(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体精製のため、連続式に実行でき、バッチを得るのに要する時間、汚染、技術的失敗、ヒューマンエラーのリスク、及び方法拡大要件の全てを減少させることができる方法の提供。【解決手段】溶液からタンパク質を精製するための方法であって、（ａ）前記溶液を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程（ｂ）、工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、および（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、を含む３つのクロマトグラフィー工程を含み、バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、および
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用マトリックスのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を、ｐＨ調節、バッファー交換または希釈などの如何なる処置も施さずに第２のクロマトグラフィー用マトリックスに直接通す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液を、ｐＨ調節、バッファー交換または希釈などの如何なる処置も施さずに第３のクロマトグラフィー用マトリックスに直接通す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の工程から最後の工程まで閉鎖系中で実行する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
最初の２つのクロマトグラフィー工程のそれぞれの工程が、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
溶液または粗製タンパク質溶出物をクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
場合により洗浄バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
場合により平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
溶出バッファーを使用してクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物またはタンパク質溶出液を溶出する工程を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌからなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉ）溶液を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、ならびに
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
（ｉｉｉ）場合により洗浄バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、および
（ｉｖ）第３のクロマトグラフィー用マトリックスのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程の工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１、第２および第３のクロマトグラフィー用マトリックスがクロマトグラフィー用カラムである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１、第２および第３のクロマトグラフィー用マトリックスがクロマトグラフィー用膜吸着剤である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１のクロマトグラフィー用マトリックスがアフィニティークロマトグラフィー用マトリックスである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アフィニティークロマトグラフィー用マトリックスがプロテインＡマトリックスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第２のクロマトグラフィー用マトリックスがマルチモード樹脂クロマトグラフィー用マトリックスまたは陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第３のクロマトグラフィー用マトリックスが陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体が、筋原線維原型のヒトβ−アミロイドタンパク質に特異的に結合する抗体、細菌表面多糖ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）に特異的に結合する抗体、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合する抗
体、およびＣＤ３８膜貫通型糖タンパク質に特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）の後にナノ濾過工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ナノ濾過工程の後に限外濾過およびダイアフィルトレーション工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
第１の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第２の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４０〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、請求項１〜８または１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
第２の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で６と７の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、請求項１〜７または９〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
平衡化バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、請求項５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
洗浄バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
精製タンパク質を少なくとも９５％の収率で回収する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
回収した精製タンパク質が少なくとも９９％の純度を示す、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
回収した精製タンパク質を医薬組成物に配合する工程をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
連続形式で溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉ）溶液をプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物をマルチモード樹脂クロマトグラフ
ィー用カラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用してマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌからなる方法。
【請求項２７】
連続形式で溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉ）溶液の一部をプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物をマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用してマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
（ｄ）全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程ａ）、ｂ）およびｃ）を順次更新する工程、ならびに
（ｅ）一回毎の第３のクロマトグラフィー工程の最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌからなる方法。
【請求項２８】
連続形式で溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）溶液をプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡ膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物を陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用して陽イオン交換膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌからなる方法。
【請求項２９】
連続形式で溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）溶液の一部をプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡ膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物を陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用して陽イオン交換膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
（ｄ）全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程ａ）、ｂ）およびｃ）を順次更新する工程、ならびに
（ｅ）一回毎の第３のクロマトグラフィー工程の最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含み、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌからなる方法。
【請求項３０】
前記平衡化バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、
前記洗浄バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、
前記第１の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、かつ
前記第２の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４０〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、
請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記平衡化バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、
前記洗浄バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、
前記第１の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節され、かつ
前記第２の溶出バッファーが１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で６と７の間の範囲に含まれるｐＨに調節された、
請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
第１の工程から最後の工程まで閉鎖系中で実行する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４つのバッファー溶液を使用して、タンパク質、具体的にはモノクローナル抗体を、小規模および大規模精製するための３工程のクロマトグラフィー法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体精製は、バイオプロダクションの最もコストが高い態様の１つであり得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は一般に、各工程で特異的バッファー系を使用し、３工程の、３樹脂クロマトグラフィー法を使用して精製される。この従来の精製法は、捕捉工程、次にイオン交換工程を包含し、洗練工程で終了し、通常（貯蔵期と開放期を含めて）３〜５日の作業日数を要する。このような従来法では、これらの３工程は一連の異なる単位操作で実行され、ｐＨ、重量モル濃度およびタンパク質濃度の調節が各工程間で必要であるため、連続式にこれらを操作することはできない。このような従来の精製法は図５に図式化する。したがって、従来の精製法は一般に、各不連続工程間に多数の異なるバッファーおよび多数の貯蔵単位を必要とする。したがって、これらの従来の精製法は、汚染、技術的失敗およびヒューマンエラーをもたらす傾向がある。さらに、溶出液を濃縮するため、ｐＨと伝導性を調節するため、および溶出液を貯蔵するために、次工程前に各工程間で中断が必要であり、前の工程が完了するまで工程を開始することができないので、図７において見ることができるように、このような従来の精製法は非常に長期で高価である。
【０００３】
細胞培養力価が増大し産生に使用される細胞培養体積が大きくなると、下流処理は生産上の障害とみなされる。これは特に、バッチ体積から下流処理能力に焦点が移ったモノクローナル抗体産生に当てはまる。さらに、初期臨床前および臨床相試験は、より迅速に産生可能である多量の抗体を必要とする。したがって、抗体精製のため連続式に実行することができる方法、ならびにバッチを得るのに要する時間、汚染、技術的失敗およびヒューマンエラーのリスク、および方法拡大要件の全ての減少に関する必要性が産業界で存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは抗体を精製するための新しい方法を発見しており、前記方法は、優れた純度での精製抗体の高収率の獲得を可能にしながら、少量の樹脂とバッファーを使用した連続形式での限られた数の工程を含む。したがって精製タンパク質は医療用途に適している。したがって、この方法を使用して、臨床試験および／またはタンパク質を含む医薬組成物の商品化用にタンパク質を精製することができる。さらに、この方法は如何なる工程間の調節も必要とせず、したがって精製対象タンパク質の採取から最終産物まで閉鎖系で実行することができる。
【０００５】
簡単に言うと、この方法は、連続形式で３つのクロマトグラフィー工程、１つのアフィニティークロマトグラフィー、１つのマルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー、および１つの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）のみを含む。これら３つのクロマトグラフィー工程は任意の順序で実行することができる。さらに、これら３つのクロマトグラフィー工程中に使用する全てのバッファーは、同じ母液から始めて製造可能であることが分かっている。これらのバッファーは、例えばＮａＣｌ、酢酸、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌと組み合わせてＢｉｓＴｒｉｓを含むことが有利である。如何なるバッファー交換の必要もないので、本発明の方法は実行するのが容易で、自動化および／または連続形式での実行に非常に適している。より詳細には、方法全体でわずか４バッファーのみの使用で、全工程間の互換性を確実にし、連鎖的製造および品質管理の節約お
よび低い貯蔵必要性をもたらすことができる。
【０００６】
さらに本発明の方法は開放期（すなわち、新たなバッファーのためのクロマトグラフィー用カラムの製造、サンプルの希釈、またはそのｐＨの調節などの手作業を実行するため精製系を開放する工程）を短縮または省略することができ、それによって汚染のリスクを低減し、区分付けの低い環境において作業する可能性を与える。さらに、本発明の方法の各クロマトグラフィー工程は再利用可能な樹脂を使用することができ、または驚くことに使い捨て膜吸着剤を再利用できるので、人間の手作業なしで所望量を得るまで３つのクロマトグラフィー工程の順序を更新することができる。特に、本発明の方法のクロマトグラフィー工程は全て、少なくとも１００回再利用することができる樹脂を使用して、または少なくとも５０回再利用することができる膜吸着剤を使用して実行することができる。本発明者らは実際、安定性を失わずに少なくとも５０回、同じ使い捨て膜吸着剤を使用できることを実証した。したがって方法のサイクル時間は短くなり、方法拡大要件は最小になり、作業および貯蔵費用を減らすことができる。樹脂およびバッファーの体積が減少し、使い捨て膜吸着剤をバッチ後に保存する必要がないからである。したがって本発明の方法は、図９および１１と比較して図１０と１２において見ることができるように、迅速でコスト効率の良いバッチ生成と精製系の作業時間の短縮の両方を可能にする。したがってそれは、土台から産業規模までの組換えタンパク質のスケールアップおよび精製に適している。
【０００７】
具体的なプロトコールが設定され、４つの異なる抗体で実行されている。このプロトコール中、第１のクロマトグラフィー工程の最後に得た粗製タンパク質溶出物は、第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に直接、すなわちｐＨ調節、バッファー交換または希釈のような如何なる処置も施さずに通し、第２のクロマトグラフィー工程の最後に得た粗製タンパク質溶出物も、第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に直接、すなわちｐＨ調節、バッファー交換または希釈のような如何なる処置も施さずに通す。この方法は図６に図式化する。さらに、このプロトコール中、タンパク質含有溶液を、連続実行で第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に充填し（実施例６参照）、図８において見ることができるように、第１のクロマトグラフィー工程から前回のタンパク質が溶出した直後に連続実行を開始する。このプロトコールには非常に迅速であるという利点があり（一連で約２時間）、（９０％を超える）改善された収率、改善された純度をもたらし、カラム使用時に使用するバッファー体積と樹脂体積の両方を減らすことができ、膜吸着剤使用時に使用するバッファー容器と樹脂容器の両方を減らすことができる。さらに、この方法には非常に柔軟性があるという利点がある。使用するカラムのサイズおよび／または実行数は、精製するタンパク質の量に容易に合わせることができるからである。さらに、この方法は完全に自動化することができ、連続形式で実行することができ、それは如何なる開放期も含まない。さらに、それは最適化を必要とせずに、４つの異なる抗体で首尾よく実行された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、溶液を第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、洗浄バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリ
ックスから、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程を含む第１のクロマトグラフィー工程、平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、場合により平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスから、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程を含む第２のクロマトグラフィー工程、平衡化バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、タンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、場合により洗浄バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程を含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、溶液の一部を第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、洗浄バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、平衡化バッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、および場合によりサニテーションバッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第１のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程を含む第１のクロマトグラフィー工程、平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、場合により平衡化バッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスから、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、および場合によりサニテーションバッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程を含む第２のクロマトグラフィー工程、平衡化バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、タンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、場合により洗浄バッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程、第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、および場合によりサニテーションバッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に通す工程を含む第３のクロマトグラフィー工程、全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で第１、第２および第３のクロマトグラフィー工程を順次更新する工程、ならびに一回毎の第３のクロマトグラフィー工程の最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含む方法も提供する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む。別の実施形態では、バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含む。本発明の方法におけるＢｉｓＴｒｉｓバッファーの使用は特に重要である。それは３つのクロマトグラフィー工程間のｐＨ調節を回避することができ、したがって方法が第１の工程から最後の工程まで閉鎖系中で実行されるからである。
【００１１】
一実施形態では、クロマトグラフィー用マトリックスの１つはプロテインＡマトリックスである。一実施形態では、クロマトグラフィー用マトリックスの１つはマルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである。一実施形態では、クロマトグラフィー用マトリックスの１つは陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明の方法はプロテインＡクロマトグラフィー用マトリックス、マルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスおよび陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスを含み、前記マトリックスは３つのクロマトグラフィー工程において任意の順序で使用される。
【００１３】
本発明の一実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡマトリックスであり、第２のクロマトグラフィー用マトリックスはマルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスであり、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである。
【００１４】
本発明の一実施形態では、それぞれのクロマトグラフィー用マトリックスはクロマトグラフィー用カラムである。その実施形態の特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡカラムであり、第２のクロマトグラフィー用マトリックスはマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムであり、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムである。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、それぞれのクロマトグラフィー用マトリックスはクロマトグラフィー用膜吸着剤である。その実施形態の特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡ膜吸着剤であり、第２のクロマトグラフィー用マトリックスは陽イオン交換膜吸着剤であり、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換膜吸着剤である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、精製するタンパク質は抗体である。別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１７】
本発明の一実施形態では、本発明の方法は、工程（ｃ）の後にナノ濾過工程、および／またはナノ濾過工程の後に限外濾過およびダイアフィルトレーション工程をさらに含む。本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、工程（ｃ）の後、ナノ濾過工程後および／または限外濾過およびダイアフィルトレーション工程の後に低ｐＨ不活性化工程をさらに含む。本発明の一実施形態では、本発明の方法は、工程（ａ）の前に、タンパク質含有液体培養培地を提供するための液体培養培地中、好ましくはバイオリアクター中での細胞培養の工程を含む。培養する細胞は哺乳動物、細菌または酵母細胞の可能性がある。
【００１８】
したがって本発明は、液体培養培地から精製タンパク質を生成するための統合法も提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、第１の溶出バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと２
０ｍＭのＮａＣｌを含み酢酸でｐＨ３．７に調節されており、第２の溶出バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸でｐＨ７．２５に調節されており、または２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸でｐＨ６．２に調節されており、平衡化バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと２０ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸でｐＨ７．４に調節されており、洗浄バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸でｐＨ７．４に調節されている。本発明の他の実施形態では、サニテーションバッファーは０．１Ｎ水酸化ナトリウムを含む。
【００２０】
本発明は、マルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、プロテインＡマトリックスおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを含むキットを提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法を使用し溶液からタンパク質を精製するために、このキットを使用する。
【００２１】
一実施形態では、キットは、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラム、プロテインＡカラムおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー用カラム、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを含む。
【００２２】
別の実施形態では、キットは、陽イオン交換膜吸着剤、プロテインＡ膜吸着剤および／または陰イオン交換膜吸着剤、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを含む。
【００２３】
本発明は、マルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、プロテインＡマトリックスおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを製造するための説明書を含むキットも提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法を使用し溶液からタンパク質を精製するために、このキットを使用する。
【００２４】
一実施形態では、キットは、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラム、プロテインＡカラムおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー用カラム、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを製造するための説明書を含む。
【００２５】
別の実施形態では、キットは、陽イオン交換膜吸着剤、プロテインＡ膜吸着剤および／または陰イオン交換膜吸着剤、およびＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる少なくとも１つのバッファーを製造するための説明書を含む。
【００２６】
本発明は、平衡化バッファーを製造するための方法であって、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと２０ｍＭのＮａＣｌの最終濃度で１００Ｌの溶液を作製する工程、酢酸で溶液のｐＨを７．４に調節する工程、および２５Ｌの溶液を回収する工程を含む方法をさらに提供する。本発明は、洗浄バッファーを製造するための方法であって、平衡化バッファーの製造からの残り７５Ｌ溶液の２５Ｌを回収する工程、およびこれら２５Ｌ溶液に当量の１ＭのＮａＣｌを加える工程を含む方法も提供する。本発明は、溶出バッファーを製造するための方法であって、平衡化バッファーの製造からの残り５０Ｌ溶液の２５Ｌを回収する工程、および酢酸でこれら２５Ｌ溶液のｐＨを３．７に調節する工程を含む方法をさらに提供
する。本発明は、溶出バッファーを製造するための方法であって、平衡化バッファーの製造からの残り２５Ｌ溶液に当量の４５ｍＭのＮａＣｌと当量の２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを加える工程、および酢酸でこれら２５Ｌ溶液のｐＨを７．２５に調節する工程を含む方法をさらに提供する。本明細書で開示する方法によって製造されるバッファーは、本発明の方法を使用して溶液からタンパク質を精製するのに使用することができる。
【００２７】
本明細書で記載するいずれかの方法によって得られる単離タンパク質、医薬物質および医薬組成物も本明細書で提供する。
【００２８】
開示する精製法のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と共に考慮して、以下の詳細な説明からより完全に理解される。特許請求の範囲は、詳細な説明中に言及される特徴および利点の具体的考察ではなく、その中の詳述によって定義されることを記す。
【００２９】
本発明の文脈において、他に記さない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、状況に応じて修正可能な用語として解釈すべきである（すなわち「これらを含むがこれらだけに限られない」ことを意味する）。さらに用語「含む」は「からなる」を包含する（例えばＸを「含む」組成物はＸのみからなる可能性があり、または他の何かを含む可能性がある、例えばＸ＋Ｙ）。
【００３０】
開示する精製法の実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と共に読むと最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例２〜７中に開示する精製法のバッファーを製剤化するために使用するプロトコールの概略を示す図である。
【図２】３ＮＨ４Ｃｌ濃度の第２の溶出バッファーに関するスイートスポット（ｓｗｅｅｔ  ｓｐｏｔｓ）を表すグラフである。
【図３】実施例５の１５回実行それぞれにおけるＨＭＷ、収率、ＨＣＰおよびＤＮＡの傾向分析を表すグラフである。
【図４】実施例８の５０回実行それぞれにおけるＨＭＷ、収率、ＨＣＰおよびＤＮＡの傾向分析を表すグラフである。
【図５】タンパク質を精製するための従来法の異なる工程の概略を示す図である。ＢＨ：大量採取、ＥｑＢ＃１：第１の平衡化バッファー、ＷＢ＃１：第１の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃１：第１の溶出バッファー、ＥｑＢ＃２：第２の平衡化バッファー、ＷＢ＃２：第２の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃２：第２の溶出バッファー、ＥｑＢ＃３：第３の平衡化バッファー、ＷＢ＃３：第３の洗浄バッファー、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、ｐＨ  ａｄｊｕｓｔ．：ｐＨ調節、ｃｏｎｃ．ａｄｊｕｓｔ．：濃度調節、ｃｏｎｄｕｃｔ．ａｄｊｕｓｔ．：伝導性調節、ｓａｍｐ．：サンプリング、ｓｔｏｒ．：貯蔵、ｆｉｌｔ．：濾過、Ｎａｎｏｆｉｌｔ．：ナノ濾過、ＴＦＦ：タンジェント流濾過。
【図６】本発明の方法の異なる工程の概略を示す図である。ＢＨ：大量採取、ＥｑＢ＃１：第１の平衡化バッファー、ＷＢ＃１：第１の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃１：第１の溶出バッファー、ＥｌＢ＃２：第２の溶出バッファー、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、ｓａｍｐ．：サンプリング、ｓｔｏｒ．：貯蔵、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＴＦＦ：タンジェント流濾過。
【図７】数回の実行またはサイクルを含む、タンパク質を精製するための従来法の異なる工程の概略を示す図である。Ｃｌａｒ．：清浄化、ＥｑＢ＃１：第１の平衡化バッファー、ＷＢ＃１：第１の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃１：第１の溶出バッファー、ＥｑＢ＃２：第２の平衡化バッファー、ＷＢ＃２：第２の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃２：第２の溶出バッファー、ＥｑＢ＃３：第３の平衡化バッファー、ＷＢ＃３：第３の洗浄バッファー、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。
【図８】数回の実行またはサイクルを含む、本発明の方法の異なる工程の概略を示す図である。Ｃｌａｒ．：清浄化、ＥｑＢ＃１：第１の平衡化バッファー、ＷＢ＃１：第１の洗浄バッファー、ＥｌＢ＃１：第１の溶出バッファー、ＥｌＢ＃２：第２の溶出バッファー、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。
【図９】数回の実行またはサイクルを含む、タンパク質を精製するための従来法の異なる工程のタイムラインの概略を示す図である。表の横第１列は時間単位の時間を示す。Ｃｌａｒ．：清浄化、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｌｏｗ  ｐＨ  ｉｎａｃｔ．：低ｐＨ不活性化、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。丸印は方法が終了した時間を表す。
【図１０】数回の実行またはサイクルを含む、本発明の方法の異なる工程のタイムラインの概略を示す図である。Ｃｌａｒ．：清浄化、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。丸印は方法が終了した時間を表す。
【図１１】数回の実行またはサイクルを含む、タンパク質を精製するための従来法の異なる工程のタイムラインの概略を示す図である。表の横第１列は時間単位の時間を示す。Ｃｌａｒ．：清浄化、ｃｈｒｏｍ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒｏｍ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｌｏｗ  ｐＨ  ｉｎａｃｔ．：低ｐＨ不活性化、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。方法の生産性の推定レベルを示す。
【図１２】数回の実行またはサイクルを含む、本発明の方法の異なる工程のタイムラインの概略を示す図である。Ｃｌａｒ．：清浄化、ｃｈｒ１：第１のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒ２：第２のクロマトグラフィー工程、ｃｈｒ３：第３のクロマトグラフィー工程、Ｎａｎｏｆ．：ナノ濾過、ＵＦ／ＤＦ：限外濾過／ダイアフィルトレーション。方法の生産性の推定レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（マルチモード樹脂とも呼ばれる）混合モード樹脂およびクロマトグラフィー用膜吸着剤の有用性に基づいて、本発明者らは、３つのクロマトグラフィー工程のみを使用する新たな精製法を開発した。言い換えると、この方法は、クロマトグラフィー用マトリックスに通す工程を含む３工程のみを含む。
【００３３】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスからタンパ
ク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用マトリックスのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
を含むか、またはこれらからなり、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法に関連する。
【００３４】
より具体的には、上述した最初の２つのクロマトグラフィー工程のそれぞれの工程が、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
溶液または粗製タンパク質溶出物を（前述のように）クロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
場合により洗浄バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
場合により平衡化バッファーをクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
溶出バッファーを使用して（前述のように）クロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物またはタンパク質溶出液を溶出する工程を含むか、またはこれらからなる可能性があり、
バッファーのそれぞれはＢｉｓＴｒｉｓを含む。
【００３５】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液の一部を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスからタンパク質溶出液を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用マトリックスのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を順次更新する工程、ならびに
工程（ｃ）のそれぞれの最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含むか、またはこれらからなり、
平衡化、洗浄および溶出バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法にも関連する。
【００３６】
本発明の文脈において、表現「クロマトグラフィー用マトリックス」は、混合物中に存在する他の分子と精製対象の分子を分離するための吸収剤として精製法において作用する膜などの、任意の種類の粒子吸収媒体、樹脂または他の固相を指す。マトリックス、特に樹脂からなるマトリックスはカラムの形態、または膜吸着剤の形態である可能性がある。
【００３７】
本発明の文脈において、「膜吸着剤」は、イオン性基を有し、アフィニティー基およびイオン交換基などの結合官能基を含む、アクリル系ポリマーのフラットシートを指す。樹脂と膜の間の違いの一つは、樹脂に関する拡散および膜中の対流による流量分布である。
【００３８】
本発明の方法の一実施形態では、第１、第２および第３のクロマトグラフィー用マトリックスはクロマトグラフィー用カラムである。本発明の方法の別の実施形態では、第１、第２および第３のクロマトグラフィー用マトリックスはクロマトグラフィー用膜吸着剤である。
【００３９】
したがって、一実施形態では本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液を第１のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用カラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、および
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程を含むか、またはこれらからなり、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法に関連する。
【００４０】
より具体的には、最初の２つのクロマトグラフィー工程のそれぞれの工程が、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
溶液または粗製タンパク質溶出物を（前述のように）クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
場合により洗浄バッファーをクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
場合により平衡化バッファーをクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
溶出バッファーを使用して（前述のように）クロマトグラフィー用カラムから粗製タンパク質溶出物またはタンパク質溶出液を溶出する工程を含むか、またはこれらからなる可能性があり、
バッファーのそれぞれはＢｉｓＴｒｉｓを含む。
【００４１】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液の一部を第１のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用カラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第１のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第２のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第３のクロマトグラフィー用カラムに通す工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を順次更新する工程、ならびに
工程（ｃ）のそれぞれの最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含むか、またはこれらからなり、
平衡化、洗浄および溶出バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法にも関連する。
【００４２】
別の実施形態では本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液を第１のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、および
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第３のクロマトグラフィー用膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程を含むか、またはこれらからなり、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法に関連する。
【００４３】
より具体的には、上述の最初の２つのクロマトグラフィー工程のそれぞれの工程が、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
溶液または粗製タンパク質溶出物を（前述のように）クロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
平衡化バッファーをクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
場合により洗浄バッファーをクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
場合により平衡化バッファーをクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
溶出バッファーを使用して（前述のように）クロマトグラフィー用膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物またはタンパク質溶出液を溶出する工程を含むか、またはこれらからなる可能性があり、
バッファーのそれぞれはＢｉｓＴｒｉｓを含む。
【００４４】
本発明は、溶液からタンパク質を精製するための方法であって、
（ａ）前記溶液の一部を第１のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第１のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第２のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
第３のクロマトグラフィー用膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、および
場合によりサニテーションバッファーを第３のクロマトグラフィー用膜吸着剤に通す工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を順次更新する工程、ならびに
工程（ｃ）のそれぞれの最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含むか、またはこれらからなり、
平衡化、洗浄および溶出バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む方法にも関連する。
【００４５】
前に示したように、前述の本発明の方法は３つのクロマトグラフィー工程のみを含む。本発明によるこの方法は３つのクロマトグラフィー工程のみを含むが、医薬品目的および特に人間への投与に適した精製タンパク質をそれによって得ることができる。
【００４６】
人間による精製法中の操作がないことに加えて（結果として精製法を完了するのに必要な全体時間の短縮）、本開示の方法は精製に使用するバッファーと樹脂の量を減らす。さらに、主要バッファーは同じ成分（すなわちＢｉｓＴｒｉｓ、ＮａＣｌ、酢酸、水および場合によりＮＨ４Ｃｌ）を含み、これはバッファー製造を非常に容易にする。本開示の精製法はｍＡｂ精製も簡略化し、全体収率を改善し、原材料、貯蔵器、商品コストおよび処理時間を減らし、さらに様々なｍＡｂの精製を可能にする。
【００４７】
従来のタンパク質精製法と対照的に、前述のように本明細書で開示する方法は、４つまたは５つのバッファー、平衡化バッファー、洗浄バッファー、２つの溶出バッファー、および場合によりサニテーションバッファーを使用する。開示する方法中で使用する４つの主要バッファーは、母液から同じ化合物系マトリックスで作製し、これはバッファー製造を非常に容易にする。
【００４８】
本明細書で使用する「本発明によるバッファー」は、ＢｉｓＴｒｉｓを含むバッファーを指す。これは当業者によく知られている化合物であり、そのＩＵＰＡＣ名は２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオールであり、そのＣＡＳ番号は６９７６−３７−０である。このような本発明によるバッ
ファーは、平衡化バッファー、洗浄バッファー、および／または溶出バッファーに相当する可能性がある。
【００４９】
より具体的には、このような本発明によるバッファーは様々な濃度の同じ化合物を含むか、またはこれらからなる可能性がある（その１つがＢｉｓＴｒｉｓである）。具体的な実施形態では、バッファーはＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸および水を含むか、またはこれらからなる。より具体的な実施形態では、バッファーはＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる。言い換えると、このようなバッファーは様々な濃度のＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる。
【００５０】
例えば溶出バッファーは、１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなる可能性があり、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨ（例えば３．７）に調節されている。このような溶出バッファーは、アフィニティークロマトグラフィー用マトリックスと、特にプロテインＡマトリックス、特にプロテインＡカラムまたはプロテインＡ膜吸着剤などのアフィニティークロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤と使用するのに非常に適している。
【００５１】
溶出バッファーは、１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓ、４０〜５０ｍＭ（例えば４５ｍＭ）のＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭ（例えば２５ｍＭ）のＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる可能性もあり、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨ（例えば７．２５）に調節されている。このような溶出バッファーは、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用マトリックスと、特に例えばＣａｐｔｏＭＭＣなどのマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムと使用するのに非常に適している。
【００５２】
溶出バッファーは、１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭ（例えば８０ｍＭ）のＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭ（例えば２５ｍＭ）のＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる可能性もあり、酢酸で６と７の間の範囲に含まれるｐＨ（例えば６．２）に調節されている。このような溶出バッファーは、陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスと、特に陽イオン交換膜吸着剤と使用されることが非常に多い。
【００５３】
平衡化バッファーは１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなる可能性があり、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨ（例えば７．４）に調節されている。
【００５４】
洗浄バッファーは１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１Ｍ（例えば１Ｍ）のＮａＣｌを含むか、またはこれらからなる可能性があり、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨ（例えば７．４）に調節されている。
【００５５】
より具体的には、本開示の方法中で使用するための１つの平衡化バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと２０ｍＭのＮａＣｌを含有し、２ｍＭの酢酸でｐＨ７．４に調節されている。本開示の方法中で使用するための１つの洗浄バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１ＭのＮａＣｌを含有し、２ｍＭの酢酸でｐＨ７．４に調節されている。本開示の方法中で使用するための第１の溶出バッファーは２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと２０ｍＭのＮａＣｌを含有し、２７５ｍＭの酢酸でｐＨ３．７に調節されている。本開示の方法中で使用するための第２の溶出バッファーは、特にマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムと共に使用するため、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、および２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含有し、５ｍＭの酢酸でｐＨ７．２５に調節されており、または特に陽イオン交換膜吸着剤と共に使用するため、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａ
Ｃｌ、および２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含有し、５ｍＭの酢酸でｐＨ６．２に調節されている。
【００５６】
前述のバッファー製剤の利点には、従来の精製法と比較して、望ましくない相互作用を最小にし、ｐＨと伝導性の低下を制限し、かつ収率の増大を促進しながら、高い適合性で本開示の方法において使用する３つのクロマトグラフィー用マトリックス、特に３つのクロマトグラフィー用カラムまたは３つのクロマトグラフィー用膜吸着剤を通過するｍＡｂ製品の能力がある。少数のバッファーの使用に加えて、本開示の方法の別の態様はＢｉｓ−Ｔｒｉｓバッファーの使用である。このようなバッファーの使用によって３つのクロマトグラフィー工程間のｐＨ調節を回避し、したがって採取から最後の精製工程まで閉鎖系中で方法を実行を可能にする。
【００５７】
本発明の文脈で場合により使用するサニテーションバッファーは、０．０５Ｎ〜０．１５Ｎ（例えば０．１Ｎ）のＮａＯＨを含むか、またはこれらからなる可能性がある。このようなサニテーションバッファーは、アフィニティークロマトグラフィー用マトリックスと、特にプロテインＡカラムなどのアフィニティークロマトグラフィー用カラムと、またはＳａｒｔｏｂｉｎｄプロテインＡ膜吸着剤などのアフィニティークロマトグラフィー用膜吸着剤と、マルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスと、特にＣａｐｔｏＭＭＣなどのマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムと、またはＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ膜吸着剤などの陽イオン交換クロマトグラフィー用膜吸着剤と、および／または陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスと、特にＢｉｏＰｒｏＱ７５などの陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムと、またはＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜吸着剤などの陰イオン交換クロマトグラフィー用膜吸着剤と使用するのに非常に適している。
【００５８】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は
１）原型タンパク質の配列を有する分子、すなわちａ）天然に存在する細胞および具体的には非組換え細胞、またはｂ）遺伝子操作もしくは組換え細胞によって産生されるタンパク質、または
２）１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、および／または少なくとも１つの翻訳後修飾（例えばグリコシル化）によって原型タンパク質の配列と異なる分子
を指す。
【００５９】
前述の段落１）中に言及した分子は原型タンパク質と呼ぶことができる。
【００６０】
前述の段落２）中に言及した分子は非天然タンパク質である。
【００６１】
特定の態様では、精製されるタンパク質は抗体である。
【００６２】
本明細書で使用する用語「抗体」は、完全抗体、または特異的結合に関して完全抗体と競合するその結合断片を指す。結合断片には、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体があるが、これらだけには限られない。用語「重鎖」は、抗原に対する特異性をもたらすのに十分な可変領域配列を有する、任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。
【００６３】
本明細書で使用する用語「重鎖」は、完全長重鎖およびその断片を包含する。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨ、および３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端に存在する。
【００６４】
本明細書で使用する用語「軽鎖」は、完全長軽鎖およびその断片を包含する。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ、および定常領域ドメインＣＬを含む。重鎖と同様に、軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に存在する。本明細書で使用する用語「軽鎖」は、抗原に対する特異性をもたらすのに十分な可変領域配列を有する、任意の免疫グロブリンポリペプチドを含む。
【００６５】
天然に存在する抗体構造単位は、テトラマーを典型的に含む。それぞれのこのようなテトラマーは典型的に２つの同一ポリペプチド鎖の対で構成され、それぞれの対は（典型的に約２５ｋＤａの分子量を有する）１つの完全長軽鎖と、（典型的に約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）１つの完全長重鎖を有する。それぞれの軽鎖と重鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を典型的に担う約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を典型的に含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は典型的に、エフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖として典型的に分類される。重鎖はｍｕ、δ、γ、α、またはεとして典型的に分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧには、これらに限らないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めた幾つかのサブクラスがある。ＩｇＭには、これらに限らないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含めたサブクラスがある。同様にＩｇＡは、これらに限らないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含めたサブクラスにさらに分けられる。完全長軽鎖および重鎖内では、典型的に、可変領域と定常領域が約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合されており、重鎖は約１０個より多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。
【００６６】
それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗原結合部位を典型的に形成する。可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により接合し、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を典型的に示す。各対の２本の鎖由来のＣＤＲは、典型的にフレームワーク領域に沿って一直線に並び、これによって特異的エピトープとの結合が可能になる。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖と重鎖可変領域の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を典型的に含む。それぞれのドメインに対するアミノ酸の割り当ては、典型的にはＫａｂａｔら、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  ｅｄ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２の定義に従う。二重特異性または二機能性抗体は典型的に、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。
【００６７】
Ｆ（ａｂ）断片は一軽鎖およびＣＨ１および一重鎖の可変領域で構成される。Ｆ（ａｂ）分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。Ｆ（ａｂ’）断片は、鎖間ジスルフィド結合が２重鎖間で形成されＦ（ａｂ’）２分子を形成することができるように、一軽鎖およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間により多くの定常領域を含有する一重鎖を含有する。Ｆｖ領域は重鎖と軽鎖両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠いている。単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって結合し１つのポリペプチド鎖を形成し、それによって抗原結合領域を形成するＦｖ分子である。「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、特定の実施形態において、同一抗原特異性を有する結合部位を含むと理解される。
【００６８】
本開示の方法によって精製することができるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば当技術分野でよく知られている標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を含めた様々な技法によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の
技法、例えばＢリンパ球のウイルスまたは腫瘍遺伝子形質転換を利用することができる。モノクローナル抗体は、例えばネズミ、キメラ、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に相当する可能性がある。
【００６９】
具体的な実施形態では、本発明の方法によって精製される抗体は、筋原線維原型のヒトβ−アミロイドタンパク質に特異的に結合する抗体（例えばヒト化抗体）、細菌表面多糖ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）に特異的に結合する抗体（例えば完全ヒト抗体）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合する抗体、およびＣＤ３８膜貫通型糖タンパク質に特異的に結合する抗体（例えばヒト化抗体）からなる群から選択されるモノクローナル抗体である。
【００７０】
本発明の方法によって精製することができる抗体の非制限的な例は、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アポリズマブ、アチヌマブ、トシリズマブ、バシリズマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビシロマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デンスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラツズマブ、デュピルマブ、サリルマブまたはフレゾリムマブも含む。
【００７１】
特定の態様では、精製されるタンパク質は酵素である。
【００７２】
本発明の方法によって精製することができる酵素の非制限的な例は、酸性α−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネートスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α−ガラクトシダーゼＢ）、酸性リパーゼ、ライソゾーム酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡまたはヘキソサミニダーゼＢを含む。
【００７３】
本発明の方法によって精製することができるタンパク質の他の非制限的な例は、ヒトエリスロポイエチン、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＴＮＦ−Ｋ）、インターフェロンαまたはインターフェロンβを含む。
【００７４】
精製対象のタンパク質を含有する溶液は培養培地、好ましくは清浄化培養培地の可能性がある。精製対象のタンパク質を含有する溶液は、例えば灌流バイオリアクターまたはフェドバッチ式バイオリアクターで得る培養培地である。
【００７５】
灌流バイオリアクターまたはフェドバッチ式バイオリアクターの例は、（その全容を参照によって本明細書に組み入れる）米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号中に開示されている。
【００７６】
用語「清浄化培養培地」は、哺乳動物、細菌または酵母細胞を実質的に含まない（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％含まない）哺乳動物、細菌または酵母細胞培養から得た液体培養培地を意味する。
【００７７】
本明細書で使用する語句「タンパク質の回収」は、本開示の精製法の使用後にタンパク
質を集めることを指す。本開示の精製法は、これらに限らないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびマルチモード樹脂クロマトグラフィーなど様々な標準的タンパク質クロマトグラフィー技法を使用して実行することができる。
【００７８】
本開示の方法の特定の実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡマトリックスである。本開示の方法の詳細な実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡカラムである。本開示の方法の他の詳細な実施形態では、第１のクロマトグラフィー用マトリックスはプロテインＡ膜吸着剤である。プロテインＡマトリックス、特にプロテインＡカラムまたはプロテインＡ膜吸着剤は、樹脂リガンドとタンパク質の間のアフィニティーによって働き、高い有効性で不純物を除去する。本開示の方法における、プロテインＡマトリックスの使用、特にプロテインＡカラムまたはプロテインＡ膜吸着剤の使用の別の利点は、ｍＡｂがプロテインＡに対して共通のアフィニティーを有することである。本開示の方法の一実施形態では、プロテインＡカラムはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。本開示の方法の別の実施形態では、プロテインＡカラムはＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ（Ｎｏｖａｓｅｐ）である。本開示の方法の一実施形態では、プロテインＡ膜吸着剤はＳａｒｔｏｂｉｎｄプロテインＡ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。
【００７９】
本開示の方法の他の実施形態では、第２のクロマトグラフィー用マトリックスはマルチモード（混合式）樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである。本開示の方法の詳細な実施形態では、第２のクロマトグラフィー用マトリックスはマルチモード（混合式）樹脂クロマトグラフィー用カラムである。マルチモード樹脂は、ｍＡｂ：イオン、疎水性および水素結合相互作用で、幾つかの機構を介して対象のタンパク質と相互作用する。より具体的には、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムでは、ｍＡｂ：イオン相互作用は、従来の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）用カラムで生じるｍＡｂ：陰イオン相互作用ではなく、ｍＡｂ：陽イオン相互作用である。
【００８０】
本開示の方法の具体的な一実施形態では、マルチモード樹脂はＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。ＣａｐｔｏＭＭＣは、高度に架橋したアガロースベースマトリックスを含むマルチモード陽イオン交換体である。ＣａｐｔｏＭＭＣの特性は以下に要約する（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、データファイル１１−００３５−４５ＡＡ参照）。
【００８１】
【表１】
2019104735.tif 000002
【００８２】
本開示の方法の他の詳細な実施形態では、第２のクロマトグラフィー用マトリックスは陽イオン交換膜吸着剤である。
【００８３】
本開示の方法の具体的な他の一実施形態では、陽イオン交換膜吸着剤はＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。本開示の方法の別の具体的な実施形態では、陽イオン交換膜吸着剤はＮａｔｒｉＰｕｒＨＤ−Ｃ膜吸着剤（Ｎａｔｒｉｘ）である。
【００８４】
本開示の方法の他の実施形態では、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックスである。本開示の方法の詳細な実施形態では、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムである。本開示の方法の他の詳細な実施形態では、第３のクロマトグラフィー用マトリックスは陰イオン交換膜吸着剤である。陰イオン交換マトリックスの、特に陰イオン交換樹脂の不活性ポリマー担体と共有結合で架橋した、正に荷電した有機成分は、ｍＡｂ：陰イオン相互作用を介して対象のタンパク質と相互作用する。本開示の方法の一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムはＢｉｏＰｒｏＱ７５（ＹＭＣ）である。ＢｉｏＰｒｏＱ７５の特性は以下に要約する（ＹＭＣ−ＢｉｏＰｒｏＱ７５およびＳ７５のデータシートを参照）。
【００８５】
【表２】
2019104735.tif 000003
【００８６】
本開示の方法の別の実施形態では、陰イオン交換膜吸着剤はＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。本開示の方法の別の実施形態では、陰イオン交換膜吸着剤はＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）である。本開示の方法の別の実施形態では、陰イオン交換膜吸着剤はＨＤ−Ｑ膜吸着剤（Ｎａｔｒｉｘ）である。
【００８７】
一実施形態では、本発明による方法は、第１のクロマトグラフィー工程の最後および／または第２のクロマトグラフィー工程の最後に、粗製タンパク質溶出物および／またはタンパク質溶出液のｐＨの調節を含まない。
【００８８】
詳細な実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程の最後で得た粗製タンパク質溶出物を、第２のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第２のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に直接通す。より具体的には、（ｐＨ調節、バッファー交換または希釈などの）如何なる処置も、したがって２工程間で実行しない。このような方法において、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムは、例えばＣａｐｔｏＭＭＣカラムに相当する可能性がある。このような方法において、陽イオン交換膜吸着剤は、例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ膜吸着剤に相当する可能性がある。さらに、第２のクロマトグラフィー工程の最後で得たタンパク質溶出液を、第３のクロマトグラフィー用マトリックス、特に第３のクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に直接通す。より具体的には、（ｐＨ調節、バッファー交換または希釈などの）如何なる処置も、したがって２工程間で実行しない
。このような方法において、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムは例えばＣａｐｔｏＭＭＣカラムに相当する可能性があり、および／または陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムは例えばＢｉｏＰｒｏＱ７５カラムに相当する可能性がある。この方法の具体例は実施例４中に開示する。このような方法において、陽イオン交換膜吸着剤は例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ膜吸着剤に相当する可能性があり、および／または陰イオン交換膜吸着剤は例えばＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜吸着剤に相当する可能性がある。この方法の具体例は実施例８中に開示する。
【００８９】
このような方法において、精製系の手作業介入および開放を必要とする工程間処置（例えば不活性化容器中での希釈、プロテインＡプール容器中での濾過後不活性化およびｐＨ調節）は全く存在しない。
【００９０】
本発明の方法中で使用するクロマトグラフィー用マトリックスは、生物学的負荷が低いクロマトグラフィー用マトリックス（例えばγ線照射クロマトグラフィー用マトリックス）である可能性がある。生物学的負荷が低いクロマトグラフィー用マトリックスの例は、その全容を参照によって本明細書に組み入れる米国仮特許出願第６１／９２８，９０６号中に開示されている。
【００９１】
したがって本発明の方法は、第１、第２および第３のクロマトグラフィー用マトリックスを含むＭＣＣＳにおいて実行することができる。
【００９２】
用語「マルチカラムクロマトグラフィー用システム」または「ＭＣＣＳ」は、合計２つ以上の相互連結型または交換型クロマトグラフィー用カラムおよび／またはクロマトグラフィー用膜のシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィー用システムの非制限的な一例は、合計２つ以上の相互連結型または交換型クロマトグラフィー用カラムおよび／またはクロマトグラフィー用膜を含有する周期的向流クロマトグラフィー用システム（ＰＣＣＳ）である。マルチカラムクロマトグラフィー用システムの他の例は本明細書に記載されており、当技術分野で知られている。
【００９３】
ＭＣＣＳ中に存在するクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）は、交換機構（例えばカラム交換機構）によって、互いに対して連結または移動させることが可能である。ＭＣＣＳは、１つまたはそれ以上の（例えば２つ、３つ、４つ、または５つの）ポンプ（例えば自動式、例えば自動式蠕動ポンプ）を含むこともできる。カラム交換事象は、ＭＣＣＳを通過する流体（例えば、ＭＣＣＳ中の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜の投入液および／または溶出液）中の特定タンパク質レベルに相当するＵＶ吸光度によって検出される精製対象タンパク質のレベル、液体（例えばバッファー）の比体積、または具体的経過時間の検出によって誘発される可能性がある。カラム交換は、ＭＣＣＳ中の少なくとも２つの異なるクロマトグラフィー用カラムおよび／またはクロマトグラフィー用膜（例えば、ＭＣＣＳ中に存在する２つ以上の異なるクロマトグラフィー用カラムおよび／またはクロマトグラフィー用膜）が、少なくとも方法の一部分中ほぼ同じ時間で異なる工程（例えば平衡化、充填、溶出または洗浄）を通過することができる機構を一般に意味する。
【００９４】
ＭＣＣＳ中に存在するクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）は、本明細書に記載する１つまたはそれ以上の任意の例示的な形状、サイズ、体積（床体積）、および／または単位操作（複数可）を有することができる。
【００９５】
ＭＣＣＳ中に存在するクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマト
グラフィー用膜（複数可）は、本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている、１つまたはそれ以上の任意の例示的な樹脂を含有することができる。例えば、ＭＣＣＳ中に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）中に含有される樹脂は、捕捉機構（例えばプロテインＡ結合捕捉機構、プロテインＧ結合捕捉機構、抗体または抗体断片結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、コファクター結合捕捉機構、アプタマー結合捕捉機構、および／またはタグ結合捕捉機構）を利用する樹脂である可能性がある。ＭＣＣＳの１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）中に含有される樹脂は、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、モレキュラーシーブ樹脂、または疎水性相互作用樹脂、またはこれらの任意の組合せの可能性がある。タンパク質を精製するために使用することができる樹脂の他の例は当技術分野で知られており、ＭＣＣＳ中に存在する１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）中に含有することができる。ＭＣＣＳ中に存在するクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜は、同じ樹脂および／または異なる樹脂（例えば、組換えタンパク質精製において使用するための、本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている任意の樹脂）を含有することができる。
【００９６】
ＭＣＣＳ中に存在するクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用樹脂（複数可）は、１つまたはそれ以上の単位操作（例えばタンパク質の捕捉、タンパク質の精製、タンパク質の洗練、ウイルスの不活性化、タンパク質含有流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、またはタンパク質含有流体の濾過）を実行することができる。非制限的な例では、ＭＣＣＳは流体（例えば液体培養培地）由来のタンパク質の捕捉、および組換え治療用タンパク質含有流体中に存在するウイルスの不活性化の単位操作を実行することができる。ＭＣＣＳは、本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている２つ以上の単位操作の任意の組合せを実行することができる。
【００９７】
ＭＣＣＳは、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）ＵＶモニター、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）バルブ、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）ｐＨ測定器、および／または１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）伝導率測定器を備えることができる。ＭＣＣＳは、（例えばＵＶ吸光度、液体の体積、または経過時間に基づき）カラム交換発生時を検知するため、およびカラム交換事象に影響を与える（それらを誘発する）ために、ソフトウェア（例えばＵｎｉｃｏｒｎ−ｂａｓｅｄソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用するオペレーティングシステムを備えることもできる。ＭＣＣＳが１個またはそれ以上のＵＶ検出器を含む例では、ＵＶ検出器は場合により、ＭＣＣＳ中の１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）クロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）のインレット、および／またはＭＣＣＳ中の１個またはそれ以上のクロマトグラフィー用カラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用膜（複数可）のアウトレットに置くことができる。
【００９８】
ＭＣＣＳは、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の）インライン型バッファー調節貯蔵器（複数可）および／またはバッファー貯蔵器（複数可）をさらに含むことができる。他の例ではＭＣＣＳは、ＭＣＣＳ中の１個またはそれ以上のクロマトグラフィー用カラムおよび／またはクロマトグラフィー用膜を容易に通過することができない流体を保持することができる、１個またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、または６個の）ブレーキタンクを含むことができる。本明細書に
記載するシステムは１個またはそれ以上のブレーキタンクを含有することができる。本明細書に記載するシステムの他の例はブレーキタンクを含まない。
【００９９】
ＭＣＣＳは、流体（例えば細胞を実質的に含まない液体培養培地）を前記ＭＣＣＳに通すことができるインレットを含むことができる。インレットは、このような目的の当技術分野で知られる任意の構造の可能性がある。インレットは、例えば流体導管を挿入することができるスレッド、リブ、またはシールを含むことができ、したがってインレットへの流体導管の挿入後、インレットから流体の重大な漏出なしで、インレットを介して流体がＭＣＣＳに進入する。本発明のシステム中で使用することができる非制限的なインレットは当業者に知られており、当業者によって理解されるであろう。本明細書で提供するシステムの幾つかの例は、ＭＣＣＳのインレットと流動的に連結したバイオリアクターも含む。本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている任意の例示的なバイオリアクターを、本発明のシステム中で使用することができる。
【０１００】
ＭＣＣＳは、タンパク質をシステムから排出することができるアウトレットを含むことができる。アウトレットは流体導管を挿入することができる、例えばスレッド、リブ、もしくはシール、またはタンパク質を含有もしくは貯蔵するように設計されたバイアルを含むことができる。アウトレットは、滅菌バイアルもしくは他のこのような貯蔵容器を密封するために使用することができる表面をアウトレット上に含有することができ、したがって滅菌バイアルもしくは貯蔵容器にタンパク質を直接流入させることが可能である。本発明のシステム中で使用することができる非制限的なアウトレットは当業者に知られており、当業者によって理解されるであろう。
【０１０１】
本明細書で提供するシステムの幾つかの例はポンプシステムも含む。ポンプシステムは、１個またはそれ以上の以下のもの、１個またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）ポンプ（例えば、本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている任意のポンプ）、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、または５個の）フィルター（例えば本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている任意のフィルター）、１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の）ＵＶ検出器、および１個またはそれ以上の（例えば２、３、４、または５個の）ブレーキタンクを含むことができる。
【０１０２】
本明細書に記載するシステムの幾つかの例は、ＭＣＣＳのポンプとインレットの間の流体導管と連結したさらなる流体導管をさらに含み、この場合さらなる流体導管の一端はバイオリアクターと流動的に連結しており、他端はポンプとインレットの間の流体導管と流動的に連結している。このさらなる流体導管は、バイオリアクター（例えばＡＴＦ細胞保持システム）から除去した液体培養培地から細胞を除去することができるフィルターを含むことができる。幾つかの例では、この個々の流体導管は、１個またはそれ以上の（例えば２、３、または４個の）ポンプ（例えば本明細書に記載するか、または当技術分野で知られている任意のポンプ）および／または１個またはそれ以上の（例えば２、３、または４個の）ブレーキタンク（例えば本明細書に記載する任意の例示的なブレーキタンク）を含むことができ、これらのポンプ（複数可）および／またはブレーキタンク（複数可）は流体導管中に存在する流体と流動的に連結している。
【０１０３】
本明細書に記載するシステムは、最終クロマトグラフィー用カラムまたはクロマトグラフィー用膜とアウトレットのと間に配置された流体導管を場合により含むことができる。本明細書に記載するシステムは、ＭＣＣＳ中の最終クロマトグラフィー用カラムまたはクロマトグラフィー用膜とアウトレットとの間に配置された流体導管中に存在する流体から、例えば沈殿材料、粒子状物質、または細菌をフィルターが除去できるように、最終クロマトグラフィー用カラムまたはクロマトグラフィー用膜とアウトレットとの間に配置され
た流体導管と流動的に連結した１個またはそれ以上のフィルターをさらに含むことができる。
【０１０４】
本発明の方法は連続式に実行することができる。言い換えると、本発明の方法は、溶液からタンパク質を精製するための連続的方法である可能性がある。
【０１０５】
用語「連続的方法」または「連続式の方法」は、システムの少なくとも一部分を介して流体を連続的に供給する方法を意味する。
【０１０６】
「流体」は本明細書において、精製対象のタンパク質を含有する溶液、ウイルス不活性化用のバッファーまたは低ｐＨもしくは酸性ｐＨ溶液などの任意の液体を意味する。
【０１０７】
好ましい実施形態では、第１、第２および第３のマトリックスに流体を連続的に供給する。
【０１０８】
用語「統合法」は、協同的に作用して具体的な結果（例えば液体培養培地由来の精製タンパク質の生成）を得る構造要素を使用して実行される方法を意味する。
【０１０９】
統合法の例は、（その全容を参照によって本明細書に組み入れる）米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号中に開示されている。
【０１１０】
本発明の方法のスケールアップは、カラム交換の使用および／または各クロマトグラフィー用カラムの床体積の増大も含むことができる。
【０１１１】
さらに本発明の方法は、第１の工程から最後の工程まで閉鎖系中で実行することができる。特に、クロマトグラフィー工程および場合により濾過工程（複数可）（例えばナノ濾過工程および／または限外濾過およびダイアフィルトレーション工程）は閉鎖系中で実行することができる。本発明の方法の具体的な実施形態では、タンパク質を含む溶液を、３つのクロマトグラフィー用マトリックス、特に３つのクロマトグラフィー用カラムまたは膜吸着剤に少しずつ通し、溶液の一部の各回の通過が１回の実行に相当する。各実行の最後に回収したタンパク質を次いで集めてプールする。この方法の具体例は実施例５、６および８中に開示する。このような方法では、クロマトグラフィー工程のカラムまたは膜吸着剤を数回使用し、場合により例えば上記で定義したサニテーションバッファーを使用して消毒殺菌し、それにより必要とされる樹脂または膜吸着剤デバイス、およびバッファーの量を減らすことができる。例えば、一連の３〜５０回実行（例えば３〜３０回実行、５〜２５回実行、１０〜２０回実行、または１５回実行）を連続的に実行することができる。より具体的には、３、４、５、６、７または８回実行を連続式に実行し、次いで（例えばサニテーションバッファーを使用して）３個のカラムまたは膜吸着剤の消毒殺菌を行うことができる。これは例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれより多い回数反復することができる。
【０１１２】
本明細書で開示する方法を使用して精製タンパク質を回収することができる。本明細書で使用する「精製」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を指す。タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの実行に有用であるため、それは、このような実行におけるそのタンパク質の使用に干渉する可能性がある、または対象のタンパク質の封入に少なくとも望ましくない可能性がある汚染物質、他のタンパク質、および／または化学物質を実質的に含まない状態でなければならない。このような実行は、治療用組成物の製造、治療用組成物中タンパク質の投与、および本明細書で開示する他の方法を含む。本明細書で言及する「精製」タンパク質は、そのタンパク質が所与の組成物中の全タン
パク質の少なくとも約８０重量／重量％、およびより好ましくは所与の組成物中の全タンパク質の少なくとも約８５重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９０重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９１重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９２重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９３重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９４重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９５重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９６重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９７重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９８重量／重量％、およびより好ましくは少なくとも約９９重量／重量％を構成するように、任意の方法によって（すなわち天然資源由来の直接精製によって、組換えによって、または合成によって）産生することができるタンパク質、および他のタンパク質成分から精製されたタンパク質であることが好ましい。
【０１１３】
本明細書で使用する「粗製タンパク質」は、そのタンパク質が所与の組成物中の全タンパク質の約８０重量／重量％未満を構成するように、任意の方法によって（すなわち天然資源由来の直接精製によって、組換えによって、または合成によって）産生することができるタンパク質、および他のタンパク質成分から精製されたタンパク質を指す。
【０１１４】
詳細な実施形態では、本発明による溶液からタンパク質を精製するための方法は、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉ）溶液をプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物をマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用してマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
を含み、
平衡化バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、洗浄バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、第１の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、かつ第２の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４０〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲
に含まれるｐＨに調節されている。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明による溶液からタンパク質を精製するための方法は、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉ）溶液の一部をプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡカラムに通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物をマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用してマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムに通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、
を含む第３のクロマトグラフィー工程、
（ｄ）全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程ａ）、ｂ）およびｃ）を順次更新する工程、ならびに
（ｅ）一回毎の第３のクロマトグラフィー工程の最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含み、
平衡化バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、洗浄バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、第１の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、かつ第２の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４０〜５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されている。
【０１１６】
別の特定の実施形態では、本発明による溶液からタンパク質を精製するための方法は、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）溶液をプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡ膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物を陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用して陽イオン交換膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、を含む第３のクロマトグラフィー工程を含み、
平衡化バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、洗浄バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、第１の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、かつ第２の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で６と７の間の範囲に含まれるｐＨに調節されている。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明による溶液からタンパク質を精製するための方法は、
（ａ）（ｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）溶液の一部をプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｉｖ）洗浄バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、
（ｖ）平衡化バッファーをプロテインＡ膜吸着剤に通す工程、および
（ｖｉ）第１の溶出バッファーを使用してプロテインＡ膜吸着剤から粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）（ｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ａ）からの粗製タンパク質溶出物を陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉｉ）平衡化バッファーを陽イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｖ）第２の溶出バッファーを使用して陽イオン交換膜吸着剤からタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、
（ｃ）（ｉ）平衡化バッファーを陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、
（ｉｉ）工程（ｂ）からのタンパク質溶出液をフロースルー形式で陰イオン交換膜吸着剤に通す工程、および
（ｉｉｉ）陰イオン交換膜吸着剤のフロースルーから精製タンパク質を回収する工程、を含む第３のクロマトグラフィー工程、
（ｄ）全溶液が使用されるまで溶液の別の部分で工程ａ）、ｂ）およびｃ）を順次更新する工程、ならびに
（ｅ）一回毎の第３のクロマトグラフィー工程の最後に回収した精製タンパク質を集める工程を含み、
平衡化バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、洗浄バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと０．９〜１．１ＭのＮａＣｌを含み、酢酸で７と８の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、第１の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと１５〜２５ｍＭのＮａＣｌを含み、酢酸で３と４の間の範囲に含まれるｐＨに調節されており、かつ第２の溶出バッファーは１５〜２５ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２０〜３０ｍＭのＮＨ４Ｃｌを含み、酢酸で６と７の間の範
囲に含まれるｐＨに調節されている。
【０１１８】
溶液からタンパク質を精製するための方法は、ナノ濾過工程、限外濾過工程および／またはダイアフィルトレーション工程などの、少なくとも１回の濾過工程を含むことができる。濾過工程（複数可）はクロマトグラフィー工程の前および／または後に実行することができる。医薬品目的で組換えタンパク質を精製するとき、典型的には、クロマトグラフィー工程に濾過工程が続く。したがって本発明の方法は、工程（ｃ）の後にナノ濾過工程をさらに含むことができる。限外濾過工程およびダイアフィルトレーション工程を、ナノ濾過工程の後にさらに実行することができる。本明細書で使用する「限外濾過」または「ＵＦ」は、半透膜を使用して、ＵＦ膜における粒径および孔径に基づき溶液から粒子および／またはイオンを物理的および選択的に除去する濾過技法を指す。本明細書で使用する「ナノ濾過」は、例えばウイルス粒子を除去するために使用されるナノフィルターを介した溶液の濾過を指す。本明細書で使用する「ダイアフィルトレーション」は、限外濾過膜を使用して溶液から塩もしくは溶媒を完全に除去する、置換する、またはそれらの濃度を低下させる技法を指す。
【０１１９】
本発明の方法は、少なくとも１回のウイルス不活性化工程もさらに含むことができる。前記少なくとも１回のウイルス不活性化工程は、本発明の方法の任意の段階で、例えば工程（ａ）の前、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の後、工程（ｃ）の後、ナノ濾過工程の後、および／または限外濾過工程およびダイアフィルトレーション工程後に実行することができる。このようなウイルス不活性化工程は、典型的には低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活性化工程である可能性がある。本明細書で使用する「低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活性化」は、酸性ｐＨを使用してウイルス、特にエンベロープウイルスを変性させるウイルス不活性化技法を指す。典型的に、低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活性化工程は、少なくとも３０分間の間（例えば１時間と２１日間の間、約２時間と２１日間の間、または約４時間と２１日間の間）、約３．０と５．０の間のｐＨ（例えば約３．５と約４．５の間、約３．５と約４．２５の間、約３．５と約４．０の間、例えば４．０）で回収タンパク質をインキュベートすることによって実行される。例えば、低ｐＨまたは酸性ｐＨ不活性化工程は、例えば６時間〜２１日間の間、４のｐＨで回収タンパク質をインキュベートすることによって実行される。
【０１２０】
本発明の方法は、工程（ａ）の前に、細胞を実質的に含まず精製対象のタンパク質を含有する液体培養培地を提供する工程も含むことができ、前記液体培養培地は第１のクロマトグラフィー用マトリックスに供給する。
【０１２１】
例えば、溶液からタンパク質を精製するための本発明の方法は、
（ａの前）細胞を実質的に含まず精製対象のタンパク質を含有する液体培養培地を提供する工程、
（ａ）工程（ａの前）の前記液体培養培地を第１のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第１の溶出バッファーを使用して第１のクロマトグラフィー用マトリックスから粗製タンパク質溶出物を溶出する工程、
を含む第１のクロマトグラフィー工程、
（ｂ）工程（ａ）の最後で得た粗製タンパク質溶出物を第２のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第２の溶出バッファーを使用して第２のクロマトグラフィー用マトリックスからタンパク質溶出液を溶出する工程、
を含む第２のクロマトグラフィー工程、および
（ｃ）工程（ｂ）の最後で得たタンパク質溶出液をフロースルー形式で第３のクロマトグラフィー用マトリックスに通す工程、
第３のクロマトグラフィー用マトリックスのフロースルーから精製タンパク質を回収する工程を含む第３のクロマトグラフィー工程を含むことができ、
バッファーのそれぞれがＢｉｓＴｒｉｓを含む。
【０１２２】
最後に精製タンパク質は、貯蔵に適した組成物、および／または動物ならびに／もしくはヒトに投与するのに適した医薬組成物に配合することができる。
【０１２３】
本開示の方法の多数の利点の１つは、それによって高純度タンパク質の良い収率を得ることができることである。本発明の方法によって回収される精製タンパク質は、例えば少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、９９．５％、または９９．９％の純度を示す可能性がある。より詳細には、本開示の方法の多数の利点の１つは、それによって少量の汚染ＤＮＡを含有する高純度タンパク質、（タンパク質凝集体に相当する）高分子量（ＨＭＷ）種および／または宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の溶液を得ることができることである。本発明の方法によって回収される精製タンパク質を含む溶液は、例えば０．４ｐｐｂ未満、０．３ｐｐｂ未満、０．２ｐｐｂ未満または０．１ｐｐｂ未満の汚染ＤＮＡの量を示す可能性がある。本発明の方法によって回収される精製タンパク質を含む溶液は、例えば０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満または０．４％未満のＨＭＷ種の濃度も示す可能性がある。本発明の方法によって回収される精製タンパク質を含む溶液は、例えば２３ｐｐｍ未満、２２ｐｐｍ未満、２１ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１９ｐｐｍ未満または１８ｐｐｍ未満のＨＣＰの濃度も示す可能性がある。さらに本発明の方法は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の収率で精製タンパク質の回収を可能にすることができる。
【０１２４】
本発明の別の態様は、本発明の方法中で使用するのに適したバッファーの製造法に関連する。実際、全てのこれらのバッファーは、単一母液から始めて非常に容易かつ迅速に製造することができる。
【０１２５】
このようなバッファーの製造法は、
ｉ）１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓおよび１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＮａＣｌの最終濃度で溶液（例えば１００Ｌの溶液）を作製する工程、
ｉｉ）酢酸で７と８の間に含まれる値（例えば７．４）に溶液のｐＨを調節する工程、
ｉｉｉ）溶液の４分の１を回収し、それによって平衡化バッファーを得る工程、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の３溶液のうち、４分の１のｐＨを酢酸で３と４の間に含まれる値（例えば３．７）に調節し、それによって溶出バッファーを得る工程、
ｖ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の２溶液のうち、４分の１を回収し、ＮａＣｌを加え４０ｍＭと５０ｍＭの間に含まれる最終ＮａＣｌ濃度（例えば４５ｍＭ）を得て、ＮＨ４Ｃｌをさらに加え２０ｍＭと３０ｍＭの間に含まれる最終ＮＨ４Ｃｌ濃度（例えば２５ｍＭ）を得て、酢酸で７と８の間に含まれる値（例えば７．２５）にｐＨを調節し、それによってさらなる溶出バッファーを得る工程、
ｖｉ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の１溶液にＮａＣｌを加え、ＮａＣｌを加え０．９Ｍと１．１Ｍの間に含まれる最終ＮａＣｌ濃度（例えば１Ｍ）を得て、それによって洗浄バッファーを得る工程
を含むか、またはこれらからなる可能性がある。
【０１２６】
このような方法は図１に図式化して示す。
【０１２７】
別のバッファーの調製法は、
ｉ）１５〜２５ｍＭ（例えば２０ｍＭ）のＢｉｓＴｒｉｓおよび１５〜２５ｍＭ（例え
ば２０ｍＭ）のＮａＣｌの最終濃度で溶液（例えば１００Ｌの溶液）を作製する工程、
ｉｉ）酢酸で７と８の間に含まれる値（例えば７．４）に溶液のｐＨに調節する工程、
ｉｉｉ）溶液の４分の１を回収し、それによって平衡化バッファーを得る工程、
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の３溶液のうち、４分の１のｐＨを酢酸で３と４の間に含まれる値（例えば３．７）に調節し、それによって溶出バッファーを得る工程、
ｖ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の２溶液のうち、４分の１を回収し、ＮａＣｌを加え７０ｍＭと９０ｍＭの間に含まれる最終ＮａＣｌ濃度（例えば８０ｍＭ）を得て、ＮＨ４Ｃｌをさらに加え２０ｍＭと３０ｍＭの間に含まれる最終ＮＨ４Ｃｌ濃度（例えば２５ｍＭ）を得て、酢酸で６と７の間に含まれる値（例えば６．２）にｐＨに調節し、それによってさらなる溶出バッファーを得る工程、
ｖｉ）工程（ｉｉｉ）からの残りの４分の１溶液にＮａＣｌを加え、ＮａＣｌを加え０．９Ｍと１．１Ｍの間に含まれる最終ＮａＣｌ濃度（例えば１Ｍ）を得て、それによって洗浄バッファーを得る工程
を含むか、またはこれらからなる可能性がある。
【０１２８】
前述のバッファーの製造法は、３つのクロマトグラフィー工程を実行する前の、本発明の方法の実際の第１の工程に相当する可能性もある。
【０１２９】
本発明はさらに、
（ａ）マルチモード樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、プロテインＡマトリックスなどのアフィニティークロマトグラフィー用マトリックス、および／または陰イオン交換クロマトグラフィー用マトリックス、および
（ｂ）本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファー、および／または本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファーの製造に関する説明書を含むか、またはこれらからなるキットに関連する。
【０１３０】
一実施形態では、キットは、
（ａ）マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラム、プロテインＡカラムなどのアフィニティークロマトグラフィー用カラム、および／または陰イオン交換クロマトグラフィー用カラム、および
（ｂ）本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファー、および／または本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファーの製造に関する説明書を含むか、またはこれらからなる。
【０１３１】
別の実施形態では、キットは、
（ａ）陽イオン交換膜吸着剤、プロテインＡ膜吸着剤などのアフィニティークロマトグラフィー用膜吸着剤、および／または陰イオン交換クロマトグラフィー用膜吸着剤、および
（ｂ）本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファー、および／または本発明による（例えばＢｉｓＴｒｉｓ、酢酸、ＮａＣｌ、水、および場合によりＮＨ４Ｃｌを含むか、またはこれらからなる）少なくとも１つのバッファーの製造に関する説明書を含むか、またはこれらからなる。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本開示の方法、およびその様々な使用の具体的実施形態を例示するものである。これらの実施例は説明目的でのみ言及し、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１３３】
精製バッファーの最適化
ＢｉｓＴｒｉｓバッファーは、マルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムと共にバッファーとして有利に使用することができる。
【０１３４】
プロテインＡクロマトグラフィー用カラム通過後に得た粗製タンパク質溶出物を、ＣａｐｔｏＭＭＣマルチモード樹脂クロマトグラフィー用カラムに通した。
【０１３５】
この樹脂は、プロテインＡカラムにおけるクロマトグラフィー工程後に得られるものと同様に、低ｐＨであってもｍＡｂを固定化することができる。しかしながら、この樹脂は充分な溶出を得るのに塩も必要とする。ただし高すぎる濃度の塩はｍＡｂの安定性に有害である。それは溶出サンプル中の高分子量（ＨＭＷ）種のレベルを増大させ、培地に固定化された不純物には影響が強すぎ、ｍＡｂの純度の低下をもたらすからである。
【０１３６】
これらの欠点を回避するため、工程（ａ）の溶出バッファーにおける塩濃度とｐＨを低下させるために本発明者らは実験計画法（ＤＯＥ）を作成した。
【０１３７】
この目的のため、本発明者らは新たな種類の塩、ＮａＣｌと同じ伝導性をもたらすが相互作用の点でＮａ＋より強い塩化アンモニウムを導入した。
【０１３８】
ＤＯＥのパラメーター
セントラルコンポジットフェイス（ＣＣＦ）設計を、ＭＯＤＤＥ９ソフトウェア（ＵＭＥＴＲＩＣＳ）と共に溶出条件の最適化に適用した。（１７の実験全てにおいて）ＣＣＦ設計は完全ファクター設計と３つの中心点で構成されていた。溶出ｐＨは７．２と７．８の間で変化し、同様にＮａＣｌ濃度は０〜１００ｍＭで変化し、ＮＨ４Ｃｌ濃度は０〜５０ｍＭで変化した。
【０１３９】
ファクターとレスポンスは以下に要約する。
【０１４０】
【表３】
2019104735.tif 000004
【０１４１】
ＤＯＥ実験
１７の実験を以下の表中に要約する。
【０１４２】
【表４】
2019104735.tif 000005
【０１４３】
ＤＯＥの結果
実験中、４つの実験が生成物回収の点で一致しないようであった。Ｎ１とＮ２実験は条件によって溶出がなく、Ｎ５とＮ１１実験の間は、１０カラム体積（ＣＶ）後に溶出を止めなければならなかった。したがって、これらの実験は分析から除外した。
【０１４４】
全ての実験結果をＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＨＣＰ分析に施した。
【０１４５】
結果は以下の表中に要約する。
【０１４６】
【表５】
2019104735.tif 000006
【０１４７】
本発明者らは、ＭＯＤＤＥ９．０予測ツールにおいて、以下のレスポンスを固定化することにより、適用条件含有スペースを意味するスイートスポットを決定した。
収率：９５〜１００％
ＨＣＰ：２０〜３０ｐｐｍ
ＨＭＷ：０．４〜０．８％
【０１４８】
３種のＮＨ４Ｃｌ濃度（０、２５および５０ｍＭ）に関して図２にスイートスポットを表す。
【０１４９】
ブラックスペースは、第１の適合基準：９０％と１００％の間の収率を含有するスペースである。ライトグレースペースは、収率とＨＣＰ率（２０〜３０ｐｐｍ）の両方を含有するスペースである。ダークグレースペースは、３適合基準：収率、ＨＣＰ率およびＨＭＷ率（０．４〜０．８％）含有スペースであるスイートスポットである。
【０１５０】
したがって本発明者らは、このグラフ図によって、ＮａＣｌを使用するほどＨＭＷおよび収率が増大していたことを実証した。さらに、ｐＨが増大するほどＨＣＰ率が重要であった。したがって本発明者らは、良い純度で高収率を得るためには、低ｐＨおよび低ＮａＣｌ濃度で溶出を実行する必要があったことを実証した。
【０１５１】
本発明者らは、ＮＨ４Ｃｌを使用してＮａＣｌ濃度を低下させることができたことを実証した。９５％を超える収率、約３０ｐｐｍのＨＣＰ率および０．６％のＨＭＷ率であるスイートスポットを考慮すると、最適ＮＨ４Ｃｌ濃度は２５ｍＭであった。
【０１５２】
したがって本発明者らは、第２のクロマトグラフィー工程に最適な溶出バッファーは、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．２５とする量の酢酸であったことを実証した。
【実施例２】
【０１５３】
第３のクロマトグラフィー工程の最適化
その塩耐性が原因で、２回の第１のクロマトグラフィー工程後に不純物を洗練しウイルスを除去するため、第３の工程としてＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣ膜を使用した精製法を最初に設計した。
【０１５４】
しかしながら、連続法ではそれぞれの工程を多数回実施する。ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣ膜などの使い捨て膜は再利用することができない。したがって本発明者らは、不純物の洗練を可能にし、ウイルスを除去し再利用できる代替の第３のクロマトグラフィー工程を設計し、したがってこれは連続法において使用することができる。
【０１５５】
３種の媒体を洗練工程として試験した：
ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、および
ＢｉｏＰｒｏＱ７５（ＹＭＣ）、ＡＥＸ樹脂。
【０１５６】
最初に、本発明者らは、ＣａｐｔｏＭＭＣ溶出（１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）後にこれらの樹脂を試験して、１００ｍＭのＮａＣｌ条件下でも不純物を除去する第３の工程の能力を評価した。ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣおよびＱ膜は１回の実行で評価した。ＢｉｏＰｒｏＱ７５は３回の実行、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび２５ｍＭのＮａＣｌ濃度で評価した。結果は以下の表中に示す。
【０１５７】
【表６】
2019104735.tif 000007
【０１５８】
したがってこれらの結果は、ＳａｒｔｏｂｉｎｄＳＴＩＣ膜は、その塩耐性ゆえ優れた不純物除去をもたらすことを示す。しかしながら、さらに１ＭＮａＣｌの洗浄後および０．１ＮのＮａＯＨ消毒殺菌後に圧力が低下しなかったため、実行中の１〜３バールの圧力の増大は、再利用技術においてこのような膜を使用することができないことを示す。不純物に関する最良の結果はＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ膜で得た。しかしながら、再利用性および有用性の問題のため、本発明者らはこの膜は適していないと考えた。
【０１５９】
最後に、ＢｉｏＰｒｏＱ７５樹脂は不純物除去に関して中間的な結果をもたらした。さらに、実行中に圧力は観察されなかった。最後に、従来の樹脂技術のため再利用性がなかった。
【０１６０】
したがって本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィー用カラムが、連続法によるタンパク質精製を実行するための洗練工程における優れた膜の代替であったことを実証した。
【実施例３】
【０１６１】
精製バッファーの配合
本明細書に記載する３工程の精製法は、いずれも同じ母液から調製した４つのバッファ
ー、１つの平衡化バッファー、１つの洗浄バッファー、および２つの溶出バッファーを利用する。プロトコールの概略図は図１中に示し、以下の通りである。当量の２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓと当量の２０ｍＭのＮａＣｌを母液として１００Ｌの注射用水（ＷＦＩ）にし、次いで酢酸を使用して溶液のｐＨを７．４に調節した。生成した溶液の２５Ｌを次いで回収し、平衡化バッファーとして貯蔵した。母液の２５Ｌを次いで除去し、当量の１ＭのＮａＣｌを加えた。この生成した２５Ｌ溶液が洗浄バッファーであった。次いで２５Ｌ母液のｐＨを酢酸で３．７に調節した。この生成した２５Ｌ溶液が第１の溶出バッファーであった。次いで母液の残りの２５Ｌを、酢酸を使用してｐＨ７．２５に調節し、当量の４５ｍＭのＮａＣｌと当量の２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌを加え、他の溶出バッファーを生成した。
【実施例４】
【０１６２】
小規模の連続的多工程法
本発明の方法を、ＣＤ３８膜貫通型糖タンパク質に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ３８ｍＡｂ）の小バッチ精製に利用した。
【０１６３】
材料および方法
材料
第１の工程：Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗチューブでカスタマイズした６０ｍＬのＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ樹脂ＸＫ５０／２０カラム中
第２の工程：Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗチューブでカスタマイズした１００ｍＬのＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂ＸＫ５０／２０カラム中
第３の工程：Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗチューブでカスタマイズした５０ｍＬのＢｉｏＰｒｏＱ７５樹脂ＸＫ５０／２０カラム中
上記と同様に１．０ｍｍ調整しＰＥＥＫで改変したＡｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒチューブ
【０１６４】
第１の工程の詳細
ＸＫ５０／２０カラムにＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ樹脂を充填した（参照番号．ＡｂＳＨＣ３５Ｐ１−Ａ−Ｖ−００２００）。最終体積は６０ｍＬであった。ＨＥＴＰは１３５３８Ｎ／ｍであり、非対称性は１．２であった。
【０１６５】
この工程には３種のバッファーを使用した：
２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、２ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４とする量の酢酸で作製した平衡化バッファー
２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４とする量の酢酸で作製した洗浄バッファー
２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．７とする量の酢酸で作製した溶出バッファー。
【０１６６】
平衡化、洗浄、充填および溶出工程用にカラムサイズに従った流速を２４ｍＬ／分（室温２．５分）に設定した。
【０１６７】
第２の工程の詳細
ＸＫ５０／２０カラムにＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂を充填した（参照番号１７−５３１７−０２）。最終体積は１００ｍＬであった。ＨＥＴＰは５６８６Ｎ／ｍであり、非対称性は１．３であった。
【０１６８】
この工程には２種のバッファーを使用した：
４０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４とする量の酢酸で作製し
た平衡化バッファー
２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．２５とする量の酢酸で作製した溶出バッファー。
【０１６９】
平衡化、充填および溶出工程用にカラムサイズに従った流速を２４ｍＬ／分（室温４．８分）に設定した。
【０１７０】
第３の工程の詳細
ＸＫ５０／２０カラムにＢｉｏＰｒｏＱ７５樹脂を充填した（参照番号ＱＡＡ０Ｓ７５）。最終体積は５０ｍＬであった。ＨＥＴＰは４８７５Ｎ／ｍであり、非対称性は１．６であった。
【０１７１】
この工程には１種のバッファーを使用した：
４０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４とする量の酢酸で作製した平衡化バッファー。
【０１７２】
平衡化および溶出工程用にカラムサイズに従った流速を２４ｍＬ／分（室温２．１分）に設定した。
【０１７３】
結果
大量採取の２．３２５ｇを（１．７１ｇ／Ｌの濃度で）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ樹脂に充填した。２．３２５ｇを精製するための合計時間は２時間１０分であった。２．１２５ｇを回収し、これは収率が９１％であったことを意味した。技術的には、カラムを連続形状で使用した場合でさえ、背圧なしで精製を首尾よく実行した。
【０１７４】
以下の表中に、３工程法で得た最終産物の不純物除去を要約し、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５９５２８中に記載の２工程法で得たそれと比較する。
【０１７５】
【表７】
2019104735.tif 000008
【０１７６】
したがって本発明者らは、新たな連続的多工程法が、同じ産物に施したＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５９５２８中に記載の２工程法と同程度に有効であったことを示した。
【０１７７】
小規模試験を実行して、各工程後に得た不純物の割合を評価した。以下の表中に要約するように、本発明者らは、各工程が不純物を除去するのに有効であったことを示した。
【０１７８】
【表８】
2019104735.tif 000009
【０１７９】
したがってこの実施例は、本発明者らにより設計された連続法はバッチ法と同程度に有効であることを示す。
【実施例５】
【０１８０】
完全規模の連続的多工程法
前述の方法を、ＣＤ３８膜貫通型糖タンパク質に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ３８ｍＡｂ）の大規模精製に適用した。
【０１８１】
材料および方法
材料
第１の工程：５０ｍｇ／ｍＬの動態結合容量（ＤＢＣ）を有する５０ｍＬのＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ樹脂
第２の工程：３５ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを有する１００ｍＬのＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂
第３の工程：１７０ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを有する５０ｍＬのＢｉｏＰｒｏＱ７５樹脂
前述の３カラムを一列に含み全カラムのモニタリングを可能にする、ＧＥからの周期的向流システム（カスタマイズしたＡｋｔａ精製器）
【０１８２】
方法
一連の１５回実行を連続的に実行した。より具体的には、５回実行を連続式に実行し、次いで新たな一連の実行開始前に、０．１ＮのＮａＯＨで３カラムの消毒殺菌を実行した。
【０１８３】
結果
一連の実行によって、５００分未満で１０ｇの抗ＣＤ３８ｍＡｂを精製することができた。
【０１８４】
大量採取の２９．５ｇを充填し２８ｇの精製ｍＡｂを回収した。したがって、本発明の連続的多工程法によって９５％の平均収率に到達することができた。これらの２８ｇの精製ｍＡｂは２５時間以内に得た。
【０１８５】
さらに、最終産物の分析結果は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５９５２８中に記載の２工程法で得た最終産物のそれに匹敵した。これらの分析結果は以下の表中に要約する。
【０１８６】
【表９】
2019104735.tif 000010
【０１８７】
以下の表において示されるように、これは各工程を別々に分析したときも当てはまった。
【０１８８】
【表１０】
2019104735.tif 000011
【０１８９】
さらに、図３中に示されるように、各実行間で傾向は如何なる有意な差も示さなかった。
【実施例６】
【０１９０】
連続式でのバッチ精製
実施例５中に記載した方法を使用して、完全規模の連続バッチで抗ＣＤ３８ｍＡｂを精製した。
【０１９１】
この実施例中、６９時間の間に１．６６ｇ／Ｌの濃度で４３ＬのｍＡｂを連続的に精製した。より具体的には、４５回実行を実行し、９６０ｍＬの清浄化産物を各実行において充填した。これによって３．４２ｇ／Ｌの濃度で１９．５Ｌの精製ｍＡｂの回収をもたらし、それはわずか７０Ｌのバッファーを使用した９３％の収率を表す。
【０１９２】
以下の表は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５９５２８中に記載の２工程の精製法の特徴と比較した、この精製法の特徴を要約する。
【０１９３】
【表１１】
2019104735.tif 000012
【０１９４】
したがって、本発明の連続的多工程法は、使用するバッファー体積を３３％、および使用する樹脂体積を９７％減らすことができる。
【実施例７】
【０１９５】
異なるモノクローナル抗体の精製
ヒト化抗ＣＤ３８抗体に加えて、国際公開Ｎｏ．ＷＯ２００９／０６５０５４中に記載されたように、前に記載した連続的多工程法を使用して、別の抗体、すなわち細菌表面多糖ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）に特異的に結合する完全ヒト抗体、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合するモノクローナル抗体、および筋原線維原型のヒトβ−アミロイドタンパク質に結合するヒト化１３Ｃ３ｍＡｂを精製した。
【０１９６】
以下の表は、これら３抗体の精製によって得た全体収率および純度を示す。
【０１９７】
【表１２】
2019104735.tif 000013
【０１９８】
結論として、４つの異なる抗体に関して、連続的多工程法は精製抗体の充分な収率および高度の純度を得ることができ、精製抗体がヒトへの投与に適した性質を有することを確認した。
【実施例８】
【０１９９】
膜吸着剤の連続的多工程法
使い捨て膜吸着剤を使用する本発明の方法を、ＣＤ３８に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ３８ｍＡｂ）の大規模精製に適用した。
【０２００】
材料および方法
材料
第１の工程：それぞれ２ｍＬの４つのＳａｒｔｏｂｉｎｄプロテインＡ膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
第２の工程：それぞれ３ｍＬの２つのＳａｒｔｏｂｉｎｄＳ「ナノ」膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
第３の工程：３ｍＬの１つのＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ「ナノ」膜吸着剤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
２０ｍＭのＢｉｓＴｒｉｓ、８０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ６．２とする量の酢酸で作製した第２の工程の溶出バッファー以外、使用したバッファーは実施例４中に記載したバッファーと同じであった。
【０２０１】
方法
この方法を実行して、連続式に前述の３工程で、それぞれ３０ｍｇの５０回実行により１．５ｇの抗体を精製した。
【０２０２】
簡潔には、プロテインＡ膜吸着剤を平衡化バッファーで平衡化し、次いで充填した。充填後、第１の溶出バッファーを用いた溶出の前に、膜吸着剤を再度平衡化した。プロテインＡ膜吸着剤の溶出液を陽イオン交換膜吸着剤に直接充填した。陽イオン交換膜は平衡化バッファーで平衡化し、一方プロテインＡ膜吸着剤は次の充填前にサニテーションバッファーで消毒殺菌した。陽イオン交換膜吸着剤は第２の溶出バッファーで溶出し、溶出液は陰イオン交換膜吸着剤に直接充填した。
【０２０３】
結果
７５０分（実行当たり１５分）で１．５ｇの抗体を精製することができた。回収率は約８０％であった。
【０２０４】
分析結果は以下の表中に要約する。
【０２０５】
【表１３】
2019104735.tif 000014
【０２０６】
したがって、使い捨て膜吸着剤を使用した本発明による連続的多工程法によって、再利用可能な樹脂を使用する方法と比較した方法およびバッファーのさらなる最適化なしで、本明細書内の満足のいく不純物除去率を得ることができる。
【０２０７】
さらに、図４中に示されるように、各実行間で傾向は如何なる有意な差も示さなかった。したがって本発明者らは、使い捨て膜吸着剤は実際に安定性があり如何なる性能低下もなく５０回実行にわたり再利用できたことを、驚くことに実証した。
【０２０８】
本発明の方法中でカラムではなく膜吸着剤を使用する主な利点を以下に要約する：
比較可能な規模で、膜吸着剤はカラムより１０倍高い流速で使用することができ、それによって工程の時間を劇的に短縮することができる。例えば、樹脂を充填した５ｍＬカラムは１ｍＬ／分の流速で使用され、一方相当する５ｍＬ膜吸着剤は少なくとも１０ｍＬ／分の流速で使用される。したがって、樹脂を充填した３カラムを使用して本発明の３クロマトグラフィー工程法を２時間３０分かかって実行する場合、膜吸着剤を使用するとそれは１５分で完了することができる。
それらが再利用可能である場合であっても膜吸着剤は使い捨てデバイスであり、したがってそれらはバッチ後に廃棄することができ、長期にわたり貯蔵する必要がない。したがって、それらを試験して長期の安定性を裏付ける必要はない。
膜吸着剤を使用する本発明の方法は、カラムコスト、カラム充填およびカラム貯蔵を回避することによって安価となる。
【実施例９】
【０２０９】
ＧＭＰ規模の連続的多工程法
前述の方法を、ＣＤ３８膜貫通型糖タンパク質に特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＤ３８ｍＡｂ）の大規模精製に適用した。
【０２１０】
材料および方法
材料
第１の工程：３５ｍｇ／ｍＬの動態結合容量（ＤＢＣ）を有する６ＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ樹脂
第２の工程：３５ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを有する６ＬのＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂
第３の工程：１７０ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを有する６ＬのＢｉｏＰｒｏＱ７５樹脂
前述の３カラムを一列に含み全カラムのモニタリングを可能にする、（３カラムを操縦する）ＧＥからの２つのＡｋｔａＰｒｏｃｅｓｓおよび（第１の工程と第２の工程の間に低ｐＨで不活性化の工程を実行する）Ｓａｒｔｏｒｉｕｓからの１つのＦｌｅｘａｃｔ。
【０２１１】
方法
一連の７回実行を連続的に実行した。
【０２１２】
結果
一連の実行によって、１６時間未満で１．３Ｋｇの抗ＣＤ３８モノクローナル抗体を精製することができた。
【０２１３】
大量採取の１４．４Ｋｇを充填し１．３０Ｋｇの精製モノクローナル抗体を回収した。したがって、本発明の連続的多工程法によって９０％の平均収率に到達することができた。これらの１．３Ｋｇの精製モノクローナル抗体は１６時間以内に得た。
【０２１４】
比較対象として、２工程法による５００Ｌバッチの精製は３日間かかり２０Ｌカラムを使用する。
【０２１５】
したがって本発明による連続手法は、時間と原材料の節約を可能にする（６６％を超える樹脂体積を節約する）進展である。
【０２１６】
さらに、最終産物の分析結果は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５９５２８中に記載の２工程法で得た最終産物のそれに匹敵した。これらの分析結果は以下の表中に要約する。
【０２１７】
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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