(57)【要約】      （修正有）【課題】高度の異形成および食道腺がんまたは低度の異形成を選択的に検出するための、プローブセットならびにプローブおよびプローブセットの使用方法が記述される。【解決手段】プローブがサンプルに存在するそれらの核酸標的に特異的にハイブリダイズする条件下で、被験者から得られた生物サンプルを染色体プローブのセットと接触させて、何かあれば、サンプルにおける食道がん腫または前駆体病変を選択的に検出することを含む。その後、高度の異形成および食道腺がんまたは低度の異形成の存在または不在は、生物サンプルに対する染色体プローブセットについて検出されたハイブリダイゼーションパターンから特異に決定される。【選択図】図１Ａ
2019213542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．食道がん腫に関する状態が未知であるヒト被験者からの食道細胞を含む生物サンプルを、２０ｑ１３座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、９ｐ２１座特異的プローブおよび８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブからなる染色体プローブのセットと接触させること；そして
ｂ．生物サンプルに対する染色体プローブのセットについての増減を評価して、ハイブリダイゼーションパターンが被験者における食道がん腫または前駆体病変の存在または不在の指標であるハイブリダイゼーションパターンを検出すること：
を含んでなる、方法。
【請求項２】
検出されるがん腫前駆体病変が低度の異形成（ＬＧＤ）である、請求項１の方法。
【請求項３】
検出されるがん腫または前駆体病変が高度の異形成（ＨＧＤ）および食道腺がん（ＥＡ）からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項４】
生物サンプルが、生検、細胞学的標本および切除標本からなる群から選ばれる標本から得られる細胞を含む、請求項１の方法。
【請求項５】
染色体プローブが蛍光により標識される、請求項１の方法。
【請求項６】
生物サンプルが細胞学的擦過標本を含む、請求項４の方法。
【請求項７】
被験者が、慢性胃食道逆流疾患およびバレット食道からなる群から選ばれる症状を有すると診断されている、請求項１の方法。
【請求項８】
染色体プローブのセットが、該前駆体病変について約０．７以下のＤＦＩを特徴とする、請求項２の方法。
【請求項９】
染色体プローブのセットが、該前駆体病変について約０．３５以下のＤＦＩを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】
染色体プローブのセットが、該食道がん腫または前駆体病変について約０．５以下のＤＦＩを特徴とする、請求項３の方法。
【請求項１１】
染色体プローブのセットが、該前駆体病変について約０．３５以下のＤＦＩを特徴とする、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーションパターンが、核の大きさ、核の形または核の染色における異常に基づいて予め選ばれる生物サンプルからの細胞において検出される、請求項１の方法。
【請求項１３】
生物サンプルがパラフィンに包埋される、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
２００４年には米国で、食道がんの１４，２５０の新症例および約１３，３００の死亡例が存在するであろうと算定されている。これらの腫瘍の約８０％は食道腺がん（ＥＡ）であり、残りの２０％は偏平上皮がんであろう。ＥＡの全部ではなくても大多数は、バレット食道（ＢＥ）、遠位の食道の正常な偏平上皮粘膜の、ゴブレット細胞を含有する分化された腸粘膜への化生によって惹起される新形成前の症状、を有する患者において生じると考えられる。ＢＥは、慢性の胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、１日当たり２０００万人以上の米国人を冒す疾患によって惹起される。慢性ＧＥＲＤを有する人々の６〜１４％がＢＥを発生させるであろう。ＢＥを有する患者におけるＥＡの出現率は１年当たり約０．５％〜１．０％であると報告されており、そしてＢＥを有する患者について生涯のがんの危険性は約５％である。
【０００２】
ＢＥを有する患者において食道腺がんへ導く組織学的段階は、次のとおりである：１）正常な層化偏平上皮の腸上皮化生（ＩＭ）、２）低度の異形成（ＬＧＤ）、３）高度の異形成（ＨＧＤ）および４）ＥＡ。ＢＥと診断された患者は、ＬＧＤ、ＨＧＤおよびＥＡを含む、新形成病変の発達に関して規則的な監視を受けるべきである。ＥＡおよびＨＧＤを有する患者は、遠位の食道切除または最近開発された治療、例えば光力学治療もしくは他の切除技術のいずれかにより積極的に処置されて、転移性および不治の疾病への進行を防がねばならない。ＬＧＤを有する患者は、ＨＧＤに進行する危険性にあるので、食道切除でなくても規則的な監視を必要とする。ＥＡを有する患者の全５年間の生残は、わずか２０％である。ＢＥに関連する新形成を有する患者の生残率における増大が必要であれば、ＥＡの新形成前駆体（すなわち、ＩＭ，ＬＧＤおよびＨＧＤ）の早期かつ正確な検出および処置が要求されるであろう。
【０００３】
組織学的結果は、現在では、患者が異形成および／またはＥＡを有するか否かを決定するための金の基準と考えられる。食道の規則的な内視鏡検査を実施し、そして罹患した食道の１〜２ｃｍ毎の４四分円の生検を得ることによって、ＢＥ患者がＨＧＤおよびＥＡの発生についてモニターされることが現在では推奨される。しかしながら、この勧告は、主として、特に長い分節のＢＥを有する患者においてこの手法を実施することに要する延長される時間のために、高頻度で従われるものではない。新形成の発生についてバレット患者をモニターするための生検の使用に関する問題は、１）罹患した粘膜の限定されるサンプリング、２）４四分円の生検を１〜２ｃｍ毎に採取することの非実用性、および３）ＬＧＤおよびＨＧＤの診断についての病理学者の乏しい観察者間の再現性を含む。１ｃｍ毎の４四分円の生検を利用する内視鏡監視は、罹患した粘膜の約１〜２％をサンプリングするのみであると評価されている。この限定されたサンプリングは、誤りの陰性病理結果または低い段階決定（ｕｎｄｅｒ−ｓｔａｇｉｎｇ）（例えば、ＨＧＤまたはＥＡを有する患者においてＩＭまたはＬＧＤのみを示す病理結果）をもたらすかもしれない。かくして、ＬＧＤ＋ＩＭ＋正常からＨＧＤおよびＥＡを区別するため、および正常＋ＩＭ患者からＬＧＤを区別するための改良された方法および組成物へのニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、被験者における食道がん腫または前駆体病変についてスクリーニングする方法を提供することである。本方法は、食道がん腫または前駆体病変に関連する染色体異常を検出するためのインサイチューハイブリダイゼーションの使用を伴う。この方法では、標識された核酸プローブのセットがサンプルにおける食道細胞にハイブリダイズされて、サンプルにおける食道がん腫および／または前駆体病変が選択的に検出される。次いで、プローブのハイブリダイゼーションパターンが調査され、その後、食道がん腫およ
び／または前駆体病変の存在または不在と相関させられる。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法における使用のための核酸プローブのセットを提供することである。プローブのセットは、生物サンプルにおける食道がん腫および／または前駆体病変を選択的に検出する能力を特徴とする。本セットは、低度の異形成（ＬＧＤ）または高度の異形成（ＨＧＤ）および食道腺がん（ＥＡ）に関連する染色体異常を担持する標的領域に対して相補的な染色体プローブを含む。個々の多プローブセットは、ＬＧＤ、ＨＧＤおよびＥＡを検出するだけでなく、また、ＬＧＤ＋正常＋ＩＭからＨＧＤ＋ＥＡを，そして正常＋ＩＭからＬＧＤを区別するために使用されてもよい。
【０００６】
本発明とともに使用するための適当なプローブは、遺伝子座に特異的な同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）プローブおよび染色体列挙（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）プローブを含む。本発明のプローブセットは、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、２０ｑ１３座特異的プローブ、染色体９列挙プローブ、染色体７列挙プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、５ｐ１５座特異的プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、染色体１７列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブからなる群から選ばれる染色体プローブを含んでもよい。プローブセットは、染色体Ｙ列挙プローブをさらに含んでもよい。
【０００７】
本発明のプローブセット内の個々のプローブの組み合わせ物は、本発明の方法において使用される場合、組み合わされた感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）および特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）のために選ばれるべきである。感受性、特異性および検出性に基づいて互いに補足するプローブであるように、食道がん腫および／または異形成に関連する最高頻度の染色体喪失（ｌｏｓｓ）または獲得（ｇａｉｎ）を検出する染色体プローブが選ばれるべきである。本発明において、ＬＧＤの同定のために選ばれるプローブセットは、多くとも約０．７であるＤＦＩ値を有するであろう。ＨＧＤ＋ＥＡの同定のために選ばれるプローブセットは、多くとも約０．５であるＤＦＩ値を有するであろう。いずれの場合でも、０．５未満のＤＦＩ値は、通常、なお一層良好な結果を提供するが、一方、多くとも約０．３５のＤＦＩ値は、通常、なお一層良好な結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、個々の多プローブセットが高い感受性および特異性により食道がん腫または前駆体病変を検出することができるという発見に一部基づいている。本発明は、低度の異形成（ＬＧＤ）、高度の異形成（ＨＧＤ）または食道腺がん（ＥＡ）における染色体異常を担持する標的領域に対して相補的な染色体プローブを含む、そのようなプローブセットの使用のための組成物および方法を含む。本発明の個々の多プローブセットは、個々のプローブよりも高い感受性および特異性を提供し、したがって、各セット内のプローブは、そのセット内に含有される各個々のプローブよりも食道がん腫または前駆体病変の良好な指標を集合的に含む。本発明のプローブセットは、異形成および／または腺がんの正確な判別を提供する。本発明前には、高い感受性と特異性により食道腺がんまたは前駆体病変を選択的に検出する能力を有するプローブセットは報告されていなかった。
【０００９】
本発明は、また、個々の多プローブセットがＬＧＤ、ＨＧＤおよびＥＡを検出するだけでなく、また、ＬＧＤ＋ＩＭ＋正常からＨＧＤおよびＥＡを，ならびにＩＭおよび正常からＬＧＤを区別するために使用されてもよい。本発明の方法およびプローブセットは、ＥＡおよび／またはその新形成前駆体の早期かつ正確な検出を可能にする。判別は、適当な処置を決定し、そして不治の状態への疾病の進行を防ぐための重要な道具である（参照、発明の背景）。
【００１０】
本発明の文脈上、用語「食道がん腫」は、粘膜内がん腫および食道腺がんまたは食道が
んを含むことが意図される。用語「前駆体病変（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｌｅｓｉｏｎ）」は、組織学的分析によって決定されるような、低度および高度の異形成を含むことｇａ意図される。用語「標的領域」または「核酸標的」は、特定の染色体の場所の喪失または獲得が食道がん腫および／または前駆体病変の存在の指標である場所に存在するヌクレオチド配列を指す。「標的領域」または「核酸標的」は、本発明のプローブによって特異的に認識され、そして本発明の方法において同プローブにハイブリダイズしなければならない。
【００１１】
染色体プローブ
本発明のプローブは、インサイチューハイブリダイゼーション技術、またはより好ましくは蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術とともに使用されるべきであり、この方法は当該技術分野において周知である。この技術では、標識された核酸プローブは、食道がん腫および／または前駆体病変の存在または不在の同定が望まれる生物サンプルにおいて、それらのそれぞれ相補的核酸標的にインサイチューでハイブリダイズされる。次いで、サンプル中のプローブの続いての検出が、被験者における異形成またはがんの臨床的診断と相関される。
【００１２】
用語「染色体プローブ」または「染色体プローブ組成物」は、染色体の領域に特異的にハイブリダイズする能力をもつポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの混合物を意味すると意図される。またプローブ標的とも言われる染色体領域は、プローブからプローブまでの長さにおいて変化してもよく、数千ヌクレオチドくらい小さいプローブ標的が検出されるけれども、典型的には約７０，０００ヌクレオチドから約８００，０００ヌクレオチドまでにわたり、そして反復配列標的を含む若干のプローブ標的は数メガ塩基の大きさにわたってもよい。染色体プローブは、しばしば、長さ約５０〜約１，０００ヌクレオチドの大きさにわたるポリヌクレオチドフラグメントからなり、そして興味ある領域を特異的に検出するそれらの能力によってのみ限定される。遺伝子座に特異的なプローブ標的は、好ましくは、少なくとも１００，０００ヌクレオチドを含む。本発明の染色体プローブは、検出を可能にする個々の部分と組み合わされるか、または会合されている。
【００１３】
本発明とともに使用するための適当なプローブは、座特異的同定プローブおよび染色体列挙プローブを含む。インサイチューハイブリダイゼーションのための座特異的プローブは、遺伝子異常がＥＡおよび／または異形成と相関される特異的な非反復遺伝子座を認識し、かつそれに結合する。プローブは、エクソン、イントロン、および／または標的領域の遺伝子発現もしくは遺伝子産物のプロセシングを制御する調節配列を含む、コーディングまたは非コーディング領域、またはその両方を標的としてもよい。特定の遺伝子座の標的化が所望される場合は、標的遺伝子の全長に沿ってハイブリダイズするプローブが、必ずしも要求されないが好適である。対照の細胞に較べて特定のサンプルの細胞では、プローブに対するシグナル数の増加または減少が、対応する領域についての獲得または喪失をそれぞれ指示する。必ずしも要求されないが、座特異的プローブは、遺伝子異常が食道がん腫または異形成と相関させられるがん遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子を含んでもよい。そのような座を含んでなる領域にハイブリダイズするプローブは、例えば、８ｑ２４．１２−１３、９ｐ２１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３を含み、これらはそれぞれ、Ｃ−ＭＹＣ、Ｐ１６（腫瘍サプレッサー遺伝子）、ＨＥＲ２（がん遺伝子）およびＺＮＦ２１７（また、がん遺伝子）にハイブリダイズする。本発明の他の座特異的プローブは、例えば、１７ｐ１３．１（ｐ５３）座特異的プローブ、７ｐ１２（ＥＧＦＲ）座特異的プローブ、５ｑ２１−２２（ＡＰＣ）座特異的プローブおよび５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。
【００１４】
染色体列挙プローブは、細胞における特定の染色体の数を列挙することができるすべてのプローブである。染色体列挙プローブは、特定の染色体の動原体の近傍領域（「ペリ−セントロメア」と呼ばれる）または動原体、典型的には反復ＤＮＡ配列を、典型的に認識
し、かつ結合する。動原体領域の喪失は、ほとんど常に完全な動原体の喪失をもたらすので、この場合には染色体の列挙が可能である。特定の染色体領域の欠失または増幅は、それが正常には内在している染色体全体の喪失または獲得（異数染色体性（ａｎｅｕｓｏｍｙ））から、特定の座に対応するシグナル数（コピー数）を対応する動原体のＦＩＳＨシグナル数に対して較べることによって判別することができる。この比較を実施する１つの方法は、動原体を表すシグナル数によって座を表すシグナル数を割ることである。１未満の比率は座の欠失を示し、そして１を超える比率は座の獲得を示す。同様に、比較は、同じ染色体における２つの異なる座の間で、例えば、その染色体の２つの異なる腕において実施されて、染色体内の不均衡な獲得または喪失を指示することができる。染色体の動原体プローブの代わりに、当業者は、染色体の腕プローブが、染色体全体の喪失または獲得を推測するために替わりに使用されてもよいことを認識できる。しかしながら、そのようなプローブのシグナルの喪失が完全な染色体の喪失を必ずしも示さないかもしれないので、そのようなプローブは染色体の列挙において正確ではない。染色体列挙プローブの例は、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬから市販されているＣＥＰ(R)プローブ（例えば、ＣＥＰ１２およびＸ／Ｙプローブ）を含む。
【００１５】
本発明のプローブセットは、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、２０ｑ１３座特異的プローブ、染色体９の列挙プローブ、染色体７の染色体列挙プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、５ｐ１５座特異的プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、染色体１７の染色体列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブからなる群から選ばれる染色体プローブを含んでもよい。プローブセットは、染色体Ｙの染色体列挙プローブをさらに含んでもよい。好適な実施態様では、本セットは、２０ｑ１３座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、９ｐ２１座特異的プローブおよび８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブを含んでもよい。
【００１６】
ＩＭ＋正常からＬＧＤを区別することができるプローブセットにおいて共通して現れる個々のプローブは、染色体７の染色体列挙プローブ、Ｙ染色体の染色体列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブを含む。ＬＧＤ＋正常＋ＩＭからＨＧＤおよびＥＡを区別することができるプローブセットにおいて共通して現れる個々のプローブは、５ｐ１５座特異的プローブ、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、９ｐ２１座特異的プローブ、染色体１７の染色体列挙プローブ、染色体９列挙プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブおよび２０ｑ１３座特異的プローブを含む。
【００１７】
ＩＭ＋正常からＬＧＤを検出し、そして／またはＬＧＤを区別することができるプローブセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）染色体９の染色体列挙プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）染色体７の染色体列挙プローブ；およびｃ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）染色体７の染色体列挙プローブ；およびｃ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｂ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）７ｐ１２座特異的プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）染色体１７の染色体列挙プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）９ｐ２１座特異的プローブ；ｂ）染色体７の染色体列挙プローブ；およびｃ）染色体９の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）９ｐ２１座
特異的プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ；ｂ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｃ）染色体７の染色体列挙プローブを含んでもよい。ＩＭからＬＧＤを検出し、そして／またはＬＧＤを区別することができるセットのいずれも、Ｙ染色体の染色体列挙プローブをさらに含んでもよい。
【００１８】
ＬＧＤ＋ＩＭ＋正常からＨＧＤ／ＥＡを検出し、そして／またはＨＧＤ／ＥＡを区別することができるプローブセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）染色体９の染色体列挙プローブ；ｃ）７ｐ１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）染色体９の染色体列挙プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）染色体９の染色体列挙プローブ；ｂ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ；ｃ）７ｐ１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）染色体９の染色体列挙プローブ；ｂ）７ｐ１２座特異的プローブ；ｃ）５ｐ１５座特異的プローブ；およびｄ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）５ｐ１５座特異的プローブ；およびｄ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）９ｐ２１座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）染色体１７の染色体列挙プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）７ｐ１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）染色体７の染色体列挙プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｄ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）９ｐ２１座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）７ｐ１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）染色体７の染色体列挙プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）７ｐ１２座特異的プローブ；ｃ）５ｑ２１−２２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）染色体１７の染色体列挙プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）染色体１７プローブ；ｂ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｃ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｄ）９ｐ２１座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）９ｐ２１座特異的プローブ；および
ｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｃ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）５ｐ１５座特異的プローブ；およびｄ）Ｙ染色体の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）染色体１７の染色体列挙プローブ；およびｄ）９ｐ２１座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｄ）染色体９の染色体列挙プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｄ）５ｑ２１−２２座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｂ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｃ）染色体１７の染色体列挙プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）染色体１７の染色体列挙プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）２０ｑ１３座特異的プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）５ｑ２１−２２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｂ）１７ｐ１３．１座特異的プローブ；ｃ）染色体１７の染色体列挙プローブ；ｄ）９ｐ２１座特異的プローブ；およびｅ）８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｂ）染色体９の染色体列挙プローブ；ｃ）５ｑ２１−２２座特異的プローブ；およびｄ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）染色体１７の染色体列挙プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；およびｃ）５ｐ１５座特異的プローブを含んでもよい。このセットは、ａ）染色体１７の染色体列挙プローブ；ｂ）１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ；ｃ）５ｐ１５座特異的プローブ；およびｄ）Ｙ染色体の染色体列挙プローブを含んでもよい。
【００１９】
染色体列挙プローブおよび座特異的同定プローブは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）またはＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から市販品を得ることができる。そのようなプローブはまた、当該技術分野において既知である標準技術を用いて製造することができる。染色体プローブは、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）から、またはヒトＤＮＡ配列の挿入物を含有する、プラスミド、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）およびＰ１人工染色体（ＰＡＣ）のようなクローン化ヒトＤＮＡから製造されてもよい。関心のある領域は、ＰＣＲ増幅またはクローニングを介して得られてもよい。あるいはまた、染色体プローブは、合成により製造されてもよい。
【００２０】
本発明のプローブの検出は、セット内の各プローブがハイブリダイゼーションにより互いに区別されれば、当該技術分野において既知である多数の方法のいかなるものによっても達成することができる。標識含有部分が、直接または間接的に染色体プローブと会合されてもよい。用語「標識含有部分」または「検出部分」は、一般に、その標的に対するハイブリダイゼーションによりそのプローブの検出を可能にさせる、直接的でも間接的でも、染色体プローブと会合される分子基を指す。種々の標識含有部分は、各ハイブリダイズされるプローブが検出において肉眼的に他と区別できるように、特定のセット内の各個々のプローブについて選択されなければならない。好ましくは、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が使用され、そして染色体プローブが明瞭な蛍光標識含有部分により標識される。蛍光団、特定の波長における照射により蛍光を発する有機分子は、染色体プローブに直接結合されてもよい。直接標識のＦＩＳＨプローブは、それらが非直接標識のプローブよりも少ない処理時間しか要しないので、好適である。また、存在す
る蛍光団の全くの数が、同じサンプル内の多数の異なるプローブの可視化を容易にさせる。多数の蛍光団が、脂肪族アミン基を含有するＤＮＡの標識を容易に受け入れる反応性形態物において市販されている。
【００２１】
核酸プローブに対する蛍光団の結合は、当該技術分野において周知であり、そしていかなる利用可能な手段によって達成されてもよい。蛍光団は、例えば、特定のヌクレオチドに共有結合で結合されてもよく、そして標識されたヌクレオチドは、ニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲ標識化のような標準技術を用いてプローブ中に組み入れられる。あるいはまた、蛍光団は、アミノ基転移されたプローブのデオキシシチジンヌクレオチドに対してリンカーを介して共有結合されてもよい。プローブの標識方法は、米国特許第５，４９１，２２４号およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００２），Ｙ．−Ｓ．Ｆａｎ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，”Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ，”Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．２１−４０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓにおいて記述されており、この両引用文献は引用によって本明細書に組み入れられている。
【００２２】
本発明とともに使用できる蛍光団は、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリスロシン−５−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ；およびＣＡＳＣＡＤＥブルーエクチラジド（ａｅｃｔｙｌａｚｉｄｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。
【００２３】
当業者は、他の発光剤または染料が、標識含有部分として蛍光団の代わりに使用されてもよい。使用されてもよい他の発光剤は、例えば、放射発光、化学発光、生物発光およびリン光性標識含有部分を含む。あるいはまた、染色体プローブのインサイチューハイブリダイゼーションは、間接的な手段によって可視化される検出部分の使用を用いてもよい。プローブは、当該技術分野において既知の日常的方法を用いてビオチンまたはジゴキシゲニンにより標識され、次いで検出のためにさらに処理されてもよい。ビオチン含有プローブの可視化は、検出可能なマーカーに共役されたアビジンの続いての結合を介して達成できる。検出可能なマーカー蛍光団であってもよく、この場合には、プローブの可視化および判別はＦＩＳＨについて上記のように達成されてもよい。標的領域にハイブリダイズされる染色体プローブは、また、不溶性の発色生成物の生成について、適当な基質と標識部分の酵素的反応によって可視化されてもよい。各プローブは、明確な標識部分の選択によってセット内の他のプローブと区別されてもよい。セット内のビオチン含有プローブは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）または西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および適当な基質に共役されたアビジンを用いる、続いてのインキュベーションを介して検出されてもよい。リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルおよびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）は、アルカリホスファターゼのための基質として働くが、一方、ジアミノベンジジンはＨＲＰの基質として働く。
【００２４】
蛍光団標識されたプローブまたはプローブ組成物が利用される実施態様では、検出方法は、蛍光顕微鏡法、流動細胞計測法、またはプローブハイブリダイゼーションを決定するための他の手段を伴ってもよい。すべての適当な顕微画像法が、多数の蛍光団を観察するために本発明の方法とともに使用されてもよい。蛍光顕微鏡法が使用される場合には、ハイブリダイズされたサンプルが、各蛍光団の励起のために適当な光線下、かつ適当なフィルターの使用により観察されてもよい。または、自動デジタル画像システム、例えばＭｅｔａＳｙｓｔｅｍまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍが使用されてもよい。
【００２５】
本発明のいかなるプローブセットも、本発明の方法の実行において使用できる、他の試薬、場合によっては指示書とともに、キットとして包装されてもよい。有用なキットは、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、２０ｑ１３座特異的プローブ、染色体９の染色体列挙プローブ、染色体７の染色体列挙プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、５ｐ１５座特異的プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、染色体１７の染色体列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブからなる群から選ばれる染色体プローブを含んでなる１組以上のプローブセットを含んでもよい。本セットは、Ｙ染色体の染色体列挙プローブをさらに含んでもよい。
【００２６】
インサイチュー・ハイブリダイゼーション
用語「インサイチュー」は、生物サンプル由来の細胞の染色体が、互いに関して染色体の実質的な崩壊または移転なしに、核から露出され、そして標識された染色体プローブに接近可能になることを意味すると意図される。「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、プローブと標的領域との間の特異的なハイブリッドの形成を指すことを意図している。典型的には、ハイブリッドは、一方が核酸標的を含み、他方がプローブの標識されたＤＮＡ核酸配列である、相補的な相対する一本鎖からなる二本鎖のらせん状形態部分を含む分子である。用語「インサイチュー・ハイブリダイゼーション」は、細胞学的または組織学的調製物または標本を含んでなる生物サンプル内に存在する標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを意味すると意図される。インサイチュー・ハイブリダイゼーションにおいて、ハイブリッドはプローブと標的との間に形成される。「インサイチュー・ハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーション前および標的へのプローブのハイブリダイゼーション後のハイブリッドまたはプローブの検出前の変性を含んでもよい。生物学的標本は、スライド表面上に層として接着することができ、そして生物サンプルは、例えば、変性条件下、またはプローブ検出手順において典型的に遭遇されるような条件下で、それらの形態を維持するように処理される個々の染色体または染色体領域を含んでもよい。
【００２７】
プローブ選択法
本発明の方法における使用のためのプローブセットは、実施例に記述される原理を用いて選ぶことができる。プローブセット内の染色体プローブの組み合わせ物は、関心のある食道がん腫および異形成に関する感受性、特異性および検出性について選ばれる。
【００２８】
感受性は、それが存在する場合の疾病（例えば、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡ）を検出するための試験（例えば、ＦＩＳＨ）の性能を指す。より正確には、感受性は、真の陽性／（真の陽性＋偽の（ｆａｌｓｅ）陰性）として定義される。高い感受性をもつ試験は、ほとんど偽陰性の結果を有しないが、一方低い感受性をもつ試験は多くの偽陰性結果を有する。他方、特異性は、疾病が存在しない場合に陰性結果を与える試験（例えば、ＦＩＳＨ）の性能を指す。より正確には、特異性は、真の陰性／（真の陰性＋偽の（ｆａｌｓｅ）陽性）として定義される。高い特異性をもつ試験は、ほとんど偽陽性の結果を有しないが、一方低い特異性をもつ試験は多くの偽陽性結果を有する。
【００２９】
一般に、ＬＧＤおよび／またはＨＧＤ＋ＥＡの検出のための最高の組み合わせ感受性および特異性をもつ染色体プローブセットが選ばれる。プローブの組み合わせ感受性および特異性は、パラメーターの理想からの距離（ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｄｅａｌ）（ＤＦＩ）によって表すことができる。ＤＦＩ値は、０〜１．４１４の範囲であり、０は１００％感受性と１００％特異性を有するプローブセットを表し、そして１．４１４は０％感受性と０％特異性を有するプローブセットを表す。本発明では、ＬＧＤの同定のために選ばれるプローブセットは、多くとも約０．７であるＤＦＩ値を有するであろう。本発明では、ＨＧＤ＋ＥＡの同定のために選ばれるプローブセットは、多くとも約０．５であるＤＦＩ値を有するであろう。約０．５未満のＤＦＩ値は、通常、なお良好な結果を与える。約０．３５未満のＤＦＩ値は、通常、なお良好な結果を与える。
【００３０】
ヒトの観察者によって（そしてコンピューターに助けられる画像技術によらない）観察されるべきセット内のプローブ数は、ハイブリダイゼーションにおいて肉眼的に判別できるシグナルを与える独特な蛍光団の数によって限定される。例えば、現在では、単一のプローブセットにおいて４種以上の独特な蛍光団（ヒトの眼に対して赤色、緑色、水色および金色シグナルとして現れる）を有することは困難である。これが重要である理由は、アッセイの感受性が一般にセット内のプローブ数の増加とともに増加するからである。しかしながら、感受性における増大は、より多くのプローブの添加とともに次第に小さくなり、そしてある時点においてプローブセットへのさらなるプローブの包含は、アッセイの感受性における有意な増大と関連されない（「利益の減少」）。また、プローブセットにおける多数のプローブの包含は、アッセイの特異性を増大する能力を有することも注目されるべきである。これらの理由のために、この数が所望される検出の感受性と特異性を提供するので、本発明のプローブセットは、好ましくは、３種または好ましくは４種の染色体プローブを含む。
【００３１】
個々のプローブは、セット内の他のプローブを補足するそれらの能力に基づいて、本発明のプローブセットにおける包含のために選ばれるべきである。各プローブは、他のプローブが以前に同定しそこなった食道がん腫または前駆体病変のマーカーを同定しなければならない。どのプローブが互いに補足するかを決定する１つの方法は、１群の腫瘍標本において最低のＤＦＩ値をもつ単一のプローブを最初に同定することである。次いで、さらなるプローブが、最初のプローブが同定しそこなった腫瘍サンプルにおいて試験され、そして最低のＤＦＩ値をもつプローブがセットに追加されてもよい。次いで、これが、所望されるＤＦＩ値をもつ染色体プローブの完全なセットが達成されるまで、繰り返されてもよい。
【００３２】
判別分析は、どのプローブがＥＡおよびその前駆体病変を最良に検出できるかを決定するために使用することができる１つの方法である。この方法は、正常な標本のような対照標本に比較された場合、個々のプローブが、試験標本（例えば、ＬＧＤ、ＨＧＤおよびＥＡ）において異常細胞の統計学的差異パーセントを検出することができるか否かを調査する。染色体（または遺伝子座）の獲得または染色体（または遺伝子座）の喪失をもつ細胞の検出は、両方とも、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡを有するバレット食道患者における新形成細胞を同定するために使用することができる。しかしながら、染色体の喪失は、ランダムなシグナルの重複および／または低いハイブリダイゼーションに因って、時々、正常細胞における人工物として生じる。その結果、染色体獲得は、多くは、新形成細胞の存在の一層信頼できる指標である。
【００３３】
個々の染色体獲得および喪失のカットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）値は、プローブセットを選ぶ場合に決定されなければならない。用語「カットオフ値」は、作成されるべき陽性決定
のためのセット内の特定のプローブまたはプローブの組み合わせ物について、遺伝的異常（すなわち、標的領域の喪失または獲得）を有する集団における細胞の絶対数またはパーセンテージのいずれかを意味すると意図される。特定のプローブについて喪失または獲得を担持している標本における細胞の数がカットオフ値よりも高い場合には、サンプルは、評価しうる病状（例えば、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡ）について陽性であると決定される。
【００３４】
プローブは、ＥＡおよびその前駆体病変を検出するそれらの能力については簡単に選択することができる。しかしながら、これらの病変を集合的に検出するのみならず、互いのものを区別する能力（例えば、ＨＧＤ＋ＥＡとＬＧＤを区別する能力）は、潜在的な臨床上の利用性を有する。この目的のために、分析は、ＩＭおよび正常標本からＬＧＤ標本を、そしてＬＧＤ、ＩＭおよび正常標本からＨＧＤおよびＥＡを区別するための種々のプローブセットのＤＦＩ値を決定するために実施される。
【００３５】
食道の異形成および／またはがん腫に関する患者のスクリーニングおよび診断
この方法は、最初に、食道がん腫または前駆体病変を有すると疑われる被験者から食道細胞を含む生物サンプルを得ることを含む。次いで、サンプルが、サンプルに存在するそれらの核酸標的にプローブを特異的にハイブリダイズさせる条件下で、染色体プローブのセットと接触されて、何かあれば、サンプルにおける食道がん腫または前駆体病変が選択的に検出される。本セットのプローブは、画像化された（ｉｍａｇｅｄ）各ハイブリダイゼーションの結果、取り去られた（ｓｔｒｉｐｐｅｄ）プローブ、および残っているプローブとその後にハイブリダイズされるサンプルにより、一回にまたは連続的にハイブリダイズされてもよい。また、多数のプローブセットがこの方式でサンプルにハイブリダイズされてもよい。染色体プローブのセットは、該セットが、生物サンプルにおける食道がん腫または前駆体病変を選択的に検出できるように選ばれる。本発明のすべてのプローブセットが本方法とともに使用することができる。本方法は、生物サンプルに対する染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを検出することを含み、この場合、ハイブリダイゼーションパターンが被験者における食道がん腫または前駆体病変の存在または不在について指示する。好適な実施態様では、ハイブリダイゼーションパターンは先に記述されたようなＦＩＳＨを介して検出される。
【００３６】
用語「生物サンプル」または「標本」は、食道細胞を含むサンプルを意味すると意図される。生物サンプルは、さらに、慢性胃食道逆流疾患、強皮症、食道腺がん、食道切除前、バレット食道または食道粘膜異常を有すると診断された被験者から得られてもよい。生物サンプルは、近位、中央または遠位の食道から得られてもよい。
【００３７】
生物サンプルは、当該技術分野におけるいかなる多数の方法を用いても得ることができる。通常は、食道の粘膜層が、十分な標本が得られるようにｎ−アセチル−システインのような粘膜溶解剤により食道粘膜から除去される必要があるであろう。食道の細胞を含む生物サンプルの例は、生検、細胞学的標本および切除標本から得られるものを含む。細胞学的標本は、内視鏡擦過標本またはバルーン（ｂａｌｌｏｏｎ）細胞学的標本であってもよい。生物標本はまた、パラフィン中に包埋され、そして本発明の方法において切片化されてもよい。典型的には、一旦得られた生物サンプルは、ハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）され、そして当該技術分野において既知の標準的方法を用いてハイブリダイゼーション前に処理される。そのような処理は、典型的には、酸アルコール溶液、酸アセトン溶液またはアルデヒド溶液、例えばホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドにおける固定を含む。３：１比のメタノール：氷酢酸が典型的には使用される。細胞はハイブリダイゼーション前に所望の密度まで濃縮されてもよい。
【００３８】
プローブをそれらの核酸標的に特異的にハイブリダイズさせる条件は、一般に、特異的
ハイブリッドを生成するための特定のハイブリダイゼーション手法において使用できる条件の組み合わせ物を含み、この条件は当業者によって容易に決定することができる。そのような条件は、典型的には、制御された温度、液相および染色体プローブと標的との接触を必要とする。ハイブリダイゼーション条件は、プローブ濃度、標的の長さ、標的とプローブのＧ−Ｃ含量、ハイブリダイゼーションバッファーの塩濃度、溶媒組成、温度、およびインキュベーション時間を含む、多くのファクターに依存して変わる。少なくとも１つの変性段階は、標的とプローブの接触を進めるであろう。あるいはまた、プローブと核酸標的の両方が、生物サンプルとプローブのその後の接触とともに、変性条件にかけられてもよい。ハイブリダイゼーションは、例えば、２〜４ｘ食塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）とホルムアルデヒドの約５０：５０容量比の混合液の液相において、範囲約２５〜約５５℃の温度で、具体的には範囲約０．５〜約９６時間である時間、またはより好ましくは、範囲約３２〜約４０℃の温度で、範囲約２〜約１６時間の間、プローブ／サンプルの続いてのインキュベーションにより達成されてもよい。特異性を増大するために、ブロッキング作用物、例えば、内容が引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第５，７５６，６９６号に記述される無標識のブロッキング核酸の使用が、本発明の方法とともに使用されてもよい。他の条件は、当業者にとって容易に明らかであるように、サンプル中に存在する核酸標的へのプローブの特異的なハイブリダイゼーションのために容易に使用することができる。
【００３９】
適当なインキュベーション時間の終了時に、サンプルＤＮＡに非特異的に結合された染色体プローブは一連の洗浄によって除去されてもよい。温度および塩濃度は所望のストリンジェンシーのために適当に選ばれる。要求されるストリンジェンシーのレベルは、ゲノム配列に関連される特異的なプローブ配列のコンプレキシティーに依存し、そして既知のゲノム組成物のサンプルに対して整然とハイブリダイズするプローブによって決定されるであろう。一般に、高いストリンジェンシー洗浄は、約０．２ｘ〜約２ｘＳＳＣおよび約０．１％〜約１％の非イオン性洗剤、例えばＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）により、範囲約６５〜約８０℃の温度で実施されてもよい。より低いストリンジェンシー洗浄が要求される場合、洗浄は増加された塩濃度により比較的低い温度で実施されてもよい。
【００４０】
ＦＩＳＨハイブリダイゼーションが実施された後、スライドは適当なフィルターを備えた蛍光顕微鏡により調査されて、新形成の診断と一致する染色体の異常を有する細胞（本発明では、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡと一致する染色体の異常を有する細胞の存在を指す）がスライド上に存在するか否かが決定される。この顕微鏡分析は、１）明らかに新形成ではない細胞、例えば炎症性細胞を除いて、ある数の連続する細胞（例えば、５０または１００個の細胞）におけるシグナルパターンを列挙するか、あるいは２）細胞が新形成であることを示唆する細胞学的特色（例えば、核の伸長、核の不規則性または斑状のクロマチン染色）を有する細胞についてスライドを走査し、そしてまさにそれらの細胞におけるシグナルパターンを列挙するか、いずれかによって実施することができる。これらの方法の各々は長所と短所を有し、そして２つの組み合わせが、時には要求されるであろう。
【００４１】
その事例が異常性について陽性であるか否かを知るために、ある種の異常性を含有する細胞の正確なパーセンテージが決定されねばならない場合には、連続する細胞を数える第１の技術が必要であろう。例えば、同型接合体または半接合体９ｐ２１喪失を示す事例が、ＬＧＤについて実際に陽性であるか否かを決定するためには、異常性を示す細胞のパーセンテージを知らなければならないであろう。また、新形成細胞が、ＬＧＤに関する事例であるような、有意な細胞学的異常性を現さない場合に、第１の技術が必要である。連続する細胞を数える最初の技術の欠点は、それが相当の時間を費し、したがって、それが比較的少数の細胞（例えば、５０または１００個の細胞）を数えるためにのみ実際的であることである。これに関する問題は、スライド上にはしばしば数千の細胞が存在し、時には
、細胞の総数の非常に小部分のみが実際に腫瘍細胞であることである。結果的に、第１の技術を用いることによって、限定されたサンプリングによる偽陰性結果の危険性がある。
【００４２】
幸いに、多数の細胞を迅速に調べることを可能にする走査技術（技術ナンバー２）は、限定されたサンプリングによる偽陰性結果の回避を助けるために使用することができる。この技術（内容が引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第６，１７４，６８１号において開示されている）は、新形成についての必ずしも絶対的な診断ではないけれども、疑わしい細胞の特徴を有する細胞について、スライド、通常は全スライドを可視的に走査することによって実施される。走査は、スライド上の各顕微鏡視野を観察しながら、新形成を示唆する核の異常を有する細胞についてのみかなり迅速に調査することによって実施される。走査をする人は、スライド上の全視野の調査を試みるが、細胞が異常な細胞学的特徴を有しなければ、視野中の細胞のシグナルパターンを評価する時間を費さない。（ＤＡＰＩによって見られる細胞学的特徴が、細胞が新形成であることを示唆する場合に、ＦＩＳＨがなお必要である理由が時には求められる。その理由は、特徴が示唆されるが、それらが必ずしも新形成の絶対的な診断ではないからである。）先に注目されたように、走査は、新形成の診断と一致する染色体の異常を有すると見られる細胞の一般に少部分に絞られる列挙を可能にする。走査はより速い分析を可能にし、そして陽性の結果が誤れない可能性を増大する。一般にＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール  ジヒドロクロリド）核対比染色とともに実施されながらの走査は、また、他の対比染色、例えばヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ）により実施することができる。典型的には約０．４μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で使用されるヨウ化プロピジウムは、６１４ｎｍの発光最大波長で観察できる赤色蛍光性のＤＮＡ特異的染料である。典型的には約１２５ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されるＤＡＰＩは、４５２ｎｍの発光最大波長で観察できる青色蛍光性のＤＮＡ特異的染料である。染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンは、染色体の喪失および／または獲得の調査のために選ばれた細胞について検出され、記録される。ハイブリダイゼーションは、染色体プローブの各々によって生成される特定のシグナルの存在または不在によって検出される。用語「ハイブリダイゼーションパターン」は、前述の２つの技術の１つによるそのような調査について選ばれたそれらの細胞の各プローブシグナルの染色体ハイブリダイゼーションシグナルの数の定量を指すと意図される。各プローブに対してハイブリダイゼーションを示す領域数によって査定されながら、各細胞内の標的領域の数が決定されると、関連した染色体の獲得および／または喪失が定量できる。常染色体にハイブリダイズするプローブでは、１細胞当たり２個以上のプローブシグナルは獲得とみなされ、一方、２個未満は喪失とみなされる。Ｙ染色体の染色体列挙プローブでは、男性において１細胞当たり１個以上のプローブシグナルは獲得とみなされ、一方、１細胞当たり１個未満のプローブシグナルは喪失とみなされる。獲得および／または喪失をもつ細胞（異常細胞）のパーセンテージが、各遺伝子座について記録される。試験された座の全てに関して異常細胞のパーセンテージがその座についてカットオフ値を超える場合は、サンプルは異常性（例えば、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡ）について陽性とみなされてもよい。
【００４３】
分析を実施する人が、走査によって調査された全細胞の正確な数（しばしば数千において）の軌跡を保存しないので、走査技術により異常を示す細胞の正確なパーセンテージを決定することは不可能である。しかしながら、探査されている細胞（すなわち、顕著な染色体の異常性、例えば、多染色体性を示す細胞）は、スライド上に存在する細胞の総数と無関係な現存する新形成の可視的診断であるので、走査技術によりスライド上で観察される細胞の正確な数を知る必要はない。言い換えれば、走査技術を使用する場合、事例が新形成について陽性または陰性であるかを決定するために使用されるそれは、異常性を示す細胞のパーセンテージよりむしろ異常性を示す細胞の絶対数である。われわれのグループまたは他のグループの従来の研究は、４個くらいの少ない多染色性をもつ細胞（スライド上の正常と思われる細胞の総数とは無関係な）（すなわち、２種以上のプローブについて
獲得を示す細胞）が、異常性について陽性である事例と確信をもって呼ぶのに十分であることを例証した（参照、Ｓｏｋｏｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２０００）。
【００４４】
先に注目されたように、単一プローブセット中の多数のプローブの包含は、単一プローブにより得られる以上にアッセイの感受性を増大する。しかしながら、この感受性の増大は、多数のプローブのいずれかが偽陽性の結果を与える機会が増加するので、特異性の喪失を伴うことがある。高い特異性を維持するために、単一遺伝子座の異常を示す細胞についての厳格なカットオフ基準を開発することができる。例えば、異常性について陽性の事例と呼ぶためには、細胞の少なくとも３０％が同型接合体９ｐ２１の喪失を示さねばならないと規定することができる。さらに、単一のプローブについてこれらのカットオフを超えない事例では、細胞が異常であるとみなすためには、２種以上の座が同じ細胞内で獲得または喪失を表示することが規定でき、次いで標本が陽性であるか否かを確定するために適当なカットオフが適用される。例えば、獲得が食道の悪性腫瘍または前駆体病変を指示する場合には、例えば、サンプルが少なくとも２個以上の標的領域の獲得を示す少なくとも４個の細胞を含有するならば、サンプルは陽性であるとみなすことができる（参照、Ｓｏｋｏｌｏｖａ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，２０００）。
【００４５】
より具体的には、例えば、標本が次に示す基準を満たせば、それらは陽性とみなされた：
・  細胞の≧１３％が半接合体および／または同型接合体９ｐ２１喪失を示す（低度の異形成の診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧４％が８ｑ２４の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧８％が１７ｑ１１の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧１２％が２０ｑ１３の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。より好適な実施態様では、細胞の≧１６％が２０ｑ１３の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧３％が多染色体性を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
【００４６】
上記の数およびプローブは単なる例にすぎない。当業者は、より低いか、より高いレベルの感受性および特異性が、実施される特定のアッセイのために使用される基準およびプローブセットに応じてもち得ることを理解するであろう。例えば、「多染色体」をもつ細胞の最大パーセンテージ（例えば、≧５％）が異常性のカットオフとして利用される場合には、より低い感受性だが、より高い特異性が得ることができる。
実施例
【実施例１】
【００４７】
プローブ選択
ＦＩＳＨプローブセット
ＦＩＳＨは３種のユニーク・プローブセットを用いて実施された。各プローブセットは、ＢＥ関連の新形成を有する患者においてしばしば変化されることが示されている染色体の動原体または特定の座に対する、４種の染色体列挙プローブ（ＣＥＰ(R)）または座特
異的同定物（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＬＳＩ(R)）を含有した（表１）。ＣＥＰ７、Ｃ
ＥＰ９およびＣＥＰ１７プローブは、それらの染色体（例えば、染色体９における９ｐ２１）における対応するＬＳＩプローブの対立遺伝子の獲得または喪失またはそれらの染色体の異数染色体性（ａｎｅｕｓｏｍｙ）を決定するために包含された。
【００４８】
【表１】
2019213542.tif 000003
【００４９】
ＬＳＩ(R)５ｑ２１−２２（ＡＰＣ）プローブを除けば、ＬＳＩ(R)およびＣＥＰ(R)プ
ローブは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅTMで標識されて、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ｗｗｗ．ｖｙｓｉｓ．ｃｏｍ）から市販されている。ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅTM標識の代わりに、核酸出発材料はアミノ交換され、次いで、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（赤色）、６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸（緑色）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸（水色）および５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ（金色）を用いて化学的に標識された。アミノ交換反応および標識方法は、引用によって本明細書に組み入れられた、Ｂｉｔｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４９１，２２４号に記述されている。
【００５０】
ＬＳＩ(R)５ｑ２１−２２（ＡＰＣ）プローブは、２種のＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎから得られる同定番号ＲＰＣＩ１１−６０ｐ２０およびＲＰＣＩ１１−１４１ｉ１１）から作成された。コンティーグのサイズは約２４６ｋｂであり、そしてＡＰＣ遺伝子はコンティーグのほぼ中心に置かれた。プローブはアミノ交換され、そして上記のように標識された。
【００５１】
研究集団
インスチチューショナル・レビュー・ボード（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ））の承認がこの研究のために得られ、そしてインフォームド・コンセントがすべての登録された患者から得られた。研究は、２００２年から２００３年までにｔｈｅ  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒにおいて遭遇された１７４人の患者を含んだ。患者が、既に同定された病変の証明されたＢＥか、または研究に入る時点で病変の証明されたＢＥを有する場合に、彼らは研究に登録された。年令３１〜８７才にわたる１７人の女性および１５３人の男性が研究された。
【００５２】
標本および病変の発見
細胞擦過標本は、ｎ−アセチル−システインの噴霧により最初に粘膜層を除去した後、ＩＭ、ＢＥ関連新形成の疑われる場所、または既に診断されたＢＥの場所の表面上を胃腸シース・ブラシ（Ｈｏｂｂｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｓｔａｆｆｏｒｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で掃くことによって得られた。ブラシは直ちにＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ(R)  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｏｘ
ｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を含有するビンに容れられ、そして処理のためにＦＩＳＨ研究所に送付された。
【００５３】
３種のプローブセットの少なくとも１つのために５０細胞を超える、列挙のために十分な数の細胞を含有した内視鏡擦過標本についての病変知見は、１７４標本の１７０において列挙することができ、次のとおりであった：正常（Ｎ＝３４）、ＩＭ（Ｎ＝２８）、ＬＧＤ（Ｎ＝２４）、ＨＧＤ（Ｎ＝６７）およびＥＡ（Ｎ＝１７）。多くの生検または粘膜内切除（ＥＭＲ）により、擦過時点で１個以上の病変結果を有した標本は、観察された組
織学的類目のもっとも進行した類目にしたがって類別された（例えば、患者が、１つはＩＭであり、他方はＨＧＤであった２つの生検を有した場合は、標本はＨＧＤ類に入れられた）。
【００５４】
ＦＩＳＨ分析のための細胞の単離
標本は収集の７２時間内に処理された。３：１メタノール：氷酢酸固定液の１０ｍｌを用いて４回、ブラシを洗浄し、そしてこの混合液を５０ｍｌ三角遠心チューブに移すことによって、細胞がブラシから除去された。次いで、細胞は８００ｘｇで８分間の遠心によって沈降された。上澄液を除き、細胞ペレットは３：１メタノール：氷酢酸溶液の１０ｍｌ中に再懸濁された。細胞懸濁液は次いで３００ｘｇで８分間遠心された。次いで、細胞ペレットの量に応じて、上澄液のすべてだが約５０〜１５０μｌが除去された。次いで、細胞ペレットは弱く回転することによって再懸濁され、そしてさらなる使用のために−４℃で保存された。
【００５５】
ＦＩＳＨ分析のためのスライドの調製
細胞懸濁液の一部（通常約１０〜５０μｌ）がミクロピペッターを用いて３個のウェル（３種のプローブセットの各々について１ウェル）上に滴下された。セルラリティ（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）（すなわち、ウェル中の細胞密度）は位相差顕微鏡を用いて調査された。セルラリティが低すぎる場合は、細胞ペレットのさらなる部分が、所望のセルラリティ（すなわち、最小の細胞重複をもつ１スポット当たり最大数の細胞）が達成されるまでウェルに添加されるか、または細胞ペレットが排出された。
【００５６】
ＦＩＳＨハイブリダイゼーション
ＦＩＳＨは次の様式で実施された：スライドが２Ｘ標準食塩クエン酸塩（ＳＳＣ）において３７℃１３分間、１０ｍＭＨＣｌ中０．０５ｍｇ／ｍｌペプシンにおいて３７℃１４分間、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）において室温（ＲＴ）で５分間、１％ホルムアルデヒドにおいてＲＴで５分間、そしてＰＢＳにおいてＲＴで５分間インキュベートされた。次いで、スライドは、ＲＴの７０％、８５％および１００％エタノール溶液中に各２分間置かれ、そして風乾された。この前処理後、適当なプローブ混合液の５μｌ（１．５μｌプローブ、３．５μｌ  ＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーションバッファー）が指定された場所に適用された。次いで、スライドはカバースリップを施され、カバースリップの端がゴムセメントで密封され、そしてＶｙｓｉｓ  ＨＹＢｒｉｔｅTM  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ／Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに置かれ、ここで、プローブと標的ＤＮＡが７３℃で３分間同時に変性され、次いで、３７℃で約１５時間インキュベートされた。一夜のハイブリダイゼーション後、スライドは２ＸＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０中で７３℃４０秒間洗浄され、そして２ＸＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０中室温で数分間洗浄された。次いで、ＤＡＰＩＩの１０μｌ対比染色が各ハイブリダイズされた場所に適用され、そしてスライドがカバースリップを施された。
【００５７】
ＦＩＳＨシグナルの列挙
スライドは、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄのための二重通過フィルターとともに、ＤＡＰＩ対比染色、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｑｕａ(R)およびＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｏｌｄ(R)のための単帯通過フィルターを備えたエピ蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡により分析された。ＦＩＳＨシグナルの列挙は、患者の臨床学的または組織学的知見の知識なしに実施された。標本は、５０〜１００個の連続する非炎症性、非偏平上皮細胞における各プローブについてのシグナル数をカウントし、記録することによって分析された。偏平上皮細胞は、他の細胞タイプが存在しなかった副次的場合についてのみ列挙された。細胞を重複して数えないように注意が払われた。可能であれば１ハイブリダイゼーション当たり１００個の細胞が列挙された。少なくとも５０個の細胞の列挙が、データ分析に含まれる事例について要求された。
【００５８】
列挙データの分析
１標本当たり分析される５０〜１００細胞の各々が、常染色体における１１の座に関して、座の正常な相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（２つのＦＩＳＨシグナル）、座の獲得（２つを超えるＦＩＳＨシグナル）または座の喪失（２つ未満のＦＩＳＨシグナル）を有するとして分類された。ＣＥＰ  Ｙでは、動原体配列の１つのコピーは正常であり、２つ以上のシグナルは獲得を示し、そしてゼロシグナルは喪失を示した。同じ染色体における多数の座（例えば、ＣＥＰ１７、１７ｐ１３．１および１７ｑ１１．２−１２）では、また、その他に関して１つの座の相対的な獲得または喪失が、各細胞について記録された。１つの座の相対的な獲得は、１つを超える第２の座のＦＩＳＨシグナルに対するその座におけるＦＩＳＨシグナルの比によって指示された。相対的な喪失では、比は１未満であった。獲得および喪失をもつ細胞のパーセンテージは、各標本における各座について一覧表にされ、そして細胞パーセンテージの平均値（ｘ）および標準偏差（ｓ）が、列挙のために不十分なシグナル特性の標本を除いて、各診断群（正常、ＩＭ、ＬＧＤ、ＨＧＤ、ＥＡ；参照、表２および３）について計算された。
【００５９】
【表２】
2019213542.tif 000004
【００６０】
（ｘ1−ｘ2）2／（ｓ12＋ｓ22）［式中、ｘ1およびｓ1は，ＩＭ、異形成またはがん群
の１つを指し、そしてｘ2およびｓ2は、正常標本の群を指す］として定義される判別値（ＤＶ）は、座の獲得または喪失が、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡのいずれかを有する患者の群からのサンプルと、これらの異常の１つを表さない患者の群（すなわち、患者のＩＭおよび正常群）からのサンプルとの間を、区別する能力の測定値として使用された。比較的大きいＤＶ値は、患者の２群の間を区別する比較的大きい能力を示した。判別のその他の測定値として、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定が、２つの異なる標本群の異常細胞のパーセンテージに応用されて、差異が統計的に有意である（確率＜０．０５は有意とみなされる）か否かを決定した。
【００６１】
感受性および特異性は、１２の座の各々について獲得または喪失を示す細胞のパーセンテージに対してカットオフを適用することによって計算された。標本は、それぞれ獲得または喪失をもつ細胞のパーセンテージがその座についてカットオフを超えた場合には、座の獲得または喪失について陽性とみなされた。特定の診断をもつ標本を検出する感受性は
、陽性であった群における標本の分数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に等しい。カウントするために十分な性質のＦＩＳＨシグナルをもつ少なくとも５０個の細胞を提供しない標本は計算から除外された。対照群に対する特異性は、１マイナス同じ基準を用いて陽性であった対照群の標本（偽陽性）の分数として計算された。プローブの組み合わせ物では、カットオフは各標的化された座に対して独立に適用された。プローブ組み合わせ物によって標的化された座のいずれかがそれぞれのカットオフについて陽性であった場合は、標本は陽性とみなされた。パラメーター「理想からの距離（ＤＦＩ）」は、両感受性および特異性を組み入れており、各プローブまたはプローブの組み合わせ物の相対性能を調査するために使用された。ＤＦＩは［（１−感受性）2＋（１−特異性）2］1/2として定義される。ＤＦ
Ｉは、１００％感受性および１００％特異性の性能をもつアッセイでは０であり、そして０％特異性および０％感受性をもつアッセイでは１．４１４に増加する。
【００６２】
プローブの補足は、カットオフ値の全範囲にわたって、４プローブの組み合わせ物までのすべての可能なプローブ組み合わせ物について感受性、特異性およびＤＦＩ値を計算することによって評価された。判別分析（表４）において０．０５未満のｐ−値を与えるプローブのみが、これらの計算において利用されて、低ＤＦＩ値がランダムな事象の組み合わせからもたらされる可能性を低下させ、そして計算時間を低減させた。１％の増加量における０と１００％異常細胞との間のカットオフ値が、各単一プローブについて計算された。組み合わせ物における各プローブは異なる最適カットオフ値を有するので、カットオフ値は、特定の組み合わせ物における各プローブについて独立に変化された。０および１００％および１％増加細胞の間のカットオフ値の独立した変化は、プローブ組み合わせ物について実用的ではなかったので、各座および各診断群における異常細胞の平均パーセンテージの標準偏差に基づくカットオフが最初に計算された。カットオフ値はｘ＋ｎ*ｓと
して作成され、式中、ｘおよびｓは、対照標本群における特定の座についての平均値および標準偏差であり（ＬＧＤについてのｘおよびｓはＥＡ＋ＨＧＤを判別するために使用され、そしてＩＭについてのｘおよびｓはＬＧＤを判別するために使用された）、そしてｎは典型的には０．２の増加量における−１〜５の範囲の乗数である。プローブ組み合わせ物では、カットオフは，組み合わせ物中の各プローブ個々にについて独立のｘおよびｓを用いるが、ｎの同じ値を用いて計算された。この手法は、対照群における異常性のレベルおよび偏差の度合に基づき各プローブに対して調節されたカットオフ値を提供した。第１の近似値に対して、ｘにおけるカットオフ値およびｓの共通乗数を基礎とすることは、カットオフ値の特定のセットのための組み合わせ物における各プローブについて対照群に対して類似の特異性を確立する（対照群内の異常細胞のパーセンテージの正規分布を仮定して）。各カットオフまたはカットオフ値のセットにおけるプローブおよびプローブ組み合わせ物は、より良好な性能を同定するために最低から最高ＤＦＩまで分類された。最高性能のプローブ組み合わせ物のための最適カットオフ値（最低ＤＦＩ値）は、対照標本群のｘおよびｓを用いて確立された最適カットオフに隣接する１％異常細胞増加量におけるカットオフ値を変えることによってさらに改善された。
【００６３】
Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（ＲＯＣ）グラフは、試験されたカットオフ値の範囲にわたる特定のプローブまたはプローブ組み合わせ物について感受性対１−特異性をプロットすることによって生成された（上記参照）。プローブ組み合わせ物において独立に変えられたカットオフ値は、各特異性値について多数の感受性値を生成するので、各特異性値における最高の感受性値のみがプロットされて、各特異性についてのカットオフ値の最適組み合わせ物を表した。プローブまたはプローブ組み合わせ物の相対性能は、曲線下面積（より大きい面積によって示されるより良好な性能）によるか、またはグラフ上の点（０，１）に対する最接近距離（１００％特異性、１００％感受性）によってこれらの曲線から調査することができる。点（０，１）に対する曲線上のすべての点の距離がＤＦＩ値に等しく、そしてより低いＤＦＩ値をもつプローブ組み合わせ物は、より高いＤＦＩ値をもつそれらよりも良好に働くことに注目。最低Ｄ
ＦＩ値に関連する細胞カットオフ値は、次に、より低いＤＦＩ値が、感受性および特異性の相対的な臨床的重要性を考慮した後に選ばれてもよいあるものをもつ、ＲＯＣ曲線上の点を通じる最適カットオフを設定するための基礎として使用することができる。例えば、若干高い感受性であるがより低い特異性をもつ曲線上の点は、医学的必要性に応じて、より低い感受性およびより高い特異性を有する曲線上のその他の点の上に選ばれてもよい。
【００６４】
結果
判別分析
ＬＧＤ、ＨＧＤおよびＥＡを有する患者の群とこれらの異常性有しない患者（すなわち、「正常」またはＩＭの診断を有する患者）とを判別する各ＦＩＳＨプローブの能力は、各組織学的類目内の異常（非二染色体性）細胞の度数を比較することによって最初に試験された。表２は、評価された標本数（Ｎ）、獲得または喪失をもつ細胞の平均パーセントおよび正常な標本群内の各座および座の比について獲得または喪失をもつ細胞のパーセンテージの標準偏差を列挙している。平均値および標準偏差は、組織学的類目の各々について計算されたが、簡潔のために、ＨＧＤについての値のみが表３では列挙されている。また、表３は、ＤＶおよびｐ−値、ＨＧＤと正常標本とを区別する特定のプローブまたはプローブ比率の能力を反映する量を列挙している。組織学的群のすべてについてのＤＶおよびｐ−値が正常標本群に対して比較され、そして表４に列挙されている。ＤＶおよびｐ−値は、より低いｐ−値がより高いＤＶを伴った点で一致した。ＤＶおよびｐ−値についての表４におけるＮＡの記入は、診断群の平均値が正常群のそれよりも低かったことを示す。
【００６５】
【表３】
2019213542.tif 000005
【００６６】
【表４】
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【００６７】
表４に挙げられたｐ−値は、染色体７および１７動原体の獲得が、正常標本よりもＩＭ標本において有意に高い細胞のパーセンテージで生じることを示している。さらに、９ｐ２１座の喪失は、正常標本よりもＩＭ標本について有意に高い細胞のパーセンテージにお
いて生じる。ＬＧＤ標本では、１細胞当たりのシグナル数によるか、またはＣＥＰ９シグナルの数に対する比によるかいずれかによって測定される９ｐ２１座の喪失は有意であった。ＩＭ標本に較べてＬＧＤ標本のより低いｐ−値および高いＤＶは、９ｐ２１座の喪失が、ＩＭ標本よりもＬＧＤ標本を、より良好に正常標本と区別できることを示している。５ｐ１５座の獲得は、正常標本群よりもＬＧＤ標本群において、有意に、より共通していた。
【００６８】
ＣＥＰ  Ｙおよび９ｐ２１／ＣＥＰ９および１７ｐ１３．１／ＣＥＰ１７の比を除いて、正常群に較べて有意に高い獲得を示すすべての個々の座または座の比とともに、異常な座の数は、ＩＭまたはＬＧＤ標本のいずれよりもＨＧＤ標本についてかなり多かった（表３および４）。有意に高いレベルの喪失は、５ｐ１５、５ｑ２１−２２、９ｐ２１、１７ｐ１３．１、ＣＥＰ  Ｙ，５ｐ１５／５ｑ２１−２２、７ｐ１２／ＣＥＰ７、９ｐ２１／ＣＥＰ９および１７ｐ１３．１／ＣＥＰ１７について明白であった。
【００６９】
ＨＧＤ標本と同様に、１７ｐ１３．１、ＣＥＰ  Ｙ、７ｐ１２／ＣＥＰ７、９ｐ２１／ＣＥＰ９および１７ｐ１３．１／ＣＥＰ１７を除く試験されたすべての座および座の比を含む、多くのＥＡ標本（表４）は、正常標本に較べて獲得をもつ細胞の有意に増大したパーセンテージを示した。喪失をもつ細胞の有意に増大したパーセンテージは、５ｑ２１−２２、９ｐ２１、ＣＥＰ  Ｙ、９ｐ２１／ＣＥＰ９および１７ｐ１３．１／ＣＥＰ１７について見出された。
【００７０】
異常性対組織学的進行
図１Ａおよび１Ｂは、各組織学的類目について各座または座の比で獲得または喪失をそれぞれ表す細胞の平均パーセンテージを示す。特定の座または座の比では、座の獲得をもつ細胞の平均パーセンテージは、通常、正常からＥＡへの進行とともに増加し、最大の増加はＬＧＤからＨＧＤへ、およびＨＧＤからＥＡへの移行において起きた。この傾向からの唯一の明らかな解離は、ＣＥＰ  Ｙおよび比９ｐ／ＣＥＰ９と１７ｐ／ＣＥＰ１７の獲得であった。ＣＥＰ  Ｙの獲得を示す細胞数の最大の増加は、正常からＩＭへの移行において起きたが、獲得のレベルは、９ｐ／ＣＥＰ９と１７ｐ／ＣＥＰ１７比の組織ステージに対してはかなり鈍感であった。
【００７１】
座の獲得をもつ細胞のパーセンテージにおけるもっとも顕著な増加は、ＬＧＤからＨＧＤへの移行において生じた。これは、５ｐ１５、ＣＥＰ７、７ｐ１２、８ｑ２４、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１７、１７ｑ、２０ｑ、５ｐ／５ｑおよび１７ｑ／１７ｐについて事実であった。９ｐ２１、１７ｐ、７ｐ／ＣＥＰ７および１７ｑ／ＣＥＰ１７では、獲得を示す細胞のパーセントにおけるもっとも顕著な増加はＨＧＤからＥＡへの進行とともにきたが、一方、ＣＥＰ  Ｙは，正常からＩＭへの移行において最大の増加を示す唯一の座であった。
【００７２】
９ｐ２１、１７ｐ、ＣＥＰ  Ｙ，９ｐ／ＣＥＰ９および１７ｐ／ＣＥＰ１７のみが、正常からＥＡへの組織学的類目の進行とともに喪失レベルの最大増加を明確に示した。９ｐ２１およびその対ＣＥＰ９比では、これらの異常を示す細胞のパーセンテージにおける最大の増加は、ＩＭからＬＧＤへの移行において観察されたが、１７ｐ、１７ｐ／ＣＥＰ１７およびＣＥＰ  Ｙでは、最大の増加はＬＧＤからＨＧＤへの移行においてあった。
【００７３】
単一プローブの感受性、特異性およびＤＦＩ値
感受性、特異性およびＤＦＩ値が、カットオフ値の範囲にわたって個々のプローブについて計算された。組み合わされたＥＡとＨＧＤ群対正常〜ＬＧＤ群では、最良のＤＦＩ値（すなわち、最低のＤＦＩ値）は、ＣＥＰ  Ｙの喪失ならびに８ｑ２４．１２−１３、１７ｑ１１．２−１２、ＣＥＰ１７、７ｐ１２および２０ｑ１３の獲得について得られた。これらのプローブでは、ＣＥＰ  Ｙの喪失、ならびに８ｑ２４．１２−１３、７ｐ１２お
よび２０ｑ１３の獲得は、それがＬＧＤからＨＧＤへの移行に関係しているように、単一プローブの性能を調査する種々の方法によって首尾一貫して同定された。さらに、１７ｑ１１．２−１２、１７ｑ１１．２−１２／ＣＥＰ１７および１７ｑ１１．２−１２／１７ｐ１２の獲得はすべて、種々の分析方法によって高く位置付けられた。
【００７４】
ＬＧＤ群対組み合わされた正常とＩＭ群についての同様な分析は、９ｐ２１、９ｐ２１／ＣＥＰ９、５ｐ１５、ＣＥＰ  ＹおよびＣＥＰ１７についての最良のＤＦＩ値（すなわち、最低のＤＦＩ値）、ならびに８ｑ２４．１２−１３および２０ｑ１３の獲得を現した。これらのプローブでは、９ｐ２１および９ｐ２１／ＣＥＰ９、およびより低い程度まで５ｐ１５が、それがＩＭからＬＧＤへの移行に関係しているように、単一プローブの性能を調査する種々の方法によって首尾一貫して同定された。
【００７５】
補足分析
どのプローブが組み合わせにおいて最良に働くかを決定するために、補足分析が実施された。感受性、特異性およびＤＦＩ値が、診断類目の各々についてすべての可能なプローブ組み合わせ物について計算された。４種のプローブが、顕微鏡をとおして観察するために適当な多色プローブセット（可視光線放出標識）に容易に組み合わされるので、４プローブまでの組み合わせ物が分析された。最初の分析では、カットオフ値が、比較される２種の標本群の異常性の低い標本（例えば、ＬＧＤ標本に較べられる場合の正常＋ＩＭ）の獲得または喪失をもつ細胞のパーセンテージの平均プラス標準偏差の倍数として生成された。表５Ａは、ｎ、ＤＦＩ、感受性および特異性の関連値とともに正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ群に対する腺がん＋ＨＧＤ群のＤＦＩに基づく４プローブの最高性能組み合わせ物を列挙している。表６Ａは、正常＋ＩＭ群に対するＬＧＤ群のＤＦＩに基づく４プローブの最高性能組み合わせ物を列挙している。表５Ｃおよび６Ｃは、ＬＧＤ対正常＋ＩＭ（メタ）、ＨＧＤ対正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ、ＥＡ対正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ＋ＨＧＤおよびＥＡ＋ＨＧＤ対正常＋ＩＭ＋ＬＧＤについて、４プローブ組み合わせ物およびそれらのそれぞれＤＦＩ値を挙げている。
【００７６】
表５Ａおよび６Ａに挙げられた多くの最高性能プローブ組み合わせ物では、これらのすべてが本発明のプローブ組み合わせ物であって、最適カットオフ値は、表５Ａおよび６Ａにおけるｎ値に基づくカットオフ付近の小範囲（例えば、１０〜２０％）にわたって、各組み合わせ物中の各プローブの１％の異常細胞増量におけるカットオフを独立に変えることによってさらに改良された。この方法のために改良された最適カットオフ値およびＤＦＩ値が表５Ｂおよび６Ｂにおいて列挙されている。
【００７７】
レシーバー・オペレーター曲線（Ｒｅｃｉｅｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅｓ）
ＲＯＣプロットは、補足分析から選ばれた多数の４プローブ組み合わせ物を用いて生成された。比較的低いＤＦＩ値によって判定されるように、少数のより良好な性能の４プローブ組み合わせ物のためのＲＯＣ曲線が図２および３においてプロットされる。図２のＲＯＣ曲線は、正常、ＩＭおよびＬＧＤ標本の集合群に対してＥＡプラスＨＧＤ標本を検出するための感受性と特異性との間の関係を図示している。（０，１）の理想点にもっとも密接する各々これらの曲線の領域は、等しい感受性および特異性の値の近くに生じる。感受性および特異性が等しいこれらの曲線における点は、約７７％〜８０％の範囲（ＤＦＩ＝０．３２〜０．２８）である。したがって、ファンクショナル・ベース（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅ）において、最高性能のプローブ組み合わせ物は、０．３３未満のＤＦＩ値を与えることができるプローブのそれらの組み合わせ物であるとみなすことができる。しかしながら、ＤＦＩ値＞０．３３をもつプローブ組み合わせ物もなお価値があるかもしれない。生検とともに最近の内視鏡の感受性および特異性は、生検＋ＩＭ＋ＬＧＤからＥＡ＋ＨＧＤを区別することでは約７０％であると評価されている。これは０．４２の
ＤＦＩ値に対応する。したがって、０．４２未満のＤＦＩ値を提供するプローブ組み合わせ物は、現存する方法を超える性能改善を提供するが、同時に、内視鏡検査において一層単純かつ迅速なサンプリングを提供するであろう。ＥＡ＋ＨＧＤ対正常〜ＬＧＤを検出するために種々の組み合わせ物において有用であることが見出されたプローブは、５ｐ１５、８ｑ２４．１２−１３、７ｐ１２、５ｑ２１−２２、９ｐ２１、ＣＥＰ１７、１７ｐ１３．１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３．２（各座における獲得）を含む。
【００７８】
図３において示されるＲＯＣ曲線は、正常＋ＩＭ標本に対してＬＧＤ標本を検出するための感受性と特異性との関係を図示している。等しい感受性および特異性の点は、約５５％から７０％まで（ＤＦＩ＝０．６４〜．４２）にわたる。したがって、操作上、０．６４未満のＤＦＩ値を与えるプローブ組み合わせ物は、より良好な性能をもつとみなすことができる。ＥＡ＋ＨＧＤの検出において良好に働き、そしてまたＬＧＤ対正常＋ＩＭの検出において最良の実用性を示したプローブ組み合わせ物は、プローブ組み合わせ物中に９ｐ２１を含んだ。ＥＡプラスＨＧＤを検出するために最適な感受性を提供するために、９ｐ２１の獲得が感受性と特異性の計算において使用されたが、９ｐ２１の喪失はＬＧＤの検出のために最適であったことに注目。
【００７９】
【表５】
2019213542.tif 000007
【００８０】
【表６】
2019213542.tif 000008
【００８１】
【表７】
2019213542.tif 000009
【００８２】
【表８】
2019213542.tif 000010
【００８３】
【表９】
2019213542.tif 000011
【００８４】
【表１０】
2019213542.tif 000012
【００８５】
プローブセット８ｑ２４．１２−１３、９ｐ２１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３
両、図２および３における最高性能のプローブセットの１つが、８ｑ２４．１２−１３、９ｐ２１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３のセットである。まさにこのプローブ組み合わせ物のＲＯＣ曲線が図４に示される。これらのＲＯＣ曲線は、個々にＥＡ、ＨＧＤおよびＬＧＤ対正常標本、ならびにＥＡ＋ＨＧＤ対正常標本を検出するための特異性および感受性を含む。等しい感受性と特異性は、ＥＡ＋ＨＧＤ対正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ標本では約８０％（ＤＦＩ＝０．２９）、そしてＬＧＤ対正常＋ＩＭ標本では約７０％（ＤＦＩ＝０．４２）において生じる。これらのＤＦＩ値を達成するために使用されるカットオフが、表５および６において列挙される（改良されたカットオフ値）。ＥＡ対正常標本を検出するためのＲＯＣ曲線は、ＨＧＤ対正常標本についての同様な曲線よりも良好な性能を示し、そしてＨＧＤ対正常標本のためのＲＯＣ曲線は、ＬＧＤ対正常標本についての曲線よりも良好な性能を示した。このことは、平均してＥＡ標本が、ＨＧＤ標本よりも高い異常細胞のパーセンテージを有し、そしてＨＧＤ標本が、ＬＧＤ標本よりも高い異常細胞のパーセンテージを有する（図１Ａおよび１Ｂ，参照）ので、その結果、より高いカットオフの使用を可能にして特異性を改良し、一方感受性を最少限度に減少させることが期待される。性能は、ＥＡ＋ＨＧＤ対正常標本単独についての性能よりもＥＡ＋ＨＧＤ対正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ標本について低い。このことは驚くべきことではない、何故ならば、ＬＧＤ群の若干の患者は、特に、生検を受けなかったがＦＩＳＨによってサンプリングされたＨＧＤ病変を有したからである。これらの事例は、ＦＩＳＨによっては偽陽性結果とみられるであろうし、その結果、本研究者らの分析において偽陽性と思われた（以下参照）。
【００８６】
予期される陽性事例
「偽陽性（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」のＦＩＳＨ結果（すなわち、陰性の病理結果をもつ患者についての陽性ＦＩＳＨ結果）が、本研究の経過を通じて予期され、そして観察された。「偽陽性」ＦＩＳＨ結果に関する可能な説明は、次のこと含む：１）ＦＩＳＨ結果が異常性についての真に誤った陽性である、２）ＦＩＳＨが内視鏡による不完全なサンプリングのために生検されなかった病変を検出している、３）生検が病理学者によって不正確に正常と解釈された、または４）組織学的変化が同定できる前に遺伝的変化を検出している。「偽陽性」ＦＩＳＨ結果の有意な部分が、真に誤った陽性結果とは信じられず、むしろ、ＦＩＳＨが、「金の基準」（すなわち、生検）によって検出されなかった異常性を検出した事例を表すと信じられる。この現象は、腫瘍の再発をモニターされている患者において再発性乳がんを検出するためにＦＩＳＨを用いた場合に、既に、観察されていた。これらの患者の長期の追跡は、明らかな偽陽性ＦＩＳＨ結果を有するこれらの患者の高い割合が、最後には生検で証明される腫瘍を発生することを示した。この理由のために、「偽陽性」の結果は、それらが、腫瘍が他の手段によって同定できる前に検出された事例をしばしば表すので、時には予期される陽性ＦＩＳＨ結果と呼ばれる。バレット食道のプローブセットにより観察された「偽陽性」ＦＩＳＨ結果が、実際に予期される陽性であるか否を、追跡データは決定する必要がある。
【実施例２】
【００８７】
食道がんの検出
限定されない本発明の例として、先の実施例１において記述された４色のプローブセット８ｑ２４．１２−１３、９ｐ２１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３は、ＬＧＤ、ＨＧＤまたはＥＡの診断と一致する染色体異常を有する細胞の存在について食道擦過サンプルを調査するために使用された。サンプルはＦＩＳＨハイブリダイゼーションのために調製され、そしてプローブ選択研究（先の実施例１）に記述され、かつ以下に記述されるプローブセットを用いるハイブリダイゼーションにかけられた。最初の１００細胞の列挙が多染色体性について陰性であった事例では、残りのスライドが、形態的に異常な細胞
（例えば、核の伸長、核の不規則性およびまだらなクロマチン染色）について走査され、そしてこれらの細胞のＦＩＳＨハイブリダイゼーションパターンがまた記録された。
【００８８】
細胞の収穫
５０ｍｌ遠心チューブおよび１．８ｍｌミクロ遠心チューブが適当な患者の確認符号で標識された。標本容器（食道ブラシを含有するＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔTM液容器）が細胞を再懸濁するために激しく振盪された。標本容器中の溶液は、標本容器中に細胞ブラシを確実に残して、５０ｍｌ遠心チューブに移された。３：１メタノール：酢酸固定液２０ｍｌが標本容器に添加された。次いで、標本容器の内容物（固定液およびブラシ）がペトリ皿に移された。ブラシは固定液中にメスを用いて手でこすり取られ、次いでペトリ皿中の溶液が標本容器中に戻された。ブラシは廃棄された。次いで、標本容器中の溶液が標識を付された５０ｍｌチューブに移された。３：１メタノール：酢酸固定液１０ｍｌが標本容器に添加された。標本容器は手で激しく振盪されて何か残っている細胞を分離し、５０ｍｌチューブに移した。標本容器は廃棄された。
【００８９】
５０ｍｌチューブ中の溶液は８００ｇで８分間遠心された。上澄液のすべて約５ｍｌが、次いで真空吸引によって除去された。３：１メタノール：酢酸１０ｍｌが５０ｍｌチューブに添加され、細胞ペレットが静かに再懸濁された。次いで、溶液が３００ｇで８分間遠心された。次いで上澄液が、ペレットの上部溶液約２ｍｌを確実に残して吸引された。ペレットは再び再懸濁された。標本は、使い捨てピペットを用いて、予め標識を付した１．８ｍｌミクロ遠心チューブに移され、４℃で保存された。長期の保存のためには、チューブは、保存前に３：１メタノール：酢酸固定液で上部まで確実に満たされて、同じ１．８ｍｌミクロ遠心チューブにおいて−７０℃で保存された。
【００９０】
スライドの調製
所望の標本を含有する１．８ｍｌミクロ遠心チューブがバランスされた遠心機中に置かれ、８００ｇで２分間回転された。使い捨てピペットが使用されて固定液の上層の大部分、通常０．２５ｍｌラインまで除去された。適当な患者の確認符号を付されたスライドが４５℃のホットプレート上に置かれた。ピペットが使用されて細胞ペレットを再懸濁し、その溶液の１０μｌがスライドの１０ｍｍの刻まれたリングの上にピペットで添加された。次いで、スライドは位相差顕微鏡下で検査されてセルラリティ（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）（すなわち、細胞の密度）が調査された。セルラリティが不十分であった場合は、さらなる量のペレットが、十分なセルラリティ（最小の細胞重複をもつ１リング当たり最大数の細胞）が達成されるまで１度に１０μｌづつスライド上に滴下された。セルラリティが高すぎる場合は、標本ペレットが３：１メタノール：酢酸固定液により希釈され、そして上記方法が新しい刻まれたリングにおいて繰り返された。
【００９１】
前処理
スライドがハイブリダイゼーションの当日に調製される場合は、スライドは１５分間４５℃ホットプレート上に置かれるか；さもなくば、スライドはこの段階を必要としなかった。化学薬品およびスライドがＶＰ２０００プロセッサー中に装填され、そしてスライドは次の溶液を通過された：１）１０分間３７℃、２．０ｘＳＳＣ（食塩クエン酸塩）；２）１３分間３７℃、０．００５％ペプシン作用溶液（ｐＨ２．０）；３）各５分間室温で、ＰＢＳ、１％ホルムアルデヒド溶液、次いで新鮮な室温ＰＢＳ；４）各２分間室温で、７０％エタノール、８５％エタノール、次いで１００％エタノール。スライドは風乾された。
【００９２】
変性／ハイブリダイゼーション
プローブ混合液の４μｌが、プローブがハイブリダイズされる細胞を含有するスライドの刻まれたリング上に置かれた。１２ｍｍの円板カバースリップがハイブリダイゼーショ
ン領域をおおって置かれ、次いでカバースリップの端がゴムセメントの連続するビーズにより密封された。スライドは、ＨＹＢｒｉｔｅTM変性／ハイブリダイゼーションシステムに置かれ、そして管（ｃａｎａｌ）が水で満たされた。スライドは７３℃で３分間加熱され、次いで、３７℃で最小８時間維持された。
【００９３】
洗浄および対比染色
スライドがＨＹＢｒｉｔｅTMから取り出され、ラバーセメントが除去された。カバースリップがゴムセメントの除去によって離れない場合、スライドは、カバースリップがひとりでに落ちるまで、室温の０．１％ＮＰ−４０／２．０ＸＳＳＣ中に浸された。次いで、スライドは、７３℃０．１％ＮＰ−４０／２．０ＸＳＳＣを含有するＣｏｐｌｉｎジャー中に最小２分間置かれた。次いで、スライドは室温の０．１％ＮＰ−４０／２．０ｘＳＳＣ中に最小５分間置かれた。ピペットを使用して、ＤＡＰＩ−１対比染色液（ａｎｔｉｆａｄｅ封入液中１０００ｎｇＤＡＰＩ／ｍｌ）の１０μｌがハイブリダイゼーションリングに適用された。２４ｘ５０カバースリップが各スライドの上に置かれた。ペーパータオルがカバースリップの上部に置かれて、余分の液体が除去された。ピペットのプラスティック末端がカバースリップに十文字に軽く押し付けられて、気泡が除去された。各スライドの背面がペーパータオルで拭われ、そして分析用トレーに置かれた。
【００９４】
分析
浸油の１滴がハイブリダイズされたリングの直接上のカバースリップに置かれた。スライドは、ＤＡＰＩ対比染色を観察するためのフィルター、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−Ｒｅｄ／Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＧｒｅｅｎTM、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＲｅｄTM、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＧｒｅｅｎTM、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ−ＡｑｕａTMおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ−ＧｏｌｄTM蛍光団を備えたエピ蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡により調査された。スライドの迅速な初期走査が実施されて、シグナル品質が調査され、そしてハイブリダイゼーションが成功したか否かが決定された。次いで、スライドは、４０ｘまたは６３ｘ対物レンズを用いて、ハイブリダイゼーションリングの１つの端から開始し、リングの反対の端に向かって規則的な方式で進めることによって、顕微鏡により分析された（図５）。次いで、４プローブ（例えば、８ｑ２４、９ｐ２１、１７ｑ１１、２０ｑ１３）の各々のシグナルパターンが、１００個の連続する非偏平上皮、非炎症性細胞について記録された。偏平上皮細胞のみが観察された事例では、シグナルパターンはこれらの細胞において列挙され、偏平上皮細胞のみが見られたことを確実に注意させた。多染色体性（すなわち、４プローブの２個以上の獲得）をもつ５個以上の細胞が最初の１００細胞のカウントにおいて見られた場合、さらなる分析は必要とされない。しかしながら、多染色体性をもつ５個未満の細胞が観察される場合は、スライドの残りが、新形成の疑われる核の形態学的特徴（例えば、核の伸長、核の不規則性、まだらなクロマチン染色）をもつ細胞について走査することができ、そしてこれらの細胞のシグナルパターンが、それらが走査によって観察され、そして１００細胞の列挙の一部として観察されたものではないことに注目して記録された。この走査方法は、引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第６，３７６，１８８号および同第６，１７４６８号に記述された方法と本質的に同じである。
【００９５】
１００細胞の列挙の終了後、細胞カウントが調査されて、異形成またはＥＡの診断と一致する１個以上の染色体異常が存在するか否かが決定された。観察され、そして異形成または腺がんのいずれかの診断と一致した染色体の変化は、多染色体性（すなわち、２個以上のシグナルの獲得）、四染色体性、単一シグナルの獲得、増幅（例えば、ＨＥＲ−２増幅）および欠失（例えば、９ｐ２１欠失）を含む。
【００９６】
診断基準
標本が次に示す基準を満たせば、それらは陽性とみなされた：
・  細胞の≧１３％が半接合体および／または同型接合体９ｐ２１喪失を示す（低度の
異形成の診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧４％が８ｑ２４の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧８％が１７ｑ１１の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧１６％が２０ｑ１３の獲得を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
・  細胞の≧３％が多染色体性を示す（高度の異形成／腺がんの診断とほとんど一致）。
【００９７】
次に示す代表的な例は、８ｑ２４、９ｐ２１、１７ｑ１１および２０ｑ１３に対するプローブを含有する４プローブＦＩＳＨカクテルを用いる４人の患者についてのＦＩＳＨ列挙の結果（すなわち、１００細胞列挙）およびそれらの解釈を示す。これらの実施例は、プローブセットが、どのようにして異形成および腺がんを検出するために使用することができるかを具体的に説明している。
【００９８】
患者１
この患者についての１つの１００細胞列挙結果が以下に示される（表７）。異常シグナルパターンをもつ細胞（すなわち、シグナルパターンが４プローブの各々について２個のコピーを示さなかった細胞）が初めに示されている。列挙結果は、細胞の４１個（表において示される初めの４１個）が多染色体性（すなわち、４プローブの２個以上の獲得）を表したことを示している。残りの５９個の細胞は正常とみなされた。１つの座について２つのシグナルの期待される正常パターンを有しない２個の細胞（細胞４２および４３）は、このタイプの異常性についてのカットオフが達成されなかったので、異常とみなされなかった。この患者の標本は、腫瘍について陽性とみなされ、そしてこの結果はＨＧＤ／ＥＡの診断とほとんど一致している。
【００９９】
【表１１】
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【０１００】
【表１２】
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【０１０１】
患者２
この患者についての１つの１００細胞列挙結果が以下に示される（表８）。異常シグナルパターンをもつ細胞（すなわち、シグナルパターンが４プローブの各々について２個のコピーを示さなかった細胞）が初めに示されている。列挙結果は、８ｑ２４の獲得をもつ２３個の細胞を示している。残りの７７個の細胞は正常とみなされた。この患者標本は陽性とみなされ、そしてこの結果はＨＧＤ／ＥＡの診断とほとんど一致している。
【０１０２】
【表１３】
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【０１０３】
【表１４】
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【０１０４】
患者３
この患者についての１つの１００細胞列挙結果が以下に示される（表９）。異常シグナルパターンをもつ細胞（すなわち、シグナルパターンが４プローブの各々について２個のコピーを示さなかった細胞）が初めに示されている。列挙結果は、細胞の５２個（表において示される初めの５２個）が同型接合体または半接合体９ｐ２１喪失のいずれかを表したことを示している。残りの４８個の細胞は正常とみなされた。２，２，１，２のシグナルパターンを有する細胞５３は、１つの座について２つのシグナルの期待される正常パターンを有しないが、このタイプの異常性（すなわち、一染色体性８ｑ２４）についてのカットオフが達成されなかったので、正常とみなされた。この患者の標本は陽性とみなされ、そしてこの結果はＬＧＤの診断とほとんど一致している。
【０１０５】
【表１５】
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【０１０６】
【表１６】
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【０１０７】
患者４
この患者についての１つの１００細胞列挙結果が以下に示される（表１０）。異常シグナルパターンをもつ細胞（すなわち、シグナルパターンが４プローブの各々について２個のコピーを示さなかった細胞）が初めに示されている。列挙結果は、１つの座について２つのシグナルの期待される正常パターンを有しない３個の細胞（細胞１〜３）を示してい
るが、しかし、これらの細胞は、何らかの異常性についてのカットオフが達成されなかったので、異常とみなされなかった。この患者の標本は陰性とみなされた。
【０１０８】
【表１７】
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【０１０９】
【表１８】
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【０１１０】
他の実施態様
本発明は、その詳細な記述とともに説明されたが、前記記述は本発明の範囲を具体的に説明するものであって、限定するものではないことを意図していると理解されるべきである。
【０１１１】
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
【０１１２】
１．
ａ．食道がん腫を有すると疑われる被験者から食道細胞を含む生物サンプルを得て；
ｂ．サンプルに存在するプローブの核酸標的にプローブを特異的にハイブリダイズさせる条件下で、サンプルを染色体プローブのセットと接触させて、もしあれば、サンプルにおける食道がん腫または前駆体病変を選択的に検出し；そして
ｃ．ハイブリダイゼーションパターンが被験者における食道がん腫または前駆体病変の存在または不在を示す、生物サンプルに対する染色体プローブのセットについてのハイブリダイゼーションパターンを検出すること：
を含んでなる、被験者における食道がん腫または前駆体病変についてスクリーニングする方法。
【０１１３】
２．  選択的に検出されるがん腫前駆体病変が低度の異形成（ＬＧＤ）である、１．の方法。
【０１１４】
３．  選択的に検出されるがん腫または前駆体病変が高度の異形成（ＨＧＤ）および食道腺がん（ＥＡ）からなる群から選ばれる、１．の方法。
【０１１５】
４．  生物サンプルが、生検、細胞学的標本および切除標本からなる群から選ばれる標本から得られる細胞を含む、１．の方法。
【０１１６】
５．  染色体プローブが蛍光により標識される、１．の方法。
【０１１７】
６．  生物サンプルが細胞学的擦過標本を含む、４．の方法。
【０１１８】
７．  被験者が、慢性胃食道逆流疾患およびバレット食道からなる群から選ばれる症状を有すると診断された、１．の方法。
【０１１９】
８．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．７のＤＦＩを特徴とする、２．の方法。
【０１２０】
９．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．３５のＤＦＩを特徴とする、８．の方法。
【０１２１】
１０．  染色体プローブのセットが、該食道がん腫または前駆体病変について多くとも約０．５のＤＦＩを特徴とする、３．の方法。
【０１２２】
１１．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．３５のＤＦＩを特徴とする、１０．の方法。
【０１２３】
１２．  該セットが、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、２０ｑ１３座特異的プローブ、染色体９の染色体列挙プローブ、染色体７の染色体列挙プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、５ｐ１５座特異的プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、染色体１７の染色体列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブからなる群から選ばれる少なくとも３種の染色体プローブを含む、１．の方法。
【０１２４】
１３．  該セットが、Ｙ染色体の染色体列挙プローブをさらに含む、１２．の方法。
【０１２５】
１４．  該セットが、少なくとも１種の染色体列挙プローブを含む、１２．の方法。
【０１２６】
１５．  該セットが、２０ｑ１３座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、９ｐ２１座特異的プローブおよび８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブを含む、１２．の方法。
【０１２７】
１６．  ハイブリダイゼーションパターンが、核の大きさ、核の形または核の染色における異常に基づいて予め選ばれる生物サンプルからの細胞において検出される、１．の方法。
【０１２８】
１７．  染色体プローブのセットが、生物サンプルにおける食道がん腫または前駆体病変を選択的に検出することができる、染色体プローブのセットを含んでなる、組成物。
【０１２９】
１８．  がん腫前駆体病変が低度の異形成（ＬＧＤ）である、１７．の組成物。
【０１３０】
１９．  がん腫または前駆体病変が高度の異形成（ＨＧＤ）および食道腺がん（ＥＡ）からなる群から選ばれる、１７．の方法。
【０１３１】
２０．  染色体プローブが蛍光により標識される、１７．の組成物。
【０１３２】
２１．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．７のＤＦＩを特徴とする、１８．の組成物。
【０１３３】
２２．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．３５のＤＦＩを特徴とする、２１．の組成物。
【０１３４】
２３．  染色体プローブのセットが、該食道がん腫または前駆体病変について多くとも約０．５のＤＦＩを特徴とする、１９．の組成物。
【０１３５】
２４．  染色体プローブのセットが、該前駆体病変について多くとも約０．３５のＤＦＩを特徴とする、２３．の組成物。
【０１３６】
２５．  該セットが、８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブ、７ｐ１２座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、２０ｑ１３座特異的プローブ、染色体９の染色体列挙プローブ、染色体７の染色体列挙プローブ、５ｑ２１−２２座特異的プローブ、５ｐ１５座特異的プローブ、１７ｐ１３．１座特異的プローブ、染色体１７の染色体列挙プローブおよび９ｐ２１座特異的プローブからなる群から選ばれる少なくとも３種の染色体プローブを含む、１７．の組成物。
【０１３７】
２６．  該セットが、Ｙ染色体の染色体列挙プローブをさらに含む、２５．の組成物。
【０１３８】
２７．  該セットが、少なくとも１種の染色体列挙プローブを含む、２５．の組成物。
【０１３９】
２８．  該セットが、２０ｑ１３座特異的プローブ、１７ｑ１１．２−１２座特異的プローブ、９ｐ２１座特異的プローブおよび８ｑ２４．１２−１３座特異的プローブを含む、２５．の組成物。
【０１４０】
２９．  生物サンプルがパラフィン中に包埋される、１．の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】各組織学的類目について、それぞれ、座の獲得または喪失を現す細胞の平均パーセンテージを示す。
【図１Ｂ】各組織学的類目について、それぞれ、座の獲得または喪失を現す細胞の平均パーセンテージを示す。
【図２】種々の可能な４プローブ組み合わせ物について、正常、ＩＭおよびＬＧＤ標本の集合群に較べてＥＡ＋ＨＧＤ標本を検出するための感受性および特異性間の関係を図示するＲＯＣ曲線を示す。
【図３】種々の可能なプローブ組み合わせ物について、正常＋ＩＭ標本に較べてＬＧＤ標本を検出するための感受性および特異性間の関係を図示するＲＯＣ曲線を示す。
【図４】８ｑ２４．１２−１３、９ｐ２１、１７ｑ１１．２−１２および２０ｑ１３のプローブセットについて、正常な標本に較べてＥＡ、ＨＧＤ、ＬＧＤおよびＥＡ＋ＨＧＤ標本を個々に検出するため，ならびに正常＋ＩＭ＋ＬＧＤ標本に較べてＥＡ＋ＨＧＤ標本を、ならびに正常＋ＩＭ標本に較べてＬＧＤを検出するための、感受性および特異性間の関係を図示するＲＯＣ曲線を示す。
【図５】１００細胞カウントを実施するために使用される方法を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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