(57)【要約】【課題】新たなデジタルＰＣＲの解析方法を提供すること。【解決手段】蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の画分に分割する工程と、前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、前記温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する工程と、を含む、ＤＮＡ検出方法とする。【選択図】図８
2019213513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の画分に分割する工程と、
前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、
温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、
前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、
前記温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する工程と、
を含む、ＤＮＡ検出方法。
【請求項２】
算出した前記蛍光強度の比が所定の閾値以下の画分を、前記検出対象のＤＮＡを含まない画分と特定する工程をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項３】
算出した前記蛍光強度の比が所定の範囲内にある画分を、前記検出対象のＤＮＡを含む画分と特定する工程をさらに含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ溶液が蛍光標識プローブを含み、
前記融解温度が、前記蛍光標識プローブと前記検出対象のＤＮＡとの間で形成される二重鎖の融解温度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有する、請求項４に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡ溶液がＤＮＡインターカレーターを含み、
前記融解温度が、前記検出対象のＤＮＡの二重鎖の融解温度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
前記複数の画分が平面配置されていることを特徴とする、請求項１〜６に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ溶液を、ドロップレットまたはウェルによって前記複数の画分に分割する、請求項１〜７に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
ＤＮＡ溶液中の検出対象のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、
前記ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、
前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、
前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度融解温度を算出し、前期ＤＮＡ溶液の第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、
を備えることを特徴とする、ＤＮＡ検出装置。
【請求項１０】
前記検出対象のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えることを特徴とする、請求項９に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１１】
前記検出結果を表示するモニターをさらに備えることを特徴とする、請求項９または１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１２】
ＤＮＡ検出装置に、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法を行わせるた
めのプログラム。
【請求項１３】
前記検出装置は、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の検出装置である、請求項１２に記載のプログラム。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のプログラムを格納する記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルＰＣＲの測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
デジタルＰＣＲ（特許文献１）は、ＰＣＲ（特許文献２−４）やリアルタイムＰＣＲ（非特許文献１）などの従来の遺伝子検査において、対象遺伝子が微量なときに測定再現性が低下するという課題を解決する方法として開発された。デジタルＰＣＲを用いると、限界希釈したサンプルを用いてＤＮＡを０（無し）か１（有り）で検出することで微量なＤＮＡを定量できる。
【０００３】
デジタルＰＣＲの検出方法の一例を以下に示す。まず、限界希釈した検体に、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、オイル中にＰＣＲ反応液のドロップレットを作製する。作製したドロップレットは、１分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかである。次に、ドロップレット内の対象遺伝子を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ後に各ドロップレットの蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつドロップレットの数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量することができる。このようなデジタルＰＣＲは、限界希釈した検体を用いるため、ＰＣＲの阻害要因となる検体由来成分の影響を抑えることができる。また、検量線を必要としないため、絶対量を直接測定できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１３−５２１７６４
【特許文献２】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献３】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献４】米国特許第４８００１５９号
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０，ｐｐ９８６−９９４，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
通常のＰＣＲでは、反応液中の反応阻害物の存在、テンプレートＤＮＡの二次構造の形成、プライマーの設計不十分などの理由により、反応効率が低下することが知られている。一方、デジタルＰＣＲでは、エンドポイントで測定するため、ＰＣＲの反応効率が測定結果に大きく影響しないとされてきた。しかし実際には、エンドポイントで測定しても各ドロップレットのＰＣＲ反応効率の不均一性による蛍光強度ばらつきが大きく、デジタルＰＣＲの測定再現性および測定精度を低下させていた。
【０００６】
そこで、本発明者らは、デジタルＰＣＲの測定再現性および測定精度の向上のため、各ドロップレットのＰＣＲ反応効率が不均一でも、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって、ドロップレット内の対象遺伝子の判別ができる技術を開発した。具体的には、例えば、ＰＣＲ後のドロップレットを平面配置し、ドロップレット内で増幅した対象遺伝子と蛍光標識プローブの融解温度（Ｔｍ）を測定することで、ＰＣＲの反応効率が不均一でも融解温度の違いによって対象遺伝子の遺伝子型を同定できるようになった。
【０００７】
一方、デジタルＰＣＲでは９割のドロップレットが対象遺伝子を含まない空のドロップレットとなるため、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを測定装置により見分け、
解析対象データから除去することは、測定再現性および測定精度を向上させる上で重要である。しかし、対象遺伝子を含まない空のドロップレットは蛍光標識プローブがハイブリダイゼーションする相手がいないため、融解温度による判別ができない。一方で、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを従来のデジタルＰＣＲのように蛍光強度で判別するのも、次のような理由から難しいことがわかってきた。まず、融解曲線分析を行うために用いているモレキュラービーコンという蛍光標識プローブは、従来のデジタルＰＣＲで用いられていたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのようにＰＣＲ中に自身が分解されて増感するような構造をもたないため、対象遺伝子を含み、ポジティブなドロップレットであっても、ＰＣＲ後の蛍光強度が小さい。次に、各ドロップレットを広く平面配置して蛍光強度を測定するため、光照射時および蛍光取り込み時に面内ばらつきが生じる。これらのことから、ドロップレット内で対象遺伝子が増幅したドロップレットの蛍光強度が小さくなり、ドロップレット全体の蛍光強度ばらつきが大きくなった結果、シグナル（Ｓ）／ノイズ（Ｎ）比が低くなり、対象遺伝子を含まない空のドロップレットと対象遺伝子を含むドロップレットを蛍光強度で判別する精度が低くなる場合があった。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを測定装置により見分け、解析対象データから除去する新たなデジタルＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、対象遺伝子を含まない空のドロップレットは温度上昇に伴う蛍光強度変化が小さく、対象遺伝子を含むドロップレットは温度上昇に伴う蛍光強度変化が大きいことから、低温時と高温時の蛍光強度比を測定することによって、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを精度よく見分けられることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明の一実施態様は、蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の画分に分割する工程と、前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、前記温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する工程と、を含む、ＤＮＡ検出方法である。このＤＮＡ検出方法は、算出した前記蛍光強度の比が所定の閾値以下の画分を、前記検出対象のＤＮＡを含まない画分と特定する工程をさらに含んでもよい。また、算出した前記蛍光強度の比が所定の範囲内にある画分を、前記検出対象のＤＮＡを含む画分と特定する工程をさらに含んでもよい。
【００１１】
上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡ溶液が蛍光標識プローブを含み、前記融解温度が、前記蛍光標識プローブと前記検出対象のＤＮＡとの間で形成される二重鎖の融解温度であってもよい。ここで、前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有してもよい。あるいは、前記ＤＮＡ溶液がＤＮＡインターカレーターを含み、前記融解温度が、前記検出対象のＤＮＡの二重鎖の融解温度であってもよい。
【００１２】
上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、前記複数の画分が平面配置されていてもよい。また、前記ＤＮＡ溶液を、ドロップレットまたはウェルによって前記複数の画分に分割してもよい。
【００１３】
本発明の他の実施態様は、ＤＮＡ溶液中の検出対象のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、前記ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、前期ＤＮＡ溶液の第１の温度の蛍
光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、を備える、ＤＮＡ検出装置である。このＤＮＡ検出装置は、前記検出対象のＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。また、前記検出結果を表示するモニターをさらに備えてもよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのＤＮＡ検出装置などのＤＮＡ検出装置に、上記いずれかのＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様は、上記プログラムを格納する記録媒体である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを精度よく特定でき、測定再現性および測定精度の高い、新たなデジタルＰＣＲの解析方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施態様における融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅産物に対し、温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を用いて行うＤＮＡ検出方法の基本概念を示す図である。
【図２】本発明の一実施態様における融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行うＤＮＡ検出方法の基本概念を示す図である。
【図３】本発明の一実施態様における、ドロップレットまたはウェルが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の模式図である。
【図４】本発明の一実施態様における、（Ａ）ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例、（Ｂ）ＰＣＲ増幅産物に対し、温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例、を示す図である。
【図５】本発明の一実施態様における、温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を用いて行うＤＮＡ検出方法において、ＤＮＡインターカレーターを用いてＤＮＡの融解温度を測定する方法を示す模式図である。
【図６】本発明の一実施態様における、温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を用いて行うＤＮＡ検出方法において、蛍光標識プローブを用いてＤＮＡの融解温度を測定する方法を示す模式図である。
【図７】本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジを示す模式図である。
【図８】図７の装置とカートリッジを用いた測定で融解温度測定を行う方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図９】モニターに表示される測定結果の一例である。
【図１０】モニターに表示される測定結果の一例である。
【図１１】本発明の一実施例において、蛍光標識プローブを用いてウェル内対象遺伝子の有無を判別する結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を
示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１９】
（１）ＤＮＡ検出方法の原理及び効果
本発明に係るＤＮＡ検出方法は、蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の画分に分割する工程と、前記画分の中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、前記温度変化に伴う前記蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、を含む。
【００２０】
ここで、図１に、前記温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出することによって、ＤＮＡを検出する方法の代表的な実施態様において想定される測定結果の例を示した。また、図２に、ＤＮＡ検出をＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行う場合の融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲの測定結果の例を示した。
【００２１】
融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲでは、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度が遺伝子型によって異なることを利用し、遺伝子型の判別を行う。図２の例は、対象遺伝子の野生型と変異型のそれぞれに対応した蛍光標識プローブを用いて、ドロップレット内のＤＮＡの融解温度を測定した結果を模式的に示した図である。ここで、蛍光標識プローブは、例えばモレキュラービーコンを用いることができ、以下モレキュラービーコンを例として、ＤＮＡ検出方法を詳細に説明する。モレキュラービーコンは、検出対象遺伝子を増幅させるＰＣＲに用いられるプライマーペアの間にある配列に相補的であって、両端に相補的な配列を有し、末端にはそれぞれ蛍光色素と消光色素（クエンチャー）が設けられているオリゴヌクレオチドである。モレキュラービーコンは、検出対象遺伝子とハイブリダイズすると、両末端にある蛍光色素と消光色素が離れて蛍光を発するが、温度上昇に伴って検出対象遺伝子から解離すると、両端の相補的な配列がハイブリダイズしてステムループ構造を形成し、蛍光色素と消光色素が近づいて蛍光色素が消光する。検出対象遺伝子の野生型アレルを含むドロップレット２０１では、検出対象遺伝子の野生型アレルに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発し、野生型アレルの蛍光標識プローブに対応した融解温度が観察される。また、検出対象遺伝子の変異型アレルを含むドロップレット２０２では、検出対象遺伝子の変異型アレルに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発し、変異型アレルの蛍光標識プローブに対応した融解温度が観察される。検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０３は、蛍光が検出されない。こうして、蛍光の有無及び蛍光の種類で、野生型アレルを有する検出対象遺伝子の有無及び変異型アレルを有する検出対象遺伝子の有無を判断できる。
【００２２】
しかしながら、ドロップレット内のＰＣＲの反応効率はドロップレットごとに均一でないこと、蛍光測定時の測定ばらつきが大きいことなどにより、検出対象遺伝子が含まれるドロップレット２０１、２０２からの蛍光強度と、検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０３からの蛍光強度に差がない場合が生じる。そこで、ドロップレット内のＤＮＡに対し、温度変化に伴う蛍光強度変化を測定し、融解曲線分析を行い、融解温度（Ｔｍ）を比較することにより、より高精度な遺伝子検出が可能になる。例えば、検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０３の場合、温度変化に伴う蛍光強度変化がないため融解温度は定まらず、不安定な値が生じる。一方、野生型アレルに対応した蛍光標識プローブと変異型アレルに対応した蛍光標識プローブについて、それぞれ異なる波長の蛍光を放出する蛍光色素を用いれば、検出された蛍光色により、野生型アレルを有する遺伝子が存在するのか、変異型アレルを有する遺伝子が存在するのかを決めることができる
。あるいは、両方同じ蛍光色素を用いた場合であっても、各蛍光標識プローブの検出対象遺伝子に対する融解温度（Ｔｍ）が異なるように、蛍光標識プローブの配列を決めておき、融解曲線分析を行って、Ｔｍを計算することによって、野生型アレルと変異型アレルのどちらが増幅したかを決定することが可能になる。
【００２３】
このように、デジタルＰＣＲでは、実験者が蛍光強度や融解温度の閾値を設定し、対象遺伝子を含まない空のドロップレットをデータから排除したり、変異の種類ごとにドロップレットの数をカウントしたりすることができる。しかしながら、検出対象遺伝子の野生型アレルを含むドロップレット２０１と検出対象遺伝子の変異型アレルを含むドロップレット２０２の蛍光強度はばらつきが大きく、蛍光強度分布が広くなる一方、検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０３の蛍光は弱いので、計算された融解温度のばらつきが大きくなってしまう場合がある。その時、図２に示すように、検出対象遺伝子が含まれるドロップレット２０１、２０２のグラフ上での分布と、検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット２０３のグラフ上での分布が重なってしまい、その部分で、遺伝子の有無が判定できなくなって、測定精度が低下する要因となる。特に、デジタルＰＣＲでは、１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を限界希釈してドロップレットを作製するため、作製されたドロップレットの５―９割は対象遺伝子を含まない空のドロップレット２０３となり、これらの空のドロップレットと対象遺伝子を含むドロップレット２０１と２０２の分布が重なっていると、高度に正確な定量が難しくなる場合がある。
【００２４】
そこで、低温時と高温時において蛍光標識プローブとＤＮＡとのハイブリダイズによる蛍光強度を測定し、その蛍光強度比を算出すると、図１に示すように、横軸を低温時と高温時の蛍光強度比、縦軸を蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度として計測結果をプロットすることができるようになり、検出対象遺伝子が含まれない空のドロップレット１０１、検出対象遺伝子の野生型アレルを含むドロップレット１０２、検出対象遺伝子の変異型アレルを含むドロップレット１０３を分離することができるようになる。その結果、対象遺伝子を含まない空のドロップレットやＰＣＲの反応効率が不十分なドロップレットを確実に識別することができ、測定再現性および測定精度を向上させることができる。
【００２５】
（２）ＤＮＡ検出装置の主要な構成
本発明のＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡ溶液中の検出対象のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度融解温度を算出し、ＤＮＡ溶液の第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を算出する計算部と、を備える。
【００２６】
ＤＮＡ溶液は、どのような担体にあってもよく、例えば、オイル中のドロップレットであってもよく、プレートなどのウェル内の溶液であってもよい。図３に、ＤＮＡ検出装置の一例として、ドロップレットまたはウェル中のＤＮＡ溶液が含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部を有するＤＮＡ検出装置を示すが、本発明のＤＮＡ検出装置はこれに限定されない。
【００２７】
図３Ａに示す蛍光測定部の例では、マイクロ流路を用いてドロップレットの蛍光強度を測定する。ドロップレット３０１がマイクロ流路３０３中を矢印の方向に流れている。ドロップレット３０２の位置までドロップレットが流れると、加温部（図示せず）によってドロップレットが加温されつつ、光源３０４により励起光がドロップレットに照射される。光源３０４によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光を蛍光フィルター３０５を通してフォトマルチプルメーター３０６で検出する。検出された蛍光デ
ータは、計算部（図示せず）に送られ、そこで蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度が算出される。光源３０４、蛍光フィルター３０５、フォトマルチプルメーター３０６で構成される蛍光検出器は、蛍光色素の色ごとに別々に設けてもよいし、図３Ａに示すように１つの光源の励起光で励起して２つの蛍光フィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する構成にしてもよい。
【００２８】
また、図３ＢおよびＣのようにドロップレットを平面配置し、ドロップレットの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ドロップレット３１１をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置し、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でドロップレット検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うドロップレットの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置したドロップレット３１１に照射する。励起光によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の融解温度が算出される。図３Ａでは、ドロップレットを一つずつ処理する必要があるが、多数のドロップレットを一度に処理できるという点で、図３ＢおよびＣの装置が好ましい。また、図３ＢおよびＣの装置では、温調装置３１２をＤＮＡの増幅反応にも用いることができる点でも、図３Ａより好適である。
【００２９】
さらに、図３Ｄのようにドロップレットの代わりにアレイ状に並んだウェルを用いて、１ウェルに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を添加し、ウェル内でＰＣＲを行ってウェルの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ウェル方式検出用カートリッジ３１３に設けられたウェルに検体を含む反応液を添加後、ウェル内でＰＣＲを行い、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でウェル方式検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うウェルの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をウェル方式検出用カートリッジ３１３に平面配置したウェルに照射する。励起光によりウェル内の反応液に含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の融解温度が算出される。図３Ｄのようにウェルを用いた場合、ドロップレットをドロップレット検出用カートリッジに平面配置する工程なしに、ウェル方式検出用カートリッジ内でＰＣＲから融解曲線分析まで行える。
【００３０】
（３）融解曲線分析方法
図４Ａは、図２で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いた場合で、検出した蛍光強度が重なり、検体溶液内の対象遺伝子の有無を判定できない場合がある測定結果の一例を示す模式図である。一方、図４Ｂは図１で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物に対し、温度変化に伴う第１の温度の蛍光強度に対する、第１の温度より低い第２の温度の蛍光強度の比を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例で、検体溶液内の対象遺伝子の有無をより精度高く判定できた測定結果の一例を示す模式図である。図５および図６は、図４で検出対象遺伝子の有無を判定できなかった検体溶液に対し、溶液内で増幅したＤＮＡの融解曲線分析を行った結果の一例を示す模式図である。
【００３１】
図４Ａに示すように、融解温度と低温時の蛍光強度により検体溶液内の検出対象遺伝子の遺伝子型判別を行うと、測定結果が検体溶液ａ４０４または検体溶液ｂ４０５の位置にプロットされれば、融解温度の値から溶液ａ４０４が検出対象遺伝子の野生型遺伝子を含
み、検体溶液ｂ４０５が検出対象遺伝子の変異型遺伝子を含むと分かる。しかし、検体溶液ｃ４０６や検体溶液ｄ４０７の位置に蛍光強度が観察されると、それらの検体溶液が検出対象遺伝子を含むかどうかは測定結果から判断することができない。
【００３２】
そこで、ＤＮＡインターカレーターを用いて検体溶液内で増幅したＤＮＡの融解温度を測定する際に、低温時と高温時の蛍光強度比も算出することによって、図４ａで判別できなかった対象遺伝子の有無を判別することができるようになる。具体的な方法は、まず、ＤＮＡインターカレーター５０２をＰＣＲ反応液に添加して検体溶液を作製し、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うと、室温程度の温度では検体溶液内で増幅した２本鎖ＤＮＡ５０１にＤＮＡインターカレーター５０２が結合し、強い蛍光を発する。その後、検体溶液の温度が上昇するにつれ、検体溶液内の２本鎖ＤＮＡ５０１が解離して１本鎖ＤＮＡ５０１となり、ＤＮＡインターカレーター５０２が結合しなくなるため、蛍光強度が減少する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図５に示す。なお、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
【００３３】
図５では、検体溶液ａ４０４の測定結果が図５Ｃ、検体溶液ｂ４０５の測定結果が図５Ａ、検体溶液ｃ４０６の測定結果が図５Ｂ、検体溶液ｄ４０７の測定結果が図５Ｄに示されている。さらに、図５Ａ〜Ｄの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図５Ｅ〜Ｈのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これがＤＮＡ二重鎖の融解温度として算出できる。図４Ａでは、検体溶液ｃ４０６と検体溶液ｄ４０７は検体溶液が対象遺伝子を含むのかどうか測定結果から判断することができなかったが、温度変化に伴う蛍光強度変化が図５Ｂは大きく、図５Ｄは小さいため、図４Ｂのように低温時と高温時の蛍光強度比を横軸に、融解温度を縦軸にプロットすると検体溶液ｃ４０６は対象遺伝子の野生型を含み、検体溶液ｄ４０７は対象遺伝子を含まない空の溶液だと判断できる。
【００３４】
なお、対象遺伝子の融解温度は、プライマーの設計を変えることでＰＣＲ増幅産物の配列や配列の鎖長に依存して制御することができる。
【００３５】
ここで用いるＤＮＡインターカレーターは、２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、２本鎖ＤＮＡの検出に用いることのできるインターカレーターであれば適用できる。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩやＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標）  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ  Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ  Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ（登録商標）−１、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＪＯＪＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＹＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＴＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＪＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＰＯ−Ｐｒｏ−３、ＹＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−５、エチジウムブロマイドなどが適用可能である。ＤＮＡインターカレーターが熱耐性である場合、ＰＣＲ反応を行う前からドロップレットに添加しておくことができる。
【００３６】
図６に示すように、本方法で、ＤＮＡインターカレーターの代わりとして、蛍光標識プローブを用いることもできる。蛍光標識プローブは、両端またはその近傍に蛍光色素とそのクエンチャーを有し、両端周辺の配列が相補的になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する一方、ループ部分の配列が検出対象遺伝子と相補的になっており、検出対象遺伝子にハイブリダイズできるような構造を有するように設計する。蛍光標識プローブ６０２は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が近接しているため、蛍光は発しない。蛍光標識プローブ６０２をＰＣＲ反応が終了した検体溶液に添加すると、室温程度の温度では検体溶液
に内で増幅したＤＮＡ６０１に蛍光標識プローブ６０２のループ部分がアニールし、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が離れるため、蛍光標識プローブ６０２は強い蛍光を発する。その後、検体溶液を加熱すると、ＤＮＡ６０１と蛍光標識プローブ６０２が解離し、蛍光標識プローブ６０２内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ６０２からの蛍光強度が低下する。さらに検体溶液を加熱すると、蛍光標識プローブ６０２のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図６に示す。なお、この蛍光標識プローブは、ＰＣＲのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、ＰＣＲのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
【００３７】
図６では、検体溶液ａ４０４の測定結果が図６Ｃ、検体溶液ｂ４０５の測定結果が図６Ａ、検体溶液ｃ４０６の測定結果が図６Ｂ、検体溶液ｄ４０７の測定結果が図６Ｄのようになる。さらに、図６Ａ〜Ｄの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図６Ｅ〜Ｈのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これが検出対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度となる。図４Ａでは、検体溶液ｃ４０６と検体溶液ｄ４０７は検体溶液が検出対象遺伝子を含むのかどうか測定結果から判断することができなかったが、温度変化に伴う蛍光強度変化が図６Ｂは大きく、図６Ｄは小さいため、図４Ｂのように低温時と高温時の蛍光強度比を横軸に、融解温度を縦軸にプロットすると検体溶液ｃ４０６は検出対象遺伝子の野生型を含み、検体溶液ｄ４０７は検出対象遺伝子を含まない空の検体溶液だと判断できる。
【００３８】
なお、検出対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの融解温度は、プローブの配列や鎖長を変えることで制御することができる。また、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）のような人工ＤＮＡを利用することで、融解温度を制御することができる。
【００３９】
ここで用いる蛍光標識プローブ６０２の蛍光色素６０３とクエンチャー６０４の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されず、蛍光色素６０３がＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー６０４がＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが例示できる。
【００４０】
蛍光標識プローブ６０２が認識する配列は、検出対象遺伝子と同じ遺伝子上にあっても、異なる遺伝子上にあってもよく、検出対象の遺伝子と１塩基だけ異なる配列を有する遺伝子、例えば同じ遺伝子の野生型と変異型であってもよい。一例として、肺がんの遺伝子検査を行う場合であれば、分子標的薬の効果を予測するため、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を判定する。その時、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の各々を認識する配列であってもよいし、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異型とその野生型を認識する配列であってもよい。
【００４１】
（４）ＤＮＡ検出装置の他の構成
本発明の一実施態様にかかるＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部、及び／又はドロップレットに対してＤＮＡを増幅するための増幅部を含んでもよい。
【００４２】
図７は、本発明の方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジの一例を示す図である。図７Ａに示すように、デジタルＰＣＲ測定装置７２１はドロップレット作製部７０１、増幅部としてのサーマルサイクラー７０２、ドロップレット検出部７０３、モニター７０４、制御部７２４から構成される。ドロップレット作製部７０１は、図７Ｂに示
すドロップレット作製用カートリッジ７０５をセットして用いる。ドロップレット作製用カートリッジ７０５は、オイル供給口７１５、ＰＣＲ反応液導入口７１６、ドロップレット排出口７１７をもつ。ドロップレット検出部７０３は、図７Ｃに示すドロップレット検出用カートリッジ７０７を温調装置７２２の上にセットして用いる。ドロップレット検出用カートリッジ７０７は、オイル供給口７１８、ドロップレット導入口７１９、液溜７２３、廃液排出口７２０をもつ。ドロップレット作製用カートリッジのオイル供給口７１５はデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０９によってオイル７１３が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのＰＣＲ反応液導入口７１６はデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７０８によって窒素ガスや空気などのガスまたはオイル７１２が供給される。ドロップレット作製用カートリッジのドロップレット排出口７１７はデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のオイル供給口７１８はデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１０によってオイル７１３が供給される。ドロップレット検出用カートリッジ７０７のドロップレット導入口７１９はデジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー７０２にセットしたマイクロチューブ７０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ７０７の廃液排出口７２０は、デジタルＰＣＲ測定装置７２１と流体的に接続され、ポンプ７１１によって廃液溜め７１４にドロップレット検出用カートリッジ７０７内の廃液が排出される。ポンプは、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。モニター７０４は、測定結果やメッセージを表示するための表示部であり、ユーザーが操作を入力する入力部でもある。
【００４３】
本発明の他の実施態様にかかるＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をチップにアレイ上に並んだウェルに塗布するためのチップ作製部、及び／又はウェル内でＤＮＡを増幅するための増幅部を含んでもよい。
【００４４】
（５）融解温度測定方法
図７の装置とカートリッジ、及びＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコンを用いて融解温度測定を行う方法の一例を、図８のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、ＤＮＡを含む生体試料由来の検体溶液を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコン、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ８０１）。このＰＣＲ反応液をドロップレット作製用カートリッジ７０５のＰＣＲ反応液導入口７１６に添加する（Ｓ８０２）。ドロップレット作製用カートリッジ７０５をデジタルＰＣＲ測定装置７２１のドロップレット作製部７０１にセットする。オイル供給口７１５からオイル７１３を、ＰＣＲ反応液導入口７１６からオイル７１２を添加する（Ｓ８０３）と、ドロップレット作製用カートリッジ７０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口７１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ７０６に移動し、チューブ内に貯蔵される（Ｓ８０４）。所定数のドロップレットが得られたところで、マイクロチューブ７０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ８０５）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、ＤＮＡが増幅するとともに、ＤＮＡインターカレーターの場合は増幅したＤＮＡにインターカレートし、モレキュラービーコンの場合は増幅したＤＮＡにハイブリダイズすることによって、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、温度を室温へと下げると合成したＤＮＡは２本鎖を形成する。ＰＣＲ後、ドロップレット検出部７０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口７１９からドロップレットを、オイル供給口７１８からオイル７１３を添加する（Ｓ８０６）。ドロップレット検出部７０３にお
いて、ドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３に溜めたドロップレットの蛍光標識プローブの蛍光強度を測定する（Ｓ８０７）。温調装置７２２によりドロップレット検出用カートリッジの液溜７２３を５０℃から８５℃まで昇温し、ＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコンからの蛍光強度を測定する（Ｓ８０８）。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで、昇温による蛍光強度変化が温度変化で微分され、蛍光強度変化の変極点が融解温度として算出される（Ｓ８０９）。４０℃と９５℃における蛍光強度の比が閾値以下のドロップレットを空と判定する（Ｓ８１０）。蛍光標識プローブの蛍光強度が閾値以上および融解温度が所定の範囲内のドロップレットをカウントする（Ｓ８１１）。対象遺伝子を含むドロップレットの数と空のドロップレットの数をモニターに表示する（Ｓ８１２）。なお、所定の蛍光強度の閾値および融解温度の所定の範囲はあらかじめ、パイロット実験などで作業者が決めておくことができる。
【００４５】
用いる検体溶液は特に限定されないが、検出対象のＤＮＡを含む試料であればよく、動植物の体液や組織、細胞、排泄物などの生体試料や、土壌サンプルなど真菌や細菌などが含まれる試料が例示できる。体液としては血液、唾液、髄液などが例示でき、血液中には存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）や血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が含まれる。組織としては、外科手術や生検法によって得られた疾患の患部（例えば、乳房や肝臓などのがん組織）が例示できる。すでに固定された組織でもよく、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（ＦＦＰＥ）でもよい。細胞としては、生検法によって採取した患部またはその付近の細胞や、血液中を循環する血中循環腫瘍細胞などが例示できる。これらの検体の前処理は特に限定されず、生体や環境などから採取後、懸濁液に添加してホモジネートしたり、あるいは溶解液で溶解させたりしたものをそのまま用いてもよいが、それらに含まれる核酸を抽出したり、精製したものを用いることが好ましい。
【００４６】
オイルはドロップレットを構成するＰＣＲ反応液に不溶性もしくは難溶性である化学的に不活性な物質であり、また、ＰＣＲのような高温での温度変化に対して安定である物質が好ましく、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイルなどが使用可能である。フッ素系オイルとしては、例えばＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎやＨｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｒなどが挙げられる。フッ素系オイルは、炭素鎖が長いほうが揮発性が低いので好ましい。また、フッ素系オイルは比重が１．７超であり、ＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重１に比べて重いため、作製したドロップレットはオイルに浮く。シリコーン系オイルとしては、例えばＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅやＴｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙｓｉｌｉｃａｔｅなどが挙げられる。シリコーン系オイルはフッ素系オイルと異なり、比重が０．９８程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重に近く、作製したドロップレットはオイル中に均一に分散する。炭化水素系オイルとしては、例えばミネラルオイルや流動パラフィン、ヘキサデカンなどが挙げられる。炭化水素系オイルは比重が０．８４程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重よりも軽いため、作製したドロップレットはオイルに沈む。
【００４７】
このオイルは、界面活性剤を添加して用いてもよい。ここで界面活性剤の種類は特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などが適用可能である。
【００４８】
（６）結果の表示
図９および図１０は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図９に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の数が表示されてもよいし、図１０に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図９や図１０のような検体溶液の数や割合だけでなく、図１のような低温時と高温時の蛍光強度比、融解温度の２軸で検体溶液の計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、
蛍光標識プローブの蛍光強度または融解温度に対する検体溶液の数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度や蛍光強度比の閾値および／または融解温度の範囲の設定を変えて、蛍光強度の閾値内及び融解温度の範囲内にある検体溶液の数を再度カウントすることもできる。
【００４９】
なお、上述したように、検体溶液はドロップレットやウェル中の溶液として扱われるので、検体溶液数の代わりに、ドロップレット数やウェル数。として表されてもよい。
【００５０】
（７）プログラム
本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。
【００５１】
また、このプログラムを格納する記録媒体も、本発明の実施形態の一つである。
【実施例】
【００５２】
本実施例では、蛍光標識プローブを用いて、ウェル内のＤＮＡの融解温度を測定した結果を示す。
【００５３】
まず、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型およびＧ１２Ｄ変異型のゲノムＤＮＡ（最終濃度６７分子／μＬ）を用意し、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、フォワードプライマー（最終濃度０．２５μＭ）、リバースプライマー（最終濃度０．５μＭ），野生型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、Ｇ１２Ｄ変異型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、及び１ｘマスターミックス（ＤＮＡポリメラーゼ，ｄＮＴＰを含む）を加え、ＰＣＲ反応液を調製した。このとき、蛍光標識プローブの相補ＤＮＡ鎖が過剰に増幅するようにプライマーペアの濃度は非対称になるように添加した。プライマー及びプローブの配列は以下のとおりである。なお、蛍光標識プローブはいずれも、両端に相補鎖を形成する特殊分子を含む。また、５’末端に蛍光色素としてＦＡＭ、３’末端にクエンチャーとしてＢＨＱ−１が結合している。
【００５４】
フォワードプライマー：5'‐AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT‐3'  （配列番号１）
リバースプライマー：5'‐GCTGTATCGTCAAGGCACTCTT‐3'  （配列番号２）
野生型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐TTGGAGCTGGTGGCGT‐3'  （配列番号３）
変異型に対応した蛍光標識プローブ：5'-TTGGAGCTGATGGCGT‐3'  （配列番号４）
その後、各ウェルに対し、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型またはＧ１２Ｄ変異型のＤＮＡのいずれかが１個入るか、どちらも入らないようにするため、１５μＬのＰＣＲ反応液を入れて、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの反応は，９５℃、１０分処理後、（９５℃，１５秒→６０℃，７５秒）を４５サイクル行い、最後に９８℃、２分処理をした。反応後、ウェルが設けられたチップを温調ステージ上で加熱しながら各ウェルの蛍光強度変化を観察し、融解曲線の測定および解析を行った。
【００５５】
図１２Ａは、ＰＣＲ反応液にＫＲＡＳ遺伝子の野生型のみを添加した際の５０℃における蛍光強度のヒストグラムを示したものである。５０℃では、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルでは増幅したＤＮＡと蛍光標識プローブがハイブリダイズして蛍光を発するため、空のウェルとＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルの２つのピークが観察される。しかし、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルのピークは高さが低くブロードなため、空のウェルとの判別は難しい。
【００５６】
図１２Ｂは、ＰＣＲ反応液にＫＲＡＳ遺伝子の野生型のみを添加した際の８５℃におけ
る蛍光強度のヒストグラムを示したものである。８５℃では、ハイブリダイズした増幅したＤＮＡと蛍光標識プローブが解離するため、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルの蛍光強度も低くなり、空のウェルの蛍光強度と変わらなくなるため、それぞれに対応するピークが重なり、１つのピークとなる。すなわち、空のウェルでは温度変化に伴う蛍光強度変化が小さく、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルでは温度変化に伴う蛍光強度変化が大きいことが分かる。
【００５７】
そこで、図１２Ｃのように、８５℃の蛍光強度に対する５０℃の蛍光強度の比を用いてヒストグラムを作成すると、空のウェルとＫＲＡＳ遺伝子の野生型を含むウェルのピークを明確に分離することができる。
【００５８】
次に、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型とＧ１２Ｄ変異型を混合し、遺伝子型の判別を行った。反応条件は、上記と同じで行った。図１２Ｃは、各ウェルの５０℃のときの蛍光強度を横軸に、融解温度を縦軸にプロットしたグラフである。蛍光強度が４０００のあたりに空のウェルの集団があり、蛍光強度が４０００から１４０００のあたりにＫＲＡＳ遺伝子の野生型とＧ１２Ｄ変異型を含むウェルの集団がある。ＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ変異型は、野生型の配列が１塩基グアニンからアデニンに変異しており、野生型に比べて融解温度が低いので、融解温度が６８℃付近に見られる集団が野生型で、融解温度が６５℃付近に見られる集団が変異型である。しかし、野生型もＧ１２Ｄ変異型も蛍光強度のばらつきが大きく、空のウェルと判別するのが難しい部分がある。
【００５９】
図１２Ｄは、８５℃の蛍光強度に対する５０℃の蛍光強度の比を横軸に、融解温度を縦軸にプロットしたグラフである。８５℃の蛍光強度に対する５０℃の蛍光強度の比を横軸に用いた結果、ＫＲＡＳ遺伝子を含むウェルの横軸方向のばらつきが小さくなり、空のウェル、野生型を含むウェル、Ｇ１２Ｄ変異型を含むウェルの集団を明確に判別できる。
【００６０】
このように、低温時と高温時の蛍光強度比を用いることで、対象遺伝子を含まない空のドロップレットを測定装置により見分け、測定再現性および測定精度の向上を図ることができる。
【符号の説明】
【００６１】
１０１  野生型の遺伝子を含むドロップレット
１０２  変異型の遺伝子を含むドロップレット
１０３  空のドロップレット
２０１  野生型の遺伝子を含むドロップレット
２０２  変異型の遺伝子を含むドロップレット
２０３  空のドロップレット
３０１  対象遺伝子を含むドロップレット
３０２  対象遺伝子を含まないドロップレット
３０３  マイクロ流路
３０４  光源
３０５  フィルター
３０６  フォトマルチプルメーター
３０７  ＣＣＤ
３０８  レンズ
３０９  ダイクロイックミラー
３１０  ドロップレット検出用カートリッジ
３１１  ドロップレット
３１２  温調装置
３１３  ウェル方式検出用カートリッジ
３１４  対象遺伝子を含むウェル
３１５  対象遺伝子を含まないウェル
４０１  野生型の遺伝子を含むドロップレット 
４０２  変異型の遺伝子を含むドロップレット 
４０３  空のドロップレット
４０４  ドロップレットａ
４０５  ドロップレットｂ
４０６  ドロップレットｃ
４０７  ドロップレットｄ
５０１  ＤＮＡ
５０２  ＤＮＡインターカレーター
５０３  融解温度 
６０１  ＤＮＡ
６０２  蛍光標識プローブ
６０３  蛍光色素
６０４  クエンチャー
６０５  融解温度 
７０１  ドロップレット作製部
７０２  サーマルサイクラー
７０３  ドロップレット検出部
７０４  モニター
７０５  ドロップレット作製用カートリッジ
７０６  マイクロチューブ
７０７  ドロップレット検出用カートリッジ
７０８〜７１１  ポンプ
７１２  オイル
７１３  オイル
７１４  廃液溜め
７１５  オイル供給口
７１６  ＰＣＲ反応液導入口
７１７  ドロップレット排出口
７１８  オイル供給口
７１９  ドロップレット導入口
７２０  廃液排出口
７２１  デジタルＰＣＲ測定装置
７２２  温調装置
７２３  液溜
７２４  制御部
【図１】
2019213513.tif 000003
【図２】
2019213513.tif 000004
【図３】
2019213513.tif 000005
【図４】
2019213513.tif 000006
【図５】
2019213513.tif 000007
【図６】
2019213513.tif 000008
【図７】
2019213513.tif 000009
【図８】
2019213513.tif 000010
【図９】
2019213513.tif 000011
【図１０】
2019213513.tif 000012
【図１１】
2019213513.tif 000013
【配列表】
2019213513000001.app