(57)【要約】      （修正有）【課題】フエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチド、上記を生成及び使用する方法、及びＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により疼痛を緩和する方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体、前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチド、前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体を生成する方法、並びに前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシン
ＩＶ変異体。
【請求項２】
ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｋ又はＨであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、そして、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹである、請求項１に記載の単離されたフエントキシンＩ
Ｖ変異体。
【請求項３】
配列番号２７７、２７８、１９２、２７９、２８０、又は３の前記アミノ酸配列を有す
る、請求項２に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項４】
ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり
、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｅ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｆ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｇ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｈ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｉ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｊ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｋ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｌ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｍ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｎ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｏ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｐ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｒ又はＤであり、
ｑ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｒ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ｓ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして
、
ｔ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している、請
求項２に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項５】
前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50が約１６０×１０-9
Ｍ未満である、請求項４に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項６】
前記フエントキシンＩＶ変異体が配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８
、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、
９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、
１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、
１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、
１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、
１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、
１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、
１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、
１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、
１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、
１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、
１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、
２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、
２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２４１、
２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、
２５２、２５３、２７７、２７８、２７９又は２８０の前記ポリペプチド配列を有する、
請求項５に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項７】
配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害
する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項８】
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、２５、
４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８２、８
３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１
、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８２
、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、２２３
、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３
、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９又は２４０の前記ポリペプチド配列
を有する、請求項７に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項９】
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３
、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７
０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３
、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、
９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７
、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７
、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７
、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７
、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７
、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７
、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７
、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７
、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７
、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７
、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７
、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７
、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７
、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７
、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７
、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０
、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０
、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００
、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０
、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０
、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０
、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０
、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０
、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示される前記ポリペプチド配列を有する
、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項１０】
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３
、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７
０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３
、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、
９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７
、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７
、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７
、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７
、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７
、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７
、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７
、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７
、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７
、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７
、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７
、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７
、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７
、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７
、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７
、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０
、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０
、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００
、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０
、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０
、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０
、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０
、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０
、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５の前記フエントキシンＩＶ変異体をコード
した単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエント
キシンＩＶ変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンＩＶ変異体を生
成する方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦
形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために請求項９に記載の前記
フエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む、方法。
【請求項１６】
治療法に使用するための、請求項９に記載のフエントキシンＩＶ変異体。
【請求項１７】
Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Ｎａ
ｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害
剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
【請求項１８】
前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内
臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）
、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎、線
維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨ
Ｎ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む、請求項
１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験対象がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の部位、末
梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、請求項１９
に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、プロトキシンＩＩ（配列番号３５６）、フエン
トキシンＩＶ（配列番号１）、プロトキシンＩＩ変異体、又はフエントキシンＩＶ変異体
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３
８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１
、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、
６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７
８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１
、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３
、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３
、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３
、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３
、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３
、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３
、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３
、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３
、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３
、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３
、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３
、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３
、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３
、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３
、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３
、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３
、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６
、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６
、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６
、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６
、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６
、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６
、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６
、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示さ
れる前記ポリペプチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先の出願との相互参照）
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７８１，２７６号、及び２０１２年９月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７０２，５３８号に基づく利益を主張する２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８３３，５５５号、及び２０１２年５月１８日出願の米国特許仮出願第６１／６４８，８７１号に基づく利益を主張するものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、フエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により疼痛を緩和する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-gated sodium channel）（ＶＧＳＣ）は、心筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在している。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：５８９〜６０２，２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ２１：１０７〜１５，２０１０）、筋緊張（Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０：８０〜３，２０１０）、及び疼痛（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５８８：１８９７〜９０４，２０１０）を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えられている（Ｈｕｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１：２４３５〜４５，２００２）。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）αサブユニットのファミリーの９つの周知のメンバー、Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９、がヒトに存在する。このＮａｖ１．ｘサブファミリーは、薬学的にテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性又はＴＴＸ抵抗性に細分化することができる。Ｎａｖ１．７（ＰＮ１、ＳＣＮ９Ａ、又はｈＮＥとも呼ばれる）はＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルとして機能する。
【０００５】
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状態に関係している。ヒトでは、Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症（ＰＥ）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４１：１７１〜４，２００４）、及び発作性激痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４，２００６）と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の症状緩和を与えることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ−Ｃｒｅｓｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  １３０：４２９〜３３，２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４，２００６）。
【０００６】
ヒトにおけるＳＮＣ９Ａの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）を引き起こす（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：８９４〜８，２００６；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ７１：３１１〜９，２００７；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２１１４〜２１，２００７）。
【０００７】
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトＮａｖ１．７のＲ１１５０Ｗの置換を生じる多型性ｒｓ６７４６０３０は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている（Ｒｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：５１４８〜５３，２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ  Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンは、脱分極に反応して増大した発火頻度を示す（Ｅｓｔａｃｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６６：８６２〜６，２００９）。線維筋痛症の機能障害型の１つが、ＳＣＮ９Ａのナトリウムチャネルの多型性ｒｓ６７５４０３１との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している（Ｖａｒｇａｓ−Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １３：２３，２０１２）。
【０００８】
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の欠失が、機械性及び熱性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２７０６〜１１，２００４）。すべての感覚ニューロンでＮａｖ１．７遺伝子の発現を停止させることにより、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの両方でＳＣＮ９Ａを欠失させることで、機械性、熱性及び神経因性疼痛が消失し、ＳＣＮ９Ａの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型が再現された（Ｍｉｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：７９１，２０１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の治療に有用となりうる。
【０００９】
クモ毒には、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１，２００２）、プロトキシンＩ、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４７３４〜４７，２００２）、及びフリクソトキシンＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６９：４１９〜２９，２００６）を含む多くのナトリウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ（Ornithoctonus huwena））より得られるフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）は、Ｎａｖ１．７及び他のＴＴＸ感受性電位依存性ナトリウムチャネルの強力な遮断薬であり、ドメインＩＩの電位センサーを内向きの閉じたコンフォメーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：２７３００〜１３，２００８）。プロトキシンＩＩは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を示すことを目的とした様々なｉｎ  ｖｉｖｏ実験の対象となっているが、これらの実験のいずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンＩＩの作用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）又はタイトジャンクションタンパク質であるクラウジンＩの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入（Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０９：２９  Ｅ２０１８−２７，２０１２）によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬を特定することが求められている。詳細には、他のＶＧＳＣのアイソフォームよりもＮａｖ１．７に対して高い選択性を有する新規なＮａｖ１．７遮断薬が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、フエントキシンＩＶ変異体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の単離されたフエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００２０】
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は末梢投与される。
【００２１】
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤はプロトキシンＩＩ又はフエントキシンＩＶ又はそれらの変異体である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。
【図１ｂ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。
【図２ａ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。
【図２ｂ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。
【図３ａ】生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。
【図３ｂ】生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。
【図４】Ｎａｖ１．７に対するＥＣ50が３００×１０-9ＭであるフエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。
【図５】ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比を用いて評価した、Ｎａｖ１．２よりもＮａｖ１．７に対して少なくとも５倍高い選択性を有する、（Ｎａｖ１．２に不活性である）フエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。
【図６】ホールセル（全細胞）パッチクランプアッセイ（ＱＰａｔｃｈ）において選択したフエントキシンＩＶ変異体のＩＣ50値及び選択性を示す。
【図７Ａ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図７Ｂ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図７Ｃ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図８】溶媒処理動物の平均ＡＵＣを減じた（個々のフエントキシンＩＶ処理ラットのそれぞれについて）、フエントキシンＩＶ処理ラットの閾値（ｇ）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたところ、用量の有意な影響が認められ（ｐ＜０．００１）、用量依存的反応が示された。ボンフェローニポスト検定によれば、各用量群間で有意差が示された（**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１）。
【図９】それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均α炭素原子（ＣＡ）の２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）により色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）の有意な（＞１０倍）低下を生じた、異なるフエントキシンＩＶアラニン突然変異体を示す。ＣＡ  ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）〜２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）ＷＴ（ｂ）Ｆ６Ａ、（ｃ）Ｐ１１Ａ、（ｄ）Ｄ１４Ａ、（ｅ）Ｌ２２Ａ、（ｆ）Ｓ２５Ａ、（ｇ）Ｗ３０Ａ、（ｈ）Ｋ３２Ａ及び（ｉ）Ｙ３３ＡのフエントキシンＩＶ突然変異体。
【図１０】それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均のＣＡ  ＲＭＳＤにより色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）においてアイソフォームに固有の変化を生じたと考えられる異なるアラニン突然変異体を示す。ＣＡ  ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）〜２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）Ｋ１８Ａ、（ｂ）Ｒ２６Ａ、（ｃ）Ｋ２７Ａ。
【図１１】組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号１）のＮＭＲ溶液構造を示す。ＮＭＲ構造より、フエントキシンＩＶとＮａｖ１．７との間の相互作用表面と考えられる極性アリール面を形成するねじれたβシート（濃紺）を形成しているＨｗＴｘ−ＩＶの５つの残基（Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３）が明らかである。
【図１２】フエントキシンＩＶがドッキングしたｈＮａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）電圧感知ドメイン（ＶＳＤ）の相同性モデルを示す。このモデルに基づけば、フエントキシンＩＶは、セグメントＳ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４により形成される溝内にドッキングする。フエントキシンＩＶ（配列番号１）の残基Ｋ３２及びＷ３０は、Ｎａｖ１．７（配列番号２６３）の残基Ｅ８１１及びＭ７５０とそれぞれ相互作用するものと予測される。
【図１３Ａ】ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１３Ｂ】ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１４Ａ】ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１４Ｂ】ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１５Ａ】ＨｗＴｘ−ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１５Ｂ】ＨｗＴｘ−ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１５Ｃ】示された濃度におけるＨｗＴｘ−ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。
【図１６Ａ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、０．３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１６Ｂ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１６Ｃ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。
【図１６Ｄ】示された濃度におけるＨｗＴｘ−ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１７Ａ】５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。
【図１７Ｂ】５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
【図１７Ｃ】足底内ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発接触性アロディニアを有意に軽減した。
【図１８Ａ】接触性アロディニアは、マウスにおいて１００％足底内ＣＦＡにより誘発されるが、５０％ＣＦＡでは誘発されない。
【図１８Ｂ】足底内ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与は、１００％  ＣＦＡ処理動物において接触性アロディニアを有意に軽減した。
【図１８Ｃ】ガバペンチンもＰｒｏＴｘ−ＩＩほどではないものの接触性アロディニアを軽減した。
【図１９Ａ】ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。
【図１９Ｂ】ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべての刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書に援用するものである。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２５】
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載するものである。
【００２６】
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる場合もある。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２８】
「相補配列」なる用語は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００３０】
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導するために使用することができるベクターを意味する。
【００３１】
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンＩＶ」又は「野生型ＨｗＴｘ−ＩＶ」なる用語は、配列番号１（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ）に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）のフエントキシンＩＶポリペプチドのことを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンＩＶ」又は「組み換えＨｗＴｘ−ＩＶ」なる用語は、配列番号２（ＧＰＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）に示される配列を有する、組み換えにより発現されたフエントキシンＩＶのことを指す。組み換えフエントキシンＩＶは、野生型フエントキシンＩＶと比較して、２個のアミノ酸からなるＮ末端尾部及びＣ末端尾部を有している。「参照フエントキシンＩＶ」なる用語は、配列番号２６７（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）のポリペプチド配列のことを指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号２６７に基づいている。例えば、明細書において「Ｆ６」とは、配列番号２６７の６番目のフェニルアラニン残基を指す。
【００３２】
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列１の野生型フエントキシンＩＶポリペプチド又は配列番号２６８の野生型フエントキシンＩＶポリヌクレオチド配列から、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの１以上の改変において異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
【００３３】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７」（ＳＣＮ９Ａ、ｈＮＥ、ＰＮ１とも呼ばれる）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号２６３に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ９αサブユニットのことを指す。
【００３４】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．２」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３５２３２．１及び配列番号２６４に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質２型αサブユニット（ＳＣＮ２Ａ）のことを指す。
【００３５】
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン）によって誘導される膜脱分極を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低減するフエントキシンＩＶ変異体の能力のことを指す（ただし、ベラトリジン誘導脱分極とは、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール］）を受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）を供与体として使用し、供与体を３９０〜４２０ｎｍで励起し、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞株を使用して５１５〜５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することによりＦＲＥＴシグナルの低下として測定される）。
【００３６】
本明細書で使用するところの「プロトキシンＩＩ」又は「ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」なる用語は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス（Thrixopelma pruriens）（ペルビアングリーンベルベットタランチュラ）の毒素ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１（５０）：１４７３４〜４７，２００２に述べられるアミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（配列番号３５６）を有するもののことを指す。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、インビトロで報告されているＩＣ50値が０．３ｎＭであり、他のＮａｖ１．ｘサブタイプと比較した場合に１００倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なＮａｖ１．７阻害剤である（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンＫＩＩＩＡ」又は「コノトキシンＫＩＩＩＡ」なる用語は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（４２）：３０６９９〜７０６，２００７に述べられる配列ＣＣＮＣＳＳＫＷＣＲＤＨＳＲＣＣ−ＮＨ2（配列番号３５７）を有する、キノシタイモ（コナス・キノシタイ）（Conus kinoshitai）毒素を指す。
【００３７】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７の遮断薬」とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性を阻害、低減、又は遮断するペプチドのことを指す。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、当該技術分野では周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してＮａｖ１．７遮断活性について試験することができる。例えば、Ｃｌａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：５０６〜５２０，２０００を参照されたい。
【００３８】
本発明は、Ｎａｖ１．７を阻害する単離されたフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明の変異体は、組み換えフエントキシンＩＶポリペプチドと比較した場合にＮａｖ１．７に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシンＩＶの特定の残基、詳細にはＦ６、Ｋ３２及びＩ３５は、置換に対して不耐性であり、更に残基Ｉ５、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｓ２５、Ｋ２７、Ｔ２８、Ｗ３０及びＹ３３（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の残基の置換は、位置Ｃ２、Ｃ９、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ２４及びＣ３１のシステイン残基に変化がない限り、Ｎａｖ１．７に対するフエントキシンＩＶ変異体の作用及び／又は選択性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
【００３９】
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００４０】
本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と比較した場合に同等に有効又はより有効なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換えフエントキシンＩＶは、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（モレキュラー・デバイシーズ社（Molecular Devices））を使用した、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞におけるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約１６０×１０-9Ｍである。フエントキシンＩＶ変異体は、上記のアッセイにおけるＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である場合に「同等に有効又はより有効」なＮａｖ１．７阻害剤である。このＩＣ50値は、アッセイ自体の内在的な変動性（１／２ｌｏｇ）のため、組み換えにより発現されるフエントキシンＩＶでは、測定されるＩＣ50よりも高く設定される。分かりやすさのため、３００×１０-9ＭのＩＣ50は、３．０×１０-7ＭのＩＣ50に等しい。
【００４１】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体では、不変残基Ｆ６、Ｋ３２及びＩ３５（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）以外に、Ｃ２〜Ｃ１７、Ｃ９〜Ｃ２４、及びＣ１６〜Ｃ３１間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のＮａｖ１．７阻害アッセイにおけるＩＣ50が約３００×１０-9Ｍ以下であれば、残りの残基は任意のアミノ酸で置換されてよい。
【００４２】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペプチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得ることもできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識されるであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ヒトライノウイルス１４型由来の組み換え３Ｃプロテアーゼ）の認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＨＲＶ３Ｃリンカー）（配列番号２７０））などのプロテアーゼ切断性リンカーと連結された（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号２６９）又は（ＧＧＧＧＳ）6（配列番号２６６）のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジン又は他のタグを用いて周知の方法により精製を促進することができる。
【００４３】
フエントキシンＩＶ変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌクレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第６５２１４２７号及び米国特許第第６６７０１２７号に述べられる方法に基づいた化学的遺伝子合成法を用いるか、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発法により合成することができる。フエントキシンＩＶ変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベクターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリーを生成することができる。
【００４４】
フエントキシンＩＶ変異体は、配列番号１の野生型ＨｗＴｘ−ＩＶと比較した場合に、例えばクローニング及び／又は発現スキームから生じる、更なるＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をＨＳＡ−（ＧＧＧＧＳ）4−ＨＲＶ３Ｃリンカー−ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体融合タンパク質として発現させた後、ＨＳＡから切断することにより、それぞれのＨｗＴｘ−ＩＶ変異体のＮ末端にＧ及びＰなどの更に２つの残基を導入することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにＧ及びＫなどの更なる残基をＨｗＴｘ−ＩＶのＣ末端に導入することができる。
【００４５】
本発明のＨｗＴｘ−ＩＶ変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがＮａｖ１．７を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン（Ｎａ+）の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
【００４６】
別の実施形態では、単離されたＨｗＴｘ−ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有し、配列中、
ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｉ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ23及びＸ26が任意のアミノ酸であり、
ｊ）Ｘ27及びＸ28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
ｋ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値は約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００４７】
別の実施形態では、前記単離されたＨｗＴｘ−ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有し、配列中、
ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｅ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｆ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｇ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｈ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｉ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｊ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｋ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｌ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｍ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｎ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｏ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｐ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｑ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｒ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｓ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｔ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
ｕ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ又はＫであり、
ｖ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｗ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｘ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｙ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｚ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ａａ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、
ｂｂ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失しており、そして、
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００４８】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、約１２×１０-9Ｍ〜約３００×１０-9ＭのＩＣ
50値でＮａｖ１．７を阻害することができる。この範囲のＩＣ50値を示す例示の変異体は、図４に示される配列番号３〜３２２のポリペプチドである。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体はＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
【００５０】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と比較してＮａｖ１．７に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンＩＶは、Ｎａｖ１．７に対して約１５９×１０Ｍ-9のＩＣ50を、Ｎａｖ１．２に対して約３４２×１０Ｍ-9のＩＣ50を有することから、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50の比は、約２．１４３である。本明細書で使用する場合、「選択性」又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」とは、ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体のＮａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50の比（ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７））が約５．０に等しいか又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンＩＶ変異体は、ＩＣ50の比が５未満であっても、変異体が少なくとも０．８×１０-6Ｍのペプチド濃度でＮａｖ１．２を阻害しない場合にＮａｖ１．７を「選択に阻害する」ものとする。Ｎａｖ１．２に対するＩＣ50は、Ｎａｖ１．７について述べた方法にしたがって、Ｎａｖ１．２を安定的に発現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすることができる。
【００５１】
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンＩＶの残基の位置としては、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３及びＱ３４が挙げられる（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。選択性を高めるための例示の置換は、Ｎ１３Ｇ、Ｎ１３Ｉ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１５Ｗ、Ｑ１５Ｐ、Ｋ１８Ｆ、Ｋ１８Ｐ、Ｓ１９Ｑ、Ｒ２６Ｋ及びＲ２６Ｉである。向上した選択性を有する例示のフエントキシンＩＶ変異体は、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０の変異体である。
【００５２】
残基Ｋ７、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｖ２３、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３、及びＱ３４、Ｇ３６及びＫ３７（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）を置換することにより、得られるフエントキシンＩＶ変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる（図１及び図３）有効性及び選択性の両方を高める例示の置換は、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、及びＫ３７Ｒである（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。向上した有効性及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号５、６、７、１２、１３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４、７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１６９、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８１、１８２、１８７、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０３、２０４、２０７、２１３、２１５、２１６、２１９及び２２１の変異体である。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、配列番号２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４及び３５５に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンＩＶ変異体である。
【００５４】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の選択性及び／又は有効性は、既存の変異体に、選択性及び／又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換（グラフティング）を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び／又は改良することが可能な例示の変異体は、変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号１９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）である。ＮＶ１Ｇ３８７は、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示した。ＮＶ１Ｇ３８７の有効性は、位置Ｅ４、Ａ８、Ｎ１３、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｓ２５、Ｋ３７及びＧ３６を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す。ＮＶ１Ｇ３２７は、Ｎａｖ１．７に対して高い有効性を示した。ＮＧ１Ｇ３２７の選択性は、位置Ｆ６、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｋ３２及びＹ３３を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエントキシンＩＶ変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価することができる点は認識されるであろう。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、
Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００５６】
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち：
配列番号２７６において、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ24が、Ｉである。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を更に有しうる。すなわち：
Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ22が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ23が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ25が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ26が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している。
【００５７】
配列番号２７６の単離されたフエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50は、約１６０×１０-9Ｍ未満でありうる。
【００５８】
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３においてヒトＮａｖ１．７と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば、フエントキシンＩＶの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによって親和性及び／又は選択性などの性質を向上させることができる。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、第２のポリペプチドと融合された配列番号３〜２５３又は２７７〜３５５のフエントキシンＩＶ変異体を含む単離された融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグなどのタグでありうる。
【００６０】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なクローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンＩＶ変異体とこうした部分とを結合することもできる。
【００６１】
更なる部分を組み込んだフエントキシンＩＶ変異体は、複数の周知のアッセイによって官能基について比較することができる。例えば、ＰＥＧと結合されたフエントキシンＩＶ変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５のポリペプチド配列を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの少なくとも１つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチジン若しくはＨＡタグなどの周知のタグ配列をコードすることができる。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号２７１、２７２、２７３、２７４及び２７５に示される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００６７】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コードされたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやはり周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、シグナル配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が含まれる。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばクリベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、担子菌類、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はアスペルギルス（Aspergillus）などの真菌細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９などの昆虫細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＣＶ−１、ボーズ（Bowes）メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
【００６９】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも１つの本発明のフエントキシンＩＶ変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、を含む本発明のフエントキシンＩＶ変異体を発現させるための方法である。
【００７１】
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペプチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気下で３７℃で培養することができる。
【００７２】
本発明の方法では、フエントキシンＩＶ変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばＦＡＣＳ若しくは免疫蛍光技術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ若しくはＨＰＬＣの使用により確認することができる。
【００７３】
本発明の別の態様は、生物学的組織中のＮａｖ１．７の活性を調節する方法であって、Ｎａｖ１．７を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンＩＶ変異体又は薬学的に許容されるその塩のＮａｖ１．７調節量と接触させる工程を含む方法である。
【００７４】
治療方法
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療において使用することができる。
【００７５】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
【００７６】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛でありうる。
【００７７】
本明細書で使用するところのＮａｖ１．７介在性疼痛とは、増大したＮａｖ１．７チャネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
【００７８】
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【００７９】
疼痛及び／又はＮａｖ１．７介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパチー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコール依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群（mixed-vascular and non vascular syndromes）、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１以上の原因により生じうる。
【００８０】
ペプチドＮａｖ１．７遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感受性につながる（Ｇｉｎｇｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０１３及び米国特許出願公開第２０１２０１８５９５６号）。この知見は、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬は、皮膚科学的又は炎症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の／突発性の状態などの様々な原因によって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Ｎａｖ１．７は、気道を支配する感覚神経においても発現される（Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｄｅｃ  １；５８９（Ｐｔ  ２３）：５６６３〜７６；Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  １０）が、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレルギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及び吃逆（しゃっくり）による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効でありうることを示唆している。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節上神経節でＮａｖ１．７をインイボで発現停止させると、機械的なプロ−ビングにより誘発させる咳嗽反射はほとんど消失した（Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  １０）。
【００８１】
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、本発明のフエントキシンＩＶ変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００８２】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のＳＮＬ（脊髄神経結紮）ラットモデル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット（Bennett）モデルなどのモデル、並びに米国特許出願第２０１１／０１２４７１１Ａ１号及び米国特許第７，９９８，９８０号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギーナン誘発アロディニア及び（ＣＦＡ）−誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
【００８３】
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明の阻害剤のフエントキシンＩＶ変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
【００８４】
本発明は、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤を使用してＮａｖ１．７介在性疼痛を治療する方法を提供する。本発明は、Ｎａｖ１．７遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び／又は緩和するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、過剰発現しているＮａｖ１．７を使用したインビトロ細胞培養モデルにおいて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニューロンにおいてはＮａｖ１．７に対して有効かつ／又は選択的であるが、こうしたペプチド阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告されている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０９：Ｅ２０１８−２７，２０１２には、ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊されない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが示されており、考えられる説明として、ＰｒｏＴｘ−ＩＩが血液神経関門を通過することができないことによるとされている（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいことが報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４，４９〜６２，２０１３）。
【００８５】
Ｎａv１．７は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）において発現し、最も顕著には侵害受容性小径ＤＲＧニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において発現し、脳ではほとんど見られない。Ｎａv１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
【００８６】
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００８７】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減が含まれる。
【００８８】
一実施形態では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
【００８９】
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛の発生につながる場合があり、したがってＮａｖ１．７のペプチド阻害剤による治療に適している可能性がある。
【００９０】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
【００９１】
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけるＮａｖ１．７のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
【００９２】
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症に伴うものである。
【００９３】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤には、プロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）（配列番号３５６）及びフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（配列番号１）が含まれる。プロトキシンＩＩ変異体（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＰｒｏＴｘ−ＩＩと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１１／００６５６４７号、国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号、及び国際公開第ＷＯ２０１２／００４６６４号に述べられている。フエントキシンＩＶ変異体（ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＨｗＴｘ−ＩＶと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第６１／７０２，５３８号に述べられ、また本明細書に述べられている。
【００９４】
本発明の方法では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は第２のポリペプチドと接合することによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたＦｃ融合タンパク質、又はヒト血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン−セリンリンカーのようなリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では周知のものである。
【００９５】
本発明の方法では、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているＮａｖ１．７のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によって生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をＮａｖ１．７のペプチドと結合させることができる。
【００９６】
更なる部分を組み込んだＮａｖ１．７のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に述べられる方法を用いてそれらのＮａｖ１．７遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における有効性について比較することができる。
【００９７】
Ｎａｖ１．７のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱、及びレイノー病が挙げられる。
【００９８】
医薬組成物
本明細書のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、薬学的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４０  ａｎｄ  ４１）に述べられている。
【００９９】
本発明の方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与される」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
【０１００】
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の局所投与は、μ−コノトキシン、ファミリー１（ＨｗＴｘ様）及びファミリー３（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ様）などのより選択性の低いＮａｖ１．７阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器）又は炎症組織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
【０１０１】
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物には、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマイクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション、ポリマー化合物（ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど）、ビーズ又はリポソームの使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有するヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもできる。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもできる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与されるフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を放出するように設計することができる。フエントキシンＩＶ変異体の吸収を促進するための更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、１乃至複数のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
【０１０５】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路；又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意の投与用（特に液体溶液若しくは懸濁液の形の）、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又は舌下投与用；又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ送達システム（皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能とする薬剤を含む（国際公開第９８／５３８４７号））（又はエレクトロポレーションなどの一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電した薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号））の形の経皮投与で使用するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
【０１０６】
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（timed-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。
【０１０７】
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ（すなわち重量にして約０．５％未満、通常、１％又は少なくとも１％〜１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％まで）、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻すことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
【０１０８】
本発明の例示の医薬組成物は、約ｐＨ  ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ  ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
【０１０９】
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のことを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件として、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護師、獣医、又は獣医学技術者）によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１１０】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌのリンゲル液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。
【０１１１】
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
フエントキシンＩＶの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）の毒に由来する野生型フエントキシンＩＶ（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ：配列番号１）内のすべての非システイン残基にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを置換した一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンＩＶ変異体を、以下のＮ末端からＣ末端までのフォーマットで、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質としてコードした。すなわち、Ｈｉｓ6−ＨＳＡ−（ＧＧＧＧＳ）4−ＨＲＶ３Ｃ切断部位−フエントキシンＩＶ変異体。すべての変異体ペプチドは、ＨＳＡからの切断後、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰ、及び内因性のアミド化認識配列であるＣ末端ＧＫを有していた。一位置変異体を、ベラトリジン誘導膜電位を阻害する各変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験し、Ｑｐａｔｃｈによる電気生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現させたフエントキシンＩＶ変異体のＣ末端ＧＫ残基も置換した。
【０１１３】
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、及びＧ３６Ｉを組み合わせ（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ５）、他方がＮ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒを組み合わせた（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ６）ものである２つのコンビナトリアルライブラリーを生成した。
【０１１４】
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡを、米国特許第６，５２１，４２７号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳した。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンＩＶ変異体を発現させる前に配列を確認した。
【０１１５】
タンパク質の発現
２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中で維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、フエントキシンＩＶ変異体をコードしたプラスミドを、標準的なプロトコールにしたがってＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）トランスフェクション試薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃及び８％  ＣＯ2に設定した加湿したインキュベーター内に１２５ＲＰＭで振盪しながら４日間置いた５，０００Ｇで１０分間遠心することにより細胞から上清を分離し、０．２μｍフィルターで濾過し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離機１０Ｋ（カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して３，７５０Ｇで約１０分遠心して１０倍及び５０倍に濃縮した。
【０１１６】
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンＩＶ変異体タンパク質を１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare））を使用してＩＭＡＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３、１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断されたペプチドを、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｎ０）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、ＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍結乾燥した。
【０１１７】
凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ  ７．４）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。（２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってペプチドを分析した。
【０１１８】
スケールアップを行うため、タンパク質を５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）、カタログ番号１７−５２４８−０２）を使用してＩＭＡＣで精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ又はＦＰＬＣを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮装置（ミリポア社（Millipore）、カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号１４１９０）を２回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、ＨＲＶ３Ｃ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３；１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断された融合タンパク質を、５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムを使用してＩＭＣにより精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｎ０）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。
【０１１９】
各ピーク画分は、分析用Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｅ０）を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Ｗａｔｅｒｓシステムにより電気スプレーイオン化質量分析によって分析した。
【０１２０】
実施例２．フエントキシンＩＶ変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Ｎａｖ１．７のアゴニストであるベラトリジン（３−ベラトイルベラセビン；バイオモル社（Biomol）、カタログ番号ＮＡ１２５）により誘導される膜脱分極を阻害する作製されたフエントキシンＩＶ変異体の能力を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上で、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（インビトロジェン社（Invitrogen）、Ｋ１０１８）を電子受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）（シグマ社（Sigma））を供与体として使用し、供与体を３９０〜４２０ｎｍで励起し、５１５〜５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することにより、ＦＲＥＴアッセイ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いて測定した。
【０１２１】
Ｇ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen）による選択下で、ｈＮａｖ１．７チャネルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、グルタミン、１０％  ＦＢＳ、１％  ＮＥＡＡ、及び４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。５０μｌの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした３８４ウェルの黒い透明底プレートに２５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。プレートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした後、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で４回洗浄し、２５μｌのアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に再懸濁した。ＰＴＳ色素の２倍ストック（６μＭ）を、ＤＭＳＯに加えた１０％プルロニックＦ１２７に色素を１：１の比（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって調製した。２５μｌの２倍ＰＴＳ１８ストックをウェルに加えて細胞を３０分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で洗い流した。
【０１２２】
フエントキシンＩＶペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、１０μＭのＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭのＶＡＢＳＣ−１を含むアッセイ緩衝液（シグマ社（Sigma）、カタログ番号２０１９８７）中に最終濃度の３倍の濃度で懸濁した。２５μｌ／ウェルの懸濁したフエントキシンＩＶペプチドを、各ウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジン（２５μｌ／ウェルの７５ｍＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導し、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の低下をアゴニストを添加した３０秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを加えた後、それぞれの測定したフエントキシンＩＶペプチドを１．３倍に希釈し、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、ＴＴＸ、プロトキシンＩＩ、及びフエントキシンＩＶは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール（アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応）及びポジティブコントロール（１０μＭのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応）にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率（％）に変換した。
【０１２３】
測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一度補正（spatial uniformity correction）」（すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する）及び「バイアス値を減ずる（subtract bias value）」（初期開始強度を各トレースから減ずる）を、オンにした。
【０１２４】
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイントは個々のウェル内での反応を表している。
【０１２５】
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（マイクロカル社（Microcal））を使用してヒル関数（Hill function）に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からＩＣ50値を外挿した。
【０１２６】
ポジティブ（Ｐ±ｄＰ）及びネガティブ（Ｎ±ｄＮ）コントロールの平均及び標準偏差を用いて、反応（Ｒ）を有するウェル内の遮断（Ｂ）の量を以下のように計算した。
【化１】
2019107017.tif 000002
【０１２７】
スクリーニング窓（データ品質の尺度）は下記のように定義される。
【化２】
2019107017.tif 000003
【０１２８】
アッセイプレートは、（１）コントロールに基づくスクリーニング窓がｚ’＞０．５であり、かつ（２）その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴の平均の±０．５ｌｏｇ単位の範囲内にあれば、可とした。
【０１２９】
フエントキシンＩＶ変異体の選択性を、約８．３５μＭのベラトリジンの最終濃度（２５μｌ／ウェルの２５μＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導した点以外は、Ｎａｖ１．７について述べたようにＧ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen））による選択下でｈＮａｖ１．２チャネルを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を使用してＮａｖ１．２誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選択性を、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比として測定した。
【０１３０】
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭのＮＥＡＡ（試薬はすべてインビトロジェン社（Invitrogen）より入手）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）中で培養した。細胞は３７℃で５％  ＣＯ2内に維持し、約７０〜９０％コンフルエンスに達した時点でアッセイを行った。ＱＰａｔｃｈ（ソフィオン社（Sophion））で試験するのに先立って、細胞を最初に０．０５％トリプシン（３７℃で５分間）を使用して解離させ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies））に再懸濁し、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により１〜２×１０6／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ  ＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実験に使用した。
【０１３１】
ギガオームシール形成及びホールセル（全細胞）パッチクランプ記録用に、細胞外液は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
【０１３２】
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。−７５ｍＶの保持電位から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させた後、保持電位（−７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合、細胞を−７５ｍＶに保持した。
【０１３３】
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの細胞外液の供給（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を含むか又は含まないもの、１μＭのＴＴＸを含みＢＳＡを含まない最後の供給を除く）を、記録される細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした（５μｌ）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、試験化合物を含むもの（３つの供給すべてについて同じ化合物を同じ濃度で）か又はコントロール緩衝液とした（コントロール細胞のみ）。これらの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた、３つの１０μｌの小供給からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得た。
【０１３４】
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として正規化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５〜６個の）細胞の平均の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の２つのこうした値の平均の値（すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率（％）の値）を、濃度反応計算に使用した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±ＳＥとして表した。
【０１３５】
参照化合物では、このプロトコールを用いてＱＰａｔｃｈから得られた結果（例えば有効性／動態）は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
【０１３６】
結果
１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得られたＮａｖ１．７に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図１に示す。１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得られたＮａｖ１．２に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図２に示す。一置換変異体のＮａｖ１．７について得られたＩＣ50に対するＮａｖ１．２について得られたＩＣ50の比として測定される選択性を、図３に示す。図４及び５は、Ｎａｖ１．７（図４）又は選択性（図５）に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
【０１３７】
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエントキシンＩＶ及びフエントキシンＩＶ変異体を、上記に述べたＱＰａｔｃｈアッセイを用いてＨＥＫ２９３細胞で安定的に発現しているＮａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して試験した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Ｎａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して各フエントキシンＩＶ変異体について得られたＩＣ50値を図６に示す。フエントキシンＩＶの選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたＩＣ50値を用いて上記に述べたようにして計算した。
【０１３８】
フエントキシンＩＶを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリアルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒ（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が含まれ、これらはいずれも有効性、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、Ｒ２６Ｗ（配列番号７２）、Ｋ２７Ｗ（配列番号５７）、Ｑ３４Ｆ（配列番号６）、及びＲ２９Ｗ（配列番号５５）が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定された変異体（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ）（配列番号５）、（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１６）、（Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号４８）、（Ｅ１Ｎ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号８３）、（Ｎ１３Ｑ，Ｒ２９Ｋ，Ｋ３７Ｒ）（配列番号１３７）、（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１９２）及び（Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ）（配列番号４６）は向上した有効性及び／又は選択性を示した。
【０１３９】
実施例３．ラットにおける足底投与後のフエントキシンＩＶの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が３００ｇよりも大きい雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を使用した。実験に使用されていない動物を、試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができるように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾値を５００ｇに設定したランダール・セリット装置（Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置、無痛覚計）内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１〜３回の連続した試験を、５〜２０分間隔で行った。
【０１４０】
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点（５、１０、２０、３０、４５、６０分）で１回の試験を行い、記録した。
【０１４１】
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンＩＶ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）を、凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２〜３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
【０１４２】
データ分析
グラム（ｇ）の閾値を記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣをそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントＴ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。
【０１４３】
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３及び３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図７）。ＡＵＣは、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図８）。フエントキシンＩＶの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラットでは同様の浮腫は認められなかった。
【０１４４】
実施例４．フエントキシンＩＶのＮａｖ１．７との相互作用の分子モデリング
ＮＭＲによる構造決定
すべてのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００、７００、又は９５０ＭＨｚ分光計を使用して行った。ペプチドを、１０％  Ｄ2Ｏを含む水性緩衝液に溶解した。緩衝液は、２０ｍＭリン酸塩、０．１ｍＭのｄＥＤＴＡ、及び０．００２％  ＮａＮ3を用いてｐＨを６．７に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて２９８Ｋで得た。個々の残基のスピン系は、ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．１９８５，６５，３５５〜３６０）を用い、スピンロック（ＭＬＥＶ）を混合時間７５ｍｓで用いて割り当てた。混合時間１５０ｍｓで得られたＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７９，７１，４５４６〜４５５３；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８０，９５，１〜６）実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15Ｎ−ＨＳＱＣ（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９８０，６９，１８５〜１８９）実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方法（Ｃａｖａｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  １９９５  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて13Ｃ−ＨＳＱＣスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル２乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ６，２７７〜２９３，１９９５）を用いてフーリエ変換を行った。
【０１４５】
ＮＯＥＳＹスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導出し、ＣＹＡＮＡ（Ｇｕｎｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２８３〜２９８，１９９７）により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意な（＞０．２ｐｐｍ）環電流異方性を示したＷ３２を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘束を適用した。アプリケーションとしてＰＲＥＤＩＴＯＲ（Ｂｅｒｊａｎｓｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２００６，３４，Ｗ６３−Ｗ６９）及びＤＡＮＧＬＥ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．２０２，２２３〜２３３，２０１０）を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バックボーンの角ωの拘束を１８０°に設定した。ＮＯＥＳＹ及び13Ｃ−ＨＳＱＣ実験より導出されたデータに基づき、Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ２〜Ｃ１７、及びＣ１６〜Ｃ３１の間のジスルフィド結合を固定した。
【０１４６】
ペプチドの相同性モデルをＣＹＡＮＡへの入力（サイクル１）として用いた後、６サイクルの複合自動ＮＯＥＳＹ割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフォーマー１つ当たり１００００回のねじれ角ダイナミクスステップの後、５０００回のエネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを用いて１０００個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する２０個のコンフォーマーのアンサンブルを、ＭＯＥ（ケミカル・グルーピング・コンピューティング社（Chemical Computing Group Inc.）ｗｗｗ：／／＿ｃｈｅｍｃｏｍｐ＿ｃｏｍ）を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入力した。
【０１４７】
分子動力学
天然ＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ  １ＭＢ６からの構造）を、分子動力学シミュレーションを使用してＨｗＴｘーＩＶの安定性の特性評価を行うための開始点として用いた。天然のＨｗＴｘ−ＩＶのシミュレーション以外に、３つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、１個のアラニンの点突然変異によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。３つのジスルフィド結合の重要度を特性評価するため、Ｃ２〜Ｃ１７、Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ１６〜Ｃ３１、Ｃ２〜Ｃ１７／Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ２〜Ｃ１７／Ｃ１６〜Ｃ３１、Ｃ９〜Ｃ２４／Ｃ１６〜Ｃ３１及びＣ２〜Ｃ１７／Ｃ９〜Ｃ２４／Ｃ１６〜Ｃ３１のシステインを個々のシステイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション（全部で７つのシミュレーション）を行った。１個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力学アラニンスキャン（すべての非システイン位置の）を行った（全部で２８のシミュレーション）。
【０１４８】
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、ＨｗＴｘーＩＶをエクスプリシット水（最小で１２オングストロームのパッディング）に溶媒和させ、０．１Ｍ  ＮａＣｌに中和した。ＮＡＭＤ  ２．８（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１７８１〜１８０２，２００５）を使用してタンパク質を最小化し、５０ｎｓで平衡化した。ＣＨＡＲＭＭ  ２２  ＣＭＡＰ（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ２５：１４００〜１４１５，２００４）パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピングアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を１ｆｓ毎に計算し、短距離の非結合相互作用を２ｆｓ毎に計算し、長距離の相互作用を４ｆｓ毎に計算した。長距離の静電気力は、格子間隔を１オングストローム未満とした粒子メッシュのＥｗａｌｄ合計法を用いて評価した。温度は、Ｌａｎｇｅｖｉｎ動力学を用いて２７℃（３００Ｋ）に維持し、Ｎｏｓｅ−Ｈｏｏｖｅｒ  Ｌａｎｇｅｖｉｎピストンを用いて０．１ＭＰａ（１ａｔｍ）の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフティングを８オングストロームで開始し、完全なカットオフを１２オングストロームとして、スケーリングした１〜４排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力学軌道を、主鎖のα炭素原子（ＣＡ）に基づいて整列させ、残基当たりの２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）を、Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１９９６，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．３３〜３８）を使用して初期ＮＭＲ構造に対してシミュレーション全体にわたって計算した。
【０１４９】
Ｎａｖ１．７の相同性モデリング及びＨｗＴｘ−ＩＶのドッキング
Ｎａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）のセグメントＳ１〜Ｓ４の相同性モデルを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．１（アクセルリス社（Accelrys））のＭｏｄｅｌｌｅｒコンポーネントを使用し、ＮａｖＡｂ構造（アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter
butzleri）由来の電位依存性Ｎａ（＋）チャネル；構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ  ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ  ３ＲＶＹにある。）をテンプレートとして構築した。次いでこのモデルを、更にリファインして静止状態のＮａｖ１．７の構造を生成した。Ｓ４をマニュアルで静止状態のコンフィギュレーションに動かし、Ｓ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４ループを再形成して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のＨｗＴｘ−ＩＶを、Ｎａｖ１．７に対するＨｗＴｘ−ＩＶ阻害のアラニンスキャンの結果、及びＨｗＴｘ−ＩＶの結合を生じる、文献に開示されるＮａｖ１．７突然変異（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１〜１０，２０１１．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  ９．）に基づき、マニュアルでＮａｖ１．７相同性モデルにドッキングさせた。
【０１５０】
マニュアルでのドッキング後、ＨｗＴｘ−ＩＶシステムがドッキングされたＮａｖ１．７  ＤＩＩ  Ｓ１〜Ｓ４全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーションを、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用し、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ  Ｉｍｐｌｉｃｉｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｓｐａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０６，８７２６〜８７３８，２００２）により行って、ドッキングした構造を更にリファインした。
【０１５１】
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性（Ｆ６Ａ、Ｐ１１Ａ、Ｄ１４Ａ、Ｌ２２Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｙ３３Ａ）又はチャネル選択性（Ｋ１８Ａ、Ｒ２６Ａ及びＫ２７Ａ）の顕著な喪失につながるＨｗＴｘ−ＩＶ突然変異の活性の変化の分子的機序の理解を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造（ｐｄｂコード１ＭＢ６）を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に５０ｎｓの分子動力学シミュレーションを行った。
【０１５２】
天然のＨｗＴｘ−ＩＶペプチドの平均のＣＡ  ＲＭＳＤはわずかに１．００７オングストロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレーションは、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）（通常、π−π相互作用を形成する）、及びＬ２２Ａ（図９ｅ）のみが、ＨｗＴｘ−ＩＶのコア安定性に影響することを示した。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなかった。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにＮａｖ１．７及びＮａｖ１．１に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）及びＬ２２Ａ（図９ｅ）は、ループ３及び４の柔軟性を増大させ、Ｋ３２Ａ（図９ｈ）は、ループ３の柔軟性を増大させ、Ｄ１４Ａ（図９ｄ）及びＰ１１Ａ（図９ｃ）は、ループ２の柔軟性の顕著な増大を示した。Ｋ２７Ａ（図１０ｃ）及びＲ２６Ａ（図１０ｂ）は、ループ４の柔軟性を増大させることが判明した。Ｋ１８Ａ（図１０ａ）及びＳ２５Ａ（図９ｆ）突然変異は、いずれのループの柔軟性にも影響しなかった。
【０１５３】
ＮＭＲ
ＨｗＴｘ−ＩＶの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーションの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えＷＴ（野生型）ＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造を決定し、これをＷ３０Ａ及びＫ３２Ａの構造と比較した。
ＱＰａｔｃｈ及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず（分子動力学シミュレーションとは概ね一致したが）、Ｗ３０Ａ及びＫ３２Ａは、ＷＴ組み換えフエントキシンＩＶと同様の全体的構造を示した。陽子間ＮＯＥＳＹ及び主鎖化学シフト値は、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有しているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これらの差異には、Ｋ３２Ａ及び野生型ペプチドのＷ３０の半径５オングストローム内に強い環電流異方性が認められることが含まれる。Ｆ６及びＴ２８に最も大きく影響するこうした異方性は、βターンのコンフォメーション／動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接した空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局所的な差異として、Ｋ３２のプロトン化されたアミンと、Ｗ３０Ａ及び野生型ペプチドに利用可能なＹ３３の電子との間の潜在的なカチオン−π相互作用を示唆している。これらの局所的な差異に関与する５つの残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２、Ｙ３３の側鎖は、すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Ｎａｖ１．７と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
【０１５４】
相同性モデリング及びドッキング
ＨｗＴｘ−ＩＶとＮａｖ１．７チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、Ｎａｖ１．７ドメインＩＩ（ＤＩＩ）の電圧センサードメイン（ＶＳＤ；セグメントＳ１〜Ｓ４）の相同性モデルを、ＮａｖＡＢをテンプレートとして構築した。取得可能なＳＡＲデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１〜１０，２０１１．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  ９．）を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、ＨｗＴｘ−ＩＶペプチドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
【０１５５】
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、ＨｗＴｘ−ＩＶが、Ｓ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４ループと（詳細には残基Ｅ７５３、Ｅ８１１、Ｄ８１６及びＥ８１８と）の相互作用によってＤＩＩ電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたドッキングした構造を図１２に示すものであり、疎水性パッチが、Ｗ３０及びＦ６と、Ｎａｖ１．７のＳ１−Ｓ２ループ及びＳ３−Ｓ４ループによって形成される溝の内部を向いた塩基性のＫ３２残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、Ｗ３０及びＦ６の疎水性パッチが、対応する疎水性残基Ｍ７５０を有するチャネル溝と相互作用することになる。Ｓ１−Ｓ２ループ及びＳ３−Ｓ４ループの端に沿った荷電相互作用により、ＨｗＴｘ−ＩＶは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、Ｓ１−Ｓ２ループ上で、ＨｗＴｘ−ＩＶ及びＮａｖ１．７チャネルのＫ７−Ｅ７５３及びＥ４−Ｋ７６２間でそれぞれ電荷−電荷相互作用が生じる。同様に、ＨｗＴｘ−ＩＶとＳ３−Ｓ４  Ｎａｖ１．７ループとの間で一連の電荷−電荷相互作用、すなわち、Ｒ２６−Ｄ８１６、Ｋ２７−８１８、及びＫ３２−Ｅ８１１も生じる。
【０１５６】
実施例５
更なるフエントキシンＩＶ変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンＩＶ変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）に基づいて２つのグラフティングライブラリーを生成した。
【０１５７】
実施例２に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例２に述べたようにしてＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃｈを使用してＩＣ５０値を測定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。
【０１５８】
変異体ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）が、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示し（図５）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグラフトした（Ｎａｖ１．７  ＩＣ５０＞０．０５μＭ）。ＮＶ１Ｇ３８７のライブラリー設計を表１に示す。
【０１５９】
【表１】
2019107017.tif 000004
【０１６０】
変異体ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）は、高い有効性を示し（図４）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした（この実験ではＮａｖ１．２と比較して５倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない）。ＮＶ１Ｇ３２７のライブラリー設計を表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2019107017.tif 000005
【０１６２】
図１３Ａは各配列を示し、図１３Ｂは、ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）スカフォールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場合を除き、ｎＭで表したＩＣ50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド濃度で得られた阻害率（％）を示した。
【０１６３】
図１４Ａは各配列を示し、図１４Ｂは、ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）スカフォールドに基づいた突然変異体の特性を示す図１４Ｂの値は、図１３Ｂと同様である。
【０１６４】
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンＩＶ変異体は、向上した選択性を示し、かつ／又は以下の変異体を含む。
【０１６５】
＞ＮＶ１Ｇ５５９
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＦＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ（配列番号２７７）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＫ２１Ｆでグラフトした）
【０１６６】
＞ＮＶ１Ｇ５６６
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＮＫＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ（配列番号２７８）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＳ２０Ｎでグラフトした）
【０１６７】
＞ＮＶ１Ｇ６１１
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＤＫＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ（配列番号２７９）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＲ２６Ｄでグラフトした）
【０１６８】
＞ＮＶ１Ｇ６１２
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＨＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ（配列番号２８０）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＫ２７Ｈでグラフトした）
【０１６９】
実施例６．Ｎａｖ１．７阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
３種類のＮａｖ１．７遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウスモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１，２００２）、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４７３４〜４７，２００２）及びコノトキシンＫＩＩＩＡ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  ２８２（４２）：３０６９９〜７０６）である。ＨｗＴｘ−ＩＶ及びＫＩＩＩＡは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソフォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることからこれらのペプチドは局所投与した。これら３種類のペプチドのＮａｖ１．７遮断の強さの順序は、ＰｒｏＴＸ−ＩＩ＞ＨｗＴＸ−ＩＶ＞ＫＩＩＩＡである。
【０１７０】
動物．雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を、約１９０〜２００ｇで注文し、３００ｇよりも大きくなった時点で使用した。
【０１７１】
材料の調製及び後足への局所投与．アミド化したフエントキシンＩＶ（ペプチド・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイビル）、プロトキシンＩＩ（株式会社ペプチド研究所、日本）又はＫＩＩＩＡを凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して−２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２〜３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
【０１７２】
ランダール・セリット試験
Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置（無痛覚計）を、最大閾値を５００ｇに設定して使用した。
【０１７３】
訓練．文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１〜３回の連続した試験を、５〜２０分間隔で行った。
【０１７４】
試験．ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行った（すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際）。注射後の各時点（５、１０、２０、３０、４５、６０、及び１２０分）で１回の試験を行い、記録した。反応は、訓練の際の反応と同様に定義した（上記の訓練の項を参照）。
【０１７５】
データ分析．グラム（ｇ）の閾値を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを互いに平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントｔ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。１２０分における反応は示しておらず、ＡＵＣの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び５〜６０分の値（Ｐｒｅ）を用いた。
【０１７６】
結果．足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３ｎｍｏｌ（図１５Ａ）及び３０ｎｍｏｌ（図１５Ｂ）のフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図示せず）。曲線下面積（ＡＵＣ）（図１５Ｃ）は、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）。
【０１７７】
足の背面に局所投与したプロトキシンＩＩは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。０．３ｎｍｏｌ（図１６Ａ）、３ｎｍｏｌ（図１６Ｂ）、及び３０ｎｍｏｌ（図１６Ｃ）のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。ＡＵＣは０．３ｎｍｏｌと３ｎｍｏｌ用量との間を除いて有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図２Ｄ）。
【０１７８】
両方の用量（３及び３０ｎｍｏｌ）で足の背面に局所投与されたＫＩＩＩＡでは、ランダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に有意ではなかった。２つの用量から得られたＡＵＣの間に有意差は認められなかった（図示せず）。
【０１７９】
この実験の結果は、ＰｒｏＴｘ−ＩＩ及びＨｗＴｘ−ＩＶが急性侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。ＫＩＩＩＡは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッセイにおける活性の順序（ＰｒｏＴＸ−ＩＩ＞ＨｗＴＸ−ＩＶ＞ＫＩＩＩＡ）は、インビトロでのＮａｖ１．７遮断の順序と一致し、このことは、Ｎａｖ１．７遮断が鎮痛活性に寄与した可能性を示唆するものである。
【０１８０】
実施例７．ＰｒｏＴｘ−ＩＩの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
動物試験開始時点において体重２４０〜２９５ｇ（平均／標準誤差：２８０．２±３．３）の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット。
【０１８１】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて５〜７秒間保持した８段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．４、０．６、１．０、２．０、４．０、６．０、８．０、及び１５．０ｇ；ストールティング社（Stoelting）、イリノイ州ウッドデール）から罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求めた。ラットは、試験に先立って１０分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
【０１８２】
熱性アロディニア試験
ＣＦＡ投与の前後に熱足刺激装置（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ装置、カリフォルニア州立大学サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して放射熱に対する足閾値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約８〜１２秒の潜時の範囲（平均約１０秒）となるように放射熱の利得及び強度を設定した。カットオフ値は、装置により２０秒に設定した。各時点で、同じ足について３つの別々の測定値を、各動物で約５分間隔で得て、互いに平均化した。
【０１８３】
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）のエマルションを、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、１００μＬのエマルションを左後足に皮下注射した。ＣＦＡ注射後１２日目に、同側の足に、１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に加えた３０ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）のいずれかを注射した。
【０１８４】
データ分析．データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
【０１８５】
結果
接触性アロディニアの閾値（図１７Ａ）及び熱性アロディニアの潜時（図１７Ｂ）は、５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した。足底内投与したプロトキシンＩＩでは、注射後３０及び６０分後に、溶媒注射動物と比較して触覚閾値が有意に増加した。
【０１８６】
実施例８．ＰｒｏＴｘ−ＩＩの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
動物．試験開始時点において体重２４〜３１ｇ（平均／標準誤差：２７．５±０．３）の雄性Ｃ５７／ｂｌ６マウスを使用した。
【０１８７】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１．０、２．０及び４．０ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求めた。マウスは、試験に先立って１日につき約１時間、２日間にわたり、更に、各試験日には試験に先立って３０分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
【０１８８】
単関節炎モデル誘発
５０％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）に対して、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比となるようにエマルションを調製した（溶媒処理群には０．９％生理食塩水のみを投与した）。１００％  ＣＦＡについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないＣＦＡを注射し、コントロール動物には０．９％生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、５０μＬハミルトン注射器及び２５ゲージの針を使用して２０μＬを左後足に皮下注射した。
【０１８９】
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。ＣＦＡ注射後３日目に、ガバペンチン（１５０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）又は溶媒（滅菌水；ｎ＝６）のいずれかを、このモデルにおいて周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与（４ｍＬ／ｋｇ）し、触覚閾値の変化について評価した。６日間のウォッシュアウト期間の後（ＣＦＡ後９日目）、同じ動物を、３ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）を左のＣＦＡ処理した足の足底内に投与して試験した。
【０１９０】
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ6／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実験に使用した。
【０１９１】
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。−７５ｍＶの保持電位から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させた後、保持電位（−７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合、細胞を−７５ｍＶに保持した。
【０１９２】
ギガオーム（ＧΩ）シール形成用に、細胞外液は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
【０１９３】
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス（溶媒又はペプチド投与したもの）から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し（１０〜１０００倍）、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と同じものとした。
【０１９４】
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの血漿含有細胞外液の供給（血漿を含まない細胞外液に１μＭのＴＴＸを含む最後の供給を除く）を、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給（５μｌ）は、コントロール血漿のみを含むものとした（血漿含有緩衝液）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、溶媒又はペプチド投与したマウスから得た血漿（コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した）か、又はコントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロールとして、既知濃度（３００μＭ）の合成プロトキシンＩＩを１０倍に希釈したコントロール血漿含有緩衝液に加え（スパイク）、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液（すなわち３０、１００、３００及び１０００倍に希釈した血漿含有緩衝液）中でコントロールペプチドのより低い濃度（すわち３、１０、３０、及び１００倍希釈濃度）を得た。これら３つの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた３つの１０μｌの小適用からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得た。
【０１９５】
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として標準化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５〜６個の）細胞（試験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの）の平均の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後（すなわち全体の４番目）の血漿の供給の最後の２つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与マウスから得たもの）緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベルを、ＰｒｏＴｘ−ＩＩのスパイクした（既知の）濃度の存在下での（希釈した）コントロール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない血漿中のＰｒｏＴｘ−ＩＩ濃度を計算した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±標準誤差として表した。
【０１９６】
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表３に示す。血漿濃度は、２つのより低い用量ではすべての時点で検出限界（約５ｎＭ）を下回った。血漿濃度は、より高い用量では５０〜８３ｎＭであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様であった（２日間以内に安定状態に達したことを示唆する）。すべての用量はよく忍容され、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
【０１９７】
【表３】
2019107017.tif 000006
【０１９８】
ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、マウスにおいて最大で４５．６ｕｇ／日まで、７日間にわたってよく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは、疼痛実験において５倍高い用量（２２８μｇ／日）を評価することとした。
【０１９９】
実施例１０．ミニポンプを使用したＰｒｏＴｘ−ＩＩの投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物．この実験では、チャールズ・リバー社（Charles River）より注文した雄性Ｃ５７Ｂｌ／６系マウスを使用した。
【０２００】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２及び４ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム（ｇ）で記録した。マウスは、試験に先立って３０分間、金網に慣らした。１００％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
【０２０１】
熱性（ハーグリーブズ（Hargreaves））アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐａｉｎ，３２：７７〜８８；Ｄｉｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３〜１９１）。この箱は、一定温度（２８℃）に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球から与えられ、刺激は、カットオフ時間２０秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全体を通して一定のアンペア数を使用することで、５分間隔で計測した３つの計測値について平均した場合に約８〜１２秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を１０分間、硝子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時（ＰＷＬ）を秒単位で記録した。
【０２０２】
ＣＦＡ
動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、２０μＬの１００％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）を、１ｍＬ注射器に取り付けた２５ゲージの針を使用して左後足に皮下注射した。
【０２０３】
試験化合物
プロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International））をＤＰＢＳ中（カルシウム及びマグネシウムを含まないもの）で９．５ｍｇ／ｍＬのストック濃度で配合した。
【０２０４】
ミニポンプ
アルゼット（Alzet）マイクロ浸透圧ミニポンプ（デュレクト社（Durect Corporation）モデル１００３Ｄ）を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウス体内への移植後、３日間にわたって１．０μｌ／時で投与した。ポンプ及びその流量調節要素（フローモデレーター）を最初に秤量し、次いで２７ゲージの先の丸い針が取り付けられた１ｍＬのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量（空の重さ及び充填時の重さ）を記録して、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の９０％を充填体積が超えるようにした（使用説明書によれば９２μＬ）。次いでポンプを、０．９％生理食塩水で充填した１５ｍＬ円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って３７℃に５〜６時間置いた。
【０２０５】
ミニポンプの埋め込み
マウスに２０μｌの０．３ｍｇ／ｍｌブプレネックスを投与した後、イソフルランにより麻酔（誘導５％、維持２％）を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、７ｍｍのステープルを使用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
【０２０６】
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（接触性）及び平均の潜時（熱的）を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
【０２０７】
手順
動物を、フォンフライ（Von Frey）スタンド及びハーグレーブズ（Hargreaves）ボックスで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド／ボックス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接触性（フォンフライスタンド）及び熱性（ハーグレーブズ）の両方で試験した。試験前閾値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、２０μＬの１００％ＣＦＡを左後足に注射した。動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方でベースライン測定値について試験して、ＣＦＡが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「１日目」、「２日目」、及び「３日目」の接触性及び熱性閾値を測定した。３日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料を得た。
【０２０８】
血漿ＰｒｏＴｘ−ＩＩを実施例９で述べたようにして決定した。ＰｒｏＴｘ−ＩＩの平均濃度は２２４μＭであった。
【０２０９】
結果
ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、浸透圧ミニポンプによる２２８μｇ／日の持続的投与後、炎症性疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値（図１９Ａ）及び熱閾値（図１９Ｂ）は、ＰｒｏＴｘ−ＩＩ処理動物において有意に増加した。これらの観察結果は、２つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８；Ｈａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９：Ｅ２０１８−２７）と対照的に、これらのデータは、Ｎａｖ１．７選択的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を与えることを示すものである。
【０２１０】
ミニポンプにより投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩの効果を、神経因性疼痛のモデルである神経部分損傷を有するマウスにおいて接触性（フォンフライ）疼痛アッセイで評価した。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、浸透圧ミニポンプによるＰｒｏＴｘ−ＩＩの２２８μｇ／日の持続的投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４（１）】
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【図４（２）】
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【図４（３）】
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【図４（４）】
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【図４（５）】
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【図４（６）】
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【図４（７）】
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【図４（８）】
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【図４（９）】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図５（３）】
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【図６（１）】
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【図６（２）】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2019107017.tif 000053
【配列表】
2019107017000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月29日(2019.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先の出願との相互参照）
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７８１，２７６号、及び２０１２年９月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７０２，５３８号に基づく利益を主張する２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８３３，５５５号、及び２０１２年５月１８日出願の米国特許仮出願第６１／６４８，８７１号に基づく利益を主張するものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、フエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により疼痛を緩和する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-gated sodium channel）（ＶＧＳＣ）は、心筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在している。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系における電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんかん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ５：５８９〜６０２，２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ−Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ２１：１０７〜１５，２０１０）、筋緊張（Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅａｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０：８０〜３，２０１０）、及び疼痛（Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５８８：１８９７〜９０４，２０１０）を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えられている（Ｈｕｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１：２４３５〜４５，２００２）。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）αサブユニットのファミリーの９つの周知のメンバー、Ｎａｖ１．１〜Ｎａｖ１．９、がヒトに存在する。このＮａｖ１．ｘサブファミリーは、薬学的にテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性又はＴＴＸ抵抗性に細分化することができる。Ｎａｖ１．７（ＰＮ１、ＳＣＮ９Ａ、又はｈＮＥとも呼ばれる）はＴＴＸ感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Ｎａｖ１．７は、神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルとして機能する。
【０００５】
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状態に関係している。ヒトでは、Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症（ＰＥ）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４１：１７１〜４，２００４）、及び発作性激痛症（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４，２００６）と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の症状緩和を与えることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ−Ｃｒｅｓｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  １３０：４２９〜３３，２００３；Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ５２：７６７〜７４，２００６）。
【０００６】
ヒトにおけるＳＮＣ９Ａの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）を引き起こす（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４４：８９４〜８，２００６；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ７１：３１１〜９，２００７；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １６：２１１４〜２１，２００７）。
【０００７】
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトＮａｖ１．７のＲ１１５０Ｗの置換を生じる多型性ｒｓ６７４６０３０は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている（Ｒｅｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：５１４８〜５３，２０１０）。Ｒ１１５０Ｗ  Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンは、脱分極に反応して増大した発火頻度を示す（Ｅｓｔａｃｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６６：８６２〜６，２００９）。線維筋痛症の機能障害型の１つが、ＳＣＮ９Ａのナトリウムチャネルの多型性ｒｓ６７５４０３１との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している（Ｖａｒｇａｓ−Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  １３：２３，２０１２）。
【０００８】
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の欠失が、機械性及び熱性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる（Ｎａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１２７０６〜１１，２００４）。すべての感覚ニューロンでＮａｖ１．７遺伝子の発現を停止させることにより、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの両方でＳＣＮ９Ａを欠失させることで、機械性、熱性及び神経因性疼痛が消失し、ＳＣＮ９Ａの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型が再現された（Ｍｉｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３：７９１，２０１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の治療に有用となりうる。
【０００９】
クモ毒には、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１，２００２）、プロトキシンＩ、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４７３４〜４７，２００２）、及びフリクソトキシンＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６９：４１９〜２９，２００６）を含む多くのナトリウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ（Ornithoctonus huwena））より得られるフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）は、Ｎａｖ１．７及び他のＴＴＸ感受性電位依存性ナトリウムチャネルの強力な遮断薬であり、ドメインＩＩの電位センサーを内向きの閉じたコンフォメーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３：２７３００〜１３，２００８）。プロトキシンＩＩは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を示すことを目的とした様々なｉｎ  ｖｉｖｏ実験の対象となっているが、これらの実験のいずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンＩＩの作用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）又はタイトジャンクションタンパク質であるクラウジンＩの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入（Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０９：２９  Ｅ２０１８−２７，２０１２）によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬を特定することが求められている。詳細には、他のＶＧＳＣのアイソフォームよりもＮａｖ１．７に対して高い選択性を有する新規なＮａｖ１．７遮断薬が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、フエントキシンＩＶ変異体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の単離されたフエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００２０】
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は末梢投与される。
【００２１】
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤はプロトキシンＩＩ又はフエントキシンＩＶ又はそれらの変異体である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。図１ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図１ｂ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。図１ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図２ａ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。図２ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図２ｂ】指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。図２ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図３ａ】生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。図３ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図３ｂ】生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。図３ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。
【図４】Ｎａｖ１．７に対するＥＣ50が３００×１０-9ＭであるフエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。
【図５】ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比を用いて評価した、Ｎａｖ１．２よりもＮａｖ１．７に対して少なくとも５倍高い選択性を有する、（Ｎａｖ１．２に不活性である）フエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。
【図６】ホールセル（全細胞）パッチクランプアッセイ（ＱＰａｔｃｈ）において選択したフエントキシンＩＶ変異体のＩＣ50値及び選択性を示す。
【図７Ａ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図７Ｂ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図７Ｃ】ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。
【図８】溶媒処理動物の平均ＡＵＣを減じた（個々のフエントキシンＩＶ処理ラットのそれぞれについて）、フエントキシンＩＶ処理ラットの閾値（ｇ）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたところ、用量の有意な影響が認められ（ｐ＜０．００１）、用量依存的反応が示された。ボンフェローニポスト検定によれば、各用量群間で有意差が示された（**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１）。
【図９】それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均α炭素原子（ＣＡ）の２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）により色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）の有意な（＞１０倍）低下を生じた、異なるフエントキシンＩＶアラニン突然変異体を示す。ＣＡ  ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）〜２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）ＷＴ（ｂ）Ｆ６Ａ、（ｃ）Ｐ１１Ａ、（ｄ）Ｄ１４Ａ、（ｅ）Ｌ２２Ａ、（ｆ）Ｓ２５Ａ、（ｇ）Ｗ３０Ａ、（ｈ）Ｋ３２Ａ及び（ｉ）Ｙ３３ＡのフエントキシンＩＶ突然変異体。
【図１０】それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均のＣＡ  ＲＭＳＤにより色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）においてアイソフォームに固有の変化を生じたと考えられる異なるアラニン突然変異体を示す。ＣＡ  ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）〜２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）Ｋ１８Ａ、（ｂ）Ｒ２６Ａ、（ｃ）Ｋ２７Ａ。
【図１１】組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号１）のＮＭＲ溶液構造を示す。ＮＭＲ構造より、フエントキシンＩＶとＮａｖ１．７との間の相互作用表面と考えられる極性アリール面を形成するねじれたβシート（濃紺）を形成しているＨｗＴｘ−ＩＶの５つの残基（Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３）が明らかである。
【図１２】フエントキシンＩＶがドッキングしたｈＮａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）電圧感知ドメイン（ＶＳＤ）の相同性モデルを示す。このモデルに基づけば、フエントキシンＩＶは、セグメントＳ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４により形成される溝内にドッキングする。フエントキシンＩＶ（配列番号１）の残基Ｋ３２及びＷ３０は、Ｎａｖ１．７（配列番号２６３）の残基Ｅ８１１及びＭ７５０とそれぞれ相互作用するものと予測される。
【図１３Ａ】ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１３Ｂ】ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１４Ａ】ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１４Ｂ】ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。
【図１５Ａ】ＨｗＴｘ−ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１５Ｂ】ＨｗＴｘ−ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１５Ｃ】示された濃度におけるＨｗＴｘ−ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。
【図１６Ａ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、０．３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１６Ｂ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。
【図１６Ｃ】ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。
【図１６Ｄ】示された濃度におけるＨｗＴｘ−ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。
【図１７Ａ】５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。
【図１７Ｂ】５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
【図１７Ｃ】足底内ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発接触性アロディニアを有意に軽減した。
【図１８Ａ】接触性アロディニアは、マウスにおいて１００％足底内ＣＦＡにより誘発されるが、５０％ＣＦＡでは誘発されない。
【図１８Ｂ】足底内ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与は、１００％  ＣＦＡ処理動物において接触性アロディニアを有意に軽減した。
【図１８Ｃ】ガバペンチンもＰｒｏＴｘ−ＩＩほどではないものの接触性アロディニアを軽減した。
【図１９Ａ】ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。
【図１９Ｂ】ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべての刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書に援用するものである。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２５】
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載するものである。
【００２６】
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる場合もある。
【００２７】
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２８】
「相補配列」なる用語は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００３０】
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導するために使用することができるベクターを意味する。
【００３１】
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンＩＶ」又は「野生型ＨｗＴｘ−ＩＶ」なる用語は、配列番号１（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ）に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）のフエントキシンＩＶポリペプチドのことを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンＩＶ」又は「組み換えＨｗＴｘ−ＩＶ」なる用語は、配列番号２（ＧＰＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）に示される配列を有する、組み換えにより発現されたフエントキシンＩＶのことを指す。組み換えフエントキシンＩＶは、野生型フエントキシンＩＶと比較して、２個のアミノ酸からなるＮ末端尾部及びＣ末端尾部を有している。「参照フエントキシンＩＶ」なる用語は、配列番号２６７（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）のポリペプチド配列のことを指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号２６７に基づいている。例えば、明細書において「Ｆ６」とは、配列番号２６７の６番目のフェニルアラニン残基を指す。
【００３２】
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列１の野生型フエントキシンＩＶポリペプチド又は配列番号２６８の野生型フエントキシンＩＶポリヌクレオチド配列から、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの１以上の改変において異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
【００３３】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７」（ＳＣＮ９Ａ、ｈＮＥ、ＰＮ１とも呼ばれる）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号２６３に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ９αサブユニットのことを指す。
【００３４】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．２」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３５２３２．１及び配列番号２６４に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質２型αサブユニット（ＳＣＮ２Ａ）のことを指す。
【００３５】
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジン（３−ベラトロイルベラセビン）によって誘導される膜脱分極を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％低減するフエントキシンＩＶ変異体の能力のことを指す（ただし、ベラトリジン誘導脱分極とは、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス−（１，３−ジエチルチオバルビツール酸）トリメチンオキソノール］）を受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）を供与体として使用し、供与体を３９０〜４２０ｎｍで励起し、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞株を使用して５１５〜５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することによりＦＲＥＴシグナルの低下として測定される）。
【００３６】
本明細書で使用するところの「プロトキシンＩＩ」又は「ＰｒｏＴｘ−ＩＩ」なる用語は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス（Thrixopelma pruriens）（ペルビアングリーンベルベットタランチュラ）の毒素ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１（５０）：１４７３４〜４７，２００２に述べられるアミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫＫＫＬＷ−ＣＯＯＨ（配列番号３５６）を有するもののことを指す。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、インビトロで報告されているＩＣ50値が０．３ｎＭであり、他のＮａｖ１．ｘサブタイプと比較した場合に１００倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なＮａｖ１．７阻害剤である（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンＫＩＩＩＡ」又は「コノトキシンＫＩＩＩＡ」なる用語は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（４２）：３０６９９〜７０６，２００７に述べられる配列ＣＣＮＣＳＳＫＷＣＲＤＨＳＲＣＣ−ＮＨ2（配列番号３５７）を有する、キノシタイモ（コナス・キノシタイ）（Conus kinoshitai）毒素を指す。
【００３７】
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７の遮断薬」とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性を阻害、低減、又は遮断するペプチドのことを指す。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、当該技術分野では周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してＮａｖ１．７遮断活性について試験することができる。例えば、Ｃｌａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５：５０６〜５２０，２０００を参照されたい。
【００３８】
本発明は、Ｎａｖ１．７を阻害する単離されたフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明の変異体は、組み換えフエントキシンＩＶポリペプチドと比較した場合にＮａｖ１．７に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシンＩＶの特定の残基、詳細にはＦ６、Ｋ３２及びＩ３５は、置換に対して不耐性であり、更に残基Ｉ５、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｓ２５、Ｋ２７、Ｔ２８、Ｗ３０及びＹ３３（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の残基の置換は、位置Ｃ２、Ｃ９、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ２４及びＣ３１のシステイン残基に変化がない限り、Ｎａｖ１．７に対するフエントキシンＩＶ変異体の作用及び／又は選択性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
【００３９】
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００４０】
本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と比較した場合に同等に有効又はより有効なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換えフエントキシンＩＶは、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（モレキュラー・デバイシーズ社（Molecular Devices））を使用した、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞におけるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約１６０×１０-9Ｍである。フエントキシンＩＶ変異体は、上記のアッセイにおけるＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である場合に「同等に有効又はより有効」なＮａｖ１．７阻害剤である。このＩＣ50値は、アッセイ自体の内在的な変動性（１／２ｌｏｇ）のため、組み換えにより発現されるフエントキシンＩＶでは、測定されるＩＣ50よりも高く設定される。分かりやすさのため、３００×１０-9ＭのＩＣ50は、３．０×１０-7ＭのＩＣ50に等しい。
【００４１】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体では、不変残基Ｆ６、Ｋ３２及びＩ３５（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）以外に、Ｃ２〜Ｃ１７、Ｃ９〜Ｃ２４、及びＣ１６〜Ｃ３１間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のＮａｖ１．７阻害アッセイにおけるＩＣ50が約３００×１０-9Ｍ以下であれば、残りの残基は任意のアミノ酸で置換されてよい。
【００４２】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペプチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得ることもできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識されるであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ヒトライノウイルス１４型由来の組み換え３Ｃプロテアーゼ）の認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＨＲＶ３Ｃリンカー）（配列番号２７０））などのプロテアーゼ切断性リンカーと連結された（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号２６９）又は（ＧＧＧＧＳ）6（配列番号２６６）のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列番号３６０）融合タンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジン（配列番号３６１）又は他のタグを用いて周知の方法により精製を促進することができる。
【００４３】
フエントキシンＩＶ変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌクレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第６５２１４２７号及び米国特許第第６６７０１２７号に述べられる方法に基づいた化学的遺伝子合成法を用いるか、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発法により合成することができる。フエントキシンＩＶ変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベクターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリーを生成することができる。
【００４４】
フエントキシンＩＶ変異体は、配列番号１の野生型ＨｗＴｘ−ＩＶと比較した場合に、例えばクローニング及び／又は発現スキームから生じる、更なるＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をＨＳＡ−（ＧＧＧＧＳ）4−ＨＲＶ３Ｃリンカー−ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体融合タンパク質（（ＧＧＧＧＳ）4：配列番号２６９；ＨＲＶ３Ｃリンカー：配列番号２７０）として発現させた後、ＨＳＡ（配列番号３６０）から切断することにより、それぞれのＨｗＴｘ−ＩＶ変異体のＮ末端にＧ及びＰなどの更に２つの残基を導入することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにＧ及びＫなどの更なる残基をＨｗＴｘ−ＩＶのＣ末端に導入することができる。
【００４５】
本発明のＨｗＴｘ−ＩＶ変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがＮａｖ１．７を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン（Ｎａ+）の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
【００４６】
別の実施形態では、単離されたＨｗＴｘ−ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号３５６）を有し、配列中、
ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｉ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ23及びＸ26が任意のアミノ酸であり、
ｊ）Ｘ27及びＸ28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
ｋ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値は約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００４７】
別の実施形態では、前記単離されたＨｗＴｘ−ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号３５７）を有し、配列中、
ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｅ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｆ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｇ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｈ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｉ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｊ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｋ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｌ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｍ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｎ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｏ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｐ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｑ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｒ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｓ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｔ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
ｕ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ又はＫであり、
ｖ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｗ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｘ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｙ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｚ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ａａ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、
ｂｂ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失しており、そして、
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００４８】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、約１２×１０-9Ｍ〜約３００×１０-9ＭのＩＣ
50値でＮａｖ１．７を阻害することができる。この範囲のＩＣ50値を示す例示の変異体は、図４に示される配列番号３〜３２２のポリペプチドである。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体はＮａｖ１．７を選択的に阻害する。
【００５０】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と比較してＮａｖ１．７に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンＩＶは、Ｎａｖ１．７に対して約１５９×１０Ｍ-9のＩＣ50を、Ｎａｖ１．２に対して約３４２×１０Ｍ-9のＩＣ50を有することから、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50の比は、約２．１４３である。本明細書で使用する場合、「選択性」又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」とは、ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体のＮａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50の比（ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７））が約５．０に等しいか又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンＩＶ変異体は、ＩＣ50の比が５未満であっても、変異体が少なくとも０．８×１０-6Ｍのペプチド濃度でＮａｖ１．２を阻害しない場合にＮａｖ１．７を「選択に阻害する」ものとする。Ｎａｖ１．２に対するＩＣ50は、Ｎａｖ１．７について述べた方法にしたがって、Ｎａｖ１．２を安定的に発現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすることができる。
【００５１】
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンＩＶの残基の位置としては、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３及びＱ３４が挙げられる（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。選択性を高めるための例示の置換は、Ｎ１３Ｇ、Ｎ１３Ｉ、Ｑ１５Ｅ、Ｑ１５Ｗ、Ｑ１５Ｐ、Ｋ１８Ｆ、Ｋ１８Ｐ、Ｓ１９Ｑ、Ｒ２６Ｋ及びＲ２６Ｉである。向上した選択性を有する例示のフエントキシンＩＶ変異体は、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０の変異体である。
【００５２】
残基Ｋ７、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｖ２３、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３、及びＱ３４、Ｇ３６及びＫ３７（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）を置換することにより、得られるフエントキシンＩＶ変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる（図１及び図３）有効性及び選択性の両方を高める例示の置換は、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、及びＫ３７Ｒである（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。向上した有効性及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号５、６、７、１２、１３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４、７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１６９、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８１、１８２、１８７、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０３、２０４、２０７、２１３、２１５、２１６、２１９及び２２１の変異体である。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、配列番号２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４及び３５５に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンＩＶ変異体である。
【００５４】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の選択性及び／又は有効性は、既存の変異体に、選択性及び／又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換（グラフティング）を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び／又は改良することが可能な例示の変異体は、変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号１９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）である。ＮＶ１Ｇ３８７は、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示した。ＮＶ１Ｇ３８７の有効性は、位置Ｅ４、Ａ８、Ｎ１３、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｓ２５、Ｋ３７及びＧ３６を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す。ＮＶ１Ｇ３２７は、Ｎａｖ１．７に対して高い有効性を示した。ＮＧ１Ｇ３２７の選択性は、位置Ｆ６、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｋ３２及びＹ３３を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエントキシンＩＶ変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価することができる点は認識されるであろう。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、
Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
【００５６】
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち：
配列番号２７６において、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ24が、Ｉであり、これにより配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23ＩＸ24Ｘ25（配列番号３５８）を有するフエントキシンＩＶ変異体が生じ、配列中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ22、及びＸ23は任意のアミノ酸であり、
Ｘ2４及びＸ2５は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫである。
配列番号３５８のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を更に有しうる（配列番号３６２）。すなわち：
Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ22が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ23が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ25が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ26が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失していおり、これにより配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23ＩＸ24Ｘ25（配列番号３５９）を有するフエントキシンＩＶ変異体が生じ、配列中、
Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ22が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ23が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ24が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ25が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している。
【００５７】
配列番号２７６の単離されたフエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50は、約１６０×１０-9Ｍ未満でありうる。
【００５８】
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３においてヒトＮａｖ１．７と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば、フエントキシンＩＶの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによって親和性及び／又は選択性などの性質を向上させることができる。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、第２のポリペプチドと融合された配列番号３〜２５３又は２７７〜３５５のフエントキシンＩＶ変異体を含む単離された融合タンパク質である。このような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグ（配列番号３６１）などのタグでありうる。
【００６０】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なクローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンＩＶ変異体とこうした部分とを結合することもできる。
【００６１】
更なる部分を組み込んだフエントキシンＩＶ変異体は、複数の周知のアッセイによって官能基について比較することができる。例えば、ＰＥＧと結合されたフエントキシンＩＶ変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５のポリペプチド配列を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチドを生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの少なくとも１つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレオチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチジン（配列番号３６１）若しくはＨＡタグなどの周知のタグ配列をコードすることができる。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号２７１、２７２、２７３、２７４及び２７５に示される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００６７】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コードされたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやはり周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、シグナル配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が含まれる。
【００６８】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばクリベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、担子菌類、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はアスペルギルス（Aspergillus）などの真菌細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９などの昆虫細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＣＶ−１、ボーズ（Bowes）メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
【００６９】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によって行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも１つの本発明のフエントキシンＩＶ変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、を含む本発明のフエントキシンＩＶ変異体を発現させるための方法である。
【００７１】
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペプチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気下で３７℃で培養することができる。
【００７２】
本発明の方法では、フエントキシンＩＶ変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばＦＡＣＳ若しくは免疫蛍光技術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ若しくはＨＰＬＣの使用により確認することができる。
【００７３】
本発明の別の態様は、生物学的組織中のＮａｖ１．７の活性を調節する方法であって、Ｎａｖ１．７を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンＩＶ変異体又は薬学的に許容されるその塩のＮａｖ１．７調節量と接触させる工程を含む方法である。
【００７４】
治療方法
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療において使用することができる。
【００７５】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
【００７６】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛でありうる。
【００７７】
本明細書で使用するところのＮａｖ１．７介在性疼痛とは、増大したＮａｖ１．７チャネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
【００７８】
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【００７９】
疼痛及び／又はＮａｖ１．７介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパチー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、天然痘感染、ヘルペス感染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコール依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群（mixed-vascular and non vascular syndromes）、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１以上の原因により生じうる。
【００８０】
ペプチドＮａｖ１．７遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスでは、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感受性につながる（Ｇｉｎｇｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２０１３及び米国特許出願公開第２０１２０１８５９５６号）。この知見は、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬は、皮膚科学的又は炎症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の／突発性の状態などの様々な原因によって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Ｎａｖ１．７は、気道を支配する感覚神経においても発現される（Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１１  Ｄｅｃ  １；５８９（Ｐｔ  ２３）：５６６３〜７６；Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  １０）が、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレルギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、気腫、及び吃逆（しゃっくり）による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効でありうることを示唆している。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節上神経節でＮａｖ１．７をインイボで発現停止させると、機械的なプロ−ビングにより誘発させる咳嗽反射はほとんど消失した（Ｍｕｒｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３  Ａｐｒ  １０）。
【００８１】
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、本発明のフエントキシンＩＶ変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００８２】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のＳＮＬ（脊髄神経結紮）ラットモデル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット（Bennett）モデルなどのモデル、並びに米国特許出願第２０１１／０１２４７１１Ａ１号及び米国特許第７，９９８，９８０号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギーナン誘発アロディニア及び（ＣＦＡ）−誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルである。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
【００８３】
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明の阻害剤のフエントキシンＩＶ変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
【００８４】
本発明は、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤を使用してＮａｖ１．７介在性疼痛を治療する方法を提供する。本発明は、Ｎａｖ１．７遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び／又は緩和するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、過剰発現しているＮａｖ１．７を使用したインビトロ細胞培養モデルにおいて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニューロンにおいてはＮａｖ１．７に対して有効かつ／又は選択的であるが、こうしたペプチド阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告されている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０９：Ｅ２０１８−２７，２０１２には、ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊されない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが示されており、考えられる説明として、ＰｒｏＴｘ−ＩＩが血液神経関門を通過することができないことによるとされている（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいことが報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １４，４９〜６２，２０１３）。
【００８５】
Ｎａv１．７は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）において発現し、最も顕著には侵害受容性小径ＤＲＧニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において発現し、脳ではほとんど見られない。Ｎａv１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
【００８６】
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
【００８７】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減が含まれる。
【００８８】
一実施形態では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
【００８９】
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛の発生につながる場合があり、したがってＮａｖ１．７のペプチド阻害剤による治療に適している可能性がある。
【００９０】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
【００９１】
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけるＮａｖ１．７のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
【００９２】
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症に伴うものである。
【００９３】
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤には、プロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ）（配列番号３５６）及びフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（配列番号１）が含まれる。プロトキシンＩＩ変異体（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＰｒｏＴｘ−ＩＩと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１１／００６５６４７号、国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号、及び国際公開第ＷＯ２０１２／００４６６４号に述べられている。フエントキシンＩＶ変異体（ＨｗＴｘ−ＩＶ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＨｗＴｘ−ＩＶと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第６１／７０２，５３８号に述べられ、また本明細書に述べられている。
【００９４】
本発明の方法では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は第２のポリペプチドと接合することによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例えば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたＦｃ融合タンパク質、又はヒト血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン−セリンリンカーのようなリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では周知のものである。
【００９５】
本発明の方法では、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているＮａｖ１．７のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によって生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をＮａｖ１．７のペプチドと結合させることができる。
【００９６】
更なる部分を組み込んだＮａｖ１．７のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に述べられる方法を用いてそれらのＮａｖ１．７遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における有効性について比較することができる。
【００９７】
Ｎａｖ１．７のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱、及びレイノー病が挙げられる。
【００９８】
医薬組成物
本明細書のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、薬学的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４０  ａｎｄ  ４１）に述べられている。
【００９９】
本発明の方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与される」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
【０１００】
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の局所投与は、μ−コノトキシン、ファミリー１（ＨｗＴｘ様）及びファミリー３（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ様）などのより選択性の低いＮａｖ１．７阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器）又は炎症組織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができる。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
【０１０１】
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物には、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマイクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マクロエマルション、ポリマー化合物（ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど）、ビーズ又はリポソームの使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有するヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもできる。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもできる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与されるフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を放出するように設計することができる。フエントキシンＩＶ変異体の吸収を促進するための更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物は、好ましくは、１乃至複数のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を、錠剤の製造に適した無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
【０１０５】
本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、非経口（皮下、筋肉内又は静脈内）、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路；又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意の投与用（特に液体溶液若しくは懸濁液の形の）、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又は舌下投与用；又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ送達システム（皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能とする薬剤を含む（国際公開第９８／５３８４７号））（又はエレクトロポレーションなどの一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電した薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加（米国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号））の形の経皮投与で使用するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
【０１０６】
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（timed-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。
【０１０７】
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ（すなわち重量にして約０．５％未満、通常、１％又は少なくとも１％〜１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％又は７０％まで）、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻すことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
【０１０８】
本発明の例示の医薬組成物は、約ｐＨ  ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ  ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
【０１０９】
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のことを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件として、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護師、獣医、又は獣医学技術者）によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１１０】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌのリンゲル液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。
【０１１１】
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
フエントキシンＩＶの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）の毒に由来する野生型フエントキシンＩＶ（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ：配列番号１）内のすべての非システイン残基にＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを置換した一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンＩＶ変異体を、以下のＮ末端からＣ末端までのフォーマットで、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列番号３６０）融合タンパク質としてコードした。すなわち、Ｈｉｓ6−ＨＳＡ−（ＧＧＧＧＳ）4−ＨＲＶ３Ｃ切断部位−フエントキシンＩＶ変異体（Ｈｉｓ6：配列番号３６１；（ＧＧＧＧＳ）4：配列番号２６９；ＨＲＶ３Ｃ：配列番号２７０）。すべての変異体ペプチドは、ＨＳＡからの切断後、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰ、及び内因性のアミド化認識配列であるＣ末端ＧＫを有していた。一位置変異体を、ベラトリジン誘導膜電位を阻害する各変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験し、Ｑｐａｔｃｈによる電気生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現させたフエントキシンＩＶ変異体のＣ末端ＧＫ残基も置換した。
【０１１３】
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果について試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、及びＧ３６Ｉを組み合わせ（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ５）、他方がＮ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒを組み合わせた（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ６）ものである２つのコンビナトリアルライブラリーを生成した。
【０１１４】
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡを、米国特許第６，５２１，４２７号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳した。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を適当な制限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンＩＶ変異体を発現させる前に配列を確認した。
【０１１５】
タンパク質の発現
２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中で維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、フエントキシンＩＶ変異体をコードしたプラスミドを、標準的なプロトコールにしたがってＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）トランスフェクション試薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃及び８％  ＣＯ2に設定した加湿したインキュベーター内に１２５ＲＰＭで振盪しながら４日間置いた５，０００Ｇで１０分間遠心することにより細胞から上清を分離し、０．２μｍフィルターで濾過し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離機１０Ｋ（カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して３，７５０Ｇで約１０分遠心して１０倍及び５０倍に濃縮した。
【０１１６】
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンＩＶ変異体タンパク質を１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare））を使用してＩＭＡＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３、１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断されたペプチドを、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｎ０）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、ＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍結乾燥した。
【０１１７】
凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ  ７．４）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。（２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってペプチドを分析した。
【０１１８】
スケールアップを行うため、タンパク質を５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）、カタログ番号１７−５２４８−０２）を使用してＩＭＡＣで精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ又はＦＰＬＣを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮装置（ミリポア社（Millipore）、カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号１４１９０）を２回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、ＨＲＶ３Ｃ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３；１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断された融合タンパク質を、５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラムを使用してＩＭＣにより精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｎ０）を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。
【０１１９】
各ピーク画分は、分析用Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ−４２５２−Ｅ０）を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Ｗａｔｅｒｓシステムにより電気スプレーイオン化質量分析によって分析した。
【０１２０】
実施例２．フエントキシンＩＶ変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Ｎａｖ１．７のアゴニストであるベラトリジン（３−ベラトイルベラセビン；バイオモル社（Biomol）、カタログ番号ＮＡ１２５）により誘導される膜脱分極を阻害する作製されたフエントキシンＩＶ変異体の能力を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上で、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（インビトロジェン社（Invitrogen）、Ｋ１０１８）を電子受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８−オクタデシルオキシピレン−１，３，６−トリスルホネート）（シグマ社（Sigma））を供与体として使用し、供与体を３９０〜４２０ｎｍで励起し、５１５〜５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することにより、ＦＲＥＴアッセイ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いて測定した。
【０１２１】
Ｇ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen）による選択下で、ｈＮａｖ１．７チャネルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、グルタミン、１０％  ＦＢＳ、１％  ＮＥＡＡ、及び４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。５０μｌの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした３８４ウェルの黒い透明底プレートに２５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。プレートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした後、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で４回洗浄し、２５μｌのアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に再懸濁した。ＰＴＳ色素の２倍ストック（６μＭ）を、ＤＭＳＯに加えた１０％プルロニックＦ１２７に色素を１：１の比（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって調製した。２５μｌの２倍ＰＴＳ１８ストックをウェルに加えて細胞を３０分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で洗い流した。
【０１２２】
フエントキシンＩＶペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、１０μＭのＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭのＶＡＢＳＣ−１を含むアッセイ緩衝液（シグマ社（Sigma）、カタログ番号２０１９８７）中に最終濃度の３倍の濃度で懸濁した。２５μｌ／ウェルの懸濁したフエントキシンＩＶペプチドを、各ウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジン（２５μｌ／ウェルの７５ｍＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導し、ＦＲＥＴ色素蛍光の平均強度の低下をアゴニストを添加した３０秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを加えた後、それぞれの測定したフエントキシンＩＶペプチドを１．３倍に希釈し、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、ＴＴＸ、プロトキシンＩＩ、及びフエントキシンＩＶは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール（アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応）及びポジティブコントロール（１０μＭのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応）にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率（％）に変換した。
【０１２３】
測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一度補正（spatial uniformity correction）」（すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する）及び「バイアス値を減ずる（subtract bias value）」（初期開始強度を各トレースから減ずる）を、オンにした。
【０１２４】
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイントは個々のウェル内での反応を表している。
【０１２５】
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（マイクロカル社（Microcal））を使用してヒル関数（Hill function）に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からＩＣ50値を外挿した。
【０１２６】
ポジティブ（Ｐ±ｄＰ）及びネガティブ（Ｎ±ｄＮ）コントロールの平均及び標準偏差を用いて、反応（Ｒ）を有するウェル内の遮断（Ｂ）の量を以下のように計算した。
【化１】
2019107017.tif 000054
【０１２７】
スクリーニング窓（データ品質の尺度）は下記のように定義される。
【化２】
2019107017.tif 000055
【０１２８】
アッセイプレートは、（１）コントロールに基づくスクリーニング窓がｚ’＞０．５であり、かつ（２）その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴の平均の±０．５ｌｏｇ単位の範囲内にあれば、可とした。
【０１２９】
フエントキシンＩＶ変異体の選択性を、約８．３５μＭのベラトリジンの最終濃度（２５μｌ／ウェルの２５μＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導した点以外は、Ｎａｖ１．７について述べたようにＧ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen））による選択下でｈＮａｖ１．２チャネルを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を使用してＮａｖ１．２誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選択性を、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比として測定した。
【０１３０】
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭのＮＥＡＡ（試薬はすべてインビトロジェン社（Invitrogen）より入手）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１）中で培養した。細胞は３７℃で５％  ＣＯ2内に維持し、約７０〜９０％コンフルエンスに達した時点でアッセイを行った。ＱＰａｔｃｈ（ソフィオン社（Sophion））で試験するのに先立って、細胞を最初に０．０５％トリプシン（３７℃で５分間）を使用して解離させ、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies））に再懸濁し、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により１〜２×１０6／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ  ＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実験に使用した。
【０１３１】
ギガオームシール形成及びホールセル（全細胞）パッチクランプ記録用に、細胞外液は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
【０１３２】
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。−７５ｍＶの保持電位から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させた後、保持電位（−７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合、細胞を−７５ｍＶに保持した。
【０１３３】
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの細胞外液の供給（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を含むか又は含まないもの、１μＭのＴＴＸを含みＢＳＡを含まない最後の供給を除く）を、記録される細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした（５μｌ）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、試験化合物を含むもの（３つの供給すべてについて同じ化合物を同じ濃度で）か又はコントロール緩衝液とした（コントロール細胞のみ）。これらの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた、３つの１０μｌの小供給からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得た。
【０１３４】
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として正規化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５〜６個の）細胞の平均の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の２つのこうした値の平均の値（すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率（％）の値）を、濃度反応計算に使用した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±ＳＥとして表した。
【０１３５】
参照化合物では、このプロトコールを用いてＱＰａｔｃｈから得られた結果（例えば有効性／動態）は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
【０１３６】
結果
１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得られたＮａｖ１．７に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図１に示す。１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得られたＮａｖ１．２に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図２に示す。一置換変異体のＮａｖ１．７について得られたＩＣ50に対するＮａｖ１．２について得られたＩＣ50の比として測定される選択性を、図３に示す。図４及び５は、Ｎａｖ１．７（図４）又は選択性（図５）に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
【０１３７】
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエントキシンＩＶ及びフエントキシンＩＶ変異体を、上記に述べたＱＰａｔｃｈアッセイを用いてＨＥＫ２９３細胞で安定的に発現しているＮａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して試験した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Ｎａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して各フエントキシンＩＶ変異体について得られたＩＣ50値を図６に示す。フエントキシンＩＶの選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたＩＣ50値を用いて上記に述べたようにして計算した。
【０１３８】
フエントキシンＩＶを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリアルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒ（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が含まれ、これらはいずれも有効性、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、Ｒ２６Ｗ（配列番号７２）、Ｋ２７Ｗ（配列番号５７）、Ｑ３４Ｆ（配列番号６）、及びＲ２９Ｗ（配列番号５５）が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定された変異体（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ）（配列番号５）、（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１６）、（Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号４８）、（Ｅ１Ｎ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号８３）、（Ｎ１３Ｑ，Ｒ２９Ｋ，Ｋ３７Ｒ）（配列番号１３７）、（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１９２）及び（Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ）（配列番号４６）は向上した有効性及び／又は選択性を示した。
【０１３９】
実施例３．ラットにおける足底投与後のフエントキシンＩＶの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が３００ｇよりも大きい雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を使用した。実験に使用されていない動物を、試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができるように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾値を５００ｇに設定したランダール・セリット装置（Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置、無痛覚計）内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１〜３回の連続した試験を、５〜２０分間隔で行った。
【０１４０】
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点（５、１０、２０、３０、４５、６０分）で１回の試験を行い、記録した。
【０１４１】
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンＩＶ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）を、凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２〜３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
【０１４２】
データ分析
グラム（ｇ）の閾値を記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣをそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントＴ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。
【０１４３】
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３及び３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図７）。ＡＵＣは、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図８）。フエントキシンＩＶの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラットでは同様の浮腫は認められなかった。
【０１４４】
実施例４．フエントキシンＩＶのＮａｖ１．７との相互作用の分子モデリング
ＮＭＲによる構造決定
すべてのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ６００、７００、又は９５０ＭＨｚ分光計を使用して行った。ペプチドを、１０％  Ｄ2Ｏを含む水性緩衝液に溶解した。緩衝液は、２０ｍＭリン酸塩、０．１ｍＭのｄＥＤＴＡ、及び０．００２％  ＮａＮ3を用いてｐＨを６．７に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて２９８Ｋで得た。個々の残基のスピン系は、ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．１９８５，６５，３５５〜３６０）を用い、スピンロック（ＭＬＥＶ）を混合時間７５ｍｓで用いて割り当てた。混合時間１５０ｍｓで得られたＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７９，７１，４５４６〜４５５３；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８０，９５，１〜６）実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15Ｎ−ＨＳＱＣ（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９８０，６９，１８５〜１８９）実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方法（Ｃａｖａｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  １９９５  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて13Ｃ−ＨＳＱＣスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル２乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ６，２７７〜２９３，１９９５）を用いてフーリエ変換を行った。
【０１４５】
ＮＯＥＳＹスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導出し、ＣＹＡＮＡ（Ｇｕｎｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２８３〜２９８，１９９７）により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意な（＞０．２ｐｐｍ）環電流異方性を示したＷ３２を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘束を適用した。アプリケーションとしてＰＲＥＤＩＴＯＲ（Ｂｅｒｊａｎｓｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２００６，３４，Ｗ６３−Ｗ６９）及びＤＡＮＧＬＥ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．２０２，２２３〜２３３，２０１０）を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バックボーンの角ωの拘束を１８０°に設定した。ＮＯＥＳＹ及び13Ｃ−ＨＳＱＣ実験より導出されたデータに基づき、Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ２〜Ｃ１７、及びＣ１６〜Ｃ３１の間のジスルフィド結合を固定した。
【０１４６】
ペプチドの相同性モデルをＣＹＡＮＡへの入力（サイクル１）として用いた後、６サイクルの複合自動ＮＯＥＳＹ割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフォーマー１つ当たり１００００回のねじれ角ダイナミクスステップの後、５０００回のエネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを用いて１０００個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する２０個のコンフォーマーのアンサンブルを、ＭＯＥ（ケミカル・グルーピング・コンピューティング社（Chemical Computing Group Inc.）ｗｗｗ：／／＿ｃｈｅｍｃｏｍｐ＿ｃｏｍ）を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入力した。
【０１４７】
分子動力学
天然ＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ  １ＭＢ６からの構造）を、分子動力学シミュレーションを使用してＨｗＴｘーＩＶの安定性の特性評価を行うための開始点として用いた。天然のＨｗＴｘ−ＩＶのシミュレーション以外に、３つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、１個のアラニンの点突然変異によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。３つのジスルフィド結合の重要度を特性評価するため、Ｃ２〜Ｃ１７、Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ１６〜Ｃ３１、Ｃ２〜Ｃ１７／Ｃ９〜Ｃ２４、Ｃ２〜Ｃ１７／Ｃ１６〜Ｃ３１、Ｃ９〜Ｃ２４／Ｃ１６〜Ｃ３１及びＣ２〜Ｃ１７／Ｃ９〜Ｃ２４／Ｃ１６〜Ｃ３１のシステインを個々のシステイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション（全部で７つのシミュレーション）を行った。１個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力学アラニンスキャン（すべての非システイン位置の）を行った（全部で２８のシミュレーション）。
【０１４８】
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、ＨｗＴｘーＩＶをエクスプリシット水（最小で１２オングストロームのパッディング）に溶媒和させ、０．１Ｍ  ＮａＣｌに中和した。ＮＡＭＤ  ２．８（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１７８１〜１８０２，２００５）を使用してタンパク質を最小化し、５０ｎｓで平衡化した。ＣＨＡＲＭＭ  ２２  ＣＭＡＰ（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ２５：１４００〜１４１５，２００４）パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピングアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を１ｆｓ毎に計算し、短距離の非結合相互作用を２ｆｓ毎に計算し、長距離の相互作用を４ｆｓ毎に計算した。長距離の静電気力は、格子間隔を１オングストローム未満とした粒子メッシュのＥｗａｌｄ合計法を用いて評価した。温度は、Ｌａｎｇｅｖｉｎ動力学を用いて２７℃（３００Ｋ）に維持し、Ｎｏｓｅ−Ｈｏｏｖｅｒ  Ｌａｎｇｅｖｉｎピストンを用いて０．１ＭＰａ（１ａｔｍ）の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフティングを８オングストロームで開始し、完全なカットオフを１２オングストロームとして、スケーリングした１〜４排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力学軌道を、主鎖のα炭素原子（ＣＡ）に基づいて整列させ、残基当たりの２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）を、Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１９９６，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．３３〜３８）を使用して初期ＮＭＲ構造に対してシミュレーション全体にわたって計算した。
【０１４９】
Ｎａｖ１．７の相同性モデリング及びＨｗＴｘ−ＩＶのドッキング
Ｎａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）のセグメントＳ１〜Ｓ４の相同性モデルを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．１（アクセルリス社（Accelrys））のＭｏｄｅｌｌｅｒコンポーネントを使用し、ＮａｖＡｂ構造（アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter
butzleri）由来の電位依存性Ｎａ（＋）チャネル；構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ  ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ  ３ＲＶＹにある。）をテンプレートとして構築した。次いでこのモデルを、更にリファインして静止状態のＮａｖ１．７の構造を生成した。Ｓ４をマニュアルで静止状態のコンフィギュレーションに動かし、Ｓ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４ループを再形成して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のＨｗＴｘ−ＩＶを、Ｎａｖ１．７に対するＨｗＴｘ−ＩＶ阻害のアラニンスキャンの結果、及びＨｗＴｘ−ＩＶの結合を生じる、文献に開示されるＮａｖ１．７突然変異（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１〜１０，２０１１．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  ９．）に基づき、マニュアルでＮａｖ１．７相同性モデルにドッキングさせた。
【０１５０】
マニュアルでのドッキング後、ＨｗＴｘ−ＩＶシステムがドッキングされたＮａｖ１．７  ＤＩＩ  Ｓ１〜Ｓ４全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーションを、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用し、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｒｎ  Ｉｍｐｌｉｃｉｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｓｐａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０６，８７２６〜８７３８，２００２）により行って、ドッキングした構造を更にリファインした。
【０１５１】
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性（Ｆ６Ａ、Ｐ１１Ａ、Ｄ１４Ａ、Ｌ２２Ａ、Ｓ２５Ａ、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｙ３３Ａ）又はチャネル選択性（Ｋ１８Ａ、Ｒ２６Ａ及びＫ２７Ａ）の顕著な喪失につながるＨｗＴｘ−ＩＶ突然変異の活性の変化の分子的機序の理解を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造（ｐｄｂコード１ＭＢ６）を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に５０ｎｓの分子動力学シミュレーションを行った。
【０１５２】
天然のＨｗＴｘ−ＩＶペプチドの平均のＣＡ  ＲＭＳＤはわずかに１．００７オングストロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレーションは、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）（通常、π−π相互作用を形成する）、及びＬ２２Ａ（図９ｅ）のみが、ＨｗＴｘ−ＩＶのコア安定性に影響することを示した。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなかった。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにＮａｖ１．７及びＮａｖ１．１に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）及びＬ２２Ａ（図９ｅ）は、ループ３及び４の柔軟性を増大させ、Ｋ３２Ａ（図９ｈ）は、ループ３の柔軟性を増大させ、Ｄ１４Ａ（図９ｄ）及びＰ１１Ａ（図９ｃ）は、ループ２の柔軟性の顕著な増大を示した。Ｋ２７Ａ（図１０ｃ）及びＲ２６Ａ（図１０ｂ）は、ループ４の柔軟性を増大させることが判明した。Ｋ１８Ａ（図１０ａ）及びＳ２５Ａ（図９ｆ）突然変異は、いずれのループの柔軟性にも影響しなかった。
【０１５３】
ＮＭＲ
ＨｗＴｘ−ＩＶの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーションの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えＷＴ（野生型）ＨｗＴｘ−ＩＶのＮＭＲ構造を決定し、これをＷ３０Ａ及びＫ３２Ａの構造と比較した。
ＱＰａｔｃｈ及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず（分子動力学シミュレーションとは概ね一致したが）、Ｗ３０Ａ及びＫ３２Ａは、ＷＴ組み換えフエントキシンＩＶと同様の全体的構造を示した。陽子間ＮＯＥＳＹ及び主鎖化学シフト値は、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有しているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これらの差異には、Ｋ３２Ａ及び野生型ペプチドのＷ３０の半径５オングストローム内に強い環電流異方性が認められることが含まれる。Ｆ６及びＴ２８に最も大きく影響するこうした異方性は、βターンのコンフォメーション／動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接した空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局所的な差異として、Ｋ３２のプロトン化されたアミンと、Ｗ３０Ａ及び野生型ペプチドに利用可能なＹ３３の電子との間の潜在的なカチオン−π相互作用を示唆している。これらの局所的な差異に関与する５つの残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２、Ｙ３３の側鎖は、すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Ｎａｖ１．７と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
【０１５４】
相同性モデリング及びドッキング
ＨｗＴｘ−ＩＶとＮａｖ１．７チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、Ｎａｖ１．７ドメインＩＩ（ＤＩＩ）の電圧センサードメイン（ＶＳＤ；セグメントＳ１〜Ｓ４）の相同性モデルを、ＮａｖＡＢをテンプレートとして構築した。取得可能なＳＡＲデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１〜１０，２０１１．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  ９．）を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、ＨｗＴｘ−ＩＶペプチドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
【０１５５】
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、ＨｗＴｘ−ＩＶが、Ｓ１−Ｓ２及びＳ３−Ｓ４ループと（詳細には残基Ｅ７５３、Ｅ８１１、Ｄ８１６及びＥ８１８と）の相互作用によってＤＩＩ電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたドッキングした構造を図１２に示すものであり、疎水性パッチが、Ｗ３０及びＦ６と、Ｎａｖ１．７のＳ１−Ｓ２ループ及びＳ３−Ｓ４ループによって形成される溝の内部を向いた塩基性のＫ３２残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、Ｗ３０及びＦ６の疎水性パッチが、対応する疎水性残基Ｍ７５０を有するチャネル溝と相互作用することになる。Ｓ１−Ｓ２ループ及びＳ３−Ｓ４ループの端に沿った荷電相互作用により、ＨｗＴｘ−ＩＶは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、Ｓ１−Ｓ２ループ上で、ＨｗＴｘ−ＩＶ及びＮａｖ１．７チャネルのＫ７−Ｅ７５３及びＥ４−Ｋ７６２間でそれぞれ電荷−電荷相互作用が生じる。同様に、ＨｗＴｘ−ＩＶとＳ３−Ｓ４  Ｎａｖ１．７ループとの間で一連の電荷−電荷相互作用、すなわち、Ｒ２６−Ｄ８１６、Ｋ２７−８１８、及びＫ３２−Ｅ８１１も生じる。
【０１５６】
実施例５
更なるフエントキシンＩＶ変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンＩＶ変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）に基づいて２つのグラフティングライブラリーを生成した。
【０１５７】
実施例２に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例２に述べたようにしてＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃｈを使用してＩＣ５０値を測定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価した。
【０１５８】
変異体ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）が、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示し（図５）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグラフトした（Ｎａｖ１．７  ＩＣ５０＞０．０５μＭ）。ＮＶ１Ｇ３８７のライブラリー設計を表１に示す。表１は配列番号２６７を開示する。
【０１５９】
【表１】
2019107017.tif 000056
【０１６０】
変異体ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）は、高い有効性を示し（図４）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした（この実験ではＮａｖ１．２と比較して５倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない）。ＮＶ１Ｇ３２７のライブラリー設計を表２に示す。表２は配列番号２６７を開示する。
【０１６１】
【表２】
2019107017.tif 000057
【０１６２】
図１３Ａは各配列を示し、図１３Ｂは、ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）スカフォールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場合を除き、ｎＭで表したＩＣ50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド濃度で得られた阻害率（％）を示した。
【０１６３】
図１４Ａは各配列を示し、図１４Ｂは、ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）スカフォールドに基づいた突然変異体の特性を示す図１４Ｂの値は、図１３Ｂと同様である。
【０１６４】
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンＩＶ変異体は、向上した選択性を示し、かつ／又は以下の変異体を含む。
【０１６５】
＞ＮＶ１Ｇ５５９
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＦＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ（配列番号２７７）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＫ２１Ｆでグラフトした）
【０１６６】
＞ＮＶ１Ｇ５６６
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＮＫＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ（配列番号２７８）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＳ２０Ｎでグラフトした）
【０１６７】
＞ＮＶ１Ｇ６１１
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＤＫＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ（配列番号２７９）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＲ２６Ｄでグラフトした）
【０１６８】
＞ＮＶ１Ｇ６１２
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＨＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ（配列番号２８０）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＫ２７Ｈでグラフトした）
【０１６９】
実施例６．Ｎａｖ１．７阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
３種類のＮａｖ１．７遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウスモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ−ＩＶ）（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４７５６４〜７１，２００２）、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４７３４〜４７，２００２）及びコノトキシンＫＩＩＩＡ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  ２８２（４２）：３０６９９〜７０６）である。ＨｗＴｘ−ＩＶ及びＫＩＩＩＡは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソフォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることからこれらのペプチドは局所投与した。これら３種類のペプチドのＮａｖ１．７遮断の強さの順序は、ＰｒｏＴＸ−ＩＩ＞ＨｗＴＸ−ＩＶ＞ＫＩＩＩＡである。
【０１７０】
動物．雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を、約１９０〜２００ｇで注文し、３００ｇよりも大きくなった時点で使用した。
【０１７１】
材料の調製及び後足への局所投与．アミド化したフエントキシンＩＶ（ペプチド・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイビル）、プロトキシンＩＩ（株式会社ペプチド研究所、日本）又はＫＩＩＩＡを凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して−２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２〜３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
【０１７２】
ランダール・セリット試験
Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置（無痛覚計）を、最大閾値を５００ｇに設定して使用した。
【０１７３】
訓練．文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１〜３回の連続した試験を、５〜２０分間隔で行った。
【０１７４】
試験．ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行った（すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際）。注射後の各時点（５、１０、２０、３０、４５、６０、及び１２０分）で１回の試験を行い、記録した。反応は、訓練の際の反応と同様に定義した（上記の訓練の項を参照）。
【０１７５】
データ分析．グラム（ｇ）の閾値を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを互いに平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントｔ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。１２０分における反応は示しておらず、ＡＵＣの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び５〜６０分の値（Ｐｒｅ）を用いた。
【０１７６】
結果．足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３ｎｍｏｌ（図１５Ａ）及び３０ｎｍｏｌ（図１５Ｂ）のフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図示せず）。曲線下面積（ＡＵＣ）（図１５Ｃ）は、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）。
【０１７７】
足の背面に局所投与したプロトキシンＩＩは、ランダール・セリット試験における足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。０．３ｎｍｏｌ（図１６Ａ）、３ｎｍｏｌ（図１６Ｂ）、及び３０ｎｍｏｌ（図１６Ｃ）のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。ＡＵＣは０．３ｎｍｏｌと３ｎｍｏｌ用量との間を除いて有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図２Ｄ）。
【０１７８】
両方の用量（３及び３０ｎｍｏｌ）で足の背面に局所投与されたＫＩＩＩＡでは、ランダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に有意ではなかった。２つの用量から得られたＡＵＣの間に有意差は認められなかった（図示せず）。
【０１７９】
この実験の結果は、ＰｒｏＴｘ−ＩＩ及びＨｗＴｘ−ＩＶが急性侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。ＫＩＩＩＡは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッセイにおける活性の順序（ＰｒｏＴＸ−ＩＩ＞ＨｗＴＸ−ＩＶ＞ＫＩＩＩＡ）は、インビトロでのＮａｖ１．７遮断の順序と一致し、このことは、Ｎａｖ１．７遮断が鎮痛活性に寄与した可能性を示唆するものである。
【０１８０】
実施例７．ＰｒｏＴｘ−ＩＩの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
動物試験開始時点において体重２４０〜２９５ｇ（平均／標準誤差：２８０．２±３．３）の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット。
【０１８１】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて５〜７秒間保持した８段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．４、０．６、１．０、２．０、４．０、６．０、８．０、及び１５．０ｇ；ストールティング社（Stoelting）、イリノイ州ウッドデール）から罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求めた。ラットは、試験に先立って１０分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
【０１８２】
熱性アロディニア試験
ＣＦＡ投与の前後に熱足刺激装置（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ装置、カリフォルニア州立大学サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して放射熱に対する足閾値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約８〜１２秒の潜時の範囲（平均約１０秒）となるように放射熱の利得及び強度を設定した。カットオフ値は、装置により２０秒に設定した。各時点で、同じ足について３つの別々の測定値を、各動物で約５分間隔で得て、互いに平均化した。
【０１８３】
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）のエマルションを、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、１００μＬのエマルションを左後足に皮下注射した。ＣＦＡ注射後１２日目に、同側の足に、１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に加えた３０ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）のいずれかを注射した。
【０１８４】
データ分析．データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
【０１８５】
結果
接触性アロディニアの閾値（図１７Ａ）及び熱性アロディニアの潜時（図１７Ｂ）は、５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した。足底内投与したプロトキシンＩＩでは、注射後３０及び６０分後に、溶媒注射動物と比較して触覚閾値が有意に増加した。
【０１８６】
実施例８．ＰｒｏＴｘ−ＩＩの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用を与える
動物．試験開始時点において体重２４〜３１ｇ（平均／標準誤差：２７．５±０．３）の雄性Ｃ５７／ｂｌ６マウスを使用した。
【０１８７】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１．０、２．０及び４．０ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求めた。マウスは、試験に先立って１日につき約１時間、２日間にわたり、更に、各試験日には試験に先立って３０分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
【０１８８】
単関節炎モデル誘発
５０％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）に対して、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比となるようにエマルションを調製した（溶媒処理群には０．９％生理食塩水のみを投与した）。１００％  ＣＦＡについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないＣＦＡを注射し、コントロール動物には０．９％生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、５０μＬハミルトン注射器及び２５ゲージの針を使用して２０μＬを左後足に皮下注射した。
【０１８９】
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。ＣＦＡ注射後３日目に、ガバペンチン（１５０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）又は溶媒（滅菌水；ｎ＝６）のいずれかを、このモデルにおいて周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与（４ｍＬ／ｋｇ）し、触覚閾値の変化について評価した。６日間のウォッシュアウト期間の後（ＣＦＡ後９日目）、同じ動物を、３ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）を左のＣＦＡ処理した足の足底内に投与して試験した。
【０１９０】
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ6／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実験に使用した。
【０１９１】
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。−７５ｍＶの保持電位から、細胞を最初に−１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させた後、保持電位（−７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合、細胞を−７５ｍＶに保持した。
【０１９２】
ギガオーム（ＧΩ）シール形成用に、細胞外液は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ  ＣｓＦ、１０ｍＭ  ＣｓＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
【０１９３】
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス（溶媒又はペプチド投与したもの）から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し（１０〜１０００倍）、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と同じものとした。
【０１９４】
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの血漿含有細胞外液の供給（血漿を含まない細胞外液に１μＭのＴＴＸを含む最後の供給を除く）を、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給（５μｌ）は、コントロール血漿のみを含むものとした（血漿含有緩衝液）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、溶媒又はペプチド投与したマウスから得た血漿（コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した）か、又はコントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロールとして、既知濃度（３００μＭ）の合成プロトキシンＩＩを１０倍に希釈したコントロール血漿含有緩衝液に加え（スパイク）、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液（すなわち３０、１００、３００及び１０００倍に希釈した血漿含有緩衝液）中でコントロールペプチドのより低い濃度（すわち３、１０、３０、及び１００倍希釈濃度）を得た。これら３つの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた３つの１０μｌの小適用からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得た。
【０１９５】
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として標準化した。電流のランダウン（rundown）について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５〜６個の）細胞（試験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの）の平均の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後（すなわち全体の４番目）の血漿の供給の最後の２つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿（ＰｒｏＴｘ−ＩＩ投与マウスから得たもの）緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベルを、ＰｒｏＴｘ−ＩＩのスパイクした（既知の）濃度の存在下での（希釈した）コントロール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない血漿中のＰｒｏＴｘ−ＩＩ濃度を計算した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±標準誤差として表した。
【０１９６】
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表３に示す。血漿濃度は、２つのより低い用量ではすべての時点で検出限界（約５ｎＭ）を下回った。血漿濃度は、より高い用量では５０〜８３ｎＭであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様であった（２日間以内に安定状態に達したことを示唆する）。すべての用量はよく忍容され、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
【０１９７】
【表３】
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【０１９８】
ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、マウスにおいて最大で４５．６ｕｇ／日まで、７日間にわたってよく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは、疼痛実験において５倍高い用量（２２８μｇ／日）を評価することとした。
【０１９９】
実施例１０．ミニポンプを使用したＰｒｏＴｘ−ＩＩの投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物．この実験では、チャールズ・リバー社（Charles River）より注文した雄性Ｃ５７Ｂｌ／６系マウスを使用した。
【０２００】
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２及び４ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム（ｇ）で記録した。マウスは、試験に先立って３０分間、金網に慣らした。１００％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
【０２０１】
熱性（ハーグリーブズ（Hargreaves））アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐａｉｎ，３２：７７〜８８；Ｄｉｒｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３〜１９１）。この箱は、一定温度（２８℃）に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球から与えられ、刺激は、カットオフ時間２０秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全体を通して一定のアンペア数を使用することで、５分間隔で計測した３つの計測値について平均した場合に約８〜１２秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を１０分間、硝子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時（ＰＷＬ）を秒単位で記録した。
【０２０２】
ＣＦＡ
動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２〜５％）、２０μＬの１００％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ州セントルイス）を、１ｍＬ注射器に取り付けた２５ゲージの針を使用して左後足に皮下注射した。
【０２０３】
試験化合物
プロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International））をＤＰＢＳ中（カルシウム及びマグネシウムを含まないもの）で９．５ｍｇ／ｍＬのストック濃度で配合した。
【０２０４】
ミニポンプ
アルゼット（Alzet）マイクロ浸透圧ミニポンプ（デュレクト社（Durect Corporation）モデル１００３Ｄ）を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウス体内への移植後、３日間にわたって１．０μｌ／時で投与した。ポンプ及びその流量調節要素（フローモデレーター）を最初に秤量し、次いで２７ゲージの先の丸い針が取り付けられた１ｍＬのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量（空の重さ及び充填時の重さ）を記録して、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の９０％を充填体積が超えるようにした（使用説明書によれば９２μＬ）。次いでポンプを、０．９％生理食塩水で充填した１５ｍＬ円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って３７℃に５〜６時間置いた。
【０２０５】
ミニポンプの埋め込み
マウスに２０μｌの０．３ｍｇ／ｍｌブプレネックスを投与した後、イソフルランにより麻酔（誘導５％、維持２％）を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコール及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、７ｍｍのステープルを使用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
【０２０６】
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（接触性）及び平均の潜時（熱的）を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ  ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
【０２０７】
手順
動物を、フォンフライ（Von Frey）スタンド及びハーグレーブズ（Hargreaves）ボックスで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド／ボックス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接触性（フォンフライスタンド）及び熱性（ハーグレーブズ）の両方で試験した。試験前閾値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、２０μＬの１００％ＣＦＡを左後足に注射した。動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方でベースライン測定値について試験して、ＣＦＡが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「１日目」、「２日目」、及び「３日目」の接触性及び熱性閾値を測定した。３日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料を得た。
【０２０８】
血漿ＰｒｏＴｘ−ＩＩを実施例９で述べたようにして決定した。ＰｒｏＴｘ−ＩＩの平均濃度は２２４μＭであった。
【０２０９】
結果
ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、浸透圧ミニポンプによる２２８μｇ／日の持続的投与後、炎症性疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値（図１９Ａ）及び熱閾値（図１９Ｂ）は、ＰｒｏＴｘ−ＩＩ処理動物において有意に増加した。これらの観察結果は、２つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ７４：１４７６〜１４８４，２００８；Ｈａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９：Ｅ２０１８−２７）と対照的に、これらのデータは、Ｎａｖ１．７選択的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を与えることを示すものである。
【０２１０】
ミニポンプにより投与したＰｒｏＴｘ−ＩＩの効果を、神経因性疼痛のモデルである神経部分損傷を有するマウスにおいて接触性（フォンフライ）疼痛アッセイで評価した。ＰｒｏＴｘ−ＩＩは、浸透圧ミニポンプによるＰｒｏＴｘ−ＩＩの２２８μｇ／日の持続的投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
【０２１１】
本願発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］  配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［２］  ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｋ又はＨであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、そして、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹである、上記［１］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［３］  配列番号２７７、２７８、１９２、２７９、２８０、又は３の前記アミノ酸配列を有する、上記［２］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［４］  ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｅ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｆ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｇ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｈ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｉ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｊ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｋ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｌ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｍ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｎ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｏ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｐ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｒ又はＤであり、
ｑ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｒ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ｓ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
ｔ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している、上記［２］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［５］  前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50が約１６０×１０-9Ｍ未満である、上記［４］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［６］  前記フエントキシンＩＶ変異体が配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９又は２８０の前記ポリペプチド配列を有する、上記［５］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［７］  配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ19Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［８］  前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９又は２４０の前記ポリペプチド配列を有する、上記［７］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［９］  配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示される前記ポリペプチド配列を有する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［１０］  配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５の前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離されたポリヌクレオチド。
［１１］  上記［１０］に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
［１２］  上記［１１］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［１３］  上記［１２］に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエントキシンＩＶ変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンＩＶ変異体を生成する方法。
［１４］  上記［９］に記載の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［１５］  被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために上記［９］に記載の前記フエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む、方法。
［１６］  治療法に使用するための、上記［９］に記載のフエントキシンＩＶ変異体。
［１７］  Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
［１８］  前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎、線維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］  前記被験対象がヒトである、上記［１８］に記載の方法。
［２０］  前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の部位、末梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、上記［１９］に記載の方法。
［２１］  前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、上記［１９］に記載の方法。
［２２］  前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、プロトキシンＩＩ（配列番号３５６）、フエントキシンＩＶ（配列番号１）、プロトキシンＩＩ変異体、又はフエントキシンＩＶ変異体である、上記［１９］に記載の方法。
［２３］  前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示される前記ポリペプチド配列を有する、上記［２２］に記載の方法。
【外国語明細書】
2019107017000001.pdf