(57)【要約】【課題】新たな指標により好中球細胞の活性を評価する方法を提供すること。【解決手段】好中球細胞の活性を評価する方法であって、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から導出された指標に基づいて、好中球細胞の活性を評価するステップを備え、当該指標が、好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間である、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球細胞の活性を評価する方法であって、
好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から導出された指標に基づいて、好中球細胞の活性を評価するステップを備え、
前記指標が、前記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間である、方法。
【請求項２】
前記評価するステップは、前記時間を基準値と比較し、前記時間が前記基準値よりも大きい場合、好中球細胞の感受性が低下していると評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料は、全血を含む試料である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記評価するステップは、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピーク面積に基づいて、好中球細胞の活性を評価することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象が、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患に罹患しているか否か、又は好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあるか否かを判定するためのデータを収集する方法であって、
好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から前記データを導出するステップを備え、
前記データが、前記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間であり、
前記生体試料が、前記対象から得られた生体試料である、方法。
【請求項６】
対象における、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患又は状態の治療効果を判定するためのデータを収集する方法であって、
好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から前記データを導出するステップを備え、
前記データが、前記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間であり、
前記生体試料が、治療後の前記対象から得られた生体試料である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好中球細胞の活性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
好中球細胞は、炎症性サイトカイン及び細菌等に対し遊走性を示し、これにより炎症部に集合し、細菌等を貪食殺菌する機能を有しており、生体防御において重要な役割を演じている。好中球細胞が細菌等を貪食殺菌する作用機序として、活性酸素（スーパーオキシド、過酸化水素等）の産生、及びミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）による次亜塩素酸の産生等が知られている。
【０００３】
一方、好中球細胞の過剰な活性化による活性酸素の産生は、酸化ストレスの原因となり、細胞や組織の障害を惹き起こし種々の病態に関与することが指摘されている（例えば、非特許文献１参照）。また近年、好中球細胞から放出されるＭＰＯは、酸化ストレスのもう一つの原因である脂質の過酸化にも関与していることがわかってきた（例えば、非特許文献１）。
【０００４】
好中球細胞の機能等を評価する方法として、例えば、特許文献１には、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を、全血を含む同一の試料を用いて測定するステップを含み、前記ミエロペルオキシダーゼ活性の測定、及び前記スーパーオキシド産生活性の測定の少なくとも一方が蛍光の検出に基づくものであり、前記蛍光の検出が、励起光源から出力された励起光を前記試料を含む試料容器に照射し、放出された蛍光を蛍光検出器により検出するものであり、かつ前記励起光源及び前記蛍光検出器が、前記試料容器の前記励起光の照射面に対して、同じ側に配置されている、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて好中球細胞の活性を評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−８４７５７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物試料分析，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ２，２０１２年，ｐｐ．１３３〜１３９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
好中球細胞は、細菌及び真菌類に接触すると好中球形質膜で包むようにして好中球内に取り込み食胞を形成する。次いで食胞が顆粒と融合し、顆粒内容物が食胞内に放出される。細胞膜（食胞の膜）に形成されたＮＡＤＰＨ酸化酵素系により活性酸素（スーパーオキシド、過酸化水素）が発生し、細菌及び真菌類を殺菌する。また、顆粒内容物に含まれるミエロペルオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１１．２．２）の酵素反応により、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と塩素イオン（Ｃｌ−）から次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）（又はそのハロゲン等価体）が産生され、細菌及び真菌類を殺菌する。
【０００８】
特許文献１に記載の方法では、例えば、好中球刺激剤の添加後、活性酸素及び次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）を定量し、測定されるピーク面積を算出することで、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を導出する。そして、測定されたミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性に基づいて、好中球細胞の活性を評価する。
【０００９】
一方、本発明者らは、動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者では、特許文献１に記載の方法に準じて、好中球刺激剤の添加後、活性酸素及び次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）の定量によりミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定したとき、ピークが立ち上がるまでの時間が長くなることを見出した。本発明は、この新規な知見に基づき、新たな指標により好中球細胞の活性を評価する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、好中球細胞の活性を評価する方法であって、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から導出された指標に基づいて、好中球細胞の活性を評価するステップを備え、上記指標が、上記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間である、方法を提供する。
【００１１】
本発明の評価方法は、好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間（以下、「指標時間」ということもある。）を指標としているため、好中球細胞の活性を評価することができる。動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者では、指標時間が長くなる。これは、好中球細胞が、過剰に活性化された結果、次の刺激に対する感受性が低下したためであると考えられる。したがって、本発明の評価方法は、例えば、好中球細胞の感受性を評価する方法と捉えることもできる。
【００１２】
評価するステップは、指標時間を基準値と比較し、指標時間が基準値よりも大きい場合、好中球細胞の感受性が低下していると評価することを含むものであってもよい。
【００１３】
上記生体試料は、全血を含む試料であるのが好ましい。全血を含む試料では、好中球細胞を分離する必要がないため、操作が簡便であると共に、分離作業によって好中球細胞にストレスを与えることを回避できること、及び血液中に含まれる様々な液性因子等との相互作用を含め生体内での動態により近い情報を得ることができるためである。
【００１４】
また、評価するステップは、指標時間に基づいて好中球細胞の活性を評価することに加えて、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピーク面積に基づいて、好中球細胞の活性を評価することを更に含むものであってよい。指標時間が長くなる被験者においては、ピーク面積の減少も同時に観察されることがある。したがって、ピーク面積に基づく評価を併せて実施することにより、好中球細胞の活性を多面的に評価することができる。また、ピーク面積に基づいて、「食」などの外因性要因や生体に備わっている抗酸化酵素等の炎症防御能力（抗酸化能又は酸化ストレス防止能）を併せて評価することもできる。
【００１５】
本発明の評価方法によれば、例えば、動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者を見分けることができる。したがって、本発明はまた、対象が、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患に罹患しているか否か、又は好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあるか否かを判定するためのデータを収集する方法であって、当該データ収集方法は、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から上記データを導出するステップを備え、上記データが、上記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間であり、上記生体試料が、上記対象から得られた生体試料である、方法を提供する。
【００１６】
本発明者らが見出した別の知見によれば、例えば、動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者において、当該状況が改善した場合は、当該状況にある場合と比べて、指標時間が短くなる。したがって、本発明は更に、対象における、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患又は状態の治療効果を判定するためのデータを収集する方法であって、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から上記データを導出するステップを備え、上記データが、上記好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間であり、上記生体試料が、治療後の上記対象から得られた生体試料である、方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、新たな指標により好中球細胞の活性を評価する方法を提供することが可能となる。本発明の評価方法は、上述の指標時間を指標とした評価を行うため、好中球細胞の感受性を評価することもできる。本発明によればまた、例えば、対象が、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患に罹患しているか否か、又は好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあるか否かを判定すること、及び対象における、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患又は状態の治療効果を判定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試験例１において、下肢閉塞性動脈硬化症に罹患し、末梢血管カテーテル治療を実施する患者から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した結果を示すグラフである。
【図２】試験例１において、治療前のスーパーオキシド産生活性のピーク面積、ミエロペルオキシダーゼ活性のピーク面積及びスーパーオキシド産生活性の指標時間それぞれの間の相関関係を解析した結果を示すグラフである。
【図３】試験例２において、健常人から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】試験例３において、健常人から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。
【図５】試験例３において、下肢閉塞性動脈硬化症患者（治療前）から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。
【図６】試験例３において、下肢閉塞性動脈硬化症患者（カテーテル治療１か月後）から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。
【図７】試験例３において、脳疾患患者から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。
【図８】参考例において、試験例１の生体試料を用いて、血漿中ＭＰＯ活性と刺激時ＭＰＯ活性（好中球刺激剤を添加して測定したＭＰＯ活性）との間の相関関係を解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２０】
本実施形態に係る好中球細胞の活性を評価する方法（「評価方法」ともいう。）は、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から導出された指標に基づいて、好中球細胞の活性を評価するステップ（「評価ステップ」ともいう。）を備えており、指標として、好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間を採用するものである。
【００２１】
本実施形態に係る評価方法は、生体試料に好中球刺激剤を添加するステップ（「添加ステップ」ともいう。）、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性を、好中球刺激剤を添加した生体試料を用いて測定するステップ（「測定ステップ」ともいう。）、及びミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から上述の指標（指標時間）を導出するステップ（「導出ステップ」ともいう。）を更に備えるものであってもよい。なお、本実施形態に係る評価方法は、添加ステップ、測定ステップ及び導出ステップを必ずしも備えている必要はなく、別途導出された指標時間を用いて評価ステップのみを実施するように構成されていてもよい。
【００２２】
生体試料は、生体から採取された好中球細胞を含む試料であればよい。好中球細胞は、例えば、血液中、唾液中、歯肉溝滲出液中に含まれる。生体試料は、例えば、生体から採取された試料（例えば、血液（全血）、唾液、歯肉溝滲出液）そのものを含む試料であってもよく、生体から採取された試料を処理し、好中球細胞を濃縮又は分離した処理液を含む試料であってもよい。好中球細胞を濃縮又は分離した処理液は、例えば、フローサイトメトリーを使用して好中球細胞を濃縮又は分離する方法等の常法に従って調製することができる。
【００２３】
生体試料は、生体から採取された試料そのもの、又は処理液そのものであってもよく、生体から採取された試料、又は処理液を生理食塩水、緩衝液等で希釈したものであってもよい。希釈する場合、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性を検出できる限りにおいて、希釈率は適宜設定してよい。例えば、全血を希釈する場合、１０〜７５０倍に希釈するのが好ましく、５０〜５００倍に希釈するのがより好ましく、１００〜４００倍に希釈するのが更に好ましく、２００〜３００倍に希釈するのが更により好ましく、２２０〜２８０倍に希釈するのが特に好ましい。
【００２４】
好中球刺激剤は、好中球細胞の機能（例えば、遊走、貪食）を活性化する物質であればよい。好中球刺激剤としては、例えば、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ：好中球遊走性ペプチド）、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ）、オプソニン化ザイモン（ＯＺ）が挙げられる。これらは１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性は、例えば、蛍光指示薬、発光（例えば、化学発光）指示薬又は吸光指示薬を利用して、蛍光、発光又は吸光を経時的に検出することにより測定することができる。指示薬は、市販されているものを使用してもよく、市販されている測定キットを使用してもよい。
【００２６】
ミエロペルオキシダーゼ活性の測定は、例えば、ミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）と反応する蛍光指示薬、発光指示薬又は吸光指示薬を使用して測定することができる。そのような指示薬として、例えば、アミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ：Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、タウリン／ＴＮＢ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．７０，ｐｐ．５９８〜６０７，１９８２年参照）、８−アミノ−５−クロロ−７−フェニルピリド［３，４−ｄ］ピリダジン−１，４−（２Ｈ，３Ｈ）ジオン（Ｌ−０１２：Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７１（１），ｐｐ．５３−５８，１９９９年参照）が挙げられる。
【００２７】
ＡＰＦとＨＯＣｌとの反応は蛍光（例えば、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ）で検出することができる。タウリン／ＴＮＢとＨＯＣｌとの反応は吸光（例えば、波長４１２ｎｍ）で検出することができる。Ｌ−０１２とＨＯＣｌとの反応は、特異性は低いが化学発光（例えば、波長４５５ｎｍ）で検出することができる。
【００２８】
スーパーオキシド産生活性の測定は、例えば、スーパーオキシドと反応する蛍光指示薬、発光指示薬又は吸光指示薬を使用して測定することができる。そのような指示薬として、例えば、２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ）、２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（ＭＣＬＡ）、２-メチル‐６−ｐ−メトキシフェニルエチニルイミダゾピラジノン（ＭＰＥＣ）、インドシアニン型イミダゾピラノジン化合物（ＮＩＲ−ＣＬＡ）、２−［２，４，５，７−テトラフルオロ−６−（２−ニトロ−４，５−ジメトキシフェニルスルホニルオキシ）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸（ＢＥＳ−Ｓｏ）が挙げられる。
【００２９】
ＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長３８０ｎｍ）で検出することができる。ＭＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長４６５ｎｍ）で検出することができる。ＭＰＥＣとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長４３０ｎｍ）で検出することができる。ＮＩＲ−ＣＬＡとスーパーオキシドとの反応は化学発光（例えば、最大発光波長８００ｎｍ）で検出することができる。ＢＥＳ−Ｓｏとスーパーオキシドとの反応は蛍光（例えば、励起波長５０５ｎｍ、蛍光波長５４４ｎｍ）で検出することができる。
【００３０】
ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性は、いずれか一方のみを測定すれば、本実施形態に係る評価方法での評価が可能となるが、例えば、特許文献１に記載の方法に準じて、同一の生体試料に対して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の両方を測定してもよい。
【００３１】
蛍光、発光又は吸光の検出は、例えば、蛍光光度計、発光測定装置、吸光光度計等の公知の装置を使用して実施できる。また、生体試料が全血を含む場合の蛍光の検出は、特許文献１に記載の方法に準じて実施するのが好ましい。
【００３２】
指標時間は、好中球刺激剤を添加した時点から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間である。図３を参照しながら、指標時間の導出方法を説明する。図３は、健常人から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した結果を示すグラフである。図３のグラフは、横軸が経過時間（計測時間）を示し、右縦軸及び左縦軸が、それぞれミエロペルオキシダーゼ活性（蛍光発光量（測定値））及びスーパーオキシド産生活性（化学発光量（測定値））を示す。
【００３３】
図３のグラフは、同一の健常人に対し、連続した３日間の間、１日毎に朝採血を実施し、それぞれの生体試料（全血を含む試料）に対してミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した結果と、約１か月後に再度採血を実施し、得られた生体試料（全血を含む試料）に対してミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した結果をまとめて示したものである。なお、当該健常人は、１日目のみ前日までの疲れが抜けず極度の疲労を訴えており、好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にあった。
【００３４】
図３中、矢印Ａは、好中球刺激剤を添加した時点を示す。矢印Ｂ及び矢印Ｃは、それぞれ２日目及び１日目の生体試料を用いた測定で、スーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点を示す。同様に、矢印Ｄ及び矢印Ｅは、それぞれ２日目及び１日目の生体試料を用いた測定で、ミエロペルオキシダーゼ活性のピークが立ち上がる時点を示す。例えば、矢印Ａで示す時点から矢印Ｃで示す時点までの時間が、１日目の生体試料で測定したスーパーオキシド産生活性から導出される指標時間である。また、例えば、矢印Ａで示す時点から矢印Ｂで示す時点までの時間が、２日目の生体試料で測定したスーパーオキシド産生活性から導出される指標時間である。なお、図３の例の場合、被験者（健常人）が極度の疲労を訴えていた１日目の指標時間の方が、２日目の指標時間と比べて、大きい値を示している。また、図３から理解できるとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性は、いずれか一方のみを測定すれば、本実施形態に係る評価方法での評価が可能となる。
【００３５】
ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点は、例えば、生体試料に好中球刺激剤を添加した後、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが出現するまで充分な時間測定を継続した後、測定時間に対して測定値をプロットしたグラフから、測定値の傾きがバックグラウンドレベルに対して変化する時点（ピークの裾付近）として特定することができる。
【００３６】
ミエロペルオキシダーゼ活性の測定を、例えば、ミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸（又はそのハロゲン等価体）の定量により行う場合、指標時間は、通常２９０〜４７０秒である。この指標時間は、例えば、動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者では、好中球細胞の刺激に対する感受性が低下しているため、より大きな値（例えば、５００秒超）にシフトする。
【００３７】
スーパーオキシド産生活性の測定を、例えば、スーパーオキシドの定量により行う場合、指標時間は、通常６５〜１５０秒である。この指標時間は、例えば、動脈硬化等の疾患への罹患、及び過度の疲労等といった好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にある被験者では、好中球細胞の刺激に対する感受性が低下しているため、より大きな値（例えば、２００秒超）にシフトする。
【００３８】
好中球細胞の活性は、導出された指標時間に基づいて評価することができる。上述のとおり、指標時間がより大きい値を示す場合は、好中球細胞の刺激に対する感受性が低下していることを意味する。例えば、導出された指標時間が、ある所定の基準値を超えた場合に、好中球細胞の感受性（刺激に対する感受性）が低下していると評価するものであってよい。同様に、導出された指標時間が、ある所定の基準値であった場合に、好中球細胞の感受性（刺激に対する感受性）が正常であると評価するものであってよい。
【００３９】
基準値は、目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、多数のヒト検体について測定した指標時間から平均値等により基準値を導出してもよい。基準値は、例えば、性別、年齢等に応じて複数あってもよい。また、特定の個人については、健康状態の時の測定値を基準値としてもよい。さらに、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患又は状態の治療効果を判定するためのデータを収集する方法においては、治療前の指標時間を基準値とすることもできる。
【００４０】
本実施形態に係る評価方法は、評価ステップにおいて、指標時間に基づいて好中球細胞の活性を評価することに加えて、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピーク面積に基づいて、好中球細胞の活性を評価することを更に含むものであってよい。ピーク面積に基づく評価を併せて実施することにより、好中球細胞の活性を多面的に評価することができる。また、ピーク面積に基づいて「食」などの外因性要因や生体に備わっている抗酸化酵素等の炎症防御能力（抗酸化能又は酸化ストレス防止能）を併せて評価することもできる。
【００４１】
本実施形態に係る評価方法は、例えば、対象が、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患に罹患しているか否か、又は好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあるか否かを判定するためのデータを収集する方法（第１のデータ収集方法）、対象における、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患又は状態の治療効果を判定するためのデータを収集する方法（第２のデータ収集方法）等にも応用できる。
【００４２】
本実施形態に係る第１のデータ収集方法は、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から指標時間を導出するステップを備え、導出した指標時間を当該データとして収集する方法である。生体試料は、対象から得られた生体試料である。
【００４３】
好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患としては、例えば、下肢閉塞性動脈硬化症等の動脈硬化症、ガン、炎症性疾患、高脂血症、糖尿病、アルツハイマー、パーキンソン病、アルコール依存症等が挙げられる。好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態としては、例えば、過度の疲労、激しい運動をした後、喫煙、加齢等が挙げられる。
【００４４】
本実施形態に係る第２のデータ収集方法は、好中球刺激剤を添加した生体試料のミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性の測定結果から指標時間を導出するステップを備え、導出した指標時間を当該データとして収集する方法である。生体試料は、治療後の対象から得られた生体試料である。
【００４５】
第２のデータ収集方法は、治療前の対象から得られた生体試料について、上述の指標時間を導出するステップを更に備え、導出した指標時間（治療前）を上記データとして更に収集する方法であってもよい。
【００４６】
本実施形態に係る第１及び第２のデータ収集方法における具体的な実施形態等は、上述したとおりである。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
〔試験方法〕
本実施例において、好中球細胞の活性評価を以下に示す方法により実施した。
【００４９】
（ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性の測定）
ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性は、特許文献１の実施例に記載の方法に準じて測定した。具体的には、試料容器として、特開２０１８−０２５４８０号公報の図１に記載の測定容器に準じた容器を用いた。生体試料は、３７℃に保温したＲＨバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に下記式（１）で表されるＭＣＬＡ（ＭＣＬＡ商品名、東京化成工業株式会社製）を０．５μＭとなるように、下記式（２）で表されるＡＰＦ（ＡＰＦ商品名、積水メディカル株式会社製）を１０μＭとなるように、及びＣａＣｌ２を１ｍＭとなるように添加して３７℃で４分間インキュベートした溶液に、対象（被験者）から採取した血液（全血）３μＬを添加して調整した（２５０倍希釈）。調整した生体試料を１分間、３７℃でインキュベートした後、蛍光及び発光同時測定装置を用いて測定を開始した。
【化１】
2019213464.tif 000002
【化２】
2019213464.tif 000003
【００５０】
励起光として１２５ｍ秒間隔でＬＥＤ（４８０ｎｍ）を点滅させながら、上述した生体試料への照射を開始した。その２．５分後に、プロテインキナーゼＣ活性化剤（ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩）：好中球刺激剤）を０．１μＭとなるように生体試料に添加し、ＡＰＦの蛍光強度（ミエロペルオキシダーゼ活性）及びＭＣＬＡの化学発光強度（スーパーオキシド産生活性）を測定した。
【００５１】
（指標時間の導出）
上述した方法により測定したＡＰＦの蛍光強度（蛍光発光量）及びＭＣＬＡの化学発光強度（化学発光量）を時間（計測時間）に対してプロットしたグラフから、指標時間を導出した。指標時間は、好中球刺激剤を添加した時点（刺激剤添加）から、ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点までの時間である。ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点は、蛍光強度又は化学発光強度の測定値の傾きがバックグラウンドレベルに対して変化する時点（ピークの裾付近）として特定した。
【００５２】
〔試験例１：動脈硬化に罹患している患者における評価〕
下肢閉塞性動脈硬化症に罹患し、末梢血管カテーテル治療を実施する患者を対象（被験者）とし、カテーテル治療前、及び当該カテーテル治療１か月後の検診時に採血（計２回）した。採血した全血を使用して、上述した試験方法でミエロペルオキシダーゼ活性（蛍光発光量）及びスーパーオキシド産生活性（化学発光量）を測定した。代表的な被験者（２名）における結果を図１に示す。
【００５３】
図１に示すとおり、両患者共に治療１か月後に、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点が、治療前と比較して早くなっている（すなわち、指標時間が小さくなっている）。両患者ともカテーテル治療効果は高く、症状に改善がみられており、従来の下肢動脈の狭窄・閉塞を評価する指標であるＡＢＩ値（Ａｎｋｌｅ  Ｂｒａｃｈｉａｌ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｎｄｅｘ）も改善していた。図１のグラフから導出した指標時間は、下記表１に示すとおりである。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
図２は、３０名の患者（被験者）から得られたデータを用いて、ミエロペルオキシダーゼ活性のピーク面積とスーパーオキシド産生活性のピーク面積（治療前：図２（Ａ）、治療１か月後：図２（Ｄ））、ミエロペルオキシダーゼ活性のピーク面積とスーパーオキシド産生活性の指標時間（治療前：図２（Ｂ）、治療１か月後：図２（Ｅ））、並びにスーパーオキシド産生活性のピーク面積とスーパーオキシド産生活性の指標時間（治療前：図２（Ｃ）、治療１か月後：図２（Ｆ））のそれぞれについて、相関関係を解析した結果を示す。治療前のスーパーオキシド産生活性のピーク面積とスーパーオキシド産生活性の指標時間との相関係数は、−０．５７９となり、負の相関を示した（図２（Ｂ））。治療前のミエロペルオキシダーゼ活性のピーク面積とスーパーオキシド産生活性の指標時間との相関係数も、同値で負の相関を示した（図２（Ｃ））。なお、治療１か月後には、両者ともに相関性が低下した（図２（Ｅ）及び図２（Ｆ））。健常人の場合は、指標時間はほとんど一定であり、両ピーク面積との負の相関はないと考えられ、治療効果で相関性が低下したと考えられる。
【００５６】
〔試験例２：健常人における評価〕
健常人を対象（被験者）とし、不定期（週に数回）に採血（計８０回程度）した。採血した全血を使用して、上述した試験方法でミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定した。図３は、同一の被験者（健常人）に対して、連続した３日間（図３中、１日目〜３日目）とその約１か月後の測定結果をまとめて示したグラフである。当該被験者は、１日目のみ前日までの疲れが抜けず極度の疲労を訴えており、好中球細胞が過剰に活性化して酸化ストレス状態に晒されたと考えられる状況にあった。
【００５７】
図３に示すとおり、極度の疲労を訴えた日の測定結果では、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点が通常時よりも遅くなった。計８０回程度の測定結果の中で、ここまでミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性のピークが立ち上がる時点が遅くなっているのは、この日のみであった。また両活性共に、ピーク面積が通常と比較して減少するという結果が得られた。ピーク面積は、通常、約１か月後の測定結果と同程度という結果が得られている。３日目にやや大きめのピーク面積となっているのは、１日目の夜に軽い運動をした影響と考えられる。軽い運動の影響等によりピーク面積が運動後２日目（図３中、３日目）まで段階的に増加する傾向が得られている。図３のグラフから導出した指標時間及びピーク面積は、下記表２に示すとおりである。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
〔試験例３：患者及び健常人における評価〕
健常人、動脈硬化に罹患している患者、及び脳疾患に罹患している患者を対象（被験者）として、上述した試験方法でミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した。結果を図４〜図７、及び表３に示す。
【００６０】
図４は、健常人から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。２０〜５０歳代の健常ボランティア１３名を被験者とし、不定期に採血した全血を測定に使用した（合計７６試料）。図４（Ａ）中、ａはスーパーオキシド産生活性から導出した指標時間の平均値及び標準偏差をプロットしたものであり、ｂはスーパーオキシド産生活性から導出した指標時間をプロットしたものである。図４（Ｂ）中、ａはミエロペルオキシダーゼ活性から導出した指標時間の平均値及び標準偏差をプロットしたものであり、ｂはミエロペルオキシダーゼ活性から導出した指標時間をプロットしたものである。健常人において、スーパーオキシド産生活性から導出した指標時間は、６５〜１５０秒程度の範囲内にあり、ミエロペルオキシダーゼ活性から導出した指標時間は、２９０〜４７０秒程度の範囲内にあった（図４及び表３）。
【００６１】
図５は、下肢閉塞性動脈硬化症患者（治療前）から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。被験者は、下肢閉塞性動脈硬化症に罹患し、治療前の指標時間が、健常人で測定された上記の範囲を上回っており、かつカテーテル治療による治療効果が認められた患者１２名である。図５（Ａ）及び（Ｂ）中、ａ及びｂは、図４と同様である（すなわち、ａは指標時間の平均値及び標準偏差をプロットしたものであり、ｂは指標時間をプロットしたものである。）。
【００６２】
図６は、下肢閉塞性動脈硬化症患者（カテーテル治療１か月後）から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。被験者は、図５と同じである。図６（Ａ）及び（Ｂ）中、ａ及びｂは、図４と同様である（すなわち、ａは指標時間の平均値及び標準偏差をプロットしたものであり、ｂは指標時間をプロットしたものである。）。図５及び図６並びに表３に示すとおり、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性から導出した指標時間のいずれも、カテーテル治療後に小さくなっていた。一方、カテーテル治療後の指標時間は、健常人で認められた指標時間よりも大きいものであった。これは、被験者（患者）は、高齢者が多く加齢の影響を受けていること、動脈硬化以外に複数の疾患を抱えていること等が原因であると考えられた。
【００６３】
図７は、脳疾患患者から採取した全血を含む生体試料を使用して、ミエロペルオキシダーゼ活性及びスーパーオキシド産生活性を測定し、指標時間を導出した結果を示すグラフである。脳疾患に罹患している患者３９名を被験者とし、不定期に採血した全血を測定に使用した（合計４８試料）。内訳は、重症筋無力症１４名（合計１６試料）、多発性硬化症１１名（合計１２試料）、視神経脊髄炎６名（合計８試料）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎３名（合計６試料）、ミラーフィッシャー症候群２名（合計３試料）、ファブリー病１名（合計２試料）、スィート病１名（合計１試料）であった。図７（Ａ）及び（Ｂ）中、ａ及びｂは、図４と同様である（すなわち、ａは指標時間の平均値及び標準偏差をプロットしたものであり、ｂは指標時間をプロットしたものである。）。図７及び表３に示すとおり、脳疾患患者は、疾患もステージも多岐に亘っていることから、導出した指標時間のばらつきが大きい。重症筋無力症等は、慢性炎症に基づく自己免疫不全である。脳疾患患者において導出された指標時間は、健常人で認められた指標時間の範囲を大きく超える例が多くなっており、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態であることが推測される。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
図４〜図７及び表３に示した結果から、例えば、スーパーオキシド産生活性（化学発光量）から導出した指標時間が１５０秒を超える、又はミエロペルオキシダーゼ活性（蛍光発光量）から導出した指標時間が５００秒を超える場合、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う疾患に罹患している、又は好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあると考えられる。すなわち、基準値として、例えば、スーパーオキシド産生活性（化学発光量）から導出した指標時間に対しては、１５０〜２００秒（例えば、１５０秒、又は２００秒）を採用することができ、ミエロペルオキシダーゼ活性（蛍光発光量）から導出した指標時間に対しては、５００〜５５０秒（例えば、５００秒、又は５５０秒）を採用することができる。
【００６６】
〔参考例：好中球刺激剤による刺激の有無と指標時間との相関関係〕
試験例１の対象（被験者）から採取した全血を用い、上述した試験方法と同様の手順でミエロペルオキシダーゼ活性の測定を行い、ピーク面積を算出した（刺激時ＭＰＯ活性）。同じ全血から血漿を分離して、比色法アッセイキット（Ａｂ１０５１３６，Ａｂｃａｍ社製）を用いて、ミエロペルオキシダーゼ活性を測定した（血漿中ＭＰＯ活性）。なお、血漿中ＭＰＯ活性は、好中球細胞に好中球刺激剤を作用させることなく、好中球細胞から分泌されたＭＰＯの活性を測定したものであり、採血時の被験者における好中球細胞の活性を反映している。
【００６７】
図８は、血漿中ＭＰＯ活性（ｍＵ／ｍＬ）と刺激時ＭＰＯ活性（ピーク面積×１０７）との相関関係を解析した結果を示す。図８（Ａ）は、治療前の相関関係を解析した結果であり、図８（Ｂ）は、カテーテル治療１か月後の相関関係を解析した結果である。図８に示すとおり、治療前は負の相関を示す一方、治療１か月後は正の相関を示した。この結果は、治療前の被験者において、好中球刺激剤で刺激しない状態でもＭＰＯ活性が高値であり過剰活性化されていること、また好中球刺激剤に対する反応性（感受性）が鈍くなっていることを示しており、好中球細胞の過剰な活性化による酸化ストレスを伴う状態にあることを示していると考えられる。
【００６８】
ミエロペルオキシダーゼ活性又はスーパーオキシド産生活性のピーク面積は、通常、好中球細胞の活性を反映しており、ピーク面積が小さい場合は、好中球細胞の活性が安定している（酸化ストレス状態ではない）、又極端に低い場合は自然免疫活性が低下していると判断される。一方、図８に示す結果から、ピーク面積が小さい場合でも、指標時間が大きい場合は、逆に好中球細胞が過剰に活性化されている（刺激剤に対する感受性が低下している）と考えられる。すなわち、指標時間とピーク面積を併せて評価することにより、好中球細胞の活性を多面的に評価することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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