(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体、前記抗体の断片、前記抗体と薬物とのコンジュゲート、および、がんの処置のためにそれらを使用する方法の提供。【解決手段】式：Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎで示される抗体薬物コンジュゲート（式中、ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；Ｌはリンカーであり；Ｄは薬物部分であり；ｍは１〜８の整数であり；およびｎは１〜１０の整数である。）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２の全てのアイソフォームに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１のＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２のＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１のＶＬ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２のＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、請求項３に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のＶＨ領域、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のＶＬ領域を含む、請求項４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる、請求項５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記リンカーが、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル  ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項８】
前記薬物部分が、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項９】
下記式：
【化１】
2019193626.tif 000063
（式中、
Ａｂは、配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；および
ｎは１〜１０である）
を有する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１２】
ＦＧＦＲ２陽性またはＦＧＦＲ４陽性がんの処置における使用のための、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
チロシンキナーゼ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲまたはＭｅｔ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、請求項１から９のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗体または抗原結合性断片を生成するための方法であって、
請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程、および培養物から抗体を回収する工程を含む、方法。
【請求項１９】
抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結する工程；
（ｂ）前記リンカー−薬物を、請求項１８に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートする工程；および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体、抗体断片、抗体薬物コンジュ
ゲート、ならびにがんの処置のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
線維芽細胞増殖因子受容体
ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を通じてシグナル伝達する線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は
、基礎的な発達経路を調節して、多種多様な組織で発現される。ＦＧＦは、増殖、細胞遊
走、分化を刺激して、骨格発達および四肢発達、創傷治癒、組織修復、造血、血管形成お
よび腫瘍発生において重要な役割を果たす（例えば、Turner and Crose, Nature Reviews
Cancer 10: 116-129 (2010)を参照）。
【０００３】
哺乳動物ＦＧＦファミリーは、多くのリガンドを含み、これらは、４つの高度に保存さ
れた膜貫通チロシンキナーゼ受容体であるＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦ
ＧＦＲ４を通じてそれらの作用を発揮する。典型的なＦＧＦＲは、切断されるシグナルペ
プチド、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（ＩｇドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ
）、酸性ボックス、膜貫通ドメイン、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有す
る（例えば、Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 203 (1990)、Johnson and Williams,
Adv. Cancer Res. 60: 1-41 (1992)を参照）。
【０００４】
さらに、転写された受容体遺伝子の選択的スプライシングは、可溶性の分泌ＦＧＦＲ、
切断型ＣＯＯＨ末端ドメインを有するＦＧＦＲ、２つまたは３つのいずれかのＩｇ様ドメ
インを有するＦＧＦＲを含む様々な受容体アイソフォームをもたらし、ならびに第３のＩ
ｇ様ドメインの選択的スプライシングを介して生じるＦＧＦＲアイソフォームは、ＦＧＦ
Ｒ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３に関してのみ行われ、第３のＩｇ様ドメインの後半を
特定し、受容体のＩＩＩｂまたはＩＩＩｃアイソフォームをもたらす。受容体の第２およ
び第３のＩｇ様ドメインは、リガンド結合に関して必要かつ十分であるのに対して、第１
のＩｇ様ドメインは、受容体自己抑制において役割を果たすと考えられている。したがっ
て、異なる受容体およびそれらのアイソフォームは、異なるリガンド結合特異性を示す（
例えば、Haugsten et al., Mol. Cancer Res. 8:1439-1452 (2010)を参照）。
【０００５】
ＦＧＦはまた、別個のＦＧＦＲおよびそれらのスプライス変異体への結合に加えて、ヘ
パリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する。それにより、二量体ＦＧＦ−ＦＧ
ＦＲ−ＨＳＰＧ三元複合体が、細胞表面上に形成される。三元複合体は、複合体中の異な
る構成成分間の多重相互作用により安定化される。２つのＦＧＦ結合部位であるヘパリン
結合部位および受容体間相互作用部位は、受容体のＩｇ様ドメインＩＩおよびＩＩＩ内で
同定されている（Haugsten et al., 2010）。
【０００６】
ＦＧＦの、ＦＧＦＲへの結合は、受容体二量体形成を誘導し、これにより、キナーゼド
メインの活性化ループ中のチロシンのリン酸転移が可能となる。活性なＦＧＦＲは、ＦＲ
Ｓ２およびＰＬＣγのような多重細胞内タンパク質をリン酸化することが知られている（
Eswarakumar et al., Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149 (2005)）。ＦＧＦＲシグ
ナル伝達は、細胞増殖および生存の刺激から成長停止、遊走および分化に及ぶ異なる細胞
型における別個の生物学的応答を生じる。
【０００７】
ＦＧＦＲおよびがん
ＦＧＦシグナル伝達は、効果：成長／生存における自己充足性（self-sufficiency）、
血管新生および腫瘍細胞遊走の強力な組合せを媒介する。その結果として、ＦＧＦシグナ
ル伝達は、その生理学的機能で発揮される厳格な調節がいったん失われると、強力に発が
ん性となる可能性がある（例えば、Heinzle et al., Expert Opin. Ther. Targets 15（7
）:829-846 (2011)を参照）。
【０００８】
ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の遺伝子増幅および／または過剰発現は、乳
がんに関与している（Penault-Llorca et al., Int J Cancer 1995、Theillet et al., G
enes Chrom. Cancer 1993、Adnane et al., Oncogene 1991、Jaakola et al., Int J Can
cer 1993、Yamada et al., Neuro Res 2002）。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４の過剰発現
はまた、膵臓腺がんおよび星状細胞腫と関連付けられている（Kobrin et al., Cancer Re
search 1993、Yamanaka et al., Cancer Research 1993、Shah et al., Oncogene 2002、
Yamaguchi et al., PNAS 1994、Yamada et al., Neuro Res 2002）。前立腺がんもまた、
ＦＧＦＲ１過剰発現に関連する（Giri et al., Clin Cancer Res 1999）。ＦＧＦＲ４過
剰発現は、横紋筋肉腫に関与している（Khan et al., Nature Medicine 2001、Baird et 
al., Cancer Res 2005）。胞巣状横紋筋肉腫のサブセットは、ＦＧＦＲ４を直接転写的に
活性化して、ＦＧＦＲ４タンパク質発現の増加をもたらす新規融合タンパク質を生じるＰ
ＡＸ３−ＦＯＸＯトランスロケーションを保有する（Cao et al., Cancer Res 2010、Dav
icioni et al., Cancer Res 2006）。
【０００９】
概して、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ１は、より一般的に遺伝子増幅により調節解除され
る。胃がんでは、増幅されたＦＧＦＲ２遺伝子は、予後不良と関連付けられる（Kunii et
al., Cancer Res. 68:2340-2348 (2008)）。また、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂからＩＩＩｃ
への切り換えは、膀胱がんおよび前立腺がんにおいて腫瘍進行、上皮間葉移行および高い
侵襲性の兆候となり得る。切り換えは、この場合、抗腫瘍原性活性を発揮するＩＩＩｂ受
容体変異体を、腫瘍形成誘発性（protumorigenic）ＩＩＩｃ受容体で置換する（例えば、
Heinzle et al., 2011を参照）。これまでのところ、ＦＧＦＲ２突然変異は、皮膚がん、
子宮内膜がん、卵巣がんおよび肺がんに関与している。ＦＧＦＲ４突然変異は、横紋筋肉
腫がん、肺がんおよび乳がんに関与している（例えば、Heinzle et al., 2011を参照）。
【００１０】
抗体薬物コンジュゲート
抗体薬物コンジュゲート（「ＡＤＣ」）は、がんの処置における細胞毒性剤の局所送達
のために使用されてきた（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３〜５４９，２００５を参照されたい）。ＡＤＣに
より、最小の毒性で最大の効能を達成することができる薬物部分の標的化された送達が可
能になる。ＡＤＣが有望な臨床結果を示すにつれて、がん療法のための新しい治療剤を開
発する必要性が増大する。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ（式中、ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ
４の両方に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり；Ｌはリンカーであ
り；Ｄは薬物部分であり；ｍは１〜８の整数であり；ｎは１〜１０の整数である）または
その薬学的に許容される塩の抗体薬物コンジュゲートを提供する。幾つかの実施形態では
、ｍは１である。幾つかの実施形態では、ｎは３または４である。特定実施形態では、ｍ
は１であり、ｎは３または４である。
【００１２】
本発明は、ヒトＦＧＦＲ２およびヒトＦＧＦＲ４に特異的に結合する抗体または抗原結
合性断片を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合
性断片は、ヒトＦＧＦＲ４およびヒトＦＧＦＲ２の全てのアイソフォームに特異的に結合
する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列
番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ
２上のエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗
体または抗原結合性断片は、配列番号１３７のアミノ酸残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（
Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）
、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７
（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に
記載する抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号
１３６または配列番号１４１を含むか、またはそれからなるヒトＦＧＦＲ２のエピトープ
に特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片
を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【００１４】
本発明の抗体、抗原結合性断片、および抗体薬物コンジュゲートはまた、ヒトＦＧＦＲ
４に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、それらは、ヒトＦＧＦＲ４のＤ１および
Ｄ２ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、それらは、ヒトＦＧＦＲ４の
Ｄ１またはＤ２ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載
する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）およ
び２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する。幾つかの
実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のア
ミノ酸残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）
、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９
（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ
）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０
６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に
結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、
配列番号１３２または配列番号１３３を含むか、またはそれからなるヒトＦＧＦＲ４のエ
ピトープに特異的に結合する。本発明はさらに、本明細書中に記載する抗体または抗原結
合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号
１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２の
エピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒ
ｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号
１３７のアミノ酸１６０〜１８９および／または配列番号１３７のアミノ酸１９８〜２１
６を含むエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する
抗体または抗原結合性断片は、配列番号１４２のアミノ酸１５０〜１７４および／または
配列番号１４２のアミノ酸２０１〜２１２を含むエピトープに特異的に結合する。幾つか
の実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号１３７の
アミノ酸１６０〜１８９および／または配列番号１３７のアミノ酸１９８〜２１６を含む
エピトープ、ならびに配列番号１４２のアミノ酸１５０〜１７４および／または配列番号
１４２のアミノ酸２０１〜２１２を含む第２のエピトープに特異的に結合する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本発明は、表１に記載する抗体、それらの抗原結合性断片、お
よびかかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。幾つか
の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１のＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶ
Ｈ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗体
および抗原結合性断片を提供し、ここで、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される
。幾つかの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断は、（ａ）配列番号１のＶＨ
ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３のＶＨ  ＣＤ
Ｒ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ａ）配列番号１１のＶＬ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番
号１２のＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号１３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領
域を含む。本発明はさらに、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲ
ートを提供する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号
７のＶＨ領域および配列番号１７のＶＬ領域を含む。幾つかの実施形態では、本明細書中
に記載する抗体は、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる。本発明はまた
、かかる抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、ヒトＦＧ
ＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に関して、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖
からなる抗体と交差競合する（cross compete）抗体または抗原断片である。本発明はま
た、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。
【００２０】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、配列番号
９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ
活性を有する。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片
は、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強さ
れたＡＤＣＣ活性を有さない。本発明はまた、かかる抗体または抗原結合性断片を含む抗
体薬物コンジュゲートを提供する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、モノクローナル抗体である。幾つ
かの実施形態では、本明細書中に記載する抗体は、モノクローナルヒトまたはヒト化抗体
である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片、
および薬物部分を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、ここで、薬物部分は、リンカー
を介して抗体または抗原結合性断片に連結され、上記リンカーは、切断性リンカー、非切
断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリン
カーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（
２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピ
リジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル
ヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベン
ゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイ
ミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジ
ル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）また
は２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ
−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１
３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架
橋試薬から誘導される。特定の実施形態では、リンカーは、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジ
ル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導され
る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片
、および薬物部分を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、ここで前記薬物部分は、Ｖ−
ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９
０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤（destab
ilizer）、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニン
アミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロ
テアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合
成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡ
Ｃ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤（DNA 
minor groove binder）およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。特定実施形態
では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの薬物部分は、メイタンシノイドである。別の特
定実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの薬物部分は、Ｎ（２’）−デアセチ
ル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）ま
たはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチ
ル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、下記式：
【００２５】
【化１】
2019193626.tif 000002
【００２６】
（式中、Ａｂは配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３の重
鎖ＣＤＲ３および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号
１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ
定義に従って規定され、ｎは１〜１０である）
を有する抗体薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を提供する。特定実
施形態では、ｎは３または４である。１つの実施形態では、Ａｂは、配列番号７のＶＨ領
域および配列番号１７のＶＬ領域を含む抗体である。別の実施形態では、Ａｂは、配列番
号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖からなる抗体である。
【００２７】
本発明はまた、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される
担体とを含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、凍
結乾燥物（lyophilisate）として調製される。幾つかの実施形態では、凍結乾燥物は、本
明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベー
ト２０を含む。
【００２８】
本発明は、それを必要とする患者におけるＦＧＦＲ２陽性またはＦＧＦＲ４陽性がんを
処置する方法であって、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物
を、上記患者に投与することを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態では、がんは、
胃がん、乳がん、横紋筋肉腫、肝臓がん、副腎がん、肺がん、食道がん、結腸がんおよび
子宮内膜がんからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは、胞巣状横紋
筋肉腫および胎児性横紋筋肉腫から選択される。幾つかの実施形態では、本明細書中に記
載する処置方法は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１
阻害剤または別のＦＧＦＲ２阻害剤を、上記患者に投与することをさらに含む。特定実施
形態では、処置方法は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１
−｛６−［４−（４−エチル−ピペリジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン
−４−イル｝−１−メチル−尿素またはその薬学的に許容される塩、例えばそのリン酸塩
と組み合わせて、本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする患
者に投与することを含む。ある特定の態様では、本発明はまた、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ
２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定さ
れない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性ながんを処置する方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、医薬としての使用のための本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲ
ートを提供する。本発明は、ＦＧＦＲ２陽性がんまたはＦＧＦＲ４陽性がんの処置におけ
る使用のための抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。本発明は、耐性が
ん、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤および
Ｍｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性であるが
んの処置における使用のための抗体薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片は、単鎖抗体
（ｓｃＦｖ）である。
【００３１】
本発明はまた、本明細書中に記載する抗体または抗原結合性断片をコードする核酸を提
供する。幾つかの実施形態では、本発明は、表１に記載するような抗体または抗原結合性
断片をコードする核酸を提供する。本発明はさらに、本明細書中に記載する核酸を含むベ
クター、およびかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３２】
本発明は、本明細書中に記載する宿主細胞を培養すること、および培養物から抗体を回
収することを含む、抗体または抗原結合性断片を生成するための方法を提供する。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結す
ること、（ｂ）上記リンカー−薬物を、細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートす
ること、および（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製することを含む、抗ＦＧＦＲ２およ
びＦＧＦＲ４抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法を提供する。幾つかの実施形
態では、上記方法に従って作製される抗体薬物コンジュゲートは、ＵＶ分光光度計を使用
して測定される、約３．５の平均ＤＡＲを有する。
【００３４】
本発明はまた、標識された本明細書中に記載する抗体もしくは抗原結合性断片、または
本明細書中に記載する抗体薬物コンジュゲートを含む診断試薬を提供する。幾つかの実施
形態では、標識は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオン
からなる群から選択される。
【００３５】
定義
別途記述しない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有
することが意図される。
【００３６】
用語「アルキル」とは、特定数の炭素原子を有する一価飽和炭化水素鎖を指す。例えば
、Ｃ１〜６アルキルとは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。アルキル基は
、直鎖状または分枝状であってもよい。代表的な分枝状アルキル基は、１、２、または３
個の分枝を有する。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチ
ル、プロピル（ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（ｎ−ブチル、イソブチル、
ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチル（ｎ−ペンチル、イソペンチル、および
ネオペンチル）、ならびにヘキシルが挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、非共有的に、可逆的に、および特異的様式で
対応する抗原に結合することができる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。
例えば、天然のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの
重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細
書でＶＨと省略される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのド
メイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細
書でＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのド
メイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼
ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領
域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端
に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、お
よびＦＲ４に配置される３つのＣＤＲと、４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の
可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の
様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）など
の、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００３８】
用語「抗体」は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化
抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対
する抗Ｉｄ抗体など）を含む。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、
ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１
、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであってもよい。
【００３９】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域（「ＣＤＲ」）」は、ＶＬおよびＶＨ
の超可変領域を互換的に指す。ＣＤＲは、そのような標的タンパク質に対する特異性を担
持する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬまたはＶＨ中には３つのＣＤ
Ｒ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けられる）が存在し、可変ドメインの約１
５〜２０％を占める。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、か
くして、結合特異性を直接担う。ＶＬまたはＶＨの残りのストレッチ、いわゆるフレーム
ワーク領域は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Kuby, Immunology, 4th ed., Cha
pter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００４０】
ＣＤＲとフレームワーク領域の位置を、当業界における様々な周知の定義、例えば、Ｋ
ａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ
）（ワールドワイブウェブ上でimgt.cines.fr/にて）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et
al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 19
6:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J.
Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1
997)を参照されたい）を使用して決定することができる。抗原結合部位の定義は、以下に
も記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); およびLefr
anc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol
., 262:732-745 (1996); およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-
9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); およびRees et 
al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University 
Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００４１】
軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分割される。用語「定常」
および「可変」は機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）部分
の両方の可変ドメインポーションが抗原認識および特異性を決定付けることが理解される
。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分
泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例
により、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端
からより遠くなるにつれて増大する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である
；ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを
実際に含む。
【００４２】
本明細書で使用される用語「抗原結合性断片」とは、抗原のエピトープと特異的に相互
作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間分布により）能力を保持す
る抗体の１または複数のポーションを指す。結合断片の例としては、限定されるものでは
ないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断
片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断
片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶ
ＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al
., Nature 341:544-546, 1989）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、また
は抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられる。
【００４３】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされ
るが、それらを、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子（一
本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を形成する単一タンパク質鎖として作製することができる合成
リンカーにより連結することができる；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 19
88;およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照されたい
。そのような一本鎖抗体も、用語「抗原結合性断片」内に包含されることが意図される。
これらの抗原結合性断片は、当業者には公知の従来の技術を使用して得られ、その断片は
インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００４４】
抗原結合性断片を、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イン
トラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃ
Ｆｖ（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参
照されたい）中に組込むこともできる。抗原結合性断片を、ＩＩＩ型フィブロネクチン（
Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場中に移植することができる（フィブロネクチン
ポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。
【００４５】
抗原結合性断片を、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する並
列Ｆｖセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組込むことがで
きる（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995; および米国特許第５，６４１
，８７０号）。
【００４６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物
」は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝的起源から誘導される抗
体および抗原結合性断片などのポリペプチドを指す。この用語はまた、単一分子組成の抗
体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の
結合特異性および親和性を示す。
【００４７】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方が
ヒト起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を
含有する場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、また
はヒト生殖系列配列の変異型または例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86,
2000に記載のような、ヒトフレームワーク配列分析から誘導されるコンセンサスフレー
ムワーク配列を含有する抗体から誘導される。
【００４８】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例
えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ
ｖｉｖｏでの体細胞変異により、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置
換により導入される突然変異）。
【００４９】
本明細書で使用される用語「親和性」とは、単一の抗原部位での抗体と抗原との相互作
用の強度を指す。それぞれの抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有力
を介して、いくつかの部位で抗原と相互作用する；相互作用が大きくなるほど、親和性が
強くなる。
【００５０】
用語「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない
抗体を指す。しかしながら、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原
との交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／また
は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５１】
用語「対応するヒト生殖系列配列」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列に
よりコードされる他の全ての既知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミ
ノ酸配列またはサブ配列と最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域
アミノ酸配列またはサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列は
また、他の全ての評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配
列またはサブ配列と最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列また
はサブ配列を指してもよい。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相
補性決定領域のみ、フレームワーク領域と相補性決定領域、可変セグメント（上記で定義
されたもの）、または可変領域を含む配列もしくはサブ配列の他の組合せであってもよい
。例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、または当業界で公知の別のアラインメントアルゴリ
ズムを使用して２つの配列を整列させる、本明細書に記載の方法を使用して、配列同一性
を決定することができる。対応するヒト生殖系列核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領
域核酸またはアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、
９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有してもよい。相当す
るヒト生殖系列配列は、例えば、公開されている国際IｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデー
タベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイブウェブ上でimgt.cines.fr/にて）およびＶ−ｂａ
ｓｅ（ワールドワイブウェブ上でvbase.mrc-cpe.cam.ac.ukにて）によって決定すること
ができる。
【００５２】
抗原（例えば、タンパク質）と抗体、抗体断片、または抗体由来結合剤との間の相互作
用を記述する文脈で使用される場合の語句「特異的に結合する」または「選択的に結合す
る」は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中の、例えば、生物試料、例えば、血
液、血清、血漿または組織試料中の、抗原の存在を決定する結合反応を指す。かくして、
ある特定の指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の結合特異性を有する抗体または
結合剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する
他の抗原に有意な量で実質的に結合しない。一実施形態では、指定のイムノアッセイ条件
下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、バックグラウンドの少なくとも１
０倍、特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原に有意な量で実質的に結合しない
。そのような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対する
その特異性について抗体または薬剤を選択する必要があってもよい。望ましい場合または
適切な場合、この選択を、他の種（例えば、マウスもしくはラット）または他のサブタイ
プに由来する分子と交差反応する抗体を除去することにより達成することができる。ある
いは、いくつかの実施形態では、ある特定の所望の分子と交差反応する抗体または抗体断
片を選択する。
【００５３】
「特異的に結合する」という用語は、エピトープと抗体、抗体断片または抗体由来の結
合性作用物質（binding agent）との間の相互作用について記載する状況で使用する場合
、エピトープが直鎖状であろうと、立体構造的であろうと、そのエピトープを見つけて、
それと相互作用する（例えば、結合する）抗体または抗原結合性断片を指す。用語「エピ
トープ」とは、本発明の抗体または抗原結合性断片が特異的に結合する抗原上の部位を指
す。エピトープは、タンパク質の三次元折畳みにより並置される連続的アミノ酸または非
連続的アミノ酸の両方から形成させることができる。連続的アミノ酸から形成されるエピ
トープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次元折畳みにより形成
されるエピトープは典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典
型的には、ユニークな空間的コンフォメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８
、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間
的コンフォメーションを決定する方法は、当業界における技術、例えば、ｘ線結晶学およ
び２次元核磁気共鳴を含む（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecu
lar Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい）。
【００５４】
様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体
を選択することができる。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するた
めには、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応
性を決定するのに使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明については
、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい）。
典型的には、特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２
倍、より典型的には、バックグラウンドの少なくとも１０〜１００倍のシグナルをもたら
す。
【００５５】
用語「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」とは、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度
定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算したものを指す。当業界における任意の公知の方
法を使用して、平衡解離定数を測定することができる。本発明の抗体は一般に、約１０−
７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、いくつかの実
施形態では、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有
する。
【００５６】
用語「バイオアベイラビリティ」とは、患者に投与される所与の量の薬物の全身利用能
（すなわち、血液／血漿レベル）を指す。バイオアベイラビリティは、投与される剤形（
dosage form）から全身循環に達する薬物の時間（速度）と総量（程度）の両方の尺度を
示す絶対項である。
【００５７】
本明細書で使用される語句「から本質的になる」とは、方法または組成物中に含まれる
活性薬剤の属または種、ならびに方法または組成物の意図される目的にとって不活性な任
意の賦形剤を指す。いくつかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗
体薬物コンジュゲート以外の１または複数のさらなる活性剤の含有を明確に排除する。い
くつかの実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗体薬物コンジュゲート
以外の１または複数のさらなる活性剤と、第２の同時投与される薬剤との含有を明確に排
除する。
【００５８】
用語「アミノ酸」とは、天然の、合成の、および非天然のアミノ酸、ならびに天然のア
ミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミ
ノ酸は、遺伝子コードによりコードされるもの、ならびに後に改変されるアミノ酸、例え
ば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである
。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水
素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチ
オニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したα−炭素を指す。そのよ
うな類似体は改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有する
が、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般
的化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似する様式で機能する化合物を
指す。
【００５９】
用語「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用され
る。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントとは、同一の、もしくは本
質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない
場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重性のため、多数の機能的に同一の
核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ
およびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。かくして、アラニンがあるコドン
によって特定される全ての位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変化させ
ることなく記載される対応するコドンのいずれかに変化させてもよい。そのような核酸変
化は「サイレント変異」であり、保存的に改変されたバリアントの１種である。ポリペプ
チドをコードする全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を記述する
。当業者であれば、核酸中のそれぞれのコドン（通常はメチオニンのための唯一のコドン
であるＡＵＧと、通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改
変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識できる。従って、ポリペプチ
ドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異は、それぞれ記載される配列中で暗黙的
である。
【００６０】
ポリペプチド配列について、「保存的に改変されたバリアント」は、あるアミノ酸の、
化学的に類似するアミノ酸との置換をもたらすポリペプチド配列に対する個々の置換、欠
失または付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業界で周
知である。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間
相同体、および対立遺伝子だけでなく、それを排除しない。以下の８群は、互いに保存的
置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギ
ン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）ア
ルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン
（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン
（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニ
ン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。いくつかの実施形態
では、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響
しないか、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指すように使用される。
【００６１】
本明細書で使用される用語「最適化された」とは、生成細胞または生物、一般には、真
核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア（Pichia）細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Trichode
rma）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞において好まし
いコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変化させたヌクレオチド配列を指す
。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られる、出発ヌクレオチド配
列により元々コードされるアミノ酸配列を完全に、またはできるだけ多く保持するように
操作される。
【００６２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一であるパーセント」
または「同一性パーセント」とは、２つ以上の配列またはサブ配列が同じである程度を指
す。２つの配列は、それらが比較される領域にわたってアミノ酸またはヌクレオチドの同
じ配列を有する場合、「同一」である。２つの配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１
つを使用して、もしくは手動によるアラインメントおよび視覚的検査により測定される比
較ウィンドウ、または指定の領域にわたって最大の一致のために比較および整列された場
合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特
定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって６０％の同一性、任
意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の
同一性）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、
長さ少なくとも約３０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、また
はより好ましくは、長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド（または２
０、５０、２００以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００６３】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として
作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列とをコンピュータ
に入力し、サブ配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメー
ターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用するか、または代替パラメー
ターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータ
ーに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントを算出する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後
に、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通
常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続す
る位置数の任意の１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメ
ントの方法は、当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントを、例え
ば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の部分相同性アルゴリズムに
より、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントア
ルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)
の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
ＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または
手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Brent et al., Current Protocol
s in Molecular Biology, 2003を参照されたい）により行うことができる。
【００６５】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの２
つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ
、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；およびAltschul et al., J.
Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソ
フトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公共的に利用可能である。このアルゴリズムは、データ
ベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴ
と一致するか、またはそれを満足する、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定すること
により高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近隣ワード
スコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、supra）。これらの初期近隣ワードヒットは、
それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するための種子として作用
する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる限りそれぞ
れの配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアを、ヌクレオチド配列については
、パラメーターＭ（一致する残基の対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不
一致の残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列に
ついては、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。それぞれの方
向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ
減少する場合、停止される；１または複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のた
め、累積スコアはゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴ
アルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定
する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、１
１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使
用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３の
ワード長、および１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリック
ス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照され
たい）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および
両方の鎖の比較を使用する。
【００６６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば
、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照された
い）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオ
チドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指示を提供する、最小合計確率（Ｐ
（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．２
未満、より好ましくは、約０．０１未満、および最も好ましくは、約０．００１未満であ
る場合、核酸は参照配列と類似すると考えられる。
【００６７】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０ウェイト残テーブル（weig
ht residue table）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用
して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Mil
ler, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988のアルゴリズムを使用して決定することもで
きる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マト
リックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、
または４のギャップ重量および１、２、３、４、５または６の長さ重量を使用して、ＧＣ
Ｇソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）
に組み込まれたNeedleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970のアルゴリズム
を使用して決定することができる。
【００６８】
上記の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質
的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、第１の核酸によりコードされる
ポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫
学的に交差反応することである。かくして、例えば、２つのペプチドが保存的置換によっ
てのみ異なる場合、ポリペプチドは典型的には第２のポリペプチドと実質的に同一である
。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指示は、以下に記載のように、２つの
分子またはその相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることで
ある。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指示は、同じプライマーを
使用してその配列を増幅することができることである。
【００６９】
用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、一本
鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリ
マーを指す。この用語は、合成である、天然である、および非天然である、参照核酸と類
似する結合特性を有する、ならびに参照ヌクレオチドと類似する様式で代謝される、公知
のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含する
。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート（ph
osphorothioate）、ホスホルアミデート（phosphoroamidate）、メチルホスホン酸、キラ
ル−メチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙
げられる。
【００７０】
別途指摘しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば
、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列も暗示的に包含する
。特に、以下に詳述されるように、１または複数の選択された（または全ての）コドンの
第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成する
ことにより、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer et al., (1991) Nucleic 
Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; およびRo
ssolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
【００７１】
核酸の文脈における用語「作動可能に連結された」とは、２つ以上のポリヌクレオチド
（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写される
配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターまたはエンハンサ
ー配列が適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュ
レートする場合、それはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配
列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列に対して物理的
に連続している、すなわち、それらはｃｉｓ作用性である。しかしながら、エンハンサー
などのいくつかの転写調節配列は、それらが転写を増強するコード配列に対して物理的に
連続しているか、またはそれに近接して位置する必要はない。
【００７２】
用語「ポリペプチド」と「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すように本
明細書では互換的に使用される。この用語は、１または複数のアミノ酸残基が対応する天
然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーお
よび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別途指摘しない限り、特定のポリペプチド配
列は、保存的に改変されたそのバリアントも暗示的に包含する。
【００７３】
本明細書で使用される用語「イムノコンジュゲート」または「抗体薬物コンジュゲート
」または「コンジュゲート」は、抗体またはその抗原結合性断片と、化学療法剤、毒素、
免疫治療剤、画像化プローブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または
静電力などを介する非共有相互作用であってもよい。当業界で公知の様々なリンカーを使
用して、イムノコンジュゲートを形成させることができる。さらに、イムノコンジュゲー
トを、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現させることができる
融合タンパク質の形態で提供することができる。本明細書で使用される場合、「融合タン
パク質」とは、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を元々コードし
ていた２つ以上の遺伝子または遺伝子断片の連結により作出されるタンパク質を指す。融
合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質の各々から誘導される機能特性を有する単一のタンパ
ク質をもたらす。
【００７４】
「塩（単数）」または「塩（複数）」という用語は、化合物の酸付加または塩基付加塩
、例えば、本発明の抗体薬物コンジュゲートと組み合わせて投与される別の治療剤である
化合物を指す。「塩」は、特に「薬学的に許容される塩」を含む。「薬学的に許容される
塩」という用語は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、通常、生物学的に、ま
たは他の点で望ましくない塩を指す。多くの場合、化合物は、アミノ基および／またはカ
ルボキシル基またはそれらに類似した基の存在によって酸および／または塩基の塩を形成
することが可能である。
【００７５】
用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例え
ば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ
、両生類、および爬虫類を含む。注記しない限り、用語「患者」または「対象」は、互換
的に本明細書に使用される。
【００７６】
本明細書で使用される用語「細胞毒素」または「細胞毒性剤」は、細胞の成長および増
殖にとって有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少させる、阻害する、または破壊するよ
うに作用することができる任意の薬剤を指す。
【００７７】
本明細書で使用される用語「抗がん剤」とは、限定されるものではないが、細胞毒性剤
、化学療法剤、放射線療法および放射線療法剤、標的化抗がん剤、ならびに免疫治療剤な
どの、がんなどの細胞増殖障害を処置するために使用することができる任意の薬剤を指す
。
【００７８】
本明細書で使用される用語「薬物部分」または「ペイロード」とは、本発明の抗体また
は抗原結合性断片にコンジュゲートされ、任意の治療剤または診断剤、例えば、抗がん剤
、抗炎症剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤）、ま
たは麻酔剤を含んでもよい化学部分を指す。例えば、薬物部分は、細胞毒のような抗がん
剤であり得る。特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０
阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリス
タチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ
）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおける
ホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤
、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損
傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤から
選択される。これらの各々を、抗体と適合するリンカーに結合させるための方法および本
発明の方法は、当業界で公知である。例えば、Singh et al., (2009) Therapeutic Antib
odies:  Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照されたい。さらに、ペイロー
ドは、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外線プローブ、親和性プ
ローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコー
ル、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体
断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、サッカリドまたはポリサッカ
リドであってもよい。
【００７９】
用語「メイタンシノイド薬物部分」は、メイタンシノイド化合物の構造を有する抗体薬
物コンジュゲートの下部構造を意味する。メイタンシノイドは、東アフリカの低木メイテ
ナス・セラタ（Maytenus serrata）から初めて単離された（米国特許第３，８９６，１１
１号）。その後、ある特定の微生物も、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノール
エステルなどのメイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，
０４２号）。合成メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が報告されている。米
国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第
４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０
７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２
８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第
４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６
４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６
３号；および第４，３７１，５３３号、ならびにKawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull
. 3441-3451（それぞれ参照により明示的に組み込まれる）を参照されたい。コンジュゲ
ーションにとって有用な特定のメイタンシノイドの例としては、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤ
Ｍ４が挙げられる。
【００８０】
「腫瘍」とは、悪性であっても、または良性であっても、新生物性細胞成長および増殖
、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。
【００８１】
用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存能力、または転移活性の速度の低下を意
味する。例えば、抗腫瘍活性は、治療法中に生じる異常細胞の成長速度の低下または腫瘍
サイズの安定性もしくは低減、または治療法を用いない対照と比較した場合の治療法に起
因したより長い生存により示され得る。そのような活性を、限定されるものではないが、
異種移植片モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査するため
の当業界で公知の他のモデルなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルに
おいて受け入れられるものを使用して評価することができる。
【００８２】
用語「悪性腫瘍」とは、非良性腫瘍またはがんを指す。本明細書で使用される用語「が
ん」は、脱調節された、または制御されない細胞成長を特徴とする悪性腫瘍を含む。例示
的ながんとしては、がん腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が挙げられる。
【００８３】
用語「がん」は、原発性悪性腫瘍（例えば、細胞が元の腫瘍部位以外の対象の身体部位
に移動していないもの）および二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる第２の部
位への腫瘍細胞の移動である転移から生じるもの）を含む。
【００８４】
「ＦＧＦＲ２」という用語は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの成員であ
る線維芽細胞増殖因子受容体２を指す。ＦＧＦＲ２の核酸およびアミノ酸配列は公知であ
り、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１．４、ＮＭ＿００１１４４９１３．１、
ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿００１１４４９１５．１、ＮＭ＿００１１４４９
１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．１、ＮＭ＿００１１４４９１８．１、ＮＭ＿００
１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７０．３、ＮＭ＿０２３０２９．２で公開されてい
る。構造的には、ＦＧＦＲ２アミノ酸配列は、切断されるシグナルペプチド、少なくとも
１つまたは複数の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、酸性ボックス、膜貫通ドメイン、
およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有する受容体チロシンキナーゼタンパク質
であり、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１４１．４、ＮＭ
＿００１１４４９１３．１、ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿００１１４４９１５
．１、ＮＭ＿００１１４４９１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．１、ＮＭ＿００１１
４４９１８．１、ＮＭ＿００１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７０．３、ＮＭ＿０２
３０２９．２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。構造的に
は、ＦＧＦＲ２核酸配列は、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００
０１４１．４、ＮＭ＿００１１４４９１３．１、ＮＭ＿００１１４４９１４．１、ＮＭ＿
００１１４４９１５．１、ＮＭ＿００１１４４９１６．１、ＮＭ＿００１１４４９１７．
１、ＮＭ＿００１１４４９１８．１、ＮＭ＿００１１４４９１９．１、ＮＭ＿０２２９７
０．３、ＮＭ＿０２３０２９．２の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有
する。
【００８５】
「ＦＧＦＲ４」という用語は、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーの成員であ
る線維芽細胞増殖因子受容体４を指す。ＦＧＦＲ４の核酸およびアミノ酸配列は公知であ
り、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、ＮＭ＿
２１３６４７．１で公開されている。構造的には、ＦＧＦＲ４アミノ酸配列は、切断され
るシグナルペプチド、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、酸性ボックス、膜貫通
ドメイン、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを有する受容体チロシンキナーゼ
タンパク質であり、その完全長にわたって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１
．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、ＮＭ＿２１３６４７．１のアミノ酸配列と少なくとも約
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ま
たは１００％配列同一性を有する。構造的には、ＦＧＦＲ４核酸配列は、その完全長にわ
たって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０１１．３、ＮＭ＿０２２９６３．２、Ｎ
Ｍ＿２１３６４７．１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
【００８６】
「ＦＧＦＲ２／４」という用語は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４を指すのに本明細書中
で使用される。例えば、ＦＧＦＲ２／４に結合する抗体は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４
に結合する抗体を指す。
【００８７】
「ＦＧＦＲ２発現性がん」または「ＦＧＦＲ２陽性がん」という用語は、がん細胞の表
面上にＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２の突然変異形態を発現するがんを指す。「ＦＧＦＲ４
発現性がん」または「ＦＧＦＲ４陽性がん」という用語は、がん細胞の表面上にＦＧＦＲ
４またはＦＧＦＲ４の突然変異形態を発現するがんを指す。
【００８８】
「チロシンキナーゼ耐性がん」または「チロシンキナーゼ耐性腫瘍」という用語は、（
１）開始するケアチロシンキナーゼ処置の規格に応答せず、「新生耐性」と称されるがん
または腫瘍、または（２）最初はケアチロシンキナーゼ処置の規格に応答し、古い、およ
び／または新しい病変または伝播の再出現により決定されるように、その後進行するがん
または腫瘍を指し、これらはまた、「二次耐性」または「再発したがん」とも称される。
【００８９】
「Ｈｅｒ２耐性がん」または「Ｈｅｒ２耐性腫瘍」という用語は、（１）開始するケア
Ｈｅｒ２処置の規格に応答せず、「新生耐性」と称されるがんまたは腫瘍、または（２）
最初はケアＨｅｒ２処置の規格に応答し、古い、および／または新しい病変または伝播の
再出現により決定されるように、その後進行するがんまたは腫瘍を指し、これらはまた、
「二次耐性」または「再発したがん」とも称される。
【００９０】
本明細書で使用される場合、任意の疾患または障害の用語「処置する（治療する（trea
t））」、「処置すること（治療すること（treating））」または「処置（治療（treatme
nt））」とは、一実施形態では、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患または
少なくとも１つのその臨床症状の発生を減速させるか、または停止させるか、または軽減
すること）を指す。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」
とは、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメーターを軽減
または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」
または「処置」とは、疾患または障害を、物理的に（例えば、認識できる症状の安定化）
、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）、またはその両方で調節することを
指す。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」または「処置」とは、
疾患または障害の開始または発生または進行を遅延させることを指す。
【００９１】
用語「治療的に許容される量」または「治療有効用量」は、所望の結果（すなわち、腫
瘍サイズの低下、腫瘍成長の阻害、転移の防止、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫感染
の阻害または防止）を得るのに十分な量を互換的に指す。いくつかの実施形態では、治療
的に許容される量は、望ましくない副作用を誘導しない、または引き起こさない。幾つか
の実施形態では、治療上許容される量は、副作用（但し、患者の状態を考慮して、医療機
関により許容されるもののみ）を誘導するか、またそれを引き起こす。治療的に許容され
る量を、最初は低用量を投与し、次いで、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に
増加させることにより決定することができる。「予防有効用量」および「治療有効用量」
の本発明の分子は、がんと関連する症状などの疾患症状の、それぞれ、開始を防止するか
、またはその重症度の低下をもたらし得る。
【００９２】
用語「同時投与する」とは、個体の血液中の２つの活性薬剤の存在を指す。同時投与さ
れる活性薬剤を、同時に、または連続的に送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、組換えヒトＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂに対する抗体パネルに関する親和性推定値を示す。
【図２】図２（Ａ）〜図２（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体の、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２受容体系においてアゴニストとして作用する能力を示す。
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体の、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２受容体系においてアンタゴニストとして作用する能力を示す。
【図４−１】図４（Ａ）〜図４（Ｂ）は、ＳＮＵ１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。
【図４−２】図４（Ａ）〜図４（Ｂ）は、ＳＮＵ１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。
【図４−３】図４（Ｃ）は、ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー−ペイロードにコンジュゲートされるＡＤＣとしての１２４３３抗体の抗腫瘍活性を示し、図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの薬物動態特性を示す。
【図４−４】図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの薬物動態特性を示す。
【図４−５】図４（Ｆ）は、抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣパネルに関するＡＤＣクリアランスに対する抗腫瘍活性を示す。
【図５】図５（Ａ）〜図５（Ｃ）は、２時間後のＦＧＦＦＲ−２で増幅させた細胞株ＳＮＵ１６（Ａ）、２〜７２時間後のＦＧＦＦＲ−２で増幅させた細胞株ＳＮＵ１６（Ｂ）またはＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞（Ｃ）におけるＦＧＦＲシグナル伝達および総合的な受容体発現を調節する能力を示すウェスタンブロットである。
【図６−１】図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ＩｇＧおよび遊離ペイロード対照に対するＳＮＵ−１６（Ａ）、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ（Ｂ）またはＮＵＧＣ３（Ｃ）細胞の増殖を阻害する能力を示し、図６（Ｄ）は、コンジュゲートされていない抗体１２４２５が、いかなる感知可能な抗増殖効果も有さなかったことを示す。
【図６−２】図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ＩｇＧおよび遊離ペイロード対照に対するＳＮＵ−１６（Ａ）、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ（Ｂ）またはＮＵＧＣ３（Ｃ）細胞の増殖を阻害する能力を示し、図６（Ｄ）は、コンジュゲートされていない抗体１２４２５が、いかなる感知可能な抗増殖効果も有さなかったことを示す。
【図７−１】図７（Ａ）〜図７（Ｂ）は、ｐＨＨ３および切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＳＮＵ−１６（Ａ）またはＮＵＧＣ３（Ｂ）腫瘍異種移植片の画像である。
【図７−２】図７（Ａ）〜図７（Ｂ）は、ｐＨＨ３および切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＳＮＵ−１６（Ａ）またはＮＵＧＣ３（Ｂ）腫瘍異種移植片の画像である。
【図８−１】図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（xenograph）（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。
【図８−２】図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。
【図８−３】図８（Ａ）〜図８（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｈ７１６（Ａ）、ＭＦＭ２２３（Ｂ）、ヒト原発性胃腫瘍異種移植片（ＣＨＧＡ−０１０）（Ｃ）、ヒト原発性肺腫瘍異種移植片モデル（ＨＬＵＸ１２２８）（Ｄ）、ヒト原発性乳がん異種移植片モデル（Ｅ）およびヒト原発性乳管癌異種移植片モデル（Ｆ）の抗腫瘍活性を示す。
【図９】図９は、ＣＨＧＡ−１１９腫瘍異種移植片モデルにおける、単独での、およびＦＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤ＢＧＪ３９８と組み合わせた、抗ＦＧＦＲ２／４ＡＤＣ、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を示す。
【図１０】図１０は、ＳＮＵ−１６腫瘍異種移植片マウスモデルにおける、異なる用量およびスケジュールでの抗ＦＧＦＲ２／４ＡＤＣ、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性を示す。
【図１１−１】図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。
【図１１−２】図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。
【図１１−３】図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、抗ＦＧＦＲ２抗体の、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣを誘導する能力（Ａ）、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ細胞においてＣ１ｑに結合する能力（Ｂ）、ＣＤＣを誘導する能力（Ｃ）の評価を示す。図１１（Ｄ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコンジュゲートされていない抗体としてのＡＤＣＣ欠失変異体のまたはＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされたＡＤＣの効果を示す。
【図１２】図１２（Ａ）〜図１２（Ｂ）は、抗ＦＧＦＲ抗体またはＡＤＣの、２時間後（Ａ）または経時的に（Ｂ）、ＦＧＦＲ４発現性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ４５３におけるＦＧＦＲシグナル伝達および総合的な受容体発現を調節する能力を示すウェスタンブロットである。
【図１３−１】図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。
【図１３−２】図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。
【図１３−３】図１３（Ａ）〜図１３（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／４抗体（コンジュゲートされていないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣとして）の、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）、ＲＨ４（Ｂ）、ＪＲ細胞（Ｃ）またはがん細胞株パネル（Ｄ）の増殖を阻害する能力を示す。
【図１４】図１４（Ａ）〜図１４（Ｃ）は、ｐＨＨ３および／または切断されたカスパーゼ３発現の評価を示す１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置後のＭＤＡ−ＭＢ４５３（（Ａ）および（Ｂ））またはＲＨ４（Ｃ）腫瘍異種移植片の画像である。
【図１５】図１５（Ａ）〜図１５（Ｂ）は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（Ａ）およびＲＨ４（Ｂ）腫瘍異種移植片マウスモデルにおける抗ＦＧＦＲ２−および抗ＦＧＦＲ２／４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。
【図１６−１】図１６（Ａ）〜図１６（Ｄ）は、マウス（（Ａ）〜（Ｂ））、ラット（Ｃ）またはカニクイザル（Ｄ）における１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルを示す。
【図１６−２】図１６（Ａ）〜図１６（Ｄ）は、マウス（（Ａ）〜（Ｂ））、ラット（Ｃ）またはカニクイザル（Ｄ）における１２４５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルを示す。
【図１７】図１７（Ａ）〜図１７（Ｂ）は、１２４２５（２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１）の操作変異体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂ）でのＳＮＵ−１６細胞の増殖を阻害する能力を示す。
【図１８】図１８（Ａ）〜図１８（Ｂ）は、１０１６４（２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１）および１２４２５（２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１）の親和性成熟変異体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂ）でのＳＮＵ−１６細胞の増殖を阻害する能力を示す。
【図１９−１】図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。
【図１９−２】図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。
【図１９−３】図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。
【図１９−４】図１９は、ＦＧＦＲ２に対する重水素交換実験の結果を示す。図１９（Ａ）は、６つの治療用ｍＡｂの非存在（対照）および存在下でのＦＧＦＲ２に関する絶対的な重水素取込みを示す。バーの高さは、３回の測定の平均値であり、エラーバーは、１つの標準偏差であり、図１９（Ｂ）は、ｍＡｂ結合性ＦＧＦＲ２と対照ＦＧＦＲ２との間の重水素取込みの差を、測定における標準誤差で除算したものを示し、図１９（Ｃ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ：ＦＧＦＲ２結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＶ２）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示し、図１９（Ｄ）は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ：ＦＧＦＲ１結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＯＪＭ）上へマッピングされたＦＧＦＲ２へのｍＡｂの結合時の高い保護の領域を示す。
【図２０−１】図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。
【図２０−２】図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。
【図２０−３】図２０は、Ｘ線結晶学エピトープマッピング研究からの結果を示す。図２０（Ａ）は、ＦＧＦＲ２への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ２上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｂ）は、ＦＧＦＲ４への１２４２５Ｆａｂ結合の全体的な構造（左パネル）および標識されたエピトープ残基を有するＦＧＦＲ４上の詳細な相互作用表面（右パネル）を示し、図２０（Ｃ）は、Ｄ２ドメインにおけるヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の配列アラインメントを示す。完全に保存される残基は、濃い灰色で影を付け、部分的に保存される残基は、薄い灰色で影を付ける。破線の四角は、ＦＧＦＲ４において、１２４２５Ｆａｂを、それらの整列された対応物と一緒に接触しているＦＧＦＲ２残基である。
【図２１】図２１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＳＮＵ  １６細胞およびＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞の感度を、ＢＧＪ３９８またはゲフィニチブ（ＩＣ５０＝１６．７ｎＭ）と比較する増殖研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方（「ＦＧＦＲ２／４」）に結合する抗体
、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲートを提供する。特
に、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に結合し、そのような結合の際に内在化する抗体および抗
体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体および抗体断片（例えば、
抗原結合性断片）を、抗体薬物コンジュゲートを生成するために使用することができる。
さらに、本発明は、望ましい薬物動態特性および他の望ましい属性を有し、したがって、
胃がん、乳がん、横紋筋肉腫（例えば、胞巣状横紋筋肉腫または胎児性横紋筋肉腫）、肝
臓がん、副腎がん、肺がん、結腸がんおよび子宮内膜がんのようなＦＧＦＲ２および／ま
たはＦＧＦＲ４を発現するがんを処置するのに使用され得る抗体薬物コンジュゲートを提
供する。本発明はさらに、本発明の抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびに
がんの処置のためにそのような医薬組成物を作製し、使用する方法を提供する。
【００９５】
抗体薬物コンジュゲート
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体、抗原結合性断片またはその機能的
等価物が薬物部分に連結された、抗体薬物コンジュゲートを提供する。一態様では、本発
明の抗体、抗原結合性断片またはその機能的等価物は、リンカーによる共有結合を介して
、抗がん剤である薬物部分に連結される。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、有効用量
の抗がん剤（例えば、細胞毒性剤）を、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４を発現する
腫瘍組織に選択的に送達し、それによって、より高い選択性（およびより低い有効用量）
を達成することができる。
【００９６】
一態様では、本発明は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、Ａｂは、本明細書に記載のＦＧＦＲ２／４結合抗体を表し；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜２０の整数である）
のイムノコンジュゲートを提供する。一実施形態では、ｎは１〜１０、２〜８、または２
〜５の整数である。特定の実施形態では、ｎは２、３または４である。いくつかの実施形
態では、ｍは１である。他の実施形態では、ｍは２、３または４である。
【００９７】
薬物と抗体の比率は特定のコンジュゲート分子については正確な値を有するが（例えば
、式（Ｉ）中でｍを掛けたｎ）、その値は、典型的には、コンジュゲーションステップと
関連する、ある程度の不均等性のため、多くの分子を含有する試料を記述するために使用
される場合には平均値であることが多いことを理解されたい。イムノコンジュゲートの試
料に関する平均充填量を、本明細書では薬物と抗体の比率、または「ＤＡＲ」と呼ぶ。幾
つかの実施形態では、薬物がメイタンシノイドである場合、それは、「ＭＡＲ」と称され
る。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは約１〜約５であり、典型的には、約３、３．５、
４、４．５または５である。いくつかの実施形態では、試料の少なくとも５０重量％は、
平均ＤＡＲ±２を有する化合物であり、好ましくは、試料の少なくとも５０％は、平均Ｄ
ＡＲ±１を含有するコンジュゲートである。好ましい実施形態は、ＤＡＲが約３．５であ
るイムノコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲ
の測定値がｎの２０％以内にあることを意味する。
【００９８】
本発明はまた、薬物部分に連結またはコンジュゲートされた、本明細書に開示される抗
体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）およびその機能的等価物を含むイムノコンジュ
ゲートに関する。一実施形態では、薬物部分Ｄは、構造：
【００９９】
【化２】
2019193626.tif 000003
（式中、波線は抗体薬物コンジュゲートのリンカーへのメイタンシノイドの硫黄原子の共
有結合を示す）
を有するものなどの、メイタンシノイド薬物部分である。Ｒは、出現する毎に、独立にＨ
またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メ
タニル、エタニル、またはプロピルであってよい、すなわち、ｍは１、２または３である
（米国特許第６３３，４１０号、米国特許第５，２０８，０２０号、Chari et al. (1992
) Cancer Res. 52; 127-131、Lui et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8618-8623
）。
【０１００】
メイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体、すなわち、メイタンシノイドのキラル
炭素でのＲおよびＳ配置の任意の組合せが、本発明のイムノコンジュゲートについて企図
される。一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。
【０１０１】
【化３】
2019193626.tif 000004
【０１０２】
一実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−
メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１としても知られる）である。
ＤＭ１は、以下の構造式により表される。
【０１０３】
【化４】
2019193626.tif 000005
【０１０４】
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４
−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３としても知られる）である
。ＤＭ３は、以下の構造式により表される。
【０１０５】
【化５】
2019193626.tif 000006
【０１０６】
別の実施形態では、メイタンシノイド薬物部分は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４
−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４としても知ら
れる）である。ＤＭ４は、以下の構造式により表される。
【０１０７】
【化６】
2019193626.tif 000007
【０１０８】
薬物部分Ｄは、リンカーＬによって抗体Ａｂに連結され得る。Ｌは、共有結合によって
薬物部分を抗体に連結することが可能な任意の化学部分である。架橋試薬は、薬物部分お
よび抗体を連結して、抗体薬物コンジュゲートを形成するのに使用され得る二官能性また
は多官能性試薬である。抗体薬物コンジュゲートは、薬物部分および抗体への結合を可能
にする反応官能性を有する架橋試薬を使用して調製することができる。例えば、システイ
ン、チオールまたはアミン、例えばＮ末端またはアミノ酸鎖側鎖（抗体のリシンのような
）は、架橋試薬の官能基と結合を形成することができる。
【０１０９】
一実施形態では、Ｌは切断性リンカーである。別の実施形態では、Ｌは非切断性リンカ
ーである。いくつかの実施形態では、Ｌは酸不安定リンカー、光不安定リンカー、ペプチ
ダーゼ切断性リンカー、エステラーゼ切断性リンカー、ジスルフィド結合切断性リンカー
、親水性リンカー、プロチャージリンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである
。
【０１１０】
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好
適な架橋試薬は当業界で周知であり、硫黄原子（ＳＭＣＣなど）を含む非切断性リンカー
または硫黄原子を含まないものを形成することができる。薬物部分、例えば、メイタンシ
ノイドと、抗体との間で非切断性リンカーを形成する好ましい架橋試薬は、マレイミドま
たはハロアセチルに基づく部分を含む。本発明によれば、そのような非切断性リンカーは
、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分から誘導されると言われる。
【０１１１】
マレイミドに基づく部分を含む架橋試薬としては、限定されるものではないが、Ｎ−ス
クシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ
）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）である
Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（
６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸（undeconoic acid）Ｎ−スク
シンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル
（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｅ
ＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ
）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＳＡ）、スクシ
ンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ
−スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−
（−ｐ−マレオミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＩＰ）およびＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨ
Ｓなどのポリエチレングリコールスペーサを含有するマレイミドに基づく架橋試薬が挙げ
られる。これらの架橋試薬は、マレイミドに基づく部分から誘導される非切断性リンカー
を形成する。マレイミドに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
【０１１２】
【化７】
2019193626.tif 000008
【０１１３】
別の実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（マレイミドメチル）
シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）またはＭＡ
Ｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳから誘導される。
【０１１４】
ハロアセチルに基づく部分を含む架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセ
テート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（
ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミ
ジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。これらの架
橋試薬は、ハロアセチルに基づく部分から誘導される非切断性リンカーを形成する。ハロ
アセチルに基づく架橋試薬の代表的な構造は、以下に示される。
【０１１５】
【化８】
2019193626.tif 000009
【０１１６】
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）ま
たはＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）から
誘導される。
【０１１７】
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で切断性リンカーを形成する好適
な架橋試薬は、当業界で周知である。ジスルフィド含有リンカーは、生理的条件下で起こ
り得るジスルフィド交換を介して切断可能であるリンカーである。本発明によれば、その
ような切断性リンカーは、ジスルフィドに基づく部分から誘導されると言われる。好適な
ジスルフィド架橋試薬としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタ
ノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート
（ＳＰＤＢ）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブ
タノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられ、その構造は以下に示される。これらのジス
ルフィド架橋試薬は、ジスルフィドに基づく部分から誘導される切断性リンカーを形成す
る。
【０１１８】
【化９】
2019193626.tif 000010
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
【０１１９】
【化１０】
2019193626.tif 000011
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、
【０１２０】
【化１１】
2019193626.tif 000012
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）および
【０１２１】
【化１２】
2019193626.tif 000013
Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホ−ブタノエート（スルホ
−ＳＰＤＢ）。
【０１２２】
一実施形態では、リンカーＬは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）
ブタノエート（ＳＰＤＢ）から誘導される。
【０１２３】
薬物部分、例えば、メイタンシノイドと、抗体との間で荷電リンカーを形成する好適な
架橋試薬は、プロチャージ架橋試薬として知られる。一実施形態では、リンカーＬは、プ
ロチャージ架橋試薬ＣＸ１−１から誘導される。ＣＸ１−１の構造は、以下の通りである
。
【０１２４】
【化１３】
2019193626.tif 000014
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−
１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３
−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）。
【０１２５】
上記で表される架橋試薬はそれぞれ、架橋試薬の一方の末端に、抗体の第一級アミンと
反応して、アミド結合を形成するＮＨＳ−エステル、および他方の末端に、メイタンシノ
イド薬物部分のスルフィドリルと反応して、チオエーテルまたはジスルフィド結合を形成
するマレイミド基またはピリジニルジスルフィド基を含有する。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、下記構造式のいずれか１つにより表
される。
【０１２７】
【化１４】
2019193626.tif 000015
2019193626.tif 000016
式中、
ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原
結合性断片であり；
アミド結合とＡｂの第１級アミンとの形成を介してＡｂに結合したＤ−Ｌ基の数を示す
ｎは、１〜２０の整数である。一実施形態において、ｎは１〜１０、２〜８または２〜５
の整数である。特定の実施形態において、ｎは３または４である。
【０１２８】
一実施形態では、コンジュゲート中の薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と抗体との
平均モル比（すなわち、メイタンシノイド抗体比（ＭＡＲ）としても知られる、平均ｎ値
）は、約１〜約１０、約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、
２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、
３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、
４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、
５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、
６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、
７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０または８．１）、約２．５〜
約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２
．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３
．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４
．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、または約４．５〜５．５（例えば、
約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、
約５．３、約５．４または約５．５）である。
【０１２９】
本発明の１つの態様では、本発明のコンジュゲートは、実質的に高い純度を有し、下記
特色の１つまたは複数を有する：（ａ）約９０％を上回る（例えば、約９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を上回るか、
またはそれに等しい）、好ましくは約９５％を上回るコンジュゲート種が単量体であるこ
と、（ｂ）コンジュゲート調製物中のコンジュゲートされていないリンカーレベルが、約
１０％未満であること（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１
％または０％未満であるか、それに等しい）（総リンカーに対して）、（ｃ）１０％未満
のコンジュゲート種が架橋されること（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％
、３％、２％、１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）、（ｄ）コンジュゲ
ート調製物における遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）レベルが、約２％未満であ
ること（例えば、約１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０
．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０
．１％または０％未満であるか、またはそれに等しい）（総細胞障害性作用物質に対する
ｍｏｌ／ｍｏｌ）、および／または（ｅ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレ
ベルにおける実質的な増加が、貯蔵時に起こらないこと（例えば、約１週、約２週、約３
週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、
約３年、約４年または約５年後）。遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルに
おける「実質的な増加」は、ある特定の貯蔵時間（例えば、約１週、約２週、約３週、約
１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約１年、約２年、約３年
、約４年または約５年）後に、遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）のレベルの増加
が、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０
．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、
約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０
％、約２．２％、約２．５％、約２．７％、約３．０％、約３．２％、約３．５％、約３
．７％、または約４．０％未満であることを意味する。
【０１３０】
本明細書で使用される用語「非コンジュゲート化リンカー」とは、抗体がリンカーを介
して薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）に共有的にカップリングしていない、架橋試薬
（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１
）から誘導されるリンカーと共有的に連結された抗体を指す（すなわち、「非コンジュゲ
ート化リンカー」はＡｂ−ＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢ、またはＡｂ−ＣＸ１−１で表すこと
ができる）。
【０１３１】
１．薬物部分
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合するイムノコンジュゲートを提供する。本発
明のイムノコンジュゲートは、薬物部分、例えば、抗がん剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤
、抗真菌剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、または麻酔剤にコンジュゲートされ
た抗ＦＧＦＲ２／４抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を含
む。本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、当業界
で公知の任意の方法を使用して、いくつかの同一の、または異なる薬物部分にコンジュゲ
ートすることができる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰａ
ｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤
、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン
、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タ
ンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコ
ンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、ＲＮＡポリメラ
ーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤ
ＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およ
びＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される。
【０１３３】
一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの薬物部分は、限定されるものではな
いが、ＤＭ１、ＤＭ３またはＤＭ４などのメイタンシノイド薬物部分である。
【０１３４】
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、
所与の生物学的応答を改変する薬物部分にコンジュゲートすることができる。薬物部分は
、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所
望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。その
ようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素
、もしくはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−イン
ターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、
サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、または例えば、リンホ
カインなどの生物応答改変剤を含んでもよい。
【０１３５】
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等
価物は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素などの薬物部分にコン
ジュゲートされる。細胞毒素の例としては、限定されるものではないが、タキサン（例え
ば、国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／３８３１８およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５
を参照されたい）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサ
イクリン、ツブリシン（tubulysin）類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチ
ンＥ、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド、ならびに反応性ポリエチレングリコール部
分（例えば、Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al.
, Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 
44, 1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood (2003)（印刷出版物に先立って、電子出
版物）、米国特許第５，４７５，０９２号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７
３８号、および第６，４３６，９３１号、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３
Ａ１号、係属中米国特許出願第１０／０２４，２９０号および第１０／１１６，０５３号
、ならびに国際特許出願（ＰＣＴ）ＷＯ０１／４９６９８を参照されたい）を含む細胞毒
性剤、タキソン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイ
トマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチ
ン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサント
ロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチ
コイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマ
イシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、
代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シ
タラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、削摩剤（ablating agent）（例えば、
メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）お
よびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトー
ル、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（Ｉ
Ｉ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダ
ウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は
アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭ
Ｃ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げ
られる（例えば、Seattle GeneticsのＵＳ２００９０３０４７２１を参照されたい）。
【０１３６】
本発明の抗体、抗体断片（抗原結合性断片）または機能的等価物にコンジュゲートする
ことができる細胞毒素の他の例としては、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイ
タンシンおよびオーリスタチン、ならびにその誘導体が挙げられる。
【０１３７】
治療剤を抗体にコンジュゲートするための様々な型の細胞毒素、リンカーおよび方法は
、当業界で公知であり、例えば、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-
215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) 
Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Krei
tman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001
) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。
【０１３８】
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、放射性ア
イソトープにコンジュゲートして、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる、細胞毒性放
射性薬剤を作成することもできる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュ
ゲートすることができる放射性アイソトープの例としては、限定されるものではないが、
ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、イットリウム−９０、およびルテチウム−１７７
が挙げられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当業界で確立され
ている。放射性イムノコンジュゲートの例は、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（ＤＥＣ  Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、商業的に入手可能であり、同様の方法を使用して、
本発明の抗体を使用して放射性イムノコンジュゲートを調製することができる。ある特定
の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合させることがで
きる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢
酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当業界で一般に公知であり、それぞ
れ全体が参照により組み込まれる、Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):24
83-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmerman et 
al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
【０１３９】
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、異種タン
パク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも
２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも
７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド
）にコンジュゲートして、融合タンパク質を作成することもできる。特に、本発明は、本
明細書に記載の抗体断片（例えば、抗原結合性断片）（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、
Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ  
ＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む融合タンパク質を
提供する。
【０１４０】
さらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソ
ンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフ
リング」と呼ばれる）の技術により作成することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用
して、本発明の抗体またはその断片の活性（例えば、より高い親和性およびより低い解離
速度を有する抗体またはその断片）を変化させることができる。一般に、米国特許第５，
６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，
２５２号、および第５，８３７，４５８号; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biot
echnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al
., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; およびLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniqu
es 24(2):308-313（これらの特許および刊行物の各々は、その全体が参照により本明細書
に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはその断片、またはコードされた抗体もし
くはその断片は、組換え前に変異性ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法によ
り無作為突然変異誘発にかけることにより変化させることができる。抗原に特異的に結合
する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１または複数の異種分子の、
１または複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えるこ
とができる。
【０１４１】
さらに、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、
ペプチドなどのマーカー配列にコンジュゲートして、精製を容易にすることができる。好
ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ（
登録商標），Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃ
Ａ，９１３１１）に提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多く
が商業的に入手可能である。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821
-824に記載のように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合の精製を
提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、
インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応するヘマグル
チニン（「ＨＡ」）タグ（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ（
登録商標）」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 
2001）が挙げられる。本発明によれば、抗体または抗原結合性断片を、腫瘍浸透ペプチド
にコンジュゲートして、その効能を増強することもできる。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的
等価物は、診断剤または検出剤にコンジュゲートされる。そのようなイムノコンジュゲー
トは、特定の療法の効能の決定などの、臨床試験手順の一部として疾患または障害の開始
、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは予後診断するのに有用であり得
る。そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエス
テラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン
およびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ  
Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘ
ａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌ
ｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４
６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）
５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商
標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登
録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ
（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕ
ｏｒ（登録商標）７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリ
ドまたはフィコエリトリンなどの蛍光材料；限定されるものではないが、ルミノールなど
の発光材料；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオ
リンなどの生物発光材料；限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１
２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、イ
ンジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（
９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（
１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、
１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈ
ｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、
６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ
、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなどの放射性材料；な
らびに様々なポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、および非放射性常
磁性金属イオンなどの、検出可能物質に抗体をカップリングさせることにより達成するこ
とができる。
【０１４３】
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を、標的抗原
のイムノアッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に結合することもできる
。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポ
リアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙
げられる。
【０１４４】
２．リンカー
本明細書で使用される場合、「リンカー」は、薬物部分などの別の部分に、抗体、抗体
断片（例えば、抗原結合性断片）または機能的等価物を連結することができる任意の化学
部分である。幾つかの場合で、リンカーの一部が、メイタンシノイドにより供給される。
例えば、チオール含有メイタンシノイドであるＤＭ１は、天然メイタンシノイドの誘導体
であり、リンカーの一部を供給する。メイタンシンのＣ−３水酸基にある側鎖は、ＣＯ−
ＣＨ３に終わり、ＤＭ１の側鎖は、ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨに終わる。したがって、
最終的なリンカーは、２つの片、即ち抗体へ導入される架橋試薬およびＤＭ１由来の側鎖
から構築される。リンカーは、化合物または抗体が活性を保持する条件下で、酸誘導性切
断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、およびジスルフ
ィド結合切断などの切断の影響を受けやすいものであってもよい（切断性リンカー）。あ
るいは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であってもよい（例えば、安定性リンカ
ーまたは非切断性リンカー）。いくつかの態様では、リンカーは、プロチャージリンカー
、親水性リンカー、またはジカルボン酸に基づくリンカーである。
【０１４５】
非切断性リンカーは、安定な、共有的な様式でメイタンシノイドなどの薬物を、抗体に
連結することができ、切断性リンカーについて上記に列挙されたカテゴリーの下から外れ
ない任意の化学部分である。かくして、非切断性リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切
断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断に対
して実質的に耐性である。さらに、非切断性とは、メイタンシノイドなどの薬物または抗
体がその活性を喪失しない条件下で、酸、光不安定性切断剤、ペプチダーゼ、エステラー
ゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理的化合物により誘導される切
断に耐える、リンカー中の、またはリンカーに隣接する化学的結合の能力を指す。
【０１４６】
ジスルフィド含有リンカーは、ジスルフィド交換によって切断可能なリンカーであり、
これは、生理学的条件下で起こり得る。酸不安定リンカーは、酸性ｐＨで切断可能なリン
カーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画は、酸性ｐ
Ｈ（ｐＨ４〜５）を有し、酸不安定リンカーを切断するのに好適な条件を提供する。
【０１４７】
光不安定リンカーは、光に接近可能である体表面で、および多くの体腔において有用で
あるリンカーである。さらに、赤外線は組織に浸透することができる。
【０１４８】
いくつかのリンカーは、ペプチダーゼ、すなわち、ペプチダーゼ切断性リンカーにより
切断することができる。特定のペプチドのみが、細胞の内部または外部で容易に切断され
る。例えば、Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 626-629 (1982)およびUmem
oto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989)を参照されたい。さらに、ペプチドは、
α−アミノ酸と、化学的には、あるアミノ酸のカルボキシレート基と、第２のアミノ酸の
アミノ基との間のアミド結合であるペプチド結合とから構成される。リシンのカルボキシ
レート基およびε−アミノ基との間の結合などの他のアミド結合は、ペプチド結合ではな
いと理解され、非切断性であると考えられる。
【０１４９】
いくつかのリンカーは、エステラーゼにより切断することができる、すなわち、エステ
ラーゼ切断性リンカーである。再度、特定のエステルのみを、細胞の内部または外部に存
在するエステラーゼにより切断することができる。エステルは、カルボン酸とアルコール
との縮合により形成される。単純エステルは、脂肪族アルコール、ならびに小環状および
低分子芳香族アルコールなどの、単純アルコールを使用して生成されるエステルである。
【０１５０】
プロチャージリンカーは、抗体薬物コンジュゲートへの組込み後にその電荷を保持する
荷電した架橋試薬から誘導される。プロチャージリンカーの例を、ＵＳ２００９／０２７
４７１３に見出すことができる。
【０１５１】
一態様では、本発明で使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジル
ジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ
）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２
−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート
（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡ
Ｂ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シク
ロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミ
ドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキ
ソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール
−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘ
プタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋試薬から誘導される。別の態様では
、本発明で使用されるリンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘ
キサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメ
チル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−
４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）または２
，５−ジオキソピロリジン−１−イル１７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１
Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−
テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）などの架橋剤から誘導される。
【０１５２】
３．ＡＤＣのコンジュゲーションおよび調製
本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号、第６，４１１，１６３
号、第７，３６８，５６５号、および第８，１６３，８８８号、ならびに米国特許出願公
開第２０１１／０００３９６９号、第２０１１／０１６６３１９号、第２０１２／０２５
３０２１号および第２０１２／０２５９１００号に記載のものなどの当業界で公知の任意
の方法により調製することができる。これらの特許および特許出願公開の全教示は、参照
により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
１ステッププロセス
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、１ステッププロセスによって調製するこ
とができる。このプロセスは、実質的に水性の媒体中で抗体、薬物および架橋剤を混合す
ること、任意選択で、好適なｐＨで１または複数の共溶媒を含有させることを含む。一実
施形態では、プロセスは、本発明の抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触
させて、抗体と薬物とを含む第１の混合物を形成させるステップ、次いで、約４〜約９の
ｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物とを含む第１の混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ
、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（
ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、または
Ａｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、およ
び（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップを含む。
【０１５４】
一実施形態では、１ステッププロセスは、約６以上（例えば、約６〜約９、約６〜約７
、約７〜約９、約７〜約８．５、約７．５〜約８．５、約７．５〜約８．０、約８．０〜
約９．０、または約８．５〜約９．０）のｐＨを有する溶液中で、抗体を、薬物（例えば
、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰ
ＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。例えば、本発明の
プロセスは、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６
、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４
、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２
、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９または約９
．０のｐＨを有する溶液中で、細胞結合剤を、薬物（ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架
橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１
−１）と接触させることを含む。特定の実施形態では、本発明のプロセスは、約７．８の
ｐＨ（例えば、７．６〜８．０のｐＨまたは７．７〜７．９のｐＨ）を有する溶液中で、
細胞結合剤を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣ
Ｃ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させるこ
とを含む。
【０１５５】
１ステッププロセス（すなわち、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで
、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣ
Ｘ１−１）と接触させること）を、当業界で公知の任意の好適な温度で実行することがで
きる。例えば、１ステッププロセスは、約２０℃以下（例えば、約−１０℃（例えば、細
胞毒性剤および二官能性架橋試薬を溶解するために使用される有機溶媒の存在によって、
溶液の凍結が防止されるという条件で）〜約２０℃、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６
℃）、または室温（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または
高温（例えば、約３０℃〜約３７℃）で行ってもよい。一実施形態では、１ステッププロ
セスは、約１６℃〜約２４℃（例えば、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２
０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で行う。別の
実施形態では、１ステッププロセスは、約１５℃以下（例えば、約−１０℃〜約１５℃、
または約０℃〜約１５℃）の温度で実行される。例えば、プロセスは、例えば、架橋剤（
例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＰＤＢ、ＳＰＤＢ、またはＣＸ１−１
）を溶解するために使用される有機溶媒（複数可）の存在によって、溶液の凍結が防止さ
れるという条件で、約１５℃、約１４℃、約１３℃、約１２℃、約１１℃、約１０℃、約
９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、約２℃、約１℃、約０℃、約
−１℃、約−２℃、約−３℃、約−４℃、約−５℃、約−６℃、約−７℃、約−８℃、約
−９℃、または約−１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次
いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ、ま
たはＣＸ１−１）と接触させることを含む。一実施形態では、プロセスは、約−１０℃〜
約１５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約０℃〜約５℃、約５℃〜約１５℃、
約１０℃〜約１５℃、または約５℃〜約１０℃の温度で、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１
またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、ス
ルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む。別の実施形態では、プロセ
スは、約１０℃の温度（例えば、８℃〜１２℃の温度または９℃〜１１℃の温度）で、抗
体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スル
ホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させることを含む
。
【０１５６】
一実施形態では、上記の接触は、抗体を提供した後、該抗体を薬物（例えば、ＤＭ１ま
たはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の
混合物を形成させ、次いで、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む第１の
混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢ
またはＣＸ１−１）と接触させることにより行われる。例えば、一実施形態では、抗体を
反応容器中に提供し、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加し（それに
よって、抗体を接触させる）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、
ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１または
ＤＭ４）とを含む混合物に添加する（それによって、抗体と薬物とを含む混合物を接触さ
せる）。一実施形態では、抗体を反応容器中に提供し、抗体を容器に提供する直後に、薬
物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。別の実施形態では、抗体を反
応容器中に提供し、抗体を容器に提供した後の時間間隔後（例えば、細胞結合剤を空間に
提供した後約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間、約
１日以上後）に、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を反応容器に添加する。薬物（例
えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、迅速に（すなわち、約５分、約１０分などの短い時間間
隔以内に）またはゆっくりと（ポンプを使用するなど）添加することができる。
【０１５７】
次いで、抗体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた直後に、または抗
体を薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）と接触させた後のいくらか後の時点で（例え
ば、約５分〜約８時間以上）、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を含む混合物
を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたは
ＣＸ１−１）と接触させることができる。例えば、一実施形態では、抗体を含む反応容器
への薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）の添加の直後に、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、
スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）を、抗体と薬物（例
えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物に添加する。あるいは、抗体を薬物（例えば
、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させた後、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約１
時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間以上で
、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭ
ＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させる
ことができる。
【０１５８】
抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣ
Ｃ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後
、反応を約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約
８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約
１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間
、約２２時間、約２３時間、約２４時間以上（例えば、約３０時間、約３５時間、約４０
時間、約４５時間、または約４８時間）進行させる。
【０１５９】
一実施形態では、１ステッププロセスは、未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ
４）および／または未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、
スルホ−ＳＰＤＢもしくはＣＸ１−１）をクエンチするためのクエンチングステップをさ
らに含む。クエンチングステップは、典型的には、コンジュゲートの精製前に行われる。
一実施形態では、混合物をクエンチング試薬と接触させることにより、混合物をクエンチ
する。本明細書で使用される場合、「クエンチング試薬」とは、遊離薬物（例えば、ＤＭ
１もしくはＤＭ４）および／または架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰ
ＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応する試薬を指す。一実施形態では、４
−マレイミド酪酸、３−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセト
アミド、またはヨードアセトアミドプロピオン酸などのマレイミドまたはハロアセトアミ
ドクエンチング試薬を使用して、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）中の任意の未反応
の基（チオールなど）がクエンチされたことを確保することができる。クエンチングステ
ップは、薬物（例えば、ＤＭ１）の二量体化を防止するのに役立ち得る。二量体化したＤ
Ｍ１は、除去するのが困難であり得る。極性の荷電したチオールクエンチング試薬（４−
マレイミド酪酸または３−マレイミドプロピオン酸など）を使用するクエンチングの際に
、過剰の未反応のＤＭ１は、精製ステップの間に共有的に連結したコンジュゲートから容
易に分離することができる極性の荷電した水溶性付加物に変換される。非極性および中性
チオールクエンチング試薬を使用するクエンチングを使用することもできる。一実施形態
では、混合物を、未反応の架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、ス
ルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と反応するクエンチング試薬と接触させることにより
、混合物をクエンチする。例えば、求核試薬を混合物に添加して、任意の未反応のＳＭＣ
Ｃをクエンチすることができる。好ましくは、求核試薬は、リシン、タウリンおよびヒド
ロキシルアミンなどの、アミノ基含有求核試薬である。
【０１６０】
好ましい実施形態では、反応（すなわち、抗体を、薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４
）、次いで、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤ
ＢまたはＣＸ１−１）と接触させること）を、混合物をクエンチング試薬と接触させた後
、完了まで進行させる。これに関して、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを
含む混合物を架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤ
ＢまたはＣＸ１−１）と接触させた後、クエンチング試薬を約１時間〜約４８時間（例え
ば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時
間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５
時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約
２２時間、約２３時間、約２４時間または約２５時間〜約４８時間）混合物に添加する。
【０１６１】
あるいは、混合物のｐＨを約５．０（例えば、４．８、４．９、５．０、５．１または
５．２）に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施形態では、ｐＨを６
．０未満、５．５未満、５．０未満、４．８未満、４．６未満、４．４未満、４．２未満
、４．０未満に低下させることにより、混合物をクエンチする。あるいは、ｐＨを、約４
．０（例えば、３．８、３．９、４．０、４．１または４．２）〜約６．０（例えば、５
．８、５．９、６．０、６．１または６．２）、約４．０〜約５．０、約４．５（例えば
、４．３、４．４、４．５、４．６または４．７）〜約５．０に低下させる。一実施形態
では、混合物のｐＨを４．８に低下させることにより、混合物をクエンチする。別の実施
形態では、混合物のｐＨを５．５に低下させることにより、混合物をクエンチする。
【０１６２】
一実施形態では、１ステッププロセスは、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離さ
せるための保持ステップをさらに含む。保持ステップは、コンジュゲートの精製前（例え
ば、反応ステップの後、反応ステップとクエンチングステップの間、またはクエンチング
ステップの後）に混合物を保持することを含む。例えば、プロセスは、（ａ）抗体を薬物
（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ
４）とを含む混合物を形成させるステップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で
、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭ
ＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて
、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４また
はＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、お
よび（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で
調製された混合物を保持して、不安定に結合したリンカーを細胞結合剤から遊離させるス
テップ、ならびに（ｃ）混合物を精製して、精製されたコンジュゲートを提供するステッ
プを含む。
【０１６３】
別の実施形態では、プロセスは、（ａ）抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と
接触させて、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を形成させるス
テップ；次いで、約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１また
はＤＭ４）とを含む混合物を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ
、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、（ｉ）コンジュゲート、（ｉｉ）
遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む混合物
を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された混合物をクエンチして、任意の
未反応の薬物（例えば、ＤＭ１もしくはＤＭ４）および／または未反応の架橋剤（例えば
、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）をクエ
ンチするステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）で調製された混合物を保持して、不安定に結合
したリンカーを細胞結合剤から遊離させるステップ、ならびに（ｄ）混合物を精製して、
精製されたコンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４ま
たはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）を提供するステップを含む。
【０１６４】
あるいは、保持ステップを、コンジュゲートの精製後に実施した後、さらなる精製ステ
ップを行うことができる。
【０１６５】
好ましい実施形態では、保持ステップの前に反応を完了まで進行させる。これに関して
、保持ステップを、抗体と薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）とを含む混合物を架橋剤
（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１
）と接触させた後、約１時間〜約４８時間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約
４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間
、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８
時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間また
は約２４時間〜約４８時間）実施することができる。
【０１６６】
保持ステップは、好適な期間（例えば、約１時間〜約１週間、約１時間〜約２４時間、
約１時間〜約８時間、または約１時間〜約４時間）にわたって好適な温度（例えば、約０
℃〜約３７℃）で溶液を維持して、安定に結合したリンカーを抗体から実質的に遊離させ
ないが、不安定に結合したリンカーを抗体から遊離させることを含む。一実施形態では、
保持ステップは、約２０℃以下（例えば、約０℃〜約１８℃、約４℃〜約１６℃）、室温
（例えば、約２０℃〜約３０℃もしくは約２０℃〜約２５℃）、または高温（例えば、約
３０℃〜約３７℃）で溶液を維持することを含む。一実施形態では、保持ステップは、約
１６℃〜約２４℃（例えば、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２
０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、または約２５℃）の温度で溶液を維持
することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約２℃〜約８℃（例えば、約０℃
、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、または
約１０℃）の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持ステップは、約
３７℃（例えば、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、また
は約４０℃）の温度で溶液を維持することを含む。
【０１６７】
保持ステップの持続期間は、保持ステップが行われる温度およびｐＨに依存する。例え
ば、保持ステップの持続期間は、高温で保持ステップを行うことにより実質的に減少させ
ることができ、その最大温度は細胞結合剤−細胞毒性剤コンジュゲートの安定性によって
制限される。保持ステップは、約１時間〜約１日（例えば、約１時間、約２時間、約３時
間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１
２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、または約２４
時間）、約１０時間〜約２４時間、約１２時間〜約２４時間、約１４時間〜約２４時間、
約１６時間〜約２４時間、約１８時間〜約２４時間、約２０時間〜約２４時間、約５時間
〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約１２時間〜約１週間（例えば、約１２時間、約１
６時間、約２０時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約
７日）または約１日〜約１週間にわたって溶液を維持することを含んでもよい。
【０１６８】
一実施形態では、保持ステップは、少なくとも約１２時間から最大で１週間までの期間
にわたって約２℃〜約８℃の温度で溶液を維持することを含む。別の実施形態では、保持
ステップは、一晩（例えば、約１２〜約２４時間、好ましくは、約２０時間）、約２℃〜
約８℃の温度で溶液を維持することを含む。
【０１６９】
保持ステップのためのｐＨ値は、好ましくは、約４〜約１０である。一実施形態では、
保持ステップのためのｐＨ値は、約４以上であるが、約６未満である（例えば、４〜５．
９）か、または約５以上であるが、約６未満である（例えば、５〜５．９）。別の実施形
態では、保持ステップのためのｐＨ値は、約６〜約１０の範囲（例えば、約６．５〜約９
、約６〜約８）である。例えば、保持ステップのためのｐＨ値は、約６、約６．５、約７
、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、または約１０であってもよい。
【０１７０】
特定の実施形態では、保持ステップは、約１２時間〜約１週間にわたって、約６〜７．
５のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすること、約５時間〜約５日間にわたって、
約４．５〜５．９のｐＨで４℃で混合物をインキュベートすること、または約５時間〜約
１日間にわたって、約４．５〜５．９のｐＨで２５℃で混合物をインキュベートすること
を含んでもよい。
【０１７１】
１ステッププロセスは、任意選択で、コンジュゲートの可溶性および回収を増加させる
ための反応ステップへのスクロースの添加を含んでもよい。望ましくは、約０．１％（ｗ
／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、５％（
ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ））の濃度でス
クロースを添加する。好ましくは、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約
０．５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、約
３％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）、約７％（ｗ
／ｖ）、約８％（ｗ／ｖ）、約９％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、または約１１％（
ｗ／ｖ））の濃度でスクロースを添加する。さらに、反応ステップはまた、緩衝剤の添加
をも含んでもよい。当業界で公知の任意の好適な緩衝剤を使用することができる。好適な
緩衝剤としては、例えば、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、
およびリン酸バッファーが挙げられる。一実施形態では、緩衝剤は、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−
（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））
、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス−（２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）
無水物）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン
酸）、ＨＥＰＰＳ（ＥＰＰＳ）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパ
ンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタ
ンスルホン酸）、およびその組合せからなる群から選択される。
【０１７２】
一実施形態では、１ステッププロセスは、混合物を精製して、精製されたコンジュゲー
ト（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−
ＤＭ１）を提供するステップをさらに含んでもよい。当業界で公知の任意の精製方法を使
用して、本発明のコンジュゲートを精製することができる。一実施形態では、本発明のコ
ンジュゲートは、接線流濾過（ＴＦＦ）、非吸着クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、吸着濾過、選択的沈降、または任意の他の好適な精製プロセス、ならびにその組
合せを使用する。別の態様では、コンジュゲートを上記の精製プロセスにかける前に、１
または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュゲートを最初に濾過する。あるいは、コンジュ
ゲートを上記の精製プロセスにかけた後に、１または複数のＰＶＤＦ膜を通してコンジュ
ゲートを濾過する。例えば、一実施形態では、コンジュゲートを１または複数のＰＶＤＦ
膜を通して濾過した後、接線流濾過を使用して精製する。あるいは、コンジュゲートを接
線流濾過を使用して精製した後、１または複数のＰＶＤＦ膜を通して濾過する。
【０１７３】
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ
、ＭＡ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ（登録商標）Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕ
ｓ  ＡＧ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）、およびＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）型システ
ム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）などの、任意の好適なＴＦＦ
システムを精製のために使用することができる。
【０１７４】
任意の好適な吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。好
ましい吸着クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー
（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合様式イオン交換クロマトグラフィー、
固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、染料リガンドクロマトグラフィー、
親和性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびその組合せが挙げられる。
好適なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨ
Ｔ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（登録商標）ヒドロキシアパタイト
（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ＮＹ）、およびセラミックフルオロア
パタイト（ＣＦＴ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なＨＣＩＣ樹脂の例は、Ｍ
ＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、
ＮＹ）である。好適なＨＩＣ樹脂の例としては、Ｂｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録
商標）、Ｈｅｘｙｌ−Ｓｅｐａｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ（登録商標）、およびＯｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（全てＧ
Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＭａｃｒｏ−
ｐｒｅｐメチルおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−ブチル樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適なイオン交換樹脂の例
としては、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商
標）、およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから）、ならびにＵｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ樹脂（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。
好適な混合様式イオン交換体の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ（登録商標）ＡＢｘ樹脂
（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が挙げられる。好適なＩＭＡＣ
樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ  
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭ
ＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙
げられる。好適な染料リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録
商標）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）およびＡｆｆ
ｉ−ｇｅｌ（登録商標）ブルー樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅ
ｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）が挙げられる。好適な親和性樹脂の例としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  
Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）および抗体が適切なレクチン結合部位を
担持する、レクチン親和性樹脂、例えば、Ｌｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（登録商標）樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が
挙げられる。好適な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８、およびＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ
Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）が挙げられる。
【０１７５】
任意の好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂を、精製のために使用することができる。
好適な非吸着クロマトグラフィー樹脂の例としては、限定されるものではないが、ＳＥＰ
ＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）樹脂
（例えば、Ｓ−２００およびＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）樹脂（例えば、Ｓ
ＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５およびＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ
（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０、およびＰ−１００
）、ならびに当業者には公知の他のものが挙げられる。
【０１７６】
２ステッププロセスおよび１ポットプロセス
一実施形態では、本発明のコンジュゲートを、米国特許第７，８１１，５７２号および
米国特許出願公開第２００６／０１８２７５０号に記載のように調製することができる。
このプロセスは、（ａ）本発明の抗体を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ
、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまたはＣＸ１−１）と接触させて、リンカー（すなわち、
Ａｂ−ＳＭＣＣ、Ａｂ−ＳＰＤＢまたはＡｂ−ＣＸ１−１）を抗体に共有結合させること
によって、リンカーが結合した抗体を含む第１の混合物を調製するステップ；（ｂ）任意
選択で、第１の混合物を精製プロセスにかけて、リンカーが結合した抗体の精製された第
１の混合物を調製するステップ；（ｃ）約４〜約９のｐＨを有する溶液中で、リンカーが
結合した抗体を薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）と反応させることにより、薬物（例
えば、ＤＭ１またはＤＭ４）を、第１の混合物中のリンカーが結合した抗体にコンジュゲ
ートして、（ｉ）コンジュゲート（例えば、Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ−ＳＰＤＢ−Ｄ
Ｍ４またはＡｂ−ＣＸ１−１−ＤＭ１）、（ｉｉ）遊離薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ
４）；および（ｉｉｉ）反応副生成物を含む第２の混合物を調製するステップ；ならびに
（ｄ）第２の混合物を精製プロセスにかけて、第２の混合物の他の成分からコンジュゲー
トを精製するステップを含む。あるいは、精製ステップ（ｂ）を省略してもよい。本明細
書に記載の任意の精製方法を、ステップ（ｂ）および（ｄ）のために使用することができ
る。一実施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）と（ｄ）の両方のために使用する。別の実
施形態では、ＴＦＦをステップ（ｂ）のために使用し、吸着クロマトグラフィー（例えば
、ＣＨＴ）をステップ（ｄ）のために使用する。
【０１７７】
１ステップ試薬およびｉｎ  ｓｉｔｕプロセス
一実施形態では、米国特許第６，４４１，１６３号および米国特許出願公開第２０１１
／０００３９６９号および第２００８／０１４５３７４号に記載のように、予め形成され
た薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰ
ＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を、本発明の抗体にコンジュゲートした後、精
製ステップを行うことにより、本発明のコンジュゲートを調製することができる。本明細
書に記載の任意の精製方法を使用することができる。薬物（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４
）を、架橋剤（例えば、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＰＤＢ、スルホ−ＳＰＤＢまた
はＣＸ１−１）と反応させることにより、薬物−リンカー化合物を調製する。任意選択で
、薬物−リンカー化合物（例えば、ＳＭＣＣ−ＤＭ１、スルホ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ＳＰ
ＤＢ−ＤＭ４またはＣＸ１−１−ＤＭ１）を精製にかけた後、抗体にコンジュゲートする
。
【０１７８】
４．望ましい抗体および抗体薬物コンジュゲートの特性評価および選択
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）または抗体薬物コンジュゲートを
、当業界で公知の様々なアッセイにより、その物理的／化学的特性および／または生物学
的活性について特性評価し、選択することができる。
【０１７９】
例えば、本発明の抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）または
ウェスタンブロットなどの公知の方法により、その抗原結合活性について試験することが
できる。
【０１８０】
トランスジェニック動物および細胞系は、腫瘍関連抗原および細胞表面受容体のがん過
剰発現の予防的または治療的処置としての潜在能力を有する抗体薬物コンジュゲート（Ａ
ＤＣ）をスクリーニングするのに特に有用である。有用なＡＤＣのスクリーニングは、ト
ランスジェニック動物に、一定範囲の用量にわたって候補ＡＤＣを投与すること、および
評価される疾患または障害に対するＡＤＣの効果（複数可）について、様々な時点でアッ
セイすることを含んでもよい。あるいは、またはさらに、該当する場合、疾患の誘導因子
への曝露の前に、またはそれと同時に、薬物を投与することができる。候補ＡＤＣを、中
効率または高効率スクリーニング形式の下で、連続的および個々に、または同時にスクリ
ーニングすることができる。
【０１８１】
一実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系または
ヒト患者腫瘍（例えば、乳がん細胞系または腫瘍断片、胃がん細胞系または腫瘍断片）を
、非ヒト動物に移植すること、（ｂ）ＡＤＣ薬物候補を非ヒト動物に投与すること、およ
び（ｃ）移植された細胞系からの腫瘍の成長を阻害する候補の能力を決定することを含む
スクリーニング方法である。本発明はまた、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現す
る安定ながん細胞系に由来する細胞を、薬物候補と接触させること、および（ｂ）安定な
細胞系の成長を阻害するＡＤＣ候補の能力を評価することを含む、ＦＧＦＲ２またはＦＧ
ＦＲ４の過剰発現を特徴とする疾患または障害の処置のためのＡＤＣ候補をスクリーニン
グする方法も包含する。
【０１８２】
一実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系に由来
する細胞を、ＡＤＣ薬物候補と接触させること、および（ｂ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ
４のリガンド活性化を遮断するＡＤＣ候補の能力を評価することを含むスクリーニング方
法である。別の実施形態では、リガンドにより刺激されたチロシンリン酸化を遮断するＡ
ＤＣ候補の能力を評価する。
【０１８３】
別の実施形態は、（ａ）ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する安定ながん細胞系に由
来する細胞を、ＡＤＣ薬物候補と接触させること、および（ｂ）細胞死を誘導するＡＤＣ
候補の能力を評価することを含むスクリーニング方法である。一実施形態では、アポトー
シスを誘導するＡＤＣ候補の能力を評価する。
【０１８４】
１つの実施形態では、候補ＡＤＣは、広範な用量にわたってトランスジェニック動物に
投与されること、および経時的な化合物に対する動物の生理学的応答を評価することによ
りスクリーニングされる。いくつかの場合、化合物を、化合物の効能を増強するコファク
ターと共に投与することが適切であり得る。対象トランスジェニック動物から誘導される
細胞系を使用して、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の過剰発現と関連する様々な障害を処置
するのに有用なＡＤＣについてスクリーニングする場合、適切な時間に試験ＡＤＣを細胞
培養培地に添加し、ＡＤＣに対する細胞応答を、適切な生化学的および／または組織学的
アッセイを使用して経時的に評価する。
【０１８５】
したがって、本発明は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方を特異的に標的として、そ
れらに特異的に結合するＡＤＣを同定するためのアッセイを提供し、腫瘍細胞上でのそれ
らの過剰発現および増幅は、異常細胞機能に相関される。１つの実施形態では、本発明は
、下記属性：ＭＣＣ−ＤＭ１またはＳＰＤＢ−ＤＭ４へのコンジュゲーション後の１０ｎ
Ｍ未満のヒトＦＧＦＲ２に対する親和性、２ｎＭ未満のＩＣ５０を有するＦＧＦＲ２／４
で増幅され、および／またはＦＧＦＲ２／４で過剰発現性の細胞の成長を阻害する能力、
例えば単回３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与後のマウスにおける４５ｍｌ／ｄ／ｋｇ未満のゆっく
りとしたクリアランス速度を有する抗ＦＧＦＲ２／４抗体または抗体断片（例えば、抗原
結合性断片）を含むＡＤＣを提供する。
【０１８６】
ＦＧＦＲ２／４抗体
本発明は、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４（ＦＧＦＲ２／４）に特異的に結合する抗
体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。本発明の抗体または抗体断片
（例えば、抗原結合性断片）としては、実施例（以下のセクション６を参照）に記載する
ように単離されるヒトモノクローナル抗体またはそれらの断片が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗
体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、配列番号７、２７、４７、６７、８７また
は１０７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、前記抗体または抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）を提供する。ある特定の実施形態では、本発明はまた、ＦＧＦ
Ｒ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）であって、
以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤ
Ｒを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）も提供する。特定の実施
形態では、本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、
抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのいずれかのアミノ酸
配列を有する１、２、３、４、５以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（またはあるいは、からなる
）前記抗体を提供する。
【０１８８】
本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）であって、配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のアミノ酸配列
を有するＶＬドメインを含む前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供
する。本発明はまた、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、
抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つのアミ
ノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む、前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断
片）も提供する。特に本発明は、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片
（例えば、抗原結合性断片）であって、以下の表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのいずれか
のアミノ酸配列を有する１、２、３以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（またはあるいは、からな
る）前記抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
【０１８９】
本発明の他の抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）は、変異しているが、表
１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０
、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では
、それは、表１に記載の配列に記載のＣＤＲ領域と比較した場合、１、２、３、４または
５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域中で変異しているアミノ酸配列変異体を含む。
【０１９０】
本発明はまた、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖およ
び完全長軽鎖をコードする核酸配列を提供する。かかる核酸配列は、哺乳動物細胞におけ
る発現に関して最適化され得る。
【０１９１】
【表１】
2019193626.tif 000017
2019193626.tif 000018
2019193626.tif 000019
2019193626.tif 000020
2019193626.tif 000021
2019193626.tif 000022
2019193626.tif 000023
2019193626.tif 000024
2019193626.tif 000025
2019193626.tif 000026
2019193626.tif 000027
2019193626.tif 000028
2019193626.tif 000029
2019193626.tif 000030
2019193626.tif 000031
【０１９２】
本発明の他の抗体としては、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸が変異している
が、表１に記載の配列に対する少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセント
の同一性を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、それは、表１に記載の配
列に記載の可変領域と比較した場合、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が可変領
域中で変異しているが、実質的に同じ治療活性を保持するアミノ酸配列変異体を含む。
【０１９３】
これらの抗体はそれぞれＦＧＦＲ２／４に結合することができるため、ＶＨ、ＶＬ、完
全長軽鎖、および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列）を「混合および一致」させて、本発明の他のＦＧＦＲ２／４結合抗体を作出
することができる。そのような「混合および一致」したＦＧＦＲ２／４結合抗体を、当業
界で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、および実施例のセクションに記載の他の
アッセイ）を使用して試験することができる。これらの鎖を混合および一致させる場合、
特定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列と置き換えるべき
である。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長重鎖配列を、構造的
に類似する完全長重鎖配列と置き換えるべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対に由来
するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定の完
全長重鎖／完全長軽鎖対に由来する完全長軽鎖配列を、構造的に類似する完全長軽鎖配列
と置き換えるべきである。従って、一態様では、本発明は、抗体がＦＧＦＲ２／４に特異
的に結合する、配列番号７、２７、４７、６７、８７および１０７からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１７、３７、５７、７７、９７お
よび１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離され
たモノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供する。
【０１９４】
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号９、２９、４９、６９、８９および１０９か
らなる群から選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含
む完全長重鎖；および配列番号１９、３９、５９、７９、９９および１１９からなる群か
ら選択される哺乳動物細胞中での発現のために最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽
鎖を有する単離されたモノクローナル抗体；または（ｉｉ）その抗原結合ポーションを含
む機能的タンパク質を提供する。
【０１９５】
別の態様では、本発明は、表１に記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ
Ｒ３、またはその組合せを含むＦＧＦＲ２／４結合抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ
１のアミノ酸配列を、配列番号１、２１、４１、６１、８１および１０１に示す。抗体の
ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２に
示す。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号３、２３、４３、６３、８３お
よび１０３に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１１、３１、５１
、７１、９１および１１１に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号１
２、３２、５２、７２、９２および１１２に示す。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列
を、配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３に示す。
【０１９６】
これらの抗体がそれぞれＦＧＦＲ２／４に結合することができ、抗原結合特異性が主に
ＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮して、ＶＨ  ＣＤＲ１、２およ
び３配列と、ＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列とを、「混合および一致」させることがで
きる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合および一致させることができるが、
それぞれの抗体はＶＨ  ＣＤＲ１、２および３と、ＶＬ  ＣＤＲ１、２および３とを含有
し、本発明の他のＣ５結合結合分子を作出しなければならない）。そのような「混合およ
び一致」したＦＧＦＲ２／４結合抗体を、当業界で公知の結合アッセイおよび実施例に記
載のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ  ＣＤＲ配
列を混合および一致させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／
またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可）と置き換えるべきである
。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合および一致させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣ
ＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列（複数可
）と置き換えるべきである。新規ＶＨおよびＶＬ配列を、１または複数のＶＨおよび／ま
たはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本開示のモノクローナル抗体について本明細書に示される
ＣＤＲ配列に由来する構造的に類似する配列と置換することにより、新しいＶＨおよびＶ
Ｌ配列を作出することができることが当業者には容易に明らかである。
【０１９７】
従って、本発明は、抗体がＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する、配列番号１、２１、４
１、６１、８１および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１
；配列番号２、２２、４２、６２、８２および１０２からなる群から選択されるアミノ酸
配列を含む重鎖ＣＤＲ２；配列番号３、２３、４３、６３、８３および１０３からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；配列番号１１、３１、５１、７１、９
１および１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１
２、３２、５２、７２、９２および１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
軽鎖ＣＤＲ２；ならびに配列番号１３、３３、５３、７３、９３および１１３からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離されたモノクローナル抗体
またはその抗原結合領域を提供する。
【０１９８】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、配列番
号３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、およ
び配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０１９９】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ２、配
列番号２３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号３３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２００】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号４１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖ＣＤＲ２、配
列番号４３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２０１】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号６１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６２の重鎖ＣＤＲ２、配
列番号６３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２０２】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号８１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８２の重鎖ＣＤＲ２、配
列番号８３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９２の軽鎖ＣＤＲ２
、および配列番号９３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２０３】
特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）は、配列番号１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２の重鎖ＣＤＲ２
、配列番号１０３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１２の軽
鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦＲ２／４に特異的に結合する抗体は、表１に記載され
る抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）である。
【０２０５】
１．エピトープおよび同エピトープに結合する抗体の同定
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸１７６（Ｌｙｓ）および２
１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体
断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの態様では、本発明は、配列番号１
３７で示されるようなヒトＦＧＦＲ２の位置１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７
５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａ
ｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）、２
１９（Ｇｌｕ）にあるアミノ酸に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結
合性断片）を提供する。
【０２０６】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ２（ｐ２１８０２−３に従って番号付け
られる、配列番号１３７）のアミノ酸１６０〜１８９（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶ
ＫＦＲＣＰＡＧＧＮＰＭＰＴＭＲ、配列番号１３６）および／またはアミノ酸１９８〜２
１６（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣ、配列番号１４１）のエピトープに結合
する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
【０２０７】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１４２のアミノ１６９（Ｌｙｓ）および２０
３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗体断
片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。幾つかの態様では、本発明は、配列番号１４
２に示されるようなヒトＦＧＦＲ４の位置１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４
（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ
）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７
４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉ
ｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）およ
び２１２（Ｇｌｕ）にあるアミノ酸に特異的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗
原結合性断片）を提供する。
【０２０８】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ４（Ｐ２２４５５−１に従って番号付け
られる、配列番号１４２）のアミノ酸１５０〜１７４（ＴＨＰＱＲＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡ
ＧＮＴＶＫＦＲＣＰＡ、配列番号１３２）および／またはアミノ酸２０１〜２１２（ＲＬ
ＲＨＱＨＷＳＬＶＭＥ、配列番号１３３）のエピトープに結合する抗体および抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）を提供する。
【０２０９】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１３７のアミノ酸１７６（Ｌｙｓ）および２
１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに、および配列番号１４２のアミノ
酸１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４上のエピトープに特異
的に結合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
【０２１０】
１つの実施形態では、本発明は、ヒトＦＧＦＲ２（ｐ２１８０２−３に従って番号付け
られる、配列番号１３７）のアミノ酸１６０〜１８９（ＫＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶ
ＫＦＲＣＰＡＧＧＮＰＭＰＴＭＲ、配列番号１３６）およびアミノ酸１９８〜２１６（Ｋ
ＭＥＫＲＬＨＡＶＰＡＡＮＴＶＫＦＲＣ、配列番号１４１）のエピトープ、およびヒトＦ
ＧＦＲ４（Ｐ２２４５５−１に従って番号付けられる、配列番号１４２）のアミノ酸１５
０〜１７４（ＴＨＰＱＲＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＧＮＴＶＫＦＲＣＰＡ、配列番号１３２）
およびアミノ酸２０１〜２１２（ＲＬＲＨＱＨＷＳＬＶＭＥ、配列番号１３３）のエピト
ープに結合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片）を提供する。
【０２１１】
本発明はまた、表１に記載する抗ＦＧＦＲ２／４抗体と同じエピトープに特異的に結合
するか、または表１に記載する抗体と交差競合する抗体および抗体断片（例えば、抗原結
合性断片）を提供する。従って、さらなる抗体および抗体断片（例えば、抗原結合性断片
）を、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交
差競合する（例えば、統計的に有意な様式で、その結合を競合的に阻害する）その能力に
基づいて同定することができる。ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４タンパク質（例え
ば、ヒトＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４）への本発明の抗体および抗体断片（例え
ば、抗原結合性断片）の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＦＧＦＲ２および
／またはＦＧＦＲ４への結合について抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と
競合することができることを示す；そのような抗体は、非限定的理論によれば、それが競
合する抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と、ＦＧＦＲ２および／またはＦ
ＧＦＲ４タンパク質上の同じか、または関連する（例えば、構造的に類似するか、または
空間的に近い）エピトープに結合することができる。特定の実施形態では、表１に記載す
る抗体または抗体断片（例えば、抗原結合性断片）と同じＦＧＦＲ２および／またはＦＧ
ＦＲ４上のエピトープに結合する抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。
そのようなヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を、本明細書に記載のように調製および
単離することができる。
【０２１２】
２．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変化
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、抗体の特性を改善するための、ＶＨおよび
／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対する改変をさらに含む改変された抗体またはそ
の抗原結合性断片を含んでもよい。いくつかの実施形態では、フレームワーク改変を行っ
て、抗体の免疫原性を低下させる。例えば、１つの手法は、１または複数のフレームワー
ク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。より特には、体細胞
変異を受けた抗体は、抗体が誘導される生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含
有してもよい。抗体フレームワーク配列を、抗体が誘導される生殖系列配列と比較するこ
とにより、そのような残基を同定することができる。フレームワーク領域配列をその生殖
系列構成に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞変異を生殖系列
配列に「復帰変異」させることができる。そのような「復帰変異」した抗体もまた、本発
明により包含されることが意図される。
【０２１３】
別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、またはさらには、１もしくは
複数のＣＤＲ領域内の１または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去するこ
とによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法はまた、「脱免
疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号に
さらに詳細に記載されている。
【０２１４】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で作製される改変に加えて、またはその代わりに、
Ｆｃ領域内に改変を含む、典型的には、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合、およ
び／または抗原依存的細胞性細胞毒性などの、抗体の１または複数の機能的特性を変化さ
せるように、本発明の抗体を操作することができる。さらに、本発明の抗体を化学的に改
変する（例えば、１もしくは複数の化学的部分を抗体に結合することができる）か、また
は改変してそのグリコシル化を変化させ、再度、抗体の１または複数の機能的特性を変化
させることができる。これらの実施形態はそれぞれ、以下にさらに詳細に記載される。
【０２１５】
一実施形態では、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加するか
、または減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を改変する。この手法は、Bodmer et al.
による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中
のシステイン残基の数を変化させて、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするか、ま
たは抗体の安定性を増加もしくは減少させる。
【０２１６】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少
させる。より特には、抗体が天然のＦｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して弱いスタ
フィロコッカス（Staphylococcyl）タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を有するように、１また
は複数のアミノ酸変異をＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域中に導入す
る。この手法は、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記
載されている。
【０２１７】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置
き換えて、抗体のエフェクター機能を変化させることにより、Ｆｃ領域を変化させる。例
えば、抗体がエフェクターリガンドに対する変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結
合能力を保持するように、１または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換える
ことができる。親和性を変化させるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または
補体のＣ１成分であってもよい。この手法は、例えば、両方ともWinter et al.による米
国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号に記載されている。
【０２１８】
別の実施形態では、抗体が変化したＣ１ｑ結合および／または低下した、もしくは無効
化される補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）を有するように、アミノ酸残基から選択される１
または複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。
【０２１９】
別の実施形態では、１または複数のアミノ酸残基を変化させることによって、補体を固
定する抗体の能力を変化させる。この手法は、例えば、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開
第ＷＯ９４／２９３５１号に記載されている。特定の実施形態では、本発明の抗体または
その抗原結合性断片の１または複数のアミノ酸を、１または複数のアロタイプアミノ酸残
基により、図４に示すようにＩｇＧ１サブクラスおよびカッパアイソタイプに置き換える
。アロタイプアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２お
よびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、ならびにJefferis et al., MAbs. 1:332-338
(2009)により記載されたようなカッパアイソタイプの軽鎖の定常領域も挙げられる。
【０２２０】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域を改変して、抗体依存的細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ
）を媒介する抗体の能力を増加させる、および／または１もしくは複数のアミノ酸を改変
することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この手法は、例えば、
PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号に記載されている。さらに、ＦｃγＲ
Ｉ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位が
マッピングされており、結合が改善されたバリアントが記載されている（Shields et al.
, J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照されたい）。
【０２２１】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗
体を作製することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を変
化させて、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのよう
な炭水化物改変を、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させる
ことにより達成することができる。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリ
コシル化部位の除去をもたらす１または複数のアミノ酸置換を作製することによって、そ
の部位でのグリコシル化を除去することができる。そのような無グリコシル化は、抗原に
対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、例えば、Co et al.
による米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号に記載されている
。
【０２２２】
さらに、またはあるいは、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセ
クテイングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの、変化した型のグリコシル化を有する
抗体を作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤ
ＣＣ能力を増加させることが証明されている。そのような炭水化物改変を、例えば、グリ
コシル化機構が変化した宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる
。グリコシル化機構が変化した細胞は当業界で記載されており、本発明の組換え抗体を発
現させることによって、グリコシル化が変化した抗体を生成する宿主細胞として使用する
ことができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５は、フコシルトラン
スフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞系を記載し、そのよ
うな細胞系中で発現された抗体は低グリコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公開第ＷＯ
０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させ
る能力が低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をももたらす、バリア
ントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shields et al., (2002) J. Biol. 
Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Umama et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／
５４３４２号は、操作された細胞系中で発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加を
もたらすバイセクテイングＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すように、糖タンパク質改変グリ
コシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−Ｎアセチルグルコサミニルトラ
ンスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載して
いる（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照されたい）。
【０２２３】
別の実施形態では、抗体をその生物学的半減期を増加させるように改変する。様々な手
法が可能である。例えば、Wardの米国特許第６，２７７，３７５号に記載のような、１ま
たは複数の以下の変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。
あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Presta et al.による米国特許第５，８
６９，０４６号および第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ
２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するよう
に、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で変化させることができる。
【０２２４】
３．ＦＧＦＲ２／４抗体の生成
限定されるものではないが、組換え発現、化学的合成、および抗体四量体の酵素的消化
などの、当業界で公知の任意の手段によって抗ＦＧＦＲ２／４抗体およびその抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）を生成することができるが、完全長モノクローナル抗体を、例
えば、ハイブリドーマまたは組換え生成によって取得することができる。組換え発現は、
当業界で公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母
宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来するものであってよい。
【０２２５】
本発明は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に
記載のような重鎖もしくは軽鎖可変領域または相補性決定領域を含むセグメントをコード
するポリヌクレオチドをさらに提供する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域をコー
ドするポリヌクレオチドは、配列番号８、２８、４８、６８、８８および１０８からなる
群から選択されるポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核
酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレ
オチドは、配列番号１８、３８、５８、７８、９８および１１８からなる群から選択され
るポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、
９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を
有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０、３０
、５０、７０、９０または１１０のポリヌクレオチドとの少なくとも８５％、８９％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ま
たは１００％の核酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、軽鎖をコードするポ
リヌクレオチドは、配列番号２０、４０、６０、８０、１００または１２０のポリヌクレ
オチドとの少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の核酸配列同一性を有する。
【０２２７】
本発明のポリヌクレオチドは、抗ＦＧＦＲ２／４抗体の可変領域配列のみをコードして
もよい。それらはまた、抗体の可変領域と定常領域との両方をコードしてもよい。いくつ
かのポリヌクレオチド配列は、例示的マウス抗ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４抗体
の１つの重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。いくつかの他の
ポリヌクレオチドは、マウス抗体の１つの重鎖と軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一
である２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【０２２８】
ポリヌクレオチド配列を、抗ＦＧＦＲ２／４抗体またはその結合断片をコードする存在
する配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）のｄｅ  ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成による
か、またはＰＣＲ突然変異誘発により生成することができる。Narang et al., Meth. Enz
ymol. 68:90, 1979のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 19
79のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981のジエチルホ
スホロアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの、当
業界で公知の方法により、核酸の直接化学合成を達成することができる。ＰＣＲによるポ
リヌクレオチド配列への変異の導入を、例えば、PCR Technology: Principles and Appli
cations for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; P
CR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic 
Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; お
よびEckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載のように実施する
ことができる。
【０２２９】
また、上記の抗ＦＧＦＲ２／４抗体を生成するための発現ベクターおよび宿主細胞も、
本発明において提供される。様々な発現ベクターを使用して、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖ま
たは結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づ
く発現ベクターと非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞中で抗体
を生成することができる。非ウイルスベクターおよび系としては、典型的には、タンパク
質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクタ
ー、およびヒト人工染色体（例えば、Harrington et al., Nat Genet  15:345, 1997を参
照されたい）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞中での抗ＦＧＦＲ２
／４ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現にとって有用な非ウイルスベクターとし
ては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢ
ＶＨｉｓＡ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳ
Ｖベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための当業界で公知のいくつかの他の
ベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベク
ター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベ
クターおよびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Brent et al., supra; S
mith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1
992を参照されたい。
【０２３０】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる意図される宿主細胞に依存する。典型的
には、発現ベクターは、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されるプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を
含有する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下以外で
は挿入された配列の発現を防止する。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノー
ス、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターが挙げられ
る。形質転換された生物の培養物を、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容され
るコード配列について集団を偏らせることなく、非誘導条件下で拡張することができる。
プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖または断片の効
率的発現にとって必要とされるか、または望まれる。これらのエレメントは、典型的には
、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、
発現の効率を、使用において細胞系にとって適切なエンハンサーの含有により増強するこ
とができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；お
よびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ
４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を
増加させることができる。
【０２３１】
発現ベクターはまた、挿入される抗ＦＧＦＲ２／４抗体配列によりコードされるポリペ
プチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置も提供することができ
る。より頻繁には、挿入される抗ＦＧＦＲ２／４抗体配列を、ベクター中に含有させる前
にシグナル配列に連結する。抗ＦＧＦＲ２／４抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコード
する配列を受容するために使用されるベクターは、その定常領域または部分もコードする
ことがある。そのようなベクターにより、定常領域との融合タンパク質としての可変領域
の発現が可能になり、それにより、インタクト抗体またはその断片の生成がもたらされる
。典型的には、そのような定常領域はヒトである。
【０２３２】
抗ＦＧＦＲ２／４抗体鎖を担持および発現させるための宿主細胞は、原核または真核で
あってもよい。大腸菌（E.coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現
させるのに有用な１つの原核宿主である。使用にとって好適な他の微生物宿主としては、
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、ならびにサルモネラ（Salmone
lla）、セラチア（Serratia）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種などの他
の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、当業者であれば、典型的には
宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製す
ることもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモ
ーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージに由来するプロ
モーター系などの、任意数の様々な周知のプロモーターが存在する。プロモーターは、典
型的には、任意選択でオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始およ
び完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物を使用
して、本発明の抗ＦＧＦＲ２／４ポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイ
ルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を使用することもできる。
【０２３３】
いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物宿主細胞を使用して、本発明の抗ＦＧＦＲ
２／４ポリペプチドを発現および生成させる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン
遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例に記載のミエローマハイブリド
ーマクローン）または外因性発現ベクターを担持する哺乳動物細胞系（例えば、以下に例
示されるＳＰ２／０ミエローマ細胞）であってもよい。これらのものは、任意の正常な死
滅する、または正常もしくは異常な不死の動物もしくはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ
細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換されたＢ細胞
およびハイブリドーマなどの、インタクト免疫グロブリンを分泌することができるいくつ
かの好適な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための哺乳動物組織
細胞培養の使用は、例えば、Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y.,
N.Y., 1987で一般的に考察されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複
製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al.
, Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮ
Ａスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプ
ロセッシング情報部位を含んでもよい。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物遺伝子ま
たは哺乳動物ウイルスから誘導されるプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、
構成的である、細胞型特異的である、段階特異的である、および／またはモジュレート可
能もしくは調節可能であってもよい。有用なプロモーターとしては、限定されるものでは
ないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、
デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩ
ＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモ
ーター（ヒト極初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当業
界で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
【０２３４】
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿
主の型に応じて変化する。例えば、原核細胞のためには塩化カルシウムトランスフェクシ
ョンが一般的に使用されるが、他の細胞宿主のためにはリン酸カルシウム処理またはエレ
クトロポレーションを使用してもよい（一般的には、Sambrook et al., supraを参照され
たい）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、
リポソーム媒介性形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法
、ビロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮ
Ａ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot and O'H
are, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強性取込み、およびｅｘ  ｖｉｖｏでの形質
導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期的な、高収率の生成のためには、安定な発現
が望ましいことが多い。例えば、抗ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４抗体鎖または結
合断片を安定に発現する細胞系を、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントと、
選択マーカー遺伝子とを含有する本発明の発現ベクターを使用して調製することができる
。ベクターの導入後、細胞を富化培地中で１〜２日間成長させた後、選択培地に切替える
ことができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存
在により、選択培地中で導入された配列を上手く発現する細胞の成長が可能となる。耐性
の安定にトランスフェクトされた細胞を、細胞型にとって適切な組織培養技術を使用して
増殖させることができる。
【０２３５】
治療的および診断的使用
本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コンジュゲート
は、限定されるものではないが、固形がんなどのがんの処置などの様々な適用において有
用である。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片
）、および抗体薬物コンジュゲートは、腫瘍成長の阻害、分化の誘導、腫瘍体積の減少、
および／または腫瘍の発がん性の低下にとって有用である。使用方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒ
ｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの方法であってもよい。
【０２３６】
一態様では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、および抗体薬物コ
ンジュゲートは、生物試料中のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の存在を検出するのに有用で
ある。本明細書で使用される用語「検出すること」は、定量的または定性的検出を包含す
る。ある特定の実施形態では、生物試料は細胞または組織を含む。ある特定の実施形態で
は、そのような組織は、他の組織と比較してより高いレベルでＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ
４を発現する正常および／またはがん性組織を含む。
【０２３７】
一態様では、本発明は、生物試料中のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の存在を検出する方
法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、抗体の抗原への結合を可能にする
条件下で、生物試料を抗ＦＧＦＲ２／４抗体と接触させること、および抗体と抗原との間
で複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。
【０２３８】
１つの態様では、本発明は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の増加された発現に関連付け
られる障害を診断する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、試験細胞
を抗ＦＧＦＲ２／４抗体と接触させること；抗ＦＧＦＲ２／４抗体のＦＧＦＲ２またはＦ
ＧＦＲ４抗原への結合を検出することにより試験細胞上でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４
の発現レベルを決定すること（定量的または定性的に）；および試験細胞中でのＦＧＦＲ
２またはＦＧＦＲ４の発現レベルを、対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常
細胞またはそのような正常細胞と同等のレベルでＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する
細胞）中でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルと比較することを含み、対照細胞
と比較して、試験細胞上でのＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現レベルが高い場合、ＦＧ
ＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現の増加と関連する障害の存在を示す。ある特定の実施形態
では、試験細胞は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４の発現の増加と関連する障害を有するこ
とが疑われる個体から得られる。ある特定の実施形態では、障害は、がんまたは腫瘍など
の細胞増殖性障害である。ある特定の実施形態では、上記方法は、試験細胞においてＦＧ
ＦＲ２遺伝子のコピー数を測定することを含む。ある特定の実施形態では、上記方法は、
ＰＡＸ−ＦＯＸＯトランスロケーション突然変異を検出することを含む。遺伝子のコピー
数および／またはトランスロケーション突然変異は、当技術分野で公知の標準的な方法、
例えばＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ等を使用して検出することができる。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、上記のものなどの診断または検出の方法は、細胞表面上で、
または表面上にＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４を発現する細胞から得られる膜調製物中で発
現されるＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗体の結合を検出することを
含む。細胞表面上に発現されるＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗体の
結合を検出するための例示的アッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
【０２４０】
ある特定の他の方法を使用して、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ２／４抗
体の結合を検出することができる。そのような方法としては、限定されるものではないが
、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ
）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテ
インＡイムノアッセイ、および免疫組織化学（ＩＨＣ）などの、当業界で周知である抗原
結合アッセイが挙げられる。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／４抗体を標識する。標識としては、限定され
るものではないが、直接検出される標識または部分（蛍光、発色、高電子密度、化学発光
、および放射性標識など）、ならびに例えば、酵素反応または分子相互作用を介して間接
的に検出される、酵素またはリガンドなどの部分が挙げられる。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、抗ＦＧＦＲ２／４抗体を、不溶性マトリックス上に固定する
。固定は、溶液中で遊離したままである任意のＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４タンパク質か
ら抗ＦＧＦＲ２／４抗体を分離することを必要とする。これは、水に不溶性のマトリック
スもしくは表面への吸着（Bennich et al, 米国特許第３，７２０，７６０号）により、
もしくは共有カップリング（例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用する）により、アッ
セイ手順の前に抗ＦＧＦＲ２／４抗体を不溶化することによって、または例えば、免疫沈
降により、抗ＦＧＦＲ２／４抗体とＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４タンパク質との複合体の
形成後に抗ｃＫＩＴ抗体を不溶化することによって、都合良く達成される。
【０２４３】
診断または検出の上記実施形態のいずれかを、抗ＦＧＦＲ２／４抗体の代わりに、また
はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して実行することができる。
【０２４４】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、ま
たは抗体薬物コンジュゲートを患者に投与することを含む、疾患を処置、または防止する
方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合
性断片）、および抗体薬物コンジュゲートを使用して処置される疾患は、がんである。処
置および／または防止され得る疾患の例としては、副腎皮質癌、膀胱がん、骨がん、乳が
ん、中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、胚芽腫、子宮
内膜がん、胃がん、頭部および頸部がん、肝細胞がん、カポジ肉腫、肝臓がん、非小細胞
肺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、
扁平上皮頸部がん、胃がん、子宮がん、膣がん、外陰がんが挙げられるが、これらに限定
されない。ある特定の実施形態では、がんは、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結
合性断片）および抗体薬物コンジュゲートが結合するＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現性
細胞を特徴とする。ある特定の実施形態では、がんは、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４のＤ
ＮＡコピー数の増加を特徴とする。ある特定の実施形態では、がんは、例えば、それぞれ
、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４  ＲＮＡの増加により測定されるように、ＦＧＦＲ２また
はＦＧＦＲ４の発現の増加を特徴とする。本発明は、治療有効量の本発明の抗体、抗体断
片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、
がんを処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、がんは固形がんである。ある
特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、がんは、耐性がんお
よび／または再発したがんである。ある特定の態様では、例えば、耐性がんは、ＥＧＦＲ
阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤およびＭｅｔ阻害剤を含むが
これらに限定されないチロシンキナーゼ阻害剤に耐性である。ある特定の実施形態では、
がんは、Ｈｅｒ２耐性がんである。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、本発明は、対象に、治療有効量の本発明の抗体、抗体断片（
例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、腫瘍
成長を阻害する方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。ある特定
の実施形態では、対象は、腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。ある特定の実
施形態では、腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害
剤およびＭｅｔ阻害剤を含むがこれらに限定されない他のチロシンキナーゼ阻害剤に耐性
である。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、腫瘍は、抗ＦＧＦＲ２／４抗体が結合するＦＧＦＲ２または
ＦＧＦＲ４を発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ヒトＦＧＦＲ２またはＦＧＦ
Ｒ４を過剰発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＦＧＦＲ２遺伝子のコピー数の
増加を有する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＦＧＦＲ４の過剰発現を引き起こすＰ
ＡＸ−ＦＯＸＯトランスロケーション突然変異を有する。
【０２４７】
本発明はまた、治療有効量の上記抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または
抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原
結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートによる処置に関して患者を選択する方法を
提供する。ある特定の態様では、上記方法は、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんを有する
患者を選択することを含む。ある特定の態様では、チロシンキナーゼ阻害剤耐性がんが、
ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤および／またはＭｅ
ｔ阻害剤に耐性であると意図される。ある特定の態様では、耐性がんは、Ｈｅｒ２耐性が
んであると意図される。より具体的には、Ｈｅｒ２耐性がんは、トラスツズマブまたはト
ラスツズマブエムタンシンに応答しないと意図される。ある特定の態様では、がんは、新
生耐性がんであると意図され、さらに他の態様では、がんは、再発したがん、例えばＨｅ
ｒ２再発がんであると意図される。本発明のある特定の態様では、上記方法は、新生耐性
または再発したがんを有する患者を選択すること、およびＦＧＦＲ２および／またはＦＧ
ＦＲ４の発現に関して測定することを含む。ある特定の態様では、再発したがんまたは腫
瘍が、初期ではＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現性がんまたは腫瘍ではなかったが、チロ
シンキナーゼ阻害剤（例えば、トラスツズマブまたはトラスツズマブエムタンシン）によ
る処置後に、チロシンキナーゼ耐性の、もしくは再発したがんまたは腫瘍であるＦＧＦＲ
２および／またはＦＧＦＲ４陽性がんとなることが意図される。
【０２４８】
疾患の処置のために、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗
体薬物コンジュゲートの適切な用量は、処置しようとする疾患の種類、疾患の重症度およ
び経過、疾患の応答性、以前の療法、患者の病歴などの様々な因子に依存する。抗体また
は薬剤を１回で、または数日から数カ月継続する一連の処置にわたって、または治癒が行
われるか、もしくは疾患状態の縮小（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与
することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から算
出することができ、個々の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬物
コンジュゲートの相対的効力に応じて変化する。ある特定の実施形態では、用量は０．０
１ｍｇ〜１０ｍｇ（例えば、０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１
ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、または１０ｍｇ）／
ｋｇ体重であり、１日、１週間、１カ月または１年に１回またはそれ以上投与することが
できる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）
、または抗体薬物コンジュゲートは、２週間毎に１回または３週間毎に１回投与される。
処置する医師であれば、体液または組織中での測定された滞留時間および薬物濃度に基づ
いて、投与のための反復速度を推定することができる。
【０２４９】
組合せ療法
ある特定の例では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体
薬物コンジュゲートを、他の抗がん剤、抗アレルギー剤、抗嘔吐剤（または制吐剤）、疼
痛緩和剤、細胞保護剤、およびその組合せなどの他の治療剤と組み合わせる。
【０２５０】
組合せ療法における使用のために考えられる一般的な化学療法剤としては、アナストロ
ゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）
）、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅ
ｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシ
タビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５
−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムス
チン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、
シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（
登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）またはＮｅｏｓａｒ（
登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））
、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩ
Ｃ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ、Ｃｏｓ
ｍｅｇａｎ）、塩酸ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、クエン酸ダ
ウノルビシンリポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、
ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、塩酸ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙ
ｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商
標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（
Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉ
ｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒド
ロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商
標））、イフォスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａ
ｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリン
カルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐ
ｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミ
トキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル
（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペ
ントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ
（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシ
ド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａ
ｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、
ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録
商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。
【０２５１】
一実施形態では、本発明の抗体、抗体断片（例えば、抗原結合性断片）、または抗体薬
物コンジュゲートを、抗がん特性を有する第２の化合物との組合せ療法として組合せ医薬
製剤、または用量レジメン中で組み合わせる。組合せ医薬製剤または用量レジメンの第２
の化合物は、それらが互いに有害に作用しないような、抗体または組合せのイムノコンジ
ュゲートに対する相補的活性を有してもよい。例えば、本発明の抗体、抗体断片（例えば
、抗原結合性断片）、または抗体薬物コンジュゲートは、化学療法剤、チロシンキナーゼ
阻害剤、ＦＧＦ下流シグナル伝達経路阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、Ｍｃｌ１
阻害剤、および他のＦＧＦＲ２阻害剤と組み合わせて投与され得るが、これらに限定され
ない。
【０２５２】
本明細書で使用される用語「組合せ医薬(pharmaceutical combination)」とは、１つの
単位剤形中の固定的組合せ、または２つ以上の治療剤を同時に独立に、もしくは特に、組
合せパートナーが協調的な、例えば、相乗効果を示すことができる時間間隔内で別々に投
与することができる非固定的組合せもしくは組み合わせ投与のための部分のキットを指す
。
【０２５３】
用語「組合せ療法」とは、本開示に記載の治療状態または障害を処置するための２つ以
上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセル
などの、実質的に同時的な様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。あるいは、そ
のような投与は、それぞれの活性成分について、複数の、または別々の容器（例えば、カ
プセル、粉末、および液体）中での同時投与を包含する。粉末および／または液体を、投
与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、そのような投与はまた
、ほぼ同時に、または異なる時間に、連続的様式でのそれぞれの種類の治療剤の使用も包
含する。いずれかの場合、処置レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の処置にお
いて組合せ薬物の有益な効果を提供する。
【０２５４】
組合せ療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であることがわかってもよい、すな
わち、活性成分を一緒に使用した場合に達成される効果は、化合物を別々に使用すること
から得られる効果の合計よりも大きい。活性成分が（１）組み合わせた単位用量製剤中で
同時製剤化および投与されるか、もしくは同時に送達される；（２）別々の製剤として交
互に、もしくは同時に送達される；または（３）いくつかの他のレジメンによるものであ
る場合、相乗効果を達成することができる。交互療法において送達される場合、化合物が
例えば、別々の注射筒中の異なる注射液により連続的に投与または送達される場合、相乗
効果を達成することができる。一般に、交互療法中では、有効用量の各活性成分は連続的
に、すなわち、順次投与されるが、組合せ療法においては、有効用量の２つ以上の活性成
分は一緒に投与される。
【０２５５】
一態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ２阻害剤
、Ｈｅｒ３阻害剤、ＩＧＦＲ阻害剤、およびＭｅｔ阻害剤などの１または複数のチロシン
キナーゼ阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対
象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
【０２５６】
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エルロチ
ニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能
なＡＢＴ８６９としても知られる、Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−
イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）ウレア）；リンゴ酸ス
ニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６としても知られ、
米国特許第６，７８０，９９６号に記載された、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキ
シフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−「３−（４−メチルピペラジン−１−イル）
プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標
））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（
登録商標））；ザクチマ（ＺＤ６４７４）；およびイマチニブまたはメシル酸イマチニブ
（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
【０２５７】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤としては、限定されるものではないが、塩酸エ
ルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）
）；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３’’Ｓ
’’）−テトラヒドロ-3-フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミ
ノ）−２−ブテナミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（
登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ
−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４
］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カ
ネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル
）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３
−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ４９７８３９−６２−０）；ムブ
リチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９
９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル
）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ
］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニル
メチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニ
ル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシ
クロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（ＸＬ６４７、
ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）；および４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル
］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−ｙｌ］−フェノール（ＰＫＩ
１６６、ＣＡＳ１８７７２４−６１−４）が挙げられる。
【０２５８】
ＥＧＦＲ抗体としては、限定されるものではないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（
登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−
７２０００）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ニモツズマブ（ｈ
Ｒ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ３３９１
５１−９６−１）；およびｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ９４６４１４−０９−１
）が挙げられる。
【０２５９】
ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２受容体）（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、
またはｐ１８５としても知られる）阻害剤としては、限定されるものではないが、トラス
ツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録
商標））；トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））；ネラチニブ（
ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）
メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−
（ジメチルアミノ）ブタ−２−エンアミド、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０２８４４３号に記
載）；ラパチニブまたはラパチニブジトシレート（ditosylate）（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商
標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ
）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３
−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロ
フェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−
キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテナミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡ
Ｓ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］
−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２
，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエス
テル（ＢＭＳ５９９６２６、ＣＡＳ７１４９７１−０９−０２）；カネルチニブ二塩酸塩
（ＰＤ１８３８０５またはＣＩ−１０３３）；およびＮ−（３，４−ジクロロ−２−フル
オロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２
−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリナミン（Ｘ
Ｌ６４７、ＣＡＳ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
【０２６０】
Ｈｅｒ３阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、
ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、
ＭＭ−１１１、およびＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
【０２６１】
ＭＥＴ阻害剤としては、限定されるものではないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、Ｃ
ＡＳ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、以前はＸＬ８８
０、ＣＡＳ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ１０００８
７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メ
トキシキノリン−４−イルオキシ)ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２
−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ４５８
）；クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）
−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５
−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール
−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２
７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（
４−メチルピペラジン−１−ｙｌ）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン
）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３
Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン
−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキ
ソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−
メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダ
ジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ９４３５４０−
７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］ト
リアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノー
ル（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４
−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラ
ゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］
ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ９１７８７９−３９−１）；
６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［
４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ１０２２
１５０−５７−７）；および（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］
スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニル
メチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−
１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ４７７５
７５−５６−７）が挙げられる。
【０２６２】
ＩＧＦ１Ｒ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ
−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１
７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、
およびＢＩ８３６８４５が挙げられる。概説については、例えば、Yee,  JNCI, 104; 975
(2012)を参照されたい。
【０２６３】
別の態様では、本発明は、限定されるものではないが、ＭＥＫ阻害剤、Ｂｒａｆ阻害剤
、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤、ＳＨＰ２阻害剤、およびまたｍＴｏｒなどの、１または複数
のＦＧＦ下流シグナリング経路阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを
、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法を提供する。
【０２６４】
例えば、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤としては、限定され
るものではないが、ＸＬ−５１８（ＡＣＣ  Ｃｏｒｐ．から入手可能な、ＧＤＣ−０９７
３、Ｃａｓ  Ｎｏ．１０２９８７２−２９−４としても知られる）；２−［（２−クロロ
−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオ
ロ−ベンザミド（ＣＩ−１０４０またはＰＤ１８４３５２としても知られ、ＰＣＴ公開第
ＷＯ２００００３５４３６号に記載されている）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキ
シプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）ア
ミノ］−ベンザミド（ＰＤ０３２５９０１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２０
０６２１３号に記載されている）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ
］メチレン］−ブタンジニトリル（Ｕ０１２６としても知られ、米国特許第２，７７９，
７８０号に記載されている）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−
ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒド
ロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９またはＢＡＹ８６９
７６６としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７０１４０１１号に記載されている）；
（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−
トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベン
ゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（Ｅ６２０１としても知られ、
ＰＣＴ公開第ＷＯ２００３０７６４２４号に記載されている）；２’−アミノ−３’−メ
トキシフラボン（Ｂｉａｆｆｉｎ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，ＫＧ，Ｇｅｒｍａｎｙから入
手可能なＰＤ９８０５９としても知られる）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡ
Ｓ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フ
ルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３
−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ１０３５５
５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ１２０４５３１−２６−
９）；およびトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ１２
０４５３１−２５−８０）が挙げられる。
【０２６５】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、限定されるものではない
が、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）
ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリ
ン（ＧＤＣ０９４１としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９／０３６０８２号および第Ｗ
Ｏ０９／０５５７３０号に記載されている）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２
−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノ
リン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（ＢＥＺ２３５またはＮＶＰ−ＢＥＺ２３
５としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０６／１２２８０６号に記載されている）；４−（
トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−
２−アミン（ＢＫＭ１２０またはＮＶＰ−ＢＫＭ１２０としても知られ、ＰＣＴ公開第Ｗ
Ｏ２００７／０８４７８６号に記載されている）；トザセルチブ（ＶＸ６８０またはＭＫ
−０４５７、ＣＡＳ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニ
ル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１
５、ＣＡＳ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）
−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ
，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチ
ル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２
，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６，ＣＡＳ５０２６３２−６６−８）；および
８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２
、ＣＡＳ１５４４４７−３６−６）が挙げられる。
【０２６６】
ｍＴｏｒとしては、限定されるものではないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登
録商標））；リダホロリムス（以前はデフェロリムス、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（
２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ
，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９
，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１
０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３
．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イ
ル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして知られ、Ａ
Ｐ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０６４３８３
号に記載されている）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）またはＲＡＤ００
１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモッ
ド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモ
ルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェ
ニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒド
ロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチ
ル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡ
Ｓ１０１３１０１−３６−４）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−
オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル
］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、
内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。
【０２６７】
さらに別の態様において、本発明は、限定されるものではないが、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃ
ｌ２阻害剤、ＭＣｌ１阻害剤、Ｔｒａｉｌ剤、Ｃｈｋ阻害剤などの１または複数のプロア
ポトーシス剤と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象
に投与することによりがんを処置する方法を提供する。
【０２６８】
例えば、ＩＡＰ阻害剤としては、限定されるものではないが、ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−
０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、およびＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡ
Ｐ阻害剤の他の例としては、限定されるものではないが、ＷＯ０４／００５２８４、ＷＯ
０４／００７５２９、ＷＯ０５／０９７７９１、ＷＯ０５／０６９８９４、ＷＯ０５／０
６９８８８、ＷＯ０５／０９４８１８、ＵＳ２００６／００１４７００、ＵＳ２００６／
００２５３４７、ＷＯ０６／０６９０６３、ＷＯ０６／０１０１１８、ＷＯ０６／０１７
２９５、およびＷＯ０８／１３４６７９（これらは全て参照により本明細書に組み込まれ
る）に開示されたものが挙げられる。
【０２６９】
ＢＣＬ−２阻害剤としては、限定されるものではないが、４−［４−［［２−（４−ク
ロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピ
ペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニ
ルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェ
ニル］スルホニル］ベンザミド（ＡＢＴ−２６３としても知られ、ＰＣＴ公開第ＷＯ０９
／１５５３８６号に記載されている）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール
（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル
−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキ
シレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商
標））；Ｂａｋ  ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４
−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル
］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチ
ル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンザミド（ＡＢＴ−７
３７、ＣＡＳ８５２８０８−０４−９）；およびナビトクラックス（ＡＢＴ−２６３、Ｃ
ＡＳ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
【０２７０】
ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）などのプロアポトーシス受
容体アゴニスト（ＰＡＲＡ）としては、限定されるものではないが、デュラネルミン（Ａ
ＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡ
Ｓ  ６５８０５２−０９−６）；レキサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ８４５８１
６−０２−６）；アポマブ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５
、ＣＡＳ８９６７３１−８２−１）；およびチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ９４６
４１５−３４−５、Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏから入手可能）が挙げられる。
【０２７１】
チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害剤としては、限定されるものではないが、７
−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ
−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］
ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ８９１４９４−６３−６）；５−
（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピ
ペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ８６０３５２−０１−８）；４−
［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１
Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩ
Ｒ１２４、ＣＡＳ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−ＡＡＤ
）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−
２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−
ピラジニル）ウレア（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ９１１２２２−４５−２）；スルホラ
ファン（ＣＡＳ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート
）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１
，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジア
ゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ１３５８９７−０６−２
）；およびＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＹＲＳＰＡＭＰＥＮＬ）、お
よびＣＢＰ５０１（（ｄ−Ｂｐａ）ｓｗｓ（ｄ−Ｐｈｅ−Ｆ５）（ｄ−Ｃｈａ）ｒｒｒｑ
ｒｒ）が挙げられる。
【０２７２】
一態様では、本発明は、１または複数のＦＧＦＲ阻害剤と組み合わせた本発明の抗体薬
物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することにより、がんを処置する方法
を提供する。例えば、ＦＧＦＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、アラニン酸
ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２
−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１
，２，４」トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエー
ト）；バルガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ９２８３２６−８３−４）；二酪酸ドビチ
ニブ（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，
５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）
−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−ウレア（ＢＧＪ３９８、Ｃ
ＡＳ８７２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；およびＮ−［
２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル
）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−）−ジメチルエチル
）−ウレア（ＰＤ１７３０７４、ＣＡＳ２１９５８０−１１−７）が挙げられる。特定の
実施形態において、本発明は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）
−１−（６（（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン
−４−イル）−１−メチルウレア（ＢＧＪ−３９８としても知られる）；または４−アミ
ノ−５−フルオロ−３−（５−（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］
イミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（ドビチニブもしくはＴＫＩ−２
５８としても知られる）、ＡＺＤ４５４７（Gavine et al., 2012, Cancer Research 72,
2045-56、Ｎ−［５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾー
ル−３−イル］−４−（３Ｒ，５Ｓ）−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンザミド）、
ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；Gozgit et al., 2012, Mol Cancer Ther., 11; 690-99；
３−［２−（イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−
Ｎ−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル
）フェニル｝ベンザミド、ＣＡＳ９４３３１９−７０−８）などの他のＦＧＦＲ２阻害剤
と組み合わせた本発明の抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するこ
とにより、がんを処置する方法を提供する。
【０２７３】
医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本発明の
イムノコンジュゲートを、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。組成物は、
がん（乳がん、結腸直腸がん、肺がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、肝臓がん、胃がん、膵
臓がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮癌、末梢神経鞘腫瘍、
シュワン腫、頭部および頸部がん、膀胱がん、食道がん、バレット食道がん、膠芽細胞腫
、軟部組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、良
性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、女性化乳房、横紋筋肉腫および子宮内膜症）を処置または防
止するのに適している１つまたは複数の他の治療剤をさらに含有することができる。
【０２７４】
治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローショ
ン、または懸濁液の形態で生理的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合する
ことにより調製することができる（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The
Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Genna
ro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and W
ilkins, New York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: 
Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharm
aceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds
.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weine
r and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N
.Y., 2000を参照されたい）。
【０２７５】
特定の実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートの臨床サービス形態（ＣＳＦ）
は、ＡＤＣ、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベ−ト２０を含有するバイアル中の凍
結乾燥物である。凍結乾燥物を注射用水で再構成させることができ、その溶液はＡＤＣ、
コハク酸ナトリウム、スクロース、およびポリソルベート２０、ｐＨ約５．０を含む。そ
の後の静脈内投与のために、得られる溶液は通常、担体溶液中にさらに希釈される。
【０２７６】
治療剤のための投与レジメンの選択は、実体の血清または組織代謝回転率、症状のレベ
ル、実体の免疫原性および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性などのいくつ
かの因子に依存する。ある特定の実施形態において、投与レジメンは、許容される副作用
レベルと一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製
剤の量は、特定の実体および処置される状態の重症度に一部依存する。適切な用量の抗体
、サイトカイン、および小分子を選択する際の指針が利用可能である（例えば、Wawrzync
zak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Kresina 
(ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, 
N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune 
Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 3
48:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon 
et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. 
Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky 
et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照されたい）。
【０２７７】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響するか、または処置に影響すると予測される
ことが当業界で公知の、または疑われるパラメーターまたは因子を使用して、医師によっ
て行われる。一般に、用量は最適用量よりもいくらか低い量から開始し、その後、任意の
負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで少しずつ増加させる。
重要な診断尺度は、例えば、生成される炎症性サイトカインの炎症またはレベルの症状の
ものを含む。
【０２７８】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベル(dosage level)を、患者にとって
毒性とならないように、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を
達成するのに有効である活性成分の量を得るために変化させることができる。選択される
用量レベルは、使用される本開発の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミ
ドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間
、使用される特定の組成物と共に使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置
される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および以前の病歴、ならびに医学界で
公知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０２７９】
本発明の抗体またはそれらの断片を含む組成物は、連続注入により、または例えば１日
、１週または１週につき１〜７回、隔週に１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週
ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、または８週ごとに１回の間隔での投与に
より供給され得る。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内で
、または吸入により提供することができる。特定の用量プロトコールは、有意な望ましく
ない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むものである。
【０２８０】
本発明のイムノコンジュゲートに関して、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ
／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜
２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜
５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００
１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．
０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０
００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ
／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重であってもよい。本発明の抗体また
はその断片の用量を、キログラム患者体重（ｋｇ）に、ｍｇ／ｋｇで投与される用量を掛
けたものを使用して算出することができる。
【０２８１】
本発明のイムノコンジュゲートの用量を反復し、投与を少なくとも１日、２日、３日、
５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６
カ月空けてもよい。特定の実施形態においては、本発明のイムノコンジュゲートの用量を
、３週間毎に反復する。
【０２８２】
特定の患者のための有効量は、処置される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経
路および用量ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化してもよい（例えば、Mayn
ard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boc
a Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ
., London, UK, 2001を参照されたい）。
【０２８３】
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内
、動脈内、脳脊髄内、病変内による注射もしくは輸注、または持続放出系もしくは埋込み
体によるものであってもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983;
Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12:
98-105, 1982; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwa
ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980; 米国特許第６，３５０，
４６６号および第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必要に応じて、組成物はまた
、可溶化剤または注射部位での疼痛を軽減するためのリドカインなどの局所麻酔剤、また
はその両方を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール化
剤を含む製剤の使用により、肺投与を使用することもできる。例えば、米国特許第６，０
１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２
７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号、
および第４，８８０，０７８；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、第ＷＯ９
７／３２５７２号、第ＷＯ９７／４４０１３号、第ＷＯ９８／３１３４６号、および第Ｗ
Ｏ９９／６６９０３号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参
照されたい。
【０２８４】
本発明の組成物を、１または複数の当業界で公知の様々な方法を使用して、１または複
数の投与経路により投与することもできる。当業者であれば理解できるように、投与の経
路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明のイムノコンジュゲート
のために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄また
は例えば、注射もしくは輸注による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通
常は注射による、腸内投与および局所投与以外の投与様式であってよく、限定されるもの
ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経
気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射およ
び輸注が挙げられる。あるいは、本発明の組成物を、局所、表皮または粘膜投与経路など
の非経口経路により、例えば、鼻内的、経口的、経膣的、直腸的、舌下的または局所的に
投与することができる。一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、輸注に
より投与される。別の実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは皮下投与され
る。
【０２８５】
本発明のイムノコンジュゲートを制御放出系または持続放出系において投与する場合、
ポンプを使用して制御放出または持続放出を達成することができる（Langer, supra; Sef
ton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 19
80; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照されたい）。ポリマー材料
を使用して、本発明の療法の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、
Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., B
oca Raton, Fla., 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and 
Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J
. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照されたい；また、Levy et a
l., Science 228:190, 1985; During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989; Howard et a
l., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989; 米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，
９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号
；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照されたい）。持続放出製剤において使用されるポ
リマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリ
レート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−
ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、
ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ
（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）
（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態において、持続放出
製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存時に安
定であり、無菌であり、および生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防ま
たは治療標的の近くに置き、かくして、全身用量のほんの一部のみを要するようにするこ
とができる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supr
a, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照されたい）。
【０２８６】
制御放出系は、Langer, Science 249:1527-1533, 1990による概説で考察されている。
当業者には公知の任意の技術を使用して、本発明の１または複数のイムノコンジュゲート
を含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号
、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ning e
t al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996；Song et al., PDA Journal of Pha
rmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995；Cleek et al., Pro. Int'l. Sym
p. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997；およびLam et al., Proc. Int'l.
Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997（それぞれ、その全体が参照に
より本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２８７】
本発明のイムノコンジュゲートを局所投与する場合、それらを軟膏、クリーム、経皮パ
ッチ、ローション、ゲル、スプレー、エアゾール、溶液、乳濁液の形態、または当業者に
は周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sci
ences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., 
Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非スプレー可能局所剤形については、局所適用と適
合する担体または１もしくは複数の賦形剤を含み、いくつかの場合、水よりも高い動的粘
度を有する粘性から半固体または固体の形態が典型的に使用される。好適な製剤としては
、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されるか、または例えば、浸透圧など
の様々な特性に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、バッフ
ァー、もしくは塩）と混合される、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、クリーム剤、軟膏剤、
散剤、リミネント剤、蝋膏剤などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、いくつか
の場合、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質
（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填
される、スプレー可能なエアゾール調製物が挙げられる。必要に応じて、モイスチャライ
ザーまたは保湿剤を医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加の成
分の例は、当業界で周知である。
【０２８８】
イムノコンジュゲートを含む組成物を鼻内投与する場合、それをエアゾール形態、スプ
レー、ミストまたは液滴の形態で製剤化することができる。特に、本発明による使用のた
めの予防剤または治療剤を、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリク
ロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体
）の使用と共に、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー提示物の形態で都合
良く送達することができる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するためのバルブを提
供することにより、用量単位を決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデン
プンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または散布器における使用
のためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成される）を製剤化する
ことができる。
【０２８９】
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放
射線療法との同時投与または処置のための方法は、当業界で公知である（例えば、Hardma
n et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therap
eutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2
001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott
, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemot
herapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい
）。治療剤の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０
％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させることができる。
【０２９０】
本発明のイムノコンジュゲートと共に投与することができるさらなる療法（例えば、予
防剤または治療剤）を、本発明のイムノコンジュゲートから５分未満空けて、３０分未満
空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空
けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空け
て、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて
、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時
間空けて、約１２時間〜約１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６
時間空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時
間空けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間
空けて、または９６時間〜１２０時間空けて投与することができる。２つ以上の療法を、
１回の同じ患者訪問のうちに投与してもよい。
【０２９１】
ある特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切
な分布を確保するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多く
の高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過することを確保するた
めに（必要に応じて）、それらを、例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リ
ポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，
３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定
の細胞または臓器中に選択的に輸送される１または複数の部分を含み、かくして、標的化
薬物送達を増強してもよい（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参
照されたい）。標的化部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米
国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Le
tt. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活
性プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２
０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M. 
L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immun
omethods 4:273も参照されたい。
【０２９２】
本発明は、単独で、または他の療法と組み合わせた本発明のイムノコンジュゲートを含
む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本発
明の併用療法の治療法（例えば、予防剤または治療剤）は、対象へ同時にまたは順次投与
され得る。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、周期的に投与
することもできる。周期的療法は、療法（例えば、薬剤）の１つに対する耐性の発生を軽
減するため、療法（例えば、薬剤）の１つの副作用を回避もしくは軽減する、および／ま
たは療法の効能を改善するための、一定期間、第１の療法（例えば、第１の予防剤または
治療剤）の投与、次いで、一定期間、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）
の投与、およびこの連続的投与の反復、すなわち、周期を含む。
【０２９３】
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、対象に同時に投与する
ことができる。
【０２９４】
用語「同時に」は、正確に同時の療法（例えば、予防剤または治療剤）の投与に限定さ
れないが、むしろ、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物が対象に連続して、お
よび本発明の抗体が他の療法（複数可）と一緒に作用して、それらを別途投与した場合よ
りも増大した利益を提供し得るような時間間隔で投与されることを意味する。例えば、そ
れぞれの療法を同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に投与することができる
；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い時間で投与して、所望の治
療または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の適切な形態で、およ
び任意の好適な経路により、別々に対象に投与することができる。様々な実施形態におい
て、療法（例えば、予防剤または治療剤）を、１５分未満空けて、３０分未満空けて、１
時間未満空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、
約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約
６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９
時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空け
て、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて、または１週間空けて対象に投与
する。他の実施形態において、２以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）を、同じ患
者訪問のうちに投与する。
【０２９５】
組合せ療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる
。あるいは、組合せ療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中、対象に同時に投
与することができる。予防剤または治療剤を、同じか、または異なる投与経路により対象
に投与してもよい。
【実施例】
【０２９６】
下記実施例および中間体は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明するのに
役立つ。
【０２９７】
実施例１：  抗ＦＧＦＲ２／４抗体に関するスクリーニング
細胞株
Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＤＳＭＺから購入し、ＫａｔｏＩＩＩ、ＳＮＵ１６、ＳＮＵ５およ
びＨＣＩ−Ｈ７１６細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入されて、ＮＵＧＣ３細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）Ｃｅ
ｌｌ  Ｂａｎｋから入手した。細胞株は全て、それぞれの供給業者により推奨されるよう
に、ウシ胎児血清アルブミン（ＦＢＳ）を補充した適切な成長培地中で日常的に培養され
た。
【０２９８】
組換えヒト、カニクイザル、マウスおよびラットＦＧＦＲベクターの生成
ヒト、マウスおよびラットＦＧＦＲ細胞外ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉｐ
ｒｏｔデータベース由来のアミノ酸配列に基づいて合成された遺伝子であった（表２を参
照）。カニクイザルＦＧＦＲ２および４  ＥＣＤ  ｃＤＮＡ鋳型は、各種カニクイザル組
織由来のｍＲＮＡを使用して生成したアミノ酸配列情報に基づいて合成した遺伝子であっ
た（例えば、Ｚｙａｇｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、表３）。合成されたＤＮＡ断片
は全て、精製を可能にするためのＣ末端タグを用いて、適切な発現ベクター、例えばＣＭ
Ｖに基づくベクターまたはｐＣＤＮＡ（商標）３．１へクローニングした。
【０２９９】
【表２】
2019193626.tif 000032
【０３００】
【表３】
2019193626.tif 000033
【０３０１】
組換えＦＧＦＲタンパク質の発現
所望のＦＧＦＲ組換えタンパク質は、予め懸濁培養に適応されて、無血清培地、Ｌ−グ
ルタミンを伴わない５０％ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（Ｈ
ｙＣｌｏｎｅ（商標））および５０％ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ−２９３（Ｇｉｂｃｏ（登録商
標））のミックス中で成長させたＨＥＫ２９３由来の細胞株（２９３Ｔ）で発現させた。
小規模および大規模の両方のタンパク質生産は、一過性トランスフェクションを介したも
のであり、プラスミド担体としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５Ｋ、ＡｌｆａＡｅｓ
ａｒ（登録商標））を有するそれぞれ最大１Ｌの多重振とう機フラスコ（Ｎａｌｇｅｎｅ
（登録商標））中で実施した。ビオチン化タンパク質が、Ｃ末端Ａｖｉタグを介して発現
されるべきであった場合、ＢｉｒＡ酵素に関する遺伝子を保有するプラスミドは、ＥＣＤ
タンパク質プラスミドに対して１：２の比で含まれた。総ＤＮＡおよびポリエチレンイミ
ンは、１：３（ｗ：ｗ）の比で使用された。ＤＮＡ対培養物の比は１ｍｇ／Ｌであった。
細胞培養物上清は、トランスフェクションの６日後に収集して、遠心分離して、精製前に
滅菌濾過した。
【０３０２】
タグ付けタンパク質精製
組換えタグ付けＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４  ＥＣＤタンパク質（例えば、ＡＰＰ−Ｆ
ＧＦＲ２およびＡＰＰ−ＦＧＦＲ４  ＥＣＤ）は、細胞培養物上清を収集することにより
精製した。抗ＡＰＰカラムは、樹脂１ｍＬ当たり抗体１０ｍｇの最終比で、抗ＡＰＰモノ
クローナル抗体をＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂへカップリングす
ることにより調製した。発現上清を、１〜２ｍＬ／分の流速で、または重力流により、抗
ＡＰＰカラムに適用させた。ＰＢＳを用いたベースライン洗浄後、結合された材料を１０
０ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）で溶出させて、ＰＢＳに対して一晩、即座に透析した後、
滅菌濾過した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定して、個々のタンパク質
のアミノ酸配列に基づいて算出されるタンパク質吸光係数を使用して変換することにより
決定した。次に、精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析用サイズ排除クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）により特徴付けた。親和性精製した調製物中に１０％を
上回る凝集物を有するものに関して、第２のステップであるＳＥＣ精製を実施して、続い
て確認特徴付けを行った。
【０３０３】
Ｂａ／Ｆ３  ＦＧＦＲ２細胞株の生成
これらの細胞を生成するために、ヒトＦＲＧＲ２−ＩＩＩｂ−Ｃ３（ＮＭ＿０２２９７
０）をｐＥＮＴＲ（商標）ＴＯＰＯＤ（登録商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃ
ａｔ＃Ｋ２４００−２０）へクローニングした後、ＣＭＶプロモーター下でｐＬｅｎｔｉ
６  ＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｖ４９６１０）へクロ
ーニングした。次に、ウイルスをパッケージングして、Ｂａ／Ｆ３細胞（ＤＳＭＺ  Ｃａ
ｔ＃ＡＣＣ３００）にレンチウイルスを遠心感染させて、続いてブラストサイジン（例え
ば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商
標）、Ｃａｔ＃３０−１００−ＲＢ）２０μｇで処置して、３７℃および５％ＣＯ２で組
織培養インキュベーター中で５日間、ＩＬ３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃４０３
−ｍｌ−０１０）を用いて選択した。続いて、生存細胞を、培地（１０％ＦＢＳ（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ＃６３１１０１）、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃
Ｈ３１４９）および２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｃａｔ＃３０−１０
０−ＲＢ）を補充したが、ＩＬ３を有さないＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃
１１８７５−０９３））中で１カ月間成長させた。続いて、生存細胞を希釈クローニング
して（dilution cloned）、クローン細胞集団を生成し、続いてこれらを、続く研究に使
用した。
【０３０４】
ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）パンニング
ヒトＦＧＦＲ２を認識する抗体の選択のために、複数のパンニング戦略を使用した。抗
体バリアントタンパク質の供給源として商業的に入手可能なファージディスプレイライブ
ラリー、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ライブラリー
を使用して、ＦＧＦＲ２に結合するクローンの選択により、ヒトＦＧＦＲタンパク質に対
する治療抗体を作成した。このファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コ
ンセプト（Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296: 57-86）に基づくものであり、ファ
ージ表面上にＦａｂを展示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を使用する（Ｗ
Ｏ０１／０５９５０）。
【０３０５】
抗ＦＧＦＲ２抗体の単離に関して、固相、溶液、ホールセルおよびディファレンシャル
ホールセルアプローチを使用した幾つかの異なるパニング戦略を用いた。
【０３０６】
組換えＦＧＦＲ２上での固相パニング
抗原選択プロセスに先立って、コーティングチェックＥＬＩＳＡを実施して、抗原に関
して最適なコーティング濃度を決定した。各種タグを有する異なる組換えＦＧＦＲ２タン
パク質は、受動的吸着により、または抗原の各々のタグを標的とする捕捉抗体により、Ｍ
ａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））上にコーティングすることに
より、固相パニングアプローチで使用された。あるいは、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標
）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）でコーティングされたポリスチレンストリッププレー
ト（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化ＦＧＦＲ２抗原を捕捉した。９６ウェルＭａ
ｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ（登録商標））の適切な数（サブライブラリー
プールの数に応じる）のウェルを、４℃で一晩、抗原でコーティングした。コーティング
されたウェルを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／５％粉乳でブロックした。各パニン
グに関して、おおよそＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体をブロ
ックした。ブロッキング手順後、予めブロックしたファージミックスを、抗原でコーティ
ングしてブロックしたウェルそれぞれに添加して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）
振とう機上で室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートした。その後、非特異的な結合
ファージを、幾つかの洗浄ステップにより洗い流した。特異的に結合されるファージの溶
出に関して、２５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）をＲＴで１０分（ｍｉｎ）間添加
した。ＤＴＴ溶出液を、Ｅ．コリ（E. coli）（大腸菌（Escherichia coli））ＴＧ−１
細胞の感染に使用した。感染後、細菌をＬＢ（溶原性ブロス）／Ｃａｍ（クロラムフェニ
コール）寒天プレート上で平板培養して、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーを
プレートからこすり落として、ファージレスキュー、選択クローンのポリクローナル増幅
およびファージ生産に使用した。各ＦＧＦＲ２固相パニング戦略は、パニングの個々のラ
ウンドを含み、特有の抗原、抗原濃度、緩衝液組成物および洗浄ストリンジェンシーを含
有した。
【０３０７】
ストレプトアビジンとカップリングさせた磁気ビーズを用いた組換えＦＧＦＲ２上での溶
液パニング
溶液パニングアプローチに関する必要条件は、抗原のビオチン化、およびビオチン化抗
原の保持活性の確認であった。溶液パニング中、Ｆａｂディスプレイングファージおよび
ビオチン化抗原を、ファージによる抗原の到達性を促進する溶液中でインキュベートした
。
【０３０８】
各ファージプールに関して、ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商
標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃ
ｋｅｒ（商標）中でブロックした。並行して、各パニングに関して、おおよそＨｕＣＡＬ
ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体を、等量の２×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅ
ｒ（商標）／０．１％ツイーン２０を用いてブロックした。続いて、ある特定濃度のビオ
チン化抗原（例えば、１００ｎＭ）を、予め吸着およびブロックさせたファージ粒子に添
加して、回転子上でＲＴで１〜２時間インキュベートした。ファージ−抗原複合体を、ブ
ロックしたストレプトアビジンビーズを使用して捕捉して、ストレプトアビジンビーズに
結合したファージ粒子を、磁気分離器で収集した。非特異的な結合ファージを、幾つかの
洗浄ステップにより洗い流した。ストレプトアビジンビーズからの特異的に結合されるフ
ァージの溶出に関して、２５ｍＭのＤＴＴをＲＴで１０分間添加した。ＤＴＴ溶出液を固
相パニングに関して記載するように加工処理した。
【０３０９】
各ＦＧＦＲ２溶液相パニング戦略は、パニングの個々のラウンドを含み、特有の抗原、
抗原濃度および洗浄ストリンジェンシーを含有した。
【０３１０】
ＦＧＦＲ２過剰発現性細胞上でのホールセルパニング
各細胞パニングに関して、ＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージ−抗体
をＰＢＳ／ＦＣＳ中で予めブロックした。並行して、ＦＧＦＲ２の過剰発現を示すファー
ジプール（ＦＧＦＲ２、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ、ＳＮＵ１６、Ｈ７１６で安定にトランスフェ
クトしたＢａ／Ｆ３細胞）１つ当たり０．５〜１．０×１０７個の標的細胞を、氷上でＰ
ＢＳ／ＦＣＳ中に再懸濁した。
【０３１１】
ブロックした標的細胞を遠沈させて、予めブロックしたファージ粒子中に再懸濁させて
、回転子上で４℃で２時間インキュベートした。ファージ−細胞複合体を、ＰＢＳ／ＦＣ
Ｓ中で洗浄した。標的細胞からの特異的に結合されるファージの溶出は、グリシン緩衝液
（ｐＨ２．２）を用いた酸性溶出により実施された。遠心分離後、緩衝されていないトリ
スを添加することにより、上清（溶出液）を中和した。最終的なファージ含有上清は、Ｅ
．コリ（E. coli）ＴＧ１培養物の感染に使用した。下記ステップは、固相パニングのセ
クションで記載されるように行った。
【０３１２】
より詳細には、各パニングランドが細胞を用いて実施される場合のいずれかのホールセ
ルパニングが実施されるか、あるいは各細胞または組換えタンパク質が、連続的なパニン
グラウンドで使用されることを意味するディファレンシャルホールセルパニングが実施さ
れた。組換え抗原に関する選択ラウンドは、固相または溶液パニングに関して記載するよ
うに実施された。
【０３１３】
成熟パニング
増加された親和性を有するＦＧＦＲ２特異的抗体を得るために、成熟パニングを実施し
た（Prassler et al., 2009, Immunotherapy, 1: 571-583）。この目的で、標準的なパニ
ング（固相および溶液相パニング）を、上述するように異なるＦＧＦＲ２抗原を用いて実
施した。
【０３１４】
パニング後、ファージ由来のｐＭＯＲＰＨ３０（登録商標）ベクターＤＮＡのＦａｂコ
ード断片を、別個の特異的な制限酵素で消化して、ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ２成熟ライ
ブラリーのいずれかを生成した。ＴＲＩＭ（商標）技術を使用して、挿入物を置き換えた
（Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 5600-5607）。
【０３１５】
生成したライブラリーを増幅して、洗浄ストリンジェンシーの増加および抗原濃度の低
減を用いてさらに２回のラウンドのパニングに付した。
【０３１６】
選択Ｆａｂ断片のサブクローニングおよび微量発現（Microexpression）
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促進するために、選択したＨｕＣＡＬ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ
（登録商標）ファージのＦａｂコード挿入物を、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０ディスプ
レイベクターから、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商
標）ｘ１１＿ＦＨへサブクローニングした。
【０３１７】
Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１−Ｆ−の形質転換後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断
片を含有するペリプラズム抽出物の単一クローン発現および調製は、これまでに記載され
るように実施した（Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem 278: 38194-38205）。
【０３１８】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一Ｆａｂクローンを、標的抗原への結合に関
してパニングアウトプットから同定する。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli
）溶解産物を使用して試験した。
【０３１９】
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ（登録商標））３８４ウェルプレートを、対象の
ＦＧＦＲ抗原で、それらのこれまでの決定飽和濃度でＰＢＳ中でコーティングした（受動
的吸着により、または抗原の各々のタグを標的とする捕捉抗体により）。あるいは、Ｒｅ
ａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ（商標）ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）でコーティングされたポリ
スチレンストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化ＦＧＦＲ２抗原を
捕捉した。
【０３２０】
ＰＢＳ中の５％スキムミルク粉末でプレートを遮断した後、Ｆａｂ含有大腸菌（E.coli
）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合を、Ａｔｔｏｐｈｏｓ（登録商標）蛍光基質（Ｒｏｃ
ｈｅ、Ｃａｔ＃１１６８１９８２００１）を使用してアルカリホスファターゼにコンジュ
ゲートされたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００希釈）により検出した
。５３５ｎｍでの蛍光放出を、４３０ｎｍで励起して記録した。
【０３２１】
ＦＡＣＳスクリーニング（蛍光標識細胞分取）
ＦＡＣＳスクリーニングでは、細胞表面発現抗原に対する単一Ｆａｂクローン結合は、
パニングアウトプットから同定される。Ｆａｂは、Ｆａｂ含有粗製Ｅ．コリ（E. coli）
溶解産物を使用して、細胞結合に関して試験される。
【０３２２】
これらの研究では、細胞懸濁液１００μｌを、新鮮な９６ウェルプレートへ移した（１
×１０５個の細胞／ウェルをもたらす）。標的細胞懸濁液含有プレートを遠心分離して、
上清を廃棄した。残存細胞ペレットを再懸濁させて、Ｆａｂ含有細菌抽出物５０μｌを相
当するウェルに添加した。
【０３２３】
あるいは、細胞ペレットを再懸濁して、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）５０μ
ｌおよび同容量のＦａｂ含有細菌抽出物を相当するウェルに添加した。
【０３２４】
次に、細胞−抗体懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。インキュベーション後、
細胞を遠沈させて、ＦＡＣＳ緩衝液２００μｌで３回洗浄した。各洗浄ステップ後、細胞
を遠心分離して、慎重に再懸濁させた。
【０３２５】
二次検出抗体（ＰＥとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｄｉａｎｏｖａ）を添
加して、試料を氷上でインキュベートして、次に、Ｆａｂインキュベーションに従って洗
浄した。蛍光強度は、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）機器で決定した。
【０３２６】
ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ断片の発現および精製
Ｆａｂ断片の発現は、Ｅ．コリ（E. coli）ＴＧ１Ｆ−細胞で実施した。培養物を３０
℃で１８時間振とうさせた。細胞を収集して、リゾチームおよびＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（
登録商標）タンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）の組合せを使用して崩壊させ
た。Ｈｉｓ６でタグ付けしたＦａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、ドイツ
）によって単離して、タンパク質濃度をＵＶ分光光度法により決定した。代表的に選択さ
れる試料の純度は、変性還元性１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動）で解析した。
【０３２７】
Ｆａｂ調製物の均質性は、較正標準物質を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ
−ＳＥＣ）により自然状態で決定された。
【０３２８】
ＩｇＧへの変換およびＩｇＧ発現
完全長ＩｇＧを発現するために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片
を、ヒトＩｇＧ１に関して、Ｆａｂ発現ベクターから適切なｐＭｏｒｐｈ（登録商標）＿
ｈＩｇベクターへサブクローニングした。あるいは、真核生物ＨＫＢ１１細胞をｐＭｏｒ
ｐｈ（登録商標）４発現ベクターＤＮＡでトランスフェクトした。細胞培養物上清を、ト
ランスフェクションの３日後または７日後に収集した。滅菌濾過後、溶液を、液体ハンド
リングステーションを使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｍａｂ
Ｓｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に付した。別記されな
い場合には、緩衝液交換は、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）へ実施され、試料は滅菌濾過された（孔サイズ０．２μｍ）。タンパク質濃度をＵＶ分
光光度法により決定して、ＩｇＧの純度は、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標
）を使用して、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥで、変性還元性条件下で解析した。
【０３２９】
バイオアッセイ
上述するパニングプロセス後に得られる抗ＦＧＦＲ抗体を、以下で例示されるアッセイ
で評価した：
【０３３０】
ＢａＦ３/ＣＭＶ−ＦＧＦＲＩＩＩＢ−Ｃ３細胞増殖アッセイ
抗ＦＧＦＲ２抗体の、ＦＧＦ１依存性細胞増殖を阻害する能力を決定するために、増殖
アッセイは、各々のキナーゼドメインを保有する完全長ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ受容体ＥＣＤ
およびＦＧＦＲ−１細胞内ドメインのキメラで安定に形質導入された操作Ｂａ／Ｆ３細胞
株（ＢａＦ３／ＣＭＶ−ＦＧＦＲＩＩＩＢ−Ｃ３）を使用して実施した。ヒトＦＧＦ１の
添加が、この細胞株において細胞増殖を促進した。
【０３３１】
細胞を完全成長培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋３０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１＋２μｇ／
ｍｌのヘパリン＋２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン）中に再懸濁して、８０μｌ中に８
×１０３個の細胞／ウェルの細胞密度で平底白色９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、＃３９０３）へ播種して、３７℃および５％ＣＯ２で
一晩インキュベートした。
【０３３２】
翌日、ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体（ＦａｂまたはＩｇＧ）を所望の濃度（５倍濃縮）
へ完全成長培地中で希釈した。抗体溶液２０μｌを、前日の播種細胞に添加して、細胞を
７２時間培養した。７２時間後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率
アッセイ試薬（＃Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを各ウェルに添加して、わず
かに振とうしてＲＴで１５分間インキュベートして、続いて照度計（ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ
、Ｔｅｃａｎ）で発光を読み出した。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０値）の決定に関して、
ＦａＢ／ＩｇＧ滴定を実施して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０を算
出した。
【０３３３】
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ＩｇＧの潜在的なアゴニスト活性の評価に関して、抗体の、外
因性ＦＧＦ１の非存在下で操作ＢａＦ／３細胞の増殖を促進する能力により決定されるよ
うに、細胞およびＩｇＧを希釈培地（ＦＧＦ１を有さない完全成長培地）中に希釈した。
細胞の播種およびＩｇＧの添加は、同日に行った。
【０３３４】
親和性決定
ＫＤ決定に関して、抗体タンパク質の単量体分画を使用した（単量体含有量少なくとも
９０％、解析用ＳＥＣにより解析、それぞれ、Ｆａｂに関してはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標
）７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＩｇＧに関してはＴｏｓｏｈ
Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））。
【０３３５】
（ａ）Ｓｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  ｄｉｓ
ｃｏｖｅｒｙ（登録商標））を使用したＫＤ決定のための溶液平衡滴定（ＳＥＴ）法
溶液中の親和性決定は、基本的には文献（Friguet et al., 1985 J Immunol Methods 7
7: 305-319）に記載されるように実施された。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するため
に、それは、古典的なＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術に移された（Haenel et al., 2
005 Anal Biochem 339: 182-184）。ＨｕＣＡＬ（登録商標）＿ＩｇＧのＫＤ決定は、下
記試薬：標準的なＭＳＤプレート上で４℃で一晩ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌでコーティ
ングされたビオチン化ｈＦＧＦＲ２を使用して、記載されるように実施した。
【０３３６】
ＭＳＤプレートを洗浄し、３０μｌ／ウェルのＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを
界面活性剤と共に添加した後、電気化学発光シグナルをＳｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｉｍａ
ｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）、Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して検出した。
【０３３７】
データを、カスタマイズされた適合モデルを適用するＸＬｆｉｔ（商標）（ＩＤＢＳ）
ソフトウェアを使用して評価した。Ｆａｂ分子のＫＤ決定のために、以下の適合モデルを
使用した（（Haenel et al., 2005 Anal Biochem 339:182-184）に従う）：
【０３３８】
【数１】
2019193626.tif 000034
（［Ｆａｂ］ｔ：適用される全Ｆａｂ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を含まないＦａｂの最大シグナル
ＫＤ：親和性
である）。
【０３３９】
ＩｇＧ分子のＫＤ決定に関して、ＩｇＧに関する下記フィットモデルが使用され（Pieh
ler et al., 1997 J Immunol Methods 201: 189-206に従って修飾される）、データの概
要を図１に示す：
【０３４０】
【数２】
2019193626.tif 000035
（［ＩｇＧ］：適用される全ＩｇＧ濃度
ｘ：適用される全可溶性抗原濃度（結合部位）
Ｂｍａｘ：抗原を含まないＩｇＧの最大シグナル
ＫＤ：親和性
である）。
【０３４１】
パニング戦略およびスクリーニングの概要
総計で、上記で概要するように組換え抗原材料ならびに細胞株を使用した２８個の異な
るパニング戦略を用いた。上述するアッセイを使用して、パニングアウトプットを、特異
性および交差反応性に関してスクリーニングして、９３５個のクローンを配列決定に関し
て選択した。上述するスクリーニングプロセス後に、以下の実施例で記載されるように、
さらなる特徴付けに関して、１５個の抗体を選択した。これらの抗体のうち、１２４３３
、１２９４７、１０８４６および１２９３１は、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂアイソフォーム（
Ｕｎｉｐｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２−３）に結合することがわかり、１０１６４、１１
７２５、１０２２０、１１７２３および１２９４４は、両方のヒトＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ
（Ｕｎｉｐｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２−３）およびＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎｉｐ
ｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２−１）に結合することがわかり、１２４２５、１２４２２、
１２４３９、１０９１８、１０９２３および１１７２２は、両方のヒトＦＧＦＲ２  ＩＩ
Ｉｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２−３）およびＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎ
ｉｐｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２−１）および同様にヒトＦＧＦＲ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ  
受託＃Ｐ２２４５５）に結合することがわかった。
【０３４２】
実施例２：  親和性決定
ＦＧＦＲ２種オルソログに対する、および同様にＦＧＦＲ４に対する抗体の親和性を、
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００機器
（ＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、およびＣＭ５センサーチップを用いて決定した。
【０３４３】
簡潔に述べると、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充し
たＨＢＳ−ＥＰ＋（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．
００５％界面活性剤Ｐ２０）を、全ての実験に関して実行緩衝液として使用した。固定化
レベルおよび分析物相互作用は、応答単位（ＲＵ）により測定した。パイロット実験を実
施して、抗ヒトＦｃ抗体の固定化の実現可能性および試験抗体の捕捉を試験ならびに確認
した。
【０３４４】
動態測定に関して、抗体がセンサーチップ表面上に固定化された実験を実施して、表１
に列挙される上述するＦＧＦＲタンパク質の、遊離溶液中で結合する能力を決定した。簡
潔に述べると、ＲＵ  ６０００に達するように、ｐＨ４．７５の５０μｇ／ｍｌの抗ヒト
Ｆｃ抗体を、４つ全てのフローセル上に流速１０μ／分でアミンカップリングによってＣ
Ｍ５センサーチップ上に固定化した。続いて、３μｇ／ｍｌの試験抗体を、１０μｌ／分
で１０秒間注入した。抗体の固定化レベルが概して、２５０未満のＲＵに維持された。続
いて、２倍系列で希釈した０．０７８〜１００ｎＭのＦＧＦＲ受容体を、流速８０μｌ／
分で７分間、参照および試験フローセルの両方にわたって注入した。実行緩衝液として０
．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充したＨＢＳ−ＥＰ＋を使
用して、結合の解離を１０分間行った。各注入サイクル後に、チップ表面を、ｐＨ２．０
で、６０μｌ／分で７０秒間、１０ｍＭグリシンで再生させた。実験は全て、２５℃で実
施して、応答データは、全体的に簡素な１：１相互作用モデルでフィッティングさせて（
評価ソフトウェアバージョン１．１（ＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して）、速度（Ｋａ
）、オフ速度（Ｋｄ）および親和性（ＫＤ）の推定値を得た。
【０３４５】
ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ種オルソログおよびＦＧＦＲ４に対して得られた親和性推定値の
概要を表４に示す。抗体の全てが評価したＦＧＦＲ２の種オルソログに結合されること、
および抗体のサブセットはまた、ヒトＦＧＦＲ４にも結合されることがわかった。さらに
、幾つかの抗体（１０８４６、１２４３３、１２９３１および１２９４７）は、ヒトＦＧ
ＦＲ２のＩＩＩｃアイソフォーム（Ｕｎｉｐｒｏｔ  受託＃Ｐ２１８０２）に結合するこ
とができなかった。抗体の全てが、ＦＧＦＲ２に特異的であるか、またはＦＧＦＲ２およ
びＦＧＦＲ４の両方に結合され、抗体はいずれも、ＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ３にはっき
りと結合しないことがわかった。
【０３４６】
【表４】
2019193626.tif 000036
【０３４７】
実施例３：  抗ＦＧＦＲ抗体の機能活性の評価
精製抗体の、ＦＧＦＲ２のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかとして作用する
能力を、Ｂａｆ細胞がＦＧＦＲ２を過剰発現するように形質導入されたＢａｆ細胞系を使
用して評価した。
【０３４８】
抗体の潜在的なアゴニスト特性を評価するために、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２細胞をＰＢＳ中
で２度洗浄して、希釈培地（１０％ＦＢＳ、２μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａ
ｔ＃Ｈ３１４９）および２０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｃａｔ＃Ａ１１１３９−０３またはＣｅｌｌｇｒｏ（登録商標）、Ｃａｔ＃３０−
１００−ＲＢ）を補充したＲＰＭＩ）中に再懸濁した後、希釈培地９０μｌ中で８０００
個の細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ＃３９０４）中に播種し
た。各アッセイでは、１つのプレートを「０日目」のプレートと称し、これらのプレート
の各ウェルに、希釈培地をさらに１０μｌ、続いて８０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ  ｔｉｔ
ｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を添加した。アッセイプ
レートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅ
ｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。各抗
体に関して、希釈培地中の１０倍溶液として、段階希釈物を調製し、適切なウェルに１０
μｌを添加した。試験抗体に加えて、ＦＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１００−
１７Ａ、最終アッセイ濃度０〜３０ｎＭ）、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＭＡＢ６８４１）および非ＦＧＦＲ２結合抗体が対照試薬として含まれ
た。アッセイプレートは、５％ＣＯ２で３７℃で３日間インキュベートした。このインキ
ュベーション後、プレートをおよそ３０分間室温にして、８０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ  
ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を添加した。次に
、プレートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌ
ｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。
細胞増殖に対する抗体の効果を決定するために、未加工発光値を反復に関して平均化して
、０日目の対照と比較した。１０８４６、１１７２５および１２４３９は、これらの研究
では評価されなかったが、試験した他の抗体はいずれも、ＦＧＦ１を置換して、細胞成長
を維持することが可能であった。データの概要を図２（Ａ）／（Ｂ）に示す。
【０３４９】
同様に、Ｂａｆ細胞系を使用して、抗体の、ＦＧＦＲ２受容体シグナル伝達のアンタゴ
ニストとして作用する潜在性を評価した。これらの研究では、上記アゴニズム研究に記載
されるように、希釈培地への３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃
１００−１７Ａ）の添加を伴って、Ｂａｆ−ＦＧＦＲ２細胞を平板培養した。各抗体に関
して、３０μｇ／ｍｌのＦＧＦ１を有する希釈培地中の４倍溶液として、段階希釈物を調
製し、適切なウェルに２５μｌを添加した。試験抗体に加えて、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体
（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＭＡＢ６８４１）および非ＦＧＦＲ２結合抗体が対
照試薬として含まれた。アッセイプレートは、５％ＣＯ２で３７℃で３日間インキュベー
トした。このインキュベーション後、プレートをおよそ３０分間室温にして、８０μｌ／
ウェルのＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３
）を添加した。次に、プレートを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを
使用して測定した。相対的な細胞増殖に対する抗体の効果を決定するために、未加工発光
値を反復に関して平均化して、比較した。１０８４６、１１７２５および１２４３９は、
これらの研究では評価されなかった。試験した他の抗体の効果は、図３（Ａ）／（Ｂ）に
示され、評価したクローンのうち、１０９１８、１０９２３、１２９３１、１２９４４、
１２９４７および１２４２２が、１００ｎＭ未満の濃度で、５０％よりも上回って、操作
Ｂａｆ細胞の増殖を阻害したことを実証する。
【０３５０】
実施例４：  ＡＤＣの調製
１ステッププロセルによるＤＭ１コンジュゲートの調製
抗体１２４２５を、コンジュゲーション反応を開始する前に接線流濾過（ＴＦＦ＃１）
により反応バッファー（１５ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）中で
透析濾過した。続いて、抗体１２４２５（５．０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭ１（抗体量に対して
５．６倍モル過剰）、次いで、ＳＭＣＣ（抗体量に対して４．７倍過剰）と混合した。反
応を、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％ＤＭＡを含有する１５ｍＭリン酸カリウムバッファ
ー（ｐＨ７．６）中、２０℃で約１６時間行った。１Ｍ酢酸を添加してｐＨを５．５０に
調整することにより反応をクエンチした。ｐＨ調整後、反応混合物を多層（０．４５／０
．２２μｍ）ＰＶＤＦフィルターを通して濾過し、精製し、接線流濾過（ＴＦＦ＃２）を
使用して８．２２％スクロースを含有する２０ｍＭコハク酸バッファー（ｐＨ５．０）中
で透析濾過した。接線流濾過のための装置パラメーターを、以下の表５に列挙する。
【０３５１】
【表５】
2019193626.tif 000037
【０３５２】
上記のプロセスから得られたコンジュゲートを、細胞毒性剤ローディング（メイタンシ
ノイドと抗体の比、ＭＡＲ）についてはＵＶ分光法；コンジュゲート単量体の決定につい
てはＳＥＣ−ＨＰＬＣ；および遊離メイタンシノイドパーセンテージについては逆相ＨＰ
ＬＣまたは疎水性保護相（Ｈｉｓｅｐ）−ＨＰＬＣにより分析した。データは表６に示す
。
【０３５３】
【表６】
2019193626.tif 000038
【０３５４】
原位置でのプロセスによりＤＭ１コンジュゲートの調製
本発明のコンジュゲートはまた、下記手順に従って、原位置でのプロセスにより調製す
ることができる。抗体（２１個のクローン）は、スルホサクシンイミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）リンカーを使用し
てＤＭ１にコンジュゲートされた。ＤＭ１およびスルホ−ＳＭＣＣヘテロ二官能性リンカ
ーのストック溶液を、ＤＭＡ中で調製した。スルホ−ＳＭＣＣとＤＭ１チオールとを一緒
に混合して、４０％ｖ／ｖの水性５０ｍＭコハク酸バッファー、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ
５．０を含有するＤＭＡ中で、ＤＭ１とリンカーとの比１．３：１モル当量およびＤＭ１
の最終濃度１．９５ｍＭで、２５℃で１０分間反応させた。次いで、抗体を反応のアリコ
ートと反応させて、５０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０および１０％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）中、
２．５ｍｇ／ｍＬのＡｂの最終コンジュゲーション条件下で、約６．５：１のＳＭＣＣと
Ａｂとのモル当量比を得た。２５℃で約１８時間後、コンジュゲーション反応混合物を、
１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
２０、ｐＨ５．５で平衡化させたＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製
した。
【０３５５】
【表７】
2019193626.tif 000039
【０３５６】
ＳＰＤＢリンカーを使用するＡＤＣの調製
抗体１２４２２、１２４２５および１２４３３（８ｍｇ／ｍｌ）を、５０ｍＭ  ＮａＣ
ｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．５）中、２５℃で１２０分間、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチ
オ）ブタノエート（ＳＰＤＢ、それぞれ、５．０、５．５および４．９倍モル過剰）を使
用して改変した。次いで、精製されていない改変Ａｂを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  
ＥＤＴＡ、および５％ＤＭＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５
）中、４ｍｇ／ｍＬの最終改変抗体濃度で、２５℃で１８時間、ＤＭ４（未結合のリンカ
ーに対して１．７倍モル過剰）にコンジュゲートした。コンジュゲーション反応混合物を
、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０、ｐＨ５．５で平衡化および溶出させるＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを
使用して精製した。
【０３５７】
【表８】
2019193626.tif 000040
【０３５８】
ＣＸ１−１リンカーを使用するＡＤＣの調製
抗体１２４２５（５．０ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＭ１（抗体量に対して７．１５倍モル過剰
）、次いで、ＣＸ１−１（抗体量に対して５．５倍過剰）と混合した。反応を、２ｍＭ  
ＥＤＴＡおよび５％ＤＭＡを含有する６０ｍＭ  ＥＰＰＳ［４−（２−ヒドロキシエチル
）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸］バッファー（ｐＨ８．５）中、２５℃で約１６
時間行った。次いで、反応混合物を、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５
％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５．５中で平衡化および溶出させるＳＥ
ＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを使用して精製した。
【０３５９】
【表９】
2019193626.tif 000041
【０３６０】
実施例５：  親抗体と比較したＡＤＣの親和性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲーション後のＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４に対する抗体
の親和性を、上記の実施例２に記載のものと同様の方法を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（登
録商標）Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣＭ５センサーチップを使用する
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）技術を使用して決定した。
【０３６１】
評価した抗体に関して、親非コンジュゲート化抗体と比較してＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジ
ュゲート化抗体について、ヒトＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂへの結合に関して類似する親和性推
定値が得られたが、これはコンジュゲーションが抗体結合に感知できるほど影響しないこ
とを示唆している（表１０）。
【０３６２】
【表１０】
2019193626.tif 000042
【０３６３】
さらに、幾つかのＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗体のＦＧＦＲ２およびＦ
ＧＦＲ４種オルソログに対する親和性を決定した。これらの研究では、親和性における感
知可能な差は、コンジュゲートされた抗体とコンジュゲートされていない抗体との間では
見られなかった（表１１）。
【０３６４】
【表１１】
2019193626.tif 000043
【０３６５】
実施例６：  ＳＮＵ１６およびＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞におけるＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ
活性
ＳＭＣＣ−ＤＭ１リンカー−ペイロードへのコンジュゲーション後に、抗体薬物コンジ
ュゲート（ＡＤＣ）の、ＦＧＦＲ２増幅細胞株ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＣＲＬ−
５９７４）およびＫａｔｏ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）の増殖を阻害
する能力を決定した。簡潔に述べると、供給業者により推奨されるように、細胞を組織培
養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で培養培地中で培養した。アッセイの当日に
、細胞をＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ  Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄した後、０．２５％ト
リプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃａｔ＃２５３００）で５分間処置して、
推奨される培養培地中に再懸濁した。次に、細胞を計数して、細胞培養培地１００μｌ中
に２６００〜３６００個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃ
ａｔ＃３９４０またはＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃａｔ＃３３４０）中に播種した。二
重反復プレートは、０日目の測定用に生成されて、全てのプレートを組織培養インキュベ
ーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。また、培地のみのウェルを生
成して、陰性対照として作用させた。このインキュベーション後、５０μｌ／ウェルのＣ
ｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を、０日
目プレートに添加して、次にそれらを１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度
を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダ
ーを使用して測定した。試験ＡＤＣは、適切な細胞培養培地中、２×ストック溶液へ二重
反復で段階希釈して、アッセイプレートの残部それぞれから培地５０μｌを除去した後、
２×段階希釈ＡＤＣ  ５０μｌを添加した（最終アッセイ濃度０．２〜５０ｎＭ  ＤＭ１
等価体）後、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で５日間インキュベート
した。このインキュベーション期間後に、相対細胞生存率を、上述するようにＣｅｌｌ  
ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決定した。細胞増殖に対するＡＤＣの
効果は、下記の通りに二重反復の平均値を使用して算出された：
阻害％＝（処置ＡＤＣ−未処置）／（未処置−０日目）×１００
【０３６６】
阻害％データを４パラメーターロジスティック方程式にフィッティングさせて、ＩＣ５
０値を決定した。ＩｇＧ対照ＡＤＣと異なり、試験ＡＤＣは、３ｎＭ未満のＩＣ５０で、
Ｋａｔｏ−ＩＩＩおよびＳＮＵ１６細胞の両方の増殖の強力な阻害剤であることがわかっ
た。（表１２）。
【０３６７】
【表１２】
2019193626.tif 000044
【０３６８】
また、ＳＰＤＢ−ＤＭ４リンカー−ペイロードを介してコンジュゲートされた幾つかの
抗ＦＧＦＲ抗体の能力を評価した。上述するように実施したこれらの研究により、評価し
た抗体はまた、ＳＰＤＢ−ＤＭ４  ＡＤＣとして細胞増殖の強力な阻害剤であることが明
らかとなり、ペイロードを首尾よく送達して、細胞を死滅させるそれらの能力は、ＭＣＣ
−ＤＭ１に限定されないことを示唆した。ＳＮＵ１６細胞株に関するデータを表１３に概
要する。
【０３６９】
【表１３】
2019193626.tif 000045
【０３７０】
実施例７：  抗ＦＧＦＲ２／４  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ活性の評価
１５個の抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４交差反応性ＡＤＣの抗腫瘍活性
は、胃のＦＧＦＲ２増幅（ＣＮ＝３１）、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂアイソフォーム発現性Ｓ
ＮＵ１６異種移植片腫瘍モデルで評価した。２つの独立した研究において、雌ヌードマウ
スに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）
（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下
移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均
腫瘍体積１９２．９ｍｍ３による移植の８日後に、第１の研究に加えた。９つの群（ｎ＝
８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳまたは下記抗体薬物コ
ンジュゲート：１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０２２０
−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０９１８−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０９２３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１１７
２２−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１
の１つの単回３ｍｇ／ｋｇ静脈内（ｉ．ｖ．）注射を投与した。マウスは、平均腫瘍体積
２２３．４ｍｍ３による移植の７日後に、第２の研究に加えた。９つの群（ｎ＝８匹／群
）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳまたは下記抗体薬物コンジュゲ
ート：１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２９４７−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２９３１−ＭＣＣ
−ＤＭ１、１２９４４−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４３９−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０８４６−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１、１１７２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または１１７２３−ＭＣＣ−ＤＭ１の１つの
３ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．注射を投与した。１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１は、両方の研究に
おける抗体薬物コンジュゲートの直接的な比較を容易とするために、２つの研究間の懸け
橋として含まれた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。これらの研究で評価さ
れるＡＤＣは、投与の２３から２４日後に広範囲の抗腫瘍活性を示した（３３．２％Ｔ／
Ｃから７７．８％退縮に及ぶ）（図４（Ａ）および図４（Ｂ））。
【０３７１】
切断性ジスルフィドリンカーに基づくＳＰＤＢ−ＤＭ４  ＦＧＦＲ２  ＡＤＣの抗腫瘍
活性を、ＳＮＵ１６異種移植片腫瘍モデルで評価した。これらの研究では、雌ヌードマウ
スに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）
（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下
移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均
腫瘍体積２２３ｍｍ３による移植の１１日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝７匹／群
）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）、１２４３
３−ＭＣＣ−ＤＭ１もしくは対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回１５ｍｇ／ｋｇ静脈内注
射、または１２４３３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４もしくはＩｇＧ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の単回５ｍ
ｇ／ｋｇ静脈内注射を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。対照ＡＤ
Ｃはいずれも、この研究では抗腫瘍活性を示さなかった（図４（Ｃ））。しかしながら、
対照的に、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２４３３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はともに、
投与した用量で、ＳＮＵ１６異種移植片モデルに対して高活性であり、抗ＦＧＦＲ  ＡＤ
Ｃの抗腫瘍効果が、異なるリンカーを用いて得られ得ることを示唆した。
【０３７２】
抗ＦＧＦＲ  ＡＤＣの薬物動態（ＰＫ）を、３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後にＳＮＵ１
６腫瘍保有マウスで評価した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、２４時間後、７２時間後、
１６８時間後、および３３６時間後に収集した。全ての研究において、「総」抗体および
「抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」の両方の血清濃度は、確証されたＥＬＩＳＡ法を
使用して全ての動物種で測定された。「総」分画は、コンジュゲートされたＤＭ１を伴う
か、または伴わない抗体の測定を指すのに対して、ＡＤＣ分画は、ＤＭ１とコンジュゲー
トされた抗体のみの測定を指す（１つ以上のＤＭ１分子）。全ての研究において、感知可
能な差は、ＡＤＣと総抗体分画とのクリアランス間で観察されなかった。ＡＤＣのＰＫ特
性の概要を図４（Ｄ）〜図４（Ｅ）に示す。ＳＮＵ１６腫瘍保有マウスにおける単回３ｍ
ｇ／ｋｇ投与後のＡＤＣクリアランスを、観察される抗腫瘍効果と比較した場合、最大の
抗腫瘍活性を有するＡＤＣ（４０％を上回る腫瘍退縮）は全て、４５ｍｌ／ｄ／ｋｇ未満
の速度で除去されることがわかった（図４（Ｆ））。
【０３７３】
実施例８：  ＦＧＦＲ２増幅細胞株を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコンジュゲートされ
ていない抗体およびコンジュゲートされた抗体のシグナル伝達活性の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲー
トされた抗ＦＧＦＲ２抗体の、ＦＧＦＲ２増幅細胞株においてＦＧＦＲシグナル伝達を調
節する能力を評価した。初期研究では、ＳＮＵ１６（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＣＲＬ−５９７
４）細胞における１２４３３、１２４２５および１０１６４抗体の効果を決定した。簡潔
に述べると、細胞を１２ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄ（商標）プレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａ
ｔ＃３３３６）において１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中に播種して、組織培養インキ
ュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。実験の当日に、細胞培養
培地を吸引して、試験抗体または小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８のいずれかで置き換
えて、全てを、（１３〜１３０ｎＭ、抗体／ＡＤＣ、５００ｎＭ、ＢＧＪ３９８）の最終
濃度で、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で希釈した。次に、細胞を組織培養インキュ
ベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で２時間インキュベートした。このインキュベーション
後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄して、氷上に置い
て、ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃０４  ９０６２３７００１）ととも
に溶解緩衝液（ＣＳＴ  Ｃａｔ＃９８０３）３００μｌを添加した。タンパク質濃度は、
ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ＃２３２２８）により決定した。続いて、タンパ
ク質６０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させて、ニトロセルロース膜上へ転写して、
ｐＦＲＳ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃３８６１
）、総ＦＧＦＲ２（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａ
ｔ＃ＳＣ−１２２またはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃６８４１）およびβ−アクチ
ン（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ３００−４８５Ａ）またはサイトケラチン（Ｄａｋｏ  Ｃ
ａｔ＃Ｍ３５１５）に対する抗体でプローブした。結果を図５（Ａ）に示し、コンジュゲ
ートされてないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣとしてのいずれの抗体も、２時間でｐ
ＦＲＳ２シグナルを調節することが不可能であることがわかった。１２４２５抗体（４．
３ｎＭ）および１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ（４．３ｎＭ抗体、１３ｎＭ  ＤＭ
１等価体）を用いてさらなる実験を行い、ここではＳＮＵ１６および同様にＫａｔｏ−Ｉ
ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）細胞の両方においてさらなる時点（４時間、
２４時間および７２時間）を評価した。結果を図５（Ｂ）（ＳＮＵ１６）および図５（Ｃ
）（Ｋａｔｏ−ＩＩＩ）に示す。ネイキッド抗体またはＡＤＣのいずれの効果も、ＳＮＵ
１６細胞においては４８時間まで、またはＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞においては７２時間まで
観察されなかった。ｐＦＲＳ２およびｔＦＧＦＲ２シグナルの両方の低減が、１２４２５
−ＭＣＣ−ＤＭ１処置後にサイトケラチンに対してＳＮＵ１６細胞において７２時間に観
察された。以下の実施例９に記載されるように、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、７２時
間の時点でのＳＮＵ１６増殖の強力な阻害剤であり、この減少は、ＳＮＵ１６細胞集団に
おいてＦＧＦＲ２発現の不均一性を反映する可能性が高い。
【０３７４】
実施例９：  細胞増殖に対するＡＤＣおよびコンジュゲートされていない抗体の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲート
された抗ＦＧＦＲ抗体の、ＦＧＦＲ２増幅過剰発現性およびヌル細胞株パネルの増殖を阻
害する能力を評価した。これらの研究では、供給業者により推奨されるように、細胞を組
織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で培養培地中で培養した。アッセイの当
日に、細胞をＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ  Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄した後、０．２５
％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｃａｔ＃２５３００）で５分間処置し
て、推奨される培養培地中に再懸濁した。次に、細胞を計数して、細胞培養培地５５〜１
００μｌ中に８００〜３６００個の細胞／ウェルの密度で９６または３８４ウェルプレー
ト（例えば、Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ＃３９４０、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃａｔ＃３
３４０、Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ＃３７０７）中に播種した。二重反復プレートは、０日目
の測定用に生成されて、全てのプレートを組織培養中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキ
ュベートした。また、培地のみのウェルを生成して、陰性対照として作用させた。このイ
ンキュベーション後、３０〜５０μｌ／ウェルのＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商
標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）を、０日目プレートに添加して、次にそれらを
１０分間、穏やかに振とうして、得られた発光強度を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎ
Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０１プレートリーダーを使用して測定した。試験ＡＤＣは
、適切な細胞培養培地中、２×または１０×ストック溶液のいずれかへ二重反復で段階希
釈した。２×ＡＤＣストック溶液が使用されるアッセイに関しては、アッセイ培地の半分
を除去して、等量の２×段階希釈ＡＤＣで置き換えた。１０×ＡＤＣストック溶液が用い
られた場合、これを、アッセイプレートへ１：１０で希釈した（例えば、５μｌ対５５μ
ｌ）後、組織培養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で５日間または６日間インキ
ュベートした。ＡＤＣの最終的なアッセイ濃度は、０．００５〜１００ｎＭ  ＤＭ１等価
体の範囲であった。このインキュベーション期間後に、相対細胞生存率を、上述するよう
にＣｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）試薬の添加により決定した。細胞増殖に対
するＡＤＣの効果は、下記の通りに二重反復の平均値を使用して算出された：
阻害％＝（処置ＡＤＣ−未処置）／（未処置−０日目）×１００
【０３７５】
阻害％データを４パラメーターロジスティック方程式にフィッティングさせて、ＩＣ５
０値を決定した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に関する代表的なデータを図６（Ａ）に示
す。このＡＤＣは、ＳＮＵ１６（図６（Ａ））およびＫａｔｏ−ＩＩＩ  ＦＧＦＲ２増幅
細胞株（図６（Ｂ））の両方において細胞増殖の強力な阻害剤であることがわかった。こ
れらの細胞株はともに、メイタンシノイドペイロードに対して感受性があることが確認さ
れた（Ｌ−Ｍｅ−ＤＭ１、図６（Ａ）〜図６（Ｃ）では遊離ＤＭ１）が、類似のメイタン
シノイド抗体比でＳＭＣＣ−ＤＭ１を介してコンジュゲートされた非ターゲッティングＡ
ＤＣ（ニワトリリゾチームに対して）に対して感受性がないことが確認された。１２４２
５−ＭＣＣ−ＤＭ１はまた、感知可能なＦＧＦ２発現を欠如しているが、メイタンシノイ
ドペイロードに対して感受性がある胃がん細胞株ＮＵＧＣ３に対して活性がなかった（図
６（Ｃ））。さらに、コンジュゲートされていない抗体１２４２５は、ＳＮＵ１６（図６
（Ｄ）およびＫａｔｏ−ＩＩＩ（データは示していない）の両方において抗増殖活性を欠
如することがわかった。ＳＮＵ１６、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ、ＳＵＭ−５２、ＭＦＭ２２３お
よびＨ７１６細胞（Kunii et al., 2008 Cancer Res 68: 2340-2348、Turner et al., 20
10 29: 2013-2023、Mathur et al., 2010. Proceedings of the 101st Annual Meeting o
f the American Association for Cancer Research, poster # 284）を含むＦＧＦＲ２増
幅細胞株における幾つかの抗ＦＧＦＲ−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣの抗増殖活性の概要を表
１４に示す。さらに、ＡＤＣはいずれも、ＡＺ５２１、ＣＡＬ−５１、ＫＹＳＥ−１５０
、ＴＥ−６、ＳＮＵ−１０４１、ＴＴ、ＣＨＬ−１、Ｇ４０１およびＨＥＣ５９を含む腫
瘍細胞株パネルに対して活性であることがわかった。
【０３７６】
【表１４】
2019193626.tif 000046
【０３７７】
実施例１０：  ＦＧＦＲ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏＰＫ−ＰＤ
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の、ｉｎ  ｖｉｖｏで薬物動態マーカーを調節する能力を
評価するために研究を行った。この研究の目標は、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４発現とＧ
２／Ｍ細胞周期停止との間の関連性を評価することであった。免疫組織化学により評価さ
れるように、ｐＨＨ３陽性核の蓄積は、Ｇ２／Ｍ停止のマーカーとして使用した。
【０３７８】
ヒトヒストンＨ３のＳｅｒ１０周囲の残基に相当する合成ホスホペプチドで動物を免疫
化することにより生産されるウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎ
ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ）から入手した。簡潔に述べると、ＩＨＣ
プロトコールは、熱、およびＶｅｎｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ＃１
抗原回復（antigen retrieval）試薬に対する標準的な曝露を含んでいた。一次抗体を１
：１００に希釈して、３７℃で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ  
ＯｍｎｉＭａｐで予め希釈したＨＲＰとコンジュゲートした抗ラビット抗体（Ｃａｔ＃７
６０−４３１１）とのインキュベーションを４分間実施した。
【０３７９】
ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移植片モデルにおいてＰＤを評価するために、雌ヌード
マウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商
標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を
皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいっ
たん３００〜５００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、ｉ．ｖ．用
量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を
受けさせた（ｎ＝３匹／群）。メイタンシノイドペイロードの予測される作用機序と一致
して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＰＢＳ処置対照と比較して、投与の２４時間後に
核ｐＨＨ３陽性の顕著な時間依存的増加をもたらした（代表的な画像を図７（Ａ）に示す
）。切断されたカスパーゼ３における時間依存的変化もまた評価した。これらの研究では
、ヒトカスパーゼ−３における（Ａｓｐ１７５）に隣接するアミノ末端残基に相当する合
成ペプチドで動物を免疫化することにより生産されるウサギポリクローナル抗体は、Ｃｅ
ｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバーズ、ＭＡ）から入手した。
ＩＨＣプロトコールは、熱を含まず、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉ
ｎｇ＃１抗原回復試薬に対する標準的な曝露を含んでいた。一次抗体を１：３００に希釈
して、室温で６０分間インキュベートした。続いて、Ｖｅｎｔａｎａ  ＯｍｎｉＭａｐで
予め希釈したＨＲＰとコンジュゲートした抗ラビット抗体（Ｃａｔ＃７６０−４３１１）
とのインキュベーションを４分間実施した。ｐＨＨ３と類似して、同様に、切断されたカ
スパーゼ３における時間依存的変化が観察された（図７（Ａ）。類似したデータが、他の
抗ＦＧＦＲ２  ＡＤＣ、例えば１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた。
【０３８０】
ＡＤＣ特異性を評価するために、ＰＤは、ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４陰性ＮＵＧＣ３異種
移植片モデルにおいて評価した。これらの研究では、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩
溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１×１０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細
胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん３００〜５００ｍｍ３に
達したら、９匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４
２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）を
受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦ
Ｒ４陰性ＮＵＧＣ３異種移植片において、１５ｍｇ／ｋｇｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１に対してｐＨＨ３レベルを調節することができなかった（代表的な画像を図
７（Ｂ）に示す）。類似したデータが、他の抗ＦＧＦＲ２  ＡＤＣ、例えば１２４３３−
ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた。
【０３８１】
まとめると、これらのデータは、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、ＦＧＦＲ２またはＦ
ＧＦＲ４発現に依存して、またメイタンシノイドペイロードの作用機序と一致する頑強な
ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞ＰＤ効果を誘発することが可能であることを実証している。
【０３８２】
実施例１１：  抗ＦＧＦＲ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
抗ＦＧＦＲ２および／または抗ＦＧＦＲ２／４  ＡＤＣの抗腫瘍活性を、幾つかの腫瘍
異種移植片モデルで評価した。
【０３８３】
ＦＧＦＲ２ゲノム増幅による異種移植片モデル
モデル１：３つの抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４二重ターゲッティング
ＡＤＣの抗腫瘍活性を、胃のＦＧＦＲ２増幅（コピー数＝３１、ＳＮＰ６．０）、ＦＧＦ
Ｒ２  ＩＩＩｃアイソフォーム発現性ＮＣＩ−Ｈ７１６結腸直腸異種移植片腫瘍モデルで
評価した。雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭ
ａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する５×１０６個の細
胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。
【０３８４】
マウスは、平均腫瘍体積１７１．７ｍｍ３による移植の４日後に、研究に加えた（図８
（Ａ））。８つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰ
ＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または単回ｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍ
ｇ／ｋｇ）、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１（５または１５ｍｇ／ｋｇ）、１２４２５−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１（５または１５ｍｇ／ｋｇ）または１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１（５または
１５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。対照ＩｇＧ
−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１５ｍｇ／ｋｇでは活性ではなかった。１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ
１は、５ｍｇ／ｋｇでは活性ではなかった。１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋ
ｇ）、１２４２２−ＭＣＣ−ＤＭ１（５および１５ｍｇ／ｋｇ）および１２４２５−ＭＣ
Ｃ−ＤＭ１（５および１５ｍｇ／ｋｇ）は、投与後の１４日まで類似した活性を示した。
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）および１０１６４−
ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇのみ）は、投与後の１８日まで最も持続性の応答をもた
らした（それぞれ、２３％、２１％および３１％Ｔ／Ｃ）。
【０３８５】
モデル２：３つの抗ＦＧＦＲ２または抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４  ＡＤＣの用量応答抗
腫瘍活性はまた、ＦＧＦＲ２増幅、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂアイソフォーム発現性ＭＦＭ２
２３  ＥＲ／ＰＲ／Ｈｅｒ２陰性胸部異種移植片腫瘍モデルで評価した。ＭＦＭ２２３モ
デルは、断片に基づくモデルとして樹立された。断片移植の１日前に、雌ヌードマウスに
、血清エストロゲンレベルを維持するための６０日持続放出１７β−エストラジオールペ
レット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）０．７２ｍ
ｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット移植の１日後、ドナーマウスから
収集した異種移植片を、レシピエントヌード雌マウスへ皮下移植される３ｍｍ３断片ごと
に３つに切断した。マウスは、平均腫瘍体積２０８．４ｍｍ３による移植の２１日後に、
研究に加えた（図８（Ｂ））。５つの群（ｎ＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当
てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または単回１０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．用量の
対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ
１または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測
定した。ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、このモデルでは活性ではなかった。単回１０ｍｇ／
ｋｇ  ｉ．ｖ．用量の１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および
１０１６４−ＤＭ１は、投与の１８日後に、３７％、２４％および７％Ｔ／Ｃをもたらし
た。
【０３８６】
モデル３：単剤としての１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性はまた、ＦＧＦＲ２増幅患
者由来原発性胃腫瘍異種移植片モデルＣＨＧＡ−０１０（ＦＧＦＲ２コピー数＝４８、（
ＳＮＰ６．０））で評価した。これらの研究では、雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスに、ＤＭＥ
Ｍ中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）を含有する３×３×３ｍｍ腫瘍断片を皮下移植した。腫瘍生着率は５０％を上
回り、移植の４週後にはおよそ２５０ｍｍ３に達した。１０ｍｇ／ｋｇＩＶ  １２４２５
−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回投与後に、腫瘍停滞は、投与後のおよそ１６〜２０日まで達成さ
れた（図８（Ｃ））。類似した単回投与データが、ＦＧＦＲ２特異的ＡＤＣ、１２４３３
−ＭＣＣ−ＤＭ１に関しても得られた（データは示していない）。さらに、１０ｍｇ／ｋ
ｇのｑ３ｗ＊２  ＩＶを受けた群は、おおよそ腫瘍停滞を初期投与後の３７日まで維持し
た一方で、単回１０ｍｇ／ｋｇ用量を受けた群での腫瘍は、初期投与後の３７日までに平
均して１５８８ｍｍ３となった。これらのデータは、ＣＨＧＡ０１０異種移植片が、１２
４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の第２の投与に応答することが可能であることを実証している。
【０３８７】
正常なＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４コピー数を有する異種移植片モデル
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性はまた、正常なＦＧＦＲ２コピー数および様
々なＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４  ｍＲＮＡ発現を有する２３個のヒト肺原発性腫瘍異種
移植片、および２２個のヒト胸部原発性腫瘍異種移植片で評価した。ヒト原発性異種移植
片モデルは、ヒト肺原発性腫瘍断片を、雌ヌードマウスへ皮下移植することにより樹立し
た。得られた腫瘍異種移植片を、雌ヌードマウスへの３ｍｍ３断片の皮下移植により、ｉ
ｎ  ｖｉｖｏで継代培養した（passaged）。動物に腫瘍断片を移植して、随時登録（roll
ing enrollment）により、即ち腫瘍がいったんおよそ２５０ｍｍ３に達したが必ずしも腫
瘍断片移植後の同じ時間ではなしに、処置（未処置、または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１
、１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．ｑ２ｗ）に割り当てた。異種移植片モデル１つ当たり１匹の
動物が、２つの処置部門それぞれに割り当てられた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで
測定し、データは、腫瘍体積の変化パーセントとして解析した。
【０３８８】
２３個の肺原発性腫瘍異種移植片モデルのうち８個、および２２個の胸部原発性腫瘍異
種移植片モデルのうち８個が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に応答した。応答は、一過性
の腫瘍成長阻害から腫瘍移植片の完全退縮までに及んだ。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に
応答する１つの肺原発性腫瘍異種移植片モデルおよび１つの胸部原発性腫瘍異種移植片モ
デルの例は、それぞれ、図８（Ｄ）および図８（Ｅ）に示す。まとめると、データは、Ｆ
ＧＦＲ２またはＦＧＦＲ４  ｍＲＮＡのいずれかの発現の上昇を伴うヒト肺および胸部原
発性腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏでの成長が、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１処置によ
り阻害され得ることを実証している。
【０３８９】
抗ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４  ＡＤＣ  １２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活
性はまた、ＦＧＦＲ２を発現するが、遺伝子の正常なコピー数を有する胸部異種移植片モ
デルで評価した。モデルは、乳管癌を有する５２歳女性由来の断片に基づく異種移植片モ
デルとして樹立され、雌ヌードマウスで展開させた。ドナーマウスから収集した異種移植
片を、３ｍｍ３断片ごとに３つに切断して、血清エストロゲンレベルを維持して、異種移
植片成長を支持するために０．００８５ｍｇ／ｍｌの１７β−エストラジオールリッチな
水を補充したレシピエントヌード雌マウスに皮下注射した。マウスは、平均腫瘍体積１９
８ｍｍ３による移植の２６日後に、研究に加えた。３つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１
つに無作為に割り当てた後、マウスに単回１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．用量の対照ＩｇＧ−
ＭＣＣ−ＤＭ１、または１５または５ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ．用量の１２４２５−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１を投与した（図８（Ｆ））。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した。
単回１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、６．５％Ｔ／Ｃを
もたらした一方で、５ｍｇ／ｋｇ用量は不活性であった。これらのデータは、遺伝子増幅
なしでＦＧＦＲ２発現性腫瘍における１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の有用性を支持する。
【０３９０】
まとめると、これらのモデルは、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅の存在または非存在下で、細胞
表面でＦＧＦＲ２を発現する腫瘍における１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の有用性を支持す
る。
【０３９１】
実施例１２：  小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８（３−（２，６−ジクロロ−３，５−
ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フ
ェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素としても公知）によるＦＧ
ＦＲ  ＡＤＣの抗腫瘍活性の改善
単独での、およびＦＧＦＲ小分子チロシンキナーゼ阻害剤３−（２，６−ジクロロ−３
，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル
）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（Guagnano et al.,
2011 J Med Chem 54: 7066-7083）と組み合わせたＦＧＦＲ２／４抗体薬物コンジュゲー
ト１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性は、ＦＧＦＲ２増幅ＣＨＧＡ１１９患者由来
の原発性胃腫瘍異種移植片モデル（ＦＧＦＲ２コピー数＝２２（ＳＮＰ６．０））で評価
した。これらの研究では、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍのサイズのＣＨＧＡ１１９腫瘍断片を
、雌ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスへ皮下（ｓ．ｃ．）移植した。移植の４０日後、ＣＨＧＡ１
１９腫瘍を保有するマウス（ｎ＝８、平均２５１ｍｍ３、範囲１０４〜３８２ｍｍ３）を
、それぞれ、経管栄養により経口的にビヒクル（酢酸／酢酸塩緩衝液中の５０％ＰＥＧ３
００）（ｐＨ４．６、１０ｍｌ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｑｄ）で、対照ＩｇＧ−３２０７−ＤＭ
１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｑ２ｗｋ）で、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／
ｋｇ、ｉ.ｖ.、ｑ２ｗｋ）で、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル
）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリ
ミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐ.ｏ.、ｑｄ）で、
または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ
−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミ
ノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩の組合せで処置した。腫瘍は
、１週につき２度カリパスで測定した。単剤としての１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および
３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エ
チル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチ
ル−尿素リン酸塩はそれぞれ、腫瘍停滞または部分的応答（それぞれ、Ｔ／Ｃ＝４％また
は３３％、ｐ＜０．０５）をもたらした一方で、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および３−
（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル
−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−
尿素リン酸塩の組合せでの処置は、処置の５週後に、ほぼ完全な腫瘍退縮を誘導した（退
縮＝−９４％、ｐ＜０．０５）（図９および表１５を参照）。１０％未満の体重損失が、
単剤または組合せ処置のいずれか後に観察された（表１５）。これらのデータは、ＦＧＦ
Ｒ  ＡＤＣをＦＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤（例えば、３−（２，６−ジクロロ−
３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イ
ル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素リン酸塩、ＴＫＩ
２５８、ポナチニブ、ＡＺＤ４５４７）と組み合わせることにより、抗腫瘍応答を改善さ
せることができることを示唆する。
【０３９２】
【表１５】
2019193626.tif 000047
【０３９３】
実施例１３：  ＦＧＦＲ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に対する用量分割の効果
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  Ｃｍａｘ（ピーク曝露）またはＣａｖｇ（投薬間隔にわ
たる平均曝露）がその抗腫瘍活性において果たす役割をより良好に理解するために、ＳＮ
Ｕ１６異種移植片モデルを使用して、時間用量分割実験を行った。固定された処置持続期
間にわたって予測される固定された総曝露をもたらす広範囲の投与スケジュール間隔およ
び用量レベルを研究した。ある特定の用量レベルで、ＦＧＦＲ２  ＡＤＣは、ＴＭＤＤに
起因して、非線形ＰＫを示す（実施例１９を参照）。したがって、全ての投与スケジュー
ル間隔および用量レベルに対して固定された総曝露を維持するためには、ＰＫモデリング
により、ＴＭＤＤはより低用量でより顕著であるため、より低くより頻繁な投与スケジュ
ールで投与される場合には、より多くの総用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が必要とさ
れることが予測された。ＰＫモデリングにより、３ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｗ＊２、２．５ｍｇ
／ｋｇ  ｑ２ｗ＊３、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ＊６および０．７ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｄ＊１
４で投与した１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、類似した総曝露を達成することが予測され
た。
【０３９４】
雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６
個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。
マウスは、平均腫瘍体積１８１．７ｍｍ３による移植の１０日後に、第１の研究に加えた
。
【０３９５】
ＰＫパラメーターを評価するために、尾部の切れ目または後眼窩出血により、血清を収集
して、ＥＬＩＳＡによって解析した。総抗体ＰＫアッセイは、比色ＥＬＩＳＡによりＤＭ
１を伴って／伴わずに、総抗体濃度を測定する。プレートを抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）
でコーティングして、検出は、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで行われ、その後適切なプレー
トリーダー上で読み取った。コンジュゲートＰＫアッセイは、非色ＥＬＩＳＡにより少な
くとも１つのＤＭ１分子に結合されている抗体を測定する。この方式では、プレートを抗
ＤＭ１抗体でコーティングして、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰで検出する。血清は、初期投
与後の下記時点で収集した：３ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｗ＊２（２、６、２４、４８、９６、１
６８、２４０、３３６、５０３ｈ）、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗ＊３（２、６、２４、４
８、９６、１６８、２４０、３３５、５０３ｈ）、１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ＊６（２、６
、２４、４８、９６、１６７、３３５、５０３、６７１、８３９ｈ）、０．７ｍｇ／ｋｇ
ｑ３ｄ＊１４（２、６、２４、４８、７１、１４３、２１５、２８７、３５９、４３１
、５０３、５７５、６４７、７１９、７９１、８６３、９３５ｈ）。
【０３９６】
５つの群（ｎ＝７匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１
０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｗ＊２、２．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｗ＊３、１．
５ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ＊６または０．７ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｄ＊１４でｉ．ｖ．投与される１
２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。予想通り、Ｃｍａｘは、治療レジメンに対して多
様であった一方で、Ｃａｖｇは変化がなかった（表１６）。全ての治療レジメンが活性で
あり、類似した腫瘍成長阻害をもたらし、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の平均曝露が、抗
腫瘍活性の主要なドライバーであることを示唆した（図１０）。これらの見解は、様々な
投与スケジュールが、有効性を損なうことなく臨床で用いることができることを示す。
【０３９７】
【表１６】
2019193626.tif 000048
【０３９８】
実施例１４：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性の評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体（１２４３３、１０１６４、１２４２５
、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５（ＡＤＣＣ枯渇変異体（Bolt et al., 2003 Eur J Immunol 23
: 403-411）））の、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を、ＮＫ３．３
細胞（キラー細胞またはエフェクター細胞、Jacky Kornbluth from San Louis Universit
yによりご厚意で提供していただいた）との同時インキュベーションで、Ｋａｔｏ−ＩＩ
Ｉ細胞（標的細胞、ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１０３）に対して決定した。簡潔に述べ
ると、Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞をカルセシンアセトキシメチルエステル（カルセイン−ＡＭ
、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃１７７８３−５ＭＧ）で染色して、２度洗浄し
て、ウェル１つ当たり５０００個の細胞の濃度で９６ウェルマイクロタイタープレート（
９６ウェル、Ｕ底、透明プラスチック、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａ
ｔ＃６５０  １６０）へピペットで取り（pipetted）、上述の抗体およびタンパク質の段
階希釈物（１ｍｌ当たり５０，０００〜０．００３μｇ）とともに１０分間、プレインキ
ュベートした後、エフェクター細胞を添加した。標的細胞の抗体特異的溶解を算出するた
めに、抗体またはエフェクター細胞を伴わない、標的細胞のみの平行インキュベーション
は、ベースラインおよび陰性対照として作用したのに対して、陽性対照または最大溶解ま
たは１００％の特異的溶解は、１％トリトン−Ｔ（商標）１００溶液を用いて、標的細胞
のみの溶解により決定した。１対５の比での標的およびエフェクター細胞の同時インキュ
ベーション後に、マイクロタイタープレートを遠心分離して、上清液の分取量を別のマイ
クロタイタープレート（９６ウェル、平底、黒色、透明な底を有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（
登録商標）Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｔ＃３９０４）に移し、溶液中の遊離カルセインの濃度を
、蛍光カウンター（Ｖｉｃｔｏｒ（商標）  ３マルチラベルカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ  
Ｅｌｍｅｒ）で決定した。結果を、図１１（Ａ）に示し、全ての試験抗体が、様々な程度
でＡＤＣＣを媒介することが観察された。抗体のＦｃ部分においてグリコシル化を保有せ
ず、したがってエフェクター細胞のＣＤ１６ａ受容体への結合を欠如するＮ２９７Ａ＿１
２４２５は、いかなるＡＤＣＣも媒介せず、特異的な陰性対照として作用した。標的細胞
の一定、かつタンパク質濃度非依存性死滅は、非特異的バックグラウンドに起因して、Ｋ
ａｔｏ−ＩＩＩ細胞に対するＮＫ３．３細胞の天然死滅活性である。抗体１２４３３は、
約６０％で標的細胞の最高の特異的溶解を媒介した（シグナルは、ＮＫ３．３細胞による
Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞のバックグラウンド溶解を推定した）のに対して、抗体１２４２５
および１０１６４は、約５５パーセントの特異的溶解に達した（シグナルは、ＮＫ３．３
細胞によるＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞のバックグラウンド溶解を推定した）。３つの分子全て
の効力（各用量応答曲線の最大半量の死滅での濃度、有効濃度５０、ＥＣ５０）は類似し
ていた。一連の類似した実験では、ネイキッド抗体１２４２５の、ＡＤＣＣを誘導する能
力を、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１と比較した。ネイキッド１２４２５と１２４２５−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１との間の差は観察されず（データは示していない）、ＤＭ１コンジュゲーシ
ョンは、ネイキッド抗体の、ＡＤＣＣを誘導する能力を感知できるほど損なわないことを
示唆した。
【０３９９】
さらなる研究では、コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体の、補体因子Ｃ１ｑ
に結合する能力を評価した。補体因子Ｃ１ｑの結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏで補体依存性細胞
障害性（ＣＤＣ）および細胞溶解を招く初期ステップである。これらの研究では、９６ウ
ェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ（登録商標）、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）
、Ｃａｔ＃４３９４５４）のウェルの表面を、抗体１２４３３、１２４２５、Ｎ２９７Ａ
＿１２４２５および１０１６４の段階希釈物で、暗所で４℃で一晩コーティングした（全
て、２５〜０．０２μｇ／ｍｌの濃度範囲で）。市販の抗体リツキシマブは、陽性対照と
して作用した。マイクロタイター上に結合抗体分析物の量をモニタリングするために、こ
の手順は、プレートに対する分析物のコーティング有効性を決定するために第２の希釈物
を利用してプレート１つにつき２度実施した（三重反復で）。Ｃ１ｑ結合は、一定濃度の
Ｃ１ｑ（Ｓｉｇｍａ、補体構成成分Ｃ１ｑ  Ｃａｔ＃Ｃ１７４０−１ｍｇ）を添加するこ
とにより定量化され、ホースラディッシュペルオキシダーゼＨＲＰにコンジュゲートされ
たポリクローナルヤギ抗ヒトＣ１ｑ抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、ヒツジ抗ヒトＣ１ｑ
：ＨＲＰ、Ｃａｔ番号２２２１−５００４Ｐ）を使用して検出した。コーティング効率の
制御は、ペルオキシダーゼとコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体断片（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９−０３６−００３、Ａｆｆｉｎ
ｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’２）断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を用いて第２の希釈物シ
リーズで決定された。ともに、ＴＭＢ基質（ＴＭＢペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット、
Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｔ＃１７２−１０６７）を使用して可視化され、続いてＵＶ−Ｖｉ
ｓ分光器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（登録商標）Ｐ
ｒｏ  ３４０）を用いて４５０ｎｍでの光学密度の測定を行った。結果を図１１（Ｂ）に
示す。試験抗体に結合されるＣ１ｑタンパク質の最大量は、全ての分析物に関して同じで
あった。マイクロタイタープレートに結合された抗体の量は、他の分子のほんのおよそ５
０％に達する１０１６４抗体を除いて、全ての分析物に関して同じであった。１２４３３
、１０１６４およびリツキシマブの効力（各用量応答曲線の最大半量の結合での濃度、有
効濃度５０、ＥＣ５０）はほぼ同じであった。１２４２５抗体のＥＣ５０は、３倍高く、
Ｎ２９７Ａ＿１２４２５のＥＣ５０は、約８倍高かった。１０１６４が、他の抗体がした
ようにマイクロタイタープレートに対して均等にウェルをコーティングしなかった結果を
考慮して、Ｃ１ｑ結合における観察結果は、Ｃ１ｑタンパク質への結合において１０１６
４のおよそ二倍の容量を含意する。
【０４００】
さらに、Ｃ１ｑ結合の評価にとって、コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ２抗体１
２４３３、１０１６４、１２４２５およびＮ２９７Ａ＿１２４２５の、補体依存性細胞障
害性（ＣＤＣ）を誘発する能力を評価した。Ｋａｔｏ−ＩＩＩ細胞（標的細胞、ＡＴＣＣ
Ｃａｔ番号ＨＴＢ−１０３）を、ウェル１つ当たり１００００個の細胞の濃度で９６ウ
ェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、滅菌、白色、９６ウェル平底細胞培養プ
レート、Ｃａｔ＃３６１０）へ均等に分配して、上述の抗体の段階希釈物とともに１０分
間、プレインキュベートした後、エフェクター試薬を添加した。この研究で使用されるエ
フェクター試薬は、ウサギ補体（ＰｅｌＦｒｅｅｚ、Ｃａｔ＃３１０６０−１）であり、
それを１対６の最終希釈でＫａｔｏ−ＩＩＩ細胞上へピペットで取った。加湿細胞培養イ
ンキュベーター中で３７℃で２時間のインキュベーション後に、マイクロタイタープレー
トを遠心分離して、上清を廃棄して、細胞ペレットを、再構成されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）発光キッ
ト、Ｃａｔ＃Ｇ７５７２）中に溶解した。発光は、マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）３）において定量化した。結果は、全ての試験抗体
に関して図１１（Ｃ）に示す。ＣＤＣの証拠は、試験抗体（図１１（Ｃ））またはさらな
る対照（市販の抗体Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）＆Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、デ
ータは示していない）に関して観察されなかった（図１１（Ｃ））。
【０４０１】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１のｉｎ  ｖｉｖｏ活性におけるＡＤＣＣの役割を評価する
ために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａ
ｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×
１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであ
った。マウスは、平均腫瘍体積２０１．４ｍｍ３による移植の７日後に、研究に加えた。
５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスは１０ｍｇ／ｋ
ｇ  ｉ．ｖ．用量のネイキッド対照ＩｇＧ、ネイキッドＮ２９７Ａ＿１２４２５、ネイキ
ッド１２４２５、Ｎ２９７Ａ＿１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または１２４２５−ＭＣＣ−
ＤＭ１を受けた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した（図１１（Ｄ））。ネイキ
ッドＡＤＣＣ枯渇１２４２５変異体（ネイキッドＮ２９７Ａ＿１２４２５）は、投与の２
５日後にＡＤＣＣコンピテント親１２４２５よりも低い抗腫瘍活性を示した（それぞれ、
６１％および１３％Ｔ／Ｃ）。これらのデータは、親１２４２５のエフェクター細胞機能
が、ネイキッド抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の活性において役割を果たし得ることを
示唆する。ＡＤＣＣコンピテント１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡＤＣＣ枯渇Ｎ２９
７Ａ＿１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、投与の２５日後に類似した抗腫瘍活性を示した（
それぞれ、４５％および３２％退縮）。これらのデータは、ＡＤＣＣ活性が消耗性である
一方で、メイタンシノイドペイロードが、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の頑強なｉｎ  ｖ
ｉｖｏ抗腫瘍活性にとって必要かつ十分であることを示唆する。
【０４０２】
実施例１５：  ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株におけるシグナル伝達を調節する抗ＦＧＦＲ
抗体およびＡＤＣの評価
コンジュゲートされていない抗ＦＧＦＲ抗体およびコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ抗
体の、ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株におけるＦＧＦＲシグナル伝達を調節する能力を評価
した。初期研究では、ＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＨＴＢ−１３１）細胞に
おける１０１６４（ＦＧＦＲ２特異的）、１２４３３（ＦＧＦＲ２特異的）、１２４２５
（ＦＧＦＲ２/４交差反応性）および関連ＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの効果を決定し
た。簡潔に述べると、細胞をＣｅｌｌＢｉｎｄ（商標）１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ、Ｃａｔ＃３３３６）において１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中に播種して、組織培
養インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で一晩インキュベートした。実験の当日に、
細胞培養培地を吸引して、試験抗体または小分子ＦＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８のいずれか
で置き換えて、全てを、（１３〜１３０ｎＭ、抗体／ＡＤＣ、５００ｎＭ、ＢＧＪ３９８
）の最終濃度で、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で希釈した。次に、細胞を組織培養
インキュベーター中で５％ＣＯ２で３７℃で２時間インキュベートした。このインキュベ
ーション後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃１７５１６Ｃ）で２度洗浄して、氷
上に置いて、ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ＃０４  ９０６２３７００１
）とともに溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ
＃９８０３）３００μｌを添加した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ
、Ｃａｔ＃２３２２８）により決定した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）により決定した。続いて、タンパク質６０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ
て、ニトロセルロース膜上へ転写して、ｐＦＲＳ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃３８６４）、総ＦＧＦＲ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃ
ａｔ＃８６５２）およびβ−アクチン（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｃａｔ＃Ａ３００−４８５Ａ）ま
たはサイトケラチン（Ｄａｋｏ、Ｃａｔ＃Ｍ３５１５）に対する抗体でプローブした。結
果を図１２（Ａ）に示し、コンジュゲートされてないか、またはＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ
としてのいずれの抗体も、２時間でｐＦＲＳ２シグナルを調節することが不可能であるこ
とがわかった。１２４２５抗体４．３ｎＭおよび１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣ（
４．３ｎＭ抗体、１３ｎＭ  ＤＭ１等価体）を用いてさらなる実験を行い、ここではさら
なる時点（４時間、２４時間および７２時間）を評価した。結果を図１２（Ｂ）に示す。
類似したデータが、ＲＨ４横紋筋肉腫細胞型細胞株でも得られた。
【０４０３】
実施例１６：  ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株における抗ＦＧＦＲ抗体およびＡＤＣの抗増
殖効果の評価
上述の実施例９で用いられるのと類似した方法論を使用して、コンジュゲートされてい
ない抗ＦＧＦＲ抗体およびＳＭＣＣ−ＤＭ１とコンジュゲートされた抗ＦＧＦＲ抗体の、
ＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株パネルの増殖を阻害する能力を評価した。
【０４０４】
ＦＧＦＲ４に対するその交差反応性と一致して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＦＧ
ＦＲ４の構成的に活性な突然変異形態を過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞の成長の強
力な阻害剤であった（Roidl et al., 2010, Oncogene, 29, 1543-1552）。ＦＧＦＲ４発
現は、抗ＦＧＦＲ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔ＃３２４３０６、図１３（Ａ））
を使用したＦＡＣＳ解析により確認された。１２４２５は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３において
だけではなく、他のＦＧＦＲ４過剰発現性細胞株でも、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体に対して
類似した結合特性を示した（データは示していない）。コンジュゲートされていない１２
４２５抗体は、不活性であったため、この効果は、ＡＤＣに特異的であった（図１３（Ａ
））。さらに、ＦＧＦＲ２特異的抗体（１０１６４）またはＡＤＣ（１０１６４−ＭＣＣ
−ＤＭ１）の投与後に、活性は観察されず、効果がＦＧＦＲ４発現により駆動されること
を示唆した（図１３（Ａ））。これは、ＦＡＣにより評価されるように、これらの細胞上
での検出可能なＦＧＦＲ２発現の欠如と一致している（データは示していない）。１２４
２５−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２４２５の類似した効果はまた、ＦＧＦＲ４過剰発現性横
紋筋肉腫細胞株ＲＨ４（図１３（Ｂ））およびＪＲ（図１３（Ｃ））でも観察された。さ
らなる細胞株に拡張されると、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の活性は、ＦＧＦＲ４過剰発
現性胸部および横紋筋肉腫細胞株のサブセットで観察された（図１３（Ｄ））。
【０４０５】
実施例１７：  ＦＧＦＲ４過剰発現性腫瘍におけるＦＧＦＲ  ＡＤＣおよびコンジュゲー
トされていない抗体のｉｎ  ｖｉｖｏＰＫ−ＰＤ
ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植片モデルにおけるＰＤ調節を評価するた
めに、雌ＮＳＧマウスを利用した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウスに、９０日持続
放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏ
ｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオールペレット
移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ
（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×１０６個の細胞
を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がい
ったん３００〜５００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈
内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１
のいずれかを受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＩｇＧ−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１を受けた対照マウスに対して、投与の９６時間後に核ｐＨＨ３陽性の顕著な
増加をもたらした（代表的な画像を図１４（Ａ）に示す）。
【０４０６】
ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−４５３異種移植片モデルにおけるＰＤ調節の時間的経過
を評価するために、雌ＮＳＧマウスを利用した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウスに
、９０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジオ
ールペレット移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａ
ｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×１
０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであっ
た。マウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ用量の１２４２５−ＭＣＣ
−ＤＭ１（１群当たり３匹のマウスを、処置投与の２４、４８、７２、９６および１６８
時間後に収集した）またはＰＢＳ（１０ｍｌ／ｋｇ）のいずれかを受けさせた。腫瘍体積
は、無作為時に３００〜５００ｍｍ３の範囲であった。メイタンシノイドペイロードの予
測される作用機序と一致して、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、ＰＢＳ処置対照に対して
、投与のおよそ７２〜９６時間後にピークに達する核ｐＨＨ３陽性の顕著な時間依存的増
加をもたらした。切断されたカスパーゼ３免疫反応性におけるピークは、投与のおよそ９
６〜１６８時間後に見られた。代表的な画像を図１４（Ｂ）に示す。
【０４０７】
ＲＨ４細胞株を含む胞巣状横紋筋肉腫の一部は、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａトランス
ロケーションを保有し、これらは、ＦＧＦＲ４  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の上昇を
もたらす。ＲＨ４異種移植片モデルにおけるＰＤ調節を評価するために、雌ヌードマウス
に、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。
懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。腫瘍がいったん５００〜７
００ｍｍ３に達したら、６匹のマウスを無作為に割り当てて、単回静脈内１５ｍｇ／ｋｇ
用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＰＢＳ（１０ｍ
ｌ／ｋｇ）のいずれかを受けさせた（ｎ＝３匹／群）。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、
ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた対照マウスに対して、投与の９６時間後に核ｐＨＨ３陽
性の顕著な増加をもたらした（代表的な画像を図１４（Ｃ）に示す）。これらの見解は、
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１が、このＦＧＦＲ４陽性異種移植片モデルにおいてＧ２／Ｍ
細胞周期停止を引き起こすことを実証している。
【０４０８】
実施例１８：  ＦＧＦＲ４過剰発現性腫瘍における抗ＦＧＦＲ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ
有効性
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活性を、ＦＧＦＲ４陽性ＭＤＡ−ＭＢ−
４５３乳がん異種移植片モデルにおいて評価した。細胞移植の１日前に、雌ＮＳＧマウス
に、９０日持続放出１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）０．３６ｍｇを皮下移植した。１７β−エストラジ
オールペレット移植の１日後、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭ
ａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、５×
１０６個の細胞を皮下注射した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであ
った。マウスは、平均腫瘍体積１９７．９ｍｍ３による移植の１２日後に、研究に加えた
。５つの群（ｎ＝５匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１
０ｍｇ／ｋｇ）、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、コンジュゲートされ
ていない１２４２５  ＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５
、１０または１５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．投与した（図１５（Ａ））。対照ＩｇＧ−ＭＣ
Ｃ−ＤＭ１は、このモデルでは活性ではなかった。１５ｍｇ／ｋｇのネイキッドＩｇＧ  
１２４２５または５ｍｇ／ｋｇの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の単回投与は、投与の２９
日後に類似した活性を示した（それぞれ、２５％および２４％Ｔ／Ｃ）。１０および１５
ｍｇ／ｋｇの両方で投与した１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、腫瘍退縮をもたらした（そ
れぞれ、７２％および９２％退縮）。
【０４０９】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量応答抗腫瘍活性を、ＦＧＦＲ４陽性、Ｐａｘ３／７
−ＦＯＸＯ１Ａ陽性ＲＨ４異種移植片モデルにおいて評価した。雌ヌードマウスに、ハン
クス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。
懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２
００．８ｍｍ３による移植の１１日後に、研究に加えた（図１５（Ｂ））。５つの群（ｎ
＝８匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスにＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）
、対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、コンジュゲートされていない１２４
２５  ＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ）、または１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１（５、１０または
１５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．投与した。対照ＩｇＧ−ＭＣＣ−ＤＭ１は、このモデルでは
活性ではなかった。同様に、単回１５ｍｇ／ｋｇ用量のネイキッドＩｇＧ  １２４２５は
、限られた活性を示した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、５、１０および１５ｍｇ／ｋ
ｇの単回用量として抗腫瘍活性を示した（それぞれ、３６％、２４％、２６％Ｔ／Ｃ）。
これらの見解により、Ｐａｘ３／７−ＦＯＸＯ１Ａトランスロケーションが、ＲＨ４細胞
株を１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１に対して感受性とさせるのに十分なＦＧＦＲ４発現をも
たらすことが確認される。したがって、１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は、Ｐａｘ３／７−
ＦＯＸＯ１Ａトランスロケーション陽性横紋筋肉腫を有する患者を処置するのに使用する
ことができた。
【０４１０】
実施例１９：  マウス、ラットおよびカニクイザルにおける抗ＦＧＦＲ４  ＡＤＣの薬物
動態の評価
抗ＦＧＦＲ  ＡＤＣの薬物動態（ＰＫ）を、１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲の幾つかの用量
レベルで腫瘍保有および腫瘍非保有マウスで、１、５および４５ｍｇ／ｋｇでの腫瘍非保
有ラットで、および３０ｍｇ／ｋｇでのカニクイザルで評価した。全ての研究において、
「総」抗体および「抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」の両方の血清濃度は、確証され
たＥＬＩＳＡ法を使用して全ての動物種で測定された。「総」分画は、コンジュゲートさ
れたＤＭ１を伴うか、または伴わない抗体の測定を指すのに対して、ＡＤＣ分画は、ＤＭ
１とコンジュゲートされた抗体のみの測定を指す（１つ以上のＤＭ１分子）。全ての研究
において、感知可能な差は、ＡＤＣと総抗体分画とのクリアランス間で観察されなかった
。
【０４１１】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫを、３ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ投与後にＳＮＵ１６腫
瘍保有マウスで研究した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、２４時間後、７２時間後、１６
８時間後、および３３６時間後に収集し、総分画およびＡＤＣ分画の血清濃度は、この用
量では重ねることができた（図１６（Ａ））。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の半減期は、
ＳＮＵ１６異種移植片の存在下で約１．５日であった。
【０４１２】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫを、１、５、１０または１５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶ
投与後に腫瘍非保有マウスでも研究した。ＰＫ試料は、投与の１時間後、６時間後、２４
時間後、７２時間後、９６時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後および５
４０時間後に収集した。総分画およびＡＤＣ分画の血清濃度は、この用量では重ねること
ができ（図１６（Ｂ））、ＰＫ特性は、腫瘍保有動物に対して、腫瘍非保有動物において
類似しているようであった。
【０４１３】
ＳＮＵ１６腫瘍保有マウスにおける１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１０１６４−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１のＰＫもまた決定した。これらのＡＤＣの全体的なＰＫプロファイルは、１
２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１のＰＫプロファイルと類似しており、得られたデータを表１７
に概要する。
【０４１４】
【表１７】
2019193626.tif 000049
【０４１５】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫを、２つの用量レベル：ＩＶ投与された１および５
ｍｇ／ｋｇで腫瘍非保有ラットで研究した。ＰＫ試料は、０．５時間、１時間、２時間、
６時間、８時間で、また１日目、２日目、４日目、８日目、１１日目、１４日目、２１日
目および３５日目に収集した。「総」および「ＡＤＣ」種に関する濃度−時間プロファイ
ルは、両方の用量レベルでほぼ重ねることができた（図１６（Ｃ））。終末排せつ相は、
１ｍｇ／ｋｇ用量群でわずかに急勾配であったが、これは、より後期の時点での標的媒介
性薬物体内動態（drug disposition）（ＴＭＤ）の結果であり得る。同様に、総分画およ
びＡＤＣ分画に関するクリアランス値は、１ｍｇ／ｋｇ用量ではそれぞれ、０．７５７±
０．０８８ｍＬ／ｈ／ｋｇおよび０．８１３±０．０４１ｍＬ／ｈ／ｋｇであった一方で
、それぞれ、０．６２３±０．０２７ｍＬ／ｈ／ｋｇおよび０．６０７±０．０１９ｍＬ
／ｈ／ｋｇのわずかに低い値が、５ｍｇ／ｋｇ用量で認められた。１２４２５−ＭＣＣ−
ＤＭ１  ＡＤＣ種は、５ｍｇ／ｋｇ用量レベルで、およそ３．９日の終末半減期を有する
。さらなる研究では、ラットＰＫはまた、５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇ用量レベル
で決定した。５ｍｇ／ｋｇ用量での半減期は上述の値に類似していたのに対して、４５ｍ
ｇ／ｋｇ用量では、半減期は、それぞれ、総分画およびＡＤＣ分画に関して１６３．９ｈ
、１２１．３ｈ（およそ５日）であり、これらの値は、非ＦＧＦＲ２／４交差反応性対照
ＡＤＣに関する観察と類似しており、任意の考え得るＴＭＤクリアランス経路の飽和を示
唆した。
【０４１６】
１２４３３−ＭＣＣ−ＤＭ１および１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫもまた、類似し
た研究で決定され、得られたＰＫパラメーターを表１８に示す。用いた用量レベルでは、
総およびＡＤＣの半減期およびクリアランスの類似した推定値が、試験した３つのＡＤＣ
全てに関して得られることがわかった。
【０４１７】
【表１８】
2019193626.tif 000050
【０４１８】
１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫを、３匹のカニクイザル（雄１匹、雌２匹）の群へ
の単回３０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ用量の投与後に研究した。血清試料は、１日目に投与０時間
（投薬前）に、および０．２５時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、７
２時間、１６８時間および２４０時間後に収集した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１への最
大曝露は、ＩＶ注射直後、即ち０．２５時間に観察され、これは、第１のサンプリング時
点であった。時間的経過は、長期排せつ相により特徴付けられ、総分画およびＡＤＣ分画
に関するプロファイルは、サンプリングの時間的経過にわたって重ねることができた（図
１６（Ｄ））。終末半減期は、およそ６〜７日であった。
【０４１９】
１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１  ＰＫもまた、３匹のカニクイザルの群への単回３０ｍｇ
／ｋｇ  ＩＶ用量の投与後に研究した。この試薬に関する時間的経過はまた、長期排せつ
相（終末半減期６〜７日）により特徴付けられ、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１および１２
４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１の両方のＰＫパラメーターを表１９に示す。
【０４２０】
【表１９】
2019193626.tif 000051
【０４２１】
実施例２０：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの配列修飾された抗ＦＧＦＲ抗
体およびＡＤＣの活性の評価
潜在的な構造の傾向（liabilities）が、最終的なタンパク質の不均一性に影響を及ぼ
し得て、また例えば抗体製造可能性および免疫原性に影響を与え得る治療用抗体の配列に
存在し得ることが理解される。かかる傾向は、グリコシル化部位、不対システイン、潜在
的な脱アミド部位等を含み得る。かかる潜在的な傾向の危険性を低減するために、突然変
異を導入して、これらの傾向の１つまたは複数を除去し得る。例えば、潜在的な脱アミド
化部位は、単独で、または他の構造変化と併せて、置き換えることができる。潜在的な脱
アミド部位の例としては、１０１６４および１２４２５の重鎖ＣＤＲ２におけるＤＧが挙
げられる（表１を参照）。これらの残基を他の適切なアミノ酸に突然変異させることがで
きる。非限定的な例として、１０１６４  ＨＣＤＲ２中のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタ
ミン酸（Ｅ）またはスレオニン（Ｔ）に突然変異させることができる。１２４２５では、
ＨＣＤＲ２  グリシン（Ｇ）を、アラニン（Ａ）のような別のアミノ酸に突然変異させる
ことができる。
【０４２２】
また、抗体が、アミノ酸レベルで各々の生殖系列配列と異なる場合、抗体は、その生殖
系列配列に突然変異し戻される（mutated back）ことができることが理解されるべきであ
る。かかる補正突然変異は、１つまたは複数の位置で行われることができ、標準的な分子
生物学技法を使用して、または遺伝子合成により生成され得る。非限定的な例として、１
２４２５重鎖の重鎖配列（配列番号９、表１を参照）は、１位でＥからＱにより、相当す
る生殖系列配列とは異なり、軽鎖（配列番号１７）は、８５位でＶに代わるＴにより、相
当する生殖系列とは異なる。したがって、１２４２５中のアミノ酸は、これらの部位のい
ずれかまたは全てで修飾され得る。
【０４２３】
この出願で記載される抗体薬物コンジュゲートを生成するのに用いられる化学は、抗体
配列におけるリシン（Ｋ）残基へのコンジュゲーションに依存する。これらのリシン残基
が、エピトープ認識に関与される領域内に、例えばＣＤＲ領域に存在する場合、かなりコ
ンジュゲーションがこれらの部位で行われる場合には、抗体薬物コンジュゲートの、その
所定の標的に結合する能力を変更させ得る。この潜在的な危険性を軽減するために、かか
るリシン残基を、アルギニン、アスパラギンまたはグルタミンのような代替的な適切なア
ミノ酸に突然変異させることができる。１つのリシンが、１２４２５の重鎖ＣＤＲ２およ
びＣＤＲ３領域の両方に存在する。これらのリシンのいずれか１つまたは複数が、アルギ
ニン、アスパラギンまたはグルタミンのような代替的な残基に突然変異され得る。
【０４２４】
上述の変化の幾つかを１２４２５抗体へ導入して、抗体２０５６２を生じた（表１）。
この抗体は、ＦＧＦＲ２に結合するその能力、ＳＮＵ１６のようなＦＧＦＲ２増幅細胞株
の増殖を阻害して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＮＵ１６細胞に対して抗腫瘍効果を引き起こすそ
の能力に関して、１２４２５と比較した。ヒトＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ４に
対する２０５６２の親和性は、類似したアッセイ条件下で１２４２５の親和性と類似して
いることがわかった（２０５６２  ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂ親和性推定値：９ｎＭ、ヒトＦ
ＧＦＲ４親和性推定値：３．３ｎＭ）。実施例６に記載する方法論を用いて、１２４２５
−ＭＣＣ−ＤＭ１と類似して、２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで
ＳＮＵ１６細胞の増殖の強力な阻害剤であった（図１７（Ａ））。ｉｎ  ｖｉｖｏでの２
０４３７−ＭＣＣ−ＤＭ１の効力を評価するために、雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩
溶液中に５０％フェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に
細胞を含有する総注射容量は２００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２１７．１ｍ
ｍ３による移植の７日後に、研究に加えた。５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無
作為に割り当てた後、マウスはＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．
用量の１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１または２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１を受けた。腫瘍は
、１週につき２度カリパスで測定した（図１７（Ｂ））。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１お
よびその変異体２０５６２−ＭＣＣ−ＤＭ１はともに、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移
植片に対してｉｎ  ｖｉｖｏで類似した活性を有した。これらのデータは、ＡＤＣとして
ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に影響を与えることなく、親抗体のＤＧ部位を除去することが可能で
あることを示唆している。
【０４２５】
実施例２１：  親和性成熟ＦＧＦＲ  ＡＤＣの生成および特徴付け
選択された抗ＦＧＦＲ抗体の生物学的活性に対する親和性の影響を評価するために、親
和性の最適化を、１２４３３、１０１６４および１２４２５クローンで実施した。これら
の研究では、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域が、トリヌクレオチド定方向突然変異
誘発を使用したカセット突然変異誘発により並行して最適化された（Virnekas et al., 1
994 Nucleic Acids Research 22: 5600-5607）一方で、フレームワーク領域が一定に保た
れた。親和性成熟に関するクローニングに先立って、親Ｆａｂ断片は、相当する発現ベク
ターｐＭ（登録商標）ｘ１１から、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介して、ＣｙｓＤｉｓｐｌａ
ｙ（商標）ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）３０へ移行させた。
【０４２６】
親Ｆａｂ断片のＬ−ＣＤＲ３を最適化するために、結合剤のＬ−ＣＤＲ３を除去して、
多様化されたＬ−ＣＤＲ３のレパートリーで置き換えた。各親Ｆａｂに関して、多様化さ
れたＨ−ＣＤＲ２とともに設定された第２のライブラリーを生成した。各成熟ライブラリ
ー（ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ２）に関して、抗体ディスプレイングファージを調製して
、ファージ力価をスポット滴定により決定した。ライブラリーの増幅は、他の箇所に記載
するように実施した（Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem 278: 38194-38205）。
品質管理のため、単一クローンを無作為に採取して、配列決定した。
【０４２７】
親和性が改善された結合剤の選択のため、成熟ライブラリーに由来するファージは、ビ
オチン化ヒトＦＧＦＲ２を使用して、３ラウンドの溶液パニングに付された。ストリンジ
ェンシーは、各パニングラウンドにおける抗原濃度を低減させることにより増大した（Lo
w et al., 1996 J Mol Biol 260(3): 359-368）。抗原の低減に加えて、オフ速度選択（H
awkins et al., 1992 J Mol Biol 226: 889-896）を実施した。これは、ＲＴでの長期に
わたる洗浄ステップと組み合わせた。一般的なパニング手順は、上述するように実施され
た（溶液パニング）。
【０４２８】
選択されるサブコードに関して、実施されたＨ−ＣＤＲ２親和性成熟パニングの第２ラ
ウンドのパニングアウトプットは、Ｌ−ＣＤＲ３でさらに多様化させた。ライブラリー生
成は、上述するように正確に行われた。改善された結合剤の選択のため、新たな生成ライ
ブラリーをさらなる２ラウンドの溶液パニングに付した。
【０４２９】
同定された配列特有のクローンを、ＩｇＧと表し、ヒトＦＧＦＲ２に対する親和性を、
実施例１および実施例２に記載する方法論に類似したＳＥＴまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録
商標）のいずれかの方法論を使用して決定した。３つの親抗体からの８０個を上回るクロ
ーンを評価して、１２４３３抗体に由来するクローンに関しては３〜６倍、１０１６４由
来のクローンに関しては２７倍、および１２４２５由来の抗体に関しては６８倍の親和性
改善が得られた。１０１６４に由来する最高の親和性クローンを２０８０９と称し、ヒト
ＦＧＦＲ２に対するその親和性は、４５０ｐＭであると決定された。興味深いことに、こ
の抗体はまた、７．４ｎＭの親和性推定値でヒトＦＧＦＲ４にも結合した。１２４２５に
由来する最高の親和性抗体を２０８１１と称し（表１）、ヒトＦＧＦＲ２に対するその親
和性は、１１０ｐＭであると決定された。ＦＧＦＲ４に対するこの抗体の親和性は、７５
ｐＭであると決定された。
【０４３０】
さらなる研究において、２０９０８および２０８１１の両方を、ＳＭＣＣ−ＤＭ１に直
接コンジュゲートして、２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１および２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１
を生じた。これらのＡＤＣの、ＳＮＵ１６の成長を阻害する能力を図１８（Ａ）に示す。
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性に対する親和性の影響を、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６異種移植
片モデルで評価した。雌ヌードマウスに、ハンクス平衡塩溶液中に５０％フェノールレッ
ドフリーＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する懸濁液
中で、１０×１０６個の細胞を皮下移植した。懸濁液中に細胞を含有する総注射容量は２
００μｌであった。マウスは、平均腫瘍体積２１７．６ｍｍ３による移植の７日後に、研
究に加えた。５つの群（ｎ＝６匹／群）のうちの１つに無作為に割り当てた後、マウスは
ＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）または３ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．用量の１２４２５−ＭＣＣ−Ｄ
Ｍ１、２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１、１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１または２０８０９−Ｍ
ＣＣ−ＤＭ１を受けた。腫瘍は、１週につき２度カリパスで測定した（図１８（Ｂ））。
１０１６４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびその親和性成熟変異体２０８０９−ＭＣＣ−ＤＭ１は
、ＳＮＵ１６異種移植片に対して類似した活性を示した。１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１は
、抗腫瘍活性に関してその親和性成熟変異体２０８１１−ＭＣＣ−ＤＭ１を上回る優位性
を示した。これらのデータは、親和性成熟がＭＣＣ−ＤＭ１  ＡＤＣとしてｉｎ  ｖｉｖ
ｏで改善された活性をもたらさなかったことを示唆している。
【０４３１】
実施例２２：  重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）によるＦＧＦＲ２およびその抗体複
合体のエピトープマッピング
重水素交換質量分析（ＨＤｘ−ＭＳ）は、タンパク質のアミド骨格への重水素取込みを
測定するものである。これらの測定値は、アミドの溶媒接近性および骨格アミドの水素結
合ネットワークの変化に対して高感度である。ＨＤｘ−ＭＳは、アポおよびリガンド結合
などの２つの異なる状態のタンパク質を比較するために使用されることが多く、ペプシン
による迅速な消化とカップリングする。そのような実験において、当業者であれば、２つ
の異なる状態間で異なる重水素取込みを示す領域、典型的には、１０〜１５アミノ酸を見
つけることができる。保護される領域は、リガンド結合に直接関与するか、またはリガン
ドの結合によりアロステリックに影響される。
【０４３２】
これらの実験では、Ｅ．コリ（E. Coli）由来のＦＧＦＲ２  Ｄ２−Ｄ３タンパク質（
配列番号１３５、以下を参照）の重水素取込みは、３つの治療用抗体：１２４２５、１０
１６４および１２４３３の非存在および存在下で測定された。抗体の結合時に重水素取込
みの低下を示すＦＧＦＲ２中の領域はエピトープ中に含まれる可能性が高いが、測定の性
質のため、直接的な結合部位から遠い変化を検出することも可能である（アロステリック
効果）。通常、最も多い量の保護を有する領域は、直接結合に関与するが、これは常に当
てはまるわけではない。アロステリック効果に由来する直接結合事象を解明するためには
、直交測定（例えば、Ｘ線結晶分析、アラニン突然変異誘発）が必要である。
【０４３３】
【表２０】
2019193626.tif 000052
【０４３４】
この実施例に記載するエピトープマッピング実験は、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＤｘ−ＭＳプラ
ットフォームで実施され、これは、ＬＥＡＰオートサンプラー、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ
ＵＰＬＣ  ＳｙｓｔｅｍおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２質量分析計を含む。研究は、Ｌｅａ
ｐＳｈｅｌｌソフトウェアにより作動されるＬＥＡＰオートサンプラーにより自動化され
、これは、重水素交換反応の開始、反応時間管理、クエンチ反応、ＵＰＬＣシステムへの
注入および消化時間管理を実施した。Ｌｅａｐオートサンプラーは、ＨＤｘ反応のために
２５℃で維持され、またそれぞれタンパク質およびクエンチ溶液の保管用に２℃に維持さ
れた２つの温度管理スタックを装備していた。三重反復対照実験を、重水素交換時間２５
分で抗原に対して実施した。ＨＤＸは、クエンチング緩衝液（６Ｍ尿素および１Ｍ  ＴＣ
ＥＰ  ｐＨ＝２．５）でクエンチした。クエンチした後、抗原を、それが、オンラインペ
プシン消化に付されるＵＰＬＣシステムに１２℃で注入して、続いて流速４０μＬ／分で
Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １×１００ｍｍカラム（１℃で維持される）にわたる迅
速な８分で２％から３５％へのアセトニトリル勾配に付した。三重反復実験は、まさに対
照実験として抗原−ｍＡｂ複合体に対して実施されたが、但し、これらの実験では、抗原
は、重水素交換に先立って２５℃で抗体とともに３０分間インキュベートされた。
【０４３５】
これらの測定の結果を図１９（Ａ）および図１９（Ｂ）に概要する。図１９（Ａ）では
、ｍＡｂの非存在（対照）下および存在下でのＦＧＦＲ２ペプチドに関する平均重水素取
込みが示される。この図では、２つの差：対照とｍＡｂとの差、およびｍＡｂ群間での差
を検討することが有用である。図１９（Ｂ）では、ｍＡｂと対照試料との間の重水素取込
みにおける差が、測定中の標準誤差で除算される。差は、それらが絶対スケールで０．５
Ｄａを上回る場合に（図１９（Ａ））、および標準誤差により除算された差の比が、−３
．０未満またはそれに等しい場合に（図１９（Ｂ））有意であるとみなされる。この解析
から、本発明者らは、ｍＡｂ結合時に保護されるＦＧＦ２の領域を、高、中および低量の
保護のカテゴリーに順位付けすることができる。高い保護のＦＧＦＲ２領域は、特異的な
抗体とのエピトープの形成に潜在的に関与するが、より低い保護領域に関して他の寄与を
除外することはできない。
【０４３６】
ＦＧＦＲ２への１０１６４の結合時に、ＦＧＦＲ２の下記の２つの領域：配列番号１３
７の残基１７４〜１８９および１９８〜２１６における高量の保護が観察される。これら
の領域は、特異的にβＣのＮ末端に対するβＢ、およびβＥに対するβＣ’ループからな
るＤ２ドメインに位置する（図１９（Ｃ）および（Ｄ））。領域２２２〜２３１に見出さ
れる低保護の１つの領域が存在する。しかしながら、この領域は、全ての研究抗体の結合
時に保護され、この観察は、この領域が、本質的に非特異的およびアロスティックであり
得るその局所水素結合ネットワークの安定化を受けることを示唆している。ＦＧＦＲ２に
対する抗体１２４２５の結合はまた、配列番号１３７の残基１７４〜１８９および１９８
〜２１６の領域で高量の保護を引き起こす。さらに、１２４２５ファミリーを用いる場合
、配列番号１３７の残基１６０〜１７３（図１９（Ａ）および（Ｂ））の領域での高量の
保護も観察された。これらの領域は、公開された結晶学データからＦＧＦ２およびＦＧＦ
１と相互作用することが知られているＦＧＦＲ２の領域を含む（Plotnikov et al., M. C
ell 2000, 101, 413-424、Beenken et. al., M. J. Biol. Chem. 2012, 287, 3067-3078
）。この領域の保護は、１２４２５ファミリーの抗体に特有である。研究される抗体のう
ち、１２４３３は、ＦＧＦＲ２のＤ３ドメインとの相互作用を通じてＦＧＦＲ２のＩＩＩ
ｂアイソフォームを特異的に標的とする点で特有である。１２４３３に関して、ペプチド
３３８〜３５４における高量の保護（およそ２Ｄａ）および３３８〜３４５由来のより短
いＮ末端断片におけるわずかな量の保護が観察された。この観察は、１２４３３結合時に
保護される３３８〜３５４ペプチドの一部が、領域３４６〜３５４であることを示唆して
いる（図１９（Ａ）および図１９（Ｂ））。領域３４６〜３５４は、ＩＩＩｃアイソフォ
ームに対してＩＩＩｂアイソフォームに特異的である４つの残基を含有し、これらの残基
は、Ｑ３４８、Ａ３４９、Ｎ３５０およびＱ３５１を含む。さらなる研究において、１０
１６４および１２４２５の親和性成熟バージョン（以下の実施例２３を参照）を評価して
、観察される保護領域の観点で、それらの各々の親抗体に類似していることがわかった。
【０４３７】
さらに、類似した方法を使用して、ＦＧＦＲ２／４交差反応抗体１２４２５の存在下で
ＦＧＦＲ４の保護を検査する重水素交換研究を実施した。ＦＧＦＲ４  Ｄ１〜Ｄ３構築物
（配列番号１２４、以下を参照）を使用した予備解析により、１２４２５の結合が、Ｄ３
領域ではいかなる保護も引き起こさないことが示唆された。保護は、Ｄ１およびＤ２ドメ
イン内の領域に限定されるようである。
【０４３８】
【表２１】
2019193626.tif 000053
【０４３９】
実施例２３：  ヒトＦＧＦＲ２／１２４２５ＦａｂおよびＦＧＦＲ４／１２４２５Ｆａｂ
複合体のＸ線結晶学的構造決定
１２４２５のＦａｂ断片（表２２）に結合されたヒトＦＧＦＲ２  ＥＣＤ断片（ＦＧＦ
Ｒ２ドメイン２またはＦＧＦＲ２  Ｄ２、配列番号１３８、表２２）またはヒトＦＧＦＲ
４  ＥＣＤ断片（ＦＧＦＲ４ドメイン２またはＦＧＦＲ４  Ｄ２、配列番号１４３、表２
２）の結晶構造が決定される。以下に詳述するように、ＦＧＦＲ２  Ｄ２またはＦＧＦＲ
４  Ｄ２が発現されて、精製されて、１２４２５Ｆａｂと混合されて、複合体を形成した
。続いて、タンパク質結晶学を用いて、１２４２５Ｆａｂに結合されたＦＧＦＲ２  Ｄ２
またはＦＧＦＲ４  Ｄ２に関する原子分解能データを作成して、エピトープを規定した。
ＦＧＦＲ２の結晶学的エピトープは、重要なエピトープ残基を突然変異させること、およ
び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて１２４２５への突然変異ＦＧＦＲ２の結合
を測定することにより、さらに確証された。
【０４４０】
結晶学およびＳＰＲ用のタンパク質生産
結晶学およびＳＰＲ用に生産されるタンパク質の配列を表２２に示す。ＦＧＦＲ２  Ｄ
２の構築物は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およびＣ末端残基（小文字で示される、
配列番号１３７）とともに、ヒトＦＧＦＲ２（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ２１８０２−３、
配列番号１３７）の残基１４６〜２４９（下線を付した）を含む。ＦＧＦＲ４  Ｄ２（配
列番号１４３）の構築物は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およびＣ末端残基（小文字
で示される）とともに、ヒトＦＧＦＲ４（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ２２４５５−１、配列
番号１４２）の残基１４０〜２４２（下線を付した）を含む。ＦＧＦＲ２ドメイン２〜ド
メイン３（Ｄ２Ｄ３）の構築物は、残基１４０〜３６９（配列番号１３７ではイタリック
体）を含む。ＦＧＦＲ２  Ｄ２Ｄ３の野生型（ＷＴ）およびＫ１７６Ａ／Ｒ２０１Ａ二重
突然変異バージョンはともに、ＳＰＲによるエピトープ確証用に生産される（それぞれ、
配列番号１４４および配列番号１４５、小文字は、組換え発現ベクター由来のＮ末端およ
びＣ末端残基である）。１２４２５Ｆａｂに関して、重鎖および軽鎖の配列が示される（
それぞれ、配列番号１３９および配列番号１４０）。
【０４４１】
【表２２】
2019193626.tif 000054
2019193626.tif 000055
2019193626.tif 000056
【０４４２】
ＦＧＦＲ  Ｄ２は、Ｅ．コリ（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮｏｖａｇｅｎＲ、ＥＭ
Ｄ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発現された。１８℃でのＩＰＴＧによる一晩の誘導後に、細
胞を収集して、−８０℃で凍結させて、溶解させた。封入体を２０ｍＭリン酸ナトリウム
ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび８Ｍ尿素で抽出して、同じ緩衝液中で予め平衡
化したＮｉ−ＮＴＡカラム上にのせた。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、
３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭイミダゾールで洗浄し
た後、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アン
モニウムおよび３００ｍＭイミダゾールで溶出させた。続いて、溶出タンパク質を２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で１２倍希釈して、緩衝液Ａ＋２％の２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６．５、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ硫酸アンモニウム（緩衝
液Ｂ）中で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｓ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
）上にのせた。Ｓカラムは、緩衝液Ａ＋２％〜１００％緩衝液Ｂの勾配により溶出した。
ＦＧＦＲ２  Ｄ２を含有する主要ピークを収集して、濃縮して、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  
ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６０
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。ピーク分
画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いて１２４２５Ｆａｂと複合体
を形成するためにプールした。
【０４４３】
ＦＧＦＲ４  Ｄ２は、Ｅ．コリ（E.coli）株Ｓｈｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７  Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓＲ）で発現された。１８℃でのＩＰ
ＴＧによる一晩の誘導後に、細胞を収集して、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３
００ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１ｍｇ／ｍｌのウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼＩ（
Ｓｉｇｍａ（登録商標））および溶解緩衝液５０ｍｌにつき１錠剤のｃＯｍｐｌｅｔｅ  
Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈ
ｅ（登録商標））中に溶解させた。溶解は、１５，０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によ
り清澄化されて、次に、ＴａｌｏｎＲ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））を、バッチ
結合のために４℃で一晩、上清に添加した。翌日、樹脂をカラムに充填して、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールで洗浄して、
５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール
で溶出させた。続いて、溶出タンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５（緩衝液
Ｃ）で１２倍希釈して、緩衝液Ｃ＋２％の５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１Ｍ  
ＮａＣｌ（緩衝液Ｄ）中で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｓ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。Ｓカラムは、緩衝液Ｃ＋２％〜１００％緩衝液Ｄの勾配に
より溶出した。ＦＧＦＲ４  Ｄ２を含有する主要ピークを収集して、濃縮して、２０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商
標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にの
せた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いて１２４２５
Ｆａｂと複合体を形成するためにプールした。
【０４４４】
１２４２５Ｆａｂは、固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）による完全長１２４２５  Ｉｇ
Ｇの切断により生産される。２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０および１０ｍＭ  ＥＤ
ＴＡ中の２０ｍｇ／ｍｌでの１２４２５  ＩｇＧを、８０：１の重量比で固定化パパイン
と混合した。混合物を１５ｍｌのチューブ中で３７℃で一晩回転させた。翌日、固定化パ
パインを、重力流カラムにより除去して、ＦａｂおよびＦｃセグメントの両方を含有する
フロースルーを収集して、ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ（商標）
カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせて、Ｆｃセグメントを除去した。Ｆａｂ
断片のみを含有するこのステップからのフロースルーを濃縮して、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ
ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６
０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にのせた。ピーク
分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣＭＳにより解析して、続いてＦＧＦＲ２  Ｄ２または
ＦＧＦＲ４  Ｄ２と複合体を形成するためにプールした。
【０４４５】
ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５およびＦＧＦＲ４  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体の結
晶化および構造決定
ＦＧＦＲ２  Ｄ２またはＦＧＦＲ４  Ｄ２と１２４２５  Ｆａｂとの複合体は、ＦＧＦ
Ｒ２  Ｄ２またはＦＧＦＲ４  Ｄ２を１２４２５  Ｆａｂと２：１のモル比（ＬＣＵＶに
よって測定された濃度）を混合すること、氷上で３０分間インキュベートすること、およ
び２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化したＨｉＬｏａ
ｄ（登録商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ）上で複合体を精製することにより調製された。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
ＬＣＭＳにより解析した。
【０４４６】
ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体を結晶化するために、複合体を含有する
分画をプールして、約３０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。トリプシン（１ｍＭ  ＨＣｌおよび２
ｍＭ  ＣａＣｌ２中に溶解、１ｍｇ／ｍｌでの）を、１：１００の容量比で複合体へ添加
して、結晶化を促進した（Wernimont et al., (2009) Plos One 4:e5095）。ＦＧＦＲ２
Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ／トリプシン混合物を即座に遠心分離して、結晶化に関して
スクリーニングした。
【０４４７】
結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散により成長させた。詳細には、タンパク質０．
１μｌを、０．１Ｍクエン酸三ナトリウム二水和物ｐＨ５．０、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
６０００を含有するリザーバ溶液０．１μｌと混合して、ドロップを同じリザーバ溶液４
５μｌに対して４℃で平衡化した。
【０４４８】
ＦＧＦＲ４  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体を結晶化するために、複合体を含有する
サイズ排除分画をプールして、２０ｍｇ／ｍｌに濃縮して、遠心分離して、結晶化に関し
てスクリーニングした。結晶は、ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体と同じ方
法（上述する）で成長させたが、但し、リザーバ溶液は、０．２Ｍギ酸マグネシウム、２
０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含有し、結晶は２０℃で成長させた。
【０４４９】
データ収集前に、ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５  ＦａｂおよびＦＧＦＲ４  Ｄ２／１
２４２５  Ｆａｂ結晶の両方を、さらなる２２．５％グリセロールを含有するリザーバ溶
液に移して、液体窒素中で急冷した（flash cooled）。回折データは、先端放射光施設（
Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）にあるビームライ
ン１７−ＩＤで収集した。データを加工処理して、ＨＫＬ２０００（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ）を使用して２．８Åで縮尺した。構造はともに、ＦＧＦＲ２  Ｄ２構造（ＰＤＢ
ＩＤ：３ＤＡＲ）および検索モデルとしての組織内Ｆａｂ構造を用いたＰｈａｓｅｒ（
McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674)を使用した分子置換により解析した
。最終的なモデルがＣＯＯＴで構築され（Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126
-2132）、Ｂｕｓｔｅｒ（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ、ＬＴＤ）で改良した。１２４
２５  Ｆａｂ中で任意の原子の５Å以内に原子を含有するＦＧＦＲ２  Ｄ２またはＦＧＦ
Ｒ４  Ｄ２の残基は、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）により同定され、
表２３および表２４に列挙される。
【０４５０】
ＦＧＦＲ２の突然変異誘発およびＳＰＲアッセイ
ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＲ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）により、Ｋ１７６Ａ／Ｒ２１０Ａ二重突然変異をＦＧＦＲ２  Ｄ２Ｄ３
構築物に導入した。ＷＴおよび突然変異ＦＧＦＲ２  Ｄ２Ｄ３タンパク質は、ＦＧＦＲ４
Ｄ２タンパク質に関するのと同じ手順を使用して生産した。
【０４５１】
ＳＰＲアッセイで使用される試薬に関して、親和性純粋なＦ（ａｂ）’断片抗ヒトＩｇ
Ｇ  Ｆｃγ断片（１０９−００６−０９８）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。センサーチップＣＭ５（ＢＲ−１００
６−０６８）、グリシンｐＨ２．０（ＢＲ−１００３−５５）およびＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝
液（ＢＲ−１００６−６９）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅに発注した。ＢＳＡは、Ｇ
ｉｂｃｏｒ（登録商標）（１５２６０）からのものであり、ヘパリンは、ＳｉｇｍａＲ（
Ｈ３１４９−１００ＫＵ）からのものである。
【０４５２】
ＳＰＲ研究は全て、評価ソフトウェアバージョン１．１およびＣＭ５センサーチップを
用いてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を使用して実施した。０．５ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡおよび１０μｇ／ｍｌのヘパリンを有するＨＢＳ−ＥＰ＋を、全ての実験に関して実
行緩衝液として使用した。固定化レベルおよび分析物相互作用は、応答単位（ＲＵ）によ
り測定された。パイロット実験を実施して、抗ヒトＦｃ抗体の固定化、続く１２４２５  
ＩｇＧの捕捉の実現可能性を試験および確認した。
【０４５３】
１２４２５動態測定に関して、抗体をチップ上に捕捉して、続いてＷＴまたは突然変異
ＦＧＦＲ２  Ｄ２Ｄ３タンパク質を流した。簡潔に述べると、ｐＨ４．７５での５０μｇ
／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体は、４つ全てのフローセルで１０μｌ／分の流速でアミンカップ
リングによりＣＭ５チップ上に固定化されて、６０００ＲＵに達した。３μｇ／ｍｌの１
２４２５を、試験フローセル上に１０μｌ／分で１０秒間注入した。０．０７８〜１００
ｎＭの２倍希釈のＦＧＦＲ２  Ｄ２Ｄ３タンパク質を、全ての参照フローセルおよび試験
フローセル上に８０μｌ／分で７分間注入した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋＋ＢＳＡ＋ヘパリ
ン緩衝液を１０分間流して、結合性１２４２５を解離させた。各注入サイクル後、チップ
表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて、６０μｌ／分で７０秒間再生させた。全ての
動態測定は、２５℃で行った。
【０４５４】
１２４２５に関するＦＧＦＲ２エピトープ
ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、１２４２５に関
するＦＧＦＲ２エピトープを同定した。結晶の非対称ユニットにおいてＦＧＦＲ２  Ｄ２
／１２４２５  Ｆａｂ複合体の６つのコピーが存在する（非対称ユニットは、結晶全体を
再現するのに必要とされる全ての構造情報を含有する）。６つ全てのコピーは、結晶充填
に起因する小さな変動を除いて、１２４２５  Ｆａｂと接触したほぼ同一の残基を共有す
る。６つ全てのコピーにより共有される１２４２５接触ＦＧＦＲ２残基のみを使用して、
エピトープを規定した。
【０４５５】
１２４２５  ＦａｂによるＦＧＦＲ２  Ｄ２上の相互作用表面は、表２３および表２４
に詳述されるように、幾つかの不連続（即ち、非隣接）配列：即ち残基１７３〜１７６、
残基１７８、残基２０８〜残基２１０、および残基２１２、２１３、２１７および２１９
により形成される。これらの残基は、１２４２５  Ｆａｂにより結合される３次元表面を
形成する（図２０（Ａ））。結晶学により規定されるこのエピトープは、残基１６０〜１
７３、１７４〜１８９および１９８〜２１６を含む重水素置換質量分析法（ＨＤｘ−ＭＳ
）により規定されるものと十分に一致している。
【０４５６】
【表２３】
2019193626.tif 000057
【０４５７】
【表２４】
2019193626.tif 000058
【０４５８】
ＦＧＦＲ２  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ構造から、ＦＧＦＲ２上の潜在的なＮ−連結さ
れたグリコシル化部位、即ち、Ａｓｎ２４１およびＡｓｎ２８８（Duchesne et al., (20
06) J. Biol. Chem 281:27178-27189）は、１２４２５エピトープから離れてタンパク質
の反対表面上に存在し（図２０（Ａ））、ＦＧＦＲ２への１２４２５結合が、グリコシル
化とは無関係であることを示す。このことは、１２４２５抗体が、類似した親和性でＥ．
コリ（E.coli）生産（グリコシル化なし）および哺乳動物細胞生産（グリコシル化）ＦＧ
ＦＲ  Ｄ２−Ｄ３に結合する（データは示していない）という見解に一致している。
【０４５９】
ＦＧＦＲ  Ｄ２のＬｙｓ１７６およびＡｒｇ２１０は、それぞれ、１２４２５  Ｆａｂ
軽鎖および重鎖と最も多く接触させる２つのエピトープ残基である。興味深いことに、Ａ
ｒｇ２１０は、ヘパリンに結合することが実証されており（Pellegrini et al., (2000) 
Nature 407:1029-1034）、これは、ＦＧＦへのＦＧＦＲ２結合、続く二量体化およびシグ
ナル伝達を高めることができる。それと同時に、Ｌｙｓ１７６はまた、ヘパリン結合ポケ
ットに存在すると想定される（Pellegrini et al., (2000) Nature 407:1029-1034）。こ
れらの２つの残基のアラニンへの突然変異は、ＳＰＲアッセイにおいて１２４２５  Ｉｇ
ＧへのＦＧＦＲ２の結合を完全に消失させ（ＳＰＲ法に関しては上記を参照）、これによ
り、１２４２５に結合する際のそれらの重要な役割が確認され、結晶構造で観察されるエ
ピトープが確証された。
【０４６０】
１２４２５に関するＦＧＦＲ４エピトープ
ＦＧＦＲ４  Ｄ２／１２４２５  Ｆａｂ複合体の結晶構造を使用して、１２４２５に関
するＦＧＦＲ４エピトープを同定した。結晶の非対称ユニットにおいてＦＧＦＲ４  Ｄ２
／１２４２５  Ｆａｂ複合体の４つのコピーが存在した。４つ全てのコピーは、結晶充填
に起因する小さな変動を除いて、１２４２５  Ｆａｂと接触したほぼ同一の残基を共有す
る。４つ全てのコピーにより共有される１２４２５接触ＦＧＦＲ４残基のみを使用して、
エピトープを規定した。
【０４６１】
１２４２５  ＦａｂによるＦＧＦＲ４  Ｄ２上の相互作用表面は、表２５に詳述される
ように、幾つかの不連続（即ち、非隣接）配列：即ち残基１５０〜１５１、１５４、１５
７、１６０、１６６〜１６９、１７１、１７３〜１７４、２０１〜２０７、２１０および
２１２により形成された。これらの残基は、１２４２５  Ｆａｂにより結合される３次元
表面を形成する（図２０（Ｂ））。
【０４６２】
【表２５】
2019193626.tif 000059
2019193626.tif 000060
2019193626.tif 000061
【０４６３】
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４上の１２４２５エピトープの比較
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４上の１２４２５エピトープは、配列およびコンホメーショ
ンの両方で非常に類似している。配列アラインメント（図２０（Ｃ））で示されるように
、ＦＧＦＲ２上の全てのエピトープ残基（破線の四角内）は、ＦＧＦＲ４により共有され
、ＦＧＦＲ４中に保存される。さらに、２つの複合体構造が、１２４２５の可変ドメイン
上で重ね合わせることができる場合、２つの抗原の構造は非常に良好に重ね合わさり、Ｆ
ＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への１２４２５結合のコンホメーションが非常に類似している
ことを示す。このことは、両方の受容体に対する１２４２５の交差反応性に関する構造的
説明を提供する。
【０４６４】
１２４２５結合およびＦＧＦＲ二量体化
どのようにしてＦＧＦＲ−ＦＧＦ−ヘパリン複合体が細胞表面上で二量体化して、下流
シグナル伝達を活性化するかに関して２つのモデル、即ち２：２：２モデル（ＦＧＦＲ：
ＦＧＦ：ヘパリン）（Schlessinger et al., (2000) Mol. Cell 6:743-750）、および２
：２：１モデル（ＦＧＦＲ：ＦＧＦ：ヘパリン）（Pellegrini et al., (2000) Nature 4
07:1029-1034）が報告されている。ＦＧＦＲ  Ｄ２／１２４２５Ｆａｂ複合体の結晶構造
に基づいて、ＦＧＦＲ２および／またはＦＧＦＲ４への１２４２５の結合は、両方の二量
体化モデルと調和せず、したがって両方の二量体化モデルを阻止することができた。
【０４６５】
実施例２４：  製剤
ＡＤＣの臨床サービス形態（ＣＳＦ）は、５０ｍｇの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、１
６．２ｍｇのコハク酸ナトリウム、４１０．８ｍｇのスクロースおよび１ｍｇのポリソル
ベート２０を含有するバイアル中の凍結乾燥物（宣言された含量の離脱を可能にするため
に１０％の過充填を考慮しない）である。５ｍＬの注射用水で凍結乾燥物を再構成させた
後、１０ｍｇ／ｍＬの１２４２５−ＭＣＣ−ＤＭ１、２０ｍＭのコハク酸ナトリウム、２
４０ｍＭのスクロースおよび０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０を含有する溶
液が得られる。
【０４６６】
その後の静脈内投与のために、得られた溶液を、通常、担体溶液中にさらに希釈して、
輸注用のすぐに使えるＡＤＣ溶液にする。
【０４６７】
ＣＳＦについては、予備安定性試験に基づいて、１０ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ濃度を選択し
た。等張性製剤を作出し、不定形の凍結乾燥ケーキ構造を維持し、タンパク質安定化を得
るために、２４０ｍＭのスクロース濃度を選択した。
【０４６８】
最も安定な製剤を選択するための重要な安定性指示分析方法は、特に、凝集レベルを決
定するためのサイズ排除クロマトグラフィー、肉眼では見ることができない粒子状物質の
試験、遊離毒素の決定および効力試験を包含していた。
【０４６９】
予備スクリーニング研究により、０．０２％の濃度のポリソルベート２０が機械的スト
レスに対する十分な安定を提供することが示された。リアルタイムおよび加速安定性条件
（２５℃および４０℃）での液体および凍結乾燥安定性研究により、ｐＨ５．０のコハク
酸製剤が全体として最良の保存安定性を提供することが示された。最も顕著には、この製
剤において、凝集と遊離毒素の放出との間の試験した全ての製剤の最良のバランスが満た
される。４０℃で３カ月後、分解生成物の特筆すべき増加を決定することはできなかった
。
【０４７０】
実施例２５：  腫瘍耐性メカニズムおよび併用療法の使用
既存の不均一性は、数多くのがんの一般的な特徴である。臨床的に有意な腫瘍（および
それらに由来する細胞株）は、それらの初期発がん性事象から離れた多世代である。それ
らは、生存に関して一般的な遺伝子ドライバー病巣に必ずしも依存するとは限らない遺伝
的に多様な部分集団（Nowell, Science 194: 23-28 (1976)）を獲得するのに十分な時間
を有していた。これらの部分集団が、各患者において単一クローン腫瘍を処置するのでは
なく、継続的世代で一緒に扱われるのに十分に適合している場合、本発明者らは、事実上
、複雑な集団を処置している。したがって、発がん遺伝子または腫瘍抑制因子の異なる増
幅を伴うクローン集団の存在は、単一療法に対する感受性または耐性を説明することがで
き、標的とされる併用療法を必要とし得る。
【０４７１】
ＦＧＦＲ２発現は、ＦＧＦＲ２増幅ＳＮＵ１６細胞およびＦＧＦＲ２増幅ヒト腫瘍におい
て不均一である
ＦＧＦＲ２発現は、当技術分野で公知であり、かつ本明細書中に記載する方法を使用し
て、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリーおよび／またはｉｎ  ｓｉｔｕハイ
ブリダイゼーションにおける蛍光により、ＳＮＵ１６細胞で測定した。親ＳＮＵ１６パラ
フィン包埋細胞ペレットのＩＨＣ染色は、広範囲のＦＧＦＲ染色強度を示した。さらに、
培養物中で伝播されたＳＮＵ１６細胞上のＦＧＦＲ２表面発現もまた、フローサイトメト
リーにより測定する場合に、ＦＧＦＲ２に関して広範囲の発現値を示した。興味深いこと
に、細胞集団がＥＧＦＲに関して同時染色された場合、ＥＧＦＲ陽性細胞の部分集団で存
在するようであった。散乱されたＥＧＦＲ増幅細胞（５％未満）はまた、前処置細胞ブロ
ック調製物中でＦＩＳＨにより明白であったが、集団がｑＰＣＲにより検査される場合に
は、ＥＧＦＲ増幅は、おそらく発現の低レベルに起因して、処置前の集団では検出するこ
とができなかった。
【０４７２】
２９６個のヒト胃腫瘍が、ｑＰＣＲにより評価され、７個（２．４％）が、ＦＧＦＲ２
コピー数の増加を有することがわかった（例えば、およそ４の遺伝子コピー数）。最高の
ＦＧＦＲ２コピー数を有する一連の試料からの９個の試料に対するＩＨＣ染色により、各
試料が、ＦＧＦＲ２発現に関して、陽性である腫瘍領域、および陰性である領域を有する
ことが明らかとなった。免疫反応性は、任意の特異的な腫瘍形態と相関しなかった。腫瘍
試料が、連続切片上のマスクとしてＦＧＦＲ２免疫反応性を使用して顕微解剖された場合
、これらのＦＧＦＲ２陽性および陰性領域からのＤＮＡは、９個全ての場合で、それぞれ
、ＦＧＦＲ２遺伝子増幅または非増幅と相関した。ＦＧＦＲ２の過剰発現および増幅の相
関は、以下に示すようにディープシーケンシングにより確認された。
【０４７３】
ＥＧＦＲは、ＢＧＪ３９８に耐性であるＳＮＵ１６細胞において過剰発現および増幅され
、ＦＧＦＲ２発現および増幅は損失される
ＳＮＵ１６細胞（ＡＣＣＴ  ＣＲＬ−５９７４）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％
ＦＢＳ（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃３０−２００１）を有する０．５μＭのＢＧＪ３９８中で培
養して、続いてＢＧＪ３９８濃度を０．５μＭ〜１．０μＭ〜２．５μＭ〜５．０μＭへ
増加させた。培地を変更して、新鮮なＢＧＪ３９８（５μＭ）を、１週に１度、６週間添
加した。細胞を、回収細胞培養凍結培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）＃１２６４８−１０１
）中で凍結させて、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ中で再構成した。続いて、耐性細
胞株の解凍した継代を、１μＭ  ＢＧＪ３９８選択のもとで維持した。ＢＧＪ３９８によ
る選択のもと培養物中で保持されるＳＮＵ１６細胞は、それぞれ、感受性細胞から耐性細
胞において、１．７ｎＭから２．４μＭまで増加するＩＣ５０で、最終的には成長阻害に
対してあまり感受性ではなくなった。
【０４７４】
ＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞のウェスタンブロット解析により、耐性細胞集団がＦ
ＧＦＲ２の発現を損失しており、もはやｐ−ＦＲＳ２を通じてシグナル伝達していないこ
とが示され、ＦＧＦＲ２シグナル伝達経路がもはや活性ではないことを示した。それどこ
ろか、耐性集団は、高レベルのＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲを発現し、細胞が代わってＥＧ
ＦＲ経路を通じてシグナル伝達していることを示した。ＢＧＪ３９８耐性ＳＮＵ１６細胞
はまた、ｑＰＣＲにより測定される場合に、ＥＧＦＲ  ＤＮＡコピー数の増加も示し、こ
れは、前処置したＳＮＵ１６細胞と比較して、タンパク質発現の増加と相関する。ＢＧＪ
３９８耐性細胞は、成長し続ける（但し、親（未処置）細胞株よりも遅い成長速度で、親
ＳＮＵ１６細胞に関する３６時間と比較して１２５時間の倍加時間で）。
【０４７５】
ＳＮＵ１６細胞におけるＢＧＪ３９８耐性の始まりは、ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブに
対する後天的感受性をもたらす（図２１）。ＳＮＵ１６親およびＢＧＪ３９８耐性細胞に
対して行われた細胞成長アッセイは、それぞれ１０μＭを上回って１６．７ｎＭまでのゲ
フィチニブＩＣ５０におけるシフトを示し、ＦＧＦＲ２からＥＧＦＲへの発がん遺伝子依
存性の切換えを確認した。
【０４７６】
本発明者らは、トランスフォーミング発がん遺伝子ＦＧＦＲ２で増幅される細胞株が、
第２の発がん遺伝子ＥＧＦＲで増幅され、かつそれに依存する既存の細胞を含有すること
を示してきた。ＦＧＦＲ２増幅細胞株ＳＮＵ１６が、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤により圧力
下に置かれた場合、１つの集団が排除され、部分集団が優性となった。本発明者らは、不
均一な腫瘍が、標的療法のような選択圧下に置かれる場合に、部分集団の成長が好都合と
なり、臨床的耐性をもたらし得ると予測する。
【０４７７】
ディープシーケンシングは、ヒト胃がん検体におけるさらなる発がん性病巣の既存を明ら
かにする
ＦＧＦＲ２を過剰発現する腫瘍領域およびＦＧＦＲ２過剰発現を伴わない腫瘍領域から
採取した対での腫瘍試料の顕微解剖した領域のディープシーケンシングは、ＦＧＦＲ２増
幅との相関を示した。ＦＧＦＲ２過剰発現を有する腫瘍領域は全て、コピー数におけるＦ
ＧＦＲ２増幅（例えば、コピー数６〜１６）を示した一方で、ＦＧＦＲ２過剰発現を伴わ
ない腫瘍領域は、ＦＧＦＲ２コピー数増幅を示さなかった。上述のＳＮＵ１６における見
解と一致して、１つの腫瘍は、非ＦＧＦＲ２増幅領域においてのみＥＧＦＲ増幅を示した
。ＥＧＦＲ増幅は、この検体ではｋｒａｓ増幅と同時発生であった。この観察は、ｋｒａ
ｓ増幅が抗ＥＧＦＲ療法で処置したがんにおける耐性のメカニズムであることを示唆する
これまでの報告と一致している（Valtorta, et al., IJC (2013) 133:1259-1266; Misale
, et al., Nature (2012) 486:532-538）。
【０４７８】
他の腫瘍は、代替的な受容体チロシンキナーゼの増幅を示した。例えば、１つの腫瘍対
は、ＦＧＦＲ２増幅領域およびＦＧＦＲ２非増幅領域の両方で増幅されるＨｅｒ２を有し
た一方で、さらなる腫瘍は、非ＦＧＦＲ２増幅領域においてのみ同定されるＩＧＦ１Ｒ増
幅を有した。全ての腫瘍における領域は全て、ｐ５３において突然変異を有するようであ
った。幾つかのさらなる突然変異が同定されたが、試料セットにわたって首尾一貫しては
見いだされなかった。初期に蔓延していない受容体チロシンキナーゼで増幅されたこれら
の小さな既存集団は、標的療法（例えば、抗ＦＧＦＲ２療法）のような選択圧が印加され
る場合に、耐性細胞の供給源であり得る。
【０４７９】
本発明者らはまた、ＦＧＦＲ２増幅を有する原発性ヒト腫瘍が、他のチロシンキナーゼ
の増幅を有する部分集団を含有すること、およびこの部分集団増幅が、場合によってはＦ
ＧＦＲ２増幅を有さない腫瘍領域で起きることを実証してきた。他の研究（Snuderl, et 
al. (2011) Cancer Cell 20: 810-817）を連想して、全ての腫瘍領域はまた、一般的な突
然変異、この場合ではｐ５３における突然変異を含有し、全体として腫瘍に関する共通母
細胞（ancestor）を示唆した。
【０４８０】
Ｈｅｒ２発現性腫瘍における耐性メカニズムとしてのＦＧＦＲ２
ＦＧＦＲ２の増幅は、ラパチニブによる処置後の乳がん細胞における耐性メカニズムと
して提唱されており（Azuma, et al. (2011) Biochem Biophys Res Comm, 407:219-224）
、ＦＧＦＲ２発現は、ラパチニブに対して乏しい応答を有する乳がん患者において過剰発
現されるとみなされた。本発明者らは、ディープシーケンシングによりヒトＨｅｒ２増幅
胃腫瘍試料が、ＦＧＦＲ２増幅細胞の既存の部分集団を有することを実証してきた（Deed
s et al,. United States and Canadian Academy of Pathology, March 2014: Abstract 
no: 453290）。これにより、ＦＧＦＲ２増幅が、抗Ｈｅｒ２療法後に他のＨｅｒ２増幅腫
瘍において耐性メカニズムを表し得ることが示唆される。したがって、ＦＧＦＲ２療法、
例えば本明細書中に記載するＦＧＦＲ２抗体およびＡＤＣと組み合わせたＨｅｒ２療法の
処置は、Ｈｅｒ２発現性がんおよび／またはＨｅｒ２耐性がんの処置に有用である。
【０４８１】
これらのデータは、ＦＧＦＲ２療法、例えば本明細書中に記載するＦＧＦＲ２  ＡＤＣ
が、がんの処置に関して他のチロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて有用であり得ること
を示唆した。さらに、本明細書中に記載するＦＧＦＲ２  ＡＤＣは、他のチロシンキナー
ゼ阻害剤（例えば、Ｈｅｒ２阻害剤、Ｈｅｒ３阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｍｅｔ阻害剤お
よびＩＧＦＲ阻害剤）を含む他のがん療法に対して耐性の患者集団の処置に有用であり得
る。
【０４８２】
本明細書に記載の実施例および実施形態は例示目的に過ぎず、それに照らして様々な改変または変更が当業者に対して示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の中に含まれることが理解される。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
式：
Ａｂ−（Ｌ−（Ｄ）ｍ）ｎ
（式中、
ＡｂはヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４の両方に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは薬物部分であり；
ｍは１〜８の整数であり；および
ｎは１〜１０の整数である）
の抗体薬物コンジュゲート。
［２］
前記ｍが１である、上記［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［３］
前記ｎが３または４である、上記［１］または［２］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［４］
前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２の全てのアイソフォームに特異的に結合する、上記［１］から［３］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［５］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［４］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［６］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、上記［１］から［５］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［７］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［６］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［８］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１からなるヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［６］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［９］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１０］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ残基残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１１］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のヒトＦＧＦＲ４のアミノ残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、上記［１］から［１０］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１２］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１３］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３からなるヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［１］から［１１］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１４］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１のＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２のＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、上記［１］から［１３］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１５］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１のＶＬ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２のＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、上記［１４］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１６］
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のＶＨ領域、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のＶＬ領域を含む、上記［１５］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１７］
前記抗体が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる、上記［１６］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１８］
前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に対して配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９の軽鎖からなる抗体と交差競合する、上記［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［１９］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有する、上記［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２０］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有さない、上記［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２１］
前記抗体が、ヒト抗体である、上記［１］から［２０］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュ
ゲート。
［２２］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、上記［１］から［２１］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２３］
前記リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、親水性リンカー、プロチャージリンカーおよびジカルボン酸に基づくリンカーからなる群から選択される、上記［１］から［２２］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２４］
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホ−ブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、マレイミドＰＥＧ  ＮＨＳ、Ｎ−スクシンイミジル  ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル  ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）または２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １７−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，８，１１，１４−テトラオキソ−４，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１−オエート（ＣＸ１−１）からなる群から選択される架橋試薬から誘導される、上記［２３］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２５］
前記リンカーが、架橋試薬Ｎ−スクシンイミジル  ４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）から誘導される、上記［２４］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２６］
前記薬物部分が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、プロアポトーシス剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管脱安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核輸送の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤およびＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される、上記［１］から［２５］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２７］
前記細胞毒性剤がメイタンシノイドである、上記［２６］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２８］
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である、上記［２７］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［２９］
下記式：
【化１５】
2019193626.tif 000062
（式中、
Ａｂは、配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３の重鎖ＣＤＲ３、および配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３の軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って規定され；および
ｎは１〜１０である）
を有する、上記［１］に記載の抗体薬物コンジュゲート。
［３０］
上記［１］から［２９］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［３１］
前記組成物が、凍結乾燥物として調製される、上記［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］
前記凍結乾燥物が、前記抗体薬物コンジュゲート、コハク酸ナトリウム、およびポリソルベート２０を含む、上記［３１］に記載の医薬組成物。
［３３］
それを必要とする患者におけるＦＧＦＲ２陽性および／またはＦＧＦＲ４陽性がんを処置する方法であって、上記［１］から［３０］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の医薬組成物を、前記患者に投与する工程を含む、方法。
［３４］
前記がんが、ＦＧＦＲ２遺伝子コピー数の増加またはＰＡＸ３−ＦＯＸＯトランスロケーションを有する、上記［２９］に記載の方法。
［３５］
前記がんが、胃がん、乳がん、横紋筋肉腫、肝臓がん、副腎がん、肺がん、食道がん、結腸がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される、上記［３３］に記載の方法。
［３６］
チロシンキナーゼ阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、Ｂｃｌ２阻害剤、ＭＣＬ１阻害剤または別のＦＧＦＲ２阻害剤を、前記患者に投与する工程をさらに含む、上記［３３］または［３４］に記載の方法。
［３７］
前記別のＦＧＦＲ２阻害剤が、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素またはその薬学的に許容される塩である、上記［３６］に記載の方法。
［３８］
前記がんが、チロシンキナーゼ阻害剤に耐性である、上記［３３］または［３５］に記載の方法。
［３９］
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲまたはＭｅｔ阻害剤である、上記［３８］に記載の方法。
［４０］
患者においてＨｅｒ２阻害剤に耐性であるがんを処置する方法であって、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の医薬組成物を、前記患者に投与する工程を含む、方法。
［４１］
医薬としての使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート。
［４２］
ＦＧＦＲ２陽性またはＦＧＦＲ４陽性がんの処置における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または上記［３１］から［３３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［４３］
チロシンキナーゼ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または上記［３１］から［３３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［４４］
ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲまたはＭｅｔ阻害剤に耐性であるがんの処置における使用のための、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の抗体薬物コンジュゲート、または上記［３０］から［３２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［４５］
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
［４６］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２上のエピトープに特異的に結合する、上記［４５］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４７］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７３（Ａｓｎ）、１７４（Ｔｈｒ）、１７５（Ｖａｌ）、１７６（Ｌｙｓ）、１７８（Ａｒｇ）、２０８（Ｌｙｓ）、２０９（Ｖａｌ）、２１０（Ａｒｇ）、２１２（Ｇｌｎ）、２１３（Ｈｉｓ）、２１７（Ｉｌｅ）および２１９（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、上記［４６］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４８］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３６または配列番号１４１を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープに特異的に結合する、上記［４７］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［４９］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［４６］から［４８］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［５０］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３７のアミノ酸残基１７６（Ｌｙｓ）および２１０（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ２のエピトープ、および配列番号１４２のアミノ酸残基１６９（Ｌｙｓ）および２０３（Ａｒｇ）を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［４５］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［５１］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１４２のアミノ酸残基１５０（Ｔｈｒ）、１５１（Ｈｉｓ）、１５４（Ａｒｇ）、１５７（Ｌｙｓ）、１６０（Ｈｉｓ）、１６６（Ａｓｎ）、１６７（Ｔｈｒ）、１６８（Ｖａｌ）、１６９（Ｌｙｓ）、１７１（Ａｒｇ）、１７３（Ｐｒｏ）、１７４（Ａｌａ）、２０１（Ａｒｇ）、２０２（Ｌｅｕ）、２０３（Ａｒｇ）、２０４（Ｈｉｓ）、２０５（Ｇｌｎ）、２０６（Ｈｉｓ）、２０７（Ｔｒｐ）、２１０（Ｖａｌ）および２１２（Ｇｌｕ）に特異的に結合する、上記［４５］から［５０］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［５２］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３を含むヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［４５］から［５１］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［５３］
前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１３２または１３３からなるヒトＦＧＦＲ４のエピトープに特異的に結合する、上記［４５］から［５１］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［５４］
（ａ）配列番号１、２１、４１、６１、８１または１０１のＶＨ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２、２２、４２、６２、８２または１０２のＶＨ  ＣＤＲ２、および（ｃ）配列番号３、２３、４３、６３、８３または１０３のＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、上記［４５］から［５３］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［５５］
（ａ）配列番号１１、３１、５１、７１、９１または１１１のＶＬ  ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２または１１２のＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１３、３３、５３、７３、９３または１１３のＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＣＤＲが、Ｋａｂａｔ定義に従って規定される、上記［５４］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［５６］
配列番号７、２７、４７、６７、８７または１０７のＶＨ領域、および配列番号１７、３７、５７、７７、９７または１１７のＶＬ領域を含む、上記［５５］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［５７］
配列番号９、２９、４９、６９、８９または１０９の重鎖、および配列番号１９、３９、５９、７９、９９または１１９の軽鎖からなる、上記［５６］に記載の抗体。
［５８］
前記抗体または抗原結合性断片が、ヒトＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４への結合に関して、上記［５７］に記載の抗体または抗原結合性断片と交差競合する、上記［４５］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［５９］
前記抗体または抗原結合性断片が、上記［５９］に記載の抗体と比較した場合に、増強されたＡＤＣＣ活性を有する、上記［４５］に記載の抗体または抗原結合性断片。
［６０］
前記抗体が、ヒト抗体である、上記［４５］から［５９］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［６１］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、上記［４５］から［６０］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［６２］
前記抗体または抗原結合性断片が、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、上記［４５］から［６１］のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
［６３］
上記項目のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性断片をコードする核酸。
［６４］
上記［６３］に記載の核酸を含むベクター。
［６５］
上記［６４］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［６６］
抗体または抗原結合性断片を生成するための方法であって、
上記［６５］に記載の宿主細胞を培養する工程、および培養物から抗体を回収する工程を含む、方法。
［６７］
抗ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ４抗体薬物コンジュゲートを生成するための方法であって、
（ａ）ＳＭＣＣを薬物部分ＤＭ−１に化学的に連結する工程；
（ｂ）前記リンカー−薬物を、上記［６６］に記載の細胞培養物から回収された抗体にコンジュゲートする工程；および
（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製する工程
を含む、方法。
［６８］
ＵＶ分光光度計を使用して測定される、約３．５の平均ＤＡＲを有する、上記［６７］に従って作製される抗体薬物コンジュゲート。
［６９］
上記［４５］から［６２］のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、または標識された上記［１］から［２９］のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む診断試薬。
［７０］
標識が、放射性標識、フルオロフォア、発色団、画像化剤、および金属イオンからなる群から選択される、上記［６９］に記載の診断試薬。
【図１】
2019193626.tif 000064
【図２】
2019193626.tif 000065
【図３】
2019193626.tif 000066
【図４−１】
2019193626.tif 000067
【図４−２】
2019193626.tif 000068
【図４−３】
2019193626.tif 000069
【図４−４】
2019193626.tif 000070
【図４−５】
2019193626.tif 000071
【図５】
2019193626.tif 000072
【図６−１】
2019193626.tif 000073
【図６−２】
2019193626.tif 000074
【図７−１】
2019193626.tif 000075
【図７−２】
2019193626.tif 000076
【図８−１】
2019193626.tif 000077
【図８−２】
2019193626.tif 000078
【図８−３】
2019193626.tif 000079
【図９】
2019193626.tif 000080
【図１０】
2019193626.tif 000081
【図１１−１】
2019193626.tif 000082
【図１１−２】
2019193626.tif 000083
【図１１−３】
2019193626.tif 000084
【図１２】
2019193626.tif 000085
【図１３−１】
2019193626.tif 000086
【図１３−２】
2019193626.tif 000087
【図１３−３】
2019193626.tif 000088
【図１４】
2019193626.tif 000089
【図１５】
2019193626.tif 000090
【図１６−１】
2019193626.tif 000091
【図１６−２】
2019193626.tif 000092
【図１７】
2019193626.tif 000093
【図１８】
2019193626.tif 000094
【図１９−１】
2019193626.tif 000095
【図１９−２】
2019193626.tif 000096
【図１９−３】
2019193626.tif 000097
【図１９−４】
2019193626.tif 000098
【図２０−１】
2019193626.tif 000099
【図２０−２】
2019193626.tif 000100
【図２０−３】
2019193626.tif 000101
【図２１】
2019193626.tif 000102
【配列表】
2019193626000001.app