(57)【要約】      （修正有）【課題】マウスを含む哺乳動物におけるうつ及び／又は不安症バイオマーカーを提供する。【解決手段】マウスのうつ及び／又は不安症バイオマーカーは，メチルアミン,N,N-ジメチル；RI955；RI1101；3-ペンテン-2-ワン；ペンタン酸, 4-メチル,エチルエステル；3-ヘプタノン,6-メチル；RI1227；RI1237；スチレン；3-ヘプタノン,5-メチレン,／5-ヘプテン3-ワン,5-メチル；ベンズアルデヒド；β-ファルネセン；α-ファルネセン；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート及び5,9-ウンデカジエン-2-オール,6,10-ジメチルからなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする。【選択図】図２
2019095429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルアミン,N,N-ジメチル（Methylamine, N,N-dimethyl-）；RI955；RI1101；3-ペンテン-2-ワン（3-penten-2-one）；ペンタン酸, 4-メチル, エチルエステル（Pentanoic acid, 4-metyl-, ethyl ester）；3-ヘプタノン, 6-メチル（3-Heptanone, 6-methyl-）；RI1227；RI1237；スチレン（Styrene）；3-ヘプタノン, 5-メチレン（3-Heptanone, 5-methylene-）／5-ヘプテン 3-ワン, 5-メチル（5-Heptene 3-one, 5-methyl）；ベンズアルデヒド（Benzaldehyde）；β-ファルネセン（beta-Farnesene）；α-ファルネセン（alpha-Farnesene）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）及び5,9-ウンデカジエン-2-オール,6,10-ジメチル（5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethyl）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とするマウスのうつ及び／又は不安症バイオマーカー。
【請求項２】
2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）及び2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする哺乳動物のうつ及び／又は不安症バイオマーカー。
【請求項３】
前記哺乳動物が，ヒト，サル，ゴリラ，オランウータン，チンパンジー，ウマ，サイ，バク，カバ，ラクダ，キリン，ウシ，ブタ，ヤギ，ヒツジ，サル，カモシカ，イノシシ，クマ，イヌ，ネコ，ウサギ，モルモット，ラット，マウス，リス，カピバラ，ナマケモノ，アリクイ，アルマジロ，コウモリ，オオカミ，クマ，パンダ，カワウソ，ラッコ，マングース，ハイエナ，ピューマ，ライオン，トラ，ジャガー，ヒョウ，チーター，カンガルー，コアラ，アシカ，アザラシ，ゾウ，クジラ，シャチ，イルカ及びジュゴンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項２に記載の哺乳動物のうつ及び／又は不安症バイオマーカー。
【請求項４】
（１）マウス由来の尿または血液を検体として採取する採取ステップ，（２）前記検体から，メチルアミン,N,N-ジメチル（Methylamine, N,N-dimethyl-）；RI955；RI1101； 3-ペンテン-2-ワン（3-penten-2-one）；ペンタン酸, 4-メチル, エチルエステル（Pentanoic acid, 4-metyl-, ethyl ester）；3-ヘプタノン, 6-メチル（3-Heptanone, 6-methyl-）；RI1227；RI1237；スチレン（Styrene）；3-ヘプタノン, 5-メチレン（3-Heptanone, 5-methylene-）／5-ヘプテン 3-ワン, 5-メチル（5-Heptene 3-one, 5-methyl）；ベンズアルデヒド（Benzaldehyde）；β-ファルネセン（beta-Farnesene）；α-ファルネセン（alpha-Farnesene）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）及び5,9-ウンデカジエン-2-オール,6,10-ジメチル（5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethyl）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を検出する検出ステップを備えるマウスのうつ及び／又は不安症の検査方法。
【請求項５】
（１）哺乳動物由来の尿または血液を検体として採取する採取ステップ，（２）前記検体から，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）及び2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を検出する検出ステップを備える哺乳動物のうつ及び／又は不安症の検査方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が，ヒト，サル，ゴリラ，オランウータン，チンパンジー，ウマ，サイ，バク，カバ，ラクダ，キリン，ウシ，ブタ，ヤギ，ヒツジ，サル，カモシカ，イノシシ，クマ，イヌ，ネコ，ウサギ，モルモット，ラット，マウス，リス，カピバラ，ナマケモノ，アリクイ，アルマジロ，コウモリ，オオカミ，クマ，パンダ，カワウソ，ラッコ，マングース，ハイエナ，ピューマ，ライオン，トラ，ジャガー，ヒョウ，チーター，カンガルー，コアラ，アシカ，アザラシ，ゾウ，クジラ，シャチ，イルカ及びジュゴンからなる群から選択される少なくとも一つである請求項５に記載の哺乳動物のうつ及び／又は不安症の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，マウスのうつ及び／又は不安症バイオマーカーなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
WHOのニュースによれば，うつ病や不安症は毎年１兆ドルの経済的損失を生んでおり，これらの疾患の予防や治療法開発に投資することにより4倍の経済的リターンが得られるとのことである。さらにWHOの調査によると，世界で2100万人以上が罹患する統合失調症患者は，心疾患・代謝・感染症による死亡率が2〜2.5倍高いと示している。また，厚生労働省による2014年の患者調査によると，総患者数に対する神経精神疾患患者数の割合が8％と高く，高脂血症，心疾患，悪性新生物，呼吸器疾患，脳血管疾患を追い抜き，糖尿病に次いで第２位である。以上のことから，うつ，不安症，統合失調症（陰性症状）を対象とした創薬の開発は有用であり，そのために，簡便な創薬のin vivoスクリーニングに利用できる非侵襲性バイオマーカーは必須である。そのような研究開発として，例えば，特許文献１〜特許文献３に示すものがある（先行技術文献については，末尾にまとめて示す）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら，上記研究開発は，十分なものとは言えず，更なる研究の余地が残されていた。
本発明は，上記した事情に鑑みてなされたものであり，その目的は，マウスのうつ及び／又は不安症バイオマーカー等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者は，野生型マウスとα2,3-シアル酸転移酵素（ST3Gal4）遺伝子欠損マウス（ST3Gal4 KOマウス；不安・うつ障害モデルマウス）の尿中に認められる物質をGC-MSを用いて特定した。マウス尿中には，数十の物質が認められ，これらのうち所定の化合物がバイオマーカーとして利用できることが分かった。
こうして，上記目的を達成するための発明に係るマウスのうつ及び／又は不安症バイオマーカーは，メチルアミン,N,N-ジメチル（Methylamine, N,N-dimethyl-）；RI955；RI1101；3-ペンテン-2-ワン（3-penten-2-one）；ペンタン酸, 4-メチル, エチルエステル（Pentanoic acid, 4-metyl-, ethyl ester）；3-ヘプタノン, 6-メチル（3-Heptanone, 6-methyl-）；RI1227；RI1237；スチレン（Styrene）；3-ヘプタノン, 5-メチレン（3-Heptanone, 5-methylene-）／5-ヘプテン 3-ワン, 5-メチル（5-Heptene 3-one, 5-methyl）；ベンズアルデヒド（Benzaldehyde）；β-ファルネセン（beta-Farnesene）；α-ファルネセン（alpha-Farnesene）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）及び5,9-ウンデカジエン-2-オール,6,10-ジメチル（5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethyl）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする。
【０００５】
また，本発明者は，本発明とは別に，ヒトの尿中／血中において，うつ及び／又は不安症を評価できる物質として，テキサノール及びテキサノール異性体を得た。これら２種類の物質は，マウスの尿または血液においても特定されている。つまり，哺乳動物であるヒト及びマウスについて，同一の血液中または尿中物質がストレスに対応することがわかった。このため，上記テキサノール及びテキサノール異性体については，うつ及び／又は不安症に関連する物質として，多くの哺乳動物で保存されている可能性が非常に高い。
こうして，別の発明に係る哺乳動物のうつ及び／又は不安症バイオマーカーは，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）及び2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことを特徴とする。このとき，哺乳動物は，ヒト，サル，ゴリラ，オランウータン，チンパンジー，ウマ，サイ，バク，カバ，ラクダ，キリン，ウシ，ブタ，ヤギ，ヒツジ，サル，カモシカ，イノシシ，クマ，イヌ，ネコ，ウサギ，モルモット，ラット，マウス，リス，カピバラ，ナマケモノ，アリクイ，アルマジロ，コウモリ，オオカミ，クマ，パンダ，カワウソ，ラッコ，マングース，ハイエナ，ピューマ，ライオン，トラ，ジャガー，ヒョウ，チーター，カンガルー，コアラ，アシカ，アザラシ，ゾウ，クジラ，シャチ，イルカ，ジュゴンなどが含まれる。
この構成によれば，哺乳動物の検体中の所定の物質の増減を調べることにより，その哺乳動物の精神疾患の状態がわかるので，創薬スクリーニングにも応用できる。
【０００６】
また，別の発明に係るマウスのうつ及び／または不安症の検査方法は，（１）マウス由来の尿または血液を検体として採取するステップ，（２）前記検体から，メチルアミン,N,N-ジメチル（Methylamine, N,N-dimethyl-）；RI955；RI1101；3-ペンテン-2-ワン（3-penten-2-one）；ペンタン酸, 4-メチル, エチルエステル（Pentanoic acid, 4-metyl-, ethyl ester）；3-ヘプタノン, 6-メチル（3-Heptanone, 6-methyl-）；RI1227；RI1237；スチレン（Styrene）；3-ヘプタノン, 5-メチレン（3-Heptanone, 5-methylene-）／5-ヘプテン 3-ワン, 5-メチル（5-Heptene 3-one, 5-methyl）；ベンズアルデヒド（Benzaldehyde）；β-ファルネセン（beta-Farnesene）；α-ファルネセン（alpha-Farnesene）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）及び5,9-ウンデカジエン-2-オール,6,10-ジメチル（5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethyl）からなる群から選択される少なくとも一つの物質を前記検体中から検出するステップを備える。
【０００７】
また，別の発明に係る哺乳動物のうつ及び／または不安症の検査方法は，（１）哺乳動物由来の尿または血液を検体として採取するステップ，（２）前記検体から，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）及び2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）からなる群から選択される少なくとも一つの物質を前記検体中から検出するステップを備える。
このとき，哺乳動物は，ヒト，サル，ゴリラ，オランウータン，チンパンジー，ウマ，サイ，バク，カバ，ラクダ，キリン，ウシ，ブタ，ヤギ，ヒツジ，サル，カモシカ，イノシシ，クマ，イヌ，ネコ，ウサギ，モルモット，ラット，マウス，リス，カピバラ，ナマケモノ，アリクイ，アルマジロ，コウモリ，オオカミ，クマ，パンダ，カワウソ，ラッコ，マングース，ハイエナ，ピューマ，ライオン，トラ，ジャガー，ヒョウ，チーター，カンガルー，コアラ，アシカ，アザラシ，ゾウ，クジラ，シャチ，イルカ，ジュゴンなどが含まれる。
この構成によれば，哺乳動物の検体中の所定の物質の増減を調べることにより，その哺乳動物の精神疾患の状態がわかるので，創薬スクリーニングにも応用できる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば，マウス・哺乳動物のうつ，不安症の状態を知るためのバイオマーカーを提供できる。当該モデルマウスが，ヒト疾患と連動していることから，本発明のバイオマーカーは，ヒトのバイオマーカーとしても使用し得る。また，このバイオマーカーは，精神疾患一般だけでなく，高齢者フレイル移行期の状態を検討できるものとしても使用できる。更に，このバイオマーカーの増減によって，精神疾患の状態がわかるので，創薬スクリーニングにも応用できる。
また，近年の厚生労働省の指針によれば，「室内空気汚染に係るガイドライン」において，TexanolとTXIBが新たにシックハウス原因物質として指定される予定となっていた（http://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-11121000-Iyakushokuhinkyoku-Soumuka/0000166137.pdf）。また，ラット体内でTXIBからTexanolがエステラーゼの作用により分解することが報告されている(Astill et al, 1972; Nielsen et al., 1997)。さらに，TexanolとTXIBが持つisobutylateは，butylateと同様に結腸細胞において代謝されるが，エネルギーとアナプレロティック反応のための炭素源に使われると考えられている (Jaskiewicz et al., 1996; Bourassa et al., 2016)。これらの物質のうちTexanolが，本願発明において，哺乳動物のうつ及び／または不安症のバイオマーカーに含まれていたことから，本願発明によれば，シックハウス症候群の可否について，早期に評価可能なモデル動物や，試験方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型マウス（Ａ）及びST3Gal4ノックアウト（KO）マウス（Ｂ）の尿中VOCの代表的なTICクロマトグラムを示す図である。  TICクロマトグラムの取得方法は，＜試験方法＞に示した通りである。図中の番号は，85％以上のSIを示す代謝物を意味する。各番号の化合物は，下記の通りである。1) Methylamine, N,N-dimethyl-; 2) 4-Octen-3-one, 6-ethyl-7-hydroxy-; 3) 2-Pentanone; 4) 2-Hexenal, 2-ethyl-; 5) Ethanone, 1-cyclopropyl-; 6) 2-Heptanone; 7) 3-Heptanone, 6-methyl-; 8) 2-Penten-1-ol, acetate, (Z)-; 9) 5-Hexen-2-one, 5-methyl-; 10) 5-Oxohexanenitrile; 11) 5-Hepten-2-one; 12) 1,3,5,7-Cyclooctatetraene; 13) 6-Hepten-3-one, 4-methyl-; 14) 3-Hepten-2-one; 15) Pentane, 2-nitro-; 16) 3-Heptanone, 5-methylene-; 17) 5-Hepten-2-one, 6-methyl-; 18) Dodecane, 2,6,11-trimethyl-; 19) Benzaldehyde; 20) (E) beta-Famesene; 21) alpha-Farnesene; 22) 2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol); 23) 2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate; 24) 2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer); 25) 5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethyl-; 26) p-Cresol; 27) 2,5-cyclohexadien-1-one, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-hydroxy-4-methyl-; 28) Methyl octadecyl ether; 29) 1-Docosanol, acetate (Eicosyl acetate).
【図２】17個のVOCをPCAスコアでグループ分けしたときの結果を示す3次元グラフ（Ａ）及び各VOCを階層クラスタ解析した結果を示す図（Ｂ）である。17個とは，Table 1から3-Hepten-2-oneを除いたVOCである。階層クラスター解析に利用したVOCは，Pentanoic acid, 4-methyl-, ethyl ester; 3-Heptanone, 6-methyl; RI1227; RI1237; Styrene; 3-Heptanone 5-methylene / 5-Heptene 3-one, 5-methyl; Benzaldehyde; Beta-Farnesene; Alpha-Farnesene; 5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethylであり，この10VOCsを用いたPCAスコアから得た，６主成分負荷量を用いてクラスター解析をおこなった。
【図３】驚愕反応と6個のVOCについての主成分分析スコアプロットとの関係を示すデータである。6個のVOCとは，クラスター解析で1グループになった，Pentanoic acid, 4-methyl-, ethyl ester; 3-Heptanone, 6-methyl; RI1237; Styrene; 3-Heptanone 5-methylene / 5-Heptene 3-one, 5-methyl; Benzaldehyde; 5,9-Undecadien-2-ol, 6,10-dimethylであり，この6VOCsを用いたPCAスコアから得た，各マウスの標準化した成分特点と驚愕反応値との相関図である。  （Ａ）は，ST3Gal4 KOマウス（KO）と野生型マウス（WT）とにおいて，120dBの驚愕反応の相違を示すグラフである。  （Ｂ）驚愕反応と6個のVOCのPC1とを二次多項式回帰曲線で解析した結果を示すグラフである。解析の結果，F (2,16) = 29.336,****p = 4.44E-006,r = 0.886（重相関係数），Y = 2.1942 - 0.7805*x+1.4666*x^2であった。ST3Gal4-KOマウスが6個のVOCを多量に排泄したときには，6個の主成分は驚愕反応と相関した。
【図４】野外試験において，発情前／発情期の雌マウスを雄マウスに会わせる前後の尿中VOC量を比較した結果を示すグラフである。グラフ中，WTは野生型マウスを，KOはST3Gal4ノックアウトマウスを，P／Eは発情前（pro-estrus）／発情期（estrus）を，Dは発情後期を，それぞれ意味する。  （Ａ）は，雌に対する全アクセス数を示すグラフ，（Ｂ）〜（Ｑ）は，縦軸（及びグラフの右上に示す構造式）に示す化合物の尿中排泄量と，雌への接触前後との関係を示すグラフである。尿は，雌に会わせる前後の1〜3週間に渡って回収した。グラフのうち，Ｆ，Ｇ，Ｉ，Ｋ，Ｌ及びＱでは，ST3Gal4 KOマウスの方が，バラツキが小さな野生型マウスの排泄量に比べて，より高い排泄量を示した。Ｄ，Ｍ及びＮでは，雌に会わせる前の方が，より少ない排泄量を示した。Ｏ及びＰでは，雌に会わせた後の方が，より多い排泄量を示した。クラスカル・ウォリス検定及びダン多重比較検定を行った。
【図５】VOCの排泄量に関する結果をまとめた表図である。  各成分の後の括弧付き番号は，表１のカラムに付した番号と同一の成分を意味する。
【図６】マウスに匂いを嗅がせたTexanol及びTXIBの標品をGC-MSで解析したときの結果を示すチャートである。左がTexanol、右がTXIBの結果を示す。Texanol標品をNMRにて確認したところ，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl, 1,3-pentandiol, 1-monoisobutylate (texanol)）と2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（2,2,4-trimethyl,1,3-pentandiol, 3-monoisobutylate (texanol isomer)）が，60%：40%（モル比）で含まれていた。
【図７】マウスを用いた恐怖条件付試験を実施中の行動に対するTexanol及びTXIBの影響を確認した結果を示す図である。（Ａ）実験スケジュールを示す図である。（Ｂ−１）Texanolを溶解した水500μLをケージに滴下し，ケージ大気中の濃度がそれぞれ0.24μg/m3（0.03ppb），7.2μg/m3（0.81ppb）及び216μg/m3（24ppb）となるように維持し，6日目に，音（CS）とフットショック(USw)を連動させた条件付刺激をマウスに与えたときの，最初の恐怖条件付トレーニングを行ったときのマウスの移動距離（Traveled distance(cm)）を示すグラフである。コントロールとして，Texanolを含まない水500μLのみを滴下したときのデータを示した。床下のペーパーチップとVOCは，1日に4回取り替えた（（Ｂ−２），（Ｂ−３），（Ｃ−１）〜（Ｃ−３）についても同じ）。（Ｂ−２）7日目に条件付刺激翌日の文脈記憶試験（マウスは，初日の条件付刺激のない，同じ環境下に300秒間入る）を行ったときの移動距離を示すグラフである。（Ｂ−３）8日目に条件付刺激2日後の音恐怖記憶試験（マウスは，初日とは異なる環境に入るが，新規の環境下60秒後から１分間条件付刺激のときの音(CS)を60秒間聞き，その後120秒間同じ環境下にいる）を行ったときの移動距離を示すグラフである。（Ｃ−１）TXIBを溶解した水500μLをケージに滴下し，ケージ大気中の濃度がそれぞれ10μg/m3（0.85ppb），50μg/m3（4.3ppb），100μg/m3（8.5ppb）及び，216μg/m3（20ppb）となるように維持し，6日目に最初の恐怖条件トレーニングを行ったときの移動距離（Traveled distance(cm)）を示すグラフである。コントロールとして，TXIBを含まない水500μLのみを滴下したときのデータを示した。（C−２）7日目に文脈記憶試験を行ったときの移動距離を示すグラフである。（C−３）8日目に音恐怖記憶試験を行ったときの移動距離を示すグラフである。各マウスにおける移動距離の合計を計算し，最大値と最小値の両方を除外し，残りの数値を解析に使用した。線グラフ（平均±SEM）は，各期間までの30秒間の移動距離の合計を示す。統計解析は，時間当たりの距離についての二元反復測定分散分析（ANOVA，VOC濃度×cm）によって実施し，テューキー（Tukey）の多重比較試験により，各VOC濃度群を0 μg/ m3濃度群（コントロール）との比較を行った。その結果，（Ｂ−１）において0 μg/ m3: F (3, 12) = 2.5706, p = 0.1029；（Ｂ−２）において F (3, 12) = 3.7556, *p = 0.0412，Turkeyでは *p = 0.0338 [0.24 vs. 0 μg/ m3]；（Ｂ−３）において F (3, 12) = 5.3794, *p = 0.0140，Turkeyでは *p = 0.0104 [216 vs. 0 μg/ m3]；（Ｃ−１）において F (4, 21) = 1.5774, p = 0.2172；（Ｃ−２）において F (4, 21) = 1.5918, p = 0.2135；（Ｃ−３）において F (4, 21) = 4.3747, **p = 0.0099，Turkeyでは **p = 0.0089 [216 vs. 0 μg/ m3] を得た。
【図８】マウスを用いた音恐怖試験におけるTexanol及びTXIBの影響を確認した結果を示すグラフである。Texanol（Ａ）〜（Ｄ）及びTXIB（Ｅ）〜（Ｈ）の結果を示す。2秒間よりも長い停止時間が認められた行動停止時間（freezing time）を計測した。300秒間の文脈恐怖記憶について，全移動距離（cm）及び行動停止時間（%）を（Ａ），（Ｂ），（Ｅ），（Ｆ）に，240秒間音恐怖記憶試験について，全移動距離（cm）及び行動停止時間（%）を（Ｃ），（Ｄ），（Ｇ），（Ｈ）に示した。統計解析は，通常の一元配置分散分析を行い，テューキー（Tukey）の多重比較試験により，各群間の比較を行った。その結果，（Ａ）において F (3, 12) = 3.7638, *p = 0.0409，Turkeyでは *p = 0.0336 [0.24 vs. 0 μg/ m3]；（Ｂ）において F (3, 12) = 1.0355, p = 0.4118；（Ｃ）において F (3, 12) = 8.9663, **p = 0.0022，Turkeyでは *p = 0.0304 [0.24 vs. 0 μg/ m3], **p = 0.0016 [216 vs. 0 μg/ m3], *p = 0.0333 [216 vs. 7.2 μg/ m3]；（Ｄ）において F (3, 12) = 5.5875, *p = 0.0124， Turkeyでは *p = 0.0474 [0.24 vs. 0 μg/ m3], **p = 0.0099 [216 vs. 0 μg/ m3]；（Ｆ）において F (4, 21) = 0.8671, p = 0.4999；（Ｇ）において F (4, 21) = 4.3772, **p = 0.0099，Turkeyでは **p = 0.0089 [216 vs. 0 μg/ m3]；（Ｈ）において F (4, 21) = 4.2410, *p = 0.0114，Turkeyでは *p = 0.0186 [10 vs. 0 μg/m3], *p = 0.0467 [100 vs. 0 μg/ m3]を得た。（Ｅ）において，ANOVAのバートレット法（Bartlett's test）では有意差（*p = 0.0162）を認めたことから，TXIB濃度の異なる群間で分散が異なることがわかった。そこで，本発明者はパラメトリックテストは使えないと判断し，ノンパラメトリック法としてクラスカルワリス法（Kruskal Wallis test）を用いた。有意差は認められなかった(p = 0.3881)。
【図９】マウスを用いた音恐怖試験に関し，8日目においてTXIBがマウスの頭部の揺れ（head swing）に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。（Ａ）0，10，50，100及び216μg/m3の結果を比較して示すグラフ，（Ｂ）0及び216μg/m3を比較して示すグラフである。統計解析は，通常の一元配置分散分析を行い，テューキー（Tukey）の多重比較試験により，各群間の比較を行った。その結果，一元配置分散分析では， F (4, 21) = 1.9680, p = 0.1365，マンホイットニーのＵテスト（両側検定）では， p = 0.1409 [10 vs. 0 μg/m3], p = 0.6064 [50 vs. 0μg/m3], p = 0.3007 [100 vs. 0μg/m3], *p = 0.0240 [216 vs. 0μg/m3]を得た。
【図１０】強制水泳試験中のマウスの不動性(%)に対するTXIBの効果を確認した結果を示す図である。（Ａ）実験スケジュールを示す図である。第３日目〜第８日目まで，100μg/m3（8.5ppb）または216μg/m3（20ppb)のTXIBを含む水（500μL）をマウスに投与し，第８日目に強制水泳試験を行った。強制水泳試験中の1分間〜6分間の間に1秒間以上の不動性を示した時間を計測した。最大値と最小値を除去し，残りの計数値を統計解析に用いた。（Ｂ）強制水泳試験中のマウスの不動性試験の結果を示すグラフである（平均±標準誤差(S.E.M.)）。統計解析は，二元反復測定分散分析（ANOVA、VOC濃度×%）によって実施し、F (2, 9) = 0.31908, p = 0.7347を得た。（Ｃ）６分間全体の不動性試験の結果を示す棒グラフである。統計解析には通常の一元配置分散分析を実施し，F (2, 9) = 0.28327, p = 0.7598を得た。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
次に，本発明の実施形態について，図表を参照しつつ説明するが，本発明の技術的範囲は，これらの実施形態によって限定されるものではなく，発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。
【００１１】
＜試験方法＞
１．実験動物
全ての動物は，「動物実験の適正行動指針」（日本学術会議，2006年）に従って処理した。実験プロトコールは，京都産業大学の動物実験倫理委員会によって承認された（承認番号2017-08）。
ST3Gal IV 遺伝子欠損マウス（C57BL/6-ST3Gal4＜tm1.1Bsi＞, RBRC02286）は，既報に従って作製したものを用いた（非特許文献１：Srimontri et al., 2014）。実験には，13代〜20代に渡って継代飼育されたC57BL/6Jマウスを用いた。マウスは，22℃〜24℃の温度で12時間毎に昼と夜を繰り返す施設にて飼育した。飼料（AIN93G及びMF：オリエンタル・イースト株式会社製）及び水は自由摂取とした。オープントップ式のプラスチックケージ（幅225mm，長さ338mm，高さ140mm）を用いて，4匹のマウスを飼育した。ケージ上面をステンレス製ワイヤグリッド蓋にて覆った。ケージ床は，おがくず（ピュアチップ：清水実験材料株式会社製）とペーパーチップ（エコーチップ：日本クレア株式会社製）で覆い，週に２回取り替えた。
【００１２】
２．試薬類
標品として，次のものを用いた。メチルアミン, N,N-ジメチル（純度25%エタノール溶液，カタログ番号T2892（東京化成工業株式会社）），3-ペンテン, 2-one（純度70％，カタログ番号145017（シグマ）），ペンタン酸, 4-メチル, エチルエステル（純度97%以上，カタログ番号58730（シグマ）），スチレン（純度99%以上，カタログ番号S0095（東京化成工業株式会社）），3-ヘプテン-2-one（純度95%以上，カタログ番号H0838（東京化成工業株式会社）），ベンズアルデヒド（純度99.9%，カタログ番号B1334（シグマ）），2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（テキサノール(texanol)：カタログ番号40366（アルファ・アエサル）），2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・イソブチレート（TXIB：純度98.5％以上，カタログ番号41601（シグマ）），n-アルカン混合溶液（C9-C40: 50 μg/mL; C10, 20, 30 and 40: 100 μg/mL）は，ジーエルサイエンス社から購入した（catalog No. 1021-58321）。β-ファルネセンは，日本テルペン化学株式会社より提供を受けた。
【００１３】
３．尿の採取
尿は，ST3Gal4ノックアウト（KO）マウス及び野生型（WT）の雄性同腹マウスから採取した。採取した尿は，液体窒素を用いて新鮮な状態で冷凍し，使用するまで-80℃にて保存した。一匹のマウスから同日に採取した尿は，一つのチューブに回収した後，1.5mLガラスバイヤル中に200μLずつ小分けし，解析した。尿中クレアチニン濃度は，ヤッフェ法（Jaffe法：非特許文献２，Bonsnes and Taussky, 1945）に基づくラボ・アッセイ・クレアチニン・比色定量キット（和光純薬工業株式会社）により測定した。
【００１４】
４．固相マイクロ抽出によるVOCの抽出
尿中VOCは，ヘッドスペース固相マイクロ抽出（SPME）繊維を用いて抽出した。VOCの分子量を幅広く確保するために，SMPE線維として，2cm 50／30μM DVB／CAR／PDMS（ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン。米国スペルコ社製）を用いた。SPME線維を250℃で30分間前処理し，VOCを採取するために，45℃で1分間平衡化した。ヘッドスペース中のVOCを尿を含むバイアルのヘッドスペースに挿入したSPME繊維により45℃で60分間抽出した。
【００１５】
５．ガスクロマトグラフィ及びマススペクトロメトリ（GC-MS）
VOCをガスクロマトグラフィ・四重極マススペクトロメトリ（TQ-8040（島津社製））によって解析した。VOCを含むSPME線維をGCの注入口に挿入し，240℃にて3分間脱着させた。注入は，スプリットレス注入法にて3分間パルスによって行った。GC-MS装置には，ProGuard及びT.L.カラムを付属したInertCap Pure-WAX（60m + 10m pro-guard ラインと2m トランスファーライン，内径0.25mm, フィルム厚さ0.5μm（ジーエルサイエンス社製））を用いた。質量分析装置の前に用いたクロマトグラフィ分析条件は，次の通りであった。40℃にて10分間保持し，1分間あたり5℃の昇温条件で240℃まで熱を掛けた後，240℃にて10分間保持した。インジェクター温度は250℃とした。ヘリウムをキャリアガスとして使用し，カラム流速はインジェクションから0分〜3分まで2mL／分，3分〜60分まで1mL／分の一定とした。
【００１６】
質量分析装置の処理パラメータは，＜試験１＞では次の通りであった。イオン源温度200℃，イオン化エネルギー70eV，スキャン頻度は35m/z〜300m/zまでを1回あたり0.3秒，カラム長を30mとした。＜試験２＞では，スキャン頻度を1回あたり0.2秒，カラム長を65mとした以外は，＜試験１＞のパラメータと同じとした（図１）。10週齢〜15週齢のマウス尿中VOCピークの解析は，QP-2010プラス（島津製作所）を用いて，ヘリウムガスの流速を20cm/sとした以外は，＜試験２＞の方法に従った。VOCピークの特定は，VOCの標品の保持時間との比較，及びNIST14標準参照データベース（NIST／EPA／NIHマス・スペクトル・ライブラリ（Wiley10））を用いたマッチング可能性によって行った。
【００１７】
極性カラム（InertCap Pure-WAX）及び非極性カラム（DB-1）の保持時間インデックス（RI）を求めるために，VOCの保持時間をn-アルカン標準品をGC-MSシステム（島津製作所）を用いて比較した。VOCを含むSPME線維をGCの注入口に挿入し，240℃にて10分間脱着させた。注入は，スプリットレス注入法にて3分間パルスによって行った。揮発成分を分離するため，DB-1カラム（30mライン，内径0.25mm，フィルム厚さ0.25μm（アジレント社製），ProGuard及びTLカラムを付属したInertCap Pure-WAX（60m + 10m pro-guard ラインと2m トランスファーライン，内径0.25mm, フィルム厚さ0.5μm（ジーエルサイエンス社製））を用いた。ガスクロマトグラムの昇温プログラムは，次の通りであった。40℃にて10分間保持し，1分間あたり5℃の昇温条件で240℃まで熱を掛けた後，10分間保持した。インジェクター温度は240℃とした。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。カラム流速は，DB-1については50cm/秒，InterCap Pure-WAXについては20cm/秒とした。質量分析装置の解析パラメータは次の通りであった。イオン源温度200℃，インターフェイス温度240℃，イオン化エネルギー70eV，スキャン頻度は35m/z〜300m/zまでを1回あたり0.2秒とした。
【００１８】
６．データ解析及び統計解析
クロマトグラフのピーク面積をGCMSsolution ver.4.45ソフトウエア（島津製作所製）を用いて求めた。電子イオン化によって得られたイオンピークの検出と計算は，Rソフトウエアver3.2.3（http://cran.r-project.org/）とXCMSソフトウエア・パッケージver1.3.2（http://masspec.scripps.edu)によって行った。ピークのうち各ピークのTIC（全イオン電流）を手動で特定し，検出されたピークを確認した。VOCの精密計測は，各種のイオンピーク（m/z）の保持時間およびピーク形状に基づいて，手作業による積分計算によって行った。
まず，20週齢〜35週齢のものについて，ST3Gal4 KOマウスと同腹仔の野生型マウスの尿中VOCの相違を調べた。マウス尿中のVOCをガスクロマトグラフィで3回，測定した。ST3Gal4 KOマウスの尿中VOC（試験１，試験２共にn=3）と，同腹仔野生型マウスの尿中VOC（試験１，試験２共にn=3）をイオンピークの相違を調べるために，XCMSによって調べた（表１）。
【００１９】
【表１】
2019095429.tif 000003
【００２０】
次に，イオンピーク面積をGCMSsolutionソフトウエアを用いて計算した。各データセットをまとめて評価するため，ノックアウトマウスと同腹仔野生型マウス（各ペアについてn=6；20週齢〜35週齢）の絶対イオンピーク面積の平均値を求め，平均ピーク面積の相対強度を計算した。これに対し，オートサンプラーを備えたGC-MSシステム（島津製作所製）を用いてVOCを求める際に，全ての尿中VOCを求めた後，ノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスの尿中VOCのイオンピークの絶対値面積を比較した（表２）。
【００２１】
【表２】
2019095429.tif 000004
【００２２】
エクセルとKyPlot 5.0（カイエンス社製）を用いて，多変量解析を実施し，6対のノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスから得られた15個のVOCの相対値から，主成分分析（PCA）スコアプロットを得た。次いで，Graph-R ver.1.24.3（Tohru Itoh）を用いて三次元図面を得た。PCAによって抽出したグループに属するVOCの分類は，エクセルとKyPlot 5.0（カイエンス社製）を用いた階層クラスタ解析によって，VOCの絶対値（面積）を求めた。次に，VOCと驚愕反射が相関するかどうかを評価するために，エクセルとKyPlot 5.0（カイエンス社製）（Srimontri et al，2014）を用いて多項式回帰曲線を求めた。
次いで，雌マウスとペアリングする前後の雄マウスから採取した尿中のVOCをGCMSによって求めたイオンピーク面積を求め，m/zの絶対値を計算した（図３）。ピーク面積を求めるために，一匹のマウスあたりクロマトグラフィを一回使用した。ピーク面積の差の相違は，エクセルとPrism6を用いて，マン・ホイットニーU検定（表２）及びクラスカル・ウォリス検定によって解析した。結果を図３に示した。
VOCの同定は，マニュアルによる解釈を加えた質量スペクトルライブラリ（NIST14及びWiley10）との比較，及び市販の標準試料との比較によって行った。市販されていないVOCについては，質量スペクトルライブラリとの比較によって同定した。
【００２３】
７．驚愕反射試験
マウスに対する驚愕反射測定装置（O'hara＆Co社製）を用いて，感覚刺激応答を観察するために，マウスによる音響驚愕反応（ASR）を調べた（非特許文献３：Buccafusco et al，2009）。マウスをアクリルチャンバー内に導入し，チャンバーを検査ユニットに置き，チャンバーと検査ユニットの両方をクランプで固定した。5分間の順応期間およびテスト期間の間に，連続する70dBのバックグラウンドノイズ（ホワイトノイズ）をスピーカーから流した。マウスに対し，500msecあたりに20msecの雑音パルス（120dB）を10回暴露した。マウスの全身驚愕反応によって引き起こされた振動を加速度センサによって数値的に表示した。数値信号を増幅して電圧に変換し，波の形状として表示した。波のピークからピークまでの値（peak to peak：p-p値）を驚愕反応の強さとして採用した。
【００２４】
８．野外試験
雌に会わせるための野外試験は，10〜16週齢のST3Gal4ノックアウトマウス及び同腹仔野生型の雄マウスを用いて実施した。雄マウスは，試験開始の少なくとも30分前に，別の待機室で単独で置いた。行動試験は，マウス遺伝子型を知らされない実験者によって，8時〜13時の間に実施された。野外試験は，野外床の上面に天井高125cmを有する四角形のアリーナ（幅490mm，長さ490mm，高さ195mm）にマウスを置くことによって行った。オープンフィールドと待機室を照らす蛍光灯の強度は17ルクスに設定した。
野外試験の直前に，ddY雌マウス（8〜12週齢）に膣スメア試験を実施した。塗抹標本をギムザ溶液（和光純薬工業株式会社）で染色し，明視野顕微鏡で検査した。発情周期の段階は，既報に従って決定した（Allen，1922）。
先ず，雄マウスをオープンフィールドに置き，1分後に，発情前期の雌マウスを30分間オープンフィールドに入れた。その後，両マウスをケージに戻した。フィールド床の上470mmに配置したカメラを用い，TimeOFCR4（O'hara＆Co社製）によってデータを収集した。行動試験はマウスの遺伝子型を知らされない実験者によって行った。記録開始から10分間の間，雄の鼻から雌の鼻，雄の鼻から雌の膣周辺，及び雄の前肢から雌の体までの1秒あたりの雄のアクセス数をカウントした。
【００２５】
９．C57Bl/6Jマウスを用いたテキサノール（texanol）とTXIBに関する試験
高齢者うつの尿中バイオマーカーを探索した結果，5種の既知VOCsがその候補であることが分かった。この5種のうち1種が，Texanolであった。一方，本発明者は，てんかん発症原因酵素であるalpha2,3-sialyltransferase（St3gal4）を欠損させた遺伝子欠損マウス（St3gal4-KOマウス）が，うつ，不安症を示すことを発表した(Srimontri et al., 2014)。このうつ，不安症を示すSt3gal4-KOマウスは，加齢に伴いtexanol isomerの尿中排泄量が亢進した(Fujita et al., 2018a)。TexanolはTXIBと共に，シックハウス原因物質になる可能性が取り上げられていた（http://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-11121000-Iyakushokuhinkyoku-Soumuka/0000166137.pdf）。TXIBはisobutyl基を2つ持つ一方でTexanolはisobutyl基を一つ持ち，ラット体内でTXIBからTexanolがエステラーゼの作用により分解することが報告されている(Astill et al, 1972; Nielsen et al., 1997)。また，isobutylateは，butylateと同様に結腸細胞において代謝されるが，エネルギーとアナプレロティック反応のための炭素源に使われると考えられている (Jaskiewicz et al., 1996; Bourassa et al., 2016)。一方で，食品のパッケージ等(Kemf et al, 2009)の環境から体内に入ったTexanolとTXIBについては，酸化や抱合型となり尿中に排泄されると予想されている(Nielsen et al, 1997)。
【００２６】
TexanolとTXIBは，室内の溶剤としてこれまで最も安全であると考えられてきた(Weschler, 2009)。しかし近年，日本では，シックハウス原因物質に指定される可能性が出てきた (厚生労働省，2017; Ghaffarianhoseini et al., 2018)。シックハウス症候群は，特に神経精神症状を伴うことが知られている(Kinman et al., 2011; Runeson-Broberg et al., 2013; Miyajima et al., 2015)。一方で，Texanolは，粘膜への影響があげられている(Ghaffarianhoseini et al., 2018)。しかしながらこれまで，TexanolやTXIBと神経精神症状との関連性をみた知見はない。
そこで，尿中のバイオマーカーとして検出されたTexanolとTXIBが実際にSt3gal4-KOマウスと同様の症状を誘導する可能性を検討した。
【００２７】
4匹の同腹仔マウス（8週齢，オス，C57Bl/6J系：日本クレア株式会社製）をオープントップ式のプラスチックケージ（幅225mm×長さ338mm，高さ140mm）を用い，輸送のストレスから回復するために1週間以上に渡って飼育した。全ての動物は，「動物実験の適正な実施に向けたガイドライン」（日本学術会議，2006年）に従って処理した。実験プロトコールは，京都産業大学の動物実験倫理委員会によって承認された（承認番号2017-08, 2018-07）。マウスは，22℃〜24℃の温度で12時間毎に昼と夜を繰り返す施設（点灯は午前8:00）にて飼育した。飼料と水は自由摂取とした。
個別換気システムから切り離されて，HEPAにより環境から隔離されたラットケージ（容量11.1L，幅234mm×長さ360mm，高さ148mm（クレアジャパン製））を使用した。各ケージには2匹の同腹雄マウスを飼育し，マウスが揮発性有機化合物（VOCs）を吸入できるようにした。ケージを開け，VOCの有無に係わらずに，床下のペーパーチップ（φ5mm，クレアジャパン製.）を12時間の昼の間には4時間毎に3回の交換を，12時間の夜の間には1度（20:00時に）だけ交換した。
【００２８】
TXIBの重大な影響は，動物を用いた反復経口曝露後の効果によって決定された。具体的には，TXIBの無毒性有害影響レベル（NOAEL）および無毒性レベル（NOEL）は，それぞれ50mg/kg/日（Nielsen et al.,1997）および30mg/kg/日（OECD,2005,CAS,N°：6846-50-0）である。この値は，ラットの腎重量の減少および血液パラメータの変化に起因している。NOAELとNOELの値に基づき，TXIBの暫定吸入限界は70kgの男性の場合に1mg/m3とされている（Nielsen et al.,1997）。これよりも少し高い値として2.5mg/m3があり（Eastman Kodak Company, 2007），更に10倍低い値として50kgの男性の場合に30mg/kg/日がある（東ら，2016）。次に，モノ-およびジ-イソブチレートを含むTexanolとTXIBは，ブチラートの低濃度環境下で，イソブチレートが結腸細胞においてエネルギーおよび嫌気性菌の炭素源として機能することが示唆されている（Jaskiewicz et al.,1996）。そこで，本発明者はTXIBの最大濃度として100μg/m3を選択した。次に，Texanolの最大濃度として，260μg/m3[≒100（μg/m3）×2×286.4（g/mol）/216.3（g/mol）］とした。
【００２９】
10週齢〜13週齢のマウスに対し，2種類の行動試験を実施した。いずれのマウスを用いるかを知らされない実験者により，Time FZ1（小原医科産業株式会社，日本）を用いて自動的に全ての行動実験（恐怖条件付けおよび強制水泳試験）を08:00〜12:00の間に行った。不安行動は聴覚性恐怖条件付試験（図７（Ａ））により評価し，抑うつ行動は強制水泳試験で評価した。聴覚性恐怖付条件付けは，既報（Kato，2015）に従って実施した。簡単に説明すると次の通りとした。訓練日（6日目）に65dBで10秒間の条件刺激（CS）と，0.3mAで1秒間のフット・ショックを与える無条件刺激（US）を，20秒間隔（200ルクス）で2回実施した。翌日（7日目）には，訓練日に用いたものと同じ透明な四角形のケージを用い，マウスにCSまたはUSを与えないままで（200ルクス）5分間置いた。更に次の日（8日目）には，マウスを前日とは異なるボックス（50ルクス）に入れ，1分間の探索時間，1分間のCS（トーン），次いで2分間の探索時間を順次マウスに与える合図試験を行った。不動行動は，Time FZ1を用いて測定したときのマウスの停止時間が2秒間よりも長いときとして定義した。
強制水泳試験（1010-lux）についても既報（Kato，2015）に従って実施した。統計解析は，平均±標準誤差（SEM）を用い，ExcelとGraphPad Prism 7（GraphPad Software社製.）を使用し，危険率5%（p≦0.05）を有意とした。最大値と最小値以外の値を用いて解析を行った（VOCの各濃度についてn=6）。
【００３０】
＜試験結果及び考察＞
本発明者は，既報において（Kato, 2015），情動行動がマウスに与えた食餌中の異なる脂肪酸を含む脂質（トリグリセリド）の質および量によって影響を受けることを示した。また，脂質を含む食事を取ることによって生じる情動行動の変化は，不安及びうつ病モデルマウスであるST3Gal4ノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスとでは異なっていた。このことは，脂質代謝の相違が，情動的及び認知的行動に関与することを示唆している。そこで，本発明者は，異なる代謝が行動に影響を与えるかどうかを調べるために，ST3Gal4ノックアウトマウスと野生型マウスとの間に存在する脂質代謝の相違について，各マウスの尿中VOCをGC-MSを用いて調べた。
【００３１】
１．ST3Gal4 KOマウスにおける尿中VOCの特異的な相違
6対のST3Gal4ノックアウトマウス及び同腹仔野生型から得た尿サンプル（200μl）をHS-SPME GC-MSを用いて解析した。＜試験方法＞に記載した通り，尿中VOCを二種類の試験（試験１及び試験２）によって調べた。代表的な全イオン電流（TIC）ピークと類似度（similarity index（SI））を表１に示した。試験２において，スキャン回数を増やすと，検出されたVOCの種類が42個から75個に増加した。GC-MSによれば，C57B1/6Jマウスの尿には，少なくとも97種類のVOCが含まれていた。ST3Gal4ノックアウトマウス及び同腹仔野生型マウスは，C57B1/6J系統のマウスから遺伝子編集によって得られたものであることから（非特許文献１：Srimontri et al., 2014），同様の代謝経路を持つと考えられる。
【００３２】
マウスあたり，トリプリケートした尿サンプル（試験１及び試験２においてST3Gal4ノックアウトマウス及び同腹仔野生型マウスのぞれぞれについてn=3）をGC-MSで解析した。XCMS（非特許文献４：Smith, 2006; 非特許文献５：Benton et al, 2008）によって，36種類のVOCを得た。XCMSソフトウエアを用いて，ピーク同定，非線形保持時間アラインメント及び質量スペクトル・イオン強度の定量を行った。アラインメントによって，各イオンピークについて，保持時間，m/z値，強度，比率（fold change），p値及び保持時間インデックス（RI）を含む情報を得た。試験１及び試験２の結果，ST3Gal4 KOマウスの尿から，558個及び729個のイオンピークを得た。ST3Gal4 KOマウスの尿から得られたイオンピークについて，危険率0.05未満（p＜0.05）のものを抽出した。試験１及び試験２について，それぞれ93個及び244個のイオンピークを得た。各保持時間に属するイオンピークを回収し，TICピーク・スペクトルをNIST14ライブラリと比較し，ピークの類似性を各SIを対照として調べた。その結果，85%以上の類似度で18個のVOCを特定した。
【００３３】
次いで，これらの18個のVOCが属するイオンピークの異なる面積が正しいどうかを調べるために，XCMSで抽出したイオンピークに含まれる候補VOCのベースピーク（表１の第３カラム）を選択し，VOCのイオンの面積をGCMSsolution ver. 4.45ソフトウエアを用いて計算した。6対のノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスにおいて，ノックアウトマウスと野生型マウスから得られたVOCの定量面積の相対比を比較し，比率（fold changes），標準誤差（S.E.M.）及びマン・ホイットニーU検定のp値を計算した（表１中の第11〜13カラム）。18個のVOCのうち13個については，データベースと高度の類似性を示し，物質が特定された。更に，13個のVOCのうち9個については，市販の標準品との比較で，質量スペクトルが一致し，VOC中の濃度測定まで行えた。一方，13個のVOCのうち4個については，情報が無いために，物質の特定を行えなかった。VOC（No.10）のRIは，1291（InertCap pure-WAXカラム）及び972（DB-1カラム）であった。RIのパターンは，2種類の化合物（3-ヘプタン, 5-メチレン／5-ヘプテン 3-one, 5-メチル）との差違が見られなかった。また，3対のマウスについては，尿中に3-ペンテン, 2-oneが認められなかったので，統計的な解析は行わなかった。不安及びうつ病モデルであるST3Gal4 KO雄性マウスでは，20〜35週齢の尿中において，2種類のVOCが減少し，10種類のVOCが増加した（表１を参照）。
【００３４】
２．GC-MSによって解析された尿中VOCの代謝的特徴
ノックアウトマウスと野生型マウスの全イオンピークを用いてXCMSによって得られたVOCの関係を評価するために，エクセルとKyPlot 5.0を用いて，ノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスから得られた17個のVOCのベースピークの相対値から主成分分析（PCA）を行った（図２）。3対のノックアウトマウスと同腹仔野生型マウスの尿中に3-ヘプテン,2-oneが認められなかったので，これを除外した。PCAにおいて，累積寄与率は0.8以上であることが望まれる。今回の結果では，主成分１（PC1）〜主成分３（PC3）の合計で0.83であった。そこで，X軸，Y軸およびZ軸の領域を含むPCAスコアプロットを表示し，17個のVOCのうち，2個及び11個のVOCからなる2つのグループが認められた（図２Ａ）。図２Ａにおいて，円内の数字は，表１の第１カラムの数字と同じである。すなわち，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（テキサノール）（15）；2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（テキサノール異性体）（16）が2個のVOCからなるグループであり，ペンタン酸, 4-メチル-, エチルエステル（5）；3-ヘプタノン, 6-メチル（6）；RI1227（7）；RI1237（8）；スチレン（9）；3-ヘプタノン, 5-メチレン／5-ヘプテン3-オン, 5-メチル（10）；ベンズアルデヒド（12）；β-ファルネセン（13）；α-ファルネセン（14）；5,9-ウンデカジエン-2-オール, 6,10-ジメチル（17）；RI2297（18）が11個のVOCからなるグループであった。また，メチルアミン, N,N-ジメチル（1）；RI955（2）；RI1101（3）；3-ペンテン-2-オン（4）は，17個のVOCについて関連性が少なかったため，それぞれ別の方向を示した。
【００３５】
次に，試験２において，10〜16週齢のST3Gal4ノックアウトマウス（n=9）と野生型マウス（n=11）から得られた尿サンプルについて，HS-SPME GS-MSによる解析を行った（表２）。試験２の目的は，個々のマウスの試料間で，（相対値ではなく）直接にピーク面積の絶対値を比較し，尿中VOC量と感情応答との相関を評価することであった。発情前／発情期の雌マウスに対する雄の接触度合いを観察するために，10〜16週齢の若い雄マウスを使用した。20〜35週齢の雄マウス尿から抽出された18個のVOC（表１）のうち，10〜16週齢の雄マウス尿からは15個のVOCが認められた（表２）。このことは，若い雄マウスの尿中には，3-ヘプテン, 2-one及びRI2297が殆ど認められなかったことを示している。
図２Ａに示す11個のVOCを含むグループをクラス分けするために，表２に示すマウス尿中の面積絶対値を用いて，階層クラスタ解析を行った。RI2297を除く10個のVOCの絶対値を用いて，PCAスコアを求めた。
【００３６】
次いで，PCAの主成分1（PC1）〜主成分6（PC6）（累積寄与で0.99）を用いて，10個のVOCの樹形図を作成した。その結果，3個のカテゴリー，すなわち（１）スチレンのみ，（２）RI1227，β-ファルネセン，α-ファルネセンを含むグループ，（３）3個のVOC (ペンタン酸, 4-メチル-,エチルエステル；3-ヘプタノン,6-メチル；3-ヘプタノン, 5-メチレン／5-ヘプテン 3-one, 5-メチル），ベンズアルデヒド，及びRI1237と5,9-ウンデカジエン-2-オール, 6,10-ジメチルに分類された（図２Ｂ）。Y軸については，ST3Gal4ノックアウトマウス群と野生型マウス群とに関わらず，個々のマウスにおけるVOC値の変化が類似しているときには，VOC間の距離は短かった。互いに近い代謝経路および分解経路上で作り出されるVOCが距離を減少させるものと考えられた。
【００３７】
３．驚愕反射と尿中VOCの生成との関係
尿中VOC量と感情反応との関係を調べるために，驚愕反応試験を行った。その結果，ST3Gal4ノックアウトマウスと野生型マウスとの間で，驚愕反射に関する相違は小さかった（マン・ホイットニーのU検定においてp=0.1882。図３Ａ）。これは，聴覚活動の驚愕反応との間に違いはないことを示している。驚愕反応試験に続いて，尿を採取した。次に，尿中VOC量と驚愕反射との関係を調べるために，図２Ｂに示すようにクラス分けされた6個のVOCの絶対値を用いてPCAスコアを求めた。主成分1（PC1）の寄与率が0.90であり，6個のVOCの全部におけるPC1の負荷量が0.90を超えたので，PC1と驚愕反応がXY軸に分布し，二次多項式回帰曲線が高い適合性を示した（r=0.886，図３B）。ST3Gal4 KOマウスの25％が，尿中に6個のVOCをより多く産生し，6個のVOCの産生と驚愕反応との間に強い相関を示した。一方，残りの75％のKOマウスでは，6個のVOC量は少なかった。野生型マウスでは，6個のVOCの生産と驚愕反応との間には，相関は認められなかった（図３Ｂ）。
【００３８】
４．雄マウスの雌マウスに対する接触度合いと尿中VOCの生産との関係
尿中VOC量と情動反応との関係を調べるために，雄性マウスと雌性マウスを用いて，社会行動試験を行った。具体的には，前発情期から初期発情期（P／E）の雌マウスに対する雄マウスの1秒あたりのアクセス数（雄の鼻から雌の鼻，雄の鼻から雌の膣周辺，及び雄の前肢から雌の体）を10分間にわたって計数した（図４Ａ）。その結果，野生型の雄マウスでは，P／E期の雌マウスに対するアクセス数は，ST3Gal4 KO雄マウスのアクセス数よりも，平均値で2.2倍多かった。また，野生型の雄マウスでは，P／E期の雌マウスに対するアクセス数は，発情後期の雌マウスに対するアクセス数よりも，平均値で2.0倍多かった。この傾向は，ST3Gal4 KO雄マウスのものと同じであった。これらの結果は，ST3Gal4 KO雄マウスは，P／E期の雌マウスに対するアクセス数が少ないことを示している。そこで，尿中VOC量と感情反応との関係を調べるために，P／E期の雌マウスに対する雄マウスのアクセス数を調べた。
【００３９】
P／E期の雌マウスに接触する前及び後の尿を雄マウスから採取し，VOCを解析した（表２）。その結果，VOCについて，尿中VOC量と雄のアクセス数との間に重要な相関を持つ3種類のパターンを見出した。まず，RI1101，β-ファルネセン及びα-ファルネセンは，雌マウスに接触する前の野生型雄マウスでは，尿中量が少なかった。野生型雄マウスが雌マウスに接触した後には，尿中の量が増加した（図４Ｄ，Ｍ，Ｎ）。β-ファルネセンとα-ファルネセンが増加するのは，ST3Gal4 KO雄マウスの場合と同様であった（表２）。但し，いずれもp値には有意性は認められなかった（クラスカル・ウォリス検定によるp値は，それぞれ0.2467及び0.1398）。これに対し，野生型雄マウスが雌マウスに接触した後には，（ST3Gal4 KO雄マウスに比べると0.57倍程度の量に過ぎないものの）RI1101は有意に増加した（クラスカル・ウォリス検定によるp=0.0077。図４Ｄ）。
【００４０】
次のパターンは，2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・1-モノイソブチレート（テキサノール），及び2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール・3-モノイソブチレート（テキサノール異性体）であった。これらのVOCは，ST3Gal4ノックアウト雄マウス及び野生型雄マウスのいずれに於いても，雌マウスとの接触後に有意に増加した（p=0.042, 0.0154。図４Ｏ，Ｐ）。具体的には，テキサノールでは，雌マウスとの接触後に2.0倍（ノックアウト雄マウス）及び2.6倍（野生型雄マウス）に増加し，テキサノール異性体では，それぞれ1.4倍（ノックアウト雄マウス）及び1.7倍（野生型雄マウス）に増加した。本発明者の検討に依れば，不安症を示すヒトにおいては，テキサノールとテキサノール異性体は，対照者と比較すると尿中量が増加していた。未成熟の雄マウスが，P／E期の雌マウスに最初に接触するときは，雌マウスに対して高い感情的ストレスを持ち得る。このため，尿中テキサノールとテキサノール異性体の増加は，抑うつ状態のヒトと同様の症状を示しているのかも知れない。
第３のパターンは，テキサノールとテキサノール異性体とは逆の反応であり，ST3Gal4ノックアウト雄マウスと野生型雄マウス（p=0.0280。図４Ｊ）との両方において，雌マウスとの接触後に減少を示したスチレンである。
【００４１】
これに対し，雌マウスと接触する前後に拘わらず，6個のVOCについては，ST3Gal4ノックアウトマウスの尿中量が，野生型マウスの尿中量よりも高かった（図４及び図５，表２）。これらのVOCについては，雌マウスとの接触前後において，雄マウスの尿中量に変化が認められなかった。更に，野生型マウスの尿中VOCのイオンピークの絶対値のばらつきは，それぞれ低かった（図４）。6個のVOCについては，尿中VOC量とP／E期の雌マウスに対する若い雄マウスのアクセス数との相関には関与していないことが示された。6個のVOCは，ST3Gal4欠損マウスのうち，25％のマウスにおける驚愕反応との相関を示した物質と同一であった。このことから，情動反応と相関する尿中のVOCは，全ての情動反応には関与しないことが示唆された。
【００４２】
５．C57BL/6マウスを用いた試験結果
まず，既報に従って（Fujita 2018a），InertCap PureWAX（GLサイエンス）とGC-MS（QP-2010 Ultra，島津製）とを用いて，TXIB（東京化成工業株式会社，日本）およびテキサノール（Alfa Aesar、Lancashire、UK）の標品の確認を行った。GC-MSの解析結果を図６に示した。TXIB標品は殆ど純粋であったが，テキサノール標品は，約40％（モル比）のテキサノール異性体を含んでいた[テキサノール：テキサノール異性体 = 12.98：8.652（ng）]。
恐怖条件訓練の初日（6日目）には，マウスの移動距離に対するテキサノール（図７（B-1））およびTXIB（図７（C-1））の吸入による影響はなかった。
第2日目に，CSまたはUSを与えない状態での実験エリア（幅170mm×長さ100mm×高さ100mmの四角形ケージ）でマウスの行動を調べた。テキサノールの蒸発によって，移動距離が僅かに減少した。最小用量（0.24μg/m3）では，各期間における30秒間の移動距離に対してわずかではあるが，影響があった（図７（B-2）では*p=0.0338），300秒間の合計距離において1/2の減少が認められた（*p=0.0336（図８（Ａ）；テューキーの多重比較試験）。一方，TXIBについては，各期間における30秒間の移動距離（図７(C-2))または300秒間の全距離（図８(Ｅ)）のいずれにおいても殆ど統計的な影響はなかった。TXIBを10〜216μg/m3となるように蒸発吸引させると，60〜200秒の140秒間の平均距離（cm）で示すように，移動距離を減少させる傾向があった（図７（C-2））。更に，TexanolまたはTXIBの蒸発投与では，300秒間における凍結についての差を生じなかった（図８（Ｂ），図８（F））。少なくとも，4日間のテキサノールの蒸発は，空間認知に関連する恐怖記憶にわずかしか影響を与えなかった。
【００４３】
第3日目に，別の実験室（幅170mm×長さ100mm×高さ100mmの固体，灰色，正方形の区域）でマウスの行動を検査した。このとき，音刺激（CS）のみを60秒〜120秒の60秒間の間に与えた。TexanolおよびTXIBの蒸発は，各期間（図７（B-3）および（C-3）），240秒間の総移動距離（図８（C）および（G））を減少させ，減少の程度は用量に従って徐々に拡大した。更に，TexanolおよびTXIBの蒸発投与は，4分あたりの総不動時間（％）を増加させた。詳細には，Texanolの蒸発投与は，0.24〜216μg/m3の用量に依存して，総不動時間（％）を2.05〜2.35倍に増加させた。一方，マウスは，TXIBが10〜100μg/m3の用量で総不動時間（％）を増加させたが，216μg/m3の用量では，総不動時間（％）の増加の程度を下げた。
また，不安を評価するためには，頭部の振れを測定することが，より敏感であることを見出した（Yang et al，2015）。0〜216μg/m3の間で頭部スイング数の差は殆ど見られなかったが（p=0.1365；図９（A）），TXIBの各用量を0μg/m3と比較した結果，TXIBを216μg/m3に蒸発させたときのヘッドスイング数は1.7倍に増加した（*p=0.024）。10, 50および100μg/m3のそれぞれのヘッドスイング数については，0μg/ m3と比較したところ数の差違は認められなかった。このように，高容量のTXIBを蒸発させることによって，マウスの頭部の揺れが誘発され，2秒より長い時間動かなくなった。最後に，厚生労働省で標準化しようと試みた基準値に基づいて，TexanolとTXIBを5日以上に渡って蒸発投与し，聴覚刺激に依って不安を高めたことを，当該研究で見つけた。0,100及び216μg/m3のTXIBの吸入効果を8日間に渡って評価した結果，試験開始から第8日目に試みた聴覚刺激に対する不安への不動性が最も高まることが分かった。その一方で，8日間の間TXIBを吸入したマウスの強制水試験を測定した結果，TXIBは，不動性(%)について影響を与えないことが分かった（図１０）。
【００４４】
嗅覚系では，感覚受容器は鼻腔内の末梢嗅上皮に局在している。臭気分子の受容体への結合に続いて，臭気刺激は受容体から嗅球に伝播する。嗅球では、僧帽細胞および房飾細胞が出力ニューロンとして配置される。房飾細胞は僧帽細胞と情報交換を行っており，僧帽細胞は，周辺から1つのシナプスを作り，軸索を他の感覚系との会合皮質である梨状皮質，感情の中心である扁桃体に送り，嗅内皮質が軸索を海馬に送って，学習および作業記憶を機能させる。TexanolとTXIBは，匂い分子として感覚受容体に結合し，匂い情報を扁桃体に直接送ることができる。扁桃体は，恐怖条件付け試験において重要な役割を果たす（Srimontri 2014）。特に音に関連付けた条件付けの際，視床の内側膝状体や大脳皮質聴覚野のニューロンが，扁桃体外側核ニューロンに聴覚情報を伝達する。今回の試験によれば，TexanolおよびTXIBの吸入による嗅球を介した扁桃体の刺激は，マウスにおいて音響恐怖を引き起こした。
これに対し，強制水泳試験は，抗うつ薬活性を調べるために用いられており，不動性の持続時間は，海馬と前頭葉の相互連絡の破綻の程度により影響を受け，破綻すると持続時間が長くなる。この海馬と前頭葉の相互連絡を，視床結合核ニューロンが中継する（Kafetzopoulosら，2018）。強制水泳試験では，TexanolやTXIBの吸入による影響は見られなかった。嗅上皮の嗅神経から入力した嗅覚刺激は，2つ以上のシナプスを介して海馬に到達することから，TexanolやTXIBの吸入による嗅覚情報は嗅内皮質を介して海馬に到達できなかったと考えられる。
【００４５】
また，TexanolとTXIBは，マウスにおいて不安を強く誘発することが示唆された。Texanol及びTXIBによる不安の媒介メカニズムを理解すれば，シックハウス症候群や化学物質過敏症に関連する神経系への影響を理解し得ると考えられた。TexanolもTXIBも室内空気環境汚染化学物質に指定されており，シックハウス化学物質には，化学物質過敏症や，喘息等アレルギー疾患に加え，不安症やうつと言った症状も引き起こす可能性が示唆されている（Choi et al., 2015; Ghaffarianhoseini et al., 2018）。これまでに我々は，尿を含むバイアル中VOC量を高齢者うつの方と不安症モデルマウス(St3gal4-ko)で計測したところ，高齢者うつでTexanolとTexanol 異性体の量が，壮年期不安症モデルマウス（35週齢）でTexanol 異性体の量が亢進することを見つけている。これまでに，Texanolが体内を通り尿中に排出されたものか，環境中のものが尿に捕集されたのかは別として、ヒトとマウスの尿で共に亢進することが確認された。今回，TexanolとTXIBが，環境基準値（2017年8月に想定されたが，その後再考することになり，2018年10月時点では基準値ではない）付近の濃度で，健康な若いマウスに不安症を起こすことを見つけた。その症状は，不安症モデルマウス(St3gal4-ko)が示すのと同様のtone fear memoryの増強であった。こうした結果から、人にも不安症を与える可能性を示唆すると共に，加齢に伴い発症の頻度が亢進する可能性を示している。このように、環境中のTXIBとTexanolをマーカーとして用いれば，不安症，うつスクリーニングシステムとして利用できることが分かった。
【００４６】
６．今回の試験結果及び本発明者の知見から，次のような考察が得られた。
（１）RI955, RI1227, RI1237については，脂質代謝産物である可能性が非常に高いことが分かった。一方，本発明者は，ヒトのうつと尿中物質との関連を調べる別の試験を行った。その別の試験の結果として，ヒトのうつを評価できる物質として，テキサノールを得た。つまり，ヒト及びマウスについては，同一の尿中物質がストレスに対応することがわかった。このため，少なくともテキサノール及びTexanol 異性体については，うつに関連する尿中物質として，多くの哺乳動物で保存されている反応の結果である蓋然性が非常に高いことがわかった。
また，これらの物質は，非侵襲的に採取できる尿から抽出できるので，動物を傷つける必要がない。
【００４７】
（２）本研究においては，糞から尿へのコンタミネーションが生じないように注意して採尿した。しかしながら，VOCの中には，尿中量と血中量とが比例しないものがあった。これは，能動的再吸収が起こっている可能性を示すものである。但し，血中には，3-penten-2-one (salivary, endogenous), RI1227 (from food), 5,9-undecadien-2-ol, 6,10-dimethylが認められなかった。本研究において，VOCをトラップするために用いたSPMEカラム中に物質を測定しているため，血中では溶解度が高く，揮発しにくい可能性がある。
（３）1-ドコサノール,酢酸（1-Docosanol, acetate (Eicosyl acetate)）については，若年マウスでは観察されなかったことから，高齢化に伴い増えてくるのかも知れない。
（４）大気中にTexanolあるいは，TXIBを混入させると，音恐怖記憶が増強し，不安症状に類似する反応を示した。このことから，Texanolあるいは，TXIBについては，うつ，不安症の評価を行うために，有効に利用できると考えられた。
【００４８】
このように，本実施形態によれば，マウス・哺乳動物のうつ，不安症の状態を知るためのバイオマーカーを提供できた。当該モデルマウスが，ヒト疾患と連動していることから，本実施形態のバイオマーカーは，ヒトの非侵襲性うつ及び／または不安症のバイオマーカーとしても使用し得る。また，このバイオマーカーは，精神疾患一般だけでなく，高齢者フレイル移行期の状態を検討できるものとしても使用できる。更に，このバイオマーカーの増減によって，精神疾患の状態がわかるので，創薬スクリーニングにも利用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４９】
【特許文献１】特開２０１４−２２４７５９号公報
【特許文献２】特開２０１４−  １３２５７号公報
【特許文献３】特開２０１２−  １３４１５号公報
【非特許文献】
【００５０】
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【非特許文献２】Bonsnes RW, Taussky HH. (1945) On the colorimetric determination of creatinine by the Jaff e reaction.  J. Biol. Chem., 158, 581-91.
【非特許文献３】Buccafusco JJ, Curzon P, Zhang M, Radek RJ, Fox GB. The Behavioral Assessment of Sensorimotor Processes in the Mouse: Acoustic Startle, Sensory Gating, Locomotor Activity, Rotarod, and Beam Walking. 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor ＆ Francis; 2009. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5236/
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【非特許文献５】Benton H, Wong D, Trauger S, Siuzdak G (2008) XCMS2: Processing Tandem Mass Spectrometry Data for Metabolite Identification and Structural Characterization. Anal Chem 80: 6382-6389. doi:10.1021/ac800795f.
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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