(57)【要約】【課題】脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成を識別する方法並びにそのキットを提供する。【解決手段】  脂肪酸エステルを炭素数１〜４の低級アルコールとの脂肪酸低級アルキルに低級アルキル化する第１工程と、遊離脂肪酸をシリル化剤と反応させて、シリル化する第２工程とを経ることにより、脂肪酸エステルであれば脂肪酸低級アルキルに調製され、かつ遊離脂肪酸であれば脂肪酸シリルに調製されるように、選択的に異なる構造の化合物に誘導体化できることを見出した。本発明方法及びそれを用いたキットによれば、試料と試薬とを混合するだけの簡便な操作で、脂肪酸エステル由来であるのか、遊離脂肪酸由来であるのか、脂肪酸の組成を精度よく識別でき、脂肪酸組成分析に対応する医薬品、化粧品、食品の分野において利用できるものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸のうち、選択的に脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化する方法であって、以下の各工程、
（Ａ）脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を含む試料を、疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む溶液に溶解し、
次に、脂肪酸エステルを、炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンと反応させて、炭素数１〜４の低級アルコールとの脂肪酸低級アルキルに低級アルキル化し、
次に、反応液に酸性水溶液を加えて酸性として、低級アルキル化を停止させるとともに疎水性溶媒層と水層の二層に分離し、生成した脂肪酸低級アルキル及び／又は遊離脂肪酸を疎水性溶媒層に抽出する第１工程、
（Ｂ）次に、第１工程の疎水性溶媒層を採取し、遊離脂肪酸をシリル化剤と反応させて、シリル化する第２工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
第１工程の炭素数１〜４の低級アルコールがメタノールであり、炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンがメトキシドイオンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１工程の疎水性溶媒が、脂肪族炭化水素溶媒、脂環式炭化水素溶媒、ハロゲン化炭化水素溶媒、芳香族炭化水素溶媒、エーテル溶媒及び有機酸アルキルエステル溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１工程の両親媒性溶媒が、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、アセトン及びメチルエチルケトンからなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１工程の低級アルキル化を、１０〜４０℃で行う請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１工程の低級アルキル化を、３〜６０分で行う請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１工程の酸性水溶液が、酢酸、塩酸、リン酸、及びホウ酸からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物の水溶液である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第２工程におけるシリル化剤がトリメチルシリル化剤である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸のうち、選択的に脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化するためのキットであって、
（Ｃ）疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む溶解液、
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンを含む低級アルキル化液、
（Ｅ）酸性水溶液を含む停止・分離液、
（Ｆ）シリル化剤を含むシリル化液
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
炭素数１〜４の低級アルコールがメタノールであり、炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンがメトキシドイオンである請求項９記載のキット。
【請求項１１】
酸性水溶液が、酢酸、塩酸、リン酸、及びホウ酸からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物の水溶液である請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
疎水性溶媒及び両親媒性溶媒を備え、疎水性溶媒が、脂肪族炭化水素溶媒、脂環式炭化水素溶媒、ハロゲン化炭化水素溶媒、芳香族炭化水素溶媒、エーテル溶媒及び有機酸アルキルエステル溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物であり、両親媒性溶媒が、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、アセトン及びメチルエチルケトンからなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である請求項９〜１１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィー等により分析するのに先立って、脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化する方法並びにそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮脂、血液、油脂等の試料に含まれる脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成を分析することは、皮膚の代謝状態、特定疾患の診断や製品の品質管理等に有用である。
【０００３】
非特許文献１には、脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成を分析する方法として、まず、試料から溶媒を用いて脂質を抽出し、次に、薄層クロマトグラフィーを用いて脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を分画する方法が記載されている。
【０００４】
しかし、上記の方法では、薄層クロマトグラフィーで溶媒を展開する時間が長く、また、プレートからシリカゲルをかきとり、溶媒で抽出して回収する等、操作が煩雑であるという問題点があった。
【０００５】
一方、分画した脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成を分析するには、通常、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー等による方法が行われ、感度が高いために少量の試料で足りる点で、ガスクロマトグラフィーが採用されることが多い。脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸をガスクロマトグラフィーに供するには気化しやすい状態にする必要があるため、ガスクロマトグラフィーによる分析に先立ち、脂肪酸エステルは炭素数１〜４の低級アルコールとの脂肪酸低級アルキルにエステル交換されたり、また、遊離脂肪酸も同様に低級アルキル化されたり、シリル化剤によってシリル化されたり等、誘導体化されることが多い。
【０００６】
特許文献１は、脂肪酸を含む試料と炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドとを反応させる第１工程と、その反応混合物を、三フッ化ホウ素の存在下で、炭素数１〜４の低級アルコールと反応させる第２工程とを経ることにより、３７℃程度の穏和な条件で、脂質等の試料中に含まれる脂肪酸エステルだけでなく、試料中の遊離脂肪酸やエステル交換反応に伴い副生する遊離脂肪酸もほぼ完全にアルキルエステル化される方法を開示している。
【０００７】
しかし、上記の方法では、脂肪酸エステルのみならず、脂肪酸部分が同じであれば遊離脂肪酸も同一のアルキルエステルに調製されるため、アルキルエステル化された脂肪酸が脂肪酸エステル由来であるのか、遊離脂肪酸由来であるのかを区別できず、脂肪酸の組成や分布を分析できないという問題点があった。
【０００８】
また、特許文献２は、グリセリン脂肪酸エステルを、炭素数１〜４の低級アルコール溶媒及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンと反応させて、脂肪酸アルキルエステルを調製する方法を開示している。
【０００９】
しかし、上記の方法では、グリセリン脂肪酸エステルのみがアルキルエステル化されるものの、遊離脂肪酸は誘導体化されないという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４９４２３８０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／１５５８５８号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】宮澤陽夫・藤野泰郎著、「生物化学実験法９  脂質・酸化脂質分析法入門」、株式会社学会出版センター、２００３年１月、ｐ．９１―１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、薄層クロマトグラフィー等を用いて脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を分画する操作が必要なく、試料に含まれる脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成を識別する方法並びにそのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を含む試料を、疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む溶液に溶解し、次に、脂肪酸エステルを、炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンと反応させて、炭素数１〜４の低級アルコールとの脂肪酸低級アルキルに低級アルキル化し、次に、反応液に酸性水溶液を加えて酸性として、低級アルキル化を停止させるとともに疎水性溶媒層と水層の二層に分離し、生成した脂肪酸低級アルキル及び／又は遊離脂肪酸を疎水性溶媒層に抽出する第１工程と、次に、第１工程の疎水性溶媒層を採取し、遊離脂肪酸をシリル化剤と反応させて、シリル化する第２工程とを経ることにより、脂肪酸エステルであれば脂肪酸低級アルキルに調製され、かつ遊離脂肪酸であれば脂肪酸シリルに調製されるように、選択的に異なる構造の化合物に誘導体化できることを見出した。
【００１４】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸のうち、選択的に脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化する方法並びにそのキットを提供する（図１）。
＜１＞脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化する方法であって、以下の各工程、
（Ａ）脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を含む試料を、疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む溶液に溶解し、
次に、脂肪酸エステルを、炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンと反応させて、炭素数１〜４の低級アルコールとの脂肪酸低級アルキルに低級アルキル化し、
次に、反応液に酸性水溶液を加えて酸性として、低級アルキル化を停止させるとともに疎水性溶媒層と水層の二層に分離し、生成した脂肪酸低級アルキル及び／又は遊離脂肪酸を疎水性溶媒層に抽出する第１工程、
（Ｂ）次に、第１工程の疎水性溶媒層を採取し、遊離脂肪酸をシリル化剤と反応させて、シリル化する第２工程、
を含むことを特徴とする方法。
＜２＞第１工程の炭素数１〜４の低級アルコールがメタノールであり、炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンがメトキシドイオンである上記＜１＞に記載の方法。
＜３＞第１工程の疎水性溶媒が、脂肪族炭化水素溶媒、脂環式炭化水素溶媒、ハロゲン化炭化水素溶媒、芳香族炭化水素溶媒、エーテル溶媒及び有機酸アルキルエステル溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である上記＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞第１工程の両親媒性溶媒が、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、アセトン及びメチルエチルケトンからなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である上記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞第１工程の低級アルキル化を、１０〜４０℃で行う上記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞第１工程の低級アルキル化を、３〜６０分で行う上記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞第１工程の酸性水溶液が、酢酸、塩酸、リン酸、及びホウ酸からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物の水溶液である上記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞第２工程におけるシリル化剤がトリメチルシリル化剤である上記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸のうち、選択的に脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化するためのキットであって、
（Ｃ）疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む溶解液、
（Ｄ）炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンを含む低級アルキル化液、
（Ｅ）酸性水溶液を含む停止・分離液、
（Ｆ）シリル化剤を含むシリル化液
を含むことを特徴とするキット。
＜１０＞炭素数１〜４の低級アルコールがメタノールであり、炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンがメトキシドイオンである上記＜９＞に記載のキット。
＜１１＞酸性水溶液が、酢酸、塩酸、リン酸、及びホウ酸からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物の水溶液である上記＜９＞又は＜１０＞に記載のキット。
＜１２＞疎水性溶媒及び両親媒性溶媒を備え、疎水性溶媒が、脂肪族炭化水素溶媒、脂環式炭化水素溶媒、ハロゲン化炭化水素溶媒、芳香族炭化水素溶媒、エーテル溶媒及び有機酸アルキルエステル溶媒からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物であり、両親媒性溶媒が、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、アセトン及びメチルエチルケトンからなる群から選択される１種又は２種以上の混合物である上記＜９＞〜＜１１＞のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明方法及びそれを用いたキットによれば、薄層クロマトグラフィー等を用いて脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を分画することなく、試料と試薬とを混合するだけの簡便な操作で、脂肪酸エステル由来であるのか、遊離脂肪酸由来であるのか、脂肪酸の組成を精度よく識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のフローチャートである。
【図２】実験例１の実施例１〜３で試験した脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸のガスクロマトグラムである。
【図３】実験例２の実施例４で試験したトリグリセリドの採取量と測定したピークの面積比を示す検量線である。
【図４】実験例２の実施例５で試験したジグリセリド及びモノグリセリドの採取量と測定したピークの面積比を示す検量線である。
【図５】実験例２の実施例６で試験したワックスエステルの採取量と測定したピークの面積比を示す検量線である。
【図６】実験例２の実施例７で試験したコレステロールエステルの採取量と測定したピークの面積比を示す検量線である。
【図７】実験例２の実施例８で試験した遊離脂肪酸の採取量と測定したピークの面積比を示す検量線である。
【図８】実験例７の実施例１７で試験した皮脂のガスクロマトグラムのうち、測定した脂肪酸メチル（脂肪酸エステル由来）及び遊離脂肪酸ＴＭＳ（遊離脂肪酸由来）のピークの保持時間と面積比を示すグラフである。
【図９】実験例７の実施例１８で試験したマウスの血漿のガスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明に記載の「脂肪酸」とは、炭素数１２以上の長鎖脂肪酸ではパルミチン酸、ステアリン酸等の飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸等の一価不飽和脂肪酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸等の多価不飽和脂肪酸が含まれ、他に炭素数５〜１１の中鎖脂肪酸、炭素数２〜４の短鎖脂肪酸等、鎖状モノカルボン酸のことをいう。これらの脂肪酸はトリグリセリドやワックスエステル等のエステル型として、後述する脂肪酸エステルの構成成分である他、遊離型として、後述する遊離脂肪酸としても脂質に存在する。これらの脂肪酸は、殆どが脂質に含まれるが、タンパク質や糖質に含まれる場合もある。
【００１９】
本発明に記載の「脂肪酸エステル」とは、中性脂肪と呼ばれるトリグリセリド（油脂）の他、ジグリセリド、モノグリセリド、ワックスエステル又はコレステロールエステル等、脂肪酸のカルボキシル基とグリセリン、高級アルコール又はコレステロール等の水酸基が脱水縮合して生じるエステル結合を含む化合物又はそのような化合物を含む組成物のことをいう。
【００２０】
本発明に記載の「遊離脂肪酸」とは、遊離型の非エステル化脂肪酸又はその塩のことをいう。遊離脂肪酸はトリグリセリド等の脂肪酸エステルが、例えば、酵素等によって加水分解されると生じる。
【００２１】
本発明に記載の「脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を含む試料」としては、動植物の組織及びその代謝物や分泌物等の生体試料、食品原材料等の採取、抽出、精製、加工、合成品等、構成成分として脂肪酸が含まれるものが挙げられる。これらの試料は、血液、血漿、微生物等、水を含む場合は、凍結乾燥、乾固、あるいは疎水性溶媒層に抽出、精製する等して、脂肪酸エステルを加水分解する原因となる水分を除くことが好ましいが、油脂等、水を含まない場合は、そのままでも本発明に供することができる。
【００２２】
本発明に記載の「炭素数１〜４の低級アルコール」としては、種々のものを採用することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール及びブタノールが挙げられる。炭素数１〜４の低級アルコールは、試料中の脂質等を溶解する溶媒となるとともに、アルキル基の供与体となる。炭素数１〜４の低級アルコールの使用量は、特に限定されず、試料に対して過剰量とすればよい。
【００２３】
本発明に記載の「炭素数１〜４の低級アルコキシドイオン」は、金属アルコキシドに由来してもよく、又は、炭素数１〜４の低級アルコールの脱プロトン化により生じてもよい。金属アルコキシドとしては、低級アルコキシドイオンを含む種々のものを採用することができ、例えば、アルカリ金属アルコキシド、アルカリ土類金属アルコキシド、好ましくは、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシドであってもよい。炭素数１〜４の低級アルコールの脱プロトン化は、強塩基又はアルカリ金属によって行ってもよい。強塩基としては、アルコキシドよりも塩基性が強い種々のものを採用することができ、例えば、金属水酸化物、金属アミド、アルキル金属、金属水素化物、好ましくは、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属アミド、アルキル・アルカリ金属、アルカリ金属水素化物、より好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムアミド、ブチルリチウム、水素化カリウムであってもよい。脱プロトン化のためのアルカリ金属としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム又はセシウムを採用してもよい。炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンは、反応液をアルカリ性にして、後述する低級アルキル化を可能とするとともに、アルキル基の供与体となる。
【００２４】
一般に、エステル交換反応とは、エステルのアルコキシル基やアシル基を他のアルコキシル基やアシル基と交換する反応をいう。
【００２５】
本発明に記載の「低級アルキル化」とは、トリグリセリド、ワックスエステル又はコレステロールエステル等の脂肪酸エステルのカルボニル基に炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンが付加して、エステル交換反応が起き、後述する脂肪酸低級アルキルが生成する反応をいう。
【００２６】
本発明に記載の「低級アルキル化液」は、炭素数１〜４の低級アルコール及び炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンを含み、これらは脂肪酸エステルの低級アルキル化に使用され、アルキル基の供与体となり得る。
【００２７】
低級アルキル化液中で、低級アルコキシドイオンの濃度は、通常０．０５Ｍ〜５Ｍとすればよく、０．１Ｍ〜４Ｍ程度が好ましく、０．５Ｍ〜３Ｍ程度がより好ましい。試料に対する低級アルキル化液の添加量は、試料中の脂肪酸エステル１ｍｇあたり、通常０．５〜１００μＬとすればよく、１〜２０μＬ程度が好ましく、２〜１０μＬ程度がより好ましい。上記範囲であれば、十分に低級アルキル化を行える。また、低級アルコキシドイオン濃度を高くすると、その分、高濃度の酸を用いて反応液を酸性にして低級アルキル化を停止する必要が生じるため、適正な液量とするために上記濃度範囲が好ましい。低級アルキル化は、１０〜４０℃の温度で、３〜６０分間行えばよい。通常、脂肪酸エステルのうち、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、ワックスエステル、コレステロールエステルを分析対象にする場合は、２０〜３０℃で、５〜２０分間行うことが好ましい。反応温度が４０℃を超えると、試料の分解や酸化が促進される傾向があり、反応時間が６０分を超えると、低級アルキル化された脂肪酸エステルがけん化されて遊離脂肪酸塩が副生する傾向がある。
【００２８】
本発明に記載の「脂肪酸低級アルキル」とは、脂肪酸エステルのカルボニル基に炭素数１〜４の低級アルコキシドイオンが付加して生じるエステル結合を含む化合物をいう。
【００２９】
低級アルキル化された脂肪酸エステルを分析に供するには、本発明の産物である脂肪酸低級アルキルのアルキル基の種類を統一する必要がある。従って、第１工程で使用する低級アルコールと低級アルコキシドの炭素数は統一する。炭素数が１２以上の長鎖脂肪酸のような分子量の大きい脂肪酸を分析対象にする場合は、最も短鎖のアルコールであるメタノール及びメトキシドを用いて、脂肪酸の低級アルキルエステルの揮発性を高め、溶出時間を早くするのが好ましい。
【００３０】
一方、炭素数が１２より小さい中鎖脂肪酸又は短鎖脂肪酸のような分子量の小さい脂肪酸を分析対象にする場合は、エチルエステル化、プロピルエステル化、ブチルエステル化等により揮発性を低くして、試料が蒸散してしまうのを防止するのが好ましい。溶媒の使用量は、試料に対して過剰量とすればよい。
【００３１】
本発明に記載の「疎水性溶媒」とは、水に混和せず二層に分離する溶媒のことをいう。疎水性溶媒は、試料中の脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を抽出する。疎水性溶媒としては、種々のものを採用することができ、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン等の脂肪族炭化水素溶媒、シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素溶媒、四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素溶媒、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル等のエーテル溶媒、酢酸メチル、プロピオン酸メチル等の有機酸アルキルエステル溶媒から成る群から選択される１種又は２種以上の混合物であってもよい。また、疎水性溶媒は、低級アルキル化により生成した脂肪酸低級アルキル及び／又は遊離脂肪酸を反応液から抽出し、分離することができる。なお、第１工程で疎水性溶媒として有機酸アルキルエステルを使用する場合は、そのアルキル基の炭素数も、第１工程で供与するアルキル基と同じにする。例えば、第１工程でメタノール及びメトキシドを使用する場合は、有機酸メチルを使用する。
【００３２】
本発明に記載の「疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒」とは、溶解液に使用する疎水性溶媒と混ぜ合わせても二層に分離せず、かつ水と混ぜ合わせても二層に分離しない溶媒のことをいう。両親媒性溶媒は、疎水性溶媒に対して混和し、かつ炭素数１〜４の低級アルコール溶媒に対しても混和するので、低級アルキル化の場を提供する仲介役として機能し、反応の効率を高めることができる。両親媒性溶媒としては、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和するもの、特に、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸の溶解に用いられる疎水性溶媒及び低級アルキル化に用いられる炭素数１〜４の低級アルコール溶媒の各々に対して混和する種々の溶媒を採用することができ、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、エチレングリコールジメチルエーテル、アセトン及びメチルエチルケトンから成る群から選択される１種又は２種以上の混合物であってもよい。
【００３３】
なお、脂肪酸低級アルキルの加水分解を抑制するためには、予め疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒並びに低級アルキル化液は、蒸留して精製するか、モレキュラーシーブを加える等して、乾燥させることが好ましい。また、疎水性溶媒として有機酸の炭素数１〜４の低級アルコールエステルを使用する場合は、試料に水が含まれていても、この低級アルコールエステルが競合して加水分解されるため、分析対象となる脂質の加水分解による遊離脂肪酸の副生が抑えられる。
【００３４】
本発明に記載の「溶解液」とは、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を含む試料から、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を溶解する溶媒のことをいう。溶解液は、疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒とを含む。ある態様では、試料に添加する前に、疎水性溶媒と両親媒性溶媒とを混合して溶解液を調製してもよい。別の態様では、試料に疎水性溶媒を添加し、続いて両親媒性溶媒を添加して、又は、試料に両親媒性溶媒を添加し、続いて疎水性溶媒を添加して、脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸の抽出又は溶解の場で溶解液を調製してもよい。
【００３５】
本発明に記載の「酸性水溶液」としては、酢酸、塩酸、リン酸、及びホウ酸からなる群から選択される１種又は２種以上の混合物の水溶液が挙げられる。ただし、試料に遊離脂肪酸として酢酸が含まれる場合は、酢酸を除く他の酸を用いることが好ましい。酸性水溶液の酸の濃度は、通常０．０５Ｍ〜５Ｍとすればよく、０．１Ｍ〜４Ｍ程度が好ましく、０．２Ｍ〜２Ｍ程度がより好ましい。酸性水溶液の添加後の溶液のｐＨは、２〜４が好ましい。上記範囲であれば、反応液を酸性にして、低級アルキル化を停止させ、脂肪酸低級アルキル及び／又は遊離脂肪酸を疎水性溶媒層に抽出することができる。
【００３６】
本発明に記載の「停止・分離液」は、酸性水溶液を含み、低級アルキル化でアルカリ性となった反応液のｐＨを低下させて反応を停止させるとともに、生成した脂肪酸低級アルキルの他、遊離脂肪酸を含む疎水性溶媒層と、それらを含まない水層の二層に分離する役割を果たす。
【００３７】
本発明に記載の「シリル化剤」としては、種々のものを採用することができる。なかでも、トリメチルシリル（以下「ＴＭＳ」とする）化剤は汎用性が高く、例えば、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（以下「ＢＳＴＦＡ」とする）、Ｎ，Ｏ−ビストリメチルシリルアセトアミド（以下「ＢＳＡ」とする）、トリメチルクロロシラン（以下「ＴＭＣＳ」とする）等は、反応性が高く、温和な条件で後述するシリル化反応を可能とするとともに、シリル基の供与体となる。
【００３８】
一般に、シリル化反応とは、有機化合物中の水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、メルカプト基等の活性水素を、シリル基に置換する反応をいう。シリル化液を使用した場合には、遊離脂肪酸の水酸基の活性水素がシリル基に置換する。
【００３９】
本発明に記載の「シリル化液」は、シリル化剤を含み、シリル化剤のみでも、あるいは疎水性溶媒に溶解し、さらにピリジン等の塩基や触媒を含んでもよい。シリル化液は遊離脂肪酸のシリル化反応に使用され、シリル基の供与体となり得る。
【００４０】
試料に対するシリル化液の使用量は、特に限定されず、試料に対して過剰量とすればよく、十分にシリル化反応が進行する。さらに、シリル化剤の使用に先立って、採取した疎水性溶媒層を、窒素の吹き付け、遠心エバポレーター等により、疎水性溶媒を留去しても、そのままシリル化反応に供してもよい。シリル化反応は、通常１０〜４０℃の温度で、１５〜１２０分間行えばよい。
【００４１】
本発明に記載の「脂肪酸シリル」とは、遊離型の脂肪酸の水酸基の活性水素がシリル基に置換した化合物をいう。第１工程で分離した疎水性溶媒層には脂肪酸低級アルキルの他、試料由来の遊離脂肪酸が含まれる。この疎水性溶媒層を採取し、抽出された遊離脂肪酸をシリル化剤と反応させることにより、脂肪酸シリルを得ることができる。
【００４２】
脂肪酸シリルは、脂肪酸低級アルキルとともに、反応液をそのまま、あるいは希釈して分析に供することができる。
【００４３】
本発明により、試料に含まれる脂肪酸のうち、選択的に、その全脂肪酸エステルを炭素数１〜４の低級アルコールと低級アルキル化でき、かつ、その全遊離脂肪酸をシリル化することができる。生成した脂肪酸低級アルキル及び／又は脂肪酸シリルは、試料中の脂肪酸組成の分析のために使用される。脂肪酸低級アルキル及び／又は脂肪酸シリルを分析して、その脂肪酸部分の化学構造、すなわちエステル型の脂肪酸部分の構造及び／又は遊離型の脂肪酸部分の構造を決定することができる。分析は、種々の手段によって行うことができ、例えば、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーによって行ってもよい。例えば、ガスクロマトグラフィーに供すると、脂肪酸部分の構造が同じであっても、脂肪酸低級アルキルと脂肪酸シリルでは、沸点等の物性の違いにより保持時間が異なるため、その由来が脂肪酸エステルであるのか、遊離脂肪酸であるのかを識別できる。特に、検出器に質量分析器を用いる場合は、マススペクトルを解析することにより、脂肪酸低級アルキルと脂肪酸シリルを識別できるため、構成する脂肪酸の組成を容易に分析することができる。その脂肪酸組成を分析することにより、皮脂であれば代謝の状態を定めたり、血液であれば健康状態のチェックや疾患の診断を行えたり、また、食品原材料であれば品質管理や製造管理に用いたりすることができる。
【００４４】
以下、本発明について実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００４５】
実験例１（脂肪酸エステルのメチル化及び遊離脂肪酸のＴＭＳ化）
この実験例では、メタノール及びメトキシドイオンにより、脂肪酸エステルをメチル化すること、かつシリル化剤により、遊離脂肪酸をＴＭＳ化することを実施例１〜３及び比較例１及び２と比較して検討した。
【００４６】
＜試料＞
試験管に表１に示すように、脂肪酸エステルとして、トリグリセリドのトリオレイン（以下、脂肪酸組成を炭素鎖数と不飽和数を用いて「Ｃ１８：１」のように表す）、トリステアリン（Ｃ１８）及び／又は遊離脂肪酸として、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）を含む混合物を試料として採取した。
【００４７】
【表１】
2019104709.tif 000003
【００４８】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
使用した溶媒、溶液及び試薬を表２に示すように、各試料に溶解液としてヘキサン１ｍＬ及びテトラヒドロフラン（脱水）１ｍＬを加え、室温で１０秒間よく撹拌し、溶解した。実施例１〜３及び比較例２では、この溶液に低級アルキル化液として２Ｍカリウムメトキシド／メタノール溶液（脱水）０．２ｍＬを加え、１０秒間よく撹拌した後、室温で１０分間反応させ、脂肪酸エステルをメチル化した。この反応液に、停止・分離液として１Ｍ酢酸２ｍＬを加え、１０秒間よく撹拌して、メチル化反応を停止した。続いて、室温で１０分間静置し、さらに毎分３０００回転で３分間遠心分離して、二層に分離させた。比較例１では、低級アルキル化液に代えてメタノール０．２ｍＬを加えた後は、実施例１〜３と同様に操作した。
【００４９】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
使用した溶媒、溶液及び試薬を表２に示すように、上記の上層（疎水性溶媒層）０．２ｍＬをバイアル瓶に採取し、遠心エバポレーター（毎分１０００回転、３５℃、３０分間）で溶媒を留去した。実施例１〜３及び比較例１では、この残留物にシリル化液としてＴＭＣＳ／ＢＳＡ／ピリジン混液（４：１：４）０．０５ｍＬを加え、室温で６０分間反応させ、遊離脂肪酸をＴＭＳ化した。この反応液にヘキサン０．９５ｍＬを加えて、試料溶液とした。比較例２では、シリル化液に代えてヘキサン０．０５ｍＬを加えた後は、実施例１〜３と同様に操作した。
【００５０】
【表２】
2019104709.tif 000004
【００５１】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、下記の試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行い、脂肪酸メチル及び脂肪酸トリメチルシリル（以下、「脂肪酸ＴＭＳ」とする）のピークの保持時間を求めた。
＜試験条件＞ＧＣ−ＦＩＤ
機器            ：島津ＧＣ２０１０
カラム          ：Ｒｔｘ−１  シリカキャピラリーカラム
（０．３２ｍｍＩＤ×３０ｍ、０．２５μｍ厚）
カラム温度      ：７０℃（０分保持）→昇温５℃／分→３２０℃（１０分保持）
気化室温度      ：３３０℃
キャリヤーガス  ：ヘリウム
流量            ：毎分２．０ｍＬ
スプリット比    ：スプリットレス
検出器          ：ＦＩＤ
検出器温度      ：３３０℃
試料注入量      ：１μＬ
【００５２】
ＧＣ分析の結果のうち、実施例１〜３のクロマトグラムを図２に示す。試料が脂肪酸エステルのみの混合物である実施例１の場合は、その脂肪酸組成に由来するオレイン酸メチル及びステアリン酸メチルのピークが検出されたが、ＴＭＳ化されたピークは検出されなかった。また、試料が遊離脂肪酸のみの混合物である実施例２の場合は、その脂肪酸組成に由来するラウリン酸ＴＭＳ、ミリスチン酸ＴＭＳ、パルミチン酸ＴＭＳ及びステアリン酸ＴＭＳのピークが検出されたが、メチル化されたピークは検出されなかった。さらに、試料が脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸の混合物である実施例３の場合は、脂肪酸エステルの脂肪酸組成に由来するオレイン酸メチル及びステアリン酸メチルのピーク、及び遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来するラウリン酸ＴＭＳ、ミリスチン酸ＴＭＳ及びパルミチン酸ＴＭＳのピークが検出された。また、実施例１〜３及び比較例１、２で検出されたピークの保持時間を表３に示す。低級アルキル化液を用いず、メチル化しない比較例１の場合は、脂肪酸エステルの脂肪酸組成に由来するピークが検出されなかった。また、シリル化液を用いず、ＴＭＳ化しない比較例２の場合は、遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来するピークが検出されなかった。よって、本発明の方法では、薄層クロマトグラフィー等を用いて脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を分画することなく、試料と試薬とを混合するだけの簡便な操作で、脂肪酸エステル由来であるのか、遊離脂肪酸由来であるのか、脂肪酸の組成を精度よく識別することができることが分かる。さらに、試料に脂肪酸エステル又は遊離脂肪酸が含まれていないことを確認することもできる。
【００５３】
【表３】
2019104709.tif 000005
【００５４】
実験例２（検量線の検討）
この実験例では、本発明で検出されるピーク面積の直線性を確認するために、皮脂の構成成分のうち、脂肪酸エステルであるトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、ワックスエステル又はコレステロールエステル、並びに遊離脂肪酸について、本発明に従い検量線を作成し、直線性を検討した。
【００５５】
＜試料＞
試験管に表４に示すように、脂肪酸エステルとして、トリグリセリドのトリパルミチン（Ｃ１６）、トリオレイン（Ｃ１８：１）、トリステアリン（Ｃ１８）、ジグリセリドのジステアリン酸グリセリド（Ｃ１８）、モノグリセリドのモノミリスチン酸グリセリド（Ｃ１４）、モノオレイン酸グリセリド（Ｃ１８：１、モノリノール酸グリセリドを含む）、ワックスエステルのミリスチン酸ヘキサデシル（Ｃ１４）、パルミチン酸ヘキサデシル（Ｃ１６）及びコレステロールエステルのパルミチン酸コレステロール（Ｃ１６）、ステアリン酸コレステロール（Ｃ１８）、及び遊離脂肪酸のラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、ステアリン酸（Ｃ１８）について、各々０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇを含む混合物を試料として採取した。
【００５６】
【表４】
2019104709.tif 000006
【００５７】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
疎水性溶媒として、３，５，５−トリメチルヘキサン酸（内標準物質）を含有するヘキサン１ｍＬを加えた後は、実施例１と同様に操作し、脂肪酸エステルをメチル化した後、二層に分離させた。
【００５８】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
上記の上層（疎水性溶媒層）０．０５ｍＬをバイアル瓶に採取した。この採取物にシリル化液としてＢＳＴＦＡ０．２ｍＬを加え、室温で６０分間反応させ、遊離脂肪酸をＴＭＳ化した。この反応液にヘキサン０．７５ｍＬを加えて、試料溶液とした。
【００５９】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、実験例１と同じ試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行い、内標準物質のピーク面積に対する脂肪酸メチル及び脂肪酸ＴＭＳのピーク面積の比Ｒを求めた。
【００６０】
ピーク面積比Ｒを縦軸にとり、各試料の採取量を横軸にとって最小二乗法により検量線を作成したところ、本発明方法は、測定範囲において十分な直線性を持つことを確認した（図３〜図７）。
【００６１】
実験例３（溶解液の検討）
この実験例では、溶解液の疎水性溶媒と、疎水性溶媒及び水の各々に対して混和する両親媒性溶媒について、実施例及び比較例を比較して検討した。
【００６２】
＜試料＞
実施例３と同様に脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を含む混合物を試料とした。
【００６３】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
表５に示すように、疎水性溶媒として、実施例１０ではヘキサンを加えた。また、実施例１１ではヘキサンに代わり、ｔ−ブチルメチルエーテルを加え、実施例１２では代わりにプロピオン酸メチルを加えた。さらに比較例３では、両親媒性溶媒に代えて、メタノールを加え、また、比較例４では代わりにヘキサンを加えた。いずれも、その後は、実施例４と同様に操作した。
【００６４】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
実施例４と同様に操作して、試料溶液とした。
【００６５】
【表５】
2019104709.tif 000007
【００６６】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、実験例１と同じ試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行った。
【００６７】
ＧＣ分析の結果、実施例１０〜１２の場合は、脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来するピークが実施例３と同様に検出されたが、比較例３又は４の場合は、脂肪酸エステルの脂肪酸組成に由来する脂肪酸メチルのピークの面積が小さかった。これは試料が十分溶解せず、また反応液が均一でないため、メチル化の効率が低くなったためと考えられた。
【００６８】
実験例４（停止・分離液の検討）
この実験例では、停止・分離液について、実施例及び比較例を比較して検討した。
【００６９】
＜試料＞
実施例３と同様に脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を含む混合物を試料とした。
【００７０】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
酸性水溶液として、実施例１３では１Ｍ酢酸、実施例１４では１Ｍ塩酸を加えた以外は、実施例４と同様に操作した。比較例５では、酸性水溶液に代えて、水を加えた以外は、実施例４と同様に操作した。
【００７１】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
実施例４と同様に操作して、試料溶液とした。
【００７２】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、実験例１と同じ試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行った。
【００７３】
ＧＣ分析の結果、実施例１３及び１４の場合は、脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来するピークが実施例３と同様に検出された。比較例５の場合は、遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来する脂肪酸ＴＭＳのピークが検出されなかった。これは遊離脂肪酸が疎水性溶媒層に抽出されなかったためと考えられた。
【００７４】
実験例５（工程順序の検討）
この実験例では、第一工程の脂肪酸エステルのメチル化と、第二工程の遊離脂肪酸のＴＭＳ化の工程順序を逆にした比較例について、検討した。
【００７５】
＜試料＞
実施例３と同様に脂肪酸エステルと遊離脂肪酸を含む混合物を試料とした。
【００７６】
＜第一工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
比較例６では、脂肪酸エステルのメチル化に先立ち、遊離脂肪酸のＴＭＳ化を行った。つまり、試料にシリル化液としてＢＳＴＦＡ０．２ｍＬを加え、室温で６０分間反応させ、遊離脂肪酸をＴＭＳ化した。この反応液にヘキサン１ｍＬ及び水１ｍＬを加え、１０秒間よく撹拌した。続いて、室温で１０分間静置し、さらに毎分３０００回転で３分間遠心分離して、二層に分離させた。
【００７７】
＜第二工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
上記の上層（ヘキサン層）０．２ｍＬを試験管に採取し、ヘキサン０．８ｍＬを加え、さらにテトラヒドロフラン（脱水）１ｍＬを加え、室温で１０秒間よく撹拌した。この溶液に低級アルキル化液として２Ｍカリウムメトキシド／メタノール溶液（脱水）０．２ｍＬを加え、１０秒間よく撹拌した後、室温で１０分間反応させ、脂肪酸エステルをメチル化した。この反応液に、停止・分離液として１Ｍ酢酸２ｍＬを加え、１０秒間よく撹拌して、メチル化反応を停止した。続いて、室温で１０分間静置し、さらに毎分３０００回転で３分間遠心分離して、二層に分離させた。この上層（疎水性溶媒層）１ｍＬを試料溶液とした。
【００７８】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、実験例１と同じ試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行った。
【００７９】
ＧＣ分析の結果、比較例６は、脂肪酸エステルの脂肪酸組成に由来する脂肪酸メチルのピークは検出されたが、遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来する脂肪酸ＴＭＳのピークは検出されず、遊離型の脂肪酸であるブロードなピークのみが検出された。これは第一工程で生成した脂肪酸ＴＭＳが、加水分解されたためと考えられた。よって、工程順序を逆にすると、遊離脂肪酸をシリル化した誘導体は得られないことが確認された。
【００８０】
実験例６（メチル化の反応条件の検討）
この実験例では、メチル化の反応温度と時間について、実施例及び比較例を比較して検討した。
【００８１】
＜試料＞
試験管に表６に示すように、擬似皮脂として脂肪酸エステル、遊離脂肪酸、その他の脂質を含む混合物を２０ｍｇずつ採取した。
【００８２】
【表６】
2019104709.tif 000008
【００８３】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
反応温度として、実施例１５では１０℃、２０℃、３０℃、４０℃に調整し、比較例７では５０℃、６０℃に調整した以外は、実施例４と同様に操作した。また、反応時間として、実施例１６では３分、５分、１０分、２０分、３０分、６０分に調整し、比較例８では９０分、１２０分に調整した以外は、実施例４と同様に操作した。
【００８４】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
実施例４と同様に操作して、試料溶液とした。
【００８５】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、下記の試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行った。
＜試験条件＞ＧＣ−ＭＳ
機器                ：日本電子ＪＭＳ−Ｑ１０００ＧＣ
カラム              ：ＨＰ−５  シリカキャピラリーカラム
（０．３２ｍｍＩＤ×３０ｍ、０．２５μｍ厚）
カラム温度          ：７０℃（０分保持）→昇温５℃／分→３２０℃（１０分保持）
気化室温度          ：３００℃
キャリヤーガス      ：ヘリウム
流量                ：毎分１．５ｍＬ
スプリット比        ：スプリットレス
検出器              ：ＭＳ
インターフェイス温度：２８０℃
イオン源温度        ：２５０℃
試料注入量          ：１μＬ
【００８６】
試料の成分のうち、ミリスチン酸ヘキサデシルに注目して、脂肪酸エステルのメチル化を評価した。得られたクロマトグラムのピークのうち、メチル化された生成物であるミリスチン酸メチルのピーク面積Ｑ１及びミリスチン酸メチルが加水分解された後、シリル化された副生成物であるミリスチン酸ＴＭＳのピーク面積Ｑ２について、出発物質であるミリスチン酸ヘキサデシルのピーク面積Ｑ３を含めた３つのピーク面積の総和（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３）に対する面積比をメチル化率及び加水分解率として、比較した。
メチル化率（％）＝Ｑ１／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３）×１００
加水分解率（％）＝Ｑ２／（Ｑ１＋Ｑ２＋Ｑ３）×１００
結果を表７に示す。反応温度については、１０℃〜３０℃では、すべてのミリスチン酸ヘキサデシルがメチル化され、４０℃では、わずかな加水分解物が副生成したものの、生成したミリスチン酸メチルのほぼすべてが残存した。しかし、５０℃を超えると副生成物が増えることが確認された。また、反応時間については、３〜３０分で、すべてのミリスチン酸ヘキサデシルがメチル化され、６０分では、わずかな加水分解物が副生成したものの、生成したミリスチン酸メチルのほぼすべてが残存した。しかし、９０分を超えると副生成物が徐々に増えることが確認された。
【００８７】
【表７】
2019104709.tif 000009
【００８８】
実験例７（試料の検討）
この実験例では、皮脂、血漿及び油脂について本発明方法を検討した。
【００８９】
＜試料＞
実施例１７：皮脂
額の皮脂約５ｍｇをあぶらとり紙に拭き取り、試験管に入れて、試料とした。
実施例１８：血漿
マウスの血漿０．４ｍＬにＢＨＴ０．０５％を含むクロロホルム／メタノール混液（２：１）５ｍＬを加え、３０秒撹拌し、さらに３０秒毎に１０分間撹拌した。これに水５ｍＬを加え、３０秒撹拌した。次に遠心分離（毎分３０００回転、５分）し、下層を別のチューブに採った。残った上層にＢＨＴ０．０５％を含むクロロホルム／メタノール混液（２：１）５ｍＬを加え、３０秒撹拌した。遠心分離（毎分３０００回転、５分）し、下層を先のチューブに加えた。これを遠心エバポレーター（毎分１０００回転、３７℃、２時間）で、溶媒を留去し、試料とした。
実施例１９：油脂
アーモンド油、アボカド油、オリーブ油、ツバキ種子油、ユチャ種子油、マカデミア種子油、各々１０ｍｇを試料とした。
【００９０】
＜第一工程：脂肪酸エステルのメチル化＞
実施例４と同様に操作した。
【００９１】
＜第二工程：遊離脂肪酸のＴＭＳ化＞
実施例４と同様に操作して、試料溶液とした。
【００９２】
＜ＧＣ分析＞
試料溶液につき、実験例６と同じ試験条件でガスクロマトグラフィーにより試験を行った。
【００９３】
ＧＣ分析の結果について、実施例１７を図８に、実施例１８を図９に、実施例１９を表８に示すように、脂肪酸エステルの脂肪酸組成に由来する脂肪酸メチル及び遊離脂肪酸の脂肪酸組成に由来する脂肪酸ＴＭＳのピークに基づいて、脂肪酸の組成を分析することができた。以上により、本発明によって調製された脂肪酸メチル及び脂肪酸ＴＭＳは、種々の試料中の脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸の脂肪酸組成を分析するのに有用であることがわかった。
【００９４】
【表８】
2019104709.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、試料に含まれる脂肪酸エステル及び／又は遊離脂肪酸を構成する脂肪酸の組成をガスクロマトグラフィー等により分析するのに先立って、試料と試薬とを混合するだけの簡便な操作で脂肪酸エステルを低級アルキル化し、かつ遊離脂肪酸をシリル化する方法並びにそのキットを提供する。従って、皮脂、血液、油脂等の脂肪酸組成を分析し、皮膚の代謝状態、特定疾患の診断や製品の品質管理等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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