(57)【要約】【課題】分光蛍光光度計で取得される三次元蛍光スペクトルにおける未知の蛍光ピークを同定するための情報として質量情報を推定することができる試料分析システム、表示方法及び試料分析方法を提供する。【解決手段】試料分析システム１００は、分光蛍光光度計１と、液体クロマトグラフ装置６０と、質量分析装置７０と、制御装置１１０と、試料導入ユニット１２０とを備える。分光蛍光光度計１で、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得し、液体クロマトグラフ装置６０で、溶離時間と、吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得し、質量分析装置７０で、溶離時間と、質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得する。各スペクトルの軸を同じ尺度に揃え、質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータにおける質量電荷比(ｍ／ｚ)を確定する。【選択図】図６
2019095206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象である試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルおよび特定の波長の励起光を照射して放出された蛍光の蛍光波長に対する蛍光強度を示す蛍光スペクトルを取得する分光蛍光光度計と、
前記試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離するとともに、当該物質毎の吸収波長を取得する液体クロマトグラフ装置と、
前記溶離時間に従って分離された物質毎の質量情報を取得する質量分析装置と、
前記分光蛍光光度計と、前記液体クロマトグラフ装置と、前記質量分析装置とを制御する制御部と、
測定結果を表示する表示部と、を備え、
前記制御部は、
前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークと、当該蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークに基づき、少なくとも前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を前記表示部に表示する、
試料分析システム。
【請求項２】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記分光蛍光光度計は、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得する、試料分析システム。
【請求項３】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記液体クロマトグラフ装置は、前記溶離時間と、前記吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得する、
試料分析システム。
【請求項４】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記液体クロマトグラフ装置は、前記試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離する分離カラムと、当該分離カラムによって分離された物質毎の吸収波長を測定するダイオードアレイ検出器とを有する、
試料分析システム。
【請求項５】
請求項４に記載の試料分析システムであって、
前記分離カラムによって分離された物質を、前記ダイオードアレイ検出器および前記質量分析装置の双方に導入する、
試料分析システム。
【請求項６】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記質量分析装置は、前記溶離時間と、前記質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得する、
試料分析システム。
【請求項７】
請求項６に記載の試料分析システムであって、
前記質量情報が質量電荷比である、試料分析システム。
【請求項８】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記質量分析装置は、単一または複数の質量検出部から構成される、
試料分析システム。
【請求項９】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記試料を当該試料分析システムに導入する試料導入ユニットを更に備え、
前記試料導入ユニットが、前記分光蛍光光度計へ試料を導入し、
前記分光蛍光光度計が、励起スペクトルを取得した後に、前記液体クロマトグラフ装置に試料を導入する、
試料分析システム。
【請求項１０】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記試料を当該試料分析システムに導入する試料導入ユニットを更に備え、
前記試料導入ユニットが、前記分光蛍光光度計及び前記液体クロマトグラフ装置の双方に試料を導入する、
試料分析システム。
【請求項１１】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記制御部は、
前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークを検出し、
前記蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークを特定し、
前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を特定する、
試料分析システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の試料分析システムであって、
前記分光蛍光光度計は、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得し、
前記液体クロマトグラフ装置は、前記溶離時間と、前記吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得し、
前記質量分析装置は、前記溶離時間と、前記質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得し、
前記制御部は、
前記三次元蛍光スペクトルの励起波長の軸と、前記三次元吸収スペクトルの吸収波長の軸を同じ尺度に揃え、
前記三次元吸収スペクトルの溶離時間の軸と、前記三次元質量スペクトルの溶離時間の軸を同じ尺度に揃え、
前記表示部が、前記三次元蛍光スペクトルと、前記三次元吸収スペクトルと、前記三次元質量スペクトルとを並べて表示する、
試料分析システム。
【請求項１３】
分光蛍光光度計と、液体クロマトグラフ装置と、質量分析装置と、測定結果を表示する表示部と、を備える試料分析システムを用いて実施する表示方法であって、
前記分光蛍光光度計が取得する三次元蛍光スペクトルの励起波長の軸と、前記液体クロマトグラフ装置が取得する三次元吸収スペクトルの吸収波長の軸を同じ尺度に揃え、
前記三次元吸収スペクトルの溶離時間の軸と、前記質量分析装置が取得する三次元質量スペクトルの溶離時間の軸を同じ尺度に揃え、
前記表示部が、前記三次元蛍光スペクトルと、前記三次元吸収スペクトルと、前記三次元質量スペクトルとを並べて表示する、
表示方法。
【請求項１４】
分光蛍光光度計と、液体クロマトグラフ装置と、質量分析装置とを備える試料分析システムを用いて実施する試料分析方法であって、
前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークを検出し、
前記蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークを特定し、
前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を特定する、
試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料分析システム、表示方法及び試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分光蛍光光度計で得られる三次元蛍光スペクトルは、試料に含まれる蛍光物質の励起波長、蛍光波長、蛍光強度を把握する有効な手段である。しかし、三次元蛍光スペクトルにて蛍光ピークが出現した際、試料に含まれる蛍光物質が未知な場合、その物質が何であるか特定することは容易でない。多くは励起波長および蛍光波長のピーク情報より、過去の報告例を参考に推定するが、通常、試料には複数の成分が含まれておりそれらのピークが重複する場合、励起波長および蛍光波長の候補ピークが近傍に複数存在する場合、過去の報告例が無い場合があり、物質の特定を妨げる。  
【０００３】
成分の質量情報の把握は物質同定に大きく寄与する。過去の報告例において、候補となる成分が複数存在した場合、質量情報を基に候補を絞り込むことが可能である。非特許文献１では、質量情報を得るために高速液体クロマトグラフのサイズ排除カラムと蛍光検出器の蛍光波長情報を用いる方法が提案されている。サイズ排除カラムは、分子量ごとに溶離時間が変わることから、複数の既知の分子量を有する校正試料を測定して分子量と溶離時間の関係性を予め把握しておくことで、目的試料の溶離時間により分子量を推定することが可能である。
【０００４】
液体クロマトグラフの検出器に蛍光検出器を用いることで、カラムで分離される各試料成分の三次元蛍光スペクトル（溶離時間・蛍光波長・蛍光強度）を測定し、蛍光光度計で取得した三次元蛍光スペクトルの目的成分の蛍光波長と一致することで目的成分かどうか判断し、その成分の溶離時間により分子量を推定することが可能である（特許文献１）。また、試料に含まれる測定対象成分（アフラトキシン）の濃度を算出するために、試料に濃度の異なるアフラトキシン溶液を添加して三次元蛍光スペクトルを測定することで、励起蛍光波長と濃度の関係性を取得し、検量モデルを作成している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１８０７０６号公報
【特許文献２】特許第５８５６７４１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Li, Wen-Tao, et al. "Characterization of dissolved organic matter in municipal wastewater using fluorescence PARAFAC analysis and chromatography multi-excitation/emission scan: a comparative study." Environmental science & technology 48.5 (2014): 2603-2609.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
三次元蛍光スペクトル測定において蛍光ピークが出現した際、試料に含まれる蛍光物質が未知な場合、その物質を特定することは容易ではない。サイズ排除カラムと蛍光検出器を用いた測定系にて校正試料を測定して溶離時間より分子量を推定する特許文献１及び２の方法があるが、この方法では、複数の既知の分子量を有する校正試料にて分子量と溶離時間の関係性を予め把握する必要があり、また得られる分子量は、校正試料に対する予測値であるため分子量の精度は高くない。そのため、非特許文献１の記載にもあるように、予め成分の予測がされており、タンパク質や腐植物質などの成分で分子量分布の特徴を把握する場合には有効であるが、未知の成分推定で分子量を把握したい場合には、適していない。サイズ排除カラムを用いる際、ある程度分子量を推測した上で分子量に応じた校正試料を複数用意する必要があり、さらにそれに応じた溶離条件の最適化が必要であるので煩雑であるという課題があった。
【０００８】
本発明は、分光蛍光光度計で取得される三次元蛍光スペクトルにおける未知の蛍光ピークを同定するための情報として質量情報を推定することができる試料分析システム、表示方法及び試料分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の試料分析システムは、測定対象である試料に励起光を照射して放出された蛍光を測定し、励起波長に対する蛍光強度を示す励起スペクトルおよび特定の波長の励起光を照射して放出された蛍光の蛍光波長に対する蛍光強度を示す蛍光スペクトルを取得する分光蛍光光度計と、前記試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離するとともに、当該物質毎の吸収波長を取得する液体クロマトグラフ装置と、前記溶離時間に従って分離された物質毎の質量情報を取得する質量分析装置と、前記分光蛍光光度計と、前記液体クロマトグラフ装置と、前記質量分析装置とを制御する制御部と、測定結果を表示する表示部と、を備え、前記制御部は、前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークと、当該蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークに基づき、少なくとも前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を前記表示部に表示する。
【００１０】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記分光蛍光光度計は、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得する。
【００１１】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記液体クロマトグラフ装置は、前記溶離時間と、前記吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得する。
【００１２】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記液体クロマトグラフ装置は、前記試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離する分離カラムと、当該分離カラムによって分離された物質毎の吸収波長を測定するダイオードアレイ検出器とを有する。
【００１３】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記分離カラムによって分離された物質を、前記ダイオードアレイ検出器および前記質量分析装置の双方に導入する。
【００１４】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記質量分析装置は、前記溶離時間と、前記質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得する。
【００１５】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記質量情報が質量電荷比である。
【００１６】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記質量分析装置は、単一または複数の質量検出部から構成される。
【００１７】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記試料を当該試料分析システムに導入する試料導入ユニットを更に備え、前記試料導入ユニットが、前記分光蛍光光度計へ試料を導入し、前記分光蛍光光度計が、励起スペクトルを取得した後に、前記液体クロマトグラフ装置に試料を導入する。
【００１８】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記試料を当該試料分析システムに導入する試料導入ユニットを更に備え、前記試料導入ユニットが、前記分光蛍光光度計及び前記液体クロマトグラフ装置の双方に試料を導入する。
【００１９】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記制御部は、前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークを検出し、前記蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークを特定し、前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を特定する。
【００２０】
本発明の試料分析システムの一態様として例えば、前記分光蛍光光度計は、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得し、前記液体クロマトグラフ装置は、前記溶離時間と、前記吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得し、前記質量分析装置は、前記溶離時間と、前記質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得し、前記制御部は、前記三次元蛍光スペクトルの励起波長の軸と、前記三次元吸収スペクトルの吸収波長の軸を同じ尺度に揃え、前記三次元吸収スペクトルの溶離時間の軸と、前記三次元質量スペクトルの溶離時間の軸を同じ尺度に揃え、前記表示部が、前記三次元蛍光スペクトルと、前記三次元吸収スペクトルと、前記三次元質量スペクトルとを並べて表示する。
【００２１】
本発明の表示方法は、分光蛍光光度計と、液体クロマトグラフ装置と、質量分析装置と、測定結果を表示する表示部と、を備える試料分析システムを用いて実施する表示方法であって、前記分光蛍光光度計が取得する三次元蛍光スペクトルの励起波長の軸と、前記液体クロマトグラフ装置が取得する三次元吸収スペクトルの吸収波長の軸を同じ尺度に揃え、前記三次元吸収スペクトルの溶離時間の軸と、前記質量分析装置が取得する三次元質量スペクトルの溶離時間の軸を同じ尺度に揃え、前記表示部が、前記三次元蛍光スペクトルと、前記三次元吸収スペクトルと、前記三次元質量スペクトルとを並べて表示する。
【００２２】
本発明の試料分析方法は、分光蛍光光度計と、液体クロマトグラフ装置と、質量分析装置とを備える試料分析システムを用いて実施する試料分析方法であって、前記分光蛍光光度計が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークを検出し、前記蛍光強度のピークに対応した、前記液体クロマトグラフ装置が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークを特定し、前記吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、前記質量分析装置が取得した質量情報を特定する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の試料分析システム、表示方法及び試料分析方法は、分光蛍光光度計と、液体クロマトグラフ装置と、質量分析装置とで取得した各スペクトルを軸調整し、三次元蛍光スペクトルにピークとして出現した蛍光成分の質量情報（質量電荷比：ｍ／ｚ）を基に、未知の物質を推定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係る試料分析システムに用いられる分光蛍光光度計の一実施形態を示す構成ブロック図。
【図２】本発明に係る分光蛍光光度計により取得される励起スペクトルを示すグラフ。
【図３】本発明に係る分光蛍光光度計により取得される蛍光スペクトルを示すグラフ。
【図４】図２、図３に基づいて取得される三次元蛍光スペクトルを示すグラフ。
【図５】本発明に係る分光蛍光光度計の蛍光強度と、液体クロマトグラフ装置の吸光度に相関性を示すグラフ、（ａ）励起スペクトル、（ｂ）吸収スペクトル。
【図６】本発明に係る試料分析システムの第１の実施形態の一例を示すブロック図。
【図７】本発明に係る試料分析システムの測定手順を示すフロー図。
【図８】本発明に係る試料分析システムの表示部に表示されるグラフ、（ａ）励起スペクトル、（ｂ）蛍光スペクトル、（ｃ）三次元蛍光スペクトル。
【図９】本発明に係る液体クロマトグラフ装置で取得される三次元の吸収スペクトルを示すグラフ。
【図１０】本発明に係る質量分析装置で取得される三次元の質量スペクトルを示すグラフ。
【図１１】図７に続くフロー図で未知の蛍光ピークを同定するための情報として質量情報を推定する手順、（ａ）第１のフロー、（ｂ）第２のフロー。
【図１２】本発明に係る試料分析システムの表示部が示す三次元蛍光スペクトル、三次元吸収スペクトルおよび三次元質量スペクトル。
【図１３】図１２と同一の表示に対して軸調整、軸表示、ピーク同定を行った各種スペクトル。
【図１４】本発明に係る試料分析システムの第２の実施形態の一例を示すブロック図。
【図１５】本発明に係る試料分析システムの第３の実施形態の一例を示すブロック図。
【図１６】本発明に係る試料分析システムの第４の実施形態の一例を示すブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明に係る試料分析システムの好適な実施形態を、図１〜図１６に基づいて詳述する。
【００２６】
図１は、本発明に係る試料分析システムに用いられる分光蛍光光度計の一実施形態を示す構成ブロック図である。図１を用いて分光蛍光光度計の構成を詳述する。
【００２７】
分光蛍光光度計１は、試料に励起光を照射して、試料から放出された蛍光を測定する装置であり、光度計部１０と、光度計部１０内に配置され、光度計部１０をコントロールし試料を分析するデータ処理部３０と、入出力を行う操作部４０とを備える。
【００２８】
光度計部１０は、光源１１と、光源１１の光から分光して励起光を生成する励起側分光器１２と、励起側分光器１２からの光を分光するビームスプリッタ１３と、ビームスプリッタ１３で分光された一部の光の強度を測定するモニタ検知器１４と、試料から放出された蛍光を単色光に分光する蛍光側分光器１５と、単色の蛍光の電気信号を検知する検知器（蛍光検知器）１６と、励起側分光器１２の回折格子を駆動する励起側パルスモータ１７と、蛍光側分光器１５の回折格子を駆動する蛍光側パルスモータ１８とを備える。さらに光度計部１０は、測定対象の試料を収容して保持する試料容器５０を設置するための試料設置部２１を備えている。ビームスプリッタ１３からの励起光が試料容器５０に入射し、試料から放出された蛍光が蛍光側分光器１５に入射する。試料設置部２１は、ビームスプリッタ１３からの励起光が、適切に試料容器５０に入射可能なように、その位置が調整可能であってもよい。
【００２９】
データ処理部３０は、コンピュータ３１と、コンピュータ３１内に配置される中央処理部３２と、試料からの蛍光をデジタル変換するＡ／Ｄ変換器３３を備える。また、操作部４０は、操作者が、コンピュータ３１の処理に必要な入力信号を入力する操作パネル４１と、コンピュータ３１により処理された各種分析結果を表示する表示装置４２と、操作パネル４１及び表示装置４２とコンピュータ３１とを連結するインターフェース４３とを備える。
【００３０】
操作者が操作パネル４１により入力した測定条件に応じて、コンピュータ３１が励起側パルスモータ１７に信号を出力し、励起側パルスモータ１７が駆動して励起側分光器１２が目的の波長位置に設定される。また、同じく測定条件に応じて、コンピュータ３１が蛍光側パルスモータ１８に信号を出力し、蛍光側パルスモータ１８が駆動して蛍光側分光器１５が目的の波長位置に設定される。励起側分光器１２、蛍光側分光器１５は、所定のスリット幅を持つ回折格子やプリズムなどの光学素子を有しており、励起側パルスモータ１７、蛍光側パルスモータ１８を動力とし、ギヤやカム等の駆動系部品を介して光学素子を回転運動させることでスペクトル走査が可能となる。
【００３１】
図２に示す励起スペクトルは、試料容器５０内の試料に対し、励起光の励起波長を変化させた際の蛍光強度を測定することにより得られるスペクトルである。励起側分光器１２が励起波長を測定開始波長から測定終了波長まで変化させ、各波長の励起光を試料に照射する。その時の固定波長に設定されている蛍光側分光器１５を経て特定波長の蛍光の変化を検知器１６が検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。コンピュータ３１（中央処理部３２）が、この信号強度を解析処理し、表示装置４２にスペクトルを表示する。
【００３２】
表示装置４２は、測定結果として、励起波長と蛍光強度の図２に示されるような２次元の励起スペクトルを表示する。図２のスペクトル（グラフ）は、特定の蛍光波長（例えば５５０ｎｍ）において励起波長を変化させた際の蛍光強度（任意単位）を示している。
【００３３】
図３に示す蛍光スペクトルは、試料容器５０内の試料に対し、固定波長の励起光を照射し、蛍光波長を変化させた際の波長毎の蛍光強度を測定することにより得られるスペクトルである。固定波長に設定された励起側分光器１２からの励起光を試料に照射する。蛍光側分光器１５は、その時の測定対象の蛍光を測定開始波長から測定終了波長まで変化させ、波長毎の蛍光の変化を検知器１６が検出し、Ａ／Ｄ変換器３３を介してコンピュータ３１に信号強度として取り込まれる。コンピュータ３１（中央処理部３２）が、この信号強度を解析処理し、表示装置４２にスペクトルを表示する。
【００３４】
表示装置４２には、測定結果として、蛍光波長と蛍光強度の図３に示されるような２次元の蛍光スペクトルを表示する。図３のスペクトルは、励起光が特定波長（例えば４５０ｎｍ）であり、蛍光波長を変化させた際の蛍光強度を示している。
【００３５】
図４は、表示装置４２が表示する三次元スペクトルであり、特に三次元蛍光スペクトルを示す。試料に対し、励起波長を固定した際の蛍光スペクトルを測定し、蛍光スペクトル走査が終了したら、蛍光波長を測定開始波長に戻し、励起波長を所定の波長間隔だけ駆動、次の励起波長における蛍光スペクトルを測定する。得られた蛍光スペクトルを励起波長、蛍光波長、蛍光強度の三次元で記憶し、励起波長が最終の波長に達するまで繰り返すことにより、三次元蛍光スペクトルを取得することができる。本スペクトルは、図２の励起スペクトルと図３の蛍光スペクトルの組み合わせということができる。
【００３６】
得られた三次元蛍光スペクトルは、図４に示すように同一の蛍光強度をそれぞれ線で結び、等高線図や鳥瞰図等の模擬三次元形式にて描写される。等高線で山となる励起波長および蛍光波長が、試料の測定に適した励起波長、特徴的な蛍光波長となり、操作者は、試料の測定範囲内の励起波長と蛍光波長の蛍光特性を、容易に把握することが可能となる。このような三次元蛍光スペクトルは、試料中の蛍光物質の成分数や成分の同定等、多くの情報を得ることができる点で有用である。
【００３７】
分光蛍光光度計１は、短い測定時間で試料の励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度が取得でき、蛍光強度のピークを分析して既知の情報と照合できれば、速やかに物質を特定可能である。しかしながら、蛍光強度のピークとして未知の物質が検出され、既知の情報に存在しないような場合には、特定は困難である。
【００３８】
そこで、発明者は、１）分光蛍光光度計１の蛍光強度と、後述する液体クロマトグラフ装置６０の吸光度に相関性があること、２）液体クロマトグラフ装置６０が溶離時間毎に物質を分離して吸収強度を得るとともに、後述する質量分析装置７０がこの溶離時間毎に分離した物質の質量情報を測定できることを見出した。この結果、蛍光強度と質量情報を結び付け、未知の物質を円滑に特定する試料分析システム１００及びその方法を見出した。
【００３９】
上述の１）分光蛍光光度計１の蛍光強度と、後述する液体クロマトグラフ装置６０との吸光度に相関性に関して、ランバートベールの法則を論ずる必要がある。ランバートベールの法則により、蛍光強度Ｆと吸光度Ａｂｓ（＝εｃｄ）との関係は、式）Ｆ＝Ｉ０（２．３０３εｃｄ）φｆ、であることが知られている。
ここで、
Ｆ：蛍光強度
Ｉ０：入射光強度
ε：モル吸光係数
ｃ：濃度
ｄ：液槽の長さ（光路長）
φｆ：量子収率
である。
【００４０】
上式に示すように、Ａ）蛍光強度Ｆは、Ｉ０（２．３０３εｃｄ）φｆで表される。この時、吸光度Ａｂｓは、εｃｄとなる。また、Ｂ）量子収率φｆは、物質の発光効率であるが、波長によらずほぼ一定の値となる。さらに、Ｃ）入射光強度（励起光強度）Ｉ０も装置関数を適用することで、波長によらずほぼ一定の値となる。
【００４１】
以上により、蛍光強度Ｆは、吸光度Ａｂｓ（εｃｄ）と比例関係になることが分かる。また、上記Ｂ）及びＣ）により、この比例関係は励起波長を変えた際にも成立することが理解され、励起波長に対する蛍光強度と、吸収波長に対する吸光度は比例関係になることが理解される。実験により得られた図５に示されるグラフからも、試料（ローダミンＢ）に光を照射して得られる蛍光強度を示す励起スペクトル（図５（ａ））と、試料に光を照射して得られる吸収強度を示す吸収スペクトル（図５（ｂ））とは、互いに相関性が高いデータであると判断できる。即ち、（分光蛍光光度計１の）励起波長に対する蛍光強度の関係と、（液体クロマトグラフ装置６０の）吸収波長に対する吸光度（吸収強度）には相関性があり、励起スペクトルおよび吸収スペクトルそれぞれの強度（蛍光強度、吸光度）は、実質的に同じ挙動を示すことが理解される。
【００４２】
よって、分光蛍光光度計１により試料中で特定の励起波長で未知の蛍光強度のピークを持つ物質が検出された場合、この試料を液体クロマトグラフ装置６０で測定すると、実質的に同一の吸収波長において吸光度のピークが得られる可能性が高い。そして、上記２）のように液体クロマトグラフ装置６０の溶離時間に対し、質量分析装置７０が連動した溶離時間で質量情報を取得しているため、このピークが発現した液体クロマトグラフ装置６０の溶離時間に対し、質量分析装置７０が同じ溶離時間で取得した質量情報が対応するはずであり、結果的に、未知の蛍光強度のピークを持つ物質の質量情報が特定されると判断できる。これにより、物質を速やかに特定しやすくなるという結論が導き出せる。
【００４３】
図６は、本発明に係る試料分析システムのブロック図である。図６に基づいて試料分析システムの第１の実施形態を説明する。
【００４４】
試料分析システム１００は、分光蛍光光度計１と、液体クロマトグラフ装置６０と、質量分析装置７０と、制御装置１１０と、試料導入ユニット１２０とを備える。
【００４５】
分光蛍光光度計１は、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得する装置で、構成は図１で詳述している。液体クロマトグラフ装置６０は、分光蛍光光度計１で分析した試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離するとともに、当該物質毎の吸収波長を取得する装置で、分離カラム６１とダイオードアレイ検出器６２を有し、溶離時間と吸収波長と吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得する。即ち、分離カラム６１は、試料を溶離時間に従って含有する物質毎に分離し、ダイオードアレイ検出器６２は、分離カラム６１によって分離された物質毎の吸収波長を測定する。また、分離カラム６１は、恒温槽６３内に配置されている。
【００４６】
質量分析装置７０は、液体クロマトグラフ装置６０で溶離時間に従って分離された物質毎の質量情報を取得する装置で、例えば物質を構成する分子の質量情報、例えば分子量情報を取得する第１の質量検出部と、当該分子を分解して得られるプロダクトイオンの質量情報を取得可能なＭＳn機能を有する第２の質量検出部を有し、溶離時間と質量情報とイオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得する。また、質量情報は、荷電粒子の質量と電荷の比である質量電荷比（ｍ／ｚ）である。ここで、ｍは分子質量、ｚは電荷数である。ただし、質量分析装置７０の構成は特に限定されず、単一の質量検出部から構成されてもよいし、二段以上で、検出対象となる質量情報の異なる複数の質量検出部を備えてもよい。
【００４７】
制御装置１１０は、制御部１１１と表示部１１２と入力部１１３とを有し、制御部１１１は、分光蛍光光度計１と液体クロマトグラフ装置６０と質量分析装置７０とを制御する。表示部１１２は測定条件及び測定結果などを表示する。入力部１１３は、操作者が各種分析に必要なデータや各種装置を動作させるコマンドなどを入力する装置である。また、分光蛍光光度計１のデータ処理部３０及び操作部４０は、制御装置１１０と統合しても良く、独立するが各種データが共用できるネットワークで連携されていても良い。
【００４８】
また制御部１１１は、分光蛍光光度計１が取得した特定の励起波長に対する蛍光強度のピークと、当該蛍光強度のピークに対応した、液体クロマトグラフ装置６０が取得した特定の吸収波長に対する吸光度のピークに基づき、吸光度のピークが得られた溶離時間に対応した、質量分析装置７０が取得した質量情報を表示部１１２に表示する。
【００４９】
試料導入ユニット１２０は、試料を試料分析システム１００に導入し、送液部１２１と試料導入部１２２とを有する。また、試料分析システム１００は、試料導入部１２２に導入する溶離液を貯蔵する溶離液部１３０と排出された溶離液を貯蔵する廃液部１３１を有している。廃液部１３１は、少なくとも一つ以上配置されている。また、試料導入部１２２は、マイクロシリンジなどで試料を導入するマニュアルインジェクターまたはバイアルに入れた試料を自動分注器で導入するオートサンプラーで構成される。
【００５０】
図７のフロー図に基づいて、試料分析システム１００を用いて実施する試料分析方法の手順の一例について説明する。
【００５１】
試料導入ユニット１２０の送液部１２１は、ポンプなどにより溶離液部１３０の溶離液を試料導入部１２２に送液する。導入された試料は溶離液とともに流路を流れ、分光蛍光光度計１に導かれる。通常、分光蛍光光度計１は溶液試料を１０ｍｍ角セルに入れ、試料設置部２１に設置し測定するが、試料送液方式とするため、本発明の分光蛍光光度計１の試料容器５０には試料の溶液が試料設置部２１に対して前後に流れるフローセルを用いることが望ましい。
【００５２】
試料が試料容器（フローセル）５０に導入された後、分光蛍光光度計１にて試料に含まれる全蛍光成分における三次元蛍光スペクトル（励起波長、蛍光波長、蛍光強度）を取得する（Ｓ１０）。当該三次元蛍光スペクトルは図８（ｃ）のグラフに示されている。三次元蛍光スペクトルは、図８（ａ）の励起スペクトルと、図８（ｂ）の蛍光スペクトルとの組み合わせである。
【００５３】
測定の際、脈流の影響でノイズが生じるため、送液は一旦停止するか脈流の影響が無い程度まで低流量にした状態で行うことが望ましい。測定に用いた試料溶液は、励起光が照射され光分解されることがある。特に、分光蛍光光度計１の光源１１は光量が強いため、試料に含まれる成分の光分解に留意する必要がある。そのため、フローセル５０の出口の流路は２分岐させ、測定に用いた試料溶液部分を廃液部１３１に導いて廃棄しても良い。光劣化が懸念される場合、次の工程に試料が送液される際に分光蛍光光度計１のフローセル５０の部分に励起光が遮断されるシャッターを挿入しておくことが望ましい。なお、光分解の影響が無い試料の場合は、そのまま次の工程に使用しても良い。
【００５４】
つづいて、分光蛍光光度計１のフローセル５０を通過した試料は、液体クロマトグラフ装置６０の分離カラム６１に到達する。分離カラム６１と試料の各成分の相互作用によって、各成分が分離カラム６１を通過する時間が異なることから、溶離時間によって成分が分離される（Ｓ２０）。溶離時間は温度に依存するため、恒温層５３にて一定温度に保つことが望ましい。
【００５５】
分離カラム６１を通過した試料の各成分は、異なる溶離時間にてダイオードアレイ（ＤＡＤ）検出器６２に導かれる。ダイオードアレイ検出器６２は、高速で吸収スペクトルを測定することが可能であることから、ここでは三次元の吸収スペクトル（溶離時間、吸収波長、吸光度）を取得する（Ｓ３０）。三次元の吸収スペクトルは、図９に示されている。ダイオードアレイ検出器６２において試料に照射される入射光は、分光蛍光光度計１の励起光と比較して、光量が小さいため、試料に含まれる成分の光分解の影響は無いことが多い。
【００５６】
ダイオードアレイ検出器６２を通過した試料の各成分は、異なる溶離時間を保持したまま質量分析装置７０に導かれ、質量分析装置７０が三次元の質量スペクトル（溶離時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）、イオン強度）を取得する（Ｓ４０）。三次元の質量スペクトルは、図１０に示されている。
【００５７】
質量分析装置７０が、例えば上述した第１の質量検出部及び第２の質量検出部を有する場合、第１の質量検出部が高真空下で気体にし、イオン化した物質（分子）の質量情報を取得する。そして、第２の質量検出部は、第１の質量検出部で測定した分子を分解して得られるプロダクトイオンの質量情報を取得する。即ち、第１の質量検出部で分子量情報を取得して、第２の質量検出部でさらに化合物を推定するためのプロダクトイオンの質量情報を取得することができる。
【００５８】
上述のフローでは、液体クロマトグラフ装置６０における溶離時間に連動して行われるため、溶液時間に沿って測定される試料（物質）は同一である。
【００５９】
次に、分光蛍光光度計１で取得される三次元蛍光スペクトルにおける未知の蛍光ピークを同定するための情報として質量情報（質量電荷比：ｍ／ｚ）を推定する手順について、図１１のフロー図に基づいて説明する。図１１（ａ）は第１のフロー、図１１（ｂ）は第２のフローを示している。
【００６０】
第１のフローでは、図７のフローで保存されたデータを呼び出し（Ｓ１００）、三次元蛍光スペクトルのみを表示部１１２に表示する（Ｓ１１０、図８（ｃ）参照）。次に、例えば操作者の処理命令入力などにより、制御部１１１は一気に蛍光強度のピークをサーチし（Ｓ１２０）、それに一致する液体クロマトグラフ装置６０の三次元吸収スペクトルデータにおける吸収ピークを探索して（Ｓ１３０）、該当する吸収ピークの溶離時間を取得する。
【００６１】
そして、溶離時間軸を一致させた液体クロマトグラフ装置６０の三次元吸収スペクトルデータと質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータより、制御部１１１は、吸収ピークを探索して（Ｓ１４０）、該当する吸収ピークの溶離時間を取得する。さらに制御部１１１は、吸収ピークの溶離時間から該当する質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータにおける質量電荷比(ｍ／ｚ)を演算処理する（Ｓ１５０）。
【００６２】
第２のフローでは、図７のフローで保存されたデータを呼び出し（Ｓ１００）、三次元蛍光スペクトルと、当該三次元蛍光スペクトルに関係する三次元吸収スペクトル、三次元質量スペクトル等を図１２の配置で表示部１１２に表示する（Ｓ１１１）。操作者は、分光蛍光光度計１で取得した三次元蛍光スペクトルデータにおける励起波長軸（Ｙ軸）と液体クロマトグラフ装置６０のダイオードアレイ検出器６２にて取得した三次元吸収スペクトルデータにおける吸収波長軸（Ｙ軸）のスケール範囲を一致させる（Ｓ１１２）。つづいて、ダイオードアレイ検出器６２にて取得した三次元吸収スペクトルデータの溶離時間軸（Ｘ軸）と質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータにおける溶離時間軸（Ｘ軸）を一致させる（Ｓ１１３）。
【００６３】
その後、操作者は三次元蛍光スペクトル（ＥＥＭ：Excitation  Emission  Matrix）データの着目する成分の励起波長のピーク波長を指定し（Ｓ１２０）、それに一致する液体クロマトグラフ装置６０の三次元吸収スペクトルデータにおける吸収ピークを探索して（Ｓ１３０）、該当する吸収ピークの溶離時間を取得する。その後、溶離時間軸を一致させた液体クロマトグラフ装置６０の三次元吸収スペクトルデータと質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータより、吸収ピークを探索して（Ｓ１４０）、該当する吸収ピークの溶離時間を取得する。
【００６４】
本発明の試料分析システム１００では、分光蛍光光度計１で、励起波長と、蛍光波長と、蛍光強度を含む三次元蛍光スペクトルを取得し、液体クロマトグラフ装置６０で、溶離時間と、吸収波長と、吸光度を含む三次元吸収スペクトルを取得し、質量分析装置７０で、溶離時間と、質量情報と、イオン強度を含む三次元質量スペクトルを取得している。
【００６５】
そして、制御部１１１は、三次元蛍光スペクトルの励起波長の軸と、三次元吸収スペクトルの吸収波長の軸を同じ尺度に揃え、三次元吸収スペクトルの溶離時間の軸と、三次元質量スペクトルの溶離時間の軸を同じ尺度に揃え、表示部１１２が、三次元蛍光スペクトルと、三次元吸収スペクトルと、三次元質量スペクトルとを並べて表示する。図１３は、図１２のグラフに対して、軸調整、軸表示（実直線）、ピーク同定（破線）を行った表示である。尚、図１２、図１３では溶離時間に対する吸光度の変化を示す質量スペクトルも表示されている。また、第１のフローによる処理においても、表示部１１２が図１２、図１３の表示を行ってよい。
【００６６】
各スペクトルの軸を揃える方法は、操作者による場合と、ソフトで自動的に制御部１１１が行う場合が有り、特に限定しない。また、軸を揃える場合、特定の波長範囲などを絞っても良い。
【００６７】
そして、吸収ピークの溶離時間から該当する質量分析装置７０の三次元質量スペクトルデータにおける質量電荷比（ｍ／ｚ)を確定することが可能となる（Ｓ１５０）。この結果、操作者等は、質量電荷比の如き質量情報を利用することができるため、例え三次元蛍光スペクトル等において未知の物質が検出されても、より容易に物質の種類を特定することが可能となる。特に、試料分析システム１００を用いて図１２、図１３に示す表示部１１２の画面を表示する表示方法によれば、操作者は、尺度が揃った吸収波長の軸および溶離時間の軸を介して、容易にピークを同定することができ、未知の物質の質量情報を容易に入手することができる。
【００６８】
図１４は、試料分析システム１００の第２の実施形態を示すブロック図である。図１４に基づいて試料分析システム１００の第２の実施形態を説明する。
【００６９】
第２の実施形態では、試料導入ユニット１２０の試料導入部１２２からの流路を２分岐させ、流路を切り替えることで、一方を分光蛍光光度計１、もう一方を液体クロマトグラフ装置６０の分離カラム６１に導いている。分光蛍光光度計１の測定に用いた試料溶液は、励起光が照射されることにより光分解されることがある。特に、分光蛍光光度計１の光源は光量が強く、試料に含まれる成分の光分解に留意する必要があるため、分光蛍光光度計１で使用した試料溶液は廃液部１３１に導いて廃棄し、分離カラム６１以降の流路には、新たな状態の試料を導入することが可能となる構成である。
【００７０】
図１５は、試料分析システム１００の第３の実施形態を示すブロック図である。図１５に基づいて試料分析システム１００の第３の実施形態を説明する。
【００７１】
第１の実施形態において、液体クロマトグラフ装置６０のダイオードアレイ検出器６２の測定に用いた試料溶液は、分光蛍光光度計１と比較して、光量は少ないが光照射されるため、光劣化または光反応した成分が質量分析装置７０に導入される可能性がある。そのため、第３の実施形態では、分離カラム６１からの流路を２分岐させ、流路を切り替えることで一方をダイオードアレイ検出器６２、もう一方を質量分析装置７０に導くことで、光照射されていない試料の成分の質量情報を得えることが可能となる。
【００７２】
図１６は、試料分析システム１００の第４の実施形態を示すブロック図である。図１６に基づいて試料分析システム１００の第４の実施形態を説明する。
【００７３】
第４の実施形態では、分光蛍光光度計１が中央処理部３２で制御され、液体クロマトグラフ装置６０と質量分析装置７０とが制御部１１１でコントロールされている。また、分光蛍光光度計１で使用した試料溶液は廃液部１３１に導いて廃棄し、分離カラム６１以降の流路には、新たな状態の試料を導入する構成である。分光蛍光光度計１で測定した試料を一旦取り出し、人為的に液体クロマトグラフ装置６０に移し、液体クロマトグラフ装置６０で測定する。各種データは双方で連携されており、全体として制御装置１１０がコントロールしても良い。
【００７４】
尚、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、適宜、変形、改良、等が可能である。その他、上述した実施形態における各構成要素の材質、形状、寸法、数値、形態、数、配置箇所、等は本発明を達成できるものであれば任意であり、限定されない。また、質量分析装置は、四重極型、イオンとラップ型、セクタ型等があり、その種類は問わない。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明に係る試料分析システム、表示方法及び試料分析方法は、未知の元素を特定したい分野に適用可能である。
【符号の説明】
【００７６】
１  分光蛍光光度計
１０  光度計部
１１  光源
１２  励起側分光器
１３  ビームスプリッタ
１４  モニタ検知器
１５  蛍光側分光器
１６  検知器
２１  試料設置部
３０  データ処理部
３１  コンピュータ
３２  中央処理部
４０  操作部
５０  試料容器（フローセル）
６０  液体クロマトグラフ装置
６１  分離カラム
６２  ダイオードアレイ検出器
６３  恒温槽
７０  質量分析装置
１００  試料分析システム
１１０  制御装置
１１１  制御部
１１２  表示部
１２０  試料導入ユニット
１２１  送液部
１２２  試料導入部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019095206.tif 000014
【図１３】
2019095206.tif 000015
【図１４】
2019095206.tif 000016
【図１５】
2019095206.tif 000017
【図１６】
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