(57)【要約】【課題】化学物質の分解性の評価において分解活性が向上し、結果のバラツキの少ない評価方法、並びに当該方法に使用する試験容器及び酸素消費量測定装置を提供する。【解決手段】化学物質の分解性を評価する方法であって、(1) 被験物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験溶液を20〜24℃の温度で培養する工程、を含む、評価方法、化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験容器、並びに当該試験容器を備えた酸素消費量測定装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質の分解性を評価する方法であって、
(1) 化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験溶液を20〜24℃の温度で培養する工程、
を含む、評価方法。
【請求項２】
前記試験溶液の容量が1200 mL以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試験溶液の容量が1500 mL以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試験溶液中の前記化学物質の濃度が20〜120 mg/Lである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
(2) 前記工程(1)における培養過程で消費された酸素量から分解度を算出する工程、
を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試験溶液が、乳化剤及び／又は担体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記乳化剤が界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記担体がシリカゲルである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程(1)における培養期間が30日以内である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験容器。
【請求項１１】
請求項１０に記載の試験容器を備えた酸素消費量測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質の分解性を評価する方法、並びに当該方法に使用する試験容器及び酸素消費量測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律(化審法)は、人の健康を損なうおそれ又は動植物の生息・生育に支障を及ぼすおそれがある化学物質による環境の汚染を防止することを目的とする法律である。
【０００３】
日本の化審法では、分解性、濃縮性、有害性と段階的な評価が行われており、分解性の評価で良分解性と判定されるとその後の評価を実施することなく化学物質を製造・輸入することが可能となる。現行の分解性の評価はOECDテストガイドライン(以下、OECD TG) 301Cに相当する試験である。また、現行の試験装置が利用可能で、海外でも実施されているOECD TG301Fが2018年度から導入されることとなっている。現行のOECD TG301Cに相当する試験では分解活性が過小評価されてしまうことがあった。また、OECD TG301CやOECD TG301Fでは試験成立条件として分解度の最大値と最小値の差が20%未満となっており、結果にバラツキの少ない評価法が求められている。
【０００４】
非特許文献１では、このような化学物質の分解性の評価に関しての研究結果が報告されている。非特許文献１の“4.5.1.4 Effect of test volume in enhanced biodegradation screening tests”の項では、分解性試験における試験溶液の影響が調べられており、活性汚泥の濃度を30 mg SS L-1として試験溶液を1L, 500 mL, 100 mL, 50 mL, 10 mLで分解性の試験が行われている。その結果として、化学物質の分解度は500 mLで頭打ちとなり、また分解に関する変動係数も500 mLで最小になることが示されている。そのため、この結果に基づけば、化学物質の分解性の試験において、500 mLを超える容量の試験溶液を用いては通常行われないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Timothy James Martin, The Influence of microbial inocula on biodegradation outcome towards enhanced regulatory assessments, Newcastle University, 2014, Ph.D. thesis, 114-119
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、化学物質の分解性の評価において分解活性が向上し、結果のバラツキの少ない評価方法、並びに当該方法に使用する試験容器及び酸素消費量測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
化審法の現行の試験法では、定められた化学物質と活性汚泥の濃度で試験液量は300 mLと規定されており、実環境と比べると化学物質が分解し難い状況であった。なお、化審法の新たな分解性の試験法では化学物質と活性汚泥の濃度は定められているが、試験液量の規定はない。
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、化審法の新たな分解性の試験法において、試験液量を1000 mLを超える量まで増加させることにより化学物質の分解を促進させることができるという知見を得た。
【０００９】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の化学物質の分解性を評価する方法、試験容器及び酸素消費量測定装置を提供するものである。
【００１０】
項１．化学物質の分解性を評価する方法であって、
(1) 化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験溶液を20〜24℃の温度で培養する工程、
を含む、評価方法。
項２．前記試験溶液の容量が1200 mL以上である、項１に記載の方法。
項３．前記試験溶液の容量が1500 mL以上である、項１又は２に記載の方法。
項４．試験溶液中の前記化学物質の濃度が20〜120 mg/Lである、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
項５．(2) 前記工程(1)における培養過程で消費された酸素量から分解度を算出する工程、
を更に含む、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項６．前記試験溶液が、乳化剤及び／又は担体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７. 前記乳化剤が界面活性剤である、項６に記載の方法。
項８. 前記担体がシリカゲルである、項６又は７に記載の方法。
項９．前記工程(1)における培養期間が30日以内である、項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
項１０．化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験容器。
項１１．前記試験容器の容量が1500 mL以上である、項１０に記載の試験容器。
項１２．前記試験容器の容量が2000 mL以上である、項１０又は１１に記載の試験容器。
項１３．乳化剤及び／又は担体を含む、項１０〜１２のいずれか一項に記載の試験容器。
項１４. 前記乳化剤が界面活性剤である、項１３に記載の試験容器。
項１５. 前記担体がシリカゲルである、項１３又は１４に記載の試験容器。
項１６．項１０〜１５のいずれか一項に記載の試験容器を備えた酸素消費量測定装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、化学物質の分解活性を向上させることができる。さらに、本発明によると、評価結果のバラツキを低減させることができ、安定した結果を得ることが可能である。
【００１２】
本発明により分解活性が向上した結果として、本来は良分解性である化学物質の分解性の評価において、その分解性が過小評価され難分解性と判定されることなく、本来の良分解性と判定されることで、難分解性と判定された場合に化審法で実施が義務付けられているその後の評価を実施することなく化学物質を製造・輸入することができるようになるので、登録に要する不当なコストを低減させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】２−エチルアントラキノンの分解性試験(300 mL及び900 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図２】２−エチルアントラキノンの分解性試験(3900 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図３】２−エチルアントラキノンの分解試験における酸素消費量からの分解度(%)(補正後)を示すグラフである。
【図４】100 mg/Lにおける２−エチルアントラキノン標準液のクロマトグラムを示す図である。
【図５】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の300 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図６】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の300 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図７】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の900 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図８】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の900 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図９】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の3900 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１０】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の3900 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１１】トリメリット酸トリス(２−エチルヘキシル)の分解性試験における化学分析からの被験物質分解度(%)を示すグラフである。
【図１２】２−エチルアントラキノンの分解性試験(300 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図１３】２−エチルアントラキノンの分解性試験(1500 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図１４】101 mg/Lにおける２−エチルアントラキノン標準液のクロマトグラムを示す図である。
【図１５】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の300 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１６】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の300 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１７】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の1500 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１８】[２−エチルアントラキノン] 28日間培養後の1500 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１９】４−フルオロフェノールの分解性試験(300 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図２０】４−フルオロフェノールの分解性試験(3900 mL)における酸素消費量(mg)を示すグラフである。
【図２１】101 mg/Lにおける４−フルオロフェノール標準液のクロマトグラムを示す図である。
【図２２】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の300 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図２３】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の300 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図２４】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の300 mL生分解区-3におけるクロマトグラムを示す図である。
【図２５】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の3900 mL生分解区-1におけるクロマトグラムを示す図である。
【図２６】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の3900 mL生分解区-2におけるクロマトグラムを示す図である。
【図２７】[４−フルオロフェノール] 28日間培養後の3900 mL生分解区-3におけるクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
なお、本明細書において「含む、含有する(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００１６】
本発明の化学物質の分解性を評価する方法は、
(1) (例えば、20〜120 mg/Lの)化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量の試験溶液を20〜24℃の温度で培養する工程、
を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の試験容器は、(例えば、20〜120 mg/Lの)化学物質、及び25〜35 mg/Lの活性汚泥を含有する、1000 mLを超える容量であることを特徴とする。本発明の酸素消費量測定装置は、当該試験容器を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明の化学物質の分解性の評価方法は、基本的にはOECD TG301Fに相当する微生物による化学物質の分解度試験であるか、又は必要によりOECD TG301Fの試験条件を適宜変更したものである。
【００１９】
分解性を評価すべき化学物質(被験物質)としては、特に制限されず、化審法の登録試験に供する必要がある各種の新規又は既存の化学物質が挙げられる。被験物質が固体で水に所定の濃度まで溶解しない場合は、可能な限り微粉砕等を実施したものを用いることができる。
【００２０】
試験溶液における被験物質の濃度は、通常80〜120 mg/L、好ましくは90〜110 mg/L、特に好ましくは100 mg/Lである。微生物への阻害のある被験物質の場合には、試験溶液における被験物質の濃度は、通常20〜40 mg/L、好ましくは27〜33 mg/L、特に好ましくは30 mg/Lである。
【００２１】
活性汚泥としては、好ましくは、地方自治体が管轄する主として家庭排水を処理する下水処理場の好気的反応槽(例えば、出口付近)の活性汚泥又は返送汚泥を用いる。下水処理場より汚泥を採取後、必要に応じてふるい等を用いて大きな粒子を除去し、試験に使用するまで好気的条件を維持することが望ましい。採取当日に活性汚泥を使用しない場合は、約22℃で好気的条件を維持し、採取後7日間使用することができる。なお、活性汚泥は、原則として、被験物質や基準物質(アニリン、酢酸ナトリウム又は安息香酸ナトリウム)を用いてじゅん化してはならない。
【００２２】
試験溶液における活性汚泥の濃度は、通常25〜35 mg/L、好ましくは28〜32 mg/L、特に好ましくは30 mg/Lである。活性汚泥の濃度は、例えば、JIS K0102-2013の14.1の方法に準じて測定することができる。
【００２３】
試験溶液としては、被験物質及び活性汚泥を基礎培養基に添加したものを使用する。基礎培養基としては、水に各種の無機塩類等が添加されたものなどが使用でき、無機塩類としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化鉄(III)などが挙げられる。また、基礎培養基のpHを調整するために使用するpH調整溶液としては、例えば、リン酸、水酸化ナトリウム溶液などが挙げられる。
【００２４】
基礎培養基としては、好ましくは以下に示す基礎培養基を使用する。なお、以下に示す質量は好ましい値であり、必要により変更することもできる。
「以下に示したA液、B液、C液及びD液を調製し、A液10 mL、B液 1 mL、C液 1 mL、D液1 mLに水を加えて1 Lとし、これを基礎培養基とする。
A液：
リン酸二水素カリウム(KH2PO4) 8.50 g
リン酸水素二カリウム(K2HPO4) 21.75 g
リン酸水素二ナトリウム二水和物(Na2HPO4・2H2O) 33.40 g
又はリン酸水素二ナトリウム十二水和物(Na2HPO4・12H2O) 67.21 g
塩化アンモニウム(NH4Cl) 0.50 g
上記を水に溶解させ1 Lとする。またpHを7.4に調整する。
B液(JIS K0102-2013の21で定められたC液に相当)：
塩化カルシウム(CaCl2) 27.50 g
又は塩化カルシウム二水和物(CaCl2・2H2O) 36.40 g
上記を水に溶解させ1 Lとする。
C液(JIS K0102-2013の21で定められたB液に相当)：
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O) 22.50 g
上記を水に溶解させ1 Lとする。
D液(JIS K0102-2013の21で定められたD液に相当)：
塩化鉄(III)六水和物(FeCl3・6H2O) 0.25 g
上記を水に溶解させ1 Lとする。なお、本液は使用する直前に調製する。」
基礎培養基に活性汚泥を添加する前に、必要により溶液のpHを7.4±0.2に調整する。
【００２５】
また、被験物質が難水溶性物質である場合は、試験溶液には、被験物質と微生物の接触を改善する目的で補助物質(溶媒、乳化剤、担体等)を更に使用することもできる。補助物質としては、好ましくは乳化剤及び担体であり、より好ましくは界面活性剤及びシリカゲルである。補助物質としては、生分解性や微生物への阻害性が無いものが望ましい。
【００２６】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤のいずれも特に制限なく使用することができ、中でも抗菌活性が低いものが好ましい。抗菌性が低い界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、非イオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレン(POE)ソルビタン脂肪酸エステル(Tween (登録商標)など)、POE−ポリオキシプロピレン(POP)ブロックコポリマー(ポロクサマーなど)、エチレンジアミンのPOE-POPブロックコポリマー付加物、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、POEヒマシ油、POEアルキルフェニルエーテル、POEアルキルエーテル、POE・POPアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、プロピレングリコール脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルなどが挙げられる。
【００２７】
試験溶液中の乳化剤及び担体の含量は、特に制限されず適宜選択することができる。乳化剤は単独で又は2種以上組み合わせて使用することができる。
【００２８】
試験溶液の容量の下限としては、例えば、1100 mL、1200 mL、1300 mL、1400 mL、1500 mL、1600 mL、1700 mL、1800 mL、1900 mL、2000 mL、2100 mL、2200 mL、2300 mL、2400 mL、2500 mL、2600 mL、2700 mL、2800 mL、2900 mL、3000 mL、3100 mL、3200 mL、3300 mL、3400 mL、3500 mL、3600 mL、3700 mL、3800 mL、3900 mL等が挙げられる。試験溶液の容量を、このような容量とすることで、化学物質の分解性評価において、化学物質の分解活性を向上させ、評価結果のバラツキを低減させることが可能となる。
【００２９】
試験溶液の容量の上限としては、例えば、6500 mL、6400 mL、6300 mL、6200 mL、6100 mL、6000 mL、5900 mL、5800 mL、5700 mL、5600 mL、5500 mL、5400 mL、5300 mL、5200 mL、5100 mL、5000 mL、4900 mL、4800 mL、4700 mL、4600 mL、4500 mL、4400 mL、4300 mL、4200 mL、4100 mL、4000 mL、3900 mL等が挙げられるが、さらに容量を大きくし実環境に近づけることにより分解活性が向上し、結果のバラツキを低減させることが可能になると考えられる。
【００３０】
試験溶液を入れるための試験容器としては、特に制限されず、ガラス製、プラスチック製等の既製品、特注品、自家製の物(例えば、培養ビン)などの中から適切な物を適宜選択して使用することができる。本発明において、特定の容量(例えば、1000 mLを超える容量)の試験容器とは、特定の容量の試験溶液を収容可能な大きさを有する試験容器を意味し、試験容器の容量は上記の試験溶液の容量に対応する。
【００３１】
化学物質の分解性の評価においては、上記試験溶液以外にも、活性汚泥が添加された基礎培養基に基準物質(アニリン、酢酸ナトリウム又は安息香酸ナトリウム)が100 mg/Lとなるよう添加したもの(必要により補助物質(適切な量)を添加する)、活性汚泥が添加された基礎培養基のみのもの(必要により補助物質(適切な量)を添加する)などを必要により準備する。
【００３２】
培養は、通常、遮光した条件のもとで、十分攪拌しながら一定の期間行う。培養の温度条件は、通常20〜24℃、好ましくは21〜23℃である。培養期間は、通常30日以内であり、好ましくは29日以内であり、より好ましくは28日以内であり、また、通常10日以上であり、好ましくは14日以上であり、より好ましくは21日以上である。培養期間は、最も好ましくは28日である。
【００３３】
培養中には、通常、培養過程で消費された酸素量(酸素消費量)の測定を行う。酸素消費量の測定は、例えば、酸素消費量測定装置を用いて行うことができる。酸素消費量測定装置は、生物化学的酸素消費量(BOD)を測定するための装置であり、各種の市販品(例えば、クーロメータ)などを使用することができる。
【００３４】
一定期間培養した後には、必要により、残留する被験物質と変化物とを分析に供し、その量を測定し、被験物質が水に溶解する場合は、溶存有機炭素の残存量も測定する。また、試験溶液のpHの測定も必要により行う。
【００３５】
試験(培養)の終了時において、試験の有効性は、例えば次のような基準で判断することができる：被験物質、活性汚泥と基礎培養基が添加された試験溶液における分解度の最大値と最小値の差が20%未満、活性汚泥が添加された基礎培養基のみを使用した物の酸素消費量が60 mg/L以下、基準物質を使用した物の酸素消費量から求めた基準物質の分解度が14日後までに60%に達するときに試験を有効と判断する。
【００３６】
本発明の化学物質の分解性を評価する方法は、好ましくは、(2) 前記工程(1)における培養過程で消費された酸素量(酸素消費量)から分解度を算出する工程を更に含む。
【００３７】
酸素消費量からの分解度(%)は、以下の式を用いて算出することができる。
分解度(%) = (BOD−B) / TOD(1) ×100
BOD: 被験物質の生物化学的酸素消費量(測定値)(mg)
B  : 基礎培養基に活性汚泥を接種したものの酸素消費量(測定値)(mg) 
TOD: 被験物質が完全に酸化した場合に必要とされる理論的酸素消費量(計算値)(mg)
(1)窒素を含む被験物質が分解した場合、硝化の程度に応じたTODを算出する。
【００３８】
また、分解度の算出は、直接定量により行うこともできる。直接定量は、全有機炭素分析計、及びその他の分析計を用いて行うことができる。以下、全有機炭素分析計を用いる場合、及びその他の分析計を用いる場合の分析法の例を示す。
【００３９】
(全有機炭素分析計を用いる場合)
試験容器から試験液を適当量分取し、これを約40,000 m/s2で15分間遠心分離又はろ過(0.45μm)し、その上澄液又はろ液から適当量を分取して全有機炭素分析計により残存する溶存有機炭素を定量する。
【００４０】
(その他の分析計を用いる場合)
試験容器内の内容物を被験物質等に適した溶剤により抽出、濃縮等適切な前処理を行った後分析機器等による定量分析を行う。この場合、原則としてJISに規定された分析法通則(高速液体クロマトグラフ分析法、ガスクロマトグラフ分析法、吸光光度分析法、質量分析法、原子吸光分析法等)に従い分析を行う。
【００４１】
直接定量からの分解度(%)は、以下の式を用いて算出することができる。
被験物質分解度(%) = (B−A) / B×100
A: 分解度試験終了後の被験物質の残留量(測定値)(mg)
B: 被験物質の添加量(mg)
【００４２】
良分解性の判定の目安は分解度が60%以上かつ分解物が生成していないことである。また、良分解性でないものは難分解性と判定される。
【００４３】
本発明によれば、化学物質の分解活性を向上させることができる。さらに、本発明によると、評価結果のバラツキを低減させることができ、安定した結果を得ることが可能である。このように、本発明により分解活性が向上した結果として、本来は良分解性である化学物質の分解性の評価において、その分解性が過小評価され難分解性と判定されることなく、本来の良分解性と判定されることで、難分解性と判定された場合に化審法で実施が義務付けられているその後の評価を実施することなく化学物質を製造・輸入することができるようになるので、登録に要する不当なコストを低減させることが可能となる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
【００４５】
試験例
・試験方法
１．微生物
微生物源として下水処理場の活性汚泥を用いた。活性汚泥の濃度測定は、JIS K0102(1993)の方法に準じた。
【００４６】
２．被験物質
２−エチルアントラキノン、トリメリット酸トリス(２−エチルヘキシル)及び４−フルオロフェノールを用いた。
【００４７】
３．試験装置
温度を一定に保つことができ撹拌機能がある酸素消費量測定装置(クーロメータ)を用いて、経時的に酸素消費量を測定した。被験物質が好気的に分解すると酸素消費するので、この酸素消費の積算量を測定することで被験物質の分解の程度を評価できる。
【００４８】
４．試験条件
以下の条件でクーロメータを用いて分解度試験を行った。
被験物質濃度  ：100 mg/L
活性汚泥濃度  ： 30 mg/L
温度          ： 22±1℃
撹拌          ： クーロメータに備わったスターラーを使用
光            ： 遮光
期間          ： 28日間
【００４９】
５．試験区
＜生分解区＞
基礎培養基*1)に被験物質と活性汚泥を加えたもの。なお、以下のI〜IIIの試験では、担体としてシリカゲルを用い、被験物質をシリカゲルに吸着させた状態*2)で添加した(n=2)。IVの試験ではシリカゲルを添加しなかった(n=3)。
【００５０】
＜コントロール区＞
基礎培養基*1)に活性汚泥を加えたもの(n=1)。なお、以下のI〜IIIの試験では、生分解区と同量のシリカゲル*2)(被験物質未吸着)を添加した。IVの試験ではシリカゲルを添加しなかった。
【００５１】
*1) 基礎培養基の調製(OECD TG 301Fに準拠)
以下に示したA液、B液、C液及びD液を調製した。A液10 mL、B液 1 mL、C液 1 mL、D液1 mLに水を加えて1Lとし、これを基礎培養基とした。
A液：
リン酸二水素カリウム(KH2PO4) 8.50 g
リン酸水素二カリウム(K2HPO4) 21.75 g
リン酸水素二ナトリウム十二水和物(Na2HPO4・12H2O) 67.21 g
塩化アンモニウム(NH4Cl) 0.50 g
上記を水に溶解させ1 Lとした。またpHを7.4に調整した。
B液：
塩化カルシウム(CaCl2) 27.50 g
上記を水に溶解させ1 Lとした。
C液：
硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4・7H2O) 22.50 g
上記を水に溶解させ1 Lとした。
D液：
塩化鉄(III)六水和物(FeCl3・6H2O) 0.25 g
上記を水に溶解させ1 Lとした。なお、本液は使用する直前に調製した。
【００５２】
*2) シリカゲルに被験物質を吸着させる方法
ISO 10634ガイダンス(ISO, 1995)で推奨されているカラムクロマトグラフィー用シリカゲル(粒子径：15μm〜500μm)を使用した。被験物質をシリカゲルに吸着させる方法は次の通りであった。被験物質1800 mgを約150 mLのクロロホルムに溶解させ、その中にシリカゲルを24 g添加し2時間撹拌した。その後、クロロホルムを揮散させるためにエバポレーションおよび45℃に設定した真空オーブンで約14日間処理した。シリカゲル単位重量あたりに吸着した被験物質量を算出するため、処理済みシリカゲルから被験物質を溶媒により抽出し、化学分析を行った。
【００５３】
また、コントロール区は、上述の処理方法でシリカゲルとクロロホルムは同じ比率に設定し、被験物質添加無しの条件で行った。
【００５４】
なお、以下のI及びIIの試験では、吸着に使用したクロロホルムがシリカゲルに残存したため、コントロール区においても酸素消費量が増大し、その補正が必要であった。I及びIIの試験では真空オーブン内でシリカゲルをガラス容器(ナスフラスコ)に入れてクロロホルムを揮散させていたが、IIIの試験ではシリカゲルをバットの上に広げ被表面積を広くして揮散させたところ、クロロホルムの残存量が急激に減少しクロロホルムによる酸素消費量が殆どなくなり、補正が不要となった。
【００５５】
６．試験容量
300 mL, 900 mL, 1500 mL, 3900 mL用の容器を用いて生分解区、コントロール区を試験した。
【００５６】
７．評価方法
(1) 酸素消費量から分解度(%)を算出する方法
以下の式を用いた。
分解度(%) = (BOD−B) / TOD ×100
BOD: 生分解区の酸素消費量(測定値)(mg)
B  : コントロール区の酸素消費量(測定値)(mg) 
TOD: 被験物質が完全に酸化した場合に必要とされる理論的酸素消費量(計算値)(mg)
[計算方法は下記の(i)〜(iii)参照]
分解度を評価する際、異なる容量の試験区の結果を用いる場合には、容量に応じた酸素消費量に補正して評価した。
【００５７】
＜TOD算出方法＞
完全酸化反応式：  被験物質 + a O2 → b CO2 + c H2O
被験物質1 mgあたりのO2量 = a×O2分子量 / 被験物質の分子量
TOD = 被験物質1 mgあたりのO2量×被験物質濃度(mg/L)×試験容量(L)
(i) ２−エチルアントラキノンの場合
完全酸化反応式：C16H12O2 + 18 O2 → 16 CO2+ 6 H2O
被験物質1 mgあたりの酸素量 = 18 O2 / C16H12O2= 575.98 / 236.27 = 2.44
TOD (例300 mLの時)：2.44×100 mg/L×0.3 L = 73.2 mg
(ii) トリメリット酸トリス(２−エチルヘキシル)の場合
完全酸化反応式：C33H54O6 + 43.5 O2 → 33 CO2 + 27 H2O
被験物質1 mgあたりの酸素量 = 43.5 O2 / C33H54O6= 1391.95 / 546.78 = 2.55
TOD (例300 mLの時)：2.55×100 mg/L×0.3 L = 76.5 mg
(iii) ４−フルオロフェノールの場合
完全酸化反応式：C6H5FO + 6.75 O2 → 6 CO2+ 2.5 H2O + F
被験物質1 mgあたりの酸素量 = 6.75 O2 / C6H5FO = 215.99 / 112.10 = 1.93
TOD（例300 mLの時）：1.93×100 mg/L×0.3 L = 57.9 mg
【００５８】
(2) 化学分析(HPLC)から被験物質分解度(%)を算出する方法
以下の式を用いた。
被験物質分解度(%) = (B−A) / B×100
A: 28日間培養後の生分解区の被験物質の残留量(測定値)(mg)
B: 被験物質の添加量 (mg)
分解物生成率(%) = C / D ×100
C: 28日間培養後の生分解区の分解物の生成量*(測定値)(mg)
D: 被験物質の添加量(mg)
*被験物質と分解物の吸光係数が等しいものとして、定量
【００５９】
・結果
I. ２−エチルアントラキノン(300 mL〜3900 mL)
[酸素消費量から分解度算出]
図１及び２に、活性汚泥による酸素消費量(mg)を示した。その結果、300 mL生分解区よりも900 mL生分解区、900 mL生分解区よりも3900 mL生分解区の酸素消費量が大きいことが明らかとなった。この傾向はコントロール区でも同様に見られた。これは、試験容量を増大させることにより２−エチルアントラキノンの分解が促進された以外に、シリカゲルに被験物質を吸着させる際に用いたクロロホルムの残量にも起因している。
【００６０】
図１の300 mLの生分解区(図中の[1]と[2])と300 mLのコントロール区(図中の[5])、900 mLの生分解区(図中の[3]と[4])と900 mLのコントロール区(図中の[6])、図２の3900 mLの生分解区とコントロール区のいずれにおいても、２−エチルアントラキノンの分解が急激に進む前の酸素消費量はコントロール区の方が大きいことから、コントロール区にクロロホルムが多く残留していたと考えられる。そのため、7.(1)の方法で算出した分解度はマイナス値となり、底値は-15%あたりであった。そこで、分解度に15%を加え補正することとした。
【００６１】
また、3900 mLのコントロール区は12日付近で酸素消費量の測定上限に達したため、28日間を通じた酸素消費量が測定できなかった。900 mLのコントロール区(図１の[6])は300 mLのコントロール区(図１の[5])の酸素消費量の3倍程度であり、3900 mLのコントロール区(図２)も12日までは300 mLのコントロール区の酸素消費量の13倍程度であった。そのため、各時点の300 mLのコントロール区の酸素消費量を13倍にしたものを3900 mLのコントロール区の値として補正した。
【００６２】
以上の補正を加えて作成したのが図３であり、900 mLの試験区の分解は300 mLと同様に21日以降に始まったもの(図３の900 mL-2)と早めに分解度の上昇が始まったもの(図３の900 mL-1)があり、3900 mLの試験区ではいずれの試験区(図３の3900 mL-1と3900 mL-2)ともに21日よりも前に分解度が上昇し分解が促進した。
【００６３】
[化学分析から被験物質の分解度算出]
28日後の試験液に、比率が3対2の割合となるようアセトニトリルを添加し、その一部を採取して遠心分離し活性汚泥やシリカゲルを沈殿させ、その上澄液を下記のHPLCの分析条件で化学分析を行い、標準液の結果を用いて7.(2)の方法で被験物質の分解度を評価した。結果を図４〜１０に示す。
【００６４】
300 mL (図５、図６)及び900 mL (図７、図８)では2連間で被験物質の分解度及び分解物の生成率にバラツキが見られた(表１)。一方、3900 mLまで増量するとどちらも被験物質の分解度は100%に達し、また分解物の生成率も同程度であった(図９、図１０、表１）。このことからも、試験液増量により被験物質の分解が促進し、またバラツキが低減することが示唆された。
【００６５】
【表１】
2019184569.tif 000002
【００６６】
・HPLC分析条件
カラム：L-column ODS (2.1 mm×150 mm)
移動相：B conc. 50.0%→(3.1%/min)→100%
A:0.1%ギ酸含有DW
B:0.1%ギ酸含有アセトニトリル
検出：254 nm, カラム温度：40℃
流速：0.2 mL/min, 注入量：10μL
【００６７】
II. トリメリット酸トリス(２−エチルヘキシル)(300 mL〜3900 mL)
28日後の試験液に、比率が3対2の割合となるようテトラヒドロフランを添加し、その一部を採取して遠心分離し、活性汚泥やシリカゲルを沈殿させ、その上澄液を上記のHPLCの分析条件で化学分析を行い、7.(2)の方法で被験物質の分解度を評価した。結果を図１１に示す。300 mLと比較して900 mLの試験区では2連間のバラツキが低減した。また、900 mLと比較して3900 mLの試験区では被験物質の分解度が向上した。酸素消費量から算出される分解度が分解性の基準に用いられるが、化学分析により算出した被験物質の分解度も同様の挙動を示すため、ここでは化学分析により評価を行った。
【００６８】
III. ２−エチルアントラキノン(300 mL〜1500 mL)
[酸素消費量から分解度算出]
図１２及び１３に、活性汚泥による酸素消費量(mg)を示した。300 mL生分解区の1連は15日後に分解が急速に進み始めたが、もう1連は28日経過しても急速な分解が開始しなかった。一方、試験濃度は同じで試験液量を増量した1500 mL生分解区の2連は10日後と22日後のいずれも28日の間に急速な分解が開始した。
【００６９】
[化学分析から分解度算出]
28日後の試験液に比率が3対2の割合となるようアセトニトリルを添加し、その一部を採取して遠心分離し、活性汚泥やシリカゲルを沈殿させ、その上澄液を上記のHPLCの分析条件で化学分析を行い、標準液の結果を用いて7.(2)の方法で被験物質の分解度を評価した。結果を図１４〜１８、表２に示す。その結果、300 mLでは被験物質の分解度が97% (図１５)と5% (図１６)と大きな差が見られたのに対し、1500 mLでは89% (図１７)と100％(図１８)と2連間でのバラつきが低減し、分解度の平均値も51%から91%と分解活性が向上した(表２)。
【００７０】
【表２】
2019184569.tif 000003
【００７１】
IV. ４−フルオロフェノール(シリカゲル無添加)(300 mL〜3900 mL)
[酸素消費量からの分解度算出]
図１９及び２０に、活性汚泥による酸素消費量(mg)を示した。試験容量を300 mLとしたときの微生物による酸素消費量(mg)から、3連の生分解区は12.5〜14日後に急激な分解が開始したことが分かった(図１９)。一方、試験容量3900 mLでは3連とも12〜13日後に酸素消費量が急激に増大し、その後1連のみ容器と蓋の接続部から空気が流入してしまい被験物質の理論酸素要求量を超過した(図２０)。300 mLの試験容器では3連とも14日までに分解が開始し、また3連間で分解開始に1.5日の差があったのに対し、3900 mLの試験容器では3連とも13日までに分解が開始し3連間で1日の差しかなかったことから、シリカゲルなどを添加しない条件においても、3900 mLに試験液を増量することにより300 mLよりも分解開始時期が早まり分解活性が向上するとともに、連間のバラつきも低減することが分かった。
【００７２】
[化学分析からの分解度算出]
28日後の試験液の一部を採取し、無処理で下記のHPLCの分析条件で化学分析を行い、標準液の結果を用いて7.(2)の方法で被験物質の分解度を評価した。結果を図２１〜２７に示す。その結果、全ての試験区において被験物質は消失したため、被験物質の残留量は0 mgと見なし、分解度は100%と算出した。
【００７３】
・HPLC分析条件
カラム：L-column ODS (3.0 mm×150 mm)
移動相：B conc. 10.0%→(3.0%/min)→100%
A:0.1%ギ酸含有DW
B:0.1%ギ酸含有アセトニトリル
検出：254 nm, カラム温度：40℃
流速：0.2 mL/min, 注入量：10μL
【図１】
2019184569.tif 000004
【図２】
2019184569.tif 000005
【図３】
2019184569.tif 000006
【図４】
2019184569.tif 000007
【図５】
2019184569.tif 000008
【図６】
2019184569.tif 000009
【図７】
2019184569.tif 000010
【図８】
2019184569.tif 000011
【図９】
2019184569.tif 000012
【図１０】
2019184569.tif 000013
【図１１】
2019184569.tif 000014
【図１２】
2019184569.tif 000015
【図１３】
2019184569.tif 000016
【図１４】
2019184569.tif 000017
【図１５】
2019184569.tif 000018
【図１６】
2019184569.tif 000019
【図１７】
2019184569.tif 000020
【図１８】
2019184569.tif 000021
【図１９】
2019184569.tif 000022
【図２０】
2019184569.tif 000023
【図２１】
2019184569.tif 000024
【図２２】
2019184569.tif 000025
【図２３】
2019184569.tif 000026
【図２４】
2019184569.tif 000027
【図２５】
2019184569.tif 000028
【図２６】
2019184569.tif 000029
【図２７】
2019184569.tif 000030