(57)【要約】      （修正有）【課題】神経性障害等を治療する際の、血液脳関門受容体媒介性血液脳関門輸送の安全性を改善するための組成物及び方法の提供。【解決手段】化合物を血液脳関門を横断して輸送する方法であって、化合物とカップリングした、血液脳関門受容体と低親和性で結合する抗体を血液脳関門に曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした化合物が血液脳関門を横断して輸送されることを含み、抗体を投与した際の赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において化合物を血液脳関門を横断して輸送する方法であって、化合物とカップリングした、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）と低親和性で結合する抗体を血液脳関門に曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした化合物が血液脳関門を横断して輸送されることを含み、対象に抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項２】
対象のＣＮＳの化合物への曝露を増加させる方法であって、化合物をＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とカップリングし、それにより、ＣＮＳの化合物への曝露が増加し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項３】
対象に投与した化合物のクリアランスを低下させる方法であって、化合物をＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とカップリングし、その結果、化合物のクリアランスが低下し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項４】
対象に投与した化合物のＣＮＳ内での保持を増加させる方法であって、化合物をＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とカップリングし、その結果、化合物のＣＮＳ内での保持が増加し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項５】
化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を、対象のＣＮＳにおいて効果的になるように最適化する方法であって、化合物とＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とをカップリングし、抗体は、化合物とカップリングした後のＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が、化合物とコンジュゲートした抗体のＢＢＢを横断した輸送量がＣＮＳにおける化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を最適化するように選択され、対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項６】
哺乳動物における神経性障害を治療する方法であって、哺乳動物を、化合物とカップリングした、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体を用いて治療することを含み、抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いことにより、抗体及びカップリングした化合物のＣＮＳへの取り込みが改善されるように選択されたものであり、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される、方法。
【請求項７】
ＢＢＢ−Ｒが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＢＢＢ−ＲがＴｆＲである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
赤血球が未成熟の赤血球である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
未成熟の赤血球が網状赤血球である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体の１つ又は複数の性質が、対象又は哺乳動物における網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つ又は複数の性質が、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能、抗体の補体活性化機能及び抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つ又は複数の性質が、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能及び抗体の補体活性化機能から選択され、及びエフェクター機能又は補体活性化機能が同じアイソタイプの野生型抗体と比較して低下している又は排除されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体のグリコシル化を減少させること、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変すること、及びＦｃ領域を改変することから選択される方法によってエフェクター機能を低下させる又は排除する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製すること；抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去すること、及び抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することから選択される方法によって抗体のグリコシル化を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる、又は抗体を合成的に作製する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は、抗体を、エフェクター機能若しくは補体活性化機能に適格なＦｃ領域又は非Ｆｃ領域を含まないように操作することによって、エフェクター機能又は補体活性化機能を低下させる又は排除する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
改変が、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異；２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異；Ｆｃ領域の一部又は全部の排除、並びにＣＨ１ドメインの１３２位における点変異から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体を、ＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
抗体に加えて別の化合物を投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
別の化合物が、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される、又は網状赤血球の成長、発生、若しくは再建が支持される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
別の化合物がエリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸、及びビタミンＢ１２から選択される、請求項２６に記載の方法
【請求項２８】
別の化合物が同じ対象又は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性をさらに低下させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
化合物が、神経性障害薬又はイメージング剤である、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない同じアイソタイプの野生型抗体と比較して増加又は減少を測定する、請求項２から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合が損なわれない、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
血液脳関門が哺乳動物におけるものである、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳動物が神経性障害を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
神経性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０が約１ｎＭから約１００μＭまでである、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＣ５０が約５ｎＭから約１００μＭまでである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＣ５０が約５０ｎＭから約１００μＭまでである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＣ５０が約１００ｎＭから約１００μＭまでである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４３】
化合物とカップリングした抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
化合物とカップリングした抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４５】
化合物とカップリングした抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０秒から約５分まで、又は約３０秒から約２分までの解離半減期を有する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４６】
抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されない、請求項８に記載の方法。
【請求項４７】
化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項４８】
治療量がＢＢＢ−Ｒ飽和量である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が多重特異性抗体であり、化合物が任意選択的に多重特異性抗体の一部分を形成する、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項５０】
多重特異性抗体が、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
脳抗原が、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
多重特異性抗体がＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
多重特異性抗体がＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体の対象における安全性を改善する方法であって、抗体を投与することにより、改変されていない抗体を投与した際に観察される対象の赤血球レベルの低下が減少する又は排除されるように、抗体の１つ又は複数の性質を改変することを含む、方法。
【請求項５５】
安全性が改善された、化合物をＢＢＢを横断して輸送するために有用な抗体を作出する方法であって、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的であり、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が望ましく低い抗体を選択することと、抗体を投与することにより、改変されていない抗体を投与した際に観察される対象の赤血球レベルの低下が減少する又は排除されるように、抗体の１つ又は複数の性質を改変することとを含む、方法。
【請求項５６】
ＢＢＢ−Ｒが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＢＢＢ−Ｒがトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
赤血球が網状赤血球である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
１つ又は複数の性質が抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能、抗体の補体活性化機能及び抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
１つ又は複数の性質が抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能及び抗体の補体活性化機能から選択され、及びエフェクター機能又は補体活性化機能が同じアイソタイプの野生型抗体と比較して低下している又は排除されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
抗体のグリコシル化を減少させること、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変すること、及びＦｃ領域を改変することから選択される方法によってエフェクター機能を低下させる又は排除する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製すること；抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去すること、及び抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することから選択される方法によって抗体のグリコシル化を減少させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる、又は抗体を合成的に作製する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
抗体のＦｃ領域又は非Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能又は補体活性化機能を低下させる又は排除する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は、抗体を、エフェクター機能若しくは補体活性化機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによって、エフェクター機能又は補体活性化機能を低下させる又は排除する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
改変が、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異；２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異、Ｆｃ領域の一部又は全部の排除、並びにＣＨ１ドメインの１３２位における点変異から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
抗体を、ＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性をさらに低下させる、請求項６０に記載の方法。
【請求項７２】
ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない同じアイソタイプの野生型抗体と比較して減少を測定する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が約１ｎＭから約１００μＭまでである、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項７４】
抗体のＩＣ５０が約１ｎＭから約１００μＭまでである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＩＣ５０が約５ｎＭから約１００μＭまでである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ＩＣ５０が約５０ｎＭから約１００μＭまでである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
ＩＣ５０が約１００ｎＭから約１００μＭまでである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
抗体がＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する、請求項５４から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０秒から約５分まで、又は約３０秒から約２分までの解離半減期を有する、請求項５４から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
抗体が、選択される抗体の親和性に基づいて抗体のパネルから選択される、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項８１】
抗体を、親和性を有するように操作する、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項８２】
抗体と治療用化合物をカップリングすることを含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項８３】
治療用化合物が神経性障害薬である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
化合物とカップリングした抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
抗体が多重特異性抗体であり、化合物が任意選択的に多重特異性抗体の一部分を形成する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
抗体がＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む多重特異性抗体である、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項８７】
脳抗原が、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
多重特異性抗体がＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
多重特異性抗体がＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合が損なわれない、請求項５４から８８の何れか一項に記載の方法。
【請求項９１】
抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されない、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体であって、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が約５ｎＭから約５０μＭまでである、又はＢＢＢ−Ｒに対する抗体の解離半減期が約３０秒から約２分までであり、及び抗体の１つ又は複数の性質が、赤血球に対する少なくとも１つの望ましくない副作用が減少するように改変されている、抗体。
【請求項９３】
ＢＢＢ−Ｒが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される、請求項９２に記載の抗体。
【請求項９４】
ＢＢＢ−Ｒがトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である、請求項９３に記載の抗体。
【請求項９５】
赤血球が網状赤血球である、請求項９４に記載の抗体。
【請求項９６】
赤血球に対する少なくとも１つの望ましくない副作用が、網状赤血球レベルの低下及び急性臨床症状から選択される、請求項９５に記載の抗体。
【請求項９７】
１つ又は複数の性質が、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能、抗体の補体活性化機能及び抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性から選択される、請求項９６に記載の抗体。
【請求項９８】
１つ又は複数の性質が、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能及び抗体の補体活性化機能から選択され、及びエフェクター機能又は補体活性化機能が同じアイソタイプの野生型抗体と比較して低下している又は排除されている、請求項９７に記載の抗体。
【請求項９９】
エフェクター機能が、抗体のグリコシル化を減少させること、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変すること、及びＦｃ領域を改変することから選択される方法によって低下する又は排除される、請求項９８に記載の抗体。
【請求項１００】
抗体のグリコシル化が、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製すること；抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去すること、及び抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することから選択される方法によって減少する、請求項９９に記載の抗体。
【請求項１０１】
非哺乳動物細胞の産生系で作製される、又は合成的に作製される、請求項１００に記載の抗体。
【請求項１０２】
抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる、請求項１００に記載の抗体。
【請求項１０３】
エフェクター機能又は補体活性化機能が、Ｆｃ領域又は非Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によって低下する又は排除される、請求項９９に記載の抗体。
【請求項１０４】
エフェクター機能又は補体活性化機能が、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによって、低下する又は排除される、請求項１０３に記載の抗体。
【請求項１０５】
改変が、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異；２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異；Ｆｃ領域の一部又は全部の排除、並びにＣＨ１ドメインの１３２位における点変異から選択される、請求項１０３に記載の抗体。
【請求項１０６】
ＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変される、請求項９７に記載の抗体。
【請求項１０７】
ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性がさらに低下される、請求項９７に記載の抗体。
【請求項１０８】
ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない同じアイソタイプの野生型抗体と比較して減少が測定される、請求項１０７に記載の抗体。
【請求項１０９】
親和性がＩＣ５０として測定される、請求項９２に記載の抗体。
【請求項１１０】
選択される抗体の親和性に基づいて抗体のパネルから選択される、請求項９２に記載の抗体。
【請求項１１１】
親和性を有するように操作される、請求項９２に記載の抗体。
【請求項１１２】
治療用化合物とさらにカップリングした、請求項９２に記載の抗体。
【請求項１１３】
治療用化合物が神経性障害薬である、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１４】
化合物とカップリングした抗体がＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１５】
多重特異性抗体であり、化合物が任意選択的に多重特異性抗体の一部分を形成する、請求項１１２に記載の抗体。
【請求項１１６】
ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む多重特異性抗体である、請求項９２に記載の抗体。
【請求項１１７】
脳抗原が、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される、請求項１１６に記載の抗体。
【請求項１１８】
多重特異性抗体がＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する、請求項１１７に記載の抗体。
【請求項１１９】
多重特異性抗体がＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する、請求項１１７に記載の抗体。
【請求項１２０】
ＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合を損なわない、請求項９２から１１９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２１】
ＴｆＲとトランスフェリンの結合を阻害しない、請求項１２０に記載の抗体。
【請求項１２２】
神経性障害を治療するための医薬を製造するための、ＢＢＢ−Ｒに低親和性で結合し、赤血球レベルに影響を及ぼさない抗体の使用。
【請求項１２３】
神経性障害を治療するための医薬を製造するための、請求項９２から１２１の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１２４】
神経性障害の治療において使用するための、ＢＢＢ−Ｒに低親和性で結合し、赤血球レベルに影響を及ぼさない抗体。
【請求項１２５】
神経性障害の治療において使用するための、請求項９２から１２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２６】
対象における赤血球レベルの上昇に関連する又はそれによって引き起こされる疾患又は障害を治療する方法であって、少なくとも部分的なエフェクター機能を有する抗ＴｆＲ抗体を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２７】
投与する工程が抗体投与の急性臨床症状が最小限になるように調整した用量及び／又は投薬頻度で行われる、請求項１２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門受容体媒介性血液脳関門輸送の安全性を改善するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大きな分子薬物の脳への浸透は、不浸透性が大きな血液脳関門（ＢＢＢ）により厳しく限定される。この障害を克服するための多くの戦略としては、脳毛細血管内皮で発現される内在性の受容体のトランスサイトーシス輸送経路を利用することが挙げられる。大きな分子の脳への受容体媒介性送達を可能にするために、これらの受容体に対するモノクローナル抗体などの組換えタンパク質が設計されてきた。脳への取り込みを最大にする一方、血液中に戻る逆トランスサイトーシスを最小限にするための、及び治療的投薬後の蓄積の程度も最大にするための戦略は、ＢＢＢ受容体に対する親和性が低い抗体により、ＢＢＢ輸送、及び関連する治療用部分／分子のＣＮＳへの保持が、そのような受容体に対する典型的な高親和性抗体と比較して実質的に増加する可能性がもたらされるという知見で対処されてきた（Atwalら、Sci. Transl. Med. 3、84ra43 (2011)；Yuら、Sci. Transl. Med. 25 May 2011: 3巻、84号、p. 84ra44）。しかし、そのような抗体及びコンジュゲートを投与することの安全性は十分には探究されていない。
【発明の概要】
【０００３】
モノクローナル抗体には神経疾患又は中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を治療するための非常に大きな治療的な可能性があるが、それらの脳内への移動は血液脳関門（ＢＢＢ）によって制限される。過去の試験により、血流内を循環しているＩｇＧのうちＢＢＢを越えてＣＮＳ内に入るものの百分率は非常に小さい（およそ０．１％）ことが示されており（Felgenhauer, Klin. Wschr. 52: 1158-1164 (1974)）、その場合、ロバストな効果を可能にするためには抗体のＣＮＳへの濃縮が不十分であり得る。ＣＮＳ内に分配される抗体の百分率は、ＢＢＢ受容体（すなわち、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）など）（例えば、国際公開第９５０２４２１号を参照されたい）を利用することによって改善することができることが以前に見いだされた。例えば、抗ＢＢＢ受容体抗体を多特異性にしてＣＮＳ内の１種又は複数種の所望の抗原を標的とすることもでき、１種又は複数種の異種分子と抗ＢＢＢ受容体抗体とをカップリングすることもでき、いずれの場合も、抗ＢＢＢ受容体抗体は、治療用分子をＣＮＳ内にＢＢＢを通して送達することに役立ち得る。
【０００４】
しかし、従来の特異的な高親和性抗体を用いたＢＢＢ受容体の標的化では、一般に、もたらされるＢＢＢ輸送の増加は限られたものであった。後に、出願人らは、試験した抗ＢＢＢ抗体の中で、ＣＮＳ内に取り込まれ分配される抗体の規模がＢＢＢ受容体に対するその結合親和性と反比例することを見いだした。例えば、治療量レベルで投薬された、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する親和性が低い抗体により、親和性が高い抗ＴｆＲ抗体と比較して抗ＴｆＲ抗体のＢＢＢ輸送及びＣＮＳへの保持が著しく改善され、及びＣＮＳ内への治療的濃縮をより容易に実現することが可能になる（Atwalら、Sci. Transl. Med. 3、84ra43 (2011)）。そのようなＢＢＢ輸送の証明を、ＴｆＲとアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）切断酵素、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）の両方に結合する二重特異性抗体を使用して実現した。本発明の方法体系を使用して操作した二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の単回全身投薬により、抗体が脳内に有意に取り込まれただけでなく、脳内Ａβ１−４０のレベルが単一特異性抗ＢＡＣＥ１単独と比較して劇的に低下し、これにより、ＢＢＢへの浸透度が抗ＢＡＣＥ１の効力に影響を及ぼすことが示唆された。（Atwalら、Sci. Transl. Med. 3、84ra43 (2011)；Yuら、Sci. Transl. Med. 3、84ra44 (2011)）。
【０００５】
これらのデータ及び実験により、低親和性抗体による手法を使用してＣＮＳ内への抗体の取り込みを増加させることの背景にある、いくつかの原因となる機構が強調された。第１に、高親和性抗ＢＢＢ受容体（ＢＢＢ−Ｒ）抗体（例えば、抗ＴｆＲＡ）により、脳脈管構造内のＢＢＢ−Ｒが直ちに飽和することによって脳への取り込みが限定され、したがって脳内に取り込まれる抗体の総量が減少し、及び脈管構造へのその分配も制限される。著しく、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性を低下させることにより、脳への取り込み及び分配が改善され、脈管構造からＣＮＳ内に分配されたニューロン及び関連するニューロピルへの局在化のロバストなシフトが観察された。第２に、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の全体的な親和性が低く、及び抗体がＣＮＳ区画内に急速に分散されることに起因してＢＢＢのＣＮＳ側への抗体の局所的な濃度は飽和しないことから、抗体が膜のＣＮＳ側からＢＢＢ−Ｒを介してＢＢＢの血管側に戻ることを減損させるために、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性をより低くすることが提唱される。第３に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、及びＴｆＲ系について観察された通り、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低い抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が高い抗体ほど効率的には系から取り除かれず、したがって、それらの高親和性対応物よりも循環濃度が高いままである。これは、低親和性抗体の循環している抗体のレベルが、高親和性抗体よりも長い期間にわたって治療レベルで持続し、したがって、脳内への抗体の取り込みがより長い期間にわたって改善されるので、有利である。さらに、血漿曝露及び脳曝露の両方におけるこの改善により、診療所における投薬の頻度を減らすことができ、これには、患者のコンプライアンス及び利便性に関してだけでなく、抗体及び／又はそれとカップリングした治療用化合物のいかなる潜在的な副作用又はオフターゲットの作用を減らすことにおいても利益がある可能性がある。
【０００６】
トランスフェリンとＴｆＲの間の天然の結合への干渉を回避するために、したがって、潜在的な鉄輸送に関連する副作用を回避するために、上で参照されている研究に記載されている低親和性ＢＢＢ−Ｒ抗体を選択／操作した。それにもかかわらず、ある特定のこれらの抗体をマウスに投与した際にいくつかの顕著な副作用が観察された。マウスは、実施例に記載の通り、急性臨床症状の急速な発症を伴う網状赤血球集団のロバストな枯渇という一次応答を示した。抗ヒトＴｆＲ抗体を用いて処理したヒト赤芽球細胞株及び初代骨髄細胞を使用した別のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、ＴｆＲ陽性赤血球系細胞のロバストな枯渇がヒト細胞系においても観察可能であることが実証された（例えば、実施例７を参照されたい）。マウスはやがて急性臨床症状及び網状赤血球レベルの低下のどちらからも回復したが、抗ＴｆＲ抗体を治療用分子として安全に使用することができるようにするためには、網状赤血球に対するこの影響を回避すること又はそうでなければ軽減することが明白に望ましい。
【０００７】
したがって、本発明は、抗ＴｆＲを投与した際の網状赤血球集団の望ましくない低下を著しく減少させる又は排除する一方で、それでも、治療濃度で投与した低親和性抗ＴｆＲ抗体によってＢＢＢ輸送の増強、ＣＮＳへの分配の増加及びＣＮＳへの保持がもたらされることを可能にする組成物及び方法を提供する。本明細書に記載されている結果は、抗ＴｆＲ投与に対する一次応答（ロバストな網状赤血球枯渇及び急性臨床徴候）は主に抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性によって駆動され、一方、残りの網状赤血球の枯渇作用は補体経路によって媒介されることを示している。一次的な網状赤血球枯渇と残りの網状赤血球の枯渇の両方に対して観察された抗ＴｆＲ抗体の作用を軽減するためのいくつかの一般的な手法が本明細書において提供され、それは単独で又は組み合わせて使用することができる。
【０００８】
１つの手法では、ＡＤＣＣ活性を低下させる又は排除するために、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のエフェクター機能を低下させる又は排除する。別の手法では、抗体と網状赤血球集団の相互作用のその集団に対する有害性が低くなるように、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性をさらに低下させる。第３の手法は、血漿中に存在する抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の量を減少させて、網状赤血球集団の、潜在的に有害な濃度の抗体への曝露を減らすことを対象とする。第４の手法では、網状赤血球集団を保護、安定化及び／又は補給し、その結果、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を投与することによるいかなる潜在的な網状赤血球集団の枯渇も回避、減少又は軽減することが試みられる。
【０００９】
本明細書に記載のエフェクター機能の低下又は排除は、（ｉ）抗体の野生型哺乳動物グリコシル化を低下させること若しくは排除することによって（例えば、そのようなグリコシル化が起こり得ない環境で抗体を作製することによって、抗体がグリコシル化され得ないように１つ若しくは複数の炭水化物結合点を変異させることによって、又は抗体がグリコシル化された後に１つ若しくは複数の炭水化物を抗体から化学的又は酵素的に除去することによって）；（ｉｉ）抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のＦｃ受容体結合能を低下させること若しくは排除することによって（例えば、Ｆｃ領域の変異によって、Ｆｃ領域内の欠失によって、又はＦｃ領域の排除によって）；又は（ｉｉｉ）エフェクター機能が最小である又はエフェクター機能がないことが公知の抗体のアイソタイプ（すなわち、これだけに限定されないがＩｇＧ４を含めたもの）を利用することによって実現することができる。
【００１０】
本明細書に記載の抗体による補体活性化の低下は、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のＣ１ｑ結合能を低下させること若しくは排除することによって（例えば、Ｆｃ領域の変異によって、Ｆｃ領域内の欠失によって、Ｆｃ領域の排除によって、又は抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の非Ｆｃ部分の改変によって）、又は補体系の活性化又は活性を他のやり方で抑制すること（例えば、１種又は複数種の補体経路活性化阻害剤又は補体経路活性阻害剤を同時投与すること）によって実現することができる。
【００１１】
網状赤血球又は他の細胞型上のＢＢＢ−Ｒと抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の結合が網状赤血球又は他の細胞型の枯渇を誘発すると、本明細書において例示されている抗ＴｆＲ抗体と同様に、網状赤血球又は他の細胞型上のＢＢＢ−Ｒへの抗体の結合が減少することにより、今度は、抗体を投与した際に観察される網状赤血球又は他の細胞型の枯渇の量が減少する。実際にこれは本発明において実証された（例えば、図６Ｂを参照されたい）。抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性は、本明細書に記載され、実施例において示されている任意の方法を使用して改変することができる。
【００１２】
網状赤血球集団の、潜在的に有害な濃度の抗体への曝露を減少させるために、血漿中に存在する抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の量の減少をいくつかのやり方で実現することができる。１つの方法は、単に投薬する抗体の量を減らし、潜在的にそれと同時に投薬の頻度も増加させ、血漿中の最大濃度は低下させるが有効性のために十分な血清中レベルは維持する一方で、それでも細胞が枯渇する副作用の閾値を下回るようにすることである。投薬の改変と組み合わせることができる別の方法は、ＴｆＲに対するｐＨ感受性結合性を有し、その結果ｐＨ７．４で血漿中の細胞表面ＴｆＲに結合し、本明細書に記載の通り親和性が望ましく低いが、エンドソーム区画内に内部移行すると、その区画の比較的低いｐＨ（ｐＨ５．５−６．０）においてそのようなＴｆＲとの結合が急速及び著しく低下するように抗ＴｆＲ抗体を選択又は操作することである。そのような解離により、抗体を抗原媒介性クリアランスから保護する、又はＣＮＳに送達されるか又はＢＢＢを戻って再利用される抗体の量を増加させることができ、いずれの場合も、抗体の投与用量を増加させずに、そのようなｐＨ感受性を有さない抗ＴｆＲ抗体と比較して抗体の有効濃度が増加する。
【００１３】
網状赤血球集団の保護、安定化及び／又は補給は、薬学的方法又は物理的方法を使用して実現することができる。抗ＢＢＢ−Ｒ抗体に加えて、網状赤血球集団に対する抗体の負の副作用を軽減する少なくとも１種の別の治療剤を同時投与（同時に又は逐次的に）することができる。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸、及びビタミンＢ１２が挙げられる。赤血球（すなわち、網状赤血球）を物理的に交換することも、例えば、同様の血液型の別の個体由来であってもよく、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を投与する対象から予め抽出したものであってもよい同様の細胞を用いて輸血することによって可能である。
【００１４】
前述の方法の任意の組合せを使用して、（ｉ）抗体及び任意のコンジュゲート化合物のＣＮＳ内への輸送が最大になるような、ＢＢＢ−Ｒに対する望ましく低い親和性、（ｉｉ）治療効果を有するためにＣＮＳ内に存在する必要がある化合物の量に関連するので、コンジュゲート化合物（非限定的な例として、抗ＴｆＲ抗体における第２の又は別の抗原結合特異性を含む）のＣＮＳ抗原に対する親和性、（ｉｉｉ）抗ＢＢＢ−Ｒ抗体のクリアランス速度、及び（ｉｖ）網状赤血球集団に対する影響の間の平衡が最適である抗体（及び／又はその投薬レジメン）を操作することができることが当業者には理解されよう。
【００１５】
抗ＴｆＲ抗体を投与することの、本発明で理解される網状赤血球の枯渇作用は、網状赤血球の過度の増殖が問題である任意の疾患又は障害の治療において有用であり得ることも理解されよう。例えば、先天性赤血球増加症又は新生物性真性赤血球増加症では、例えば網状赤血球の過剰増殖に起因する赤血球数の上昇により、血液が濃くなり、同時に生理的症状が生じる。本発明の抗ＴｆＲ抗体を、抗体の少なくとも部分的なエフェクター機能を保存して投与することにより、ＣＮＳへの正常なトランスフェリン輸送に影響を及ぼすことなく、未成熟の網状赤血球集団を選択的に除去することが可能になる。そのような抗体の投薬は、当技術分野において十分に理解されている通り、急性臨床症状が最小限になり得るように調節することができる（すなわち、非常に低用量で又は間隔を広く空けて投薬することによって）。
【００１６】
抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａはそれぞれアルツハイマー病を治療するための有望及び新規の治療薬候補である。さらに、受容体媒介性輸送（ＲＭＴ）に基づく二重特異性標的化技術により、ＣＮＳ疾患に対する広範囲の潜在的な治療薬に対する扉が開かれた。本発明は、治療薬のＢＢＢを通した輸送及びＣＮＳへの分配が、網状赤血球を枯渇させることなく著しく改善される、ＢＢＢ浸透性治療薬を操作する方法を提供する。
【００１７】
したがって、第１の実施態様では、本発明は、対象において化合物を血液脳関門を通して輸送する方法であって、化合物とカップリングした、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）と低親和性で結合する抗体を血液脳関門に曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした化合物が血液脳関門を通って輸送されることを含み、対象に抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００１８】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００１９】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００２０】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００２１】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J . Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【００２２】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００２３】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（例えば、Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００２４】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、ＢＢＢは哺乳動物におけるものである。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。別の態様では、ＢＢＢはヒトにおけるものである。
【００２５】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００２６】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００２７】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００２８】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、対象のＣＮＳの化合物への曝露を増加させる方法であって、化合物をＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とをカップリングし、それにより、ＣＮＳの化合物への曝露が増加し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００３０】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００３１】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００３２】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００３３】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【００３４】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００３５】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（例えば、Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００３６】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、抗体とカップリングした化合物を哺乳動物に投与する。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。
【００３７】
別の態様では、ＣＮＳの化合物への曝露の増加を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない典型的な抗体とカップリングした化合物へのＣＮＳの曝露と比較して測定する。別の態様では、ＣＮＳの化合物への曝露の増加を、ＣＮＳにおいて見いだされる化合物の量を投与後に血清中に見いだされる量と比較した比として測定する。別のそのような態様では、ＣＮＳ曝露の増加は、０．１％超の比になる。別の態様では、ＣＮＳの化合物への曝露の増加を抗体とカップリングしていない状態の化合物のＣＮＳ曝露と比較して測定する。別の態様では、ＣＮＳの化合物への曝露の増加をイメージングによって測定する。別の態様では、ＣＮＳの化合物への曝露の増加を、１つ又は複数の生理的症状の変化などの間接的な読み取りによって測定する。
【００３８】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００３９】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【００４０】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００４１】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００４２】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００４３】
別の実施態様では、本発明は、対象に投与した化合物のクリアランスを低下させる方法であって、化合物とＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とをカップリングし、その結果、化合物のクリアランスが低下し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００４４】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００４５】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００４６】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００４７】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【００４８】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００４９】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００５０】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、対象は哺乳動物である。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。
【００５１】
別の態様では、化合物のクリアランスの減少を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない典型的な抗体とカップリングした化合物のクリアランスと比較して測定する。別の態様では、化合物のクリアランスの減少を、抗体とカップリングしていない状態の化合物のクリアランスと比較して測定する。
【００５２】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００５３】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【００５４】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００５５】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００５６】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００５７】
対象に投与した化合物のＣＮＳ内での保持を増加させる方法であって、化合物とＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とをカップリングし、その結果、化合物のＣＮＳ内での保持が増加し、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００５８】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００５９】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００６０】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００６１】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【００６２】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００６３】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（例えば、Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００６４】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、化合物を哺乳動物に投与する。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。
【００６５】
別の態様では、化合物のＣＮＳへの保持の増加を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低下していない典型的な抗体とカップリングした化合物のＣＮＳへの保持と比較して測定する。別の態様では、化合物のＣＮＳへの保持の増加を、ＣＮＳにおいて見いだされる化合物の量を投与後の１つ又は複数の時点で血清中に見いだされる量と比較した比として測定する。別のそのような態様では、ＣＮＳへの保持の増加により、投与後の１つ又は複数の時点で０．１％を超える比がもたらされる。別の態様では、化合物のＣＮＳへの保持の増加を、抗体とカップリングしていない状態の化合物のＣＮＳへの保持と比較して測定する。別の態様では、化合物のＣＮＳへの保持の増加をイメージングによって測定する。別の態様では、化合物のＣＮＳへの保持の増加を、１つ又は複数の生理的症状の変化などの間接的な読み取りによって測定する。
【００６６】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００６７】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【００６８】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００６９】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００７０】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００７１】
別の実施態様では、本発明は、化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を、対象のＣＮＳにおいて効果的になるように最適化する方法であって、化合物とＢＢＢ−Ｒと低親和性で結合する抗体とをカップリングし、抗体は、化合物とカップリングした後のＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が、化合物とコンジュゲートした抗体のＢＢＢを通した輸送量がＣＮＳにおける化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質を最適化するように選択され、対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００７２】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００７３】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００７４】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００７５】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【００７６】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００７７】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（例えば、Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００７８】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、ＢＢＢは哺乳動物におけるものである。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。別の態様では、ＢＢＢはヒトにおけるものである。
【００７９】
一態様では、最適化は、各抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性が異なる一連の抗体−化合物複合体を生成すること、及びそれぞれのＣＮＳにおける薬物動態及び／又は薬力学的性質を評価することを含んでよい。別の態様では、最適化は、例えば、これだけに限定されないが、ＣＮＳに直接導入した場合、又は抗ＢＢＢ−Ｒ抗体とカップリングしていない状態で対象に導入した場合の化合物の薬物動態及び／又は薬力学的性質などの公知の標準と相対的であってよい。
【００８０】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００８１】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【００８２】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００８３】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００８４】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００８５】
別の実施態様では、本発明は、哺乳動物における神経性障害を治療する方法であって、哺乳動物を、化合物とカップリングした、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体を用いて治療することを含み、抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低く、したがって、抗体及びカップリングした化合物のＣＮＳへの取り込みが改善されるように選択されたものであり、及び対象に化合物とカップリングした抗体を投与した際の対象における赤血球レベルの低下が減少する又は排除される方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００８６】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。別の態様では、方法は、対象を赤血球の枯渇についてモニタリングする工程をさらに含む。
【００８７】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【００８８】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【００８９】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【００９０】
別の態様では、抗体及びカップリングした化合物に加えて、別の化合物を投与する。そのような態様の１つでは、別の化合物は、網状赤血球レベルが低下しないことに関与又は寄与する。別のそのような態様では、別の化合物により、補体経路の活性化又は活性が阻害又は防止される（例えば、Mollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121を参照されたい）。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球が抗体関連枯渇から保護される。別のそのような態様では、別の化合物により、網状赤血球の成長、発生、又は再建が支持される。別の態様では、別の化合物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸及びビタミンＢ１２から選択される。別の態様では、別の化合物は同じ対象由来の赤血球又は網状赤血球である。別の態様では、別の化合物は別の対象由来の赤血球又は網状赤血球である。
【００９１】
別の態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。一態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。
【００９２】
一態様では、治療することにより、障害症状が緩和又は排除される。別の態様では、治療することにより、神経性障害が好転する。
【００９３】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【００９４】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【００９５】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【００９６】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【００９７】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【００９８】
別の実施態様では、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体の対象における安全性を改善する方法であって、抗体を投与することにより、改変されていない抗体を投与した際に観察される対象の赤血球レベルの低下が減少する又は排除されるように、抗体の１つ又は複数の性質を改変することを含む方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【００９９】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。
【０１００】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体の親和性の改変を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が改変されていない（すなわち、低下していない）同じアイソタイプの野生型抗体と比較して測定する。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【０１０１】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【０１０２】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【０１０３】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【０１０４】
別の態様では、抗体を治療用化合物とカップリングする。別のそのような態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、ＢＢＢは哺乳動物におけるものである。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。別の態様では、ＢＢＢはヒトにおけるものである。
【０１０５】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【０１０６】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【０１０７】
別の態様では、抗体は、選択される抗体の親和性に基づいて抗体のパネルから選択される。別の態様では、抗体を、所望の親和性を有するように操作する。そのような態様の１つでは、抗体を、これだけに限定されないが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、ランダム変異誘発、及び部位特異的変異誘発を含めた当技術分野で公知のタンパク質工学の方法体系のいずれかを使用して生成する。
【０１０８】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【０１０９】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【０１１０】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【０１１１】
別の実施態様では、本発明は、安全性が改善された、化合物をＢＢＢを通して輸送するために有用な抗体を作出する方法であって、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に特異的であり、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が望ましく低い抗体を選択すること、及び抗体を投与することにより、改変されていない抗体を投与した際に、観察される対象の赤血球レベルの低下が減少する又は排除されるように、抗体の１つ又は複数の性質を改変することを含む方法を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【０１１２】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。
【０１１３】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体の親和性の改変を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が改変されていない（すなわち、低下していない）同じアイソタイプの野生型抗体と比較して測定する。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【０１１４】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【０１１５】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【０１１６】
別の態様では、抗体の投薬量及び／又は投与の頻度を、赤血球が曝露される抗体の濃度が低下するように調節する。別の態様では、抗体をＢＢＢ−Ｒに対するｐＨ感受性結合性を有するように改変する。
【０１１７】
別の態様では、抗体を治療用化合物とカップリングする。別のそのような態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、ＢＢＢは哺乳動物におけるものである。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。別の態様では、ＢＢＢはヒトにおけるものである。
【０１１８】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約１ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約５０ｎＭから約１００μＭまでである。別のそのような態様では、ＩＣ５０は約１００ｎＭから約１００μＭまでである。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約５ｎＭから約５０μＭまでの親和性を有する。別の態様では、抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約３０μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約５０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【０１１９】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【０１２０】
別の態様では、抗体は、選択される抗体の親和性に基づいて抗体のパネルから選択される。別の態様では、抗体を、所望の親和性を有するように操作する。そのような態様の１つでは、抗体を、これだけに限定されないが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、ランダム変異誘発、及び部位特異的変異誘発を含めた当技術分野で公知のタンパク質工学の方法体系のいずれかを使用して生成する。
【０１２１】
別の態様では、化合物とカップリングした抗体を治療量で投与する。そのような態様の１つでは、治療量は、抗体が特異的に結合するＢＢＢ−Ｒを飽和させる用量である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体を、化合物とカップリングした抗体と赤血球の相互作用が最小限になる一方で、それでも化合物をＢＢＢを通してＣＮＳ内に治療レベルで送達することが容易になる用量及び投薬頻度で投与する。
【０１２２】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【０１２３】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【０１２４】
別の実施態様では、本発明は、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に結合する抗体であって、ＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が約５ｎＭから約５０μＭまでであり、赤血球に対する少なくとも１つの望ましくない副作用が減少するように抗体の１つ又は複数の性質が改変されている抗体を提供する。一態様では、ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ受容体）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）からなる群から選択される。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはヒトＢＢＢ−Ｒである。そのような態様の１つでは、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲである。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲ活性は阻害されない。別のそのような態様では、ＢＢＢ−ＲはＴｆＲであり、抗体によってＴｆＲとトランスフェリンの結合は阻害されない。
【０１２５】
別の態様では、赤血球は未成熟の赤血球である。別のそのような態様では、未成熟の赤血球は網状赤血球である。別の態様では、網状赤血球レベルの低下に急性臨床症状が伴う。
【０１２６】
別の態様では、抗体の１つ又は複数の性質は、網状赤血球レベルに対する抗体の影響が低下し、及び／又は対象における急性臨床症状の重症度若しくは存在が低下するように改変されている。そのような態様の１つでは、抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を改変する、すなわち、低下させる。別のそのような態様では、抗体の親和性の改変を、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が改変されていない（すなわち、低下していない）同じアイソタイプの野生型抗体と比較して測定する。別のそのような態様では、抗体Ｆｃ領域のエフェクター機能を改変する。そのような態様の１つでは、エフェクター機能が同じアイソタイプの野生型抗体のエフェクター機能と比較して低下している又は排除されている。別のそのような態様では、抗体のグリコシル化を減少させることによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が可能にならない環境で作製することによって抗体のグリコシル化を減少させる。そのような態様の１つでは、抗体を非哺乳動物細胞の産生系で産生させる。別のそのような態様では、抗体を合成的に作製する。別のそのような態様では、抗体上にすでに存在する炭水化物基を除去することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体を野生型グリコシル化が起こらないように改変することによって抗体のグリコシル化を減少させる。別のそのような態様では、抗体のＦｃ領域の２９７位に、その位置の野生型アスパラギン残基がその位置におけるグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置き換えられるような変異が含まれる。別の態様では、抗体のアイソタイプをエフェクター機能が天然に低下している又は排除されているアイソタイプに改変することによってエフェクター機能を低下させる又は排除する。
【０１２７】
別の態様では、Ｆｃ領域を改変してエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によってエフェクター機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位から選択される、１つ又は複数のＦｃ受容体との結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体をエフェクター機能に適格なＦｃ領域を含まないように操作することによってエフェクター機能を低下させる若しくは排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。
【０１２８】
別の態様では、抗体のＦｃ領域及び／又は非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、２７０位、３２２位、３２９位、及び３２１位から選択される、Ｃ１ｑとの結合が損なわれるようなＦｃ領域の点変異である。別のそのような態様では、改変は、Ｆｃ領域の一部又は全部を排除することである。別のそのような態様では、Ｆｃ領域の全部若しくは一部を欠失させることによって、又は抗体を補体経路に関与するＦｃ領域を含まないように操作することによって補体誘発機能を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、抗体はＦａｂ又は単鎖抗体から選択される。別のそのような態様では、抗体の非Ｆｃ領域を改変して抗体による補体経路の活性化を低下させる又は排除する。そのような態様の１つでは、改変は、Ｃ３との結合が損なわれるＣＨ１領域の点変異である。そのような態様の１つでは、点変異は１３２位におけるものである（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223を参照されたい）。
【０１２９】
別の態様では、抗体を治療用化合物とカップリングする。別のそのような態様では、化合物は神経性障害薬である。別の態様では、化合物はイメージング剤である。別の態様では、化合物を標識する。別の態様では、抗体を標識する。別の態様では、抗体によってＢＢＢ−Ｒとそのネイティブなリガンドの１つ又は複数との結合は損なわれない。別のそのような態様では、抗体は、ＴｆＲとトランスフェリンの結合が阻害されないようにＴｆＲに特異的に結合する。別の態様では、ＢＢＢは哺乳動物におけるものである。別のそのような態様では、哺乳動物はヒトである。別のそのような態様では、哺乳動物は神経性障害を有する。別のそのような態様では、神経性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、及び外傷性脳損傷からなる群から選択される。別の態様では、ＢＢＢはヒトにおけるものである。
【０１３０】
別の態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒに対するＩＣ５０は約３０ｎＭから約３０μＭまでである。別のそのような態様では、抗体は、化合物とカップリングした場合、ＢＢＢ−Ｒに対して約３０ｎＭから約１μＭまでの親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察される親和性の間の親和性を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体について観察されるＩＣ５０の間のＩＣ５０を有する。一態様では、スキャッチャード解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を測定する。
【０１３１】
別の態様では、抗体の、それが特異的に結合するＢＢＢ−Ｒからの解離半減期は約３０秒から約３０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約１０分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約５分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約３分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約３０秒から約２分までである。別のそのような態様では、解離半減期は約２分である。別のそのような態様では、解離半減期は約１分以下である。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別のそのような態様では、化合物とカップリングした抗体はＴｆＲに特異的に結合し、ＴｆＲに対して、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期と抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲとの結合について観察される解離半減期の間の解離半減期を有する。別の態様では、ＢＩＡＣＯＲＥ解析を使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。別の態様では、競合ＥＬＩＳＡなどの競合結合アッセイを使用して抗ＢＢＢ−Ｒ又は抗ＢＢＢ−Ｒ／化合物のＢＢＢ−Ｒに対する解離半減期を測定する。
【０１３２】
別の態様では、抗体は、選択される抗体の親和性に基づいて抗体のパネルから選択される。別の態様では、抗体を、所望の親和性を有するように操作する。そのような態様の１つでは、抗体を、これだけに限定されないが、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、ランダム変異誘発、及び部位特異的変異誘発を含めた当技術分野で公知のタンパク質工学の方法体系のいずれかを使用して生成する。
【０１３３】
別の態様では、化合物と抗体を共有結合によってカップリングする。そのような態様の１つでは、化合物と抗体をリンカーによってつなげる。そのような態様の１つでは、リンカーは切断可能である。別のそのような態様では、リンカーは切断可能でない。別のそのような態様では、化合物と抗体を直接連結する。そのような態様の１つでは、抗体は多重特異性抗体であり、化合物は多重特異性抗体の一部分を形成する。別のそのような態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。別のそのような態様では、脳抗原は、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａｂｅｔａ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６からなる群から選択される。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＢＡＣＥ１の両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体はＴｆＲとＡｂｅｔａの両方に結合する。別のそのような態様では、多重特異性抗体を標識する。別の態様では、ＢＢＢ輸送と同時に又はその後に化合物が抗体から遊離するように化合物と抗体と可逆的にカップリングする。
【０１３４】
前述の態様はいずれも単独で又は前述の実施態様と組み合わせて適用することができることが理解されよう。
【０１３５】
別の実施態様では、本発明は、神経性障害を治療するための医薬を製造するための、ＢＢＢ−Ｒに低親和性で結合し、及び赤血球レベルを低下させない抗体の使用を提供する。前述の任意の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又は本明細書の他の箇所に記載の任意の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を当該方法において使用することができる。
【０１３６】
別の実施態様では、本発明は、神経性障害の治療において使用するための、ＢＢＢ−Ｒに低親和性で結合し、及び赤血球レベルを低下させない抗体を提供する。前述の任意の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体又は本明細書の他の箇所に記載の任意の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を当該方法において使用することができる。
【０１３７】
別の実施態様では、本発明は、神経性障害薬などの治療用化合物を血液脳関門を通して輸送する方法であって、神経性障害薬とカップリングした抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を血液脳関門に曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした神経性障害薬が血液脳関門を通って輸送することを含み、抗体によって赤血球レベルが低下しない方法を提供する。
【０１３８】
本発明は、さらに、哺乳動物における神経性障害を治療する方法であって、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）と脳抗原の両方に結合する多重特異性抗体を用いて哺乳動物を治療することを含み、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体が、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低く、それにより、抗脳抗原抗体の脳への取り込みが改善され、及び抗体を投与することによって赤血球レベルが低下しないように選択されたものである方法を提供する。
【０１３９】
本発明は、さらに、対象における赤血球レベルの上昇に関連する又はそれによって引き起こされる疾患又は障害を治療する方法であって、少なくとも部分的なエフェクター機能を有する抗ＴｆＲ抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。一態様では、投与する工程は、抗体投与の急性臨床症状が最小限になるように調整した用量及び／又は投薬頻度で行われる。
【０１４０】
本発明の前述の方法及び組成物はいずれも、互いと及び／又は本明細書に記載の本発明の別の態様と組み合わせることができることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】実施例１に記載の通り、抗トランスフェリン受容体（「ＴｆＲ」）バリアント及び抗ＴｆＲ／ベータ−セクレターゼ（「ＢＡＣＥ１」）バリアントのＴｆＲに対する親和性、並びにマウスにおける投与後の抗体及びＡβ１−４０の濃度を評価した実験の結果を示すグラフである。競合ＥＬＩＳＡアッセイ結果により、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１バリアントと抗ＴｆＲバリアントがＴｆＲに対して異なる親和性を有することが示されている。
【図１Ｂ−Ｅ】実施例１に記載の通り、抗トランスフェリン受容体（「ＴｆＲ」）バリアント及び抗ＴｆＲ／ベータ−セクレターゼ（「ＢＡＣＥ１」）バリアントのＴｆＲに対する親和性、並びにマウスにおける投与後の抗体及びＡβ１−４０の濃度を評価した実験の結果を示すグラフである。図１Ｂ及び図１Ｄは、それぞれ、コントロールＩｇＧ、抗ＢＡＣＥ１、又は抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１バリアントを５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した後の野生型マウスにおける平均の血漿中抗体濃度及び脳内抗体濃度を示す（群当たりｎ＝６）。図１Ｃ及び図１Ｅは、それぞれ、注射した抗体の活性のマーカーとして、同じ処置をしたマウスにおけるＡβ１−４０の血漿中濃度及び脳内濃度を示す。
【図２Ａ】骨髄における赤血球（ＲＢＣ）成熟化の概略図であり、前赤芽球（Ｐｒｏ−ＥＢ）から好塩基性赤芽球（Ｂａｓｏ−ＥＢ）、多染赤芽球（Ｐｏｌｙ−ＥＢ）、正染性赤芽球（Ｏｒｔｈｏ−ＥＢ）、そして最終的に網状赤血球への進行が示されている。網状赤血球は骨髄から循環中に放出され、そこで成熟してＲＢＣになる。骨髄における成熟化の後期に、赤血球前駆体により鉄含有タンパク質であるヘモグロビンが合成され、これには同時にＴｆＲ発現が増加することが必要である。トランスフェリン受容体は、細胞が網状赤血球の段階を通って成熟するにつれ、ヘモグロビン合成の休止及び細胞増殖とともに減り、その結果、成熟ＲＢＣではＴｆＲは発現されない。ＲＢＣ成熟化の各細胞の段階に存在するＴｆＲの相対数が図の上部のグラフに示されており、これはIacpettaら、Biochim. Biophys. Acta 687: 204-210 (1982)からのデータに基づく。
【図２Ｂ−Ｃ】実施例２Ａに記載の通りマウスにおいて抗ＴｆＲ投与及び抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１投与の網状赤血球に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。図２Ｂは、静脈内投与した抗ＴｆＲＤ、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１又はコントロールＩｇＧの、投与の１時間後の野生型マウスの全血由来の未成熟の網状赤血球の画分のパーセントに対する影響を試験した実験の結果を示す（群当たりｎ＝６）。図２Ｃは、静脈内投与した抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１又はコントロールＩｇＧの、投薬の２４時間後又は７日後の野生型マウスの全血中の総網状赤血球数に対する影響を試験した実験の結果を示す（群当たりｎ＝６）。全てのデータが平均±ＳＥＭとして示されている。
【図２Ｄ−Ｅ】コントロールＩｇＧを５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射、又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（図２Ｄ）又は抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１（図２Ｅ）を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで注射した後の野生型マウスにおける平均脳内Ａｂｅｔａ１−４０濃度を示すグラフである（群当たりｎ＝６）。
【図２Ｆ】抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の薬物動態を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでコントロールと比較して評価した実験の結果を示すグラフである。図２Ｆは、示されている時点における脳内抗体濃度の測定値を提供する。
【図２Ｇ−Ｈ】抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の薬物動態を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでコントロールと比較して評価した実験の結果を示すグラフである。図２Ｆは、示されている時点における脳内抗体濃度の測定値を提供する。図２Ｇは、示されている時点における血漿中抗体濃度の測定値を提供する。図２Ｈは、示されている時点における血漿中Ａｂｅｔａレベルの測定値を提供する。
【図３Ａ−Ｂ】実施例２Ｂに記載の通り、種々の抗ＴｆＲ抗体による網状赤血球枯渇に対するエフェクター機能の排除の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。抗体を示されている用量で静脈内注射した２４時間後の野生型マウス（図３Ａ）、Ｆｃγ−／−（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆｃｅｒ１ｇｔｍ１Ｒａｖ  Ｎ１２）マウス（図３Ｂ）由来の全血中の総網状赤血球数が、コントロールＩｇＧと比較して示されている（群当たりｎ＝６）。
【図３Ｃ−Ｄ】実施例２Ｂに記載の通り、種々の抗ＴｆＲ抗体による網状赤血球枯渇に対するエフェクター機能の排除（図３Ｃ）又は補体機能の排除（図３Ｄ）の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。抗体を示されている用量で静脈内注射した２４時間後の野生型マウス（図３Ｃ）、Ｃ３−／−マウス（図３Ｄ）由来の全血中の総網状赤血球数が、コントロールＩｇＧと比較して示されている（群当たりｎ＝６）
【図３Ｅ】実施例２Ｂに記載の通り、種々の抗ＴｆＲ抗体による網状赤血球枯渇に対する補体機能の排除の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。以前に観察された抗ＴｆＲによる網状赤血球の枯渇に対する補体系の欠陥の影響を評価した実験の結果を示す。野生型又はＣ３ノックアウトマウスにコントロールＩｇＧ又は抗ＴｆＲＤ／コントロールＩｇＧ混合物を５０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した（群当たりｎ＝６）。
【図４Ａ】実施例２Ｂに記載の通り、マウス赤白血病芽球（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｂｌａｓｔ）において、抗ＴｆＲＡ、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１、又はコントロールＩｇＧによる抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の誘導を種々の抗体濃度で評価したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例２Ｂに記載の通り、マウス赤白血病芽球において、抗ＴｆＲＡ、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１、又はコントロールＩｇＧによる補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の誘導を種々の抗体濃度で評価したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例２Ｃに記載の通り、Ｆｃ結合又はＢＡＣＥ１結合の排除が単一特異性抗ＴｆＲ抗体又は二重特異性抗ＴｆＲ抗体による網状赤血球枯渇に影響を及ぼすかどうかを評価した実験の結果を示すグラフである。示されているＦ（ａｂ’）２若しくはコントロールＩｇＧ（図５Ａ及び図５Ｂ）又は二重特異性抗体（図５Ｃ）を静脈内注射した２４時間後の野生型マウスについての総網状赤血球数が示されている（群当たりｎ＝６）。
【図５Ｂ−Ｃ】実施例２Ｃに記載の通り、Ｆｃ結合又はＢＡＣＥ１結合の排除が単一特異性抗ＴｆＲ抗体又は二重特異性抗ＴｆＲ抗体による網状赤血球枯渇に影響を及ぼすかどうかを評価した実験の結果を示すグラフである。示されているＦ（ａｂ’）２若しくはコントロールＩｇＧ（図５Ａ及び図５Ｂ）又は二重特異性抗体（図５Ｃ）を静脈内注射した２４時間後の野生型マウスについての総網状赤血球数が示されている（群当たりｎ＝６）。
【図６】実施例３に記載の通り、ＴｆＲに対する親和性を低下させることの、網状赤血球枯渇及び脳内ＴｆＲ発現に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。図６Ａ及び図６Ｂは、示されている抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１バリアント抗体を静脈内注射した２４時間後の野生型マウスにおける総網状赤血球数をコントロールＩｇＧと比較して示す。図６Ｃは、コントロールＩｇＧ、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１、又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を示されている用量で静脈内注射した４日後の全マウス脳溶解物からの、ウエスタンブロットによる脳内ＴｆＲ発現レベルの数量化を示す（群当たりｎ＝３）。ＴｆＲ発現の数量化はアクチンに対して正規化されており、データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図７】実施例４に記載の通り、ＴｆＲ抗体による処置が血液脳関門浸透性に影響を及ぼすかどうかを評価した実験の結果を示すグラフである。野生型マウスにコントロールＩｇＧを５０ｍｇ／ｋｇで、又は同時注射する抗体の組合せのそれぞれを２５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。静脈内注射した２４時間後の平均の脳内への抗体の取り込みを、一般的なヒト−ＦｃＥＬＩＳＡ（図７Ａ）又はＢＡＣＥ１−外部ドメインＥＬＩＳＡ（図７Ｂ）を使用して測定した。図７Ｃは、コントロールＩｇＧの静脈内注射又は抗体の同時注射後のマウス脳におけるＡβ１−４０濃度の数量化を示す（群当たりｎ＝６）。
【図８Ａ−Ｄ】実施例５に記載の通り、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の複数回投薬の、処置されたマウスにおける網状赤血球レベルに対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。野生型マウスに、２５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を週１回、静脈内投薬した。図８Ａ及び図８Ｂは、それぞれ、抗体を２回又は４回投薬した２４時間後、４日後及び７日後の時点で観察された血漿中抗体濃度及び脳内抗体濃度を示す。図８ＡのＹ軸の目盛りはμＭ単位であるが図８ＢのＹ軸の目盛りはｎＭ単位であることに留意するべきである。対応する血漿中平均Ａβ１−４０濃度（図８Ｃ）及び脳内平均Ａβ１−４０濃度（図８Ｄ）も測定した。
【図８Ｅ−Ｆ】実施例５に記載の通り、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の複数回投薬の、処置されたマウスにおける網状赤血球レベルに対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。野生型マウスに、２５ｍｇ／ｋｇのコントロールＩｇＧ又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を週１回、静脈内投薬した。図８Ｅは、コントロールＩｇＧ又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の２回目の投薬の２４時間後、４回目の投薬の２４時間後、及び４回目の投薬の７日後のマウスにおける総網状赤血球数を示す。図８Ｆは、コントロールＩｇＧ又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を週に１回、４回投薬した後の全マウス脳溶解物からのウエスタンブロットによる脳内ＴｆＲ発現レベルの数量化の結果を示すグラフを示す。ＴｆＲ発現の数量化はアクチンに対して正規化されており、データは平均±ＳＥＭとして示されている。
【図９Ａ−Ｂ】マウスにおいて、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の血液中及び骨髄中の赤血球亜集団に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。血液（図９Ａ）及び骨髄（図９Ｂ）のどちらにおいてもＴｅｒ１１９陽性赤血球系列の別個の集団はそれらのＴｆＲ発現によって、及びフローサイトメトリーを使用した細胞サイズ（前方散乱プロファイルによって決定）によって区別される（Panigaら、PLoS One 6、9 (2011)）。骨髄中のＴｅｒ１１９陽性細胞サブセットを、ＥｒｙＡ＝大きな、ＴｆＲ陽性の初期好塩基性赤芽球、ＥｒｙＢ＝小さな、ＴｆＲ陽性の多染赤芽球、及びＥｒｙＣ＝ＴｆＲ陰性の成熟赤血球と定義した。
【図９Ｃ−Ｄ】マウスにおいて、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の血液中及び骨髄中の赤血球亜集団に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を投薬した後の血液中の総Ｔｅｒ１１９陽性赤血球集団（網状赤血球及び赤血球；９Ｃ）及びＴｆＲ陽性網状赤血球（９Ｄ）の時間経過をコントロールＩｇＧと比較して示す（群当たりｎ＝６）
【図１０Ａ−Ｂ】マウスにおいて、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の血液中及び骨髄中の赤血球亜集団に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１又はコントロールＩｇＧを投薬した後の骨髄中の別個の赤血球亜集団（ＥｒｙＡ、ＥｒｙＢ、ＥｒｙＣ）の数量化に関するグラフを提供する（群当たりｎ＝６）。
【図１０Ｃ−Ｄ】マウスにおいて、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の血液中及び骨髄中の赤血球亜集団に対する影響を評価した実験の結果を示すグラフである。抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１又はコントロールＩｇＧを投薬した後の骨髄中の別個の赤血球亜集団（ＥｒｙＡ、ＥｒｙＢ、ＥｒｙＣ）の数量化に関するグラフを提供する（群当たりｎ＝６）。
【図１１】マウスにおいて血液中及び骨髄中の赤血球集団に対する抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の親和性及びエフェクター機能の影響を分析した実験の結果を示すグラフである。エフェクターを欠く抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）及び抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）、エフェクター機能が完全な抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）、又はコントロールＩｇＧを投薬した後の血液中の総Ｔｅｒ１１９陽性赤血球集団（図１１Ａ）及びＴｆＲ陽性網状赤血球集団（図１１Ｂ）の数量化を示す（群当たりｎ＝６）。
【図１２】マウスにおいて血液中及び骨髄中の赤血球集団に対する抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体の親和性及びエフェクター機能の影響を分析した実験の結果を示すグラフである。エフェクターを欠く抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）及び抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）、エフェクター機能が完全な抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）を投薬した後、又はコントロールＩｇＧを投薬した後の骨髄中の別個の赤血球亜集団（総Ｔｅｒ１１９陽性赤血球系列、図１２Ａ；ＥｒｙＡ、図１２Ｂ；ＥｒｙＢ、図１２Ｃ、及びＥｒｙＣ、図１２Ｄ）の数量化を提供する（群当たりｎ＝６）。
【図１３Ａ】実施例７に記載の通り、ヒト赤芽球細胞株又は初代ヒト骨髄単核細胞において抗ヒトＴｆＲ（「抗ｈＴＦＲ」）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】実施例７に記載の通り、ヒト赤芽球細胞株又は初代ヒト骨髄単核細胞において抗ヒトＴｆＲ（「抗ｈＴＦＲ」）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。
【図１４Ａ】実施例７に記載の通り、ヒト赤芽球細胞株又は初代ヒト骨髄単核細胞において抗ヒトＴｆＲ（「抗ｈＴＦＲ」）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。
【図１４Ｂ】実施例７に記載の通り、ヒト赤芽球細胞株又は初代ヒト骨髄単核細胞において抗ヒトＴｆＲ（「抗ｈＴＦＲ」）抗体のＡＤＣＣ活性に対するエフェクター機能の状態の影響を評価した実験の結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】天然の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＹＷ４１２．８から得た抗ＢＡＣＥ１クローンＹＷ４１２．８の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す図である。可変軽（ＶＬ）配列アラインメント（配列番号１−６）を示す。各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域で示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｈ１を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｌ２を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｌ３を示す。
【図１５Ｂ】天然の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＹＷ４１２．８から得た抗ＢＡＣＥ１クローンＹＷ４１２．８の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す図である。可変重（ＶＨ）配列アラインメント（配列番号７−８）を示す。各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域で示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｈ１を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｈ２を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｈ３を示す。
【図１６Ａ】合成の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＦａｂ１２から得た抗ＢＡＣＥ１抗体クローンＦａｂ１２の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す図である。軽鎖の配列アラインメント（配列番号９−１２）を示す。各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域によって示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｌ１を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｌ２を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｌ３を示す。
【図１６Ｂ】合成の多様性ファージディスプレイライブラリーのナイーブな選別及び親和性成熟した形態のＦａｂ１２から得た抗ＢＡＣＥ１抗体クローンＦａｂ１２の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を示す図である。重鎖の配列アラインメント（配列番号１３）を示す。各クローンのＨＶＲ配列が枠で囲まれた領域によって示されており、最初の枠はＨＶＲ−Ｈ１を示し、２番目の枠はＨＶＲ−Ｈ２を示し、３番目の枠はＨＶＲ−Ｈ３を示す。
【図１７】例示的な抗Ａｂｅｔａ抗体の重鎖（図１７Ａ；配列番号１４）及び軽鎖（図１７Ｂ；配列番号１５）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１４２】
Ｉ．定義
「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」とは、脳毛細血管内皮原形質膜内の密着結合によって形成される、末梢循環と脳及び脊髄（すなわち、ＣＮＳ）の間の生理的関門を指し、これにより、分子の脳への輸送を、尿素（６０ダルトン）などの非常に小さい分子でさえも制限する関門が創出される。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液−脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門はＣＮＳ内の連続した毛細血管関門であり、本明細書では、集合的に血液脳関門又はＢＢＢと称される。ＢＢＢは、関門が毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞で構成される血液−ＣＳＦ関門（脈絡嚢）も含む。
【０１４３】
「中枢神経系」又は「ＣＮＳ」とは、身体の機能を制御する神経組織の複合体を指し、脳及び脊髄を含む。
【０１４４】
「血液脳関門受容体」（本明細書では「ＢＢＢ−Ｒ」と略される）とは、分子を血液脳関門を通して輸送することができる、脳内皮細胞上で発現される膜貫通受容体タンパク質である。ＢＢＢ−Ｒの例としては、これだけに限定されないが、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、これだけに限定することなく、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含めた低密度リポタンパク質受容体、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）並びにヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本発明の例示的なＢＢＢ−Ｒはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。
【０１４５】
「トランスフェリン受容体」（「ＴｆＲ」）とは、脊椎動物において鉄取り込みに関与する、２つのジスルフィド結合したサブユニット（それぞれの見かけの分子量が約９０，０００である）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量が約１８０，０００である）である。一実施態様では、本発明のＴｆＲは、例えば、Schneiderら Nature 311: 675 - 678 (1984)に記載されているアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。
【０１４６】
「神経性障害」とは、本明細書で使用される場合、ＣＮＳに影響を及ぼし、及び／又は病因がＣＮＳにある疾患又は障害を指す。例示的なＣＮＳ疾患又は障害としては、これだけに限定されないが、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、及びリソソーム蓄積症が挙げられる。本出願の目的に関して、ＣＮＳは、通常は血液網膜関門によって体の残りの部分から隔離されている眼を包含するものと理解されよう。神経性障害の特定の例としては、これだけに限定されないが、神経変性疾患（これだけに限定されないが、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性を含む）、タウオパチー（これだけに限定されないが、アルツハイマー病及び核上性麻痺を含む）、プリオン病（これだけに限定されないが、牛海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、クールー病、ゲルストマンシュトロイスラーシャインカー病、慢性消耗性疾患、及び致死性家族性不眠症を含む）、球麻痺、運動ニューロン疾患、及び神経系ヘテロ変性障害（ｈｅｔｅｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（これだけに限定されないが、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス症候群、コケイン症候群、ハレルフォルデンスパッツ症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝レンズ核変性症、レッシュナイハン症候群、及びウンフェルリヒトルントボルク病を含む）、認知症（これだけに限定されないが、ピック病、及び脊髄小脳失調症を含む）、癌（例えば、体内の他の箇所の癌に由来する脳転移を含めたＣＮＳの癌）が挙げられる。
【０１４７】
「神経性障害薬」とは、１種又は複数種の神経性障害を治療する薬物又は治療剤である。本発明の神経性障害薬としては、これだけに限定されないが、抗体、ペプチド、タンパク質、ＣＮＳ標的（一又は複数）の天然のリガンド、ＣＮＳ標的（一又は複数）の天然のリガンドの改変型、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム、及び小分子、又は前述のもののいずれかの活性断片が挙げられる。本発明の例示的な神経性障害薬は、本明細書に記載されており、それらとしては、これだけに限定されないが、例えば、これだけに限定されないが、アミロイド前駆体タンパク質若しくはその一部、アミロイドベータ、ベータ−セクレターゼ、ガンマ−セクレターゼ、ｔａｕ、アルファ−シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、神経膠腫又は他のＣＮＳ癌マーカー、及びニューロトロフィンなどのＣＮＳ抗原又は標的分子それ自体である、又はそれを特異的に認識し、及び／又はそれに作用する（すなわち、それを阻害する、活性化する、又は検出する）抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸及び小分子、並びに、前述のもののいずれかの活性断片が挙げられる。神経性障害薬及びそれらを使用して治療することができる障害の非限定的な例が以下の表１において提供される。
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【０１４８】
「イメージング剤」とは、その存在及び／又は位置を直接的に又は間接的に検出することが可能になるような１つ又は複数の性質を有する化合物である。そのようなイメージング剤の例としては、検出を可能にする標識部分が組み入れられたタンパク質及び小分子化合物が挙げられる。
【０１４９】
「ＣＮＳ抗原」又は「脳抗原」とは、脳を含めたＣＮＳにおいて発現される抗原であり、抗体又は小分子を用いて標的することができる。そのような抗原の例としては、限定することなく、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａｂｅｔａ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ｔａｕ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦＲ１）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１β）、及びカスパーゼ６が挙げられる。一実施態様では、抗原はＢＡＣＥ１である。
【０１５０】
「ＢＡＣＥ１」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含めた任意の脊椎動物を供給源とする任意のネイティブなベータ−セクレターゼ１（β−部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、膜関連アスパラギン酸プロテアーゼ２、メマプシン２、アスパルチルプロテアーゼ２又はＡｓｐ２とも称される）を指す。この用語は、「全長の」プロセシングを受けていないＢＡＣＥ１並びに細胞におけるプロセシングにより生じた任意の形態のＢＡＣＥ１を包含する。この用語は、ＢＡＣＥ１の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なＢＡＣＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、全体が出典明示により本明細書に援用されるVassarら、Science 286: 735-741 (1999)において報告されているヒトＢＡＣＥ１、アイソフォームＡの配列である。ヒトＢＡＣＥ１には、アイソフォームＢ、アイソフォームＣ及びアイソフォームＤを含めたいくつかの他のアイソフォームが存在する。全体が出典明示により本明細書に援用されるUniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817を参照されたい。
【０１５１】
「抗ベータ−セクレターゼ抗体」、「抗ＢＡＣＥ１抗体」、「ベータ−セクレターゼに結合する抗体」及び「ＢＡＣＥ１に結合する抗体」という用語は、ＢＡＣＥ１と十分な親和性で結合することができる抗体を指し、したがって、当該抗体は、ＢＡＣＥ１の標的化における診断剤及び／又は治療剤として有用である。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体と無関係非ＢＡＣＥ１タンパク質の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、抗体とＢＡＣＥ１の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ＢＡＣＥ１に結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍまで、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍまで）である。ある特定の実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は、異なる種及びアイソフォーム由来のＢＡＣＥ１の間で保存されているＢＡＣＥ１のエピトープに結合する。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体ＹＷ４１２．８．３１が結合したＢＡＣＥ１上のエピトープに結合する抗体が提供される。他の実施態様では、ＢＡＣＥ１の触媒ドメインに位置するＢＡＣＥ１内のエキソサイトに結合する抗体が提供される。一実施態様では、全体が出典明示により本明細書に援用されるKornackerら、Biochem. 44: 11567-11573 (2005)において同定されているペプチド（すなわち、ペプチド１、２、３、１−１１、１−１０、１−９、１−８、１−７、１−６、２−１２、３−１２、４−１２、５−１２、６−１２、７−１２、８−１２、９−１２、１０−１２、４、５、６、５−１０、５−９、スクランブル、Ｙ５Ａ、Ｐ６Ａ、Ｙ７Ａ、Ｆ８Ａ、Ｉ９Ａ、Ｐ１０Ａ及びＬ１１Ａ）とＢＡＣＥ１との結合について競合する抗体が提供される。例示的なＢＡＣＥ１抗体の配列が図１５Ａ−Ｂ及び図１６Ａ−Ｂに示されている。本発明の例示的な抗体の１つは、抗体ＹＷ４１２．８．３１の可変ドメインを含む（例えば図１５Ａ−Ｂの場合と同様に）。
【０１５２】
「ネイティブな配列」タンパク質とは、本明細書では、タンパク質の天然に存在するバリアントを含めた、天然に見いだされるタンパク質のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、その天然の供給源から単離された又は組換えによって作製されたタンパク質を包含する。
【０１５３】
「抗体」という用語は、本明細書では最も広範な意味で使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物活性を示す限りは抗体断片を包含する。
【０１５４】
「抗体断片」とは、本明細書では、抗原と結合する能力を保持するインタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例は当技術分野で周知であり（例えば、Nelson、MAbs (2010) 2 (1): 77-83を参照されたい）、それらとしては、これだけに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；これだけに限定されないが単鎖可変性断片（ｓｃＦｖ）を含めた単鎖抗体分子、リンカーを伴う又は伴わない（及び任意選択的にタンデムな）軽鎖及び／又は重鎖抗原結合性ドメインの融合物、並びに抗体断片から形成される単一特異性又は多特異性の抗原結合性分子（これだけに限定されないが、Ｆｃ領域を欠く多数の可変ドメインから構築される多重特異性抗体を含む）が挙げられる。
【０１５５】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体が、モノクローナル抗体の作製の間に生じ得る可能性があるバリアント以外は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合することを指し、そのようなバリアントは一般に微量で存在する。一般には異なる決定因子（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子を対象とする。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られたという抗体の特性を示し、任意の特定の方法によって抗体を作製する必要であると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256: 495 (1975) に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作出されたものであっても、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許４８１６５６７号を参照されたい）によって作出されたものであってもよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら、Nature、352: 624-628 (1991)及びMarksら、J. Mol. Biol.、222: 581-597 (1991)に記載されている技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されたものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体の特定の例としては、その抗原結合性断片を含め、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
【０１５６】
本発明のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、残りの鎖（一又は複数）は、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を包含する（米国特許４８１６５６７号；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81: 6851-6855 (1984)）。対象のキメラ抗体は、本明細書では、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルの又はカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合性配列とヒト定常領域の配列とを含む「霊長類化」抗体（“ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ”  ａｎｄｉｂｏｄｙ）を包含する（米国特許５６９３７８０号）。
【０１５７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小限含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの改変は抗体の性能をさらに高めるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲは、上記のＦＲ置換（一又は複数）以外は全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域、一般にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細に関しては、Jonesら、Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmannら、Nature 332: 323-329 (1988)、及びPresta、Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照されたい。
【０１５８】
「ヒト抗体」とは、本明細書では、ヒトＢ細胞から得られる抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含む抗体であり、ヒト抗体の抗原結合性断片を包含する。そのような抗体は、これだけに限定されないが、免疫化すると内在性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）による産生（例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 2551 (1993)；Jakobovitsら、Nature、362: 255-258 (1993)；Bruggermannら、Year in Immuno.、7: 33 (1993）、及び米国特許５５９１６６９号、同５５８９３６９号及び同５５４５８０７号を参照されたい）；ヒト抗体又はヒト抗体断片を発現しているファージディスプレイライブラリーからの選択（例えば、McCaffertyら、Nature 348: 552-553 (1990)；Johnsonら、Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)；Clacksonら、Nature、352: 624-628 (1991)；Marksら、J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)；Griffithら、EMBO J.12: 725-734 (1993)；米国特許５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照されたい）；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞による生成（米国特許５５６７６１０号及び同５２２９２７５号）、並びにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含めた種々の技法によって同定又は作出することができる。
【０１５９】
「多重特異性抗体」とは、本明細書では、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒと脳抗原の両方に結合することができる。多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。２つ、３つ、又はそれ以上（例えば４つ）の機能的な抗原結合部位を有する、操作された抗体も意図されている（例えば、米国特許出願第２００２／０００４５８７Ａ１号、Millerらを参照されたい）。多重特異性抗体は、全長抗体としても抗体断片としても調製することができる。
【０１６０】
抗体とは、本明細書では、抗原結合性又は生物活性が変更された「アミノ酸配列バリアント」を包含する。そのようなアミノ酸の変更の例としては、抗原に対する親和性が増強された抗体（例えば「親和性成熟」抗体）、及び存在する場合にはＦｃ領域が変更された、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／若しくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が変更された（増加又は減弱した）抗体（例えば、国際公開第００／４２０７２号、Presta, L.及び国際公開第９９／５１６４２号、Iduosogieら）；並びに／又は血清半減期が増加若しくは減弱した抗体（例えば、国際公開第００／４２０７２号、Presta, L.を参照されたい）が挙げられる。
【０１６１】
「親和性改変バリアント」は、親抗体（例えば親のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域又は枠組み残基が、親和性が変更される（増加又は低下する）ように置換されている。そのような置換バリアントを生成するための好都合なやり方ではファージディスプレイを使用する。簡単に述べると、いくつかの超可変領域の部位（例えば６−７部位）を変異させて、各部位における全ての可能性のあるアミノ置換を生成する。このように生成された抗体バリアントが、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合物として一価で提示される。次いで、ファージ提示されたバリアントを、それらの生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変するための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施して、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を同定することができる。その代わりに又はそれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とその標的の接触点を同定することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接する残基が、本明細書で詳述されている技法に従った置換の候補である。そのようなバリアントが生成されたら、さらなる開発のために、バリアントのパネルをスクリーニングに供し、親和性が変更された抗体を選択することができる。
【０１６２】
「ｐＨ感受性抗体バリアント」とは、第１のｐＨにおける標的抗原に対する結合親和性が、異なるｐＨにおけるその標的抗原に対する結合親和性と異なる抗体バリアントである。非限定的な例として、本発明の抗ＴｆＲ抗体は、ＴｆＲに対してｐＨ感受性結合性を有し、したがって、ｐＨ７．４では血漿中の細胞表面ＴｆＲに望ましい低親和性（本明細書に記載の通り）で結合するが、エンドソーム区画内に内部移行すると、比較的低いｐＨ（ｐＨ５．５−６．０）においてＴｆＲから急速に解離するように選択又は操作することができる。そのような解離により、抗体を抗原媒介性クリアランスから保護すること、及びＣＮＳに送達されるか又はＢＢＢを通って再利用される抗体の量を増加させることができ、いずれの場合も、そのようなｐＨ感受性を有さない抗ＴｆＲ抗体と比較して抗体の有効濃度が増加する（例えば、Chaparro-Riggersら J. Biol. Chem. 287 (14): 11090-11097；Igawaら、Nature Biotechnol. 28 (11): 1203-1208を参照されたい）。血清ｐＨにおける親和性とエンドソーム区画ｐＨにおける親和性の所望の組合せは、特定のＢＢＢ−Ｒ及びコンジュゲート化合物について当業者が容易に決定することができる。
【０１６３】
本発明の抗体は、例えば半減期若しくは安定性を増大させるため、又は他の点で抗体を改善するために、「異種分子」とコンジュゲートすることができる。例えば、抗体は、種々の非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体のうちの１つと連結することができる。１つ又は複数のＰＥＧ分子と連結したＦａｂ’などの抗体断片が本発明の例示的な実施態様である。別の例では、異種分子は治療用化合物又は可視化剤（すなわち、検出可能な標識）であり、抗体はそのような異種分子をＢＢＢを通して輸送するために使用される。異種分子の例としては、これだけに限定されないが、化学化合物、ペプチド、ポリマー、脂質、核酸、及びタンパク質が挙げられる。
【０１６４】
本発明の抗体は「グリコシル化バリアント」であってよく、したがって、Ｆｃ領域に結合した炭水化物が存在する場合に、そのいずれかが変更されており、存在するかしないかが改変されているか、又は種類が改変されている。例えば、抗体のＦｃ領域にフコースが結合していない成熟炭水化物構造を有する抗体が米国特許出願第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）に記載されている。米国特許出願第２００４／００９３６２１号（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物内に二分したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が国際公開第２００３／０１１８７８号、Jean-Mairetら及び米国特許６６０２６８４号、Umanaらにおいて参照されている。抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が国際公開第１９９７／３００８７号、Patelらにおいて報告されている。Ｆｃ領域に結合する炭水化物が変更された抗体に関する国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）も参照されたい。グリコシル化が改変されている抗体が記載されている米国特許出願第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）も参照されたい。Ｆｃ領域内のコンセンサスグリコシル化配列（２９７−２９９位のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｘはプロリンではあり得ない）の変異を、例えば、２９８位にＰｒｏを配置させることによって、又は２９９位をＳｅｒ又はＴｈｒ以外の任意のアミノ酸に改変することによってこの配列のＡｓｎを任意の他のアミノ酸に変異させることにより、その位置におけるグリコシル化が抑止されるはずである（例えば、Fares Al-Ejehら、Clin. Cancer Res. (2007) 13: 5519s-5527s；Imperiali及びShannon、Biochemistry (1991) 30 (18): 4374-4380；Katsuri、Biochem J. (1997) 323 (Pt 2): 415-419；Shakin-Eshlemanら、J. Biol. Chem. (1996) 271: 6363-6366を参照されたい）。
【０１６５】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. (1991)）及び／又は「超可変ループ」由来の残基（例えば軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は本明細書において定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１６６】
「全長抗体」とは、抗原結合性可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、ネイティブな配列の定常ドメイン（例えばヒトネイティブな配列の定常ドメイン）であってもそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。
【０１６７】
「ネイキッド抗体（ｎａｋｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、細胞毒性部分、ポリマー、又は放射標識などの異種分子とコンジュゲートしていない抗体である（本明細書において定義されている）。
【０１６８】
抗体の「エフェクター機能」とは、補体経路の活性化以外の免疫系の活性化をもたらす抗体の生物活性を指す。そのような活性は、主に抗体のＦｃ領域（ネイティブな配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列バリアントのＦｃ領域）において見いだされる。抗体のエフェクター機能の例としては、例えば、Ｆｃ受容体結合性及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が挙げられる。一実施態様では、本発明の抗体は、基本的にエフェクター機能を欠く。別の実施態様では、本発明の抗体は最小限のエフェクター機能を保持する。エフェクター機能を改変又は排除する方法は当技術分野で周知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、エフェクター機能に関与するＦｃ領域の全部又は一部を排除すること（すなわち、抗体又は抗体断片を、例えば、これだけに限定されないが、本明細書に記載されており当技術分野で公知のＦａｂ断片、単鎖抗体などのＦｃ領域の全部又は一部を欠く形式で使用すること）；Ｆｃ領域を１つ又は複数のアミノ酸位で改変してエフェクター機能を排除すること（Ｆｃ結合に影響する：２３８位、２３９位、２４８位、２４９位、２５２位、２５４位、２６５位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７８位、２８９位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、３０１位、３０３位、３２２位、３２４位、３２７位、３２９位、３３３位、３３５位、３３８位、３４０位、３７３位、３７６位、３８２位、３８８位、３８９位、４１４位、４１６位、４１９位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位、及び４３９位）、並びに、抗体のグリコシル化を改変すること（これだけに限定されないが、抗体を野生型哺乳動物グリコシル化が可能にならない環境で作製すること、すでにグリコシル化された抗体から１つ又は複数の炭水化物基を除去すること、及び抗体を１つ又は複数のアミノ酸位で改変して抗体がその位置でグリコシル化される能力を排除すること（これだけに限定されないが、Ｎ２９７Ｇ及びＮ２９７Ａを含む）を含む）が挙げられる。
【０１６９】
抗体の「補体活性化」機能、又は「補体経路の活性化」を可能にする若しくは誘発する抗体の性質とは、互換的に使用され、対象における免疫系の補体経路を伴う又は刺激する抗体の生物活性を指す。そのような活性としては、例えば、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が挙げられ、これは、抗体のＦｃ部分と非Ｆｃ部分のどちらによっても媒介され得る。補体活性化機能を改変又は排除する方法は当技術分野で周知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、補体活性化に関与するＦｃ領域の全部又は一部を排除すること（すなわち、抗体又は抗体断片を、例えば、これだけに限定されないが、本明細書に記載され当技術分野で公知のＦａｂ断片、単鎖抗体などのＦｃ領域の全部若しくは一部を欠く形式で使用すること、又はＦｃ領域を、１つ若しくは複数のアミノ酸位、例えば、Ｃ１ｑ結合に関与することが公知の２７０位、３２２位、３２９位及び３２１位などで改変して補体構成成分との相互作用若しくは補体構成成分を活性化する能力を排除する若しくは減らすこと）、及び補体活性化に関与する非Ｆｃ領域の一部を改変又は排除すること（すなわち、１３２位でＣＨ１領域を改変することが挙げられる（例えば、Vidarteら、(2001) J. Biol. Chem. 276 (41): 38217-38223）を参照されたい）。
【０１７０】
全長抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なる「クラス」に割り当てることができる。全長抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、このうちのいくつかは「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元の立体配置は周知である。
【０１７１】
「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞によって発現される抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体又はその抗原結合性断片）を指す。組換え抗体を産生させるための「宿主細胞」の例としては、（１）哺乳動物の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、Ｈｅｌａ細胞及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）に属する植物（例えばタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母細胞（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する酵母細胞（例えばクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））；（５）細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などが挙げられる。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合すること（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ）」とは、抗体が抗原に選択的に又は優先的に結合することを指す。結合親和性は、一般に、スキャッチャード解析、又は表面プラズモン共鳴技法（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する）などの標準のアッセイを使用して決定される。
【０１７３】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、参照抗体とその抗原の結合を競合アッセイにおいて５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体はその抗体とその抗原の結合を競合アッセイにおいて５０％以上遮断する。一実施態様では、抗ＢＡＣＥ１抗体は、ＹＷ４１２．８．３１が結合するＢＡＣＥ１エピトープに結合する。
【０１７４】
「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞機能を阻害若しくは防止し、及び／又は細胞死若しくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤としては、これだけに限定されないが、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤又は化学療法薬（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びその断片；抗生物質；その断片及び／又はバリアントを含めた、細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素などの毒素が挙げられる。
【０１７５】
作用剤、例えば医薬製剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を実現するために必要な投与量で、所望の治療的又は予防的結果を実現するために必要な期間にわたって有効な量を指す。
【０１７６】
「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及びバリアントのＦｃ領域を包含する。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までにわたる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）は存在していてもしていなくてもよい。別段の指定がない限り、本明細書では、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1991に記載されている、ＥＵ指標とも称されるＥＵ番号付け系に従う。
【０１７７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）内の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【０１７８】
「免疫コンジュゲート」とは、これだけに限定されないが、標識又は細胞傷害性薬剤を含めた１種又は複数種の異種分子（一又は複数）とコンジュゲートした抗体である。任意選択的に、そのようなコンジュゲーションはリンカーを介したものである。
【０１７９】
「リンカー」とは、本明細書で使用される場合、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体と異種分子を共有結合によって、又は非共有結合によって接続する構造である。ある特定の実施態様では、リンカーはペプチドである。他の実施態様では、リンカーは化学的リンカーである。
【０１８０】
「標識」とは、本発明の抗体とカップリングした、検出又はイメージングのために使用されるマーカーである。そのような標識の例としては、放射標識、フルオロフォア、発色団、又はアフィニティータグが挙げられる。一実施態様では、標識は、医用画像用に使用される放射標識、例えばｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしてもとしても公知である）用のスピンラベル、例えば、上記と同様にヨウ素−１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、鉄などである。
【０１８１】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サルなど）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【０１８２】
「単離された」抗体とは、その天然の環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動的方法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィーによる方法（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定して９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度を評価するための方法についての総説に関しては、例えば、Flatmanら、J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007)を参照されたい。
【０１８３】
「添付文書」という用語は、治療用製品の商用包装に習慣的に含まれ、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含有する説明書を指すために使用される。
【０１８４】
「医薬製剤」という用語は、含有される活性成分の生物活性が有効になることが可能になるような形態であり、製剤を投与する対象に対して許容できないほど毒性である追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。
【０１８５】
「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中の、対象に対して非毒性である、活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、これだけに限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が挙げられる。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法上の変形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など）とは、治療されている個体の自然経過を改変する試みにおける臨床的介入を指し、これは予防のためにも臨床的病態の過程中にも実施することができる。治療の望ましい効果としては、これだけに限定されないが、疾患の出現又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的影響の減弱、転移の予防、疾患の進行の速度の低下、病態の好転又は一時的緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。一部の実施態様では、本発明の抗体を使用して、疾患の発生を遅延させる又は疾患の進行を遅くする。
【０１８７】
ＩＩ．組成物及び方法
Ａ．抗ＢＢＢ−Ｒ抗体及びそのコンジュゲートの作製
本発明の方法及び製造品では、ＢＢＢ−Ｒに結合する抗体を使用する又は組み入れる。抗体の作製又はスクリーニングのために使用するＢＢＢ−Ｒ抗原は、例えば、所望のエピトープを含有するＢＢＢ−Ｒの可溶性の形態又はその一部（例えば細胞外ドメイン）であってよい。その代わりに又はそれに加えて、細胞表面においてＢＢＢ−Ｒを発現している細胞を使用して抗体を生成又はスクリーニングすることができる。抗体を生成するために有用なＢＢＢ−Ｒ他の形態及び提示は、当業者には明らかになるであろう。本発明のＢＢＢ−Ｒの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及びＬＲＰ８など、グルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）及びヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。
【０１８８】
本発明によると、「低親和性」の抗ＢＢＢ−Ｒ（例えば抗ＴｆＲ）抗体は、そのような抗体がＣＮＳ（例えば、脳）取り込みの改善を示すことが実証される本発明のデータに基づいて選択される。そのような低親和性抗体を同定するために、これだけに限定することなく、スキャッチャードアッセイ及び表面プラズモン共鳴技法（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する）を含めた、抗体の親和性を測定するための種々のアッセイが利用可能である。本発明の一実施態様によると、抗体は、ＢＢＢ−Ｒ抗原（例えばＴｆＲ）に対して、約５ｎＭ、又は約２０ｎＭ、又は約１００ｎＭから約、約５０μＭ、又は約３０μＭ、又は約１０μＭ、又は約１μＭ、又は約５００ｎＭまでの親和性を有する。したがって、親和性は、例えばスキャッチャード解析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定して、約５ｎＭ−約５０μＭの範囲、又は約２０ｎＭ−約３０μＭの範囲、又は約３０ｎＭ−約３０μＭの範囲、又は約５０ｎＭ−約１μＭの範囲、又は約１００ｎＭ−約５００ｎＭの範囲であってよい。本発明の別の実施態様では、抗体のＢＢＢ−Ｒ抗原（例えばＴｆＲ）からの解離半減期は、競合結合分析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定して、１分未満、２分未満、３分未満、４分未満、５分未満、又は１０分未満から約２０分まで、又は約３０分までである。
【０１８９】
したがって、本発明は、神経性障害薬を血液脳関門を通して輸送するために有用な抗体を作出する方法であって、抗体を、血液脳関門受容体（ＢＢＢ−Ｒ）に対する抗体のパネルから、約５ｎＭから約、又は約２０ｎＭから約、又は約１００ｎＭから、約５０μＭまで、又は約３０μＭまで、又は約１０μＭまで、又は約１μＭまで、又は約５００ｍＭまでの範囲のＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有することを理由に選択することを含む方法を提供する。したがって、親和性は、例えばスキャッチャード解析又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）によって測定して約５ｎＭ−約５０μＭの範囲、又は約２０ｎＭ−約３０μＭの範囲、又は約３０ｎＭ−約３０μＭの範囲、又は約５０ｎＭ−約１μＭの範囲、又は約１００ｎＭ−約５００ｎＭの範囲であってよい。当業者には理解される通り、異種分子／化合物を抗体とコンジュゲートすることにより、多くの場合、抗体のその標的に対する親和性が、例えば、立体的な障害、さらには、抗体が抗体の元の標的とは異なる抗原に結合する１つ又は複数の腕を有して多特異性になっている場合には１つの結合性腕が排除されることに起因して低下する。一実施態様では、ＢＡＣＥ１とコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体のＴｆＲに対するＫｄは、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定して約３０ｎＭであった。別の実施態様では、ＢＡＣＥ１とコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体のＴｆＲに対するＫｄは、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定して約６００ｎＭであった。別の実施態様では、ＢＡＣＥ１とコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体のＴｆＲに対するＫｄは、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定して約２０μＭであった。別の実施態様では、ＢＡＣＥ１とコンジュゲートしたＴｆＲに特異的な本発明の低親和性抗体のＴｆＲに対するＫｄは、ＢＩＡＣＯＲＥによって測定して約３０μＭであった。
【０１９０】
抗体の親和性を評価するための１つの例示的なアッセイは、スキャッチャード解析によるものである。例えば、対象の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を、ラクトペルオキシダーゼ法を使用してヨウ素化することができる（Bennett及びHoruk、Methods in Enzymology 288 p.134-148 (1997)）。放射標識した抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を、ＮＡＰ−５カラムを使用したゲル濾過によって遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製し、その特異的活性を測定する。固定濃度のヨウ素化抗体及び漸減濃度の段階的に希釈した標識されていない抗体を含有する競合反応混合物５０μＬを９６ウェルプレートに入れる。ＢＢＢ−Ｒを一過性に発現している細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１×ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からなる成長培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養する。Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して細胞をディッシュから分離し、結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、及び０．２％アジ化ナトリウムを伴うＤＭＥＭ）で洗浄する。洗浄した細胞を、おおよその密度を結合緩衝液０．２ｍＬ中細胞２００，０００個として５０μＬの競合反応混合物を含有する９６ウェルプレートに加える。細胞を伴う競合反応物中の標識されていない抗体の最終濃度は、変動させ、１０００ｎＭで開始し、次いで、１：２倍希釈によって低下させて、添加ゼロ、緩衝液のみの試料を含めて１０種の濃度にする。各濃度の標識されていない抗体について、細胞を伴う競合反応物を３連でアッセイする。細胞を伴う競合反応物を室温で２時間インキュベートする。２時間インキュベートした後、競合反応物をフィルタープレートに移し、結合緩衝液を用いて４回洗浄して、結合したヨウ素化抗体を分離する。フィルターをガンマカウンターによって計数し、Munson及びRodbard (1980)のあてはめアルゴリズムを使用して結合データを評価し、結合抗体の親和性を決定する。
【０１９１】
本発明の組成物を使用した例示的なスキャッチャード解析は以下の通り実施することができる。抗ＴＦＲＡを、ラクトペルオキシダーゼ法を使用してヨウ素化した（Bennett及びHoruk、Methods in Enzymology 288 p.134-148 (1997)）。放射標識した抗ＴＦＲＡを、ＮＡＰ−５カラムを使用したゲル濾過によって遊離１２５Ｉ−Ｎａから精製し、精製された抗ＴＦＲＡの特異的活性は１９．８２ｍＣｉ／μｇであった。固定濃度のヨウ素化抗体及び漸減濃度の段階的に希釈した標識されていない抗体を含有する競合反応混合物５０μＬを９６ウェルプレートに入れた。マウスＴｆＲを一過性に発現している２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１×ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からなる成長培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して細胞をディッシュから分離し、結合緩衝液（１％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、及び０．２％アジ化ナトリウムを伴うＤＭＥＭ）で洗浄した。洗浄した細胞を、おおよその密度を結合緩衝液０．２ｍＬ中細胞２００，０００個として５０μＬの競合反応混合物を含有する９６ウェルプレートに加えた。細胞を伴う競合反応物それぞれのヨウ素化抗体の最終濃度は１００ｐＭ（０．２５ｍＬ当たり１３４，０００ｃｐｍ）であった。細胞を伴う競合反応物中の標識されていない抗体の最終濃度は、変動させ、１０００ｎＭで開始し、次いで、１：２倍希釈によって低下させて、添加ゼロ、緩衝液のみの試料を含めて１０種の濃度にした。各濃度の標識されていない抗体について、細胞を伴う競合反応物を３連でアッセイした。細胞を伴う競合反応物を室温で２時間インキュベートした。２時間インキュベートした後、競合反応物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎフィルタープレートに移し、結合緩衝液を用いて４回洗浄して、結合したヨウ素化抗体を分離した。フィルターをＷａｌｌａｃ  Ｗｉｚａｒｄ１４７０ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で計数した。Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ（１９８０）のあてはめアルゴリズムを使用するＮｅｗ  Ｌｉｇａｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用して結合データを評価して、結合抗体の親和性を決定した。
【０１９２】
本発明の組成物を使用した例示的なＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）解析は以下の通り実施することができる。Ｋｄを、２５℃、抗ヒトＦｃキット（ＢｉＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定した。簡単に述べると、カルボキシメチル化されたデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を供給者の説明書に従って用いて活性化した。抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で５０μｇ／ｍｌに希釈した後に、毎分５μｌの流速で注入して、およそ１００００応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得た。抗体を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して反応していない群を遮断した。カイネティクスを測定するために、単一特異性又は多特異性の抗ＴｆＲ抗体バリアントをＨＢＳ−Ｐに注入して約２２０ＲＵに到達させ、次いで、ＭｕＴｆＲ−Ｈｉｓの２倍段階希釈物（０．６１ｎＭ−１５７ｎＭ）を２５℃、毎分およそ３０μｌの流速でＨＢＳ−Ｐに注入した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にあてはめることによって算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chenら、J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)を参照されたい。
【０１９３】
別の実施態様によると、Ｋｄを、２５℃で、抗ヒトＦｃキット（ＢｉＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００デバイス（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いた表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化されたデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を供給者の説明書に従って用いて活性化する。抗ヒトＦｃ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で５０μｇ／ｍｌに希釈した後、毎分５μｌの流速で注入しておよそ１００００応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗体を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、反応していない群を遮断する。カイネティクスを測定するために、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体バリアントをＨＢＳ−Ｐに注入して約２２０ＲＵに到達させ、次いで、ＢＢＢ−Ｒ−Ｈｉｓの２倍段階希釈物（０．６１ｎＭ−１５７ｎＭ）を２５℃、毎分およそ３０μｌの流速でＨＢＳ−Ｐに注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用し、会合及び解離センサーグラムを同時にあてはめることによって算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chenら、J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)を参照されたい。
【０１９４】
１つ又は複数の抗体のＢＢＢ−Ｒに対する親和性についての代替の測定値は、公知のＢＢＢ−ＲリガンドとＢＢＢ−Ｒの結合を５０％阻害するために抗体がどのくらい必要であるかの尺度である半数阻害濃度（ＩＣ５０）である。所与の化合物についてのＩＣ５０を決定するいくつかの方法は当技術分野で公知であり、一般的な手法は、本明細書の実施例、すなわち図１Ａに関して記載されているものなどの競合結合アッセイを実施することである。一般に、ＩＣ５０が高いことにより、公知のリガンドの結合を阻害するために必要な抗体がより多いこと、したがって、そのリガンドに対する抗体の親和性が比較的低いことが示される。逆に、ＩＣ５０が低いことにより、公知のリガンドの結合を阻害するために必要な抗体がより少ないこと、したがって、そのリガンドに対する抗体の親和性が比較的高いことが示される。
【０１９５】
ＩＣ５０を測定するための例示的な競合ＥＬＩＳＡアッセイは、漸増濃度の抗ＴｆＲ又は抗ＴｆＲ／脳抗原（すなわち、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａなど）バリアント抗体を使用して、ビオチン化ＴｆＲＡとＴｆＲとの結合について競合させるものである。抗ＴｆＲ競合ＥＬＩＳＡを、２．５μｇ／ｍｌのＰＢＳ中精製マウスＴｆＲ細胞外ドメインでコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．Ｊ．）において４℃で一晩実施した。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）を使用してブロッキングした。各抗ＴｆＲ又は抗ＴｆＲ／脳抗原（すなわち、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲ／Ａｂｅｔａ）の滴定物（１：３段階希釈物）をビオチン化抗ＴｆＲＡ（最終濃度０．５ｎＭ）と合わせ、プレートに加えて室温で１時間置いた。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用してプレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲＡを検出した。
【０１９６】
一実施態様では、標識及び／又は神経性障害薬若しくはイメージング剤をＢＢＢを通してより効率的に輸送するために、本発明の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を標識及び／又は薬物若しくはイメージング剤とカップリングする。そのようなカップリングは、化学的架橋剤によって、又は融合タンパク質を生成することによってなどで実現することができる。
【０１９７】
共有結合性コンジュゲーションは、直接的なものであってもリンカーを介したものであってもよい。ある特定の実施態様では、直接コンジュゲーションはタンパク質融合物の構築によるもの（すなわち、ＢＢＢ−Ｒ抗体及び神経性障害薬をコードする２つの遺伝子を遺伝子融合し、単一のタンパク質として発現させることによるもの）である。ある特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の２つの部分のうちの一方の上の反応性基と神経薬上の対応する基又はアクセプターの間の共有結合の形成によるものである。ある特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、コンジュゲートする２つの分子のうちの一方を、コンジュゲートする他方の分子と適切な条件下で共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含むように改変（すなわち、遺伝子改変）することによるものである。非限定的な一例として、所望の反応性基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）を、例えば、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体に導入し、神経薬とジスルフィド結合を形成させることができる。核酸とタンパク質の共有結合性コンジュゲーションの方法も当技術分野で公知である（すなわち、光架橋（ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）、例えば、Zatsepinら Russ. Chem. Rev. 74: 77-95 (2005)を参照されたい）。非共有結合性コンジュゲーションは、当業者には容易に理解される疎水性結合、イオン結合、静電気的な相互作用などを含めた任意の非共有結合手段によるものであってよい。コンジュゲーションは種々のリンカーを使用して実施することもできる。例えば、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体と神経薬は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸−スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸（例えば、トルエン２，６−ジイソシアン酸など）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などを使用してコンジュゲートすることができる。ペプチド結合によってつながった１−２０個のアミノ酸で構成されるペプチドリンカーも使用することができる。特定のそのような実施態様では、アミノ酸は、２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される。ある特定の他のそのような実施態様では、アミノ酸の１つ又は複数は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。リンカーは、脳に送達された際の神経薬の遊離を容易にする「切断可能なリンカー」であってよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chariら、Cancer Res. 52: 127-131 (1992)；米国特許５２０８０２０号）を使用することができる。
【０１９８】
本発明は、これだけに限定されないが、これだけに限定されないが、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）を含めた架橋試薬を用いて調製したコンジュゲートを明白に意図している。
【０１９９】
ニューロパチー障害に対しては、これだけに限定されないが、麻薬／オピオイド鎮痛薬（すなわち、モルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、メペリジン、メサドン、オキシモルフォン、ペンタゾシン、プロポキシフェン、トラマドール、コデイン及びオキシコドン）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（すなわち、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、及びトルメチン）、コルチコステロイド（すなわち、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン及びトリアムシノロン）、抗片頭痛剤（すなわち、スマトリプチン、アルモトリプタン、フロバトリプタン、スマトリプタン、リザトリプタン、エレトリプタン、ゾルミトリプタン、ジヒドロエルゴタミン、エレトリプタン及びエルゴタミン）、アセトアミノフェン、サリチル酸塩（すなわち、アスピリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、ジフルニサル、及びサルサレート）、抗痙攣薬（すなわち、カルバマゼピン、クロナゼパム、ガバペンチン、ラモトリジン、プレガバリン、チアガビン、及びトピラマート）、麻酔薬（すなわち、イソフルラン、トリクロロエチレン、ハロタン、セボフルラン、ベンゾカイン、クロロプロカイン、コカイン、シクロメチカイン、ジメトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、ノボカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アルチカイン、ブピバカイン、カルチカイン、シンコカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、ピペロカイン、プリロカイン、ロピバカイン、トリメカイン、サキシトキシン及びテトロドドキシン）、及びｃｏｘ−２阻害剤（すなわち、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びバルデコキシブ）を含めた、鎮痛薬である神経薬を選択することができる。眩暈を伴うニューロパチー障害に対しては、これだけに限定されないが、メクリジン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン及びジアゼパムを含めた、抗眩暈剤である神経薬を選択することができる。悪心を伴うニューロパチー障害に対しては、これだけに限定されないが、プロメタジン、クロルプロマジン、プロクロルペラジン、トリメトベンズアミド、及びメトクロプラミドを含めた、制吐剤である神経薬を選択することができる。神経変性疾患に対しては、成長ホルモン又は神経栄養因子である神経薬を選択することができ、例として、これだけに限定されないが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−４／５、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２及び他のＦＧＦ、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＦＲ）、顆粒球−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン−１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミッドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）が挙げられる。
【０２００】
癌に対しては、化学療法剤である神経薬を選択することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチルオロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）を含む）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン合成類似体、カルゼレシン合成類似体及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマＩＩ及びカリチアマイシンオメガＩＩなど（例えば、Agnew, Chem Intl. Engl.編、33: 183-186 (1994)を参照されたい）；ジネミシンＡを含めたジネミシン；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏ）−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎ホルモン（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充物、例えば、フォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド、例えば、マイタンシン及びアンサマイトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジン；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、クレモホールを含まない、アルブミンで操作したパクリタキセルのナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ    Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸など；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；薬学的に許容される塩、上記のいずれかの酸又は誘導体；並びに上記の２つ以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、及びオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせて用いる治療レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどが挙げられる。
【０２０１】
癌の成長を促進し得るホルモンの影響を調節する、低下させる、遮断する、又は阻害するように作用する抗ホルモン剤も化学療法剤のこの定義に包含され、これらは、多くの場合、全身治療（ｓｙｓｔｅｍｉｃ，  ｏｒ  ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の形態である。抗ホルモン剤はホルモン自体であってよい。例として、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含めた抗エストロゲン剤及び選択的なエストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体下方制御因子（ＥＲＤ）；卵巣を抑制する又は活動停止させるように機能する作用剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプトレリンなど；他の抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなど、並びに副腎におけるエストロゲン産生を調節する、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなどが挙げられる。さらに、そのような化学療法剤の定義は、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、又はＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネートなど；並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係づけられるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ジトシル酸ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６としても公知のＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）、及び薬学的に許容される塩、上記のいずれかの酸又は誘導体を包含する。
【０２０２】
癌を治療又は予防するための神経薬として選択することができる化合物の別の群は、抗癌免疫グロブリン（これだけに限定されないが、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、パニツムマブ及びリツキシマブを含む）である。いくつかの場合には、これだけに限定されないが、トシツモマブと１３１Ｉ放射標識、又はトラスツズマブエムタンシンを含めた、抗体と毒性標識の組み合わせ又はコンジュゲートを使用して、所望の細胞（すなわち、癌細胞）を標的化し、死滅させることができる。
【０２０３】
眼の疾患又は障害に対しては、眼科抗血管新生薬（すなわち、ベバシズマブ、ラニビズマブ及びペガプタニブ）、眼科緑内障薬（すなわち、カルバコール、エピネフリン、臭化デメカリウム、アプラクロニジン、ブリモニジン、ブリンゾラミド、レボブノロール、チモロール、ベタキソロール、ドルゾラミド、ビマトプロスト、カルテオロール、メチプラノロール、ジピベフリン、トラボプロスト及びラタノプロスト）、炭酸脱水素酵素阻害剤（すなわち、メタゾラミド及びアセタゾラミド）、眼科抗ヒスタミン薬（すなわち、ナファゾリン、フェニレフリン及びテトラヒドロゾリン）、眼科潤滑剤、眼科ステロイド（すなわち、フルオロメトロン、プレドニゾロン、ロテプレドノール、デキサメタゾン、ジフルプレドナート、リメキソロン、フルオシノロン、メドリゾン及びトリアムシノロン）、眼科麻酔薬（すなわち、リドカイン、プロパラカイン及びテトラカイン）、眼科抗感染薬（すなわち、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、シプロフロキサシン、モキシフロキサシン、クロラムフェニコール、バシトラシン／ポリミキシンｂ、スルファセタミド、トブラマイシン、アジスロマイシン、ベシフロキサシン、ノルフロキサシン、スルフイソキサゾール、ゲンタマイシン、イドクスウリジン、エリスロマイシン、ナタマイシン、グラミシジン、ネオマイシン、オフロキサシン、トリフルリジン、ガンシクロビル、ビダラビン）、眼科抗炎症薬（すなわち、ネパフェナク、ケトロラク、フルルビプロフェン、スプロフェン、シクロスポリン、トリアムシノロン、ジクロフェナク及びブロムフェナク）、並びに眼科抗ヒスタミン薬又は充血除去薬（すなわち、ケトチフェン、オロパタジン、エピナスチン、ナファゾリン、クロモリン、テトラヒドロゾリン、ペミロラスト、ベポタスチン、ナファゾリン、フェニレフリン、ネドクロミル、ロドキサミド、フェニレフリン、エメダスチン及びアゼラスチン）である神経薬を選択することができる。
【０２０４】
発作性障害に対しては、これだけに限定されないが、バルビツール酸系抗痙攣薬（すなわち、プリミドン、メタルビタール、メホバルビタール、アロバルビタール、アモバルビタール、アプロバルビタール、アルフェナール、バルビタール、ブラロバルビタール及びフェノバルビタール）、ベンゾジアゼピン系抗痙攣薬（すなわち、ジアゼパム、クロナゼパム、及びロラゼパム）、カルバミン酸抗痙攣薬（すなわち、フェルバメート）、炭酸脱水素酵素阻害剤である抗痙攣薬（すなわち、アセタゾラミド、トピラマート及びゾニサミド）、ジベンザゼピン抗痙攣薬（すなわち、ルフィナマイド、カルバマゼピン、及びオクスカルバゼピン）、脂肪酸誘導体である抗痙攣薬（すなわち、ジバルプロエクス及びバルプロ酸）、ガンマアミノ酪酸類似体（すなわち、プレガバリン、ガバペンチン及びビガバトリン）、ガンマアミノ酪酸再取り込み阻害薬（すなわち、チアガビン）、ガンマアミノ酪酸トランスアミナーゼ阻害剤（すなわち、ビガバトリン）、ヒダントイン抗痙攣薬（すなわち、フェニトイン、エトトイン、ホスフェニトイン及びメフェニトイン）、種々雑多な抗痙攣薬（すなわち、ラコサミド及び硫酸マグネシウム）、プロゲスチン（すなわち、プロゲステロン）、オキサゾリジンジオン抗痙攣薬（すなわち、パラメタジオン及びトリメタジオン）、ピロリジン抗痙攣薬（すなわち、レベチラセタム）、スクシンイミド 抗痙攣薬（すなわち、エトスクシミド及びメトスクシミド）、トリアジン抗痙攣薬（すなわち、ラモトリジン）、及び尿素抗痙攣薬（すなわち、フェナセミド及びフェネトライド）を含めた、抗痙攣薬又は抗てんかん薬である神経薬を選択することができる。
【０２０５】
リソソーム蓄積症に対しては、それ自体が、当該疾患で損なわれる酵素である、又はそうでなければその酵素の活性を模倣する神経薬を選択することができる。リソソーム蓄積症を治療するための例示的な組換え酵素としては、これだけに限定されないが、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４２１４１号に記載されているもの（すなわち、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−スルファターゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−スルファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＢ、ベータグルクロニダーゼ、酸性アルファ−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ベータ−ガラクトセレブロシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、アスパルトアシラーゼ、パルミトイル−タンパク質チオエステラーゼ１及びトリペプチジルアミノペプチダーゼ１）が挙げられる。
【０２０６】
アミロイドーシスに対しては、これだけに限定されないが、ベータセクレターゼ、ｔａｕ、プレセニリン、アミロイド前駆体タンパク質又はその一部、アミロイドベータペプチド又はそのオリゴマー又は原線維、細胞死受容体６（ＤＲ６）、終末糖化産物（ＲＡＧＥ）の受容体、パーキン、及びハンチンチンから選択される標的に特異的に結合する抗体又は他の結合性分子（これだけに限定されないが、小分子、ペプチド、アプタマー、又は他の結合性タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｅｒ）を含む）；コリンエステラーゼ阻害剤（すなわち、ガランタミン、ドネペジル、リバスチグミン及びタクリン）；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（すなわち、メマンチン）、モノアミン枯渇薬（すなわち、テトラベナジン）；メシル酸エルゴロイド；抗コリン作用薬である抗パーキンソン薬（すなわち、プロシクリジン、ジフェンヒドラミン、トリヘキシルフェニジル（ｔｒｉｈｅｘｙｌｐｈｅｎｉｄｙｌ）、ベンズトロピン、ビペリデン及びトリヘキシフェニジル）；ドーパミン作動性抗パーキンソン薬（すなわち、エンタカポン、セレギリン、プラミペキソール、ブロモクリプチン、ロチゴチン、セレギリン、ロピニロール、ラサギリン、アポモルヒネ、カルビドパ、レボドパ、ペルゴリド、トルカポン及びアマンタジン）；テトラベナジン；抗炎症薬（これだけに限定されないが、非ステロイド性抗炎症薬（すなわち、インドメタシン及び上に列挙されている他の化合物を含む）；ホルモン（すなわち、エストロゲン、プロゲステロン及びロイプロリド）；ビタミン（すなわち、葉酸及びニコチンアミド）；ジメボリン（ｄｉｍｅｂｏｌｉｎ）；ホモタウリン（すなわち、３−アミノプロパンスルホン酸；３ＡＰＳ）；セロトニン受容体の活性モジュレーター（すなわち、キサリプロデン）；インターフェロン、並びにグルココルチコイドを含む神経薬を選択することができる。
【０２０７】
ウイルス性疾患又は微生物性疾患に対しては、これだけに限定されないが、抗ウイルス化合物（これだけに限定されないが、アダマンタン抗ウイルス薬（すなわち、リマンタジン及びアマンタジンを含む）、抗ウイルスインターフェロン（すなわち、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（すなわち、マラビロク）、インテグラーゼ鎖転移阻害剤（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（すなわち、ラルテグラビル）、ノイラミニダーゼ阻害剤（すなわち、オセルタミビル及びザナミビル）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（すなわち、エファビレンツ、エトラビリン、デラビルジン及びネビラピン）、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（テノホビル、アバカビル、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、エンテカビル、エムトリシタビン、アデホビル、ザルシタビン、テルビブジン及びジダノシン）、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ダルナビル、アタザナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル及びサクイナビル）、プリンヌクレオシド（すなわち、バラシクロビル、ファムシクロビル、アシクロビル、リバビリン、ガンシクロビル、バルガンシクロビル及びシドホビル）、及び種々雑多な抗ウイルス薬（すなわち、エンフビルチド、ホスカルネット、パリビズマブ及びホミビルセン））、抗生物質（これだけに限定されないが、アミノペニシリン系抗生物質（すなわち、アモキシシリン、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロサキシリン、フルクロキサシリイン、テモシリン、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン、ピペラリシン及びバカンピシリン）、セファロスポリン系抗生物質（すなわち、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロル、及びセフォキシチン）、カルバペネム／ペネム系抗生物質（すなわち、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム及びドリペネム）、モノバクタム系抗生物質（すなわち、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンＡ及びタブトキシニン−ベータ−ラクタム、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤（すなわち、クラブラン酸、タゾバクタム及びスルバクタム）と別のベータ−ラクタム系抗生物質の組合せ、アミノグリコシド系抗生物質（すなわち、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、及びパロモマイシン）、アンサマイシン系抗生物質（すなわち、ゲルダナマイシン及びハービマイシン）、カルバセフェム系抗生物質（すなわち、ロラカルベフ）、グリコペプチド系抗生物質（すなわち、テイコプラニン及びバンコマイシン）、マクロライド系抗生物質（すなわち、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン及びスペクチノマイシン）、モノバクタム系抗生物質（すなわち、アズトレオナム）、キノロン系抗生物質（すなわち、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン及びテマフロキサシン）、スルホンアミド系抗生物質（すなわち、マフェニド、スルホンアミドクリソイジン（ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｏｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフイソキサゾール、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール）、テトラサイクリン系抗生物質（すなわち、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン及びオキシテトラサイクリン）、抗新生物性又は細胞傷害性抗生物質（すなわち、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ペントスタチン及びバルルビシン）、並びに種々雑多な抗細菌化合物（すなわち、バシトラシン、コリスチン及びポリミキシンＢ））、抗真菌薬（すなわち、メトロニダゾール、ニタゾキサニド、チニダゾール、クロロキン、ヨードキノール及びパロモマイシン）、並びに駆虫薬（これだけに限定されないが、キニーネ、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、スルファドキシン、プログアニル、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アーテミシニン、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、メベンダゾール、パモ酸ピランテル、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、リファンピン、アンホテリシンＢ、メラルソプロール、エフロルニチン及びアルベンダゾールを含む）を含む神経薬を選択することができる。
【０２０８】
虚血に対しては、これだけに限定されないが、血栓溶解薬（すなわち、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ及びテネクテプラーゼ）、血小板凝集阻害剤（すなわち、アスピリン、シロスタゾール、クロピドグレル、プラスグレル及びジピリダモール）、スタチン（すなわち、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及びピタバスタチン）、並びに、例えば、血圧薬を含めた血流又は血管の柔軟性を改善するための化合物を含む神経薬を選択することができる。
【０２０９】
行動障害に対しては、神経薬は、これだけに限定されないが、非定型抗精神病薬（すなわち、リスペリドン、オランザピン、アリピプラゾール、クエチアピン、パリペリドン、アセナピン、クロザピン、イロペリドン及びジプラシドン）、フェノチアジン系抗精神病薬（すなわち、プロクロルペラジン、クロルプロマジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、トリフロペラジン、チオリダジン及びメソリダジン）、チオキサンテン（すなわち、チオチキセン）、種々雑多な抗精神病薬（すなわち、ピモジド、リチウム、モリンドン、ハロペリドール及びロキサピン）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（すなわち、シタロプラム、エスシタロプラム、パロキセチン、フルオキセチン及びセルトラリン）、セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害薬（すなわち、デュロキセチン、ベンラファキシン、デスベンラファキシン、三環系抗うつ薬（すなわち、ドキセピン、クロミプラミン、アモキサピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、トリミプラミン、イミプラミン、プロトリプチリン及びデシプラミン）、四環系抗うつ薬（すなわち、ミルタザピン及びマプロチリン）、フェニルピペラジン系抗うつ薬（すなわち、トラゾドン及びネファゾドン）、モノアミン酸化酵素阻害薬（すなわち、イソカルボキサジド、フェネルジン、セレギリン及びトラニルシプロミン）、ベンゾジアゼピン系薬（すなわち、アルプラゾラム、エスタゾラム、フルラゼパム、クロナゼパム、ロラゼパム及びジアゼパム）、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害薬（すなわち、ブプロピオン）、ＣＮＳ刺激薬（すなわち、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、アンフェタミン、メチルフェニデート、デクスメチルフェニデート、リスデキサンフェタミン、モダフィニル、ペモリン、フェンジメトラジン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン、アルモダフィニル、ジエチルプロピオン、カフェイン、アトモキセチン、ドキサプラム、及びマジンドール）、抗不安薬／鎮静薬／睡眠薬（これだけに限定されないが、バルビツール酸系薬（すなわち、セコバルビタール、フェノバルビタール及びメホバルビタール）を含む）、ベンゾジアゼピン系薬（上記の通り）、及び種々雑多な抗不安薬／鎮静薬／睡眠薬（すなわち、ジフェンヒドラミン、ナトリウムオキシベート、ザレプロン、ヒドロキシジン、抱水クロラール、アルピデム、ブスピロン、ドキセピン、エスゾピクロン、ラメルテオン、メプロバメート及びエトクロルビノール））、セクレチン（例えば、Ratliff−SchaubらAutism 9: 256-265 (2005)を参照されたい）、オピオイドペプチド（例えば、Cowenら、J. Neurochem. 89: 273-285 (2004)を参照されたい）、並びに神経ペプチド（例えば、Hethwaら Am. J. Physiol. 289:E301-305 (2005)を参照されたい）を含めた、挙動改変化合物から選択することができる。
【０２１０】
ＣＮＳ炎症に対しては、炎症自体に対処する神経薬（すなわち、非ステロイド系抗炎症薬、例えば、イブプロフェン又はナプロキセンなど）、又は炎症の根本原因を治療する神経薬（すなわち、抗ウイルス薬又は抗癌薬）を選択することができる。
【０２１１】
本発明の一実施態様によると、「カップリング」は、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を生成することによって実現される。多重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第１の抗原結合部位と、ベータ−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）又はＡｂｅｔａ、及び本明細書に開示されている他の脳抗原などの脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。
【０２１２】
そのような多特異性／二重特異性抗体が結合する例示的な脳抗原はＢＡＣＥ１であり、それに結合する例示的な抗体は本明細書の図９Ａ−ＢのＹＷ４１２．８．３１抗体である。
【０２１３】
別の実施態様では、脳抗原はＡｂｅｔａであり、そのような抗体の例は、明白に出典明示により本明細書に援用される国際公開第２００７０６８４１２号、同第２００８０１１３４８号、同第２００８０１５６６２２号、及び同第２００８１５６６２１号に記載されており、例示的なＡｂｅｔａ抗体は、それぞれ図１１Ａ及び図１１Ｂの重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含むＩｇＧ４  ＭＡＢＴ５１０２Ａ抗体を含む。
【０２１４】
多重特異性抗体を作出するための技法としては、これだけに限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein及びCuello、Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTrauneckerら、EMBO J.10: 3655 (1991)を参照されたい）、並びに「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許５７３１１６８号を参照されたい）が挙げられる。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作出するために静電気的なステアリング作用を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋させること（例えば、米国特許４６７６９８０号、及びBrennanら、Science、229: 81 (1985)を参照されたい）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を作製すること（例えば、Kostelnyら、J. Immunol.、148 (5): 1547-1553 (1992)を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作出するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 6444-6448 (1993)を参照されたい）；並びに単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えばGruberら、J. Immunol.、152: 5368 (1994)を参照されたい）；並びに、例えば、Tuttら J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載の通り三重特異性抗体を調製することによって作出することもできる。
【０２１５】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含めた、機能的な抗原結合部位を３つ以上有する操作された抗体も本発明に包含される（例えば米国特許出願第２００６／００２５５７６Ａ１号、及びWuら Nature Biotechnology (2007)を参照されたい）。
【０２１６】
本発明の抗体又は断片は、ＢＢＢ−Ｒ（例えばＴｆＲ）に結合する抗原結合部位並びに脳抗原（例えばＢＡＣＥ１）に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も包含する（例えば、米国特許出願第２００８／００６９８２０号を参照されたい）。
【０２１７】
一実施態様では、抗体は抗体断片であり、種々のそのような断片は上に開示されている。別の実施態様では、抗体はインタクトな抗体又は全長抗体である。インタクトな抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てることができる。インタクトな抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元の立体配置は周知である。一実施態様では、インタクトな抗体はエフェクター機能を欠く。別の実施態様では、インタクトな抗体はエフェクター機能が低下している。
【０２１８】
抗体を生成するための技法は公知であり、本明細書の上の定義の節において例が提供されている。一実施態様では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体又はその抗原結合性断片である。
【０２１９】
抗体とＢＢＢ−Ｒの結合を決定するための種々の技法が利用可能である。そのようなアッセイの１つは、ヒトＢＢＢ−Ｒ（及び脳抗原）に結合する能力を確認するための酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。このアッセイによると、抗原（例えば組換えＢＢＢ−Ｒ）でコーティングしたプレートを抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を含む試料と一緒にインキュベートし、抗体と対象の抗原の結合を決定する。
【０２２０】
一態様では、本発明の抗体をその抗原結合活性について、例えば、公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによって試験する。
【０２２１】
全身投与された抗体の取り込み及び抗体の他の生物活性を評価するためのアッセイを、実施例に開示されている通り、又は対象の抗ＣＮＳ抗原抗体について公知の通り実施することができる。
【０２２２】
ここで、多重特異性抗体をＢＡＣＥ１に結合させる例示的なアッセイについて記載する。
【０２２３】
競合アッセイを使用して、本明細書に記載の抗ＢＡＣＥ１抗体又はＦａｂのいずれか、例えば、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０とＢＡＣＥ１との結合について競合する抗体を同定することができる。ある特定の実施態様では、そのような競合抗体は、本明細書に記載の抗ＢＡＣＥ１抗体又はＦａｂ、例えば、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０のいずれかが結合するものと同じエピトープに結合する（例えば、直鎖エピトープ（ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ）又は立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ））。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な方法の例はMorris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Method in Molecular Biology 66巻 （Humana Press、Totowa、NJ）において提供される。
【０２２４】
例示的な競合アッセイでは、固定化したＢＡＣＥ１を、ＢＡＣＥ１（例えば、ＹＷ４１２．８、ＹＷ４１２．８．３１、ＹＷ４１２．８．３０、ＹＷ４１２．８．２、ＹＷ４１２．８．２９、ＹＷ４１２．８．５１、Ｆａｂ１２、ＬＣ６、ＬＣ９、ＬＣ１０）に結合する第１の標識された抗体、及び第１の抗体とＢＡＣＥ１との結合について競合する能力に関して試験される第２の標識されていない抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマの上清中に存在してよい。コントロールとして、第１の標識された抗体を含むが第２の標識されていない抗体は含まない溶液中で固定化したＢＡＣＥ１をインキュベートする。第１の抗体がＢＡＣＥ１に結合することが許容される条件下でインキュベートした後、過剰な結合していない抗体を除去し、固定化したＢＡＣＥ１に結びついた標識の量を測定する。固定化したＢＡＣＥ１に結びついた標識の量が、試験試料においてコントロール試料と比較して実質的に低下した場合、これにより、第２の抗体が第１の抗体とＢＡＣＥ１との結合について競合することが示される。Harlow及びLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 14章（Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY）を参照されたい。
【０２２５】
一態様では、生物活性を有する抗ＢＡＣＥ１抗体を同定するアッセイが提供される。生物活性としては、例えば、ＢＡＣＥ１アスパルチルプロテアーゼ活性の阻害を挙げることができる。例えば、合成基質ペプチドを使用した均一時間分解蛍光（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）ＨＴＲＦアッセイ若しくはマイクロ流体キャピラリー電気泳動（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）（ＭＣＥ）アッセイによって、又はＡＰＰなどのＢＡＣＥ１基質を発現する細胞株においてｉｎ  ｖｉｖｏで評価される、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてそのような生物活性を有する抗体も提供される。
【０２２６】
本発明の抗体（多重特異性抗体を含む）は、任意選択的に、その重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞において組換えによって産生される（例えば宿主細胞（一又は複数）が核酸を伴う１つ又は複数のベクターによって形質転換されている）。宿主細胞（一又は複数）は、任意選択的に、哺乳動物の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０２２７】
Ｂ．医薬製剤
本発明に従って使用される抗体の治療用製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16版、Osol, A.編 (1980)）と混合して凍結乾燥製剤又は水溶液の形態にすることにより、保管用に調製される。許容できる担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）など）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含めた単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。
【０２２８】
本発明の製剤は、必要に応じて、任意選択的に、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する２種以上の活性化合物も含有してよい。そのような医薬の種類及び有効量は、例えば、製剤中に存在する抗体の量、及び対象の臨床的パラメータに左右される。そのような医薬の例を以下に考察する。
【０２２９】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によって又は界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに包み、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションにすることもできる。そのような技法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版、Osol, A.編 (1980)に開示されている。１種又は複数種の治療剤を抗ＢＢＢ−Ｒとカップリングしたリポソームに封入することができる（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）。
【０２３０】
持続放出調製物を調製することができる。適切な持続放出調製物の例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、マトリックスは造形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）など、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用する製剤は滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に実現される。
【０２３２】
一実施態様では、製剤は等張性である。
【０２３３】
Ｃ．抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の治療的使用
本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体（それを含む多重特異性抗体を含む）は、種々のｉｎ  ｖｉｖｏ方法において利用することができる。例えば、本発明は、治療用化合物を、赤血球集団に対する影響を低下させる又は排除しながら血液脳関門を通して輸送する方法であって、治療用化合物（例えばＢＢＢ−Ｒと脳抗原の両方に結合する多重特異性抗体）とカップリングした抗ＢＢＢ−Ｒ抗体をＢＢＢに曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした治療用化合物がＢＢＢを通って輸送されることを含む方法を提供する。別の例では、本発明は、神経性障害薬を血液脳関門を通して輸送する方法であって、脳障害薬（例えばＢＢＢ−Ｒと脳抗原の両方に結合する多重特異性抗体）とカップリングした本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体をＢＢＢに曝露し、その結果、抗体により、抗体とカップリングした神経性障害薬がＢＢＢを通って輸送され、赤血球集団に対する影響は低下する又は排除されることを含む方法を提供する。一実施態様では、本発明のＢＢＢは哺乳動物（例えばヒト）、例えば、これだけに限定することなく、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳卒中、認知症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、嚢胞性線維症、アンジェルマン症候群、リドル症候群、パーキンソン病、ピック病、パジェット病、癌、外傷性脳損傷などを含めた神経性障害を有する哺乳動物（例えばヒト）におけるものである。
【０２３４】
一実施態様では、神経性障害は、ニューロパチー、アミロイドーシス、癌（例えばＣＮＳ又は脳に関与する）、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物感染症、炎症（例えばＣＮＳ又は脳の炎症）、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、リソソーム蓄積症などから選択される。
【０２３５】
ニューロパチー障害は、神経シグナル伝達が不適切である若しくは制御されていない、又はそれを欠くことを特徴とする神経系の疾患又は異常であり、それらとして、これだけに限定されないが、慢性疼痛（侵害受容性疼痛を含む）、癌に関連する疼痛を含めた体組織への傷害によって引き起こされる疼痛、神経因性疼痛（神経、脊髄、又は脳における異常によって引き起こされる疼痛）、及び心因性疼痛（完全に又は大部分が心理学的障害に関連する）、頭痛、片頭痛、ニューロパチー、並びに多くの場合そのようなニューロパチー障害に付随する症状及び症候群、例えば、眩暈又は悪心などが挙げられる。
【０２３６】
アミロイドーシスは、これだけに限定されないが、続発性アミロイドーシス、加齢性アミロイドーシス、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）；グアムパーキンソン認知症症候群（Ｇｕａｍ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、脳アミロイド血管症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症；クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症、ＨＩＶ関連認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、及びベータ−アミロイド沈着に関する眼の疾患（すなわち、黄斑変性症、ドルーゼン−関連する視神経症、及び白内障）を含めた、ＣＮＳにおける細胞外へのタンパク質の沈着に関連する疾患及び障害の一群である。
【０２３７】
ＣＮＳの癌は、１つ又は複数のＣＮＳ細胞（すなわち、神経系細胞）の異常な増殖を特徴とし、それらとして、これだけに限定されないが、神経膠腫、多形神経膠芽腫、髄膜腫、星状細胞腫、聴神経腫、軟骨腫、乏枝神経膠腫、髄芽腫、神経節膠腫、神経鞘腫、神経線維腫、神経芽細胞腫、及び硬膜外腫瘍、髄内腫瘍又は硬膜内腫瘍が挙げられる。
【０２３８】
眼の疾患又は障害は、本発明の目的に関して、ＢＢＢによって隔離されたＣＮＳ臓器と考えられる眼の疾患又は障害である。眼の疾患又は障害としては、これだけに限定されないが、強膜、角膜、虹彩及び毛様体の障害（すなわち、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜剥離、雪眼炎、アーク眼、タイゲソン点状表層角膜症、角膜血管新生、フックスジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎及びぶどう膜炎）、水晶体の障害（すなわち、白内障）、脈絡膜及び網膜の障害（すなわち、網膜剥離、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、黄斑変性症（滲出型又は萎縮型）、網膜上膜、網膜色素変性症及び黄斑浮腫）、緑内障、飛蚊症、視神経及び視覚路の障害（すなわち、レーベル遺伝性視神経症及び視神経乳頭ドルーゼン）、眼筋／両眼運動／遠近調節／屈折の障害（すなわち、斜視、眼麻痺、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、遠視、近視、乱視、不同視、老視及び眼筋麻痺）、視覚障害及び視覚消失（すなわち、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、色覚異常（color blindness）、色覚異常（achromatopsia）、夜盲症、視覚消失、河川盲目症及び小眼球症／コロボーマ）、赤目、アーガイル・ロバートソン瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症及び無虹彩症が挙げられる。
【０２３９】
ＣＮＳのウイルス又は微生物感染症としては、これだけに限定されないが、急性又は慢性であり得る髄膜炎、脳炎、脊髄炎、血管炎及び膿瘍を含めたＣＮＳ病態生理を生じる、ウイルス（すなわち、インフルエンザ、ＨＩＶ、ポリオウイルス、風疹）、細菌（すなわち、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）の種、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）の種、及び結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、並びに真菌などの他の微生物（すなわち、酵母、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、寄生生物（すなわち、トキソプラズマ原虫）又はアメーバによる感染症が挙げられるが、これだけに限定されない。
【０２４０】
ＣＮＳの炎症としては、これだけに限定されないが、ＣＮＳへの傷害によって引き起こされる炎症が挙げられ、傷害は、肉体的傷害（すなわち、事故、外科手術、脳外傷、脊髄損傷、脳震盪に起因するもの）及び１つ又は複数の他のＣＮＳの疾患又は障害（すなわち、膿瘍、癌、ウイルス又は微生物感染症）に起因する又はそれに関連する傷害であり得る。
【０２４１】
ＣＮＳの虚血とは、本明細書で使用される場合、脳における異常な血流又は血管の挙動に関する障害の一群又はその原因を指し、それらとして、これだけに限定されないが、限局性脳虚血、広範囲の脳虚血、脳卒中（すなわち、くも膜下出血及び脳内出血）、及び動脈瘤が挙げられる。
【０２４２】
神経変性疾患は、ＣＮＳにおける神経系細胞の機能喪失又は死に関連する疾患及び障害の一群であり、それらとして、これだけに限定されないが、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルパーズ病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、アミロイドーシスによって引き起こされる又はそれに付随する変性、フリードライヒ失調症、前頭側頭葉変性症、ケネディ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、横断性脊髄炎、レフサム病、及び脊髄小脳失調症が挙げられる。
【０２４３】
ＣＮＳの発作疾患及び障害はＣＮＳにおける電気伝導が不適切及び／又は異常であることに関連し、それらとしては、これだけに限定されないが、てんかん（すなわち、欠伸発作、脱力発作、良性ローランドてんかん、小児期欠伸てんかん、間代性発作、複雑部分発作、前頭葉てんかん、熱性痙攣、点頭てんかん、若年性ミオクローヌスてんかん、若年性欠伸てんかん、レンノックスガストー症候群、ランドウクレフナー症候群、ドラベ症候群、大田原症候群、ウエスト症候群、ミオクローヌス発作、ミトコンドリア障害、進行性ミオクローヌスてんかん、心因性発作、反射てんかん、ラスムッセン症候群、単純部分発作、二次性全般発作、側頭葉てんかん、強直間代発作、強直性発作、精神運動発作、辺縁系てんかん、部分発症発作、全般発症発作、てんかん重積状態、腹部てんかん、無動発作、自律神経発作、広範両側性ミオクローヌス、月経随伴性てんかん、失立発作、情動発作、焦点発作、笑い発作、ジャクソンマーチ、ラフォラ病、運動発作、多巣性発作、夜間発作、感光性発作、偽発作、感覚発作、微細発作、シルバン発作、離脱発作、及び視覚反射発作）が挙げられる。
【０２４４】
行動障害は、患っている対象側の挙動が異常であることを特徴とするＣＮＳの障害であり、それらとして、これだけに限定されないが、睡眠障害（すなわち、不眠症、睡眠時随伴症、夜驚症、概日リズム睡眠障害、及びナルコレプシー）、気分障害（すなわち、うつ病、自殺性うつ病、不安、慢性情動障害、恐怖症、パニック発作、強迫性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、慢性疲労症候群、広場恐怖症、心的外傷後ストレス障害、双極性障害）、摂食障害（すなわち、食欲不振又は過食症）、慢性幻覚精神病、発達行動障害（すなわち、自閉症、レット症候群、アスベルガー症候群）、人格障害及び精神病性障害（すなわち、統合失調症、妄想性障害など）が挙げられる。
【０２４５】
リソソーム蓄積症は、いくつかの場合にはＣＮＳに関連する又はＣＮＳに特異的な症状がある代謝障害であり、そのような障害としては、これだけに限定されないが、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ファブリー病、ムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型及びＶＩＩ型）、糖原病、ＧＭ１−ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ファーバー病、カナバン白質ジストロフィー、及び神経セロイドリポフスチン沈着症１型及び２型、ニーマンピック病、ポンペ病、及びクラッベ病が挙げられる。
【０２４６】
別の実施態様では、赤血球の不適切な過剰産生に関連する又はそれによって引き起こされる疾患、又は赤血球の過剰産生が疾患の影響であるような疾患を、本発明で理解される、少なくとも部分的なエフェクター機能を保持する抗ＴｆＲ抗体の網状赤血球枯渇作用によって予防又は治療することができる。例えば、先天性又は新生物性の真性赤血球増加症では、例えば、網状赤血球の過剰増殖に起因して赤血球数が上昇することにより、血液が濃くなり、同時に生理的症状が生じる（d'Onofrioら、Clin. Lab. Haematol. (1996) Suppl. 1:29-34）。少なくとも抗体の部分的なエフェクター機能が保存されている本発明の抗ＴｆＲ抗体を投与することにより、ＣＮＳへの正常なトランスフェリン輸送に影響を及ぼすことなく、未成熟の網状赤血球集団を選択的に除去することが可能になる。そのような抗体の投薬は、当技術分野において十分に理解されている通り、急性臨床症状を最小限にすることができるように調節することができる（すなわち、非常に低用量で又は間隔を広く空けて投薬することによって）。
【０２４７】
一態様では、神経性障害を症状が発症する前に検出するために、及び／又は疾患若しくは障害の重症度若しくは持続時間を評価するために本発明の抗体を使用する。一態様では、抗体により、Ｘ線撮影法、断層撮影法、又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によるイメージングを含めた、神経性障害の検出及び／又はイメージングが可能になる。
【０２４８】
一態様では、医薬として使用するための本発明の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体が提供される。別の態様では、神経性の疾患又は障害（例えば、アルツハイマー病）を、赤血球（すなわち、網状赤血球）を枯渇させることなく治療することにおいて使用するための低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体が提供される。ある特定の実施態様では、本明細書に記載の治療方法において使用するための改変された低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体が提供される。ある特定の実施態様では、本発明は、神経性の疾患又は障害を有する個体を治療する方法であって、個体に有効量の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体（任意選択的に、神経性障害薬とカップリングした）を投与することを含む方法において使用するための安全性が改善されるように改変された低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を提供する。そのような実施態様の１つでは、方法は、個体に少なくとも１種の追加的な治療剤を有効量で投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、神経性の疾患又は障害（例えば、アルツハイマー病）のリスクがある又はそれに罹患している患者におけるアミロイド斑の形成を減少させる又は阻害することにおいて使用するための安全性が改善されるように改変された抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を提供する。上記の実施態様のいずれかによる「個体」は、任意選択的にヒトである。ある特定の態様では、本発明の方法において使用するための本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体により、抗体とカップリングした神経性障害薬の取り込みが改善される。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、本発明の低親和性抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、神経性の疾患又は障害を治療するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、神経性の疾患又は障害を治療する方法であって、神経性の疾患又は障害を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む方法において使用するためのものである。そのような実施態様の１つでは、方法は、個体に少なくとも１種の追加的な治療剤を有効量で投与することをさらに含む。
【０２５０】
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、アルツハイマー病を有する個体に、ＢＡＣＥ１とＴｆＲの両方又はＡｂｅｔａとＴｆＲの両方に結合する本発明の多重特異性抗体を有効量で投与することを含む。そのような実施態様の１つでは、方法は、個体に少なくとも１種の追加的な治療剤を有効量で投与することをさらに含む。上記の実施態様のいずれかによる「個体」はヒトであってよい。
【０２５１】
本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、療法において、単独で、又は他の作用剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、少なくとも１種の追加的な治療剤と同時投与することができる。ある特定の実施態様では、追加的な治療剤は、治療のために使用される抗ＢＢＢ−Ｒ抗体と同じ又は異なる神経性障害を治療するために有効な治療剤である。追加的な治療剤の例としては、これだけに限定されないが、上記の種々の神経薬、コリンエステラーゼ阻害剤（例えば、ドネペジル、ガランラミン、リバスチグミン、及びタクリンなど）、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、メマンチンなど）、アミロイドベータペプチド凝集阻害剤、抗酸化剤、γ−セクレターゼモジュレーター、神経増殖因子（ＮＧＦ）模倣物又はＮＧＦ遺伝子療法薬、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＨＭＳ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（スタチン）、アンパキン、カルシウムチャネル遮断薬、ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、静脈内注射用免疫グロブリン、ムスカリン性受容体アゴニスト、ニコチン受容体モジュレーター、能動的又は受動的アミロイドベータペプチド免疫薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、セロトニン受容体アンタゴニスト及び抗アミロイドベータペプチド抗体が挙げられる。ある特定の実施態様では、少なくとも１種の追加的な治療剤を神経薬の１つ又は複数の副作用を軽減する能力に関して選択する。
【０２５２】
本明細書において例示されている通り、ある特定の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体は、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を用いて治療される対象における網状赤血球集団に負の影響を及ぼす副作用を有し得る。したがって、ある特定の実施態様では、そのような網状赤血球集団に対する負の副作用を軽減する能力に関して選択された少なくとも１種の別の治療剤を本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体と同時投与する。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、赤血球（すなわち、網状赤血球）集団を増加させるための作用剤、赤血球（すなわち、網状赤血球）の成長及び発生を支持するための作用剤、及び赤血球集団を抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の影響から保護するための作用剤が挙げられ、そのような作用剤としては、これだけに限定されないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、鉄補給剤、ビタミンＣ、葉酸、及びビタミンＢ１２、並びに、例えば、同様の血液型の別の個体由来であってもよく、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を投与する対象から予め抽出したものであってもよい同様の細胞を用いて輸血することによる赤血球（すなわち、網状赤血球）の物理的交換が挙げられる。いくつかの場合には、現存する赤血球（すなわち、網状赤血球）を保護することが意図された作用剤は、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体療法の前に又はそれと同時に対象に投与されることが好ましいが、一方、赤血球又は血液細胞集団（すなわち、網状赤血球又は網状赤血球集団）の再成長／発生を支持する又は開始させることが意図された作用剤は、そのような血液細胞を抗ＢＢＢ−Ｒ抗体による治療の後に補給することができるように、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体療法と同時に又はその後に投与されることが好ましいことが当業者には理解されよう。
【０２５３】
ある特定の他のそのような実施態様では、少なくとも１種の別の治療剤を、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体を投与した際の補体経路の活性化を阻害又は防止する能力に関して選択する。そのような治療剤の例としては、これだけに限定されないが、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の補体経路に結合する又はそれを活性化する能力に干渉する作用剤、及び補体経路内の１つ又は複数の分子相互作用を阻害する作用剤が挙げられ、一般に、その内容が出典明示により明白に本明細書に援用されるMollnes及びKirschfink (2006) Molec. Immunol. 43: 107-121に記載されている。
【０２５４】
上記のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別々の製剤中に２種以上の治療剤が含まれる）及び個別投与を包含し、その場合、本発明の抗体の投与は、追加的な治療剤及び／又はアジュバントを投与する前に、それと同時に、及び／又はその後に行われてよい。本発明の抗体は、例えば、これだけに限定されないが、放射線療法、行動療法、又は当技術分野で公知であり、治療又は予防される神経性障害に適した他の療法などの他の介入的療法と組合せて使用することもできる。
【０２５５】
本発明の抗ＢＢＢ−Ｒ抗体（及び任意の追加的な治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに、局所的な治療のために望ましい場合には病巣内投与を含めた任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が挙げられる。投薬は、ある程度は投与が短期であるか又は慢性的であるかに応じて、任意の適切な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものであってよい。これだけに限定されないが、種々の時点にわたる単回投与又は多数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含めた種々の投薬スケジュールが本発明において意図されている。
【０２５６】
本発明の抗体は、適正医療規範に適合するように製剤化され、用量決定され、投与される。この場合の考察の因子としては、特定の治療されている障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医療実践者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、必ずしもではないが、任意選択的に、問題の障害を予防若しくは治療するために、又は抗体投与の１つ又は複数の副作用を予防する、軽減する若しくは好転させるために現在使用されている１つ又は複数の作用剤と一緒に製剤化される。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記の他の因子に左右される。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投与量及び投与経路を用いて、又は本明細書に記載の投与量の約１％から９９％までの投与量で、又は、適切であることが経験的／臨床的に決定される任意の投与量及び任意の経路によって使用される。
【０２５７】
疾患を予防又は治療するために、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、又は１種又は複数種の他の追加的な治療剤と組み合わせて使用する場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するのか治療目的で投与するのか、以前の療法、患者の臨床的病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の自由裁量に左右される。抗体は、１回で又は一連の治療にわたって患者に投与することが適切である。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回又は複数回の別々の投与によるものであっても継続的な注入によるものであっても、患者に投与するための最初の候補投与量は約１μｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体であってよい。１つの典型的な毎日の投与量は、上記の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたり得る。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、一般に、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで治療を持続させる。抗体の投与量の一例は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲になる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ又は複数の用量（又はそれらの任意の組合せ）を患者に投与することができる。そのような用量は、断続的に、例えば１週間ごと又は３週間ごとに投与することができる（例えば、患者が約２用量−約２０用量、又は例えば約６用量の抗体を受けることになるように）。最初に高負荷用量、続いて１つ又は複数のより低い用量を投与することができる。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。抗ＴｆＲ抗体を投与することによる網状赤血球集団に対する影響を減少させるための１つの方法は、投薬の量又はタイミングを、網状赤血球と相互作用する、血流中に存在する循環している抗体の分量が全体的に低くなるように改変することであることが理解されよう。非限定的な一例では、低用量の抗ＴｆＲ抗体を、高用量の場合よりも高い頻度で投与することができる。使用される投与量は、ＣＮＳに送達することが必要な抗体の量（それ自体が抗体のＣＮＳ抗原特異的部分の親和性に関連する）、その抗体のＴｆＲに対する親和性、並びに、赤血球（すなわち、網状赤血球）を保護する化合物（一又は複数）、成長及び発生を刺激する化合物（一又は複数）、又は補体経路を阻害する化合物（一又は複数）を抗体と一緒に又は段階的に投与するかどうかの間で平衡させることができる。この療法の進行は、本明細書に記載され当技術分野で公知の従来の技法及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２５８】
上記の製剤又は治療方法はいずれも、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明の免疫コンジュゲートを使用して行うことができることが理解される。
【０２５９】
Ｄ．製造品
本発明の別の態様では、上記の障害を治療、予防及び／又は診断するために有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ用溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されていてよい。容器には、組成物が単独で又は状態を治療、予防及び／又は診断するために有効な別の組成物と組み合わせて保持されており、及び滅菌アクセスポートがあってよい（例えば、容器は、皮下注射針で穴をあけることができる静脈内注射用溶液バッグ又は止め栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書には、組成物が選択された状態の治療に使用するためのものであることが示されている。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が含有される第１の容器と、（ｂ）別の細胞傷害性剤又は他の点での治療剤を含む組成物が含有される第２の容器とを含んでよい。本発明のこの実施態様では、製造品は、組成物を、特定の状態の治療に使用することができることが示された添付文書をさらに含んでよい。その代わりに又はそれに加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びブドウ糖溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに含んでよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めた商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでよい。
【０２６０】
上記の製造品はいずれも、抗ＢＢＢ−Ｒ抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明の免疫コンジュゲートを含んでよいことが理解される。
【０２６１】
製造品は、任意選択的に、対象における神経性障害を治療するための説明書を伴う添付文書をさらに含み、説明書には、本明細書に開示されている抗体を用いた治療により神経性障害が治療されることが示されており、及び任意選択的に、抗体のＢＢＢを通る取り込みが、ＢＢＢ−Ｒに対するその親和性が低いことに起因して改善されていることが示されている。
【実施例】
【０２６２】
実施例１
低親和性抗ＴｆＲ抗体の生成及び特徴付け
この分野では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の、トランスフェリンを血液脳関門（ＢＢＢ）を通して輸送する天然の能力を活用して、異種分子を血流から脳内に輸送することができることが理解されている（例えば、国際公開第９５０２４２１号を参照されたい）。出願人らは、この系に対する重要な改変、すなわち、抗トランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ）とコンジュゲートした異種分子の脳内への輸送及び脳内での保持が、特定の範囲内で抗ＴｆＲのトランスフェリン受容体に対する親和性を低下させることによって実質的に増強されることを以前に開発した（Sci. Transl. Med. 3、84ra43 (2011)）。
【０２６３】
マウスＴｆＲに対する親和性を次第に低下させた抗ＴｆＲ抗体のパネルを生成し、そのうちの３つ（抗ＴｆＲＡ、抗ＴｆＲＤ、及び抗ＴｆＲＥと称される）を、ＢＡＣＥ１に特異的な他の抗体腕を用いて二重特異性形式にさらに改変した。単一特異性抗体及び二重特異性抗体をそれぞれ、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてマウスＴｆＲに対するその親和性について評価した。簡単に述べると、アッセイを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの、ヘキサヒスチジンタグを用いてタグを付けた精製ｍｕＴｆＲ（ｍｕＴｆＲ−Ｈｉｓ）でコーティングしたｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．  Ｊ）において、４℃で一晩実施した。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）を使用してブロッキングした。１：３の段階的に力価を決定した二価ＩｇＧ（抗ＴｆＲＡ、抗ＴｆＲＤ、抗ＴｆＲＥ）又は二重特異性Ａｂ（抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１、又は抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１）を１ｎＭのビオチン化抗ＴｆＲＡと合わせ、プレートに加え、室温で１時間置いた。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用してプレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲＡを検出した（図１Ａ）。アッセイにおいて単一特異性抗体又は二重特異性抗体それぞれとマウスＴｆＲの結合について観察されたＩＣ５０値が表２に示されている。
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【０２６４】
マウスにおける単回投与後の抗体の分配を以下の通り実施した。全ての試験に６〜８週齢の野生型雌Ｃ５７Ｂ／６マウスを使用した。動物の世話は施設のガイドラインに従った。マウスに、コントロールＩｇＧ、抗ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１バリアントのいずれかを５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。総注射体積は２５０μＬを越えず、必要な場合には抗体をＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した。示されている時間の後、マウスにおいてＤ−ＰＢＳを毎分２ｍＬの速度で用いて８分間灌流を行った。脳を抽出し、皮質及び海馬を単離し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳ中１％ＮＰ−４０（Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）中にホモジナイズした。ホモジナイズした脳試料を４℃で１時間回転させた後に、１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させた。脳抗体を測定するために上清を単離した。全血を採取した後に、ＥＤＴＡ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に灌流し、室温で３０分静置し、５０００×ｇで１０分、遠心沈澱を行った。抗体及びマウスＡβ１−４０を測定するために血漿の上層を新しいチューブに移した。
【０２６５】
マウスの血漿試料中及び脳試料中の全抗体濃度を、抗ｈｕＦｃ／抗ｈｕＦｃ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＮＵＮＣ  ３８４−ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮＪ）を、Ｆｃ断片特異的ポリクローナル抗体であるロバ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡを用いて２５℃で１時間ブロッキングした。各抗体（コントロールＩｇＧ、抗ＢＡＣＥ１、及び抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１二重特異性バリアント）をそれぞれの抗体濃度を数量化するための標準物質として使用した。プレートを、マイクロプレートウォッシャー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、標準物質及び試料を、０．５％ＢＳＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に希釈し、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、２５℃で２時間置いた。結合した抗体を、Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体である、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して試料を展開し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）で４５０ｎｍにおける吸収を測定した。４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して標準曲線から濃度を決定した。アッセイの数量化の下限（ＬＬＯＱ）値は血清では３．１２ｎｇ／ｍｌであり、脳では１２．８１ｎｇ／ｇであった。実験群間の差異の統計解析を、対応のない両側ｔ検定を使用して実施した。
【０２６６】
結果が図１Ｂ及び図１Ｄに示されている。コントロールＩｇＧと抗ＢＡＣＥ１抗体のどちらも、１０日間の測定期間にわたって持続した脳への取り込みは限定されたものであったが、それらの血漿中濃度は、経時的な段階的クリアランスにもかかわらず、全ての時点において、試験した分子のいずれよりも高かった。評価した３種の抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１バリアントの中で、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の両方で、投薬後１日目に脳において３５ｎＭから４０ｎＭまでの濃度が示された（コントロールＩｇＧよりも７−８倍高い；図１Ｄ）。しかし、脳内の抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１の濃度は２日目の後に急速に低下し、６日目までにコントロールレベルに戻った。抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１は抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１よりも長く脳内に存続し、脳内濃度はよりゆるやかに低下したが、１０日目までに、濃度はコントロールの濃度と一致した。抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１ははるかに穏やかに脳に進入したが（コントロールの２−３倍）、その後の数日にわたる低下は他の２種の抗体バリアントの低下よりもかなり低かった。３種の抗体バリアント全ての血漿中レベルが経時的に低下した（図１Ｂ）。抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１は４日目までに血漿から完全になくなったが、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１は１０日目までに十分になくなり、抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１は、血漿中にコントロールＩｇＧ又は抗ＢＡＣＥ１のレベルに匹敵するレベルでなお存続した。
【０２６７】
総合すると、これらの所見は、使用した抗体のうち親和性が最も高いもの（抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１）が最も急速に脳からなくなり、使用した抗体のうち親和性が最も低いもの（抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１）が最も長く脳内に存続したので、抗体のＴＦＲに対する親和性を低下させることにより脳におけるその保持が実際に改善されるという以前の発見と一致した。しかし、脳内に経時的に輸送された抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の総量は、脳内に経時的に輸送された抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１の総量をはるかに超え、これにより、ＢＢＢを通した輸送と脳内での存続の両方を最大にするためには抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１の親和性が最適であることが示唆されることもデータから明らかであった。
【０２６８】
脳内に及び血漿中に輸送された分子の存在及び存続は、潜在的な有効性の尺度の１つにすぎず、それらの区画内の分子の活性がさらに興味深い。したがって、両方の区画内のＢＡＣＥ１酵素活性を、Ａβ１−４０（アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対するＢＡＣＥ１酵素活性による切断の副生成物）の量を測定することによって評価した。簡単に述べると、上記の通り野生型マウスにおいて抗体による処置及び灌流を実施した。Ａβ１−４０測定値については、半脳（ｈｅｍｉ−ｂｒａｉｎ）を５Ｍの塩酸グアニジン緩衝液中にホモジナイズし、試料を室温で３時間回転させた後に、新鮮に添加したアプロチニン（２０ｍｇ／ｍＬ）及びロイペプチン（１０ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ中０．２５％カゼイン、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に希釈した（１：１０）。希釈したホモジネートを１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させ、Ａβ１−４０を測定するために上清を単離した。血漿を上記の通り調製した。血漿中及び脳内の総マウスＡβ１−４０の濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、上記のものと同様の手順に従って決定した。Ａβ１−４０測定用の半脳を１％ＮＰ−４０（Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）中にホモジナイズし、室温で１時間回転させた後に、１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させた。Ａβ１−４０のＣ末端に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）をプレート上にコーティングし、ビオチン化抗マウスＡβモノクローナル抗体Ｍ３．２（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）を検出のために使用した。アッセイのＬＬＯＱ値は、血漿では１．９６ｐｇ／ｍｌであり、脳では３９．１ｐｇ／ｇであった。実験群間の差異の統計解析を、対応のない両側ｔ検定を使用して実施した。
【０２６９】
血漿及び脳についての結果がそれぞれ図１Ｃ及び図１Ｅに示されており、これは、示されている時間において各区画内に存在する抗体の量と一致する（図１Ｂ及び図１Ｄを参照されたい）。重要なことに、脳において経時的に観察されたＡβ１−４０の量は、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスにおいて最長の期間にわたって最低であった。
【０２７０】
実施例２Ａ
抗ＴｆＲ投薬の網状赤血球に対する影響
予想外に、マウスを単一特異性の抗ＴｆＲＡ又は抗ＴｆＲＤで処置すると、１ｍｇ／ｋｇ以上の全ての用量レベルで、二重特異性の抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスでは観察されなかった普通でない急性の臨床徴候が観察された（表３参照）。
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特に、単一特異性で処置したマウスでは、処置の５分以内に投薬後嗜眠が示され、マウスは動かなくなり、反応しなくなり（いくつかの動物では時々、痙攣性の動きがあった）、その後、投薬の２０−２５分後までにだらしなく、体を丸めた外観が生じた。そのような観察された影響は処置後数時間のうちに消滅した。ある特定の単一特異性抗体で処置したマウスでは、時々の血尿、並びに投与の１時間後に末端心臓血液採取が二重特異性で処置した動物からの採取と比較して難しかったことに基づいて、明らかな低血圧があると思われた。マウスの未成熟の赤血球では末梢血流中に存在するためにＴｆＲが発現されることが公知であり（図２Ａ参照）、マウスにおいて観察された影響は、そのような血液細胞が傷害を受けたとすると説明することができるので、マウスにおいて未成熟の赤血球（網状赤血球）に対する抗体による処置の影響を調査した。
【０２７１】
マウスに、実施例１に記載のものと同じ手順を使用して、抗ＴｆＲＤ又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した、又はコントロールＩｇＧを５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射し、投与の１時間後に全血試料を取得し、カリウム−ＥＤＴＡを含有する採取管に入れた。これらの血液試料に関して、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＴ２０００ｉＶ（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）を製造者の説明書に従って使用して赤血球及び網状赤血球の数及び指標を決定した。簡単に述べると、Ｓｙｓｍｅｘにより、総網状赤血球並びに未成熟の網状赤血球の画分（蛍光が高い及び中央／中間の網状赤血球の合計）を、蛍光ポリメチン色素を使用して細胞内ＲＮＡと結合させ、生じた細胞光散乱特性を測定するフローサイトメトリーによって検出し、分類する。
【０２７２】
投薬１時間後に、抗ＴｆＲＤにより、試験した全ての用量レベルで、未成熟の網状赤血球レベルが用量にかかわらずほぼ同じ程度に低下した。各抗ＴｆＲＤ投与量群で処置したマウスは、同様の重症度及び浸透度の急性臨床徴候も示した（図２参照Ｂ）。対照的に、１ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウス由来の血液試料と５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウス由来の血液試料は、コントロールＩｇＧで処置した試料のものと同様の未成熟の網状赤血球の画分を有した。５０ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスは、網状赤血球の顕著な低下を示したが（コントロール量の約５０％）（図２Ｂ）、この低下にはいかなる急性臨床徴候も伴わなかった。したがって、二重特異性抗ＴｆＲＤを含有する抗体の網状赤血球レベルに対する影響は、単一特異性抗ＴｆＲＤの影響よりも小さく、急性の有害な臨床徴候は引き出されなかった。
【０２７３】
ＴｆＲに対する親和性が異なる第２の二重特異性抗体を含めて実験を繰り返した。マウスに、実施例１に記載のものと同じ手順を使用して、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射した、又はコントロールＩｇＧを５０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射し、投薬の２４時間後及び７日後に血液試料を取得した。全血中の網状赤血球数を上記の通り測定した。図２Ｃに結果が示されている。投薬の２４時間後に、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１で処置したマウス試料の全てで、同様の総網状赤血球数の顕著な減少が示された。２５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置した試料及び５０ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置した試料では、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１で処置した試料と同様に少ない網状赤血球数が示された。しかし、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置した試料で示された網状赤血球数の減少は、投薬の２４時間後にＩｇＧコントロール試料と比較してそれほど大きくなかった。投薬の７日後までに、全群で正常なレベルの網状赤血球が示され（図２Ｃ）、これにより、コントロール量と比較して網状赤血球レベルの持続的な低下が示された（およそ５０％）５０ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１試料を例外として、最初の網状赤血球枯渇から回復したことが示唆された。したがって、最も低い試験用量の抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１のみは網状赤血球に対して中程度の影響を有したが、他の試験用量の全てでは、投薬の２４時間後に網状赤血球のほぼ完全な喪失が導かれ、これにより、抗体の親和性を低下させること（抗ＴｆＲＡに対して抗ＴｆＲＤ）及び用量を低下させることにより、網状赤血球の喪失に関連する安全性に関する懸念が弱まることが示された。しかし、投薬の７日後までに、最も高い用量の抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１のみは網状赤血球レベルに対していかなる測定可能な影響も有さなかったが、試験した他の用量の全てでは、網状赤血球数がＩｇＧコントロールマウスのレベルと同様のレベルまで回復した。特に、投薬の７日後における抗体のＴｆＲに対する絶対的な親和性は、より長い時点についての血流内での抗体の存続ほど重要ではなかった。抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１のＴｆＲに対する親和性がはるかに高いにもかかわらず（表Ａ）、高用量の抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスでは、７日目までに赤血球数の回復が示され、これは、この抗体の循環からのクリアランスが抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１と比較して速いことと対応した（実施例１、図１Ｂにおいて見られる通り）。
【０２７４】
網状赤血球枯渇において用量反応が観察されたので、種々の用量レベルと、脳内のＡｂｅｔａを低下させる関連する能力を相関させることが可能かどうかを決定するために実験を実施した。簡単に述べると、全ての試験に６−８週齢の野生型雌Ｃ５７Ｂ／６マウスを使用した。マウスに、コントロールＩｇＧ、又は抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１のいずれかを５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。総注射体積は２５０μＬを越えず、必要な場合には抗体をＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した。示されている時間の後、マウスにおいてＤ−ＰＢＳを毎分２ｍＬの速度で用いて８分間灌流を行った。脳を抽出し、皮質及び海馬を単離し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｏａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳ中１％ＮＰ−４０（Ｃａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）中にホモジナイズした。ホモジナイズした脳試料を４℃で１時間回転させた後に、１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させた。脳抗体を測定するために上清を単離した。全血を採取した後に、ＥＤＴＡ  ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に灌流し、室温で３０分置き、５０００×ｇで１０分、遠心沈澱を行った。抗体及びマウスＡｂｅｔａ１−４０を測定するために血漿の上層を新しいチューブに移した。
【０２７５】
マウスの血漿試料中及び脳試料中の全抗体濃度を、抗Ｆｃ／抗ｈｕＦｃ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＮＵＮＣ  ３８４ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（Ｎｅｐｔｕｎｅ、ＮＪ）を、Ｆｃ断片特異的ポリクローナル抗体であるロバ抗ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡを用いて２５℃で１時間ブロッキングした。各抗体をそれぞれの抗体濃度を数量化するための標準物質として使用した。プレートを、マイクロプレートウォッシャー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、標準物質及び試料を、０．５％ＢＳＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ、０．２５％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に希釈し、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎを加えて２５℃で２時間置いた。結合した抗体を、Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体である、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で展開し、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）で４５０ｎｍにおける吸収を測定した。４パラメータ非線形回帰プログラムを使用して標準曲線から濃度を決定した。アッセイの数量化の下限（ＬＬＯＱ）値は血清では３．１２ｎｇ／ｍｌであり、脳では１２．８１ｎｇ／ｇであった。実験群間の差異の統計解析を、対応のない両側ｔ検定を使用して実施した。
【０２７６】
脳内及び血漿中のＡｂｅｔａ１−４０も検出した。簡単に述べると、マウスを、抗体で処置し、上記の方法に従って灌流を行った。Ａｂｅｔａ１−４０を測定するために、半脳を５Ｍの塩酸グアニジン緩衝液中にホモジナイズし、試料を室温で３時間回転させた後に、新鮮に添加したアプロチニン（２０ｍｇ／ｍＬ）及びロイペプチン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中０．２５％カゼイン、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に希釈した（１：１０）。希釈したホモジネートを１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させ、Ａｂｅｔａ１−４０を測定するために上清を単離した。血漿を上記の通り調製した。血漿中及び脳内の総マウスＡｂｅｔａ１−４０濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、上記のものと同様の手順に従って決定した。Ａｂｅｔａ１−４０のＣ末端に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）をプレート上にコーティングし、ビオチン化抗マウスＡｂｅｔａモノクローナル抗体Ｍ３．２（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）を検出のために使用した。アッセイのＬＬＯＱ値は血漿では１．９６ｐｇ／ｍｌであり、脳では３９．１ｐｇ／ｇであった。実験群間の差異の統計解析を、対応のない両側ｔ検定を使用して実施した。
【０２７７】
抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１については、２５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇのどちらの用量レベルにおいても脳内Ａｂｅｔａのロバスト及び持続的な減少が観察されたが（図２Ｄ）、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１では、３つの用量レベル全てにおいて脳内Ａｂｅｔａのロバストであるが急性の減少が示された（図２Ｅ）。これらのデータは、末梢及び脳のどちらで観察された化合物の薬物動態とも一致した（図２Ｆ−２Ｈ）。これらのデータから、これらの試験では、２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１が、脳内Ａｂｅｔａレベルを有意に低下させるために十分であることが明らかになった。
【０２７８】
抗ＴｆＲ抗体種による網状赤血球枯渇は、エフェクター機能／抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、直接標的媒介性溶解／アポトーシス、及び／又はマクロファージによるオプソニン化網状赤血球の食作用を含めた種々の異なる天然のプロセスに起因し得る。抗ＴｆＲ抗体を投与した後に観察された網状赤血球枯渇に関与する機構をよりよく理解するために、一連の実験を行った。
【０２７９】
実施例２Ｂ
エフェクター機能を調節することの影響
ＴｆＲに対する親和性及び結合価が異なることに加えて、前述の実験で使用した単一特異性抗ＴｆＲ抗体及び二重特異性抗ＴｆＲ抗体は、それらのエフェクター機能の程度も異なった。単一特異性抗ＴｆＲ抗体は、ＣＨＯ細胞において産生させたものであり、哺乳動物型のグリコシル化及び野生型エフェクター機能を有した。二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、当技術分野で周知の以下の方法の１つ又は複数を使用してＦｃγ受容体と相互作用する能力を著しく低下させた又は排除したものである：Ｆｃ領域に変異Ｎ２９７Ｇ又はＮ２９７Ａが存在することに起因してグリコシル化を抑止すること（Atwalら、Sci. Transl. Med. 3、84ra43 (2011)；Fares Al-Ejehら、Clin. Cancer Res. (2007) 13: 5519s-5527s）、抗体Ｆｃ領域を、エフェクター機能が完全に抑止されることが既知である、２６５位におけるアスパラギン酸からアラニンへの変異（Ｄ２６５Ａ）を含有するように改変すること（例えば、米国特許７３３２５８１号を参照されたい）、又は抗体を、大腸菌に産生させることなどの、野生型哺乳動物グリコシル化が妨げられる様式で作製すること。
【０２８０】
実施例２Ａにおいて実施したマウス試験を、これらのＦｃ改変抗体を用いて、及びＦｃγ受容体又は補体Ｃ３のいずれかを欠く異なるマウス系統においても繰り返して、それぞれエフェクターに駆動されるＡＤＣＣ又はＣＤＣを含めた網状赤血球枯渇の潜在的な機構を評価した。全血試料を、抗体を静脈内注射した２４時間後の総網状赤血球数について評価した。第１の実験では、エフェクター機能を欠く単一特異性抗ＴｆＲＤを１ｍｇ／ｋｇ又は２５ｍｇ／ｋｇで野生型マウスに投与することには、完全なエフェクター機能を有する抗ＴｆＲＤ抗体と同じ網状赤血球数に対する枯渇作用があった（図３Ａと図２Ｂを比較されたい）。しかし、エフェクターを欠く抗ＴｆＲＤ抗体で処置したマウスでは、エフェクター陽性抗ＴｆＲＤ抗体で処置したマウスとは著しく異なり、急性臨床徴候は観察されなかった（実施例２Ａ）。同様に、Ｆｃγ受容体を欠く（エフェクター機能によって誘発され得るＡＤＣＣ機構を排除するため）マウスにエフェクター陽性抗ＴｆＲＤを投与した場合、２５ｍｇ／ｋｇを投薬した後に網状赤血球レベルはゼロ近くまで低下したが、急性臨床徴候は観察されなかった（図３Ｂ）。
【０２８１】
Ｆｃγノックアウトマウスにおいて、エフェクター機能を欠く二重特異性抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１  Ｄ２６５Ａ抗体の網状赤血球レベルに対する影響も評価した（図３Ｂ）。マウスにおいて抗体のエフェクター機能が完全に抑止されており、及びＦｃγ受容体が存在しなくても、２５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与した際の網状赤血球枯渇は軽減されなかった。野生型マウスにおいてエフェクターを欠く二重特異性抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体を使用した他の実験と一致して、処置したＦｃγノックアウトマウスにおいて有害な臨床徴候は観察されなかった。
【０２８２】
エフェクター機能が存在することが急性臨床症状の駆動に十分であるかどうかを決定するために、及びエフェクター機能の網状赤血球枯渇に対する寄与をさらに特徴付けるために、野生型マウスにおいて実験を繰り返し、低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のエフェクターを欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１  Ｄ２６５Ａと、相当する用量の完全なエフェクター陽性抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を比較した（図３Ｃ）。エフェクター機能を二重特異性抗体に導入すると、急性臨床徴候が観察された。さらに、エフェクター陽性抗体を用いると、エフェクターを欠く型の抗体と比較して、低用量レベルでロバストな網状赤血球枯渇が観察された（図３Ｃ及び図２Ｃ）。この総合データから、エフェクター機能は網状赤血球枯渇の駆動に必要ではないが、この枯渇に、特に低用量レベルで明白に寄与する。重要なことに、マウスにおいて観察された急性臨床症状は抗体のエフェクターの状態と関連づけられ、したがって、エフェクターを欠く抗体又はＦｃγノックアウトマウスのどちらによってもこれらの症状が十分に軽減される。
【０２８３】
補体カスケードが臨床症状又は網状赤血球の喪失のいずれかに関与したかどうかを決定するために、補体Ｃ３が欠損したマウス（すなわち、正常な補体カスケードを欠くマウス）において実験を再度実施した。図３Ｄに示されている通り、エフェクター陽性抗ＴｆＲＡにより、これらのマウスにおいて重度な網状赤血球枯渇とロバストな急性臨床症状の両方が引き起こされ、これにより、補体Ｃ３及び関連する補体カスケードが、投与した抗体が完全なエフェクター機能を有する場合に観察される作用のいずれの駆動においても主要な役割を果たしてはいないことが示された。完全なエフェクター機能の不在下で同じ結果が得られるかどうかを試験するために、Ｃ３ノックアウトマウスにエフェクターを欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体を投薬して、補体によって残りの網状赤血球の枯渇が媒介されるかどうかを決定した。図３Ｅに結果が示されている。実際に、残りの網状赤血球の枯渇は、Ｃ３ノックアウトマウスにエフェクターを欠く抗ＴｆＲ二重特異性抗体を高い治療量レベル（５０ｍｇ／ｋｇ）で投薬することでエフェクター機能と補体カスケードの両方が排除されている場合、レスキューされる。したがって、補体は、マウスにおいて、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ抗体を投与した後の網状赤血球枯渇の機構としての機能を果たすと思われる。
【０２８４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイも実施した。簡単に述べると、標的細胞として初代マウス骨髄細胞又はマウス赤白血病リンパ芽球（ＨＰＡ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）、及びウサギ血清に由来する補体（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ  ＮＪ）を使用してＣＤＣアッセイを実施した。Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）によって細胞を計数し、生存能力を決定した。抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体、抗ＴｆＲＡ抗体、陰性コントロール抗体又は陽性コントロール抗体（それぞれＩｇＧ又は抗Ｈ２Ｋｂ）をアッセイ培地（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２及び１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地）中に１：４に段階的に希釈し、白色の平底９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ  ＭＡ）に分配した。アッセイ培地中に１：３に希釈した血清補体及び標的細胞（ウェル当たり細胞２×１０５個）を加えた後、プレートを５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした。次いでプレートを絶えず振盪しながら室温で１０分間放置した。細胞溶解の程度を、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ（商標）Ｍ５プレートリーダーを用いて発光強度を測定することによって数量化した。試料希釈物の発光値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して用量反応曲線を４パラメータモデルにあてはめた。
【０２８５】
興味深いことに、マウス細胞を血清補体の存在下で単一特異性のエフェクター機能のために適格な抗ＴｆＲＡによって処置することによっても、エフェクターを欠く二重特異性抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１によって処置することによっても、細胞の補体媒介性溶解は生じなかったが、抗Ｈ２Ｋｂ陽性コントロールでは有意な細胞溶解が示された（図４Ａ）。特に、抗体のエフェクター活性が異なることは、ＣＤＣ活性を引き出すそれらの能力に影響しないと思われた。１つの非限定的な説明は、抗ＴｆＲのＦ（ａｂ’）２断片ではインタクトであるに違いない機構である、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、補体により、脾臓マクロファージ及び肝臓マクロファージによる循環している網状赤血球のオプソニン化を介して網状赤血球枯渇が媒介され得ることである（Garratty (2008)、Transfusion Med. 18 (6): 321-334；Mantovaniら、(1972) J. Exp. Med. 135: 780-792；Molinaら、(2002) Blood 100 (13): 4544-4549）。
【０２８６】
以前に記載されている、エフェクター機能に媒介される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、急性臨床症状、及び網状赤血球枯渇の間の関連を支持するｉｎ  ｖｉｖｏにおける結果を確認するために、同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験も行った。エフェクター細胞として健康なドナーから新鮮に単離したＰＢＭＣ、及び標的細胞として初代マウス骨髄細胞又はマウス赤白血病リンパ芽球（ＨＰＡ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）を使用してＡＤＣＣアッセイを行った。ＦｃγＲＩＩＩＡの残基１５８位におけるアロタイプの差異に由来するドナーの変動を最小限にするために、血液ドナーを、ヘテロ接合性ＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子型（Ｆ／Ｖ１５８）を有するドナーに限定した。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、Ｕｎｉ−Ｓｅｐ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を使用して密度勾配遠心分離によって単離した。標的細胞を１．４ｍＭのカルセインＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｂｅｓ）の溶液で前標識し、９６ウェルの丸底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ；Ｃａｎａｄａ）にウェル当たり４×１０４個で播種した。抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体、抗ＴｆＲ抗体及びコントロール抗体の段階希釈物を、標的細胞を含有するプレートに加え、その後、３７℃、５％二酸化炭素で３０分インキュベートしてオプソニン化させた。抗体の最終濃度は、４倍段階希釈後に１，０００ｎｇ／ｍＬから０．００４ｎｇ／ｍＬまでにわたった。インキュベートした後、アッセイ培地１００μＬ中ＰＢＭＣエフェクター細胞１×１０６個を各ウェルに加えてエフェクター細胞と標的細胞の比を２５：１にし、プレートをさらに３時間インキュベートした。インキュベートの最後にプレートを遠心分離し、上清における蛍光シグナルを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｍ５マイクロプレートリーダーを使用し、励起４８５ｎｍ及び発光５２０ｎｍで測定した。標的細胞のみを含有するウェルのシグナルにより、標識した細胞からのカルセインＡＭの自発性放出が示されたが（自発性放出）、トリトン（商標）Ｘ−１００を用いて溶解させた標的細胞を含有するウェルでは、入手可能な最大のシグナルがもたらされた（最大の溶解）。抗体非依存性細胞傷害性（ＡＩＣＣ）を、標的細胞及びエフェクター細胞を含有するウェルにおいて抗体を添加せずに測定した。特異的なＡＤＣＣの程度を以下の通り算出した：
％ＡＤＣＣ＝１００×（試料シグナル−ＡＩＣＣ）÷（最大の溶解−自発性放出）
試料希釈物のＡＤＣＣ値を抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用して用量反応曲線を４パラメータモデルにあてはめた。
【０２８７】
このアッセイで使用した抗ＴｆＲＡはエフェクター機能を有したが、このアッセイで使用した抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１はエフェクター機能を有さなかった。図４Ｂに示されている通り、エフェクター機能を有する抗体ではＡＤＣＣが誘導されたが、エフェクター機能を欠く抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体では誘導されず、前のマウス実験の結果と相関しなかった。これらのデータにより、処置したマウスにおける急性臨床徴候が、循環している網状赤血球と結合するエフェクター陽性抗体によって能動的に引き出されるＡＤＣＣに起因すること、及びエフェクターに駆動されるＡＤＣＣも抗体を投与した後の網状赤血球枯渇に寄与する可能性があるという観念がさらに支持される（図３Ｃ）。
【０２８８】
実施例２Ｃ
Ｆｃ又はＢＡＣＥ１の結合の調節の影響
Ｆｃ腕及びＢＡＣＥ１腕の役割を、網状赤血球枯渇の媒介におけるそれらの潜在的な関与についてそれぞれ別々に調査した。完全なエフェクター機能及び正常なグリコシル化を有する野生型ＩｇＧ１のＦｃ領域を有する単一特異性抗ＴｆＲ及び二重特異性抗ＴｆＲを生成した。簡単に述べると、記載されている通り、ＴｆＲ（ホール）半抗体及びＩｇＧ（ノブ）半抗体をＣＨＯにおいて別々に発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアニーリングさせた（Carter, P. (2001) J. Immunol. Methods 248、7-15；Ridgway, J. B.、Presta, L. G.、及びCarter, P. (1996) Protein Eng. 9、617-621；Merchant, A. M.、Zhu, Z.、Yuan, J. Q.、Goddard, A.、Adams, C. W.、Presta, L. G.、及びCarter, P. (1998) Nat. Biotechnol. 16、677-681；Atwell, S.、Ridgway, J. B.、Wells, J. A.、及びCarter, P. (1997) J. Mol. Biol. 270、26-35）。抗ＴｆＲ  ＩｇＧ抗体、抗ＴｆＲ／ＩｇＧ抗体又は抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体から、固定化ペプシンで消化することによってＦ（ａｂ’）２断片を生成した。抗体を１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２中で再構成し、固定化ペプシン樹脂（ＩｇＧ１ｍｇ当たり固定ゲル０．３ｍＬ）と一緒に３７℃で一晩、回転させながらインキュベートした。インキュベートした後、試料を遠心分離して、固定化ペプシンをＦ（ａｂ’）２消化混合物から分離した。次いで、強力な陽イオン交換樹脂であるＳＰセファロース（１ｍＬのＨｉＴｒａｐ（商標）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ））を使用してＦ（ａｂ’）２断片を精製した。試料を５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０にローディングし、２０カラム体積にわたって０−０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出し、 その後、試料をＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。これらの抗体及びＦ（ａｂ’）２を用い、上記と同じ手順で、静脈内２５ｍｇ／ｋｇ用量の単一特異性Ｆ（ａｂ’）２又は静脈内５０ｍｇ／ｋｇ用量の二重特異性Ｆ（ａｂ’）２若しくはコントロールＦ（ａｂ’）２若しくは抗体を使用してマウス実験を実施した。全血試料を、抗体／Ｆ（ａｂ’）２を静脈内注射した２４時間後の総網状赤血球数について評価した。結果が図５Ａ−５Ｃに示されている。
【０２８９】
抗ＴｆＲＤ  Ｆ（ａｂ’）２を投与することには、抗ＴｆＲＤ抗体を投与することと非常に類似した網状赤血球枯渇作用があり（図５Ａと図３Ａ及び図３Ｂを比較されたい）、これにより、評価した用量レベルにおいて観察された網状赤血球枯渇に抗体のＦｃ部分は必要ではないことが示された。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２分子では全長の二重特異性ＩｇＧ抗体と比較して網状赤血球枯渇のわずかな減弱が示されたが（図５Ｂと図２Ｃを比較されたい）、これは、一般的にＦ（ａｂ’）２のクリアランスがＩｇＧと比較して速く、（Covellら、(1986) Cancer Res. 46: 3969-3978）、それにより、投薬後２４時間の間隔にわたる抗体の曝露が全体的に減少することに起因する可能性が最も高いことに留意するべきである。それにでもなお、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体を投与した後に観察された網状赤血球枯渇により、網状赤血球枯渇が生じることにＦｃ領域は必要ではないという結論がさらに強調される。ＢＡＣＥ１腕を欠く二重特異性抗体（抗ＴｆＲＤ／コントロールＩｇＧ）により、網状赤血球が抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１と同じ程度に枯渇し（図５Ｃ）、これにより、ＢＡＣＥ１腕も網状赤血球排除に寄与しないことが実証された。
【０２９０】
実施例３
結合親和性のさらなる操作
いくらかの上記の結果により、観察される網状赤血球枯渇の程度に対して親和性及び用量成分が存在することが示唆された（図２Ｃ）。親和性及び用量が網状赤血球枯渇にどのように影響を及ぼすかをよりよく理解するために、実施例２において実施したマウスへの投薬実験を、２つの異なる用量レベル（２５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）の低親和性抗ＴｆＲ抗体、具体的には抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１を追加して繰り返した。抗ＴｆＲＥでは、試験したいずれの用量においても網状赤血球への影響は基本的になかったが（図６Ａ）、同様の用量の抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１では、網状赤血球が枯渇した。実施例１において考察されている結果から、抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１よりも血漿曝露の持続及び脳内での存続は良好であるが、血液脳関門を通るロバストな輸送は劣ることが観察された。抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１投与により網状赤血球枯渇が生じるが、抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１投与では網状赤血球枯渇が生じないことを考慮して、ＴｆＲに対して抗ＴｆＲＤの親和性と抗ＴｆＲＥの親和性の間の親和性を有するバリアント抗ＴｆＲを生成して、ＢＢＢ輸送及び脳内での存続を犠牲にすることなく抗体の安全性プロファイルを改善することができるかどうかを確かめた。
【０２９１】
簡単に述べると、標準の変異誘発技法を用い、部位特異的変異誘発を使用して、それぞれ抗ＴｆＲＤバリアント及び抗ＴｆＲＢバリアントを表す２つの点変異を組み合わせて抗ＴｆＲＤｂと称される単一の抗体にした。同様に、それぞれ抗ＴｆＲＤバリアント及び抗ＴｆＲＣバリアントを表す２つの点変異を導入して抗ＴｆＲＤｃと称される単一の抗体にした。どちらの抗体も、実施例２Ｃに記載のノブ・アンド・ホール（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）技術を使用して抗ＢＡＣＥ１を有する二重特異性形式に作出した。どちらの抗体もＴｆＲに対する親和性は抗ＴｆＲＤ抗体の親和性と抗ＴｆＲＥ抗体の親和性の間であり、抗ＴｆＲＤｂ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲに対する親和性は抗ＴｆＲＤｃ／ＢＡＣＥ１抗体のＴｆＲに対する親和性のおよそ３倍であった。これらの新しいバリアントを用いてマウス投与／網状赤血球枯渇実験を繰り返した。図６Ｂに結果が示されている。どちらのバリアントでも、網状赤血球枯渇が同じ用量レベルの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１抗体で観察される網状赤血球枯渇よりも著しく改善され（すなわち、減少）、投薬の２４時間後の網状赤血球レベルがコントロールで処置したマウスの網状赤血球レベルに近づいたことが実証された。予測通り、新しいバリアント抗体のどちらも、経時的な血漿中抗体濃度、脳内抗体濃度（最大値と経時的な低下の両方）、及びＡβ１−４０の減少は、同じ用量レベルで投与した場合の抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１及び抗ＴｆＲＥ／ＢＡＣＥ１の経時的な血漿中抗体濃度、脳内抗体濃度（最大値と経時的な低下の両方）、及びＡβ１−４０の減少の間であった。
【０２９２】
血液脳関門におけるＴｆＲの発現に対する親和性及び用量の影響も調査した。マウスに対して抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１又は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで単回投与する処置を行い、投薬の４日後に脳におけるＴｆＲ発現をウエスタンブロットによって評価した。抗体で処置したマウス由来の脳にＰＢＳを灌流した後に抽出し、単離した皮質及び海馬を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するＰＢＳ中１％ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中にホモジナイズした。ホモジナイズした脳を４℃で１時間回転させた後に、１４，０００ｒｐｍで２０分高速回転させた。上清を単離し、等濃度のタンパク質を４−１２％Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離した。膜を抗ＴｆＲ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び抗アクチン抗体（Ａｂｃａｍ）と一緒に４℃で一晩インキュベートし、その後、ＩＲＤｙｅ（登録商標）（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）二次抗体と一緒に室温で２時間インキュベートした。免疫ブロットを画像化し、バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用してデンシトメトリーによって数量化した。投薬の４日後に、ＴｆＲ発現は抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処理した試料３つ全てにおいて同様であったが、高用量レベルではコントロールレベルよりもわずかに低下した（図６Ｃ）。対照的に、漸増用量の抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１抗体により、投薬の４日後に血液脳関門におけるＴｆＲの発現が顕著に減少した。したがって、抗ＴｆＲ抗体の親和性を低下させることにより、観察される脳内ＴｆＲ発現の用量依存的な低下も改善され、これは抗体の全体的な安全性プロファイルの改善にさらに寄与する可能性がある。
【０２９３】
実施例４
ＢＢＢ浸透性の評価
異種分子を脳内に輸送するために血液脳関門輸送受容体を利用することの懸念は、ＢＢＢ自体が損なわれる可能性があることである。したがって、抗ＴｆＲを投薬した際のＢＢＢの抗体に対する浸透性を調査した。野生型マウスに、コントロールＩｇＧを５０ｍｇ／ｋｇで、又は示されている同時注射する抗体の組合せのそれぞれを２５ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。静脈内注射した２４時間後の平均の脳内への抗体の取り込みを、一般的なヒト−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡを実施例１に従って使用し、又は抗ＢＡＣＥ１特異的ＥＬＩＳＡを実施例１に記載のものと同様の手順に従って使用して評価した。ＢＡＣＥ１細胞外ドメインをコートタンパク質として使用し、Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体である、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて検出を実施した。このアッセイのＬＬＯＱ値は抗ＢＡＣＥ１についてはおよそ２．５６ｎｇ／ｇであり、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１については１２．８ｎｇ／ｇであった。実施例１に記載のものと同じ手順を使用して投与後の脳内Ａβ１−４０レベルを測定した。
【０２９４】
結果が図７Ａ−７Ｃに示されている。脳抗体曝露はコントロールＩｇＧ＋抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスで最も高かったが、抗ＴｆＲＤを含有する抗体の組合せで処置したマウスでも相当なものであった（図７Ａ）。これは、低親和性の二重特異性形態の抗ＴｆＲＤが脳内に取り込まれ、高親和性の単一特異性形態の抗ＴｆＲＤよりも長く存続するという点で、実施例１の結果と相関する。抗ＴｆＲ抗体と同時投与した抗体は脳内に相当量では取り込まれず、脳内で相当量が観察された抗ＢＡＣＥ１は抗ＴｆＲＤと直接コンジュゲートしたものだけであった（図７Ｂ）。同様に、脳において観察された抗ＢＡＣＥ１活性は、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスにおけるものだけであった（図７Ｃ）。総合すると、これらのデータにより、抗体に対する血液脳関門浸透性は抗ＴｆＲ処置の影響を受けないことが示される。
【０２９５】
実施例５
網状赤血球レベルに対する多数回投薬の影響
前述の試験は、抗ＴｆＲ抗体の単回投薬並びに網状赤血球レベルに対して生じる影響及び同時に生じる急性臨床症状に焦点を合わせた。より長い期間にわたって複数回投薬した後に異なる影響が観察されるかどうかを確認するために、さらなる試験を行った。単回の静脈内投薬の代わりに、マウスに、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１又はＩｇＧコントロールを、１週間に１回、合計４週間にわたって静脈内投薬したこと以外は前述の実施例に記載のものと同じプロトコールを使用した。２回目の注射の１日後、４日後又は７日後及び４回目の注射の１日後、４日後又は７日後に組織／血液を採取し、上記のプロトコールを使用して処理した。さらに、血清試料について、直接ビリルビン、血清鉄、総鉄結合能及び不飽和鉄結合能を、Ｉｎｔｅｇｒａ（商標）４００（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の説明書に従って使用して比色定量アッセイによって決定した。各時点及び各処置群についてマウス６匹を使用した。
【０２９６】
抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の血清中抗体濃度は、２回又は４回投薬した後、経時的に同様であり、これにより、投薬を繰り返した後のマウス血流におけるクリアランスは実質的に異ならないことが示唆された（図８Ａ）。しかし、４回目の投薬の４日後に、２回目の投薬後の同じ時間と比較して全体的な抗体曝露のわずかな減少が明らかであり、これにより、投与したヒトＩｇＧ抗体に対するマウス抗薬物抗体（ＡＤＡ）が出現したことが示唆された。血清中抗体濃度と同様に、脳内抗体濃度も４回目の投薬の４日後に低下したが、脳内での経時的な抗体の存続は２回目の投薬後に観察されたものが再現された（図８Ｂ）。Ａｂｅｔａ１−４０の血漿中レベル（図８Ｃ）及び脳内レベル（図８Ｄ）は、２回又は４回投薬した後に血清中及び脳内に存在することが観察された抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１の量とよく相関した。
【０２９７】
重要なことに、複数回投薬の状況で網状赤血球毒性の増悪は観察されなかった。図８Ｅに示されている通り、絶対的な網状赤血球数は、２回目の投薬の１日後から４回目の投薬の７日後までに劇的に改善された（値がコントロールレベルに戻った又はそれを超えた）。４週間の時点で赤血球質量の減少又は血清鉄及び総鉄結合能（血清トランスフェリンの代替パラメータ）の変化の証拠はなかった。評価した組織のいずれにおいても病理組織的変化又は染色可能な鉄レベルの変更の証拠もなかった。理論に束縛されることなく、最初の投薬によって引き出され、投薬期間全体を通して持続する骨髄再生応答の増強が、４回目の投薬の後に観察された全体的な網状赤血球の減少の好転に関与する可能性があることが提唱される。さらに、ＡＤＡが存在する疑いがあることにより、投薬を繰り返すと全体的な循環している抗体のレベルがさらに低下し、これも４週目に観察された網状赤血球枯渇の緩和に寄与する。最後に、ＴｆＲの脳での発現は、４回目の投薬の１日後、４日後、又は７日後に、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１で処置したマウスとコントロールＩｇＧで処置したマウスで異ならなかった（図８Ｆ）。
【０２９８】
実施例６
血液中及び骨髄中の赤血球前駆細胞に対するエフェクターを含有する二重特異性及びエフェクターを欠く二重特異性の影響
骨髄中の赤血球前駆細胞集団に対する抗体投薬の影響を解明するために追加的な実験を実施した。まず、抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１を投薬した後の網状赤血球の喪失の時間経過を調査するために、野生型マウスに、コントロールＩｇＧ又はエフェクター機能を欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を５０ｍｇ／ｋｇで、滅菌ＰＢＳ中２００μＬの単回のボーラスとして静脈内注射した（群当たりｎ＝６）１時間後、４時間後、１６時間後、及び２４時間後に血液及び骨髄を単離した。示されている投薬後の時点で動物から血液及び骨髄を回収した。イソフルラン麻酔後に眼窩出血を血液抽出のために使用し、片側の大腿骨から骨髄を回収し、単一細胞懸濁液を調製した。次いで、細胞を７０ミクロンの細胞濾過器で濾過した。細胞を洗浄し、設定した体積のＰＢＳに再懸濁させた。固定体積の細胞懸濁液を固定濃度のＦＩＴＣ標識蛍光ビーズに加え、フローサイトメーターで分析し、試料当たり５０００のビーズ事象を収集して細胞数を得た。赤血球集団の定量的分析をフローサイトメトリーによって決定した。血液及び骨髄のどちらにおいても、別個の赤血球系細胞の集団をそれらのＴｅｒ１１９ マーカー（マウス成熟赤血球及び赤血球前駆体細胞でのみ発現されることが決定されているマーカー）の発現、ＴｆＲ発現、及び側方散乱プロファイルによってゲーティングした（以前にPanigaら、"Expression of Prion Protein in Mouse Erythroid Progenitors and Differentiating Murine Erythroleukemia Cells." PLoS One 6、9 (2011)；図9A及び9Bに記載されている通り）。簡単に述べると、試料を抗マウスＴｅｒ１１９−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びビオチン化抗マウスＴｆＲと一緒に、その後ストレプトアビジン−ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と一緒に氷上で２０分インキュベートした。試料を０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ多色フローサイトメーターに流し、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して解析した。
【０２９９】
エフェクター機能を欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１を用いた処置により、コントロールＩｇＧと比較して血液中の赤血球の総数は変更されなかったが（図９Ｃ）、それにもかかわらず、血液中に循環しているＴｆＲ発現網状赤血球は急速及び著しく減少した（図９Ｄ）。血液での所見とは対照的に、エフェクターを欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１は、骨髄中の、ＴｆＲ高発現集団（ＥｒｙＡ集団及びＥｒｙＢ集団）（図１０Ｂ−Ｃ）、並びにＴｆＲ陰性成熟赤血球（ＥｒｙＣ集団）（図１０Ｄ）を含めた赤血球前駆細胞集団のいずれに対しても作用しなかった（図１０Ａ−Ｃ）。まとめると、これらの結果により、単回投薬後に、エフェクターを欠く抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１では、マウスの血液中のＴｆＲ発現網状赤血球のみが枯渇し、骨髄中の他の赤血球系細胞の亜集団は影響を受けないことが実証された。
【０３００】
血液中の赤血球亜集団及び骨髄中の赤血球亜集団に対する完全なエフェクター機能抗体の影響を調査するために、並びに親和性が赤血球系細胞の枯渇において役割を果たすかどうかを決定するために、野生型マウスに、上記のものと同じ注射及び試料採取プロセスに従って、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）、抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）、又はコントロールＩｇＧ（「Ｆｃ−」は変異Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ｇが存在すること又はグリコシル化されていないことに起因してエフェクターを欠く抗体を示し、「Ｆｃ＋」は野生型エフェクター機能を有する抗体を示す）を単回ＩＶ投薬した。コントロールＩｇＧと比較して、抗体投薬後の循環血液中の成熟赤血球の総数に対して、エフェクター機能が存在することによる影響も、ＴｆＲに対する親和性による影響もなかった（図１１Ａ）。以前の知見を確認すると、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体を投薬することにより、血液中のＴｆＲ発現網状赤血球が急速及び持続的に減少した（図１１Ｂ、図９Ｄと比較されたい）。さらに、抗ＴｆＲＡ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）を投薬した動物と抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）を投薬した動物の間で網状赤血球の減少の時間経過にもその大きさにも有意差はなかったので、ＴｆＲに対する親和性によって二重特異性抗体により網状赤血球の喪失が駆動される程度は変更されなかった（図１１Ｂ）。しかし、エフェクター機能が完全な抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）を投薬することにより、エフェクターを欠く二重特異性抗体と比較して網状赤血球の喪失が有意に増悪し（図１１Ｂ）、これにより、エフェクター機能が抗体投薬後の網状赤血球枯渇の重症度において重要な役割を果たすことが示唆された。
【０３０１】
骨髄では、エフェクターを欠く（Ｆｃ−）抗ＴｆＲ二重特異性抗体により、コントロールＩｇＧと比較して赤血球系細胞の総数は変更されなかった（図１１Ａ）。しかし、エフェクター機能が完全な抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）では、投薬の２４時間後に赤血球系細胞の総数が減少した（図１２Ａ）。具体的には、コントロールＩｇＧと比較して、完全なエフェクター機能の存在下ではＴｆＲ陽性赤血球前駆体細胞（ＥｒｙＡ集団及びＥｒｙＢ集団）が有意及びロバストに減少したが、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体によるＴｆＲ陽性赤血球系細胞亜集団に対する作用はなかった（図１２Ｂ−Ｃ）。興味深いことに、エフェクター機能が完全な抗ＴｆＲＤ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ＋）を投薬した４時間後及び１６時間後にエフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１（Ｆｃ−）抗体及びコントロールＩｇＧと比較すると成熟赤血球の数が一過性に増加した（図１２Ｄ）。１つの非限定的な解釈では、この一過性の増加は、赤血球前駆体細胞の枯渇に応答して赤血球成熟化の加速を駆動する二次的な代償的機構に起因する可能性がある。まとめると、これらのデータにより、エフェクターを欠く抗ＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体により、骨髄中のＴｆＲ陽性赤血球系細胞の喪失が軽減されることが示唆される。
【０３０２】
実施例７
ヒト赤白血病細胞株及び初代骨髄単核細胞に対するエフェクターを含有する単一特異性抗体及び二重特異性抗体並びにエフェクターを欠く単一特異性抗体及び二重特異性抗体の影響
前述の実施例では、ヒトＴｆＲを特異的に認識しない抗マウスＴｆＲ抗体を使用した。マウス試験において観察された網状赤血球枯渇がマウスの系に独特のものであるかを確認するために、ヒトＴｆＲに結合する抗ＴｆＲを利用して別の実験を実施した。
【０３０３】
健康なヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用してＡＤＣＣアッセイを行った。ヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ、ＡＴＣＣ）及び初代ヒト骨髄単核細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、Ｉｎｃ．）を標的細胞として使用した。実験の第１のセットでは、ＦｃγＲＩＩＩＡの残基１５８位におけるアロタイプの差異から潜在的に生じる可能性があるドナー間の変動を最小限にするために、血液ドナーを、ヘテロ接合性ＲｃγＲＩＩＩＡ遺伝子型（Ｆ／Ｖ１５８）を有するドナーに限定した（図１３Ａ−Ｂ）。実験の第２のセットでは（図１４Ａ−Ｂ）、ＨＥＬ細胞のみを標的細胞として使用し、Ｆ／Ｖ１５８遺伝子型又はＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型のいずれかを有する健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣを一緒に使用した。ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ活性の増加並びにＩｇＧ４抗体に結合する能力に関連することが公知であるので（Bowles及びWeiner、2005； Bruhnsら 2008）、Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型もこのアッセイに含めた。Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）により、製造者の説明書に従って細胞を計数し、生存能力を決定した。
【０３０４】
Ｕｎｉ−Ｓｅｐ（商標）ｂｌｏｏｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．；Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を使用してＰＢＭＣを密度勾配遠心分離によって単離した。アッセイ培地（１％ＢＳＡ及び１００単位／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシンを伴うＲＰＭＩ−１６４０）５０μＬ中の標的細胞を９６ウェルの丸底プレートにウェル当たり４×１０４個で播種した。試験抗体及びコントロール抗体の段階希釈物（ウェル当たり５０μＬ）を、標的細胞を含有するプレートに加え、その後、３７℃、５％ＣＯ２で３０分インキュベートしてオプソニン化させた。抗体の最終濃度は、５倍に段階希釈した後、合計１０のデータ点で０．００５１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬにわたった。インキュベート後、アッセイ培地１００μＬ中ＰＢＭＣエフェクター細胞１．０×１０６個を各ウェルに加えてエフェクター細胞：標的細胞の比を２５：１にし、プレートをさらに４時間インキュベートした。インキュベートの最後にプレートを遠心分離し、上清を乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性についてＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｎｅｃｅ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して試験した。ＬＤＨ反応混合物を上清に加え、プレートを室温で１５分、絶えず振盪しながらインキュベートした。１ＭのＨ３ＰＯ４を用いて反応を終了させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプラスマイクロプレートリーダーを使用して４９０ｎｍにおける吸収を測定した（各ウェルについて６５０ｎｍにおいて測定されたバックグラウンドを引く）。標的細胞のみを含有するウェルの吸収がバックグラウンドについてのコントロールとしての機能を果たし（低コントロール）、トリトン−Ｘ１００を用いて溶解させた標的細胞を含有するウェルにより入手可能な最大のシグナルがもたらされた（高コントロール）。抗体非依存性細胞傷害性（ＡＩＣＣ）を、標的細胞及びエフェクター細胞を含有するウェルにおいて抗体を添加せずに測定した。特異的なＡＤＣＣの程度を以下の通り算出した：
2019034948.tif 000005
試料希釈物のＡＤＣＣ値を抗体濃度に対してプロットし、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏを使用して用量反応曲線を４パラメータモデルにあてはめた。
【０３０５】
実験の第１のセットでは、種々の抗ヒトＴｆＲ構築物のＡＤＣＣ活性を、ヒト赤白血病細胞株（ＨＥＬ細胞）又は初代ヒト骨髄単核細胞のいずれかを標的細胞として使用して評価した。二価ＩｇＧ１エフェクター機能のために適格な抗ヒトＴｆＲ１抗体１５Ｇ１１、及び前の実施例においてエフェクター機能を抑止するＤ２６５Ａ変異及びＮ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１形式で使用した同じ抗ＢＡＣＥ１腕を有するこの抗体の二重特異性形態（実施例６を参照されたい）を種々の濃度で、陰性コントロールとして抗ｇＤ  ＷＴ  ＩｇＧ１を使用し、陽性コントロールをマウス抗ヒトＨＬＡ（クラスＩ）として使用したＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。結果が図１３Ａ及び図１３Ｂに示されている。標的としてＨＥＬ細胞（図１３Ａ）又は標的として骨髄単核細胞（図１３Ｂ）のいずれを用いても、単一特異性抗ヒトＴｆＲ抗体１５Ｇ１１により、有意なＡＤＣＣ活性が引き出された。この活性は、ＨＥＬ細胞における陽性コントロール抗ヒトＨＬＡ抗体による活性と同様であり、骨髄単核細胞に対する陽性コントロールよりもロバストであるが低いレベルであった。骨髄単核細胞実験において観察されたレベルがいくらか低いことは、おそらくこの実験で使用した骨髄系列ＰＢＭＣ細胞及び赤血球系列ＰＢＭＣ細胞の不均一な混合物の一部では高レベルのＴｆＲが発現されるが、ＨＥＬ細胞ではクローン細胞集団全体を通して一貫してＴｆＲが高発現されるという事実に起因する。著しく対照的に、エフェクターを欠く二重特異性抗ヒトＴｆＲ／ＢＡＣＥ１抗体は、陰性コントロールと同様に、ＨＥＬ細胞又は骨髄単核細胞のいずれにおいてもいかなるＡＤＣＣ活性も示さなかった。
【０３０６】
実験の第２のセットでは、このアッセイ系で抗体のアイソタイプスイッチの影響を評価した。ＡＤＣＣアッセイ手順は、標的細胞が全てＨＥＬ細胞であったこと、及びエフェクター細胞が、ヘテロ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ／Ｆ１５８遺伝子型又はホモ接合性ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ／Ｖ１５８遺伝子型のいずれかを有する健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣであったこと以外は上記の手順と同一であった。試験した抗ヒトＴｆＲは全て二重特異性であり、抗ｇＤを有し、３つの異なるＩｇ骨格：野生型ヒトＩｇＧ１、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１、及びヒトＩｇＧ４を有した。ヒトＩｇＧ４骨格を有する抗Ａｂｅｔａ抗体も試験し、マウス抗ヒトＨＬＡ（クラスＩ）が陽性コントロールとしての機能を果たした。結果が図１４Ａ及び図１４Ｂに示されている。エフェクター細胞活性化とＶ／Ｖ１５８遺伝子型の公知の関連性に基づいて予測される通り（Bowles及びWeiner 2005）、ＡＤＣＣ活性は、Ｖ／Ｖ１５８ドナーＰＢＭＣ（標的細胞の〜４５％が影響を受けた）により、Ｆ／Ｖ１５８ドナー（標的細胞の〜２５％が影響を受けた）と比較してよりロバストに引き出された（図１４Ａと図１４Ｂを比較されたい）。野生型ＩｇＧ１を有する抗ＴｆＲ／ｇＤではＨＥＬ細胞においてロバストなＡＤＣＣが誘導されたが、エフェクターを欠くＩｇＧ１を有する抗ＴｆＲ／ｇＤではＨＥＬ細胞においていかなるＡＤＣＣ活性も示されず、これにより実験の第１のセットからの結果が再現された。特に、１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度において、ＩｇＧ４アイソタイプの抗ＴｆＲ／ｇＤが軽度のＡＤＣＣ活性を示した。この活性は抗Ａｂｅｔａ  ＩｇＧ４の結果では観察されず、これにより、ＡＤＣＣ活性のためにはＴｆＲの結合が必要であることが示された。この所見は、ＩｇＧ４が最小であるが測定可能なエフェクター機能を有するという以前の報告と相関する（Adolffsonら、J. Neurosci. 32 (28): 9677-9689 (2012)；van der Zeeら Clin Exp. Immunol. 64: 415-422 (1986)）；Taoら、J. Exp. Med. 173:1025-1028 (1991)）。
【０３０７】
したがって、マウスにおける赤血球系列細胞の枯渇がＴｆＲ依存性及びエフェクター機能依存性の様式で起こるという本発明の所見は、ヒトの系に直接置き換えることができる。前述の本発明は、理解を明確にするために図表及び実施例によって一部の詳細で記載されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書において引用されている全ての特許文献及び科学文献の開示は、それらの全体が出典明示により本明細書に明白に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図３Ａ−Ｂ】
2019034948.tif 000013
【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図８Ｅ−Ｆ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月7日(2018.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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