(57)【要約】【課題】安全性が高く、長期摂取可能な、新たなＨｓｐ発現促進剤の提供。【解決手段】次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。2019034907.tif 000010（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。
【化１】
2019034907.tif 000008
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
【請求項２】
Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする請求項１に記載の熱ショックタンパク質発現促進剤。
【請求項３】
次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【化２】
2019034907.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
【請求項４】
Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする請求項３に記載の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【請求項５】
熱ショックタンパク質がＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上である請求項１若しくは２記載の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は請求項３若しくは４に記載の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【請求項６】
熱ショックタンパク質がＨｓｐ７０である請求項１若しくは２記載の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は請求項３若しくは４に記載の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな熱ショックタンパク質（Heat Shock Protein、Ｈｓｐ）発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）は、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり、タンパク質のフォールディングを制御する分子シャペロンとして機能すると考えられている。
【０００３】
一方、特発性肺線維症に代表される肺線維症は、肺組織が長期にわたって傷害され、線維化する症状であり、原因には間質性肺炎、過敏性肺炎などが考えられている難病である。従来、肺線維症の治療法としてはインドリノン誘導体を投与する方法があるが（特許文献１）、重度の下痢や肝機能障害等、重篤な副作用を招く恐れがある。
近年、肺組織の線維化の予防及び治療にはＨｓｐが関与していることが報告されている（非特許文献１）。
したがって、Ｈｓｐ発現促進剤は、肺線維症の予防及び治療に有用であると考えられ、Ｈｓｐの発現を促進し、肺線維症の予防又は治療に有用で、安全性が高く、長期摂取可能な物質の探索が望まれている。
【０００４】
ヒドロキシシナモイル誘導体の１種である１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースは、腎上皮ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるラジカル消去効果および当該細胞の酸化的損傷に対する保護効果を有すること（非特許文献２）等が報告されている。
【０００５】
しかしながら、ヒドロキシシナモイル誘導体がＨｓｐの発現促進作用を有することはこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２５３７０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takayoshi Fujibayashi et al., BMC Pulmonary Medicine 2009, 9-45
【非特許文献２】Xiang  Lan  PIAO et al.，J Nutr Sci Vitaminol, 51, 142-147, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、安全性が高く、長期摂取可能な、新たなＨｓｐ発現促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、多くの天然物の中からＨｓｐ発現促進剤を見出すべく検討した結果、特定のヒドロキシシナモイル誘導体が優れたＨｓｐ発現促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進剤。
【００１１】
【化１】
2019034907.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
２）Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする１）の熱ショックタンパク質発現促進剤。
３）次の一般式（１）で表されるヒドロキシシナモイル誘導体を有効成分とする熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【００１３】
【化２】
2019034907.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である）
４）Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であるヒドロキシシナモイル誘導体（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）を有効成分とする３）に記載の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
５）熱ショックタンパク質がＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上である１）若しくは２）の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は３）若しくは４）の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
６）熱ショックタンパク質がＨｓｐ７０である１）若しくは２）の熱ショックタンパク質発現促進剤、又は３）若しくは４）の熱ショックタンパク質発現促進用食品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、ケールやブロッコリーから容易に取得可能であり、長期摂取可能である。したがって、本発明のＨｓｐ発現促進剤は、安全性の高いＨｓｐ発現促進剤として、Ｈｓｐが関与する疾患、例えば肺線維症の予防治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ケール抽出物分画物のＨＰＬＣクロマトグラム。（Ａ）：ポリフェノール濃縮物の分画、（Ｂ）：Ｆ４画分の分画
【図２】Ｈｓｐ７０発現促進作用。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は前記一般式（１）で表されるものであり、式中、Ｒ１〜Ｒ４は、シナポイル基、フェルロイル基及び水素原子のいずれかを示し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがシナポイル基であり、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つがフェルロイル基である。本発明において、シナポイル基は下記式（ａ）で表される基であり、フェルロイル基は下記式（ｂ）で表される基である。
【００１８】
【化３】
2019034907.tif 000004
【００１９】
また、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体のうち、Ｈｓｐ発現促進作用の点から、前記一般式（１）において、Ｒ１がシナポイル基であり、Ｒ２がフェルロイル基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子である化合物（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）が好ましい。１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースは下記式で示される化合物である。
【００２０】
【化４】
2019034907.tif 000005
【００２１】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、植物体から抽出・精製することにより取得することができる。植物体からの抽出・精製は、例えば、ケール、ブロッコリー、キャベツ等のアブラナ科植物の葉、茎等から溶剤抽出して得られる抽出物を、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を用いて分離・精製することにより得ることができる。以下に、ケールから本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の１つである、１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースの単離例を示す。
【００２２】
１）ケール葉を細断及び／又は粉砕した後、搾汁処理することにより得られるケール搾汁を熱風乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末化したケール搾汁の粉末にメタノール水溶液を加えて攪拌抽出し、遠心分離してケール抽出物を得る。
２）１）で得られたケール抽出物を、ＯＤＳカラム（例えば、ＩｎｅｒｔＳｅｐ  Ｃ１８カラム）に吸着させ、カラムに吸着している画分を６０％メタノールで溶出させ，濃縮乾固して、ポリフェノール画分を得る。
３）２）で得られた濃縮物を５％アセトニトリル−０．２％酢酸に溶解し、分取ＨＰＬＣ（例えば、ＯＤＳカラム（例えばＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム）、移動相（溶離液Ａ：５％アセトニトリル−０．２％酢酸、溶離液Ｂ：９５％アセトニトリル−０．２％酢酸）によるグラジエント溶出）に供して図１Ａに示す５画分（Ｆ１〜Ｆ５）を得、さらにＦ４画分を前記分取ＨＰＬＣと同様の条件のＨＰＬＣに供して図１Ｂに示す８の画分（Ｆ４−１〜Ｆ４−８）を得、Ｆ４−７画分から１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを単離する。
【００２３】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、植物体から抽出したものをそのまま用いてもよく、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。なお、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は化学合成によっても得ることができる。また、本発明のＨｓｐ発現促進剤として、ヒドロキシシナモイル誘導体の含量が高いケール等の植物を使用してもよい。これらの植物は植物体全体、または葉、茎、根、花蕾等植物体の一部を使用してもよく、これらをそのまま、あるいは加熱、破砕、搾汁等の処理を行ったものを使用してもよい。また、植物体における本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の含量を指標として、ヒドロキシシナモイル誘導体の含量が高く、Ｈｓｐ発現促進効果が高いケール等の植物新品種の開発を行うことができる。
【００２４】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、後記実施例に示すように、Ｈｓｐ７０の発現促進作用を有する。したがって、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体は、Ｈｓｐ発現促進剤となり、Ｈｓｐ発現促進のために使用できる。
Ｈｓｐには、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０（Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ３２等があり、本発明のＨｓｐ発現促進剤が発現を促進させるＨｓｐは特に限定されるものではないが、Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０からなる群から選ばれる１種以上が好ましく、Ｈｓｐ７０がより好ましい。
Ｈｐｓは、細胞が熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり、分子シャペロンとして機能するが、Ｈｓｐ１０４、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ４７、Ｈｓｐ４０、Ｈｓｐ３２等は、Ｈｓｐの中でも主要な分子種、若しくは主要な分子種のコファクターであり、これらの発現が促進されると、より強いＨｓｐの分子シャペロン機能が期待できる。
肺線維症は、過剰なコラーゲンと他の細胞外マトリックスの蓄積により肺組織が線維化した症状をいう。中でも、特発性肺線維症は、５年生存率が２０〜４０％の予後不良の慢性難治性疾患である。近年、肺組織の線維化の予防および治療には、Ｈｓｐが関与していることが報告されている（非特許文献１）。したがって、Ｈｓｐ発現促進剤は、肺線維症の予防及び治療に有用である。肺線維症は、難病であり、通常、副作用の多いステロイド療法が行われている疾患であることから、安全性が高く、長期間摂取可能なケール又はその加工物により予防及び治療できることは、極めて有益である。
【００２５】
本発明において、「Ｈｓｐの発現促進」とは、Ｈｓｐ  ｍＲＮＡへのＨｓｐ遺伝子の転写を誘導又は促進すること、Ｈｓｐタンパク質へのＨｓｐ  ｍＲＮＡの翻訳を誘導又は促進することが挙げられる。
【００２６】
上記のＨｓｐ発現促進剤、Ｈｓｐ発現促進用食品は、Ｈｓｐの発現を促進するため、肺線維症を予防又は改善するための医薬品、医薬部外品、サプリメント又は食品となり、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤となり得る。
尚、上記食品には、一般飲食品のほか、Ｈｓｐの発現促進、肺線維症の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性表示食品、特定保健用食品等が包含される。
【００２７】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を含む上記医薬品（医薬部外品を含む）は、任意の投与形態で投与され得るが、経口投与が好ましい。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。
【００２８】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２９】
また、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を配合した上記食品の形態は、各種食品組成物の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３０】
上記の医薬品（医薬部外品を含む）や食品中の本発明のヒドロキシシナモイル誘導体の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、製剤全質量の０．００１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１質量％である。
【００３１】
本発明のヒドロキシシナモイル誘導体を医薬品や食品として、或いは医薬品や食品に配合して使用する場合の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与の場合の成人１人当たりの１日の投与量は、通常、本発明のヒドロキシシナモイル誘導体として好ましくは０．０１ｍｇ〜５００ｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｇ、さらに好ましくは０．１〜１０ｇ、よりさらに好ましくは０．１〜１ｇである。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【００３３】
製造例１  １−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースの取得
（１）ケール搾汁（品種名：ハイクロップ）の粉末（ケール搾汁由来の固形分４０％，以下ケール粉末）を使用した。ケール抽出液の調製として，ケール粉末７ｇを７０％メタノール１４ｍＬに懸濁し，ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ，ＰＴ３１００）を用いて氷上で破砕処理（１２，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ）を３回行った。次に，超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ，ＳＬＰｅ  ４０，先端部６．３５ｍｍ径）を用いて氷上で超音波抽出を行った。遠心分離（４０００ｇ，４℃，１０分間）の上清を，さらに遠心分離（１５，０００×ｇ，４℃，１５分間）し、得た上清を０．４５μｍフィルターで濾過し，凍結乾燥したものをケール抽出物とした。
【００３４】
（２）次に，固相抽出によりポリフェノール成分の濃縮を行った。ＩｎｅｒｔＳｅｐ  Ｃ１８カラム（ジーエルサイエンス，カラムサイズ２ｇ／１２ｍＬ）をメタノール１２ｍＬでコンディショニングし，水１２ｍＬで平衡化し，（１）で調製したケール抽出物を１０％メタノールで溶解した試料１０ｍＬを加えてカラムに吸着させた。続いて，１０％メタノール６ｍＬでカラム洗浄を行った後，カラムに吸着している画分を６０％メタノール４ｍＬで溶出させ，サンプル濃縮機（バイオメディカルサイエンス，ＭＤ２００）で濃縮乾固した。
【００３５】
（３）（２)で得られた濃縮乾燥物を６０％メタノールに溶解し、以下に示す条件で分取ＨＰＬＣに供して図１Ａに示す５画分（Ｆ１〜Ｆ５）を得、さらにＦ４画分を再度ＨＰＬＣに供して図１Ｂに示す８の画分（Ｆ４−１〜Ｆ４−８）を得、Ｆ４−７画分から１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを単離した。なお、Ｆ４画分のＨＰＬＣ条件は（２）で得られた濃縮乾燥物を分画するＨＰＬＣ条件と同一である。
＜分取ＨＰＬＣの条件＞
・カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３カラム（ジーエルサイエンス，５ｍｍ，１０×２５０ｍｍ）
・インジェクション量：５００μＬ
・流速：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
・移動相：溶離液Ａ（５％アセトニトリル−０．２％酢酸）、溶離液Ｂ（９５％アセトニトリル−０．２％酢酸）
・グラジエント条件：表１の通り
・カラム温度４０℃
・検出：ＵＶ２８０ｎｍ
・カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａｖｐ（島津製作所），ポンプ：ＰＵ−２０８９  Ｐｌｕｓ（日本分光），ＵＶ検出器：ＵＶ−２０７５  Ｐｌｕｓ（日本分光）
【００３６】
【表１】
2019034907.tif 000006
【００３７】
＜Ｆ４−７画分から単離された化合物（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）のＮＭＲ及びマススペクトル）＞
1H-NMR(800MHz、DMSO-d6)δ;
7.55 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7’), 7.53 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-7 ), 7.27 (1H, s, H-2’), 7.06 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6’), 6.99 (2H, s, H-2, 6), 6.76 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5’), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8), 6.44 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8’), 5.78 (1H, d, J = 8.4 Hz, glc-1), 4.91 (1H, dd, J = 9.0, 9.0 Hz, glc-2), 4.20 (1H, d, J = 7.8 Hz, glc-1’), 4.04 (1H, d, J = 10.2 Hz, glc-6a), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.77 (6H, s, -OCH3), 3.65-3.59 (4H, m, glc-3,5, 6b), 3.45 (1H, m, glc-4), 3.13 (1H, dd, J = 8.6, 8.6 Hz, glc-3’), 3.06 (3H, m, glc-4,4’,5’), 2.98 (1H, dd, J = 8.4, 8.3 Hz, glc-2’).
【００３８】
13C-NMR(200MHz、DMSO-d6)δ;
165.7 (C-9), 165.0 (C-9’), 149.3 (C-4’), 148.1 (C-3,5), 148.1 (C-3’), 147.4 (C-7), 145.5 (C-7’), 138.8 (C-4), 125.5 (C-11), 123.9 (C-1), 123.4 (C-6’), 115.4 (C-5’), 114.0 (C-8’), 113.5 (C-8), 106.6 (C-2’), 103.1 (glc-1’), 91.9 (glc-1), 76.9 (glc-5’), 76.7 (glc-5), 76.4 (glc-3’), 73.4 (glc-3), 72.5 (glc-2’) 70.0 (glc-4’), 69.5 (glc-4), 67.8 (glc-6), 61.0 (glc-6’), 56.1 (OCH3), 55.6 (OCH3).
【００３９】
ESI-MS (negative ion mode) m/z 723.2143 （[M-H]-）
【００４０】
実施例１  Ｈｓｐ発現促進作用
（１）ＴＩＧ−１細胞の培養
正常ヒト線維芽細胞ＴＩＧ−１は，独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ細胞バンク（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）より購入した。ＴＩＧ−１細胞は，１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清），５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン，５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンを含むＭＥＭ−α培地でＣＯ２インキュベーター（ＳＣＡ−８０ＤＲ，ＡＳＴＥＣ社）を用いて３７℃，５％ＣＯ２下で、終濃度５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように６ｃｍ２シャーレに１．５ｍＬ播種し，２日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを顕微鏡により確認した後，順次実験に使用した。本実験では，集団倍化数（ＰＤＬ）＝２７〜３９のＴＩＧ−１細胞を使用した。
【００４１】
（２）遺伝子発現解析
製造例１で得られた１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース（Ｆ４−７画分）を（１）で得られたＴＩＧ−１細胞に終濃度８０μｇ／ｍＬとなるよう６ｃｍ２シャーレに１．５ｍＬ添加し，３７℃，５％ＣＯ２下で２４時間培養した。また、（１）で得られたＴＩＧ−１細胞に１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオースを添加せずに前記と同様に培養したものをｃｏｎｔｒｏｌとした。両サンプルの培地を除去し，ＰＢＳで２回洗浄し，１シャーレ当たり１．４ｍＬのＴｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター社）を加え，ピペッティングにより細胞を回収し，Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した後，ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を使ってｃＤＮＡを合成し，これをテンプレートＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲ法によりＨｓｐ７０遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲではＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｑＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｋａｐａ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用し、使用したＨＳＰＡ１（Ｈｓｐ７０）、β−ａｃｔｉｎのプライマーは表２に示した。反応溶液は，テンプレートＤＮＡ含有試料２μＬ，プライマー溶液（５μｍｏｌ／μＬ）各０．４μＬ，ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  １０μＬ，および滅菌水７．６μＬを用いて全量を２０μＬとした。反応条件は，プレインキュベートを９５℃，１分間行った後，熱変性を９５℃，３０秒間，アニーリングを６０℃，３０秒間，伸長反応を７２℃，１分間で，４０サイクルとした。ハウスキーピング遺伝子のβ−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡを内部標準遺伝子とし，Ｈｓｐ７０  ｍＲＮＡの発現量をＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｉｎｇｌｅ（タカラバイオ社）で測定し，Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（タカラバイオ社）により比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて解析した。結果を図２に示した。図２においては、ｃｏｎｔｒｏｌのｍＲＮＡ発現量を１とした相対値で示した。
【００４２】
【表２】
2019034907.tif 000007
【００４３】
図２より、Ｆ４−７画分（１−シナポイル−２−フェルロイルゲンチオビオース）には、Ｈｓｐ７０遺伝子発現量の上昇が認められ、Ｈｓｐ７０発現促進作用を有することが示された。
【図１】
2019034907.tif 000011
【図２】
2019034907.tif 000012
【配列表】
2019034907000001.app