(57)【要約】【課題】本明細書では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を改善するための組成物および方法が提供される。【解決手段】一部の実施形態では、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種ヌクレオチド配列、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含むように遺伝子改変されている。一部の実施形態では、宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロール−１−ホスファターゼである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼはＧＰＰ１／ＲＨＲ２である。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼはＧＰＰ２／ＨＯＲ２である。【選択図】図１
2019213558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２】
ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を
さらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３】
（ａ）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種
核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
【請求項４】
ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸をさらに含む、
請求項３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項５】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファ
ターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の遺
伝子改変宿主細胞。
【請求項６】
前記グリセロール−１−ホスファターゼが、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２
、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項５に記載の遺伝子改変宿
主細胞。
【請求項７】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、
請求項６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項８】
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、
請求項６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項９】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体
もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に
破壊されている、請求項６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１０】
イソプレノイドを産生することができる、請求項１から９までのいずれか一項に記載の
遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１１】
イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種ま
たは複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む、請求項１０に記載の
遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１２】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクター
ゼを含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１３】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてア
セトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１４】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡ
を縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主
細胞。
【請求項１５】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換す
る酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１６】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート５−ホスフ
ェートにリン酸化する酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項１７】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ホスフェートをメバロ
ネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主
細胞。
【請求項１８】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ピロホスフェートをイ
ソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿
主細胞。
【請求項１９】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸
キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼか
ら選択される、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２０】
前記ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、請求項１１に記載の
遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２１】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核
酸が単一の転写調節因子の制御下にある、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２２】
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核
酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞
。
【請求項２３】
イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭ
ＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１１に
記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２４】
ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成する
ことができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿
主細胞。
【請求項２５】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵
素をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２６】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前
記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネ
ンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−
ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジ
エンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネ
ソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシ
ンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、請求項２５に記
載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２７】
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テ
トラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、請求項
１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項２８】
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項１０に記載の遺伝子
改変宿主細胞。
【請求項２９】
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセ
ン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプ
レン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−
ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選
択される、請求項１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３０】
細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される
、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３１】
酵母細胞である、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３２】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項３１に
記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３３】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母
細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、請求項１から３２ま
でのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
【請求項３４】
イソプレノイドを産生するための方法であって、
（ａ）請求項１０から３３までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞の集団を、
炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養する
ステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。
【請求項３５】
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させる
ための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコード
する異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するス
テップ
を含む、方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）を
コードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡの産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．
８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するス
テップ
を含む、方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異
種核酸を発現させるステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファ
ターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、請求項３５から３８までのいずれか一項に記載
の方法。
【請求項４０】
前記グリセロール−１−ホスファターゼがＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、
ならびにその相同体およびバリアントから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、
請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体
もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に
破壊されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる
群から選択される、請求項３５から４３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項３５から４３までのいずれか一項に記載の方法
。
【請求項４６】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４５に
記載の方法。
【請求項４７】
前記宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破
壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来
化合物を産生する、請求項３５から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８００，３５６号
（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する
。
【０００２】
１．発明の分野
本開示は、工学的に操作された宿主細胞においてアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する
ための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）は、ポリケチド、脂肪酸、イソプレノイド、フェ
ノール類、アルカロイド、ビタミン、およびアミノ酸を含めた必須の生物学的化合物の合
成における重要な中間体である。アセチルＣｏＡに由来する代謝産物の中には、工業的に
有用な化合物を含めた一次代謝産物および二次代謝産物がある。酵母では、アセチルＣｏ
Ａはピルビン酸代謝で生合成される（図１）。しかし、この生合成経路では、ピルビン酸
カルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応によ
ってＣＯ２が失われる。工業的な発酵環境において、ピルビン酸代謝に対する代替物をも
たらし、解糖を減少させることの１つの利益は、ピルビン酸の脱カルボキシル化において
産生されるＣＯ２が減少し、したがって、最終産物においてより多くの炭素を捕捉し、そ
れにより、最大理論収量を上昇させることができることである。第２の利益は、産生され
るＮＡＤＨが減少し、したがって、それを再酸化するために必要な酸素が著しく減少する
ことである。これは、ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）とホスホアセチル
トランスフェラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）を併せて発現させることによって実
現することができる。
【０００４】
ＰＫおよびＰＴＡは、フルクトース−６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）またはキシルロース
−５−ホスフェート（Ｘ５Ｐ）がアセチルＣｏＡに変換される反応を触媒する。図１に示
されている通り、ＰＫにより、ペントースホスフェート中間体であるキシルロース（ｘｙ
ｕｌｏｓｅ）５−ホスフェートから、または、さらに上の解糖中間体であるＤ−フルクト
ース６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）から引き出される。ＰＫにより、Ｘ５Ｐがグリセルアル
デヒド３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）とアセチルホスフェートに分かれる、またはＦ６Ｐが
エリトロース４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）とアセチルホスフェートに分かれる。次いで、
ＰＴＡにより、アセチルホスフェートがアセチルＣｏＡに変換される。Ｇ３Ｐはさらに下
の解糖に再度入ることができ、Ｅ４Ｐはペントースホスフェート経路またはトランスアル
ドラーゼおよびトランスケトラーゼの非酸化的ペントースホスフェート経路ネットワーク
を通じた循環による解糖に再度入ることができる。
【０００５】
出願人らは、ＰＫ酵素およびＰＴＡ酵素を導入することで得ることができる異種性イソ
プレノイド産生の効率の改善について以前に記載した。その内容全体が参照により本明細
書に組み込まれる２０１２年１１月９日出願の米国特許出願第１３／６７３，８１９号（
現在は米国特許第８，４１５，１３６号）を参照されたい。特に、ネイティブな酵母代謝
ネットワークにおいて生じる化学反応のみを使用してグルコースから細胞質ゾル内アセチ
ルＣｏＡを合成する場合、メバロン酸経路によるグルコースからイソプレノイドであるフ
ァルネセンへの変換の可能性のある最大化学量論的収量は２３．６ｗｔ％である。アセト
アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）およびＮＡ
ＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより触媒される反応をメバロネート産生の代謝ネ
ットワークに含めることによって、理論的な最大化学量論的収量は２５．２ｗｔ％に改善
される。さらにＰＫおよびＰＴＡを導入することで、反応ネットワークは、最適な状態で
、２９．８ｗｔ％またはそれを超える質量収量に到達することができ、これは最大理論収
量の有意な上昇である。
【０００６】
Ｓｏｎｄｒｅｇｇｅｒらにより、キシロース利用酵母株におけるエタノール産生に関す
るＰＫおよびＰＴＡの利益についても記載されている。その内容全体が参照により本明細
書に組み込まれるＳｏｎｄｒｅｇｇｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ
ｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０巻（５号）：２８９２〜２８９７頁（２０
０４年）を参照されたい。Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性
キシロースレダクターゼおよびＮＡＤ＋依存性キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現
に起因する低エタノール収量に対処するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに異種ホスホ
ケトラーゼ経路（ＰＫ、ＰＴＡ、およびＡＤＡ）が導入された。この２つのオキシドレダ
クターゼ反応における補因子嗜好が異なることにより、還元された反応中間体であるキシ
リトールの広範囲にわたる蓄積、したがって、低エタノール収量として顕在化する嫌気性
レドックス平衡問題が引き起こされる。ホスホケトラーゼ経路を導入することによってレ
ドックス代謝の平衡化が行われ、それにより、エタノールに変換されるキシロース当たり
１つのＮＡＤＨの正味の再酸化が導かれ、エタノール収量が２５％改善される。しかし、
ＰＫの過剰発現によっても、アセテート蓄積の増大および発酵速度の低下が導かれる。ホ
スホケトラーゼ経路と、アセトアルデヒドをアセテートに変換するＡＬＤ６の変異を組み
合わせることによっていくらかのアセテート蓄積は減少させることができるが、組換えホ
スホケトラーゼ経路を通じたフラックスは、キシリトールおよびグリセロールの蓄積を完
全に排除するために必要になる最適なフラックスの約３０％であった。著者らにより、ホ
スホケトラーゼ経路に基づくアセテート形成を妨げるためにホスホトランスアセチラーゼ
および／またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのより高い活性が必要であり得ること
が示唆された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８，４１５，１３６号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｎｄｒｅｇｇｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年）７０巻（５号）：２８９２〜２８９７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、異種ＰＫ経路を導入することによりアセチルＣｏＡ由来化合物の収量の実
質的な改善を導くことができるが、その一方で、ＰＫおよびＰＴＡによる最適な炭素フラ
ックスを実現するために、この経路の実行のさらなる改善が必要であると思われる。本明
細書で提供される組成物および方法は、この必要性に対処し、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の概要
本明細書では、工業的に有用な化合物を産生するためのホスホケトラーゼ（ＰＫ）およ
びホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）の利用を改善するための組成物および方法が提
供される。これらの組成物および方法は、ホスホケトラーゼ経路に基づくアセテート蓄積
が、ＰＫ触媒作用の産物であるアセチルホスフェートの酵素により触媒される加水分解に
起因するという驚くべき発見に基づく。アセチルホスフェートの加水分解は、イソプレノ
イド、ポリケチド、および脂肪酸を含めたアセチルＣｏＡ由来の任意の種類の産物の産生
に、炭素の枯渇によって負の影響を及ぼし得る望ましくない副反応である。アセチルホス
フェート加水分解を触媒する宿主細胞内のネイティブな酵素を機能的に破壊することによ
り、アセテート蓄積が減少し、ＰＫ／ＰＴＡ経路を通じたアセチルＣｏＡ産生への炭素フ
ラックスが増大する。
【００１１】
本明細書で提供される組成物および方法は、さらに、アセチルホスフェートからアセテ
ートへの加水分解を触媒する酵母内のネイティブな酵素、すなわちＧＰＰ１／ＲＨＲ２、
およびそれと密接に関連するホモログであるＧＰＰ２／ＨＯＲ２の予想外の発見に基づく
。これらの酵素はどちらも、以前は単にグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１
．３．２１；あるいは「グリセロール−３−ホスファターゼ」と称される）活性を有する
と特徴付けられており、したがって、これらの酵素の無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ
）アセチル−ホスファターゼ活性は予想外のものである。ＰＫおよびＰＴＡを異種発現す
る細胞では、ＲＨＲ２をコードする遺伝子およびＨＯＲ２をコードする遺伝子の一方また
は両方を欠失させることにより、アセテート蓄積の減少が導かれ、ＲＨＲ２をコードする
遺伝子を単独で欠失させることにより、アセテートレベルの実質的な低下が導かれる。さ
らに、ＰＫ、ＰＴＡおよびメバロン酸経路を含むように工学的に操作された細胞において
ＲＨＲ２遺伝子を欠失させることにより、アセチルＣｏＡ由来イソプレノイドであるファ
ルネセンの産生が相当に増大する。
【００１２】
したがって、本明細書では、遺伝子改変宿主細胞および工業的に有用な化合物を産生す
るためのそれらの使用方法が提供される。一態様では、本明細書では、ホスホケトラーゼ
（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、およびアセチルホスフェートをア
セテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含む遺伝子改変宿主細胞が提供される。一
部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ
２．３．１．８）をコードする異種核酸をさらに含む。
【００１３】
別の態様では、本明細書では、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１
．８）をコードする異種核酸、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因
性酵素の機能的破壊を含む遺伝子改変宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、遺伝
子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核
酸をさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロー
ル−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセ
ロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２ＨＯＲ２、ならびにその
相同体およびバリアントからなる群から選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変宿
主細胞は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２の機能的破壊を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿
主細胞は、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の機能的破壊を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿
主細胞は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方の機能的破壊を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実
施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ネイティブなピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ
）−バイパスの１種または複数種の酵素の機能的破壊をさらに含む。一部の実施形態では
、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の酵素は、アセチルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣ
Ｓ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ６（ＡＬＤ６）から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生す
ることができる。一部の実施形態では、異種アセチルＣｏＡ由来化合物は、イソプレノイ
ド、ポリケチド、および脂肪酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子
改変宿主細胞は、イソプレノイドを産生することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロホスフェートを作製
するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または
複数種の異種核酸を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は
、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の
１種または複数種の酵素は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡ
を形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、
アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含
む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメ
バロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種
の酵素は、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む。一
部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ホスフェ
ートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、
ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペン
テニルピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種
または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロ
ン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される。一部の実
施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。
一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数
種の異種核酸は単一の転写調節因子の制御下にある。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の
１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸は多数の異種性転写調
節因子の制御下にある。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピ
ロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換する
ことができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変
宿主細胞は、ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物
を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、
遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形
成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形
成することができる酵素は、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシ
ンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネン
シンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンター
ゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシン
ターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃ
ｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンター
ゼからなる群から選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、イソプレノイドは、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、
トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選
択される。一部の実施形態では、イソプレノイドはセスキテルペンである。一部の実施形
態では、イソプレノイドは、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである。一部の実施形態では、
イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β
−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、
リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン
、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択され
る。
【００２０】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主
細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）
経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；ホスホケトラ
ーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードす
る異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能
的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファター
ゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態
では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もし
くはバリアントである。
【００２１】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主
細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）
経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；ホスホケトラー
ゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする
異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的
破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼ
は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態で
は、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしく
はバリアントである。
【００２２】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主
細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）
経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡ
シンテターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアル
デヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−
バイパスの少なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする
異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセ
ロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供さ
れる。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２
またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−
ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２３】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主
細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）
経路の１種または複数種の酵素であって、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含
む１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡシン
テターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−バイ
パスの少なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種
核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロー
ル−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される
。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２また
はその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホス
ファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２４】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主
細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）
経路の複数の酵素であって、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ
を含む複数の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡシンテターゼ
１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−バイパスの少
なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホ
スホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−
ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の
実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相
同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファター
ゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２５】
別の態様では、本明細書では、ポリケチドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞
であって、ポリケチド生合成経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数
種の異種核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチ
ラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（Ｅ
Ｃ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリ
セロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリア
ントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／Ｈ
ＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２６】
別の態様では、本明細書では、脂肪酸を産生することができる遺伝子改変宿主細胞であ
って、脂肪酸生合成経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種
核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（
ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１
．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール
−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントであ
る。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２ま
たはその相同体もしくはバリアントである。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、細菌細胞、真菌細
胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態で
は、細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２８】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変
換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏ
Ａ由来化合物（例えば、イソプレノイド、ポリケチド、または脂肪酸）を産生する。
【００２９】
別の態様では、本明細書では、異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生するための方法で
あって、本明細書に記載の異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生することができる遺伝子
改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記異種アセチルＣｏＡ由来化合物を作製
するのに適した条件下で培養するステップ、および前記異種アセチルＣｏＡ由来化合物を
培地から回収するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、異種アセチル
ＣｏＡ由来化合物は、イソプレノイド、ポリケチド、および脂肪酸からなる群から選択さ
れる。
【００３０】
別の態様では、本明細書では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ
由来化合物の産生を増大させるための方法であって、宿主細胞においてホスホケトラーゼ
（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップ、およびアセ
チルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップを含む
方法が提供される。一部の実施形態では、当該方法は、宿主細胞においてホスホトランス
アセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステッ
プをさらに含む。
【００３１】
別の態様では、本明細書では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡの産生を増大させるた
めの方法であって、宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３
．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、およびアセチルホスフェートを
アセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、当該方法は、宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．
１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む。
【００３２】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロー
ル−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセ
ロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにそ
の相同体およびバリアントから選択される。一部の実施形態では、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２ま
たはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態では、ＧＰＰ２
／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態で
は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同
体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方を機能的
に破壊する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細
胞、および植物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細
胞である。一部の実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅである。一部の実施形態では、宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変
換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏ
ＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、酵母宿主細胞における糖（グルコースおよびキシロース）からアセチルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡ由来化合物への変換に関与する経路の略図である。太い矢印は組換えホスホケトラーゼ経路を示す。アセチルホスフェートはアセチルＣｏＡへのホスホケトラーゼ（ＰＫ）／ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｋｌａｓｅ）（ＰＴＡ）経路の中間体であり、ＲＨＲ２およびＨＯＲ２によってアセテートに加水分解される。略語：Ｇ６Ｐ、グルコース−６−ホスフェート；Ｒ５Ｐ、リブロース−５−ホスフェート；Ｘ５Ｐ、キシルロース−５−ホスフェート；Ｆ６Ｐ、フルクトース−６−ホスフェート；Ｅ４Ｐ、エリトロース（ｅｒｙｈｔｒｏｓｅ）−４−ホスフェート；ＦＢＰ、フルクトース−１，６−ビスホスフェート（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；ＤＨＡＰ、ジヒドロキシアセトンホスフェート；Ｇ３Ｐ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート；ＰＥＰ、ホスホエノールピルベート；ＡＤＡ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化；ＡＣＰ、アセチルホスフェート。
【図２】図２は、イソプレノイド産生のためのメバロン酸経路の代表的な酵素を示す図である。略語：ＡｃＣｏＡ、アセチルＣｏＡ；ＡｃＡｃＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ；ＨＭＧＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ；Ｍｅｖ５Ｐ、メバロネート−５−ホスフェート；Ｍｅｖ５ＤＰ、メバロネート−５−ジホスフェート；ＩＰＰ、イソペンテニルジホスフェート；ＤＭＡＰＰ、ジメチルアリルピロホスフェート；Ｅｒｇ１０、アセチルＣｏＡチオラーゼ；ＡＣＣ１、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ；ＡＡＣＳ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ；Ｅｒｇ１３、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ；ＨＭＧｒ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ；Ｅｒｇ１２、メバロン酸キナーゼ；Ｅｒｇ８、ホスホメバロン酸キナーゼ；Ｅｒｇ１９、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｂは、野生型（Ｙ９６７株、左）、ならびに、異種アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、およびネイティブなＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含む組換え酵母細胞（Ｙ１２８６９株；中央）、ならびに異種ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）をさらに含む組換え酵母細胞（Ｙ１２７４６株；右）の糖消費（Ａ）およびアセテート産生（Ｂ）を示す図である。
【図３−２】図３Ｃ〜３Ｄは、異種アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、およびネイティブなＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含む組換え酵母細胞（Ｙ１２８６９株；左）、ならびに、異種ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）（Ｙ１９３９０株；中央）またはホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）をさらに含む組換え酵母細胞（Ｙ１９３９１株；右）の糖消費（Ｃ）およびアセテート産生（Ｄ）を示す図である。
【図４】図４は、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ９６７株の無細胞抽出物（ＣＦＥ）における、１２０分の時間経過にわたるアセチルホスフェート加水分解の実証を示す図である。ＣＦＥのみ（左）；ＣＦＥと、それに加えて、３０ｍＭの、広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤であるフッ化ナトリウム（中央）、および熱失活させたＣＦＥ（右）が示されている。
【図５】図５は、Ｙ９６７無細胞抽出物に対する陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）の０〜１００％勾配を３０カラム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いてタンパク質を溶出し、１ｍＬ画分を採取し、タンパク質ゲル電気泳動によって分析し（図５Ｂ）、アセチルホスファターゼ活性についてアッセイした（図５Ａ）。ＡＣＰ、アセチルホスフェート。
【図６】図６Ａは、Ｙ９６７の画分＃１０に対する陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。この精製による最も活性な画分であった＃１４を、質量分析によって分析して、画分中のタンパク質の同一性を決定した（図６Ｂ）。ＲＨＲ２を活性な画分中のホスファターゼとして同定した。
【図７】図７は、野生型酵母株（Ｙ９６８）、または、ＲＨＲ２の欠失、ＨＯＲ２の欠失もしくはＲＨＲ２とＨＯＲ２の両方の欠失を含む組換え酵母株のＣＦＥに対するアセチルホスファターゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、組換え酵母株集団のアセテートレベル（Ａ）、グリセロールレベル（Ｂ）および光学濃度（Ｃ）を示すグラフである。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２株はＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）、ホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）、およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現する。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２ｒｈｒ２＾株は、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２株と同質遺伝子型であるが、ＲＨＲ２の欠失をさらに含む（ｒｈｒ２＾）。
【図８−２】図８Ｄ〜８Ｅは、組換え酵母株集団のアセテートレベル（Ｄ）および光学濃度（Ｅ）を示すグラフである。Ｙ１２７４５株は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現する。Ｙ１２７４６ｒｈｒ２＾株はＹ１２７４６株と同質遺伝子型であるが、ＲＨＲ２の欠失をさらに含む（ｒｈｒ２＾）。
【図９】図９は、ＲＨＲ２遺伝子がインタクトであるか（ＲＨＲ２＋）、または欠失している（ｒｈｒ２−）組換え酵母株集団の相対的なファルネセンレベル（上）および相対的な光学濃度（下）を示す図である。Ｙ９６８（右側のパネル）は野生型酵母株である。Ｙ１２８６９．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２８６９」；右から２番目のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現するが、ホスホケトラーゼまたはホスホトランスアセチラーゼを発現しない。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２７４６」；左から２番目のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現し、ファルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するための経路としてホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用する。Ｙ１２７４５．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２７４５」；左側のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、ファルネセン産生経路内の遺伝子、ファルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するための経路としてホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
５．  実施形態の詳細な説明
５．１  用語
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、通常は天然に見いだされないもの
を指す。「異種ヌクレオチド配列」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見
いだされないヌクレオチド配列を指す。このように、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）そ
の宿主細胞に対して外来（すなわち、その細胞に対して「外因性」）であるもの；（ｂ）
宿主細胞において天然に見いだされる（すなわち、「内因性」である）が、細胞内に天然
ではない数量（すなわち、宿主細胞において天然に見いだされるよりも多いもしくは少な
い数量）で存在するもの；または、（ｃ）宿主細胞において天然に見いだされるが、その
天然の遺伝子座以外に位置するものであり得る。「異種酵素」という用語は、天然では所
与の細胞において通常は見いだされない酵素を指す。この用語は、（ａ）所与の細胞に対
して外因性である（すなわち、宿主細胞に天然では存在しないまたは宿主細胞の所与の状
況では天然には存在しないヌクレオチド配列によりコードされる）酵素；および（ｂ）宿
主細胞において天然に見いだされる（例えば、細胞に対して内因性のヌクレオチド配列に
よりコードされる酵素である）が、宿主細胞において天然ではない量（例えば、天然に見
いだされるよりも多いまたは少ない量）で産生される酵素を包含する。
【００３５】
他方では、「ネイティブ」または「内因性」という用語は、分子、特に酵素および核酸
に関して本明細書で使用される場合、それが由来するまたは天然に見いだされる生物体に
おいて発現する分子をその発現レベルとは関係なく示し、発現レベルはネイティブな微生
物におけるその分子の発現レベルよりも低くて、それと同等であっても、それよりも高く
てもよい。ネイティブな酵素またはポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物では改変さ
れ得ることが理解される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、例えば標的遺伝子、例えばＰＤＨ−バイパスの１種または
複数種の遺伝子の「機能を破壊する」または「機能の破壊」とは、標的遺伝子を、宿主細
胞において標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように変更するこ
とを意味する。一部の実施形態では、標的遺伝子の機能的破壊により、標的遺伝子の発現
レベルが、機能が破壊されていない場合のその発現と比較して少なくとも５％、１０％、
１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。同
様に、例えば標的タンパク質、例えばアセチルホスファターゼ活性を有するタンパク質の
「機能を破壊する」または「機能の破壊」とは、標的タンパク質を、宿主細胞においてタ
ンパク質の活性が低下するように変更することを意味する。一部の実施形態では、標的タ
ンパク質の機能的破壊により、標的タンパク質の活性または発現レベルが、機能が破壊さ
れていない場合のその活性または発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０
％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。一部の実施形態
では、宿主細胞における標的遺伝子によりコードされる標的タンパク質の活性が排除され
る。他の実施形態では、宿主細胞における標的遺伝子によりコードされる標的タンパク質
の活性が低下する。標的遺伝子の機能的破壊は、遺伝子の全部または一部を欠失させ、そ
の結果、遺伝子発現を排除するまたは低下させること、または遺伝子産物の活性を排除す
るまたは低下させることによって実現することができる。標的遺伝子の機能的破壊は、遺
伝子の調節エレメント、例えば、遺伝子のプロモーターを変異させ、その結果、発現を排
除するまたは低下させることによって、または、遺伝子のコード配列を変異させ、その結
果、遺伝子産物の活性を排除するまたは低下させることによっても実現することができる
。一部の実施形態では、標的遺伝子の機能的破壊により、標的遺伝子の完全なオープンリ
ーディングフレームが除去される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「親細胞」という用語は、改変宿主細胞に対して工学的に
操作された１つまたは複数の特定の遺伝子改変、例えば、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使
用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現、ＡＡＣＳの異種発現、ホスホケトラーゼの異
種発現、ホスホトランスアセチラーゼの異種発現、およびメバロン酸経路の１種または複
数種の酵素の異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含まない以外は
本明細書に開示されている遺伝子改変宿主細胞と同一の遺伝的背景を有する細胞を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「産生」という用語は、一般に、本明細書で提供される遺
伝子改変宿主細胞によって産生されるある量のイソプレノイドを指す。一部の実施形態で
は、産生は、宿主細胞によるイソプレノイドの収量で表される。他の実施形態では、産生
は、イソプレノイドの産生における宿主細胞の生産性で表される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「生産性」という用語は、経時的な（１時間当たり）宿主
細胞を培養する発酵培養液の量（体積）当たりの産生されたイソプレノイドの量（重量）
として表された、宿主細胞によるイソプレノイドの産生を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「収量」という用語は、宿主細胞により消費された炭素源
の量当たりの産生されたイソプレノイドの量として重量で表された、宿主細胞によるイソ
プレノイドの産生を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「アセチルＣｏＡ由来化合物」という句は、その生合成に
おいてアセチルＣｏＡを基質として使用する化合物を指す。例示的なアセチルＣｏＡ由来
化合物としては、これだけに限定されないが、イソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸、お
よびアルコールが挙げられる。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ由来化合物は、エタ
ノール、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２５
３，００１号に記載のペントース基質から産生されるバイオエタノールである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、具体的に列挙されている「
参照」ポリペプチド（例えば、野生型配列）とは、アミノ酸の挿入、欠失、変異、および
置換により異なるが、参照ポリペプチドと実質的に同様の活性を保持するポリペプチドを
指す。一部の実施形態では、バリアントは、変異誘発などの組換えＤＮＡ技法によって創
出される。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、その参照ポリペプチドとは
、１つの塩基性残基の別の塩基性残基での置換（すなわちＬｙｓのＡｒｇでの置換）、１
つの疎水性残基の別の疎水性残基での置換（すなわちＩｌｅのＬｅｕでの置換）、または
１つの芳香族残基の別の芳香族残基での置換（すなわちＴｙｒのＰｈｅでの置換）などに
より異なる。一部の実施形態では、バリアントは、参照配列の実質的な構造類似性がもた
らされる保存的置換が得られる類似体を含む。このような保存的置換の例としては、これ
だけに限定することなく、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換およびその逆；アスパ
ラギンのグルタミンでの置換およびその逆；トレオニンのセリンでの置換およびその逆；
アルギニンのリシンでの置換およびその逆；または、イソロイシン、バリンまたはロイシ
ンのいずれかの互いでの置換が挙げられる。
【００４３】
５．２  宿主細胞
本明細書で提供される組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核
生物細胞、または真核細胞が挙げられる。
【００４４】
適切な原核生物宿主としては、これだけに限定されないが、種々のグラム陽性細菌、グ
ラム陰性細菌、またはグラム不定細菌のいずれかが挙げられる。例としては、これだけに
限定されないが、以下の属に属する細胞が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａ
ｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈ
ｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｃｅｎ
ｅｄｅｓｍｕｎ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ、
Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ。原核
生物株の例としては、これだけに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈ
ｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、およびＳ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが挙げられる。特定の実施形態では、宿主細
胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。
【００４５】
適切な古細菌宿主としては、これだけに限定されないが、以下の属に属する細胞が挙げ
られる：Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ。古細菌株の例としては
、これだけに限定されないが、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、
Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅ
ｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａ
ｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂ
ｙｓｓｉ、およびＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘが挙げられる。
【００４６】
適切な真核生物宿主としては、これだけに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫
細胞、および植物細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本方法において有用な酵母と
して、微生物受託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されており、とりわけ、以
下の属に属する酵母が挙げられる：Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏ
ｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖ
ｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂ
ｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄ
ａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙ
ｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐ
ｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐ
ｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉ
ｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐ
ｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏ
ｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋ
ｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、
Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、
Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈ
ｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗ
ａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈ
ｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒ
ｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌ
ｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓ
ｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈ
ｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔ
ｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉ
ｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕ
ｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ
ｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、
Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇ
ｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａ。
【００４７】
一部の実施形態では、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐ
ｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  
ｌａｃｔｉｓ（以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと称されていた）、Ｋ
ｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａ
ｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ  ａｎｇ
ｕｓｔａとして公知である）である。一部の実施形態では、宿主微生物は、Ｃａｎｄｉｄ
ａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄ
ｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣ
ａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属の株である。
【００４８】
特定の実施形態では、宿主微生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅである。一部の実施形態では、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、
ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ−１９０４、
ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、Ｖ
Ｒ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、
ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、およびＡＬ−１からなる群から選択される、Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。一部の実施形態では、宿主微生物
は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、およびＳＡ−１からなる群
から選択される、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定
の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＰＥ−２で
ある。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
株はＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅの株はＢＧ−１である。
【００４９】
一部の実施形態では、宿主微生物は、工業的発酵に適した微生物である。特定の実施形
態では、微生物を、工業的発酵環境のストレス条件と認識される高溶媒濃度、高温、基質
利用の拡大、栄養分の制限、糖および塩に起因する浸透ストレス、酸味、亜硫酸塩および
細菌コンタミネーション、またはこれらの組合せの下で生存するのに適当な状態にする。
【００５０】
５．３  アセチルＣｏＡへのホスホケトラーゼ（ＰＫ）／ホスホトランスアセチラーゼ
（ＰＴＡ）経路
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞におけるホスホケトラ
ーゼ経路は、細胞を、ホスホケトラーゼ、および任意選択でホスホトランスアセチラーゼ
をコードするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現するように工学的に操
作することよって活性化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供され
る遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種
ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態、特に、ホスホケトラーゼ活性とは関係なく、ア
セチルホスフェートを代謝中間体として供給することができる実施形態では、本明細書で
提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される
遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポ
リヌクレオチドと、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
異種ポリヌクレオチドの両方を含む。
【００５１】
５．３．１  ホスホケトラーゼ（ＰＫ）
ホスホケトラーゼ（ＥＣ４．１．２．９）により、キシルロース５−ホスフェートから
グリセルアルデヒド３−ホスフェートおよびアセチルホスフェートへの変換；ならびに／
またはフルクトース−６−ホスフェートからエリトロース−４−ホスフェートおよびアセ
チルホスフェートへの変換が触媒される。ホスホケトラーゼ活性は、キシロースを唯一の
炭素源として用いて成長するいくつかの酵母株において同定されているが、グルコースを
用いて成長する酵母株では同定されていない（ＥｖａｎｓおよびＲａｔｌｅｄｇｅ、Ａｒ
ｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３９巻：４８〜５２頁；１９８４年）。ホスホケトラ
ーゼの阻害剤としては、これだけに限定されないが、エリトロース４−ホスフェートおよ
びグリセルアルデヒド３−ホスフェートが挙げられる。
【００５２】
ホスホケトラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの多
数の例が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞に使用する
ことができる。一部の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／また
はポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ  ＭＤ３６３のキシ
ルロース５−ホスフェートケトラーゼ（ＸｐｋＡ）である（Ｐｏｓｔｈｕｍａら、Ａｐｐ
ｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８巻：８３１〜７頁；２００２年）
。ＸｐｋＡは、乳酸菌におけるホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）の中心的な酵素であり、
４．４５５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの特異的活性を示す（Ｐｏｓｔｈｕｍａら、Ａｐｐｌ
．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８巻：８３１〜７頁；２００２年）。
他の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは
、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのホスホケトラーゼであり（Ｌ
ｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２７巻（１２号）；８５３〜８５８頁（２
００５年））、これは９．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの特異的活性を示し、４．５を超え
るｐＨで安定である（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９巻：
５１５〜５２０頁；１９６６年）。このホスホケトラーゼは、Ｄ−キシルロース５−ホス
フェートに対しては４．７ｍＭのＫｍを示し、フルクトース６−ホスフェートに対しては
２９ｍＭのＫｍを示す（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９巻
：５１５〜５２０頁；１９６６年）。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄ
ｅｓの代表的なホスホケトラーゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＹ８０４１９０
、および本明細書で提供される配列番号１が挙げられる。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅ
ｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの代表的なホスホケトラーゼタンパク質配列としては、受託番号
ＹＰ＿８１９４０５、ＡＡＶ６６０７７．１、および本明細書で提供される配列番号２が
挙げられる。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポ
リペプチドは、例えば、Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒら（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７０巻：２８９２〜７頁；２００４年）によるペントース代謝性Ｓ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に記載されているＢ．ｌａｃｔｉｓ由来のＤ−キシルロース５
−ホスフェート／Ｄ−フルクトース６−ホスフェートホスホケトラーゼ遺伝子ｘｆｐであ
る。
【００５３】
他の有用なホスホケトラーゼとしては、これだけに限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７６７８（ＡＢＩＸ０２０００００２．
１：２３５０４００．．２３５２８７７；ＥＤＴ４６３５６．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ（ＮＣ＿０１７８３４．１：１１２７５８０．．１１３
００５７；ＹＰ＿００６２８０１３１．１）；およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  
ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ（ＡＹ５１８２１６．１：９８８．．３４６５；ＡＡＲ９８７
８８．１）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４（ＣＢＦ７６
４９２．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（ＡＡＲ９８７８７．１
）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＩＭＢ  ４１１７１（ＺＰ
０３６４６１９６．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕ
ｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９（ＺＰ  ０２９６２８７０．１）；Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１（ＮＰ＿７８６０６０．１）；Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ
２７３０５（ＺＰ＿０３９４０１４２．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔ
ｅｒｉ  １００−２３（ＺＰ＿０３０７３１７２．１）；およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ
８２９３（ＹＰ＿８１８９２２．１）に由来するものが挙げられる。
【００５４】
他の有用なホスホケトラーゼとしては、その内容全体が参照により本明細書に組み込ま
れる国際公開第ＷＯ２０１１／１５９８５号に記載されているものが挙げられる。これら
のホスホケトラーゼとしては、（ＹＰ＿００１６０１８６３．１；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  Ｐａｌ  ５）、（ＹＰ＿００１０９３
２２ｌ．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ  ＰＶ−４）、（ＹＰ＿９２６７９
２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ  ＳＢ２Ｂ）、（ＹＰ＿７３５
０９３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＭＲ−４）、（ＹＰ＿００１０４９４３９
．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＯＳ１５５）、（ＺＰ＿０２１５７８８
４．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂｅｎｔｈｉｃａ  ＫＴ９９）、（ＹＰ＿００１４７２
９２５．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）、（ＹＰ＿
００１７５９６６９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｗｏｏｄｙｉ  ＡＴＣＣ  ５１９０８
）、（ＹＰ＿００１６７３３５２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉ
ｓ  ＨＡ  Ｗ−ＥＢ４）、（ＹＰ＿５６３７３３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｄｅｎｉ
ｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＯＳ２１７）、（ＺＰ＿０５１１１６９７．１；Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ  ｄｒａｎｃｏｕｒｔｉｉ  ＬＬＡＰ  １２）、（ＥＥＱ８４３０７．１；Ａｊｅｌ
ｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ  ＥＲ−３）、（ＸＰ＿００２６２６７３４
．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ  ＳＬＨ１４０８１）、（Ｘ
Ｐ＿００１５３９００９．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＮＡｍ
１）、（ＥＥＨ０４１３３．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｇ１
８６ＡＲ）、（ＥＥＨ２０２５８．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉ
ｌｉｅｎｓｉｓ  Ｐｂ０３）、（ＥＥＨ４４６５２．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄ
ｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｐｂ  １８）、（ＸＰ＿００２５８２７５２．１；Ｕ
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２１）、（ＺＰ＿０５０２７０７８．１；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌ
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ｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＩＭＢ  ４１１７１）、（ＺＰ＿０４４４８１０１．１；Ｂｉｆｉｄ
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ＡＲ  １７２）、（ＡＡＲ９８７８９．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｌｌ
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ｉｓ  ＡＴＣＣ  １４０１９）、（ＺＰ＿０５９６５２０１．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔ
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Ｏ’）、（ＥＥＳ５３２０４．１；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｅｒｒｏｄｉａｚ
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ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  Ａ
ＴＣＣ  １１８４２）、（ＺＰ＿０３９５５９１７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  
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１；Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１６３）、（ＮＰ＿７８６
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ｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＹＰ＿８０３８９１．１
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Ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２７３０５）、（ＺＰ＿０４００９２７３．１；Ｌ
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６Ｄ１）、（ＺＰ＿０４６０１９０６．１；Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ
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ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ｓｔｒ．  Ｃｈａｌｌｉｓ  ｓｕｂｓｔｒ．  Ｃ
ＨＩ）、（ＮＰ＿７３６２７４．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａ
ｅ  ＮＥＭ３１６）、（ＺＰ＿０４４４２８５４．１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ  
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ｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＥＧ２）、（ＺＰ＿０５６７５３０７．１；Ｅｎ
ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ｃｏｍ１２）、（ＢＡＨ６９９２９．１；Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＰＧ  １８）、（ＹＰ＿００２０００００６
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、（ＮＰ＿７８６７５３．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣ
ＦＳ  １）、（ＺＰ＿０４００９９７６．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖ
ａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  １１７４１）、（ＹＰ＿８１８９２２．１；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴ
ＣＣ  ８２９３）、（ＹＰ＿７９４６６９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖ
ｉｓ  ＡＴＣＣ  ３６７）、（ＺＰ＿０４７８２５５３．ｌ；Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｐａ
ｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ３３３１３）、（ＹＰ＿００１７２７４５
４．１；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＫＭ２０）、（ＹＰ＿８１９４０５
．１；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｓｅ
ｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３）、（ＡＢＸ７５７７２．ｌ；Ｌａｃｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ  １ａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｌａｃｔｉｓ）、（ＹＰ＿８１１３１４．１；
Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ  ＰＳＵ−１）、（ＺＰ＿０２９５１１９１．１；Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ５５２１）、（ＺＰ＿０５３９０２９４．１
；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７）、（ＮＰ＿３４７
９７１．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２
４）、（ＺＰ＿０３８００２９６．１；Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｍｅｓ  ＡＴＣＣ
２７７５８）、（ＺＰ＿０４８５７６２４．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  
５＿１＿３９Ｂ  ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０４７４３０２９．２；Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎ
ｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｌ  １−８２）、（ＺＰ＿０２０３８２７１．１；Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９７９９）、（ＸＰ＿００２１８０５
４２．１；Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｍｕｔｕｍ  ＣＣＡＰ  １０５５／
１）、（ＹＰ＿５６８６３０．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａ１ｕｓｔｒ
ｉｓ  ＢｉｓＢ５）、（ＹＰ＿４８７４６２．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  
ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＨａＡ２）、（ＮＰ＿９４７０１９．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９）、（ＹＰ＿５３３６６０．１；Ｒｈｏ
ｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ１８）、（ＹＰ＿９７３５
１２．１；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＪ２）、
（ＺＰ＿０１４６４１９１．１；Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＤＷ
４／３−１）、（ＹＰ＿００１２６７７７８．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄ
ａ  Ｆｌ）、（ＹＰ＿８２９６４４．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＦＢ２４
）、（ＹＰ＿００２４８６３９２．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅ
ｎｏｌｉｃｕｓ  Ａ６）、（ＺＰ＿０５８１６６５１．１；Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ  
ｋｅｄｄｉｅｉｉ  ＤＳＭ  １０５４２）、（ＹＰ＿００２８８３０５３．１；Ｂｅｕｔ
ｅｎｂｅｒｇｉａ  ｃａｖｅｍａｅ  ＤＳＭ  １２３３３）、（ＹＰ＿００３１６１５４
０．１；Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３）、（ＺＰ
＿０３９１１４８２．１；Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  
ＤＳＭ  １５８９４）、（ＣＡＪ５７８５０．１；Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖ
ｉｇｅｎａ）、（ＹＰ＿００１１３４６０５．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌ
ｖｕｍ  ＰＹＲ−ＧＣＫ）、（ＹＰ  ９５３８７７．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  
ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ  ＰＹＲ−ｌ）、（ＹＰ＿００３１５５６１１．１；Ｂｒａｃｈ
ｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＤＳＭ  ４８１０）、（ＹＰ＿００３１４８１
２７．１；Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ２０５４７）、（
ＹＰ＿００１２２１１６８．１；Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ
ｓｕｂｓｐ．  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ＮＣＰＰＢ  ３８２）、（ＹＰ＿００１
１５８４２６．１；Ｓａ１ｉｎｉｓｐｏｒａ  ｔｒｏｐｉｃａ  ＣＮＢ−４４０）、（Ｙ
Ｐ＿００１５３６４２０．１；Ｓａ１ｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏ１ａ  ＣＮＳ−
２０５）、（ＺＰ＿０４６０８３０２．１；Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．  Ａ
ＴＣＣ  ３９１４９）、（ＹＰ＿８８７９１４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍ
ｅｇｍａｔｉｓ  ｓｔｒ．  ＭＣ２  １５５）、（ＹＰ＿６３９９５６．１；Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＭＣＳ）、（ＺＰ＿０４７４９１５７．１；Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ  ＡＴＣＣ  １２４７８）、（ＹＰ＿００１８５１０３
９．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍＭ）、（ＮＰ＿９６０５０７．１
；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ  Ｋ−１０）、（ＺＰ＿０５２２４３３０．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ１ａｒｅ  ＡＴＣＣ  １３９５０）、（ＹＰ＿００１７０３２４０
．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、（ＺＰ＿００９９５１３３
．
１；Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＨＴＣＣ２６４９）、（ＹＰ＿２９１０２６．１；
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ）、（ＺＰ＿０４０３１８４５．１；Ｔｈ
ｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ  ＤＳＭ  ４３１８３）、（ＺＰ＿０４４
７５５１４．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０
２１）、（ＺＰ＿０４３３５６４１．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉ
ｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１）、（ＺＰ＿
０４４８２２０１．１；Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ  ＤＳ
Ｍ  ４４７２８）、（ＹＰ＿００３０９９７１２．１；Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍ
ｉｒｕｍ  ＤＳＭ  ４３８２７）、（ＮＰ＿７３３５０８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））、（ＣＡＪ８８３７９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３８７７）、（ＺＰ＿０５５３６８８
３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００）、（Ｚ
Ｐ＿０５０２０４２１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２
９０８３）、（ＣＢＧ６７６２５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８
７．２２）、（ＮＰ＿８２２４４８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉ
ｌｉｓ  ＭＡ−４６８０）、（ＺＰ＿０４６８９５４７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １４６７２）、（ＺＰ＿０５５３００２１．１；Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６）
、（ＺＰ＿０５５１２５０１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３６５３）、（ＺＰ＿０５８００９２７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ  ｆｌａｙｏｇｒｉｓｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３３３１）、（ＹＰ＿００１８２８２７
５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒｉｓｅｕｓ  
ＮＢＲＣ  １３３５０）、（ＺＰ＿０４７０５４９３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  
ａｌｂｕｓ  ＪＩ０７４）、（ＺＰ＿０４９９６９６３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．  Ｍｇｌ）、（ＺＰ＿０５４８５３０９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ
．  ＳＰＢ７８）、（ＺＰ＿０３８６０８８２．１；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ  ｆｌａｙｉｄ
ａ  ＤＳＭ  １７８３６）、（ＹＰ＿１１７５３９．１；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉ
ｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２）、（ＹＰ＿００１５０５５５６．１；Ｆｒａｎｋｉａ  
ｓｐ．  ＥＡＮｌｐｅｃ）、（ＹＰ＿４８２６２７．１；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  Ｃｃ
Ｉ３）、（ＹＰ＿００３１１６８９３．１；Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐ
ｈｉｌａ  ＤＳＭ  ４４９２８）、（ＹＰ＿８７２２８０．１；Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕ
ｓ  ｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｌＩＢ）、（ＹＰ＿９２４８０７．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄ
ｅｓ  ｓｐ．  ＪＳ６１４）、（ＹＰ＿００１１０４１５７．１；Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏ
ｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ  ２３３８）、（ＹＰ＿００２２８２６
７３．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｙ．  ｔｒｉｆｏｌｉ
ｉ  ＷＳＭ２３０４）、（ＹＰ＿００２９７７２５６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇ
ｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｙ．  ｔｒｉｆｏｌｉｉ  ＷＳＭ１３２５）、（ＹＰ＿００１
９７９７９６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＩＡＴ  ６５２）、（ＹＰ＿４７
０９２６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＦＮ  ４２）、（ＹＰ＿００２５４０
６３３．１；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  Ｋ８４）、（ＺＰ
＿０５１８２３６６．１；Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．  ８３／１３）、（ＺＰ＿０４６８
３３８４．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＬＭＧ  ３３０１
）、（ＹＰ＿００１３７３２５４．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ  
ＡＴＣＣ  ４９１８８）、（ＹＰ＿００１２０４１０９．１；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉ
ｕｍ  ｓｐ．  ＯＲＳ２７８）、（ＹＰ＿００１２３８４１８．ｌ；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＴＡｉｌ）、（ＮＰ＿７６９１５８．１；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＹＰ＿５７７１６４．１；Ｎｉ
ｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ  Ｘ１４）、（ＹＰ＿００２９６１６１
２．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ  １）、（Ｙ
Ｐ＿６７４７９２．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＮＣＩ）、（ＺＰ＿０
５８１３６１７．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ  ＷＳ
Ｍ２０７５）、（ＹＰ＿３１８５５９．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄ
ｓｋｙｉ  Ｎｂ−２５５）、（ＹＰ＿００１７５５２８０．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＪＣＭ  ２８３１）、（ＹＰ＿００１７５３
１１９．ｌ；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＪＣＭ
２８３１）、（ＹＰ＿００３０６６０１１．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  
ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＤＭ４）、（ＹＰ＿００２９６４７７７．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ  １）、（ＹＰ＿００２５０１２９２．
１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕ１ａｎｓ  ＯＲＳ  ２０６０）、（Ｙ
Ｐ＿００２４９５２６５．１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕ１ａｎｓ  
ＯＲＳ  ２０６０）、（ＹＰ＿００１７７０３８７．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ  ｓｐ．４−４６）、（ＹＰ＿００２９４４７１２．１；Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐ
ａｒａｄｏｘｕｓ  Ｓ１１０）、（ＺＰ＿０１１５６７５７．１；Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ
ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ  ＨＴＣＣ２５１６）、（ＺＰ＿０１６２８７８７．１；Ｎｏｄ
ｕ１ａｒｉａ  ｓｐｕｍｌｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４）、（ＹＰ＿００１８６５５４６．
１；Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２）、（ＹＰ＿３２１０
１５．１；Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉ１ｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３）、（ＺＰ
＿０３７６９１４０．１；Ｎｏｓｔｏｃ  ａｚｏｌｌａｅ’  ０７０８）、（ＮＰ＿９２
３９４３．１；Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏ１ａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１）、（
ＹＰ＿４７７３８５．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．  ＪＡ−２−３Ｂ’ａ（２
−１３））、（ＹＰ＿００１３２８６５９．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｄｉ
ｃａｅ  ＷＳＭ４１９）、（ＹＰ＿７６５６７０．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍ
ｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．  ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）、（ＮＰ＿３８４２１２．２；Ｓ
ｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１）、（ＺＰ＿０２９２８４５５
．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  ４１３６）、（
ＹＰ＿００１６３７５３９．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅ
ｎｓ  Ｐａｌ）、（ＺＰ＿０１０４５８２５．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｎ
ｂ−３１１Ａ）、（ＺＰ＿０２７３６６０２．１；Ｇｅｍｍａｔａ  ｏｂｓｃｕｒｉｇｌ
ｏｂｕｓ  ＵＱＭ  ２２４６）、（ＹＰ＿００３１５７８７１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉ
ｃｒｏｂｉｕｍ  ｂａｃｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ４０２８）、（ＺＰ＿０３６３１３０４
．１；ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｅｌｌｉｎ５１４）、（ＺＰ＿０４５７７５５８．１；Ｏｘ
ａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ  ＨＯｘＢＬＳ）、（ＺＰ＿０４５７９７１
２．１；Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ  ＯＸＣＣ１３）、（ＹＰ＿８
２６１６９．１；Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ｕｓｉｔａｔｕｓ  Ｅｌｌｉｎ６０７６）、（
ＹＰ＿００２０１８７５３．１；Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ  ｐｈａｅｏｃｌａｔｈｒａｔ
ｉｆｏｒｍｅ  ＢＵ−１）、（ＹＰ＿００２０１６２８５．１；Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈ
ｌｏｒｉｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ  ＤＳＭ  ２７１）、（ＹＰ＿００１９４３３６９．１
；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  ＤＳＭ  ２４５）、（ＮＰ＿６６２４０９
．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ＴＬＳ）、（ＺＰ＿０１３８６１７９．
１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  １３０３１）、（ＹＰ
＿３７５４２２．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍ  ＤＳＭ  ２７３）、（
ＹＰ＿２８５２７７．１；Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ＲＣＢ）
、（ＹＰ＿３１４５８９．１；Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
ＡＴＣＣ  ２５２５９）、（ＹＰ＿５４５００２．１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ  ＫＴ）、（ＮＰ＿８４２１３９．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏ
ｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ  １９７１８）、（ＹＰ＿７４８２７４．１；Ｎｉ
ｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｃ９１）、（ＹＰ＿４１１６８８．１；Ｎｉ
ｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５１９６）、（ＹＰ＿３
４４７００．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７）
、（ＹＰ＿００７００４．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ  
ａｍｏｅｂｏｐｈｉ１ａ  ＵＷＥ２５）、（ＮＰ＿４３５８３３．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１）、（ＺＰ＿０４４２１８７４．１；Ｓｕｌｆ
ｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｄｅ１ｅｙｉａｎｕｍ  ＤＳＭ  ６９４６）、（ＮＰ＿１０
７０５４．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９）、（Ｙ
Ｐ＿００２２８９７９７．１；Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎ
ｓ  ＯＭ５）、（ＹＰ＿００１８３３３１２．ｌ；Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉ
ｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｄｉｃａ  ＡＴＣＣ  ９０３９）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なホスホケトラーゼとして
は、本明細書に記載のホスホケトラーゼのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げら
れる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のホスホケト
ラーゼのいずれかと実質的な相同性を共有し、かつ、（２）Ｘ５Ｐからグリセルアルデヒ
ド３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）およびアセチルホスフェートへの変換；またはＦ６Ｐから
エリトロース４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）およびアセチルホスフェートへの変換を触媒す
ることができる。ホスホケトラーゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がホスホケトラー
ゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましく
は少なくとも９５％同じであれば、ホスホケトラーゼと「実質的な相同性」を共有すると
いえる。
【００５６】
５．３．２  ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスア
セチラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ホスホトランスアセチラーゼ（Ｅ
Ｃ２．３．１．８）により、アセチルホスフェートがアセチルＣｏＡに変換される。
【００５７】
ホスホトランスアセチラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペ
プチドの多数の例が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞
に使用することができる。一部の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子お
よび／またはポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のホスホ
トランスアセチラーゼである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの代表的なホ
スホトランスアセチラーゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００９７０６．１
：１４２８５５４．．１４２９５５５、および本明細書で提供される配列番号３が挙げら
れる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの代表的なホスホトランスアセチラー
ゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１３９４７８０および本明細書で提供さ
れる配列番号４が挙げられる。他の有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、これだ
けに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（ＮＣ＿０１０６０
９．１：４６０３０３．．４６１２７７；ＹＰ＿００１８４１３８９．１０）；Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＣ＿０１４４７９．１：３６７１８６５．．３６７２８
３６；ＹＰ＿００３８６８０６３．１）；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｅ（Ｌ２３１４７．１：２０７．．１２０８；ＡＡＡ７２０４１．１）；Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ（ＢＡＢ１９２６７．１）；
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１（ＮＰ＿７８４５５０．
１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１（ＺＰ
０３９４４４６６．１）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．  １６８（ＮＰ＿３９１６４６．１）；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃ
ｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＡＡＡ７２０４１．１）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  
ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＤＳＭ  ４１５０（ＺＰ  ０３１５２６０６．１）；Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４（ＮＰ＿３４８３
６８．１）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５（ＹＰ  ００
１３９４７８０．１）；Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ＤＳＭ  ２００８（
ＺＰ  ０３８５５２６７．１）；およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕ
ｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．  Ａ
ＴＣＣ  ９１５０（ＹＰ＿  １４９７２５．１）に由来するものが挙げられる。
【００５８】
他の有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、その内容全体が参照により本明細書
に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１／１５９８５号に記載されているものが挙げられ
る。これらのホスホトランスアセチラーゼとしては、（ＺＰ＿０５４２７７６６．１；Ｅ
ｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｐｈｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ４９９８９）、（ＺＰ＿０３６２
７６９６．１；ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｅｌｌｉｎ５１４）、（ＺＰ＿０３１３１７７０．
１；Ｃｈｔｈｏｎｉｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ  Ｅｌｌｉｎ４２８）、（ＹＰ＿０
０１８７８０３１．１；Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ＴＣＣＢＡ
Ａ−  ８３５）、（ＺＰ＿０４５６２９２４．１；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．３０
＿２）、（ＹＰ＿００１４５１９３６．１；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ  Ａ
ＴＣＣ  ＢＡＡ−８９５）、（ＹＰ＿１４９７２５．１；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔ
ｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  
Ａ  ｓｔｒ．  ＡＴＣＣ  ９１５０）、（ＹＰ＿００１５６９４９６．１；Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｚｏｎａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  ６２：
ｚ４，ｚ２３：−−）、（ＮＰ＿４１６９５３．１；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
ｓｔｒ．  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．  ＭＧ１６５５）、（ＹＰ＿００２９２０６５４
．１；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４）、（ＺＰ＿
０４６３７７９７．１；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ  ２９９０
９）、（ＺＰ＿０１２２２６０４．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄ
ｕｍ  ３ＴＣＫ）、（ＺＰ＿０２１５６８５５．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂｅｎｔｈ
ｉｃａ  ＫＴ９９）、（ＹＰ＿９５８５０８．１；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａ
ｅｏｌｅｉ  ＶＴ８）、（ＹＰ＿０６６７７１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙ
ｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ＬＳｖ５４）、（ＹＰ＿００２７８０５３１．１；Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  Ｂ４）、（ＹＰ＿７０３５０６．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）、（ＺＰ＿０５４７９９６３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ  ｓｐ．  ＡＡ４）、（ＹＰ＿００２７６１３９８．１；Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ  
ａｕｒａｎｔｉａｃａ  Ｔ−２７）、（ＺＰ＿０４６７０１８９．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿７＿４７ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０５４９３９５８．
１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ  ２７８２）、（Ｙ
Ｐ＿００３１４３５０６．１；Ｓｌａｃｋｉａ  ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ
ＤＳＭ  ２０４７６）、（ＺＰ＿０５０９０８２２．１；Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ｓｐ．  
Ｒ１１）、（ＺＰ＿０１７４８０２１．１；Ｓａｇｉｔｔｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔａ  Ｅ
−３７）、（ＮＰ＿６０４０６９．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕ
ｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＺＰ＿０５８１４
７３４．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ３＿１＿３３）、（ＺＰ＿０６０２
６６１３．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  
３３６９３）、（ＺＰ＿０５６１７６３２．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  
３＿１＿５Ｒ）、（ＺＰ＿０５６２８０３０．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．
Ｄ１２）、（ＺＰ＿０４８６０９４６．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖａｎｕｍ  
ＡＴＣＣ  ２７７２５）、（ＺＰ＿０４５６７４４４．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ９８１７）、（ＹＰ＿００１４８９４３７．１；Ａ
ｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｕｔｚｌｅｒｉ  ＲＭ４０１８）、（ＹＰ＿００３１６３２３６
．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ）、（ＺＰ＿０
５９０２４２０．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｈｏｆｓｔａｄｉｉ  Ｆ０２５４）、
（ＺＰ＿０６０１１３０８．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｉ
Ｆ０２６４）、（ＺＰ＿０４４７９５４８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍ
ｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ  １２１１２）、（ＺＰ＿０３８５５２６７．１；Ｖｅ
ｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ＤＳＭ  ２００８）、（ＺＰ＿０３９２８５２３
．１；Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｄ２１）、（ＮＰ＿９７０６５９．１
；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５）、（ＺＰ＿０５６
２１５１０．１；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ  ＡＴＣＣ  ３５５８０）、
（ＮＰ＿２１８５３４．１；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐ
ａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓ）、（ＺＰ＿０４０４７３１８．１；Ｂｒａ
ｃｈｙｓｐｉｒａ  ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ  ＤＳＭ  １２５６３）、（ＹＰ＿００２７２０
４７８．１；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＷＡｌ）、（Ｙ
Ｐ＿００１７４０７０６．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｃｌｏａｃａｍｏｎａｓ  ａｃｉ
ｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、（ＥＥＲ０５０１３．１；Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ  ｍａｎｎ
ｕｓ  ＡＴＣＣ  ５０９８３）、（ＹＰ＿９４５５８２．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｔｕｒ
ｉｃａｔａｅ  ９１Ｅ１３５）、（ＹＰ＿００１８８４０１３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  
ｈｅｒｍｓｉｉ  ＤＡＨ）、（ＹＰ＿００２２２２２３３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｄｕ
ｔｔｏｎｉｉ  Ｌｙ）、（ＺＰ＿０３６７５３０６．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｉｅｌ
ｍａｎｉｉ  Ａ１４Ｓ）、（ＺＰ＿０３４３５３９４．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅ
ｌｉｉ  ＡＣＡ−ｌ）、（ＺＰ＿０３５４００１８．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎ
ｉｉ  Ｆａｒ０４）、（ＺＰ＿０３６７２９２８．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｖａｌａｉｓ
ｉａｎａ  ＶＳ１１６）、（ＮＰ＿２１２７２３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏ
ｒｆｅｒｉ  Ｂ３１）、（ＹＰ＿００１９５６２８７．１；ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｔｅ
ｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ  １  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ−Ｄ１７
）、（ＮＰ＿９７５２６８．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ
．  ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ＳＣ  ｓｔｒ．  ＰＧｌ）、（ＹＰ＿４２４２１６．１；Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ  ＡＴＣ
Ｃ  ２７３４３）、（ＹＰ＿０５３２８３．１；Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ  ｆｌｏｒｕｍ  
Ｌｌ）、（ＣＡＫ９９５４０．１；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｃｉｔｒｉ）、（ＮＰ＿０
７２９６６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  Ｇ３７）、（ＮＰ＿１
１０１１６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  Ｍ１２９）、（ＮＰ＿８
５３４０３．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ  Ｒ）、（ＮＰ＿
７５７８８９．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ  ＨＦ−２）、（ＹＰ＿
１１６０１６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅａ  ２３２）、（
ＹＰ＿００２９６０６０７．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｅ）、
（ＹＰ＿００１２５６２８２．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＰＧ
２）、（ＢＡＨ６９５０３．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＰＧ１
８）、（ＹＰ＿２７８７７１．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ５３）、
（ＮＰ＿３２６０６８．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ  ＵＡＢ  ＣＴＩ
Ｐ）、（ＹＰ＿０１５８６５．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ  １６３Ｋ）、
（ＹＰ＿００１２５６６３０．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＰＧ
２）、（ＹＰ＿８０２６８５．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．
Ｃｃ（Ｃｉｎａｒａ  ｃｅｄｒｉ））、（ＹＰ＿００１８８５４３２．１；Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｂ  ｓｔｒ．  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ）、（ＹＰ＿
００１３０８３０２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＣｌ
ＭＢ  ８０５２）、（ＺＰ＿０５１３１２８０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  
７＿２＿４３ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０２９４８６０４．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕ
ｔｙｒｉｃｕｍ  ５５２１）、（ＮＰ＿５６２６４１．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐ
ｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒ．  １３）、（ＺＰ＿０５３９１２３２．１；Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７）、（ＹＰ＿００１３９４７８０
．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５）、（ＺＰ＿０２９
９５４１９．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  １５５７
９）、（ＮＰ＿７８１８７０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８）、
（ＺＰ＿０４８６２１９２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｄ  ｓ
ｔｒ．  １８７３）、（ＹＰ＿８７８２９８．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ
ＮＴ）、（ＺＰ＿０４８０４９６０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖ
ｏｒａｎｓ  ７４３Ｂ）、（ＮＰ＿３４８３６８．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅ
ｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）、（ＡＣＡ５１６６８．１；Ｔｈｅｒｍｏ
ａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、（ＺＰ＿０５
３３６８８６．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＳＭ  ５７１）、（ＮＰ＿６２３０９７．１；Ｔｈｅｒｍ
ｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＭＢ４）、（ＹＰ＿００
１６６３３５４．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｘ５１４）、
（ＹＰ＿００２５０８７７１．１；Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈ  ｒｉｘ  ｏｒｅｎｉｉ  
Ｈ  １６８）、（ＹＰ＿００３１９０６７９．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  
ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  ７７１）、（ＹＰ＿００１９１７７７６．１；Ｎａｔ
ｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  ＪＷＩＮＭ−ＷＮ−ＬＦ）、（Ｙ
Ｐ＿３６０２８８．１；Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒ
ｍａｎｓ  Ｚ−２９０１）、（ＥＹ８３５５１．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．２
＿１＿３３Ｂ）、（ＺＰ＿０２０３３４０８．１；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍ
ｅｒｄａｅ  ＡＴＣＣ  ４３１８４）、（ＮＰ＿９０５２９７．１；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍ
ｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３）、（ＺＰ＿０４０５６０００．１；Ｐｏｒｐ
ｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｕｅｎｏｎｉｓ  ６０−３）、（ＺＰ＿０４３８９８８４．１；Ｐ
ｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５４０６）、（Ｚ
Ｐ＿０２０６８８１５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  
８４９２）、（ＺＰ＿０３４６０７４９．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈ
ｉｉ  ＤＳＭ  ２０６９７）、（ＺＰ＿０３６７６９４４．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ
ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  １４８３８）、（ＹＰ＿０９７７６１．
１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＹＣＨ４６）、（ＺＰ＿０４５４５８
２５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  Ｄ１）、（ＺＰ＿０３６４３５４４．１；
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  １８２２８）、（ＺＰ＿０
３２０７０７８．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｌｅｂｅｉｕｓ  ＤＳＭ  １７１３５
）、（ＹＰ＿００１２９７８５５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  Ａ
ＴＣＣ  ８４８２）、（ＺＰ＿０５７３６７０２．１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔａｎｎ
ｅｒａｅ  ＡＴＣＣ  ５１２５９）、（ＺＰ＿０６００７５８７．１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌ
ｌａ  ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  １７３６１）、（ＺＰ＿０５８５８９３５．１；Ｐ
ｒ
ｅｖｏｔｅｌｌａ  ｖｅｒｏｒａｌｉｓ  Ｆ０３１９）、（ＺＰ＿０５９１６９９７．１
；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  ４７２  ｓｔｒ．  Ｆ０２９
５）、（ＹＰ＿００２３０８７８２．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｚｏ  ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎ  ｙｍｐｈａｅ  ｇｅｎｏｍｏｖａｒ．  ＣＦ
Ｐ２）、（ＹＰ＿７５３４５９．１；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ  ｓ
ｕｂｓｐ．  ｗｏｌｆｅｉ  ｓｔｒ．  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、（ＺＰ＿０１７７１３
８９．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６）
、（ＺＰ＿０３２９６８４９．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＤＳ
Ｍ  １３２７９）、（ＺＰ＿０４４４５３０８．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｎｔｅｓ
ｔｉｎａｌｉｓ  ＤＳＭ  １３２８０）、（ＺＰ＿０３５６７５１５．１；Ａｔｏｐｏｂ
ｉｕｍ  ｒｉｍａｅＡＴＣＣ  ４９６２６）、（ＹＰ＿００３１７９６６７．１；Ａｔｏ
ｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ  ＤＳＭ  ２０４６９）、（ＺＰ＿０３９４６１３３．
１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ  ＤＳＭ  １５８２９）、（ＺＰ＿０３９９０
６５４．１；Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｎｕｓ  Ｆ０２６８）、（ＺＰ＿０４４５
０８４９．１；Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＡＴＣＣ  ４９１７６）
、（ＺＰ＿０５７９７６０１．１；Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｔａ
ｘｏｎ  ０７８  ｓｔｒ．  Ｆ０２６２）、（ＺＰ＿０３７３０２４７．１；Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍ６２／１）、（ＺＰ＿０４８５６２５２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ５＿１＿３９ＢＦＡＡ）、（ＺＰ＿０１９６６３３２．１；Ｒｕｍ
ｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ２９１７４）、（ＺＰ＿０５３４５６１６
．１；Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ  ｆｏｒｍａｔｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ  １４４６９）、（
ＺＰ＿０３７８０８２９．１；Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏ  ｐｈｉｃａ
ＤＳＭ  １０５０７）、（ＺＰ＿０３２８９３６０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎ
ｅｘｉｌｅ  ＤＳＭ  １７８７）、（ＺＰ＿０２０４２０９２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９１４９）、（ＺＰ＿０３１６８１１２．１；Ｒｕ
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔａｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９１７６）、（ＺＰ＿０１９６
８８３７．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ  ＡＴＣＣ  ２７７５６）、
（ＺＰ＿０２４３０４２６．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ
３５７０４）、（ＺＰ＿０３７７９７４４．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｙｌｅｍ
ｏｎａｅ  ＤＳＭ  １５０５３）、（ＺＰ＿０２２３４５９５．１；Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒ
ｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２７７５５）、（ＺＰ＿０１９９４６７３．１；
Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＤＳＭ  １３８１４）、（ＹＰ＿００１５５８４
４２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＩＳＤｇ）、（
ＺＰ＿０４６６７０８５．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿
７＿４７ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０２０８５３９１．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｌｔ
ｅａｅ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、（ＺＰ＿０５７９０８５３．１；Ｂｕｔｙｒｉｖ
ｉｂｒｉｏ  ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ  ＤＳＭ  ２８７６）、（ＺＰ＿０２０２６０３４．１
；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７５６０）、（ＹＰ＿
００２９３０５１３．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２７７
５０）、（ＺＰ＿０４８０８２１３．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ
ＭＩＴ  ９８−５４８９）、（ＺＰ＿０３６５６１２０．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ  ＭＩＴ  ９８−５４９１）、（ＺＰ＿０４５８３２１７．１
；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｇｈａｍｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−４３０）、
（ＮＰ＿８６０８４０．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ
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、（ＹＰ＿００３１８２０８２．１；Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａ  ＤＳＭ  ２
２４３）、（ＹＰ＿００３１５１０２７．１；Ｃｒｙｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｒ
ｔｕｍ  ＤＳＭ  １５６４１）、（ＹＰ＿００３１４３６０１．１；Ｓｌａｃｋｉａ  ｈ
ｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＤＳＭ  ２０４７６）、（ＺＰ＿０５４９８１３
５．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ  ２７８２）、
（ＺＰ＿０３１５２６０６．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  
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ｏｒ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ８９０３）、（ＡＡＡ７２０４１．１
；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、（ＮＰ＿６１８４８２．
１；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ）、（ＹＰ＿３０
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ｏ）、（ＺＰ＿０２１４２２７８．１；Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  
Ｏｃｈ  １４９）、（ＹＰ＿６８１１８４．１；Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ  ＯＣｈ  １１４）、（ＹＰ＿００１５３３１６８．１；Ｄｉｎｏｒｏｓ
ｅｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ  ＤＦＬ  １２）、（ＺＰ＿０５１２４９３５．１；
Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＫＬＨ１１）、（ＺＰ＿０５
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ＴＩ−１１５７）、（ＹＰ＿００１３１３５８６．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍ
ｅｄｉｃａｅ  ＷＳＭ４１９）、（ＮＰ＿４３７５１２．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１）、（ＺＰ＿０４６８２１２９．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃ
ｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＬＭＧ  ３３０１）、（ＹＰ＿００１３７２０３６
．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃ  ＡＴＣＣ  ４９１８８）、（Ｙ
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ＰｓＪＮ）、（ＹＰ＿５５４６１３．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａ
ｎｓ  ＬＢ４００）、（ＹＰ＿００１８６２２９７．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐ
ｈｙｍａｔｕｍ  ＳＴＭ８１５）、（ＹＰ＿２９７９７４．１；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅ
ｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４）、（ＹＰ＿００２００８２１９．１；Ｃｕｐｒｉａｖｉ
ｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、（ＹＰ＿００１５８４４８８．１；Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、（ＹＰ＿００２２３
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ＴＣＫ）、（ＺＰ＿０３６９８３６１．１；Ｌｕｔｉｅｌｌａ  ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ
２００２）、（ＺＰ＿０１８１１５１５．１；Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ  ＳＷＡＴ−３）、（ＺＰ＿００９８８３４９．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｌｅｎｄ
ｉｄｕｓ  １２Ｂ０１）、（ＺＰ＿０１８６６２３４．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎ
ｉｉ  ＡＫ１）、（ＺＰ＿０５８８５１６３．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙ
ｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−４５０）、（ＡＡＳ７８７８９．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｕ
ｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、（ＹＰ＿３４５１９６．１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＡＡＮ０８４９０．１；Ｃａｓｔｅｌｌ
ａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）、（ＺＰ＿００９６１３４５．１；Ｒｏｓｅｏ
ｖａｒｉｕｓ  ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ  ＩＳＭ）、（ＹＰ＿１６８７５５．１；Ｒｕｅ
ｇｅｒｉａ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＺＰ＿０１９０１１９３．１；Ｒｏｓ
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ｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌ  ｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２０８３）、（ＹＰ＿
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ｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｂｉｎｏｌｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ２３８０）、（ＹＰ＿００２５３７
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ｙｉ  ＳＺ）、（ＺＰ＿０５３１１９２２．１；Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｍ１８）
、（ＹＰ＿００３０２１７５８．１；Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｍ２１）、（ＹＰ＿
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ｐｅｔｏｎ  ｔｈａｌａｓｓｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ３５１１０）、（ＺＰ＿０１９２４８５
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ｓｔｒ．  Ｓｈｅｅｂａ）、（ＺＰ＿０１８１０３３７．１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔ
ｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｊｅｊｕｎｉ  ＣＧ８４８６）、（ＺＰ＿００３６
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ｎｉｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−  ３８１）、（ＺＰ＿０５６２４８２０．１；Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ＲＭ３２６８）、（ＹＰ＿８９１９８８．１；Ｃａｍ
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＿
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ａｅ  ＲＭ３２７７）、（ＺＰ＿０３７４２９３３．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕ
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ｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ２００９８）、（ＺＰ＿０３６１８８８６．１；
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ｆａｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ  ５５８１３）、（ＹＰ＿００２３２３１８３．１；Ｂｉｆｉｄ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １
５６９７）、（ＺＰ＿０３６４６１８７．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆ
ｉｄｕｍ  ＮＣｌＭＢ  ４１１７１）、（ＺＰ＿０３９３７６１１．１；Ｇａｒｄｎｅｒ
ｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １４０１９）、（ＺＰ＿０２９６２８６９．
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ＨＮ０１９）、（ＺＰ＿０５９６５１８５．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇ
ａｌｌｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ２００９３）、（ＺＰ＿０２０４３４０８．１；Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １７９８２）、（ＺＰ＿０３９２
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ＡＴＣＣ  １３０３２）、（ＮＰ＿７３９２０１．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｒｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ  ＹＳ−３１４）、（ＮＰ＿９４０３７９．１；Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ＮＣＴＣ  １３１２９）、（ＺＰ＿０４８
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ｍ  ＡＴＣＣ  ５１８６７）、（ＺＰ＿０５７０８６２３．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｒｎ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ３３０３０）、（ＺＰ＿０３９７７９１
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４４２９１）、（ＺＰ＿０３９３２０６４．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃ
ｃｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ４９７２５）、（ＺＰ＿０５３６６８９０．１；Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃｕｍ  ＳＫ１４１）、（ＹＰ＿
００２８３５８１７．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｎｍｕｃｏｓｕｍ  Ａ
ＴＣＣ  ７００９７５）、（ＹＰ＿２５００２０．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｊｅｉｋｅｉｕｍ  Ｋ４１１）、（ＹＰ＿００１８０１１３２．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ７１０９）、（ＹＰ＿００２９０６
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ｍｙｃｏｌａｔｕｍ  ＳＫ４６）、（ＺＰ＿０３７１８９８７．１；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
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Ｐ＿０４６０２９７７．１；Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ５１１４７）
、（ＹＰ＿４２６４６６．１；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ
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ｓｉｎｉｄｉａ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔ  ｏｆ  Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｂｒｅｖｉｐａ
ｌｐｉｓ）、（ＮＰ＿７７７７９３．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓ
ｔｒ．  Ｂｐ（Ｂａｉｚｏｎｇｉａ  ｐｉｓｔａｃｉａｅ））、（ＹＰ＿００３２４９４
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ｍｏｇｅｎｅｓ  Ｓ８５）、（ＺＰ＿０３５３５３０２．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｔ１７）、（ＺＰ＿０４０５６４３８．１；Ｃａｐｎｏ
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ＥＭ）、（Ｐ７７８４４；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、
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ｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ  ＤＳＭ  ３３５３）、（ＺＰ＿０５６１４４３４．１；Ｆａｅ
ｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉ  ｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５）、（ＺＰ＿０
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ａｎｓ  ＤＳＭ  １６８４１）、（ＺＰ＿０４７４５２７５．２；Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  
ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｌｌ−８２）、（ＹＰ＿００２９３７３３２．１；Ｅｕｂａ
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、（ＺＰ＿０２０７８３２７．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ  ＤＳＭ
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ｕｍ  ＤＳＭ  ３９９１）、（ＺＰ＿０３３０５５３２．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ  ＤＳＭ  ７４５４）、（ＺＰ＿０５４７３２９１．１；Ａ
ｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ５１１７０）、（ＺＰ＿０３
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ｉ  ＤＳＭ  ２０５４８）、（ＺＰ＿０３９１６０４８．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５１１７２）、（ＮＰ＿６０７２１３．１；Ｓ
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Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、（ＢＡＨ８８０１６．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
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ｓｏｎｉｉ  ＮＣＣ  ５３３）、（ＹＰ＿１９３６１０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ）、（ＺＰ＿０４０１１０１９．１；Ｌａｃｔｏ
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ｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．  １６８）、（ＹＰ＿００１
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２）、（ＹＰ＿０８１０７３．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ａ
ＴＣＣ  １４５８０）、（ＺＰ＿０３０５５１０１．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌ
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ｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫＩ）、（ＹＰ＿００２９５１２７０．１；Ｇｅ
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６）、（ＺＰ＿０１８６１２５１．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＳＧ−ｌ）、（ＺＰ
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（ＺＰ＿０１１７３９４５．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＲＲＬＢ−１４９１１）
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ＴＥ８３１）、（ＺＰ＿０４３１４７５３．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＢＧ
ＳＣ  ６Ｅ１）、（ＹＰ＿０１４７２７．１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅ
ｎ  ｅｓ  ｓｔｒ．  ４ｂ  Ｆ２３６５）、（ＺＰ＿０４４４３７５７．１；Ｌｉｓｔｅ
ｒｉａ  ｇｒａｙｉ  ＤＳＭ  ２０６０１）、（ＮＰ＿２４４６９０．１；Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５）、（ＹＰ＿１７７４０２．１；Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ  ＫＳＭ−Ｋ１６）、（ＹＰ＿００２８８５８１６．１；Ｅｘｉｇ
ｕｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．  ＡＴ１ｂ）、（ＹＰ＿００１８１２７２１．１；Ｅｘ
ｉｇｕｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ  ２５５−１５）、（ＺＰ＿０２１
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ｉｓ  Ｍ２３８６４：Ｗ１）、（ＺＰ＿０３６１２９７３．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ＳＫ１４）、（ＺＰ＿０４６７７７９８．１；Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｗａｍｅｒｉ  Ｌ３７６０３）、（ＮＰ＿７６３９１４．１；Ｓｔａｐｈ
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ＣＳＣ１４３５）、（ＺＰ＿０４０５９８１８．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈ
ｏｍｉｎｉｓ  ＳＫｌ１９）、（ＡＢＲ５７１７７．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｘｙｌｏｓｕｓ）、（ＹＰ＿３０２２１４．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａ
ｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １５
３０５）、（ＹＰ＿００２６３３３４０．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｍｏ
ｓｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｍｏｓｕｓ  ＴＭ３００）、（ＹＰ＿００２５６１２３６．
１；Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＪＣＳＣ５４０２）、（ＺＰ
＿０３９４４４６６．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ
１４９３１）、（ＺＰ＿０５５５３５０２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌ
ｅｏｈｏｍｉｎｉｓ  １０１−４−ＣＨＮ）、（ＺＰ＿０３９５９６２９．１；Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９５４０）、（ＹＰ＿００１２
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ｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ３３３１３）、（ＺＰ＿０１５４４４６８．１；Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕ
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ｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ４９１７５）、（ＺＰ＿０５８５
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（ＺＰ＿０５６４９７５５．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  Ｅ
Ｇ２）、（ＺＰ＿０３９４７９１８．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ
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ｃｉｕｍ  ＴＸ１３３０）、（ＹＰ＿３９５９５４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  
ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＺＰ＿０４４４９７６２．１；Ｃ
ａｔｏｎｅｌｌａ  ｍｏｒｂｉ  ＡＴＣＣ  ５１２７１）、（ＹＰ＿００１０３２１００
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ＣＣ  ３３４）、（ＮＰ＿７８４５５０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔ
ａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１）、（ＹＰ＿７９４８４８．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂ
ｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ  ３６７）、（ＺＰ＿０３９５４８３１．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ  ＡＴＣＣ  ８２９０）、（ＢＡＢＩ９２６７．１；Ｌａ
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ｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５７４５）、（ＺＰ＿０２０９３７
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ｉｎｉｂａｃ  ｔｕｒｎｔｅｒｒａｅ  Ｔ７９０１）、（ＹＰ＿９５８４１１．１；Ｍａ
ｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｑｕａｅｏｌｅｉ  ＶＴ８）、（ＹＰ＿４３５５８０．１；Ｈａ
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Ｐ＿７９１００１．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｎｇａｅ  ｐｖ．  ｔｏｍａｔ
ｏ  ｓｔｒ．  ＤＣ３０００）、（ＹＰ＿２５８０６９．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｆ−５）、（ＹＰ＿６０６６３７．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ  Ｌ４８）、（ＹＰ＿００２８００５７９．１；Ａｚｏｔ
ｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ  ＤＪ）、（ＹＰ＿００１１７１６６３．１；Ｐ
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ＳＭ  １１３００）、（ＮＰ＿２９３７９９．１；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏ
ｄｕｒａｎｓ  Ｒ１）、（ＹＰ＿５２１５５０．１；Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ  ｆｅｒｒｉ
ｒｅｄｕｃｅｎｓ  Ｔ１１８）、（ＹＰ＿５３０９６２．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ  
ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ１８）、（ＹＰ＿５３１８８２．１；Ｒｈｏ
ｄｏｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＡ５３）、（ＺＰ＿０２３
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、（ＹＰ＿４２８０７９．１；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ
１１１７０）、（ＹＰ＿５３０５３５．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｎａｓ  ｐ
ａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ１８）、（ＮＰ＿９０１２００．１；Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＡＴＣＣ  １２４７２）、（ＺＰ＿０３６９８３４５
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ｓｐ．  ＲＵＨ２６２４）、（ＺＰ＿０３８２４４１６．１；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２７２４４）、（ＹＰ＿００１３８０２８０．１；Ａｎａｅｒｏ
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Ｌ５５Ｅ）、（ＹＰ＿００１３４４９４９．１；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃ
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ａ  ｓｔｒ．  Ｐｍ７０）、（ＺＰ＿０５９２０４４４．１；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  
ｄａｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ  ４３３２５）、（ＺＰ＿００１３３９９２．２；Ａｃｔｉ
ｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  １  ｓｔ
ｒ．  ４０７４）、（ＺＰ＿０４７５３５４７．１；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍ
ｉｎｏｒ  ＮＭ３０５）、（ＮＰ＿８７３８７３．１；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃ
ｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（ＺＰ＿０４９７８９０８．１；Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ  ＰＨＬ２１３）、（ＹＰ＿００２４７５０２２．１；Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ  ＳＨ０１６５）、（ＺＰ＿０５７３０５８１．１；
Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．  Ａｔ−９ｂ）、（ＹＰ＿００１９０７１３３．１；Ｅｒｗｉｎ
ｉａ  ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ  Ｅｔ１／９９）、（ＹＰ＿４５５２８７．１；Ｓｏｄ
ａｌｉｓ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ  ｓｔｒ．  ‘ｍｏｒｓｉｔａｎｓ’）、（ＺＰ＿
０５７２３９２２．１；Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  Ｅｃｈ５８６）、（ＹＰ＿
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６３）、（ＹＰ＿００２９８８１５９．１；Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  Ｅｃｈ
７０３）、（ＮＰ＿６６８９３８．１；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ  １０
）、（ＹＰ＿００１４７９５４３．１；Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎ
ｓ  ５６８）、（ＹＰ＿００２９３４０９８．１；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｉｃｔａ
ｌｕｒｉ  ９３−１４６）、（ＹＰ＿００２１５１５０２．１；Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒ
ａｂｉｌｉｓ  ＨＩ４３２０）、（ＮＰ＿９３０３２８．１；Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）、（ＹＰ＿
００２９２０５５３．１；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  ＮＴＵＨ−Ｋ２
０４４）、（ＹＰ＿００１１７７５５７．１；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．６３８
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）、（ＢＡＡ０４６６３．１；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＹＰ＿００２９
２４４０３．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｌｌａ  ｄｅｆｅｎｓａ  
５ＡＴ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））、（ＺＰ＿０３８２７７３５．１
；Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒａｓｉ
ｌｉｅｎｓｉｓ  ＰＢＲ１６９２）、（ＺＰ＿０１１５９２８２．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＫＡ３４）、（ＹＰ＿１３０９７３．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９）、（ＺＰ＿０６０５２４８１．１；Ｇｒｉｍ
ｏｎｔｉａ  ｈｏｌｌｉｓａｅ  ＣＩＰ  １０１８８６）、（ＺＰ＿０５８７７０３５．
１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｕｍｉｓｓｉｉ  ＣＩＰ  １０２９７２）、（ＺＰ＿０５８８１９
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＿０５８８１９６０．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｙｉｉ  ＣＩＰ  ６９．
１
４）、（ＺＰ＿０２１９６７４８．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．および４）、（ＮＰ＿９３
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＿０４４１５１１４．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｂｙ．  ａｌｂｅｎｓｉｓ
ＶＬ４２６）、（ＹＰ＿００１１４３１２５．１；Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎ
ｉｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  Ａ４４９）、（ＹＰ＿００２８９
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１２１５３５０．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＮＰＴ３）、（ＹＰ＿９４
４５９８．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ  ３７）、（ＹＰ＿０
０１４７３４４３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）
、（ＹＰ＿００１７６１２５７．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｗｏｏｄｙｉ  ＡＴＣＣ  
５１９０８）、（ＹＰ＿００１０９４５１９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃ
ａ  ＰＶ  −４）、（ＹＰ＿００１６７４８１１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉ
ｆａｘｅｎｓｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ４）、（ＹＰ＿８６９１９１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌ
ａ  ｓｐ．  ＡＮＡ−３）、（ＹＰ＿９２７３７１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｍａ
ｚｏｎｅｎｓｉｓ  ＳＢ２Ｂ）、（ＹＰ＿７５１１６０．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｆ
ｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ  ＮＣｌＭＢ  ４００）、（ＹＰ＿５６３４１３．１；Ｓｈｅ
ｗａｎｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＯＳ２１７  ）、（ＹＰ＿００１４７５
２７２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）、（ＹＰ＿
００１６７４９４９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ  ＨＡＷ−
ＥＢ４）、（ＺＰ＿０４７１６６６０．１；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉ
ｉ  ＡＴＣＣ  ２７１２６）、（ＹＰ＿６６２１６０．１；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍ
ｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ  Ｔ６ｃ）、（ＺＰ＿０１６１２２２５．１；Ａｌｔｅｒ
ｏｍｏｎａｄａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＴＷ−７）、（ＺＰ＿０１１３４６４０．
１；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔｅ  Ｄ２）、（ＹＰ＿２６９
８７３．１；Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅ  ａ  ３４Ｈ）、（Ｙ
Ｐ＿００１３４１１６７．１；Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＷＹＬ１）、（ＺＰ
＿０１０７７３５２．１；Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＥＤｌ２１）、（ＹＰ＿
００１２０９３６２．１；Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ  ＶＣＳ１７０
３Ａ）、（ＺＰ＿０５７０５１９３．１；Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｍｉｎ
ｉｓ  ＡＴＣＣ  １５８２６）、（ＥＥＹ６２８１７．１；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  
ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  Ｔ３０−４）、（ＥＥＹ６２８１６．１；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒ
ａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  Ｔ３０−４）、（ＸＰ  ００１６９４５０４．１；Ｃｈｌａｍ
ｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、（ＸＰ  ００１７５３１２０．１；Ｐｈ
ｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｐａｔｅｎｓ）、（ＹＰ＿０
０１８０４５１０．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２）、（Ｚ
Ｐ＿０１７２９２２０．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０）、（ＹＰ
＿００３１３８３３７．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８８０２）、（Ｙ
Ｐ＿００２３８００３４．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２４）、（
ＹＰ＿００１６６１１１０．１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｍｏｓａ  ＮＩＥ
Ｓ−８４３）、（ＹＰ＿００２４８５１５１．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣ
Ｃ  ７４２５）、（ＮＰ＿４４１０２７．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  Ｐ
ＣＣ  ６８０３）、（ＺＰ＿０１０６１１７１．１；Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉ  ｅｌｌ
ａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ  ＭＥＤ２１７）、（ＹＰ＿００１１９５８６２．１；Ｆｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ  ＵＷ１０１）、（ＹＰ＿００３１９４
９２７．１；Ｒｏｂｉｇｉｎｉｔａｌｅａ  ｂｉｆｏｒｍａｔａ  ＨＴＣＣ２５０１）、
（ＺＰ＿０１１０７７９２．１；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ  ＨＴＣＣ２１７０）、（ＺＰ＿０１０５１７３１．１；Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  
ｓｐ．  ＭＥＤ１５２）、（ＺＰ＿０１１１９２０４．１；Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  
ｉｒｇｅｎｓｉｉ  ２３−Ｐ）、（ＺＰ＿０３３９０９２９．１；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐ
ｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ  ＡＴＣＣ  ３３６１２）、（ＹＰ＿００３１４１９７７
．１；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ  ＤＳＭ  ７２７１）、（ＹＰ
＿０１２２４０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｔｒ．  Ｈｉ
ｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ）、（ＹＰ＿００２４３６２７６．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒ
ｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｔｒ．  ‘Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｆ’）、（ＹＰ＿３８９７３
０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｄ
ｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｔｒ．  Ｇ２０）、（ＹＰ＿００２９９２１６５．１；Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ  ２６３８）、（ＹＰ＿００
３１９７９０１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｒｅｔｂａｅｎｓｅ  ＤＳＭ  
５６９２）、（ＹＰ＿００３１５７５７７．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂ
ａｃｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ４０２８）、（ＺＰ＿０３７３７９１１．１；Ｄｅｓｕｌｆ
ｏｎａｔｒｏｎｏｓｐｉｒａ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ  ＡＳ０３−１）、（ＹＰ＿
００２９９０３３２．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ
２６３８）、（ＺＰ＿０３３１２２３７．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅ
ｒ  ＡＴＣＣ  ２９０９８）、（ＹＰ＿００２４７８８９０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂ
ｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓ
ｔｒ．  ＡＴＣＣ  ２７７７４）、（ＹＰ＿０６４２９４．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅ
ａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ＬＳｖ５４）、（ＹＰ＿５９４６５６．１；Ｌａｗｓｏ
ｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ＰＨＥ／ＭＮ１−００）、（ＺＰ＿０１６２
１８２０．１；Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８１０６）、（ＺＰ＿０３２７２８９
９．１；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８）、（ＹＰ＿８４５５９
６．１；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ  ＭＰＯＢ）、（
ＺＰ＿０４７７３９３２．１；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ
１８０）、（ＮＰ＿８６９００２．１；Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃ
ａ  ＳＨ  １）、（ＹＰ＿３９２５７１．１；Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  １２５１）、（ＺＰ＿０５０７１７１７．１；Ｃａｍｐｙｌｏ
ｂａｃｔｅｒａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＤ  １）、（ＺＰ＿０４４２１８９９．
１；Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｄｅｌｅｙｉａｎｕｍ  ＤＳＭ  ６９４６）、
（ＹＰ＿００１３５９２９５．１；Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ  ｓｐ．  ＮＢＣ３７−１）、
（ＹＰ＿９５１５４４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ  Ｐ
ＹＲ−１）、（ＹＰ＿００１１３１４８８．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖ
ｕｍ  ＰＹＲ−ＧＣＫ）、（ＹＰ＿６３７７１４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓ
ｐ．  ＭＣＳ）、（ＹＰ＿８８５１８８．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍ
ａｔｉｓ  ｓｔｒ．  ＭＣ２  １５５）、（ＹＰ＿００１７０４９５３．１；Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、（ＺＰ＿０４７４７５２９．１；Ｍｙｃｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ  ＡＴＣＣ  １２４７８）、（ＹＰ＿００１８４９
０２４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ）、（ＮＰ＿２１４９２
２．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）、（Ｎ
Ｐ＿９６２８１９．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａ
ｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０）、（ＺＰ＿０５２２３８７２．１；Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  ＡＴＣＣ  １３９５０）、（ＹＰ
＿００２７６４９１９．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ
４）、（ＹＰ＿７０２１６２．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡＩ）
、（ＹＰ＿１２１５６２．１；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１
５２）、（ＺＰ＿０４０２５３６１．１；Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔ
ａｂｏｌａ  ＤＳＭ  ２０１６２）、（ＹＰ＿００３２７５４３１．１；Ｇｏｒｄｏｎｉ
ａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ  ＤＳＭ  ４３２４７）、（ＹＰ＿００３１６０６１０．１
；Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３）、（ＺＰ＿０５
８１６６５０．１；Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ  ｋｅｄｄｉｅｉｉ  ＤＳＭ  １０５４２
）、（ＺＰ＿０４３６８０２７．１；Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ  
ＤＳＭ  ２０１０９）、（ＹＰ＿００２８８３０５４．１；Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ  
ｃａｖｅｍａｅ  ＤＳＭ  １２３３３）、（ＺＰ＿０３９１１４８１．１；Ｘｙｌａｎｉ
ｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  ＤＳＭ  １５８９４）、（ＹＰ＿９２４
１４３．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐ．１Ｓ６１４）、（ＺＰ＿０３８６４７８
９．１；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ  ｆｌａｖｉｄａ  ＤＳＭ  １７８３６）、（ＺＰ＿０１１
３１０５７．１；ｍａｒｉｎｅ  ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＰＨＳＣ２０Ｃ１）
、（ＹＰ＿００１７０８９４１．１；Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓ
ｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）、（ＹＰ＿０６１４６２．１；Ｌｅｉｆ
ｓｏｎｉａ  ｘｙｌｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉ  ｓｔｒ．  ＣＴＣＢ０７）、（ＹＰ＿
７４８１８３．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｃ９１）、（ＹＰ＿
００３１１６８９２．１；Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ
４４９２８）、（ＹＰ＿００３１９９９８３．１；Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｍｕｉｔ
ｉｐａｒｔｉｔａ  ＤＳＭ  ４４２３３）、（ＹＰ＿００３１５４３２１．１；Ｂｒａｃ
ｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＤＳＭ  ４８１０）、（ＺＰ＿０３９２７４
９２．１；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ  ＤＳＭ  １５４３４）
、（ＹＰ＿００３１４８９３１．１；Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ  
ＤＳＭ  ２０５４７）、（ＺＰ＿０５８０３９５０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆ
ｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３３３１）、（ＹＰ＿００１８２３６２３．１；
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒｉｓｅｕｓ  ＮＢＲＣ
１３３５０）、（ＺＰ＿０５００２６９３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖ
ｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４）、（ＺＰ＿０５０１５４９３．１；Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０８３）、（ＺＰ＿０５５３８６６
０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００）、（Ｚ
Ｐ＿０４６８５７８９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣ
Ｃ  １４６７２）、（ＺＰ＿０５５３４３０８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒ
ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６）、（ＺＰ＿０５５２３５５４．１
；
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４）、（ＮＰ＿８２３９９９．１
；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０）、（ＣＢＧ６
９９２１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２）、（ＺＰ＿０
４７０４９０５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ  １１０７４）、（ＺＰ＿
０４９９７７４５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇｌ）、（ＺＰ＿０５５
０９１４７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｃ）、（ＺＰ＿０５５１４７１８
．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３６５３
）、（ＺＰ＿０４９９４２９０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＰＢ７４）
、（ＺＰ＿０４４７４０８２．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ
ＤＳＭ  ４３０２１）、（ＹＰ＿００１１６０５０１．１；Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  
ｔｒｏｐｉｃａ  ＣＮＢ−４４０）、（ＹＰ＿００１５３８８５３．１；Ｓａｌｉｎｉｓ
ｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ＣＮＳ−２０５）、（ＺＰ＿０４６０５５７５．１；Ｍ
ｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ３９１４９）、（ＹＰ＿８３２７１６
．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＦＢ２４）、（ＡＢＲ１３６０３．１；Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、（ＹＰ＿００２９５６２９６．１；Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＮＣＴＣ  ２６６５）、（ＺＰ＿０５３６７２４９．１
；Ｒｏｔｈｉａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２５２９６）、（ＹＰ＿００１
８５４００４．１；Ｋｏｃｕｒｉａ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ  ＤＣ２２０１）、（ＺＰ＿
０４９８４４６３．１；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．
ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ  ＦＳＣ０２２）、（ＹＰ＿００１６７７４２２．１；Ｆｒａｎ
ｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ
ＡＴＣＣ  ２５０１７）、（ＹＰ＿５８８８２７．１；Ｂａｕｍａｎｎｉａ  ｃｉｃａ
ｄｅｌｌｉｎｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  Ｈｃ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ  ｏａｇｕｌａｔａ
））、（ＮＰ＿２４０００７．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．
ＡＰＳ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎｐｉｓｕｍ））、（ＺＰ＿０５０５７４９４．１
；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＧ１２３５）、（ＺＰ＿
０２９３０２５２．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ
４１３６）、（ＺＰ＿０１４５２３８６．１；Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ｆｅｒｒ
ｏｏｘｙｄａｎｓ  ＰＶ−ｌ）、および（ＺＰ＿０１３０７３９２．１；Ｂｅｒｍａｎｅ
ｌｌａ  ｍａｒｉｓｒｕｂｒｉ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なホスホトランスアセチラ
ーゼとしては、本明細書に記載のホスホトランスアセチラーゼのいずれかの「誘導体」と
いわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細
書に記載のホスホトランスアセチラーゼのいずれかと実質的な相同性を共有し、かつ、（
２）アセチルホスフェートからアセチルＣｏＡへの変換を触媒することができる。ホスホ
トランスアセチラーゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がホスホトランスアセチラーゼ
のアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは
少なくとも９５％同じであれば、ホスホトランスアセチラーゼと「実質的な相同性」を共
有するといえる。
【００６０】
５．４  アセチルホスファターゼ活性の機能的破壊
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルホスフェ
ートをアセテートに変換する酵素的機能の破壊を含む。一部の実施形態では、酵素は宿主
細胞のネイティブなものである。
【００６１】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロー
ル−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセ
ロール−１−ホスファターゼ活性を有する酵素は、ＲＨＲ２（ＧＰＰ１／ＲＨＲ２；系統
名：ＹＩＬ０５３Ｗ）、またはそのホモログもしくはバリアントである。ＧＰＰ１／ＲＨ
Ｒ２は、グリセロール生合成に関与する構成的に発現されるグリセロール−１−ホスファ
ターゼであり、嫌気ストレスおよび浸透ストレスの両方に応答して誘導される。例えば、
それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂ
ｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻（２３号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）；Ｎ
ｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻（９号）：１３８７５〜１３８８１
頁（１９９６年）；Ｐａｈｌｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻（５号）：３
５５５〜３５６３頁（２００１年）；ＮｅｖｏｉｇｔおよびＳｔａｈｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１巻（３号）：２３１〜４１頁（１９９７年）；Ｂｙｒｎｅ
およびＷｏｌｆ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １５巻（１０号）：１４５６〜６１頁、および
Ｈｉｒａｙａｍａら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９巻（２号）：１２７〜３８頁
を参照されたい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ１／ＲＨＲ２遺伝子の配列は以前に
記載されている。例えば、Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻（２３
号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）、およびＰａｈｌｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏ
ｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻（５号）：３５５５〜３５６３頁（２００１年）を参照されたい
。Ｇｐｐ１／Ｒｈｒ２により以下の反応が触媒されることが以前に記載されている：
グリセロール−１−ホスフェート＋Ｈ２Ｏ⇔グリセロール＋ホスフェート
代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ１／ＲＨＲ２ヌ
クレオチド配列としては、受託番号ＮＭ＿００１１７９４０３．１、および本明細書で提
供される配列番号５が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅのＧｐｐ１／Ｒｈｒ２タンパク質配列としては、受託番号ＮＰ＿０１２２１１、
および本明細書で提供される配列番号６が挙げられる。
【００６２】
同じくアセチルホスフェートのアセテートへの加水分解を触媒するＧＰＰ１／ＲＨＲ２
の密接に関連するホモログはＨＯＲ２（ＧＰＰ２／ＨＯＲ２；系統名：ＹＥＲ０６２Ｃ）
である。Ｇｐｐ２／Ｈｏｒ２も同様に、以下の反応を触媒することができるグリセロール
−１−ホスファターゼであることが以前に記載されている：グリセロール−１−ホスフェ
ート＋Ｈ２Ｏ⇔グリセロール＋ホスフェート。したがって、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の機能的
破壊も同様に本明細書で提供される組成物および方法に使用される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅのＧＰＰ２／ＨＯＲ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｎｏｒｂｅ
ｃｋら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１巻（２３号）
：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）、およびＰａｈｌｍａｎら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６巻（５号）：３５５５〜３５６３頁（
２００１年）を参照されたい。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのＧＰＰ２／ＨＯＲ２ヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＭ＿００１１７８９５
３．３、および本明細書で提供される配列番号７が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧｐｐ１／Ｒｈｒ２タンパク質配列としては、受
託番号ＮＰ＿０１０９８４、および本明細書で提供される配列番号８が挙げられる。
【００６３】
当技術分野で理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存在する
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２および／またはＧＰＰ２／ＨＯＲ２のホモログも同様に本明細書に記
載の方法を使用して失活させることができる。さらに、アセチル−ホスファターゼ活性を
コードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチド（例えば、ＲＨＲ２お
よび／またはＨＯＲ２）を、他のポリヌクレオチド、遺伝子および／もしくはポリペプチ
ド配列を同定するため、または他の宿主細胞におけるアセチル−ホスファターゼ活性を有
するホモログを同定するために使用することができる。このような配列は、例えば、文献
においておよび／または当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて
同定することができる。例えば、他の細胞型におけるアセチル−ホスファターゼ活性をコ
ードする配列のバイオインフォマティクスを使用した同定は、本明細書で提供されるもの
などのアセチル−ホスファターゼ活性および／またはグリセロール−１−ホスファターゼ
活性をコードする公知のＤＮＡ配列およびポリペプチド配列を伴う公的に利用可能なデー
タベースのＢＬＡＳＴ（上記）検索によって実現することができる。同一性は、初期状態
のパラメータ、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナ
ルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝０．１、およびタンパク質重み行列
のＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズを使用したアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基
づいたものであってよい。
【００６４】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素（例え
ば、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２）の活性または発現が少なくとも約５０％低下する。別の実
施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の活性または発現
が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の活性または発現の低下ま
たは欠失を含まない組換え微生物と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、
少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、
少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％低下する。一部の
実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素はＲＨＲ２また
はその相同体である。一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換す
る内因性酵素はＨＯＲ２またはその相同体である。
【００６５】
当業者に理解される通り、これだけに限定されないが、調節型プロモーターの使用、弱
い構成的プロモーターの使用、二倍体酵母におけるタンパク質をコードする遺伝子の２つ
のコピーのうちの１つの破壊、二倍体酵母における遺伝子の両方のコピーの破壊、アンチ
センス核酸の発現、ｓｉＲＮＡの発現、内因性プロモーターの負の調節因子の過剰発現、
内因性遺伝子もしくは異種遺伝子の活性の変更、特異的活性が低い異種遺伝子の使用など
、またはこれらの組合せを含めた、グリセロール−１−ホスファターゼ（例えば、ＲＨＲ
２および／またはＨＯＲ２）などのアセチルホスフェートをアセテートに変換するタンパ
ク質の活性を低下させるまたは破壊するために利用可能ないくつかの機構が存在する。
【００６６】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性（例えば
、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）をコードする少なくとも
１種の遺伝子の変異を含み、それにより、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの
活性の低下がもたらされる。別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホス
ファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログも
しくはバリアント）の部分的な欠失を含み、それにより、遺伝子によりコードされるポリ
ペプチドの活性の低下がもたらされる。別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセ
チル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはその
ホモログもしくはバリアント）の完全な欠失を含み、それにより、遺伝子によりコードさ
れるポリペプチドの活性の低下がもたらされる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変宿
主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯ
Ｒ２またはそのホモログもしくはバリアント）に付随する調節領域の改変を含み、それに
より、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の低下がもたらされる。さらに
別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、転写調節因子の改変を含み、それにより、ア
セチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそ
のホモログもしくはバリアント）の転写の低下がもたらされる。
【００６７】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートからアセテートへの変換を触媒することが
できるタンパク質をコードする１種または複数種の遺伝子の破壊は、微生物細胞に構築物
が導入されると、このような遺伝子（例えば、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２）を特異的に破壊
し、それにより、破壊された遺伝子を非機能的にすることができる「破壊構築物」を使用
することによって実現される。一部の実施形態では、標的遺伝子の破壊により、機能的タ
ンパク質の発現が妨げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子の破壊により、破壊され
た遺伝子から非機能的タンパク質が発現される。一部の実施形態では、アセチルホスフェ
ートをアセテートに変換することができるタンパク質をコードする遺伝子の破壊は、「破
壊性配列」を相同組換えにより標的遺伝子座に組み込むことによって実現される。このよ
うな実施形態では、破壊構築物は、標的遺伝子座のヌクレオチド配列の対と相同なヌクレ
オチド配列の対（相同配列）で挟まれた破壊性配列を含む。標的遺伝子の標的部分を破壊
構築物で置き換えると、破壊性配列により、標的遺伝子からの機能的タンパク質の発現が
妨げられるまたは非機能的タンパク質の発現が引き起こされる。
【００６８】
遺伝子を破壊することができる破壊構築物は、当技術分野で周知の標準の分子生物学技
法を使用して構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３
版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ、ＮＹを参照されたい。本方法の実施において変動し得る破壊構築物のパラメータとし
ては、これだけに限定されないが、相同配列の長さ；相同配列のヌクレオチド配列；破壊
性配列の長さ；破壊性配列のヌクレオチド配列、および標的遺伝子のヌクレオチド配列が
挙げられる。一部の実施形態では、各相同配列の長さの有効な範囲は５０〜５，０００塩
基対である。特定の実施形態では、各相同配列の長さは約５００塩基対である。遺伝子タ
ーゲティングのために必要な相同性の長さの考察に関しては、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃ
ｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１巻：５５８６〜９１頁（１９９１年）を参照されたい。一部の実
施形態では、相同配列は標的遺伝子のコード配列を含む。他の実施形態では、相同配列は
標的遺伝子の上流または下流の配列を含む。一部の実施形態では、１つの相同配列は標的
遺伝子のコード配列の５’側に位置するヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含
み、他の相同配列は標的遺伝子のコード配列の３’側に位置するヌクレオチド配列と相同
なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、破壊性配列は、破壊性配列を含む微生
物細胞の選択を可能にする選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。したがっ
て、このような実施形態では、破壊構築物は、二重の機能、すなわち、標的遺伝子を機能
的に破壊する機能と、標的遺伝子が機能的に破壊された細胞を同定するための選択マーカ
ーをもたらす機能を有する。一部の実施形態では、標的遺伝子によりコードされる野生型
タンパク質のある程度の活性を有する融合タンパク質が生じ得る翻訳リードスルーを防止
するために、終結コドンを、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の下流にインフ
レームで配置する。一部の実施形態では、破壊性配列の長さは一塩基対である。コード配
列に単一の塩基対を挿入することにより、機能的タンパク質の発現が妨げられ得るフレー
ムシフト変異が構成され得るので、標的遺伝子を破壊するためには単一の塩基対の挿入で
十分であり得る。一部の実施形態では、破壊配列の配列は、相同配列間に位置する標的遺
伝子のヌクレオチド配列とは単一の塩基対が異なる。標的遺伝子内のヌクレオチド配列を
破壊性配列で置き換えると、導入される単一の塩基対の置換により、タンパク質内の重要
な部位における単一のアミノ酸の置換および非機能的タンパク質の発現がもたらされ得る
。しかし、非常に短い破壊性配列を使用して実施された破壊は自然突然変異によって野生
型配列に後戻りしやすく、したがって、宿主株にアセチル−ホスファターゼ機能の回復が
もたらされることが理解されるべきである。したがって、特定の実施形態では、破壊性配
列は一塩基対〜数塩基対よりも長い。反対の極端な場合では、過剰な長さの破壊性配列で
は中程度の長さの破壊性配列に対していかなる利点も付与される見込みがなく、トランス
フェクションまたはターゲティングの効率が低下する可能性がある。この場合の過剰な長
さとは、標的遺伝子内の選択された相同配列間の距離よりも何倍もの長さである。したが
って、ある特定の実施形態では、破壊性配列の長さは２〜２，０００塩基対であり得る。
他の実施形態では、破壊性配列の長さは、破壊構築物内の相同配列とマッチする標的遺伝
子座の領域間の距離とほぼ同等の長さである。
【００６９】
一部の実施形態では、破壊構築物は直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、破壊構
築物は環状ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、環状破壊構築物は、上記の通り破壊
性配列によって隔てられた相同配列の対を含む。一部の実施形態では、環状破壊構築物は
単一の相同配列を含む。このような環状破壊構築物は、標的遺伝子座に組み込まれると、
直線になり、相同配列の一部が各末端に位置し、標的遺伝子ヌクレオチド配列のいずれも
置き換えることなく、破壊構築物の残りのセグメントが標的遺伝子に挿入され、それを破
壊する。特定の実施形態では、環状破壊構築物の単一の相同配列は標的遺伝子のコード配
列内に位置する配列と相同である。
【００７０】
破壊構築物は、それだけに限定することなく当業者に公知の任意の方法によって微生物
細胞に導入することができる。このような方法としては、これだけに限定されないが、細
胞による溶液からの分子の直接取り込み、または、例えばリポソームもしくは免疫リポソ
ーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を使用したリポフェクションにより容易にした取
り込み；粒子媒介性トランスフェクションなどが挙げられる。例えば、米国特許第５，２
７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇ
ｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−
Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを
参照されたい。酵母細胞を形質転換するための特定の方法は当技術分野で周知である。Ｈ
ｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１２
９２〜３頁（１９７８年）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：
３３７６〜３３８５頁（１９８５年）を参照されたい。例示的な技法としては、これだけ
に限定されないが、スフェロプラスト法、電気穿孔、ＰＥＧ１０００媒介性形質転換、お
よび酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性形質転換が挙げられる。
【００７１】
５．５  アセチルＣｏＡ産生を改善するためのさらなる改変  
５．５．１  ＡＤＡ
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アシル化アセトア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ（あるいは「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル
化」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」、またはＡＤＡと称される（
ＥＣ１．２．１．１０））をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさら
に含む。
【００７２】
本明細書で提供される組成物および方法に有用な、この反応を触媒することができるタ
ンパク質としては、以下の４種のタンパク質が挙げられる：
（１）アセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの可逆的な変換、およびその後のアセト
アルデヒドからエタノールへの可逆的な変換を触媒する二機能性タンパク質。この種類の
タンパク質の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡｄｈＥタンパク質（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ｎｏ
：ＮＰ＿４１５７５７）である。ＡｄｈＥは、遺伝子融合の進化的な産物であると思われ
る。ＡｄｈＥタンパク質のＮＨ２末端領域はアルデヒド：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ
と高度に相同であり、ＣＯＯＨ末端領域はＦｅ２＋依存性エタノール：ＮＡＤ＋  オキシ
ドレダクターゼのファミリーと相同である（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら
、（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻：３３８６９〜３３８７５頁
）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｄｈＥは金属に触媒される酸化を受け、したがって、酸素感受性で
ある（Ｔａｍａｒｉｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻：３０
２７〜３２頁）。
【００７３】
（２）厳密にまたは通性の嫌気性微生物におけるアセチルＣｏＡからアセトアルデヒド
への可逆的な変換を触媒するが、アルコール脱水素酵素活性を有さないタンパク質。この
種類のタンパク質の例は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて報告され
ている（Ｓｍｉｔｈら（１９８０年）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．
２０３巻：６６３〜６７５頁）。ＡＤＡはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ
ＤＳＭ  ５５５（受託番号：ＥＤＫ３３１１６）のゲノム内にアノテートされている。
相同なタンパク質ＡｃｄＨがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのゲノム
において同定される（受託番号：ＮＰ＿７８４１４１）。この種類のタンパク質の別の例
はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ５９３におけるａ
ｌｄ遺伝子産物である（Ｔｏｔｈら（１９９９年）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５巻：４９７３〜４９８０頁、受託番号：ＡＡＤ３１８４１）。
【００７４】
（３）エタノールアミン異化に関与するタンパク質。エタノールアミンは、炭素源と窒
素源の両方として多くの腸内細菌により利用され得る（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１
９９５年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７巻：１３５７〜１３６６頁）。エタノー
ルアミンは、まずエタノールアミンアンモニアリアーゼによってアンモニアおよびアセト
アルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドがＡＤＡによってアセチルＣｏＡに変
換される。この種類のＡＤＡの例はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにお
けるＥｕｔＥタンパク質である（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１９９５年）Ｊ．  Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７巻：１３５７〜１３６６頁、受託番号：ＡＡＬ２１３５７；Ｕ
１８５６０．１も参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉもエタノールアミンを利用することがで
き（Ｓｃａｒｌｅｔｔら（１９７６年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９５巻
：１７３〜１７６頁）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＥｕｔＥタンパク質と相同
なＥｕｔＥタンパク質（受託番号：ＡＡＧ５７５６４；ＥＵ８９７７２２．１も参照され
たい）を有する。
【００７５】
（４）４−ヒドロキシ−２−ケトバレレート異化に関与する二機能性アルドラーゼ−デ
ヒドロゲナーゼ複合体の一部であるタンパク質。このような二機能性酵素により、多くの
細菌種におけるフェノール、トルエート、ナフタレン、ビフェニルおよび他の芳香族化合
物の分解の中間体であるカテコールに対するメタ開裂経路の最終的な２つのステップが触
媒される（ＰｏｗｌｏｗｓｋｉおよびＳｈｉｎｇｌｅｒ（１９９４年）Ｂｉｏｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ  ５巻、２１９〜２３６頁）。４−ヒドロキシ−２−ケトバレレートは、ま
ず、４−ヒドロキシ−２−ケトバレレートアルドラーゼによってピルビン酸およびアセト
アルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドがＡＤＡによってアセチルＣｏＡに変
換される。この種類のＡＤＡの例はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＣＦ６００における
ＤｍｐＦタンパク質（受託番号：ＣＡＡ４３２２６）である（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら（１９
９２年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４巻：７１１〜２４頁）。Ｅ．ｃｏｌｉは、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＦ６００におけるＤｍｐＦタンパク質と相同なＭｐ
ｈＦタンパク質を有する（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら（１９９７年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．  １７９巻：２５７３〜２５８１頁、受託番号：ＮＰ＿４１４８８５）。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法に有用なＡＤＡ（またはこの
ような活性をコードする核酸配列）は、その内容全体が参照により組み込まれる国際公開
第ＷＯ２００９／０１３１５９号に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｄｈＥ
、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ  ａｄｈ２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｄｈＥ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｅ２  ａｄｈＥ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＥＤＫ３３１１６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ａｃｄＨ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＹＰ
００１２６８１８９）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＤＡは、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｅｕｔＥ（ＦＲ７４５８７５．１）、Ｄｅｓ
ｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ｅｕｔＥ（ＣＲ５２２８７０．１）、
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＨＢＳ−２  ｅｕｔＥ（ＡＢＱ４４５１１．２）、
Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ  ａｂｙｓｓｉ  ｅｕｔＥ（ＺＰ＿０９５４９５７６）、およびＨ
ａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉｉ  ＡＴＣＣ  ４９２３９（ＹＰ＿０
０２５６５３３７．１）からなる群から選択される。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法に有用なＡＤＡは、Ｄｉ
ｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥである。代表的なＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅのｅｕ
ｔＥヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿０１２９１２．１：１１１０４７６．．
１１１１８５５、および本明細書で提供される配列番号９が挙げられる。代表的なＤｉｃ
ｋｅｙａ  ｚｅａｅのｅｕｔＥタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００３００３３
１６、および本明細書で提供される配列番号１０が挙げられる。
【００７８】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なＡＤＡとしては、本明細
書に記載のＡＤＡのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘
導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のＡＤＡのいずれかと実質的な相同
性を共有する、および（２）アセトアルデヒドからアセチルＣｏＡへの変換を触媒するこ
とができる。ＡＤＡの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が本明細書に記載のＡＤＡのいず
れかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも
９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、ＡＤＡと「実質的な相同性」を
共有するといえる。
【００７９】
５．５．２  ＰＤＨ−バイパスの機能的破壊
アセチルＣｏＡは、ミトコンドリアにおいてＰＤＨ複合体により触媒されるピルビン酸
の酸化的脱カルボキシル化によって形成され得る。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは
アセチルＣｏＡをミトコンドリアの外に輸送することができないので、ＰＤＨバイパスは
、細胞質ゾル区画内にアセチルＣｏＡをもたらすことにおいて重要な役割を果たし、ピル
ビン酸をアセチルＣｏＡに変換するためのＰＤＨ反応に対する代替の経路をもたらす。Ｐ
ＤＨバイパスには、酵素であるピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ；ＥＣ４．１．１
．１）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ；ＥＣ１．２．１．５およびＥＣ
１．２．１．４）、およびアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ；ＥＣ６．２．１．１）
が関与する。ピルビン酸デカルボキシラーゼにより、ピルビン酸からアセトアルデヒドお
よび二酸化炭素への脱カルボキシル化が触媒される。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ
により、アセトアルデヒドが酢酸に酸化される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、アルデ
ヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは５種のメンバーを含有する。ＡＬＤ２（ＹＭＲ１７
０ｃ）、ＡＬＤ３（ＹＭＲ１６９ｃ）、およびＡＬＤ６（ＹＰＬ０６１ｗ）は細胞質ゾル
内アイソフォームに対応し、ＡＬＤ４（ＹＯＲ３７４ｗ）およびＡＬＤ５（ＹＥＲ０７３
ｗ）はミトコンドリア内の酵素をコードする。主要な細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼアイソフォームは、ＡＬＤ６によりコードされる。アセテートからのアセチ
ルＣｏＡの形成はＡＣＳにより触媒され、ＡＴＰの加水分解を伴う。ＡＣＳは２つの構造
遺伝子、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２によりコードされる。
【００８０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパス
経路の１種または複数種の遺伝子の機能的破壊をさらに含む。一部の実施形態では、宿主
細胞のＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の遺伝子の破壊により、以下の反応のうちの
１つまたは複数を触媒する能力が損なわれた遺伝子改変微生物細胞が生じる：（１）ピル
ビン酸デカルボキシラーゼによるピルビン酸からアセトアルデヒドへの脱カルボキシル化
；（２）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによるアセトアルデヒドからアセテートへの
変換、および（３）アセチルＣｏＡシンテターゼによるアセテートおよびＣｏＡからのア
セチルＣｏＡの合成。
【００８１】
一部の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞はＰＤＨ−バイパス経路の１種また
は複数種の遺伝子の機能的破壊を含み、機能が低下したまたは非機能的ＰＤＨ−バイパス
経路の単独で、または弱いＡＤＡと組み合わせた活性は、宿主細胞の成長、生存能力、お
よび／または健康を支持するために十分でない。
【００８２】
一部の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の内因性タンパク質の活性
または発現が少なくとも約５０％低下する。別の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスの１種
または複数種の内因性タンパク質の活性または発現が、ＰＤＨ−バイパスの１種または複
数種の内因性タンパク質の活性または発現の低下または欠失を含まない組換え微生物と比
較して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７
５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９
５％、または少なくとも約９９％低下する。
【００８３】
５．５．２．１  ＡＬＤ４およびＡＬＤ６
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ）活性
をコードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アル
デヒドデヒドロゲナーゼは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６、なら
びにそのホモログおよびバリアントからなる群から選択される遺伝子によりコードされる
。
【００８４】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＬＤ４の機能的破壊を含む。代表的な
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＤ４ヌクレオチド配列として
は、受託番号ＮＭ＿００１１８３７９４、および本明細書で提供される配列番号１１が挙
げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｄ４タン
パク質配列としては、受託番号ＮＰ＿０１５０１９．１、および本明細書で提供される配
列番号１２が挙げられる。
【００８５】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、細胞質ゾル内アルデヒドデヒドロゲナー
ゼ（ＡＬＤ６）の機能的破壊を含む。Ａｌｄ６ｐは、ネイティブなＰＤＨ−バイパスにお
いて、アセトアルデヒドがアセテートに変換されるように機能する。代表的なＳａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＤ６ヌクレオチド配列としては、受託番
号ＳＣＵ５６６０４、および本明細書で提供される配列番号１３が挙げられる。代表的な
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｄ６タンパク質配列としては
、受託番号ＡＡＢ０１２１９、および本明細書で提供される配列番号１４が挙げられる。
【００８６】
当技術分野において理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存
在するアルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログも同様に本明細書に記載の方法を使用して
失活させることができる。
【００８７】
当業者には理解される通り、２種以上のアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性または発現
を低下させるまたは排除することができる。具体的な一実施形態では、ＡＬＤ４およびＡ
ＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除
する。別の具体的な実施形態では、ＡＬＤ５およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくは
バリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。さらに別の具体的な実施形態
では、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活
性または発現を低下させるまたは排除する。さらに別の具体的な実施形態では、細胞質ゾ
ルに局在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ  ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、およびＡＬＤ６または
そのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。さらに
別の具体的な実施形態では、ミトコンドリアに局在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ａ
ＬＤ４およびＡＬＤ５またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下さ
せるまたは排除する。
【００８８】
５．５．２．２  ＡＣＳ１およびＡＣＳ２
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）活性を
コードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アセチ
ルＣｏＡシンテターゼは、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ならびにそのホモログおよびバリアント
からなる群から選択される遺伝子によりコードされる。
【００８９】
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）活性を
コードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。ＡＣＳ１およびＡＣＳ２はど
ちらもアセテートをアセチルＣｏＡに変換することができるアセチルＣｏＡシンテターゼ
である。ＡＣＳ１は呼吸性条件下でのみ発現され、ＡＣＳ２は構成的に発現される。ＡＣ
Ｓ２をノックアウトすると、株は呼吸性条件（例えば、エタノール、グリセロール、また
はアセテート培地）では成長することができるが、発酵性炭素源（例えば、スクロース、
グルコース）では死滅する。
【００９０】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＣＳ１の機能的破壊を含む。Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｎａｇａｓ
ｕら、Ｇｅｎｅ  ３７巻（１〜３号）：２４７〜２５３頁（１９８５年）を参照されたい
。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ１ヌクレオチド
配列としては、受託番号Ｘ６６４２５、および本明細書で提供される配列番号１５が挙げ
られる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｃｓ１タンパ
ク質配列としては、受託番号ＡＡＣ０４９７９、および本明細書で提供される配列番号１
６が挙げられる。
【００９１】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＣＳ２の機能的破壊を含む。Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｖａｎ  ｄ
ｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３１巻（３号）：７０４〜７
１３頁（１９９５年）を参照されたい。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２ヌクレオチド配列としては、受託番号Ｓ７９４５６、および本明
細書で提供される配列番号１７が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｃｓ２タンパク質配列としては、受託番号ＣＡＡ９７７２５、お
よび本明細書で提供される配列番号１８が挙げられる。
【００９２】
当技術分野において理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存
在するアセチルＣｏＡシンテターゼのホモログも同様に本明細書に記載の方法を使用して
失活させることができる。
【００９３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、呼吸性条件下で（すなわち、宿主細胞を例えばエタ
ノール、グリセロール、またはアセテートの存在下で成長させた場合に）アセテートをア
セチルＣｏＡに変換することができる細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含
む。一部のこのような実施形態では、宿主細胞はＡＣＳ１活性を含む酵母細胞である。他
の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞は、呼吸性条件下では内因性アセチルＣｏ
Ａシンテターゼ活性を含まない、またはそれが低下している。一部のこのような実施形態
では、宿主細胞は、親細胞と比較してＡＣＳ１活性を含まない、またはそれが低下してい
る酵母細胞である。
【００９４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、非呼吸性条件下で（すなわち、宿主細胞を発酵性炭
素源（例えば、スクロース、グルコース）の存在下で成長させた場合に）アセテートをア
セチルＣｏＡに変換することができる細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含
む。一部のこのような実施形態では、宿主細胞はＡＣＳ２活性を含む酵母細胞である。他
の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞は、非呼吸性条件下で内因性アセチルＣｏ
Ａシンテターゼ活性を含まない、またはそれが低下している。一部のこのような実施形態
では、宿主細胞は、親細胞と比較して、ＡＣＳ２活性を含まない、またはそれが低下して
いる酵母細胞である。
【００９５】
一部の実施形態では、宿主細胞は、異種ＰＫおよび細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテ
ターゼ活性（例えば、ＡＣＳ１および／またはＡＣＳ２）を含む。このような実施形態で
は、宿主細胞においてＰＫによりアセチルホスフェートが産生される。インタクトな細胞
質ゾル内ＡＣＳ活性により、ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２により触媒されるアセチル
ホスフェートのアセチルＣｏＡへの加水分解の結果として蓄積するアセテートが変換され
得る。
【００９６】
５．６  イソプレノイド産生のためのＭＥＶ経路
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１種
または複数種の異種酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の
酵素は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する
酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、２分子のア
セチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態
では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡ
を縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の
１種または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む。一部
の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネートをメバロネート
５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種ま
たは複数種の酵素は、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェー
トに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は
、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素
を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセチルＣｏＡチオラ
ーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンテターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ
レダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリ
ン酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、アセトアセチ
ルＣｏＡの形成を触媒することができるＭＥＶ経路の酵素に関しては、遺伝子改変宿主細
胞は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例え
ばアセチルＣｏＡチオラーゼ；またはアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセ
トアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかを
含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させ
てアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼと、アセチル
ＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセ
トアセチルＣｏＡシンターゼの両方を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２種以上の酵素をコードする１種また
は複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路
の２種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施
形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することができる酵素およ
びメバロネートをメバロネート５−ホスフェートに変換することができる酵素をコードす
る１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、
ＭＥＶ経路の３種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４種の酵素をコードする１種または複数
種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５種
の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態で
は、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオ
チド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７種の酵素をコードす
る１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、
ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰ
Ｐ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコ
ードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰ分
子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができ
る酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は
、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵
素をコードする異種核酸をさらに含む。
【０１００】
５．６．１  アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、２分子のアセチル補酵素Ａを縮合させて
アセトアセチルＣｏＡを形成することができる酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼを
コードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列
の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２
３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２
；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１０１】
アセチルＣｏＡチオラーゼにより、２分子のアセチルＣｏＡの可逆的な縮合が触媒され
てアセトアセチルＣｏＡが生じるが、この反応は熱力学的に好ましくない；アセトアセチ
ルＣｏＡチオリシスがアセトアセチルＣｏＡ合成よりも好まれる。アセトアセチルＣｏＡ
シンターゼ（ＡＡＣＳ）（あるいはアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェ
ラーゼ；ＥＣ２．３．１．１９４と称される）により、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡ
が縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される。アセチルＣｏＡチオラーゼとは対照的に
、ＡＡＣＳにより触媒されるアセトアセチルＣｏＡ合成は、付随するマロニルＣｏＡの脱
カルボキシル化に起因して、基本的にエネルギーが好まれる反応である。さらに、ＡＡＣ
ＳはアセトアセチルＣｏＡに対してチオリシス活性を示さず、したがって、反応は不可逆
的である。
【０１０２】
アセチルＣｏＡチオラーゼおよび異種ＡＤＡおよび／またはホスホトランスアセチラー
ゼ（ＰＴＡ）を含む宿主細胞では、アセチルＣｏＡチオラーゼにより触媒される可逆反応
では、アセトアセチルＣｏＡチオリシスが好まれ、大きなアセチルＣｏＡプールが生じ得
る。ＡＤＡの可逆的な活性を考えると、このアセチルＣｏＡプールにより、今度はアセチ
ルＣｏＡがアセトアルデヒドに変換される逆反応に向けてＡＤＡが駆動され、それにより
、アセチルＣｏＡ産生に向かうＡＤＡによってもたらされる利益が減少する可能性がある
。同様に、ＰＴＡの活性は可逆的であり、したがって、大きなアセチルＣｏＡプールによ
り、アセチルＣｏＡがアセチルホスフェートに変換される逆反応に向けてＰＴＡが駆動さ
れる可能性がある。したがって、一部の実施形態では、アセチルＣｏＡに対する強力な引
きをもたらしてＡＤＡおよびＰＴＡの正反応を駆動するために、本明細書で提供される遺
伝子改変宿主細胞のＭＥＶ経路ではアセトアセチルＣｏＡシンターゼを利用してアセチル
ＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを形成する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＡＡＣＳはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株に由
来する（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７巻
（２５号）：１１２６５〜７０頁（２０１０年）。代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  
ｓｐ．ＣＬ１９０株のＡＡＣＳヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＢ５４０１３１．
１、および本明細書で提供される配列番号１９が挙げられる。代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株のＡＡＣＳタンパク質配列としては、受託番号Ｄ７ＵＲＶ
０、ＢＡＪ１００４８、および本明細書で提供される配列番号２０が挙げられる。本明細
書で提供される組成物および方法に有用な他のアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては
、これだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  （ＡＢ１８３７５０
；ＫＯ−３９８８  ＢＡＤ８６８０６）；Ｓ．  ａｎｕｌａｔｕｓ  ９６６３株（ＦＮ１
７８４９８；ＣＡＸ４８６６２）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ−３９８８
（ＡＢ２１２６２４；ＢＡＥ７８９８３）；Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．  Ａ４
０６４４  （ＡＢ１１３５６８；ＢＡＤ０７３８１）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ
．  Ｃ  （ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０；ＺＰ＿０５５１１７０２）；Ｎｏｃａｒ
ｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１  （ＮＺ＿ＡＢＵＩ０
１００００２３；ＺＰ＿０４３３５２８８）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒ
ａｎｓ  Ａｇｙ９９  （ＮＣ＿００８６１１；ＹＰ＿９０７１５２）；Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ  （ＮＣ＿０１０６１２；ＹＰ＿００１８５１５０２）
；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇ１  （ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１；ＺＰ＿０５
００２６２６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＡＡ４  （ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１０
０００３７；ＺＰ＿０５４７８９９２）；Ｓ．  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １
５９９８  （ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１０００２９５；ＺＰ＿０４６９６７６３）；Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＡＣＴＥ  （ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０；ＺＰ＿０６２
７５８３４）；Ｓ．  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６  （Ｎ
Ｚ＿ＡＣＥＺ０１００００３１；ＺＰ＿０５５２９６９１）；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  
ＣｃＩ３  （ＮＣ＿００７７７７；ＹＰ＿４８０１０１）；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓ
ｉｌｉｅｎｓｉｓ  （ＮＣ＿０１８６８１；ＹＰ＿００６８１２４４０．１）；およびＡ
ｕｓｔｗｉｃｋｉａ  ｃｈｅｌｏｎａｅ  （ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５；ＺＰ＿１
０９５０４９３．１）が挙げられる。追加の適切なアセトアセチルＣｏＡシンターゼとし
て、その内容全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４
９号および同第２０１１／０２８１３１５号に記載されているものが挙げられる。
【０１０４】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なアセトアセチルＣｏＡシ
ンターゼとしては、本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘
導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１
）本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を共有
する、および（２）アセトアセチルＣｏＡが形成されるアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡ
の不可逆的な縮合を触媒することができる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼの誘導体は
、誘導体のアミノ酸配列がアセトアセチルＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と少なくとも
８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれ
ば、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【０１０５】
５．６．２  アセトアセチルＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡの別の分子
を縮合させて３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成
することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド
配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに
限定されないが、（ＮＣ＿００１１４５．ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  １９０６１．２０５３
６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓ
ｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００２
７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。
【０１０６】
５．６．３  ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロネートへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することがで
きる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む
。一部の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨ使用ヒドロキシメチル
グルタリル−ＣｏＡレダクターゼ−ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ
ーゼ（ＥＣ１．１．１．３４；ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから
（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒するものであり、クラスＩ  ＨＭＧｒ
およびクラスＩＩ  ＨＭＧｒの２つのクラスにカテゴリー化することができる。クラスＩ
は真核生物および大多数の古細菌由来の酵素を含み、クラスＩＩはある特定の原核生物お
よび古細菌のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。配列の相違に加えて、この２つのクラ
スの酵素は、これらの補因子特異性に関しても異なる。ＮＡＤＰＨを排他的に利用するク
ラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡ
ＤＨを識別するその能力が変動する。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８６巻（７号）：１９２７〜１９３２頁（２００４年）を参照
されたい。クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを選択するための補因子特異性が以
下に提供される。
【０１０７】
【表１】
2019213558.tif 000003
本明細書で提供される組成物および方法に有用なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしては
、ＮＡＤＨを補因子として利用することができるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、
Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＨＭＧ−
ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、
例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉまたはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａ
ｎｓ由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを補因子として利用することが
できる。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉに由来する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．
８８）をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａ遺伝子
の配列は以前に記載されている。ＢｅａｃｈおよびＲｏｄｗｅｌｌ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．  １７１巻：２９９４〜３００１頁（１９８９年）を参照されたい。代表的なＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉのｍｖａＡヌクレオチド配列としては、受託
番号Ｍ２４０１５、および本明細書で提供される配列番号２１が挙げられる。代表的なＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配
列としては、受託番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶ、および
本明細書で提供される配列番号２２が挙げられる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＳｉｌｉｃｉｂａｃ
ｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉに由来する。代表的なＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒ
ｏｙｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００６
５６９．１、および本明細書で提供される配列番号２３が挙げられる。代表的なＳｉｌｉ
ｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列とし
ては、受託番号ＹＰ＿１６４９９４、および本明細書で提供される配列番号２４が挙げら
れる。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＤｅｌｆｔｉａ  ａ
ｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来する。代表的なＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、ＮＣ＿０１０００２  ＲＥＧＩ
ＯＮ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（３１９９８０．．３２１２６９）、および本明細書で提供
される配列番号２５が挙げられる。代表的なＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１５６１３１
８、および本明細書で提供される配列番号２６が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＳｏｌａｎｕｍ  ｔ
ｕｂｅｒｏｓｕｍに由来する（Ｃｒａｎｅら、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １
５９巻：１３０１〜１３０７頁（２００２年））。
【０１１２】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−Ｃ
ｏＡレダクターゼとしては、本明細書に記載のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ
、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉおよびＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒ
ａｎｓに由来するものいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「
誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレ
ダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）補因子としてＮＡＤＨ
を優先的に使用しながら（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱
アシル化を触媒することができる。ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの誘導体は
、誘導体のアミノ酸配列がＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列と少
なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同
じであれば、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有する
といえる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ＮＡＤＨ使用」という句は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−Ｃｏ
Ａレダクターゼが、例えば、ＮＡＤＨに対する特異的活性がＮＡＤＰＨに対するものより
も高いことが実証されることにより、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して選
択的であることを意味する。一部の実施形態では、補因子としてのＮＡＤＨに対する選択
性は、ｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比で表される。一部の実施形態で
は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡ
ＤＰＨ）比は少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５超である。一部の実施形
態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＮＡＤＨを排他的に使用する。例え
ば、ＮＡＤＨを排他的に使用するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ｉｎ  ｖ
ｉｔｒｏにおいてＮＡＤＨを唯一の補因子として供給するといくらかの活性を示し、ＮＡ
ＤＰＨを唯一の補因子として供給した場合には検出可能な活性を示さない。その内容全体
が本明細書に組み込まれるＫｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９巻：１２２６
〜１２３４頁（２０００年）、およびＷｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  
１８２巻（１８号）：５１４７〜５２頁（２０００年）に記載されているものを含めた、
補因子特異性を決定するための当技術分野で公知の任意の方法を利用して、補因子として
ＮＡＤＨを好むＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを同定することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＰＤＨよりも
ＮＡＤＨに対して選択的になるように、例えば、補因子結合ポケットの部位特異的変異誘
発によって工学的に操作されている。ＮＡＤＨ選択性を工学的に操作するための方法はＷ
ａｔａｎａｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３巻：３０４４〜３０５４頁（２０
０７年）に記載されており、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの補因子特異性を決定するため
の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉ．  ９巻：１２２６〜１２３４頁（２０００年）に記載されている。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、メバロネート分解
経路をネイティブに含む宿主種、例えば、メバロネートをその唯一の炭素源として異化す
る宿主種に由来する。これらの実施形態の中では、通常そのネイティブな宿主細胞内の内
部移行した（Ｒ）−メバロネートの（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒す
るＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを利用して、メバロネート生合成経路を含む
遺伝子改変宿主細胞における逆反応、すなわち（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバ
ロネートへの還元的脱アシル化を触媒する。メバロネートをそれらの唯一の炭素源として
成長することができる原核生物は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、
Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１巻（１２号）：６４６８〜６４
７２頁（１９８９年）；Ｂｅａｃｈら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１巻：２９９
４〜３００１頁（１９８９年）；Ｂｅｎｓｃｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４
５巻：３７５５〜３７６２頁；Ｆｉｍｏｎｇｎａｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４
巻：２０８６〜２０９０頁（１９６５年）；Ｓｉｄｄｉｑｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８巻：１１０〜１１３頁（１９６２年）；Ｓ
ｉｄｄｉｑｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ９３巻：２０７〜２１４頁（１９６７年
）、およびＴａｋａｔｓｕｊｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃ
ｏｍｍｕｎ．１１０巻：１８７〜１９３頁（１９８３年）に記載されている。
【０１１６】
本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態では、宿主細胞は、ＮＡＤＨ
使用ＨＭＧｒとＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方を含む。ＮＡＤＰＨ使
用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけ
に限定されないが、（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ
１１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＡＢ０１５６２
７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ  ３９８８）、（ＡＸ１２８２１３、切断
型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする配列をもたらす；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および（ＮＣ＿００１１４５：相補体（１１５７３４．１
１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１７】
５．６．４  メバロネートからメバロネート−５−ホスフェートへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートに変
換することができる酵素、例えば、メバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配
列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限
定されないが、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、および
（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１８】
５．６．５  メバロネート−５−ホスフェートからメバロネート−５−ピロホスフェー
トへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−
ピロホスフェートに変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコー
ドする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実
例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉ
ｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ
＿００１１４５．相補体  ７１２３１５．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１９】
５．６．６  メバロネート−５−ピロホスフェートからＩＰＰへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニ
ルジホスフェート（ＩＰＰ）に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸
デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコード
するヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｘ９７５５７；Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
）が挙げられる。
【０１２０】
５．６．７  ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路により生成したＩＰＰをジメチルアリル
ピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラー
ゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレ
オチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＣ＿０００９１３、３０３
１０８７．３０３１６３５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、および（ＡＦ０８２
３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられる。
【０１２１】
５．６．８  ポリプレニルシンターゼ
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合さ
せて炭素を６つ以上含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシ
ンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、１分子のＩＰＰと１分子のＤＭＡＰＰを縮合させて
１分子のゲラニルピロホスフェート（「ＧＰＰ」）を形成することができる酵素、例えば
ＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードす
るヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ５１３１１１；
Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、
（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒ
ｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕ
ｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８
７７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ  １４
５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４
５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（
ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２
８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  
ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ
）、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚ
ｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  
ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）および（ＡＦ
２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）
が挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、２分子のＩＰＰと１分子のＤＭＡＰＰを縮合させる
かＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加してファルネシルピロホスフェート（「ＦＰＰ」）
の分子を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオ
チド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだ
けに限定されないが、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ
）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６
３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕ
ｓ）、（Ｄ００６９４；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（ＡＥ００９
９５１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔ
ｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧ
ＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ
ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（Ａ
Ｆ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ
ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉ
ｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕ
ｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣ
ＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈ
ｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇ
ｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳ
ＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕ
ｓ  ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００
００１７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎ
ｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕ
ｓ  ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２
０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａ
ｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏ
ｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａ
ｎａ）、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕ
ｓ  ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）
、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（Ｙ
Ｐ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅ
ｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ
．  Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  
ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ  
ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ  
ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（Ａ
Ｅ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）、および（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ  ７７９７０
６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられる。
【０１２４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを組み合
わせてゲラニルゲラニルピロホスフェート（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素
をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオ
チド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａ
ｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉ
ｓ、ＡＴＣＣ  ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈ
ｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００１
４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎ
ｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ
ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ
０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍ
ｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄ
ｅｓ  ｆ．  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕ
ｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ  ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏ
ｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、
（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔ
ｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕ
ｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａ
ｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏ
ｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ  Ｙ
Ｐ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、（
ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒ
ｉ  ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ
）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、
Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１
、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、
（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ）、および（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿７２１０１５；
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）が挙げられる。
【０１２５】
５．６．９  テルペンシンターゼ
一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペ
ン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステ
ロイド化合物、カロテノイド、または修飾されたイソプレノイド化合物を形成することが
できる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、カレンシンターゼをコードする。適切なヌ
クレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥ
ＧＩＯＮ  ４３．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、ＲＥ
ＧＩＯＮ：７８．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）が挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ゲラニオールシンターゼをコードする。適
切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、
（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５
５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆ
ｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  １８６４株）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉ
ｏｄｏｒａ  １８６１株）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒ
ａ  ４９３５株）、および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ
）が挙げられる。
【０１２８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドはリナロールシンターゼをコードする。適切な
ヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４９７４８５；Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＢ
７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ１５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、
（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａ
ｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ
）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃ
ｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌ
ａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ
）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８
；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＤ０７６０５；
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ  ＸＰ＿４６３９１８
；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄ
ｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７
３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅ
ｎｓｉｓ）、および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ変種ｃ
ｒｉｓｐａ栽培品種Ｎｏ．  ７９）が挙げられる。
【０１２９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、リモネンシンターゼをコードする。適切な
ヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（＋）−リモネンシンタ
ーゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）
および（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕ
ｇｏｓａ）および（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．
１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：
７３．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩ
ＯＮ：２９．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）が挙げられる。
【０１３０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ミルセンシンターゼをコードする。適切な
ヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｕ８７９０８；Ａｂｉ
ｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）
、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２
；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４
８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７
１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ
ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、および（ＡＪ３０４
８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）が挙げられる。
【０１３１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、オシメンシンターゼをコードする。適切な
ヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＹ１９５６０７；Ａ
ｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  
ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２
２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８
３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１
７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿０
０１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（
ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（Ａ
Ｂ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）、および（ＡＹ５７
５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が
挙げられる。
【０１３２】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ピネンシンターゼをコードする。適切
なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（＋）α−ピネンシン
ターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、
（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．１９２１；Ｐｉ
ｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９
、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）が挙げられる。
【０１３３】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ピネンシンターゼをコードする。適切
なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（−）β−ピネンシン
ターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎ
ｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉ
ｍｏｎ）が挙げられる。
【０１３４】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、サビネンシンターゼをコードする。適切な
ヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉ
ｃｉｎａｌｉｓ由来のＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１７９８が挙げられる。
【０１３５】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、γ−テルピネンシンターゼをコードする。
適切なヌクレオチド配列の実例としては、（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来のＡＦ５１４
２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．１８３２）および（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来のＡ
Ｂ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ  １．１８０３）が挙げられる。
【０１３６】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、テルピノレンシンターゼをコードする。適
切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｏｓｃｉｍｕｍ  
ｂａｓｉｌｉｃｕｍ由来のＡＹ６９３６５０）および（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎ
ｚｉｅｓｉｉ由来のＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．１８８７）が挙げられる。
【０１３７】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、アモルファジエンシンターゼをコードする
。適切なヌクレオチド配列の実例は、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号の
配列番号３７である。
【０１３８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ファルネセンシンターゼをコードする
。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｐｙｒｕｓ  ｃ
ｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’Ａｎｊｏｕ（セイヨウナシ；遺伝子名ＡＦＳ１
）由来のＤＱ３０９０３４およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（リンゴ；遺伝子ＡＦ
Ｓ１）由来のＡＹ１８２２４１が挙げられる。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、Ｐｌａｎｔａ  ２１
９巻（１号）：８４〜９４頁（２００４年）。
【０１３９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ファルネセンシンターゼをコードする
。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｍｅｎｔｈａ  
ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａ１１）由来の受託番号ＡＦ０２４
６１５、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のＡＹ８３５３９８が挙げられる。
Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６巻（９号）：９６１〜９６７頁（
２００５年）。
【０１４０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコードする。
適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｚｅａ  ｍａｙｓ
由来の受託番号ＡＦ５２９２６６およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ由来のＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）が挙げられる。Ｓｏｎｇ，  Ｌ．、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８巻
：１４９〜１５８頁（２００６年）。
【０１４１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ネロリドールシンターゼをコードする。適
切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由
来のＡＦ５２９２６６が挙げられる（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）。
【０１４２】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、パチョロールシンターゼをコードする。適
切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏ
ｎ  ｃａｂｌｉｎ由来のＡＹ５０８７３０  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５９が挙げられる。
【０１４３】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ノートカトンシンターゼをコードする。適
切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉ
ｎｅｎｓｉｓ由来のＡＦ４４１１２４  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６４７およびＰｅｒｉｌｌ
ａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ由来のＡＹ９１７１９５  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５３が挙げ
られる。
【０１４４】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、アビエタジエンシンターゼをコードする。
適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｕ５０７６８；
Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）が
挙げられる。
【０１４５】
一部の実施形態では、宿主細胞はＣ５イソプレノイドを産生する。これらの化合物は１
つのイソプレン単位に由来し、ヘミテルペンとも称される。ヘミテルペンの実例はイソプ
レンである。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ１０イソプレノイドである。これら
の化合物は、２つのイソプレン単位に由来し、モノテルペンとも称される。モノテルペン
の実例は、リモネン、シトロネロール（ｃｉｔｒａｎｅｌｌｏｌ）、ゲラニオール、メン
トール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョン、およびミルセンである。他の実施
形態では、イソプレノイドは、Ｃ１５イソプレノイドである。これらの化合物は、３つの
イソプレン単位に由来し、セスキテルペンとも称される。セスキテルペンの実例は、ペリ
プラノンＢ、ギンコライドＢ（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅ  Ｂ）、アモルファジエン、アルテ
ミシニン、アルテミシン酸、バレンセン、ノートカトン、エピセドロール（ｅｐｉ−ｃｅ
ｄｒｏｌ）、エピアリストロケン（ｅｐｉ−ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｅｎｅ）、ファルネソ
ール、ゴシポール、サントニン（ｓａｎｏｎｉｎ）、ペリプラノン、フォルスコリン、お
よびパチョロール（パチョリアルコールとしても公知である）である。他の実施形態では
、イソプレノイドは、Ｃ２０イソプレノイドである。これらの化合物は、４つのイソプレ
ン単位に由来し、ジテルペンとも称される。ジテルペンの実例は、カスベン（ｃａｓｂｅ
ｎｅ）、エリュテロビン、パクリタキセル、プロストラチン、シュードプテロシン（ｐｓ
ｅｕｄｏｐｔｅｒｏｓｉｎ）、およびタキサジエンである。さらに他の例では、イソプレ
ノイドは、Ｃ２０＋イソプレノイドである。これらの化合物は、５つ以上のイソプレン単
位に由来し、トリテルペン（６つのイソプレン単位に由来するＣ３０イソプレノイド化合
物）、例えば、アルブルシドＥ（ａｒｂｒｕｓｉｄｅＥ）、ブルセアンチン（ｂｒｕｃｅ
ａｎｔｉｎ）、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシン、およびス
クアレン；テトラテルペン（８つのイソプレノイドに由来するＣ４０イソプレノイド化合
物）、例えばβ−カロテン；およびポリテルペン（９つ以上のイソプレン単位に由来する
Ｃ４０＋イソプレノイド化合物）、例えばポリイソプレンを含む。一部の実施形態では、
イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β
−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、
リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン
、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される
。イソプレノイド化合物としては、これだけに限定されないが、カロテノイド（例えば、
リコピン、α−およびβ−カロテン、α−およびβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼ
アキサンチン、アスタキサンチン、およびルテイン）、ステロイド化合物、ならびに他の
化学基により修飾されたイソプレノイドで構成される化合物、例えば混合テルペン−アル
カロイド、ならびに補酵素Ｑ−１０も挙げられる。
【０１４６】
５．６．１０  イソプレノイドを産生する方法
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生するための方法であって、（ａ）
イソプレノイドを産生することができる本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれか
の集団を、炭素源を含む培地中、イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培
養するステップ、および（ｂ）前記イソプレノイド化合物を培地から回収するステップを
含む方法が提供される。
【０１４７】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼの異種発現、ホスホト
ランスアセチラーゼの異種発現、メバロン酸経路の１種または複数種の酵素の異種発現、
および任意選択で、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種
発現、およびＡＡＣＳの異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含み
、遺伝子改変宿主細胞は、１つまたは複数の改変を含まない親細胞または遺伝子改変宿主
細胞の１つまたは複数の改変のサブセットのみを含むが他の点では遺伝的に同一の親細胞
と比較して増大した量のイソプレノイド化合物を産生する。一部の実施形態では、増大し
た量は、例えば、収量、産生、生産性で、細胞培養物１リットル当たりのグラム数で、乾
燥細胞重量１グラム当たりのミリグラム数で、細胞培養物の単位体積当たりで、単位乾燥
細胞重量当たりで、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積当たりで、または単位時間当
たりの単位乾燥細胞重量当たりで測定して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２
０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超である。
【０１４８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムを超える高
レベルのイソプレノイドを産生する。一部のこのような実施形態では、イソプレノイドは
細胞培養物１リットル当たり約１０〜約５０グラム、約１５グラム超、約２０グラム超、
約２５グラム超、または約３０グラム超の量で産生される。
【０１４９】
一部の実施形態では、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ミリグラムを超
える高レベルのイソプレノイドを産生する。一部のこのような実施形態では、イソプレノ
イドは乾燥細胞重量１グラム当たり約５０〜約１５００ミリグラム、約１００ミリグラム
超、約１５０ミリグラム超、約２００ミリグラム超、約２５０ミリグラム超、約５００ミ
リグラム超、約７５０ミリグラム超、または約１０００ミリグラム超の量で産生される。
【０１５０】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベル
よりも、細胞培養物の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少な
くとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少な
くとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少な
くとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なく
とも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なく
とも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なく
とも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍
、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれ以上高いもので
ある高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５１】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベル
よりも、単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくと
も約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくと
も約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくと
も約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも
約２．  ５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくと
も約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくと
も約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、
少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれより高いものであ
る高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベル
よりも、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくと
も約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくと
も約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくと
も約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくと
も約２倍、少なくとも約２．  ５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくと
も約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくと
も約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少
なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、または
それより高いものである高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベル
よりも、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約
１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約
３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約
６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約
２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２
０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７
５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくと
も約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれよ
り高いものである高イソプレノイドを産生する。
【０１５４】
大多数の実施形態では、宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの産生を誘導性化合
物によって誘導することができる。このような宿主細胞を誘導性化合物の不在下で容易に
操作することができる。次いで、誘導性化合物を添加して宿主細胞による高レベルのイソ
プレノイドの産生を誘導する。他の実施形態では、宿主細胞による高レベルのイソプレノ
イドの産生を、例えば成長温度、培地の構成物などの培養条件を変化させることによって
誘導することができる。
【０１５５】
５．６．１１  培養培地および培養条件
微生物培養物を維持し、成長させるための材料および方法は微生物学または発酵科学の
当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ、１９８６年を参照されたい）。宿主細胞、発酵、およびプロセスの特定の必要条
件に応じて、好気性条件、微好気性条件、または嫌気性条件について適切な培養培地、ｐ
Ｈ、温度、および必要条件を考察しなければならない。
【０１５６】
本明細書で提供されるイソプレノイドを産生する方法は、これだけに限定されないが、
細胞培養プレート、フラスコ、または発酵槽を含めた適切な容器中の適切な培養培地（例
えば、パントテン酸を補充したまたは補充していない）で実施することができる。さらに
、当該方法は、微生物の産物の工業生産を支持するための当技術分野で公知の任意の発酵
の規模で実施することができる。撹拌層型発酵槽、エアリフト型発酵槽、気泡型発酵槽、
またはこれらの任意の組合せを含めた任意の適切な発酵槽を使用することができる。Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主細胞として利用する特定の実施形
態では、Ｋｏｓａｒｉｃら、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版、１２巻、３９８〜４７３頁、Ｗｉｌ
ｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＤａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙに詳細に記載されている通り、発酵槽において株を成長させることができる
。
【０１５７】
一部の実施形態では、培養培地は、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変
微生物が生存すること、すなわち、成長および生存能力を維持することができる任意の培
養培地である。一部の実施形態では、培養培地は、同化できる炭素、窒素源およびリン酸
源を含む水性培地である。このような培地は、適切な塩、無機物、金属および他の栄養分
も含んでよい。一部の実施形態では、炭素源および必須の細胞栄養分のそれぞれを増加的
または継続的に発酵培地に添加し、必要な栄養分のそれぞれを、例えば、炭素源をバイオ
マスに変換する細胞の代謝機能または呼吸機能に基づく所定の細胞の成長曲線に従って、
基本的に、成長している細胞による効率的な同化のために必要な最小限のレベルに維持す
る。
【０１５８】
微生物を培養するための適切な条件および適切な培地は当技術分野で周知である。一部
の実施形態では、適切な培地は、例えば、誘導因子（例えば、遺伝子産物をコードする１
つまたは複数のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、リプレッ
サー（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が抑圧可能な
プロモーターの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子改変を含む微生物を
選択するための抗生物質）などの１種または複数種の追加の作用剤を補充したものである
。
【０１５９】
一部の実施形態では、炭素源は、単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（単糖（ｓｉ
ｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ））、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはこれらの１つまたは複
数の組合せである。適切な単糖の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マ
ンノース、フルクトース、キシロース、リボース、およびこれらの組合せが挙げられる。
適切な二糖の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロー
ス、セロビオース、およびこれらの組合せが挙げられる。適切な多糖の非限定的な例とし
ては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびこれらの組合せが挙げられ
る。適切な非発酵性炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙
げられる。
【０１６０】
培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、細胞の成長を促進するが、使用される
微生物の成長を抑圧するほどには高くないものであるべきである。一般には、培養は、グ
ルコースなどの炭素源を、成長およびバイオマスの所望のレベルが実現されるレベルであ
るが、検出不可能なレベル（約０．１ｇ／ｌ未満の検出限界）で添加して行われる。他の
実施形態では、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は約１ｇ／Ｌ超、好ましくは
約２ｇ／Ｌ超、より好ましくは約５ｇ／Ｌ超である。さらに、培養培地中のグルコースな
どの炭素源の濃度は、一般には、約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、よ
り好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養物成分濃度への言及は、最初の成分濃度およ
び／または進行中の成分濃度のどちらを指す場合もあることに留意するべきである。いく
つかの場合には、培養中に培養培地から炭素源を枯渇させることが望ましい。
【０１６１】
適切な培養培地に使用することができる同化できる窒素の供給源としては、これだけに
限定されないが、単純な窒素源、有機窒素源および複合窒素源が挙げられる。このような
窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩ならびに動物起源、植物起源および／
または微生物起源の物質が挙げられる。適切な窒素源としては、これだけに限定されない
が、タンパク質加水分解産物、微生物バイオマス加水分解産物、ペプトン、酵母抽出物、
硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられる。一般には、培養培地中の窒素源
の濃度は、約０．１ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１．０
ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、窒素源を培養培地に添加すること
は微生物の成長のために有利ではない。結果として、培養培地中の窒素源の濃度は、約２
０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さ
らに、いくつかの場合には、培養中に培養培地から窒素源を枯渇させることが望ましい。
【０１６２】
有効な培養培地は、無機塩、ビタミン、微量金属または成長プロモーターなどの他の化
合物を含有してよい。このような他の化合物は、有効な培地中の炭素、窒素または無機物
供給源の中に存在してもよく、培地に特異的に添加することもできる。
【０１６３】
培養培地は、適切なリン酸源も含有してよい。このようなリン酸源は、無機リン酸源お
よび有機リン酸源の両方を含む。好ましいリン酸源としては、これだけに限定されないが
、リン酸二水素ナトリウムまたはリン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムまたは
リン酸一水素カリウム、リン酸アンモニウムならびにこれらの混合物などのリン酸塩が挙
げられる。一般には、培養培地中のリン酸の濃度は約１．０ｇ／Ｌ超、好ましくは約２．
０ｇ／Ｌ超、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超える
と、リン酸を培養培地に添加することは、微生物の成長のために有利ではない。したがっ
て、培養培地中のリン酸の濃度は、一般には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ
未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。
【０１６４】
適切な培養培地は、マグネシウムの供給源も、好ましくは硫酸マグネシウム七水和物な
どの生理的に許容される塩の形態で含んでよいが、同様の量のマグネシウムをもたらす濃
度の他のマグネシウム源を使用することができる。一般には、培養培地中のマグネシウム
の濃度は約０．５ｇ／Ｌ超、好ましくは約１．０ｇ／Ｌ超、より好ましくは約２．０ｇ／
Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、マグネシウムを培養培地に添加するこ
とは微生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度
は、一般には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／
Ｌ未満である。さらに、いくつかの場合には、培養中に培養培地からマグネシウム源を枯
渇させることが望ましい。
【０１６５】
一部の実施形態では、培養培地は、クエン酸三ナトリウムの二水和物などの生物学的に
許容されるキレート化剤も含んでよい。このような例では、培養培地中のキレート化剤の
濃度は約０．２ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１ｇ／Ｌ超で
ある。しかし、ある特定の濃度を超えると、キレート化剤を培養培地に添加することは微
生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地中のキレート化剤の濃度は、一
般には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満
である。
【０１６６】
培養培地は、培養培地の所望のｐＨを維持するために生物学的に許容される酸または塩
基を最初に含んでもよい。生物学的に許容される酸としては、これだけに限定されないが
、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸およびこれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容される
塩基としては、これだけに限定されないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウムおよびこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、使用される塩基
は水酸化アンモニウムである。
【０１６７】
培養培地は、これだけに限定されないが塩化カルシウムを含めた生物学的に許容される
カルシウム源も含んでよい。一般には、培養培地中の塩化カルシウム二水和物などのカル
シウム源の濃度は、約５ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌまでの範囲内、好ましくは約２
０ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌまでの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌから約
５００ｍｇ／Ｌまでの範囲内である。
【０１６８】
培養培地は、塩化ナトリウムも含んでよい。一般には、培養培地中の塩化ナトリウムの
濃度は、約０．１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌまでの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌから約４ｇ
／Ｌまでの範囲、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌまでの範囲内である。
【０１６９】
一部の実施形態では、培養培地は、微量金属も含んでよい。このような微量金属は、便
宜上、培養培地の残りの部分とは別に調製することができるストック溶液として培養培地
に添加することができる。一般には、培養培地に添加されるこのような微量金属溶液の量
は、約１ｍｌ／Ｌ超、好ましくは約５ｍＬ／Ｌ超、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌ超であ
る。しかし、ある特定の濃度を超えると、微量金属を培養培地に添加することは微生物の
成長のために有利ではない。したがって、培養培地に添加されるこのような微量金属溶液
の量は、一般には、約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好まし
くは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。微量金属をストック溶液に添加することに加えて、個々
の成分を、それぞれが上記の微量金属溶液の範囲により規定される成分の量に独立に対応
する範囲内で別々に添加してもよいことに留意するべきである。
【０１７０】
培養培地は、パントテン酸、ビオチン、カルシウム、パントテン酸、イノシトール、ピ
リドキシン−ＨＣｌ、およびチアミン−ＨＣｌなどの他のビタミンも含んでよい。このよ
うなビタミンは、便宜上、培養培地の残りの部分とは別に調製することができるストック
溶液として培養培地に添加することができる。しかし、ある特定の濃度を超えると、ビタ
ミンを培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。
【０１７１】
本明細書に記載の発酵方法は、これだけに限定されないが、回分、流加、細胞再利用、
連続および半連続を含めた従来の培養方式で実施することができる。一部の実施形態では
、発酵は流加方式で行われる。このような場合、発酵の産生段階の間のパントテン酸を含
めた培地の成分のいくつかは培養中に枯渇させる。一部の実施形態では、このような成分
を、例えば産生段階の最初に比較的高濃度で培養物に補充し、その結果、添加が必要にな
るまでの期間にわたって成長および／またはイソプレノイド産生を支持することができる
。これらの成分の好ましい範囲を、レベルが培養物から枯渇したら添加を行うことによっ
て培養全体を通して維持する。培養培地中の成分のレベルは、例えば、定期的に培養培地
から試料採取し、濃度についてアッセイすることによってモニターすることができる。あ
るいは、標準の培養手順を展開したら、培養全体を通して特定の時間における既知のレベ
ルに対応する時間設定した間隔で添加を行うことができる。当業者には理解される通り、
栄養分の消費の速度は、培養中に培地の細胞密度が上昇するにつれて上昇する。さらに、
外来微生物が培養培地中に導入されることを回避するために、当技術分野で公知の無菌添
加法を使用して添加を実施する。さらに、培養中に少量の消泡剤を添加することができる
。
【０１７２】
培養培地の温度は、遺伝子改変細胞の成長および／またはイソプレノイドの産生に適し
た任意の温度であってよい。例えば、培養培地に種菌を接種する前に、培養培地を約２０
℃から約４５℃までの範囲内の温度、好ましくは約２５℃から約４０℃までの範囲内の温
度、より好ましくは約２８℃から約３２℃までの範囲内の温度にし、その温度で維持する
ことができる。
【０１７３】
培養培地のｐＨは、酸または塩基を培養培地に添加することによって制御することがで
きる。ｐＨを制御するためにアンモニアを使用する場合では、アンモニアは培養培地中の
窒素源としての機能も都合よく果たす。ｐＨは約３．０から約８．０まで、より好ましく
は約３．５から約７．０まで、最も好ましくは約４．０から約６．５までで維持すること
が好ましい。
【０１７４】
一部の実施形態では、培養培地のグルコース濃度などの炭素源濃度を培養中にモニター
する。培養培地のグルコース濃度は、例えば、上清、例えば培養培地の無細胞成分などの
グルコース濃度をモニターするために使用することができるグルコースオキシダーゼ酵素
試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの公知の技法を使用してモニターする
ことができる。前記の通り、炭素源濃度は、細胞の成長阻害が起こるレベルよりも低く維
持するべきである。このような濃度は生物体によって変動し得るが、炭素源としてのグル
コースに関しては、約６０ｇ／Ｌを超えるグルコース濃度で細胞の成長阻害が起こり、こ
れは試験によって容易に決定することができる。したがって、グルコースを炭素源として
使用する場合、グルコースを発酵槽に送り込み、検出限界未満に維持することが好ましい
。あるいは、培養培地中のグルコース濃度を約１ｇ／Ｌから約１００ｇ／Ｌまでの範囲内
、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌまでの範囲内、およびさらにより好ましく
は約５ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌまでの範囲内で維持する。炭素源濃度は、例えば、実質的
に純粋なグルコース溶液を添加することによって所望のレベル内に維持することができる
が、元の培養培地の一定分量を添加することによって培養培地の炭素源濃度を維持するこ
とが許容され、それが好ましい場合がある。元の培養培地の一定分量の使用は、培地中の
他の栄養分  （例えば、窒素源およびリン酸源）の濃度を同時に維持することができるの
で、望ましい場合がある。同様に、培養培地中の微量金属濃度を、微量金属溶液の一定分
量を添加することによって維持することができる。
【０１７５】
５．６．１２  イソプレノイドの回収
イソプレノイドが宿主細胞によって産生されたら、それを、その後の使用のために、当
技術分野で公知の任意の適切な分離および精製方法を使用して回収または単離することが
できる。一部の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から遠心分離によっ
て分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から自然に分離さ
せる。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から解乳化剤および／ま
たは造核剤を発酵反応物に添加することによって分離する。解乳化剤の実例としては、凝
集剤および凝固薬が挙げられる。造核剤の実例としては、イソプレノイド自体の液滴なら
びにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｍｙｒｉｓｔｒａｔｅ
）、およびオレイン酸メチルなどの有機溶媒が挙げられる。
【０１７６】
これらの細胞において産生されるイソプレノイドは、培養上清中に存在し、かつ／また
は宿主細胞に付随し得る。イソプレノイドが宿主細胞に付随する実施形態では、イソプレ
ノイドの回収は、細胞を透過処理または溶解する方法を含み得る。その代わりに、または
それと同時に、これだけに限定されないが、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分
離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的な誘導体化および結晶化を含めた回収プロセスを使
用して培養培地中のイソプレノイドを回収することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、イソプレノイドを有機相中に存在し得る他の産物から分離する。
一部の実施形態では、分離は、吸着、蒸留、ガス−液体抽出（ストリッピング）、液液抽
出（溶媒抽出）、限外濾過、および標準のクロマトグラフィー技法を使用して実現される
。
【０１７８】
５．７  ポリケチド
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルＣｏＡか
らポリケチドを産生することができる。ポリケチドは、協調した活性部位の群を含有する
大きな多酵素タンパク質複合体である、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）と称される酵素
活性の集合により触媒される逐次的な反応によって合成される。ポリケチド生合成は、ア
セチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡなどの単純な２炭素構成要素、３炭
素構成要素、４炭素構成要素およびそれらの活性化された誘導体であるマロニルＣｏＡ、
メチルマロニルＣｏＡおよびエチルマロニルＣｏＡから始まり、主にクライゼン縮合反応
によるマロニルＣｏＡ由来単位の脱炭酸縮合を通じて段階的に進行する。ＰＫＳ遺伝子は
通常、細菌において、および真核生物における遺伝子クラスターにおいて１つのオペロン
内に組織化されている。３つの型のポリケチドシンターゼが特徴付けられている：Ｉ型ポ
リケチドシンターゼは、大きな、高度なモジュラータンパク質であり、２つのクラス：１
）ドメインを周期的に再使用する反復ＰＫＳおよび２）別々のモジュール配列を含有し、
ドメインを繰り返さないモジュラーＰＫＳに細分される。ＩＩ型ポリケチドシンターゼは
、単機能性タンパク質の凝集体であり、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼはアシル担体タン
パク質ドメインを使用しない。
【０１７９】
連続的な鎖伸長ステップのそれぞれに下記の通りケト還元、脱水およびエノイル、還元
の固定されたひと続きがある脂肪酸の生合成とは異なり、ポリケチド生合成の個々の鎖伸
長中間体は、官能基修飾の全てを受けるか、官能基修飾の一部を受けるか、官能基修飾を
受けないかであり、それにより、多数の化学的に多様な産物がもたらされる。異なる開始
単位および鎖伸長単位の使用ならびに新しい立体異性体の生成により、さらなる複雑さが
生じる。
【０１８０】
ポリケチドシンターゼにより導かれる完全なポリケチド合成の順序は以下に従う（Ｎ末
端からＣ末端の順序で）：アシル担体タンパク質への最初の炭素構成要素の開始またはロ
ーディング、成長しているマクロライド鎖の伸長を触媒する伸長モジュールおよび合成さ
れたマクロライドの放出を触媒する終結モジュール。この生合成において活性な成分ドメ
インまたは別々の酵素機能性としては、開始剤、伸長剤および中間アシル単位のローディ
ングのためのアシル−トランスフェラーゼ；成長しているマクロライドをチオールエステ
ルとして保持するアシル担体タンパク質；鎖伸長を触媒するβ−ケト−アシルシンターゼ
；アルコール官能性への最初の還元に関与するβ−ケトレダクターゼ；水を排除して不飽
和チオールエステルを生じさせるデヒドラターゼ；最終的な還元を触媒して完全に飽和さ
せるエノイルレダクターゼ、およびマクロライドの放出および環化を触媒するチオールエ
ステラーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡお
よびマロニルＣｏＡの少なくとも１つをアシル担体タンパク質と縮合させることができる
酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡ
およびマロニルＣｏＡからなる群から選択される第１の反応物とマロニルＣｏＡまたはメ
チルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応物を縮合させてポリケチド産
物を形成することができる酵素、例えばβ−ケト−アシルシンターゼをコードする異種ヌ
クレオチド配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合
物上のβ−ケト化学基をβ−ヒドロキシ基に還元することができる酵素、例えばβ−ケト
レダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合
物のアルカン化学基を脱水させてα−β−不飽和アルケンを産生することができる酵素、
例えばデヒドラターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合
物のα−β−二重結合を飽和アルカンに還元することができる酵素、例えばエノイル−レ
ダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アシル担体タン
パク質からポリケチド化合物を加水分解することができる酵素、例えばチオエステラーゼ
をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＫＳ触媒領域を含む酵素をコードする１
種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細
胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を
含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードす
る２種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は
、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含
む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする１
種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細
胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする２種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８７】
特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小の芳香族ＰＫＳ系、例えば、それぞ
れＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素、およ
びＡＣＰ活性を含む酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では
、ポリケチド産生細胞は、最小のモジュラーＰＫＳ系、例えば、それぞれＫＳ触媒領域を
含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、およびＡＣＰ活性を含む酵素をコードする異種ヌク
レオチド配列を含む。さらに別の特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新規のポ
リケチド合成のためのモジュラー芳香族ＰＫＳ系、例えば、それぞれＫＳ触媒領域を含む
酵素、ＡＴ触媒領域を含む１種または複数種の酵素、およびＡＣＰ活性を含む１種または
複数種の酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、最小のＰＫＳ系、例えば、最小の芳香族ＰＫＳ系または最小のモ
ジュラーＰＫＳ系を含むポリケチド産生細胞は、最終産物ポリケチドの産生に寄与し得る
追加の触媒活性をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新生ポリケ
チド骨格の環化を容易にするシクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域を含む酵素をコードする１種
または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞
は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種
ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、アロマターゼ（
ＡＲＯ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含
む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領
域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施
形態では、ポリケチド産生細胞は、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域を含む酵素をコー
ドする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチ
ド産生細胞は、ＡＣＰのパンテテイニル化をもたらすホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵
素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、合成後ポリケチド修飾活性を付与する１
種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド
産生細胞は、例えば、抗生物質活性を有するポリケチドが望まれる場合に、ポリケチドの
合成後修飾をもたらすグリコシラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異
種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ヒドロ
キシラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさら
に含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エポキシダーゼ活性を含む酵素を
コードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では
、ポリケチド産生細胞は、メチラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異
種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、これだけに限定されないが、ポリケチド
合成経路の酵素の少なくとも１種、および、アセチルＣｏＡ化合物を修飾して、マクロラ
イド、抗生物質、抗真菌薬、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール化合物、抗寄生虫化
合物、コクシジウム抑制化合物、動物成長プロモーターまたは殺虫剤などのポリケチド産
物形成することができる酵素を含めた生合成酵素をコードする１種または複数種の異種ヌ
クレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物はポリエンである。
一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は環状ラクトンである。一部の実施形態では、ＨＡ
ＣＤ化合物は、１４員、１５員、または１６員のラクトン環を含む。一部の実施形態では
、ＨＡＣＤ化合物は、ポリケチドマクロライド、抗生物質、抗真菌薬、細胞増殖抑制薬、
抗コレステロール薬、抗寄生虫薬、コクシジウム抑制薬、動物成長プロモーターおよび殺
虫剤からなる群から選択されるポリケチドである。
【０１９１】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、異種ヌクレオチド配列、例えば、これだ
けに限定されないが、以下のポリケチドから選択されるポリケチドを産生することができ
るＰＫＳ酵素およびポリケチド修飾酵素をコードする配列を含む：アベルメクチン（例え
ば、米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；欧州特許公開
第１１８，３６７号；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３年、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」；Ｂａｌｔｚ、Ｈｅｇｅｍａｎ、＆  Ｓｋａｔｒｕｄ編（ＡＳＭ）
、２４５〜２５６頁、「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃ
ｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ａｖｅｒｍ
ｅｃｔｉｎ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，  ａｎｄ  Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ」；Ｍａｃ
Ｎｅｉｌら、１９９２年、Ｇｅｎｅ  １１５巻：１１９〜１２５頁；ならびにＩｋｅｄａ
およびＯｍｕｒａ、１９９７年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ９７巻：２５９９〜２６０９頁
を参照されたい）；カンジシジン（ＦＲ００８）（例えば、Ｈｕら、１９９４年、Ｍｏｌ
．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４巻：１６３〜１７２頁を参照されたい）；カルボマイシ
ン、クラマイシン（例えば、Ｂｅｒｇｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．  １９９２年２月；１５巻（１号）：８０〜９頁を参照されたい）；ダウノルビ
シン（例えば、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４年１０月；１７６巻（２０号）：６
２７０〜８０頁を参照されたい）；エポチロン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６６０２８
号；およびＰＣＴ公開第００／０３１２４７号を参照されたい）；エリスロマイシン（例
えば、ＰＣＴ公開第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；米国特許第
５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻：６
７５〜９頁；およびＣｏｒｔｅｓら、１９９０年１１月８日、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：
１７６〜８頁を参照されたい）；ＦＫ−５０６（例えば、Ｍｏｔａｍｅｄｉら、１９９８
年；Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５６巻：５２８〜５３４頁；およびＭｏｔａｍ
ｅｄｉら、１９９７年、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４４巻：７４〜８０頁を参
照されたい）；ＦＫ−５２０（例えば、ＰＣＴ公開第００／０２０６０１号；およびＮｉ
ｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０巻：５７８９〜９６頁を参照された
い）；グリセウシン（Ｇｒｉｓｅｕｓｉｎ）（例えば、Ｙｕら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．  １９９４年５月；１７６巻（９号）：２６２７〜３４頁を参照されたい）；ロバスタ
チン（例えば、米国特許第５，７４４，３５０号を参照されたい）；フレノリシン（Ｆｒ
ｅｎｏｌｙｃｉｎ）（例えば、Ｋｈｏｓｌａら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９３年４月
；１７５巻（８号）：２１９７〜２０４頁；およびＢｉｂｂら、Ｇｅｎｅ  １９９４年５
月３日；１４２巻（１号）：３１〜９頁を参照されたい）；グラナチシン（例えば、Ｓｈ
ｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８９年９月；８巻（９号）：２７１７〜２５頁；お
よびＢｅｃｈｔｏｌｄら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９５年９月２０日；２４
８巻（５号）：６１０〜２０頁を参照されたい）；メデルマイシン（例えば、Ｉｃｈｉｎ
ｏｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３年７月；１４９巻（Ｐｔ７号）：１６３
３〜４５頁を参照されたい）；モネンシン（例えば、Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ  
Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２年８月；２３４巻（２号）：２５４〜６４頁を参照され
たい）；ノナクチン（例えば、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０００年
２月１日；１８３巻（１号）：１７１〜５頁を参照されたい）；ナナオマイシン（例えば
、Ｋｉｔａｏら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）、１９８０年７月；３３巻（７号
）：７１１〜６頁を参照されたい）；ネマデクチン（例えば、ＭａｃＮｅｉｌら、１９９
３年、上記を参照されたい）；ニダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（例えば、ＰＣＴ
公開第９８／５１６９５号；およびＫａｋａｖａｓら、１９９７年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．  １７９巻：７５１５〜７５２２頁を参照されたい）；オレアンドマイシン（例
えば、Ｓｗａｎら、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４２巻：３５８
〜３６２頁；ＰＣＴ公開第００／０２６３４９号；Ｏｌａｎｏら、１９９８年、Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５９巻（３号）：２９９〜３０８頁；およびＰＣＴ特許出
願公開第ＷＯ９９／０５２８３号を参照されたい）；オキシテトラサイクリン（例えば、
Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．  １９９４年４月８日；１４１巻（１号）：１４１〜２頁を参照さ
れたい）；ピクロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６１５９９号；ＰＣＴ公開第０
０／００６２０号；Ｘｕｅら、１９９８年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  
５巻（１１号）：６６１〜６６７頁；Ｘｕｅら、１９９８年１０月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ
ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１２１１１〜１２１１６頁を参照された
い）；プラテノリド（例えば、欧州特許公開第７９１，６５６号；および米国特許第５，
９４５，３２０号を参照されたい）；ラパマイシン（例えば、Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９
９５年８月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：７８３
９〜７８４３頁；およびＡｐａｒｉｃｉｏら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １６９巻：９〜１
６頁を参照されたい）；リファマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／０７８６８号
；およびＡｕｇｕｓｔら、１９９８年２月１３日、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、５巻（２号）：６９〜７９頁を参照されたい）；ソランギウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕ
ｍ）（例えば、米国特許第６，０９０，６０１号を参照されたい）；ソラフェン（例えば
、米国特許第５，７１６，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら、１９９５年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ  １７７巻：３６７３〜３６７９頁を参照されたい）；スピノシン（例えば
、ＰＣＴ公開第９９／４６３８７号を参照されたい）；スピラマイシン（例えば、米国特
許第５，０９８，８３７号を参照されたい）；テトラセノマイシン（例えば、Ｓｕｍｍｅ
ｒｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年３月；１７４巻（６号）：１８１０〜２
０頁；およびＳｈｅｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年６月；１７４巻（１１
号）：３８１８〜２１頁を参照されたい）；テトラサイクリン（例えば、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈ
ｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００９年１２月９日；１３１巻（４８号）：１７６７７〜８９頁を参
照されたい）；タイロシン（例えば、米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，
６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州特許公開第７９１，６５５号
；欧州特許公開第２３８，３２３号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １８
３巻：２３１〜６頁；ならびにＭｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ  およびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ
、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３巻：３４９〜３５５頁を参照され
たい）；および６−メチルサリチル酸（ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）
（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．  １９９９年４月；１巻（２
号）：１８０〜７頁；およびＳｈａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃ
ｏｍｍｕｎ．  ２００６年６月２３日；３４５巻（１号）：１３３〜９頁を参照されたい
）。
【０１９２】
５．８  脂肪酸
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルＣｏＡか
ら脂肪酸を産生することができる。脂肪酸は、脂肪酸シンターゼにより触媒されるアセチ
ルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからの一連の脱炭酸クライゼン縮合反応によって合成され
る。ポリケチドシンターゼと同様に、脂肪酸シンターゼは単一の酵素ではなく、２７２ｋ
Ｄａの多機能性ポリペプチドで構成され、基質が１つの機能性ドメインから次の機能性ド
メインに渡される酵素系である。２つの主要なクラスの脂肪酸シンターゼが特徴付けられ
ている：Ｉ型脂肪酸シンターゼは、哺乳動物および真菌（しかし真菌のシンターゼと哺乳
動物のシンターゼの構造的配置は異なる）および細菌のＣＭＮ群（コリネバクテリア、マ
イコバクテリア、およびノカルジア）に共通する単一の多機能性ポリペプチドである。古
細菌および真正細菌に見いだされるＩＩ型シンターゼは、脂肪酸の合成に関与する一連の
別個の単機能性酵素である。シンターゼの２つのクラスにおける脂肪酸の伸長および還元
の機構は、これらの触媒事象に関与する酵素ドメインの大部分が２つのクラスの間で相同
であるので、同じである。
【０１９３】
脱炭酸クライゼン縮合反応における脂肪酸鎖の伸長の各ラウンド後に、ケトレダクター
ゼ、デヒドラターゼ、およびエノールレダクターゼの逐次的な作用によってβ−ケト基が
完全に飽和した炭素鎖に還元される。成長している脂肪酸鎖はアシル担体タンパク質に付
着したこれらの活性部位間を移動し、最終的には、炭素鎖の長さが１６（パルミチン酸（
ｐａｌｍｉｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ））に達するとチオエステラーゼの作用によって放出さ
れる。
【０１９４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、これだけに限定
されないが、脂肪酸合成経路の酵素の少なくとも１種、およびアセチルＣｏＡ化合物を修
飾して、パルミチン酸、パルミトイルＣｏＡ、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン
酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、お
よびドコサヘキサエン酸などの脂肪酸産物を形成することができる酵素を含めた生合成酵
素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、
パルミチン酸、パルミトイルＣｏＡ、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノ
ール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコ
サヘキサエン酸からなる群から選択される脂肪酸である。
【０１９５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡ
およびマロニルＣｏＡの少なくとも１つをアシル担体タンパク質と共有結合により連結す
ることができる酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド
配列を含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、それぞれアシル
担体タンパク質（ＡＣＰ）に結合したアセチル化学的部分とマロニル化学的部分を縮合さ
せてアセトアセチル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばβ−ケトアシル−ＡＣ
Ｐシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ＮＡＤＰＨを用
いてアセトアセチル−ＡＣＰ内の二重結合を還元してＤ−３−ヒドロキシブチリルヒドロ
キシラーゼ−ＡＣＰ内にヒドロキシル基を形成することができる酵素、例えば、β−ケト
アシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、Ｄ−３−ヒドロ
キシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水してベータ炭素とガンマ炭素の間に二重結
合を創出し、それによりクロトニル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばβ−ヒ
ドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ＮＡＤＰＨを用
いてクロトニルＡＣＰを還元してブチリル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えば
エノイルＡＣＰレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０２００】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アシル担体タン
パク質からＣ１６アシル化合物を加水分解してパルミチン酸を形成することができる酵素
、例えばチオエステラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して１
種または複数種の脂肪酸の産生の増大をもたらすために、アセチルＣｏＡシンターゼおよ
び／またはマロニルＣｏＡシンターゼをコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド
配列を含む。
【０２０２】
例えば、アセチルＣｏＡ産生を増大させるために、以下の遺伝子のうちの１つまたは複
数を細胞において発現させることができる：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸
および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥＩｐデヒドロゲナーゼ成分およ
びＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコードする）、ｆａｂＨ、
ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、およびｆａｂＦ。このような酵素をコードするヌクレオ
チド配列の実例としては、これだけに限定されないが、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡ
Ｃ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡ、ＡＡＣ７６９５２としても公
知）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７
５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡ
Ｃ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）が挙げられる。
【０２０３】
一部の実施形態では、細胞において脂肪酸分解に関与するタンパク質をコードする遺伝
子を減弱させるまたはノックアウトすることにより、脂肪酸レベルの上昇をもたらすこと
ができる。例えば、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｉｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏ
ｘＢ、ａｃｋＡ、および／またはａｃｋＢの発現レベルを、工学的に操作された宿主細胞
において、当技術分野で公知の技法を使用して減弱させるまたはノックアウトすることが
できる。このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけ
に限定されないが、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、Ｉ
ｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３
２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡ
Ｃ７５３５６）、およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）が挙げられる。生じた宿主細胞を
適切な環境で成長させると、アセチルＣｏＡ産生レベルが上昇する。
【０２０４】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡに変換する
ことができる酵素、例えば、多サブユニットＡｃｃＡＢＣＤタンパク質をコードする異種
ヌクレオチド配列を含む。ＡｃｃＡＢＣＤをコードする適切なヌクレオチド配列の実例と
しては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ６．４．１．２が
挙げられる。
【０２０５】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、リパーゼをコードする異種ヌクレオチド配列
を含む。リパーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定
されないが、受託番号ＣＡＡ８９０８７およびＣＡＡ９８８７６が挙げられる。
【０２０６】
一部の実施形態では、細胞において、脂肪酸生合成経路の初期のステップ（例えば、ａ
ｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨ、およびｆａｂｌ）を阻害する長鎖アシルＡＣＰのレベルの上昇
を導く可能性があるＰｌｓＢを阻害することにより、脂肪酸レベルの上昇を実施すること
ができる。ＰｌｓＢの発現レベルは、工学的に操作された宿主細胞において、当技術分野
で公知の技法を使用して減弱させるまたはノックアウトすることができる。ＰｌｓＢをコ
ードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号
ＡＡＣ７７０１１が挙げられる。特定の実施形態では、ｐｌｓＢ  Ｄ３１  ＩＥ変異を使
用して、細胞における利用可能なアシル−ＣｏＡの量を増大させることができる。
【０２０７】
一部の実施形態では、細胞において、ｆａｂＡの抑制をもたらすｓｆａ遺伝子を過剰発
現させることにより、一価不飽和脂肪酸の産生の増大をもたらすことができる。ｓｆａを
コードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番
号ＡＡＮ７９５９２が挙げられる。
【０２０８】
一部の実施形態では、細胞において、脂肪酸基質の鎖長を制御する酵素、例えばチオエ
ステラーゼの発現を調節することにより、脂肪酸レベルの上昇をもたらすことができる。
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、ｔｅｓ遺伝子またはｆａｔ遺伝子を過剰発現す
るように改変されている。適切なｔｅｓヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限
定されないが、受託番号：（ｔｅｓＡ：ＡＡＣ７３５９６、Ｅ．ｃｏｌｉ由来、Ｃ１８：
１脂肪酸を産生することができる）および（ｔｅｓＢ：ＡＡＣ７３５５５、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来）が挙げられる。適切なｆａｔヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定さ
れないが、（ｆａｔＢ：Ｑ４１６３５およびＡＡＡ３４２１５、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉ
ａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ由来、Ｃ１２：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔ
Ｂ２：Ｑ３９５１３およびＡＡＣ４９２６９、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来
、Ｃ８：０〜Ｃ１０：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ３：ＡＡＣ４９２
６９およびＡＡＣ７２８８１、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１４：０〜
Ｃ１６：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ：Ｑ３９４７３およびＡＡＣ４
９１５１、Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ由来、Ｃ１４：０脂肪酸を産生す
ることができる）、（ｆａｔＢ［Ｍ１４１Ｔ］：ＣＡＡ８５３８８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、Ｃ１６：１脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＡ
：ＮＰ  １８９１４７およびＮＰ  １９３０４１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉ
ａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＡ：ＣＡＣ３９１０
６、Ｂｒａｄｖｒｈｉｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を優
先的に産生することができる）、（ｆａｔＡ：ＡＡＣ７２８８３、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏ
ｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することができる）、および（ｆａｔＡ１
、ＡＡＬ７９３６１、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ由来）が挙げられる。
【０２０９】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用してチオエステラ
ーゼＣ１８の発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１０脂肪酸のレベルの上昇をも
たらすことができる。チオエステラーゼＣ１８をコードする適切なヌクレオチド配列の実
例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１
が挙げられる。他の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用してチ
オエステラーゼＣ１０の発現または活性を増大させることにより、Ｃ１０脂肪酸のレベル
の上昇をもたらすことができる。チオエステラーゼＣ１０をコードする適切なヌクレオチ
ド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号Ｑ３９５１３が挙げられる
。
【０２１０】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して非Ｃ１４脂肪
酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１４
脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。他の実施形態では、細胞において、当技
術分野で公知の技法を使用して基質Ｃ１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現ま
たは活性を増大させることにより、Ｃ１４脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる
。このようなチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、こ
れだけに限定されないが、受託番号Ｑ３９４７３が挙げられる。
【０２１１】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して非Ｃ１２脂肪
酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１２
脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。他の実施形態では、細胞において、当技
術分野で公知の技法を使用して基質Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現ま
たは活性を増大させることにより、Ｃ１２脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる
。このようなチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、こ
れだけに限定されないが、受託番号Ｑ４１６３５が挙げられる。
【０２１２】
５．９  他の化合物を産生するためのＰＫ／ＰＴＡ
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞（例えば、ＰＫ／ＰＴ
Ａおよびアセチルホスファターゼ活性、例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはその相同体を
コードするポリペプチドの機能的破壊を含む宿主細胞）を、米国特許出願公開第２０１２
０１５６７３５号に記載の通り、細胞内ピルビン酸から開始されて、例えば、２，３−ブ
タンジオール、２−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、リンゴ酸塩、
イソアミルアルコール、およびイソブタノールが産生される生合成経路が発現されるよう
に工学的に操作する。生合成経路による産物形成へのピルビン酸の利用可能性を増大させ
るために、ピルビン酸を利用する生合成経路を発現するように工学的に操作された組換え
宿主細胞における酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の破壊が使用されている
。ピルビン酸を利用する生合成経路の産物を産生するためにＰＤＣ−ＫＯ組換え宿主細胞
を使用することができるが、ＰＤＣ−ＫＯ組換え宿主細胞はそれらが成長するために、外
因性炭素基質の補充（例えば、エタノールまたはアセテート）を必要とする。特に、２種
の外因性炭素基質が必要であり、そのうちの一方が所望の産物に変換され、他方は成長す
るためにこのような補充を必要とする組換え宿主細胞によって完全にまたは部分的にアセ
チルＣｏＡに変換される。しかし、異種ホスホケトラーゼ経路の発現により、異種ＰＫ／
ＰＴＡでないＰＤＣ−ＫＯ細胞と比較して、その成長のためにこれらの外因性炭素基質を
もたらす必要性が低下するまたは排除される。したがって、アセチルホスフェートのアセ
テートへの加水分解を触媒することができるＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはその相同体の追加
の機能的破壊により、これらの細胞において細胞の成長のために利用可能な基質としての
アセチルＣｏＡの供給を増大させるＰＫ／ＰＴＡの能力がさらに改善されることが予想さ
れる。
【０２１３】
５．１０  遺伝子改変細胞を作製する方法
本明細書では、上記の改変のうちの１つまたは複数、例えば、ＰＫ、ＰＴＡ、および／
または、例えばアセチルＣｏＡ由来化合物の生合成経路の酵素をコードする１種または複
数種の異種核酸を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作出するための方法も提供され
る。宿主細胞における異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を、宿主細
胞における発現を可能にする調節エレメントの制御下で含む核酸を宿主細胞に導入するこ
とによって実現することができる。一部の実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドで
ある。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むこと
ができる染色体内組み込みベクターである。
【０２１４】
これらのタンパク質をコードする核酸は、それだけに限定することなく当業者に公知の
任意の方法によって宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７
８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１２９２〜３
頁；Ｃｒｅｇｇら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：３３７６〜
３３８５頁；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ
、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照
されたい）。例示的な技法としては、これだけに限定されないが、スフェロプラスト法、
電気穿孔、ＰＥＧ１０００媒介性形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介
性形質転換が挙げられる。
【０２１５】
宿主細胞における酵素のコピー数は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することに
よって変更することができる。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコ
ピー数を改変することによって（例えば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターのより多
くのもしくはより少ないコピー数を使用することによって、またはヌクレオチド配列の追
加のコピーを宿主細胞のゲノムに導入することによって、または宿主細胞のゲノム内のヌ
クレオチド配列を欠失させるもしくは破壊することによって）、オペロンのポリシストロ
ニックｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変化させること、もしくはオペロンを分割して、
それぞれがそれ自体制御エレメントを有する個々の遺伝子にすることによって、またはヌ
クレオチド配列が作動可能に連結したプロモーターもしくはオペレーターの強度を増大さ
せることによって実現することができる。その代わりに、またはそれに加えて、宿主細胞
における酵素のコピー数を、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することに
よって変更することができる。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改変すること、リボ
ソーム結合部位の配列を改変すること、酵素コード配列のリボソーム結合部位と開始コド
ンの間の距離または配列を改変すること、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流
」に位置するもしくはそれと近接するシストロン間領域全体を改変すること、ヘアピンお
よび特殊化された配列を使用してｍＲＮＡ転写物の３’末端を安定化すること、酵素のコ
ドン使用を改変すること、酵素の生合成において使用される稀なコドンｔＲＮＡの発現を
変更すること、ならびに／または酵素の安定性を、例えば、そのコード配列の変異によっ
て増大させることによって実現することができる。
【０２１６】
宿主細胞における酵素の活性は、これだけに限定されないが、宿主細胞において溶解性
の増大または減少を示す改変された形態の酵素を発現させること、酵素の活性の阻害をも
たらすドメインを欠く変更された形態の酵素を発現させること、基質に対するＫｃａｔが
高いもしくは低いまたはＫｍが低いもしくは高い改変された形態の酵素を発現させること
、または経路内の別の分子によるフィードバック調節もしくはフィードフォワード調節の
影響を多かれ少なかれ受ける変更された形態の酵素を発現させることを含めたいくつもの
やり方で変更することができる。
【０２１７】
一部の実施形態では、宿主細胞を遺伝子改変するために使用される核酸は、形質転換さ
れた宿主細胞を選択するためおよび宿主細胞に選択圧力をかけて外来ＤＮＡを維持させる
ために有用な１種または複数種の選択マーカーを含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マ
ーカーの実例としては、これだけに限定されないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ
１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、
およびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡ遺伝子産物によ
り、ベータ−ラクタム系抗生物質（例えば、狭域セファロスポリン、セファマイシン、お
よびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）ならび
にテモシリン以外の全ての抗グラム陰性細菌ペニシリンに対する耐性が付与される；Ｓ．
ｎｏｕｒｓｅｉ由来のＮＡＴ１遺伝子産物により、ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔ
ｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性が付与される；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  
Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物により、ビアラホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐
性が付与される；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１−
Ｃ遺伝子産物により、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する耐性が付与される；ＰＤＲ
４遺伝子産物により、セルレニンに対する耐性が付与される；ＳＭＲ１遺伝子産物により
、スルホメツロンメチルに対する耐性が付与される；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ
遺伝子産物により、クロラムフェニコールに対する耐性が付与される；マウスｄｈｆｒ遺
伝子産物により、メトトレキセートに対する耐性が付与される；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  
ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物により、ハイグロマイシンＢに対する耐性が付与
される；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物により、細胞がＤ−セリンを唯一の窒素源と
して伴うプレートで成長することが可能になる；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺
伝子により、Ｇ４１８に対する耐性が付与される；Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕ
ｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物により、ゼオシン（ブレオマ
イシン）に対する耐性が付与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺
伝子改変宿主細胞を単離した後、抗生物質耐性マーカーを欠失させる。
【０２１９】
一部の実施形態では、選択マーカーにより、遺伝子改変微生物における栄養要求性（ａ
ｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）（例えば、栄養要求性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｏｔｒｏ
ｐｈｙ））がレスキューされる。このような実施形態では、親微生物は、アミノ酸または
ヌクレオチド生合成経路において機能し、それが非機能的になると親細胞が１種または複
数種の栄養分の補充を伴わない培地では成長することができなくなるような１種または複
数種の遺伝子産物の機能的破壊を含む。このような遺伝子産物としては、これだけに限定
されないが、酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲ
Ｐ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次いで、親細胞を破壊された
遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクターまたは染色体組み込み構築物で形質
転換することによって栄養要求性表現型をレスキューすることができ、生成した遺伝子改
変宿主細胞を、親細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。ＵＲ
Ａ３遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、およびＬＹＳ２遺伝子を選択マーカーとして利用すること
には、正の選択と負の選択の両方が可能であるので、顕著な利点がある。正の選択はＵＲ
Ａ３変異、ＴＲＰ１変異、およびＬＹＳ２変異の栄養要求性の補完によって行い、負の選
択は特異的な阻害剤、すなわち、それぞれ原栄養株の成長は妨げるが、それぞれＵＲＡ３
変異体、ＴＲＰ１変異体、およびＬＹＳ２変異体の成長は可能にする５−フルオロ−オロ
ト酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸、およびアミノアジピン酸（ａＡＡ）に基
づく。他の実施形態では、選択マーカーにより、公知の選択方法によって同定することが
できる他の非致死的欠損または表現型がレスキューされる。
【０２２０】
本開示の方法、組成物および生物体において有用な具体的な遺伝子およびタンパク質が
本明細書に記載されているが、このような遺伝子に対する絶対的な同一性は必要ないこと
が理解される。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子ま
たはポリヌクレオチドを変化させ、活性についてスクリーニングすることができる。一般
には、このような変化は、保存的変異およびサイレント変異を含む。このような改変され
たまたは変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、機能的酵素の発現について当
技術分野で公知の方法を使用してスクリーニングすることができる。
【０２２１】
遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に同等のポリペプチドを
コードする他のポリヌクレオチドも、このような酵素をコードするポリヌクレオチドをク
ローニングし、それを発現させるために使用することができる。
【０２２２】
当業者には理解される通り、コード配列を、特定の宿主におけるその発現が増強される
ように改変することが有利であり得る。遺伝暗号は６４種の可能性のあるコドンを伴い重
複するものであるが、大多数の生物体では、一般には、これらのコドンのサブセットが使
用される。ある種においてほとんどの場合に利用されるコドンは最適なコドンと称され、
それほど利用されないコドンは稀なまたは低使用コドンに分類される。コドンは、時には
「コドン最適化」または「種コドンバイアスの制御」と称されるプロセスで宿主の好まし
いコドン使用が反映されるように置換することができる。
【０２２３】
特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを含有する最適化されたコー
ド配列（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７巻：４７
７〜５０８頁）を、例えば、翻訳の速度を増大させるため、または、最適化されていない
配列から産生される転写物と比較して半減期が長いことなどの望ましい特性を有する組換
えＲＮＡ転写物を産生するために調製することができる。翻訳終止コドンを宿主の嗜好が
反映されるように改変することができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳
動物の典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的
な終止コドンはＵＧＡであり、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉでは、一般にＵＡＡが終止コドン
として使用される（Ｄａｌｐｈｉｎら、１９９６年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  
２４巻：２１６〜８頁）。
【０２２４】
遺伝暗号の縮重性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ分子を、本開示
の所与の酵素をコードするために使用することができることが当業者には理解される。上
記の生合成酵素をコードするネイティブなＤＮＡ配列は、本明細書では、ただ単に本開示
のある実施形態を例示するために参照されており、本開示は、本開示の方法において利用
される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤ
ＮＡ分子を包含する。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性の喪失または著し
い喪失を伴うことなくそのアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および
挿入を許容し得る。本開示は、本明細書に記載の具体的なタンパク質とは異なるアミノ酸
配列を有するこのようなポリペプチドを、当該改変ポリペプチドまたはバリアントポリペ
プチドが参照ポリペプチドの酵素的同化活性または異化活性を有する限りは包含する。さ
らに、本明細書に示されているＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に
本開示の複数の実施形態を例示する。
【０２２５】
さらに、本明細書で提供される組成物および方法に有用な酵素のホモログは本開示に包
含される。一部の実施形態では、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミ
ノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、
または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適に比較するために配列
をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１のアミノ酸配列また
は核酸配列と第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入する
ことができ、また、比較する目的で非相同配列を無視することができる）。一実施形態で
は、比較する目的でアラインメントする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも
３０％、一般には少なくとも４０％、より一般には少なくとも５０％、さらに一般には少
なくとも６０％、さらにより一般には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％であ
る。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチ
ドを比較する。第１の配列内のある位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸
残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子はその位置において
同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸ま
たは核酸「相同性」と等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適
にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さ
を考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【０２２６】
タンパク質またはペプチドに関して「相同」が使用される場合、同一ではない残基の位
置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なることが理解される。「保存的アミ
ノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有す
る側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミ
ノ酸置換によりタンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。２つまたはそれより多い
アミノ酸配列が保存的置換によって互いと異なる場合では、パーセント配列同一性または
相同性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を
行うための手段は当業者には周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．  Ｒ．、１９９
４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５巻：３６５〜８９頁を参照された
い）。
【０２２７】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存的置換になるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ
）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラ
ギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシ
ン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニ
ン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０２２８】
ポリペプチドの配列相同性は、パーセント配列同一性とも称され、一般には、配列解析
ソフトウェアを使用して測定される。分子配列と異なる生物体由来の多数の配列を含有す
るデータベースの比較に使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢ
ＬＡＳＴである。多数の異なる生物体由来の配列を含有するデータベースを検索する場合
、アミノ酸配列を比較することが典型的である。
【０２２９】
さらに、前述の酵素をコードする任意の遺伝子（または本明細書で言及されている任意
の他の遺伝子（またはその発現を制御もしくは調節する任意の調節エレメント））を、当
業者に公知の定向進化または合理的変異誘発などの遺伝子工学／タンパク質工学技法によ
って最適化することができる。このような措置により、当業者が酵素を酵母における発現
および活性のために最適化することが可能になる。
【０２３０】
さらに、これらの酵素をコードする遺伝子を他の真菌種および細菌種から同定すること
ができ、この経路を調節するために発現させることができる。これだけに限定されないが
、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｕｖａｒｕｍを含めたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ  ｓｐｐ．、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、およびＫ．ｍａ
ｒｘｉａｎｕｓを含めたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ
．、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含めたＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ
ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｙ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓを含
めたＹａｍａｄａｚｙｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓ
ｉｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓ．ｐｏｍｂｅを含めたＳｃ
ｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．
、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、またはＵｓｔ
ｉｌａｇｏ  ｓｐｐ．を含めた種々の生物体がこれらの酵素の供給源として機能し得る。
嫌気性真菌由来の遺伝子の供給源としては、これだけに限定されないが、Ｐｉｒｏｍｙｃ
ｅｓ  ｓｐｐ．、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、またはＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔ
ｉｘ  ｓｐｐ．が挙げられる。有用な原核生物酵素の供給源としては、これだけに限定さ
れないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０２３１】
追加の相同な遺伝子および相同な酵素を同定するために、当業者に公知の技法が適し得
る。一般に、類似の遺伝子および／または類似の酵素は機能分析によって同定することが
でき、機能的な類似性を有する。類似の遺伝子および類似の酵素を同定するために、当業
者に公知の技法が適し得る。例えば、相同なまたは類似のＰＫ、ＰＴＡ、ＲＨＲ２または
ＨＯＲ２遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技法としては、これだけに限
定されないが、目的の遺伝子／酵素公開された配列に基づくプライマーを使用したＰＣＲ
による遺伝子のクローニング、または目的の遺伝子の間で保存された領域を増幅するため
に設計された変性プライマーを使用した変性ＰＣＲによる遺伝子のクローニングを挙げる
ことができる。さらに、当業者は、機能的な相同性または類似性を有する相同なまたは類
似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技法を使用することができる。そ
れらの技法は、細胞または細胞培養を触媒酵素の活性に関して、前記活性についてのｉｎ
ｖｉｔｒｏ酵素アッセイによって検査すること（例えば、本明細書またはＫｉｒｉｔａ
ｎｉ，  Ｋ．、Ｂｒａｎｃｈｅｄ−Ｃｈａｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９７０年に記載の通り）、次いで、前記活性を有する酵素
を精製することによって単離すること、酵素のタンパク質配列をエドマン分解などのなど
の技法によって決定すること、可能性のある核酸配列に対してＰＣＲプライマーを設計す
ること、前記ＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅すること、および前記核酸配列をクローニ
ングすることを含む。相同なまたは同様の遺伝子および／または相同なまたは同様の酵素
、類似の遺伝子および／または類似の酵素またはタンパク質を同定するための技法は、候
補遺伝子または酵素に関するデータをＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣな
どのデータベースと比較することも包含する。本明細書における教示に従って上記のデー
タベース内で候補遺伝子または酵素を同定することができる。
【実施例】
【０２３２】
６．実施例
６．１  実施例１：
ＰＫおよびＰＴＡを発現する宿主細胞におけるアセテート産生
この実施例では、ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを異種発現する
酵母株におけるアセテートの産生を記載している。
【０２３３】
６．１．１  材料および方法
６．１．１．１  株の工学的操作
６．１．１．１．１  Ｙ９６７およびＹ９６８
Ｙ９６７およびＹ９６８は野生型原栄養Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２であり、Ｙ９６７はＭａｔＡであり、Ｙ９６８はＭａｔａｌｐｈ
ａである。Ｙ１２８６９、Ｙ１２７４６、およびこれらの誘導体の全ての出発株はＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ００３株（ＣＥＮ．ＰＫ２、Ｍａｔア
ルファ、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２８９、ｌｅｕ２−３，１２２、ｈｉｓ３＾１）で
あった。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡ媒介性形質転換は全て、Ｇｉｅｔｚ  ＲＷお
よびＷｏｏｄｓ  ＲＡ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｐａｒｔ  Ｂ．  Ｓａｎ  Ｄ
ｉｅｇｏ、ＣＡ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．８７〜９６頁（２００２年
）に記載されている通り標準の酢酸リチウム手順を使用して行い、全ての場合において、
構築物の組み込みをゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２３４】
６．１．１．１．２  Ｙ１２８６９
Ｙ１２８６９を、Ｙ００３への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、導入
することによりＡＣＳ２遺伝子座の上流のヌクレオチドの配列からなる配列と下流のヌク
レオチドの配列からなる配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ
２遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ２２３５；配列番号２７）を導入することによって
遺伝子ＡＣＳ２を欠失させた。この構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に導入
されると、相同組換えによってゲノムのＡＣＳ２遺伝子座に組み込まれ、その組み込み配
列でＡＣＳ２コード配列が置き換えられることによってＡＣＳ２が機能的に破壊され得る
。形質転換体を、２％ＥｔＯＨを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｌｅｕプレートに
プレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ４９４０であった。
【０２３５】
次に、ＡＬＤ６を欠失させ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ  ｅｕｔＥを、以下に示されて
いる組み込み構築物（ｉ７４８０４；配列番号２８）を用いてＹ４９４０に導入した。
【０２３６】
【化１】
2019213558.tif 000004
この組み込み構築物は、選択マーカー（ＴＲＰ１）、ならびにＴＤＨ３プロモーター（
ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の８４０塩基対上流）およ
びＴＥＦ２ターミネーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領
域の５０８塩基対下流）の制御下にあるＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥ（ＮＣ
ＢＩ参照配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）をコードする酵母コドン最適化配列遺伝
子の２つのコピーを含む。これらの成分は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列
と下流のヌクレオチド配列に挟まれている。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相
同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＬＤ６コード配
列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８
，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。構築物をＹ４９４０に導入して
それを形質転換し、２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＴＲＰプレート上で形質転換体を選択
し、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はｙ１２６０２であった。
【０２３７】
次に、Ｙ１２６０２において、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にあ
る、ＡＣＳ１の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブ
なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ７６２２０；
配列番号２９）を導入することによってＡＣＳ１を欠失させた。形質転換体を、２％グル
コースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣ
Ｒ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２７４７であった。
【０２３８】
次に、Ｙ１２７４７を、ネイティブなＵＲＡ３配列から増幅されたＰＣＲ産物で形質転
換した。この配列により、ｕｒａ３−５２変異が修復される。ＲｏｓｅおよびＷｉｎｓｔ
ｏｎ、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３巻：５５７〜５６０頁（１９８４年）を参照
されたい。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｕｒａ
プレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２８６９で
あった。
【０２３９】
６．１．１．１．３  Ｙ１２７４５
Ｙ１２７４５を、Ｙ４９４０への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Ｙ
４９４０を以下に示されている組み込み構築物（ｉ７３８３０；配列番号３０）で形質転
換した。
【０２４０】
【化２】
2019213558.tif 000005
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレ
オチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選
択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流
）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コド
ン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）；ＴＤＨ３プロモータ
ー（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コ
ード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ
ホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ
＿００１３９４７８０．１）を含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換
えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置
き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２
１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡ
プレート上で形質転換体を選択した。生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７４８１
０；配列番号３１）で形質転換した。
【０２４１】
【化３】
2019213558.tif 000006
この構築物は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流の
ヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＴＲＰ１）；ＴＤＨ３プ
ロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（Ｔ
ＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞
に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列
でＡＬＤ６コード配列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構
築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコ
ースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認し
た。
【０２４２】
次に、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にある、ＡＣＳ１の上流のヌ
クレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ  ＨＩＳ３遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ７６２２０；配列番号２９）を導入す
ることによってＡＣＳ１を欠失させた。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源と
して含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した
。
【０２４３】
６．１．１．１．４  Ｙ１２７４６
Ｙ１２７４６を、Ｙ４９４０への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Ｙ
４９４０を以下に示されている組み込み構築物（ｉ７３８３０；配列番号３０）で形質転
換した。
【０２４４】
【化４】
2019213558.tif 000007
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレ
オチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選
択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流
）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コド
ン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）；ＴＤＨ３プロモータ
ー（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コ
ード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ
ホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ
＿００１３９４７８０．１）を含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換
えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置
き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２
１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡ
プレート上で形質転換体を選択した。
【０２４５】
生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７４８１０；配列番号３１）で形質転換した
。
【０２４６】
【化５】
2019213558.tif 000008
この構築物は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流の
ヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＴＲＰ１）；ＴＤＨ３プ
ロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（Ｔ
ＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔ
ｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞
に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列
でＡＬＤ６コード配列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構
築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコ
ースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認し
た。
【０２４７】
最後に、生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７６２２１；配列番号３２）で形質
転換した。
【０２４８】
【化６】
2019213558.tif 000009
この構築物は、選択マーカー（ＨＩＳ３）；ならびにＴＤＨ３プロモーター（ネイティ
ブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の８４０塩基対上流）およびＴＥＦ
２ターミネーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領域の５０
８塩基対下流）の制御下にあるＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥ（ＮＣＢＩ参照
配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）をコードする酵母コドン最適化配列遺伝子の２つ
のコピーを含む。これらの成分は、ＡＣＳ１遺伝子座の上流のヌクレオチド配列と下流の
ヌクレオチド配列に挟まれている。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換え
によって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＣＳ１コード配列が置き
換えられることによってＡＣＳ１が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１
，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＨＩＳプ
レート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２７４６
であった。
【０２４９】
６．１．１．１．５  Ｙ１９３９０
Ｙ１９３９０は、Ｙ１２８６９の直接の派生物である。Ｙ１２８６９のウラシル要求性
誘導体を以下に示されている組み込み構築物ＭＳ４９２５３（配列番号３６）で形質転換
した：
【０２５０】
【化７】
2019213558.tif 000010
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレ
オチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選
択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流
）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬ
ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コド
ン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）の２つのコピーを含む
。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み
込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによってＢＵＤ９
が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用し
て組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択した
。
【０２５１】
６．１．１．１．６  Ｙ１９３９１
Ｙ１９３９１は、Ｙ１２８６９の直接の派生物である。Ｙ１２８６９のウラシル要求性
誘導体を以下に示されている組み込み構築物ＭＳ４９２９８（配列番号３７）で形質転換
した：
【０２５２】
【化８】
2019213558.tif 000011
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレ
オチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選
択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流
）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあ
るＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のホスホトランスアセチラーゼの酵母
コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１３９４７８０．１）の２つの
コピーを含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞の
ゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによ
ってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の
方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換
体を選択した。
【０２５３】
６．１．１．２  培養条件
Ｙ９６７、Ｙ１２８６９、Ｙ１２７４５、Ｙ１２７４６、Ｙ１９３９０およびＹ１９３
９１の種菌培養物を、単一のコロニーから、５０ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．０、および２
０ｇ／Ｌのスクロースを伴うシード培地５ｍｌ中、３０℃、２００ｒｐｍで一晩成長させ
た（１５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、８ｇ／Ｌのリン酸カリウム、６．１ｇ／Ｌの硫酸マ
グネシウム、１５０ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ、５７．５ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、４．８ｍｇ／Ｌ
の塩化コバルト、３．２４ｍｇ／Ｌの塩化マンガン、５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、２９．４ｍｇ
／Ｌの塩化カルシウム、２７．８ｍｇ／Ｌの硫酸鉄、４．８ｍｇ／Ｌ  モリブデン酸ナト
リウム、０．６ｍｇ／Ｌのビオチン、１２ｍｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１２ｍｇ
／Ｌのニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌのイノシトール、１２ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン、１２ｍ
ｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、０．２４ｍｇ／Ｌのパラアミノ安息香酸）。次いで、前培養
物を、５０ｍＭのコハク酸ｐＨ５．０、および４０ｇ／Ｌのスクロースを伴うシード培地
２５ｍｌを含む１２５ｍｌのフラスコに接種し、最初のＯＤ６００を０．１にし、３０℃
、２００ｒｐｍで成長させた。
【０２５４】
６．１．１．３．  アセテート、フルクトース、グルコース、およびスクロースの定量
化
全細胞ブロス１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を
使用して１３，０００ＲＰＭで１分回転させて上清を清澄化することによってアセテート
および糖（フルクトース、グルコース、スクロース）を定量化した。次いで、上清を８ｍ
Ｍの硫酸で希釈し（１：１ｖ／ｖ）、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、１．８ｍ
ｌのバイアルに移した。ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  ３００ｍｍ×７
．８ｍｍカラムを使用して、可変性の波長および屈折率検出を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  １２
００  ＨＰＬＣを用いて試料を分析した。移動相は４ｍＭの硫酸であり、カラム温度は４
０℃であり、流速は毎分０．５ｍｌであった。
【０２５５】
６．１．１．４．  結果
図３Ｂには、野生型Ｃｅｎ．ＰＫ２、Ｙ９６７がバッチ確定スクロース振とうフラスコ
培養物中での成長中にアセテートを産生することが示されている。ＰＤＨ−バイパスの欠
失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ
アシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現するＹ１２８６９により産生されるアセテートは
、ＰＤＨ−バイパスを使用する野生型対照よりもはるかに少なく、これはアセトアルデヒ
ドをアセテートに変換する細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであるＡＬＤ
６の欠失に起因する可能性がある。ＰＤＨ−バイパスの欠失を含み（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ
２Δ  ａｌｄ６Δ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）な
らびにホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴ
Ａ）を異種発現するＹ１２７４６株では、アセテートの大きな増大が観察され、野生型Ｙ
９６７によって産生される量に勝る。Ｙ１２８６９での結果により、ａｃｓ１Δ  ａｃｓ
２Δ  ａｌｄ６Δであり、細胞質ゾル内アセチルＣｏＡにフラックスを持っていくために
ＡＤＡを使用する株ではアセテートのベースラインレベルが非常に低いことが示される。
全ての場合において、糖消費の速度は同等であり（本明細書では、糖とは、培地中のスク
ロース、グルコース、およびフルクトースの合計と定義される）、これにより、アセテー
トレベルの差異がフィードストックの示差的な消費に起因するものではないことが例証さ
れる（図３Ａ）。これらの結果により、Ｙ１２７４６におけるアセテートの増大は、ホス
ホケトラーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの存在に起因することが示唆さ
れる。ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの両方の触媒活性によりアセ
チルホスフェートが産生される。したがって、Ｙ１２７４６における自発的なまたは触媒
されるアセチルホスフェートの加水分解からアセテート蓄積が生じ得る。
【０２５６】
ＡＤＡ、ＰＫおよびＰＴＡを発現する株（Ｙ１２７４６）におけるアセテートの供給源
を決定するために、細胞質ゾル内ＡｃＣｏＡをもたらすためにＡＤＡのみを使用する株（
Ｙ１２８６９、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み
、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現する）を、
（１）Ｙ１９３９０をもたらす、強力なプロモーターＰＴＤＨ３によって駆動されるＰＫ
の２つの過剰発現したコピーをコードする組込み構築物、または（２）Ｙ１９３９１をも
たらす、強力なプロモーターＰＴＤＨ３によって駆動されるＰＴＡの２つの過剰発現した
コピーをコードする組込み構築物のいずれかで形質転換した。図３Ｄに示されている通り
、ＰＫまたはＰＴＡのいずれかを発現する株では親株と比較してアセテート蓄積の増大が
観察された。アセテートレベルが示差的な糖消費に起因するものではないことを例証する
ために糖消費が図３Ｃに示されている。ＰＫはＸ５ＰをアセチルホスフェートおよびＧ３
Ｐに変換するものであり、ＰＴＡは、アセチルＣｏＡ＋Ｐｉとアセチルホスフェート＋Ｃ
ｏＡを相互変換する。これらの知見により、図１に示されるように、ＰＫによりＸ５Ｐか
ら引き出されたものであれ、ＰＴＡによりＡｃＣｏＡから引き出されたものであれ、アセ
チルホスフェートがアセテートに加水分解され得ることが示唆される。
【０２５７】
６．２  実施例２：
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける主要なアセチルホスファ
ターゼの同定
この実施例では、酵母においてアセチルホスフェートを加水分解することができる酵素
の同定を記載している。
【０２５８】
６．２．１  材料および方法
６．２．１．１  細胞培養
所与の酵母株の単一のコロニーを、２％デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地
（ＹＰＤ）５ｍＬ中で一晩発端培養として培養した。翌日、ＹＰＤ５０ｍｌをこの発端培
養物に接種し、ＯＤ６００を０．２にした。別段の指定がない限り、フラスコを３０℃、
２００ＲＰＭで振とうしながら２４時間インキュベートした。
【０２５９】
６．２．１．２  無細胞抽出物の調製
細胞培養物を１５ｍＬのファルコンチューブ３つに分け、４０００×ｇで５分遠心分離
することによって収集した。次いで、上清を廃棄し、氷冷した緩衝液Ｗ（１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）１０ｍＬに
再懸濁させ、その後、４０００ｘｇで５分遠心分離することによって細胞を洗浄した。上
清を廃棄し、細胞を溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＬ当たり１つのＥＤＴＡフ
リープロテアーゼインヒビター錠（Ｒｏｃｈｅ））１ｍＬに再懸濁させた。次いで、細胞
を、Ｏリングキャップを伴う２ｍＬのプラスチックスクリューキャップ微量遠心チューブ
（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ  ５２０−ＧＲＤ）に移し、破壊ビーズ（Ｄｉｓｒｕｐｔｉ
ｏｎ  ｂｅａｄｓ、０．５Ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ）およびビーズビーターを使用して、６Ｍ
／Ｓで１分間にわたって細胞を溶解させた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも
５分置いた。次いで、チューブを再度ビージビーターに戻し、６Ｍ／Ｓで１分置き、氷浴
に戻して５分置いた。チューブを最低でも１６０００×ｇで２０分回転させて細胞片をペ
レット化した。次いで、上清を新しい低温チューブに移した。タンパク質の濃度を、タン
パク質についての典型的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した（Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄ  ＭＭ  Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐ
ｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉ
ｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２巻、２４８〜２５４
頁（１９７６年））。
【０２６０】
６．２．１．３  アセチルホスファターゼ反応およびアセチルホスフェートの定量化
アセチルホスファターゼ活性アッセイを、３０℃、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２＋からなる反応緩衝液中で
行った。アセチルホスフェートを、示されている通り５ｍＭまたは１０ｍＭのいずれかの
出発濃度になるまで添加した。無細胞抽出物を示されている量で添加することによって反
応を開始させた。ホスファターゼ阻害について試験するために、選択のためにフッ化ナト
リウムをウェルに３０ｍＭの濃度で添加した。密閉した９６ウェルプレートで反応を行い
、反応生成物の総体積は２５０μｌであった。アセチルホスフェート濃度を、Ｌｉｐｍａ
ｎｎおよびＴｕｔｔｌｅ（Ｌｉｐｍａｎｎ  Ｆ、Ｔｕｔｔｌｅ  ＬＣ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．  １５９巻、２１〜２８頁（１９４５年））により開発された方法によって
測定した。反応混合物５０μｌを２Ｍのヒドロキシルアミン、ｐＨ６．８、５０μｌに添
加し、十分に混合し、室温で少なくとも１０分インキュベートした。次いで、１５％トリ
クロロ酢酸３４μｌを添加し、混合し、その後、４ＮのＨＣｌ、３４μｌ、および５％Ｆ
ｅＣｌ３、３４μｌをそれぞれ添加した後に十分に混合した。次いで、プレートを、スイ
ングバケットローターＪＳ−５．３を伴うＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機Ｊ−Ｅにおいて、３
０００ｒｐｍで５分遠心分離して沈殿したタンパク質をペレット化した。次いで、次いで
、上清１５０μｌを新鮮な９６ウェル透明平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎ
ｅ  Ｃａｔ．−Ｎｏ．：６５５１６１）に移した。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄ
ｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーによって５０５ｎｍの波長
において読み取った。
【０２６１】
６．２．１．４  活性なホスファターゼ画分の精製
所与の酵母株の単一のコロニーを、２％デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地
（ＹＰＤ）５ｍＬ中で一晩発端培養として培養した。翌日、５００ｍｌのＹＰＤを伴う２
．８Ｌのフェルンバッハフラスコ２つにこの発端培養物を接種し、ＯＤ６００を０．２に
した。フラスコを、３０℃、１６０ＲＰＭで振とうしながら２４時間インキュベートした
。培養物を、４０００ｘｇで５分遠心分離することによって収集した。細胞ペレットを滅
菌水５００ｍＬで洗浄し、４０００ｘｇで５分遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、
氷冷した溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＬ当たり１つのＥＤＴＡフリープロテ
アーゼインヒビター錠（Ｒｏｃｈｅ））５０ｍＬに再懸濁させた。細胞浮遊液を、破砕ビ
ーズ（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｅａｄｓ、０．５Ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ）５ｍＬを満たし
た１５ｍＬのファルコンチューブ６つに分割した。次いで、チューブをビーズビーターに
入れ、６Ｍ／Ｓで４５秒置いた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも５分置いた
。ビーズビーティングをさらに３回繰り返し、各破砕セグメントの間に氷水浴に少なくと
も５分入れた。チューブを、４℃に冷却したＪＡ−２０ローター内のＢｅｃｋｍａｎ遠心
分離機Ｊ−Ｅで１６，０００ｒｐｍ（３０，９６６×ｇ）で３０分回転させて、細胞片を
ペレット化した。細胞溶解物を、Ｓａｌｔら（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔ
ｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｌｕｂｌ
ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ：  Ａ  ｓｔ
ｕｄｙ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔｓ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ  １７巻、１０７〜１１３頁（１９９５年））に記載されている選択的フ
ロキュレーション法によって以下の通りさらに清澄化した：無細胞溶解物を、５ｍＭのＮ
ａＯＨストック溶液を添加することによってｐＨ７．４に調整した。次いで、等体積のＰ
ＥＩ／Ｂｏｒａｘ溶液（０．５ＭのＮａＣｌ、０．２５％ＰＥＩ、１００ｍＭのＢｏｒａ
ｘ）を細胞溶解物に添加し、十分に混合した。次いで、混合物を、４℃、２，５００×ｇ
で３０分遠心分離した。次いで、硫酸アンモニウムを８０％の飽和濃度に達するまで絶え
ず撹拌しながらゆっくりと添加することによってタンパク質沈殿させた。撹拌をさらに１
０分継続し、次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２０ローターにおいて４℃、１５，０００
ｒｐｍで１０分遠心分離することによって沈殿したタンパク質を収集した。上清を除去し
、タンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１０％グリセロール）に
穏やかに再懸濁させた。次いで、タンパク質を、３，５００Ｄａ分子量カットオフ透析カ
セット（Ｐｉｅｒｃｅ＃６６３００）０．５〜３ｍＬに添加し、１．５Ｌの緩衝液Ａ中、
４℃で一晩透析した。透析した試料を１６０００×ｇで１０分遠心分離して、沈殿したタ
ンパク質をペレット化した。タンパク質の濃度を、タンパク質についての典型的なＢｒａ
ｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ、Ａ  ｒａｐｉｄ  ａ
ｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  
ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎ
ｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  
Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２巻、２４８〜２５４頁（１９７６年））。タンパク質
２０ｍｇをＧＥ  ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ４．６
／１００  ＰＥ陰イオン交換カラムにローディングした。緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ
−Ｃｌ、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）の０〜１００％勾配を３０カラ
ム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いてタンパク質を溶出し、試料１ｍＬを採取
した。各画分の活性をアッセイするために、各画分７５μＬを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−
Ｃｌ、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する反応物２５０μＬ
中８ｍＭのＡＣＰに添加し、上記の通りアッセイした。この分離からの活性な画分を緩衝
液Ａに対して一晩、再度透析した。次いで、試料全体を同じＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ４．
６／１００  ＰＥ陰イオン交換カラムにローディングし、０〜４５％緩衝液Ｂの勾配を３
０カラム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いて溶出し、試料１ｍＬを採取した。
試料を活性について上記の通りアッセイした。
【０２６２】
６．２．１．５  タンパク質ゲル電気泳動
タンパク質画分を、基準ゲル電気泳動系を使用して分析した。画分１０μＬを、５％ｖ
／ｖ２−メルカプトエタノールを伴う２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＢｉｏＲａｄ  Ｃ
ａｔ番号１６１−０７３７）１０μＬに添加し、１０分煮沸した。次いで、試料を短時間
遠心分離し、１５μｌを２６ウェル４〜１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ（商標
）Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌにローディングし、１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（
ＢｉｏＲａｄにより調製されたもの、１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ＃１６１
−０７３２）に１３０ボルトで５０分流した。ゲルを脱イオン水２００ｍＬで３回、それ
ぞれ５分すすいだ。次いで、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆ
ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ番号ＬＣ６０６０）をゲルに添加してゲルを完全
に覆い、次いで、室温で１時間、穏やかにゆすりながらインキュベートした。次いで、Ｓ
ａｆｅＳｔａｉｎを廃棄し、ゲルを、脱イオン水２００ｍＬを用いて１時間ゆすりながら
洗浄した。
【０２６３】
６．２．１．６  活性なホスファターゼ画分中のタンパク質の同定
タンパク質消化およびペプチドの分離
総タンパク質１００μｇを、その後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定するためにトリプ
シンによるタンパク質分解に供した。総タンパク質１００μｇを、Ｔｒｉｓ−カルボキシ
エチルホスフィン（４ｍＭ）を用いて３７℃で３０分還元し、次いで、ヨードアセトアミ
ド（１５ｍＭ）を用いて暗闇中、ＲＴで３０分アルキル化した。トリプシン５μｇを消化
混合物に添加し、３７℃で１２時間にわたって完全に消化した。０．１％ギ酸を用いて反
応をクエンチし、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃｏｌｕｍｎ（
５ｃｍｘ２．１ｍｍ  ＩＤ、粒子サイズ２．１ｕｍ）に注射し、０．１％ギ酸を修飾因子
として使用し、低アセトニトリルから高アセトニトリルまでの９０分の勾配にわたって分
離した。ＬＣポンプは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＣＢＭ２０Ａ  ＬＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ
により作動する２台のＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０ＡＤであった。
【０２６４】
質量分析パラメータ：
ＱＴＲＡＰ  ４０００ハイブリッドトリプル四重極リニアイオントラップ質量分析計を
使用して、カラムから溶出するペプチドを同定した。ＩＤＡパラメータは以下の通りであ
った：選択イオン、３５０〜１３００ｄａ；電荷の状態を決定するために使用するＥＲス
キャン；１＋イオン拒絶、未知許容；回転衝突エネルギー：あり（ｑｔｒａｐ４０００の
ＡＢ  ＳＣＩＥＸ標準）；各ＭＳ／ＭＳの最大充填時間：９５０ｍｓ。
【０２６５】
Ｍａｓｃｏｔによるペプチド同定
Ｍａｔｒｉｘ  ＳｃｉｅｎｃｅによるＭａｓｃｏｔを使用し以下のパラメータを用いて
ＣＥＮＰＫ２配列データベースからペプチドを同定した。固定修飾（Ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）：カルバミドメチル。可変修飾（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）：脱アミド（ＮＱ）、酸化（ＭＷ）。前駆体質量許容差（Ｐｒｅｃｕ
ｒｓｏｒ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：０．５ｄａ。生成物質量許容差（Ｐｒｏｄ
ｕｃｔ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：１．０ｄａ。切断ミス最大数（Ｍｉｓｓｅｄ
ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ａｌｌｏｗｅｄ）：１。
【０２６６】
６．２．１．７  株の工学的操作
機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くＹ９６８のバージョンを、ＲＨＲ２をノックアウトするた
めにｍｓ５９８５８を用いて、またはＨＯＲ２をノックアウトするためにｍｓ５９９７１
を用いて形質転換した。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用し
て組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、
ＰＣＲ増幅によって確認した。この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれ
ており、それにより、当該マーカーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用す
るために、細胞をＹＰＤ中で一晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。
ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないこ
とによって確認した。次いで、Ｙ９６８．ｍｓ５９８５８のｕｒａ−バージョンをｍｓ５
９９７１で形質転換して、２重ＲＨＲ２およびＨＯＲ２ノックアウトＹ９６８．ｍｓ５９
８５８．ｍｓ５９９７１株を生成した。
【０２６７】
６．２．２  結果
６．２．２．１  アセチルホスフェートの加水分解は酵素により触媒され、熱および広
範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤により阻害される
図４に示されている通り、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ９６７株由来の無細胞
抽出物の添加により、アセチルホスフェートの加水分解が触媒され、加水分解の速度は、
添加する無細胞抽出物の量に左右される。無細胞抽出物の量を増大することにより、加水
分解の速度が上昇する。無細胞抽出物を煮沸すると、漸増量の無細胞抽出物を添加するこ
とによりもはやアセチルホスフェートの加水分解速度は影響を受けず、これにより、反応
性成分が熱により失活したことが示される。同様に、３０ｍＭの、広範なスペクトルのホ
スファターゼ阻害剤であるフッ化ナトリウムを添加することにより、アセチルホスフェー
トの加水分解時の無細胞抽出物の効力がなくなる。これらの結果により、ホスファターゼ
がアセチルホスフェート加水分解の触媒作用に関与する可能性があることが示唆される。
【０２６８】
６．２．２．２  タンパク質分画により、単一の富化された活性な画分が単離される
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して無細胞抽出物中の可溶性タンパク質を分離
した。図５Ａには、ホスファターゼ活性のほぼ全てが１つの画分に濃縮され、残りの活性
がその画分の付近にあったことが示されている。これにより、無細胞抽出物中のこの活性
に関与する酵素が、単一のタンパク質、または陰イオン交換クロマトグラフィーによって
分離した際に一緒に溶出する、同様のイオン性相互作用を有するタンパク質のいずれかで
あることが示される。
【０２６９】
ＦＰＬＣ陰イオン交換精製からの活性な画分＃１０について、より浅い０〜４５％緩衝
液Ｂの勾配を使用して２回目の精製を行った。図６Ａに示されている通りこの精製による
最も活性な画分であった＃１４を質量分析によって分析して、画分中のタンパク質の同一
性を決定した。活性な画分において同定されたタンパク質のうち（図６Ｂ）、Ｒｈｒ２と
、著しい配列類似性に起因し質量分析によって区別することができないそのホモログであ
るＨｏｒ２のみが、ＳＧＤデータベースによってホスファターゼと同定された一覧にある
タンパク質であった。Ｒｈｒ２は、高レベルで構成的に発現されるグリセロール−１−ホ
スファターゼである。Ｈｏｒ２は、同一の反応を触媒するが、正常状態下では低レベルで
のみ発現され、浸透ストレスによって誘導される（Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｉｓｏｅｎｚｙ
ｍｅｓ  ｏｆ  ＤＬ−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７
１巻、１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年））。アセチルホスフェートは酵母のネイ
ティブな代謝産物ではなく、したがって、加水分解は同様の基質を標的とする酵素の無差
別な反応によって引き起こされることが予想される。Ｒｈｒ２／Ｈｏｒ２は、以下に示さ
れている通りそれらのネイティブな基質であるグリセロール−１−ホスフェートもアセチ
ルホスフェートと同様の低分子量のリン酸化化合物であるので、この反応の最上位の候補
である。
【０２７０】
【化９】
2019213558.tif 000012
６．２．２．３  ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２の欠失によりホスファターゼ活性が
低下する
Ｒｈｒ２および／またはＨｏｒ２がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて観察されるホス
ファターゼ活性に関与するかどうかを決定するために、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２のいずれ
かを欠く新しい株、およびＲＨＲ２とＨＯＲ２を両方とも欠く１つの株を創出した。これ
らの株を以前に記載されている通り培養し、無細胞抽出物を調製し、アセチルホスファタ
ーゼ活性について試験した。図７に示されている通り、ＲＨＲ２の欠失によりホスファタ
ーゼ活性が劇的に低下するが、ＨＯＲ２の欠失にはアセチルホスフェートの加水分解の速
度に対する効果はない。しかし、すでにＲＨＲ２が欠失している株ではＨＯＲ２の欠失に
よりアセチルホスフェートの加水分解が低下する。これは、ＲＨＲ２の欠失後にＨｏｒ２
の発現が上方制御されることが示されている公開された研究と一致する（ＤｅＬｕｎａら
、Ｎｅｅｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｅｖ
ｅｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｕｐ
ｌｉｃａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ、ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌ．、８巻、ｅ１００００３４７頁（２０
１０年））。図７に示されている通り、これらのホスファターゼを両方とも排除すること
により、ほぼバックグラウンドレベルのアセチルホスフェート加水分解がもたらされる。
これらの結果により、グリセロール−１−ホスファターゼであるＲｈｒ２およびＨｏｒ２
がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける大多数のアセチルホスファターゼ活性に関与するこ
とが確認される。
【０２７１】
６．３  実施例３：
アセチルホスフェートホスファターゼの欠失により、アセテート分泌が低下し、アセチ
ルＣｏＡに由来する化合物の産生が改善される
６．３．１  材料および方法
６．３．１．１  株の構築
Ｙ９６８、Ｙ１２８６９、およびＹ１２７４６、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くバージョ
ンを、ファルネセン産生体に変換するために、ｍｓ６３９０７またはｍｓ６３９０９のい
ずれかを用いて、およびｍｓ６４４７２を用いて形質転換した。
【０２７２】
ｍｓ６３９０７組み込み構築物（ｉ８４０２２；配列番号３３）が下に示されている。
【０２７３】
【化１０】
2019213558.tif 000013
この構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子座の上流の
ヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれ
た、全てガラクトース−誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１
およびＧＡＬ１０のプロモーター）の下にある、選択マーカー（ＵＲＡ３）；それ自体の
プロモーターの下にあるネイティブな酵母ＧＡＬ４転写因子のコピー；２つのネイティブ
な酵母のメバロン酸経路の酵素（アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１
０、およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３）、ならびにＳｉｌｉｃｉ
ｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの酵母コドン最適化バー
ジョンの２つのコピーをコードするヌクレオチド配列を含む。宿主細胞に導入されると、
ｍｓ６３９０７構築物は相同組込みによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込
み配列でＨＯコード配列が置き換えられることによってＨＯが機能的に破壊される。構築
物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコー
スを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した
。この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マ
ーカーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、細胞をＹＰＤ中で
一晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。ＵＲＡ３のループアウトをＰ
ＣＲ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないことによって確認した。ｍｓ６
３９０９組み込み構築物（ｉ８４０２６；配列番号３４）は、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ  Ｈ
ＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする配列が、ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする切断型ＨＭＧ１コード配列であるｔＨＭＧｒ
で置き換えられていることを１つの例外として、ｍｓ６３９０７と同一である。
【０２７４】
ｍｓ６４４７２組み込み構築物（ｉ８５２０７；配列番号３５）が下に示されている。
【０２７５】
【化１１】
2019213558.tif 000014
この構築物は、全てガラクトース−誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺
伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＧＡＬ７のプロモーター）の下にある、選択マーカー
（ＵＲＡ３）；５つのネイティブな酵母のエルゴステロール経路の酵素（メバロン酸キナ
ーゼをコードするＥＲＧ１２、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８、メバロ
ン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９、ジメチルアリル二リン酸イ
ソメラーゼをコードするＩＤＩ１、およびファルネシルピロホスフェートシンテターゼを
コードするＥＲＧ２０）、ならびに進化した、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ  ファル
ネセンシンターゼの酵母コドン最適化バージョンをコードするヌクレオチド配列を含む。
これらの配列は、ＧＡＬ８０の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレ
オチド配列からなる相同配列で挟まれている。宿主細胞に導入されると、ｍｓ６４４７２
構築物は相同組込みによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＧＡＬ
８０コード配列が置き換えられることによってＧＡＬ８０が機能的に破壊される。構築物
は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコース
を伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マー
カーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、細胞をＹＰＤ中で一
晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。ＵＲＡ３のループアウトをＰＣ
Ｒ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないことによって確認した。
【０２７６】
次に、Ｙ９６８．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２、Ｙ１２８６９．ｍｓ６３９０７．
ｍｓ６４４７２、およびＹ１２７４７．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２のｕｒａ−バー
ジョンを、ＲＨＲ２  ＯＲＦをノックアウトするためにｍｓ５９８５８で形質転換した。
この組み込み構築物は、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にある、ＲＨ
Ｒ２の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子からなる。形質転換体を、２％グルコースを唯一の
炭素源として含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって
確認した。
【０２７７】
６．３．１．２  培養条件
単一のコロニーを９６ウェルプレートのウェル中のシード培地（実施例１に記載されて
いる）３６０μｌに接種し、３４℃で３日間、１０００ｒｐｍで振とうすることにより成
長させた。次いで、培養物１４．４μｌを５０ｍＭのコハク酸ｐＨ５．０および４０ｇ／
Ｌガラクトースを伴うシード培地３６０μｌ中に継代培養し、３４℃で２日間、１０００
ｒｐｍで振とうすることによって成長させた。
【０２７８】
６．３．１．３  アセテートおよびグリセロールの定量化
アセテートおよびグリセロールを定量化した  全細胞ブロス１ｍｌを１．５ｍｌのエッ
ペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して１３，０００ＲＰＭで１分回転さ
せて上清を清澄化することによって。次いで、上清を８ｍＭの硫酸で希釈し（１：１ｖ／
ｖ）、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、１．８ｍｌのバイアルに移した。Ｂｉｏ
Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  ３００ｍｍ×７．８ｍｍカラムを使用して、可
変性の波長および屈折率検出を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを用いて試料を
分析した。移動相移動相は４ｍＭの硫酸であり、カラム温度は４０℃であり、流速は毎分
０．５ｍｌであった。
【０２７９】
６．３．１．４  ファルネセンの定量化
３４℃で２日間のインキュベーションの最後に、全細胞ブロス９８μｌをナイルレッド
溶液（ＤＭＳＯ中１００μｇ／ｍｌ）２μｌと混合して平底９６ウェルアッセイプレート
（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１６）に入れ、９６ウェルプレート振とう機で３０秒混合した。次
いでプレートをＢｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリーダーにおいて５００ｎｍにおける励起
および５５０ｎｍにおける放出を用いて読み取った。
【０２８０】
６．３．１．５  光学濃度の定量化
９６ウェルアッセイプレートにおいて、培養物８μｌと希釈剤（２０％ＰＥＧ２００、
２０％エタノール、２％トリトンＸ−１１４）９２μｌを混合し、室温で３０分インキュ
ベートした。アッセイプレートをボルテックスした後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリ
ーダーでＯＤ６００を測定した。
【０２８１】
６．３．２  結果
図８Ａには、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み
、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）ならびにホスホケト
ラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現し
、かつファルネセン産生経路内の遺伝子を過剰発現するＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．
ｍｓ６４４７２株により、ＲＨＲ２遺伝子が欠失したＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍ
ｓ６４４７２バージョンよりも多くのアセテートが分泌されることが示されている。図８
Ｂに示されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾の
グリセロールレベルはＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２と比較して大きく
変化しないので、ＲＨＲ２の欠失によるグリセロール産生に対する影響はない。図８Ｃに
示されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾におけ
るアセテートの実質的なレベルの低下は、細胞密度はＲＨＲ２＋集団とｒｈｒ２＾集団の
どちらについても同様であるので、細胞の成長の低下に起因するものではない。これらの
結果により、無細胞抽出物におけるアセチルホスフェートホスファターゼ活性に関与する
Ｒｈｒ２が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアセチルホスフェートのアセテートへの加水分解の
主な原因でもあることが実証される。
【０２８２】
ＲＨＲ２が欠失すると観察されるアセテートの減少がファルネセン産生とは独立して起
こるかものかどうかを決定するために、１２７４６株のＲＨＲ２遺伝子がインタクトであ
るまたは欠失しているがファルネセン産生経路内の遺伝子を発現しないバージョンにおけ
るアセテート産生を測定した。図８Ｄには、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃ
ｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅ
ｕｔＥ）ならびにホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（
Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現するＹ１２７４６株により、Ｙ１２７４６のＲＨＲ２遺伝子が
欠失したバージョンよりも多くのアセテート分泌されることが示されている。図８Ｅに示
されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾における
アセテートの実質的なレベルの低下は、細胞密度はＲＨＲ２＋集団およびｒｈｒ２＾集団
のどちらについても同様であるので、細胞の成長の低下に起因するものではない。これら
のデータにより、アセテートの減少が過剰発現したファルネセン産生経路の存在にかかわ
らず起こることが例証される。
【０２８３】
図９には、ｒｈｒ２の欠失により、ファルネセン産生がＹ１２７４６．ｍｓ６３９０７
．ｍｓ６４４７２では２．１倍改善され、Ｙ１２７４５．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７
２では１．４倍改善されることが示されている（各株バックグラウンドにおいて、ＲＨＲ
２＋親を１に正規化）。さらに、ｒｈｒ２の欠失により、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０７
．ｍｓ６４４７２の炭素消耗時の最終的な光学濃度が改善される。Ｙ１２７４５．ｍｓ６
３９０７．６４４７２とＹ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２はどちらも、フ
ァルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するためにホスホケト
ラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用し、したがって経路の中間体としてアセ
チルホスフェートを使用する。Ｙ９６８．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２株およびＹ１
２８６９．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２株はホスホケトラーゼまたはホスホトランス
アセチラーゼを発現せず、経路の中間体としてアセチルホスフェートを使用しない。これ
らの株バックグラウンドにおけるｒｈｒ２の欠失には、いずれの株バックグラウンドにお
いてもファルネセン産生または光学濃度に対する効果はない。これにより、ｒｈｒ２を特
異的にノックアウトすることの利益は、中間代謝産物よしてアセチルホスフェートを使用
する株、例えば、異種ＰＫおよび／またはＰＴＡを株に当てはまることが示される。
【０２８４】
本明細書において引用されている刊行物、特許および特許出願は全て、個々の刊行物ま
たは特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたと同じく参照
により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例に
より一部の詳細について記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の
範囲の主旨または範囲から逸脱することなくそれらに対してある特定の変化および改変を
成すことができることが当業者には容易に明らかになる。
【図１】
2019213558.tif 000015
【図２】
2019213558.tif 000016
【図３−１】
2019213558.tif 000017
【図３−２】
2019213558.tif 000018
【図４】
2019213558.tif 000019
【図５】
2019213558.tif 000020
【図６】
2019213558.tif 000021
【図７】
2019213558.tif 000022
【図８−１】
2019213558.tif 000023
【図８−２】
2019213558.tif 000024
【図９】
2019213558.tif 000025
【配列表】
2019213558000001.app
【外国語明細書】
2019213558000001.pdf