(57)【要約】【課題】ＡＧＲ２発現促進剤を提供する。【解決手段】ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進剤。
【請求項２】
ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤。
【請求項３】
ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進用食品。
【請求項４】
ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。
【請求項５】
ムチンが分泌型ムチンである請求項２記載の剤、又は請求項４記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＲ２の発現を促進するＡＧＲ２発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＧＲ２（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）ファミリーに属しているタンパク質である。ＡＧＲ２は、チオレドキシン用ドメイン（ＣＸＸＳ）を１つ持っており、タンパク質のＳ−Ｓ結合部位に結合して、タンパク質のフォールディングや成熟に関与すると考えられている（非特許文献１、２）。そして、ＡＧＲ２は、腸においてムチンに結合してムチンの成熟・放出に関与し、腸の粘膜保護に必須であること（非特許文献３）、また、ＡＧＲ２は気道において発現し、喘息で発現誘導されムチンを過剰分泌すること（非特許文献４）、喘息モデルマウスの気道では、ＡＧＲ２の発現が高く、ムチン（ＭＵＣ５）を過剰分泌すること（非特許文献５）が報告されている。したがって、ＡＧＲ２の発現が促進されればムチンの放出が促進されると考えられる。
【０００３】
一方、眼科領域において、分泌型ムチンの放出はドライアイを改善すること（非特許文献６）、また、胃においては、胃の粘液（ムチン）放出が促進されることによって胃酸の刺激から胃粘膜を保護し、胃炎や胃潰瘍を予防できると考えられている。また、ムチンを含む気道の液は、外来からの微生物や粉塵を防ぐ役割をしており、ムチンの分泌が低下した場合には、防御機能が低下し、様々な疾病に感染する可能性が増大することから、気道においてムチンの放出を促進することは感染防御に有用である。したがって、ＡＧＲ２の発現促進は、ムチンの分泌低下に起因して発症する斯かる疾患の予防、治療又は改善に役立つと考えられる。
【０００４】
ベツリン酸（ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）はシラカバの樹皮、センブリ、チョウジ、ブドウ果皮、チャーガ（カバノアナタケ）などに存在するルパン系トリテルペン化合物の１種である。ベツリン酸には、制癌作用、抗炎症作用、抗菌作用、抗黴作用、抗ウイルス作用（非特許文献７）の他、コラーゲン合成促進作用（特許文献１）、皮膚のシワ、シミの改善作用（特許文献２）等、種々の薬理作用があることが報告されている。
【０００５】
しかしながら、ベツリン酸がＡＧＲ２の発現を促進すること、またムチンの放出を促進することについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−２０８４２４号公報
【特許文献２】特開平９−８７１５６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mol Phylogenet Evol, 36(3), 734-740(2005).
【非特許文献２】J Immunol Methods, 378(1-2), 20-32(2012).
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci, 106(17), 6950-6955(2009).
【非特許文献４】Am J Respir Cell Mol Biol., 47(2), 178-185(2012).
【非特許文献５】J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci., 33(1), 33-6(2013).
【非特許文献６】京府医大誌 122（8），549〜558(2013).
【非特許文献７】Nat. Prod. Rep., 23, 919-942(2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＡＧＲ２発現促進剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、天然由来の成分について種々検討した結果、ベツリン酸が優れたＡＧＲ２発現促進作用を有し、ＡＧＲ２発現促進剤及びムチン放出促進剤として有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進剤。
２）ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤。
３）ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進用食品。
４）ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＡＧＲ２の発現を促進することにより、ムチンの分泌低下に起因して発症する疾患の予防や治療、例えばドライアイの予防又は改善、胃炎や胃潰瘍の予防、気道感染症の予防に有用な、医薬品、食品が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「ベツリン酸」は、下記式で示される３β−ヒドロキシルパ−２０（２９）−エン−２８−酸である。
【００１３】
【化１】
2019104684.tif 000002
【００１４】
ベツリン酸の塩としては薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機アミン塩、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００１５】
ベツリン酸は、それを含有する植物、例えばシラカバの樹皮、チャーガ等から分離精製して取得できる他（中国特許出願公開第１０１４８５７０３号明細書）、化学合成することも可能である（特表２００３−５１９６７４号公報）。また、市販品を使用することも可能である。
【００１６】
後記実施例に示すように、ベツリン酸は、ヒト正常表皮細胞におけるＡＧＲ２遺伝子及びＡＧＲ２タンパク質の発現促進作用を有する。ＡＧＲ２は、腸においてムチンに結合してムチンの成熟・放出に関与し、腸の粘膜保護に必須であること（前記非特許文献３）、また、ＡＧＲ２は気道において発現し、喘息で発現誘導されムチンを過剰分泌すること（前記非特許文献４）、喘息モデルマウスの気道では、ＡＧＲ２の発現が高く、ムチン（ＭＵＣ５）を過剰分泌すること（前記非特許文献５）が報告されていることから、ＡＧＲ２の発現が促進されればムチンの放出が促進されると考えられる。
従って、ベツリン酸又はその塩は、ＡＧＲ２発現促進剤、ムチン放出促進剤（以下、「ＡＧＲ２発現促進剤等」とも称する）となり得、ＡＧＲ２の発現を促進するため、ムチンの放出を促進するために使用することができ、またＡＧＲ２発現促進剤、ムチン放出促進剤を製造するために使用することができる。
ここで、「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【００１７】
本発明において、ＡＧＲ２の発現促進には、遺伝子レベルでの発現促進及びタンパク質レベルでの発現促進が包含される。遺伝子レベルでの発現促進にはｍＲＮＡの発現促進、好ましくはｍＲＮＡへの転写促進が挙げられ、タンパク質レベルでの発現促進には翻訳における促進が含まれる。ここで、「ＡＧＲ２（Ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）」とは、ＮＣＢＩのデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ）[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/]において、「ＡＧＲ２」として登録されているタンパク質を意味する。
【００１８】
また、本発明において、「ムチン放出促進」とは、上皮細胞、杯細胞におけるムチンの分泌を促進することを意味する。本発明において、ムチンはＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ，ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７等の分泌型ムチンであるのが好ましい。
前述したとおり、眼科領域において、分泌型ムチンの放出促進はドライアイの改善に有用であり（前記非特許文献６）、消化管においては、粘膜保護作用を有し、胃炎や胃潰瘍の予防又は改善に有用である。また、気道においてムチンの放出促進は細菌やウイルス感染の防御に有用である。したがって、本発明のＡＧＲ２発現促進剤、ムチン放出促進剤は、ムチンの分泌低下に起因して発症する斯かる疾患の予防、治療又は改善に役立つと考えられる。
【００１９】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、「治療」には、疾患の完全治癒に加えて、症状を改善させることが包含される。
【００２０】
本発明の本発明のＡＧＲ２発現促進剤等は、それ自体、ＡＧＲ２の発現を促進するため、ムチンの放出を促進するための医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品であってもよく、或いは当該医薬品、医薬部外品、又は食品に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
当該食品には、ＡＧＲ２の発現促進、ムチンの放出促進をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品（ＡＧＲ２発現促進用食品、ムチン放出促進用食品）、例えば機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。これらの食品は機能表示が許可された食品であるため、一般の食品と区別することができる。
【００２１】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は注射剤、坐剤、吸入薬等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の製剤は、本発明のベツリン酸又はその塩を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、ベツリン酸又はその塩以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与である。
【００２２】
上記食品の形態としては、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。
【００２３】
種々の形態の食品は、本発明のベツリン酸又はその塩を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、クロロゲン酸類以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。
【００２４】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明のベツリン酸又はその塩の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、総量中ベツリン酸遊離体換算で、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上、更に好ましくは０．００１質量％以上であり、また、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、更に好ましくは１質量％以下である。また、好ましくは０．００００１〜２０質量％、より好ましくは０．０００１〜１０質量％、更に好ましくは０．００１〜１質量％である。
【００２５】
上記医薬品（医薬部外品も含む）及び食品の投与量又は摂取量は、適宜決定され得るが、通常、成人（６０ｋｇ）に対して１日あたり、本発明のベツリン酸又はその塩として、ベツリン酸遊離体換算で、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、また、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。本発明では斯かる量を１回で投与又は摂取するのが好ましい。
【００２６】
上記製剤は、任意の計画に従って投与又は摂取され、投与又は摂取期間は特に限定されないが、反復・連続して投与又は摂取することが好ましく、７日間以上連続して投与又は摂取することがより好ましく、２８日間以上連続して投与又は摂取することが更に好ましい。
【００２７】
投与又は摂取対象としては、例えばドライアイ又はその恐れのあるヒト、胃炎や胃潰瘍の予防又は改善を望むヒト、細菌やウイルスによる気道感染の予防を望むヒトが挙げられる。
【００２８】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進剤。
＜２＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤。
＜３＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とするＡＧＲ２発現促進用食品。
＜４＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。
＜５＞ＡＧＲ２発現促進剤を製造するための、ベツリン酸又はその塩の使用。
＜６＞ムチン放出促進剤を製造するための、ベツリン酸又はその塩の使用。
＜７＞ＡＧＲ２発現促進に使用するための、ベツリン酸又はその塩。
＜８＞ムチン放出促進に使用するための、ベツリン酸又はその塩。
＜９＞ベツリン酸又はその塩を対象に投与するか又は摂取させることを含む、ＡＧＲ２発現促進方法。
＜１０＞ベツリン酸又はその塩を対象に投与するか又は摂取させることを含む、ムチン放出促進方法。
＜１１＞＜２＞、＜４＞、＜６＞、＜８＞において、ムチンは分泌型ムチンである。
＜１２＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とする消化管粘膜保護剤。
＜１３＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とするドライアイ予防又は改善剤。
＜１４＞ベツリン酸又はその塩を有効成分とする気道感染防御剤。
【実施例】
【００２９】
実施例１  ＡＧＲ２遺伝子発現量促進作用の解析
ヒト正常表皮細胞（ＮＨＥＫ）はＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）（Ｋｕｒａｂｏより購入）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞を１２穴プレートに１×１０５個で播種し、２４時間培養後、培地を血清無添加培地に交換するとともに、被験物質を最終濃度（１００ｎＭ〜１μＭ）なるように調製し、培地に添加した。１日培養後、細胞からＭａｘｗｅｌｌ  １６  ＬＥＶ  ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの濃度を測定し、一定量のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはＨｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。
【００３０】
得られたｃＤＮＡから、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより、ＡＧＲ２の遺伝子発現の定量を行った。定量は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ（ＡＧＲ２：Ｈｓ００１８０７０２＿ｍ１、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、ＰＲＩＳＭ  ７５００（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出定量した。２０μＬの反応系にて、増幅条件は９５℃、１５秒の変性反応、６０℃、１分のアニーリング、伸長反応にて行った。遺伝子発現量はＲＰＬＰ０（Ｈｓ９９９９９９０２＿ｍ１、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）発現量により補正し、試料無添加（溶媒のみ）コントロールにおけるＡＧＲ２の発現量を１とした場合の相対値として示した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2019104684.tif 000003
【００３２】
実施例２  ＡＧＲ２蛋白質発現量促進作用の解析
ヒト正常表皮細胞（ＮＨＥＫ）はＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）（Ｋｕｒａｂｏより購入）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞を１２穴プレートに１×１０５個で播種し、２４時間培養後、培地を血清無添加培地に交換するとともに、被験物質を最終濃度（１０μＭ）なるように調製し、培地に添加した。１日培養後、細胞を可溶化液〔ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｓｉｇｍａ）〕を用いて蛋白抽出液を作製した。蛋白質量の濃度を測定し、一定量蛋白質量分のサンプルにＳａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、１００ｍＭ  ＤＴＴを加え、熱処理（９５℃５ｍｉｎ）を行った。４−２０％Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動を行い、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でＰＶＤＦ膜に転写した。５％  スキムミルク溶液で１時間Ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、１次抗体（ａｎｔｉ−ＡＧＲ２、ａｂｃａｍ）で反応させた（４℃、Ｏ／Ｎ）。２次抗体（ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１時間反応させた後、Ｃｌａｒｉｔｙ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で発光させた。検出は、ＬＡＳ−４０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）を用いた。その後、Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で抗体を除去し、再度１次抗体（ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、）、２次抗体（ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で反応させ、検出を行った。蛋白質発現量はＡｃｔｉｎの発現量により補正し、試料無添加（溶媒のみ）コントロールにおけるＡＧＲ２の発現量を１とした場合の相対値として示した。結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2019104684.tif 000004