(57)【要約】      （修正有）【課題】口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）コンセンサスタンパク質、そのコード配列およびそれから生成されるワクチンの提供。【解決手段】本明細書で提供されるのは、口蹄疫のＦＭＤＶサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のＦＭＤＶ  ＶＰ１〜４コートタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を含む核酸、ならびに該配列を発現するプラスミドおよびワクチンである。同じく本明細書で提供されるのは、先に記載されたワクチンを用いた１種以上のＦＭＤＶサブタイプに対する免疫反応を生成する方法、ならびにワクチンを接種されたホ乳類とＦＭＤＶに感染したそれらとを判別する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、合成のコンセンサス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）免疫原性タンパク質およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子、ＦＭＤＶのワクチン、ＦＭＤＶへの免疫反応を誘導する方法、ＦＭＤＶに感染した個体とＦＭＤＶのワクチンを接種された個体とを判別する方法、ならびに個体をＦＭＤＶに対して予防的および／または治療的に免疫化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
口蹄疫は、ウシ、ブタ、ヤギおよびシカをはじめとする家畜および野生の偶蹄目動物の高度伝染性疾患であり、宿主内で急速に複製して接触した感受性動物に伝播する。該疾患は、発熱、跛行、ならびに舌、足、鼻、および乳首の水疱性病変を特徴とし、罹患率は高いが、成体動物の死亡率は低い。原因物質は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）というピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ）アフトウイルス属（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｕｓ）のタイプ種である。ＦＭＤＶは、４種の構造タンパク質ＶＰ１〜４それぞれを６０コピー有する正二十面体カプシドによって取り囲まれた、ほぼ８５００塩基の一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムであり、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３をはじめとする複数のサブタイプを有し、抗原多様性が高い。１９９７年の台湾、２００１年の英国およびオランダをはじめ、過去に疾患が発生しなかった複数の国々で近年になり口蹄疫が集団発生し、また南米の複数の国々で発生したことは、経済的崩壊性のあるウイルスであることを認識させた。更に、テロリストがＦＭＤＶの使用により、年間１０００億米ドルの畜産業など国家を標的とした攻撃をする可能性があり、世界全体の問題となっている。
【０００３】
過去の、ＦＭＤＶを制御する手段としては、感染動物または接触動物の殺処分、および除染が挙げられる。ＦＭＤＶ発生により家畜を殺処分した国では、最後の発生後３ヶ月間、ＦＭＤＶの非存在状態を経た場合のみ、畜産業を再開することができる。動物にワクチン接種を行い殺処分を行わなかった国では、ＦＭＤの非存在状態を回復するのに丸々一年待たなければならないため、各国では通常、ＦＭＤＶ発生を処理するための動物へのワクチン接種を、最後の手段として用いる。しかし、各国はＦＭＤＶの発生前に動物にワクチン接種して、ＦＭＤの非存在状態を保持できるように期待している。
【０００４】
過去にＦＭＤＶワクチンは、化学的に不活化された全ウイルス抗原を、アジュバントと一体化して含んでいたが、これには欠点があり、ワクチン製造に高価な高度密閉施設が必要である。過去２５〜３０年間にわたり、研究者らは、単回接種後に防御をもたらすワクチンの開発を試みてきた。これらの努力には、ウイルス粒子から精製されたＶＰ１、生物工学的に作られたＶＰ１、ＶＰ１ペプチド、化学合成されたＶＰ１ペプチド、ＶＰ１エピトープを発現する生ベクターの使用、ＶＰ１エピトープをコードするＤＮＡの接種、およびＦＭＤＶ感染培養物から生成された全カプシドタンパク質ＶＰ１〜４の使用または複製欠損ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターを介したＶＰ１〜４カプシドの送達が含まれる。これらのアプローチは全て、ＦＭＤＶウイルスのサブタイプ全てにまたがるエピトープをわずかな数しか接種動物に供与しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって当該技術分野では、ＦＤＭＶの様々なサブタイプにまたがる複数のＦＭＤＶエピトープへの防御をもたらすのに適したワクチン、およびＦＭＤＶに感染したホ乳類を診断する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本明細書で提供されるのは、口蹄疫ウイルスサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３、ＳＡＴ４のＶＰ１〜４のコンセンサスアミノ酸配列をコードする配列、またはその相補配列を含む単離された核酸である。核酸は、（ａ）配列番号１７〜２３；（ｂ）２４〜３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）の８０％変異体；および（ａ）または（ｂ）の相補配列、からなる群より選択される配列を含んでいてもよい。同じく提供されるのは、先に記載された配列からなる異種配列を含むベクターである。
【０００７】
同じく本明細書で提供されるのは、複数の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）サブタイプに対する免疫反応をホ乳類体内で生成することが可能なワクチンであり、ここでワクチンは、１種以上のＦＭＤＶサブタイプのカプシドタンパク質ＶＰ１〜４を含むコンセンサスＦＭＤＶ抗原をコードするコード配列に機能的に連結したプロモータを含むＤＮＡプラスミドと、薬学的に許容しうる賦形剤とを含み、ここでＤＮＡプラスミドは、ホ乳類細胞中のコンセンサスＦＭＤＶ抗原を、ホ乳類体内での免疫反応を誘発するのに効果的な量で発現することが可能である。ワクチンにより、ＦＭＤＶサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせに対する免疫反応を生成してもよい。ワクチンのプラスミドのコード配列は、配列番号１〜７またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるＦＭＤＶ抗原のものであってもよい。ワクチンのプラスミドのコード配列は、ＩｇＧまたはＩｇＥであるＮ末端リーダー配列を更に含んでいてもよい。ワクチンのプラスミドは、コード配列の３’末端に続くポリアデニル化配列を更に含んでいてもよい。ワクチンのプラスミドは、サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３からのコンセンサスＦＭＤＶ  ３Ｃプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を更に含んでいてもよい。ＦＭＤＶ  ３Ｃプロテアーゼのヌクレオチド配列は、配列番号１５であってもよく、配列番号１６に示されたアミノ酸配列によりコードされていてもよい。ワクチンのプラスミドは、最適化されたコドンであってもよい。ＦＭＤＶ抗原のコード配列は、配列番号７〜１４をはじめとするＶＰ１〜４および３Ｃプロテアーゼを含んでいてもよい。ワクチンの薬学的に許容しうる賦形剤は、アジュバントであってもよく、該アジュバントは、ＩＬ−２またはＩＬ−１５であってもよい。ワクチンの薬学的に許容しうる賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよい。トランスフェクション促進剤は、６mg/ml未満の濃度のポリアニオン、ポリカチオンまたは脂質
、例えば、ポリ−Ｌ−グルタマートであってもよい。ワクチンを、ブタ、反芻動物、ヒトまたは霊長類に投与してもよい。ワクチンにより、体液反応もしくは細胞反応、または体液反応と細胞反応の両方を誘発してもよい。
【０００８】
同じく本明細書で提供されるのは、複数の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）サブタイプに対して免疫反応をホ乳類体内で生成することが可能なワクチンであり、ここでワクチンは、サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上のＦＭＤＶサブタイプからのカプシドタンパク質ＶＰ１〜４を含むコンセンサスＦＭＤＶ抗原をコードするコード配列に機能的に連結したプロモータを含むＤＮＡプラスミド１種以上と、薬学的に許容しうるその賦形剤とを含み、ここでＤＮＡプラスミドは、ホ乳類細胞中のコンセンサスＦＭＤＶ抗原を、ホ乳類体内での免疫反応を誘発するのに効果的な量で発現することが可能である。ＦＭＤＶ抗原のコード配列は、配列番号１〜７またはそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。ワクチンのプラスミドは、サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のためのＦＭＤＶのコンセンサス３Ｃプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を更に含んでいてもよく、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。該ワクチンをホ乳類、例えばブタ、反芻動物、ヒトまたは霊長類に投与してもよい。該ワクチンにより、ホ乳類体内における免疫反応、例えば、体液反応、細胞反応、または体液反応と細胞反応の両方を誘発してもよい。
【０００９】
同じく本明細書で提供されるのは、複数のＦＭＤＶサブタイプに対する免疫反応をホ乳類体内で生成することが可能なワクチンであり、ここでワクチンは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のカプシドタンパク質ＶＰ１〜４をコードするコンセンサスアミノ酸配列を１種以上含む抗原と、薬学的に許容しうるその賦形剤とを含む。ＦＭＤＶ抗原のコードアミノ酸配列は、配列番号２４〜３０であってもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ＩＬ−２およびＩＬ−１５からなる群より選択されるアジュバントであってもよい。ワクチンの薬学的に許容しうる賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよい。トランスフェクション促進剤は、６mg/ml未満の濃度のポリアニオン、ポリカチオンまたは脂質、例えば、ポリ−
Ｌ−グルタマートであってもよい。ワクチンをホ乳類、例えばブタ、反芻動物、ヒトまたは霊長類に投与してもよい。ワクチンにより、ホ乳類体内における免疫反応、例えば、体液反応、細胞反応、または体液反応と細胞反応の両方を誘発してもよい。
【００１０】
同じく本明細書で提供されるのは、請求項１または２１に記載のＤＮＡプラスミドワクチンをホ乳類組織に送達すること、およびＤＮＡプラスミドを細胞に侵入させるのに効果的な定電流のエネルギーパルスで組織の細胞を電気穿孔すること、を含む、ホ乳類体内の複数のＦＭＤＶウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法である。該方法における請求項１記載のＤＮＡプラスミドの送達は、ＤＮＡプラスミドワクチンを皮膚間、皮下、または筋肉の組織に注射することを含んでいてもよい。電流およびエネルギーパルスを、既存の電流と等しい定電流でプリセットすることにより、該方法のＤＮＡプラスミドを送達してもよい。該方法の電気穿孔ステップは、電気穿孔された細胞中のインピーダンスを測定すること、エネルギーパルスのエネルギーレベルを測定されたインピーダンスに対して調整して、電気穿孔された細胞中で定電流を保持することを更に含んでいてもよく、ここで測定および調整ステップは、エネルギーパルスの寿命内で行われる。電気穿孔ステップは、エネルギーパルスを分散パターンで送達するパルスシーケンスパターンにより、エネルギーパルスを複数の電極に送達することを更に含んでいてもよい。
【００１１】
同じく提供されるのは、ホ乳類から液体試料を単離すること、ホ乳類の液体試料から抗体を単離すること、およびステップｂから単離された抗体を、請求項３記載のワクチンを接種された対照ホ乳類と比較すること、を含む、ＦＭＤＶに感染したホ乳類を診断する方法であり、ここで対照ホ乳類はＦＭＤＶ  ＶＰ１〜４タンパク質への抗体のみを有し、感染したＦＭＤＶホ乳類はＦＭＤＶ  ＶＰ１〜４タンパク質およびＦＭＤＶ非構造タンパク質への抗体を有する。非構造タンパク質は、ＦＭＤＶ  ２Ｃ、３Ａ、および３Ｄポリメラーゼであってもよい。
【００１２】
リーダー配列を有する、または有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２のうちの１種以上、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択される１種以上の配列を有するタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸分子が、提供される。
【００１３】
幾つかの実施形態において、核酸配列は、リーダー配列のためのコード配列を有する、または有さない配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸をコードするそのフラグメント、その相補配列、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１に対して８０％相同的な核酸分子、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸をコードするそのフラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択される。
【００１４】
そのような核酸分子ならびに／またはリーダー配列を有する、もしくは有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、ならびに少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、からなる群より選択されるタンパク質１種以上を含むワクチンが、提供される。
【００１５】
同じく提供されるのは、リーダー配列を有する、または有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、ならびに少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、からなる群より選択されるタンパク質を１種以上含む組成物である。
【００１６】
ホ乳類体内の１種以上のＦＭＤＶウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法が、提供される。本明細書および幾つかの実施形態に開示されたワクチンの使用を含む方法は、ＦＭＤＶ免疫原性配列を有するタンパク質をコードする核酸分子をホ乳類の組織に投与するステップと、ＤＮＡプラスミドを細胞に侵入させるのに効果的な定電流のエネルギーパルスで組織の細胞を電気穿孔するステップとを含んでいてもよい。
【００１７】
ＦＭＤＶに感染したホ乳類を、本明細書に開示された工程によりワクチン接種されたホ乳類体内で診断する方法も、提供される。該方法は、ワクチン接種されたホ乳類から液体試料を単離すること、および前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質および／または前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質に対する抗体の存在を検出すること、を含む。そのようなＦＭＤＶタンパク質および／またはそのようなＦＭＤＶタンパク質に対する抗体の存在は、ワクチン接種されたホ乳類がＦＭＤＶに感染していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
コンセンサスアミノ酸配列を、多重ＦＭＤＶタンパク質と様々なセロタイプからの個々のＦＭＤＶタンパク質とを含む融合タンパク質に関して生成させた。該タンパク質をコードする核酸分子も、生成させた。
【００１９】
本発明の一態様において、コンセンサスＦＭＤＶタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４および／または３Ｃと、これらのタンパク質をコードする核酸配列とを含む融合タンパク質が存在し、それを生成させてワクチン中で使用し、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３をはじめとするＦＭＤＶの１種以上のサブタイプにまたがる口蹄疫に対するホ乳類の防御を提供することができる。
【００２０】
本発明の別の態様において、２種の異なるサブタイプからの、コンセンサスＦＭＤＶタンパク質ＶＰ１と、このタンパク質をコードする核酸配列とを含む融合タンパク質が存在し、それを生成させてワクチン中で使用し、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３をはじめとするＦＭＤＶの１種以上のサブタイプにまたがる口蹄疫に対するホ乳類の防御を提供することができる。
【００２１】
本発明の別の態様において、コンセンサスＦＭＤＶタンパク質ＶＰ１と、それをコードする核酸配列とが存在し、それを生成させてワクチン中で使用し、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３をはじめとするＦＭＤＶの１種以上のサブタイプにまたがる口蹄疫に対するホ乳類の防御を提供することができる。
【００２２】
科学的理論に束縛されるものではないが、ＦＭＤＶの１種以上のサブタイプのためのコンセンサスアミノ酸配列ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、および／またはＶＰ４を対象とするワクチンが、ＦＭＤＶの各サブタイプ内の大部分の種に対して効果的な免疫反応（体液、細胞、またはその両方のいずれか）を誘発するのに効果的となるエピトープの大きなレパートリーを提示する。本発明は、ホ乳類に投与してＦＭＤＶへの予防的防御を提供するために、ＦＭＤＶサブタイプのこれらのコンセンサスアミノ酸ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、および／またはＶＰ４配列を用いて、ワクチン中で用いられる適切なプラスミドおよびタンパク質を生成させることに関する。同じく本発明は、ＦＭＤＶ  ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、および／またはＶＰ４抗原のこれらのコンセンサス配列を用いることで、ＦＭＤＶの非構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼを対象とする抗体の検出を介して、適切にワクチン接種されてＦＭＤＶに感染しなかったホ乳類と、感染したホ乳類とを同定および判別する診断方法に関する。
【００２３】
科学的理論に束縛されるものではないが、ＶＰ１は、ＶＰ１のコンセンサスアミノ酸配列を対象とするワクチンにとって、優れた免疫原性ターゲットである。ＶＰ１は、卓越した免疫原である。
【００２４】
１．定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確に示されない限りは、複数の指示対象を包含する。
【００２５】
本明細書における数値的範囲の引用では、同程度の正確さを含む、それらの間に介入する各数字が、明白に予期される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて、数値７および８が予期され、範囲６．０〜７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明白に予期される。
【００２６】
ａ．アジュバント
本明細書で用いられる「アジュバント」は、本明細書に記載されたＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、ＤＮＡプラスミドおよび本明細書の以後に記載されるコード核酸配列によりコードされる口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）抗原の抗原性を向上させる任意の分子を意味してもよい。
【００２７】
ｂ．抗体
「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ジアボディ、二特異性抗体、二機能性抗体およびそれらの誘導体をはじめとする分類ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ、またはフラグメントの抗体、あるいはそのフラグメントまたは誘導体を意味してもよい。抗体は、所望のエピトープまたはそれから誘導された配列に十分な結合特異性を示すホ乳類の血清試料、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体、またはそれらの混合物から単離された抗体であってもよい。
【００２８】
ｃ．コード配列
本明細書で用いられる「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味してもよい。コード配列は、核酸を投与される個体またはホ乳類の細胞中での発現を指導することが可能なプロモータおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に機能的に連結された開始および終結シグナルを更に含んでいてもよい。
【００２９】
ｄ．相補配列
本明細書で用いられる「相補配列」または「相補的な」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間のワトソン・クリック型（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対を意味する核酸を意味してもよい。
【００３０】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書で用いられる「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプのアライメントの分析に基づいて構築され、特定のインフルエンザ抗原の複数のサブタイプまたはセロタイプに対して広範囲の免疫性を誘導するために用いうる、合成核酸配列または対応するポリペプチド配列を意味してもよい。コンセンサスＦＭＤＶ抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、およびＣ２プロテアーゼヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含んでいてもよい。同じく合成抗原、例えば融合タンパク質をコンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）に操作してもよい。
【００３１】
ｆ．定電流
本明細書で用いられる「定電流」は、組織に送達された電気パルスの持続時間にわたり、組織、または前記組織を画定する細胞が受容または経験した電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載された電気穿孔装置から送達される。本明細書で提供された電気穿孔装置は、好ましくは瞬時フィードバックを有する、フィードバック要素を有するため、この電流は、電気パルスの寿命内では前記組織中で一定アンペアを維持する。フィードバック要素は、パルスの持続時間を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上昇させる）ことができ、それにより同じ組織内の電流は、電気パルスを通して（μ秒の単位）、そしてパルスとパルスの間は一定を維持する。幾つかの実施形態において、フィードバック要素は、制御装置を含む。
【００３２】
ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
本明細書で用いられる「電流フィードバック」または「フィードバック」は、互換的に用いられてもよく、電極間で組織内電流を測定すること、および該電流をそれに応じて一定レベルに保持するためにＥＰ装置により送達されるエネルギー出力を変化させること、を含む、提供された電気穿孔装置の活性応答を意味してもよい。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気的処理の開始前にユーザーによりプリセットされる。装置内の電気回路では、電極間の組織内電流を連続してモニタリングして、モニタリングされた電流（または組織内電流）をプリセット電流と比較することができ、そしてエネルギー出力調整を連続して行ってモニタリングされた電流をプリセットレベルに保持することができるため、フィードバックは電気穿孔装置の電気穿孔成分、例えば制御装置により遂行されてもよい。フィードバックループは、類似の閉回路フィードバックであるため、瞬時であってもよい。
【００３３】
ｈ．分散された電流
本明細書で用いられる「分散された電流」は、本明細書に記載された電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味してもよく、そのパターンにより、電気穿孔されている組織の任意の領域での電気穿孔関連の熱性ストレスの発生が最小になるか、または好ましくは排除される。
【００３４】
ｉ．電気穿孔
本明細書で互換的に用いられる「電気穿孔」、「電気可透過化」、または「電気的運動促進」（「ＥＰ」）は、膜貫通電場パルスの使用により生体膜中で顕微鏡的経路（細孔）を誘導することを指してもよく、それらの存在により、生体分子、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水が細胞膜の一方の側から他方の側に通過する。
【００３５】
ｊ．フィードバック機構
本明細書で用いられる「フィードバック機構」は、所望の組織のインピーダンス（エネルギーパルスの送達前、送達時および／または送達後）を受けて既存の値、好ましくは電流と比較し、送達されたエネルギーパルスを調整してプリセット値を実行する、ソフトウエアまたはハードウエア（またはファームウエア）により実施される工程を指してもよい。フィードバック機構は、類似の閉回路により実施してもよい。
【００３６】
ｋ．フラグメント
本明細書で用いられる「フラグメント」は、少なくとも１種のＦＭＤＶサブタイプ、例えばＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のための非フラグメントの免疫反応と実質的に類似した、ホ乳類体内での免疫反応を誘発することが可能なポリペプチドをコードする部分または核酸を意味してもよい。該フラグメントは、配列番号１〜７および１５〜２１をはじめとする、本発明の様々なコードヌクレオチド配列の少なくとも１種から選択されたＤＮＡフラグメントであってもよい。該フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１の核酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含んでいてもよい。該フラグメントがアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１または２７５のうちの１種以上を含むことを条件とし、該フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含んでいてもよい。そのようなフラグメントは全て、アミノ酸を任意に除外してもよい。該ＤＮＡフラグメントは、３０以上のヌクレオチド長、４５以上、６０以上、７５以上、９０以上、１２０以上、１５０以上、１８０以上、２１０以上、２４０以上、２７０以上、３００以上、３６０以上、４２０以上、４８０以上、５４０以上、６００以上、６６０以上、７２０以上、７８０以上、８４０以上、９００以上、９６０以上、１０２０以上、１０８０以上、１１４０以上、１２００以上、１２６０以上、１３２０以上、１３８０以上、１４４０以上、１５００以上、１５６０以上、１６２０以上、１６８０以上、１７４０以上、１８００以上、１８６０以上、１８２０以上、１８８０以上、１９４０以上、２０００以上、２６００以上、２７００以上、２８００以上、２９００以上、２９１０以上、２９２０以上、２９３０以上、２９３１以上、２９３２以上、２９３３以上、２９３４以上、２９３５以上、２９３６以上、２９３７以上、または２９３８以上のヌクレオチド長であってもよい。
【００３７】
ＤＮＡフラグメントは、免疫グロブリンリーダーのためのコード配列、例えばＩｇＥまたはＩｇＧ配列を含んでいてもよい。
【００３８】
ＤＮＡフラグメントは、１０未満のヌクレオチド、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７５未満、９０未満、１２０未満、１５０未満、１８０未満、２１０未満、２４０未満、２７０未満、３００未満、３６０未満、４２０未満、４８０未満、５４０未満、６００未満、６６０未満、７２０未満、７８０未満、８４０未満、９００未満、９６０未満、１０２０未満、１０８０未満、１１４０未満、１２００未満、１２６０未満、１３２０未満、１３８０未満、１４４０未満、１５００未満、１５６０未満、１６２０未満、１６８０未満、１７４０未満、１８００未満、１８６０未満、１８２０未満、１８８０未満、１９４０未満、２０００未満、２６００未満、２７００未満、２８００未満、２９００未満、２９１０未満、２９２０未満、２９３０未満、２９３１未満、２９３２未満、２９３３未満、２９３４未満、２９３５未満、２９３６未満、２９３７未満、または２９３８未満のヌクレオチドであってもよい。
【００３９】
「フラグメント」は、少なくとも１種のＦＭＤＶサブタイプ、例えばＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のための非フラグメントの免疫反応と実質的に類似したホ乳類体内での免疫反応を誘発することが可能なポリペプチドフラグメントを意味してもよい。該フラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２をはじめとする本発明の様々なコードポリペプチド配列の少なくとも１種から選択されたポリペプチドフラグメントであってもよい。ポリペプチドフラグメントを分析して、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＦＭＤＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなどの公的に入手可能なデータベースによって提供される少なくとも１種の抗原エピトープと接触させでもよい。タンパク質のフラグメントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含んでいてもよい。ポリペプチドは、免疫グロブリンリーダーのためのアミノ酸配列、例えばＩｇＥまたはＩｇＧを含んでいてもよい。ポリペプチドフラグメントは、３０以上のアミノ酸長、４５以上、６０以上、７５以上、９０以上、１２０以上、１５０以上、１８０以上、２１０以上、２４０以上、２７０以上、３００以上、３６０以上、４２０以上、４８０以上、５４０以上、６００以上、６６０以上、または７１０以上のアミノ酸長であってもよい。ポリペプチドフラグメントは、１０未満のアミノ酸、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７５未満、９０未満、１２０未満、１５０未満、１８０未満、２１０未満、２４０未満、２７０未満、３００未満、３６０未満、４２０未満、４８０未満、５４０未満、６００未満、６６０未満、７００未満、７０１未満、７０２未満、７０３未満、７０４未満、７０５未満、７０６未満、７０７未満、７０８未満、７０９未満、または７１０未満のアミノ酸長であってもよい。
【００４０】
ｌ．相同性
マルチプル配列アラインメントの相同性を、ＣｌｕｓｔａｌＷ  (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)を用いて生成させてもよい。
【００４１】
ｍ．同一性のある
２種以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、本明細書で用いられる「同一性のある」または「同一性」は、特定領域で同一となる特定割合の残基をその配列が有することを意味してもよい。割合は、２つの配列を最適にアライニングすること、特定領域で２つの配列を比較すること、同一残基が両方の配列内に生じる位置の数を決定して適合位置の数を得ること、適合位置の数を特定領域の位置の総数で割ること、およびその結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ること、により計算してもよい。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つ以上のねじれ型末端を生成していて、比較される特定領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分子ではなく分母中に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等であると見なしてもよい。同一性は、手動で実施してもよく、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを用いることにより実施してもよい。
【００４２】
ｎ．インピーダンス
本明細書で用いられる「インピーダンス」は、フィードバック機構を議論する際に用いてもよく、オームの法則により電流値に変換することができ、こうしてプリセット電流と比較することができる。
【００４３】
ｏ．免疫反応
本明細書で用いられる「免疫反応」は、提供されたＤＮＡプラスミドワクチンを介したＦＭＤＶコンセンサス抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えばホ乳類の免疫系の活性化を意味してもよい。免疫反応は、細胞反応もしくは体液反応、またはその両方の形態であってもよい。
【００４４】
ｐ．核酸
本明細書で用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合的に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味してもよい。一本鎖の表示は、相補鎖の配列も定義する。つまり核酸は、表示された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を、所定の核酸と同じ目的で用いてもよい。つまり核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補配列も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ターゲット配列にハイブリダイズしうるプローブを提供する。つまり核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００４５】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンをはじめとする塩基の組み合わせを含んでいてもよい。核酸は、化学合成法または組換え法により得られてもよい。
【００４６】
核酸は、一般にホスホジエステル結合を含むが、異なる結合、例えば、ホスホラミダート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合と、ペプチド核酸バックボーンおよび結合と、を少なくとも１つ有しうる核酸類似体を含んでいてもよい。他の類似の核酸としては、参照により組み入れられた米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号に記載されたものなど、正のバックボーン；非イオン性バックボーン；および非リボースバックボーンを有するものが挙げられる。非天然由来または修飾ヌクレオチドを１つ以上含む核酸も、核酸の一定義に含まれる。修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置してもよい。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖−またはバックボーン−修飾リボヌクレオチドから選択してもよい。しかし、５−位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８−位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザアデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなど、ヌクレオ塩基修飾リボヌクレオチド、即ち、天然由来ヌクレオ塩基の代わりに非天然由来ヌクレオ塩基を含むリボヌクレオチドも適していることに、留意しなければならない。２’−ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮ（ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）から選択される基により置換されていてもよい。修飾されたヌクレオチドは、例えば参照により本明細書に組み入れられたKrutzfeldt  et  al.,  Nature  (Oct.  30,    2005)、Soutschek  et  al.,  Nature  432:173-178  (2004)および米国特許公開第２００５０１０７３２５号に記載された通り、
例えばヒドロキシプロリノール結合を介して、コレステロールと共役したヌクレオチドを包含してもよい。修飾されたヌクレオチドおよび核酸は、参照により本明細書に組み入れられた米国特許第２００２０１１５０８０号に記載された通り、ロックされた核酸（ＬＮＡ）を包含してもよい。追加の修飾ヌクレオチドおよび核酸は、参照により本明細書に組み入れられた米国特許公開第２００５０１８２００５号に記載されている。リボース−リン酸バックボーンの修飾を、様々な理由で、例えば、生理学的環境でそのような分子の安定性および半減期を向上させるため、細胞膜を通した拡散を促進するため、またはバイオチップのプローブとして、実行してもよい。天然由来核酸と類似体との混合物を生成してもよく、あるいは異なる核酸類似体の混合物ならびに天然由来核酸と類似体との混合物を、生成してもよい。
【００４７】
ｑ．機能的に連結された
本明細書で用いられる「機能的に連結された」は、遺伝子の発現が空間的につながったプロモータの制御下にあることを意味してもよい。プロモータは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置してもよい。プロモータと遺伝子の間の距離は、プロモータが誘導された遺伝子内では、そのプロモータとプロモータが制御する遺伝子との間の距離と、ほぼ同一であってもよい。当業者に公知の通り、この距離の変動は、プロモータ機能を喪失せずに適合させることができる。
【００４８】
ｒ．プロモータ
本明細書で用いられる「プロモータ」は、細胞内の核酸の発現を供与、活性化または促進させることが可能な合成または天然由来の分子を意味してもよい。プロモータは、発現を更に促進し、そして／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるために、１つ以上の特異的転写調節配列を含んでいてもよい。プロモータは、遠位のエンハンサまたはレプレッサ要素を含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対に位置することができる。プロモータは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物をはじめとする供給源から誘導してもよい。プロモータは、遺伝子成分の発現を構成的に調節してもよく、あるいは発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に関連して、または発現が起こる発達段階に関連して、または生理学的ストレス、病原、金属イオンもしくは導入剤などの外部刺激に応答して、変動的に調節してもよい。プロモータの代表的な例としては、バクレリオファージＴ７プロモータ、バクテリオファージＴ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｌａｃオペレータ−プロモータ、ｔａｃプロモータ、ＳＶ４０後期プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモータ、ＣＭＶ  ＩＥプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータまたはＳＶ４０後期プロモータ、およびＣＭＶ  ＩＥプロモータが挙げられる。
【００４９】
ｓ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合混合物中のように、第一の核酸配列（例えば、プローブ）が、第二の核酸配列（例えば、ターゲット）にハイブリダイズする条件を意味してもよい。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境では異なっている。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度、pHで特異的となる配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択してもよい。Ｔｍは、ターゲットに相補的なプローブの５０％が平衡状態でターゲット配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、pH、および核酸濃度下で）であってもよい（ターゲット配列はＴｍでは過剰に存在するため、平衡状態でプローブの５０％が占領される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば、pH７．０〜８．３で０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）濃度となり、温度が短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃となり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃となる条件であってもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、正のシグナルは、バックグランドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であってもよい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、以下のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣで洗浄、ならびに６５℃の０．１％ＳＤＳ。
【００５０】
ｔ．実質的に相補性
本明細書で用いられる「実質的に相補性」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域で、第一の配列が第二の配列の相補配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味してもよい。
【００５１】
ｕ．実質的に同一の
本明細書で用いられる「実質的に同一の」は、第一の配列が第二の配列の相補配列に実質的に相補性である場合に、第一の配列と第二の配列とが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域で、あるいは核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味してもよい。
【００５２】
ｖ．サブタイプまたはセロタイプ
本明細書で互換的に、そしてＦＭＤＶウイルスに関連して用いられる「サブタイプ」または「セロタイプ」は、ＦＭＤＶウイルス抗原の遺伝子変異体を意味しており、そのため１つのサブタイプは、異なるサブタイプとは別の免疫系によって認識される。
【００５３】
ｗ．変異体
核酸に関して本明細書で用いられる「変異体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の部分もしくはフラグメント；（ii）参照されるヌクレオチド配列もしくはその部分の相補配列；（iii）参照される核酸もしくはその相補配列と実質的に同一である核酸；また
は（iv）ストリンジェントな条件下で、参照された核酸、その相補配列、もしくはそれと実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸、を意味してもよい。
【００５４】
アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。変異体は、少なくとも１種の生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照部分と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味してもよい。アミノ酸の保存的置換、即ち、アミノ酸と、類似の性質（例えば、親水性、帯電領域の程度および分布）を有する異なるアミノ酸との置換は、典型的には軽微な変化を含むことが、当該技術分野で認識されている。これらの軽微な変化は、当該技術分野で理解される通り、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することにより、一部同定することができる。Kyte  et  al.,  J.
Mol.  Biol.  157:105-132  (1982)。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および荷電の考慮に基づく。類似のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が、置換することができ、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野で公知である。一態様において、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が、置換されている。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告された有用な指標を計算することができる。参照により本明細書に完全に組み入れられた米国特許第４，５５４，１０１号。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施してもよい。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、および他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００５５】
ｘ．ベクター
本明細書で用いられる「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味してもよい。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合されるベクターのいずれかであってもよい。
【００５６】
２．ＦＭＤＶタンパク質
本明細書で提供されるのは、１種以上の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）サブタイプに対してホ乳類体内で免疫反応を誘発することが可能な抗原である。抗原は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、そのコンセンサス、その変異体、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせを含むＦＭＤＶ抗原であってもよい。ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のものであってもよい。ＦＭＤＶ抗原は、免疫反応を誘導しうる特定のＦＭＤＶ免疫原に対して効果的となりうる抗原エピトープを少なくとも１つ含んでいてもよい。ＦＭＤＶ抗原のエンプティウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１〜４は、インタクトＦＭＤＶウイルス中に存在する免疫原性部位およびエピトープの全体的レパートリーを提供する。コンセンサスＦＭＤＶ抗原配列は、１種のＦＭＤＶサブタイプの複数のＦＭＤＶウイルスのＦＭＤＶ抗原配列から得てもよい。コンセンサスＦＭＤＶ抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４  ＦＭＤＶサブタイプコンセンサスタンパク質配列を含んでいてもよく、それらがコンセンサスＶＰ１〜４タンパク質であってもよい。コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質は、少なくとも１つのＦＭＤＶタンパク質３Ｃ切断部位を含んでいてもよい。タンパク質３Ｃ切断部位は、コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質のコンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４配列それぞれの間に存在してもよい。タンパク質３ＣでのコンセンサスＶＰ１〜４タンパク質の切断により、コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質を切断して、コンセンサスＶＰ１−、コンセンサスＶＰ２−、コンセンサスＶＰ３−、およびコンセンサスＶＰ４−タンパク質を生成してもよい。あるいは本来のタンパク質溶解切断部位が、コンセンサス抗原配列、例えばアミノ酸配列：配列番号４５：ＲＧＲＫＲＲＳのそれぞれの間に存在してもよい。
【００５７】
コンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４、ならびにプロテアーゼ３Ｃのコンセンサスを含む融合タンパク質が、提供される。それは、それぞれサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３のコンセンサス配列である、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４である。
【００５８】
配列番号１６は、コンセンサス３Ｃプロテアーゼ配列である。
【００５９】
コンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４を含む融合タンパク質が、提供される。それは、それぞれサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３のコンセンサス配列である、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０である。
【００６０】
配列番号３２、３４、３６、および３８は、それぞれＶＰ１サブタイプＡｓｉａ、Ｏ、ＡおよびＣのコンセンサス配列である。これらの配列は、ＩｇＥリーダー配列である配列番号４４を含み、それは各例において、異なるリーダーで置換されているか、または欠失されてメチオニンで置換されていてもよい。
【００６１】
配列番号４０および４２は、ＶＰ１のコンセンサス配列２種の融合タンパク質である。配列番号４０は、コンセンサスＶＰ１サブタイプＡおよびＶＰ１サブタイプＣである。配列番号４２は、コンセンサスＶＰ１サブタイプＡｓｉaおよびＶＰ１サブタイプＯである
。これらの配列は、ＩｇＥリーダー配列である配列番号４４を含み、それは各例において、異なるリーダーで置換されているか、または欠失されてメチオニンで置換されていてもよい。
【００６２】
加えて、タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２のフラグメントであってもよい。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の２０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の２０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の３０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の４０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の５０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の６０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の７０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の８０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９５％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９６％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９７％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９８％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、コンセンサスタンパク質の９９％である。
【００６３】
加えて、タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に相同性であってもよい。幾つかの実施形態において、タンパク質は、８０％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９０％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９５％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９６％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９７％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９８％相同性である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、９９％相同性である。
【００６４】
加えて、タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に相同的なタンパク質のフラグメントであってもよい。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の２０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の２０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の３０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の４０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の５０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の６０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の７０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の８０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９０％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９５％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９６％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９７％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９８％である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、相同タンパク質の９９％である。
【００６５】
３．コード配列
本明細書で提供されるのは、１種以上の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）サブタイプに対してホ乳類体内で免疫反応を誘発することが可能な抗原のコード配列である。抗原は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、そのコンセンサス、その変異体、そのフラグメントまたはそれらの組み合わせを含むＦＭＤＶ抗原であってもよい。ＦＭＤＶ抗原は、ＦＭＤＶサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３からのものであってもよい。ＦＭＤＶ抗原は、免疫反応を誘導しうる特定のＦＭＤＶ免疫原に対して効果的となりうる抗原エピトープを少なくとも１つ含んでいてもよい。ＦＭＤＶ抗原のエンプティウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１〜４は、インタクトＦＭＤＶウイルス中に存在する免疫原性部位およびエピトープの全体的レパートリーを提供する。コンセンサスＦＭＤＶ抗原配列は、１種のＦＭＤＶサブタイプの複数のＦＭＤＶウイルスからのＦＭＤＶ抗原配列から得てもよい。コンセンサスＦＭＤＶ抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４  ＦＭＤＶサブタイプコンセンサスタンパク質配列を含んでいてもよく、それらがコンセンサスＶＰ１〜４タンパク質であってもよい。コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質は、少なくとも１つのＦＭＤＶタンパク質３Ｃ切断部位を含んでいてもよい。タンパク質３Ｃ切断部位は、コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質のコンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４配列それぞれの間に存在してもよい。タンパク質３ＣでのコンセンサスＶＰ１〜４タンパク質の切断により、コンセンサスＶＰ１〜４タンパク質を切断して、コンセンサスＶＰ１−、コンセンサスＶＰ２−、コンセンサスＶＰ３−、およびコンセンサスＶＰ４−タンパク質を生成してもよい。あるいは本来のタンパク質溶解切断部位が、コンセンサス抗原配列、例えばアミノ酸配列：配列番号４５：ＲＧＲＫＲＲＳのそれぞれの間に存在してもよい。
【００６６】
コンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４、ならびにプロテアーゼ３Ｃのコンセンサスを含む融合タンパク質のコード配列が、提供される。それは、サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のコンセンサス配列をそれぞれコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３である。
【００６７】
配列番号１５は、コンセンサス３Ｃプロテアーゼ配列をコードする。
【００６８】
コンセンサスＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含む融合タンパク質のコード配列が、提供される。それは、サブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のコンセンサス配列である、それぞれ配列番号１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９である。
【００６９】
配列番号３１、３３、３５、および３７は、それぞれＶＰ１サブタイプＡｓｉａ、Ｏ、ＡおよびＣのコンセンサス配列をコードする。これらの配列は、ＩｇＥリーダー配列である配列番号４４のコード配列を含み、それは各例において、異なるリーダーのコード配列で置換されているか、または欠失されて開始コドンのみで置換されていてもよい。
【００７０】
配列番号４０および４２は、ＶＰ１の２種のコンセンサス配列の融合タンパク質である。配列番号４０は、コンセンサスＶＰ１サブタイプＡおよびＶＰ１サブタイプＣである。配列番号４２は、コンセンサスＶＰ１サブタイプＡｓｉaおよびＶＰ１サブタイプＯであ
る。これらの配列は、ＩｇＥリーダー配列である配列番号４４を含み、それは各例において、異なるリーダーのコード配列で置換されているか、または欠失されて開始コドンのみで置換されていてもよい。
【００７１】
加えて、コード配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２のフラグメントであってもよい。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサスタンパク質の２０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の３０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の４０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の５０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の６０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の７０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の８０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の９０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の９５％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の９６％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、コンセンサス配列の９７％であるタンパク質をコードする。
【００７２】
加えて、コード配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に相同性であるタンパク質をコードしていてもよい。幾つかの実施形態において、コード配列は、８０％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９０％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９５％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９６％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９７％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９８％相同性であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、９９％相同性であるタンパク質をコードする。
【００７３】
加えて、コード配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に相同的なタンパク質のフラグメントであるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の２０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の３０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の４０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の５０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の６０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の７０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の８０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９０％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９５％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９６％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９７％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９８％であるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、コード配列は、相同タンパク質の９９％であるタンパク質をコードする。
【００７４】
加えて、コード配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のフラグメントであってもよい。幾つかの実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００７５】
加えて、コード配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１に相同性であってもよい。幾つかの実施形態において、コード配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１に８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同性である。
【００７６】
加えて、コード配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のフラグメントに相同性であってもよい。幾つかの実施形態において、フラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり、コード配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のフラグメントに８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同性である。
【００７７】
４．プラスミド
本明細書で提供されるのは、ホ乳類体内での免疫反応を誘発するのに効果的な量で、ホ乳類細胞中で１種以上のＦＭＤＶ抗原を発現することが可能なベクターである。該ベクターは、ＦＭＤＶ抗原をコードする異種核酸を含んでいてもよい。該ベクターは、プラスミドであってもよい。該プラスミドは、ＦＭＤＶ抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であってもよく、トランスフェクトされる宿主細胞は、培養され、ＦＭＤＶ抗原の発現が起こる条件下に保持される。
【００７８】
プラスミドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２、そのフラグメント、その相当配列、および相同物のフラグメント、からなる群より選択されるＦＭＤＶ抗原をコードする核酸を含んでいてもよい。プラスミドは、コード配列の上流に存在しうる開始コドンまたはリーダー配列と、コード配列の下流に存在しうる終結コドンとを更に含んでいてもよい。開始コドンおよび終止コドンは、コード配列の枠内に存在してもよい。
【００７９】
プラスミドは、コード配列に機能的に連結したプロモータを含んでいてもよい。コード配列に機能的に連結したプロモータは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）プロモータ、例えば、ウシ免疫欠損ウイルス（ＢＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ前初期プロモータ、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）プロモータ、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータであってもよい。プロモータは、ヒト遺伝子、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインからのプロモータであってもよい。プロモータは、天然または合成の組織特異性プロモータ、例えば筋肉または皮膚特異性プロモータであってもよい。そのようなプロモータの例は、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、米国特許出願公開ＵＳ２００４０１７５７２７に記載されている。
【００８０】
プラスミドは、ポリアデニル化シグナルを含んでいてもよく、それがコード配列の下流に存在してもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
【００８１】
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサを含んでいてもよい。エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサ、例えば、ＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶまたはＥＢＶのものであってもよい。ポリヌクレオチドの機能は、参照により本明細書に完全に組み入れられた、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号およびＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。
【００８２】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で保持して細胞内のプラスミドの複数のコピーを生成するために、ホ乳類の複製起点を含んでいてもよい。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州、サンディエゴ）のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であってもよく、それらは、エプスタイン・バー・ウイルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいてもよく、それを、統合を行わずに高コピー数のエピソーム複製を生成してもよい。プラスミドのバックボーンは、ｐＡＶ０２４２であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであってもよい。
【００８３】
プラスミドは、調節配列を含んでいてもよく、それがプラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。コード配列は、コドンを含んでいてもよく、それが宿主細胞中でコード配列のより効率的な転写を可能にしてもよい。
【００８４】
コード配列は、Ｉｇリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、コード配列の５’であってもよい。この配列によりコードされたコンセンサスタンパク質は、Ｎ−末端Ｉｇリーダーに続いてコンセンサスタンパク質を含んでいてもよい。Ｎ−末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであってもよい。
【００８５】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよく、それを大腸菌（Escherichia  coli）（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中でのタンパク質産生のために用いてもよい。プラスミドは、ｐＹＥＳ２（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよく、それをホ乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でのタンパク質生成に用いてもよい。
【００８６】
プラスミドは、１種以上のサブタイプ、例えば、Ａｓｉａ、Ａ、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４および３Ｃの１種以上をコードするコード配列を１種以上含んでいてもよい。
【００８７】
幾つかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプＡｓｉａ、Ａ、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３の複数の異なるコンセンサスＦＭＤＶ抗原ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４および３Ｃのコード配列を含む。
【００８８】
幾つかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプＡｓｉａ、Ａ、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３の複数の異なるコンセンサスＦＭＤＶ抗原ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のコード配列を含む。
【００８９】
幾つかの実施形態において、プラスミドは、サブタイプＡｓｉａ、Ａ、ＯおよびＣのうちの２種の異なるコンセンサスＦＭＤＶ抗原ＶＰ１の２種、例えば、サブタイプＡｓｉa
からのＶＰ１とサブタイプＯからのＶＰ１、またはサブタイプＡからのＶＰ１とサブタイプＣからのＶＰ１、のコード配列を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態において、プラスミドは、コンセンサスＦＭＤＶ抗原ＶＰ１、例えば、ＶＰ１サブタイプＡｓｉa、ＶＰ１サブタイプＡ、ＶＰ１サブタイプＯまたはＶＰ１サ
ブタイプＣ、のコード配列を含む。
【００９１】
コード配列は、全てが機能的に連結されたプロモータにより調節された異なるＤＮＡプラスミド、例えば、１種以上のプロモータにより調節された、複数のコンセンサスＦＭＤＶ抗原を含むコード配列を有するＤＮＡプラスミド、によりコードさせることができる。
【００９２】
５．ワクチン
科学的理論に束縛されるものではないが、ＦＭＤＶに対して広範に免疫反応（体液、細胞、またはその両方）を誘発するために用いられうるワクチンが、先に示されたコード配列、即ち、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプからなる群より選択されるサブタイプからのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４および３Ｃの１種以上をコードする核酸配列、を１種以上含んでいてもよい。コード配列は、相同配列、フラグメント、およびフラグメントの相同配列を含むものを挙げることができる。あるいは、または加えて、抗ＦＭＤＶ免疫反応を誘導する組成物が、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプからなる群より選択されるタンパク質を１種以上含んでいてもよい。
【００９３】
本明細書で提供されるのは、１種以上のＦＭＤＶサブタイプに対する免疫反応を、ホ乳類体内で生成することが可能なワクチンである。ワクチンは、先に議論されたプラスミドを含んでいてもよい。ワクチンは、それぞれがＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプ１種以上を対象とするプラスミドを、複数含んでいてもよい。ワクチンは、それ自体がＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプ１種以上を対象とする、ＦＭＤＶ抗原を含んでいてもよい。ワクチンは、世界の特定の領域、例えばアジア、ヨーロッパおよびサブアフリカからのＦＭＤＶサブタイプを対象とするプラスミドを含んでいてもよい。あるいは、または加えて、ワクチンは、Ａ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプ１種以上のタンパク質を含んでいてもよい。ワクチンは、それ自身がＡ、Ａｓｉａ  １、Ｃ、Ｏ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３またはそれらの組み合わせなどのＦＭＤＶサブタイプ１種以上を対象とする、ＦＭＤＶ抗原を含んでいてもよい。ワクチンは、世界の特定の領域、例えばアジア、ヨーロッパおよびサブアフリカからのＦＭＤＶサブタイプを対象とするプラスミドおよび／またはタンパク質を含んでいてもよい。ワクチンは、治療的または予防的免疫反応を誘導するように提供してもよい。
【００９４】
ワクチンは、ＦＭＤＶ  Ｃ３プロテアーゼをコードする核酸を含んでいてもよく、それはコンセンサスＣ３プロテアーゼ核酸であってもよい。コンセンサスタンパク質３Ｃ核酸は、タンパク質３Ｃコード配列であってもよい。あるいは、または加えて、ワクチンは、ＦＭＤＶ  コンセンサスＣ３プロテアーゼなどのＦＭＤＶ  ３Ｃプロテアーゼ、例えばタンパク質３Ｃを含んでいてもよい。ワクチンは、完全または部分的ＶＰ１〜４コード配列と、完全または部分的３Ｃコード配列とをコードするキメラ遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、または加えて、ワクチンは、完全または部分的ＶＰ１〜４と、完全または部分的Ｃ３とを含む融合タンパク質を含んでいてもよい。
【００９５】
本明細書で提供されるのは、ＤＮＡを約１ナノグラム〜約１０mg含む本発明による医薬組成物である。幾つかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０mg、またはそれ以上から、２）最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラムまで（それらの数値を含む）、または最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５��４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５もしくは１０００マイクログラムまで（それらの数値を含む）、または最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０mgまで（それらの数値を含む）を含む。幾つかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、ＤＮＡを約５ナノグラム〜約１０mg含む。幾つかの実施形態において、本発明による医薬組成物は、ＤＮＡを約２５ナノグラム〜約５mg含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約５０ナノグラム〜約１mg含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約５〜約２５０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１０〜約２００マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１５〜約１５０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約２０〜約１００マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約２５〜約７５マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約３０〜約５０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約３５〜約４０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１００〜約２００マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１０マイクログラム〜約１００マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約２０マイクログラム〜約８０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約２５マイクログラム〜約６０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約３０ナノクログラム〜約５０マイクログラム含む。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約３５ナノクログラム〜約４５マイクログラム含む。幾つかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約０．１〜約５００マイクログラム含む。幾つかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１〜約３５０マイクログラム含む。幾つかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約２５〜約２５０マイクログラム含む。幾つかの好ましい実施形態において、該医薬組成物は、ＤＮＡを約１００〜約２００マイクログラム含む。
【００９６】
本発明による医薬組成物は、用いられる投与様式に従って配合される。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それは滅菌されていて、パイロジェンフリーおよび微粒子フリーである。好ましくは、等張性配合剤が用いられる。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。幾つかの例において、等張性溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水が、好ましい。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。幾つかの実施形態において、血管収縮剤が、配合剤に添加される。
【００９７】
好ましくは該医薬組成物は、ワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。
【００９８】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであってもよい。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス前立腺抗原１種以上の核酸コード配列を含む、複数の同一または異なるプラスミドを含んでいてもよい。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス前立腺抗原を１種以上コードする核酸配列を１種以上含んでいてもよい。ＤＮＡワクチンが、１種を超えるコンセンサス前立腺抗原のコード配列を含む場合、そのような配列は全て、単一プラスミド上に存在してもよく、またはそのような配列のそれぞれが、異なるプラスミド上に存在してもよい。
【００９９】
幾つかの実施形態において、ワクチンは、コンセンサス前立腺抗原１種以上と組み合わせたコンセンサス前立腺抗原１種以上をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
【０１００】
ＤＮＡワクチンは、参照により本明細書に完全に組み入れられた、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に開示されている。ＤＮＡワクチンは、染色体に統合されるのを阻害する要素または試薬を更に含むことができる。ワクチンは、前立腺抗原のＲＮＡであってもよい。ＲＮＡワクチンを、細胞に導入することができる。
【０１０１】
ワクチンは、先に記載された遺伝子構築物または抗原を含む組換えワクチンであってもよい。ワクチンは、１種以上のタンパク質サブユニットの形態の１種以上のコンセンサス前立腺抗原、または１種以上のコンセンサス抗原を含む１種以上の弱毒ウイルス粒子を含むこともできる。弱毒ワクチンは、弱毒生ワクチン、死菌ワクチン、ならびに組換えベクターを用いて１種以上のコンセンサス前立腺抗原をコードする外来遺伝子を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよびタンパク質ワクチンであってもよい。弱毒生ワクチン、前立腺抗原を送達するのに組換えベクターを用いるもの、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられた、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されている。ワクチンは、他のワクチン成分、例えば、ＦＭＤＶタンパク質またはタンパク質をコードする発現ベクターと組み合わせたプラスミドを含んでいてもよい。
【０１０２】
提供されたワクチンを用いて、治療的または予防的免疫反応をはじめとする免疫反応を誘導してもよい。コンセンサス前立腺抗原を対象とする抗体および／またはキラーＴ細胞を、生成してもよい。そのような抗体および細胞を、単離してもよい。
【０１０３】
ワクチンは、薬学的に許容しうる賦形剤を更に含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能的分子であってもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であってもよい。
【０１０４】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタマートは、６mg/ml未満の濃
度でワクチン中に存在する。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、遺伝子構築物と一体化させて投与してもよい。幾つかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０参照）などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。好ましくはトランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４mg/ml未満、２mg/ml未満、１mg/ml未満、０．７５０mg/ml未満、０．５００mg/ml未満、０．２５０mg/ml未満、０．１００mg/ml未満、０．０５０mg/ml未満、または０．０１０mg/ml未満である。
【０１０５】
薬学的に許容しうる賦形剤は、アジュバントであってもよい。アジュバントは、代替的なプラスミド中で発現されるか、またはワクチン中で先のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞走化性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、欠失したシグナル配列を有するＩＬ−１５を含み、そして場合によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＣＤ８６、からなる群より選択してもよい。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【０１０６】
有用なアジュバントとなりうる他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管上皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性化ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびその機能的フラグメントをコードするものが挙げられる。
【０１０７】
ワクチンは、参照により完全に組み入れられた、１９９４年４月１日出願の米国特許出願第０２１，５７９号に記載された遺伝子ワクチン促進剤を更に含んでいてもよい。
【０１０８】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が、用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤を更に含んでいてもよい。ワクチン配合剤へのＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなど、安定化により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせてもよい。
【０１０９】
６．ワクチンを送達する方法
本明細書で提供されるのは、免疫反応を誘導しうるＦＭＤＶの免疫原に対して特に効果的となるエピトープを含むＦＭＤＶ抗原の遺伝子構築物およびタンパク質を提供するためのワクチンを送達する方法である。ワクチンを送達する方法またはワクチン接種の方法を提供して、治療的および予防的免疫反応を誘導してもよい。ワクチン接種工程により、複数のＦＭＤＶサブタイプに対する免疫反応をホ乳類体内で生成してもよい。ワクチンを個体に送達して、ホ乳類の免疫系の活性を調整し、そして免疫反応を促進してもよい。ワクチンの送達は、細胞中で発現され、免疫系が認識した細胞の表面に送達されて、細胞反応、体液反応、または細胞反応と体液反応を誘導する核酸分子としてのＦＭＤＶ抗原のトランスフェクションであってもよい。先に議論されたワクチンをホ乳類に投与することにより、ワクチンの送達を利用して、複数のＦＭＤＶウイルスに対するホ乳類体内での免疫反応を誘導または誘発してもよい。
【０１１０】
ワクチンおよびプラスミドをホ乳類細胞内に送達する際に、トランスフェクトされた細胞は、ワクチンから注入されたプラスミドそれぞれのコンセンサスカプシドを発現および分泌する。これらの分泌されたカプシドタンパク質は、免疫系により外来物質として認識され、それらに対して抗体が生成される。これらの抗体は、免疫系により保持され、続いてのＦＭＤＶ感染を急速に浄化させる。
【０１１１】
ワクチンをホ乳類に投与して、ホ乳類体内の免疫反応を誘発してもよい。ホ乳類は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
【０１１２】
ａ．併用処置
ワクチンを、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞走化性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列を検出させるＩＬ−１５を含み、そして場合によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＣＤ８６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管上皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性化ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびその機能的フラグメントまたはその組み合わせをコードする他のタンパク質または遺伝子と併用で投与してもよい。ワクチンを、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質またはそれらの機能的フラグメントと併用で投与してもよい。
【０１１３】
ワクチンを、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、該組成物を適切に許容しうる配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンを、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法（ＥＰ）、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
【０１１４】
ワクチンのプラスミドは、インビボ電気穿孔を用いる、または用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム介在ベクター、ナノ粒子促進ベクター、組換えベクター、例えば組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えワクチンをはじめとする複数の周知テクノロジーによりホ乳類に送達してもよい。ＦＭＤＶ抗原を、インビボ電気穿孔と共にＤＮＡ注入を介して送達してもよい。
【０１１５】
ｂ．電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、ユーザーによるプリセット電流入力と類似の定電流を生成するエネルギーパルスを、ホ乳類の所望の組織に送達するように構成しうる電気穿孔装置を用いて遂行してもよい。電気穿孔装置は、電気穿孔成分および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔成分は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の１種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、ＶＧＸＰ  Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ（商標）システムを用いて遂行して、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進してもよい。
【０１１６】
電気穿孔成分は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔成分と連通する別個の要素（または成分）である。電気穿孔成分は、電気穿孔装置の１つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔成分とは別個の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が１つの装置として、または互いに連通する別個の要素として機能しうるように限定しなくてもよい。電気穿孔成分は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができてもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、そこで電極アセンブリは、電気穿孔成分からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔成分に連通する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔成分により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を保持することができる。
【０１１７】
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下の電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔成分に入力される。プログラムされたシーケンスは、順序どおり送達された複数のパルスを含んでいてもよく、そこで複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する１つのニュートラル電極を含む少なくとも２つの活性電極の異なる１つにより送達される。
【０１１８】
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、５０μs、２０μs、１０μsまたは１μsごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時（即ち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定すると実質的に瞬時）である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に連通し、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を保持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に保持してもよい。
【０１１９】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進しうる電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ他による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ他により提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されたそれらのものが挙げられる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するのに用いられうる他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、２００６年１０月１７日出願の米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ  １１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが挙げられる。
【０１２０】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ他による米国特許第７，２４５，９６３号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極は、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルス制御装置から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター；および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を把握して、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御装置を活性化して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
Ｓｍｉｔｈ他により提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられうる電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザーの制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように構成されていてもよい。電極アレイの形態によって、注射針（選択された生体分子を送達する）が、ターゲット臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ表示された領域のターゲット組織の周辺に注射により投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載された電極は、好ましくは２０mm長および２１ゲージである。
【０１２３】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだ幾つかの実施形態で予期される通り、以下の特許：１９９３年１２月２８日発行の米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日発行の米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日発行の同第６，２６１，２８１号、２００５年１０月２５日発行の同第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日発行の米国特許第６，９３９，８６２号に記載された電気穿孔装置が存在する。更に、様々な装置のいずれかを用いたＤＮＡの送達に関係する２００４年２月２４日発行の米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡ注入の方法が注目された２００８年２月５日発行の米国特許第７，３２８，０６４号に提供された主題を含む特許が、本明細書で予期される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
【０１２４】
ｃ．ワクチンを調製する方法
本明細書で提供されるのは、ワクチンを調製する方法である。幾つかの実施形態において、該方法は、ＤＮＡプラスミドを含むワクチンを調製する方法である。ＤＮＡプラスミドを、ホ乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。プラスミドを、適合性宿主細胞にトランスフェクトして培養し、ＦＭＤＶ抗原の発現が起こる条件下に保持する。ＦＭＤＶ抗原を、細胞を溶解することにより培養物から回収するか、または培地から回収して、単離してもよい。単離されたＶＰ１〜４コンセンサスタンパク質を、ワクチン中で抗体の天然供給源として用いてもよい。単離された本質的に純粋なＦＭＤＶ抗原を生成するのに用いられうる自動合成装置を用いて、ＦＭＤＶ抗原を組換え技術により生成してもよい。これらの技術は、ＦＭＤＶの特定のサブタイプのＦＭＤＶ抗原の変異体を導入するのに有用となりうる。
【０１２５】
本発明のＥＰ装置と共に用いられるＤＮＡプラスミドは、公知の装置および技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくはそれらは、２００７年３月２３日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載された最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。幾つかの例において、これらの研究に用いられるＤＮＡプラスミドは、１０mg/mL以上の濃度で配合させることができる。その製造技術は、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されたものに加えて、２００７年７月３日発行の許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置およびプロトコルも含み、組み入れている。先に参照された出願および特許、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ全体が本明細書に組み入れられる。
【０１２６】
ｄ．ＶＰ１〜４発現構築物を調製する方法
最初にサブタイプの少なくとも１０種の異なる配列を用いて、ＦＭＤＶサブタイプＡｓｉａ、Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のうちの１つのＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４アミノ酸配列を最適化することにより、多重標的ＦＭＤＶ  ＤＮＡワクチンを構築する。それぞれサブタイプ最適化ＶＰ１〜４タンパク質をコードする核酸を生成する。ＦＭＤＶタンパク質３Ｃプロテアーゼ切断部位を介入させることにより分離されたＶＰを用いて、サブタイプ最適化ＶＰ１〜４核酸配列を隣接するコード配列としてクローニングする。最適化ＶＰ１〜４コード配列を、オペレータの制御下で、ｐＶＡＸまたはｐＡＶ０２４２のいずれかの発現ベクターに挿入する。ＩｇＥリーダー配列を最適化ＶＰ１〜４コード配列の上流に配置するため、コードされたタンパク質にはＮ末端ＩｇＥリーダーが含まれる。２つの終止コドンを、ＶＰ１〜４コード配列の３’末端に配置する。
【０１２７】
加えて、サブタイプからの少なくとも１０種の異なる配列を用いて、ＦＭＤＶサブタイプＡｓｉａ  １、Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のうちの１つの３Ｃ核酸配列を最適化することにより、ＦＭＤＶタンパク質３Ｃをコードする核酸を構築する。サブタイプ最適化３Ｃタンパク質をコードする核酸を生成し、ｐＶＡＸまたはｐＡＶ０２４２プラスミドにクローニングする。
【０１２８】
ｅ．ワクチンをマーカとして用いる方法
同じく本明細書で提供されるのは、ワクチンを接種されたホ乳類とＦＭＤＶに感染したホ乳類とを判別する方法である。該方法は、ホ乳類からの試料、および試料からホ乳類抗原を単離することを含んでいてもよい。ワクチンを接種されたホ乳類は、ＦＭＤＶ抗原のエンプティカプシドタンパク質にだけ特異性のある抗体、即ち、ＦＭＤＶサブタイプＡ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３、またはそれらの組み合わせに対するウイルスコートタンパク質ＶＰ１〜４を有していてもよい。ＦＭＤＶに感染したホ乳類は、特定のＦＭＤＶサブタイプ、例えばＡ、Ａｓｉａ  １、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、またはＳＡＴ３のＦＭＤＶウイルスコートタンパク質ＶＰ１〜４に対する抗体に加え、ＦＭＤＶの非構造（ＮＳ）タンパク質に対する抗体を有する。ＦＭＤＶのＮＳタンパク質は、プロテアーゼである３ＣプロテアーゼならびにＦＭＤＶタンパク質２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、および３Ｄ（ポリメラーゼ）を含んでいてもよい。該方法は、ＦＭＤＶのＮＳタンパク質、例えば高度抗原性３Ｄタンパク質に対する抗体を同定することを含んでいてもよい。該方法は、ワクチン接種されたホ乳類の血清試料に比較してＦＭＤＶ  ＮＳタンパク質の有無を決定することを更に含む。感染したホ乳類は、ＦＭＤＶのＮＳタンパク質に対する抗体を有するが、ワクチン接種されたホ乳類は、ＦＭＤＶ感染に対して十分な免疫を有するため、ＮＳタンパク質に対する抗体を有さない。該方法は、ＶＰ１〜４への抗体を有するホ乳類と、ＦＭＤＶのＶＰ１〜４および３Ｄポリメラーゼへの抗体を有するホ乳類とを判別することを含んでいてもよい。
【０１２９】
一般に、薬剤を用いてもよい。該薬剤は、ＶＰ１〜４またはＮＳタンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼであってもよい。ホ乳類の試料をＦＭＤＶ抗体を用いて単離し、薬剤と競合的に反応させて、ＦＭＤＶ抗体の特異性を同定する。
【０１３０】
該方法の試料をホ乳類から単離することができ、血液からの血清試料、唾液、涙液、脳脊髄液、水性体液、胸膜液、心膜液、リンパ液、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、乳び、胆汁、尿、滑液、嘔吐物、腹膜液、便水、精液、羊水、乳、血清、間質液、および膵液を含んでいてもよい。
【０１３１】
診断検査を実施する方法としては、ホ乳類の［３５Ｓ］−メチオニン標識細胞溶解物を用いた免疫沈澱、ウェスタンブロット、および特定のＦＭＤＶタンパク質、例えばＶＰ１〜４および３Ｄポリメラーゼへの免疫ブロットを実施することが挙げられる。
【０１３２】
本明細書に記載された検出方法を、様々な周知検出システムで実行して、検査試料または対照試料中のＦＭＤＶ  ＶＰ１〜４または３Ｄポリメラーゼへの抗体の存在を決定してもよい。検出システムは、特定のＦＭＤＶタンパク質、例えばＶＰ１〜４および３Ｄポリメラーゼに結合する検出標識から発生したシグナルと所定の値とを比較して、検査試料中のＶＰ１〜４または３Ｄポリメラーゼへの抗体の有無を決定する蛍光または他の手段を含んでいてもよい。所定の値は、対照試料で測定されたシグナルに対する、検査試料で測定されたシグナルの比であってもよい。一般にＦＭＤＶ  ３Ｄポリメラーゼに陽性で、それゆえ感染したホ乳類と見なしうるＦＭＤＶ  ３Ｄポリメラーゼ抗体を含まない対照試料で測定された平均シグナルの３標準偏差高いシグナルを発生する検査試料。
【０１３３】
あるいは、デンシトメータなどの装置を、検出可能標識の数値測定に用いてもよい。予備測定された値は、Sackett  et  al.,  Clinical  Epidemiology:  A  Basic  Science
for  Clinical  Medicine,  p.  106-107  (Little  Brown  and  Co.,  1985)の方法
を利用し、受信者動作曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｅｖｅ）（ＲＯＣ）を用いて決定してもよい。所定の値が、先に記載された蛍光イメージング装置または他の手段による相対的光単位に基づいていてもよい。簡潔に述べると、所定の値は、診断された検査結果の可能な各値に対応する真陽性率（即ち、感受性）および擬陽性率（即ち、１００％特異性）の対のプロットから決定してもよい。上部左側の角に最も近いプロットの所定の値（即ち、最大面積を含む値）は、最も正確な所定の値であり、この方法により決定される所定の値よりも高いシグナルを発生する試料を、陽性と見なしてもよい。あるいは所定の値をプロットに沿って左にシフトさせて、擬陽性率を最小にしてもよい。
【０１３４】
（ａ）免疫ブロット
検出方法を免疫ブロット検出システムで用いて、検査試料または対照試料中のＦＭＤＶ
ＶＰ１〜４または３Ｄポリメラーゼへの抗体を検出してもよい。免疫ブロットでは、固形担体を用いて、薬剤を固定してもよい。
【０１３５】
免疫ブロットで、２つの別個の対照試料（即ち、第一の対照および第二の対照）を用いてもよく、それらが固形担体に固定されていてもよい。免疫ブロットで、３つの別個の分離した対照試料（即ち、第一の対照、第二の対照および第三の対照）を用いてもよい。１つを超える対照試料が存在する場合、対照は互いに同一であっても、または互いに異なっていてもよい。対照試料の２つ（例えば、第一の対照および第二の対照）が同一であってもよい。対照試料の２つが同一である場合、対照試料の１つの濃度（第一の対照もしくは第二の対照のいずれか一方、または３つの対照が存在する場合には、第一の対照もしくは第三の対照もしくは第二の対照もしくは第三の対照のレベル）は、他の対照よりも高くても（または大きくても）よい。対照試料は、他の対照よりも高い濃度であってもよく、「高対照」と呼ばれてもよい。高対照よりも低濃度の、切片、ディスクまたはシートに固定された対照は、「低対照」と呼ばれてもよい。高対照に対する低対照の濃度比は、約１：２〜約１：１０、好ましくは約１：５〜約１：６であってもよい。例えば第一の対照が低対照であってもよく、第二の対照が高対照であってもよい。あるいは、第一の対照が高対照であってもよく、第二の対照が低対照であってもよい。別の実施例によれば、対照が３つの検出システムは、低対照および高対照に加えて、第三の対照（例えば、試料の添加を確証するために用いることができる）を含んでいてもよい。低対照および高対照は、ヒト血漿であってもよく（高対照に対する低対照の比は、約１：２〜約１：１０であり）、第三の対照は、ＳＤＢ  Ｃｈａｇａｓまたはヒト血漿であってもよい。貫流形式では、固形担体に固定された薬剤を、検査試料を含む溶液に浸漬してもよい。あるいは固形担体を希釈剤と共に反応トレーに配置し、その後、検査試料を反応トレーに添加してもよい。検査試料および薬剤を、本明細書の先に記載されたものと同じ時間および技術を利用して、十分な時間、インキュベートする。未結合の検査試料を、本明細書の先に記載された技術を用いて除去してもよい。この形式では、検査試料が膜を通過する際に、検査試料中のＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体を、固定された薬剤（および少なくとも１つの対照）に結合させてもよい。少なくとも１種の検出試薬（例えば、検出可能標識を含む、本明細書の先に記載された検出試薬）を添加してもよい。検出試薬を含む溶液が切片を貫流する際に、少なくとも１種の検出試薬を、形成された薬剤−抗体複合体のそれぞれに結合させてもよい。検査試料中のＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体の有無を決定するために、先に記載された通りカットオフを用いるか、または以下に詳細に議論される通り１つ以上の対照により発生した１つ以上のシグナルの強度を比較することにより、結合した検出試薬の検出を実施してもよい。
【０１３６】
先に記載された低対照および高対照を貫流形式で用いてもよい場合、薬剤に関する検査バンド（またはスポットまたはドット）のそれぞれでの検出可能標識のシグナルの存在を同定することにより、検査試料中のＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体の有無を決定してもよい。シグナルを薬剤の検査バンドで同定する場合、０〜４＋のスケールを用いて、この検出されたシグナルの強度を低対照バンド（またはスポットまたはドット）および高対照バンド（またはスポットまたはドット）のシグナルの強度と比較する。バンドが可視でない場合には、読み取りは０である。低対照バンドおよび高対照バンドの強度は、それぞれ１＋（低対照）および３＋（高対照）である。低対照の強度に相当する強度を有する検査バンドは、１＋と評定される。低対照バンドと高対照バンドの間の強度を有するバンドは、２＋と評定される。高対照の強度に相当する強度を有するバンドは、３＋と評定される。高対照の強度よりも高いバンド強度は、４＋と評定される。
【０１３７】
（ｂ）拮抗アッセイ
検出方法を、拮抗検出システムで用いて、ＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体を有する検査試料を検出してもよい。薬剤は、先に記載された通り固形担体に固定されていてもよい。固定された薬剤を、その後、薬剤と結合することが公知の検出可能に標識された競合抗体に接触させて、検査試料中のＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体と拮抗させてもよい。固定された薬剤は、検査試料にも接触させる。抗体組の両者が固定された薬剤に関して競合するため、検出可能に標識された抗体のシグナルが、ＶＰ１〜４またはＮＳ構造タンパク質、例えば３Ｄポリメラーゼへの抗ＦＤＭＶ抗体を含む検査試料では低くなっていてもよい。
【０１３８】
ｆ．診断キット
本明細書で提供されるのは、ＦＭＤＶに感染したホ乳類に対して、ワクチンを接種されたホ乳類を同定する診断的方法を実施するキットである。該キットは、ＦＭＤＶに感染したホ乳類を同定し、ワクチン接種したホ乳類のエンピティカプシドタンパク質ＶＰ１〜４のみへの抗体に対して、ＦＭＤＶの３Ｄポリメラーゼタンパク質をはじめとするＦＳタンパク質に対する抗体を同定することが可能な材料を提供する。検査キットは、１種以上の試薬、例えば、本発明による免疫アッセイを１種以上実践するのに有用な薬剤を含んでいてもよい。検査キットは一般に、試薬を保持する容器１個以上を含む包装を、１個以上の別個の組成物として、または任意に試薬の適合性が許す限り混和物として含む。検査キットは、ユーザーの立場から望ましくなりうる他の材料、例えば緩衝液、希釈剤、標準物質、および／または試料の処理、洗浄もしくはアッセイの任意の他のステップを実施するのに有用な任意の他の材料を含んでいてもよい。
【０１３９】
本発明によるキットは、固相と、固形担体に固定された薬剤とを含んでいてもよい。キットをサンドイッチ免疫アッセイを実施するために用いてもよく、標識された検出抗体を含んでいてもよい。標識された検出抗体が、抗ヒトＩｇＧ標識抗体であってもよい。キットは、検出可能標識を更に含んでいてもよい。
【０１４０】
検査キットが、少なくとも１種の直接標識、例えばアクリジニウム−９−カルボキサミドを含んでいてもよい。本発明による検査キットは、少なくとも１種の間接的標識を含んでいてもよい。用いられる標識が、一般に検出可能なシグナルを生成する指示薬を必要とする場合、検査キットは、１種以上の適切な指示薬を含んでいてもよい。
【０１４１】
検査キットが、本発明の免疫アッセイを１種以上実施するための使用説明書を含んでいてもよい。本発明のキットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼付されていてもよく、または添付文書として含まれていてもよい。使用説明書は、典型的には記載または印刷された材料であるが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明書を保存してそれらをエンドユーザーに連絡することが可能な任意の媒体が、本発明により予期される。そのような媒体としては、非限定的に、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で用いられる用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでいてもよい。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
組換えＶＰ１〜４の発現
サブタイプ最適化ＶＰ１〜４タンパク質および最適化３Ｃタンパク質を、先の最適化ＶＰ１〜４および３Ｃ発現プラスミドを用いてインビトロ翻訳アッセイを実施することにより発現させる。これらのタンパク質の翻訳により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に予測されたバンドが得られる。
【０１４３】
ＶＰ１〜４タンパク質の発現を確認するために、サブタイプ最適化ＶＰ１〜４タンパク質およびＮ末端ＩｇＥリーダーをコードする核酸を、ＨＩＳタグ細菌発現ベクターにクローニングする。サブタイプ最適化３Ｃタンパク質をコードする核酸も、ＨＩＳタグ細菌発現ベクターにクローニングする。最適化ＶＰ１〜４および３Ｃタンパク質を、細菌発現システムを用いて発現させ、Ｎｉカラム分離を用いてアフィニティ精製する。精製されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、予測されたバンドが明らかとなる。
【０１４４】
実施例２
ワクチン接種の方法
ＤＮＡプラスミドの有効性を検査するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを最適化ＶＰ１〜４および３ＣコードｐＶＡＸプラスミドで免疫化する。エンプティｐＶＡＸおよびヒトＩＬ−１５コードｐＶＡＸベクターを、対照として用いる。０、１４、および２８日目に、マウスを１日３回免疫化する。最終的な免疫化の３日後に、免疫化マウスを殺処分する。マウスの血清を回収して、抗−ＶＰ１、−ＶＰ２、−ＶＰ３、および−ＶＰ４  ＥＬＩＳＡについて分析する。実施例１のＨＩＳタグ組換えタンパク質を、捕捉抗原として用いる。ｐＶＡＸ対照マウスの血清は、サブタイプ最適化ＶＰ１〜４のいずれも認識することができない。これに対して、サブタイプ最適化ＶＰ１〜４ＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスは、サブタイプ最適化ＶＰ１、−２、−３、および−４に対する抗体を生成しており、最適化ＶＰ１〜４融合ワクチンが、４種のＶＰ全てに対する免疫反応をマウスで開始させていることが示される。
【０１４５】
実施例３
発現構築物の調製
多重標的ＦＭＤＶ  ＤＮＡワクチンを構築した。サブタイプＡｓｉａ  １、Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、およびＳＡＴ３のＶＰ１配列が、各サブタイプの少なくとも１０種の異なる配列により最適化された第一のコンセンサスであった。その後、２種のＶＰ１配列を１種のプロモータ下で挿入して、２種の隣接する切断部位で分離した。
【０１４６】
ＩｇＥリーダー配列を第一のＯＲＦの前に挿入して、２種の終止コドンを第二のＯＲＦの後に挿入した。ＡｓｉａおよびＯ  ＶＰ１をコードする第一のプラスミドは、１３６２ｂｐである。
【０１４７】
ＡおよびＣ  ＶＰ１をコードする第二のプラスミドは、１３５６ｂｐである。第三および第四のプラスミドは、第一のコードＳＡＴ１およびＳＡＴ２  ＶＰ１と、第二のコードＳＡＴ３  ＶＰ１とを含むサブアフリカサブタイプをターゲットとする。
【０１４８】
実施例４
組換えＶＰ１〜４の発現
クローニングされたプラスミドを、その後、インビトロ翻訳アッセイで発現させた。単一ＶＰ１構築物−Ａ、Ａｓｉa、Ｃ、およびＯ−の全ての翻訳により、予測されたバンド
［約２４．５kDa］が得られ、Ａ＋Ｃ  ＶＰ１およびＡｓｉａ＋Ｏ  ＶＰ１構築物により
、より高分子量の二量体バンドが得られた。それらの構築物は、免疫沈澱に用いられたＦＬＡＧ−エピトープを有する。
【０１４９】
実施例５
ワクチン接種法
ＦＭＤに対する免疫反応を確認するために、４種のＶＰ１サブタイプ（Ａ、Ａｓｉａ、Ｃ、およびＯ）全ての組換えＦＭＤ  ＶＰ１タンパク質を生成させた。
組換えコンセンサスＦＭＤＶ  ＶＰ１配列（ＩｇＥリーダー配列はＮ末端に下線を付した）
タンパク質を、ＨＩＳタグ細菌発現ベクターにクローニングして、ベクターを発現した。Ｎｉ−カラム分離を介してタンパク質を精製したが、発現されたタンパク質を矢印で示している。
【０１５０】
次に、ＤＮＡプラスミドの有効性を検査するために、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ電気穿孔を用いて、免疫化あたりＤＮＡ  １５μgでマウスを免疫
化した。７種の免疫化群が存在した。
１．ｐＶａｘ
２．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ａ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
３．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ａｓｉａ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
４．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｃ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
５．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ｏ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
６．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ａ−Ｃ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
７．ｐＶａｘ−ＦＭＤＶ  ＶＰ１  Ａｓｉａ−Ｏ＋ｐＶＡＸ１−ＩＬ−１５
【０１５１】
０、１４、および２８日目に、マウスを３回免疫化して、最終的な免疫化の３日後に、殺処分した。動物から血清を回収して、抗−ＶＰ１  ＥＬＩＳＡについて分析した。組換えタンパク質を、捕捉抗原として用いた。ｐＶＡＸ対照マウスの血清は、Ａ、Ａｓｉａ、Ｃ、およびＯ  ＶＰ１タンパク質を認識することができなかった。これに対して、Ａ、Ａｓｉａ、Ｃ、およびＯ  ＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスは、それぞれＡ、Ａｓｉａ、Ｃ、およびＯ  ＶＰ１タンパク質に対する抗体を生成した。より重要なこととして、ＶＰ１  Ａ−ＣまたはＡＰ１  Ａｓｉａ−Ｏワクチンのいずれかで免疫化されたマウスは、４種のＶＰ１サブタイプ全てに対する抗体を生成しており、コンセンサス−ＶＰ１融合ワクチンが４種のアジア−ヨーロッパＦＭＤＶサブタイプ全てに対する免疫反応を生成していることが示唆される。
【０１５２】
（項目１）
リーダー配列を有する、または有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２のうちの１種以上、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択される１種以上の配列を有するタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸。
（項目２）
配列が、リーダー配列のためのコード配列を有する、または有さない配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸をコードするそのフラグメント、その相補配列、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１に対して８０％相同的な核酸分子、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸をコードするそのフラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択される、項目１記載の核酸。
（項目３）
リーダー配列を有する、または有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２からなる群より選択されるタンパク質をコードする配列を含む、項目１記載の核酸。
（項目４）
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１からなる群より選択される配列を含む、項目１記載の核酸。
（項目５）
リーダー配列が、ＩｇＥリーダー配列である、項目１〜４のいずれか記載の核酸。
（項目６）
プラスミドである、項目１〜５のいずれか記載の核酸。
（項目７）
発現ベクターであるプラスミドである、項目１〜６のいずれか記載の核酸。
（項目８）
項目１〜７のいずれか記載の核酸ならびに／またはリーダー配列を有する、もしくは有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択されるタンパク質１種以上を含むワクチン。
（項目９）
アジュバントを更に含む、項目８記載のワクチン。
（項目１０）
ＩＬ−１２および／もしくはＩＬ−１５、またはＩＬ−１２および／もしくはＩＬ−１５をコードする核酸配列、からなる群より選択されるアジュバントを更に含む、項目８記載のワクチン。
（項目１１）
リーダー配列を有する、または有さない配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２に対して８０％以上の相同性を有する変異体、その相補配列、少なくとも２０のアミノ酸を含むその免疫原性フラグメント、ならびにその相補配列、からなる群より選択されるタンパク質を１種以上含む組成物。
（項目１２）
項目８記載のワクチンを投与することを含む、ホ乳類における１種以上のＦＭＤＶウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法。
（項目１３）
ワクチンが核酸分子を含み、
ａ）前記核酸分子をホ乳類の組織に投与するステップと、
ｂ）ＤＮＡプラスミドを細胞に侵入させるのに効果的な定電流のエネルギーパルスで前記組織の細胞を電気穿孔するステップと、
を含む、項目１２記載の方法。
（項目１４）
ステップａ）が、ＤＮＡプラスミドワクチンを皮膚間、皮下、または筋肉の組織に注射することを含む、項目１３記載の方法。
（項目１５）
電流が組織に送達されるようにプリセットされ、エネルギーパルスがプリセット電流と等しい定電流である、項目１３または１４記載の方法。
（項目１６）
電気穿孔ステップが、
（ａ）電気穿孔された細胞中でインピーダンスを測定すること、
（ｂ）エネルギーパルスのエネルギーレベルを前記測定されたインピーダンスに対して調整して、前記電気穿孔された細胞中で定電流を保持すること、を更に含み、
ここで測定および調整ステップが、エネルギーパルスの寿命内で行なわれる、項目１３〜１５のいずれか記載の方法。
（項目１７）
電気穿孔ステップが、エネルギーパルスを分散パターンで送達するパルスシーケンスパターンにより、前記エネルギーパルスを複数の電極に送達することを含む、項目１３〜１６のいずれか記載の方法。
（項目１８）
ホ乳類がＦＭＤＶに感染しておらず、免疫反応が防御的免疫反応である、項目１２〜１７のいずれか記載の方法。
（項目１９）
ホ乳類がＦＭＤＶに感染しており、免疫反応が治療的免疫反応である、項目１２〜１７のいずれか記載の方法。
（項目２０）
項目８記載のワクチンを接種されたホ乳類においてＦＭＤＶに感染したホ乳類を診断する方法であって、
ａ）前記ホ乳類から液体試料を単離すること、および
ｂ）前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質および／または前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質に対する抗体の存在を検出すること、を含み、
前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質および／または前記ワクチン中に含まれないＦＭＤＶタンパク質に対する抗体の存在が、ホ乳類がＦＭＤＶに感染していることを示す、方法。
【配列表】
2019213523000001.app