(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）に対する免疫グロブリン単一可変ドメインの、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤の提供。【解決手段】慣用的な４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖若しくはナノボディに由来する重鎖可変ドメイン配列を含む、少なくとも１つの特定の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）結合剤と、ｐＨが５．０〜７．５の範囲であるクエン酸緩衝液とを含む製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）結合剤と、ｐＨが５．０〜７．５の範囲であるクエン酸緩衝液とを含む製剤。
【請求項２】
前記ｖＷＦ結合剤が、配列番号２０に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、慣用的な４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖若しくはナノボディに由来する重鎖可変ドメイン配列（ＶＨＨ配列を含むがそれに限定されるわけではない）を含む、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
前記ｖＷＦ結合剤が配列番号１〜１９の少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の製剤。
【請求項５】
前記ｖＷＦ結合剤が、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む１本鎖ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項記載の製剤。
【請求項６】
前記ｖＷＦ結合剤が一価又は多価である、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
前記ｖＷＦ結合剤が単一特異的又は多重特異的である、請求項５記載の製剤。
【請求項８】
１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＣＤＲが移植されているか、ヒト化されているか、ラクダ化されているか、脱免疫化されているか、又はファージディスプレイによって選択されている、請求項５記載の製剤。
【請求項９】
前記ｖＷＦ結合剤が、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１０】
前記ｖＷＦ結合剤が、０．１〜８０mg/mLの範囲の濃度を有する、請求項１〜９のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１１】
前記緩衝液が、５〜２００mMの範囲の濃度を有する、請求項１〜１０のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１２】
賦形剤をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１３】
前記賦形剤が１０〜５００mMの範囲の濃度を有する、請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
前記賦形剤が、スクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、及びＮａＣｌからなるリストから選択される、請求項１２又は１３記載の製剤。
【請求項１５】
前記スクロースが、１〜１５％、好ましくは２〜１２％、好ましくは４〜１０％の範囲、例えば、４、５、６、７、８又は９％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、請求項１４記載の製剤。
【請求項１６】
前記緩衝液が、６．０〜７．０、より好ましくは６．５のｐＨを有する、請求項１〜１５のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１７】
好ましくは０．００１〜０．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜０．０２％（ｖ／ｖ）の濃度の、Ｔｗｅｅｎ−８０のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項記載の製剤。
【請求項１８】
フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）結合剤とクエン酸緩衝液とを含む製剤であって、該緩衝液は、６．５±０．５、例えば６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８、より具体的には６．５のｐＨを有し、該製剤は、１〜１５％、好ましくは２〜１２％、好ましくは４〜１０％の範囲、例えば４、５、６、７、８又は９％（ｗ／ｖ）の濃度を有するスクロースをさらに含み、好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度の、Ｔｗｅｅｎ−８０のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、該製剤。
【請求項１９】
２９０±６０mOsm/kgの範囲、より好ましくは２９０±２０mOsm/kgの範囲の浸透圧を有する、請求項１〜１８のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２０】
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、又はＮａＣｌから選択された賦形剤；
（ｃ）約０．００１％から０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mMから約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む製剤であって、製剤中のｖＷＦ結合剤は、５℃で少なくとも１２か月間保存した後にその安定性の少なくとも約８０％を保持する、該製剤。
【請求項２１】
（ｉ）５℃で少なくとも１２か月間保存した後に５％未満の高分子量（ＨＭＷ）種；及び／又は
（ｉｉ）５℃で少なくとも１２か月間保存した後に５％未満の低分子量（ＬＭＷ）種
を有する、請求項１〜２０のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２２】
ｖＷＦ結合剤の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％又はさらには少なくとも９９％が、保存前の結合活性と比較して保存後にその結合活性を保持し、該結合活性はＥＬＩＳＡ及び／又はビアコアによって測定される、請求項１〜２０のいずれか記載の製剤。
【請求項２３】
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース；
（ｃ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mM〜約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、液体製剤又は再構成された凍結乾燥製剤である、請求項１〜２２のいずれか記載の製剤。
【請求項２４】
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％の濃度のスクロース；
（ｃ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mM〜約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、原末保存製剤であり、少なくとも１００リットルの製剤が氷点下条件で保存される、請求項１〜２２のいずれか記載の製剤。
【請求項２５】
静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射から選択された１つ以上などの、非経口投与に適した、請求項１〜２３のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２６】
液体型、凍結乾燥型、噴霧乾燥型、再構成される凍結乾燥型、又は凍結型である、請求項１〜２３のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２７】
ヒト又は動物被験体の処置法に使用するための、請求項１〜２６のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２８】
ＴＴＰ又はＡＣＳの処置に使用するための、請求項１〜２７のいずれか一項記載の製剤。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項記載の製剤の調製法。
【請求項３０】
ｖＷＦ結合剤を含む製剤を調製する方法又はプロセスであって、該方法又はプロセスは、
−  細胞培養においてｖＷＦ結合剤を発現させること；
−  クロマトグラフィー精製工程及び限外ろ過／ダイアフィルトレーション工程の少なくとも１つにｖＷＦ結合剤を通過させることによって、ｖＷＦ結合剤を精製すること；
−  （ｉ）約１％から約１５％の濃度のスクロース；
（ｉｉ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｉｉｉ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mMから約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む製剤中において、ｖＷＦ結合剤の濃度を約０．１〜８０mg/mLへと調整すること
を含む、該方法又はプロセス。
【請求項３１】
ｖＷＦ結合剤分子を含有する再構成された製剤を調製する方法であって、該方法は、（ｉ）ｖＷＦ結合剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、及び緩衝液の混合物を凍結乾燥させて、凍結乾燥させた混合物を形成する工程；及び（ｉｉ）希釈液中において凍結乾燥させた混合物を再構成し、これにより製剤を調製する工程からなり、再構成された製剤は、
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース；
（ｃ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mMから約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、該方法。
【請求項３２】
製剤を単位投与剤形で調合する工程をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２４のいずれか一項記載の製剤を調製することを含む、ｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチドを、保存のために安定化させるための方法。
【請求項３４】
請求項１〜２４のいずれか一項記載の製剤を調製することを含む、ｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチドを保存するための方法。
【請求項３５】
−  請求項１〜２４のいずれかの製剤の試料を準備すること；
−  １つ以上のＨＭＷ種又はＬＭＷ種の色、透明度、粘度、又は量から選択された製剤パラメーターを評価すること；
−  該パラメーターが予め選択された基準を満たすかどうかを決定し、それにより製造プロセスを分析すること
を含む、製造プロセスを分析する方法。
【請求項３６】
バッチ間のばらつきをモニタリング若しくは制御する方法において２つ以上の試料製剤を比較すること、又は試料を標準品と比較することをさらに含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
比較に基づいて、該製剤を分類、選択、承認又は棄却、発売又は差し控え、医薬品への加工、船舶輸送、様々な場所への移動、製剤化、ラベル貼り、梱包することをさらに含む、請求項３５の方法。
【請求項３８】
評価された製剤パラメーターに関するデータを含みかつ場合により製剤のバッチについての識別名を含む記録を提供すること；該記録を意思決定者に提出すること；場合により、該意思決定者からの伝達を受け取り；場合により、意思決定者からの伝達に基づいて製剤のバッチを発売又は市販するかどうかを決定することをさらに含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
請求項１〜２４のいずれかの製剤を含有する容器と使用説明書とを含む、キット又は製品。
【請求項４０】
前記製剤がバイアル又は注射用シリンジ中に存在する、請求項３９のキット又は製品。
【請求項４１】
前記製剤が、プレフィルド注射用シリンジ中に存在する、請求項３９のキット又は製品。
【請求項４２】
前記シリンジ又はバイアルが、環状オレフィンポリマー又はコポリマーから選択されたガラス、プラスチック、又はポリマー材料から構成される、請求項４０のキット又は製品。
【請求項４３】
請求項１〜２３のいずれか一項記載の製剤を含む、患者、好ましくはヒト患者への非経口投与に適した薬学的単位投与剤形。
【請求項４４】
ｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチドの保存のための、請求項１〜２４のいずれか一項記載の製剤の使用。
【請求項４５】
保存が、例えば−７０℃から＋４０℃の温度で、例えば−７０℃、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃、好ましくは−７０℃から＋２５℃の温度で、１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間、好ましくは少なくとも１２か月間である、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載されているか、又は請求項２８〜３３記載の方法によって得ることのできるｖＷＦ結合剤を含む製剤を含む、医薬組成物又は診断用組成物。
【請求項４７】
請求項１〜２４のいずれかの製剤を含む医薬組成物を被験体に投与し、これにより、ｖＷＦ関連疾患に伴う１つ以上の症状を低減させることを含む、ｖＷＦ関連疾患を治療又は予防する方法。
【請求項４８】
前記ｖＷＦ関連疾患がＴＴＰである、請求項４７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）に対する免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号１〜１９、特に配列番号１に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン、すなわちナノボディＡＬＸ−００８１の安定製剤に関する。
【０００２】
本発明は、幅広い温度での長期間の保存時に安定である製剤を提供する。本発明の製剤は、前記ポリペプチドの高い安定性を確実とし、化学的又は物理的劣化を伴うことなく複数回の凍結解凍サイクルを可能とし、機械的ストレス、例えば振とう、剪断又は撹拌ストレスに関連した安定性を与える。それらは医薬調製物及び診断用調製物に適し、薬学的に許容される希釈剤、例えば食塩水、リンガー液、又はグルコース／デキストロース溶液に適合できる。
【０００３】
本発明はまた、製剤の調製法、並びに、製剤の保存法及び使用法に関する。本発明はさらに、製剤の単位投与剤形、キット及び医療使用に関する。
【０００４】
２．発明の背景
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばラクダＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、又はヒト化ＶＨＨドメインは、急速に増えつつある抗体治療薬のクラスの代表である。例えば、ｖＷＦに対する免疫グロブリン単一可変ドメインは、国際公開公報第２００４／０１５４２５号、国際公開公報第２００４／０６２５５１号、国際公開公報第２００６／０７４９４７号、国際公開公報第２００６／１２２８２５号、国際公開公報第２００９／１１５６１４号及び国際公開公報第２０１１／０６７１６０号に記載されている。
【０００５】
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）などのタンパク質は、典型的には、最初の製造から使用まで、例えば患者への投与までの間に保存かつ輸送されなければならない。輸送、製造、保存、及び運送プロセスは、免疫グロブリン単一可変ドメインに対して多数のストレス、例えば化学的及び物理的ストレスを与える可能性がある。保存中に化学的修飾、例えば、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、異性化、β脱離、又はジスルフィド交換などが起こる可能性がある。物理的ストレスは、変性及びアンフォールディング、凝集、粒子状物の形成、沈降、白濁化又は吸着を引き起こす可能性がある。
【０００６】
安定性を増強させ、化学的及び／又は機械的なストレスから活性作用物質を保護し、従って有意な物理的又は化学的劣化を伴うことなく保存及び温度変化を可能とし、長期間安定であり続け、及び／又は患者にとって利便性がある（例えば活性作用物質が高濃度で溶解している）、例えば本明細書において定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメインのための製剤を提供する必要性が依然としてある。
【０００７】
３．発明の要約
上記のストレスは、タンパク質治療薬、例えば抗体治療薬の物理化学的完全性に影響を及ぼす可能性があることが知られている。例えば、凝集、脱アミド化及び酸化は、抗体分解の最もよくある原因として記載されている（Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 10, 307-377）。同時に、免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性を保持する製剤が提供されることは有益である。化学的及び物理的完全性は、例えば治療剤としての使用のために必要とされ、典型的には生物学的活性にも関連している。本発明者らのタンパク質安定性に関する知識は増えつつあるが、これらの多数のストレスを完全に抑制又は最小限としかつ長い有効期限を保証するように製剤化条件を最適化することは依然として大きな課題である。
【０００８】
免疫グロブリン単一可変ドメインの適切な製剤に関することは殆ど知られていない。国際公開公報第２０１０／０７７４２２号は、凍結乾燥保護剤、界面活性剤、及び、ｐＨ５．０〜７．５のヒスチジン緩衝液及びトリスＨＣｌ緩衝液から選択された緩衝液を含む、ＴＮＦに結合するナノボディの製剤を記載している。
【０００９】
具体的なｖＷＦ結合剤、特にｖＷＦに対して高い親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＡＬＸ−００８１［国際一般的名称：カプラシズマブ（caplacizumab）］は、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）を受けている急性冠症候群（ＡＣＳ）患者のための補助的療法として試験され、また血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置として開発されている。第Ｉ相臨床試験は成功裡に完了し、第ＩＩ相試験における検査が現在進行中である。これまで、ＡＬＸ−００８１は、Ｄ−ＰＢＳ、２００mMのグリシン及び０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中に５mg/mLの活性医薬成分（ＡＰＩ）を含有するリン酸を基剤とした液体製剤として提示されている。
【００１０】
この製剤は効果的であることが判明したが、それはいくつかの点で改善され得る。第一に、現行の濃度ではおそらく複数回の皮下注射を必要とし（皮下注射１回あたりの容量は約１mLに制限されると仮定する）、これにより患者にとっての利便性及び簡便性は低減する。第二に、より高い温度での現行のＡＬＸ−００８１製剤（本明細書において以後、現代のＡＬＸ−００８１とも称する）の保存安定性及び有効期限を改善させることができる。高温での本製剤の安定性は、主に、ポリペプチドに対する化学的修飾によって決まる。化学的修飾は、効力の低下と連関し得る。実用的な有効期限は、製品を−２０℃で保存することによって到達することができるが、これは、大半の実践的な目的に対する好ましい選択肢であるとは考えられない。
【００１１】
凍結−乾燥は、対象のタンパク質調製物から水を除去する役目を果たす、タンパク質の保存のための一般的に使用される技術である。凍結−乾燥（freeze-drying）、すなわち凍結乾燥（lyophilization）は、乾燥しようとする材料をまず凍結させ、その後、氷又は凍結した溶媒を、真空環境において昇華によって除去するプロセスである。賦形剤を予め凍結乾燥させた製剤に含めて、凍結−乾燥プロセス中の安定性を増強、及び／又は保存時の凍結乾燥製品の安定性を向上させることができる（Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)）。
【００１２】
本発明は、フォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）結合剤と、ｐＨ５．０〜７．５の範囲のクエン酸又はリン酸緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液とを含む製剤に関する。特に、本発明は、該ｖＷＦ結合剤が、配列番号２０に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、本明細書に記載のような製剤に関する。
【００１３】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列である免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には、慣用的な４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むがそれに限定されるわけではない）、好ましくはナノボディに由来する重鎖可変ドメイン配列である、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか、又は実質的にからなるが、それに限定されるわけではない。
【００１４】
さらに、本発明は、前記ｖＷＦ結合剤が配列番号１〜１９の少なくとも１つを含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。さらに、本発明は、該ｖＷＦ結合剤が、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む１本鎖ポリペプチドであり、好ましくは該ｖＷＦ結合剤が一価又は多価であり、該ｖＷＦ結合剤が単一特異的又は多重特異的であり、及び／又は、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＣＤＲが移植されているか、ヒト化されているか、ラクダ化されているか、脱免疫化されているか、及び／又はインビトロで作製されている（例えばファージディスプレイによって選択されている）、本明細書に記載されているような製剤に関する。本発明はまた、該ｖＷＦ結合剤が、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。本発明はまた、該ｖＷＦ結合剤が、０．１〜８０mg/mLの範囲の濃度を有し、及び／又は該緩衝液が５〜２００mMの範囲の濃度を有する、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、賦形剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関し、好ましくは該賦形剤は、１０〜５００mMの範囲の濃度を有し、より好ましくは、該賦形剤は、スクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、及びＮａＣｌからなるリストから選択され、さらにより好ましくは、該スクロースは、１〜１５％、好ましくは２〜１２％、好ましくは４〜１０％の範囲、例えば４、５、６、７、８又は９％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは７％の濃度を有する。
【００１６】
本発明はまた、該緩衝液が、クエン酸緩衝液（好ましくは該クエン酸緩衝液は、６．０〜７．０、より好ましくは６．５のｐＨを有する）；及びリン酸緩衝液（好ましくは該リン酸緩衝液は、６．５〜７．５の範囲、好ましくは７．１のｐＨを有する）から選択される、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、好ましくは０．００１〜０．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜０．０２％（ｖ／ｖ）の濃度の、Ｔｗｅｅｎ−８０のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、該緩衝液が、６．５±０．５、例えば６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８、より具体的には６．５のｐＨのクエン酸緩衝液であり、該製剤は、１〜１５％、好ましくは２〜１２％、好ましくは４〜１０％、例えば４、５、６、７、８又は９％（ｗ／ｖ）の範囲、最も好ましくは７％の濃度を有するスクロースをさらに含み、好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度の、Ｔｗｅｅｎ−８０のような非イオン性洗浄剤をさらに含む、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００１９】
また、本発明は、前記製剤が、２９０±６０mOsm/kgの範囲、より好ましくは２９０±２０mOsm/kgの範囲の浸透圧を有する、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００２０】
本発明はさらに、
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース、グリシン、マンニトール、トレハロース、又はＮａＣｌから選択された賦形剤；
（ｃ）約０．００１％から０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような約５mMから約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液、及び、製剤のｐＨが約６．５〜７．５となるような約１０mMから約５０mMの濃度のリン酸緩衝液（ただし、製剤中のｖＷＦ結合剤は、５℃で少なくとも１２か月間又は５℃でさらには２４か月間保存した後にその安定性の少なくとも約８０％を保持する）から選択された緩衝液
を含む、製剤に関する。
【００２１】
本発明はまた、５℃で少なくとも１２か月間若しくは５℃でさらには２４か月間保存した後に５％未満の高分子量（ＨＭＷ）種；及び／又は、５℃で少なくとも１２か月間若しくは５℃でさらには２４か月間保存した後に５％未満の低分子量（ＬＭＷ）種を有する製剤に関する。
【００２２】
本発明はさらに、ｖＷＦ結合剤の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又はさらには少なくとも９９％が、保存前の結合活性と比較して保存後にその結合活性を保持する製剤に関し、該結合活性はＥＬＩＳＡ及び／又はビアコアによって測定される。
【００２３】
さらに、本発明は、前記製剤が、液体型、凍結乾燥型、噴霧乾燥型、再構成される凍結乾燥型、又は凍結型である、本明細書に記載されているような製剤に関し、より具体的には本発明は、
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース；
（ｃ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mM〜約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、液体製剤又は再構成される凍結乾燥製剤に関する。その後、凍結乾燥製剤は、必要に応じて、凍結乾燥型を適切な希釈剤（例えば水）と混合して、元来の製剤成分を所望の濃度まで再度可溶化することによって再構成させることができる。
【００２４】
本発明はまた、前記製剤が、
（ａ）約０．１mg/mLから約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤；
（ｂ）約１％から約１５％の濃度のスクロース；
（ｃ）約０．００１％〜０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び
（ｄ）製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような、約５mM〜約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液
を含む、原末保存製剤であり、少なくとも１００リットルの製剤が氷点下条件で保存される、本明細書に記載されているような製剤に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、前記製剤が被験体、例えばヒト被験者（例えば、ｖＷＦ関連疾患を有する患者）への非経口投与に適した、製剤に関する。該製剤を、注射（例えば静脈内、皮下、筋肉内、又は腹腔内）によって被験体に投与することができる。
【００２６】
また、本発明は、ヒト又は動物被験体の処置法に使用するための、好ましくはｖＷＦ関連疾患、例えば急性冠症候群（ＡＣＳ）、一過性脳虚血発作、不安定性又は安定性狭心症、脳卒中、心筋梗塞、又は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置に使用するための、最も好ましくはＴＴＰ又はＡＣＳの処置に使用するための、本明細書に記載されているような製剤を提供する。さらに、本発明は、本明細書に記載のような製剤を調製する方法又はプロセスに関する。該方法又はプロセスは、細胞培養液中においてｖＷＦ結合剤を発現させ；例えばクロマトグラフィー精製工程、限外濾過／ダイアフィルトレーション工程の少なくとも１つにｖＷＦ結合剤を通過させることによって、ｖＷＦ結合剤を精製する工程；本明細書に記載のような凍結乾燥保護剤、界面活性剤、及び緩衝液、例えば、約１％から約１５％の濃度のスクロース；約０．００１％〜０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び製剤のｐＨが約６．０〜７．０となるような約５mMから約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液を含有する製剤中において、ｖＷＦ結合剤の濃度を例えば約０．１〜８０mg/mlへと調整する工程；及び、場合により、該製剤を単位投与剤形で調合する工程を含む。
【００２７】
本発明はまた、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書に記載のようなＡＬＸ−００８１を含有する再構成される製剤を調製するための方法又はプロセスを特色とする。該方法は、ｖＷＦ結合剤、凍結乾燥保護剤、界面活性剤及び緩衝液の混合物を凍結乾燥させ、これにより凍結乾燥混合物を形成する工程；及び、凍結乾燥させた混合物を希釈剤中において再構成して、これにより本明細書に記載のような製剤を調製する工程を含む。特に、該製剤は、（ａ）約０．１〜約８０mg/mLの濃度のｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１；（ｂ）約１％から約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース；（ｃ）約０．００１％から約０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＴｗｅｅｎ−８０；及び（ｄ）該製剤のｐＨが約６〜７．０となるような、約５〜約２００mMの濃度のクエン酸緩衝液を含み；及び、場合により、該製剤を単位投与剤形で調合する工程を含む。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書において定義されているような製剤を調製することを含む、保存のためにｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチドを安定化させるための方法に関する。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書において定義されているような製剤を調製することを含む、ｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチドを保存するための方法に関する。
【００３０】
また、本明細書に記載された又は本明細書に記載の方法によって得ることのできる製剤のいずれかを含む、医薬組成物又は診断用組成物を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、製品又はプロセス、例えば製造プロセスを分析する方法を特色とする。該方法は、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書に記載のＡＬＸ−００８１の製剤を準備する工程、及び、本明細書に記載のような、１つ以上のＨＭＷ種、ＬＭＷ種の色、透明度、粘度又は量などの製剤パラメーターを評価することを含む。評価は、１つ以上のパラメーターの評価、例えば、該パラメーターが予め選択された基準を満たすかどうかを決定、例えば、予め選択された基準が存在するかどうか、又は予め選択された範囲内に存在するかどうかを決定し、これによりプロセスを分析することを含み得る。例えば、該プロセスの評価は、ｖＷＦ結合剤の製剤の安定性の測定を含む。ＡＬＸ−００８１製剤の安定性は、例えば、凝集物の形成（これは、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってアッセイされる）によって、本明細書に記載のような色、透明度、又は粘度によって測定することができる。
【００３２】
さらに、前記方法は、バッチ間のばらつきをモニタリング又は制御する方法において２つ以上の試料製剤を比較すること、調製物を標準品と比較すること、比較に基づいて、該製剤を、分類、選択、承認又は棄却、発売又は差し控え、医薬品への加工、船舶輸送、様々な場所への移動、製剤化、ラベル貼り、又は梱包することをさらに含み得る。また、該方法はさらに、評価された製剤パラメーターに関するデータを含みかつ場合により製剤のバッチについての識別名を含む記録を提供すること；該記録を意思決定者に提出すること；場合により、該意思決定者からの伝達を受け取り；場合により、意思決定者からの伝達に基づいて製剤のバッチを発売又は市販するかどうかを決定することをさらに含み得る。
【００３３】
また、本発明の製剤と例えば医療従事者による使用のための説明書とを含む、キット又は製品を提供する。キット又は製品は、本明細書に記載のような本発明の製剤を含有するバイアル又はシリンジを含み得る。好ましくは、バイアル又はシリンジは、環状オレフィンポリマー又はコポリマーから選択されたガラス、プラスチック、又はポリマー材料から構成される。さらに、該製剤はまた、注射器具（例えば注射用シリンジ、例えばプレフィルド注射用シリンジ）中に存在していてもよい、
【００３４】
本発明はさらに、ヒト患者への本発明の製剤の非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）に適した本発明の安定な製剤を含む、薬学的な単位投与剤形を提供する。
【００３５】
さらに、本発明の製剤は、ｖＷＦ結合剤、好ましくは配列番号１〜１９の少なくとも１つを含むポリペプチド、例えば本明細書に記載のＡＬＸ−００８１の保存のために使用することができ、該保存は、例えば−７０℃から＋４０℃の温度で、例えば−７０℃、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃、好ましくは−７０℃から＋２５℃の温度で、１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間、好ましくは少なくとも１２か月間である。
【００３６】
本発明はまた、ｖＷＦ関連疾患、例えば急性冠症候群（ＡＣＳ）、一過性脳虚血発作、不安定性又は安定性狭心症、脳卒中、心筋梗塞、又は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を治療又は予防する方法に関し；該方法は、被験体に、本発明の製剤を含む医薬組成物を投与し、これにより、ｖＷＦ関連疾患に伴う１つ以上の症状を低減させることを含む。特に、該ｖＷＦ関連疾患はＴＴＰである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＡＬＸ−００８１のために実施された標準的な６５時間の凍結乾燥プログラムの種々の工程を示すフローチャート。
【図２Ａ】−７０℃、＋５℃及び＋２５℃で１か月間及び２か月間保存した後のＡＬＸ−００８１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの関連部分；ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。
【図２Ｂ】３７℃で０、４及び８週間インキュベートした後のＡＬＸ−００８１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの関連部分の拡大表示。３７℃における延長されたインキュベーションの結果として（０、４、８週間）、ＲＰ−ＨＰＬＣのメインピークの分裂が観察される；ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。
【図３Ａ】凍結解凍（ＦＴ）サイクル前（ａ）並びに−２０℃（ｃ）及び−７０℃（ｂ）での１０回の凍結解凍（ＦＴ）サイクル後の、ブランククエン酸緩衝液（ｂｃｂ）と２０mMのクエン酸（ｐＨ７．０）中５５．９mg/mLのＡＬＸ−００８１のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルの重ね合わせ（λ＝２８０nm）。ランニング緩衝液で予め希釈された試料についてマイナーなクエン酸ピークが観察された；ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。
【図３Ｂ】＋４℃で±１週間保存した後のブランククエン酸緩衝液（ｂｃｂ）と２０mMのクエン酸（ｐＨ７．０）中５５．９mg/mLのＡＬＸ−００８１のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルの重ね合わせ（λ＝２８０nm）。ＡＬＸ−００８１は、インタクトな修飾されていないＡＬＸ−００８１に相当する１本のメインピーク（９７％）、及び、全表面積の僅か３％を示す小さなプレピークへと分離した。ランニング緩衝液中で予め希釈されたＡＬＸ−００８１について、マイナーなクエン酸ピークが観察された；ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。
【図４Ａ】＋２５℃において５０mMクエン酸ｐＨ６．０、５０mMクエン酸ｐＨ６．０＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）及び５０mMクエン酸ｐＨ６．０＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中において撹拌されたＡＬＸ−００８１試料の散乱強度。「＋」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．０中の試料を示し（ｙ＝０．００４４ｘ＋３．５９６２、Ｒ２＝０．９５４９）；「ｏ」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．０＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中の試料を示し（ｙ＝０．０００２ｘ＋１．０４４７、Ｒ２＝０．４６７３）；「ｘ」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．０＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中の試料を示す（ｙ＝０．０００４ｘ＋０．５１２５、Ｒ２＝０．６８０４）；（ｘ軸＝時間（秒）；ｙ軸＝散乱強度）。
【図４Ｂ】＋２５℃において５０mMクエン酸ｐＨ６．５、５０mMクエン酸ｐＨ６．５＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）及び５０mMクエン酸ｐＨ６．５＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中において撹拌されたＡＬＸ−００８１試料の散乱強度。「＋」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．５中の試料を示し（ｙ＝０．００４１ｘ＋４．７６６７、Ｒ２＝０．９４３１）；「ｏ」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．５＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中の試料を示し（ｙ＝０．０００４ｘ−０．０２０８、Ｒ２＝０．９３９１）；「ｘ」は、５０mMクエン酸ｐＨ６．５＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中の試料を示す（ｙ＝０．０００１ｘ−１．８８５３、Ｒ２＝０．０３７６）；（ｘ軸＝時間（秒）；ｙ軸＝散乱強度）。
【図５】＋４０℃（ａ）及び−７０℃（ｂ）において１か月間保存した後、Ｄ−ＰＢＳ＋２００mMグリシン＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０中５mg/mLのＡＬＸ−００８１のｃＩＥＦプロファイルの重ね合わせ；（λ＝２８０nm）。ＡＵ：吸光度単位。ｐｘｌｐｏｓ：ピクセル単位。
【図６Ａ】ミリＱ水を用いて再構成する前（パネルＡ）及び後（パネルＢ）の凍結乾燥させたＡＬＸ−００８１製剤（形態３＝クエン酸／スクロースｐＨ６．０；形態７＝クエン酸／スクロースｐＨ６．５；形態１７＝Ｄ−ＰＢＳ／グリシン）の写真。
【図６Ｂ】ミリＱ水を用いて再構成する前（パネルＡ）及び後（パネルＢ）の凍結乾燥させたＡＬＸ−００８１製剤（形態３＝クエン酸／スクロースｐＨ６．０；形態７＝クエン酸／スクロースｐＨ６．５；形態１７＝Ｄ−ＰＢＳ／グリシン）の写真。
【図７】クエン酸／スクロースを基剤とした凍結乾燥ＡＬＸ−００８１製剤の写真。
【図８Ａ】１５、２０、２５、３０、４０及び５０mMのクエン酸ｐＨ６．５を含有する２８mg/mLのＡＬＸ−００８１液体製剤を＋２５℃（パネルＡ）又は＋５℃（パネルＢ）において４日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液（５０mM）が基準として含まれる。
【図８Ｂ】１５、２０、２５、３０、４０及び５０mMのクエン酸ｐＨ６．５を含有する２８mg/mLのＡＬＸ−００８１液体製剤を＋２５℃（パネルＡ）又は＋５℃（パネルＢ）において４日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液（５０mM）が基準として含まれる。
【図９Ａ】１５mMクエン酸ｐＨ６．５と種々の量のスクロース及びＴｗｅｅｎ−８０とを含有する、２０mg/mLのＡＬＸ−００８１液体製剤を＋２５℃（パネルＡ）又は＋５℃（パネルＢ）において４日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液（５０mM）が基準として含まれる。
【図９Ｂ】１５mMクエン酸ｐＨ６．５と種々の量のスクロース及びＴｗｅｅｎ−８０とを含有する、２０mg/mLのＡＬＸ−００８１液体製剤を＋２５℃（パネルＡ）又は＋５℃（パネルＢ）において４日間保存した後の写真。ブランクのクエン酸緩衝液（５０mM）が基準として含まれる。
【図１０】＋５℃で保存した場合の、時間の関数としての、凍結乾燥ＡＬＸ−００８１医薬品中のピログルタメートのパーセントの予測。
【図１１】＋２５℃で保存した場合の、時間の関数としての、凍結乾燥ＡＬＸ−００８１医薬品中のピログルタメートのパーセントの予測。
【００３８】
５．発明の詳細な説明
特記しない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術及び操作を実施することができ、それは当業者には明らかであるように、それ自体公知の方法で実施されている。例えば、本明細書に記載された標準的な便覧及び一般的な背景技術、さらに、そこで引用されている参考文献；並びに、例えば、タンパク質工学技術、例えばアフィニティ成熟、及び、免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術を記載した、以下の概説：Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43に再度言及する。
【００３９】
今回驚くべきことに、ｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１（配列番号１）を、ヒトに特定の投与処方計画で投与することができることが判明した。ｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１は、投与終了時直ちに急速に作用を発現して、薬力学的作用を生じ、その効力を約１２〜２４時間維持することが判明した。さらに、ｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１（配列番号１）は、健康な男性の試験志願者において良好な耐容性を示し、かつ安全であることが判明した。これらの結果は、ｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１（配列番号１）は、待機的な経皮的冠動脈形成術（また、本明細書において以後、「ＰＣＩ」）を受けている安定狭心症患者における急性処置に、及び、血栓性血小板減少性紫斑病（また、本明細書において以後、「ＴＴＰ」）患者の処置に適している。
【００４０】
それにも関わらず、ヒトレシピエントに投与されたｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１（配列番号１）の現行の製剤は、改善可能であった。
【００４１】
本明細書に記載のｖＷＦ結合剤、特にＡＬＸ−００８１についての改質発明により、溶解度が上昇し（８０mg/mLまで）かつ液体中での保存安定性が有意に向上した（例えば、新規製剤の保存時に、その液体状態で元来の製剤より少ない酸化が起こる）新規なクエン酸／スクロースを基剤とした製剤となった。また、凍結乾燥型では、＋４０℃で１２か月間保存した後又はさらには＋４０℃で２４か月間保存した後でさえも、酸化又はａｓｐ異性化は実質的に全く検出できなかった。少量のピログルタメートの残留形成は依然として観察された。クエン酸及びスクロース濃度のさらなる最適化により、凍結乾燥製品の水分含量は減少し、これにより、残留ピログルタメート形成速度は最小限となった。
【００４２】
従って、本発明は、抗ｖＷＦ結合剤（例えばＡＬＸ−００８１）の安定な液体製剤及び凍結乾燥製剤、並びに、ｖＷＦ関連疾患を治療又は予防するためのその使用を提供する。
【００４３】
５．１  本発明のポリペプチド（群）
本発明に使用されるｖＷＦ結合剤は、典型的には、ヒトフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ、配列番号２０）に結合するタンパク質又はポリペプチドである。好ましくは、ｖＷＦ結合剤は、少なくとも１つの免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含む又はからなるタンパク質又はポリペプチドである。さらにより好ましくは、本発明のｖＷＦ結合剤は、配列番号１〜１９、最も好ましくは配列番号１を含む又はからなるタンパク質又はポリペプチドである。ｖＷＦ結合剤は、ＰＣＩを受けているＡＣＳ患者の補助的療法として、又は血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置として使用され得る。「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「アミノ酸配列」という用語は、本明細書において同義語として使用される。従って、本発明のアミノ酸配列はｖＷＦ結合剤である。
【００４４】
従って、例えば、本発明に使用するための適切なｖＷＦ結合剤は、表Ａ−１中の化合物、例えば配列番号１〜１９の化合物、又は、表Ａ−１の化合物に対して８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一率を有する化合物を含み得る（「配列同一率」については定義の章を参照されたい）。
【００４５】
好ましくは、本発明に使用するためのｖＷＦ結合剤は、１２Ａ０２Ｈ１様化合物である。本明細書の目的のための１２Ａ０２Ｈ１様化合物は、１２Ａ０２Ｈ１（すなわち配列番号１９）を含む化合物、又は、１２Ａ０２Ｈ０１（配列番号１９）に対して８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一率（本明細書においてさらに定義されているような）を有する化合物である。特に好ましいｖＷＦ結合剤はＡＬＸ−００８１（配列番号１）である。
【００４６】
上記の全てのｖＷＦ結合剤は、文献から周知である。これは、その製造を含む（特に、例えば国際公開公報第２００６／１２２８２５号を、しかしまた国際公開公報第２００４／０６２５５１号も参照されたい）。例えば、ＡＬＸ−００８１は、例えば、国際公開公報第２００６／１２２８２５号又は国際公開公報第２００９／１１５６１４号に記載されているように調製される。
【００４７】
特記されない限り、「免疫グロブリン配列」（本明細書においては、重鎖抗体又は慣用的な４本鎖抗体を指すために使用される）という用語は、完全なサイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、ドメイン又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインをそれぞれ含むがそれに限定されるわけではない）の両方を含む一般的な用語として使用されている。抗原結合分子又は抗原結合タンパク質という用語は、免疫グロブリン配列と互換的に使用され、これは免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（登録商標）を含む。
【００４８】
本発明の実施態様は、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）である免疫グロブリン配列；より具体的には、慣用的な４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は抗体重鎖に由来する重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨＨ配列）に関する。
【００４９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン又はその適切なフラグメント上に存在し、単一免疫グロブリンドメイン又はその適切なフラグメントによって形成された分子と定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「慣用的な」免疫グロブリン又はそのフラグメントとは異なる。典型的には、慣用的な免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は相互作用して抗原結合部位を形成している。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計で６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与する。
【００５０】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインによって形成される。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲ、例えば１、２、又は３つのＣＤＲによって形成される。
【００５１】
従って、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする、慣用的な免疫グロブリン又はそのフラグメントを含まない。これはまた、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」又は「含有する」本発明の実施態様についても該当する。本発明の脈絡において、このような実施態様は、慣用的な免疫グロブリン又はそのフラグメントを除外する。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」又は「含有する」組成物は、例えば、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む構築物に関し得る。あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメイン以外のさらに他の構成成分、例えば様々な種類の補助物質、タンパク質タグ、着色剤、色素などが存在してもよい。しかし、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインによって形成される慣用的な免疫グロブリンのフラグメントを含む。
【００５２】
本発明によると、本発明のポリペプチド、より具体的には免疫グロブリン配列は、以下の１つ以上からなり得るか又は含み得（ドメイン抗体、又はドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、又は単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、又はｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸配列、又はナノボディ（登録商標）（ＶＨＨ配列、例えばヒト化ＶＨＨ配列又はラクダ化ＶＨ配列を含むがそれに限定されるわけではない））、それは好ましくはナノボディ（登録商標）である。
【００５３】
本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの適切なフラグメントを包含する。免疫グロブリン単一可変ドメインの「適切なフラグメント」は、天然の免疫グロブリン単一可変ドメインよりも少ないアミノ酸を含有するが、依然として抗原結合活性を示す（よって、通常、本明細書においてさらに記載されているような、少なくとも１つのＣＤＲを形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含有する）ポリペプチドに関する。このような免疫グロブリン単一可変ドメイン及びフラグメントは、最も好ましくは、免疫グロブリンの折り畳みを含むか、又は、適切な条件下で、免疫グロブリンの折り畳みを形成することができる。より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びそのフラグメントは、標的抗原に結合することができるようなものである。従って、免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又はその適切なフラグメント；或いは重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）又はその適切なフラグメントを；それが単一の抗原結合単位（すなわち、例えば、別の可変ドメインと例えばＶＨ／ＶＬ相互作用を通して相互作用して機能的抗原結合ドメインを形成する必要のある例えば慣用的な抗体及びｓｃＦｖフラグメントに存在する可変ドメインの場合のように、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能的抗原結合単位を形成する必要がないような、免疫グロブリン単一可変ドメインから実質的になる機能的抗原結合単位）を形成することができる限り含むことができる。
【００５４】
本発明の免疫グロブリン配列は、好ましくは、実質的に単離形である。本発明の免疫グロブリン配列はまた、本発明の１つ以上のアミノ酸配列を含み得るか又は実質的にからなり得、場合によりさらに、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）を含み得る、本発明のタンパク質又はポリペプチド（本明細書において定義されているような）の一部を形成し得る。例えばであって限定するものではないが、本発明の１つ以上のアミノ酸配列は、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用され得、これは、場合により、結合単位としての役目を果たし得る１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含有していてもよく、よって、それぞれ本発明の一価、多価又は多重特異的ポリペプチド（全て本明細書に記載されている）を与え得る。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた実質的に単離形であり得る。
【００５５】
本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、及びラクダ免疫グロブリン配列を含む、様々な起源の免疫グロブリン配列に関する。本発明はまた、完全なヒト、ヒト化又はキメラ免疫グロブリン配列を含む。例えば、本発明は、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化ドメイン抗体、例えばWard et al（例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号及びDavies and Riechmann (1994 and 1996)参照）によって記載のようなラクダ化ｄＡｂを含む。さらに、本発明は、例えば多価及び／又は多重特異的構築物を形成している融合免疫グロブリン配列（１つ以上のＶＨＨドメインを含有する多価及び多重特異的ポリペプチド並びにその調製について、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 7346-7350, 2001、並びに、例えば国際公開公報第９６／３４１０３号及び国際公開公報第９９／２３２２１号も言及する）、及び、本発明の免疫グロブリン配列から誘導可能である、タグ又は他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む免疫グロブリン配列を含む。サメの免疫グロブリン単一可変ドメインも記載されている（例えば国際公開公報第０３／０１４１６１号又はStreltsov, 2005に記載されているように「ＩｇＮＡＲｓ」とも呼ばれる）。
【００５６】
特定の実施態様において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（登録商標）、特にラクダＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、又はラクダ化ＶＨドメインである。当業者は、ＶＨＨドメインのヒト化及び／又はＶＨドメインのラクダ化について十分に知っているだろう。
【００５７】
免疫グロブリン配列、特にナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列及び構造は、４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ領域」から構成されると考えられ得るがこれに限定されるわけではなく、これらは当技術分野において及び本明細書において「フレームワーク領域１」すなわち「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」すなわち「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」すなわち「ＦＲ３」；及び、「フレームワーク領域４」すなわち「ＦＲ４」とそれぞれ称され；そのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」によって分断され、これらは当技術分野において「相補性決定領域１」すなわち「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」すなわち「ＣＤＲ２」；及び、「相補性決定領域３」すなわち「ＣＤＲ３」と称される。
【００５８】
ナノボディ（登録商標）におけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０の領域にあり得、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかし、ナノボディ（登録商標）の部分、フラグメント、類似体又は誘導体（本明細書においてさらに記載されているような）は、このような部分、フラグメント、類似体又は誘導体が、本明細書に概略を示したさらなる必要条件を満たし、かつまた好ましくは本明細書に記載の目的に適している限り、その長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意されたい。
【００５９】
従って、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）からなるか又は実質的にからなる、アミノ酸配列であろう。この脈絡において「実質的にからなる」は、例えば精製又は標識のために使用されるタグなどの追加の配列が存在し得るが、このような追加の配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインそれ自体と比較して少なく、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合活性には干渉しないことを意味する。
【００６０】
本明細書において使用されるような「免疫グロブリン配列」又は「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列、及びポリペプチドそれ自体の両方を指す。これ以上の限定された意味は具体的な内容から明らかとなろう。
【００６１】
特に、本発明のアミノ酸配列は、ナノボディ（登録商標）又はその適切なフラグメントであり得る。ＶＨＨ及びナノボディのさらなる説明のために、Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302のMuyldermansによる概説記事；並びに、一般的な背景技術として記載されている以下の特許出願：ブリュッセル自由大学の国際公開公報第９４／０４６７８号、国際公開公報第９５／０４０７９号及び国際公開公報第９６／３４１０３号；ユニリーバの国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第９９／３７６８１号、国際公開公報第００／４０９６８号、国際公開公報第００／４３５０７号、国際公開公報第００／６５０５７号、国際公開公報第０１／４０３１０号、国際公開公報第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、及び国際公開公報第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)の国際公開公報第９７／４９８０５号、国際公開公報第０１／２１８１７号、国際公開公報第０３／０３５６９４号、国際公開公報第０３／０５４０１６号、及び国際公開公報第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.及びAblynx N.V.の国際公開公報第０３／０５０５３１号；カナダ国立研究機関による国際公開公報第０１／９０１９０号；Institute of Antibodiesによる国際公開公報第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；並びに、Ablynx N.V.による国際公開公報第０４／０４１８６７号、国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第０４／０４１８６５号、国際公開公報第０４／０４１８６３号、国際公開公報第０４／０６２５５１号、国際公開公報第０５／０４４８５８号、国際公開公報第０６／４０１５３号、国際公開公報第０６／０７９３７２号、国際公開公報第０６／１２２７８６号、国際公開公報第０６／１２２７８７号及び国際公開公報第０６／１２２８２５号、並びに、Ablynx N.V.によるさらに他の公開された特許出願に言及する。また、これらの出願に記載されたさらなる先行技術、特に、国際出願の国際公開公報第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載された参考文献のリストに言及し、これらのリスト及び参考文献は参照により本明細書に組み入れられる。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び特にヒト化ナノボディ）は、特に、１つ以上のフレームワーク配列中の１つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって特徴付けられ得る。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、並びに、他の修飾、部分又はフラグメント、誘導体又は「ナノボディ融合物」、多価構築物（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）、並びに、ナノボディ及びその調製物の半減期を延長するための様々な修飾をはじめとする、ナノボディのさらなる記載が、例えば国際公開公報第０７／１０４５２９号に見い出され得る。
【００６２】
本発明によって提供される免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは単離形又は実質的には単離形である。本発明の免疫グロブリン配列はまた、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ場合によりさらに、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）を含み得る、本発明のタンパク質又はポリペプチドの一部を形成し得る。例えばであって限定するものではないが、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用され得、これは場合により、結合単位としての役目を果たし得る１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含んでいてもよく、よって、それぞれ一価、多価、又は多重特異的な本発明のポリペプチド（全て本明細書に記載されている）をもたらし得る。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた、単離形又は実質的に単離形であり得る。従って、本発明によると、免疫グロブリン単一可変ドメインは、上記に概略が示されているような、単一ドメインの形で２つ以上の抗原結合単位を含む構築物を含む。例えば、同じ又は異なる抗原特異性を有する２つ（又はそれ以上）の免疫グロブリン単一可変ドメインを連結させて、例えば、二価、三価、又は多価の構築物を形成することができる。２つ以上の特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを合わせることによって、二重特異的、三重特異的などの構築物を形成することができる。例えば、本発明によるポリペプチドは、標的Ａに対する２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、及び標的Ｂに対する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得、これによりそれはＡに対しては二価、Ｂに対しては一価となる。当業者が容易に想定することができるこのような構築物及びその修飾は、本発明によって全て包含される。特定の実施態様において、本発明は、同じ標的抗原内の異なるエピトープに対する少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、二重パラトープ構築物に関する。
【００６３】
全てのこれらの分子はまた、「本発明のポリペプチド」とも称され、これは、本発明の
免疫グロブリン配列」又は「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同義語である。
【００６４】
さらに、本明細書において使用される「配列」という用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語において使用される）は一般的に、内容からより限定された解釈が必要とされない限り、関連アミノ酸配列、並びに、それをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
【００６５】
本発明の１つの非限定的な実施態様によると、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ（登録商標）又はポリペプチドはグリコシル化されている。本発明の別の非限定的な実施態様によると、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ（登録商標）又はポリペプチドはグリコシル化されていない。
【００６６】
５．２  抗原への「結合」
本発明は、本明細書において定義されているような抗原、例えばフィンヴィルブランド因子に結合することができる及び／又はそれに対して親和性を有する、免疫グロブリン配列に関する。本発明の脈絡において、特定の抗原に「結合する及び／又はそれに対して親和性を有する」は、例えば、抗体及びそのそれぞれの抗原の脈絡において理解されているような当技術分野における通常の意味を有する。
【００６７】
本発明の特定の実施態様において、「に結合する及び／又はそれに対して親和性を有する」という用語は、免疫グロブリン配列が抗原と特異的に相互作用することを意味し、これは該抗原「に対する」免疫グロブリン配列の同義語として使用される。
【００６８】
「特異性」という用語は、特定の免疫グロブリン配列、抗原結合分子、又は抗原結合タンパク質（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）が結合することのできる様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合力に基づいて決定され得る。抗原と抗原結合タンパク質の解離についての平衡定数（ＫＤ）によって示される親和性は、抗原決定基と、抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である：ＫＤ値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度は強くなる（あるいは、親和性はまた、親和性定数（ＫＡ）として表わすことができ、これは１／ＫＤである）。当業者には明らかであろうように（例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて）、親和性は、対象の特異的抗原に依存して、それ自体公知の方法で決定され得る。結合力は、抗原結合分子（例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合強度の尺度である。結合力は、抗原決定基と、抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。
【００６９】
典型的には、本発明の免疫グロブリン配列（例えば、本発明のアミノ酸配列、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ（登録商標）、及び／又はポリペプチド）は、１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）、その抗原に結合し、及び／又は、１０２Ｍ−１ｓ−１から約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１から１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１から約１０７Ｍ−１ｓ−１、例えば１０５Ｍ−１ｓ−１から１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度で本明細書に定義されているようなその抗原に結合し；及び／又は、１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）から１０−６ｓ−１（数日間のｔ１／２を有するほぼ不可逆的な複合体を与える）、好ましくは１０−２ｓ−１から１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１から１０−６ｓ−１、例えば１０−４ｓ−１から１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ速度で本明細書に定義されているようなその抗原に結合する。
【００７０】
１０−４Ｍを超える任意のＫＤ値（又は１０４Ｍ−１より低い任意のＫＡ値）が、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。
【００７１】
好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン配列は、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満、例えば５００pM未満の親和性で所望の抗原に結合する。
【００７２】
抗原又は抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばスキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイをはじめとするそれ自体公知の任意の適切な方法、及び当技術分野においてそれ自体公知であるその様々な変法；並びに、本明細書に記載の他の技術で決定され得る。
【００７３】
解離定数（ＫＤ）は、当業者には明らかであるように、実際又は見かけの解離定数であり得る。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、これには例えば、本明細書に記載の技術が挙げられる。これに関して、１０−４モル／リットル又は１０−３モル／リットル（例えば１０−２モル／リットル）を超える解離定数を測定することは不可能であり得ることも明らかである。場合により、これも当業者には明らかであるように、（実際の又は見かけの）解離定数は、［ＫＤ＝１／ＫＡ］の関係性を用いて、（実際又は見かけの）解離定数（ＫＡ）に基づいて計算することができる。
【００７４】
親和性は、分子相互作用の強度又は安定性を示す。親和性は、一般的に、ＫＤすなわち解離定数として示され、その単位はモル／リットル（又はＭ）である。親和性はまた、１／ＫＤに等しい会合定数ＫＡとしても表すことができ、その単位は（モル／リットル）−１（又はＭ−１）である。本明細書において、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、免疫グロブリン配列、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ナノボディ（登録商標）、又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は、主に、それらの相互作用のＫＤ値で表され；ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を鑑み、そのＫＤ値による分子相互作用の強度の特定を、対応するＫＡ値を算出するのに使用することも可能であることは、当業者にとって明らかであろう。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）という周知の関係性により結合自由エネルギー（ＤＧ）に関連しているので、ＫＤ値は熱力学的意味でも分子相互作用の強度を特徴付ける。
【００７５】
有意（例えば特異的）と判断される、本明細書に定義されているようなｖＷＦと本発明の免疫グロブリン配列との結合などの、生物学的相互作用についてのＫＤは、典型的には、１０−１０Ｍ（０．１nM）〜１０−５Ｍ（１００００nM）の範囲内である。相互作用が強くなればなるほど、そのＫＤは小さくなる。
【００７６】
ＫＤはまた、ｋｏｆｆとして示される複合体の解離速度定数と、ｋｏｎとして示されるその会合速度の比として表すことができる（よって、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ、及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。解離速度ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１である（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。会合速度ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。
【００７７】
本発明の免疫グロブリン配列に関しては、会合速度は１０２Ｍ−１ｓ−１から約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変動し得、二分子間相互作用に関する拡散律速会合速度定数に近似し得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所与の分子相互作用の半減期に関連する。本発明の免疫グロブリン配列の解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日間であるほぼ不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変動し得る。
【００７８】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が公知の様々な技術、例えば周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（例えば、Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照）を介して測定することができる（該技術では、１つの分子をバイオセンサーチップ上に固定し、他の分子をフロー条件下で固定された分子上を通過させ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの測定値、従ってＫＤ（又はＫＡ）値を得る）。これは、例えば、周知のビアコア機器を使用して実施することができる。
【００７９】
測定プロセスが、例えばバイオセンサー上への１つの分子のコーティングに関連したアーチファクトによって、示唆される分子の固有の結合親和性に何らかの影響を及ぼす場合には、測定されたＫＤは見かけのＫＤに相当し得ることも、当業者には明らかであろう。また、１つの分子が他の分子に対する１つ以上の認識部位を含有する場合にも、見かけのＫＤが測定され得る。このような状況においては、測定された親和性が、２つの分子による相互作用の結合力によって影響を受ける場合がある。
【００８０】
親和性を評価するために使用され得る別のアプローチは、Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985)の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）手順である。この方法により、溶液相の結合平衡の測定が確立され、プラスチックなどの支持体上への分子のうちの１つの吸着に関連する考えられ得るアーチファクトが回避される。
【００８１】
しかし、ＫＤの正確な測定は極めて多大な労力を要する場合があり、結果として２つの分子の結合強度を評価するために、見かけのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫した方法で行なわれている限り（例えばアッセイ条件を一定に維持して）、見かけのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、従って、本明細書においてＫＤ及び見かけのＫＤには等しい重要性又は関連性があるとして扱われるべきであることに留置されたい。
【００８２】
最後に、多くの状況において、経験豊富な科学者は、いくつかの基準分子と比較して結合親和性を決定するのが好都合であると判断することができることに留置すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合することが知られており、かつＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）における容易な検出のために、フルオロフォア又は発色団基、又は他の化学的部分、例えばビオチン、或いは他のフォーマット（蛍光検出用のフルオロフォア、吸光検出用の発色団、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用のビオチン）を用いて適切に標識された、基準分子Ｃを使用することができる。典型的には、基準分子Ｃを固定濃度に維持し、Ｂの所与の濃度又は量に対してＡの濃度を変化させる。結果として、Ａの非存在下でＣについて測定されたシグナルが半分となる、ＩＣ５０値がＡの濃度に対応して得られる。基準分子のＫＤであるＫＤ ｒｅｆ並びに基準分子の総濃度Ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋Ｃｒｅｆ／ＫＤ ｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に関する見かけのＫＤを得ることができる。Ｃｒｅｆ＜＜ＫＤ ｒｅｆであれば、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤に関して一貫して（例えばＣｒｅｆを一定にして）実施されるのであれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強度又は安定性を評価することができ、またこの測定値は、本明細書を通じてＫＤ又は見かけのＫＤと同等であると判断される。
【００８３】
５．３  標的抗原
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ｖＷＦに結合及び／又はそれに対して親和性を有する。本発明の脈絡において、「ｖＷＦ」は、カニクイザル、ヒヒ、ブタ、モルモット、ブタ、マウス、及び／又はヒトのｖＷＦ、最も好ましくはヒトｖＷＦ、すなわち配列番号２０又はＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０００５４３を含むがそれに限定されるわけではない。
【００８４】
５．４  免疫グロブリン配列の具体的な実施態様
本発明は、国際公開公報第２００４／０１５４２５号、国際公開公報第２００４／０６２５５１号、国際公開公報第２００６／０７４９４７号、国際公開公報第２００６／１２２８２５号、国際公開公報第２００９／１１５６１４号、又は国際公開公報第２０１１／０６７１６０号（全て本出願人名）に開示されている方法に記載の、又はその方法によって得ることのできる免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。本発明はまた、これらのアミノ酸配列の最適化変異体を包含する。一般的には、本発明によるアミノ酸配列の「最適化変異体」は、１つ以上の有益な置換、例えば、ｉ）「ヒト化」の程度、ｉｉ）化学的安定性、及び／又はｉｉｉ）発現レベルを増加させる置換などを含む変異体であり；国際公開公報第２００６／１２２８２５号の実験部に記載のような例えば効力アッセイによって測定される効力は依然として、野生型１２Ａ０２（国際公開公報第２００６／１２２８２５号に定義されている）に対して同等（すなわち１０％以下の逸脱）、又はこれもまた国際公開公報第２００６／１２２８２５号において定義されている変異体１２Ａ０２Ｈ１（配列番号１９）に対して同等である。好ましくは、１２Ａ０２の野生型配列と比較して、本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つのこのような置換、好ましくは少なくとも２つのこのような置換、好ましくは少なくとも３つのヒト化置換、好ましくは少なくとも１０個のこのようなヒト化置換を含む。
【００８５】
特定の態様において、本発明のアミノ酸配列は、野生型配列１２Ａ０２と比較して、合計して１〜１５、好ましくは２〜１４、例えば９〜１３、例えば１０、１１又は１２個のアミノ酸置換を含む。記載されているように、これらの差異は好ましくは少なくとも、１つ、好ましくは少なくとも２つ、例えば３つ、４つ、又は５つ、又は１０個のヒト化置換を含み、場合により、１つ以上のさらなる置換（例えば、本明細書に記載されているようなさらなる置換（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つ、又はそのいずれか２つ以上の任意の適切な組合せ）を含み得る。ここでも、本明細書の開示に基づいて、場合により僅かな程度の試行錯誤の後に、当業者は、１つ以上のこのような適切なヒト化置換及び／又はさらなる置換（の適切な組合せ）を選択することができるだろう。
【００８６】
本発明は、本明細書に与えられた具体例のいずれかに、又は上記の参考文献によって定義されているような具体例のいずれかに対して非常に類似しているポリペプチド配列を包含する。非常に類似とは、少なくとも９０％、例えば９５、９７、９８、又は９９％のアミノ酸同一率を意味する。非常に類似しているポリペプチド配列は、それらが由来している配列と同じ機能を有する、すなわち、それらはｖＷＦに結合する、より具体的にはｖＷＦに結合して、ｖＷＦと血小板との間の相互作用を阻害する。
【００８７】
特定の実施態様において、本発明は、配列番号１〜１９のいずれか１つ、特に配列番号１に非常に類似した配列に関する。しかし、本明細書に定義されているような製剤における各変異体についての配列の安定性が評価されなければならず、本発明は特に、本明細書において定義されているような製剤において安定である変異体又は非常に類似した配列に言及する。
【００８８】
本発明のポリペプチド配列を作製するための方法は幅広く知られており、例えば、組換え発現又は合成が挙げられる。当業者は、適切な発現技術、例えば適切な組換えベクター及び宿主細胞、例えば細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞をよく知っている。当業者はまた、適切な精製技術及びプロトコールもよく知っている。
【００８９】
５．５  本発明の製剤
本発明は、安定であり、好ましくは医薬品の調製を含む薬学的用途に適した、ｖＷＦに対するポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）、又は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドの製剤を提供する。
【００９０】
ｖＷＦ結合剤、例えばＩＳＶＤの製剤は、ＩＳＶＤ、凍結保護剤及び／又は凍結乾燥保護剤の役目を果たし得る化合物、並びに緩衝液を含む。製剤のｐＨは、一般的には、ｐＨ５〜７．５である。実施態様によっては、製剤は液体として保存される。他の実施態様において、製剤は液体として調製され、その後、保存前に例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥させる。乾燥させた製剤（すなわち凍結乾燥物）は、乾燥化合物、例えばエアゾール又は粉末として使用することができるか、或いは、例えば水、緩衝液、又は他の適切な液体（希釈剤）を使用してその元来の濃度又は別の濃度へと再構成することができる。
【００９１】
ｖＷＦ結合剤の精製プロセスは、例えば凍結させた液体としての長期保存に適した、及び／又はその後の凍結乾燥（例えばクエン酸／スクロース製剤を使用して）に適した製剤へとｖＷＦ結合剤を転換させることを可能とするように設計される。製剤を、特定の濃度のタンパク質、例えばｖＷＦ結合剤と共に凍結乾燥させる。その後、凍結乾燥製剤を、必要に応じて適切な希釈剤（例えば水）を用いて再構成して、元来の製剤成分を再度可溶化して所望の濃度に、一般的には、凍結乾燥前の濃度と比較して同じ又はより高い濃度にすることができる。凍結乾燥させた製剤を再構成して、最初に凍結乾燥させた液体の容量と比較して凍結乾燥物に加える希釈剤の量に依存して、元来の濃度（すなわち凍結乾燥前）とは異なる濃度を有する製剤を作製することができる。ｖＷＦ結合剤の完全性の１つ以上のパラメーターをアッセイすることによって適切な製剤を同定することができる。アッセイされたパラメーターは、一般的には、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）による高分子量（ＨＭＷ）種の比率又は低分子量（ＬＭＷ）種の比率である。
【００９２】
従って、本発明は、適切な純度によって特徴付けられ、例えば薬学的目的のために必要とされる適切な濃度の製剤を提供する。製剤は、広範囲の濃度、広範囲の保存条件（例えば温度、例えばストレスのかかった条件、例えば高温（例えば＋２５℃又はそれ以上）、凍結乾燥、振とう、又は他の形態の物理的ストレス）で安定形である、本明細書に定義されているような、ポリペプチド、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを提供する。
【００９３】
製剤は、水性担体を含む。水性担体は特に緩衝液である。
【００９４】
しかし、本発明はまた、液体製剤のさらなる加工によって得ることのできる製品、例えば凍結製品、凍結乾燥製品、又は噴霧乾燥製品も包含する。再構成時に、これらの固体製品は、本明細書に記載のような液体製剤となり得る（しかしこれに限定されるわけではない）。それ故、その最も広義な意味において、「製剤」という用語は、液体及び固体の両方の製剤を包含する。しかし、固体製剤は、液体製剤から（例えば、凍結、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって）得ることができると理解され、従って、本明細書の液体製剤について明記された特色によって規定される様々な特徴を有する。本発明は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥前の元来の組成物から誘導された組成物に至る再構成を除外しない。
【００９５】
本発明の製剤は、少なくとも１つのｖＷＦ結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、本明細書において定義されているような少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施態様において、該製剤は、配列番号１〜１９、好ましくは配列番号１から選択された１つ以上のポリペプチドを含む。該ポリペプチドはさらに、例えば、構築物の半減期を延長することのできる血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメイン（これは、任意の適切な血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインであり得る）（血清アルブミン結合ペプチド又は結合ドメインを含まない同構築物と比較して）を組み込むことによって半減期が延長され得、特に、出願人による国際公開公報第２００８／０６８２８０号（及び特に国際公開公報第２００９／１２７６９１号及び国際公開公報第２０１１／０９５５４５号、どちらも出願人による）に記載の血清アルブミン結合ペプチド、又は血清アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば血清アルブミン結合ナノボディ；例えば、Ａｌｂ−１又はヒト化形のＡｌｂ−１、例えばＡｌｂ−８、それは例えば国際公開公報第０６／１２２７８７号に言及されている）であり得る。これもまた本発明によって包含される半減期を延長するための代替的な手段は、例えば、当技術分野において広く知られているＰＥＧ化（ＰＥＧ）、例えば部位特異的又はランダムなＰＥＧ化、好ましくは部位特異的ＰＥＧ化を含む。５０００を超える、例えば１０，０００〜２００，０００、好ましくは２０，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧを使用することができる。半減期延長の任意の態様において、本明細書において定義されるポリペプチドの活性は損なわれない、例えば、半減期の延長されていない同ポリペプチドの活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を保持すると考えられる。活性は、例えば、標的抗原への結合、及び／又はバイオアッセイにおける効力に関連し得る。当業者はまた、選択された半減期延長技術が、それが免疫原性を高めないか又はさらには低下させないという点で適切であることを確認するだろう。
【００９６】
５．５．１  緩衝液
本発明の製剤は、クエン酸又はリン酸緩衝液の少なくとも１つから選択された緩衝液、好ましくはクエン酸緩衝液を含む。特定の実施態様において、クエン酸緩衝液は、クエン酸一水和物及びクエン酸三ナトリウム二水和物、例えば０．２１５４ｇ/Ｌのクエン酸一水和物及び５．５８０５ｇ/Ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物を使用して調製される。非限定的な例において融解温度を測定することによって決定したところ、これらの緩衝液は、他の試験した緩衝液と比較してｖＷＦ結合剤の安定性を増強する。
【００９７】
本発明による製剤は、５〜２００mM、例えば５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００mM、好ましくは５〜１００mM、より好ましくは７．５〜８０mM、さらにより好ましくは１０〜５０の範囲、例えば１０、１５、２０、２５又は３０mM、最も好ましくは２０mMの濃度のクエン酸緩衝液を含み、各値は、場合により±５mMの範囲を包含すると理解される。本発明による製剤は、５〜２００mM、例えば５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００mM、好ましくは５〜８０mM、より好ましくは７．５〜６０mM、さらにより好ましくは１０〜４０の範囲、例えば１０、１５、２０、２５、又は３０mM、最も好ましくは１０mMの濃度のリン酸緩衝液を含み得、各値は、場合により±５mMの範囲を包含すると理解される。より低い濃度の緩衝液は、最終浸透圧に対して作用を及ぼし、従って、添加されなければならない場合がある追加の溶質に対して作用を及ぼすと理解されるだろう。
【００９８】
本発明の製剤のｐＨは５．０〜７．５の範囲内にあり、各値は、±０．２の範囲を包含すると理解される。本発明の製剤についての好ましいｐＨ値の具体例は、５．０、５．５、５．８、６．０、６．２、６．５、６．７、７．０、７．１、７．２、又は７．５、好ましくは６．０〜７．０、より好ましくは６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、又は６．９、例えば６．５のｐＨを含む非限定的なリストから選択され得、各値は、場合により±０．２の範囲を包含すると理解される。
【００９９】
意外なことに、クエン酸及びリン酸緩衝液は、例えばヒスチジン及びトリス−ＨＣｌ緩衝液と重なるｐＨ範囲を有するが、安定性を支える。
【０１００】
最も有利なｐＨは、製剤に含まれる緩衝液に依存するだろう。従って、本発明は、特に、６．５〜７．５の範囲、好ましくは６．９、７．０、７．１、例えば７．１のｐＨを有する、リン酸緩衝液を含む製剤に関する。
【０１０１】
クエン酸緩衝液を含む製剤は、保存及び使用にとって著しく適切であったことが示された。しかし、従来の知恵とは対照的に、クエン酸緩衝液を含む液体製剤は、約６．０のｐＨで最も安定であり、一方、クエン酸緩衝液を含む凍結乾燥製剤は、約６．５のｐＨで最も安定であった。従って、本発明は、６．０〜７．０、より好ましくは６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、又は６．９、例えば６．５のｐＨを有するクエン酸緩衝液を含む製剤に関し、各値は、場合により±０．２の範囲を包含すると理解される。
【０１０２】
５．５．２  濃度
本発明の製剤は、臨床用途に適した濃度（患者に使用する前に希釈するための原液に使用される濃度を含む）の、本明細書に定義されているようなｖＷＦ結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチドを含む。改善された安定化とは別に、本発明の製剤は、より高濃度のｖＷＦ結合剤、例えばＩＳＶＤ又はポリペプチドを可能とする。特に、本発明の製剤は、目視、顕微鏡、ＳＥ−ＨＰＬＣ、及びＤＬＳによって確認したところ、物理学的に安定であり続け、すなわち、濁度及び／又は小粒子の形成がない。高温での長期間におよぶ保存及び繰り返しの凍結解凍サイクルは、これらの製剤におけるｖＷＦ結合剤の物理的安定性に影響を及ぼさないようであった。
【０１０３】
本発明の製剤における、活性作用物質、例えばｖＷＦ結合剤又は本発明のポリペプチドの典型的な濃度は、０．１〜８０mg/mL、好ましくは１〜７０mg/mL、５〜６０mg/mL、７．５〜５０mg/mL、又は１０〜４０mg/mLの範囲、例えば５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又は６０mg/mL、好ましくは１２．５mg/mL、又は１０mg/mLの非限定的な濃度の例を含み、各値は、場合により±２０％の範囲を包含すると理解される（例えば、１０という数値は、場合により８〜１２mg/mLの範囲を包含する）。
【０１０４】
５．５．３  賦形剤
本発明による製剤はまた場合により、１つ以上の賦形剤を含み得る。本明細書において使用される「賦形剤」という用語は、製剤に有益な物理的特性を与える該化合物のための希釈剤、ビヒクル、保存剤、凍結乾燥保護剤、結合剤、又は安定化剤として一般的に使用される不活性物質を指す。当業者は、凍結乾燥保護、安定化、防腐などの、製剤において特定の機能を有し得る、薬学的目的に適した賦形剤をよく知っているだろう。一般的に使用される安定化剤及び保存剤は、当業者には周知である（例えば国際公開公報第２０１０／０７７４２２号参照）。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容される担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースを基剤とした物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びラノリンを含むがそれに限定されるわけではない。有利な実施態様において、賦形剤は、ＮａＣｌ、トレハロース、スクロース、マンニトール、又はグリシンからなるリストから選択された１つ以上であり得る。
【０１０５】
本発明を理解すれば、当業者は、製剤に添加すべき賦形剤の適切な濃度を容易に決定することができる。例示的な実施態様において、ＮａＣｌは、１０〜５００mMの範囲、例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、１５０、２５０、又は５００mM、好ましくは５０〜１５０mM、例えば７５又は１４０mMの濃度を有し、各値は、場合により±５mMの範囲を包含すると理解され；及び／又は、マンニトールは、１〜１０％、好ましくは２〜４％、例えば２、３、又は４％（ｗ／ｗ）の濃度を有し、各値は場合により±０．５％の範囲を包含すると理解され；及び／又は、スクロースは、１〜１５％、好ましくは２〜１２％、又は４〜１０％、例えば４、５、６、７、８、又は９％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは７％の濃度を有し、各値は、場合により±０．５％の範囲を包含すると理解され；及び／又は、グリシンは、１０〜５００mMの範囲、例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１５０、２５０又は５００mM、好ましくは５０〜４００mM、７５〜３００mM、１００〜２５０mM、例えば１４０又は２００mMの濃度を有し、各値は場合により±５mMの範囲を包含すると理解され；及び／又はトレハロースは、１０〜５００mMの範囲、例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、１００、１５０、２５０、又は５００mM、好ましくは１００〜３００mM、１５０〜２８０mM、例えば１６０mM又は２６０mMの濃度を有し、各値は場合により±５mMの範囲を包含すると理解される。
【０１０６】
好ましい実施態様において、本発明の任意の態様による製剤は、ヒト血液に対して等張である。等張液は血漿と同じ浸透圧を有し、よって被験体の血漿の浸透圧を変化させることなく被験体に静脈内注入することができる。張度は、浸透圧で表わすことができ、これは、理論的な浸透圧、又は好ましくは実験的に決定された浸透圧であり得る。典型的には、浸透圧は、２９０±６０mOsm/kg、好ましくは２９０±２０mOsm/kgの範囲内である。
【０１０７】
従って、賦形剤（存在する場合）の選択において、当業者は緩衝液の濃度及び１つ以上の賦形剤の濃度を考慮し、好ましくは、上記に明記された範囲内の浸透圧を有する製剤に到達するだろう。当業者は、浸透圧を推定する計算をよく知っている（例えば国際公開公報第２０１０／０７７４２２号参照）。必要であれば、当業者はまたさらに、製剤の浸透圧を調整するための化合物を含めることができる。例示的な化合物としては、上記の賦形剤、及び／又はソルビトール、メチオニン、デキストロース、イノシトール、アルギニン、若しくはアルギニン塩酸塩の１つ以上が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【０１０８】
スクロースを含む製剤が、例えばポリペプチドの保存及び凍結解凍の最中の物理的安定性を維持するのに特に適していることが示された。従って、本発明は、約５〜９％、より好ましくは６〜８％、さらにより好ましくは７％のスクロースを含む製剤に関し、各値は、場合により±０．５％の範囲を包含すると理解される。
【０１０９】
本発明の製剤はまた、凍結解凍の最中に本発明のポリペプチドを保護するのに特に有用である化合物も含み得る。このような化合物はまた、凍結乾燥保護剤としても知られ、これは当業者には周知である。具体例としては、糖、例えばスクロース、ソルビトール又はトレハロース；アミノ酸、例えばグルタメート、特にグルタミン酸一ナトリウム、又はヒスチジン；ベタイン、硫酸マグネシウム、糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びその組合せが挙げられるがそれらに限定されるわけではない。本発明を理解することによって、添加されるこのような化合物の必要量は、液体型及び凍結乾燥を受ける時の製剤の安定性を考慮して当業者によって容易に決定され得る。凍結乾燥に特に適した製剤はさらに、増量剤を含み得る。適切な作用物質は、当業者には広く知られている。スクロースを含む製剤は、ｖＷＦ結合剤の保存及び凍結解凍の最中の物理的安定性を維持するのに特に適しているだけでなく、凍結乾燥保護剤としても適していたことが示された。
【０１１０】
５．５．４  洗浄剤
本発明のさらなる実施態様において、本発明の任意の態様による製剤はさらに、洗浄剤又は界面活性剤を含み得る。本発明に使用するのに適切な洗浄剤又は界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリソルベート−２０、−４０、−６０、−６５、−８０、又は−８５が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。ポリソルベートに対する一般的な商標名としては、Ａｌｋｅｓｔ、Ｃａｎａｒｃｅｌ、及びＴｗｅｅｎが挙げられる。当業者は、例えば国際公開公報第２０１０／０７７４２２号に列挙されているような、洗浄剤のさらなる非限定的な例を知っている。好ましい実施態様において、洗浄剤は非イオン性洗浄剤である。より具体的には、洗浄剤はポリソルベート−８０（本明細書において以後Ｔｗｅｅｎ−８０とも称される）である。当業者は、本発明の製剤に対する洗浄剤の適切な濃度を容易に決定することができる。典型的には、濃度は、製剤化されたｖＷＦ結合剤の凝集を減少させる剪断ストレス、例えば撹拌ストレス条件下で、洗浄剤の有益な効果、例えば安定化作用を維持しつつ、できるだけ低いものであろう。例示的で非限定的な実施態様において、洗浄剤の濃度は、０．００１〜０．５％の範囲、例えば０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、又は０．５％、好ましくは０．０１〜０．０５％、より好ましくは０．０１〜０．０２％、例えば０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度であり得る。
【０１１１】
５．５．５  組合せ
本発明の製剤において第５．５．１章〜第５．５．４章に上記された様々な実施態様を、制限なく組み合わせることができる。例えば、上限又は下限として上記に列挙された数値の任意の組合せを使用した数値の範囲が含まれることを意味する。しかし、製剤の好ましい非限定的な例としては、緩衝液がｐＨ約６．５、好ましくは２０mMの濃度のクエン酸緩衝液である製剤が挙げられ、該製剤はさらに、好ましくは約７％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロースを含み、場合によりさらに、好ましくは０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度の非イオン性洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０を含む。
【０１１２】
５．６  さらなる加工
概略が示されているように、上記の製剤のいずれかを、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、又は凍結、例えばバルク凍結によってさらに加工することができる。得られた加工された製品は、上記に定義されているような、出発液体製剤に由来する特徴を有する。必要であれば、追加の作用物質を、例えば凍結乾燥保護剤などをさらなる加工のために含めることができる。
【０１１３】
５．６．１  凍結
場合によっては、ｖＷＦ結合剤を含有する製剤を保存のために凍結させる。従って、該製剤は、このような条件下、例えば凍結解凍（ＦＴ）サイクル下で比較的安定であることが望ましい。製剤の適合性を決定する１つの方法は、試料製剤を、少なくとも２回、例えば３回、４回、５回、８回、１０回又はそれ以上の凍結（例えば−２０℃又は−７０℃で）及び解凍（例えば、２５℃の水浴中での急速な解凍又は＋２℃〜＋８℃での緩徐な解凍）サイクルにかけ、元来の製品に対する質量回収率と、ＦＴサイクル後に蓄積したＬＭＷ種及び／又はＨＭＷ種の存在及び／又は量とを決定し、それを、例えばＳＥ−ＨＰＬＣによってＦＴ手順前の試料に存在したＬＭＷ種又はＨＭＷ種の量と比較するというものである。ＬＭＷ種又はＨＭＷ種の増加は、低下した安定性を示す。
【０１１４】
５．６．２  凍結乾燥
製剤を凍結乾燥後に保存してもよい。それ故、凍結乾燥後の製剤のポリペプチド成分の安定性について製剤を試験することは、製剤の適合性を決定するのに有用である。該方法は、試料製剤を凍結ではなく凍結乾燥し、その元来の容量となるまで再構成し、ＬＭＷ種及び／又はＨＭＷ種の存在について試験することを除いて、凍結について上記したのと類似している。凍結乾燥試料製剤を、凍結乾燥させなかった対応する試料製剤と比較する。対応する試料と比較して凍結乾燥試料中のＬＭＷ種又はＨＭＷ種の増加は、凍結乾燥試料の低下した安定性を示す。一般的には、凍結乾燥プロトコールは、試料を凍結乾燥器（lyophilizer）又は凍結乾燥器（freeze-dryer）にローディング、予備冷却期間、凍結、真空開始、１回目の乾燥温度まで上昇、１回目の乾燥、２回目の乾燥温度まで上昇、２回目の乾燥、及び試料に栓をすることを含む。凍結乾燥のプロセスは当技術分野において周知であるが、様々な因子が、試料の凍結乾燥特徴（ガラス転移温度（Ｔｇ’）及び崩壊温度（Ｔｃ）を含む）を決める。凍結乾燥プロトコールのために選択され得るさらなるパラメーターとしては、真空（例えばミクロン単位）及び冷却器の温度が挙げられる。
【０１１５】
適切な温度の上昇速度は、約０．１℃／分〜２℃／分、例えば０．１℃／分〜１．０℃／分、０．１℃／分〜０．５℃／分、０．２℃／分〜０．５℃／分、０．１℃／分、０．２℃／分、０．３℃／分、０．４℃／分、０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分、及び１．０℃／分である。凍結乾燥サイクルにおける凍結中の適切な棚温度は、一般的に、約−５５℃〜−５℃、−２５℃〜−５℃、−２０℃〜−５℃、−１５℃〜−５℃、−１０℃〜−５℃、−１０℃、−１１℃、−１２℃、−１３℃、−１４℃、−１５℃、−１６℃、−１７℃、−１８℃、−１９℃、−２０℃、−２１℃、−２２℃、−２３℃、−２４℃、又は−２５℃である。棚温度は、１回目の乾燥と２回目の乾燥で異なり得、例えば、１回目の乾燥は、２回目の乾燥より低い温度で行なうことができる。非限定的な例において、１回目の乾燥は０℃で又は代替的には＋５℃で、２回目の乾燥は＋２５℃で実施することができる。場合によっては、凍結の最中及び真空開始前にアニーリングプロトコールを使用する。このような場合、アニーリング温度を選択しなければならず、温度は一般的に組成物のガラス転移温度より高い。一般的に、アニーリング時間は、約２〜２０時間、約３〜１９時間、約２〜１０時間、約３〜５時間、約３〜４時間、約２時間、約３時間、約５時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１５時間、又は約１９時間である。アニーリング温度は、一般的に、約−３５℃〜約−５℃、例えば約−２５℃〜約−８℃、約−２０℃〜約−１０℃、約−２５℃、約−２０℃、約−１５℃、約０℃、又は約−５℃である。場合によっては、アニーリング温度は、一般的に、−３５℃〜＋５℃、例えば−２５℃〜−８℃、−２０℃〜−１０℃、−２５℃、−２０℃、−１５℃、０℃、＋５℃である。
【０１１６】
本明細書に記載の製剤の安定性を、−２５℃〜＋３０℃の１回目の乾燥棚温度、及び０℃〜＋３０℃の２時間〜３３時間の２回目の乾燥期間をはじめとする、様々な凍結乾燥パラメーターを使用して試験することができる。２回目の乾燥温度は、活性医薬成分の分解を引き起こすことのない、できるだけ高温であるべきである。
【０１１７】
本発明の製剤に使用される賦形剤は、好ましくは、以下のパラメーターの１つ以上を満たすべきである：薬理学的に不活性である；加工の必要条件に適合できる；患者による十分な耐容性が示される；活性物質を損傷しない；可溶性で吸着可能な製品を与える；常温保存可能な製品を与える；及び、商業的に許容される製品を与える。
【０１１８】
１つの実施態様において、本発明の製剤は、例えば図１又は表１４に概略が示されているように凍結乾燥によって調製される。
【０１１９】
クエン酸／スクロースを基剤とした製剤の凍結乾燥は、ｖＷＦ結合剤の安定性を劇的に向上させることが実証された。特に、クエン酸／スクロースを基剤とした製剤は、液体型で起こる化学的修飾を実質的に防ぐが、少量のピログルタメートの形成は例外である。意外なことに、クエン酸濃度を下げ、同時にスクロース濃度を上昇させることにより、化学的安定性は向上し、例えば、ピログルタメート形成は減少する。ｖＷＦ結合剤は、極限の製品温度まで凍結乾燥させた後も頑強であることが実証された。実際に、安定性プロファイルは、様々な凍結乾燥サイクルを使用して調製された物質において同一であった。
【０１２０】
一般的に、凍結乾燥サイクルは、１０時間から１００時間、例えば２０時間から８０時間、３０時間から７０時間、４０時間から６０時間、４５時間から５０時間、５０時間から６６時間行なうことができる。
【０１２１】
非限定的な例において、２０mMクエン酸、７％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ６．５中１２．５mg/mLのタンパク質濃度のｖＷＦ結合剤の製剤をバルクで製剤化しかつ凍結乾燥させた。
【０１２２】
本発明の製剤の保存のための温度範囲の非限定的な例は、約−２０℃〜約＋５０℃、例えば約−１５℃〜約＋４０℃、約−１５℃〜約＋３０℃、約−１５℃〜約＋２０℃、約＋５℃〜約＋２５℃、約＋５℃〜約＋２０℃、約＋５℃〜約＋１５℃、約＋２℃〜約＋１２℃、約＋２℃〜約＋１０℃、約＋２℃〜約＋８℃、約＋２℃〜約＋６℃、又は約＋２℃、＋３℃、＋４℃、＋５℃、＋６℃、＋７℃、＋８℃、＋１０℃、＋１５℃、＋２５℃、＋３０℃、又は＋４０℃である。保存温度にも関わらず、特定の場合において、試料は、保存中に一過性に起こり得る温度変化、及びこのような組成物について予想され得る輸送条件の下で安定である。
【０１２３】
本明細書に定義される本発明の製剤を用いて研究することによって、活性物質の十分な保持及び迅速な溶解に適した粒径を示す、結果として生じる乾燥粉末を得ることが可能であることが確立された。本発明による乾燥製剤は、加工、最終仕上げ、保存、及び施薬を通じて安定かつ均一であり続ける粒子を含む。該製剤は常温保存可能かつさらさらして流動性であり、その最終容器に分注されても問題を全く呈さず、患者による投与が簡単である。
【０１２４】
５．６．３  噴霧乾燥
場合によっては、製剤を噴霧乾燥させ、その後、保存する。噴霧乾燥は、当技術分野において公知の方法を使用して実施され、またこれを改変して、液体又は凍結噴霧乾燥（例えば、Niro Inc. (Madison, WI)、Upperton Particle Technologies (Nottingham, England)、又は米国特許公開公報第２００３／００７２７１８号及び第２００３/００８２２７６号、又はBuchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY)の方法などの方法を使用して）を使用することができる。
【０１２５】
５．６．４  希釈剤
本明細書に記載の凍結乾燥製剤は、必要に応じて、凍結乾燥型を適切な希釈剤と混合して、元来の製剤成分を所望の濃度まで再度可溶化することによって再構成され得る。本明細書において使用される「希釈剤」という用語は、本明細書に記載のような適切な濃度に変化又は到達するための、薬学的に許容される（ヒトへの投与に対して安全かつ無毒性である）溶媒を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水（例えば注射用水、ミリＱ水）、食塩水、ブドウ糖、デキストロース、リンガー液、及び水性緩衝溶液が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【０１２６】
５．７  医薬組成物
本発明の製剤は、好ましくは、動物又はヒトの生体の治療法に使用するのに適している。従って、本発明は、本発明の任意の態様に記載の又は本発明の任意の方法若しくはプロセスによって得ることのできるポリペプチド製剤を含む、医薬組成物又は診断用組成物に関する。
【０１２７】
本発明の製剤は、好ましくは、医薬製剤である。特に、該製剤は、ヒトへの非経口投与、例えば皮下、静脈内、筋肉内、皮内、又は腹腔内投与、好ましくは静脈内又は皮下投与に適している。投与は、液体製剤を投与するあらゆる方法、特に注射を包含する。例えば埋め込み可能な器具、微量注入ポンプ（場合により埋め込み可能）、及び／又は（埋め込み可能な）持続放出製剤、例えば沈着物、ゲル、生分解性ポリマー製剤を介した他の形態の全身投与も本発明の範囲内である。医薬組成物は、製造中及び保存中に無菌かつ安定である。なぜなら、ｖＷＦ結合剤の誘導体／分解産物は臨床の場では望ましくないからである。該組成物はまた高純度であり、例えば、細菌の産生物、例えばＬＰＳの存在が排除される。該製剤を、任意の適切な手段、例えば滅菌ろ過、放射線照射、及びその組合せなどによって滅菌することができる。好ましくは、医薬組成物を、非経口投与（特に静脈内、動脈内、又は経皮）に適応させる。静脈内投与が特に重要であると考えられる。好ましくは、ｖＷＦ結合剤は、非経口剤形、最も好ましくは静脈内剤形及び皮下剤形である。
【０１２８】
医薬製剤として適切であるために、本発明の製剤は、典型的には、適切な容量比の本発明のポリペプチド（すなわち活性作用物質）を含む。例えば、皮下注射のための活性作用物質の濃度は、静脈内注射用の製剤と比較して、より少ない容量で必要な薬学的用量を投与できるように、より高濃度であり得る。しかし、実施態様によっては、活性作用物質の濃度は、皮下又は静脈内注射と同一であり、本明細書に定義されているような例示的な範囲内であり得る。
【０１２９】
実施態様によっては、本発明の製剤は、追加の作用物質、例えば追加の活性作用物質、賦形剤、安定化剤、保存剤、例えば抗菌剤などを含み得る。
【０１３０】
本発明の製剤は、好ましくは、それを必要とする患者に適用される投与量である。それにも関わらず、特定の投与形態及び投与量は、患者の個別事項、特に年令、体重、生活習慣、活動レベル、及び全身の病状を必要に応じて考慮に入れながら、担当の医師によって選択され得る。より具体的には、ＡＬＸ−００８１は、２４時間の投与間隔で静脈内又は皮下に投与される。さらにより好ましくは、ＡＬＸ−００８１は、例えばＲＩＰＡ、すなわちリストセチン誘導血小板凝集（Favaloro EJ. Clin Haematol 2001; 14: 299-319）及び／又はリストセチンコファクター血小板凝集アッセイ（Howard MA, Firkin BG. Ristocetin - a new tool in the investigation of platelet aggregation. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1971; 26: 362-9）によって測定される凝集活性を考慮して、２４時間投与間隔で静脈内又は皮下に投与される。例えば、凝集活性がその後の６時間の間に、ＲＩＰＡによって測定したところ１０％以下に留まっている又はＲＩＣＯによって測定したところ２０％以下に留まっていると推定される場合には（臨床的に関連した阻害）、さらなる用量を投与しない。
【０１３１】
しかし、一般的にｖＷＦ結合剤の用量は、様々な因子、例えば活性成分の有効性及び作用持続時間、温血種、並びに／又は温血動物の性別、年齢、体重及び個々の状態に依存し得る。
【０１３２】
通常、用量は、１回量のｖＷＦ結合剤が、例えば、インビトロの結果に基づいて、又はカニクイザルにおける亜慢性毒性を試験する用量漸増試験の結果に基づいて推定されるようなものである。このような前臨床データセットに基づいて、ｖＷＦ結合剤についての開始用量及びその後の漸増用量を決定することができる。例えば、用量は、０．５〜５０mg、特に１〜３０mgであり、体重が約７５（＋／−３０）kgである温血動物に投与される（しかし、同様にこの標準とは異なっていてもよい）。所望であれば、この用量はまた、いくつかの、場合により均等な分割用量で摂取してもよい（「mg」は処置しようとする哺乳動物（ヒトを含む）１体あたりの薬物のmgを意味する）。
【０１３３】
上記の用量（１回量として投与されるか（これは１つの実施態様である）又は何回かの分割用量で投与されるかのいずれかである）は、例えば６時間毎に１回、１２時間毎に１回、又は１日１回、上記のように繰り返され得る。換言すれば、医薬組成物は、連続６時間の療法からより長期の間隔をあけた投与療法までの処方計画で投与されてもよい。
【０１３４】
好ましくは、ｖＷＦ結合剤は、本明細書においてＡＬＸ−００８１について示唆されているようにＰＣＩを必要とする患者における補助的処置に使用されるのと同じ桁の用量で投与される。例えば、好ましい１２Ａ０２Ｈ１を含有するｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１及びその機能的変異体について、約０．５〜約４０mg、好ましくは約１〜約３５mg、又は約２〜約３０mg、さらにより好ましくは約３〜約２５mg、又は約４〜約２０mg、又は約５〜約１７．５mg、又はさらには約６〜約１６mg、又は約７．５〜約１５mg、又はさらには約１０〜約１４mgの範囲、より好ましくは約１０、約１２．５又は約１３．８mgのｖＷＦ結合剤の用量が、ヒト患者における急性処置に使用され得る。
【０１３５】
１回量単位剤形の製剤は、好ましくは、約０．５〜約４０mg、好ましくは約１〜約３５mg、又は約２〜約３０mg、さらにより好ましくは約３〜約２５mg、又は約４〜約２０mg、又は約５〜約１７．５mg、又はさらには約６〜約１６mg、又は約７．５〜約１５mg、又はさらには約１０〜約１４mg、より好ましくは約１０、約１２．５、又は約１３．８mgの活性成分を含み、１回量単位剤形ではない製剤は、好ましくは、約０．５〜約４０mg、好ましくは約１〜約３５mg、又は約２〜約３０mg、さらにより好ましくは約３〜約２５mg、又は約４〜約２０mg、又は約５〜約１７．５mg、又はさらには約６〜約１６mg、又は約７．５〜約１５mg、又はさらには約１０〜約１４mg、より好ましくは約１０、約１２．５、又は約１３．８mgの活性成分を含む。
【０１３６】
非経口投与用の医薬調製物は、例えば、アンプルなどの単位投与剤形のものである。それらは、それ自体が公知の方法で、例えば、慣用的な混合、溶解、又は凍結乾燥プロセスによって調製される。
【０１３７】
非経口製剤は、ＰＣＩの部位などで様々な点で、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、又は好ましくは静脈内で効果的である、特に注射液である。このような液体は、好ましくは、使用前に、例えば、活性成分を単独で又は薬学的に許容される担体と一緒に含む凍結乾燥させた調製物又は濃縮物から調製することのできる、等張水溶液又は懸濁液である。医薬調製物は滅菌されていてもよく、並びに／又は、例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩、及び／又は緩衝液などの補助剤を含んでいてもよい。
【０１３８】
経皮適用に適した製剤は、有効量の活性成分を担体と共に含む。有利な担体としては、宿主の皮膚を通過するのを助ける吸収可能な薬理学的に許容される溶媒が挙げられる。特徴的には、経皮デバイス（device）は、裏当て部分（backing member）と、場合により担体と共に化合物を含有するレザバーと、場合により予め定められた制御速度で長期間にわたって活性成分を宿主の皮膚へ送達する速度制御バリアーと、該デバイスを皮膚に固定するための手段とを含む包帯の形態である。
【０１３９】
以下の表は、本発明のクエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液を基剤とした製剤のいくつかの非限定的な例を提供する。全ての製剤を、所望であれば適切な賦形剤を添加することによって２９０±６０mOsm/kgの浸透圧へと調整することができる。製剤は、本発明のポリペプチドのいずれか１つ以上、例えば配列番号１〜１９、特に配列番号１を含むことができる。
【０１４０】
【表１】
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【０１４１】
この表中の緩衝液の濃度は、場合により±５mMを包含することが理解される。ｐＨ値は、場合により±０．２を包含することが理解される。上記の各々の緩衝液は、例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、１５０、２５０、又は５００mMの濃度の例えばＮａＣｌ；例えば２、３又は４％（ｗ／ｖ）の濃度のマンニトール；例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、１５０、２５０、又は５００mMの濃度のグリシン；例えば２５、３０、４０、５０、６０、７０、１００、１５０、２５０、又は５００mM^の濃度のトレハロース、及び例えば４、５、６、７、８、又は９％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース、及び／又は０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、又は０．５％（ｖ／ｖ）の濃度の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０から選択された１つ以上の賦形剤と組み合わせることができる。
【０１４２】
５．８  本発明の効果
本発明は、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号１〜１９、特に配列番号１の安定な製剤を提供する。「安定な」は、一般的に、免疫グロブリン単一可変ドメインが、長期間、例えば１か月〜３６か月間保存した時に、たとえ、１つ以上の化学的若しくは物理的ストレス、例えば高温（＋２５℃であるかそれ以上）、又は物理的ストレス、例えば振とう若しくは撹拌に曝されたとしても、有意な物理的又は化学的変化を被らないことを意味する。より特定すると、「安定な」は、（定義されているような）条件下で（定義されているような）長期間かけて保存した場合に、本発明のポリペプチドの１つ以上の分解産物、例えば低分子量（ＬＭＷ）誘導体（フラグメント）；及び／又は、化学的誘導体若しくは改変体、例えばピログルタメート変異体；及び／又は、例えば凝集によって形成された高分子量（ＨＭＷ）誘導体（オリゴマー又はポリマー）の（定義されているような）形成がほんの僅かであることを意味する。
【０１４３】
当業者は、タンパク質サイズを評価するための技術、例えばサイズ排除クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ、又は化学的誘導体の形成を評価するための技術、例えば逆相ＨＰＬＣをよく知っている。当業者はまた、このような分析を実施するための一般的に使用される装置及びソフトウェアツールもよく知っている。例えば、当業者は、例えば相対的ピーク面積の点からクロマトグラフィーの実行を分析するための一般的に使用されるソフトウェアを知っている。例としては、ChemStationソフトウェアの具備されたAgilent 1200 HPLCシステム（Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B）又はChromeleonソフトウェアの具備されたDionex Ultimate 3000 HPLCシステム（Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8）が挙げられる。
【０１４４】
タンパク質、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの安定性を評価するために使用することのできる一般的な技術としては、静的光散乱、タンジェンシャルフローろ過、フーリエ変換赤外分光法、円二色性、尿素誘起タンパク質アンフォールディング、内因性トリプトファン蛍光、及び／又は１−アニリン−８−ナフタレンスルホン酸タンパク質結合が挙げられる。さらに、本発明の製剤は、保存の経過中、及び／又は本明細書に定義されているような１つ以上のストレスの影響下で殆ど又は全く効力／生物学的活性の減少を示さない。生物学的活性及び／又は効力は、例えば国際公開公報第２００６／１２２８２５号に記載のように決定することができる。
【０１４５】
５．８．１  熱的安定性
本発明の製剤は、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメインの高熱安定性をもたらすことによって特徴付けられる。熱安定性は、例えば、融解温度（Ｔｍ）を決定することによって評価することができる。融解温度を決定するために適切な技術は公知であり、これには例えば本明細書に記載のような例えばサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）が挙げられる。より具体的には、本発明の製剤は、他の製剤と比較して、ＴＳＡによって決定されるような免疫グロブリン単一可変ドメインのＴｍの上昇をもたらす。この効果は、実験章の表１に例示されている。
【０１４６】
実験章から確認することができるように、高い熱的安定性、すなわち高いＴｍは、保存に対する安定性の指標として捉えることができる。
【０１４７】
本発明によると、本発明の製剤は、幅広い範囲のｐＨ値におよび、例えばクエン酸緩衝液では６．０〜７．０、及びリン酸緩衝液では６．５〜７．５におよびＴｍに対してプラスの影響を及ぼす。Ｔｍに対する最も有益な効果は、ｐＨ６〜７、特にｐＨ６．５±０．２のクエン酸緩衝液、及びｐＨ６．５〜７．５、特にｐＨ７．１±０．２のリン酸緩衝液について観察され得る。
【０１４８】
賦形剤の添加は、Ｔｍに対してさらなる正又は負の効果を及ぼし得る（表１）。例えば、トレハロースは、（特定の緩衝液の脈絡において）例えば１５０mM〜３００mMの間でＴｍを上昇させることができる。また、マンニトール又はスクロースも、Ｔｍに対して明確に正の効果を及ぼした。これらの賦形剤は、本発明の特定の実施態様において、例えば増量剤又は凍結乾燥保護剤が有益である製剤において用途を見出し得る。これらの例示的な実施態様は、単独で又はマンニトール若しくはスクロースと組み合わせて、さらに公知の凍結乾燥保護剤又は増量剤の使用を排除しない。
【０１４９】
本明細書の実験章によって証明されているように、ＴＳＡによって決定されるようなＴｍは、ｖＷＦ結合剤、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの安定性の価値ある指標としての役目を果たす。
【０１５０】
５．８．２  機械的ストレスに対する安定性
本発明の製剤は、撹拌、振とう又は剪断ストレスなどの機械的ストレスに対する高い安定性によって特徴付けられる。機械的ストレス下での安定性を評価するための可能なアッセイは、分光蛍光光度計での５００nmの散乱シグナルのモニタリング又は例えば３４０nmでのＵＶ分光光度法を介してである。散乱又はＵＶ吸収度の増加は、凝集体の形成を反映する。凝集体が形成されると（ＨＭＷ）、経時的な増加は線形曲線を描き、その勾配（散乱強度／時間、又は吸光度単位／秒）を決定することができる。好ましくは、本発明の製剤は、０．０００６未満、例えば０．０００５未満、例えば０〜０．０００４の勾配によって特徴付けられる（図４Ａ及びＢ参照）。
【０１５１】
クエン酸緩衝液を含む製剤が特に好ましく、例えば上記に定義されているような撹拌後のタンパク質回収率に対して正の効果を及ぼす。例えば、質量回収率は、少なくとも９０％、９５％、９８％、又は１００％である。タンパク質回収率は、例えば撹拌によって試料にストレスをかける前のタンパク質総含量と比較して決定される。リン酸緩衝液を含む製剤により、上記に定義されているような撹拌後に少なくとも７５％、８０％、８５％、又はさらにはそれ以上の回収率がもたらされる。
【０１５２】
５mg/mLという例示的であって非限定的な濃度においては、本発明の製剤は、Ｔｗｅｅｎの非存在下における撹拌に応答して可逆的な凝集体を形成するだけである。従って、本発明の製剤は、機械的なストレス下で不可逆的な凝集体の形成を防ぐ。従って、本発明のさらなる実施態様において、本発明の製剤は、例えば上記に定義されているような濃度の、例えば０．０１％〜０．０２％（ｖ／ｖ）の濃度の、上記に定義されているような非イオン性洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０を含み得る。洗浄剤の添加はさらに、製剤の物理的安定性を向上させることができる。例えば、５mg/mLという非限定的な例示的な濃度において、洗浄剤の添加は、例えば分光蛍光光度計での５００nmの散乱シグナルのモニタリング又はＵＶ分光光度法（３４０nm）によって決定されるような（可逆的及び不可逆的な）凝集体の形成を防ぐことができる（図４Ａ及びＢ）。
【０１５３】
本発明の製剤の物理的安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣによっても実証することができる。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの種々の非限定的な製剤は、オリゴマー（ＨＭＷ）又は分解産物（ＬＭＷ）を形成することなく、機械的ストレス、例えば撹拌ストレスに耐えることができる。本発明の製剤は、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって１．５時間撹拌した後に決定されるように、分解又はオリゴマー化を伴うことなく安定であり続ける。
【０１５４】
どの製剤においても、オリゴマー化又は分解（例えばＲＰ−ＨＰＬＣ（分解のみ）又はＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルによって決定されるような）は全く検出されない。従って、本発明の好ましい実施態様によると、該製剤はクエン酸緩衝液を含み、例えば上記されているような条件下で、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又はさらには約１００％の回収率を示し、回収率は、例えば、ストレスをかけていない試料と比較して、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣによって決定される。有利には、クエン酸緩衝液の脈絡における賦形剤はスクロースであり得、上記に定義されているような回収率は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又はさらには約１００％である。
【０１５５】
５．８．３  液体製剤の安定性試験
５．８．３．１  保存安定性
本発明の液体製剤は、例えば−７０℃、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃の温度で、例えば１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間保存した場合に良好な安定性を与える。最も有益な結果は、表５に例示されているようなクエン酸緩衝液を基剤とした製剤を用いて得ることができる。
【０１５６】
当業者は、＋２５℃での、より特定すると＋４０℃での保存は、ストレスのかかった保存条件を示すことをさらに認識しているだろう。このような条件は、不安定性のあらゆる兆候、例えば化学的又は物理的不安定性を増加及び加速すると予想される。従って、例えば＋２５℃又は＋４０℃における比較的短期間の保存は、穏やかな条件下（例えば＋５℃又は凍結）での長期間の保存安定性についての良い指標を与える。
【０１５７】
５．８．３．２  タンパク質回収率の観点からの保存安定性
例えば、本発明の製剤は、−７０℃〜＋４０℃の温度で保存した後に少なくとも９５％、例えば少なくとも９６、９７、９８、９９、又はさらには約１００％のタンパク質回収率を与える。タンパク質回収率は、−７０℃に保たれた基準試料と比較して、表５に例示されているように、タンパク質を定量する任意の公知の手段によって、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣによって決定することができる。これらの結果は、例えば、指定された温度で１か月間、１．５か月間、３か月間、６か月間、９カ月間、１２か月間、１８か月間、２４か月間、３０か月間、又はさらには３６カ月間の保存後に、観察することができる。
【０１５８】
５．８．３．３  化学的誘導体／分解産物の観点からの保存安定性
さらに、本発明の製剤は、例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるようなピークサイズの化学的誘導体、例えばピログルタメート変異体の産生を５．０％未満という最小限とする（表５参照）。このタイプの分析においては、所与のピークの面積を、クロマトグラムの総面積と比較し、相対的面積を各ピークに割り当てる。当業者は、クロマトグラムを分析するための適切な分析手段、例えば適切なソフトウェアを知っている（具体的で非限定的な例としては、ChemStationソフトウェアの具備されたAgilent 1200 HPLCシステム（Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B）又はChromeleon ソフトウェアの具備されたDionex Ultimate 3000 HPLCシステム（Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8）が挙げられる）。従って、好ましくは、ピログルタメート変異体は、−７０℃〜＋４０℃、例えば＋４０℃の温度で保存した時に、例えば上記に定義されているような期間、例えば１か月間保存した後に、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるような、５％未満、好ましくは４．６％未満、例えば４．５％未満、４．３％未満、４．２％未満、４．０％未満、又はさらには３．８％未満のピーク面積を与える。
【０１５９】
本発明の製剤はまた、−７０℃〜＋４０℃の温度での上記に定義されているような保存期間にわたる、例えば１か月間にわたる、酸化、例えば酸化産物（例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって決定される）の形成を最小限とする（表５参照）。従って、本発明の製剤により、−７０℃〜＋４０℃の温度、例えば＋４０℃での保存時に、例えば、上記に定義されているような期間、例えば１か月間におよぶ保存後に、３％未満、好ましくは２．７％未満、好ましくは２．５％未満、例えば２．３％未満、２．２％未満、例えば２．０％未満、又はさらには例えば１．７％又は１．５％未満のピーク面積を有する酸化変異体（例えばＲＰ−ＨＰＬＣによって決定される）が得られる。
【０１６０】
５．８．３．４  オリゴマー化の観点からの保存安定性
本発明の製剤はまた、−７０℃〜＋４０℃の保存温度で上記に定義されているような保存期間、例えば１か月間の後に、明瞭な可溶性のオリゴマー物質は全く形成されないか（例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって定義される）；又は、−７０℃〜＋４０℃の保存温度で、例えば＋４０℃で上記に定義されているような保存期間、例えば１か月間の後に、１％未満、好ましくは０．５％未満、例えば０．３％の可溶性オリゴマー物質が形成される（例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって定義される）ような、保存安定性を与える。
【０１６１】
本発明はまた、−７０℃又は＋４０℃で、上記に定義されているような保存期間、例えば１か月間の保存後に、依然として０．１５以下、好ましくは０．１以下である、吸光度値［（１００×Ａ３４０）／（Ａ２８０−Ａ３４０）］によって決定されるような凝集係数を与える効果を有する。
【０１６２】
５．８．３．５  主産物の回収率に反映されるような保存安定性
本発明の製剤は、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ（表５参照）によって決定されるような主産物のピーク面積が、−７０℃〜＋４０℃で上記に示された保存期間後、例えば１か月後に、約９０％であるか；又は、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ（表５参照）によって決定されるような主産物のピークが、少なくとも８５％以上、例えば８６％、８７％、又は８８％であるような効果を有する。より好ましくは、メインピークは、−７０℃〜＋４０℃、例えば＋４０℃での上記に示された保存期間後、例えば１か月後に、９０％、９２％又は９５％、例えば少なくとも９７％、より好ましくは１００％であるか；或いは、例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって決定されるような主産物のピークが、−７０℃〜＋４０℃、例えば＋４０℃での上記に示された保存期間後、例えば１か月後に、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又はさらには約１００％である。
【０１６３】
本発明による製剤はまた、−７０℃〜＋２５℃で１〜３か月間、例えば２０mg/mL以下の濃度で保存した後に、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるようなメインピーク面積が、保存前の製剤と比較して未変化のままであり、かつ、全ピークの少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を示すという効果を有し、基準試料は、例えば９５％のメインピークを有する。＋４０℃で１か月間保存すると、本発明の製剤は、少なくとも８０％、８５％、又は９０％；２か月間の保存後には少なくとも８０％又は８５％、３か月間の保存後には少なくとも７５％又は８０％のＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるメインピークを保持する。
【０１６４】
さらに、ｃＩＥＦによって決定されるように、本発明の製剤は、−７０℃〜＋４０℃の温度で１〜３か月間、例えば２０mg/mL以下の濃度で保存した後、基準試料（保存されていない製剤、メインピークは少なくとも９８％である）と同等な主産物の回収率をもたらす効果を有し、例えばメインピークは少なくとも８５％以上、例えば８６％、８７％、又は８８％である。より好ましくは、メインピークは、−７０℃〜＋４０℃での保存後に、９０％、９２％、又は９５％、例えば少なくとも９７％、より好ましくは１００％である。
【０１６５】
５．８．３．６  凍結解凍条件下の安定性
経時的に一定に保たれているか（例えば＋５℃で保存）又は１回のＦＴサイクル（例えば−２０℃又は−７０℃で保存）を含む保存条件下において製剤の安定性を与えることとは別に、本発明のさらなる効果は、反復ＦＴサイクル条件下での安定性である。凍結状態から液体状態への転移及びその逆は、免疫グロブリン単一可変ドメインに対して特にストレスの多い条件を課す。
【０１６６】
本発明の製剤はまた、ＦＴ条件下で良好な安定性を与える効果も有する。例えば、本発明の製剤は、−７０℃と室温（例えば＋２５℃）との間の、又は−２０℃と室温との間の例えば１０回のＦＴサイクルにかけることができる。該製剤に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣによって確認されるように、有意な劣化を伴うことなく、これらの条件に耐えるだろう。本発明の製剤の種々の非限定的な実施態様に対する反復ＦＴサイクルの作用を評価し、全ての場合において、ｖＷＦ結合剤、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性が保存されたことが判明した。全回収率は９５〜１００％の範囲内、好ましくは少なくとも９５、９８又は９９％であった。種々のピークの相対的な比率は、１回だけのＦＴサイクルにかけられた対照と比較して未変化のままであった。
【０１６７】
より具体的には、５mg/mL〜２０mg/mLの濃度において、１０回のＦＴサイクルにより回収率を得た（ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣのいずれかによって決定されるような、例えばポリペプチドのピーク総面積、すなわちＡＵに基づいて決定され、これは少なくとも９０％、９５％、９８％、又は１００％である；特定の実施態様において、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、基準試料と比較して未変化であった（１回のＦＴサイクル））。
【０１６８】
５．８．３．７  効力の観点からの安定性
当業者は、ｖＷＦ結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には配列番号１〜１９のいずれか１つ、例えば配列番号１に記載のポリペプチドの効力を決定するための様々な方法を知っている（例えば、国際公開公報第２００６／１２２８２５号の実験章、例えば実施例３〜６、１８、及び１９、又は国際公開公報第２００９／１１５６１４号の実験章を参照）。
【０１６９】
１つの実施態様において、本発明のポリペプチドの効力を、慣用的なアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ビアコア、ＲＩＡ、ＦＡＣＳなどによって、その抗原に対する結合によって決定することができる。
【０１７０】
ｖＷＦ結合剤の効力は、ストレスのかかった条件下で、すなわち＋４０℃で４週間の保存下で試験されたように、本発明の製剤において依然として許容された。
【０１７１】
５．８．３．８  適合性の観点からの安定性
本発明の製剤はまた、一連の様々な希釈剤と適合性である。例えば、該製剤は、免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的安定性に影響を及ぼすことなく、このような希釈剤と混合／希釈することができる。
【０１７２】
従って、本発明の製剤はまた、本明細書において定義されるような幅広い濃度におよび安定性を与える。
【０１７３】
５．８．３．９  安定化効果の要約
本発明の製剤は、−７０℃〜＋２５℃の温度で長期間の保存後でさえ、例えば上記に定義されているような期間の後でさえ、本発明のポリペプチドの化学的及び物理的完全性を維持する効果を有する。
【０１７４】
−７０℃で１か月間の本明細書に定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、特にＡＬＸ−００８１の保存は、どの本発明の製剤についても、特に実験章において試験された非限定的な緩衝液の例についても、その物理化学的特徴に影響を及ぼさなかった。保存は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ又はｃＩＥＦプロファイルに対して有意な作用を及ぼさなかった。
【０１７５】
５．８．４  凍結乾燥製剤の安定性試験
さらに、本発明は、特に凍結乾燥にとって有用である、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書において定義されているような免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号１〜１９、好ましくは配列番号１の安定な製剤を提供する。本発明の製剤には、凍結乾燥後に改善された溶解度及び改善された保存安定性がもたらされた。
【０１７６】
５．８．４．１  保存安定性
本発明の製剤は、凍結乾燥後に、例えば−７０℃、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃の温度で、例えば１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０又は３６か月間保存した場合に、良好な安定性を与えることができる。最も有益な結果は、クエン酸緩衝液を基剤とした製剤、例えば実験章に例示されているような製剤３及び７を用いて得ることができる（例えば、良好なケーキ形成、及び眼に見える崩壊の兆候なし、図６）。当業者は、以下の考察において、好ましい数値は、例えば表８に例示されているようなクエン酸緩衝液の組成物を反映することを認識することができる。
【０１７７】
当業者はまた、＋２５℃での、より特定すると＋４０℃での保存は、ストレスのかかった保存条件を示すことを認識しているだろう。このような条件は、不安定性、例えば化学的又は物理的不安定性のあらゆる兆候を増加及び加速すると予想される。従って、例えば＋２５℃又は＋４０℃における比較的短期間の保存は、より穏やかな条件下（例えば＋５℃又は凍結）でのより長期間の保存安定性に関する良好な指標を与える。
【０１７８】
５．８．４．２  タンパク質回収率の観点からの保存安定性
例えば、本発明の製剤は、凍結乾燥後に、−７０℃〜＋４０℃の温度で保存した後に、少なくとも９５％、例えば少なくとも９６、９７、９８、９９、又はさらには約１００％のタンパク質回収率を与える。タンパク質回収率は、タンパク質を定量する任意の公知の手段によって、例えば含量、ＲＰ−ＨＰＬＲ、又はＳＥ−ＨＰＬＣによって決定することができる。これらの結果は、例えば、示された温度で１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間保存した後に観察することができる。
【０１７９】
５．８．４．３  化学的誘導体／分解産物の観点からの保存安定性
さらに、本発明の製剤は、例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって確認されているように、凍結乾燥後に化学的誘導体の産生を防止及び最小限とし得る。
【０１８０】
５．８．４．４  オリゴマー化の観点からの保存安定性
本発明の製剤はまた、凍結乾燥後に保存安定性を与えることができ、よって、−７０℃〜＋４０℃の保存温度で、上記に定義されているような保存期間、例えば１か月間の後に明瞭な可溶性のオリゴマー物質は全く形成されないか（例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって定義される）；或いは、−７０℃〜＋４０℃、例えば＋４０℃の保存温度で、上記に定義されているような保存期間、例えば１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間の保存後に１％未満、好ましくは０．５％未満、例えば０．３％の可溶性オリゴマー物質が形成される（例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって定義される）。
【０１８１】
５．８．４．５  主産物の回収率において反映されるような保存安定性
本発明の製剤はまた、凍結乾燥後に、例えばＳＥ−ＨＰＬＣ（表１８及び表２７〜２９参照）によって決定されるような、主産物のピークは、−７０℃〜＋４０℃で上記に示されているような保存期間後、例えば１、３、６、９、１２、１８、又は２４か月間の保存後に約１００％であるか；或いは、例えばＳＥ−ＨＰＬＣ（表１８及び表２７〜２９参照）によって決定されるような、主産物のピークは、少なくとも８５％以上、例えば８６％、８７％、又は８８％であるという効果を有し得る。より好ましくは、メインピークは、−７０℃〜＋４０℃、例えば＋２５℃での上記に示されているような保存期間後、例えば１、３、６、９、１２、１８、又は２４か月間の後に、９０％、９２％、又は９５％、例えば少なくとも９７％、より好ましくは１００％であるか；或いは、例えばＳＥ−ＨＰＬＣによって決定されるような、主産物のピークは、−７０℃〜＋４０℃で、例えば＋４０℃で、上記に示されているような保存期間後、例えば１、３、６、９、１２、１８、又は２４か月間の保存後に、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、又はさらには約１００％である。
【０１８２】
本発明による製剤はまた、凍結乾燥後、例えば−７０℃〜＋４０℃で１２．５mg/mLの濃度で１〜１２か月間保存した後の、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるようなメインピークは、保存前の製剤と比較して未変化のままであり、かつ、全ピークの少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９３％を示すという作用を有し、基準試料は、例えば９３％のメインピークを有する（表１５参照）。凍結乾燥後に＋４０℃で１２か月間まで保存した場合に、本発明の製剤は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定されるように少なくとも９１％、９２％又は９３％のメインピークを保持する。
【０１８３】
さらに、ｃＩＥＦ（表２７〜２９参照）によって決定されるように、本発明の製剤は、凍結乾燥後、−７０℃〜＋４０℃の温度で例えば１２．７mg/mLの濃度で１〜２４か月間保存した後に、基準試料（保存されていない製剤、メインピークは少なくとも９６％である）に匹敵する、主産物の回収率を与えるという効果を有し、例えばメインピークは少なくとも８５％以上、例えば８６％、８７％、又は８８％である。より好ましくは、メインピークは、−７０℃〜＋４０℃での保存後に、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、又は９６％、例えば少なくとも９７％、より好ましくは１００％である。
【０１８４】
５．８．４．６  凍結解凍条件下での安定性
本発明の製剤はまた、ＦＴ条件下での凍結乾燥後に良好な安定性を与えるという効果も有する。例えば、本発明の製剤を、例えば、−２０℃と室温（例えば＋２５℃）との間の５回のＦＴサイクルにかけることができる。該製剤に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣによって確認されているように、有意な劣化を伴うことなく、これらの条件に耐えるだろう。全ての場合において、ｖＷＦ結合剤、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインの化学的及び物理的完全性が保存されている。全回収率は、−７０℃で保存された液体対照試料と比較して、９５〜１００％の範囲内、好ましくは９５、９８又は９９％であった。
【０１８５】
より具体的には、１６mg/mLの濃度で、５回のＦＴサイクルにより、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣのいずれかによって決定されているように、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％であるポリペプチドの回収率（例えば総面積、すなわちＡＵに基づいて決定される）が得られ；特定の実施態様において、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、基準試料（−７０℃で保存された液体対照試料）と比較して未変化であった（表１２参照）。
【０１８６】
５．８．４．７  効力の観点からの安定性
当業者は、ｖＷＦ結合剤、特に免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には配列番号１〜１９のいずれか１つ、例えば配列番号１のポリペプチドの効力を決定するための様々な方法を知っている（例えば、国際公開公報第２００６／１２２８２５号、例えば実施例３〜６、１８及び１９、又は国際公開公報第２００９／１１５６１４号の実験章を参照）。凍結乾燥後のｖＷＦ結合剤の効力は、製剤における反復ＦＴサイクル後にも影響を受けなかった。特に、本発明の製剤におけるｖＷＦ結合剤の効力は、ストレスのかかった条件下で、すなわち＋４０℃で１２か月間以下の保存（表２３）、及びさらには＋４０℃で２４か月間以下の保存の下で（表２９）試験したところ安定であり続けた。１つの実施態様において、凍結乾燥後の本発明のポリペプチドの効力を、慣用的なアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ビアコア、ＲＩＡ、ＦＡＣＳなどによってその抗原に対するその結合によって決定することができる。より具体的には、本発明の製剤において、ｖＷＦ結合剤の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、又はさらには少なくとも９９％が、上記のストレス条件下での保存後に、保存前の結合活性と比較してその結合活性を保持する。
【０１８７】
さらなる態様において、本発明の製剤は、ＡＬＸ−００８１の液体製剤を凍結乾燥製剤と比較した場合に、ビアコアアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、リストセチン誘導コファクター活性アッセイ（ＲＩＣＯ）及び／又はＧｙｒｏｌａｂに基づいたアッセイなどであるがそれらに限定されるわけではない様々な免疫学的アッセイによって評価したところ、殆ど生物学的活性の減少を示さない（第７．１３章及び表２４参照）。
【０１８８】
５．８．４．８  安定化効果の要約
本発明の製剤は、凍結乾燥後に、本発明のポリペプチド、特にＡＬＸ−００８１の化学的及び物理的完全性を維持する作用を有し、すなわち、−７０℃〜＋４０℃の温度で、長期間の保存後でさえ、例えば上記に定義されているような期間の間、製品の純度／不純度プロファイルは実質的に変化していない。例えば、凍結乾燥後の長期間の保存は、実験章によって支持されるように、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ又はｃＩＥＦプロファイルに対して有意な作用を及ぼさなかった。
【０１８９】
５．９  本発明の方法
本発明のｖＷＦ結合剤は、任意の一般的に使用される方法によって作製され得る。典型例としては、適切な宿主系、例えば細菌又は酵母における組換え発現が挙げられる。ｖＷＦ結合剤は、本発明に従って製剤化される前に適切な精製計画を受けるだろう。
【０１９０】
本発明は、本明細書に定義されているような製剤を作製する方法を包含する。本発明のｖＷＦ結合剤を本発明による緩衝液を使用してカラムから溶出させる場合、精製工程及び製剤化工程は同時に起こり得る。あるいは、本発明の製剤は、任意の適切な手段、例えば、透析、限外ろ過などの当技術分野において広く使用される手段によって、緩衝液を交換することによって調製してもよい。
【０１９１】
実施態様によっては、本発明の製剤を作製する方法はまた、例えば水又は適切な緩衝液（これは場合によりさらなる賦形剤を含んでいてもよい）の添加による、凍結乾燥製剤又は噴霧乾燥製剤の再構成に関し得る。
【０１９２】
本発明による製剤の調製法は、臨床用途に適したバイアル、例えば密封容器にそれを充填する、及び／又はそれを投与単位剤形に調合するなどの、さらなる工程を包含していてもよい。該方法はまた、噴霧乾燥、凍結乾燥、又は凍結、例えばバルク凍結などのさらなる工程を含んでいてもよい。本発明はまた、容器、投与単位剤形、又は本明細書に列挙された任意の方法によって得ることのできる他の製品も包含する。
【０１９３】
本発明の製剤は、ｖＷＦ結合剤、例えば本明細書に定義されているようなＩＳＶＤを保存するために使用することができる。従って、本発明は、本明細書に定義されているような製剤の使用によって特徴付けられる、本明細書において使用されるｖＷＦ結合剤の保存法を包含する。より具体的には、本発明は、例えば本明細書に記載の製剤の調製を含む、保存のために本明細書に定義されているようなｖＷＦ結合剤を安定化させるための方法を包含する。保存は、場合により−７０℃〜＋４０℃、例えば−７０℃、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃の温度で、好ましくは−７０℃〜＋２５℃の温度で、より好ましくは−２０℃〜＋５℃の温度で、１〜３６か月間、例えば１、１．５、３、６、９、１２、１８、２４、３０、又は３６か月間、例えば少なくとも１２か月間又はさらには２４か月間であり得る。従って、保存は、凍結、凍結-乾燥（freeze-drying）（凍結乾燥（lyophilization））及び／又は噴霧-乾燥を包含し得る。保存法はさらに、本明細書に定義されているようなｖＷＦ結合剤の物理的及び化学的完全性の評価を含み得る。
【０１９４】
本発明はまた、本明細書に定義されているようなｖＷＦ結合剤の少なくとも１つを含む、製剤を分析するための方法に関する。該製剤を、本明細書に定義されているようなｖＷＦ結合剤の化学的又は物理的不安定性のあらゆる兆候について分析することができる。例えば、該製剤を、分解産物、例えば低分子量誘導体、例えばタンパク質分解フラグメント；及び／又は化学的誘導体、例えばピログルタメート変異体；及び／又は高分子量誘導体、例えば凝集体、集塊物などの存在について評価することができる。該製剤をまた、タンパク質総含量及び／又は効力について評価することもできる。本明細書に言及される様々なアッセイ方法の各々を、本発明の分析法に使用することができる。
【０１９５】
従って、本発明はまた、例えば製造、保存及び使用の中の１つ以上の最中に、製剤の品質及び／又は安定性をモニタリング及び／又は評価する方法に関する。本発明はまた、例えば、該製剤が本明細書にさらに記載されているような製品の規格を満たすことを評価するための、製剤の品質制御法に関する。これらの中のいずれかの態様における本発明は、１つ以上の基準試料との比較、バッチ間のばらつきの分析、及び進行中の生産プロセスのモニタリングから選択された１つ以上を含む。
【０１９６】
本発明は、例えば本発明の製剤を含むことによって、又はその生産若しくは調合（これに限定されない）に必要とされることによって、本発明の製剤に関連している全ての製品に関する。
【０１９７】
例えば、本発明は、本発明による１つ以上の製剤を含む、製品、例えば密封容器に関する。本発明はまた、本明細書に記載の任意の実施態様による１つ以上の製剤を含む、薬学的単位投与剤形、例えば、患者、好ましくはヒト患者への非経口投与に適した投与剤形に関する。投与単位剤形は、例えば、プレフィルドシリンジ、アンプル、カートリッジ、又はバイアルの形式であり得る。シリンジ、アンプル、カートリッジ又はバイアルは、ガラス又はプラスチックなどの任意の適切な材料から製造され得、これはゴム材料、例えばバイアル用のゴム栓、並びにシリンジ及びカートリッジ用のゴムプランジャー及びゴムパッキンを含み得る。本発明はまた、本発明による１つ以上の製剤を含むキットにも関する。該キットはさらに、使用説明書及び／又は臨床添付文書を含み得る。本明細書に定義されているような製品の任意の実施態様において、本発明はまた、梱包材、使用説明書、及び／又は、例えば規制の観点から必要とされる臨床添付文書の存在を包含する。
【０１９８】
５．１０  定義
５．１０．１  同一性
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間の「配列同一」率（本明細書において「アミノ酸同一率」とも呼ばれる）は、［第２アミノ酸配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と同一である第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列中のアミノ酸残基の総数］で割り、［１００％］をかけることによって計算することができ、第１アミノ酸配列と比較して第２アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の各々の欠失、挿入、置換、又は付加は、１つのアミノ酸残基（位置）における相違、すなわち本明細書において定義されているような「アミノ酸の相違」と考えられる。
【０１９９】
あるいは、２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一度を、標準的な設定を使用してＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０などの公知の配列アラインメント用コンピューターアルゴリズムを使用して計算することができる。
【０２００】
配列同一度を決定するためのいくつかの他の技術、コンピューターアルゴリズム及び設定は、例えば、国際公開公報第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号、欧州特許第１０８５０８９号、国際公開公報第００／５５３１８号、国際公開公報第００／７８９７２号、国際公開公報第９８／４９１８５号及び英国特許第２３５７７６８−Ａ号に記載されている。
【０２０１】
通常、本明細書で上記に概略が示されている計算法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一」率を決定する目的のために、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１」アミノ酸配列と捉え、他のアミノ酸配列を「第２」アミノ酸配列と捉える。
【０２０２】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一度を決定する際に、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れる場合があり、これは一般的に、アミノ酸残基が、類似した化学的構造を有する別のアミノ酸残基と置換され、かつ該ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対して殆ど又は全く影響を及ぼさない、アミノ酸置換として記載され得る。このような保存的アミノ酸置換は、例えば国際公開公報第０４／０３７９９９号、英国特許第２３５７７６８−Ａ号、国際公開公報第９８／４９１８５号、国際公開公報第００／４６３８３号及び国際公開公報第０１／０９３００号から当技術分野において周知であり；このような置換の（好ましい）タイプ及び／又は組合せは、国際公開公報第０４／０３７９９９号並びに国際公開公報第９８／４９１８５号からの関連の教義、及びそこに引用されたさらに他の参考文献に基づいて選択され得る。このような保存的置換は、好ましくは、以下の群（ａ）〜（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基によって置換されている、置換である：（ａ）小さな脂肪族性か、非極性か、又は僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；（ｂ）極性で負に荷電した残基及びその（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族性で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙへ、又はＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎへ、又はＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａへ、又はＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎへ、又はＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕへ、又はＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅへ、又はＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇへ、Ｇｌｎへ、又はＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕへ、Ｔｙｒへ、又はＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔへ、Ｌｅｕへ、又はＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；及び／或いはＰｈｅからＶａｌへ、Ｉｌｅへ、又はＬｅｕへ。本明細書に記載のポリペプチドに適用される全てのアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978によって開発された様々な種の相同タンパク質間のアミノ酸変異の頻度の分析に基づいて、Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149, 1978によって開発された構造形成能の分析に基づいて、並びに、Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析に基づき得、これらの全ての文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ナノボディ（登録商標）の一次構造、二次構造及び三次構造に関する情報が本明細書及び上記に列挙された一般的な背景技術に示されている。また、この目的のために、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Nature Structural Biology (1996); 3, 752-757；及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)によって示されている。慣用的なＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ界面を形成しているいくつかのアミノ酸残基及びこれらの位置において起こり得るラクダ化置換に関するさらなる情報を、上記に列挙された先行技術に見出すことができる。
【０２０３】
６．略称
ＡＰＩ          活性医薬成分
ｃＩＥＦ          キャピラリー等電点電気泳動法
ＤＬＳ            動的光散乱法
ＤＯＥ            実験計画
ＤＰ              医薬品
ＤＳ              薬物
ＦＴ              凍結解凍
ＨＭＷ            高分子量
ＬＭＷ            低分子量
ＭＡＬＳ          多角度光散乱法
ＲＨ              相対湿度
ＲＰＣ            逆相クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣ    逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＥ−ＨＰＬＣ    サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
ＳＯＰ            標準作業手順書
Ｔｍ              融解温度（℃）
ＴＳＡ            サーマルシフトアッセイ
ｖＷＦ            フォンヴィルブランド因子
ＷＦＩ            注射用水
【０２０４】
本発明は今回、以下の非限定的な好ましい態様、実施例及び図面を用いてさらに説明されるだろう。
【０２０５】
本出願全体を通して引用される全ての参考文献の全内容（参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属出願を含む）、特に本明細書で上記に参照されている教義が、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
【０２０６】
７．実施例
多種多様で異なるかつ外見的には矛盾した目的を充足することを目的とした、改善された製剤用緩衝液を得るために一組の実験が設計された。特に、ＡＬＸ−００８１の安定性、生物学的活性、純度及び品質を維持することができ、凍結、凍結乾燥、熱、及び／又は再構成などの様々なストレスに対して長期間におよび安定である、例示的な製剤が本明細書において提供される。
【０２０７】
現代のＡＬＸ−００８１ ＤＳは、２００mMグリシン及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．１を含有するリン酸を基剤とした（Ｄ−ＰＢＳ）緩衝液中に５mg/mLの活性医薬成分（ＡＰＩ）を含有する液体製剤（ＤＳ）として提示されている。この製剤は、初期の臨床試験中に適用されたが、それはいくつかの点で改善され得る。第一に、相対的に低い濃度はおそらく複数回の皮下注射を必要とするので（皮下注射１回あたりの容量は約１mLに制限されると仮定）、患者の利便性は低下するだろう。第二に、３〜８℃又は室温でのＡＬＸ−００８１の現行製剤の保存安定性は低い。本製剤の短い有効期限は主に、化学的修飾によって決まる（第７．２章参照）。化学的修飾は、効力の低下に連関し得る。実用的な有効期限は、−２０℃で製品を保存することによって成し遂げられ得るが、これはしかし、最も実用的な目的のための好ましい選択肢とは考えられない。
【０２０８】
７．１  方法
試料を、実質的には、含量、効力及び純度、沈降、濃度、分解、凝集及び効力を評価するための標準作業手順書に従って分析した。さらに、全ての試料を濁度又はタンパク質凝集物若しくは沈降物の存在について目視した。特定の凍結乾燥試料の残留水分含量を、カールフィッシャー滴定を用いて決定した。
【０２０９】
以下の３つの凍結乾燥プログラムを本研究に使用してＡＬＸ−００８１を凍結乾燥させた：表１４に記載されているような残留水分含量を減少させるように最適化された、標準的な６５時間の実行（図１）、より短縮された３７時間の実行、及びより長い６６時間の凍結乾燥サイクル。
【０２１０】
簡潔に言えば、短縮された３７時間の凍結乾燥プロセスの開始時に、棚温度は＋２０℃であり、２時間で−５０℃とした。次に、０．０４mbarの真空を１時間で作った。０．０４mbarの真空に達した後、棚温度を４時間の間−５０℃に保った。これらの４時間後、温度を次第に１５時間で０℃まで上昇させた（すなわち、１回目の乾燥工程、凍結水の除去）。０℃の棚温度を、０．０４mbarの真空を保ちつつ７時間保持した。７時間後、温度を＋２５℃まで３時間で上昇させ、続いて、２５℃で５時間保った（すなわち、２回目の乾燥工程、凍結していない水の除去）。バイアルを±０．４００mbarの真空下で封をし、その後、常圧を回復させた。
【０２１１】
同じ方法を、標準的な６５時間の実行に適用し、これは、真空下＋２５℃で２８時間に延長された二回目の乾燥工程においてのみ異なり、結果として約６５時間の全サイクル時間となる。標準的な６５時間の凍結乾燥の実行における様々な工程の概観図が図１に示されている。凍結乾燥プロセス中に、戦略的に重要な位置における３つのバイアル中の製品の温度をモニタリングした。最後に、標準的な６５時間の実行を、温度プローブの解読値に従って実行中に改変させ、その結果、表１４に記載のような延長された凍結乾燥サイクルがもたらされた。
【０２１２】
７．２  現代のＡＬＸ−００８１製剤の化学的安定性
ＲＰ−ＨＰＬＣは、薬物（ＤＳ）の化学的安定性を評価する最も有益な方法の１つである。
【０２１３】
ＲＰ−ＨＰＬＣはＡＬＸ−００８１ ＤＳを多くの異なる種に分離した。メインピークに加えて、プレピーク（インタクトで改変されていない材料の前に溶出する物質）及び多くのポストピークを識別することもできた。これまでに作成されたバッチにおいて、プレピーク及びポストピーク１は、一貫して、それぞれＤＳの約２％及び３．６％を示し、一方、他のポストピークはＤＳの１％未満を占めた。
【０２１４】
しかし、促進された（＋５℃）又はストレスのかかった（＋２５℃及び＋３７℃／＋４０℃）条件下での保存中に、特定の製品に関連した変異体の相対量は、図２Ａに示されているように、時間及び温度と共に増加した。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣのメインピークは、特に高温（＋２５℃以上）における長期間のインキュベート時にいくつかの異なる種に分かれるようである（図２Ｂ）。データは、いくつかのより早期に溶出する新規分子種が保存中に生成されることを示す。
【０２１５】
製造時にＡＬＸ−００８１ ＤＳに存在していたか又は保存中に発生した最も重要な修飾は以下である：（ｉ）プレピーク１（酸化）；（ｉｉ）ポストピーク１（ｎｏｒ−ｌｅｕ変異体）；（ｉｉｉ）ポストピーク２（ピログルタメートの形成）、及び（ｉｖ）メインピークの分裂（異性化）。修飾（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、効力に有意に影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。対照的に、ＣＤＲ３領域に位置する配列番号１の１０５位及び２３６位におけるアスパラギン酸残基の異性化が、ＡＬＸ−００８１の効力の起こり得る低下の根底にある主な分子機序であることが示された（上記の（ｉｖ）参照）。
【０２１６】
製造時に存在するか又は保存中に発生した、ＡＬＸ−００８１製品に関連した変異体のいくつかを、ｃＩＥＦによって検出することもできた。これはポストピークとして出現したピログルタメート修飾についても該当した（上記の（ｉｉｉ）参照）。また、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に観察されたものと同じように、両方の１２Ａ０２Ｈ１ドメインの１０５位における異性化事象により、メインピークの広幅化及び最終的にはｃＩＥＦメインピークの分裂が生じた（上記の（ｉｖ）参照）。
【０２１７】
７．３  緩衝液及び賦形剤のスクリーニング
ｖＷＦ結合剤の製剤をさらに発展させるために、（ｉ）様々な緩衝液、（ｉｉ）様々な濃度で、（ｉｉｉ）様々なｐＨの各緩衝液；及び（ｉｖ）各々を様々な賦形剤と組み合わせて、などの、全てが互いに影響を及ぼす様々なパラメーターを精巧に作り上げて、複雑な一組の実験が設計された。
【０２１８】
緩衝液系は、注射時に生体の緩衝液系を有意に攪乱しないように、できるだけ低い緩衝能を有するべきである。さらに、活性医薬成分（ＡＰＩ）の活性に対する緩衝液の種類及び濃度は、非常に注意深く評価されなければならない。
【０２１９】
一般的には、上昇したタンパク質安定性レベルは、高い融解温度に原因がある。従って、ＡＬＸ−００８１の熱的特性を、様々な組成物の存在下でモニタリングした。特に、ＴＳＡ実験を、１９２個の異なる等張製剤において実施し、その結果を実験計画（ＤＯＥ）に投入して、ＡＬＸ−００８１の熱的安定性に対する、緩衝液、濃度、イオン強度、ｐＨ、及び賦形剤の効果を評価した。解読値はＡＬＸ−００８１の融解温度（Ｔｍ）であり、これは様々な試験組成物におけるタンパク質の熱的安定性の指標である。
【０２２０】
簡潔に言えば、使用されたサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）は、タンパク質が熱的アンフォールディングを受けている間の、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅなどの蛍光色素のシグナル変化を追跡する。Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを適切にフォールディングされたタンパク質溶液に加えると、それはタンパク質上のどの表面にも結合することができず、その蛍光シグナルは消光する。温度が上昇すると、タンパク質は熱的アンフォールディングを受け、その疎水性コア領域を露出する。その後、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅは疎水性領域に結合して消光せず、その結果、蛍光シグナルは増加する。アッセイを、試験しようとする様々な製剤、０．２mg/mLのＡＬＸ−００８１及び１０×Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅを含有する溶液に対して実施した。プログラムは、以下の工程からなった：４．４℃/秒の勾配速度で３７℃まで加熱し、１０秒間保持；０．０２℃/秒の連続的な勾配速度で９０℃まで加熱（１℃あたり２０回集録）；及び、２．２℃/秒の勾配速度で３７℃まで冷却し、１０秒間保持。
【０２２１】
様々な濃度（１０〜２００mM）、ｐＨ値、及び賦形剤を有する以下のセットの緩衝液を本明細書において調査した：
−  クエン酸        ｐＨ６．０−６．５−７．０
−  ヒスチジン      ｐＨ５．５−６．０−６．５
−  リン酸          ｐＨ６．５−７．０−７．５
−  トリスＨＣｌ    ｐＨ７．４−７．７−８．０
−  ＮａＣｌ        ０〜１４０mMの濃度範囲
−  グリシン        ０〜２７０mMの濃度範囲
−  マンニトール    ０〜２７０mMの濃度範囲
−  スクロース      ０〜２７０mMの濃度範囲
−  トレハロース    ０〜２７０mMの濃度範囲
【０２２２】
得られた融点（Ｔｍ）を、因子スクリーニング実験の分析用のDesign Expertプログラムに取り込み、最も高い熱的安定性をもたらす５０個の製剤を予測した（表１参照）。
【０２２３】
トレハロース、スクロース、マンニトール又はグリシンを含有するリン酸塩（ｐＨ７．０〜７．５）及びクエン酸塩（ｐＨ６．２〜７．０）について最も高いＴｍ値が予測された。全く意外なことには、研究結果は、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．８〜８．０）及びヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ６．５）を基剤とした緩衝液は有意により低い融点へと戻ることを示唆するが、それらは、国際公開公報第２０１０／０７７４２２号に記載のように免疫グロブリン単一可変ドメインの溶液ｐＨを制御するための最適な緩衝液系として以前に選出されていた。
【０２２４】
従って、トレハロース、スクロース、グリシン又はマンニトールを含有するリン酸塩及びクエン酸塩製剤は、ｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１の安定化に特に良好に機能したと結論付けられた。
【０２２５】
７．４  安定性試験
ＡＬＸ−００８１の溶解度をさらに高めることができるかどうかを評価するために、いくつかの製剤において初回スクリーニングを実施した。ＡＬＸ−００８１の緩衝液を交換して対象の製剤とし（Ｔｗｅｅｎ−８０を除く）、５ｋＤａのカットオフフィルターの具備された撹拌式セル（例えばアミコン型）でさらに濃縮した。眼に見える沈降又は濁度が生じるとすぐに、試料をろ過し、タンパク質濃度を測定した。表２は、得られた結果の要約を示す。
【０２２６】
リン酸塩及びヒスチジンを基剤とした緩衝液中の濃縮により、比較的低いタンパク質濃度（１０mg/mL未満）で試料の濁度及び沈降物の形成が起こった。対照的に、ＡＬＸ−００８１は、約５６mg/mLの濃度に達した後でさえも、クエン酸緩衝液中において依然として物理的に安定であった。目視に加えて、粒子状物質又はＨＭＷ種の不在が、蛍光顕微鏡によって（ナイルレッドを用いての染色、ＳＥ−ＨＰＬＣ及びＤＬＳによって）確認された。さらに、約５６mg/mLの溶液を−２０℃又は−７０℃で１０回のＦＴサイクルにかけるか、或いは＋４℃で約１週間保存することは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって証明されたように、分子の物理的安定性に影響を及ぼさなかったようであった（それぞれ図３Ａ及び３Ｂ参照）。
【０２２７】
クエン酸緩衝液中のＡＬＸ−００８１の比較的高い溶解度は、ＰＥＧ沈降アッセイによって裏付けられた（データは示されていない）。
【０２２８】
７．５  Ｔｗｅｅｎ−８０
非イオン性界面活性剤のポリソルベート（Ｔｗｅｅｎとも呼ばれる）（ポリオキシエチレン（Ｎ）ソルビタンモノラウレート；Ｎ＝２０、４０、６０、６５、８０又は８５）がＡＬＸ−００８１製剤に必要とされるかどうかを決定するために、いくつかの撹拌ストレス実験を、ｐＨ６．０及び６．５の５０mMクエン酸緩衝液中において実施した。ＡＬＸ−００８１の物理的安定性に対する様々な濃度のＴｗｅｅｎ８０（Ｔｗｅｅｎ−８０皆無、対０．０１％対０．０２％（ｖ／ｖ））の効果を分光蛍光光度計で５００nmの散乱シグナルをモニタリングすることによって５mg/mLで評価した。
【０２２９】
Ｔｗｅｅｎ−８０は、両方の緩衝液中の散乱シグナルの増加を防ぎ、その保護作用を実証した（図４Ａ及び４Ｂ）。０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０又は０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）を含有する試料間には有意差は観察されなかった。さらに、撹拌前後の試料のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、全く差異を示さなかった：９５〜１００％の回収率が達成され、オリゴマー化又は分解も全く検出できなかった。
【０２３０】
これらの結果に基づいて、ｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１の製剤に０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）を含めることを決断した。
【０２３１】
７．６  Ｔｗｅｅｎ
ポリオキシエチレン鎖長及び脂肪酸エステル部分において異なる、ポリソルベートの集合の中の他のメンバー（例えばＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−６５、及びＴｗｅｅｎ−８５）が、抗ｖＷＦ結合剤の製剤に必要とされるかどうかを決定するために、いくつかの撹拌ストレス実験を、実質的に上記の第７．５章に記載されているように、ｐＨ６．０及び６．５の５０mMクエン酸緩衝液中において実施した。ｖＷＦ結合剤の物理的安定性に対する、様々な濃度の様々なＴｗｅｅｎメンバー（Ｔｗｅｅｎ皆無、対０．０１％対０．０２％（ｖ／ｖ））の効果を、分光蛍光光度計で５００nmの散乱シグナルをモニタリングすることによって５mg/mLで評価する。
【０２３２】
Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−４０、Ｔｗｅｅｎ−６０、Ｔｗｅｅｎ−６５及びＴｗｅｅｎ−８５は、Ｔｗｅｅｎ−８０と実質的に同じ有益な結果をもたらす。
【０２３３】
７．７  液体製剤の安定性試験
２０mg/mLの濃度の様々なクエン酸を基剤とした等張製剤におけるＡＬＸ−００８１の安定性を評価するためにより包括的な試験を実施した。表３は、試験された様々な製剤の概観を示す。
【０２３４】
主な目標は、液体製品の安定性に対する、ｐＨ（６．０−６．５−７．０）及び賦形剤の種類（ＮａＣｌ、マンニトール、スクロース又はグリシン）の効果を評価することであった。制御及び直接比較する目的のために、試験はまた、Ｄ−ＰＢＳ及びグリシン中５mg/mLで製剤化された現代のＡＬＸ−００８１（Ｔｗｅｅｎ−８０濃度がより低いことを除いて、現行製剤と同一）、並びに、以前に記載されたしかし２０mg/mLではなく５mg/mLの濃度で製剤化された様々なクエン酸を基剤とした等張性ＡＬＸ−００８１溶液を含んでいた。総計で、これにより、１７個の異なる液体製剤（製剤番号１〜１７）が大規模な安定性試験にかけられた。Ｔｗｅｅｎ濃度の差異の影響を排除するために、全ての製剤が０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）を含有していた。
【０２３５】
７．７．１  凍結-解凍に対する安定性
液体製剤としてのＡＬＸ−００８１の安定性に対する反復ＦＴサイクルの効果を評価した。様々な製剤のアリコート（０．５mL／チューブ）を−７０℃又は−２０℃で１０回以下のＦＴサイクルにかけた。１回のサイクルは、±２０分間の凍結、その後、＋２５℃の水浴中での５分間の解凍を含んでいた。この処理の後、全ての製剤が視覚的に透明のままであった。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は良好な回収率を示し（９５〜１００％）、プロファイルの有意差も検出することができず、ｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１の品質は試験された１７個の異なる液体製剤の反復凍結解凍サイクルによって影響を受けないことを示唆する。
【０２３６】
７．７．２  保存安定性
１７個の異なる製剤の安定性はまた、ストレスのかかった条件下、すなわち＋４０℃でアリコート（０．５mL/チューブ）を保存することによって評価され；−７０℃の長期保存条件が基準として含められた。分析はＲＰ−ＨＰＬＣに焦点が当てられた。なぜならこの方法は、一般的に、保存中に起こる化学的修飾を明らかとするための特に有益な方法として知られているからである（表４参照）。この章は、１か月間の保存後に得られたデータの概観を示し；結果は、より早期の時点、すなわち１週間後及び２週間後における所見を確認する。
【０２３７】
（ａ）ＲＰ−ＨＰＬＣ
上記の第７．２章で以前に示されているように、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、現代のＡＬＸ−００８１ ＤＳ（Ｄ−ＰＢＳ／グリシン製剤）をいくつかの製品に関連した変異体及び不純物へと分離した。簡潔に言えば、ストレスのかかった条件下で（例えば＋４０℃）、純度（メインピーク％）はいくつかの既存のプレ/ポストピークの増加並びに追加のピークの形成と共に同時に低下した。
【０２３８】
本試験において得られたＲＰ−ＨＰＬＣデータを表５に要約する。
【０２３９】
全体的に、得られた結果は、本製剤の緩衝液（すなわちＤ−ＰＢＳ／グリシン）で観察されたのと実質的に同じ修飾が、様々なクエン酸緩衝液においても起こったが、相対的ピーク面積における幾分かの相違も観察することができたことを示した。特に、プレピーク面積の増加（酸化）は、Ｄ−ＰＢＳ／グリシン製剤と比較してクエン酸製剤（特にｐＨ６．０）においてはより緩徐であった。このプレピークの確立に関して、グリシンは様々な賦形剤の中で最も好ましくないようであった。＋４０℃で１か月間保存した後の様々なポストピークのプロファイルは、全ての製剤について同等であったが、第二のポストピーク（すなわちピログルタメート変異体）は、ｐＨ６．０〜６．５よりもｐＨ７．０でより顕著であるようであった。メインピークの広幅化／分裂の程度（ａｓｐ異性化の結果）は、低い分解能に因り定量するのが困難であり；ショルダーピークの面積比も正確に推定することができず、それ故、メインピークについて表５で報告された相対表面積に含められた。それにも関わらず、対応するＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（データは示されていない）は、定性的な評価を行なうことを可能とし；これらのデータは、異性化の程度が、様々な製剤において極めて類似していることを示唆する。
【０２４０】
（ｂ）ｃＩＥＦ
ＲＰ−ＨＰＬＣと同様に、ｃＩＥＦ法は、ストレスのかかった条件下で保存中に起こる特定の製品の変異体の検出を可能とする（詳細については第７．２章を参照）。これは、−７０℃及び＋４０℃で１か月間保存した後の現代のＡＬＸ−００８１の電気泳動図を比較する図５において例示される。
【０２４１】
本試験で得られたｃＩＥＦデータ（データは示されていない）は基本的に、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって到達した結論、すなわち、同じタイプの修飾が、図５に示されているような本明細書において製剤１７によって示される本製剤の緩衝液（すなわちＤ−ＰＢＳ／グリシン）で観察されているのとほぼ同じ程度で様々なクエン酸緩衝液中においても起こることを確認する。しかし、相対的ピーク面積の幾分かの差異も観察することができた。特に、ポストピーク（すなわちピログルタメート変異体）は、ｐＨ６．０〜６．５よりもｐＨ７．０においてより顕著であるようであり、これは、表５で以前に要約されたＲＰ−ＨＰＬＣによる所見と一致する。
【０２４２】
（ｃ）ＳＥ−ＨＰＬＣ
ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を実施して、ＡＬＸ−００８１の物理的安定性を調べた、すなわちストレスのかかった条件下で保存中に形成された可能性もあったＨＭＷ種及び／又は分解産物を検出した。ここで試験された全ての製剤について、ストレス試験は、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムに対して有意な作用を及ぼさなかったようであった。
【０２４３】
（ｄ）結論
様々なＡＬＸ−００８１液体製剤の保存安定性に関する最も重要な所見の要約を表５に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に基づいた最も有益なデータのみを列挙した。これらのデータは、ｐＨ６．０〜６．５の５０mMクエン酸中のより高い化学的安定性を示唆する。グリシンを除き、賦形剤の種類は、安定性に対して有意な影響を及ぼさなかった。物理的安定性に関しては、様々な製剤間で差異も全く観察できなかった。後者は、様々なＨＰＬＣ分析において全ての試料について観察された±１００％回収率によって、並びに、凝集／分解の不在を示すＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムによって証明された。上記の結果に基づいて、ｐＨ６．０〜６．５のクエン酸／スクロース製剤の可能性をさらに探索することを決断した。
【０２４４】
７．８  凍結乾燥製剤の安定性試験
凍結乾燥の効果を、液体の及び凍結乾燥させたクエン酸／スクロース中のＡＬＸ−００８１製剤（ｐＨ６．０〜６．５で２０mg/mLのＡＰＩ）の保存安定性を比較することによって評価した。試験された製剤の概観を表６に示す。先行技術のＤ−ＰＢＳ／グリシンを基剤とした製剤（５mg/mLのＡＰＩ）を比較のために含めた。液体の（すなわち凍結乾燥前）及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１を凍結させて（液体試料については−７０℃、凍結乾燥製剤については−２０℃）、並びに、＋５℃、＋２５℃、及び＋４０℃に保ち、試料を、２週間及び１．５か月間保存した後に分析した。
【０２４５】
図６のパネルＡは、図１に示されているような標準的な６５時間の実行を使用した凍結乾燥プロセス後のバイアルの写真を示す。クエン酸／スクロースを含有する製剤の凍結乾燥により良好なケーキが形成されたが、Ｄ−ＰＢＳ／グリシン中で製剤化された試料は妥当なケーキを生じなかった。全ての試料を、ミリＱ水を用いて容易に再可溶化することもでき、溶液は、透明無色であった（図６、パネルＢ）。
【０２４６】
７．８．１  凍結乾燥前後の製品の評価
ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、全ての試験した製剤についての、出発液体製品（−７０℃以下に保つ）と、凍結乾燥させ再構成した後の製品との間の物理化学的特徴の観点からの有意差は判明しなかった。さらに、完全な試料の回収が、全製剤について実証された（表７）。
【０２４７】
７．８．２  １．５か月間の保存後の凍結乾燥製品の評価
（ａ）目視及び含量
凍結乾燥試料のケーキは、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、又は＋４０℃において１．５か月間保存した後に眼に見える崩壊の兆候は示さなかった。
【０２４８】
試料は、ミリＱ水で再構成した後に透明無色であった。また、保存は、再構成後に測定された含量に対して有意な影響を及ぼさなかった（表８）。
【０２４９】
（ｂ）ＲＰ−ＨＰＬＣ
３つの異なる凍結乾燥製剤（３番、７番、及び１７番）のプロファイルを、それぞれ−２０℃、＋５℃、＋２５℃、及び＋４０℃で１．５か月間保存した後に比較した。最もストレスの多い条件（＋４０℃）での比較が、化学的安定性に対する凍結乾燥の影響を最も良く明らかとする。
【０２５０】
対応する結果を表８に要約する。図に示すように、凍結型での保存は、本試験で試験されたどの製剤におけるＡＬＸ−００８１にも影響を及ぼさないようである。
【０２５１】
概して、得られたデータからの有力な結論は、クエン酸／スクロースを基剤とした製剤の凍結乾燥は実質的に、いくらかの少量のピログルタメートの修飾を除いて、液体型で起こる化学的修飾を防ぐというものである。これらの凍結乾燥製剤において、プレピークの面積率の増加も、メインピークの広幅化／分裂の兆候もなかった。対照的に、Ｄ−ＰＢＳ／グリシンを基剤とした製剤の凍結乾燥により、化学的安定性の有意な向上はもたらされなかった。クエン酸／スクロース凍結乾燥製剤中のピログルタメート形成は、ｐＨ６．５よりもｐＨ６．０の方が僅かにより顕著であるようであった。これは、＋２５℃でのデータによって立証され、この温度ではピログルタメートの形成速度はより低いが、同じｐＨ依存性を示す。予想されたように、−２０℃又は＋５℃での１．５か月間までの保存は、凍結乾燥ＡＬＸ−００８１の検出可能な劣化を全く引き起こさなかった（データは示されていない）。
【０２５２】
驚くべきことに、＋４０℃で、クエン酸／スクロースを基剤とした製剤において、Ｄ−ＰＢＳ／グリシンを基剤とした製剤と比較してより改善された安定性が得られ、後者は、化学的修飾に対して有意により高い感受性を示す。
【０２５３】
液体製剤については、−７０℃、＋５℃及び＋２５℃での１．５か月間までの保存は、ＡＬＸ−００８１に対して有意な作用を及ぼさなかった（データは示されていない）。＋４０℃で１．５か月間の保存後に観察された劣化は、以前の観察とおおまかに一致する（第７．７．２参照）。
【０２５４】
（ｃ）ｃＩＥＦ
ｃＩＥＦ分析によって得られた結果は、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果と一致する。最も顕著には、クエン酸／スクロースを基剤とした製剤の凍結乾燥は、ピログルタメートの修飾を完全には防ぐことができない。実際に、＋４０℃で１．５か月間の凍結乾燥製品の保存により、ポストピークは増加した。ここでも、ｐＨ６．５よりもｐＨ６．０のクエン酸／スクロースの方により迅速なピログルタメートの形成が観察された。
【０２５５】
（ｄ）ＳＥ−ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳ／ＤＬＳ
−７０℃／−２０℃、＋５℃及び＋２５℃での１．５か月間までの保存は、凍結乾燥又は液体のＡＬＸ−００８１製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルに対して作用を及ぼさなかった（データは示されていない）。しかし、＋４０℃において全ての液体製剤においてピークの広幅化及びショルダーピークの形成も観察できた。ＭＡＬＳ分析は、これらのショルダーピークは単量体ＡＬＸ−００８１に対応することを示した（データは示されていない）。データは、ストレスのかかった保存の結果として、ＡＬＸ−００８１の亜集団におけるコンフォメーション変化を言外に示唆する。驚くべきことに、凍結乾燥クエン酸／スクロース製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、＋４０℃のストレス試験によって影響を受けず、このことはこれらの凍結乾燥製剤はまた、ＡＬＸ−００８１の物理的安定性も改善することを示す。しかし、これは、凍結乾燥されたＤ−ＰＢＳ／グリシン製剤については該当せず；この製剤を＋４０℃でストレスにかけることで、ショルダーピークが生じるだけでなく、幅広なプレピークとして眼に見えるいくつかのより高い分子量種も生じたようであった（表８）。ＤＬＳ分析は、どの製剤においても大きなオリゴマー種を全く検出しなかった（データは示されていない）。
【０２５６】
（ｅ）結論
試験された凍結乾燥ＡＬＸ−００８１製剤の保存安定性に関する最も重要な所見の要約を表８に示す。要するに、クエン酸／スクロース製剤間でほんの僅かな安定性の差異が観察されたが、意外なことにＡＬＸ−００８１はｐＨ６．０よりもｐＨ６．５の方がピログルタメートを形成しにくいようであった。それ故、ＡＬＸ−００８１についてのさらなる改質研究は、ｐＨ６．５のクエン酸／スクロースを基剤とした製剤に焦点が当てられた。
【０２５７】
７．９  クエン酸／スクロースを基剤とした製剤のさらなる最適化
これまで回収されたデータは、クエン酸／スクロースを基剤とした製剤が溶解度を改善し、かつこの製剤の凍結乾燥がＡＬＸ−００８１の保存安定性を劇的に向上させることを示す。しかし、より高温での凍結乾燥ＡＬＸ−００８１の保存により、少量ではあるけれども、依然としてピログルタメートが形成される。この修飾が凍結乾燥製品の有効期限を制限する可能性があると考えることは妥当である（＋５℃で保存した場合でさえ）。凍結乾燥がなぜこの修飾を防ぐことができなかったのかは依然として解明されていない。
【０２５８】
凍結乾燥製品中に残留している水分が重要な役を果たすと仮定した。
【０２５９】
この仮説が真実であれば、上記に列挙されているような乾燥時間、温度、真空などの物理的凍結乾燥パラメーターを最適化することによって残留水分を最小限とすることができるが、同時に、ｖＷＦ結合剤の他のパラメーターは一定に維持するべきである。別のアプローチは製剤の修飾であるが、ここでも同時にｖＷＦ結合剤の他のパラメーターは一定に維持するべきである。さらに、製剤の修飾と組み合わせて物理的凍結乾燥パラメーターの調整も使用し得る。
【０２６０】
７．９．１  凍結乾燥パラメーターの最適化
（ｉ）乾燥時間、（ｉｉ）様々な工程の温度、（ｉｉｉ）真空、及び（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組合せをはじめとする、物理的凍結乾燥パラメーターの最適化は満足の行くものではなかった。すなわち、残留水分含量に対して、又はｖＷＦ結合剤のパラメーターに影響を及ぼすことには、全く効果がないか又は不適切な効果しかなかった。
【０２６１】
７．９．２  凍結乾燥のために製剤を最適化
凍結乾燥製品の化学的安定性に対する水分含量の作用を、クエン酸緩衝液及びスクロース賦形剤の濃度を調整することによって調べた。さらに、凍結乾燥プログラム中の２回目の乾燥時間を調べた。
【０２６２】
７．１０  凍結乾燥製品の安定性に対する水分含量の作用
クエン酸及びスクロース濃度を変化させた３つの異なるＡＬＸ−００８１等張製剤（３つ全てｐＨ６．５）を、２つの異なる凍結乾燥プログラムにかけた：一方では標準的な６５時間の実行、他方では短縮された３７時間の実行。試験された製剤の概観を表９に示す。図７は、凍結乾燥後に得られたバイアルを示す。凍結乾燥により、全ての製剤について良好なケーキが形成された。
【０２６３】
ＡＬＸ−００８１の凍結乾燥試料を、−２０℃及び＋４０℃の両方の２週間及び４週間の保存後に分析した。本実験において、製剤の有用性をさらに立証するために徹底的な試験を実施することを決断した。
【０２６４】
まず、＋４０℃で４週間までの保存中では凍結乾燥試料のケーキはインタクトなままであり、再構成により透明な溶液が得られた。凍結乾燥サイクルは、含量（２７７nmにおいて分光光度的に測定）又は浸透圧に対して有意な影響を全く及ぼさないようであった。以前の実験と一致することには、＋４０℃で４週間の保存は、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＭＡＬＳ及びＤＬＳ分析に基づいて、ＡＬＸ−００８１の物理的安定性に影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。さらに、ビアコアに基づいたアッセイによって決定されたＡＬＸ−００８１の効力は、凍結乾燥プロセス及びその後の保存によって影響を受けなかった（データは示されていない）。しかし、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、保存によりここでも、少量ではあるけれども、ピログルタメート変異体が形成されたことを実証した。これは、最も高いクエン酸濃度及び最も低いスクロース濃度を含有する製剤について僅かにより顕著であった（表１０）。さらに、各凍結乾燥製剤について、全水分含量をカールフィシャー滴定によって決定した。これらのデータの要約は、対応するストレスのかけられた試料において検出されたピログルタメートの量と一緒に、表１０に示されている。各凍結乾燥プログラムについて別々に得られたデータから、より高い水分含量は、ピログルタメートをより形成し易いようにする。このことは、凍結乾燥製品中に存在する残留水分は化学的修飾を促進することを示唆する。
【０２６５】
結論すると、この結果は、凍結乾燥ｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１の水分含量の低減は、その化学的安定性にとって有益であることを示す。
【０２６６】
７．１１  緩衝液の強度の低減及びスクロース含量の増加の効果
前の章で得られたデータは、スクロース濃度を上昇させつつクエン酸濃度を低減させることは（これにより等張溶液を維持する）、凍結乾燥製品の安定性にとって有益であることを示す。同時に、ＡＬＸ−００８１は、改善された溶解度を得るために十分に高い濃度のクエン酸を必要としたという証拠が得られた。それ故、＋５℃及び＋２５℃での保存中の溶液の外見に対するクエン酸及びスクロース濃度の効果を評価し、低濃度のクエン酸の存在下における凍結−解凍に対する安定性を再度評価することを決断した。
【０２６７】
７．１１．１  クエン酸／スクロース濃度の影響の評価
第１の実験において、１２個の異なるＡＬＸ−００８１製剤を＋５℃及び＋２５℃で４日間まで保存した。試料を、濁度又は沈降物の存在について定期的に検査した。４日間保存した後の試料を撮影した写真を図８及び９に示す。様々な製剤及び対応する結果の概観を表１１に提示する。＋２５℃で４日間保存した後、全ての試料は無色透明のままであった（図８、パネルＡ）。対照的に、＋５℃で賦形剤を含まない大半のクエン酸製剤は、濁った（図８、パネルＢ）。明らかに、濁度はクエン酸濃度に反比例し、５０mMクエン酸製剤は透明なままである。また、１５mMのクエン酸を含有する試料の試料回収率は６８％であったが（２０時間保存後ののＡ２７７に基づく）、他の回収率は９０〜１００％まで変動した（データは示されていない）。スクロースを１５mMのクエン酸製剤に加えることで、試料の濁りが防がれたが、最低濃度のスクロース（すなわち５％）では幾分かの僅かな濁度が＋５℃において検出された（図９、パネルＢ）。
【０２６８】
観察により、ＡＬＸ−００８１を可溶性で、特に低温で可溶性で維持する上での、十分に高い濃度のクエン酸の重要性が確認される。それにも関わらず、クエン酸濃度の上昇により、水分含量は増加した。意外なことに、クエン酸濃度の低減は、スクロースの添加によって補うことができる。溶解度に対するＴｗｅｅｎ−８０の効果は全く観察されなかった。
【０２６９】
７．１１．２  ＦＴ安定性の評価
経過観察実験は、いくつかのクエン酸／スクロースを基剤とした製剤のＦＴ安定性に焦点を当てた。９個の異なるＡＬＸ−００８１製剤を、−２０℃の５回の連続的なＦＴサイクルにかけた。試験製剤及び対応する結果の概観を表１２に示す。全ての試料は透明のままであり、ＦＴサイクルは、含量分析及びＳＥ−ＨＰＬＣデータに基づいて、ｖＷＦ結合剤、例えばＡＬＸ−００８１の物理的安定性に影響を及ぼさなかった。
【０２７０】
７．１１．３  等張度の観点からのスクロース及びクエン酸濃度の最適化
上記の保存及びＦＴの結果に基づいて、最適なクエン酸緩衝液の濃度は、２０mMであるとして選択された。最終実験を、スクロース濃度の異なる３つの製剤に対して実施した。この実験の目的は、等張処方に到達するための最適なスクロース濃度を確立するため、及び、２０mg/mLのＡＬＸ−００８１のＦＴ安定性を確認するためであった。５回の連続的なＦＴサイクルに加えて、各製剤をまた、１回のＦＴサイクルにかけ、続いて＋２５℃で２４時間保存し、追加のＦＴサイクルにかけて、製造中の取扱い工程を模倣した。
【０２７１】
結果の要約を表１３に示す。全ての試験製剤は透明であり、様々な取り扱いは、含量／回収率又は浸透圧に対して影響を及ぼさなかった。浸透圧の数値に基づいて、７％のスクロース濃度は等張溶液を得るのに最適であるようである。
【０２７２】
７．１２  １２か月間まで様々な温度で保存された凍結乾燥ＡＬＸ−００８１製剤の安定性試験
２０mMクエン酸緩衝液ｐＨ６．５、７％スクロース（ｗ／ｖ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中１２．５mg/mLで製剤化されたＡＬＸ−００８１を、表１４に提示された条件に従って凍結乾燥した。試料を、続いて、−２０℃（±５℃）、＋５℃（±３℃）、＋２５℃（±２℃／６０±５％ＲＨ）及び＋４０℃（±２℃／７５±５％ＲＨ）で保存した。
【０２７３】
凍結乾燥製剤の安定性を、様々な時点で、すなわち、最初に、１か月後、３か月後、６か月後、９か月後、及び１２か月後に評価し、純度、外見、物理化学的特性、及び効力について評価した。詳細な試料の特徴付けデータを表１５〜２３に示す。
【０２７４】
試料の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって評価し、メインピーク面積の比率、並びに、プレピーク面積及びポストピーク面積の比率を決定した。タンパク質濃度をＵＶ吸光度によって決定した。
【０２７５】
さらに、凍結乾燥試料を目視し、再構成し、再構成された製剤を目視した。再構成後の試料のｐＨを測定し、凍結乾燥粉末の水分含量を、比色滴定（カールフィッシャー）によって決定した。粒子状物質の計数測定を実施して、１０μm以上及び２５μm以上の粒子を計数した。試料をさらに、ビアコアに基づいたアッセイを使用して生物学的機能について特徴付けた。効力を、基準物質に対する相対的効力の比率として表現した。
【０２７６】
得られた安定性データは、凍結乾燥ＡＬＸ−００８１製品の特徴は、−２０℃又は＋５℃でのいずれかでの１２か月間の保存によって有意に影響を受けないことを示す。そうした温度で安定性試験の全期間中に回収されたデータは、ゼロの時点で発生したデータと同等であることが判明した。
【０２７７】
＋２５℃又は＋４０℃で保存された試料についていくつかの小さな変化が観察され、これは、促進された又はストレスのかけられた保存条件に原因がある可能性がある。主な観察は以下であった：
○  ＋２５℃及び＋４０℃において、ポストピーク２の増加が、１２か月間の保存中にＲＰ−ＨＰＬＣで観察され、これは、それぞれ０．７％から１．１％への又は２．４％へのピログルタメート変異体の形成に相当する。
○  ＋４０℃で１２か月間の保存後の０．７％から２．１％（ｗ／ｗ）への水分含量の増加が認められた。これは、栓による保存環境（すなわち７５％ＲＨ）からの水分の摂取、続いて製品に徐々に拡散されることに原因がある可能性がある。
【０２７８】
ストレスのかかった条件下で得られた結果は、製品の水分含量と化学的安定性との間の相関を示唆し；これは、第７．１０章で以前に報告されたデータに相当する。
【０２７９】
従って、これらのデータは、保存中のＤＰ製品の水分含量の制御の重要性を示す。
【０２８０】
＋４０℃における保存は、＋２５℃での長期の安定性を予測するものと考えることができることを考慮して、本明細書に含まれる１２か月間の安定性データは、室温での長期保存安定性についての、及び、より穏やかな条件下で（例えば＋５℃で又は凍結させて）保存した場合にはさらにより長期間の安定性についての良好な指標を提供する。
【０２８１】
７．１３  抗ｖＷＦナノボディカプラシズマブ（ＡＬＸ−００８１）の液体の及び凍結乾燥させた医薬品製剤の生物学的活性に関するインビトロでの比較研究
７．１３．１  目的
多くのアッセイを使用して、現代のＡＬＸ−００８１ＤＰ［２００mMグリシン及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）を含有するリン酸を基剤とした（Ｄ−ＰＢＳ）緩衝液ｐＨ７．１中、５mg/mLの活性医薬成分（ＡＰＩ）を含有する液体製剤］と、上記に提示されているような凍結乾燥ＡＬＸ-００８１ ＤＰ製剤［２０mMクエン酸緩衝液ｐＨ６．５、７％スクロース（ｗ／ｖ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中１２．５mg/mLで製剤化］との、生物学的活性及び標的への結合に関するインビトロでの同等性を評価した：
ａ）ビアコアに基づいた効力のアッセイ
ｂ）ＥＬＩＳＡに基づいた効力のアッセイ
ｃ）リストセチン誘導コファクター活性（ＲＩＣＯ）薬力学的バイオマーカーアッセイ
ｄ）Ｇｙｒｏｌａｂに基づいた親和性の決定。
【０２８２】
これらのアッセイは、ＡＬＸ-００８１の液体の及び凍結乾燥させた医薬品（カプラシズマブ）の対照比較を可能とした。予め定められた同等性基準を使用して、各アッセイにおける同等性を評価し、これを表２４に列挙する。
【０２８３】
７．１３．２  方法
ａ）ビアコアアッセイは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づき、センサーチップ上に固定されたヒトｖＷＦ Ａ１ドメインへのＡＬＸ-００８１の貪欲な結合を測定する。アッセイは、発売時の安定性に関する効力の試験のために選択された。
【０２８４】
ｂ）ＥＬＩＳＡに基づいた効力アッセイは、カプラシズマブの標的中和能のさらなる特徴付けのために開発されたＡＬＸ-００８１の効力試験のための直交法である。このアッセイは、カプラシズマブによる、リストセチンにより誘導されたフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）の結合した血小板への結合の阻害を測定する。
【０２８５】
ｃ）ＲＩＣＯアッセイは、カプラシズマブの薬理学的活性についての薬力学的マーカーとして使用される。アッセイは、ヒト凍結乾燥血小板が、抗生物質のリストセチンの添加後に凝集物を形成する（これは、剪断により誘導されたｖＷＦの活性化を模倣する）速度及び程度を測定する。
【０２８６】
ｄ）Ｇｙｒｏｌａｂに基づいたアッセイは、カプラシズマブとその多量体の標的ｖＷＦとの動態学的相互作用を分析し、ヒト多量体ｖＷＦに対するカプラシズマブの親和性定数を決定する。簡潔に言えば、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォーム上での親和性の決定は、以下のように確立された：Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ＣＤを使用した。捕捉ツールとして、３０００nMの社内製のビオチニル化され精製されたｖＷＦ（サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されたＨａｅｍａｔｅＰ）を、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを予め充填されたカラムに流した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する滅菌ろ過されたＤ−ＰＢＳを、捕捉ツールの希釈のために使用した。精製ｖＷＦ ＨａｅｍａｔｅＰの１/３倍連続希釈液を、室温（＋２０℃）で２４時間、９６ウェルプレート中、６００rpmの回転機において、ＡＤ１緩衝液（用量反応曲線のためのアッセイ希釈緩衝液）中一定濃度のカプラシズマブ（５pM）と共にプレインキュベートした。２４時間後、プレートを２００ｇで１分間遠心分離にかけた。遊離カプラシズマブ分子を含有する７０μLのプレインキュベート混合物を、ディープウェルＰＣＲプレートに入れた。その後、この混合物をカラムに流し、遊離カプラシズマブは、カラムに固定されたビオチニル化ｖＷＦに結合することもできた。Ｇｙｒｏｌａｂシステムは、３つ組の混合物をＣＤに自動的に移動させた。遊離カプラシズマブを、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液（市販の検出用緩衝液）中で希釈された５０nM ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗カプラシズマブモノクローナル抗体を用いて検出した。３回の独立した実験を実施して、最終的なＫＤを決定した。赤色レーザーによって蛍光色素を励起し、蛍光シグナルを得て、光電子増倍管（ＰＭＴ）によって増幅した。このアッセイの増幅レベルは１％ＰＭＴであった。未知のリガンド分析モデルを、カプラシズマブのＫＤの決定のために使用した。ＧｙｒｏｌａｂワークステーションのＸＬ ｆｉｔソフトウェアを用いて分析を行なった。
【０２８７】
７．１３．３  結果
ａ）液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１試験試料の相対効力を、効力アッセイに使用されたＡＬＸ-００８１基準物質（主要標準品２（master reference standard）（ＭＲＳ−２）とも呼ばれる）と比較して、ビアコア効力アッセイにおいて測定した。相対効力はそれぞれ１０２．８％及び１０２．９％であり、これは、ビアコアを介して決定された生物学的効力に関して完全な同等性を示す（表２４参照）、
【０２８８】
ｂ）ＭＲＳ−２と比較した、液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１試験試料の相対効力を、ＥＬＩＳＡに基づいた効力アッセイにおいて決定した。相対効力値はそれぞれ９９．４％及び１０９．５％であり、従ってこれは十分に同等基準内である（表２４参照）。それ故、これらの結果は、両方の製剤がＥＬＩＳＡを介して決定された効力に関して同等であることを示す。
【０２８９】
ｃ）液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１試験試料のＲＩＣＯ活性を、対照比較において測定し、ＲＩＣＯ活性を完全に遮断（２０％未満）する濃度を決定した。ＲＩＣＯ活性を完全に遮断（２０％未満）する濃度は、どちらの製剤についても０．４μg/mL以下であった。これらの結果は、十分に同等基準内であり（表２４参照）、両方の製剤の薬力学的活性に関して完全な同等性を示す。
【０２９０】
ｄ）液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ−００８１試験試料の親和性定数（ＫＤ値）もまた、Ｇｙｒｏｌａｂに基づいたアッセイにおける対照比較において決定した。ＫＤ値はそれぞれ６．８４pM及び４．４６pMであり、信頼区間が重なっていた。それ故、これらの結果は、多量体の標的ｖＷＦに対する親和性に関して両方の製剤の完全なる同等性を示す（表２４参照）。
【０２９１】
７．１３．４  結論
本研究の目的は、インビトロにおける生物学的活性及び標的への結合を評価することのできる４つのアッセイを用いて、液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ−００８１医薬品（カプラシズマブ）のインビトロにおける同等性を評価することであった：
ａ）ビアコアに基づいた効力アッセイ
ｂ）ＥＬＩＳＡに基づいた効力アッセイ
ｃ）リストセチン誘導コファクター活性（ＲＩＣＯ）薬力学的バイオマーカーアッセイ
ｄ）Ｇｙｒｏｌａｂに基づいた親和性の決定。
【０２９２】
全てのインビトロアッセイが、予め定められた許容可能な基準を満たし、かつＡＬＸ-００８１の両方の製剤が、生物学的活性及び標的への結合の観点から同等であることを示した（表２４参照）。試験された液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１ＤＰ製剤は、以下を示した：
●  ビアコア及びＥＬＩＳＡアッセイを介して決定された類似した相対的効力
●  ＲＩＣＯアッセイを介したインビトロで同等な薬力学的活性（標的の中和）
●  Ｇｙｒｏｌａｂアッセイを介した同等な標的への親和性
【０２９３】
７．１４  液体の及び凍結乾燥させたＡＬＸ-００８１製剤の促進されたかつ長期の安定性試験
実施例７．１２に補足して、独立した安定性実験を、異なるバッチのＡＬＸ−００８１同製剤を使用して実施した［２０mM クエン酸緩衝液ｐＨ６．５、７％スクロース（ｗ／ｖ）及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）］。
【０２９４】
凍結乾燥製剤及び液体製剤の両方の安定性を、異なる温度で試験した：
−  ２０mM クエン酸緩衝液ｐＨ６．５、７％ スクロース（ｗ／ｖ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中、１３．８mg/mLのＡＬＸ−００８１液体製剤を、−６０℃以下及び＋５℃（±３℃）の温度で保存し、様々な時点で、すなわち最初、９か月後、１２か月後、１８か月後、及び２４か月後の時点で安定性について試験した。
−  ２０mM クエン酸緩衝液ｐＨ６．５、７％ スクロース（ｗ／ｖ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）中、１２．７mg/mLのＡＬＸ−００８１凍結乾燥製剤を、＋５℃（±３℃）、＋２５℃（±２℃／６０±５％ＲＨ）及び＋４０℃（±２℃／７５±５％ＲＨ）で保存した。液体製剤と同様に、凍結乾燥製剤の安定性を０か月後、９か月後、１２か月後、１８か月後、及び２４か月後に決定した。
【０２９５】
各時点において、試料の化学的及び物理的安定性を、ｃＩＥＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、外見、ｐＨ及びＵＶ吸光度をはじめとする多くの分析技術を使用してモニタリングした。凍結乾燥粉末の水分含量を、比色滴定によって決定した。社内製のＡＬＸ−００８１標準品と比較した、液体試料及び凍結乾燥試料の相対効力を、ビアコアにおいて測定した。
【０２９６】
液体製剤及び凍結乾燥製剤についての詳細な試料特徴付けデータを、それぞれ表２５〜２６及び表２７〜２９に示す。前記の各表の２列目に提示された基準を満たした試料を、製品の規格内であると判断した。
【０２９７】
得られたデータは、本発明の製剤が少なくとも２４か月間非常に安定であることを実証する。凍結乾燥ＡＬＸ−００８１の物理化学的特徴並びに生物学的活性は、＋５℃又は＋２５℃のいずれかでの２４か月間の保存によって有意に影響を受けなかった。＋４０℃で２４か月間ＡＬＸ−００８１にストレスをかけると、ポストピーク２の増加が観察され、これは、出発物質中の１．１％から、９、１２、１８及び２４か月後のそれぞれ、２．８％、３．２％、４．２％及び６．２％のピログルタメート変異体の形成に相当する。
【０２９８】
−６０℃以下又は＋５℃の温度での少なくとも２４か月間のＡＬＸ−００８１液体製剤の保存は、その物理化学的安定性に有意な影響を及ぼさず；含量の値は安定であり、試料は透明のままであり、初期の物質のｃＩＥＦ、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、安定試料のものと同等であった。
【０２９９】
＋４０℃で保存された凍結乾燥試料について報告された変化は、ストレスのかかった保存条件が原因である可能性があり、より穏やかな条件下での長期保存の安定性についての良好な指標を与える。
【０３００】
長期安定性の予測
現行の医薬品の規格は、ピログルタメートの許容される比率は４％以下であると述べている。この規格及び現行の安定性データに基づいて、アレニウス式を使用して、＋５℃及び＋２５℃における凍結乾燥医薬品の有効期限を予測した。アレニウス式は、製薬工業で一般的に使用される反応速度の温度依存性を説明した正確な式である。図１０及び１１に示されているように、凍結乾燥医薬品は、＋５℃で保存された場合には少なくとも５００か月間、及び＋２５℃で保存された場合には少なくとも６０か月間、規格内であり続けると予想される。
【０３０１】
７．１５  一般的な結論
ｗＷＦ結合剤、特に本明細書に記載のＡＬＸ−００８１の改質発明は、改善された溶解度（８０mg/mLまで）及び有意に改善された液体保存安定性（例えばその元来の製剤と比較してあまり酸化されていない）を有する新規なクエン酸／スクロースを基剤とした製剤とした。また、凍結乾燥型では、＋４０℃で１２か月間の保存後又はさらには２４か月間の保存後でさえ実質的に全く酸化又はａｓｐ異性化を検出することができなかった。クエン酸及びスクロース濃度のさらなる最適化により、凍結乾燥製品の水分含量は減少し、これによりピログルタメート形成速度は最小限となった。ｖＷＦ結合剤の各々の物理化学的特徴は、製剤の物理的並びに化学的な様々な構成成分、例えば緩衝液の選択、ｐＨ、濃度、賦形剤などによって異なった影響を受けたことが示された。様々な化学的及び／又は物理的ストレスを救済又は防ぐために最適化された、様々な製剤が本明細書において提供される。
【０３０２】
大半の重要な基準を満たす１つの製剤緩衝液を設計した：２０mMクエン酸ｐＨ６．５＋７．０％スクロース（ｗ／ｖ）＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｖ／ｖ）。この製剤を使用して、ＡＬＸ−００８１は、−２０℃、＋５℃、＋２５℃、及び＋４０℃において少なくとも１２か月間又はさらには２４か月間安定であることが示された。これらのデータは明瞭に、現行の液体製剤よりも、＋５℃におけるかなりより長い有効期限を指摘する。
【０３０３】
さらに、本発明者らは、現在まで臨床試験に使用されてきたＡＬＸ−００８１の現代の製剤が、インビトロでの生物学的活性及び標的への結合の観点から本明細書に提示された新規な最適化された凍結乾燥ＡＬＸ−００８１製剤と同等であることを十分に示した。
【０３０４】
【表２】
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【０３０５】
【表３】
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【０３０６】
【表４】
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【０３０７】
【表５】
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【０３０８】
【表６】
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【０３０９】
【表７】
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【０３１０】
【表８】
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【０３１１】
【表９】
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【０３１２】
【表１０】
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【０３１３】
【表１１】
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【０３１４】
【表１２】
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【０３１５】
【表１３】
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【０３１６】
【表１４】
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【０３１７】
【表１５】
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【０３１８】
【表１６】
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【０３１９】
【表１７】
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【０３２０】
【表１８】
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【０３２１】
【表１９】
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【０３２２】
【表２０】
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【０３２３】
【表２１】
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【０３２４】
【表２２】
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【０３２５】
【表２３】
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【０３２６】
【表２４】
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【０３２７】
【表２５】
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【０３２８】
【表２６】
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【０３２９】
【表２７】
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【０３３０】
【表２８】
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【０３３１】
【表２９】
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【０３３２】
【表３０】
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【０３３３】
【表３１】
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【０３３４】
【表３２】
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【０３３５】
均等物
前記の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能とするのに十分であると考えられる。本発明は、与えられた実施例によって範囲を制限されない。なぜなら、実施例は本発明の１つの態様の１つの説明として捉えられ、他の機能的に等価な実施態様も本発明の範囲内であるからである。本明細書に示されかつ記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、当業者には、前記の説明から明らかとなり、これは添付の特許請求の範囲内に該当する。本発明の利点及び目的は、本発明の各々の実施態様によって必ずしも包含されない。
【０３３６】
本出願全体を通して引用された全ての参考文献、特許及び公表された特許出願の内容は、その全体が参照により、特に本明細書で参照された用途又は対象物のために、本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月6日(2018.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載される発明。
【外国語明細書】
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