情報を取得し、取得した前記大きさ情報に基づいて球面収差補正値を決定する補正値決定部と、
該補正値決定部により決定された前記球面収差補正値に従って、前記第２対物レンズの球面収差を補正する球面収差補正部とを備える請求項１から請求項１４のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項１６】
前記補正値決定部が、前記第２撮像部により、前記サンプルの３次元的な前記撮像データを取得する場合において、前記サンプルにおける鉛直方向の位置に応じて前記球面収差補正値を修正する請求項１５に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、スフェロイドやオルガノイド等の３次元培養細胞の顕微鏡画像データを取得した後、取得した顕微鏡画像データに対して画像解析技術を用いてスクリーニングを行うことによって、薬効を評価する方法が注目されている。また、近年、３次元培養細胞を構成する個々の細胞の細胞内小器官を解析することが求められており、必然的に解像度の高い画像が要求されている。
【０００３】
一方で、細胞スクリーニングでは、大量のストレージに必要なコストや、データ解析のためのコストを削減することが求められており、解析に必用な分解能が得られるという条件において、画像データ量を決定する撮像画素数は可能な限り少ないことが望まれている。したがって、撮像画素数と撮像領域とにより決定される画素ピッチ上の分解能は、光学的な分解能を勘案して適切に設定されなければならない。
【０００４】
高解像度の必要性に関しては、これまでの２次元培養細胞の解析、換言すれば単層細胞の解析においても求められていた。しかしながら、２次元培養細胞の撮像では、細胞がウエルの底面の全領域に存在しているので、ウエルの底面よりも小さな撮像領域によって１箇所または所定の複数箇所を撮影することによって、得られた撮像データを統計解析に供すればよい。そのため、撮像位置の正確さが求められるようなことはなかった。
【０００５】
これに対し、マイクロプレートのウエルに収容されているスフェロイド等のサンプルを高解像で撮像し、かつ、サンプルが写っていない無駄なピクセルデータの蓄積を回避するためには、顕微鏡の視野内にスフェロイド全体が入るように設定した上で、可能な限り高倍率によって撮影することが重要となる。これには、高解像度の画像を取得する前に、スフェロイドの代表位置、換言すればスフェロイドの中心位置を予め正確に検出しておき、撮像時にスフェロイドの代表位置を対物レンズの光軸に合わせる必用がある。
【０００６】
上述した課題を解決する手段として、切替え装置に低倍の対物レンズと高倍の対物レンズを装着し、低倍対物レンズによりウエル全域のサンプルを撮影することによって目的の撮像位置を決定し、その後、高倍対物レンズに切り替えてから、高解像の撮像を行う方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５０９８２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、低倍の対物レンズを用いて全てのウエル内のサンプルを順に撮像した後に、高倍の対物レンズを用いて全てのウエルに対して順にサンプルを撮像していくため、スループットが低くなるという問題がある。
【０００９】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、複数のサンプルの高解像の撮像データを高スループットで取得することができる顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、アレイ状に配列された複数のサンプル容器を水平方向に移動可能に支持する可動ステージと、第１対物レンズを有し、前記サンプル容器に収容されているサンプルの撮像データを取得する第１撮像部と、前記第１対物レンズよりも倍率が高い第２対物レンズを有し、前記サンプル容器に収容されている前記サンプルの撮像データを取得する第２撮像部と、前記第１撮像部により得られた前記サンプル容器ごとの前記サンプルの前記撮像データに基づき、前記サンプルごとに代表位置を決定する代表位置決定部と、前記可動ステージにより前記第１撮像部および前記第２撮像部に対して複数の前記サンプル容器を移動させることによって、前記第１撮像部および前記第２撮像部により各前記サンプル容器内の前記サンプルの撮像データを順次取得させる制御部とを備え、該制御部が、同一の前記サンプル容器内の前記サンプルに対して、前記第１撮像部により前記撮像データを取得させた後に、前記第１撮像部によって得られた前記撮像データに基づいて前記代表位置決定部により決定された前記サンプルの前記代表位置を前記可動ステージにより前記第２対物レンズの光軸に合わせてから、前記第２撮像部により前記撮像データを取得させ、かつ、前記第２撮像部による前記撮像データの取得に同期して、前記第１撮像部により別の前記サンプル容器内の前記サンプルの前記撮像データを取得させる顕微鏡である。
【００１１】
本態様によれば、同一のサンプル容器内のサンプルに対して、高倍の第２対物レンズを有する第２撮像部に先立って、低倍の第１対物レンズを有する第１撮像部により撮像データが取得される。これにより、代表位置決定部によって、そのサンプル容器に収容されているサンプルの代表位置を容易かつ確実に決定することができる。そして、代表位置決定部によりそのサンプルの代表位置が決定されると、可動ステージによりそのサンプルの代表位置が第２対物レンズの光軸に合わせられた状態で、第２撮像部により撮像データが取得される。これにより、第２撮像部によって、サンプルが十分に写っていない無駄な撮像データを抑制することができ、サンプルの高解像の撮像データを効率的に取得することができる。
【００１２】
この場合において、制御部が、第２撮像部による撮像データの取得に同期して、第１撮像部により別のサンプル容器内のサンプルの撮像データを取得させることによって、第１撮像部により全てのサンプルの撮像データを取得してから第２撮像部により全てのサンプルに対して撮像データを取得していく場合と比較して、第１撮像部による撮像データの取得と第２撮像部による撮像データの取得とが時間的に重複されて行われる分だけ、スループットを向上することができる。これにより、複数のサンプルの高解像の撮像データを高スループットで取得することができる。
【００１３】
上記態様においては、前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器間のピッチの整数倍の距離だけ前記アレイ状の配列方向に間隔をあけて配置されることとしてもよい。
この構成によって、第１撮像部および第２撮像部により、サンプル容器間のピッチの整数倍の分だけ離れた異なるサンプル容器内のサンプルの撮像データを互いに同期して取得することができる。
【００１４】
上記態様においては、前記サンプル容器が、ｍ個×ｎ個、かつ、ｍ＞ｎの２次元的な配列状態で前記可動ステージにより支持され、前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器がｍ個配列される方向に間隔をあけて配置されることとしてもよい。
【００１５】
この構成によって、第１撮像部による撮像データの取得と第２撮像部による撮像データの取得とが同期せずに行われる回数を低減することができる。すなわち、上記構成によれば、ｍ個配列されているサンプル容器のうち、一方の端側に配置されているサンプル容器のサンプルについては、第２撮像部と同期せずに先に第１撮像部だけで撮像データを取得しておき、他方の端側に配置されているサンプル容器のサンプルについては、第１撮像部と同期せずに第２撮像部だけで撮像データを取得することになるが、第１撮像部および第２撮像部の一方だけにより撮像データを取得するサンプル容器がそれぞれｎ個だけで済む。したがって、第１撮像部および第２撮像部の一方だけによる撮像データの取得にかける時間をより短くすることができる。
【００１６】
上記態様においては、前記サンプルに照明光を照射することによって、前記第１撮像部に向けて前記第１対物レンズの光軸に沿って照明光を前記サンプルに透過させる透過照明装置を備えることとしてもよい。
この構成によって、透過照明装置および第１撮像部により、サンプルを透過照明観察することができる。
【００１７】
上記態様においては、前記サンプルに照明光を照射することによって、前記第１撮像部に向けて前記第１対物レンズの光軸に沿って前記照明光を前記サンプルにおいて反射させる反射照明装置を備えることとしてもよい。
この構成によって、反射照明装置および第１撮像部により、サンプルを反射照明観察することができる。
【００１８】
上記態様においては、前記第１対物レンズの光軸に対して角度をつけて前記サンプルに前記照明光を照射することによって、前記サンプルを偏射照明するとしてもよい。
この構成によって、コントラストの高い良好な撮像データを取得することができる。
【００１９】
上記態様においては、前記第２対物レンズが鉛直上方に光軸を向けて配置されることとしてもよい。
この構成によって、サンプル容器に収容されているサンプルに対して、第２対物レンズをより近い位置に配置することができる。これにより、第１対物レンズと比較して作動距離が短い第２対物レンズを用いたサンプルの撮像データの取得を容易にすることができる。
【００２０】
上記態様においては、前記第１対物レンズが鉛直下方に光軸を向けて配置されることとしてもよい。
この構成によって、第１対物レンズと第２対物レンズとを互いに邪魔せずに配置することができる。
【００２１】
上記態様においては、前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、前記サンプル容器の配列方向に該サンプル容器１つ分だけ距離をあけて配置されることとしてもよい。
この構成によって、第１撮像部と第２撮像部により、互いに隣接するサンプル容器内のサンプルの撮像データを同期して取得することができる。
【００２２】
上記態様においては、前記第１対物レンズの光軸と前記第２対物レンズの光軸とが、互いに４．５ｍｍ、９ｍｍまたは１８ｍｍ離れて配置されることとしてもよい。
この構成によって、複数のサンプル容器として、複数のウエルが互いに４．５ｍｍ、９ｍｍまたは１８ｍｍのピッチをあけて配列されてなる一般的なマイクロプレートを採用する場合において、いずれのマイクロプレートにも対応することができる。
【００２３】
上記態様においては、前記第２撮像部が、像倍率を変更する変倍機能を有することとしてもよい。
この構成によって、変倍機能により、第２撮像部による撮像領域をサンプルの大きさに合わせることができる。これにより、撮像データにおいてサンプルが写っていない範囲を低減することができる。
【００２４】
上記態様においては、前記第２撮像部が、前記サンプル上で照明光を走査させる走査部を備え、該走査部が、前記照明光の走査域を変更することによって前記変倍機能を実現することとしてもよい。
この構成によって、走査部を利用して変倍機能を効率的に実現することができる。
【００２５】
上記態様においては、前記第１撮像部により取得された前記撮像データに基づいて、前記水平方向に沿う平面内における前記サンプルの大きさ情報を取得し、取得した前記大きさ情報に基づいて、前記像倍率を調整する像倍率調整部を備えることとしてもよい。
この構成によって、像倍率調整部により、光学分解能に対して、撮像画素数と撮像領域とにより決定される画素ピッチ上の分解能を向上することができる。
【００２６】
上記態様においては、前記第２撮像部が、撮像画素数を変更する撮像画素数変更手段を備えることとしてもよい。
この構成によって、撮像画素数変更手段により、撮像画素数と撮像領域とにより決定される画素ピッチ上の分解能を適切に設定することができる。
【００２７】
上記態様においては、前記第１撮像部により取得された前記撮像データに基づいて、前記水平方向に沿う平面内における前記サンプルの大きさ情報を取得し、取得した前記大きさ情報に基づいて球面収差補正値を決定する補正値決定部と、該補正値決定部により決定された前記球面収差補正値に従って、前記第２対物レンズの球面収差を補正する球面収差補正部とを備えることとしてもよい。
この構成によって、第２撮像部により取得される撮像データの質を向上することができる。
【００２８】
上記態様においては、前記補正値決定部が、前記第２撮像部により、前記サンプルの３次元的な前記撮像データを取得する場合において、前記サンプルにおける鉛直方向の位置に応じて前記球面収差補正値を修正することとしてもよい。
この構成によって、球面収差が補正された良質なサンプルの３次元的な撮像データを取得することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、複数のサンプルの高解像の撮像データを高スループットで取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置により使用するマイクロプレートを鉛直上方から見た図である。
【図３】第１撮像部のみによる撮像データの取得を説明するフローチャートである。
【図４】第１撮像部と第２撮像部とが同期して行う撮像データの取得を説明するフローチャートである。
【図５】第２撮像部のみによる撮像データの取得を説明するフローチャートである。
【図６】第１撮像部によるウエルの撮影順序の一例を示した図である。
【図７】第２撮像部によるウエルの撮影順序の一例を示した図である。
【図８】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
【図９】本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成図である。
【図１０】図９の顕微鏡装置によるウエルの撮影順序の一例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置（顕微鏡）について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示すように、アレイ状に配列された複数のウエル（サンプル容器）Ｗを有するマイクロプレート１３を水平方向に移動可能に支持する可動ステージ３と、各ウエルＷに収容されているスフェロイド（サンプル）Ｓの撮像データを取得する第１撮像部５および第２撮像部７と、スフェロイドＳごとに中心位置（代表位置）を決定するコンピュータ（代表位置決定部）９と、第１撮像部５および第２撮像部７により各ウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを順次取得させる制御器（制御部）１１とを備えている。
【００３２】
スフェロイドＳは、蛍光標識されている。スフェロイドＳの直径は、例えば、約２００μｍである。
【００３３】
マイクロプレート１３は、例えば、図２に示すように、縦横に等間隔で配列されたｍ個×ｎ個（ｉ＝１〜ｍ、ｊ＝１〜ｎ）、かつ、ｍ＞ｎのウエルＷを有している。例えば、マイクロプレート１３は、ウエル数が１２×８＝９６個（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）で、ウエルピッチ、すなわち縦横に隣接する２つのウエルＷの中心の間隔が９ｍｍである。
【００３４】
各ウエルＷは、光学的に透明な材質により構成され、一端に底部を有する有底円筒状に形成されている。ウエルＷの底部の上面を底面Ｗａという。本実施形態においては、底面Ｗａが直径約１ｍｍの大きさを有することとする。これらウエルＷは、深さ方向の途中位置から底面Ｗａに向かって次第に先細になる斜面Ｗｂを有している。各ウエルＷには、培養液ＣとともにスフェロイドＳが１つずつ収容されている。
【００３５】
液滴を吊り下げた状態からなるハンギングドロップ内で形成したスフェロイドＳをハンギングドロップともにウエルＷ内に落下させることによって、スフェロイドＳがウエルＷの斜面Ｗｂを滑り落ちてから底面Ｗａに着地する。スフェロイドＳの直径は約２００μｍなので、最終的に底面Ｗａのどこに着地するかは決まっておらず、ウエルＷの底面Ｗａの中央に着地するときもあれば、底面Ｗａにおける周辺に着地するときもある。
【００３６】
可動ステージ３は、マイクロプレート１３を水平に載置した状態で固定する。以下、可動ステージ３によりマイクロプレート１３が水平に支持された状態で、ウエルＷが１２個配列されている方向をＸ方向とし、ウエルＷが８個配列されている方向をＹ方向とする。
【００３７】
この可動ステージ３は、図示しないモータを備えており、電動によってマイクロプレート１３をＸ方向およびＹ方向に移動させることができる。以下、Ｘ方向およびＹ方向に直交する鉛直方向をＺ方向とする。
【００３８】
第１撮像部５は、可動ステージ３により支持されるマイクロプレート１３の上方に配置される。この第１撮像部５は、鉛直下方に向けて配置された４倍の倍率を有する低倍対物レンズ（第１対物レンズ）２１と、低倍対物レンズ２１をＺ方向に移動させる照準部２３と、反射ミラー２５と、ハーフミラー２７と、結像レンズ２９と、カメラ３１とを備えている。低倍対物レンズ２１の光軸は、装置の高さを抑えるために反射ミラー２５によって折り曲げられている。
【００３９】
照準部２３は、ウエルＷの底面Ｗａから略１００μｍのＺ位置に焦点を合わせる。低倍対物レンズ２１は、ＮＡ、すなわち開口数が小さいため、それぞれのスフェロイドＳに焦点を合わせなくても、スフェロイドＳの位置と直径とを決定するのに十分な焦点深度を有している。スフェロイドＳの大きさが全く未知で、しかも大きさのばらつきが大きい場合は、例えば、コントラスト法により、照準部２３を駆動することによってスフェロイドＳの直径を鮮明にしてもよい。
【００４０】
カメラ３１は、例えば、ＣＣＤカメラである。このカメラ３１は、低倍対物レンズ２１および結像レンズ２９との組み合わせにより、約２×２ｍｍの撮像領域を確保することができる。したがって、ウエルＷの底面Ｗａの最外縁部を低倍対物レンズ２１の光軸上に合わせたとしても、ウエルＷの全領域を撮影することができる。
【００４１】
第１撮像部５には、スフェロイドＳに照明光を照射することによって、スフェロイドＳにおいて第１撮像部５に向けて低倍対物レンズ２１の光軸に沿って照明光を反射させる反射照明装置３３が接続されている。反射照明装置３３は、照明光を発生するハロゲンランプ３５と、ハロゲンランプ３５から発せられた照明光を集光することによってハーフミラー２７に入射させる集光レンズ３７とを備えている。
【００４２】
これら反射照明装置３３および第１撮像部５においては、ハロゲンランプ３５から発せられた照明光は、集光レンズ３７により集光されてハーフミラー２７により反射された後、反射ミラー２５により反射されて低倍対物レンズ２１によりウエルＷ内のスフェロイドＳに対して鉛直上方から照射される。照明光が照射されることによりスフェロイドＳにおいて反射された反射光は、低倍対物レンズ２１により集光されて照明光の光路を戻り、反射ミラー２５により反射されてハーフミラー２７を透過した後、結像レンズ２９により集光されてカメラ３１により撮影される。
【００４３】
第２撮像部７は、例えば、共焦点顕微鏡によって構成されており、可動ステージ３により支持されるマイクロプレート１３の下方に配置される。この第２撮像部７は、鉛直上方に向けて配置された２５倍の倍率を有する高倍対物レンズ（第２対物レンズ）３９と、高倍対物レンズ３９をＺ方向に移動させる照準部４１と、結像レンズ４３と、瞳投影レンズ４５と、ＸＹガルバノミラースキャナ４７と、レーザ光（照明光）を発生するレーザ４９と、ダイクロイックミラー５１と、共焦点レンズ５３と、ピンホール５５と、光電子増倍管等の光検出器５７とを備えている。
【００４４】
高倍対物レンズ３９は、例えば、液浸対物レンズである。この高倍対物レンズ３９には、球面収差を補正する補正環（球面収差補正部）５９が設けられている。補正環５９は、補正環５９を回転駆動させる補正環駆動装置６１に接続されている。
ダイクロイックミラー５１は、レーザ４９から発せられたレーザ光を反射する一方、スフェロイドＳから発せられる蛍光を透過させる。
【００４５】
ＸＹガルバノミラースキャナ４７は、レーザ光の走査域を変更することによって像倍率を変更する変倍機能として機能する。ＸＹガルバノミラースキャナ４７の図示しないミラーの走査角度を制御することにより、レーザ光の走査域を変更することができる。
【００４６】
光検出器５７は、撮像画素数を変更する撮像画素数変更手段として機能する。すなわち、ＸＹガルバノミラースキャナ４７によるレーザ光の走査に対して、光検出器５７による光検出の分割時間を変更することにより、撮像画素数を変更できる。ＸＹガルバノミラースキャナ４７および光検出器５７により、撮像画素数と撮像領域とによって決定される画素ピッチ上の分解能と光学的な分解能とを適切に設定することができる。
【００４７】
第２撮像部７には、高倍対物レンズ３９とウエルＷの底部との間に純水等の液体Ｌを給水するための給液装置６３が備えられている。給液装置６３は、高倍対物レンズ３９とウエルＷの底部との間に液体Ｌを供給する流路および高倍対物レンズ３９とウエルＷの底部との間から液体Ｌを排出する流路を形成するベローズ６５およびカバー部６７と、液体Ｌを貯留しておく給水タンク６９と、給水タンク６９内の液体Ｌをベローズ６５およびカバー部６７の流路を経由して高倍対物レンズ３９とウエルＷの底部との間に供給するポンプ７１と、ベローズ６５およびカバー部６７の流路から液体Ｌを排出する配管７３と、配管７３を経由して排出された液体Ｌを収容する排液タンク７５とを備えている。
【００４８】
この給液装置６３は、高倍対物レンズ３９がウエルＷの底面Ｗａを隔ててスフェロイドＳに対向して配置されたときに、給水することによって、高倍対物レンズ３９の先端レンズ（図示略）とウエルＷの底部との間に液体Ｌを貯留させる。給水は、高倍対物レンズ３９が新たなスフェロイドＳに対向する度に行われる必要はなく、適宜省略してもよい。
【００４９】
また、第２撮像部７には、図示しない赤外レーザを搭載した位相差式のオートフォーカス装置７７と、オートフォーカス装置７７の赤外レーザから発せられた赤外光を反射する一方、可視光を透過させるダイクロイックミラー７９とが備えられている。
【００５０】
ダイクロイックミラー７９は、高倍対物レンズ３９の光軸上であって、高倍対物レンズ３９と結像レンズ４３との間に配置されている。オートフォーカス装置７７は、ウエルＷの底面Ｗａを検出する。そして、オートフォーカス装置７７は、照準部４１を駆動することにより、ウエルＷの底面Ｗａに高倍対物レンズ３９の焦点を合わせる。
【００５１】
この第２撮像部７においては、レーザ４９から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー５１により反射されて、ＸＹガルバノミラースキャナ４７により２次元的に走査された後、瞳投影レンズ４５、結像レンズ４３およびダイクロイックミラー７９を透過して、高倍対物レンズ３９によりウエルＷ内のスフェロイドＳに対して鉛直下方から照射される。レーザ光が照射されることによりスフェロイドＳにおいて発せられる蛍光は、高倍対物レンズ３９により集光されてレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー７９、結像レンズ４３および瞳投影レンズ４５を透過した後、ＸＹガルバノミラースキャナ４７を経由してダイクロイックミラー５１を透過し、共焦点レンズ５３により集光される。そして、ピンホール５５を通過した蛍光が光検出器５７により検出される。
【００５２】
上述した第１撮像部５の低倍対物レンズ２１の光軸と第２撮像部７の高倍対物レンズ３９の光軸は、ウエルピッチ１つ分（Ｎ＝１）だけ離れて配置される。より具体的には、これら低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸は、互いにＸ方向にウエルＷ１つ分だけ距離をあけて配置される。
【００５３】
コンピュータ９は、演算部としてのＣＰＵ（中央処理部）を備え、光検出器５７により取得された撮像データに基づいて、スフェロイドＳの画像を生成する。また、コンピュータ９は、カメラ３１により取得されたウエルＷごとのスフェロイドＳの撮像データに基づいて、スフェロイドＳごとに中心位置を決定する。また、コンピュータ９は、スフェロイドＳの直径を計測し、スフェロイドＳが球体であることを前提として、計測した直径に基づいて球面収差補正値を決定する。また、コンピュータ９は、第２撮像部７により撮像データを取得する場合において、スフェロイドＳのＺ方向の観察位置に応じて、球面収差補正値を修正する。
【００５４】
制御器１１は、例えば、ＣＰＵ(Central  Processing  Unit）と、ＲＯＭ（Read  Only  Memory）およびＲＡＭ（Random  Access  Memory）等の主記憶部と、ＨＤＤ（Hard  Disk  Drive）等の補助記憶部と、データを出力する出力部と、外部機器との間で種々のデータのやりとりを行う外部インタフェース等（いずれも図示略）を備えている。補助記憶部には各種プログラムが格納されており、ＣＰＵが補助記憶部からプログラムをＲＡＭ等の主記憶部に読み出して、そのプログラムを実行することにより、可動ステージ３、カメラ３１、第２撮像部７の照準部４１、ポンプ７１、補正環駆動装置６１、ＸＹガルバノミラースキャナ４７の光走査範囲および光検出器５７による光検出の分割時間を制御する。
【００５５】
例えば、制御器１１は、駆動プログラムの実行により、可動ステージ３を駆動することによって、第１撮像部５および第２撮像部７に対してマイクロプレート１３をＸ方向およびＹ方向に移動させる。これにより、第１撮像部５および第２撮像部７により撮像データを取得するウエルＷのスフェロイドＳを変更する。また、制御器１１は、収差補正プログラムの実行により、コンピュータ９によって決定されたスフェロイドＳの球面収差補正値に基づいて、補正環駆動装置６１を制御する。これにより、補正環駆動装置６１によって、補正環５９が駆動される。
【００５６】
また、制御器１１は、撮像プログラムの実行により、同一のウエルＷ内のスフェロイドＳに対して、第２撮像部７に先立って、第１撮像部５により撮像データを取得させる。そして、同一のウエルＷ内のスフェロイドＳに対して、第１撮像部５によって取得した撮像データに基づいて、コンピュータ９によりそのスフェロイドＳの中心位置を決定させるとともに、コンピュータ９による決定に基づいて可動ステージ３を駆動することによって、そのスフェロイドＳの中心位置を高倍対物レンズ３９の光軸に合わせてから、第２撮像部７によりそのスフェロイドＳの撮像データを取得させる。また、制御器１１は、第２撮像部７による撮像データの取得に同期して、第１撮像部５により別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを取得させる。
【００５７】
上記構成の顕微鏡装置１の作用について、図３〜図５のフローチャートを参照して説明する。本実施形態において採用するマイクロプレート１３は、ウエル数が１２×８＝９６個（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）であるので、ｍ＝１２、ｎ＝８である。また、低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸の間隔（Ｎ）はＮ＝１である。
【００５８】
本実施形態に係る顕微鏡装置１によりマイクロプレート１３の各ウエルＷに収容されているスフェロイドＳを観察するには、図３のフローチャートに示されるように、まず、第１撮像部５により、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）まで先読みする。
【００５９】
具体的には、まず、制御器１１により、ｉ＝１、ｊ＝１が設定される（ステップＳＡ１）。次いで、制御器１１により可動ステージ３が駆動されることによって、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）の中心位置が第１撮像部５の低倍対物レンズ２１の光軸上に配置される（ステップＳＡ２）。そして、第１撮像部５によってウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データが取得される（ステップＳＡ３）。
【００６０】
第１撮像部５により取得されたウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データはコンピュータ９に送られ、コンピュータ９により画像処理されることによって、スフェロイドＳの中心位置が決定される。また、コンピュータ９により、スフェロイドＳの直径も計測され、計測した直径に基づいて球面収差補正値が決定される（ステップＳＡ４）。
【００６１】
次いで、制御器１１により、現在の設定がｉ＝偶数か否かが判断される（ステップＳＡ５）。また、制御器１１により、現在の設定が、ｊ＝ｎか否か（ステップＳＡ６）またはｊ＝１か否か（ステップＳＡ７）が判断される。現在の設定はｉ＝１、ｊ＝１であり、ｉ＝偶数ではなく（ステップＳＡ５「ＮＯ」）、また、ｊ＝ｎでもないので（ステップＳＡ６「ＮＯ」）、制御器１１により、ｊ＝ｊ＋１、すなわちこの場合はｉ＝１、ｊ＝２に設定が変更されて、ステップＳＡ２に戻る。
【００６２】
そして、可動ステージ３により、マイクロプレート１３がＹ方向に移動されることによって、図６に示すように、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝２）〜ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）まで、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）と同様にして、それぞれステップＳＡ２〜ＳＡ６が順に実施される。
【００６３】
ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）までステップＳＡ２〜ＳＡ６が実施されると、すなわち、設定がｉ＝１、ｊ＝８まで変更されると、ｊ＝ｎを満たすことから（ステップＳＡ６「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝Ｎか否かが判断される（ステップＳＡ８）。本実施形態においては低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸の間隔（Ｎ）がＮ＝１であるから（ステップＳＡ８「ＹＥＳ」）、先読みは終了する。
【００６４】
次に、図４に示すフローチャートに示されるように、制御器１１により、ｉ＝ｉ＋１、すなわちこの場合はｉ＝２、ｊ＝８に設定される（ステップＳＢ１）。そして、以下の２つのプロセスにおいて、各ウエルＷ内のスフェロイドＳに対して、先に第１撮像部５により撮像データが取得されたウエルＷ内のスフェロイドＳに対する第２撮像部７による撮像データの取得と、第１撮像部５による別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データの取得とが同期されて順に行われる。
【００６５】
具体的には、一方のプロセスでは、まず、制御器１１により、第２撮像部によるＺ方向の観察位置がＺ＝１に設定される（ステップＳＢ２）。また、制御器１１により、第２撮像部７による観察対象がウエルＷ（ｉ−Ｎ、ｊ）、すなわちこの場合はウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）に設定される。
【００６６】
次いで、制御器１１により、コンピュータ９によって決定されたウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの中心位置に従って可動ステージ３が駆動され、そのスフェロイドＳの中心位置が高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられる（ステップＳＢ３）。第１撮像部５によりウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の撮影が行われた直後であるので、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）ではなく、最初にウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの中心位置を高倍対物レンズ３９の光軸に合わせることにより、可動ステージ３の移動距離を短縮することができる。
【００６７】
次いで、制御器１１により、ポンプ７１が駆動されることによって、高倍対物レンズ３９の先端レンズとウエルＷの底部との間に液体Ｌが貯留される（ステップＳＢ４）。そして、制御器１１により、オートフォーカス装置７７が駆動され、高倍対物レンズ３９の焦点がウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の底面Ｗａに合わせられる（ステップＳＢ５）。
【００６８】
この状態で、第２撮像部７により、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの撮像データが取得される（ステップＳＢ６）。そして、制御器１１により、予め設定された例えば１μｍのＺステップ間隔で照準部４１が駆動され、例えば予め決めてあるステップ数ＰまでＺ位置が変更されながら、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの撮像データが繰り返し取得される（ステップＳＢ６〜ＳＢ８）。第２撮像部７により取得されたウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳにおけるＺ位置が異なる複数の撮像データはコンピュータ９に送られ、コンピュータ９により３次元的なＸＹＺ画像が生成される。
【００６９】
このとき、コンピュータ９により、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの球面収差補正値が、Ｚ位置に応じて修正される。そして、制御器１１により、Ｚ位置ごとに、修正された球面収差補正値に従って補正環駆動装置６１が制御されることによって、補正環５９により球面収差が補正される。なお、撮像データを取得するＺ方向のステップ数Ｐは予め決めておいてもよいが、画像処理により蛍光画像が得られなくなった時点で撮像を止めることが望ましい。
【００７０】
もう一方のプロセスでは、ステップＳＢ３においてウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの中心位置が高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられることによって、図６に示すように、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の次にウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）が第１撮像部５の低倍対物レンズ２１の光軸上に配置される。
【００７１】
そして、第２撮像部７によりウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の底面Ｗａから略１００μｍ上方のＺ位置において撮像データが取得されるときに（ステップＳＢ７「ＹＥＳ」）、第１撮像部５により、ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）のスフェロイドＳの撮像データが取得される（ステップＳＡ３´）。
【００７２】
このとき、ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）の中心は低倍対物レンズ２１の光軸上にはないが、第１撮像部５の撮像領域はウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）の直径の２倍が確保されているので、第１撮像部５により、ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）内のスフェロイドＳを逃すことなく撮像できる。
【００７３】
第１撮像部５により取得された撮像データはコンピュータ９に送られ、コンピュータ９により、ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）のスフェロイドＳの中心位置が決定されるとともに、スフェロイドＳの直径が計測されることによって球面収差補正値が決定される（ステップＳＡ４´）。決定された球面収差補正値は、第２撮像部７によるＸＹＺ画像の取得に利用される。
【００７４】
続いて、制御器１１により、第２撮像部７によるウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の深さ方向の観察位置、すなわちＺ位置がステップ数Ｐまで変更されたと判断されると（ステップＳＢ８「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝偶数か否かが判断される（ステップＳＢ９）。また、制御器１１により、現在の設定が、ｊ＝ｎか否か（ステップＳＢ１０）またはｊ＝１か否か（ステップＳＢ１１）が判断される。
【００７５】
現在の設定はｉ＝２、ｊ＝８であり、ｉ＝偶数であるが（ステップＳＢ９「ＹＥＳ」）、ｊ＝１ではないので（ステップＳＢ１１「ＮＯ」）、制御器１１により、ｊ＝ｊ−１、すなわちこの場合はｉ＝２、ｊ＝７に設定が変更されて、ステップＳＢ２に戻る。
【００７６】
そして、制御器１１により可動ステージ３が駆動されることによって、第１撮像部５および第２撮像部７に対してウエルＷが移動され、各ウエルＷに対して、第２撮像部７によりステップＳＢ２〜ＳＢ８が繰り返されるとともに、第２撮像部７によりステップＳＡ３´，ＳＡ４´が繰り返される。
【００７７】
具体的には、第２撮像部７に対しては、図７に示すように、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝１）まで、各ウエルＷ内のスフェロイドＳの中心位置が高倍対物レンズ３９の光軸に順に合わせられて、ステップＳＢ２〜ＳＢ８が繰り返される。そして、コンピュータ１１により、各スフェロイドＳの３次元的なＸＹＺ画像が生成される。
【００７８】
一方、第１撮像部５に対しては、図６に示すように、ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）まで、各ウエルＷが低倍対物レンズ２１の光軸上に順に移動されて、ステップＳＡ３´，ＳＡ４´が繰り返される。
【００７９】
このとき、制御器１１により、第２撮像部７により、ウエルＷごとに底面Ｗａから略１００μｍ上方のＺ位置において撮像データが取得されるときに（ステップＳＢ６）、第１撮像部５により、別のウエルＷのスフェロイドＳの撮像データが取得される（ステップＳＡ３´）。
【００８０】
ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）までステップＳＡ３´，ＳＡ４´が実施されると、すなわち、設定がｉ＝１２、ｊ＝１まで変更されると（ステップＳＢ９「ＹＥＳ」、ステップＳＢ１１「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝ｍか否かが判断される（ステップＳＢ１２）。本実施形態においてはｍ＝１２であるから（ステップＳＢ１２「ＹＥＳ」）、第１撮像部５による撮像データの取得は終了する。
【００８１】
次に、図５のフローチャートに示されるように、制御器１１により、ｉ＝ｉ＋１、すなわちこの場合はｉ＝１３、ｊ＝１に設定される（ステップＳＢ１）。そして、第１撮像部５による撮像データの取得は終了した状態で、第２撮像部７により、ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）まで、ステップＳＢ１〜ＳＢ１０が実施される。
【００８２】
ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）までステップＳＢ２〜ＳＢ１０が実施されると、すなわち、設定がｉ＝１３、ｊ＝８まで変更されると、ｊ＝ｎを満たすことから（ステップＳＢ１０「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝ｍ＋Ｎか否かが判断される（ステップＳＢ１２´）。本実施形態においてはｍ＝１２、Ｎ＝１であるから（ステップＳＢ１２´「ＹＥＳ」）、第２撮像部７による撮像データの取得も終了する。最後に、コンピュータ９により、ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）までの各スフェロイドＳの３次元的なＸＹＺ画像が生成されると、撮影は終了する。
【００８３】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１によれば、同一のウエルＷ内のスフェロイドＳに対して、第２撮像部７に先立って、第１撮像部５により撮像データが取得される。これにより、コンピュータ９によって、そのウエルＷに収容されているスフェロイドＳの中心位置を容易かつ確実に決定することができる。そして、コンピュータ９によりそのスフェロイドＳの中心位置が決定されると、可動ステージ３によりそのスフェロイドＳの中心位置が高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられた状態で、第２撮像部７により撮像データが取得される。これにより、第２撮像部７によって、スフェロイドＳが十分に写っていない無駄な撮像データを抑制することができ、スフェロイドＳの高解像の撮像データを効率的に取得することができる。
【００８４】
この場合において、制御器１１が、第２撮像部７による撮像データの取得に同期して、第１撮像部５により別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを取得させることによって、第１撮像部５により全てのスフェロイドＳの撮像データを取得してから第２撮像部７により全てのスフェロイドＳに対して撮像データを取得していく場合と比較して、第１撮像部５による撮像データの取得と第２撮像部７による撮像データの取得とが時間的に重複されて行われる分だけ、スループットを向上することができる。これにより、複数のスフェロイドＳの高解像の撮像データを高スループットで取得することができる。
【００８５】
本実施形態においては、コンピュータ９および制御器１１が像倍率調整部として機能することとしてもよい。すなわち、コンピュータ９が、第１撮像部５により取得されたスフェロイドＳの撮像データからスフェロイドＳのＸＹ平面内での大きさ情報を取得し、制御器１１が、この大きさ情報に基づいて、ＸＹガルバノミラースキャナ４７によるレーザ光の走査域を変更することにより、第２撮像部７の像倍率を調整することとしてもよい。
【００８６】
これにより、光学分解能に対して、撮像画素数と撮像領域とにより決定される画素ピッチ上の分解能を向上することができる。さらに、第２撮像部７の像倍率が決定されたときに撮像画素数を変更することによって、撮像画素数と撮像領域とにより決定される画素ピッチ上の分解能を最適化することができる。
【００８７】
また、本実施形態においては、低倍対物レンズ２１の光軸を高倍対物レンズ３９の光軸上に略合わせる移動手段を設けることとしてもよい。移動手段により反射照明装置３３と第１撮像部５とを移動させることによって、第２撮像部７に対する透過照明装置を構成することができる。これにより、高倍対物レンズ３９を用いた高倍率の透過照明観察を行うことができる。
【００８８】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置（顕微鏡）について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置８１は、図８に示すように、第１撮像部５に代えて、可動ステージ３により支持されるマイクロプレート１３の下方に配置される第１撮像部８３を備え、第２撮像部７に代えて、多光子励起顕微鏡を構成する第２撮像部８５を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８９】
本実施形態においては、ウエルＷが斜面Ｗｂを有さず、底面Ｗａが直径約６ｍｍの大きさを有している。各ウエルＷには、それぞれ複数個のスフェロイドＳが培養液Ｃとともに収容されている。
【００９０】
第１撮像部８３は、鉛直上方に向けて配置された１倍の倍率を有する低倍対物レンズ（第１対物レンズ）８７と、照準部２３と、反射ミラー２５と、結像レンズ２９と、カメラ３１とを備えている。照準部２３は、低倍対物レンズ８７をＺ方向に移動させることによって、ウエルＷの底面Ｗａから略１００μｍのＺ位置に焦点を合わせる。
【００９１】
本実施形態において、カメラ３１は、低倍対物レンズ８７および結像レンズ２９との組み合わせにより、約１３×１３ｍｍの撮像領域を確保することができる。したがって、ウエルＷの底面Ｗａの最外縁部を低倍対物レンズ８７の光軸上に合わせたとしても、ウエルＷの全領域を撮影することができる。
【００９２】
本実施形態においては、反射照明装置３３に代えて、スフェロイドＳに照明光を照射することによって、第１撮像部８３に向けて低倍対物レンズ８７の光軸に沿って照明光をスフェロイドＳに透過させる透過照明装置８９を備えている。
【００９３】
透過照明装置８９は、ハロゲンランプ３５と、集光レンズ３７と、集光レンズ３７により集光された照明光を平行光に変換するコンデンサレンズ９１と、偏射照明用の絞り９３とを備えている。この透過照明装置８９は、低倍対物レンズ８７の光軸に対して角度をつけてスフェロイドＳに照明光を照射することによって、スフェロイドＳを偏射照明する。
【００９４】
これら透過照明装置８９および第１撮像部８３においては、ハロゲンランプ３５から発せられた照明光は、集光レンズ３７により集光された後、絞り９３により光路を制限される。そして、絞り９３を通過した照明光が、コンデンサレンズ９１により平行光に変換されて、ウエルＷ内のスフェロイドＳに対して上方から角度をつけて照射される。照明光が照射されることによりスフェロイドＳを透過した透過光は、低倍対物レンズ８７により集光されて、反射ミラー２５により反射された後、結像レンズ２９により集光されてカメラ３１により撮影される。
【００９５】
第２撮像部８５は、高倍対物レンズ３９と、結像レンズ４３と、瞳投影レンズ４５と、ＸＹガルバノミラースキャナ４７と、超短パルス赤外レーザ光を発生する超短パルス赤外レーザ９５と、超短パルス赤外レーザ９５から発せられた超短パルス赤外レーザ光を透過させる一方、スフェロイドＳから発せられる蛍光を反射するダイクロイックミラー９７と、ダイクロイックミラー９７により反射された蛍光を集光する集光レンズ９９と、光検出器５７とを備えている。
【００９６】
また、第２撮像部８５には、ダイクロイックミラー７９に代えて、オートフォーカス装置７７から射出する赤外レーザ光のみを反射する一方、その他の波長の光を透過させるノッチ型ダイクロイックミラー１００が備えられている。ノッチ型ダイクロイックミラー１００は、高倍対物レンズ３９の光軸上であって、高倍対物レンズ３９と結像レンズ４３との間に配置されている。
【００９７】
この第２撮像部８５においては、超短パルス赤外レーザ９５から発せられた超短パルス赤外レーザ光は、ＸＹガルバノミラースキャナ４７により２次元的に走査された後、瞳投影レンズ４５、ダイクロイックミラー９７、結像レンズ４３およびノッチ型ダイクロイックミラー１００を透過して、高倍対物レンズ３９によりウエルＷ内のスフェロイドＳに対して鉛直下方から照射される。超短パルス赤外レーザ光が照射されることによりスフェロイドＳにおいて発生した蛍光は、高倍対物レンズ３９により集光されてレーザ光の光路を戻り、ノッチ型ダイクロイックミラー１００および結像レンズ４３を透過してダイクロイックミラー９７により反射された後、集光レンズ９９により集光されて光検出器５７により検出される。
【００９８】
上述した第１撮像部８３の低倍対物レンズ８７の光軸と第２撮像部８５の高倍対物レンズ３９の光軸は、マイクロプレート１３のウエルピッチ３つ分（Ｎ＝３）だけ離れて配置される。より具体的には、低倍対物レンズ８７の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸は、互いにＸ方向にウエルＷ３つ分だけ距離をあけて配置される。
【００９９】
上記構成の顕微鏡装置８１の作用について、図３〜図５のフローチャートを参照して説明する。本実施形態において採用するマイクロプレート１３は、ウエル数が１２×８＝９６個（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）であるので、ｍ＝１２、ｎ＝８である。また、低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸の間隔（Ｎ）はＮ＝３である。
【０１００】
本実施形態に係る顕微鏡装置８１によりマイクロプレート１３の各ウエルＷに収容されているスフェロイドＳを観察するには、図３のフローチャートに示されるように、まず、第１撮像部８３により先読みする。
【０１０１】
具体的には、まず、制御器１１により、ｉ＝１、ｊ＝１が設定される（ステップＳＡ１）。そして、制御器１１により可動ステージ３が駆動されることによって、図６に示すように、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝８）まで、各ウエルＷの中心位置が第１撮像部８３の低倍対物レンズ８７の光軸上に順に移動されて、ステップＳＡ２〜ＳＡ７が実施される。
【０１０２】
ウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝８）までステップＳＡ２〜ＳＡ７が実施されると、すなわち、設定がｉ＝３、ｊ＝８まで変更されると、ｊ＝ｎを満たすことから（ステップＳＡ６「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝Ｎか否かが判断される（ステップＳＡ８）。本実施形態においては低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸の間隔（Ｎ）がＮ＝３であるから（ステップＳＡ８「ＹＥＳ」）、先読みは終了する。
【０１０３】
次に、図４に示すフローチャートに示されるように、制御器１１により、ｉ＝ｉ＋１、すなわちこの場合はｉ＝４、ｊ＝８に設定される（ステップＳＢ１）。そして、制御器１１により可動ステージ３が駆動されることによって、第１撮像部５および第２撮像部７に対してウエルＷが移動され、各ウエルＷに対して、第２撮像部７によりステップＳＢ２〜ＳＢ８が繰り返されるとともに、第１撮像部５によりステップＳＡ３´，ＳＡ４´が繰り返される。
【０１０４】
具体的には、一方のプロセスでは、第２撮像部８５に対して、図７に示すように、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝１）まで、ウエルＷ内のスフェロイドＳの中心位置が高倍対物レンズ３９の光軸に順に合わせられて、ステップＳＢ２〜ＳＢ８が繰り返される。そして、コンピュータ９により、スフェロイドＳごとに３次元的なＸＹＺ画像が生成される。
【０１０５】
もう一方のプロセスでは、第１撮像部８３に対して、図６に示すように、ウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝４、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝５、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝６、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝７、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝８、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝９、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）まで、各ウエルＷが低倍対物レンズ８７の光軸上に順に移動されて、ステップＳＡ３´，ＳＡ４´が繰り返される。
【０１０６】
このとき、上記２つのプロセスにおいて、制御器１１により、各ウエルＷ内のスフェロイドＳに対する第２撮像部７による撮像データの取得（ステップＳＢ６）と、第１撮像部５による別のウエルＷ内のスフェロイドＳに対する撮像データの取得（ステップＳＡ３´）とが同期される。
【０１０７】
ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）までステップＳＡ３´，ＳＡ４´が実施されると、すなわち、設定がｉ＝１２、ｊ＝１まで変更されると（ステップＳＢ９「ＹＥＳ」、ステップＳＢ１１「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝ｍか否かが判断される（ステップＳＢ１２）。本実施形態においてはｍ＝１２であるから（ステップＳＢ１２「ＹＥＳ」）、第１撮像部５による撮像データの取得は終了する。
【０１０８】
次に、図５のフローチャートに示されるように、制御器１１により、ｉ＝ｉ＋１、すなわちこの場合はｉ＝１３、ｊ＝１に設定される（ステップＳＢ１）。そして、第１撮像部８３による撮像データの取得は終了した状態で、第２撮像部８５により、ウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１０、ｊ＝８）→ウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１１、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）まで、ステップＳＢ１〜ＳＢ１１が実施される。
【０１０９】
ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）までステップＳＢ２〜ＳＢ１１が実施されると、すなわち、設定がｉ＝１５、ｊ＝８まで変更されると、ｊ＝ｎを満たすことから（ステップＳＢ１０「ＹＥＳ」）、制御器１１により、現在の設定がｉ＝ｍ＋Ｎか否かが判断される（ステップＳＢ１２´）。本実施形態においてはｍ＝１２、Ｎ＝３であるから（ステップＳＢ１２´「ＹＥＳ」）、第２撮像部７による撮像データの取得も終了する。最後に、コンピュータ９により、スフェロイドＳごとに３次元的なＸＹＺ画像が生成されて、撮影は終了する。
【０１１０】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置８１によっても、制御器１１が、第２撮像部８５による撮像データの取得に同期して、第１撮像部８３により別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを取得させることによって、第１実施形態と同様の効果が期待できる。また、本実施形態においては、各ウエルＷに収容されている複数のスフェロイドＳをそれぞれウエルＷに対応付けて、各スフェロイドＳの中心位置と球面収差補正値を決定し、第２撮像部８５による撮像データの取得に利用することができる。
【０１１１】
また、本実施形態においては、第１撮像部８３が倒立型によって構成され、偏射照明が可能な透過照明装置８９が低倍対物レンズ８７の光軸上に付加される。この構成により、第１撮像部８３において、コントラストの高い良好な撮像データを取得することができる。また、第２撮像部８５が、多光子励起顕微鏡で構成されていることによって、透明化処理がなされていない比較的大きなスフェロイドＳに対しても良好な撮像データを取得することができるという利点がある。
【０１１２】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡装置（顕微鏡）について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１０１は、図９に示すように、低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸とが同軸上に配置されており、第１撮像部５が、少なくともＲ＝（ウエルピッチ＋ウエル直径）を半径とする領域を撮像可能な撮像領域を有している点で第１実施形態と異なる。図９において、図示していないが、顕微鏡装置１０１は、第１実施形態と同様に、反射照明装置３３およびカメラ３１を備えている。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡装置１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【０１１３】
本実施形態においては、制御器１１により可動ステージ３が駆動されることによって、図１０に示すように、第１撮像部５および第２撮像部７に対して、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝１）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝２）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝２）→ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝３）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝３）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝４）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝４）→ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝５）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝５）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝６）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝６）→ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝７）からウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝７）→ウエルＷ（ｉ＝１２、ｊ＝８）からウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）の順に移動される。
【０１１４】
最初に、第１撮像部５により、ウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データが取得される。図１０において、大円は第１撮像部５の撮像領域を概念的に表している。
【０１１５】
次いで、制御器１１により、第１撮像部５により取得されたウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データに基づいてコンピュータ９により決定されるそのスフェロイドＳの中心位置に従って可動ステージ３が駆動され、そのスフェロイドＳの中心位置が第２撮像部７の高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられる。
【０１１６】
そして、第２撮像部７によるウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データの取得と同期して、第１撮像部５によりウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データが取得される。
【０１１７】
次いで、制御器１１により、第１撮像部５により取得されたウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データに基づいてコンピュータ９により決定されるそのスフェロイドＳの中心位置に従って可動ステージ３が駆動され、そのスフェロイドＳの中心位置が第２撮像部７の高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられる。
【０１１８】
そして、第２撮像部７によるウエルＷ（ｉ＝２、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データの取得と同期して、第１撮像部５によりウエルＷ（ｉ＝３、ｊ＝１）のスフェロイドＳの撮像データが取得される。
【０１１９】
同様にして、図１０に示す矢印に従って、第１撮像部５および第２撮像部７に対してウエルＷが移動されながら、先に第１撮像部５により撮像データが取得されたウエルＷ内のスフェロイドＳに対する第２撮像部７による撮像データの取得と、第１撮像部５による別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データの取得とが同期して順に行われる。
【０１２０】
最後に、第１撮像部５により取得されたウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの撮像データに基づいてコンピュータ９により決定されるそのスフェロイドＳの中心位置に従って可動ステージ３が駆動され、そのスフェロイドＳの中心位置が第２撮像部７の高倍対物レンズ３９の光軸に合わせられる。
【０１２１】
そして、第１撮像部５による撮像データの取得は終了した状態で、第２撮像部７によりウエルＷ（ｉ＝１、ｊ＝８）のスフェロイドＳの撮像データが取得され、コンピュータ９によりそのスフェロイドＳのＸＹＺ画像が生成されると、撮影は終了する。
【０１２２】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置によっても、制御器１１が、第２撮像部７による撮像データの取得に同期して、第１撮像部５により別のウエルＷ内のスフェロイドＳの撮像データを取得させることによって、第１実施形態と同様の効果がある。特に、本実施形態においては、９６個のウエルＷの内、９４個のウエルＷに対して、第１撮像部５と第２撮像部７とが同期してスフェロイドＳの撮像データを取得するので、非常に高いスループットを達成することができる。
【０１２３】
上記第１、第２実施形態においては、例えば、ウエル数が１５３６個（ｉ＝１〜４８、ｊ＝１〜３２）で、ウエルピッチが２．２５ｍｍのマイクロプレートを基準として、低倍対物レンズ２１の光軸と高倍対物レンズ３９の光軸とを互いに４．５ｍｍ、９ｍｍまたは１８ｍｍ離して配置することとしてもよい。
【０１２４】
こうすることによって、ウエル数が３８４個（ｉ＝１〜２４、ｊ＝１〜１６）で、ウエルピッチが４．５ｍｍのマイクロプレート、ウエル数が９６個（ｉ＝１〜１２、ｊ＝１〜８）で、ウエルピッチが９ｍｍのマイクロプレート１３、および、ウエル数が２４個（ｉ＝１〜６、ｊ＝１〜４）で、ウエルピッチが１８ｍｍのマイクロプレートのいずれにも対応することができる。
【０１２５】
また、上記各実施形態においては、複数のウエルＷが方形状に配列されているマイクロプレート１３を例示して説明したが、これに代えて、複数のウエルＷが周方向に間隔をあけて円環状に配列されているマイクロプレートを採用することとしてもよい。この場合、マイクロプレートを回転させる回転ステージ採用し、可動ステージ３が、この回転ステージをＸ方向およびＹ方向に移動させることとすればよい。
【０１２６】
複数のウエルＷが１列の円環状に配列されたマイクロプレートに対しては、低倍対物レンズ２１，８７と高倍対物レンズ３９とを周方向にウエルピッチの整数倍（Ｎ)の間隔をあけて配置することとすればよい。
【０１２７】
複数のウエルＷが径方向に位置をずらした複数列の円環状に配列されたマイクロプレートに対しては、低倍対物レンズ２１，８７と高倍対物レンズ３９とを周方向に間隔をあけて配置するとともに、移動手段を設けることによって、撮像データを取得するウエルＷの列を変更する場合に第１撮像部５の位置を調整することとすればよい。
【０１２８】
また、低倍対物レンズ２１，８７と高倍対物レンズ３９は、径方向にウエルピッチの整数倍（Ｎ）の間隔をあけて配置することとしてもよい。ウエルピッチが回転角度で決められている場合は、低倍対物レンズ２１，８７および高倍対物レンズ３９に対して、ウエルＷの列に関わらず同じ回転角度でマイクロプレートを回転させることとすればよい。また、ウエルピッチが距離で決められている場合は、低倍対物レンズ２１，８７および高倍対物レンズ３９に対して、ウエルＷの列によってマイクロプレートの回転角度を変更することとすればよい。
【０１２９】
また、上記各実施形態においては、９６個のウエルＷを有する一般的なマイクロプレート１３を例示して説明したが、サンプル容器としては、一般的なマイクロプレートのウエルに限らない。例えば、ハンギングドロップを形成する支持体がアレイ配列されてなる基材に対しても適用することができる。
【０１３０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【０１３１】
また、例えば、上記各実施形態においては、低倍対物レンズ２１，８７および高倍対物レンズ３９を例示して説明したが、第２撮像部７が、第１撮像部５が有する第１対物レンズよりも倍率が高い第２対物レンズを有することとすればよく、これらに限定されるものではない。また、第１撮像部５、８３および第２撮像部７、８５の撮像領域も、上記各実施形態において例示した大きさに限定されるものではない。
【０１３２】
また、サンプルの代表位置として、スフェロイドＳの中心位置を例示して説明したが、スフェロイドＳにおいて基準となる位置であればよい。また、サンプルとして、スフェロイドＳを例示して説明したが、これに代えて、例えば、細胞、細胞組織またはオルガノイド等からなる生物由来材料等を採用してもよい。
【符号の説明】
【０１３３】
１、８１、１０１    顕微鏡装置（顕微鏡）
３                  可動ステージ
５、８３            第１撮像部
７、８５            第２撮像部
９                  コンピュータ（代表位置決定部、補正値決定部、像倍率調整部）
１１                制御器（制御部、像倍率調整部）
２１、８７          低倍対物レンズ（第１対物レンズ）
３３                反射照明装置
３９                高倍対物レンズ（第２対物レンズ）
４７                ＸＹガスバノミラースキャナ（走査部、像倍率調整部）
５７                光検出器（撮像画素数変更手段）
５９                補正環（球面収差補正部）
８９                透過照明装置
Ｓ                  スフェロイド（サンプル）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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