(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲ法による検体中での細菌種の検出または同定における、感度の更なる向上及び迅速性の向上のためのプライマーセット及びキットの提供。【解決手段】特定の群から選択された特定のプライマーペアを含む、細菌ＤＮＡ増幅用のＰＣＲプライマーセット、これを用いたＰＣＲ用のキット及び検体中の細菌種の検出または同定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記第Ｓ１群〜第Ｓ７群から選択して得られた１つのプライマーペアを含むことを特徴とする細菌DNA増幅ＰＣＲ用のプライマーセット。
第Ｓ２群：
２−１６Ａ：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４６〜４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１Ａ：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−６Ａ：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−７Ａ：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５、４７及び４８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−８Ａ：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−９Ａ：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１０Ａ：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１２Ａ：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４８及び５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１４Ａ：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２−１５Ａ：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ６群
６−６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１Ａ：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９３、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び
１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−４Ａ：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１１Ａ：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６−１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｓ７群
７−１２Ａ：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２及び５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１Ａ：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８〜１２５、１２７、１２８、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−２Ａ：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８〜１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−３Ａ：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６及び１１８〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−４Ａ：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−５Ａ：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−６Ａ：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、１１８〜１２２、１２４及び１２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−７Ａ：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１８、１２０、１２１、１２４及び１２６〜１３０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−８Ａ：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１８〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−９Ａ：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６、及び１１８〜１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１０Ａ：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１８〜１２６、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７−１１Ａ：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
第Ｓ１群：
１−１Ａ：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−２Ａ：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−３Ａ：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−８Ａ：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１９〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み
合わせからなるプライマーペア、
１−９Ａ：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１−１０Ａ：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ３群：
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｓ４群：
４−１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４−４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｓ５群
５−１Ａ：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−５Ａ：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７２、７３及び７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−６Ａ：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５−８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【請求項２】
前記第Ｓ１群〜第Ｓ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含む、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
以下の１）〜７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含む請求項１に記載のプライマーセット。
１）前記第Ｓ１群から選択される１つのプライマーペア、
２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
３）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【請求項４】
前記１）〜７）のプライマーペアのいずれか１つを含む請求項３に記載のプライマーセット。
【請求項５】
以下のＡ〜Ｇのいずれか１つの組み合わせを含む請求項４に記載のプライマーセット。
（Ａ）前記１）のプライマーセットを含む場合において、前記２）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記２）のプライマーセットを含む場合において、前記１）及び３）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記３）のプライマーペアを含む場合に、１）、２）及び４）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記４）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜３）及び５）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記５）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜４）及び６）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記６）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記７）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
【請求項６】
細菌種検出用である請求項１〜５のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項７】
細菌種検出及び／または同定用である請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項８】
前記７つのプライマーペアのうちの、少なくとも４つのプライマーペアを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌種同定用のプライマーセット。
【請求項９】
下記第Ｋ１群〜第Ｋ７群から選択して得られた１つのプライマーペアを含むことを特徴とする細菌種検出用のキット。
第Ｋ２群：
２−１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４６及び４８〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２−１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ６群
６−６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６−１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｋ７群
７−１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５〜１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７−１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ１群：
１−１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１と２３〜２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１−１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ３群：
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｋ４群：
４−１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４−４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｋ５群
５−１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５−８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【請求項１０】
前記第Ｋ１群〜第Ｋ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含む、請求項９に記載の細菌種検出用キット。
【請求項１１】
以下の１）〜７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含む請求項９に記載のキット。
１）前記第Ｋ１群から選択される１つのプライマーペア、
２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
３）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【請求項１２】
前記１）〜７）のプライマーペアのいずれか１つを含む請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
以下のＡ〜Ｇのいずれか１つの組み合わせを含む請求項１２に記載のキット。
（Ａ）前記１）のプライマーセットを含む場合において、前記２）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記２）のプライマーセットを含む場合において、前記１）及び３）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記３）のプライマーペアを含む場合に、１）、２）及び４）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記４）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜３）及び５）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記５）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜４）及び６）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記６）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記７）のプライマーペアを含む場合に、前記１）〜６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
【請求項１４】
細菌種検出及び／または同定用である請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
前記７つのプライマーペアのうちの、少なくとも４つのプライマーペアを含む請求項９〜１４のいずれか１項に記載の細菌種同定用のキット。
【請求項１６】
配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２〜５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーから選択された少なくとも１種との追加のプライマーペアを更に含む請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記追加のプライマーペアが配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーのプライマーペアである請求項１６記載のキット。
【請求項１８】
ＰＣＲ用酵素を更に含む請求項９〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
プライマー及びＰＣＲ酵素は個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器の少なくとも１つを更に含む請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器の個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下であることを特徴とする、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、MgCl2及び測定用容器は個別に包装されており、各包装内における細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
蛍光色素を更に含む請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２４】
プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、蛍光色素、MgCl2及び測定用容器の個々又は全体として、細菌由来の細菌混入量が１０fg以下であることを特徴とする、請求項２３記載の細菌種同定キット。
【請求項２５】
プライマー、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、dNTP、蛍光色素、MgCl2及び測定用容器は個別に包装されており、各包装内における細菌由来の核酸混入量が１０fg以下である請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ガンマ線処理、限外ろ過処理及びＥＭＡ処理のいずれかの処理が施されていることにより細菌由来の核酸混入量が１０fg以下となっている請求項２１、２２、２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
dNTPがホットスタートPCR用に化学修飾されたdNTPである、請求項２０〜２２及び２４〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
ＰＣＲ用酵素が、細菌由来のDNA含有量１０fg/μL未満のTaq DNA Polymeraseである、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
検体中の検出対象細菌種の検出及び／または同定方法において、
前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程と、
前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程と、
を有し、
前記プライマーとして請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプライマーセットまたは請求項９乃至２８のいずれか１項に記載のキットを用いることを特徴とする細菌種の同定方法。
【請求項３０】
請求項９〜２８のいずれか１項に記載されるキットを用いる請求項２９に記載の細菌種の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PCR、特にリアルタイムPCRを用いた検査法による細菌種の検出及び／または同定に有用なプライマーセット、細菌種の検出または同定用の該プライマーセットを含むキット、ならびにこれらを用いる細菌種の検出及び／または同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物検査は、研究現場、医療現場、食品製造現場等で必要とされている技術である。
医療現場、食品製造現場においては、従来、塗抹・鏡検・培養等がルーチンの検査法として実施されている。また、医療現場では、微生物の中には抗生剤耐性遺伝子を有する場合もあるため、併行して薬剤感受性試験が行われることも多い。しかしながら、培養等上記の一般的検査法は相当な時間（日単位）を要するため、近年、検査の迅速化・高感度化が求められ盛んに研究が行われている。特に、遺伝子解析に基づく公開データベースの蓄積により、病原遺伝子の解析、毒素遺伝子の解析、抗生物質耐性遺伝子の解析、系統発生学的視点によるrRNAをコードするDNA配列（rDNA）の解析などにより、検査手法も多様な発達を遂げている。
【０００３】
現在、遺伝子検査法としては、DNAプローブ法と遺伝子増幅法（PCR法）に大別されている。とりわけ、PCR法は、試料中に存在する微量のDNAを短時間で増幅することができ、かつ、DNAプローブ法に比して検出感度が高く、その分適用範囲が広い。
【０００４】
このような背景からPCRを用いた未同定の菌の検出について検討がなされており、敗血症起因微生物DNAの痕跡をPCRにより増幅し、増幅された起因微生物DNAを、経験的に想定した微生物に標的を定めた菌種固有のヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、起因微生物を検出及び細菌種の同定する試みがなされている（特開平6-90799号公報）。
【０００５】
さらに、検出及び細菌種の同定の迅速性を求めて、ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムPCRを基本原理とした敗血症検査技術開発が検討されている（生物試料分析，Vol.28,No5.(2005),400-40）。また、微生物DNAを鋳型として特定のプライマーセットを複数用いてPCRでの遺伝子増幅を行い、次いで得られる複数のDNA断片に応じた融解温度（Tm値）の組合せ、あるいは各Tm値間の差を解析することによる起因菌の迅速な検出及び細菌種の同定方法が検討されている（国際公開2007/097323号）。
【０００６】
しかしながら、短時間で得られる結果においても精度が担保されていなければならないため、PCRにおいては感度と特異度の高さを両立させることが重要と言える。これら先行技術はPCRによる遺伝子増幅技術を応用してはいるものの想定した標的微生物に限定された方法である。
【０００７】
一方、PCRに用いるDNAポリメラーゼを提供するために、遺伝子組み換え技術によるDNAポリメラーゼ調製物の製造方法が検討されている（特開2006-180886号公報）。真核生物を宿主として製造された耐熱性ＤＮＡ調製物を用いてPCR法により極微量の検体細菌DNAの増幅を行う際における非特異核酸増幅を抑制する方法が提案されている（国際公開第2010/082640号）。この真核生物を宿主として生産した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ調製物をＰＣＲに用いることによって、極微量の検体細菌の新規検査に好適な分析方法を提供することができ、当該技術は、極微量の検体細菌の分析方法としては、極めて画期的な技術である。
【０００８】
また、最新のリアルタイムPCR装置を用い、細菌から増幅された3種のDNA断片に対して、高解像度融解曲線分析（High Resolution Melting：HRM）により曲線を得、その形の組み合わせにより細菌種を判定する手法が提案されている（Journal of Clinical Microbiology 2009, p.2252-2255：Journal of Clinical Microbiology 2010, p. 3410-3413）。しかしながら、これらの文献には波形の一致、不一致を判定する明確な基準は開示されていない。また、上記の文献では60種の細菌の判定を実施しているが、DNA断片３種からのHRMによる曲線3種では100種を超えるような広範囲の菌種を同定することは困難であると推測される。同時に本手法ではDNAを抽出するためのサンプルとしては血液培養後の検体を使用しており、培養のために必要となるだけの時間がかかる手法となっている。
【０００９】
さらに同様にリアルタイムPCR装置を用い、増幅された16S rDNA断片と複数のプローブとのTm値を測定し、そのTm値をもとに細菌種を特定する方法が開示されている（Journal of Clinical Microbiology 2010, p. 258-267）。本手法においても、DNAを抽出するためのサンプルとしては血液培養後の検体を使用しており、培養のために必要となるだけの時間がかかる手法となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−９０７９９号公報
【特許文献２】国際公開２００７／０９７３２３号
【特許文献３】特開２００６−１８０８８６号公報
【特許文献４】国際公開第２０１０／０８２６４０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】生物試料分析，Vol.28,No5.(2005),400-40
【非特許文献２】Journal of Clinical Microbiology 2009, p.2252-2255
【非特許文献３】Journal of Clinical Microbiology 2010, p.3410-3413
【非特許文献４】Journal of Clinical Microbiology 2010, p.258-267
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献４に開示される技術に基づけば、簡便に極微量の検体細菌からのDNAを増幅し、短時間の内に分析、特に定量または同定分析することができれば、これまで解析不可能であった極微量レベルでの遺伝子についてまで解析可能になるばかりでなく、医療分野や獣医分野、生活用水や食品などの各種検体の分析分野においては迅速且つ正確な判断に繋がるものと考えられる。しかしながら、臨床現場、食品製造現場等からはより一層の検出感度向上や迅速性が求められている。
【００１３】
先に述べたとおり、PCR法を用いた検出方法は、DNAプローブ法に対して迅速性を有し、また、高感度検出にも適用しており、臨床現場、食品製造現場等においける迅速かつ高感度検出方法として有用である。しかしながら、従来のPCR法を用いた検出方法では、検体中に含まれる菌種が不明である場合に対応できない場合や、検出に必要な量の核酸を確保するための検体中の菌の増殖に時間を要するなど、より一層の検出感度の向上及び迅速性を達成するには十分に対応できない場合があった。
【００１４】
例えば、非特許文献４においては、培養などを経たのちの相当量の菌体量が分析に必要であることは、PCRに供する細菌DNAを2-10 ng用いていることからも伺われる。細菌として大腸菌を例とすると、大腸菌MG1655株のゲノムサイズは4639675 bpであり、そこから1塩基対の平均分子量、さらに1細菌細胞あたりゲノムは1コピー（1分子）であることを考慮、計算すると、大腸菌1細胞あたりのゲノムDNAは約5fgであり、PCRに供するDNA量に相当する細菌量が相当な量であることが伺われ、このことから、本手法の検出感度が十分でないことが想定される。
【００１５】
PCR法を用いて菌の検出や同定を行う場合において、検査の検出・同定感度を上げるためには、PCR法において用いるプライマーセットの選択が重要な要素の一つとなる。例えば、プライマーセットの選択によっては、PCRにおける増幅率、立ち上がりサイクル数、目的としない増幅産物の生産率等において異なり、検査の検出・同定感度を上げるためには、これらの各要件を最適化したプライマーセットが必要となる。検体の種類によっては、血液等由来の検体のように、検査対象となる細菌由来のDNA以外に、例えば血液検体の場合は白血球や剥離した上皮細胞などのヒト細胞に由来するDNAが大量に存在している場合もある。本発明者の検討によれば、このような検体において検査対象となる細菌のDNAの含有量が少ない場合に、PCR用のプライマーセットの検査対象となる細菌DNAに対する選択性、あるいはその増幅産物の生産率が低いと、検査対象の菌種の同定に必要な量の増幅産物の取得ができない場合や、目的としないDNAの増幅産物の量が多くなり同定のバックグランドの上昇を招く場合がある。特許文献４においては、PCR法を用いた検査対象となる細菌の同定に、真核生物を宿主として用いて生産された細菌由来のDNAの量を抑えた耐熱DNAポリメラーゼ調製物を用いることによって、特許文献４が対象としている従来技術による同定方法に対しては、同定感度の格段の向上を達成しているが、上記のように検査対象となる細菌のDNAの量が、大量に存在する検査対象となる細菌以外のDNAに対してさらに少ない検体においても、更なる高感度での同定を可能とする必要がある。このような観点からも、PCR法に用いるプライマーセットについて、目的としない増幅産物がない、選択性のより高いプライマーの設計が重要である。しかしながら、上述したような血液等の検体を検査対象とする際の技術課題に着目して設計されてプライマーセットは従来技術においては見当たらないのが現状である。
【００１６】
更に、増幅産物のTm値を用いて検出対象菌の分析や未同定菌の同定を行う場合には、検査の迅速性や検出感度を上げる上で好適なTm値を有する増幅産物が得られるプライマーセットを選択することが好ましい。
【００１７】
一方、PCR法での増幅に用いる耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の特性やその使用条件も、PCR法を用いた検査の検出感度を上げる上で重要な要素のひとつとなる。
【００１８】
PCR反応において一般的に使用される市販の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物の中には高純度精製調製物も市販されているが、これら高純度精製調製物を用いたPCR反応でも、高感度検出を行うために遺伝子増幅反応を通常の30サイクル程度を超えて行う必要がある場合などにおいては、原因不明、由来不明の増幅産物が検出されてしまい、その使用には限界があった。
【００１９】
特許文献４では、DNAポリメラーゼの宿主由来の細菌DNAの混入については触れられているが、その他試薬、器具からの汚染源である細菌由来DNAの混入については言及していない。ところが、試薬、器具からの汚染源である細菌由来DNAの混入は、極微量の検体中の細菌DNAの検出及び細菌種の同定において極めて重大な影響を及ぼすことが本発明者らの検討により判明した。
【００２０】
極微量の検体中の細菌由来DNAを増幅する場合のPCR分析において、感度と特異度を共により一層高く制御するための手段は、未だ提供されておらず、検体中の細菌由来のDNAを対象とした場合における細菌種の高感度な同定についても十分に達成できているとはいえない。
【００２１】
特許文献２に開示の真核生物を宿主として生産された耐熱性DNAポリメラーゼ調製物を用いる検出方法によれば、細菌由来のDNAの検出限界を10fg/μLまで下げることができ、従来のPCRをもちいた検出方法と比較して、より高感度での検体由来DNAの分析が可能となった。
【００２２】
特許文献２で開示されている方法によると、配列番号５１と配列番号５２を用いてPCR法をおこなうと10fg/μL以上の微生物DNAを検出することはできるが、10fg/μL未満の濃度のDNAについては検出することができない。このことから、ある溶液を鋳型として特許文献２で開示されている方法で配列番号５１と配列番号５２を用いてPCRをおこない目的産物の増幅が確認できなければ、その溶液に混入している細菌由来DNAの濃度が10fg/μL未満であることが確認できる。
【００２３】
検体中の細菌種の検出のみならず、検体中の細菌種の同定を高感度で高精度に行うには、細菌由来のDNA量の検出限界を下げることに加えて、細菌種同定に十分な量の検体由来のDNA増幅産物が得られることが必要となる。例えば、検体由来のDNAの増幅産物のTm値を測定することよって検体中の細菌種の同定を行う場合には、信頼性の高いTm値の測定結果を得るには、そのために十分な量の増幅産物がPCRによって得られることが重要となる。言い換えれば、十分なDNAの増幅が行われていない際には正確なTm値の測定を行うことができず、高精度な同定が難しくなる。
【００２４】
例えば、大腸菌1細胞あたりのゲノムDNAは約5fgであり、検出限界が10fg/μLである検出方法の場合は、理論上、PCRに供する試料１μL当たりのDNA量は大腸菌細胞２個相当分となり、検体中における大腸菌の高感度での検出を行うことが可能となる。これに対して、DNA増幅産物の信頼性のあるTm値を測定する上で最低限必要とされる検体中の大腸菌由来のDNA量、すなわち同定限界が20pg/μLであると仮定すると、PCRに供するDNA量に相当する細菌量が相当な量となることが伺われる。
【００２５】
本発明者における検討によれば、高感度での細菌種の検出が可能な測定系において、同定限界を更に下げて高感度での細菌種の同定を精度良く行うには、増幅産物の増幅率や選択性が更に向上したプライマーセットを用いることが有効であるとの新たな知見を得た。例えば、特許文献２及び特許文献４で用いられている全ての細菌の16SrRNA遺伝子に共通な配列部位からつくられたプライマーは同じ配列を有しており、これらの特許文献に開示のプライマーセットよりも増幅産物の増幅率や選択性が更に向上したプライマーセットを提供することができれば、細菌種の検出感度のみならず、細菌種の同定感度を更に向上させることが可能となる。
【００２６】
従って、本発明の目的は、PCR法による検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上のために有用なプライマーセット、これを用いたPCR用のセット及び検体中の細菌種の検出または同定方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的は、細菌由来の核酸の混入量を最小限として、上記のプライマーセットを用いたPCR法を行うことによって、検体中での細菌種の検出または同定における感度の更なる向上を達成することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定のプライマーセットを用いること、さらには、使用する試薬及び器具の汚染源である細菌由来DNAの混入を最小限とすることにより、極微量の検体中の細菌DNAの検出及び該細菌種の同定を高感度、高精度に実施することができる細菌種同定キットが得られることを見出した。
【００２９】
本発明にかかる細菌DNA増幅用のPCR用のプライマーセットは、後述する第Ｓ１群〜第Ｓ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする。
【００３０】
本発明にかかる細菌種検出用のキットは、後述する第Ｋ１群〜第Ｋ７群の各群毎に１つのプライマーペアを選択して得られた７つのプライマーペアのうちの、少なくとも１つのプライマーペアを含むことを特徴とする。
【００３１】
このキットは、プライマーセットの他に、ＰＣＲ用酵素、pH緩衝液、蛍光色素、dNTP、MgCl2及び測定用容器等から選択される試薬及び部品の少なくとも１つを更に有することができ、これらの個々又は全体として、細菌由来の核酸混入量が１０fg以下とすることができる。
【００３２】
本発明にかかる、検体中の検出対象細菌種の検出及び／または同定方法は、
前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程と、
前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程と、
を有し、
前記プライマーとして上記のプライマーセットを用いる
ことを特徴とする細菌種の検出及び／または同定方法である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、高感度での細菌種の検出及び／または同定に有用な細菌ＤＮＡ増幅ＰＣＲ用プライマーセット及び細菌種検出及び／または同定用のキットを提供することができる。更に、このキットに使用する試薬及び器具の汚染源である細菌由来DNAの混入を最小限とすることにより、細菌種の検出及び／または同定における感度を更に向上させることができる。従って、本発明によれば、医療分野、食品分野等における極微量の検体中の細菌由来DNAの検出及び細菌種の検出及び／または同定を、従来の検査キットよりも高感度、高精度に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】実施例２と比較例２での電気泳動の結果の一部を示す図である。
【図１Ｂ】実施例３と比較例３でのリアルタイムPCRの結果の一部（増幅曲線）を示すグラフである。
【図１Ｃ】実施例３と比較例３でのリアルタイムPCRでの結果の一部（融解曲線）を示すグラフである。
【図２】実施例１２における結果を示す図である。
【図３】実施例１３における結果を示す図である。
【図４】実施例１４における結果を示す図である。各線は以下のプライマーペアの増幅結果である。（１）配列番号１５と１６の組み合わせ。（２）配列番号４３と５０の組み合わせ。（３）配列番号５１と５２の組み合わせ。（４）配列番号５３と５７の組み合わせ。（５）配列番号６２と７０の組み合わせ。（６）配列番号８１と１０３の組み合わせ。（７）配列番号１１５と５の組み合わせ。
【図５】実施例１６における結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
＜Primer＞
本発明における第一のポイントは、検出感度向上及びそれに基づく同定精度向上という効果が享受できる特定のプライマーセットにある。
【００３６】
特許文献４に記載のプライマーセットにおける各プライマーは、細菌の16S rRNAをコードするDNA（16S  rDNA）における細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を有する（配列番号１、配列番号１６、配列番号２８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７６、配列番号９１、配列番号１０４、配列番号２）。しかしながら、図１Ａのレーン２に示される通り、特許文献４に記載のプライマーセットでは、電気泳動分析において分析対象物以外のバンドが出現したりまた目的の増幅産物が検出できなかったり、また、リアルタイムPCRにおいて増幅効率が低いものが散見されたり（図１Ｂの点線参照）、リアルタイムPCRでの融解曲線分析においてメインのピーク以外のピーク（又は肩）が出現した（図１Ｃの点線参照）。これらは、極微量の検体由来DNAの検出及び細菌種の同定における更なる検出感度の向上において障害となる場合がある。
【００３７】
16S rDNA上の細菌共通の保存領域は複数存在するが、特許文献２に記載のプライマーセットが認識する７領域内について検討を行った。具体的には、特許文献２に記載のプライマーセットを基準に、共通保存領域の3’末端側及び5’末端側に数塩基〜数十塩基分ずれた範囲であり、かつ十〜数十塩基分のプライマーをForward, Reverseそれぞれにつき各種設計した。設計した７つの保存領域に相当する複数のプライマーペアについて、効果を確認したところ、以下の第Ｓ１群〜第Ｓ７群に分類されるプライマーペア並びに第Ｋ１群〜第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。
【００３８】
そこで、第Ｓ１群〜第Ｓ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つの第１〜第７の選択されたプライマーペアの群のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも４つによって細菌種の検出及び／または同定に利用し得る細菌ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ用のプライマーセットとした。なお、第１〜第７の選択されたプライマーペアの内の少なくとも４つのプライマーペアを用いることによって細菌種同定用のプライマーセットとすることができる。
（プライマーセット用プライマーペア）
第Ｓ１群：
１−１Ａ：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−２Ａ：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−３Ａ：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−８Ａ：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１９〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−９Ａ：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１−１０Ａ：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１、２３、２４、２６及び２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ２群：
２−１Ａ：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−６Ａ：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−７Ａ：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５、４７及び４８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−８Ａ：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−９Ａ：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１０Ａ：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１２Ａ：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４８及び５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１４Ａ：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１５Ａ：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４８及び４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
２−１６Ａ：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４６〜４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ３群：
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ４群：
４−１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４−４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ５群
５−１Ａ：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−５Ａ：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７２、７３及び７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−６Ａ：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５−８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｓ６群
６−１Ａ：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９３、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−４Ａ：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び
１００〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１１Ａ：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６−１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｓ７群
７−１Ａ：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８〜１２５、１２７、１２８、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−２Ａ：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５及び１１８〜１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−３Ａ：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６及び１１８〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−４Ａ：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−５Ａ：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２０及び１２３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−６Ａ：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、１１８〜１２２、１２４及び１２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−７Ａ：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１８、１２０、１２１、１２４及び１２６〜１３０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−８Ａ：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１８〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−９Ａ：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６、及び１１８〜１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１０Ａ：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１８〜１２６、１３０及び１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１１Ａ：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列
からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７−１２Ａ：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２及び５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
更に、細菌種検出用キットを構成するプライマーペアとしては、以下の第Ｋ１群〜第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。
【００３９】
そこで、第Ｋ１群〜第Ｋ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つの第１〜第７の選択されたプライマーペアの群のうちの少なくとも１つ用いて、好ましくは少なくとも４つによって細菌種の検出及び／または同定用のキットを構成することができる。なお、第１〜第７の選択されたプライマーペアの群の内の少なくとも４つのプライマーペアを用いることによって細菌種同定用のキットとすることができる。
【００４０】
（キット用プライマーペア）
第Ｋ１群：
１−１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１と２３〜２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１−１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ２群：
２−１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４６及び４８〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
または
２−１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ３群：
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ４群：
４−１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４−４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ５群
５−１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５−８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ６群
６−１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６−１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア
第Ｋ７群
７−１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７−１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５〜１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【００４１】
上記の第Ｓ１群〜第Ｓ７群から選択されるプライマーペアを含むプライマーセットは、以下のＳ−１）〜Ｓ−７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
Ｓ−１）第Ｓ１群のプライマーセットとして、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ−２）第Ｓ２群のプライマーセットとして、配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ−３）第Ｓ３群のプライマーセットとして、配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ−４）第Ｓ４群のプライマーセットとして、配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ−５）第Ｓ５群のプライマーセットとして、配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｓ−８）第Ｓ６群のプライマーセットとして、配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
Ｓ−７）第Ｓ７群のプライマーセットとして、配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【００４２】
更に、上記のプライマーセットは、前記Ｓ−１）〜Ｓ−７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが細菌種検出用として好ましく、以下のＡ〜Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種検出及び／または同定用として好ましい。
（Ａ）前記Ｓ−１）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｓ−２）〜Ｓ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記Ｓ−２）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記Ｓ−１）及びＳ−３）〜Ｓ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記Ｓ−３）のプライマーペアを必ず含む場合に、Ｓ−１）、Ｓ−２）及びＳ−４）〜Ｓ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記Ｓ−４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ−１）〜Ｓ−３）及びＳ−５）〜Ｓ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記Ｓ−５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ−１）〜Ｓ−４）及びＳ−６）〜Ｓ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記Ｓ−６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ−１）〜Ｓ−５）及びＳ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記Ｓ−７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｓ−１）〜Ｓ−６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
【００４３】
上記の第Ｋ１群〜第Ｋ７群から選択されるプライマーペアを含むキット用のプライマーセットは、以下のＫ−１）〜Ｋ−７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
Ｋ−１）第Ｋ１群のプライマーセットとして、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ−２）第Ｋ２群のプライマーセットとして、配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ−３）第Ｋ３群のプライマーセットとして、配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ−４）第Ｋ４群のプライマーセットとして、配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ−５）第Ｋ５群のプライマーセットとして、配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
Ｋ−６）第Ｋ６群のプライマーセットとして、配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
Ｋ−７）第Ｋ７群のプライマーセットとして、配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【００４４】
更に、上記のキット用のプライマーセットは、前記Ｋ−１）〜Ｋ−７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが細菌種検出用として好ましく、以下のＡ〜Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種検出及び／または同定用として好ましい。
（Ａ）前記Ｋ−１）のプライマーペアを必ず含む場合において、前記Ｋ−２）〜Ｋ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記Ｋ−２）のプライマーペアを必ず含む場合において、前記Ｋ−１）及びＫ−３）〜Ｋ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記Ｋ−３）のプライマーペアを必ず含む場合に、Ｋ−１）、Ｋ−２）及びＫ−４）〜Ｋ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記Ｋ−４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ−１）〜Ｋ−３）及びＫ−５）〜Ｋ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記Ｋ−５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ−１）〜Ｋ−４）及びＫ−６）〜Ｋ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記Ｋ−６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ−１）〜Ｋ−５）及びＫ−７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記Ｋ−７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記Ｋ−１）〜Ｋ−６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
【００４５】
上記のプライマーセットにおいてＳ−１〜Ｓ−７のプライマーペアの内の４つを組み合わせて用いることによって、細菌種の同定を行うことができ、これらの７つのプライマーペアから選択される組数を５以上に増やすことが好ましく、Ｓ−１〜Ｓ−７の７つのプライマーペアの全てを組み合わせることがより好ましい。このように、選択されるプライマーの組数を増やすことで同定精度を更に向上させることができる。
【００４６】
同様に、上記のキット用のプライマーセットにおいてＫ−１〜Ｋ−７のプライマーペアの内の４つを組み合わせて用いることによって、細菌種の同定を行うことができ、これらの７つのプライマーペアから選択される組数を５以上に増やすことが好ましく、Ｋ−１〜Ｋ−７の７つのプライマーペアの全てを組み合わせることがより好ましい。このように、選択されるプライマーの組数を増やすことで同定精度を更に向上させることができる。
【００４７】
また、本発明の効果を享受できる範囲内であれば、配列中の一部の塩基を変換したものも適用できる。原則、本願の請求項記載の配列番号の各DNA断片の相補鎖とハイブリダイズ可能なものであれば本発明のプライマー同等とみなされるが、塩基配列において１〜２個の塩基が付加、欠失又は置換した塩基配列であれば本発明のプライマーと同等であると解される。
【００４８】
本発明のプライマーセットは、相当量の組合せに基づき効果の有無を確認のうえ初めて見出したものであり、単なる効果の追認のレベルでは到底なしえないものであること、また、配列検索の結果、細菌種検出及び／または同定用プライマーセットとして新規な組合せであることを確認していること、を付記する。
【００４９】
本発明は、本発明のプライマーセット以外に、真菌、特定微生物又はウイルスについての公知のプライマーを複数併用することを妨げるものではない。
【００５０】
本発明のプライマーセットは、検体から抽出された細菌DNAからPCRにより目的とするDNA断片を増幅し、増幅されたDNA断片のTmを測定したり、分子量を測定したり、配列を解読する目的で好適に用いられる。具体的には、本発明のプライマーセットによって増幅されるBacteriaの16S rDNA配列の一部からなるDNA断片のTm値によって細菌種を同定するために好適に用いられる。
【００５１】
PCRでのDNA増幅、Tm測定において、プライマーセット用またはキット用の前記第１〜第７のプライマーペアのうち１つ以上のプライマーペアを使用する前に、16S rDNA上の細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を含む、塩基数が15〜30bのForward及びReverseプライマーペアによりあらかじめ目的とする配列を含むDNAを増幅し、該増幅された試料について前記プライマーセットによりさらにPCR増幅してもよい（いわゆる、Nested PCR法およびSemi-nested PCR法）。
【００５２】
１回目のPCRによるDNA増幅に用いる、塩基数が15〜30bのForward及びReverseプラマーは、16S rDNA配列上の細菌共通の保存領域にハイブリダイズするDNA配列を含むものであれば特に限定されないが、そのプライマーペアを用いてのPCR産物のDNA鎖長が500bp〜1500bpであることが好ましい。特に、２回目の増幅に用いられるプライマーセット、具体的には第K1群からK7群に記載のプライマーペアがハイブリダイズし、そこから少なくとも4つ以上のDNA断片が得られるようなDNA産物を生じるプライマーが好ましい。
【００５３】
本発明に使用されるプライマーセットは、極微量の検体細菌DNAの検出及び／または細菌種の同定に好適に使用される。そのため、各プライマーペア中に汚染源である細菌由来DNAの混入が最小限に抑えられている必要がある。汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、プライマーペア調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。
【００５４】
PCRにおけるPrimer濃度は特に限定されないが、一般的には0.05μM〜1.0μMの範囲で、検討に応じて適宜設定する。
【００５５】
＜試薬＞
本発明でPCR分析のために使用されるプライマーセット以外の試薬は、公知のものを公知の組合せにより使用することができる。測定に必要な試薬は、PCR用の酵素、pH緩衝液、dNTP、Mg2+源、ろ過処理などにより精製された滅菌水が挙げられる。また、リアルタイムPCR分析においては蛍光色素が上記に加えて必要となる。
【００５６】
＜PCR用の酵素＞
本発明において使用されるPCR用の酵素としては、細菌由来のDNA混入量を最小限にとどめた耐熱性DNAポリメラーゼを用いることが好ましい。具体的には、真核生物で生産されたもの、高度精製処理されたもの、又は選択的膜透過性色素であるＥＭＡ（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）により処理されたものが挙げられるが、この限りではない。
【００５７】
本発明における、宿主又は汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、酵素調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。なお、細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子を利用して真核生物で生産され、細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子からのDNAが混入している状態の耐熱性DNAポリメラーゼ調製物（調製液）を用いる場合には、耐熱性DNAポリメラーゼをコードする遺伝子以外の細菌由来のDNAの混入量を上記の上限以下とする。ＰＣＲ用酵素は、細菌由来のDNA含有量１０fg/μL未満のTaq DNA Polymeraseであることが好ましい。
【００５８】
本発明において使用されるPCR用の酵素をコードする遺伝子は、耐熱性DNAポリメラーゼをコードするcDNA、ゲノムDNA、合成DNAなどいかなる遺伝子であってもよく、また１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよく、天然、あるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。更に耐熱性DNAポリメラーゼが生物由来である場合には、該耐熱性DNAポリメラーゼの由来についても特に限定されない。
【００５９】
本発明で用いられる耐熱性DNAポリメラーゼの具体例としては、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Thermococcus gorgonarius）、サーモコッカス・コダカラエンシスKOD１（Thermococcus kodakaraensis KOD１）、パイロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）パイロコッカス・フリオシス（Pyrococcus furiosus）、エアロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）、アクイフェックス・アエオリカス（Aquifex aeolicus）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）、パイロロバス・フマリ（Pyrolobus fumarii）、またはメタノパイラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来の耐熱性DNAポリメラーゼを挙げることができる。
【００６０】
また、耐熱性DNAポリメラーゼは遺伝子工学的に人工的に合成された耐熱性DNAポリメラーゼであってもよい。
【００６１】
本発明で使用されるPCR用の酵素は、好ましくは耐熱性を有する生物由来の耐熱性DNAポリメラーゼであり、より好ましくはメタン菌、好熱好酸菌、好熱菌、超好熱菌などの原核生物由来のものである。
【００６２】
（真核生物生産）
本発明に使用されるPCR用酵素としては、真核生物を宿主として生産された酵素であることが好ましい。
【００６３】
真核細胞としては菌類、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、宿主細胞としては真核生物由来の細胞であれば良く、特に限定はされない。
【００６４】
菌類としては酵母やカビなどの子嚢菌、糸状菌、担子菌、接合菌などが挙げられ、中でも酵母または糸状菌が好ましく、具体例として、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クライベロマイセス属（Kluyveromyces）、チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、トリコスポロン属（Trichosporon）、ロドスポリジウム属（Rhodosporidi）、アスペルギルス属（Aspergillus）、フザリウム属（Fusarium）、トリコデルマ属（Trichoderma）などが挙げられる。
【００６５】
具体的には、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・ボイディニ（Candida boidini）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulans)、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、及びトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）などを挙げることができる。
【００６６】
動物細胞としてはヒト由来培養細胞、マウス由来培養細胞などが挙げられ、具体例としてはCHO細胞、Hela細胞などが挙げられる。植物細胞としては、植物より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、タバコ(Nicotiana)属細胞、シロイヌナズナ(Arabidopsis)属細胞、サツマイモ(Ipomoea)属細胞、ニンジン(Daucus)属細胞、イネ(Oryza)属細胞などが挙げられ、具体的にはNicotiana tabacum BY-2培養細胞、Arabidopsis thaliana培養細胞、Ipomoea batatas培養細胞、Daucus carota培養細胞、Oryza sativa培養細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては、昆虫より誘導した細胞であればよく、望ましくは株化された培養細胞であり、ハスモンヨトウ近似種Spodoptera frugiperdaの 卵巣細胞由来培養細胞sf９株、sf21株、カイコ(Bombix mori)培養細胞Bm-N株などが挙げられる。宿主細胞として好ましくは、酵母などの増殖が早い微生物あるいは真核生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母、Nicotiana tabacumなどのタバコ(Nicotiana)属植物の培養細胞をはじめとする植物細胞、アスペルギルス・オリザなどのアスペルギルス（Aspergillus）属を始めとする糸状菌が挙げられる。
【００６７】
製造方法は特に限定されないが、例えば、特許文献４に記載の方法に準じて適宜製造することができる。
【００６８】
（高度精製処理）
また、大腸菌等の細菌を宿主として生産された一般の酵素であっても、DNA分解酵素やイオン交換樹脂などを用いて宿主細菌由来のDNAを物理的に除去する高度に精製処理を施したものであって、汚染源である細菌由来DNAの混入量を酵素調製液に対して10fg未満としたものであれば、本発明に用いることができる。
【００６９】
（選択性膜透過性色素による処理）
PCR用の酵素について、選択性膜透過性色素であるEMA（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）と混合し光照射することにより、汚染源である細菌由来DNA、特に死菌細菌由来DNAを不活化することができる。不活化したDNAは、PCRによる増幅が起こらないため、検体に存在する検出の対象となる細菌由来のDNAのみ検出及び細菌種の同定することが可能となる。処理条件は、当該試薬及び当該試薬処理剤の製造販売メーカーの推奨条件に従う。
【００７０】
＜その他試薬、器具等＞
pH緩衝液は、PCR分析に供する試料として、pH=7.0〜10.0（より好ましくは、pH8.0〜9.0）に調整するために用いられる。具体的には、Tris塩酸緩衝液などが挙げられる。例えば、Tris塩酸緩衝液の場合、5mM〜100mMで使用する。
【００７１】
dNTPは、PCRによるDNA増幅のためのヌクレオシド源であり、dATP、dGTP、dCTP、dTTPの４種類が必要である。また、dNTPは、ホットスタート法に用いるために化学修飾されたもの、例えばTriLink BioTechnologies, Inc.製、CleanAmpTM dNTPを用いても良い。使用量は、dATP、dGTP、dCTP、dTTPを各々0.2mM前後の濃度で使用する。
【００７２】
PCRによるDNA増幅においては、Mg2+が必要である。Mg2+源としては、MgCl2、MgSO4などが挙げられる。好ましいのはMgCl2であり、その使用量は、0.5mMから5.0mMの範囲で検討に応じて適宜使用する。
【００７３】
蛍光色素は、リアルタイムPCRによるDNA増幅産物の検出、さらには、増幅されたDNA断片のＴｍ測定の目的で用いられ、種々の公知のものが利用できる。例えば、標識機能を有するインターカレーターを用いる方法や、増幅するDNA配列に対し特異的にハイブリダイズするヌクレオチドに蛍光物質を結合したプローブを用いる方法などが挙げられる。インターカレーターとしては、不飽和型蛍光色素であるエジチジウムブロマイド、サイバー・グリーンＩ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）や飽和型蛍光色素であるResolight  (Roche社製)、EvaGreen（Biotim社製）などが挙げられる。好ましいインターカレーターは、不飽和型蛍光色素であるサイバー・グリーンＩ、飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolight、より好ましくは飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolightである。使用量は、使用する蛍光色素の製造販売メーカーの推奨に従う。
【００７４】
その他キットには、PCRの陽性対照として使用する細菌のゲノムDNAや、陰性対照として使用する滅菌水が含まれていてもよい、
本発明において用いられるPCR分析測定用容器（例えば分析測定用チューブ）としては、測定機器に応じた形状や構造を有するものを選択して用いることができる。測定機器の入手先によって推奨されたものを用いれば、特に問題なく測定に用いることができる。
【００７５】
本発明を実施するに際してその他に必要な器具としては、ピペット、ピペット用チップ、1.5mlマイクロチューブなど広く分子生物学の実験に使用される器具類が挙げられ、装置類としてはPCR、クリーンベンチ、チューブ用遠心機など広く分子生物学の実験に使用される機器が挙げられる。
【００７６】
＜コンタミレベル＞
本発明における第二のポイントは、検出及び/または同定に使用するプライマーを含めPCR測定用に調製した試料液全体としての汚染源である細菌由来DNAの混入レベルを極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定を妨げないレベルまで下げることにある。
【００７７】
特許文献４には、耐熱性ポリメラーゼ調製液中の細菌由来DNAの混入量として、10fg以下が好ましい旨記載されている。しかしながら、本発明者らが検討した結果、試薬・器具中の細菌汚染についても、極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定においては極めて重要なファクターであることを見出した。市販の試薬・器具をそのまま用いて分析に供した場合、ときによって、PCRでの増幅が見られるケースが散見された（比較例11）。
【００７８】
本発明においては、使用される各試薬はもちろんのこと、測定用調製液作製のために使用される器具、ろ過水についても、汚染源である細菌由来DNAの混入を抑えることが必要である。器具については、環境からのDNAの混入を遮断した、例えばクリーンルーム等の作業空間中で、DNA混入の無いDNAを溶解する洗浄水で器具を洗浄し、洗浄後の洗浄水をPCR法による分析にかけることで、DNAの混入を検査することができる。必要に応じて、この方法を用いてＤＮＡの混入の有無を検査してもかまわない。
【００７９】
本発明における、汚染源である細菌由来DNAの混入量としては、同定キット全体に対して10fg以下、好ましくは5fg以下、さらに好ましくは1fg以下である。それぞれの試薬・器具に対しては、後述のキットの態様にもよるが、個別の調製液に対して10fg未満、好ましくは5fg未満、さらに好ましくは1fg未満である。汚染源である細菌由来DNAの混入量をこのレベルに抑えることにより、極微量の検体細菌の検出及び細菌種の同定に必要なPCR分析にける30サイクル以上の増幅を実行しても、不要なピークの出現やTm値のずれなど無く、高感度、高精度に細菌種の検出及び細菌種の同定ができる。
【００８０】
＜コンタミ除去方法＞
本発明で使用する試薬・器具について、汚染源である細菌由来DNAの混入を抑える方法としては、ＵＶ照射処理、ガンマ線滅菌処理、限外ろ過処理、ＥＭＡ処理等が挙げられる。受入検査等により汚染源である細菌由来DNAの混入量が10fg以下であることが明確な場合には、必ずしも以下の処理を行う必要はない。
【００８１】
（ガンマ線滅菌処理）
本発明で使用する試薬・器具について、ガンマ線を直接照射することにより、汚染源である細菌由来DNAを破壊することができる。ガンマ線照射条件については、被照射物の種類により異なる。一般的には、5kGy〜30kGy、好ましくは10kGy〜25kGyの処理が適用される。
【００８２】
ただし、Resolight、EvaGreen、サイバーグリーンＩなど特定の蛍光色素、プライマー、ポリプロピレンなど特定の材質の器具に対しては、ガンマ線照射により劣化が生じるため、条件によってはガンマ線滅菌処理を適用できない。後述する実施例１５は、ガンマ線滅菌処理の効果について示したものである。
【００８３】
（限外ろ過処理）
本発明で使用する試薬について、限外ろ過処理をすることにより、汚染源である細菌由来DNAを分離除去することができる。具体的には、汚染源である細菌由来DNAが細菌そのものであったり、ゲノムDNAである場合、その分子量は大きなものであることから、使用する試薬などは限外ろ過膜を通過し、ゲノムDNAは限外ろ過膜を通過しないよう、膜を選定の上、限外ろ過を実施すればよい。限外ろ過膜としては、分画分子量が1kDa〜1000kDa、好ましくは、10kDa〜100kDa、より好ましくは30kDa〜50kDaである膜を用いることが好ましい。ただし、プライマーを限外ろ過処理する場合には、限外ろ過膜の分画分子量は10kDa〜1000kDa、好ましくは30kDa〜100kDa、より好ましくは、30kDa〜50kDaである膜を用いる。限外ろ過膜の材質としては、特に限定されないが、再生セルロース、セルロースアセテート、ポリエーテルスルホンなどが挙げられる。限外ろ過のための圧力源としては、気体加圧、遠心等いずれの方法を用いても良いが、処理量に応じて好ましい方法が選択される。
【００８４】
処理量が少ない場合には、遠心膜ろ過処理が好ましい。遠心膜ろ過処理の場合の、処理液量や遠心操作時の遠心力（Ｇ）は、使用するろ過装置の製造販売メーカーの推奨に従う。
【００８５】
後述する実施例１３、実施例１４及び比較例１０、比較例１１は、遠心式膜ろ過処理の効果について示したものである。
【００８６】
（選択性膜透過性色素処理）
試薬・器具について、選択性膜透過性色素であるEMA（ethidium monoazide）やPMA（propidium monoazide）で処理し光照射することにより、汚染源である細菌由来DNA、特に死菌細菌由来DNAを不活化することができる。不活化したDNAは、PCRによる増幅が起こらないため、検体に存在する検出対象となる細菌由来のDNAのみ検出及び細菌種の同定することが可能となる。
【００８７】
処理条件は、当該試薬及び当該試薬処理剤の製造販売メーカーの推奨条件に従う。例えば、タカラバイオ社の”Viable Bacteria Selection Kit for PCR”では、処理対象とする溶液40μlに対して、添付のSolution A-gn液10 μl、Solution B-gn液5μlを添加し、５〜１５分間遮光下で静置・反応させた後、約５分間光照射することが開示されている。後述する実施例１６は、ＥＭＡ処理の効果について示したものである。
＜キットの態様＞
本発明の細菌種同定キットは、本発明のプライマーセットによって増幅される細菌の16S rDNA配列の一部からなるＤＮＡ断片を解析することで細菌種を同定するためのキットである。DNA断片の解析はDNA断片の分子量解析や、Ｔｍ値測定などが上げられる。好ましくはＴｍ値測定であり、その目的においてはリアルタイムPCRが好適に使用される。分子量の解析は、電気泳動や質量分析計などにより解析可能である。
【００８８】
細菌種検出用キットを構成するプライマーペアとしては、以下の第Ｋ１群〜第Ｋ７群に分類されるプライマーペアが好適であることが判明した。そこで、第Ｋ１群〜第Ｋ７群の各群のそれぞれから１つのプライマーペアを選択し、こうして得られた７つのプライマーペアの少なくとも１つを、好ましくは少なくとも４つを用いて、細菌種の検出用のキットとした。
【００８９】
（キット用プライマーペア）
第Ｋ１群：
１−１：配列番号１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−２：配列番号１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１８、２０及び２１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−３：配列番号１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２１と２３〜２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−４：配列番号１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−５：配列番号１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−６：配列番号１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−７：配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−８：配列番号６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−９：配列番号７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
１−１０：配列番号８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６〜２７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
１−１１：配列番号９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６、１７、１９及び２６のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ２群：
２−１：配列番号２８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５及び配列番号４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−２：配列番号２９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４、４５、４７、４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−３：配列番号３０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマー
ペア、
２−４：配列番号３１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４６及び４７のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−５：配列番号３２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５及び４７〜４９のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−６：配列番号３３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−７：配列番号３４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−８：配列番号３５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−９：配列番号３６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４６及び４８〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１０：配列番号３７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４５〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１１：配列番号３８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１２：配列番号３９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つのリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１３：配列番号４０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１４：配列番号４１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２−１５：配列番号４２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
または
２−１６：配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４〜４８及び５０のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ３群：
配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ４群：
４−１：配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−２：配列番号５４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４−３：配列番号５５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び号６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
４−４：配列番号５６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７〜５９及び６１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ５群
５−１：配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０、７１及び７３〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−２：配列番号６３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−３：配列番号６４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−４：配列番号６５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−５：配列番号６６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−６：配列番号６７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５−７：配列番号６８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
５−８：配列番号６９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０〜７５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ６群
６−１：配列番号７６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−２：配列番号７７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−３：配列番号７８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−４：配列番号７９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−５：配列番号８０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１００〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−６：配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−７：配列番号８２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−８：配列番号８３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−９：配列番号８４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１０：配列番号８５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１１：配列番号８６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９３、９７及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１２：配列番号８７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１３：配列番号８８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６−１４：配列番号８９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
６−１５：配列番号９０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９１、９２、９６及び１０１〜１０３のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせからなるプライマーペア、
第Ｋ７群
７−１：配列番号１０４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−２：配列番号１０５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−３：配列番号１０６の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−４：配列番号１０７の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−５：配列番号１０８の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−６：配列番号１０９の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−７：配列番号１１０の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−８：配列番号１１１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−９：配列番号１１２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１０：配列番号１１３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１１６〜１３１のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
７−１１：配列番号１１４の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５及び１２５のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、または
７−１２：配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２、５、１１６、１１８、１２３及び１２５〜１２８のいずれか１つの配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【００９０】
上記のプライマーセット及びキットは、以下の１）〜７）の７つのプライマーペアのうち、少なくとも１つのプライマーペアを含むことが好ましい。
１）配列番号１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
２）配列番号４３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
３）配列番号５１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５２の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
４）配列番号５３の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５７の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
５）配列番号６２の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７０の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、
６）配列番号８１の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０３の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア、及び
７）配列番号１１５の配列からなるフォワードプライマーと、配列番号５の配列からなるリバースプライマーの組み合わせからなるプライマーペア。
【００９１】
更に、上記のキットは、前記１）〜７）のプライマーペアのいずれか１つを必須成分として含むことが好ましく、以下のＡ〜Ｇのいずれか１つの組み合わせを含むことが細菌種同定用として好ましい。
（Ａ）前記１）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記２）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｂ）前記２）のプライマーセットを必ず含む場合において、前記１）及び３）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｃ）前記３）のプライマーペアを必ず含む場合に、１）、２）及び４）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｄ）前記４）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）〜３）及び５）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｅ）前記５）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）〜４）及び６）〜７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｆ）前記６）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）〜５）及び７）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
（Ｇ）前記７）のプライマーペアを必ず含む場合に、前記１）〜６）から選択される少なくとも３つのプライマーペアを更に含む。
【００９２】
本発明にかかる細菌種の検出及び／または同定キットは、上述したプライマーペアの１つ以上を含んで構成される。このプライマーの他に、必要に応じて、PCR用の酵素、pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)及び滅菌水から等の試薬、PCR分析測定用容器（例えば分析測定用チューブ）やその他に必要な器具などの部品から選択される少なくとも１種の試薬及び／または部品を含むことができる。更に、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を成分として加えることができる。また、PCR法の各種態様によっては、これらの成分の他に用いるPCR法に必要な成分をキットに加えてもよい。これらの各試薬または各部品は、個別に、またはその一部毎に、あるいは全部が一体など、いかなる形態で包装されていても良い。具体的には、例えば以下のような態様である。
１）用いる試薬毎に個分けする。
２）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素を予め混合したもの、プライマー対及び酵素の３つに小分けする。
３）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、プライマー対を予め混合したもの、及び酵素の２つに小分けする。
４）pH緩衝液、MgCl2、dNTP(又はCleanAmp-dNTP)、リアルタイムPCRでの解析においては蛍光色素、プライマーと酵素、全てを予め混合する。
【００９３】
上記キットは、全体として汚染源である細菌由来のDNAの混入量が10fg以下であり、使用される酵素は、真核生物生産、高度精製処理又はＥＭＡなど選択性膜透過性色素処理を施されたものであり、使用される試薬・器具（PCR分析用チューブを含む）は、必要に応じて、個別又は全体として、ガンマ線滅菌処理、遠心式膜ろ過処理又は選択性膜透過性色素処理を施されたものである。各試薬及び部品の包装に当たっては、包装密封後の包装内における細菌由来のDNAの混入量が10fg以下となるように各種処理を行う。
【００９４】
＜用途分野・検体＞
本発明の細菌種検出及び／または同定キットは、医療分野、食品分野、環境分析等、様々な分野における細菌の検出及び細菌種の同定に使用することができる。特に、医療分野においては、感染症における感染菌を検出及び／または細菌種の同定することができるため有用である。
【００９５】
細菌検査に供される検体としては、特に限定されず広範囲な検体に適用可能である。具体的には、医療分野においては、血液、髄液、涙液、羊水、その他体液、カテーテル等医療器具付着物などが挙げられる。血液、羊水、髄液については、重篤な感染症の原因菌検出において特に有用である。食品分野においては、食品自体、生産途中の液体、又は固体試料、製造工程内の機器付着物などが挙げられる。
【００９６】
＜DNA抽出処理＞
本発明の同定キットを用いて検体中の細菌の検出及び／または細菌種の同定を実施する場合、検体中に存在するであろう細菌からあらかじめDNAを抽出しておく必要がある。DNA抽出方法としては、現在、アルカリ溶解法、ボイリング法、フェノール抽出法などが知られており、また、メーカー各社から専用のDNA抽出キットも販売されている。
【００９７】
本発明におけるDNAの抽出方法は特に限定されないが、検体により最適な方法は異なるため、対象検体に相応した方法を選択することが望ましい。なお、本願実施例において使用しているキアゲン社製QIAamp DNA Mini Kitやロシュ社製High pure PCR template preparation kitは好適に使用可能なDNA抽出方法の一例である。また、キアゲン社製QIAamp DNA Mini Kitのマニュアルにあるように、溶出量は必要に応じて５０mｌから２００mlの中で変えることができる。
【００９８】
＜PCR分析＞
本発明のプライマーセット又はキットは、PCR法において使用される。PCR法としては、検体細菌を検出するための目的遺伝子の増幅のためのPCR法であれば種々のPCR法を利用できる。好ましい分析法としては、リアルタイムPCRであり、より好ましくはリアルタイムPCRとTm測定のための解曲線分析の組み合わせである。この場合、使用するリアルタイムPCR機器のスペックとしては、温度制御能が±0.1℃であることが好ましい。以下、PCRおよびリアルタイムPCRとそれを用いたTm測定の具体例を列記する。
【００９９】
PCRおよびリアルタイムPCRにおいては、装置、手法など通常知られたものを使用すればよい。
【０１００】
PCRにおける温度サイクルの条件（温度、時間、昇降温速度、サイクル数）は特に限定されず、使用するプライマーや酵素、鋳型などの性質やPCR後のDNA検出方法の感度に応じて適宜設定すればよい。こうした条件の設定については多くの文献が既に知られている。
【０１０１】
PCRにおいて、一般的には、鋳型二本鎖DNAの熱変性ステップ、プライマーのアニーリングステップ、酵素によるDNA伸長ステップを繰り返す。熱変性のステップは鋳型二本鎖DNAが一本鎖に解離する温度と時間であればよく、例えば90℃〜98℃で数秒〜数分を設定する。またPCR開始時にはその1回目のサイクルにのみ、数分〜10分の熱変性の過程を追加することも多い。プライマーのアニーリングステップはプライマーの塩基配列、塩基数に応じ設定するが、40℃〜72℃で数秒〜数十秒を設定することが多い。DNA伸長ステップにおいては、温度については酵素の最適温度などの性質に応じ、例えば、58℃〜76℃が一般的であり、DNA伸長ステップの時間については増幅させたいDNAの鎖長と酵素のDNA合成速度から必要時間を概算し設定する。熱変性、アニーリング、伸長のステップを繰り返すことで目的のDNAを増幅させるが、この繰り返し回数は、鋳型DNAの量や、酵素の量、PCR後のDNA検出方法の感度に応じて、適宜変更すればよいが、一般的な例として10〜50回が例示される。また、アニーリングの温度とDNA伸長の温度が同程度である場合、両ステップを同時に行うことも可能である。
【０１０２】
リアルタイムPCRにおいても、DNA増幅に必要な熱変性、アニーリング、DNA伸長についての条件設定、さらにはそれらのステップの繰り返し回数は、上記のPCRについての記載と同様である。リアルタイムPCRにおいては、DNA伸長のステップの前後などに、インターカレーターやプローブに由来する蛍光強度を測定することで増幅されたDNA量を定量ないしは見積もることが可能である。蛍光強度を測定する温度は使用するプローブの種類などに応じて適宜変更可能である。蛍光強度を測定する温度は、例えばインターカレーターを用いての実施の場合は、DNA伸長時の温度そのままでも良く、また、増幅される目的DNAの鎖長が比較的長く、そのTm値が比較的高い場合には、プライマーダイマーなどの比較的鎖長が短い非特異的に増幅された目的外DNA（非特異的増幅DNAともいう）はそのTm値が比較的低いことを利用して、目的DNAのTm値と非特異的増幅DNAのTm値の中間値をはじめとする、これらの間の温度に設定しても良い。こうすることで、特にインターカレーターを用いての実施ではプライマーダイマーなどの非特異的増幅DNAのみが二本鎖から一本鎖に解離し、蛍光強度から定量ないしは見積もられるDNA量は目的DNAについてのものとすることが可能である。
【０１０３】
さらに、リアルタイムPCRにおいてはDNA増幅工程の終了後、融解曲線解析により、増幅されたDNAのTmを測定できる。融解曲線分析では、温度変化に応じたDNAの二本鎖から一本鎖への解離を観察するが、その温度および検出条件は特に限定はない。一般的に、熱変性（Denaturation）（90℃から98℃）、二本鎖形成（Annealing）（40℃から80℃）、融解（Melting）（二本鎖形成の温度から98℃前後まで徐々に昇温）の段階をへて、融解のステップでの蛍光強度の変化をモニターすることで、融解曲線を得て、そこからTm値を得ることができる。こうした測定はリアルタイムPCR装置の多くの機種で可能であり、機器の使用方法に準じて実施可能である。
【０１０４】
＜検出及び／または同定方法＞
本発明にかかる検体中の細菌種の検出または同定方法としては、以下の工程を有する方法を用いることができる。
（１）前記検体から調製した細菌のゲノムDNAと、検出対象細菌種に特異的な目的遺伝子を含む増幅産物を得るためのプライマーと、耐熱性DNAポリメラーゼとを用いてPCRを行う工程。
（２）前記PCRにおける増幅産物中での前記目的遺伝子の検出、または、該増幅産物の分析により、前記検体中における検出対象細菌種の検出または同定を行う工程。
【０１０５】
プライマーとして本発明にかかるプライマーセットを用いることによって、高感度の細菌種の同定を行うことができる。更に、先に述べたコンタミレベルをコントロールした試薬や器具を用いることにより、更なる高感度化及び迅速化を達成することができる。
【０１０６】
この検出及び／または同定方法では、増幅工程を、目的遺伝子以外の遺伝子（目的外遺伝子）の増幅抑制下で行うことが好ましい。この目的外遺伝子の増幅抑制には、ホットスタート法PCRが利用できる。一例として、抗DNAポリメラーゼ抗体を用いるホットスタート法が挙げられる。その際、耐熱性DNAポリメラーゼ１Ｕに対して、過剰量の抗DNAポリメラーゼ抗体を用いることが好ましい。また、特開2000-4847や特開平10-276776に開示されているようにDNAポリメラーゼに対して、可逆的な化学修飾を施すことによるホットスタート法も好適に利用できる。さらには、化学修飾されたdNTPを用いたり、米国特許出願第２００７０２８１３０８号のように化学修飾されたプライマーを用いたホットスタート法も好適に利用できる。また、加熱により溶融するワックスなどを用いて、DNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼによるDNA増幅に必要不可欠な構成成分（例えば、プライマーやdNTPやMg2+塩）とを物理的に隔離することによるホットスタート法も好適に利用できる。
【０１０７】
増幅産物の検出及び／または同定工程は、検出用の蛍光標識を有するインターカレーターやプローブを用いたリアルタイムPCRによりTmを測定することで実施可能である。好ましくはインターカレーターを用いたリアルタイムPCRであり、好ましいインターカレーターは不飽和型蛍光色素であるサイバー・グリーンＩ、飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolight、より好ましくは飽和型蛍光色素であるEvaGreenやResolightである。
【０１０８】
リアルタイムPCRを用いたTm測定による検出及び／または同定工程では、前記目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物は非検出として行うことができる。そのための方法としては、目的遺伝子の増幅産物を検出可能とし、それ以外の目的外遺伝子の増幅産物を非検出とする条件を、
（１）目的遺伝子増幅産物の融解温度（TmＡ）が、目的外遺伝子の増幅産物の融解温度（TmＢ）よりも高くなるように前記プライマーを設計し、
（２）増幅産物の検出を、TmＡとTmＢとの間の温度で行う
ことにより設定し、目的遺伝子の増幅産物のみを検出する方法が好ましい。
【０１０９】
更に、増幅工程と検出及び／または同定工程を、増幅産物の量を表示する表示装置を用いるリアルタイムPCRにより行い、目的外遺伝子の増幅産物が前記表示装置において非表示となる方法を用いることができる。
【０１１０】
検出及び／または同定工程は、増幅産物をゲル上などでの電気泳動により展開、可視化する増幅産物の解析により行うこともできる。また、検出及び／または同定工程は、増幅産物の塩基配列を解読することによる増幅産物の解析により行うことも可能である。さらに、この工程は増幅産物の分子量を質量分析計で測定して解析する方法によって行うことにもできる。
【０１１１】
＜同定方法＞
検出細菌を同定するために、本発明にかかるプライマーセットを用いて検出細菌から得られるDNA断片のTm値を利用することができる。同定するためのアルゴリズムとしては、上述したTm値そのものの組合せだけでなく、各Tm値間の差の組合せを利用して同定することで、例えば機器の試行回毎の測定誤差といった測定誤差の影響を最小限とする工程を付加することができる。
【０１１２】
上記の、機器の試行回毎の測定誤差を補正する方法として、“Tm値の組合せの平均値を算出し、その平均値からの各Tm値の相対値の組合せ”を利用することが出来る。つまり、Tm値の組合せの配置を“形”として同定する方法である。Tm値の組合せの配置を２次元で示した“形”は測定誤差に影響されない。例えば、検出細菌に特異的なTm値の組合せ（ｎ個（ｎは4以上、7以下の整数））をＴ１db〜Ｔｎdbとし（dbはdatabase）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１db〜ｄｎdbとする。同様に検体から得られた未知の検出対象生物のTm値の組合せ（ｎ個（ｎは4以上、7以下の整数））をＴ１ref〜Ｔｎrefとし（refはreference）、その平均値からの相対値をそれぞれｄ１ref〜ｄｎrefとする。そうしてdatabaseと比較し、「相対値の組合せが近似したもの＝Tm値の組合せの配置の“形”が近いもの」、を同定アルゴリズムとして利用する。
【０１１３】
具体的な計算方法としては、例えば、ユークリッド空間上の２点間距離を算出する方法（式１）が挙げられるが、この限りではない。
【０１１４】
［式１］
Dist.=√[(D1db−D1ref)2+(D2db−D2ref)2+….(Dndb−Dnref)2]
式１による計算方法であれば、この計算式によって得られるＤ値が０に最も近いものが求める検出細菌種として同定される。ただし、使用するPCR機器の測定誤差の関係上、機器の温度制御スペックやプライマーの数にもよるが、Ｄ値の許容範囲としては、0〜0.37、好ましくは0〜0.30である。
【０１１５】
以上のアルゴリズムは、コンピュータ上でデータベース型同定ソフトウェアとして利用できる。
【０１１６】
＜同定可能な細菌種＞
同定可能な微生物は、分類上細菌に該当するものであれば、機構上検出及び細菌種の同定が可能である。具体的な細菌種としては、Achromobacter denitrificans、Achromobacter xylosoxidans、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter calcoaceticus、Actinomyces israelii、Aerococcus christensenii、Aeromonas hydrophila、Aeromonas sobria、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Alcaligenes faecalis、Alistipes onderdonkii、Anaerococcus vaginalis、Anaeroglobus geminatus、Arcanobacterium haemolyticum、Arcanobacterium pyogenes、Arthrobacter cumminsii、Atopobium vaginae、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus sphaericus、Bacillus subtilis、Bacteroides dorei、Bacteroides finegoldii、Bacteroides fragilis、Bacteroides nordii、Bacteroides salyersiae、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bacteroides vulgatus、Bartonella henselae、Bartonella quintana、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bilophila wadsworthia、Bordetella pertussis、Borrelia burgdorferi、Borrelia recurrentis、Brevibacillus laterosporus、Brucella abortus、Brucella melitensis、Brucella suis、Burkholderia cepacia、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Campylobacter coli、Campylobacter curvus、Campylobacter jejuni、Campylobacter rectus、Capnocytophaga gingivalis、Capnocytophaga granulosa、Capnocytophaga haemolytica、Capnocytophaga sputigena、Cardiobacterium hominis、Chryseobacterium meningosepticum、Citrobacter amalonaticus、Citrobacter freundii、Citrobacter koseri、Clostridium butyricum、Clostridium difficile、Clostridium histolyticum、Clostridium hylemonae、Clostridium paraputrificum、Clostridium perfringens、Clostridium septicum、Clostridium sporogenes、Clostridium subterminale、Clostridium tertium、Clostridium tetani、Corynebacterium amycolatum、Corynebacterium confusum、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium glucuronolyticum、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium kroppenstedtii、Corynebacterium macginleyi、Corynebacterium minutissimum、Corynebacterium pseudodiphtheriticum、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium riegelii、Corynebacterium tuberculostearicum、Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium xerosis、Edwardsiella tarda、Eggerthella lenta、Eikenella corrodens、Elizabethkingia meningoseptica、Empedobacter brevis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterobacter sakazakii、Enterococcus avium、Enterococcus bovis、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus cecorum、Enterococcus dispar、Enterococcus durans、Enterococcus faecium、Enterococcus flavescens、Enterococcus gallinarum、Enterococcus gilvus、Enterococcus hirae、Enterococcus italicus、Enterococcus malodoratus、Enterococcus mundtii、Enterococcus pallens、Enterococcus pseudoavium、Enterococcus raffinosus、Enterococcus sanguinicola、Erysipelothrix rhusiopathiae、Escherichia albertii、Escherichia coli、Eubacterium lentum、Eubacterium limosum、Finegoldia magna、Francisella tularensis、Fusobacterium necrophorum、Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium periodonticum、Fusobacterium varium、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、Geobacillus stearothermophilus、Granulicatella adiacens、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Hafnia alvei、Halomonas venusta、Helicobacter cinaedi、Helicobacter pylori、Kingella kingae、Klebsiella granulomatis、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus jensenii、Lactococcus garvieae、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Micrococcus luteus、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nocardia cyriacigeorgica、Odoribacter splanchnicus、Pantoea agglomerans、Parabacteroides distasonis、Parvimonas micra、Pasteurella multocida、Pediococcus damnosus、Peptoniphilus asaccharolyticus、Peptoniphilus gorbachii、Peptostreptococcus anaerobius、Plesiomonas shigelloides、Porphyromonas asaccharolytica、Porphyromonas gingivalis、Prevotella bivia、Prevotella bivia、Prevotella corporis、Prevotella intermedia、Prevotella melaninogenica、Prevotella nigrescens、Prevotella timonensis、Prevotella veroralis、Propionibacterium acnes、Propionibacterium avidum、Propionibacterium granulosum、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Providencia rettgeri、Providencia stuartii、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Rothia dentocariosa、Rothia mucilaginosa、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Serratia plymuthica、Shigella boydii、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella sonnei、Spirillum minus、Staphylococcus aureus、Staphylococcus auricularis、Staphylococcus capitis、Staphylococcus caprae、Staphylococcus carnosus、Staphylococcus cohnii、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus lugdunensis、Staphylococcus pasteuri、Staphylococcus pettenkoferi、Staphylococcus pulvereri、Staphylococcus saccharolyticus、Staphylococcus saprophyticus、Staphylococcus schleiferi、Staphylococcus simulans、Staphylococcus warneri、Staphylococcus xylosus、Stenotrophomonas maltophilia、Streptobacillus moniliformis、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus canis、Streptococcus constellatus、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus equi、Streptococcus gallolyticus、Streptococcus gordonii、Streptococcus infantarius、Streptococcus iniae、Streptococcus intermedius、Streptococcus lutetiensis、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus pasteurianus、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus porcinus、Streptococcus pyogenes、Streptococcus salivarius、Streptococcus salivarius、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptococcus suis、Streptococcus vestibularis、Sutterella wadsworthensis、Treponema pallidum、Ureaplasma parvum、Vagococcus fluvialis、Veillonella atypica、Veillonella parvula、Vibrio alginolyticus、Vibrio cholerae、Vibrio fluvialis、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus、Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosisなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１７】
以下、本発明を実施例及び試験例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１８】
（製造例１）ＤＮＡＰ調製方法
特許文献４の段落０１９５から０２０１に準じて以下の方法でｅ−ＤＮＡＰを調製し、以下の実施例で使用した。
（１）ＤＮＡの合成
T.aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはGenScript社にて全ＤＮＡ配列を合成した。この際、コドン配列を酵母宿主、S. cerevisiaeに最適化した。合成したＤＮＡは、プラスミドpUC５７に組み込まれGenScript社より提供され、ベクターpUC-TA０１を得た。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、５’末端配列にHindIII、３’末端配列にEcoRI制限酵素サイトが入るように設計した。
（２）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ発現用ベクターの構築
合成したT. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をプラスミドpYES２（invitrogen社）に挿入し、ベクターpYES-TA０１を構築した。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、pUC-TA０１を制限酵素HindIII、EcoRI（TaKaRa Bio）にて消化し、１％アガロースゲル（Wako）にて電気泳動し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を回収した。プラスミドpYES２はEcoRI、NotI（TaKaRa Bio）にて消化し、ＤＮＡ Ligation Kit Ver.２.１（TaKaRa Bio）にて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子とpYES２を連結した。
（３）S. cerevisiaeの形質転換
Saccharomyces cerevisiae X２１８０のゲノムを鋳型に配列番号１３４をフォワードプライマーとして配列番号１３５をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない約５５０ｂｐの断片Ａを得た。同様にSaccharomyces cerevisiae X２１８０のゲノムを鋳型に配列番号１３６をフォワードプライマーとして配列番号１３７をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない約５５０ｂｐの断片Ｂを得た。次に断片Ａと断片Ｂを鋳型に配列番号１３４をフォワードプライマーとして配列番号１３７をリバースプライマーとしてＰＣＲをおこない断片ＡＢを得た。次にSaccharomyces cerevisiae X２１８０を培養後にコンピテントセルを作成し、断片ＡＢをFastTrackTM-Yeast Transformation Kit（Geno Technology社）を用いて形質転換した。５−ＦＯＡが終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるよう含まれた最小寒天培地に形質転換体を塗布した。この寒天培地を２８℃にて３日間培養後に５−ＦＯＡを含む最小寒天培地にて生育可能な株を取得し、Saccharomyces cerevisiae X２１８０−Ｓ株とした。なお、酵母  Saccharomyces cerevisiae X２１８０株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手可能である。
【０１１９】
この得られたベクターpYES-TA０１を酵母（Saccharomyces cerevisiae X２１８０−Ｓ株）へ導入した。宿主はウラシル要求株であれば他の酵母を用いることも可能である。形質転換はFastTrackTM-Yeast Transformation Kit（Geno Technology社）を用いた。
（４）S. cerevisiaeによるT. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産
以下の実験では、超純水・器具はDNAフリーなものを用いておこなった。得られた形質転換体は、SD培地（０.６７% Bacto yeast nitrogen base、２% Galactose、）１００mlにて、２８℃、７２時間振とう培養を行った。これらを５０００rpm、１０分間遠心分離し集菌、破砕用緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.５、５０mM KCl）に懸濁し、０.５mmガラスビーズを用いて菌体を破砕した後１２０００rpm、３０分間遠心分離を行い、酵母破砕液上清および沈殿物を得て細胞抽出物とした。次に、上記細胞抽出物を７０℃にて６０分間熱処理をおこない、熱処理後に５０００rpm、３０分間４℃遠心分離し上清を回収した。この上清に終濃度０．１％になるようにポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ）を添加し、１分間激しく攪拌した後に５分間室温で放置した。その後、８０００rpm、３０分間４℃遠心分離し上清を回収し、この上清を０．４５μｍのフィルターに通した。
【０１２０】
（５）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製
以下の実験では、超純水・器具はDNAフリーなものを用い、低温キャビネット内にておこなった。回収した粗抽出液を緩衝液Ａ（５０mM Tris-HCl pH７.５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦ（ＧＥ）に供し、その後５％の緩衝液Ｂ（５０mM Tris-HCl pH７.５、１Ｍ ＮａＣｌ）をカラムに流し夾雑物を溶出した。次に１５％の緩衝液Ｂをカラムに流し耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを溶出した。溶出した酵素溶液を１５％の緩衝液Ｂで平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎに供し、緩衝液Ｂを５０％まで段階的に高めていき、酵素が溶出された画分を回収した。この酵素画分の緩衝液を保存用緩衝液（４０mM Tris-HCl pH８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭＥＤＴＡ）に置換し、さらに保存用溶液（９８％グリセロール、１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＮＰ−４０）を等量添加し攪拌後に酵素溶液として−２０℃で保存した。
（６）T. aquaticus由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性測定
まず、表１に示した溶液を調製し、７０℃で５分間保温した。この溶液を用いて表２に示したように反応用液を調製し７４℃で５分間反応をおこない、反応停止のために１０ｍＭ  ＥＤＴＡを５０μＬ添加した。反応停止後にＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  １０μＬと滅菌水１５μＬを添加し室温で５分間放置後に蛍光の測定（Ｅｍ：４９７ｎｍ、Ｅｘ：５２８ｎｍ）をおこなった。Ｔｈｕｎｄｅｒ  Ｔａｑ（日本ジーン）のユニット数を基準とすることで、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を定義した。
【０１２１】
【表１】
2019107019.tif 000002
【０１２２】
【表２】
2019107019.tif 000003
【０１２３】
（実施例１）ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲによる細菌同定
本実施例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した溶液のうち表３に示すＥＣ１とＥＣ３を反応の鋳型に用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。なお、大腸菌エシェリヒア・コリMG1655株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手可能である。
【０１２４】
【表３】
2019107019.tif 000004
【０１２５】
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うにあたり、表４に示した組成で、９５℃５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した。
【０１２６】
【表４】
2019107019.tif 000005
【０１２７】
プライマーについてはフォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２を用いた。ＰＣＲ終了後に反応液を回収し、ＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈した。この希釈した溶液を鋳型として、表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１２８】
【表５】
2019107019.tif 000006
【０１２９】
ＰＣＲの方法については、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。
プライマーは、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでおこない、ＤＮＡ増幅後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこないＴｍ値を測定した。
ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。この結果を比較例１の結果とあわせて表６に示す。
【０１３０】
（比較例１）  実施例１（nested-PCR）の比較（ｄｉｒｅｃｔＰＣＲ）
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定しＤＮＡフリーな超純水にて希釈した溶液のうち、表３にあるようにＥＣ１とＥＣ３を反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成でおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲの方法については、９５℃５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  ２０秒を３５回繰り返した。
プライマーは、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでおこない、ＤＮＡ増幅後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこないＴｍ値を測定した。得られたＴｍ値については特許文献４の実施例７に準じて、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。この結果を実施例１の結果とあわせて表６に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
【０１３１】
【表６】
2019107019.tif 000007
【０１３２】
（実施例２）  プライマー検証（精製coliゲノムでの電気泳動）
本実施例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。
プライマーの組み合わせについては、
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２−５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（２）配列番号１及び６−１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６−２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（３）配列番号２８−４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４−５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（４）配列番号５３−５６からなるフォワードプライマーと配列番号５７−６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（５）配列番号６２−６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（６）配列番号７６−９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１−１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（７）配列番号１０４−１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６−１３１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１３３】
上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例２の結果と合わせて表７−１〜表７−７に示す。
【０１３４】
なお、表７における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異増幅産物
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
（比較例２）  実施例２の比較例
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１３５】
上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。その結果を実施例２の結果と合わせて表７−１〜表７−７に示す。
【０１３６】
【表７−１】
2019107019.tif 000008
【０１３７】
【表７−２】
2019107019.tif 000009
【０１３８】
【表７−３】
2019107019.tif 000010
【０１３９】
【表７−４】
2019107019.tif 000011
【０１４０】
【表７−５】
2019107019.tif 000012
【０１４１】
【表７−６】
2019107019.tif 000013
【０１４２】
【表７−７】
2019107019.tif 000014
【０１４３】
（実施例３）  プライマー検証（精製coliゲノムでのPCR・Melting）
本実施例では、表３のＥＣ３を鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２−５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（２）配列番号１及び６−１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６−２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（３）配列番号２８−４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４−５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（４）配列番号５３−５６からなるフォワードプライマーと配列番号５７−６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（５）配列番号６２−６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（６）配列番号７６−９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１−１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（７）配列番号１０４−１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６−１３１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５及び１２５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１４４】
リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例３の結果と合わせて表８−１〜表８−７に示す。
【０１４５】
なお、表８における評価は以下の基準に従って行った。
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
−：ピーク無し
（比較例３）  実施例３の比較例
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では表３に示してあるＥＣ３を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１４６】
リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例３の結果と合わせて表８−１〜表８−７に示す。
【０１４７】
【表８−１】
2019107019.tif 000015
【０１４８】
【表８−２】
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【０１４９】
【表８−３】
2019107019.tif 000017
【０１５０】
【表８−４】
2019107019.tif 000018
【０１５１】
【表８−５】
2019107019.tif 000019
【０１５２】
【表８−６】
2019107019.tif 000020
【０１５３】
【表８−７】
2019107019.tif 000021
【０１５４】
（実施例４）  プライマー検証（摸擬ＤＮＡ検体での電気泳動）
本実施例では、１００μｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ （ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。プライマーの組み合わせについては、
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２−５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（２）配列番号１及び６−１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６−２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４及び４５及び４７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせと、配列番号３０からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３１からなるフォワードプライマーと配列番号４７からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３２からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせと、配列番号３３−４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４−５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５４からなるフォワードプライマーと配列番号５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５５からなるフォワードプライマーと配列番号５７−５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５６からなるフォワードプライマーと配列番号６１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０および７１および７３−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号６３−６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（６）配列番号７６−９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１−１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（７）配列番号１０４−１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６−１３１からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１５５】
上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例４の結果と合わせて表９−１〜表９−７で示す。
【０１５６】
なお、表９における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異産物増幅
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
（比較例４）  実施例４の比較例
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本実施例では、１００μｇ／ｍｌ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１５７】
上記のプライマーの組み合わせの内、（１）については９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。上記プライマー組み合わせの内、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。その結果を実施例４の結果と合わせて表９−１〜表９−７に示す。
【０１５８】
【表９−１】
2019107019.tif 000022
【０１５９】
【表９−２】
2019107019.tif 000023
【０１６０】
【表９−３】
2019107019.tif 000024
【０１６１】
【表９−４】
2019107019.tif 000025
【０１６２】
【表９−５】
2019107019.tif 000026
【０１６３】
【表９−６】
2019107019.tif 000027
【０１６４】
【表９−７】
2019107019.tif 000028
【０１６５】
（実施例５）  プライマー検証（摸擬DNA検体でのPCR・Melting）
本実施例では、１００μｇ／ｍｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。
プライマーの組み合わせについては、
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２−５からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（２）配列番号１および６−１５からなるフォワードプライマーと配列番号１６−２７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４及び４５及び４７からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号３０からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３１からなるフォワードプライマーと配列番号４７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３２からなるフォワードプライマーと配列番号４８からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号３３−４３からなるフォワードプライマーと配列番号４４−５０からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５４からなるフォワードプライマーと配列番号５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５５からなるフォワードプライマーと配列番号５７−５９及び６１からなるリバースプライマーのそれぞれの組み合わせ、配列番号５６からなるフォワードプライマーと配列番号６１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０および７１および７３−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号６３−６９からなるフォワードプライマーと配列番号７０−７５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（６）配列番号７６−９０からなるフォワードプライマーと配列番号９１−１０３からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
（７）配列番号１０４−１１３からなるフォワードプライマーと配列番号２及び１１６−１３１からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、配列番号１１４からなるフォワードプライマーと配列番号５からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列列番号１１５からなるフォワードプライマーと配列番号２及び５からなるリバースプライマーそれぞれの組み合わせ、
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１６６】
リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。なお、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせについては特許文献４の追試実験である。その結果を比較例５の結果と合わせて表１０−１〜表１０−７で示す。
【０１６７】
なお、表１０における評価は以下の基準に従って行った。
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis：
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
−：ピーク無し
（比較例５）  実施例５の比較例
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本実施例では、１００μｇ／ｍｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に終濃度１０ｐｇ／ｍｌになるように大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した溶液、ＨＥを鋳型として使用した。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。
（１）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（２）配列番号１からなるフォワードプライマーと配列番号１６からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（３）配列番号２８からなるフォワードプライマーと配列番号４４からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（４）配列番号５３からなるフォワードプライマーと配列番号５７からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（５）配列番号６２からなるフォワードプライマーと配列番号７０からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（６）配列番号７６からなるフォワードプライマーと配列番号９１からなるリバースプライマーの組み合わせ、
（７）配列番号１０４からなるフォワードプライマーと配列番号２からなるリバースプライマーの組み合わせ
になるよう反応液に添加し、ＰＣＲをおこなった。上記（１）の組み合わせについては表４で示した組成で、上記（２）から（７）の組み合わせについては表５に示した組成で反応をおこなった。
【０１６８】
リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては上記プライマー組み合わせの内、（１）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返し、（２）から（７）については９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得した。増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例５の結果と合わせて表１０−１〜表１０−７で示す。
【０１６９】
【表１０−１】
2019107019.tif 000029
【０１７０】
【表１０−２】
2019107019.tif 000030
【０１７１】
【表１０−３】
2019107019.tif 000031
【０１７２】
【表１０−４】
2019107019.tif 000032
【０１７３】
【表１０−５】
2019107019.tif 000033
【０１７４】
【表１０−６】
2019107019.tif 000034
【０１７５】
【表１０−７】
2019107019.tif 000035
【０１７６】
（実施例６）  ｄｉｒｅｃｔＰＣＲにおける特許文献４との比較
本実施例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した表３で示すＥＣ１とＥＣ２溶液を反応の鋳型に用いた。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットの全てを用いてＰＣＲをおこない、得られた各断片のＴｍ値について特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。この結果を比較例６の結果とあわせて表１１に示す。
【０１７７】
（比較例６）  実施例６の特許文献４におけるプライマー部分
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では大腸菌ＭＧ１６５５の培養液からＱＩＡａｍｐＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って大腸菌ＤＮＡを抽出し、抽出後に吸光度計にてＤＮＡ量を測定し、超純水にて希釈した表３で示すＥＣ１とＥＣ２溶液を反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃   １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットの全てを用いてＰＣＲをおこない、得られた各断片のＴｍ値について特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較しＤ値を得た。この結果を実施例６の結果とあわせて表１１に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
【０１７８】
【表１１】
2019107019.tif 000036
【０１７９】
（実施例７）  摸擬検体での検出感度および特許文献４におけるプライマーとのｎｅｓｔｅｄＰＣＲの比較
本実施例では、健常人の全血２ｍｌに表１２で示したようになるよう大腸菌懸濁液を添加したものを用意した。実験は全て富山大学（〒930-0194  富山県富山市杉谷2630）の付属病院検査部検査室内にて行った。
【０１８０】
【表１２】
2019107019.tif 000037
【０１８１】
全血に大腸菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液、Ｂ１とＢ２を鋳型としてＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ ＭＤｘ ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した。
プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５の組み合わせについておこない表４に示した組成で反応をおこなった。次にこの反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、さらにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。
プライマーは、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットの全てを用いて用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較し検証を行った。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。その結果を比較例７の結果とあわせて表１３に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
【０１８２】
（比較例７）  実施例７の特許文献４におけるプライマー部分
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では、健常人の全血２ｍｌに表１２で示したようになるよう大腸菌懸濁液を添加したものを用意した。実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。全血に大腸菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液を鋳型としてＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｑ ５−ｐｌｅｘ （ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムはまず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２の組み合わせについておこない、表１に示した組成で反応をおこなった。次にこの反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、これを鋳型として表２に示した組成で９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせの
７セットの全てを用いておこなった。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた大腸菌のＴｍ値と比較し検証を行った。その結果を実施例７の結果とあわせて表１３に示す。Ｄ値が０．３以下である場合に同種であると判定した。
【０１８３】
【表１３】
2019107019.tif 000038
【０１８４】
（実施例８）  多菌種でのプライマーの検証。（電気泳動）
本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲプログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。
プライマーは、
（１）配列番号１３と配列番号１７の組み合わせ、
（２）配列番号３４と配列番号５０の組み合わせ、
（３）配列番号４３と配列番号５０の組み合わせ、
（４）配列番号５４と配列番号６１の組み合わせ、
（５）配列番号５５と配列番号５８の組み合わせ、
（６）配列番号５５と配列番号６１の組み合わせ、
（７）配列番号６８と配列番号７２の組み合わせ、
（８）配列番号７７と配列番号１０３の組み合わせ、
（９）配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、
（１０）配列番号１１４と配列番号１２５の組み合わせ、
（１１）配列番号１１５と配列番号５
の組み合わせについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例８とあわせて表１４−１〜１４−５に示す。
【０１８５】
なお、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの菌株については、理化学研究所バイオソースセンター、ジャパンカルチャーコレクションオブマイクロオーガニズムズにて入手可能である。
【０１８６】
なお、表１４における評価は以下の基準に従って行った。
目的産物量：
◎：増幅が特に良い
○：増幅が良い
△：増幅が悪い
×：増幅が特に悪い
非特異産物増幅
○：非特異産物無し
△：非特異産物有り
×：非特異産物が多い
立ち上がりサイクル数：
◎：立ち上がりサイクル数が速い（2サイクル以上減）
○：立ち上がりサイクル数がやや速い。（0-1サイクル減）
△：立ち上がりサイクル数がやや遅い（1-2サイクル増）
×：立ち上がりサイクル数が遅い（3サイクル以上増）
Melting analysis：
○：ピークが1つしかない
△：小さなピーク有り
×：複数のピーク有り
−：ピーク無し
（比較例８）  多菌種でのプライマーの検証。（電気泳動）
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。ＰＣＲプログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。
【０１８７】
プライマーは、
（１）配列番号１と配列番号１６の組み合わせ、
（２）配列番号２８と配列番号４４の組み合わせ、
（３）配列番号５１と配列番号５２の組み合わせ、
（４）配列番号５３と配列番号５７の組み合わせ、
（５）配列番号６２と配列番号７０の組み合わせ、
（６配列番号７６と配列番号９１の組み合わせ、
（７）配列番号１０４と配列番号２の組み合わせ
についてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を実施例８とあわせて表１４に示す。
【０１８８】
（実施例９）  多菌種でのプライマーの検証。（PCR）
本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムについては９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。プライマーは、
（１）配列番号１３と配列番号１７の組み合わせ、
（２）配列番号３４と配列番号５０の組み合わせ、
（３）配列番号４３と配列番号５０の組み合わせ、
（４）配列番号５４と配列番号６１の組み合わせ、
（５）配列番号５５と配列番号５８の組み合わせ、
（６）配列番号５５と配列番号６１の組み合わせ、
（７）配列番号６８と配列番号７２の組み合わせ、
（８）配列番号７７と配列番号１０３の組み合わせ、
（９）配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、
（１０）配列番号１１４と配列番号１２５の組み合わせ、
（１１）配列番号１１５と配列番号５の組み合わせ
についてＰＣＲをおこない、その後増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値を測定した。この結果を元に増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を比較例５とあわせて表１４に示す。
【０１８９】
（比較例９）  多菌種でのプライマーの検証。（PCR）
以下の比較例は特許文献４の追試実験である。本比較例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの培養菌体からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使ってゲノムを抽出したものを反応の鋳型に用いた。反応は表５に示した組成で反応をおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、プログラムは９５℃５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３５回繰り返した。
【０１９０】
プライマーは、配列番号１と配列番号１６の組み合わせ、配列番号２８と配列番号４４の組み合わせ、配列番号５１と配列番号５２の組み合わせ、配列番号５３と配列番号５７の組み合わせ、配列番号６２と配列番号７０の組み合わせ、配列番号７６と配列番号９１の組み合わせ、配列番号１０４と配列番号２の組み合わせについてＰＣＲをおこない、その後増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値を測定した。この結果を元に増幅曲線の立ち上がりサイクル数及び解離曲線の検証をおこなった。その結果を実施例９と合わせて表１４に示す。
【０１９１】
【表１４−１】
2019107019.tif 000039
【０１９２】
【表１４−２】
2019107019.tif 000040
【０１９３】
【表１４−３】
2019107019.tif 000041
【０１９４】
【表１４−４】
2019107019.tif 000042
【０１９５】
【表１４−５】
2019107019.tif 000043
【０１９６】
（実施例１０）  大腸菌以外の菌種の模擬血液検体での検証
本実施例では富山大学（付属病院検査部検査室）で保存されていたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌｃｔｉａｅの培養菌体を表１５に示した濃度になるように健常人の全血２ｍｌに添加したものを富山大学の協力の下に用意した。実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。全血に菌懸濁液を添加した溶液を１００ｇにて５分間遠心分離し血漿画分を回収後、この上清をさらに１３０００ｇにて５分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿からＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を使って抽出したＤＮＡ溶液を鋳型として、富山大学付属病院検査部検査室内でＰＣＲをおこなった。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５組み合わせについておこなった。反応は表４に示した組成で反応をおこなった。この反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、さらにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーは、
フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及びフォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせの７セットを用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた各菌種のＴｍ値と比較し検証を行った。
その結果を表１５に示す。
【０１９７】
【表１５】
2019107019.tif 000044
【０１９８】
（実施例１１）  富山大学付属病院臨床検体での検証
本実施例では富山大学付属病院において敗血症が疑われる患者の血液検体から抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として用い、実験は全て富山大学付属病院検査部検査室内にて行った。超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。リアルタイムＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭを用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した。プライマーは、フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号５の組み合わせについておこなった。反応は表４に示した組成で反応をおこなった。この反応産物をＤＮＡフリーな超純水にて５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成で９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。ＤＮＡ解離曲線の作成は９５℃で１０秒加熱した後に、７２℃  ９０秒保温し、０．５℃ずつ９５℃まで昇温させた。また各段階で２秒保温しデータを取得し、増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーは、
フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号８１と配列番号１０３の組み合わせ、及び
フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットを用いた。得られたＴｍ値については特許文献４にあるとおり、予め取得しておいた各菌のTm値を入力したデータベース内のデータと比較し検証を行った。
その結果を表１６に示す。
【０１９９】
【表１６】
2019107019.tif 000045
【０２００】
（実施例１２）  ホットスタートＰＣＲについて
本実施例ではＤＮＡ溶液（ＨＥ）を鋳型として使用し、ホットスタート用ｄＮＴＰであるＣｌｅａｎＡｍｐ  ｄＮＴＰｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と通常用いられるｄＮＴＰを用いて増幅反応をおこない、その結果を比較した。組成は、表４及び表１７に示した組成で反応をおこなった。
【０２０１】
【表１７】
2019107019.tif 000046
【０２０２】
超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。鋳型は表３で示したEC3を用いた。プライマーはフォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号２の組み合わせでおこない、ＰＣＲプログラムは、まず９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。反応後の溶液は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後に目的産物の増幅量及び非特異的産物の増幅について検証をおこなった。
【０２０３】
その結果を図２に示す。
【０２０４】
（実施例１３）  除ＤＮＡ処理（限外ろ過，大腸菌ゲノム添加実験）
超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００μＬ作成し、さらに４ｐｇの大腸菌ＤＮＡを添加した。この溶液を、上記操作を終えたアミコンＵＦＣ５０５０８に供し、５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液を回収した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、さらにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーについては、
フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例１０の結果と合わせ図３に示す。
【０２０５】
（比較例１０）  除ＤＮＡ処理（限外ろ過，大腸菌ゲノム添加実験のネガコン）  
アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００μＬ作成し、この溶液を、上記操作を終えたアミコンＵＦＣ５０５０８に供し、５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液を回収した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーについては、
フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び、
フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をお
こなった。その結果を実施例１３の結果とあわせ図３に示す。
【０２０６】
（実施例１４）  除DNA処理（コンタミ試薬の精製，direct-PCR）
超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。アミコンＵＦＣ５０５０８（ミリポア）に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。次に１規定の塩酸５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去した。最後に滅菌水５００μＬを供し５０００ｇで５分間遠心分離をおこない、ろ液及びフィルター内に残った溶液を除去する操作を２回おこなった。次に表４に示す反応液組成から鋳型及びＥｖａＧｒｅｅｎを除いたものを混合した溶液１００μＬ作成した。このろ液にＥｖａＧｒｅｅｎと滅菌水を添加しＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃ １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を２６回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び、
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び、
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び、
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び、
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び、
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び、
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を比較例１１の結果と合わせ図４に示す。
【０２０７】
（比較例１１）  除DNA処理（コンタミ試薬の精製，direct-PCR）
超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。表４に示す反応組成の溶液を作成し、PCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を３５回繰り返した。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として表５に示した組成にてPCRをおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、９５℃ ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を２６回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない、各増幅産物のＴｍ値の測定をおこなった。
プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１５とリバースプライマー配列番号１６の組み合わ
せ、及び、
（２）フォワードプライマー配列番号４３とリバースプライマー配列番号５０の組み合わせ、及び
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び、
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び、
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び、
（６）フォワードプライマー配列番号８１とリバースプライマー配列番号１０３の組み合わせ、及び、
（７）フォワードプライマー配列番号１１５とリバースプライマー配列番号５の組み合わせ
の７セットについてＰＣＲをおこない、目的断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を実施例１４の結果とあわせ図４に示す。
【０２０８】
（実施例１５）  除ＤＮＡ処理（ガンマ線滅菌  大腸菌DNAをガンマ線処理）
超純水・器具はDNAフリーなものを用いた。滅菌水１００μＬに５００ｆｇの大腸菌ＤＮＡを添加した溶液を用意し、これに１０ｋＧｙ及び２５ｋＧｙのガンマ線を照射した。この溶液を鋳型として以下の条件でＰＣＲをおこなった。反応は表１に示した組成で反応をおこなった。ＰＣＲ装置はロータージーンＱ  ＭＤｘ  ５ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ＰＣＲプログラムについては、まず、９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６５℃  １０秒、７２℃  ３０秒を４０回繰り返した後にＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。プライマーは、配列番号１と２の組み合わせでおこなった。この反応液の産物を５００倍に希釈し、されにこれを鋳型として９５℃  ５分間加熱した後に、９４℃  １０秒、６０℃  １０秒、７２℃  １０秒を３０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこなった。
プライマーについては、
（１）フォワードプライマー配列番号１とリバースプライマー配列番号１６の組み合わせ、及び、
（２）フォワードプライマー配列番号２８とリバースプライマー配列番号４４の組み合わせ、及び、
（３）フォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２の組み合わせ、及び、
（４）フォワードプライマー配列番号５３とリバースプライマー配列番号５７の組み合わせ、及び、
（５）フォワードプライマー配列番号６２とリバースプライマー配列番号７０の組み合わせ、及び、
（６）フォワードプライマー配列番号７６とリバースプライマー配列番号９１の組み合わせ、及び、
（７）フォワードプライマー配列番号１０４とリバースプライマー配列番号２の組み合わせ
の７セットでＰＣＲをおこない、各ＤＮＡ断片の増幅が見られるか否かについて検証をおこなった。その結果を表１８に示す。
【０２０９】
【表１８】
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【０２１０】
（実施例１６）  除ＤＮＡ処理（ＥＭＡ）
超純水・器具はDNAフリーなものを用い、作業はクリーンベンチ内でおこなった。表５に示す反応液組成から鋳型、プライマー、ｅｖａｇｒｅｅｎを除いた溶液を調製し、これに２５ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを添加した。次に終濃度２０μＭになるようＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｍｏｎｏａｚｉｄｅ  Ｂｒｏｍｉｄ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を添加した上記溶液と、ネガティブコントロールとしてＥＭＡを添加していない上記溶液を用意した。これらの溶液を５７０ルーメンのＬＥＤ電球の下に設置し１５分間、光を照射した。その後、プライマー、ＥｖａＧｒｅｅｎを加え、９５℃  １０分間加熱した後に、９５℃  １０秒、６０℃  ３０秒、７２℃を６０回繰り返した後、増幅産物のＤＮＡ解離曲線の作成をおこない目的産物の増幅の有無を検証した。プライマーはフォワードプライマー配列番号５１とリバースプライマー配列番号５２を用いた。その結果を図５に示す。
【０２１１】
（実施例１７）  ４つのＴｍ値での菌種の同定
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅの４菌種の培養液を無記名にして、ブラインドテストをおこなった。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを細菌1、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを細菌２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを細菌３、  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅを細菌４とし、ＤＮＡ抽出をおこない同定を試みた。ＰＣＲ反応は実施例１１の方法と同様におこなった。同定はその内４つのＴｍ値の組み合わせでのみでおこなった。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ  Ｑの測定誤差を加味し、Ｄｉｓｔ＜０．２以下のものを同一菌種であるとした。
【０２１２】
【表１９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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