(57)【要約】      （修正有）【課題】追加カロリーなしで所望の甘味を達成するために発酵乳製品に甘味料を加えるための代替手段の提供。さらに、発酵乳製品中のラクトースをラクトース不耐性消費者に許容できるレベルまで低下させる方法の提供。【解決手段】２−デオキシグルコースに耐性を示すグルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）変異を有するガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株及びｇｌｃＫ変異ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の提供。乳に当該ストレプトコッカス・サーモフィルス変異株及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス変異株を植菌し発酵させると、その乳中にグルコースを分泌し、ラクトースレベルを有意に減少させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列内に変異を有するガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株であって、前記変異が、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、又は前記遺伝子の発現に負の効果を有する、前記株。
【請求項２】
細胞内へのグルコースの輸送を低減する変異を有する、請求項１に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項３】
グルコーストランスポーターの成分をコードする遺伝子内に変異を有し、前記変異が、グルコーストランスポーターを不活化するか、又は前記遺伝子の発現に負の効果を有する、請求項２に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項４】
グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＣManタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子のＤＮＡ配列内に変異を有し、前記変異が、ＩＩＣManタンパク質を不活化するか、又は前記遺伝子の発現に負の効果を有する、請求項３に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項５】
９．５％のＢ−乳中に、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌し、そして、４０℃で２０時間培養したとき、前記９．５％のＢ−乳中のグルコースの量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで高める、請求項１〜４のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項６】
０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ−乳中に、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌し、そして、４０℃で２０時間培養したとき、前記０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ−乳中のグルコースの量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで高める、請求項１〜５のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項７】
受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５７５７株、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５８８７株、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenで寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６４０４株、及びそれらから誘導された変異株から成る群から選択されるストレプトコッカス・サーモフィルス株であって、前記変異株が、出発物質として、寄託された菌株のうちの１つを使用することによって得られ、そして、前記変異株が、前記寄託された菌株のラクトース発酵特性、及び／又はグルコース分泌特性を保持するか、又はさらに改善した、前記株。
【請求項８】
２−デオキシグルコースに耐性があり、且つ、９．５％のＢ−乳中に、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌し、そして、４０℃で少なくとも２０時間培養したとき、前記９．５％のＢ−乳中のグルコースの量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで高める、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株。
【請求項９】
受託番号ＤＳＭ２６４２０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９、受託番号ＤＳＭ２６４２１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１６０、及びそれらから誘導された変異株から成る群から選択されるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株であって、前記変異株が、出発物質として、寄託された菌株のうちの１つを使用することによって得られ、そして、前記変異株が、前記寄託された菌株のラクトース発酵特性、及び／又はグルコース分泌特性を保持するか、又はさらに改善した前記菌株。
【請求項１０】
１０4〜１０12ＣＦＵ／ｇの、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物。
【請求項１１】
前記ストレプトコッカス・サーモフィルス株が、９．５％のＢ−乳を酸性化できず、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定され、そして、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの前記ストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、９．５％のＢ−乳の酸性化を引き起こすのに有効な量のスクロースをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載の、１０4〜１０12ＣＦＵ／ｇのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を更に含む、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
乳基質に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を少なくとも１つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項１４】
前記ストレプトコッカス・サーモフィルス株が、９．５％のＢ−乳を酸性化できず、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定され、そして前記乳基質に、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの前記ストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、Ｂ−乳の酸性化を引き起こすのに有効な量のスクロースが添加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
乳基質に、請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を少なくとも１つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項１６】
乳基質に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の少なくとも１つ、及び請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の少なくとも１つを植菌し、そして、発酵させることを含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の少なくとも１つを含む発酵乳製品。
【請求項１８】
請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の少なくとも１つを含む発酵乳製品。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の少なくとも１つ、及び請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の少なくとも１つ含む、請求項１７又は１８に記載の発酵乳製品。
【請求項２０】
発酵乳製品の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株、及び請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用。
【請求項２１】
発酵乳製品の甘味を強くするための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株、及び請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用。
【請求項２２】
発酵乳製品中にラクトース含有量を低減するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株、及び請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用。
【請求項２３】
ラクトース不耐症の症状を避ける際に使用するための、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の発酵乳製品。
【請求項２４】
ビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用。
【請求項２５】
ビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項８又は９に記載のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用。
【請求項２６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ＧＭＯストレプトコッカス・サーモフィルス株のスクリーニング及び単離の方法であって、以下のステップ：
ａ）ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し；
ｂ）前記母株から誘導されたストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性があるストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し；そして
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性があるストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、そのストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中でＭ１７培地＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、
を含む前記方法。
【請求項２７】
ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のスクロース中で速いが、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中の母株の増殖速度と比較して、速度低下がゼロであるか、又は少なくとも０〜５０％低下することを条件に、ステップｃ）で選択されたストレプトコッカス・サーモフィルス株から誘導された２−デオキシグルコース耐性ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ガラクトース発酵母株が、受託番号ＤＳＭ２５８３８でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１４９９４株、受託番号ＤＳＭ２２９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６株、及びそれらから誘導された菌株から成る群から選択される、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のスクリーニング及び単離の方法であって、以下のステップ：
ａ）ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株を提供し、
ｂ）前記母株から誘導された変異株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールを選択して、単離し、そして
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、そのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の増殖速度が、ＭＲＳ−ＩＭ培地の＋２％のラクトース中でＭＲＳ−ＩＭ培地の＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を選択して、単離すること、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
前記母株が、受託番号ＤＳＭ２６４１９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ７５９株、受託番号ＤＳＭ１９２５２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１０Ｃ１９株、及びそれらから誘導された菌株から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ラクトースの分解によって形成された高レベルのグルコースの分泌による甘味料特性を有するストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）菌株及び培養物、ラクトースの分解によって形成された高レベルのグルコースの分泌による甘味料特性を有するラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）菌株、当該菌株を含むスターター培養物 (starter cultures)、並びに前記培養を用いて発酵させた乳製品に関する。また、本発明は、当該菌株の獲得方法、並びに発酵乳製品の調製のため、及び発酵乳製品のラクトース含有量を減少させると同時に、発酵乳製品の甘味を増大させるためのそうした菌株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
不純物が入っていない発酵乳製品は、発酵中の乳酸菌によるラクトースの乳酸への変換の結果、刺激性の味又は酸っぱい味によって見分けられる。そのため、それらは、より甘い味の製品を求める購入者の願望を叶えるために、果物、はちみつ、糖又は人工甘味料の添加によって甘味が加えられることが多い。
【０００３】
食品産業には、ここ２０年間で蔓延するようになった太り過ぎ及び肥満問題の克服に協力するように、低カロリー甘味食品の需要がますます高まっている。通常、快い感覚とみなされる甘味は、糖と他のいくつかの物質の存在によって生み出される。糖類の知覚は、大きく異なっている。１００の基準としてスクロースを使用すると、ラクトースの甘味は１６であり、ガラクトースの甘味は３２であり、そして、グルコースの甘味は７４である（Godshall (1988). Food Technology 42(11) : 71-78）。これにより、ほとんど同じレベルのカロリーを有しているにもかかわらず、グルコースはラクトースより４倍超甘いと知覚される。
【０００４】
発酵食品中の糖は、カロリーの摂取を抑えながら、甘味を提供できるアスパルテーム、アセスルファムＫ、スクラロース及びサッカリンなどの甘味料に置き換えられることがさらに多い。しかしながら、人工甘味料の使用は、異味をもたらす可能性があり、さらに、人工甘味料の消費が空腹感の増強、アレルギー、癌などの不利益をもたらすことを示唆しているいくつかの研究が、天然甘味料しか含まない、又は好ましくは追加の甘味料を全く含まない発酵乳製品に対する消費者の嗜好に寄与している。
【０００５】
これにより、天然の（内的な）甘味が高い発酵乳製品を開発することに特別な課題がある。
【０００６】
発酵乳製品の酸性は、主に存在している乳酸菌と、発酵乳製品を調製するのに使用されるプロセスパラメータに依存する。
【０００７】
二糖であるラクトースの発酵は、乳酸菌で非常によく研究されるが、それはラクトースが乳の主要な炭素源であるからである。多くの種では、ラクトースは取り込み後にβ−ガラクトシダーゼによってグルコースとガラクトースに分割される。グルコースは、グルコキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化され、そして、ほとんどの乳酸菌ではエムデン−マイアーホフ−パルナス経路 (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)（解糖）を介して発酵させる（図１）。
【０００８】
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、生物体が混合スターター培養物の一部として通常使用され、他の成分がラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、例えば、ヨーグルト向けにはラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスであり、スイスタイプチーズ向けにはラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）である工業的好熱性乳発酵向けに最も幅広く使用される乳酸菌のうちの１つである。
【０００９】
多くの国々において、ヨーグルトの法的な定義では、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスと並んでストレプトコッカス・サーモフィルスを必要としている。両種とも、ヨーグルトにおいて重要な香気成分であるアセトアルデヒドを望ましい量産生する。
【００１０】
ラクトースとスクロースは、ストレプトコッカス・サーモフィルスによってそれらの構成単糖よりも容易に発酵される。過剰なガラクトースだけが存在する中、ストレプトコッカス・サーモフィルスが使用されているときには、ラクトース分子のグルコース部分が発酵され、ガラクトースが発酵乳製品中に蓄積する。高い酸濃度が発酵を制限しているヨーグルトでは、遊離ガラクトースが残るが、スイスチーズ製造の初期に生じた遊離ガラクトースは、後でラクトバチルス・ヘルベティカスによって発酵させる。
【００１１】
しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの両方から成るガラクトース発酵株は、数人の研究者によって報告されており（Hutkins et al: (1986) J, Dairy Sci, 69(1) ; 1-8; Vaiilancourt et al. (2002) J. Bacteriol. 184(3); 785-793）、そして、ＷＯ２０１１／０２６８６３（Chr. Hansen）では、ガラクトース発酵であるストレプトコッカス・サーモフィルス株を獲得する方法が記載されている。
【００１２】
食品産業の要望を満たすためには、新しい株、特にストレプトコッカス・サーモフィルス株及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を提案することが意味を持ち、そしてそれが、グルコースの分泌によって発酵製品中に追加的なカロリーなしでより多くの天然の甘味（内的な甘味）を提供する。
【００１３】
Poolら（2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464）は、グルコキナーゼをコードする遺伝子、ＥＩＩ（ｍａｎ／ｇｌｃ）の欠失によってグルコース代謝が完全に中断されるラクトコッカス・ラクティス株、及び新たに発見されたグルコース−ＰＴＳ ＥＩＩ（ｃｅｌ）を開示している。構築方法は、すべての変異の作出について遺伝子組み換えなので、その結果、得られた菌株は、現在のところ食品に使用できない遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）である。
【００１４】
Thompsonら（1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223）は、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）（現在、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に改名された）におけるラクトース代謝を研究した。この研究では、マンノース−ＰＴＳ系の変異株を得るために２−デオキシグルコースが使用された。それに続いて、この変異株は、ＵＶ変異誘発を使用して変異誘発され、その後、レプリカ平板法によってグルコース陰性のコロニーがスクリーニングされた。このように、二重変異株（マンノースＰＴＳ及びグルコキナーゼ）が単離された。この二重変異株が、「スターター」生物体によるラクトース発酵の調整にかかわる機構を研究するのに使用された。これらの変異株は、それらを市販のスターター培養物中に含有するのが不適当とされる、それらの親株と比較していくつかの不利益を有している。変異株の細胞収率は、発酵させたラクトース１モルあたり、親株の半分であり、且つ、ラクトースで培養したとき、倍加時間は変異株で有意の延長されていた。同様に、乳酸の収率は、発酵されたラクトース１モルあたり、親株の半分であった。乳中のこれらの菌株の挙動は、分析されなかったが、酸性化の速度が有意に減速されるであろうことは予測される。
【００１５】
加えて、ラクトコッカス・ラクティスは、一般に、アセトアルデヒド産生のために選択されることはなく、そして、ヨーグルトの法的な定義の要件の達成に寄与しない。
【００１６】
Chervauxら（2000. Appi. And Environ. Microbiol,, 66, 5306-5311）は、新規に化学的に定義された培地中のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の生理機能を研究し、グルコース発酵を欠いている２−デオキシグルコース耐性変異株を単離した。いくつかの異なった表現型が観察され、そして、株に特異的な効果が報告された。
【００１７】
先のアプローチはどれも、当該菌株を単独で又は他の乳酸菌株と一緒に使用して発酵させた食品の天然の甘味料に関して増大された特性を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を提供するという問題を解決していない。
【００１８】
さらに、先のアプローチはどれも、当該菌株を使用して発酵させた食品中のラクトース含有量をラクトース不耐症のヒトが許容できるレベルまで低下させるという問題を解決していない。
【発明の概要】
【００１９】
先に記載した従来技術とは対照的に、本発明者らは、ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株を２−デオキシグルコースにさらすことによって、グルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内に変異を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株が選択できること、さらに、乳基質上で培養したとき、これらの細胞がラクトースとガラクトースを消化し、環境内にグルコースを分泌することを見出した。
【００２０】
驚いたことに、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、これらのストレプトコッカス・サーモフィルス株単独で、乳をさらに完全に酸性化できる。従って、それらは、発酵乳適用に有用である。
【００２１】
しかしながら、グルコースは、多くの乳酸菌によって炭素源として使用され、且つ、いずれの分泌グルコースも発酵乳製品中に存在している他の微生物によって消費され得る。
【００２２】
この問題を克服するために、本発明は、炭素源としてのグルコースを用いて増殖する能力を喪失したか、又は当該条件下で増殖する能力が低減されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの２−デオキシグルコース耐性変異株を提供する。
【００２３】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの変異株は、存在するかもしれない他の微生物によって乳中に分泌されたグルコースを消費しないだけでなく、また、周囲の媒質中に多量のグルコースを分泌もし、そして、驚いたことに、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。従って、それらは、発酵乳適用に有用である。
【００２４】
当該食品グレード細菌は、グルコースを含む発酵乳製品の栄養価を高めるのに使用できる。グルコースは、ラクトース及びガラクトースの両方に比べて、より高い知覚甘味を有するので、従って、乳基質に対するグルコースの分泌が、発酵乳製品中のより高い知覚（内的）甘味をもたらす。
【００２５】
本発明の発明者らは、乳基質を本発明に従ってストレプトコッカス・サーモフィルス株及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株で発酵させたとき、乳中のラクトースレベルが有意に減少することを見出した。
【００２６】
ラクトース不耐症 (lactose intolerance) は、ラクトースを消化することができないことによって引き起こされる病態である。ラクトース不耐症のヒトの大部分は、彼らの食事中食のいくらかの量のラクトースを許容することはできるので、彼らの症状（吐き気、痙攣、腹部膨満、下痢症状、及び放屁を含む）の重症度は、消費されるラクトースの量によって重くなる。
【００２７】
これにより、ラクトースを含まないか、又は低いラクトース含有量の食品を製造することができることは、本業界において非常に重要なことである。
【００２８】
低ラクトース食品及び無ラクトース食品のラクトース含有量についてＥＵで定義された共通の制限値は今のところ存在しないが、Finnish Food Safety Authority Eviraには、北欧の制限値が無ラクトース食料については１０ｍｇ／１００ｇ又は１００ｍｌ未満のラクトース含有量、そして、低ラクトース食料については１ｇ未満／１００ｇ又は１００ｍｌ未満のラクトース含有量であると記載してある。
【００２９】
酪農工業は今日、追加カロリーなしで所望の甘味を達成するために発酵乳製品に甘味料を加えるための代替手段を提供するという問題に直面している。さらに、発酵乳製品中のラクトースをラクトース不耐性消費者に許容できるレベルまで低下させる方法を確立することは、非常に有利であろう。
【００３０】
先の問題は、９．５％のＢ−乳 (B-milk)に、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株又は１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を植菌し、本発明に従って４０℃で少なくとも２０時間、ストレプトコッカス・サーモフィルス株又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株で発酵させたとき、前記乳中にグルコースを分泌する変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株及び変異株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を提供することによって解決された。好ましくは、９．５％のＢ−乳に、１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株又は１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を植菌し、本発明に従って４０℃で少なくとも２０時間、ストレプトコッカス・サーモフィルス株又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株で発酵させたとき、当該変異株は単独で、少なくとも５ｍｇ／ｍｌのグルコースをＢ−乳中に分泌する。前記菌株は、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。最終的な発酵乳は、その発酵乳中に１５ｍｇ／ｍｌ未満のラクトースしか含んでいない。その結果、最終的な発酵乳は、約２倍以上の高い内的甘味指数を有する。
【００３１】
ストレプトコッカス・サーモフィルス株を提供するために、本発明者らは、ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株から２−デオキシグルコース耐性変異株、好ましくはこれまでわずかにしか発現されていないか、又は全く発現されていないオペロンの発現を増大させるガラクトースオペロン内の変異を有する株を単離する方法であって、前記２−デオキシグルコース耐性表現型が、コードされたタンパク質を部分的に若しくは完全に不活化するグルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内の変異によって引き起こされる方法を見出した。前記方法は、母株を２−デオキシグルコースにさらし、そして、本明細書中の実施例１に記載したものなどのＭ１７培地＋２％のガラクトースを含有するアガロース平板培養上に２−デオキシグルコースの存在下でも増殖できる変異株を選択することを含む。これらの変異株は、スクリーニングされ、そして、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中でＭ１７培地＋２％のグルコースより高い増殖速度を有する菌株が選ばれる。
【００３２】
驚いたことに、グルコキナーゼ遺伝子（ｇｌｃｋ）内に変異を有するが、一見して通常に機能しているグルコーストランスポーター系を有するストレプトコッカス・サーモフィルスの変異株が、グルコースを分泌していたことがわかった。これらの変異株は、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７と命名された。
【００３３】
さらに、本発明者らは、ラクトース発酵及びグルコース分泌のためのさらに高い能力を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株が、グルコキナーゼ遺伝子内の変異を伴うストレプトコッカス・サーモフィルス株を２−デオキシグルコースに晒し、そして、スクロースがわずか０．０１％の濃度でＢ−乳に加えられているときを除いて、９、５％のＢ−乳中で増殖できない菌株を選択することによって選択できることを見出した。当該高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株を、ＣＨＣＣ１６４０４と命名した。
【００３４】
ＣＨＣＣ１６４０４が、グルコーストランスポーター遺伝子（ｍａｎＭ）内に変異を有しており、細胞内へのグルコースの輸送へのグルコース輸送タンパク質の関与の不活性化をもたらした。
【００３５】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を提供するために、本発明者らは、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株の２−デオキシグルコース耐性変異株を単離する方法を見出したが、その変異株は、炭素源としてグルコースにより増殖する能力を喪失しているか、又は炭素源としてグルコースにより増殖する能力の欠陥を有しているかのいずれかである。前記方法は、前記母親を２−デオキシグルコースに晒し、そして、本明細書中の実施例５に記載したものなど、２％のラクトースを含むＭＲＳ−ＩＭ培地の入ったアガロース平板上、２−デオキシグルコースの存在下で増殖できる変異株を選択することを含む。これらの変異株は、スクリーニングされ、そして、どちらかが完全に失われているか、又はグルコースで増殖できる母株と比較したときに、２％のグルコースを含むＭＲＳ−ＩＭ上で増殖する能力を完全に喪失しているか、又はその能力に欠陥がある菌株が選択される。
【００３６】
この驚くべき知見によると、本発明は、追加のカロリーなしに天然の甘味を提供するように発酵製品中にグルコースを分泌する新規乳酸菌株、特にｇｌｃＫ遺伝子内に変異を有するストレプトコッカス・サーモフィルス、又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス変異株など、前記菌株を作製する方法、当該菌株を使用して作られた発酵乳製品、並びに強い甘味及び低減されたラクトースレベルを有する発酵乳製品を調製するための当該菌株の使用に関する。
【００３７】
さらに、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は、驚いたことに、乳中に単独で存在しているときにはうまく増殖しないプロバイオティック細菌であるビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス株（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）ＢＢ−１２（登録商標）の増殖を促進することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるラクトース異化の略図である。ＧｌｃＫ、グルコキナーゼ；ＬａｃＳ、ラクトーストランスポーター；ＬａｃＺ、β−ガラクトシダーゼ；ＧａｌＭ、ムタロターゼ；ＧａｌＫ、ガラクトキナーゼ；ＧａｌＴ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；ＧａｌＥ、ＵＤＰ−グルコース４エピメラーゼ；Ｇａｌ１Ｐ、ガラクトース−１−リン酸。
【図２】ストレプトコッカス・サーモフィルスのグルコキナーゼ遺伝子（ｇｌｃＫ）のＤＮＡ配列（配列番号１）、並びにコードされているアミノ酸配列（配列番号２）を表す。ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７のそれぞれに見られる単一ヌクレオチド置換を示す。
【図３】ストレプトコッカス・サーモフィルスのグルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）をコードするｍａｎオペロンを表す。母株であるＣＨＣＣ１５７５７と比較したときに、高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株であるＣＨＣＣ１６４０４は、グルコース／マンノースＰＴＳのＩＩＣManタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子内に変異を有することがわかった。ＧからＴへの変異は、２０９位のアミノ酸におけるグルタミン酸のためのＧＡＡコドンをＴＡＡ終止コドン（＊）に変更させ、ＣＨＣＣ１６４０４の翻訳を中止するので、タンパク質の機能が不活性化される。
【図４】ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７のｍａｎＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）、並びにコードされているアミノ酸配列（配列番号６）を表す。ＣＨＣＣ１６４０４に見られる単一ヌクレオチド置換を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の詳細な開示
本明細書中で使用される場合、「乳酸菌」という用語は、糖の発酵において主に産生される酸として乳酸、酢酸及びプロピオン酸を含む酸を産生する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種（Lactococcus spp.）、ストレプトコッカス亜種（Streptococcus spp.）、ラクトバチルス亜種（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック亜種（Leuconostoc spp.）、ペディオコッカス亜種（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム亜種（Brevibacterium spp.）、エンテロコッカス亜種（Enterococcus spp.）及びプロピオニバクテリウム亜種（Propionibacterium spp.）を含む目である「ラクトバチルス目（Lactobacillales）」に属する。ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）及びストレプトコッカス・サーモフィルスから成る属の細菌を含めた乳酸菌は、発酵乳製品などの酪農製品の生産のために発酵容器やバット内でそのままインキュベーションすることを意図した、バルクスターター繁殖（bulk starter propagation）のための冷凍若しくは凍結乾燥培養株、又はいわゆるダイレクトバットセット（Direct Vat Set）（ＤＶＳ）培養株のいずれかとして通常、酪農業界に供給される。そのような培養株は、一般に、「スターター培養株」又は「スターター」と称される。
【００４０】
本願の記載における「１つの（「ａ」及び「ａｎ」）」並びに「前記（ｔｈｅ）」という用語、及びこれらの類似語（特に特許請求の範囲）は、他の言及が無い限り、又は明確に否定していない限り、単数及び複数の両方を包含すると想定される。「含む（「comprising」「having」「including」及び「containing」）」という用語は、他に言及が無い限り、非限定的用語（すなわち、「これだけに限定されるものではないが、含む（including, but not limited to）」を意味する）として理解されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、他に言及が無い限り、単に当該範囲内の各個別の数値を個別に参照する簡単な方法と見なされることが意図され、各個別の数値は、それらが個別に本明細書中に記載されているかのように本明細書中に包含される。本明細書中に記載される全ての方法は、本記載中に他の言及が無い限り、又は明確に否定されていない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書中の任意の及び全ての実施例、又は例示的用語（「例えば（「such as」）」）は、本発明をより良く明示することのみを意図しており、他の言及が無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の明示されていない要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。
【００４１】
いくつかの国では、ヨーグルトの法的な定義は、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの両方の存在を必要としている。両種とも、ヨーグルトの重要な香気成分であるアセトアルデヒドを望ましい量作り出す。
【００４２】
チーズ、例えばモッツァレラ及びピザチーズ、並びにフェタなどもまた、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの両方を使用した発酵によって調製される（Hoier et al. (2010) in The Technology of Cheesemak-ing, 2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192）。
【００４３】
食品産業の要件を満たすために、追加のカロリーを与えることなく、発酵製品中に直接より多くの天然の甘味（内的な甘味）を産生する新たな菌株、特にラクトバシルス・デルブリッキ亜種ブルガリクス株及びストレプトコッカス・サーモフィルス株を開発することが望ましくなった。
【００４４】
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、生物体が混合スターター培養物の一部として通常使用され、他の成分がラクトバチルス属、例えば、ヨーグルトではラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス、そして、スイスタイプチーズではラクトバチルス・ヘルベティカスである商業的な乳発酵に最も幅広く使用される乳酸菌の１つである。
【００４５】
ラクトースとスクロースは、ストレプトコッカス・サーモフィルスによってそれらの構成単糖よりも容易に発酵される。ストレプトコッカス・サーモフィルスが使用されているときには、ラクトース分子のグルコース部分だけがストレプトコッカス・サーモフィルスによって発酵され、ガラクトースが発酵乳製品中に蓄積する。高い酸濃度が発酵を制限しているヨーグルトでは、遊離ガラクトースが残るが、スイスチーズ製造の初期に生じた遊離ガラクトースは、後でラクトバチルス・ヘルベティカスによって発酵される。チーズ製造に使用されるスターター培養物の多くに見られるラクトコッカス・ラクティスもまた、ストレプトコッカス・サーモフィルスによって産生されたガラクトースを消費できる。
【００４６】
できるだけ最適な増殖性能を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株を確保するために、本発明者らは、ストレプトコッカス・サーモフィルスのガラクトース発酵株を選択剤である２−デオキシグルコースに晒した。典型的な２−デオキシグルコース耐性変異株は、グルコキナーゼをコードする遺伝子内、及びグルコーストランスポーターをコードする遺伝子内に変異を有する。２−デオキシグルコースに耐性がある単離された変異株、ＣＨＣＣ１５７５７、ＣＨＣＣ１５８８７及びＣＨＣＣ１６４０４は、それらのグルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内に変異を有する。グルコキナーゼ遺伝子内の変異に加えて、本発明者らは、ＣＨＣＣ１６４０４が、運び出されたグルコースがなぜ再び細胞内に再び運び込まれないかを明らかにできる、グルコース／マンノーストランスポーター遺伝子内の終止コドン変異を有することがわかった。
【００４７】
驚いたことに、当該変異株は単独で、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。従って、それらは、発酵乳適用に有用であり、そして、それらは、ヨーグルトの特徴である乳を凝固させる母株の能力を保持している。さらに、グルコース輸送変異株の分離の必要なしに、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７又はＣＨＣＣ１５８８７を植菌し、そして、４０℃で少なくとも２０時間発酵させたとき、あるいは、０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４を植菌し、そして、４０℃で少なくとも２０時間発酵させたとき、変異株が５ｍｇ／ｍｌ超のグルコースを分泌することがわかった。同時に、それぞれわずか約１０ｍｇ／ｍｌのラクトースと１．５ｍｇ／ｍｌ未満のラクトース（検出限界）が、発酵乳中に残っている。そのため、発酵乳製品を製造するための当該菌株の使用は、ラクトース不耐症の人々のために重要であり得る。
【００４８】
その結果、最終的な発酵乳は、Godshall（1988. Food Technology 42(11) :71-78）によって説明されたとおり計算して、少なくとも２．０のより高い内的甘味指数を有する。
【００４９】
これにより、本発明の第一の態様は、ストレプトコッカス・サーモフィルスのガラクトース発酵変異株に関するが、前記変異株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列内に変異を担持し、前記変異は、コードされたグルコキナーゼタンパク質を不活化するか、又はその遺伝子の発現に負の効果を有する。グルコキナーゼ活性のレベル又はグルコキナーゼ遺伝子の発現レベルを計測するための方法は、容易に知られ（Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186）、そして、市販キット及び容易に入手可能な材料を使用したトランスクリプトミクス又は定量的ＰＣＲを用いた酵素アッセイを含んでいる。
【００５０】
細菌の「菌株」は、本明細書中で使用される場合、増殖又は繁殖するときに遺伝的に不変のままである細菌を指す。同一の細菌の多様性が含まれる。
【００５１】
「ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース上／その中で増殖できるストレプトコッカス・サーモフィルス株を指す。ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、一晩培養物から１％で植菌し、３７℃で２４時間インキュベートした際に、唯一の炭水化物として２％のガラクトースを含有するＭ１７培養液のｐＨを５．５以下に下げるストレプトコッカス・サーモフィルス株と本明細書中に規定される。
【００５２】
ガラクトース発酵菌株は、ＷＯ２０１１／０２６８６３に記載の方法によって得ることもできる。
【００５３】
「変異がグルコキナーゼタンパク質を不活化する」という用語は、本明細書中で使用される場合、「不活性グルコキナーゼタンパク質」をもたらす変異、細胞内に存在している場合、その正常機能を発揮することができないグルコキナーゼタンパク質、並びにグルコキナーゼタンパク質の形成を妨げる又はグルコキナーゼタンパク質の分解をもたらす変異を指す。
【００５４】
特に、不活性グルコキナーゼタンパク質は、機能的グルコキナーゼタンパク質と比較して、グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進することができないか、
又は著しく遅い速度でしかグルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進できないタンパク質である。機能的グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子と比較して、当該不活性グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に変異を含んでおり、前記変異は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質の機能的特性を変更させる欠失、フレームシフト変異、終止コドンの挿入又はアミノ酸置換をもたらす変異、あるいは、遺伝子の転写又は翻訳を低減するか、又は停止するプロモーター変異を含み得る。
【００５５】
好ましい実施形態において、変異は、グルコキナーゼタンパク質の活性（グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化速度）を少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
【００５６】
グルコキナーゼ活性は、Poolら（2006, Metabolic Engineering 8;456-464）によって説明されたグルコキナーゼ酵素分析法によって測定できる。
【００５７】
「機能的グルコキナーゼタンパク質 (functional glucokinase protein)」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞内に存在している場合には、グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進するグルコキナーゼタンパク質を指す。特に、機能的グルコキナーゼタンパク質は、配列番号１の１〜９６６位に相当する配列、あるいは、配列番号１の１−９６６位に対応する配列に対して少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％程度の同一性、例えば少なくとも９５％程度の同一性、例えば少なくとも９８％程度の同一性、例えば少なくとも９９％程度の同一性を有する配列を有するＯＲＦを含む遺伝子によってコードされ得る。
【００５８】
２つの配列のパーセント同一性は、例えばKarlin及びAltschul（1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87;2264）のアルゴリズム、Karlin及びAltschul（1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 5873-5877）に記載された修正アルゴリズム；Myers及びMiller（1988. CABIOS 4; 11-17）のアルゴリズム；Needleman及びWunsch（1970. J. Mol. Biol. 48;443-453）のアルゴリズム；並びにPearson及びLipman（1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448）のアルゴリズムなどの数学的アルゴリズムを使用することによって決定できる。これらの数学的アルゴリズムに基づいて核酸又はアミノ酸の配列同一性を決定するコンピュータソフトウェアもまた入手可能である。例えば、ヌクレオチド配列の比較は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行われる。アミノ酸配列の比較は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴに関するパラメーターを残すためには、初期設定のパラメーターが使用できる。
【００５９】
多くの国々では、発酵乳製品への遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の使用が承認されていない。本発明では代わりに、発酵乳製品中での望ましいグルコース蓄積を提供できる天然に存在する変異株又は誘発された変異株を獲得する方法を提供する。
これにより、本発明のより好ましい実施形態において、変異株は、天然に存在する変異株又は誘発された変異株である。
【００６０】
「突然変異細菌」又は「変異株」とは、本明細書中で使用される場合、天然の（自然発生的、自然に生じた）変異細菌、又は野性型ＤＮＡ内に存在しないそのゲノム（ＤＮＡ）内の１若しくは複数の変異を含む誘発された変異細菌を指す。「誘発された変異株」は。変異が、例えば化学的変異誘発物質、ＵＶ又はガンマ放射線などを用いた処理などのヒトの処理によって引き起こされた細菌である。対照的に、「自然発生的な変異株」又は「天然に存在する変異株」は、人によって変異誘発されていない。変異株細菌は、本明細書中では、非ＧＭＯ（非遺伝子組み換え生物）、すなわち、組み換えＤＮＡ技術によって改変されていない。
【００６１】
「野生型株」は、天然に見られるように、非変異型の細菌を指す。
【００６２】
「甘味料特性を有する菌株 (strains with a sweetening property)」、「発酵乳製品中でグルコースの望ましい蓄積を提供する菌株 (strains which can provide a desirable accumulation of glucose in the fermented milk product)」及び「食品の天然の甘味料に関して優れた特性を有する菌株 (strains with enhanced properties for natural sweetening of food products)」などの用語は、乳製品の発酵において本発明の菌株を使用する有利な態様を特徴づけるために本明細書中で互換的に使用される。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルスの変異株は、９．５％のＢ−乳中に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で少なくとも２０時間培養されると、その９．５％のＢ−乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍＬまで増加させる。
【００６４】
別の好ましい実施形態、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス変異株は、０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ−乳中に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で少なくとも２０時間培養されると、その０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ−乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍＬまで増加させる。
【００６５】
本明細書の文脈において、９、５％のＢ−乳とは、９．５％の乾物量レベルに低脂肪脱脂乳を還元し、９９℃で３０分間低温殺菌し、その後、４０℃に冷まして作られた、煮沸した乳である。
【００６６】
本発明のより好ましい実施形態において、変異株は、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも７ｍｇ／ｍＬ程度、例えば少なくとも８ｍｇ／ｍＬ程度、例えば少なくとも９ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１２ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１３ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１４ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも２５ｍｇ／ｍｌなどのグルコース量の増大をもたらす。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルスの変異株は２−デオキシグルコースに耐性がある。
【００６８】
本明細書中の「２−デオキシグルコースに耐性」という用語は、特定の変異菌株が、２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含むＭ１７培地のプレート上に画線接種されたときに、４０℃で２０時間インキュベーション後にコロニーに増殖する能力を有するということによって規定される。培地中の２−デオキシグルコースの存在は、非変異菌株の増殖を妨げるであろうが、その一方で、変異菌株の増殖が影響を受けないか又は顕著な影響を受けることはない。耐性の評価においで感受性基準菌株として使用できる非変異菌株としては、好ましくは菌株ＣＨＣＣ１４９９４及びＣＨＣＣ１１９７６が挙げられる。
【００６９】
本明細書中の実施例１及び２は、２−デオキシグルコースに耐性があるストレプトコッカス・サーモフィルス変異株の分離を例示している。
【００７０】
さらに別の実施形態において、本発明による変異株は、その増殖パターンによって特徴づけできる。これは、変異株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中に比べ、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中の方が速いという知見によって例示される。増殖速度は、本明細書中の実施例２に記載した時間での６００ナノメートル（ＯＤ６００）で指数増殖期培養の吸光度における推移として計測される。
【００７１】
好ましい実施形態において、増殖速度は、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中に比べて、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中で少なくとも５％高い、例えば少なくとも１０％程度高い、例えば少なくとも１５％程度高い、例えば少なくとも２０％程度高い。
【００７２】
好ましい実施形態において、変異は、配列番号２の７２位において、セリンをコードしているコドンの、プロリンをコードしているコドンでの置き換えをもたらす。好ましくは、ｇｌｃＫ遺伝子内の変異は、配列番号１の２１４位におけるＴのＣでの置き換えをもたらす。
【００７３】
別の好ましい実施形態において、変異は、配列番号２の１４１位における、トレオニンをコードしているコドンのイソロイシンをコードするコドンでの置き換えをもたらす。
【００７４】
好ましくは、ｇｌｃＫ遺伝子内の変異は、配列番号１の４２２位におけるＣのＴでの置き換えをもたらす。
【００７５】
ストレプトコッカス・サーモフィルスのｇｌｃＫ遺伝子が、ｇｌｃＫ遺伝子の他の部位の他のタイプの変異によって不活性化され得ることは、強調されるべきである。
【００７６】
好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、細胞内へのグルコースの輸送を低減する変異を有する。
【００７７】
「細胞内へのグルコースの輸送を低減する変異」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞の環境中のグルコースの蓄積をもたらすグルコースの輸送にかかわるタンパク質をコードする遺伝子内の変異を指す。ストレプトコッカス・サーモフィルス株の培地中のグルコースレベルは、当業者に知られている方法によって、そして、培地が乳基質であるときには、本明細書中の実施例４に記載のとおり容易に計測できる。
【００７８】
好ましい実施形態において、変異は、細胞内へのグルコースの輸送を、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
【００７９】
細胞内へのグルコースの輸送は、Cochuら（2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432）によって説明されているグルコース取り込みアッセイによって測定できる。
【００８０】
好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコーストランスポーターの成分をコードする遺伝子内に変異を担持しており、前記変異は、グルコース輸送タンパク質を不活化するか、又はその遺伝子の発現に対して負の効果を有する。
【００８１】
前記成分とは、グルコースの輸送に重要であるグルコース輸送タンパク質のあらゆる成分であってよい。例えば、図３に表されているストレプトコッカス・サーモフィルスのグルコース／マンノースＰＴＳのあらゆる成分の不活性化が、グルコーストランスポーター機能の不活性化をもたらすことは、企図されている。
【００８２】
「変異がグルコーストランスポーターを不活化する」という用語は、本明細書中で使用される場合、「不活性グルコーストランスポーター」をもたらす変異、細胞内に存在している場合、その正常機能を発揮することができないグルコース輸送タンパク質、並びにグルコース輸送タンパク質の形成を妨げる又はグルコース輸送タンパク質の分解をもたらす変異を指す。
【００８３】
特に、不活性グルコース輸送タンパク質は、機能的グルコース輸送タンパク質と比較して、原形質膜を越えるグルコースの輸送を促進することができない又は著しく遅い速度でしか原形質膜を越えるグルコースの輸送を促進できないタンパク質である。
【００８４】
機能的グルコース輸送タンパク質をコードする遺伝子と比較して、当該不活性グルコース輸送タンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に変異を含んでおり、前記変異は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質の機能的特性を変更させる欠失、フレームシフト変異、終止コドンの挿入又はアミノ酸の置き換えをもたらす変異、あるいは、その遺伝子の転写又は翻訳を低減又は停止するプロモーター変異を含み得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、変異は、グルコース輸送タンパク質の活性（グルコースの輸送の速度）を少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
グルコーストランスポーター活性は、Cochuら（2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432）によって説明されたグルコース取り込みアッセイによって測定できる。
【００８６】
「機能的グルコース輸送タンパク質」という用語、本明細書中で使用される場合、細胞内に存在している場合、原形質膜を越えてグルコースの輸送を促進するグルコース輸送タンパク質を指す。
【００８７】
より好ましいストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＣManタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子のＤＮＡ配列内に変異を有するが、前記変異は、ＩＩＣManタンパク質を不活化するか、又はその遺伝子の発現に対して負の効果を有する。
【００８８】
よりいっそう好ましい実施形態において、変異は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＣManタンパク質の配列番号６の２０９位において、グルタミン酸をコードするコドンの終止コドンでの置き換えをもたらす。好ましくは、変異は、配列番号５の６２５位においてＧのＴでの置き換えをもたらす。
【００８９】
本発明の第二の態様は、受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４、及びそれらから誘導された菌株から成る群から選択されるストレプトコッカス・サーモフィルス株に関する。
【００９０】
本明細書の文脈において、「それらから誘導された菌株」という用語は、例えば、遺伝子工学、放射線及び／又は化学的処理から成る手段によって本発明の菌株（又はそれらの母株）から誘導された菌株、又は誘導されることができる菌株と理解されるべきである。「それらから誘導された菌株」はまた、自然発生的な変異株でもあり得る。「それらから誘導された菌株」が機能上同等な変異株、例えば、それらの母株と実質的に同じであるか、又は改善された（例えば、グルコースの分泌に関する）特性を有する変異株であることが好ましい。当該「それらから誘導された菌株」は、本発明の一部である。特に、「それらから誘導された菌株」という用語は、本発明の菌株を、例えばエタンメタンスルホナート（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学的変異誘発物質、ＵＶ光を用いた処理を含めたいずれかの慣習的に使用されている変異誘発処理、又は自然に起こっている変異株に晒すことによって得られた菌株を指す。変異株は、いくつかの変異誘発処理に供され得るが（１回の処理とは、１回の変異誘発ステップとそれに続くスクリーニング／選択ステップと理解されるべきである）、ここでは２０未満、１０未満、又は５未満の処理（又はスクリーニング／選択ステップ）が行われるのが好ましい。ここでの好ましい変異株では、母株と比較して、細菌ゲノムのヌクレオチドの１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満又は０．０００１％未満が別のヌクレオチドに置き換えられているか又は欠失している。
【００９１】
従って、好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４、及びそれらから誘導された変異株から成る群から選択され、前記変異株は、出発物質として寄託された菌株のうちの１つを使用することによって得られ、そして、前記変異株は、前記寄託された菌株のラクトース発酵特性、及び／又はグルコース分泌特性を保持するか又はさらに改善した。
【００９２】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスは、通常、生物体が混合スターター培養物の一部として使用される商業的な乳発酵のために頻繁に利用される乳酸菌である。
ラクトースは、通常、ガラクトース上で増殖しないラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス及びこの種の菌株によって、単糖であるグルコース、フルクトース、及びマンノースより容易に発酵される（Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds (1974): Bergey's manual of determinative bacteriology (The Williams & Wilkins Co. Baltimore, Md), 8th ed,）。
【００９３】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスによるラクトースの発酵中、ラクトース分子のグルコース部分だけが発酵され、これにより、ガラクトースが発酵乳製品中に蓄積する。
【００９４】
炭素源としてグルコースにより増殖できないラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を得るために、本発明者らは、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を２−デオキシグルコースに晒した。単離された変異株は、２−デオキシグルコースに対して耐性であり、炭素源としてグルコースを使用せずに、乳基質中で増殖できた。変異株が、乳のグルコース含量を増加させることがわかった。従って、これらの菌株の使用によって製造される発酵乳製品は、製品の味をより甘くするより多いグルコース量を特徴とする。
【００９５】
驚いたことに、本発明のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は単独で、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。さらに、実施例で実証されているように、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を植菌し、そして、４０℃で少なくとも２０時間本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を用いて発酵させたとき、前記菌株は、約５ｍｇ／ｍｌ以上のグルコースを分泌した一方で、発酵乳中に約１０ｍｇ／ｍｌ未満のラクトースしか残さなかったことがわかった。そのため、発酵乳製品を製造するための当該菌株の使用は、ラクトース不耐症の人々のための重要であり得る。
【００９６】
その結果、最終的な発酵乳は、Godshall（1988. Food Technology 42(11) :71-78）によって説明されたとおり計算して、約２以上、例えば２．５以上程度又は例えば３以上程度のより高い内的甘味指数を有する。
【００９７】
本発明の第三の態様は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株に関するが、前記菌株は２−デオキシグルコースに耐性がある。
【００９８】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株と関連した「２−デオキシグルコースに耐性」という用語は、特定の細菌株が、２％のラクトース及び２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するＭＲＳ−ＩＭ培地のプレート上で画線接種されたとき、４０℃で２０時間のインキュベーション後にコロニーまで増殖する能力を有することによって規定される。培地中の２−デオキシグルコースの存在は、非耐性株の増殖を妨げるであろうが、その一方で、耐性株の増殖は影響を受けないか、又は顕著な影響を受けることはない。耐性の評価において感受性基準菌株として使用できる非耐性ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株としては、受託番号ＤＳＭ２６４１９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ７５９、及び受託番号ＤＳＭ１９２５２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたＣＨＣＣ１００１９が挙げられる。
【００９９】
２％のラクトースを含有するＭＲＳ−ＩＭアガロースプレート及びさらに２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するプレートがコロニーに覆われた事象では、プレート中の２−デオキシグルコースの濃度を、例えば３０ｍＭ又はさらに４０ｍＭ超まで高めるのが適当である。コロニーが得られなかった事象では、プレート中の２−デオキシグルコースの濃度を、例えば１５ｍＭ若しくは１０ｍＭ、又はそれ以下に下げるのが適当である。必要と思われるのであれば、適当な物理的又は化学的変異誘発プロトコールを使用することによって、変異率を上げられる。
【０１００】
好ましくは、本発明のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で少なくとも２０時間、例えば２０〜３０時間程度、例えば２０時間程度培養されたとき、９．５％のＢ−乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで増加させる。
【０１０１】
本発明のより好ましい実施形態において、変異株は、少なくとも６ｍｇ／ｍｌ、例えば少なくとも７ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも８ｍｇ／ｍＬ程度、例えば少なくとも９ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１２ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１３ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１４ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ程度のグルコース量の増加をもたらす。
【０１０２】
本発明の第四の態様は、受託番号ＤＳＭ２６４２０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９、受託番号ＤＳＭ２６４２１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１６０、及びそれらから誘導された菌株から成る群から選択されるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株に関する。
【０１０３】
「それらから誘導された菌株」という用語は、先に規定されたとおり理解されるべきである。
【０１０４】
従って、好ましい実施形態において、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は、受託番号ＤＳＭ２６４２０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９、受託番号ＤＳＭ２６４２１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１６０、及びそれらから誘導された変異株から成る群から選択されるが、前記変異株は、出発物質として寄託された菌株のうちの１つを使用することによって得られ、そして、前記変異株は、前記寄託された菌株のラクトース発酵特性、及び／又はグルコース分泌特性を保持するか又はさらに改善していた。
【０１０５】
本発明の第五の態様は、１０4〜１０12ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｇの本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株、例えば１０5〜１０11ＣＦＵ／ｇ程度、例えば１０6〜１０10ＣＦＵ／ｇ程度、又は例えば１０7〜１０9ＣＦＵ／ｇ程度のストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物に関する。
【０１０６】
好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、９．５％のＢ−乳を酸性化できず、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定される。９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４によって９．５％のＢ−乳の酸性化を引き起こすことができる量の化合物を、組成物はさらに含む。
【０１０７】
好ましくは、前記化合物はスクロースである。
【０１０８】
好ましくは、スクロースの量は、０．０００００１％〜２％、例えば０．００００１％〜０．２％程度、例えば０．０００１％〜０．１％程度、例えば０．００１％〜０．０５％程度である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、前記組成物は、１０4〜１０12ＣＦＵ／ｇの本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、例えば１０6〜１０10ＣＦＵ／ｇ程度、例えば１０5〜１０11ＣＦＵ／ｇ程度又はとしては、１０7〜１０9ＣＦＵ／ｇ程度のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株をさらに含む。
【０１１０】
本発明の好ましい組成物は、例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９及び／又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１６０を、ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７と組み合わせて含む。さらに好ましい組成物は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９及び／又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１６０を、ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７と組み合わせて含む。より一層好ましい組成物は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１６１５９及び／又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１６０を、ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４と組み合わせて含む。
【０１１１】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、及び他の乳酸菌は、例えば酪農工業などの、例えば発酵乳製品などの、各種食品の製造に技術的な目的に役立つスターター培養物として一般的に使用される。これにより、別の好ましい実施形態において、前記組成物はスターター培養物として好適である。
【０１１２】
スターター培養物は、液状スターター培養物に加えて、冷凍か又は乾燥スターター培養物として提供されてもよい。これにより、さらに別の好ましい実施形態において、前記組成物は、冷凍、凍結乾燥又は液状の形態である。
【０１１３】
ＷＯ２００５／００３３２７で開示されるように、特定の凍結保護剤をスターター培養物に加えることは、有益である。これにより、本発明によるスターター培養組成物は、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）、アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン−５’−一リン酸（ＧＭＰ）、ウラノシン−５’−一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、ヒポキサンチン、キサンチン、ヒポキサンチン、オロチジン、チミジン、イノシン及び当該化合物のうちのいずれかの誘導体から成る群から選択される１若しくは複数の凍結保護剤を含んでもよい。
【０１１４】
本発明の第六の態様は、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株のうちの少なくとも１つを乳基質に植菌し、そして、発酵させることを含む発酵乳製品を製造する方法を対象とする。
【０１１５】
「乳 (milk)」という用語は、任意の哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー又はラクダなどを搾乳して得た乳分泌物として理解されるべきである。好ましい態様において、乳は、牛乳である。
【０１１６】
「乳基質 (milk substrate)」という用語は、本発明の方法に係る発酵に供され得る任意の生乳／加工乳材料を指す。従って、有用な乳基質は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質を含有する任意の乳又は乳様製品の溶液／懸濁物、例えば全乳又は低脂肪乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳粉、練乳、粉乳、ホエイ、ホエイ透過物、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエイタンパク質濃縮物、又はクリームを含む。明らかに、乳基質は任意の哺乳類由来であってもよく、例えば実質的に純粋な哺乳類の乳、又は還元乳粉である。
【０１１７】
好ましくは、乳基質中のタンパク質の少なくとも一部は、例えばカゼイン又はホエイタンパク質などの乳中に天然に存在するタンパク質である。しかしながら、前記タンパク質の一部は、乳中に天然に存在しないタンパク質であってもよい。
【０１１８】
発酵の前に、当該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化又は殺菌されてもよい。
【０１１９】
本明細書中、「均質化」という用語は、可溶性懸濁物又は乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは、乳脂肪が乳から分離しない程度に小さなサイズに分散するように実施されるべきである。これは、乳を高圧で小さなオリフィスを通して押し出すことにより達成され得る。
【０１２０】
本明細書中、「殺菌 (pasteurizing)」とは、生きた生物、例えば微生物を減少又は死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間、特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。当該特定の温度は、通常加熱により達成される。殺菌温度及び時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅又は不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。
【０１２１】
本発明における「発酵」は、微生物の作用により炭水化物がアルコール又は酸に変換されることを意味する。好ましくは、本発明の方法は、ラクトースを乳酸に変換することを含む。
【０１２２】
発酵乳製品の製造に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素量、（単数若しくは複数の）微生物の量及び特性、並びに処理時間などの適切な処理条件をどのように選択するかを心得ている。自明であるが、発酵条件は、本発明の達成を支持するように、すなわち、固形又は液状の乳製品（発酵乳製品）を得るように選択される。
【０１２３】
「発酵乳製品」という用語は、本明細書中で使用される場合、食料又は飼料製品を指し、前記食料又は飼料製品の調製は、乳酸菌による乳基質の発酵にかかわっている。本明細書中で使用される場合、「乳製品を発酵させた」としては、これだけに限定されるものではないが、例えばヨーグルト、チーズ、サワークリーム及びバターミルク、並びに発酵ホエイなどの製品が挙げられる。
【０１２４】
好ましい実施形態において、播種されるストレプトコッカス・サーモフィルス細胞の濃度は、乳基質１ｍｌあたり１０4〜１０9ＣＦＵのストレプトコッカス・サーモフィルス細胞、例えば乳基質１ｍｌあたり１０4ＣＦＵ〜１０8ＣＦＵ程度のストレプトコッカス・サーモフィルス細胞である。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、９．５％のＢ−乳を酸性化できず、９．５％のＢ−乳に１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定される。９．５％のＢ−乳に１０5〜１０7ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４による９．５％のＢ−乳の酸性化を引き起こすことができるような量の化合物が、その乳基質に加えられる。
【０１２６】
好ましくは、前記化合物はスクロースである。
【０１２７】
好ましくは、スクロースの量は、０．０００００１％〜２％、例えば０．００００１％〜０．２％程度、例えば０．０００１％〜０．１％程度、例えば０．００１％〜０．０５％程度である。
【０１２８】
本発明の第七の態様は、本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のうちの少なくとも１つを乳基質に植菌し、そして、発酵させることを含む発酵乳製品を製造する方法を対象とする。
【０１２９】
好ましい実施形態において、播種されるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの濃度は、乳基質１ｍｌあたり１０4〜１０9ＣＦＵのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス細胞、例えば乳基質１ｍｌあたり１０4ＣＦＵ〜１０8ＣＦＵ程度のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス細胞である。
【０１３０】
好ましい実施形態において、発酵乳製品を製造する方法は、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株のうちの少なくとも１つ、及び本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のうちの少なくとも１を乳基質に植菌し、そして、発酵させることを含む。
【０１３１】
別の好ましい実施形態において、発酵乳製品は、ヨーグルト又はチーズである。
【０１３２】
ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスを用いた発酵によって調製されるチーズの例としては、モッツァレラ及びピザチーズが挙げられる（Hoier et al. (2010) in The Technology of Cheese ma king, 2nd Ed. Blackwll Publishing, Oxford; 166-192）。
【０１３３】
好ましくは、発酵乳製品はヨーグルトである。
【０１３４】
本明細書の文脈において、ヨーグルトスターター培養物は、少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株と少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む細菌培養物である。これによれば、「ヨーグルト」という用語は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株とストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物を乳に植菌し、そして、発酵させることによって入手可能な発酵乳製品を指す。
【０１３５】
第八の態様において、本発明は、本発明の第六又は第七の態様による方法によって入手可能な発酵乳製品に関する。
【０１３６】
第九の態様において、本発明は、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株のうちの少なくとも１つを含む発酵乳製品に関する。
【０１３７】
第十の態様において、本発明は、本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のうちの少なくとも１つを含みで発酵乳製品に関する。
【０１３８】
好ましい実施形態において、発酵乳製品は、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株のうちの少なくとも１つ、及び本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のうちの少なくとも１つを含む。
【０１３９】
別の好ましい実施形態において、前記発酵乳製品は、ヨーグルト又はチーズである。好ましくは、前記発酵乳製品はヨーグルトである。
【０１４０】
第十一の態様において、本発明は、発酵乳製品の調製のための、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用に関する。
【０１４１】
第十二の態様において、本発明は、発酵乳製品の調製のための、本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの使用に関する。
【０１４２】
本発明の第十三の態様は、発酵乳製品の調製のための、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株、及び本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用に関する。
【０１４３】
第十四の態様は、発酵乳製品の甘味を増大させるための、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用に関する。
【０１４４】
第十五の態様において、本発明は、発酵乳製品の甘味を増大させるための、本発明の第三及び第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用を対象とする。
【０１４５】
第十六の態様において、本発明は、発酵乳製品の甘味を増大させるための、本発明の第三及び第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、及び本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用を対象とする。
【０１４６】
特に、消費者団体としての子供は、甘い味の食品を優先するので、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株と本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株が、子供のための発酵乳製品の甘味を増強するのに特に有用であり得ることが企図される。
【０１４７】
本発明の第十七の態様は、カロリー摂取を低減する際に使用するための本発明による発酵乳製品に関する。
【０１４８】
本発明による発酵乳製品は、太り過ぎ又は肥満に悩んでいる人々の食事に特に有効であると考えられる。
【０１４９】
これにより、好ましい実施形態において、本発明による発酵乳製品は、太り過ぎ又は肥満に悩んでいる人のカロリー摂取を低減するのに使用するためのものである。
【０１５０】
太り過ぎ及び肥満は、世界保健機構（ＷＨＯ）によって、健康に対してリスクを与える異常な又は過剰な脂肪蓄積と規定された病的な状態である。ボディマスインデックス（ＢＭＩ）は、成人の太り過ぎや肥満を分類するための大まかな指針として使用され、人の体重（キログラム単位）を、彼／彼女の身長（メートル単位）の二乗で割って計算される（ｋｇ／ｍ2）。ＷＨＯ定義では、２５以上のＢＭＩが太り過ぎであり、３０以上のＢＭＩが肥満であると宣言している。
【０１５１】
本発明の第十八の態様は、発酵乳製品中のラクトース含有量を減少させるための、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用に関する。
第十九の態様において、本発明は、発酵乳製品中にラクトース含有量を減少させるための、本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用を対象とする。
【０１５２】
本発明の第二十の態様は、発酵乳製品中にラクトース含有量を減少させるための、本発明の第一又は第二の態様によるストレプトコッカス・サーモフィルス株、及び本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用に関する。
【０１５３】
本発明の第二十一の態様は、ラクトース不耐症の症状を回避する際に使用するための、本発明による発酵乳製品を対象とする。
【０１５４】
第二十二の態様は、薬剤として使用するための本発明の組成物に関する。
【０１５５】
第二十三の態様において、本発明は、ビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用を対象とする。
【０１５６】
好ましい実施形態において、前記ビフィドバクテリウム株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）、ビフィドバクテリウム・ブレビス（Bifidobacterium brevis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）から成る群から選択される種、例えば受託番号ＤＳＭ１５９５４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）ＢＢ−１２（登録商標）株、寄託番号ＤＳＭ１５９５４でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス株、受託番号ＤＳＭ１５９５３でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis）株及び受託番号ＤＳＭ１５９５５でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）株から成る群から選択される菌株などに属している。最も好ましいビフィドバクテリウム株は、受託番号ＤＳＭ１５９５４でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（登録商標）である。
【０１５７】
第二十四の態様において、本発明は、ビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用に関する。
【０１５８】
好ましい実施形態において、前記ビフィドバクテリウム株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ブレビス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス及びビフィドバクテリウム・インファンティスから成る群から選択される種、例えば受託番号ＤＳＭ１５９５４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）に寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（登録商標）株、寄託番号ＤＳＭ１５９５４でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス株、受託番号ＤＳＭ１５９５３でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種インファンティス株及び受託番号ＤＳＭ１５９５５でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム株から成る群から選択される菌株などに属している。最も好ましいビフィドバクテリウム株は、受託番号ＤＳＭ１５９５４でＤＳＭＺに寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（登録商標）である。
【０１５９】
第二十五の態様は、受託番号ＤＳＭ１５９５４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティス菌株ＢＢ−１２（登録商標）の増殖を改善するために、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株及び本発明によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用に関する。
【０１６０】
２−デオキシグルコース、そして、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中と比較した、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中の細菌の増殖パターンの測定が、グルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内に変異を有する細菌の選択に使用される。
【０１６１】
本発明の第二十六の態様において、変異ｇｌｃＫ遺伝子を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株をスクリーニングし、そして、単離する方法が提供される。その方法は、以下のステップ：
ａ）ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し、
ｂ）前記母株から誘導された変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性がある変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し、そして
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性がある変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、その変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中でＭ１７培地＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、
を含む。
【０１６２】
本明細書中の「２−デオキシグルコースに耐性」という用語は、特定の変異菌株が、２％のラクトース又は２％のガラクトースを含有する及び２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するＭ１７培地のプレート上に画線接種されたときに、４０℃で２０時間インキュベーション後にコロニーに増殖する能力を有するということによって規定される。培地中の２−デオキシグルコースの存在は、非変異菌株の増殖を妨げるであろうが、その一方で、変異菌株の増殖が影響を受けないか又は顕著な影響を受けることはない。耐性の評価においで感受性基準菌株として使用できる非変異菌株としては、菌株ＣＨＣＣ１４９９４及びＣＨＣＣ１１９７６が挙げられる。
【０１６３】
本明細書中の実施例１及び２は、２−デオキシグルコースに耐性があるストレプトコッカス・サーモフィルス変異株の分離を例示している。
好ましい実施形態において、前記方法は、ステップａ１）前記母株を変異誘発に晒すこと、例えば化学的及び／又は物理的変異原などに母株を晒すこと、をさらに含む。
【０１６４】
別の好ましい実施形態において、前記方法は、ステップｄ）ステップｃ）で選択されたストレプトコッカス・サーモフィルス株から誘導された２−デオキシグルコース耐性ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、そのストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のスクロース中で速いが、しかし、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中の母株の増殖速度と比較して、減速がゼロであるか、又は少なくとも０〜５０％であることを条件に、ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、をさらに含む。
【０１６５】
ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株は、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース上／中で増殖でき、そして、１％で一晩培養物から植菌し、３７℃で２４時間インキュベートしたとき、それらが、唯一の炭水化物として２％のガラクトースを含有するＭ１７培養液中でｐＨを５．５以下に下げる能力を有することによって本明細書中で規定される。当該ガラクトース陽性株は、従来技術に記載されており、そして、ＷＯ２０１１／０２６８６３（Chr. Hansen A/S）には、当該菌株を得る方法が説明されている。
【０１６６】
より好ましい実施形態において、母株は、受託番号ＤＳＭ２５８３８でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１４９９４、受託番号ＤＳＭ２２９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１１９７６、及びそれらから誘導された株から成る群から選択される。
【０１６７】
本明細書の文脈において、「それらから誘導された菌株」という用語は、例えば、遺伝子工学、放射線及び／又は化学的処理から成る手段によってガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株から誘導された菌株、又は誘導されることができる菌株と理解されるべきである。「それらから誘導された菌株」はまた、自然発生的な変異株でもあり得る。「それらから誘導された菌株」が機能上同等な変異株、例えば、それらの母株と実質的に同じであるか、又は改善された（例えば、ガラクトース発酵に関する）特性を有する変異株であることが好ましい。当該「それらから誘導された菌株」は、本発明の一部である。特に、「それらから誘導された菌株」という用語は、本発明の菌株を、例えばエタンメタンスルホナート（ＥＭＳ）又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学的変異誘発物質、ＵＶ光を用いた処理を含めたいずれかの慣習的に使用されている変異誘発処理、又は自然に起こっている変異株に晒すことによって得られた菌株を指す。変異株は、いくつかの変異誘発処理に供され得るが（１回の処理とは、１回の変異誘発ステップとそれに続くスクリーニング／選択ステップと理解されるべきである）、ここでは２０未満、１０未満、又は５未満の処理（又はスクリーニング／選択ステップ）が行われるのが好ましい。ここでの好ましい変異株では、母株と比較して、細菌ゲノムのヌクレオチドの１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満又は０．０００１％未満が別のヌクレオチドに置き換えられているか又は欠失している。
【０１６８】
第二十七の態様において、第二十六の態様による方法によって入手可能な変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株が、本明細書中に含まれる。
【０１６９】
本発明の第二十八の態様において、欠陥のあるグルコース代謝を有するラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株をスクリーニングし、そして、単離する方法を提供する。その方法は、以下のステップ：
ａ）ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株を提供し、
ｂ）前記母株から誘導された変異株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールを選択して、単離し、そして
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、そのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の増殖速度が、ＭＲＳ−ＩＭ培地の＋２％のラクトース中でＭＲＳ−ＩＭ培地の＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を選択して、単離すること、
を含む。
【０１７０】
２−デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の変異株の単離は、実施例中に詳細に記載されている。実施例５の２−デオキシグルコース耐性選択アッセイに基づいて、当業者は、この着目の特定の菌株が２−デオキシグルコースに対して本明細書中に関連する耐性を有するかどうか、着目の特定の菌株（例えば、関連する市販品からの菌株）について日常的に試験できる。
【０１７１】
実施例６の２−デオキシグルコース耐性変異株の増殖パターンに基づいて、当業者は、この着目の特定の菌株が選択される変異株の特性である関連増殖パターンを有するかどうか、着目の特定の菌株（例えば、関連する市販品からの菌株）について日常的に試験できる。
【０１７２】
好ましい実施形態において、前記方法は、ステップａ１）前記母株を変異誘発にさらすこと、例えば化学的及び／又は物理的変異原などに母株をさらすこと、をさらに含む。
【０１７３】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株は、ＭＲＳ−ＩＭ培地＋２％のラクトース上／中で増殖でき、そして、１％で一晩培養物から植菌し、３７℃で２４時間インキュベートしたとき、それらが、唯一の炭水化物として２％のラクトースを含有するＭＲＳ−ＩＭ培養液のｐＨを５．５以下に下げる能力を有することによって本明細書中に規定される。
【０１７４】
より好ましい実施形態において、母株は、受託番号ＤＳＭ２６４１９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ７５９、受託番号ＤＳＭ１９２５２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ１００１９、及びそれらから誘導された菌株から成る群から選択される。
【０１７５】
第二十九の態様において、第二十八の態様による方法によって入手可能なラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株が、本明細書中に含まれる。
【０１７６】
以下で本発明の実施形態が、制限されることのない実施例によって説明される。
【実施例】
【０１７７】
材料と方法
培地：
ストレプトコッカス・サーモフィルスに関して、使用する培地は、当業者に知られているＭ１７培地である。
【０１７８】
Ｍ１７アガロース培地は、１リットルのＨ2Ｏあたりの以下の組成を有する：
アガロース、１２．７５ｇ
アスコルビン酸、０．５ｇ
カゼインペプトン（トリプシン消化物）、２．５ｇ
β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、１９ｇ
硫酸マグネシウム水和物、０．２５ｇ
肉エキス、５ｇ
肉ペプトン（ペプシン消化物）、２．５ｇ
大豆ペプトン（パパイン消化物）、５ｇ
酵母抽出物、２．５ｇ
最終的なｐＨ７．１±０．２（２５℃）、
そして、Ｍ１７培養液は、１リットルのＨ2Ｏあたり以下の組成を有する：
アスコルビン酸、０．５ｇ
硫酸マグネシウム、０．２５ｇ
肉エキス、５ｇ
肉ペプトン（ペプシン消化物）、２．５ｇ
グリセロリン酸ナトリウム、１９ｇ
大豆ペプトン（パパイン消化物）、５ｇ
トリプトン、２．５ｇ
酵母抽出物、２．５ｇ
最終的なｐＨ７．０±０．２（２５℃）。
【０１７９】
添加された炭素源は、無菌のラクトース２０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ又はガラクトース２０ｇ／ｌである。
【０１８０】
当業者が知っているとおり、Ｍ１７培地は、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖に好適であるように考慮された培地である。さらに、当業者が理解しているように、本文脈において、Ｍ１７濃縮物は、様々な供給業者から供給される可能性があるので、特定の供給業者とは無関係に、当業者は、本明細書中の着目の関連細胞について、２−デオキシグルコース耐性に関して（標準的な測定不確実性の範囲内で）本明細書中に関連する同じ結果を得る。
【０１８１】
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスを培養するのに使用する培地は、ＭＲＳ−ＩＭ培地であった。ＭＲＳ−ＩＭは、アガロースプレート又は培養液の形態で使用した。
【０１８２】
ＭＲＳ−ＩＭアガロース培地は、１リットルのＨ2Ｏあたりの以下の組成を有する。
トリプトン                Oxoid L42          １０．０ｇ
酵母抽出物                Oxoid L21          ５．０ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０            Merck nr8.22187    １．０ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4                Merck nr105104      ２．６ｇ
酢酸Ｎａ                  Merck nr106267      ５．０ｇ
ＭｇＳＯ4、７Ｈ2Ｏ        Merck nr105882      ０．２ｇ
ＭｎＳＯ4、Ｈ2Ｏ          Merck nr105941      ０．０５ｇ
アガロース                SO-BI-GEL          １３．０ｇ
オートクレーブ後に、ｐＨを２５℃にて６．９±０．１に調整する。
【０１８３】
液体培養のために以下の実施例で使用するＭＲＳ−ＩＭ培養液は、１リットルのＨ2Ｏあたり以下の組成を有する：
トリプトン                Oxoid L42          １０．０ｇ
酵母抽出物                Oxoid L21          ５．０ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０            Merck nr8.22187    １．０ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4                Merck nr105104      ２．６ｇ
酢酸Ｎａ                  Merck nr106267      ５．０ｇ
クエン酸二アンモニウム    Merck nr101154      ２．０ｇ
ＭｇＳＯ4、７Ｈ2Ｏ        Merck nr105882      ０．２ｇ
ＭｎＳＯ4、Ｈ2Ｏ          Merck nr105941      ０．０５ｇ
【０１８４】
オートクレーブ後に、ｐＨを２５℃にて６．９±０．１に調整する。炭素源であるラクトース２０ｇ／ｌ又はグルコース２０ｇ／ｌを、最初に濾過滅菌した後に、オートクレーブ処理した培養液に添加した。
【０１８５】
上記ＭＲＳ−ＩＭ培地は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの増殖を支える培地の能力に影響を及ぼすことなく、ある程度変更できる。さらに、当業者には明らかなように、ＭＲＳ−ＩＭ濃縮物又は先に記載した種々の成分は、様々な供給業者から入手でき、そして、ＭＲＳ−ＩＭ培地の調製に使用され得る。これらの培地は、以下の実施例、特に２−デオキシグルコース耐性の選択アッセイに同様に使用する。
【０１８６】
母株
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６（ＧａｌＫ遺伝子に変異を有し、且つ、ＷＯ２０１１／０２６８６３に記載のようにエキソ多糖類を産生するガラクトース発酵株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１４９９４（ガラクトース発酵株）。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ７５９。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１００１９。
【０１８７】
２−デオキシグルコース耐性株
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５７５７（ＣＨＣＣ１４９９４の２−デオキシグルコース耐性変異株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５８８７（ＣＨＣＣ１１９７６の２−デオキシグルコース耐性変異株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６４０４（ＣＨＣＣ１５７５７の高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株）。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１５９（ＣＨＣＣ７５９の２−デオキシグルコース耐性変異株）。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１６０（ＣＨＣＣ１００１９の２−デオキシグルコース耐性変異株）。
【０１８８】
実施例１：高グルコース分泌を有するストレプトコッカス・サーモフィルスのグルコースキナーゼ変異株の単離のための２−デオキシグルコースの使用
ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１１９７６及びストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１４９９４の変異株に単離するために、単一コロニーの増殖によって得られた細胞を、２％のラクトースを含有する１０ｍｌのＭ１７培養液に植菌し、４０℃で一晩培養した。
【０１８９】
翌日、前記菌株を、２％のガラクトースと、２０ｍＭ（ＣＨＣＣ１４９９４）又は３０ｍＭ（ＣＨＣＣ１１９７６）のいずれかの濃度の２−デオキシグルコースを含むＭ１７アガロースプレート上に段階希釈で平板培養し、そして、４０℃で２０時間インキュベートした。耐性コロニーを、それらを選択するので、まず同じタイプのアガロースプレート上に再度画線接種した。生存菌株を、２％のラクトース、２％のガラクトース又は２％のグルコースのいずれかを含む新しいＭ１７培養液の植菌に使用し、そして、増殖を計測した。
【０１９０】
実施例２に概説しているように、こうして、ガラクトースに比べて、グルコース上でより速く増殖できる多数の変異株を同定した。当該２つの変異株は、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７であり、それはそれぞれ、ＣＨＣＣ１４９９４及びＣＨＣＣ１１９７６に由来する。
【０１９１】
実施例２：２−デオキシグルコース耐性変異株の増殖パターン
ガラクトース上で増殖できる２−デオキシグルコース耐性変異株の選択を確実にするために、ガラクトース発酵菌株コレクションから選択した２つの菌株を使用した。これらのガラクトース発酵菌株は、それでも、Ｍ１７培養液＋２％のガラクトース中に比べて、Ｍ１７培養液＋２％のグルコース中で、対数期には少なくとも１０％速く増殖したのに対して、その一方、ＣＨＣＣ１１９７６及びＣＨＣＣ１４９９４の２−デオキシグルコース耐性変異株誘導体、例えばＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７などは、Ｍ１７培養液＋２％のグルコースに比べて、Ｍ１．７培養液＋２％のガラクトース中で、対数期にはさらに速く増殖することを特徴とした。対数期における増殖は、本明細書中では、指数増殖期培養物に関する４０℃での経時的な６００ナノメートル（ＯＤ600）の吸光度の上昇として計測した。当業者が知っているように、培養物が指数増殖の状態にあるとき、それは種ごとに異なっていてもよい。当業者は、対数期の増殖、例えばＯＤ600 ０．１〜１．０の間、をどのように測定するか分かる。培養物の吸光度（ＯＤ）は、分光光度計で計測した。
【０１９２】
結論：
この実施例２の２−デオキシグルコース耐性変異株の増殖パターンに基づいて、−着目の特定の菌株（例えば、関連する市販品からの菌株）に関して−、当業者は、この着目の特定の菌株が、選択した変異株の特性である本明細書中に関連する増殖パターンを有するかどうか、日常的に試験できる。
【０１９３】
実施例３：グルコースキナーゼをコードする遺伝子の変異解析アッセイ
グルコースキナーゼをコードする遺伝子の変異解析アッセイを行うために、実施例１で同定した変異株から全ＤＮＡを分離した。グルコースキナーゼ遺伝子の配列決定では、ＣＨＣＣ１５７５７の遺伝子がトレオニンコドンの代わりにイソロイシンを生じるコドン１４１における非保存変異を含んでいることが明らかになった。変異株ＣＨＣＣ１５８８７からの遺伝子の配列決定では、セリンからプロリンへの非保存アミノ酸変化をもたらすコドン７２における変異が明らかになった（図２）。
【０１９４】
実施例１及び２で指定された条件に準拠し、そして、実施例１に記載のとおり単離した２−デオキシグルコース耐性株は、グルコースキナーゼ（ｇｌｃＫ）をコードする遺伝子内に変異を有することを特徴としている。その変異は、コードする酵素のアミノ酸変化をもたらすか、又はコードする酵素を短縮する終止コドンの発生をもたらす。
【０１９５】
ｇｌｃＫ遺伝子内の変異を明らかにするために、着目の特定の菌株を、２％のラクトースを添加した液体培養液（Ｍ１７）中、４０℃で一晩培養した。染色体ＤＮＡの分離後に、そのＤＮＡを、グルコースキナーゼをコードする遺伝子のすぐ上流とすぐ下流の保存領域に相補的な２つのプライマーを使用したＰＣＲ分析にかけた。プライマーの配列は、以下のとおりである：
ＧＫ１Ｆ：５’ CTT GGG TAA AAG GCT CTA TG ３’（配列番号３）
ＧＫ１Ｒ：５’ CGT TTT TCA ACA AAA AAG TGC TACC ３’（配列番号４）
【０１９６】
ＰＣＲ反応の条件は、ＰＣＲ増幅キット（ROCHE）の製造業者によって指定されたとおりであった、例えば：
２μｌの染色体ＤＮＡ
１μｌのプライマーＧＫ１Ｆ
１μｌのプライマーＧＫ１Ｒ
２５μｌのマスターミックス
２１μｌのＨ2Ｏ
【０１９７】
ＰＣＲプログラム：（９４℃−１．５分、５０℃−１分、７２℃−１．５分）×３０
ＰＣＲ増幅では、１１６８ｂｐの断片が生じた。Biorad製のＰＣＲ精製キットを使用した精製後に、そのＰＣＲ断片を、増幅のために使用したのと同じ２つのプライマーを使用したMacrogenでのＤＮＡ配列決定のために提出した。配列決定法後に、ＤＮＡ配列を母株のものと比較した。
【０１９８】
実施例４：発酵乳の炭水化物分析
別の実験において、関連糖の糖濃度は、それぞれＣＨＣＣ１４９９４、ＣＨＣＣ１１９７６、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７で発酵させた乳で測定した。９．５％のＢ−乳に、２％のガラクトースを添加したＭ１７培養液中で一晩培養した１％（１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ）の培養物を植菌した。酸性化を、ＩＮＴＡＢ ＰＣロガー及びＥａｓｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて観察した。４０℃で３０時間の酸性化後に、乳サンプルを、ＨＰＬＣ分析のために採取して、関連糖と酸の含有量を得た。酸性化カーブは、変異株がわずかに遅れて酸性化を開始したが、同等の最終ｐＨで終わったことを示していた。そのＨＰＬＣデータを、表１に示す。
【０１９９】
表１から、２つのｇｌｃＫ変異株、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７が、ラクトースの少なくとも７１％を消費するのに対して、母株はラクトースの約２８％しか消費しないことが明らかである。最も多くラクトースを発酵させる変異株、ＣＨＣＣ１５８８７に関しては、わずか１１．９ｍｇ／ｍｌしか発酵乳中に残っておらず、ラクトース不耐症の人々にとっても、この製品の役割を示している。非常に意義深いことには、２つのｇｌｃＫ変異株が８．３〜１１．３ｍｇ／ｍｌのグルコースを分泌しているのに対して、母株のグルコース分泌は検出レベルを下回っている。同時に、両変異株はまた、母株より多くのガラクトースを分泌する：３４〜５２％。
【０２００】
スクロースを基準の１００とすると、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４．３であることを考慮すると、最終的な発酵製品の相対的な甘味の計算は、最良の変異株であるＣＨＣＣ１５７５７を用いて発酵させたとき、対応する母株ＣＨＣＣ１４９９４に比べて、甘みが２．０倍強いことを示している。
【０２０１】
【表１】
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【０２０２】
２つのｇｌｃＫ変異株、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１５８８７が高レベルのグルコースを分泌する場合、ｇｌｃＫ遺伝子の変異は、コードするグルコキナーゼタンパク質を不活化することが企図される。
【０２０３】
実施例５：２−デオキシグルコース耐性ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の選択
２−デオキシグルコース耐性変異株の選択
着目の２つのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、ＣＨＣＣ７５９及びＣＨＣＣ１００１９を、互いに独立に、２％のラクトースを含有する１０ｍｌのＭＲＳ−ＩＭ培養液中に植菌し、そして、４０℃で一晩嫌気的にインキュベートした。次のステップでは、約３×１０8細胞を含んでいるこれらの培養物のサンプルを、２％のラクトースを含み、さらに２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含むＭＲＳ−ＩＭアガロースプレート上で平板培養した。前記プレート上に生じたコロニーを、２％のラクトースを含み、さらに２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含むＭＲＳ−ＩＭアガロースプレート上に単一コロニーを画線接種することによって精製し、そして、以下で記載するようにさらに特徴づけした。
【０２０４】
２−デオキシグルコース耐性のアッセイ：
以下の方法は、着目の菌株が２−デオキシグルコースに耐性があるか否か判断するのに好適である。着目の菌株を、上記の２％のラクトースを含有する１０ｍｌのＭＲＳ−ＩＭ培養液中に植菌し、そして、４０℃で一晩嫌気的にインキュベートした。次のステップでは、約１０4〜１０5細胞を含んでいるこれらの培養物の希釈サンプルを、２％のラクトースを含み、さらに耐性変異株の選択のために使用した同じ２−デオキシグルコース濃度（典型的には２０ｍＭであるが、他の濃度も使用されるであろう）を含有するＭＲＳ−ＩＭアガロースプレート上に平板培養する。前記アガロースプレートを、４０℃で２０時間、嫌気条件下でインキュベートし、そして、調べた。２−デオキシグルコースに耐性がないラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は、あったとしてもごくわずかなコロニーしか生じないのに対して、２−デオキシグルコースに耐性がある菌株は、多数のコロニーを生じる。適当な対照としては、２０ｍＭの濃度にて２−デオキシグルコースに対して感受性であるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、ＣＨＣＣ７５９及びＣＨＣＣ１００１９、並びに２０ｍＭの２−デオキシグルコースに耐性があるＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０が挙げられる。
【０２０５】
結果：２−デオキシグルコース存在下の選択条件下で増殖できたいくつかのクローンを、このアプローチによって単離した。２−デオキシグルコースを含んでいるプレート上で迅速な増殖を示した変異株を、ＣＨＣＣ１６１５９（母株ＣＨＣＣ７５９から誘導された）及びＣＨＣＣ１６１６０（母株ＣＨＣＣ１００１９から誘導された）と指定した。これらの変異株を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨに寄託した。
【０２０６】
実施例６：ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの２−デオキシグルコース耐性変異株の増殖パターン
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの２−デオキシグルコース耐性変異株がグルコース上で増殖する能力を失ったか又は炭素源としてのグルコースで増殖する能力に欠陥があるのを確認するために、変異株の増殖パターンを、２％のグルコースを含有するＭＲＳ−ＩＭ培養液中で母株であるＣＨＣＣ７５９及びＣＨＣＣ１００１９と、変異株であるＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０の両方を培養することによって母株の増殖パターンと比較した。
【０２０７】
２つの母株、ＣＨＣＣ７５９及びＣＨＣＣ１００１９が１０時間未満の倍加時間で２％のグルコースを添加したＭＲＳ−ＩＭ培養液中で指数関数的に増殖したのに対して、２つの２−デオキシグルコース耐性変異株、ＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０は、この培地中で増殖しなかったか、又は非常にゆっくりにしか増殖しなかった。対数期における増殖を、４０℃にて指数増殖期培養物の６００ナノメートル（ＯＤ600）の吸光度を分光光度計で計測することによって観察した。対数期の増殖は、ＯＤ600 ０．１〜１．０で達した。
【０２０８】
実施例７：ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの菌株を用いて発酵させた乳の炭水化物分析
別の実験において、様々な糖の糖濃度を、それぞれラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株ＣＨＣＣ７５９、ＣＨＣＣ１００１９、ＣＨＣＣ１６１５９、及びＣＨＣＣ１６１６０で発酵させた乳で測定した。９．５％のＢ−乳に、２％のラクトースを含有するＭＲＳ−ＩＭ培養液中で嫌気的に一晩培養した１％（１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ）の液体培養物を植菌した。酸性化を、ＩＮＴＡＢ ＰＣロガー及びＥａｓｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて観察した。４０℃で３０時間の酸性化後に、ＨＰＬＣ分析のために乳サンプルを採取して、様々な糖及び有機酸の量を計測した。酸性化カーブは、変異株が酸性化をいくらか遅れて開始し、そして、わずかに高い最終ｐＨで終わったことを示した。ＨＰＬＣデータを、表２に示した。
【０２０９】
表２から分かるように、２つの２−デオキシグルコース耐性変異株、ＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０は、ラクトースの少なくとも約９４％を消費したが、それに対して、母株はラクトースの少なくとも約３７％しか消費しなかった。最も高い乳酸の産生を示した変異株であるＣＨＣＣ１６１６０に関して、わずか２．９ｍｇ／ｍｌのラクトースしか発酵乳中に残らなかった。こうした低レベルのラクトースしか含まない発酵乳製品は、ラクトース不耐症の人々による消費に好適であり得る。
【０２１０】
意義深いことには、２つの変異株、ＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０は、１５．２〜１５．８ｍｇ／ｍｌのグルコースを分泌したのに対して、母株のグルコース分泌は、それぞれＣＨＣＣ１００１９では検出レベルを下回り、そして、ＣＨＣＣ７５９では４．２ｍｇ／ｍｌであった。同時に、両変異株はまた、母株より多くのガラクトースを分泌した。スクロースの甘味の基準値を１００とすると、そして、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４である場合、最終的な発酵製品の相対的な甘味の計算は、変異株ＣＨＣＣ１６１６０が対応する母株ＣＨＣＣ１００１９に比べて２．５倍甘い発酵乳製品を生じることを示している。
【０２１１】
【表２】
2019107002.tif 000003
【０２１２】
実施例８：ストレプトコッカス・サーモフィルスの高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株の選択
ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７の高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株を単離するために、単一コロニーの増殖物由来の細胞を、２％のガラクトースを含有する１０ｍｌのＭ１７培養液中に植菌し、４０℃で一晩培養した。
【０２１３】
翌日、前記菌株を、２％のガラクトースと、３０ｍＭの濃度の２−デオキシグルコースを含むＭ１７アガロースプレート上に段階希釈で平板培養し、そして、４０℃で２０時間インキュベートした。耐性コロニーを、それらを選択するので、まず同じタイプのアガロースプレート上に再度画線接種した。生存菌株を、２％のラクトース、２％のガラクトース、２％のスクロース又は２％のグルコースのいずれかを含む新しいＭ１７培養液の植菌に使用した。
【０２１４】
これから、我々は、Ｂ−乳中では増殖できないが、４０℃で２％のスクロースを添加したＭ１７中で増殖できるＣＨＣＣ１５７５７から誘導された変異株ＣＨＣＣ１６４０４を単離できた。さらに、ＣＨＣＣ１６４０４は、２％のグルコースを添加したＭ１７中で増殖できなかった。
【０２１５】
対数期における増殖は、本明細書中では、指数増殖期培養物に関する４０℃での経時的な６００ナノメートル（ＯＤ600）の吸光度の上昇として計測した。
【０２１６】
実施例９：高ラクトース発酵及びグルコース分泌ストレプトコッカス・サーモフィルス変異株ＣＨＣＣ１６４０４の増殖パターン
変異株ＣＨＣＣ１６４０４の維持及び適切な増殖を確認するために、前記菌株を、４０℃で２％のスクロースを添加したＭ１７中で培養した。我々が驚いたことに、我々は、変異株ＣＨＣＣ１６４０４が、その菌株が２％のスクロースを添加したＭ１７培養液中で一晩培養した１％（１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ）の培養物を植菌したときか、又は乳にスクロースが添加されたときのみ、９．５％のＢ−乳を酸性化することができることを観察した。我々は、わずか０．０１％のスクロースの乳への添加が、ＣＨＣＣ１６４０４が９．５％のＢ−乳を酸性化するのを可能にしたことを観察した。さらに、ＣＨＣＣ１６４０４は、同じ条件下でグルコースを添加したＭ１７中で増殖できる母株ＣＨＣＣ１５７５７とは対照的に、４０℃で２％のグルコースを添加したＭ１７中で増殖できなかった。これらの結果を総合すると、ＣＨＣＣ１６４０４を生じたＣＨＣＣ１５７５７の２−デオキシグルコース処理は、培地から分泌したグルコースの取り込みを不可能にしているグルコース取り込み系を不活化する変異を選択した。
【０２１７】
実施例１０：高ラクトース発酵及びグルコース分泌ストレプトコッカス・サーモフィルス変異株ＣＨＣＣ１６４０４で発酵させた乳の炭水化物分析
別の実験において、関連糖の糖濃度を、ＣＨＣＣ１６４０４で発酵させた乳で測定した。それぞれ０．０１％、０．０２％、０．０３％及び０．０５％のスクロースを添加した９．５％をＢ−乳の入ったボトルに、２％のスクロースを添加したＭ１７培養液中で一晩培養した１％（１０6〜１０7ＣＦＵ／ｍｌ）の培養物を植菌した。酸性化を、ＩＮＴＡＢ ＰＣロガー及びＥａｓｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて観察した。４０℃で３０時間の酸性化後に、ＨＰＬＣ分析のための乳サンプルを採取して、関連糖及び酸の含有量を得た。
【０２１８】
表３から、驚いたことに高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株ＣＨＣＣ１６４０４が、この実験で試験したすべての濃度の添加スクロースにおいて、ラクトースのすべてを消費したことは明らかであった。我々はまた、より高いスクロース濃度（例えば、＞０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加したとき、ラクトース発酵が、最終的なｐＨに達する前に終了しないことも観察した。さらに、表３はまた、すべてのラクトースがグルコースとガラクトースに変換されること、そして、添加されたスクロースのすべての濃度において、ガラクトースの一部だけが発酵に使用されることも示された。興味深いことに、分泌されたグルコースは、再び取り込まれることはなく、その結果、乳中には２３．９ｍｇ／ｍｌ超のグルコースが残った。約２５％のガラクトースが発酵したので、発酵後には１６ｍｇ／ｍｌ超のガラクトースが乳中に残った。これらのデータは、母株ＣＨＣＣ１５７５７から引き継いだｇｌｃＫ変異に加えて、ＣＨＣＣ１６４０４が、分泌したグルコースの培地からの取り込みを不可能にするグルコース取り込み系を不活化する変異もたんじしていることを示している。表３のデータと表１のデータとの比較、並びに、スクロースを基準の１００とすると、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４．３であることを考慮すると、最終的な発酵製品の相対的な甘味の計算は、ＣＨＣＣ１６４０４で発酵させたとき、菌株ＣＨＣＣ１４９９４を用いたときに比べて、約３．５倍強い甘味を生じた。
【０２１９】
【表３】
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【０２２０】
実施例１１：ストレプトコッカス・サーモフィルス株とラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスから成る菌株の組み合わせで発酵させた乳の炭水化物分析
この実験では、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株（ＣＨＣＣ７５９、ＣＨＣＣ１００１９、ＣＨＣＣ１６１５９及びＣＨＣＣ１６１６０から選択）と、ＣＨＣＣ１４９９４、ＣＨＣＣ１５７５７又はＣＨＣＣ１６４０４のいずれかであるストレプトコッカス・サーモフィルス株との組み合わせで発酵させた乳中の糖と有機酸の濃度を測定した。
【０２２１】
ヨーグルトの製造には、通常、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株とストレプトコッカス・サーモフィルス株の両方を含む混合スターター培養物の使用を伴う。典型的に、ヨーグルトの製造に使用する乳基質には、１倍量のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスと９倍量のストレプトコッカス・サーモフィルスを植菌する。ヨーグルト製造の標準的な手順におけるグルコース分泌能力を分析するために、９．５％のＢ−乳に、２％のラクトースを含むＭＲＳ−ＩＭ培養液中で嫌気的に一晩培養した０．１％のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス培養物、及び２％のガラクトース（ＣＨＣＣ１５７５７）若しくは２％のスクロース（ＣＨＣＣ１６４０４）を含むＭ１７培養液中で一晩培養した０．９％のストレプトコッカス・サーモフィルス培養物を植菌した。酸性化を、ＩＮＴＡＢ ＰＣロガー及びＥａｓｙｖｉｅｗソフトウェアを用いて観察した。３０時間の酸性化後に、ＨＰＬＣ分析のための乳サンプルを採取して、様々な糖及び酸の量を計測した。ＨＰＬＣデータを、表４に示した。
【０２２２】
ストレプトコッカス・サーモフィルスの２−デオキシグルコース耐性変異株であるＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１６４０４の使用が、それがラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株又は２−デオキシグルコース耐性変異株と組み合わせられるかどうかに関係なく、乳中へのグルコースの分泌をもたらすことは、表４から分かる。しかしながら、グルコース濃度は、両種の２−デオキシグルコース耐性変異株の組み合わせ、例えばＣＨＣＣ１５７５７とＣＨＣＣ１６１５９の組み合わせ、又はＣＨＣＣ１５７５７とＣＨＣＣ１６１５０の組み合わせ、が使用されたときにより高くなる。これらの混合培養物を使用したとき、ラクトースの少なくとも８２％が消費されるのがわかり、そして、１１．８ｍｇ／ｍｌ〜１４．１ｍｇ／ｍｌのグルコースが分泌されることがわかった。同様の結果は、ストレプトコッカス・サーモフィルス株がｇｌｃＫ遺伝子内に変異を有する２−デオキシグルコース耐性変異株でもあるＣＨＣＣ１５８８７であるときにも得られる。
【０２２３】
同時に、スターター培養物中の２−デオキシグルコース耐性変異株の存在もまた、より多くのガラクトース分泌をもたらす。変異株、例えばＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１６１５９の組み合わせが使用されるとき、ガラクトース分泌は、対応する母株ＣＨＣＣ１４９９４及びＣＨＣＣ１００１９を含むスターター培養物と比較して、約３倍多い（１７．１ｍｇ／ｍｌ）。
【０２２４】
グルコース分泌は、高ラクトース発酵及びグルコース分泌ストレプトコッカス・サーモフィルス変異株ＣＨＣＣ１６４０４と、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの２−デオキシグルコース耐性変異株との組み合わせ、例えばＣＨＣＣ１６４０４とＣＨＣＣ１６１５９の組み合わせ、又はＣＨＣＣ１６４Ｃ４とＣＨＣＣ１６１６０の組み合わせが使用されたときに、よりいっそう効果的である。
【０２２５】
スクロースの甘味を１００（基準値）とすると、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４であることを考慮すると、表４の最後の列に示した最終的な発酵製品の相対的な甘味の計算は、様々な菌株の組み合わせで最終的な発酵製品の残留ラクトース、グルコース及びガラクトースの終濃度を明確にできることを示唆している。高濃度の分泌グルコース及びガラクトースによる最高の内的な甘味があり、且つ、残留ラクトースが存在しないヨーグルトが所望される場合には、最も効果的な菌株の組み合わせは、ＣＨＣＣ１６４０４とＣＨＣＣ１６１６０である。この組み合わせは、対応するストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの２ＤＧ感受性株、ＣＨＣＣ１４９９４及びＣＨＣＣ１００１９の組み合わせに比べて３．６倍甘く、且つ、発酵性乳中に検出可能なラクトースが残っていないヨーグルトを提供する。
【０２２６】
【表４】
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【０２２７】
実施例１２：ストレプトコッカス・サーモフィルス及びラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスのグルコース分泌変異株の使用によるビフィズス菌（Bifidobacteria）の増殖の改善
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（登録商標）（Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmarkから市販されている）のような最も認知されているプロバイオティック細菌のうちのいくつかは、乳のようなラクトースベースの媒質中に単独で存在しているとき、うまく増殖しない。そのため、この実験において、我々は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＢＢ−１２（登録商標）を、ストレプトコッカス・サーモフィルス又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスのグルコース分泌株と組み合わせることの効果を調査した。
【０２２８】
実験１：
ＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））を、ＭＲＳ＋０．０５％のシステイン塩酸塩中、４０℃で、嫌気条件下にて一晩培養した。
ＣＨＣＣ１４９９４を、２％のガラクトースを含んだＭ１７中、４０℃で一晩培養した。
ＣＨＣＣ１５７５７を、２％のガラクトースを含んだＭ１７中、４０℃で一晩培養した。
【０２２９】
実験２：
ＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））を、ＭＲＳ＋０．０５％のシステイン塩酸塩中、４０℃で、嫌気条件下にて一晩培養した。
ＣＨＣＣ１００１９を、２％のラクトースを含んだＭＲＳ中、４０℃で一晩、嫌気的に培養した。
ＣＨＣＣ１６１５９を、２％のラクトースを含んだＭＲＳ中、４０℃で一晩、嫌気的に培養した。
【０２３０】
２００ｍｌのＢ−乳が入った６本のボトルに、類似した吸光度を有する、合計で１％の増殖した培養物を４０℃で一晩植菌した：
１．  １％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））
２．  ０．５％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））＋０．５％のＣＨＣＣ１４９９４
３．  ０．５％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））＋０．５％のＣＨＣＣ１５７５７
４．  １％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））
５．  ０．５％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））＋０．５％のＣＨＣＣ１００１９
６．  ０．５％のＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））＋０．５％のＣＨＣＣ１６１５９
【０２３１】
ボトル２〜３及び５〜６のみ、乳中のＢＢ−１２の能力不足により酸性化した。発酵後、それぞれの培養物１００μｌを、ＢＢ−１２（登録商標）の増殖を選択するアガロースプレート、具体的には、すなわち、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが添加されたＭＲＳ＋０．０５％のシステイン塩酸塩＋テトラサイクリン上に、様々な希釈率（１０-5、１０-6、１０-7、１０-8）で平板培養し、そして、４０℃で一晩インキュベートした。続いて、コロニー数をカウントすることによって測定し、そして、その結果の平均を、ＣＦＵ／ｍｌ（１ｍｌあたりのコロニー形成単位）として表５に示す。
【０２３２】
【表５】
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【０２３３】
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５７５７とラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１５９のグルコース分泌変異株が、ＢＢ−１２（登録商標）と一緒に存在しているときのみ、ＢＢ−１２（登録商標）の増殖が促進され、そして、ＣＦＵ／ｍｌとして示される総細胞数は、これらの培養物中で約１０×（１ｌｏｇ）多い。この結果は、グルコース分泌株が、培養物中に一緒に混合されたとき、ＢＢ−１２（登録商標）のようなプロバイオティック株の含有量を高めるのに使用できることを示唆している。
【０２３４】
実施例１３：ＣＨＣＣ１５７５７とＣＨＣＣ１６４０４のゲノム比較、並びにグルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）のＩＩＣManタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子内の変異の同定
【０２３５】
ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１６４０４のゲノムＤＮＡ調製物を、Beijing Genomics Institute（BGI, Beijing, China）で配列決定し、ＣＬＣゲノミックワークベンチソフトウェア（CLCBio, Arhus, Denmark）を使用して組み立て、そして、仕上げた。ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１６４０４のゲノム配列を、Ｍａｕｖｅ ２．３．１ソフトウェアを使用して、基準のＣＨＲＺ１０６６のラベル付ゲノム配列を使用して整列させた。整列後に、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）分析を、ＣＨＣＣ１５７５７及びＣＨＣＣ１６４０４の両方に対して、フリーＭａｕｖｅ ２．３．１ソフトウェアを使用して実施した。これは、グルコース／マンノースＰＴＳのＩＩＣManタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子の２０９位アミノ酸のＧＡＡコドン（グルタミン酸）内のＧからＴへの変異の同定を可能にした。この変化は、タンパク質の２０９位にＴＡＡ終止コドンを導入し（図３）、そして、短縮型の産生をもたらし、そのため無機能型ＩＩＣManタンパク質の産生をもたらす。そのため、この変異がグルコース／マンノースＰＴＳを介した細胞内へのグルコースの輸送の妨害をもたらすことが企図される。
【０２３６】
寄託及びエクスパート・ソリューション (Expert Solution)
出願人は、以下に記載した寄託された微生物のサンプルが、本特許を取得する日まで、専門家にのみ入手可能にすべきであることを要求する。
【０２３７】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５７５７は、２０１２年４月３日に、受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２３８】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５８８７は、２０１２年４月３日に、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２３９】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６４０４は、２０１２年１２月１２日に、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４０】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１４９９４は、２０１２年４月３日に、受託番号ＤＳＭ２５８３８でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４１】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６は、２００９年９月８日に、受託番号ＤＳＭ２２９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４２】
菌株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ７５９は、２０１２年９月６日に、受託番号ＤＳＭ２６４１９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４３】
菌株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１００１９は、２００７年４月３日に、受託番号ＤＳＭ１９２５２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４４】
菌株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１５９は、２０１２年９月６日に、受入番号ＤＳＭ２６４２０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
【０２４５】
菌株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスＣＨＣＣ１６１６０は、２０１２年９月６日に、受託番号ＤＳＭ２６４２１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスＣＨＣＣ５４４５（ＢＢ−１２（登録商標））は、２００３年９月３０日に、受託番号ＤＳＭ１５９５４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でおこなわれた。
【０２４６】
【化１】
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【図１】
2019107002.tif 000008
【図２】
2019107002.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列内に変異を有するガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株であって、
前記変異により、グルコキナーゼタンパク質が部分的又は完全に不活化して、前記株が２−デオキシグルコースに耐性となることにより、２％（ｗ／ｖ）ラクトース又は２％（ｗ／ｖ）ガラクトース、及び２−デオキシグルコース２０ｍＭを含有するＭ１７培地のプレート上に画線して４０℃で２０時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる、前記株。
【請求項２】
受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５７５７株、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１５８８７株、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenで寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６４０４株から成る群から選択されるストレプトコッカス・サーモフィルス株。
【請求項３】
１０4〜１０12ＣＦＵ／ｇの、請求項１又は２のいずれかに記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物。
【請求項４】
１０4〜１０12ＣＦＵ／ｇの１種以上のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス変異株を更に含み、前記株が、２−デオキシグルコースに耐性を有することにより、２％（ｗ／ｖ）ラクトース及び２−デオキシグルコース２０ｍＭを含有するＭＲＳ−ＩＭ培地のプレート上に画線して４０℃で２０時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
乳基質に、請求項１又は２のいずれかに記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を少なくとも１つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項６】
乳基質に、請求項３又は４のいずれかに記載の組成物を少なくとも１つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項７】
請求項１又は２のいずれかに記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の少なくとも１つを含む発酵乳製品。
【請求項８】
請求項３又は４のいずれかに記載の組成物を含む発酵乳製品。
【請求項９】
発酵乳製品の製造のための、請求項３又は４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１０】
発酵乳製品の甘味を強くするための、請求項３又は４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１１】
発酵乳製品中にラクトース含有量を低減するための、請求項３又は４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ラクトース不耐症の症状を避ける際に使用するための、請求項７又は８のいずれかに記載の発酵乳製品。
【請求項１３】
ラクトースを含有する乳中でのビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項１又は２のいずれかに記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用。
【請求項１４】
乳中でのビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項３又は４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１５】
変異ｇｌｃＫ遺伝子を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株のスクリーニング及び単離の方法であって、以下のステップ：
ａ）ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し；
ｂ）前記母株から誘導された変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性があることにより、２％（ｗ／ｖ）ラクトース又は２％（ｗ／ｖ）ガラクトース、及び２−デオキシグルコース２０ｍＭを含有するＭ１７培地のプレート上に画線して４０℃で２０時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる、変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し；
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性がある変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、その変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中でＭ１７培地＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、
を含む前記方法。
【外国語明細書】
2019107002000001.pdf