(57)【要約】【課題】本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成のための方法、組成物、システム、及びキット並びにそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用を提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。【解決手段】本開示は、ポリヌクレオチドプロセッシングのための組成物、方法、システム、及び装置を提供する。そのようなポリヌクレオチドプロセッシングは、ポリヌクレオチド配列決定などの様々な用途に有用であり得る。いくつかの場合、本開示は、ポリヌクレオチドバーコードライブラリーの生成のため、及びそのようなポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへの結合のための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書の記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2013年2月8日に出願された米国仮特許出願第61/762,435号、2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/800,223号、2013年6月27日に出願された米国仮特許出願第61/840,403号、及び2013年7月10日に出願された米国仮特許出願第61/844,804号の利益を主張し、前記出願はその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドバーコードは、次世代配列決定技術などの多くの用途において有用である。そのようなバーコードは一般に、ユニークな識別子配列を含有し、十分な多様性及び規模で製造するには極端に高価であり得る。単一のポリヌクレオチドバーコードを合成する費用は、合成中の塩基あたりの費用とポリヌクレオチドの長さの関数である。したがって、それぞれ異なる配列を有する複数のバーコードを合成する費用は、塩基あたりの費用に、分子あたりの塩基数を掛け、複数のバーコード内の分子数を掛けたものに等しい。現在、DNA配列を合成するには、1塩基あたり約0.10$かかる。数万から数千万のバーコードのバーコードライブラリーについては、この費用は法外なものである。したがって、バーコードのライブラリーを生成する改善された方法が大いに必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第2012/0211084号
【特許文献２】米国特許出願公開第2012/0132288号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献２】Using Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献３】Cells: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献４】PCR Primer: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献５】Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献６】「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、1984、IRL Press London
【非特許文献７】Zongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012)
【非特許文献８】Merrimanら、Electrophoresis、33(23) 3397〜3417頁(2012)
【非特許文献９】Branskyら、Lab on a Chip、2009、9、516〜520頁
【非特許文献１０】Demirci及びMontesano、Lab on a Chip、2007、7、1139〜1145頁
【非特許文献１１】Weizmannら、Nature Methods、2006、3(7):545〜550頁
【非特許文献１２】Holtzeら、Lab on a Chip、2008、8(10):1632〜1639頁
【非特許文献１３】Garsteckiら、Applied Physics Letters、2004、85(13):2649〜2651頁
【非特許文献１４】Abateら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、2010、107(45)、19163〜19166頁)
【非特許文献１５】Esser-Kahnら(2011) Macromolecules 44: 5539〜5553頁
【非特許文献１６】Wangら(2009) ChemPhysChem 10:2405〜2409頁
【非特許文献１７】Plunkettら、Biomacromolecules、2005、6:632〜637頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成のための方法、組成物、システム、及びキット並びにそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用を提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の態様は、1つ又は複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、ポリヌクレオチドのそれぞれがバーコード配列を含み、ポリヌクレオチドが1つ又は複数のパーティション内に配置され、ライブラリーが少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列を含む、ライブラリーを提供する。
【０００７】
いくつかの場合、バーコード配列は、少なくとも約5ヌクレオチド長である。また、バーコード配列は無作為ポリヌクレオチド配列であってもよい。
【０００８】
更に、パーティションは、平均で、約1個のポリヌクレオチド、約0.5個のポリヌクレオチド、又は約0.1個のポリヌクレオチドを含んでもよい。パーティションは、液滴、カプセル、ウェル又はビーズであってもよい。
【０００９】
更に、ライブラリーは、少なくとも約10,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
【００１０】
いくつかの場合、パーティションは、同じポリヌクレオチドの複数のコピーを含んでもよい。
【００１１】
更に、それぞれのポリヌクレオチドは、固定化配列、配列決定プライマーのためのアニーリング配列、及び標的ポリヌクレオチドとのライゲーションのために適合する配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。
【００１２】
いくつかの場合、それぞれのポリヌクレオチドは、MALBACプライマーである。
【００１３】
本開示の別の態様は、バーコード配列を含むポリヌクレオチドのライブラリーを合成する方法であって、a)バーコード配列を含む複数のポリヌクレオチドを合成する工程;b)ポリヌクレオチドを複数のパーティションに分離することによって、区分化されたポリヌクレオチドを生成する工程;c)区分化されたポリヌクレオチドを増幅することによって、増幅されたポリヌクレオチドを生成する工程;及びd)増幅されたポリヌクレオチドを含むパーティションを単離する工程を含む方法を提供する。いくつかの場合、合成する工程は、カップリング反応にアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンの混合物を含有させる工程を含む。
【００１４】
更に、分離は、限界希釈を実施することによって、希釈されたポリヌクレオチドを生成する工程を含んでもよい。いくつかの場合、分離は、前記希釈されたポリヌクレオチドを区分化する工程を更に含む。
【００１５】
更に、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応、非対称性ポリメラーゼ連鎖反応、エマルジョンPCR(ePCR)、ビーズの使用を含むePCR、ヒドロゲルの使用を含むePCR、複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅サイクル(MALBAC)、単一プライマー等温増幅、並びにその組合せからなる群から選択される方法により実施することができる。いくつかの場合、増幅は、RNAプライマーを用いて実施され、増幅されたポリヌクレオチドをRNAase Hに曝露する工程を含んでもよい。
【００１６】
いくつかの場合、バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチドの各々は、MALBACプライマーである。
【００１７】
いくつかの場合、単離を、フロー支援選別により実施することができる。
【００１８】
また、バーコード配列を含むポリヌクレオチド及び増幅されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドから、ヘアピン構造を形成させることができる。いくつかの場合、方法は、ヘアピン構造を非アニーリング領域内で切断する工程を更に含んでもよい。
【００１９】
更に、バーコード配列を含む前記ポリヌクレオチド、前記区分化されたポリヌクレオチド、及び前記増幅されたポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドは、ビーズに結合していてもよい。
【００２０】
前記方法は、増幅されたポリヌクレオチドを部分相補配列とアニーリングさせる工程を更に含んでもよい。部分相補配列は、バーコード配列を含んでもよい。
【００２１】
前記方法は、増幅されたポリヌクレオチドの少なくとも1つを標的配列に結合させる工程を更に含んでもよい。標的配列は断片化されてもよい。いくつかの場合、標的配列は、機械的剪断及び酵素による処理からなる群から選択される方法によって断片化される。機械的剪断は、超音波により誘導することができる。いくつかの場合、酵素は、制限酵素、フラグメンターゼ、及びトランスポザーゼからなる群から選択される。更に、結合は、ライゲーション及び増幅からなる群から選択される方法により実施することができる。
【００２２】
いくつかの場合、増幅は、MALBACプライマーを用いて実施され、それによってMALBAC増幅産物を生成するMALBAC増幅である。いくつかの場合、MALBACプライマーは、増幅されたポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、MALBACプライマーは、前記増幅されたポリヌクレオチドではないポリヌクレオチドを含む。そのような場合、前記方法は、MALBAC増幅産物を増幅されたポリヌクレオチドに結合させる工程を更に含んでもよい。
【００２３】
更に、それぞれのパーティションは、平均で、バーコード配列を含む約1個のポリヌクレオチド、バーコード配列を含む0.5個のポリヌクレオチド、又はバーコード配列を含む0.1個のポリヌクレオチドを含んでもよい。更に、パーティションは、液滴、カプセル、及びウェルからなる群から選択されてもよい。
【００２４】
いくつかの場合、ライブラリーは、少なくとも約1,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約100,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約1,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約2,500,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約5,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約10,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約25,000,000個の異なるバーコード配列、少なくとも約50,000,000個の異なるバーコード配列、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
【００２５】
いくつかの場合、パーティションは、バーコード配列を含む同じポリヌクレオチドの複数のコピーを含む。
【００２６】
更に、バーコード配列を含むポリヌクレオチドは、固定化配列、配列決定プライマーのためのアニーリング配列、及び標的ポリヌクレオチドとのライゲーションに適合する配列からなる群から選択される配列を含んでもよい。
【００２７】
本開示の更なる態様は、少なくとも約1,000個のビーズを含むライブラリーであって、少なくとも約1,000個のビーズの各ビーズが異なるバーコード配列を含む、ライブラリーを提供する。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、固定化配列及び/又は配列決定プライマーのためのアニーリング配列を含むポリヌクレオチド中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、少なくとも約5ヌクレオチド長又は少なくとも約10ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの場合、異なるバーコード配列は、無作為ポリヌクレオチド配列であっても、又は組合せによって生成されてもよい。
【００２８】
更に、1,000個のビーズの各々は、複数のコピーの異なるバーコード配列を含んでもよい。例えば、1,000個のビーズの各々は、少なくとも約100,000コピー、少なくとも約1,000,000コピー、又は少なくとも約10,000,000コピーの異なるバーコード配列を含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、同じバーコード配列を含む2個以上のビーズを更に含んでもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの少なくとも2個のビーズは、同じバーコード配列を含んでもよい。更に、少なくとも約1,000個のビーズは、少なくとも約10,000個のビーズ、又は少なくとも約100,000個のビーズを含む。
【００２９】
また、ライブラリーは、少なくとも約1,000個、少なくとも約10,000個、少なくとも約100,000個、少なくとも約1,000,000個、少なくとも約2,500,000個、少なくとも約5,000,000個、少なくとも約10,000,000個、少なくとも約25,000,000個、少なくとも約50,000,000個、又は少なくとも約100,000,000個の異なるバーコード配列を含んでもよい。
【００３０】
いくつかの場合、少なくとも約1,000個のビーズを、複数のパーティションにわたって分配することができる。いくつかの場合、パーティションは乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの各ビーズは、異なるパーティション中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるパーティションは、乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズの2つ以上のビーズは、異なるパーティション中に含まれていてもよい。いくつかの場合、異なるパーティションは、乳濁液の液滴であってもよい。いくつかの場合、1,000個のビーズはヒドロゲルビーズであってもよい。
【００３１】
本開示の更なる態様は、種の区分化における、オリゴヌクレオチドの区分化における、パーティションからの種の刺激原選択的放出における、パーティション中での反応(例えば、ライゲーション及び増幅反応)の実施における、核酸合成反応の実施における、核酸のバーコード化における、配列決定のためのポリヌクレオチドの調製における、ポリヌクレオチドの配列決定における、突然変異検出における、神経障害診断における、糖尿病診断における、胎児異数性診断における、がん突然変異検出及び法医学における、疾患検出における、医学的診断における、低入力核酸適用における、循環腫瘍細胞(CTC)配列決定における、ポリヌクレオチド位相化における、少数の細胞からのポリヌクレオチドの配列決定における、遺伝子発現の分析における、細胞からのポリヌクレオチドの区分化における、又はその組合せにおける、本明細書に記載のライブラリー、組成物、方法、装置、又はキットの使用を提供する。
【００３２】
参照による組込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本開示の方法、組成物、システム、及び装置の新規特徴は、特に、添付の特許請求の範囲の詳細と共に説明される。本開示の特徴及び利点のより良好な理解は、本開示の方法、組成物、システム、及び装置の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明、並びに添付の図面に対する参照により得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】例示的なフォーク型アダプターを概略的に示す図である。
【図２】例示的なバーコード領域の配置を概略的に示す図である。
【図３】標的ポリヌクレオチドの反対の末端にライゲートされた2つのフォーク型アダプターの例示的配列を示す図である。
【図４】実施例1に記載のフォーク型アダプターを生成するために用いられる方法の例を概略的に示す図である。
【図５】実施例2に記載のカプセル内カプセルの例を概略的に示す図である。
【図６】実施例3に記載のカプセル内カプセルの例を概略的に示す図である。
【図７】実施例4に記載の方法に従って生成することができる生成物(又は中間体)の例を概略的に示す図である。
【図８ａ】実施例4に記載の配列の例を示す図である。
【図８ｂ】実施例4に記載の配列の例を示す図である。
【図８ｃ】実施例4に記載の配列の例を示す図である。
【図９ａ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｂ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｃ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｄ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｅ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｆ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｇ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｈ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｉ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図９ｊ】実施例5に記載の配列の例を示す図である。
【図１０ａ】実施例6に記載の配列の例を示す図である。
【図１０ｂ】実施例6に記載の配列の例を示す図である。
【図１０ｃ】実施例6に記載の配列の例を示す図である。
【図１０ｄ】実施例6に記載の配列の例を示す図である。
【図１０ｅ】実施例6に記載の配列の例を示す図である。
【図１１ａ】実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１１ｂ】実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１１ｃ】実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１１ｄ】実施例7に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１２】例示的なフローフォーカシング(flow-focusing)法によるカプセルの生産を概略的に示す図である。
【図１３】例示的なフローフォーカシング法によるカプセル内カプセルの生産を概略的に示す図である。
【図１４ａ】実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１４ｂ】実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１４ｃ】実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１４ｄ】実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１４ｅ】実施例8に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１５ａ】実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１５ｂ】実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１５ｃ】実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１５ｄ】実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１５ｅ】実施例9に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１６】実施例10に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図１７】実施例11に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
【図１８】実施例12に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
【図１９ａ】実施例13に記載の配列の例を示す図である。
【図１９ｂ】実施例13に記載の配列の例を示す図である。
【図１９ｃ】実施例13に記載の配列の例を示す図である。
【図１９ｄ】実施例13に記載の配列の例を示す図である。
【図１９ｅ】実施例13に記載の配列の例を示す図である。
【図１９ｆ】実施例13に記載の方法及び構造の例を示す図である。
【図２０】実施例14に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
【図２１ａ】実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図２１ｂ】実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図２１ｃ】実施例15に記載の方法及び構造を概略的に示す図である。
【図２２】実施例16に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
【図２３】実施例17に記載のカプセル内カプセルを概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の様々な実施形態をここで示し、説明したが、そのような実施形態はほんの一例として提供されるに過ぎないことが当業者には明らかである。当業者であれば、本発明から逸脱することなくいくつかの変動、変化、及び置換を行うことができる。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物を用いることができることが理解されるべきである。
【００３６】
本開示は、ポリヌクレオチドバーコードの生成及びそのようなポリヌクレオチドバーコードの使用のための方法、組成物、システム、及びキットを提供する。そのようなポリヌクレオチドバーコードを、任意の好適な用途に使用することができる。いくつかの場合、本開示で提供されるポリヌクレオチドバーコードを、次世代配列決定反応において用いることができる。次世代配列決定反応は、全ゲノムの配列決定、単一ヌクレオチド多型(SNP)及び他の突然変異などの特定の配列の検出、核酸(例えば、デオキシリボ核酸)挿入の検出、並びに核酸欠失の検出を含む。
【００３７】
本明細書に記載の方法、組成物、システム、及びキットの使用は、別途指摘しない限り、有機化学、ポリマー技術、マイクロフルイディクス、分子生物学、組換え技術、細胞生物学、生化学、及び免疫学の任意の従来技術を含んでもよい。そのような従来技術は、ウェル及びマイクロウェルの構築、カプセル生成、乳濁液の生成、スポッティング、マイクロ流体装置構築、ポリマー化学、制限消化、ライゲーション、クローニング、ポリヌクレオチド配列決定、及びポリヌクレオチド配列アセンブリを含む。好適な技術の特異的な非限定例は、本開示を通じて記載される。しかしながら、等価な手順を用いることもできる。ある特定の技術の説明を、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual、及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual (全てCold Spring Harbor Laboratory Pressから)、並びに「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、1984、IRL Press Londonなどの標準的な実験室マニュアルに見出すことができ、これらは全てその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
I.定義
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、本文が別途明確に指摘しない限り、複数形も同様に含むことが意図される。更に、用語「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」、「など(such as)」又はその変形が明細書及び/又は特許請求の範囲のいずれかで用いられる程度で、そのような用語は限定的ではなく、用語「含む(comprising)」と類似する様式で包括的であることが意図される。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「約」とは一般に、特定の使用の文脈内の記述された数値よりも15%高いか、又は低い範囲を指す。例えば、「約10」は8.5〜11.5の範囲を含む。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「バーコード」とは一般に、分析物に関する情報を伝達するために分析物に結合させることができる標識を指す。例えば、バーコードは、特定のパーティション内に含まれる標的ポリヌクレオチドの断片に結合したポリヌクレオチド配列であってもよい。次いで、このバーコードを、標的ポリヌクレオチドの断片を用いて配列決定することができる。複数の配列上の同じバーコードの存在は、配列の起源に関する情報を提供することができる。例えば、バーコードは、配列が特定のパーティション及び/又はゲノムの近位領域に由来したことを示してもよい。これは、いくつかのパーティションが配列決定の前にプールされる場合の配列アセンブリに特に有用であり得る。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「bp」は一般に、「塩基対」の省略形を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「マイクロウェル」は一般に、1mL未満の容量を有するウェルを指す。用途に応じて、マイクロウェルを様々な容量で作製することができる。例えば、マイクロウェルを、本明細書に記載の任意のパーティション容量を収容するのに適切なサイズで作製することができる。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「パーティション」は、動詞又は名詞であってもよい。動詞として用いられる場合(例えば、「区分化する」又は「区分化」)、この用語は一般に、1つの画分(又は細分)を別の画分から隔離するために用いることができる容器間での種又は試料(例えば、ポリヌクレオチド)の分画化(例えば、細分化)を指す。そのような容器は、名詞「パーティション」を用いて言及される。区分化を、例えば、マイクロフルイディクス、希釈、分注などを用いて実施することができる。パーティションは、例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズ、希釈溶液中のビーズ表面、又は試料の1つの画分を別の画分から隔離するための任意の他の好適な容器であってもよい。また、パーティションは、別のパーティションを含んでもよい。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は一般に、複数のヌクレオチドを含む分子を指す。例示的なポリヌクレオチドとしては、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチド核酸などのその合成類似体が挙げられる。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「種」は一般に、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットと共に用いることができる任意の物質を指す。種の例としては、試薬、分析物、細胞、染色体、タグ付分子又は分子群、バーコード、及びこれらの種のいずれかを含む任意の試料が挙げられる。本開示の他の場所でより完全に考察される通り、任意の好適な種を用いることができる。
【００４７】
II.ポリヌクレオチドバーコード化
ある特定の用途、例えば、ポリヌクレオチド配列決定は、配列の起源を同定するため、例えば、配列決定された断片からより大きい配列を集合させるためのユニークな識別子(「バーコード」)に依拠してもよい。したがって、配列決定の前にポリヌクレオチド断片にバーコードを付加することが望ましいことがある。バーコードは、ポリヌクレオチドバーコードなどの、様々な異なる形式のものであってもよい。特定の用途に応じて、バーコードを可逆的又は不可逆的な様式でポリヌクレオチド断片に結合させることができる。更に、バーコードは、配列決定中に個々のポリヌクレオチド断片の同定及び/又は定量化を可能にしてもよい。
【００４８】
1つ又は複数のバーコードが特定のパーティション中に導入されるように、バーコードをパーティション中に充填することができる。いくつかの場合、各パーティションは、異なるセットのバーコードを含有してもよい。これは、バーコードをパーティション中に直接分注することにより、又は別のパーティション内に含有されるパーティション内にバーコードを入れることにより達成することができる。
【００４９】
バーコードを、バーコード化しようとする種(例えば、ポリヌクレオチド断片、ポリヌクレオチドの鎖、細胞など)あたりのバーコードの期待又は予測される比でパーティション中に充填することができる。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個のバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個を超えるバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。いくつかの場合、バーコードは、種あたり約0.0001、0.001、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、500、1000、5000、10000、又は200000個未満のバーコードが充填されるように、パーティション中に充填される。
【００５０】
ポリヌクレオチド断片あたり1個を超えるバーコードが存在する場合、そのようなバーコードは同じバーコードのコピーであるか、又は異なるバーコードであってもよい。例えば、複数の同一のバーコードを単一のポリヌクレオチド断片に結合させるか、又は複数の異なるバーコードをポリヌクレオチド断片に結合させるように、結合プロセスを設計することができる。
【００５１】
本明細書に提供される方法は、ポリヌクレオチド断片へのバーコードの結合にとって必要な試薬をパーティションに充填する工程を含んでもよい。ライゲーション反応の場合、制限酵素、リガーゼ酵素、バッファー、アダプター、バーコードなどを含む試薬を、パーティション中に充填することができる。増幅によりバーコード化する場合、プライマー、DNAポリメラーゼ、dNTP、バッファー、バーコードなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。トランスポゾン媒介性バーコード化(例えば、NEXTERA)の場合、トランスポゾーム(すなわち、トランスポザーゼとトランスポゾンの末端複合体)、バッファーなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。MALBAC媒介性バーコード化の場合、MALBACプライマー、バッファーなどを含む試薬をパーティション中に充填することができる。本開示を通して記載されるように、これらの試薬をパーティション中に直接充填するか、又は別のパーティションを介して充填してもよい。
【００５２】
バーコードを、付着末端又は平滑末端を用いてポリヌクレオチド断片にライゲートすることができる。また、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を、バーコードを含むプライマーを用いてポリヌクレオチド断片を増幅することにより生成することもできる。いくつかの場合、ポリヌクレオチド断片のMALBAC増幅を用いて、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を生成することができる。MALBACのために用いられるプライマーは、バーコードを含んでも、又は含まなくてもよい。MALBACプライマーがバーコードを含まない場合、例えば、PCRなどの他の増幅方法により、バーコードをMALBAC増幅産物に付加することができる。また、バーコード化されたポリヌクレオチド断片を、トランスポゾン媒介性方法を用いて生成することもできる。本開示において考察される任意の他の種と同様、アッセイ又はプロセスの必要に応じて、これらのモジュールを同じか、又は異なるパーティション内に含有させることができる。
【００５３】
いくつかの場合、バーコードを、モジュラー形式で集合するように設計されたより小さい成分から組合せ的に集合させることができる。例えば、3つのモジュール、1A、1B及び1Cを組合せ的に集合させて、バーコード1ABCを生産することができる。そのような組合せアセンブリは、複数のバーコードを合成する費用を有意に低下させることができる。例えば、3Aモジュール、3Bモジュール、及び3Cモジュールからなる組合せシステムは、わずか9つのモジュールから3*3*3=27の可能なバーコード配列を生成することができる。
【００５４】
いくつかの場合、本開示の他の場所に更に記載されるように、2つのオリゴヌクレオチドを混合し、それらをハイブリダイズさせてアニーリングした、又は部分的にアニーリングしたオリゴヌクレオチド(例えば、フォーク型アダプター)を生産することにより、バーコードを組合せ的に集合させることができる。これらのバーコードは、バーコード化されるポリヌクレオチド断片とのライゲーションを容易にするために、1つ又は複数のヌクレオチドの突出部を含んでもよい。いくつかの場合、アンチセンス鎖の5'末端をリン酸化して、二本鎖ライゲーションを確保することができる。この手法を用いて、異なるモジュールを、例えば、オリゴヌクレオチドAとB、AとC、AとD、BとC、BとDなどを混合することにより集合させることができる。本開示の他の場所により詳細に記載されるように、アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、ヘアピンループを有する単一の分子として合成し、バーコード化しようとするポリヌクレオチドへのライゲーション後に切断することができる。
【００５５】
本開示の他の場所により詳細に記載されるように、互いへのポリヌクレオチドの結合は、ハイブリダイゼーション適合性突出部に依拠してもよい。例えば、断片間のライゲーション適合性を確保するために、AとTとのハイブリダイゼーションが用いられることが多い。いくつかの場合、Taqポリメラーゼなどの酵素を用いる処理により、突出部を作出することができる。いくつかの場合、制限酵素を用いて、例えば、A又はTであってもよい単一塩基の3'突出部を有する切断産物を作出することができる。単一塩基の3'突出部を脱離させる制限酵素の例としては、MnII、HphI、Hpy188I、HpyAV、HpyCH4III、MboII、BciVI、BmrI、AhdI、及びXcmIが挙げられる。他の場合、制限酵素により異なる突出部(例えば、5'突出部、単一塩基より大きい突出部)を生成することができる。突出部を生成するために用いることができる更なる制限酵素としては、BfuCl、TaqαI、BbVI、Bccl、BceAl、BcoDI、BsmAI、及びBsmFIが挙げられる。
【００５６】
III.区分化されたバーコードライブラリーの生成
いくつかの場合、本開示は、区分化されたバーコードライブラリーの生成のための方法及びそのような方法に従って生産されたライブラリーを提供する。いくつかの場合、本明細書に提供される方法は、パーティション内に含まれるバーコードのライブラリーを提供するために、DNA配列の無作為合成、パーティションへの分離、分離された配列の増幅、及び増幅された分離された配列の単離を組み合わせる。
【００５７】
a.ポリヌクレオチドバーコードの無作為合成
いくつかの場合、本明細書に記載の方法は、DNA合成の無作為方法などの、ポリヌクレオチド合成の無作為方法を用いる。無作為DNA合成中に、カップリング工程におけるそれぞれの塩基型が産物のサブセットにカップリングされるように、A、C、G及び/又はTの任意の組合せをカップリング工程に添加することができる。A、C、G及びTが等しい濃度で存在する場合、産物の約1/4が各塩基を含む。連続カップリング工程、及びカップリング反応の無作為性により、4n(ここで、nはポリヌクレオチド中の塩基数である)個の可能な配列の生成が可能となる。例えば、長さ6の無作為ポリヌクレオチドのライブラリーは、46=4,096のメンバーの多様性を有するが、長さ10のライブラリーは1,048,576のメンバーの多様性を有する。したがって、非常に大きく複雑なライブラリーを生成することができる。これらの無作為配列は、バーコードとして役立ち得る。
【００５８】
また、任意の好適な合成塩基を、本発明と共に用いてもよい。いくつかの場合、各カップリング工程に含まれる塩基を、好ましい産物を合成するために変化させることができる。例えば、各カップリング工程中に存在する塩基数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上であってもよい。いくつかの場合、各カップリング工程中に存在する塩基数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、、10以上であってもよい。いくつかの場合、各カップリング工程中に存在する塩基数は、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10未満であってもよい。
【００５９】
また、個々の塩基の濃度を、好ましい産物を合成するために変化させてもよい。例えば、任意の塩基が、別の塩基の濃度の約0.1、0.5、1、5又は10倍の濃度で存在してもよい。いくつかの場合、任意の塩基が別の塩基の濃度の少なくとも約0.1、0.5、1、5、又は10倍の濃度で存在してもよい。いくつかの場合、任意の塩基が別の塩基の濃度の約0.1、0.5、1、5、又は10倍未満の濃度で存在してもよい。
【００６０】
無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、用途に応じて、任意の好適な長さであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のヌクレオチドであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20以上のヌクレオチドであってもよい。いくつかの場合、無作為ポリヌクレオチド配列の長さは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20未満のヌクレオチドであってもよい。
【００６１】
いくつかの場合、ライブラリーは、メンバー数によって定義される。いくつかの場合、ライブラリーは、約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、少なくとも約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーは、約256、1024、4096、16384、65536、262144、1048576、4194304、16777216、67108864、268435456、1073741824、4294967296、17179869184、68719476736、2.74878*1011、又は1.09951*1012未満のメンバーを含んでもよい。いくつかの場合、ライブラリーはバーコードライブラリーである。いくつかの場合、バーコードライブラリーは少なくとも約1000、10000、100000、1000000、2500000、5000000、10000000、25000000、50000000、又は100000000の異なるバーコード配列を含んでもよい。
【００６２】
無作為バーコードライブラリーはまた、他のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの場合、これらの他のポリヌクレオチド配列は、天然で非無作為であり、例えば、プライマー結合部位、フォーク型アダプターの生成のためのアニーリング部位、固定化配列、及び標的ポリヌクレオチド配列とのアニーリングを可能にし、したがってポリヌクレオチド配列のバーコード化を可能にする領域を含む。
【００６３】
b.パーティション中へのポリヌクレオチドの分離
無作為バーコード配列を含むポリヌクレオチドの合成の後、ポリヌクレオチドを別々のコンパートメントに区分化して、バーコード配列を含む区分化されたポリヌクレオチドのライブラリーを生成する。任意の好適な分離方法及び任意の好適なパーティション又はパーティション内パーティションを用いることができる。
【００６４】
いくつかの場合、区分化は、特定の容量の希釈液が、平均で1未満のポリヌクレオチドを含有するように、無作為バーコード配列を含むポリヌクレオチドの混合物を希釈することによって実施される。次いで、特定の容量の希釈液を、パーティションに移すことができる。したがって、任意の複数のパーティション中に、各パーティションは1又は0個のポリヌクレオチド分子を有する可能性がある。
【００６５】
いくつかの場合、各パーティションが約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2個以上の分子を含むように、希釈を実施することができる。いくつかの場合、各パーティションが少なくとも約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2個以上の分子を含むように、希釈を実施することができる。いくつかの場合、各パーティションが約0.001、0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、又は2個未満の分子を含むように、希釈を実施することができる。
【００６６】
いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、特定数の分子を含む。いくつかの場合、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、特定数の分子を含む。いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションは、特定数の分子を含む。
【００６７】
いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションは、1以下のポリヌクレオチドを含む。
【００６８】
いくつかの場合、パーティションは、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズの表面、又は試料の1つの画分を別の画分から隔離するための任意の他の好適な容器である。パーティションがビーズを含む場合、増幅のためのプライマーをビーズに結合させることができる。パーティションは、本開示の他の場所により詳細に記載される。
【００６９】
c.区分化されたポリヌクレオチドの増幅
次いで、上記のように区分化されたポリヌクレオチドを増幅して、標的ポリヌクレオチド配列のバーコード化のための十分な材料を生成する。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ヘリカーゼ依存的増幅、直線後指数的PCR(LATE-PCR)、非対称性増幅、デジタルPCR、縮重オリゴヌクレオチドプライマーPCR(DOP-PCR)、プライマー伸長増幅前PCR(PEP-PCR)、ライゲーション媒介性PCR、ローリングサークル増幅、多置換増幅(MDA)、及び単一プライマー等温増幅(SPIA)、エマルジョンPCR(ePCR)、ビーズの使用を含むePCR、ヒドロゲルの使用を含むePCR、複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅サイクル(MALBAC)、並びにその組合せなどの、任意の好適な増幅方法を用いることができる。MALBAC法は、例えば、Zongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
【００７０】
いくつかの場合、例えば、一本鎖産物を生成する増幅方法(例えば、非対称性増幅、SPIA、及びLATE-PCR)が好ましいことがある。いくつかの場合、二本鎖産物を生成する増幅方法(例えば、標準的なPCR)が好ましいことがある。いくつかの場合、増幅方法は、区分化されたポリヌクレオチドを指数的に増幅する。いくつかの場合、増幅方法は、区分化されたポリヌクレオチドを直線的に増幅する。いくつかの場合、増幅方法は、最初は指数的に、次いで直線的にポリヌクレオチドを増幅する。更に、単一の型の増幅を用いてポリヌクレオチドを増幅するか、又は異なる型の増幅の連続的工程を用いて増幅を完了させることができる。例えば、ePCRを更なる周回のePCRと組み合わせるか、又は異なる型の増幅と組み合わせることができる。
【００７１】
増幅は、バーコードを含む好適な量のポリヌクレオチドが産生されるまで実施される。いくつかの場合、増幅を、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60サイクル以上実施することができる。いくつかの場合、増幅を、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60サイクル以上実施することができる。いくつかの場合、増幅を、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、又は60サイクル未満実施することができる。
【００７２】
いくつかの場合、増幅を、ある特定の量のポリヌクレオチド生成物が各パーティション中に生産されるまで実施することができる。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が約10,000,000,000; 5,000,000,000; 1,000,000,000; 500,000,000; 100,000,000; 50,000,000; 10,000,000; 5,000,000; 1,000,000; 500,000; 400,000; 300,000; 200,000;  又は100,000分子となるまで実施される。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が少なくとも約100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000;  又は10,000,000,000分子となるまで実施される。いくつかの場合、増幅は、ポリヌクレオチド産物の量が約10,000,000,000; 5,000,000,000; 1,000,000,000; 500,000,000; 100,000,000; 50,000,000; 10,000,000; 5,000,000; 1,000,000; 500,000; 400,000; 300,000; 200,000;  又は100,000分子未満となるまで実施される。
【００７３】
d.増幅された配列を含むパーティションの単離
上記のように、いくつかの場合、バーコードを含むポリヌクレオチドは、各パーティションが平均で1未満のポリヌクレオチド配列を含有するように区分化される。したがって、いくつかの場合、パーティションの画分は、ポリヌクレオチドを含有せず、したがって、増幅されたポリヌクレオチドを含有することができない。したがって、ポリヌクレオチドを含まないパーティションからポリヌクレオチドを含むパーティションを分離することが望ましいことがある。
【００７４】
ある場合、ポリヌクレオチドを含むパーティションを同定することができるフローに基づく選別法を用いて、ポリヌクレオチドを含むパーティションを、ポリヌクレオチドを含まないパーティションから分離する。いくつかの場合、ポリヌクレオチドの存在の指標を用いて、ポリヌクレオチドを含まないものからポリヌクレオチドを含むパーティションを区別することができる。
【００７５】
いくつかの場合、核酸染色を用いて、ポリヌクレオチドを含むパーティションを同定することができる。例示的な染色としては、挿入染料、副溝結合剤、主溝結合剤、外部結合剤、及びビス挿入剤が挙げられる。そのような染料の特定例としては、SYBRグリーン、SYBRブルー、DAPI、ヨウ化プロピジウム、SYBRゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマリン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンD、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン類及びアクリジン類、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー-1及び-2、エチジウムモノアジド、ACMA、インドール類、イミダゾール類(例えば、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580及びDAPI)、アクリジンオレンジ(これも挿入することができる)、7-AAD、アクチノマイシンD、LDS751、ヒドロキシスチルバミジン、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45 (青)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25 (グリーン)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85 (オレンジ)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、及び-63 (赤)が挙げられる。
【００７６】
いくつかの場合、粒子の磁気分離又は沈降などの単離方法を用いることができる。そのような方法は、例えば、増幅しようとするポリヌクレオチド、増幅しようとする前記ポリヌクレオチドに対応するプライマー、及び/又は増幅のポリヌクレオチド産物を、ビーズに結合させる工程を含んでもよい。いくつかの場合、増幅しようとするポリヌクレオチド、増幅しようとする前記ポリヌクレオチドに対応するプライマー、及び/又はポリヌクレオチド生成物のビーズへの結合は、例えば、PCアミノC6などの光不安定リンカーを介するものであってもよい。光不安定リンカーを用いる場合、光を用いて、連結されたポリヌクレオチドをビーズから遊離させることができる。ビーズは、例えば、磁気ビーズ又はラテックスビーズであってもよい。次いで、ビーズは、例えば、磁気選別又は沈降による分離を可能にすることができる。ラテックス粒子の沈降を、例えば、グリセロールなどの、ラテックスよりも密度の高い液体中での遠心分離によって実施することができる。いくつかの場合、密度勾配遠心分離を用いることができる。
【００７７】
ビーズは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、ビーズの直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。ビーズは、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、ビーズは、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、ビーズは、約0.001μm〜1 mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、20μm〜50μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
【００７８】
いくつかの場合、ポリヌクレオチドを含むパーティションと、ポリヌクレオチドを含まないパーティションとの示差的電荷を用いて、例えば、パーティション上での電気泳動又は誘電泳動を実施することにより、ポリヌクレオチドを含むパーティションを単離することができる。
【００７９】
いくつかの場合、浸透圧の差異に基づく、パーティションの選択的膨張又は縮小を用いて、ポリヌクレオチドを含む粒子を同定することができる。いくつかの例においては、ポリヌクレオチドを含むパーティションを、フロー分画、溶媒抽出、示差的融解(例えば、核酸プローブを用いる)、又は凍結により単離することができる。
【００８０】
ポリヌクレオチドを含むパーティションの単離は、1回のバルク合成費用のみを負担しながら、有意な多様性を有する区分化されたポリヌクレオチドバーコードのライブラリーを提供する。
【００８１】
IV.バーコードを含むアダプターの生成
本開示に記載のバーコードは、様々な構造を有してもよい。いくつかの場合、本開示のバーコードは、アダプターの一部である。一般に、「アダプター」は、バーコードの標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にするために用いられる構造である。アダプターは、例えば、バーコード、標的ポリヌクレオチドとのライゲーションに適合するポリヌクレオチド配列、並びにプライマー結合部位及び固定化領域などの機能的配列を含んでもよい。
【００８２】
いくつかの場合、アダプターは、フォーク型アダプターである。フォーク型アダプターの例を、図1に概略的に図示する。図1を参照すると、2コピーのフォーク型アダプター構造106は、標的ポリヌクレオチド105の反対側に記載される。それぞれのフォーク型アダプターは、第1の固定化領域101、第2の固定化領域102、第1の配列決定プライマー領域103、第2の配列決定プライマー領域104及び互いにアニーリングする一対の部分相補領域(103及び104内)を含む。配列決定プライマー領域又は固定化領域のいずれかを用いて、バーコード化されたポリヌクレオチドを、例えば、ビーズの表面上に固定することができる。配列決定プライマー領域を、例えば、配列決定プライマーのためのアニーリング部位として用いることができる。いくつかの場合、突出部を、標的配列との互換性を可能にするように設計することができる。図1において、一対のアニーリングしたポリヌクレオチド103及び104は、3'-T突出部を有し、これは標的ポリヌクレオチド105上の3'-A突出部と適合する。バーコードを、フォーク型アダプターの任意の好適な部分に含有させることができる。バーコードを含むフォーク型アダプターの標的配列105への結合後、配列決定プライマー領域103及び104を用いて、標的ポリヌクレオチドを配列決定することができる。フォーク型アダプター構造の別の例としては、New England Biolabs(商標)社から入手可能なIllumina(商標)ライブラリー調製物及びIllumina用NEBNext(登録商標)Multiplex Oligos中で用いられるものが挙げられる。非フォーク型アダプターの例としては、Merrimanら、Electrophoresis、33(23) 3397〜3417頁(2012)(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたものが挙げられる。
【００８３】
図2は、図1に記載のフォーク型アダプター内のバーコード領域の配置の3つの概略的な図例を示す。一例において、バーコード205(BC1)は、第1の固定化領域201内又は第1の固定化領域201と第1の配列決定プライマー領域203との間に位置する。別の例においては、バーコード206(BC2)は、第1の配列決定プライマー領域203の内部に、又はそれに隣接して位置する。更に別の例においては、バーコード207(BC3)は、第2の固定化領域202内又は第2の固定化領域202と第2の配列決定プライマー領域204との間に位置する。図2は標的配列の両末端上のバーコードを記載するが、いくつかの用途にとっては標的配列あたりにただ1つのバーコードで十分であるため、これは必須ではない。しかしながら、本開示の他の場所に記載のように、標的配列あたり1つを超えるバーコードを用いることもできる。
【００８４】
図3は、標的ポリヌクレオチド(NNN)の反対の末端にライゲートされた2つのフォーク型アダプターの例示的配列(配列番号1及び配列番号22)を提供し、配列レベルでの各フォーク型アダプターのバーコード領域(太字、ヌクレオチド30〜37、71〜77、81〜87、及び122〜129)を示す。図3において、ヌクレオチド1〜29は第1のフォーク型アダプターの固定化領域を表し、ヌクレオチド38〜70は第1のフォーク型アダプターの配列決定プライマー領域を表し、ヌクレオチド78〜80(NNN)は任意の長さの標的ポリヌクレオチドを表し、ヌクレオチド88〜120は第2のフォーク型アダプターの配列決定プライマー領域を表し、ヌクレオチド129〜153は第2のフォーク型アダプターの固定化領域を表す。
【００８５】
V.パーティション
a.パーティションの一般的特徴
本開示を通して記載される通り、本開示のある特定の方法、組成物、システム、装置、及びキットは、ある特定の種の別々のパーティションへの細分化(区分化)を用いることができる。パーティションは、例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液の連続相、試験管、スポット、カプセル、ビーズの表面、又は試料若しくは種の1つの画分を隔離するための任意の他の好適な容器であってもよい。パーティションを用いて、更なるプロセッシングのための種を含有させることができる。例えば、種がポリヌクレオチド分析物である場合、更なるプロセッシングは、試薬である種を用いる切断、ライゲーション、及び/又はバーコード化を含んでもよい。任意数の装置、システム又は容器を用いて、パーティションを保持する、支持する、又は含有させることができる。いくつかの場合、マイクロウェルプレートを用いて、パーティションを保持する、支持する、又は含有させることができる。任意の好適なマイクロウェルプレート、例えば、96、384又は1536個のウェルを有するマイクロウェルプレートを用いることができる。
【００８６】
各パーティションはまた、任意の他の好適なパーティションを含有するか、又はその中に含有されていてもよい。例えば、ウェル、マイクロウェル、穴、ビーズの表面、又はチューブは、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、乳濁液中の連続相、スポット、カプセル、又は任意の他の好適なパーティションを含んでもよい。液滴は、カプセル、ビーズ、又は別の液滴を含んでもよい。カプセルは、液滴、ビーズ、又は別のカプセルを含んでもよい。これらの説明は単に例示的なものに過ぎず、あらゆる好適な組合せ及び複数性も想定される。例えば、任意の好適なパーティションは、複数の同じか、又は異なるパーティションを含んでもよい。一例においては、ウェル又はマイクロウェルは、複数の液滴及び複数のカプセルを含む。別の例においては、カプセルは、複数のカプセル及び複数の液滴を含む。あらゆる組合せのパーティションが想定される。Table 1(表1)は、互いに組み合わせることができるパーティションの非限定例を示す。
【００８７】
【表１】
2019107035.tif 000002
【００８８】
本明細書に記載の任意のパーティションは、複数のパーティションを含んでもよい。例えば、パーティションは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個のパーティションを含んでもよい。パーティションは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個のパーティションを含んでもよい。いくつかの場合、パーティションは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、又は50000個未満のパーティションを含んでもよい。いくつかの場合、各パーティションは、2〜50、2〜20、2〜10、又は2〜5個のパーティションを含んでもよい。
【００８９】
パーティションは、任意の好適な種又は種の混合物を含んでもよい。例えば、いくつかの場合、パーティションは、試薬、分析物、試料、細胞、及びその組合せを含んでもよい。他のパーティションを含むパーティションは、同じパーティション中のある特定の種及び異なるパーティション中のある特定の種を含んでもよい。特定のプロセスの必要性に応じて、種を任意の好適なパーティション間で分配することができる。例えば、Table 1(表1)中の任意のパーティションは、少なくとも1つの第1の種を含有し、Table 1(表1)中の任意のパーティションは少なくとも1つの第2の種を含有してもよい。いくつかの場合、第1の種は試薬であってもよく、第2の種は分析物であってもよい。
【００９０】
いくつかの場合、種は、細胞から単離されたポリヌクレオチドである。例えば、いくつかの場合、ポリヌクレオチド(例えば、ゲノムDNA、RNAなど)は、任意の好適な方法(例えば、市販のキット)を用いて細胞から単離される。このポリヌクレオチドを定量することができる。次いで、定量されたポリヌクレオチドを、本明細書に記載のように複数のパーティションに区分化することができる。ポリヌクレオチドの区分化を、アッセイの定量化及び必要性に応じて、所定の包含量で実施することができる。いくつかの場合、パーティションの全部又は多く(例えば、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、若しくは95%)は、非重複断片の別々の混合物が複数のパーティションにわたって形成されるように、重複するポリヌクレオチドを含まない。次いで、区分化されたポリヌクレオチドを、当業界で公知の、又は本開示に記載の任意の好適な方法に従って処理することができる。例えば、区分化されたポリヌクレオチドを、断片化、増幅、バーコード化などすることができる。
【００９１】
種を、様々な方法を用いて区分化することができる。例えば、種を希釈し、複数のパーティションにわたって分注することができる。種を含む媒体の最終希釈を、パーティションの数が種の数を超えるように実施することができる。また、乳濁液若しくはカプセルを形成する前に、又は基質上に種をスポットする前に希釈液を用いることもできる。種の数とパーティションの数との比は、約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、少なくとも約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、約0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、50、100、又は1000未満であってもよい。種の数とパーティションの数との比は、約0.1〜10、0.5〜10、1〜10、2〜10、10〜100、100〜1000以上の範囲であってもよい。
【００９２】
また、区分化を、圧電液滴生成(例えば、Branskyら、Lab on a Chip、2009、9、516〜520頁)又は表面音響波(例えば、Demirci及びMontesano、Lab on a Chip、2007、7、1139〜1145頁)を用いて実施することもできる。
【００９３】
用いられるパーティションの数は、用途に応じて変化してもよい。例えば、パーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、or 10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。パーティションの数は、少なくとも約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。パーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000未満であってもよい。パーティションの数は、約5〜10000000、5〜5000000、5〜1,000,000、10〜10,000、10〜5,000、10〜1,000、1,000〜6,000、1,000〜5,000、1,000〜4,000、1,000〜3,000、又は1,000〜2,000であってもよい。
【００９４】
区分化される異なるバーコード又はバーコードの異なるセットの数は、例えば、区分化しようとする特定のバーコード及び/又は用途に応じて変化してもよい。バーコードの異なるセットは、例えば、同一のバーコードが各セット間で異なる同一のバーコードのセットであってもよい。又は、バーコードの異なるセットは、例えば、各セットがその含まれるバーコードにおいて異なる、異なるバーコードのセットであってもよい。例えば、約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、約1、5、10、50、100、1000、10000、  20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の異なるバーコード又はバーコードの異なるセットを区分化することができる。いくつかの例においては、約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000のバーコードを区分化することができる。
【００９５】
バーコードを、特定の密度で区分化することができる。例えば、バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、  20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000のバーコードを含有するように区分化することができる。
【００９６】
バーコードを、同一のバーコードが特定の密度で区分化されるように区分化することができる。例えば、同一のバーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000の同一のバーコードを含有するように区分化することができる。
【００９７】
バーコードを、異なるバーコードが特定の密度で区分化されるように区分化することができる。例えば、異なるバーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、100000000以上の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000、又は100000000未満の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。バーコードを、各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、100000〜1000000、10000〜1000000、10000〜10000000、又は10000〜100000000の異なるバーコードを含有するように区分化することができる。
【００９８】
バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、例えば、区分化しようとする異なるバーコードの用途及び/又は数に応じて変化してもよい。例えば、バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、又は10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100,000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1,000,000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、少なくとも約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、20000000以上であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5、10、50、100、250、500、750、1000、1500、2000、2500、5000、7500、10,000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000、又は20000000未満であってもよい。バーコードを区分化するために用いられるパーティションの数は、約5〜10000000、5〜5000000、5〜1,000,000、10〜10,000、10〜5,000、10〜1,000、1,000〜6,000、1,000〜5,000、1,000〜4,000、1,000〜3,000、又は1,000〜2,000であってもよい。
【００９９】
上記のように、異なるバーコード又はバーコードの異なるセット(例えば、各セットは複数の同一のバーコード又は異なるバーコードを含む)を、各パーティションが異なるバーコード又は異なるバーコードセットを含むように区分化することができる。いくつかの場合、各パーティションは、同一のバーコードの異なるセットを含んでもよい。同一のバーコードの異なるセットを区分化する場合、パーティションあたりの同一のバーコードの数は変化してもよい。例えば、約100,000以上の異なるセットの同一のバーコードを、各パーティションが同一のバーコードの異なるセットを含むように、約100,000以上の異なるパーティションにわたって区分化することができる。各パーティション中、バーコードのセットあたりの同一のバーコードの数は、約1,000,000の同一のバーコードであってもよい。いくつかの場合、バーコードの異なるセットの数は、パーティションの数に等しいか、又は実質的に等しくてもよい。任意の好適な数の異なるバーコード又は異なるバーコードセット(本明細書の他の場所に記載の区分化される異なるバーコード又は異なるバーコードセットの数を含む)、パーティションあたりのバーコードの数(本明細書の他の場所に記載のパーティションあたりのバーコードの数を含む)、及びパーティションの数(本明細書の他の場所に記載のパーティションの数を含む)を組み合わせて、パーティションあたり多数のバーコードを含む区分化されたバーコードの多様なライブラリーを生成することができる。したがって、理解されるように、上記の異なる数のバーコードのいずれかを、パーティションあたり上記のバーコード密度のいずれかと共に、及びパーティションの上記の数のいずれかにおいて提供することができる。
【０１００】
パーティションの容量は、用途に応じて変化してもよい。例えば、本開示に記載の任意のパーティション[例えば、ウェル、スポット、液滴(例えば、乳濁液中)、及びカプセル]の容量は、約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fLであってもよい。パーティションの容量は、少なくとも約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fLであってもよい。パーティションの容量は、約1000μl、900μl、800μl、700μl、600μl、500μl、400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、900nL、800nL、700nL、600nL、500nL、400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、10nL、5nL、5nL、2.5nL、1nL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、25pL、10pL、5pL、1pL、900fL、800fL、700fL、600fL、500fL、400fL、300fL、200fL、100fL、50fL、25fL、10fL、5fL、1fL、又は0.5fL未満であってもよい。パーティションの容量は、約0.5fL〜5pL、10pL〜10nL、10nL〜10μl、10μl〜100μl、又は100μl〜1mLであってもよい。
【０１０１】
異なるパーティション中の液体の容量における変動性が存在してもよい。より特には、異なるパーティションの容量は、パーティションのセットにわたって少なくとも(又は多くても)±1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、又は1000%変化してもよい。例えば、ウェル(又は他のパーティション)は、第2のウェル(又は他のパーティション)内の液体容量の多くても80%である液体の容量を含んでもよい。
【０１０２】
また、特定の種を特定のパーティションに標的化することもできる。例えば、いくつかの場合、捕捉試薬(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)を、特定の種(例えば、ポリヌクレオチド)を捕捉するためにパーティション内に固定又は配置することができる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドをビーズの表面上に固定して、相補配列を有するオリゴヌクレオチドを含む種を捕捉することができる。
【０１０３】
また、種を特定の密度で区分化することもできる。例えば、各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、又は1000000の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり少なくとも約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、1000000以上の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり約1、5、10、50、100、1000、10000、100000、又は1000000未満の種を含有するように、種を区分化することができる。各パーティションがパーティションあたり約1〜5、5〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、又は100000〜1000000の種を含有するように、種を区分化することができる。
【０１０４】
少なくとも1つのパーティションがそのパーティション内でユニークである種を含むように、種を区分化することができる。これは、約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上のパーティションに当てはまってもよい。これは、少なくとも約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上のパーティションについて当てはまってもよい。これは、約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満のパーティションについて当てはまってもよい。
【０１０５】
b.パーティションとしてのウェル
いくつかの場合、ウェルがパーティションとして用いられる。ウェルはマイクロウェルであってもよい。ウェルは、1つの種又は複数の種を含む媒体を含んでもよい。種は様々な構成でウェル内に含有されてもよい。一例では、種はウェル中に直接分注される。ウェル中に直接分注された種を、例えば、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆ってもよい。この層は、例えば、油、ワックス、膜などであってもよい。ウェルに別の種を導入する前後に、層を溶解又は融解することができる。ウェルを、密封層を用いて、任意の時点で、例えば、任意の種の添加後に密封することができる。
【０１０６】
一例では、試料プロセッシングのための試薬をウェル中に直接分注し、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆う。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、層の上部に導入する。層を溶解若しくは融解させるか、又は分析物(若しくは試薬)は層を介して拡散する。ウェルを密封し、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。
【０１０７】
いくつかの場合、ウェルは他のパーティションを含む。ウェルは、例えば、別のウェル、スポット、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどの任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは、単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
【０１０８】
一例では、ウェルは試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。カプセルを、液体媒体を用いてウェル中に充填するか、又は液体培地を用いずに(例えば、本質的に乾燥させて)ウェル中に充填することができる。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは、1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、ウェル中に導入することができる。ウェルを密封し、刺激を適用してカプセルの内容物のウェル中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらすことができる。ウェルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートすることができる。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物がウェル中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬がウェル中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
【０１０９】
別の例では、ウェルは乳濁液を含み、乳濁液の液滴は試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。プロセッシングしようとする分析物を含む試料は、乳濁液の液滴中に含まれる。ウェルを密封し、刺激を適用してカプセルの内容物の液滴中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。ウェルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
【０１１０】
ウェルを、アレイ、例えば、マイクロウェルアレイとして配置することができる。個々のウェルの寸法及び基質のサイズに基づいて、ウェルアレイは様々なウェル密度を含んでもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2であってもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、少なくとも10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2であってもよい。いくつかの場合、ウェル密度は、10ウェル/cm2、50ウェル/cm2、100ウェル/cm2、500ウェル/cm2、1000ウェル/cm2、5000ウェル/cm2、10000ウェル/cm2、50000ウェル/cm2、又は100000ウェル/cm2未満であってもよい。
【０１１１】
c.パーティションとしてのスポット
いくつかの場合、スポットがパーティションとして用いられる。スポットを、例えば、表面上に物質を分注することにより作製することができる。種は、様々な構成でスポット中に含まれていてもよい。一例では、種は、スポットを形成するために用いられる媒体中に種を含有させることによってスポット中に直接分注される。スポット上に直接分注された種を、例えば、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆うことができる。この層は、例えば、油、ワックス、膜などであってもよい。別の種をスポット上に導入する前後に層を溶解又は融解させることができる。スポットを任意の時点で、例えば、任意の種の添加後に、オーバーレイによって密封することができる。
【０１１２】
一例では、試料プロセッシングのための試薬を、スポット、例えば、スライドガラス上に直接分注し、溶解性、融解性、又は透過性である層で覆う。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、層の上部に導入する。層を溶解若しくは融解させるか、又は分析物(若しくは試薬)は層を通して拡散する。スポットを密封し、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。
【０１１３】
本開示の他の場所(例えば、Table 1(表1))に記載のように、スポットをウェル内に配置することもできる。いくつかの場合、各スポットの内容物が混ざらないように、複数のスポットをウェル内に配置することができる。そのような構成は、例えば、種が互いに接触しないようにすることが望ましい場合に有用であり得る。いくつかの場合、ウェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30以上のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30未満のスポットを含んでもよい。いくつかの場合、ウェルは、2〜4、2〜6、2〜8、4〜6、4〜8、5〜10、又は4〜12のスポットを含んでもよい。ウェルに物質(例えば、分析物を含有する媒体)を添加する際に、スポット中の種が混ざってもよい。更に、異なる種(又は種の組合せ)を含有する別々のスポットの使用も、スポットをウェルの内部に入れるために用いられる装置の交差夾雑を防止するのに有用であり得る。
【０１１４】
いくつかの場合、スポットは他のパーティションを含む。スポットは、例えば、別のスポット、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどを含む任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは、単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
【０１１５】
一例では、スポットは、試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を、スポットに導入する。スポットを密封し、刺激を適用して、カプセルの内容物のスポット中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。スポットを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物がスポット中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬がスポット中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
【０１１６】
別の例では、スポットは乳濁液を含み、乳濁液の液滴は試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。プロセッシングしようとする分析物を含む試料は、乳濁液の液滴内に含まれる。スポットを密封し、刺激を適用して、カプセルの内容物の液滴への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。スポットを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
【０１１７】
スポットは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、スポットの直径は、約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、2mm、5mm、又は1cmであってもよい。スポットは、少なくとも約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1mm、2mm、5mm、又は1cmの直径を有してもよい。いくつかの場合、スポットは、約0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1mm、1mm、2mm、5mm、又は1cm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、スポットは、約0.1μm〜1cm、100μm〜1mm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
【０１１８】
スポットは、アレイ、例えば、スポットアレイとして配置することができる。個々のスポットの寸法及び基質のサイズに基づいて、スポットアレイは様々なスポット密度を含んでもよい。いくつかの場合、スポット密度は、10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2であってもよい。いくつかの場合、スポット密度は、少なくとも10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2であってもよい。いくつかの場合、スポット密度は、10スポット/cm2、50スポット/cm2、100スポット/cm2、500スポット/cm2、1000スポット/cm2、5000スポット/cm2、10000スポット/cm2、50000スポット/cm2、又は100000スポット/cm2未満であってもよい。
【０１１９】
d.パーティションとしての乳濁液
いくつかの場合、乳濁液中の液滴がパーティションとして用いられる。乳濁液を、例えば、当業界で公知の方法(例えば、Weizmannら、Nature Methods、2006、3(7):545〜550頁; Weitzら、米国特許出願公開第2012/0211084号を参照されたい)などの任意の好適な方法により調製することができる。いくつかの場合、フッ化炭素中水乳濁液を用いることができる。これらの乳濁液は、ポリエチレングリコール(PEG)とのオリゴマーパーフルオロポリエーテル(PFPE)などのフッ素系界面活性剤を含んでもよい(Holtzeら、Lab on a Chip、2008、8(10):1632〜1639頁)。いくつかの場合、単分散性乳濁液を、マイクロ流体フローフォーカシング装置中で形成させることができる(Garsteckiら、Applied Physics Letters、2004、85(13):2649〜2651頁)。
【０１２０】
種を、例えば、液滴を形成する第1の相(例えば、油又は水)と第2の(連続)相(例えば、水又は油)とを含有する乳濁液中の液滴内に含有させることができる。乳濁液は、単一の乳濁液、例えば、油中水又は水中油乳濁液であってもよい。乳濁液は、二重乳濁液、例えば、水中油中水又は油中水中油乳濁液であってもよい。より高次数の乳濁液も可能である。乳濁液を、本開示に記載の任意の好適なパーティションなどの任意の好適な容器中に保持することができる。
【０１２１】
いくつかの場合、乳濁液中の液滴は、他のパーティションを含む。乳濁液中の液滴は、例えば、別の液滴(例えば、乳濁液中の液滴)、カプセル、ビーズなどを含む任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
【０１２２】
一例においては、乳濁液中の液滴は、試料プロセッシングのための試薬を含むカプセルを含む。本開示の他の場所に記載のように、カプセルは、1つ若しくは複数のカプセル、又は他のパーティションを含有してもよい。プロセッシングしようとする分析物を含む試料を液滴内に含有させる。刺激を適用して、カプセルの内容物の液滴中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。液滴を、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬がカプセル中にあり、分析物が液滴中にある実施形態を記載するものであるが、反対の構成、すなわち、試薬が液滴中にあり、分析物がカプセル中にあるのも可能である。
【０１２３】
乳濁液中の液滴は、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、乳濁液中の液滴の直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。液滴は、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、液滴は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、液滴は、約0.001μm〜1mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
【０１２４】
乳濁液中の液滴はまた、特定の密度を有してもよい。いくつかの場合、液滴は水性液体(例えば、水)より低密度である;いくつかの場合、液滴は水性液体より高密度である。いくつかの場合、液滴は非水性液体(例えば、油)よりも低密度である;いくつかの場合、液滴は非水性液体よりも高密度である。液滴は、約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。液滴は、少なくとも約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/ cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。他の場合、液滴の密度は、多くても約0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3であってもよい。そのような密度は、任意の特定の液体(例えば、水性、水、油など)中のカプセルの密度を反映してもよい。
【０１２５】
e.パーティションとしてのカプセル
いくつかの場合、カプセルがパーティションとして用いられる。カプセルを、乳化重合(Weitzら、米国特許出願公開第2012/0211084号)、多電解質との層ごとの集合、液滴形成、内部相分離、及びフローフォーカシングなどの、当業界で公知の方法を含む任意の好適な方法によって調製することができる。任意の好適な種をカプセル内に含有させることができる。カプセルを、本開示に記載の任意の好適なパーティションなどの任意の好適な容器中に保持することができる。
【０１２６】
いくつかの場合、カプセルは他のパーティションを含む。カプセルは、例えば、別のカプセル、乳濁液中の液滴、ビーズなどの任意の好適なパーティションを含んでもよい。各パーティションは単一のパーティション又は複数のパーティションとして存在してもよく、各パーティションは同じ種又は異なる種を含んでもよい。
【０１２７】
一例では、外側カプセルは、内側カプセルを含む。内側カプセルは、試料プロセッシングのための試薬を含む。分析物は、内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中に封入される。刺激を適用して、内側カプセルの内容物の外側カプセル中への放出を引き起こし、試薬と、プロセッシングしようとする分析物との接触をもたらす。外側カプセルを、分析物のプロセッシングのための適切な条件下でインキュベートする。次いで、プロセッシングされた分析物を回収することができる。この例は試薬が内側カプセル中にあり、分析物が内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中にある実施形態を記載するが、反対の構成、すなわち、試薬が内側カプセルと外側カプセルとの間の媒体中にあり、分析物が内側カプセル中にあるのも可能である。
【０１２８】
カプセルを予備形成し、注入により試薬を充填することができる。例えば、Abateら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、2010、107(45)、19163〜19166頁)及びWeitzら(米国特許出願公開第2012/0132288号)に記載のピコインジェクション法を用いて、試薬を本明細書に記載のカプセルの内部に導入することができる。一般に、カプセル外殻の硬化の前に、例えば、カプセル外殻の形成前に、乳濁液の液滴などのカプセル前駆体の内部に種を注入することにより、ピコインジェクションを実施する。
【０１２９】
カプセルは、均一なサイズ又は不均一なサイズのものであってもよい。いくつかの場合、カプセルの直径は、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmであってもよい。カプセルは、少なくとも約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mmの直径を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは、約0.001μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、50μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、又は1mm未満の直径を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは、約0.001μm〜1mm、0.01μm〜900μm、0.1μm〜600μm、100μm〜200μm、100μm〜300μm、100μm〜400μm、100μm〜500μm、100μm〜600μm、150μm〜200μm、150μm〜300μm、又は150μm〜400μmの直径を有してもよい。
【０１３０】
カプセルはまた、特定の密度を有してもよい。いくつかの場合、カプセルは水性液体(例えば、水)よりも低密度である;いくつかの場合、カプセルは水性液体よりも高密度である。いくつかの場合、カプセルは非水性液体(例えば、油)よりも低密度である;いくつかの場合、カプセルは非水性液体よりも高密度である。カプセルは、約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/ cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。カプセルは、少なくとも約0.05g/cm3、0.1g/cm3、0.2g/cm3、0.3g/cm3、0.4g/cm3、0.5g/cm3、0.6g/cm3、0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、  0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3の密度を有してもよい。他の場合、カプセル密度は、多くても約0.7g/cm3、0.8g/cm3、0.81g/cm3、0.82g/cm3、0.83g/cm3、0.84g/cm3、0.85g/cm3、0.86g/cm3、0.87g/cm3、0.88g/cm3、0.89g/cm3、0.90g/cm3、0.91g/cm3、0.92g/cm3、  0.93g/cm3、0.94g/cm3、0.95g/cm3、0.96g/cm3、0.97g/cm3、0.98g/cm3、0.99g/cm3、1.00g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.2g/cm3、1.3g/cm3、1.4g/cm3、1.5g/cm3、1.6g/cm3、1.7g/cm3、1.8g/cm3、1.9g/cm3、2.0g/cm3、2.1g/cm3、2.2g/cm3、2.3g/cm3、2.4g/cm3、又は2.5g/cm3であってもよい。そのような密度は、任意の特定の液体(例えば、水性、水、油など)中のカプセルの密度を反映してもよい。
【０１３１】
1.フローフォーカシングによるカプセルの生産
いくつかの場合、カプセルを、フローフォーカシングにより生産することができる。フローフォーカシングは、第2の液体と混ざらない第1の液体を第2の液体中に流入させる方法である。図12を参照すると、モノマー、架橋剤、開始剤、及び水性界面活性剤を含む第1(例えば、水性)の液体1201を、界面活性剤及び促進剤を含む第2(例えば、油)の液体1202中に流入させる。マイクロ流体装置中のT連結部1203に第2の液体を進入させた後、第1の液体の液滴は第1の液体の流れから離脱し、第1の液体中のモノマー、架橋剤、及び開始剤と、第2の液体中の促進剤との混合のため、カプセル外殻が形成し始める1204。したがって、カプセルが形成される。カプセルが下流に進むにつれて、促進剤への曝露の増加のため、外殻はより厚くなる。また、試薬濃度の変化を用いて、カプセル外殻の厚さ及び透過性を変化させることもできる。
【０１３２】
種、又は液滴などの他のパーティションを、例えば、第1の液体中に種を含有させることにより封入することができる。第2の液体中への種の含有は、カプセルの外殻中に種を埋込むことができる。勿論、特定の試料プロセッシング法の必要性に応じて、相を逆転させてもよい、すなわち、第1の相が油性相であってもよく、第2の相が水性相であってもよい。
【０１３３】
2.フローフォーカシングによるカプセル内カプセルの生産
いくつかの場合、カプセル内カプセルを、フローフォーカシングにより生産することができる。図13を参照すると、カプセル、モノマー、架橋剤、開始剤、及び水性界面活性剤を含む第1(例えば、水性)の液体1301を、界面活性剤及び促進剤を含む第2(油)の液体1302中に流入させる。マイクロ流体装置中のT連結部1303に第2の液体を侵入させた後、第1の液体の液滴は第1の液体の流れから離脱し、第1の液体中のモノマー、架橋剤、及び開始剤と、第2の液体中の促進剤との混合のため、第2のカプセル外殻がカプセルの周囲で形成し始める1304。したがって、カプセル内カプセルが形成される。カプセルが下流に進行するにつれて、促進剤への曝露の増加のため、外殻はより厚くなる。試薬濃度の変化を用いて、第2のカプセル外殻の厚さ及び透過性を変化させることもできる。
【０１３４】
種を、例えば、第1の液体中に種を含有させることにより封入することができる。第2の液体中への種の含有は、カプセルの第2の外殻中に種を埋込むことができる。勿論、特定の試料プロセッシング法の必要性に応じて、相を逆転させてもよい、すなわち、第1の相が油性相であってもよく、第2の相が水性相であってもよい。
【０１３５】
3.バッチ式でのカプセルの生産
いくつかの場合、カプセルを、乳濁液中の液滴などのカプセル前駆体を用いて、バッチ式で生産することができる。カプセル前駆体を、任意の好適な方法により、例えば、モノマー、架橋剤、開始剤、及び界面活性剤を含む液滴を用いて乳濁液を生産することにより形成させることができる。次いで、促進剤を媒体に添加し、カプセルの形成を得ることができる。フローフォーカシングの方法に関しては、反応物の濃度、及び促進剤への曝露時間を変化させることにより、外殻の厚さを変化させることができる。次いで、カプセルを洗浄、回収することができる。本明細書に記載の任意の方法に関して、他のパーティションを含む種を、カプセル内に、又は好適な場合、外殻内に封入することができる。
【０１３６】
別の例においては、乳濁液の液滴を、乳濁液生成プロセス中に出口ウェルに存在する促進剤に曝露することができる。例えば、カプセル前駆体を、図12に例示されるフローフォーカシング法などの任意の好適な方法により形成させることができる。第2の液体1202中に促進剤を含有させるよりもむしろ、T連結部の出口に位置する媒体(例えば、図12の水平チャネルの右端に位置する媒体)中に促進剤を含有させることができる。乳濁液の液滴(すなわち、カプセル前駆体)がチャネルを出るにつれて、それらは促進剤を含む媒体(すなわち、出口媒体)と接触する。カプセル前駆体が出口媒体の密度よりも低い密度を有する場合、カプセル前駆体は媒体を通って上昇し、促進剤への対流的及び拡散的曝露を確保し、チャネルの出口での重合の可能性を低下させる。
【０１３７】
VI.種
本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを、任意の好適な種と共に用いることができる。種は、例えば、試薬又は分析物などの、試料プロセッシングにおいて用いられる任意の物質であってもよい。種の例としては、全細胞、染色体、ポリヌクレオチド、有機分子、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、サッカリド、糖、脂質、酵素、制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、バーコード、アダプター、小分子、抗体、フルオロフォア、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、ジデオキシヌクレオチド三リン酸(ddNTP)、バッファー、酸性溶液、塩基性溶液、温度感受性酵素、pH感受性酵素、光感受性酵素、金属、金属イオン、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、マンガン、水性バッファー、軽度のバッファー、イオン性バッファー、阻害剤、サッカリド、油、塩、イオン、洗剤、イオン性洗剤、非イオン性洗剤、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、DNA、RNA、ペプチドポリヌクレオチド、相補的DNA(cDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA)、プラスミドDNA、コスミドDNA、染色体DNA、ゲノムDNA、ウイルスDNA、細菌DNA、mtDNA(ミトコンドリアDNA)、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、マイクロRNA、dsRNA、リボザイム、リボスイッチ及びウイルスRNA、全部又は一部のロックド核酸(LNA)、ロックド核酸ヌクレオチド、他の任意の型の核酸類似体、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、キレート化剤、還元剤、酸化剤、プローブ、発色団、染料、有機物、乳化剤、界面活性剤、安定剤、ポリマー、水、小分子、薬剤、放射性分子、保存剤、抗生物質、アプタマーなどが挙げられる。まとめると、用いられる種は、特定の試料プロセッシングの必要性に応じて変化する。
【０１３８】
いくつかの場合、パーティションは、類似する属性を有する種のセット(例えば、酵素のセット、鉱物のセット、オリゴヌクレオチドのセット、異なるバーコードの混合物、同一のバーコードの混合物)を含む。他の場合、パーティションは、種の異種混合物を含む。いくつかの場合、種の異種混合物は、特定の反応を実施するのに必要な全ての成分を含む。いくつかの場合、そのような混合物は、反応を実施するのに必要な1、2、3、4、5以上の成分を除いて、反応を実施するのに必要な全ての成分を含む。いくつかの場合、そのような更なる成分は、異なるパーティション内に、又はパーティションの内部若しくは周囲の溶液内に含まれる。
【０１３９】
種は、天然のもの又は合成のものであってもよい。種は、当業界で公知の任意の方法を用いて得られた試料中に存在してもよい。いくつかの場合、試料は、それを分析物について分析する前にプロセッシングしてもよい。
【０１４０】
種を、生物、全細胞、細胞調製物及び任意の生物、組織、細胞、又は環境に由来する無細胞組成物などの任意の好適な位置から取得することができる。種を、環境試料、生検、吸引物、ホルマリン固定包埋組織、空気、農業試料、土壌試料、石油試料、水試料、又は粉塵試料から取得することができる。いくつかの例においては、種を、血液、尿、糞便、血清、リンパ液、唾液、粘膜分泌物、汗、中枢神経系液、膣液、又は精液を含んでもよい体液から取得することができる。また、種を、化粧品、食品、パーソナルケア製品などの製造された製品から取得することもできる。種は、組換えクローニング、ポリヌクレオチド増幅、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、精製方法(ゲノムDNA又はRNAの精製など)、及び合成反応を含む実験操作の産物であってもよい。
【０１４１】
いくつかの場合、種は質量により定量してもよい。種を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μgの質量で提供することができる。種を、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μgの質量で提供することができる。種を、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000ng、1μg、5μg、10μg、15μg、又は20μg未満の質量で提供することができる。種を、約1〜10、10〜50、50〜100、100〜200、200〜1000、1000〜10000ng、1〜5μg、又は1〜20μgの範囲の質量で提供することができる。本開示の他の場所に記載のように、種がポリヌクレオチドである場合、増幅を用いてポリヌクレオチドの量を増加させることができる。
【０１４２】
また、ポリヌクレオチドを、「ゲノム等価物」として定量することもできる。ゲノム等価物は、標的ポリヌクレオチドが誘導される生物の1倍体ゲノムと等価なポリヌクレオチドの量である。例えば、単一の2倍体細胞は、DNAの2つのゲノム等価物を含有する。ポリヌクレオチドを、約1〜10、10〜50、50〜100、100〜1000、1000〜10000、10000〜100000、又は100000〜1000000の範囲のゲノム等価物の量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、又は1000000のゲノム等価物の量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、又は1000000未満のゲノム等価物の量で提供することができる。
【０１４３】
また、ポリヌクレオチドを、提供される配列包括度の量により定量することもできる。配列包括度の量とは、再構築された配列中の所与のヌクレオチドを表す読取りの平均数を指す。一般に、領域が配列決定される回数が多くなるほど、得られる配列情報はより正確になる。ポリヌクレオチドを、約0.1X〜10X、10X〜50X、50X〜100X、100X〜200X、又は200X〜500Xからの配列包括度の範囲を提供する量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、少なくとも約0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X、5X、10X、25X、50X、100X、125X、150X、175X、又は200Xの配列包括度を提供する量で提供することができる。ポリヌクレオチドを、約0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1.0X、5X、10X、25X、50X、100X、125X、150X、175X、又は200X未満の配列包括度を提供する量で提供することができる。
【０１４４】
いくつかの場合、種を、特定の工程の前又は後にパーティション中に導入する。例えば、溶解バッファー試薬を、細胞試料のパーティション中への区分化の後にパーティション中に導入することができる。いくつかの場合、試薬及び/又は試薬を含むパーティションを、異なる反応又は操作が異なる工程で起こるように連続的に導入する。また、試薬(又は試薬を含むパーティション)を、反応又は操作工程が散在する工程で充填してもよい。例えば、分子(例えば、核酸)を断片化するための試薬を含むカプセルをウェルに充填した後、断片化工程を行い、次いで、バーコード(又は他のユニークな識別子、例えば、抗体)をライゲートするための試薬を含むカプセルを充填し、その後、断片化された分子にバーコードをライゲートすることができる。
【０１４５】
VII.分析物及び他の種のプロセッシング
いくつかの場合、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを用いて、種、例えば、分析物を含有する試料をプロセッシングすることができる。任意の好適なプロセスを実施することができる。
【０１４６】
a.標的ポリヌクレオチドの断片化
いくつかの場合、本開示の方法、組成物、システム、装置、及びキットを、ポリヌクレオチド断片化のために用いることができる。ポリヌクレオチドの断片化は、ポリヌクレオチド配列決定を含む様々な方法における工程として用いられる。典型的には、長さに関して記載される(断片あたりのヌクレオチドの直線数により定量される)、ポリヌクレオチド断片のサイズは、標的ポリヌクレオチドの供給源、断片化に用いられる方法、及び所望の用途に応じて変化してもよい。単一の断片化工程又は複数の断片化工程を用いることができる。
【０１４７】
本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約1〜10、10〜20、20〜50、50〜100、50〜200、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜1000、1000〜5000、5000〜10000、10000〜100000、100000〜250000、又は250000〜500000ヌクレオチド長であってもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、少なくとも約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000以上のヌクレオチド長であってもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000未満のヌクレオチド長であってもよい。
【０１４８】
本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約1〜10、10〜20、20〜50、50〜100、50〜200、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜1000、1000〜5000、5000〜10000、10000〜100000、100000〜250000、又は250000〜500000ヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、少なくとも約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000以上のヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。本明細書に記載の方法を用いて生成される断片は、約10、20、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、100000、250000、500000未満のヌクレオチドの平均又は中央長さを有してもよい。
【０１４９】
いくつかの断片化方法が当業界で公知である。例えば、断片化を、物理的、機械的又は酵素的方法により実施することができる。物理的断片化は、標的ポリヌクレオチドを熱又はUV光に曝露することを含んでもよい。機械的破壊を用いて、標的ポリヌクレオチドを所望の範囲の断片に機械的に剪断することができる。機械的剪断を、標的ポリヌクレオチドの反復的ピペッティング、超音波処理(例えば、超音波を用いる)、キャビテーション及び噴霧化を含む、当業界で公知のいくつかの方法により達成することができる。また、標的ポリヌクレオチドを、酵素的方法を用いて断片化することもできる。いくつかの場合、酵素的消化を、制限酵素などの酵素を用いて実施することができる。
【０１５０】
前記段落及び本開示のいくつかの段落に記載の断片化方法は「標的」ポリヌクレオチドを参照して記載されたが、これは本開示の上記又は他の場所において限定を意味するものではない。本明細書に記載の、又は当業界で公知の任意の断片化方法を、本発明と共に使用される任意のポリヌクレオチドに適用することができる。いくつかの場合、このポリヌクレオチドは、ゲノムなどの、標的ポリヌクレオチドであってもよい。他の場合、このポリヌクレオチドは、当業者が更に断片化することを望む標的ポリヌクレオチドの断片であってもよい。更に他の場合、更なる断片を更に断片化してもよい。任意の好適なポリヌクレオチドを、本明細書に記載の方法に従って断片化することができる。
【０１５１】
制限酵素を用いて、標的ポリヌクレオチドの特異的又は非特異的断片化を実施することができる。本開示の方法は、一般にI型酵素、II型酵素、及び/又はIII型酵素として記載される、1つ又は複数の型の制限酵素を用いてもよい。II型及びIII型酵素は一般に、商業的に入手可能であり、当業界で周知である。II型及びIII型酵素は、二本鎖ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチド塩基対の特定の配列(「認識配列」又は「認識部位」)を認識する。これらの配列の結合及び認識の際に、II型及びIII型酵素はポリヌクレオチド配列を切断する。いくつかの場合、切断は、「付着末端」と呼ばれる、突出する一本鎖DNAの一部を含むポリヌクレオチド断片をもたらす。他の場合、切断は、突出部を含む断片をもたらさず、「平滑末端」を作出する。本開示の方法は、付着末端又は平滑末端のいずれかを生成する制限酵素の使用を含んでもよい。
【０１５２】
制限酵素は、標的ポリヌクレオチド中の様々な認識部位を認識することができる。いくつかの制限酵素(「精密カッター」)は、単一の認識部位(例えば、GAATTC)だけを認識する。他の制限酵素はより雑多であり、1つより多い認識部位、又は様々な認識部位を認識する。いくつかの酵素は、認識部位内の単一の位置で切断するが、他の酵素は複数の位置で切断することができる。いくつかの酵素は認識部位内の同じ位置で切断するが、他の酵素は可変位置で切断する。
【０１５３】
本開示は、1つ又は複数の制限酵素を選択して、所望の長さの断片を生産する方法を提供する。ポリヌクレオチド断片化を、in silicoでシミュレートし、断片化を最適化して、望ましくないサイズ範囲内の断片の数又は画分を最小化しながら、特定のサイズ範囲内のポリヌクレオチド断片の最も多い数又は画分を得ることができる。最適化アルゴリズムを適用して、2つ以上の酵素の組合せを選択し、断片量の所望の分布を有する所望の断片サイズをもたらすことができる。
【０１５４】
ポリヌクレオチドを、2つ以上の制限酵素に同時的又は連続的に曝露することができる。これを、例えば、1つより多い制限酵素をパーティションに加えるか、又は1つの制限酵素をパーティションに加え、消化を実施し、制限酵素を不活化し(例えば、熱処理による)、次いで、第2の制限酵素を加えることにより達成することができる。任意の好適な制限酵素を、本明細書に提示される方法において、単独で、又は組み合わせて用いることができる。
【０１５５】
いくつかの場合、種は、「レアカッター(rare-cutter)」である制限酵素である。本明細書で用いられる用語「レアカッター酵素」とは一般に、ゲノム中に稀にのみ存在する認識部位を有する酵素を指す。制限酵素で仮説的無作為ゲノムを切断することにより生成される制限断片のサイズを、4N(式中、Nは酵素の認識部位中のヌクレオチド数である)で近似することができる。例えば、7個のヌクレオチドからなる認識部位を有する酵素は、47bp毎に1回、ゲノムを切断し、約16,384bpの断片を産生する。一般に、レアカッター酵素は、6個以上のヌクレオチドを含む認識部位を有する。例えば、レアカッター酵素は、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15ヌクレオチドを含むか、又はそれからなる認識部位を有してもよい。レアカッター酵素の例としては、NotI(GCGGCCGC)、XmaIII(CGGCCG)、SstII(CCGCGG)、SalI(GTCGAC)、NruI(TCGCGA)、NheI(GCTAGC)、Nb.BbvCI(CCTCAGC)、BbvCI(CCTCAGC)、AscI(GGCGCGCC)、AsiSI(GCGATCGC)、FseI(GGCCGGCC)、PacI(TTAATTAA)、PmeI(GTTTAAAC)、SbfI(CCTGCAGG)、SgrAI(CRCCGGYG)、SwaI(ATTTAAAT)、BspQI(GCTCTTC)、SapI(GCTCTTC)、SfiI(GGCCNNNNNGGCC)、CspCI(CAANNNNNGTGG)、AbsI(CCTCGAGG)、CciNI(GCGGCCGC)、FspAI(RTGCGCAY)、MauBI(CGCGCGCG)、MreI(CGCCGGCG)、MssI(GTTTAAAC)、PalAI(GGCGCGCC)、RgaI(GCGATCGC)、RigI(GGCCGGCC)、SdaI(CCTGCAGG)、SfaAI(GCGATCGC)、SgfI(GCGATCGC)、SgrDI(CGTCGACG)、SgsI(GGCGCGCC)、SmiI(ATTTAAAT)、SrfI(GCCCGGGC)、Sse2321(CGCCGGCG)、Sse83871(CCTGCAGG)、LguI(GCTCTTC)、PciSI(GCTCTTC)、AarI(CACCTGC)、AjuI(GAANNNNNNNTTGG)、AloI(GAACNNNNNNTCC)、BarI(GAAGNNNNNNTAC)、PpiI(GAACNNNNNCTC)、PsrI(GAACNNNNNNTAC)などが挙げられる。
【０１５６】
いくつかの場合、ポリヌクレオチドを、同時に断片化及びバーコード化することができる。例えば、トランスポザーゼ(例えば、NEXTERA)を用いてポリヌクレオチドを断片化し、バーコードをポリヌクレオチドに付加することができる。
【０１５７】
VIII.刺激応答性
いくつかの場合、刺激を用いてパーティションからの種の放出を誘発することができる。一般に、刺激は、ウェルの壁、スポットの成分、液滴(例えば、乳濁液中の液滴)の安定性、又はカプセルの外殻などの、パーティションの構造の破壊を引き起こすことができる。これらの刺激は、パーティションがその内容物を放出するのを誘導するのに特に有用である。パーティションは別のパーティション内に含有されてもよく、各パーティションは異なる刺激に対して応答性(又は非応答性)であってもよいため、刺激応答性を用いて、あるパーティション(例えば、刺激に対して応答するパーティション)の内容物を、別のパーティション(例えば、その刺激に対して応答しないか、又はその刺激に対する応答性が低いパーティション)中に放出させることができる。
【０１５８】
いくつかの場合、内側カプセルを溶解する刺激を適用し、混合試料を含有するカプセルをもたらすことにより、内側カプセルの内容物を、外側カプセルの内容物中に放出させることができる。勿論、この実施形態は純粋に例示的なものであり、刺激応答性を用いて、任意の好適なパーティションの内容物を、任意の他の好適なパーティション、媒体、又は容器中に放出させることができる(パーティション内パーティションのより特定の例については、例えば、Table 1(表1)を参照されたい)。
【０１５９】
用いることができる刺激の例としては、以下により完全に記載されるような、化学的刺激、嵩変化、生物学的刺激、光、温度刺激、磁気刺激、媒体のウェルへの添加、及びその任意の組合せが挙げられる(例えば、Esser-Kahnら(2011) Macromolecules 44: 5539〜5553頁; Wangら(2009) ChemPhysChem 10:2405〜2409頁を参照されたい)。
【０１６０】
a.化学的刺激及び嵩変化
いくつかの化学的トリガーを用いて、パーティションの破壊を誘発することができる(例えば、Plunkettら、Biomacromolecules、2005、6:632〜637頁)。これらの化学的変化の例としては、限定されるものではないが、パーティションの成分の完全性に対するpHにより媒介される変化、架橋結合の化学的切断によるパーティションの成分の崩壊、及びパーティションの成分の誘発された脱重合化が挙げられる。嵩変化を用いて、パーティションの破壊を誘発することもできる。
【０１６１】
pHの低下などの、溶液のpHの変化は、いくつかの異なる機構によりパーティションの破壊を誘発し得る。酸の添加は、様々な機構によりパーティションの一部の分解又は脱集合を引き起こし得る。プロトンの添加は、パーティションの成分中のポリマーの架橋を脱集合させる、パーティションの成分中のイオン結合若しくは水素結合を破壊する、又はパーティションの成分中のナノ細孔を作出し、内部の内容物を外部に漏出させ得る。pHの変化はまた、乳濁液を脱安定化し、液滴の内容物の放出をもたらすことができる。
【０１６２】
いくつかの例においては、パーティションは、ケタールなどの酸分解性化学架橋剤を含む材料から生産される。pHの低下、特に、5未満のpHへの低下は、ケタールのケトン及び2つのアルコールへの変換を誘導し、パーティションの破壊を容易にすることができる。他の例においては、パーティションを、pH感受性である1つ又は複数の多電解質を含む材料から生産することができる。pHの低下は、そのようなパーティションのイオン結合若しくは水素結合相互作用を破壊するか、又はその中にナノ細孔を作出することができる。いくつかの場合、多電解質を含む材料から作製されたパーティションは、pHの変化の際に拡張、収縮する荷電したゲルに基づくコアを含む。
【０１６３】
パーティションを含む架橋材料の破壊を、いくつかの機構により達成することができる。いくつかの例においては、パーティションを、酸化、還元又は他の化学的変化を誘導する様々な化学物質と接触させることができる。いくつかの場合、パーティションのジスルフィド結合が破壊されるように、ベータ-メルカプトエタノールなどの還元剤を用いることができる。更に、酵素を添加して、パーティションを形成する材料中のペプチド結合を切断することによって、パーティションの完全性の喪失をもたらすことができる。
【０１６４】
脱重合化を用いて、パーティションを破壊することもできる。化学的トリガーを添加して、保護頭部基の除去を容易にすることができる。例えば、トリガーは、ポリマー内の炭酸エステル又はカルバメートの頭部基の除去を引き起こし、次いで、脱重合及びパーティションの内側からの種の放出を引き起こすことができる。
【０１６５】
更に別の例においては、化学的トリガーは、浸透圧トリガーを含んでもよく、それにより、溶液中のイオン又は溶質濃度の変化はパーティションを作製するのに用いられる材料の膨張を誘導する。膨張は、パーティションが破裂してその内容物を放出するような内圧の増強を引き起こすことができる。膨張はまた、材料の孔径の増加を引き起こし、パーティション内に含まれる種を拡散させることもでき、その逆もまた可能である。
【０１６６】
パーティションはまた、圧力により誘導される破裂、融解、又は多孔率の変化などの、嵩変化又は物理的変化によりその内容物を放出するように作製することもできる。
【０１６７】
b.生物学的刺激
生物学的刺激を用いて、パーティションの破壊を誘発することもできる。一般に、生物学的トリガーは化学的トリガーと類似するが、多くの例は生体分子、又は酵素、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、核酸などの生体系に一般的に見出される分子を用いる。例えば、パーティションを、特異的プロテアーゼによる切断に対して感受性であるペプチド架橋を有するポリマーを含む材料から作製することができる。より特には、1つの例は、GFLGKペプチド架橋を含む材料から作製されたパーティションを含んでもよい。プロテアーゼであるカテプシンBなどの生物学的トリガーの添加の際に、外殻ウェルのペプチド架橋が切断され、カプセルの内容物が放出される。他の場合、プロテアーゼを熱活性化することができる。別の例においては、パーティションは、セルロースを含む成分を含む。加水分解酵素であるキトサンの添加は、セルロース結合の切断、キトサンを含むパーティションの成分の脱重合、及びその内部の内容物の放出のための生物学的トリガーとして役立つ。
【０１６８】
c.温度刺激
パーティションを、温度刺激の適用の際にその内容物を放出するように誘導することもできる。温度の変化は、パーティションに対する様々な変化を引き起こすことができる。熱の変化は、パーティションの一部が崩壊するようなパーティションの融解、又は乳濁液の破壊を引き起こし得る。他の場合、熱は、パーティションが破裂又は爆発するようにパーティションの内部成分の内圧を増加させ得る。更に他の場合、熱は、パーティションを、収縮した脱水状態に変形させることができる。熱はまた、パーティションを構築するための材料として用いられる熱感受性ポリマーに対して作用することもできる。
【０１６９】
一例においては、パーティションは、温度感受性ヒドロゲルを含む材料から作製される。35℃を超える温度などの、熱の適用の際に、ヒドロゲル材料は収縮する。材料の突然の収縮は、圧力を増大させ、パーティションを破裂させる。
【０１７０】
いくつかの場合、パーティションを生産するために用いられる材料は、異なる熱感受性を有する、ジブロックポリマー、又は2つのポリマーの混合物を含んでもよい。一方のポリマーは特に、熱の適用後に収縮する可能性があるが、他方はより熱安定性であってもよい。熱がそのような外殻壁に適用された場合、熱感受性ポリマーは収縮するが、他方は無傷のままであり、細孔の形成を引き起こしてもよい。更に他の場合、パーティションを生産するために用いられる材料は、磁気ナノ粒子を含んでもよい。磁界への曝露は、熱の生成を引き起こし、パーティションの破裂をもたらし得る。
【０１７１】
d.磁気刺激
パーティションを生産するために用いられる材料中への磁気ナノ粒子の含有は、上記のパーティションの誘発された破裂を可能にし、並びに他のパーティションへのこれらのパーティションの誘導(例えば、カプセルのアレイ中のウェルへの誘導)を可能にし得る。一例においては、パーティションを生産するために用いられる材料中へのFe3O4ナノ粒子の含有は、振動磁界刺激の存在下で破裂を誘発する。
【０１７２】
e.電気及び光刺激
パーティションを、電気刺激の結果として破壊することもできる。前記セクションに記載された磁気粒子と同様、電気感受性粒子は、誘発されたパーティションの破裂、並びに電界又は酸化還元反応における整列などの他の機能の両方を可能にし得る。一例では、電気感受性材料を含む材料から作製されたパーティションを、内部試薬の放出を制御することができるような電界中で整列させる。他の例では、電界は、多孔率を増加させ得るパーティション内での酸化還元反応を誘導することができる。
【０１７３】
光刺激を用いて、パーティションを破壊することもできる。いくつかの光トリガーが可能であり、特定の範囲の波長の光子を吸収することができるナノ粒子及び発色団などの様々な分子を使用するシステムを含んでもよい。例えば、金属酸化物コーティングを用いて、ある特定のパーティションを生産することができる。SiO2/TiO2で被覆されたパーティションのUV照射は、パーティション壁の崩壊をもたらし得る。更に別の例においては、アゾベンゼン基などの光により切替え可能な材料を、パーティションを生産するために用いられる材料中に組み込むことができる。UV又は可視光の適用の際に、これらのものなどの化学物質は、光子の吸収の際に可逆的cis-trans異性化を受ける。この態様において、光スイッチの組込みは、パーティションの一部の崩壊、又はパーティションの一部の多孔率の増加をもたらす。
【０１７４】
f.刺激の適用
本開示の装置、方法、組成物、システム、及びキットを、そのようなトリガー又は刺激を提供する任意の器具又は装置と組み合わせて用いることができる。例えば、刺激が温度刺激である場合、装置を、ウェルの加熱を可能にする熱又は温度制御プレートと組み合わせて用い、カプセルの破裂を誘導することができる。限定されるものではないが、放射熱移動、対流熱移動、又は伝導熱移動による熱の印加などの、熱移動のいくつかの方法のいずれかを、温度刺激のために用いることができる。他の場合、刺激が生物学的酵素である場合、酵素が各ウェル中に配置されるように、酵素を装置中に注入することができる。別の態様においては、刺激が磁界又は電界である場合、装置を磁気又は電気プレートと組み合わせて用いることができる。
【０１７５】
IX.用途
a.ポリヌクレオチド配列決定
一般に、本明細書に提供される方法及び組成物は、配列決定などの下流の用途のためのポリヌクレオチド断片の調製に有用である。配列決定を、任意の好適な技術により実施することができる。例えば、配列決定を、古典的なSangerの配列決定法により実施することができる。配列決定法としては、高効率配列決定、ピロシーケンシング、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノ細孔配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、RNA-Seq (Illumina社)、Digital Gene Expression (Helicos社)、次世代配列決定、合成による単一分子配列決定(SMSS) (Helicos社)、大規模平行配列決定、クローン単一分子アレイ(Solexa社)、ショットガン配列決定、Maxim-Gilbert配列決定、プライマーウォーキング、及び当業界で公知の任意の他の配列決定法も挙げられる。
【０１７６】
いくつかの場合、変化する数の断片を配列決定する。例えば、いくつかの場合、約30%〜90%の断片を配列決定する。いくつかの場合、約35%〜85%、40%〜80%、45%〜75%、50%〜70%、55%〜65%、又は50%〜60%の断片を配列決定する。いくつかの場合、少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%の断片を配列決定する。いくつかの場合、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%未満の断片を配列決定する。
【０１７７】
いくつかの場合、断片に由来する配列を集合させて、個々の配列読取り物よりも長い元の標的ポリヌクレオチドの連続する領域に関する配列情報を提供する。個々の配列読取り物は、約10〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400以上のヌクレオチド長であってもよい。
【０１７８】
バーコードタグの同一性は、個々の断片に由来する配列読取り物を順序付ける、並びにハプロタイプ間を区別するのに役立ち得る。例えば、個々の断片の区分化の間に、親ポリヌクレオチド断片を異なるパーティションに分離することができる。パーティション数の増加と共に、同じパーティション中に含まれる母型ハプロタイプと親ハプロタイプの両方に由来する断片の可能性は無視できるほど小さくなる。したがって、同じパーティション中の断片に由来する配列読取り物を集合させ、順序付けることができる。
【０１７９】
b.ポリヌクレオチド位相化
本開示はまた、位相化又は連結情報を生成させることができるような様式でポリヌクレオチド断片を調製するための方法及び組成物も提供する。そのような情報は、ポリヌクレオチドの長いストレッチにより分離される遺伝子変化(例えば、SNP、突然変異、インデル、コピー数変化、トランスバージョン、転座、逆位など)などの、配列における関連する遺伝子変化の検出を可能にし得る。用語「インデル」とは、同時局在化した挿入及び欠失並びにヌクレオチドの正味の増加又は減少をもたらす突然変異を指す。「マイクロインデル」は、1〜50ヌクレオチドの正味の増加又は減少をもたらすインデルである。これらの変化は、cis又はtransの関係で存在してもよい。cis関係においては、2つ以上の遺伝子変化が同じポリヌクレオチド又は鎖中に存在する。trans関係においては、2つ以上の遺伝子変化が複数のポリヌクレオチド分子又は鎖上に存在する。
【０１８０】
本明細書で提供される方法を用いて、ポリヌクレオチド位相化を決定することができる。例えば、ポリヌクレオチド試料(例えば、所与の遺伝子座又は複数の遺伝子座に広がるポリヌクレオチド)を、パーティションあたり多くても1分子のポリヌクレオチドが存在するように区分化することができる。次いで、ポリヌクレオチドを断片化、バーコード化、及び配列決定することができる。配列を、遺伝子変化について検査することができる。2つの異なるバーコードでタグ付けされた同じ配列中の遺伝子変化の検出は、2つの遺伝子変化がDNAの2つの別の鎖から誘導され、transの関係を反映することを示してもよい。逆に、同じバーコードでタグ付けされた2つの異なる遺伝子変化の検出は、2つの遺伝子変化がDNAの同じ鎖に由来し、cisの関係を反映することを示してもよい。
【０１８１】
位相情報は、特に、ポリヌクレオチド断片が特定の疾患又は障害(例えば、嚢胞性線維症などの劣性遺伝病、がんなど)を有するか、又は有することが疑われるリスクのある対象に由来する場合、ポリヌクレオチド断片の特性評価にとって重要となり得る。この情報は、以下の可能性:(1)DNAの同じ鎖上の同じ遺伝子内の2つの遺伝子変化及び(2)DNAの別々の鎖上に位置するが同じ遺伝子内の2つの遺伝子変化の間を識別することができる。可能性(1)は、1コピーの遺伝子が正常であり、個体が疾患を含まないことを示してもよいが、可能性(2)は、特に、2つの遺伝子変化が同じ遺伝子コピー内に存在する場合に遺伝子の機能を損傷する場合、個体が疾患を有するか、又は疾患を発症することを示してもよい。同様に、位相化情報はまた、以下の可能性:(1)それぞれ、DNAの同じ鎖上の異なる遺伝子内の2つの遺伝子変化及び(2)それぞれ、DNAの別々の鎖上に位置するが異なる遺伝子内の2つの遺伝子変化の間を識別することもできる。
【０１８２】
c.少数の細胞に由来するポリヌクレオチドの配列決定
本明細書に提供される方法を用いて、細胞特異的情報を取得することができる様式で細胞内に含まれるポリヌクレオチドを調製することもできる。この方法は、約10〜100個の細胞を含む試料からなど、非常に小さい試料からの遺伝子変化(例えば、SNP、突然変異、インデル、コピー数変化、トランスバージョン、転座、逆位など)の検出を可能にする。いくつかの場合、少なくとも約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。他の場合、多くても約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100個の細胞を、本明細書に記載の方法において用いることができる。
【０１８３】
ある例において、方法は、パーティションあたり多くても1個の細胞(又は1個の細胞の抽出物)が存在するような細胞試料(又は粗細胞抽出物)を区分化すること、細胞を溶解すること、本明細書に記載の任意の方法により細胞内に含まれるポリヌクレオチドを断片化すること、断片化したポリヌクレオチドをバーコードに結合させること、プールすること、及び配列決定することを含む。
【０１８４】
本明細書の他の場所に記載のように、バーコード及び他の試薬を、パーティション(例えば、カプセル)内に含有させることができる。各細胞が異なるカプセルと接触するように、細胞の充填の前、後、又はそれと同時に、これらのカプセルを別のパーティション(例えば、ウェル)中に充填することができる。この技術を用いて、ユニークなバーコードを、各細胞から得られるポリヌクレオチドに結合させることができる。次いで、得られるタグ付けされたポリヌクレオチドをプールし、配列決定し、バーコードを用いてポリヌクレオチドの起源を追跡することができる。例えば、同一のバーコードを有するポリヌクレオチドを同じ細胞が起源であると決定することができるが、異なるバーコードを有するポリヌクレオチドを異なる細胞が起源であると決定することができる。
【０１８５】
本明細書に記載の方法を用いて、がん腫瘍細胞の集団にわたるがん突然変異の分布を検出することができる。例えば、いくつかの腫瘍細胞は、両方の対立遺伝子中にがん遺伝子(例えば、HER2、BRAF、EGFR、KRAS)の突然変異、又は増幅を有してもよく(ホモ接合性)、その他は1つの対立遺伝子中に突然変異を有してもよく(ヘテロ接合性)、更にその他は突然変異を有さなくてもよい(野生型)。本明細書に記載の方法を用いて、これらの差異を検出し、また、ホモ接合性、ヘテロ接合性、及び野生型細胞の相対数を定量することができる。そのような情報を用いて、例えば、特定のがんを段階評価する、並びに/又はがんの進行及び経時的なその処置をモニタリングすることができる。
【０１８６】
いくつかの例においては、本開示は、2つの異なるがん遺伝子(例えば、KRAS及びEGFR)中の突然変異を同定する方法を提供する。同じ細胞が両方の突然変異を有する遺伝子を含む場合、これはより侵攻的な形態のがんを示してもよい。対照的に、突然変異が2つの異なる細胞中に位置する場合、これは、がんがより良性であるか、又はあまり進行していないことを示してもよい。
【０１８７】
d.遺伝子発現の分析
本開示の方法は、遺伝子発現の変化の検出のための試料のプロセッシングに適用可能であってもよい。試料は、細胞、mRNA、又はmRNAから逆転写されたcDNAを含んでもよい。試料は、いくつかの異なる細胞若しくは組織からの抽出物を含むプールされた試料、又は単一の細胞若しくは組織からの抽出物を含む試料であってもよい。
【０１８８】
細胞を、パーティション(例えば、マイクロウェル)中に直接入れ、溶解することができる。溶解後、本発明の方法を用いて、配列決定のために細胞のポリヌクレオチドを断片化し、バーコード化することができる。ポリヌクレオチドを細胞から抽出した後、それらを、本発明の方法において用いられるパーティション中に導入することもできる。mRNAの逆転写を、本明細書に記載のパーティション中で、又はそのようなパーティションの外部で実施することができる。cDNAの配列決定は、経時的な、又は特定の条件への曝露後の特定の細胞中の特定の転写物の存在量の指示を提供することができる。
【０１８９】
上記に提示された方法は、現在のポリヌクレオチドプロセッシング法を超えるいくつかの利点を提供する。第1に、操作者間変動性が大きく低下する。第2に、前記方法を、低コストであり、容易に組立てることができるマイクロ流体装置中で実行することができる。第3に、標的ポリヌクレオチドの制御された断片化により、ユーザは規定の適切な長さを有するポリヌクレオチド断片を生産することができる。これは、ポリヌクレオチドを区分化するのに役立ち、また、過剰に大きい断片の存在に起因する配列情報損失量も減少させる。前記方法及びシステムはまた、プロセッシングされたポリヌクレオチドの完全性を維持する容易なワークフローを提供する。更に、制限酵素の使用により、ユーザはアダプター及び/又はバーコードとの適合性のために設計することができるDNA突出部(「付着末端」)を作出することができる。
【０１９０】
e.細胞からの、染色体などのポリヌクレオチドの区分化
一例において、本開示で提供される方法、組成物、システム、装置、及びキットを用いて、細胞から、全染色体などのポリヌクレオチドを区分化することができる。一例では、単一の細胞又は複数の細胞(例えば、2、10、50、100、1000、10000、25000、50000、100000、500000、1000000個以上の細胞)を、溶解バッファー及びプロテイナーゼKを含む容器中に充填し、特定の期間にわたってインキュベートする。複数の細胞の使用により、例えば、各ポリヌクレオチドを区分化し、それ自身のパーティション中で分析することにより、ポリヌクレオチド位相化が可能になる。
【０１９１】
インキュベーション後、例えば、細胞溶解物をカプセル中にフローフォーカシングすることにより、細胞溶解物を区分化する。位相化を実施しようとする場合、各カプセルが単一の分析物(例えば、単一の染色体)のみ、又は単一コピーの任意の特定の染色体(例えば、1コピーの第1の染色体と1コピーの第2の染色体)のみを含むように、フローフォーカシングを実施する。いくつかの場合、染色体が同じ染色体ではない限り、複数の染色体を同じカプセル内に封入することができる。封入は、ポリヌクレオチドの剪断を最小化するために、穏やかな流動の下で行われる。カプセル内にポリヌクレオチド(例えば、染色体)を維持しながら、カプセルの内容物の洗浄、及びカプセル中への試薬の導入を可能にするために、カプセルは多孔性であってもよい。次いで、封入されたポリヌクレオチド(例えば、染色体)を、本開示に提供されるか、又は当業界で公知の任意の方法に従ってプロセッシングすることができる。カプセル外殻は、剪断及び更なる分解から、封入されたポリヌクレオチド(例えば、染色体)を保護する。勿論、この方法を、任意の他の細胞成分に適用することもできる。
【０１９２】
上記のように、カプセル外殻を用いて、剪断からポリヌクレオチドを保護することができる。しかしながら、カプセルを、ポリヌクレオチド又は他の分析物の区画化された剪断を可能にするためのパーティションとして用いることもできる。例えば、いくつかの場合、ポリヌクレオチドをカプセル内に封入した後、超音波剪断、又は任意の他の好適な剪断にかけることができる。カプセル外殻を、剪断下で無傷のままとなるように構成させることができる一方、封入されたポリヌクレオチドを剪断するが、カプセル内に保持することができる。いくつかの場合、ヒドロゲル液滴を用いて、同じ目的を達成することができる。
【０１９３】
f.がん突然変異の検出及び法医学
本明細書に記載のパーティション中での増幅に基づくバーコード化スキームによるバーコード化方法は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片などの、分解した試料からバーコードライブラリーを生成するのに有用であり得る。本明細書に記載の方法は、パーティション内の全てのアンプリコンが同じ初期分子を起源とすることを同定することができる。実際、パーティションバーコード化を用いて、ユニークな開始ポリヌクレオチドに関する情報を保持することができる。そのような同定は、異なる起源分子に由来するアンプリコンを識別することができるため、ライブラリーの複雑性の決定に役立ち得る。更に、本明細書に記載の方法は、ユニークな包括度の評価を許容し、バリアントコーリング(variant calling)感受性の決定に役立ち得る。これらの利点は、がん突然変異の検出及び法医学において特に有用であり得る。
【０１９４】
g.低入力DNA適用(循環腫瘍細胞(CTC)配列決定)
本明細書に記載のバーコード化方法は、例えば、循環腫瘍細胞(CTC)の核酸の配列決定などの、低ポリヌクレオチド入力適用において有用であり得る。例えば、パーティション内での本明細書に記載のMALBAC法は、低ポリヌクレオチド入力適用において良好なデータ品質を取得するのに役立つ、及び/又は増幅誤差を濾過除去するのに役立ち得る。
【０１９５】
X.キット
いくつかの場合、本開示は、パーティションの生成のための試薬を含むキットを提供する。キットは、任意の好適な試薬並びにパーティション及びパーティション内パーティションの生成のための説明書を含んでもよい。
【０１９６】
一例では、キットは、乳濁液中の液滴内でカプセルを生成するための試薬を含む。例えば、キットは、カプセルを生成するための試薬、乳濁液を生成するための試薬、及び乳濁液の液滴中にカプセルを導入するための説明書を含んでもよい。本開示を通じて特定されるように、任意の好適な種を、液滴中及び/又はカプセル中に組み込むことができる。本開示のキットはまた、予め区分化されたバーコードを含むポリヌクレオチドなどの、任意のこれらの種を提供することもできる。同様に、本開示を通じて記載されるように、カプセルを、刺激の適用の際に乳濁液の液滴中にその内容物を放出するように設計することができる。
【０１９７】
別の例においては、キットは、カプセル内カプセルを生成するための試薬を含む。例えば、キットは、内側カプセルを生成するための試薬、外側カプセルを生成するための試薬、及びカプセル内カプセルを生成するための説明書を含んでもよい。本開示を通じて特定されるように、任意の好適な種を、内側及び/又は外側カプセル中に組み込むことができる。本開示のキットはまた、予め区分化されたバーコードを含むポリヌクレオチドなどの、任意のこれらの種を提供することもできる。同様に、本開示を通じて記載されるように、内側カプセルを、刺激の適用の際に外側カプセル中にその内容物を放出するように設計することができる。
【０１９８】
XI.装置
いくつかの場合、本開示は、分析物のプロセッシングのためのパーティションを含む装置を提供する。装置は、本開示の他の場所に記載のような、マイクロウェルアレイ、又はマイクロスポットアレイであってもよい。装置を、それが任意の好適なパーティションを含む様式で形成させることができる。いくつかの場合、装置は、複数のウェル、又は複数のスポットを含む。勿論、装置中の任意のパーティションは、カプセル、乳濁液中の液滴などの他のパーティションを保持することもできる。
【０１９９】
装置を、任意の好適な材料から形成させることができる。いくつかの例においては、装置は、石英ガラス、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、ポリ(メチルメタクリレート)、サファイア、シリコン、ゲルマニウム、環状オレフィンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリカーボネート、プラスチック、及びその組合せからなる群から選択される材料から形成される。
【０２００】
いくつかの場合、装置は、パーティション中への、及びパーティション間での液体の流動のためのチャネルを含む。任意の好適なチャネルを用いることができる。装置は、液体注入口及び液体排出口を含んでもよい。注入口及び排出口を、液体操作装置に結合して、種を装置中に導入することができる。装置を、任意の種の導入の前又は後に密閉することができる。
【０２０１】
親水性及び/又は疎水性である材料を、装置の異なる部分において用いることができる。例えば、いくつかの場合、本開示の装置は、親水性材料を含む内部表面を有するパーティションを含む。いくつかの場合、パーティションにとって外部である表面は、疎水性材料を含む。いくつかの場合、液体流動路は、疎水性又は親水性材料で被覆される。
【０２０２】
理解される通り、本開示は、本明細書に記載の様々な用途、使用、及び目的を含む、特定の使用又は目的のための本明細書に記載の任意の組成物、ライブラリー、方法、装置、及びキットの使用を提供する。例えば、本開示は、種の区分化における、オリゴヌクレオチドの区分化における、パーティションからの種の刺激選択的放出における、パーティション中での反応(例えば、ライゲーション及び増幅反応)の実施における、核酸合成反応の実施における、核酸のバーコード化における、配列決定のためのポリヌクレオチドの調製における、ポリヌクレオチドの配列決定における、ポリヌクレオチド位相化における、少数の細胞からのポリヌクレオチドの配列決定における、遺伝子発現の分析における、細胞からのポリヌクレオチドの区分化における、突然変異検出における、神経障害診断における、糖尿病診断における、胎児異数性診断における、がん突然変異検出及び法医学における、疾患検出における、医学的診断における、循環腫瘍細胞(CTC)配列決定などの低入力核酸適用における、その組合せにおける、並びに本明細書に記載の任意の他の用途、方法、プロセス又は使用における、本明細書に記載の組成物、方法、ライブラリー、装置、及びキットの使用を提供する。
【実施例】
【０２０３】
(実施例1)
非対称性PCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターのライブラリーの生産
本実施例は、次世代配列決定技術(例えば、ILLUMINA)と適合するバーコード配列を含むフォーク型アダプターの製造のための方法を提供する。本実施例において、バーコードは、図2に記載のように、位置207に配置される。
【０２０４】
図4を参照すると、第1の固定化領域402、バーコード領域403、及び第1の配列決定プライマー領域404を含む一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列401を合成する。バーコード領域403は、各カップリング工程中に等モル濃度のA、G、T及びCを含有させることにより合成される7ヌクレオチドの無作為配列である。
【０２０５】
合成後、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド401を、各液滴が平均で0.1のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、非対称性PCRによる、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド401の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)及びDNA挿入染料(例えば、臭化エチジウム)も含む。リバースプライマーは、過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。ポリヌクレオチドは増幅され、反応は増幅の指数期410を通って進行し、二本鎖産物405を産生し、増幅の直線期411を通って進行し、一本鎖産物406を産生する。
【０２０６】
液滴を、増幅されたポリヌクレオチドを含む液滴を収集するための蛍光支援細胞選別装置(FACS)412上で選別する。部分相補ユニバーサル配列407をパーティションに添加し、部分的にアニーリングしたフォーク型構造413を生成する。部分相補ユニバーサル配列407は、第2の固定化領域408及び第2の配列決定プライマー領域409を含み、後者は配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合するT突出部を含む(示さない)。
【０２０７】
(実施例2)
フラグメンターゼを用いる断片化及びバーコード化
第1の固定化領域402、バーコード領域403、及び第1の配列決定プライマー領域404を含む一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列(例えば、図4の401)を、実施例1、又は本開示に記載される任意の他の方法に記載のように合成、区分化、増幅、及び選別する。界面重合を一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列を含む液滴上で実施して、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列406のライブラリーを含む複数のカプセルを生成し、ここで、ライブラリー中のそれぞれ(又は多く)の配列はその対応するバーコード領域403の配列において異なる。したがって、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーが生成される。
【０２０８】
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)、及び部分相補ユニバーサル配列(例えば、図4の407)を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成された、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーと、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
【０２０９】
混合物Z1及びZ2を混合し、カプセル内カプセルを、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って形成させる。図5は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示するものである。外側カプセル501は、内側カプセル502と媒体504とを含む。内側カプセル502は、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーの1メンバーである。したがって、内側カプセル502は、複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド503を含み、外側カプセル501などのパーティション内のポリヌクレオチドに同じバーコードを結合させるために用いることができる。
【０２１０】
媒体504は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体504は、標的ポリヌクレオチド505、部分相補ユニバーサル配列506、並びにフラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス507を含む。
【０２１１】
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル502を破裂させ、その内容物を外側カプセル501中に放出させる。Taqポリメラーゼは断片化され、平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド503は、部分相補ユニバーサル配列506とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル501を破裂させ、全ての外側カプセルに由来する試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。次いで、配列決定の前に、必要に応じて追加の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を実施してもよい。
【０２１２】
いくつかの場合、混合物Z1は、複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列506を含み、ここで各バージョンはそれ自身、試料特異的バーコードを有する。
【０２１３】
更に、上記の例はバーコード配列を含むフォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合させるために熱安定性リガーゼを用いるが、本開示の他の場所に記載のように、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
【０２１４】
(実施例3)
超音波処理による断片化及びバーコード化
封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーを、実施例2に記載のように、又は本開示に記載の任意の他の好適な方法により生成する。標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化しようとするポリヌクレオチド)を、カプセル中に区分化する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセルを、超音波ストレスに耐えるように構成する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセルを、超音波ストレス(例えば、COVARIS Focused-Ultrasonicator)に曝露し、標的ポリヌクレオチドを断片化し、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセルを生成する。
【０２１５】
封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリー(例えば、図4:406)、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセル、部分相補ユニバーサル配列(例えば、図4:407)、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)、並びに適切なバッファーを含む混合物Z1を調製する。カプセル内カプセルを、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って生成する。
【０２１６】
図6は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示するものである。外側カプセル601は、複数の内側カプセル602及び605並びに媒体604を含む。内側カプセル602及び605は、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603を含むカプセルと、断片化された標的ポリヌクレオチド606を含むカプセルとを含む。内側カプセル602は、複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603を含み、これを用いて、内側カプセル605内に含有される断片化された標的ポリヌクレオチド606などの、パーティション内のポリヌクレオチドに同じバーコードを結合させることができる。
【０２１７】
媒体604は、上記の混合物Z1の内容物を含有する。より特には、媒体604は、部分相補ユニバーサル配列607、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)608、並びに適切なバッファーを含む。
【０２１８】
断片化された標的ポリヌクレオチド606を含む内側カプセル605を刺激に曝露してそれらを破裂させ、その内容物を外側カプセル601の内容物中に放出させる。T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する;Taqポリメラーゼは断片化された、平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。次いで、T4ポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼを熱不活化し、刺激を印加して内側カプセル602の内容物を外側カプセル601中に放出させる。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド603は、部分相補ユニバーサル配列607とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル601を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
【０２１９】
実施例2に記載のように、いくつかの場合、Z1は複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列607を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによって標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
【０２２０】
(実施例4)
単一プライマー等温増幅(SPIA)及び制限消化によるフォーク型アダプターの生成
本実施例は、SPIA及び制限消化によるフォーク型アダプターの合成を証明するものである。図7は、本実施例の方法に従って生成することができる産物(又は中間体)の例を提供する。図7を参照すれば、本開示の他の場所に記載のフォーク型アダプターの前駆体として用いることができるヘアピンアダプター701(配列番号2)が示される。本実施例において、ヘアピンアダプターを、SPIAを用いて一本鎖増幅産物として合成する。ヘアピンアダプター701は、二本鎖領域702、ATライゲーションのための3'-T突出部703、及び制限酵素により切断することができる領域704(すなわち、位置33と34の間)を含む。ヘアピンアダプターは、バーコード領域と、固定化領域及び配列決定プライマーのアニーリングのための領域などの機能的領域とを含んでもよい。
【０２２１】
アダプターの切断(例えば、位置33と34の間)は、図8aに記載のフォーク型アダプターを生成する(配列番号3〜4)。切断しようとする領域と相補的なオリゴヌクレオチド配列を導入し、アニーリングしたアダプターを制限酵素に曝露することにより、このアダプターを切断する。図8aに記載のフォーク型アダプター領域の、標的ポリヌクレオチドへのライゲーションは、図8bに記載の構造をもたらす(配列番号5〜6)。図8を参照すれば、図8b中の配列の下線部分は、図8aに記載のフォーク型アダプターとのライゲーションに適合する3'-A突出部を有する標的ポリヌクレオチドを含む。
【０２２２】
次いで、図8bに示される配列(配列番号5〜6)を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、図8cに示される、配列番号7(配列番号5の増幅産物)及び配列番号8(配列番号6の増幅産物)を産生させる。図8cにおいて、配列番号7は、第1の固定化配列(下線付き5'部分)及び第2の固定化配列(下線付き3'部分)を配列番号5に付加する、配列番号5の増幅産物である。配列番号8は、配列番号6の非ハイブリダイズ部分を異なる配列(下線付き3'部分及び下線付き5'部分)で置き換える配列番号6の増幅産物である。更に、配列番号8は、ポリヌクレオチドの5'非ハイブリダイズ領域内に6つのヌクレオチドバーコード(TAGTGC;太字)を含む。したがって、増幅産物は、バーコード化された標的ポリヌクレオチド配列(111で表される)、固定化配列、及びバーコードを含む。
【０２２３】
(実施例5)
単一プライマー等温増幅(SPIA)及び制限消化による更なるフォーク型アダプター
本実施例は、NがA、T、G又はCを表す、SPIA及び制限消化による図9aに記載のフォーク型アダプター(配列番号9〜10)の合成を証明するものである。図9bは、一本鎖形式のフォーク型アダプター(配列番号11)を示し、ここで一本鎖形式はヘアピン構造を形成することができる。星印で示される位置でのヘアピン構造の切断により、図9aに示されるフォーク型アダプターが得られる。
【０２２４】
SPIAのための鋳型は、図9cに示される配列である(配列番号12)。図9cにおいて、「R」はRNAの領域を表す。図9dは、図9c中の配列により形成されるヘアピン構造を示す。図9d中の配列(配列番号12)をポリメラーゼで処理して、ヌクレオチドを3'末端に付加し、図9eに示される配列を生成する(配列番号13)。次いで、図9e中の配列(配列番号13)を、DNAにハイブリダイズしたRNAを分解するRNase Hで処理して、図9f中の配列(配列番号14)を得る。
【０２２５】
次いで、鎖置換SPIAを、配列番号14に対して実施する。鎖置換増幅におけるプライマーは、RRRRRRRRRRRRR(すなわち、R13)の形態のものである。このプライマーは、配列番号14のハイブリダイズしない3'末端よりも1塩基長いRNAプライマーである(すなわち、N12)(図9f)。より特には、図9fに示されるように、配列番号14の3'末端は、12個のNヌクレオチドを含有する。RNAプライマーは13個のヌクレオチドを含有する。RNAプライマーのヌクレオチド2〜13は、配列番号14の12個のハイブリダイズしないNヌクレオチドと相補的である。RNAプライマーのヌクレオチド1は、第1のハイブリダイズした塩基(3'から5'に向かう)、この場合、Tと相補的である。RNAプライマーはAを置換し、図9gに示される二本鎖伸長産物を生成する(配列番号15〜16)。ただ1つのプライマーが存在するため、反応は複数のコピーの一本鎖産物を産生する。一本鎖増幅産物をRNase Hで処理して、図9hに示される一本鎖増幅産物を生成する(配列番号17)。図9iは、5'-3'形式でのこの配列(配列番号17)を示す。図9jは、ヘアピン形式でのこの配列(配列番号17)を示す。
【０２２６】
次いで、図9jに示されるヘアピンアダプターを、3'-A突出部を有する断片化されたポリヌクレオチドにライゲートする。ヘアピンを、その領域と相補的なオリゴヌクレオチドを付加し、制限酵素で切断することにより、図9j中の曲線で隔てられたAとC残基の間で切断する。これにより、フォーク型アダプターが生成される。次いで、実施例4に記載のようにPCR増幅を行って、固定化領域及びバーコードを、標的ポリヌクレオチドに結合されるフォーク型アダプターに付加する。
【０２２７】
(実施例6)
指数的PCR及びハイブリダイゼーションによるバーコードを含むフォーク型アダプターの生成
本実施例は、ハイブリダイゼーションによるバーコードを含むフォーク型アダプターの生産を証明する。図10aは、図8aに提供される例示的フォーク型アダプターを示す。実施例4に記載されたように、このアダプターを標的ポリヌクレオチドにライゲートした後、増幅反応を実施して、バーコードを含む更なる機能的配列を付加することができる。しかしながら、バーコード(及び他の機能的配列)をフォーク型アダプター中に直接組み込んだ後、フォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合することもできる。例えば、図10bは、第1の固定化領域(下線付き)及び7ヌクレオチドのバーコード領域(太字/下線付き;「N」)の付加と共に、図10aのフォーク型アダプターを示す。
【０２２８】
図10bのバーコード化されたフォーク型アダプターを、最初に一本鎖として配列番号18を合成することにより生産する。バーコード領域における多様性を、本開示を通して記載されるように、A、G、T及びCの等モル混合物を用いて生成する。実施例1に記載のように、液滴に基づくPCRを実施する。しかしながら、1つのDNAプライマーと1つのRNAプライマーとを用いて、液滴中の配列番号18を増幅する。増幅を、挿入染料の存在下で行い、増幅された配列番号18を含む液滴を、実施例1に記載のように単離する。図10cは、二本鎖増幅産物を示す。配列番号19の下線部分は、RNAプライマーから誘導されるRNA鎖である。次いで、図10cに示される配列を、下線付きのRNA領域を消化するRNase Hで処理し、図10dに示される構築物を得る。フォーク型構築物を生成するために、部分相補ユニバーサル配列(配列番号21)を図10dに示される構築物に付加して、図10eに示される産物を生産する。このプロセスを用いる利点は、それがSPIAにより提供されるポリヌクレオチドの線形増幅に対して指数的PCRにより提供されるポリヌクレオチドの有意により高い増幅を用いる点である。
【０２２９】
(実施例7)
二重指標化手法
本実施例は二重指標読取りのためのバーコードの合成のための手法を証明する。二重指標読取りは、それぞれの鎖に結合したバーコードを用いる、二本鎖断片の両方の鎖の読取りである。図11は、二重指標化種法のためのバーコードの合成の一例及びカプセル構成におけるカプセル中のバーコードの使用例を示す。
【０２３０】
図11aに示されるように、第1の固定化領域1102、第1のバーコード領域1103、及び第1の配列決定プライマー領域1104を含む第1の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1101を合成する。平行して、図11bに示されるように、第2の固定化領域1132、第2のバーコード領域1133、及び第2の配列決定プライマー領域1134を含む第2の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1131を合成する。いくつかの場合、バーコード領域1103及び1133は同じ配列のものである。他の場合、バーコード領域1103及び1133は、異なる配列のものであるか、又は部分的に異なる配列のものである。
【０２３１】
合成後、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)を、平行して、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、非対称性PCRによる、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)並びにDNA挿入染料(例えば、臭化エチジウム)も含む。リバースプライマーは過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。ポリヌクレオチド1101(図11a)及び1131(図11b)が増幅され、反応は増幅の指数期1110を通って進行し、二本鎖産物1105(図11a)及び1135(図11b)を産生し、増幅の直線期1111を通って進行し、それぞれ、一本鎖産物1106(図11a)及び1136(図11b)を産生する。
【０２３２】
液滴を、蛍光支援細胞選別装置(FACS)1112上で選別して、増幅されたポリヌクレオチドを含む液滴を収集する。
【０２３３】
次いで、界面重合を、それぞれ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列1106及び1136の液滴を含む液滴上で実施して、それぞれ、一本鎖アダプターバーコードポリヌクレオチド配列1106又は1136の1つをそれぞれ含む、2つの型のカプセル1120(図11a)及び1150(図11b)を生成する。
【０２３４】
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)1170と、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)とを含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されたカプセル1120及び1180と、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
【０２３５】
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載の方法に従ってカプセル内カプセルを形成させる。図11cは、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1160は、カプセル1120及び1150並びに媒体1190を含む。したがって、カプセル1120及び1150はそれぞれ、複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1106及び1136をそれぞれ含み、これを用いてバーコード1103及び1133を、外側カプセル1160の媒体1190中の標的ポリヌクレオチド1170などの、パーティション内のポリヌクレオチドに結合させることができる。
【０２３６】
媒体1190は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体1190は、標的ポリヌクレオチド1170と、フラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス1180とを含む。
【０２３７】
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いてカプセル1120及び1150を破裂させ、その内容物を外側カプセル1160の媒体1190中に放出させる。Taqポリメラーゼは、断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1106は、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド1136とハイブリダイズし、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部(示さない)と適合する3'-T突出部を有する、バーコード領域1103及び1133を含むフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを、断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1160を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
【０２３８】
更に、上記の例はバーコード配列を含むフォーク型アダプターを標的ポリヌクレオチドに結合させるために熱安定性リガーゼを用いるが、本開示の他の場所に記載のように、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
【０２３９】
(実施例8)
ビーズエマルジョンPCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターの生産
図14aに示されるように、第1の固定化領域1402、バーコード領域1403、及び第1の配列決定プライマー領域1404を含む一本鎖アダプター-バーコード配列1401を合成する。合成後、一本鎖アダプター-バーコード配列1401を、各液滴が平均で1個のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、光不安定リンカーにより、第1の配列決定プライマー領域1404中に含まれる配列と相補的な、1つ又は複数のコピーのRNAプライマー1406に連結される第1のビーズ1405;第1の固定化領域1402中に含まれる配列(示さない)と相補的なDNAプライマー;及び一本鎖アダプター-バーコード配列1401の増幅にとって必要な試薬(例えば、ポリメラーゼ、dNTP、バッファー、塩)も含む。両方とも第1のビーズ1405に結合して構造1420を形成し、溶液中(示さない)にある、二本鎖産物1408を産生するポリヌクレオチドを増幅する1407。
【０２４０】
次いで、乳濁液を破壊し、乳濁液成分をプールして産物混合物を形成させる。図14bに示されるように、次いで、遊離したビーズを適切な媒体で数回洗浄1409(遠心分離による)し、水酸化ナトリウム(NaOH)1410で処理して、第1のビーズ1405に結合した二本鎖産物を変性させた後、更に洗浄する1411。構造1420の変性1410及び洗浄1411の後、得られる構造1430は、相補的固定化領域1413、相補的バーコード領域1414、及び相補的配列決定プライマー領域1415を含む、一本鎖アダプター-バーコード配列1401に対する一本鎖相補体1412を含む。示されるように、相補的配列決定プライマー領域1415は、RNAプライマー1406を含む。次いで、構造1430を適切な媒体中に再懸濁する。
【０２４１】
次に、図14cに示されるように、相補的固定化領域1413と相補的な1又は複数のコピーのDNAポリヌクレオチド1417を含む第2のビーズ1416を、媒体に添加する。相補的DNAポリヌクレオチド1417及び一本鎖相補体1412の相補的固定化領域1413を介して、第2のビーズ1416は一本鎖相補体1412に結合する。ここで、一本鎖相補体は、第1のビーズ1405の一方の末端で結合し、他方の末端で第2のビーズ1416は構造1440を形成する。
【０２４２】
図14dに示されるように、次いで、構造1440を、グリセロール勾配を用いて遠心分離1418し、構造1440中に含まれない構造1430から構造1440を分離する。第2のビーズ1416が磁気ビーズである場合、磁気分離を代替手段として用いることができる。次いで、産物をNaOH 1419で処理して、第2のビーズ1416に由来する一本鎖相補体1412を変性させ、構造1430の再生を得る。次いで、構造1430を数回の洗浄(遠心分離による)にかけ、第2のビーズ1416を除去する。構造1430に結合した一本鎖相補体1412は、一本鎖バーコードアダプターである。
【０２４３】
図14eに示されるように、一本鎖相補体1412を用いて、フォーク型アダプターを生成することができる。次いで、フォーク型アダプター1450を生成するために、一本鎖相補体1412を、光を用いて構造1430から放出1424させた後、ユニバーサル相補配列1426と混合1425するか、又は最初にユニバーサル相補配列1426と混合1425した後、構造1430から放出1424させる。ライゲーション可能な末端を生成するために、RNAase Hを用いて、一本鎖相補体1412のRNAプライマー1406を消化し、II型制限酵素を用いてユニバーサル相補配列1426上の単一塩基T突出部を生成する。T突出部は、配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合する(示さない)。
【０２４４】
(実施例9)
ビーズエマルジョンPCR及び部分相補ユニバーサル配列の付加によるバーコード配列を含むフォーク型アダプターの生産
図15aに示されるように、第1の固定化領域1502、バーコード領域1503、及び第1の配列決定プライマー領域1504を含む一本鎖アダプター-バーコード配列1501を合成する。合成後、一本鎖アダプター-バーコード配列1501を、各液滴が平均で1個のポリヌクレオチドを含むように、油中水乳濁液中の水性液滴中に希釈する。液滴はまた、光不安定リンカーにより、第1の固定化領域1502中に含まれる配列と相補的な、1つ又は複数のコピーのRNAプライマー1506に連結される第1のビーズ1505;第1の配列決定プライマー領域1502中に含まれる配列(示さない)と相補的なDNAプライマー;及び一本鎖アダプター-バーコード配列1501の増幅にとって必要な試薬(例えば、ポリメラーゼ、dNTP、バッファー、塩)も含む。両方とも第1のビーズ1505に結合して構造1520を形成し、溶液中(示さない)にある、二本鎖産物1508を産生するポリヌクレオチドを増幅する1507。
【０２４５】
次いで、乳濁液を破壊し、乳濁液成分をプールして産物混合物を形成させる。図15bに示されるように、次いで、遊離したビーズを適切な媒体で数回洗浄1509(遠心分離による)し、水酸化ナトリウム(NaOH)1510で処理して、第1のビーズ1505に結合した二本鎖産物を変性させた後、更に洗浄する1511。構造1520の変性1510及び洗浄1511の後、得られる構造1530は、相補的固定化領域1513、相補的バーコード領域1514、及び相補的配列決定プライマー領域1515を含む、一本鎖アダプター-バーコード配列1501に対する一本鎖相補体1512を含む。示されるように、相補的配列決定プライマー領域1515は、RNAプライマー1506を含む。次いで、構造1530を適切な媒体中に再懸濁する。
【０２４６】
次に、図15cに示されるように、相補的配列決定プライマー領域1515と相補的な1又は複数のコピーのDNAポリヌクレオチド1517を含む第2のビーズ1516を、媒体に添加する。相補的DNAポリヌクレオチド1517及び一本鎖相補体1512の相補的配列決定プライマー領域1515を介して、第2のビーズ1516は一本鎖相補体1512に結合する。ここで、一本鎖相補体は、第1のビーズ1505の一方の末端で結合し、他方の末端で第2のビーズ1516は構造1540を形成する。
【０２４７】
図15dに示されるように、次いで、構造1540を、グリセロール勾配を用いて遠心分離1518し、構造1540中に含まれない構造1530から構造1540を分離する。第2のビーズ1516が磁気ビーズである場合、磁気分離を代替手段として用いることができる。次いで、産物をNaOH 1519で処理して、第2のビーズ1516に由来する一本鎖相補体1512を変性させ、構造1530の再生を得る。次いで、構造1530を数回の洗浄(遠心分離による)にかけ、第2のビーズ1516を除去する。構造1530に結合した一本鎖相補体1512は、一本鎖バーコードアダプターである。
【０２４８】
図15eに示されるように、一本鎖相補体1512を用いて、フォーク型アダプターを生成することができる。次いで、フォーク型アダプター1550を生成するために、一本鎖相補体1512を、場合により光を用いて構造1530から放出1524させた後、ユニバーサル相補配列1526と混合1525する。ライゲーション可能な末端を生成するために、II型制限酵素を用いてユニバーサル相補配列1526上の単一塩基T突出部を生成する。T突出部は、配列決定しようとするポリヌクレオチド標的上のA突出部と適合する(示さない)。
【０２４９】
(実施例10)
ビーズエマルジョンPCRによるフォーク型アダプター鋳型バーコード配列及びそれから誘導されるアダプターの生産
図16に示されるように、一本鎖アダプター-バーコード配列1602に結合した磁気ビーズ(1601)を含む構造1600を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。次に、構造1600を、本明細書に記載の方法、例えば、界面重合によりカプセル(又は或いは、別の乳濁液)1620中に区分化する。カプセル1620はまた、非対称性PCRによる、一本鎖アダプター-バーコード配列1602の増幅のための試薬(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、dNTP、バッファー、塩)も含む。リバースプライマーは、過剰のフォワードプライマー中に存在するか、又はその逆であり、非対称性増幅を可能にする。一本鎖アダプター-バーコード配列1602は増幅1603され、反応は増幅の直線期1604を通って進行し、一本鎖バーコードアダプター-鋳型1602と相補的な、一本鎖アダプター産物1605を産生する。この時点で、カプセル1620は溶液中の一本鎖アダプター1605と、磁気ビーズ(1601)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1602との両方を含む。次いで、カプセル1620を、磁気分離1606により、ビーズ(したがって、鋳型1602と一本鎖アダプター1605)を含まないものから分離する。カプセル1620を破裂させ、実施例9に記載のようにフォーク型アダプターを生成することができる。
【０２５０】
(実施例11)
ビーズエマルジョンPCRを用いるバーコード化及びフラグメンターゼを用いる断片化
図17に示されるように、磁気ビーズ(1701)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1702を含む構造1700を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。界面重合を、構造1700を含む液滴上で実施し、光不安定リンカーを介して、ビーズ1701に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1702を含むカプセル1704を生成する。
【０２５１】
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、フラグメンターゼ酵素(例えば、NEBNEXT DSDNA FRAGMENTASE)、及び部分相補ユニバーサル配列を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されるカプセル1704と、フラグメンターゼ酵素を活性化するのに十分な濃度の塩化マグネシウムとを含む。混合物Z1、Z2、又はZ1とZ2の両方はまた、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼも含む。
【０２５２】
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの、本開示の他の場所に記載の方法に従って、カプセル内カプセルを形成させる。図17は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1703は、内側カプセル1704と媒体1705とを含む。内側カプセル1704は、封入されたビーズ結合一本鎖バーコードアダプターのライブラリーの1メンバーである。したがって、内側カプセル1704は、複数コピーの構造1700を含み、これを用いて遊離一本鎖アダプター-バーコード配列1702を生成し、同じバーコードアダプターを、外側カプセル1703などのパーティション内ポリヌクレオチドに結合させることができる。
【０２５３】
媒体1705は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体1705は、標的ポリヌクレオチド1706、部分相補ユニバーサル配列1707、並びにフラグメンターゼ、T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、熱不安定性リガーゼ、塩化マグネシウム、及び適切なバッファーを含む酵素ミックス1708を含む。
【０２５４】
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、酵素は標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、フラグメンターゼは標的ポリヌクレオチドを断片化し、T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する。次いで、フラグメンターゼ及びT4ポリメラーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル1704を破裂させ、その内容物を外側カプセル1703中に放出させる。Taqポリメラーゼは、断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。一本鎖アダプター-バーコード配列1702は、部分相補ユニバーサル配列1707とハイブリダイズし、光によりビーズから放出され、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1703を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。必要に応じて、配列決定の前に、追加の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を実施してもよい。
【０２５５】
いくつかの場合、Z1は、複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列1707を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによる標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
【０２５６】
(実施例12)
ビーズエマルジョンPCRを用いるバーコード化及び超音波処理による断片化
図18に示されるように、磁気ビーズ(1801)に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1802を含む構造1800を、実施例8、実施例9に記載の方法、又は本明細書に記載の任意の他の方法に従って生産する。界面重合を、構造1800を含む液滴上で実施して、光不安定リンカーを介して、ビーズ1801に結合した一本鎖アダプター-バーコード配列1802を含むカプセル1803を生成する。標的ポリヌクレオチド(すなわち、断片化しようとするポリヌクレオチド)を、カプセル1804中に区分化する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセル1804を、超音波ストレスに耐えるように構成する。標的ポリヌクレオチドを含むカプセル1804を超音波ストレス(例えば、COVARIS Focused-Ultrasonicator)に曝露し、標的ポリヌクレオチドを断片化し、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセルを生成する。
【０２５７】
カプセル1803、断片化された標的ポリヌクレオチドカプセル1804、部分相補ユニバーサル配列1805、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)1806、並びに適切なバッファーを含む混合物Z1を調製する。フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載の方法に従って、カプセル内カプセルを生成する。
【０２５８】
図18は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル1807は、カプセル1803及び1804と、媒体1808とを含む。内側カプセル1803及び1804は、それぞれ、構造1800を含むカプセルと、断片化された標的ポリヌクレオチド1809を含むカプセルとを含む。内側カプセル1803は複数コピーの構造1800を含み、これを用いて遊離一本鎖バーコードアダプター1802を生成し、同じバーコードアダプターを、内側カプセル1804内に含有される断片化されたポリヌクレオチド1809などの、パーティション内のポリヌクレオチドに結合することができる。
【０２５９】
媒体1808は、上記の混合物Z1の内容物を含有する。より特には、媒体1808は、部分相補ユニバーサル配列1805、酵素混合物(T4ポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び熱安定性リガーゼ)1806、並びに適切なバッファーを含む。
【０２６０】
断片化された標的ポリヌクレオチド1809を含む内側カプセル1804を刺激に曝露して、それらを破裂させ、その内容物を外側カプセル1807の内容物中に放出させる。T4ポリメラーゼは断片化された標的ポリヌクレオチドの末端を平滑化する;Taqポリメラーゼは断片化された平滑末端化された標的ポリヌクレオチドに3'-A突出部を付加する。次いで、T4ポリメラーゼ及びTaqポリメラーゼを熱不活化し、刺激を印加して内側カプセル1803の内容物を外側カプセル1807中に放出させる。一本鎖アダプター-バーコード配列1802は部分相補ユニバーサル配列1805とハイブリダイズし、アダプターは光によりビーズから放出され、断片化された標的ポリヌクレオチド上の3'-A突出部と適合する3'-T突出部を有するフォーク型アダプターを形成する。熱安定性リガーゼは、フォーク型アダプターを断片化された標的ポリヌクレオチドにライゲートし、バーコード化された標的ポリヌクレオチドを生成する。次いで、外側カプセル1807を破裂させ、全ての外側カプセルからの試料をプールし、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
【０２６１】
いくつかの場合、Z1は複数のバージョンの部分相補ユニバーサル配列1807を含んでもよい。更に、本実施例は熱安定性リガーゼを用いることによる標的ポリヌクレオチドのバーコード化を証明するものであるが、PCRを用いてこの工程を達成することもできる。
【０２６２】
(実施例13)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図19aに示されるように、配列番号22を含むプライマーを調製する。このプライマーは、バーコード領域(「Barcode」と命名される)、プライマー配列決定領域(「PrimingSeq」と命名される)、及びA、T、C、又はGの任意の組合せを含んでもよい8ヌクレオチド可変領域(「NNNNNNNN」と命名される)を含む。図19に示されるプライマーを、パーティション(例えば、カプセル、乳濁液の液滴など)中に鎖置換活性を有するポリメラーゼ(例えば、Vent、exo + DeepVent、exo-DeepVent)と共に、標的ポリヌクレオチド(図19においてループで示される)と混合する。いくつかの場合、非鎖置換ポリメラーゼ(例えば、Taq、PfuUltra)を用いる。次いで、パーティションをMALBAC増幅にかける。適切なMALBACサイクリング条件は公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるZongら、Science、338(6114)、1622〜1626頁(2012)に記載されている。
【０２６３】
ループしたMALBAC産物を、配列番号23として図19bに示されるように生産する。ループしたMALBAC産物は図19aに示される元のプライマー、ループに向かうバーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド、及び元のプライマー配列と相補的であり、それにハイブリダイズした領域を含む。パーティションを破壊し、内容物を回収する。いくつかの場合、複数のパーティションを生成する。パーティションを集合的に破壊し、それぞれの内容物を回収した後、プールする。
【０２６４】
次に、図19bに示される生成されたMALBAC産物を、制限酵素(例えば、BfuCl又は同様のもの)で処理して、MALBAC産物上で4塩基対の突出部(この場合、斜体で示されるGATC)を生成する。この構造は配列番号24により表され、図19cに示される。図19d中に配列番号25として示されるフォーク型アダプターは、MALBAC産物上で生成される突出部と相補的な突出部(この場合、太字で示されるCTAG)を含む。フォーク型アダプターを図19c中のMALBAC産物と混合し、相補的領域がハイブリダイズする。熱安定性リガーゼを用いてフォーク型アダプターとMALBAC産物を一緒にライゲートして、所望の構造である図19eを配列番号26として形成させる。更なる増幅方法(例えば、PCR)を用いて、更なる領域(例えば、固定化領域、更なるバーコードなど)をフォーク型アダプターに付加することができる。
【０２６５】
いくつかの場合、他の塩基対突出部(例えば、1塩基対突出部〜10塩基対突出部)が望ましいことがある。制限酵素を用いてこれらの突出部を生成し、必要に応じて、本明細書に記載のものなどの代替物として用いることができる。一例では、2塩基対突出部を、TaqαIを用いてMALBAC産物上で生成する。
【０２６６】
代替手段として、RNAプライマー配列がバーコード領域の5'側に置かれ、RNAaseを用いて突出部を生成するように、図19aに示されるプライマーを設計することができる。図19fに示されるように、MALBAC産物1900は、バーコード領域1902の5'側に置かれたRNAプライマー配列1901を含む。MALBAC産物1900はまた、配列決定プライマー領域1903、標的ポリヌクレオチド1904、相補的配列決定プライマー領域1905、相補的バーコード領域1906、及びRNAプライマー配列1901と相補的な領域1907も含む。MALBAC産物1900をRNAse H 1908で処理し、RNAプライマー領域配列1901を消化して、MALBAC産物1900上で2〜6塩基対突出部1909を得て、構造1920を得る。次いで、構造1910上の突出部と相補的な領域を含むユニバーサル相補領域1910を構造1910に付加する。次いで、ユニバーサル相補領域1910は構造1920とハイブリダイズし、熱安定性リガーゼを用いてユニバーサル相補領域1910を構造1920にライゲートする。
【０２６７】
(実施例14)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図20に示されるように、バーコード領域を含む鋳型2000を、例えば、界面重合又は本明細書に記載の任意の他の方法を用いて、カプセル2002中でのPCRにとって必要な薬剤2001と混合する。PCRを用いて、鋳型2000からMALBACプライマーを生成する。次に、カプセル2000を、バーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド2005及びMALBAC増幅にとって必要な試薬2006(例えば、DeepVentポリメラーゼ、dNTP、バッファー)を含む混合物2004をも含む外側カプセル2003中に封入する。カプセル2002は、カプセル2002を破裂させるように設計された刺激へのカプセル2002の適切な曝露の際に破壊され、カプセル2002の内容物は混合物2004のものと混合する。標的ポリヌクレオチド2005のMALBAC増幅が開始し、図19fに1900として示されたものとして記載されたものと類似するMALBAC産物を産生する。
【０２６８】
次いで、外側カプセル2003を適切な刺激を用いて破壊し、内容物を回収する。次いで、MALBAC産物を適切な制限酵素で処理し、実施例13に記載の物質中のフォーク型アダプターにカップリングさせる。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を必要に応じて実施する。
【０２６９】
(実施例15)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図21aに示されるように、MALBACプライマー2100を調製する。MALBACプライマー2100は、配列プライミング領域2101及び8ヌクレオチド可変領域2102を含む。プライマー2100を、パーティション(例えば、カプセル、乳濁液など)中に鎖置換活性を有するポリメラーゼ(例えば、Vent、exo + DeepVent、exo - DeepVent)と共に、標的ポリヌクレオチド2103と混合する。いくつかの場合、非鎖置換ポリメラーゼ(例えば、Taq、PfuUltra)を用いる。次いで、パーティションをMALBAC増幅2104にかける。
【０２７０】
配列決定プライミング領域2101、標的ポリヌクレオチド2103、及び相補的配列プライミング領域2105を含む、ループしたMALBAC産物2110を生産する。次いで、図21b中に線形形態2120で示される、MALBAC産物2110を、配列決定プライマー領域2106、バーコード領域2107、及び固定化領域2108を含む別のプライマー2130と接触させる。プライマー2130を、非対称性デジタルPCRを用いて生産する。単一サイクルのPCRを用いて、プライマーを用いて、プライマー2130、及びしたがって、バーコード領域2107を含む二本鎖産物2140を生成する。
【０２７１】
次いで、二本鎖産物2140を変性させた後、図21cに示される別のプライマー2150と接触させる。プライマー2150は、バーコード領域2109、配列決定プライマー領域2111、及び固定化領域2112を含む。プライマー2113及び2114の存在下で、更なるラウンドのPCRはバーコード領域2109を、バーコード領域2107に結合した標的ポリヌクレオチドの末端に付加することができる。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択など)を必要に応じて実施する。
【０２７２】
(実施例16)
複数のアニーリング及びルーピングに基づく増幅(MALBAC)を用いるバーコード化
図22に示されるように、バーコード領域を含むプライマー鋳型2200を、例えば、界面重合又は本明細書に記載の任意の他の方法を用いて、カプセル2202中でのPCRにとって必要な試薬2201と混合する。次いで、PCRを用いて、鋳型2200からプライマーを生成する。次に、カプセル2202を、バーコード化しようとする標的ポリヌクレオチド2205、MALBAC増幅にとって必要な試薬2206(例えば、DeepVentポリメラーゼ、dNTP、バッファー)、及びバーコードを含まないMALBACプライマー2207(実施例15に記載のMALBACプライマー2100と類似する)を含む混合物2204をも含む外側カプセル2203中に封入する。標的ポリヌクレオチド2205のMALBAC増幅が開始し、図21a中に2110として示されるものとして記載されるものと類似するMALBAC産物を産生する。次いで、カプセル2202は、カプセル2202を破裂させるように設計された刺激へのカプセル2202の適切な曝露の際に破壊され、カプセル2202の内容物は混合物2204のものと混合する。単一サイクルのPCRを鋳型2200から生成されたプライマーを用いて開始させ、実施例15に記載のものと類似する、バーコード化産物を生成する。
【０２７３】
次いで、外側カプセル2203を適切な刺激を用いて破壊し、内容物を回収する。次いで、更なる下流の調製工程(例えば、バルク増幅、サイズ選択、更なるバーコードの付加など)を必要に応じて実施する。
【０２７４】
(実施例17)
トランスポザーゼ及びタグメンテーション(Tagmentation)を用いるバーコード化
図23に示されるように、実施例1に記載のように、又は本開示に記載の任意の他の方法により、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を合成、区分化、増幅、及び選別する。界面重合を、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列を含む液滴上で実施して、カプセル2301を生成する。
【０２７５】
2つの混合物を調製する。混合物Z1は、標的ポリヌクレオチド2302(すなわち、断片化及びバーコード化しようとするポリヌクレオチド)、トランスポゾーム2303、及び部分相補ユニバーサル配列2304を含む。第2の混合物Z2は、上記のように生成されたカプセル2301と、本明細書の他の場所に記載のようなPCRにとって必要な試薬2305とを含む。
【０２７６】
混合物Z1及びZ2を混合し、フローフォーカシングなどの本開示の他の場所に記載される方法に従ってカプセル内カプセルを形成させる。図23は、上記の方法に従って生産されるカプセル内カプセルを例示する。外側カプセル2306は、カプセル2301と媒体2307とを含む。カプセル2301は、封入された一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチドのライブラリーの1メンバーである。したがって、カプセル2301は、複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を含み、これを用いて同じバーコードを、外側カプセル2306などのパーティション内のポリヌクレオチドに結合させることができる。
【０２７７】
媒体2307は、上記の混合物Z1及びZ2の内容物を含有する。より特には、媒体2307は、標的ポリヌクレオチド2302、部分相補ユニバーサル配列2304、及びホットスタートTaqなどの、PCRにとって必要な試薬2305を含む。
【０２７８】
カプセル内カプセルの生成、及び適切な条件へのカプセル内カプセルの曝露の際に、トランスポゾームは標的ポリヌクレオチドをプロセッシングする。より特には、トランスポザーゼは、タグメンテーションを介して標的ポリヌクレオチドを断片化し、それを共通のプライミング配列でタグ付けする。次いで、タグ付けされた標的ポリヌクレオチドを加熱して、トランスポザーゼにより生成される標的ヌクレオチド中の任意のギャップを埋める。次いで、トランスポザーゼを熱不活化し、刺激を用いて内側カプセル2301を破裂させ、その内容物を外側カプセル2306中に放出させる。外側カプセル2306を95℃に加熱することにより、ホットスタートTaqを活性化する。反応を限定サイクルのPCRを用いて進行させ、一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列2300を標的ポリヌクレオチド2302に付加する。次いで、外側カプセル2306を破裂させ、標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
【０２７９】
特定の実施を例示及び記載してきたが、それに対して様々な改変を加えることができ、それは本明細書で企図されることが上記から理解されるべきである。また、本発明は明細書内に提供される特定例によって限定されることを意図していない。本発明を上記の明細書を参照して記載してきたが、本明細書の好ましい実施形態の記載及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の表現、構成又は相対的比率に限定されないことが理解されるべきである。本発明の実施形態の形態及び詳細における様々な改変は、当業者には明らかである。したがって、本発明は任意のそのような改変、変更及び等価物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びその等価物内の方法及び構造がそれによって包含されることが意図される。
【符号の説明】
【０２８０】
101  第1の固定化領域
102  第2の固定化領域
103  第1の配列決定プライマー領域
104  第2の配列決定プライマー領域
105  標的ポリヌクレオチド
106  フォーク型アダプター構造
201  第1の固定化領域
202  第2の固定化領域
203  第1の配列決定プライマー領域
204  第2の配列決定プライマー領域
205  バーコード(BC1)
206  バーコード(BC2)
207  バーコード(BC3)
401  一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
402  第1の固定化領域
403  バーコード領域
404  第1の配列決定プライマー領域
405  二本鎖産物
406  一本鎖産物
407  部分相補ユニバーサル配列
408  第2の固定化領域
409  第2の配列決定プライマー領域
410  増幅の指数期
411  増幅の直線期
412  蛍光支援細胞選別装置(FACS)
413  部分的にアニーリングしたフォーク型構造
501  外側カプセル
502  内側カプセル
503  複数のコピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
504  媒体
505  標的ポリヌクレオチド
506  部分相補ユニバーサル配列
507  酵素ミックス
601  外側カプセル
602  内側カプセル
603  一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
604  媒体
605  内側カプセル
606  断片化された標的ポリヌクレオチド
607  部分相補ユニバーサル配列
608  酵素混合物
701  ヘアピンアダプター
702  二本鎖領域
703  ATライゲーションのための3'-T突出部
704  制限酵素により切断することができる領域
1101  第1の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
1102  第1の固定化領域
1103  第1のバーコード領域
1104  第1の配列決定プライマー領域
1105  二本鎖産物
1106  一本鎖産物
1106  複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
1110  増幅の指数期
1111  増幅の直線期
1112  蛍光支援細胞選別装置(FACS)
1120  カプセル
1131  第2の一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
1132  第2の固定化領域
1133  第2のバーコード領域
1134  第2の配列決定プライマー領域
1135  二本鎖産物
1136  一本鎖産物
1136  複数コピーの一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド
1150  カプセル
1160  外側カプセル
1170  標的ポリヌクレオチド
1180  カプセル
1180  酵素ミックス
1190  媒体
1201  第1の液体
1202  第2の液体
1203  T連結部
1204  カプセル外殻が形成し始める
1301  第1の液体
1302  第2の液体
1303  T連結部
1304  第2のカプセル外殻が形成し始める
1401  一本鎖アダプター-バーコード配列
1402  第1の固定化領域
1403  バーコード領域
1404  第1の配列決定プライマー領域
1405  第1のビーズ
1406  RNAプライマー
1407  ポリヌクレオチドを増幅する
1408  二本鎖産物
1409  洗浄
1410  変性
1411  洗浄
1412  一本鎖相補体
1413  相補的固定化領域
1414  相補的バーコード領域
1415  相補的配列決定プライマー領域
1416  第2のビーズ
1417  DNAポリヌクレオチド
1418  遠心分離
1419  NaOH
1420  構造
1424  放出
1425  混合
1426  ユニバーサル相補配列
1430  構造
1440  構造
1450  フォーク型アダプター
1501  一本鎖アダプター-バーコード配列
1502  第1の固定化領域
1503  バーコード領域
1504  第1の配列決定プライマー領域
1505  第1のビーズ
1506  RNAプライマー
1507  ポリヌクレオチドを増幅する
1508  二本鎖産物
1509  洗浄
1510  水酸化ナトリウム(NaOH)
1511  洗浄
1512  一本鎖相補体
1513  相補的固定化領域
1514  相補的バーコード領域
1515  相補的配列決定プライマー領域
1516  第2のビーズ
1517  相補的DNAポリヌクレオチド
1518  遠心分離
1519  NaOH
1520  構造
1524  放出
1525  混合
1526  ユニバーサル相補配列
1530  構造
1540  構造
1550  フォーク型アダプター
1600  構造
1601  磁気ビーズ
1602  一本鎖アダプター-バーコード配列
1603  増幅
1604  増幅の直線期
1605  一本鎖アダプター、一本鎖アダプター産物
1606  磁気分離
1620  カプセル
1700  構造
1701  磁気ビーズ
1702  一本鎖アダプター-バーコード配列
1703  外側カプセル
1704  内側カプセル
1705  媒体
1706  標的ポリヌクレオチド
1707  部分相補ユニバーサル配列
1708  酵素ミックス
1800  構造
1801  磁気ビーズ
1802  一本鎖アダプター-バーコード配列
1803  内側カプセル
1804  内側カプセル、標的ポリヌクレオチドカプセル
1805  部分相補ユニバーサル配列
1806  酵素混合物
1807  外側カプセル
1808  媒体
1809  断片化された標的ポリヌクレオチド
1900  MALBAC産物
1901  RNAプライマー配列
1902  バーコード領域
1903  配列決定プライマー領域
1904  標的ポリヌクレオチド
1905  相補的配列決定プライマー領域
1906  相補的バーコード領域
1907  RNAプライマー配列と相補的な領域
1908  RNAse H
1909  塩基対突出部
1910  構造
1910  ユニバーサル相補領域
1920  構造
2000  鋳型
2001  薬剤
2002  カプセル
2003  外側カプセル
2004  混合物
2005  標的ポリヌクレオチド
2006  試薬
2100  MALBACプライマー
2101  配列プライミング領域
2102 8ヌクレオチド可変領域
2103  標的ポリヌクレオチド
2104  MALBAC増幅
2105  相補的配列プライミング領域
2106  配列決定プライマー領域
2107  バーコード領域
2108  固定化領域
2109  バーコード領域
2110  MALBAC産物
2111  配列決定プライマー領域
2112  固定化領域
2113  プライマー
2114  プライマー
2120  線形形態
2130  プライマー
2140  二本鎖産物
2150  プライマー
2200  鋳型
2201  試薬
2202  カプセル
2203  外側カプセル
2204  混合物
2205  標的ポリヌクレオチド
2206  試薬
2207  MALBACプライマー
2300  一本鎖アダプター-バーコードポリヌクレオチド配列
2301  カプセル、内側カプセル
2302  標的ポリヌクレオチド
2303  トランスポゾーム
2304  部分相補ユニバーサル配列
2305  試薬
2306  外側カプセル
2307  媒体
【図１】
2019107035.tif 000003
【図２】
2019107035.tif 000004
【図３】
2019107035.tif 000005
【図４】
2019107035.tif 000006
【図５】
2019107035.tif 000007
【図６】
2019107035.tif 000008
【図７】
2019107035.tif 000009
【図８ａ】
2019107035.tif 000010
【図８ｂ】
2019107035.tif 000011
【図８ｃ】
2019107035.tif 000012
【図９ａ】
2019107035.tif 000013
【図９ｂ】
2019107035.tif 000014
【図９ｃ】
2019107035.tif 000015
【図９ｄ】
2019107035.tif 000016
【図９ｅ】
2019107035.tif 000017
【図９ｆ】
2019107035.tif 000018
【図９ｇ】
2019107035.tif 000019
【図９ｈ】
2019107035.tif 000020
【図９ｉ】
2019107035.tif 000021
【図９ｊ】
2019107035.tif 000022
【図１０ａ】
2019107035.tif 000023
【図１０ｂ】
2019107035.tif 000024
【図１０ｃ】
2019107035.tif 000025
【図１０ｄ】
2019107035.tif 000026
【図１０ｅ】
2019107035.tif 000027
【図１１ａ】
2019107035.tif 000028
【図１１ｂ】
2019107035.tif 000029
【図１１ｃ】
2019107035.tif 000030
【図１１ｄ】
2019107035.tif 000031
【図１２】
2019107035.tif 000032
【図１３】
2019107035.tif 000033
【図１４ａ】
2019107035.tif 000034
【図１４ｂ】
2019107035.tif 000035
【図１４ｃ】
2019107035.tif 000036
【図１４ｄ】
2019107035.tif 000037
【図１４ｅ】
2019107035.tif 000038
【図１５ａ】
2019107035.tif 000039
【図１５ｂ】
2019107035.tif 000040
【図１５ｃ】
2019107035.tif 000041
【図１５ｄ】
2019107035.tif 000042
【図１５ｅ】
2019107035.tif 000043
【図１６】
2019107035.tif 000044
【図１７】
2019107035.tif 000045
【図１８】
2019107035.tif 000046
【図１９ａ】
2019107035.tif 000047
【図１９ｂ】
2019107035.tif 000048
【図１９ｃ】
2019107035.tif 000049
【図１９ｄ】
2019107035.tif 000050
【図１９ｅ】
2019107035.tif 000051
【図１９ｆ】
2019107035.tif 000052
【図２０】
2019107035.tif 000053
【図２１ａ】
2019107035.tif 000054
【図２１ｂ】
2019107035.tif 000055
【図２１ｃ】
2019107035.tif 000056
【図２２】
2019107035.tif 000057
【図２３】
2019107035.tif 000058
【配列表】
2019107035000001.app