(57)【要約】【課題】Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のエピトープおよびこれに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス中和結合分子の提供。【解決手段】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の特異的エピトープとこれに結合するＢ型肝炎ウイルス中和結合分子に関する。本発明が提供するエピトープは、三次元的構造を形成することにより生成され、既存のワクチンまたはＨＢＩｇの投与に対する回避突然変異が生成されるａ決定基を含まないことから、これに結合する抗体を含む組成物または前記エピトープを含むワクチン組成物は、回避突然変異による効能の低下が生じる可能性が非常に低い。したがって、このような抗体またはワクチン組成物は、ＨＢＶの予防および／または治療に非常に有用に使用可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１０６−１５１の中から選択された３〜３８ｍｅｒのエピトープ。
【請求項２】
前記エピトープは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１０６−１１０、１０７−１１１、１０８−１１２、１０９−１１３、１１０−１１４、１１４−１１８、１１５−１１９、１１９−１２３、１２０−１２４、１４３−１４７、１４４−１４８、１４５−１４９、１４６−１５０、１４７−１５１、１１０−１１８、１１８−１２０、１１６−１２０、１１７−１２１、１１８−１２２、１２０−１４７、１１０−１２０、１１８−１４７または１１０−１４７であることを特徴とする請求項１に記載のエピトープ。
【請求項３】
前記エピトープは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１１０−１２０または１１０−１４７であることを特徴とする請求項１または２に記載のエピトープ。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１１０、１１８および１２０からなる群より選択された１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）中和結合分子。
【請求項５】
前記エピトープは、アミノ酸位置１４７を追加的に含むことを特徴とする請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
前記結合分子は、１Ｘ１０−９Ｍ未満の結合親和度を有することを特徴とする請求項４または５に記載の結合分子。
【請求項７】
前記結合分子は、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項４または５に記載の結合分子。
【請求項８】
前記抗体は、ヒト単一クローン抗体であることを特徴とする請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
請求項１〜３から選択されたいずれか１項に記載のエピトープを暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターが形質転換された組換え微生物またはウイルス。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え微生物またはウイルスを培養するステップを含むエピトープを生産する方法。
【請求項１３】
請求項１〜３から選択されたいずれか１項に記載のエピトープまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶワクチン組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容可能な免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を追加的に含むことを特徴とする請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１〜３から選択されたいずれか１項に記載のエピトープまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶ検出用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原のエピトープおよびこれに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス中和結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）は、急性および慢性肝炎を誘発するヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＤＮＡウイルスであって、肝硬変と肝臓癌の主な発病原因である。ＨＢＶは、標準血清に対するＢ型肝炎ウイルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＢｓＡｇ）の反応およびＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の差に基づく１０種の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）に分類されるか、遺伝子塩基配列の差による８種の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分類される。２０１２年現在、全世界的に２億４千万人程度の慢性ＨＢＶ感染患者が存在すると把握され、毎年５０万人以上の人がＢ型肝炎に起因する疾病で死亡することが知られている。韓国および中国の成人の慢性ＨＢＶ感染率は５〜８％にのぼる程度と非常に高く、成人慢性肝炎患者の８０％、肝硬変症の６５％、そして肝細胞癌腫患者の７０％がまさにＨＢＶ感染に関連している。慢性Ｂ型肝炎はワクチンの開発および普及により予防が可能になったにもかかわらず、未だに慢性肝疾患の最も重要な原因であり、肝疾患による社会的費用支出が次第に増加しているのが現状である。したがって、慢性Ｂ型肝炎を予防および治療できる新たな形態の抗ウイルス剤の開発が切実に要求されている。
【０００３】
慢性Ｂ型肝炎の治療用薬物としては、現在、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、ｐｅｇｎｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、そしてテノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）などが使用されており、インターフェロンを除いた経口用治療剤はいずれも、ヌクレオシド／ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）類似体である。これらの薬物は、ＨＢＶの逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の活性を抑制することによりウイルスのＤＮＡ複製を阻害して、結果的に、血清内ＨＢＶ  ＤＮＡの量を減少させ、ＡＬＴの数値を正常化させ、肝線維化も改善する効果を示している。
【０００４】
しかし、ヌクレオシド類似体は、長期間使用時、薬剤に対する耐性を誘発して薬効の低下をもたらし、結果的に、肝炎の悪化につながる。最も最近開発されたテノホビルの場合、今のところ耐性発生は報告されていないが、全世界的に最も広く使用されてきたラミブジンの場合、５年後の耐性発病率は７０〜８０％に達することが知られている。また、これらの経口用薬物は、ＨＢＶの感染を直接的に阻害することはできないため、産婦から胎児への垂直感染および肝移植患者における再感染防止のためには、経口用治療剤と共に、ヒト血漿由来のＢ型肝炎兔疫グロブリン（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＨＢＩｇ）製剤が一緒に使用されている。
【０００５】
既存のＨＢＩｇは、Ｂ型肝炎に対する抗体を保有している人の血液から高度な精製技術を用いて抗体を分離し、ウイルス不活化技術を用いて潜在的な汚染源を除去して製造される。しかし、原料である血漿の確保が難しいことから過度の輸入費用を支払うこととなり、需要に弾力的に対応できない問題がある。また、血漿由来のウイルスの除去に多くの時間と費用がかかるが、依然として潜在的感染源が存在する可能性を排除することができず、低い効力に起因する投与の不便さと経済的負担も存在するなどの欠点がある。
【０００６】
さらに、既存のＢ型肝炎ワクチンの接種により形成される抗体はほとんどがＨＢｓＡｇのアミノ酸１２４−１４７番部位のａ決定基を認識することが知られている。ａ決定基がＨＢＶの主な中和エピトープとして作用することは事実であるが、一部の患者で発生したａ決定基内の特定突然変異がＢ型肝炎ワクチンの接種により形成される抗体を回避し得ることが報告されている。したがって、このような既存のワクチンやＨＢＩｇの回避突然変異にも対応可能な新たなＢ型肝炎の予防および治療用抗体やワクチンの開発に対する必要性がますます高まっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、上記の問題点を解決すべく、本発明者らは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１１０、１１８、１２０および／または１４７を含むエピトープを開発し、これが三次元的構造的な特性を有することを確認した。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のエピトープを提供することである。
【０００９】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）中和結合分子を提供することである。
【００１０】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記結合分子を暗号化するポリヌクレオチドを提供することである。
【００１１】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。
【００１２】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記発現ベクターが形質感染してＨＢＶ中和結合分子を生産する宿主細胞を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記結合分子を含むＢ型肝炎の予防、治療または診断用組成物を提供することである。
【００１４】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを提供することである。
【００１５】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。
【００１６】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターが形質転換された組換え微生物またはウイルスを提供することである。
【００１７】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記組換え微生物またはウイルスを培養するステップを含むエピトープを生産する方法を提供することである。
【００１８】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープ、または該エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶワクチン組成物を提供することである。
【００１９】
また、本発明が解決しようとする他の課題は、前記エピトープ、または該エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶ検出用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記の課題を解決すべく、本発明では、ＨＢｓＡｇに特異的に結合するヒト抗体（ＰＣＴ／ＫＲ２０１４／００４６１２参照、以下、「本発明の抗体」）のエピトープがＨＢｓＡｇのアミノ酸位置１１０、１１８、１２０および／または１４７を含むことを確認した。また、これら４個のアミノ酸を含む配列またはその一部が三次元的構造を形成して本発明の抗体が結合可能なエピトープを形成することを確認することにより、本発明を完成した。
【００２１】
したがって、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１０６〜１５１の中から選択された３〜３８ｍｅｒのエピトープを提供する。
【００２２】
本発明の一具体例において、前記エピトープは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の１１０、１１８、１２０および／または１４７位置のアミノ酸を含むことができる。前記位置のアミノ酸を含むエピトープは、その三次元構造を維持するために、またはワクチンなどの組成物として利用時の効率を向上させるために、担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と結合された形態で利用可能である。本発明に係る担体は、生体に適し、本発明において目的の効果を収められるものであればすべて使用可能であるが、ペプチド、血清アルブミン、兔疫グロブリン、ヘモシアニンおよび多糖体などから選択されることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の一具体例において、前記エピトープは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１０６−１１０、１０７−１１１、１０８−１１２、１０９−１１３、１１０−１１４、１１４−１１８、１１５−１１９、１１９−１２３、１２０−１２４、１４３−１４７、１４４−１４８、１４５−１４９、１４６−１５０、１４７−１５１、１１０−１１８、１１８−１２０、１１６−１２０、１１７−１２１、１１８−１２２、１２０−１４７、１１０−１２０、１１８−１４７または１１０−１４７であってもよい。
【００２４】
本発明において、前記ＨＢＶ遺伝子型Ｃ（サブタイプａｄｒ）のＨＢｓＡｇ野生型全アミノ酸配列は、配列番号３で表されてもよいし、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＧＱ８７２２１０．１からも配列情報を確認することができる。
【００２５】
また、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１１０、１１８および１２０からなる群より選択された１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）中和結合分子を提供する。さらに、前記エピトープは、ＨＢｓＡｇのアミノ酸位置１４７を追加的に含んでもよい。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記エピトープに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）中和結合分子は、１×１０−９Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。他の具体例において、前記結合分子は、９×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、８×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、７×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、６×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、５×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、４×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、３×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、２×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、１×１０−１０Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、１×１０−１１Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。さらに他の具体例において、前記結合分子は、１×１０−１２Ｍ未満の結合親和度を有してもよい。
【００２７】
本発明に係るＨＢＶ中和結合分子は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のサブタイプａｄｗ、ａｄｒ、ａｙｗ、およびａｙｒから構成された群より選択されるいずれか１つ以上に結合してＢ型肝炎ウイルスに中和活性を有することができる。
【００２８】
本発明に係る前記結合分子は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）のＢ型肝炎ウイルスに結合して中和活性を有する。
【００２９】
また、本発明に係る前記結合分子は、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、クレブジン（ｃｌｅｖｕｄｉｎｅ）またはエンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）耐性Ｂ型肝炎ウイルスに結合して中和活性を有する。
【００３０】
本発明の一具体例として、前記結合分子は、ＨＢｓＡｇの１０１番、１１２番、１２６番、１２９番、１３３番、１４３番、１７３番、１７５番、１８４番、１８５番または１９６番のアミノ酸位置の突然変異抗原に結合してＢ型肝炎ウイルスに中和活性を有することができるが、これに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の一具体例として、前記突然変異抗原は、Ｑ１０１Ｒ、Ｋ１１２Ｒ、Ｔ１２６Ｎ、Ｉ１２６Ｓ、Ｑ１２９Ｈ、Ｍ１３３Ｈ、Ｐ１４３Ｋ、Ｌ１７３Ｆ、Ｌ１７５Ｓ、Ａ１８４Ｖ、Ｉ１８５ＭまたはＷ１９６Ｌ突然変異抗原であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の一具体例において、前記結合分子は、抗体またはその断片である。前記抗体は、Ｆａｂ切片、Ｆｖ切片、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の一実施例では、ＨＢｓＡｇに結合する完全なヒト抗体を提供する。本明細書において、抗体は、最大限に広い意味で使用され、具体的には、無傷（ｉｎｔａｃｔ）単一クローン抗体、多クローン抗体、２種以上の無傷抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および目的の生物学的活性を示す抗体断片を含む。抗体は、特異的な抗原を認識し結合可能な免疫系によって生成される蛋白質である。その構造的な面において、抗体は、通常４個のアミノ酸鎖（２個の重鎖および２個の軽鎖）からなるＹ−形状の蛋白質を有する。それぞれの抗体は、主に可変領域および不変領域の２つの領域を有する。Ｙの腕の末端部分に位置した可変領域は、標的抗原に結合し相互作用する。前記可変領域は、特定抗原上の特異的結合部位を認識し結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｙの尻尾部分に位置した不変領域は、免疫系によって認識され相互作用する。標的抗原は一般的に、多数の抗体上のＣＤＲによって認識される、エピトープという多数の結合部位を有している。異なるエピトープに特異的に結合するそれぞれの抗体は異なる構造を有する。そのため、１抗原は１つ以上の相応する抗体を有することができる。
【００３３】
同時に、本発明は、前記抗体の機能的変異体を含む。抗体は、変異体がＢ型肝炎ウイルスまたはその表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のサブタイプに特異的に結合するために本発明の抗体と競争できるならば、本発明の抗体の機能的変異体と見なされる。機能的変異体は、一次構造的配列が実質的に類似の誘導体を含むが、これに制限されるわけではなく、例えば、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）変形、化学薬品および／または生化学薬品を含み、これらは、本願発明の親単一クローン抗体からは発見されない。このような変形には、例えば、アセチル化、アシル化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、架橋、二硫化結合形成、グリコシル化、水酸化、メチル化、酸化、ペグ化、蛋白質分解およびリン酸化などが含まれる。機能的変異体は、選択的に親抗体のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失またはその組合せを含有するアミノ酸配列を含む抗体であってもよい。さらに、機能的変異体は、アミノ末端またはカルボキシ末端のうちの１つまたはすべてにおいてアミノ酸配列の切断体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）を含むことができる。本発明の機能的変異体は、本発明の親抗体と比較して同一または異なったり、より高いか低い結合親和力を有することができるが、依然としてＢ型肝炎ウイルスまたはその表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のサブタイプに結合することができる。一例として、骨格構造、超可変（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）領域、特にＣＤＲ３領域を含むが、これに限定されるものではない、可変領域のアミノ酸配列が変形可能である。一般的に、軽鎖または重鎖領域は、３つのＣＤＲ領域を含む、３つの超可変領域、およびさらに保存された領域、すなわち骨格領域（ＦＲ）を含む。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基と超可変ループからのアミノ酸残基を含む。本発明の範囲に属する機能的変異体は、本明細書の親抗体と約５０％〜９９％、約６０％〜９９％、約８０％〜９９％、約９０％〜９９％、約９５％〜９９％、または約９７％〜９９％のアミノ酸配列相同性を有することができる。比較されるアミノ酸配列を最適に配列し、類似または同一のアミノ酸残基を定義するために、コンピュータアルゴリズムの中で当業者に知られたＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いることができる。機能的変異体は、親抗体またはその一部を、ＰＣＲ方法、オリゴマーヌクレオチドを用いた突然変異の生成および部分突然変異の生成を含む公知の一般分子生物学的方法によって変化させたり、有機合成方法で得ることができるが、これに制限されるわけではない。
【００３４】
また、本発明は、前記結合分子を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。一例として、本発明は、前記抗−ＨＢｓＡｇ単一クローン抗体を暗号化する、単離された核酸分子を含む。
【００３５】
さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。前記発現ベクターとしては、セルトリオン社固有の発現ベクターであるＭａｒＥｘベクター、および商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムドイド（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択されたいずれか１つから選択された発現ベクターを用いてもよいが、これに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する時には、目的の宿主細胞の性質に従う。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われてもよいが、これに限定されるものではなく、当業者は、使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。発現ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含むことができるが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物生産の有無によって選別が可能である。選別マーカーの選択は目的の宿主細胞によって選別され、これはすでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を設けない。また、本発明の核酸分子を、精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むことができるが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【００３６】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、前記発現ベクターが形質感染してＢ型肝炎ウイルスに中和活性を有する結合分子を生産する宿主細胞に関する。本発明において、前記宿主細胞は、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むことができるが、これに限定されない。前記哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などを用いてもよいが、これに限定されず、当業者に知られた哺乳動物の宿主細胞として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
【００３７】
さらに、本発明は、前記結合分子を含むＢ型肝炎の予防、治療または診断用組成物を提供する。本発明の組成物は、前記結合分子と共に、インターフェロン、抗−ＨＢＶ単一クローン抗体、抗−ＨＢＶポリクローナル抗体、ヌクレオシド類似体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤または治療ワクチンを抗ウイルス薬物として追加的に含んでもよい。
【００３８】
本発明の結合分子を含む組成物は、それぞれ通常の方法により、滅菌注射溶液、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）剤形、事前充填式注射（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）溶液剤、経口型剤形、外用剤または坐剤などの形態に剤形化してもよいが、これに限定されるものではない。
【００３９】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した対象に前記組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含むＢ型肝炎治療方法に関する。本発明の治療方法において、当業者に知られた治療剤を一緒に投与することができる。本発明の治療方法において、投与方法は、経口および非経口に分けられ、一例として、投与経路は、静脈内であってもよいが、これに限定されない。
【００４０】
本発明の一具体例において、前記治療方法は、抗−ウイルス薬物を投与するステップを追加的に含んでもよい。前記抗−ウイルス薬物は、インターフェロン、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体、抗−ＨＢＶモノクローナル抗体、抗−ＨＢＶポリクローナル抗体、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ製剤または治療ワクチンであってもよいが、これに限定されるものではない。前記ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体は、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、クレブジン（ｃｌｅｖｕｄｉｎｅ）またはアデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、対象に前記組成物を治療学的に有効な量で投与するステップを含むＢ型肝炎予防方法に関する。本発明の予防方法において、当業者に知られた予防剤を一緒に投与することができる。本発明の予防方法において、投与方法は、経口および非経口に分けられ、一例として、投与経路は、静脈内であってもよいが、これに限定されない。
【００４２】
本発明の組成物をヒトを含む哺乳動物に投与することにより、ＨＢＶ感染およびＨＢＶ感染によって誘発される疾病を予防または治療することができる。この時、前記結合分子（例、抗体）の投与量は、処理される対象、疾病または状態の深刻度、投与の速度および処方医師の判断による。有効成分として、前記結合分子は、哺乳動物に対して、１日０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または０．００５〜１ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で１日１回または分割して非経口的経路を通して投与可能である。場合によって、前記言及された範囲より少ない投与量がより適することがあり、有害な副作用を起こすことなくより多量で使用されてもよいし、より多い投与量の場合は、１日かけて数回の少ない分量で分配されてもよい。
【００４３】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、ｉ）サンプルと前記組成物とを接触させるステップと、ｉｉ）前記組成物とサンプルとの反応を検出するステップとを含む、患者のＢ型肝炎ウイルス感染有無の診断方法に関する。本発明の診断方法において、本発明の結合分子（例、単一クローン抗体）は、診断検出のために、必要に応じて標識物質を接合させてもよいし、これは当業者にすでに公知の事項である。
【００４４】
本発明の診断方法において、前記サンプルは、対象の痰、唾、血液、汗、肺細胞、肺組織の粘液、呼吸器組織および唾液からなる群より選択されたいずれか１つであってもよいが、これに限定されず、当業者に知られた通常の方法でサンプルの用意が可能である。
【００４５】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、ｉ）サンプルと前記組成物とを接触させるステップと、ｉｉ）前記組成物とサンプルとの反応を検出するステップとを含む、患者のＢ型肝炎ウイルス感染有無の診断のために情報を提供する方法に関する。
【００４６】
さらに、本発明の他の具体例として、本発明は、ｉ）前記組成物と、ｉｉ）容器とを含むＢ型肝炎ウイルス診断用キットに関する。本発明の診断用キットにおいて、前記２）の容器には固体担体が含まれる。本発明の結合分子は、固体担体に付着してもよく、このような固体担体としては、多孔性または非多孔性、平面または非平面であってもよい。
【００４７】
また、本発明の他の具体例として、本発明は、患者に由来するサンプルと前記組成物とを接触させるステップを含むＢ型肝炎ウイルス存在の有無を検出する方法に関する。
【００４８】
さらに、本発明は、前記エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを提供する。本発明で提供される前記アミノ酸位置を含むエピトープを暗号化するポリヌクレオチドは、それ自体で遺伝子ワクチン形態に利用可能である。この時、前記ポリヌクレオチドは、伝達体なしにそれ自体でも利用可能であり、ウイルス性または非ウイルス性伝達体に担持されて体内に伝達されてもよい。ウイルス性または非ウイルス性伝達体は、本発明の属する技術分野で通常利用可能と知られたものであればいずれでも利用可能である。具体的には、ウイルス性伝達体は、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ−関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｌｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などが可能であり、非ウイルス性ベクターとしては、陽イオン性ポリマー、非イオン性ポリマー、リポソーム、脂質、リン脂質、親水性ポリマー、疎水性ポリマーおよびこれらの中から選択された１つ以上の複合体などが利用可能であるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
また、本発明は、前記エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５０】
さらに、本発明は、前記発現ベクターが形質転換された組換え微生物またはウイルスを提供する。一具体例として、前記組換え微生物またはウイルスは、組換え大膓菌、組換え酵母、または組換えバクテリオファージであってもよい。
【００５１】
本発明の一具体例として、本発明は、ＨＢｓＡｇのアミノ酸位置１１０、１１８、１２０および／または１４７を含むエピトープを微生物またはウイルスの表面に発現する方法を提供する。この時、誘導するプロモーターまたは信号蛋白質をコーディングする配列を含むことを特徴とする組換えベクターおよび前記組換えベクターを含む多様な微生物またはウイルスが使用されてもよいし、特に、好適な微生物またはウイルスは、組換え大膓菌、組換え酵母および組換えバクテリオファージなどがあるが、これに限定されるものではない。前記微生物またはウイルスの表面に前記アミノ酸位置を含むエピトープを微生物またはウイルスの表面に発現させるためには、本発明の属する技術分野でよく知られたディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）技術が利用可能であり、特に、微生物細胞またはウイルスの表面に発現するように誘導するプロモーターまたは信号蛋白質をエンコーディングする配列に前記アミノ酸位置を含むエピトープをエンコーディングするポリヌクレオチド配列を結合させて発現するか、元々表面に発現する蛋白質をエンコーディングする遺伝子部位の一部を欠損させ、これに前記アミノ酸位置を含むエピトープをエンコーディングするポリヌクレオチド配列を挿入する方法などが利用可能であるが、これに限定されるものではない。このような方法で微生物またはウイルスの表面に発現した前記アミノ酸位置を含むエピトープはそれ自体で分離、精製され、本発明に係る特定の用途に使用することができ、表面に発現した状態で前記アミノ酸位置を含むエピトープに特異的に結合する抗体を選別して得る用途にも利用可能である。
【００５２】
また、本発明は、前記組換え微生物またはウイルスを培養するステップを含むエピトープを生産する方法を提供する。
【００５３】
さらに、本発明は、前記エピトープ、または該エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶワクチン組成物を提供する。このＨＢＶワクチン組成物は、薬学的に許容可能な免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を追加的に含んでもよい。免疫補助剤としては、体内に注入時に抗体の形成を増進させる役割を果たして本発明における目的の達成が可能なものであればいずれでも使用可能であり、アルミニウム塩（Ａｌ（ＯＨ）３、ＡＬＰＯ４）、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ソルビタン（ｓｏｒｂｉｔａｎｅ）、ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、ＣｐＧ、リポソーム、コレステロール、ＭＰＬ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、ＧＬＡ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）を用いてもよいが、これに限定されるものではない。
【００５４】
また、本発明は、前記エピトープ、または該エピトープを暗号化するポリヌクレオチドを含むＨＢＶ検出用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００５５】
本発明が提供するＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のエピトープは、既存のワクチンまたはＨＢＩｇの投与に対する回避突然変異が生成されるａ決定基内の主要残基を含まないことから、これに結合する抗体を含む組成物または前記エピトープを含むワクチン組成物は、回避突然変異による効能の低下が生じる可能性が非常に低い。したがって、このような抗体またはワクチン組成物は、ＨＢＶの予防および／または治療に非常に有用に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の抗体の結合部位を特定するために、野生型ＨＢｓＡｇ（２２６ａ．ａ）をアミノ酸配列１〜１００（Ｒｅｇｉｏｎ１）、１０１〜１６０（Ｒｅｇｉｏｎ２）、１６１〜２２６（Ｒｅｇｉｏｎ３）の３つの部位に分けてそれぞれの部位を欠損させた突然変異構造を示すものである。
【図２】ファージ（ｐｈａｇｅ）を用いたＥＬＩＳＡで野生型ＨＢｓＡｇと前記Ｒｅｇｉｏｎ１、２、３のそれぞれが欠損した３種の突然変異ＨＢｓＡｇに対する本発明の抗体の結合力を確認した実験の結果である。
【図３】本発明の抗体のエピトープ究明のために、１５個のアミノ酸が順次に欠損した４種の突然変異ＨＢｓＡｇの構造を示すものである。
【図４】ファージ（ｐｈａｇｅ）を用いたＥＬＩＳＡで前記１５個のアミノ酸が順次に欠損した４種の突然変異ＨＢｓＡｇに対する本発明の抗体の結合力を確認した実験の結果である。
【図５】ＨＢｓＡｇモデル上に示されたエピトープと二硫化結合の位置である。
【図６Ａ】本発明の抗体エピトープの特性究明のために、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を行った結果である。
【図６Ｂ】本発明の抗体エピトープの特性究明のために、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を行った結果である。
【図７】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のａ決定基の多様な突然変異抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡを用いて確認した結果である。
【図８Ａ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ方法を利用して細胞内のウイルス量を増殖しているＨＢＶのＤＮＡ量で測定した結果である。
【図８Ｂ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ方法を利用して細胞内のウイルス量を増殖しているＨＢＶのＤＮＡ量で測定した結果である。
【図８Ｃ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ方法を利用して細胞内のウイルス量を増殖しているＨＢＶのＤＮＡ量で測定した結果である。
【図８Ｄ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ方法を利用して細胞内のウイルス量を増殖しているＨＢＶのＤＮＡ量で測定した結果である。
【図９Ａ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）方法を利用して増殖されて細胞外に排出されたウイルス量をＨＢｓＡｇ量で測定した結果である。
【図９Ｂ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）方法を利用して増殖されて細胞外に排出されたウイルス量をＨＢｓＡｇ量で測定した結果である。
【図９Ｃ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）方法を利用して増殖されて細胞外に排出されたウイルス量をＨＢｓＡｇ量で測定した結果である。
【図９Ｄ】本発明の一実施例により、本発明の抗体１、２のＢ型肝炎ウイルス４つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに対する試験管内中和実験の結果であって、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）方法を利用して増殖されて細胞外に排出されたウイルス量をＨＢｓＡｇ量で測定した結果である。
【図１０】本発明の抗体１、２の１５個のＨＢＶ表面抗原血清サンプル（Ｂ型肝炎ウイルス７つの遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈの患者に由来する）に対する結合活性をｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図１１】本発明の抗体１、２の薬剤（ラミブジン、アデホビル、クレブジン、エンテカビル）耐性ウイルスに対する結合活性をｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、発明の範囲が実施例によって限定されるものではない。本発明で引用された文献は、本発明の明細書に参照として組み込まれる。
【００５８】
実施例１：欠損突然変異抗原を用いた本発明の抗体の結合部位の特定
本発明の抗体のＨＢｓＡｇ上の結合部位を確認するために、ＨＢｓＡｇの野生型および各種欠損突然変異を製造し、これに対する結合能力をファージ（Ｐｈａｇｅ）を用いたｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）で調べた。
【００５９】
この時、実験は２つのステップで進行させたが、まず、ＨＢｓＡｇ（２２６ａ．ａ）をアミノ酸配列１〜１００、１０１〜１６０、１６１〜２２６までの３つの部位に分けてそれぞれの部位を欠損させた突然変異と野生型の発現ベクターを製造して（図１参照）、ファージの表面にそれぞれの蛋白質を発現させた後、本発明の抗体に対する結合力を測定した。
【００６０】
実施例１−１．野生型ＨＢｓＡｇおよび３種の突然変異ＨＢｓＡｇ発現ベクターの製造
野生型ＨＢｓＡｇおよびこれを３つの部分に分けた欠損突然変異蛋白質をファージの表面に発現させるために、ファージの発現ベクターを用いてクローニングを行った。詳細な実験方法は次の通りである。ＨＢｓＡｇ野生型と部位毎欠損突然変異をクローニングするために、ＨＢＶ遺伝子型ＣのＨＢｓＡｇ遺伝子塩基配列を含んでいるＨＢＶベクター（韓国の建国大学医学専門大学院薬理学教室）を鋳型として重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によりそれぞれに対する遺伝子を増幅した。これに制限酵素ＳｆｉＩを処理した後、同一の制限酵素で処理されたファージ発現ベクターにそれぞれ挿入した。作製されたプラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃２７１０６）を用いて抽出され、抽出されたＤＮＡを用いて、塩基配列の分析により最終的に抗体の塩基配列を確認した。完成した各クローンの名称およびＨＢｓＡｇ部位は表１の通りである。
【００６１】
【表１】
2019213536.tif 000002
【００６２】
本実施例において、前記ＨＢＶ遺伝子型Ｃ（サブタイプａｄｒ）のＨＢｓＡｇ野生型全アミノ酸配列は、配列番号３で表され、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＧＱ８７２２１０．１からも配列情報を確認することができる。
【００６３】
実施例１−２．野生型ＨＢｓＡｇおよび３種の突然変異ＨＢｓＡｇと本発明の抗体の結合力確認実験
クローニングされたＨＢｓＡｇ全体あるいは一部に対する結合実験を行うために、まず、発現用大膓菌（ＥＲ２７３８、Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６０５２２−２）にエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりベクターを挿入した後、抗生剤（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性のある大膓菌を選択的に翌日培養し始めた。約１０時間程度培養した後、バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を感染させ、感染した大膓菌を選択的に培養するために、他の種類の抗生剤（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を使用した。翌日バクテリオファージを抽出するために、まず、大膓菌を遠心分離機で分離した後、上層液にｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）を処理して３０分間氷に放置し、再び遠心分離機でバクテリオファージを分離した。分離されたバクテリオファージを溶かした後、上層液をフィルタリングしてＨＢｓＡｇ全体あるいは一部を表面に有している純粋なバクテリオファージを抽出した。
【００６４】
バクテリオファージの表面に露出した野生型および突然変異ＨＢｓＡｇと本発明の抗体との結合力を定量的に評価するために、ＥＬＩＳＡ手法を利用した。まず、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃１０９−００６−０９８）をコーティングバッファー（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ｃ３０４１）と混合し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１日間４度でコーティングさせた後、本発明の抗体をそれに結合させた。その後、抽出されたバクテリオファージを本発明の抗体に結合させ、ＨＲＰ酵素の付いているバクテリオファージＭ１３蛋白質抗体（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ、２７−９４２１−０１）を使用した後、２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＡＢＴＳ、ＫＰＬ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃５０−６２−００）を用いて、実際に本発明の抗体に結合した野生型および突然変異ＨＢｓＡｇを有しているバクテリオファージの量を測定した。この時、ＨＢｓＡｇを表面に発現している各実験群のすべてのバクテリオファージの量を測定するために、ａｎｔｉ−ＨＡ抗体（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃Ａ００１６８−１００）を９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１日間４度でコーティングさせた後、抽出されたバクテリオファージを抗体に結合させ、同一の方式で測定した。
【００６５】
その結果、アミノ酸１０１から１６０番までが欠損したＨＢｓＡｇを表面に発現しているＲｅｇｉｏｎ１＋３のバクテリオファージサンプルでのみ、特異的に本発明の抗体との低い結合力が観察された（図２参照）。このことは、本発明の抗体の主要結合部位がＲｅｇｉｏｎ２部位に含まれていることを意味する。
【００６６】
実施例２：連続欠損突然変異抗原を用いた本発明の抗体のエピトープの特定
実施例１で確認した本発明の抗体の主要結合部位に基づいてエピトープ部位を特定するために、Ｒｅｇｉｏｎ２の開始アミノ酸である１０１番から１５個のアミノ酸を順次に切っていく連続欠損（ｓｅｒｉａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）突然変異を製造した後、バクテリオファージの表面に露出させて、ＥＬＩＳＡにより本発明の抗体に対する結合力を確認した。
【００６７】
実施例２−１．４種の突然変異ＨＢｓＡｇ発現ベクターの製造
Ｒｅｇｉｏｎ２＋３のクローンを基準としてアミノ酸１５個ずつ欠損突然変異を製造した。完成した各クローンの名称およびＨＢｓＡｇ部位は表２の通りである（図３参照）。詳細なクローニング過程は実施例１−１と重複するので省略する。
【００６８】
【表２】
2019213536.tif 000003
【００６９】
実施例２−２．４種の突然変異ＨＢｓＡｇと本発明の抗体との結合力確認実験
実施例１−２と同様の方法で４種の連続欠損突然変異が表面に露出しているバクテリオファージを抽出して、ＥＬＩＳＡを行った。
【００７０】
その結果、Ｒｅｇｉｏｎ２＋３ｄｅｌ１において、本発明の抗体に対する結合力が確実に低下することを確認したが、これは、本発明の抗体の主要抗原決定基（エピトープ）はアミノ酸１０１から１１５までの部位に存在することを意味する（図４参照）。
【００７１】
実施例３．単一アミノ酸突然変異抗原を用いた本発明の抗体のエピトープ究明
本発明の抗体のエピトープをさらに正確に究明するために、米国のインテグラルモレキュラー（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）社のショットガン突然変異法（ｓｈｏｔｇｕｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９；１３１（２０）：６９５２〜６９５４等参照）を利用して、ＨＢｓＡｇ（ａｄｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ）内にランダム突然変異（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入させて、各突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合能力を測定した。実験に使用された突然変異抗原のライブラリーの特性は表３の通りである。作製されたライブラリーそれぞれのクローンは、３８４−ｗｅｌｌプレートに培養されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現した。
【００７２】
【表３】
2019213536.tif 000004
【００７３】
実施例３−１：抗体のエピトープ確認
突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合能は、免疫蛍光ＦＡＣＳ分析法で３回繰り返し測定され、野生型ＨＢｓＡｇに対する反応性を基準として標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）が行われた。また、ＨＢｓＡｇに対するマウス単クローン抗体であるｏｒｂ４３８０５を対照抗体として用いた結合能の結果は、実験結果の信頼度確認およびエピトープの選定に対する基準設定に使用された。すなわち、対照抗体のｏｒｂ４３８０５に対する結合反応性が野生型ＨＢｓＡｇに対する結合反応性対比５５％以上（＞５５％ＷＴ）でかつ、同時に本発明の抗体に対する結合反応性が野生型対比１５％未満（＜１５％ＷＴ）であるクローンに存在する突然変異残基を、本発明の抗体の結合に必須の核心残基（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ）として選別した。
【００７４】
実験の結果、計４個の突然変異抗原から本発明の抗体に対する核心残基が導出され、これによって、本発明の抗体のエピトープにはＨＢｓＡｇのアミノ酸１１０、１１８、１２０および１４７番位置が含まれていることが確認された。具体的な実験結果は表４の通りである。
【００７５】
【表４】
2019213536.tif 000005
【００７６】
このうち、アミノ酸１１０番位置は、前記実施例２の実験を通して特定された結合部位にも含まれるため、本発明の抗体に対する核心的なエピトープと結論付けることができる。１１８、１２０および１４７番位置は、実施例２の実験結果で特定された結合部位内にないものの、欠損実験の場合、多数のアミノ酸が除去されることによって構造的な変化がある可能性があり、一部のエピトープを究明できない可能性が大きい。
【００７７】
詳細に説明すれば、ＨＢｓＡｇは、Ｃ１０７−Ｃ１３８、Ｃ１３９−Ｃ１４７などのような二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）によって三次元的な構造を維持しているが、実施例２の欠損突然変異でこの結合が損傷すると元の構造が崩れて抗体の結合に影響を与えることを確認することができる。すなわち、本実施例において、単一突然変異実験を通して先の実施例２の欠損実験で見つけられなかったエピトープ残基を究明した（図５参照）。ただし、１４７番位置の場合、ＨＢｓＡｇの三次元構造の維持に重要な二硫化結合を形成する残基であるため、１１０、１１８および１２０番部位の構造エピトープが正常に形成できるように補助する役割で本発明の抗体との結合に参加することもできる。
【００７８】
実施例４：本発明の抗体エピトープの特性究明
実施例１、２および３を通して明らかにされた結合部位が構造エピトープを形成するかを確認するために、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った。この時、蛋白質の変性条件であるＳｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルと、非変性条件であるＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲルをすべて用いて、ＨＢｓＡｇの構造による本発明の抗体との結合力の差を究明した。特に、蛋白質の変性条件内においても還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の使用の有無によってＨＢｓＡｇの三次構造の形成に重要な二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を除去して完全に線状化（ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ）させた場合と、そうでない場合とに分けて、構造エピトープ形成の有無を綿密に検討した。
【００７９】
４−１．Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析
本発明の抗体が自然的に形成されたＨＢｓＡｇの構造エピトープを認識するか否かを評価するために、ＳＤＳが添加されていないＮａｔｉｖｅＰＡＧＥゲルを用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った。まず、ＨＢｓＡｇが入っている溶液にＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＴＭ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＢＮ２００３）とＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＴＭ５％Ｇ−２５０  Ｓａｍｐｌｅ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＢＮ２００４）とを混合した後、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＴＭ  Ｎｏｖｅｘ（Ｒ）３−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＢＮ１００３ＢＯＸ）にローディングした。２時間程度のゲルラニング後、ＮｕＰＡＧＥ（Ｒ）  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＮＰ０００６）を用いて、ゲルにある蛋白質をＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＬＣ２００２）にトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。１時間５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）が含まれたＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）−Ｔｗｅｅｎ２０バッファーでｍｅｍｂｒａｎｅブロッキングを行った後、３％スキムミルクが含まれたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファーに一次抗体を混合してｍｅｍｂｒａｎｅに一晩冷蔵処理した。この時、本発明の抗体に対する陽性対照群として、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）の標準品（ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＨＢｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ｈｕｍａｎ（ｃｏｄｅ：０７／１６４））を使用し、陰性対照群としては、ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（ＨＥＲ２）に対するヒト化抗体である抗−ＨＥＲ２抗体を使用した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファーでｍｅｍｂｒａｎｅを十分にウォッシュ（ｗａｓｈ）した後、二次抗体として、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）付きのａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃３１４１３）を３％スキムミルクが含まれたＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファーに混合した後、１時間処理した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで十分にウォッシュした後、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ（ＥＣＬ）基質を処理後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）機器を用いて、ＨＢｓＡｇとテストされた各抗体との間の結合の有無を観察した。
【００８０】
実験の結果、自然的な三次構造を維持したＨＢｓＡｇは、本発明の抗体と非常に高い結合力を示した（図６Ａ参照）。この結合の特異性は、陽性対照群のＷＨＯ標準品と、陰性対照群の抗−ＨＥＲ２抗体との実験の結果から確認された。ＷＨＯ標準品は、ヒト血液から精製した多クローン抗体であって、これにはＨＢｓＡｇの線状および構造エピトープを認識する抗体がすべて含まれているため、この実験で結合が確認され、非特異的な抗体である抗−ＨＥＲ２抗体は結合しなかったのである。
【００８１】
一方、ＨＢｓＡｇの分子量は２３ｋｄ前後と知られているが、今回の実験で抗体と結合されたＨＢｓＡｇの分子量は非常に大きいことが明らかになったが、ｎａｔｉｖｅ  ＨＢｓＡｇは自主的に組立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）られ、特定形態（２２ｎｍのｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成することがよく知られているため、自然な現象と結論付けることができる（Ｉｒａ  Ｂｅｒｋｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，Ｍａｒ２０１１；８５（５）：２４３９−２４４８）。
【００８２】
４−２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析
本発明の抗体に対するエピトープの構造的特性をより綿密に分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび還元剤を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った。全般的な実験の過程は実施例４−１と同一であり、簡略に示すと次の通りである。
【００８３】
まず、ＨＢｓＡｇ溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒと混合した後、９５℃で５分間反応させた後、４−２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＴＧＸ  Ｐｒｅｃａｓｔ  ｇｅｌにローディングしてｇｅｌ  ｒｕｎｎｉｎｇを行った。この時、ローディングサンプルは２種類で用意したが、一方は還元剤（ＮｕＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（１０×）、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を添加して蛋白質の完全な変性を誘導したものであり、他方は還元剤が入っておらずＨＢｓＡｇの二硫化結合が維持されて不完全な変性が行われたものである。Ｒｕｎｎｉｎｇ後、ＨＢｓＡｇをｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＮＣ）ｍｅｍｂｒａｎｅにトランスファーさせ、ブロッキング後、一次抗体で一晩冷蔵処理した。一次抗体としては、本発明の抗体、ＷＨＯ標準品、ＨＢＩｇ（Ｈｅｐａｂｉｇ、緑十字、韓国）、抗−ＨＥＲ２抗体を使用した。続く過程は前記過程と同一であるので省略する。
【００８４】
実験の結果、本発明の抗体が二硫化結合まで除去されて完全に線状化されたＨＢｓＡｇには全く結合せず、部分的変性のみが生じたＨＢｓＡｇにはよく結合できることが確認された。陽性対照群として使用されたＷＨＯ標準品とＨＢＩｇの場合、実施例４−１で説明したように多クローン抗体であるので、線状エピトープを認識する抗体を含んでいて、ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎで完全に線状化されたＨＢｓＡｇにもよく結合することが明らかになった。抗−ＨＥＲ２抗体の場合、ＨＢｓＡｇの構造にかかわらず全く結合しなかった。ＨＢｓＡｇの三次構造において、蛋白質の内部的にあるいは蛋白質の間に形成される二硫化結合が重要な作用をすることは広く知られた事実である（Ｍａｎｇｏｌｄ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．，１９９７；１４２（１１）：２２５７−６７）。
【００８５】
したがって、本発明の抗体の結合には、二硫化結合によるＨＢｓＡｇの三次構造の維持が必須であることが分かり、結局、本発明の抗体は、ＨＢｓＡｇの構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識すると結論付けることができる。
【００８６】
実施例５：ａ決定基の多様な突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合活性調査
ａ決定基上の４つの突然変異抗原に対する本発明の抗体の結合活性を確認すべく、ＥＬＩＳＡを行った。これらの抗原はそれぞれ１２６、１２９、１３３、１４３番のアミノ酸位置で変異を有するものであって、実際に慢性Ｂ型肝炎患者で報告されたＨｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＨＢＩｇ）またはワクチンに対する回避突然変異から発見されたものだけでなく、診断においても表面抗原の測定がままならないなどの問題を起こすものである（Ｈｏｒｖａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２（８）：４８８−４９６，２０１１）。これら抗原の組換え蛋白質は前記ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ社から購入した。
【００８７】
図７は、ａ決定基の突然変異抗原による本発明の抗体１、２それぞれの反応性を示すもので、その結果は、反応性の有無に応じて陽性（＋）および陰性（−）に区分して表５にまとめた。
【００８８】
【表５】
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【００８９】
実験の結果、本発明の抗体１、２は、多様なａ決定基の突然変異ＨＢｓＡｇに対して結合能を保有することを確認した。これは、本発明の抗体がＨＢｓＡｇの１１０、１１８、１２０および／または１４７番位置のエピトープを認識するため、高い変異率を示すａ決定基（アミノ酸１２４−１４７）の影響から自由であり得ることが分かる。
【００９０】
また、１４７番のアミノ酸の場合、構造の形成に重要な残基であって、この残基の突然変異は感染性に深刻な影響を与えることが知られているため、実際に突然変異の発生率が非常に低いことが予想される。
【００９１】
したがって、１１０、１１８、１２０および／または１４７番位置のエピトープを含むワクチン組成物または前記エピトープに結合する抗体は、回避突然変異による効能の低下が生じる可能性が低く、ＨＢＶの予防または治療に有用に使用可能である。
【００９２】
実施例６：Ｂ型肝炎ウイルスに対する試験管内中和効力検証
多様な遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスに対する本発明の抗体の中和力を検証するために、試験管内中和実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った。
【００９３】
ＨＢＶに対する試験管内中和実験は、ヒト肝細胞にウイルスを感染させる時、各抗体の処理条件に応じてどれくらい感染が阻害されるかを、ウイルスの増殖が最も活発な時点で細胞内および細胞外のウイルス量を測定することにより抗体の中和力を評価する方法である。細胞内のウイルス量は増殖しているＨＢＶのＤＮＡ量で測定し、増殖されて細胞外に排出されたウイルス量は培地内のＨＢＶ  ＤＮＡ量とＨＢｓＡｇ量で測定した。この時、ＨＢＶ  ＤＮＡはＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅを用いたｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲ方法で、ＨＢｓＡｇはｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）方法で定量した。
【００９４】
６−１．一次試験管内中和実験
Ｂ型肝炎ウイルスの感染に必要なヒト肝細胞は、ウイルス接種１日前日、ヒト化された肝組織を持っているキメラマウス（ｕＰＡ／ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｌｉｖｅｒ）から２段階のコラゲナーゼパーフュージョン（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）方法により用意された。分離された肝細胞は、第１型コラーゲンが塗布されている２４−ウェルプレートにウェルあたり４×１０５個ずつ敷き、この時、培地としては、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＵＳＡ、Ｆ０５００Ａ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｃｉｎｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１５１４０）と２０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１５６３０）が含まれたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１１９６５）が各ウェルあたり５００μｌずつ使用された。用意された肝細胞は、３７℃の５％ＣＯ２湿潤（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）細胞培養器で２４時間培養された。
【００９５】
ウイルス感染は、ヒト化された肝組織を持っているキメラマウスで生産されたＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ２４６３４５．１）、Ｂ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ２４６３４１）、Ｃ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ２４６３３８．１）、Ｄ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ２４６３４７）の４つの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）のＨＢＶを用いて行われ、本発明の抗体と混合された状態でウェルあたり２×１０６個のウイルスの濃度で細胞に処理された。詳細な過程は次の通りである。
【００９６】
Ａ．ウイルス接種混合物の用意
ｄＨＣＧＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＮａＨＣＯ３  ４４ｍＭ、Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ１５ｕｇ／ｍｌ、ｉｎｓｕｌｉｎ０．２５ｕｇ／ｍｌ、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ５０ｎＭ、ＥＧＦ５ｎｇ／ｍｌ、Ａｓｃ−２ｐ０．１ｍＭ、ＤＭＳＯ２％）を用いて、最終的に１００μｌとなるようにウイルスと各抗体とを混合して、常温で１時間反応させた。この時、ウイルスは２×１０６個となるようにし、本発明の抗体は１０、１、０．１、０．０１ｕｇ／ｍｌの４つの濃度となるように希釈した。
【００９７】
Ｂ．ウイルス接種
１２５μｌのｄＨＣＧＭ培地に２５μｌの４０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、Ｐ１４５８）を混合した後、Ａで用意したウイルス／抗体混合物を入れることにより、最終的に２５０μｌの接種混合物を用意した。用意された細胞から培地を除去した後、接種混合物を入れて、その後、２４時間培養した。
【００９８】
Ｃ．培地交換および培養、分析サンプルの用意
ウイルスの接種後、肝細胞は計１２日間培養され、１日、２日、７日目に細胞のｗａｓｈｉｎｇおよび培地の交換が行われた。既存の培養液を除去した後、５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳでウォッシングを行い、同量のｄＨＣＧＭ培地を新たに入れた。そして、７日目の培地交換の場合、既存の培養液は、細胞から新たに生産されて排出された細胞外ＨＢｓＡｇとＨＢＶ  ＤＮＡ定量のために、それぞれ３００μｌと３０μｌずつ集めておき、分析時点まで−２０℃に保管された。
【００９９】
１２日の培養期間が終わった後には、細胞および培養液とも細胞内／外のウイルス定量分析に使用された。培養液は、既存と同様の方式でＨＢｓＡｇ測定用とＨＢＶ  ＤＮＡ測定用とに分けて採取され、細胞は各ウェルを５００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで１回洗浄した後、５００μｌのＳＭＩＴＥＳＴ（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れて溶解させる方式で採取された。ＨＢＶ  ＤＮＡの抽出は、製造会社（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のプロトコルによって行われた。
【０１００】
Ｄ．サンプル分析
ＨＢＶ  ＤＮＡ定量は、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、そしてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いたｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲ方法で行われた。ＨＢｓＡｇ定量は、ＣＬＩＡ方法を用いた自動化システムであるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳＡ）で行われた。
【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
【表７】
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【０１０３】
本発明の抗体１、２に対する実験の結果は、図８Ａ〜図８Ｄ、図９Ａ〜図９Ｄのように、各測定項目によってウイルスの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）ごとに区分して示した。
【０１０４】
まず、各抗体の処理濃度に応じた細胞内ＨＢＶ  ＤＮＡ量を比較分析してみると、本発明の抗体１、２が遺伝子型Ｃで区分されるＨＢｓＡｇのａｄｒサブタイプに対する結合力を基準として選別されたものであるので、遺伝子型Ｃに対してはいずれも強い中和力を有することを確認することができた。陽性対照用に使用されたＨＢＩｇが、陰性対照用に使用された抗−ＨＥＲ２抗体に比べて４００倍以上のＨＢＶ  ＤＮＡ量の減少を示した状況で、その処理量の１／１０である本発明の抗体２の１ｕｇ／ｍｌ処理サンプルにおいても同水準のウイルスＤＮＡの減少を示した。本発明の抗体１の場合は、０．１ｕｇ／ｍｌの低い濃度処理でも１００倍にのぼるＨＢＶ  ＤＮＡの減少を示すことにより、比較的に高い水準の中和力を維持することが明らかになった。また、本発明の抗体１、２は、特に、Ａ、Ｂ遺伝子型に対しては陽性対照群のＨＢＩｇより最高中和力において２倍以上高い優れた効力を示し、Ｄ遺伝子型に対しては中和効力が１ｕｇ／ｍｌ（本発明の抗体２）または０．１ｕｇ／ｍｌ（本発明の抗体１）の低い濃度でも高く維持された（図８Ａ〜図８Ｄ）。
【０１０５】
上記の本発明の抗体１、２のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４つの遺伝子型に対する中和効力の特徴は、培養液で測定した細胞外ＨＢｓＡｇの定量結果にも非常に類似して反映されていることが明らかになった（図９Ａ〜図９Ｄ）。
【０１０６】
以上の結果をまとめてみると、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４つの遺伝子型のＨＢＶに対して試験管内中和効力検証を実施し、その結果、本発明の抗体１、２が使用されたすべてのウイルスに対して高い水準の中和力を有することが確認された。
【０１０７】
実施例７：多様な慢性Ｂ型肝炎患者由来遺伝子型ウイルスの表面抗原に対する結合特性調査
本発明の抗体１、２が実際に全世界的に流行する多様な遺伝子型のウイルスに対して結合して中和効力を示し得るかを確認すべく、患者血清由来の多様な遺伝子型ウイルスの表面抗原からなっているＷｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）のｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｎｅｌ（１ｓｔ  ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ  ｆｏｒ  ＨＢＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｆｏｒ  ＨＢｓＡｇ  Ａｓｓａｙｓ、ＰＥＩ  ｃｏｄｅ６１００／０９）を用いてｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡを行った。当該標準品の詳細情報は表８の通りであり、実験方法は下記の通りである。
【０１０８】
２つの抗体を抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ（ｇａｍｍａ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ、１０９−００６−０９８）がコーティングされた９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ、４４９８２４）の各ウェルに２ｕｇ／ｍｌの濃度で１００μｌずつ分注して吸着させた。ウォッシング後、前記プレートを３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が含有されたリン酸緩衝溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、ＵＳＡ、Ｄ５１２０）で処理してブロッキングした。再びウォッシングした後、ＨＢｓＡｇ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｐａｎｅｌである１５個の血清試料を１００μｌずつ分注して、３７℃で９０分間反応（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた。この時、各血清試料は、４５０／６２０ｎｍで吸光度０．８〜１．２程度を有するように、１％ＢＳＡが含有されたリン酸緩衝溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ、ＵＳＡ、Ｄ５１２０）で適切に希釈した。抗体と反応して付いているＨＢｓＡｇを感知するために、過酸化酵素が標識されたウサギの抗−ＨＢＶ表面抗原抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，ＰＡ１−７３０８７）を３７℃で６０分間処理した。発色および反応停止、そして吸光度の測定は、実施例５と同様の方法を用いた。２つの抗体の各遺伝子型ＨＢＶ表面抗原に対する反応性は、エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてグラフで分析した（図１０）。
【０１０９】
分析の結果、本発明の抗体１、２とも、１５個のＨＢｓＡｇサンプルによく結合することを確認した。上述のように、この表面抗原サンプルは、実際に患者の血液から製造された血清であり、ＨＢＶの全８つの遺伝子型のうちのＧ型を除くＡからＨ型までの７つの遺伝子型をカバーしている。また、複数種類の亜遺伝子型が存在するＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ型の場合、各遺伝子型ごとに優位に広がっている亜遺伝子型およびサブタイプ（血清型）のサンプルが２〜３個ずつ含まれているが、これは、実験に使用されたＷＨＯのＨＢＶ遺伝子型パネルが実質的に全世界で流行する大部分のＨＢＶ遺伝子型を代弁するとの意味である。パネルには遺伝子型Ｇが抜けているが、Ｇの場合は今のところ亜遺伝子型が報告されておらず、サブタイプ（血清型）としてはａｄｗ２に分類されるため、パネルに含まれている５つのａｄｗ２サンプルに対する実験結果でＧ型に対する本発明の抗体１、２の結合活性から推察可能である。
【０１１０】
したがって、全１５個のサンプルに本発明の抗体１、２が優れた結合活性を示したのは、２つの抗体が全世界的に流行しているすべての遺伝子型のＨＢＶに結合することができ、それによる中和力を示すことができることを意味する。
【０１１１】
【表８】
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【０１１２】
実施例８：多様な薬剤耐性ウイルスに対する結合特性調査
慢性Ｂ型肝炎患者に広く使用されるＨＢＶ重合酵素の抑制剤であるラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ、ＬＭＶ）、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ、ＡＤＶ）、クレブジン（ｃｌｅｖｕｄｉｎｅ、ＣＬＶ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ、ＥＴＶ）に対する耐性突然変異と本発明の抗体１、２との間の結合特性を、前記実施例７で用いた方法と同様のｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。実験に使用された野生型ウイルスをはじめとするすべての耐性突然変異ウイルスは、当該薬物治療に対する耐性が発生した患者の血液から得たＨＢＶ  ＤＮＡを用いて、建国大学医学専門大学院薬理学教室でクローニングされたものであって、Ｈｕｈ７細胞株あるいはＨｅｐＧ２細胞株を用いた形質導入実験を通して薬剤耐性が実験的にも確認された菌株である（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８８（１２）：６８０５−６８１８、２０１４）。すべてのウイルスは遺伝子型Ｃ型であり、各ウイルスの特徴は表９の通りである。
【０１１３】
このように用意されたそれぞれのＨＢＶ発現ベクターをＴ７５フラスコ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、３５３１３６）に培養したＨｕｈ７細胞株にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１６９８０１９）を用いて形質導入し、３日間培養してウイルスを生産した。生産されたウイルスはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて濃縮し、各サンプルのウイルス量は、Ｍｏｎｏｌｉｓａ  ＨＢｓＡｇ  Ｕｌｔｒａ（ＢｉｏＲａｄ、７２３４６）ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いてＨＢｓＡｇ量で比較した後、互いに類似の値を有するように適切に希釈して実験に使用した。
【０１１４】
実験の結果、本発明の抗体１、２とも、ラミブジン（ＬＭＶ）、アデホビル（ＡＤＶ）、クレブジン（ＣＬＶ）、エンテカビル（ＥＴＶ）耐性ウイルスに野生型ウイルスと同水準で結合活性を有することが明らかになった（図１１参照）。ここで、ＡＤＶ耐性ウイルスに対する結合活性が相対的に少し低いように見えるが、これは、当該サンプルの生産量自体が他のサンプルに比べてやや低いことに起因すると判断される。
【０１１５】
このことは、本発明の抗体１、２が実験に使用された各薬剤耐性ウイルスの１種類に対してのみならず、当該薬剤に対して発生する大部分の耐性ウイルスに対して結合活性および中和効能を有し得ることを意味する。なぜならば、ＨＢＶに薬剤耐性をもたらす変異は、表９から確認できるように、ＨＢＶポリメラーゼのｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ドメインの特定アミノ酸変異に関連し、このような変異は、薬剤ごとに非常に特異的に発生するからである。このような特異的なポリメラーゼの変異は、遺伝子を共有するＨＢＶの特性上、ＨＢｓＡｇの特異的変異を伴ったりするが、例えば、ポリメラーゼのｒｔＭ２０４Ｉ変異はＨＢｓＡｇのＷ１９６Ｌ変異を、ｒｔＡ１８１Ｖ変異はＨＢｓＡｇのＬ１７３Ｆ変異をもたらす。本発明の抗体１、２は、薬剤耐性変異に伴うこれら表面抗原の変異にかかわらずよく結合することを確認した。
【０１１６】
また、この実験で使用された各耐性ウイルスは、前記言及した耐性特異的な表面抗原の変異に加えて、非特異的に発生した多くの表面抗原の変異を有している（表９参照）。この実験の結果は、本発明の抗体１、２がＨＢｓＡｇのＱ１０１Ｒ、Ｋ１１２Ｒ、Ｉ１２６Ｓ、Ｌ１７５Ｓ、Ａ１８４Ｖ、Ｉ１８５Ｍ位置に変異があるウイルスに結合および中和活性を有し得ることを表す。
【０１１７】
【表９】
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【０１１８】
実施例９：抗原−抗体の結合親和度測定
本発明の抗体の抗原−抗体の結合親和度を測定するために、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下、ＳＰＲ）検定を利用した。具体的には、組換えＨＢｓＡｇ（ａｄｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ、ＰｒｏｓｐｅｃＢｉｏ）と本発明の抗体との結合親和度は、２５℃で分析緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０）を使用するＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装備で表面プラズモン共鳴分析により決定された。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ５．０）中に希釈されたＨＢｓＡｇ蛋白質５０μｇ／ｍｌを製造会社の指針および手順に従って、アミンカップリングキット（Ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ）を用いてＣＭ５研究用バイオセンサチップに約５００ＲＵだけ直接的に固定させた。バイオセンサの表面で反応しない部分をエタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）で遮断した。反応分析のために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００コントロールソフトウェア、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００エバリュエーションソフトウェアを用いた。本発明の抗体は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に希釈した。検定過程で、すべての測定は、固定されたＨＢｓＡｇのないバイオセンサの表面を対照群として使用した。結合および分離速度定数Ｋａ（Ｍ−１ｓ−１）およびＫｄ（ｓ−１）は、３０μｌ／分の流速で決定した。速度定数は３倍の連続希釈であって、２．４６〜２００ｎＭ範囲の抗体濃度で反応結合測定を実施し、緩衝液を対照群として用いることにより獲得した。次に、抗体と標的抗原との間の反応に対する平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）を反応速度定数から次の等式によって計算した：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ。結合は、時間と反応速度定数の関数を計算して記録する。
【０１１９】
実験の結果は表１０の通りであり、本発明の抗体のＨＢｓＡｇに対する高い結合親和度を確認した。
【０１２０】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のアミノ酸位置１１０、１１８、１２０、および１４７を含むエピトープに特異的に結合するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）中和結合分子であって、抗体またはその断片である結合分子。
【請求項２】
前記結合分子は、
ｉ）配列番号５のＣＤＲ１領域、配列番号６のＣＤＲ２領域、および配列番号７のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号８のＣＤＲ１領域、配列番号９のＣＤＲ２領域、および配列番号１０のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子；または
ｉｉ）配列番号１１のＣＤＲ１領域、配列番号１２のＣＤＲ２領域、および配列番号１３のＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域と、配列番号１４のＣＤＲ１領域、配列番号１５のＣＤＲ２領域、および配列番号１６のＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域とを含む結合分子
であることを特徴とする請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記結合分子は、１Ｘ１０−９Ｍ未満の平衡解離定数ＫＤを有することを特徴とする請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記抗体は、ヒト単一クローン抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項５】
請求項１〜４から選択されたいずれか１項に記載の結合分子を暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターが形質転換された宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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