(57)【要約】【課題】トラスツズマブの副作用と関連する遺伝子多型を特定し、当該遺伝子多型を用いてトラスツズマブの副作用を予測する。【解決手段】被検者におけるrs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を分析し、当該遺伝子多型の遺伝子型を判定し、判定した遺伝子型に基づいてトラスツズマブ投与による副作用を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者から採取された生体試料中のゲノムDNAに存在する、rs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を分析し、当該遺伝子多型の遺伝子型を判定し、判定した遺伝子型に基づいてトラスツズマブ投与による副作用を判定する方法。
【請求項２】
上記rs139944387で特定される遺伝子多型は、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列における9775番目において、野生型がチミンであり変異型がシトシンである一塩基多型であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記rs139944387で特定される遺伝子多型が野生型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用が低いと判定し、変異型と野生型のヘテロである場合にはトラスツズマブの副作用が高いと判定し、変異型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用がより高いと判定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記被検者は、HER2過剰発現が確認された癌の患者であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記癌は乳癌又は胃癌であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
上記副作用は心不全、心原性ショック、肺浮腫、心嚢液貯留、心筋症、心膜炎、不整脈及び徐脈から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
rs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を含む連続する５〜５０塩基の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、トラスツズマブ投与による副作用判定用プローブセット。
【請求項８】
上記５〜５０塩基の領域は、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列における9775番目を含むことを特徴とする請求項７記載の副作用判定用プローブセット。
【請求項９】
上記rs139944387で特定される遺伝子多型における野生型に対応する野生型プローブと、当該遺伝子多型における変異型に対応する変異型プローブとを含む請求項７記載の副作用判定用プローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トラスツズマブ副作用判定方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
トラスツズマブは、HER2（Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2(ヒト上皮増殖因子受容体２型、別称：c-erbB-2)）を標的としたヒト化モノクローナル抗体を主成分とする抗悪性腫瘍剤（商品名：ハーセプチン）である。HER2は、転移性乳癌患者の約25〜30%で過剰発現が認められる。HER2の過剰発現は、がん細胞の増殖を促進し、HER2過剰発現腫瘍は予後不良であることが知られている。トラスツズマブは、現在、HER2過剰発現が確認された乳癌患者、又はHER2過剰発現が確認された治癒切除不能な進行・再発の胃癌患者に対して投与することができる。
【０００３】
トラスツズマブ投与による副作用としては、一例として、心障害：心不全(症候：呼吸困難、起座呼吸、咳嗽等、症状・異常：S3ギャロップ、駆出率低下、末梢性浮腫等)、心原性ショック、肺浮腫、心嚢液貯留、心筋症、心膜炎、不整脈、徐脈等が挙げられている。よってトラスツズマブの投与の際には、心症状の発現状況・重篤度等に応じて必ず心機能検査(心エコー等)を行い、患者の状態(左室駆出率（LVEF）の変動を含む)を十分に観察することとされている。このように、トラスツズマブについては心毒性を有することが知られている。
【０００４】
従来、トラスツズマブ投与による副作用については、上述した心毒性の観点から、アントラサイクリン系薬剤を投与中の患者又はその前治療歴のある患者、胸部へ放射線を照射中の患者、心不全症状のある患者又はその既往歴のある患者、左室駆出率(LVEF)が低下している患者、コントロール不能な不整脈のある患者、臨床上重大な心臓弁膜症のある患者、冠動脈疾患(心筋梗塞、狭心症等)の患者又はその既往歴のある患者、高血圧症の患者又はその既往歴のある患者、安静時呼吸困難(肺転移、循環器疾患等による)のある患者又はその既往歴のある患者、若しくは高齢者に対しては慎重投与が推奨されていた。しかしながら、トラスツズマブ投与前において副作用を予測する指標は知られていないのが現状であった。
【０００５】
ところで、網膜色素変性症の原因遺伝子の一つとしてEYS遺伝子が知られている。非特許文献１及び２には、EYS遺伝子に存在する特定の遺伝子多型が網膜色素変性症に関与していることが報告されている。また、非特許文献３には、EYS遺伝子に存在する特定の遺伝子多型が重度のスタチン誘導性筋疾患に関与することが示されている。なお、特許文献１には、EYS遺伝子に存在する特定の遺伝子多型を検出するためのプライマーセット、プローブ、マイクロアレイ、及びこれらを備える検出キット、並びに網膜色素変性症原因遺伝子変異の検査方法が開示されている。
【０００６】
このように、EYS遺伝子に存在する特定の遺伝子多型が網膜色素変性症や重度のスタチン誘導性筋疾患に関連することが知られているものの、トラスツズマブといった抗体医薬、抗悪性腫瘍剤による副作用との関連は知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】El-Aziz, Mai M. Abd, et al. "EYS, encoding an ortholog of Drosophila spacemaker, is mutated in autosomal recessive retinitis pigmentosa."Nature genetics 40.11 (2008): 1285-1287.
【非特許文献２】Hosono, Katsuhiro, et al. "Two novel mutations in the EYS gene are possible major causes of autosomal recessive retinitis pigmentosa in the Japanese population."PLoS One 7.2 (2012): e31036.
【非特許文献３】Isackson, Paul J., et al. "Association of common variants in the human eyes shut ortholog (EYS) with statin‐induced myopathy: Evidence for additional functions of EYS."Muscle & nerve 44.4 (2011): 531-538.
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第5828499号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、トラスツズマブの副作用と関連する遺伝子多型は知られておらず、遺伝子多型に基づいてトラスツズマブの副作用を判定することはできなかった。
【００１０】
そこで、本発明は、トラスツズマブの副作用と関連する遺伝子多型を特定し、当該遺伝子多型を用いてトラスツズマブの副作用を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、トラスツズマブの副作用に関連する遺伝子多型を見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
【００１２】
（１）被検者から採取された生体試料中のゲノムDNAに存在する、rs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を分析し、当該遺伝子多型の遺伝子型を判定し、判定した遺伝子型に基づいてトラスツズマブ投与による副作用を判定する方法。
（２）上記rs139944387で特定される遺伝子多型は、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列における9775番目において、野生型がチミンであり変異型がシトシンである一塩基多型であることを特徴とする（１）記載の方法。
（３）上記rs139944387で特定される遺伝子多型が野生型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用が低いと判定し、変異型と野生型のヘテロである場合にはトラスツズマブの副作用が高いと判定し、変異型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用がより高いと判定することを特徴とする（１）記載の方法。
（４）上記被検者は、HER2過剰発現が確認された癌の患者であることを特徴とする（１）記載の方法。
（５）上記癌は乳癌又は胃癌であることを特徴とする（４）記載の方法。
（６）上記副作用は心不全、心原性ショック、肺浮腫、心嚢液貯留、心筋症、心膜炎、不整脈及び徐脈から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１）記載の方法。
（７）rs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を含む連続する５〜５０塩基の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、トラスツズマブ投与による副作用判定用プローブセット。
（８）上記５〜５０塩基の領域は、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列における9775番目を含むことを特徴とする（７）記載の副作用判定用プローブセット。
（９）上記rs139944387で特定される遺伝子多型における野生型に対応する野生型プローブと、当該遺伝子多型における変異型に対応する変異型プローブとを含む（７）記載の副作用判定用プローブセット。
【００１３】
なお、本発明に係るトラスツズマブ投与による副作用判定用プローブセットは、検体に含まれる上記５〜５０塩基の領域を増幅させるプライマーを含むトラスツズマブによる副作用判定キットとしても良い。すなわち、本発明に係るキットは、EYS遺伝子におけるrs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を含む連続する５〜５０塩基の領域を特異的に増幅させるプライマーと、その増幅された領域と特異的にハイブリダイズする上記副作用判定用プローブセットを含むものであってもよい。また、本発明に係るキットは、上記領域を増幅させる際に必要な各種試薬及び/又は増幅した領域と上記核酸プローブとを特異的にハイブリダイズさせる際に必要な各種試薬を含むものであってもよい。さらに、上記トラスツズマブによる副作用判定用プローブセットを担体に固定することで、トラスツズマブによる副作用判定用DNAチップとすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、遺伝子多型を検出するといった簡便な手段によりトラスツズマブ投与による副作用を高精度に判定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、EYS遺伝子におけるrs139944387で特定される遺伝子多型又は当該遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型を特定することにより、トラスツズマブ投与による副作用を判定する方法である。トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）は、ヒトHER2分子を標的分子とした分子量148kDaのヒト化モノクローナル抗体であり、HER2分子の細胞外領域のエピトープ（aa529-625）と特異的に結合する。トラスツズマブは、トレハロース水和物、L-ヒスチジン塩酸塩水和物、L-ヒスチジン及びポリソルベート等の添加物を含有する注射用組成物として医薬として利用される。HER2過剰発現が確認される癌、例えば、HER2過剰発現が確認された乳癌及びHER2過剰発現が確認された治癒切除不能な進行・再発の胃癌を挙げることができる。
【００１６】
すなわち、本発明によれば、上述した各種癌に対するトラスツズマブ投与による副作用を判定することができる。
【００１７】
上記遺伝子多型を特定するには、被検者から採取された生体試料に含まれるゲノムDNAを用いることができる。ここで、被検者から採取する生体試料は、ゲノムDNAを含むものであれば特に制限されない。例えば、血液及びこれに由来する血液関連試料（血液、血清及び血漿など）、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水及び髄液等の体液、ならびに細胞、組織または臓器の破砕物及び抽出液などが挙げられる。本発明においては、好ましくは、血液関連試料を用いる。
【００１８】
被検者から採取した生体試料からゲノムDNAを抽出する抽出手段としては、特に限定されず、前記生体試料から直接的にDNA成分を分離し、精製して回収できる手段であることが好ましい。
【００１９】
ここで、EYS遺伝子（NCBI Reference Sequence: NM_001142800.1 (mRNA)）の塩基配列を配列番号１に示す。EYS遺伝子におけるrs139944387で特定される遺伝子多型は、配列番号１に示す塩基配列における9775番目に位置する。rs139944387で特定される遺伝子多型（すなわち、配列番号１に示す塩基配列の9775番目の塩基）は、野生型ではチミンであり、変異型ではシトシンである。なお、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列の相補鎖については、野生型がアデニンであり、変異型がグアニンである。
【００２０】
「連鎖不平衡」とは、生物の集団において、複数の遺伝子座の対立遺伝子又は遺伝的マーカー（多型）の間にランダムでない相関が見られる、すなわちそれらの特定の組合せ（ハプロタイプ）の頻度が有意に高くなる集団遺伝学的な現象を意味し、「遺伝的連鎖」とは、特定の対立遺伝子の組合せが、メンデルの独立の法則に従わずに親から子へ一緒に遺伝する遺伝学的現象を意味する。具体的に、rs139944387で特定される遺伝子多型と連鎖不平衡若しくは遺伝的連鎖にある遺伝子多型としては、特に限定されないが、例えば、rs369842650とrs111991705及びrs115820073で特定される一塩基多型を挙げることができる。なお、rs139944387は、rs369842650とrs111991705の間、及びrs369842650とrs115820073の間に位置する（r2=1.0）。
【００２１】
上述した遺伝子多型を特定する方法、すなわち遺伝子多型をタイピングする方法としては、公知の一塩基多型を分析する方法を用いることができ、リアルタイムPCR法、ダイレクトシーケンシング法、TaqMan(登録商標)PCR法、インベーダー（登録商標）法、ルミネックス（登録商標）法、クエンチングプライマー／プローブ（QP）法、MALDI-TOF法、分子ビーコン法等を挙げることができる。具体的には、被検者（通常、ヒト被検者をさす）から採取した生体試料のゲノムDNAを鋳型とする増幅反応によって測定対象の一塩基多型部位を含む核酸断片を、プライマーを用いて増幅し、得られた核酸断片と、野生型及び変異型に対応する一対のプローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法や、上記PCR増幅過程において、当該一塩基多型部位に特異的なプローブを用いることで、野生型及び変異型を検出する方法を挙げることができる。
【００２２】
遺伝子多型を特定する際に用いるプローブセット（すなわち、トラスツズマブ投与による副作用判定用プローブセット）としては、rs139944387で特定される遺伝子多型を含む連続する５〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１０塩基〜３０塩基の領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブセットであればよい。また、プローブとしてLocked Nucleic Acid（LNA）等の人工核酸を用いて合成したオリゴプローブを用いることで、短い塩基でも特異的にハイブリダイズするプローブとすることが可能となる。なお、プローブセットとは、野生型のアレルに対応する野生型プローブと、変異型アレルに対応する変異型プローブとを意味する。一例として、野生型プローブの塩基配列を配列番号２（TAGTT-T-AGAGC）に示し、変異型プローブの塩基配列を配列番号３（TAGTT-C-AGAGC）に示す。
【００２３】
ストリンジェントな条件下としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、6×SSC（1.5M NaCl，0.15M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を10×SSＣとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で45℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで50℃にて洗浄するような条件を挙げることができる。また、ストリンジェントな条件下は、Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6を参照して適宜設定することができる。或いは、ストリンジェントな条件下としては、3×SSC/0.3×SDSを含む溶液中で54℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄液A（10×SSC/1%SDS溶液）、洗浄液B（20×SSC）及び洗浄液Ｃ（5×SSC）で順次洗浄するような条件（特開2011-250726参照）等の条件を挙げることができる。 
【００２４】
また、遺伝子多型を特定する際に用いるプローブセットは、担体上に固定して用いてもよく、担体としては、平面状の基板やビーズ状の球状担体を挙げることができ、具体的には、特開2011-250726に記載された担体を挙げることができる。また、野生型を検出するプローブとバリアント型を検出するプローブとを同一の担体に固定してもよいし、異なる担体に固定してもよい。
【００２５】
上記遺伝子多型を特定する方法において用いるプライマーとしては、ゲノムDNAを鋳型として、rs139944387で特定される遺伝子多型を含む連続する少なくとも５塩基を核酸断片として増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマーであればよい。より具体的には、配列番号１に示すEYS遺伝子の塩基配列の9775番目の塩基を含む少なくとも５塩基、好ましくは１０〜５００塩基、より好ましくは２０〜２００塩基、さらに好ましくは５０〜１００塩基を増幅することができるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを、配列番号１に示す塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
【００２６】
また、rs139944387で特定される遺伝子多型を含む連続する少なくとも５塩基を増幅する際に、あらかじめ標識したプライマーを用いるか、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として用いることで、増幅した配列を識別することが可能となる。標識物質としては特に限定されないが、放射性同位元素、蛍光色素、又はジゴキシゲニン（DIG）やビオチン等の有機化合物等を挙げることができる。
【００２７】
上記プローブ又はプライマーは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置等を使用することができる。
【００２８】
増幅した核酸断片が標識を有する場合、標識を検出することで各プローブ（トラスツズマブ投与による副作用判定用プローブセットに含まれる野生型プローブ又は変異型プローブ）にハイブリダイズした核酸断片を測定することができる。例えば、蛍光色素を標識として使用した場合には、当該蛍光色素に由来する蛍光強度を測定することによって、プローブにハイブリダイズした核酸断片を測定することができる。具体的には、野生型プローブにハイブリダイズした核酸断片と、変異型プローブにハイブリダイズした核酸断片との比を算出するには、野生型プローブにおける標識を検出したときの出力値と、変異型プローブにおける標識を検出したときの出力値とから算出することができる。なお、標識として蛍光標識を使用した場合は蛍光強度が出力値となる。
【００２９】
より具体的に、変異型プローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する出力値（蛍光強度）を、変異型プローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する出力値（蛍光強度）及び野生型プローブにハイブリダイズした核酸断片に由来する出力値（蛍光強度）の平均値で除算することで判定値を算出することができる。この判定値は、核酸断片に含まれる変異型の存在量を正規化した値に近似する。よって、当該判定値の高さによって、被検者における一塩基多型を分析し変異型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判別することができる。 
【００３０】
当該判定値を使用する場合、被検者における一塩基多型を分析して変異型をホモとして有しているか、野生型をホモとして有しているか、又はヘテロとして有しているかを判別するため、予め二段階の閾値（閾値Ａ及び閾値Ｂ）を設定することが好ましい。なお、ここで、閾値Ａ及び閾値Ｂは、（閾値Ａ＞閾値Ｂ）の関係を有しているものとする。すなわち、上述のように算出された判定値が閾値Ａを超えると変異型をホモとして有していると判断し、当該判定値が閾値Ａ以下であり閾値Ｂを超えるとヘテロとして有していると判断し、当該判定値が閾値Ｂ以下であると野生型をホモとして有していると判断できる。 
【００３１】
閾値Ａ及び閾値Ｂの設定方法としては、特に限定されないが、予め遺伝子型が判別している試料を用いて上述のように判定値を算出し、上記変異型をホモとして有している場合、野生型をホモとして有している場合、又はヘテロとして有している場合についてそれぞれ確率密度を正規分布として算出する方法を挙げることができる。このとき、確率密度が互いに重なる交点（確率密度の大小が入れ替わる位置で、それぞれの極大値の間）を求め、また、上記変異型をホモとして有している場合、野生型をホモとして有している場合、又はヘテロとして有している場合それぞれの平均値を求める。そして、変異型をホモとして有している場合とヘテロとして有している場合の閾値としては、（変異型をホモとして有している場合の平均値とヘテロとして有している場合の平均値）の平均値と交点の平均値として算出することができる。同様にヘテロとして有している場合と野生型をホモとして有している場合の閾値としては、（ヘテロとして有している場合の平均値と野生型をホモとして有している場合の平均値）の平均値と交点の平均値として算出することができる。
【００３２】
そして、被検者について上記rs139944387で特定される遺伝子多型が野生型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用が低いと判定し、変異型と野生型のヘテロである場合にはトラスツズマブの副作用が高いと判定し、変異型のホモである場合にはトラスツズマブの副作用がより高いと判定する。ここで、判定対象の被検者とは、上述したトラスツズマブの適応範囲の疾患を疑われた者或いは当該疾患と診断された者など特に限定されない。
【００３３】
また、副作用としては、心不全、心原性ショック、肺浮腫、心嚢液貯留、心筋症、心膜炎、不整脈及び徐脈から選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。言い換えると、副作用としては、トラスツズマブの心毒性に起因する症状と定義することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
〔材料と方法〕
〔患者〕
トラスツズマブ誘発心毒性を有する合計9人の乳癌患者を、本実施例における全エキソーム配列決定に使用した。がん細胞を含有しないホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）リンパ節又は血液サンプルから生殖細胞系DNAを抽出した。追試験では、NCC Biobankに登録されたサンプルから、トラスツズマブで治療された234人の患者（10人の症例及び224人の対照）を使用して追試を行った。なお、これら234人の患者の内訳は、乳癌が166例であり、胃癌が64例であり、その他が4例である。ここで、トラスツズマブ治療前と比較して左室駆出率（LVEF）が10％以上減少する毒性をトラスツズマブ誘発心毒性として定義した。この研究は、国立がん研究センターの施設審査委員会によって承認された。
【００３６】
〔全エキソーム配列決定〕
全エキソーム配列決定に際して、先ず、SureSelect XT Target Enrichment Kit（Agilent Technologies社製）を用いてシーケンシングライブラリーを調製し、製造業者のプロトコールに従ってSureSelect Human All Exon V5 + lncRNAキット（Agilent Technologies社製）を用いてキャプチャした。次いで、キャプチャされた各ライブラリーを、HiSeq 2000シークエンシングプラットフォーム（Illumina社製）にロードして100塩基のペアエンドリードで読み取った。製造業者のプロトコールに従ってSanger法又はTaqMan Genotyping Assays（Thermo Fisher Scientific社製）によりジェノタイピングを行い、トラスツズマブ誘発性心毒性に関連する可能性のある10種の候補変異の結果を検証した。
【００３７】
〔変異解析及びフィルタリング〕
全てのリードを、アライメントツール：BWAMEMを用いてヒトゲノム（GRCh37/hg19）にアライメントした。なお、本実施例では、以下の（i）〜（iv）のリードを削除した。（i）マッピング品質の低いリード、（ii）PCR重複のリード、（iii）アラインメントスコア（SAMフォーマットの「AS」タグを使用）が低く、及びミスマッチ率（リードの長さに対するミスマッチの数の百分率）≧5％のリード、及び（iv）準最適アライメントスコア（SAMフォーマットの「XS」タグを使用）が高く、及びミスマッチ率≧5％のリード。
【００３８】
生殖細胞系SNV/indel（一塩基変異/挿入/欠失）コールの分析は、Broad Genome Analysis Toolkit（GATK）v3.5のベストプラクティスに基づいて行った。GATKのIndelRealigner及びBaseRecalibratorによるindel再アライメント及び塩基品質スコアの再較正を実行した後、HaplotypeCallerを利用して各サンプルについてgVCFフォーマットを作成した。各サンプルのgVCFファイルは、GenotypeGVCFsによって統合した。以下の（１）〜（２）はVariantFiltrationによりフィルタリングした。（１）SNV：SnpCluster (クラスターサイズ=3、クラスターウインドウサイズ=10)、深度による品質(QD<2.0)、ストランドバイアスを検出するフィッシャーの正確検定を利用したフレッド-スケールされたp値（FS>60.0）、マッピング品質（MQ<40.0）、MappingQualityRankSumTest（MQRankSum<-12.5）、ReadPosRankSumTest（ReadPosRankSum<-8.0）、StrandOddsRatio（SOR> 4.0）、フレッド-スケールされた品質スコア（QUAL<50.0）：（２）INDEL：QD<2.0、FS>200.0、ReadPosRankSum<-20.0、SOR>10.0、サンプル間の近親交配の可能性に基づく試験(InbreedingCoeff<-0.8)。また、以下の（３）〜（６）についても本実施例ではフィルタリングした。（３）平均リード深度<8である変異、（４）Repeat Masker又はTandem repeat finderで同定される反復領域における変異、（５）ホモポリマーにおけるIndel変異、及び（６）偽陽性を減らすために、通常のパネルをフィルターとして使用した。
【００３９】
本実施例では、フィッシャーの正確確率検定を用いて、9つの症例サンプルと130の正常サンプルとの間の参照対立遺伝子及び変異対立遺伝子の数を統計的に比較することによって変異を抽出した。ここで、130の正常サンプルに対しては、症例サンプルと同じ方法を用いて全エキソーム配列決定とバリアントコールを行っている。p値≧0.05の変異を除外した。ANNOVARを使用して遺伝的変異に適切に注釈を付けた。これには、遺伝子アノテーション、アミノ酸変化注釈、SIFTスコア、PolyPhen2スコア及びdbSNP識別子が含まれている。
【００４０】
〔統計解析〕
フィッシャーの正確確率検定及びマンホイットニーU検定を用いて、臨床的特徴とトラスツズマブ誘発性心毒性との間の関連性の有意性を評価した。本実施例では、1,208の健常日本人由来の遺伝子型データを含むヒト遺伝的変異データベース（HGVD）（Nmax=1,208）において、マイナーアレル頻度（MAF）<0.05を有する変異を選択した。本実施例では、9症例（心毒性のサンプル）と1,208のコントロール（HGVDにおける健常日本人サンプル）との関連性試験を、フィッシャーの正確確率検定を用いて3つの遺伝モデル（対立遺伝子頻度モデルと、優性遺伝モデル以下優性モデル又は劣性遺伝モデル以下、劣性モデル）について行った。優性モデル及び劣性モデルは、心毒性リスク対立遺伝子がそれぞれ優性遺伝様式及び劣性遺伝様式に従って有害事象に寄与し得ると仮定している。
【００４１】
3つの遺伝子モデルの複数の試験について行ったボンフェローニ補正後の有意水準は、本実施例の試験においてP=7.38×10-6[0.05/（2,258×3）]であり、追試においてP=0.0019[0.05/（9×3）]であった。オッズ比（OR）及び信頼区間（CI）は、非リスク遺伝子型を参照として計算した。追試のサンプルサイズの計算は、GDesignMini（StaGen社製）によって実施した。
【００４２】
〔結果〕
〔患者特性〕
トラスツズマブ誘発性心毒性のリスクを決定する遺伝子マーカーを同定するために、本実施例では、NCCバイオバンクの登録サンプルからトラスツズマブで治療された243人の患者を選択した。表１には、トラスツズマブで治療された243人の患者の特徴を示している。表１に示すように、トラスツズマブ治療開始時における症例の平均年齢及び対照の平均年齢は、それぞれ52及び56歳であった。表１に示す特性のうち、症例群と対照群との間に有意差を示す特性は認められなかった。
【００４３】
【表１】
2019213508.tif 000002
【００４４】
〔全エキソーム配列決定及び候補変異の同定〕
本実施例では、トラスツズマブ治療前と比較してLVEFが10％以上減少する毒性をトラスツズマブ誘発心毒性として定義した。この基準には、低グレードの心毒性が含まれる。トラスツズマブ誘発性の低グレードの心毒性は、特に高齢の女性及び心臓病の合併症を有する患者において生命を脅かしうるため、本実施例ではこの基準を臨床的に有意な毒性と定義した。
【００４５】
トラスツズマブ誘発性心毒性を有する9人の患者の生殖細胞系列DNAを用いて、全エキソーム配列決定を行った。本実施例では、標的エキソン領域においての平均129倍の深度で、9症例において合計239,360の変異を発見した。本実施例では、上述した〔材料及び方法〕に記載したようにフィルタリングすることで、計2,258の遺伝子変異を選択した。
【００４６】
本実施例では、9例（トラスツズマブ誘発性心毒性）とHGVDに登録された最大1,208の健常日本人コントロールとの間で症例対照研究を行い、トラスツズマブ誘発性心毒性のリスクに関連する遺伝子変異（MAF<0.05）を見いだした。如何なる変異も有意水準に達しなかったが（P= 7.38×10-6、上記〔材料及び方法〕参照）、表２に示すように、Pmin<0.001を示した10種類の変異を見つけることができた。表３に示すように、本実施例において、最も低いP値を示した変異型は、PHDフィンガータンパク質3（PHF3）におけるrs139503277（非同義変異）であった（Pmin=0.00012、オッズ比（OR）=51.23、11.34-231.37の95％信頼区間（CI））。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
〔追試〕
本実施例の結果をさらに検証するために、10人の症例及びトラスツズマブ誘発性心毒性の徴候を示さなかった224人の対照を含む234人の独立した患者を用い、上述した結果に示したPmin<0.001を示した10種類の変異（表2参照）について追試を行った。なお、上述した本実施例で用いたデータを用いた計算によれば、上述した10種類の変異について少なくとも0.8の検出力を達成するために、10症例及び188以上の対照が追試に必要であることが示された。
【００５０】
上述した10種類の変異のうち2つの変異は強い連鎖不平衡の関係にあったので（r2=0.85）、本実施例では、ボンフェローニ補正後の3つの遺伝子モデルについて、有意水準を追試におけるP値：0.0019[0.05/（9×3）]に設定した。ボンフェローニ補正後の追試では、関連性について有意水準を示した変異は同定できなかった。
これは、追試におけるサンプルサイズが不十分であることが原因である可能性があるが、本実施例と同様な効果を有する3つの変異が存在することを観察した(ケラチン15(KRT15)のエキソン2におけるrs78272919、ジンク-リングフィンガー3(ZNRF3)のエキソン2におけるrs5762940及びアイズシャットホモログ(EYS)のエキソン44におけるrs139944387；表４)。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
本実施例及び追試に使用したサンプルの数は十分ではなかったが、同定した3種類の変異は、トラスツズマブ誘発性心毒性と関連する候補である可能性がある。本実施例及び追試を合わせた結果は、上述した実施例のみの結果と比較して、トラスツズマブ誘発性心毒性を有する染色体6q12上の座位のより強い関連（より小さいP値）を示した(EYSにおけるrs139944387、combined-Pmin=0.00056、OR=13.73、4.27-44.21の95%信頼区間(CI)；表５)。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
なお、トラスツズマブのターゲットであるHER2は、11個のリガンドが同定されているEFGRファミリーに属している。このリガンドがEGFRの細胞外ドメインと結合することで、受容体は機能的な活性なダイマーを形成する（例えば、EGFR-HER2等）。HER2については、すべてのEGFRに対するヘテロ二量体化パートナーであることが知られており、HER2シグナルは心臓恒常性において重要であることが報告されている。
【００５５】
本実施例ではEYSがHER2を含むEGFRの新規リガンドであり得るという証拠はないが、EYSが心筋細胞におけるHER2シグナル伝達の効率に影響を与える可能性、遺伝子変異によって引き起こされるEYE機能の個体間の差異がトラスツズマブ誘発性心毒性の発生率に影響を及ぼす可能性が示唆された。
【００５６】
また、HER2をコードするErb-B2受容体チロシンキナーゼ2（ERBB2）遺伝子におけるrs1058808（P1170A）及びrs1136201（I655V）は、主として白人においてトラスツズマブ誘発性心毒性を発症するリスクを与える候補変異であることが示唆されている。しかしながら、本実施例では、これら2つのSNPはトラスツズマブ誘発性心毒性に関連しないというデータが得られた（rs1058808についてcombined-Pmin=0.42、OR=0.75、0.39-1.43の95%信頼区間；rs1136201についてcombined-Pmin=0.35、OR=0.50、0.15-1.62の95%信頼区間）。なお、白人において、これら2つのSNPの対立遺伝子頻度はそれぞれ0.33（rs1058808）と0.25（rs1136201）であるが、日本人においてはそれぞれ0.44と0.13である。このような、2つのSNPの対立遺伝子頻度の差異も、これら2つのSNPはトラスツズマブ誘発性心毒性に関連しないという結果の原因の1つと考えられる。
【配列表】
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