(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞の接着性を増加させることにより、骨形成及び骨組織形成を促進することのできる組成物の提供。【解決手段】特定の化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞、及びリン酸カルシウムマトリックスを含む組成物。前記化合物が、（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）塩酸塩であり、前記単離された細胞が、ヒト骨髄由来間葉幹細胞であり、かつ前記リン酸カルシウムマトリックスが、リン酸三カルシウムセラミックであることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とを含む組成物であって、前記化合物が、
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（式中、
Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、およびＲｉｉｉ’は、ヒドロであり；
Ｒｉｉ、Ｒｉｉ’は、独立して、グリシン−Ｏ−カルボキシレート、サルコシン−Ｏ−カルボキシレート、アラニン−Ｏ−カルボキシレート、バリン−Ｏ−カルボキシレート、ロイシン−Ｏ−カルボキシレート、イソロイシン−Ｏ−カルボキシレート、フェニルアラニン−Ｏ−カルボキシレート、チロシン−Ｏ−カルボキシレート、トリプトファン−Ｏ−カルボキシレート、アスパラギン−Ｏ−カルボキシレート、グルタミン−Ｏ−カルボキシレート、リジン−Ｏ−カルボキシレート、またはプロリン−Ｏ−カルボキシレートである）
の構造を有し、前記組成物が、リン酸カルシウムマトリックスをさらに含み、前記化合物が、前記リン酸カルシウムマトリックス上に非共有結合的または共有結合的に連結されていることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記骨細胞に分化可能な単離された細胞が、単離されたヒト骨髄由来間葉幹細胞、ヒト脂肪組織の間葉幹細胞、ヒト血液の間葉幹細胞、ヒト骨アロ移植組織もしくは骨自家移植組織の間葉幹細胞、ヒト歯髄の間葉幹細胞、ヒト周皮細胞、ヒト筋芽細胞、ヒト軟骨細胞、ヒト前骨芽細胞、もしくは尿幹細胞、または、前記骨細胞に分化可能な単離された細胞が、羊水もしくは臍帯血から単離された幹細胞、胚性幹細胞、もしくは多能性幹細胞であることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物において、前記リン酸カルシウムマトリックスが、リン酸三カルシウムセラミックであることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、前記化合物が、（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩であり、前記単離された細胞が、ヒト骨髄由来間葉幹細胞であり、かつ前記リン酸カルシウムマトリックスが、リン酸三カルシウムセラミックであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の組成物において、前記化合物が、前記リン酸カルシウムマトリックス上に非共有結合的に連結されていることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の組成物において、前記組成物が、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、Ｗｎｔタンパク質、トランスフォーミング成長因子、間質由来因子−１、上皮小体成長ホルモン、ビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、デオキシコール酸、テリパラチド、アスコルビン酸、アスコルビン酸２−リン酸、βグリセロールリン酸、およびデキサメタゾンからなる群から選択される１又は複数の成分をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
骨関連疾患の治療用医薬を製造するための、請求項１に記載の式ＶＩで示される構造を有する化合物の使用。
【請求項８】
骨細胞に分化可能な単離された細胞と、リン酸カルシウムマトリックスと、請求項１に記載の式ＶＩで示される構造を有する化合物とを組み合わせて外科ケージ中に導入することにより作製されることを特徴とする骨移植材料。
【請求項９】
リン酸カルシウム材料への細胞の接着性を増加させる方法において、リン酸カルシウム材料の存在下で、請求項１に記載の式ＶＩで示される化合物により、細胞を処理することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の組成物の凍結保存方法であって、前記方法がステップ
（ａ）シール可能なチューブ中で請求項１乃至６の何れか１項に記載の組成物と凍結保存剤とを組み合わせることと、
（ｂ）前記チューブを液体窒素中で凍結させることと、
（ｃ）前記チューブを前記液体窒素中に維持することと、
を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１８０１３４７号明細書（その全内容はこれをもってその全体が参照により組み込まれる）に基づく特典を主張する。
【０００２】
本開示は、一般的には、骨または軟骨またはそれらの前駆組織の細胞療法および組織工学に使用するための改善された組成物である、化合物とマトリックスと単離された細胞との組成物に関する。他の観点では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成を促進するための、化合物とマトリックスとおよび／または単離された細胞との組成物の使用方法を提供する。他の観点では、本開示は、一緒に使用したときに骨または軟骨またはそれらの前駆組織の形成を強力に刺激する化合物およびマトリックスを同定するための化合物スクリーニング方法を提供する。より特定的には、マトリックスへの細胞の接着、細胞増殖、細胞分化、およびミネラル化タンパク質沈着を増加させることにより、骨形成性系列に関係して細胞骨形成を増加させるように、小分子およびマトリックスの存在下で動物細胞（好ましくは、血清および／または細胞共培養物の存在下で最適に培養されたヒト細胞）を誘導する。他の観点では、骨または軟骨を形成する動物細胞療法または組織工学手法の細胞移植を改善する留置可能な組成物であるマトリックスへの細胞接着を増加させるように、小分子で前処理されたまたはそれが吸着されたマトリックスを使用する。基本的には、本発明では、規定の生物学的経路を介して細胞をモジュレートするように、マトリックスの存在下で小分子を使用する。まとめると、小分子／マトリックス／細胞の組合せは、骨形成を支援するマイクロ環境を構成し、骨または軟骨またはそれらの前駆組織をｉｎ  ｖｉｖｏで生成する留置可能な組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製、あるいは骨または軟骨の形成または修復に用いられる内因性細胞をもたらす小分子および／またはマトリックスの直接ｉｎ  ｖｉｖｏ投与、のいずれかに使用が可能である。
【背景技術】
【０００３】
骨は、その恒常性が骨形成と骨吸収とのバランスに相当するので、動的組織である。骨形成では、成体幹細胞が、骨芽細胞、骨細胞に成熟する能力を有する骨前駆細胞（すなわち、前骨芽細胞）に分化して、成熟骨および骨の硬組織であるミネラル化マトリックスを形成する。骨形成に寄与する内因性間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、最も優位には骨髄に見いだされるが、この骨髄由来間葉幹細胞（骨髄由来間質幹細胞ＢＭＳＣとしても知られる）は、比較的少ない。ＭＳＣはまた、脂肪組織、軟骨組織、血液、臍帯血、筋肉組織、歯髄、および角膜実質組織から同定および採取されてきた。骨からの細胞単離物は、起源が膜内性骨か軟骨内性骨かにかかわらず、多くの場合、骨をもたらすＭＳＣ、前骨芽細胞、またはＭＳＣと前骨芽細胞との混合物を含有する。また、単離された胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞は、骨を生成可能であるが、通常、成体幹細胞は、骨形成の内因性細胞源である。しかしながら、ＭＳＣ自体および幹細胞全般は、他の非骨形成性細胞の系列または組織を選定可能であり、これらの細胞自体は、骨形成に必要とされる傷害部位への移行の点ではあまり効率的ではない。本開示は、細胞系列の関係付けの誘導に使用可能な新規な組成物および方法を提供する。
【０００４】
骨吸収では、破骨細胞（骨組織を吸収する細胞）が、ミネラル化マトリックスを溶解して骨表面に空隙を形成する。骨形成と骨吸収とのバランスは、健常骨の保守に役立つが、健常骨の保守は、多くの場合、年齢と共に低下する。骨形成と骨吸収とのアンバランスは、通常、骨量の損失を原因となり、最終的に、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症などの骨関連疾患をもたらす。これらの骨疾患は、骨折リスクの増加、骨折重症度の増加、長期の治癒期間、および患者転帰の悪化を伴い、すべて、命にかかわる合併症を引き起こす可能性がある。そのほかに、年齢または傷害に伴って、椎間板変性疾患または脊柱変形の発生率が増加するので、これらの病態に罹患している個体では対処できない重度の疼痛を伴う脊椎すべり症が起こる。本明細書に開示された本発明は、これらの病態のいくつかを治療する方法を提供する。
【０００５】
患者から（たとえば、股関節、脚、または頭蓋冠骨から）骨が採取され、骨欠損、骨折、または空隙に再適用される骨移植片は、自然過程を介して効率的に修復できない骨傷害の修復の「ゴールドスタンダード」である。その利点は、移植物質が、ＭＳＣと、前骨芽細胞と、成長因子と、ミネラル化タンパク質マトリックスと、の混合物を含有することにより、骨成長、リモデリング、およびバイオインテグレーションを刺激することである。しかしながら、骨欠損の充填に利用可能な移植物質の量は、基本的に、患者から採取可能な骨の量により制限され、しかも骨採取手順は、患者の罹患、外科失血を伴うものであり、移植片の品質を損なう基礎的骨疾患の患者には一般に適さない。また、骨を生成するＭＳＣの能力は、年齢と共に低下することが示唆されているので、患者適格集団は、さらに制限される可能性がある。ドナー個体からの同種異系ＭＳＣの移植は、自家移植片の採取手順を回避するが、患者に移植された後、依然としてシグナルまたは刺激を必要とするという点で、骨を形成する能力に関して自己ＭＳＣよりも優れた明らかな利点を提供しない。人工バイオマテリアルは、骨移植片代替物として有望視されてきたが、ほとんどのバイオマテリアルは、組成物中の生体成分が欠如しているため、バイオインテグレーションが不十分であり（吸収されない）、かつ脆性を有する。
【０００６】
細胞療法および組織工学は、前述の制限の多くを克服する骨形成法として使用可能である。同種異系または自己由来の幹細胞を採取、精製、および拡大培養して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨形成が望まれる部位に留置または注射するのに十分な細胞数を提供することが可能である。しかしながら、ロバストな骨を形成するために、およびＭＳＣを骨傷害部位に効率的に移植するために、追加のシグナルまたは刺激が必要である。留置可能／注射可能な細胞療法のための細胞担体材料の選択は、骨成長の効率および品質さらには担体物質のリモデリングを介するバイオインテグレーションに有意に影響を及ぼしうる。また、骨形成部位の血管新生および造血の改善は、骨成長の改善に関連付けられてきた。したがって、幹細胞の生物学的ニッチまたはマイクロ環境の役割は、骨の形成および修復を促進するシグナル、刺激、および生物学的因子を提供することにより、決定的な役割を果たす。
【０００７】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む成長因子は、変性椎間板疾患で行われうる腰部脊椎の脊椎融合手順などの種々の用途で、骨を修復するために使用されてきた。また、組換えＢＭＰ−２は、多くの用途で骨移植片の骨誘導性を増加させるために、添加剤として広く使用されてきた。しかしながら、ＢＭＰ−２の商業生産は、経費がかかり、とくに適応外使用で、ＢＭＰ−２の治療的適用に関連付けられる種々の有害作用が存在していた。これらの観点から、ＢＭＰ−２の治療的使用が制限されてきた。ＭＳＣの骨形成を誘導する成長因子の使用と比較して、骨形成の小分子インデューサーは、それほど高くない製造コスト、より長い貯蔵寿命、便利な投与レジメンおよび処方を有し、生物物質（たとえば、投与後、なんらかの形で生体内に存続するＤＮＡ）とは異なり、小分子は、代謝されて生体から排出されるので、より良好な安全域を有する。したがって、現在、骨形成の促進および留置可能な物質または移植片での骨形成の促進のために使用可能な臨床的に許容可能な作用剤が欠如している。
【０００８】
今まで、小分子の細胞系列亢進性とマトリックスのマイクロ環境支援性とを組み合わせることにより、ヒト骨形成を促進する重要な問題に対処する手法は、報告されてこなかった。ＭＳＣは、マトリックス担体上で、移植前、種々の小分子を含めて骨形成剤で処理されてきたが、これまで、小分子とマトリックスとの並行操作により骨細胞を形成するための有意な方法は、報告されてこなかった。予想外なことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマトリックスの存在下でＭＳＣを特定の小分子で処理したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨の形成および修復を行うインプラントとしてきわめて有用な細胞調製物が得られた。たとえば、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）セラミックマトリックスの存在下で小分子を添加したところ、ＭＳＣは、治療に有用な骨系列に誘導されたので、本明細書中に明記されるように、幹細胞からの骨成長を促進するための現在入手可能な安全な骨誘導剤が欠如しているという骨修復の主要な問題が解決される。
【０００９】
一般的には、骨形成の誘導は、以下の４つの段階に分割可能である：骨傷害への幹細胞の動員、傷害部位での幹細胞の増殖、幹細胞から骨芽細胞および骨細胞への分化、マトリックスの吸収および骨のリモデリングを伴うミネラル化マトリックス沈着による骨組織の形成。留置された細胞および骨移植片の効率を改善するために本発明には、マトリックスと一緒に作用して骨形成の４つの段階すべてを劇的に改善する小分子が記述されている。予想外だったことは、小分子刺激ＭＳＣがＴＣＰマトリックスの存在下でその骨形成性を劇的に増加させた様式であり、多くの場合、小分子およびＴＣＰマトリックスの作用は、幹細胞の骨形成性分化の増加に関して相乗的であった。我々は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）シグナリングおよび／またはビタミンＤレセプターシグナリングを促進する小分子を同定した。Ｗｎｔシグナリングは、明らかな二次的経路である。確立された骨形成バイオマーカーを用いて、たとえば、当該分野で確立されたバイオマーカーであるアルカリホスファターゼ機能活性の誘導またはｍＲＮＡ発現レベルを用いて、マトリックスの存在下（または不在下）で骨形成を促進する分子を同定した。小分子刺激細胞またはマトリックスのみの存在下でインキュベートされた細胞のいずれと比較しても、マトリックスの存在下で細胞と共に特定の小分子をインキュベートすることにより、小分子またはマトリックスを独立させて組み合わせた作用を超える骨形成性分化の増加が得られた。また、予想外なことに、マトリックスの存在下で細胞と共に特定の小分子をインキュベートしたところ、マトリックスへの細胞移動および細胞局在化の増加が発見された。本発明により作製された誘導細胞インプラントをｉｎ  ｖｉｖｏで試験したところ、骨誘導の改善が示された。したがって、小分子とマトリックスとを組み合わせることにより、マトリックスへの細胞移動および細胞局在化、さらには細胞増殖、細胞分化、および細胞からのミネラル化タンパク質沈着を支援するマイクロ環境が形成された。本発明は、多種多様な他のヒト組織修復プロセスに適用可能である。
【００１０】
小分子とマトリックスとによる誘導骨形成のユニークな機序の利点を生かして、骨の形成および修復の組織工学および細胞療法のために、細胞およびマトリックスの両方の骨形成性を改善するための組成物および方法を開発した。小分子誘導ヒトＭＳＣマトリックス組合せ物（すなわち、マトリックスの存在下で小分子と共に培養されたｈＭＳＣ）の場合、ＭＳＣは、マトリックスまたは骨へのその移行能および局在化が増加し、さらには骨形成性系列に沿ったその増殖および分化が増加した。マトリックスの場合、小分子を用いて表面に被覆し、細胞をマトリックスに移行させる「走化性」作用を誘導することが可能である。我々は、骨成長の加速、骨傷害の治癒、および細胞ベースインプラントの細胞移植の改善に使用するための、骨形成および骨組織形成を促進する小分子誘導ｈＭＳＣとマトリックスとを用いる高度に規定された手法を発明した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、マトリックスの存在下でヒト間葉幹細胞を骨芽細胞に誘導するための増殖、分化、および移行に対する式Ｉ〜ＶＩで示される化合物の作用を示すスキーム。
【図２】図２は、化合物とマトリックスとの組合せが、化合物のみまたはマトリックスのみの作用と比較してＡＬＰ活性の相乗的増加を与えることを示した、リン酸三カルシウムセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下または不在下でのＣ２Ｃ１２細胞の６日間のインキュベーション後のアルカリホスファターゼ機能活性に対する化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）の作用のプロット。Ａ．Ｗｎｔシグナリング経路をモジュレートする化合物１および２の作用。Ｂ．ＴＬＲシグナリング経路をモジュレートする化合物３および４の作用。
【図３】図３は、化合物とマトリックスとの時間依存的作用が、化合物のみまたはマトリックスのみの作用を超えることを示した、リン酸三カルシウムセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下または不在下でのｈＭＳＣの８日間および２５日間のインキュベーション後のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）機能活性に対する化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）の作用のプロット。Ａ．化合物１。Ｂ．化合物２。Ｃ．化合物３。Ｄ．化合物４。
【図４】図４は、マトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下または不在下で２５日間インキュベートされたｈＭＳＣからのカルシウム沈着に対する化合物３または４（５００ｎＭ）の作用のプロット。Ａ．化合物３または化合物４がｈＭＳＣでカルシウム沈着を増加させることを示した、マトリックスの不在下での３または４を用いた２５日間のインキュベーション後のｈＭＳＣのアリザリンレッドＳ染色の定量。Ｂ．マトリックスの存在下での３または４が、化合物のみおよびマトリックスのみの組合せ作用を超えてカルシウム沈着を増加させることを示した、マトリックスの存在下での３または４を用いた２５日間のインキュベーション後のｈＭＳＣのアリザリンレッドＳ染色の定量。画像解析ソフトウェアを用いてデンシトメトリー解析により染色細胞培養物の定量を行った。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。
【図５】図５は、留置の８週間後の免疫不全マウスにおける筋肉内配置インプラントのＨ＆Ｅ染色組織切片の一連の組織学的画像およびそれらの解析。Ｉ〜ＩＩＩ．誘導ｈＭＳＣとマトリックスとのインプラントが、顆粒の外周上での類骨形成および細胞密度の増加を与えることを示す、マトリックスのみ（Ｉ）、ｈＭＳＣとマトリックス（ＩＩ）、および小分子誘導ｈＭＳＣとマトリックス（ＩＩＩ）が施された組織切片の一連のより高倍率（４０×）の画像。ＩＶ．留置されたＴＣＰ顆粒の周辺の染色組織の強度に関して盲検化訓練観察者によりスコア付けされたインプラントのＨ＆Ｅ染色組織切片。誘導ｈＭＳＣ−マトリックスインプラントがより多くの類骨形成を与えることを示した、７５パーセンタイル（ボックス）およびメジアン（ライン）を有するボックスウィスカープロットで示されたスコア付け結果。画像は、０〜４でスコア付けされた。ただし、０：類骨なし、１：類骨の薄肉領域および／または不連続領域、２：顆粒の外周上の類骨の薄肉領域、３：顆粒の外周上の類骨の厚肉領域または緻密領域、４：顆粒の外周上の類骨のロバスト領域。Ｖ．小分子誘導ｈＭＳＣ−マトリックスインプラントがより多くの類骨形成を与えることを示した、画像解析ソフトウェアを用いたデンシトメトリー解析によるインプラントの４×倍率のＨ＆Ｅ染色組織切片の定量。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）であった。ＶＩ．小分子誘導ｈＭＳＣ−マトリックスインプラントに基づく類骨密度の改善を示した、画像解析ソフトウェアを用いたデンシトメトリー解析による図４Ａ〜４Ｃ（４０×倍率）に示される組織学画像の定量。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。統計解析は、スチューデントｔ検定を用いて行われる（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６】図６は、小分子誘導ｈＭＳＣ−ＴＣＰインプラントの代表的調製プロセス（ステップ１〜５）およびインプラントをどのように使用するかに関する代表的方法（ステップｉ〜ｉｉｉ）を示した、高レベルのフロー図。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、
【化１】
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で示される構造を有する。式中、点線は、任意選択の二重結合を表し、Ａ、Ｂ、Ｅは、炭素または窒素であり、Ｄは、炭素であり、Ｆは、窒素であり、かつＲ１、Ｒ６、およびＲ７は、独立して、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニルと３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、またはペルフルオロフェニルカルボニルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立して、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、クロロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロプ−１−イル、Ｎ−アザシクロブト−１−イル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、またはＮ−プロピルピペラジニルである。
【００１３】
本発明はまた、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、
【化２】
2019213917.tif 000004
で示される構造を有する。式中、点線は、任意選択の二重結合を表し、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、独立して、炭素または窒素であり、ＢおよびＤは、炭素であり、かつＲ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルアミノ、または非置換であり、Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、もしくは２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、一緒になって、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含む。
【００１４】
本発明はさらに、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、
【化３】
2019213917.tif 000005
で示される構造を有する。式中、点線は、任意選択の二重結合を表し、Ａは、酸素、窒素、硫黄、または水素であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、（シクロヘテロアルキル）スルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、またはスルホネートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義  以下の用語、定義、および略語が適用される。本明細書で用いられる略語は、化学技術および生物学技術の範囲内のその従来の意味を有する。
【００１６】
本明細書で用いられる「骨形成」とは、前駆細胞または骨系列に沿って成熟した任意の細胞の形成を含めて、骨、骨組織、および骨細胞の形成を意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成は、骨の吸収およびリモデリングを含む複雑なプロセスであるが、本開示の目的では、「骨形成」という用語は、より厳格に骨組織の形成という意味で定義され、ｉｎ  ｖｉｖｏで破骨細胞により行われる骨の吸収または分解を必ずしも想定しているわけではない。したがって、骨形成という用語は、細胞が骨形成性系列に沿って成長するかぎり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの例を意味しうる。骨形成は、限定されるものではないが、ｉ）所望の部位への前骨芽細胞または幹細胞または骨に分化可能な細胞の局在化、ｉｉ）骨前駆細胞の増殖もしくは成長または骨細胞および骨組織（硬組織またはミネラル化マトリックス）の増殖もしくは成長、ｉｉｉ）前骨芽細胞、骨芽細胞、骨細胞などの骨系列の細胞への前駆細胞または前駆体細胞の細胞分化または細胞分化転換、ｉｖ）骨の硬組織をもたらす骨芽細胞や骨細胞などの骨細胞からのミネラル化マトリックスの沈着、を含む多ステッププロセスと考えられる。前駆細胞または前駆体細胞は、中胚葉系列にプレコミットされた間葉幹細胞（ＭＳＣ）もしくは骨髄由来間質細胞（ＢＭＳＣ）、または多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、および骨系列にプレコミットされていない胚性幹細胞、または骨系列以外の系列にプレコミットされているが適切な刺激を用いて骨系列に変換可能な筋芽細胞などの細胞でありうる。
【００１７】
本明細書で用いられる「骨形成性」とは、骨前駆細胞または骨系列に沿って成熟した任意の細胞を含めて、骨、骨組織、または骨細胞の形成に関連付けられるまたはそれを支援する性質および特性を意味する。たとえば、骨形成性の物質は、骨、沈着骨マトリックスを形成する可能性がより高く、細胞動員および／または血管形成のプロセスを支援するであろう。第２の例として、骨形成性幹細胞とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで骨系列の細胞への分化が高度に可能で、結果的に骨組織のミネラル化マトリックスを生成する細胞を意味しうる。第３の例として、骨形成性インプラントとは、動物内への配置後、骨成長および骨組織のミネラル化マトリックス沈着を支援可能な物質を意味するであろう。
【００１８】
本明細書で用いられる「幹細胞」とは、他の細胞型に分化する能力を有する任意の前駆細胞または前駆体細胞を意味する。幹細胞は、部分的に効力により分類され、全能性で生物のすべての細胞型を生成可能でありうるか、多能性で３つの胚葉のいずれかの細胞を生成可能でありうるか、または複能性で複数のただし制限された細胞系列を生成可能でありうるか、寡能性でごく少数の細胞型に分化可能でありうるか、または単能性でただ１つの細胞型に分化可能でありうる。効力の程度が異なる幹細胞が多くの組織型に見いだされうるが、細胞内での強制遺伝子発現により、または核再プログラミングにより、または化学的方法により、非多能性細胞または体細胞から誘導することも可能であり、これらは、本開示の用語では分化転換とも考えられうる。本発明に係る方法に使用するための幹細胞としては、たとえば、種々の組織に由来する間葉幹細胞、骨髄由来間質細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、前脂肪細胞、骨軟骨前駆細胞、前軟骨細胞、前筋芽細胞、周皮細胞、造血幹細胞、およびこれらの細胞系列の一過性細胞が挙げられる。さらなる例として、強制遺伝子発現、体細胞核移入（すなわち、核再プログラミング）、または多能性の誘導に用いられる化学的もしくは生化学的な刺激を介する多能性の誘導により、体細胞が本発明の対象であると考えられるので、線維芽細胞、脂肪細胞、マクロファージ、角化細胞、造血細胞、赤血球、白血球、および血小板もまた、含まれる。
【００１９】
本明細書で用いられる「系列」とは、共有された祖先パスを意味する。細胞発生では、系列とは、特定の細胞型と、ｉ）特定の細胞が誘導されうるさまざまな発生段階の細胞またはｉｉ）特定の細胞がなりうる細胞（実際または仮定）のいずれかと、の間のパスを意味する。
【００２０】
本明細書で用いられる「分化する」または「分化」とは、前駆体細胞または前駆細胞が成長して特定の細胞型になるプロセスを意味する。分化細胞は、その遺伝子発現パターン、細胞表面タンパク質発現、または細胞の特徴的機能性により同定可能である。
【００２１】
「分化転換」とは、細胞がプレコミット系列から他の系列に成長するプロセスを意味する。分化転換細胞は、その遺伝子発現パターン、その表面タンパク質発現、または細胞の特徴的機能性により同定可能である。
【００２２】
本明細書で用いられる「培養」とは、細胞の増殖、分化、および老化回避が可能な条件下に細胞を維持することを意味する。細胞は、その正常成長を維持するのに適切な成長因子および化学品を含有する成長培地で培養可能である。
【００２３】
本明細書で用いられる「移行」または「移行する」とは、細胞が特定の位置から他の位置に移動するプロセスを意味する。実験手順では、移行とは、細胞がランダム細胞運動を制限する設計された開口を通って一方の表面から他方の表面に移動することを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏ状況では、移行とは、生体の一方の位置から生体の他方の位置への細胞の移動を意味する。
【００２４】
「インプラント」とは、他の生体に挿入される物体または物質を意味する。本明細書で用いられる場合、この用語は、多くは外科技術または注射技術の使用を介して、動物内に配置される物質を意味する。「留置」という用語は、一般的には、生体内にインプラントを配置または挿入するプロセスを意味する。
【００２５】
「細胞インプラント」とは、細胞を含有しかつ他の生体に挿入されるエンティティー、物質、または物質組成物を意味する。
【００２６】
本明細書で用いられる「移植」とは、一方の環境から他方の環境に物質を移入するプロセスを意味する。この用語は、一般的には、細胞、バイオマテリアル、または合成材料をはじめとする生物学的物質をｅｘ  ｖｉｖｏ環境から動物またはヒトに移入することに関連して用いられる。本開示の目的では、「移植」および「留置」という用語は、同義的に用いられている（すなわち、インプラントは、動物内に留置または移植されうる）。
【００２７】
「マトリックス」とは、一般的には、周囲のものとは異なる二次元または三次元の環境を提供する物質または材料を意味する。本明細書で用いられるこの用語は、一般的には、１つ以上の環境、たとえば、外表面もしくは内表面、空隙の内部体積、またはマトリックス自体を含む物質を提供する天然に存在するまたは合成の材料を意味する。たとえば、本開示に係るマトリックスは、固体、半固体、および液体の状態の物質を含む。さらなる例として、本開示に係るマトリックスは、ナノメートル〜メートルのサイズで延在する固体物質を含み、さらに、多孔性もしくは非多孔性、透過性もしくは非透過性、可溶性、またはコロイド状の物質の形態をとりうるが、半固体および液体の状態の物質もまた、多孔性もしくは非多孔性、透過性もしくは非透過性、またはコロイド状、または可溶性の形態でありうる。
【００２８】
「セラミック」とは、一般的には、加熱プロセスにより硬化された物質を意味する。本明細書で用いられる場合、この用語は、一般的には、高温オーブン内で焼結させることにより硬化されたミネラル組成物を意味する。この物質は、種々の形状、サイズ、粒子サイズ、表面トポグラフィー、マイクロ多孔度、物理的性質、たとえば、脆性および溶解性、ならびに化学的性質、たとえば、分解、化学的安定性、イオン放出速度、および吸収を有するセラミックが提供されるように、調製および処理が可能である。
【００２９】
本明細書で用いられる「由来」とは、供給源から出現したまたは取得されたことを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる「誘導」とは、第２のエンティティーにより引き起こされた一方のエンティティーの変化を意味する。たとえば、細胞は、化合物の存在により細胞がその現在のものとは異なる細胞系列を選定するように、化合物により誘導可能である。
【００３１】
本明細書で用いられる「促進」とは、プロセスを進行させたり、特定の特徴、性質、プロセス、または挙動の存在を支援したりすることを意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「小分子」とは、一般的には、ポリマーでもバイオポリマーでも高分子でもない比較的低い分子量の分子を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「生体接着性」とは、特定のエンティティーを結合一体化させる接着性を有する天然起源または非天然起源の生物学的適合性材料を意味する。たとえば、凝固血液は、生物学的適合性である。凝固血液は、ゲル様の性質を有し、これにより、細胞、巨視的または微視的な粒子、リン酸三カルシウム顆粒、および小分子に結合して、複合材料を凝集形態、多くは巨視的形態に保持することが可能である。単純形態の凝固血液は、フィブリノーゲンとトロンビンとの反応を行ってフィブリンゲルを形成することにより、ｅｘ  ｖｉｖｏで構成可能であり、このゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏに留置した後、安全に生分解することが知られている。
【００３４】
本明細書で用いられる「サスペンジョン」とは、一般的には、不均一混合物を意味する。最も一般的には、サスペンジョンとは、混合物の１つ以上の成分が、多くは液体である第２の成分中に完全には可溶でないまたは不溶である、二相混合物を意味する。たとえば、サスペンジョンは、液体の存在下でコロイド状で存在するか不溶粒子として存在するかにかかわらず、溶液中に微粒子状物質を含む。
【００３５】
「アルキル」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の一部として、とくに明記されていないかぎり、直鎖状（すなわち、非分岐状）または分岐鎖状または環状の炭化水素基またはそれらの組合せを意味する。それらは、完全飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和でありうるとともに、指定の炭素原子数（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０とは、１〜１０個の炭素を意味する）を有する２価基および多価基を含みうる。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、同族体、および異性体、たとえば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの異性体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。不飽和アルキル基とは、１個以上の二重結合または三重結合を有する不飽和アルキル基のことである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の一部として、アルキルから誘導される２価基を意味し、限定されるものではないが、−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−−、−−ＣＨ２ＣＣＣＨ２−−、−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２−−により例示される。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有するであろう。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、一般的には、８個以下の炭素原子を有する短鎖状のアルキル基またはアルキレン基のことである。
【００３７】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは他の用語との組合せで、とくに明記されていないかぎり、少なくとも１個の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子と、からなる、安定な直鎖状または分岐鎖状または環状の炭化水素基またはそれらの組合せを意味し、ここで、窒素原子、リン原子、および硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよく、かつ窒素ヘテロ原子は、任意選択で四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、およびＳ、ならびにＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合される位置に、配置されうる。例としては、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ３、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ３、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ３、−−ＣＨ２−−Ｓ−−ＣＨ２−−ＣＨ３、−−ＣＨ２−−ＣＨ２、−−Ｓ（Ｏ）−−ＣＨ３、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２−−ＣＨ３、−−ＣＨ＝ＣＨ−−Ｏ−−ＣＨ３、−−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−−ＣＨ２−−ＣＨ＝Ｎ−−ＯＣＨ３、−−ＣＨ＝ＣＨ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ３、Ｏ−−ＣＨ３、−−Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ３、および−−ＣＮが挙げられるが、これらに限定されるものではない。２個または３個までのヘテロ原子は、たとえば、−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＯＣＨ３、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように、連続していてもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導される２価基を意味し、限定されるものではないが、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−Ｓ−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−および−−ＣＨ２−−Ｓ−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−により例示される。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖末端の一方または両方を占有可能である（たとえば、アルキルエンオキソ、アルキルエンジオキソ、アルキルエンアミノ、アルキレンジアミノなど）。またさらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基では、結合基の方向は、結合基の式が書かれている方向により示唆されものではない。たとえば、式−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’−−は、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’−−および−−Ｒ’ＯＣ（Ｏ）−−の両方を表す。以上に記載したように、ヘテロアルキル基は、本明細書で用いられる場合、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合されている基、たとえば、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−−ＮＲ’Ｒ’’、−−ＯＲ’、−−ＳＲ、および／または−−ＳＯ２Ｒ’を含む。「ヘテロアルキル」が挙げられた後に−−ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基が列挙された場合、ヘテロアルキルおよび−−ＮＲ’Ｒ’’という用語は、冗長でも相互排他的でもないことは、理解されよう。もっと正確に言えば、特定のヘテロアルキル基は、明確化するために挙げられている。したがって「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書では、−−ＮＲ’Ｒ’’などの特定のヘテロアルキル基を除外するものと解釈されるべきでない。
【００３８】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それぞれ、それ自体でまたは他の用語との組合せで、とくに明記されていないかぎり、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状体を意味する。そのほかに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合される位置を占有可能である。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、それぞれ、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルの２価誘導体を意味する。
【００３９】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それ自体でまたは他の置換基の一部として、とくに明記されていないかぎり、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。そのほかに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むものとみなされる。たとえば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、限定されるものではないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むものとみなされる。
【００４０】
「アリール」という用語は、とくに明記されていないかぎり、単環または縮合一体化もしくは共有結合された多環でありうるポリ不飽和芳香族炭化水素を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子（多環の場合、各個別の環中）を含有するアリール基（または環）を意味し、ここで、窒素原子および硫黄原子は、任意選択で酸化されており、かつ窒素原子は、任意選択で四級化されている。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合可能である。アリール基およびヘテロアリール基の例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上述のアリール環系およびヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、以下に記載の許容可能な置換基からなる群から選択される。「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」という用語は、それぞれ、アリールおよびヘテロアリールの２価基を意味する。
【００４１】
簡潔さを期して、「アリール」という用語は、他の用語と組み合わせて用いられる場合（たとえば、アリールオキソ、アリールチオキソ、およびアリールアルキル）、以上に定義されたアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（たとえば、メチレン基）が、たとえば、酸素原子により置き換えられたアルキル基を含めて（たとえば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）、アリール基がアルキル基に結合された基（たとえば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むものとみなされる。しかしながら、本明細書で用いられる「ハロアリール」という用語は、１個以上のハロゲンで置換されたアリールのみを対象とすることを意味する。
【００４２】
ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロアリールが特定の数のメンバーを含む場合（たとえば、「３員〜７員」）、「メンバー」という用語は、炭素原子またはヘテロ原子を意味する。
【００４３】
本明細書で用いられる「オキソ」という用語は、炭素原子に二重結合された酸素を意味する。
【００４４】
「ヘテロ環」および「ヘテロ環式」という用語は、１〜８個の炭素原子と、１〜４個のヘテロ原子、たとえば、環内の窒素、硫黄、または酸素と、の単環または縮合多環を有する１価不飽和基を意味する。
【００４５】
「メチルチオ」という用語は、−Ｓ−ＣＨ３部分を意味する。
【００４６】
「スルホンアミド」という用語は、以下に示される化合物Ａ、
【化４】
2019213917.tif 000006
さらには化合物Ａから誘導される部分を意味する。
【００４７】
「フリル」、「テトラヒドロフリル」、および「ピリジル」という用語は、それぞれ、フラン、テトラヒドロフラン、およびピリジンの分子から１個の水素を除去することにより形成された基を意味する。
【００４８】
「アルキルアミン」および「シクロアルキルアミン」という用語は、それぞれ、第１級、第２級、または第３級のアミノ基により置換された１個の水素を有するアルカンまたはシクロアルカン、さらにはそのようなアミンから誘導された部分および基を意味する。
【００４９】
「アルキルアミド」という用語は、第１級、第２級、または第３級のアミノ基により置換された１個の水素を有するアルカンを意味する。
【００５０】
以上の各用語（たとえば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル、および「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、さらにはそれらの２価基誘導体）は、置換形および非置換形の両方の指定の基を含むものとみなされる。
【００５１】
アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルの１価および２価の誘導体基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして参照されることが多い基を含む）に対する置換基は、限定されるものではないが、ゼロ〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、そのような基の全炭素原子数である）の範囲内の数の−−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−−ＯＲ’、−−ＮＲ’Ｒ’’、−−ＳＲ’、−ハロゲン、−−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−−ＣＯ２Ｒ’、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−−ＮＲ’−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−−ＮＲ−−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−−ＣＮ、および−−ＮＯ２から選択される１個以上のさまざまな基でありうる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（たとえば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を意味する。たとえば、本開示に係る化合物が２個以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基は、独立して、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基の場合（これらの基の２つ以上が存在する場合）と同様に選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一窒素原子に結合されている場合、それらは、窒素原子と組み合わされて、４、５、６、または７員の環を形成可能である。たとえば、−−ＮＲ’Ｒ’’は、限定されるものではないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むものとみなされる。置換基に関する以上の考察から、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、たとえば、ハロアルキル（たとえば、−−ＣＦ３および−−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（たとえば、−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むものとみなされることは、当業者であれば理解されよう。
【００５２】
「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキル部分を意味する。ここで、アルキルは、先に定義したとおりである。定義の範囲内にあるアルコキシ構造の例としては、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ基、たとえば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ、またはヘキシルオキシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
「カルボキシレート」および「アルカノエート」という用語ならびに「オエート」という接尾辞は、置換基として−Ｏ−（Ｏ）Ｃ−部分を意味する。ここで、置換基と化合物との結合は、酸素原子を介して形成される。カルボキシレート構造の例としては、アセテート（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）Ｏ−）置換基あるいはグリシンカルボキシレート（Ｈ２ＮＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−）置換基が挙げられる。
【００５４】
以上のアルキル基で説明した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基（さらにはそれらの２価誘導体）に対する例示的な置換基は、さまざまであり、たとえば、ゼロ〜芳香族環系上の全オープン価数の範囲内の数のハロゲン、−−ＯＲ’、−−ＮＲ’Ｒ’’、−−ＳＲ’、−ハロゲン、−−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−−ＣＯ２Ｒ’、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−−ＮＲ’−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−−ＮＲ−−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−−ＮＲ−−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−−ＣＮおよび−−ＮＯ２、−−Ｒ’、−−Ｎ３、−−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキソ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択され、かつＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、独立して、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから選択される。たとえば、本開示に係る化合物が２個以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基は、独立して、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基の場合（これらの基の２つ以上が存在する場合）と同様に選択される。
【００５５】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、任意選択で式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−−（ＣＲＲ’）ｑ−−Ｕ−−で示される環を形成しうる。ここで、ＴおよびＵは、独立して、−−ＮＲ−−、−−Ｏ−−、−−ＣＲＲ’−−、または単結合であり、かつｑは、０〜３の整数である。他の選択肢として、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上に置換基の２つは、任意選択で式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−−Ｂ−−で示される置換基で置き換えられうる。ここで、ＡおよびＢは、独立して、−−ＣＲＲ’−−、−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ（Ｏ）−−、−−Ｓ（Ｏ）２−−、−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−−、または単結合であり、かつｒは、１〜４の整数である。そのように形成された新しい環の単結合の１つは、任意選択で二重結合で置き換えられうる。他の選択肢として、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、任意選択で式−−（ＣＲＲ’）ｓ−−Ｘ’−−（Ｃ’’Ｒ’’’）ｄ−−で示される置換基で置き換えられうる。ここで、ｓおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、かつＸ’は、−−Ｏ−−、−−ＮＲ’−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ（Ｏ）−−、−−Ｓ（Ｏ）２−−、または−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、独立して、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから選択される。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むものとみなされる。
【００５７】
本明細書で用いられる「アミノアルキル」とは、アルキレン結合基に共有結合されたアミノ基を意味する。アミノ基は、−−ＮＲ’Ｒ’’である。ここで、Ｒ’およびＲ’’は、典型的には、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、あるいは置換または非置換のヘテロアリールから選択される。
【００５８】
「置換基」とは、本明細書で用いられる場合、以下の部分、すなわち、（Ａ）−−ＯＨ、−−ＮＨ２、−−ＳＨ、−−ＣＮ、−−ＣＦ３、−−ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールから選択される基と、（Ｂ）（ｉ）オキソ、−−ＯＨ、−−ＮＨ２、−−ＳＨ、−−ＣＮ、−−ＣＦ３、−−ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも１個の置換基で置換された、および（ｉｉ）（ａ）オキソ、−−ＯＨ、−−ＮＨ２、−−ＳＨ、−−ＣＮ、−−ＣＦ３、−−ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリールから、および（ｂ）オキソ、−−ＯＨ、−−ＮＨ２、−−ＳＨ、−−ＣＮ、−−ＣＦ３、−−ＮＯ２、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリールおよび非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも１個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールから、選択される少なくとも１個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール、から選択される少なくとも１個の置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール、から選択される基と、を意味する。
【００５９】
「サイズ限定置換基」とは、本明細書で用いられる場合、「置換基」に関連して以上に記載したすべての置換基から選択される基のうち、置換または非置換のアルキルが、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルが、置換または非置換の２員〜２０員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルが、置換または非置換のＣ４〜Ｃ８シクロアルキルであり、かつ各置換または非置換のヘテロシクロアルキルが、置換または非置換の４員〜８員のヘテロシクロアルキルであるものを意味する。
【００６０】
「低級置換基」とは、本明細書で用いられる場合、「置換基」に関連して以上に記載したすべての置換基から選択される基のうち、各置換または非置換のアルキルが、置換または非置換のＣ１〜Ｃ８アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルが、置換または非置換の２員〜８員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルが、置換または非置換のＣ５〜Ｃ７シクロアルキルであり、かつ各置換または非置換のヘテロシクロアルキルが、置換または非置換の５員〜７員のヘテロシクロアルキルであるものを意味する。
【００６１】
本開示に係る化合物は、塩として存在しうる。適用可能な塩形の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（たとえば、（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩、またはラセミ混合物を含めてそれらの混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸との塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法により調製されうる。また、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、マグネシウム塩などの塩基付加塩、または類似の塩も含まれる。開示化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、ニートまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで、そのような化合物の中性形を適量の所望の酸に接触させることにより、酸付加塩を得ることが可能である。許容可能な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無機酸から誘導されるもの、さらには酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような有機酸から誘導される塩が挙げられる。このほかに、アルギニン塩などのアミノ酸塩、およびグルクロン酸やガラクツロン酸などのような有機酸の塩が挙げられる。本開示に係るいくつかの特定の化合物は、化合物を塩基付加塩または酸添加塩のいずれかにも変換しうる塩基および酸の両方の官能基を含有する。
【００６２】
本開示に係る特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心もしくはキラル中心）または二重結合を有し、絶対立体化学用語で（Ｒ）または（Ｓ）として、アミノ酸では（Ｄ）または（Ｌ）として定義されうるエナンチオマー、ラセミ体、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体、および個別の異性体は、本開示の範囲内に包含される。本開示に係る化合物は、合成および／または単離ができないほど不安定であることが当技術分野で公知のものを含まない。本開示は、ラセミ形および光学的純粋形の化合物を含むものとみなされる。光学活性（Ｒ）および（Ｓ）−または（Ｄ）および（Ｌ）−異性体は、キラルシントンもしくはキラル反応剤を用いて調製されうるか、または従来技術を用いて分割されうる。本明細書に記載の化合物がオレフィン結合または他の幾何不斉中心を含む場合、とくに明記されていないかぎり、化合物にはＥおよびＺ幾何異性体の両方が包含されるものとする。
【００６３】
本明細書で用いられる「相対立体化学」という用語は、２つ以上のステレオ中心間の空間配置を意味する。２つ以上のステレオ中心は、たとえば、ステレオ中心を関連付ける指定の分子平面または対称軸の同一側にシス配置でステレオ中心が配向するか、あるいはステレオ中心を関連付ける指定の分子平面または対称軸の反対側にトランス配置でステレオ中心が配向するか、を示すことにより、互いに関連付けられうる。したがって、中心間の相対立体化学では、以上に記載のＲまたはＳの絶対立体化学表示が定義されない。
【００６４】
「互変異性体」という用語は、本明細書で用いられる場合、平衡状態で存在しかつ一方の異性形から他方の異性形に容易に変換される２種以上の構造異性体の１つを意味する。本開示に係る特定の化合物は、示された互変異性形にかかわらず、互変異性形で存在しうるとともに、そのような互変異性形の化合物はすべて、熱力学的により安定な互変異性体であるかに関係なく、本開示の範囲内にあることは、当業者には自明であろう。本開示の目的では、互変異性体間の相互変換に関与する結合は、破線の結合として表される（たとえば、互変異性ケト官能基ではＣ−−−Ｃ＝Ｏ）。たとえば、互変異性ケト官能基は、そのエノール形で同等に示すことが可能である。
【００６５】
とくに明記されていないかぎり、本明細書に描かれた構造はまた、すべての立体化学形の構造、すなわち、各不斉中心に対してＲ配置およびＳ配置を含むものとみなされる。したがって、本化合物の単一の立体化学異性体、さらには鏡像異体およびジアステレオ異性体の混合物は、本開示の範囲内にある。
【００６６】
とくに明記されていないかぎり、本明細書中に示される構造はまた、１個以上の同位体富化原子が存在する点のみが異なる化合物をも含ものとみなされる。たとえば、ジュウテリウムもしくはトリチウムによる水素の置換または１３Ｃもしくは１４Ｃで富化された炭素による炭素の置換がなされている点を除けば本構造を有する化合物もまた、本開示の範囲内にある。
【００６７】
本開示に係る化合物は、そのような化合物を構成する１個以上の原子に天然に存在しない割合の原子同位体を含有しうる。たとえば、化合物は、たとえば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射性標識されうる。本開示に係る化合物の同位体変化形はすべて、放射性か否かにかかわらず、本開示の範囲内に包含される。
【００６８】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基部分に依存して、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むものとみなされる。本開示に係る化合物が比較的酸性の官能基を含有する場合、ニートまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで、そのような化合物の中性形を適量の所望の塩基に接触させることにより、塩基付加塩を得ることが可能である。薬学的に許容可能な塩基付加塩の例は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩と、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基と、を含む。本開示に係る化合物が比較的塩基性の官能基を含有する場合、ニートまたは好適な不活性溶媒中のいずれかで、そのような化合物の中性形を適量の所望の酸に接触させることにより、酸付加塩を得ることが可能である。薬学的に許容可能な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無機酸から誘導されるもの、さらには酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸から誘導される塩が挙げられる。このほかに、アルギニン塩などのアミノ酸塩、およびグルクロン酸やガラクツロン酸などのような有機酸の塩が挙げられる（たとえば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７，６６，１−１９を参照されたい）。本開示に係るいくつかの特定の化合物は、化合物を塩基付加塩または酸添加塩のいずれかにも変換しうる塩基および酸の両方の官能基を含有する。
【００６９】
化合物の中性形は、塩を塩基または酸と接触させてから従来の方法で親化合物を単離することにより再生可能である。化合物の親形は、極性溶媒への溶解性などの特定の物理的性質が種々の塩形とは異なる。
【００７０】
塩形に加えて、本開示は、プロドラッグの形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で化学的変化または代謝媒介変化を容易に受けて本開示に係る化合物を提供する化合物である。そのほかに、プロドラッグは、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境で化学的または生化学的な方法により本開示に係る化合物に変換可能である。たとえば、プロドラッグは、細胞または留置用マトリックスもしくは生体接着剤と一緒に配置された場合、好適な酵素または生物学的もしくは化学的な環境により（または自然に水により）、本開示に係る化合物に徐々に変換可能である。
【００７１】
本開示に係る特定の化合物は、非溶媒和形さらには水和形をはじめとする溶媒和形で存在可能である。一般的には、溶媒和形は、非溶媒和形と等価であるとみなされるべきものであり、本開示の範囲内に包含される。本開示に係る特定の化合物は、複数の結晶形またはアモルファス形で存在しうる。一般的には、物理的形態はすべて、本開示により想定される用途で等価であり、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
「ａ」、「ａｎ」、または「ａ（ｎ）」という用語は、本明細書の置換基群に関連して用いられる場合、少なくとも１個を意味する。たとえば、化合物が“ａｎ”  ａｌｋｙｌ  ｏｒ  ａｒｙｌ（アルキルまたはアリール）で置換される場合、化合物は、任意選択で少なくとも１個のアルキルおよび／または少なくとも１個のアリールで置換される。さらに、一部分がＲ置換基で置換される場合、その基は、「Ｒ置換」として参照されうる。一部分がＲ置換である場合、その部分は、少なくとも１個のＲ置換基で置換され、各Ｒ置換基は、任意選択で異なる。
【００７３】
化合物「の投与」または化合物「を投与する」という用語は、治療を必要とする被験体に本開示に係る化合物または化合物−マトリックス組成物または化合物−細胞−マトリックス組成物あるいは医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきであり、投与経路に関して非限定用語として理解されるべきである。
【００７４】
本開示に係る化合物の説明は、当業者に公知の化学結合の原理により限定される。したがって、基が１個以上の数の置換基により置換されうる場合、そのような置換は、化学結合の原理を満たすように、かつ本質的に不安定でない化合物、および／または周囲条件下、たとえば、水性、中性、もしくはいくつかの既知の生理学的条件下でおそらく不安定であるとして当業者に知られていると思われる化合物を与えるように、選択される。たとえば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者に公知の化学結合の原理に従って環ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することにより、本質的に不安定な化合物を回避する。
【００７５】
本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式Ｉ
【化５】
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で示される構造を有する。式中、鎖線は、任意選択の二重結合を表し、Ａ、Ｂ、Ｅは、炭素または窒素であり、Ｄは、炭素であり、Ｆは、窒素であり、Ｒ１、Ｒ６、およびＲ７置換基は、独立して、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニル、であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロプ−１−イル、Ｎ−アザシクロブト−１−イル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、またはＮ−プロピルピペラジニルである。
【００７６】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＩ
【化６】
2019213917.tif 000008
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ１およびＲ７置換基は、独立して、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニルであり、Ｒ４およびＲ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、クロロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロプ−１−イル、Ｎ−アザシクロブト−１−イル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、またはＮ−プロピルピペラジニルである。
【００７７】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＩａ
【化７】
2019213917.tif 000009
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ’’は、独立して、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イルであり、Ｘは、独立してかつ任意選択で、酸素または硫黄であり、かつ各Ｒ’’’は、独立して、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルである。
【００７８】
本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式ＩＩＩ
【化８】
2019213917.tif 000010
で示される構造を有する。Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、独立して、炭素または窒素であり、ＢおよびＤは、炭素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、もしくはＮ−フェニルアミノ、または非置換であり、Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、もしくは２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチル、であり、またはＲ６およびＲ７は、一緒になって、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含む。
【００７９】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶ
【化９】
2019213917.tif 000011
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ２は、独立して、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、もしくは２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、もしくは２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、一緒になって、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含む。
【００８０】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶａ
【化１０】
2019213917.tif 000012
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ６およびＲ７は、独立して、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、両方とも置換されて、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含み、Ｒ６およびＲ７は、両方がヒドロではなく、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、およびＲｖは、独立してかつ任意選択で、ジュウテロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、アセトアミド、ニトロ、メトキシ、エトキシ、プロピオキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、１，２，３−トリアゾリル、テトラゾリルで構成される。
【００８１】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶｂ
【化１１】
2019213917.tif 000013
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ６およびＲ７は、独立して、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、一緒になって、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含み、Ｒ６およびＲ７は、両方がヒドロではなく、ＸおよびＹは、独立して、炭素、酸素、または窒素であり、かつｍは、０〜６である。
【００８２】
本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式Ｖ
【化１２】
2019213917.tif 000014
で示される構造を有する。式中、Ａは、独立して、酸素、窒素、硫黄、または水素であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分であり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、（シクロヘテロアルキル）スルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、またはスルホネートである。
【００８３】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＶＩ
【化１３】
2019213917.tif 000015
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉ’、およびＲｉｉｉ’は、独立して、ヒドロ、メトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フルオロ、シアノ、グリシン−Ｏ−カルボキシレート、サルコシン−Ｏ−カルボキシレート、アラニン−Ｏ−カルボキシレート、バリン−Ｏ−カルボキシレート、ロイシン−Ｏ−カルボキシレート、イソロイシン−Ｏ−カルボキシレート、フェニルアラニン−Ｏ−カルボキシレート、チロシン−Ｏ−カルボキシレート、トリプトファン−Ｏ−カルボキシレート、アスパラギン−Ｏ−カルボキシレート、グルタミン−Ｏ−カルボキシレート、リシン−Ｏ−カルボキシレート、プロリン−Ｏ−カルボキシレート、２−アミノ−２−メチル−プロピオネート、１−アミノシクロプロピルカルボキシレート、１−アミノシクロブタンカルボキシレート、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロピル、Ｎ−アザシクロブチル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、またはＮ−プロピルピペラジニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルであり、またはＲ３およびＲ４は、アルキル鎖と一緒になって、５員環もしくは６員環を定義する。
【００８４】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＶＩａ
【化１４】
2019213917.tif 000016
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、およびＲｉｉｉ’は、独立して、ヒドロ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、ＲｉおよびＲｉ’置換基は、独立して、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチルであり、またはＲｉおよびＲｉ’は、アルキル鎖と一緒になって、５員環もしくは６員環を定義し、Ｒｖｉ置換基は、グリシノイル、サルコシノイル、アラニノイル、バリノイル、ロイシノイル、イソロイシノイル、フェニルアラニノイル、チロシノイル、トリプトファノイル、アスパラギノイル、グルタミノイル、リシノイル、アスパルトイル、グルタモイル、セリノイル、トレオニノイル、メチオニノイル、プロリノイル、（２−アミノ−２−メチル）プロパノイル、（２−アミノシクロプロピルメタノイル、または（１−アミノシクロブタン）カルボノイル、２−アミノ−３−メチルペンタノイル、２−アミノ−４−メチルペンタノイルである。
【００８５】
一実施形態では、本開示は、骨細胞に分化可能な単離された細胞が、単離されたヒト骨髄由来間葉幹細胞、脂肪組織のヒト間葉幹細胞、血液のヒト間葉幹細胞、骨アロ移植組織もしくは骨自家移植組織のヒト間葉幹細胞、歯髄のヒト間葉幹細胞、ヒト周皮細胞、ヒト筋芽細胞、およびヒト軟骨細胞、ヒト前骨芽細胞、尿幹細胞、またはそれらのそれぞれの前駆細胞、たとえば、羊水もしくは臍帯血から単離された幹細胞、胚性幹細胞、および誘導多能性幹細胞である、以上の組成物のすべてを提供する。
【００８６】
一実施形態では、本開示は、リン酸カルシウムマトリックスがリン酸三カルシウムセラミックまたは骨誘導性である、以上の組成物を提供する。
【００８７】
一実施形態では、本開示は、リン酸カルシウムマトリックスをさらに含む、以上の組成物のいずれかの組成物を提供する。ここで、化合物は、リン酸カルシウムマトリックスに共有結合もしくは非共有結合されるか、または骨誘導性である。
【００８８】
本開示は、ｃｉｓ−１−アセチル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンと、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【００８９】
本開示は、３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンと、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【００９０】
本開示は、（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩と、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【００９１】
本開示は、（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（３−（４−（２−アミノ−３−メチルブタノイルオキシ）ベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシリデン）−３−ヒドロキシプロプ−１−エニル）フェニルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩と、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【００９２】
一実施形態では、本開示は、化合物がリン酸カルシウムマトリックスに共有結合または非共有結合されている、以上の組成物を提供する。
【００９３】
一実施形態では、本開示は、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、Ｗｎｔタンパク質、トランスフォーミング成長因子、間質由来因子−１、上皮小体成長ホルモン、ビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、デオキシコール酸、テリパラチド、アスコルビン酸、アスコルビン酸２−リン酸、β−グリセロールリン酸、デキサメタゾン、もしくはそれらのそれぞれの塩、プロドラッグ、またはそれらの組合せをさらに含む、以上の組成物を提供する。
【００９４】
本開示は、
（ａ）式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物を用いて、骨細胞に分化可能な単離された細胞を処理することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの処理された細胞を被験体に投与することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【００９５】
本開示は、細胞を被験体に投与する前にステップ（ａ）からの細胞をリン酸カルシウムマトリックス上に接種するステップをさらに含む、以上の方法を提供する。
【００９６】
本開示は、
（ａ）式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物を用いて、骨細胞に分化可能な単離された細胞を処理することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの処理された細胞を被験体に投与することと、もしくは
（ｂ’）ステップ（ａ）からの処理された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを被験体に投与することと、または
（ａ’）骨細胞に分化可能な単離された細胞と、リン酸カルシウムマトリックスと、式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物と、を被験体に投与することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【００９７】
本開示は、骨細胞に分化可能な単離された細胞と、リン酸カルシウムマトリックスと、式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物と、を組み合わせて外科ケージ内に導入することにより調製された骨移植材料を提供する。
【００９８】
本開示は、式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される化合物を用いてリン酸カルシウム材料の存在下で細胞を処理することにより、リン酸カルシウム材料への細胞の接着性を増加させる方法を提供する。
【００９９】
本開示は、
（ａ）本開示に係る組成物と生体接着剤とを組み合わせることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の組成物を被験体に投与することと、または
（ｃ）ステップ（ａ）の組成物を外科ケージに添加して被験体内に留置することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【０１００】
本開示は、
（ａ）シール可能なチューブ内で本開示に係る組成物を凍結保存剤と組み合わせることと、
（ｂ）液体窒素中でチューブを凍結させることと、
（ｃ）液体窒素中でチューブを保持することと、
により、開示に係る組成物を凍結保存する方法を提供する。
【０１０１】
本開示は、
（ａ）リン酸カルシウム材料の存在下で試験化合物を細胞インキュベーションに添加することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞でアルカリホスファターゼ機能活性を決定することと、または
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞でＴｏｌｌ様レセプター発現を決定することと、または
（ｄ）ステップ（ａ）の細胞でＲｕｎｘ２およびＢＭＰ２  ｍＲＮＡタンデム発現を決定することと、
を含む、マトリックスの存在下で骨形成を刺激する新しい化合物を同定する方法を提供する。
【０１０２】
一態様では、本開示は、骨成長および修復に好適な、化合物とマトリックスとの組成物を提供する。
【０１０３】
他の態様では、本開示は、化合物とマトリックスと骨細胞に分化可能な単離された細胞との組成物を提供する。
【０１０４】
他の態様では、本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞との組成物を提供する。
【０１０５】
他の態様では、本開示は、骨形成を増加させる、複数の化合物とおよび／または複数のマトリックスとの組成物を提供する。
【０１０６】
他の態様では、本開示は、複数の化合物とおよび／または複数のマトリックスと骨細胞に分化可能な単離された細胞との組成物を提供する。
【０１０７】
他の態様では、本開示は、化合物とマトリックスと生体接着材料との組成物を提供する。
【０１０８】
他の態様では、本開示は、化合物とマトリックスと骨細胞に分化可能な単離された細胞と生体接着材料との組成物を提供する。
【０１０９】
他の態様では、本開示はと化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞と生体接着材料との組成物を提供する。
【０１１０】
他の態様では、本開示は、化合物が本明細書に定義された式Ｉ〜ＶＩで示される、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１１】
他の態様では、本開示は、化合物がＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）シグナリング経路をモジュレート可能な小分子である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１２】
他の態様では、本開示は、化合物がＷｎｔシグナリング経路をモジュレート可能な小分子である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１３】
他の態様では、本開示は、化合物がビタミンＤレセプターの機能および発現をモジュレート可能な小分子である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１４】
他の態様では、本開示は、化合物がアルカリホスファターゼ機能活性などの骨形成の表現型マーカーを促進可能な小分子である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１５】
他の態様では、本開示は、マトリックスが骨誘導材料である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１６】
他の態様では、本開示は、マトリックスが骨伝導材料である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１７】
他の態様では、本開示は、マトリックスがリン酸三カルシウムセラミックである、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１８】
他の態様では、本開示は、マトリックスが合成もしくは天然のポリマーである、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１１９】
他の態様では、本開示は、単離された細胞が動物幹細胞である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１２０】
他の態様では、本開示は、単離された細胞がヒト成人幹細胞である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１２１】
他の態様では、本開示は、単離された細胞がヒト間葉幹細胞である、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１２２】
他の態様では、本開示は、血清が存在する、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１２３】
他の態様では、本開示は、生物学的成長因子が添加されている、以上の組成物のいずれか１つを提供する。
【０１２４】
他の態様では、本開示は、新しい骨形成性培地である、本明細書に定義される式Ｉ〜ＶＩで示される化合物が追加された細胞培養培地の組成物を提供する。
【０１２５】
他の態様では、本開示は、式ＩＩで示される化合物を提供する。
【０１２６】
他の態様では、本開示は、式ＩＶで示される化合物を提供する。
【０１２７】
他の態様では、本開示は、式ＶＩで示される化合物を提供する。
【０１２８】
一実施形態では、本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式Ｉ
【化１５】
2019213917.tif 000017
で示される構造を有する。式中、Ａ、Ｂ、Ｅは、炭素または窒素であり、Ｄは、炭素であり、Ｆは、窒素であり、Ｒ１、Ｒ６、およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロプ−１−イル、Ｎ−アザシクロブト−１−イル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、Ｎ−プロピルピペラジニルである。
【０１２９】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＩ
【化１６】
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で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ１およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、イソプロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニル、であり、Ｒ４およびＲ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、クロロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロプ−１−イル、Ｎ−アザシクロブト−１−イル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、Ｎ−プロピルピペラジニルである。
【０１３０】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＩａ
【化１７】
2019213917.tif 000019
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ’’は、独立してかつ任意選択で、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イルであり、Ｘは、独立してかつ任意選択で、酸素または硫黄であり、Ｒ’’’置換基は、独立してかつ任意選択で、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルである。
【０１３１】
本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式ＩＩＩ
【化１８】
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で示される構造を有する。式中、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、独立してかつ任意選択で、炭素または窒素であり、ＢおよびＤは、炭素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルアミノ、または非置換であり、Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、両方とも置換されて、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含む。
【０１３２】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶ
【化１９】
2019213917.tif 000021
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシルフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、もしくは２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルであり、またはＲ６およびＲ７は、両方とも置換されて、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含む。
【０１３３】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶａ
【化２０】
2019213917.tif 000022
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ６およびＲ７は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルで構成され、またはＲ６およびＲ７は、両方とも置換されて、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含み、Ｒ６およびＲ７は、両方がヒドロではなく、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、およびＲｖは、独立してかつ任意選択で、ジュウテロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、アセトアミド、ニトロ、メトキシ、エトキシ、プロピオキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、１，２，３−トリアゾリル、テトラゾリルで構成される。
【０１３４】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＩＶｂ
【化２１】
2019213917.tif 000023
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ６およびＲ７は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルで構成され、またはＲ６およびＲ７は、両方とも置換されて、環内６員Ｎ−メチルピラジン環、Ｎ−エチルピラジン環、もしくはＮ−プロピルピラジン環を含み、Ｒ６およびＲ７は、両方がヒドロではなく、ＸおよびＹは、独立してかつ任意選択で、炭素、酸素、または窒素であり、ｍは、０〜６である。
【０１３５】
本開示は、化合物と骨細胞に分化可能な単離された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを含む組成物を提供する。ここで、化合物は、式Ｖ
【化２２】
2019213917.tif 000024
で示される構造を有する。
【０１３６】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＶＩ
【化２３】
2019213917.tif 000025
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ａは、独立してかつ任意選択で、酸素、窒素、硫黄、または水素であり、Ｒ１およびＲ２置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分であり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、（シクロヘテロアルキル）スルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、またはスルホネートである。
【０１３７】
一実施形態では、本開示は、化合物が式ＶＩａ
【化２４】
2019213917.tif 000026
で示される構造を有する、以上の組成物を提供する。式中、Ｒ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉｉｉ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、ＲｉおよびＲｉ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチルであり、または両方ともアルキル鎖で置換されて５員環もしくは６員環を含み、Ｒｖｉ置換基は、グリシノイル、サルコシノイル、アラニノイル、バリノイル、ロイシノイル、イソロイシノイル、フェニルアラニノイル、チロシノイル、トリプトファノイル、アスパラギノイル、グルタミノイル、リシノイル、アスパルトイル、グルタモイル、セリノイル、トレオニノイル、メチオニノイル、プロリノイル、（２−アミノ−２−メチル）プロパノイル、（２−アミノシクロプロピルメタノイル、（１−アミノシクロブタン）カルボノイル、２−アミノ−３−メチルペンタノイル、２−アミノ−４−メチルペンタノイルである。
【０１３８】
一実施形態では、本開示は、骨細胞に分化可能な単離された細胞が、単離されたヒト骨髄由来間葉幹細胞、脂肪組織のヒト間葉幹細胞、血液のヒト間葉幹細胞、骨アロ移植組織もしくは骨自家移植組織のヒト間葉幹細胞、歯髄のヒト間葉幹細胞、ヒト周皮細胞、ヒト筋芽細胞、およびヒト軟骨細胞、ヒト前骨芽細胞、尿幹細胞、またはそれらのそれぞれの前駆細胞、たとえば、羊水もしくは臍帯血から単離された幹細胞、胚性幹細胞、および誘導多能性幹細胞である、以上の組成物のすべてを提供する。
【０１３９】
一実施形態では、本開示は、リン酸カルシウムマトリックスがリン酸三カルシウムセラミックまたは骨誘導性である、以上の組成物を提供する。
【０１４０】
一実施形態では、本開示は、リン酸カルシウムマトリックスをさらに含む、以上の組成物のいずれかの組成物を提供する。ここで、化合物は、リン酸カルシウムマトリックスに共有結合されるか、または骨誘導性である。
【０１４１】
本開示は、ｃｉｓ−１−アセチル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンと、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【０１４２】
本開示は、３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンと、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【０１４３】
本開示は、（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩と、ヒト骨髄由来間葉幹細胞である単離された細胞と、リン酸三カルシウムセラミックと、の組成物を提供する。
【０１４４】
（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（３−（４−（２−アミノ−３−メチルブタノイルオキシ）ベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシリデン）−３−ヒドロキシプロプ−１−エニル）フェニルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩。
【０１４５】
一実施形態では、本開示は、化合物がリン酸カルシウムマトリックスに共有結合されている、以上の組成物を提供する。
【０１４６】
一実施形態では、本開示は、骨形態形成タンパク質、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、Ｗｎｔタンパク質、トランスフォーミング成長因子、間質由来因子−１、上皮小体成長ホルモン、ビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、デオキシコール酸、テリパラチド、アスコルビン酸、アスコルビン酸２−リン酸、β−グリセロールリン酸、デキサメタゾン、もしくはそれらのそれぞれの塩、プロドラッグ、またはそれらの組合せをさらに含む、以上の組成物を提供する。
【０１４７】
本開示は、
（ａ）式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物を用いて、骨細胞に分化可能な単離された細胞を処理することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの処理された細胞を被験体に投与することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【０１４８】
本開示は、細胞を被験体に投与する前にステップ（ａ）からの細胞をリン酸カルシウムマトリックス上に接種するステップをさらに含む、以上の方法を提供する。
【０１４９】
本開示は、
（ａ）式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物を用いて、骨細胞に分化可能な単離された細胞を処理することと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの処理された細胞を被験体に投与することと、または
（ｂ’）ステップ（ａ）からの処理された細胞とリン酸カルシウムマトリックスとを被験体に投与することと、または
（ａ’）骨細胞に分化可能な単離された細胞と、リン酸カルシウムマトリックスと、式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物と、を被験体に投与することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【０１５０】
本開示は、骨細胞に分化可能な単離された細胞と、リン酸カルシウムマトリックスと、式ＩＩで示される構造、式ＩＶで示される構造、または式ＶＩで示される構造を有する化合物と、を組み合わせて外科ケージ内に導入することにより調製された骨移植材料を提供する。
【０１５１】
本開示は、式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される化合物を用いてリン酸カルシウム材料の存在下で細胞を処理することにより、リン酸カルシウム材料への細胞の接着性を増加させる方法を提供する。
【０１５２】
本開示は、
（ａ）本開示に係る組成物と生体接着剤とを組み合わせることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の組成物を被験体に投与することと、または
（ｃ）ステップ（ａ）の組成物を外科ケージに添加して被験体内に留置することと、
を含む、骨形成の誘導方法を提供する。
【０１５３】
本開示は、
（ａ）シール可能なチューブ内で本開示に係る組成物を凍結保存剤と組み合わせることと、
（ｂ）液体窒素中でチューブを凍結させることと、
（ｃ）液体窒素中でチューブを保持することと、
により、開示に係る組成物を凍結保存する方法を提供する。
【０１５４】
本開示は、
（ａ）リン酸カルシウム材料の存在下で試験化合物を細胞インキュベーションに添加することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞でアルカリホスファターゼ機能活性を決定することと、または
（ｃ）ステップ（ａ）の細胞でＴｏｌｌ様レセプター発現を決定することと、または
（ｄ）ステップ（ａ）の細胞でＲｕｎｘ２およびＢＭＰ２  ｍＲＮＡタンデム発現を決定することと、
を含む、マトリックスの存在下で骨形成を刺激する新しい化合物を同定する方法を提供する。
【０１５５】
本発明に係る組成物は、マトリックス（前処理または他の処理）と、単離された動物細胞（前処理または他の処理）と、一般式Ｉ〜ＶＩで示される小分子と、血清と、本明細書にさらに記載される生体接着物質と、成分のすべての組合せと、を含む。
【０１５６】
マトリックスは、以下の非限定用語によりさらに記載されうる。
【０１５７】
マトリックスは、独立してかつ任意選択で、ナノメートル〜数メートルのサイズで延在しうる２次元または３次元のフレームワーク中の合成または天然に存在する物質で構成され、したがって、カルシウムまたはＴＣＰから誘導された材料、炭酸カルシウム、アラゴナイト、硫酸カルシウム、焼き石膏、バイオガラス、二酸化シリコン、フルオロシリケート、コロイドシリカ、酸化アルミニウム、アルミニウム金属合金、二酸化チタン、チタン金属合金、サンゴ、スポンジ骨格、加工藻類、サンゴ質ヒドロキシアパタイト、キトサン、多孔性または中実性のカーボン、グラファイト、木材、炭化木材、合成または天然に存在するポリマー、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（β−リンゴ酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（アジピン酸）、ポリ（テレフタル酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミノ酸、ポリリン酸塩、ポリホスホネート、ポリホスファゼン、ポリ（シアノアクリレート）、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリジヒドロピラン、ポリジメチルシロキサン、ポリメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルピロリドン、エチルビニルアセテート、ポリ（ビニルアセテート）、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリアセタール、炭水化物ポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、ヒアルロン酸、ペントサンポリスルフェート、デンプン、スクロース、ラクトース、フルクトース、寒天、アガロース、タンパク質、コラーゲン、アルブミン、ゼラチン、糖タンパク質、グリコシルアミノグリカン、ヘパリンスルフェート、コンドロイチン−４−スルフェート、コンドロイチン−６−スルフェート、ケラチンスルフェート、ポリまたはオリゴ−（エチレングリコール）から誘導された合成もしくは天然のポリマー、細胞排出生物学的マトリックス、脱ミネラル化骨マトリックス、失活骨マトリックス、失活筋肉組織、自家骨、同種異系骨、異種骨、海綿骨、フリーズドライ骨、死体骨、ボーンワックス、ビーワックス、骨セメント、またはそれらの組合せを含めて、ナノ粒子、マイクロ粒子、マクロ粒子、および他のマクロ物体、たとえば、シート、プレーン、ベッド、ブロック、ファイバー、メッシュ、ゲル、ネットワーク、ラティスなどからなりうる。
【０１５８】
他の態様では、マトリックスは、独立してかつ任意選択で、特定のマトリックスに適用可能なエッチング、超音波処理、３Ｄプリンティング、レーザーアブレーション、浸透圧ショック、電解、または電気メッキを含めて、化学的または物理的方法により、巨視的形状、多孔度、およびマイクロ多孔度を調整すべく、さらに改変されうる。
【０１５９】
他の態様では、マトリックスはさらに、独立してかつ任意選択で、塩、たとえば、塩化ナトリウム、フッ化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、フッ化リチウム、塩化カリウム、フッ化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム（ＩＩ）、フッ化マグネシウム（ＩＩ）、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム（ＩＩ）、塩化カルシウム、フッ化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、さらにはニトレート、カーボネート、ホスフェート、スルフェート、ハリド、ボロネート、オキシドの金属塩、アンモニウム塩、もしくは有機カチオン塩、またはリチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシウム、ルビジウム、ストロンチウム、セシウム、バリウム、スカンジウム、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、金、亜鉛、アルミニウム、ケイ素、ゲルマニウム、フッ素、ランタン、ユウロピウム、ガドリニウム、もしくはそれらの組合せの他の塩でドープされうる。
【０１６０】
他の態様では、マトリックスはさらに、独立してかつ任意選択で、混合物またはコポリマーを含めて、合成または天然に存在するポリマー、たとえば、ポリ（乳酸）およびポリ（グリコール酸）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（β−リンゴ酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（アジピン酸）、ポリ（テレフタル酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリアミノ酸、ポリホスフェート、ポリホスホネート、ポリホスファゼン、ポリ（シアノアクリレート）、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリジヒドロピラン、ポリジメチルシロキサン、コロイドシリカ、ポリメタクリレート、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルピロリドン、エチルビニルアセテート、ポリ（ビニルアセテート）、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリアセタール、炭水化物ポリマー、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デンプン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸誘導体、ペントサンポリスルフェート、寒天、アガロース、タンパク質、キトサン、コラーゲン、アルブミン、ゼラチン、糖タンパク質、グリコシルアミノグリカン、ヘパリンスルフェート、コンドロイチン−４−スルフェート、コンドロイチン−６−スルフェート、ケラチンスルフェート、ポリまたはオリゴ−エチレングリコールから誘導された合成または天然のポリマー、細胞排出生物学的マトリックスを用いて、その表面が被覆されうる。
【０１６１】
他の態様では、マトリックスはさらに、独立してかつ任意選択で、天然源から単離されているか合成により調製されたかにかかわらず、翻訳後修飾タンパク質、組換えタンパク質、またはペプチド、および前記タンパク質の生物活性セグメントを含めて、骨形成を促進すると認められる物質として生物学的活性タンパク質を用いて、その表面が被覆されうる。生物学的活性タンパク質の例としては、成長因子および生物物質、たとえば、骨形態形成タンパク質、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、骨シアロタンパク質、オステオプロテゲリン、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、血管内皮成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、間質由来成長因子、間質由来成長因子−１、上皮小体ホルモン、テリパラチド、白血病抑制因子、インスリン様成長因子、インスリン、Ｗｎｔタンパク質、フリズルドタンパク質、フラズルドタンパク質、ヘッジホッグタンパク質、コーディンタンパク質、ノギンタンパク質、ケルベロスタンパク質、フォリスタチンタンパク質、エリトロポイエチン、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ラミニン、ヘパリンスルフェート、コンドロイチン硫酸、ケラチンスルフェート、アルブミン、またはサイトカイン、たとえば、ＴＮＦα、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ、ＳＤＦ−１、細胞排出生物学的マトリックス、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１６２】
他の態様では、マトリックスにはさらに、独立してかつ任意選択で、小分子、たとえば、ビスホスホネート、他の生物活性剤にテザー連結されたビスホスホネート、ビタミン、ビタミンＤ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、デオキシコール酸、ステロイドおよび誘導体、抗生物質、免疫抑制薬理剤、ペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、オリゴ糖、グリコシルアミノ酸、ＴＬＲもしくはＷｎｔシグナリング経路をモジュレートする小分子、または医薬剤、薬剤の任意の組合せ、またはそれらの混合物が吸収されうる。
【０１６３】
一実施形態では、マトリックスは、任意選択で、リン酸カルシウム材料、たとえば、ヒドロキシアパタイト、二相性リン酸カルシウム、もしくはＴＣＰ、またはそれらの混合物で構成される。
【０１６４】
さらなる実施形態では、リン酸カルシウムから誘導されたマトリックスは、独立してかつ任意選択で、典型的には摂氏９００〜１５００度の焼結温度を含めて、さまざまな焼結温度でセラミックとして調製されたリン酸カルシウムをさらに含む。
【０１６５】
さらなる実施形態では、リン酸カルシウムから誘導されたセラミックマトリックスは、独立してかつ任意選択で、異なる格子構造、たとえば、ＴＣＰのα格子またはβ格子の形態を有してリン酸カルシウムから誘導されたセラミックで構成される。
【０１６６】
さらなる実施形態では、リン酸カルシウムから誘導されたマトリックスは、独立してかつ任意選択で、リン酸カルシウムから誘導された材料、たとえば、β−ＴＣＰと、ヒドロキシアパタイトと、の二相混合物で構成される。
【０１６７】
さらなる実施形態では、リン酸カルシウムから誘導されたマトリックスは、独立してかつ任意選択で、１０マイクロメートル未満のミクロ細孔のパーセントとして定義したとき０．５〜９５％の範囲内にあるミクロ多孔度を有して調製されたセラミックをさらに含む。
【０１６８】
さらなる実施形態では、リン酸カルシウムから誘導されたマトリックスは、独立してかつ任意選択で、種々の粒子サイズ、典型的には１００マイクロメートル〜１０ミリメートルのサイズを有して調製されたセラミックをさらに含む。
【０１６９】
好ましい実施形態では、マトリックスは、摂氏１１００度で焼結され、かつ粉砕され、かつ５００〜１０００マイクロメートルの粒子サイズに篩処理された、９０％以上のβ−リン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトとからなるリン酸カルシウムセラミックを含む。
【０１７０】
式Ｉ〜ＶＩで示される小分子は、以下の非限定用語により定義されうる。
【０１７１】
一態様では、本開示は、式Ｉで示される化合物または薬学的に許容可能なその塩、Ｎ−オキシド、立体異性体、もしくは溶媒和物を提供する。
【化２５】
2019213917.tif 000027
ここで、式Ｉは、以下のように定義される。
【０１７２】
Ａ、Ｂ、Ｅは、炭素または窒素であり、Ｄは、炭素であり、Ｆは、窒素であり、Ｒ１、Ｒ６、およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニルｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロピル、Ｎ−アザシクロブチル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、Ｎ−プロピルピペラジニルである。
【０１７３】
以上に定義された式ＩのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ハロ、ＣＦ３、Ｃ２Ｆ５、ヒドロキシル、シアノ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルカノエート、アミノアルカノエート、（ヘテロアルキル）カルボキシレート、アリールカルボキシレート、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、ヘテロアルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、（アミノアルキル）カルボニル、（アミノヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、スルホネート、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分によりさらに置換される。
【０１７４】
Ｒ２およびＲ３は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０１７５】
Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０１７６】
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０１７７】
Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、環系を含む。
【０１７８】
Ｒ８およびＲ９は、任意選択で、オキソ（＝Ｏ）、チオノ（＝Ｓ）、またはアルケニル（＝ＣＲ２）官能基として一緒になる。
【０１７９】
Ｒ１０およびＲ１１は、任意選択で、オキソ（＝Ｏ）、チオノ（＝Ｓ）、またはアルケニル（＝ＣＲ２）官能基として一緒になる。
【０１８０】
Ｒ８とＲ１０またはＲ１１とは、任意選択で、置換されて、シクロアルキル系、シクロヘテロアルキル系、アリール系、またはヘテロアリール系を含めて、環系を含む。
【０１８１】
Ｒ９とＲ１０またはＲ１１とは、任意選択で、置換されて、シクロアルキル系、シクロヘテロアルキル系、アリール系、またはヘテロアリール系を含めて、環系を含む。
【０１８２】
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１、およびＦは、独立してかつ任意選択で、置換されて、ＳおよびＲ立体異性体を含む。
【０１８３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立してかつ任意選択で、ラセミ形を含めて、立体異性体を含有する官能基により置換される。
【０１８４】
炭素原子、水素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、および硫黄原子が、独立してかつ任意選択で、たとえば、水素をジュウテリウムに、炭素−１２を炭素−１３に、または窒素−１４を窒素−１５に置き換えるなど、安定な同位体または放射性の同位体に置き換えられた、以上に列挙された原子の同位体形。
【０１８５】
式Ｉの好ましい実施形態は、式ＩＩにより表される部分構造である。
【化２６】
2019213917.tif 000028
ここで、式ＩＩは、以下のように定義される。
【０１８６】
Ｒ１およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、メチルカルボニル、トリジュウテロメチルカルボニル、トリフルオロメチルカルボニル、２，２，２−トリフルオロエチルカルボニル、プロピルカルボニル、ブチルカルボニル、ｓｅｃ−ブチルカルボニル、イソブチルカルボニルｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、ペンチルカルボニル、２−ペンチルカルボニル、３−ペンチルカルボニル、１，１−ジメチルプロピルカルボニル、１，２−ジメチルプロピルカルボニル、２−メトキシエチルカルボニル、２−エトキシルエチルカルボニル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、アザシクロプロプ−２−イルカルボニル、アザシクロブト−２−イルカルボニル、アザシクロペント−２−イルカルボニル、アザシクロヘキス−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル、テトラヒドロフラン−３−イルカルボニル、テトラヒドロチエン−２−イルカルボニル、テトラヒドロチエン−３−イルカルボニル、２，３−ジメトキシフェニルカルボニル、２，４−ジメトキシフェニルカルボニル、２，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，６−ジメトキシフェニルカルボニル、３，５−ジメトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリメトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリメトキシフェニルカルボニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニルカルボニル、４−エトキシフェニルカルボニル、２，３−ジエトキシフェニルカルボニル、２，４−ジエトキシフェニルカルボニル、２，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，６−ジエトキシフェニルカルボニル、３，４−ジエトキシフェニルカルボニル、３，５−ジエトキシフェニルカルボニル、２，３，４−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３，６−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，４，６−トリエトキシルフェニルカルボニル、３，４，５−トリエトキシフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニルカルボニル、２，４−ジメチルフェニルカルボニル、２，５−ジメチルフェニルカルボニル、２，６−ジメチルフェニルカルボニル、３，４−ジメチルフェニルカルボニル、３，５−ジメチルフェニルカルボニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニルカルボニル、２，３−ジエチルフェニルカルボニル、２，４−ジエチルフェニルカルボニル、２，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，６−ジエチルフェニルカルボニル、３，４−ジエチルフェニルカルボニル、３，５−ジエチルフェニルカルボニル、２，３−ジフルオロフェニルカルボニル、２，４−ジフルオロフェニルカルボニル、２，５−ジフルオロフェニルカルボニル、２，６−ジフルオロフェニルカルボニル、３，５−ジフルオロフェニルカルボニル、ペルフルオロフェニルカルボニルあり、Ｒ４およびＲ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、フルオロ、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロピル、Ｎ−アザシクロブチル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、Ｎ−プロピルピペラジニルである。
【０１８７】
式ＩＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒは、メチルでり、Ｒ’は、シクロプロピルカルボニルであり、かつＲ’’は、ヒドロである。
【０１８８】
式ＩＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒは、メトキシであり、Ｒ’は、イソプロピルカルボニルであり、かつＲ’’は、ヒドロである。
【０１８９】
式ＩＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒは、メチルであり、Ｒ’は、メチルカルボニルであり、かつＲ’’は、ヒドロである。
【０１９０】
式ＩＩの好ましい実施形態では、Ｃ２およびＣ４の２つのステレオ中心は、シス相対立体化学を有して、Ｃ２およびＣ４は、それぞれＲ配置およびＳ配置、またはそれぞれＳ配置およびＲ配置、または単一エナンチオマーのいずれかでありうる。
【０１９１】
式ＩＩの好ましい実施形態は、式ＩＩａにより表される部分構造である。
【化２７】
2019213917.tif 000029
ここで、式ＩＩａは、以下のように定義される。
【０１９２】
Ｒ’’は、独立してかつ任意選択で、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチルｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２−メトキシエチル、２−エトキシルエチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニルカルボニル、３−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニルで構成され、Ｒ４およびＲ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ジュウテリオ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、２−プロピルオキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、または１，２−ジメチルプロポキシある。
【０１９３】
式ＩＩａのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ４およびＲ’は、メチルであり、Ｒ’’は、シクロプロピルカルボニルであり、かつＲ７は、ヒドロである。
【０１９４】
式ＩＩａのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ４およびＲ’は、メトキシであり、Ｒ’’は、イソプロピルカルボニルであり、かつＲ７は、ヒドロである。
【０１９５】
式ＩＩａの好ましい実施形態では、Ｃ２およびＣ４の２つのステレオ中心は、シス相対立体化学を有して、Ｃ２およびＣ４は、それぞれＲ配置およびＳ配置、またはそれぞれＳ配置およびＲ配置、または単一エナンチオマーのいずれかでありうる。
【０１９６】
式ＩＩの好ましい実施形態は、式ＩＩａにより表される部分構造である。
【化２８】
2019213917.tif 000030
ここで、式ＩＩａは、以下のように定義される。
【０１９７】
Ｒ’’は、独立してかつ任意選択で、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イルであり、Ｘは、独立してかつ任意選択で、酸素または硫黄であり、Ｒ’’’置換基は、独立してかつ任意選択で、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルである。
【０１９８】
他の態様では、本開示は、式ＩＩＩで示される化合物または薬学的に許容可能なその塩、Ｎ−オキシド、もしくは溶媒和物を提供する。
【化２９】
2019213917.tif 000031
ここで、式ＩＩＩは、以下のように定義される。
【０１９９】
Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、Ｋ、およびＬは、独立してかつ任意選択で、炭素または窒素であり、ＢおよびＤは、炭素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルアミノであり、Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、５−（１，２，４−オキサジアゾリル）、３−（１，２，４−オキサジアゾリル）、２−ピラジニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アザシクロプロパン−１−イル、アザシクロプロパン−２−イル、アザシクロブタン−１−イル、アザシクロブタン−２−イル、アザシクロペンタン−１−イル、アザシクロペンタン−２−イル、アザシクロヘキサン−１−イル、アザシクロヘキサン−２−イル、テトラヒドルフラン−２−イルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、または２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルである。
【０２００】
以上に定義された式ＩＩＩのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ハロ、ＣＦ３、Ｃ２Ｆ５、ヒドロキシル、シアノ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルカノエート、アミノアルカノエート、（ヘテロアルキル）カルボキシレート、アリールカルボキシレート、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、ヘテロアルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、（アミノアルキル）カルボニル、（アミノヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、スルホネート、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分によりさらに置換される。
【０２０１】
Ｒ１およびＲ２は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０２０２】
Ｒ２およびＲ３は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、縮合環系を含む。
【０２０３】
Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０２０４】
Ｒ４およびＲ５は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、またはヘテロアリール縮合系を含めて、ビシナル縮合環系を含む。
【０２０５】
Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル系、シクロヘテロアルキル系、アリール系、またはヘテロアリール系を含めて、環系を形成する。
【０２０６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、オキソ（＝Ｏ）、チオノ（＝Ｓ）、もしくはアルケニル（＝ＣＲ２）官能基、または対応する互変異性体である。
【０２０７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立してかつ任意選択で、ＳおよびＲ立体異性体を含む立体異性体またはラセミ形を付与する官能基により置換される。
【０２０８】
炭素原子、水素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、および硫黄原子が、独立してかつ任意選択で、たとえば、水素をジュウテリウムに、炭素−１２を炭素−１３に、または窒素−１４を窒素−１５に置き換えるなど、安定な同位体または放射性の同位体に置き換えられた、以上の原子の同位体形。
【０２０９】
式ＩＩＩの好ましい実施形態は、式ＩＶにより表される部分構造である。
【化３０】
2019213917.tif 000032
ここで、式ＩＶは、以下のように定義される。
【０２１０】
Ｒ２置換基は、独立してかつ任意選択で、フェニル、ペルジュウテロフェニル、２−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−メトキシフェニル、２，３−ジメトキシフェニル、２，４−ジメトキシフェニル、２，５−ジメトキシフェニル、２，６−ジメトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、３，５−ジメトキシフェニル、２，３，４−トリメトキシフェニル、２，３，５−トリメトキシフェニル、２，３，６−トリメトキシフェニル、２，４，５−トリメトキシフェニル、２，４，６−トリメトキシルフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、２−エトキシフェニルカルボニル、３−エトキシフェニル、４−エトキシフェニル、２，３−ジエトキシフェニル、２，４−ジエトキシフェニル、２，５−ジエトキシフェニル、２，６−ジエトキシフェニル、３，４−ジエトキシフェニル、３，５−ジエトキシフェニル、２，３，４−トリエトキシフェニル、２，３，５−トリエトキシフェニル、２，３，６−トリエトキシフェニル、２，４，５−トリエトキシフェニル、２，４，６−トリエトキシルフェニル、３，４，５−トリエトキシフェニル、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニルカルボニル、２，３−ジメチルフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，５−ジメチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、３，４−ジメチルフェニル、３，５−ジメチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２，３−ジエチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，５−ジエチルフェニル、２，６−ジエチルフェニル、３，４−ジエチルフェニル、３，５−ジエチルフェニル、２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル、４−フルオロフェニル、２，３−ジフルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，５−ジフルオロフェニル、２，６−ジフルオロフェニル、３，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、ペルフルオロフェニル、２−シアノフェニル、３−シアノフェニル、４−シアノフェニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、２−オキサゾリル、２−チアゾリル、２−オキサゾリニル、２−ベンゾオキサゾリル、５−（１，２，４−オキサジアゾリル）、３−（１，２，４−オキサジアゾリル）、または２−ピラジニルであり、Ｒ６およびＲ７置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、または２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルである。
【０２１１】
式ＩＶの他の好ましい実施形態では、Ｒ６およびＲ７置換基は、両方とも置換されて、窒素含有環系が置換基として命名される４−（Ｎ−メチルピラジニル）、４−（Ｎ−エチルピラジニル）、４−（Ｎ−プロピルピラジニル）、４−（Ｎ−ブチルピラジニル）、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−アザシクロブチル、またはＮ−アザシクロプロパニルの窒素含有環系を含む。
【０２１２】
式ＩＶのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ２は、４−フルオロフェニルであり、Ｒ６は、２−（ジメチルアミノ）エチルであり、かつＲ７は、ヒドロである。
【０２１３】
式ＩＶのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ２は、フェニルであり、Ｒ６は、２−（ジメチルアミノ）エチルであり、かつＲ７は、ヒドロである。
【０２１４】
式ＩＩＩの好ましい実施形態は、式ＩＶａにより表される部分構造である。
【化３１】
2019213917.tif 000033
ここで、式ＩＶａは、以下のように定義される。
【０２１５】
Ｒ６は、独立してかつ任意選択で、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、または２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルで構成され、Ｒ７は、ヒドロであり、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒｉｖ、およびＲｖは、独立してかつ任意選択で、ジュウテロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、アセトアミド、ニトロ、メトキシ、エトキシ、プロピオキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、１，２，３−トリアゾリル、テトラゾリルで構成される。
【０２１６】
式ＩＶａの他の好ましい実施形態では、Ｒ６およびＲ７置換基は、両方とも置換されて、窒素含有環系が置換基として命名される４−（Ｎ−メチルピラジニル）、４−（Ｎ−エチルピラジニル）、４−（Ｎ−プロピルピラジニル）、４−（Ｎ−ブチルピラジニル）、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−アザシクロブチル、またはＮ−アザシクロプロパニルの窒素含有環系を含む。
【０２１７】
式ＩＩＩの好ましい実施形態は、式ＩＶｂにより表される部分構造である。
【化３２】
2019213917.tif 000034
ここで、式ＩＶｂは、以下のように定義される。
【０２１８】
Ｒ６は、独立してかつ任意選択で、２−（ジメチルアミノ）エチル、２−（ジエチルアミノ）エチル、２−（ジプロピルアミノ）エチル、３−（ジメチルアミノ）プロピル、３−（ジエチルアミノ）プロピル、３−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ジメチルアミノ）プロピル、２−（ジエチルアミノ）プロピル、２−（ジプロピルアミノ）プロピル、２−（ピロリジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−メチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−エチル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−プロピル−ピペラジニル）エチル、２−（Ｎ−アザシクロプロパニル）エチル、または２−（Ｎ−アザシクロブタニル）エチルで構成され、Ｒ７は、ヒドロであり、ＸおよびＹは、独立してかつ任意選択で、炭素、酸素、または窒素であり、ｍは、０〜６である。
【０２１９】
式ＩＶｂの他の好ましい実施形態では、Ｒ６およびＲ７置換基は、両方とも置換されて、窒素含有環系が置換基として命名される４−（Ｎ−メチルピラジニル）、４−（Ｎ−エチルピラジニル）、４−（Ｎ−プロピルピラジニル）、４−（Ｎ−ブチルピラジニル）、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−ピロリジニル、Ｎ−アザシクロブチル、またはＮ−アザシクロプロパニルの窒素含有環系を含む。
【０２２０】
他の実施形態では、本開示は、式Ｖで示される化合物または薬学的に許容可能なその塩、Ｎ−オキシド、もしくは溶媒和物を提供する。
【化３３】
2019213917.tif 000035
ここで、式Ｖは、以下のように定義される。
【０２２１】
Ａは、独立してかつ任意選択で、酸素、窒素、硫黄、または水素であり、Ｒ１およびＲ２置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分であり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、（シクロヘテロアルキル）スルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、スルホネート、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分である。
【０２２２】
以上に定義された式Ｖで示されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ハロ、ＣＦ３、Ｃ２Ｆ５、ヒドロキシル、シアノ、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１２）ヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、アルカノエート、アミノアルカノエート、（ヘテロアルキル）カルボキシレート、アリールカルボキシレート、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、ヘテロアルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、（アミノアルキル）カルボニル、（アミノヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、ヘテロアルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、スルホネート、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分によりさらに置換される。
【０２２３】
以上に定義された式Ｖで示されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、天然に存在するアミノ酸のカルボキシレートによりさらに置換される。
【０２２４】
Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて、シクロアルキル縮合系、シクロヘテロアルキル縮合系、アリール縮合系、ヘテロアリール縮合系などの縮合環系を含む。
【０２２５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立してかつ任意選択で、ＳおよびＲ立体異性体を含む立体異性体またはラセミ形を付与する官能基により置換される。
【０２２６】
炭素原子、水素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、および硫黄原子が、独立してかつ任意選択で、たとえば、水素をジュウテリウムに、炭素−１２を炭素−１３に、または窒素−１４を窒素−１５に置き換えるなど、安定な同位体または放射性の同位体に置き換えられた、以上に列挙された原子の同位体形。
【０２２７】
式Ｖの好ましい実施形態は、式ＶＩにより表される部分構造である。
【化３４】
2019213917.tif 000036
ここで、式ＶＩは、以下のように定義される。
【０２２８】
Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉ’、Ｒｉｉｉ’、Ｒ３、およびＲ４は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、（ヘテロアリール）アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、アルカノエート、アミノアルカノエート、（ヘテロアルキル）カルボキシレート、アリールカルボキシレート、アミノ、Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−（ヘテロアルキル）アミノ、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ，Ｎ−ジアリールアミノ、Ｎ−アミド、Ｓ−アルキルチオ、Ｓ−（ヘテロアルキル）チオ、Ｓ−アリールチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、（シクロヘテロアルキル）カルボニル、（アミノアルキル）カルボニル、（アミノヘテロアルキル）カルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオニル、アリールチオニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルホスホニル、アリールホスホニル、アミノホスホニル、ホスホネート、スルホネート、または塩もしくはプロドラッグを形成する他の部分で構成される置換基である。
【０２２９】
Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて、置換されたシクロアルキル系、シクロヘテロアルキル系、アリール系、ヘテロアリール系などの５員および６員の環系を含めて、環系を含む。
【０２３０】
式ＶＩの好ましい実施形態では、Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉ’、Ｒｉｉｉ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペントキシ、３−ペントキシ、１，１−ジメチルプロポキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２，２，２−トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フルオロ、シアノ、グリシンカルボキシレート、サルコシンカルボキシレート、アラニンカルボキシレート、バリンカルボキシレート、ロイシンカルボキシレート、イソロイシンカルボキシレート、フェニルアラニンカルボキシレート、チロシンカルボキシレート、トリプトファンカルボキシレート、アスパラギンカルボキシレート、グルタミンカルボキシレート、リシンカルボキシレート、プロリンカルボキシレート、２−アミノ−２−メチル−プロピオネート、１−アミノシクロプロピルカルボキシレート、１−アミノシクロブタンカルボキシレート、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−アザシクロプロピル、Ｎ−アザシクロブチル、Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペリジノ、Ｎ−ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、Ｎ−エチルピペラジニル、Ｎ−プロピルピペラジニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、トリジュウテロメチル、トリフルオロメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルであり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、ブチルである。
【０２３１】
以上の式ＶＩの好ましい実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて一緒になって、６員シクロヘキサノン環系を提供する−Ｃ３Ｈ６−アルキル鎖を構成する。
【０２３２】
式ＶＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉ’、Ｒｉｉｉ’置換基は、ヒドロ（Ｈ）であり、Ｒ３およびＲ４置換基は、両方とも置換されて、−Ｃ３Ｈ６−アルキル鎖を介する６員環系を形成し、かつＲｉｉおよびＲｉｉ’置換基は、両方ともＬ−バリンカルボキシレート塩酸塩である。
【０２３３】
式ＶＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉｉ’、Ｒｉｖ、およびＲｖ置換基は、ヒドロ（Ｈ）であり、ＲｉｉおよびＲｉｉ’置換基は、両方ともＯ−Ｌ−バリンカルボキシレート塩酸塩である。
【０２３４】
式ＶＩのさらなる好ましい実施形態では、Ｒ、Ｒｉ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉ’、Ｒｉｉ’、Ｒｉｉｉ’、Ｒｉｖ、およびＲｖ置換基は、ヒドロ（Ｈ）であり、Ｒｉｉ置換基は、Ｏ−Ｌ−バリンカルボキシレート塩酸塩である。
【０２３５】
式Ｖのさらなる好ましい実施形態では、式ＶＩａにより表される部分構造である。
【化３５】
2019213917.tif 000037
ここで、式ＶＩａは、以下のように定義される。
【０２３６】
Ｒ、Ｒｉｉｉ、Ｒ’、Ｒｉｉｉ’置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、ＲｉおよびＲｉ’の置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、フルオロ、クロロ、シアノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノであり、Ｒ３およびＲ４置換基は、独立してかつ任意選択で、ヒドロ、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒｖｉ置換基は、グリシノイル、サルコシノイル、アラニノイル、バリノイル、ロイシノイル、イソロイシノイル、フェニルアラニノイル、チロシノイル、トリプトファノイル、アスパラギノイル、グルタミノイル、リシノイル、アスパルトイル、グルタモイル、セリノイル、トレオニノイル、メチオニノイル、プロリノイル、（２−アミノ−２−メチル）プロパノイル、（２−アミノシクロプロピルメタノイル、（１−アミノシクロブタン）カルボノイル、２−アミノ−３−メチルペンタノイル、２−アミノ−４−メチルペンタノイルである。
【０２３７】
以上の式ＶＩａの好ましい実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、任意選択で、両方とも置換されて一緒になって、６員または５員のいずれかのシクロヘキサノン環系を提供する−Ｃ３Ｈ６−または−Ｃ２Ｈ４−アルキル鎖を構成する。
【０２３８】
生物学的活性小分子とマトリックスとおよび／または細胞とを含む本発明に係る組成物を以下の非限定用語で説明した。
【０２３９】
本発明に係る組成物の非限定例として、溶液、サスペンジョン、二相固液混合物、乾燥粉末、ゲル、パテとして、化合物とマトリックスとを混合することにより、もしくは化合物およびマトリックスの独立した調製物を混合することにより、たとえば、化合物の溶液をマトリックスに添加することにより、もしくは化合物の溶液を他の溶液中のマトリックスのサスペンジョンに添加することにより、化合物とマトリックスとの組成物を取得した。あるいは
本開示に係る組成物の調製方法の非限定例として、好適な液相中のサスペンジョン、または容器内、たとえば、細胞培養ディッシュ、プレート、バイオリアクター、もしくはマトリックス内の接着細胞、のいずれかとして存在する単離された細胞にマトリックスを添加し、その後、得られた混合物に化合物溶液を添加することにより、化合物とマトリックスと単離された細胞との組成物を取得した。あるいは
本発明に係る組成物の非限定例として、物理吸着もしくは化学吸着のいずれかで小分子をマトリックスの表面に吸着させることにより、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物とマトリックスとの組成物（すなわち、前処理マトリックス）を取得した。あるいは
本発明に係る組成物の調製方法の非限定例として、好適な液相中のサスペンジョン、または容器内、たとえば、細胞培養ディッシュ、プレート、バイオリアクター、マトリックス内の接着細胞、のいずれかとして存在する単離された細胞に、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物が吸着されたマトリックスを添加することにより、前処理されたマトリックスと単離された細胞との組成物を取得した。あるいは
本発明に係る組成物の非限定例として、さまざまな時間でいずれかの成分を導入または除去することを含めて、化合物とマトリックスとおよび／または細胞との組成物をさまざまな時間で混合した。あるいは
本発明に係る組成物は、作用剤の組合せにより、独立して使用されるいずれの作用剤をも上回って、細胞分化、細胞増殖、または細胞移行が増加するように、マトリックスの存在下で既知の骨形成性小分子および動物細胞を使用することを包含するものとみなされうる。あるいは
非限定例として、単離された細胞の存在下である、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物とマトリックスとの組成物は、骨髄由来の間質細胞もしくは間葉幹細胞、脂肪組織の間葉幹細胞、血液の間葉幹細胞、骨アロ移植組織または骨自家移植組織の間葉幹細胞、歯髄の間葉幹細胞、周皮細胞、筋前駆細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨軟骨前駆細胞、造血幹細胞、単球、リンパ球（もしくはＴ細胞）、尿幹細胞、またはそれらのそれぞれの前駆細胞、たとえば、羊水もしくは臍帯血から単離された幹細胞、胚性幹細胞、および誘導多能性幹細胞を含んでいた。あるいは
非限定例として、以上の組成物は、同種異系骨組織、骨髄の同種異系細胞、骨髄穿刺液の同種異系細胞、血液の同種異系細胞、軟骨の同種異系細胞、同種異系骨芽細胞、失活同種異系骨組織、脱ミネラル化同種異系骨組織、同種異系細胞または同種異系組織に由来する誘導多能性幹細胞、同種異系胚性幹細胞、自家骨、骨髄の自家細胞、骨髄穿刺液の自家細胞、血液の自家細胞、軟骨の自家細胞、自家骨芽細胞、失活自家骨組織、脱ミネラル化自家骨組織、自家細胞または自家組織に由来する誘導多能性幹細胞、自家胚性幹細胞、異種骨組織、骨髄の異種細胞、骨髄穿刺液の異種細胞、血液の異種細胞、異種骨芽細胞、失活異種骨組織、脱ミネラル化異種骨組織、軟骨の異種細胞、異種細胞または異種組織に由来する誘導多能性幹細胞、異種胚性幹細胞を含めて、同種異系源、自家源、または異種源の細胞をさらに含む。あるいは
非限定例として、以上の組成物は、任意選択で、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物および／またはマトリックスおよび／または細胞に結合可能な生体接着剤の添加、たとえば、フィブリンゲルの使用を含んでいた。あるいは
非限定例として、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物とマトリックスと細胞との組成物を、独立してまたは任意選択で、合成ポリマー、たとえば、アルキレンオキシドポリマーおよびそのコポリマー、たとえば、ポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンとのトリブロックコポリマーで構成されたポロキサマー、さらにはボーンワックス、ビーワックス、ゼラチン、ラミニン、カルシウムアルギネート、アガロース、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、炭水化物ポリマー、ヒアルロン酸および誘導体、糖、ゲル、ヒドロゲル、超分子ゲル、超分子ポリマー、パテ、脱ミネラル化組織もしくは失活組織、他のマトリックス、または凝固して留置可能な凝集性混合物を提供する血液および血清を含めて、担体物質、たとえば、ゲル、パテ、骨伝導材料、他の骨誘導材料、骨セメント、ならびに医薬用途および医療用インプラント手順で使用される合成または天然に存在する高分子材料と組み合わせた。あるいは
本発明に係る組成物を外科ケージまたは注射可能なシリンジの形態の外科インプラントデバイスに添加する。あるいは
式Ｉ〜ＶＩとマトリックスとの組成物を、独立してまたは任意選択で、外科デバイス、外科ケージで細胞および／もしくは担体物質と、またはチタン合金もしくは二酸化チタンとポリ（エーテルエーテルケトン）ポリマーとで構成された脊椎融合手順に使用される外科ケージを含めて、骨修復に使用するための外科機器と、または骨折部もしくは骨欠損部に留置するために、または骨欠損部位もしくはその近傍に医療シリンジにより注射するために、骨移植物質と、組み合わせる。あるいは
以上に記載したように、任意選択で、細胞、担体物質、または外科インプラントデバイスと組み合わされた、式Ｉ〜ＶＩとマトリックスとの組成物を、そのような目的に使用される抗生物質または免疫抑制剤を含めて、医療留置を促進する物質とさらに組み合わせる。あるいは
任意選択で担体物質と組み合わされた本発明に係る以上の組成物を、凍結保存を促進する物質とさらに組み合わせた。あるいは
本発明に係る組成物の好ましい実施形態では、単離された細胞は、ヒト骨髄由来間葉幹細胞などのヒト成体幹細胞であった。式Ｉ〜ＶＩで示される化合物およびリン酸三カルシウムセラミックマトリックスの存在下で、単離されたヒト骨髄由来間葉幹細胞を８日間培養した。誘導細胞−マトリックス組成物を採取し、次いで、フィブリンゲルと組み合わせ、そして凍結保存した。
【０２４０】
他の態様では、本開示は、化合物およびマトリックスの存在下で細胞を培養して細胞の骨形成を増加させるために用いられる方法を提供する。
【０２４１】
他の態様では、本開示は、化合物と、マトリックス上への細胞移行を増加させるマトリックスと、の存在下で細胞を培養するために用いられる方法を提供する。
【０２４２】
他の態様では、本開示は、化合物の存在下で細胞を培養して細胞の骨形成を増加させるために用いられる方法を提供する。
【０２４３】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するために用いられた方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物およびマトリックスの存在下で培養した。
【０２４４】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するために用いられた方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物およびマトリックスの存在下で培養し、次いで、細胞とマトリックスとの組成物を生体接着剤と組み合わせた。
【０２４５】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するために用いられた方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物およびマトリックスの存在下で培養し、次いで、細胞とマトリックスと化合物との組成物を生体接着剤と組み合わせた。
【０２４６】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するための方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物の存在下で培養し、次いで、独立したステップで、細胞をマトリックスと組み合わせた。
【０２４７】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するための方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物の存在下で培養し、次いで、独立したステップで、細胞をマトリックスおよび生体接着剤と組み合わせた。
【０２４８】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するために用いられた方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物およびマトリックスの存在下で培養し、次いで、独立したステップで、細胞とマトリックスとの組成物を生体接着剤と組み合わせた。
【０２４９】
他の態様では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供される骨形成性細胞インプラントを作製するために用いられた方法を提供する。ただし、単離された細胞を化合物およびマトリックスの存在下で培養し、その後、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に供すべく化合物を除去した。
【０２５０】
他の態様では、本開示は、化合物がＴｏｌｌ様レセプターシグナリング経路をモジュレート可能な小分子である、以上の方法を提供する。
【０２５１】
他の態様では、本開示は、化合物がＷｎｔシグナリング経路をモジュレート可能な小分子である、以上の方法を提供する。
【０２５２】
他の態様では、本開示は、化合物がビタミンＤレセプターの機能および発現を促進可能な小分子である、以上の方法を提供する。
【０２５３】
他の態様では、本開示は、化合物がアルカリホスファターゼ機能活性などの骨形成のバイオマーカーを促進可能な小分子である、以上の方法を提供する。
【０２５４】
一実施形態では、本開示は、骨形成を増加させた式Ｉ〜ＶＩで示される化合物を用いる以上の方法を提供する。
【０２５５】
一実施形態では、本開示は、マトリックスが骨誘導材料であった、以上の方法を提供する。
【０２５６】
一実施形態では、本開示は、マトリックスが骨伝導材料であった、以上の方法を提供する。
【０２５７】
一実施形態では、本開示は、マトリックスがリン酸三カルシウムセラミック顆粒であった、以上の方法を提供する。
【０２５８】
他の態様では、本開示は、マトリックスの存在下で化合物を単離された細胞に投与して、アルカリホスファターゼ機能活性を決定することにより、化合物−マトリックスの組合せを試験するために用いられた方法を提供する。
【０２５９】
他の態様では、本開示は、マトリックスの存在下で化合物を単離された細胞に投与して、骨形成のｍＲＮＡバイオマーカー、たとえば、Ｒｕｎｘ２およびＢＭＰ２、またはＴｏｌｌ様レセプターの発現を決定することにより、化合物−マトリックスの組合せを試験するために用いられた方法を提供する。
【０２６０】
他の態様では、本開示は、小分子とマトリックスとの組成物および調製方法の非限定例に対応する、マトリックス上に化合物を吸着させるために用いられた方法を提供する。
【０２６１】
他の態様では、本開示は、本発明に係る組成物を動物中に留置して、骨欠損、骨折、または骨疾患の骨の形成および／または修復を促進するために用いられた方法を提供する。
【０２６２】
他の態様では、本開示は、本発明に係る組成物を含有する外科ケージを動物中に留置して脊椎融合を行うための方法を提供する。
【０２６３】
他の態様では、本開示は、化合物および／またはマトリックスの存在下で細胞を培養することにより、骨形成性系列の新しい細胞系を誘導する方法を提供する。
【０２６４】
他の態様では、本開示は、化合物および／またはマトリックスの存在下で細胞を培養することにより、複能性細胞、多能性細胞、および全能性細胞の骨形成性細胞系列への細胞分化を誘導するために用いられた方法を提供する。
【０２６５】
他の態様では、本開示は、化合物および／またはマトリックスの存在下で細胞を培養して、他の系列にプレコミットされた細胞の細胞系列コミットメントを変更するために用いられた方法を提供する。
【０２６６】
他の態様では、本開示は、化合物および／またはマトリックスの存在下で細胞を共培養することにより、動物細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ拡大するために用いられた方法を提供する。
【０２６７】
他の態様では、本開示は、本開示に係る組成物を凍結保存するために用いられた方法を提供する。
【０２６８】
他の態様では、本開示は、本発明に係る組成物を調製するために用いられたプロセスを提供する。
【０２６９】
他の態様では、本開示は、動物において一般式Ｉ〜ＶＩで示される骨形成性化合物を用いて骨粗鬆症または他の骨疾患を治療するために用いられた方法を提供する。
【０２７０】
他の態様では、本開示は、独立したステップで、新骨形成、骨融合、または骨修復が望まれる部位にマトリックスのインプラントが施された動物に、一般式Ｉ〜ＶＩで示される骨形成性化合物を投与するための方法を提供する。
【０２７１】
他の態様では、本開示は、動物において骨欠損部、骨折部、または骨傷害部の近傍に本発明に係る組成物を留置することにより、傷害部位またはその近傍に細胞を誘引する方法を提供する。
【０２７２】
他の態様では、本開示は、傷害部位にマトリックスを留置し、かつ独立したステップで細胞の全身投与または局所投与を行って、傷害部位への細胞動員を増加させることにより、動物において骨傷害を修復する方法を提供する。
【０２７３】
他の態様では、本開示は、傷害部位にマトリックスを留置し、かつ独立したステップで一般式Ｉ〜ＶＩで示される化合物の全身投与または局所投与を行って、傷害部位への細胞動員を増加させることにより、動物において骨傷害を修復する方法を提供する。
【０２７４】
本開示はまた、パッケージング材料と、前記パッケージング材料内に含有された医薬組成物と、を含む製造物品を提供する。ただし、前記パッケージング材料は、前記医薬組成物が本開示に係る化合物およびマトリックスを含むことを示すラベルを含む。
【０２７５】
本開示はまた、たとえば、医薬製剤分野で周知の技術に従って、従来の固体または液体の媒体または希釈剤、さらには、所望の投与モードに適切なタイプの医薬品添加剤（たとえば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤、風味剤など）を利用することにより製剤化されうる、少なくとも１種の化合物とマトリックスとを含む組成物を提供する。
【０２７６】
本開示に係る化合物は、賦形剤を用いて製剤化されうる。本開示の実施に使用されることが想定される賦形剤は、当業者が入手可能なものであり、たとえば、米国薬局方Ｖｏｌ．ＸＸＩＩおよび国民医薬品集Ｖｏｌ．ＸＶＩＩ（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．（１９８９））（その関連内容は参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。それに加えて、本開示には、化合物の多形体、水和物、および溶媒和物が含まれる。
【０２７７】
開示された組成物は、任意の好適な手段により、たとえば、骨欠損部、骨折部、もしくは空隙空間に外科留置することにより、後続の留置に供される外科ケージ中に配置することにより、または注射技術により（たとえば、薬学的に許容可能な担体配合物中の無菌注射サスペンジョンとして）により、投与されうる。他の選択肢として、本発明に係る化合物およびマトリックスは、個別に投与可能である。この場合、マトリックスは、骨欠損部位、骨折部位、もしくは空隙部位に外科留置または注射され、かつ化合物は、たとえば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、または粉末剤の形態で経口的に、静脈内に、注入により、または局所注射もしくは全身注射により、投与可能である。そのような形態では、本発明に係る化合物は、リポソーム製剤を含めて、薬学的に許容可能な製剤で投与可能である。他の選択肢として、本発明に係る化合物は、注射もしくは注入によりまたは留置により、経口的に、静脈内に、局所的に投与可能である。
【０２７８】
ヒトなどの霊長動物に加えて、さまざまな他の動物を本開示に係る方法に従って治療可能である。たとえば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットなどの動物、または他のウシ科動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物、もしくはネズミ科動物の種を治療可能であるが、これらに限定されるものではない。
【０２７９】
この実施形態に係る化合物、化合物−マトリックス、または化合物−細胞−マトリックスの組成物は、単独または他の作用剤との組合せのいずれかで、薬学、細胞療法、または留置可能なデバイスおよび／もしくは材料の技術分野で周知の方法のいずれかにより、適宜、作製されうる。方法は、活性組成物を、１種以上の副成分を構成する担体または生体接着剤に、関連付けるステップを含む。一般的には、組成物は、活性成分を液体担体または微細化固体担体またはゲルと均一かつ十分に関連付けてから、必要であれば、生成物を所望の製剤に造形することにより、作製される。本発明に係る化合物を含有する医薬組成物はまた、経口使用に好適な形態、たとえば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性のサスペンジョン剤、分散性の粉末剤もしくは顆粒剤、エマルジョン剤、硬質もしくは軟質のカプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、存在しうる。
【０２８０】
本開示に係る化合物の経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造技術分野で公知の任意の方法に従って調製されうるとともに、薬学的に洗練された嗜好性のよい製剤を提供するために、そのような組成物は、甘味剤、風味剤、着色剤、および保存剤からなる群から選択される１種以上の作用剤を含有しうる。錠剤は、錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合して活性成分を含有する。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、または胃腸管内での崩壊および吸収を遅らせるように公知の技術によりコーティングして、より長期間にわたり持続作用を提供しうる。たとえば、グリセリルモノステアレートやグリセリルジステアレートなどの時間遅延材料を利用してもよい。それらはまた、制御放出に供すべく浸透圧治療錠剤を形成するようにコーティングしてもよい。
【０２８１】
また、経口使用に供される製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、たとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンと混合された硬質ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水または油性媒体、たとえば、ラッカセイ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセル剤として、提供されうる。
【０２８２】
任意の特定の患者に対する本開示に係る組成物の特定の用量レベルは、さまざまであり、骨欠損部、傷害部、または空隙空間部のサイズ、傷害の位置、および脊椎融合手順に供される外科ケージなどの外科デバイスのアイデンティティーまたは特性を含めて、さまざまな因子に依存するであろうことは、理解されよう。主に、特定の適応症に対する用量レベルは、外科医の自由裁量に委ねられ、医療分野で標準的な技術、機器、および方法により左右されるであろう。
【実施例】
【０２８３】
当該分野の慣例および技術
骨形成時の細胞分化。骨系列の細胞への幹細胞の分化を誘導するための一般的方法は、骨形成性培地中で細胞を培養することである。骨形成性培地は、βグリセロールリン酸、アスコルビン酸２−リン酸、およびデキサメタゾンからなるが、これらの作用剤の組合せまたは個別の成分を使用する骨形成性培地には多くの変化形態が存在するので、骨形成性培地の標準的処方を定義することは、困難である。典型的には、細胞は、骨形成性培地中で７〜２１日間培養され、その間、ヒト間葉幹細胞などの細胞は、骨系列の細胞に分化する。骨系列の細胞への幹細胞の分化を誘導する第２の方法は、正常培地または骨形成性培地のいずれかで細胞を培養することであるが、ただし、強力な細胞分化因子である骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）の添加を伴う。典型的な用量（２５〜３００ｎｇ／ｍＬ）でＢＭＰ−２を用いると、ヒトＭＳＣは、骨系列の細胞に分化する。
【０２８４】
骨形成時の細胞分化の特徴付け。骨系列に分化するヒト間葉幹細胞などの細胞は、複数の方法により特徴付けされる。細胞培養で骨形成を観測する主要な方法の１つは、無機ピロリン酸をリン酸に加水分解し、ヒドロキシアパタイトおよび骨組織の沈着ミネラルマトリックスの形成を促進する酵素であるアルカリホスファターゼをモニターすることによりものである。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のタンパク質レベルは、免疫組織化学的染色、ウェスタンブロット、およびＥＬＩＳＡにより決定される。ＡＬＰ機能活性の決定は、酵素の色素形成促進酵素または蛍光促進酵素を用いて細胞溶解物を処理し、蛍光シグナル測定またはＵＶ／Ｖｉｓ吸光度／透過率測定の読取り値として酵素活性を定量することに基づく。一般的には、タンパク質レベルおよびアルカリホスファターゼの関連酵素活性は、細胞が骨形成を受けるとともに増加するが、レベルは、経時的に安定化する。それに加えて、骨形成のバイオマーカーとして機能し、かつ細胞分化状態の変化をシグナル伝達する、ｍＲＮＡ発現の変化もまた、存在する。たとえば、Ｒｕｎｘ２、ＡＬＰ、コラーゲンＩ、オステオカルシン、骨形態形成タンパク質２、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、およびＳ１００Ａ４のｍＲＮＡ発現の増加は、ｑＰＣＲの技術により決定される。
【０２８５】
マトリックスの存在下で細胞に作用する式Ｉ〜ＶＩで示される化合物の作用により骨形成性系列に細胞を誘導する予想外にロバストな方法を介して、動物において骨形成および／または骨修復を促進するために、本発明に係る組成物および方法を使用した。本発明に係る組成物は、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物とマトリックス、または式Ｉ〜ＶＩで示される化合物とマトリックスと骨細胞に分化可能な単離された細胞、のいずれかを含むものであったが、これらに限定されるものではない。そのような組成物は、留置可能であり、自然骨修復プロセスが非効率的であるさまざまな用途で、または脊椎融合手順で、骨の形成および修復を改善するために使用される。本発明に係る方法により、これらの組成物の調製、さらには外科技術または注射技術を用いて動物において骨形成および骨修復を改善するためのそれらの使用が、同様に可能であった（ただし、これらに限定されるものではない）。また、前処理された細胞および／またはマトリックスの組合せは、骨形成および移行増加を含めて、予想外の細胞機能を誘導した。
【０２８６】
小分子で処理された細胞およびマトリックスの特徴の１つは、骨形成性培地、骨形成性サプリメント、またはＢＭＰ−２の不在下でさえも、これらの作用剤が骨形成を誘導することであった。さらに、マトリックスの存在下で式Ｉ〜ＶＩで示される化合物を適用することにより、独立して使用された化合物またはマトリックスのいずれよりも上回って、細胞で骨形成を誘導した。本発明に関連する分野のさらなる慣例を以下に説明する。
【０２８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで骨の形成および修復に適用するために、ｅｘ  ｖｉｖｏで本発明に係る組成物を調製した（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を用いて）。したがって、骨芽細胞特異的タンパク質の発現の検出、骨組織ミネラル化の検出、細胞内での遺伝子発現の改変など、骨形成の検出に利用されてきた従来の方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）により、組成物の単離された細胞での骨形成の誘導が検出された。骨芽細胞特異的タンパク質は、アルカリホスファターゼ、コラーゲンＩ、およびオステオカルシンを含んでいた。
【０２８８】
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＬＰ活性の検出。ＡＬＰは、分化骨芽細胞の分子マーカーとして広範に受け入れられてきた。骨前駆細胞が骨芽細胞に分化する場合、ＡＬＰの発現が増加するので、骨芽細胞は、無機ピロリン酸をリン酸に加水分解し、ヒドロキシアパタイトの形成または骨マトリックス中のミネラル化タンパク質沈着を促進する。他のシナリオでは、異なる系列に属する細胞が骨芽細胞に分化転換する場合、ＡＬＰの発現は、骨形成の分子マーカーである。分化骨芽細胞中のＡＬＰの活性は、基質としてパラニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰＰ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで解析した。培養ディッシュ上の細胞を添加されたｐＮＰＰと共に１０〜３０分間インキュベートした後、溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解し、プレートリーダーを用いてＡＬＰ機能活性の比色（またはＵＶ吸収／透過）読取り値により解析した。
【０２８９】
２．ｑＰＣＲによる骨形成性マーカーの検出。タンパク質レベルおよびＡＬＰ活性などの機能の変化に加えて、コラーゲンＩ、オステオカルシン、Ｒｕｎｘ２、ＢＭＰ−２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、または他の遺伝子のレベルの増加を含めて、骨芽細胞特異的遺伝子発現の変化が起こる。遺伝子発現の改変は、ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベルを分析することにより検出した。一般的には、化合物および／またはマトリックスと共に存在する組成物の細胞を溶解し、その全ＲＮＡを抽出した。そのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、一定レベルのｃＤＮＡをｑＰＣＲにより解析した。
【０２９０】
３．アリザリンレッド染色によるカルシウム沈着の検出。骨芽細胞が成熟する場合、骨の硬組織は、多量のヒドロキシアパタイトおよび／またはミネラル化タンパク質堆積物を含有する。ミネラル化沈着物のカルシウム成分は、アリザリンレッド染色（ＡＲＳ）により解析した。ＡＲＳは、組織中のカルシウムを特異的に染色するので、赤色は、蓄積された沈着カルシウムのインジケーターである。したがって、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物の存在下で骨細胞に分化可能な単離された細胞および／またはマトリックスは、当該分野の技術を用いてカルシウム沈着に関して特徴付け可能である。
【０２９１】
４．動物モデルでの骨修復。骨の傷害および修復の動物モデルで、本発明を適用した。動物モデルは、とくに、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、非ヒト霊長動物を含む。マウスおよびラットでは、従来のモデルは、筋肉パウチ留置モデル、皮下留置モデル、または頭蓋冠傷害、または下顎骨傷害を含む。骨形成を促進すると認められる正常骨環境外にインプラントが配置されるので、マウスの筋肉内留置モデルを用いて、インプラントの骨誘導性および骨形成性を評価した。したがって、筋肉内インプラントモデルにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨およびその前駆組織を形成するインプラントの内因的能力を試験した。この場合、自然骨環境で留置により偏りを生じる可能性は低い。また、免疫不全齧歯動物株の利用可能性は、免疫抑制剤の共投与を利用しないヒト細胞の研究を可能にした。本発明では、細胞とマトリックスと化合物とのさまざまな組合せを用いた留置可能な組成物をｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成に適用した。たとえば、化合物およびマトリックスの存在下で処理された単離された培養細胞の組成物を留置した。本発明ではまた、ｉ）化合物の存在下で処理した後で留置可能なマトリックスと組み合わされた単離された培養細胞の組成物を留置すること、ｉｉ）化合物で被覆されたかもしくはそれが吸着されたマトリックスを留置すること、ｉｉｉ）化合物を単独で投与すること、またはｉｖ）動物中にマトリックスを留置し、個別のステップで化合物を投与すること、を記述する。最も重要なこととして、化合物およびマトリックスの存在下で骨細胞に分化可能な単離された細胞の組成物は、個別に使用される化合物またはマトリックスのいずれの使用によっても予測されないロバストな骨形成を与えた。投与経路は、主に、生体接着剤、細胞担体、骨伝導足場、または外科デバイスと任意選択で組み合わされた本発明に係る組成物の外科留置または注射によるものであった。他の選択肢として、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物は、動物における骨形成を促進する方法として、経口的に、静脈内に、軟膏剤により、または局所注射もしくは注入により、動物に投与される。さらに、骨形成に対する化合物およびマトリックスの作用が、各エンティティーの異なる投与経路を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで再構成されるように、経口、静脈内、または注射／注入による化合物の投与は、マトリックスおよび／または細胞の外科留置と連携される。このように、医薬製剤および投与の慣例の多くが、当業者により理解されるように、本発明にも当てはまる。動物モデルでの骨形成の効率の評価は、新骨形成、骨修復、および骨癒合を定期的に組織形態計測により評価して、留置材料の組織学的評価の結果を分析することにより、行った。
【０２９２】
５．骨密度の測定。骨密度は、広く市販されている骨密度検出器により測定される。本発明を患者に投与した後、骨密度を定期的に測定して骨修復の進行をモニターする。一般的には、骨密度検出器は、全身骨画像を評価して画像の骨密度の変化を解析することが可能なＸ線イメージングシステムである。
【０２９３】
６．医療用途。本発明は、当該分野の標準的技術を用いて外科ケージを留置することにより、ヒト骨傷害の治療および骨修復の促進のために、さらには脊椎融合の促進のために、使用される。ただし、外科ケージは、本発明に係る組成物を含有する。ヒト骨疾患としては、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、マッキューン・オルブライト症候群、パジェット病、頸椎椎間板変性、腰部変性椎間板疾患、変性側弯症、および変性脊椎すべり症が挙げられる。既存の骨疾患は、骨修復プロセスまたは治療的介入の忠実度を損なうので、多くの場合、骨疾患は、骨折または骨損傷を修復する複雑な要因である。いくつかの場合、骨障害は、癌、たとえば、骨肉腫や骨に播種された他の癌に関連付けられうる。一部の骨傷害は、骨形成不全症、頭側傷害、または外傷から生じる骨折または骨破壊に起因する。動物モデルと同様に、本発明に係る投与は、ｉ）化合物およびマトリックスの存在下で培養された単離された細胞の組成物を留置することを含めて、ｉｉ）化合物の存在下で培養した後で留置可能なマトリックスと組み合わされた単離された細胞の組成物を留置することを含めて、ｉｉｉ）化合物がコーティンまたは吸着されたマトリックスの組成物を留置することを含めて、ｉｖ）化合物を単独で投与することを含めて、あるいはｖ）動物中にマトリックスを留置して、個別のステップで化合物を投与することを含めて、複数の製剤を介しておよび複数の経路を介して行われる。最も重要なこととして、化合物およびマトリックスの存在下で骨細胞に分化可能な単離された細胞の組成物は、個別に使用される化合物またはマトリックスのいずれの使用によっても予測されないロバストな骨形成を与える。投与経路は、主に、生体接着剤、細胞担体、骨伝導足場、または外科デバイスと任意選択で組み合わされた本発明に係る組成物の外科留置または注射によるものである。他の選択肢として、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物は、動物における骨形成を促進する方法として、経口的に、静脈内に、軟膏剤により、または局所注射もしくは注入により、動物に投与される。さらに、骨形成に対する化合物およびマトリックスの作用が、各エンティティーの異なる投与経路を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで再構成されるように、経口、静脈内、または注射／注入による化合物の投与は、マトリックスおよび／または細胞の外科留置と連携される。このように、医薬製剤および投与の慣例の多くが、当業者により理解されるように、本発明にも当てはまる。本発明の好ましい実施形態は、１％〜３０％の血清条件下、１００〜５００，０００／ｃｍ２の細胞密度、式Ｉ〜ＶＩで示される化合物（０．５〜５００ｎＭ）およびマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、８日間または好適な細胞培養時間の終了時まで培養された、骨に分化可能な単離された細胞を含むものであった。１〜２５日間培養した後、誘導細胞−マトリックス組成物をｉｎ  ｖｉｖｏで所望の部位に外科的に留置したか、または当該分野の技術標準を用いて脊椎融合手順により外科ケージに添加した。非限定例として、新骨形成、骨修復、および骨癒合／融合をラジオグラフィーで評価することにより、およびオスウェストリー障害指数などの患者の転帰基準によ��、骨形成の効率の評価を行った。
【０２９４】
以下の実施例により本開示の実施形態をさらに例示しうるが、これらに限定されるものではない。
【０２９５】
実施例１．式ＩＩで示される化合物を取得するための一般的合成手順およびその特徴付け
一般式ＩＩ：
【化３６】
2019213917.tif 000038
で示される構造を以下のスキームに従って合成した。
【０２９６】
スキーム１．式ＩＩで示される化合物を調製するための一般的手順。
【化３７】
2019213917.tif 000039
置換アニリンおよびアセトアルデヒドからの２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンの２，４−ｃｉｓおよび２，４−ｔｒａｎｓ立体異性体の両方の一般的合成手順（スキーム１）。１−Ｈ−ベンゾトリアゾール（０．４ｅｑｕｉｖ）をエタノール中のアセトアルデヒド（２ｅｑｕｉｖ、１Ｍ）およびアニリン（２．０ｅｑｕｉｖ、１Ｍ）の溶液に２１℃で添加し、密封フラスコ中で撹拌し、３〜７日間後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中ジエチルエーテル）により粗生成物を精製して、ｃｉｓ−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンおよびｔｒａｎｓ−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンおよび両方の立体異性体の混合画分を得た。
いくつかの場合、テトラヒドロキノリンを熱ヘキサン／ジエチルエーテル（約２／１）から再結晶化する。
【０２９７】
ｃｉｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（スキーム１）の一般的合成手順。無水酢酸（１．８当量）および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（０．１５当量）をＣＨＣｌ３中のｃｉｓ−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（１．０当量、０．１Ｍ）およびトリエチルアミン（３．３当量）の溶液に２１℃で添加した。２４時間後、反応をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）および飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／エチルアセテート）により精製し、ｃｉｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンを提供した。
【０２９８】
ｔｒａｎｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンおよびｔｒａｎｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−Ｎ−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（スキーム１の反応２）の一般的合成手順。無水酢酸（２．６当量）をＣＨＣｌ３中のｔｒａｎｓ−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（１．０当量、０．０９Ｍ）およびトリエチルアミン（３．３当量）の溶液に２１℃で添加した。１〜２時間後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）および飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／エチルアセテート）により精製し、ｔｒａｎｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンおよびｔｒａｎｓ−１−アセチル−２−メチル−Ｎ−アリール−Ｎ−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミンを提供した。
【０２９９】
１−ベンゾイル−２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４テトラヒドロキノリン−４−アミン（反応２ｉｎスキーム１）の代替的合成手順。ベンゾイルクロリド（１．３当量）をＣＨ２Ｃｌ２中のｃｉｓまたはｔｒａｎｓの２−メチル−Ｎ−アリール−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（１．０当量、０．０９Ｍ）およびトリエチルアミン（３．３当量）の溶液に２１℃で添加した。１〜１６時間後、反応を後処理し、標記化合物を提供した。
【０３００】
合成された式ＩＩで示される化合物の例は、表１に与えられており、化合物のすべての可能な立体異性体を含む。式Ｉおよび式ＩＩにより包含される他の化合物は、スキーム１および本明細書に記載の合成方法を適切に適用することにより、調製される。スキーム１に示される一般式ＩＩで示される化合物の特徴付けデータは、以下のとおりである。
【０３０１】
ｃｉｓ−１−アセチル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン（化合物１）。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３１．２（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．４４（６／４ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２７（ｂ，１Ｈ），７．１１−７．０１（ｍ，４Ｈ），６．５９（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｂ，１Ｈ），４．１７（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．６５（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．４，８．８，４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．２４（近接シグナルとオーバーラップする，１Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【表１】
2019213917.tif 000040
【０３０２】
ｃｉｓ−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物５。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２６７．２（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．３５（１０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．０８−７．０６（ｍ，３Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｂ，１Ｈ），３．８３（ｂ，２Ｈ），３．４６（ｍ，１Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．２５−２．１７（ｍ，４Ｈ），１．５８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．９，１１．３，３．９Ｈｚ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物６。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２６７．２（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．２６（１０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２６（ｓ，１Ｈ），７．０３（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｍ，２Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．７８（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｂ，２Ｈ），３．５９（ｍ，１Ｈ），２．４１（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．７，５．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），１．４９（ａｐｐ  ｑ，Ｊ＝１１．３，１Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−２−メチル−Ｎ−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物７。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２３９．２（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．３５（２０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２６−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．１０（ｍ，１Ｈ），６．７７−６．６７（ｍ，４Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝３．８，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｂ，２Ｈ），３．４８（ｍ，１Ｈ），２．２３（ｄｔ，Ｊ＝１３．２，２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．９，１１．３，３．８Ｈｚ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−２−メチル−Ｎ−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物８。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２６１．１（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．２６（２０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．４０（ｄｔ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２６−７．１９（ｍ，２Ｈ），７．０６（ｍ，１Ｈ），６．７７−６．６６（ｍ，４Ｈ），６．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８５（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｂ，２Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．７，５．５，２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．５３（ａｐｐ  ｑ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物９。Ｒｆ＝０．５３（４０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．９３（ｍ，３Ｈ），６．８３（ｔｄ，Ｊ＝８．５，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｍ，２Ｈ），６．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．４５（ｄｄ，Ｊ＝４．４，３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｂ，２Ｈ），３．４１（ｍ，１Ｈ），２．１４（ｄｔ，Ｊ＝１３．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５７（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．２，１１．３，４．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５９（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．０，１１．６，３．９Ｈｚ，１Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１０。Ｒｆ＝０．４７（４０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，３．８，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｍ，２Ｈ），６．７７（ｔｄｄ，Ｊ＝８．８，３．０，０．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｍ，２Ｈ），６．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７−３．４（ｂ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．６，５．５，２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．４９（ａｐｐ  ｑ，Ｊ＝１１．６，１Ｈ），１．２４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−２−メチル−６−メトキシ−Ｎ−（ｐ−メトキシフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１１。Ｒｆ＝０．３０（４０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．８５−６．７８（ｍ，４Ｈ），６．６９−６．６５（ｍ，２Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），４．７４（ｍ，１Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｑ，１Ｈ），２．３８（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−２−メチル−６−メトキシ−Ｎ−（ｐ−メトキシフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１２。Ｒｆ＝０．３５（４０％ジエチルエーテル／ヘキサン）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．８６−６．８１（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），６．７３（ｍ，１Ｈ），６．６８−６．６３（ｍ，２Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．４２（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｄｔ，Ｊ＝１２．９，２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．５７（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−アセチル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１３。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３１．０（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．２４（７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２０（ｂ，１Ｈ），７．０８（ｂ，２Ｈ），６．９９（ｄｄ，Ｊ＝８．５，０．６Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｂ，１Ｈ），４．５３（ａｐｐ  ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．２，７．２，４．７Ｈｚ，１Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．７４（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−（２−プロピルカルボニル）−２，６−ジメチル−４−（４−メチルフェニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、化合物１４。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３５８．９（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．５５（７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１７（ｓ，１Ｈ），７．１０（ｍ，１Ｈ），７．０２（ｍ，３Ｈ），６．５６（ｍ，２Ｈ），４．９２（ｂ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１０（ａｐｐ  ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６６（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．１，８．８，４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），１．２６（ｍ，４Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−（２−プロピルカルボニル）−２，６−ジメチル−４−（４−メチルフェニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、化合物１５。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３５９．０（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．５４（７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２２（ｂ，１Ｈ），７．０８（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，３Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．８７（ｂ，１Ｈ），４．５１（ａｐｐ  ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ａｐｐ  ｓｅｐｔｅｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．２，７．４，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．６８（ｂ，１Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．１８（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−（シクロプロピルカルボニル）−２，６−ジメチル−４−（４−メチルフェニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、化合物１６。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３４．５（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．４６（７／３ヘキサン／エチルアセテート）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２５（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．０９（ｄｄ，Ｊ＝７．９，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｍ，２Ｈ），６．６１（ｍ，２Ｈ），４．８２（ｍ，１Ｈ），４．２４（ｍ，１Ｈ），３．６８（ｂ，１Ｈ），２．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．０，８．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｍ，１Ｈ），１．２７（ｍ，２Ｈ），１．１６（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），１．０３（ｍ，１Ｈ），０．８８（ｍ，１Ｈ），０．７０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−（シクロプロピルカルボニル）−２，６−ジメチル−４−（４−メチルフェニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、化合物１７。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３４．５（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．６５（７／３ヘキサン／エチルアセテート）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２２（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），６．５９（ｍ，２Ｈ），４．８９（ａｐｐ  ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５１（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），１．７７（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．０３（ｍ，１Ｈ），０．８８（ｍ，２Ｈ），０．６８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−ベンゾイル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１８。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３９３．０（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．２９（８／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．２７（ｍ，３Ｈ），７．２７−７．１９（ｍ，４Ｈ），７．０６（ｍ，２Ｈ），６．７３（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｂ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｍ，１Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｍ，１Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−ベンゾイル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物１９。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３９３．０（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．３５（８／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３５−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．２７−７．１９（ｍ，４Ｈ），７．０３（ｍ，２Ｈ），６．７５（ｍ，１Ｈ），６．７０（ｂ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｍ，１Ｈ），２．４９（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｓ，６Ｈ），１．３３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−アセチル−４−（フェニルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、化合物２０。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２８１．９（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．２７（７／３ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１２（ｍ，４Ｈ），６．７５（ａｐｐ  ｔｔ，Ｊ＝７．４，１．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｍ，２Ｈ），４．９１（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，３．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｂ，１Ｈ），２．６６（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．７，８．５，４．１Ｈｚ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｍ，１Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−アセチル−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２１。Ｒｆ＝０．３０（６／４ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１１（ｂ，１Ｈ），７．０２（ｍ，２Ｈ），６．９２（ｍ，２Ｈ），６．５６（ｍ，２Ｈ），４．９３（ｂ，１Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝１２．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．４，８．８，４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｍ，１Ｈ），１．１７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−アセチル−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２２。Ｒｆ＝０．２４（７５／２５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１９（ｂ，１Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝８．５，３．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｔｄ，Ｊ＝８．６，３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｍ，２Ｈ），６．５６（ｍ，２Ｈ），４．８９（ｂ，１Ｈ），４．４９（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｂ，１Ｈ），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），１．７９（ｍ，１Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−ベンゾイル−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２３。Ｒｆ＝０．５８（６／４ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．２４（ｍ，５Ｈ），７．０５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．８，２．７，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），６．６４（ｍ，３Ｈ），６．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ａｐｐ  ｑｄ，Ｊ＝６．４，２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝１１．６，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｂ，１Ｈ），２．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．１，８．５，４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．２５（ｔｄ，Ｊ＝１２．１，８．２Ｈｚ，１Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−ベンゾイル−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２４。Ｒｆ＝０．４２（７５／２５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．２４（ｍ，５Ｈ），７．１７（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｍ，２Ｈ），６．７１（ｍ，２Ｈ），６．６６（ｍ，２Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），４．６３（ａｐｐ  ｔ，Ｊ＝５．０，Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），２．００（ｄｔ，Ｊ＝１３．３，５．５Ｈｚ，１Ｈ），１．３６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｃｉｓ−１−（ｐ−メトキシベンゾイル）−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２５。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４３０．８（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．１７（７５／２５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
δ７．２２（ｍ，２Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），６．７７（ｍ，２Ｈ），６．７１−６．５２（ｍ，４Ｈ），４．８９（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｄｄ，Ｊ＝１１．８，４．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．１，８．８，４．４Ｈｚ，１Ｈ），１．３９（ｔｄ，Ｊ＝１２．４，８．８Ｈｚ，１Ｈ），１．２８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−（ｐ−メトキシベンゾイル）−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２６。Ｒｆ＝０．１６（１／５／９４酢酸／アセトニトリル／クロロホルム）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２４（ｓ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．６４（ｍ，７Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ），４．６２（ａｐｐ  ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．４８（ｄｔ，Ｊ＝１３．２，６．６Ｈｚ，１Ｈ），１．９６（ｄｔ，Ｊ＝１３．８，５．５Ｈｚ，１Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−アセチル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−Ｎ−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２７。Ｒｆ＝０．１９（６／４ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２８（ｂ，１Ｈ），７．０２（ｍ，３Ｈ），６．８１−６．７０（ｂ，２Ｈ），６．１６（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｂ，１Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−ベンゾイル−２，６−ジメチル−Ｎ−（ｐ−メチルフェニル）−Ｎ−ベンゾイル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２８。Ｒｆ＝０．１５（８／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３８−７．２９（ｍ，３Ｈ），７．２６−７．１６（ｍ，５Ｈ），７．０９（ｍ，２Ｈ），６．９８−６．７８（ＡＢ  ｑ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｍ，１Ｈ），６．３６（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｂ，１Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．１６（ｍ，５Ｈ），１．３０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−ベンゾイル−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−Ｎ−ベンゾイル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物２９。Ｒｆ＝０．３１（７５／２５ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３９−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２６−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．１１（ｍ，２Ｈ），６．９１−６．８７（ｍ，４Ｈ），６．６６（ｔｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ），５．１２（ｂ，１Ｈ），２．３２（ｔｄ，Ｊ＝１２．７，５．０，１Ｈ），２．２０（ｍ，１Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
ｔｒａｎｓ−１−（ｐ−メトキシベンゾイル）−２−メチル−６−フルオロ−Ｎ−（ｐ−フルオロフェニル）−Ｎ−（ｐ−メトキシベンゾイル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−４−アミン、化合物３０。Ｒｆ＝０．３１（６／４ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３３−７．２９（ｍ，３Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−６．８９（ｍ，４Ｈ），６．６４（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．７Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝９．１，５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１９（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｂ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），２．３４（ｔｄ，Ｊ＝１３．２，５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｄｄｄ，Ｊ＝１２．９，８．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０３０３】
実施例２．式ＩＶで示される化合物を取得するための一般的合成手順およびその特徴付け
スキーム２に示される一般的合成手順に従って一般式ＩＶ：
【化３８】
2019213917.tif 000041
で示される構造を合成した。
【０３０４】
スキーム２．式ＩＶで示される化合物を調製するための一般的合成手順。
【化３９】
2019213917.tif 000042
α置換ニトリルとエチルカルボキシレートとの反応の一般的手順（スキーム２中の第１の反応）。エタノール中のＮａＯＥｔの２．２Ｍ溶液（１．２当量のＮａＯＥｔを送達）をニトリルの溶液（１当量、１Ｍ）に２１℃で添加した。エチルカルボキシレートを添加し、４０℃で２．５時間撹拌し、水とベンゼンとの間で分配し、２１℃に冷却し、激しく撹拌し、そしてｐＨ２にした。生成物を真空濾過により単離した。
【０３０５】
５−アミノ置換ピラゾールの一般的合成手順（スキーム２の反応２）。ヒドラジン一水和物（２．４当量）をトルエン中５％（ｖ／ｖ）酢酸のα置換ニトリル（１当量、０．２５Ｍ）の溶液に添加した。反応混合物を６時間還流し、周囲温度に冷却し、そしてロータリーエバポレーションにより濃縮した。こうして得られた残渣に２Ｎ  ＨＣｌ（ａｑ）を添加し、エチルアセテート／ヘキサンの１／１（ｖ／ｖ）混合物で洗浄した。酸性水性層を２８％ＮＨ４ＯＨ（ａｑ）でｐＨ１０まで処理し、生成物をエチルアセテート（４×）中に抽出し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、そして濃縮してアミノ置換ピラゾールを提供した。
【０３０６】
ピラゾロピリジンの一般的合成手順（スキーム２の反応３）。β−ケトエステル（１当量）を酢酸中のアミノ置換ピラゾール（１当量０．５Ｍ）の溶液に２１℃で添加した。反応を１２〜１８時間還流し、２１℃に冷却し、混合物にヘキサン／ジエチルエーテル（３／１）を添加し、生成物を沈殿させた。ヘキサン／ジエチルエーテル（３／１）を用いて真空濾過により生成物を捕集し、濯いだ。
【０３０７】
７−クロロ置換ピラゾロピリジンの一般的合成手順（スキーム２の反応４）。オキシ塩化リン（５．４当量）をトルエン中の７−ヒドロキシ置換ピラゾロピリジン（１当量、０．２７Ｍ）の溶液に２１℃で添加し、１２時間還流し、２１℃に冷却し、氷水上に注加し、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ）および飽和ＮａＣｌ（ａｑ）で洗浄し、濾過し、濃縮し、クロロ置換ピラゾロピリジンを与えた。
【０３０８】
７−アミノ置換ピラゾロピリジンの一般的合成手順（スキーム２の反応５）。アミン（５．５当量）を２−プロパノール中のクロロ置換ピラゾロピリジン（１当量、０．１９Ｍ）の溶液に２１℃で添加した。反応を１２〜１８時間還流し、２１℃に冷却し、次いで、−２２℃で貯蔵し、生成物を沈殿させた。
【０３０９】
合成された一般式ＩＶで示される化合物の例は、表２に与えられている。
【表２】
2019213917.tif 000043
【０３１０】
スキーム２に示される手順により調製された一般式ＩＶで示される化合物の特徴付けは、以下のとおりである。
【０３１１】
３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物２。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３１０．０（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｓ，１Ｈ），８．１０−８．０６（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．７２（ｂ，１Ｈ），３．８６（ｍ，２Ｈ），２．６８（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｍ，３Ｈ），２．３８（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−５，６−ジメチル−７−（Ｎ−メチル−Ｎ−ピペラジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３１。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３２２．３（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２７（ｓ，１Ｈ），８．０８−８．０５（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），２．７０（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｍ，３Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（３−メチルブチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３２。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３０９．２（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２３（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），６．２０（ｂ，１Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．６３（ｍ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｍ，１Ｈ），１．６６（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．００（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３３。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３２４．２（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２３（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｍ，６Ｈ），１．８９（五重線，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−５，６−ジメチル−７−［Ｎ−（２−メトキシエチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３４。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２９７．３（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），６．３４（ｂ，１Ｈ），３．９２（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
７−（（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−２，２−ジメチルプロパン）アミノ）−５，６−ジメチル−３−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３５。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３５２．２（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２２（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｂｒｏａｄ  ｓ，１Ｈ），８．０９（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），２．４０−２．３９（ｍ，８Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．０５（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
７−（（テトラヒドロピラン−４−イル）アミノ）−５，６−ジメチル−３−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、化合物３６。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３２３．３（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２５（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｄｔ，Ｊ＝１２．１，４．１Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｔｄ，Ｊ＝１１．１，２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６２（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．６６（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２，５，６−トリメチル７−［Ｎ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）アミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。化合物３７。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２４８．１（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．４９（ｍ，１Ｈ），６．１３（ｓ，１Ｈ），３．８３（ｍ，２Ｈ），２．８５（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｍ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−２，５，６−トリメチル７−［Ｎ−（２−Ｎ−メチルアミノエチル）−Ｎ−メチルアミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．９２（ｂ，２Ｈ），７．６８（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２４−３．２２（ｂ，６Ｈ），２．８４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｓ，６Ｈ），２．３１（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ。
３−フェニル−２，５，６−トリメチル７−［Ｎ−（２−Ｎ−メチルアミノエチル）−Ｎ−メチルアミノ］−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３２４．０（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７７（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｍ，２Ｈ），７．２３（ｍ，１Ｈ），６．５３（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．５３（ｍ，３Ｈ），２．３８（ｓ，６Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
【０３１２】
実施例３．式ＶＩで示される化合物を取得するための一般的合成手順およびそれらの特徴付け
スキーム３および４に示される一般的合成手順に従って式ＶＩ：
【化４０】
2019213917.tif 000044
で示される化合物を合成した。
【０３１３】
スキーム３．式ＶＩで示される化合物を調製するための一般的合成手順。
【化４１】
2019213917.tif 000045
方法Ａでは、無水ホウ酸（０．６５当量）を１，３−ジケトン（１当量、スキーム３）またはケトン（１当量、スキーム４）に添加し、Ａｒ下、室温で１時間撹拌した。個別に、トリ−ｎ−ブチルボレート（４．１当量）をエチルアセテート中のアルデヒド（２．０当量、０．８Ｍ）の溶液に添加し、ホウ酸錯体を添加し、ｎ−ブチルアミン（０．２当量）を１０分ごとに０．１ｍＬずつ添加した。得られた混合物を１２〜２０時間撹拌し、６０℃で加熱し、１時間撹拌しながらＨＣｌ（ａｑ）（０．４Ｎ、出発のケトンまたはジケトンの１ｍｍｏｌあたり１．５ｍＬ）で酸性化し、冷却し、有機層を水およびブラインで洗浄し、乾燥し、濾過し、濃縮乾固し、−２２℃フリッジで一晩にわたりＥｔＯＡｃおよびＭｅＯＨ（３／２）に溶解させた。濾過により沈殿物を捕集し、冷ＭｅＯＨで洗浄し、捕集し、乾燥し、生成物を与えた。スキーム３および４の方法Ｂでは、対応するアルデヒド（２当量）をケトンまたは１，３−ジケトン（１当量）のいずれかと無水ホウ酸（１当量）との混合物に添加した。モルホリン（ケトンまたは１，３−ジケトンの１ｍｍｏｌあたり０．０１ｍＬ）および酢酸（ケトンまたは１，３−ジケトンの１ｍｍｏｌあたり０．０１ｍＬ）を添加し、最大パワーでマイクロ波オーブン内で１分間加熱し、室温に冷却し、ＭｅＯＨを添加し、沈殿物を濾過し、冷ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、所望の生成物を提供した。
【表３】
2019213917.tif 000046
【０３１４】
１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン（クルクミン）、化合物３８。方法Ａ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３６９（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．４１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｍ，４Ｈ），６．７２（ｍ，２Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．６９（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス（４−ジメチルアミノ−２−メトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物３９。方法Ａ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４２３（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．２１（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９０（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ  ），６．５４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．４０−６．１９（ｍ，４Ｈ），５．７６（ｓ，１Ｈ）  ３．９０（ｓ，６Ｈ），３．０５（ｓ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
４−エチル−５−ヒドロキシ−１，７−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４０。方法Ａ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３５（Ｍ−）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ７．７７（ｍ，６Ｈ），７．１４（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｍ，４Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），１．０８（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−４−エチル−ヘプタ−１，６−ジエン−３，５−ジオン、化合物４１。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４１３（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．８（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６３（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｍ，４Ｈ），６．７０−６．６５（ｍ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，６Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．０２（ｍ，１２Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），０．９６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ。
４−エチル−１，７−ビス（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）−ヘプタ−１，６ジエン−３，５−ジオン、化合物４２。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４２３（ＭＮａ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９６−７．８８（ｍ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２６−６．９８（ｍ，６Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，６Ｈ），３．３１（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｍ，２Ｈ），０．９３（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス（４−（ジメチルアミノ）−２−メトキシフェニル）−４−エチル−ヘプタ−１，６ジエン−３，５−ジオン、化合物４３。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４４９（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．１９（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．００（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），６．２５（ｍ，４Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，６Ｈ），３．０５（ｍ，１２Ｈ），２．０１（ｍ，２Ｈ），０．９５（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−５−ヒドロキシヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４４、方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４１１（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．７１（８／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．０２（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｍ，２Ｈ），７．７０（ｍ，５Ｈ），６．２６（ｍ，１Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（４−メトキシ−フェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４５。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３５（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．１８（５／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．６２（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｍ，４Ｈ），６．９３（ｍ，４Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（３−ヒドロキシフェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４６。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３０９（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．５３（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５０（ｄ，Ｊ  ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ），７．１６（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ），７．００−６．９５（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），６．７８（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝  １５．９Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ−ＣＯ−），５．８０（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ−）ｐｐｍ。
１，７−ビス−（４−ジメチルアミノフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４７。方法Ａ、Ｒｆ＝０．５０（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６０（ｄ，Ｊ  ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｍ，４Ｈ），６．６８（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝  １５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．７３（ｓ，１Ｈ），３．０３（ｓ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４８。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６９（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．４３（１／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．４０（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ、  ２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），６．９１（ｍ，２Ｈ），６．７３（ｍ，２Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝  １７．１Ｈｚ，２Ｈ），５．７０（ｓ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（４−ヒドロキシ２−メトキシフェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物４９。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６７（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．３３（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．８７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ、  ２Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．７７（ｍ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，２Ｈ），６．４６（ｍ，２Ｈ），５．８０（ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（２−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物５０。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３６８（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．３０（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．０８（ｓ，２Ｈ），７．０５（ｍ，４Ｈ），６．３８−６．３０（ｍ，４Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス−（３−クロロ４−ヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物５１。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７６（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．１４（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．５４（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ、  ２Ｈ），７．４０−７．３６（ｍ，４Ｈ），６．３３（ｓ，２Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），５．７７（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（２−メトキシフェニル）−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物５２。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３３７（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．３８（５／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δδ８．０５（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８５−７．６０（ｍ，４Ｈ），７．１１−６．７０（ｍ，４Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ）  ６．００（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン、化合物５３。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７１（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．２６（５／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９３（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ、  ２Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．１０−６．９８（ｍ，３Ｈ），６．８７−６．８４（ｍ，３Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
１，７−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−ヘプタ−１，４，６−トリエン−３−オン（ＢＤＣ）、化合物５４。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ３０９（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．１５（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．５６（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｍ，４Ｈ），６．７８（ｍ，４Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，２Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），ｐｐｍ。
２−（４−ヒドロキシベンジリデン）−６−（３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリロイル）−シクロヘキサノン、化合物５５。ＥｔＯＡｃおよびＭｅＯＨからの再結晶化に従った方法Ａ。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３４７（Ｍ−）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ、９：１、ｖ／ｖ）：δ７．４６（ｍ，３Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝１５．９，２Ｈ），６．６７（ｍ，４Ｈ），２．５５（ｍ，６Ｈ），１．６７（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ。
２−（５−フルオロ−２−メトキシベンジリデン）−６−（３−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）−１−ヒドロキシアリリデン）シクロヘキサノン、化合物５６。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝４１１（Ｍ−）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．０５（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０５−６．９６（ｍ，３Ｈ），６．８８−６．８１（ｍ，３Ｈ），３．８６（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，６Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジリデン）−６−（３−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノフェニル）アクリロイル）シクロヘキサノン、化合物５７。方法Ａ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０３（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．６７（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７２（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．５０−７．３８（ｍ，４Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（  ｍ，４Ｈ），３．０３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１２Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），２．６５（  ｍ，２Ｈ），１．７９（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２−（４−ヒドロキシ３−メトキシベンジリデン）−６−（３−（４−ヒドロキシ３−メトキシフェニル）アクリロイル）シクロヘキサノン、化合物５８。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４０７（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．１５（３／２ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．７３（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｍ，１Ｈ），７．０６−６．９３（ｍ，６Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−２−メトキシベンジリデン）−６−（３−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−２−メトキシフェニル）アクリロイル）シクロヘキサノン、化合物５９。方法Ａ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６１（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．７２（ジクロルメタン）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ８．０１（ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｍ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ，２Ｈ），６．２０（ｍ，２Ｈ），３．８８（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，６  Ｈ），３．０３（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１２Ｈ），２．９４（ｍ，４Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２−（１−ヒドロキシ３−（４−ヒドロキシフェニル）アリリデン）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）シクロペンタノン、化合物６０。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３５（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．４８（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．５７（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．４１（ｍ，４Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），６．８７−６．８０（ｍ，４Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【０３１５】
本発明に係る式ＶＩの例として以下の化合物も調製した。
１−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−７−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）ヘプタ−１，６ジエン−３，５−ジオン、化合物６１。以下の手順により調製した。無水ホウ酸（０．９７ｇ、１４ｍｍｏｌ）をエチルアセテート（４ｍＬ）中に溶解された２，４−ペンタジオン（２ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、７０℃で４０分間撹拌し、４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（０．９９ｇ、６．７ｍｍｏｌ）およびトリブチルボレート（１．８ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）をこの溶液に添加した。得られた混合物を７０℃で３０分間撹拌した。ブチルアミン（０．６６ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を２０分間にわたり滴下し、次いで、１００℃で１時間撹拌した。この混合物に１Ｎ  ＨＣｌを添加し、溶液を５０℃で３０分間撹拌した。溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、得られた粗生成物をクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製し、黄色固体として１−（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−５−ヒドロキシヘキサ−１，４−ジエン−３−オンを与えた。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３２（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．２７（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）。この中間体（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および無水ホウ酸（２１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）をエチルアセテート（４ｍＬ）に溶解させ、７０℃で３０分間撹拌した。５−フルオロ−２−メトキシベンズアルデヒド（６４．５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）およびトリブチルボレート（０．２３ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）を添加した。反応を７０℃で３０分間撹拌した。ピペリジン（０．０４ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を１００℃で１時間撹拌し、次いで、６０℃に冷却し、ｐＨ３〜４になるように１Ｎ  ＨＣｌを添加した。４０分後、反応を冷却し、チルアセテートで抽出した。分取ＴＬＣ（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により粗生成物を精製して、化合物６１を与えた。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ３７０（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９５（ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，１Ｈ），７．５８−７．４４（ｍ，Ｊ＝１５Ｈｚ，３Ｈ  ），７．０５（ｍ，２Ｈ），６．８８（ｍ，２Ｈ），６．６６（ｍ，２Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝１５Ｈｚ，１Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），５．６０（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
２−（４−ヒドロキシベンジル）−６−（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパノイル）シクロヘキサノン、化合物６２。Ｐｄ／Ｃ（６ｍｇ）をＥｔＯＡｃ中の化合物５５（３０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）に添加し、Ｈ２（ｇ）を充填し、室温で２時間撹拌し、濾過し、そしてエバポレートして６２を与えた。ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝３７５（ＭＮａ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．０４（ｍ，４Ｈ），６．７５（ｍ，４Ｈ），３．１４（ｍ，１Ｈ），２．８４（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．５７（ｍ，４Ｈ），２．１８（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
５−ヒドロキシ−１，７−ビス（４−ヒドロキシフェニル）ヘプト−４−エン−３−オン、化合物６３。Ｐｄ／Ｃ（１９ｍｇ）をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）中の化合物５４（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）に添加し、水素を充填した。１２時間後、Ｐｄ／Ｃを濾別し、無色溶媒を除去して生成物５４与えた。ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝３１１（ＭＨ−）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．００（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），５．５０（ｓ，１Ｈ），２．７７（ｍ，４Ｈ），２．５２（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
２−（３−シクロヘキシルアクリロイル）−６−（シクロヘキシルメチレン）シクロヘキサノン、化合物６４。方法Ａ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３２７（ＭＨ−）、Ｒｆ＝０．１（２０／１ヘキサン／エーテル）、１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ６．５３（ｍ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｔ，１Ｈ），２．５−２．２８（ｍ，６Ｈ），１．７１−１．０４（ｍ，２２Ｈ）ｐｐｍ。
３，５−ビス（４−ヒドロキシベンジリデン）ジヒドロ−２Ｈピラン−４（３Ｈ）−オン、化合物６５。方法Ｂ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝３０９（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．４２（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７４（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｍ，４Ｈ），７．０５（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
２−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノベンジリデン）−６−（３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリロイル）シクロヘキサノン、化合物６６。２ステップで調製した。無水ホウ酸（５７１ｍｇ、８．２ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）中の２−アセチルシクロヘキサンオン（１．６ｍＬ、１２．３ｍｍｏｌ）に添加し、７０℃で４０分間撹拌し、次いで、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（０．５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびトリブチルボレート（１．３ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、ｎ−ブチルアミン（０．２ｍＬ）を滴下し、溶液を１００℃で１時間撹拌し、次いで、５６℃に冷却した。０．４Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）を添加し、混合物を５６℃で３０分間撹拌し、５６℃に冷却し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１００％ヘキサン→５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により粗生成物を精製して、黄色粉末として中間体３００ｍｇを与えた。ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝２４３（ＭＨ−），１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ／ＣＤＣｌ３，４／１，ｖ／ｖ）：δ７．６０（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｍ，２Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），１．７４（ｍ，４Ｈ）。ステップ２で、無水ホウ酸（１４．３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を２−（３−（４−ヒドロキシフェニル）アクリロイル）シクロヘキサノン（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）に添加し、次いで、４−ジメチルアミノベンズアルデヒド（３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、モルホリン（０．１ｍＬ）および酢酸（０．１ｍＬ）を添加した。反応を最大パワーでマイクロ波オーブン内で１分間加熱し、ＭｅＯＨを添加し、超音波処理し、エバポレートし、フラッシュクロマトグラフィーにより（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）精製し、黄色固体として１８ｍｇの生成物を与えた。Ｒｆ＝０．３２、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ＝３７６（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ，３０／１，ｖ／ｖ）：δ７．６５（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８４−６．７７（ｍ，６Ｈ），３．１４（ｓ，６Ｈ），２．６９（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｍ，２Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【０３１６】
本発明に係る一般式ＶＩで示される追加の化合物をスキーム４に従って調製した。
【０３１７】
スキーム４．式ＶＩで示される追加の化合物を調製するための合成手順。
【化４２】
2019213917.tif 000047
方法Ｃまたは方法Ｄの一般的手順を用いてスキーム４に従って化合物の合成を行った。
【０３１８】
方法Ｃ．ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１．２５当量／ヒドロキシル）または１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１．２５当量／ヒドロキシル）を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（５／１）中のクルクミン誘導体（１当量、０．０１２Ｍ）およびカルボン酸（２．０当量／ヒドロキシル）に添加した。いくつかの場合、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、０．２当量）を添加した。２１℃で２〜１６時間後、ＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分配し、分離し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、分取ＴＬＣまたはシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を用いて精製した。ステップ２で、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２（９／１）中の以上のクルクミン生成物（１当量、０．０２Ｍ）にＨＣｌ（ｇ）を０℃で１〜３時間バブリングし、エバポレートし、エーテルで洗浄し、ＨＣｌ塩を与えた。
【０３１９】
方法Ｄ．カルボン酸クロリド（２．１当量／ヒドロキシル）をＣＨ２Ｃｌ２中のクルクミン誘導体（１当量、０．０１〜０．１Ｍ）およびトリエチルアミン（２．１当量／ヒドロキシル）に添加した。２１℃で２〜１６時間後、反応をＣＨ２Ｃｌ２と水との間で分離し、脱水し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、分取ＴＬＣまたはシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、エステル化クルクミンを与えた。
【表４】
2019213917.tif 000048
【０３２０】
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノエート）、化合物６７。方法Ｃステップ１、ＤＣＣ使用、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝７２９．１（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．３（３／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．６４（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，４Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝９．３，４  Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｓ，１Ｈ），５．０６（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，１８Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（４，１フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩、化合物３。方法Ｃステップ２、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝５０６．９（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，４Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．１０（  ｓ，１Ｈ），４．２５（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），２．５（ｍ，２Ｈ），１．２２−１．１９（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３，５−ジオキソヘプタ−１，６−ジエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエート）、化合物６８。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝７２９（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．３（３／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６４（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，４Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝９．３，４  Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），５．８４（ｓ，１Ｈ），５．０６（ｍ，２Ｈ），４．４６（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，１８Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３，５−ジオキソヘプタ−１，６−ジエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２，６−ビス−アミノ）ヘキサノエートＨＣｌ塩、化合物６９。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝５６５（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．８０（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），６．８４（ｍ，４Ｈ），４．４１（ｍ，４Ｈ），３．０１（ｍ，４Ｈ），２．１８（ｍ，６Ｈ），１．８１（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（２−メトキシ−４，１−フェニレン）ビス（２−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノエート）、化合物７０。方法Ｃおよび分取ＴＬＣによる精製（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝７８９．５（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．４（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．６５（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１８−７．０６（ｍ，６Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，２Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），４．５４（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｓ，６Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，１８Ｈ），１．２５（ｍ，１２Ｈ），４．４５（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｓ，３６Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３−ヒドロキシ−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエン−１，７−ジイル）ビス（２−メトキシ−４，１−フェニレン）ビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩、化合物７１。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝５６７（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｓ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，６Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３，５−ジオキソヘプタ−１，６−ジエン−１，７−ジイル）ビス（２−メトキシ−４，１−フェニレン）ビス（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエート）、化合物７２。方法Ｃおよび分取ＴＬＣによる精製（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０４８（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝４．９（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ  １／１）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．６１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｍ，４Ｈ），７．０５（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｍ，４Ｈ），６．４４（ｍ，１Ｈ），５．７３（ｍ，２Ｈ），５．２９（ｍ，２Ｈ），４．６８（ｍ，２Ｈ），４．４５（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｍ，４Ｈ），１．４６（ｓ，３６Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−Ｏ，Ｏ’−（３，５−ジオキソヘプタ−１，６−ジエン−１，７−ジイル）ビス（４，１−フェニレン）ビス（２，６−ビス−アミノ）ヘキサノエートＨＣｌ塩、化合物７３。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝６４７（ＭＮａ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．６８（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．１３（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｓ，６Ｈ），２．９８（ｍ，６Ｈ），２．１５−１．７６（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。
酢酸４−（７−（４−アセトキシフェニル）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−ヘプタ−１，４，６−トリエニル）フェニルエステル、化合物７４。方法Ｄ、Ｒｆ＝０．７１（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．７０（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ−），７．６１（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），７．１７（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ−ＣＯ−），５．８７（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ−），２．３５（ｓ，６Ｈ，２ｘ  ＣＨ３）ｐｐｍ。
２，２−ジメチルプロピオン酸４−（７−（４−（２，２−ジメチルプロピオニルオキシ）−フェニル）−３，５−ジオキソ−ヘプタ−１，６−ジエニル）フェニルエステル、化合物７５。方法Ｄ、ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４７７（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．３５（４／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７０（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ−），７．６（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），７．１７（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ−ＣＯ−），５．８７（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ−），１．２２（ｓ，１８Ｈ，２ｘ（ＣＨ３）３）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（３−（４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノイルオキシ）ベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）フェニルビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノエート）、化合物７６。方法Ｃ、分取ＴＬＣによる精製（３／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝７４７（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．４７（３／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７８（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．６０−７．４２（ｍ，４Ｈ），７．１６（ｍ，４Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０７（ｍ，１Ｈ），４．４８（ｍ，２Ｈ），２．６９（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，１８Ｈ），１．１０（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（３−（４−（２−アミノ−３−メチルブタノイルオキシ）ベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシリデン）−３−ヒドロキシプロプ−１−エニル）フェニルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩、化合物４。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝５４７（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．８１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｍ，５Ｈ），４．２６（ｍ，２Ｈ），２．７６（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）４−（３−（３−（４−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノイルオキシ）−３−メトキシベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）−２−メトキシフェニルビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノエート）、化合物７７。方法Ｃ、分取ＴＬＣによる精製（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、ＥＳＩ／ＭＳ：８２９（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．４１（２／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１２−６．９９（ｍ，６Ｈ），５．１０（ｍ，２Ｈ），４．５３（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），２．７５−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｓ，１８Ｈ），１．０８（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）４−（３−（３−（４−（２−アミノ−３−メチルブタノイルオキシ）−３−メトキシベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）−２−メトキシフェニルビス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタノエート）ＨＣｌ塩、化合物７８。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝６０７（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７２（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３４−７．１１（ｍ，６Ｈ），４．２７（ｍ，２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），２．７７（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｍ，３Ｈ），１．８１（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｍ，１２Ｈ）ｐｐｍ。
４−（３−（３−（４−（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイルオキシ）−３−メトキシベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）−２−メトキシフェニルビス（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエート）、化合物７９。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０８７（ＭＮａ＋）、Ｒｆ＝０．４８（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．１２−６．９９（ｍ，６Ｈ），５．２４（ｍ，４Ｈ），４．６４（ｍ，４Ｈ），４．２９（ｍ，４Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．１３（ｍ，８Ｈ），２．６８（ｍ，４Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．３１（ｓ，１８Ｈ）ｐｐｍ。
４−（３−（３−（４−（２，６−ジアミノヘキサノイルオキシ）−３−メトキシベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）−２−メトキシフェニルビス（２，６−ジアミノヘキサノエート）ＨＣｌ塩、化合物８０。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝６６４（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７２（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．１１（ｍ，６Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｍ，８Ｈ），２．７８（ｍ，４Ｈ），２．０１（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（４−（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノイルオキシ）ベンジリデン）−３−ヒドロキシプロプ−１−エニル）フェニルビス（２，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノエート）、化合物８１。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝１００５（ＭＨ＋）、Ｒｆ＝０．６１（１／１ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．７７（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１６−７．０４（ｍ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，５Ｈ），５．２０（ｍ，２Ｈ），４．５４（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｍ，４Ｈ），２．６８（ｍ，４Ｈ），１．９６（ｍ，４Ｈ），１．８０（ｍ，４Ｈ），１．４７（ｓ，３６Ｈ）ｐｐｍ。
（２Ｓ，２’Ｓ）−４−（３−（４−（２，６−ジアミノヘキサノイルオキシ）ベンジリデン）−２−オキソシクロヘキシル）−３−オキソプロプ−１−エニル）フェニルビス（２，６−ジアミノヘキサノエート）ＨＣｌ塩、化合物８２。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ  ｍ／ｚ＝６０５（ＭＨ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．７９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｍ，５Ｈ），４．９６（ｍ，２Ｈ），４．３９（ｍ，４Ｈ），２．９９（ｍ，８Ｈ），２．７３（ｍ，４Ｈ），２．２２−１．５３（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。
（Ｓ）−４−（３−ヒドロキシ−７−（４−ヒドロキシフェニル）−５オキソヘプタ−１，３，６−トリエニル）フェニル２−Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ−３−メチルブタノエートＨＣｌ塩、化合物８３。方法Ｃ、１モル当量のバリン使用、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｍ，２Ｈ），６．８６（ｍ，２Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），５．８２（ｓ，１Ｈ），５．０９（ｍ，１Ｈ），４．４８（ｓ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｍ，９Ｈ），１．１２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．０６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ。
（Ｓ）−４−（３−ヒドロキシ−７−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソヘプタ−１，３，６−トリエニル）フェニル２−アミノ−３−メチルブタノエートＨＣｌ塩、化合物８４。方法Ｃ、ＥＳＩ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝４０７．２（ＭＨ＋）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ７．７３（ｍ  ２Ｈ），７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，２Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．８４−６．７８（ｍ，３Ｈ），６．６６−６．７１（ｍ，１Ｈ），１．２（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。（他のピークは溶媒シグナルとオーバーラップする）
【０３２１】
実施例４．リン酸三カルシウムマトリックスの作製
ＴＣＰ粉末を粉砕し、篩処理し、次いで、６０℃で２％過酸化水素（１．０ｇ粉末／１．２ｍＬ溶液）およびナフタレン粒子（７１０〜１４００μｍ、１．０ｇ粉末／０．３ｇナフタレン粒子の比）の溶液で処理した。続いて、ナフタレンを８０℃でエバポレートし、多孔性グリーン体を乾燥させた。グリーン体を１１００℃で８時間焼結することにより、多孔性リン酸三カルシウムを得た。得られたセラミックをアセトン、次いで７０％エタノールおよび脱塩水で超音波洗浄し、８０℃で乾燥し、使用前のγ線照射により滅菌した。
【０３２２】
実施例５．マトリックス上への化合物の吸着
本発明に係る物質および作製方法の非限定例として、リン酸カルシウムから誘導された材料などのマトリックスの表面上に一般式ＩＩ、ＩＶ、およびＶＩで示される化合物を吸着させた。
【０３２３】
式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される化合物をＭｅＯＨまたは好ましくはエチルアセテートのいずれかの有機溶媒に溶解させて、マトリックス（たとえば、リン酸カルシウムから誘導された材料）と組み合わせた。マトリックス−化合物溶液のサスペンジョンをＲＴで１０分間組み合わせ、エバポレートし、真空下で乾燥させた。化合物添加マトリックスの取得後、水、血清、または細胞培地の存在下で、化合物の遅放性を示す速度になり（たとえば、１では水中で３５３分間のｔ１／２）、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートするのに十分な遅放性であった。３を用いて０．０３％（ｗｔ／ｗｔ）で配合されたマトリックス（溶液中で０．３μｇ化合物／ｍｇセラミックまで送達可能）を作製するために、ＭｅＯＨ中の６μｇの３を約２０ｍｇのセラミックに添加した。１０分後、有機溶媒を除去して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための黄色〜橙色の被覆セラミックを提供した。
【０３２４】
実施例６．化合物をスクリーニングするためのＷｎｔ転写レポーターアッセイ
発光シグナルを規格化するための内部対照としてのＴＫ駆動ウミシイタケルシフェラーゼプラスミドおよび経路活性化源としてのＷｎｔ３Ａ発現ベクターと共に、（７×）ＴＣＦホタルルシフェラーゼ反応エレメントにより駆動される市販のＳｕｐｅｒ（８×）ＴＯＰｆｌａｓｈベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に一過的にトランスフェクトした。ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプラスミドにより８時間トランスフェクトし、９６ウェルプレートのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に再プレーティングし、続いて、化合物（１．６ｎＭ〜５μＭ）（ＤＭＳＯ最終濃度は０．５％である）で２０時間処理した。ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ値により規格化した。アッセイでのＷｎｔ反応の最大活性化は、最も強力なアクチベーターで約３００％であった（表５）。
【表５】
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【０３２５】
実施例７．本発明に係る物質によるＣ２Ｃ１２細胞の分化転換、分化転換プロセスの特徴付けプロトコル
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞を低継代（＜１５継代）で使用した。１０％熱不活性化ＦＢＳが追加されたＤＭＥＭ培地（成長培地）中、５％ＣＯ２、３７℃で、Ｃ２Ｃ１２細胞を培養した。
【０３２６】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）機能活性アッセイ：１２ウェルプレート中の１ｍＬ成長培地に７，０００細胞／ウェルでＣ２Ｃ１２細胞をプレーティングした。一晩インキュベートした後、リン酸カルシウムセラミック（５ｍｇ／ウェル）を細胞に添加した。０．１％ＤＭＳＯ中の１、２、３、または４を添加した（５００ｎＭ）。４８時間ごとに、化合物を含有する新鮮な培地で培地の半分を交換型した。６日後、培地を除去し、ＡＬＰ溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２  および１％トリトンＸ１００）を添加し、遠心分離（４℃、３５００×ｇで５分間）により細胞溶解物を取得した（ＲＴで１０分間インキュベーション）。パラニトロフェノールリン酸（ｐＮＰＰ）（２ｍｇ／ｍＬ）を５０μｌ細胞溶解物と共にインキュベートした（１０分、３７℃）。１００μｌの０．０２Ｎ  ＮａＯＨを添加した後、吸光度ＯＤ４０５を測定した。ブラッドフォードタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を決定した。ＡＬＰ活性の結果をｎＭ  ｐＮＰ加水分解／ｍｇ全タンパク質としてプロットした。対照サンプル（すなわち、ＤＭＳＯ処理サンプル）を１倍に規格化した後、変化倍率をプロットして相対ＡＬＰ活性を示した。式ＩＩまたはＩＶで示される２３種の化合物（Ｗｎｔシグナリング経路アクチベーター）（表６）および式ＶＩで示される２０種の化合物（ＴＬＲシグナリング経路アクチベーター）（表７）の骨形成効力（ＡＬＰ活性の増加）から、いくつかの試験化合物は骨形成性であるが、リン酸カルシウムマトリックスの存在下でＡＬＰ活性の有意な増加が観測されることが示された。このプロトコルは、ｈＭＳＣ細胞およびＥ１５細胞に同様に適用された。
【０３２７】
骨形成性マーカーのｑＰＣＲ検出：以上に記載したように、マトリックスの存在下または不在下で細胞を化合物と共に培養した。ただし、９６ウェルプレートフォーマットを使用した。Ｔｒｉｚｏｌを用いて細胞から全ＲＮをＡ抽出した（以上のとおり）。７５０ｎｇの全ＲＮＡを用いてＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉｓｃｒｉｐｔキットによりｃＤＮＡを作製し、２０倍希釈した後、ｑＰＣＲに使用した。次の条件下で、すなわち、９５℃２分間、４０サイクルで９５℃１０秒間および６０℃４５秒間、６０℃、融解曲線のために７１サイクルで、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲ結果をΔΔＣｔ法により解析した。１８ｓ  ｒＲＮＡを内部標準として使用した。このプロトコルをｈＭＳＣ細胞およびＥ１５細胞に適用した。
【表６】
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【表７】
2019213917.tif 000051
【０３２８】
細胞増殖／生存能アッセイ：９６ウェルプレート上に５００細胞／ウェルの密度で細胞を接種した。２４時間後、リン酸カルシウムマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下または不在下で化合物（すなわち、５ｎＭ、５０ｎＭ、５００ｎＭ、または５０００ｎＭ）を細胞に添加した。８日間にわたり４８時間ごとに培地の１／２を化合物を含有する新鮮な培地と置き換えた。指定の時間で、１μｇのレサズリンを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ただちに５９０ｎｍの蛍光シグナル（５３０ｎｍで励起）を測定した。読みを時間ゼロの値（ｖａｌｕｅ０ｈ）として表した。細胞を１時間インキュベートした後、５９０ｎｍで第２の蛍光測定を行った（ｖａｌｕｅ１ｈ）。対照条件（すなわち、ＤＭＳＯ媒体処理）に規格化した後、１時間と０時間との差（ｖａｌｕｅ１ｈ−ｖａｌｕｅ０ｈ）の読みを用いて、細胞増殖／生存能の変化倍率をプロットした。Ｗｎｔシグナリングを活性化する式ＩＩまたはＩＶで示される化合物およびＴＬＲシグナリング経路を活性化する式ＶＩで示される化合物を解析した。このプロトコルは、ｈＭＳＣ細胞およびＥ１５細胞にも同様に適用された。骨細胞系列にコミットする細胞の数がかなり限られている点を踏まえると、細胞増殖は、ロバストではなかった。
【０３２９】
アリザリンレッドＳ染色：ＡＬＰ機能活性アッセイに記載したようにＣ２Ｃ１２細胞を培養したが（２５日間にわたり４８時間ごと化合物を添加したこと以外は上記のとおり）、ただし、４８ウェルプレートフォーマットを使用した。２５日目、培地を除去し、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）で細胞を洗浄した。室温で７０％エタノールを用いて細胞を３０分間固定し、水で３回濯いだ。水を除去した後、各ウェルに２００μｌのアリザリンレッドＳ（２％、ｐＨ４．１）を添加し、少なくとも２０分間インキュベートした。色素を除去し、穏やかに混合しながら過剰のＨ２Ｏで細胞を４回洗浄した。細胞を水で覆って蒸発を防止し、プレートリーダーまたは顕微鏡により解析した。このプロトコルをｈＭＳＣ細胞およびＥ１５細胞に適用した。
【０３３０】
実施例８．リン酸カルシウムセラミックマトリックスの存在下または不在下でのＣ２Ｃ１２細胞に対する１、２、３、または４の作用
ＡＬＰ活性．化合物１、２、３、および４（５００ｎＭ）は、Ｃ２Ｃ１２細胞において未処理細胞と対比して骨形成（ＡＬＰ活性）を誘導した（１．７〜６倍）（表８および図１）。セラミックを用いずに処理されたＣ２Ｃ１２細胞と比較して、リン酸カルシウムセラミック（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、１〜４（５００ｎＭ）は、２．３〜２２倍の骨形成（ＡＬＰ活性）を誘導した（表８および図１）。
【表８】
2019213917.tif 000052
【０３３１】
２．バイオマーカー．未処理細胞と比較して、化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）は、Ｃ２Ｃ１２細胞において１．２〜５倍の骨形成性バイオマーカー（コラーゲンＩｍＲＮＡ）の発現を誘導した（実施例７に記載の６日間処理）。
【０３３２】
マトリックスを用いずに処理されたＣ２Ｃ１２細胞と比較して、リン酸カルシウムセラミック（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で１、２、３、または４（５００ｎＭ）で処理された細胞は、１０〜９０倍の骨形成性バイオマーカー（すなわち、コラーゲンＩｍＲＮＡ）の発現を顕著に誘導した（６日間処理、実施例７）。
【０３３３】
マトリックスの不在下で処理された細胞と比較して、化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）は、骨形成に関連付けられてきたＷｎｔ経路関連タンパク質ｍＲＮＡ（すなわち、ＩＤ３ｍＲＮＡ）の発現増加を誘導した。たとえば、マトリックスの不在下で、１は、１．８倍のＩＤ３ｍＲＮＡの発現増加を誘導し、マトリックスの存在下で、化合物１および２は、それぞれ、５．０倍および１．７倍のＩＤ３ｍＲＮＡの発現増加を誘導した（６日間処理、実施例７）。
【０３３４】
化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）は、単独で、Ｃ２Ｃ１２細胞の顕著なカルシウム沈着を誘導した。マトリックスの不在下で、１および２は、それぞれ、カルシウム沈着を１．６倍および２．０倍に増加させた。マトリックスの存在下で、１および２は、それぞれ、２．５倍および２．３倍のカルシウム沈着増加を誘導した（２５日間処理、実施例７）。
【０３３５】
実施例９．Ｃ２Ｃ１２細胞における化合物１、２、３、または４の毒性の欠如
以上に記載の標準的細胞培養条件を用いて化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ、２５日間にわたり４８時間ごと、実施例７）で処理された２５日間培養Ｃ２Ｃ１２細胞のアラマーブルーアッセイは、細胞生存能の減少を示さなかった。
【０３３６】
細胞傷害性はまた、ＢａｘやＦｏｓなどのアポトーシスマーカー遺伝子の発現増加に関連付けられる。ｑＰＣＲ解析に基づいて、我々は、化合物１、２、３、または４で２５日間まで処理されたＣ２Ｃ１２細胞で典型的なアポトーシスバイオマーカー（すなわち、ＢａｘおよびＦｏｓ）の遺伝子発現を検出できなかった（５００ｎＭまたは５μＭの化合物、２５日間にわたり４８時間ごと、実施例７）。
【０３３７】
実施例１０．化合物３で処理した後のｈＭＳＣにおける遺伝子発現
マトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で、ｈＭＳＣ細胞における標的ｍＲＮＡ発現に対する３（５００ｎＭ）の作用は、予想外なことに相乗的であった（ｑＰＣＲにより決定したとき）。Ｒｕｎｘ２およびＢＭＰ−２は、骨形成性マーカーであり、Ａｘｉｎ２、Ｗｎｔ３ａ、およびＳｏｘ９は、Ｗｎｔ誘導性遺伝子マーカーである。３日間処理した後、遺伝子発現を解析した（実施例７に記載のとおり）（表９）。マトリックスの存在下で、Ｒｕｎｘ２およびＢＭＰ−２  ｍＲＮＡ発現（それぞれ、８．２倍および７．５倍）は、骨形成と相関した。この３日間の間、Ｗｎｔリプレッサー遺伝子Ａｘｉｎ２は、３の処理により劇的に減少したが（８０％の減少）、Ｗｎｔ３ａやＷｎｔ５ａなどの他のＷｎｔ誘導性マーカーは、それぞれ、８２．４倍および６．３倍にアップレギュレートされた。Ｓｏｘ９発現は、４０％を減少した。マトリックスの不在下でのｈＭＳＣに対する３の作用と比較して、一般的には、マトリックスの存在下で３で処理された細胞では、遺伝子発現の増加が観測された（ＢＭＰ−２発現の相乗的増加およびＷｎｔ３ａ発現に対する顕著な相乗作用）。
【表９】
2019213917.tif 000053
【０３３８】
実施例１１．リン酸カルシウムセラミックマトリックスの存在下または不在下で式ｉｉ、ｉｖ、およびｖｉで示される化合物により誘導されるｈＭＳＣ細胞分化、分化転換プロセスの特徴付けプロトコル
ヒト骨髄由来間質細胞としても知られるｈＭＳＣを６継代未満で実験に使用した。２０％熱不活性化ＦＢＳおよび１×ＧｌｕｔａＭａｘが追加されたα−ＭＥＭ培地（成長培地）中、５％ＣＯ２、３７℃で、ｈＭＳＣを培養した。
【０３３９】
アルカリホスファターゼ機能活性アッセイ：ＡＬＰ機能活性のアッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（実施例７）に対して記載したのと同一の手順に従ってｈＭＳＣを用いて行った。
【０３４０】
骨形成性マーカーのｑＰＣＲ検出：
ｍＲＮＡ発現のアッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（実施例７）に対して記載したのと同一の手順に従ってｈＭＳＣを用いて行った。
【０３４１】
細胞増殖／生存能アッセイ：
細胞増殖のアッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（実施例７）に対して記載したのと同一の手順に従ってｈＭＳＣを用いて行った。
【０３４２】
アリザリンレッドＳ染色：
アリザリンレッドＳ染色のアッセイは、Ｃ２Ｃ１２細胞（実施例７）に対して記載したのと同一の手順に従ってｈＭＳＣを用いて行った。
【０３４３】
オイルレッドＯ染色：オイルレッドＯ（ＯＲＯ、１−（２，５−ジメチル−４−（２−５−ジメチルフェニル）フェニルジアゼニル）アゾナフタレン−２−オール）を用いて脂肪細胞の存在に対して染色した。ｄＨ２Ｏ中０．０３％の最終濃度を与えるようにＯＲＯ溶液を調製した。アリザリンレッド染色（実施例７）に対して以上に記載したように、４８ウェルプレートでｈＭＳＣを培養した。細胞インキュベーションの２５日目、室温で４％ホルムアルデヒドを用いて細胞を４０分間固定した。細胞を１時間染色し、続いて、洗浄水が透明になるまで（赤色溶出物がなくなるまで）、ｄＨ２Ｏ（１ｍＬ）で洗浄した。顕微鏡下で細胞培養物画像を取り込み、デンシトメトリーにより定量した。
【０３４４】
アルシアンブルー染色：アルシアンブルー染色を用いて軟骨細胞の存在に対して染色した。アルシアンブルー溶液（１％ｗｔ／体積、酢酸、ｐＨ２．５）。アリザリンレッドＳ染色アッセイ（実施例７）に対して以上に記載したように、４８ウェルプレートでｈＭＳＣを培養した。細胞培養の２５日後、室温で４％のホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し（４０分間）、１時間染色し、続いて、水が透明になるまで（青色溶出物がなくなるまで）、ｄＨ２Ｏ（１ｍＬ）で洗浄した。顕微鏡下で細胞培養物画像を取り込み、デンシトメトリーにより定量した。
【０３４５】
実施例１２．リン酸カルシウムセラミックマトリックスの存在下または不在下でのｈＭＳＣ分化に対する１、２、３、または４の作用
化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）ＤＭＳＯ処理細胞より２．６倍までのｈＭＳＣ（ＡＬＰ機能活性に基づく）中の誘導骨形成。化合物１、２、３、または４は、早くも８日目にＡＬＰ活性を誘導し、機能活性は、処理の８日目レベルから２５日目レベルまでさらに増加した（表１０および図２）。マトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で１、２、３、または４（５００ｎＭ）と共にｈＭＳＣを８日間インキュベートした後、ＡＬＰ機能活性に基づいて、リン酸カルシウムマトリックスのみで処理された細胞の４．５倍まで骨形成が誘導された（表１０および図２）。化合物１、２、３、および４はすべて、マトリックスの存在下で、早くも８日目にＡＬＰ活性を誘導し、機能活性は、処理の８日目レベルから２５日目レベルまでさらに増加した。驚くべきことに、マトリックスの存在下の化合物１、２、３、および４では、ＡＬＰ活性の増加は、化合物のみまたはマトリックスのみを用いてインキュベートされた細胞のＡＬＰ活性を有意に上回った（ｐ＜０．００５）。ＡＬＰ活性の誘導は、用量依存的であり、化合物１のＥＣ５０は２６ｎＭであり、化合物３のＥＣ５０は１４０ｎＭであり、化合物４のＥＣ５０は１３０ｎＭであった。
【０３４６】
化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）と共にｈＭＳＣをインキュベートしたところ、骨形成性バイオマーカー（すなわち、ＡＬＰｍＲＮＡ）の発現が、ＤＭＳＯ処理細胞の５倍まで誘導された（表１１）（実施例１１に記載の８日間細胞培養）。
【０３４７】
化合物３（５００ｎＭ）と共にｈＭＳＣを８日間インキュベートしたところ、骨形成性バイオマーカーＡＬＰおよびコラーゲンＩの発現が、媒体（すなわちＤＭＳＯ）処理細胞の４．０倍〜１．５倍に増加した（表１１）。
【表１０】
2019213917.tif 000054
【０３４８】
リン酸カルシウムセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で化合物３（５００ｎＭ、４８時間ごとに、実施例１１）と共にｈＭＳＣをインキュベートしたところ、骨形成性バイオマーカーが誘導された。化合物のみで細胞を処理する作用またはマトリックスのみで細胞を処理する作用のいずれと比較しても、ＶＤＲ、ＡＬＰ、コラーゲンＩ、およびオステオカルシンのｍＲＮＡ発現は、マトリックスの存在下で３で処理された細胞では、はるかに大きく増加した（５００ｎＭの３、４８時間ごとの８日間処理、実施例１１に記載のとおり）。たとえば、３およびリン酸カルシウムマトリックスの存在下で培養されたｈＭＳＣでは、ＶＤＲｍＲＮＡが４５倍に増加し、ＡＬＰｍＲＮＡが５５倍に増加した。結論として、小分子３は、ｈＭＳＣで骨形成を誘導したが、高精製クルクミン（すなわち３８）またはＢＤＣ（すなわち５４）の存在下でＶＤＲまたはＡＬＰのロバストなｍＲＮＡアップレギュレーションが観測されなかったので、リン酸カルシウムセラミックの存在下で、反応は、驚くほど増加する。３と細胞とマトリックスとの間に予想外の最適相互作用が存在し、ロバストな骨形成を与える。
【表１１】
2019213917.tif 000055
【０３４９】
マトリックスの存在下または不在下で化合物３または４と共にｈＭＳＣをインキュベートしたところ（２５日間、４８時間ごとの処理、実施例１１）、アリザリンレッド染色により決定したとき、カルシウム沈着の顕著な増加が示された。３または４（５００ｎＭ）でｈＭＳＣを処理したところ、カルシウム沈着が、それぞれ、２．０倍および２．１倍に増加し、マトリックスの存在下で化合物３または４でｈＭＳＣ（５００ｎＭ）を処理したところ、カルシウム沈着が、それぞれ、４．２倍および４．０倍に増加した（図３）。化合物３または４およびマトリックスの存在により、化合物のみまたはマトリックスのみでｈＭＳＣを処理するよりもはるかに骨形成が増加するという点で、カルシウム沈着の結果は、ＡＬＰ機能活性およびｍＲＮＡ骨形成性バイオマーカー発現と一致する。
【０３５０】
化合物３および４は、オイルレッドＯ染色により測定したとき、ｈＭＳＣの脂肪生成を促進しなかった。オイルレッドＯ染色剤は、ｈＭＳＣの天然系列である脂肪細胞を検出する。媒体（すなわちＤＭＳＯ）処理ｈＭＳＣと比較して、マトリックスの存在下または不在下で化合物３または４と共にｈＭＳＣをインキュベートしても、２５日後のオイルレッドＯ染色により決定したとき、脂肪生成の増加を生じなかった。デンシトメトリーによる細胞培養物画像の定量から、ＴＣＰ（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下での化合物３および４（５００ｎＭ、２５日間にわたり４８時間ごと、実施例１１）の作用は、脂肪生成に対して適度に阻害的であることが示された。
【０３５１】
化合物３および４は、アルシアンブルー染色により測定したとき、ｈＭＳＣの軟骨形成を促進しなかった。アルシアンブルー染色は、ｈＭＳＣの天然系列である軟骨細胞を検出する。媒体（すなわちＤＭＳＯ）処理ｈＭＳＣと比較して、マトリックスの存在下または不在下で化合物３または４と共にｈＭＳＣをインキュベートしても、２５日後のアルシアンブルーＯ染色により決定したとき、軟骨形成の増加を生じなかった。デンシトメトリーによる細胞培養物画像の定量から、ＴＣＰ（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下での化合物３および４（５００ｎＭ）の作用は、媒体（すなわちＤＭＳＯ）処理ｈＭＳＣと比較して、軟骨形成に対して適度に阻害的であることが示された。結論としては、マトリックスの存在下で３または４でｈＭＳＣを処理すると、細胞を骨系列に選択的にコミットするが、脂肪細胞や軟骨細胞にはコミットしない。
【０３５２】
実施例１３．化合物に対するｈＭＳＣの毒性の欠如
以上に記載の標準的細胞培養条件を用いて化合物１、２、３、または４（５００ｎＭ）と共にインキュベートされた２５日齢ｈＭＳＣ細胞のアラマーブルーアッセイ、では、細胞生存能の減少は示されなかった。
【０３５３】
化合物１、２、３、または４をｈＭＳＣに投与した後、アポトーシスの定量により測定したとき、細胞傷害性は示されなかった。ｈＭＳＣでは、ＢａｘやＦｏｓなどのアポトーシスｍＲＮＡバイオマーカー遺伝子の発現増加は、細胞傷害性に関連付けられる。ｑＰＣＲ解析に基づいて、我々は、化合物１、２、３、または４で２５日間まで処理されたｈＭＳＣ細胞で典型的なアポトーシスバイオマーカー（すなわち、ＢａｘおよびＦｏｓ）の遺伝子発現を検出できなかった（５００ｎＭまたは５μＭの化合物）。この結果から、化合物３または４の存在下で２５日間にわたりｈＭＳＣで誘導される細胞の増殖または分化またはカルシウム沈着は、石灰化をはじめとする異栄養イベントをもたらしうる細胞に対する毒性傷害によるものではないこと、および観測されたカルシウム染色が、成熟骨芽細胞のミネラル化マトリックス沈着に起因するものであること、が示された。
【０３５４】
実施例１４．化合物１、２、３、または４を用いたリン酸カルシウムセラミックマトリックスに対するｈＭＳＣの細胞移行および局在化の誘導
骨傷害部位へのヒトＭＳＣ移行は、修復プロセスの重要な部分である。トランスウェル移行システムを用いたｈＭＳＣ移行に関する研究から、化合物およびマトリックスの存在下でインキュベートされたｈＭＳＣでは、マトリックス上への細胞移行が増加することが示された。ｈＭＳＣを化合物（５００ｎＭ）で８時間前処理し、その後、移行アッセイを行った。８時間後、化合物を細胞から洗浄除去し、伝統的なトランスウェル移行システムに細胞を配置した。頂部リザーバーは、無血清ＤＭＥＭを含有し、底部リザーバーは、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳを含有していた。一晩インキュベートした後、非移行細胞を除去し、次いで、移行細胞（底部チャンバーに固着される）を７０％のＥｔＯＨで固定し（４０分間）、１ｍｇ／ｍＬのクリスタルバイオレット（１ｈｒ）で染色した後、全移行細胞を顕微鏡下でカウントした。化合物２（５００ｎＭ、８時間）で処理されたｈＭＳＣでは、マトリックスへの細胞移行が、以上に記載の条件下でＤＭＳＯ前処理細胞の１０倍誘導された。個別実験で、化合物４（実施例５で調製されたもの）であらかじめ被覆されたマトリックスを底部チャンバーに配置し、頂部チャンバーからのｈＭＳＣの移行を評価した。化合物４で被覆されたマトリックスでは、ＤＭＳＯ処理細胞と比較してマトリックスへの細胞移行が２倍誘導された。
【０３５５】
化合物１または２（５００ｎＭ、実施例５に記載したとおり）をあらかじめ吸着させたリン酸カルシウムマトリックスを用いて、ｈＭＳＣ移行を解析し、トランスウェルシステム（２％血清、以上に記載のとおり）で研究した。化合物１および２は、非被覆セラミックの３．５倍および１．９倍の細胞移行を誘導した。限定されるものではないが、これらの実施例から、本開示に係る化合物が存在する場合、リン酸カルシウムセラミックマトリックスへの細胞の移行および局在化を増加させる手法の有用性が示される。式ＩＩ、ＩＶ、およびＶＩで示される化合物を用いてセラミックをあらかじめ被覆したり、細胞を前処理したりすることもまた、有用である。
【０３５６】
実施例１５．化合物１、２、３、または４により誘導されるｈＭＳＣでのＴＬＲ発現
ＴＬＲは、ｈＭＳＣ分化のモジュレーターである。ＴＬＲ（ＴＬＲ１−１０）ｍＲＮＡは、ｈＭＳＣでのｑＰＣＲにより検出可能である。ＴＬＲ４は、骨形成のバイオマーカーであり、ＴＬＲ３は、脂肪生成のバイオマーカーである。化合物１、２、３、または４と共にｈＭＳＣを８日間共培養し、ｑＰＣＲによりＴＬＲ  ｍＲＮＡを定量した後、脂肪生成に対する骨形成のインジケーターとしてＴＬＲ４／ＴＬＲ３の発現比を決定した。化合物１、２、および３（５００ｎＭ）は、ＴＬＲ４／ＴＬＲ３比の中程度の増加を誘導した。予想外だったことは、類似の条件下において、リン酸カルシウムマトリックスの存在下では、ＴＬＲ４／ＴＬＲ３比の５〜９倍増加が観測されたことから、式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される化合物で処理された細胞の骨形成活性がマトリックスの存在下で劇的に増加するという観測が裏付けられる。また、我々は、他の条件が同じであればＥ１５細胞でのＴＬＲ４／ＴＬＲ３の遺伝子発現比が３〜４倍に増加することを観測した。
【０３５７】
実施例１６．ＥＳＣを培養し、細胞分化を促進し、分化プロセスを特徴付けるためのプロトコル
１５継代未満でＡＴＣＣから取得したヒト胚性幹細胞Ｅ１５（ｈＥＳＣ）を、１５％熱不活性化ＦＢＳおよび１×ＧｌｕｔａＭａｘが追加されたＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２中、３７℃で、培養した。ＴＬＲは、幹細胞分化のバイオマーカーである。ＴＬＲ４発現は、骨形成性バイオマーカーであり、ＴＬＲ３発現は、脂肪生成性バイオマーカーである。以上に記載の標準的細胞培養条件下、試験化合物の存在下でｈＥＳＣを８日間培養した後、ｑＰＣＲによるＴＬＲ  ｍＲＮＡの単離および定量は、ＴＬＲ発現レベルの顕著な変化を示した。化合物処理により誘導されるｈＥＳＣでの骨形成性誘導のバイオマーカーとしてＴＬＲ４／ＴＬＲ３比を用いて、我々は、化合物３および４（５００ｎＭ）がＴＬＲ４／ＴＬＲ３比の２倍増加を誘導することを観測した。
【０３５８】
同様に、化合物３または４（５００ｎＭ）と共にｈＥＳＣを８日間培養した後、ｈＥＳＣでの骨形成性ｍＲＮＡバイオマーカー発現（コラーゲンＩ）の誘導が、ＤＭＳＯで処理された細胞と比較して１．７〜５倍になった。結果から、化合物３や４などの式ＶＩで示される化合物は、部分的には、ｈＭＳＣの骨形成を促進するようにＴＬＲシグナリングをモジュレートすることにより作用する。
【０３５９】
実施例１７．同種異系細胞およびアロ移植組織に対する分化を促進する化合物の作用
緩速撹拌しながら３７℃で脱ミネラル化同種異系骨片を急速解凍し、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で洗浄し、室温で６００×ｇで５分間遠心分離した。コラゲナーゼで材料を消化し、混合物を１００ｍ細胞ストレーナーに通して濾過し、残留骨片をＤＰＢＳで濯いだ。放出された細胞を室温で１，２００×ｒｐｍに５分間遠心分離し、再懸濁し、１０ｍＬ  α−ＭＥＭ培地＋２０％ＦＢＳ＋１×Ｇｌｕｔｍａｘ中にプレーティングした。３７℃および５％ＣＯ２で３日後、ＴＣＰマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）それに続いて化合物１（５００ｎＭ）（または式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される他の化合物）を添加し、８日間にわたり２日ごとに細胞培養培地を化合物を含有する新鮮な培地と置き換えた。８日後、ＡＬＰ活性、骨形成性ｍＲＮＡバイオマーカー（すなわち、ＶＤＲおよびコラーゲンＩ）、および細胞増殖を決定するために、細胞を採取した。細胞増殖は、２．５倍に増加した。ＶＤＲおよびコラーゲンＩｍＲＮＡ発現は、それぞれ、４．５倍および２．２倍に増加した。マトリックスの存在下での単離されたｈＭＳＣと同様に、アロ移植由来の細胞もまた、化合物およびマトリックスの存在に反応して、骨形成を与える。細胞は、実施例１９および２０に記載されるように留置で使用可能である。
【０３６０】
実施例１８．骨形成を促進する化合物３のプロドラッグ性
化合物３は、天然に存在するクルクミン５４（ビスデメトキシクルクミンとしても知られる）のビス（アミノ酸）プロドラッグであった。ビス（アミノ酸）プロドラッグ３は、１０ｍｇ／ｍＬ超の水への溶解度を付与するが、親化合物５４は、微溶性であるにすぎない。ＨＰＬＣにより測定したとき、３は、プロドラッグの加水分解を介して５４を提供した（実施例３に記載のとおり）。
【０３６１】
ｐＨ６．５  ＰＢＳで、化合物３は、２３分間の加水分解の半減期を有して７７分間にわたり存続した。５分以内に、３の加水分解により、ビス（アミノ酸）プロドラッグ３のモノ加水分解生成物である化合物８４を生じた（実施例３に記載）。１５分以内に、３（および８４）からの完全加水分解生成物である化合物５４が溶液中で優位になった。７７分間まで、３のほとんどが加水分解されたが、化合物８４および化合物５４は、存続した。したがって、化合物３は、ｐＨ６．５リン酸緩衝液（１０ｍＭ）中では１時間超にわたり存続するが、ｐＨ７．５緩衝液中ではそうではなく、化合物８４および５４を溶液中に送達しうることが、結果から示される。
【０３６２】
生物学的活性に関して化合物３および化合物５４を比較した。化合物３または５４（５０ｎＭ）のいずれかと共にＣ２Ｃ１２細胞をインキュベートし、３日後、以上に記載のプロトコルを用いてアラマーブルーアッセイにより細胞増殖を決定した。化合物３は、細胞増殖の４倍増加を与え、一方、化合物５４は、２倍増加を与えた。これらのおよび他の結果から、水溶性化合物３の生物学的活性は、水性媒体中の３のプロドラッグ加水分解生成物である化合物５４の生物学的活性とは異なることが示された。
【０３６３】
これらの結果から、化合物３を細胞に投与するための一般的なプロトコルを導出した。最初に、溶液中で３および８４の存在を延長するために、ｐＨ６．５リン酸緩衝液（１０ｍＭ）中で細胞を化合物３と共に４０分間インキュベートした。４０分後、細胞培養培地（たとえば、２０％ＦＢＳを有するｐＨ７．４のＤＭＥＭ）を等体積でインキュベーションに添加した。４８時間後、細胞培養物培地を除去し、化合物３を含有する新鮮なｐＨ６．５リン酸緩衝液（１０ｍＭ）を細胞に添加して、化合物処理のさらなる反復を開始する。
【０３６４】
実施例１９．本発明に係る材料を用いた骨形成性細胞製品の外科インプラント
ＧＭＰグレードのｈＭＳＣを１８４０細胞／ｃｍ２の密度で成長培地（α−ＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）に接種する。２４時間インキュベートした後、リン酸カルシウムセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で式ＩＩ、ＩＶ、またはＶＩで示される化合物（とくに３（５００ｎＭ））で細胞を処理した。化合物３の処理では、ＰＢＳ緩衝液（１２ｍＭ、ｐＨ６．５、４０分間）中で細胞を４０分間インキュベートした。次いで、等体積のｈＭＳＣ培養培地を３と共に細胞インキュベーションに添加し、８日間にわたり４８時間ごと培地を置き換えた。８日目、細胞−セラミックス−化合物混合物をＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｃａ＋２フリー）で１回洗浄し、０．５×トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を４〜５分間トリプシン処理した。得られた細胞を５００×ｇ（３分間）でペレット化してトリプシンおよび残留化合物３を除去した。３回洗浄を行った後、凍結保存剤（２０％ＦＢＳ、５％ＤＭＳＯ、α−ＭＥＭ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁された細胞およびリン酸カルシウムセラミックマトリックス（細胞培養物から）を凍結させた。使用当日、細胞−マトリックス混合物を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離によりペレット化した。シリンジを用いて、誘導細胞−セラミック組成物を患者の血液または血清サンプルのいずれかまたはリンゲル液中に再構成し、細胞およびリン酸カルシウムセラミックマトリックスの適切な製剤と混合する。任意選択で、細胞接着剤を誘導ｈＭＳＣ／マトリックス組成物と組み合わせ、その後、適切な外科機器およびデバイスで送達するために外科ケージ中に混合物を添加する。この手順を用いて、骨系列にコミットされたきわめて骨形成性の高い細胞を作製した。これは、当該分野の技術を用いて、たとえば脊椎融合手順で使用するようにとくに設計されたＰＥＥＫ外科ケージに組成物を添加することにより、外科医により動物（好ましくはヒト患者）に配達される。
【０３６５】
実施例２０．本発明に係る組成物の作製および移植（筋肉内骨誘導）
ＴＣＰセラミックマトリックスの存在下での化合物３によるｈＭＳＣの誘導（図５、ステップ１〜３）。６ウェルプレート中に１７，５００細胞／ウェルの密度でｈＭＳＣ（すなわち、５継代未満）を接種し、種々の条件下で８日間培養し、その後、マウス中に留置した。次の実験計画に従ってマウスをグループ分けした。ｉ）媒体のみで８日間処理した後でＴＣＰセラミックマトリックスと組み合わされた非誘導ｈＭＳＣ（すなわち、０．１％ＤＭＳＯ、最終濃度）、およびｉｉ）ＴＣＰセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下で３（５００ｎＭ）で８日間処理された誘導ｈＭＳＣ、およびｉｉｉ）８日間モック培養されたＴＣＰセラミックマトリックス（すなわち、細胞なし）。使用したＴＣＰセラミックマトリックスは、５００〜１００μｍの顆粒であった。化合物誘導細胞を作製するために、０日目にＴＣＰセラミックマトリックス（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下でｈＭＳＣを化合物３と共にインキュベートし、４８時間ごとに培地を補充した。化合物３を細胞培養物に投与するために、１ｍＬ  ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）で細胞を洗浄し次いで、化合物３（１０００ｎＭ）を含有する１ｍＬ  ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を添加した。化合物３を４０分間適用加した。５００ｎＭの最終濃度になるようにＭＥＭ培地を既存のＰＢＳ（ｐＨ６．５）細胞インキュベーションに添加した。
【０３６６】
化合物誘導ｈＭＳＣの単離およびその凍結保存（図５、ステップ４〜５）。８日間の細胞培養期間の終了時、１ｍｌ  ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で細胞を３回洗浄し、トリプシン処理により６ウェルプレートから除去した。誘導細胞では、プレート上に残留したＴＣＰ顆粒を維持した。ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、１２００×ｇで細胞を３分間遠心分離した。細胞ペレットを細胞培養物から取り出したＴＣＰセラミックと再度組み合わせ、混合物を１ｍＬ凍結媒体（２０％ＦＢＳおよび５％ＤＭＳＯを含有する必須ＭＥＭ）中に懸濁させた。液体窒素中に細胞−ＴＣＰ混合物を凍結保存する前に、各サンプルの１０μｌアリコートを採取し、これを用いて細胞をカウントするかまたは留置前にＡＬＰ機能活性およびｍＲＮＡバイオマーカー発現（すなわち、オステオカルシン、コラーゲンＩ）を確認した。
【０３６７】
手のためのインプラントの作製（図５、ステップｉおよびｉｉ）。手術日に、ｉ）ＴＣＰセラミックマトリックス、ｉｉ）ｈＭＳＣ（５０万）および５ｍｇＴＣＰセラミックマトリックス、またはｉｉｉ）化合物誘導ｈＭＳＣ（５０万）および５ｍｇＴＣＰセラミックマトリックスのいずれかで構成されたインプラントを移植用として作製した。凍結細胞／セラミックサスペンジョンを解凍し、ＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。マウス中に留置する直前にすべてのインプラントを生体接着剤と組み合わせた。細胞−マトリックス混合物（３により誘導されたものまたは誘導されなかったもの）またはＴＣＰマトリックスのみのインプラントを、それぞれ、１０μｌの０．１６ｍｇ／μｌフィブリノーゲン溶液中に、再懸濁させ、次いで、１０μｌの０．０３６ｍｇ／μｌトロンビン溶液を添加した。トロンビンの添加直後、コアフィブリンメッシュ構造が形成された。ただちにフィブリンゲル中の細胞−セラミックサスペンジョンを動物中に留置すべく使用した。
【０３６８】
本発明に係る組成物の外科留置（図５、ステップｉｉｉ）。１０週齢の免疫不全Ｂｇν−ＸＩＤヌード雌マウス（２０ｇ）をインプラントレシピエントとして使用した。留置手術間前、病原体フリーの施設内でマウスを２週気候順化した。１４匹のマウスの大腿二頭筋中に、合計で２８個の両側筋肉内インプラントを与えた。マウスを実験グループに分けて、のインプラントを施した。ｉ）ＴＣＰマトリックスのみ（ｎ＝３匹のマウス、６個のインプラント）、ｉｉ）ｈＭＳＣ＋ＴＣＰマトリックスのインプラント（ｎ＝５、１０個のインプラント）、およびｉｉｉ）化合物誘導ｈＭＳＣ＋ＴＣＰマトリックスのインプラント（ｎ＝６、１２個のインプラント）。手術では、無菌生理食塩水中のケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（７．５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を１回腹腔内注射することにより、マウスを麻酔した。手術全体にわたりマウスをモニターし、その後、外科麻酔面の保守を行った。各後肢上の手術領域をＢｅｔａｄｉｎｅで清浄化した。約１〜２ｃｍの長さの両側手術切開を背側後肢に長手方向に設けた。筋線維長軸に平行なブラントジセクションにより、大腿二頭筋中にポケットを設けた。各マウスに対して、無菌鉗子を用いて細胞−セラミックインプラントを筋肉パウチ中に配置し、筋膜を５−０Ｖｉｃｒｙｌ吸収性縫合糸で縫合した。外科創傷クリップを用いて切開部位皮膚を密閉した。手術後最大５日間まで飲料水中の抗生物質トリメトプリム／スルファメトキサゾール（０．０５％および０．０１重量％）を動物に与えた。切開部位の治癒の目視確認後、手術後１週間以内に創傷クリップを除去した。８週間後、組織学的評価のためにマウスを安楽死させた。ただちに、インプラントを含有する筋肉組織のエクスプラントを２１℃で４８時間にわたり新たに調製された１０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）で固定した。
【０３６９】
組織形態計測的およびラジオグラフィー的な研究。組織学的処理の前、エクスプラントを、剖検時、各組織に配置された縫合糸を基準にした一貫性のある方向でラジオグラフィーにかけた。Ｆａｘｉｔｒｏｎ  ２２ｋｖ２０秒間でＸ線を用いて硬組織標準（スチールルーラー）および骨組織標準（ラット腓骨）によりラジオグラフを得た。８週間後、インプラントは凝集的に残留することがラジオグラフから確認された（すなわち、ＴＣＰマトリックス顆粒は一体化されて残留した）。
【０３７０】
組織学的処理およびスライド作製のために、試料を段階的な一連のエタノールにより脱水し、ガラスバイアルに移し、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）中に浸漬した。３日後、ＭＭＡと０．５％無水ベンゾイルペルオキシドとの混合物を試料中に浸透させて重合を推進した。次いで、完全に重合されるまで（３〜１０日間）、埋込みポットを水浴（２９〜３３℃）中に配置した。Ｐｏｌｙｃｕｔスラブミクロトームを用いて、室温で各埋込み試料から３つの４μｍセクションをカットし、７０％エタノール中のガラススライド上に載せて、空気乾燥させた。剖検時に配置された縫合糸のラジオグラフおよび目視検査を用いて、試料方向を決定した。放射線不透過性のインプラント材料の最長軸を通って、インプラントのほぼ中央のラインから、および中央のラインから２００μｍ離間させて各側から１つずつ、セクションを採取した（中央のラインの浅層および深層）。縫合糸の方向がスライドラベルの方向になるように、セクションをスライド上に載せた。上置されたセクションをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色で染色した。１滴のＤＰＸ封入剤を用いて、上置され染色されたスライドをカバースリップで覆い、空気乾燥させた。
【０３７１】
ＥＶＯＳ（登録商標）ＸＬ  Ｃｏｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、スライドのディジタル画像を４×倍率で取得した。留置ＴＣＰ顆粒位置の周辺領域を表す合成ディジタル画像から対象領域（ＲＯＩ）をクロップした。顆粒に近接する領域に重点を置いて、ＲＯＩをスコア付けするように盲検化訓練観察者に依頼した。次のような半定量的スコア付けシステムを使用した。すなわち、０−ＲＯＩに類骨なし、１−ＲＯＩに類骨の薄肉領域または不連続領域、２−ＲＯＩに類骨の薄膜、３−ＲＯＩに厚肉分布または緻密分布、および４−ＲＯＩにロバスト類骨形成。３名の独立した観察者によりスライドをスコア付けし、ボックスウィスカープロットを用いて十分なデータセットをノンパラメトリック方式で表示した（図４、ＩＶ）。化合物３およびＴＣＰセラミックマトリックスの存在下でｈＭＳＣを８日間培養することにより作製された誘導ｈＭＳＣインプラントでは、このグループは、ＲＯＩに多くの類骨組織を有するとして盲検観察者によりランク付けされる。メジアンスコアおよび７５パーセンタイルのスコアは、両方とも、ＴＣＰマトリックス上に誘導ｈＭＳＣなしで構成されたインプラントまたはＴＣＰマトリックスインプラントのみで構成されたインプラントよりも有意に高かった（ｐ＜０．００５）。
【０３７２】
各スライドに一貫して保持されたＲＯＩの全領域と比較してＲＯＩの類骨組織をマニュアルの選択することにより、顕微鏡画像のデンシトメトリー解析を行った。選択された類骨組織の全画素をカウントし、ＲＯＩの全画素に対するパーセントとして表し、一方、バックグラウンドに対して一貫性のあるカットオフフィルターを適用することにより、すべて画像を規格化した。ＲＯＩの類骨パーセントを実験グループ間の相対差として表した（図４、ＶおよびＶＩ）。組織セクションのデンシトメトリー解析の結果により、以上に記載のランク付けを確認した。化合物３およびＴＣＰセラミックマトリックスの存在下でｈＭＳＣを８日間培養することにより作製された誘導ｈＭＳＣインプラントは、ＴＣＰのみで構成されたインプラントの２．１倍のＲＯＩ類骨を与え、非誘導ｈＭＳＣおよびＴＣＰセラミックマトリックスで構成されたインプラントの１．３倍のＲＯＩ類骨を与えた。４０×倍率でＲＯＩをより綿密に検査したところ（図４、Ｉ〜ＩＩＩ）、非誘導細胞またはＴＣＰのみのグループではそれほど顕著ではないＴＣＰセラミックマトリックスの周辺類骨組織が緻密領域であること示された。まとめると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養時に化合物３およびＴＣＰセラミックマトリックスの作用によりｈＭＳＣの誘導を行うと、これらの組成物をｉｎ  ｖｉｖｏで留置した時、よりロバストな骨形成がもたらされることが、ｉｎ  ｖｉｖｏデータから示された。こうした知見から、本開示に係る新規な組成物および方法を用いてｈＭＳＣインプラントのｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導を行うと、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成の改善がもたらされるという仮説が裏付けられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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