(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素を使用せず安価に、且つ環境負荷の少ない方法で、β−グルカンからオリゴ糖を製造する方法の提供。【解決手段】β−グルカン含有組成物、又はβ−グルカンを水熱処理することによるオリゴ糖の製造方法。該水熱処理の温度は、１２０℃以上２６０℃以下であることが好ましく、オリゴ糖の重合度及び／又は収率を水熱処理の温度及び処理時間を調節することにより最適化することが好ましい。該β-グルカンとしては、β−１，３−１，６-グルカンであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-グルカン含有組成物、又はβ-グルカンを水熱処理することによるオリゴ糖製造方法。
【請求項２】
１２０℃以上２６０℃以下の温度で水熱処理する請求項１記載のオリゴ糖製造方法。
【請求項３】
オリゴ糖の重合度及び／又は収率を
水熱処理の温度及び処理時間を調節することにより最適化する請求項１又は２に記載のオリゴ糖製造方法。
【請求項４】
前記β-グルカンがβ-１，３-１，６-グルカンである請求項１〜３いずれか１項記載のオリゴ糖製造方法。
【請求項５】
水熱処理の温度及び処理時間を次式（Ｉ）によって算出し、
収率を調節する請求項３又は４記載のオリゴ糖製造方法。
【数１】
2019034910.tif 000007
（式(I)中、ｔは処理時間（分）、Ｙは２〜５糖のオリゴ糖の合計収率（％）、Ｔは処理温度（℃）を表す。）
【請求項６】
さらに分離精製することによって、
糖鎖に分岐のあるオリゴ糖を精製する請求項４記載のオリゴ糖製造方法。
【請求項７】
前記β-グルカン含有組成物、又はβ-グルカンを酸性水溶液として調整する請求項１〜４、及び６いずれか１項記載のオリゴ糖製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
β-グルカンからオリゴ糖を製造する方法に関する。特に、水熱処理による処理条件を調節することによって、オリゴ糖の収率や得られるオリゴ糖の重合度分布を調節して製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴ糖とは２から２０程度の単糖がグリコシド結合により結合したオリゴマーをいう。動植物由来の原料に含有されている天然のオリゴ糖は、スクロース、ラクトース、トレハロースなどの二糖類がほとんどであり、重合度の高いオリゴ糖の含有量は少ない。近年、オリゴ糖には様々な生理活性があることが明らかになってきている。特に、重合度の高いオリゴ糖や分岐のあるオリゴ糖の生理活性が注目されているが、含有量が少ないために精製が困難であり、研究が進んでいない。そのため、様々なオリゴ糖を高純度で生産する技術の開発が望まれている。オリゴ糖を産生する技術としては、糖鎖高分子を分解する方法と、単糖から合成する方法との２つに大別される。
【０００３】
糖鎖高分子を分解してオリゴ糖を得る方法としては、β-グルカンなどの糖鎖高分子を分解する方法がある。β-グルカンとは、グルコース同士がβ結合によって化学的に結合した高分子ポリマーの総称であり、多様な分子種が存在する。
【０００４】
自然界のβ-グルカンは、（１→３）、（１→４）、及び（１→６）結合の組み合わせによる高分子多糖が多い。菌類、藻類、高等植物などには、様々な結合様式、構造、分子量を備えたβ-グルカンが含有されていることが報告されている。β-グルカンの中には、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗がん作用、免疫調節作用など様々な作用が認められることが報告されている。
【０００５】
例えば、カワラタケの培養菌体から得られたクレスチン、シイタケの子実体から得られたレンチナン、スエヒロタケ由来のシゾフィランなどは免疫賦活剤として効果があることが知られている（特許文献１）。また、黒酵母やパン酵母から抽出されたβ-グルカンも免疫賦活剤としての効果があることが報告されている（非特許文献１、２）。
【０００６】
しかし、ヒトではβ-グルカンを分解する消化酵素を分泌することができないため、吸収効率が低く、効果が低いことが懸念されている。したがって、これらβ-グルカンを吸収されやすいオリゴ糖として投与することにより、より高い効果が得られる可能性がある。また、β-グルカンを分解して得られるオリゴ糖は、医薬品や機能性食品としてだけではなく、食品の甘味剤、増量剤、賦形剤、包括剤としても利用可能である。
【０００７】
特許文献２には、カードラン、パキマンなどのβ-グルカンにβ-１，３グリコシル糖分解酵素を作用させてラミナリトリオースを得ることが開示されている。特許文献３には、３重らせん構造を有する分岐β-１，３-グルカンを部分的にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ-１，３-グルカナーゼを作用させて低分子量のβ-グルカンを製造する方法が開示されている。特許文献４には、β-１，３-グルカンを弱酸によって部分分解処理を行い、ユーグレナ藻体あるいはその抽出物を作用させてラミナリオリゴ糖を製造することが開示されている。また、非特許文献３には、黒酵母由来のβ-グルカンを水熱処理によって粘性を低下させ、酵素により分解する方法が開示されている。
【０００８】
一方、単糖からオリゴ糖を合成する方法としては、比較的短い糖鎖や単純な構造の糖鎖を合成する方法が開発されている。例えば、β-１，３-グルカンホスホリラーゼやラミナリビオースホスホリラーゼを用いて、グルコース-１-リン酸を基質とした重合反応により、ラミナリオリゴ糖やβ-1，３-グルカンを製造する方法が開示されている（特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平６−１５７３３３号公報
【特許文献２】特開平７−２８４３９７号公報
【特許文献３】特開平６−２７７０８５号公報
【特許文献４】特開平６−１１３８７４号公報
【特許文献５】特開２００１−２９９３３８号公報
【特許文献６】国際公開第２０１０／０９２９９７号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tada, R. et al., 2009, Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol.73(4), p.908-911.
【非特許文献２】吉村  明伸  他、2003年、Radioisotopes、Vol.52、p.687-691.
【非特許文献３】Hirabayashiet al., 2016, World J. Microbiol. Biotechnol., Vol.32, No.12, Article:206
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、特許文献２及び３、非特許文献３に記載されている高分子のβ-グルカンから酵素分解によって適切な鎖長のオリゴ糖を得る方法は、酵素を使用するために安価に製造することができない。また、得られた糖を分解に用いた酵素から分離する必要がある。また、特許文献４に記載されているユーグレナ藻体、あるいはユーグレナ抽出物を用いて分解する方法は、β-グルカンを水溶化する必要があるため、β-１，３-グルカンを弱酸で部分分解処理し、その後にユーグレナ藻体等で処理する必要があり、酵素を使用せずに製造することができるものの、多くの工程が必要であり、製造に時間を要する。
【００１２】
また、特許文献５に記載されているグルコース-１-リン酸を基質としてホスホリラーゼを用いて重合する方法は、比較的小さなオリゴ糖を製造することしかできない。また、酵素を用いて合成する方法では、特許文献６に記載されているように、酵素反応によって生じる特定の構造の多糖しか合成することができない。結合様式が組み合わさった構造をとっている糖、分岐のある糖などを合成することは非常に困難である。さらに、酵素を使用することから、安価に製造することができない。
【００１３】
本発明者らは、水熱処理により、β-グルカンがオリゴ糖に分解すること、さらに、処理温度、処理時間を調節することにより、オリゴ糖の重合度や収率を調節できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明は、安価に、かつ環境負荷の少ない方法で、β-グルカンからオリゴ糖を生産する方法を提供することを課題とする。また、生成されるオリゴ糖の鎖長やその分布、及び収率を制御しながら生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は以下に記載するβ-グルカンからオリゴ糖を製造する方法に関する。
（１）β-グルカン含有組成物、又はβ-グルカンを水熱処理することによるオリゴ糖製造方法。
（２）１２０℃以上２６０℃以下の温度で水熱処理する請求項１記載のオリゴ糖製造方法。
（３）オリゴ糖の重合度及び／又は収率を水熱処理の温度及び処理時間を調節することにより最適化する請求項１又は２に記載のオリゴ糖製造方法。
（４）前記β-グルカンがβ-１，３-１，６-グルカンである請求項１〜３いずれか１項記載のオリゴ糖製造方法。
（５）水熱処理の温度及び処理時間を次式（Ｉ）によって算出し、
収率を調節する請求項３又は４記載のオリゴ糖製造方法。
【数１】
2019034910.tif 000002
（式(I)中、ｔは処理時間（分）、Ｙは２〜５糖のオリゴ糖の合計収率（％）、Ｔは処理温度（℃）を表す。）
（６）さらに分離精製することによって、糖鎖に分岐のあるオリゴ糖を精製する請求項４記載のオリゴ糖製造方法。
（７）前記β-グルカン含有組成物、又はβ-グルカンを酸性水溶液として調整する請求項１〜４、及び６いずれか１項記載のオリゴ糖製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
温度や時間など水熱処理条件を変えることによって、得られるオリゴ糖の分布や生成物の収率を制御することができる。今まで製造が困難であった３糖以上が結合したオリゴ糖、特に５糖以上が結合したオリゴ糖を精製することが可能となる。また、水熱処理によってβ-グルカンからオリゴ糖を製造するため、環境負荷が少ないだけではなく、酵素反応に較べて再現性が良く、安定して特定の鎖長のオリゴ糖を製造することが可能となる。さらに、酵素を失活させ、分離するなどの反応後の精製工程を必要としないことから非常に簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】オリゴ糖収率に対するβ-グルカン濃度の影響を示す図。
【図２】２糖から５糖の合計収率に対するβ-グルカン濃度の影響を示す図。
【図３】オリゴ糖収率に対するβ-グルカン濃度の影響を示す図。
【図４】２糖から５糖の合計収率に対するβ-グルカン濃度の影響を示す図。
【図５】処理温度により得られるオリゴ糖の経時変化を示す図。
【図６】処理温度による２糖から５糖の合計収率を示す図。
【図７】０．１５ｗｔ％ラミナランの処理温度による２糖から５糖の合計収率を示す図。
【図８】収率と処理時間の相関を示す図。
【図９】処理温度、処理時間の違いにより得られる糖を解析した結果を示す図。
【図１０】活性炭クロマトグラフィー、ＬＣ−ＭＳによる解析結果を示す図。
【図１１】ｐＨ２．０の酸性水溶液中で水熱処理を行うことによる処理時間、収率に対する影響を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、水熱処理を行うことによって、β-グルカンからオリゴ糖を生成する方法である。水熱処理とは、常圧での水の沸点である１００℃以上の温度で、加圧下で液体状態を維持した水中で処理を行うことをいう。本発明は、β-グルカンを含有する原料を処理する際の温度、時間、β-グルカン濃度がオリゴ糖の重合度分布、及び収率に大きく影響するという発明者の知見に基づいている。
【００１９】
β-グルカンは、ここでは海藻アラメ由来のラミナラン（東京化成工業株式会社製）、又は黒酵母由来のβ-グルカン（伊藤忠製糖株式会社製）を用いた。しかし、由来にかかわらず、どのようなβ-グルカンであっても同様に水熱処理を行い、オリゴ糖を得ることができることは言うまでもない。また、原料は精製されたβ-グルカンを用いても、β-グルカンを多量に含む分画や部分精製品を用いてもよいが、精製したβ-グルカンを用いた方が、製造する糖の重合度、収率を調節しやすいことから好ましい。
【００２０】
水熱処理は高温高圧対応の回分式反応器（Ｓｗａｇｅｌｏｋ社製、内容量６ｍｌ）に所定の濃度のβ-グルカン水溶液を入れ、所定の温度に設定したオイルバス又は溶融塩炉に入れることで反応を開始させた。一定時間反応させた後、回分式反応器をオイルバス又は溶融塩炉から取り出し、冷水浴に入れて反応器を冷却することで反応を停止させた。または、流通式装置を用いて、所定の温度、及び時間で処理を行った。
【００２１】
下記に処理条件の検討結果を示すが、１２０℃〜２６０℃の範囲の温度で水熱処理を行うことにより、β-グルカンをオリゴ糖に分解することができる。水熱処理の温度、処理時間は、目的とするオリゴ糖の重合度、収率に合わせて適宜選択することができる。高温であればあるほど、処理時間は短時間ですむが、夾雑物や単糖が分解することにより褐変が生じる。単糖の過分解、処理時間による収率等の調節の容易さを考慮すると、２２０℃以下、より好ましくは２００℃以下の温度で加熱するのが好ましい。また、低温では処理時間が長時間にわたるが、長鎖のオリゴ糖を製造することができる。したがって、重合度の高いオリゴ糖を得る場合には処理温度を低く設定すればよい。例えば、２糖〜５糖を得る場合には、１４０℃以上、好ましくは１５０℃以上、より好ましくは１６０℃以上の温度で加熱するのがよい。６糖以上の重合度の糖を得る場合には、１８０℃以下の温度で水熱処理を行うか、あるいは高温で短時間の処理を行うことが好ましい。
【００２２】
反応器から回収した試料は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、島津製作所ＬＣシステム、示差屈折率検出器：ＲＩＤ−２０Ａ、システムコントローラー：ＣＢＭ−２０、ソフトウェア：ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）、質量分析高速液体クロマトグラフ装置（島津製作所製ＬＣ−ＭＳシステム、質量分析計：ＬＣＭＳ−２０２０、システムコントローラー：ＣＢＭ−２０、蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）：ＥＬＳＤ−ＬＴ  ＩＩ、ソフトウェア：ＬＣＭＳ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、高分解能二次元ＮＭＲ測定法（ＨＳＱＣ、装置：ＢＲＵＫＥＲ社ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ４００ＭＨｚ、解析ソフト：ｔｏｐｓｐｉｎ３．２、溶媒：重水Ｄ２Ｏ）を用いて解析を行った。ＨＰＬＣは、分析用カラムとして、ｓｈｏｄｅｘ  ｓｕｇａｒ  ＫＳ８０１、またはｓｈｏｄｅｘ  ｓｕｇａｒ  ＫＳ８０２を用い、検出器は示唆屈折率検出器を用いた。また、ＬＣ−ＭＳは、ＧＰＣモードカラム、アミノカラムを用いて分析した。
【００２３】
１．原料濃度の影響
ラミナランを原料として、水熱処理によるオリゴ糖の産生を解析した。水熱処理を行うラミナランの濃度を０．１５ｗｔ％〜２０ｗｔ％まで変えて２００℃の亜臨界水で水熱処理し、単糖（１糖）から５糖までの収率の経時変化を解析した（図１）。なお、ラミナランは室温では２０ｗｔ％がほぼ飽和溶液となる。処理温度は２００℃と同一であるにもかかわらず、原料濃度によって、最大の収率でオリゴ糖を得られるまでの処理時間が異なることが明らかとなった。例えば、２糖から５糖の収率が最大となるのは、０．１５ｗｔ％では６０分前後であるのに対し、２０ｗｔ％では３０分前後となっている。β-グルカン濃度が高いほど、短時間でオリゴ糖に分解されることが明らかとなった。
【００２４】
いずれの濃度の場合でも、２糖から５糖はほぼ同じ処理時間において収率が最大となることから、２糖から５糖の合計収率を求め、原料濃度と処理時間との関係を解析した（図２）。
【００２５】
２糖から５糖の合計収率の解析結果においても、最大収率となる処理時間が、β-グルカン濃度が高いほど短時間となっていた。また、最大収率は、２０ｗｔ％では約１５％であるのに対し、５ｗｔ％、１０ｗｔ％では約２０％とより高い最大収率を示していた。
【００２６】
ラミナラン以外のβ-グルカンを原料として用いた場合でも、収率に対して原料濃度が影響するか解析した。黒酵母由来のβ-グルカンの濃度を変えて収率の経時変化を解析した。なお、黒酵母由来のβ-グルカンは室温で１０ｗｔ％程度の溶解度を示す。
【００２７】
黒酵母由来のβ-グルカンを０．１５ｗｔ％、５ｗｔ％に調整し、水熱処理温度２００℃で処理し、単糖から５糖の収率の経時的変化の解析を行った（図３）。５ｗｔ％濃度の黒酵母由来のβ-グルカンを用いた場合には３０分、０．１５ｗｔ％では６０分程度と、ラミナランで得られた結果と同様に、黒酵母由来のβ-グルカンを用いた場合でも、濃度の高い試料を用いた方がより短時間でオリゴ糖に分解された。
【００２８】
黒酵母由来のβ-グルカンにおける２糖から５糖のオリゴ糖の合計収率の経時変化に対する原料濃度の影響を図４に示す。５ｗｔ％では２糖から５糖の合計収率が約１６％であるのに対し、０．１５ｗｔ％では約１０％と、濃度を高くして水熱処理を行った方が、収率が高い。
【００２９】
このようにβ-グルカンの由来する原料が異なっても、水熱処理に対して同様の傾向を示すことが分かった。すなわち、濃度が高い方がより早く、かつ収率良くオリゴ糖に分解される。ラミナラン、黒酵母由来のβ-グルカンは、結合様式として（１→３）、（１→６）結合が混在しているβ-１，３-１，６-グルカンである。上記結果から少なくとも同様の結合様式を有するβ-グルカンであれば水熱処理に対して同様の傾向を示すものと考えられる。
【００３０】
２．温度条件
処理温度と、オリゴ糖の分解について解析を行った。ラミナランを１０ｗｔ％に調整し、１６０℃〜２２０℃までの亜臨界水で水熱処理し単糖から５糖までの糖の収率の経時変化を解析した（図５）。単糖は経時的に増加していく傾向にあるが、２００℃、２２０℃といった高い温度で処理した場合には、一定時間の後に減少していく。これは、高温で長時間水熱処理することにより糖の過分解が生じるためだと考えられる。実際に高温で水熱処理を行うと、試料に茶色の着色が見られる。
【００３１】
２糖以上の糖は各温度で収率が最大となるまでの時間が異なるものの、最大の収率に達した後に減少する。例えば、処理温度１６０℃では２糖以上の糖は、６００分前後に収率が最大になっているが、２２０℃では１２分前後に収率が最大になっている。最大の収率に達した後に減少するのは、オリゴ糖がさらに分解することにより単糖になるためだと考えられる。
【００３２】
図６は、各処理温度の２糖から５糖の合計収率の経時的な変化を示している。図６左のグラフは７２０分まで、右のグラフは８０分までのオリゴ糖の収率の変化を示している。ラミナランを１６０℃で処理した場合と、１８０℃以上の温度で処理した場合と、オリゴ糖に分解されるのに要する時間が大きく異なっている。処理温度が高いほど短時間でオリゴ糖に分解できることを示しており、１６０℃ではオリゴ糖に分解する速度が極端に遅くなることが示されている。
【００３３】
また、１６０℃の場合には、分解に時間がかかるだけではなく、１８０℃、２００℃、２２０℃のいずれの温度条件で処理したものと比較しても合計収率が低下している。また、１８０℃の処理温度のときには、合計収率が最大に達するまでの時間は約１２０分と、２００℃、２２０℃と比較して時間を要するが、２糖から５糖までの合計収率は２０．４％と最も収率が多くなっている。高温では反応が早く進むため、単糖に分解される糖が多く、２糖から５糖までの合計収率が少なくなっているものと考えられる。
【００３４】
β-グルカンの濃度が処理時間、収率に影響することから、ラミナランの濃度を変えて、処理温度の影響を解析した。０．１５ｗｔ％のラミナランを用いて、１８０℃、１９０℃、２００℃で水熱処理を行い、２糖〜５糖までの合計収率を求めた（図７）。β-グルカンが低濃度の場合であっても、高温で処理することにより合計収率が最大に達する時間はより短時間であった。また、１８０℃で処理した場合に、合計収率は約１８％と最も多くオリゴ糖を得ることができた。
【００３５】
３．水熱処理時間の調節
上記結果から、水熱処理によるオリゴ糖の生成は、β-グルカン濃度、処理温度、処理時間に依存することが明らかとなった。処理時間や収率は、原料となるβ-グルカン濃度にも依存するが、工業的に生産する際は効率の点から低濃度で水熱処理を行うことは考えにくい。そこで、工業的生産の際の濃度範囲でβ-グルカン濃度を変えて、処理温度２００℃における収率と反応時間の相関を解析した（図８）。図８は、５ｗｔ％、１０ｗｔ％、２０ｗｔ％ラミナラン、５ｗｔ％黒酵母由来のβグルカンを２００℃で処理した場合の反応時間と収率との関係を示したものである。すべての濃度で収率と反応時間との間に非常に良い相関があることは明らかである。
【００３６】
上記結果から、工業的生産において重要と考えられる１ｗｔ％以上２０ｗｔ％以下の濃度では、濃度を変えて処理しても処理時間が極端に変わるということはなく、処理温度と処理時間に対して比較的似た挙動を示すものと考えられる。
【００３７】
収率と反応時間には、次式（Ｉ）の相関があることが明らかとなった。次式中ｔは処理時間（分）、Ｙは２〜５糖のオリゴ糖の合計収率（％）、Ｔは処理温度（℃）を示す。
【数１】
2019034910.tif 000003
【００３８】
上記式は、処理温度が１６０℃の場合には、処理時間が他の処理温度と較べて長くなるため、誤差が大きくなるが、１８０℃以上の温度では非常に相関が高い。
【００３９】
実験結果からは、ラミナラン、黒酵母由来のβ-グルカンいずれの場合も、２〜５糖のオリゴ糖の合計収率は２０％程度が上限と考えられる。上記式を用いることによって、処理温度において最大収率を得ることのできる処理時間を定めることが可能となる。
【００４０】
４．６糖以上の糖の生成
オリゴ糖は重合度がある程度大きくなると合成によって得ることは困難である。しかし、分解による方法であれば、５糖以上の重合度の糖も得ることができる。そこで、処理温度、処理時間を調整して得られるオリゴ糖の鎖長の解析を行った。
【００４１】
黒酵母由来のβ-グルカンを濃度３．０ｗｔ％に調整し、２６０℃、１４秒、又は１０．０５ｗｔ％に調整したものを１８０℃、８０分で水熱処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより解析を行った。ＧＰＣモードカラムを用い、検出は蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）を用いて分析した（図９（Ａ））。
【００４２】
ＬＣ−ＭＳの解析により、６糖、７糖のオリゴ糖のピークを検出することができた。８糖以上の重合度の糖は、水熱処理により生じた分解産物等の夾雑物とピークが重なり、ＬＣ−ＭＳでは分離することができないが、８糖以上の重合度の糖も生成物中に存在しているものと考えられる。各重合度の糖の収率を表１に示す。なお、表中、不明と記載しているのは、図９（Ａ）において１糖よりも後に検出されるピークを指す。また、７糖はピークとして検出できるものの、ベースラインが上がっていることから、７糖以上の糖と夾雑物（図９（Ａ）において、７糖、８糖+夾雑物として示しているピーク）を合わせた割合を示している。
【００４３】
【表１】
2019034910.tif 000004
【００４４】
２６０℃という高温処理であっても、短時間の処理を行うことによって、６糖以上の重合度を示すオリゴ糖を得ることができた。また、１８０℃、８０分の処理では６糖を４．７％と高い収率で得ることができた。これらの結果から、低温で処理時間を調整する、あるいは高温でも非常に短時間の処理を行うことにより、高い重合度の糖を選択的に得ることができると考えられる。
【００４５】
次に、処理時間を調整することにより、重合度の高い糖が得られることを示す。処理温度１８０℃で、８０分、１００分、又は１２０分処理を行い、ＬＣ−ＭＳにより得られたオリゴ糖の解析を行った（図９（Ｂ）、表２）。処理時間が短い方が重合度の高いオリゴ糖を得ることができる。５糖以上の分画を比較すると、８０分、１００分、１２０分ではそれぞれ５８．７％、２５．０％、１１．２％と処理時間が短い方がより多くの重合度の高いオリゴ糖が得られている。短時間処理の試料では過分解による夾雑物が少ないことから、半分以上が５糖以上の重合度の糖であると考えられる。
【００４６】
【表２】
2019034910.tif 000005
【００４７】
上記で示したように処理温度、処理時間を調整することによって、重合度の異なるオリゴ糖を得ることができる。これら処理温度及び処理時間を調整して得られたオリゴ糖試料から、５糖以上の分画を分取し、さらに精製することによって、今まで得ることが困難であった５糖以上のオリゴ糖も精製することができる。
【００４８】
５．糖鎖に分岐のあるオリゴ糖の生成
β-１，３-１，６-グルカンをオリゴ糖生成の原料として用いることにより、糖鎖に分岐構造を有するオリゴ糖が生成されている可能性がある。そこで、生成されたオリゴ糖を標準品と比較し、どのような構造のオリゴ糖が生成されているか解析を行った。
【００４９】
３．０ｗｔ％の黒酵母β-グルカンを２６０℃、１４秒水熱処理した試料の糖鎖構造の分析を行った。水熱処理した試料は、エバポレーターで濃縮し、活性炭クロマトグラフィーを用いて分画を行った（図１０、活性炭カラムクロマトグラム）。初めに単糖の溶出分を５倍量の水で水洗することで除去し、その後エタノールのグラジエント溶出により、２糖、３糖、４糖を多く含む分画（＞４糖）、微量の５糖を含む分画（＞５糖）、微量の６糖を含む分画（＞６糖）を得た。さらに、２糖（Ｆ２）、３糖（Ｆ３）、４糖を多く含む分画（＞４糖）（Ｆ４）について、固相抽出、弱イオン交換樹脂を用いて脱色、精製を行い凍結乾燥後、ＬＣ−ＭＳ、ＨＳＱＣで解析を行った。
【００５０】
ＬＣ−ＭＳ解析の結果を示す（図１０、ＬＣ−ＭＳの解析、表３）。図１０に示すように２糖の分画であるＦ２はＬＣ−ＭＳにより、Ｆ２（１）、Ｆ２（２）の２つのピークに分離した。標準品（ラミナリビオース（Ｌａｍ２）、ラミナリトリオース（Ｌａｍ３）、ラミナリテトラオース（Ｌａｍ４）、ゲンチオビオース（Ｇｅｎ２）、ゲンチオトリオース（Ｇｅｎ３）、ゲンチオテトラオース（Ｇｅｎ４））との比較から、Ｆ２はラミナリビオース、及びゲンチオビオースであることが明らかとなった。Ｆ３分画は４つのピークが観察され、標準品との比較から、ピークＦ３（１）は、ラミナリビオース、Ｆ３（２）は、ラミナリトリオースとゲンチオビオースの混合であることが推測されたが、Ｆ３（３）、Ｆ３（４）の構造は不明であった。Ｆ４分画は３つのピークが観察され、ピークＦ４（１）は、ラミナリテトラオースに他の糖が混在している分画であることが推測されたが、他のピークについては、標準品との比較からは推測することができなかった。
【００５１】
ＨＳＱＣによる構造解析の結果は、ＬＣ−ＭＳの結果と良い一致を示し、さらにＬＣ−ＭＳ解析では不明であった糖鎖構造を明らかにすることができた（表３）。なお、表３中、ＲＴ、Ｍ／Ｚは、アミノカラムを用いたＬＣ−ＭＳ解析のＲｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ、Ｍ／Ｚ値を、ＨＳＱＣはＨＳＱＣによる解析から推定される構造を示す。Ｌａｍ２はラミナリビオース、Ｌａｍ３はラミナリトリオース、Ｌａｍ４はラミナリテトラオース、Ｇｅｎ２はゲンチオビオースを示す。「？」は構造が特定できなかった糖を示す。また、ＨＳＱＣの欄は結合様式を示し、例えば、Ｇβ１−３Ｇは、グルコースがβ１-３結合していることを示す。また、ピーク面積比解析は、各ピークの各分画内で割合を示している。例えば、ＬＣ−ＭＳにおいて、Ｆ２（１）の５９．８％という値は、Ｆ２分画（Ｆ２（１）＋Ｆ２（２））における面積比を示している。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
ＨＳＱＣ解析から明らかなように、β-１，３-１，６-グルカンを水熱処理によって分解することにとって、Ｇβ１-６Ｇβ１-３Ｇ（ピークＦ３（３））、あるいはＧβ１-３Ｇβ１-６Ｇ（ピークＦ３（４））のように分岐構造のある３糖を得ることができた。水熱処理によって４糖以上の重合度の大きい糖も製造されていること、処理条件によって重合度の高い糖を調整して製造可能であることから、さらに構造の複雑な糖を製造することも可能である。
【００５４】
ＬＣ−ＭＳによるピーク面積比解析からは、例えば、Ｇβ１-６Ｇβ１-３Ｇ（ピークＦ３（３））は３４．６％、Ｇβ１-３Ｇβ１-６Ｇ（ピークＦ３（４））は１６．１％と、分岐構造を有する糖も各分画において多くの割合を占めており、精製して提供することが可能であることが示唆される。
【００５５】
６．酸による処理時間の短縮
水熱処理を行う際に試料のｐＨを酸性にすることにより、より早く加水分解が進み、低温、短時間で処理できる可能性がある。そこで、試料溶液を酸性にし、水熱処理を行った。
【００５６】
１０ｗｔ％ラミナランを硫酸でｐＨ２．０に調整し、処理温度２００℃で水熱処理を行い、単糖〜５糖の収率の経時的な変化を解析した（図１１（Ａ））。ｐＨを酸性に調整せず、中性で水熱処理を行った場合（図１参照）は、収率がピークに達するのは３０分前後であるが、ｐＨ２．０に調整して水熱処理を行った場合は２５分程度でピークに達する。また、酸性で水熱処理を行った方が個々の糖の収率も高い。
【００５７】
２糖〜５糖の合計収率を比較すると（図１１（Ｂ））、ｐＨ２．０に調整することにより、ｐＨを調整せずに水熱処理を行った試料（硫酸なし、ｐＨ７．０）に較べて、短時間かつ収率も良くオリゴ糖を得ることができる。
【００５８】
以上の結果から、試料濃度、ｐＨ、処理温度、処理時間を変えてβ-グルカンを水熱処理することによって、収率、オリゴ糖の重合度を調節することができる。これら条件を適宜調整することにより、収率良く所望の鎖長のオリゴ糖を得ることが可能となる。特に、水熱処理の処理温度、処理時間を調整することにより、所望の鎖長のオリゴ糖を調整することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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