(57)【要約】      （修正有）【課題】電気パルスの列の適用により癌細胞などの異常細胞を選択的に処置するためのシステム及び方法の提供。【解決手段】パルス長及び連続パルス間の遅延は、細胞内膜電位に対する効果をもたらすように最適化される。本システム及び方法に基づく療法は、２つの処置領域、すなわち、異常細胞が非選択的に死滅させられる電極を包囲するアブレーション領域、及び標的細胞が細胞内膜電位に対する効果により選択的に死滅させられる、アブレーション領域を包囲する選択的処置領域をもたらす。結果として、健康な組織を残しながら、腫瘍辺縁内の浸潤腫瘍細胞が効果的に処置され得る。本システム及び方法は、固形腫瘍が形成され、腫瘍を包囲する顕微鏡的疾病からの再発の可能性がある様々な癌を治療するのに有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を選択的に処置する方法であって、
連続パルス間に遅延を伴う複数の電気パルスを組織に印加することを含み、各パルスの長さ及び連続パルス間の前記遅延は、第１の処置領域及び第２の処置領域を作り出すように最適化され、
前記第１の処置領域内で、癌細胞及び非癌細胞は死滅させられ、前記第２の処置領域内で、癌細胞が死滅させられるか、または阻害される一方で、非癌細胞は残される、前記方法。
【請求項２】
前記印加は、インビトロで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記印加は、インビボで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記印加は、エクスビボで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の処置領域内で、癌細胞は、細胞分裂の減速または停止によって阻害される、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の処置領域内で、癌細胞は、遊走の減速または停止によって阻害される、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の処置領域内で、癌細胞は、血液及び栄養素の輸送の低減によって阻害される、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の処置領域内で、癌細胞及び非癌細胞は、壊死によって死滅させられる、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の処置領域内で、癌細胞は、アポトーシスによって死滅させられる、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１０】
いくつかの癌細胞及びいくつかの非癌細胞は、前記第１の処置領域内で死滅させられる、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１１】
いくつかの癌細胞は、前記第２の処置領域内で死滅させられるか、または阻害され、いくつかの非癌細胞は、前記第２の処置領域内で残される、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１２】
癌細胞及び非癌細胞の両方は、それらの膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、前記第１の処置領域内で死滅させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞は、それらの核膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、前記第２の処置領域内で死滅させられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
連続パルス間の前記遅延は、各パルスの前記長さよりも大きい、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１５】
連続パルス間の前記遅延は、各パルスの前記長さの分数である、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１６】
各パルスの前記長さが、前記癌細胞の細胞膜の充電時間＋前記癌細胞の核膜の放電時間に等しい一方で、連続パルス間の前記遅延は、前記癌細胞の前記細胞膜の前記充電時間に等しい、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌細胞の前記細胞膜の前記充電時間及び前記癌細胞の前記核膜の前記放電時間は、数値モデリングにより決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記パルス列は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、または正弦波である電界波形を含む、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項１９】
前記電界波形は、単極性または双極性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記電界波形は、第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号であり、前記第２の周波数調波は、前記第１の周波数調波よりも高い周波数を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記電界波形は、連続してマイクロ秒オーダのパルスと交互になったナノ秒オーダのパルスを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記電界波形は、非対称である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記電界波形は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内の搬送波周波数を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記波形の搬送波周波数またはパルス持続時間は、前記癌細胞のクロスオーバ周波数に基づく、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
各パルスの前記長さ及び連続パルス間の前記遅延は、前記癌細胞の物理的な核対細胞質のサイズ比に基づき最適化される、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項２６】
前記パルスは、双極性方形波であり、各パルスの前記長さは、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒である、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を選択的に処置する方法であって、
細胞を含有する物質に処置として複数の電気パルスを印加することを含み、前記パルスは、双極性方形波であり、各パルスの長さは、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒であり、パルス間の遅延は、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒であり
一種類の細胞が前記複数の電気パルスによって処置され、別の種類の細胞は、処置されない、前記方法。
【請求項２８】
処置された細胞は、死滅させられ、未処置の細胞は、死滅させられていない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記印加は、インビトロで実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記印加は、インビボで実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記印加は、エクスビボ内で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を選択的に処置する方法であって、
細胞を含有する物質に複数の電気パルスを含むパルス列を印加することを含み、前記パルス列は、第１の周波数調波と、第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する第２の周波数調波とを含む、重畳二峰性信号である電界波形を有する、前記方法。
【請求項３４】
前記パルス列は、選択された種類の細胞を選択的に死滅させ、別の種類の細胞を残す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記印加は、インビトロで実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記印加は、インビボで実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記印加は、エクスビボで実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
細胞を選択的に処置するシステムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記電極に連結され、かつ複数の電気パルスを含むパルス列を印加するように構成される、電圧パルス発生器であって、前記パルス列は、第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号である電界波形あり、前記第２の周波数調波は、前記第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する、電圧パルス発生器と、を備える、前記システム。
【請求項４０】
前記電圧パルス発生器は、前記パルス列が選択された種類の細胞を選択的に死滅させ、別の種類の細胞を残すように、前記二峰性信号を選択するように構成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記電圧パルス発生器は、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列される、ソリッドステート切り替えデバイスを備える、請求項３９または４０に記載のシステム。
【請求項４２】
細胞を選択的に処置する方法であって、
選択された生物物理学的細胞下構造を有する細胞のみを死滅させるのに十分な様式で、細胞を含有する物質に電気パルスを送達することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記選択された生物物理学的細胞下構造を有する前記細胞は、核を有し、前記細胞は、前記細胞の前記核を破壊することによって死滅させられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記選択された生物物理学的細胞下構造を有する前記細胞は、選択された核対細胞質の面積比を有する、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞を選択的に処置する方法であって、
細胞を含有する物質に複数の電気パルスを印加することを含み、前記複数の電気パルスは、一種類の細胞の標的細胞を処置し、別の種類の細胞の非標的細胞を残すように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、前記方法。
【請求項４６】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記印加は、インビトロで実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記印加は、インビボで実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記印加は、エクスビボで実施される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
癌細胞が処置され、正常な細胞が残される、選択的方法である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
より悪性の種類の癌細胞が処置され、あまり侵攻性ではない種類の癌細胞は残される、緩和方法である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
悪性の細胞を選択的に焼灼する方法であって、
組織領域内に存在する悪性の細胞に対する第１の細胞死閾値を決定することと、
前記組織領域内に存在する非悪性の細胞に対する第２の細胞死閾値を決定することと、
前記悪性の細胞を死滅させるために、前記第１の細胞死閾値以上かつ前記第２の細胞死閾値未満の電気パルスを、前記組織領域に適用することと、を含む、前記方法。
【請求項５３】
前記非悪性の細胞は、死滅させられない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記悪性の細胞のそれぞれは、細胞核を含み、前記細胞核を破壊するのに十分な様式で前記電気パルスを適用することによって死滅させられる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２の処置領域は、腫瘍を包囲し、前記癌細胞は、前記腫瘍由来の浸潤性細胞である、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組織は、脳組織であり、前記腫瘍は、神経膠芽腫である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的細胞についての核対細胞質比を決定することと、
前記標的細胞についての前記核対細胞質比に基づき、前記周波数、振幅、及びパルス波形を選択することと、をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記核対細胞質比は、前記細胞を含有する物質の生検から採取された細胞から測定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
細胞小器官内への材料の輸送を増強する方法であって、
細胞を含有する物質に複数の電気パルスを印加することを含み、前記複数の電気パルスは、細胞小器官内への分子の輸送を最適化するように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、前記方法。
【請求項６０】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記印加は、インビトロで実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記印加は、インビボで実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記印加は、エクスビボで実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の電気パルスは、異なるパルス幅を有する正パルス及び負パルスを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記複数の電気パルスは、異なる振幅を有する正パルス及び負パルスを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞小器官は、核、ミトコンドリア、小胞体、液胞、リソソーム、または葉緑体である、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年５月１２日出願の米国仮出願第６１／９９２，０２３号の開示に依拠し、その出願日の優先権及び利益を主張するものであり、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
背景
【０００２】
本発明は、電気処置エネルギーの適用を伴う内科的処置に関する。本発明の実施形態は、２つの処置領域、すなわち、細胞が非選択的に死滅させられる電極を包囲する第１の領域、及び異常細胞などの細胞が選択的に死滅させられる、第１の領域を包囲する第２の選択的処置領域を作り出すシステム及び方法に関する。特定の実施形態では、パルス長及び連続パルス間の遅延が、細胞内膜電位に対する効果をもたらすように最適化される、電気パルスの列の適用により、癌細胞などの細胞を選択的に処置するためのシステム及び方法が提供される。本発明のシステム及び方法により、腫瘍辺縁内に配置される浸潤腫瘍細胞が効果的に処置され得る一方で、腫瘍辺縁内の健康な組織を残す。
【背景技術】
【０００３】
局所アブレーション技術は、典型的には、明確に画定された領域内の癌性細胞を破壊することによって、腫瘍を攻撃する。典型的には、これらの技術は、癌性細胞だけではなく、処置される体積内の細胞及び組織構造の全てを破壊する。局所アブレーション技術の主要な課題は、典型的には、健康な細胞及びいくつかの浸潤性癌性細胞を含有する腫瘍を包囲する領域があることである。これらの浸潤性癌細胞は、処置されない場合、腫瘍の再発をもたらす可能性がある。従来の外科的切除及び局所アブレーションにおける解決法は、これらの浸潤性癌細胞も除去しようとして、腫瘍辺縁を越えて処置することである。これは、典型的には血管及び神経などの重要な構造付近に生じる腫瘍に関する主要な課題を示す。したがって、本技術分野において、これらの制限を克服する新しい電気穿孔プロトコルの必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、腫瘍辺縁内の浸潤性癌細胞を処置するシステム及び方法を提供する。この二峰性増強アブレーション機構（ＢＥＡＭ）プラットフォームは、パルスの細胞内効果を増強する一方で、健康な組織に対する効果を最小限に抑えるように特に最適化されている、高周波電界のバーストを使用する。実施形態では、最適なバーストは、細胞膜の充電時間＋核膜の放電時間にほぼ等しい持続時間を有する構成的パルスを含む。パルス間の最適なオフタイムは、細胞膜の充電時間にほぼ等しい。
【０００５】
実施形態では、ある特定の細胞（悪性）細胞は、それらの生物物理学的細胞下構造に基づき、優先的に標的化され得る。それらの悪性度の指標であるより大きい核対細胞質比を有する細胞は、これらのパルスの影響をより受けやすい。細胞に影響を及ぼす機構は、それらの核を破壊することに関連する。細胞サイズは、典型的なＩＲＥに対して、細胞が印加された電界下で死滅するときを決定するための一次パラメータであるが、対照的に、本発明の実施形態によると、細胞サイズは、主要な役割を果たさない。
【０００６】
特定の実施形態は、連続パルス間に遅延を伴う複数の電気パルスを組織に印加することを含む、細胞を選択的に処置する方法を提供し、各パルスの長さ及び連続パルス間の遅延は、第１の処置領域及び第２の処置領域を作り出すように最適化され、第１の処置領域内で、癌細胞などの標的細胞及び非癌細胞などの非標的細胞は、死滅させられ、第２の処置領域内で、標的細胞が死滅させられるか、または阻害される一方で、非標的細胞は残される。そのような方法において、印加は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで実施され得る。
【０００７】
実施形態によると、第２の処置領域内で、癌細胞などの標的細胞は、細胞分裂の減速もしくは停止によって阻害されるか、または標的細胞（例えば、癌細胞）は、遊走の減速もしくは停止によって阻害されるか、または標的細胞（例えば、癌細胞）は、血液及び栄養素の輸送の低減によって阻害されるか、または標的細胞（例えば、癌細胞）は、アポトーシスによって死滅させられるか、またはいくつかの標的細胞（例えば、癌細胞）が第２の処置領域内で死滅させられるか、もしくは阻害され、いくつかの非標的細胞（例えば、非癌細胞）が第２の処置領域内で残される。実施形態では、第２の処置領域は、腫瘍を包囲し、標的癌細胞は、腫瘍由来の浸潤性細胞である。組織は、脳組織、及び／または腫瘍神経膠芽腫であってもよい。本開示の任意の実施形態における標的細胞は、例えば、癌細胞、浸潤性細胞、または任意の望ましくない細胞を含む任意の種類の細胞であってもよい。非標的細胞は、同様に任意の種類の細胞であってもよく、典型的には、健康な細胞、正常な細胞、または非癌細胞である。
【０００８】
実施形態によると、第１の処置領域内で、標的細胞及び非標的細胞（例えば、癌細胞及び非癌細胞）は、壊死によって死滅させられるか、またはいくつかの癌細胞及びいくつかの非癌細胞が第１の処置領域内で死滅させられる。
【０００９】
同様に、実施形態によると、標的及び非標的細胞の両方（例えば、癌細胞及び非癌細胞）は、それらの膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、第１の処置領域内で死滅させられ得る。
【００１０】
実施形態では、癌細胞は、それらの膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、第２の処置領域内で死滅させられる。
【００１１】
実施形態では、連続パルス間の遅延は、各パルスの長さよりも大きくてもよく、または連続パルス間の遅延は、各パルスの長さの分数であってもよく、または各パルスの長さが癌細胞の細胞膜の充電時間＋癌細胞の核膜の放電時間に等しくてもよい一方で、連続パルス間の遅延は、癌細胞の細胞膜の充電時間に等しい。同様に、癌細胞の細胞膜の充電時間及び癌細胞の核膜の放電時間は、数値モデリングにより決定され得る。
【００１２】
実施形態では、パルス列は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、または正弦波である電界波形を含む。実施形態では、電界波形は、単極性もしくは双極性であるか、または第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号であってもよく、第２の周波数調波は、第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する。
【００１３】
実施形態では、電界波形は、連続してマイクロ秒オーダのパルスと交互になったナノ秒オーダのパルスを含む。同様に、電界波形は、対称または非対称であってもよい。実施形態における電界波形は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内の搬送波周波数を有することができる。波形の搬送波周波数またはパルス持続時間は、癌細胞のクロスオーバ周波数に基づき得る。
【００１４】
実施形態では、各パルスの長さ及び連続パルス間の遅延は、癌細胞の物理的な核対細胞質のサイズ比に基づき最適化される。
【００１５】
本発明の実施形態は、患者内の固形腫瘍を識別することと、固形腫瘍内に、またはそれに隣接して少なくとも１つの電極を挿入することと、連続パルス間に遅延を伴う複数の電気パルスを含むパルス列を印加することと、を含む、患者内の癌を治療する方法を含む。そのような方法はまた、望ましくない細胞または必ずしも癌性ではない標的細胞を処置することにも適用できる。実施形態では、各パルスの長さ及び連続パルス間の遅延は、少なくとも１つの電極の半径内に第１の処置領域、ならびに第１の半径の間及び電極の第２の半径内に第２の処置領域を作り出すように最適化され、第２の処置領域は、第１の処置領域の外側にある。第１の処置領域内で、癌細胞及び健康な細胞が非選択的に死滅させられる一方で、第２の処置領域内で、癌細胞が選択的に死滅させられるか、または阻害され、健康な細胞が残される。患者内の癌を治療する方法は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで実施され得る。
【００１６】
本発明の実施形態では、第２の処置領域内の癌細胞の選択的阻害は、細胞分裂の減速または停止を含む。あるいは、または加えて、第２の処置領域内の癌細胞の選択的阻害は、遊走の減速または停止を含む。あるいは、または加えて、第２の処置領域内の癌細胞の選択的阻害は、血液及び栄養素の輸送の低減を含む。
【００１７】
本発明の実施形態では、癌細胞及び健康な細胞は、壊死によって第１の処置領域内で死滅させられる。あるいは、または加えて、癌細胞は、アポトーシスによって第２の処置領域内で死滅させられる。
【００１８】
本発明の実施形態では、癌細胞及び健康な細胞は、それらの膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、第１の処置領域内で死滅させられる。あるいは、または加えて、癌細胞は、それらの膜内外電位の致死限界値への増加の結果として、第２の処置領域内で死滅させられる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態は、核の膜内外電位を標的化して、それが本発明の最適化されたパルスの結果として致死限界値に達するようにし得る。しかしながら、他の実施形態は、膜内外電位に対する効果によるか、または任意の他の機構によるかにかかわらず、ミトコンドリア、滑面小胞体、粗面小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ペルオキシソーム、貯蔵小胞、及び輸送小胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意の膜結合細胞内小器官を標的化し得る。
【００２０】
本発明の実施形態では、連続パルス間の遅延は、各パルスの長さよりも大きい。あるいは、連続パルス間の遅延は、各パルスの長さの分数である。
【００２１】
本発明の実施形態では、各パルスの長さが細胞膜の充電時間＋核膜の放電時間に等しい一方で、連続パルス間の遅延は、細胞膜の充電時間に等しい。同様に、実施形態は、そのようなタイミングの倍数またはそのようなタイミングの分数さえ含み得る。細胞膜の充電時間及び核膜の放電時間は、数値モデリングにより決定され得る。
【００２２】
本発明の実施形態では、パルス列は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、または正弦波である電界波形を含む。電界波形は、単極性または双極性であってもよい。電界波形は、第１の周波数調波（低周波調波など）と第２の周波数調波（高周波調波など）とを含む、重畳二峰性信号であってもよい。電界波形は、連続してマイクロ秒オーダのパルスと交互になったナノ秒オーダのパルスを含んでもよい。電界波形は、非対称であってもよい。電界波形は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内の搬送波周波数を有してもよい。波形の搬送波周波数またはパルス持続時間は、癌細胞、望ましくない細胞、または別様に標的細胞と称される細胞のクロスオーバ周波数に基づき得る。
【００２３】
実施形態では、各パルスの長さ及び連続パルス間の遅延は、癌細胞の物理的な核対細胞質のサイズ比に基づき最適化される。
【００２４】
本発明の実施形態では、パルスは、双極性方形波であり、各パルスの長さは、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒である。
【００２５】
本発明の実施形態は、患者内の固形腫瘍を識別することと、固形腫瘍内に、またはそれに隣接して少なくとも１つの電極を挿入することと、複数の電気パルスを含むパルス列を印加することと、を含む、患者内の癌を治療する方法を含み、パルスは、双極性方形波であり、各パルスの長さは、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒である。
【００２６】
本発明の実施形態は、患者内の固形腫瘍を識別することと、固形腫瘍内に、またはそれに隣接して少なくとも１つの電極を挿入することと、複数の電気パルスを含むパルス列を印加することと、を含む、患者内の癌を治療する方法を含み、パルス列は、低周波調波及び高周波調波など、第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号である、電界波形を有する。
【００２７】
本発明の実施形態は、少なくとも１つの電極と、電極と動作可能に連結され、かつ複数の電気パルスを含むパルス列を印加するように構成される電圧パルス発生器とを備える、対象における癌を治療するためのシステムを含み、パルス列は、低周波調波と高周波調波とを含む重畳二峰性信号である、電界波形を有する。電圧パルス発生器は、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列される、ソリッドステート切り替えデバイスを備えてもよい。
【００２８】
また、細胞を含有する物質に処置として複数の電気パルスを印加することを含む、細胞を選択的に処置する方法が含まれ、パルスは、双極性方形波であり、各パルスの長さは、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒であり、パルス間の遅延は、２５０ナノ秒〜５０マイクロ秒であり、複数の電気パルスによって、一種類の細胞が処置され、別の種類の細胞は処置されない。実施形態では、処置された細胞は、死滅させられ、未処置の細胞は、死滅させられない。細胞を含有する物質は、例えば、組織、無生物、溶液、身体の一部、または生存もしくは非生存患者、ヒト、動物、もしくは組織であってもよい。
【００２９】
実施形態では、細胞を含有する物質に複数の電気パルスを含むパルス列を印加することを含む、細胞を選択的に処置する方法が提供され、パルス列は、第１の周波数調波と、第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号である、電界波形を有する。実施形態では、パルス列は、選択された種類の細胞を選択的に死滅させ、別の種類の細胞を残す。
【００３０】
本発明のシステムは、本発明の１つ以上の方法を実装するように構成される任意のシステムを含む。少なくとも１つの電極と、電極に連結され、かつ複数の電気パルスを含むパルス列を印加するように構成される電圧パルス発生器とを備える、細胞を選択的に処置するためのシステムが含まれ、パルス列は、第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号である、電界波形を有し、第２の周波数調波は、第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する。
【００３１】
実施形態では、電圧パルス発生器は、パルス列が選択された種類の細胞を選択的に死滅させ、別の種類の細胞を残すように、二峰性信号を選択するように構成されるか、または電圧パルス発生器は、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列されるソリッドステート切り替えデバイスを備える。
【００３２】
さらなる方法は、細胞を選択的に処置する方法を含み、本方法は、選択された生物物理学的細胞下構造を有する細胞のみを死滅させるのに十分な様式で、細胞を含有する物質に電気パルスを送達することを含む。実施形態では、選択された生物物理学的細胞下構造を有する細胞は、核を有し、細胞は、細胞の核を破壊することによって死滅させられる。選択された生物物理学的細胞下構造を有する細胞は、選択された核対細胞質の面積比を有することができる。
【００３３】
細胞を含有する物質に複数の電気パルスを印加することを含み、複数の電気パルスは、一種類の細胞の標的細胞を処置し、別の種類の細胞の非標的細胞を残すように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、細胞を選択的に処置する方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。本発明のそのような方法は、癌細胞が処置され、正常な細胞が残される、選択的方法であってもよい。そのような方法は、より悪性の種類の癌細胞が処置され、あまり侵攻性ではない種類の癌細胞が残される、緩和方法であってもよい。
【００３４】
本発明の方法は、標的細胞についての核対細胞質比を決定することと、標的細胞についての核対細胞質比に基づき、周波数、振幅、及びパルス波形を選択することと、をさらに含むことができる。実施形態では、核対細胞質比は、細胞を含有する物質の生検から採取された細胞から測定または別様に決定される。
【００３５】
悪性の細胞を選択的に焼灼する方法が本発明に含まれ、本方法は、組織領域内に存在する悪性の細胞に対する第１の細胞死閾値を決定することと、組織領域内に存在する非悪性の細胞に対する第２の細胞死閾値を決定することと、悪性の細胞を死滅させるために、第１の細胞死閾値以上かつ第２の細胞死閾値未満の電気パルスを、組織領域に適用することと、を含む。本発明の方法の実施形態では、非悪性の細胞は死滅させられない。実施形態では、悪性の細胞はそれぞれ、細胞核を含み、細胞核を破壊するのに十分な様式で電気パルスを適用することによって、死滅させられる。
【００３６】
細胞を含有する物質に複数の電気パルスを印加することを含み、複数の電気パルスは、細胞小器官内への分子の輸送を最適化するように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、細胞小器官内への材料の輸送を増強する方法が、実施形態に含まれる。
【００３７】
実施形態によると、複数の電気パルスは、異なるパルス幅を有する正パルス及び負パルスを含むか、または複数の電気パルスは、異なる振幅を有する正パルス及び負パルスを含む。実施形態では、細胞小器官は、核、ミトコンドリア、小胞体、液胞、リソソーム、または葉緑体である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
添付の図面は、本発明の実施形態のある特定の態様を示し、本発明を制限するために使用されるべきではない。明細書と合わせて、図面は、本発明のある特定の原理を説明するのに役立つ。
【００３９】
【図１】ｘ及びｙ軸がメートルでの距離を示す、本発明に従ったアブレーション領域及び選択的処置領域を示す概略図である。
【図２】核膜内外電位に対する最適化されたパルス長及びパルス遅延の効果を示すグラフである。
【図３】健康な細胞及び癌細胞内の核膜内外電位に対する準最適なパルスの効果を示すグラフである。
【図４】非対称パルスによる遺伝子の電気泳動的転移を示す、概略図及び重ね合されたグラフである。
【図５Ａ】図５Ｂ〜５Ｇに対する重要な要素としての役割を果たす、２つの異なるサイズの核を有する細胞の概略図である。
【図５Ｂ】低周波双極性正弦波信号を示すグラフである。
【図５Ｃ】高周波双極性正弦波信号を示すグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｂの低周波調波と図５Ｃの高周波調波とを含む二峰性正弦波信号を示すグラフである。
【図５Ｅ】図５Ｂの低周波双極性正弦波信号の結果としての、２つの異なるサイズの核を有する細胞の核膜内外電位を示すグラフである。
【図５Ｆ】図５Ｃの高周波双極性正弦波信号の結果としての、２つの異なるサイズの核を有する細胞の核膜内外電位を示すグラフである。
【図５Ｇ】図５Ｄの二峰性正弦波信号の結果としての、２つの異なるサイズの核を有する細胞の核膜内外電位を示すグラフである。
【図６】本発明の代表的なシステムの概略図である。
【図７】本発明の処置を実施するための代表的な制御コンピュータの概略図である。
【図８】過電流状態及び／または不足電流を検出するための要素を含む、図６のシステムに示される発生器の詳細を示す図である。
【図９】１０００Ｖ／ｃｍのパルス電界の影響下の１．０Ｓ／ｍ溶液中に懸濁している細胞の膜内外電位（ＴＭＰ）の数値シミュレーションの結果を示すグラフである。
【図１０】膜内外電位（ＴＭＰ）に対するパラメータ研究で使用されるパラメータ値を示す表である。
【図１１】４００Ｖ／ｃｍの電界対周波数の下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についての定常状態の最大膜内外電位（ＴＭＰ）を示すグラフである。赤い垂直線は、０．０１Ｓ／ｍの導電性培地中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の第１のクロスオーバ周波数を表す。
【図１２Ａ】１００ｋＨｚ（図１２Ａ）及び１ＭＨｚ（図１２Ｂ）における１０００Ｖ／ｃｍの電界への膜内外電位（ＴＭＰ）応答を示すグラフである。
【図１２Ｂ】１００ｋＨｚ（図１２Ａ）及び１ＭＨｚ（図１２Ｂ）における１０００Ｖ／ｃｍの電界への膜内外電位（ＴＭＰ）応答を示すグラフである。
【図１３】１０００Ｖ／ｃｍの電界への細胞の脂質二重層に対する過渡応答を示すグラフである。
【図１４】１０００Ｖ／ｃｍの電界への細胞の過渡応答を示すグラフである。
【図１５】０．５：１の核対細胞質比を有する細胞についての膜内外電位（ＴＭＰ）及び核膜内外電位（ｎＴＭＰ）を示すグラフである。
【図１６】パルス間のオフタイムが５００ナノ秒に保持されるとき、パルス時間が核膜内外電位（ｎＴＭＰ）に対して有する効果を示すグラフである。
【図１７】核膜内外電位（ｎＴＭＰ）に対するパルス遅延の効果を示すグラフである。
【図１８Ａ】パルス形状が単一のパルス最大値を超えて核膜内外電位（ｎＴＭＰ）を増加させるように最適化され得ることを示すグラフであり、図１８Ａは、５００ナノ秒オン、５００ナノ秒オフのパルス療法の結果としてのｎＴＭＰを示す。
【図１８Ｂ】パルス形状が単一のパルス最大値を超えて核膜内外電位（ｎＴＭＰ）を増加させるように最適化され得ることを示すグラフであり、図１８Ｂは、４マイクロ秒オン、５００ナノ秒オフのパルス療法の結果としてのｎＴＭＰを示す。
【図１９】核膜内外電位に対する核サイズの効果を示すグラフである。
【図２０】正弦波信号に対して達成可能な定常状態の最大膜電位を示すグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ｂ及び２１Ｃに対する重要な要素としての役割を果たす、２つの異なるサイズの核を有する細胞の概略図である。
【図２１Ｂ】４０００Ｖ／ｃｍの電界強度を有する二峰性正弦波信号を印加する結果としての、２つの異なるサイズの核の細胞の核膜内外電位を示すグラフである。
【図２１Ｃ】５０００Ｖ／ｃｍの電界強度を有する二峰性正弦波信号を印加する結果としての、２つの異なるサイズの核の細胞の核膜内外電位を示すグラフである。
【図２２】核電気穿孔法の選択的領域を示すグラフである。示される電界曲線は、４０００Ｖ／ｃｍ（実線）及び５０００Ｖ／ｃｍ（破線）である。
【図２３Ａ】単一のサブマイクロ秒パルス波形を示すグラフである。
【図２３Ｂ】不可逆電気穿孔パルス列を作るために、２００回繰り返される図２３Ａの単一のサブマイクロ秒パルス波形を示すグラフである。
【図２３Ｃ】処置の１時間後及び１６時間後における１０００Ｖ／ｃｍ、２０００Ｖ／ｃｍ、及び４０００Ｖ／ｃｍのパルスに関する、細胞生存率に対する図２３Ｂのパルス列の効果のグラフである。
【図２４】パルス長の関数として、１５００Ｖ／ｃｍのパルスで処置された細胞の生存率を示すグラフである。
【図２５】パルス長の関数として、３０００Ｖ／ｃｍのパルスで処置された細胞の生存率を示すグラフである。
【図２６】パルス長の関数として、４０００Ｖ／ｃｍのパルスで処置された細胞の生存率を示すグラフである。
【図２７Ａ】選択的標的化によるアブレーション増強を示す図であり、ｘ及びｙ軸は、メートルでの距離を示し、アブレーション領域は白色で示され、選択的標的化増強の領域は、オレンジ色で示される（白黒の図中では灰色）。図２７Ａは、インビトロ値を使用した、１０００Ｖのパルスの結果としてのこれらの領域を示す。
【図２７Ｂ】選択的標的化によるアブレーション増強を示す図であり、ｘ及びｙ軸は、メートルでの距離を示し、アブレーション領域は白色で示され、選択的標的化増強の領域は、オレンジ色で示される（白黒の図中では灰色）。図２７Ｂは、同等のインビボ閾値を使用した、１０００Ｖのパルスの結果としてのこれらの領域を示す。
【図２８】数値解析で使用されるパラメータを示す表である。
【図２９Ａ】実施例２で使用される実験準備の概略図である。１００ｕＬの細胞懸濁液を２ｍｍの電気穿孔キュベットに添加した。差し込み図は、細胞膜及び核膜をシミュレーションするために使用されるメッシュを表す。
【図２９Ｂ】実施例２の全ての実験に使用されるプロトコルを表す正極性及び負極性パルスの循環を含む、実験的バーストの概略図である。
【図３０Ａ】時間、ｔ／μｓの関数として、印加電圧、Ｕ／ｋＶ、ｉをプロットする、実施例２の実験を使用した異なる長さのパルスの例示的な波形を示すグラフである。各バーストは、５０μｓが各極性で電圧印加されて、１００μｓの合計オン時間を有する。２５０ｎｓ（図３０Ａ）の構成的パルスを有するバーストからの代表的なセグメント。
【図３０Ｂ】時間、ｔ／μｓの関数として、印加電圧、Ｕ／ｋＶ、ｉをプロットする、実施例２の実験を使用した異なる長さのパルスの例示的な波形を示すグラフである。各バーストは、５０μｓが各極性で電圧印加されて、１００μｓの合計オン時間を有する。１μｓ（図３０Ｂ）の構成的パルスを有するバーストからの代表的なセグメント。
【図３０Ｃ】時間、ｔ／μｓの関数として、印加電圧、Ｕ／ｋＶ、ｉをプロットする、実施例２の実験を使用した異なる長さのパルスの例示的な波形を示すグラフである。各バーストは、５０μｓが各極性で電圧印加されて、１００μｓの合計オン時間を有する。５μｓ（図３０Ｃ）の構成的パルスを有するバーストからの代表的なセグメント。
【図３１Ａ】有限要素シミュレーションの結果を示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３１Ａは、５０ｎｓの立ち上がり及び立ち下がり時間を有する双極性方形波が、細胞膜（Ｕｍ）及び（図３１Ｃ）核膜（Ｕｎ）の最大（図３１Ｂ）膜内外電位をシミュレーションするために使用したことを示す。
【図３１Ｂ】有限要素シミュレーションの結果を示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３１Ａは、５０ｎｓの立ち上がり及び立ち下がり時間を有する双極性方形波が、細胞膜（Ｕｍ）及び（図３１Ｃ）核膜（Ｕｎ）の最大（図３１Ｂ）膜内外電位をシミュレーションするために使用したことを示す。
【図３１Ｃ】有限要素シミュレーションの結果を示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３１Ａは、５０ｎｓの立ち上がり及び立ち下がり時間を有する双極性方形波が、細胞膜（Ｕｍ）及び（図３１Ｃ）核膜（Ｕｎ）の最大（図３１Ｂ）膜内外電位をシミュレーションするために使用したことを示す。
【図３２Ａ】細胞膜電位に対するパラメータ解析の結果を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３２Ａ）パルス幅、（図３２Ｂ）培地導電率、（図３２Ｃ）パルス間遅延時間を変化させる効果が示される。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３２Ｂ】細胞膜電位に対するパラメータ解析の結果を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３２Ａ）パルス幅、（図３２Ｂ）培地導電率、（図３２Ｃ）パルス間遅延時間を変化させる効果が示される。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３２Ｃ】細胞膜電位に対するパラメータ解析の結果を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３２Ａ）パルス幅、（図３２Ｂ）培地導電率、（図３２Ｃ）パルス間遅延時間を変化させる効果が示される。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３３Ａ】細胞特性パラメータ解析を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３３Ａ）核−細胞質比、（図３３Ｂ）細胞質導電率、及び（図３３Ｃ）細胞膜誘電率を変化させる効果が示される。良性及び癌性細胞の細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖが、図３３Ｄ及び３３Ｅに示される。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３３Ｂ】細胞特性パラメータ解析を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３３Ａ）核−細胞質比、（図３３Ｂ）細胞質導電率、及び（図３３Ｃ）細胞膜誘電率を変化させる効果が示される。良性及び癌性細胞の細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖが、図３３Ｄ及び３３Ｅに示される。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３３Ｃ】細胞特性パラメータ解析を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３３Ａ）核−細胞質比、（図３３Ｂ）細胞質導電率、及び（図３３Ｃ）細胞膜誘電率を変化させる効果が示される。良性及び癌性細胞の細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖが、図３３Ｄ及び３３Ｅに示される。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３３Ｄ】細胞特性パラメータ解析を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３３Ａ）核−細胞質比、（図３３Ｂ）細胞質導電率、及び（図３３Ｃ）細胞膜誘電率を変化させる効果が示される。良性及び癌性細胞の細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖが、図３３Ｄ及び３３Ｅに示される。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３３Ｅ】細胞特性パラメータ解析を示すグラフである。細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。（図３３Ａ）核−細胞質比、（図３３Ｂ）細胞質導電率、及び（図３３Ｃ）細胞膜誘電率を変化させる効果が示される。良性及び癌性細胞の細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖが、図３３Ｄ及び３３Ｅに示される。Ｕｍ及びＵｎに対する軸が異なる目盛りを有することに留意されたい。
【図３４Ａ】２５０ｎｓ及び１μｓの実験的パルスによる膜電位のシミュレーションを示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３４Ａは、１．５ｋＶ／ｃｍの２５０ｎｓのインパルスを示し、図３４Ｂは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。図３４Ｃは、１．５ｋＶ／ｃｍの１μｓインパルスを示し、図３４Ｄは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。
【図３４Ｂ】２５０ｎｓ及び１μｓの実験的パルスによる膜電位のシミュレーションを示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３４Ａは、１．５ｋＶ／ｃｍの２５０ｎｓのインパルスを示し、図３４Ｂは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。図３４Ｃは、１．５ｋＶ／ｃｍの１μｓインパルスを示し、図３４Ｄは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。
【図３４Ｃ】２５０ｎｓ及び１μｓの実験的パルスによる膜電位のシミュレーションを示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３４Ａは、１．５ｋＶ／ｃｍの２５０ｎｓのインパルスを示し、図３４Ｂは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。図３４Ｃは、１．５ｋＶ／ｃｍの１μｓインパルスを示し、図３４Ｄは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。
【図３４Ｄ】２５０ｎｓ及び１μｓの実験的パルスによる膜電位のシミュレーションを示すグラフである。印加された電界、Ｅ／（ｋＶ／ｃｍ）、細胞膜にわたる電圧降下、Ｕｍ／Ｖ、及び核膜にわたる電圧降下、Ｕｎ／Ｖは、時間、ｔ／μｓの関数として示される。図３４Ａは、１．５ｋＶ／ｃｍの２５０ｎｓのインパルスを示し、図３４Ｂは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。図３４Ｃは、１．５ｋＶ／ｃｍの１μｓインパルスを示し、図３４Ｄは、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）の得られる膜内外電位を示す。破線は、細胞膜の膜内外電位（Ｕｍ）を表し、実線は、核膜の膜内外電位（Ｕｎ）を表す。
【図３５】４０００Ｖ／ｃｍへの曝露中の培地温度の変化を示すグラフである。温度の変化、ΔＴ／Ｋは、時間の関数、ｔ／ｓとして示される。５０ｕｓ及び２５０ｎｓの構成的パルスを有するバーストは、同様の温度上昇をもたらした。ΔＴ＝Ｔ−Ｔ基準であり、式中、Ｔ基準＝２０℃である。
【図３６Ａ】細胞死が即時及び遅延機構によって生じることを示すグラフである。相対生存率、ｒ生存率は、パルス幅、Δｔｐ／μｓの関数として示される。（図３６Ａ）１５００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｂ）３０００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｃ）４０００Ｖ／ｃｍのバーストへの曝露の１時間後及び２４時間後の細胞の相対生存率。ｒ生存率＝Ｎ生存／Ｎ合計は対照に正規化され、式中、Ｎは細胞の数である。全実験において、細胞を８０回のバーストに曝露し、それぞれは、１００μｓの電圧印加時間を有する。エラーバーは、最低で３つ（ｎ＝３）の無作為化実験後の標準偏差を表す。星印（＊）は、１〜２４時間の時点の統計的有意性（α≦０．１）を示す。
【図３６Ｂ】細胞死が即時及び遅延機構によって生じることを示すグラフである。相対生存率、ｒ生存率は、パルス幅、Δｔｐ／μｓの関数として示される。（図３６Ａ）１５００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｂ）３０００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｃ）４０００Ｖ／ｃｍのバーストへの曝露の１時間後及び２４時間後の細胞の相対生存率。ｒ生存率＝Ｎ生存／Ｎ合計は対照に正規化され、式中、Ｎは細胞の数である。全実験において、細胞を８０回のバーストに曝露し、それぞれは、１００μｓの電圧印加時間を有する。エラーバーは、最低で３つ（ｎ＝３）の無作為化実験後の標準偏差を表す。星印（＊）は、１〜２４時間の時点の統計的有意性（α≦０．１）を示す。
【図３６Ｃ】細胞死が即時及び遅延機構によって生じることを示すグラフである。相対生存率、ｒ生存率は、パルス幅、Δｔｐ／μｓの関数として示される。（図３６Ａ）１５００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｂ）３０００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｃ）４０００Ｖ／ｃｍのバーストへの曝露の１時間後及び２４時間後の細胞の相対生存率。ｒ生存率＝Ｎ生存／Ｎ合計は対照に正規化され、式中、Ｎは細胞の数である。全実験において、細胞を８０回のバーストに曝露し、それぞれは、１００μｓの電圧印加時間を有する。エラーバーは、最低で３つ（ｎ＝３）の無作為化実験後の標準偏差を表す。星印（＊）は、１〜２４時間の時点の統計的有意性（α≦０．１）を示す。
【図３７】バーストが、膜電位が臨界閾値を超える時間に対して累積的影響を有することを示すグラフであり、細胞膜または核膜が臨界閾値よりも大きい時間、ｔ／μｓは、パルス幅、Δｔｐ／μｓの関数として示される。図３７Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、及びＪは、細胞膜が１Ｖよりも大きい電位降下（Ｕｍ）を有する時間を表す。図３７Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、及びＬは、核膜が０．５、０．７５、または０．９Ｖよりも大きい電位降下（Ｕｍ）を有する時間を表す。
【図３８Ａ】従来の単極性ＩＲＥパルスを示す概略図である。
【図３８Ｂ】従来の高周波双極性バーストを示す概略図である。
【図３８Ｃ】３Ｄ組織模倣体に挿入される電極を有する実験準備を示す写真である。
【図３８Ｄ】交互パルス間に２μｓの遅延を伴う、（図３８Ｄ）２、（図３８Ｅ）２４、及び（図３８Ｆ）５０の双極性２μｓパルスを含む、８０回のバーストを用いた処置後の組織模倣体の生存［緑色］及び死滅［赤色］領域の画像である。図３８Ｇは、交互パルス間に２０ｍｓを有する５０の双極性２μｓパルスの拡散処置を示す。スケールバーは、２ｍｍを表す。
【図３８Ｅ】交互パルス間に２μｓの遅延を伴う、（図３８Ｄ）２、（図３８Ｅ）２４、及び（図３８Ｆ）５０の双極性２μｓパルスを含む、８０回のバーストを用いた処置後の組織模倣体の生存［緑色］及び死滅［赤色］領域の画像である。図３８Ｇは、交互パルス間に２０ｍｓを有する５０の双極性２μｓパルスの拡散処置を示す。スケールバーは、２ｍｍを表す。
【図３８Ｆ】交互パルス間に２μｓの遅延を伴う、（図３８Ｄ）２、（図３８Ｅ）２４、及び（図３８Ｆ）５０の双極性２μｓパルスを含む、８０回のバーストを用いた処置後の組織模倣体の生存［緑色］及び死滅［赤色］領域の画像である。図３８Ｇは、交互パルス間に２０ｍｓを有する５０の双極性２μｓパルスの拡散処置を示す。スケールバーは、２ｍｍを表す。
【図３８Ｇ】交互パルス間に２μｓの遅延を伴う、（図３８Ｄ）２、（図３８Ｅ）２４、及び（図３８Ｆ）５０の双極性２μｓパルスを含む、８０回のバーストを用いた処置後の組織模倣体の生存［緑色］及び死滅［赤色］領域の画像である。図３８Ｇは、交互パルス間に２０ｍｓを有する５０の双極性２μｓパルスの拡散処置を示す。スケールバーは、２ｍｍを表す。
【図３９】組織模倣体実験的パラメータを示す表である。
【図４０Ａ】２２００Ｖ２ｓの用量に対する組織模倣体中のＰＰＴ細胞についての致死電界閾値を示すグラフである。図４０Ｂは、１５００Ｖ／ｃｍを用いた処置後の培地懸濁液中のＰＰＴ細胞の相対生存率を示すグラフである。図４０Ｂ中のデータは、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４からであり、図４０Ａ及びＢ中でラベル付けされたデータは、Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２からである。図４０Ｃは、実験的に測定され、数値的に予測される、組織模倣体の中心における温度プロファイルを示すグラフである。
【図４１Ａ】以下の処置に対する致死電界閾値を示すグラフである。図４１Ａ：１処置当たり８または８０回のバーストを有する、１バースト当たり５４０Ｖ及び１００ｕｓの電圧印加時間。２及び５０μｓ群は、双極性パルスを含み、１００μｓ群は、単極性パルスを有した。
【図４１Ｂ】以下の処置に対する致死電界閾値を示すグラフである。図４１Ｂ：１バースト当たり同等のエネルギーを有する、２５０、５４０、及び６５０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｃ：１バースト当たり電圧印加される４、４８、または１００μｓを有する、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｄ：ｉｎｔｅｒ−バースト遅延が１ｓ［バースト］または２０ｍｓ［拡散］であった、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｂ〜Ｄ：処置群は、８０秒間、８０回のバーストの処置を受けた［拡散群］。‡とラベル付けされたデータは、Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２からである。
【図４１Ｃ】以下の処置に対する致死電界閾値を示すグラフである。図４１Ｂ：１バースト当たり同等のエネルギーを有する、２５０、５４０、及び６５０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｃ：１バースト当たり電圧印加される４、４８、または１００μｓを有する、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｄ：ｉｎｔｅｒ−バースト遅延が１ｓ［バースト］または２０ｍｓ［拡散］であった、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｂ〜Ｄ：処置群は、８０秒間、８０回のバーストの処置を受けた［拡散群］。‡とラベル付けされたデータは、Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２からである。
【図４１Ｄ】以下の処置に対する致死電界閾値を示すグラフである。図４１Ｂ：１バースト当たり同等のエネルギーを有する、２５０、５４０、及び６５０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｃ：１バースト当たり電圧印加される４、４８、または１００μｓを有する、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｄ：ｉｎｔｅｒ−バースト遅延が１ｓ［バースト］または２０ｍｓ［拡散］であった、５４０Ｖにおける２μｓ群。図４１Ｂ〜Ｄ：処置群は、８０秒間、８０回のバーストの処置を受けた［拡散群］。‡とラベル付けされたデータは、Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２からである。
【図４２Ａ】（図４２Ａ）シャム群に対する処置後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。
【図４２Ｂ】（図４２Ｂ）１μｓ群に対する処置後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。
【図４２Ｃ】（図４２Ｃ）２μｓ群に対する処置後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。
【図４２Ｄ】（図４２Ｄ）５μｓ群に対する処置後の日数の関数としての腫瘍体積を示すグラフである。
【図４２Ｅ】各処置群に対する全てのマウスにわたって平均化された腫瘍の体積を示すグラフである。
【図４３Ａ】腫瘍に挿入される針を介して送達されるパルスを示す写真である。
【図４３Ｂ】即時の腫瘍白色化を示す写真であり、図４３Ｃは、ほとんどの処置後に観察された２４時間後の痂皮形成を示す写真である。
【図４３Ｄ】シャム群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。図４３Ｅ及び４３Ｇは、５μｓ群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。写真は、処置３０日後の皮下腫瘍の存在及び非存在を示す。皮膚の表面上に書かれた数字は、組織準備中の組織配向に関する。
【図４３Ｅ】シャム群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。図４３Ｅ及び４３Ｇは、５μｓ群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。写真は、処置３０日後の皮下腫瘍の存在及び非存在を示す。皮膚の表面上に書かれた数字は、組織準備中の組織配向に関する。
【図４３Ｆ】シャム群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。図４３Ｅ及び４３Ｇは、５μｓ群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。写真は、処置３０日後の皮下腫瘍の存在及び非存在を示す。皮膚の表面上に書かれた数字は、組織準備中の組織配向に関する。
【図４３Ｇ】シャム群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。図４３Ｅ及び４３Ｇは、５μｓ群からの代表的なエンドポイント画像を示す写真である。写真は、処置３０日後の皮下腫瘍の存在及び非存在を示す。皮膚の表面上に書かれた数字は、組織準備中の組織配向に関する。
【図４３Ｈ】疑似マウス表皮（画像の上部）及び下層の腫瘍（画像の下部）を示す顕微鏡画像である。スケールバーは、２５０μｍを表す。
【図４３Ｉ】処置されたマウス表皮（画像の上部）及び下層の筋肉組織（画像の下部）を示す顕微鏡画像である。スケールバーは、２５０μｍを表す。
【図４４】マウス腫瘍アブレーションのための処置マトリクスを示す表である。
【図４５Ａ】ＩＲＥが細胞サイズに依存する一方で、ＢＥＡＭが細胞サイズに依存しないことを予測する、２個のパルス波形を使用した有限要素モデリングを示すグラフである。図４５Ａ：シミュレーションされた単極性１００μｓ  ＩＲＥ波形及び双極性１μｓ  ＢＥＡＭ波形。図４５Ｂ：５００Ｖ／ｃｍを印加するＩＲＥ波形に曝露された２つの異なる細胞サイズに対する計算された細胞性ＴＭＰ応答は、ＴＭＰサイズ依存性を示す。図４５Ｃ：ＢＥＡＭパルス波形応答は、５００Ｖ／ｃｍにおけるＴＭＰ細胞サイズ依存性を示さない。
【図４５Ｂ】ＩＲＥが細胞サイズに依存する一方で、ＢＥＡＭが細胞サイズに依存しないことを予測する、２個のパルス波形を使用した有限要素モデリングを示すグラフである。図４５Ｂ：５００Ｖ／ｃｍを印加するＩＲＥ波形に曝露された２つの異なる細胞サイズに対する計算された細胞性ＴＭＰ応答は、ＴＭＰサイズ依存性を示す。
【図４５Ｃ】ＩＲＥが細胞サイズに依存する一方で、ＢＥＡＭが細胞サイズに依存しないことを予測する、２個のパルス波形を使用した有限要素モデリングを示すグラフである。図４５Ｃ：ＢＥＡＭパルス波形応答は、５００Ｖ／ｃｍにおけるＴＭＰ細胞サイズ依存性を示さない。
【図４６Ａ】ヒドロゲルプラットホーム内の電界及び熱的分布を予測するための有限要素モデルを示す図である。図４６Ａ：操作された３Ｄコラーゲンヒドロゲルは、細胞播種コラーゲン（０．２％または２％ｗ／ｗ）を、制御された形状のＰＤＭＳウェル内に添加することによって作製される。それらは、培養培地によって供給される栄養素を有する細胞培養条件下で、ウェルプレート中で保持される。
【図４６Ｂ】ヒドロゲルプラットホーム内の電界及び熱的分布を予測するための有限要素モデルを示す図である。図４６Ｂ：組織模倣体内の電界分布を計算するために使用されるメッシュは、処置試験のための実験準備を示す。
【図４６Ｃ】ヒドロゲルプラットホーム内の電界及び熱的分布を予測するための有限要素モデルを示す図である。図４６Ｃのｄ〜ｅ：４５０Ｖ（図４６Ｃのｃ）及び７００Ｖ（図４６Ｃのｄ）パルスがシミュレーションされるときの電界（Ｖ／ｃｍ）等高線。図４６Ｃのｅ：処置直後の温度等高線（７００Ｖの５０パルス）は、室温よりも１２℃の最大温度上昇を示す。図４６Ｃのｆ：処置１分後の温度等高線は、細胞がＩＲＥまたはＢＥＡＭパルスの結果として、何の長期にわたる熱効果にも曝露されないことを確実にする。
【図４７Ａ】細胞サイズ依存性ＩＲＥ病変及び細胞サイズ非依存性ＢＥＡＭ病変を明らかにする、ＥＣＭ調整ヒドロゲルを示す画像及びグラフである。図４７Ａ：変化した細胞形態及び全体的な細胞サイズは、ヒドロゲルマトリクスの密度を０．２％から２．０％のコラーゲンに変化させることに起因する（ｎ＝２５、スケールバー２０μｍ）。
【図４７Ｂ】細胞サイズ依存性ＩＲＥ病変及び細胞サイズ非依存性ＢＥＡＭ病変を明らかにする、ＥＣＭ調整ヒドロゲルを示す画像及びグラフである。図４７Ｂ：０．２％コラーゲン中のより大きい細胞に対するＩＲＥ処置の比較は、２％コラーゲン中のより小さい細胞に対するよりも大きい病変、及びしたがって、より低い細胞死閾値を明らかにする（ｎ＝２０、ｐ＜０．００１）（スケールバー１ｍｍ）。
【図４７Ｃ】細胞サイズ依存性ＩＲＥ病変及び細胞サイズ非依存性ＢＥＡＭ病変を明らかにする、ＥＣＭ調整ヒドロゲルを示す画像及びグラフである。図４７Ｃ：０．２％及び２％コラーゲン中のＢＥＡＭ処置の比較は、細胞サイズの差にかかわらず、均一な病変、及びしたがって、同等の細胞死閾値を明らかにする。（ｎ＝２０、ｐ≧０．１）（スケールバー１ｍｍ）。（ｐ≦０．０００５（＊＊＊）及びｐ≦０．０００１（＊＊＊＊））。
【図４８Ａ】硬さが変化する一定の細胞形態が、ＩＲＥ及びＢＥＡＭに対して同等の致死限界値をもたらすことを示す画像及びグラフである。図４８Ａ：アルギン酸塩の密度の変化は、細胞−ＥＣＭ結合部位の欠如によって細胞形態を変化させず、処置に対する硬さの効果を分離することを可能にする（ｎ＝２５）。
【図４８Ｂ】硬さが変化する一定の細胞形態が、ＩＲＥ及びＢＥＡＭに対して同等の致死限界値をもたらすことを示す画像及びグラフである。図４８Ｂ：ＩＲＥ病変及び致死限界値は、同等の細胞形態に対する硬さの差にわたって同等である（ｎ＝２０、ｐ≧０．１）（スケールバー１ｍｍ）。
【図４８Ｃ】硬さが変化する一定の細胞形態が、ＩＲＥ及びＢＥＡＭに対して同等の致死限界値をもたらすことを示す画像及びグラフである。図４８Ｃ：ＢＥＡＭ病変及び致死限界値は、アルギン酸塩の硬さの差にわたって同等である（ｎ＝２０、ｐ≧０．１）（スケールバー１ｍｍ）。
【図４９Ａ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図４９Ｂ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図４９Ｃ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図４９Ｄ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図４９Ｅ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図４９Ｆ】ＩＲＥで焼灼された正常及び腫瘍性イヌ脳組織の組織形態を示す顕微鏡画像である。ａ）内包の正常で未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）及び白質（図４９Ｃ）。ＩＲＥアブレーションは、神経細胞（図４９Ｂ）及びグリア細胞死（図４９Ｂ及びＤ）、ならびに空胞変性及び軸索消失（図４９Ｄ）をもたらす。ＩＲＥアブレーション前（図４９Ｅ）及び後（図４９Ｆ）の多形性膠芽腫の生検。ＩＲＥ処置は、腫瘍及び間質細胞構築の破壊、ならびに腫瘍細胞死を引き起こす。全ての切片がヘマトキシリン及びエオシンで染色される。
【図５０Ａ】ＩＲＥパルスによって生成される電界の数値モデリングが、電界がパルス時間の短い持続時間にわたってのみ細胞内の細胞質に到達する一方で、電界の大部分が細胞膜周囲に集まる培地内で保持されることを予測することを示すグラフである。
【図５０Ｂ】電界分布の数値モデリングが、ＢＥＡＭパルスによって生成される電界が、オンタイムのパルスの全持続時間にわたって、原形質膜を通って細胞質内に浸透することを予測することを示すグラフである。
【図５０Ｃ】Ｕ−８７、ＮＨＡ、Ｃ６、及びＤ１ＴＮＣ１細胞のそれぞれの一連の蛍光画像であり、それらは、モデリングで使用されるための、及び実験的病変結果と相関するための、形状係数の決定を可能にする。
【図５０Ｄ】Ｕ−８７、ＮＨＡ、Ｃ６、及びＤ１ＴＮＣ１細胞が全細胞面積（ｎ＝２０）の有意差（ｐ≧０．１）を示さないことを示すグラフである。
【図５０Ｅ】悪性のグリオーマ細胞（Ｕ−８７及びＣ６）の核面積が、非悪性の星状細胞（ＮＨＡ及びＤ１ＴＮＣ１）に対してよりも大きいことを示すグラフである（ｎ＝２０、ｐ≦０．０５（＊）及びｐ≦０．００５（＊＊））。
【図５１Ａ】ＩＲＥ病変サイズが異なる細胞型にわたって有意差を有しないことを示す一連の画像である（ｎ＝１０、ｐ≧０．１）。
【図５１Ｂ】悪性のグリオーマ細胞（Ｕ−８７及びＣ６）に対するＢＥＡＭ病変サイズが、非悪性の星状細胞（ＮＨＡ及びＤ１ＴＮＣ１）よりも大きいことを示す一連の画像である（ｎ＝１０）。
【図５１Ｃ】病変サイズを細胞死閾値と関連付けるＣＯＭＳＯＬモデリングが、異なる細胞型に対するＩＲＥ閾値間に有意差を示さず（ｎ＝１０、ｐ≧０．１）、ＩＲＥ閾値が主に細胞サイズに依存するという仮説を確認することを示すグラフである。
【図５１Ｄ】悪性の細胞についての細胞死閾値が、ＢＥＡＭ処置を用いて正常な細胞よりも小さく、電界値の範囲が、健康な細胞を死滅させることなく、悪性の細胞を死滅させるということを規定することを示すグラフである（ｎ＝１０、ｐ≦０．０００１（＊＊＊＊））。
【図５２Ａ】ＩＲＥ処置に曝露される細胞が、５分の時間経過にわたって３Ｄヒドロゲル中で培養される細胞からの染色チューブリンの拡散を示し、パルスの結果としての細胞外膜の破壊を示唆することを示す一連の画像である。
【図５２Ｂ】ＢＥＡＭ処置に曝露される細胞が、核の急激な崩壊を示し、チューブリン染色が薄暗くなる一方で、それがＩＲＥの場合にあるように、元の細胞膜の外側で明確に拡散しないことを示す一連の画像である。これは、ＩＲＥとＢＥＡＭとの間で核及び細胞の両方に対する異なる効果を示唆する。
【図５２Ｃ】いかなるパルスにも曝露されない細胞が、対照としての役割を果たして、５分の時間経過にわたって撮像からの光退色効果がないことを確実にすることを示す一連の画像である。
【図５３Ａ】モデリングされたグリオーマ及び星状細胞についてのＢＥＡＭ実験的致死限界値への予測されたＴＭＰ及びｎＴＭＰ応答が、ｎＴＭＰ効果を示唆することを示すグラフである。図５３Ａ：所与の細胞型に対する、シミュレーションされたＢＥＡＭ実験的致死電界閾値に曝露されたグリオーマ細胞及び星状細胞について、実験的形状を有するモデリングされた細胞が、応答におけるＴＭＰ増加の差を示す。
【図５３Ｂ】モデリングされたグリオーマ及び星状細胞についてのＢＥＡＭ実験的致死限界値への予測されたＴＭＰ及びｎＴＭＰ応答が、ｎＴＭＰ効果を示唆することを示すグラフである。図５３Ｂ：所与の細胞型に対する、シミュレーションされたＢＥＡＭ実験的致死電界閾値に曝露されたグリオーマ細胞及び星状細胞について、実験的形状を有するモデリングされた細胞が、応答のＴＭＰ増加の差を示す。応答における同様のｎＴＭＰ増加を示し、細胞死を引き起こすｎＴＭＰ増加に対する値を示唆する。
【図５４Ａ】ＢＥＡＭ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ａ〜Ｂ）、ならびにＩＲＥ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ｃ〜Ｄ）を示すグラフである。ＴＭＰプロット中、点線は、１５ｕｍの直径を有する細胞を表し、実線は、１０ｕｍの直径を有する細胞を表す。外膜にわたる最大ＴＭＰは、ＩＲＥ中ほど、ＢＥＡＭ中に細胞サイズに依存しない。
【図５４Ｂ】ＢＥＡＭ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ａ〜Ｂ）、ならびにＩＲＥ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ｃ〜Ｄ）を示すグラフである。ＴＭＰプロット中、点線は、１５ｕｍの直径を有する細胞を表し、実線は、１０ｕｍの直径を有する細胞を表す。外膜にわたる最大ＴＭＰは、ＩＲＥ中ほど、ＢＥＡＭ中に細胞サイズに依存しない。
【図５４Ｃ】ＢＥＡＭ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ａ〜Ｂ）、ならびにＩＲＥ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ｃ〜Ｄ）を示すグラフである。ＴＭＰプロット中、点線は、１５ｕｍの直径を有する細胞を表し、実線は、１０ｕｍの直径を有する細胞を表す。外膜にわたる最大ＴＭＰは、ＩＲＥ中ほど、ＢＥＡＭ中に細胞サイズに依存しない。
【図５４Ｄ】ＢＥＡＭ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ａ〜Ｂ）、ならびにＩＲＥ処置に対する印加された電界及びＴＭＰ（図５４Ｃ〜Ｄ）を示すグラフである。ＴＭＰプロット中、点線は、１５ｕｍの直径を有する細胞を表し、実線は、１０ｕｍの直径を有する細胞を表す。外膜にわたる最大ＴＭＰは、ＩＲＥ中ほど、ＢＥＡＭ中に細胞サイズに依存しない。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
ここで、本発明の様々な例示的な実施形態を詳細に参照する。本明細書に記載され、かつ図面に示される実施形態は、例示目的のみであり、本発明の範囲を制限することを目的としていない。当業者が本発明の範囲及び趣旨内であると認識する変更が、本明細書及び添付の図面に記載される特定の実施形態に行われ得る。
【００４１】
本教示全体を通して、明示的または黙示的に、本明細書に開示または示唆される特徴及び／または構成要素のうちの全てが、当業者によって理解されるように、適切な時及び場合はいつでも、任意の組み合わせで実施及び／または実装され得る。本明細書に開示される様々な特徴及び／または構成要素は全て、基本的概念の例示であり、したがって、それらの実際の記載を制限しない。実質的に同じ機能を達成するための任意の手段が、予測できる代替物及び均等物と見なされ、したがって、書面により十分に記載され、かつ十分に使用可能である。本明細書に記載される様々な実施例、例示、及び実施形態は、決して、いかなる度合いまたは程度にも、本明細書に示される特許請求された発明の、及び本願に対する優先権を主張する任意の将来の出願における最も広い範囲を制限しない。
【００４２】
本発明者らは、高周波パルス電界が細胞内膜を標的化するように操作及び最適化され得るという驚くべき発見をした。より具体的には、高周波パルス電界を適用する特定のプロトコルが、核などの細胞小器官内の細胞の細胞内膜電位を増加させるために使用され得る。細胞内膜電位を標的化することによって、癌細胞は、健康な組織よりも選択的に標的化され得る。一実施形態では、高周波パルス電界は、腫瘍に適用されて、２つの処置領域、すなわち、アブレーション領域及び選択的処置領域を作る。アブレーション領域内では、健康な細胞及び癌細胞は、壊死細胞死によって死滅する。アブレーション領域外では、癌細胞のみが、細胞内小器官の膜電位の変化の結果としてのプログラム細胞死により死滅する一方で、健康な細胞は残される。したがって、細胞膜は、処置の主な標的ではなく、共鳴する追加の効果が核、ミトコンドリア、及び他の主要な膜結合細胞小器官などの細胞内構成要素を標的化する。実施形態では、これらの効果は、パルス長及び遅延時間の両方の最適化により達成される。例示的な実施形態では、パルス長が細胞膜の充電時間＋核膜の放電時間にほぼ等しくなるように最適化される一方で、遅延時間は、細胞膜の充電時間にほぼ等しくなるように最適化される。実施形態では、遅延時間は、パルス長の分数である。
【００４３】
本発明の実施形態は、健康な細胞を保存する一方で、異常細胞の細胞死をもたらす、腫瘍辺縁を越えた電界強度の範囲を生成するように設計されるパルスを含む。腫瘍辺縁内で、電界強度は、全ての細胞型を死滅させるのに十分である。加えて、本発明の実施形態は、健康な細胞に影響を及ぼさない一方で、異常細胞の核透過性の増強をもたらす、腫瘍辺縁を越えた電界強度の範囲を生成するように設計されるパルスを含む。腫瘍辺縁内で、電界強度は、全ての細胞型の核透過性を増強するのに十分である。加えて、本発明の実施形態は、健康な細胞に影響を及ぼさない一方で、異常細胞の分裂を減速させる、または停止する、腫瘍辺縁を越えた電界強度の範囲を生成するように設計されるパルスを含む。腫瘍辺縁内で、電界強度は、全ての細胞型の増殖速度を減速させるのに十分である。加えて、本発明の実施形態は、健康な細胞に影響を及ぼさない一方で、転移を予防するために異常細胞の遊走を停止する、腫瘍辺縁を越えた電界強度の範囲を生成するように設計されるパルスを含む。腫瘍辺縁内で、電界強度は、全ての細胞型の遊走を停止するのに十分である。加えて、本発明の実施形態は、異常細胞への血液及び栄養素の輸送を防止する、腫瘍辺縁を越えた電界強度の範囲を生成するように設計されるパルスを含む。腫瘍辺縁内で、血液及び栄養素の輸送は、全ての細胞型に対して防止される。
【００４４】
実施形態では、腫瘍辺縁内で生成される電界強度は、健康な細胞を保存する一方で、異常細胞に選択的である。電界波形は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、または正弦波であってもよく、かつ単極性または双極性であってもよい。実施形態では、電界波形は、低周波成分／調波及び高周波成分／調波からなる重畳二峰性信号であってもよい。実施形態では、電界波形は、連続して、長時間のマイクロ秒オーダのパルスと交互になった短時間のナノ秒オーダのパルスからなってもよい。
【００４５】
実施形態では、波形は、非対称であり、透過性膜を通じて外因性物質、化学物質、ＤＮＡ分子、またはナノ粒子を電気泳動的に駆動する。波形の搬送波周波数は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であってもよい。実施形態では、波形の搬送波周波数またはパルス持続時間は、細胞集団のクロスオーバ周波数に基づき選択される。他の実施形態では、パルスは、選択性を可能にするように、標的化された処置領域内の細胞集団の誘電特性に基づき最適化される。他の実施形態では、パルスは、選択性を可能にするように、標的化された処置領域内の細胞集団の物理的な核対細胞質のサイズ比に基づき最適化される。他の実施形態では、パルスは、選択細胞集団内で電気融合を生成するように設計される。
【００４６】
他の実施形態では、パルスは、核膜及び外膜の膜内外電位の同時調節を生成するように設計される。所望の調節効果は、核及び外膜の両方の可逆電気穿孔を誘発し得る。あるいは、所望の調節効果は、外膜の可逆電気穿孔及び核膜の不可逆電気穿孔を誘発し得る。あるいは、所望の調節効果は、壊死及びアポトーシスの両方を誘発する。あるいは、所望の調節効果は、細胞分裂を減速させる、または停止する。あるいは、所望の調節効果は、浸潤性細胞の転位を予防することである。
【００４７】
本処置は、外部デバイスを使用して、１時間未満続く単一のセッションで適用されてもよい。本処置は、外部または埋め込み型デバイスを使用して、複数日にわたって適用されてもよい。パルス間の静止時間は、異常細胞を選択するための最適化ルーチンの一部として変更されてもよい。パルスは、必要とされる効果的な電界強度を低下させ、かつソリッドステート切り替えデバイスの使用を可能にするために、反復的な様式で送達され得る。
【００４８】
実施形態では、必要とされる効果的な電界強度は、約１００〜１０，０００Ｖ／ｃｍである。ソリッドステート切り替えデバイスは、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列されてもよい。
【００４９】
本発明の実施形態は、健康な細胞を保存する一方で、細胞死をもたらし、異常細胞の増殖速度を減速させる、異常細胞の遊走を停止する、または異常細胞への血液及び栄養素の輸送を防止する、異常細胞増殖領域を越えた電界強度の範囲を生成するように設計される電気パルスを含み、異常細胞増殖領域内で、電界強度は、全ての細胞型を死滅させる、全ての細胞型の増殖速度を減速させる、全ての細胞型の遊走を停止する、または全ての細胞型への血液及び栄養素の輸送を防止するのに十分である。腫瘍辺縁内で、電界強度は、全ての細胞型の核透過性を増強するのに十分である。
【００５０】
本発明の実施形態は、対象の体内の異常細胞増殖領域内に、またはそれに隣接して導入されるように構成される少なくとも１つの電極と、電極に連結され、複数の電気パルスを印加して、健康な細胞を保存する一方で、異常細胞を死滅させる、異常細胞の増殖速度を減速させる、異常細胞の遊走を停止する、または異常細胞への血液及び栄養素の輸送を防止するように選択的な電界強度を有する、増殖領域内の電界を生成するように構成される、電圧パルス発生器とを備える、異常細胞増殖を患う対象を治療するシステムを含む。
【００５１】
本発明の実施形態は、対象の体内の異常増殖領域内に、またはそれに隣接して電極を埋め込むことと、複数の電気パルスを電極から異常細胞増殖領域内に放出させて、電界を生成することと、を含む、異常細胞増殖を患う対象を治療する方法を含み、異常細胞増殖領域内で生成される電界強度は、健康な細胞を保存する一方で、異常細胞を死滅させる、異常細胞の増殖速度を減速させる、異常細胞の遊走を停止する、または異常細胞への血液及び栄養素の輸送を防止するように選択的である。本方法の実施形態では、電界は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、または正弦波の単極性または双極性波形を有する。複数の電気パルスは、低周波成分及び高周波成分からなる重畳二峰性信号の形態をとってもよい。あるいは、複数の電気パルスは、連続して、長時間のマイクロ秒オーダのパルスと交互になった短時間のナノ秒オーダのパルスからなってもよい。本方法の実施形態では、複数の電気パルスの周波数は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲内であってもよい。本方法の実施形態では、パルスは、非対称であり、透過性膜を通じて外因性物質、化学物質、ＤＮＡ分子、またはナノ粒子を電気泳動的に駆動する。
【００５２】
本方法の実施形態では、必要とされる効果的な電界強度は、約１００〜１０，０００Ｖ／ｃｍである。パルスの搬送波周波数またはパルス持続時間は、細胞集団のクロスオーバ周波数に基づき選択されてもよい。あるいは、または加えて、パルスは、選択性を可能にするように、標的化された処置領域内の細胞集団の誘電特性または物理的な核対細胞質のサイズ比に基づき最適化されてもよい。本方法の実施形態では、パルスは、選択細胞集団内の電気融合を生成するように設計される。本方法の実施形態では、パルスは、核膜及び外膜の膜内外電位の同時調節を生成するように設計される。実施形態では、所望の調節効果は、外膜の可逆電気穿孔及び核膜の不可逆または可逆電気穿孔を誘発する。あるいは、または加えて、所望の調節効果は、壊死及びアポトーシスの両方を誘発する。
【００５３】
本方法の実施形態では、本処置は、外部デバイスまたは埋め込み型デバイスを使用して、少なくとも１つのセッションによって適用される。パルス間の静止時間は、異常細胞を選択するための最適化ルーチンの一部として変更されてもよい。実施形態では、パルスは、必要とされる効果的な電界強度を低下させ、かつソリッドステート切り替えデバイスの使用を可能にするために、反復的な様式で送達される。ソリッドステート切り替えデバイスは、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列されてもよい。
【００５４】
実施形態では、本発明のパルス、システム、及び方法は、生物医学的癌または腫瘍処置に適用され得る。
【００５５】
以下の図面は、本発明をさらに例示する。図１は、本発明の例示的な二重処置領域を示す。２つの黒丸を包囲する白い内側部分は、一対の電極を包囲するアブレーション領域を表す。アブレーション領域内で、健康な細胞及び癌細胞の両方が壊死する。アブレーション領域の外周の外側のオレンジ色の領域（白黒の図中では灰色の領域）は、選択的処置領域を表し、そこでは、癌細胞は死滅し、健康な細胞は残される。二重処置領域は、核膜などの細胞内膜の膜電位を標的化する、本発明の最適化されたパルスパラメータに起因する。
【００５６】
図２は、核膜内外電位に対するパルスパラメータの最適化の効果を示す。図面に見られるように、パルス長の分数である双極性パルス間の短い遅延時間は、単一のパルスの核膜内外電位（単一のパルス最大値）を超える核膜内外電位の増加（最適化されたパルス最大値）をもたらす。
【００５７】
図３は、癌細胞及び健康な細胞の核膜内外電位（ｎＴＭＰ）が、準最適なパルスに異なって応答することを示す。図面に示されるように、癌細胞の核膜内外電位が致死限界値に達する一方で、健康な細胞の核膜内外電位は、癌細胞の核膜内外電位の何分の１かでしかない。理論に束縛されるものではないが、これらの差は、部分的に、癌細胞内の核のより大きいサイズによるものであり得る。実施形態では、変数は、培地、細胞質、及び核質ドメインのそれぞれに対するＶ培地、Ｖ細胞質、Ｖ核質として定義される。次いで、変数は、細胞膜（ＴＭＰ）を（Ｖ培地−Ｖ細胞質）として、かつ核膜（ｎＴＭＰ）を（Ｖ細胞質−Ｖ核質）として計算するために定義される。
【００５８】
実施形態では、最適化されたパルスプロトコルは、細胞質と細胞内小器官との間の分子の輸送を増加させるために使用され得る。例えば、本発明の最適化されたパルスプロトコルは、電気遺伝子療法及び電気化学療法を増強し得る。加えて、非対称パルスは、電気泳動的転移を増強し得る。これは、図４に概略的に示される。
【００５９】
実施形態では、二峰性正弦波信号は、増幅効果を達成するために使用され得る。実際に、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの周波数成分を有する信号など、２つ以上の異なる周波数成分を有する任意の信号が使用され得る。例えば、図５Ｄは、２つの異なる周波数成分、第１の周波数成分（図５Ｂ）と、より高い第２の周波数成分（図５Ｃ）とを含む、二峰性正弦波信号を示し、核膜内外電位に対するそれらのそれぞれの効果は、図５Ｅ〜５Ｇに示される。図５Ａは、異なる核サイズを有する２つの異なる細胞の膜内外電位がどのようにプロットされるのかを示す、図５Ｅ〜５Ｇに対する重要な要素であり、破線は、８マイクロメートルの直径の細胞を表し、実線は、６マイクロメートルの直径の細胞を表す。
【００６０】
加えて、本発明の実施形態は、本方法の１つ以上のステップを実施することが可能な１つ以上のシステムを含んでもよい。本発明の一実施形態は、図６及び７に示される。本発明で使用され得る代表的な構成要素は、図６に示される構成要素のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、実施形態では、１つ以上のプローブ２２は、処置エネルギーを送達するために使用され得、標的組織の組織細胞を不可逆的に電気穿孔することが可能なパルスなど、処置エネルギーとして高電圧パルスを発生させる電圧パルス発生器１０によって電力供給される。示される実施形態では、電圧パルス発生器１０は、個々のレセプタクルに差し込まれるように適合される最大で６つの個々のプローブ２２を受容するための、６つの別々のレセプタクルを含む。レセプタクルはそれぞれ、順序通りの番号でラベル付けされる。他の実施形態では、電圧パルス発生器は、６つ超または未満のプローブを受容するための任意の数のレセプタクルを有することができる。
【００６１】
例えば、本発明に従った処置プロトコルは、複数の電極のうちの１つ以上を含み得る。所望の処置パターンに従って、複数の電極は、互いに対して様々な位置に配置され得る。特定の実施例では、複数の電極は、ほぼ中心においてなど、円の内部に配置される単一の電極を有する比較的円形のパターン内に配置され得る。電極の任意の構成が可能であり、配列は、円形である必要はないが、凸状または凹状の多角形形状を含む、任意の規則的または不規則的多角形形状を含む、任意の形状周辺部が、処置される範囲に応じて使用され得る。単一の中心に位置する電極が接地電極であってもよい一方で、複数の他の電極は、電圧印加され得る。任意の数の電極は、約１〜２０など複数であってもよい。実際に、３つの電極でさえ、１つの接地電極が電圧印加されることが可能な２つの電極間に配置される、複数の電極を形成することができ、または４つの電極が、２つの電極対を提供する様式で配置され得る（各対は、１つの接地及び電圧印加されることが可能な１つの電極を含む）。処置中、処置方法は、例えば、同時に１つ以上の電極に電圧印加すること、及び／または順次に、交互パターンで、スキップパターンでなど、特定の配列の１つ以上の電極に電圧印加する、及び／または同時に全ての電極ではないが複数の電極に電圧印加することなど、任意の配列の電極に電圧印加することを伴い得る。
【００６２】
示される実施形態では、各プローブ２２は、絶縁スリーブによって分離される２つの電極を有する、単極性電極または双極性電極のいずれかを含む。一実施形態では、プローブが単極性電極を含む場合、電極の活性部分の曝露の量は、電極に対して絶縁スリーブを後退または前進させることによって調節され得る。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３４４，５３３号を参照されたい。パルス発生器１０は、キーボード１２及びポインティングデバイス１４などの入力デバイスと、安全マージン３０１によって包囲される病変３００などの標的処置範囲の画像を見るための表示デバイス１１などの出力デバイスとを有する、処置制御コンピュータ４０に接続される。処置エネルギー送達デバイス２２は、患者１５内の病変３００を処置するために使用される。撮像デバイス３０は、リアルタイムで患者１５内の病変３００を見るためのモニタ３１を含む。撮像デバイス３０の例としては、当該技術分野において既知のような超音波、ＣＴ、ＭＲＩ、及びＸ線透視デバイスが挙げられる。
【００６３】
本発明は、以下でより詳細に考察されるように、ユーザが医療処置手技を計画し、実行し、その結果を考察することを補助する、コンピュータソフトウェア（処置計画モジュール５４）を含む。例えば、処置計画モジュール５４は、ユーザが、最も効果的な処置領域を作り出す方法で、病変３００と関連付けて処置エネルギー送達デバイス２０のプローブ２２のそれぞれをより正確に位置付けることを可能にすることによって、ユーザが医療処置手技を計画することを補助する。処置計画モジュール５４は、プローブの位置及び処置パラメータに基づき、予想された処置領域を表示することができる。加えて、処置計画モジュール５４は、ユーザがＩＲＥに対する１つ以上のパラメータを入力することを可能にするユーザインターフェースを有してもよい。
【００６４】
処置計画モジュール５４は、リアルタイムで処置の進行を表示することができ、かつ処置手技が完了した後のその結果を表示することができる。この情報は、それが、例えば、処置が成功したかどうか、及び／または患者を再処置することが必要もしくは所望であるかどうかを決定するために、治療医師によって使用され得る様式で表示され得る。
【００６５】
本願の目的で、用語「コード」、「ソフトウェア」、「プログラム」、「アプリケーション」、「ソフトウェアコード」、「コンピュータ可読コード」、「ソフトウェアモジュール」、「モジュール」、及び「ソフトウェアプログラム」は、プロセッサによって実行可能であるソルトウェア命令を意味するようにほとんど同じ意味で使用される。「ユーザ」は、例えば、医師または他の利用専門家を含む、任意のヒトであってもよい。プロセッサによって実行される処置計画モジュール５４は、発生器１０と関連するモニタ１１に、テキスト及びグラフィックデータを含む様々なデータを出力する。
【００６６】
ここで図７を参照すると、本発明の処置制御コンピュータ４０は、患者のための処置の計画を管理する。コンピュータ４０は、ＵＳＢ（ユニバーサル・シリアル・バス）インターフェースなどのＩ／Ｏインターフェース４２を介して通信リンク５２に接続され、通信リンク５２上で電圧発生器１０から情報を受信し、かつそこに情報を送信する。コンピュータ４０は、全てバス５３を介して互いに共通接続される、ＲＡＭなどのメモリ記憶４４と、プロセッサ（ＣＰＵ）４６と、ＲＯＭまたはＥＥＰＲＯＭなどのプログラム記憶装置４８と、ハードディスクなどのデータ記憶装置５０とを含む。プログラム記憶装置４８は、とりわけ、処置を計画し、実行し、かつその結果を考察するときにユーザと相互作用する、ユーザインターフェースモジュールを含む、処置計画モジュール５４を記憶する。プログラム記憶装置４８内のソフトウェアプログラムモジュール及びデータ記憶装置５０からのデータのいずれも、必要に応じてメモリ４４に転送され、ＣＰＵ４６によって実行され得る。
【００６７】
実施形態では、ユーザインターフェースは、コンピュータ可読コードと併用され得るグラフィカルユーザインターフェースであってもよい。ユーザインターフェースは、ユーザが、ＩＲＥのための処置プロトコルの設定において、処置計画モジュール５４によって使用される１つ以上のパラメータを記録または入力することを可能にし得る。ユーザインターフェースは、テキストフィールド、チェックボックス、プルダウン、スライダ、コマンドボタンなどの入力を可能にし得る。この入力５４に基づき、処置計画モジュール５４は、標的組織のＩＲＥのための閾値電界、及びこの閾値電界を生成するのに十分な様式でＩＲＥを適用するための処置プロトコルの１つ以上のパラメータを計算することができる。
【００６８】
実施形態では、処置計画モジュール５４は、実施際に記載されるような数値モデリング能力を提供する。モデルは、処置前に、様々なパルスパラメータの核及び細胞の膜内外電位をシミュレーションするために使用されてもよい。ユーザインターフェースは、図１０の表に列挙されるパラメータ、ならびにパルス長、パルス間遅延、電界強度などに対する値のうちの１つ以上の入力を可能にし得、これらから、核及び細胞の膜内外電位のグラフ表示がプロットされ得る。加えて、処置計画モジュールは、パラメータのうちの１つ以上の入力に基づき、表示デバイス１１上のアブレーション領域及び包囲する選択的処置領域の視覚化を可能にし得る。
【００６９】
一実施形態では、コンピュータ４０は、電圧発生器１０に内蔵される。別の実施形態では、コンピュータ４０は、通信リンク５２を介して電圧発生器に接続される分離ユニットである。好ましい実施形態では、通信リンク５２は、ＵＳＢリンクである。一実施形態では、撮像デバイス３０は、コンピュータ４０に接続されない独立型デバイスである。図６に示される実施形態では、コンピュータ４０は、通信リンク５３を介して撮像デバイス３０に接続される。示されるように、通信リンク５３は、ＵＳＢリンクである。本実施形態では、コンピュータは、撮像デバイス３０から受信される画像データなどのデータを解析することによって、病変３００のサイズ及び配向を決定することができ、コンピュータ４０は、この情報をモニタ１１上に表示することができる。本実施形態では、撮像デバイス３０によって生成される病変画像は、処置計画モジュール５４を実行するコンピュータの表示デバイス（モニタ）１１のグリッド（図示せず）上に直接表示され得る。本実施形態は、グリッド上の病変画像の正確な表示を提供し、グリッド上に病変画像を作るために病変の寸法を手動で入力するステップを排除し得る。本実施形態はまた、病変が不規則な形状を有する場合、病変画像の正確な表示を提供するのに有用である。
【００７０】
ソフトウェアがパルス発生器１０から独立して使用され得ることが留意されるべきである。ユーザは、以下で説明されるように異なるコンピュータ上で処置を計画し、次いで、処置パラメータをＵＳＢフラッシュドライブなどの外部メモリデバイス（図示せず）に保存することができる。任意の非一時的コンピュータ可読媒体が、特定の処置プロトコルのためのソフトウェア及び／またはソフトウェアの出力を格納するために使用され得る。次いで、処置パラメータに関するメモリデバイスからのデータは、処置のために発生器１０と共に使用されるコンピュータ４０上にダウンロードされ得る。加えて、ソフトウェアは、電気エネルギーを送達する処置をユーザに教育する目的で、アブレーションの領域、温度閾値またはカットオフ、及び電界閾値またはカットオフの仮説的な説明のために使用され得る。例えば、データは、特定のプロトコルを実行するためのデバイスにプログラミングされるよりもむしろ、特定の患者に対する好ましい処置プロトコルを決定または推定するために、ヒトによって評価され得る。処置プロトコルは、処置計画モジュール５４によって計算されたＩＲＥを誘発するための最小電界閾値を生成するように設計され得る。
【００７１】
図８は、高電流、低電流、高電圧、または低電圧状態などの印加されたパルスの異常を検出するための回路の一実施形態を示す。この回路は、発生器１０内に位置する（図６を参照されたい）。ＵＳＢ接続５２は、ユーザコンピュータ４０から制御装置７１に命令を送信する。制御装置は、図２に示されるように、コンピュータ４０と同様のコンピュータであってもよい。制御装置７１は、プロセッサ、ＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、マイクロコントローラ、またはワイヤードロジックを含むことができる。次いで、制御装置７１は、パルス発生回路７２に命令を送信する。パルス発生回路７２は、パルスを発生させ、電気エネルギーをプローブに送信する。明確にするために、一対のプローブ／電極のみが示される。しかしながら、発生器１０は、任意の数のプローブ／電極（例えば、６個などの１〜１０個のプローブ）を収容し、アブレーション領域の形状をカスタマイズするために、同時に複数の電極に電圧印加することができる。示される実施形態では、パルスは、一度に一対の電極が印加され、次いで、別の対に切り替えられる。パルス発生回路７２は、スイッチ、好ましくは、コンピュータ４０から受信される命令に基づき、プローブの対を切り替える電子スイッチを含む。センサなどのセンサ７３は、リアルタイムでプローブの各対の間の電流または電圧を検知し、そのような情報を制御装置７１に通信することができ、制御装置７１は、その情報をコンピュータ４０に通信する。センサ７３が高電流または低電流状態などの処置中の異常な状態を検出する場合、それは、制御装置７１及びコンピュータ４０と通信し、それによって、制御装置が信号をパルス発生回路７２に送信して、その特定のプローブの対に対するパルスを中止し得る。処置計画モジュール５４は、処置進行を追跡し、かつユーザに、低パルスもしくは不足パルスまたは過電流パルスに対して自動的に再処置する選択肢を提供する特徴をさらに含むことができる（以下の考察を参照されたい）。また、発生器が何らかの理由により途中で停止する場合、処置計画モジュール５４は、それが終了した同じ時点で再開し、同じ処置の一部として不足している処置パルスを適用することができる。他の実施形態では、処置計画モジュール５４は、処置中のある特定のエラーを検出することができ、それは、「充電故障」、「ハードウェア故障」、「高電流故障」、及び「低電流故障」を含むがこれらに限定されない。
【００７２】
電気穿孔法による望ましくない組織の破壊（アブレーション）のための一般的な処置プロトコルが既知である。それらは、望ましくない組織の付近に、かつ組織と、望ましくない組織の一領域または全範囲の全体にわたって細胞の不可逆電気穿孔を引き起こす電気パルスのアプリケーションとの間で良好に電気接触して、電気穿孔電極を挿入すること（担持すること）を伴う。膜が不可逆的透過されたであった細胞は、除去されてもよく、または原位置に残されても（除去されなくても）よく、したがって、身体の免疫系によって徐々に除去されてもよい。細胞死は、望ましくない範囲内に不可逆電気穿孔の電気パラメータを誘導することによってもたらされる。
【００７３】
電気穿孔プロトコルは、組織内に電界の生成をもたらし、電気パルスのジュール加熱によって影響を受ける。組織電気穿孔プロトコルを設計するとき、有害な熱効果を誘発することなく、組織透過性を最大化する適切な電気パラメータを決定することが重要である。組織の実質的な体積が、細胞への有害な熱効果を誘発することなく、可逆電気穿孔法で電気穿孔され得、これらの体積が定量化されていることが示されている（Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．，Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，ａｎｄ  Ｌ．Ｍ．Ｍｉｒ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３．Ｖｏｌ．６１（１−２）：ｐ．９９−１０７）。
【００７４】
組織内で不可逆電気穿孔を誘発するために使用される電気パルスは、可逆電気穿孔に必要とされる電気パルスより大きさ及び持続時間が典型的には大きい。さらに、不可逆電気穿孔のためのパルスの持続時間及び強度は、細胞内電気操作または熱アブレーションなどの電気パルスを使用した他の方法とは異なる。方法は、細胞内（ナノ秒）電気操作が細胞死を引き起こす、例えば、腫瘍の組織を焼灼するために使用されるとき、または熱効果が細胞に損傷をもたらし、細胞死を引き起こすときでさえ、非常に異なる。
【００７５】
不可逆電気穿孔のためのパルス長に対する典型的な値は、約５マイクロ秒〜約６２，０００ミリ秒または約７５マイクロ秒〜約２０，０００ミリ秒または約１００マイクロ秒±１０マイクロ秒の範囲内である。これは、細胞内（ナノ秒）電気操作において一般に使用されるパルス長より有意に長く、１マイクロ秒以下であり、米国公開特許出願第２００２／００１０４９１号を参照されたい。
【００７６】
パルスは、典型的には、組織によって経験される局所電界が不可逆電気穿孔に対して約１００Ｖ／ｃｍ〜７，０００Ｖ／ｃｍまたは２００Ｖ／ｃｍ〜２０００Ｖ／ｃｍまたは３００Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍ、約６００Ｖ／ｃｍであるような電圧で適用される。これは、細胞内電気操作のために使用されるものよりも実質的に低く、約１０，０００Ｖ／ｃｍであり、米国公開特許出願第２００２／００１０４９１号を参照されたい。
【００７７】
上記で表現される電圧は、電圧勾配（１センチメートル当たりの電圧）である。電極は、異なる形状及びサイズであってもよく、互いから異なる距離に位置付けられてもよい。形状は、円形、楕円形、正方形、矩形、または不規則などであってもよい。１つの電極からもう１つの電極への距離は、例えば、約０．５〜１０ｃｍ、１〜５ｃｍ、または２〜３ｃｍの範囲内であってもよい。電極は、例えば、０．１〜５平方ｃｍまたは１〜２平方ｃｍの表面積を有してもよい。
【００７８】
電極のサイズ、形状、及び距離は、変化することができ、そのようなものは、使用される電圧及びパルス持続時間を変化させ得る。当業者は、本開示に従ってパラメータを調節して、所望の程度の電気穿孔を得、周囲の細胞への熱損傷を回避する。
【００７９】
電気穿孔手技の効果を決定する主要な要因は、組織が曝露される電界である。しかしながら、ＩＲＥプロトコルは、処置の毒性にも影響を及ぼし得る様々な電気パルスパラメータを有する。電界に加えて、これらは、パルス形状、パルス数、パルス長、及び反復率を含む。パルス中のＩＲＥ処置の熱効果は、組織の導電率及びそれが曝露される電圧の一次関数である。したがって、特定の組織の種類に対する熱効果を最小限に抑えることは、組織内の細胞を死滅させるために、最低限必要な電界、及びしたがって、印加電圧を見つけることによって行われ得る。
【００８０】
この目的で、本発明の実施形態に従ったパルスパラメータ及び電極構成は、以下のうちのいずれかの任意の組み合わせを含むことができる：約１μｓ〜１ｍｓの範囲内のパルス長；約１μｓ〜１ｍｓの範囲のパルス数；約５〜５，０００Ｖ／ｃｍに及ぶ各導電性ワイヤ対に対する、及び／または処置領域にわたる電界分布；約０．１〜約５００ｍＣの各導電性ワイヤ対によって、かつ／または処置領域にわたって送達される総電荷；約０．００１〜１００Ｈｚの範囲のパルス印加の周波数；約０〜１００ＭＨｚの範囲のパルス信号の周波数；現在好ましいパルス形状は二相性ＤＣパルスであるが、方形波、指数関数減衰波、のこぎり波、正弦波、または交互極性であるパルス形状、正、負、及び中性電荷パルス（パルス内で極性を変化させる）；約０〜約１００アンペアの範囲の処置された組織内の得られる電流、１〜２０個の電極及び／または導電性ワイヤ、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の電極及び／または導電性ワイヤ分離距離；ならびに結果を特殊化／カスタマイズするために、電極を除去して、それらを組織内の異なる位置に置き換えること、または電極の数を変更することなど、同じ処置内で上記のパラメータのいずれかを変更することを含む、単一の処置のための複数の組のパルス／電極パラメータ。
【００８１】
実施形態では、処置プロトコルは、そのオーダでパルス間に遅延を伴う、約２５０ｎｓ〜５０μｓの範囲内のパルス長を採用することができる。約５μｓ〜約０．５ｍｓ、または約１０μｓ〜約０．１ｍｓ、または約１５μｓ〜約９５μｓなど、約１μｓ〜１ｍｓの範囲のパルス長もまた可能である。２０μｓ、２５μｓ、３０μｓ、３５μｓ、４０μｓ、４５μｓ、５０μｓ、５５μｓ、６０μｓ、６５μｓ、７０μｓ、７５μｓ、８０μｓ、８５μｓ、９０μｓ、１１０μｓ、１５０μｓ、または２００μｓなどのパルス長もまた許容できる。いくつかの実施形態では、電気穿孔による療法のパルス持続時間は、１００μｓを超え得る。任意の長さのパルスまたはパルス列は、本発明に従った実施形態で適用され得る。例えば、１０ピコ秒〜約１０秒、または例えば、約１００ピコ秒〜約１秒、または１ナノ秒〜１００ミリ秒、または約１０ナノ秒〜約１０ミリ秒、または約１００ナノ秒〜約１ミリ秒、または約１マイクロ秒もしくは１０マイクロ秒〜約１００マイクロ秒など、約１ピコ秒〜１００秒のパルス長が使用され得る。いくつかの実施形態は、約１１０、もしくは１２０、もしくは１３０、もしくは１４０、もしくは１５０、もしくは２００、もしくは３００、もしくは３５０、もしくは４００、もしくは５００、もしくは６００、もしくは７００、もしくは８００、もしくは９００マイクロ秒、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ミリ秒、またはさらには１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ミリ秒、またはさらには、例えば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ミリ秒からのパルス長など、約１００マイクロ秒〜約１秒の範囲のパルス長を有してもよい。
【００８２】
例示的な実施形態では、パルスは、単極性または双極性であり、パルス長は、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、及び９０μｓ、またはこれらの値の間の任意の範囲を含む、約０．２５マイクロ秒〜約１００マイクロ秒の範囲であってもよい。
【００８３】
例示的な実施形態では、連続パルスは、単極性であるか、双極性であるかにかかわらず、０．２マイクロ秒、０．３マイクロ秒、０．４マイクロ秒、０．５マイクロ秒、０．６マイクロ秒、０．７マイクロ秒、０．８マイクロ秒、０．９マイクロ秒、１マイクロ秒、１．５マイクロ秒、２マイクロ秒、２．５マイクロ秒、３マイクロ秒、３．５マイクロ秒、４マイクロ秒、４．５マイクロ秒、５マイクロ秒、５．５マイクロ秒、６マイクロ秒、６．５マイクロ秒、７マイクロ秒、７．５マイクロ秒、８マイクロ秒、８．５マイクロ秒、９マイクロ秒、９．５マイクロ秒、１０マイクロ秒、２０マイクロ秒、３０マイクロ秒、４０マイクロ秒、５０マイクロ秒、６０マイクロ秒、７０マイクロ秒、８０マイクロ秒、９０マイクロ秒、１００マイクロ秒、１２０マイクロ秒、１４０マイクロ秒、１６０マイクロ秒、及び１８０マイクロ秒、またはこれらの値の間の任意の範囲を含む、約０．１マイクロ秒〜約２００マイクロ秒のパルス間遅延を有してもよい。
【００８４】
例示的な実施形態では、パルス間遅延は、パルス長の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、及び９５％、またはこれらの値の間の任意の範囲を含む、パルス長の一部分である。例示的な実施形態では、パルス間遅延は、パルス長の１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２．０×、２．２×、２．４×、２．６×、２．８×、３．０×、３．２×、３．４×、３．６×、３．８×、４．０×、４．２×、４．４×、４．６×、４．８×、５．０×、５．５×、６．０×、６．５×、７．０×、７．５×、８．５×、９．０×、９．５×、及び１０．０×、またはこれらの値の間の任意の範囲を含み、パルス長を超える。
【００８５】
パルス数は、例えば、５〜５，０００、または約１０〜２，０００、または約２０〜１，０００、または約３０〜５００、または約５０〜２００、または約７５〜１５０、または約９０〜１２０、または約９５〜１１０、または約１００個のパルスに及び得る。他の実施形態によると、パルス数は、約１０〜約３５０パルスなどの約５〜約４００パルス、または例えば、約２０〜約２５０パルスを含む、約１５〜約３００パルス、または約３０〜約１５０パルス、例えば、約５０〜約１２５パルス、約７５〜約１７５パルスなどの約２５〜約２００パルス、または約１００パルスなどの約９０〜１１０パルスに及び得る。
【００８６】
典型的には、各導電性ワイヤ対に対する、及びＩＲＥのための処置領域にわたる電界分布は、例えば、１５００Ｖ／ｃｍ〜２０００Ｖ／ｃｍ、２０００Ｖ／ｃｍ〜３０００Ｖ／ｃｍ、３０００Ｖ／ｃｍ〜４０００Ｖ／ｃｍ、２０００Ｖ／ｃｍ〜４０００Ｖ／ｃｍ、２５００Ｖ／ｃｍ〜４０００Ｖ／ｃｍなどを含む、１５００Ｖ／ｃｍ〜４，０００Ｖ／ｃｍの範囲の電圧を使用して実施される。約１５００Ｖ／ｃｍ未満を使用することを含む、はるかに低い電力の電圧もまた使用され得る。約５００Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍ、もしくはさらには約５０Ｖ／ｃｍ〜約２００Ｖ／ｃｍなどの約１０Ｖ／ｃｍ〜約７５０Ｖ／ｃｍの印加電界、または約７５Ｖ／ｃｍ〜約１００Ｖ／ｃｍの電界分布が使用され得る。例えば、脳腫瘍の処置において、典型的には、１０００Ｖ／ｃｍ未満の印加電界が使用され得る。使用され得る電気パルス発生器は、例えば、０〜３，０００Ｖを送達することができる、ＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）のＮａｎｏＫｎｉｆｅ（登録商標）システムなど、０〜約５，０００Ｖを送達することが可能である電気パルス発生器を含む。
【００８７】
別の実施形態では、電気穿孔による療法のパルスの振幅は、約２２００Ｖ／ｃｍ、または約３０００Ｖ／ｃｍなどの２５００Ｖ／ｃｍ、または３５００Ｖ／ｃｍ、または４５００Ｖ／ｃｍなどの約４０００Ｖ／ｃｍ、または約５５００Ｖ／ｃｍなどの約５０００Ｖ／ｃｍ、または約６０００Ｖ／ｃｍ、または約７０００Ｖ／ｃｍなどの約６５００Ｖ／ｃｍ、または８０００Ｖ／ｃｍなどの約７５００Ｖ／ｃｍ、または９０００Ｖ／ｃｍを含む約８５００Ｖ／ｃｍ、または約１０，０００Ｖ／ｃｍなどの約９５００Ｖ／ｃｍなどの振幅を含み、２０００Ｖ／ｃｍを超える。本明細書の文脈における振幅は、電気パルスを使用して印加され、かつパルスが正または負のいずれかの極性であり得る、電気エネルギーの大きさを指す。
【００８８】
本発明の方法によると、パルスのサイクル時間は、概して約１Ｈｚに設定される。さらに、隣接する電極の交互極性が、電荷蓄積を最小限に抑え、より均一な処置領域を提供することがわかっている。より具体的には、本発明者らによって実施された実験において、ステンレス鋼電極表面上の電荷蓄積を防止するために、組間に交互極性を有する、９組の１０の５０μｓパルス（電圧対距離比２０００Ｖ／ｃｍ）を送達することによって、ＮａｎｏＫｎｉｆｅ（登録商標）（Ａｎｇｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｑｕｅｅｎｓｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）発生器、先端が丸い双極性電極（Ａｎｇｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｎｏ．２０４００２ＸＸ）を使用して、側頭葉の頭側（シルヴィウス外回）に表在性局所焼灼ＩＲＥ病変を作った。イヌの脳に対するエクスビボの実験から、これらのパラメータを決定し、手技中に送達される電荷が、電気けいれん療法（大鬱病のためのＦＤＡ承認治療）中にヒトの脳に送達される電荷よりも低いことを確実にした。脳への過剰な電荷送達は、記憶喪失を誘発する可能性があり、したがって、好ましくは回避される。
【００８９】
特定の方法の実施形態は、例えば、約１０Ｈｚ〜２０ＧＨｚなどの約１Ｈｚ〜２０ＧＨｚ、または約５０Ｈｚ〜５００Ｈｚ、または１００Ｈｚ〜１ｋＨｚ、または１０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚ、または２５０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、または９００ｋＨｚ〜２ＭＨｚなどの５００ｋＨｚ〜１ＭＨｚ、または約２００ＭＨｚ〜約１５ＧＨｚを含む約１００ＭＨｚ〜約１０ＧＨｚなどのパルス速度を使用して、電気穿孔による療法を適用することを採用してもよい。例示的な実施形態では、パルス速度は、１００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚである。
【００９０】
好ましい実施形態では、約１ｍＣ〜約２０ｍＣ、または約１．５ｍＣ〜約１５ｍＣ、または約２ｍＣ〜約１０ｍＣ、または約５ｍＣ〜約８ｍＣなどの、各導電性ワイヤ対によって、かつ／または約０．５〜約２５ｍＣの処置領域わたって送達される総電荷が使用され得る。同様に、好ましい実施形態では、処置された組織内の得られる電流は、例えば、４Ａなど、約１Ａ〜約８Ａ、または約２Ａ〜約６Ａ、または約３Ａ〜約５Ａに及び得る。実際に、ある特定の用途に対して、送達される総電荷は、約１０ｍＣ〜約２００ｍＣ、または約１５ｍＣ〜約１５０ｍＣ、または約２０ｍＣ〜約１００ｍＣ、または約５０ｍＣ〜約８０ｍＣなど、約０．５〜約５００ｍＣに及び得る。処置された組織内の得られる電流は、例えば、４０Ａなど、約１Ａ〜約８０Ａ、または約２０Ａ〜約６０Ａ、または約３０Ａ〜約５０Ａに及び得る。ＩＲＥ処置のための電流が４０及び５０アンペアに達するか、またはそれを超えることは珍しくはなく、同様にそのような条件下で動作することが可能なパルス発生器を用いて、さらに高い電流下で動作することがさらに実現可能である。電流は、ある特定の用途において、特に、血管中に存在する血液など、組織または培地が高導電性である範囲内で動作するとき、高くなることが予測される。組織内のパルス幅、パルス形状、パルス数、及び得られる電流は、総電荷を制限するための特定の目標を達成するように調節され得、本明細書に開示される特定の値のいずれかが、目標の予測電荷を計算するために使用され得る。
【００９１】
任意の数の導電性ワイヤまたは電極が使用され得る。しかしながら、好ましい実施形態では、３〜１６、または約３〜１５、または４〜１２、または５〜１０、または６〜８など、３〜約１８個の電極が使用される。電極／ワイヤのうちの任意の１つ以上が、特定の処置結果を達成するために、選択的に電圧印加され得る。さらに、導電性ワイヤ及び／または電極などの導電性表面間の分離距離は、約０．３ｍｍ〜約３ｍｍ、もしくは約０．４ｍｍ〜約２ｍｍ、もしくは約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの範囲などの約０．２ｍｍ〜約４ｍｍ、または約０．９ｍｍ〜約３ｃｍ、もしくは約１．２ｃｍ〜約２ｃｍ、もしくは約１．５ｃｍ〜約１．８ｃｍなどの約０．８ｍｍ〜約４ｃｍなどに及び得る。
【００９２】
本発明の実施形態で使用され得るプロトコルの追加のパラメータは、米国公開特許出願第ＵＳ  ２００７／００４３３４５号、同第２００９／０２６９３１７号、同第２０１１／０１０６２２１号、同第２０１２／０１０９１２２号、同第２０１３／０１８４７０２号、同第２０１３／０３４５６９７号、同第２０１４／００３９４８９号、及び同第２０１５／００８８１２０号、ならびに米国特許第８，９２６，６０６号、同第８，９９２，５１７号、同第８，８１４，８６０号、同第８，４６５４８４号に提供され、それらのそれぞれの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
実施例
【００９４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのに役立つ。
【００９５】
実施例１は、健康な組織を残す一方で、癌細胞内の細胞内効果を調節するように特に最適化されている高周波電界の１つ以上のバーストを使用する、二峰性増強アブレーション機構（ＢＥＡＭ）プラットフォームを示す。最適なバーストは、細胞膜の充電時間＋核膜の放電時間にほぼ等しい持続時間を有する構成的パルスを含む。この新規の概念は、以下の項でさらに説明され、外部マーカの必要性はないが、医薬化合物に対する同様の特異性を有する、特定の癌の種類を標的化することに関する示唆がある。
【００９６】
実施例２は、高周波双極性バーストのインビトロ効果を示す。バースト内の個々のパルスは、極性が交互になった２μｓで連続のパルスによって分離される。バーストは、１秒当たり１回を８０秒間繰り返され、各バーストは、細胞を印加電圧に１００μｓ曝露する。細胞膜及び細胞内小器官に対するこれらのパルスの効果を説明するために、本発明者らは、核膜を含む細胞の有限要素モデルを示す。脂質二重層及び核膜の電荷挙動は、２５０ｎｓ〜５０μｓのパルスへの応答で評価される。細胞内及び細胞外導電率、核対細胞質比、ならびにパルス間遅延時間に対して、パラメータ解析が実施される。インビトロ実験は、プロトコルの非熱性質を確認し、この中間のパルス幅範囲内の不可逆電気穿孔を説明するために示される。
【００９７】
実施例３では、本発明者らは、２５０ｎｓ〜１００μｓのパルス持続時間間隔を調査し、３Ｄ腫瘍模倣体を使用した特定の二峰性増強アブレーション機構（ＢＥＡＭ）プロトコルに対する致死電界強度を計算した。本発明者らは、０．２５、０．５、１、２、５、１０、及び５０μｓのパルスを含むバーストに対する公称致死限界値がそれぞれ、２０２２、１６８７、１０７０、７５５、６４０、６２９、及び５３１Ｖ／ｃｍであったことがわかった。インビボでＢＥＡＭの有効性を調査するために、マウス腫瘍モデルを使用した。２００回のバーストの腫瘍を曝露し、それぞれは、１００μｓ電圧印加され、１、２、または５μｓの持続時間の個々のパルスを含んだ。全ての処置群において、平均腫瘍増殖は、対照と対比して実質的に阻害された。１４匹の処置されたマウス中６匹が、処置の３０日後、腫瘍の測定可能な兆候がなく、全てのプロトコルは、完全な退縮を達成することができた。この研究は、ＢＥＡＭが局所療法として使用される可能性を示し、より大きい前臨床モデルにおけるその調査の価値がある。
【００９８】
実施例４において、本発明者らは、細胞の電気破壊に基づく物理的処理方法を報告し、その作用は、細胞形態に強く依存する。興味深いことに、数値モデリングは、長いパルス（約１００μｓ）によって誘発される外側の脂質二重層の破壊が、より大きい細胞に対して増強される一方で、短いパルス（約１μｓ）が細胞内部内に高い電界を優先的にもたらし、その大きさは核サイズに対応することを示唆する。拡大された核が悪性度の信頼性のある指標を示すため、これは、悪性の細胞を優先的に標的化するための一方法を示す。本発明者らは、自然発生イヌＧＢＭを治療するための、パルス電界（ＰＥＦ）を使用した正常な細胞及び悪性の細胞の両方の死滅を説明する一方で、適切に調整されたＰＥＦが核サイズに基づく標的化アブレーションを提供するために使用され得る。処置試験中の高解像度照合を可能にする、正常な脳組織及び悪性の脳組織の３Ｄヒドロゲルモデルを使用して、本発明者らは、ＰＥＦが癌性細胞を優先的に死滅させるように調整され得ることを確認した。最後に、本発明者らは、ＰＥＦから細胞死に必要な核膜電位破壊を推定した。結果は、ＧＢＭ腫瘍の再発を引き起こす療法抵抗性細胞ニッチを安全に標的化するのに有用であり得る。
【００９９】
実施例１
【０１００】
懸濁液中の細胞の数値モデルをＣｏｍｓｏｌ  ４．２ａで作った。２つのスキームを使用して、膜被覆球として細胞をモデリングした。第１のモデルにおいて、試料流体（細胞の外部）、細胞膜、及び細胞質（細胞の内部）を表す、個々のドメインを作った。細胞膜を表す５ｎｍ厚の球形シェルドメインは、デフォルトメッシュパラメータへの有意な修正を必要とし、多数の四面体要素をもたらした。簡潔に、全体的な形状に「極めて粗い」の定義済みの密度を有する単一のメッシュを割り当てた。次いで、８１７，１８４個の四面体要素を有する形状をうまくメッシュするために、デフォルトパラメータに対する値を、最小要素サイズ（０．０００２５）、最大要素増加率（１．２）、曲率の解像度（０．０４）、及び狭領域の解像度（０．０００１）に対して変化させた。クアッドコア３．０ＧＨｚプロセッサ及び８ＧＢのＲＡＭを有するコンピュータは、１，０９２，９０２の自由度を有する１４μｓの過渡モデルを解決するために、１５時間の計算時間を必要とした（図９に示される結果）。このモデルは、推定上、最も正確なアプローチであり、０．０１〜１０Ｓ／ｍの導電率に対するＴＭＰの周波数、正弦波、及びパルス応答を計算するために使用した。しかしながら、計算コストが高く、膜内外電位の解析を細胞外膜に限定した。
【０１０１】
双極性方形波のバーストの効果及び核膜に対する効果をモデリングするために、より効率的なインピーダンス境界条件モデルを使用した。この方法において、立方体ドメインは、実験的培地を表し、２つの球体は、細胞質及び核質のそれぞれに対するドメインを表した。各ドメインに対して、別々の電流物理学モジュールを使用し、従属電圧変数を培地、細胞質、及び核質ドメインのそれぞれに対して、Ｖ培地、Ｖ細胞質、Ｖ核質と定義した。次いで、細胞膜（ＴＭＰ）及び核膜（ｎＴＭＰ）を（Ｖ培地−Ｖ細胞質）及び（Ｖ細胞質−Ｖ核質）のそれぞれとして計算するために、変数を定義した。電流モジュールにおいて、膜を表す境界を、隣接ドメイン中の電圧として規定される基準電圧を有するインピーダンス境界条件として定義した。培地ドメインにおいて、細胞膜を表す境界を、Ｖ細胞質の基準電圧を有するインピーダンス境界として定義した。層仕様を「薄層」として定義し、導電率、比誘電率、及び表面厚さを、図１０の表に示される値を使用して定義した。
【０１０２】
インピーダンス境界条件モデルにおいて、メッシュを、１７，８２５個の四面体要素をもたらす「通常」サイズの要素を有する単一のフリー四面体群として定義した。このモデルの予備研究において、追加のメッシュ細分化ステップ（細分化の数＝２）もとった。細分化を用いて、同じ１４μｓシミュレーションのこの計算を、２７分で完了した。細分化なしでは、計算時間をさらに１４分まで低減した。物理的境界モデルと比較して、両方のインピーダンス境界構成が同様の結果を十分に再現した。細分化されていないインピーダンス境界条件モデルを使用して、残りのパラメータ研究を実施した。
【０１０３】
解析モデリング
電気穿孔法に対する二峰性正弦波の効果を調査するために、求心性の核を有する球状細胞に対する周波数ドメイン中のラプラス方程式を解いた解析モデルを実施した（Ｙａｏ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｎｅｒ  ａｎｄ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅｄ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｆｉｅｌｄ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｃｉ，２００７．３５（５）：ｐ．１５４１−１５４９）。各細胞領域を誘電率及び導電率の両方によって特徴付け、周波数でのＴＭＰ及びｎＴＭＰ計算精度がＭＨｚ範囲であることを確実にする。簡潔に、時間ドメイン中の低周波（２５０ｋＨｚ）及び高周波（１ＭＨｚ）電界を統合し、ラプラス変換をとることによって信号を周波数ドメインに変換し、信号に細胞の幾何学及び誘電特性を表す伝達関数を掛け（Ｋｏｔｎｉｋ，Ｔ．ａｎｄ  Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００６．９０（２）：ｐ．４８０−４９１）、逆ラプラス変換をとることによって結果を時間ドメインに変換して戻すことによって、解を得た。最適化されたバーストの臨床的有用性を示すために、標準的な技術に従って、無限組織ドメイン中の２つの針電極（φ１ｍｍ）に対して、ラプラス方程式を解いた。電極を０．１ｃｍ離間し、印加電圧を２０ｋＶに設定した。
【０１０４】
細胞調製及び実験
【０１０５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で、０．１Ｓ／ｍの導電率を有する緩衝液中に懸濁させた。各極性において１０００Ｖピークを送達することが可能なカスタムパルス発生システムを使用して、１ｍｍまたは２ｍｍ電気穿孔キュベット中で、細胞懸濁液にわたって約１０００、２０００、及び４０００Ｖ／ｃｍの電界強度を作った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１Ｈｚの反復率で、図１４（上部及び中央）に示される、１．８μｓの不感時間によって分離される７００ｎｓ幅の２００の双極性方形波パルスからなる９０回のバーストに曝露した。細胞生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、処置の１及び１６時間後に評価した。１６時間後の全生存率を、生存している処置された細胞対生存している未処置（シャム対照）細胞の比として定量化した。
【０１０６】
０．２Ｓ／ｍの培地導電率で、５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度において、緩衝液中に懸濁したＰＰＴ８１８２マウス初代膵臓腫瘍細胞を用いて、追加の実験を実施した。１００μＬの細胞懸濁液を２ｍｍギャップキュベットに添加し、各極性において５０マイクロ秒（合計１００μｓ）のオンタイムの８０回のバーストを印加した。各バースト内で、個々のパルスは、逆極性において、パルスの終了と次のパルスの開始との間に２μｓの遅延を伴う、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１μｓ、２μｓ、５μｓ、１０μｓ、または５０μｓのオンタイムを有した。細胞を、１５００Ｖ／ｃｍ、３０００Ｖ／ｃｍ、及び４０００Ｖ／ｃｍの大きさを有する電界に曝露した。
【０１０７】
数値モデリング（外膜）
【０１０８】
図１１は、１Ｈｚ及び１００ＭＨｚの間の周波数に対する、４００Ｖ／ｃｍの電界中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する最大ＴＭＰを示す。ＤＣ及び低周波正弦波電圧は、平均化された電圧印加時間が細胞膜の充電時間よりもはるかに長いため、細胞膜のＴＭＰの増加において非常に効果的である。結果として、４００Ｖ／ｃｍの低周波正弦波電圧に対して、ＴＭＰは、培地の導電率とは無関係に、上昇し、電気穿孔に対する閾値よりも大きい値で保持される。低導電率溶液中で、細胞膜はよりゆっくりと変化する。周波数が１ｋＨｚを超えて増加すると、電圧は、０．０１Ｓ／ｍの緩衝液中で細胞膜を完全に充電するのに十分長い間オンではない。結果は、それらの細胞膜を有意に変化させることなく、細胞と相互作用するための最適な周波数範囲が、１ｋＨｚを超えると生じることを示す。１００ｋＨｚを超えて動作するとき、非常に大きい大きさの電界がＴＭＰを有意に増加させることなく使用され得る。
【０１０９】
興味深いことに、以前の実験的観察（Ｓａｎｏ，Ｍ．，Ｊ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ａｎｄ  Ｒ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ａ  Ｌｏｗ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ．２０１１：ＵＳＡ、Ｓａｎｏ，Ｍ．Ｂ．，Ｊ．Ｌ．Ｃａｌｄｗｅｌｌ，ａｎｄ  Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｌｏｗ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ｃＤＥＰ）Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  Ｓｏｒｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅｓ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２０１１、及びＳａｎｏ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０１１．ＤＯＩ  １０．１００２／ｅｌｐｓ．２２０１１００３５１）は、それらのクラウジウス−モソッティ係数の第１のクロスオーバ周波数未満の細胞のある程度の電気穿孔であるが、この周波数を超える最小電気穿孔を示した（すなわち、細胞は、負のＤＥＰを受けながら電気穿孔されるが、正のＤＥＰを受けるときは最小限の影響を受けた）。図１１に示される結果の解析は、クロスオーバ周波数がＴＭＰ曲線上の−３ｄＢ点と配置されることを示す。これは、クロスオーバ周波数において、細胞が、より低い周波数において吸収されるエネルギーの約半分を吸収していることを示し、ＤＥＰ及び電気穿孔効果への膜電気特徴の強い依存を示す。
【０１１０】
培地の導電率が増加すると、細胞膜の充電時間は、培地導電率が１．０Ｓ／ｍに達するまで減少する。この閾値を超えて、培地導電率の増加は、ＴＭＰ充電時間にわずかな影響を及ぼす。０．１Ｓ／ｍにおいて、−３ｄＢ周波数は、約１００ｋＨｚまで到達されない。１．０及び１０．０Ｓ／ｍにおいて、この周波数は、より高く約３００ｋＨｚまでシフトされる。より高い導電率の緩衝液がインビトロ実験で使用される場合、周波数範囲はまた、細胞膜の損傷を回避するためにシフトされ得る。
【０１１１】
図１２Ａ及び１２Ｂは、１００ｋＨｚ及び１ＭＨｚのそれぞれの周波数における、１０００Ｖ／ｃｍの電界に対するＴＭＰの時間依存充電を示す。１００ｋＨｚにおいて、最大ＴＭＰは、培地導電率によってわずかに影響を受ける。０．０１Ｓ／ｍにおいて、最大値のわずかな位相シフト及び減少が達成される。１ＭＨｚにおいて、ＴＭＰは、培地導電率によって大幅な影響を受ける。位相シフト及び減少は、０．０１及び０．１Ｓ／ｍ導電性培地に対して明らかである。この場合もやはり、これは、低導電性培地が脂質二重層電気穿孔に対する細胞へのある程度の保護を提供することを示す。生理学的基準を超える導電率（１．０Ｓ／ｍ）を有する培地において、ＴＭＰは、適用された信号と共に有意に（かつ同相で）増加する。
【０１１２】
図１３及び１４は、１０００Ｖ／ｃｍの大きさを有する２及び２０μｓのそれぞれのパルス電界へのＴＭＰ応答を示す。正弦波信号での結果から予想されるように、ＴＭＰ増加率は、培地導電率に大きく依存する。最低培地導電率（０．０１Ｓ／ｍ）に対して、ＴＭＰがその最大値に達するのに２０μｓよりも長くかかる。この充電時間は、１．０Ｓ／ｍ以上の導電率に対して約２μｓまで減少する。これらの結果は、パルス電界によって引き起こされる指数関数的増加及び減少を示す。生理学的導電率のより遅い充電率は、電流が細胞の周囲よりもむしろ細胞を通って流れることを優先するためである。これは、細胞内構成要素に優先的に影響を及ぼすようにパルスパラメータを最適化する能力を強調する。
【０１１３】
数値モデリング（核膜）
【０１１４】
細胞がパルス電界に曝露されるとき、細胞膜の容量性の性質は、完全に充電されたときの細胞を通る電流の流れを遮断する。しかしながら、膜は、即座に充電することができず、イオン及び分子が再配列し、電流が細胞の細胞質を通って流れる短い時間がある。この変位電流は、核及び細胞小器官を包囲する膜の膜内外電位を増加させる。これらの細胞構成要素は、細胞よりもはるかに小さく、同じ電界内のそれらの理論的最大ＴＭＰは、それらの有効半径と直線的に減少する。加えて、完全に充電された細胞膜が細胞質を通る電流の流れを遮断すると、これらの内部膜は、ＴＭＰ充電時間よりも短い期間にわたって充電することができる。
【０１１５】
図１５は、４μｓのオンタイム及び２μｓのオフタイムを有する双極性パルスに対する細胞及び核膜の充電特徴を示す。最初の５００ｎｓにわたって、電流は、細胞質を通って流れ、核膜内外電位（ｎＴＭＰ）は増加する。５００ｎｓ後、細胞膜は、電流の流れを遮断し始め、ｎＴＭＰは、ゼロに減衰して戻り始める。立ち上がりパルスがオフになると、細胞膜上の電荷は消失し始め、イオンの再配分は、電流を反対方向に流させ、逆極性において核膜を充電する。このプロセスは、パルスが極性を切り替えるときに反復する。全ての双極性パルスが、パターン＋＋−−＋＋を有するｎＴＭＰの４つの増加をもたらす。同じ極性における連続的ｎＴＭＰ増加のこのパターンは、達成可能な最大ｎＴＭＰ値を増加させるための最適なパルス構成が存在することを示唆する。
【０１１６】
図１６は、パルスオフタイムが５００ｎｓで一定に保持されるときのｎＴＭＰへのパルスオンタイムの影響を示す。第１の正のパルスの開始時に、ｎＴＭＰは、それが減衰し始める前の最初の５００ｎｓで、最大で最大約０．３５Ｖを充電する。第１のパルスの終了時、細胞質内の変位電流は、ｎＴＭＰを強制的に負にする。負極性パルスの開始は、負の方向でｎＴＭＰの大きさをさらに増加させる。この相加効果は、第１の正のｎＴＭＰよりも大きさが大きい、負のｎＴＭＰ値をもたらす。
【０１１７】
非常に短いオンタイムパルスに対して、核膜は、正のパルスがゼロに戻る前に完全に放電していない。これは、達成可能な最大の負のｎＴＭＰを減少させる。５００ｎｓのオンタイムパルスに対して、第１の正のｎＴＭＰが０．３５Ｖに達する一方で、第１の負のｎＴＭＰは、−０．４７Ｖに達する。この効果は、正のパルスがオフにされる前に、ゼロに減衰して戻るのに十分長い時間、正のｎＴＭＰが与えられる場合に、さらに増強される。パルス長が３．５〜４μｓに増加するとき、ｎＴＭＰは、単一の単極性パルスによって達成される値のほぼ２倍の最大０．６２Ｖの大きさに達する。図１６は、パルスパラメータを慎重に調整することによって、印加された電界の大きさを増加させることなく、核膜内外電位が倍増され得ることを示す。
【０１１８】
図１７は、パルス間の遅延時間の効果を示す。第１の正のパルスの終了時、ｎＴＭＰは減衰し、約２５０ｎｓ後、負になる。それは、ゼロに向かって減衰して戻る前に、第１の正のパルスの終了の約５００ｎｓ後、その最大の負の値に達する。負のパルスが、ｎＴＭＰがゼロに減衰して戻る前に開始される場合、得られるｎＴＭＰの増加は、単一の単極性パルスによって達成される増加よりも大きい。最大ｎＴＭＰ値は、パルス間の遅延が５００ｎｓであるときに達成される。この最適な時間は、細胞及び核膜に対するＲＣ時定数に寄与する係数の組み合わせによる。図１６及び１７に示される結果は、パルス特徴が、高周波双極性パルスに対して達成可能な最大ｎＴＭＰを増加させるように最適化され得ることを示す。
【０１１９】
ｎＴＭＰを最大化するために、最適なパルスオンタイムは、細胞膜の充電時間＋核膜の放電時間に等しいように思われる。これは、ｎＴＭＰが充電し、次いで、それがパルスの立ち下がりエッジにおいて強制的に負にされる前にゼロに戻ることを可能にする。同様に、最適なオフタイムは、細胞膜の充電時間にほぼ等しい。これは、ちょうど第２のパルスが開始されるとき、減衰することなく、その最大の逆極性値まで増加することを可能にする。
【０１２０】
図１８Ａ及び１８Ｂは、この最適化スキームに従う効果を示す。ほとんどの場合、双極性パルスの列の使用は、単一のパルス最大値を超えてｎＴＭＰを増加させる。５００ｎｓのオフタイムを有する５００ｎｓのパルス（図１８Ａ）に対して、第１のパルスｎＴＭＰは、約０．３３Ｖである。パルスのバーストを使用して、この値は、０．４４Ｖまで増加する。４μｓのオンタイム及び５００ｎｓのオフタイムを有する最適化されたパルスの使用（図１８Ｂ）は、最大ｎＴＭＰをほぼ０．７Ｖまで増加させる。この最適化されたパルス構成は、システムに印加される電圧を増加させる必要なく、電界が核膜に対して有する効果を倍増する。
【０１２１】
図１９は、ｎＴＭＰに対する核サイズの効果を示す。これは、最適化されたパルスプロトコルの選択性に関する示唆がある。典型的には、細胞が進行すると（正常→良性→悪性→転移性）、核対細胞質比は増加する。結果として、細胞は、最適化された双極性パルスプロトコルに対してより感受性が高くなる。これは、核対細胞質比の増加に伴うピークｎＴＭＰの増加によってわかる。臨床的に、これは、転移性、浸潤性癌細胞のみに影響を及ぼし、周囲の健康な細胞を残すアブレーションの領域につながり得る。この実施例は、図２１Ａ〜Ｃで強調される。別の実施形態では、これは、致死未満量での転移性細胞の選択的核導入を可能にし得る。
【０１２２】
本発明の実施形態によると、核対細胞質比は、選択された種類の細胞の核面積及び細胞質面積を得て、面積の比を決定することによって決定され得る。核及び細胞質面積を得るための一方法は、組織などの処置される物質の生検を得て、選択された細胞の核面積及び細胞質面積を測定することである。次いで、選択された細胞に対して、核及び細胞質面積の比が決定され得る。処置プロトコルは、処置のための標的として選択された細胞及び他の非標的細胞の核対細胞質比間の差に基づき、最適化され得る。例えば、処置プロトコルは、他の細胞ではなくある特定の細胞を処置するか、または別様にそれに対して効果を有する様式で、電気パルスを印加するように設計され得る。処置パラメータは、ある特定の核対細胞質比またはそれ以上を有する標的細胞に対して所望の効果を有する（例えば、そのような細胞を死滅させる）が、標的細胞の核対細胞質比よりも低い核対細胞質比を有する細胞に対して効果がない（例えば、死滅させない）か、または異なる効果を有するように選択され得る。
【０１２３】
図２０は、１００Ｈｚ〜１ＧＨｚの搬送波信号を有する信号に対する細胞膜及び核膜の相対的な定常状態の充電挙動を示す。低周波において、細胞膜は、完全に充電し、細胞内構成要素の定常状態の最大膜電位を軽減する。電界がより迅速に振動すると（周波数が増加すると）、細胞膜は、もはや単一のサイクル中に完全に充電することができない。これは、細胞内構成要素の膜がより長い持続時間充電することを可能にし、膜電位の増加をもたらす。約５００ｋＨｚを超えると、核膜は、細胞膜よりも高い膜電位を生じる。周波数が１００ＭＨｚを超えて増加すると、内部構成要素は、単一のサイクル中に効果的に充電できず、最大電位の減少をもたらす。これは、パルスが細胞内構成要素に対する効果を最大化する一方で、細胞膜への効果を最小限に抑えるように最適化され得る周波数帯域があることを示す。
【０１２４】
解析モデリング
【０１２５】
図２１Ｂ〜Ｃは、異なる核対細胞質比を有する２つの細胞に関して、ｎＴＭＰに対する二峰性正弦波の効果を示す。図２１Ａは、２つの異なる細胞の核膜内外電位がどのようにプロットされるのかを示す、図２１Ｂ及び２１Ｃに対する重要な要素である。本方法において言及されるように、適用された信号は、重畳された低周波（２５０ｋＨｚ）及び高周波（１ＭＨｚ）電界からなる。各個々の信号のピーク電界は、２０００Ｖ／ｃｍである。しかしながら、重畳される場合、２つの信号が同相であるとき、振動は最大で４０００Ｖ／ｃｍ増加する。４０００Ｖ／ｃｍにおいて、より大きい核を有する細胞のみが核電気穿孔を受ける（点線）。より小さい核を有する細胞において同等のレベルの電気穿孔を達成するために、５０００Ｖ／ｃｍの電界が必要とされる。
【０１２６】
上記の二峰性正弦波の臨床的有用性は、図２２に示される。２つの針電極を０．１ｃｍ離間し、印加電圧を２０ｋＶに設定した。実線（５０００Ｖ／ｃｍの電界等高線）は、全ての細胞が処置によって影響を受ける領域の境界を示す。実線と破線（４０００Ｖ／ｃｍの等高線）との間の領域は、より大きい核対細胞質比を有する浸潤癌細胞のみが影響を受ける領域を表す。この領域内の健康な細胞は、影響を受けない。
【０１２７】
実験結果
【０１２８】
図２３Ｃは、０．１Ｓ／ｍの緩衝液中の不可逆電気穿孔パルス列（図２３Ｂ）を作るために、２００回反復される７００ｎｓ幅のパルスのバースト（図２３Ａ）に曝露されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率を示す。処置の１及び１６時間後に、付着し、懸濁液に浮遊する細胞の数を、対照と比較することによって、生存率を評価した。１０００Ｖ／ｃｍにおいて、処置の直後及び１６時間後、細胞の生存率に対して最小の効果があった。２０００Ｖ／ｃｍ及び４０００Ｖ／ｃｍにおいて、生存率は、ウェルプレートに付着した細胞のみを考慮したとき、５０％及び１０％まで低減した。回外の検査は、４０００Ｖ／ｃｍに対して、細胞の細胞骨格ネットワークが損傷を受けたか、またはそれらが様々な段階のアポトーシスにあったという兆候である、ウェルプレート表面に付着しなかった細胞が多数あったことを明らかにした。
【０１２９】
０．２Ｓ／ｍの導電率を有する培地中のＰＰＴ８１８２マウス膵臓癌細胞に対して、広範なパラメータ研究（図２４〜２６）を実施した。２５０ｎｓ〜５０μｓの幅を有するパルスからなる、１００μｓの合計オンタイムを有する８０回のバーストを、１５００Ｖ／ｃｍ（図２４）、３０００Ｖ／ｃｍ（図２５）、及び４０００Ｖ／ｃｍ（図２６）の電界強度で送達した。１５００Ｖ／ｃｍにおいて、２μｓ以上のパルス幅は、２４時間後に５０パーセント未満まで全生存率を低減することが可能であった。５マイクロ秒以上のパルスに対して、２４時間後の生存率は、有意に低減され、細胞が何らかの形態のアポトーシスまたは遅延細胞死を受けていたことを示す。３０００Ｖ／ｃｍにおいて、１μｓ以上のパルスは、細胞生存率を５０パーセント未満低減し、２μｓ以上のパルスは、２４時間後に細胞代謝活性の兆候をほぼ完全に排除した。４０００Ｖ／ｃｍにおいて、５００ナノ秒のパルスは、１時間後の即時の細胞死（６０％の生存率）及び２４時間後の遅延細胞死（３０％の生存率）を誘発するように思われる。これよりも大きいパルスは、１時間で即時の細胞死（＜３０％生存率）を、かつ２４時間でさらなる遅延細胞死（＜１０％生存率）を誘発する。細胞生存率は、全電界強度に対して、２５０ｎｓのパルス幅によってわずかに影響を受けた。
【０１３０】
図２４〜２６の解析は、２μｓよりも長いパルスを有するバーストに対して、１時間及び３０００Ｖ／ｃｍでの生存率が、２４時間及び１５００Ｖ／ｃｍでの生存率に等しいことを示す。１及び２μｓのパルスに対して、１時間及び４０００Ｖ／ｃｍでの生存率は、２４時間及び３０００Ｖ／ｃｍでの生存率に等しい。インビボで印加されるとき、これは、浸潤性癌細胞が選択的に標的化される選択的標的化増強の領域をもたらす。図２７Ａは、インビトロ実験で構築された閾値に基づく、予想されるアブレーション及び増強を示す。選択的領域は、アブレーション領域よりも高さ及び幅が約２ｃｍ大きい楕円を掃引し、１ｃｍの端内の浸潤性細胞が処置されることを示す。電界閾値が、インビボで観察される電界閾値の約３倍の減少に相当するように調節されるとき、より大きい体積であるが、同様の増強領域が達成される（図２７Ｂ）。
【０１３１】
結論
【０１３２】
本発明者らは、印加された電界の周波数及び懸濁培地の導電率がＴＭＰの蓄積において大きな役割を果たすことを示した。電気穿孔が望ましくない場合、最低導電率の生理学的に好適な緩衝液が使用されるべきである。０．０１Ｓ／ｍにおいてでさえ、連続正弦波電圧がＤＣと約１０ｋＨｚとの間に印加される場合、ＴＭＰは増加する。電気穿孔（可逆的及び不可逆的の両方）の程度は、電界強度が一定に保持される場合、この周波数を超えて有意に減少する。これは、細胞内構成要素に対する効果を最大化するための、印加された電界の時間的特性の有意な最適化を可能にする。
【０１３３】
組織アブレーションの場合のように、電気穿孔が望ましくない場合、十分に導電性の培地内で動作することが有利でする。細胞膜に対する充電時間の数値解析は、１．０Ｓ／ｍが臨界導電率であることを示す。これを超えると、充電時間が有意に増加しない一方で、これ未満だと、細胞は、短パルスに対してその最大ＴＭＰに達しない可能性がある。しかしながら、生理学的組織は、典型的には、０．１〜０．７Ｓ／ｍの導電率を有する。その結果、短い持続時間のパルスは、細胞膜に対する効果を軽減する一方で、細胞内構成要素に対する効果を増強する。理論的に、５００ｎｓのオフタイムを有する４μｓのパルスのバーストは、核膜内外電位に対する最大の効果をもたらし、高周波パルスの致死率をさらに増加させるのを促し得る。
【０１３４】
細胞は、細胞を包囲する流体／培地との複雑な抵抗器−コンデンサ（ＲＣ）ネットワークを形成する。細胞膜のコンデンサ性質（Ｃ）は、細胞外物質の抵抗（Ｒ）と結合し、細胞膜がその理論的最大電位まで充電する速度を制限する。概して、より小さい細胞は、より小さい正味容量を有する。これは、それらがより大きい細胞よりも迅速に充電することを可能にする。この充電挙動は、細胞内細胞質を通る電流の流れを遮断する。組織体積中の最小細胞は、任意のパルス電界の最小の細胞内効果を受ける。同じサイズの非癌性細胞と比較したときでさえ、非常に転移性が高い細胞が、細胞膜の形態の変化によってより高い膜容量を有することが示されている。この生物物理学的変化の結果、浸潤性癌性細胞は、周囲の健康な細胞よりも大きい正味容量を示す。これは、浸潤性細胞の細胞膜の充電と関連するより長い時定数をもたらす。細胞膜充電におけるこのラグは、細胞内構成要素に対する電荷蓄積の増加をもたらし、核及び細胞小器官に対する増幅した電気穿孔効果をもたらす。
【０１３５】
その結果、治療用電界は、組織内の癌性細胞のみが治療効果を受けるように、健康な細胞及び癌性細胞を含む組織体積に印加され得る。これは、薬物、遺伝子、もしくはタンパク質送達、またはアポトーシスカスケードの特定の誘発のための細胞内構成要素の選択的電気穿孔であってもよい。これらのパルスはまた、特定の体積の組織が不可逆電気穿孔を受け、追加の外部体積が標的化された癌細胞のみのアポトーシス誘導用量を受けるように設計され得る。この後のシナリオは、腫瘍を包囲する健康な組織に埋め込まれた、顕微鏡的疾病などの浸潤性細胞の選択的標的化を可能にする。
【０１３６】
実施例２
【０１３７】
方法
【０１３８】
数値モデリング
【０１３９】
インピーダンス境界条件スキームを使用して、ＣＯＭＳＯＬ  ４．２で、懸濁液中の細胞の数値モデルを作った（Ｇ．Ｐｕｃｉｈａｒ，Ｔ．Ｋｏｔｎｉｋ，Ｂ．Ｖａｌｉｃ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｎ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｓｈａｐｅｄ  ｃｅｌｌｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３４（２００６）６４２−６５２）。解ドメインは、０．１ｍｍの縁部長さを有する三次元立方体からなった。このドメインの中心において、細胞質及び核質を表す２つの球体を作った。解ドメイン内で、電流モジュールを使用して、以下の方程式について解き、
【０１４０】
【数１】
2019193668.tif 000003
【０１４１】
【数２】
2019193668.tif 000004
【０１４２】
【数３】
2019193668.tif 000005
【０１４３】
式中、Ｕは、電位であり、Ｅは、電界であり、Ｊは、電流密度であり、Ｑは、電流源である。１つの境界に時間依存電位を割り当てた。
【０１４４】
【数４】
2019193668.tif 000006
【０１４５】
対向する境界を相対接地として割り当てた。
【０１４６】
【数５】
2019193668.tif 000007
【０１４７】
残りの境界を電気絶縁として定義し、
【０１４８】
【数６】
2019193668.tif 000008
【０１４９】
式中、ｎは、表面の法線ベクトルであり、Ｊは、電流である。
【０１５０】
各ドメイン（培地、細胞質、核質）に対して、別個の電流物理学モジュールを使用し、培地、細胞質、及び核質ドメインに対する従属電位変数Ｕ培地、Ｕ細胞質、Ｕ核質を、それぞれ定義した。次いで、これらの変数を定義して、細胞膜（Ｕｍ）及び核膜（Ｕｎ）にわたる電圧を計算した。
【０１５１】
【数７】
2019193668.tif 000009
【０１５２】
【数８】
2019193668.tif 000010
【０１５３】
各電流モジュールにおいて、膜を表す境界を、隣接（Ｕ基準）ドメイン中の電位として規定した基準電圧を有するインピーダンス境界条件として定義した。
【０１５４】
【数９】
2019193668.tif 000011
【０１５５】
式中、σは、導電率であり、εは、誘電率であり、ｄは、細胞膜または核膜の厚さである。例えば、培地ドメインにおいて、細胞膜を表す境界を、Ｕ細胞質の基準電位を有するインピーダンス境界として定義した。細胞質ドメインにおいて、細胞膜を表す同じ境界を、Ｕ培地の基準電位を有するインピーダンス境界として定義した。境界を「薄層」として定義し、導電率、比誘電率、及び表面厚さを、表１に示される値を使用して定義した。核膜は、核周囲空間によって分離される２つの個々の脂質膜からなる。モデルの複雑性を制限し、これらの個々の構成要素の電気特性を不適切に評価することを回避するために（文献で容易に入手可能ではない）、本発明者らは、これらの生物学的特徴を、それらの組み合わされた特徴を表す電気特性が利用可能である単一の４０ｎｍ膜とひとくくりに扱った。
【０１５６】
メッシュを、縁部上に１．８〜１０μｍの要素を有する単一のフリー四面体群として定義し、１９３５３個の四面体要素を得た。このモデルの予備研究において、より細かいメッシュ及びより粗いメッシュを使用した。シミュレーション時間は、連続細分化間で２倍以上に倍増した。ここで示されるメッシュと次の連続細分化との間の平均偏差は、細胞膜及び核膜電位のそれぞれに対して２．０％及び５．５％未満であった。各パラメータに対して、８ＧＢのＲＡＭを有するクアッドコア３．０ＧＨｚプロセッサ上で、溶液は、約２２分で見られた。図２８の表の値を使用した数値シミュレーションの結果を、Ｋｏｔｎｉｋ  ａｎｄ  Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ（Ｔ．Ｋｏｔｎｉｋ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９０（２００６）４８０−４９１）によって示される解析方法を使用して見られた結果と比較した。細胞膜及び核膜にわたる最大／最小電位を計算するとき、数値溶液と解析溶液との間の誤差はそれぞれ、０．１５％／０．１５％及び１．９７％／０．８９％であった。
【０１５７】
細胞調製及び実験
【０１５８】
全実験において、５．５：１の比の培養培地（ＤＭＥＭ）対低導電率スクロース緩衝液（８５ｇのスクロース、３．０ｇのグルコース、７．２５ｍＬのＲＰＭＩ、及び９９２．７５ｍＬの脱イオン水）からなる緩衝液中に、細胞を懸濁させた（Ｌ．Ａ．Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｊ．Ｌｕ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ａ．Ｍａｒｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．Ｌ．Ｊｅｏｎ，Ａ．Ｐ．Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．Ｍｏｎｕｋｉ，Ｕｎｉｑｕｅ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｙ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２６（２００８）６５６−６６５）。実験前に、導電率計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｂ−１７３，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）で細胞懸濁液の導電率を測定して、０．２Ｓ／ｍの最終導電率を確認した。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．は、膵臓組織の導電率が、１ｋＨｚ〜２ＭＨｚの周波数のそれぞれに対して、０．０９７〜０．４４Ｓ／ｍと変化したことを報告した（Ｄ．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｇｒｅｅｎｗｅｌｌ，Ａ．Ｈａｒｐｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｓａｎｋｅｙ，Ｔ．Ｓｃｒａｔｃｈｅｒｄ，Ｔｈｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｓ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１８９（１９６７）２４７−２６０）。試料を通じて送達される電流を最小限に抑える一方で、インビボ組織に見られるような範囲内で導電率値を維持するように、０．２Ｓ／ｍの培地導電率を選択した。本発明者らのパルス発生システムにおける制限によって、より高い導電率の緩衝液は、その安全な動作領域外でパルス送達システムを駆動する。
【０１５９】
ＰＰＴ８１８２マウス初代膵臓腫瘍細胞（Ｊ．ｖｏｎ  Ｂｕｒｓｔｉｎ，Ｓ．Ｅｓｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｐａｕｌ，Ｂ．Ｓｅｉｄｌｅｒ，Ｍ．Ｂｒａｎｄｌ，Ｍ．Ｍｅｓｓｅｒ，Ａ．ｖｏｎ  Ｗｅｒｄｅｒ，Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｍａｇｅｓ，Ｐ．Ｐａｇｅｌ，Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ＳＮＡＩＬ／ＨＤＡＣ１／ＨＤＡＣ２  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３７（２００９）３６１、ｖｏｎ  Ｂｕｒｓｔｉｎ，２００９）を全実験で使用した。これらの細胞は、組織構造、転移、及び遺伝子変化の観点からヒト膵臓癌を複製することが示されている（ｖｏｎ  Ｂｕｒｓｔｉｎ，２００９、Ｂ．Ｓｅｉｄｌｅｒ，Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．Ｍａｙｒ，Ｈ．Ｎａｋｈａｉ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｄ．Ｓａｕｒ，Ａ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｖｉａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０５（２００８）１０１３７−１０１４２、Ｄ．Ｓａｕｒ，Ｂ．Ｓｅｉｄｌｅｒ，Ｇ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．Ａｌｇuｌ，Ｒ．Ｂｅｃｋ，Ｒ．Ｓｅｎｅｋｏｗｉｔｓｃｈ−Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ，Ｍ．Ｓｃｈｗａｉｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄ，ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２９（２００５）１２３７−１２５０、及びＭ．Ｊ．ＰａｓｚｅＫ，Ｎ．Ｚａｈｉｒ，Ｋ．Ｒ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｌａｋｉｎｓ，Ｇ．Ｉ．Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｇｅｆｅｎ，Ｃ．Ａ．Ｒｅｉｎｈａｒｔ−Ｋｉｎｇ，Ｓ．Ｓ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．Ｄｅｍｂｏ，Ｄ．Ｂｏｅｔｔｉｇｅｒ，Ｔｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ，８（２００５）２４１−２５４）。
【０１６０】
加湿雰囲気下、５％  ＣＯ２中で、３７℃において、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びペニシリン／ストレプトマイシンの１％原液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンが補充される、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で、細胞を培養した。全細胞を、８０％のコンフルエンスにおいて、トリプシン処理によって、実験のために採取した。懸濁液を２回遠心分離し、５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で実験緩衝液中に再懸濁させた。パルス送達の直前に、１００μＬの細胞懸濁液を、２ｍｍギャップキュベット（モデル６２０，Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に注入した。実験準備の概略図は、図２９Ａに示される。
【０１６１】
全実験に対するプロトコルは、図２９Ｂに示される波形を使用した。概略図は、個々のパルスの反復配列を含む例示的なバーストを示す。バーストは、正極性パルスで開始し、２μｓの休止、次いで、負極性パルスが続き、さらに２μｓの休止が続く。この循環は、電圧が合計で１００μｓ（各極性において５０μｓ）送達されるまですぐに反復される。８０回のバーストを１Ｈｚの周波数で送達した。各バースト内で、同等の電圧印加時間を得るために、個々のパルスは、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１、２、５、１０、または５０μｓの単一の持続時間を有し、したがって、バーストはそれぞれ、４００、２００、１００、５０、２０、１０、または２個のパルスを含んだ。２μｓの遅延時間を順次の逆極性パルス間でプログラミングして、電子機器がリンギングによる過電圧から保護した。バーストの代表的な実施例は、図３０Ａ〜３０Ｃに示される。１５００、３０００、及び４０００Ｖ／ｃｍの電圧対距離比（Ｅ）を有する電位に、細胞を曝露した。細胞懸濁液中に直接挿入された光ファイバ温度プローブ（Ｌｕｘｔｒｏｎ  ＦＯＴ  Ｌａｂ  Ｋｉｔ，ＬｕｍａＳｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して、パルシングによる細胞懸濁液中の温度変化を測定した。
【０１６２】
インビトロ研究に対して、処置群のそれぞれを最低３回（ｎ＝３）繰り返し、各群に対する実験を少なくとも２つの異なる日に実施した。各処置に対して、シャム曝露を含む異なる実験的パラメータをランダム配列で入れ替えた。処置後、試料を、１及び２４時間の時点で評価される２つの等しい５０μＬの試料に分割した。氷上に配置されるか（１時間の群）、またはインキュベータに移動させられる（２４時間の群）前に、試料を約２０〜３０分間、室温で保持した一方で、残りの実験群を完了させた。曝露の約１時間後、トリパンブルー色素排除アッセイを使用して生存率を評価した。不可逆的に電気穿孔された細胞は、色素を除外することが不可能であり、青色に染色された。血球計を使用して細胞を視覚的に計算し、生存率の割合を、
【０１６３】
【数１０】
2019193668.tif 000012
として決定した。
【０１６４】
【数１１】
2019193668.tif 000013
【０１６５】
１時間の時間群のシャム対照試料の平均生存率は、８５％よりも大きかった。２４時間で解析される試料を、合計で１ｍＬの培養培地を含む１２ウェルプレート中の別々のウェルに配置し、ウェルプレートがいっぱいになるまで室温で維持した（約３０分間）。この時点で、ウェルプレートを２４時間、３７℃及び５％  ＣＯ２で、インキュベータ内に配置した。次いで、製造業者が推奨する手順を使用して、アラマーブルー代謝アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、生存率を評価した。簡潔に、１００μＬ／ｍＬのアラマーブルー原液を各ウェルに添加した。４時間後、５７０／６００ｎｍの波長で、分光光度計を使用して、試料を読み取った。各試料に対して、吸光度を３つの別々のウェルで測定し、平均化した。細胞なしの試料培地、及び電界に曝露しなかった対照細胞試料に対して、追加の測定を行った。生存率の割合を、
【０１６６】
【数１２】
2019193668.tif 000014
として決定し、
【０１６７】
式中、Ｉは、分光光度計からの相対強度測定値である。概して、トリパンブルー解析及び代謝アッセイは、互いを非常にうまく補完する。Ｉｂｅｙ  ｅｔ  ａｌ．は、代謝アッセイが、ナノ秒のパルス電界曝露後のトリパンブルー解析からのアッセイに酷似していたことを以前に示した（Ｂ．Ｌ．Ｉｂｅｙ，Ａ．Ｇ．Ｐａｋｈｏｍｏｖ，Ｂ．Ｗ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｖ．Ａ．Ｋｈｏｒｏｋｈｏｒｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ａ．Ｒａｓｓｏｋｈｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｇ．Ｊ．Ｗｉｌｍｉｎｋ，Ｏ．Ｎ．Ｐａｋｈｏｍｏｖａ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｅ  ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｕｌｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，１８００（２０１０）１２１０−１２１９）。本研究で使用されるアラマーブルーアッセイは、哺乳類細胞内の細胞毒性を測定するために確立されている（Ｊ．Ｏ' Ｂｒｉｅｎ，Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｏｒｔｏｎ，Ｆ．Ｐｏｇｎａｎ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６７（２０００）５４２１−５４２６）。２．５×１０３〜２×１０６個の細胞／ｍＬで播種した細胞に対する減少率を測定して、シャム集団がアラマーブルー溶液を完全に低減しなかったこと（結果は図示せず）を確実にし、２．５×１０５個の細胞／ｍＬを用いた４時間のインキュベーション時間を最適であると決定した。１時間及び２４時間の両方の群に対する生存率データをシャム対照群に正規化した。ＪＭＰ  ＰｒｏＶ．１０．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、データの統計解析を完了した。
【０１６８】
電子機器
【０１６９】
任意波形発生器（ＡＦＧ３０２１Ｃ，Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、波形を生成し、それを、高インピーダンス負荷による＋／−１０００Ｖの出力が可能な特注高電圧パルス発生器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）によって増幅した。５０ＭＨｚ  １０００ｘ高電圧プローブ（Ｐ５２１０Ａ，Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、電圧を減衰させ、５０ＭＨｚ電流プローブ上のアクティブクランプ（ＴＣＰ３０５，Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、電流を測定した後に、オシロスコープ（ＤＰＯ２００２Ｂ，Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、出力波形を視覚化した。出力上の短絡保護抵抗器は、２ｍｍキュベットを通る最大出力電圧を約８００Ｖ（４０００Ｖ／ｃｍ）に制限した。
【０１７０】
結果及び考察
【０１７１】
数値モデリング
【０１７２】
図３１Ａ〜３１Ｃに示されるように、１５００Ｖ／ｃｍの電界（図３１Ａ）の影響下で、細胞膜（Ｕｍ）（図３１Ｂ）及び核膜（Ｕｎ）（図３１Ｃ）にわたる電位降下はそれぞれ、１．４７Ｖ及び０．２８Ｖの最大値に達する。Ｕｍは、０．３４μｓで最大値の５０％、１．１１μｓで７０．７％、及び７．９２μｓで９９．９９％の最大値に達する。Ｕｎは、１４５ｎｓで９９．９９％の最大値に達し、約０．９４μｓで再び７０ｍＶを下回る。核膜のこの短い充電及び放電は、細胞膜が充電しているときに細胞質内を流れる電流による。この過渡電流は、核及び細胞小器官を包囲する膜にわたって電位を増加させる。これらの細胞内構成要素は細胞よりも小さく、それらの電流への曝露は短く、より小さい電位増加をもたらす。
【０１７３】
正極性パルスが立ち下がると、細胞膜は、放電し始め、立ち上がりパルスエッジと比較して、反対方向への細胞質内の第２の電流の流れをもたらす。これは、核膜にわたる負電位の形成をもたらす。この負電位は、−０．２８Ｖの最小値に達し、同様の０．９４μｓで−７０ｍＶを下回る。負極性パルスの立ち上がりエッジは、Ｕｎの同様の減少をもたらし、核膜の膜電位の興味深い二重ピークをもたらす。この第２のピークは、−０．２９Ｖの値に達する。このピークは、初期パルスによって達成される最大値とは１０ｍＶのみ異なるが、それは、パルス長及びパルス間の遅延時間の最適化が、細胞内膜に対する効果の増加をもたらし得たことを示唆する。
【０１７４】
本実施例において、本発明者らは、解析を単純化するために、細胞膜に対する電気穿孔の効果を無視することを選択した。しかしながら、電気穿孔の場合、電流は、細胞質を通って流れることができ、持続電位は、細胞内膜にわたって誘発される。
【０１７５】
実験パラメータの解析
【０１７６】
図３２Ａ〜Ｃは、実験的に制御され得る変数のパラメータ解析を示す。図３２Ａに示されるパルス持続時間は、達成される最大Ｕｍ及びＵｍが１Ｖの臨界閾値を超えて上昇する持続時間に直接影響を与える。１μｓよりも短いパルスは、この閾値を超えてＵｍを上昇させない。パルス持続時間が１μｓを超えて増加すると、Ｕｍは、１．４７Ｖの最大値まで飽和する。対照的に、ＵｎがＵｍと比較して急上昇するため、核膜に対する効果は、パルス持続時間によって最小限の影響を受ける。パルス幅にかかわらず、Ｕｎは、１４５ｎｓ内に最大値に達する。１μｓ以下のパルスに対して、Ｕｎは、正のパルスの立ち下がりエッジ前に完全にゼロに戻らず、負のＵｎ応答を弱める。
【０１７７】
Ｕｍが１Ｖを超えて上昇した後１μｓ以内に、孔形成挙動が生じ、電位のさらなる増加を抑え（Ｋ．Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｉ．Ａｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．Ｓａｉｔａ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．Ｉｔｏｈ，Ｋ．Ｎａｇａｙａｍａ，Ａ．Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｕｎｄｅｒ  ａ  ｐｕｌｓｅｄ−ｌａｓｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５３（１９８８）１０１５−１０１９）、その後、新しい孔形成は制限され、孔拡大が支配的現象として引き継ぐ（Ｋ．Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｔ．Ｙ．Ｔｓｏｎｇ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｒｅｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｉｚｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，（１９７７）；Ｋ．Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｔ．Ｙ．Ｔｓｏｎｇ，Ｖｏｌｔａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，４７１（１９７７）２２７−２４２）ことが観察されている。ここに示される電界強度において、１μｓ以下の持続時間のパルスは、効率的に細胞膜内の孔拡大をもたらさない可能性がある（Ｏ．Ｍ．Ｎｅｓｉｎ，Ｏ．Ｎ．Ｐａｋｈｏｍｏｖａ，Ｓ．Ｘｉａｏ，Ａ．Ｇ．Ｐａｋｈｏｍｏｖ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ６０−  ａｎｄ  ６００−ｎｓ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｕｌｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１８０８（２０１１）７９２−８０１）。
【０１７８】
試料培地の導電率、図３２Ｂは、細胞膜及び核膜の充電−放電挙動に有意に寄与する。低い培地導電率（０．０１Ｓ／ｍ）において、培地は、電流の流れに有意な抵抗を示し、細胞膜は、ゆっくりと充電する。この低導電性培地は、細胞質を通って流れることができる電流を最小限に抑え、達成される最大Ｕｎを弱める。培地導電率が増加すると、細胞膜は、より迅速に充電し、導電率が１Ｓ／ｍを超えて増加すると飽和する。これらのシミュレーションに基づき、０．２Ｓ／ｍの培地導電率は、実験的に、膜充電時間とパルス発生器から必要とされる電流出力との間の妥協である。培地導電率の増加は、わずかにより速い膜充電時間をもたらした可能性がある。
【０１７９】
正極性パルスと負極性パルスとの間の遅延、図３２Ｃは、膜内外電位（Ｕｍ）に対してわずかな効果を有するが、それは、核膜（Ｕｎ）に対して有意な影響を有する。正のパルスの立ち下がりエッジは、核膜上の負電位蓄積をもたらす。Ｕｎは、各パルスの立ち下がりエッジ後に約１００ｎｓの極大値に達する。パルスの長い遅延に対して、この電位は、ゼロに減衰して戻る。対照的に、遅延が短縮されると、Ｕｎは、負極性パルスの立ち上がりエッジによって度合いが増す。最終的に、遅延が０．１μｓまで減少すると、Ｕｎの効果的な倍増が達成される。これらのシミュレーションに基づき、パルス極性の変化間に１００ｎｓの遅延を伴うバーストは、核膜にわたって最大の電位を達成する。直観に反した方法で、ゼロのパルス間遅延を含むことは、１００ｎｓの場合よりも低いＵｎをもたらす（結果は図示せず）。Ｕｎの倍増を達成するために、核膜にわたる電位は、印加電圧がオフにされる前に、ゼロに減衰して戻ることができなければならない。このシナリオにおいて、０．９４μｓ以上の持続時間である全てのパルスが、単一のパルス最大と比べて、Ｕｎの約２倍の増加をもたらした。
【０１８０】
ＰＥＦアポトーシスカスケードにおけるＤＮＡ損傷の役割は、完全に理解されておらず、核は、典型的には、ＰＥＦ療法のための標的ではない。しかしながら、内因性及び外因性アポトーシス細胞死の過程は、ミトコンドリア及び小胞体に対する電界強度依存効果と関連する。図３２Ｃに示されるように、波形最適化を使用して、これらの細胞小器官の膜内外電位の増加を倍増することができる場合、関連するアポトーシスカスケードを誘発するために、より低い振幅電界が必要とされる。あるいは、パルス幅及びパルス間遅延を細かく調整することによって、ＤＮＡ損傷過程を増強し、ＰＥＦアポトーシスカスケードにおけるこの機構のさらなる研究を可能にすることが可能であり得る。残念ながら、よく制御された１００〜５００ｎｓのパルス間遅延シナリオの実験的調査は、本発明者らの電流システムの出力電圧のリンギングによって阻止され、今後の研究の対象として残っている。
【０１８１】
細胞電気特性の解析
【０１８２】
細胞膜、核膜、細胞質、及び核質に関する電気特性は、文献で容易に入手可能である（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｂｒａｙ，Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｒａｆｆ，Ｋ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４、Ｐ．Ｒ．Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｒ．Ｐｅｔｈｉｇ，Ｊ．Ｐ．Ｂｕｒｔ，Ｆ．Ｆ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｒｉｅｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１１４９（１９９３）１１９−１２６、Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｂ．Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｆ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．Ｃ．Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｃｅｌｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７６（１９９９）  ３３０７−３３１４、Ｉ．Ｅｒｍｏｌｉｎａ，Ｙ．Ｐｏｌｅｖａｙａ，Ｙ．Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｂ．−Ｚ．Ｇｉｎｚｂｕｒｇ，Ｍ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｉｍｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ，８（２００１）２５３−２６１、Ｊ．Ｇｉｍｓａ，Ｔ．Ｍuｌｌｅｒ，Ｔ．Ｓｃｈｎｅｌｌｅ，Ｇ．Ｆｕｈｒ，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ａｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ：ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７１（１９９６）４９５−５０６、及びＫ．Ａｓａｍｉ，Ｙ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０１０（１９８９）４９−５５）。Ｓｕｂｕｎｃｕ  ｅｔ  ａｌ．は、０．３〜０．６Ｓ／ｍの細胞質導電率を報告している（Ａ．Ｃ．Ｓａｂｕｎｃｕ，Ｊ．Ａ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｊ．Ｂｅｅｂｅ，Ａ．Ｂｅｓｋｏｋ，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｌｏｎｅｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，４（２０１０）０２１１０１）。Ｌａｂｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．は、細胞がアポトーシスを受け始めるときの０．２８Ｓ／ｍ���０．４５Ｓ／ｍの導電率の増加を報告している（Ｆ．Ｈ．Ｌａｂｅｅｄ，Ｈ．Ｍ．Ｃｏｌｅｙ，Ｍ．Ｐ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，１７６０（２００６）９２２−９２９）。Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、前骨芽細胞及び正常なイヌ腎細胞のそれぞれに対して、０．７２４Ｓ／ｍ及び０．９３Ｓ／ｍの導電率の増加を報告している（Ａ．Ｒｏｎ，Ｒ．Ｒ．Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．Ｆｉｓｈｅｌｓｏｎ，Ｉ．Ｓｈｕｒ，Ｒ．Ｓｏｃｈｅｒ，Ｄ．Ｂｅｎａｙａｈｕ，Ｙ．Ｓｈａｃｈａｍ−Ｄｉａｍａｎｄ，Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎａｌ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３５（２００８））５９−６８。Ｍｕｌｈａｌｌ  ｅｌ  ａｌ．は、正常なケラチン生成細胞、異常なケラチン生成細胞、２つの異なる悪性のケラチン生成細胞のそれぞれに対して、０．７１、０．４２、０．２６、及び０．２５Ｓ／ｍの細胞質導電率を得た（Ｈ．Ｍｕｌｈａｌｌ，Ｆ．Ｌａｂｅｅｄ，Ｂ．Ｋａｚｍｉ，Ｄ．Ｃｏｓｔｅａ，Ｍ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ｌｅｗｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ，ｐｒｅ−ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｏｒａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１（２０１１）２４５５−２４６３）。加えて、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、薬物耐性細胞が非薬物耐性細胞よりも低い細胞質導電率を有することを示す（Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｑ．Ｔａｎ，Ｅ．Ｓｈｏｊａｅｉ−Ｂａｇｈｉｎｉ，Ｙ．Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｌｉ，Ｐ．Ｐｒａｓａｄ，Ｌ．Ｙｏｕ，Ｘ．Ｙ．Ｗｕ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，１１（２０１１）３１７４−３１８１）。これらの結果は、細胞が良性から悪性に移行するときの細胞質導電率の減少の証拠を提供する。
【０１８３】
Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、癌細胞が薬物耐性を達成するときの０．４５〜０．４９及び０．４０〜０．４９の核対細胞質（ＮＣＲ）比の増加を示す。同様に、Ｈｅｌｃｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．は、ＮＣＲが腫瘍悪性度の関数として０．３から０．８に増加し、ますます悪性の癌に対してＮＣＲはより高くなることを組織学的に示す（Ｋ．Ｈｅｌｃｚｙｎｓｋａ，Å．Ｋｒｏｎｂｌａｄ，Ａ．Ｊoｇｉ，Ｅ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｇ．Ｌａｎｄｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐaｈｌｍａｎ，Ｈｙｐｏｘｉａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｄｕｃｔａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３（２００３）１４４１−１４４４）。Ｓａｌｍａｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．は、細胞が連続的により悪性になると、同系細胞株の特定の膜容量が、１５．３９ｍＦ／ｍ２から２６．４２ｍＦ／ｍ２まで増加したことを示した（Ａ．Ｓａｌｍａｎｚａｄｅｈ，Ｍ．Ｂ．Ｓａｎｏ，Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ−Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｍｅｌｚ，Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，７（２０１３）０１１８０９）。これは、８．７０から１４．９２への相対的な膜誘電率の増加につながる。
【０１８４】
０．７、０．４７５、及び０．２５Ｓ／ｍの細胞質導電率値、０．３、０．５５、及び０．８のＮＣＲ、ならびに９、１２、及び１５の膜誘電率を使用して、パラメータ解析を実施して、良性から中程度、悪性のそれぞれへのこの移行を表した。本発明者らは、０．７Ｓ／ｍの細胞質導電率、０．３のＮＣＲ、及び８．７の膜誘電率を有する「良性」細胞の応答をモデリングした。「転移性」細胞を０．２５Ｓ／ｍの細胞質導電率、０．８のＮＣＲ、及び１５の膜誘電率を有するものとしてモデリングした。全ての他の値（表１）を一定に保持した。
【０１８５】
核対細胞質比（ＮＣＲ）、図３３Ａは、Ｕｍに対してわずかな効果、及びＵｎに対して測定可能な効果を有する。電磁理論（Ｐ．Ｍａｒｓｚａｌｅｋ，Ｄ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｙ．Ｔｓｏｎｇ，Ｓｃｈｗａｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，５８（１９９０）１０５３−１０５８）から予測されるように、核膜にわたる電位は、方程式、
【０１８６】
【数１３】
2019193668.tif 000015
【０１８７】
に関し、式中、ｒは、核の半径であり、Ｅは、細胞が曝露される電界である。しかしながら、核の他の誘電特性が膜充電時間に影響を及ぼす可能性がある（Ｔ．Ｋｏｔｎｉｋ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，９０（２００６）４８０−４９１、Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｏｅｎｂａｃｈ，Ｓ．Ｊ．Ｂｅｅｂｅ，Ｅ．Ｓ．Ｂｕｅｓｃｈｅｒ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｐｕｌｓｅｓ，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ，２２（２００１）４４０−４４８）。図３３ＡでＮＣＲが増加すると、Ｕｎも増加する。細胞質導電率、図３３Ｂは、Ｕｍ及びＵｎの最大振幅にわずかな影響を有するが、より低い導電率値は、わずかにより高いＵｎ値をもたらす。細胞膜の誘電率、図３３Ｃは、細胞膜及び核膜の充電及び放電に影響を及ぼす。より高い誘電率は、Ｕｍをより低い誘電率の細胞よりもわずかにゆっくり増加させる。細胞膜のこのよりゆっくりとした充電時間は、わずかにより高い膜内外電位に達する核膜をもたらす。
【０１８８】
実験パルスの数値シミュレーション
【０１８９】
図３１Ａ〜３３Ｃのシミュレーション結果は、１０ｎｓの立ち上がり及び立ち下がり時間を有する完全な方形波への理想的な応答を表す。波形は、図３４Ａ及び３４Ｃに示されるように、立ち上がりエッジに対する、及び立ち下がりエッジ後のリンギング効果を示した。図３４Ｂ及び３４Ｄは、実験的な２５０ｎｓ及び１μｓのパルスのそれぞれによって生じる膜内外電位（Ｕｍ）及び核膜内外電位（Ｕｎ）を示す。理想的な場合にあるように、パルスの立ち下がりエッジは、逆極性におけるＵｎの増加をもたらす。出力波形のリンギングは、Ｕｎのさらなる小さい増加を引き起こす。１５００Ｖ／ｃｍにおいて、２５０ｎｓのパルスの第１の立ち上がりエッジは、０．２１ＶのＵｎ振幅最大値をもたらす。同じパルスの立ち下がりエッジ及びリンギングは、１９％の増加である、０．２５Ｖの最大Ｕｎ振幅をもたらす。
【０１９０】
１μｓの実験的パルスに対して、｜Ｕｍ｜が１．２４Ｖの最大値に達する一方で、｜Ｕｎ｜は、０．３２Ｖの最大値に達する。この実験的パルスに対するＵｍの大きさは、図３２Ａで予測される理想値（１．２１Ｖ）にほぼ等しい。しかしながら、この実験的パルスに対するＵｎの大きさ（０．３２Ｖ）は、図３２Ａで予測される値（０．２９Ｖ）よりも大きい。これは、実験的パルスがゼロに低下して戻った後に生じるリンギングによる。
【０１９１】
パルス長が増加すると、初期Ｕｎ応答は、ゼロに向かって低下して戻ることができる。その結果、より長いパルスに対して、立ち下がりエッジ及び後続のリンギングは、増加した効果を有する。同様の電界強度に対して、５μｓのパルスは、５０％の増加である、０．２４Ｖから０．３６ＶへのＵｎ振幅変化をもたらす。これらの場合、リンギングのピーク振幅は、パルス振幅の４６〜５２％であり、２００ｎｓ未満続く。
【０１９２】
実験結果
【０１９３】
２２〜２５℃の初期試料温度で実験を実施した。４０００Ｖ／ｃｍにおいて、全ての実験群が３．５℃未満の温度上昇をもたらした。５０μｓ及び２５０ｎｓの構成的パルスを用いた実験に対する代表的な温度プロファイルは、図３５に示される。２５０ｎｓのパルスを有するバーストに対する温度増加は、より長い持続時間のパルスに対する増加と同様である。これは、構成パルスの持続時間にかかわらず、各バーストにおける同等の量のエネルギーの送達によるものである可能性が高い。実験の開始温度は、温度が３７℃を超えて上昇せず、温度の細胞の生存率に影響を及ぼす交絡因子として可能性を軽減することを確実にした。
【０１９４】
図３６Ａ〜３６Ｃは、（図３６Ａ）１５００Ｖ／ｃｍ、（図３６Ｂ）３０００Ｖ／ｃｍ、及び（図３６Ｃ）４０００Ｖ／ｃｍの電界強度に対する、処置の１及び２４時間後の試料の生存率を示す。構成パルス長と生存率との間には明確な反比例関係があり、より長い持続時間のパルスは、１及び２４時間の両方の生存率研究に対して、より低い生存率をもたらす。
【０１９５】
具体的に、１５００Ｖ／ｃｍにおいて、５０μｓのパルス（２×）を含むバーストは、３１％の処置の１時間後の生存率をもたらし、それは、２４時間後に３％に低減した。２５０ｎｓ（４００×）〜１０μｓ（１０×）のパルスを含む１５００Ｖ／ｃｍのバーストは、５０％を超える１時間の生存率をもたらし、とりわけ、２μｓ（５×）以上のパルスは、シャム処置と同様の８５％以上の生存率を有した。１時間と２４時間との時点の間で、生存率は、全ての構成パルスにわたって１５００Ｖ／ｃｍに曝露された細胞に対して、平均２０％低下した。この電界強度に対して、１０μｓのパルスを含むバーストが２４時間にわたって生存率の最大変化、４９％を有した一方で、２５０及び５００ｎｓのパルスは、対照と比較して生存率のわずかな変化をもたらした。生存率の有意な変化は、２μｓ以上のパルスを有するバーストに対して、１時間と２４時間との時点の間で生じた。１０及び５０μｓのパルスが遅延細胞死をもたらしたが、作用の機構は不明確であることが興味深い。
【０１９６】
細胞生存率は、パルス持続時間が１μｓ以上であったとき、３０００Ｖ／ｃｍ対１５００Ｖ／ｃｍバーストに対して有意により低かった。２４時間後、２〜５０μｓのパルスに対する生存率は、３０００Ｖ／ｃｍにおいて５％未満に低減した。３０００Ｖ／ｃｍ〜４０００Ｖ／ｃｍの間で、生存率に対する最も有意な影響は、５００ｎｓのパルスに対して生じた。全電界強度に対して、２５０ｎｓのパルスは、細胞生存率に対して最小の影響を有した。
【０１９７】
２５０ｎｓのパルスを含むバーストに対して、１５００、３０００、及び４０００Ｖ／ｃｍの処置後の生存率の差は、統計的に有意ではなかった（α≦０．１）。全ての他のパルス幅は、各時点において、１５００Ｖ／ｃｍの処置と３０００Ｖ／ｃｍの処置との間で統計的に有意な差を有した（α≦０．０６）。３０００の処置と４０００Ｖ／ｃｍの処置との間で、５μｓ（１時間）、５００ｎｓ（１時間）、及び５００ｎｓ（２４時間）群は、統計的に異なる生存率を有した（α≦０．０３）。
【０１９８】
興味深いことに、本研究は、生存率が送達されるエネルギー用量と直接的に相関がないことを示す。これは、異なるパルス幅の単極性パルスの電気透過性（Ａ．Ｍａｃｅｋ−Ｌｅｂａｒ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ｐｕｌｓｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３５（２００１））及び致死（Ｂ．Ｌ．Ｉｂｅｙ，Ａ．Ｇ．Ｐａｋｈｏｍｏｖ，Ｂ．Ｗ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｖ．Ａ．Ｋｈｏｒｏｋｈｏｒｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｒｏｔｈ，Ｍ．Ａ．Ｒａｓｓｏｋｈｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｇ．Ｊ．Ｗｉｌｍｉｎｋ，Ｏ．Ｎ．Ｐａｋｈｏｍｏｖａ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｅ  ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｕｌｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，１８００（２０１０）１２１０−１２１９）効果が、単独で送達されるエネルギーの量と相関し得ない複雑な関係を示すという、他によって示される結果と一致する。示されるパルス長と毒性との間の逆相関は、ここで１．１１〜７．９２μｓとして計算された細胞膜充電時間に関連し得る。図３７Ａ〜Ｌは、Ｕｍ及びＵｎが臨界閾値を超えて上昇する時間に対する各バースト内の複数のパルスの効果を示す。１５００Ｖ／ｃｍ、１つの正及び１つの負の２５０ｎｓのパルスの単一のサイクルは、合計で２００ｎｓのみにわたって、１Ｖを超えてＵｍを増加させる。しかしながら、１バースト当たり２００のサイクル（４００の合計パルス）の累積的影響は、約４０μｓにわたって、１Ｖを超えてＵｍを増加させる。１５００Ｖ／ｃｍ（図９Ａ及びＢ）において、１Ｖの閾値を超える時間は、構成的パルス幅（Δｔｐ）が増加するにつれて増加する。このプロセスは、５０μｓの構成的パルス幅を有するバーストに対して、最大で約９９．８μｓに達し、それは、１つのサイクルのみを有する。３０００及び４０００Ｖ／ｃｍにおいて、図３７Ｅ及びＦ、Ｉ及びＪは、より短いパルスのバーストは、より長いパルス持続時間を有するバーストよりもより長い持続時間にわたって、１Ｖを超えてＵｍを上昇させるが、これは、細胞生存率にわずかな影響を有するように思われる。ここで検査されていないが、膜充電時間を下回って電圧印加されるパルスは、制限された孔拡大をもたらし、致死効果を最小限に抑え得る。
【０１９９】
１５００Ｖ／ｃｍにおいて、パルス持続時間のどれも、０．５、０．７５、または０．９Ｖの閾値を超えてＵｎを上昇させなかった（図３７Ｃ及びＤ）。０．７及び０．９Ｖは、最高電圧（４０００Ｖ）におけるいかなるシミュレーションに対しても到達されなかった１．０Ｖの閾値の代わりとして示され、可逆電気穿孔の開始に近似するために、０．５Ｖが使用される（Ａ．Ｍ．Ｌｅｂａｒ，Ｇ．Ｃ．Ｔｒｏｉａｎｏ，Ｌ．Ｔｕｎｇ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｉｎｔｅｒ−ｐｕｌｓｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｐｕｌｓｅｓ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ，ＮａｎｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ，１（２００２）１１６−１２０、Ａ．Ｐｏｌａｋ，Ｄ．Ｂｏｎｈｅｎｒｙ，Ｆ．Ｄｅｈｅｚ，Ｐ．Ｋｒａｍａｒ，Ｄ．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｍ．Ｔａｒｅｋ，Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２４６（２０１３）８４３−８５０）。３０００Ｖ／ｃｍ（図３７Ｇ及びＨ）において、全てのパルス持続時間は、０．５Ｖの閾値を超えてＵｎを増加させることができる。完全バーストの累積的影響は、より短い構成的パルスに対して、実質的により長い持続時間にわたって、０．５Ｖの閾値を超えて増加するＵｎをもたらす。４０００Ｖ／ｃｍ（図３７Ｋ及びＬ）において、いくつかのパルス持続時間は、０．７５及び０．９Ｖの閾値を超えてＵｎを上昇させることができる。興味深いことに、５００ｎｓのパルスは、任意の他のパルス持続時間よりも、閾値の全てを超えるより大きい累積時間をもたらす。これは、なぜ５００ｎｓのバーストが１時間と２４時間との間で生存率の有意な変化をもたらしたが、２５０ｎｓがもたらさなかったのかを説明するのに役立ち得る。
【０２００】
１μｓ以上の持続時間のパルスを含む全てのバーストに対して、２４時間後の３０００Ｖ／ｃｍにおける生存率は、１時間後の４０００Ｖ／ｃｍにおける対応する生存率よりも低い。これは、アブレーションサイズが経時的に大きくなり得ること、及び即座の観察が処置される全体積を予測するのに不十分であり得ることを示すため、インビボの用途に関して興味深い意味合いを有する。数値シミュレーションから、より大きい細胞質−核比を有する細胞が、同様の比を有する同様のサイズの細胞よりも高いＵｎ振幅を達成することが予想される。高い核−細胞質比（ＮＣＲ）は、悪性の細胞の攻撃性と関連しており、癌の悪性度を分類するときのパラメータとして使用される（Ｋ．Ｓｅｉｂｅｒｔ，Ｓ．Ｍ．Ｓｈａｆｉｅ，Ｔ．Ｊ．Ｔｒｉｃｈｅ，Ｊ．Ｊ．Ｗｈａｎｇ−Ｐｅｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｏ' Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｈ．Ｔｏｎｅｙ，Ｋ．Ｋ．Ｈｕｆｆ，Ｍ．Ｅ．Ｌｉｐｐｍａｎ，Ｃｌｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＣＦ−７  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（１９８３）２２２３−２２３９、Ｙ．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｓ．Ｋａｍｏｉ，Ｓ．Ａｍａｄａ，Ｆ．Ａｋｉｙａｍａ，Ｓ．Ｇ．Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，Ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃａｎｃｅｒ，８２（１９９８）８９３−９０１、Ａ．Ｍａｌｐｉｃａ，Ｍ．Ｔ．Ｄｅａｖｅｒｓ，Ｋ．Ｌｕ，Ｄ．Ｃ．Ｂｏｄｕｒｋａ，Ｅ．Ｎ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｇｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．Ｓｉｌｖａ，Ｇｒａｄｉｎｇ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｗｏ−ｔｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２８（２００４）４９６−５０４、及びＳ．Ｇ．Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｏｓａｌ，Ｉｎｔｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９（２０００）７−１５）。
【０２０１】
加えて、侵襲性及び転移性電位の増加が細胞膜の波打ち現象と相関しており、侵攻性の細胞内のより高い膜容量をもたらすことが示されている（Ａ．Ｓａｌｍａｎｚａｄｅｈ，Ｍ．Ｂ．Ｓａｎｏ，Ｒ．Ｃ．Ｇａｌｌｏ−Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｍｅｌｚ，Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，７（２０１３）０１１８０９、Ａ．Ｓａｌｍａｎｚａｄｅｈ，Ｈ．Ｋｉｔｔｕｒ，Ｍ．Ｂ．Ｓａｎｏ，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｍｅｌｚ，Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，６（２０１２）０２４１０４、及びＡ．Ｓａｌｍａｎｚａｄｅｈ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｖｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｍｅｌｚ，Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌ，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．，（２０１３））。数値シミュレーション（図３３Ｄ）において、正常な細胞モデルが｜Ｕｎ｜≒０．１４Ｖを受ける一方で、癌細胞モデルは、｜Ｕｎ｜≒０．３２Ｖに達する。癌細胞モデル内の核は、ＮＣＲの変化の結果として、正常な細胞モデルよりも約２倍高い電位に達する。この効果は、パルス間の遅延が１００ｎｓに低減される場合、さらに増幅され（図３３Ｅ）、癌細胞モデルに対して｜Ｕｎ｜≒０．６Ｖである。悪性の細胞が、核−細胞質比の増加に加えて膜容量の増加に起因する、脂質二重層の充電時間の増加によって、双極性パルスへの応答の増加を受けることが予想される。しかしながら、これらのバーストが侵攻性の細胞の標的化において増加した効率性を有するかを決定するために、今後の研究が必要とされる。
【０２０２】
結論
【０２０３】
本発明者らは、有限要素シミュレーションを通じて、細胞膜の充電−放電挙動が、細胞内構成要素が受ける電界に影響を及ぼすことがわかった。この単純化モデルは、いくつかの制限を有する。細胞を単純な球体としてモデリングして、それらの非付着状態での細胞の形状を反映した。インビボで、細胞は、典型的には、膜内外電位に対するパルス電界の効果を変化させ得るより複雑な、細長い、または紡錘形の形状をとる。加えて、組織内の細胞は、局所不均一性及びそれらのすぐ近くにおける細胞の応答によって影響を受け、それは、ここでは説明されなかった。
【０２０４】
細胞質−核比、細胞質導電率、及び細胞膜誘電率は、核膜の充電特徴において重要な役割を果たす。実験的に、本発明者らは、１バースト当たりの総電圧印加時間を１００μｓで一定に保持し、８０回のバーストを送達したとき、双極性方形波のバーストが、３．５℃未満、培地温度を増加させたことがわかった。したがって、得られる細胞応答は、非熱的現象に直接関係する細胞応答に限定される。示される双極性パルスのバーストに対して、同量のエネルギーの送達にもかかわらず、パルス幅と毒性との間に逆相関が存在する。処置後２４時間にわたる細胞生存率の変化は、即時及び遅延の両方の細胞死過程の存在を示すが、正確な機構は未知である。
【０２０５】
本発明者らが知る限りでは、これは、０．２５〜５０μｓのパルスを有する双極性方形波バーストの効果に対する最初の実験的パラメータ解析である。３０００Ｖ／ｃｍの処置群において、細胞生存率は、２、５、１０、及び５０μｓのパルスを含むバーストのそれぞれに対して、４．０％、０．５％、０．３％、及び１．０％まで低減した。４０００Ｖ／ｃｍの処置群において、細胞生存率は、１、２、５、１０、及び５０μｓのパルスを含むバーストのそれぞれに対して、３．８％、１．４％、０．９％、０．８％、及び０．８％まで低減した。Ｒｕｂｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｏｎｉｋ，Ｐ．Ｍｉｋｕｓ，Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１８０（２００８）２６６８−２６７４）は、２０００Ｖ／ｃｍにおける１０個の１００μｓの単極性パルスが、７０％の生存率をもたらしたことを示した。同じ研究において、彼らは、２５０Ｖ／ｃｍにおける７５個の１００μｓの単極性パルスが、１０〜２０％の生存率をもたらした一方で、２５０Ｖ／ｃｍにおける９０個の１００μｓの単極性パルスが、０〜１０％まで生存率を低減したことを示した。Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃ．Ｂ．Ａｒｅｎａ，Ｃ．Ｓ．Ｓｚｏｔ，Ｐ．Ａ．Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｎ．Ｒｙｌａｎｄｅｒ，Ｒ．Ｖ．Ｄａｖａｌｏｓ，Ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０３（２０１２）２０３３−２０４２（“Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２”））は、１５００Ｖ／ｃｍにおける８０個の１００μｓの単極性パルスの後、細胞生存率は約８％であったことを示し、このプロトコルは、前立腺（Ｇ．Ｏｎｉｋ，Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｆｉｒｓｔ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  Ｆｏｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ，ｉｎ：Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｋｙ（Ｅｄ．）Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２０１０，ｐｐ．２３５−２４７）、膵臓（Ｒ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ  ＩＩ，Ｋ．ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｓ．Ｅｌｌｉｓ，Ｖ．Ｖｅｌａｎｏｖｉｃｈ，Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，２１５（２０１２）３６１−３６９）、及び肝臓（Ｒ．Ｃａｎｎｏｎ，Ｓ．Ｅｌｌｉｓ，Ｄ．Ｈａｙｅｓ，Ｇ．Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｒｒｅｖｅ���ｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｔｏ  ｖｉｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，（２０１２））における不可逆電気穿孔の臨床応用において現在うまく採用されているプロトコルと一致する。ここに示される双極性バーストプロトコルによって生じる毒性の比較可能なレベルは、より長い持続時間の単極性パルスによる筋肉収縮が望ましくないインビボ療法において有利であり得ることを示す。
【０２０６】
実施例３
【０２０７】
材料及び方法
【０２０８】
コラーゲンヒドロゲル腫瘍模倣体
【０２０９】
組織構造、転移、及び遺伝子変化の観点からヒト膵臓癌を複製することが示されている（ｖｏｎ  Ｂｕｒｓｔｉｎ，２００９、Ｓｅｉｄｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａｖｉａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，１０１３７−１０１４２（２００８）、Ｓａｕｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９，１２３７−１２５０（２００５）、ＰａｓｚｅＫ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ８，２４１−２５４（２００５）、及びＳｚｏｔ，Ｃ．Ｓ．，Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｒｙｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｎ．３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，７９０５−７９１２（２０１１））、ＰＰＴ８１８２マウス初代膵臓腫瘍細胞（ｖｏｎ  Ｂｕｒｓｔｉｎ，２００９）を、３Ｄ腫瘍プラットフォーム実験で使用した。加湿雰囲気下、５％  ＣＯ２中で、３７℃において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する、Ｌ−グルタミンが補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で、細胞を培養した。全細胞を、８０％のコンフルエンスにおいて、トリプシン処理によって、実験のために採取した。
【０２１０】
図３８Ａ及びＢは、高周波ＢＥＡＭ処置が、単一の単極性パルス（図３８Ａ）をより高周波の双極性パルスのバースト（図３８Ｂ）に置き換えることを示す。図３８Ｃに示されるコラーゲンＩヒドロゲルをすでに記載されるように生成した（Ｓｚｏｔ，Ｃ．Ｓ．，Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｒｙｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｎ．３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，７９０５−７９１２（２０１１））。簡潔に、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット尾腱を切除し、室温で、１０ｍＭのＨＣｌ中で一晩、攪拌下で溶解させた。得られる単量体コラーゲン懸濁液を３０分間、２２，５００×ｇで遠心分離し、上清を傾けて移し、後の使用まで４℃で保管した。ＨＣｌ中のコラーゲンＩを、１０×の濃度のＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウムが補充される、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１ＮのＮａＯＨ、ならびに脱イオンＨ２Ｏを含有する緩衝液で中和することによって、コラーゲンヒドロゲルを形成して、７．４のｐＨで８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。ＰＰＴ８１８２細胞を、１×１０６個の細胞／ｍＬの最終播種密度で中和緩衝液中に懸濁し、次いで、コラーゲンＩ溶液と混合した。コラーゲン−細胞懸濁液を１０ｍｍ直径の円筒形の型にピペットで移して、重合後に３ｍｍの厚さを得た。３７℃での２０分のゲル化期間に続いて、ヒドロゲルを型から除去し、パルス送達前１８時間にわたって、完全培地中で培養した。
【０２１１】
電子機器及びプロトコル
【０２１２】
カスタムパルス発生システムを使用して、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１μｓ、２μｓ、５μｓ、１０μｓ、及び５０μｓの構成的パルス幅を有する双極性パルスのバーストを送達した。５００Ω抵抗器を負荷と並行に配置して、適切なパルス形状決定を確実にし、かつ開回路へのパルスの送達から保護する。２．０ｍｍの縁間分離距離を有する中空の１．２７ｍｍ直径の分注針（Ｈｏｗａｒｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｌ  Ｄｏｒａｄｏ，ＫＳ）から、カスタム電極を作製した。
【０２１３】
全てのパルス幅に対して、５４０Ｖピーク及び１００μｓの総電圧印加時間で、予備研究を実施した。このプロトコルは、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１μｓ、２μｓ、５μｓ、１０μｓ、または５０μｓのそれぞれの個々のパルス持続時間を有するバーストを含むために、４００、２００、１００、５０、２０、５、または２個のパルスを使用した。１μｓ以下のパルスを含むバーストに対する、５４０Ｖピークにおけるアブレーション領域は、電極を包囲する形のよい楕円ではなかった。むしろ、死滅細胞は、２つの電極の間に延在するが、接続はしなかった、小さい三角形領域を占めた。電界強度は、この領域内で迅速に変化し、電解閾値の計算の大きな変化をもたらした。これを回避するために、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１μｓ、及び２μｓ群に対して、６５０Ｖのより高い電圧を使用した。群間の比較を容易にするために、単純化された電気用量式を使用した。
【０２１４】
【数１４】
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【０２１５】
式中、Ｖは、印加電圧であり、Ｔｐは、パルス幅であり、ｎは、１バースト当たりのパルス数であり、Ｎは、一定の８０で保持した１処置当たりのバースト数である。５４０Ｖピーク群は、２３００Ｖ２ｓの近似用量を有した。６５０Ｖピークにおいて、２５０ｎｓ、５００ｎｓ、１μｓ、及び２μｓ群のそれぞれに対して、２５６、１２８、６４、及び３２個のパルスを使用した。これは、２２００Ｖ２ｓの近似用量をもたらした。２１６個のパルスを有する２５０Ｖピークにおける追加の２μｓ群、２０００Ｖ２ｓの近似用量も実施して、エネルギー及び致死電界閾値の効果を比較した。
【０２１６】
バースト電圧印加時間の効果を調査するために、５４０Ｖで２μｓのパルスを含む８０回のバーストを用いて、１組の実験を実施した。２μｓのパルス間遅延を伴い、１バースト当たり２、２４、または５０回、パルスを反復した。パルスの「拡散」及び「バースト」送達を比較するために、１秒当たり５０個のパルスの追加の群を試験した。この群において、合計で８０秒間、２０ｍｓ毎に、２μｓのパルス間遅延を伴い、１つの正のパルス及び１つの負のパルスを送達した。これは、示される、１秒のバースト間遅延を使用しなかった唯一の群である。
【０２１７】
処置時間の効果を調査するために、８回のバーストを用いて、１組の実験を実施した。これらの群は、それぞれ１バースト当たり５０、２、または１回反復した２μｓ、５０μｓ、及び１００μｓのパルスを有した。実験的パラメータは、図３９の表中で要約される。全てのパラメータを最低３（ｎ＝３）回反復した。
【０２１８】
試料処理
【０２１９】
処置の２４時間後、正常な培養培地を、４μｍのカルセインＡＭ（ライブ染色、λｅｍ＝５１５ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が補充された２．５ｍＬの培地に置き換え、３０分間３７Ｃでインキュベータした。視覚化の５分前、７５μＬの１．５ｍＭヨウ化プロピジウム（ＰＩ；デッド染色、λｅｍ＝６１７ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、培地に５分間補充した。最後に、ヒドロゲルをＰＢＳですすいで、いかなる吸収されていない色素を洗い流し、信号対ノイズ比を増加させた。２０×対物レンズを有するＬｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して、１組の画像をタイル表示させ、表面のすぐ下の処置された足場の平面全体を再構築した。
【０２２０】
組織模倣体における電界閾値の解析
【０２２１】
ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２ａ，ＣＯＭＳＯＬ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で、有限要素モデルを作った。コラーゲンヒドロゲルを、５ｍｍの半径及び１．２Ｓ／ｍの導電率を有する３ｍｍ厚のシリンダとしてモデリングした。１．２７ｍｍの外径の電極を表すシリンダを、それらの縁間距離が２ｍｍと等しくなるようにオフセットした。解ドメイン内で、電流モジュールを使用して、以下の方程式を解き、
【０２２２】
【数１５】
2019193668.tif 000017
【０２２３】
【数１６】
2019193668.tif 000018
【０２２４】
【数１７】
2019193668.tif 000019
【０２２５】
式中、Ｕは、電位であり、Ｅは、電界であり、Ｊは、電流密度であり、Ｑは、電流源であり、σは、導電率であり、εｒは、比誘電率であり、ε０は、真空の誘電率である。１つの電極を包囲する境界に一定の電位を割り当てた。
【０２２６】
【数１８】
2019193668.tif 000020
【０２２７】
もう一方の電極の境界を相対接地として割り当てた。
【０２２８】
【数１９】
2019193668.tif 000021
【０２２９】
残りの境界を電気絶縁として定義し、
【０２３０】
【数２０】
2019193668.tif 000022
【０２３１】
式中、ｎは、表面の法線ベクトルであり、Ｊは、電流である。
【０２３２】
筋肉収縮なしの非熱アブレーションのための改良したデューティサイクルアプローチ（Ａｒｅｎａ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈ−ＦＩＲＥ）ｆｏｒ  Ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  Ｏｎｌｉｎｅ  １０（２０１１）、Ｎｅａｌ，Ｒ．Ｅ．，２ｎｄ，Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．＆Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐｌａｎｎｉｎｇ．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ５９，１０７６−１０８５（２０１２））を使用して、８０秒にわたって、５４０Ｖ及び１００μｓの電圧印加時間に対して、ジュール加熱による温度の変化を計算した。修正した熱伝導方程式を一時的に解くことによって、温度分布（Ｔ）を得て、
【０２３３】
【数２１】
2019193668.tif 000023
【０２３４】
式中、τは、パルス持続時間であり、Ｐは、パルスの期間であり、ｋは、熱伝導率であり、ｃは、定圧比熱であり、ρは、密度である。外側境界を対流冷却として扱い、
【０２３５】
【数２２】
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【０２３６】
２２℃の外部温度（Ｔ外部）及び２５（Ｗｍ−２Ｋ−１）の熱伝達係数（ｈ）を有する。中間の時間ステップを使用して、少なくとも１つの時間ステップが毎秒行われたことを確実にした。５４０Ｖにおけるシミュレーションは、熱効果が電界分布に対するわずかな影響をもたらしたことを示し、温度増加による導電率の変化を、計算時間を最小限に抑えるために、後続のモデルにおいて無視した。電気穿孔による導電率の変化も同様に、足場内の細胞の低濃度によって無視した。実験的に測定された値を複製するために、１つの電極上の電圧は、１０Ｖずつ、４７０〜７００Ｖ掃引し、もう一方は、接地で保持した。
【０２３７】
ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４３ｕ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を使用して、ヒドロゲルの表面付近のタイル表示された画像（図３８Ｄ〜Ｇの代表的な実施例）を検査した。ＰＩ（死滅領域）を占めた細胞の領域の幅及び高さを測定した。次いで、これらの値を数値シミュレーションからの電界強度と関連付けて、細胞死に必要とされる電界閾値を決定した（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。９９％（α＝０．０１）の信頼度を有するＪＭＰ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０  Ｐｒｏ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、データの統計解析を完了した。
【０２３８】
マウス腫瘍モデル
【０２３９】
この研究は、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。６〜７週齢のＨｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ雄マウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＶＡ）を、３％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）の吸入によって麻酔をかけると同時に、ヒト神経膠芽腫細胞（ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ）を、背側脇腹領域に皮下接種した。マウスを、特定病原体除去条件下で、５匹の群で、個々に換気ケージ内に収容し、随意に、滅菌水及び飼料へのアクセスを可能にした。接種前、細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｌ−グルタミンが補充された高グルコース。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中で、標準的な技術を使用して培養した。８０％のコンフルエンスに達すると、細胞を、ＰＢＳ及びマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の８５／１５の混合物中に、５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。各注入のために、この最終懸濁液の２００μＬのアリコートを使用した（合計で１×１０６個の細胞）。
【０２４０】
カリパスを使用して、腫瘍増殖を経時的に測定し、修正した楕円体計算式（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｂｉｎｄｅｒｕｐ，Ｔ．＆Ｋｊａｅｒ，Ａ．Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＣＴ  ｉｓ  ｍｏｒｅ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｈａｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  １８ＦＦＤＧ−ｍｉｃｒｏＰＥＴ  ｏｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｌｉｐｅｒ．ＢＭＣ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ８，１６（２００８））に従って、体積（ｖ）を計算し、
【０２４１】
【数２３】
2019193668.tif 000025
【０２４２】
式中、ｌは、縦径の長さであり、ｗは、横径の幅である。最大直径が約５ｍｍに達したとき、腫瘍を処置した。処置群は、図４４の表に示される。マウスに同じイソフルラン吸入プロトコルを実施した後に麻酔をかけ、腫瘍を覆う皮膚を７０％イソプロピルアルコールで準備した。次いで、カスタムスチール針電極ｓ（０．４ｍｍφ）を腫瘍の中心に前進させた。全ての処置で０．４ｃｍの間隔（中心間）を使用した。全処置群において、パルス発生システムを、その最大の１０００Ｖピーク出力を送達するように設定した。１バースト当たりの電圧印加時間を１００μｓに固定し、バーストを２分間、１Ｈｚの反復率で送達した。
【０２４３】
処置後、局所用抗生物質軟膏を針挿入創に塗布した。マウスを麻酔から外し、回復のために、１ｍＬのｓｔｅｒｉｌｅ  ｓａｌｉｎｅ溶液中で希釈した５ｍｇ／ｋｇのケトプロフェン鎮痛剤を提供した。腫瘍体積が８００ｍｍ３に達した場合、マウスを人道的な理由で処置後３０日またはそれよりも早く安楽死させた。
【０２４４】
任意の存在する主要組織の試料を切除し、処理のために切開した。代表的な組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で保存し、パラフィンに包埋した。ホルマリン保存パラフィン包埋試料を切開し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、組織構造に関して処理した。全ての顕微鏡写真を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００倒立顕微鏡を用いて得た。
【０２４５】
結果
【０２４６】
ＢＥＡＭ処置パルス幅、パルス数、及び総電圧印加時間は、致死電界閾値に影響を及ぼす
【０２４７】
典型的なＩＲＥ処置は、それぞれが１Ｈｚ反復率で１００μｓの持続時間の、８０個の単極性パルスの送達を伴う。ＰＰＴ８１８２細胞株及び同じ組織模倣体を使用して、Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）は、この標準的なプロトコルに対する致死限界値が５０１Ｖ／ｃｍであることがわかった。図４０Ａは、単極性パルスが同等の電気用量を有する双極性パルスのバーストによって置き換えられるときの致死限界値を示す。致死電界閾値は、０．２５、０．５、１、２、５、１０、及び５０μｓのパルスを含むバーストのそれぞれに対して、２０２２、１６８７、１０７０、７５５、６４０、６２９、及び５３１Ｖ／ｃｍであることがわかった。
【０２４８】
測定される温度プロファイルは、数値的に予測されたプロファイルとよく相関した（図４０Ｃ）。これらのパルスのシミュレーションは、８０個のパルスを送達した後の組織模倣体の中心における約１２℃の温度増加を予測する。実験的に、全ての群にわたる平均温度増加は、１４．４±２．２℃であった。室温で実験を実施し、実験的に測定された最大温度は、３４．８℃であった。最大温度の最大変化、３．２℃は、２μｓの群と５０μｓの群との間で生じた。
【０２４９】
２及び５０μｓのパルスを有するバーストに対して、８及び８０回のバーストを用いた処置を実施した。比較のために、１００μｓの持続時間の８または８０個のいずれかの単極性パルスを用いた処置を実施した（図４１Ａ）。８個のパルスに対する閾値は、２、５０、及び１００μｓ群のそれぞれに対して、１６７５、１２１１、及び８２０Ｖ／ｃｍであることがわかった。８０個のパルスに対する対応する閾値は、７５６、５３１、及び５０１Ｖ／ｃｍであることがわかった。
【０２５０】
本発明者らの等価用量近似の制限を調査するために、２μｓのパルスを有する一定に保持された８０回のバーストを、３つの異なる電圧：２５０、５４０、及び６５０Ｖで送達した。これらの場合、各バーストは、２１６、５０、及び３２個のパルスを含み、２０００、２３００、及び２２００Ｖ２ｓのそれぞれの近似用量を得た。これらの処置に関する細胞死に対する閾値は、６６３、７１８、及び８２２Ｖ／ｃｍ（図４１Ｂ）であった。２５０及び６５０Ｖ群は、９９％信頼度（α＝０．０１）で統計的に異なることがわかった。
【０２５１】
２μｓのパルスを有するバーストに対して、電圧を５４０Ｖで一定に保持したが、１バースト当たりの電圧印加時間が１００から４８または４μｓに低減したとき、電界閾値は、７１８Ｖ／ｃｍから８５５及び１１１０Ｖ／ｃｍのそれぞれに増加することが分かった（図４１Ｃ）。１００μｓと４８μｓとの間の差は、統計的に有意ではなかった。
【０２５２】
図４１Ｄは、致死電界閾値に対するパルス間遅延の効果を示す。５４０Ｖにおいて、２μｓのパルス間のパルス間遅延は、２μｓから２００μｓに増加した。「バースト」と同様に、この「拡散」処置に１秒当たり１００μｓ電圧印加し、この波形を８０秒間送達した。パルス間遅延のこの変化は、７１８Ｖ／ｃｍから７７０Ｖ／ｃｍへの電界閾値の増加をもたらした。この差は、統計的に異ならなかった。
【０２５３】
ＢＥＡＭ処置は、インビボで腫瘍増殖を阻害する
【０２５４】
処置時、腫瘍は、シャム、５μｓ、２μｓ、及び１μｓ群に対して、平均９１、１０１、４５、及び４４ｍｍ３であった。処置の３０日後、これらの平均は、３３２、６２、１６、及び４４ｍｍ３に変化していた（図４２Ｅ）。４つのシャム腫瘍のうちの３つが、３０日目までにサイズが２倍以上になった（図４２Ａ）。４つ目は、サイズが有意に増加せず、研究の終了時に９２ｍｍ３を測定した。１、２、及び５μｓ群における腫瘍（図４２Ｂ〜Ｄ）は、退縮が観察される前の１〜５日目にわたって異なるサイズの増加を示した。１μｓ群は、研究の終了時に２つの完全な退縮を有した。他の２つの腫瘍は、３０日目に８５及び９１ｍｍ３を測定した。２μｓ群は、１つの完全な退縮を有し、他の腫瘍は、３０日目に３２．９ｍｍ３を測定した（図４２Ｃ）。５μｓ群は、３つの完全な退縮を有した。残りの腫瘍は、７７、７７、９７、１０６、及び１４４ｍｍ３の体積を有した。図４Ｅは、３０日間の試験にわたる各処置群に対する平均腫瘍体積を示す。
【０２５５】
インビボ処置の直後、腫瘍の白色化が生じた。これは、血流の低減と関連し、浮腫の初期段階である（図４３Ｂ）。電気穿孔による療法のこの特徴的な抗血管作用は、出血性転移を治療するための電気化学療法（ＥＣＴ）で利用されている（Ｊａｒｍ，Ｔ．，Ｃｅｍａｚａｒ，Ｍ．，Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｄ．＆Ｓｅｒｓａ，Ｇ．Ａｎｔｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １０，７２９−７４６（２０１０））。非絶縁電極の使用により、腫瘍を覆っている皮膚は、腫瘍と共に死滅させられた。これは、処置後１日目以内に痂皮形成（図４３Ｃ）をもたらし、それは、典型的には２週間以内に消えた。組織採取の直前及び後に撮られたエンドポイント画像は、ＢＥＡＭ処置の３０日後の完全な腫瘍退縮の証拠を示す（図４３Ｄ〜Ｇ）。
【０２５６】
図４３Ｈ及びＩは、シャム群（図４３Ｈ）及び５μｓ処置群（図４３Ｉ）におけるマウスの研究エンドポイントからの組織切片を示す。処置されたマウスにおいて測定可能な腫瘍が観察されなかったという事実にもかかわらず、生存神経膠芽腫細胞の袋が、筋肉組織の上に位置する血管を包囲して存在していた。同様の特徴が、シャムマウスにおいても見られ、さらに筋肉層の下に生存腫瘤を伴った。生存腫瘍を含む細胞は、はっきりと識別できる細胞質及び明確に画定された細胞膜によって包囲される大きい核を示す。加えて、筋肉と脂肪層との間の接触面における腫瘍の境界に沿って、健康な血管系の証拠がある。
【０２５７】
考察
【０２５８】
双極性パルスのバーストに対して、細胞死を誘発するために必要とされる電界閾値は、構成的パルスの持続時間と逆相関する（図４０Ａ）。致死限界値は、パルス持続時間が５０μｓから２μｓに減少すると、わずかに増加する。１μｓのパルスを有するバーストに関する細胞死に対する閾値は、５０μｓのパルスを有するバーストに対する閾値の約２倍であり、２５０ｎｓのパルスは、５０μｓの処置よりも約４倍大きい閾値を有する。図４０Ａに示される処置は全て、８０回のバーストにおいて等価用量を受けた。
【０２５９】
図４０Ｂは、培地中に懸濁し、１５００Ｖ／ｃｍの電圧対距離比で、８０個の単極性の１００μｓのパルス、または２５０ｎｓ〜５０μｓのパルス（１バースト当たり１００μｓ電圧印加される）を有する、８０個の双極性バーストに曝露したＰＰＴ８１８２細胞に対する、Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｎｏ，Ｍ．Ｂ．，Ａｒｅｎａ，Ｃ．Ｂ．，ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｓａｕｒ，Ｄ．＆Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｎａｎｏ−  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｕｌｓｅ  ｂｕｒｓｔｓ  ｆｏｒ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １００，６９−７９（２０１４）及びＡｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）出典のデータを示す。懸濁液中、２μｓ以下のパルスを有するバーストは、細胞生存率に影響を及ぼさない。対照的に、１５００Ｖ／ｃｍは、１μｓ以上のパルスを有するバーストに対して、組織模倣体中の細胞の全てを死滅させるのに十分である。
【０２６０】
細胞が懸濁液にあるとき、それらは、より球状の外観をとる。対照的に、３Ｄ組織模倣体中で増殖されるとき、それらは、広がり始め、より自然な表現型を得る。インビボで、ＩＲＥは、典型的には、約５００〜７５０Ｖ／ｃｍに曝露される領域内で観察され（Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｎｏｎｔｈｅｒｍａｌ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３６，１２７−１３６  （２０１０）、Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ，Ｄ．，Ｓｅｍｒｏｖ，Ｄ．，Ｍｅｋｉｄ，Ｈ．＆Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．Ａ  ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  １５２３，７３−８３（２０００）、及びＥｄｄ，Ｊ．Ｆ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｌ．，Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．，Ｍｉｒ，Ｌ．Ｍ．＆Ｒｕｂｉｎｓｋｙ，Ｂ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｆｏｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ５３，１４０９−１４１５（２００６））、これらの３Ｄ組織模倣体中で予測された電界強度は、双極性バーストに対するインビボ閾値を表す可能性がより高い。しかしながら、どのようにこれらの閾値が、健康な細胞及び悪性の細胞、血管系、管系、及び結合組織を含む、膵臓腫瘍などの複雑で不均一な組織を焼灼するために必要な閾値に匹敵するのかを決定するために、広範なインビボ評価がなお必要とされる。
【０２６１】
電気遺伝子（ＥＧＴ）及びＥＣＴプロトコルは、典型的には、細胞膜を透過するが、細胞死を誘発しないことを目的に、８個のパルスを採用する。図４１Ａは、８個の単極性の１００μｓのパルスと双極性の５０μｓのバーストとの間に有意差があることを示す。これは、これらの群が、バースト数が８０に増加したときに有意に異ならなかったため、興味深い。パルス数の増加は、全ての群に対して、致死電界閾値を有意に低減した。８個のパルスと８０個のパルスとの間で、閾値は、２μｓ双極性、５０μｓ双極性、及び１００μｓ単極性群のそれぞれに対して、９２０Ｖ／ｃｍ（５５％）、６７９Ｖ／ｃｍ（５６％）、及び３１９Ｖ／ｃｍ（３９％）低下する。興味深いことに、２μｓのパルスを有する８０回のバーストに対する致死限界値は、８個の単極性の１００μｓのパルスと同じであった。ここでは調査されないが、双極性パルスの使用は、調査者が有害な致死効果なしで、ＥＧＴまたはＥＣＴを使用して、より大きい体積を処置することを可能にする。
【０２６２】
１μｓ、５００ｎｓ、及び２５０ｎｓを用いたプロトコルは、電圧が５４０Ｖに設定され、１バースト当たりの電圧印加時間が１００μｓであったとき、組織模倣体中で関連した病変をもたらすことができなかった。これは、致死電界閾値を正確に計算すことを困難にした。本発明者らの初期の予備研究において、本発明者らは、１００μｓの電圧印加時間で８０個のパルスを送達すると同時に、電圧を６５０Ｖまで増加させることが、コラーゲンマトリクスの熱変性をもたらしたことがわかった。Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）は、ＩＲＥ中のコラーゲン変性を、４５℃を超える温度と関連付けた。５４０Ｖ及び１００μｓと同様の用量、６５０Ｖにおける６４μｓへの電圧印加時間の低減は、全ての群に対して、形の良い楕円形状の病変をもたらした。本発明者らは、１μｓ以下のパルスを用いて、全ての群に対して、より高い電圧の等価用量のプロトコルを使用した。
【０２６３】
図４１Ｂにおいて、本発明者らは、試験された最低電圧、２５０Ｖにおいて関連した病変を形成した、２μｓのパルスを有するバーストを使用したこの等価用量仮説の有効性を調査した。６５０Ｖ及び５４０Ｖにおける等価用量プロトコル間、または９９％信頼度（α＝０．０１）を有する５４０Ｖプロトコルと２５０Ｖプロトコルとの間に、統計的な差はなく、９５％信頼度（α＝０．０５）で、３つの群間に統計的な差はない。これは、３Ｄ腫瘍模倣体モデルにおいて、等価用量近似が、プロトコルの比較のために十分であることを示す。
【０２６４】
等価用量仮説がこの範囲（２５０〜６５０Ｖ）からどれだけ離れて有効であるかは不明確である。しかしながら、臨床ＩＲＥシステムは、現在、２７００Ｖの出力に限定される。この電圧において、４μｓ電圧印加されるバーストは、等価用量及び約７５０Ｖ／ｃｍの致死限界値を有する（図４１Ｂからの値の平均）。図４１Ｃは、バーストが４μｓと比べて１００μｓ電圧印加されるときに、致死限界値の３５％の低減があることを示す。これらの２つの効果が相加的である場合、１バースト当たり１００μｓ電圧印加される、２μｓのパルスの８０回のバーストを有するプロトコル（用量≒５８，０００Ｖ２ｓ）は、約４６０Ｖ／ｃｍの致死限界値を有することが予測される。これは、ＢＥＡＭ処置が、現在採用される臨床システムと同様のアブレーション体積を作ることが可能であるべきであることを示す。しかしながら、アブレーション体積の広範なインビボ試験及び測定が、これを検証するために必要とされる。
【０２６５】
マウス腫瘍モデルに対する以前のインビボＩＲＥ実験は、同様のサイズの腫瘍の完全な退縮を得るために、１０００Ｖピーク以上の振幅を有するパルスの印加を必要とした。Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅａｌ  ＩＩ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １２３，２９５−３０１（２０１０））は、それぞれが１００μｓの持続時間及び１３００Ｖピーク（５６００Ｖ／ｃｍ）の１００個の単極性パルスが、２．３ｍｍの電極間隔を有する双極性プローブを介して印加されるとき、７匹のマウスのうち５匹において完全な退縮を達成した。Ａｌ−Ｓａｋｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌ−Ｓａｋｅｒｅ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２，ｅ１１３５（２００７））は、それぞれが１００μｓの持続時間及び１０００（２５００Ｖ／ｃｍ）の８０個のパルスが、４ｍｍ離間した平板電極間で印加されたとき、１３匹のマウスのうち１２匹において完全な退縮を達成した。
【０２６６】
臨床プロトコルを模倣するために、この研究における処置を、２つの針電極を介して適用した。０．４ｍｍの間隔を使用して、本発明者らのパルス発生システムの１０００Ｖピークの限度に相当すると同時に、腫瘍の被覆率を最大化した。これらのインビボ実験で使用される０．４ｍｍ直径の電極は、臨床的に使用される１ｍｍ直径の電極、及び腫瘍模倣体で使用される１．２７ｍｍの電極よりも有意に小さかった。電極直径は、電界分布と密接な関係があり、より小さい電極は、より小さいアブレーション領域をもたらす。これを説明するために、送達されるバースト数を１２０まで増加して、広範な熱的加熱効果を回避すると同時に、可能な限り最良の結果を提供する。肉眼及び組織学的検査は、熱損傷からの任意の瘢痕形成を示さなかった。
【０２６７】
処置群において、測定された腫瘍体積は、処置後最初の１〜５日間にわたって増加した。浮腫の発生と共にかさぶたの形成は、短期間の経過観察中に腫瘍体積の過大評価をもたらした可能性がある。処置送達後２週間以内に、かさぶたは消え、腫瘍退縮の証拠は観察可能であった。
【０２６８】
この処置プロトコルは、腫瘍増殖を阻害する。処置群における平均腫瘍体積は、研究の終了時に対照よりも有意に小さかった。ＩＡＣＵＣプロトコルの限られた期間により、腫瘍が処置後に指数増殖期に入ったかどうかが不明確であり、本発明者らは、カプランマイヤー生存曲線を得ることができなかった。合計で、１４匹の処置されたマウスのうち６匹が、処置の３０日後、腫瘍の測定可能な兆候を有さず、全てのプロトコルが、いくつかの完全な退縮を達成することができた。今後の研究は、動物の生涯にわたって腫瘍退縮を監視するための長期研究を含むべきである。
【０２６９】
いくつかの処置された動物の組織学的検査は、皮層内の筋肉の筋膜の表面にある腫瘍性細胞の袋を明らかにし、それは、処置中を示す。より高い印加電圧、バースト数の増加、及び／または１バースト当たりのより高い電圧印加時間を有するプロトコルを使用することによって、より良好な退縮結果が得られ得ることが可能である。Ａｌ−Ｓａｋｅｒｅによって示される研究が、１００％の退縮率を得なかったが、彼らのプロトコルが、有望な結果を伴い、ヒト臨床用途にうまく適応されていることに留意されたい。
【０２７０】
結論
【０２７１】
この研究は、ＩＲＥ及びＢＥＡＭプロトコルに対する致死限界値の差を示す。等価用量を送達するにもかかわらず、より短い構成パルスを有するバーストは、典型的には、アブレーションのためにより高い電界強度を必要とする。バーストの数、１バースト当たりの電圧印加時間、及びパルス持続時間は全て、致死限界値に影響を及ぼす重要な要因である。８０回のバーストを使用して、本発明者らは、１、２、及び５μｓのパルスが１０７０、７５５、及び６４０Ｖ／ｃｍの電界閾値を有したことがわかった。２００回のバーストをインビボで送達したとき、これらのパルスは、腫瘍体積に対して同様の効果を有した。ＢＥＡＭで処置された全てのマウスが、療法によく耐え、未処置対照と比較して、腫瘍体積が有意に減少した。各群は、少なくとも１つの完全な退縮を達成した。この研究は、ＢＥＡＭが腫瘍アブレーションのために使用され得るという強い証拠を提供し、今後の調査が保証される。
【０２７２】
実施例４
【０２７３】
方法
【０２７４】
細胞培養
【０２７５】
Ｕ−８７  ＭＧ初代ヒト神経膠芽腫細胞（ＡＴＣＣ）、Ｄ１ＴＮＣ１ラット星状細胞（ＡＴＣＣ）、及びＣ６ラット神経膠芽腫細胞（ＡＴＣＣ）を、加湿インキュベータ内で、５％  ＣＯ２中、３７℃において、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。正常なヒト星状細胞（ＮＨＡ）の細胞（Ｌｏｎｚａ）を、加湿インキュベータ内で、５％  ＣＯ２中、３７℃において、星状細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。細胞を、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度でヒドロゲル中に播種した。ヒドロゲルを、加湿インキュベータ内で、５％  ＣＯ２中、３７℃において、細胞型に対して適切な増殖培地中に浸漬し、細胞生存率を最大で７日間、ヒドロゲル内に維持した（図４６Ａ）。
【０２７６】
３Ｄコラーゲン足場の構築
【０２７７】
すでに記載されるように、ラット尾腱を酢酸中に溶解し、続いて、冷凍及び凍結乾燥することによって、Ｉ型コラーゲン原料を調製した（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。２つの異なるコラーゲン原液濃度：４．５ｍｇ／ｍＬ及び３０ｍｇ／ｍＬを作った。２ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を有する足場を濃縮コラーゲン原料から作製し、０．２％（ｗ／ｗ）及び２％（ｗ／ｗ）のコラーゲンゲルを作った。７．０−７．４の範囲内のｐＨが達成されるまで、酸溶解コラーゲンを１０Ｘ  ＤＭＥＭ（１０％の全コラーゲン溶液体積）及び十分な体積の１Ｎ  ＮａＯＨと混合することによって、中和されたコラーゲン溶液を作った。中和されたコラーゲンをＤＭＥＭ中に懸濁している細胞と混合して、最終コラーゲン混合物中で１×１０６個の細胞／ｍＬの細胞密度を達成した。溶液を、スパチュラを用いて慎重に混合して、細胞を損傷することなく、ゲル全体にわたる均一な分散を確実にした。次いで、コラーゲン溶液を、１０ｍｍの直径及び１ｍｍの深さの切り抜きを有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）型内に分注し、平坦に形作られて、一貫した足場形状を確実にした。腫瘍細胞による酸素（Ｏ２）消費率に関する本発明者らの以前の数学モデリング及び実験（Ｖｅｒｂｒｉｄｇｅ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｇｅｎ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６，２１３３−２１４１，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ｔｅａ．２００９．０６７０（２０１０）（“Ｖｅｒｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０”））は、この細胞密度及び足場の厚さにおいて、Ｏ２濃度が足場の深さ全体にわたって均一であることを確実にする。コラーゲンを、４５分間、３７℃及び５％  ＣＯ２で重合させた。
【０２７８】
３Ｄアルギン酸塩足場の構築
【０２７９】
コラーゲンに関するのと同じＰＤＭＳ型を使用して、アルギン酸カルシウムゲルを作り、直径１０ｍｍ及び厚さ１ｍｍのディスクを作った。本発明者らがすでに報告しているように、緩衝液中に溶解し、透析し、冷凍及び凍結乾燥し、続いて、無血清ＤＭＥＭ中で再構成した粉末状アルギン酸塩（Ｐｒｏｔａｎａｌ  ＬＦ  １０／６０，ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）を使用して、２つのアルギン酸塩ゲル原料濃度（０．４％及び４．０％（ｗ／ｖ）を調製した（Ｖｅｒｂｒｉｄｇｅ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｇｅｎ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６，２１３３−２１４１，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ｔｅａ．２００９．０６７０（２０１０））。アルギン酸塩濃度を、使用されるコラーゲン濃度と同様に、機械的硬さが広範囲に広がるように選択した。アルギン酸塩溶液を１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で細胞と混合し、ＰＤＭＳ型内に分注し、多孔質膜を有して平坦に形作った。アルギン酸ヒドロゲルを、４５分間、多孔質膜の被覆にわたって分注される０．１ＭのＣａＣｌ２に浸漬することによって架橋した。次いで、アルギン酸ヒドロゲルを、３７℃、５％  ＣＯ２で、１０％  ＦＢＳ及び１％  ＰＳが補充されたＤＭＥＭを有する２４ウェルプレート中で培養した。
【０２８０】
形状係数の決定
【０２８１】
Ｕ−８７、ＮＨＡ、Ｄ１ＴＮＣ１、及びＣ６細胞を、すでに記載された４つの条件のうちの１つのヒドロゲル中に個々に播種した（０．２％、２％コラーゲン、０．４％、４％アルギン酸塩）。２４時間細胞を培養した後、４％ホルマリンを使用してヒドロゲルを固定し、遮断し、４０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを使用して透過した。細胞アクチンをＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５６８ファロイジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色する一方で、細胞核をジアミノフェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＬＬＣ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）レーザ走査共焦点顕微鏡を使用して、細胞を視覚化した。次いで、染色した細胞を使用して、４つの条件のそれぞれにおける細胞に対する細胞形状係数を決定した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）で画像解析を行い、細胞の核面積、核外周、細胞質面積、細胞質外周、ならびに最長及び最短直径を決定した。１ヒドロゲル当たり少なくとも４つの細胞に対して測定を行い、少なくとも５つのヒドロゲルを各条件に対して解析した。
【０２８２】
ライブ蛍光イメージング
【０２８３】
Ｕ−８７細胞を通常の培養条件下で培養し、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｎｕｃｌｅｕｓ−ＲＦＰ，Ｂａｃｍａｎ  ２．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｔｕｂｕｌｉｎ−ＧＦＰ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１細胞当たり１０個の粒子の濃度で培地に添加して、１６時間インキュベータした。次いで、細胞を継代し、１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で、０．２％コラーゲンの最終濃度のヒドロゲルに播種した。細胞を２４時間コラーゲンヒドロゲル中で培養した後、Ｚｅｉｓｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＬＬＣ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）の台上で、ヒドロゲルの電気穿孔を実施して、処置中の撮像を可能にした。パルス処置を開始する直前、次いで、パルシングが開始した後５分間、３０秒毎に、単一細胞の画像を撮った。ＩＲＥ処置またはＢＥＡＭ処置への曝露後に、細胞を撮像した。パルスに曝露しなかった細胞もまた、対照として撮像した。
【０２８４】
３Ｄ足場の電気穿孔
【０２８５】
一定の電気特性を有するヒドロゲル中で、パルス電気穿孔実験を実施した。ゲル−細胞混合物のそれぞれの導電率を、導電率計を用いて測定して、同様の電気特性（０．９８±０．０４Ｓ／ｍ）を確実にした。ＥＣＭ  ８３０パルス発生器（Ｈａｒｖａｒｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、ＩＲＥパルスを発生させ、カスタム電極を介して組織に送達した。特注のパルス発生システム（ＩＮＳＰＩＲＥ  ２．０，ＶｏｌｔＭｅｄ  Ｉｎｃ．，Ｂｌａｃｋｓｂｕｒｇ，ＶＡ）を使用して、高周波パルスを送達した。直径が０．８７ｍｍで、縁間が３．３ｍｍ分離した、２つの固体ステンレス鋼シリンダを電極として使用した。
【０２８６】
合計で５０個の方形波パルス（ＩＲＥ）または１μｓのパルスの５０回のバースト（ＢＥＡＭ）を送達して、処置を実施した。ＩＲＥプロトコルは、１秒当たり１パルスの反復率で、１００μｓのパルスを送達した。ＢＥＡＭプロトコルにおいて、５μｓのパルス間遅延を伴う１００×１μｓのパルスからなるバーストを、１秒当たり１バーストの反復率で送達した。ＩＲＥ処置に対して、パルス振幅を４５０Ｖピークに設定した一方で、ＢＥＡＭ処置に対して、ＩＲＥ群とほぼ同じ体積のアブレーションをもたらすために、７００Ｖピークを使用した。
【０２８７】
ヒドロゲル中の有限要素解析
【０２８８】
ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．３，ＣＯＭＳＯＬ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した有限要素モデルを使用して、ラプラス方程式を解いて、使用されるそれぞれ異なる電圧に対するヒドロゲル内の電界分布を見つけた。ジュール加熱方程式を解いて、各処置の結果として、ヒドロゲル中の温度分布を計算するためにも、ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓを使用した。ヒドロゲルの深さに及ぶ２つのスチール電極シリンダ（ｄ＝０．８７ｍｍ）を有する、１０ｍｍの直径及び１ｍｍの厚さのシリンダとして、シミュレーション形状をモデリングした。連続細分化間の誤差が１％未満になるまで、メッシュを細分化した。最終メッシュは、４７，４３８個の要素を含み、Ｐｅｎｔｉｕｍ  ｉ３プロセッサ上で、約３分で解が見つかった。
【０２８９】
個々の細胞の有限要素解析
【０２９０】
インピーダンス境界条件スキーム（Ｓａｎｏ，Ｍ．Ｂ．，Ａｒｅｎａ，Ｃ．Ｂ．，ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｓａｕｒ，Ｄ．＆Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｎａｎｏ−  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｕｌｓｅ  ｂｕｒｓｔｓ  ｆｏｒ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １００，６９−７９，ｄｏｉ：ＤＯＩ  １０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｅｌｅｃｈｅｍ．２０１４．０７．０１０（２０１４））を用いた有限要素モデルを使用して、細胞膜及び核膜にわたる膜内外電位をモデリングした。これらの有限要素モデルを使用して、シミュレーションされたＩＲＥ  ａｎｄ  ＢＥＡＭパルスに対する代表的な細胞形状の応答を数値的に調査した。共焦点顕微鏡画像からＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）で行われた平均測定に基づき、細胞形状を決定した。２つの異なるコラーゲン密度（０．２％、２％）でのＵ−８７細胞、ならびに０．２％コラーゲンマトリクス中の４つの異なる細胞型（Ｕ−８７、ＮＨＡ、Ｃ６、Ｄ１ＴＮＣ１）に対する形状を使用した。ＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓの２Ｄ−軸対称プラットフォームを使用して、全てのモデルを解いた。別個の電流物理学モジュールを各ドメイン（培地、細胞質、核質）に対して使用した。３００μｍの辺を有する大きい培地ドメインを使用して、いかなる有意な境界効果を回避した。半楕円形として細胞及び核をモデリングし、それらの長さ及び幅は、共焦点顕微鏡画像からの測定に従って異なった。
【０２９１】
電流モジュールを使用して、時間ドメイン内でシミュレーションを解いた。細胞膜及び核膜によってもたらされる抵抗及び容量を説明するために、既存の文献に基づき、核及び細胞質の境界にインピーダンス特性を割り当てた。
【０２９２】
致死限界値の決定
【０２９３】
処置を送達した２４時間後に、ヒドロゲル上でライブ／デッド染色を最初に実施することによって、細胞死に対する閾値を決定した。生存細胞がカルセインＡＭ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で染色され、緑色の蛍光を発した一方で、死滅細胞は、エチジウムホモダイマーＩＩＩ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で染色され、赤色の蛍光を発した。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用して、赤色に染色した死滅領域の直径を測定した。アブレーション領域の形状測定を有限要素モデルにマッピングして、足場の処置中の電界を計算した（図４６Ｃのｃ）。生存及び死滅領域の縁部における電界の大きさを、所与の細胞型に関する細胞死に対する電界閾値と見なした。
【０２９４】
インビボでのイヌ処置
【０２９５】
全てのイヌのインビボ研究は、動物実験委員会（０８−２１８−ＣＶＭ）によって承認された。すでに記載された方法（Ｅｄｄ，Ｊ．Ｆ．＆Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐｌａｎｎｉｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６，２７５−２８６，ｄｏｉ：１０．１１７７／１５３３０３４６０７００６００４０３（２００７）（“Ｅｄｄ  ａｎｄ  Ｄａｖａｌｏｓ，２００７”）、Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎ−ＴＩＲＥ）  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｉｎ  ａ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １０，７３−８３（２０１１）、Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌ，Ｊ．Ｈ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｔ．Ｌ．＆Ｄａｖａｌｏｓ，Ｒ．Ｖ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎ−ＴＩＲＥ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｂｒａｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４，４３３−４４０，ｄｏｉ：１０．４１４２／ｊｖｓ．２０１３．１４．４．４３３（２０１３）（“Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３”））に従って、麻酔された正常なイヌ対象の脳において、かつ自然発生悪性神経膠腫を有するイヌにおいて、ＩＲＥ処置を実施した。担癌イヌにおいて、ＩＲＥアブレーション前に、脳病変の生検を実施して、腫瘍の病理組織学的診断及び悪性度分類を可能にし、焼灼した領域の追加の生検をＩＲＥの２４時間以内に得て、ＩＲＥ処置の効果を特徴付けた。
【０２９６】
組織形態学的染色
【０２９７】
ＩＲＥで処置した正常なイヌ及び担癌イヌからの保管された、パラフィン包埋の、横方向に配向した脳切片を回収し、５μｍの厚さに切断し、正電荷スライド上に載置し、ヘマトキシリン及びエオシンで定期的に染色した（Ｅｄｄ  ａｎｄ  Ｄａｖａｌｏｓ，２００７、Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。電荷結合素子デジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  ＤＳ−Ｆｉ１ｃ，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）及び市販の画像解析ソフトウェアシステム（ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて、大脳皮質、皮質下白質、対側の相同皮質、及び白質対照のＩＲＥ焼灼領域を表す対象の領域、ならびにＩＲＥ処置前及び後のイヌＧＢＭのデジタル顕微鏡写真を撮った。
【０２９８】
統計解析
【０２９９】
Ｐｒｉｓｍ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６，Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で実施された両側ｔ検定によって、統計的有意性を決定した。有意性をｐ＜０．０５として定義して、９５％信頼区間を使用した。全ての数値結果は、全ての実験測定の平均及び標準偏差として報告される。異常値を除外しなかった。
【０３００】
結果
【０３０１】
パルス電界の細胞サイズ選択性
【０３０２】
有限要素モデリングを用いて、電界パルスへの単一細胞応答をシミュレーションした。モデリングされたＩＲＥパルス（図４５Ａ）への応答した、シミュレーションしたＴＭＰ変化は、細胞サイズに非常に依存する（図４５Ｂ）。対照的に、ＢＥＡＭパルスに曝露された細胞は、これらのモデルにおける細胞サイズに伴う有意なＴＭＰ変化を示さない（図４５Ｃ）。
【０３０３】
細胞死に関する電界閾値に対する細胞サイズの効果を実験的に調査するために、本発明者らは、三次元ＧＢＭヒドロゲル腫瘍モデルを使用して、腫瘍微小環境の機械的及び化学的構造を調整し（図４６Ａ）、次いで、療法−試験プラットフォームとして使用した（図４６Ｂ）。本発明者らは、有限要素モデリングを使用して、２つの実験的電圧において、パルス曝露中のヒドロゲル内の電界をシミュレーションすることによって、致死電界閾値を決定した（図４６Ｃのｃ及びｄ）。これらのシミュレーションは、電界の大きさが増加すると、ピーナッツ形から円形に変化する、電圧の関数としての予測された病変形状の変化を明らかにする。ヒドロゲル中の処置によって誘発された温度分布の有限要素モデリングは、細胞が生理学的レベルを超える温度に曝露されないため、細胞損傷が熱効果によって生じないことを証明したが（図４６Ｃのｅ）、長期の温度増加は明らかではない（図４６Ｃのｆ）。
【０３０４】
ヒドロゲル足場内の細胞サイズ及び形状は、足場密度の関数であり、組織モデル中のコラーゲン密度を変化させることによって、本発明者らは、単一の細胞型に対する細胞サイズ及び外膜外周を制御することができた。Ｕ−８７  ＭＧヒトＧＢＭ細胞は、より低い密度（０．２％ｗ／ｗ）コラーゲン（１５７２±５０３μｍ２）と比較して、より高い密度（２％ｗ／ｗ）コラーゲン（９２０±２４９μｍ２）中で有意により小さい面積（ｐ＝０．００５）を示した（図４７Ａ）。このインビトロモデルを使用して、次いで、本発明者らは、これらの細胞形状が、ＢＥＡＭパルスに対してではなく、ＩＲＥに対する致死限界値を決定したと判断した。モデルによって予測されるように、０．２％コラーゲン中の細胞に対するＩＲＥ病変は、２．０％コラーゲン中の細胞に対する病変よりも大きい（図４７Ｂ、ｐ＜０．０００１）。より大きい細胞が４２８±４７Ｖ／ｃｍを超える振幅を有するＩＲＥパルスによって死滅させられた一方で、より小さい細胞は、細胞死に対してより大きい電界を必要とした（４９２±４１Ｖ／ｃｍ）。対照的に、ＢＥＡＭ処置は、コラーゲン密度とは無関係であった６０１±６５Ｖ／ｃｍの平均致死限界値に対応する、病変サイズの統計的に有意な差をもたらさなかった（図４７Ｃ）。２つの足場に対する導電率は、実験的に比較可能であり、細胞密度は、２つの条件下で同一であった。
【０３０５】
本発明者らは、アルギン酸カルシウムヒドロゲルにおいて追加の実験を実施し、細胞形態は、細胞−ＥＣＭ結合部位の欠如によって、異なる足場密度に対して比較的一定である（図４８Ａ）。アルギン酸ヒドロゲル中、病変サイズ及び致死限界値は、ＩＲＥ（図４８Ｂ）及びＢＥＡＭ（図４８Ｃ）の両方に対して、ポリマー濃度とは無関係であった。
【０３０６】
ＩＲＥのインビボ選択性
【０３０７】
本発明者らは、ＩＲＥ２９を使用して、自然発生悪性神経膠腫を患うイヌ患者をすでに処置した。この処置からの組織構造は、ここに示される本発明者らの３Ｄインビトロアブレーション結果と、ヒトＧＢＭ表現型をよく示す文脈中のインビボの結果との間の重要な比較点を提供する。未処置の大脳皮質灰白質（図４９Ａ）をＩＲＥ処置に曝露したとき、神経細胞及びグリア細胞が焼灼されると、非識別細胞死が生じた（図４９Ｂ）。同様に、ＩＲＥで処置された未処置の内包の白質（図４９Ｃ）は、空胞変性及び軸索消失に加えて、グリア死をもたらした。悪性の神経膠芽腫細胞（図４９Ｅ）がＩＲＥ処置で焼灼されたが（図４９Ｆ）、間質細胞構築も焼灼される。細胞サイズに基づき、ＩＲＥ閾値の統計的に有意であるがそれでもなお小さい差を証明する、本発明者らのインビトロ研究と組み合わせて、イヌＧＢＭにおけるＩＲＥアブレーションの比較的非選択的な性質を証明する、これらのインビボの結果に基づき、次に、本発明者らは、細胞特異的標的化を与えるために、パルス電界に対する電位に重点を置いた。イヌ患者からの組織構造画像は、健康な組織（図４９Ａ、Ｃ）と比較した、ＧＢＭ細胞の腫大した核を特徴とする、よく知られている腫瘍細胞表現型を示し（図４９Ｅ）、したがって、処置電界の細胞内局所化が核サイズの差によって腫瘍細胞標的化を可能にし得るという本発明者らの仮説を動機付ける。
【０３０８】
パルス電界の細胞内効果
【０３０９】
電界の細胞内局所化を介してＢＥＡＭパルスの効果を発揮するための、ＢＥＡＭパルスに対する電位を検査するために、本発明者らは、単一細胞にわたる電界分布の有限要素モデリングを実施した。このモデルは、１００μｓ印加される、５００Ｖ／ｃｍの電界の大きさを有する、シミュレーションされたＩＲＥパルスに対して、外部電界の１４％のみが細胞膜を横断し、細胞質内に存在することを予測する（図５０Ａ）。対照的に、ＢＥＡＭパルスは、細胞の外側にそれらのエネルギーのほとんどを送達する（図５０Ｂ）。細胞質が、各１μｓのＢＥＡＭパルスの持続時間全体にわたって、４００Ｖ／ｃｍを超えて充電される一方で、同じことが各１００μｓのＩＲＥパルスの８％のみに当てはまる。ＢＥＡＭによって作られる強力な細胞内電界のこの予測に関して、腫瘍細胞核に対する効果の意味合いを試験するために、本発明者らは、正常な細胞に対する複数の悪性細胞の比較を含むように選択される、４つの異なる細胞型を使用した３Ｄモデル（図５０Ｃ）を構築した。これらの３Ｄ培養細胞は、細胞面積の有意差を示さなかったが（図５０Ｄ）、核面積の有意差を示した（図５０Ｅ）。ヒト悪性グリオーマ細胞株（Ｕ−８７）が、正常なヒト星状細胞（ＮＨＡ）よりも有意に大きい核面積を示した一方で（ｐ＝０．００４８）、ラット神経膠芽腫株（Ｃ６）は、正常なラット星状細胞（Ｄ１ＴＮＣ１）と比較して、核面積の増加を示した（ｐ＝０．０１４０）。
【０３１０】
ＩＲＥ細胞サイズ依存性及び核サイズ非依存性のモデル予測と一致して、４つの細胞型は、同様のＩＲＥ病変を示した（図５１Ａ）。対照的に、ＧＢＭ細胞を有する組織模倣体中のＢＥＡＭ病変は、正常な星状細胞での病変よりも有意に大きかった（図５１Ｂ）。細胞型にわたる同様の致死ＩＲＥ閾値（図５１Ｃ）は、４つ全ての細胞型が同様の外膜面積を有するという事実と一致する。しかしながら、ＢＥＡＭ実験結果は、悪性の細胞に対してより低い致死限界値を明らかにし（図５１Ｄ）、それらは、それらの正常な細胞対応物と比較して、より大きい核を有する。ヒト細胞へのＢＥＡＭ処置に対して、Ｕ８７神経膠芽腫細胞を６０１＋／−７１Ｖ／ｃｍの閾値で死滅させた一方で、ＮＨＡを１００６＋／−８１Ｖ／ｃｍの閾値で死滅させた（ｐ＜０．０００１）。ラット細胞株に対して、Ｃ６細胞が７５２＋／−５８Ｖ／ｃｍの致死限界値を有した一方で、Ｄ１ＴＮＣ１細胞は、１１０７＋／−１０６Ｖ／ｃｍの致死限界値を有した（ｐ＜０．０００１）。
【０３１１】
ＩＲＥ及びＢＥＡＭの死滅機構
【０３１２】
ＩＲＥ及びＢＥＡＭによる死滅機構間の差を調査するために、本発明者らは、各処置計画への曝露後に、単一細胞の撮像を実施した。細胞核及びチューブリンをライブ蛍光染色によって染色し、３Ｄコラーゲンヒドロゲル中で培養した。ＩＲＥへの曝露の直前、次いで、その後３０秒間隔で、これらのヒドロゲル内の原位置での蛍光撮像を実施し、パルシング後１分以内の細胞膜からの色素の外向きの拡散を明らかにした（図５２Ａ）。処置後５分のうちに、チューブリン色素が細胞の外にほぼ完全に拡散した一方で、核色素は、核の完全性の破壊を示した。対照的に、ＢＥＡＭに曝露された細胞は、５分の時間スケールで、核の強い内向きの崩壊、続いて、チューブリン染色細胞質の崩壊を示した（図５２Ｂ）。同じ時間経過にわたって撮像される処置のいずれにも曝露されない対照細胞は、処置で誘発された変化が光退色と関連していないことを確実にする（図５２Ｃ）。
【０３１３】
核破壊に対する致死限界値の推定
【０３１４】
本発明者らは、後続の数学モデルのための入力として実験データを利用して、ＢＥＡＭ致死限界値と核サイズとの間の関係を調査した。このデータに基づき、細胞死が細胞型とは無関係である細胞型において生じる一方で、この核破壊に必要とされる外部電界は、核サイズに反比例して増減するように思われる。致死限界値、核形状、並びにグリオーマ細胞及び星状細胞に対する理想的な細胞形状に関する実験的発見を使用して、本発明者らは、各細胞型に対する最小致死電界への単一細胞応答の有限要素モデリングを実施した。これらの致死条件、ＮＨＡ細胞に対する１００６Ｖ／ｃｍ、及びＵ−８７細胞に対する６０１Ｖ／ｃｍへの細胞曝露をシミュレーションして、本発明者らは、星状細胞に対するよりもグリオーマ細胞に対する、ＴＭＰのより大きい増加を発見したが（図５３Ａ）、これらのＴＭＰは、ＩＲＥに対する予想された１Ｖの瞬間致死限界値を有意に下回った。対照的に、ｎＴＭＰ応答のシミュレーションは、両方の細胞型に対して、同様のｎＴＭＰの増加を予測し、細胞死が、約１３０ｍＶの破壊において、両方の細胞に対して共通のｎＴＭＰの値で生じていることを示す。
【０３１５】
考察
【０３１６】
全体的な目的は、すでに公開された方法（Ｖｅｒｂｒｉｄｇｅ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｘｙｇｅｎ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｚｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ  １６，２１３３−２１４１，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ｔｅａ．２００９．０６７０（２０１０））に基づき、正常な脳微小環境と対比した、腫瘍の組織操作されたモデルを利用して、ＩＲＥ及びＢＥＡＭパルスへの代表的な細胞形状の応答を調査することであった。これらのプラットフォームは、２Ｄ実験では可能ではない、電界への応答に対する３Ｄ細胞形態の効果を調査するための三次元の生理学的組織コンテクストを大いに提供すると同時に、インビボで見つかった他の交絡変数を排除する。ヒドロゲルは、ＩＲＥパルスへの組織応答を試験するための関連プラットフォームとしてすでに構築されているが（Ａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、そのようなモデルはまた、２Ｄモデルと比較して、ヒト腫瘍生理学及び療法応答をよりよく反復することが証明されている（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ３Ｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  ４，８５５−８６０，（２００７）、Ｆｏｎｇ，Ｅ．Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｅｗｉｎｇ  ｓａｒｃｏｍａ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ３Ｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１０，６５００−６５０５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２２１４０３１１０（２０１３））。標的化パラメータ及び微小環境を容易に調整する能力で、これらのモデルは、広くは、療法応答に対する、より具体的には、治療用電界へ応答に対する、細胞形態学及び組織物理学の影響を測定するための有益なツールを提供する。
【０３１７】
本発明者らの研究が、イヌ患者における自然発生ＧＢＭの処置における彼らの経験によって情報が与えられ、かつそれに基づくことに留意することが重要である。自発的な原発性脳腫瘍は、２つの種−イヌ及びヒトにおいて比較的よく見られるだけである。ヒト及びイヌ脳腫瘍は、組織病理学的及び診断的画像特徴を含む多くの特徴を共有し、それは、ヒト臨床実施で使用される、世界保健機関病理分類及び撮像による治療応答評価スキームの適用を可能にする。イヌ及びヒト脳腫瘍はまた、増殖因子受容体の同様の発現パターン、染色体の欠失、及び腫瘍抑制遺伝子の機能の喪失を有することが証明されている。腫瘍が、ヒトに対するよりもイヌにおいて５〜７倍速く進行するため、自然発生脳腫瘍を患うイヌは、新規の脳腫瘍治療法の信頼でき、かつ迅速な評価及び転換のための魅力的なモデルである（Ｒｏｓｓｍｅｉｓｌ，Ｊ．Ｈ．Ｎｅｗ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ  ａｎｄ  Ｃａｔｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ：Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ４４，１０１３−１０３８，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｖｓｍ．２０１４．０７．００３（２０１４））。
【０３１８】
サイズの大きい差に基づき、腫瘍を血液細胞と区別する、ＰＥＦを使用したサイズ選択的アブレーションは、細胞懸濁液に関してすでに報告されているが（Ｅｐｐｉｃｈ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｌｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８８２−８８７，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／７８５０４（２０００）（“Ｅｐｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００”））、生理学的関連組織内で培養される細胞に関してはまだ証明されていない。本発明者らの実験は、ＩＲＥが３Ｄ組織内への細胞サイズ選択的致死限界値をもたらすという概念を支持する。細胞播種ヒドロゲルのバルク電気抵抗特性は、コラーゲン密度の関数として変化せず、したがって、本発明者らは、測定された差が、変化した組織電気特性よりもむしろ細胞形態の結果であると信じている。アルギン酸塩中で実施された対照実験は、コラーゲン中で観察された差が、マトリクス密度の直接検知などのさらなる要素よりもむしろ、細胞サイズの変化によって生じたというこの仮説をさらに支持する。この発見は、結合リガンド密度の変化が病変サイズにも影響を及ぼし得る可能性を排除しないが、このサイズ依存性は、溶液中の細胞に関するすでに公開されたデータと一致する（Ｅｐｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに、細胞サイズとの閾値のこの相関関係は、ＢＥＡＭに関しては欠けている。本発明者らは、これが細胞の内部の細胞小器官と主に相互作用するＢＥＡＭ電界によるものであると仮定する。本発明者らの有限要素モデリングは、単一細胞モデルに印加される単一のＢＥＡＭバーストがシミュレーションされたＩＲＥバーストよりも細胞の内側ではるかに高い電界を生成するため、この仮説を確実にした。ＢＥＡＭ処置は、これらの１μｓのパルスのうちの１００個を超えた迅速なバーストを送達する。これは、ＢＥＡＭパルスが細胞内膜を優先的に充電することを可能にし、それは、細胞型の関数としての細胞死に対する重大な効果を有するであろうと本発明者らが予想していた。
【０３１９】
本発明者らのインビトロ３Ｄモデル結果は、細胞サイズへの電界閾値の統計的に有意な依存性を証明するが、インビボで観察された細胞サイズ不均一性は、この依存性が標的化特異性のために利用されることを防止し得る。腫瘍のイヌ脳試料及び健康なイヌ脳試料の本発明者らのＨ＆Ｅ染色においてはっきりとわかる、細胞型間のはるかにより明らかな差は、健康な脳組織と比較した、癌細胞の腫大した核である。癌の病理学的指標として使用されて、それらの非悪性の対応物と比較した、腫大した核は、腫瘍細胞の最も信頼できる際立った特徴のうちの１つであるが（Ｚｉｎｋ，Ｄ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａ．Ｈ．＆Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，６７７−６８７（２００４））、この特徴に対する抗癌療法の標的化は、一度も証明されていない。
【０３２０】
核は、典型的には、最大の隣接する細胞内特徴であり、ＢＥＡＭによって生成される高い細胞内電界による損傷に対する適切な標的である。処置に対する核面積の効果を実験的に試験するために、本発明者らは、原形質膜面積の有意差なく核サイズの差を示した異なる細胞型を選択し、細胞サイズによる交絡効果を排除した。数値シミュレーションは、核サイズの増加をｎＴＭＰの増加に対する重要な変数と見なした。ｎＴＭＰの増加は、特定の閾値を超えて細胞死を引き起こし得、したがって、悪性の細胞は、核選択性を示さないＩＲＥとは対照的に、正常な細胞よりも低いＢＥＡＭ致死限界値を有するはずである。ＩＲＥ閾値の類似性は、原形質膜面積の有意差がなかったという事実と一致する。ＢＥＡＭ病変サイズの差は、ＢＥＡＭ閾値の差が、全細胞面積とは対照的に核面積に関連し、より低い致死限界値がより大きい核に対応するということを支持する。ＢＥＡＭから生成される細胞内電界は、電界の大部分に曝露されるより大きい膜がより小さい膜よりも影響を及ぼすのが容易であるため、ＩＲＥが原形質膜に影響を及ぼす方法と少なくとも部分的に類似した方法で、細胞間核膜に影響を及ぼすように思われる。
【０３２１】
各処置に曝露された単一細胞の時間経過画像は、異なる細胞特徴が２つの処置による重要な変数であるという発見と一致する、ＢＥＡＭとＩＲＥとの間の死滅機構の異なる差を示す。ＩＲＥ処置後の細胞死の時間経過は、細胞膜による細胞内に元々閉じ込められたチューブリンタンパク質が、ＩＲＥへの曝露後に細胞の外に拡散し始めるため、細胞死の原因として、細胞膜の即時の破壊を強く暗示する。対照的に、ＢＥＡＭに曝露された細胞が細胞外膜からの拡散では、なくむしろ核崩壊を示す一方で、チューブリンは、元の細胞面積内で保持される。これらの発見は、外膜がＢＥＡＭにおける細胞死の機構において同じくらいの役割を果たさず、むしろ主要な効果は核に対することを示唆する。
【０３２２】
本発明者らの結果を所与として、ＢＥＡＭが、核面積が主要な変数になる方法で、細胞の生物物理学的構造に作用しているように思われる。グリオーマ及び星状細胞の細胞を、それらの個々の致死ＢＥＡＭ閾値（６０１Ｖ／ｃｍ対１００６Ｖ／ｃｍ）に対してシミュレーションしたとき、本発明者らは、それぞれ約１５０〜２５０ｍＶ及び１００〜１３０ｍＶの同様のＴＭＰ及びｎＴＭＰ範囲を発見した。これらのシミュレーションは、興味深いことに、核サイズの関数として、外側ＴＭＰの小さい差を予測した。しかしながら、このＴＭＰの大きさ、約１５０ｍＶは、不可逆電気穿孔による細胞死に対する予想された瞬間閾値（１Ｖ）よりも有意に低かった。したがって、ＢＥＡＭによる死滅の主な機構が、細胞ＴＭＰの増加ではなく、むしろ細胞内効果に関係するように思われる。グリオーマ及び星状細胞の細胞に対して、１３０ｍＶの最大のシミュレーションされたｎＴＭＰもまた、外膜破壊によって生じる死滅に対する致死限界値をはるかに下回り、ｎＴＭＰの小さい破壊が細胞生存に有意に影響を及ぼし得ることを示唆する。細胞死への経路が、細胞膜破壊との組み合わせまたは細胞内効果の別個の連鎖と対比して、核膜に対する効果のみによって支配されるかどうかは不明確である。しかしながら、異なる致死電界強度における、２つの異なる細胞型間のｎＴＭＰ値の相関関係は、核面積がＢＥＡＭ処置後に細胞死過程に影響を及ぼすことを示唆する。
【０３２３】
本発明者らの数学モデルは、細胞外膜が楕円形に近似され、生理学的細胞の不規則な形状または個々の細胞の電気特性の不均一性を説明しないため、制限を有する。電気穿孔効果による膜導電率の変化を含むことは、本発明者らのシミュレーションの精度を強化すると予測される。実験的証拠が、外膜電気穿孔がＢＥＡＭ中に生じている（図５２Ａ〜Ｃ中の時点を超えた時点、データは図示せず）ということも示唆する一方で、本発明者らの実験結果及びモデル結果は、ＢＥＡＭの作用機構へのｎＴＭＰ効果の能動的な役割を強く示唆する。短パルスを使用した不可逆電気穿孔における死滅機構が複雑で、十分に理解されておらず、複数の異なる経路をたどり得ることが広く認識される（Ｗｅａｖｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｃ．，Ｅｓｓｅｒ，Ａ．Ｔ．，Ｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．＆Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ，Ｔ．Ｒ．Ａ  ｂｒｉｅｆ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｕｌｓｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｓｐａｃｅ：Ａ  ｒｅｇｉｏｎ  ｗｈｅｒｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｒｅ  ｅｘｐｅｃｔｅｄ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８７，２３６−２４３，ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｅｌｅｃｈｅｍ．２０１２．０２．００７（２０１２））。さらに、核穿孔は、癌細胞の核サイズの増加だけではなく、浸潤に必要な核の硬さの減少など、核の他の異常によっても補助され得る（Ｄａｈｌ，Ｋ．Ｎ．，Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ａ．Ｊ．Ｓ．＆Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｈａｐｅ，ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０２，１３０７−１３１８，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１０８．１７３９８９（２００８））。別の可能性は、腫大した核の周囲のひずみによって引き起こされる、細胞質に印加される電界の増幅である。これは、ミトコンドリアなどの他の内部の細胞小器官がＢＥＡＭパルスによって破壊されることをもたらし得る。本発明者らの結果は、細胞死ＰＥＦ閾値の決定において、ＩＲＥ及びＢＥＡＭの両方におけるＴＭＰ増加、ならびに特にＢＥＡＭと関連するｎＴＭＰ増加の重要性を強調する。
【０３２４】
ＩＲＥ及びＢＥＡＭの死滅機構が、化学療法及び腫瘍処置電界を含む多くの現在のＧＢＭ療法によって利用される高度に増殖性の表現型を標的化することに基づいていないことに留意することが重要である（Ｋｉｒｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄｓ  ａｒｒｅｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４，１０１５２−１０１５７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０２９１６１０４（２００７））。これらの療法が再発を引き起こす静止した腫瘍幹細胞を残す一方で、ＩＲＥ及びＢＥＡＭは、巨大腫瘍細胞及び腫瘍幹細胞の両方に対して、膜破壊による死滅応答を引き起こすはずである。細胞を、電界によって誘発される損傷に抵抗性を有するようにするために、多数の遺伝子変異が必要とされる可能性が高いため、この物理的死滅機構が、短い時間スケールで抵抗性亜集団の発生を選択する可能性は低い。
【０３２５】
ＢＥＡＭによる細胞死滅の正確な機構は、まだわかっていないが、本発明者らのモデリング及び実験データは、原形質膜を標的化する長いＩＲＥパルスの機構とは異なり、ＩＲＥとは異なり、同様のサイズの細胞の間で細胞型に依存する機構を示唆する。ＢＥＡＭ死滅機構は、悪性の細胞の生物物理学的構造が、研究された健康な細胞への損傷を誘発しないが、悪性の細胞において死滅応答を引き起こす電界分布の範囲を使用して、これらの細胞の選択的標的化を可能にするようなものである。巨大腫瘍を含む悪性の細胞が、腫瘍を包囲する正常な星状細胞（約９３０〜１２００Ｖ／ｃｍ）よりも低い細胞死閾値（約５３０〜８１０Ｖ／ｃｍ）を有するため、腫瘍の縁部にこれらの２つの閾値間の電圧を送達する処置計画が、健康な星状細胞を残す一方で、腫瘍細胞のアブレーションをもたらし得るという結果になる。腫瘍の縁部におけるそのような範囲内の閾値は、外科処置をＧＢＭ、及びより広くは浸潤性腫瘍に対して効果がないものにする侵襲性神経膠芽腫細胞の死滅において、効果的であり得る。
【０３２６】
実施例５
【０３２７】
ＩＲＥパルスより短い１または２桁の大きさの持続時間を有する個々のパルスは、細胞外径にあまり依存しないような方法で、細胞を死滅させることができる（同様のサイズの核を仮定して）。個々のパルスは、筋肉収縮を低減するために、交互極性で印加される。加えて、個々のパルスは、高周波バーストを形成するように反復され、複数のバーストが、典型的には、細胞死を誘発するのに必要である。これは、複数のより長い持続時間のパルスがＩＲＥ処置中に印加される方法と同様である。ＢＥＡＭ処置のこの形態は、典型的には、より高い電界閾値を必要とするが、細胞サイズに対する依存性はより小さい。したがって、処置計画は、異なる細胞型がそれらの形態にかかわらず、同じ電界閾値を有するため、有意に縮小される。
【０３２８】
図５４Ａ〜Ｄに提供される理論的な実施例において、細胞は、球形であると仮定され、導電率λｏ及びλｉは、０．１Ｓ／ｍに設定され、λｍは、３ｅ−７Ｓ／ｍに設定される。図５４Ａ〜Ｄのプロットは、１０ｕｍの直径を有する細胞（実線）及び１５ｕｍの直径を有する細胞（点線）に対する、細胞極（θ＝０）におけるＴＭＰを示す。図５４Ａ及びＢに示されるように、細胞は、２０００Ｖ／ｃｍで印加される５００ｎｓの長さのパルスを有するＢＥＡＭに曝露される。図５４Ｃ及びＤに示されるように、細胞は、１２５０Ｖ／ｃｍで印加される５ｕｓの長さのパルスを有するＩＲＥに曝露される。ＢＥＡＭパルスが膜充電時間よりも短いため、パルスの終了時のピークＴＭＰ到達は、両方の細胞直径に対してほぼ同じである。ＩＲＥ中、外膜は、完全に充電され、ＴＭＰは、それぞれに対して有意に異なるプラトーに達する。
【０３２９】
本発明は、様々な特徴を有する特定の実施形態を参照して記載されてきた。上記に提供される開示の観点から、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明の実施に様々な修正及び変更が行われ得ることが、当業者に明らかとなるであろう。当業者は、開示された特徴が単独で、任意の組み合わせで使用され得るか、または所与の用途もしくは設計の要件及び仕様に基づき、省略され得ることを認識するであろう。一実施形態がある特定の特徴を「含むこと」を指すとき、その実施形態は、あるいは、その特徴のうちのいずれか１つ以上「からなる」、または「から本質的になる」ことができることを理解されたい。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書及び実施の考慮から、当業者に明らかとなるであろう。
【０３３０】
具体的に、値の範囲が本明細書に提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各値もまた、具体的に開示されることに留意されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、同様にその範囲内に含まれるか、または除外されてもよい。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数指示語を含む。本明細書及び実施例が本質的に例示的であると見なされること、及び本発明の本質から逸脱しない変更が本発明の範囲内に入ることを目的とする。さらに、本記事に列挙される参考文献の全ての全体が、参照によりそれぞれ個々に本明細書に組み込まれ、したがって、本発明の実施可能な程度の開示を補う効率的な方法を提供すること、ならびに当業者のレベルを詳述する背景を提供することを目的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
2019193668.tif 000035
【図５Ｇ】
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【図６】
2019193668.tif 000037
【図７】
2019193668.tif 000038
【図８】
2019193668.tif 000039
【図９】
2019193668.tif 000040
【図１０】
2019193668.tif 000041
【図１１】
2019193668.tif 000042
【図１２Ａ】
2019193668.tif 000043
【図１２Ｂ】
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【図１３】
2019193668.tif 000045
【図１４】
2019193668.tif 000046
【図１５】
2019193668.tif 000047
【図１６】
2019193668.tif 000048
【図１７】
2019193668.tif 000049
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
2019193668.tif 000053
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
2019193668.tif 000057
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
2019193668.tif 000087
【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７】
2019193668.tif 000091
【図３８Ａ】
2019193668.tif 000092
【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３８Ｇ】
2019193668.tif 000098
【図３９】
2019193668.tif 000099
【図４０Ａ】
2019193668.tif 000100
【図４０Ｂ】
2019193668.tif 000101
【図４０Ｃ】
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【図４１Ａ】
2019193668.tif 000103
【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
2019193668.tif 000108
【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４３Ｇ】
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【図４３Ｈ】
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【図４３Ｉ】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
2019193668.tif 000129
【図４７Ｃ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
2019193668.tif 000137
【図４９Ｅ】
2019193668.tif 000138
【図４９Ｆ】
2019193668.tif 000139
【図５０Ａ】
2019193668.tif 000140
【図５０Ｂ】
2019193668.tif 000141
【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
2019193668.tif 000143
【図５０Ｅ】
2019193668.tif 000144
【図５１Ａ】
2019193668.tif 000145
【図５１Ｂ】
2019193668.tif 000146
【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
2019193668.tif 000148
【図５２Ａ】
2019193668.tif 000149
【図５２Ｂ】
2019193668.tif 000150
【図５２Ｃ】
2019193668.tif 000151
【図５３Ａ】
2019193668.tif 000152
【図５３Ｂ】
2019193668.tif 000153
【図５４Ａ】
2019193668.tif 000154
【図５４Ｂ】
2019193668.tif 000155
【図５４Ｃ】
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【図５４Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月15日(2019.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結され、かつ標的領域に複数の電気パルスを印加するように構成される電圧パルス発生器と、を備え、
前記複数の電気パルスは、２５０ナノ秒と５０マイクロ秒との間の長さを有し、連続するパルス間に遅延を有し、各パルスの長さ及び連続するパルス間の遅延は、第１の処置領域及び第２の処置領域を作り出すように最適化され、
前記複数の電気パルスは、前記第１又は第２の処置領域内において、選択的電気穿孔が可能である、電気穿孔システム。  
【請求項２】
前記電圧パルス発生器は、前記複数の電気パルスが前記第１の処置領域内で不可逆電気穿孔が可能であるように、複数の電気パルスを印加するように構成される、請求項１に記載の電気穿孔システム。
【請求項３】
前記標的領域は、組織である、請求項１に記載の電気穿孔システム。
【請求項４】
細胞を選択的に処置するための電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結され、かつ細胞を含有する物質に複数の単極性又は双極性の電気パルスを含むパルス列を印加するように構成される電圧パルス発生器であって、前記パルス列は、矩形パルス波、ランプ波、指数関数減衰波、又は正弦波である電界波形を有し、あらゆる遅延及びパルス長は、第１の処置領域及び第２の処置領域を作り出すように最適化される、電圧パルス発生器と、を備え、
前記電圧パルス発生器は、前記第２の処置領域内で細胞分裂の減速或いは停止により、遊走の減速或いは停止により、又は血液及び栄養素の輸送の低減によって、癌細胞が阻害されるように、前記複数の電気パルスを印加するように構成されている、電気穿孔システム。
【請求項５】
前記電圧パルス発生器は、幾つかの細胞が壊死により死滅するか、幾つかの細胞がアポトーシスにより死滅するか、或いは幾つかの細胞が壊死により死滅し且つ幾つかの細胞がアポトーシスにより死滅するように、前記複数の電気パルスを印加するように構成されている、請求項４に記載の電気穿孔システム。
【請求項６】
前記細胞を含有する物質は、組織であり、前記複数の電気パルスは、前記第１の処置領域内で不可逆電気穿孔が可能である、請求項４に記載の電気穿孔システム。
【請求項７】
電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結され、かつ複数の電気パルスを含むパルス列を印加するように構成される電圧パルス発生器であって、前記パルス列は、第１の周波数調波と第２の周波数調波とを含む重畳二峰性信号である電界波形を有し、前記第２の周波数調波は、前記第１の周波数調波の周波数よりも高い周波数を有する、電圧パルス発生器とを備え、
前記電圧パルス発生器は、幾つかの細胞が壊死により死滅するか、幾つかの細胞がアポトーシスにより死滅するか、或いは幾つかの細胞が壊死により死滅し且つ幾つかの細胞がアポトーシスにより死滅するように、前記複数の電気パルスを印加するように構成されている、電気穿孔システム。
【請求項８】
前記電圧パルス発生器は、前記パルス列が標的領域内において標的に選択的に影響を及ぼすように、前記二峰性信号を選択するように構成される、請求項７に記載の電気穿孔システム。
【請求項９】
前記電圧パルス発生器は、マルチレベル、中性点クランプ形、またはカスケードＨブリッジトポロジーで配列される、ソリッドステート切り替えデバイスを備える、請求項７に記載の電気穿孔システム。
【請求項１０】
細胞を選択的に処置するための電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結される電圧パルス発生器であって、第１の処置領域内の幾つかの細胞が分のオーダーで早く死滅し、且つ第２の処理領域内の幾つかの細胞が時間のオーダーでゆっくり死滅するように、細胞を死滅させるのに十分な方法で、細胞を含有する物質に電気パルスを送達するように構成される電圧パルス発生器と、
を備える電気穿孔システム。
【請求項１１】
前記細胞の幾つかは、選択された生物物理学的細胞下構造と核とを有し、前記電圧パルス発生器は、前記細胞の前記核を破壊することによって前記細胞が死滅させられるように構成される、請求項１０に記載の電気穿孔システム。
【請求項１２】
前記選択された生物物理学的細胞下構造を有する前記細胞は、選択された核対細胞質の面積比を有する、請求項１１に記載の電気穿孔システム。
【請求項１３】
細胞を選択的に処置するための電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結され、かつ細胞を含有する物質に複数の電気パルスを印加するように構成される電圧パルス発生器であって、前記複数の電気パルスは、第１の処置領域細胞が分のオーダーで早く死滅し、且つ第２の処理領域細胞が時間のオーダーでゆっくり死滅するように、一種類の細胞の標的細胞を処置し、別の種類の細胞の非標的細胞を残すように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、電圧パルス発生器と、を備える、電気穿孔システム。
【請求項１４】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項１３に記載の電気穿孔システム。
【請求項１５】
前記電圧パルス発生器は、癌細胞が処置され、正常な細胞が残されるように、複数の電気パルスを印加するように構成される、請求項１３に記載の電気穿孔システム。
【請求項１６】
前記電圧パルス発生器は、より悪性の種類の癌細胞が処置され、あまり侵攻性ではない種類の癌細胞は残されるように、複数の電気パルスを印加するように構成される、請求項１３に記載の電気穿孔システム。
【請求項１７】
悪性の細胞を選択的に焼灼するための電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
標的組織領域内に存在する悪性の細胞に対する第１の細胞死閾値を決定し、且つ、前記標的組織領域内に存在する非悪性の細胞に対する第２の細胞死閾値を決定するように構成される電気穿孔処置ソフトウェアプログラムと、
前記少なくとも１つの電極に連結され、且つ、前記非悪性の細胞の幾つかを残しつつ、前記悪性の細胞の幾つかを死滅させるために、前記第１の細胞死閾値以上かつ前記第２の細胞死閾値未満の電気パルスを、１ｋＨｚと１０ＭＨｚとの間の周波数で、前記組織領域に適用するように構成される電圧パルス発生器と、
を備える、電気穿孔システム。
【請求項１８】
前記非悪性の細胞は、死滅させられない、請求項１７に記載の電気穿孔システム。
【請求項１９】
前記悪性の細胞のそれぞれは、細胞核を含み、前記細胞核を破壊するのに十分な様式で前記電気パルスを適用することによって死滅させられる、請求項１７に記載の電気穿孔システム。
【請求項２０】
前記悪性の細胞は、腫瘍由来の浸潤性癌細胞である、請求項１７に記載の電気穿孔システム。
【請求項２１】
前記標的細胞領域は、脳組織を含み、前記悪性の細胞は、神経膠芽腫細胞である、請求項２０に記載の電気穿孔システム。
【請求項２２】
細胞小器官内への材料の輸送を増強するための電気穿孔システムであって、
少なくとも１つの電極と、
前記少なくとも１つの電極に連結され、かつ細胞を含有する物質に複数の単極性又は双極性の電気パルスを印加するように構成される電圧パルス発生器であって、前記複数の電気パルスは、腫瘍境界を越えて異常細胞への血液及び栄養素の輸送を妨げ、且つ、前記腫瘍境界内のあらゆる細胞への血液及び栄養素の輸送を妨げるように選択される周波数、振幅、及びパルス波形を有する、電圧パルス発生器と、
を備える電気穿孔システム。
【請求項２３】
前記細胞を含有する物質は、組織である、請求項２２に記載の電気穿孔システム。
【請求項２４】
前記複数の電気パルスは、異なるパルス幅または異なる振幅を有する正パルス及び負パルスを含む、請求項２２に記載の電気穿孔システム。
【請求項２５】
前記複数の電気パルスは、異なる振幅を有する正パルス及び負パルスを含む、請求項２２に記載の電気穿孔システム。
【請求項２６】
前記複数の電気パルスは、１ｋＨｚと１０ＭＨｚとの間の周波数で、２５０ナノ秒と５０マイクロ秒との間のパルス長で、連続するパルス間の遅延を有するか或いは有さずに、印加される、請求項２２に記載の電気穿孔システム。
【外国語明細書】
2019193668000001.pdf