(57)【要約】      （修正有）【課題】多能性幹細胞から肝細胞及び／又は胆管細胞系細胞を製造する方法の提供。【解決手段】（ａ）長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝芽細胞を含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）前記肝芽細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、前記肝芽細胞の集団を解離して凝集体を作製し、凝集体を、少なくとも、肝細胞増殖因子、デキサメタゾン、オンコスタチンＭ及びその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む、成熟培地で、任意にゼラチン状マトリックス中で培養して、肝臓細胞系及び／又は胆管細胞系細胞を生成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系細胞を製造する方法であって、
（ａ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（ｂ）細胞集団の肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導して、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞などの肝細胞系細胞を含む集団を得るステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、胚葉体（ＥＢ）において内胚葉細胞を誘導するステップによって、又は単層中にある内胚葉細胞を誘導するステップによって得られ、ここで誘導された内胚葉集団が、ｎｏｄａｌアゴニスト、例えばアクチビンの存在下で長期間培養されて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖が、１つ又は複数のさらなるステップを含んでいてもよく、任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集体を含む細胞集団が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及び／又はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片の存在下で培養される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
ａ）単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
ｄ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｅ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項５】
多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
ａ）任意選択で、多能性幹細胞を、ＢＭＰ４アゴニストと接触させることによって、多能性幹細胞の胚葉体（ＥＢ）を形成するステップと、
ｂ）ＥＢを、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと
ｃ）誘導された内胚葉細胞集団を解離して、解離された誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｄ）解離された誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｅ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化するステップと、
ｆ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｇ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の増殖された肝芽細胞集団及び／又は肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項６】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５のＣＸＣＲ４＋及びｃＫＩＴ＋陽性細胞、並びに／又は少なくとも７０％、７５％、８０％のＳＯＸ１７＋細胞を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
特定化するステップが、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され（例えば、アクチビン処理され）誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と接触させるステップを含み、任意選択で、ＦＧＦが、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４又はそれらの組合せである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
凝集体が、少なくとも７０％、８０％、８５％又は９０％のアルブミン陽性細胞を含む細胞集団から作製される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、凝集体の細胞内のｃＡＭＰ経路を活性化して、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導するステップをさらに含み、任意選択で、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップが、凝集体を８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸などのｃＡＭＰ類似体と接触させるステップを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から、肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、請求項１に記載のステップａ）に従って特定化するステップと、
ｄ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟培地を用いて培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）凝集細胞成熟培地中で凝集細胞を培養するサブステップと、
（ｉｖ）任意選択で、凝集の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に凝集細胞においてｃＡＭＰ経路を任意選択で活性化するサブステップと
を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項１１】
凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．任意選択で、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進するＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＣＩＨＲ９９０２１などのｗｎｔアゴニスト、又は
ｂ．ｃＡＭＰ活性化ステップの間に添加され、ＣＹＰ酵素の発現を増強し、肝細胞前駆体の成熟を促進する、ＸＡＶ９３９及び／又はＭｅｋ／Ｅｒｋアンタゴニスト、例えば、ＰＤ０３２５９０１などのＷｎｔアンタゴニスト
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
凝集細胞成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．胆管細胞系統特定化を促進するＮｏｔｃｈアゴニスト、
ｂ．肝細胞系統特定化を促進するγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５，４５８などのＮｏｔｃｈアンタゴニスト
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
凝集細胞が、アゴニスト及び任意選択で、ＴＧＦβアンタゴニスト（ＳＢ４３１５４２など）を用いて、約６〜約１２日間、好ましくは、約８〜約１０日間、任意選択で、約９日間処理される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
成熟培地及び／又は凝集体特定化培地が、ｎｏｔｃｈアゴニストを含み、ｃＡＭＰ活性化が除かれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法であって、
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と、任意選択で、約４〜約８日間接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、約１、２、３又は約４日間接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）請求項１に記載のステップａ）に従って、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を任意選択で、約４〜約１０日間特定化し、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及び／又はＯＳＭを含む成熟培地を用いて、任意選択で、約１０〜１４日間培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）Ｄｅｘを含む成熟培地中で約１〜１０日間凝集体を培養するサブステップと、
（ｉｖ）ａ）Ｄｅｘ及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、任意選択で、ｃＡＭＰ類似体を含む肝細胞成熟培地中で約６日〜約１０日凝集体を培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に、ｃＡＭＰアゴニストを添加するサブステップ、又は
ｂ）凝集体を、ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ＯＰ−９細胞などのｎｏｔｃｈシグナルドナー及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＥＧＦ、ＴＧＦｂ１及びＨＧＦを含む胆管細胞成熟／特定化培地中で、約５日〜約９０日間培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２０〜４０日培養した後に、ｎｏｔｃｈアゴニストを添加するステップ並びに／又はｎｏｔｃｈアゴニストがｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞である場合には、凝集体を共培養するサブステップと
を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項１６】
製造された肝細胞が、機能的肝細胞である、請求項１から１３まで及び１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
機能的肝細胞が、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子又はタンパク質の増大した発現及び／又は活性を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である、請求項１から１３まで及び１５から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップ中に、ｎｏｔｃｈアゴニストを用いて細胞集団の凝集体を処理することによって、胆管細胞の運命が特定化される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｎｏｔｃｈアゴニストが、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合しているｎｏｔｃｈリガンドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｎｏｔｃｈアゴニストが、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｎｏｔｃｈアゴニストが、ｎｏｔｃｈリガンドδ、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ１ペプチド、又はＰｒｅｆ−１／ＤＬＫ−１／ＦＡ１から選択されるｎｏｔｃｈリガンドを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーなどのｎｏｔｃｈアゴニストと、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦとの存在下で、少なくとも５日間又は約５〜約１４日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞へのさらなる系統特定化及び／又は成熟を誘導するステップを含む、請求項１９から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
製造された胆管細胞の集団が、機能的胆管細胞の集団であり、任意選択で、機能的胆管細胞が、例えば、Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種の遺伝子又はタンパク質の、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び／又はｎｏｔｃｈアゴニストで処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して増大された発現を含み、任意選択で、胆管細胞の集団の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％が、ＣＫ１９＋胆管細胞及び／若しくはＣＦＴＲ＋胆管細胞である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団が、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導され、多能性幹細胞が、任意選択で、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦとの存在下で、少なくとも５、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間共培養して、少なくとも１種の肝前駆細胞の、機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含む、請求項１９から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を作製する方法であって、
ａ．肝芽細胞、任意選択で、２５日目段階の肝芽細胞；肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞の集団を、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法に従って製造するステップと、
ｂ．ｉ．細胞の集団、任意選択で肝芽細胞を含む細胞の集団を、
１．任意選択で、キメラ凝集体で培養された、内皮細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋内皮細胞、任意選択で、胚性ＣＤ３４＋内皮細胞と共培養し、任意選択で、凝集体はゲル／マトリックス中に包埋され、機能的肝細胞を含む細胞の集団を製造するステップ又は
２．任意選択で、キメラ凝集体の、ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞、任意選択で、ＯＰ９細胞、ＯＰ９−Ｊａｇｇｅｄ１細胞及び／又はＯＰ９δ１細胞と共培養し、任意選択で、凝集体は、ゲル／マトリックス中に包埋され、ＥＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ及びＨＧＦ又はＥＧＦ、ＴＧＦｂ１及びＨＧＦとともに培養されて、機能的胆管細胞を含む細胞の集団を製造するステップ、及び／又は
ｉｉ．ａ）又はｂｉ）から得た細胞の集団又はそれから機能的肝細胞及び／若しくは胆管細胞が濃縮若しくは単離された集団を、対象に導入するステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
細胞の集団が、ｉ）内皮細胞と、少なくとも約４日間、約６日間、約８日間、約１０日間、約１２日間若しくはそれより多くの日数、最大、例えば、１５日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間若しくは９０日間共培養されるか、又はｉｉ）ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ＯＰ９細胞、ＯＰ９−Ｊａｇｇｅｄ１細胞及び／又はＯＰ９δ１細胞と、少なくとも約約４日間、約６日間、約８日間、約１０日間、約１２日間又はそれより多くの日数、最大、例えば、約９０日間又は約６０日間共培養される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
凝集体がゲル／マトリックス中に包埋され、３次元培養される、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞、任意選択で、機能的肝細胞集団の細胞を濃縮又は単離するステップをさらに含む、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大約９５％の肝細胞及び／又は胆管細胞、任意選択で、機能的肝細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から３１までのいずれか一項に記載の製造された細胞の集団。
【請求項３３】
創薬、薬物代謝分析、バイオ人工肝臓装置の開発のための、並びに／又は肝臓及び／若しくは胆管疾患の治療のための細胞置換療法としての、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の方法に従って製造された細胞の集団又は請求項３２に記載の細胞の集団の使用。
【請求項３４】
請求項１から３３までに記載のアゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子などのうち１種又は複数、請求項１から３１までに記載の方法で使用され得る細胞などを増殖させるための１種又は複数の培地、容器、並びに／又は請求項１から３１までに記載の方法に従って増殖及び／若しくは調製されたか若しくは請求項１から３１までに記載の方法で使用するための細胞を含み、任意選択で請求項１から３１までに記載の方法に従って使用するための使用説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヒト多能性幹細胞から機能的肝細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ；胚幹細胞；ｈＥＳＣ及び誘導された多能性幹細胞；ｈｉＰＳＣを含む）から機能的肝細胞を製造する能力は、肝疾患の治療のための薬物代謝研究及び細胞ベースの療法のための肝細胞の供給源を供給する。肝細胞は、薬物代謝、ひいては身体からの生体異物排出の管理に関与する細胞であることから特に重要である１〜３。この役割に加えて、特定の薬物を代謝する能力は個体間で異なり得る４という事実を考えると、代表集団サンプルから機能的肝細胞を入手する手段は、製薬業界内での創薬及び薬物試験に劇的な影響を与えると予想される。ｈＰＳＣ由来肝細胞は、薬物試験のための新規プラットフォームを提供することに加え、肝疾患の患者のための可能性ある新規療法を提示できる。肝臓移植は、末期肝疾患のために有効な治療を提供するが、生存可能なドナー臓器の不足が、このアプローチで治療され得る患者集団を制限する５〜７。肝細胞移植及びｈＰＳＣ由来肝細胞を用いて開発されたバイオ人工肝臓装置は、特定の種類の肝疾患の患者のための代替救命療法に相当する。しかし、これらの適用は、ｈＰＳＣから成熟した代謝的に機能性の細胞を生成する能力に応じて変わる。このような細胞の再現性のある効率的な作製は、肝細胞成熟を制御する調節経路があまり理解されていないという事実のために今日まで難しいものであった。
【０００３】
機能的ヒト肝細胞の可能性ある治療的及び商業的重要性を考え、ｈＰＳＣからのこれらの細胞の作製のためのプロトコールを最適化することに、相当な努力が向けられてきた８〜１６。胚体内胚葉の誘導、内胚葉の肝臓への運命を特定化すること、肝芽細胞として知られる肝臓前駆細胞の作製及び肝芽細胞の成熟肝細胞への分化を含む、分化培養における肝臓発達の重要な段階を繰り返すほとんどすべてのアプローチが試みられた１７。ほとんどの研究において、分化は、内胚葉誘導及び肝臓特定化を含む発達の初期段階を調節するとわかっている経路アゴニスト及びアンタゴニストの逐次添加を用いて、単層形式で誘導される。この戦略を用いれば、これらの初期分化ステップを最適化して、Ｈｅｘ、α−フェトプロテイン及びアルブミンなどのマーカーの発現によって規定されるような胚体内胚葉、肝芽細胞及び未熟肝細胞が極めて高濃度化された集団の作製が可能になった１７。これらの初期分化ステップは、ある程度確立されているが、例えば、第Ｉ相及び第ＩＩ相薬物代謝酵素活性によって規定されるような機能的細胞への肝細胞の成熟を促進する条件は記載されていない。異なるプロトコールを用いて製造された集団は、その成熟状態が顕著に異なっており、ほとんどの場合、主として未熟な肝細胞が生じる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の一態様は、長期ｎｏｄａｌアゴニスト（extended nodal agonist）処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞系細胞を製造する方法を含み、方法は、
（ａ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（ｂ）細胞集団の肝細胞前駆細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導して、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞などの肝細胞系細胞を含む集団を得るステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む。
【０００５】
一実施形態では、肝細胞及び／又は胆管細胞系細胞は、肝芽細胞である。一実施形態では、方法は、増殖した肝芽細胞集団を製造する。別の実施形態では、肝細胞系細胞は、成熟肝細胞であるか、又は胆管細胞系細胞は、成熟胆管細胞である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団は、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から誘導される。多能性幹細胞は、任意選択で、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【０００７】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団は、一実施形態では、胚葉体（ＥＢ）において内胚葉細胞を誘導するステップによって得られる。別の実施形態では、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団は、単層中にある内胚葉細胞を誘導するステップによって得ている。それぞれの場合において、誘導された内胚葉集団が、ｎｏｄａｌアゴニスト、例えばアクチビンの存在下で長期間培養されて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団が製造される。
【０００８】
一実施形態では、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５  ＣＸＣＲ４＋及びｃＫＩＴ＋陽性細胞、及び／又は少なくとも７０％、７５％、８０％のＳＯＸ１７＋細胞を含む。
【０００９】
一実施形態では、特定化するステップは、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され（例えば、アクチビン処理され）誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と接触させるステップを含む。ＦＧＦは、例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４又はそれらの組合せであり得る。組合せは、例えば、逐次添加され得る。
【００１０】
一実施形態では、特定化ステップは、まず、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４を含む特定化培地と、およそ４０〜６０時間、任意選択で、およそ４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は６０時間接触させるステップ、次いで、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と任意選択で、約４、５、６又は７日間接触させるステップを含む。
【００１１】
別の実施形態では、凝集体が、少なくとも７０％、８０％、８５％又は９０％アルブミン陽性細胞を含む細胞集団から作製される。別の実施形態では、凝集体は、２４、２５、２６、２７又は２８日培養した後に作製される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、凝集体は、酵素処理及び／又は手作業による解離によって、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の単層から作製される。
【００１３】
成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、１つ又は複数のさらなるステップを含んでいてもよい。さらなる実施形態では、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集体を含む細胞集団が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及び／又はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片の存在下で培養される。
【００１４】
一実施形態では、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、凝集体の細胞内のｃＡＭＰ経路を活性化して、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導するステップをさらに含む。別の実施形態では、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップは、凝集体を、ｃＡＭＰ及び／又はｃＡＭＰ類似体（例えば、８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸、ジブチリル−ｃＡＭＰ、アデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−ｃＡＭＰＳ）及び／又は８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ）など）及び／又は任意のその他のｃＡＭＰアゴニストと接触させるステップを含む。
【００１５】
例えば、一実施形態では、ＨＧＦ、ＤＥＸ及びＯＳＭを含む成熟培地中でプレ凝集体集団を、例えば、約１０、１１、１２、１３又は１４日間培養した後で、凝集体に、ｃＡＭＰアゴニスト及びＤＥＸ及び任意選択で、ＨＧＦを含む成熟培地が添加される。
【００１６】
一実施形態では、製造された肝細胞の集団は、機能的肝細胞を含む集団である。
【００１７】
実施形態では、肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞は、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集及び／又はｃＡＭＰシグナル伝達誘導を伴わずに製造された、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理されてない誘導された内胚葉細胞集団（例えば、アクチビンなどのｎｏｄａｌアゴニストで長期間処理されていない誘導された内胚葉集団から）製造された肝細胞を含む細胞集団と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種若しくはそれ以上の遺伝子又はＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択されるタンパク質の発現の増大を含む。他の実施形態では、肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である。
【００１８】
一実施形態では、胆管細胞の運命は、細胞集団の凝集体を、ｎｏｔｃｈアゴニストで処理することによって特定される。
【００１９】
一実施形態では、製造される胆管細胞の集団は、機能的胆管細胞の集団である。機能的胆管細胞は、例えば、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び／又はｎｏｔｃｈアゴニストで処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して、増大された、少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種の遺伝子又はＳｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択されるタンパク質の発現を含む。他の実施形態では、胆管細胞の集団の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、ＣＫ１９＋胆管細胞である。他の実施形態では、機能的胆管細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％は、ＣＦＴＲ＋胆管細胞である。
【００２０】
記載されるように、方法は、単層で増殖された内胚葉細胞集団に適用され得る。
【００２１】
したがって、さらなる態様は、多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法を含み、方法は、
ａ）単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｅ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、増殖した肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む。
【００２２】
さらに、内胚葉集団はまた、胚葉体中に含まれ得る。
【００２３】
したがって、開示のさらなる態様は、多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法を提供し、方法は、
ａ）任意選択で、多能性幹細胞を、ＢＭＰ４アゴニストと接触させることによって、多能性幹細胞の胚葉体（ＥＢ）を形成するステップと、
ｂ）ＥＢを、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと
ｃ）誘導された内胚葉細胞集団を解離して、解離された誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｄ）解離された誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｅ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｆ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｇ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、成熟、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、凝集体内のｃＡＭＰ経路を活性化して、細胞集団の肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞を含む集団への成熟を誘導するステップをさらに含む。一実施形態では、方法は、凝集体を、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストと接触させるステップを含む。
【００２５】
一実施形態では、単層又はＥＢは、誘導培地中でｎｏｄａｌアゴニストと少なくとも約１日、２日、３日又は約４日間接触される。
【００２６】
一実施形態では、内胚葉集団の解離に先立つステップ（例えば、胚葉体（ＥＢ）段階）において、ＥＢは、ｎｏｄａｌアゴニストとともに少なくとも３６、３８、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８若しくは６０時間又は少なくとも約１日、２日、３日若しくは約４日間培養される。
【００２７】
したがって、本開示の別の態様では、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法に関し、方法は、
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、少なくとも１種のＦＧＦアゴニスト及び１種のＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化し、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟培地を用いて培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）凝集細胞成熟培地中で凝集細胞を培養するサブステップと、
（ｉｖ）任意選択で、凝集の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に凝集細胞においてｃＡＭＰ経路を活性化するサブステップと
を含む、ステップと
を含む。
【００２８】
一実施形態では、凝集細胞成熟培地は、肝細胞成熟を促進する因子又は胆管細胞発達を促進する因子又は両方を含み得る。
【００２９】
別の実施形態では、凝集細胞は、ＣＩＨＲ９９０２１などのｗｎｔアゴニストを用いて、任意選択で、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβアンタゴニストの存在下で凝集時に処理される。本明細書において実証されるように、例えば、２６日目の（又はＥＢを使用する実施形態では、任意選択で、１日若しくは２日遅く、例えば、２７日目の）、Ｗｎｔ経路及びＳＭＡＤ経路の活性化は、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進する。例えば、ｗｎｔアゴニストが添加される場合に、前記集団の最大１０倍の増殖が、得られ得ることが実証される。
【００３０】
一実施形態では、凝集細胞は、ｗｎｔアゴニスト及び任意選択で、ＴＧＦβアンタゴニスト（ＳＢ４３１５４２など）を用いて、約６〜約１２日間、好ましくは、約８〜約１０日間、任意選択で、約９日間処理される。
【００３１】
なおさらなる実施形態では、ＸＡＶ９３９（略してＸＡＶとも呼ばれる）などのＷｎｔアンタゴニスト及び／又はＭｅｋ／Ｅｒｋアンタゴニスト、例えばＰＤ０３２５９０１（略してＰＤとも呼ばれる）が、ｃＡＭＰ活性化ステップの間に添加される。ｃＡＭＰシグナル伝達の活性化の間の、Ｗｎｔアンタゴニスト及び／又はＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストの添加は、ＣＹＰ酵素の発現を、例えば、最大、成体肝臓細胞において見られるレベルに又はそれ以上に増強する。例えば、培養約２８日目から約３２日目に添加される、例えば、ｃＡＭＰの存在下で添加されるＭＥＫ／Ｅｒｋの阻害剤は、ＣＹＰ３Ａ４のレベルの増大した肝細胞をもたらす。Ｗｎｔアンタゴニストと組み合わせたＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストの添加も、ＣＹＰ１Ａ２のレベルを高めると示されている。一実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、ＸＡＶ９３９である。別の実施形態では、ＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストは、ＰＤ０３２５９０１である。
【００３２】
一実施形態では、凝集のおよそ１〜約４日後に、細胞は、ｎｏｔｃｈアゴニストを用いて処理される。このような段階でのｎｏｔｃｈアゴニストの添加は、胆管細胞成熟を促進する。例えば、胆管細胞成熟が好ましいいくつかの実施形態では、ｃＡＭＰシグナル伝達を誘導することは省略される。
【００３３】
例えば、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５，４５８などのＮｏｔｃｈアンタゴニストを用いてＮｏｔｃｈシグナル伝達をさらに阻害することは、胆管細胞発達を阻害し、生じた細胞は、肝細胞の特徴を保持すると本明細書において実証される。一実施形態では、方法は、例えば、肝細胞分化が望まれる実施形態において、凝集のおよそ１〜約４日後に、細胞をｎｏｔｃｈアンタゴニストを用いて処理することを含む。
【００３４】
別の実施形態では、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法は、
ａ）単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と、任意選択で、約４〜約８日間接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと任意選択で、約１、２、３又は約４日間接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、少なくとも１種のＦＧＦアゴニスト及び少なくとも１種のＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と、任意選択で、約４〜約１０日間接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化し、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及び／又はＯＳＭを含む成熟培地を用いて、任意選択で、約１０〜１４日間培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）Ｄｅｘを含む成熟培地中で約１〜１０日間凝集体を培養するサブステップと、
（ｉｖ）ａ）Ｄｅｘ及びｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストを含む成熟培地中で約６日〜約１０日凝集体を培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後にｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストを添加するサブステップ、又は
ｂ）凝集体を、ｎｏｔｃｈアゴニスト及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦを含む成熟培地中で、約６日〜約２０日間培養し、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２０〜４０日培養した後に、ｎｏｔｃｈアゴニストを添加するサブステップと
を含む、ステップと
を含む。
【００３５】
一実施形態では、方法は、例えば、約２０日培養した後及び／又は培養の４０日前に凝集させるステップを含む。
【００３６】
本開示はまた、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導する方法も提供し、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、Ｎｏｔｃｈアゴニストとともに培養して、少なくとも１種の胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含む。
【００３７】
ｎｏｔｃｈアゴニストは、例えば、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合している任意のｎｏｔｃｈリガンドであり得る。一実施形態では、ｎｏｔｃｈリガンドは、ｎｏｔｃｈリガンドδである。一実施形態では、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー（例えば、ｎｏｔｃｈアゴニスト）と、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦの存在下で、少なくとも５日間又は約５〜約９０日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含む。
【００３８】
任意選択で、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ｎｏｔｃｈアゴニスト（例えば、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー）と接触させるステップは、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ、並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦを含む成熟培地中で、少なくとも若しくは約５〜少なくとも若しくは約９０日間、任意選択で、少なくとも若しくは約５〜少なくとも若しくは約６０日間、少なくとも若しくは約３０日間、少なくとも若しくは約２５日間、２日少なくとも若しくは約１日間及び／又は少なくとも若しくは約１４日間共培養して、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞への、任意選択で機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含み、任意選択で、機能的胆管細胞は、分岐した、嚢胞、管状又は球型構造を形成する。
【００３９】
別の実施形態では、本出願は、
（ａ）本明細書において記載される方法のいずれかに従う、肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞の集団を製造するステップと
（ｂ）細胞の集団又は任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞が濃縮又は単離された集団を対象に導入するステップと
を含む方法を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、方法は、肝細胞及び／又は胆管細胞の細胞集団を濃縮又は単離するステップをさらに含む。任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞の細胞集団は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大約９５％の肝細胞及び／又は胆管細胞（例えば、任意選択で、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞）を含む。
【００４１】
本開示はまた、創薬、薬物代謝分析、バイオ人工肝臓装置の開発のための、並びに／又は肝臓状態及び疾患の治療のための細胞置換療法としての、肝細胞及び／若しくは胆管細胞の集団の使用を提供する。
【００４２】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、本開示の趣旨及び範囲内の種々の変法及び改変が、この詳細な説明から当業者には明らかとなるので、詳細な説明及び具体的な例は、本開示の好ましい実施形態を示しながら、単なる例示として記載されるにすぎないことが理解されよう。
【００４３】
以下、本開示の一実施形態を図面と共に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ｈＥＳＣ由来胚葉体における内胚葉誘導を示す図である。図１（ａ）は、分化プロトコールの模式図である。ＥＢは、６日目にトリプシン処理され、アクチビンの存在下で単層として２日間置き、適当な段階の胚体内胚葉が生成する。肝系統は、ＢＭＰ４及びＦＧＦの存在下での培養によってこの内胚葉集団から特定化される。肝成熟は、最初に、ＨＧＦ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及びオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の１２日間の添加と、それに続く、３次元凝集体の生成、それが、Ｄｅｘを補給した肝細胞培地において８日間、続いて、ｃＡＭＰ類似体、８−ｂｒ−ｃＡＭＰを添加したこの培地においてさらに１２日間（３２〜４４日目）培養されることによる段階的プロセスによって誘導される。図１（ｂ）は、６日目アクチビン−及びアクチビン／Ｗｎｔ３ａ−によって誘導された集団における、ＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋（ＣＤ１１７）及びＥＰＣＡＭ＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析を示す。図１（ｃ）は、６日目アクチビン−及びアクチビン／Ｗｎｔ３ａ−によって誘導された集団における、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合を示す細胞内フローサイトメトリー分析を示す。ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋集団の大きさは、アクチビン単独で誘導されたＥＢ（Ｓｏｘ１７：９１＋／−１．８％、ＦｏｘＡ２：８０．３＋／−２．５％）と比較して、アクチビン／Ｗｎｔ３ａによって誘導されたＥＢにおいて有意に大きかった（Ｓｏｘ１７：９６．２＋／−１．１％、ＦｏｘＡ２：８８．５＋／−２．９％）＊Ｐ＜０．０５（Ｐ＝０．００２）、＊＊Ｐ＜０．０１（Ｐ＝０．００５）；スチューデントのｔ検定、ｎ＝４。図１（ｄ）は、アクチビン及びアクチビン／Ｗｎｔ３ａによって誘導されたＥＢにおけるＴ、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ及びＦＯＸＡ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲベースの分析を示す。ＥＢは、示された時点で分析された。バーは、３回の独立した実験の平均のＳＤを表す。図１（ｅ）は、アクチビン／Ｗｎｔ３ａによって誘導されたＥＢにおける、ＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋集団の発生の動態を示すフローサイトメトリー分析である。図１（ｆ）は、神経基本培地中でアクチビンを用いて誘導された６日目ＥＢにおけるＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋、ＥＰＣＡＭ＋、Ｓｏｘ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。
【００４５】
【図２】（ａ）示されたサイトカインを用いて特定化された単層培養におけるアルブミン発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。細胞を、６日目から１２日目まで種々の因子（ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ；ＢＭＰ４  ５０ｎｇ／ｍｌ；ＨＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ；又はｂＦＧＦ  ２０ｎｇ／ｍｌ及びＢＭＰ４  ５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理し、次いで、ＤＥＸ、ＨＧＦ及びＯＳＭとともに培養し、２４日目に分析した。バーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定されるｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）培養物における発現に関連して示される。＊＊＊ｂＦＧＦで処理された培養物と比較してＰ＜０．００１。スチューデントのｔ検定、ｎ＝３。（ｂ）ＦＧＦ１０の存在下及び非存在下で特定化された集団におけるアルブミン発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。培養物を、６日目から８日目の間、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理した（又はしなかった）。この段階で、ＦＧＦ１０を除去し、細胞を８から１２の間、ｂＦＧＦ／ＢＭＰ４において培養した。バーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１と設定されるＦＧＦ１０（−）培養物における発現に関連して示される。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定、ｎ＝３。
【００４６】
【図３】アクチビンシグナル伝達の期間が、肝発達に影響を及ぼすことを示す図である。図３（ａ）は、６日目アクチビン／Ｗｎｔ３Ａ誘導されたＥＢにおける、並びにそれから誘導された単層集団における、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合を示す細胞内フローサイトメトリー分析である。単層集団を、特定化培地（−アクチビン）において直接、又はアクチビン（５０ｎｇ／ｍｌ）において２日間、次いで、特定化培地（＋アクチビン）において培養し、特定化培地において２又は４日培養した後に、集団を分析した（−アクチビン群については、総８日目及び１０日目、＋アクチビン群については、１０日目及び１２日目）。バーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。１０／１２日目のＳＯＸ１７＋の割合は、非処理集団（７３．３＋／−７．５％対４５．９＋／−３．７％）と比較してアクチビン処理において有意に高かった。同様に、８／１０日目及び１０／１２日目のＦＯＸＡ２＋細胞の割合は、非処理集団と比較してアクチビン処理において有意に高かった（８日目：９６．１＋／−０．９％対７６．５＋／−１０．１％、１２日目：９２．７＋／−２．５％対５０．２＋／−６．３％）。図３（ｂ）は、アクチビン処理及び非処理単層培養物における総細胞数を表す。６日目ＥＢ由来細胞を、直接肝分化培地において、又はアクチビンの存在下で２日間、次いで、肝分化培地において培養した。図３（ｃ）は、非処理細胞及びアクチビン処理内胚葉から生成した、８、１０及び１２日培養時の集団におけるＣＸＣＲ４及びＣＫＩＴ陽性細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。図３（ｄ）は、アクチビン処理（黒色バー）及び非処理（灰色バー）内胚葉から生成した、肝単層集団のＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析を示す。集団を、示された内胚葉（ＨＥＸ、ＡＦＰ、ＡＬＢ及びＨＮＦ４ａ）及び中胚葉（ＭＥＯＸ１、ＭＥＳＰ１、ＣＤ３１及びＣＤ９０）遺伝子の発現について分析した。アクチビン処理集団（灰色バー）を、総培養の１２、１８及び２６日目に分析したが、非処理集団（黒色バー）を、培養の１０、１６及び２４日目に分析した。示された発現レベルは、ＴＢＰに関連する。バーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。図３（ｅ）は、アクチビン処理（２６日目）及び非処理（２４日目）内胚葉に由来する単層集団におけるＣＤ３１＋ＣＤ９０＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。ＣＤ３１＋及びＣＤ９０＋集団は、処理培養物と比較して非処理において有意に大きかった（ＣＤ３１：１３．６＋／−２．３％対０．４９＋／−０．１１％、Ｐ＜０．００１；ＣＤ９０：４１．２＋／−４．７％対８．５＋／−１．１９％、Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ｎ＝３）。対照的に、非処理細胞から生成した集団と比較して、アクチビン処理内胚葉に由来する集団において、より多い部分のＥＰＣＡＭ＋細胞が検出された（ＥＰＣＡＭ：９０．７＋／−２．７％対５６．８＋／−７．３％；Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。図３（ｆ）は、アクチビン処理（２６日目）及び非処理（２４日目）内胚葉から生成した培養物におけるアルブミン陽性細胞の割合を示す免疫染色分析を示す。アルブミンは、Ａｌｅｘａ４８８を用いて可視化される。スケールバー：２００μｍ。（ｇ）アクチビン処理（灰色バー；２６日目）及び非処理（黒色バー；２４日目）内胚葉から生成した単層培養物におけるアルブミン（ＡＬＢ）及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）細胞の割合を示す細胞内フローサイトメトリー分析。図中のバーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定；ｎ＝３）。ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【００４７】
【図４】凝集が肝成熟を促進することを示す図である。図４（ａ）は、培養２８日目の肝凝集体の位相差画像である。スケールバー、２００μｍ。図４（ｂ）は、分化３２日目での単層（黒色バー）及び３次元凝集体培養物（灰色バー）におけるＡＬＢ、ＣＰＳ１、ＴＡＴ、Ｇ６Ｐ及びＴＤＯ発現のＲＴ−ｑＰＣＲベースの分析を示す。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される成体肝臓における発現に関連して示される。図４（ｃ）は、単層（黒色バー）及び３次元凝集体培養（灰色バー）における分化３２日目のＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７及びＣＹＰ３Ａ４発現のＲＴ−ｑＰＣＲベースの分析である。発現レベルは、ＴＢＰに関連している。図４（ｄ）は、３６日目での単層（２次元）及び凝集体（３次元）培養物におけるアシアロ糖タンパク質受容体−１＋（ＡＳＧＰＲ−１）細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。ＡＳＧＰＲ−１＋細胞の頻度は、３次元凝集体培養物において有意に高かった（２次元：２８．８＋／−３．１％、３次元：６４．７＋／−４．２６％、Ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。すべてのグラフ中のバーは、３回の独立した実験から得たサンプルの平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓、ＰＨ；２日間培養された初代肝細胞。
【００４８】
【図５】ｃＡＭＰシグナル伝達が、ｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の成熟を誘導することを示す図である。図５（ａ）は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下及び非存在下で培養された肝凝集体における、ＰＧＣ１−ａ、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、Ｇ６Ｐ及びＴＡＴ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析である。発現レベルは、ＴＢＰと関連している。図５（ｂ）は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下及び非存在下で培養された肝凝集体における、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）＋及びアルブミン（ＡＬＢ）＋細胞（４４日目）の割合を示す細胞内フローサイトメトリー分析である。ＡＦＰ＋細胞の頻度は、非誘導集団と比較して、ｃＡＭＰを用いて誘導された集団において有意に低かった（３４．５＋／−１２．４％対５６．９＋／−３．６％、Ｐ＜０．０５、平均＋／−ＳＤ、ｎ＝３）。他方、ＡＬＢ陽性細胞の割合は、ｃＡＭＰ処理集団において高かった（８９．５＋／−５．６％対８２．３＋／−３．０％、Ｐ＜０．０５（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝３）。図５（ｃ）は、ＨＥＳ２、Ｈ９及び３８−２細胞から生成したｃＡＭＰ処理膵臓凝集体及び肝凝集体におけるＰＧＣ１−ａ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析である。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される非処理細胞における発現に関連して倍数変化として示される。図５（ｄ）は、非処理及びｃＡＭＰ処理凝集体における４４日目のＩＣＧ取り込みを示す。すべてのグラフ中のバーは、３回の独立した実験から得た値の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【００４９】
【図６】ｃＡＭＰシグナル伝達が、ｈＥＳＣ由来肝細胞において代謝酵素活性を増大することを示す図である。図６（ａ）は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下及び非存在下で培養された肝凝集体（４４日目）におけるＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６及びＵＧＴ１Ａ１の発現を示す。初代肝細胞（ＰＨ）のレベルは、対照として示されている。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される非処理細胞における発現と関連して倍数変化として示される。図６（ｂ）は、未処理（−）及びｃＡＭＰ処理（＋）単層集団（４４日目）における、ＰＧＣ１ａ、ＴＡＴ、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される未処理（−）及びｃＡＭＰ処理（＋）単層集団（４４日目）における発現に関連して倍数変化として示される。図６（ｃ）は、非処理（−Ａｃｔ）又は長期アクチビン処理（＋Ａｃｔ）内胚葉から生成したｃＡＭＰ処理凝集体（４４日目）におけるＣＹＰ１Ａ２及びＡＬＢ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。図６（ｄ）は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ＋）において６日（ｃＡＭＰ＋／−）又は１２日間培養された凝集体におけるＣＹＰ１Ａ２発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。図６（ｅ）は、ｈＥＳＣ由来肝細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＰ１Ａ２活性を示すことを示す。非処理及びｃＡＭＰ処理凝集体及び初代肝細胞を、フェナセチン（２００μＭ）とともに２４時間インキュベートした。フェナセチンからのＯ−脱エチル化代謝産物アセトアミノフェンの生成を、ＨＰＬＣによってモニタリングした。活性は、細胞１０，０００個あたりで示されている（＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。図６（ｆ）は、ｈＥＳＣ由来肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＰ２Ｂ６活性を示すことを示す。ｃＡＭＰ処理凝集体及び初代肝細胞を、ブプロピオン（１μＭ）とともに４８時間インキュベートした。ブプロピオンからの代謝産物Ｏ−ヒドロキシ−ブプロピオンの形成をＨＰＬＣによって測定した。活性は、細胞５０，０００個あたりで示されている（ｎ＝３）。図６（ｇ）は、スルファメタジン（ＳＭＺ）のＮ−アセチル化ＳＭＺへの代謝は、第ＩＩ相酵素（単数又は複数）ＮＡＴ１及び／又はＮＡＴ２の存在を示すことを示す。ｃＡＭＰ処理凝集体及び初代肝細胞を、ＳＭＺ  ５００μＭ）とともに４８時間培養し、Ｎ−アセチル化ＳＭＺをＨＰＬＣによって測定した。活性は、細胞１０，０００個あたりで示されている（ｎ＝３）。図６（ｈ）は、総ＵＧＴ活性を示すｃＡＭＰ処理凝集体による４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）からの４−ＭＵグルクロニド（４−ＭＵＧ）の生成を示すＨＰＬＣ分析である。ｃＡＭＰ処理凝集体及び初代肝細胞を、４−ＭＵとともに４８時間培養した。４ＭＵＧの形成は、ＨＰＬＣによって測定した。活性は、細胞１０，０００個あたりで示されている、（ｎ＝３）。すべてのグラフ中のバーは、３回の独立した実験から得たサンプルの平均の標準偏差（ＳＤ）を表す、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ＰＨ；初代肝細胞。
【００５０】
【図７】種々の多能性幹細胞系からの肝分化を示す図である。図７（ａ）は、Ｈ９  ｈＥＳＣ、Ｈ１  ｈＥＳＣ及び３８−２  ｉＰＳＣから生成した、アクチビン／Ｗｎｔ３ａ誘導６日目ＥＢにおけるＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋、ＥＰＣＡＭ＋、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸａ２＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。図７（ｂ）は、アクチビンを用いて変動する期間処理された、Ｈ９、Ｈ１及び３８−２由来内胚葉から生成した単層培養物におけるアルブミン発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。種々の集団を以下の時点で分析した：アクチビンなし：２４日目、２日アクチビン：分化の２６日目、４日アクチビン：２８日目。図７（ｃ）は、種々のｈＰＳＣ系から生成したＡＬＢ及びＡＦＰ陽性細胞の頻度を示す細胞内フローサイトメトリー分析を示す（アクチビンなし（−）：２４日目、２日アクチビン：分化の２６日目、４日アクチビン：２８日目）。図７（ｄ）は、培養２６日目のＨ９由来肝細胞の形態を示す位相差画像である。スケールバー：２００μｍ。図７（ｅ）は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下及び非存在下で培養された、Ｈ９によって誘導された及びｉＰＳＣ（３８−２）によって誘導された肝凝集体（４４日目）におけるＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６及びＵＧＴ１Ａ１を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される非処理細胞における発現に関連して倍数変化として示される。すべてのグラフ中のバーは、３回の独立した実験から得た値の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定、ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓、ＰＨ：初代肝細胞。
【００５１】
【図８】（ａ）（ｂ）（ｃ）は、ＣＨＩＲ９９０２１が、胚体内胚葉細胞を誘導し得ることを実証する図である。（ａ）アクチビン／ｗｎｔ３ａ若しくは（ｂ）アクチビン／ＣＨＩＲ９９０２１を用いる胚葉体誘導６日目の、又は（ｃ）アクチビン／ｗｎｔ３ａ若しくは（ｄ）アクチビン／ＣＨＩＲ９９０２１を用いる単層誘導７日目のＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析を示す図である。（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）ＮＳＧマウスにおける異所性肝臓組織。移植後２ヶ月のｈＥＳＣ由来肝細胞のクラスター（矢頭）を示す腸間膜のＨ＆Ｅ染色切片の顕微鏡写真。倍率は５倍であった。腸（矢印）、移植された細胞（矢頭）。（ｆ）図８（ｃ）からのＨ＆Ｅ染色切片の高倍率（１０Ｘ）顕微鏡写真。（ｇ）（ｈ）移植の２ヶ月後の腸間膜領域におけるｈＥＳＣ由来細胞の存在を示す免疫組織化学的染色。矢印で示されるヒトアルブミン（Ａｌｅｘａ４８８：緑色）及び矢頭で示されるＣＫ１９（Ｃｙ３：赤）についての二重染色は、移植された細胞は、肝細胞及び胆管細胞系統に分化する可能性を有することを示す。ＨＥＳＣ由来肝細胞様細胞は、アルブミン陽性細胞（矢印）として観察されたのに対し、胆管細胞様細胞は、ＣＫ１９を発現し、管様構造（矢頭）中に見られた。
【００５２】
【図９】肝前駆細胞増殖及び成熟に影響を及ぼす因子を表す図である。図９（ａ）は、Ｗｎｔシグナル伝達及びＳｍａｄシグナル伝達による肝前駆細胞集団の増殖を示す。種々の濃度のＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ、１μＭ及び３μＭ）及びＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２（６μＭ）における、Ｈ９由来２７日目肝前駆細胞の培養９日後のＡＬＢ＋ＡＦＰ＋細胞数の増大倍数が示されている。図９（ｂ）及び（ｃ）は、Ｈ９由来２７日目肝前駆細胞の培養９日後（３６日目）の、ＡＬＢ陽性細胞（ｂ）並びにＡＬＢ及びＨＮＦ４αの二重陽性（ｃ）の存在を示す免疫蛍光染色を表す。図９（ｄ）及び（ｅ）は、Ｗｎｔ／ｐ−カテニン及びＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達の阻害が、４４日目凝集体（全部で３）においてＣＹＰ３Ａ４（エルキニブ（erkinhib）＋ｃａｍｐ十分）及びＣＹＰ１Ａ２の発現を増大させることを示す。Ｗｎｔ阻害剤ＸＡＶ９３９（１μＭ）及びＭＥＫ／Ｅｒｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）を、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰと一緒に分化３０日目に凝集体培養物に、単独又は一緒に添加した。成体肝臓において見られるレベルに関連してＣＹＰ３Ａ４（ｄ）及びＣＹＰ１Ａ２（ｅ）の発現が示されている。ｃＡＭＰと一緒のＭＥＫ／ＥｒＫ阻害剤の添加は、成体肝臓で見られるレベルに匹敵するＣＹＰ３Ａ４発現のレベルを誘導したのに対し、ｃＡＭＰととものＷｎｔ及びＭＥＫ／ＥｒＫ阻害剤両方の添加は、最高レベルのＣＹＰ１Ａ２発現を誘導した。図９（ｆ）は、種々の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）での２６日目肝細胞様細胞培養物におけるＡＬＢの発現を示す。示される値は、１に設定されるゼラチン上で培養された細胞に関連している。
【００５３】
【図１０】肝前駆細胞におけるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路が、胆管細胞系統の分化に影響を及ぼすことを示す図である。（ａ）コラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスにおいて生成した３次元（３Ｄ）組織から得たＨ＆Ｅ染色切片の高倍率（２０Ｘ）顕微鏡写真。Ｈ９由来２５日目肝前駆細胞を、低クラスター培養皿中で４８時間、５：１の比でＯＰ９−δ１間質細胞と混合した（凝集させた）。キメラ凝集体を、１型コラーゲン（８０％）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（２０％）の混合物中に包埋し、３次元共培養を確立した。培養物を、ＨＧＦ２０ｎｇ／ｍｌ及びＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌを含有する培地中、ＧＳＩの存在下又は非存在下で９日間維持した。ＧＳＩを用いて処理された培養物中では、凝集体形態が維持された。これらの凝集体は、アルブミンを発現する肝細胞様細胞を含有していた。ＧＳＩの非存在下では、凝集体は、大規模な分岐構造を発生した。分岐内の細胞は、上皮形態を示し、内側管腔周囲に組織化した。これらの細胞は、ＣＫ１９を発現し、これは、それらが胆管細胞であること及び分岐構造が発達中の胆管に相当し得ることを示唆する。図１０（ｂ）は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化が、管構造におけるＣＫ１９及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の発現を上方制御することを示す。示される値は、ＧＳＩの存在下で培養された細胞に関連している。Ｎｏｔｃｈ（−）共培養（すなわち、ＧＳＩを用いて処理された）における細胞は、アルブミンの発現によって実証されるように肝細胞の特徴を保持した。図１０（ｃ）は、３次元共培養におけるＣＦＴＲの発現は、単層培養で見られるものよりも高度に誘導されたことを示す。示される値は、単層条件において培養された細胞に関連している。
【００５４】
【図１１】肝細胞／胆管細胞分化プロトコールの模式図である。（ａ）胚体内胚葉を作製するための単層培養物はまた、ｗｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ９９０２１と一緒のアクチビンの存在下でも作製した。単層誘導における５日目の内胚葉細胞は、ＥＢにおける６日目の細胞と同等である。肝前駆細胞及び成熟肝細胞の生成には、単層培養では５日目を超えるさらなるアクチビン処理も必要である。（ｂ）胚体内胚葉を作製するために使用されたＥＢ培養。（ｃ）胆管細胞を作製するために使用されたプロトコールの模式図。単層培養において生成した胚体内胚葉を、肝臓への運命へ特定化し、その結果、培養２５日目までに肝前駆細胞（肝芽細胞）が生成した。肝前駆細胞を解離し、低クラスター培養皿中で２日間、ＯＰ９／ＯＰ９δ細胞を用いて凝集させた。キメラ凝集体をコラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌゲル中に包埋し、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を補給した培地で、全Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤（例えば、ｎｏｔｃｈアンタゴニスト）、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ−６８５，４５８の存在下又は非存在下で培養した。
【００５５】
【図１２】ｈＥＳＣ由来内皮細胞が肝成熟を増強することを実証する図である。（ａ）ｈＥＳＣ由来内皮細胞（ＲＦＰ陽性）及び肝芽細胞からなるキメラ凝集体の作製のために使用されるプロトコール。ＲＦＰ（＋）／ＣＤ３４（＋）内皮細胞は、ＢＭＰ４を用いる４日間の、次いで、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを用いるさらに２日間のＥＢの誘導によって生成した。ＦＡＣＳによって単離されたＲＦＰ（＋）／ＣＤ３４（＋）内皮細胞を、コラーゲンＩ型でコーティングしたウェルに置き、ＥＧＭ−２培地を用い、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦの存在下で６日間培養した。キメラ凝集体を作製するために、培養したＲＦＰ（＋）／ＣＤ３４（＋）細胞をトリプシン処理し、解離させ、ウェルあたり細胞１００個の細胞密度でＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレート中に置いた。２日培養した後、２５日目肝芽細胞を、ウェルあたり細胞１０００個の細胞密度でＲＦＰ（＋）／ＣＤ３４（＋）内皮凝集体上に置いた。スケールバー１００μｍ（ｂ）３３日目の内皮／肝凝集体内のＲＦＰ陽性細胞を示す位相差及び蛍光画像。ＲＦＰは、内皮細胞を伴わずに生成した肝凝集体では検出されない。スケールバー１００μｍ（ｃ）３３日目の内皮／肝細胞凝集体中のＲＦＰ陽性細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析。（ｄ）４４日目の内皮細胞を伴う及び伴わない凝集体におけるＣＹＰ３Ａ４発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される成体肝臓サンプルの発現に対する変化倍数として示される。
【００５６】
【図１３】ｈＰＳＣ由来肝細胞の成熟に対する３次元ゲル培養の効果を実証する図である。肝芽細胞又は肝芽細胞及び内皮細胞（ｅｎｄ）からなる凝集体が、培養２５日目に生成し、次いで、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを補給した肝細胞培養培地中液体中でさらに７日間培養し、続いて、ｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）及びＸＡＶ９３９を補給した同一培地中で１２日間培養した。成熟に対するコラーゲンの効果を調べるために、３２日目キメラ凝集体を、コラーゲン１型ゲル中に包埋し、ｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１及びＸＡＶ９３９の存在下で１２日間培養した。４４日目にすべての培養物を回収し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって示された遺伝子の発現について分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定されている。ＡＬＢ及びＣＹＰ３Ａ４の発現は、成体肝臓におけるそのレベルに対する変化倍数として示されている。ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７の発現は、胎児肝臓におけるそのレベルに対する変化倍数として示されている。ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【００５７】
【図１４】ｈＰＳＣ分化培養物における発達の肝芽細胞段階の特徴を示す図である。（ａ）分化プロトコールの模式図。（ｂ）単層誘導形式で７日目のＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋集団の発達を示すフローサイトメトリー分析。（ｃ）図１４ａに示された培養条件で維持された、Ｈ９由来肝芽細胞における示された遺伝子の発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ。培養７、１３、１９及び２５日目に示された遺伝子の発現を分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される胎児肝臓における発現に対する変化倍数として示される。ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【００５８】
【図１５】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、ｈＰＳＣ由来肝芽細胞様集団からの胆管細胞発達を促進することを示す図である。γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、Ｎｏｔｃｈ経路のアンタゴニストの存在下又は非存在下で、ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＴＧＦｂ１（５ｎｇ／ｍｌ）を補給した培地におけるＯＰ９とともに共培養した後の肝芽細胞由来細胞におけるＡＬＢ及びＣＫ１９のＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析。培養３０、３３及び３６日目に、細胞を回収し、分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１として設定される２７日目肝芽細胞凝集体における発現のレベルに対する変化倍数として示される。（ｂ）ＯＰ９を伴う又は伴わない培養後の肝芽細胞由来細胞におけるＮｏｔｃｈ標的遺伝子ＨＥＳ１、ＨＥＳ５及びＨＥＹ１のＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析。細胞を培養３６日目にアッセイした。この分析のために、２７日目肝芽細胞凝集体を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達アンタゴニストγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）の存在下又は非存在下で、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｂ１（５ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、ＯＰ９（ＯＰ９＋）間質細胞又はＭａｔｒｉｇｅｌ（ＯＰ９−）のいずれかに置いた。値は、ＴＢＰに関連して決定され、Ｍａｔｒｉｇｅｌでの培養３６日目の細胞における発現のレベルに対する変化倍数として示された。この値は、１として設定された。すべてのグラフ中のバーは、３回の独立した実験の平均の標準偏差（ＳＤ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定；ｎ＝３）。
【００５９】
【図１６】３次元培養は、胆管細胞成熟を促進する：２５日目ｈＥＳＣ由来細胞及びＯＰ９間質細胞（ＧＦＰ＋）からなるキメラ凝集体の形態を示す図である。Ｈ９由来２５日目肝芽細胞を、低クラスター培養皿中で４８時間、４：１の比でＯＰ９間質細胞と混合した（凝集させた）。キメラ凝集体を、１型コラーゲン（１．２ｍｇ／ｍｌ）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（４０％）の混合物に包埋し、３次元ゲル培養を確立した。培養物を、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｂ１を含有する培地中、ＧＳＩの存在下又は非存在下で２週間にわたって維持した。（ｂ）３次元培養物において発達する管状、嚢胞又は球形態を示す構造の割合。値は、ＧＳＩの存在下又は非存在下で発達する全構造の割合として示されている。値は、３回の独立した実験を代表するものである。（ｃ）３次元ゲルにおいて発達したプールされた構造のＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析。４４日目に培養物を回収し、細胞を、肝細胞（ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７）及び胆管細胞（ＣＫ１９、Ｓｏｘ９及びＣＦＴＲ）系統を示す遺伝子の発現について分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定されるＧＳＩを用いて処理された集団における発現のレベルに対する変化倍数として示される。
【００６０】
【図１７】ｈＰＳＣ由来胆管細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで管様構造を形成することを示す図である。（ａ〜ｂ）ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｂ１を含有する培地においてＯＰ９間質細胞と９日間共培養された２５日目肝芽細胞由来細胞の移植８週間後のＭａｔｒｉｇｅｌプラグにおける胆管細胞移植片の組織学的分析。共培養後、細胞を解離し、免疫不全ＮＯＤ／重症複合免疫不全／ＩＬ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスの乳房脂肪パッドに移植した（レシピエントあたり１０６個）。乳房脂肪パッドにおいて、低倍率像（ａ）及び高倍率像（ｂ）（Ｈ＆Ｅ染色）で複数の管構造が可視化された。（ｃ〜ｄ）移植後に乳房脂肪パッドにおいて発達したｈＥＳＣ由来管構造におけるＲＦＰ陽性細胞を検出するための免疫染色。これらの研究のために、ＲＯＳＡ遺伝子座からＲＦＰを発現するＨＥＳ２−ＲＦＰ  ｈＥＳＣから胆管細胞を作製した。ＯＰ９間質細胞とともに９日共培養した後に生成した胆管細胞を、ＮＳＧマウスの乳房脂肪パッド中に移植した。移植の８週間後に発達した移植片を、免疫組織化学によってＲＦＰ＋細胞の存在について分析した。すべての管構造内でＲＦＰ陽性細胞が検出され、細胞がヒト起源でありＨＥＳ２−ＲＦＰ細胞に由来することが確認された。低倍率（ｃ）及び高倍率（ｄ）の像において、ＲＦＰ＋構造が見えた。
【００６１】
【図１８】３次元ゲルにおいて生成したｈＰＳＣ由来嚢胞構造が、機能的ＣＦＴＲタンパク質を含有することを示す図である。（ａ）Ｈ９（ｈＥＳＣ）由来及びＹ２−１（ｉＰＳＣ）由来胆管細胞から生成した、カルセイン緑色標識された、フォルスコリン／ＩＢＭＸ（Ｆ／Ｉ）刺激された嚢胞構造の代表的な共焦点顕微鏡像。像は、Ｆ／Ｉ刺激の２４時間後に撮られた。スケールバー５００μｍ（ｂ）ＣＦＴＲ阻害剤の存在下又は非存在下でのＦ／Ｉ刺激の２４時間後の嚢胞膨潤の程度の定量化。Ｆ／Ｉ刺激された嚢胞膨潤を、速度イメージングソフトウェアを使用して定量化した。嚢胞の全体の大きさは、Ｆ／Ｉ刺激の前のものに対して正規化されている。値は、３回の個々の実験に由来する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定；ｎ＝３）。
【００６２】
【図１９】嚢胞性線維症患者ｉＰＳＣからの胆管細胞の作製を示す図である。（ａ）フォルスコリンの存在下又は非存在下での３次元ゲル培養４４日目の、ＣＦＴＲが欠失したＦ５０８  ｉＰＳ細胞（ＣＦ−ｉＰＳＣ）に由来する胆管細胞様細胞の位相差画像。ＣＦ−ｉＰＳＣ由来肝芽細胞及び図１４ａに示されるプロトコールを使用して、キメラ肝芽細胞／ＯＰ９凝集体を作製した。コラーゲン／Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養に包埋した後に、２週間の培養期間の最初の１種間のフォルスコリンの添加によって凝集体からの嚢胞形成を誘導した（左）。フォルスコリン刺激がない場合には、ＣＦ−ｉＰＳＣ由来胆管細胞は、管腔嚢胞よりも分岐管構造を形成した（右）。（ｂ）培養７及び１４日目のＣＦ−ｉＰＳＣ及び正常ｉＰＳＣ（Ｙ２−１）由来胆管細胞から発生した嚢胞構造数の定量化。ＣＦ−ｉＰＳＣ由来胆管細胞を、２週間の培養期間の最初の１週間の間、フォルスコリンの存在下又は非存在下で３次元ゲル条件において維持した（左のグラフ）。正常なｉＰＳ細胞由来胆管細胞を、２週間の培養期間の最初の１週間の間、ＣＦＴＲ阻害剤の存在下又は非存在下で維持した（右のグラフ）。フォルスコリンの添加は、培養７及び１４日目の両方で、ＣＦ−ｉＰＳＣ由来胆管細胞から発生した嚢胞構造数を増大させた（左のグラフ）。正常なｉＰＳＣ由来胆管細胞へのＣＦＴＲ阻害剤の添加は、嚢胞形成を遅延させた（右のグラフ）。（ｃ）４４日目での正常なｉＰＳＣ−（上のパネル）及びＣＦ−ｉＰＳＣ−（下のパネル）胆管細胞に由来する嚢胞の組織学的分析。両胆管細胞集団を、２週間の培養期間の最初の１週間の間、フォルスコリンの存在下で培養した。正常ｉＰＳＣ由来胆管細胞へのフォルスコリンの添加は、大きな管腔嚢胞の形成を誘導した（上のパネル）。ＣＦ−ｉＰＳＣ由来嚢胞は、小さく、しばしば、内部隔壁を含有していた（下のパネル）。
【００６３】
【図２０】低分子矯正剤（correctors）ＶＸ−８０９及びＣ４での処理によるＣＦ−ｉＰＳＣ由来胆管細胞におけるＣＦＴＲ機能の回復を示す図である。ウエスタンブロット解析は、ＶＸ−８０９及びＣ４で処理したＣＦ−ｉＰＳＣ由来胆管細胞におけるＣＦＴＲ（バンドＣ）の成熟複合体グリコシル化形態の蓄積を示す。補正されていない細胞では、タンパク質の突然変異体型（バンドＢ）が優勢であった。陽性対照としてヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）を使用した。（ｂ）２人の個別の患者（９９７ＣＦＴＲ  ｄｅｌ及びＣ１  ＣＦＴＲ  ｄｅｌ−その両方ともδＦ５０８突然変異を保持する）から得たＣＦ−ｉＰＳＣから生成した、カルセイン緑色標識され、フォルスコリン／ＩＢＭＸ（Ｆ／Ｉ）刺激された嚢胞構造の代表的な共焦点顕微鏡像。像は、Ｆ／Ｉ刺激の２４時間後に撮った。スケールバー５００μｍ（ｃ）ＣＦＴＲ阻害剤の存在下又は非存在下でのＦ／Ｉ刺激の２４時間後にｈＰＳＣ−嚢胞において観察された膨潤の程度の定量化。速度イメージングソフトウェアを使用して、Ｆ／Ｉ刺激された嚢胞膨潤を定量化した。嚢胞の全体の大きさは、３回の個別の実験から得られたＦ／Ｉ刺激の前のものに対して正規化されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定；ｎ＝３）。
【００６４】
【図２１】ＯＰ９との共培養の９日後の肝芽細胞由来集団におけるＡＬＢ＋及びＣＫ１９＋細胞の割合を示す細胞内フローサイトメトリー分析。細胞を、ＧＳＩの存在下又は非存在下において、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｂ１を含有する培地で培養した。Ｃｔｒｌは、アイソタイプ対照を示す。
【００６５】
【図２２】他のｈＰＳＣからの肝特定化及び肝芽細胞の分化を示す図である。図１４ａにおいて示されるように維持された、ＨＥＳ２及びＹ２−１  ｉＰＳ細胞由来肝芽細胞における示された遺伝子の発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。培養７、１３、１９及び２５日目に、示された遺伝子の発現を分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される、胎児肝臓における発現に対する変化倍数として示される。ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【００６６】
【図２３】ｈＰＳＣ由来胆管細胞からの嚢胞構造の作製のために使用された３次元ゲルを示す図である。（ａ）２５日目ｈＰＳＣ由来肝芽細胞及びＯＰ９細胞（ＧＦＰ＋）からなるキメラ凝集体を作製するために使用された分化プロトコールの模式図。２５日目肝芽細胞を解離し、低クラスター培養皿中４：１の比でＯＰ９細胞と共培養した。キメラ凝集体を１型コラーゲン（１．２ｍｇ／ｍｌ）及びＭａｔｒｉｇｅｌ（２０％）の混合物からなるゲル中に包埋した。（ｂ）ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｂ１を含有する培地における培養４４日目にＯＰ９の存在下又は非存在下でゲルにおいて発達した構造のＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析。Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子の発現は、ＯＰ９の存在下で有意に上方制御された。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１に設定される、ＯＰ９の非存在下で培養された細胞における発現に対する変化倍数として示されている。（ｃ）培養４４日目のＧＳＩの存在下（右のパネル）及び非存在下（左のパネル）でＯＰ９細胞とともに培養されたＨ９由来胆管細胞から発達した嚢胞構造の組織学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）。（ｄ）ＯＰ９の存在下又は非存在下で培養された正常ｉＰＳＣ由来胆管細胞から生成した構造におけるＣＦＴＲタンパク質（バンドＣ）の成熟複合体グリコシル化形態の存在を示すウエスタンブロット解析。未分化の正常ｉＰＳＣを陰性対照として使用した。（ｅ）ＯＰ９の存在下又は非存在下で培養された正常ｉＰＳＣ由来胆管細胞から生成した構造におけるＣＦＴＲのＲＴ−ｑＰＣＲベースの発現分析。培養４４日目に細胞を分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１として設定される、ｃａｃｏ−２細胞（腸結腸癌腫細胞系統）において検出された発現値に対する変化倍数として示されている。＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定；ｎ＝３）。
【００６７】
【図２４】嚢胞性線維症患者ｉＰＳＣからの胚体内胚葉及び肝芽細胞の作製を示す図である。単層培養７日目のＣＦ−ｉＰＳ細胞（Ｃ１  ｄｅｌ  ＣＦＴＲ）からのＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋集団の発達を示すフローサイトメトリー分析。（ｂ）図１４ａに概説される培養条件で維持された、ＣＦ−ｉＰＳＣ由来肝芽細胞集団における示された遺伝子の発現を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。培養７、１３、１９及び２５日目に、示された遺伝子の発現を分析した。値は、ＴＢＰに関連して決定され、１として示される、胎児肝臓における発現に対する変化倍数として示される。ＡＬ：成体肝臓、ＦＬ：胎児肝臓。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本明細書において記載される一連のステップによる多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの肝細胞及び胆管細胞の効率的な作製のための、及び代謝的に機能的な肝細胞及び／又は胆管細胞の作製のための、頑強な信頼のおけるプラットフォームが本明細書において記載される。例えば、任意選択で、特定の細胞集団の増殖及び／又は特定の運命を増大する１種又は複数のステップと組み合わせた、例えば、ＦＧＦアゴニスト誘導及びＢＭＰ４アゴニスト誘導と組み合わせた、凝集及びｃＡＭＰシグナル伝達の活性化を誘導する１種又は複数の長期ｎｏｄａｌ（例えば、アクチビン）シグナル伝達処理は、胚葉体において、又は単層から誘導された胚体内胚葉からの、例えば、増殖した肝芽細胞を含めた肝細胞及び胆管細胞系細胞並びに／又はさらなる操作を用いて、機能的な、成熟した肝細胞及び胆管細胞の再現可能な作製を可能にするということが実証される。
【００６９】
本開示の一態様は、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞又は肝芽細胞、肝細胞及び／若しくは胆管細胞などの胆管細胞系細胞を製造する方法を含み、方法は、（ａ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片の組合せを含む特定化培地と接触させて、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得ることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆体を含む細胞集団を得るステップと、（ｂ）細胞集団の肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導して、肝細胞の増殖した集団並びに／又は肝細胞及び／又は胆管細胞を含む集団を得るステップであって、成熟を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製するステップを含む、ステップとを含む。
【００７０】
凝集は、成熟にとって、また成熟を促進するために重要であると本明細書において実証される。
【００７１】
一実施形態では、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞は、肝芽細胞及び／又は未熟肝細胞及び／又は未熟胆管細胞を含む。
【００７２】
用語「接触させること」（例えば、内胚葉細胞集団を成分（単数又は複数）と接触させること）は、成分（単数又は複数）及び細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベートすること（例えば、培養中の細胞に化合物を添加すること）を含むものとし、接触させるステップは、任意の適した方法で実施され得る。例えば、細胞は、接着培養において、又は懸濁培養において処理され得、成分は、時間的に、実質的に同時に（例えば、カクテル中で一緒に）又は逐次（例えば、第１の成分の添加から１時間、１日又はそれ以上内に）添加され得る。細胞はまた、増殖因子若しくは他の分化剤などの別の薬剤又は細胞を安定化する、若しくは細胞をさらに分化させる環境と接触され得、細胞を、例えば、実施例にさらに記載されるような多能性（及び／又は分化した）集団を培養するための当業界公知の条件下で培養することを含む。
【００７３】
用語「内胚葉」及び「胚体内胚葉」とは、本明細書において、極めて初期の胚における３種の原始生殖細胞層のうちの１種を指す（他の２種の生殖細胞層は、中胚葉及び外胚葉である）。内胚葉は、３層のうち最内部である。内胚葉細胞は分化して、まず、胚消化管を、次いで、食道、胃、腸、直腸、結腸、咽頭嚢派生扁桃腺、甲状腺、胸腺、副甲状腺、肺、肝臓、胆嚢及び膵臓を含む派生した組織を生じる。
【００７４】
「誘導された内胚葉細胞集団」とは、本明細書において、例えば、図１ａに示されるような「胚体内胚葉誘導」段階に対応する内胚葉細胞の集団を指す。この集団は、例えば、アクチビンなどのｎｏｄａｌアゴニストに曝露された胚葉体（embyroid bodies）（ＥＢ）から、場合により、ｎｏｄａｌアゴニスト及びＷｎｔ３ａなどのｗｎｔ／β−カテニンアゴニスト又はＣＨＩＲ−９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモ−インディルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））若しくはＳｔｅｍｇｅｎｔ（カタログ：０４００３）製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯなどのＧＳＫ−３選択的阻害剤に曝露されたＥＢから調製され得る。或いは、誘導された内胚葉細胞集団は、単層に増殖された細胞から調製され得る。誘導された内胚葉細胞集団は、例えば、表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＫＩＴ及びＥＰＣＡＭ並びに転写因子ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２などの１種又は複数のマーカーについての、フローサイトメトリー分析及び分子分析によって同定され得る。誘導された内胚葉細胞集団はまた、例えば、ＣＸＣＲ４及びＣＫＩＴ又はＣＸＣＲ４及びＥＰＣＡＭを同時発現する集団の少なくとも７０、８０、９０若しくは９５％又は７０、８０、９０若しくは９５％超によって同定され得る。誘導された内胚葉細胞集団はまた、例えば、ＳＯＸ１７及び／又はＦＯＸＡ２を発現する集団の７０、８０、９０又は９５％を超える集団によって同定され得る。誘導された内胚葉細胞集団は、例えば、２次元（単層）又は３次元（胚葉体又は凝集体の他の形態）形式であり得る。誘導された内胚葉集団は、例えば、実施例１において実証されるように、ｈＥＳＣ並びに誘導された多能性細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。
【００７５】
誘導された内胚葉細胞集団は、例えば、ｎｏｄａｌアゴニストで長期間処理され、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され、誘導された内胚葉細胞集団を提供する。
【００７６】
実施例１に記載され、図３ａに示されるように、６日目細胞（方法が単層誘導を含む場合には５日目）を、ＦＧＦ／ＢＭＰ４を用いる特定化に先立ってアクチビンにおいてさらに２日間培養することは、アクチビン（例えば、ｎｏｄａｌアゴニストの一例）においてさらに２日間培養されていない細胞と比較して、１２日目に測定されるように高い割合のＳＯＸ１７＋ＦＯＸＡ２＋細胞をもたらす。このステップはまた、本明細書において、「長期アクチビン」処理とも呼ばれ、「長期ｎｏｄａｌアゴニスト」処理の一例である。
【００７７】
「長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され、誘導された内胚葉細胞集団（extended nodal agonist treated induced endoderm cell population）」とは、本明細書において、アクチビンなどのｎｏｄａｌアゴニストで長期間、例えば、さらなる約１〜約４又は約１、２、３若しくは４日処理された誘導された内胚葉細胞集団を指す（例えば、アゴニストでの処理を含み得る内胚葉誘導相に加えたものである「長期間」）。本明細書において実証されるような長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理は、培養２６日目にＨＥＸ、ＡＦＰ、ＡＬＢ及びＨＮＦ４αを含めた肝前駆細胞（肝芽細胞）発達を示す遺伝子の高レベルの発現をもたらした（図３ｄに示されるように）。長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団は、胚葉体（ＥＢ）において内胚葉細胞を誘導することによって、又は単層にある内胚葉細胞を誘導することによって得られ、ここで、誘導された内胚葉集団は、ｎｏｄａｌアゴニスト、例えば、アクチビンの存在下で、長期間培養され、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を製造する。
【００７８】
長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団は、一実施形態では、胚葉体（ＥＢ）において内胚葉細胞を誘導することによって得られる。別の実施形態では、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団は、単層にある内胚葉細胞を誘導することによって得られる。各場合において、誘導された内胚葉集団は、ｎｏｄａｌアゴニスト、例えば、アクチビンの存在下で、長期間培養される。
【００７９】
例えば、誘導された内胚葉細胞集団がＥＢから誘導される実施形態では、任意選択で、誘導された内胚葉集団は、続いて、解離される。本明細書において、「解離された細胞」又は「解離された細胞集団」とは、３次元凝集体ではない、例えば、物理的に互いに分離している細胞を指す。解離された細胞は、細胞のクラスター又はクランプを指す「細胞凝集体」とは区別される。
【００８０】
一実施形態では、誘導された内胚葉集団は、少なくとも８０％、８５％、９０％のＣＸＣＲ４＋及びｃＫＩＴ＋陽性細胞、並びに／又は少なくとも７０％、７５％、８０％のＳＯＸ１７＋細胞を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、誘導された内胚葉細胞集団（及び／又は長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団）は、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から製造される。多能性幹細胞は、任意選択で、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【００８２】
用語「多能性」とは、本明細書において、種々の条件下で、２種以上の分化した細胞種に分化する能力、例えば、３種の生殖細胞層に特徴的な細胞種に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して２種以上の細胞種に分化するその能力によって特性決定される。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によって実証される。
【００８３】
用語「前駆体細胞」とは、分化によって生じ得る、細胞に関連して十分に分化した細胞よりも、発達経路又は進行に沿ってより早い段階である細胞表現型を有する細胞を指す。前駆体細胞は、発達経路及び細胞が発達し、分化する環境に応じて、複数の別個の分化した細胞種又は単一の分化した細胞種を生じさせ得る。
【００８４】
用語「幹細胞」とは、本明細書において、増殖し、自己複製し、順に、分化した又は分化可能な娘細胞を生じさせ得る、多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆体細胞を生じさせ得る未分化の細胞を指す。娘細胞は、例えば、増殖し、親の発達能力を有する１種又は複数の細胞を保持しながら、１種又は複数の成熟細胞種に続いて分化する後代を製造するよう誘導され得る。
【００８５】
用語「胚幹細胞」は、胚盤胞（embryonic blastocyst）の内細胞塊の多能性幹細胞を指すものとして使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、同６，２００，８０６号を参照のこと）。このような細胞はまた、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内細胞塊から得ることもできる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、同５，９９４，６１９号、同６，２３５，９７０号を参照のこと）。胚幹細胞の示差的な特徴が、胚幹細胞表現型を規定する。したがって、細胞が、他の細胞から区別できるような１種又は複数の胚幹細胞固有の特徴を有する場合、胚幹細胞の表現型を有する。例示的な示差的な胚幹細胞の特徴として、制限するものではないが、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する反応性などが挙げられる。
【００８６】
一実施形態では、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法は、（ａ）誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理された内胚葉細胞集団を、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団に特定化するステップを含む。
【００８７】
一実施形態では、特定化ステップは、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４を含む特定化培地と接触させるステップを含む。ＦＧＦアゴニストは、例えば、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４、その活性断片及び／又は組合せであり得る。組合せは、細胞に、例えば、逐次添加され得る。
【００８８】
一実施形態では、特定化ステップは、まず、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４を含む特定化培地と約４０〜約６０時間、例えば、約４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８又は約６０時間接触させるステップ、次いで、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と、約４〜約７日間、例えば、約４、５、６又は約７日間接触させるステップとを含む。
【００８９】
一実施形態では、特定化培地は、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１１５７６ＳＡ）、アスコルビン酸、ＭＴＧ、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）（例えば、８日目〜１０日目、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（例えば、１０日目〜１４日目）及びＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）を補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。
【００９０】
任意選択で、内胚葉細胞集団は、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４と１〜３日間、任意選択で、２日間接触され、その後、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４と２〜６日間、任意選択で、３〜５日間、任意選択で、４日間接触される。いくつかの実施形態では、内胚葉細胞集団は、ＢＭＰ４及びＦＧＦ１０又はｂＦＧＦを含む細胞培養培地でインキュベートされる。任意選択で、内胚葉細胞集団は、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、ＢＭＰ４及びＦＧＦ１０又はｂＦＧＦを補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む細胞培養培地においてインキュベートされる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、内胚葉細胞集団は、解離され、次いで、単層細胞は、ＦＧＦ及びＢＭＰ４アゴニストと接触される。
【００９２】
他の実施形態では、単層細胞は、アクチビンと、１〜４日間、任意選択で、１、２、３又は４日間接触され、次いで、ＦＧＦ及びＢＭＰ４などのＢＭＰ４アゴニストと接触される。任意選択で、単層細胞は、アクチビンＡを含む細胞培養培地、任意選択で、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ及びＢＭＰ４を補給したＳｔｅｍＰＲＯ−３４を含む培地中でインキュベートされる。
【００９３】
さらなる実施形態では、特定化ステップは、細胞を、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子を含む特定化培地と接触させることを含む。
【００９４】
用語「特定化培地」とは、本明細書において、細胞又は細胞集団の特定化を促進するか、又は容易にするために使用される培養培地を指す。肝特定化培地の一例は、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１１５７６ＳＡ）及びアスコルビン酸、ＭＴＧ、ＢＭＰ４アゴニストと、ＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４及びＦＧＦ２から選択される少なくとも１種のＦＧＦアゴニストを補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）とを含む。いくつかの段階については、いくつかの実施形態では、例えば、肝細胞及び胆管細胞系統の両方を特定化するために、同一特定化培地が使用され得る。他の段階では、他の実施形態では、特定化培地は、肝細胞及び／又は胆管細胞発達の特定化を促進する１種又は複数の因子、例えば、ｎｏｔｃｈアンタゴニスト又はｎｏｔｃｈアゴニストを含む。用語「特定化すること」とは、本明細書において、特定の細胞の運命に向かわせるプロセスを意味し、その前には、細胞種はまだ決定されておらず、細胞が特定の運命に向けて有するいかなる傾向も、逆転され、別の運命に変換され得る。特定化は、細胞の運命が通常の条件下では変更され得ない状態を誘導する。
【００９５】
例えば、誘導された内胚葉の、肝臓への運命に沿った特定化は、例えば、実施例９において実証されるように、例えば、Ｔｂｘ３  ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＣＫ１９、Ｓｏｘ９、ＮＨＦ６β及びＮｏｔｃｈ２を含めた肝細胞及び／又は胆管細胞によって発現される遺伝子を測定することによって確認され得る。例えば、Ｎｏｔｃｈ２発現は、ＨＧＦ／ＤＥＸ／ＯＳＭ処理肝芽細胞では上方制御されることが実証されている。Ｎｏｔｃｈ２タンパク質及び／又は発現の検出は、細胞集団が胆管細胞特定化され得ることを確認するために使用され得る、例えば、Ｎｏｔｃｈ２は、実施例９に記載されるように検出され得る。
【００９６】
細胞との関連で、用語「分化した」又は「分化する」は、相対的な用語であり、「分化した細胞」は、比較されている細胞よりも発達経路をさらに先に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統によって制限された前駆体細胞（誘導された内胚葉前駆体細胞など）に分化し得、これは、順に、その経路をさらに進んだ他の種類の前駆体細胞に分化し、次いで、特定の組織種において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合も保持しない場合もある最終段階の機能的細胞に成熟し得る。用語「分化」とは、本明細書において、誘導された内胚葉集団及び特定化された細胞集団、例えば、肝細胞又は胆管細胞特定化細胞集団を製造するためのステップを含む。
【００９７】
別の実施形態では、凝集体が、少なくとも７０％、８０％、８５％又は少なくとも９０％のアルブミン陽性細胞を含む細胞集団から生成し、別の実施形態では、凝集体は、２４、２５、２６、２７又は２８日培養した後に生成する（例えば、ＰＳＣが得られた日が０日目と考えられる場合に）。
【００９８】
任意選択で、凝集体は、酵素処理及び／又は手作業での解離によって生成する。いくつかの実施形態では、凝集体は、コラゲナーゼ及び／又はＴｒｙｐｌｅＬＥを用いて細胞を解離することによって生成する。いくつかの実施形態では、細胞は続いて、超低クラスター皿で培養される。他の実施形態では、単層培養は、ピペッティングによって機械的にばらばらにしてもよいし、又は酵素的に解離させて、低接着プレートでのインキュベーションを用いて、又は細胞の集団を振盪することによって凝集させてもよい。任意選択で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌを使用してもよい。
【００９９】
一実施形態では、細胞（例えば、単層及び凝集前の細胞）が、マトリックスコーティングされたプレートで、任意選択で、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされたプレートで増殖される。肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞の接着を支持する他のマトリックスコーティングされたプレート、例えば、ラミニン、フィブロネクチン及びコラーゲンコーティングされたプレートも使用され得る。図９ｆは、例えば、いくつかの異なるマトリックスコーティング基板を使用する誘導２６日目でのＡＬＢ発現を実証する。
【０１００】
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、１種又は複数のサブステップを含んでいてもよい。
【０１０１】
さらなる実施形態では、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集体を含む細胞集団は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及び／又はオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片の存在下で培養される。例えば、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、凝集前及び／又は凝集後に、ＨＧＦ、ＤＥＸ及び／又はＯＳＭを含む成熟培地中で約１０、１１、１２、１３又は１４日培養してもよく、凝集体は、ＨＧＦ、ＤＥＸ及び／又はＯＳＭを含む成熟培地中で約６、７、８、９又は１０日間培養してもよい。例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦの添加は、凝集体の生存を促進する。
【０１０２】
一実施形態では、成熟を誘導するステップ並びに任意選択で、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、凝集体の細胞内のｃＡＭＰ経路を活性化して肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への分化及び／又は成熟を誘導するステップをさらに含む。
【０１０３】
例えば、単層誘導された細胞については２５日目での、ＥＢ誘導された細胞については２６日目での長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理及び細胞の凝集は、例えば、ｃＡＭＰシグナル伝達に応答できる集団をもたらす。本明細書において示されるように、ｃＡＭＰの活性化は、ＣＹＰ発現及び肝細胞成熟を増大する。
【０１０４】
別の実施形態では、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップは、凝集体を、８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ジブチリル−ｃＡＭＰ、アデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−ｃＡＭＰＳ）及び／又は８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ））などのｃＡＭＰアゴニスト類似体及び／又はコレラ毒素、フォルスコリン、カフェイン、テオフィリン及び百日咳毒素などの任意の他のｃＡＭＰアゴニストと接触させることを含む。実験は、例えば、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇ：カタログ番号：Ｂ００２ＣＡＳ番号：［１２７６３４−２０−２］）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びフォルスコリン（ＦＳＫ）（Ｓｉｇｍａ：６６５７５−２９−９）を使用して実施された。例えば、フォルスコリン（ＦＳＫ）（Ｓｉｇｍａ：６６５７５−２９−９）＋ＸＡＶ９３９＋ＰＤ０３２５９０１を含む組合せは、ＣＹＰ発現を増大し、肝細胞前駆細胞の肝細胞への成熟を誘導するのに有効であった。本明細書において、「ｃＡＭＰアゴニスト」として、ｃＡＭＰ並びにｃＡＭＰを活性化するコレラ毒素、フォルスコリン、カフェイン、テオフィリン及び百日咳毒素などの分子を活性化するｃＡＭＰ、ｃＡＭＰ類似体が挙げられる。いくつかの実施形態ではホスホジエステラーゼ阻害剤（ホスホジエステラーゼはｃＡＭＰ阻害剤である）であるＩＢＭＸも、例えば、フォルスコリンと組み合わせて使用され得る。
【０１０５】
例えば、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌから低減した）の添加が、凝集体の生存を促進するが、ＯＳＭを維持することは、第１相ＣＹＰ酵素、特に、ＣＹＰ３Ａ４の発現の誘導に対して阻害効果を有することがわかっている。したがって、いくつかの実施形態では、凝集体は、ＯＳＭの非存在下でｃＡＭＰ類似体及び／又はアゴニストとともに培養される。
【０１０６】
用語「成熟」とは、本明細書において、細胞（例えば、肝芽細胞）にとって、より特定化されたようになる及び／又は十分に機能的な状態、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその機能的状態を得るのに必要であるプロセスを意味する。一実施形態では、未熟な肝細胞又は肝前駆細胞が、成熟した、機能的肝細胞になるプロセスが、成熟と呼ばれる。
【０１０７】
図１ａは、「肝成熟Ａ」を指し、図１４ａは、肝芽細胞分化を指す。両場合において言及される細胞集団は、例えば、ＤＥＸの存在下で、任意選択で、ＨＧＦ及びＯＳＭ及び／又はｃＡＭＰと組み合わせて培養され続けた場合に肝細胞を製造し得る、又はＥＧＦ、ＴＧＢ１  ＨＧＦ及びＥＧＦの存在下で、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのＮｏｔｃｈアゴニスト（例えば、ｎｏｔｃｈシグナルドナー）と組み合わせて培養される場合に胆管細胞を製造し得る肝芽細胞集団である。
【０１０８】
用語「成熟培地」とは、本明細書において、細胞又は細胞集団の成熟を促進するか、又は容易にするために使用される培養培地を指し、成熟因子並びに細胞増殖誘導因子及び系統誘導因子を含み得る。肝細胞成熟を有するための成熟培地の一例として、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１１５７６ＳＡ）並びにアスコルビン酸、グルタミン、ＭＴＧ及び任意選択で、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及び／又はオンコスタチンＭを補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられる。肝細胞を誘導するための成熟培地の別の例として、ＥＧＦを含まない肝細胞培養培地（ＨＣＭ）（Ｌｏｎｚａ：ＣＣ−４１８２）が挙げられる。成熟培地はまた、任意選択で、例えば、肝細胞系細胞の増殖及びその成熟を誘導するｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストも含む。成熟培地は、肝細胞及び／又は胆管細胞発達、さらなる系統特定化及び／又は増殖及び／又はさらなる系統選択を促進する因子を含み得る。例えば、Ｗｎｔアンタゴニストは、単独で又はＴＧＦβアンタゴニスト及び／若しくはＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストと組み合わせて、肝細胞成熟を促進する。Ｎｏｔｃｈアゴニストは、例えば、本明細書において、胆管細胞系統発達を誘導すると実証され、胆管細胞が望まれる場合に添加される。同様に、Ｎｏｔｃｈアンタゴニストは、肝細胞系統を促進し、肝細胞が望まれる場合に、例えば、胆管細胞発達を阻害するために添加され得る。
【０１０９】
種々の成熟培地が逐次使用され得る（例えば、単層成熟培地（例えば、凝集前に使用される）、凝集体成熟培地（例えば、凝集後に使用される）；例えば、肝細胞発達を促進する因子を含む肝細胞成熟培地及び例えば、胆管細胞発達を促進する胆管細胞成熟培地。
【０１１０】
例えば、一実施形態では、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニスト及びＤＥＸ、任意選択で、ＨＧＦを含む成熟培地は、ＨＧＦ、ＤＥＸ及びＯＳＭを含む成熟培地で、例えば、約１０、１１、１２、１３又は１４日間、プレ凝集体集団を培養した後に凝集体に添加される。
【０１１１】
用語「肝細胞」とは、本明細書において、肝臓実質細胞を指す。肝細胞は、肝臓の細胞質塊の大部分を構成し、タンパク質合成及び貯蔵、炭水化物代謝、コレステロール、胆汁酸塩及びリン脂質合成及び解毒、外因性及び内因性物質の修飾及び排泄に関与している。
【０１１２】
用語「初代培養肝細胞」とは、本明細書において、生存組織（例えば、生検材料）から直接採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖のために確立された肝細胞である。
【０１１３】
用語「肝芽細胞」とは、本明細書において、肝臓及び胆管細胞系統の細胞、例えば、肝細胞又は胆管細胞に分化する能力を有する前駆体細胞を指す。肝芽細胞は、例えば、未熟な肝細胞及び未熟な胆管細胞（例えば、特定化された細胞の運命を有し、肝細胞のみ又は胆管細胞のみに成熟し得る細胞）を含み得る肝細胞及び胆管細胞前駆細胞のサブセットである。いくつかの実施形態では、肝芽細胞は、Ｈｅｘ、ＨＮＦ４、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びアルブミン（ＡＬＢ）などのマーカーの発現によって規定される。例えば、肝芽細胞は、例えば、２８日目肝芽細胞含有培養物においてｎｏｔｃｈシグナル伝達が活性化される場合に、胆管細胞（例えば、ＣＫ１９＋細胞）を生じさせ得る。用語「肝細胞前駆体」とは、本明細書において、例えば、アルブミン陽性である、及び／又はＣＹＰ酵素を発現する、機能的肝細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。
【０１１４】
用語「胆管細胞前駆細胞」とは、本明細書において、例えば、ＣＫ１９陽性である、及び／又はＣＦＴＲを発現する、機能的胆管細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。
【０１１５】
用語「未熟な肝細胞」とは、本明細書において、アルブミンを発現するが、適当なレベルの機能的ＣＹＰ３Ａ４及び／又はＣＹＰ１Ａ２酵素を発現しない肝細胞系細胞を指す。いくつかの実施形態では、未熟な肝細胞は、成熟肝細胞の機能性を獲得するには成熟を経なければならない。いくつかの実施形態では、未熟な肝細胞は、Ｈｅｘ、α−フェトプロテイン及びアルブミンなどのマーカーの発現によって規定される。
【０１１６】
「成熟肝細胞」とは、本明細書において、ＣＹＰ酵素、例えば、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２並びにアルブミンを発現する肝細胞系細胞を意味する。任意選択で、成熟肝細胞は、機能的又は測定可能なレベルの、例えば、成体細胞に匹敵する、第Ｉ相及び第ＩＩ相薬物代謝酵素などの代謝酵素を含む。第Ｉ相薬物代謝酵素の例として、それだけには限らないが、チトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｂ６が挙げられる。第ＩＩ相薬物代謝酵素の例として、それだけには限らないが、アリールアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼＮＡＴ１及びＮＡＴ２及びＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼＵＧＴ１Ａ１が挙げられる。例えば、成熟肝細胞は、代謝的に活性な肝細胞であり得る。ヨードシアニングリーン（ＩＣＧ）の細胞取り込みは、成体肝細胞に特徴的であると考えられ２９、肝機能を評価するための試験基質として臨床的に使用される３０。成熟した肝細胞は、例えば、ＩＣＧ陽性染色肝細胞である。肝細胞の集団では、肝細胞の集団は、成熟した５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の肝細胞が、ＩＣＧであると考えられ得る。成熟した肝細胞は、「未熟な肝細胞」と比較して増大したアルブミンを発現し、例えば、未熟な肝細胞よりも少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％又は２００％多いアルブミンを発現する。
【０１１７】
一実施形態では、肝細胞は、機能的肝細胞である。
【０１１８】
用語「機能的肝細胞」とは、本明細書において、成体肝細胞（例えば、成熟した肝細胞）及び／又は、例えば、アルブミン及び／又は出発細胞と比較して増大したアルブミンを発現する、肝臓への運命に向かわされる、出発細胞よりも分化した（例えば、内胚葉集団細胞、肝細胞前駆体又は未熟な肝細胞と比較して）未熟な肝細胞の１種又は複数の特徴を示す肝細胞を指す。任意選択で、機能的肝細胞は、成熟した肝細胞であり、機能的な、又は測定可能なレベルの、例えば、成体細胞に匹敵する、第Ｉ相及び第ＩＩ相薬物代謝酵素などの代謝酵素を含む。例えば、機能的肝細胞は、代謝的に活性な肝細胞であり得る。ヨードシアニングリーン（ＩＣＧ）の細胞取り込みは、成体肝細胞に特徴的であると考えられ２９、肝機能を評価するための試験基質として臨床的に使用される３０。機能的肝細胞は、例えば、ＩＣＧ陽性染色肝細胞である。肝細胞の集団では、肝細胞の集団は、例えば、肝細胞の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、ＩＣＧ陽性であり、肝細胞の機能的集団と考えられ得る。別の例では、機能的肝細胞は、アルブミン分泌性肝細胞であり、肝細胞の集団は、例えば、肝細胞の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、アルブミン分泌性である場合に、肝細胞の機能的集団と考えられ得る。
【０１１９】
実施形態では、肝細胞は、任意選択で、機能的肝細は、肝細胞及び／若しくは胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団並びに／又は長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理されていない誘導された内胚葉細胞集団から製造され、凝集及び／若しくはｃＡＭＰシグナル伝達誘導を伴わずに製造された肝細胞と比較して、ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質の増大した発現を含む。他の実施形態では、肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、機能的肝細胞は、初代培養成熟肝細胞で見られるレベルに匹敵するか、又はそれよりも高い、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及び／又はＣＹＰ２Ｄ６の核酸又はタンパク質レベル、任意選択で、少なくとも１．１、２、３、４又は５倍又は１．１倍から５倍の間の任意の０．１増分増大している、任意選択で、少なくとも５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％又は９５％〜１０５％増大しているレベルを示す。例えば、初代肝細胞で見られる発現の１．１５倍〜６．１倍（例えば、ＣＹＰ１Ａ２  ６．１倍（６１０％）、ＣＹＰ３Ａ４  １３．２倍（１３２０％）、ＣＹＰ  ２Ｂ６  ２倍（２００％）、ＣＹＰ２Ｃ９  １．５２倍１５２％、ＵＧＴ１Ａ１  ２倍（２００％）、ＣＹＰ２Ｄ６  １．１５倍（１１５％））の増大した発現。いくつかの実施形態では、肝細胞は、同様の段階の初代肝細胞で見られるレベルに匹敵するか、又はそれより高いＡＬＢ、ＨＮＦ４、ＡＦＰ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ１、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２及び／又はＵＧＴ１Ａ１の核酸又はタンパク質レベル、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％又は９５％〜１０５％であるレベルを示す。
【０１２１】
他の実施形態では、機能的肝細胞は、肝芽細胞及び／又は未熟な肝細胞におけるものよりも高いＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及び／又はＣＹＰ２Ｄ６の核酸又はタンパク質レベル、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％又は５００％であるレベルを示す。いくつかの実施形態では、機能的肝細胞は、肝芽細胞及び／又は未熟な肝細胞で見られるレベルよりも高いＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ１、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２及び／又はＵＧＴ１Ａ１の核酸又はタンパク質レベル、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも１１０％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、４００％又は５００％であるレベルを示す。
【０１２２】
他の実施形態では、機能的肝細胞は、受容体アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＰＲ１）を発現する。他の実施形態では、肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％は、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である。
【０１２３】
さらなる実施形態では、機能的肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＰ１Ａ２活性を示す。任意選択で、機能的肝細胞は、初代肝細胞で見られるレベルに匹敵するか、又はそれより高いＣＹＰ１Ａ２活性を、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％又は９５％〜１０５％であるレベルを示す。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ１Ａ２活性は、細胞をフェナセチンとともにインキュベートすること及び細胞におけるＯ−脱エチル化代謝産物蓄積の生成をモニタリングすることによって測定される。
【０１２４】
さらなる実施形態では、機能的肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＰ２Ｂ６活性を示す。任意選択で、機能的肝細胞は、初代肝細胞で見られる活性に匹敵するか、又はそれより高いＣＹＰ２Ｂ６活性を、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％又は９５％〜１０５％であるレベルを示す。いくつかの実施形態では、ＣＹＰ２Ｂ６活性は、細胞をブプロピン（bupropin）とともにインキュベートすること及び細胞における代謝産物Ｏ−ヒドロキシ−ブプロピオンの形成をモニタリングすることによって測定される。
【０１２５】
さらなる実施形態では、肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＡＴ１及び／又はＮＡＴ２活性を示す。任意選択で、肝細胞は、初代肝細胞で見られる活性に匹敵するか、又はそれより高いＮＡＴ１及び／又はＮＡＴ２活性を、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも１．１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍又は約５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％若しくは９５％〜１０５％であるレベルを示す。いくつかの実施形態では、ＮＡＴ１及び／又はＮＡＴ２活性は、スルファメタジン（ＳＭＺ）のＮ−アセチル化ＳＭＺへの代謝によって示される。
【０１２６】
さらなる実施形態では、肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＵＧＴ活性を示す。任意選択で、肝細胞は、初代肝細胞で見られる活性に匹敵するか、又はそれより高いＵＧＴ活性を、任意選択で、初代肝細胞で見られるレベルの少なくとも５０％〜１００％、７５％〜１２５％、８５％〜１１５％、９０％〜１１０％又は９５％〜１０５％であるレベルを示す。いくつかの実施形態では、ＵＧＴ活性は、細胞における４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）からの４−ＭＵグルクロニド（４−ＭＵＧ）の生成によって示される。
【０１２７】
実施形態では、肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞は、肝細胞及び／若しくは胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団並びに／又は長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理されていない誘導された内胚葉細胞集団から製造され、凝集及び／若しくはｃＡＭＰシグナル伝達誘導を伴わずに製造された肝細胞と比較して、ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種又はそれ以上の遺伝子又はタンパク質の増大した発現を含む。他の実施形態では、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％の肝細胞、任意選択で、機能的肝細胞は、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である。
【０１２８】
さらに別の実施形態では、機能的肝細胞は、肝細胞成熟を示すグローバルな遺伝子発現プロファイルを示す。任意選択で、機能的肝細胞は、肝芽細胞及び／又は未熟な肝細胞のグローバルな遺伝子発現プロファイルよりも初代肝細胞とより同様であるグローバルな遺伝子発現プロファイルを示す。グローバルな遺伝子発現プロファイルは、当業界公知の任意の方法、例えば、マイクロアレイ分析によって得られる。
【０１２９】
一実施形態では、胆管細胞の運命は、細胞集団の凝集体をｎｏｔｃｈアゴニストを用いて処理することによって特定化される。
【０１３０】
用語「胆管細胞」とは、本明細書において、胆管を作製する細胞を指す。
【０１３１】
用語「胆管細胞前駆細胞」とは、本明細書において、胆管細胞（例えば、肝芽細胞）並びに機能的胆管細胞に成熟し得る未熟な胆管細胞に分化する能力を有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、胆管細胞系統の細胞は、ＣＫ１９、セクレチン受容体（ＳＲ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）及びクロライド重炭酸塩陰イオン交換体２（Ｃｌ（−）／ＨＣＯ（３）（−）ＡＥ）などのマーカーの発現によって規定される。
【０１３２】
用語「未熟な胆管細胞」とは、本明細書において、成熟胆管細胞の機能を獲得するために成熟を経なければならない胆管細胞系細胞を指す。いくつかの実施形態では、任意選択で、早期にＮｏｔｃｈアゴニスト処理された、任意選択で、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日又は少なくとも４日間処理された細胞を含む未熟な胆管細胞は、ＣＫ１９及び／又はＳｏｘ９を発現する。
【０１３３】
一実施形態では、胆管細胞は、機能的胆管細胞である。
【０１３４】
用語「機能的胆管細胞」とは、本明細書において、成体胆管細胞（例えば、成熟胆管細胞）の特徴のうち１種又は複数を示す胆管細胞を指す、及び／又はＣＫ−１９、ＭＤＲ１及び／又はＣＦＴＲを発現する胆管細胞系細胞である。例えば、機能的胆管細胞は、ＭＤＲ１輸送体を発現し、嚢胞構造にある場合には、ローダミン１２３などのトレーサー色素を構造管腔空間中に中に輸送し得る。別の例として、ＣＦＴＲ機能活性は、例えば、図１８に示されるように、例えば、嚢胞構造でフォルスコリン誘導性膨潤アッセイを使用して評価され得る。胆管細胞の集団では、集団は、例えば、細胞の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、セクレチン受容体（ＳＲ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ＣＫ−１９及び／又はクロライド重炭酸塩陰イオン交換体２（Ｃｌ（−）／ＨＣＯ（３）（−）ＡＥ）を発現する場合に機能的集団と考えられ得る。
【０１３５】
用語「成熟胆管細胞」とは、本明細書において、セクレチン受容体（ＳＲ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）及び任意選択で、クロライド重炭酸塩陰イオン交換体２（Ｃｌ（−）／ＨＣＯ（３）（−）ＡＥ）などの特定化された輸送体又は細胞膜受容体活性を発現する胆管細胞である。
【０１３６】
一実施形態では、製造される胆管細胞の集団は、機能的胆管細胞の集団である。機能的胆管細胞は、例えば、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び／又はｎｏｔｃｈアゴニストを用いて処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して、Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２種又は３種の遺伝子又はタンパク質の増大した発現を含む。他の実施形態では、胆管細胞の集団の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％は、ＣＫ１９＋胆管細胞である。他の実施形態では、機能的胆管細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％は、ＣＦＴＲ＋胆管細胞である。
【０１３７】
用語「発現」とは、ＲＮＡ及びタンパク質並びに、必要に応じて、適当な場合には、それだけには限らないが、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾及びプロセシングを含めた分泌性タンパク質の製造に関与している細胞プロセスを指す。「発現生成物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。
【０１３８】
本明細書において言及される用語「細胞培養培地」（本明細書において「培養培地」又は「培地」とも呼ばれる）とは、細胞生存力を維持し、増殖及び任意選択で、分化を支持する栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のうちいずれかを適当な組合せで含有し得る：塩（単数又は複数）、バッファー（単数又は複数）、アミノ酸、グルコース又は他の糖（単数又は複数）、抗生物質、血清又は血清代替品及びペプチド増殖因子、ビタミンなどといった他の化合物。特定の細胞種のために通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【０１３９】
適した培養培地として、例えば、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＣＭＲＬ及び／又は例えば、成分及び任意選択で、他の薬剤が添加され得る基本培養培地組成を提供する、内胚葉細胞の成長を支持する任意の他の培地を含めた適した基本培養培地を挙げることができる。
【０１４０】
種々の日数の培養が本明細書において言及される。当業者ならば、培養期間は変わり得るということを認識していると予想される。
【０１４１】
本明細書において、いくつかの実施形態では、「５日目」とは、一般に、例えば、ＰＳＣ単層に由来する誘導された内胚葉細胞集団を指す。ＥＢに由来する誘導された内胚葉細胞集団は、ＥＢ形成を誘導するのに約２４時間の処理を必要とするので、同様の培養点に達するために約６日間培養される。したがって、７日目単層誘導培養物は、８日目胚葉体誘導培養物などと同等である。この段階で、誘導された内胚葉集団は、例えば、Ｆｏｘａ２及びＳｏｘ１７を発現する細胞を含み得る。同様に、「７日目」は、一般に、２日間長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理された誘導された内胚葉集団を指す（例えば、ＥＢ法については、８日目となる）。「２５日目」は、一般に、細胞が凝集される段階を指す（単層に由来する場合には、又はＥＢに由来する場合には２６日目）。単層細胞が使用される場合には、ＥＢを用い、通常、１日遅延された培養期間を用いて同等の方法が使用され得る、図１１は、単層細胞を使用するスケジュールの一例（図１１Ａ）及びＥＢを使用する一例（図１１Ｂ）を提供する。胆管細胞を作製するための一例のスケジュールが、図１１Ｃ及び１４Ａに提供されている。
【０１４２】
用語「ＦＧＦアゴニスト」とは、本明細書において、例えば、ＦＧＦ又はＦＧＦシグナル伝達経路を活性化する、例えば、ＦＧＦ受容体と結合し、活性化する小分子を含めたサイトカインなどの分子を意味する。例えば、ＦＧＦ受容体活性化は、免疫検出によってＭＥＫ／ＥＲＫ、ＡＫＴ及び／又はＰＩ３Ｋ活性を測定することによって評価され得る。
【０１４３】
用語「ＦＧＦ」とは、本明細書において、任意の線維芽細胞増殖因子、例えば、任意選択で、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた活性コンジュゲート及びその断片を含めた、ヒトＦＧＦ１（遺伝子番号２２４６）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦとしても知られる；遺伝子番号２２４７）、ＦＧＦ３（遺伝子番号２２４８）、ＦＧＦ４（遺伝子番号２２４９）、ＦＧＦ５（遺伝子番号２２５０）、ＦＧＦ６（遺伝子番号２２５１）、ＦＧＦ７（遺伝子番号２２５２）、ＦＧＦ８（遺伝子番号２２５３）、ＦＧＦ９（遺伝子番号２２５４）及びＦＧＦ１０（遺伝子番号２２５５）を指す。特定の実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ４及び／又はＦＧＦ２である。
【０１４４】
本明細書において、「ＦＧＦの活性コンジュゲート及び断片」は、ＦＧＦ受容体と結合し、活性化する、任意選択で、ＦＧＦシグナル伝達を活性化する線維芽細胞増殖因子のコンジュゲート及び断片を含む。
【０１４５】
ＦＧＦの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ＦＧＦ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１４６】
ＦＧＦ１０の濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ  例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ＦＧＦ１０濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１４７】
ｂＦＧＦの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ  例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ｂＦＧＦ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１４８】
一実施形態では、ＢＭＰ４アゴニストは、群ＢＭＰ４、ＢＭＰ２及びＢＭＰ７から選択される。ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＢＭＰ２は、例えば、胚発達において同一受容体を共有する。
【０１４９】
用語「ＢＭＰ４」（例えば、遺伝子番号６５２）は、本明細書において、骨形成タンパク質４、例えば、ヒトＢＭＰ４、並びに例えば、ＢＭＰ４受容体シグナル伝達を活性化し得る、任意選択で、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた、その活性コンジュゲート及び断片を指す。ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ４の濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ＢＭＰ濃度、例えば、ＢＭＰ４濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１５０】
記載したように、方法は、単層で増殖された内胚葉細胞集団に適用され得る。
【０１５１】
したがって、さらなる態様は、多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法を含み、方法は、
ａ）単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地と接触させるステップと、
ｅ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップと
を含む。
【０１５２】
さらに、内胚葉集団はまた、胚葉体中に含まれ得る。したがって、さらなる態様は、多能性幹細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法を含み、方法は、
ａ）任意選択で、多能性幹細胞を、ＢＭＰ４アゴニストと接触させることによって、多能性幹細胞の胚葉体（ＥＢ）を形成するステップと、
ｂ）ＥＢを、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）誘導された内胚葉細胞集団を解離して、解離された誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｄ）解離された誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｅ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｆ）任意選択で、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、デキサメタゾン及び／又はオンコスタチンＭ及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む成熟培地を接触させるステップと
ｇ）細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、細胞集団の凝集体を作製するステップを含むステップと
を含む。いくつかの実施形態では、成熟を誘導するステップ並びに任意選択で、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、凝集体内のｃＡＭＰ経路を活性化して、細胞集団の肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞を含む集団への成熟を誘導するステップをさらに含む。一実施形態では、方法は、凝集体をｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストと接触させるステップを含む。
【０１５３】
別の態様は、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を製造する方法を含み、方法は、
ａ）胚葉体に形成されるために単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、少なくとも１種のＦＧＦアゴニスト及び１種のＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟／特定化培地で培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後に、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと
（ｉｉｉ）凝集細胞成熟培地で凝集細胞を培養するサブステップと、
（ｉｖ）任意選択で、凝集の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に凝集細胞においてｃＡＭＰ経路を活性化するサブステップと
を含む、ステップと
を含む。
【０１５４】
一実施形態では、多能性幹細胞の胚葉体（ＥＢ）は、多能性幹細胞をＢＭＰ４（任意選択で、１〜５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４又は約５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４）の存在下で１２〜３６時間、任意選択で、約２４時間培養することによって形成される。
【０１５５】
ＥＢが形成された後、それらは、内胚葉細胞集団を誘導するために、ｎｏｄａｌアゴニストを補給した誘導培地で３〜１０日間、任意選択で、４〜８日又は約５又は６日間再度培養され得る。ｎｏｄａｌアゴニストは、任意選択で、アクチビンＡである。ＥＢはまた、内胚葉細胞集団を誘導するために、任意選択で、Ｗｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストと接触される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、アクチビンＡなどのｎｏｄａｌアゴニストの存在下で、さらに１〜４日間（例えば、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理）（すなわち、内胚葉細胞集団を少なくとも１種のＦＧＦアゴニスト及び１種のＢＭＰ４アゴニストの組合せと接触させる前）培養される。
【０１５７】
記載されたように、次いで、細胞は、例えば、凝集及び種々の成熟因子での処理を含めた、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するよう処理される。これらのステップは、例えば、ｃＡＭＰ活性化に応答する細胞の集団を生成し得る。長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理及び凝集は、ｃＡＭＰ活性化に応答する細胞を生成するステップである。
【０１５８】
ｃＡＭＰ活性化に応答する細胞は、単層ベースの方法については培養２６日後である。
【０１５９】
一実施形態では、凝集細胞成熟／特定化培地は、肝細胞成熟を促進する因子又は胆管細胞発達を促進する因子又は両方及び／又は前駆体集団の増殖を増大する因子を含み得る。
【０１６０】
例えば、凝集体は、実証されるように、肝細胞又は胆管細胞に特定化され得る肝芽細胞を含む。
【０１６１】
任意選択で、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、細胞凝集体を、ｉ）ｃＡＭＰシグナル伝達アクチベーター（例えば、ｃＡＭＰ類似体及び／又はアゴニスト）及び／又はｉｉ）Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達のアンタゴニスト（例えば、Ｗｎｔ阻害剤ＸＡＶ９３９）及び／又はＭＥＫ／Ｅｒｋシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＭＥＫ／Ｅｒｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１）と接触させるステップをさらに含む。ｃＡＭＰシグナル伝達の活性化の間のＷｎｔアンタゴニスト及び／又はＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストの添加は、ＣＹＰ酵素の発現を、例えば、成体肝臓細胞において見られるレベル又はそれ以上まで増強する。例えば、約２８日目〜約３２日目培養物に添加されたｃＡＭＰの存在下でのＭＥＫ／Ｅｒｋの阻害は、例えば、ＣＹＰ３Ａ４のレベルの増大された肝細胞をもたらす。Ｗｎｔアンタゴニストと組み合わせたＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストの添加は、ＣＹＰ１Ａ２のレベルも増大するとわかる。一実施形態では、ｗｎｔアンタゴニストは、例えば、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＸＸＸ（ＩＷＰ２（ＳＴＥＭＧＥＮＴ０４−００３４）、Ｄｋｋ−１（Ｒ＆Ｄ、５４３９−ＤＫ−０１０））、ＩＷＲ−１  ｅｎｄｏ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ６８１６９９−１０）を含む。Ｗｎｔシグナル伝達の既知アンタゴニストは、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）タンパク質、Ｗｎｔ阻害因子−１（ＷＩＦ−１）及び分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）を含み、一実施形態では使用され得る。別の実施形態では、ＭＥＫ／Ｅｒｋアンタゴニストは、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｖ１１２１）、ＰＤ０９８０５９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｃｉｈ  Ｐ２１５−１ＭＧ）から選択される。
【０１６２】
任意選択で、細胞凝集体は、０．１〜１０μＭ、任意選択で、０．５〜２μＭ又は約１μＭのＸＡＶ９３９及び／又はＰＤ０３２５９０１と接触される。
【０１６３】
他の阻害剤／アクチベーターの濃度は、例えば、本明細書において記載された阻害剤アクチベーターに同様の活性化／阻害をもたらす濃度である。
【０１６４】
別の実施形態では、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、細胞凝集体を、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニスト及びＧＳＫ３選択的阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）などのｗｎｔアゴニスト又はＴＧＦ−βアンタゴニスト（例えば、阻害剤ＳＢ４３１５４２）の両方と接触させるステップをさらに含む。任意選択で、細胞凝集体は、０．１〜１０μＭ、任意選択で、０．２〜４μＭのＣＨＩＲ９９０２１及び／又は約２〜１０μＭ若しくは約６μＭのＳＢ４３１５４２と接触される。ＴＧＦ−β阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ４３１７−５ＭＧ）、ＳＢ  ５２５３３４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ８８２２−５ＭＧ）及びＡ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９２９）を含む。
【０１６５】
本明細書において実証されるように、例えば、２７日目でのＷｎｔ経路の活性化及びＴＧＦ−ｐ／ＳＭＡＤ経路の阻害は、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進する。例えば、ｗｎｔアゴニストが添加される場合には、前記集団の最大１０倍の増殖が得られ得るということが実証される。
【０１６６】
一実施形態では、凝集細胞は、ｗｎｔアゴニスト及び任意選択で、ＴＧＦβアンタゴニスト（ＳＢ４３１５４２など）を用いて、約６〜約１２日間、好ましくは、約８〜約１０日間、任意選択で、９日間処理される。このような処理は、例えば、肝芽細胞の増殖をもたらす。一実施形態では、方法は、肝芽細胞の増殖した集団を製造するステップを含む。これらの細胞は、成熟した肝細胞及び／又は胆管細胞を含めた、より分化した細胞の集団を製造するために使用され得る。
【０１６７】
一実施形態では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ４３１７−５ＭＧ）、ＳＢ５２５３３４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ８８２２−５ＭＧ）、Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ、２９２９）から選択される。
【０１６８】
一実施形態では、凝集細胞成熟培地は、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、
任意選択で、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進するＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせた、ＣＩＨＲ  ９９０２１などのｗｎｔアゴニスト、又は
ＸＡＶ９３９などのＷｎｔアンタゴニスト及び／若しくはｃＡＭＰ活性化ステップの間に添加され、ＣＹＰ酵素の発現を増強し、肝細胞前駆体の成熟を促進する、Ｍｅｋ／Ｅｒｋアンタゴニスト、例えば、ＰＤ０３２５９０１
を含む。
【０１６９】
別の実施形態では、凝集細胞成熟培地は、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で：
胆管細胞系統特定化を促進するＮｏｔｃｈアゴニスト、
肝細胞系統特定化を促進するγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５，４５８などのＮｏｔｃｈアンタゴニスト
を含む。
【０１７０】
以下に記載されるように、ｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの添加は、Ｈ９由来凝集体において、ＣＹＰ３Ａ４（１６倍）、ＣＹＰ１Ａ２（１００倍）及びＣＹＰ２Ｂ６（１０倍）並びに第ＩＩ相酵素ＵＧＴ１Ａ１（１６倍）の有意なレベルの発現を誘導した（図７ｅ）。
【０１７１】
別の実施形態では、細胞凝集体は、酵素処理及び／又は手作業による解離によって、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の単層から作製される。
【０１７２】
一実施形態では、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟／特定化培地において、任意選択で、細胞凝集の前に培養された肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、内皮細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋陽性内皮細胞と共培養される。一実施形態では、内皮細胞は、胚性ＥＳＣ、好ましくは、ヒトに由来する。一実施形態では、内皮細胞は、成熟した内皮細胞、任意選択で、ヒトであり、及び／又は成熟した内皮細胞に由来する。
【０１７３】
ＣＤ３４＋内皮細胞は、例えば、ｈＥＳＣから実施例８に記載されるように作製され得る。実施例８に記載されるように、内皮細胞は、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの組合せを用いる約６日間の誘導によって作製され得、その時点で、ＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３１＋及びＫＤＲ＋も）は、ＦＡＣＳによって単離され得る。選別されたＣＤ３４＋細胞は、内皮細胞成長培地、任意選択で、ＥＭＧ２培地において、例えば、６日間さらに培養され、次いで、キメラ凝集体の作製のために使用され得る。
【０１７４】
一実施形態では、ＨＧＦ、ＯＳＭ及びＤＥＸを含む成熟／特定化培地で培養された肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、キメラ凝集体を形成するために、任意選択で、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌｓ（商標）などの凝集容器（例えば、単一細胞種又は混合細胞種の凝集を促進する容器）を使用して、キメラ凝集が達成されるまで、例えば、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌｓを使用する場合には、約１日、約２日又は約３日間、ＣＤ３４＋陽性内皮細胞とともに共培養される。凝集はまた、本明細書において記載される方法又は当業界公知の方法を使用して実施され得る。実施例８に記載されるように、ウェルの底をコーティングするために、肝細胞集団に先立って内皮細胞が容器に添加され得る。肝細胞集団は、単細胞懸濁液として添加され得る、例えば、２５／２６日目肝芽細胞は、内皮細胞の頂部に添加され、混合物はＡｇｇｒｅｗｅｌｌｓ中で培養され得る。適した凝集時に、キメラ肝／内皮凝集体は、続いて、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌｓから回収され、培養され得る。図１２ｂにおいて示されるように、内皮細胞と一緒に培養された凝集体は、内皮細胞を含有しており、単独で培養されたものよりも大きかった。また、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって、さらに１２日間培養されたキメラ肝／内皮凝集体は、内皮細胞を伴わずに作製された肝凝集体よりも実質的に高いレベルのＣＹＰ３Ａ４メッセージを発現したことも実証される（図１２ｄ）。これらのレベルは、ｃＡＭＰの添加を伴わずに達成されたので、内皮細胞は、ｈＰＳＣ由来肝細胞の成熟を促進し得る。一実施形態では、肝／内皮キメラ凝集体は、少なくとも若しくは約６日間、少なくとも若しくは約８日間、少なくとも若しくは約１０日間、少なくとも若しくは約１２日間、又は所望の若しくは予め選択されたレベルのＣＹＰ３Ａ４メッセージが得られるまで培養される。
【０１７５】
さらなる実施形態では、肝内皮キメラ凝集体は、ゼラチン状マトリックス、任意選択で、マトリックスを含むコラーゲン、任意選択で、ゲル中で培養される。一実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩ又はＩＶである。一実施形態では、ゼラチン状マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、抽出されたＥＣＭ（例えば、肝臓組織由来の細胞外マトリックス）及び／又はそれらの組合せを含む。
【０１７６】
一実施形態では、マトリックスを含むコラーゲン中で培養された凝集体は、ｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１及びＸＡＶ９３９の存在下で培養される。
【０１７７】
３次元凝集、ｃＡＭＰ及びＰＤ／ＸＡＶの組合せは、ヒト多能性幹細胞由来肝細胞の大幅な分化を促進することがわかった（図９）、（図９ｄ及びｅ）。ＡＦＰ及び胎児ＣＹＰ３Ａ７の発現の一部は保持された。実施例８において、細胞外マトリックスタンパク質の供給源を供給するよう、コラーゲンゲルにおいてｃＡＭＰ、ＰＤ及びＸＡＶの組合せを用いて肝内皮キメラ凝集体を処理することは、集団のさらなる成熟を促進することが実証される。図１３に示されるように、凝集体への内皮細胞の添加（ｅｎｄ）は、凝集体が液体培養において維持された場合には、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＦＰ又はＣＹＰ３Ａ７の発現レベルに大きく影響を与えなかった。対照的に、コラーゲンゲルにおける凝集体の培養は、ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７発現に対して劇的な効果を有しており、両方とも、成体肝臓で見られるレベルと同様のほとんど検出できないレベルに低減された。
【０１７８】
一実施形態では、例えば、凝集後およそ１〜約４日内に、細胞はｎｏｔｃｈアゴニストを用いて処理される。このような段階でのｎｏｔｃｈアゴニストの添加は、胆管細胞成熟を促進する。いくつかの実施形態では、例えば、胆管細胞成熟が好ましい場合には、ｃＡＭＰシグナル伝達を誘導することは省略される。
【０１７９】
したがって、本開示はまた、胆管細胞前駆細胞の胆管細胞への成熟を誘導する方法を提供し、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、Ｎｏｔｃｈアゴニストとともに培養して、胆管細胞前駆細胞の胆管細胞（holangiocytes）、任意選択で、機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップ
を含む。
【０１８０】
一実施形態では、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から機能的胆管細胞を製造する方法：
ａ）誘導された内胚葉細胞集団を提供するために、単層として培養されたか又は胚葉体に形成された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と接触させるステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦアゴニスト及びＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と接触させることによって特定化して、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）胆管細胞前駆細胞の胆管細胞への成熟を誘導するステップ並びにさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、
（ｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉ）胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、Ｎｏｔｃｈアゴニストを含む成熟培地を用いて培養するサブステップと
を含む、ステップと
を含み、ここで、Ｎｏｔｃｈアゴニストが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞、任意選択で、ＯＰ−９、ＯＰ−Ｊａｇｇｅｄ１及び／又はＯＰ−９δ１細胞である場合には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞は、細胞集団と同時凝集される。
【０１８１】
さらなる実施形態では、凝集体は、ゼラチン状マトリックス、任意選択で、マトリックスを含むコラーゲン、任意選択で、ゲルにおいて培養される（又はＮｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞を含む場合には、共培養される）。一実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩ又はＩＶである。一実施形態では、ゼラチン状マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ラミニン、フィブロネクチン、抽出されたＥＣＭ（例えば、肝臓組織由来の細胞外マトリックス）及び／又はそれらの組合せを含む。
【０１８２】
さらに、例えば、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５，４５８（Ｔｏｃｒｉｓ  ２６２７番）ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ＿Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄ５９４２）ＬＹ  ４１１５７５（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  ０４−００５４）及びＬ−６８５４５８）などのＮｏｔｃｈアンタゴニストを用いてＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することは、胆管細胞発達を阻害し、生じた細胞は、肝細胞の特徴を保持すると本明細書において実証されている。
【０１８３】
別の実施形態では、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞などの肝細胞系細胞を製造する方法、本方法は、
ａ）胚葉体に形成されるために単層として培養された多能性幹細胞を、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、ｉ）Ｗｎｔ３ａ及び／又はｉｉ）ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストとを含む誘導培地と、任意選択で、約４〜約８日間接触させて、誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｂ）誘導された内胚葉細胞集団を、ｎｏｄａｌアゴニストと、任意選択で、約２、３又は約４日間接触させて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を提供するステップと、
ｃ）長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞集団を、少なくとも１種のＦＧＦアゴニスト及び１種のＢＭＰ４アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と任意選択で、約４〜約１０日間接触させることによって特定化し、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を得るステップと、
ｄ）肝細胞又は胆管細胞前駆細胞の、任意選択で、増殖した肝芽細胞集団及び／又は肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、
（ｉ）肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及びＯＳＭを含む成熟培地を用いて、任意選択で、約１０〜１４日間培養するサブステップと、
（ｉｉ）任意選択で、細胞集団が、少なくとも７０％、８０％、８５％若しくは９０％のアルブミン陽性細胞を含む場合に、又は約２０〜約４０日培養した後、例えば、約２４〜約２８日培養した後に、細胞集団の凝集体を作製するサブステップと、
（ｉｉｉ）凝集体を、任意選択で、Ｄｅｘを含む成熟培地中で、１〜１０日間培養するサブステップと、
（ｉｖ）ａ）Ｄｅｘ及び任意選択で、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストを含む成熟培地（例えば、凝集成熟培地）において約６日〜約１０日間、任意選択で、凝集体の作製の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に、凝集体を培養するサブステップ、又は
ｂ）任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２０〜４０日培養した後にｎｏｔｃｈアゴニストを添加しながら、ｎｏｔｃｈアゴニスト及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニスト、ＨＧＦ及び／又はＥＧＦを含む成熟培地において、約６日〜約２０日間、凝集体を培養するサブステップと
を含む、ステップと
を含む。
【０１８４】
Ｎｏｔｃｈアゴニストは、例えば、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合している任意のｎｏｔｃｈリガンドであり得る。一実施形態では、ｎｏｔｃｈリガンドは、ｎｏｔｃｈリガンドδ、Ｊａｇｇｅｄ−１（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ  １８８−２０４）、Ｊａｇｇｅｄ１ペプチド（ａｂｃａｍ、ａｂ９４３７５）、組換えヒトＰｒｅｆ−１／ＤＬＫ−１／ＦＡ１（Ｒ＆Ｄ  １１４４−ＰＲ）である。一実施形態では、成熟及びさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦの存在下で、少なくとも若しくは約５〜約１０日間、約１４日間又はそれ以上、例えば、９０日間、任意選択で、少なくとも若しくは約５日〜少なくとも若しくは約６０日間、少なくとも若しくは約３０日間、少なくとも若しくは約２５日間、２日間少なくとも若しくは約１日間及び／又は少なくとも若しくは約１４日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の、機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含む。製造された構造は、培養で６０日間にわたって維持され得ることが実証された。したがって、一実施形態では、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー（ｎｏｔｃｈアゴニスト）と、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦの存在下で、少なくとも５日間、任意選択で、最大５から９０日又は５から６０日の間の任意の日数、接触される。
【０１８５】
任意選択で、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと接触させるステップは、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦを含む成熟培地において、少なくとも若しくは約５〜少なくとも若しくは約９０日間、任意選択で、少なくとも若しくは約５〜少なくとも若しくは約６０日間、少なくとも若しくは約３０日間、少なくとも若しくは約２５日間、２日間少なくとも若しくは約１日間及び／又は少なくとも若しくは約１４日共培養して、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞への成熟を誘導するステップを含む。
【０１８６】
一実施形態では、成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１、ＨＧＦ及びＥＧＦ並びに／又はＨＧＦ、ＴＧＦβ１及びＥＧＦの存在下で、少なくとも５、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間又はそれ以上、９０日間、任意選択で、少なくとも若しくは約５〜少なくとも若しくは約６０日間、少なくとも若しくは約３０日間、少なくとも若しくは約２５日間、２日間少なくとも若しくは約１日間及び／又は少なくとも若しくは約１４日間、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞と共培養するステップを含む。
【０１８７】
本明細書において、用語「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアクチベーター」又は「ｎｏｔｃｈアゴニスト」とは、本明細書において、肝細胞及び／又は胆管細胞においてＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する任意の分子又は細胞を指し、それだけには限らないが、ＯＰ９細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー、骨髄由来マウス間質細胞の系統及びｎｏｔｃｈリガンドが挙げられる。ＯＰ−９細胞は、１種又は複数のｎｏｔｃｈリガンドを内因性に発現し、過剰発現するよう操作されている。ＯＰ−９−Ｊａｇｇｅｄ１は、組換え／外因性Ｊａｇｇｅｄ１ｎｏｔｃｈリガンドを過剰発現するよう操作されており、ＯＰ９−δ１は、組換えδ１ｎｏｔｃｈリガンドを過剰発現するよう操作されている。一実施形態では、ＯＰ９  ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーは、ＯＰ９、ＯＰ９−Ｊａｇｇｅｄ１又はＯＰ−δ１細胞から選択される。ＯＰ９細胞は、ｎｏｔｃｈリガンドδを発現する。それらは、ｎｏｔｃｈリガンドを発現するので、それによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアクチベーターとして作用し得る。Ｊａｇｇｅｄ−１（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ  １８８−２０４）、Ｊａｇｇｅｄ１ペプチド（ａｂｃａｍ、ａｂ９４３７５）並びに組換えヒトＰｒｅｆ−１／ＤＬＫ−１／ＦＡ１（Ｒ＆Ｄ  １１４４−ＰＲ）を発現する分子及び／又は細胞も含まれる。「ｎｏｔｃｈアゴニスト」は、例えば、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合され得る。
【０１８８】
一実施形態では、胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、少なくとも１種の胆管細胞前駆細胞の、機能的胆管細胞への分化を誘導するために、１０〜２０ｎｇ／ｍｌ、任意選択で、約２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ及び／又は２５〜７５ｎｇ／ｍｌ、任意選択で、約５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞と共培養される。
【０１８９】
述べられているように、肝芽細胞（例えば、図１ａ及び１４ａに示されるように、段階２５又は２６日目）は、ステップｇ）に記載されるように凝集させることができ（３次元凝集体とも呼ばれる）、ステップｇ）は、細胞集団の肝細胞及び胆管細胞前駆細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、細胞集団の凝集体を作製することを含む、ステップを含む。これらの３次元凝集体は、肝細胞に成熟／分化され、胆管細胞にさらに特定化され得る肝芽細胞を含む。胆管細胞が望まれる実施形態では、さらなる系統特定化は、凝集体を、任意選択で、肝芽細胞及びＮｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞を含むキメラ凝集体として、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９  Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのＮｏｔｃｈシグナル伝達ドナーと共培養するステップによって得られる。
【０１９０】
一実施形態では、胆管細胞前駆細胞を含む肝芽細胞集団は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び／又はコラーゲンを含むマトリックス／ゲル中で、任意選択で、キメラ凝集体として、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞と共培養される。
【０１９１】
一実施形態では、マトリックス／ゲルは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも又は最大４０％、少なくとも又は最大５０％、少なくとも又は最大６０％、少なくとも又は最大７０％、少なくとも又は最大８０％、少なくとも又は最大９０％及び／又は最大１００％のＭａｔｒｉｇｅｌを含む。
【０１９２】
一実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＶを含む。一実施形態では、マトリックス／ゲルは、約０〜約５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ、任意選択で、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３．０ｍｇ／ｍＬ又は約４．０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩを含む。一実施形態では、マトリックス／ゲルは、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．８ｍｇ／ｍＬ、約２．０ｍｇ／ｍＬ、約２．２５ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約２．７５ｍｇ／ｍＬ又は約３．０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩを含む。
【０１９３】
実施例９において実証されるように、共培養が、少なくとも３０％又はそれ以上のＭａｔｒｉｇｅｌ組成物を含む場合には嚢胞構造が得られる。増大した分岐構造が望まれる場合には、Ｍａｔｒｉｇｅｌ濃度は、例えば、約２０％に低下され得る。
【０１９４】
実施例９において実証されるように、本明細書において記載される方法を使用して、胆管細胞分岐及び嚢胞構造を発現するＣＦＴＲが製造され得る。ＣＦＴＲは、膨潤アッセイを使用して示されるように機能的である。したがって、一実施形態では、製造及び／又は単離される胆管細胞は、胆管細胞を発現するＣＦＴＲである。
【０１９５】
用語「ｎｏｄａｌアゴニスト」は、本明細書において、肝細胞系細胞における「ｎｏｄａｌ」（例えば、遺伝子番号４３３８などのヒトｎｏｄａｌ）又は「アクチビン」などのｎｏｄａｌシグナル伝達を活性化する任意の分子を意味する。
【０１９６】
用語「アクチビン」又は「ＡｃｔＡ」とは、本明細書において、「アクチビンＡ」（例えば、遺伝子番号３６２４）、例えば、ヒトアクチビン並びに任意選択で、例えば、ｎｏｄａｌシグナル伝達を活性化し得る、天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めたその活性コンジュゲート及び断片並びに天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めたその活性コンジュゲート及び断片を指す。アクチビンの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、アクチビン濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１９７】
用語「ＨＧＦ」とは、本明細書において、肝細胞増殖因子（遺伝子番号３０８２）、例えば、ヒトＨＧＦ並びに天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めた、その活性コンジュゲート及び断片を指す。ＨＧＦの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ＨＧＦ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０１９８】
用語「ＴＧＦβ」とは、本明細書において、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２及びＴＧＦｂ３、例えば、ヒトＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２及びＴＧＦｂ３並びに天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含めたその活性コンジュゲート及び断片のうちいずれか１種を意味する。以下に記載されるように、ＴＧＦｂ１は、肝芽細胞がＯＰ９と共培養される場合には、胆管細胞分岐を促進する。ＴＧＦｂ２及びＴＧＦｂ３もまた試験され、同様の条件下で分岐構造を促進する。
【０１９９】
用語「ＴＧＦβ１」とは、本明細書において、トランスフォーミング増殖因子β１、例えば、ヒトＴＧＦβ１遺伝子ＩＤ７０４０）並びに天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含む、その活性コンジュゲート及び断片を指す。胆管細胞特定化のためのＴＧＦβ１の濃度は、例えば、約５ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。
【０２００】
用語「ｗｎｔ／β−カテニンアゴニスト」とは、本明細書において、肝細胞においてｗｎｔ／β−カテニン受容体シグナル伝達を活性化する任意の分子を意味し、例えば、Ｗｎｔ３ａ並びにＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＣＨＩＲ９９０２１  Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、６−ブロモ−インディルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ：１３１２３））又はＳｔｅｍｇｅｎｔ製のＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯ（カタログ：０４００３）などのＧＳＫ３選択的阻害剤を含む。ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の選択的阻害剤である。考慮されるＧＳＫ３選択的阻害剤は、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路中のＧＳＫ−３α／βの選択的阻害剤である。肝細胞におけるＷｎｔ／β受容体シグナル伝達は、例えば、ｑＰＣＲによって、例えば、Ａｘｉｎ２遺伝子発現の増大を測定することによって、及び／又は例えば、Ｑｉａｇｅｎ製のＣｉｇｎａｌ  ＴＣＦ／ＬＥＦリポーター（Ｃｉｇｎａｌ  ＴＣＦ／ＬＥＦリポーター（ｌｕｃ）キット：ＣＣＳ−０１８Ｌ）を使用してβカテニンリン酸化を測定することによって決定され得る。
【０２０１】
用語「Ｗｎｔ３ａ」とは、本明細書において、無翅型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー３Ａ因子（例えば、遺伝子番号８９７８０）、例えば、ヒトＷｎｔ３ａ並びに天然に存在する活性コンジュゲート及び断片を含む、その活性コンジュゲート及び断片を指す。Ｗｎｔ３ａの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、Ｗｎｔ３ａ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０２０２】
用語「アゴニスト」とは、本明細書において、例えば、経路又はシグナル伝達分子のアクチベーターを意味する。例えば、ｎｏｄａｌアゴニストとは、ｎｏｄａｌシグナル伝達を選択的に活性化する分子を意味する。
【０２０３】
用語「アンタゴニスト」とは、本明細書において、例えば、経路又はシグナル伝達分子の選択的阻害剤を意味する。例えば、ＴＧＦβアンタゴニストは、例えば、Ｓｍａｄのリン酸化を測定することによってＴＧＦβシグナル伝達を選択的に阻害する分子である。Ａ８３−０１は、ＳＢ４３１５４２よりも強力なｓｍａｄ２の阻害剤である。
【０２０４】
用語「選択的阻害剤」とは、本明細書において、関連分子よりも少なくとも１．５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ又は１０Ｘより効率的に選択的実体又は経路を阻害する阻害剤を意味する。例えば、ＧＳＫ−３選択的阻害剤は、例えば、ＬｉＣｌによって阻害されるよりも少なくとも１．５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ若しくは１０Ｘより効率的に、又は他のキナーゼ、他のＧＳＫ及び／若しくは他の経路中のＧＳＫ３を阻害するよりも少なくとも１．５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ若しくは１０Ｘより効率的にｗｎｔ経路中のＧＳＫ−３を阻害する。例えば、ＣＨＩＲ  ９９０２１は、約５ｎＭのＩＣ５０でＧＳＫ３Ｂ及び１０ｎＭのＩＣ５０でＧＳＫ３ａを特異的に阻害し、他のキナーゼに対してはほとんど効果がないとｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて示されている。したがって、選択的阻害剤は、他のもの、例えば、２種の他の、３種の他のなどの非関連キナーゼよりも少なくとも１．５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ又は１０Ｘ低いＩＣ５０を示し得る。同様に、用語「選択的アクチベーター」とは、関連分子よりも少なくとも１．５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ又は１０Ｘより効率的に選択的実体又は経路を活性化するアクチベーターを意味する。用語「活性断片」とは、本明細書において、大きさが小さいが、断片であるポリペプチドと実質的に相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここで、活性断片は、断片である全長ポリペプチドと比較して、少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％有効な生物学的作用を有し、或いは任意選択で、断片であるポリペプチドと比較して、１００％超、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍又は４倍以上有効な生物学的作用を有する。
【０２０５】
用語「活性コンジュゲート」とは、本明細書において、分子の活性部分の活性を全く又は実質的に干渉しない、蛍光タグなどのタグ又は例えば、長期貯蔵、熱、酵素、低ｐＨ、撹拌などのもとでの安定性を改善するための安定化実体とコンジュゲートしているポリペプチド（又は他の分子）を意味する。例えば、コンジュゲートは、コンジュゲートしていないポリペプチド又は他の分子と比較して、約少なくとも５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は１００％又は１００％超、例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍又は４倍超有効な生物学的作用（例えば、受容体活性化活性）を有し得る。
【０２０６】
一実施形態では、用語「活性断片及びコンジュゲート」とは、分子の同族受容体を活性化する能力を保持する分子の断片及びコンジュゲートを指す。任意選択で、活性断片及びコンジュゲートは、全長及び／又はコンジュゲートしていない分子の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％程度活性である。
【０２０７】
各ポリペプチドの保存的突然変異変異体及び活性化突然変異変異体などの変異体も使用され得る。
【０２０８】
用語「Ｄｅｘ」とは、本明細書において、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）を指す。Ｄｅｘの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、Ｄｅｘ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０２０９】
用語「ＯＳＭ」とは、本明細書において、オンコスタチンＭを指す。ＯＳＭの濃度は、例えば、約１ｎｇ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。別の実施形態では、ＯＳＭ濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ又は約５００ｎｇ／ｍｌである。
【０２１０】
述べられているように、本開示のいくつかの実施形態は、肝細胞及び／又は胆管細胞成熟を誘導するために、凝集体内のｃＡＭＰ経路を活性化することを含む。
【０２１１】
本明細書において、用語「ｃＡＭＰ経路」とは、細胞間情報伝達において使用される、アデニルシクラーゼ経路、Ｇタンパク質共役受容体によって引き起こされるシグナル伝達カスケードを指す。ｃＡＭＰ経路は、任意選択で、ヒトｃＡＭＰ経路である。
【０２１２】
本明細書において、用語「ｃＡＭＰ経路を活性化するステップ」とは、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する、例えば、ｃＡＭＰのレベルを高めるための経路を誘導するステップを指す。ｃＡＭＰ経路が活性化される場合には、活性化されたＧＰＣＲは、結合しているＧタンパク質複合体においてコンホメーション変化を引き起こし、ＧＤＰをＧＴＰと交換するＧαサブユニット及びβ及びγサブユニットからの分離をもたらす。Ｇαサブユニットは、順に、アデニリルシクラーゼを活性化し、これが、ＡＴＰをｃＡＭＰに変換する。ｃＡＭＰ経路はまた、アデニリルシクラーゼ又はＰＫＡを直接活性化することによって、下流で活性化され得る。ｃＡＭＰ経路を活性化する分子として、それだけには限らないが、ｃＡＭＰ、８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状一リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ジブチリル−ｃＡＭＰ、アデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−ｃＡＭＰＳ）及び／又は８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ−異性体（Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ））などのｃＡＭＰ類似体が挙げられる。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ及びＳｐ−ｃＡＭＰＳは、ｃＡＭＰの細胞透過性類似体の例である。ｃＡＭＰシグナル伝達を活性化するいくつかの他のｃＡＭＰもまた、当業界公知であり、使用され得る。ｃＡＭＰ経路を活性化する他の化合物（例えば、ｃＡＭＰアゴニスト）として、それだけには限らないが、コレラ毒素、フォルスコリン、カフェイン、テオフィリン及び百日咳毒素が挙げられる。例えば、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇ：カタログ番号：Ｂ  ００２  ＣＡＳ番号：［１２７６３４−２０−２］）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ及びフォルスコリン（ＦＳＫ）（Ｓｉｇｍａ：６６５７５−２９−９）を使用して実験が実施され、これらの化合物は、交換され得ることを示した。
【０２１３】
本方法のいくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ経路は、任意選択で、肝凝集体を、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、任意選択で、１〜４０、１〜３０、１〜２０、５〜１５、８〜１２又は約１０ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰなどの０．５〜５０ｍＭの細胞透過性ｃＡＭＰ類似体と接触させるステップによって活性化される。肝凝集体は、任意選択で、細胞透過性ｃＡＭＰ類似体、例えば、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰと、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間接触される。
【０２１４】
成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、一連のステップを含んでいてもよい。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞及び／又は凝集体を含む細胞集団は、ＨＧＦ、デキサメタゾン及びオンコスタチンＭを含む細胞培養培地で培養される。他の実施形態では、凝集体は、Ｂ２７、アスコルビン酸、グルタミン、ＭＴＧ、ＨＧＦ、デキサメタゾン及びオンコスタチンＭを補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む細胞培養培地で培養される。他の実施形態では、細胞は、凝集の前及び／又は凝集の間に、ＨＧＦ、デキサメタゾン及びオンコスタチンＭ、任意選択で、Ｂ２７、アスコルビン酸、グルタミン、ＭＴＧ、ＨＧＦ、デキサメタゾン及びオンコスタチンＭを補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む細胞培養培地で培養される。細胞培養培地は、任意選択で、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤及びＢＳＡも補給される。例えば、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団は、ＨＧＦ、ＤＥＸ及びＯＳＭを含む成熟培地で、１０、１１、１２、１３又は１４日間培養され得、及び／又は凝集体は、ＨＧＦ、ＤＥＸ及びＯＳＭを含む成熟培地で６、７、８、９、１０日間培養され得る。
【０２１６】
別の実施形態では、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップは、凝集体内のｃＡＭＰ経路を活性化して、少なくとも１種の肝細胞又は胆管細胞前駆細胞を、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の成熟を誘導するステップをさらに含む。別の実施形態では、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップは、凝集体を、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストと、例えば、上記のｃＡＭＰ類似体又はｃＡＭＰアゴニストと接触させるステップを含む。
【０２１７】
例えば、一実施形態では、ＨＧＦ、ＤＥＸ及びＯＳＭを含む成熟培地で培養するステップに続いて、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニスト及びＤＥＸ及び任意選択で、ＨＧＦを含む成熟培地が、例えば、約１０、１１、１２、１３又は１４日間凝集体に添加される。
【０２１８】
一実施形態では、凝集体は、ｃＡＭＰ経路が活性化されるまで、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及びＯＳＭを含む細胞培養培地で培養される。一実施形態では、凝集体は、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニスト及びＤｅｘを含有する培地で培養される。ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される場合には、ＯＳＭは、培地から除去される。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される場合には、ＨＧＦもまた培地から除去される。別の実施形態では、培地中のＨＧＦの量は、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストの添加後に低減される（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦから１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦが低減される）。
【０２１９】
別の実施形態では、凝集体は、ＨＧＦ、Ｄｅｘ及びＯＳＭで約６、７、８、９、１０、１１又は１２日間培養され、その時点で、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される。一実施形態では、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される場合には、ＯＳＭ及び任意選択で、ＨＧＦは除去される。他の実施形態では、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される場合には、培地中のＨＧＦの濃度は低減される（例えば、約２０ｎｇ／ｍｌから約１０ｎｇ／ｍｌに）。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、誘導された内胚葉細胞集団の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞に分化／成熟する。
【０２２１】
したがって、一実施形態では、方法は、ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉細胞の集団からの約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は約９５％超の機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の製造を誘導する。
【０２２２】
成熟は、例えば、成熟肝細胞マーカーのレベルを調べることによって検出され得る。例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＡＴ、ＴＤＯ１、ＮＡＴ２、ＵＧＴ１Ａ１及び／又はＡＳＧＰＲ１は、その発現が、例えば、ＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る成熟肝細胞又は機能的肝細胞マーカーである。分化はまた、成熟肝細胞を認識する抗体、例えば、ＡＳＧＰＲ−１を検出する抗体を使用して検出され得る。
【０２２３】
一実施形態では、内胚葉細胞集団は、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化される。
【０２２４】
一実施形態では、多能性幹細胞は、ヒトなどの哺乳類に由来する。一実施形態では、多能性幹細胞は、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【０２２５】
本明細書において、用語「ｉＰＳＣ」及び「誘導された多能性幹細胞」は、同義的に使用され、例えば、それだけには限らないが、ＳＯＸ２（遺伝子番号６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子番号９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子番号４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子番号７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子番号７９７２７））と組み合わせた、１種又は複数の遺伝子（ＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子番号５４６０を含む）の発現を誘導するステップによって、非多能性細胞、通常、成体体細胞から人為的に導かれた（例えば、誘導された又は完全な逆転によって）多能性幹細胞を指す。
【０２２６】
一実施形態では、方法は、内胚葉細胞集団を得るためのステップを含む。例えば、ＥＳＣ又はｉＰＳＣなどの多能性幹細胞において胚体内胚葉を誘導するための方法が、本明細書において提供される。
【０２２７】
一実施形態では、内胚葉細胞集団を得るステップは、多能性幹細胞培養物から胚葉体を形成するステップを含む。ＥＢは、当業界公知の任意の方法、例えば、Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｃ．ら１８に記載される方法によって形成され、これでは、ＥＢは、低レベルのＢＭＰ４アゴニストにおいて２４時間培養した小さい凝集体から形成される。
【０２２８】
別の実施形態では、内胚葉細胞集団を得るステップは、単層で多能性幹細胞培養物を得る及び／又は増殖させるステップを含む。
【０２２９】
ＥＢ及び／又は単層細胞は、続いて、胚体内胚葉を誘導するために高濃度のアクチビンＡと接触される。任意選択で、ＥＢ及び／又は単層は、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ又は９０〜１１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン、任意選択で、約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１４日間曝露される。
【０２３０】
別の実施形態では、ＥＢ及び／又は単層細胞は、アクチビンＡに加えて、Ｗｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ−９９０２１、６−ブロモ−インディルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、若しくはＳｔｅｍｏｌｅｃｕｌｅ（商標）ＢＩＯなどのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストと接触される。例えば、ＧＳＫ−３選択的阻害剤ＢＩＯは、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化によってヒト及びマウスＥＳＣにおいて多能性を維持すると実証された。５３
【０２３１】
任意選択で、ＥＢ及び／又は単層細胞は、１０〜４０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ又は２０〜３０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、任意選択で、約２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａに、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間曝露される。別の実施形態では、ＥＢ及び／又は単層細胞は、約０．０３μＭ〜約３０μＭのＣＨＩＲ−９９０２１又は約０．１μＭ〜約３μＭ、任意選択で、約０．３μＭ〜約１μＭのＣＨＩＲ−９９０２１に曝露される。一実施形態では、ＥＢは、約０．１μＭ〜約２μＭに曝露される。別の実施形態では、単層細胞は、約１μＭ〜約３０μＭ、例えば、約１μＭ〜約３μＭのＣＨＩＲ−９９０２１に曝露される。当業者は、同等に有用な量のその他ＧＳＫ−３阻害剤を確認できる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＥＢ及び／又は単層細胞は、まず、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌのアクチビン又は９０〜１１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン、任意選択で、約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は約１０日間と接触され、その後、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌのアクチビン又は９０〜１１０ｎｇ／ｍｌのアクチビン、任意選択で、約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１０〜４０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ又は２０〜３０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、任意選択で、約２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａと、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は約１０日間接触され、誘導された内胚葉細胞集団を製造する。
【０２３３】
一実施形態では、他所に記載されるように、誘導された内胚葉細胞集団は、ＡｃｔＡなどのｎｏｄａｌアゴニストとともに、少なくとも３６、３８、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８若しくは６０時間又は約１〜約４日間培養されて、長期ｎｏｄａｌアゴニスト処理され誘導された内胚葉集団を製造する。
【０２３４】
任意選択で、胚体内胚葉を誘導するための基本培養培地は、胚体内胚葉を誘導するための当業界公知の任意の培地、任意選択で、神経基本培地又はＳｔｅｍＰｒｏ３４である。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、アクチビンＡ、グルタミン、アスコルビン酸、ＭＴＧ、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４が補給される。他の実施形態では、細胞培養培地は、Ｗｎｔ３ａ又はＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤などのｗｎｔ／β−カテニンアゴニストがさらに補給される。
【０２３５】
細胞を分化させて、誘導された内胚葉細胞集団を得る他の方法も、使用され得る。
【０２３６】
確定的な内胚葉又は誘導された内胚葉細胞集団は、任意選択で、表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＫＩＴ及びＥＰＣＡＭ並びに転写因子ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２又はそれらの任意の組合せの発現によって規定される。いくつかの実施形態では、内胚葉細胞集団の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％超が、アクチビン誘導後にＣＸＣＲ４、ＣＫＩＴ及びＥＰＣＡＭを発現する。別の実施形態では、内胚葉細胞集団の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％超が、アクチビン誘導後にＳＯＸ１７及び／又はＦＯＸＡ２を発現する。
【０２３７】
特定の実施形態では、方法は、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を濃縮及び／又は単離して、任意選択で、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の単離された集団を作製するステップをさらに含む。
【０２３８】
一実施形態では、単離するステップは、細胞の集団を、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞と結合する特定の物質と接触させるステップを含む。
【０２３９】
細胞の単離された集団に関して、用語「単離された集団」とは、本明細書において、細胞の混合された集団又は不均一な集団から除去され、分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞が単離又は濃縮された不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。細胞は、例えば、単細胞懸濁液、単層及び／又は凝集体であり得る。例えば、胆管細胞を含むいくつかの実施形態では、単離集団はまた、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈリガンドを発現する細胞を含み得る。例えば、肝細胞を含むいくつかの実施形態では、単離された集団はまた、内皮細胞を含み得る。任意選択で、解離された細胞懸濁液及び／又は凝集体中の単離された集団は、例えば、スクリーニング適用、疾患モデリング適用及び／又は例えば、スキャフォールドなどを含む移植適用において使用され得る。
【０２４０】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に純粋」とは、総細胞集団を構成する細胞に関して少なくとも約６５％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。同様に、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の「実質的に純粋な」集団に関しては、約３０％未満、約２０％未満、より好ましくは、約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは、約５％、４％、３％、２％、１％未満又は１％未満の、本明細書においてこの用語によって規定される機能的肝細胞及び／又は胆管細胞ではない細胞又はその後代を含有する細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の集団を増殖させる方法を包含し、これでは、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の増殖した集団は、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の実質的に純粋な集団である。
【０２４１】
用語「濃縮する」又は「濃縮された」は、本明細書において同義的に使用され、１種の細胞の収率（割合）が、出発培養物又は調製物中のその種類の細胞の割合を上回って、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％又は少なくとも約６０％増大されることを意味する。濃縮と部分的な精製とは、同義的に使用される場合がある。
【０２４２】
細胞の集団は、細胞表面マーカーなどのマーカーに基づく方法（例えば、ＦＡＣＳ選別など）などの種々の方法を使用して濃縮され得る。
【０２４３】
細胞及び組成物
上記で論じられたように、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞は、本明細書に記載の方法を使用して単離され得る。したがって、適用のさらなる態様は、本明細書において記載される方法に従って製造された細胞の集団を含む。一実施形態では、細胞の集団は、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞、任意選択で、例えば、本明細書に記載の方法に従って製造され、例えば、成熟した及び／又は機能的細胞のマーカーを発現する成熟した及び／又は機能的な肝細胞及び／又は胆管細胞の濃縮され、精製されるか、又は単離された細胞集団である。濃縮され、精製されるか、又は単離されるものは、任意選択で、単細胞懸濁液、凝集体、キメラ凝集体及び／又は分岐構造及び／若しくは嚢胞を含む構造である。
【０２４４】
一実施形態では、成熟した及び／又は機能的な肝細胞は、ＡＦＰ及び／又は胎児ＣＹＰ３Ａ７の発現を欠く。
【０２４５】
一実施形態では、成熟した及び／又は機能的胆管細胞（cholangioctye）は、ＭＤＲ輸送体遺伝子、アクアオリン、ＣＦＴＲ及び／又はその突然変異体を発現する。
【０２４６】
一実施形態では、細胞集団は、任意選択で、Ｎｏｔｃｈ２を発現する肝芽細胞集団である。
【０２４７】
一実施形態では、単離され、精製された及び／又は濃縮された集団が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造される。
【０２４８】
一実施形態では、細胞の集団は、適した希釈剤とともに組成物中に含まれる。
【０２４９】
適した希釈剤として、例えば、血清、血清代替品又は血清栄養補助剤及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールメチルセルロース又はポリビニルピロリドンなどの適した凍結保護物質を含有する、例えば、適した培養培地又は凍結培地が挙げられる。さらなる態様は、任意選択で、細胞培養基本培地の栄養補助剤として使用され得るＦＧＦ及び／又はＢＭＰ４アゴニストを含む培養培地栄養補助剤組成物を含む。栄養補助剤としてまた、アクチビンＡ、Ｗｎｔ３Ａ、ＣＨＩＲ−９９０２１などのＧＳＫ−３選択的阻害剤、ＨＧＦ、デキサメタゾン、オンコスタチンＭ、アスコルビン酸、グルタミン及びＢ２７栄養補助剤などの本明細書において論じられる他の成分を挙げることができる。
【０２５０】
一実施形態では、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞は、肝臓及び／又は胆管疾患に罹患した対象のｉＰＳに由来する。一実施形態では、疾患は、一遺伝子性疾患、例えば、嚢胞性線維症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ１、２及び３型）である。
【０２５１】
一実施形態では、疾患は、嚢胞性線維症である。一実施形態では、対象は、突然変異、例えば、嚢胞性線維症遺伝子、例えば、δＦ５０８、９９７  ＣＦＴＲ  ｄｅｌ及び／Ｃ１  ＣＦＴＲ突然変異を保持する。図９に示されるように、記載される方法は、嚢胞性線維症患者から作製され／由来するｉＰＳＣから肝芽細胞（heptoblast）集団を作製し得る。
【０２５２】
一実施形態では、疾患は、複合胆管疾患、任意選択で、原発性硬化性胆管炎又は胆管閉鎖症である。
【０２５３】
別の態様は、本明細書に記載の方法に従って調製された、本明細書において記載された細胞の集団を含む埋め込み可能な構築物又は体外バイオ人工肝臓装置（ＢＡＬ）を含む。
【０２５４】
用途
本明細書において記載される機能的肝細胞及び／又は胆管細胞及びそれらの誘導体は、１種又は複数の適用において使用され得る。例えば、方法は、肝臓及び／又は胆管疾患に罹患した対象に由来するか、又はそれから得られたｉＰＳＣから肝系細胞の集団を製造するために使用され得る。
【０２５５】
したがって、別の態様は、肝臓及び／又は胆管疾患細胞モデルを作製する方法であり、
ｉ）肝臓及び／又は胆管疾患に罹患した対象に由来するか、又はそれから得られる細胞からｉＰＳＣを作製するステップと、
ｉｉ）本明細書において記載される方法に従って、肝系細胞並びに／又は凝集体及び／若しくは構造、任意選択で、分岐構造及び／若しくは嚢胞を含む肝系細胞を作製するステップと、
を含む。
【０２５６】
疾患は、一実施形態では、疾患は、一遺伝子性疾患、例えば、嚢胞性線維症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ１、２及び３型）である。一実施形態では、疾患は、複合体胆管疾患、任意選択で、原発性硬化性胆管炎又は胆管閉鎖症である。
【０２５７】
別の態様は、嚢胞性線維症細胞モデルを作製するための方法であって、
ｉ）嚢胞性線維症に罹患した対象に由来するか、又はそれから得られた細胞からｉＰＳＣを作製するステップと、
ｉｉ）本明細書において記載される方法に従って、胆管細胞系細胞並びに／又は構造、任意選択で、分岐構造及び／若しくは嚢胞を含む胆管細胞系細胞を作製するステップと
を含む、方法である。
【０２５８】
例えば、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞は、予測薬毒性学、薬物スクリーニング及び創薬のために使用され得る。
【０２５９】
したがって、一実施形態では、本明細書において記載される方法を使用して作製された機能的肝細胞及び／又は胆管細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと、１）細胞増殖、２）肝細胞及び／若しくは胆管細胞特定化の成熟、３）１種又は複数の肝芽細胞、肝細胞及び／若しくは胆管細胞特性並びに／又は４）野生型細胞集団及び／又は試験化合物の非存在下で試験された他の対照と比較された、１種若しくは複数の肝臓及び／若しくは胆管疾患細胞モデル欠陥の回復及び／若しくは寛解を測定するステップとを含むアッセイが提供される。
【０２６０】
一実施形態では、方法は、例えば、実施例９において測定されるような、１種又は複数の肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞特性を測定するステップをさらに含む。
【０２６１】
一実施形態では、１種又は複数の胆管細胞特性は、
ａ）Ｉ）分岐構造及び／又は嚢胞の存在及び／又は数；ＩＩ）胆管細胞マーカー発現レベル、形態（成熟した形態及び／又は未熟な形態）及び／又は発現パターンを評価する、野生型ｉＰＳＣと比較した、肝芽細胞／胆管細胞系統分化能、
ｂ）野生型ｉＰＳＣと比較した、胆管細胞系形成の動態学、並びに／又は
ｃ）輸送体活性、任意選択で、ＣＦＴＲ活性
を含む。
【０２６２】
例えば、ＣＦＴＲ活性は、例えば、フォルスコリンなどのｃＡＭＰアゴニストを使用して嚢胞膨潤を測定することによって評価され得る。実施例９は、ＣＦＴＲ活性を測定するために使用され得る方法の一例を提供する。
例えば、化学矯正剤ＶＸ８０９及びＣｏｒｒ−４ａは、フォルスコリン刺激アッセイにおける嚢胞膨潤によって測定されるように（実施例９）、胆管細胞嚢胞において突然変異体ＣＦＴＲ活性を回復させ／増強し得ることが示された。例えば、新規薬物／生物製剤の評価を提供する及び／又は患者に特異的な反応を評価するための、推定又は既知ＣＦＴＲ処理を用いて試験する場合に、この特性又は別の特性の回復及び／又は寛解が評価され得る。
【０２６３】
別の態様として、機能的ＣＦＴＲアッセイであって、
ｉ）任意選択で、ＣＦ及び／又はＣＦ関連疾患を有する患者に由来するｉＰＳＣから分化した嚢胞中の胆管細胞系細胞を、ｃＡＭＰアクチベーター、任意選択で、フォルスコリン及びＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）と接触させるステップと
ｉｉ）任意選択で、試験物質の存在下で膨潤を測定するステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、試験物質の存在下又は非存在下で野生型細胞又は他の対照と比較するステップと
を含むアッセイが挙げられる。
【０２６４】
例えば、試験物質は、ＶＸ−７７０などのＣＦＴＲチャネル増強物質の存在下で、比較及び／又は試験され得る。ＶＸ−７７０は、特定のＣＦ突然変異、Ｇ５５１Ｄを保持する患者に使用されるＦＤＡ承認薬である（Ｋａｌｙｄｅｃｏとしても知られる）。
【０２６５】
【０２６６】
記載される細胞はまた、細胞移植のために使用され得る。例えば、細胞の混合集団濃縮及び／又は単離された機能的肝細胞及び／又は胆管細胞が、例えば、肝疾患を治療するために、それを必要とする対象に導入され得る。
【０２６７】
したがって、態様は、本明細書において記載される方法に従って、細胞を得るステップ並びに／又は単離された肝細胞及び／若しくは胆管細胞、任意選択で、機能的肝細胞及び／若しくは胆管細胞を調製するステップ並びにそれを必要とする対象、例えば、肝臓及び／又は胆管疾患を有する対象に前記細胞を投与するステップを含む。
【０２６８】
例えば、Ｙｕｓａら（５５）は、ｉＰＳＣ由来肝細胞において既知遺伝子欠陥を修正するステップ及びそれらを再移植する（retranspanting）ステップを記載した。修正された細胞は、マウスに再移植され、疾病状態ではこれまでには存在しなかった機能性を示した。Ｙｕｓａらは、この目的に最も適したトランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を含めた哺乳類細胞において効率的に転位させることができる蛾由来ＤＮＡトランスポゾンであることを見出した。可動性因子によって、ｐｉｇｇｙＢａｃ反転リピートが両端に接する導入遺伝子を全く残りの配列を残さずに除去することが可能となる。生じたｉＰＳＣ−３−Ｇ５−Ａ７は、修正されたＡ１ＡＴ、親の線維芽細胞と比較して無傷のゲノムを有しており、肝細胞様細胞に分化した時点で正常なＡ１ＡＴタンパク質を発現した。
【０２６９】
トランスポゾンは、任意選択で使用される。発現構築物を導入する他の方法として、レンチウイルス、アデノウイルスベースの方法が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遺伝子を細胞中に導入するための効率的な系は、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルスを含めたウイルスをベースとするベクターである。ヒトにおける遺伝子送達のための代替アプローチとして、裸の、プラスミドＤＮＡ並びにリポソーム−ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる（Ｕｌｒｉｃｈら、１９９６；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ、１９９５年）。２種以上の導入遺伝子が、送達されたベクター構築物によって発現され得るということは理解されなければならない。或いは、各々、１種又は複数の異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターも、細胞に送達され得る。
【０２７０】
同時トランスフェクション（別個の分子上のＤＮＡ及びマーカー）が、任意選択で、使用される（例えば、ＵＳ５，９２８，９１４及びＵＳ５，８１７，４９２を参照のこと）。同様に、ベクター自体（好ましくは、ウイルスベクター）内のマーカー（緑色蛍光タンパク質マーカー又は誘導体など）が有用である。
【０２７１】
ヒト多能性幹細胞におけるゲノム編集のためによく使用される系は、例えば、Ｊｏｕｎｇ及びＳａｎｄｅｒ  ２０１３年（５６）並びにＲａｎら２０１３年（５７）にそれぞれ記載されるような転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系である。
【０２７２】
さらなる方法は、任意選択で、遺伝子編集及び突然変異した遺伝子の修正のためのＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼと組み合された、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）含む。例えば、Ｇａｊら（５８）を含む。
【０２７３】
したがって、一実施形態では、方法は、肝臓及び／又は胆管疾患に罹患した患者から細胞、任意選択で、血液細胞を得るステップと、機能的及び／又は治療用タンパク質をコードする構築物をゲノム編集及び／又は挿入するステップと、構築物を挿入する前又は後のいずれかに、本明細書に記載の方法に従って、肝芽細胞、肝細胞及び／又は胆管細胞を誘導するステップとを含む。
【０２７４】
一実施形態では、投与される細胞の集団は、約２５／２６日目の細胞の集団である。一実施形態では、細胞は、肝細胞又は胆管細胞（cholagiocyte）の運命に特定化される。
【０２７５】
また、前記細胞及び前記細胞を含む組成物の、それを必要とする対象、例えば、肝疾患を有する対象の移植及び／又は治療のための使用も含まれる。
【０２７６】
例えば、図８ｃ）〜ｅ）に示され、実施例３に記載されるように、ＥＳＣ由来の移植された肝細胞が生着し、肝細胞及び胆管細胞系統の細胞に分化することができることが実証される。同様に、実施例９は、ＣＦＴＲ機能的胆管細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで製造され得ることを実証する。
【０２７７】
したがって、一実施形態では、それを必要とする対象を、本明細書に記載の方法に従って作製された肝細胞を用いて移植又は治療する方法が提供される。一実施形態では、本開示は、肝疾患及び／又は胆管疾患を有する対象の例の、それを必要とする対象を治療するための本明細書に記載の方法に従って作製された細胞の使用を含む。
【０２７８】
一実施形態では、治療有効量が投与される。
【０２７９】
Ｔａｋｅｂｅらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作出された肝芽の移植による、ヒトｉＰＳＣからの血管形成された、機能的ヒト肝臓の作製を実証した。
【０２８０】
一実施形態では、得られた細胞は、自己細胞、例えば、対象から得た血液及び／又は皮膚細胞から作製したｉＰＳＣに由来する。一実施形態では、ＰＳＣは、例えば、生検、血液細胞、皮膚細胞、毛包及び／又は線維芽細胞から得られたｉＰＳＣであり得る。
【０２８１】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して作製された肝細胞及び／又は胆管細胞（cholagiocytes）は、毒性スクリーニングにおいて試験物質と接触される。ＣＹＰは、薬物代謝及び生体内活性化に関与する主要な酵素である。薬物−薬物相互作用アッセイ、ＣＹＰ阻害アッセイ及びＣＹＰ誘導アッセイを含めた種々のアッセイが実施され得る。
【０２８２】
例えば、薬物は、ＣＹＰアイソザイムを誘導すること（ＣＹＰ誘導）によって、又は所与のＣＹＰの活性を直接阻害すること（ＣＹＰ阻害）のいずれかによって、種々のＣＹＰアイソザイムの活性を増大又は低減し得る。ＣＹＰ酵素活性の変化は、種々の薬物の代謝及び／又はクリアランスに影響を及ぼし得る。例えば、ある薬物が、別の薬物のＣＹＰ媒介性代謝を阻害する場合には、第２の薬物は、身体内に毒性レベルに蓄積し得る。
【０２８３】
他の実施形態では、ＣＹＰ阻害スクリーニングが実施され得る。本明細書に記載の方法を使用して製造された肝細胞は、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及び／又はＣＹＰ７Ａ１を発現するとわかると実証されるように、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又は蛍光アッセイを使用する１種又は複数のこれらのアイソザイムの阻害についてのスクリーニングが実施され得る。ＣＹＰ  ＩＣ５０及び／又はＫｉが決定され得る。
【０２８４】
さらに他の実施形態では、ＣＹＰ酵素の誘導が評価され得る。例えば、いくつかの化合物は、ＣＹＰ酵素を誘導し、その結果、誘導されたＣＹＰ酵素の基質である同時投与される薬物の代謝が増大する。したがって、このような同時投与される薬物は、有効性を失い得る。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ及びＣＹＰ３Ａ４などのＣＹＰ酵素は、誘導の影響を受けやすい。ＣＹＰの触媒活性及びｍＲＮＡレベルは、対照に対して測定され得、結果は、誘導倍数として表される。
【０２８５】
さらに他の実施形態では、薬物代謝産物が評価され得る。例えば、薬物の代謝産物スペクトルが決定され得る。
【０２８６】
一実施形態では、種々の濃度の試験物質が、本明細書に記載の方法を使用して得られた細胞に添加され、細胞は、生存、ＣＹＰ４５０アイソザイム活性、ＣＹＰ４５０アイソザイムｍＲＮＡレベル及び／又は代謝産物プロファイルについて評価される。方法は、例えば、全体的に薬物をスクリーニングするため、又は薬物に対する患者の特異的毒性を評価するために使用され得る。
【０２８７】
一実施形態では、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞は、組織工学において使用される。例えば、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の精製された集団を利用できることによって、規定数の機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を有する操作された構築物の作製が可能となる。他の例では、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞の精製された集団を利用できることによって、バイオ人工肝臓装置の作製が可能となる。
【０２８８】
研究段階での肝臓を臓器全体として用いる移植の代替手段としては、単離された細胞移植、埋め込み可能な構築物の組織工学、及び体外バイオ人工肝臓装置（ＢＡＬ）を使用することが挙げられる（５１に概説される）。この参考文献の４５１頁に示されるように、「その将来の使用は、細胞成分の選択及び安定化に応じて変わるであろう」。細胞系統及び非ヒト細胞が評価されてきたが、臨床使用については困難がある。ヒト機能的肝細胞及び／又は胆管細胞供給源における制限も、このような装置の開発を妨げてきた。
【０２８９】
５２に概説されるように、肝臓は、アルブミンを含めた血漿タンパク質、補体系の成分並びに凝固及び線維素溶解因子の主な供給源である。肝臓不全の結果、低分子量物質を処理することができなくなり、低分子量物質の一部は水溶性である（アンモニア、フェニルアラニン、チロシン）が、多くは水に難溶性であり、輸送タンパク質、主にアルブミンと結合されて血液中に輸送される（中鎖脂肪酸、トリプトファン及びその代謝産物、内因性ベンゾジアゼピン及び他の向神経活性物質、メルカプタン、毒性胆汁酸、ビリルビン、重金属及び内因性血管拡張剤）。これは、直接的細胞毒性（例えば、黄疸による急性尿細管壊死）による複数の続発性臓器不全、機能的ホメオスタシス変更（例えば、血行動態調節不全の結果としての肝腎症候群）又は両方の組合せ（例えば、肝性脳症及び昏睡）を引き起こす、内因性毒素の蓄積につながる。肝臓支持療法のために、組み合わされた透析及び血漿交換、選択的血漿ろ過及び吸着２７又は選択的血漿交換治療技術が開発されている。血漿交換技術は、例えば、高度選択的メンブラン及びアルブミン透析を使用して、水溶性毒素とともにアルブミン結合型毒素のクリアランスを増大する。
【０２９０】
アルブミンを産生する機能的肝細胞及び／又は肝細胞を得ることが、ＢＡＬとともに使用され得る。例えば、機能的肝細胞が得られる場合には、必ずしも、アルブミン透析を実施する必要はない。肝臓から分泌される主要なタンパク質であるアルブミンタンパク質を生成できるＥＳ／ｉＰＳ由来肝細胞も、ＢＡＬ及びアルブミン透析とともに使用され得る。ヒト供給源からのアルブミンの製造は、例えば、ＢＡＬにおいて重要である。アルブミンは、ホルモン、脂肪酸及び毒性物質を含めた他の化合物を輸送する。アルブミン透析の利益は、毒性化合物が結合しているアルブミンが血流から排除され得るということである。肝臓及び腎臓疾患のために臨床的に使用されるヒト血清アルブミンは、現在、献血された血液のみから得られる。アルブミン分泌細胞を作製することは、及び／又は高度の肝機能活性とともに、ＢＡＬ系を確立するために有利であると予想される。
【０２９１】
一実施形態では、方法は、患者特異的疾患ｈｉＰＳＣに適用され、例えば、モデル肝疾患に使用される。例えば、肝疾患を有する患者から肝臓又は他の細胞が、単離され、ｈｉＰＳＣを得るために処理され得、次いで、これが、培養され、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を分化するよう誘導され得る。これらの細胞は、疾患に関与している遺伝子又は患者の免疫細胞に対する反応などの疾患の特徴を評価するために使用され得る。
【０２９２】
例えば、正常な細胞及び患者特異的疾患ｈｉＰＳＣが、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞に誘導され、比較され得る。例えば、正常及び患者特異的ｈｉＰＳＣに由来する膵臓前駆細胞及びβ細胞の遺伝子解析、エピジェネティック解析及びプロテオミクス解析が実施され得る。このような詳細な解析は、シグナル伝達経路、転写調節ネットワーク及び／又は正常ヒト肝臓発達を調節する細胞表面マーカー並びに疾患において役割を果たすものの発見につながり得る。
【０２９３】
用語「対象」とは、本明細書において、哺乳動物を含めた動物界のすべてのメンバーを含み、ヒトを指すことが適している。
【０２９４】
単離された細胞に適用されるような、用語「処理する」、「処理すること」、「処理」などは、細胞を、任意の種類のプロセス又は条件に晒したり、又は任意の種類の操作若しくは手順を細胞に実施したりすることを含む。対象に適用される場合、この用語は、個体に医学的又は外科的手当、ケア又は管理を提供することを指す。
【０２９５】
本明細書において、対象に適用される用語「処理」は、臨床結果を含めた有益な又は所望の結果を得ることを目的とするアプローチを指し、例えば、医薬的介入、手術、放射線療法及び自然療法的介入並びに試験処置を含めた医療処置及び適用を含む。有益な又は所望の臨床結果として、それだけには限らないが、検出可能、検出不能にかかわらず、１種又は複数の症状又は状態の軽減又は寛解、疾患の程度の縮小、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の蔓延を防ぐこと、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の寛解又は緩和及び緩解（部分的又は全体的にかかわらず）を挙げることができる。「処理」はまた、処理を受けていない場合に予測される生存と比較した延命を意味し得る。
【０２９６】
本明細書において、用語「投与する」、「導入する」及び「移植する」は、所望の部位での導入された細胞の少なくとも部分的局在をもたらす方法又は経路によって細胞（例えば、機能的肝細胞及び／又は胆管細胞）を対象に送達することとの関連で同義的に使用される。細胞は、肝臓に直接的に埋め込まれ得るか、或いは、埋め込まれた細胞の少なくとも一部若しくは細胞の成分が、生存可能なままである対象中の所望の場所への送達をもたらす任意の適当な経路によって投与され得る。
【０２９７】
キット
さらなる態様は、キットを含む。キットは、例えば、上記のアゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子などのうち１種又は複数、本明細書において記載される方法において使用され得る細胞などを増殖させるための１種又は複数の培地、容器、並びに／又は本明細書に記載の方法に従って増殖及び／若しくは調製された細胞を含み得る。一実施形態では、キットは、本明細書における方法に従って使用するための使用説明書を含む。一実施形態では、キットは、任意選択で、使用説明書、例えば、細胞などを増殖させるための１種又は複数の培地、容器を含めた、例えば、上記のアゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子などのうち１種又は複数とともに、本明細書において製造された細胞の集団を含む。
【０２９８】
本開示の範囲を理解するうえで、用語「含む（comprising）」及びその派生語は、本明細書において、述べられた特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を特定するが、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を排除しない制約がない用語であると意図される。前述のことは、用語「含む（including）」、「有する（having）」及びその派生語などの同様の意味を有する語句にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」及び「およそ」などの程度の用語は、本明細書において、最終結果が有意に変更されないような修飾された用語の合理的な量の逸脱を意味する。これらの程度の用語は、この逸脱が修飾する語句の意味を無効にしない場合には、修飾された用語の少なくとも±５％の逸脱を含むと考えられなければならない。
【０２９９】
本開示の範囲を理解するうえで、用語「からなる」及びその派生語は、本明細書において、述べられた特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を特定し、他の述べられていない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を排除する制約のある用語であると意図される。
【０３００】
本明細書における終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に含まれるすべての数及び分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４及び５を含む）。全ての数及びその分数は用語「約」によって修飾されていると推定されることも理解されるべきである。さらに、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が別のことを明確に示さない限り、複数の言及を含むということも理解されるべきである。用語「約」は、言及がなされる数字の、プラス又はマイナス０．１〜５０％、５〜５０％又は１０〜４０％、好ましくは、１０〜２０％、より好ましくは、１０％又は１５％を意味する。
【０３０１】
さらに、特定の節において記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように適している本明細書において記載される他の実施形態に適用可能であるものとする。例えば、以下の一節では、本発明の種々の態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、反対に明確に示されない限り、他の態様（単数又は複数）と組み合され得る。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合され得る。
【０３０２】
上記の開示は、本願を全般的に記載する。より完全な理解は、以下の特定の実施例を参照することによって得られ得る。これらの実施例は、本願の範囲を制限しようとするのではなく、単に例示目的で記載される。状況が示唆するか、好都合にする場合には、等価物の形態の変化及び置き換えが考慮される。本明細書において特定の用語が使用されてきたが、このような用語は、記述的意味で意図され、制限を目的としない。
【０３０３】
以下の限定されない例は、本開示の例示である。
【実施例】
【０３０４】
（例１）
＜ＥＢにおける内胚葉誘導＞
図１ａに、胚葉体（ＥＢ）を使用してｈＥＳＣから肝細胞を作製するために使用される戦略を示す。単層培養を使用するプロトコールと同様に１６、初期胚における肝臓発達の臨界的段階を繰り返す特定のステップを含む。ＥＢは、これまでに記載されたように１８、低レベルのＢＭＰ４中での２４時間の培養によって小さい凝集体から形成される。ＥＢは、胚体内胚葉、表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＫＩＴ及びＥＰＣＡＭ並びに転写因子ＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２の発現によって規定される集団を誘導するために、続いて、高濃度のアクチビンＡ（本明細書において以下、アクチビンと呼ばれる）に５日間曝露される。図１ｂに示されるように、誘導されたＥＢ集団の９０％超が、５日のアクチビン誘導（６日の総培養）後にＣＸＣＲ４及びＣＫＩＴ又はＣＸＣＲ４及びＥＰＣＡＭを同時発現する。細胞内フローサイトメトリー分析は、集団の９０％超がＳＯＸ１７を発現し、８０％超がＦＯＸＡ２＋であると示した。
【０３０５】
単層誘導プロトコールを使用する研究は、Ｗｎｔシグナル伝達が、おそらくは前原始線条形成の増強のためにアクチビン誘導性内胚葉発達を増強することを実証した１０。アクチビン誘導されたＥＢ培養物へのＷｎｔ３Ａの添加は、ＥＢ内のＣＸＣＲ４＋、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合の再現性のある増大につながった（図１ｃ）。ＣＸＣＲ４発現の増大につれて、ＣＫＩＴ＋ＣＸＣＲ４＋及びＣＸＣＲ４＋ＥＰＣＡＭ＋細胞の割合が、集団の９５％超に増大した。分子解析は、Ｗｎｔ誘導されたＥＢにおけるＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２発現レベルの上昇を示し、フローサイトメトリーデータが確認された（図１ｄ）。Ｗｎｔの添加は、Ｏｃｔ３／４の発現の低下を加速しなかったが、３日目のＴ（ブラキュリ）発現並びに４及び６日目のグースコイド（ＧＳＣ）発現の増大につながった（図１ｄ）。Ｗｎｔは、マウスＥＳＣモデルにおいて１９、及び単層ｈＥＳＣ由来培養物において１０実証されるように、原始線条形成を増強する。動態解析は、分化の３から６日の間のＣＫＩＴ＋ＣＸＣＲ４＋、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋陽性細胞の割合の迅速な、動的な増大を示した（図１ｅ）。ＥＢにおける内胚葉誘導は、使用された基本培養培地によって影響を受けた。ＳｔｅｍＰｒｏ３４は、これまでに使用した神経基本培地よりも効率的な内胚葉誘導を支持した（図１ｆ）。高度に濃縮された内胚葉の誘導は、ｈＰＳＣからの肝細胞様細胞の効率的な、再現性のある作製における重要な第１のステップである。例えば、少なくとも９０％のＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋及び８０％のＳＯＸ１７＋細胞という誘導レベルが、最適な肝系統発達をもたらすとわかった。
【０３０６】
＜ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達の期間が、肝発達に影響を及ぼす。＞
ＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋集団を肝臓への運命に特定化するために、６日目ＥＢを解離し、細胞を単層として、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４の存在下でＭａｔｒｉｇｅｌコーティングしたプレート上に４８時間、次いで、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４において６日間置いた。マウスにおいて２０及びヒトＥＳＣ分化培養物において１６、ＦＧＦ及びＢＭＰは、ヒト及びマウス特定化にとって重要であることがこれまでに実証されている。Ｓｉ−Ｔａｙｅｂらでは、ＦＧＦ２及びＢＭＰ４が組み合わされ、作製された細胞の８０〜８５％が、アルブミンを発現した。これら２種の因子の組合せは、試験された条件下での最適な肝誘導にとって必要であることがわかった（図２ａ）。分化培養においてｂＦＧＦ／ＢＭＰ４単独と比較してアルブミン発現を増大するとわかったので、ＦＧＦ１０／ＢＭＰ４ステップを含めた（図２ｂ）。これらの誘導条件を用いて、相当数のアルブミン陽性細胞が、分化の１２から２４日目の間に培養物において一貫して発達した。
【０３０７】
ＢＭＰ４／ＦＧＦ特定化ステップは、肝発達を促進するが、１０日目での培養物の解析は、培養物内のＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合が、９０％超からおよそ５０％に有意に減少したことを示した（図３ａ）。理論に捉われるものではないが、この減少は、６日目集団が、ＦＧＦ及びＢＭＰ４の存在下で優先的に増殖した非内胚葉細胞によって混入されていたか、又は細胞の内胚葉の運命がまだ固定しておらず、結果として、使用された条件下で、一部が別の運命を選んだことのいずれかを示唆した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏマウスＥＳＣ分化系において、前原始線条細胞から内胚葉の運命を確立するために、長期のアクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達が必要であることがこれまでに実証されている１９。シグナル伝達が、ヒトＰＳＣを用いた場合に有用であるかどうかはわかっていなかった。このシグナル伝達経路の期間を増大する効果は、ＦＧＦ／ＢＭＰ４特定化ステップの前にアクチビンにおいて単層細胞を２日間培養することによってヒト系において延長された。さらに２日間アクチビンを用いて誘導される場合には、１２日目に測定されたＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋細胞の割合は、非処理群においてよりも有意に高かった（図３ａ）。理論に捉われるものではないが、総細胞数が、処理集団において少なかったので（図３ｂ）、この段階でのアクチビンシグナル伝達が、内胚葉細胞の生存を優先的に支持することがあり得る。
【０３０８】
長期アクチビン処理は、ＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋集団を、培養８日目まで維持し（図３ｃ）、培養２６日目にＨＥＸ、ＡＦＰ、ＡＬＢ及びＨＮＦ４ａを含めた肝前駆細胞（肝芽細胞）発達を示す遺伝子の高レベルの発現をもたらした（図３ｄ）。２４日目のＭＥＯＸ１、ＭＥＳＰ１、ＣＤ３１及びＣＤ９０の発現によって、並びにＣＤ９０間葉細胞及びＣＤ３１＋内皮細胞の存在によって実証されるように、非処理ＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋内胚葉から作製された培養物は、混入する中胚葉を含有していた（図３ｄ，ｅ）。アクチビン処理内胚葉に由来する集団は、中胚葉遺伝子の発現の低下を示し、高割合のＥＰＣＡＭ＋細胞、検出可能でないＣＤ３１＋細胞及びかなり少ないＣＤ９０集団を有していた（図３ｅ）。これらの相違と一致して、培養２６日目の非処理集団と比較して、処理したものにおいて有意に高い割合のアルブミン陽性細胞が得られた（図３ｆ、ｇ）。興味深いことに、ＡＦＰ陽性細胞の割合は２群の間で異なっていなかった。理論に捉われるものではないが、これは、この段階では、非処理集団におけるその発現は、肝臓特異的ではない可能性があることを示唆する。
【０３０９】
＜凝集は、肝成熟を促進する＞
長期アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達が肝発達を促進したが、アルブミン及びＨＮＦ４ａなどの遺伝子の発現レベルは、成体肝臓と比較してｈＥＳＣ由来集団では有意に低く、２６日目培養物における細胞は、まだ未熟であることを示唆した。これまでの研究は、細胞凝集は、培養物において初代肝細胞の分化した表現型を維持し得２１−２３、ｈＥＳＣ由来肝細胞のある程度の成熟を促進する２４ことを示した。次に、アクチビン処理内胚葉に由来する２６日目肝芽細胞集団の成熟に対する凝集の役割を調べた。酵素処理及び手作業による解離の組合せによって単層から凝集体を作製し、次いで、ＨＧＦ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）及びオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）の存在下で６日間培養した（図４ａ）。凝集は、分化に影響を及ぼさず、ＡＬＢ（アルブミン）、ＣＰＳ１（カルバモニル−ホスファターゼシンターゼ１）、ＴＡＴ（チロシンアミノトランスフェラーゼ）、Ｇ６Ｐ（グルコース６ホスファターゼ）及びＴＤＯ（トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ）を含めた、肝臓機能と関連するいくつかの遺伝子の発現の増大につながった（図４ｂ）。いくつかの場合には、レベルは、（ＡＬＢ）成体肝臓において見られるレベルと同様であり、（ＴＤＯ）より高かった（図４ｂ）。凝集はまた、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７及びＣＹＰ３Ａ４を含めたいくつかのシトクロムＰ４５０遺伝子の発現を増大させた。ＣＹＰ３Ａ４のレベルは、初代肝細胞において見られたものと同様であったが、成体肝臓におけるものよりもかなり低かった（図４ｃ）。ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６を含めた他のＰ４５０遺伝子並びに第ＩＩ相酵素ＵＧＴ１Ａ１の発現は、何らかの有意なレベルに誘導されなかった。
【０３１０】
成熟した肝細胞では、細胞表面マーカーアシアロ糖タンパク質受容体−１（ＡＳＧＰＲ−１）が見られ、ｈＥＳＣ分化培養物において成熟細胞を示すとわかっている。凝集は、培養物において検出されるＡＳＧＰＲ−１＋細胞の割合の劇的な増大をもたらし、５０％超の陽性細胞を含有する集団が一貫して得られた（図４ｄ）。免疫染色は、アルブミン＋３２日目凝集体細胞でＡＳＧＰＲ−１及びＥ−カドヘリンが検出されることを示した。これらの知見は、まとめて、凝集の３−Ｄ構造への簡単なプロセスが、肝成熟を示す変化を促進することを示す。
【０３１１】
＜ｃＡＭＰシグナル伝達は、ｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の成熟を誘導する。＞
細胞をさらに成熟させるために、ｃＡＭＰシグナル伝達の役割が調べられた。肝細胞系統を使用する研究は、この経路の活性化が、幾分かは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１−α（ＰＧＣ１−ａ）、ＨＮＦ４ａと一緒に機能して、肝細胞機能に関与する多数の遺伝子の発現を調節するコアクチベーターの誘導によって肝遺伝子発現を誘導し得ることを示した２５−２８。ｃＡＭＰシグナル伝達が、ｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の成熟を促進し得るかどうかを調べるために、８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ｃＡＭＰの細胞透過性類似体を培養３２〜４４日目に肝凝集体に添加した。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを用いる処理は、ＰＧＣ１−ａの発現を有意に増強した（１５倍）が、ｈＥＳＣ由来肝細胞においてＨＮＦ４ａの発現は増強しなかった（図５ａ）。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰはまた、Ｇ６Ｐ及びＴＡＴの発現を、成体肝臓におけるものに近似するレベルに対して、それぞれ、平均２５及び３３倍誘導した（図５ａ）。対照的に、ＡＦＰ及びＡＬＢの発現レベルは、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰによって下方制御された。フローサイトメトリー分析によって、ＡＦＰ発現分析が確認され、非処理対照と比較して、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理凝集体におけるＡＦＰ陽性細胞の数の低減（５４％から２６％）が示された。ｍＲＮＡのレベルが低下したという事実にもかかわらず、ＡＬＢ陽性細胞の割合は低減されなかった（図５ｂ）。理論に捉われるものではないが、これらの相違は、ＲＮＡ対タンパク質発現における相違を反映できなかった。膵臓などの他の組織も、ＰＧＣ−１ａを発現する。しかし、肝細胞において観察された誘導とは対照的に、ＰＧＣ１−ａの発現は、ｈＥＳＣ由来インスリン陽性膵臓細胞においてｃＡＭＰシグナル伝達によって誘導されず（図５ｃ）、これは、この応答が組織特異的であり得ることを示した。
【０３１２】
ヨードシアニングリーン（ＩＣＧ）の細胞取り込みは、成体肝細胞に特徴的であると考えられ２９、肝機能を評価するための試験基質として臨床的に使用されている３０。ｃＡＭＰシグナル伝達は、この活性を示す細胞の割合を劇的に増大させたと、ほとんどすべての処理された凝集体がＩＣＧで染まったという観察結果によって実証された（図５ｄ）。
【０３１３】
共焦点顕微鏡を使用して、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの存在下及び非存在下で培養した４４日目凝集体におけるＡＬＢ及びＡＦＰ又はＡＬＢ及びＨＮＦ４ａの同時発現を評価した。免疫染色分析は、フローサイトメトリーデータと一致しており、ｃＡＭＰ処理された凝集体は、非処理のものと比較して、同様のレベルのＡＬＢを発現するが、低いレベルのＡＦＰを発現することを示した。
【０３１４】
ｈＥＳＣ由来単層及び凝集体集団によって、並びにＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞及び低温保存された肝細胞（ＰＨ、ロットＯＳＩ）によって分泌されたアルブミン（ＡＬＢ）のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出した。両凝集体集団におけるＨＮＦ４ｃｔｆｆｌタンパク質のレベルは匹敵しており、ＰＣＲ解析を確認した。ｈＥＳＣ由来細胞によるアルブミン分泌は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理によって影響を受けなかったが、凝集ステップによって劇的に増強された。アルブミン分泌は、単層培養物において２０日目に低レベルで検出可能であったが、３２日目の凝集した培養物では劇的に増大した（約５倍）。ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７及びＰＨ細胞では低レベルのみが検出された。一方、ヨードシアニングリーン（ＩＣＧ）を取り込む能力、成体肝細胞の特徴（Ｓｔｉｅｇｅｒら、２０１２年）は、ｃＡＭＰシグナル伝達によって増強された。ｃＡＭＰ処理されたもの及び非処理のものによるＩＣＧ取り込み及び放出を、４４日目凝集体において測定した。
【０３１５】
ｃＡＭＰシグナル伝達は、ｈＥＳＣ由来肝細胞において代謝酵素活性を増大する。
ｃＡＭＰシグナル伝達はまた、重要な第Ｉ相シトクロムＰ４５０遺伝子の発現パターンの変化、特に、胎児遺伝子ＣＹＰ３Ａ７の発現のレベルの低下及び成体遺伝子ＣＹＰ３Ａ４（２．５倍）、ＣＹＰ１Ａ２（１８倍）及びＣＹＰ２Ｂ６（４．７倍）の発現の大幅な増大も誘導した（図６ａ）。ＵＧＴ１Ａ１、重要な第ＩＩ相酵素も、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰによって有意に誘導された（１１倍）（図６ａ）。ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ１Ａ２の誘導されたレベルは、初代肝細胞において見られたものよりも有意に高かったが、ＣＹＰ２Ｂ６のレベルは、２種の集団において同様であった。ｈＥＳＣ由来集団におけるＵＧＴ１Ａ１発現は、初代肝細胞において見られたレベルに達しなかった。理論に捉われるものではないが、ＣＹＰ１Ａ２の発現が、肝臓に制限され、誕生後にのみ検出されることを考えると３１、これらの知見は、ｃＡＭＰシグナル伝達が、発達の胎児段階を超える分化を促進することを示唆する。
【０３１６】
単層培養物に添加された場合には、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の発現の増大はほとんど検出されなかったので、Ｐ４５０遺伝子に対するｃＡＭＰシグナル伝達の誘導効果は、３次元凝集体中の細胞においてのみ観察された（図６ｂ）。ＰＧＣ１−ａ及びＴＡＴの発現は、おそらくは、これらの遺伝子のプロモーター領域がｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）部位を含有するという事実のために、単層形式において誘導された。さらに規定するために、長期アクチビン処理された内胚葉から作製されたｃＡＭＰ応答凝集体に影響を及ぼす変数を、さらに２日のアクチビン／ｎｏｄａｌ処理を伴わずに内胚葉から作製されたものと比較した。非処理集団（−Ａｃｔ）に由来する凝集体では、ＣＹＰ１Ａ２及びＡＬＢの誘導は、ほとんど観察されず、ｃＡＭＰシグナル伝達は、高度に濃縮された、適宜パターン形成された細胞に対してのみ有効であることを示唆した（図６ｃ）。上記の研究のために、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを、１２日間（３２日目〜４４日目）培養物中に含めた。遺伝子発現の変化が、連続的なシグナル伝達に応じて変わるかどうかを調べるために、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを用いて６日間誘導され、次いで、残りの６日間８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの非存在下で維持された細胞を、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰにおいて全１２日間培養されたものと比較した（図６ｄ）。ＣＹＰ１Ａ２の発現は、短い誘導時間後に維持され、これは、高レベルの発現は、連続的シグナル伝達によるものではなく、むしろ、肝細胞成熟を示す変化を反映することを示した。
【０３１７】
Ｐ４５０酵素の機能活性を調べるために、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってアイソザイム選択マーカー薬物を代謝する能力を測定した。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理された細胞は、初代培養肝細胞と同程度に高いレベルでＣＹＰ１Ａ２選択基質フェナセチンをＯ−脱エチル化した（図６ｅ）。非処理細胞は、検出可能な活性を示さなかった。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理細胞において、ブプロピオンの水酸化によって測定されるようなＣＹＰ２Ｂ６活性も、初代肝細胞において見られたものに匹敵するレベルで検出された（図６ｆ）。アリールアミンＡ／−アセチルトランスフェラーゼＮＡＴ１及び／又はＮＡＴ２（図６ｇ）並びにＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）（図６ｈ）を含めた第ＩＩ相代謝酵素の解析は、初代培養肝細胞のものより高い活性を示し、ｃＡＭＰシグナル伝達が、集団の成熟と一致する、広範囲の酵素の発現の上方制御を誘導することを示した。これらの観察結果は、全体で、ｃＡＭＰシグナル伝達が、３−Ｄ凝集体中のｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の成熟を促進することを示す。
【０３１８】
さらに、２種の重要な酵素、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の代謝活性の誘導性も評価した。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理細胞は、ＣＹＰ１Ａ２選択的基質フェナセチンを代謝できた。７２時間のランソプラゾールを用いる細胞の誘導は、この活性の３．４倍の増大をもたらした。非処理（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）細胞は、誘導可能ではなかった低レベルの活性を有していた。２種の独立した初代肝細胞サンプルは、低い又は匹敵するレベルの基本代謝活性を示したが、高レベルの誘導（１８倍及び９倍）を示した。ＣＹＰ３Ａ４活性は、テストステロンを６β−ヒドロキシルテストステロンに代謝する細胞の能力によって測定した。８−Ｂｒ−Ｃａｍｐ処理細胞は、この活性を示した。ＣＹＰ３Ａ４インデューサーリファンピシンの添加は、活性を２．２倍増大させ、ｈＥＳＣ由来細胞においてこの酵素もまた誘導可能であることを示した。ＣＹＰ１Ａ２を用いて観察されたように、非誘導細胞では、ＣＹＰ３Ａ４活性はほとんど検出されなかった。初代肝細胞は、低いが有意なレベルのＣＹＰ３Ａ４誘導を示した。
【０３１９】
＜他のｈＰＳＣ系からの肝特定化及び成熟＞
上記で詳述されたアプローチが、種々のヒト多能性幹細胞系に広く適用可能であるかどうかを調べるために、プロトコールを使用して、ｈＥＳＣ系Ｈ９及びＨ１並びに誘導された多能性細胞（ｉＰＳＣ）系３８−２を、肝臓への運命に分化させた。３種の系すべてから得た６日目ＥＢが、Ｗｎｔ３ａ／アクチビン誘導ステップ後に高割合のＣＫＩＴ＋ＣＸＣＲ４＋及びＣＫＩＴ＋ＥＰＣＡＭ＋細胞を含有していた（図７ａ）。全てのＥＢにおいてＥＰＣＡＭ＋細胞の割合は高かったが、Ｈ９由来細胞は、他の系から作製された細胞よりも実質的に高いレベルのＥＰＣＡＭを発現した。Ｈ９由来集団の９５％超が、ＳＯＸ１７＋及びＦＯＸＡ２＋を発現したが、ｉＰＳＣ誘導細胞の６５〜７０％しか、これらの転写因子を発現しなかったので（図７ａ）、ＥＰＣＡＭ発現のレベルは、内胚葉誘導の程度と相関していた。これらの知見は、表面マーカー解析単独は、内胚葉発達をモニタリングするのに十分ではないこと並びにＳＯＸ１７及びＦＯＸＡ２発現の定量的解析が、この胚葉の誘導を測定するために必要であることを示す。ＨＥＳ２細胞を用いて観察されるように、長期アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達は、各系からのＣＫＩＴ＋ＣＸＣＲ４＋集団の肝発達を改善した（図７ｂ）。しかし、有意なレベルのＡＬＢ発現をもたらすのに必要なアクチビン処理の期間は、細胞系統間で変わった。Ｈ９由来細胞を用いた場合、２日間のアクチビン処理後に高レベルのＡＬＢ発現が達成されたのに対し、Ｈ１及び３８−２細胞は両方とも、４日のさらなるアクチビンシグナル伝達を必要とした。この処理を用いて、それぞれ、Ｈ９、Ｈ１及び３８−２細胞系から９０％、８５％及び７０％のＡＬＢ＋細胞からなる培養物を作製することが可能であった（図７ｃ）。分化２６日目のＨ９由来細胞は、培養された肝細胞のものと極めて類似した敷石形態を示した（図７ｄ）。
【０３２０】
８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの添加は、Ｈ９由来凝集体において、有意なレベルのＣＹＰ３Ａ４（１６倍）、ＣＹＰ１Ａ２（１００倍）及びＣＹＰ２Ｂ６（１０倍）並びに第ＩＩ相酵素ＵＧＴ１Ａ１（１６倍）の発現を誘導した（図７ｅ）。誘導の規模は、ＨＥＳ２由来細胞において実質的に高く、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の発現のレベルは、初代肝細胞におけるものよりも有意に高かった。２種のｈＥＳＣ系間の誘導の相違の理由は、現在わかっていない。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰもまた、ｈｉＰＳＣ由来凝集体においてこれらの酵素の発現を、初代肝細胞におけるものと同程度に高いレベルに誘導した（図７ｅ）。
【０３２１】
ＨＥＳ２系を用いて観察されたように、Ｈ９由来細胞は、ランソプラゾール誘導性ＣＹＰ１Ａ２活性を有していた。Ｈ９及びｉＰＳＣ由来細胞はまた、リファンピシンを用いて誘導可能であるＣＹＰ３Ａ４活性も示した。ｉＰＳＣ由来細胞では、誘導性ＣＹＰ１Ａ２活性は検出可能ではなく、おそらくは、この集団の最適以下の分化を反映していた。
【０３２２】
＜ｃＡＭＰによって刺激された肝集団のマイクロアレイ解析＞
ｃＡＭＰ誘導の結果をさらに評価するために、また初代肝細胞に対するｈＥＳ由来肝集団の発達状態を評価するために、マイクロアレイ解析を実施して、種々の集団のグローバルな発現プロファイルを比較した。合計２３０３８種のフィルターをかけた転写物を、最終解析において使用した。二元配置教師なし階層的クラスター解析は、３群が別個の集団として現れることを示した。３種のｃＡＭＰによって誘導された集団は、互いに最も類似していたが、３種の初代肝細胞集団は最も多様な発現パターンを示した。ＦＤＲ修正されたＡＮＯＶＡ（ｑ＜０．０５）を使用して、３種のサンプル群すべてにわたって最も統計的に有意な変動性を示す７８４種の転写物を同定した。これらのデータの階層的にクラスター化された可視化によって、各生物学的群において高度に発現される転写物のクラスターが同定された。これらのクラスターは、初代肝細胞では１８１種の転写物、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ誘導された細胞では１０６種の転写物及び非処理細胞では８０種の転写物からなっていた。８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ誘導された細胞において濃縮された遺伝子は、重要なＰ４５０酵素並びに糖新生、グルコースホメオスタシス及び脂質代謝を含めた肝臓機能の多数の態様と関連しているものの遺伝子個体発生カテゴリーのほとんどを含んでいた。初代肝細胞において最高レベルで発現されたクラスターは、免疫系、炎症関連及びＭＨＣ遺伝子からなっていた。誘導されていないｈＥＳＣ由来細胞において検出されたクラスターは、濃縮された遺伝子個体発生カテゴリーを全く含有していなかった。
【０３２３】
集団のより詳細な比較のために、肝臓機能の重要な態様に関与しているタンパク質をコードする転写物の選択されたセットを解析した。これらは、第Ｉ及びＩＩ相薬物代謝酵素のサブセット、トランスポーター、血液凝固因子、リポタンパク質、核受容体及び転写因子及び一般的な肝臓酵素及び他の機能的分子を含んでいた。これらのデータの解析は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理ｈＥＳＣ由来細胞及び初代肝細胞において、遺伝子の多くが匹敵するレベルで発現されることを示した。各カテゴリーの選択遺伝子は、未処理細胞又は初代肝細胞と比較して、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ処理細胞において相当に高いレベルで発現される。これらとして、ｑＰＣＲ及び機能研究を確認する第Ｉ相酵素ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４、第ＩＩ相酵素ＳＵＬＴ２Ａ１、輸送体ＳＬＣＯ１Ｂ１、一般的な肝臓酵素ＴＡＴ、Ｇ６Ｐ及びＴＤＯ（それぞれ、チロシン代謝、糖新生及びトリプトファン代謝に関与している）、表面受容体ＡＳＧＰＲ−１及びＡＬＢが挙げられる。肝細胞におけるＩＣＧの細胞取り込みは、有機アニオン輸送体ＳＬＣＯ１Ｂ１及びＳＬＣＯ１Ｂ３並びにＮａ＋独立性輸送体ＳＬＣ１０Ａ１によって調節されるので２９、その発現の誘導は、ｃＡＭＰ処理凝集体が高レベルのＩＣＧ取り込みを示したという知見と一致する。総合すると、マイクロアレイ解析から得られたこれらのデータは、ｃＡＭＰを用いる肝芽細胞段階凝集体の誘導が、肝細胞成熟を示すグローバルな発現変化をもたらすことを示す。これらの解析に基づいて、このアプローチによって作製されたｈＥＳＣ由来肝細胞は、初代ヒト肝細胞のものと少なくとも同等の発達段階を表すと思われる。
【０３２４】
＜考察＞
ｈＰＳＣ由来肝細胞が薬物代謝解析にとって、及び肝疾患の治療のための移植にとって有用であるためには、細胞は、相対的に成熟しており、測定可能なレベルの重要な第Ｉ及びＩＩ相薬物代謝酵素を含めた成体肝細胞の多数の特徴を示さなければならない。今日までに、いくつかの異なる研究が、胚における重要な発達ステップの要点を繰り返すよう設計された段階的プロトコールを使用して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの両方から未熟な肝系細胞を作製することが可能であると示している。これらの研究の成功は、分化の初期段階を制御する経路は、ある程度規定されているという事実を反映する。対照的に、肝細胞成熟を制御する因子及び細胞相互作用は、不十分にしか理解されておらず、結果として、２、３の研究のみしか、代謝的に機能的な細胞の発達を報告していない。Ｄｕａｎら１２は、初代肝細胞で見られるレベルに匹敵する、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６酵素活性のレベルを示したＨ９  ｈＥＳＣから肝細胞を導くことが可能であると示した。Ｄｕａｎらは、彼らの方法において、血清のバッチ間でその一部が変わる多数の因子を含む血清を使用した。関与する因子は不明確であった。これらの知見は、相対的に成熟したｈＥＳＣ由来肝細胞が作製され得ることを示すが、研究は、成熟を促進する経路に関する詳細は全く提供せず、また、戦略が、他のｈＰＳＣ系に広く適用可能であることを実証することもなかった。Ｄｕａｎらの図６に示されるように、彼らは、ヒトＥＳ細胞（Ｈ９）から得た肝細胞において代謝薬物を測定した。フェナセチンは、ＣＹＰ１Ａ２活性を誘導し、その評価を提供し、ミダゾラム、ブフラロール及びジクロフェナクは、それぞれ、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｄ６を誘導し、その評価を提供する。例えば、本明細書において記載されるＨＥＳ２細胞系などでは、初代肝細胞と比較して、ほとんど同等のレベルの酵素活性（ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６）が見られた。ｑＰＣＲ解析では、Ｈ９細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６の発現のレベルは、ＨＥＳ２細胞系で見られるレベルよりも５〜８倍高かった。本明細書において記載される方法は、ＣＹＰ酵素ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６の点で初代肝細胞とより密接に似ている細胞をもたらす。同様に、初代肝細胞と比較して、本方法を使用して作製された細胞では、ほとんど同一又は匹敵するレベルのＣＹＰ２Ｄ６発現が見られる。
【０３２５】
いくつかの他のグループが、単独又はＳｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞との共培養と一緒の、ｈＥＳＣ由来集団における特定の転写因子の強制された発現が、成熟を促進し、その結果、重要な代謝酵素を発現する細胞が作製され得ることを示した３２−３４。しかし、このアプローチの主要な欠点は、どの実験にもウイルス形質導入が必要であること並びに感染の効率における相違及び強力な転写因子の適当なレベルの発現の確立における相違を含めた操作に起因する可変性である。初代肝細胞と比較した場合に、このアプローチによって作製されたｈＥＳＣ由来集団における発現レベルは、初代肝細胞で見られるレベルよりも相当に低かった。
【０３２６】
本明細書において、成熟を調節する経路についての洞察が提供される。３次元凝集及びｃＡＭＰシグナル伝達の組合せは、肝芽細胞の成熟において極めて重要な役割を果たすことも実証される。さらに、内胚葉誘導後のアクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達は、肝芽細胞前駆体集団の最適作製にとって必須であり、濃縮された前駆体集団は、成熟した集団の誘導にとって有用である。これら３種の別個のステップの組合せは、例えば、初代成体肝細胞で見られるレベルと同様の、機能的代謝酵素の発現プロファイル及びレベルを示す肝細胞様細胞の作製をもたらす。
【０３２７】
ＣＸＣＲ４＋Ｃ−ＫＩＴ＋集団内の持続したアクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達は、成熟肝細胞の作製にとって有用であるという観察結果は、成熟細胞の効率的な作製のための初期段階細胞の適当な操作の重要性を強調する。分化６日目から８日目の間の長期アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達の効果（ＨＥＳ２細胞について）は、培養２６日目に検出されたアルブミン陽性細胞の遺伝子発現パターン及び割合に影響を及ぼした。このステップはまた、ｃＡＭＰに応じて、代謝的に機能する肝細胞を生じさせるよう成熟する肝細胞の集団の発達を促進した。６日目ＥＢ標的集団は、９５％超のＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋ＥＰＣＡＭ＋ＳＯＸ１７＋細胞からなっていたので、このさらなるシグナル伝達ステップは、不十分な内胚葉誘導の補償ではない。むしろ、理論に捉われるものではないが、おそらくは、アクチビンがこれらの系統を誘導するか、又はＢＭＰ若しくはＦＧＦの非存在下でその生存を促進することができないために、混入する中胚葉派生物（ＣＤ９０＋及びＣＤ３１＋細胞）を低減すると思われる。中胚葉混入を低減することに加えて、さらなるアクチビン培養ステップも、この経路は、腸管の前側−後側パターン形成において役割を果たすとわかっているので３５、３６、内胚葉を腹側前腸の運命に適宜パターン形成することにおいて役割を果たし得る。持続したアクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達はまた、ｈＥＳＣからの膵臓発達に影響を及ぼすことがこれまでに実証された１８。
【０３２８】
特定の実施形態では、プロトコールの成熟段階は、２つの別個であるが、相互依存するステップを含む。最初のものは、３次元凝集体の作製である。これまでの研究は、３次元培養が、肝細胞生存並びにマウス及びヒト初代胎児肝細胞の成熟を改善し得ることを示した２４、３７、３８。最近、Ｍｉｋｉらが、灌流バイオリアクターにおける３次元培養が、ｈＥＳＣ由来肝細胞の分化を改善し得ることを報告し、これは、３次元環境が、細胞の成熟にとって重要であり得ることを示す。しかし、比較が胎児及び成体肝臓対照に対して行われなかったので、これらの相違の規模は、解釈することが困難である。本研究は、ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ及びＴＤＯなどの重要な肝臓遺伝子の発現の大幅な増大によって、またＡＳＧＰＲ１、成熟肝細胞で見られる受容体を発現する細胞の割合の劇的な増大によって実証されるように、静的３次元形式での培養が、分化を促進することを示すこれらの知見を拡張した。２次元培養物では、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４などの遺伝子が誘導されなかったので、凝集体内の成熟はまた、ｃＡＭＰに対する反応性にとって重要である。凝集が成熟を促進する機序は、現在わかっていないが、理論に捉われるものではないが、細胞相互作用の増強及びおそらくは、肝臓内の肝細胞の細胞形態学をある程度模倣する３次元構造内の極性化上皮細胞の生成と関連する可能性がある。
【０３２９】
成熟戦略の第２のステップは、任意選択で、細胞透過性の、より遅く加水分解されるｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの添加による、３次元凝集体内のｃＡＭＰ経路の活性化である。ＰＧＣ１−ａ、ＴＡＴ及びＧ６Ｐを含めた肝臓内の特定の遺伝子は、そのプロモーター領域中にＣＲＥＢエレメントを含有し、結果として、ｃＡＭＰシグナル伝達の直接標的である２５、３９、４０。これを考えると、これらの標的遺伝子は、２次元の単層において、並びに３次元凝集体において誘導された。ＰＣＲ及びマイクロアレイ解析は、経路の活性化が、薬物代謝、ミトコンドリア生合成、脂質合成及びグルコース代謝を含めた肝細胞機能の種々の態様と関連している遺伝子発現パターンの変化を誘導したので、ｃＡＭＰシグナル伝達の効果が、標的遺伝子の誘導を超えて拡張することを明確に実証する。これらのグローバルな変化は、ｃＡＭＰシグナル伝達が、肝芽細胞の成熟を促進するという解釈を支持する。持続したｃＡＭＰシグナル伝達は、発現の上昇したレベルを維持するためには必要ではなかったという事実は、効果が、成熟の１種であり、特定の遺伝子の発現の簡単な誘導及び維持ではないという解釈をさらに支持する。発現の最も顕著な変化の一部は、初代ヒト肝細胞において見られたものと同程度か、又はそれより高いレベルで検出されたＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４及びＵＧＴ１Ａ１を含めた重要な薬物代謝酵素に関して観察された。ＨＥＳ２由来細胞が、初代肝細胞におけるものに匹敵する機能的酵素のレベルを示したので、転写物レベルが機能を示した。２種のｈＥＳＣ系に由来する肝細胞において同様の誘導のパターンが観察され、１種のｈｉＰＳＣ系は、この成熟戦略が広く適応可能であることを示す。
【０３３０】
インスリン及びグルカゴンなどの内分泌ホルモンは、グルコース代謝に対する急性効果並びに遺伝子発現の調節による慢性効果を有する成体肝臓においてｃＡＭＰレベルに影響を及ぼし得る。空腹という条件下で、ｃＡＭＰレベルは上方制御され、その結果、ＰＧＣ１−ａ及び糖新生に関与する遺伝子の迅速な誘導をもたらし、エネルギー供給を確実にする４１、４２。空腹という条件に加えて、ＰＧＣ１−ａの発現は、マウス肝臓において誕生の１日後に劇的に上方制御されるということが報告されている４３。この上方制御は、新生児肝細胞の成熟を迅速に促進すると考えられる。理論によって制限されるものではないが、ＰＧＣ−１ａ発現の上方制御によって、ｈＥＳＣ由来肝芽細胞に対するｃＡＭＰシグナル伝達の効果は、空腹の際の肝臓において、及び／又は誕生時の肝細胞系において観察される変化の要点をある程度繰り返し、成熟細胞の多数の特徴を示す細胞の生成をもたらし得る。
【０３３１】
要約すると、本発明者らは、ｈＰＳＣから得られた肝系細胞の成熟を促進し、初代ヒト肝細胞のものと同様の遺伝子発現プロファイルを示す細胞の生成をもたらすステップを初めて規定した。代謝的に機能的な細胞の発達は、これらの進歩が、製薬業界における薬物代謝解析のための、ｈＰＳＣ由来肝細胞様細胞の日常的な製造を可能にすることを実証するので、重要なエンドポイントである。ｃＡＭＰによって誘導された細胞はまた、バイオ人工肝臓装置の開発のための、また最終的に、肝疾患の治療のための細胞置換療法のための移植のための理想的な候補集団を提供する。
【０３３２】
材料及び方法
＜ＨＰＳＣ培養及び分化＞
これまでに記載されたように４４、ＨＰＳＣを、２０％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ）を補給したＤＥＭＥ／Ｆ１２（５０：５０、Ｇｉｂｃｏ）からなるｈＥＳＣ培地中の照射されたマウス胚支持細胞で維持した。胚葉体（ＥＢ）の作製に先立って、ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされたプレートで１日間継代して、支持細胞の集団を枯渇させた。この段階で、これまでに記載されたように４４，４５、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡによってｈＥＳＣを解離させて、小さいクラスターを作製し、次いで、ＢＭＰ４（３ｎｇ／ｍｌ）の存在下、血清不含分化（ＳＦＤ）培地で２４時間（０日目〜１日目）培養した。１日目で、ＥＢを回収し、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；２．５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＢＭＰ４（０．２５ｎｇ／ｍｌ）を補給したＳｔｅｍＰＲＯ−３４（登録商標）からなる誘導培地Ａで３日間再培養した。４日目に、ＥＢを回収し、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＢＭＰ４（０．２５ｎｇ／ｍｌ）を補給したＳｔｅｍＰＲＯ−３４（登録商標）（培地Ｂ）で再培養した。６日目に、ＥＢを回収し、単細胞に解離させ、細胞を、Ｗｎｔ３Ａを含まず、５０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンＡを含む培地Ｂ中、細胞４×１０５個の濃度で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた１２ウェルプレートで２日間培養した。８日目に、培地Ｂを、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ａ１１５７６ＳＡ）、アスコルビン酸、ＭＴＧ、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）（８日目〜１０日目）、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）（１０日目〜１４日目）及びＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）を補給したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなる肝特定化培地で置換した。培地を８日目から１４日目まで２日毎に交換した。ＨＥＳ２由来肝細胞の成熟を促進するために、それらを成熟培地Ａで１２日間培養した。成熟培地Ａは、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、アスコルビン酸、グルタミン、ＭＴＧ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びオンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）を有するＩＭＤＭからなっていた。培養２６日目に集団から凝集体を作製した。凝集体を作製するために、細胞を、コラゲナーゼ及びＴｒｙｐｌｅＬＥを用いて解離させ、次いで、ウェルあたり細胞６×１０５個の濃度で６ウェル超低クラスター皿において、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤及び０．１％ＢＳＡを補給した成熟培地Ａで培養した。凝集体は、３日毎に培地を交換しながら３２日目までこれらの条件下で維持した。３２日目に、培地を、ＥＧＦを含まない肝細胞培養培地（ＨＣＭ）（Ｌｏｎｚａ：ＣＣ−４１８２）からなる成熟培地Ｂに交換した。この段階で１０ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌａｂ：Ｂ００７）を添加した。培地を３日毎に交換した。Ｈ９、Ｈ１及びＩＰＳ細胞から肝細胞様細胞を作製するために、肝特定化培地へ以��の交換を行った。ｂＦＧＦの濃度を４０ｎｇ／ｍｌに増大させ、８日目〜１４日目の培養のために基本培地をＩＭＤＭからＨ１６  ＤＭＥＭに、次いで、１４日目〜２０日目に、Ｈ１６  ＤＭＥＭ及び２５％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２に交換した。２０日目〜３２日目に使用される成熟培地Ａのために、ＩＭＤＭを、Ｈ２１  ＤＭＥＭ及び２５％Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２及び０．１％ＢＳＡと置き換えた。別に記載されない限り、すべてのサイトカインは、ヒトであり、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＥＢ及び単層培養物は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２環境で維持した。凝集培養物は、５％ＣＯ２の周囲空気環境で維持した。
【０３３３】
＜フローサイトメトリー＞
フローサイトメトリー分析を、これまでに記載されたように実施した４５。細胞表面マーカーについて、染色を１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で実施した。細胞内タンパク質について、染色を、ＰＢＳ中、４％のパラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ、ＵＳＡ）で固定された細胞で実施した。これまでに記載されたように４５、細胞を、Ｓｏｘ１７及びＦｏｘＡ２染色のために９０％氷冷メタノールを用いて２０分間透過処理した。アルブミン及びα−フェトプロテイン染色を、１０％ＦＣＳ及び０．５％サポニン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ中で実施した。染色された細胞を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して解析した。
【０３３４】
＜免疫染色＞
免疫染色を、これまでに記載されたように４５実施した。細胞を、４％ＰＦＡを含む培養ウェル中、３７℃で１５分間固定し、ＤＰＢＳ（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含む）＋０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、次いで、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む洗浄バッファー中で２０分間透過処理した。ＤＰＢＳ（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含む）＋０．１％ＢＳＡでさらに３回洗浄した後、細胞を、タンパク質ブロック溶液（ＤＡＫＯ；Ｘ０９０９）を用いて室温で２０分間ブロッキングした。アルブミン及びα−フェトプロテイン陽性細胞の評価のために、細胞を、ヤギ抗ＡＬＢ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）又はウサギ抗ＡＦＰ抗体（ＤＡＫＯ）のいずれかを用いて室温で１時間染色した。アイソタイプ対照の濃度は、一次抗体と対応していた。シグナルを可視化するために、細胞を、続いて、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はロバ抗ウサギＣｙ３抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかとともに室温で１時間インキュベートした。Ｓｏｘ１７染色のために、上記のように、細胞を固定し、透過処理し、ブロッキングした。細胞を、ヤギ抗ＳＯＸ１７（Ｒ＆Ｄ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ととものインキュベーションによってシグナルを可視化した。ＡＳＧＰＲ−１染色のために、凝集体をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされたカバーガラス上で１日間培養した。接着させ、広げたのち、細胞を４％ＰＦＡを用いて３７℃で１５分間固定し、次いで、冷１００％メタノールを用いて１０分間透過処理した。細胞を、上記の通り、洗浄し、ブロッキングした。固定された細胞を、ヤギ抗ＡＳＧＰＲ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とともに４℃で一晩、次いで、ウサギ抗ＡＬＢ（ＤＡＫＯ）とともに室温で１時間インキュベートした。ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ４８８抗体及びロバ抗ウサギＣＹ３抗体ととものインキュベーションによって、シグナルを可視化した。一次及び二次抗体は、ＤＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で希釈した。ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅを使用して、核を対比染色した。染色された細胞を、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ６０００）を使用して可視化し、Ｌｅｉｃａ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを使用して像を獲得した。
【０３３５】
＜定量的リアルタイムＰＣＲ＞
全ＲＮＡを、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて調製し、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて処理した。スーパースクリプト（登録商標）ＩＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ランダムヘキサマー及びオリゴ（ｄＴ）を使用して、５００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲを、これまでに記載されたように４５、ＱｕｅｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用してＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で実施した。発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に対して正規化した。ＵＧＴ１Ａ１発現を測定するために、δ−δ  ＣＴ法を使用して、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（−）処理細胞におけるレベルに対する相対遺伝子発現を算出した。総ヒト成体及び胎児肝臓ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。２種の初代肝細胞ＲＮＡサンプルは、Ｄｒ  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｃ．Ｓｔｒｏｍ（ピッツバーグ大学）によって提供され、３番目のサンプルは、Ｚｅｎｂｉｏから購入した（ロット；２１９９）。２種の初代肝細胞サンプルは、２日間培養し、回収した。一方（ＨＨ１８９２）は、１歳のコーカサス人男性から単離され、もう一方（ＨＨ１９０１）は、１４ヶ月齢の男性の胆汁うっ滞によって拡張された肝臓から単離されている。３番目のサンプル（Ｚｅｎｂｉｏ：ロット２１９９）は、４８歳男性コーカサス人臓器ドナーから単離されている。
【０３３６】
＜肝凝集体のヨードシアニングリーン取り込み＞
ヨードシアニングリーン（ＩＣＧ、Ｓｉｇｍａ）溶液を、ＨＣＭ（Ｌｏｎｚａ）中、１ｍｇ／ｍｌ  ＩＣＧの最終濃度で細胞に添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で調べた。
【０３３７】
＜ＨＰＬＣによる薬物代謝アッセイ＞
肝凝集体をＣＹＰ１Ａ２基質フェナセチン（２００μＭ）、ＣＹＰ２Ｂ６基質ブプロピオン（９００μＭ）、ＮＡＴ１／２基質スルファメタジン（ＳＭＺ）（５００μＭ）又は総ＵＧＴ基質４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）（２００μＭ）のいずれかを含有するＨＣＭ中で２４又は４８時間のいずれかインキュベートした。インキュベーション後、培地のアリコートを採取し、個別に最適化された高速液体クロマトグラフィーアッセイを使用して代謝産物のレベルを定量した。ヒドロキシブプロピオンレベルを、Ｌｏｂｏｚら４６におけるＨＰＬＣ法に基づいてアッセイした。４−ＭＵグルクロニドを、これまでに記載されたように４７、タンデム質量分析と一体となった高速液体クロマトグラフィーによって測定した。低温保存肝細胞を解凍し、ウェルあたり細胞１×１０４個の密度でコラーゲン培養皿上に２４又は４８時間のいずれかで置いた。２４又は４８時間のいずれか培養した後、上清を回収し、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＮＡＴ１／２及び総ＵＧＴの活性を測定した。
【０３３８】
＜マイクロアレイ処理及びデータ解析＞
ＲＮＡサンプルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｒｅで標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘガイドラインに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  ｖ１．０チップに流した。手短には、３００ｎｇの各サンプルの全ＲＮＡ出発材料を、Ａｍｂｉｏｎ  ＷＴ発現キットへのインプットとして使用した。次いで、２．７μｇの増幅されたｃＤＮＡを断片化し、標識し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  ｖ１．０チップと１８時間ハイブリダイズさせた（６０ＲＰＭで４５℃）。アレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｐ４５０流体工学ステーションを使用して洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ７Ｇを用いてスキャンした。スキャニング後、各チップを調べ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ品質コントロールガイドラインを通るとわかった。生ＣＥＬファイルをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｖ１１．５．１）にインポートし、プローブレベルデータを、ＨｕＧｅｎｅ−１＿０−ｓｔ０ｖ１＿ｎａ３１＿ｈｇ１９＿２０１０−０９−０３  ｂｕｉｌｄに基づくＥｘｏｎＲＭＡ１６アルゴリズムを使用してまとめた。さらに、各遺伝子を検討中の全てのサンプル中の中央値に対して正規化した。すべての統計は、ｌｏｇ２変換したデータで実施した。合計、２８８６９種の転写物が、このアレイで表される。
【０３３９】
第１のステップとして、３種のサンプル群のすべてにわたって測定された発現の低い２０番目のパーセンタイル中に一貫してあるものを除去するよう転写物にフィルターをかけた。平均連結ルールの下、ピアソン中心化距離測定基準を用いる教師なし階層的クラスタリング解析を使用して、サンプル及び群間の全体的な類似性及び相違に対処した。３種のサンプル群間の有向統計分析を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ＦＤＲ、ｑ＜０．０５）４８を用いるＡＮＯＶＡを使用して実施した。生物学的意味を有する異なって発現される転写物のセットを見出すために、遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析を、ｑ＜０．１有意水準で補正されたＢｅｎｊａｍｉｎｉ及びＹｕｋｅｔｉｅｌｉ超幾何分布検定を使用して実施した４９。特定の転写物の２種の先験的に規定されたセットをより詳細に調べた：対象の特定の肝臓関連活性と関連する転写物；及びＨＯＭＥＲデータベース５０から得られる公的に入手可能な情報に基づいて、発現され、肝臓特異的であるとわかった転写物。
【０３４０】
（例２）
ＣＨＩＲ９９０２１は、正準Ｗｎｔシグナル経路を模倣すると報告されているＧＳＫ３の選択的阻害剤である。ＣＨＩＲ９９０２１を、胚葉体の誘導及びｈＰＳＣからの胚体内胚葉のための単層誘導において、ｗｎｔ３ａの代替物として試験した（例えば、アクチビンと組み合わせて添加した）。図８ａ）及びｂ）において見られるように、Ｗｎｔ３ａと置き換わるＣＨＩＲ９９０２１を使用して誘導されたＣＫＩＴ＋ＣＸＣＲ４＋及びＣＸＣＲ４＋ＥＰＣＡＭ＋細胞の割合は、集団の９５％超であり、アクチビン／ｗｎｔ３ａ誘導を用いて見られるものに匹敵する。
図８（ａ）及び（ｂ）は、ＣＨＩＲ９９０２１が胚体内胚葉細胞を誘導し得ることを実証する。図８（ａ）は、アクチビン／ｗｎｔ３ａを用いる胚葉体誘導の６日目アクチビン／ＣＨＩＲ９９０２１におけるＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞の割合を示す、フローサイトメトリー分析である。図８（ｂ）は、６日目アクチビン／ＣＨＩＲ９９０２１におけるＣＸＣＲ４＋、ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞の割合を示すフローサイトメトリー分析である。図８（ｃ）及び（ｄ）は、（ｃ）アクチビン／ｗｎｔ３ａ又は（ｄ）アクチビン／ＣＨＩＲ９９０２１を用いる７日の単層誘導を示す。
【０３４１】
＜方法＞
＜ＧＳＫ３β阻害剤を用いる胚体内胚葉の誘導＞
ＥＢ誘導のために、ＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ）を、内胚葉誘導のためのＷｎｔ３ａから置き換えた。
【０３４２】
これまでに記載されたように（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００７）、単層誘導のために、ＨＰＳＣを、２０％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ）を補給したＤＥＭＥ／Ｆ１２（５０：５０、Ｇｉｂｃｏ）からなるｈＥＳＣ培地中の照射されたマウス胚支持細胞で維持した。単層培養における内胚葉の誘導に先立って、ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた表面（通常、１２ウェルプレート）上で１日間継代した。０日目に、細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ：Ｓｉｇｍａ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ）又はＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩベースの培地で培養した。１日目〜３日目に、培地を、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩを用いて１日毎に交換した。３日目〜５日目に、細胞を、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補給したＳＦＤベースの培地で培養した。培地を１日おきに交換した。７日目に、上記のように、胚体内胚葉を、ＦＧＦ及びＢＭＰ経路アゴニストを用いる処理によって肝臓への運命に特定化した。
【０３４３】
（例３）
＜ＮＳＧマウスにおける異所性肝臓組織＞
移植されたｈＥＳＣ由来肝芽細胞は、生着し、肝細胞分化マーカーを発現する細胞を生成する。
【０３４４】
【０３４５】
図８（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）は、例２に記載されるように移植される細胞を作製するためにＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１を使用した点を除いて、例１に記載された方法を使用して調製されたＥＳ由来肝臓細胞の生着を実証する。
【０３４６】
図８（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）（ｈ）ＮＳＧマウスにおける異所性肝臓組織。図８（ｅ）は、腸間膜領域のＨ＆Ｅ染色の実証的顕微鏡写真であり、移植の２ヶ月後のｈＥＳＣ由来肝細胞のクラスター（矢頭）を示す。倍率は５Ｘであった。腸（矢印）、移植された細胞（矢頭）。図８（ｆ）は、図８（ｅ）から得たＨ＆Ｅ染色された切片の高倍率（１０Ｘ）顕微鏡写真を示す。
【０３４７】
図８（ｇ）（ｈ）免疫組織化学的染色は、移植の２ヶ月後の腸間膜領域におけるｈＥＳＣ由来細胞の存在を示す。ヒトアルブミン（Ａｌｅｘａ４８８：緑色）（矢印で示される）及びＣＫ１９（Ｃｙ３：赤色）（矢頭で示される）の二重染色は、移植された細胞が、肝細胞及び胆管細胞系統に分化する潜在力を有することを示す。ＨＥＳＣ由来肝細胞様細胞が、アルブミン陽性細胞（矢印）として観察されたが、胆管細胞様細胞は、ＣＫ１９を発現し、管様構造中に見られた（矢頭）。
【０３４８】
＜方法＞
＜ＮＳＧマウスにおける異所性肝臓組織＞
６週齢のＮＳＧマウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、ＵＨＮ動物施設に収容した。ｈＥＳＣ由来肝細胞前駆細胞（肝芽細胞）及びｈＥＳＣ由来ＣＤ３４＋内皮細胞からなる凝集体（２７日目）を、５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に懸濁し、移植まで氷上で維持した。レシピエントマウスに１〜３％のイソフランを用いて麻酔し、開腹手術した。腸間膜領域を露出させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌとの細胞混合物を腸間膜領域上に置き、吸収性止血剤、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（Ｅｔｈｉｃｏｎ  ３６０、ＵＳＡ）で覆った。移植の２ヶ月後、マウスを屠殺し、組織学的分析によってｈＥＳＣ由来細胞の存在について評価した。
【０３４９】
（例４）
Ｗｎｔ／ｐ−カテニン経路と関連する小分子は、肝前駆細胞を増殖させ得る。２７日目肝前駆細胞（Ｈ９）を解離させ、ウェルあたり細胞１×１０４個の密度で９６ウェルＭａｔｒｉｇｅｌコーティングされた皿に置いた。細胞を、種々の濃度のＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ、１μＭ及び３μＭ）で処理し、９日間培養した。処理を伴わない２７日目細胞数と比較して、細胞数をカウントすることによって、肝前駆細胞の割合の増大を調べた（図９ａ）。
【０３５０】
Ｗｎｔ及びＭＥＫ／ＥｒＫ経路の阻害は、第Ｉ相薬物代謝酵素と関連する遺伝子の発現を増大し得る。
【０３５１】
Ｗｎｔ／ｐ−カテニンシグナルの阻害と関連する小分子（ＸＡＶ９３９：１μＭ）及びＭＥＫ／Ｅｒｋシグナルの阻害と関連する小分子（ＰＤ０３２５９０１：１μＭ）とともに培養された４４日目の３次元肝凝集におけるＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現。Ｗｎｔ及びＭＥＫ／ＥｒＫシグナルの阻害は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰと一緒に、ＣＹＰ３Ａ４の遺伝子発現を増大するよう影響を及ぼす（図９ｄ）。
【０３５２】
Ｗｎｔ／ｐ−カテニンシグナルの阻害と関連する小分子（ＸＡＶ９３９：１μＭ）及びＭＥＫ／Ｅｒｋシグナルの阻害と関連する小分子（ＰＤ０３２５９０１：１μＭ）とともに培養された４４日目の３次元肝凝集におけるＣＹＰ１Ａ２の遺伝子発現。Ｗｎｔ及びＭＥＫ／ＥｒＫシグナルの阻害は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰと一緒に、ＣＹＰ１Ａ２の遺伝子発現を増大するよう影響を及ぼす（図９ｄ）。
【０３５３】
いくつかの異なる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）での２６日目肝細胞様細胞培養物でのＡＬＢの遺伝子発現。胚葉体（ＥＢ）に由来する内胚葉細胞を解離させ、細胞４×１０５個の細胞密度でＥＣＭ上に置き、上記のように２６日目まで肝特定化及び成熟培地で培養した。２６日目細胞から全ＲＮＡを抽出し、アルブミン発現のレベルを測定した。発現レベルを、ゼラチンコーティングされた培養条件と比較して、倍数差によって決定した（図９ｆ）。
【０３５４】
＜方法＞
＜ＧＳＫ３β阻害剤を用いる胚体内胚葉の誘導＞
ＥＢ誘導のために、ＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ）を、内胚葉誘導の間、Ｗｎｔ３ａと置き換えた。
【０３５５】
これまでに記載されたように（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００７）、単層誘導のために、ＨＰＳＣを、２０％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ）を補給したＤＥＭＥ／Ｆ１２（５０：５０、Ｇｉｂｃｏ）からなるｈＥＳＣ培地中の照射されたマウス胚支持細胞で維持した。単層培養における内胚葉の誘導に先立って、ｈＥＳＣを、１２ウェルのＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングされた表面上で１日間継代した。０日目に、細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ：Ｓｉｇｍａ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．３μＭ）又はＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩベースの培地で培養した。１日目〜３日目に、グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補給したＲＰＭＩからなる培地を、１日毎に交換した。３日目、５日目に、細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；５ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を補給したＳＦＤベースの培地で培養した。培地を１日おきに交換した。７日目に、胚体内胚葉細胞は、上記のように、肝特定化培地を用いて分化し始めた。
【０３５６】
（例５）
＜ｃＡＭＰ処理を用いる細胞凝集体の成熟の誘導＞
細胞凝集体を例１におけるように作製した
【０３５７】
細胞凝集体を、３２日目までＨＧＦ、Ｄｅｘ及びＯＳＭで培養し、その時点で、ｃＡＭＰを添加した。ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される時点でＯＳＭを除去した。いくつかの実施形態では、ＨＧＦもまた、ｃＡＭＰ類似体及び／又はｃＡＭＰアゴニストが添加される時点で除去した。他の実施形態では、ｃＡＭＰが添加された時点での１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの添加（２０ｎｇ／ｍｌから低減された）は、凝集体の生存を促進するとわかった。
【０３５８】
理論に捉われるものではないが、ＯＳＭを維持することは、第１相ＣＹＰ酵素、特に、ＣＹＰ３Ａ４の発現の誘導に対して阻害効果を有するということが考えられる。
【０３５９】
（例６）
＜肝前駆細胞におけるｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、胆管細胞系統の分化に影響を及ぼす＞
胆管細胞様細胞の分化を調べるために、Ｈ９由来２７日目肝前駆細胞を、ＨＧＦ２０ｎｇ／ｍｌ及びＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌの存在下でＯＰ９細胞（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー）と共培養した。Ｈ９由来の２７日目肝前駆細胞を、例１におけるように導いた。肝前駆細胞が、ＯＰ−９細胞からＮｏｔｃｈシグナル伝達活性化を受け取った場合には、アルブミン陽性細胞は完全に減少し、組織化された分岐外観を有するＣＫ１９陽性細胞に変わった（図１０ａ、ｂ）。対照的に、γ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ−６８５，４５８（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）と共培養された細胞においてＮｏｔｃｈシグナル伝達が阻害される場合には、アルブミン及びＣＫ−１９陽性細胞が見出された（図１０ｂ）。
【０３６０】
さらに、ＧＳＩの存在下又は非存在下のいずれかで共培養された細胞のＨ＆Ｅ切片は、ＧＳＩの存在下で、キメラ凝集が維持されることを示した。ＧＳＩ処理の非存在下では、細胞は、管腔を含有する上皮管様構造に配列された（図１０ａ）。
【０３６１】
図１０ｂに示されるように、ＧＳＩの非存在下で３６日目のＯＰ９共培養におけるＣＫ１９及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の増大された発現。示される値は、ＧＳＩの存在下で培養された細胞に対するものである。ＧＳＩの存在下で培養することによってＮｏｔｃｈシグナル伝達が不活化される場合には、アルブミンの発現が見られ、これは、細胞が肝芽細胞の特徴を保持することを実証する。
【０３６２】
最後に、肝前駆細胞のＯＰ９細胞との３次元共培養は、２次元培養と比較して３６日目でのＣＦＴＲの発現の増大をもたらした（図１０ｃ）。
【０３６３】
上記の実験は、胆汁様構造を形成する胆管細胞様細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化によって（例えば、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞と共培養することによって）Ｈ９由来肝前駆細胞から誘導され得ることを実証する。ＣＦＴＲ、機能的胆管細胞のマーカーの発現は、２次元培養物においてよりも３次元ゲル共培養物において高く、これは、環境もまた胆管細胞成熟に影響を及ぼし得ることを示す。
【０３６４】
（例７）
例示的成熟培地処方
＜１４日目（ＥＢ）／１３日目単層から２６日目（ＥＢ）／２５日目（単層）のＨＥＳ２細胞系用＞
ベースとする培地：
ＩＭＤＭ、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）
サイトカイン及び増殖因子：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びオンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）。
【０３６５】
＜１４日目（ＥＢ）１３日目単層〜２０日目（ＥＢ）／１９日目（単層）のＨ９及びｉＰＳ細胞系用＞
ベースとする培地：
Ｈ１６／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（７５％／２５％）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；  Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）
サイトカイン及び増殖因子：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びオンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）。
【０３６６】
＜２０日目（ＥＢ）／１９日目単層〜２６日目（ＥＢ）／２５日目（単層）用＞
ベースとする培地：
Ｈ２１／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（７５％／２５％）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）
サイトカイン及び増殖因子：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びオンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）．
【０３６７】
凝集段階
２６日目／２５日目〜３２日目／３１日目
ベースとなる培地：
ＩＭＤＭ又はＨ２１／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（７５％／２５％）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン（２ｍＭ：）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤（１０μＭ）及び０．１％ＢＳＡ。
サイトカイン及び増殖因子：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びオンコスタチンＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）。
ｃＡＭＰを用いる凝集段階
３２日目／３１日目〜４４日目／４３日目
ベースとなる培地：
ＥＧＦを含まない肝細胞培養培地（ＨＣＭ）（Ｌｏｎｚａ：ＣＣ−４１８２）。１０ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌａｂ：Ｂ００７）、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの阻害と関連する小分子（ＸＡＶ  ９３９：１μＭ）及びＭＥＫ／Ｅｒｋシグナルの阻害と関連する小分子（ＰＤ０３２５９０：１μＭ）。
【０３６８】
＜胆管細胞成熟培地＞
ベースとなる培地：
Ｈ２１／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（７５％／２５％）、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ  Ｂ２７栄養補助剤、グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）、ＭＴＧ（４．５×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）。
サイトカイン及び増殖因子：
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）（５０ｎｇ／ｍｌ）
【０３６９】
（例８）
＜ｈＥＳＣ由来肝発達に対する内皮細胞の効果。＞
内皮細胞が、肝臓発達において重要な役割を果たすことを考え、この系統を、ｈＥＳＣ由来肝細胞の成長及び／又は成熟に対する影響について評価した。これらの研究のために、ｈＥＳＣからＣＤ３４＋内皮細胞を作製した。これらの研究のために、ＲＯＳＡ遺伝子座から赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ｃＤＮＡを発現し、本発明者らが内皮細胞を追跡することを可能にするよう操作されているＨＥＳ２  ｈＥＳＣ系を使用した。ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの組合せを用いる６日間の誘導によって内皮細胞を作製し、その時点で、ＦＡＣＳによってＣＤ３４＋細胞（同様にＣＤ３１＋及びＫＤＲ＋）を単離した。選別されたＣＤ３４＋細胞を、ＥＧＭ２内皮細胞増殖培地で６日間培養し、次いで、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌｓ（商標）を使用するキメラ凝集体の作製のために使用した。内皮細胞を、肝細胞の２日前にＡｇｇｒｅｗｅｌｌｓに添加し、それらがウェルの底をコーティングするのを可能にした（図１２ａ）。この時点で、２５日目肝芽細胞の単細胞懸濁液を内皮細胞の頂部に添加し、混合物をＡｇｇｒｅｗｅｌｌｓで４８時間培養した。凝集体を、続いてＡｇｇｒｅｗｅｌｌｓから取り出し、さらに６日間培養し、その時点で、それらを回収し分析した。図１２ｂに示されるように、内皮細胞と一緒に培養された凝集体は、ＲＦＰ＋細胞を含有しており、単独で培養されたものよりも大きかった。フローサイトメトリー分析は、ＲＦＰ＋細胞が、集団の３０％超に相当することを示し（図１２ｃ）、これは、有意な数が、凝集体中に肝細胞を組み込んだことを示す。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、さらに１２日間培養されたキメラ凝集体は、内皮細胞を伴わない肝凝集体よりも実質的に高いレベルのＣＹＰ３Ａ４メッセージを発現することを示した（図１２ｄ）。重要なことに、これらのレベルはｃＡＭＰの添加を伴わずに達成され、これは、内皮細胞が、ｈＰＳＣ由来肝細胞の成熟を促進し得ることを示唆する。これらの知見は、胚性内皮細胞との相互作用が、ｈＥＳＣ由来肝細胞の生存及び成熟に影響を及ぼすことを示す。
【０３７０】
＜コラーゲンゲル中でのｈＥＳＣ由来肝細胞の成熟。＞
３次元凝集、ｃＡＭＰ及びＰＤ／ＸＡＶの組合せは、ヒト多能性幹細胞由来肝細胞の有意な分化を促進し（図９）、（図９ｄ及びｅ）。細胞は、ＡＦＰ及び胎児ＣＹＰ３Ａ７の幾分かの発現を保持しており、これは、それらが十分に成熟していない可能性があることを示す。集団の成熟を促進するために、キメラ内皮／肝凝集体を、ｃＡＭＰ、ＰＤ及びＸＡＶの組合せを用いて処理した。これらの凝集体は、液体培養で、又はコラーゲンゲル中のいずれかで維持し、細胞外マトリックスタンパク質の供給源を供給した。図１３に示されるように、凝集体への内皮細胞の添加（ｅｎｄ）は、凝集体が液体培養で維持された場合にはＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＦＰ又はＣＹＰ３Ａ７の発現レベルに大きく影響を及ぼさなかった。対照的に、コラーゲンゲル中での凝集体の培養は、ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７発現に対して劇的な効果を有しており、両方とも、成体肝臓で見られるレベルと同様のほとんど検出できないレベルに低減された。これらの知見は、シグナル伝達経路、細胞相互作用及び細胞外環境はすべて、ｈＰＳＣ由来肝細胞の成熟において役割を果たすことを示唆する。これは、ＡＦＰを、あったとしてもほとんど発現しない細胞を作製することが可能であることを実証する。この発現パターンは、これらの細胞が、成体肝臓中の肝細胞に匹敵する段階に進んだことを示唆する。
【０３７１】
（例９）
【０３７２】
ヒト胚性及び誘導された多能性幹細胞（多能性幹細胞；ＰＳＣ）からの組織特異的細胞種の効率的な作製のためのプロトコールの開発は、ヒト発達及び疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの確立に向けて、並びに創薬及び予測毒性学のための新規プラットフォームの設計のために役立ってきた。胆管系の臓器を構成する肝細胞並びに胆管細胞は、薬物の、並びにさまざまな遺伝性及び感染性疾患の有害作用の第一標的であるので、肝臓を含む系統は、特に重要なものである。肝細胞の薬物代謝における中心的な役割を考え、今日までのほとんどの努力は、ｈＰＳＣからのこの細胞種の作製に向けられてきた。低い効率であり、代謝機能を欠くものの、機能的Ｐ４５０酵素の発現を含めた成熟肝細胞の一部の特徴を示す細胞の生成を促進する段階的分化プロトコールを開発することが可能であった。最近の研究は、この戦略を患者に特異的な誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に、また肝細胞機能に影響を及ぼすモデル遺伝性肝疾患に拡張した。
【０３７３】
胆道が絡む障害は、相当な病的状態をもたらし、決定的な管理のためには全臓器移植を必要とすることも多い慢性肝疾患の一般的な原因である。嚢胞性線維症肝臓及びアラジール症候群などの一遺伝子性胆管疾患の根底にある機序は、不完全にしか理解されないままであり、原発性硬化性胆管炎及び胆管閉鎖症などのより複雑な胆管疾患には、その病態生理学を理解するための、又は新規薬理学的物質をスクリーニングするための適当なモデルがない。ｈＰＳＣから機能的な胆管細胞を作製する能力は、これらの満たされていない要求を満たすと予想される。
【０３７４】
ｈＰＳＣからの胆管細胞の誘導の成功は、分化培養におけるこの系統の胚性発達を正確にモデル化する能力に左右される。胆管細胞は、胎児期の初期に発達し、同様に肝細胞系統を生じる肝芽細胞として知られる二分化能前駆体から派生する。マウスにおけるターゲッティング研究は肝芽細胞からの胆管細胞系統の特定化は、前駆細胞によって発現されるＮｏｔｃｈ２と、発達中の門脈間充織に存在するＪａｇｇｅｄ−１の相互作用によって媒介される、Ｎｏｔｃｈ依存性事象であると示した。小児胆道疾患アラジール症候群は、Ｎｏｔｃｈ２又はＪａｇｇｅｄ１のいずれかにおける突然変異によって引き起こされるという発見は、この経路がまた、ヒトにおける胆管細胞発達にも関与しているという強力な証拠を提供する。胆管細胞が成熟するにつれ、それらは、組織化して、発達中の原始管構造を裏打ちする極性化上皮を形成し、それが胆管を生じさせる。
【０３７５】
胆管疾患を有する患者から得たｉＰＳＣの調査の基礎として、ｈＰＳＣからの機能的胆管細胞の方向づけられた分化及び成熟のための頑強なプロトコールが記載されている。ｈＰＳＣ由来胆管細胞は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）を含めた、成熟胆管において見られるマーカーを発現する上皮化嚢胞構造を形成するよう誘導され得る。これらの構造におけるＣＦＴＲ機能は、フォルスコリンを用いるｃＡＭＰ経路の刺激後の嚢胞膨潤の調節によって実証された。嚢胞性線維症患者ｉＰＳＣから生成した嚢胞は、フォルスコリン誘導性膨潤アッセイにおいて、ＣＦＴＲ矯正剤の添加によって救出され得る欠乏症を示した。これらの知見は、まとめると、ｈＰＳＣから胆管細胞及び胆管様構造を作製すること並びにこれらの派生体細胞種を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで嚢胞性線維症胆管疾患の態様をモデル化することが可能であることを実証する。
【０３７６】
＜結果＞
ｈＰＳＣ分化培養における発達の肝芽細胞段階の特性決定
【０３７７】
ｈＰＳＣから胆管細胞を作製するために、分化培養において発達の肝芽細胞段階をまず特性決定することが必要であった。本発明者らは、これらの研究のために、ｈＰＳＣからの機能的肝細胞の作製のために本発明者らが開発したプロトコール１の改変版を使用した（図１４ａ）。本発明者らのこれまでのアプローチとの主要な相違は、内胚葉誘導ステップを、３次元胚葉体（ＥＢ）においてよりは、むしろ単層において実施したことであった。この変更は、分化３日目までに９０％超のＣＸＣＲ４＋ＣＫＩＴ＋及びＥＰＣＡＭ＋細胞からなる集団が生じたので、培養物における内胚葉発達の加速をもたらした（図１４ｂ）。ＥＢ分化５日目までに匹敵する集団は検出されなかった１。内胚葉を肝臓への運命に特定化するために、培養物を、分化７日目にｂＦＧＦ及びＢＭＰ４の組合せを用いて処理した。
【０３７８】
胚における肝発達の開始時に、新規に形成された肝芽細胞は、腹側前腸上皮から葉裂し、横中隔に侵入して、肝芽を形成する。芽の形成は、このプロセスの初期段階の間に一時的に発現される転写因子Ｔｂｘ３に左右される２、３。芽が増殖するにつれ、前駆体細胞は、Ｔｂｘ３を下方制御し、維持し、並びに／又はアルブミン（ＡＬＢ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、Ｓｏｘ９、ＮＨＦ６ｐ及びＮＯＴＣＨ２を含めた、肝及び／若しくは胆管細胞系統において通常発現される遺伝子の組合せの発現を上方制御する。ｂＦＧＦ／ＢＭＰ４処理ｈＥＳＣ由来内胚葉集団のＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、分化１３日目でのＴＢＸ３発現の一時的な上方制御を示し、この時点を肝芽細胞特定化の段階と同定した（図１４ｃ）。免疫染色は、１３日目集団中の細胞の大部分はＴＢＸ３＋であることを示し、これは、肝芽細胞特定化が効率的であることを示した。ＳＯＸ９及びＨＮＦ６Ｂ発現の開始は、ＴＢＸ３のものと重複していた（図１４ｃ）。しかし、ＴＢＸ３とは異なり、これらの遺伝子の発現は、２５日目、解析の最終日まで増大し続けた。ＡＬＢ及びＡＦＰの発現は、１９日目に上方制御され、２５日目でも増大した。ＣＫ１９は、二相性パターンを示し、発現のピークレベルが１３日目及び２５日目で検出された。免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー解析は、分化２５日目の細胞の大部分は、ＡＬＢ＋、ＡＦＰ＋及びＣＫ１９＋であることを示した。これらの知見は一緒に、２５日目集団内の細胞は、発達の増殖した肝芽細胞段階、ｉｎ  ｖｉｖｏでの肝芽の等価物を代表することを強力に示唆する。Ｎｏｔｃｈ１ではなくＮｏｔｃｈ２発現も、２５日目に上方制御され、これは、この集団が、この経路によってシグナル伝達できる肝芽細胞を含有するという解釈をさらに支持する。
【０３７９】
＜Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、ｈＰＳＣ由来肝芽細胞様集団からの胆管細胞発達を促進する。＞
本発明者らは、胆管細胞発達に対するＮｏｔｃｈシグナル伝達の効果を調べるために、肝芽細胞集団（２５日目）を、Ｊａｇｇｅｄ１を含めた種々のＮｏｔｃｈリガンドを発現すると知られているＯＰ９間質細胞と４、５共培養した。ｈＰＳＣ由来細胞は、単細胞懸濁液として間質で培養された場合に十分に生存しなかった。この問題を克服するために、本発明者らは、２５日目単層細胞から３次元凝集体を作製し、それらをＯＰ９間質細胞上で培養した。免疫染色及びフローサイトメトリー解析は、凝集体内の細胞の大部分は、共培養前は、ＡＬＢ＋ＡＦＰ＋ＣＤ１９＋ＮＯＴＣＨ２＋であることを示し、それらが肝芽細胞の特徴を維持していることを示した。８０％のみのＡＬＢ＋ＡＦＰ＋ＣＫ１９＋細胞からなる、２５日目集団から生じた凝集体が、４８時間培養した後に９０％超のＡＬＢ＋ＡＦＰ＋ＣＫ１９＋細胞を含有していたので、この凝集ステップは、肝芽細胞を選択すると思われる。ＯＰ９間質で共培養されると（９日目）、凝集体は、もはやＡＬＢを発現しないＣＫ１９＋細胞の別個のクラスターを形成し、これは、それらが胆管細胞特定化の最初の段階を経たことを示唆する。マウスにおける研究は、ＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｐｉシグナル伝達が胆管発達において役割を果たすことを示したので６−８、本発明者らは、次いで、これらの因子を個別に、又は組み合わせてクラスターに添加して、これらの経路の活性化が、ＣＫ１９＋クラスターのさらなる発達を促進するかどうかを調べた６−８。ＥＧＦ又はＴＧＦβｉ又は両方の組合せの添加は、ＣＫ１９＋凝集体の大きさの増大につながった。対照的に、ＨＧＦ単独は、ほとんど効果がなかった。興味深いことに、ＥＧＦ及びＨＧＦ又はＥＧＦ、ＨＧＦ及びＴＧＦｐｉのいずれかの組合せが、劇的な形態変化を誘導し、ＣＫ１９＋細胞からなる分岐構造の形成を促進した。ＲＴ−ｑＰＣＲ図１５ａ及びフローサイトメトリー解析（図２１）は、免疫染色知見を確認し、ＯＰ９との共培養後にＡＬＢ＋細胞が完全にないことを実証した。
【０３８０】
γセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）、Ｎｏｔｃｈ経路のアンタゴニストの添加は、ＡＬＢ発現の下方制御を阻止し、培養物中のＣＫ１９＋細胞の割合が低下し、分岐構造の発達を阻害し、これは、これらの効果がＮｏｔｃｈシグナル伝達によって媒介されることを示す（図１５ａ）。Ｎｏｔｃｈ標的ＨＥＳ１、ＨＥＳ５及びＨＥＹ１の発現は、ＯＰ９での培養の９日後に上方制御された。（図１５ｂ）。この発現の増大は、γ−セクレターゼ阻害剤の添加によって阻止され、ＯＰ９との共培養は、Ｎｏｔｃｈ経路を効率的に活性化したことを実証する（図１５ｂ）。２種の他のｈＰＳＣ系（ＥＳＣ  ＨＥＳ２及びｉＰＳＣ  Ｙ２−１）の分化潜在力の解析は、ＴＢＸ３及び肝芽細胞マーカー発現の同様の一時的パターンを示し、これは、これらの段階を通した推移が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける肝発達の特徴であることを示す（図２２）。両系から導かれた凝集体は、ＯＰ９間質細胞との共培養後にＣＫ１９＋ＡＬＢ−細胞からなる分岐構造を生成した。Ｈ９由来集団を用いて観察されたように、ＡＬＢ発現の下方制御及びこれらの構造の発達は、ＮＯＴＣＨ依存性事象であった。これらの知見は、まとめると、肝芽細胞集団におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化が、胆管細胞発達の最初の段階を誘導すること並びにＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｐｉシグナル伝達の組合せが、おそらくは管形態形成の初期段階を反映する、分岐構造の形成につながる形態変化を促進することを示した。
【０３８１】
＜３次元培養は胆管細胞成熟を促進する＞
ＯＰ９共培養において観察された分岐が、胆管発達の最初の段階を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、３次元細胞構造の成長を促進するための培養系を次いで確立した。このアプローチを用いて、２５日目ｈＥＳＣ由来細胞及びＯＰ９間質細胞（ＧＦＰ＋）からなるキメラ凝集体を、１．２ｍｇ／ｍｌのコラーゲン、４０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ並びにＨＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦｐｉからなる培地混合物中で培養した（図２３ａ）。これらの条件での培養２週間以内に、凝集体は、劇的な形態変化を経て、管状構造、管腔嚢胞又は両方の混合物のいずれかを形成した（図１６ａ、ｂ）。嚢胞は、これらの培養物中、最も豊富な構造であった（図１６ｂ）。Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５及びＨｅｙ１の発現は、ＯＰ９細胞を伴わない凝集体に由来するものと比較して、キメラ凝集体から発達した集団では上方制御され、これは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は培養物中で活性であることを示す（図２３ｂ）。組織学的解析は、管状及び嚢胞構造が、管腔を有する管形態を有し、ＣＫ１９＋及びＥ−カドヘリン＋を発現するがＡＬＢ−を発現しない上皮様細胞を含むことを示した。ＺＯ−１（密着帯１）、密着結合マーカーも発現され、構造の頂端側に制限されるとわかり、これは、細胞が頂底極性、成熟した上皮管の特徴を獲得したことを示唆する。管中の細胞はまた、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、成体胆管において最初に発現される膜貫通チャネルを発現した。ＺＯ−１と同様に、ＣＦＴＲタンパク質は、管様構造の頂端側で大部分検出された。ウエスタンブロット解析は、キメラ凝集体から生じた集団中のタンパク質の存在を確認した（図２３ｄ）。ＯＰ９を伴わずに培養された凝集体に由来する細胞では、ＣＦＴＲメッセージ及びタンパク質のレベルは、有意に低く、これは、その発現は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に応じて変わることを示す（図２３ｄ、ｅ）。これらの構造における、ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７を含めた肝マーカーの欠如並びに胆管細胞マーカーＣＫ１９、ＳＯＸ９及びＣＦＴＲの発現の上方制御が、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析によって確認された（図１６ｃ）。これらの条件下での培養後に、ｉＰＳＣ由来凝集体から、同様のＣＫ１９＋ＣＦＴＲ＋管状及び嚢胞構造が発達した。一緒に、これらの知見は、肝芽細胞集団は、ｍａｔｒｉｇｅｌ及びコラーゲンの混合物で培養された場合に、成熟胆管において見られるマーカーを発現する管様構造を生成し得るということを示す。
【０３８２】
ＧＳＩの添加は、管様構造及び嚢胞の形成を防ぎ、ＡＬＢ及び低レベルのＣＫ１９を発現する密な凝集体の発達を促進し（図１６ａ、ｂ  球形）、これは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の非存在下で、培養物中に肝芽細胞特徴を有する細胞が持続することを示唆する。ＧＳＩの添加はまた、肝細胞マーカー（ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７）の発現の増大並びに胆管細胞発達と関連している遺伝子（ＣＫ１９、Ｓｏｘ９及びＣＦＴＲ）の発現の減少につながった（図１６ｃ）。
【０３８３】
＜ｈＰＳＣ由来胆管細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで管様構造を形成する。＞
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｈＰＳＣ由来胆管細胞の発達潜在力を評価するために、本発明者らは、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ中のそれら（１０６個の細胞）を、免疫不全ＮＯＤ／重症複合免疫不全／ＩＬ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスの乳房脂肪パッド中に移植した。本発明者らは、これらの研究のために、ＨＥＳ２−ＲＦＰ  ｈＥＳＣに由来する２５日目肝芽細胞集団のＯＰ９間質との共培養によって生じた分岐構造に由来する解離された細胞を使用した。これらのｈＥＳＣを、ＲＯＳＡ遺伝子座からＲＦＰを発現するよう操作した９。移植の６〜８週間後、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグ中に複数の管様構造が検出された（図１７ａ、ｂ）。管内の細胞は、ＲＦＰ＋であり、これは、それらがヒト起源のものであり、ＨＥＳ２−ＲＦＰ細胞に由来したことを実証する（図１７ｃ、ｄ）。さらに、細胞はＣＫ１９及びＣＦＴＲを発現し、これは、それらが胆管細胞の特徴を示したことを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じた構造を用いて観察されたように、ＣＦＴＲ発現は、管の頂端側に分離した。移植された動物のいずれにおいても奇形腫は観察されなかった。
【０３８４】
＜ｈＰＳＣ由来胆管細胞様は機能的である＞
ｈＰＳＣ由来胆管細胞の機能を評価するための第１ステップとして、本発明者らは、ローダミン１２３、正常な胆管細胞中に存在するＭＤＲ１輸送体の機能活性を測定するために使用されるトレーサー色素を流出するその能力を評価した。Ｈ９  ｈＥＳＣ又はｉＰＳＣのいずれかに由来する嚢胞構造は、色素を管腔空間に輸送し、能動輸送体活性を示した。２０μＭベラパミル、ＭＤＲ輸送体の阻害剤の存在下では、ローダミンは、構造の管腔中に蓄積せず、色素の動きが、おそらくはＭＤＲ輸送体タンパク質による能動輸送を反映することを確認した。
【０３８５】
ＣＦＴＲ機能活性を実証するために、本発明者らは、嚢胞構造でフォルスコリン誘導性膨潤アッセイを次いで実施した。このアッセイを用いて、フォルスコリン／ＩＢＭＸの添加によるｃＡＭＰ経路の活性化は、ＣＦＴＲ機能を増大し、流体輸送及び嚢胞の膨潤をもたらした。膨潤は、カルセイングリーン、細胞透過性蛍光色素を用いて染色した後に可視化され得る（図１８ａ）。培養物へのフォルスコリン及びＩＢＭＸの添加は、２４時間後に測定された場合に、それぞれ、Ｈ９−及びｉＰＳＣ−由来嚢胞の大きさの２．０９＋／−０．２１及び２．６５＋／−３．１倍の増大を誘導した（図１８ｂ）。ＣＦＴＲ阻害剤（ＣＦＴＲｉｎｈ−１７２）の添加は、フォルスコリン／ＩＢＭＸ誘導性膨潤を防ぎ、これは、嚢胞の大きさの増大がＣＦＴＲ依存性であることを示す。これらのアッセイから得られた知見は、ｈＰＳＣ由来嚢胞／管様構造中の細胞が、肝胆管において見られる機能的胆管細胞の特性を示すことを実証する。
【０３８６】
＜嚢胞性線維症患者ｉＰＳＣからの胆管細胞の作製及び機能解析＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで疾患をモデル化するためのこの系の有用性を実証するために、本発明者らは、共通のＦ５０８欠失（例えば、δＦ５０８）を保持する２人の異なる嚢胞性線維症患者から作製したｉＰＳＣからの嚢胞形成を次いで解析した。両ｈｉＰＳＣ系は、野生型ｈＰＳＣについて観察されたものと同様の動態学を有する肝芽細胞集団を生成した（図２４ａ、ｂ）。肝芽細胞発達は変更されないが、２週間培養した後にゲル中に分岐構造のみが観察されたので、患者ｉＰＳＣからの嚢胞形成は明確に損なわれた（図１９ａ）。患者細胞からの嚢胞形成は、２週間の培養期間のうち最初の１週間のフォルスコリンの添加（変更）によって誘導され得る（図１９ａ、ｂ）。しかし、患者ｉＰＳＣから発達した嚢胞の多くは、完全には管腔ではないが、むしろ分岐管構造を含有していた（図１９ｃ）。正常なｉＰＳＣから発達したものに特有の高頻度の管腔嚢胞が、長期間の培養後に検出され、これは、突然変異体細胞の成熟が遅延されたことを示唆する。正常なｉＰＳＣ由来胆管細胞の培養物へのＣＦＴＲ阻害剤の添加はまた、嚢胞形成を遅延し、これは、これらの構造の生成は、ある程度、機能的ＣＦＴＲに応じて変わったことを示す（図１９ｂ）。
【０３８７】
本発明者らは、ＣＦＴＲ機能アッセイに先立って、化学矯正剤ＶＸ−８０９及びＣｏｒｒ−４ａを使用する２日間の嚢胞性線維症患者ｉＰＳＣに由来する胆管細胞様細胞におけるＦ５０８  ｄｅｌ  ＣＦＴＲの機能的回復を次いで評価した。両分子は、突然変異体ＣＦＴＲタンパク質のフォールディング欠陥を修正するよう機能する。矯正剤の添加は、嚢胞形成を改善しなかったが、管腔の頂端側での検出可能なレベルのＣＦＴＲの蓄積をもたらした。しかし、野生型嚢胞の管腔中のＣＦＴＲの均一分布とは異なり、タンパク質は、矯正剤を用いて処理された患者由来嚢胞では別個のパッチ中に現れた。このパターンは、突然変異体タンパク質の輸送欠陥の不完全な救済を反映する可能性がある。ウエスタンブロット解析は、矯正剤の添加の効果を示した。正常細胞中のＣＦＴＲの大部分は、図２０ａ中のレーンＨＢＥ中の上部のバンド（Ｃ）によって同定される、大きく、成熟した形態である。患者由来細胞は、かなり少ないＣＦＴＲタンパク質を含有しており、大部分は、小さい未熟な形態であった。矯正剤の添加は、患者細胞中の成熟したタンパク質の割合を劇的に増大させた。矯正剤がＣＦＴＲ機能に影響を及ぼすかどうかを調べるために、本発明者らは、次いで、処理された、及び処理されていない嚢胞を、フォルスコリン／ＩＢＭＸ誘導性膨潤アッセイに付した（図２０ｂ、ｃ）。患者特異的嚢胞は、矯正剤の非存在下では膨潤をほとんど示さなかった。しかし、矯正剤を添加した場合には、フォルスコリン／ＩＢＭＸ及びＶＸ７７０を用いて２４時間誘導した後に、患者Ｃ１から生じた嚢胞は、およそ２．１８＋／−０．５２倍増大したのに対し、患者９９７由来のものは、１．６４＋／−０．０８倍増大した。これらの知見は、総合すると、患者特異的ｉＰＳＣ由来胆管細胞におけるＣＦＴＲ機能不全の態様をモデル化することが可能であること及び患者を治療するために使用される矯正剤が欠陥を救済し得ることを示す。
【０３８８】
＜考察＞
ｈＰＳＣの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで管様構造に自己組織化する機能的胆管細胞様細胞への方向づけられた分化のための系が記載されている。
【０３８９】
マウス研究は、門脈間充織細胞とのＪａｇｇｅｄ１相互作用及び肝細胞でのＮｏｔｃｈ２を含めたＮｏｔｃｈ経路は、ｉｎ  ｖｉｖｏで胆管細胞の運命決定を誘導するために重要であると示唆した。
【０３９０】
ＯＰ９細胞によって提供されたＮｏｔｃｈシグナル伝達は、単層だけでなく、３次元ゲル培養物における運命の決定を成功裏に操作した。Ｇセクレターゼ阻害剤に加えてＮｏｔｃｈシグナル伝達が影響を受けた場合には、逆転効果が観察された。これまでの報告は、低い効率であるものの、ヒトＥＳ細胞から生成した胆管細胞様管構造は、極性及びローダミン１２３取り込みで機能を示すこととなった。
【０３９１】
ＯＰ９によって提供されたＮｏｔｃｈシグナル伝達は、ヒトＥＳ由来胆管細胞様細胞からの生着を促進し、細胞は、マウス乳房脂肪パッド中にＲＦＰ陽性管様構造を形成した。これらの構造は、ＯＰ９の非存在下では観察されなかった。総合すると、ＯＰ９共培養系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、ｎｏｔｃｈシグナル伝達を効率的に提供して、ヒトＰＳＣ由来肝芽細胞から胆管細胞様細胞を誘導する。
【０３９２】
ｈＰＳＣからの肝細胞成熟が、本明細書における３次元培養環境によって増強されると示される。同様に、胆管細胞系細胞の成熟もまた、３次元ゲル培養系によって促進された。肝芽細胞凝集体がＯＰ９細胞を介してＮｏｔｃｈシグナル伝達によって刺激されると、胆管細胞系統及び成熟と関連する遺伝子発現は、有意に増大した。さらに、胆管細胞としての機能活性がｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出された。
【０３９３】
ヒトｉＰＳ由来胆管細胞様管構造は、機能的ＣＦＴＲ活性を実証した。これらの細胞は、患者特異的な方法での薬物スクリーニングのために使用され得る。
【０３９４】
さらに、患者特異的胆管細胞様管構造は、効率的に得られ、一遺伝子性状態進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ１、２及び３型）及びアラジール症候群及びより一般的な、複雑な胆管疾患、胆道閉鎖及び原発性硬化性胆管炎などの他の重症胆管疾患において既存又は新規治療薬を検証するために使用され得る。
【０３９５】
本願を本明細書において好ましい例であると考えられるものを参照して記載したが、本願は開示される例に制限されないと理解されるべきである。対照的に、本願は、種々の改変及び同等の配置を対象とするものとする。
【０３９６】
すべての刊行物、特許及び特許出願が、参照によりその全文は、各個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照によってその全文が組み込まれるよう、具体的に、個別に示されるかのような同程度に、本明細書に組み込まれる。具体的には、表又は別の場所に提供される、例えば、受託番号及び／又はバイオマーカー配列（例えば、タンパク質及び／又は核酸）を含めた、本明細書において提供された各受託番号と関連している配列が、参照によりその全文が組み込まれる。
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６．  Ｈａｓｈｉｋｕｒａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｌｉｖｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  ｐａｔｉｅｎｔ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３４３，  １２３３−１２３４  （１９９４）．
７．  Ｍｉｒｏ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｌａｇｕｎｏ，  Ｍ．，  Ｍｏｒｅｎｏ，  Ａ．  ＆  Ｒｉｍｏｌａ，  Ａ．  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ＥＳＬＤ）：  ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （ＯＬＴ）？  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４４，  Ｓ１４０−１４５  （２００６）．
８．  Ｃａｉ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５，  １２２９−１２３９  （２００７）．
９．  Ｄｕａｎ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，  ３０５８−３０６８  （２００７）．
１０．  Ｈａｙ，  Ｄ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈＥＳＣｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ＡｃｔｉｖｉｎＡ  ａｎｄ  Ｗｎｔ３ａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，  １２３０１−１２３０６  （２００８）．
１１．  Ｂａｓｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６，  ９９０−９９９  （２００９）．
１２．  Ｄｕａｎ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８，  ６７４−６８６  （２０１０）．
１３．  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  ３２９−３３５  （２０１０）．
１４．  Ｔｏｕｂｏｕｌ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  １７５４−１７６５  （２０１０）．
１５．  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５５，  １１９３−１２０３  （２０１２）．
１６．  Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  ２９７−３０５  （２０１０）．
１７．  Ｓｉ−Ｔａｙｅｂ，  Ｋ．，  Ｌｅｍａｉｇｒｅ，  Ｆ．Ｐ．  ＆  Ｄｕｎｃａｎ，  Ｓ．Ａ．  Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １８，  １７５−１８９  （２０１０）．
１８．  Ｎｏｓｔｒｏ，  Ｍ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ＷＮＴ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，  ８６１−８７１  （２０１１）．
１９．  Ｇａｄｕｅ，  Ｐ．，  Ｈｕｂｅｒ，  Ｔ．Ｌ．，  Ｐａｄｄｉｓｏｎ，  Ｐ．Ｊ．  ＆  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．Ｍ．  Ｗｎｔ  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，  １６８０６−１６８１１  （２００６）．
２０．  Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＰ−４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４，  １４０２−１４１１  （２００６）．
２１．  Ｂｏｒｅｌ  Ｒｉｎｋｅｓ，  Ｉ．Ｈ．，  Ｔｏｎｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｈｅｅｈａ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，  Ｒ．Ｇ．  ＆  Ｙａｒｍｕｓｈ，  Ｍ．Ｌ．  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １，  ２８１−２９２  （１９９２）．
２２．  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｒ．Ａ．  ＆  Ｓｏａｍｅｓ，  Ａ．Ｒ．  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ：  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｎｏｎｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｆｕｎｄａｍ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２１，  １４９−１５８  （１９９３）．
２３．  Ｓａｒｇｉａｃｏｍｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２８，  ４８０−４９０  （１９９８）．
２４．  Ｍｉｋｉ，  Ｔ．，  Ｒｉｎｇ，  Ａ．  ＆  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７，  ５５７−５６８  （２０１１）．
２５．  Ｄａｎｋｅｌ，  Ｓ．Ｎ．，  Ｈｏａｎｇ，  Ｔ．，  Ｆｌａｇｅｎｇ，  Ｍ．Ｈ．，  Ｓａｇｅｎ，  Ｊ．Ｖ．  ＆  Ｍｅｌｌｇｒｅｎ，  Ｇ．  ｃＡＭＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８０３，  １０１３−１０１９  （２０１０）．
２６．  Ｂｅｎｅｔ，  Ｍ．，  Ｌａｈｏｚ，  Ａ．，  Ｇｕｚｍａｎ，  Ｃ．，  Ｃａｓｔｅｌｌ，  Ｊ．Ｖ．  ＆  Ｊｏｖｅｒ，  Ｒ．  ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  （Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ）  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４ａｌｐｈａ  （ＨＮＦ４ａｌｐｈａ）  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｏ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｂ６  （ＣＹＰ２Ｂ６）  ｇｅｎｅ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５，  ２８４５７−２８４７１  （２０１０）．
２７．  Ｂｅｌｌ，  Ａ．Ｗ．  ＆  Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｇ．Ｋ．  Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＮＦ−４ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＣＡＲ  ａｎｄ  ＰＸＲ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４，  １８６−１９４  （２００６）．
２８．  Ａｒｐｉａｉｎｅｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ＣＹＰ２Ａ５  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２３２，  １３５−１４１  （２００８）．
２９．  Ｓｔｉｅｇｅｒ，  Ｂ．，  Ｈｅｇｅｒ，  Ｍ．，  ｄｅ  Ｇｒａａｆ，  Ｗ．，  Ｐａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，  Ｇ．  ＆  ｖａｎ  Ｇｕｌｉｋ，  Ｔ．  Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６７５，  １−５  （２０１２）．
３０．  Ｈｕｅｔ，  Ｐ．Ｍ．  ＆  Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，  Ｊ．Ｐ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３，  ９１３−９１８  （１９８３）．
３１．  Ｈｉｎｅｓ，  Ｒ．Ｎ．  ＆  ＭｃＣａｒｖｅｒ，  Ｄ．Ｇ．  Ｔｈｅ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｒｕｇ−ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３００，  ３５５−３６０  （２００２）．
３２．  Ｎａｇａｍｏｔｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌ  ｓｈｅｅｔｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３３，  ４５２６−４５３４  （２０１２）．
３３．  Ｔａｋａｙａｍａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＨＮＦ４ａｌｐｈａ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０，  １２７−１３７  （２０１２）．
３４．  Ｔａｋａｙａｍａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＥＳＣｓ  ａｎｄ  ｉＰＳＣｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＳＯＸ１７  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ２１７８０  （２０１１）．
３５．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，  ２６７−２７２  （２０１１）．
３６．  Ｓｐｅｎｃｅ，  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７０，  １０５−１０９  （２０１１）．
３７．  Ｋｏｙａｍａ，  Ｔ．，  Ｅｈａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｏｈｓｈｉｍａ，  Ｎ．  ＆  Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｈ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ，  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ａｎｄ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １５，  １０９９−１１０７  （２００９）．
３８．  Ｒｉｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｆｏｕｒ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６，  ８３５−８４５  （２０１０）．
３９．  Ｍｏｎｔｏｌｉｕ，  Ｌ．，  Ｂｌｅｎｄｙ，  Ｊ．Ａ．，  Ｃｏｌｅ，  Ｔ．Ｊ．  ＆  Ｓｃｈｕｔｚ，  Ｇ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｎ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｆｕｎｄａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８，  １３８−１４６  （１９９４）．
４０．  Ｌｅｏｐｏｌｄ，  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １３，  １８９−１９７  （２００７）．
４１．  Ｌｉｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ／ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６，  ２６９−２７３  （２００８）．
４２．  Ｈｅｒｚｉｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣＲＥＢ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＰＧＣ−１．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，  １７９−１８３  （２００１）．
４３．  Ｌｉｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＧＣ−１ｂｅｔａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，  ３０８４３−３０８４８  （２００３）．
４４．  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｍ．，  Ｄ’Ｓｏｕｚａ，  Ｓ．Ｌ．，  Ｌｙｎｃｈ−Ｋａｔｔｍａｎ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｗａｎｔｚ，  Ｓ．  ＆  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０９，  ２６７９−２６８７  （２００７）．
４５．  Ｎｏｓｔｒｏ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｇ．Ｍ．  ＆  Ｇａｄｕｅ，  Ｐ．  Ｗｎｔ，  ａｃｔｉｖｉｎ，  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２，  ６０−７１  （２００８）．
４６．  Ｌｏｂｏｚ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｇｒｏｓｓ，  Ａ．Ｓ．，  Ｒａｙ，  Ｊ．  ＆  ＭｃＬａｃｈｌａｎ，  Ａ．Ｊ．  ＨＰＬＣ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｊｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ．  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８２３，  １１５−１２１  （２００５）．
４７．  Ｇａｇｎｅ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｍｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＵＧＴ１Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ  （ＳＮ−３８）．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６２，  ６０８−６１７  （２００２）．
４８．  Ｋｌｉｐｐｅｒ−Ａｕｒｂａｃｈ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｗｏ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ  ４５，  ４８６−４９０  （１９９５）．
４９．  Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，  Ｙ．，  Ｄｒａｉ，  Ｄ．，  Ｅｌｍｅｒ，  Ｇ．，  Ｋａｆｋａｆｉ，  Ｎ．  ＆  Ｇｏｌａｎｉ，  Ｉ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １２５，  ２７９−２８４  （２００１）．
５０．  Ｚｈａｎｇ，  Ｆ．  ＆  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ｙ．  ＨＯＭＥＲ：  ａ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２  Ｓｕｐｐｌ  １０，  Ｓ４  （２０１１）．
５１．  Ａｌｌｅｎ，  Ｊ．Ｗ．  Ｈａｓｓａｎｅｉｎ，  Ｔ  ＆  Ｂｈａｔｉａ  Ｓ．Ｎ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３４：４４７−４５５  （２００１）．
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５３．  Ｓａｔｏ，  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ＧＳＫ−３  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：５５−６３  （２００４）．
５４．  ＴＡＫＥＢＥ，  Ｔ  ＥＴ  ＡＬ．  ＶＡＳＣＵＬＡＲＩＺＥＤ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＨＵＭＡＮ  ＬＩＶＥＲ  ＦＲＯＭ  ＡＮ  ＩＰＳＣ−ＤＥＲＩＶＥＤ  ＯＲＧＡＮ  ＢＵＤ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴ．  ＮＡＴＵＲＥ  ４９９：４８１−４  （２０１３）．  
５５．  Ｙｕｓａ  ｅｔ  ａｌ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｙｒｐｓｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：  ３９１−６  （２０１１）．
５６．  Ｊｏｕｎｇ，  ＪＫ  ａｎｄ  Ｊｅｆｆｒｙ  Ｄ  Ｓａｎｄｅｒ  ＴＡＬＥＮｓ：  ａ  ｗｉｌｄｅｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １４：  ４９−５５  （２０１３）．
５７．  Ｒａｎ  ＦＡ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８：２２８１−２３０８  （２０１３）．
５８．  Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．  ＺＦＮ，  ＴＡＬＥＮ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡｓ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：  ３９７−４０５  （２０１３）．
【図１−１】
2019213538.tif 000002
【図１−２】
2019213538.tif 000003
【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
2019213538.tif 000007
【図５−１】
2019213538.tif 000008
【図５−２】
2019213538.tif 000009
【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
2019213538.tif 000013
【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
2019213538.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019213538.tif 000019
【図１４】
2019213538.tif 000020
【図１５】
2019213538.tif 000021
【図１６】
2019213538.tif 000022
【図１７】
2019213538.tif 000023
【図１８】
2019213538.tif 000024
【図１９】
2019213538.tif 000025
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系細胞を製造する方法であって、
（ａ）長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団を、ＦＧＦ受容体アゴニスト及びＢＭＰ４受容体アゴニスト及び／又はその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む特定化培地と、少なくとも４〜１０日間接触させることによって、長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団を特定化して、肝芽細胞を含む細胞集団を得るステップと、
（ｂ）前記肝芽細胞の成熟を誘導し、任意選択でさらなる系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップであって、
i. 前記肝芽細胞の集団を解離し、
ii. 前記解離した肝芽細胞の凝集体を作製し、
iii. 前記肝芽細胞の凝集体を、少なくとも、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及びその活性コンジュゲート及び／又は断片を含む、成熟培地で、任意にゼラチン状マトリックス中で培養して、肝臓細胞系及び／又は胆管細胞系細胞を生成することを含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉集団が、胚葉体（ＥＢ）において、又は単層中において、ｎｏｄａｌシグナル伝達経路アゴニストを含む内胚葉細胞誘導培地で、ヒトＥＳＣ（ｈＥＳＣ）又はヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）を培養して得られ、ここで誘導された内胚葉集団が、前記ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストと共に内胚葉細胞誘導の後少なくとも１〜８日間培養されて、長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉集団が製造される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成熟培地は、少なくとも肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉集団が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％のＣＸＣＲ４＋及びｃＫＩＴ＋陽性細胞、並びに／又は少なくとも７０％、７５％、８０％のＳＯＸ１７＋細胞を含み；
前記特定化するステップが、長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニスト（例えばアクチビン）で処理された誘導内胚葉集団を、ＦＧＦ及びＢＭＰ４を含む特定化培地と接触させるステップを含み、任意選択で、ＦＧＦが、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４又はそれらの組合せであり；
前記解離された肝芽細胞から製造された凝集体が、少なくとも７０％、８０％、８５％又は９０％のアルブミン陽性細胞を含み；そして／又は
成熟を誘導し、任意選択でさらに系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップが、前記凝集体の細胞内のｃＡＭＰ経路を活性化して、肝芽細胞の、肝細胞及び／又は胆管細胞への成熟を誘導するステップを含み、任意選択で、ｃＡＭＰ経路を活性化するステップが、前記凝集体を８−ブロモアデノシン−３’５”−環状一リン酸などのｃＡＭＰ類似体と接触させるステップを含む、
請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ａ．任意選択で、凝集の約１〜約１０日内に、例えば、凝集の６日内に、任意選択で、約２７〜約３６日培養した後に、前記凝集細胞においてｃＡＭＰ経路を活性化するか；
或いは
Ｂ．前記凝集体は、任意選択で、ＥＧＦ、ＴＧＦβ１及びＨＧＦ、ＨＧＦ及びＥＧＦ、或いはＨＧＦの存在下で、ｎｏｔｃｈアゴニスト、任意選択で、ＯＰ−９細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー及び任意選択で、ｃＡＭＰアゴニストも含む、成熟培地中で、約５日〜約９０日間培養され、任意選択で、凝集体を作製するステップの約１〜約１０日内に、例えば、凝集体を作製するステップの６日内に、任意選択で、約２０〜４０日培養した後に、ｎｏｔｃｈアゴニストを添加するステップ並びに／又はｎｏｔｃｈアゴニストがｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナー細胞である場合には、凝集体を共培養する；
ステップを含む方法。
【請求項６】
前記成熟培地が、成熟を誘導し、さらに系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．任意選択で、アルブミン＋／ＨＮＦ４＋前駆体集団の増殖を促進するＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ受容体アンタゴニストと組み合わせたＣＨＩＲ９９０２１などのｗｎｔ受容体アゴニスト、又は
ｂ．ｃＡＭＰ活性化ステップの間に添加され、ＣＹＰ酵素の発現を増強し、肝細胞前駆体の成熟を促進する、ＸＡＶ９３９及び／又はＭｅｋ／Ｅｒｋアンタゴニスト、例えば、ＰＤ０３２５９０１などのＷｎｔ受容体アンタゴニスト；好ましくはここで凝集細胞はＷｎｔ受容体アンタゴニスト及び任意選択でＴＧＦβ受容体アンタゴニスト（ＳＢ４３１５４２など）で約６日から約１２日、好ましくは約８日から約１０日、任意選択で約９日間処理される；
を含む、選択Ａを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記成熟培地が、成熟を誘導し、さらなる系統特定化及び／又は増殖を促進する１種又は複数の因子、任意選択で、
ａ．胆管細胞系統特定化を促進するＮｏｔｃｈアゴニスト、
ｂ．肝細胞系統特定化を促進するγ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）Ｌ６９５．４５８などのＮｏｔｃｈアンタゴニスト
を含む、選択Ａを含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記成熟培地が、ｎｏｔｃｈアゴニストを含む場合、ｃＡＭＰ活性化が除かれている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記成熟培地が、ｎｏｔｃｈアゴニストを含み、そして製造された肝細胞が、機能的肝細胞であり；
好ましくは、機能的肝細胞が、肝細胞及び／又は胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、
ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の発現及び／又は活性；及び／又は
ＡＬＢ、ＣＰＳ１、Ｇ６Ｐ、ＴＤＯ、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＮＡＴ２及びＵＧＴ１Ａ１からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現
が増大している、ことを含む；
請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的肝細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が、ＡＳＧＰＲ−１＋細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
成熟を誘導し、さらに系統特定化及び／又は増殖を誘導するステップ中に、ｎｏｔｃｈアゴニストを用いて細胞集団の凝集体を処理することによって、胆管細胞の運命が特定化され；
好ましくはｎｏｔｃｈアゴニストが、細胞、プラスチック、ＥＣＭ又はビーズなどの表面と結合しているｎｏｔｃｈリガンドを含み；
より好ましくはｎｏｔｃｈアゴニストが、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞などのｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーを含む；
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｎｏｔｃｈアゴニストが、ｎｏｔｃｈリガンドδ、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｊａｇｇｅｄ１ペプチド、又はＰｒｅｆ−１／ＤＬＫ−１／ＦＡ１から選択されるｎｏｔｃｈリガンドを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１３】
胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団を、ｎｏｔｃｈアゴニストと、少なくとも５日間又は約５〜約１４日間接触させて、胆管細胞前駆細胞の、胆管細胞、任意選択で、機能的胆管細胞へのさらなる系統特定化及び／又は成熟を誘導するステップを含む、請求項７、８、１１又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
製造された胆管細胞の集団が、肝細胞及び胆管細胞前駆細胞を含む細胞集団の細胞と比較して、及び／又はｎｏｔｃｈアゴニストで処理されていない凝集体から製造された集団細胞と比較して、
Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種のタンパク質の発現が増大している、及び／又は
Ｓｏｘ９、ＣＫ１９及びＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される少なくとも１種、少なくとも２若しくは３種の遺伝子の発現が増大している
機能的胆管細胞を含み、
任意選択で、胆管細胞の集団の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％が、ＣＫ１９＋胆管細胞及び／若しくはＣＦＴＲ＋胆管細胞である、請求項７、８、１１、１２又は１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＧＦ、ＴＧＦβ１及びＨＧＦ、ＨＧＦ及びＥＧＦ、或いはＨＧＦの存在下で、少なくとも５、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間、ｎｏｔｃｈシグナル伝達ドナーが、ＯＰ９、ＯＰ９δ及び／又はＯＰ９Ｊａｇｇｅｄ１細胞を含み、少なくとも１種の肝前駆細胞の、機能的胆管細胞への成熟を誘導する；
請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
機能的肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞集団を作製するインビトロの方法であって、
ａ．肝芽細胞、任意選択で、２５日目段階の肝芽細胞；肝細胞及び／又は胆管細胞を含む細胞の集団を、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法に従って製造するステップと、
ｂ．細胞の集団、任意選択で肝芽細胞を含む細胞の集団を、
１．任意選択で、キメラ凝集体で培養された、内皮細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋内皮細胞、任意選択で、胚性ＣＤ３４＋内皮細胞と共培養し、任意選択で、凝集体はゲル／マトリックス中に包埋され、機能的肝細胞を含む細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
細胞の集団が、内皮細胞と、少なくとも４日間、６日間、８日間、１０日間、１２日間、１５日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間若しくは９０日間共培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
凝集体がゲル／マトリックス中に包埋され、３次元培養される、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を濃縮又は単離するステップをさらに含み、
好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は最大約９５％の肝細胞及び／又は胆管細胞、
任意選択で、機能的肝細胞を含む、
請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れかに記載の、アゴニスト、アンタゴニスト、成熟因子、１種又は複数の細胞を増殖させるための培地及び容器の１種又は複数を含む、
長期ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び／若しくは製造するために使用されるキットであって、
任意選択で長期アクチビン／ｎｏｄａｌシグナル伝達アゴニストで誘導された内胚葉細胞集団から肝細胞及び／又は胆管細胞系統集団の細胞を増殖及び／若しくは製造するために使用される使用説明書を含む、キット。
【外国語明細書】
2019213538000001.pdf