(57)【要約】      （修正有）【課題】捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含むサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出方法を提供する。【解決手段】酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここでは、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/ml又はそれ以上の濃度で用いられ、サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と１〜２４時間にわたり同時にインキュベートし、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を、単一のリジン残基を介して誘導体化し、サンプルは１０%血清を含み、オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含む、関節リウマチ患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための方法であって、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/ml又はそれ以上の濃度を有し、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と０．５〜２４時間にわたり同時にインキュベートし、
ｃ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を、各々、単一のリジン残基を介して１回だけ誘導体化し、
ｄ）サンプルは１%血清／血漿又はそれ以上を含み、
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加え、並びに
ｆ）捕捉及びトレーサー上でのモノマービオチン及びジゴキシゲニン。
【請求項２】
サンプルが、抗薬物抗体及びリウマチ因子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗体が抗炎症抗体である、請求項１〜２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
抗炎症抗体が、関節リウマチ、又は若年性関節炎、又は変形性関節症、又はキャッスルマン病、又はメサンギウム増殖性糸球体腎炎の処置のための抗体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗体が抗癌抗体である、請求項１又は２のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
抗癌抗体が、骨髄腫又は形質細胞腫の処置のための抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
抗体が抗ＩＬ６Ｒ抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
抗ＩＬ６Ｒ抗体がトシリズマブである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、請求項１〜８のいずれか一項記載のアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、形質細胞腫を有する個体を処置する方法。
【請求項１０】
抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、請求項１〜８のいずれか一項記載のアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、骨髄腫を有する個体を処置する方法。
【請求項１１】
ＩＬ６Ｒ活性を阻害するために、抗ＩＬ６Ｒ抗体の有効量を個体に投与し、請求項１〜８のいずれか一項記載のアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体の存在を決定することを含む、個体においてＩＬ６Ｒ活性を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において報告するのは、抗炎症性抗体で処置された患者からの血清サンプル中の抗薬物抗体を検出するための干渉抑制イムノアッセイ及びその使用である。
【０００２】
発明の背景
新規治療用抗体の臨床開発では、適当なアッセイによる、それらの潜在的な免疫原性の評価が要求される（Kaliyaperumal, A. and Jing, S., Curr. Pharm. Biotechnol. 10 (2009) 352-358）。抗薬物抗体（ＡＤＡ）テストは、通常、２段階のアプローチを含む：（１）ＡＤＡ検出のためのアッセイ及び（２）ＡＤＡ特徴付けのためのアッセイ。ＡＤＡ検出アッセイは、スクリーニング及び特異性の確認（確証的）アッセイを含む。マイクロタイタープレートベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、それらのハイスループット効率、相対的な単純さ、及び高い感度のため、依然として、ＡＤＡについてスクリーニングするために最も広く使用されているフォーマットである（Geng, D., et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 39 (2005) 364-375）。ＡＤＡ  ＥＬＩＳＡは、最もしばしば、高い選択性、全てのアイソタイプの検出、及び汎種ＡＤＡ検出能力を提供する架橋フォーマットにおいて設計されている（Mire-Sluis, A.R., et al., J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16）。
【０００３】
架橋ＥＬＩＳＡが開発され、抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについてのスクリーニング及び確認ＡＤＡアッセイとして使用されてきた（Stubenrauch, K., et al., Clin. Ther. 32 (2010) 1597-1609）。
【０００４】
Stubenrauch, K.らは、ヒト抗体に曝露されたマウスからの血清サンプル中での薬物耐性を用いたジェネリック抗薬物抗体アッセイを報告している（Anal. Biochem. 430 (2012) 193-199）。Bourdage, J. S.らは、抗原コーティング濃度依存性に対する二重抗原架橋イムノアッセイフォーマットの効果及びモノクローナル抗体のための免疫原性アッセイを設計するための意義を報告している（J. Pharm. Biochem. Anal. 39 (2005) 685-690）。Mikulskis, A.らは、薬物開発のサポートにおける頑強な、薬物耐性の免疫原性アッセイの開発のための選択肢のプラットフォームとして溶液ＥＬＩＳＡを報告している（J. Immunol. Meth. 365 (2010) 38-49）。Pan, J.らは、２つのバイオ治療薬の免疫原性テストにおいて、NIDSA（登録商標）迅速アッセイとＥＬＩＳＡ方法との比較を報告している（J. Pharm. Tox. Meth. 63 (2010) 150-159）。
【０００５】
WO 2009/077127において、識別アッセイが報告されている。
【０００６】
Qiu, Z. J.らは、自己免疫血清中のヒト抗治療用抗体の検出のための新規の均一ビオチン−ジゴキシゲニンベースのアッセイを報告している（J. Immunol. Meth. 362 (2010) 101-111）。
【０００７】
発明の概要
本明細書において報告するのは、治療用抗体を用いて処置された患者のサンプルを含む血清中での抗薬物抗体（ＡＤＡ）の検出のためのスクリーニング、確認、及び追跡調査アッセイとして使用することができる架橋酵素結合免疫吸着アッセイ（架橋ＥＬＩＳＡ）である。本明細書において報告するアッセイは、サンプルを含む血清が、自己免疫疾患（例えば関節リウマチ（ＲＡ）など）を伴う患者からである場合に特に有用である。
【０００８】
本明細書において報告するアッセイは、分析されるサンプル中の治療用抗体の量に関して、改善された耐性（ＡＤＡ  ＥＬＩＳＡでの増加した薬物耐性）を示し、及び、同時に、偽陽性のアッセイ結果の数が低下する。
【０００９】
本明細書において報告するアッセイを用いて、遊離薬物による、及びリウマチ因子（ＲＦ）による干渉を最小限にすることができることが見出されている。
【００１０】
このアッセイは、サンプルが、抗薬物抗体の検出のためのイムノアッセイにおいて干渉することができ、このように、偽陽性のイムノアッセイ結果を説明しうる、問題の抗薬物抗体以外の抗体を含む場合に特に有用である。
【００１１】
一実施形態において、本明細書において報告する方法は、抗炎症治療のために使用される薬物抗体の抗薬物抗体の決定のために使用される。
【００１２】
増加した薬物耐性は、以下の相乗的な相互作用により達成された：１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化捕捉及びトレーサー試薬の濃度を増加させること；２）血清サンプルと捕捉試薬及びトレーサー試薬との同時（連続の代わりの）インキュベーション；３）長期インキュベーション時間；４）均一にモノ共役された捕捉試薬及びトレーサー試薬の使用；並びに５）増加した血清マトリックス含量の使用。
【００１３】
リウマチ因子からの干渉は、添加剤としてのオリゴマーヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の添加により抑制することができる。
【００１４】
本明細書において報告する干渉抑制ＡＤＡアッセイの薬物耐性は、当技術分野において公知のアッセイよりも少なくとも１０倍高い。
【００１５】
本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含むサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであり、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/mlを上回る濃度で用いられ、
ｂ）サンプルは、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と４〜２４時間にわたり同時にインキュベートされ、
ｃ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、単一のリジン残基を介して誘導体化され、
ｄ）サンプルは、７．５%血清又はそれ以上を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える。
【００１６】
本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含む、関節リウマチ患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて０．５μg/ml又はそれ以上の濃度を有し、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と０．５〜２４時間にわたり同時にインキュベートし、
ｃ）捕捉薬物抗体は、捕捉薬物抗体及び特異的結合対の第１成分の１：１コンジュゲートであり、トレーサー薬物抗体は、トレーサー薬物抗体及び検出可能な標識の１：１コンジュゲートであり、
ｄ）サンプルは１%血清又はそれ以上を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える。
【００１７】
一実施形態において、サンプルは、５%血清又はそれ以上を含む。一実施形態において、サンプルは、７．５%血清又はそれ以上を含む。
【００１８】
一実施形態において、サンプルは、抗薬物抗体及びリウマチ因子を含む。
【００１９】
一実施形態において、薬物抗体は、炎症性疾患の処置のための抗体である。一実施形態において、炎症性疾患の処置のための抗体は、自己免疫疾患の処置のための抗体である。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ又は若年性関節炎又は変形性関節症又はキャッスルマン病である。
【００２０】
一実施形態において、薬物抗体は、癌の処置のための抗体である。一実施形態において、抗体は、骨髄腫又は形質細胞腫の処置のためである。
【００２１】
一実施形態において、薬物抗体は、ＩＬ−６受容体に対する（抗ＩＬ６Ｒ抗体）、又はＩＧＦ−１受容体（抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、又はＩＬ−１３受容体１α（抗ＩＬ１３Ｒ１α抗体）に対する、又はＯＸ４０Ｌ（抗ＯＸ４０Ｌ抗体）に対する、又は腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα抗体）に対する抗体である。一実施形態において、薬物抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体である。一実施形態において、抗ＩＬ６Ｒ抗体は、トシリズマブである。
【００２２】
一実施形態において、捕捉薬物抗体は、固相にコンジュゲートされている。一実施形態において、固相への捕捉薬物抗体のコンジュゲーションは、特異的結合対を介して実施される。一実施形態において、特異的結合対（第１成分／第２成分）は、ストレプトアビジン若しくはアビジン／ビオチン、又は抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）、又はレクチン／多糖類、又はステロイド／ステロイド結合タンパク質、又はホルモン／ホルモン受容体、又は酵素／基質、又はＩｇＧ／プロテインＡ及び／若しくはＧより選択される。
【００２３】
一実施形態において、捕捉薬物抗体は、（特異的結合対の第１成分として）ビオチンにコンジュゲートされる。この場合において、固相へのコンジュゲーションは、固定化されたアビジン又はストレプトアビジンを介して実施される。
【００２４】
一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされる。一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、特異的結合対を介して検出可能な標識にコンジュゲートされる。一実施形態において、特異的結合対（第１成分／第２成分）は、ストレプトアビジン若しくはアビジン／ビオチン、又は抗体／抗原（例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996を参照のこと）、又はレクチン／多糖類、又はステロイド／ステロイド結合タンパク質、又はホルモン／ホルモン受容体、又は酵素／基質、又はＩｇＧ／プロテインＡ及び／若しくはＧより選択される。
【００２５】
一実施形態において、トレーサー薬物抗体は、（検出可能な標識として）ジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。この場合において、検出可能な標識への連結は、ジゴキシゲニンに対する抗体を介して実施される。
【００２６】
一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において約０．５μg/mlから約１０μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、０．５μg/ml超から１０μg/ml未満の濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１μg/mlから約５μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．４μg/mlから約１．８μg/mlの濃度を有する。一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．４５μg/mlから約１．６μg/mlの濃度を有する。好ましい一実施形態において、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、約１．５μg/mlの濃度を有する。
【００２７】
一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも６時間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも１２時間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、少なくとも１６時間である。
【００２８】
一実施形態において、インキュベーション時間は、最大２４時間である。
【００２９】
一実施形態において、インキュベーション時間は、４時間と２４時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、６時間と２４時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、１２時間と２４時間の間である。好ましい一実施形態において、インキュベーション時間は、１２時間と２０時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、１４時間と１８時間の間である。一実施形態において、インキュベーション時間は、約１６時間である。
【００３０】
一実施形態において、サンプルは、１%〜２０%血清を含む。一実施形態において、サンプルは、約１０%血清を含む。
【００３１】
一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、１０μg/mlから１０００μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、１５μg/mlから５００μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、２０μg/mlから２５０μg/mlの最終濃度まで加える。一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、２５μg/mlから１００μg/mlの最終濃度まで加える。好ましい一実施形態において、オリゴマーヒトＩｇＧを、約５０μg/mlの最終濃度まで加える。
【００３２】
本明細書において報告する一態様は、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を含む、関節リウマチ患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイであって、ここで、
ａ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイにおいて約１．５μg/mlの濃度を有し、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と１４〜１６時間にわたり同時にインキュベートし、
ｃ）捕捉薬物抗体は、捕捉薬物抗体のリジン残基を介した捕捉薬物抗体及びビオチンの１：１コンジュゲートであり、トレーサー薬物抗体は、トレーサー薬物抗体のリジン残基を介したトレーサー薬物抗体及びジゴキシゲニンの１：１コンジュゲートであり、
ｄ）サンプルは１%〜２０%血清を含み、並びに
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前に、２５μg/ml〜１００μg/mlの最終濃度までサンプルに加える。
【００３３】
本明細書において報告する一態様は、抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおけるリウマチ因子の捕捉のためのオリゴマーヒトＩｇＧの使用である。
【００３４】
本明細書において報告する一態様は、治療的抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗薬物抗体の存在を決定することを含む、疾患を有する個体を処置する方法である。
【００３５】
本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、炎症性疾患を有する個体を処置する方法である。
【００３６】
一実施形態において、炎症性疾患は、自己免疫疾患である。一実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節炎、変形性関節症、又はキャッスルマン病より選択される。
【００３７】
一実施形態において、炎症性疾患は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎である。
【００３８】
本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、形質細胞腫を有する個体を処置する方法である。
【００３９】
本明細書において報告する一態様は、抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物）の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、骨髄腫を有する個体を処置する方法である。
【００４０】
本明細書において報告する一態様は、ＩＬ６Ｒ活性を阻害するための抗ＩＬ６Ｒ抗体の有効量を個体に投与し、本明細書において報告するアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、個体においてＩＬ６Ｒ活性を阻害する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについて例示した薬物耐性の抗薬物抗体アッセイのアッセイ原理。
【図２】抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについての干渉抑制された抗薬物抗体アッセイのアッセイ原理。
【図３】抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについての干渉抑制された抗薬物抗体アッセイについて得られた検量曲線。
【図４】抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについて本明細書において報告する２ステップ抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおける、及び干渉抑制された抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおける薬物耐性の比較；増加量の薬物の存在における３００ng/mL抗薬物抗体のシグナル；点線：ＣＰの従来のアッセイ；実線：本明細書において報告するＣＰ干渉抑制アッセイ；円を伴う点線：従来のアッセイ；四角を伴う実線：本明細書において報告する干渉抑制アッセイ。
【図５】干渉抑制された抗薬物抗体ＥＬＩＳＡを用いたカットポイント決定。
【図６】ＴＣＺ−Ｂｉ（モノ）及びＴＣＺ−Ｄｉｇ（モノ）を伴う干渉抑制された抗薬物抗体ＥＬＩＳＡを用いたカットポイント決定。
【図７】ＴＣＺ処置されたＲＡ患者からの７７の異なる血清サンプルにおける、従来のＥＬＩＳＡを使用したシグナル変動。
【図８】ＴＣＺ処置されたＲＡ患者からの７７の異なる血清サンプルにおける、本明細書において報告する干渉抑制ＥＬＩＳＡを使用したシグナル変動。
【００４２】
定義
用語「１：１コンジュゲート」は、単一の共有結合を介して互いに連結／コンジュゲートされた、正確には２つの実体からなるコンジュゲートを表示する。例えば、用語「捕捉薬物抗体及び特異的結合対の第１の成分の１：１コンジュゲート」は、特異的結合対の第１の成分の正確に１分子への単一の化学結合を介して共有結合的にコンジュゲートされた捕捉薬物抗体の正確に１分子からなる化学的コンジュゲートを表示する。同様に、用語「トレーサー薬物抗体及び検出可能な標識の１：１コンジュゲート」は、正確に１つの検出可能な標識分子への単一の化学的結合を介して共有結合的にコンジュゲートされたトレーサー薬物抗体の正確に１分子からなる化学的コンジュゲートを表示する。
【００４３】
本発明に従った用語「薬物抗体」は、個体に投与することができる抗体を表示し、そのため前記個体のサンプルは、投与後に前記薬物抗体を含むことが推測される。薬物抗体は、治療目的のためにヒトに投与されることが意図される抗体である。本明細書に報告される１つのアッセイ内で、薬物抗体、捕捉薬物抗体、及びトレーサー薬物抗体は、例えば、同じ発現ベクターを用いて組換え産生され、同じアミノ酸配列を含む「同じ」抗体分子を含む。薬物抗体（治療用モノクローナル抗体）は、種々の疾患、例えば腫瘍学的疾患（例、血液学的及び固形悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫、乳癌、及び結腸直腸癌を含む）又は炎症性疾患など様々な疾患の処置のために広く使用されている。そのような抗体は、例えば、Levene, A. P., et al., Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152;Groner, B., et al., Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547；及びHarris, M., Lancet Oncol. 5 (2004) 292-302により報告されている。
【００４４】
一実施形態において、薬物抗体は、炎症性疾患の処置のために有用である抗体、即ち、抗炎症抗体、例えば抗ＩＬ−６受容体抗体、又は抗ＩＬ−ＩＧＦ−１受容体抗体、又は抗ＩＬ−１３受容体１α１抗体などである。
【００４５】
例示的な（好ましくはモノクローナル）薬物抗体は、ＩＬ−６受容体に対する抗体（抗ＩＬ−６Ｒ抗体）である。そのような抗体は、例えば、Mihara, et al., Clin. Immunol. 98 (2001) 319-326；Nishimoto, N., et al, Blood 106 (2005) 2627-2632により、臨床治験ＮＣＴ０００４６７７４において、又はWO 2004/096274において報告されている。
【００４６】
例示的な（好ましくはモノクローナル）薬物抗体は、ＩＧＦ−１受容体に対する抗体（抗ＩＧＦ１抗体）である。そのような抗体は、例えば、WO 2004/087756において、又はWO 2005/005635において報告されている。
【００４７】
例示的な（好ましくはモノクローナル）薬物抗体は、ＩＬ−１３受容体αに対する抗体（抗ＩＬ１３Ｒ１α抗体）である。ＩＬ１３Ｒ１αに対する抗体は、例えば、WO 96/29417、WO 97/15663、WO 03/080675、Graber, P., et al., Eur. J. Immunol. 28 (1998) 4286-4298；Poudrier, J., et al., J. Immunol. 163 (1999) 1153-1161；Poudrier, J., et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3157-3164；Aikawa, M., et al., Cytokine 13 (2001) 75-84から公知であり、例えば、R&D Systems Inc. USAから商業的に入手可能である。ＩＬ１３Ｒ１αに対するさらなる例示的な抗体が、WO 2006/072564に報告されている。
【００４８】
本明細書において使用する用語「抗炎症治療のために使用される薬物抗体」は、炎症を媒介する細胞表面受容体に対して向けられた薬物抗体を表示する。そのような受容体は、例えば、ＩＬ−６受容体、又はＩＧＦ−１受容体、又はＩＬ−１３ａ受容体１である。患者からのサンプル（そのような抗炎症薬物抗体を用いて処理される）を分析する場合、方法の陽性結果が、真の抗薬物抗体（真の陽性結果）又はサンプルの抗薬物抗体以外の抗体（偽陽性結果）に基づくか否かを決定しなければならない。そのような場合の例は、患者からのサンプルであり、その患者は、自己免疫疾患、例えばリウマチなどを有し、このように、前記患者から得られたサンプルは、いわゆる「リウマチ因子」を含む。本明細書において使用する用語「リウマチ因子」は、ヒトＩｇＧ、より厳密にはヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合する抗体を表示する。大半の場合において、これらの「リウマチ因子」は、オリゴマー結合分子である。
【００４９】
本明細書において使用する用語「抗薬物抗体」は、薬物抗体の抗原性領域に対して向けられる、即ち、それに結合する抗体を表示する。この抗原性領域は、薬物抗体の可変領域、ＣＤＲ、定常領域、又は糖構造でありうる。一実施形態において、抗薬物抗体は、薬物抗体のＣＤＲ又は薬物抗体の二次修飾（組換え細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＢＨＫ細胞などにおける薬物抗体の組換え産生に起因する）に対して向けられる。一般的に、抗薬物抗体は、薬物抗体が投与される動物の免疫系により認識される薬物抗体の抗原性領域に対して向けられる。上に記載する抗体を「特異的な抗薬物抗体」と呼ぶ。
【００５０】
薬物抗体は、可能な限り少ない抗原性領域を含むように設計される。例えば、ヒトにおける使用が意図される薬物抗体は、薬物抗体に対する免疫応答の生成を最小限にするために、ヒト患者への適用前にヒト化される。この免疫応答は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形態でありうるが、それは、そのようなヒト化薬物抗体の非ヒト部分（例えば可変ドメイン中の相補性決定領域など）に対して向けられる（例、Pan, Y., et al., FASEB J. 9 (1995) 43-49を参照のこと）。
【００５１】
本明細書において使用する用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）において超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触部」）を含む、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含む：ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書における例示的なＨＶＲは、以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）  ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。
【００５２】
他に示さない場合、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例、ＦＲ残基）を、本明細書において、Ｋａｂａｔに従ってナンバリングする。
【００５３】
抗体は、多くの反応性成分、例えば、アミノ基（リジン、α−アミノ基）、チオール基（シスチン、システイン、及びメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、及び糖アルコール基などを含む。これらを、表面、タンパク質、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、セルロース、又はポリスチロールなど）、酵素、又は結合対のメンバーなどの結合パートナーへの共役のために用いることができる（例、Aslam M., and Dent, A., Bioconjuation MacMillan Ref. Ltd. (1999) 50-100を参照のこと）。
【００５４】
用語「抗イディオタイプ抗体」は、結合特異性（例えば親抗体の結合部位など）に、特異的に結合する抗体を表示し、即ち、抗イディオタイプ抗体は、例えば、親抗体の抗原結合部位に対して向けられる。
【００５５】
一実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、親抗体のＣＤＲの１つ以上に、特異的に結合する。
【００５６】
一実施形態において、親抗体は治療用抗体である。一実施形態において、親抗体は多重特異性抗体である。一実施形態において、親抗体は二重特異性抗体である。
【００５７】
タンパク質の最も共通の反応基の１つは、アミノ酸リジンの脂肪族εアミンである。一般的に、ほぼ全ての抗体が大量のリジン残基を含む。リジンアミン／アミノ基は、ｐＨ８．０以上で適度に良好な求核剤であり（ｐＫａ＝９．１８）、従って、種々の試薬と簡単及び円滑に反応し、安定な結合を形成する。
【００５８】
抗体中の別の共通の反応基は、硫黄を含むアミノ酸シスチン及びその還元産物システイン（又はハーフシスチン）からのチオール残基である。システインは遊離チオール基を含み、それはアミンよりも求核性であり、一般的に、タンパク質中で最も反応性の官能基である。チオールは、一般的に、中性ｐＨで反応性であり、従って、アミンの存在において選択的に他の分子と共役させることができる。遊離スルフヒドリル基は比較的反応性であるため、これらの基を伴うタンパク質は、しばしば、それらを伴い、それらの酸化形態で、ジスルフィド基又はジスルフィド結合として存在する。
【００５９】
シスチン及びシステインに加えて、一部のタンパク質は、アミノ酸メチオニンも有し、それはチオエーテル連結中に硫黄を含んでいる。文献には、いくつかのチオール化架橋試薬、例えばトラウト試薬（２−イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ））、サクシニミジル（アセチルチオ）酢酸（ＳＡＴＡ）、又はスルホスクシニミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサン酸（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）などの使用が報告されており、複数のスルフヒドリル基を、反応性アミノ基を介して導入する効率的な方法を提供している。
【００６０】
反応性エステル、特にＮヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基の修飾のための最も共通に用いられる試薬である。水性環境中での反応のための最適ｐＨはｐＨ８．０〜９．０である。
【００６１】
イソチオシアネートはアミン修飾試薬であり、タンパク質とチオ尿素結合を形成する。それらは、水性溶液中で（最適にはｐＨ９．０〜９．５で）タンパク質アミンと反応する。
【００６２】
アルデヒドは、穏やかな水性条件下で、脂肪族及び芳香族のアミン、ヒドラジン、及びヒドラジドと反応し、イミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基は、穏やかな又は強い還元剤（例えば水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど）を用いて選択的に還元されて、安定なアルキルアミン結合を生じることができる。
【００６３】
アミンを修飾するために使用されてきた他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）は、２つのアミン反応性無水物基を含む二機能性キレート剤である。それは、タンパク質のＮ末端基及びε−アミン基と反応し、アミド連結を形成することができる。無水物環が開き、配位複合体中で金属に強固に結合することができる多価の金属キレート化アームが作られる。
【００６４】
用語「サンプル」は、生きている物又は過去に生きていた物からの物質の任意の量を含むが、それに限定されない。そのような、生きている物は、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、及び他の動物を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、サンプルは、サル、特にカニクイザル、又はウサギ、又はマウス若しくはラットから得られる。そのような物質は、一実施形態において、個体からの全血、血清、又は血漿を含むが、これらに限定されず、それらは臨床ルーチンにおいて最も広く使用されるサンプルの供給源である。
【００６５】
用語「固相」は、非液体物質を表示し、材料、例えばポリマー、金属（常磁性粒子、強磁性粒子）、ガラス、及びセラミックなどで作られた粒子（微粒子及びビーズを含む）；ゲル物質、例えばシリカゲル、アルミナゲル、及びポリマーゲルなど；毛細管（ポリマー、金属、ガラス、及び／又はセラミックで作られうる）；ゼオライト及び他の多孔物質；電極；マイクロタイタ―プレート；固体細片；及びキュベット、チューブ、又は他の分光計サンプル容器を含む。固相成分は、「固相」が、サンプル中の物質と相互作用することが意図される、少なくとも１つの部分をその表面上に含む点で、不活性な固体表面から区別される。固相は、固定成分、例えばチューブ、細片、キュベット、若しくはマイクロタイタ―プレートなどでありうる、又は、非固定成分、例えばビーズ及び微粒子などでありうる。タンパク質及び他の物質の非共有付着又は共有付着の両方を可能にする種々の微粒子を使用することができる。そのような粒子は、ポリマー粒子、例えばポリスチレン及びポリ（メチルメタクリル酸）など；金粒子、例えば金ナノ粒子及び金コロイドなど；並びにセラミック粒子、例えばシリカ、ガラス、及び金属酸化物粒子などを含む。例えば、Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A、又はButler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23を参照のこと。
【００６６】
色原体（蛍光性又は発光性の基及び色素）、酵素、ＮＭＲ活性基、金属粒子、又はハプテン（例えばジゴキシゲニンなど）から、検出可能な標識が、一実施形態において選択される。一実施形態において、検出可能な標識は、ジゴキシゲニンである。検出可能な標識は、また、光活性化可能な架橋基（例、アジド基又はアジリン基）でありうる。電気化学発光により検出することができる金属キレートは、また、一実施形態において、シグナル放出基であり、特に好ましくはルテニウムキレート（例、ルテニウム（ビスピリジル）３２＋キレート）である。適切なルテニウム標識基が、例えば、EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511、及びWO 92/14138において記載されている。
【００６７】
異なるイムノアッセイの原理が、例えば、Hage, D. S.（Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R）により記載されている。Lu, B.ら（Analyst. 121 (1996) 29R-32R）には、イムノアッセイにおける使用のための抗体の配向固定化が報告されている。アビジン−ビオチン媒介性イムノアッセイが、例えば、Wilchek, M. and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469により報告されている。
【００６８】
発明の詳細な説明
本明細書において報告するのは、遊離の治療用抗体への増加した耐性及びリウマチ因子干渉への増加した抵抗性を伴う血清サンプルを使用した、干渉抑制された抗薬物抗体アッセイである。
【００６９】
抗薬物抗体アッセイの原理は、ジゴキシゲニン化薬物（薬物Ｄｉｇ）及びビオチン化薬物（薬物Ｂｉ）（例、トシリズマブ（それぞれＴＣＺ−Ｄｉｇ及びＴＣＺ−Ｂｉ））との複合体中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）の捕捉であり、後者は、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート（ＳＡ−ＭＴＰ）上への固定化に導く。ＳＡ−ＭＴＰ上で薬物Ｂｉに結合されたＡＤＡ／薬物Ｄｉｇ複合体は、抗ジゴキシゲニン抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素コンジュゲート（抗Ｄｉｇ−ＨＲＰ）により検出される。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、基質ＡＢＴＳの呈色反応を触媒する。色の強度は、検体物の濃度に比例する。抗薬物抗体アッセイの一般的原理を図１に示す。
【００７０】
一般的なアッセイ原理の変更を伴わず、従来の抗薬物抗体アッセイの薬物及びリウマチ因子耐性は、以下により増加されうることが見出されている：
１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化捕捉及びトレーサー試薬の濃度を増加させること；
２）血清サンプルと捕捉試薬及びトレーサー試薬との同時（連続の代わりの）インキュベーション；
３）血清サンプルと捕捉試薬及びトレーサー試薬との延長されたインキュベーション；
４）不均一に共役された混合物の代わりでの、均一の捕捉試薬及びトレーサー試薬の使用；
５）増加した血清マトリックスの使用；
６）アッセイ添加剤としてのオリゴマーＩｇＧの含有；並びに
７）モノビオチン化捕捉及びモノジゴキシゲニン化トレーサー抗体の使用。
【００７１】
これらの対処は、相乗効果を提供した。
【００７２】
上の対処は、治療薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための、干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体アッセイに導く。
【００７３】
本明細書において報告する、干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体アッセイの一般的な原理を図２に示し、抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブについて例示する。
【００７４】
本明細書において報告するアッセイのセットアップを用いて、ＡＤＡアッセイの薬物耐性が、従来の抗薬物抗体アッセイと比較して、患者からの血清サンプル中で少なくとも１０倍増加した。同時に、偽陽性のアッセイ結果に導くリウマチ因子への感受性も減少した。
【００７５】
治療用の抗炎症抗体トシリズマブ（ＴＣＺ）は、インターロイキン６受容体に対する組換えヒト化モノクローナル抗体である。それは、関節リウマチの臨床試験において効果的であることが示されている（Ohsugi, Y. and Kishimoto, T., Expert Opin. Biol. Ther. 8 (2008) 669-681）。これらの試験において使用されるＡＤＡスクリーニング及び確認アッセイは、静脈内投薬計画を使用し、定常状態で達した、典型的なＴＣＺ血清濃度について十分な薬物耐性を示す。
【００７６】
しかし、異なる投与の経路、例えば皮下投与、より頻繁な投与、及び小児における新たな適応症は、定常状態でより高いＴＣＺ血清濃度をもたらしうる。
【００７７】
加えて、例えば、リウマチ因子（ＲＦ）は、しばしば、自己免疫疾患を伴う患者（例えば関節リウマチ患者など）において有意に増加する。ＲＦは、凝集されたガンマグロブリンへの優先的な結合を実証し、インビボでの免疫複合体のクリアランス機構に含まれる（Tatarewicz, S., et al., J. Immunol. Methods. 357 (2010) 10-16）。ＲＦは、優先的に五量体免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ抗体）アイソタイプであり（Artandi, S.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1991) 94-98）、多価及び培地親和性を伴い、治療用抗体の定常部に非特異的に結合することができ、ＡＤＡアッセイにおいて偽陽性結果に導く。例えば、親和性精製されたウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体をサンプル希釈物中に含めて、ＲＡサンプル中の交差反応性ＩｇＭ抗体干渉が克服された（例、Araujo, J., et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 55 (2011) 1041-1049を参照のこと）。
【００７８】
治療用抗体の血清サンプル中に存在するＲＦの非特異的結合が、ＡＤＡアッセイを実施する前に、オリゴマーヒトＩｇＧをサンプルに加えることにより防止することができることが見出された。加えられたオリゴマーＩｇＧは、ＲＦのための追加の標的を提供し、本明細書において報告するＡＤＡアッセイにおいてＲＦの干渉を最大に排除する。
【００７９】
以下において、本明細書において報告する干渉抑制ＡＤＡアッセイは、トシリズマブで処置された関節リウマチ患者の血清サンプル（ＴＣＺ）の分析により例示される。
【００８０】
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブに対する抗薬物抗体を検出するための従来の抗薬物抗体アッセイの薬物耐性を増加させるための対処は、以下である：
１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化ＴＣＺの濃度を増加させること（例、０．５μg/mlから１．５μg/mlまで）；
２）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの同時インキュベーション；
３）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの長期インキュベーション（例、１時間〜１６時間）；
４）リジン及び糖共役試薬の混合物の代わりの、リジン共役ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇ試薬だけの使用；
５）増加した血清マトリックス含量の使用；並びに
６）ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇのインキュベーションの前にサンプルへのオリゴマーヒトＩｇＧの添加。
【００８１】
薬物耐性
臨床サンプル中で検出される抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブの濃度は、０．５μg/ml又はそれより高く、しばしば、１μg/ml〜１０μg/mlの範囲中にある。
【００８２】
従来の抗薬物抗体アッセイの薬物耐性は、陽性対照ＡＤＡの所与の濃度が、カットポイントを上回り検出することができる最も高いＴＣＺ濃度を決定することにより評価された。表１は、結果の要約を提示する。
【００８３】
【表１】
2019207246.tif 000002
【００８４】
１２５ng/mLのＡＤＡ濃度が検出され、１０μg/mlのＴＣＺの存在において陽性とテストされた。
【００８５】
本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体アッセイでの薬物耐性を、陽性対照ＡＤＡの所与の濃度が、カットポイントを上回り検出することができる最も高いＴＣＺ濃度を決定することにより評価した。表２は、結果の要約を提示する。
【００８６】
【表２】
2019207246.tif 000003
【００８７】
本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおいて、３０ng/mLの非常に低いＡＤＡ濃度が検出され、１０μg/mlのＴＣＺの存在において陽性とテストされた。さらに、１００ng/mL及び３００ng/mLのＡＤＡ濃度は、それぞれ３０μg/ml及びさらに１００μg/mlの薬物抗体耐性を示す。
【００８８】
以前に使用された、トシリズマブについての二段階の従来の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡを用いて行われた同じ実験との比較において、干渉抑制アッセイを用いて少なくとも１０倍高い薬物耐性が明らかになった（また、３００ng/mLのＡＤＡ濃度についての図４を参照のこと）。
【００８９】
一価結合ビオチン及びジゴキシゲニンと捕捉及びトレーサー薬物抗体との、それぞれ１：１コンジュゲートを伴う、本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体アッセイの薬物耐性を、陽性対照ＡＤＡの所定の濃度が、カットポイントを上回り検出することができる、最も高いＴＣＺ濃度を決定することにより評価した。表３は、結果の要約を提示する。
【００９０】
【表３】
2019207246.tif 000004
【００９１】
本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおいて、２５０ng/mLのＡＤＡ濃度が検出され、８０μg/mlのＴＣＺの存在において陽性とテストされた。
【００９２】
干渉抑制：
１６の臨床血清サンプルが、Stubenrauchら（上記）において記載される通りの従来の抗薬物抗体アッセイにより分析された。結果を表４ａに要約する。
【００９３】
【表４】
2019207246.tif 000005
【００９４】
アッセイ原理の変更を伴わず、一連の対処が、本明細書において報告する通りの干渉抑制された薬物耐性の抗薬物抗体ＥＬＩＳＡを得るために取られた。
【００９５】
これらは以下である：
１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化ＴＣＺの濃度を増加させること（例、０．５μg/mlから１．５μg/mlまで）；
２）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの同時インキュベーション；
３）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの長期インキュベーション（例、１時間〜１６時間）；
４）リジン及び糖共役試薬の混合物の代わりの、リジン共役ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇ試薬だけの使用；
５）増加した血清マトリックス含量の使用；並びに
６）ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇのインキュベーションの前にサンプルへのオリゴマーヒトＩｇＧの添加。
【００９６】
本明細書において報告する干渉抑制アッセイを用いて得られた結果を表４ｂに示す。
【００９７】
【表５】
2019207246.tif 000006
【００９８】
上に概説する通りの対処の一部だけが取られた場合、干渉の低下が十分ではなく、依然として、リウマチ因子による干渉に対する感受性が存在し、偽陽性ＡＤＡアッセイ結果をもたらすことが見出されている。
【００９９】
例えば、以下の対処が取られた場合、
１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化ＴＣＺの濃度を増加させること（例、０．５μg/mlから１．５μg/mlまで）；
２）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの同時インキュベーション；
３）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの長期インキュベーション（例、１時間〜１６時間）；
４）リジン及び糖共役試薬の混合物の代わりの、リジン共役ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇ試薬だけの使用；並びに
５）増加した血清マトリックス含量の使用；
偽陽性のアッセイ結果に対する感受性の完全な低下を見ることはできない。比較データを表４ｃに示す。
【０１００】
【表６】
2019207246.tif 000007
【０１０１】
従来のＡＤＡアッセイ及び本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性のＡＤＡアッセイを用いた、ＴＣＺ処置ＲＡ患者からの２５８の異なる血清サンプルの比較評価では、１２サンプルにおいて同じ陽性結果が示された。従来のアッセイでは、２７のプラセボ患者が陽性と測定されたのに対し、本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性のＡＤＡアッセイでは４つだけであった。結論として、本明細書において記載する一連の対処及びＡＤＡアッセイ添加物としてのオリゴマーヒトＩｇＧの添加によって、従来のＡＤＡアッセイと比較し、増加した薬物耐性及び抑制されたＲＦによる干渉が付与された。
【０１０２】
上記のデータのサブセット分析を表７に示す。
【０１０３】
【表７】
2019207246.tif 000008
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１０４】
表８ａにおいて、ＴＣＺで処置されていない２７人のプラセボ患者についてのアッセイシグナルが示されている。ＴＣＺ処置誘導性ＡＤＡの非存在に起因して、この群における高いアッセイシグナルは、予想されておらず、潜在的な干渉を示しうる。
【０１０５】
【表８】
2019207246.tif 000009
試験関連カットポイント（ＣＰ）：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１０６】
両方のアッセイのシグナルパターンは、非常に異なっている：全ての２７のプラセボサンプルが、従来のＥＬＩＳＡを使用して陽性と決定されたのに対し、しかし、２７サンプルのうち４つだけが、本明細書において報告する干渉抑制ＥＬＩＳＡを用いて陽性と決定された。
【０１０７】
プラセボ処置患者に加えて、ＴＣＺ処置患者のサンプルが分析されている。表８ｂにおいて、ＴＣＺ処置前の患者についての結果が示されている。表８ｃにおいて、ＴＣＺ処置患者についての結果が示されている。
【０１０８】
【表９】
2019207246.tif 000010
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１０９】
【表１０】
2019207246.tif 000011
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１１０】
本明細書において報告するアッセイは、用いられる治療用抗体及び標的から独立した利益を提供する。これは、関節リウマチについて陽性と診断された患者のサンプルを使用して、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、抗ＩＬ１３Ｒα抗体、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、及び抗Ａｂｅｔａ抗体について、下表に示す。
【０１１１】
【表１１】
2019207246.tif 000012
【０１１２】
【表１２】
2019207246.tif 000013
【０１１３】
【表１３】
2019207246.tif 000014
【０１１４】
【表１４】
2019207246.tif 000015
【０１１５】
【表１５】
2019207246.tif 000016
【０１１６】
以下の実施例及び図を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。改変が、本発明の精神から逸脱することなく示される手順においてなされうることが理解される。
【０１１７】
実施例
材料及び方法
精製されたプールヒト免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）を、Stubenrauchら（Anal. Biochem. 390 (2009) 189-196）により記載される通りに調製した。簡単には、健康なドナーからのプールヒト血清を、Aerosil（二酸化ケイ素、１．５%（ｗ／ｖ））を用いて脱脂し、硫酸アンモニウム（２．０M）を用いて沈殿させた。ペレットをリン酸緩衝液中でホモジナイズし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した。この混合物を、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ７．０）により分離し、フロースルー中のＩｇＧを５．９３mg/mLまで濃縮し、ゲル濾過により精製した。
【０１１８】
ポリクローナル抗ジゴキシゲニン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Ｆａｂフラグメント）を、Roche Diagnostics GmbH（ドイツ、マンハイム）（カタログ番号１１６３３７１６）から入手した。陽性品質管理（ＱＣ）及び較正標準（ＣＳ）として使用されるポリクローナルウサギ抗ＴＣＺ抗体（０．５mg等量/mL）を、Stubenrauchら（上記）に記載される通りに調製した。
【０１１９】
個々のヒト血清サンプルは、Roche Diagnostics GmbH（ドイツ、ペンツベルク）の血清銀行により提供された。陰性対照用のプールヒト血清マトリクスは、TCS Biosciences Ltd.（英国、バッキンガム）により供給された。
【０１２０】
以下の試薬は、Roche Diagnostics GmbH（ドイツ、マンハイム）から入手した：２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）基質（カタログ番号１１６８４３０２−００１）、ＥＬＩＳＡ用の洗浄緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１M  ＫＨ２ＰＯ４、０．１M  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．３７M  ＮａＣｌ、０．０２７M  ＫＣｌ；ｐＨ７．０）／０．０５%ポリソルベート２０（Tween 20）（カタログ番号１１３３２４６５−００１）及びＥＬＩＳＡにおいて希釈緩衝液として使用される調整済みユニバーサル緩衝液（カタログ番号４７４２６７２）。全ての化学物質は分析グレードであった。
【０１２１】
ストレプトアビジンコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）は、MicroCoat Biotechnologie GmbH（ベルンリート）から得られた。コーティングされていないNunc 96マイクロウェルプレートは、Fisher Scientific GmbH（ドイツ、シュヴェーアテ）（カタログ番号４４２５８７）からであり、プレインキュベーションのために使用された。
【０１２２】
従来の抗薬物抗体アッセイ：
アッセイは室温で実施した。第１工程において、ＴＣＺ−Ｂｉを、シェーカー上で、４００rpmで１時間にわたり１００μLをインキュベートすることにより、０．５μg/mlの濃度でＳＡ−ＭＴＰに結合させた。プレインキュベーション溶液をＳＡ−ＭＴＰに加える前に、過剰の未結合ＴＣＺ−Ｂｉを、３回洗浄することにより除去した。コーティング手順と並行して、標準及びサンプルのプレインキュベーションは、別々のコーティングされていない９６ウェルプレート中で２通りに実施した。サンプル及び標準を、ウェル中で１０%血清マトリックスを用いて７５μLの容量まで希釈し（１：１０）、同じ容量のＴＣＺ−ＤＩＧと混合し、１時間のプレインキュベーション期間を開始した。ＴＣＺ−ＢｉコーティングされたＳＡ−ＭＴＰを、プレインキュベーションプレートの各ウェルから、コーティングされたＭＴＰのウェルに１００μLを移すことにより添加し、シェーカー上で、４００rpmで１時間にわたりインキュベートした。洗浄後、１００μL（１００mU/mL）の容量中のポリクローナル抗Ｄｉｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートをウェルに加え、１時間にわたりシェーカー上でインキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ触媒による発色反応を、１００μLのＡＢＴＳ溶液を加えることにより開始した。最大光学密度（ＯＤ）が約２．０であった時、通常２０〜３０分間以内に、呈色反応のシグナルを、４０５nm（参照、４９０nm）の波長で、ＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。同じアッセイを、確認試薬の存在において、確認試薬を伴わない同時測定を用いて実施した。得られたＯＤのデータは、サンプル濃度を算出するためのＷｉｅｍｅｒ−Ｒｏｄｂａｒｄ方法に従った非線形４パラメーター回帰曲線適合により標準検量曲線を作成するために使用した。
【０１２３】
テスト結果についてのカットオフポイントは、健康なボランティア及びＲＡを伴う患者からのヒトブランク血清サンプルの複数の分析からのアッセイシグナル（ＯＤ）の９５%ＣＩで設定した。スクリーニングテストの結果は、カットオフを上回る値で陽性と考えた。非スパイクサンプルと比べた、吸光度における＞２０%の減少は、陽性結果を示した。スクリーニングのカットオフは、参照抗体の６１．４ng/mLで決定した。アッセイ内及びアッセイ間の正確性は、それぞれ８４．８%〜９３．１%及び９１．３%〜９２．２%であった。アッセイ内及びアッセイ間の精度についての対応する値は１．８%〜２．０%及び６．８%〜８．０%であった。ＥＬＩＳＡの正確性は、アッセイの結果が真の値と一致した程度により定義した。正確性は、ヒト血清中にスパイクされたウサギポリクローナル抗ＴＣＺ陽性対照標準の測定濃度を、抗ＴＣＺの名目濃度と比較することにより決定した。高濃度（３６０ng当量/mL）及び低濃度（６０ng当量/mL）陽性対照標準を、アッセイ内の正確性を決定するために、２通りに測定された各陽性対象標準の６アリコート中、及び、アッセイ間の正確性を決定するために、２通りに測定された各陽性対照標準の３アリコート中で分析した。
【０１２４】
実施例１
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブのビオチン化
ａ）従来のビオチン化ＩｇＧの調製
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブを、緩衝液（１００mMリン酸カリウム緩衝液（以下において、Ｋ−ＰＯ４として表示する）、ｐＨ８．５）に対して透析した。その後、溶液を、５mg/mLのタンパク質濃度まで調整した。Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、１：５のモル比で抗体溶液に加えた。６０分後、反応を、Ｌ−リジンを加えることにより停止させた。余剰の標識試薬を、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．５を添加した５０mM  Ｋ−ＰＯ４に対する透析により除去した。ＴＣＺ−Ｂｉのアリコートに、６．５%スクロースを含め、−８０℃で保存した。
【０１２５】
ｂ）モノビオチン化ＩｇＧの調製
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブを、１００mM  Ｋ−ＰＯ４、ｐＨ８．５に対して透析し、その後、溶液を５mg/mLのタンパク質濃度まで調整した。Ｄ−ビオチノイル−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、１：１のモル比で抗体溶液に加えた。６０分後、反応を、Ｌ−リジンを加えることにより停止させた。余剰の標識試薬を、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．２を添加した２５ｍＭ  Ｋ−ＰＯ４に対する透析により除去した。混合物を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１００mM  Ｋ−ＰＯ４、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．２を伴う緩衝液に移し、ストレプトアビジンムテインセファロースを伴うカラムに適用した。非ビオチン化ＩｇＧはフロースルー中あり、モノビオチン化ＩｇＧは、１００mM  Ｋ−ＰＯ４、１５０mM  ＫＣｌ、１．５%ＤＭＳＯ、ｐＨ７．２を用いて溶出し、より高いビオチン化集団を含むビオチン化ＩｇＧを、１００mM  Ｋ−ＰＯ４、１５０mM  ＫＣｌ、２ｍＭ  Ｄ−ビオチン、ｐＨ７．２を用いて溶出する。モノビオチン化抗体を、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．５を添加した５０mM  Ｋ−ＰＯ４に対して透析した。アリコートに、６．５%スクロースを含め、−８０℃で保存した。
【０１２６】
実施例２
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブのジゴキシゲニン化
ａ）従来のジゴキシゲニン化ＩｇＧの調製
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブを、緩衝液（１００mMリン酸カリウム緩衝液（以下において、Ｋ−ＰＯ４として表示する）、ｐＨ８．５）に対して透析した。その後、溶液を、５mg/mLのタンパク質濃度まで調整した。ジゴキシゲニン３−Ｏ−メチル−εアミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ＤＭＳＯ中に溶解し、１：４のモル比で抗体溶液に加えた。６０分後、反応を、Ｌ−リジンを加えることにより停止させた。余剰の標識試薬を、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を添加した５０mM  Ｋ−ＰＯ４に対する透析により除去した。ジゴキシゲニン化ＴＣＺ（ＴＣＺ−Ｄｉｇ）は、６．５%スクロースを含むアリコートとして、−８０℃で保存した。
【０１２７】
ｂ）モノジゴキシゲニン化ＩｇＧの調製
抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブを、１００mM  Ｋ−ＰＯ４、ｐＨ８．５に対して透析し、その後、溶液を５mg/mLのタンパク質濃度まで調整した。ジゴキシゲニン３−Ｏ−メチル−εアミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、１：１のモル比で抗体溶液に加えた。６０分後、反応を、Ｌ−リジンを加えることにより停止させた。余剰の標識試薬を、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．５を添加した５０mM  Ｋ−ＰＯ４に対する透析により除去した。混合物を、ジゴキシゲニンに対する固定化モノクローナル抗体を伴うセファロースカラムに適用した。非ジゴキシゲニン化抗体は通過画分にあり、モノジゴキシゲニン化ＩｇＧは、穏やかな溶出緩衝液（Thermo Scientific、＃２１０１３）を用いて溶出し、より高いジゴキシゲニン化集団を含むジゴキシゲニン化抗体を、１Ｍプロピオン酸を用いて溶出する。モノジゴキシゲニン化抗体を伴う分画を、第１に２０mM  ＴＲＩＳ、２０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に対して、第２に５０mM  Ｋ−ＰＯ４、１５０mM  ＫＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した。アリコートに、６．５%スクロースを含め、−８０℃で保存した。
【０１２８】
実施例３
オリゴマー形態におけるヒトＩｇＧの生成
イオン交換クロマトグラフィーによりヒト血清から精製したヒトＩｇＧを、１００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８．４を含む１５０mMリン酸カリウム緩衝液に対して透析し、タンパク質溶液を、５０mg/mLタンパク質濃度まで濃縮した。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）をＤＭＳＯ中に溶解し、１：６（ＩｇＧ：ＤＳＳ）のモル比で抗体溶液に加えた。混合物を２５℃及びｐＨ８．４で撹拌を伴いインキュベートし、反応物を、分析用ゲル濾過カラム（例、ＴＳＫ４０００カラムを使用して）を用いて分析した。重合を、１４０分後に、最終濃度２０mMまでリジンを加えることにより停止させた。２５℃での４５分のインキュベーション後、オリゴマーヒトＩｇＧをゲル濾過（例、セファクリルＳ４００カラムを使用する）により分離し、低分子量画分を除去した。オリゴマーの組成物は、ＵＶ分光法、サイズ排除クロマトグラフィー、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により特徴付けた。オリゴマーヒトＩｇＧを分注し（１０．５mg/mL）、それを、イムノアッセイにおけるＡＤＡアッセイ添加剤（ＡＡＡ）としての使用のために、Universal緩衝液（カタログ番号４７４２６７２）を用いて５５．６μg/mlの濃度まで新たに希釈するまで、−６５℃で保存した。
【０１２９】
実施例４
較正標準及び品質管理サンプルの調製
較正標準（ＣＳ）及び品質管理サンプル（ＱＣ）のためのストック溶液を別々に調製した。ＣＳサンプルは、ＴＣＺの０．５mg/mLストック溶液を使用し、アッセイの日に新たに調製した。ヒトプール血清（ＨＰＳ）を用いた予備希釈後、結果として得られたＣＳ作業溶液を、１００%  ＨＰＳを用いて段階的に希釈し、アッセイ使用前に、１，０００；５００；２５０；１２５；６２．５；３１．３；及び１５．６ng/mLのキャリブレータ濃度をもたらした。陰性対照は１００%  ＨＰＳであった。アッセイにおけるプレインキュベーション工程のために、ＣＳサンプルを１：１０に希釈し、１０%の血清濃度及び１００ng/mL〜１．５６ng/mLのアッセイ濃度範囲に調整した。
【０１３０】
使用されたＱＣストックサンプルは、１００%ヒトプール血清中で作られ、単一使用のアリコートとして−２０℃で保存した。３つの別々のＱＣサンプルを調製し、高（７５０ng/mL）、中程度（４００ng/mL）、及び低（５０ng/mL）の非希釈血清濃度を表すストック濃度で保存した。アッセイにおけるプレインキュベーション工程のために、ＱＣサンプルを、１０%の血清濃度に達するように、捕捉／検出溶液中で新たに１：１０希釈した。２５ng/mLでのアッセイの典型的なカットポイントでの第４のＱＣサンプルをさらに使用した。
【０１３１】
実施例５
ＡＤＡスクリーニング及び確認アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡを、トシリズマブ（ＴＣＺ）に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）のスクリーニング及び確認の両方のために使用した（Stubenrauch, K., et al., Clin. Ther. 32 (2010) 1597-1609を参照のこと）。この方法の原理は、ＴＣＺ−Ｄｉｇ及びＴＣＺ−Ｂｉとの複合体におけるＡＤＡの捕捉であり、後者は、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート上での固定化に導く。ＳＡ−ＭＴＰに結合したＴＣＺ−Ｂｉ／ＡＤＡ／ＴＣＺ−Ｄｉｇ複合体は、抗Ｄｉｇ−ＨＲＰ酵素コンジュゲート抗体により検出された。薬物耐性抗薬物抗体アッセイの原理を図１に示す。ＡＤＡアッセイの添加剤としてのオリゴマーＩｇＧの包含は、図２に示す通りの干渉抑制された抗薬物抗体アッセイに導く。ポリクローナル抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、基質ＡＢＴＳの呈色反応を触媒する。色の強度は、分析物の濃度に比例する。
【０１３２】
スクリーニングアッセイは、室温で実施した。試薬及び血清サンプルを、Universal緩衝液（カタログ番号４７４２６７２）を用いて希釈し、全ての洗浄工程を、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５%ポリソルベート２０（Tween 20）（カタログ番号１１３３２４６５−００１））を用いて３回実施した（１ウェル当たり３００μL）。インキュベーションは、５００rpmでのマイクロタイタープレートシェーカー（ＭＴＰシェーカー）上で、震盪下で実施した。テストサンプル、ＱＣ及びＣＳサンプルは、捕捉抗体ＴＣＺ−Ｂｉ及び検出抗体ＴＣＺ−Ｄｉｇを用いて、一晩（１６時間まで）インキュベートした。プレインキュベーションマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の各ウェルに、オリゴマーヒトＩｇＧ  ＡＤＡアッセイ添加剤（ＡＡＡ）を伴う、１．６６７μg/mlのＴＣＺ−Ｂｉ及び１．６６７μg/mlのＴＣＺ−Ｄｉｇを含む捕捉／検出溶液の２２５μLを添加し、その後、それぞれのサンプルの２５μLを加えた。結果として得られるＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇの濃度は、各々１．５μg/mlであり、オリゴマーヒトＩｇＧは５０μg/mlの濃度を有していた。添加されたＭＴＰは、蒸発を防止するために被覆し、一晩インキュベートした。プレインキュベーションプレートの各ウェルの１００μLの２通りを、ストレプトアビジンコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）のウェルに移し、被覆し、１時間にわたりインキュベートした。
【０１３３】
洗浄後、２５mU/mLの濃度を伴うポリクローナル抗Ｄｉｇ  Ｆａｂ−ＨＲＰ複合体を、各ウェルに１００μLの容量で加え、１時間にわたりインキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳ調製済み溶液を、各ウェルに１００μLアリコートで加え、約１０〜１５分間にわたり、振盪しながらインキュベートした。発色反応のシグナルを、４０５ｎｍ波長（リファレンス波長：４９０nm）でＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。各々の血清サンプルの吸光度値を３通りに測定した。最も高い標準は、１．８〜２．２の間の任意単位（ＡＵ）の光学密度（ＯＤ）に達しなくてはならない。得られたＯＤのデータを、サンプル濃度を算出するために、非線形４パラメーター適合「Ｗｉｅｍｅｒ  Ｒｏｄｂａｒｄ」により標準検量曲線を生成するために使用した。サンプルは、濃度の回収が、特異性カットポイント未満である場合、ＡＤＡに陽性として確認された。
【０１３４】
特異性カットポイントの評価を、１つのＭＴＰについて２通りに、関節リウマチ患者の３２の個々のブランクヒト血清サンプルの分析により実施した。カットポイントによって、それを上回る場合、サンプルがＡＤＡスクリーニングアッセイにおけるＡＤＡの存在について潜在的に陽性として定義されるシグナルが特定される。データの非正規性に起因して、９５%パーセンタイルを伴う非パラメトリックアプローチが、複製プレート上のカットポイントの平均値に基づくカットポイントの算出のために適用された。
【０１３５】
関節リウマチ患者の３２の個々のヒトブランク血清サンプルの重複測定からＡＤＡアッセイのカットポイントを決定するために行った実験によって、約０．００９の標準偏差（ＳＤ）を伴う３つの異なるプレート上での約０．０２６の平均ＡＵが明らかになった。対応する変動係数（ＣＶ）は、それぞれ２３．８%；２０．０%；及び１９．０%であった。これらのデータセットに基づき、ＮＦ＝１．６９０５の正規化係数が得られ、それは、アッセイ定量化を通して使用され、プレート特異的なカットポイントに適用される（プレート特異的なカットポイント［ＡＵ］＝シグナル［ＡＵ］（陰性対照）×ＮＦ）。
【０１３６】
スクリーニングＡＤＡアッセイの定量化については、１．５６ng/mL〜１００ng/mLのアッセイ濃度範囲を伴う７つの較正サンプル及びブランクサンプルを伴う５つの独立した検量曲線製剤を、１つのプレート上で２通りに測定した。アッセイ内での定量化の実行は、単一のプレート上で２通りに測定された４つのＱＣサンプルの各々を伴う５つの複製物（５つの別々のバイアル）を用いて実施した。２通りに測定された全てのＱＣサンプルのアッセイ間の定量化データが、４つの異なる日に少なくとも２人のオペレーターにより実施される７つの独立したテストの実行から得られた。
【０１３７】
干渉抑制ＥＬＩＳＡの典型的な較正曲線を図３に示す。サンプルの二重測定の精度を定量化実験の間に評価し、そのＣＶは１５%を超えなかった。干渉抑制ＡＤＡ  ＥＬＩＳＡのアッセイ内及びアッセイ間の精度及び正確性の値を表５に要約する。
【０１３８】
【表１６】
2019207246.tif 000017
【０１３９】
決定されたアッセイ内精度は、２５ng/mLのカットポイントＱＣを含む、全てのＱＣについて＜５%であった。決定されたアッセイ内の正確性は、９１．１%〜１０２%の範囲中にあったが、全てのカットポイントＱＣサンプルは陽性とテストされた。逆算されたＱＣについてのアッセイ間の精度は、全てのＱＣについて＜６%であった。決定されたアッセイ間の正確性は、高、中、低ＱＣについて９２．８%〜１０５%であった。全てのカットポイントのＱＣ測定値が、ＡＤＡ陽性を提供した。
【０１４０】
潜在的な高用量フック効果は、２５，０００ng/mL〜６．１ng/mLのアッセイ濃度範囲内の陽性対照サンプルでの連続滴定（２：１）により評価した。アッセイ範囲内のＡＤＡ濃度の回復は、７７．９%と９８．９%の間であった。潜在的なマトリックス効果の分析のために、１１の個々の正常ヒト血清サンプルを、高及び低用量ＱＣ、即ち、１００%血清中の５０及び７５０ng/mLで、陽性対照ＡＤＡを用いてスパイクし、定量化した。また、ＱＣサンプルも同じプレート上で分析した。低及び高ＡＤＡ濃度の回復は、１１１%（範囲：１０４〜１１７%）及び１１１%（範囲：１０７〜１１７%）であり、干渉抑制ＡＤＡ  ＥＬＩＳＡにおいてマトリックス効果がないことを示した。
【０１４１】
薬物耐性は、最も高いＴＣＺ濃度を決定することにより評価したが、その濃度では、陽性対照ＡＤＡの所与の濃度が、カットポイントを上回り検出することができる。表２は、完全なデータセットの要約を提示する。
【０１４２】
【表１７】
2019207246.tif 000018
【０１４３】
臨床サンプル中で検出される抗ＩＬ６Ｒ抗体トシリズマブの濃度は、０．５μg/ml又はそれより高く、しばしば、１μg/ml〜１０μg/mlの範囲中にある。３０ng/mLの非常に低いＡＤＡ濃度が検出され、１０μg/mlのＴＣＺの存在において陽性とテストされた。さらに、１００ng/mL及び３００ng/mLのＡＤＡ濃度は、それぞれ３０μg/ml及びさらに１００μg/mlの薬物抗体耐性を示す。以前に使用された、トシリズマブについての二段階の従来のＡＤＡ  ＥＬＩＳＡを用いて行われた同じ実験によって、干渉抑制アッセイを用いて少なくとも１０倍高い薬物耐性が明らかになった（３００ng/mLのＡＤＡ濃度についての図４を参照のこと）。
【０１４４】
確認アッセイにおける過剰な遊離薬物として使用されたＴＣＺの濃度は、薬物干渉実験において得られたデータセットに基づいていた。サンプル中の高レベルのＡＤＡを抑制することができるＴＣＺ濃度を評価するために、陽性対照サンプルの４つの異なる濃度（１００%血清中の１，０００；５００；２５０；８３．３ng/mL）を、各々、漸増濃度のＴＣＺ（１００%血清中の０；１６；３１；６３；１２５；２５０μg/ml）とインキュベートした。陽性対照ＡＤＡの高濃度での測定シグナルの少なくとも９５%（５%未満のシグナル回復に相当する）を阻害するＴＣＺ濃度は、ＴＣＺの２５μg/mlと決定された。
【０１４５】
後の試験中のテスト段階の間に試験サンプル中のＡＤＡの親和性の差に起因する偽陰性の可能性を低下させるために、決定された値の２倍高い過剰な遊離薬物濃度を、さらなる評価のために使用した（即ち、１００%血清中の４００μg/mlに相当する４０μg/mlのアッセイ濃度）。
【０１４６】
特定のＡＤＡを確認するために必要とされる最小のシグナル阻害値は、関節リウマチ患者の１６の個々のブランクヒト血清サンプルとＴＣＺとのプレインキュベーションにより決定され、１つのテスト実行において２通りに分析された。分析は、４００μg/mlの遊離ＴＣＺを伴い、又は伴わずに実施された。遊離ＴＣＺの添加は、平均１４．１%（−１１．５%から３４．８%の範囲及び１１．２%のＳＤ）だけアッセイシグナルを低下させることが見出されている。９９．９%の信頼区間（平均値＋３．０９ＳＤ）を適用することによって、ブランク血清サンプルについての４９%の最小シグナル低下がもたらされた。この計算に基づき、サンプルは、シグナルが、遊離薬物の非存在下におけるそれと比較した際に、過剰の遊離薬物の存在において多く４９%を上回り減少した場合、陽性確認と評価された。参照サンプルとして、過剰ＴＣＺを伴わない、対応するサンプルが使用された。確認アッセイにおけるシグナル阻害の再現性を実証するために、高、中、低の陽性ＱＣ濃度を伴う血清サンプルを、事前に定められた濃度で、過剰のＴＣＺを伴い、及び伴わず、３回分析した。
【０１４７】
ＴＣＺについての干渉抑制ＡＤＡアッセイは、１００%血清中のＡＤＡキャリブレータの１，０００ng/mL〜１５．６ng/mLの測定範囲を有していた。アッセイ内の精度は、全ての品質管理について５%未満であり、アッセイ内の正確性は、９１．１%〜１０２%であった。アッセイ間の精度及び正確性は、それぞれ６%未満及び９２．８%〜１０５%であった。
【０１４８】
アッセイの定量化によって、フック及びマトリックス効果が排除された。
【０１４９】
干渉抑制ＡＤＡアッセイの薬物耐性は、以前のバージョンよりも少なくとも１０倍高いことが分かる。
【０１５０】
確認アッセイは、サンプルが、過剰な遊離薬物、即ち、ＴＣＺを伴わず、及び伴い、並行して分析されたことを除き、本質的に、スクリーニングアッセイについて前に記載された通りに実施された。確認の捕捉／検出溶液には、サンプルの添加後に４０μg/ml  ＴＣＺの最終アッセイ濃度を達成するために、追加の過剰ＴＣＺ（４４．４μg/ml）を伴う、捕捉／検出溶液の同じ用量が含まれた。過剰薬物を伴う確認条件下でのパーセントシグナル阻害の算出は、以下の等式を使用して行われた：
%シグナル阻害＝１００×（１−（［ＡＵ］薬物前処理サンプル／［ＡＵ］未処理サンプル））
【０１５１】
実施例６
臨床サンプルへの干渉抑制ＡＤＡアッセイの適用
１）ビオチン化及びジゴキシゲニン化ＴＣＺの濃度を増加させること（例、１．５μg/mlまで）；２）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの同時インキュベーション；３）血清サンプルとＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇとの長期インキュベーション（例、一晩）；４）リジン及び糖共役試薬の混合物の代わりの、リジン共役ＴＣＺ−Ｂｉ及びＴＣＺ−Ｄｉｇ試薬だけの使用；並びに、増加した血清マトリックス（例、５%の代わりに１０%）の使用からなる薬物耐性を増加させるための対処は、１２／２８から２５／２８へのＡＤＡ陽性の増加をもたらした。
【０１５２】
１６の臨床血清サンプルを、一連の３つの異なるＡＤＡアッセイにより分析した：従来のＡＤＡアッセイ、本明細書において報告する干渉抑制ＡＤＡアッセイ（オリゴマーヒトＩｇＧを加えない）、及び本明細書において報告する干渉抑制ＡＤＡアッセイ（オリゴマーヒトＩｇＧを加える）。結果を表６に要約する。１６サンプルのうち、１５が、ＡＤＡアッセイのバージョンにおいて陽性とテストされ、ここで、対処１から５だけが取られているのに対し、８／１６だけが、従来の、並びに本明細書において報告する干渉抑制された薬物耐性ＡＤＡアッセイにおいて陽性とテストされ、ここで、対処１から６が取られており、８サンプル中７つにおいて同一の結果を伴った。同一の結果を伴う、これらの７のサンプルは、サンプル中の低ＲＦ濃度により、及び／又はベースラインで特徴付けられた。全ての７つのサンプルが、真のトシリズマブ特異的なＡＤＡを示しているトシリズマブのＦａｂ部分に結合したＩｇＧアイソタイプのＡＤＡを含んだ。７つのサンプルのうち３つが、また、ＩｇＭアイソタイプＡＤＡを有していたが、しかし、それは、また、Ｆａｂ部分に結合していた。対照的に、残りのサンプルの大部分が、主に、トシリズマブの定常Ｆｃ部分に結合したＩｇＭアイソタイプのＡＤＡを有していた。これらのサンプルは、また、ＲＦの高い、即ち、＞１，０００U/mLの濃度を含んでいた。
【０１５３】
【表１８】
2019207246.tif 000019
【０１５４】
実施例５において報告するＡＤＡイムノアッセイを使用し、ベースラインで、及びトシリズマブの投与後に採取した、関節リウマチ患者からの１４８の異なる血清サンプルを分析した。干渉抑制ＡＤＡアッセイを用いた分析の結果を、従来のＡＤＡイムノアッセイを用いた分析により得られた結果と比較した。より詳細な分析のために、ＡＤＡアイソタイプ及び結合領域、並びに臨床事象に関する追加情報を伴う１８人の異なる患者からの（１４８のうちの）合計９２の血清サンプルを選択した。患者は、彼らが以下の基準の少なくとも１つ満たした場合に選択された：１）任意の時点でのＡＤＡ陽性免疫応答；２）高いＴＣＺ血清濃度；３）臨床反応（例えば注入関連、過敏症、又はアナフィラキシーなど）。ＡＤＡの結合領域及びアイソタイプの分析は、以前に記載された通りに（Stubenrauch, K., et al., Anal. Biochem. 390 (2009) 189-196）、バイオセンサーイムノアッセイを用いて実施した。簡単には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイのセットアップでは、ＡＤＡの差動結合分析のための、完全長抗体並びにその定常（Ｆｃ）及び抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントの固定化により、単一のバイオセンサーチップ上で４つの平行フローセルが使用された。異なるアイソタイプのポリクローナルヒトＡＤＡを模倣する陽性対照標準コンジュゲートは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍ、ＩｇＧ、又はＩｇＥへのＴＣＺに対するポリクローナルウサギ抗体をコンジュゲートさせることにより得られた（WO 2008/061684を参照のこと）。リウマチ因子（ＲＦ）アッセイは、Siemens Healthcare Diagnostics（Newark, DE, USA）からのＲＦ試薬を使用して、Siemens BN II比濁計で実施した。簡単には、ヒト免疫グロブリン及び羊からの抗ヒトＩｇＧからなる免疫複合体を用いてコーティングされたポリスチレン粒子は、ＲＦを含むサンプルと混合した場合に凝集する。これらの凝集体は、サンプルを通過した光のビームを散乱する。散乱光の強度は、サンプル中のそれぞれのタンパク質の濃度に比例する。結果は、公知の濃度の標準との比較により評価される。
【０１５５】
本明細書において報告する従来のアッセイ及び干渉抑制された薬物耐性ＡＤＡアッセイを用いた、ＴＣＺ処置されたＲＡ患者からの２５８の異なる血清サンプルの比較評価では、１２のサンプルにおいて同じ陽性結果が示された。従来のアッセイでは、２７のプラセボ患者が測定されたのに対し、干渉抑制された薬物耐性ＡＤＡアッセイは、本明細書において報告する通りである４。結論として、本明細書において報告する一連の対処及びＡＤＡアッセイの添加物としてのオリゴマーヒトＩｇＧの添加によって、増加した薬物耐性が付与され、従来のＡＤＡアッセイと比較し、ＲＦによる干渉が抑制された。
【０１５６】
上記データのサブセット分析を以下の表７に示す。
【０１５７】
【表１９】
2019207246.tif 000020
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１５８】
表８Ａには、ＴＣＺで処置されていない２７人のプラセボ患者についてのアッセイシグナルをバー及び数字として示す。ＴＣＺ処置誘導性のＡＤＡの非存在に起因して、この群における高いアッセイシグナルは予想されず、潜在的な干渉を示しうる。
【０１５９】
【表２０】
2019207246.tif 000021
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１６０】
両方のアッセイのシグナルパターンは、非常に異なっている：全ての２７のプラセボサンプルが、従来のＥＬＩＳＡを使用して陽性と決定されたのに対し、２７サンプル中の４つだけが、本明細書において報告する干渉抑制ＥＬＩＳＡを用いて陽性と決定された。
【０１６１】
プラセボ処置された患者に加えて、ＴＣＺ処置された患者のサンプルが分析されている。表８ｂには、ＴＣＺ処置前の患者についての結果を示す。表８ｃには、ＴＣＺ処置された患者についての結果を示す。
【０１６２】
【表２１】
2019207246.tif 000022
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１６３】
【表２２】
2019207246.tif 000023
試験関連ＣＰ：０．２１５（従来のＥＬＩＳＡ）；０．０５８（干渉抑制ＥＬＩＳＡ）；＋：陽性のＥＬＩＳＡ結果；−：陰性のＥＬＩＳＡ結果
【０１６４】
両方のアッセイを用いたシグナルパターンは、類似していない：２５人の患者が、従来のＥＬＩＳＡを使用して陽性と決定されたのに対し、１０人の患者だけが、本明細書において報告する干渉抑制ＥＬＩＳＡを使用して陽性と決定された。
【０１６５】
実施例７
捕捉試薬及びトレーサー試薬の誘導体化の種類の影響
モノラベリング対マルチラベリング
ビオチン化及びジゴキシゲニン化ＴＣＺの濃度を増加させる（例、１．５μg/mlまで）ことからなる、薬物耐性を増加させるための対処；これによって、粘着性のジゴキシゲニンにより、より高いバックグラウンドが起こりうる；より高いカットポイントに起因する悪化した薬物耐性に注意するために、モノビオチン化及びモノジゴキシゲニン化によって、より高い捕捉及びトレーサー濃度の存在により、より低いバックグラウンドシグナルが与えられる。
【０１６６】
サンドイッチＥＬＩＳＡを、トシリズマブ（ＴＣＺ）に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）のスクリーニング及び確認の両方のために使用した（Stubenrauch, K., et al., Clin. Ther. 32 (2010) 1597-1609を参照のこと）。この方法の原理は、ＴＣＺ−Ｄｉｇ（モノ）及びＴＣＺ−Ｂｉ（モノ）との複合体におけるＡＤＡの捕捉であり、後者は、ストレプトアビジンでコーティングされたプレート上での固定化に導く。ＳＡ−ＭＴＰに結合したＴＣＺ−Ｂｉ／ＡＤＡ／ＴＣＺ−Ｄｉｇ複合体（一晩のインキュベーション）は、抗Ｄｉｇ−ＨＲＰ酵素コンジュゲート抗体により検出された。薬物耐性抗薬物抗体アッセイの原理を図１に示す。ＡＤＡアッセイの添加剤としてのオリゴマーＩｇＧの含有は、図２に示す通りの干渉抑制された抗薬物抗体アッセイに導く。ポリクローナル抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、基質ＡＢＴＳの呈色反応を触媒する。色の強度は、分析物の濃度に比例する。
【０１６７】
スクリーニングアッセイは、室温で実施した。試薬及び血清サンプルを、Universal緩衝液（カタログ番号４７４２６７２）を用いて希釈し、全ての洗浄工程を、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５%ポリソルベート２０（Tween（登録商標）20）（カタログ番号１１３３２４６５−００１））を用いて３回実施した（１ウェル当たり３００μL）。インキュベーションは、５００rpmでのマイクロタイタープレートシェーカー（ＭＴＰシェーカー）上で、震盪下で実施した。テストサンプル、ＱＣ及びＣＳサンプルは、捕捉抗体ＴＣＺ−Ｂｉ及び検出抗体ＴＣＺ−Ｄｉｇを用いて、一晩（１６時間）インキュベートした。プレインキュベーションマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の各ウェルを、オリゴマーヒトＩｇＧ  ＡＤＡアッセイ添加剤（ＡＡＡ）を伴う、１．６６７μg/mlのＴＣＺ−Ｂｉ（モノ）及び１．６６７μg/mlのＴＣＺ−Ｄｉｇ（モノ）を含む捕捉／検出溶液の２２５μLを添加し、その後、それぞれのサンプルの２５μLを加えた。結果として得られるＴＣＺ−Ｂｉ（モノ）及びＴＣＺ−Ｄｉｇ（モノ）の濃度は、各々１．５μg/mlであり、オリゴマーヒトＩｇＧは５０μg/mlの濃度を有していた。添加されたＭＴＰは、蒸発を防止するために被覆し、一晩インキュベートした。プレインキュベーションプレートの各ウェルの１００μLの２通りを、ストレプトアビジンコーティングされたマイクロタイタープレート（ＳＡ−ＭＴＰ）のウェルに移し、被覆し、１時間にわたりインキュベートした。
【０１６８】
洗浄後、２５mU/mLの濃度を伴うポリクローナル抗Ｄｉｇ  Ｆａｂ−ＨＲＰ複合体を、各ウェルに１００μLの容量で加え、１時間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳ調製済み溶液を、各ウェルに１００μLアリコートで加え、約１０〜１５分間、振盪しながらインキュベートした。色生成反応のシグナルを、４０５nm波長（参照波長：４９０nm）でＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。各血清サンプルの吸光度値を３通りに測定した。最も高い標準は、１．８〜２．２の間の任意単位（ＡＵ）の光学密度（ＯＤ）に達しなくてはならない。得られたＯＤのデータを、サンプル濃度を算出するために、非線形４パラメーター適合「Ｗｉｅｍｅｒ  Ｒｏｄｂａｒｄ」により標準検量曲線を生成するために使用した。サンプルは、濃度の回収が、特異性カットポイント未満である場合、ＡＤＡに陽性として確認された。
【０１６９】
カットポイントを決定するために、ＲＤ（リウマチ性疾患）を伴う患者の３５の未処理の血清を、両方のアッセイにおいて測定した。図５及び６に示す通り、ＴＣＺ−Ｂｉ（モノ）及びＴＣＺ−Ｄｉｇ（モノ）を伴う干渉抑制された抗薬物抗体ＥＬＩＳＡと比較し、干渉抑制された抗薬物抗体ＥＬＩＳＡにおける血清のシグナル間の変動は高かった。
【０１７０】
さらなる評価のために、ＴＣＺ処置されたＲＡ患者からの７７の異なる血清サンプルを、干渉抑制ＡＤＡアッセイの両方の変異体を用いて分析した。全てのサンプルが、ＴＣＺ処置の前（ベースライン）に採取されたため、ＴＣＺに対するＡＤＡは存在しないはずである。カットポイントよりも高いシグナルは、処置薬物（ＴＣＺ）に対するＡＤＡと関係のない推定（偽陽性）を示しうる。
【０１７１】
マルチラベルＴＣＺを用いたアッセイ（図７）では、モノラベルＴＣＺを用いたアッセイ（図８）よりも多くのシグナル変動が示された。見て分かる通り、この変動はシステムの体系的セットアップではないが（単純に、Ｙ軸上でのシフトでありうる）、しかし、それは、得られたシグナルのバンド幅における増加である。これらのアッセイ特異的なカットポイントを使用し、干渉抑制された薬物耐性ＡＤＡアッセイ（モノ）におけるほぼ全てのサンプルが、カットポイントを下回っている。マルチアッセイにおいて測定されたほとんど全てのサンプルが、カットポイントを上回っている。
【図１】
2019207246.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄腫患者のサンプル中の薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出のための方法であって、
ａ）酵素結合免疫吸着アッセイにおいて、０．５μｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度を有する捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体を提供する工程、
ｂ）サンプルを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体と０．５〜２４時間にわたり同時にインキュベートする工程、
ｃ）薬物抗体を、各々、単一のリジン残基を介して１回だけ誘導体化し、薬物抗体及びビオチンの１：１コンジュゲートである捕捉薬物抗体、並びに、薬物抗体及びジゴキシゲニンの１：１コンジュゲートであるトレーサー薬物抗体を得る工程、
ｄ）１%血清／血漿又はそれ以上を含むサンプルを提供する工程、
ｅ）オリゴマーヒトＩｇＧを、捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体とのインキュベーションの前にサンプルに加える工程、並びに
ｆ）捕捉薬物抗体及びトレーサー薬物抗体との複合体中の抗薬物抗体を検出する工程を含む、方法。
【請求項２】
サンプルが、抗薬物抗体及びリウマチ因子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
薬物抗体が、抗炎症抗体である、請求項１〜２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
抗炎症抗体が、関節リウマチ、又は若年性関節炎、又は変形性関節症、又はキャッスルマン病、又はメサンギウム増殖性糸球体腎炎の処置のための抗体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
薬物抗体が、抗癌抗体である、請求項１又は２のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
抗癌抗体が、骨髄腫又は形質細胞腫の処置のための抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
薬物抗体が、抗ＩＬ６Ｒ抗体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
抗ＩＬ６Ｒ抗体が、トシリズマブである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗ＩＬ６Ｒ抗体（薬物抗体）の有効量を投与された個体において、請求項１〜８のいずれか一項記載のアッセイを用いて抗抗ＩＬ６Ｒ抗体抗体（抗薬物抗体）の存在を決定することを含む、骨髄腫を有する個体を処置するためのデータを提供する方法。
【外国語明細書】
2019207246000001.pdf