(57)【要約】【課題】好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する新規な方法を提供する。【解決手段】好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する方法であって、ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７遺伝子およびＣＣＬ２１遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定するか、当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する測定工程を含む、検査方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸球性消化管疾患（Eosinophilic gastrointestinal disorders, ＥＧＩＤ）または食物蛋白誘発腸症（Food Protein-Induced Enteropathy Syndrome (Enteropathy)）を検査する方法であって、
ヒトの生体より採取した試料におけるthymic stromal lymphopoietin （ＴＳＬＰ）遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７遺伝子およびＣＣＬ２１遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定するか、当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する測定工程を含む、検査方法。
【請求項２】
上記測定工程において、少なくともＴＳＬＰ遺伝子およびＩＬ−３３遺伝子の発現量を測定するか、当該試料における少なくともＴＳＬＰタンパク質およびＩＬ−３３タンパク質の量を測定する、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
上記試料が血液由来の試料である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
上記好酸球性消化管疾患は、好酸球性胃腸炎（Eosinophilic Gastroenteritis, ＥＧＥ）である、請求項１〜３の何れか一項に記載の検査方法。
【請求項５】
上記ヒトは２歳以下である、請求項１〜４の何れか一項に記載の検査方法。
【請求項６】
上記測定工程において、上記試料における、ＴＳＬＰ遺伝子の発現量、ＩＬ−３３遺伝子の発現量、ＣＣＬ７遺伝子の発現量、およびＣＣＬ２１遺伝子の発現量、および、ＴＳＬＰタンパク質の量、ＩＬ−３３タンパク質の量、ＣＣＬ７タンパク質の量、ＣＣＬ２１タンパク質の量から選択される少なくとも１つが対照と比較して高いときに、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因が有るまたは発症している、と判定する、請求項１〜５の何れか一項に記載の検査方法。
【請求項７】
好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する検査キットであって、
ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子の発現産物、ＩＬ−３３遺伝子の発現産物、ＣＣＬ７遺伝子の発現産物およびＣＣＬ２１遺伝子の発現産物の少なくとも１つ、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
好酸球性胃腸炎（eosinophilic gastroenteritis（ＥＧＥ））および好酸球性食道炎（eosinophilic esophagitis（ＥoＥ））は、好酸球性消化管疾患（Eosinophilic gastrointestinal disorders, ＥＧＩＤ）と総称される疾患群に属する疾患の一つである。好酸球性消化管疾患は、消化管における好酸球の広範な浸潤によって特徴づけられ、しばしば食物の摂取によって引き起こされる（非特許文献１）。ＥoＥに対する幾つかの研究では、ＴＨ２偏向サイトカイン(ＩＬ−１３等)およびケモカイン(ＣＣＬ２６/eotaxin-3等)の過剰産生を含む、ＥoＥの病理に関わる特定の分子的、細胞的かつ免疫学的なメカニズムが明らかにされている（非特許文献２）。対照的に、ＥＧＥの病因は、大部分が未解明のままである。乳幼児期のＥＧＥはしばしば重篤な、体重減少等の、非特異的な消化管上の症状を示し、その診断を困難にしている。以前の研究では、ＥoＥを伴う患者の場合と同様に、ＥＧＥを伴う成人患者の血中において、幾つかのサイトカイン（ＩＬ−５およびＩＬ−１５）が、増大したレベルにおいて検出されうることが報告されている（非特許文献３）。また、好酸球性消化管疾患と相同性の高い疾患群として非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギー（Non-IgE mediated gastrointestinal food allergy）が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Rothenberg ME. Eosinophilic gastrointestinal disorders (EGID). J Allergy Clin Immunol 2004;113:11-28.
【非特許文献２】Sherrill JD, Rothenberg ME. Genetic dissection of eosinophilic esophagitis provides insight into disease pathogenesis and treatment strategies. J Allergy Clin Immunol 2011;128:23-32.
【非特許文献３】Kinoshita Y, Furuta K, Ishimura N, Ishihara S. Elevated plasma cytokines in Japanese patients with eosinophilic esophagitis and gastroenteritis. Digestion 2012;86:238-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、ＥＧＥおよびＥoＥを含む好酸球性消化管疾患において、適切な診断のためには、繰り返しの消化管内視鏡検査による好酸球集積の証明が必要とされている。消化管内視鏡検査は、検査対象にとって負担の大きい検査手法である。特に検査対象が乳幼児の場合は、過度に侵襲的な検査手法であるため、診断の遅れを招き、重大な合併症を引き起こす原因ともなっている。
【０００５】
そこで、消化管内視鏡検査よりも、検査対象にとって負担の小さい新たな検査手法が切望されている。特定の疾患に関連する分子マーカーの探索は、新たな検査手法の開発に道を開きうる。しかし、好酸球性消化管疾患において、当該疾患の検査に使用可能な分子マーカーは未だ見出されていない。非特許文献２および３にも、好酸球性消化管疾患の診断に有用な分子の同定が果たせなかったとの結果が記載されている。
【０００６】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査に使用し得る分子マーカーとその利用とを提供すること、すなわち、当該分子マーカーを利用した好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の新規な検査方法および検査キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、サイトカインおよび／またはケモカインファミリーのうち、ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の発現量、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質の量が好酸球性消化管疾患（Eosinophilic gastrointestinal disorders, ＥＧＩＤ）または食物蛋白誘発腸症（Food Protein-Induced Enteropathy Syndrome (Enteropathy)）の分子マーカーとして用いることができることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の何れかの発明を包含する。
【０００９】
１）  好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する方法であって、ヒトの生体より採取した試料におけるthymic stromal lymphopoietin （ＴＳＬＰ）遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７遺伝子およびＣＣＬ２１遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定するか、当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する測定工程を含む、検査方法。
【００１０】
２）  上記測定工程において、少なくともＴＳＬＰ遺伝子およびＩＬ−３３遺伝子の発現量を測定するか、当該試料における少なくともＴＳＬＰタンパク質およびＩＬ−３３タンパク質の量を測定する、１）に記載の検査方法。
【００１１】
３）  上記試料が血液由来の試料である、１）または２）に記載の検査方法。
【００１２】
４）  上記好酸球性消化管疾患は、好酸球性胃腸炎（Eosinophilic Gastroenteritis, ＥＧＥ）である、１）〜３の何れかに記載の検査方法。
【００１３】
５）  上記ヒトは２歳以下である、１）〜４）の何れかに記載の検査方法。
【００１４】
６）  上記測定工程において、上記試料における、ＴＳＬＰ遺伝子の発現量、ＩＬ−３３遺伝子の発現量、ＣＣＬ７の発現量、およびＣＣＬ２１遺伝子の発現量、および、ＴＳＬＰタンパク質の量、ＩＬ−３３タンパク質の量、ＣＣＬ７タンパク質の量、ＣＣＬ２１タンパク質の量から選択される少なくとも１つが対照と比較して高いときに、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因が有るまたは発症している、と判定する、１）〜５）の何れかに記載の検査方法。
【００１５】
７）  好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する検査キットであって、ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子の発現産物、ＩＬ−３３遺伝子の発現産物、ＣＣＬ７遺伝子の発現産物およびＣＣＬ２１遺伝子の発現産物の少なくとも１つ、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、新規な好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】血清におけるＴＳＬＰおよびＩＬ−３３のレベルの増加を示す図である。Ａ−Ｅは、血清のマルチプレックスアッセイ(Millipore, St Charles, Mo)の結果を示し、７名の健常者のコントロール対象（ＣＴＲＬ）と、３７名の即時型のＦＡの無症状期の患者、３１名の活動期のＡＤの患者、８名の活動期のＵＣの患者、および、９名の乳幼児ＥＧＥの患者との比較を示す。エラーバーは、中央値と四分位数間領域（interquartile ranges）とを表す。図中のＡおよびＢは、血清中のＴＳＬＰおよび血清中のＩＬ−３３のレベルは、乳幼児ＥＧＥの患者の患者において明らかに増加(****P < .0001)している一方で、３〜４名のＡＤの患者では、軽度な増加を示すのみであった。図中のＣおよびＤは、ＭＣＰ３（Monocyte chemoattractant protein 3）、および、６ＣＫｉｎｅのレベルが、ＥＧＥの患者で増加したことを示す(**P < .01)。図中のＥは、ＣＴＡＣＫ（cutaneous T cell-attracting chemokine）のレベルが、ＡＤの患者で特に増加したことを示す(***P < .001)。図中のＦは、血清中のＴＳＬＰおよび血清中のＩＬ−３３のレベルが、互いに強く相関することを示す(r＝0.91, P < .0001)。図中のＧは、ＣＴＡＣＫのレベルとＴＳＬＰのレベルとに相関が無いことを示す。皮膚と消化管とにおけるアレルギー性の炎症は、ＣＴＡＣＫおよびＴＳＬＰによって明確に区別された。図中のＨおよびＩは、ＴＳＬＰ(図中のＨ)、および、ＩＬ−３３(図中のＩ)の血清中のレベルは何れも、活動期から回復期に向かうにつれて顕著に減少することを示す(*P < .05)。
【図２】炎症を起こしたＳ状結腸の生検試料において、特異的に発現する遺伝子のマイクロアレイ解析、および、ｑＰＣＲ解析の結果を示す図である。図中のＡは、コントロール群と比較して、ＥＧＥの群で特異的に発現している８４１の遺伝子(fold change(変化倍率） > 2, P < .05)、および、コントロール群と比較して、ＵＣの群で特異的に発現している７６２の遺伝子(fold change > 2, P < .05)とを、クラスター解析を用いて解析し、ヒートマップとして示した結果である。上方制御された遺伝子は赤色で、下方制御された遺伝子は青色で示した。クラスター５および６は、ＥＧＥトランスクリプトームを強調しており、右側の拡大図は、クラスター５の一部分をなす、ＴＳＬＰを含む１４遺伝子を示している。N/Aは Not applicableを指す。図中のＢに示す通り、ＥＧＥの患者は、ＵＣの患者と比較した場合に、Ｓ状結腸において、ＴＳＬＰおよびＩＬ３３の両方のｍＲＮＡの顕著に増加した発現を示す(**P ＝ .0018,***P ＝ .0003)ことが、ｑＰＣＲによって確認された。エラーバーは、中央値と四分位数間領域とを表す。
【図３】食事療法の開始後における、乳幼児のＥＧＥ患者における、ＧＩ粘膜の顕微鏡観察、および、体重増加に関する知見を示す図である。図中のＡは、番号５番の患者の食道の粘膜を示す。好酸球の顕著な浸潤および脱顆粒が、食道の重層扁平層において見られた。図中のＢは、番号３番の患者の食道の粘膜を示す。図中のＣは、番号５番の患者の十二指腸の粘膜を示す。図中のＤは、 番号１０番の患者の結腸の粘膜を示す。Ａ〜Ｄの全ては、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色したプレパレーションである(倍率が×1,000倍)。図中のＥは、番号４番の患者であって、発明者らの病院に転院をしてきた体重減少（−３．８ ＳＤ)を伴う１歳の男児に関するデータであり、牛乳、大豆および鶏卵を除去した後に、体重の劇的な増加が見られた。当該男児の運動能力の発達も、後に正常化した。図中のＦは、番号５番の患者であって、月齢５カ月から体重の増加が停止した１歳の男児に関するデータである。当該男児は食事制限の処置が行われ、体重が正常化した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１９】
〔用語の説明〕
本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」とも換言できる。「タンパク質」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。「タンパク質」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するポリペプチドを包含する。
【００２０】
本明細書において「核酸」には、任意の単純ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。
【００２１】
本明細書において「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。
【００２２】
したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬剤として利用できる。
【００２３】
「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００２４】
本明細書において「健常者」とは、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に罹患していない正常な個体を指す。
【００２５】
本発明において「発症のリスク（危険度）を有する」とは、発症には至っていないが、発症の可能性が健常者と比べて高いことを意図しており、「好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症」の発症のリスクを有するとは、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の前段階であり好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に至る可能性の高い状態であることも包含する。
【００２６】
本発明において「診断」とは、被験者が対象となる疾患に罹患しているかどうか、被験者が罹患している好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の重症度、被験者が対象となる障害を発症するリスク（危険度）、および／または、被験者の対象となる好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因の有無を、評価し、疾患または病態の同定を行うことをいう。
【００２７】
本明細書中の「検査する」または「検査」とは、医師による同定（診断）を必須としない、検査対象のヒト（「被験者」と称する場合もある）における、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査を指す。本発明の検査方法によって得られた検査結果は、医師によってなされる診断の一材料になりうる。なお、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因の有無を検査するとは、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を既に発症しているか否かとはかかわり無く、将来的に好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症する可能性を検査することも含む概念である。一方、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の有無を検査するとは、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症しているか否かについて検査することを指す。
【００２８】
本発明において「治療」とは、対象疾患の症状を完治または軽減させること、対象疾患の症状の悪化を抑制すること、対象疾患の発症を抑制すること、または遅延させることを含む。すなわち、被験者が対象疾患を発症していない場合の「予防」を含む。
【００２９】
〔１．検査方法〕
本発明に係る検査方法は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する方法であって、ヒトの生体より採取した試料（以下「生体試料」と称する場合がある）におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３とも称する。以下、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３とも表記する）遺伝子およびＣＣＬ２１（６ＣＫｉｎｅとも称する。以下、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅとも表記する）遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定するか、当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する測定工程を含む方法である。
【００３０】
＜好酸球性消化管疾患＞
好酸球性消化管疾患（Eosinophilic gastrointestinal disorders, ＥＧＩＤ）は、消化管を主座とする好酸球性炎症疾患の総称であり、好酸球の消化管局所への異常な集積および浸潤により好酸球性炎症が生じて組織が傷害され、機能不全を起こす疾患である。好酸球性消化管疾患はさらに、好酸球の浸潤部位によって、食道粘膜上皮内のみに多数の好酸球の浸潤がみられる好酸球性食道炎（Eosinophilic Esophagitis, ＥｏＥ）と、食道病変の有無にかかわらず胃または腸管の粘膜固有層に多数の好酸球浸潤が出現する好酸球性胃腸炎（Eosinophilic Gastroenteritis, ＥＧＥ）とに分類される。
【００３１】
（好酸球性胃腸炎（Eosinophilic Gastroenteritis, ＥＧＥ））
好酸球性胃腸炎における好酸球の浸潤部位は、食道から大腸まで部位はさまざまであり、そのため、症状は、病変部位によって異なり得るが、好酸球性胃腸炎の食欲不振、嘔吐、腹痛、下痢、血便および腹水などの症状が挙げられる。また、当該疾患の症状としては、体重増加不良または体重減少、および活動性低下などの消化器症状以外の症状も挙げられる。また、重症者では、消化管閉塞（筋層に好酸球が浸潤した場合など）、腸破裂および腹膜炎等を起こすことがある。また、消化管の吸収不全に起因して低蛋白血症または鉄欠乏性貧血等を生じる場合もある。
【００３２】
好酸球性胃腸炎は新生児（出生後２８日以下）〜成人（２０歳以上）までの年齢で男女ほぼ均等に発症する。好酸球性胃腸炎の発症の原因は、非-ＩｇＥ仲介型食物アレルギー考えられている。好酸球性胃腸炎の患者は気管支ぜんそく、じんま疹等のアレルギー疾患を合併していることが多い。
【００３３】
好酸球性胃腸炎は、従来の診断において以下の指針１〜８に基づいて診断される疾患である。１、と２または３を満たすものを対象とする。これら以外の項目は参考とする。
１．症状（腹痛、下痢、嘔吐等）を有する。
２．胃、小腸、大腸の生検で粘膜内に好酸球主体の炎症細胞浸潤が存在している（２０／高視野倍率（high-power field （ＨＰＦ））以上の好酸球浸潤、生検は数ヶ所以上で行い、また他の炎症性腸疾患を除外することを要する）。なお、胃または腸管の粘膜固有層への好酸球の浸潤は健常者にもみられるため、部位別の正常好酸球数との比較が正確な診断のためには必要となる。
３．腹水が存在し腹水中に多数の好酸球が存在している。
４．喘息などのアレルギー疾患の病歴を有する。
５．末梢血中に好酸球増多を認める。
６．ＣＴスキャンで胃、腸管壁の肥厚を認める。
７．内視鏡検査で胃、小腸、大腸に浮腫、発赤、びらんを認める。
８．グルココルチコイドが有効である。
【００３４】
（好酸球性食道炎（Eosinophilic Esophagitis, ＥｏＥ））
好酸球性食道炎における好酸球の浸潤部位は、食道に限定される。
【００３５】
好酸球性食道炎は、新生児〜成人までの年齢で発症するが、３０歳代〜５０歳代の男性に特に多く発症する。なお、好酸球性食道炎のうち、プロトンポンプ阻害薬（Proton Pump Inhibitor, PPI）が有効な例はPPI-RＥproton-pump inhibitor (PPI)-responsive esophageal eosinophilia（PPI-RＥ）と分類されることもある。
【００３６】
症状は、年齢により症状が異なる。乳児（１歳以下）および幼児（６歳以下）は哺乳障害、幼児から小児（１８歳以下）は嘔吐、腹痛および嚥下障害、０歳代から成人以降では嚥下障害および食物嵌頓が挙げられる。さらに長期化、重症化すると、食道狭窄を生じることがある。
【００３７】
好酸球性食道炎は、従来の診断において以下の指針１〜７に基づいて診断される疾患である。１および２を満たすものを対象とする。これら以外の項目は参考とする。
１．食道機能障害に起因する症状（嚥下障害、つかえ感等）を有する。
２．食道粘膜の生検で上皮内に２０／ＨＰＦ以上の好酸球が存在している。
（生検は食道内の数ヶ所を行うことが望ましい）
３．内視鏡検査で食道内に白斑、縦走溝、気管様狭窄を認める。
４．ＣＴスキャンまたは超音波内視鏡検査で食道壁の肥厚を認める。
５．末梢血中に好酸球増多を認める。
６．男性
７．プロトンポンプ阻害薬は無効でグルココルチコイド製剤が有効である。
【００３８】
＜食物蛋白誘発腸症＞
食物蛋白誘発腸症は、非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギー（Non-IgE mediated gastrointestinal food allergy）の一種であり、乳児において、慢性下痢、体重増加不良を主徴とする。診断は主に病理組織における、炎症細胞浸潤によって行われる。
【００３９】
＜被験者＞
本実施形態に係る検査方法は、あらゆる年齢の被験者に適用することができる。なお、被験者の年齢は低いほど好ましく、例えば６歳以下の幼児期までであることが好ましく、２歳以下の幼児期までであることがより好ましく、１歳以下の乳児期までであることがさらに好ましい。より低い年齢で検査することにより、乳幼児期における消化管からの吸収不全による成長障害または発育不全、体重減少および低蛋白血症などを早期に防止することができる。また、消化管の内視鏡検査を実施することが困難である新生児〜乳児において、診断をより早期に行うことができるため、疾患の罹患の発見および治療開始の遅延による重篤な障害等が生じることを防ぐことができる。また、一実施形態において、被験者は出生前の胎児であってもよい。
【００４０】
＜生体試料＞
生体試料は、被験者の生体から採取される。生体試料の種類としては、特に限定されず、被験者のタンパク質および核酸（遺伝子発現産物としてのｍＲＮＡ）の少なくとも一方を含んでいればよい。生体試料としては、例えば、細胞試料、組織試料、体液試料が挙げられ、中でも体液試料が好ましい。体液試料としては、血液試料、リンパ液試料、髄液試料等が挙げられるが、血液試料および腹水が好ましく、血液試料のうち、特に末梢血試料が好ましい。末梢血試料は、例えば指先への穿刺等によって容易に採取が可能であるから被験者の負担が少なく、加えて、本発明の検査方法の対象となる分子マーカーを充分に含んでいる。また、血液試料のうち、臍帯血試料の場合は出生時に臍帯から容易に採取が可能であり、超早期診断が可能であるという利点を有している。
【００４１】
また、必要に応じて、生体試料は、対照用の試料とするために好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を有さない健常者からも採取される。対照用の試料は、被験者のものと同種（同じ部位から採取したもの）であることが好ましい。なお、本発明の検査方法を行うに際して予め対照用のデータが準備されている場合には、健常者からの生体試料の採取は行わなくてよい。
【００４２】
採取された生体試料は、必要に応じてタンパク質または核酸を抽出する操作を行ったり、不要な成分を除去する操作を行ってから、検査に供してもよい。例えば、血液試料を用いる場合は、採取した血液から調製した血清または血漿を検査に用いることが好ましい。
【００４３】
また、得られた生体試料は、必要に応じて凍結保存等の、生体試料の種類に適した方法で保存してもよい。生体試料は、保存することにより所望の時期に検査方法の対象となる分子マーカーを測定することができる。なお、保存の際には、採取したままの状態の試料を保存してもよく、また採取した後に調製した試料（例えば血清または血漿）を保存してもよい。
【００４４】
＜測定工程＞
本発明の検査方法は、以下のａ）またはｂ）に示す測定工程を含む。
工程ａ）上記生体試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定する
工程ｂ）上記生体試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する。
【００４５】
上記工程ａ）または工程ｂ）のいずれを用いるかは、生体試料の種類または被験者の種類（年齢、検査すべき疾患）などの条件に基づき選択されるが、血清試料の場合は、工程ｂ）が好ましい。なお、工程ａ）の場合はＴＳＬＰ遺伝子およびＩＬ−３３遺伝子のうちの少なくとも一方の発現量を測定することが好ましく、好酸球性胃腸炎の判定のためには、少なくともＴＳＬＰ遺伝子およびＩＬ−３３遺伝子の発現量を測定することがより好ましく、工程ｂ）の場合はＴＳＬＰおよびＩＬ−３３の量のうちのすくなくとも一方を測定することが好ましく、好酸球性胃腸炎の判定のためには、少なくともＴＳＬＰおよびＩＬ−３３の量を測定することがより好ましい。
【００４６】
また、好酸球性消化管疾患のうち、好酸球性胃腸炎をより正確に判定するためには、上述のサイトカインおよび／またはケモカインタンパク質の他にＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２およびneurofilament medium polypeptide（ＮＥＦＭ）のうちの少なくとも１つの遺伝子発現量またはタンパク質の量を測定することをさらに包含していてもよい。
【００４７】
工程ａ）
工程ａ）は、上記生体試料を用いて、当該試料中のＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定する工程である。なお、ＴＳＬＰ遺伝子とはＴＳＬＰをコードしている核酸の総称であり、ＩＬ−３３遺伝子とはＩＬ−３３をコードしている核酸の総称であり、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子とはＣＣＬ７／ＭＣＰ−３をコードしている核酸の総称であり、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子とはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅをコードしている核酸の総称である。
【００４８】
ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量の測定方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法等の核酸増幅技術を用いて所望の核酸（例えば、転写産物たるｍＲＮＡ）を増幅する手法を含む方法であってもよい。核酸増幅技術を用いた方法としては、例えば、定量ＲＴ‐ＰＣＲが挙げられ、直接ｍＲＮＡを検出する方法としてはノーザンブロット法等が挙げられる。あるいは、マイクロアレイ等の核酸チップを用いた、遺伝子の発現量の測定方法等であってもよい。なお、「遺伝子の発現量を測定する」とは、「遺伝子の発現産物（後述する）の量（濃度等）を測定する」と交換可能に用いることができる。
【００４９】
なお、遺伝子の発現量を測定する際に、生体試料に含まれるｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを調製してもよい。ｍＲＮＡとしてのＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の増幅は、ＮＣＢＩ等の公共データベースより入手可能な塩基配列情報に基づいて行うことができる。例えば、ＮＣＢＩのデータベースにおいてＴＳＬＰ遺伝子の登録番号はＮＭ＿０３３０３５．４である。また、ＩＬ−３３遺伝子の登録番号はＮＭ＿０３３４３９．３である。また、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子の登録番号はＮＭ＿００６２７３．３である。また、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の登録番号はＮＭ＿００２９８９．３である。以上の情報に基づけば、当業者は容易にＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子を増幅するための適切なプライマーを設計することができる。
【００５０】
工程ｂ）
工程ｂ）は、上記生体試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質の量、より具体的には、生体試料の単位量あたりに含まれるタンパク質の量（例えば、タンパク質の濃度）を測定する工程である。但し、生体試料の単位量あたりに含まれるタンパク質の量を測定するという概念には定量的測定および定性的測定の両方が含まれ、濃度測定の他、対照と比較可能な形式でタンパク質の量を提示することが含まれる。より具体的には、例えば、検量線等を用いて濃度換算する以前の、取得した時点でのデータ比較、またはタンパク質の量が、ある一定の閾値を超えているか否かを示す形式での結果の提示等も含まれる。
【００５１】
ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅのうちの少なくとも１つのタンパク質の量を測定する方法は特に限定されないが、例えば、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅに対して特異的な抗体を用いた免疫学的な手法を用いた方法、液体カラムクロマトグラフィーおよび質量分析法などが挙げられる。
【００５２】
一実施形態において、本発明に係る検査方法は、１）本発明に係るＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅに対して特異的な抗体タンパク質のうちの少なくとも１つと、被験者から採取された生体試料とを接触させる接触工程、および、２）接触工程後に当該抗体を検出し、抗体レベルを測定する抗体レベル測定工程、を含む方法である。
【００５３】
＜接触工程＞
上記接触工程は、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅに対して特異的な抗体タンパク質と、被験者から採取された生体試料とを混合することなどによって当該抗体タンパク質と生体試料とを接触させる工程である。
【００５４】
＜抗体レベル測定工程＞
上記抗体レベルの測定工程は、上記接触工程後に行われ、抗タンパク質抗体を検出し、当該抗体の抗体レベルを測定する工程である。本発明において「抗体レベル」とは、生体試料中に含まれる当該抗体の量あるいは抗体価をいう。これらの値の測定は、公知の方法を用いて行うことが可能である。
【００５５】
抗体を用いた方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay、酵素結合免疫吸着アッセイ）法、定量ウェスタンブロッティング法、ドットブロットアッセイ法および免疫沈降（Immunoprecipitation）法などが挙げられ、ＥＬＩＳＡ法を用いることが好ましい。ＥＬＩＳＡ法の種類としては、特に限定されないが、いわゆる抗原測定系（生体試料中に含まれる抗原量の測定）である、直接吸着法によるＥＬＩＳＡ、競合法によるＥＬＩＳＡ、サンドイッチ法によるＥＬＩＳＡ、およびマイクロ流路式またはマイクロビーズなどを利用した、微量試料の測定に特化したＥＬＩＳＡ等が挙げられる。また放射性イムノアッセイ法（ＲＩＡ）、および免疫拡散アッセイ法のような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫組織学的方法を利用したアッセイ法で検出してもよい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像解析等によって検出することもできる。
【００５６】
生物学的試料中に存在する抗体の量は、例えば、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物（例えば、健常者の標準試料若しくは典型的な好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者の標準試料）中に存在する量との比較によって簡易に算出され得る。
【００５７】
ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ特異的な抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。例えば、ヒトのＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅのアミノ酸配列はＮＣＢＩ等の公共データベースより入手可能である。例えばＮＣＢＩのデータベースにおいて、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅの登録番号はそれぞれＮＰ＿１４９０２４．１、ＮＰ＿２５４２７４．１、ＮＰ＿００６２６４．２およびＮＰ＿００２９８０．１である。以上の情報に基づけば、当業者は容易にＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ特異的な抗体を作製するための抗原として適切なアミノ酸配列を決定することができる。
【００５８】
本発明において「抗体」とは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラス、ならびに抗体の機能的断片を含む形態であることを意図している。当該抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれの天然型抗体も含む概念であり、その他に、遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体、ならびに当該抗体の機能的断片を含む。「抗体の機能的断片」とは、前述の抗体の一部分の領域を有し、かつ抗原結合能を有しているもの（結合性断片と同義）を指す。天然型抗体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ラマ、ウシ、ニワトリ、サメ、および魚を含む、あらゆる生物種に由来し得る。遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体を遺伝子改変して得られるヒト化抗体および霊長類化抗体などのキメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、変異導入抗体およびグラフト結合抗体（例えば、他のタンパク質および放射性標識などがコンジュゲートまたは融合している抗体）が挙げられ、既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。また、抗体の機能的断片としては、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilized Fv）およびｄＡｂ（single domain antibody)等が挙げられる(George et al, Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。
【００５９】
さらに、本発明において結合性断片は、対象とするタンパク質に対して反応性を維持する範囲において変異導入された抗体断片も結合性断片の概念として含んでいる。前述の変異導入は、当業者によって適宜選択される、遺伝子改変技術等の公知の技術を用いて行われる。
【００６０】
＜検査工程＞
本発明に係る検査方法は、さらに必要に応じて、上記測定工程での測定結果に基づき、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する検査工程をさらに含んでいてもよい。当該検査は任意の試験者によって行われるものを意図し、医師等による診断を包含していない。好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査は、上述の工程ａ）または工程ｂ）に示す測定工程により得られた、ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量、またはＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質の量を、被験者と対照とで比較することによって行う。
【００６１】
別の一実施形態では、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査工程は、上述の工程ａ）または工程ｂ）に示す測定工程により得られた、ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量、またはＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質の量を、被験者の経時的な異なる時期における試料において比較することによって行う。当該工程は、一被験者において、疾患の進行または治療の進行または治療の効果を客観的に観察および評価するために有効である。
【００６２】
検査工程における検査でなされる判定の一例では、対照と比較して被験者の生体試料におけるＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ（タンパク質の量でも遺伝子の発現量であってもよい）のうちの少なくとも１つの量が有意に高い場合、被験者は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因を有しているまたは発症していると判定される。なお、量が有意に高い（多い）とは、定量的測定による結果であっても定性的測定による結果であってもよく、具体的な数値の比較はもちろん、相対的な量の比較（実際に量を算出する必要は無く、ある基準より高いか低いかを判断する）も含む概念である。
【００６３】
対照試料の上記検査は、被験者の試料の検査と同時に行われてもよく、また別々に行われてもよい。すなわち、被験者の数値と比較される対照試料の数値は、被験者の試料が検査されるときとは異なるときに行われた検査で得られた値であってもよい。また、対照試料の検査は、被験者の検査を行う者自身が行う必要は無く、例えば、既に取得されデータベース等に蓄積されている対照試料の検査値を閾値として用いることもできる。
【００６４】
検査に用いられる対照試料の数値については、健常者個人の試料の数値を直接利用してもよく、一定の人数の健常者の試料の数値を母集団としたときに得られる平均値を利用してもよい。また、カットオフ値をあらかじめ設定しておき、被験者の数値とこのカットオフ値とを比較してもよい。当業者は、健常者における定量値（正常値）、典型的な好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者の定量値（疾患値）、または軽度、中度もしくは重度の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者の定量値（疾患値）を参考に、適切に閾値を設定することができる。すなわち、一般に診断薬における閾値は、臨床試験から得られた健常者や患者の多くの測定値を基に、その目的に合わせて当業者が適切に設定するものであり（例えば、スクリーニング検査のように、疾患群を見逃さないことを最優先として二次検査以降で確定診断するような場合には、特異度よりも感度を優先し、カットオフ値を低く設定する、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の症状の程度を診断する場合には、軽度、中度または重度の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者の定量値を参考に閾値を高く設定する等）、本明細書に開示されている記載から、当業者は容易に診断のための閾値を決定することができる。診断に用いられる対照の数値については、健常者または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者個人の試料の数値を直接利用してもよく、一定の人数の健常者または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症患者の試料の数値を母集団としたときに得られる平均値を利用してもよい。例えば、被験者の生体試料における、ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量または当該試料におけるＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅのうちの少なくとも１つのタンパク質量がカットオフ値以上である場合には、当該被験者の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の可能性が高いと判定することができる。また、被験者の生体試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の少なくとも１つの発現量、または当該試料におけるＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅのうちの少なくとも１つのタンパク質量がカットオフ値より高い場合には、当該被験者の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の可能性および危険性を有すると判定することができる。
【００６５】
「カットオフ値」とは、その値を基準として疾患の素因の有無または発症の有無を判定をした場合に、診断感度（有病正診率）および診断特異度（無病正診率）の両方が十分に高い値を指す。例えば、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症している個体において高い陽性率を示し、かつ、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症していない個体で高い陰性率を示す値をカットオフ値として設定することができる。
【００６６】
ここで「診断感度」とは、特定の疾患の素因を有している、または特定の疾患を発症している集団に対して検査を行ったときの陽性（異常値）を示す割合（真の陽性の割合）を指す。また、「診断特異度」とは、特定の疾患を罹患していない集団に対して検査を行ったときの陰性（正常値）を示す割合（真の陰性の割合）を指す。また、「陽性的中率」は、検査において陽性を示した被験者のうち、実際に疾患を罹患している個体の割合をさし、陰性的中率は、検査において陰性を示した被験者のうち、実際に疾患を罹患していない個体の割合を意味している。
【００６７】
カットオフ値の算出方法は、当該技術分野において公知のものを用いることができる。例えば、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症している個体および好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症していない個体から採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つのサイトカインおよび／またはケモカイン遺伝子の発現量、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つの量を算出し、算出された値における診断感度および診断特異度を求める。以上により得られた値に基づき、市販の好適な解析ソフトを使用してＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成する。続いて、当該曲線から、診断感度および診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば多数の健常者より調製した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の少なくとも１つの発現量、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つタンパク質の量の「平均値＋２標準偏差」をカットオフ値とすることも好ましく、この値を用いれば良好な感度および特異性で好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症している、または発症の危険性があると判定することが可能となる。
【００６８】
例えば、複数の対照試料から得られた数値（タンパク質濃度）の平均値或いはそれよりやや高い値（例えば、血清におけるタンパク質濃度の正常値としては、ＴＳＬＰ：０ｐｇ／ｍＬ〜４．７ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ−３３：０ｐｇ／ｍＬ〜８．９ｐｇ／ｍＬ、ＣＣＬ７／ＭＣＰ３：０ｐｇ／ｍＬ〜１．５ｐｇ／ｍＬ、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ：０ｐｇ／ｍＬ〜４５８ｐｇ／ｍＬ）をカットオフ値とすれば、全ての好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の危険性、すなわち素因の有無、または発症の有無を検出できることを示す。カットオフ値は一定の年齢ごとにデータを分類して、それぞれの年齢におけるＲＯＣ曲線を作成して決定しても良い。
【００６９】
＜その他の工程＞
好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症と好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症以外の疾患との鑑別工程
一実施形態において、本発明の検査方法は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症と好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症以外の疾患とを鑑別する鑑別工程を包含している。
【００７０】
好酸球性消化管疾患と症状が類似しており、鑑別が必要な疾患は複数存在している。好酸球性消化管疾患と異なる疾患として鑑別されるべき疾患としては過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis（ＵＣ））、コラーゲン形成大腸炎、薬剤性腸炎、特発性好酸球増多症候群、リンパ腫、強皮症、チャーグストラウス症候群（Churg-Strauss syndrome）、およびヘノッホ−シェーンライン（Henoch-Schonlein）紫斑病、壊死性腸炎、消化管閉鎖細菌性腸炎、偽膜性腸炎、溶血性尿毒症症候群、寄生虫疾患、乳糖不耐症、新生児メレナメッケル憩室症、中腸軸捻転、腸重積、幽門狭窄およびヒルシュスプルング病などが挙げられる。また、特に、好酸球性食道炎と鑑別される疾患としては、胃食道逆流症、カンジダ感染および薬剤アレルギー等が挙げられる。
【００７１】
例えば、過敏性腸症候群と好酸球性胃腸炎とは、従来、症状からの鑑別困難であり、病理組織学的検討が必要であった。また、クローン病、潰瘍性大腸炎と好酸球性胃腸炎とは典型的腸管病変が存在しない場合、病理組織学的検討でも好酸球性胃腸炎との鑑別は困難である。よって従来では臨床経過を見ながら判断を行うなど、鑑別に時間がかかった。そのため、診断が遅れる、または診断を誤るという虞があった。また、食道病変を有する好酸球性胃腸炎と好酸球性食道炎とは、胃と十二指腸の生検を行うことで鑑別する必要があった。
【００７２】
また、例えば、好酸球性消化管疾患と鑑別される疾患としては、新生児および乳児における非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギー（Non-IgE mediated gastrointestinal food allergy）が挙げられる。非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギーとしては、食物蛋白誘発胃腸炎（Food Protein-Induced Enterocolitis Syndrome (FPIES)）、食物蛋白誘発大腸末端炎（Food Protein-Induced Proctocolitis Syndrome (Proctocolitis)）、食物蛋白誘発腸症（Food Protein-Induced Enteropathy Syndrome (Enteropathy)）およびセリアック病（Celiac Disease）等が挙げられる。これらの疾患の診断は、好酸球性消化管疾患と同様、従来、負荷試験、病理組織における炎症細胞浸潤の観察等の検査によって診断されている。好酸球性消化管疾患は従来、消化管内視鏡を行うことによる病理学的な診断が必要であるが、非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギーは食物負荷試験によって、症状が誘発された場合に確定診断となる。
【００７３】
これらに対し、本発明の検査方法または診断方法によって疾患の判定を行うことによって、内視鏡検査やＣＴスキャン等の検査、生検等を必須として実施することなく、または内視鏡検査等の病理学的な検査などの前に、好酸球性消化管疾患と類似の症状を示すこれらの疾患と好酸球性消化管疾患との鑑別を簡便かつ容易に診断することができる。被験者への身体的負担は著しく軽減される。さらに、診断が迅速かつ簡便に行うことができるため、診断の遅れによる症状の進行または重症化を防ぐことができる。
【００７４】
また、上記の検査方法の項目に記載した通り、測定工程において遺伝子発現量またはタンパク質の量を測定するサイトカインおよび／またはケモカインを適宜選択すれば、好酸球性胃腸炎と好酸球性食道炎との判別も容易に実施することができる。
【００７５】
また、本発明に係る検査方法は、上述した従来の診断方法（すなわち内視鏡検査等を包含する診断方法）、症状スコアなどの採点による重症度の判定および従来の診断基準に基づく診断、体重減少、下痢、低蛋白血症および高好酸球血症等の有無等の指標に基づく診断などを含む従来の診断方法の少なくとも１つ以上を、適宜組み合わせることもできる。
【００７６】
また、上述の検査工程は、以下に示す診断方法における診断工程と同様である。検査方法における各工程は、以下に示す診断方法における診断工程にも適用される。診断方法については以下の〔２．好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断方法〕に記載する。
【００７７】
〔２．好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断方法〕
本発明は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を診断する方法であって、ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現量を測定するか、当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つの量を測定する測定工程を含む診断方法も提供する。
【００７８】
一実施形態における診断方法は、被験者から採取された生体試料において、ＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７タンパク質およびＣＣＬ２１タンパク質のうちの少なくとも１つに対する抗タンパク質抗体の抗体レベルを測定する工程を包含する、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断方法を提供する。
【００７９】
一実施形態に係る被験者における好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断方法は、被験者から採取された生体試料において、検査工程におけるタンパク質量または遺伝子発現量の測定結果に基づき、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の罹患の有無、および／または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症発症の素因の有無を診断する診断工程を包含する。本発明に係る診断方法における測定工程は、上述の〔検査方法〕の＜測定工程＞の項目に記載した通りである。
【００８０】
＜診断工程＞
本発明に係る診断方法における診断工程は、上述の〔検査方法〕の＜検査工程＞の項目に記載した通りであるが、当該診断は医師または他の有資格の医学専門家による診断を包含する。
【００８１】
診断工程において、被験者が好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に罹患しているかどうか、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症発症の素因の有しているか否かを判定することを含む。別の実施形態では、本発明の診断方法は、被験者が食物アレルギーを有している場合、当該アレルギーが、非−ＩｇＥ仲介型の反応であるか否かを判定する工程を包含していてもよい。
【００８２】
診断工程において、被験者から採取された生体試料における、タンパク質の量または遺伝子の発現量を測定することにより、被験者が好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に罹患しているかどうかだけではなく、従来の好酸球性消化管疾患の診断基準を満たさない食物蛋白誘発腸症を有しているかまたは非−ＩｇＥ仲介型消化管食物アレルギーの素因を有しているか否かを診断することができる。これはすなわち、被験者が好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症するリスクを評価することができるということである。
【００８３】
〔３．検査キット〕
また、本発明は、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を検査する検査キットであって、ヒトの生体より採取した試料におけるＴＳＬＰ遺伝子の発現産物、ＩＬ−３３遺伝子の発現産物、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子の発現産物およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の発現産物の少なくとも１つの発現産物、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のうちの少なくとも１つを検出するための核酸プローブ、核酸プライマー、核酸アプタマー、抗体またはペプチドプローブを含む、検査キットを提供する。
【００８４】
上記発現産物とは、ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを指す。本発明の検査キットは、上記ｍＲＮＡが逆転写されてなるｃＤＮＡの形態として検出するものも含む。
【００８５】
また、上記核酸プローブとは、上記発現産物の何れかと特異的に結合する核酸プローブを指し、より具体的にはTaqManプローブ、Invadorプローブ等が挙げられる。上記核酸プライマーとは、上記発現産物としてのｍＲＮＡまたはこれを逆転写したｃＤＮＡを特異的に増幅することができる核酸プライマーを指し、より具体的にはＲＴ‐ＰＣＲ法等の核酸増幅法で用いるプライマーが挙げられる。また、上記核酸アプタマーとは、生体試料中に含まれるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のいずれかと特異的に結合する核酸で構成された核酸構築物を指す。
【００８６】
ペプチドプローブとは、ＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質のいずれかと特異的に結合するペプチド性のプローブを指す。具体的には例えば、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３またはＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅと特異的に結合するペプチド配列が挙げられる。
【００８７】
キットに含まれる核酸プローブ、核酸プライマーおよび核酸アプタマーは、天然の核酸の他に、非天然型核酸（ＰＮＡ等）を含んで構成されていてもよい。ペプチドプローブも同様に天然アミノ酸の他に、非天然型アミノ酸を含んで構成されていてもよい。
【００８８】
本発明に係る検査キットは、さらに、必要に応じて、ＰＣＲ等の核酸増幅法に用いる各種試薬および器具（ポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、各ｄＮＴＰおよびピペット等）、試料を調製するための各種試薬および器具（試験管、バッファー等）、核酸増幅断片を解析するための各種試薬および器具（電気泳動ゲル材料およびピペット等）、検査キットの使用説明書、測定の時に用いられる対照用となる試料、測定結果を解析するときに用いられる対照用のデータ等の少なくとも１つを備えていてもよい。なお、検査キットの使用説明書には、上記〔１．検査方法〕の欄で説明した、本発明に係る検査方法の内容が記録されている。
【００８９】
以上のように、本発明の検査方法、診断方法および検査キットによれば、これまで医師の主観によるものが大きかった好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断が、生物学的基準を導入した検査に基づいて診断することが可能となることから、診断技術の向上が予想される。また早期に診断することが可能となるため、本疾患に罹患しているにもかかわらず診断が遅れたために障害を引き起こすというケースを防ぐことができる。
【００９０】
〔４．検査方法によって得られた検査結果または診断方法によって得られた診断方法の利用〕
上記〔１．検査方法〕の欄で説明した検査方法を行うことによって得られた検査結果は、医師による診断を行う際の診断資料の１つとして利用することができる。また、上記〔１．検査方法〕の欄で説明した検査方法を行うことによって、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の素因を有するという検査結果が得られた被験者、または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を有しているという検査結果が得られた被験者については、必要に応じて医師による診断の結果を伴った上で、治療を行うことができる。上記〔２．診断方法〕の欄で説明した診断方法を行うことによって、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症の素因を有するという検査結果が得られた被験者、または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を有している、または上記好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に関連するサイトカインおよび／またはケモカインの遺伝子発現量またはタンパク質の量が健常状態ではない、および／または、被験者が好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症するリスクが高いと判定得られた診断結果が得られた被験者について、必要に応じて医師による判断を伴った上で、治療を行うことができる。
【００９１】
また本発明の検査方法または診断方法によれば、治療方法の決定、疾患の判定および疾患の経過観察、治療効果の有無の判定、予後の予測、および他の疾患との鑑別を行うことができる。ここで、治療方法の例は以下の〔５．好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の治療方法〕の項目に詳細を説明する。
【００９２】
〔５．好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の治療方法〕
本発明は、さらに、上述の検査方法による検査の結果または上述の診断方法による診断の結果、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因を有するまたは発症している、と判定した被験者に、食事療法、薬物療法およびバルーン拡張術および手術療法から選択される少なくとも１つの療法を行うことを特徴とする好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の治療方法を提供する。一例において、治療が必要と診断される被験者は、上述の測定工程で得られたタンパク質量または遺伝子発現量がある規定値（例えば対照から算出されたカットオフ値）より高い場合に、当該被験者に、上述の少なくとも１つ以上の療法を実施することを特徴とする好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の治療方法を提供する。
【００９３】
（治療方法の対象）
本発明の治療方法の対象は、本発明の検査方法または診断方法により、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を有する、または好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の素因を有すると判断された被験者である。
【００９４】
また、本発明の治療方法の対象は、本発明に係る好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の診断方法により、上記好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症に関連するサイトカインおよび／またはケモカインの遺伝子発現量またはタンパク質発現量が健常状態ではない、および／または、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症するリスクが高いと判定された被験者であってもよい。また、一実施形態では、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の従来の診断基準を満たさない被験者であって、本発明の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法または診断方法により、被験者が好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症する素因を有すると診断された被験者であってもよい。このような被験者は、将来、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症を発症するリスクが高い。従って、このような被験者に対し、例えば、食事療法を包含する本発明の治療方法を行うことにより、好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の発症をあらかじめ予防することが可能となる。
【００９５】
（適用可能な治療方法）
本発明の治療方法において適用可能な食事療法としては、アミノ酸成分栄養食だけを摂食させる成分栄養療法、複数種類（例えば、４種または６種等）のアレルゲンとなりやすい既定の食材を除去する既定除去食、および皮膚プリックテストおよび皮膚パッチテストを行って被験者にとってアレルゲンである可能性の高い食材を選択し、除去する、個別化除去食等の食事療法が挙げられる。なお、除去される６種のアレルゲンの例は、小麦、卵、ミルク、大豆、ナッツおよび海産物である。
【００９６】
本発明の治療方法において適用可能な薬物療法としては、ＰＰＩ、局所作用ステロイド，全身性グルココルチコイド等の全身ステロイドまたは抗アレルギー薬などの薬剤を投与する薬物療法が挙げられる。ステロイド依存や副作用が強い場合には免疫抑制薬が考慮される。
【００９７】
特に好酸球性食道炎の薬物療法においては、PPIを選択することが好ましい。PPI抵抗性の例にはフルチカゾンなどの局所作用ステロイドの口腔内噴霧とその嚥下による局所ステロイド療法がおこなわれ得る。ステロイド投与中止後の再燃再発の懸念および副作用の危険性の観点からはステロイド療法以外の治療法が好ましい。
【００９８】
また、一実施形態において、薬物療法は本発明の検査方法または診断方法において分子マーカーとして用いている上述のサイトカインおよび／またはケモカインのアンタゴニストを投与する療法であってもよい。
【００９９】
また、一実施形態において、上記治療法を用いた治療中の被験者に、本発明の検査方法による検査または診断方法による診断を行ってもよい。ＴＳＬＰ遺伝子、ＩＬ−３３遺伝子、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３遺伝子およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ遺伝子の発現量、または当該試料におけるＴＳＬＰタンパク質、ＩＬ−３３タンパク質、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３タンパク質およびＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅタンパク質の量は、疾患の重症度に比例しているため、治療の各段階における治療効果の有無および炎症消失の判定を行うことができる。
【０１００】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【実施例】
【０１０１】
〔実施例１〕
（１．方法等）
＝患者の選択等＝
このケース−コントロール研究は、国立成育医療研究センター（ＮＣＣＨＤ）にて行われた。乳幼児の好酸球性消化管疾患（eosinophilic gastroenteritis（ＥＧＥ））の患者、潰瘍性大腸炎（ulcerative colitis（ＵＣ））の患者、即時型の食物アレルギー（immediate-type food allergy （ＦＡ））の患者、および、アトピー性皮膚炎（Atopic dermatitis（ＡＤ））の患者、並びに、健常者のコントロール（ＣＴＲＬ）に由来する、血清サンプルおよび粘膜の生検試料を同定するため、発明者らは臨床データベース（ＮＣＣＨＤのアレルギー部門の「Allergy-2」データベース）をサーチした。同一の患者からの重複サンプル、および、成人患者（２０歳以上）からのサンプルは、排除した。
【０１０２】
このデータベースには、３つのパウエルの基準（Powell’s criteria：参考文献Ｅ１）を満たし、かつ非−ＩｇＥ仲介型の消化管食物アレルギー（non-IgE mediated gastrointestinal food allergy：参考文献Ｅ２）を持つと診断された、１０４名の乳幼児が含まれていた。１０４名の患者のうちの２４名の患者は、反復性の嘔吐も血便も経験していなかった。この２４名の患者のうちの１３名の患者は、重篤な体重減少および／または難治性下痢症（intractable diarrhea）を経験しており、臨床的診断を確立するために、消化管ファイバースコープ検査および組織学的な検査を行った。１３名の患者全員が、消化管（gastrointestinal:ＧＩ）粘膜において好酸球増加（eosinophilia）を示し、本研究に含めることとした (表Ｅ１)。番号１〜９番の患者に関して、サイトカインおよびケモカインのアッセイのために、処置の開始前に、血清のサンプルを、入院時に、首尾よくストックした。番号２〜５、７および１０〜１３番の患者に関して、ＲＮＡを測定するための粘膜の生検試料を採取し、これら９名からの試料を全てｑＰＣＲに供した。番号２〜４、７および１０の患者からの試料は、マイクロアレイ解析用に適当なＲＮＡ品質およびＲＮＡ量であった。
【０１０３】
発明者らは、１２名のＣＴＲＬ（血清はｎ＝７、ＧＩ粘膜生検試料はｎ＝５)、３７名の即時型のＦＡの無症状期の患者（血清：ｎ＝３７）、３１名の活動期（active-phase）のＡＤの患者(血清：ｎ＝３１)、および、１３名の活動期のＵＣの患者（血清はｎ＝８、ＧＩ粘膜生検試料はｎ＝８)の解析を行った。採取した血清試料全てを、サイトカインおよびケモカインレベルの解析に用いた。５名全てのＣＴＲＬの粘膜試料をマイクロアレイ解析に供した。ＵＣ患者に関して、８名全ての粘膜試料をｑＰＣＲに用い、うち５名がマイクロアレイ解析用に適当なＲＮＡ品質およびＲＮＡ量であった。
【０１０４】
＝包含基準（Inclusion criteria）＝
ＥＧＥの診断は、他のいかなる病状も伴わないという条件で、臨床的症状、および、ＧＩの粘膜における集積した好酸球増加に基づいて行った。ＥＧＥの診断ガイドラインとして発行されたものは無く、かつ、その診断ガイドラインは非常に議論のあるところであるため（参考文献Ｅ３〜Ｅ５）、ＧＩの粘膜における好酸球増加は、DeBrosseらの報告（参考文献Ｅ６）に従って定義づけした。すなわち、少なくとも一つのＧＩの器官において増加した好酸球のカウントが見られた場合に（以下に列記をする）、ＥＧＥであるとする組織学的な診断が行われた。
【０１０５】
＞１５個の好酸球／高視野倍率（high-power field （ＨＰＦ））、食道で、
＞１５個の好酸球／ＨＰＦ、胃で、
＞２５個の好酸球／ＨＰＦ、十二指腸で、
＞２５個の好酸球／ＨＰＦ、回腸で、
＞４０個の好酸球／ＨＰＦ、上行結腸で、または、
＞２５個の好酸球／ＨＰＦ、横行結腸−直腸で。
なお、ここで、＞は、右側に示された数を超えていることを指す。
【０１０６】
ＣＴＲＬたる対象者は、病気が疑われた場合には、血液検査またはＧＩ内視鏡検査に基づいて、小児科医が、病気を有していないと決定した。ＣＴＲＬたる対象者が、ＦＡ、ＡＤ、ＵＣまたはＥＧＥの履歴を有さないことも確認した。５名をＧＩ内視鏡検査で検査し、検査した全ての消化管の部分が正常な病理結果を示した。ＣＴＲＬたる対象者は全て、如何なる経口のグルココルチコイド処置も受けていなかった。
【０１０７】
ＦＡおよびＡＤの診断は、ＮＣＣＨＤに属する二名の小児アレルギー専門医によって、それぞれ、「Japanese Guideline for Food Allergy 2014（参考文献Ｅ７）」、「Japanese Guideline for Atopic Dermatitis 2014（参考文献Ｅ８）」に基づき行った。ＦＡおよびＡＤたるこれら対象者が、ＵＣまたはＥＧＥの履歴を有さないこと、および、如何なる経口のグルココルチコイド処置も受けていなかったことを確認した。
【０１０８】
ＵＣの診断は、ＮＣＣＨＤに属する二名の小児胃腸病専門医および病理専門医によって、臨床的特性、内視鏡検査上の特性、および組織学的特性の組合せに基づき行った。
【０１０９】
＝患者の臨床データ＝
ＥＧＥ患者の臨床データは表Ｅ１に示す。全ての患者において、消化管における好酸球増加が見られた（表Ｅ２，図３のＡ−Ｄ）。
番号１〜９番の患者について、血清中のサイトカイン／ケモカインを調べた。これら９名の患者は何れも、−２ＳＤ未満の体重減少を示した。３名の患者は体重減少のみが観察され、他のＧＩの症状は伴っていなかった。２名の患者に低蛋白血症（Hypoproteinemia）が見られた。有害食物（offending food）の除去を行った後に、全ての患者で体重が増加した（図３のＥおよびＦ）。８名の患者は、発達のマイルストーンにおいて遅れが見られたが、後に発達は追いついた。原因食物は、症状の消散後に、長期耐性試験（chronic tolerance test：有害食物を３週間に渡り、毎日摂取）を行うことで同定した。有害食物は、８名（８９％）の患者で牛乳であり、１名（１１％）の患者で母乳であり、２名（２２％）の患者で大豆であり、１名(１１％)の患者で鶏卵であり、１名（１１％）の患者で高度加水分解調剤（extensively hydrolyzed formula ：New MA-1（登録商標））であり、１名（１１％）の患者で大豆油を含んだアミノ酸調剤(Elental-P（登録商標）であった。９名の患者のうち５名は、一種を超える食物に反応をした。３名の患者は、クラス２またはより高タイターの食物特異的ＩｇＥ抗体を示したが、有害食物の摂取後に、即時型の過敏反応を生じなかった。有害食物の摂取を開始した後、数日して、非即時型の反応の兆候である、下痢がはじめて顕在化した。番号５番の患者のみが、ＥＧＥが消散した後２年経って、ピーナツの摂取後に、即時型の反応を生じた。本研究の間、９名の患者は何れも、プロトンポンプ阻害剤もステロイドも投与されていなかった。
【０１１０】
表Ｅ３は、ＥＧＥ, ＣＴＲＬ、ＦＡ、ＡＤ、およびＵＣの基本的特徴を比較したものである。 血清中のサイトカイン／ケモカインの解析を受けたＡＤ患者の重篤度は、軽度（mild）から重篤の範囲内であった。ＳＣＯＲＡＤインデックスの中央値（ＩＱＲ）は３７（２９−５７）であった。血清中のサイトカイン／ケモカインの解析を受けたＵＣ患者の重篤度は、「Pediatric Ulcerative Colitis Activity Index（参考文献Ｅ９）」に従えば、軽度（mild)から中度（moderate）の範囲内であった。ＰＵＣＡＩ中央値（ＩＱＲ）は、３２．５（１１．３−３８．８）であった。マイクロアレイ解析、およびｑＰＣＲ解析のため、Matts grade（参考文献Ｅ１０）を用いて、ＵＣの患者の重篤度を分類した（３名の患者が≧３グレード; ５名の患者が≧２グレード)。
【０１１１】
＝マルチプレックス解析＝
血清を分離し、一部を−８０℃で凍結保存した。Milliplex Human Cytokine/Chemokine Kits (Millipore, St. Charles, MO)を用いて、製造者のインストラクションに従って、血清のサイトカインおよびケモカインのレベルをアッセイした。全部で、３６種のサイトカインおよびケモカインをアッセイした。アッセイしたサイトカインおよびケモカインは、ＴＮＦα、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ３、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ１３、ＩＬ１７、ＩＬ３３、ＴＳＬＰ、ＣＣＬ１／Ｉ３０９、ＣＣＬ２／ＭＣＰ１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ１β、ＣＣＬ７／ＭＣＰ３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ２、ＣＣＬ１１／ｅｏｔａｘｉｎ、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ４、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ１δ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２４／ｅｏｔａｘｉｎ２、ＣＣＬ２６／ｅｏｔａｘｉｎ３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＸＣＬ１−３／ＧＲＯ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ７８、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ１０、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ１、および、ＣＸ３ＣＬ１／Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅである。
【０１１２】
＝マイクロアレイ解析＝
生検後に、室温で、試料をRNAlater（登録商標）溶液(QIAGEN, Valencia, CA, USA)中に配し、遺伝子発現プロファイリングを行うまで、−８０℃で保管した。以前に記載されているように（参考文献Ｅ１１）、製造者のインストラクションに従って、microarray analysis (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) を行った。簡潔には、RNeasy Micro kit (Qiagen)を用いて総ＲＮＡを抽出し、Agilent BioanalyzerおよびRNA 6000 Nano kit (Agilent Technologies)を用いた評価を行った。遺伝子発現プロファイルは、Agilent SurePrint G3 Human GE 8 × 60kを用いたマイクロアレイ技術を用いて評価した。データ解析は、GeneSpring software ver. 12.5 (Agilent Technologies)を用いて行った。
【０１１３】
マイクロアレイ間の染色強度における変動をノーマライズする目的で、当該マイクロアレイ上の全遺伝子の平均差（average difference：ＡＤ）を、当該マイクロアレイ上の全測定値の中央値で除した。ＥＧＥの患者、またはＵＣの患者において、ＣＴＲＬにおける場合と比較して、シグナル強度において有意差が認められる遺伝子を(P < .05, t test with Benjamini and Hochberg false discovery rate correction)、上方制御（up-regulated）、または、下方制御（down-regulated）と見做した。ＥＧＥ、ＵＣ、およびＣＴＲＬを対照した遺伝子発現データを用いて階層的クラスタリング（Hierarchical clustering）を実行した。
【０１１４】
＝ｑＰＣＲ解析＝
ｑＰＣＲのために、既報（参考文献Ｅ１２および１３）に従って、総ＲＮＡの抽出、および、ｃＤＮＡ合成を実行した。ヒトＩＬ３３用のプライマーセット(sense, 5’-TCA GGT GAC GGT GTT GAT GG-3’; antisense, 5’-CCT GGT CTG GCA GTG GTT TT-3’)、ＴＳＬＰ用のプライマーセット(sense, 5’-GCCCAGGCTATTCGGAAACT-3’; antisense, 5’-CGACGCCACAATCCTTGTAATT-3’)、および、β-actin用のプライマーセット(sense, 5’-CCCAGCCATGTACGTTGCTAT-3’; antisense, 5’-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3’)は、Fasmac (Kanagawa, Japan)において合成した。各ｑＰＣＲ実験において、２ｎｇの総ＲＮＡサンプルと等価のｃＤＮＡのアリコートを用いた。ｍＲＮＡの発現レベルは、各サンプルにおけるβ-actinのレベルでノーマライズした。
【０１１５】
＝統計解析＝
研究グループ間の差異は、Dunn’s multiple comparison testまたはMann Whitney U testを伴う、Kruskal-Wallis testを用いて決定した。相関は、Spearmanのｒ値を用いて計算した。統計的解析は、GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を用いて行った。０.０５未満のＰ値を有意と見做した。
【０１１６】
＝倫理面＝
本研究は、ＮＣＣＨＤの組織評価委員会（日本国  東京）によって承認されているプロトコールに従って行った。インフォームドコンセントは、各参加者本人か、参加者本人の法的な保護者より取得した。
【０１１７】
（２．結果・考察等）
発明者らは、マイクロアレイを用いて、乳幼児のＥＧＥの患者における消化管の病変部位において、上方制御された遺伝子を見出す試みを行った。ここで、発明者らは、血清中のＴＳＬＰ（thymic stromal lymphopoietin）および血清中のＩＬ−３３のレベルが、乳幼児のＥＧＥの患者において特に増加していることを見出し、かつ、ＴＳＬＰおよびＩＬ−３３がＳ字結腸の粘膜において上方制御されていることも証明した。発明者らは、重篤な体重減少および／または難治性下痢症を伴う、活動期のＥＧＥの患者１３名を集めた。処置の開始前に、入院に際して血液を採取した。ＥＧＥの組織学的な診断は、消化管粘膜における集積した好酸球増加の存在に基づいて行った(すなわち、DeBrosseら（参考文献Ｅ６）の報告にある、正常範囲の上限を超えるもの）。ＥＧＥの患者の、上部消化管および下部消化管の内視鏡検査を、食事の除去（food elimination）を含む処置の開始から２〜４週間後に行った。番号１〜１３番の患者が、消化管において好酸球増加を示し、当該患者の体重減少は、有害食物の除去後には消散した(図３、および、表Ｅ１を参照)。
【０１１８】
表Ｅ３および表Ｅ４に、健常なコントロールの対象と、食物アレルギー、ＡＤ、ＵＣおよびＥＧＥの患者とにおける、臨床データの比較と血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルの比較とを示す。解析を行った３６種類の血清サイトカイン／ケモカインの中で、ＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、ＣＣＬ７／monocyte chemoattractant protein 3、および、ＣＣＬ２１／６ＣＫｉｎｅのレベルが、ＥＧＥの患者において特に増加した(図１のＡ−Ｄ、および、表Ｅ４）。
【０１１９】
これらのサイトカイン／ケモカインの診断上の有用性を、適切なカットオフポイントをセットして調べ、ＥＧＥに関しては、ＴＳＬＰおよびＩＬ−３３が、非常に優れた感度（７７．８％）および特異度（ＴＳＬＰ, ９７．６％； ＩＬ−３３, ９５．２％）を示した（表Ｅ５を参照）。ＣＣＬ２７／cutaneous T cell-attracting chemokineは、ＡＤの患者で、特にそのレベルが増加した代表的なケモカインである（図１のＥ）。ＴＳＬＰは、ＩＬ−３３と非常に強い相関(r＝0.91, P <.0001)を示すが、cutaneous T cell-attracting chemokineとは相関を示さなかった(図１のＦおよびＧ)。このアッセイキットにおいて、ＴＳＬＰとＩＬ−３３との交さ反応性は無かった（データは示さず）。血清中のＴＳＬＰおよびＩＬ−３３のレベルは、症状および徴候の改善とともに減少した (図１のＨおよびＩ)。
【０１２０】
血清中のサイトカイン／ケモカインのレベルの測定とあわせて、個々の患者の、炎症を起こしているＳ字結腸から取得した粘膜生検試料を、ホールゲノム転写解析に供した(ＥＧＥの患者、ＵＣの患者、および 健常者のコントロールの対象:ｎはそれぞれ５）。健常者のコントロール群と比較して、ＥＧＥの群で特異的に発現している８４１の遺伝子(≧2-fold change, adjusted P < .05)と、健常者のコントロール群と比較して、活動期のＵＣの群で特異的に発現している７６２の遺伝子(≧2-fold change, adjusted P <.05)とを、クラスター解析を用いて解析した(図２のＡ)。ＴＳＬＰのｍＲＮＡの発現は、ＥＧＥの患者で顕著に増加した(3.3-fold change, adjusted P ＝ .02)。ＩＬ３３の発現は、ＥＧＥの患者で増加する傾向がみられた(1.8-fold change)。表Ｅ６に、免疫系の分子、および、ＥｏＥ−関連性の分子の遺伝子発現をまとめている。
【０１２１】
ＵＣの患者において、沢山の炎症関連遺伝子(例えば、ＩＬ１Ｂ、ＩＦＮＧ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ６、および、ＣＸＣＬ１１)の発現が上方制御されているにも関わらず、ＥＧＥの患者においては、より少数の同様の遺伝子(ＴＳＬＰ、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、および、neurofilament medium polypeptide ［ＮＥＦＭ］)の発現が上方制御されていた。ｑＰＣＲでさらに、ＵＣの患者と比較して、ＥＧＥの患者のＳ字結腸の粘膜において、ＴＳＬＰのｍＲＮＡおよびＩＬ３３のｍＲＮＡの両方が、顕著に増加した発現を示すことが確認された(図２のＢ)。
【０１２２】
マイクロアレイ解析の結果、および、ｑＰＣＲの結果でも、ＥＧＥの患者のＳ字結腸の粘膜において、ＴＳＬＰおよびＩＬ３３の発現が見られ、血清で得られた知見と一致していた。しかし、マイクロアレイにおける幾つかのサイトカインの遺伝子発現のレベルは、血清でのデータと一致しなかった。この不一致の原因は、ＧＩ内視鏡検査の前に設けた２週間〜４週間の食物除去の期間によって、例えば、消化管に穿孔が生じるリスクが低減されたからかもしれない。発明者らは、この期間を、重篤なＥＧＥの患者はしばしば栄養不良の状態に陥る事実があるという観点から決定した。しかし、ＥＧＥの患者の粘膜においてＴＳＬＰおよびＩＬ３３が上方制御を示していることが、結果の一貫性を実証している。ＥＧＥの患者における、血清中のＴＳＬＰおよびＩＬ−３３の発現は、胃腸での炎症を反映しているかもしれず、少なくとも部分的には、これらの病変部位に由来するものであるかもしれない。
【０１２３】
ＴＳＬＰおよびＩＬ−３３は、今では、アレルギー性の不調において、鍵となるサイトカインであると認識されている。特に、ＴＳＬＰの近傍に位置する多型は、ＥｏＥに関連すると報告されている（参考文献Ｅ１５）。
【０１２４】
以前の研究では、ＵＣの患者、および、ＡＤの患者の両方で、血清中のＴＳＬＰ、ＩＬ−３３、またはこれらの両方のレベルが増加したことを示している（参考文献Ｅ１６・１７）が、本実施例では、病気の重篤度および炎症のレベルが相当に高かったにも関わらず、ＵＣの患者、または、ＡＤの患者で、これらの血清レベルは高くなかった。
【０１２５】
乳幼児のＥＧＥの患者群は、食物除去の開始後に顕著に改善して体重が増加し、かつ、長期耐性試験（有害食物を、連続する２〜３週間にわたり、毎日摂取）で陽性反応を示したので、非−ＩｇＥ仲介型の消化管食物アレルギー（参考文献Ｅ１８・１９）の診断が確立された。これらの患者のうち幾名かは、複数の食物に対して陽性のＩｇＥレベルを有していたが、有害食物の摂取に際しても、これら患者にはいかなる即時型の症状（例えば、じんましんや、ゼーゼーする等）も現れなかった。通常、食物負荷試験において反応を誘発するには、数日を要する。また、大部分の患者は、皮膚プリックテストにおいて食物アレルギーに対する陰性反応を示した。したがって、これら患者における消化管の炎症の大部分は、有害食物に対する非ＩｇＥ−仲介型の反応によって（ＩｇＥ−仲介型の反応によってではなく）引き起こされたと考えられる。さらに、食物蛋白誘発胃腸炎（enterocolitis syndrome）、または、食物蛋白誘発大腸末端炎（proctocolitis syndrome）の患者とは異なり、これらの患者は反復性の嘔吐も血便の病状も有していない。これまで、顕著な好酸球性の炎症は報告されてはいないが（参考文献Ｅ１９）、食物蛋白誘発腸症（Enteropathy）というのが、今回対象としたＥＧＥの患者に対する適切な診断であろう。
【０１２６】
＝参考文献Ｅの一覧＝
参考文献Ｅ１  Powell GK. Food protein-induced enterocolitis of infancy: differential diagnosis and management. Compr Ther 1986; 12:28-37.
参考文献Ｅ２  Nomura I, Morita H, Hosokawa S, Hoshina H, Fukuie T, Watanabe M, et al. Four distinct subtypes of non-IgE-mediated gastrointestinal food allergies in neonates and infants, distinguished by their initial symptoms. J Allergy Clin Immunol 2011; 127:685-8.
参考文献Ｅ３  Talley NJ, Shorter RG, Phillips SF, Zinsmeister AR. Eosinophilic gastroenteritis: a clinicopathological study of patients with disease of the mucosa, muscle layer, and subserosal tissues. Gut 1990; 31:54-8.
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参考文献Ｅ９  Turner D, Otley AR, Mack D, Hyams J, de Bruijne J, Uusoue K, et al. Development, validation, and evaluation of a pediatric ulcerative colitis activity index: a prospective multicenter study. Gastroenterology 2007; 133:423-32.
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参考文献Ｅ１９  Nowak-Wegrzyn A, Katz Y, Mehr SS, Koletzko S. Non-IgE-mediated gastrointestinal food allergy. J Allergy Clin Immunol 2015;135:1114-24.
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
表１中、CM：牛乳; HM：加水分解牛乳(MA-1); AAM:アミノ酸ミルク(大豆油を含有）; An：過敏症、ND：未検出；CRP：C-反応性タンパク質を示す。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
表２中、Tissue eosinophil count (eosinophils / HPF)：組織好酸球計数（好酸球／ＨＲＦ）Diagnosis：診断；Esophagus：食道； Stomach：胃；Duodenum：十二指腸；Ileum：回腸；Colon：結腸、Sigmoid：Ｓ状結腸；  Rectum：直腸；NA：適用不可； HPF：４００Ｘ高視野倍率を示す。*ＧＩ生検の典型的領域が決定され、400X HPFにおける好酸球数が係数された。太字の数字は、従来の検査にしたがって「増加」したことを示す。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
表３中、Atopic history：アトピー歴、Asthma：喘息、Immediate-type food allergy：中間型食物アレルギー、Blood eosinophil ratio：血中好酸球の割合、C-reactive protein：Ｃ−反応性タンパク質、Total protein：総タンパク質、Albumin：アルブミン、Total IgE、総ＩｇＥ、Egg-specific IgE：鶏卵特異的ＩｇＥ、Milk-specific IgE：牛乳特異的−ＩｇＥ、Wheat-specific IgE：小麦特異的ＩｇＥを示す。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
表５は、ＥＧＥの診断のために最適化したカットオフのためのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、感度および特異性の値を示す。
【０１３６】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キットは、臨床医学的な利用をはじめ、種々の分野で利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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