(57)【要約】【課題】可変重鎖および／または可変軽鎖における特定の位置に特定のアミノ酸残基を含む、極めて安定な分子である、複数の抗原に結合する抗体、例えば二重特異性および二価抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、複数の抗原に結合する抗体を提供し、前記抗体は、少なくとも２つの抗体軽鎖可変ドメインおよび２つの抗体重鎖可変ドメインを有し、各軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインに連結してＶＨ／ＶＬコンストラクトを形成し、ＶＨドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２、１０３および／または１４４の特定のアミノ酸を含み、ＶＬドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置４７および／または５０の特定のアミノ酸を含む。本発明の組み換え抗体の発現のための核酸分子、ベクターおよび宿主細胞、それらを単離するための方法、ならびに医薬における前記抗体の使用もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条に従い、２０１１年１０月２０日出願の米国仮特許出願第６１／５４９，４８２号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、少なくとも２つの抗体軽鎖可変ドメインと、２つの抗体重鎖可変ドメインとを有する安定な複数抗原結合抗体に関し、定常ドメインを有さず、各軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインに連結してＶＨ／ＶＬコンストラクトを形成し、ＶＨドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２、１０３および／または１４４に特定のアミノ酸を含み、ＶＬドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置４７および／または５０に特定のアミノ酸を含む。本発明は、さらに、そのような抗体を生成する方法、およびそのような抗体を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２つ以上の抗原に結合することができる抗体分子は、複数のタンパク質が関与する疾患の治療のための可能性のある治療薬剤として望ましい。例えば、同じシグナル伝達経路における２つのタンパク質を標的とすること、または２つの異なる経路の活性を、各経路におけるタンパク質を標的とすることにより調節することが望ましい場合が多い。そのような抗体の例は、多重特異性抗体（例えば、２つの異なる標的分子に結合する二重特異性抗体）および多価抗体（例えば、１つの標的分子の２つの異なる結合部位に結合する二価抗体）を含む。治療抗体の分野において、２つの治療抗体を単一の分子に組み合わせ、相加的または相乗的効果を利用しながら、安定性および他の望ましい特性を維持するための、いくつかのアプローチが開発されている。そのようなアプローチは、タンデム単鎖可変断片（ＴｄｓｃＦｖ）（非特許文献１；非特許文献２）、二特異性抗体（非特許文献３）、タンデム二特異性抗体（非特許文献４）、１つで２つの抗原に結合する抗体（非特許文献５）、および二重可変ドメイン抗体（非特許文献６）等の組み換え構成を含む。
【０００４】
２成分治療アプローチが魅力的である疾患の一例は、脈絡膜血管新生である。脈絡膜血管新生の血管成分は、血管内皮細胞、内皮細胞前駆体、および周皮細胞を含む。組織病理学により、血管新生刺激の源であると共に、多くの場合容量分析的に最大の成分であると思われる血管外成分は、炎症性、グリアおよび網膜色素上皮細胞、ならびに線維芽細胞を含む。組織損傷は、いずれの成分によっても引き起こされる可能性がある。各成分は、様々な単剤治療により別個に標的とされ得る。しかしながら、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する二重特異性抗体は、両方の成分を同時に攻撃する機会を示す。
【０００５】
多重特異性および多価抗体に関連した一般的な問題は、低い安定性、ならびに産生収率、純度および親和性に関する問題である。合理的設計および指向進化（非特許文献７）を含む、これらの問題に対応するための様々なアプローチが開発されている。しかしながら、そのようなアプローチは、時間を要し、さらに普遍的に該当し得る結果を提供しなければならない。
結果として、当該技術分野において、安定で可溶性であり、また従来の多重特異性および多価抗体構成の欠陥を有さない多重特異性および多価抗体構成が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０１：１０１２−１０１９
【非特許文献２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９：１４１５−１４２５
【非特許文献３】Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１７７−１８９
【非特許文献４】Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，  ２００９，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５６２：１７７−１９３
【非特許文献５】Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１６１４
【非特許文献６】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：１２９０−１２９７
【非特許文献７】Ｍａｂｒｙ  ａｎｄ  Ｓｎａｖｅｌｙ，  ２０１０，  ＩＤｒｕｇｓ  １３：５４３−５４９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、可変重鎖および／または可変軽鎖における特定の位置に特定のアミノ酸残基を含む、極めて安定な分子である、複数の抗原に結合する抗体、例えば二重特異性および二価抗体を提供する。
【０００８】
一態様において、本発明は、複数抗原結合抗体分子であって、
ａ）１つは抗原Ａに対する特異性を有し（ＶＨ−Ａ）、１つは抗原Ｂに対する特異性を有する（ＶＨ−Ｂ）、２つの重鎖可変ドメインと、
ｂ）１つは抗原Ａに対する特異性を有し（ＶＬ−Ａ）、１つは抗原Ｂに対する特異性を有する（ＶＬ−Ｂ）、２つの軽鎖可変ドメインと
を含み、２つの重鎖可変ドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンもしくはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンもしくはトレオニンのうちの少なくとも１つを含み、ならびに／または２つの軽鎖可変ドメインのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含む、複数抗原結合抗体分子を提供する。
【０００９】
ある特定の態様において、ＶＨ−Ａは、ＶＬ−Ａに連結して、抗原Ａに対する特異性を有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ  Ａ）を形成し、ＶＨ−Ｂは、ＶＬ−Ｂに連結して、抗原Ｂに対する特異性を有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ  Ｂ）を形成する。
【００１０】
一態様において、本発明は、複数抗原結合抗体分子であって、ペプチドリンカー１により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）と、ペプチドリンカー２により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）とを含み、複数抗原結合抗体は、定常領域を有さず、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含み、ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つを含む、複数抗原結合抗体分子を提供する。
【００１１】
ある特定の態様において、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトは、ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ｂ方向またはＶＨ−Ｂ−（リンカー１）−ＶＬ−Ａ方向にある。他の態様において、ＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトは、ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ａ方向またはＶＨ−Ａ−（リンカー２）−ＶＬ−Ｂ方向にある。
【００１２】
別の態様において、ＶＬ−ＡまたはＶＬ−Ｂは、配列番号６の配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するフレームワーク配列を含む。
【００１３】
別の態様において、ＶＨ−ＡまたはＶＨ−Ｂは、配列番号７の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するフレームワーク配列を含む。
【００１４】
別の態様において、ＶＬ−Ａ／ＶＨ−ＢおよびＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトのうちの少なくとも１つは、ヒトＶｋａｐｐａ１ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶｌａｍｂｄａ１ファミリー軽鎖可変領域、またはヒトＶｋａｐｐａ３ファミリー軽鎖可変領域を含む。
【００１５】
別の態様において、ＶＬ−Ａ／ＶＨ−ＢおよびＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトのうちの少なくとも１つは、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖可変領域、ヒトＶＨ１ａファミリー重鎖可変領域、またはヒトＶＨ１ｂファミリー重鎖可変領域を含む。
【００１６】
別の態様において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ウサギ目からのＣＤＲを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、複数抗原結合抗体であって、
ａ）ペプチドリンカー３により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してｓｃＦｖ−Ａを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）を含む、単鎖抗体と、
ｂ）ペプチドリンカー３により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してｓｃＦｖ−Ｂを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）を含む、単鎖抗体と
を含み、ｓｃＦｖ−Ａは、ペプチドリンカー１によりｓｃＦｖ−Ｂに連結され、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含み、ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つを含む、複数抗原結合抗体を提供する。
【００１８】
一態様において、本発明の複数の抗原結合抗体は、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ａ−リンカーＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ｂ構成の、抗原Ａに対する特異性を有する単鎖抗体および抗原Ｂに対する特異性を有する単鎖抗体を含む。好ましい態様において、リンカーは、２０個のアミノ酸を有する。別の好ましい態様において、リンカーは、配列番号４の配列を有する。
【００１９】
さらに別の態様において、本発明は、複数抗原結合抗体分子であって、ウサギ目からのＣＤＲと、ペプチドリンカー１により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）と、ペプチドリンカー２により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）とを含み、重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置２４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置２５にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置５６にアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、ＡＨｏ位置８２にリシン（Ｋ）、ＡＨｏ位置８４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置８９にバリン（Ｖ）、およびＡＨｏ位置１０８にアルギニン（Ｒ）の少なくとも３つを含む、複数抗原結合抗体分子を提供する。ある特定の態様において、そのような抗体は、可変軽鎖ドメインの少なくとも１つにおいて、ＡＨｏ位置１にグルタミン酸（Ｅ）、ＡＨｏ位置３にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置４にロイシン（Ｌ）、ＡＨｏ位置１０にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置４７にアルギニン（Ｒ）、ＡＨｏ位置５７にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置９１にフェニルアラニン（Ｆ）および／またはＡＨｏ位置１０３にバリン（Ｖ）をさらに含む。
【００２０】
本発明の具体的な好ましい実施形態は、以下のある特定の好ましい実施形態のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
複数抗原結合抗体分子であって、
ａ）１つは抗原Ａに対する特異性を有し（ＶＨ−Ａ）、１つは抗原Ｂに対する特異性を有する（ＶＨ−Ｂ）、２つの重鎖可変ドメインと、
ｂ）１つは抗原Ａに対する特異性を有し（ＶＬ−Ａ）、１つは抗原Ｂに対する特異性を有する（ＶＬ−Ｂ）、２つの軽鎖可変ドメインと
を含み、前記２つの重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンもしくはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンもしくはトレオニンのうちの少なくとも１つを含み、ならびに／または
前記２つの軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含む、複数抗原結合抗体分子。
（項目２）
ＶＨ−Ａは、ペプチドリンカー１によりＶＬ−Ｂに連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトを形成し、ＶＨ−Ｂは、ペプチドリンカー２によりＶＬ−Ａに連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目３）
前記ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトが、ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ｂ方向にある、項目２に記載の複数抗原結合抗体。
（項目４）
前記ＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトが、ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ａ方向にある、項目２に記載の複数抗原結合抗体。
（項目５）
ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ１〜１０個のアミノ酸を有する、項目２に記載の複数抗原結合抗体。
（項目６）
ペプチドリンカー１は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を有し、ペプチドリンカー２は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を有する、項目５に記載の複数抗原結合抗体。
（項目７）
ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトは、ペプチドリンカー３によりＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトにさらに連結している、項目２に記載の複数抗原結合抗体。
（項目８）
ペプチドリンカー３は、１０〜３０個のアミノ酸を有する、項目７に記載の複数抗原結合抗体。
（項目９）
ペプチドリンカー３は、（ＧＧＧＧＳ）４  （配列番号４）の配列を有する、項目８に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１０）
ＶＨ−Ａ−配列番号１−ＶＬ−Ｂ−配列番号４−ＶＨ−Ｂ−配列番号１−ＶＬ−Ａ構成を有する、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１１）
前記ＶＨ−Ａは、ＶＬ−Ａに連結して、抗原Ａに対する特異性を有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ  Ａ）を形成し、ＶＨ−Ｂは、ＶＬ−Ｂに連結して、抗原Ｂに対する特異性を有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ  Ｂ）を形成する、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１２）
前記ｓｃＦｖ−Ａは、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ａ−リンカー３−ＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ｂ構成でｓｃＦｖ−Ｂに連結している、項目１１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１３）
前記リンカー３は、配列番号４の配列を有する、項目１２に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１４）
前記２つの軽鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ヒトＶｋａｐｐａ１ファミリー軽鎖可変領域であるか、またはそれから得られる、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１５）
前記２つの重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖可変領域であるか、またはそれから得られる、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１６）
前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインは、ウサギ目からのＣＤＲを含む、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１７）
ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−Ｂは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを含む、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１８）
ＶＬ−Ａおよび／またはＶＬ−ＢのＡＨｏ位置５０の前記アルギニンは、置換により導入される、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目１９）
ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−ＢのＡＨｏ位置１２のセリン、ＡＨｏ位置１０３のセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４のセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つは、置換により導入される、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目２０）
二価である、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目２１）
二重特異性である、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目２２）
前記重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置２４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置２５にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置５６にアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、ＡＨｏ位置８２にリシン（Ｋ）、ＡＨｏ位置８４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置８９にバリン（Ｖ）、およびＡＨｏ位置１０８にアルギニン（Ｒ）の少なくとも３つを含む、項目１に記載の複数抗原結合抗体。
（項目２３）
項目１に記載の複数抗原結合抗体を含む、薬学的組成物。
（項目２４）
疾患の診断および／または治療のための、項目１に記載の複数抗原結合抗体の使用。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において示される詳細は、例であり、本発明の好ましい実施形態の例示的な考察のみを目的とし、本発明の様々な実施形態の原理および概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示される。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはしないが、説明を図面および／または例と併せれば、本発明のいくつかの形態がどのようにして実践において具現化され得るかが、当業者に明らかとなる。
【００２２】
本発明がより容易に理解され得るようにするために、ある特定の用語が以下のように、また発明を実施するための形態の全体を通して記載されるように定義される。定義および説明は、以下の例において明確および明瞭に変更されない限り、または意味の適用によりいかなる解釈も無意味となる、もしくは本質的に無意味となる場合でない限り、今後のいかなる解釈にも優先されることを意図し、目的とする。用語の解釈が無意味となる、または本質的に無意味となる場合、定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎまたは当業者に知られている辞書、例えばＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００４）から採用されるべきである。
【００２３】
本発明の全般的な目的は、治療用途に好適な複数の抗原に結合することができる抗体を提供することである。本明細書において初めて説明されるように、そのような抗体の特性は、ある特定のアミノ酸が軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにおける特定の位置に存在する場合、改善され得る。そのような改善された特性は、例えば、増加した安定性、産生収率、および純度を含む。
【００２４】
したがって、本発明は、複数の抗原に結合する抗体であって、
ａ）ペプチドリンカー１により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）と、
ｂ）ペプチドリンカー２により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）と
を含み、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置４７および／または５０にアルギニンを含み、ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンもしくはトレオニン、および／またはＡＨｏ位置１４４にセリンもしくはトレオニンを含む抗体を提供する。一実施形態において、ＶＬは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含み、ＶＨは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを含む。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、定常ドメインを有さない複数抗原結合抗体、例えばｓｃＦｖ抗体である。
【００２６】
「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーにより接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）を含む分子を指し、定常ドメインを有さない。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造ＮＨ２−ＶＬ−リンカーＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカーＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。好適なリンカーは、本明細書に記載され、また当業者に知られており、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１０／００６４５４に記載のリンカーを含む。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「複数抗原結合抗体」は、少なくとも４つの可変ドメインを有する抗体であり、異なる標的分子の２つ以上の抗原（例えば二重特異性抗体）または同じ標的分子の２つ以上の抗原（例えば二価抗体）に結合し得る。本発明の複数抗原結合抗体の形態は、当業者に知られているように、二特異性抗体、単鎖二特異性抗体、およびタンデム抗体を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
「二重特異性抗体」は、本明細書において使用される場合、２つの異なる標的分子に結合し得る抗体である。
【００２９】
「二価抗体」は、本明細書において使用される場合、１つの標的分子の２つの異なる部位に結合し得る抗体である。
【００３０】
ある特定の実施形態において、本発明の複数抗原結合抗体のＶＬは、本明細書において複数抗原結合抗体構成の安定性を改善することが示されている少なくとも１つの特定の位置において少なくとも１つの特定のアミノ酸を含み、本発明の複数抗原結合抗体のＶＨは、本明細書において複数抗原結合抗体構成の安定性を改善することが示されている３つの特定の位置のうちの少なくとも１つにおいて３つの特定のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態において、ＶＬにおける位置は、ＡＨｏ位置５０および／またはＡＨｏ位置４７であり、前記位置（複数を含む）のアミノ酸は、アルギニンである。別の特定の実施形態において、ＶＨにおける位置は、ＡＨｏ位置１２、１０３、および１４４であり、前記位置の好ましいアミノ酸は、ＡＨｏ位置１２におけるセリン、ＡＨｏ位置１０３におけるセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４におけるセリンまたはトレオニンである。好ましい実施形態において、ＶＨにおけるアミノ酸は、ＡＨｏ位置１２におけるセリン、ＡＨｏ位置１０３におけるトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４におけるトレオニンである。ある特定の実施形態において、これらの好ましいアミノ酸は、特定された位置（複数を含む）における自然発生アミノ酸の置換により、ＶＬおよび／またはＶＨに導入され得る。
【００３１】
ＡＨｏ付番方式は、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．  （２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０９：６５７−６７０）においてさらに説明されている。代替的に、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）によりさらに説明されているＫａｂａｔ付番方式が使用されてもよい。抗体重鎖および軽鎖可変領域におけるアミノ酸残基位置を特定するために使用される２つの異なる付番方式の変換表は、Ａ．  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  ２００１，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３０９：６５７−６７０に記載されている。ＶＬにおけるＡＨｏ位置４７の対応するＫａｂａｔ番号は、３９である。ＶＬにおけるＡＨｏ位置５０の対応するＫａｂａｔ番号は、４２である。ＶＨにおけるＡＨｏ位置１２の対応するＫａｂａｔ番号は、１１である。ＶＨにおけるＡＨｏ位置１０３の対応するＫａｂａｔ番号は、８９である。ＶＨにおけるＡＨｏ位置１４４の対応するＫａｂａｔ番号は、１０８である。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される好ましい位置に好ましいアミノ酸の１つ以上を含み、また、少なくとも２つの抗体、または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、それらの抗体断片の結合特異性を含む、複数抗原結合抗体を提供する。そのような抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体またはその任意の最小断片、例えばＦｖまたはＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号（その内容は参照により明示的に組み込まれる）に記載のような単鎖コンストラクトであってもよい。ある特定の実施形態において、そのような複数抗原結合抗体は、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを有する少なくとも１つのＶＬ、ならびにＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンを有する少なくとも１つのＶＨを含む。
【００３３】
リンカーおよびＶＨ／ＶＬコンストラクト
本明細書において使用される場合、「ペプチドリンカー１」および「ペプチドリンカー２」は、ＶＨ／ＶＬコンストラクトで可変ドメインを互いに、または１つ以上のｓｃＦｖコンストラクトを互いに接続するリンカーペプチドを指す。「ＶＨ／ＶＬコンストラクト」は、特定の抗原に結合するＣＤＲを有するＶＨドメイン、および異なる抗原に結合するＣＤＲを有するＶＬドメインを含む、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−ＢもしくはＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクト、または、特定の抗原に結合するＣＤＲを有するＶＨドメイン、および同じ抗原に結合するＣＤＲを有するＶＬドメインを含む、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−ＡもしくはＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ｂコンストラクトであってもよい。そのようなコンストラクトの形態は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬまたはＶＬ−Ｌ−ＶＨ（式中、Ｌは、ペプチドリンカー１または２である）であってもよい。そのようなペプチドリンカーは、好ましくは、約２０アミノ酸以下の長さである。特に、そのようなペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の長さである。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、３〜７アミノ酸の長さである。ペプチドリンカー１および／またはペプチドリンカー２の好ましいリンカー配列は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）である。本発明の複数抗原結合抗体におけるペプチドリンカー１および／またはペプチドリンカー２として有用な他のリンカー配列は、ＧＧＳおよびＧＧＧＧＧＧＳ（配列番号２）を含む。ある特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬコンストラクトは、単鎖抗体であってもよい。単鎖抗体におけるリンカーは、当該技術分野において知られている。好ましくは、本発明の抗体における好ましい抗原に結合するＶＨおよびＶＬドメインを連結する単鎖抗体のリンカーは、例えば以下に示される配列番号４の配列を有する、２０アミノ酸までであってもよい。
【００３４】
ある特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬコンストラクトは、ペプチドリンカー３により別のＶＨ／ＶＬコンストラクトに接続される。他の実施形態において、ＶＨ／ＶＬコンストラクトにおける可変ドメインは、ペプチドリンカー３により互いに接続される。ペプチドリンカー３は、好ましくは、約１０アミノ酸超および約３０アミノ酸未満の長さである。特に、ペプチドリンカー３は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の長さである。ある特定の実施形態において、ペプチドリンカー３は、１０〜１５アミノ酸の長さである。ペプチドリンカー３の好ましいリンカー配列は、ＧＳＤＳＮＡＧＲＡＳＡＧＮＴＳ（配列番号３）である。ペプチドリンカー３の別の好ましいリンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号４）である。保存的変化（例えば置換）が、本発明の複数抗原結合抗体の活性および好ましい特性に影響することなくリンカー配列に形成され得ることが、当業者に理解される。
【００３５】
ある特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬコンストラクトは、ＶＨ−Ａ−（リンカー１または２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＨ−Ｂ−（リンカー１または２）−ＶＬ−Ａ；ＶＨ−Ａ−（リンカー１または２）−ＶＬ−Ａ；ＶＨ−Ｂ−（リンカー１または２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ａ；ＶＬ−Ｂ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ｂの構成の１つであってもよい。ＶＨ／ＶＬコンストラクト内のＶＨおよびＶＬドメインの他の方向が、当業者に企図され得る。例えば、ＶＬ−Ａ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ｂ、ＶＬ−Ｂ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ａ、ＶＬ−Ａ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ａ、ＶＬ−Ｂ−（リンカー１または２）−ＶＨ−Ｂである。特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬコンストラクトがペプチドリンカー３により接続される場合、ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ａ−（リンカー３）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー３）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ａ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー３）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＨ−Ａ、ＶＬ−Ａ−（リンカー１）−ＶＨ−Ａ−（リンカー３）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＨ−Ｂの構成の１つが形成され得る。本明細書において特定される構成は、限定されない例であり、当業者は、コンストラクトが生成され適切に折り畳まれる時に標的抗原の結合が達成される限り、様々な他の方向でＶＨおよびＶＬドメインを配置することができることが、容易に理解されるはずである。
【００３６】
一態様において、本発明の複数の抗原結合抗体は、ＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ａ−リンカー３−ＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ｂ構成の、抗原Ａに対する特異性を有する単鎖抗体および抗原Ｂに対する特異性を有する単鎖抗体を含み、リンカー３は、配列番号４の配列を有する。
【００３７】
一実施形態において、本発明の複数抗原結合抗体の好ましい構成は、ＶＨ−Ａ−配列番号１−ＶＬ−Ｂ−配列番号４−ＶＨ−Ｂ−配列番号１−ＶＬ−Ａである。
【００３８】
代替的に、本発明のＶＨ／ＶＬコンストラクトは、（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはその他により）互いに機能的に連結して、複数抗原結合抗体を形成し得る。
【００３９】
本発明は、複数の抗原に結合する抗体を提供する。本明細書に記載のように、そのような抗体は、異なる標的分子に結合し得る（例えば、少なくとも２つの異なるタンパク質に対する特異性を有する二重特異性抗体）か、または同じ標的分子上の異なるエピトープに結合し得る（例えば、同じタンパク質に対する特異性を有するが、そのタンパク質上の２つ以上の結合部位に結合する二価抗体）。具体的な標的分子（複数を含む）は、当業者により必要性に応じて選択され得る。
【００４０】
限定ではなく例として、本発明は、本明細書における実施例に記載のように、ＶＥＧＦおよびＴＮＦαに対する特性を有する二重特異性抗体を提供する。そのような抗体は、ＶＥＧＦおよびＴＮＦαを阻害することが望ましい疾患を治療するのに有用である。
【００４１】
ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／ＴＮＦα抗体は、加齢黄斑変性、脈絡膜血管新生、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維増殖症、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、昏睡、男化腫瘍、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭部および頸部の癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、膠芽細胞腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に付随する異常血管増殖、浮腫（脳腫瘍に付随するもの等）、メグズ症候群、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、一般的な炎症の慢性および／または自己免疫性状態、一般的な免疫介在性炎症性障害、炎症性ＣＮＳ疾患、目、関節、皮膚、粘膜、中枢神経系、胃腸管、尿路または肺に影響する炎症性疾患、一般的なブドウ膜炎の状態、網膜炎、ＨＬＡ−Ｂ２７＋ブドウ膜炎、ベーチェット病、乾性眼症候群、緑内障、シェーグレン症候群、糖尿病（糖尿病性神経障害を含む）、インスリン耐性、一般的な関節炎の状態、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎およびライター症候群、若年性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎疾患、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、化膿性汗腺炎、脂肪織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化過剰症および骨炎）、座瘡、スイート症候群、天疱瘡、クローン病（腸外兆候を含む）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、過敏性肺炎、一般的なアレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェゲナー肉芽腫症、川崎症候群、巨細胞性動脈炎、チャーグ−ストラウス血管炎、結節性多発動脈炎、熱傷、移植片対宿主病、宿主対移植片反応、臓器または骨髄移植後の拒絶反応の発現、一般的な血管炎の全身および局所的状態、全身性および円板状エリテマトーデス、多発性筋炎および皮膚筋炎、強皮症、子癇前症、急性および慢性膵臓炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、眼科手術（例えば水晶体手術（眼のレンズ置換術）または緑内障手術）後等の術後炎症、関節手術（関節鏡視下手術を含む）、関節関連構造の手術（例えば靭帯）、口腔および／または歯科手術、低侵襲的心臓血管手技（例えば、ＰＴＣＡ、アテローム切除術、ステント留置）、腹腔鏡下および／または内視鏡下腹腔内および婦人科手技、内視鏡下泌尿器科手技（例えば、前立腺手術、尿道鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）、または一般的な手術前後の炎症（予防）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルト−ヤコブ病の治療に使用され得る。癌関連骨溶解、癌関連炎症、癌関連疼痛、癌関連悪液質、骨転移、ＴＮＦαの中心または周縁作用によりもたらされるか否か、および疼痛の炎症性、侵害性または神経障害性形態に分類されるか否かに関わらない、疼痛の急性および慢性形態、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、��合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、局所的疼痛状態、転移腫瘍による慢性疼痛症候群、月経困難症。細菌、ウイルスまたは真菌性敗血症、結核、ＡＩＤＳ、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、高血圧、脂質異常症、心不全および慢性心不全。
【００４２】
本発明の抗体のその特異的標的抗原への結合は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、または免疫ブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、一般的に、関心のある複合体に特異的な標識化された試薬（例えば抗体）を使用することにより、特に関心のあるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。代替的に、複合体は、様々な他の免疫測定法のいずれかを使用して検出され得る。例えば、抗体は、放射活性物質で標識化され、放射免疫測定法（ＲＩＡ）において使用されてもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｍａｒｃｈ，  １９８６を参照されたい）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用等の手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出され得る。
【００４３】
本発明の抗体は、治療および診断目的を含むいくつかの目的に有用である。
【００４４】
ＶＬおよびＶＨドメインの特性
ある特定の実施形態において、本発明の複数抗原結合抗体のＶＬおよびＶＨは、ヒト抗体、非ヒト抗体（例えば、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、ウサギ目、または任意の他の好適な動物において産生された抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体等からのＣＤＲを含む。特定の実施形態において、ＣＤＲは、ウサギ目からのものである。
【００４５】
「ウサギ目」という用語は、ウサギ科（例えば野ウサギ（ｈａｒｅ）およびウサギ（ｒａｂｂｉｔ））、およびナキウサギ科（ナキウサギ（ｐｉｋａ））を含む、分類学上のウサギ目のメンバーを指す。最も好ましい実施形態において、ウサギ目は、ウサギである。「ウサギ」という用語は、本明細書において使用される場合、ウサギ科に属する動物を指す。
【００４６】
「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域の１つを指す。６つのＣＤＲに対して最も一般的に使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２）により提供された。いくつかの場合において、ＫａｂａｔによるＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲ  Ｈ２、ＣＤＲ  Ｈ３またはＨ２、Ｈ３）に対してのみ適用することができ、一方重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲ  Ｈ１またはＨ１）は、以下の残基により定義される（Ｋａｂａｔ付番）：  重鎖のＣＤＲ１は、位置２６から開始し、位置３６の前で終了する。この定義は、基本的に、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａにより異なって定義されるようなＣＤＲ  Ｈ１の融合である。
【００４７】
一実施形態において、本発明の複数抗原結合ｓｃＦｖ抗体のＶＬは、以下の配列（配列番号５）に対して少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは９９％の同一性を有する配列を含む。
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＫＬＬＩＹ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ  
【００４８】
別の実施形態において、本発明のＶＨ複数抗原結合ｓｃＦｖ抗体は、以下の配列（配列番号６）に対して少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、より好ましくは９９％の同一性を有する配列を含む。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（Ｘ）ｎ＝１−５０  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００４９】
本明細書において使用される場合、Ｘ残基は、ＣＤＲ挿入部位である。Ｘは、任意の自然発生アミノ酸であってもよく、少なくとも３つおよび最大５０個のアミノ酸が存在し得る。配列番号５および配列番号６のフレームワーク配列は、Ｘ残基を有さない配列であると理解される。
【００５０】
本発明の複数抗原結合抗体において有用な好適な抗体フレームワークは、ヒトＶｋａｐｐａ１ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶｌａｍｂｄａ１ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶｋａｐｐａ３ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖可変領域、ヒトＶＨ１ａファミリー重鎖可変領域、およびヒトＶＨ１ｂファミリー重鎖可変領域を含むがこれらに限定されず、軽鎖可変領域は、（例えば自然発生アミノ酸の置換により）ＡＨｏ位置４７および／または５０にアルギニンを有する、または有するように操作されており、重鎖可変領域は、（例えば自然発生アミノ酸の置換により）ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンを有する、または有するように操作されている。
【００５１】
本発明の複数抗原結合抗体を生成するために使用され得るフレームワークの限定されない例は、参照により全内容が組み込まれる国際特許出願ＷＯ２００８／００４８３４、国際特許出願ＷＯ  ２００９／１５５７２６、および国際特許出願ＷＯ０３／０９７６９７に開示されているフレームワークを含む。そのような例において、軽鎖可変領域は、ＡＨｏ位置４７および／または５０にアルギニンを含むように修飾されてもよく、重鎖可変領域は、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンもしくはトレオニン、および／またはＡＨｏ位置１４４にセリンもしくはトレオニンを含むように修飾されてもよい。
【００５２】
「抗体フレームワーク」または「フレームワーク」という用語は、本明細書において使用される場合、可変ドメインＶＬまたはＶＨの一部を指し、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の骨格として機能する。本質的に、これは、ＣＤＲを有さない可変ドメインである。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「同一性」は、２つのポリペプチド、分子、または２つの核酸の間の配列の一致を指す。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占有される場合、または、２つのポリペプチドのそれぞれにおける位置がリシンにより占有される場合）、それぞれの分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の「同一性パーセント」は、２つの配列により共有される一致する位置の数を比較される位置の数で除し、１００を乗じた関数である。例えば、２つの配列における１０個の位置のうち６個が一致する場合、２つの配列は６０％の同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６つの全位置のうち３つが一致する）。一般に、２つの配列が最大同一性を与えるように整列された時に比較がなされる。そのような整列は、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．）等のコンピュータプログラムにより便利に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３−４５３の方法を使用して提供され得る。また、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ４：１１−１７  （１９８８））のアルゴリズムを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびにギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ加重１、２、３、４、５、または６を用い、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３  （１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５４】
一実施形態において、本発明の複数抗原結合抗体は、ウサギ目ＣＤＲと、ＡＨｏ位置２４におけるトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置２５におけるバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置５６におけるアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、ＡＨｏ位置８２におけるリシン（Ｋ）、ＡＨｏ位置８４におけるトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置８９におけるバリン（Ｖ）、およびＡＨｏ位置１０８におけるアルギニン（Ｒ）のうちの、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つを含む１つ以上の重鎖可変ドメインとを含む。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の複数抗原結合抗体は、ウサギ目ＣＤＲと、可変軽鎖ドメインの少なくとも１つにおいて、ＡＨｏ位置１にグルタミン酸（Ｅ）、ＡＨｏ位置３にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置４にロイシン（Ｌ）、ＡＨｏ位置１０にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置４７にアルギニン（Ｒ）、ＡＨｏ位置５７にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置９１にフェニルアラニン（Ｆ）および／またはＡＨｏ位置１０３にバリン（Ｖ）とを含む。
【００５６】
核酸分子およびベクター
一実施形態において、本発明は、本発明の複数抗原結合ｓｃＦｖ抗体の生成のための核酸分子を含む。
【００５７】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作用可能に連結」する。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作用可能に連結する。ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の抗体、本発明の可変軽鎖、および／または本発明の可変重鎖をコードする単離核酸分子を提供する。
【００５８】
一実施形態において、本発明の核酸分子は、本明細書に記載のような１つ以上のＶＨ／ＶＬコンストラクトをコードする。例えば、本発明の核酸分子は、ＶＨ−Ａ−（リンカー１もしくは２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＨ−Ｂ−（リンカー１もしくは２）−ＶＬ−Ａ；ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー３）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ａ；ＶＨ−Ａ−（リンカー１もしくは２）−ＶＬ−Ａ；ＶＨ−Ｂ−（リンカー１もしくは２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＨ−Ａ−（リンカー１）−ＶＬ−Ａ−（リンカー３）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＬ−Ｂ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１もしくは２）−ＶＨ−Ｂ、ＶＬ−Ｂ−（リンカー１もしくは２）−ＶＨ−Ａ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１）−ＶＨ−Ｂ−（リンカー３）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＨ−Ａ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１もしくは２）−ＶＨ−Ａ、ＶＬ−Ｂ−（リンカー１もしくは２）−ＶＨ−Ｂ；ＶＬ−Ａ−（リンカー１）−ＶＨ−Ａ−（リンカー３）−ＶＬ−Ｂ−（リンカー２）−ＶＨ−Ｂ；または当業者により企図される任意の他の方向の構成の１つでＶＨ／ＶＬコンストラクトをコードする。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターを含む。
【００６０】
「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、追加的なＤＮＡ断片がライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、そこでは追加のＤＮＡ断片がウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、複製の細菌源を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合されてもよく、それにより宿主ゲノムと共に複製される。そのような発現ベクターおよび発現産物を単離する方法は、当業者に一般的に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９に記載されている。
【００６１】
「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入されている細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物細胞を含み得る。軽質転換を受けやすい細菌は、エンテロバクター属、例えば大腸菌またはサルモネラの菌種；バシラス属、例えば枯草菌；肺炎球菌属；連鎖球菌属、およびインフルエンザ菌のメンバーを含む。好適な微生物は、サッカロマイセス・セレビシアエおよびピキア・パストリスを含む。好適な動物宿主細胞株は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）およびＮＳ０細胞を含む。
【００６２】
複数抗原に結合する抗体を調製するためのある特定の方法は、例えば、参照によりその全内容が明示的に組み込まれる米国特許第７，８３８，６３７号および米国特許第７，１２９，３３０号に記載されている。
【００６３】
本発明の抗体は、組み換え遺伝子の分野における日常的な技術を使用して生成され得る。ポリペプチドの配列を知れば、それらをコードするｃＤＮＡを、当該技術分野において周知の方法による遺伝子合成によって生成することができる。これらのｃＤＮＡは、好適なベクタープラスミドにクローニングされ得る。
【００６４】
本発明の抗体は、開示される配列からなるのではなく、それらを含むことを理解されたい。例えば、クローニング戦略は、Ｎ末端に１つまたはいくつかの追加的残基を有する抗体が存在するコンストラクトが作製されることを必要とし得る。具体的には、開始コドンから得られたメチオニンは、翻訳後に切断されていない場合、最終タンパク質に存在し得る。ｓｃＦｖ抗体に対するほとんどのコンストラクトは、Ｎ末端に追加的アラニンを形成する。
【００６５】
薬学的組成物
ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１種の生理学的に許容される担体または賦形剤と共に、１つ以上の本発明の複数抗原結合抗体を含む、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、例えば、水、緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水）、エタノール、鉱物油、植物油、ジメチルスルホキシド、炭水化物、（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、アジュバント、ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸、酸化防止剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン等のキレート剤、および／または保存剤を含んでもよい。
【００６６】
担体は、多くは化合物の安定性またはバイオアベイラビリティを制御することを目的とした、患者への投与前に抗体と関連し得る物質である。そのような製剤中での使用のための担体は、一般に生体適合性であり、また生分解性であってもよい。担体は、例えば、一価または多価分子、例えば血清アルブミン（例えば、ヒトまたはウシ）、卵アルブミン、ペプチド、ポリリシン、ならびにアミノデキストランおよびポリアミドアミン等の多糖類を含む。担体はまた、例えば、ポリラクテートポリグリコレート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロースまたはデキストランを含む、ビーズおよび微小粒子等の固体支持材料を含む。担体は、共有結合（直接またはリンカー基を介して）、非共有結合的相互作用またはその混合を含む、様々な手法で化合物を保持し得る。
【００６７】
薬学的組成物は、例えば、眼内、鼻腔内、耳内、舌下、経皮、局所的、経口、経鼻、経直腸または非経口投与を含む、任意の適切な投与様式用に製剤化され得る。ある特定の実施形態において、経口用途に好適な形態の組成物が好ましい。そのような形態は、例えば、丸薬、錠剤、トローチ、ドロップ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル剤、またはシロップもしくはエリキシル剤を含む。さらに他の実施形態内において、本明細書において提供される組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよい。非経口という用語は、本明細書において使用される場合、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、くも膜下および腹腔内注射、ならびに任意の同様の注射または注入技術を含む。
【００６８】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、眼周囲、結膜、テノン嚢下、腔内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後方、または小管内注射等の眼組織注射により；カテーテルまたは他の留置デバイス、例えば網膜ペレット、眼内インサート、坐薬、または多孔質、非多孔質もしくはゼラチン状材料を含むインプラントを使用して眼に直接適用することにより；局所的点眼剤または軟膏により；あるいは、盲嚢内または強膜に隣接して（経強膜的）もしくは強膜の中（強膜内）もしくは眼内に移植された徐放デバイスにより、眼に直接送達され得る。腔内注射は、薬剤を小柱網に到達させるように角膜を通して前眼房内に行われてもよい。小管内注射は、シュレム管から、またはシュレム管へと排液する静脈集合路内に行われてもよい。
【００６９】
眼内送達のために、本発明の抗体は、眼科的に許容される保存剤、共溶媒、界面活性剤、粘度向上剤、浸透向上剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、または水と組み合わされて、水性無菌眼科用懸濁液または溶液を形成してもよい。局所眼科製品は、例えば複数用量形態で包装されてもよい。したがって、使用中の微生物汚染を防止するために、保存剤が必要となり得る。好適な保存剤は、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に知られた他の試薬を含む。そのような保存剤は、典型的には、０．００１％から１．０％ｗ／ｖのレベルで使用される。本発明の単位用量組成物は、無菌であるが、典型的には保存されない。したがって、そのような組成物は、一般に、保存剤を含有しない。
【００７０】
ある特定の実施形態において、眼に局所的に投与されることを意図した組成物は、点眼薬または眼軟膏剤として製剤化され、抗体の総量は、約０．００１％から１．０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０１％から約１．０％（ｗ／ｗ）である。
【００７１】
ある特定の状況における本発明の薬学的組成物は、局所投与用の溶液として投与される。製剤化の容易性、および、罹患した眼に溶液の１滴から２滴を注入することによりそのような組成物を容易に投与することができる患者の能力に基づき、水性溶液が一般に好ましい。しかしながら、組成物はまた、懸濁液、粘凋性もしくは半粘凋性ゲル、または他の種類の固体もしくは半固体組成物であってもよい。
【００７２】
経口用途を意図した薬学的組成物は、薬学的組成物の製造のための技術分野において知られた任意の方法に従って調製されてもよく、魅力的で味の良い調製物を提供するために、１種以上の薬剤、例えば甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤を含有してもよい。錠剤は、錠剤の製造に好適な生理学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。そのような賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）、造粒および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア）ならびに滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）を含む。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または、胃腸管における分解および吸収を遅延させ、それにより長期間にわたる持続作用を提供するために、既知の技術によりコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料が使用され得る。
【００７３】
油性懸濁液は、植物油（例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油）、または液体パラフィン等の鉱物油に、活性成分を懸濁させることにより製剤化され得る。油性懸濁液は、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコール等の増粘剤を含有してもよい。上記のような甘味剤、および／または香味剤が、味の良い経口用調製物を提供するために添加され得る。そのような懸濁液は、アスコルビン酸等の酸化防止剤の添加により保存され得る。
【００７４】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、分散または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存料と混合された活性成分を提供する。好適な分散または湿潤剤および懸濁剤は、すでに上で述べられたものにより例示される。また、追加の賦形剤、例えば甘味、香味および着色剤が存在してもよい。
【００７５】
また、薬学的組成物は、水中油エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油（例えば、オリーブ油もしくは落花生油）、鉱物油（例えば、液体パラフィン）、またはそれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、自然発生ガム（例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム）、自然発生ホスファチド（例えば、大豆、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトールから得られるエステルまたは部分エステル）、無水物（例えば、モノオレイン酸ソルビタン）、ならびに脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。また、エマルジョンは、１種以上の甘味および／または香味剤を含んでもよい。
【００７６】
薬学的組成物は、使用されるビヒクルおよび濃度に依存して、調節剤がビヒクル中に懸濁または溶解された、無菌注射用水性または油性懸濁液として調製され得る。そのような組成物は、既知の技術に従い、上述のもの等の好適な分散、湿潤剤および／または懸濁剤を使用して製剤化され得る。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液および等張食塩水がある。さらに、溶媒または懸濁化媒体として、無刺激不揮発性油が使用され得る。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の低刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸が注射用組成物の調製に使用されてもよく、局所麻酔薬、保存剤および／または緩衝剤等のアジュバントがビヒクルに溶解されてもよい。
【００７７】
薬学的組成物は、持続放出製剤（すなわち、投与後の調節剤の徐放に影響するカプセル等の製剤）として製剤化され得る。そのような製剤は、一般に、周知の技術を使用して調製され、例えば経口、経直腸、もしくは皮下埋め込みにより、または所望の標的部位への埋め込みにより投与され得る。そのような製剤中での使用のための担体は、生体適合性であり、また生分解性であってもよく、好ましくは、製剤は、比較的一定のレベルの調節剤放出を提供する。持続放出製剤中に含有される抗体の量は、例えば、埋め込みの部位、放出の速度および期待される期間、ならびに治療または予防されるべき疾患／障害の性質に依存する。
【００７８】
本明細書において提供される薬学的組成物は、好ましくは、標的分子（複数を含む）に検出可能に結合し、標的分子（複数を含む）に関連した疾患／障害を予防または阻害するために十分な体液（例えば、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、滑液、リンパ液、細胞間質液、涙液または尿）中の濃度を達成する量で投与される。用量は、認識可能な患者の利益をもたらす場合、効果的であるとみなされる。
【００７９】
本発明の抗体の適切な用量（「治療上効果的な量」）は、例えば、治療されるべき状態、状態の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、薬歴、患者の病歴および抗体に対する反応、使用される抗体の種類、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は、好適には、１回で、または一連の治療にわたり患者に投与され、診断以降の任意の時点で患者に投与され得る。抗体は、唯一の治療として、または問題の状態の治療に有用な他の薬物もしくは療法と併せて投与され得る。
【００８０】
一般的な提案として、投与される抗体の治療上効果的な量は、１回または複数の投与に関わらず、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲内であり、使用される抗体の典型的な範囲は、例えば、毎日投与される約０．３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．３から約１５ｍｇ／ｋｇである。しかしながら、他の投薬計画も有用となり得る。この療法の進行は、従来の技術により容易に監視される。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、本発明の薬学的組成物の水性薬学的製剤を保持し、随意に使用説明書を提供する容器を備える製造品が提供される。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、およびシリンジを含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成され得る。例となる容器は、３〜２０ｃｃの使い捨てガラスバイアルである。代替的に、複数用量製剤のために、容器は、３〜１００ｃｃのガラスバイアルであってもよい。容器は製剤を保持し、容器上またはそれに関連したラベルは、使用上の説明を示してもよい。製造品は、さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明書を有する添付文書を含む、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００８２】
ある特定の実施形態において、本発明は、以下を提供する。
１．複数抗原結合抗体分子であって、
ａ）ペプチドリンカー１により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）と、
ｂ）ペプチドリンカー２により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）と
を含み、複数抗原結合抗体は、定常ドメインを有さず、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含み、ならびに／またはＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つを含む、複数抗原結合抗体分子。
２．ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号５の配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
３．ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号６の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
４．ＶＬ−Ａ／ＶＨ−ＢおよびＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトのうちの少なくとも１つは、ヒトＶｋａｐｐａ１ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶｌａｍｂｄａ１ファミリー軽鎖可変領域、またはヒトＶｋａｐｐａ３ファミリー軽鎖可変領域を含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
５．ＶＬ−Ａ／ＶＨ−ＢおよびＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトのうちの少なくとも１つは、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖可変領域、ヒトＶＨ１ａファミリー重鎖可変領域、またはヒトＶＨ１ｂファミリー重鎖可変領域を含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
６．ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ウサギ目からのＣＤＲを含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
７．ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−Ｂは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを含む、１に記載の複数抗原結合抗体。
８．ＶＬ−Ａおよび／またはＶＬ−ＢのＡＨｏ位置５０のアルギニンは、置換により導入される、１に記載の複数抗原結合抗体。
９．ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−ＢのＡＨｏ位置１２のセリン、ＡＨｏ位置１０３のセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４のセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つは、置換により導入される、１に記載の複数抗原結合抗体。
１０．ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ１〜１０個のアミノ酸を有する、１に記載の複数抗原結合抗体。
１１．ＶＨ−Ａ／ＶＬ−ＢコンストラクトをＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトに連結するペプチドリンカー３をさらに含み、ペプチドリンカー３は、１０〜３０個のアミノ酸を有する、１に記載の複数抗原結合抗体。
１２．ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ３〜７個のアミノ酸を有し、ペプチドリンカー３は、１５〜２０個のアミノ酸を有する、１１に記載の複数抗原結合抗体。
１３．ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ５個のアミノ酸を有し、ペプチドリンカー３は、２０個のアミノ酸を有する、１２に記載の複数抗原結合抗体。１４．ペプチドリンカー１は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を含み、ペプチドリンカー２は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を含み、ペプチドリンカー３は、（ＧＧＧＧＳ）４  （配列番号４）の配列を含む、１３に記載の複数抗原結合抗体。
１５．ＶＨ−Ａ−配列番号１−ＶＬ−Ｂ−配列番号４−ＶＨ−Ｂ−配列番号１−ＶＬ−Ａ構成を有する、１４に記載の複数抗原結合抗体。
１６．二価である、１に記載の複数抗原結合抗体。
１７．二重特異性である、１に記載の複数抗原結合抗体。
１８．１に記載の複数抗原結合抗体を含む、薬学的組成物。
１９．疾患の診断および／または治療のための、１に記載の複数抗原結合抗体の使用。
２０．１に記載のＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトおよび／またはＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトをコードする核酸分子。
２１．２０に記載の核酸分子を含むベクター。
２２．２１に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
２３．１１に記載の抗体をコードする核酸分子。
２４．２３に記載の核酸分子を含むベクター。
２５．２４に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
２６．複数抗原結合抗体であって、
ａ）ペプチドリンカー３により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してｓｃＦｖ−Ａを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）を含む、単鎖抗体と、
ｂ）ペプチドリンカー３により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してｓｃＦｖ−Ｂを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）を含む、単鎖抗体と
を含み、ｓｃＦｖ−Ａは、ペプチドリンカー１によりｓｃＦｖ−Ｂに連結され、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置５０にアルギニンを含み、ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つを含む、複数抗原結合抗体。
２７．ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−Ｂは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
２８．ＶＬ−Ａおよび／またはＶＬ−ＢのＡＨｏ位置５０のアルギニンは、置換により導入される、２６に記載の複数抗原結合抗体。
２９．ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−ＢのＡＨｏ位置１２のセリン、ＡＨｏ位置１０３のセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４のセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つは、置換により導入される、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３０．ペプチドリンカー１は、１〜１０個のアミノ酸を有する、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３１．ペプチドリンカー３は、１０〜３０個のアミノ酸を有する、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３２．ペプチドリンカー１は、３〜７個のアミノ酸を有し、ペプチドリンカー３は、１５〜２０個のアミノ酸を有する、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３３．ペプチドリンカー１は、５個のアミノ酸を有し、ペプチドリンカー３は、１５個のアミノ酸を有する、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３４．ＶＬ−ＡまたはＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号６の配列に対して少なくとも６５％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３５．ＶＨ−ＡまたはＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号７の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３６．ｓｃＦｖ−ＡおよびｓｃＦｖ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ヒトＶｋａｐｐａ１ファミリー軽鎖可変領域、ヒトＶｌａｍｂｄａ１ファミリー軽鎖可変領域、またはヒトＶｋａｐｐａ３ファミリー軽鎖可変領域を含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３７．ｓｃＦｖ−ＡおよびｓｃＦｖ−Ｂのうちの少なくとも１つは、ヒトＶＨ３ファミリー重鎖可変領域、ヒトＶＨ１ａファミリー重鎖可変領域、またはヒトＶＨ１ｂファミリー重鎖可変領域を含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３８．ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ウサギ目からのＣＤＲを含む、２６に記載の複数抗原結合抗体。
３９．複数抗原結合抗体分子であって、
ａ）ウサギ目からのＣＤＲと；
ｂ）ペプチドリンカー１により抗原Ｂに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ｂ）に連結してＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトを形成する、抗原Ａに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ａ）と、
ｃ）ペプチドリンカー２により抗原Ａに対する特異性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ−Ａ）に連結してＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトを形成する、抗原Ｂに対する特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ−Ｂ）と；
ｄ）ＶＨ−Ａ／ＶＬ−ＢコンストラクトをＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトに連結する、１０〜３０個のアミノ酸を有するペプチドリンカー３とを含み、重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置２４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置２５にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置５６にアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）、ＡＨｏ位置８２にリシン（Ｋ）、ＡＨｏ位置８４にトレオニン（Ｔ）、ＡＨｏ位置８９にバリン（Ｖ）、およびＡＨｏ位置１０８にアルギニン（Ｒ）の少なくとも３つを含み、ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ１〜１０個のアミノ酸を有する、複数抗原結合抗体分子。
４０．ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号５の配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、３９に記載の複数抗原結合抗体。
４１．ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂのうちの少なくとも１つは、配列番号６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するフレームワーク配列を含む、３９に記載の複数抗原結合抗体。
４２．可変軽鎖ドメインのうちの少なくとも１つにおいて、ＡＨｏ位置１にグルタミン酸（Ｅ）、ＡＨｏ位置３にバリン（Ｖ）、ＡＨｏ位置４にロイシン（Ｌ）、ＡＨｏ位置１０にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置４７にアルギニン（Ｒ）、ＡＨｏ位置５７にセリン（Ｓ）、ＡＨｏ位置９１にフェニルアラニン（Ｆ）および／またはＡＨｏ位置１０３にバリン（Ｖ）をさらに含む、３９に記載の複数抗原結合抗体。
４３．重鎖可変ドメインの少なくとも１つは、ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つを含む、３９の複数抗原結合抗体。
４４．ＶＨ−Ａおよび／またはＶＨ−ＢのＡＨｏ位置１２のセリン、ＡＨｏ位置１０３のセリンまたはトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４のセリンまたはトレオニンのうちの少なくとも１つは、置換により導入される、４３に記載の複数抗原結合抗体。
４５．ペプチドリンカー１およびペプチドリンカー２は、それぞれ５個のアミノ酸を有する、３９に記載の複数抗原結合抗体。
４６．ペプチドリンカー３は、１５〜２０個のアミノ酸を有する、４５に記載の複数抗原結合抗体。
４７．ペプチドリンカー１は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を含み、ペプチドリンカー２は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）の配列を含み、ペプチドリンカー３は、（ＧＧＧＧＳ）４  （配列番号４）の配列を含む、４６に記載の複数抗原結合抗体。
４８．ＶＨ−Ａ−配列番号１−ＶＬ−Ｂ−配列番号４−ＶＨ−Ｂ−配列番号１−ＶＬ−Ａ構成を有する、４７に記載の複数抗原結合抗体。
４９．二価である、３９に記載の複数抗原結合抗体。
５０．二重特異性である、３９に記載の複数抗原結合抗体。
５１．３９に記載の複数抗原結合抗体を含む、薬学的組成物。
５２．疾患の診断および／または治療のための、３９に記載の複数抗原結合抗体の使用。５３．３９に記載のＶＨ−Ａ／ＶＬ−Ｂコンストラクトおよび／またはＶＨ−Ｂ／ＶＬ−Ａコンストラクトをコードする核酸分子。
５４．５３に記載の核酸分子を含むベクター。
５５．５４に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
【００８３】
本明細書全体を通して引用されるいかなる特許、特許出願および参考文献の内容も、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
文脈により別の意味が必要とされない限り、本明細書において使用される単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例により本開示をさらに説明するが、実施例はさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図ならびに全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
（実施例１）
【００８６】
ウサギ抗体から得られる二重特異性および二価抗体の分子設計、クローニングおよび発現。
二重特異性および二価抗体をコードするＤＮＡ配列を、デジタル遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド合成、続いて重複伸長技術を使用した得られた断片のアニーリングにより生成した。全ての配列は、大腸菌コドン使用頻度、ＧＣ含量、ｍＲＮＡ二次構造、コドンおよびモチーフ反復、ならびに制限酵素認識部位に関して最適化した。異なるアミノ酸リンカー（表１を参照されたい）を使用して、異なる特異性を有するウサギ抗体からのヒト化ＶＬおよびＶＨドメインを接続した。
【表１】
2019104759.tif 000002
【００８７】
標的分子に二重特異的および二価的に結合するように、複数抗原結合抗体を調製した。全ての分子を、Ｔ７ｌａｃプロモーター、細菌リボソーム結合部位、続いて抗体分子を含有する不溶性大腸菌発現用の発現ベクター中でクローニングした。それぞれの封入体発現プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、適切な抗生物質を含有するｄＹＴ培地中で３７℃で増殖させた。約２．０の吸収（Ａ６００）で、１ｍＭイソプロピル１−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド（最終濃度）の添加によりタンパク質発現を開始した。誘導から３時間後、大腸菌細胞を採取し、超音波照射により破壊し、洗浄および遠心分離ステップを繰り返すことにより封入体を単離した。
【００８８】
封入体を６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌの存在下でｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化し、２０ｍＭジチオスレイトールの添加により還元した。基本的なリフォールディングスクリーニングを行って、試験された条件の範囲から最善のｐＨ、酸化還元系（シスチン／システイン）、および塩濃度を選択した。実験室規模のリフォールディングプロセスに対し、それぞれの個々の抗体の最善の条件を使用した。５０倍体積のリフォールディング緩衝液への急速な希釈により、二重特異性または二価抗体タンパク質を復元した。上方濃縮およびＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に対する透析後、サイズ排除クロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製した。
（実施例２）
【００８９】
二価抗体の生成
インターロイキン２３（ＩＬ−２３）に結合する二価抗体を、ウサギ抗体の一般的グラフトのためのヒト骨格であるｒＦＷ１．４フレームワークの可変ドメインに基づいて生成した（国際公開第ＷＯ２００９／１５５７２６号に記載のように）が、これは本質的に全てのウサギ抗体に適合する。二特異性抗体、単鎖二特異性抗体、およびタンデム単鎖抗体を含む３つの構成を生成した。ヒトＩＬ−２３に結合することが示された抗体から、ＣＤＲを取り出した。ヘテロ二量体の形成をもたらす同じ細胞内のＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢおよびＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ構成の２つの断片の発現により、二特異性抗体（Ｄｂ）が得られ、コード配列の各１つの前に、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）がある。これらの分子において、リンカー１および２は、５アミノ酸であった（ＧＧＧＧＳ、配列番号１）。別の構成において、２つのポリペプチド鎖が、追加の中間リンカー（リンカー３）により融合され、単鎖二特異性抗体（ｓｃＤｂ）をコードする単一の遺伝子を生成し（ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ）、リンカー３は、１５アミノ酸からなっていた（ＧＳＤＳＮＡＧＲＡＳＡＧＮＴＳ、配列番号３）（Ｖoｌｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １４：８１５−８２３）。第３の構成であるタンデムｓｃＦｖ（ＴｄｓｃＦｖ）は、短い中間リンカー（ＧＧＧＧＳ、配列番号１）および長いリンカー３（（ＧＧＧＧＳ）４、配列番号４）により２つのｓｃＦｖを接続することにより生成され、ＶＬ−Ａ−リンカー３−ＶＨ−Ａ−リンカー１−ＶＬ−Ｂ−リンカー３−ＶＨ−Ｂのドメイン順序をもたらし、ＶＨ−ＡおよびＶＨ−Ｂ、ならびにＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂが同一である二価分子を生成した。
【００９０】
ｓｃＤｂ構成におけるフレームワーク領域に対する異なる特徴の効果を、産生能、安定性およびオリゴマーを形成する傾向に関して評価した。構成を表２に記載する。簡潔に述べると、分子＃１は、追加的な置換のないｓｃＤｂにおけるｒＦＷ１．４の可変ドメインからなっていた。分子＃２は、ＡＨｏ位置５０にアルギニンが両方のＶＬドメイン（ＶＬ−Ａ／−Ｂ）上に導入された＃１の変形であった。分子＃３もまた＃１に基づいていたが、両方のＶＨドメイン（ＶＨ−Ａ／−Ｂ）上に導入された３つの置換、具体的にはＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを有していた。分子＃１４は、両方のＶＬドメイン（ＶＬ−Ａ／−Ｂ）上のＡＨｏ位置５０のアルギニン、ならびに両方のＶＨドメイン（ＶＨ−Ａ／−Ｂ）上のＡＨｏ位置１２のセリン、ＡＨｏ位置１０３のトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４のトレオニンの置換を有する分子＃１からなっていた。比較を目的として、ヒト生殖系列抗体レパートリーのコンセンサス配列を使用して、追加のｓｃＤｂ（＃５）を生成した（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６）。フレームワーク領域は、ＨｕＣａｌと示される、ＶＨ３およびＶＬカッパ１サブタイプのコンセンサス配列に対応する。このヒト化ｓｃＤｂは、本明細書に記載の他の二価ｓｃＤｂにおいて使用された同じＣＤＲで生成され、したがって、差異は、フレームワーク領域にのみ位置する。
【表２】
2019104759.tif 000003
（実施例３）
【００９１】
二重特異性抗体の生成
１つの単一分子内に２つの異なる特異性を有するように、二重特異性単鎖二特異性抗体を設計した。元はＶＥＧＦ１６５およびＴＮＦαに対するウサギ抗体のヒト化により生成された２つの異なるｓｃＦｖ抗体からのＶＨおよびＶＬドメインを、可変領域遺伝子の源として使用し、ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ構成の単一断片を構築したが、Ａという標識が付された可変ドメインはＶＥＧＦ１６５に結合し、Ｂという標識を付された可変ドメインはＴＮＦαに結合する。ＶＥＧＦ１６５に結合する抗体は、以下のＶＬ配列：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＥＩＩＨＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡＮＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ、配列番号７；
および
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ配列番号８の配列を有するＶＨを有していた。
ＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを有するＶＨドメインの配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＧＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、配列番号９であった。
ＴＮＦαに結合する抗体は、
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＳＳＱＳＶＹＧＮＩＷＭＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＧＮＦＮＴＧＤＲＹＡＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ、配列番号１０のＶＬ配列；
および
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＩＳＲＳＹＷＩＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＣＩＹＧＤＮＤＩＴＰＬＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＧＹＡＤＹＡＹＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、配列番号１１の配列を有するＶＨを有していた。
【００９２】
二重特異性抗体は、実施例１に記載の標準的ＤＮＡ操作技術を使用して設計および構築した。フレームワーク領域に導入された異なるフレームワークの特徴、および異なるリンカーの組み合わせの効果を、異なる二重特異性ｓｃＤｂに対して評価し、表３に記載する。
【表３】
2019104759.tif 000004
【００９３】
５−２０−５のリンカーの組み合わせ、ならびにＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを有する発現したコンストラクトの配列は、以下の通りであった：
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＧＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＳＳＱＳＶＹＧＮＩＷＭＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＧＮＦＮＴＧＤＲＹＡＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＩＳＲＳＹＷＩＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＣＩＹＧＤＮＤＩＴＰＬＹＡＮＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＧＹＡＤＹＡＹＤＬＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＥＩＩＨＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡＮＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１２）。
（実施例４）
【００９４】
二重特異性および二価抗体の特性決定。
産生能  
不溶性発現タンパク質をリフォールディングし、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により精製した。得られたタンパク質を、培養培地１リットル当たりのｍｇとして、その精製タンパク質収率に基づき特性決定した。この値は、それぞれの分子の生産能の特徴的な測定値を与えた。純度は、リフォールディングされたタンパク質の精製後の試料の、可溶性凝集物を除くモノマー含量として定義した。分取用サイズ排除クロマトグラフィーにより純度を決定した。ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、モノマーおよび可溶性凝集物のピークを非モノマー種から分離した。モノマータンパク質のパーセンテージを、全生成物ピークの総面積で除したモノマーピークの面積として計算した。
【００９５】
熱安定性測定（ＦＴ−ＩＲ、ＤＳＣ）
分子を３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、通過物をブランク測定のために採取した。ＦＴ−ＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）読取値およびＤＳＣ（キャピラリ示差走査熱量測定）を行って、熱安定性を測定した。Ｔｅｎｓｏｒ  Ｂｒｕｋｅｒ機器においてＦＴ−ＩＲ  Ｂｉｏ−ＡＴＲ（減衰全反射）細胞を使用し、ＦＴ−ＩＲスペクトルを得た。分子を５℃ステップの熱勾配（２５℃から９５℃）で熱負荷することにより、二次構造の変化を示す変性プロファイルを得た。全てのスペクトル操作は、ＯＰＵＳソフトウェアを使用して行った。一時的な大気（ＣＯ２およびＨ２Ｏ）バックグラウンドおよびブランク試料に対して正規化を行った。次いで、得られたタンパク質スペクトルをベースライン補正し、タンパク質アミドＩスペクトルを、予期された領域における最も広い分解可能なピークの幅から決定した。平滑化関数と共に三次多項式関数を使用して、アミドＩバンドスペクトルに対し二次導関数スペクトルを得た。３回の低温測定に対し０％の変性タンパク質、および３回の高温測定に対し１００％の変性タンパク質を仮定して、最初の曲線フィッティング計算に線形補正曲線を使用したアミドＩ二次導関数分析により、タンパク質構造の変化を推定した。変性プロファイルを使用して、ボルツマンＳ字モデルを適用して全てのバリエーションに対し熱的アンフォールディング遷移の中間点（Ｔｍ）を近似した。ＤＳＣ測定もまた、試料を熱的にアンフォールディングさせた。示差走査熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌキャピラリＶＰ−ＤＳＣ）は、２００℃／時間の温度勾配を使用した。緩衝剤信号の基準低減およびμＭの各タンパク質濃度に対する正規化、続いてベースライン補正を行うことによりデータ分析を実行したが、全ての操作はＤＳＣのＭｉｃｒｏＣａｌソフトウェアで実行した。Ｔｍは、エネルギー取り込みのほとんどが生じた際の点に等しい温度であり、アンフォールディングの温度を示した。
【００９６】
短期安定性試験
可溶性凝集物および分解生成物に関し、４０℃で２週間のインキュベーションの前および後に、タンパク質を検査した。１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、および６０ｍｇ／ｍｌの所望濃度までタンパク質を濃縮した。タンパク質が所望濃度に達するために十分可溶性でない場合は、可能な限りの最高濃度を分析した。最高濃度は、さらなる濃縮が濃度を増加させることなく沈殿をもたらすのみとなった時に到達した。これらの試料を０日目および１４日目に分析した。１２．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、両方の時点で純度および出現する可能性のある分解バンドの分析を行った。インキュベーション期間の前および後に、可溶性のオリゴマー化および凝集物を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ）−ＨＰＬＣにより評価した。ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ２０００カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でモノマーを非モノマー種から分離し、モノマータンパク質のパーセンテージを、全生成物ピークの総面積で除したモノマーピークの面積として計算した。ナノドロップデバイスを使用して、波長２８０ｎｍでのＵＶ吸収測定により全濃度を決定した。このようにして、この短期安定性の試験は、溶解度、安定性、凝集およびオリゴマー化等の特性を評価した。
【００９７】
結果
ＩＬ２３に結合する二価分子：
ＩＬ−２３に二価的に結合する、異なるｓｃＦｖ様構成を試験した。これらの分子は、上記実施例２に記載のようにＩＬ−２３に結合するＶＨおよびＶＬドメインを含んでいた。全ての分子を、方法において説明されるように、それらの産生特性、熱安定性および短期安定性に従い特性決定した。
試験した構成は、特に以下を含んでいた。
分子＃１４：二特異性抗体（Ｄｂ）：ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢおよびＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ；（リンカー１および２＝配列番号１）；  
分子＃１５：単鎖二特異性抗体（ｓｃＤｂ）：ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ；（リンカー１および２＝配列番号１；リンカー３＝配列番号４）；  
分子＃１６：タンデムｓｃＦｖ（ＴｄｓｃＦｖ）：ＶＬＡ−リンカー３−ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ；（リンカー３＝配列番号４；リンカー１＝配列番号１）。
【００９８】
これらの構成の全てにおいて、ＶＬ−Ａおよび−Ｂは同一であり、ＶＨ−Ａおよび−Ｂは同一であり、したがって、ＩＬ−２３に結合する二価抗体を生成した。
【００９９】
細菌系におけるｓｃＤｂおよびＴｄｓｃＦｖ抗体の産生能は、しばしば、それらの比較的低い収率および凝集体を形成する傾向により制限される。しかしながら、評価した全ての構成は、精製された封入体からのリフォールディングにより効率的に産生された。リフォールディングされたタンパク質は、分取サイズ排除クロマトグラフィーによるその後の精製後には主にモノマーであった（表４を参照されたい）。ｄｓｃＦｖ  ＃１６は、最も高い収率を示したが、８９％という最も低い純度を示した。Ｄｂ  ＃１５およびｓｃＤｂ
＃１４は、同様の収率を有し、ｓｃＤｂは、ＳＥ−ＨＰＬＣによりモノマー含量として測定された最も高い純度を示した。
【表４】
2019104759.tif 000005
【０１００】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定すると、３つ全ての構成が約７３℃の同様のＴｍを示した。結果を表５に示す。
【表５】
2019104759.tif 000006
【０１０１】
ＦＴ−ＩＲにより測定されるＴｍにわずかな差が観察された（表６を参照されたい）。ＤＳＣ測定と一致して、これらの結果は、３つ全ての構成が熱的に安定であることを裏付けた。
【表６】
2019104759.tif 000007
【０１０２】
試料が４０℃で１４日間インキュベートされる短期安定性試験において、溶解度および安定性を試験した（表７を参照されたい）。Ｄｂ  ＃１５およびｓｃＤｂ  ＃１４は、最大約２０ｍｇ／ｍｌの濃度までのみ可溶であったが、それらは、１４日目に、まだ約９５％の高モノマー含量を維持した。これは、この短期間における高い安定性を反映していた。ＴｄｓｃＦｖ  ＃１６は、最大４０ｍｇ／ｍｌまで可溶であったが、１４日の期間にモノマー含量を失い、最終的に６６．６％のモノマー含量となった。したがって、この実験は、ｓｃＤｂ  ＃１４およびＤｂ  ＃１５が、これらの条件下で、ＴｄｓｃＦｖ  ＃１６と比較して凝集する傾向を低減したことを実証した。
【表７】
2019104759.tif 000008
【０１０３】
ＩＬ２３に結合する二価分子、フレームワークの特徴を有するｓｃＤｂ構成：
次いで、ＩＬ−２３に二価的に結合する、表２に記載される異なるｓｃＤｂ変異体を試験した。全ての分子を、方法において説明されるように、それらの産生特性、熱安定性および短期安定性に従い特性決定した。
【０１０４】
全ての二価ｓｃＤｂ分子は、ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ−リンカー２−ＶＬＡ（リンカー１および２＝配列番号１；ならびにリンカー３＝配列番号４）のドメイン順で生成され、ＶＬ−Ａおよび−Ｂは同一であり、ＶＨ−Ａおよび−Ｂは同一であり、特定の置換は実施例２、表２に要約される。
【０１０５】
ｒＦＷ１．４フレームワークに基づく全ての二価分子は、十分に産生可能であり、試料は、分取サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後には主にモノマーであった（表８を参照されたい）。生殖系列コンセンサスフレームワークに基づくｓｃＤｂ  ＃５は、最も低い産生収率および精製された試料のモノマー含量を示した。
【表８】
2019104759.tif 000009
【０１０６】
ｒＦＷ１．４フレームワークに基づく全ての二価分子は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）において約７３℃の高いＴｍを示した。生殖系コンセンサスフレームワークに基づくｓｃＤｂは、６６℃の最も低いＴｍを示した（表９を参照されたい）。
【表９】
2019104759.tif 000010
【０１０７】
安定性および最大到達濃度における明確な差が、異なるバージョンの二価ＩＬ−２３結合分子の間に観察された（表１０を参照されたい）。生殖系列コンセンサスに基づくｓｃＤｂ  ＃５  は、４０℃で２週間のインキュベーション後に４４％の減少したモノマー含量を示した。ｒＦＷ１．４フレームワークに基づく分子は、４０℃で２週間のインキュベーション後に主にモノマー性を維持し、８７〜９５％のモノマー含量を示した。
【０１０８】
両方のＶＬドメイン上のＡＨｏ残基位置５０にアルギニンが導入された変異体＃２は、両方のＶＬドメインにおいて残基位置５０にリシンを有する＃１と比較して、４０℃で２週間のインキュベーション後に最も高いモノマー含量を示した。また、両方のＶＨドメイン上にＡＨｏ位置１２にセリン、ＡＨｏ位置１０３にトレオニン、およびＡＨｏ位置１４４にトレオニンを含有する変異体＃３は、＃１と比較して、４０℃で２週間のインキュベーション後により高いモノマー含量を示した。また、これらの置換の組み合わせであるｓｃＤｂ  ＃４は、タンパク質を濃縮する能力の増加をもたらし、これは溶解度のさらなる増加を意味した（表１０を参照されたい）。
【表１０】
2019104759.tif 000011
【０１０９】
ＶＥＧＦおよびＴＮＦαを結合する二重特異性分子：
ＶＥＧＦおよびＴＮＦαに二重特異的に結合する異なるｓｃＤｂ変異体を試験した。分子間の差については、実施例３、表３を参照されたい。全ての分子を、それらの産生特性、熱安定性および短期安定性に従い特性決定した。
【０１１０】
全ての二価ｓｃＤｂ分子が、ＶＨＡ−リンカー１−ＶＬＢ−リンカー３−ＶＨＢ−リンカー２−ＶＬ−Ａの順であった。ドメインＶＬ−ＡおよびＶＨ−Ａは、ＴＮＦα結合抗体断片をアセンブルした。ドメインＶＬ−ＢおよびＶＨ−Ｂは、ＶＥＧＦ結合抗体断片をアセンブルした。導入された置換およびリンカー配列の変化は、実施例３、表３に具体的に要約される。
【０１１１】
全ての二重特異的分子が産生可能であったが、異なる収量およびモノマー含量に達した（表１１を参照されたい）。２０  ａａ（配列番号４）からなるリンカー３を含有する＃１１  ｓｃＤｂバージョンを、同じ置換を含有するがリンカー３（配列番号３である）のみが異なるバージョン＃９と比較した。ＳｃＤｂバージョン＃１１は、６１ｍｇ／ｍｌおよび７５％の増加した収率および純度を示したが、一方ｓｃＤｂ  ＃９は、わずか７ｍｇ／ｍｌの収率および３４％の純度を有した。＃１０上の追加の置換は、いかなる置換も有さないｓｃＤｂバージョン＃６と比較して、純度を著しく増加させた。
【表１１】
2019104759.tif 000012
【０１１２】
置換を有する全ての二重特異性ｓｃＤｂ分子が、熱安定性に関するＤＳＣ測定において、７２℃を超える高いＴｍを示す。いかなる置換も有さないバージョンであり、５７．２℃のＴｍに達するのみであった＃６と比較すると、特にそうであった（表１２を参照されたい）。リンカー構造の交換は、熱安定性を変化させなかった。これらのｓｃＤｂ変異体、＃１１、＃１２、および＃１３はまた、７４℃のＴｍをまだ有していた。
【表１２】
2019104759.tif 000013
【０１１３】
２０ａａ（配列番号４）からなるリンカー３を有する二重特異性ｓｃＤｂ変異体、＃１１、＃１２、および＃１３は、ＦＴ−ＩＲにより測定すると、約６９℃のＴｍを示した。これらの値を、１５ａａリンカー３（配列番号３）を含有する＃９の６６．２℃のＴｍと比較した。これらの熱安定性の結果は、１５ａａから２０ａａのリンカー３の交換が、表１３に示されるように、ｓｃＤｂ分子のＴｍを増加させることを示した。
【表１３】
2019104759.tif 000014
【０１１４】
二重特異性ｓｃＤｂバージョンにおいて、濃縮プロセス中および４０℃で１４日間のインキュベーション後に、溶解度および安定性の明確な差が観察された。ＦＷ領域上に導入された置換は、ｓｃＤｂタンパク質の溶解度および安定性を増加させた（表１４を参照されたい）。ＶＨ−Ｂ上に追加の置換を有するバージョン＃１０は、１４日目に、８８％のモノマー含量を有していた。これらの値を、１４日目に５３％のモノマー含量を有する＃９および１９％のモノマー含量を有する＃６と比較する。これらの結果は、置換により安定性が向上することを示した。０日目よりも１４日目において純度がより高い場合、この比較から分子を除外した。
【０１１５】
１５ａａ配列（配列番号３）から２０ａａ（配列番号４）へのリンカー３の交換は、ｓｃＤｂ分子の溶解度および安定性の増加をもたらした（表１４を参照されたい）。＃１１、＃１２、および＃１３と比較した分子＃９の溶解度および安定性の差は、この結論を裏付ける。ｓｃＤｂの変異体、＃９ならびに＃１１、＃１２、および＃１３は、同じ置換を含有していたが、異なるリンカー３配列を含有していた（実施例３、表３を参照されたい）。リンカー３、２０ａａ（配列番号４）ならびにリンカー１および２、５ａａ（配列番号１）を有するｓｃＤｂの＃１１バージョンは、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で８１％のモノマー含量を示したが、＃９は、５３％のモノマー含量で１０ｍｇ／ｍｌに達するのみであった（表１４を参照されたい）。
【表１４】
2019104759.tif 000015
【０１１６】
上記開示は、本発明のある特定の具体的実施形態を強調するものであり、その全ての改変または代替の均等物が、添付の特許請求の範囲に記載されるような本発明の精神および範囲内であることを理解されたい。
【配列表】
2019104759000001.app
【外国語明細書】
2019104759000001.pdf