(57)【要約】      （修正有）【課題】スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための方法の提供。【解決手段】スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、以下の工程段階:a)スクロース含有基質を、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程と、b)イソマルツロース含有組成物を取得する工程、とを含む方法において、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスが、370〜550μmの範囲のd(0.5)値を有し、担体が、アルギネート担体又はポリビニルアルコール担体であることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、以下の工程段階:
a)スクロース含有基質を、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程と
b)イソマルツロース含有組成物を取得する工程
とを含む方法において、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜900μmの粒径dpを有することを特徴とする方法。
【請求項２】
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜400μmの粒径dpを有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが球状である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
スクロースイソメラーゼバイオマス対担体の重量比が、10〜6部のスクロースイソメラーゼバイオマス対6〜2部の担体である(それぞれ乾重量)、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
イソマルツロース含有組成物がトレハルロースを含有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、結合、架橋、又は封入固定化によって、担体固定化されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
担体が、アルギン酸塩担体又はポリビニルアルコール担体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、スクロースイソメラーゼ、スクロースイソメラーゼ活性を有する微生物細胞、又はスクロースイソメラーゼ活性を有する細胞抽出物である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、ラオウルテラ(Raoultella)属、ペクトバクテリウム(Pectobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、パントエア(Pantoea)属、ロイカネア(Leucanea)属、プロタミノバクター(Protaminobacter)属、又はバチルス(Bacillus sp.)属種の微生物に由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、プロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum)、クレブシエラ属種、特にLX3株又はNK33-98-8株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、特に342株、エンテロバクター属種、特にSZ62株又はFMB1株、エルウィニア・タスマニエンシス(Erwinia tasmaniensis)、特にEt1/99株、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)、特にSCRI 1043株、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carovotum)、特に亜種ブラシリエンシス(brasiliensis)、特にPBR 1692株、アゾトバクター・ビネランディ(Azotobacter vinelandii)、ロイカネア・ロイコセファリア(Leucanea leucocephalia)、エルウィニア・ラポンティシ(Erwinia rhapontici)、ラオウルテラ・プランティコーラ(Raoultella planticola)、シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)、ロイコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、パントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、又はアグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)に由来する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程段階a)及びb)が、固定床又は撹拌槽反応器中で行われる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
得られたイソマルツロース含有組成物が接触水素化される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1から12のいずれか一項に記載の方法、続いて、得られたイソマルツロース含有組成物の接触水素化を行い、糖アルコール含有組成物が得られる、糖アルコール含有組成物を製造するための方法。
【請求項１４】
糖アルコール含有組成物がイソマルト又はイソマルト変種である、請求項13に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソマルツロース(パラチノース、6-O-α-D-グルコピラノシル-D-フルクトース)は、生物工学プロセスにおいて、酵素的異性化により、スクロースから製造可能であることが公知である。イソマルツロースは、食料品及び類似製品におけるスクロース代替品としてますます重要性を得ている生理学的に貴重な糖である。イソマルツロースは、非齲蝕原性であり、本質的にはスクロースと同じエネルギー含有量において、低いグリセミック指数を有する。イソマルツロースは、2005年以降、食料品中での使用が承認されている。さらに、イソマルツロースは、糖アルコールであるイソマルト、1,6-GPS(6-O-α-D-グルコピラノシル-D-ソルビトール)と1,1-GPM(1-O-α-D-グルコピラノシル-D-マンニトール)とからなるラセミ混合物及びそれらの変種、特に1,6-GPS-濃縮又は1,1-GPM-濃縮混合物を製造するための出発物質である。
【０００３】
公知の生物工学系では、スクロースは、酵素的に、完全にはイソマルツロースに異性化されない。むしろ、さらなる異性化生成物及び副産物が生成する。本質的なもう1つの異性化生成物は、トレハルロースである。
【０００４】
スクロースのもう1つの本質的な異性体であるトレハルロース(1-O-α-D-グルコピラノシル-D-フルクトース)は、天然には、例えば蜂蜜の中に見出され、イソマルツロースと同様に非齲蝕原性である。
【０００５】
両方の異性体、イソマルツロース及びトレハルロースとも、例えば、EP1424074A1から、ヒト及び動物(消費者)の小腸においてスクロースと比べて低い加水分解率を有し、それゆえ有利な食品成分、とりわけ血糖値をより良く制御可能に維持するような食品成分であるヘテロ二糖として公知である。
【０００６】
ラージスケールでは、イソマルツロース及びトレハルロースは、固定化細菌細胞又はその断片を使用しながら酵素的転位(enzymatische Umlagerung)によって製造される。その際、二糖スクロースの単糖ユニット間に存在するα1-α2-グリコシド結合が、イソマルツロースではα1-α6-結合に、又はトレハルロースではα1-α1-結合に異性化される。スクロースから両方の非齲蝕原性二糖へのこの転位は、細菌酵素であるスクロースイソメラーゼ(E.C. 5.4.99.11、同義語:スクロースムターゼ、スクロースムターゼ、スクロースイソメラーゼ、イソマルツロースシンターゼ)の触媒下に起こる。スクロースイソメラーゼ活性を有し、生物工学プロセスにおいて使用可能な微生物は、とりわけプロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum)、エルウィニア・ラポンティシ(Erwinia rhapontici)、シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)、パントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)及びセラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)である。使用される生物及び反応条件に応じて、異なる量比での、望みの非齲蝕原性の二糖、イソマルツロース及びトレハルロースに加えて、ある程度の割合の、場合によっては望ましくない単糖、例えばグルコース及び/又はフルクトース、並びにオリゴマーも含み得る生成物混合物がこの反応ではもたらされる。
【０００７】
EP0483755B1は、トレハルロース含有及びイソマルツロース含有組成物を製造するための方法を開示し、ただし、その目的には、主にトレハルロース含有生成物を得るために、シュードモナス・メソアシドフィラMX-45(FERM-BP 3619)又はアグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)MX-232(FERM-BP 3620)が使用される。
【０００８】
スクロース含有溶液から、主にトレハルロース含有組成物を製造するための、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、サーマス・ルーバー(Thermus ruber)、サーマス・アクアチカ(Thermus aquatica)、又はピメロバクター(Pimelobacter)に由来する酵素活性の使用が、EP0794259B1から公知である。
【０００９】
EP0091063A2及びEP0625578A1は、固定化細菌細胞、とりわけプロタミノバクター・ルブルム(CBS 574.77)を使用しながらイソマルツロースを製造する方法を開示する。開示される方法は、スクロース含有溶液を起点とし、この溶液が、固定化細胞の使用下に、主にはイソマルツロースを含有するもののトレハルロースも含有する生成物に変換される。
【００１０】
開示される方法はすべて、スクロースイソメラーゼの限定的活性を特徴とし、ただし、とりわけイソマルツロース、トレハルロース、又は両方とものラージスケール製造には、方法効率の改善、とりわけ迅速な転化速度、並びに/又は転化率及び/若しくは収率の上昇が望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP1424074A1
【特許文献２】EP0483755B1
【特許文献３】EP0794259B1
【特許文献４】EP0091063A2
【特許文献５】EP0625578A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の基礎を成す技術的課題は、前記の不利点を克服すること、とりわけ、その枠内では従来技術と比べて改善された、スクロースからイソマルツロース含有及び/又はトレハルロース含有生成物への転化が達成される方法を提供することである。とりわけ、転化速度の上昇、並びに/又は転化率及び/若しくは収率の上昇を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、その基礎を成す技術的課題を、独立請求項に記載の教示の提供によって解決する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明による、第一の粒子調製(粗粒)のサイズ分布を図示する。
【図２】本発明による、第二の粒子調製(標準粒(Normalkorn))のサイズ分布を図示する。
【図３】本発明による、第三の粒子調製(微細粒)のサイズ分布を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
とりわけ、本発明は、以下の教示を提供する。
【００１６】
本発明は、とりわけ、スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、以下の工程段階:
a)スクロース含有基質を、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程、及び
b)イソマルツロース含有組成物を取得する工程
を含む本発明による方法において、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜1300μm、とりわけ100〜900μmの粒径dpを有することを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが球状である。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、立方体、板、粒子、糸の形態、とりわけ中空糸、球、中空球、又はLentiKats(登録商標)の形態を有してもよい。
【００１９】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、スクロースイソメラーゼバイオマス対担体の重量比が、10〜6、好ましくは7部のスクロースイソメラーゼバイオマス対6〜2、好ましくは3部の担体である(それぞれ乾重量)。
【００２０】
特に好ましい実施形態では、スクロースイソメラーゼバイオマス対担体の重量比が、0.2〜0.8、とりわけ0.3〜0.7、又は好ましくは0.4〜0.6である。
【００２１】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、イソマルツロース含有組成物がトレハルロースを含有する。
【００２２】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、スクロースイソメラーゼバイオマスが、吸着、結合、とりわけ共有結合、架橋、カプセル化、又は封入固定化によって、担体固定化されている。
【００２３】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、担体が、アルギン酸塩（alginate）担体又はポリビニルアルコール担体であり、とりわけアルギン酸ナトリウム担体である。
【００２４】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、スクロースイソメラーゼバイオマスが、スクロースイソメラーゼ、スクロースイソメラーゼ活性を有する微生物細胞、又はスクロースイソメラーゼ活性を有する細胞抽出物である。
【００２５】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、スクロースイソメラーゼバイオマスが、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア属、エルウィニア属、エンテロバクター(Enterobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、ラオウルテラ(Raoultella)属、ペクトバクテリウム(Pectobacterium)属、シュードモナス属、アゾトバクター(Azotobacter)属、パントエア属、ロイカネア(Leucanea)属、プロタミノバクター属、又はバチルス(Bacillus)属の微生物に由来する。
【００２６】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、スクロースイソメラーゼバイオマスが、プロタミノバクター・ルブルム、クレブシエラ属種、特にLX3株又はNK33-98-8株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、特に342株、エンテロバクター属種、特にSZ62株又はFMB1株、エルウィニア・タスマニエンシス(Erwinia tasmaniensis)、特にEt1/99株、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)、特にSCRI 1043株、ペクトバクテリウム・カロボタム(Pectobacterium carovotum)、特に亜種ブラシリエンシス(brasiliensis)、特にPBR 1692株、アゾトバクター・ビネランディ(Azotobacter vinelandii)、ロイカネア・ロイコセファリア(Leucanea leucocephalia)、エルウィニア・ラポンティシ、ラオウルテラ・プランティコーラ(Raoultella planticola)、シュードモナス・メソアシドフィラ、ロイコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、パントエア・ディスパーサ、セラチア・プリムチカ、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、又はアグロバクテリウム・ラジオバクターに由来する。
【００２７】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、工程段階a)及びb)が、固定床又は撹拌槽反応器中で行われる。
【００２８】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、得られるイソマルツロース含有組成物が、接触水素化される。
【００２９】
本発明による方法は、好ましくは連続的に行われるが、半連続的、又はバッチ式に行われてもよい。
【００３０】
本発明は、とりわけ糖アルコール含有組成物を製造するための、本発明による方法に関し、ただし、スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、本発明による方法、及びそれに続いて、得られたイソマルツロース含有組成物の接触水素化が行われて、糖アルコール含有組成物が得られる。
【００３１】
本発明は、本発明による、糖アルコール含有組成物を製造するための方法にも関し、ただし、糖アルコール含有組成物は、イソマルト又はイソマルト変種である。
【００３２】
本発明との関連では、「スクロース含有基質」とは、1〜100重量%、好ましくは1〜99重量%、好ましくは10〜95重量%、とりわけ20〜90重量%のスクロース(それぞれ、基質の固形分重量（Gewicht der Trockensubstanz des Substrats）に対して)を含有する組成物と理解される。
【００３３】
一実施形態では、スクロース含有基質は、スクロースのみからなり得る。
【００３４】
別の一実施形態では、スクロース含有基質は、スクロースの他に、とりわけ、トレハルロース、イソメレジトース、グルコース、フルクトース、スクロース、イソマルトース、三糖及びオリゴマーからなる群から選択される、1つ、2つ、3つ、複数又は多数のさらなる物質を含有してもよい。
【００３５】
特に好ましい一実施形態では、スクロース含有基質が、好ましくは2重量%〜好ましくは最高85重量%、好ましくは3重量%〜好ましくは最高90重量%、好ましくは4重量%〜好ましくは最高95重量%、好ましくは5重量%〜好ましくは最高96重量%、好ましくは6重量%〜好ましくは最高97重量%、好ましくは7重量%〜好ましくは最高98重量%、好ましくは8重量%〜好ましくは最高99重量%、好ましくは9重量%〜好ましくは最高100重量%、好ましくは10重量%〜好ましくは最高85重量%、好ましくは20重量%〜好ましくは最高90重量%、好ましくは30重量%〜好ましくは最高95重量%、好ましくは40重量%〜好ましくは最高96重量%、好ましくは50重量%〜好ましくは最高97重量%、好ましくは60重量%〜好ましくは最高98重量%、好ましくは70重量%〜好ましくは最高99重量%、又は好ましくは80重量%〜好ましくは100重量%のスクロース含有量を好ましくは有する(それぞれ、基質の固形分重量に対して)。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質が、好ましくは5重量%〜好ましくは最高75重量%、好ましくは10重量%〜好ましくは最高78重量%、好ましくは20重量%〜好ましくは最高85重量%、好ましくは30重量%〜好ましくは最高88重量%、好ましくは40重量%〜好ましくは最高93重量%、好ましくは50重量%〜好ましくは最高94重量%、好ましくは60重量%〜好ましくは最高95重量%、好ましくは65重量%〜好ましくは最高96重量%、好ましくは10重量%〜好ましくは最高97重量%、好ましくは20重量%〜好ましくは最高98重量%、好ましくは30重量%〜好ましくは最高99重量%、好ましくは40重量%〜好ましくは100重量%のスクロース含有量を有する(それぞれ、基質の固形分重量に対して)。
【００３７】
好ましくは60〜90重量%、好ましくは70〜80重量%、好ましくは30〜60重量%、好ましくは40〜50重量%のスクロース含有量が特に好ましい(それぞれ、スクロース含有基質の固形分重量に対して)。
【００３８】
特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質が、90〜99重量%、好ましくは90〜98重量%、とりわけ90〜97重量%のスクロース(それぞれ、基質の固形分重量に対して)を有する。
【００３９】
特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質が、液状、好ましくは溶解状又は懸濁状で存在し、好ましくは液状、とりわけ水性の媒体中に存在する。特に好ましい実施形態では、水性媒体が水である。特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質が、水性媒体、つまり水性溶液又は水性懸濁液中に存在する。
【００４０】
特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質を含有する水性媒体、つまり、例えば溶液又は懸濁液が、0.1〜80重量%、好ましくは1〜70重量%、好ましくは4〜60重量%、好ましくは5〜50重量%、とりわけ5〜40重量%、とりわけ5〜30重量%、好ましくは35〜45重量%、好ましくは20〜27重量%、好ましくは40〜75重量%、とりわけ40〜60重量%、とりわけ10〜60重量%、好ましくは20〜55重量%のスクロース含有基質を有し、ただし、この量範囲は、媒体の重量、つまり、例えば水で100%まで加算される(重量%は、それぞれ、スクロース基質含有媒体の総重量に対し、媒体中でのスクロース含有基質の固形分含有量に対応する)。
【００４１】
特に好ましい実施形態では、スクロース含有基質を含有する溶液又は懸濁液は、糖加工工場に由来する希薄汁又は濃厚汁であってよく、5〜70%、好ましくは50〜70%、とりわけ55〜68%、とりわけ5〜30%、好ましくは20〜27%の固形分含有量を好ましくは有する(重量%は、それぞれ、スクロース基質含有媒体の総重量に対する)。
【００４２】
スクロース含有基質を含有する媒体、とりわけ溶液又は懸濁液として、糖蜜、又は他の不純スクロース含有組成物を使用することも、本発明によると可能である。
【００４３】
好ましいもう1つの実施形態においては、スクロース含有基質を有する液状媒体、とりわけスクロース含有基質を有する溶液又は懸濁液が、0.1〜80重量%、5〜30重量%、20〜30重量%、20〜60重量%、30〜60重量%、35〜45重量%、40〜75重量%、40〜60重量%、10〜60重量%、又は好ましくは20〜55重量%のスクロース含有量(それぞれ、スクロース含有液状媒体の総重量に対して)を有する。
【００４４】
本発明との関連では、「イソマルツロース含有組成物」とは、スクロース含有基質に対するスクロースイソメラーゼ活性による異性化生成物と理解される。本発明のイソマルツロース含有組成物は、イソマルツロース及びトレハルロースからなる混合物を有し、とりわけその両者からなる。好ましくは、一実施形態では、トレハルロースよりも多量のイソマルツロースが存在し、別の一実施形態では、イソマルツロースよりも多量のトレハルロースが存在する。イソマルツロース含有組成物のさらなる構成要素は、イソメレジトース、フルクトース、グルコース、イソマルトース、スクロース、三糖、オリゴマー、又はこれらの糖の2つ以上の混合物であり得る。
【００４５】
特に好ましくは、イソマルツロース含有組成物中のイソマルツロースの分率が、少なくとも80重量%、好ましくは少なくとも81重量%、少なくとも82重量%、少なくとも83重量%、少なくとも84重量%、少なくとも85重量%、好ましくは少なくとも86重量%、とりわけ少なくとも87重量%、少なくとも88重量%、少なくとも89重量%、少なくとも90重量%、少なくとも91重量%、少なくとも92重量%、又は93重量%である(それぞれ、イソマルツロース含有組成物の固形分に対して)。そのようなイソマルツロース含有組成物の、100%まで加算される、残りの構成要素は、トレハルロース、及び任意選択でイソメレジトース、フルクトース、グルコース、スクロース、イソマルトース、三糖、オリゴマー、又はそのうちの2つ以上によって形成される。
【００４６】
特に好ましい実施形態においては、イソマルツロース含有組成物が、60〜98重量%、とりわけ70〜95重量%、好ましくは75〜88重量%、とりわけ75〜84重量%のイソマルツロース(それぞれ、イソマルツロース含有組成物の固形分に対して)を有する。
【００４７】
好ましいもう1つの実施形態においては、イソマルツロース含有組成物が、1〜20重量%、5〜20重量%、10〜30重量%、又は20〜最高99重量%、好ましくは20〜40重量%、好ましくは20〜30重量%、好ましくは30〜好ましくは最高95重量%、好ましくは45〜96重量%、好ましくは46〜97重量%、好ましくは47〜98重量%、好ましくは48〜99重量%、好ましくは49〜99重量%、好ましくは40〜最高98重量%、好ましくは50〜97重量%、60〜96重量%、又は好ましくは70〜最高97重量%、好ましくは80〜最高98重量%、好ましくは75〜最高98重量%、とりわけ50〜99重量%、とりわけ60〜98重量%、とりわけ85〜最高99重量%、及び好ましくは95重量%〜99重量%、好ましくは96〜99重量%、好ましくは97〜99重量%、好ましくは98〜99重量%のトレハルロース(それぞれ、イソマルツロース含有組成物の固形分に対して)を含有してもよい。組成物全体の100重量%まで加算される、残りの構成要素は、イソマルツロース、及び任意選択でグルコース、フルクトース、イソメレジトース、イソマルトース、スクロース、三糖、オリゴマー、又はそのうちの2つ以上によって形成される。
【００４８】
特に好ましい実施形態では、イソマルツロース含有組成物が、60〜90重量%のイソマルツロース、5〜40重量%のトレハルロース、並びに0〜5重量%の、イソメレジトース、スクロース、フルクトース、グルコース、イソマルトース、三糖、及びオリゴマーからなる群から選択される少なくとももう1つの物質を有する。
【００４９】
好ましいもう1つの実施形態では、本イソマルツロース含有組成物が、60〜90重量%のトレハルロース、5〜40重量%のイソマルツロース、並びに0〜5重量%の、イソメレジトース、フルクトース、グルコース、スクロース、イソマルトース、三糖、及びオリゴマーからなる群から選択される少なくとももう1つの物質を有する。
【００５０】
好ましいもう1つの実施形態では、イソマルツロース含有組成物が、液状、好ましくは溶解状又は懸濁状で存在し、好ましくは液状、とりわけ水性の媒体中に存在する。特に好ましい実施形態では、水性媒体が水である。特に好ましい実施形態では、イソマルツロース含有組成物が、水性媒体、つまり水性溶液又は水性懸濁液中に存在する。
【００５１】
特に好ましい実施形態では、イソマルツロース含有組成物を含有する水性媒体、つまり、例えば、溶液又は懸濁液が、0.1〜80重量%、好ましくは1〜70重量%、好ましくは4〜60重量%、好ましくは5〜50重量%、とりわけ5〜40重量%、とりわけ5〜30重量%、好ましくは35〜45重量%、好ましくは20〜27重量%、好ましくは40〜75重量%、とりわけ40〜60重量%、とりわけ10〜60重量%、好ましくは20〜55重量%のイソマルツロース含有組成物を有し、ただし、これらの量範囲は、媒体、つまり、例えば水の重量で100%まで加算される(重量%は、それぞれ、イソマルツロース含有組成物含有媒体の総重量に対し、媒体中でのイソマルツロース含有組成物の固形分含有量に対応する)。
【００５２】
本発明との関連では、「スクロースイソメラーゼバイオマス」とは、バイオマス、とりわけ細胞、細胞抽出物、酵素、又は酵素混合物であり、ただし、そのバイオマスは、適した条件下において、スクロース含有基質をイソマルツロース含有組成物に変換できる、つまりスクロースイソメラーゼ活性を有する。好ましくは、スクロースイソメラーゼが、α-グルコシルトランスフェラーゼ又はスクロース6-グルコシル-ムターゼ(EC 5.4.99.11)活性を有する。
【００５３】
有利には、スクロースイソメラーゼバイオマスとして使用可能な細胞は、生存状態でも死亡状態でもよい。特に好ましい実施形態では、スクロースイソメラーゼバイオマスとして使用される細胞が、完全な、若しくは破壊された、とりわけ破砕された細胞、細胞断片、細胞溶解産物、又は細胞抽出物であってもよい。本発明により使用されるスクロースイソメラーゼバイオマスは、好ましい実施形態では、例えば、溶媒抽出、フレンチプレス、凍結乾燥、及び/又は酵素処理のような従来の精製法によって、精製、とりわけ単離されていてもよい。使用されるスクロースイソメラーゼバイオマスは、天然由来であってもよいか、又は一実施形態では、遺伝子工学で改変されていてもよい。
【００５４】
本発明により想定される、スクロース含有基質を、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程段階a)は、本発明により好ましくは、スクロース含有基質の、イソマルツロース含有組成物への変換が、好ましくは転化最適化された方式で起こり得るように行われる。
【００５５】
好ましくは、接触が、10〜40℃、好ましくは15〜40℃、好ましくは10〜37℃、好ましくは25〜40℃、好ましくは25〜30℃、好ましくは30〜40℃、好ましくは10〜25℃、好ましくは15〜30℃、好ましくは18〜26℃、好ましくは10〜20℃、とりわけ10〜17℃の温度で行われる。
【００５６】
好ましいもう1つの実施形態では、工程段階a)を、pH値、5.0〜9.0、好ましくは5.0〜7.0、好ましくは6.0〜7.0で行うことが想定されている。
【００５７】
本発明との関連では、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスとは、担体表面又は担体内に固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスと理解される。この担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスは、以下では、簡潔に固定化物とも呼ばれる。固定化は、従来の方式で、例えば、吸着、結合、とりわけ共有結合、架橋、カプセル化、又は封入固定化により行われ得る。
【００５８】
特に好ましい方式では、本発明は、第一の工程段階x1)において、例えば、発酵槽中での獲得によりバイオマスを提供し、このバイオマスを、第二の工程段階x2)において、アルギン酸塩溶液と混合し、第三の工程段階x3)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物を、カルシウム塩溶液、とりわけ塩化カルシウム溶液又は酢酸カルシウム溶液に導入する、とりわけ滴下することによって、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスを製造することを想定する。形成する粒子は、ゲル化し、第四の工程段階x4)において、例えば、流動床型乾燥機中で乾燥させる。
【００５９】
特に好ましい実施形態では、第一の工程段階x1)で準備されたバイオマスを、アルギン酸塩溶液と混合する前に濃縮、つまり煮つめることを想定してもよい。
【００６０】
特に好ましい実施形態では、工程段階x3)において、とりわけ圧縮空気を利用した圧力下での滴下により、つまりブロー法(Abblasverfahren)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物をカルシウム塩溶液に導入することを想定する。好ましいもう1つの実施形態では、工程段階x3)において、静電的方法を利用して、とりわけカルシウム塩溶液及びバイオマス・アルギン酸塩混合物に電圧を印加しながら、バイオマス・アルギン酸塩混合物をカルシウム塩溶液に滴下してもよい。もう1つの実施形態においては、工程段階x3)が、例えば、ピストン（Stempels）を利用して、バイオマス・アルギン酸塩混合物を振動させて、この混合物をカルシウム塩溶液へと意図的に滴下させることにより行われてもよい。場合によっては、高められた圧力、例えば高められた空気圧を使用してもよい。
【００６１】
もう1つの実施形態では、工程段階x3)において、側方ブロー圧を利用して、バイオマス・アルギン酸塩混合物をカルシウム塩溶液に滴下してもよい。好ましいもう1つの実施形態では、工程段階x3)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物を、回転ディスク上に施与し、それにより、カルシウム塩溶液に滴下してもよい。好ましいもう1つの実施形態では、工程段階x3)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物を、回転ノズルを介して、カルシウム塩溶液に滴下してもよい。
【００６２】
好ましいもう1つの実施形態では、工程段階x3)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物を、ジェットカッタ/Jet-Cutter(登録商標)により、カルシウム塩溶液に滴下してもよい。好ましいもう1つの実施形態では、工程段階x3)において、バイオマス・アルギン酸塩混合物を、ベルト乾燥機及び風乾と組み合わせたマルチノズルシステムにより、任意選択で切削工具を使用しながら、カルシウム塩溶液に滴下してもよい。
【００６３】
前記の工程段階、とりわけ前記の、工程段階x3)に基づく固定化技術が、有利に、本発明による好ましい粒径dpの提供をもたらす。
【００６４】
本発明との関連では、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスとは、粒子形態で存在する、つまり粒子の形態で、とりわけ固体粒子の形態で存在するような、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスと理解される。
【００６５】
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスは、好ましい実施形態では、乾燥形態で、100〜1300μm、好ましくは200〜1300μm、好ましくは150〜1200μm、好ましくは150〜1000μm、好ましくは100〜900μm、好ましくは150〜950μm、好ましくは150〜900μm、好ましくは150〜850μm、とりわけ100〜800μm、好ましくは200〜800μm、とりわけ200〜950μm、とりわけ250〜500μm、とりわけ300〜700μm、好ましくは400〜600μm、とりわけ450〜550μm、とりわけ480〜540μm、好ましくは500μmの粒径dpを有する(それぞれ、担体固定化された乾燥スクロースイソメラーゼバイオマスに関して)。
【００６６】
本発明は、とりわけ本発明による方法に関し、ただし、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、400〜600μm、とりわけ100〜400μm、とりわけ100〜300μm、とりわけ200〜300μm、好ましくは250〜300μmの粒径dpを有する。
【００６７】
特に好ましい実施形態では、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、250〜500μmの粒径dpを有する。
【００６８】
特に好ましい実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、380〜570μmの範囲の体積平均値D[4,3]を、とりわけ380〜400μm、450〜490μm、又は530〜580μmの範囲の体積平均値D[4,3]を有する。
【００６９】
好ましいもう1つの実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、360〜540μm、とりわけ360〜380μm、430〜450μm、又は510〜530μmの範囲のD[3,2]値を有する。
【００７０】
好ましいもう1つの実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、0.0100〜0.0180の範囲の、とりわけ0.0100〜0.0118、又は0.0130〜0.0140、又は0.0150〜0.0170m2/gの範囲の比表面積を有する。
【００７１】
特に好ましいもう1つの実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、0.190〜0.210の範囲の均一性を有する。
【００７２】
好ましいもう1つの実施形態では、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、270〜400μmの範囲の、とりわけ270〜290μm、320〜340μm、又は380〜400μmの範囲のd(0.1)値を有する。
【００７３】
好ましいもう1つの実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、370〜550μm、とりわけ370〜390μm、450〜470μm、又は530〜550μmの範囲のd(0.5)値を有する。
【００７４】
好ましいもう1つの実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、510〜760μm、とりわけ510〜530μm、610〜640μm、又は730〜760μmの範囲のd(0.9)値を有する。
【００７５】
本教示において他の記載がない限り、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスの特徴づけに記載される全パラメータ、例えば、比表面積、粒径、体積平均値、又はd(0.1)値、d(0.5)値、d(0.9)値は、乾燥形態で測定された粒子に関する。
【００７６】
特に好ましい一実施形態では、乾燥形態の、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜500、とりわけ100〜450、とりわけ100〜400、とりわけ100〜300、とりわけ200〜300、好ましくは250〜300μmの粒径dpを有する。
【００７７】
本発明との関連では、「d(0.5)値」という用語、又は「粒径d(0.5)」という用語は、質量分布又は体積分布に関する粒子サイズ分布の中央値と理解され、ただし、d(0.5)とは、粒子質量の50%が、それぞれ記載される値よりも小さいということを意味する。
【００７８】
対応して、d(0.1)又はd(0.9)という用語は、粒子質量の10%又は90%が、それぞれ記載される値よりも小さいと理解される。
【００７９】
粒子サイズ分布は、体積粒子サイズ分布である。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、製造された、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスの粒子サイズ分布の測定が、レーザ回折を利用して、とりわけ本教示の例1からの方法に基づいて行われる。
【００８１】
特に好ましい実施形態では、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、球状である。
【００８２】
担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスは、好ましい実施形態では、均等係数<1.2を有する。
【００８３】
均等係数は、次の式に基づいて算出される。
【００８４】
【数１】
2019213533.tif 000002
【００８５】
特に好ましい実施形態では、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスが、少なくとも400ユニット/g乾燥基質（TS：Trockensubstanz des Substrats）、好ましくは少なくとも450ユニット/gTS、好ましくは少なくとも500ユニット/gTS、とりわけ少なくとも600ユニット/gTS、とりわけ少なくとも700ユニット/gTS、好ましくは少なくとも800ユニット/gTSの比活性を有する。
【００８６】
本発明との関連では、本発明の方法とは、とりわけ、イソマルツロース含有組成物を得るための、前記の工程段階a)及びb)に基づく方法と理解され、ただし、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、前記で特徴づけられた、本発明による種類の、とりわけ100〜1300μm、とりわけ150〜1300μm、好ましくは100〜900μm(それぞれ、乾燥形態で測定)の粒径dpを有する。そのような方法の特別な有利な一形態も本発明の方法であり、ただし、本発明による方法の、様々な特別な形態を、それらの組み合わせが技術的に互いに排除し合わない限り、互いに組み合わせることも可能である。
【００８７】
本発明のさらなる有利な形態は、従属請求項から明らかになる。
【００８８】
以下の例及び対応する図により本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００８９】
[実施例1]
Mastersizer 2000(MALVERN社)を用いた、レーザ回折による、固定化生体触媒の粒子サイズ分布の算定(乾燥測定)
【００９０】
[実施]
レーザ回折測定を用いて、本発明により製造された生体触媒(固定化物)の粒子サイズ分布を算出する。サイズ分布の記載には、パラメータd0.1、d0.5、d0.9、及び均一性を示す。
【００９１】
[簡単な説明]
測定原理は、ISO 13320に準拠する、散光/レーザ回折分光法に基づく。散乱粒子を、低濃度において、レーザ光線中に導入する。粒子の導入は、乾燥生体触媒サンプルを測定セルへと吸い込むことによって行う(「乾燥測定」)。粒子の直径に依存して、レーザ光の回折が起こり、それが、散乱放射線として検出器によって捕捉される。測定結果は、まず、検出器で測定された光強度の形態で存在し、粒子サイズ分布に換算されなくてはならない。換算は、ここで与えられている粒子>1μmを対象とした、通常の評価ソフトウェアを用いて、Joseph von Fraunhoferの近似(1814)により行う。
【００９２】
[機器/補助手段]
-  メッシュサイズが1.25mmのDIN ISO 3310-1に準拠する、直径が200mmの分析用篩
-  分析用篩の受け皿(Auffangboden)及び蓋
-  乾燥分散ユニットScirocco 2000 (A)を装備したMalvern Mastersizer 2000(付属の制御・評価ソフトウェア込み)、Malvern Instruments Ltd社
【００９３】
[サンプル準備]
-  すべての考量は、±0.01g(読み取り精度)で行う。
-  篩及び受け皿の空重量(Tara)を算出する
-  受け皿と篩とを組み立てる
-  それぞれの生体触媒バッチの(通常は250mL小瓶中の)生体触媒サンプル全体の重量を算出する
-  サンプルを定量的に篩上に移し、蓋を載せて、手で篩う
-  篩った後に、残渣を含む篩も、通過物を含む受け皿も重さを量る(総計)
-  評価/算出:篩残渣から、生体触媒サンプルの百分率での粗部分を算出する
-  篩残渣を捨て、受け皿中の通過物をオリジナルサンプル瓶に戻す
【００９４】
[Malvern Mastersizer 2000を用いた測定]
[サンプルの配量/供給]
サンプルの配量は、スリット幅が調整可能な振動溝を介して行う。篩の中子として、複数の球を装備した粗い篩を挿入する。
【００９５】
配量(スリット幅)は、生成物に応じて、測定濃度(緑色範囲)が達成されるように調整しなければならない。
【００９６】
[分散媒体]
分散媒体としては、特定圧力の空気を使用する。
【００９７】
測定の実施は、Mastersizer 2000、分散ユニットScirocco 2000(A)を用いて行う。
【００９８】
[実施例2]
A.生体触媒の製造
プロタミノバクター・ルブルム(CBS 574.77)株の継代培養からの細胞を、製糖工場由来の濃厚汁8kg(固形分含有量=65%)、コーンスティープリカー2kg、(NH4)2HPO40.1kg、及び蒸留水89.9kgからなる無菌栄養基質(必要に応じてpH7.2に調整)10mlを用いて洗浄した。この懸濁液を、前記の組成の栄養溶液200mlを含む1リットルフラスコ中の振とう機前培養用の植え付け物として利用する。
【００９９】
29℃で30時間インキュベートした後、それぞれ10個のフラスコ(総内容物量は2リットル)を、30リットル小型発酵槽中の、前記組成物の栄養溶液18リットルに植え付け、29℃において、1分当たり空気20リットルを加えながら、350回転毎分の撹拌速度で発酵させる。
【０１００】
5x109菌/mlを超える菌数に達したら、発酵を止める。遠心分離によって、発酵槽溶液から細胞を収穫し、2%のアルギン酸ナトリウム溶液中に懸濁する。
【０１０１】
回転固定化、ジェットカッタ法、又は振動滴下法を使用して、とりわけ静電的方法、ブロー法、又は振動法を使用して、とりわけ側方ブロー圧、回転ディスク、又は回転ノズルを使用して、懸濁液を、2%塩化カルシウム溶液に滴下し、本発明によると好ましい、とりわけ粒径dpが250〜500μm(乾燥粒子に関して)の、粒径及び粒子サイズ分布を準備する。ベルト乾燥機の使用下にマルチノズルシステムも使用する。
【０１０２】
表1は、模範的に得られた3つの生体触媒調製に関して、得られた特徴的なパラメータを示し、詳細には、粗粒と呼ばれる第一の調製、標準粒と呼ばれる第二の調製、及び微細粒と呼ばれる第三の調製に関してである。
【０１０３】
【表１】
2019213533.tif 000003
【０１０４】
生成した固定化物球を水で洗浄する。この生体触媒は、+4℃において数週間保管可能である。
【０１０５】
B.イソマルツロース含有組成物の製造
Aで得られたような固定化細胞を、調温可能なカラム反応器に充填し、25〜30℃に調温し、TS含有量が35〜45%のスクロース溶液を連続的に貫流させた。その際、流速は、使用されるスクロースの少なくとも97%が転位されるように調整する。
【０１０６】
【表２】
2019213533.tif 000004
【０１０７】
表2は、表1に基づく、異なる粒径の固定化物の、固定床100ml中での触媒活性を示す。
【０１０８】
カラム反応器から流出するイソマルツロース含有組成物のHPLC分析は、以下の組成をもたらした。
【０１０９】
【表３】
2019213533.tif 000005
【０１１０】
表2 (粗粒、標準粒、微細粒)に基づく生成物スペクトル(g/100g固形分での表示)。
【０１１１】
D.イソマルツロース含有組成物の水素化
それぞれ、残りのスクロースを除去した、イソマルツロース含有組成物の調合を、ラネーニッケルで、80℃におき、水素ガスを用いておよそ10MPaの圧力下に連続的に水素化した。ニッケルを分離し、イオン交換により精製すると、中性条件下に水素化されたイソマルツロース含有組成物の調合は、およそ以下の組成物を有した。
【０１１２】
【表４】
2019213533.tif 000006
【０１１３】
[実施例3]
この生体触媒を製造する目的で、シュードモナス・メソアシドフィラMX-45(FERM 11808)株の継代培養からの細胞を、製糖工場由来の濃厚汁8kg(固形分含有量=65%)、コーンスティープリカー2kg、(NH4)2HPO40.1kg、及び蒸留水89.9kgからなる、pH7.2に調整した無菌栄養基質10mlを用いて洗浄した。この懸濁液を、栄養溶液200mlを含む1リットルフラスコ中の振とう機前培養用の植え付け物として利用する。
【０１１４】
29℃で30時間インキュベートした後、それぞれ10個のフラスコ(総内容物量は2リットル)を、30リットル小型発酵槽中の、前記組成物の栄養溶液18リットルに植え付け、29℃において、1分当たり空気20リットルを用いて、350回転毎分の撹拌速度で発酵させた。
【０１１５】
5x109菌/mlを超える菌数に達したら、発酵を止め、遠心分離によって、発酵槽溶液から細胞を収穫し、2%のアルギン酸ナトリウム溶液中に懸濁した。
【０１１６】
回転固定化、ジェットカッタ法、又は振動滴下法を使用して、とりわけ静電的方法、ブロー法、又は振動法を使用して、とりわけ側方ブロー圧、回転ディスク、又は回転ノズルを使用して、懸濁液を、2%塩化カルシウム溶液に滴下し、本発明によると好ましい、とりわけ表1に準拠する粒径dp(乾燥粒子に関して)を有する、粒径及び粒子サイズ分布を準備する。ベルト乾燥機の使用下にマルチノズルシステムも使用する。
【０１１７】
生成した固定化物球を水で洗浄した。この生体触媒は、+4℃において数週間保管可能である。
【０１１８】
イソマルツロース含有組成物を製造するために、このように得られた、シュードモナス・メソアシドフィラMX-45(FERM 11808)の固定化細胞を、調温可能なカラム反応器に充填し、およそ25〜30℃に調温し、TS含有量がおよそ35〜45%のスクロース溶液を連続的に貫流させた。その際、流速は、使用されるスクロースの少なくとも97%が転位されるように調整した。
【０１１９】
カラム反応器から流出するイソマルツロース含有組成物のHPLC分析は、以下の組成をもたらした。
【０１２０】
【表５】
2019213533.tif 000007
【０１２１】
このように製造されたイソマルツロース含有組成物から残りのスクロースを除去し、ラネーニッケルで、およそ80℃におき、水素ガスを用いて8〜12MPaの圧力下に連続的に水素化した。
【０１２２】
ニッケルを分離し、イオン交換により精製すると、中性条件下に水素化されたイソマルツロース含有組成物は、以下の組成物を有した。
【０１２３】
【表６】
2019213533.tif 000008
【０１２４】
水素化オリゴマーと非水素化オリゴマー、及びソルビトールを、クロマトグラフィー分離によって生成物から除去するために、水素化に続いて、ナトリウムイオン又はカリウムイオンを充填した強酸性のカチオン交換樹脂を含むクロマトグラフィー分離カラムを用いて、クロマトグラフィー分離を行った。
【図１】
2019213533.tif 000009
【図２】
2019213533.tif 000010
【図３】
2019213533.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月16日(2019.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、以下の工程段階:
a)スクロース含有基質を、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程と
b)イソマルツロース含有組成物を取得する工程
とを含む方法において、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスが、370〜550μmの範囲のd(0.5)値を有し、担体が、アルギネート担体又はポリビニルアルコール担体であることを特徴とする方法。
【請求項２】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、死亡状態の細胞、又は破砕された細胞、細胞断片、細胞溶解産物、又は細胞抽出物である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
イソマルツロース含有組成物中のイソマルツロースの分率が、少なくとも84重量%である(イソマルツロース含有組成物の固形分に対して)、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、450〜470μmの範囲のd(0.5)値を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが球状である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
スクロースイソメラーゼバイオマス対担体の重量比が、10〜6部のスクロースイソメラーゼバイオマス対6〜2部の担体である(それぞれ乾重量)、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
イソマルツロース含有組成物がトレハルロースを含有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、結合、架橋、又は封入固定化によって、担体固定化されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、スクロースイソメラーゼ、スクロースイソメラーゼ活性を有する微生物細胞、又はスクロースイソメラーゼ活性を有する細胞抽出物である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、ラオウルテラ(Raoultella)属、ペクトバクテリウム(Pectobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、パントエア(Pantoea)属、ロイカネア(Leucanea)属、プロタミノバクター(Protaminobacter)属、又はバチルス(Bacillus sp.)属種の微生物に由来する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、プロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum)、クレブシエラ属種、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、エンテロバクター属種、エルウィニア・タスマニエンシス(Erwinia tasmaniensis)、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carovotum)、アゾトバクター・ビネランディ(Azotobacter vinelandii)、ロイカネア・ロイコセファリア(Leucanea leucocephalia)、エルウィニア・ラポンティシ(Erwinia rhapontici)、ラオウルテラ・プランティコーラ(Raoultella planticola)、シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)、ロイコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、パントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、又はアグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)に由来する、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、プロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum)に由来する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、クレブシエラ属種LX3株又はNK33-98-8株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)342株、エンテロバクター属種SZ62株又はFMB1株、エルウィニア・タスマニエンシス(Erwinia tasmaniensis)Et1/99株、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)SCRI 1043株、又はペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carovotum)亜種ブラシリエンシス(brasiliensis)に由来する、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
スクロースイソメラーゼバイオマスが、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carovotum)亜種ブラシリエンシス(brasiliensis)PBR 1692株に由来する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
工程段階a)及びb)が、固定床又は撹拌槽反応器中で行われる、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程段階a)及びb)が、固定床で行われる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1から16のいずれか一項に記載の方法、続いて、得られたイソマルツロース含有組成物の接触水素化を行い、糖アルコール含有組成物が得られる、糖アルコール含有組成物を製造するための方法。
【請求項１８】
糖アルコール含有組成物がイソマルト又はイソマルト変種である、請求項17に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
水素化オリゴマーと非水素化オリゴマー、及びソルビトールを、クロマトグラフィー分離によって生成物から除去するために、水素化に続いて、ナトリウムイオン又はカリウムイオンを充填した強酸性のカチオン交換樹脂を含むクロマトグラフィー分離カラムを用いて、クロマトグラフィー分離を行った。
本発明の実施形態として例えば以下を挙げることができる。
［実施形態１］
スクロース含有基質からイソマルツロース含有組成物を製造するための、以下の工程段階:
a)スクロース含有基質を、担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスと接触させる工程と
b)イソマルツロース含有組成物を取得する工程
とを含む方法において、担体固定化されたスクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜900μmの粒径dpを有することを特徴とする方法。
［実施形態２］
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが、100〜400μmの粒径dpを有する、実施形態1に記載の方法。
［実施形態３］
担体固定化された粒子状スクロースイソメラーゼバイオマスが球状である、実施形態1又は2に記載の方法。
［実施形態４］
スクロースイソメラーゼバイオマス対担体の重量比が、10〜6部のスクロースイソメラーゼバイオマス対6〜2部の担体である(それぞれ乾重量)、実施形態1から3のいずれかに記載の方法。
［実施形態５］
イソマルツロース含有組成物がトレハルロースを含有する、実施形態1から4のいずれかに記載の方法。
［実施形態６］
スクロースイソメラーゼバイオマスが、結合、架橋、又は封入固定化によって、担体固定化されている、実施形態1から5のいずれかに記載の方法。
［実施形態７］
担体が、アルギネート担体又はポリビニルアルコール担体である、実施形態1から6のいずれかに記載の方法。
［実施形態８］
スクロースイソメラーゼバイオマスが、スクロースイソメラーゼ、スクロースイソメラーゼ活性を有する微生物細胞、又はスクロースイソメラーゼ活性を有する細胞抽出物である、実施形態1から7のいずれかに記載の方法。
［実施形態９］
スクロースイソメラーゼバイオマスが、大腸菌(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、ラオウルテラ(Raoultella)属、ペクトバクテリウム(Pectobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、アゾトバクター(Azotobacter)属、パントエア(Pantoea)属、ロイカネア(Leucanea)属、プロタミノバクター(Protaminobacter)属、又はバチルス(Bacillus sp.)属種の微生物に由来する、実施形態1から8のいずれかに記載の方法。
［実施形態１０］
スクロースイソメラーゼバイオマスが、プロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum)、クレブシエラ属種、特にLX3株又はNK33-98-8株、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、特に342株、エンテロバクター属種、特にSZ62株又はFMB1株、エルウィニア・タスマニエンシス(Erwinia tasmaniensis)、特にEt1/99株、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム(Pectobacterium atrosepticum)、特にSCRI 1043株、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carovotum)、特に亜種ブラシリエンシス(brasiliensis)、特にPBR 1692株、アゾトバクター・ビネランディ(Azotobacter vinelandii)、ロイカネア・ロイコセファリア(Leucanea leucocephalia)、エルウィニア・ラポンティシ(Erwinia rhapontici)、ラオウルテラ・プランティコーラ(Raoultella planticola)、シュードモナス・メソアシドフィラ(Pseudomonas mesoacidophila)、ロイコノストク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、パントエア・ディスパーサ(Pantoea dispersa)、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthica)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、又はアグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)に由来する、実施形態1から9のいずれかに記載の方法。
［実施形態１１］
工程段階a)及びb)が、固定床又は撹拌槽反応器中で行われる、実施形態1から10のいずれかに記載の方法。
［実施形態１２］
得られたイソマルツロース含有組成物が接触水素化される、実施形態1から11のいずれかに記載の方法。
［実施形態１３］
実施形態1から12のいずれかに記載の方法、続いて、得られたイソマルツロース含有組成物の接触水素化を行い、糖アルコール含有組成物が得られる、糖アルコール含有組成物を製造するための方法。
［実施形態１４］
糖アルコール含有組成物がイソマルト又はイソマルト変種である、実施形態13に記載の方法。
【外国語明細書】
2019213533000001.pdf