(57)【要約】【課題】効率良く操作を行うことができるライフサイエンス用チューブの蓋、チューブセットおよび細胞の選別方法を提供する。【解決手段】取り付けた際に、ライフサイエンス用チューブ側になる面に凹部３４を有し、凹部３４の底面３４ａが平坦で、かつ、円形または四角形以上の多角形であり、側面３４ｂが底面３４ａから開口部に向かって広がる方向の傾斜面からなる蓋３２である。また、蓋３２と合わせて使用されるチューブ５０とのチューブセット、および、蓋３２を用いた細胞の選別方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライフサイエンス用チューブの蓋であって、
前記ライフサイエンス用チューブ側に凹部を有し、
前記凹部の底面が平坦で、かつ、円形または四角形以上の多角形であり、側面が底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面からなるライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項２】
前記側面は、前記底面に対して異なる角度を有する二段以上の傾斜面を有する請求項１に記載のライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項３】
前記底面の大きさは、外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下である請求項１または２に記載のライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項４】
３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上である請求項１から３のいずれか１項に記載のライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項５】
アクリル樹脂、ポリプロピレン、または、ポリスチレンにより形成されている請求項１から４のいずれか１項に記載のライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項６】
前記凹部の表面に細胞低付着処理が施されている請求項１から５のいずれか１項に記載のライフサイエンス用チューブの蓋。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のライフサイエンス用チューブの蓋と、ライフサイエンス用チューブと、を備えるライフサイエンス用チューブセット。
【請求項８】
前記ライフサイエンス用チューブが、ＰＣＲ用チューブ、または、タンパク質低吸着チューブである請求項７に記載のライフサイエンス用チューブセット。
【請求項９】
細胞をライフサイエンス用チューブの蓋に分取する工程と、
分取された前記細胞を撮像し、細胞画像を取得する工程と、
前記細胞画像に基づいて、目的細胞を選別する工程と、を有する細胞の選別方法。
【請求項１０】
前記目的細胞を選別する工程後の前記ライフサイエンス用チューブの蓋に、前記ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程と、
前記目的細胞を前記ライフサイエンス用チューブに移動させる工程と、
前記ライフサイエンス用チューブ内の前記目的細胞を処理する工程と、を有する請求項９に記載の細胞の選別方法。
【請求項１１】
前記目的細胞を処理する工程が、ＰＣＲ処理である請求項１０に記載の細胞の選別方法。
【請求項１２】
前記ライフサイエンス用チューブの蓋は、前記ライフサイエンス用チューブ側に凹部を有し、前記凹部の底面が円形または四角形以上の多角形であり、側面が底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面からなる請求項１０または１１に記載の細胞の選別方法。
【請求項１３】
前記底面の大きさが、外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下である請求項１２に記載の細胞の選別方法。
【請求項１４】
前記細胞画像を取得する工程における、撮影の対物レンズの倍率が５倍以上６３倍以下であり、
前記底面の大きさは、画像撮影領域において、外接する円形に近似した時の直径が、前記画像撮影領域の直交する二辺のうちの短辺の長さより短く、短辺の長さの１／２以上である請求項１３に記載の細胞の選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス用チューブの蓋、ライフサイエンス用チューブセットおよび細胞の選別方法に係り、特に、細胞の画像解析に適したライフサイエンス用チューブの蓋、ライフサイエンス用チューブセットおよびライフサイエンス用チューブの蓋を用いた細胞の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の細胞から目的細胞を取得する方法として、フローサイトメトリーにより、目的細胞を分取することが行われている。フローサイトメトリーは、微細な細胞を流体中に分散させ、その流体を細かく流して、個々の細胞を光学的に分析し、この分析結果に基づいて取得する細胞の判定、および、分取を行うものである。
【０００３】
また、複数の細胞をまとめてウエルスライド上に滴下し、微小なウエルに細胞を落とし、撮影、画像の解析を行い、目的細胞を特定する。その後、特定した目的細胞をキャピラリーで吸引し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）プレートもしくはチューブに移す操作が行われている。
【０００４】
遺伝子解析装置に用いられる容器として、例えば、下記の特許文献１には、ＰＣＲ用途に使用されるチューブに、取り外し可能な蓋を有する反応容器が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−０７２２６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１で用いられる反応容器の蓋は、内部に収容する反応液が蒸発して消失することを防止するために密閉するために用いられることが記載されているのみである。したがって、特許文献１に記載されている反応容器についても、他の装置、方法を用いて目的細胞を判定した後、反応容器に分取する必要があり、操作フローが煩雑、時間がかかる、また、操作に使用される装置、器具が高額であるという問題があった。
【０００７】
また、フローサイトメトリーにおいては、分取した細胞の中で、目的以外の細胞が混入するケースがあり、目的の細胞である割合は、数割程度である。そのため、フローサイトメトリーで分取した細胞の全てに対して、解析、または解析のための前処理を行うことは非効率であった。また、ＰＣＲプレートもしくはＰＣＲチューブの底面は、平坦ではないため、フォーカスが合わせられず、ＰＣＲプレート上もしくはＰＣＲチューブ内での細胞の観察はできていなかった。
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、蓋を用いて画像解析を行うことで、その後の解析、または、解析の前処理を、効率良く行うことができるライフサイエンス用チューブの蓋、ライフサイエンス用チューブセットおよび細胞の選別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、ライフサイエンス用チューブの蓋であって、ライフサイエンス用チューブ側に凹部を有し、凹部の底面が平坦で、かつ、円形または四角形以上の多角形であり、側面が底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面からなるライフサイエンス用チューブの蓋を提供する。
【００１０】
本発明のライフサイエンス用チューブの蓋によれば、ライフサイエンス用チューブの蓋のライフサイエンス用チューブが装着される面側に凹部を有し、この凹部の底面を平坦とすることで、凹部内の検体の画像を撮像することができる。蓋の凹部の底面を平坦とすることで、凹部内の検体に焦点を合わせることができ、良好な画像を撮像することができる。
【００１１】
また、凹部の側面を底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面とすることで、開口部を広くすることができ、検体を凹部内に入り易くすることができる。また、底面に向かって狭くすることで、底面のサイズを小さくすることができ、検体に対する底面のサイズを所定の範囲とすることができる。したがって、検体の画像解析において、１視野による撮影で、底面全体を撮像することができ、効率良く撮像、検体の画像解析を行うことができる。
【００１２】
また、側面を開口部に向かって広がる方向の傾斜面とすることで、培養液中の気泡を抜き易くすることができ、気泡により光が屈折することを防止することができ、良好な画像を撮像することができる。
【００１３】
なお、本明細書において、「ライフサイエンス用」とは、細胞や生体分子を取り扱うことをいい、より具体的には、細胞の培養、検出、分離、精製、分析および評価や、生体分子を含む化合物の合成、検出、分離、精製、分析および評価などに用いられるものをいい、「ライフサイエンス用チューブ」とは、ライフサイエンスの用途に用いられる容器のことをいう。
【００１４】
また、「ライフサイエンス用チューブ側」とは、ライフサイエンス用チューブが装着される面側であり、ライフサイエンス用チューブとともに使用した場合、ライフサイエンス用チューブの蓋とチューブとの間で空間を形成する面側のことをいう。
【００１５】
本発明の別の態様においては、側面は、底面に対して異なる角度を有する二段以上の傾斜面を有することが好ましい。
【００１６】
この態様によれば、蓋の凹部の側面を、底面に対して異なる角度を有する二段以上の傾斜面とすることで、凹部の側面の設計の自由度を増すことができる。例えば、凹部の開口部側の角度を大きくすることで、検体を凹部内により入り易くすることができる。また、側面の底面側の角度を小さくすることで、底面を狭くすることができ、撮像する際の倍率を高くしても、１枚の画像で底面を撮像することができる。側面の底面側の角度を大きくすることで、凹部内に導入された検体が側面でとどまることを防止し、底面まで落とすことができる。
【００１７】
本発明の別の態様においては、底面の大きさは、外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であることが好ましい。
【００１８】
底面の大きさを、上記範囲とすることで、通常の画像の撮像に用いられる倍率（５倍以上６３倍以下）の対物レンズを用いて撮像することで、底面全体を１枚の画像で撮像することができる。したがって、効率良く、撮像、検体の画像解析を行うことができる。
【００１９】
本発明の別の態様においては、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上であることが好ましい。
【００２０】
この態様によれば、ライフサイエンス用チューブの蓋に用いられる材料の上記波長の光に対する透過率を６０％以上とすることで、良好な画像を撮像することができる。
【００２１】
本発明の別の態様においては、アクリル樹脂、ポリプロピレン、または、ポリスチレンにより形成されていることが好ましい。
【００２２】
この態様は、ライフサイエンス用チューブの蓋に用いられる材料を限定したものであり、アクリル樹脂、ポリプロピレン、または、ポリスチレンを用いることで、蓋の透明性を得ることができ、良好な画像を撮像することができる。また、ポリプロピレン、または、ポリスチレンを用いることで、耐熱性を確保することができるので、次の工程が温度をかける処理、例えば、ＰＣＲ処理などの場合であっても、蓋をそのまま用いて処理を行うことができる。
【００２３】
本発明の別の態様においては、凹部の表面に細胞低付着処理が施されていることが好ましい。
【００２４】
この態様によれば、凹部の表面に細胞付着処理を施すことで、蓋からライフサイエンス用チューブに細胞を移す際に、細胞が蓋の凹部に付着することを防止することができる。したがって、蓋からライフサイエンス用チューブへ検体の移動を確実に行うことができる。
【００２５】
本発明は、上記目的を達成するために、上記記載のライフサイエンス用チューブの蓋と、ライフサイエンス用チューブと、を備えるライフサイエンス用チューブセットを提供する。
【００２６】
本発明のライフサイエンス用チューブセットによれば、上記記載のライフサイエンス用チューブの蓋を用いて画像解析を行った検体を、セットで用いられるライフサイエンス用チューブに移動し、その後の処理を行うことができる。したがって、蓋を有する１つのライフサイエンス用チューブセットで、検体の画像解析とその後の処理を行うことができ、効率よく操作を行うことができる。
【００２７】
本発明の別の態様においては、ライフサイエンス用チューブが、ＰＣＲ用チューブ、または、タンパク質低吸着チューブであることが好ましい。
【００２８】
この態様は、ライフサイエンス用チューブの具体例を記載したものであり、ライフサイエンス用チューブとしてＰＣＲ用チューブ、タンパク質低吸着チューブを用いることができる。
【００２９】
本発明は、上記目的を達成するために、細胞をライフサイエンス用チューブの蓋に分取する工程と、分取された細胞を撮像し、細胞画像を取得する工程と、細胞画像に基づいて、目的細胞を選別する工程と、を有する細胞の選別方法を提供する。
【００３０】
本発明の細胞の選別方法によれば、ライフサイエンス用チューブの蓋を用いて、細胞画像により目的細胞の選別を行うことで、高い精度で目的細胞を選別することができ、かつ、ライフサイエンス用チューブへの目的細胞の移動を容易に行うことができる。
【００３１】
本発明の別の態様においては、目的細胞を選別する工程後のライフサイエンス用チューブの蓋に、ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程と、目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程と、ライフサイエンス用チューブ内の目的細胞を処理する工程と、を有することが好ましい。
【００３２】
この態様によれば、ライフサイエンス用チューブの蓋を用いて細胞の画像解析を行い、目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させ、目的細胞の処理をライフサイエンス用チューブ内で行うことで、蓋を備える１つのライフサイエンス用チューブで、画像解析、および、その後の処理を行うことができる。
【００３３】
本発明の別の態様においては、目的細胞を処理する工程が、ＰＣＲ処理であることが好ましい。
【００３４】
この態様は、目的細胞を処理する工程を限定したものであり、ＰＣＲ処理を行うことができる。
【００３５】
本発明の別の態様においては、ライフサイエンス用チューブの蓋は、ライフサイエンス用チューブ側に凹部を有し、凹部の底面が円形または四角形以上の多角形であり、側面が底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面からなることが好ましい。
【００３６】
この態様よれば、ライフサイエンス用チューブの蓋のライフサイエンス用チューブが装着される面側に凹部を有し、この凹部の底面を平坦とすることで、凹部内の細胞の画像を撮像することができる。蓋の凹部の底面を平坦とすることで、凹部内の細胞に焦点を合わせることができ、良好な画像を撮像することができる。
【００３７】
また、凹部の側面を底面から開口部に向かって広がる方向の傾斜面とすることで、開口部を広くすることができ、細胞を凹部内に入り易くすることができる。また、底面に向かって狭くすることで、底面のサイズを小さくすることができ、細胞に対する底面のサイズを所定の範囲とすることができる。したがって、検体の画像解析において、底面全体を１枚の画像で撮像することができ、効率良く撮像、検体の画像解析を行うことができる。
【００３８】
また、側面を開口部に向かって広がる方向の傾斜面とすることで、培養液中の気泡を抜き易くすることができ、気泡により光が屈折することを防止することができ、良好な画像を撮像することができる。
【００３９】
本発明の別の態様においては、底面の大きさが、外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であることが好ましい。
【００４０】
底面の大きさを、上記範囲とすることで、１視野による撮影で、底面全体を撮像することができる。したがって、効率良く、撮像、画像の解析を行うことができる。
【００４１】
本発明の別の態様においては、細胞画像を取得する工程における、撮影の対物レンズの倍率が５倍以上６３倍以下であり、底面の大きさは、画像撮影領域において、外接する円に近似した時の直径が、画像撮影領域の直交する二辺のうちの短辺の長さより短く、短辺の長さの１／２以上であることが好ましい。
【００４２】
この態様によれば、撮影の対物レンズの倍率が５倍以上６３倍以下における画像撮影領域において、底面の大きさ（外接する円に近似した時の直径）を、画像撮影領域の直交する二辺のうち短辺の長さより短く、短辺の長さの１／２以上とすることで、画像撮像領域内で、底面全体、および、細胞の観察に最適なサイズとすることができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明のライフサイエンス用チューブの蓋によれば、観察対象となる検体（細胞）を、凹部に導入し、画像解析を行うことができる。そして、ライフサイエンス用チューブとセットで用いることで、蓋を有する１つのライフサイエンス用チューブセットで、検体の画像解析とその後の処理を行うことができ、効率よく操作を行うことができる。また、細胞
の選別方法によれば、ライフサイエンス用チューブの蓋で画像解析により目的細胞の選別を行うことで、高い精度で目的細胞を選別することができ、かつ、ライフサイエンス用チューブへの目的細胞の移動を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】細胞を撮像する装置の構成を示す概略構成図である。
【図２】トレーの別の態様を示す図である。
【図３】ライフサイエンス用チューブの蓋の形状を示す断面図である。
【図４】撮像される画像と凹部の底面のサイズとの関係を示した図である。
【図５】他の実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋の形状を示す断面図である。
【図６】さらに他の実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋の形状を示す断面図である。
【図７】細胞の選別方向の工程を示す工程図である
【図８】細胞の選別方向の工程を示す工程図である。
【図９】細胞の選別方向の工程を示す工程図である。
【図１０】ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程を説明する図である。
【図１１】目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、添付図面に従って本発明に係るライフサイエンス用チューブの蓋、ライフサイエンス用チューブセットおよび細胞の選別方法について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。また、以下では、細胞を例として説明するが、本発明のライフサイエンス用チューブの蓋、ライフサイエンス用チューブセットの用途は細胞に限定されず、生体分子を含む化合物などに用いることもできる。
【００４６】
まず、本実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋（以下、単に「蓋」ともいう）を適用し、画像を撮像する撮像装置を備える解析装置について説明する。
【００４７】
図１は、分取する工程で、ライフサイエンス用チューブの蓋に分取された目的細胞の撮像や、細胞からの光学情報を取得する装置の構成を示す概略構成図である。好ましい態様として、抗原抗体反応などによって分取した細胞に標識した蛍光色素からの蛍光発光の情報の取得や、可視光により細胞の光透過画像取得が可能な解析装置である。
【００４８】
図１に示す解析装置１０は、対象となる細胞の発する蛍光を測定するための光を照射する蛍光用励起光源装置１２、細胞の透過光を測定するための光（可視光）を照射する明視野用光源装置１４、撮像の対象となる細胞１６を収納するライフサイエンス用チューブの蓋３２およびプレート１８からなるトレー１９、および、レンズ２０、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４および蛍光フィルタ２６を保持したフィルタ群（フィルタキューブ）２８、ならびに、細胞１６からの蛍光および透過光を撮像する撮像装置３０を備える。
【００４９】
蛍光用励起光源装置１２は、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、または、ＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）などを用いることができる。これらの光源を用いることにより、細胞１６に照射する照射光の波長領域を狭くすることで、精度の高い分析を確実に行うことが可能となる。また、蛍光用励起光源装置１２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色ＬＥＤなどを用いることができる。これらの光源を用いる場合でも、励起フィルタ２２で、目的の波長のみ透過させることで、細胞１６に目的の波長の光を照射させることができる。なお、明視野用光源装置１４としても、蛍光用励起光源装置１２と同様の光源を用いることができる。
【００５０】
トレー１９は、プレート１８と、分取された細胞１６を収納する蓋３２とからなる。蓋３２は、ライフサイエンス用チューブ（以下、単に「チューブ」ともいう）が装着される側に凹部を有し、この凹部内に分取された細胞を収納する。なお、本明細書においては、ライフサイエンス用チューブの蓋３２のライフサイエンス用チューブが装着される側をライフサイエンス用チューブの蓋の表面といい、反対側を裏面とする。プレート１８は、蓋３２を保持するサンプル台であり、細胞１６は蓋３２の裏面側から撮像されるため、蓋３２の凹部の底面に対応するプレート１８の位置に貫通孔を有する。または、光を透過させることができる透明な材料で形成されている。
【００５１】
図２は、トレーの別の態様を示す図である。図２に示すトレー３１９は、プレート３１８と蓋３３２が一体となって構成されている点が、図１に記載されているトレー１９と異なっている。解析装置１０に使用されるトレーとしては、図２に示すように、プレート３１８と蓋３３２が一体となったトレーを用いることができる。プレート３１８と蓋３３２を一体に形成することで、射出成型で一度に作製することができ、精度良く蓋３３２を配列させることができる。また、トレーを低コストで作製することができる。
【００５２】
図１に戻り、レンズ２０は、蛍光用励起光源装置１２から出力された光により細胞１６が発した蛍光、および、明視野用光源装置１４から出力された光が細胞１６を透過した透過光を拡大する。レンズ２０は、一般的に光学用途に用いられるレンズを用いることができる。
【００５３】
フィルタ群２８は、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を備える。このようなフィルタ群２８の具体例としては、フィルタキューブを用いることが好ましく、例えば、Zeiss Filter Set49 (DAPI)を用いることができる。蛍光用励起光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ２２により、目的の波長領域の光のみを透過する。励起フィルタ２２を透過した光は、ダイクロイックミラー２４で、トレー１９の方向に反射する。蛍光用励起光源装置１２から出射した励起光により生じた、細胞１６からの蛍光発光は、レンズ２０、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を経て撮像装置３０で撮像される。励起光により発光する蛍光は、蛍光の波長領域が励起光の波長領域より長波長側に存在するので、ダイクロイックミラー２４を使用することにより、蛍光発光のみを透過させることが可能となる。更に、励起光は透過させずに、蛍光のみを透過させる蛍光フィルタ２６を用いることで、撮像装置３０で細胞１６からの蛍光発光のみの情報で撮像することが可能となる。したがって、蛍光フィルタ２６により、蛍光のみを透過させることで、撮像装置３０で撮像される画像が励起光に影響されることなく、画像を取得することができ、蛍光発光情報により検査の精度を向上させることができる。
【００５４】
蛍光用励起光源装置１２から照射された光による蛍光撮影は、細胞の検査目的に応じて１つの細胞に対する複数の情報を取得するため、通常は複数の種類の色素により免疫染色される。この場合、免疫染色された細胞のそれぞれの色素からの蛍光に対して、それぞれの色素の蛍光波長に適した透過特性または反射特性を有するフィルタ群を用いて撮影することにより、異なる波長の光学的情報を得ることができる。なお、明視野用光源装置１４により細胞１６の透過光を撮像する場合は、フィルタ群２８を取り外した状態で撮像する。これにより、透過光を撮像装置３０で撮像することができる。
【００５５】
撮像装置３０としては、トレー１９上の蓋３２内の細胞１６の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
【００５６】
≪ライフサイエンス用チューブの蓋≫
図３は、本実施形態で用いられるライフサイエンス用チューブの蓋３２の形状を示す断面図である。図１に示す解析装置１０においては、蓋３２の底面側から励起光を照射し、蓋３２を透過した、励起光により発光した細胞からの蛍光などの細胞からの情報を含む光を受光するため、蓋３２の材料としては、これらの光に対して透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないことなどの条件を有することが好ましい。また、細胞１６を撮像するため、蓋３２の凹部３４の底面３４ａは、平坦な形状である。凹部３４の底面３４ａを平坦とすることで、焦点を細胞１６に合わせることが可能となり、底面３４ａに存在する細胞１６の画像解析を精度良く行うことができる。
【００５７】
また、底面３４ａの形状は、円形または四角形以上の多角形である。また、底面３４ａの大きさは、底面３４ａに外接する円に近似した時、円の直径Ｌが０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下とすることが好ましく、より好ましくは０．１ｍｍφ以上０．５ｍｍφ以下であり、さらに好ましくは、０．２ｍｍφ以上０．４ｍｍφ以下である。なお、図３においては、底面３４ａを円形として記載する。底面３４ａの形状、大きさを上記の形状、サイズとすることで、５倍以上６３倍以下の倍率の対物レンズを用いることにより、好ましい細胞画像の大きさで、かつ１視野による撮影（ワンショット撮影）で、底面３４ａ全体を撮像することができる。細胞の検査目的に応じて１つの細胞に対する複数の情報を取得するために、通常は複数種類の色素を用いて免疫染色を行う。従って、細胞１６の撮像は、それぞれの色素からの蛍光情報と、明視野撮影を行って、必要に応じ撮影後に各画像を重ね合わせて、細胞の解析を行うことができる。
【００５８】
図４は、顕微鏡により撮像される画像撮像領域４０と凹部３４の底面３４ａのサイズとの関係を示した図である。底面３４ａのサイズは、底面３４ａの直径Ｌが、画像撮影領域４０の直交する二辺、長辺ｅ、短辺ｄのうち、短辺ｄの長さより短く、かつ、短辺ｄの長さの１／２以上とすることが好ましい。底面の直径Ｌの長さをｄ＞Ｌ＞ｄ／２とすることで、細胞が収納される蓋の平坦な底面３４ａを、画像撮影領域４０内において、好ましい細胞画像の大きさで、かつ１視野による細胞の撮影が可能となる。画像撮影領域４０のサイズは、顕微鏡の対物レンズの倍率と撮影カメラにより決定される。通常用いられるカメラを用いることで、例えば、２０倍の対物レンズであれば、底面の直径Ｌを０．４ｍｍφとすることで、画像撮影領域４０内に１枚で底面３４ａを撮像することができる。また、４０倍の対物レンズであれば底面の直径Ｌを０．２ｍｍφ、６３倍の対物レンズであれば直径Ｌを０．１ｍｍφ、１０倍の対物レンズであれば直径Ｌを１ｍｍφとすることで、１枚の画像で底面３４ａを撮像することができる。細胞を観察するためには、倍率は高倍率が好ましいが、倍率が高くなると蓋３２の裏面側の凹凸などにより、画像解析の精度に影響が出始めることから、対物レンズの倍率は２０倍程度が好ましい。
【００５９】
凹部３４の側面３４ｂは、底面３４ａから開口部に向かって広がる方向に斜めに形成されており、テーパー形状を有する。側面３４ｂを斜めに形成することにより、培養液中の気泡を容易に抜くことができ、気泡により光が屈折することを防止することができる。また、広い開口部を確保できるために、細胞１６を凹部３４内に収納することが容易になり、更に、底面の面積を小さくすることが可能となる。
【００６０】
また、蓋３２の底面３４ａの厚みｔは０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下とすることが好ましい。図１に示すように、細胞１６の撮像は、蓋３２の裏面側（底面側）から撮像することになるため、底面３４ａの厚みが１ｍｍ以下であれば、レンズ２０を細胞１６に接近させることができ、高倍率での細胞の撮影が可能となり、好ましい。また、０．２ｍｍ以上であると、狭い範囲に焦点深度を設定することが可能となり、蓋３２の裏面側にわずかでもキズなどがある場合でも、キズの焦点がずれるために撮像される画像にキズの像が映し出されることがなくなり、細胞の画像のみを撮像することが可能となり、好ましい。底面３４ａの厚みｔは、０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下がより好ましく、０．４ｍｍがさらに好ましい。
【００６１】
蓋３２の材質としては、画像を撮像する際に、光を透過しやすい材質とすることが好ましく、具体的には、アクリル樹脂、ポリプロピレン、または、ポリスチレンから選択される材料を用いることができる。これらの材料により製造された蓋３２は、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。光の透過性の観点においては、アクリル樹脂、または、ポリプロピレンを用いることが好ましい。また、目的細胞を選別した後の処理がＰＣＲ処理である場合、耐熱性を有することが好ましく、ポリプロピレン、または、ポリスチレンを用いることで、ＰＣＲ処理において材料が劣化することを防止することができる。なお、本発明において、「透過率」とは、透過光を入射光で割った値（透過率＝透過光／入射光）であり、例えば１００の光束を入射させたときに透過した光束が６０であれば透過率は６０％と算出される。
【００６２】
また、凹部３４の表面（底面３４ａおよび側面３４ｂ）は、細胞低付着処理が施されていることが好ましい。細胞低付着処理は、細胞、すなわち、タンパク質が凹部３４内の底面３４ａおよび側面３４ｂに付着しないようにする処理であり、タンパク質の吸着を防止する性質を有する材料を表面にコートすることにより行われる。凹部３４内へのタンパク質吸着の原因は、蓋３２の材料である樹脂表面の疎水性基とタンパク質中の疎水性基が結合する疎水性相互作用が主な原因とされているため、親水性基を有する材料をコーティングすることによって細胞低付着処理を施した表面とすることができる。
【００６３】
細胞低付着処理に用いられる材料として、ホスホコリン基を含む高分子（例えば、リピジュア（登録商標）（別名：ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine）ポリマー）（日油株式会社製））、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ＰＶＡ（polyvinyl alcohol）ヒドロゲル、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）などを用いることができる。コーティング方法としては、上記材料を溶媒に分散させた分散液に、ディップ浸漬後、乾燥することで、コーティングを行うことができる。溶媒としては、例えば、リピジュアの場合、エタノールを用いることができ、エタノールに０．５ｗｔ％の割合でリピジュアを混合、分散し、分散液とする。
【００６４】
凹部３４の表面に細胞低付着処理を施すことで、凹部３４内に細胞をフローサイトメトリーなどにより分取する際に、底面３４ａに到達する前に側面３４ｂへ付着することを防止することができる。また、画像解析後、細胞をチューブへ移動させる際に、底面３４ａに付着することなく、容易にチューブに移動させることができる。
【００６５】
細胞低付着処理としては、付着したタンパク質を分解させる酵素を安定化させることにより行うこともできる。
【００６６】
図５は、別の一実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋１３２の形状を示す断面図である。図５に示す蓋１３２の凹部１３４の側面は、底面１３４ａに対して角度θＢを有する側面１３４ｂ、および、底面１３４ａに対して角度θＣを有する側面１３４ｃとからなる。図５に示すように、側面を、多段で屈曲させ、底面１３４ａに対して異なる角度θＢ、θＣを有する二段の傾斜面である側面１３４ｂ、１３４ｃにより形成することができる。二段の傾斜面で側面を形成することで、凹部１３４内の側面の設計の自由度を増すことができる。凹部１３４の開口部側の角度θＣを大きくすることで、細胞を凹部１３４内により入り易くすることができる。また、底面１３４ａ側の角度θＢを小さくすることで、底面１３４ａを狭くすることができ、画像を撮像する際に、高い倍率で撮像しても１枚の画像で底面１３４ａを撮像することができる。角度θＢ、θＣの関係は、特に限定されない。図５においては、角度θＣが、角度θＢより大きい図で記載されているが、角度θＢを角度θＣより大きくしてもよい。角度θＢを大きくすることで、側面１３４ｂで細胞がとどまり、底面１３４ａに細胞が到達しないことを防止することができる。なお、図５においては、側面を二段の傾斜面としているが、段数は特に限定されず、三段以上の傾斜面とすることもできる。
【００６７】
図６は、さらに別の一実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋２３２の形状を示す断面図である。図６に示す蓋２３２は、凹部内にスペーサー２３６を備える点が、他の実施形態と異なっている。スペーサー２３６の凹部２３４の形状を、上記の蓋３２、１３２の凹部３４、１３４の形状とし、蓋２３２の内部に嵌め込むことで、上記の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６８】
＜ライフサイエンス用チューブセット＞
上述のライフサイエンス用チューブの蓋は、ライフサイエンス用チューブと合わせてライフサイエンス用チューブセットとして使用される。ライフサイエンス用チューブとしては、細胞の培養、検出、分離、精製、分析および評価や、生体分子を含む化合物の合成、検出、分離、精製、分析および評価などの用途に使用されるチューブを用いることができる。具体的には、タンパク質、ペプチド解析などにおいて、容器への試料付着を軽減するタンパク質低吸着チューブを用いることができる。また、ＰＣＲ処理を行うＰＣＲ用チューブを用いることができる。本実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋とセットで用いることで、１つのライフサイエンス用チューブセットで、画像解析とその後の処理、解析などを行うことができる。
【００６９】
＜細胞の選別方法＞
次に、上記のライフサイエンス用チューブの蓋、および、ライフサイエンス用チューブセットを用いた細胞の選別方法について説明する。
【００７０】
図７から図９は、細胞の選別方向の工程を示す工程図である。また、図１０は、ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程を説明する図であり、図１１は、目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程を説明する図である。本実施形態の細胞の選別方法によれば、細胞をライフサイエンス用チューブの蓋に分取する工程と、分取された細胞を撮像し、細胞画像を取得する工程と、細胞画像に基づいて、目的細胞を選別する工程と、を有する。また、目的細胞を選別する工程の後、ライフサイエンス用チューブの蓋に、ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程と、目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程と、ライフサイエンス用チューブ内の目的細胞を処理する工程と、を行う。以下、各工程について説明する。
【００７１】
≪分取する工程≫
まず、図７に示すように、蓋３２の凹部３４内に培養液３８を滴下する。次に、図８に示すように、培養液３８を有する凹部３４内に、細胞１６を分取する。複数の細胞から目的細胞を分取する工程としては、例えば、フローサイトメトリーにより行うことができる。フローサイトメトリーは、測定対象の細胞などの測定対象物質を含むサンプル液を、フローセルにおいてシース液の層流の中心側に流し、光学検出部においてレーザ光を測定対象物質に照射して、それによって生じる散乱光と蛍光を測定することにより、測定対象物質の大きさや構造などを測定するものである。光学検出部における測定のパラメータとしては、前方散乱光、側方散乱光および蛍光があるが、前方散乱光では測定対象物の大きさが、また側方散乱光および蛍光により、測定対象物質の構造などを測定することができる。
【００７２】
そして光学検出部における測定のパラメータを用いて、ソーティング系により、トレー上の蓋に目的細胞を分取する。フローサイトメトリーにおいては、サンプル／シース液は、上から下に流れていくように設計されており、層流のままフローセルの先端にあるノズルから飛び出し落下する。フローセルの外へ出たサンプル／シース液が、途中から液滴（ドロップ）になるように、トランスデューサ（振動子）を用いてフローセル全体またはフローセル内部に上下振動を与える。光学検出部における測定のパラメータを用いた分取条件に基づいて、分取する細胞かどうかを判別し、液滴になる直前に、サンプル／シース液全体に、＋または−の荷電をする。その後、液滴は２枚の偏向板の間を落下し、＋に荷電した液滴は−極板側に、−に荷電した液滴は＋極板側に引かれ、細胞捕集部にあるトレー上の各蓋に細胞を分取することができる。
【００７３】
なお、フローサイトメトリーの方法としては、一例として上記の方法を記載したが、上記の方法に限定されず、一般的に行われている方法で行うことができる。また、分取する工程としては、フローサイトメトリーに限定されず、他の方法でも行うことができる。
【００７４】
≪細胞画像を取得する工程≫
次に、蓋３２に分取された細胞を撮像し、細胞画像を取得する。図９は、細胞画像を取得する工程を示す図である。細胞画像を撮像する装置としては、図１に示す装置を用いることができる。
【００７５】
本実施形態で用いられるライフサイエンス用チューブの蓋３２は、上述したように、凹部３４の底面３４ａが平坦で、かつ、円形または四角形以上の多角形であり、側面３４ｂが底面３４ａから開口部に向かって広がる方向に斜めに形成されている。したがって、底面３４ａに存在する細胞１６の画像の撮像に適しており、本実施形態のライフサイエンス用チューブの蓋３２を用いて、効率良く、良好な細胞画像を取得することができる。
【００７６】
≪目的細胞を選別する工程≫
次に、細胞画像を取得する工程で得られた細胞画像に基づいて、目的細胞の確認、および、選別を行う。細胞画像による目的細胞の確認は、例えば、核の有無、核の大きさ、核の形状（細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い）、細胞の形状（連続しているかギザギザしているか）、蛍光の輝度のピーク値、平均値、輝度分布(細胞膜均一に蛍光しているか、局所的に強く蛍光しているか)、特定の波長の透過光に対する吸収度合い（ヘモグロビンか、白血球かの判別）、ヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性（還元ヘモグロビン［Ｈｂ］と酸化ヘモグロビン［ＨｂＯ２］の波長に対する吸収係数）など、を用いて行うことができる。
【００７７】
≪ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程≫
次に、目的細胞を選別する工程後のライフサイエンス用チューブの蓋３２に、ライフサイエンス用チューブ５０を取り付ける。図１０は、ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程を説明する図である。チューブ５０は、目的細胞を選別する工程において、目的細胞と選別された細胞１６が分取された蓋３２にのみチューブ５０を取り付けてもよいし、すべての蓋３２にチューブ５０を取り付けてもよい。ライフサイエンス用チューブを取り付ける工程は、専用の装置を用いて行うことが可能である。
【００７８】
目的細胞と選別された細胞１６が分取された蓋３２にのみチューブ５０を取り付けた場合、チューブ５０を取り付けた目的細胞のみ、次の工程を行う。したがって、チューブ５０と、そのチューブ５０内の細胞１６の情報を紐付けしておくことが好ましい。細胞１６の情報を、蓋３２あるいはチューブ５０と紐付けする方法としては、トレー１９上に配列された蓋３２の配列情報を、蓋３２に文字で刻印しておく方法が挙げられる。配列情報の記載例としては、「Ｃ４」であるならば、プレートのＣ行４列目、「Ｄ４」であるならばＤ行の４列目を意味する。また、トレー１９の配列情報ではなく、細胞の情報をＱＲコード（登録商標）で印字してもよい。また、蓋３２にトレーの配列情報を記憶したＲＦＩＤ（radio frequency identifier）タグを設けることで、細胞の情報を明確にしておくこともできる。
【００７９】
≪細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程≫
チューブ５０を蓋３２に取り付けた後、蓋３２内の細胞１６を、チューブ５０に移動する。図１１は、目的細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程を説明する図である。蓋３２からチューブ５０への細胞１６移動は、例えば、蓋３２にチューブ５０を取り付けた後、反転させ、遠心分離を行うことで、チューブ５０内に、細胞１６を培養液３８とともに移動させることができる。細胞をライフサイエンス用チューブに移動させる工程は、専用の装置を用いて行うことが可能である。
【００８０】
≪目的細胞を処理する工程≫
目的細胞をチューブ５０に移動させた後、目的細胞の処理を行う。目的細胞を処理する工程としては、例えば、ＰＣＲ処理を挙げることができる。ＰＣＲ処理は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）分子の特定の領域を増幅させる方法であり、例えば、次の方法により行うことができる。ただし、ＰＣＲ処理は以下の方法に限定されない。また、目的細胞を処理する工程もＰＣＲ処理に限定されず、他の処理を行うこともできる。
【００８１】
［ＰＣＲ処理］
（工程１）
反応液を９４℃程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分離する。
【００８２】
（工程２）
反応液を６０℃程度にまで急速冷却し、その一本鎖ＤＮＡとプライマーを所定の温度に加熱（アニーリング）し、一本鎖ＤＮＡとプライマーを加熱させる。
【００８３】
（工程３）
プライマーにＤＮＡポリメラーゼを反応させ、一本鎖ＤＮＡとプライマーの分離が起きず、ＤＮＡポリメラーゼ活性に適した温度（６０〜７２℃程度）まで、加熱する。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間（増幅する長さによるが通常１〜２分）、この状態を継続する。
【００８４】
（工程４）
工程１から工程３を１サイクルとし、工程１から工程３までの手順を繰り返すことにより、特定のＤＮＡ断片を増幅することができる。一般的に、ＰＣＲ処理をｎ回のサイクル行うと、１つの２本鎖ＤＮＡから目的部分を２ｎ倍に増幅することができる。長いＤＮＡ鎖が最後まで残ってしまうが、通常２０サイクル程度行うことで、必要とする特定のＤＮＡ断片に比べ、ＤＮＡの量を無視できる程、少なくすることができる。
【００８５】
このように、本実施形態の細胞の選別方法によれば、蓋を用いて、細胞画像の撮像、目的細胞の判定を行った後、チューブに細胞を移動し、目的細胞の処理を行うことができる。したがって、蓋を有する１つのライフサイエンス用チューブセットで、画像解析から、細胞の処理まで行うことができる。また、画像解析を行う蓋から、処理を行うチューブまでの細胞の移動を、キャピラリーを用いるなどの難しい操作を必要とせず、容易に行うことができる。
【符号の説明】
【００８６】
１０  解析装置
１２  蛍光用励起光源装置
１４  明視野用光源装置
１６  細胞
１８、３１８  プレート
１９、３１９  トレー
２０  レンズ
２２  励起フィルタ
２４  ダイクロイックミラー
２６  蛍光フィルタ
２８  フィルタ群（フィルタキューブ）
３０  撮像装置
３２.１３２、２３２、３３２  ライフサイエンス用チューブの蓋（蓋）
３４、１３４、２３４  凹部
３４ａ、１３４ａ  底面
３４ｂ、１３４ｂ、１３４ｃ  側面
３８  培養液
４０  画像撮影領域
５０  ライフサイエンス用チューブ（チューブ）
２３６  スペーサー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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