(57)【要約】【課題】浮遊性細胞を高密度に培養し、培養終了後に不要になった培養液成分を除去（洗浄）し、増殖した細胞を高率に回収できる培養細胞の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、選択透過性膜により内部が第１室および第２室に区画された細胞培養容器を用いて浮遊性細胞を培養し、洗浄し、回収する培養細胞の製造方法であって、（１）前記第１室に前記浮遊性細胞を含む細胞懸濁液を充填した後、前記第２室に細胞培養液を流動して前記第１室に導入した前記浮遊性細胞を培養する工程、（２）培養を停止した後、前記第１室に細胞洗浄液を導入するとともにろ過をかけて前記浮遊性細胞を洗浄する工程、（３）洗浄した前記浮遊性細胞を前記細胞洗浄液とともに前記細胞培養容器から回収する工程、を含む、培養細胞の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択透過性膜により内部が第１室および第２室に区画された細胞培養容器を用いて浮遊性細胞を培養し、洗浄し、回収する培養細胞の製造方法であって、
（１）前記第１室に前記浮遊性細胞を含む細胞懸濁液を充填した後、前記第２室に細胞培養液を流動して前記第１室に導入した前記浮遊性細胞を培養する工程、
（２）培養を停止した後、前記第１室に細胞洗浄液を導入するとともにろ過をかけて前記浮遊性細胞を洗浄する工程、
（３）洗浄した前記浮遊性細胞を前記細胞洗浄液とともに前記細胞培養容器から回収する工程、
を含む、培養細胞の製造方法。
【請求項２】
前記浮遊性細胞は、遺伝子改変された細胞である、請求項１に記載の培養細胞の製造方法。
【請求項３】
前記浮遊性細胞は、リンパ球である、請求項１または２に記載の培養細胞の製造方法。
【請求項４】
前記選択透過性膜は、前記第１室側の表面の平均孔径が１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
【請求項５】
前記選択透過性膜は、最大孔径が２０００ｎｍ未満である、請求項１〜４のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
【請求項６】
前記選択透過性膜は、中空糸型選択透過性膜である、請求項１〜５のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
【請求項７】
前記選択透過性膜は、内径が１００μｍ以上１５００μｍ以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択透過性膜を含む細胞培養容器を用いてリンパ球等の浮遊性細胞を培養し、洗浄し、回収することが可能な培養細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４のがんの治療法として、がん免疫療法が近年注目を集めている。がん免疫療法は、本来ヒトが持っている免疫の力を利用した、がんに対する治療法の総称であるが、その一つに免疫細胞療法がある。これは、がん患者の血液中のリンパ球や、リンパ球にがん細胞の抗原を提示する樹状細胞といった免疫系細胞を体外に取り出し、培養・強化した後に体の中に戻し、免疫力を高めることによりがんを治療しようとする方法である。近年、免疫チェックポイント阻害剤が登場したことにより、改めてがんに対する免疫細胞療法の重要性が高まってきたといえる。
【０００３】
現在、免疫細胞療法に用いる細胞、例えばＴリンパ球の培養は、フラスコやフラスコを模した培養バッグで行われている。フラスコや培養バッグを用いる細胞培養は、操作が単純、簡便であるという反面、面積や容積を大きくする必要があり、多くの培養スペースが必要であり、また、自動培養装置などにおいては装置が大型化するといった問題がある。
【０００４】
また、培養した細胞を免疫細胞治療に用いる場合は、患者体内に静脈点滴で戻すため、培養液成分を可能な限り除去する必要がある。即ち、細胞培養終了後は細胞を多量の培養液とともに回収し、遠心分離用容器に分注して遠心分離により培養液を除去し、生理食塩液等を加えて細胞を再懸濁するといった操作を複数回繰り返すことにより培養液を除去する必要がある。
【０００５】
特許文献１、２には、中空糸膜を用いて細胞の懸濁液を濃縮する機構が示されており、こういった装置を利用することにより培養液を除去することが可能である。しかしながら従来、細胞の培養、洗浄、回収の工程は、それぞれ別工程になっているため、工程移送時の作業の煩雑さや回収率の低下、コンタミの問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２１０１８７号公報
【特許文献２】特開２０１６−１１６４６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、浮遊性細胞を高密度に培養し、培養終了後に不要になった培養液成分を除去（洗浄）し、増殖した細胞を高率に回収できる培養細胞の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．選択透過性膜により内部が第１室および第２室に区画された細胞培養容器を用いて浮遊性細胞を培養し、洗浄し、回収する培養細胞の製造方法であって、
（１）前記第１室に前記浮遊性細胞を含む細胞懸濁液を充填した後、前記第２室に細胞培養液を流動して前記第１室に導入した前記浮遊性細胞を培養する工程、
（２）培養を停止した後、前記第１室に細胞洗浄液を導入するとともにろ過をかけて前記浮遊性細胞を洗浄する工程、
（３）洗浄した前記浮遊性細胞を前記細胞洗浄液とともに前記細胞培養容器から回収する工程、
を含む、培養細胞の製造方法。
２．前記浮遊性細胞は、遺伝子改変された細胞である、１に記載の培養細胞の製造方法。
３．前記浮遊性細胞は、リンパ球である、１または２に記載の培養細胞の製造方法。
４．前記選択透過性膜は、前記第１室側の表面の平均孔径が１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下である、１〜３のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
５．前記選択透過性膜は、最大孔径が２０００ｎｍ未満である、１〜４のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
６．前記選択透過性膜は、中空糸型選択透過性膜である、１〜５のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
７．前記選択透過性膜は、内径が１００μｍ以上１５００μｍ以下である、１〜６のいずれかに記載の培養細胞の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、１つの細胞培養容器を用いて浮遊性細胞の培養、洗浄、回収までを一気通貫に実施することができるため、高額になりがちなリンパ球等の浮遊性細胞の培養細胞の製造コストを抑えることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に用いるプレート型選択透過性膜を収納した細胞培養容器の一例を示す模式図である。
【図２】本発明に用いる中空糸型選択透過性膜を収納した細胞培養容器の一例を示す模式図である。
【図３】本発明に用いる装置構成の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（選択透過性膜）
本発明において、選択透過性膜は、浮遊性細胞を通過せず、培養液成分や細胞の代謝物（老廃物）を透過できるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、セルロースアセテートや再生セルロースなどのセルロース系素材や、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等の合成系素材からなるものが利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、選択透過性膜はこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されたものでもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。選択透過性膜を親水化処理する方法としては、例えば、選択透過性膜をポリビニルピロリドンやエチレン−ビニルアルコール共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。
【００１３】
本発明において、選択透過性膜は、プレート（平膜）型の形状でもよいし、中空糸型の形状でもよいが、浮遊性細胞の培養を行う第１室に面する側（有細胞側）の表面の平均孔径は１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、５００ｎｍ以下である。なお、中空糸型の場合、中空糸の内側（中空部側）を第１室としても、中空糸の外側を第１室としてもよい。第１室に面する側の表面の平均孔径を前記範囲とすることによって、膜表面の孔（穴）への浮遊性細胞の落ち込みを抑制することができる。
【００１４】
本発明において、選択透過性膜は、第１室側（有細胞側）から第２室側（無細胞側）に向かって細孔径が小さくなる傾斜構造であることが好ましい。このような傾斜構造をとることによって、細胞の洗浄工程において培養液成分や細胞代謝物を除去しやすくなる。すなわち、洗浄工程において、培養液成分や細胞代謝物は、膜の孔径よりも小さく洗浄によってその大部分は膜を透過するが、中には膜を透過しないものもあり、第１室側から第２室側に向かってろ過をかけた際に膜内（細孔内）に入り込みトラップされやすくなるため（深層ろ過）、洗浄性を高めることができる。逆に、第１室側（有細胞側）から第２室側（無細胞側）に向かって細孔径が大きくなる傾斜構造の膜を用いると、膜表面に培養液成分や細胞代謝物（老廃物）が溜まることがあり、細胞に再付着することになる。なお、第１室から第２室に向かってろ過をかける際には、第１室側を加圧してもよいし、第２室側を減圧してもよい。
【００１５】
本発明において、選択透過性膜は、最大孔径が２０００ｎｍ未満であることが好ましい。最大孔径を２０００ｎｍ未満とすることにより、培養液成分や細胞代謝物（老廃物）を効率的に膜透過（捕捉）させ、浮遊性細胞を高純度に洗浄することができる。このとき、培養液成分や細胞代謝物（老廃物）を効率的に膜透過させるためには、選択透過性膜の平均孔径が１０ｎｍ以上であることが好ましい。平均孔径を１０ｎｍ以上とすることにより、培養液に含まれるγ−グロブリン（分子量：約１５万、直径約８．４ｎｍ）等の巨大溶質も膜を透過させることができる。選択透過性膜の最大孔径は、より好ましくは、１５ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である。
【００１６】
本発明において、選択透過性膜として、中空糸型選択透過性膜を用いる場合、中空糸型選択透過性膜の内径は、１００μｍ以上１５００μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、１５０μｍ以上１３００μｍ以下である。中空糸型選択透過性膜の内径を前記範囲とすることにより、浮遊性細胞の培養空間を広く確保することができるため、浮遊性細胞同士の接触や膜表面との接触を低減することができ、細胞へのダメージを抑えることができる。中空糸型選択透過性膜の内径を大きくしすぎると、単位容積あたりの膜面積を稼げなくなるためコンパクト性を損なう問題が生ずる。
【００１７】
本発明において、選択透過性膜の膜厚は、１０μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは、５０μｍ以上２５０μｍ以下である。選択透過性膜の膜厚を前記範囲とすることにより、膜内濃度分極を小さく抑えることができるため選択透過性膜を介して細胞液成分や細胞代謝物（老廃物）の物質交換を効率的に行うことができる。
【００１８】
本発明において、選択透過性膜の透水性は特に限定されないが、第１室側と第２室側との物質交換性を高めたり、洗浄工程におけるろ過圧力を低くするためには、透水性の高い膜を用いるのが好ましく、３７℃における純水の透水性が１０〜３０００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇであることが好ましい。より好ましくは、５００〜２０００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇである。そのためには、空隙率が３０〜７５％の選択透過性膜を用いるのが好ましい。
【００１９】
（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器は、選択透過性膜により内部が第１室および第２室に区画された構成のものであればよく、例えば、図１に示すようなプレート型選択透過性膜１により容器２の内部空間が仕切られており、一方の空間が第１室３を構成し、他方の空間が第２室４を構成しているものが挙げられる。また、図２に示すような容器２に数十本〜数万本の中空糸型選択透過性膜１を収納し、中空糸型選択透過性膜１の両端を接着樹脂で容器２に固定した構成のものが挙げられる。この場合、中空糸型選択透過性膜１の内部空間（中空部）を第１室とし、外部空間を第２室としてもよいし、逆に外部空間を第１室とし、内部空間（中空部）を第２室としてもよい。なお、図１、図２において、細胞培養容器は、第１室および第２室にそれぞれ連通する導入口５ａ、６ａおよび排出口５ｂ、６ｂを供えている。
【００２０】
（細胞培養装置）
図３は、本発明に用いる細胞培養装置の一例を示している。図３には、図１に示すプレート型選択透過性膜を収納した細胞培養容器を例示している。細胞培養容器の第１室に連通する導入口５ａには、導入口４０から浮遊性細胞を含む細胞懸濁液を送液するための流路および細胞洗浄液容器７から細胞洗浄液を送液するための流路が接続されている。また、細胞懸濁液と細胞洗浄液の流路を切替えられるように流路の途中にバルブ２０が設けられている。また、前記細胞培養容器の第１室に連通する排出口５ｂには、培養後の細胞回収液を排出するための流路が接続されており、流路の途中には流量調整用のバルブ２１および送液ポンプ３１、細胞回収容器１０または排出口５０への流路を切替えるためのバルブ２２が設けられている。一方、細胞培養容器の第２室に連通する導入口６ａには、培養液貯留容器８から培養液を第２室に送液するための流路が接続されている。また、第２室に連通する排出口６ｂには、細胞培養液または細胞洗浄液を排出するための流路が接続されており、流路の途中には送液ポンプ３０が設けられており、排出された培養液または洗浄液を回収するための回収容器９に接続されている。なお、図３において、図２に示す中空糸型選択透過性膜を収納した細胞培養容器を用いた場合にも、同様の装置構成にて本発明を実施することができる。
【００２１】
（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる細胞としては、特に限定されるものではないが、浮遊性／非接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、浮遊性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、血液幹細胞などの幹細胞、前駆細胞、あるいは血球系のＴリンパ球やナチュラルキラー細胞などでもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子が導入された細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工された細胞であっても良い。
【００２２】
以下、本実施形態の培養細胞の製造方法の各工程について、図３を参照して説明する。
（浮遊性細胞の培養工程）
浮遊性細胞を培養する工程は、細胞培養容器の第１室に充填した浮遊性細胞を含む細胞懸濁液と第２室を流動する細胞培養液とを選択透過性膜を介して接触させることで、拡散現象を利用して細胞培養液から培養液成分を第１室（有細胞側）に移動（膜透過）させ、また培養に伴う細胞代謝物（老廃物）を第２室（無細胞側）に移動（膜透過）させることにより培養環境を整えながら細胞を培養する工程である。
【００２３】
図３を参照して、バルブ２１を閉の状態にして導入口４０より浮遊性細胞を懸濁した細胞懸濁液を送液し第１室３に細胞懸濁液を充填する。細胞懸濁液が充填された後、バルブ２０を閉の状態とする。第１室に細胞懸濁液を充填すると同時または前後においてポンプ３０を起動して培養液貯留容器８から第２室を経由して回収容器９に向かって培養液を送液する。このとき、培養液の流量は、細胞増殖度合いや環境に応じて調整することが好ましい。また、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器およびそれらを繋ぐ流路は、温度およびＣＯ２濃度の制御機構を備えたインキュベータ内に設置することが好ましい。
【００２４】
本発明において、細胞懸濁液は、浮遊性細胞を１×１０５〜１×１０７個／ｍＬになるように細胞培養液に懸濁したものを指す。
【００２５】
本発明において、細胞培養液は、ヒトリンパ球用無血清培養液（株式会社細胞科学研究所）などが使用できる。
【００２６】
（浮遊性細胞の洗浄工程）
浮遊性細胞の洗浄工程は、培養を終了した後の浮遊性細胞を第１室に保持した状態で細胞洗浄液により洗浄する工程である。
【００２７】
図３を参照して、培養を終了した後、バルブ２３を閉止し、次に細胞洗浄液容器７から細胞洗浄液を細胞培養容器の第１室３に送液できるようにバルブ２０を操作し、ポンプ３０を起動する。選択透過性膜１は、培養液成分や細胞代謝物（老廃物）は透過するが、細胞は透過しない孔径を有するため、前記培養液成分や代謝物（老廃物）は洗浄液とともに膜を透過して（ろ過されて）回収容器９に回収される。なお、ろ過圧力が高すぎると、細胞にダメージを与えることになるので、ポンプ出力は適宜調整する必要がある。
【００２８】
本発明において、細胞洗浄液としては、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いるのが好ましい。
【００２９】
（浮遊性細胞の回収工程）
浮遊性細胞の回収工程は、洗浄を終了した培養細胞を洗浄液や培養液とともに第１室より排出し、細胞回収容器１０に回収する工程である。
【００３０】
図３を参照して、浮遊性細胞の洗浄が終了した後、細胞培養容器の第１室より浮遊性細胞を細胞回収容器１０に回収するためにバルブ２１および２２を操作して流路を連通させる。その後、ポンプ３１を起動することにより、浮遊性細胞を含む洗浄液を回収容器１０に回収することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
（膜断面構造の分析）
湿潤状態の選択透過性膜をエタノールで脱水処理し、エポキシ溶液で樹脂包埋した。ミクロトームで膜断面試料を作製し、日立製Ｓ−４８００走査型電子顕微鏡を用いて加速電圧２０ｋＶでＥＤＳによるライン分析を行った。得られたチャートより膜断面の疎密の程度を解析した。例えば、ポリスルホンやポリエーテルスルホン膜の場合は、Ｓ原子について分析を行えばよい。
【００３３】
（選択透過性膜の径および厚みの測定）
選択透過性膜の形状評価は以下の方法で行った。３ｍｍφの穴を開けた２ｍｍ厚のＳＵＳ板の穴に、適量の選択透過性膜を詰め、カミソリ刃でカットして断面を露出させた後、Ｎｉｋｏｎ製の顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ＬＶ１００）およびＮｉｋｏｎ製の画像処理装置（ＤＩＧＩＴＡＬ  ＳＩＧＨＴ  ＤＳ−Ｕ２）およびＣＣＤカメラ（ＤＳ−Ｒｉ１）を用いて、断面の形状を撮影し、画像解析ソフト（ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄ３．００  ＳＰ６）の計算機能により、選択透過性膜の外径、内径および厚みを算出した。
【００３４】
（透水性の測定）
細胞培養容器の導入口５ａ、６ａおよび排出口５ｂ、６ｂに流路を接続し、細胞培養容器への純水の流入圧と細胞培養容器からの純水の流出圧を測定できるようにした。次に、細胞培養容器の第１室および第２室の両方に純水を満たした。導入口５ａから純水を細胞培養容器に導入し、５ｂに接続した流路（圧力測定点よりも下流）および６ａに接続した流路を鉗子で封じて流れを止め、細胞培養容器の５ａから入った純水を全量ろ過するようにした。３７℃に保温した純水を加圧タンクに入れ、レギュレーターにより圧力を制御しながら、３７℃恒温槽で保温した細胞培養容器へ純水を送り、６ｂから流出したろ液量をメスシリンダーで測定した。膜間圧力差（ＴＭＰ）は、ＴＭＰ＝（Ｐｉ＋Ｐｏ）／２とした。ここで、Ｐｉは細胞培養容器の入口側圧力、Ｐｏは細胞培養容器の出口側圧力である。ＴＭＰを４点変化させ、ろ過流量を測定し、それらの関係の傾きから透水性［ｍＬ／ｈｒ／ｍｍＨｇ］を算出した。このときＴＭＰとろ過流量の相関係数は０．９９９以上でなくてはならないとした。選択透過性膜の透水性（ＵＦＲ（Ｈ））は膜面積（Ａ）と細胞培養容器の透水性（ＵＦＲ（Ｄ））から算出した。
ＵＦＲ（Ｈ）＝ＵＦＲ（Ｄ）／Ａ
ここでＵＦＲ（Ｈ）は選択透過性膜の透水性（ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇ）、ＵＦＲ（Ｄ）は細胞培養容器の透水性（ｍｌ／ｈｒ／ｍｍＨｇ）、Ａは細胞培養容器内の選択透過性膜の膜面積（ｍ２）である。
【００３５】
（選択透過性膜表面の平均孔径）
選択透過性膜の表面の平均孔径は、以下のようにして測定した。走査型電子顕微鏡を用いて選択透過性膜の表面を極力多数の細孔の形状が明確に確認できる程度の倍率で撮影した。なお、孔径が１００ｎｍ〜１μｍ程度であれば、３０００倍程度の倍率の電子顕微鏡画像を用いるのが適当である。次に、電子顕微鏡画像のコピーの上に透明シートを重ね、黒いペン等を用いて細孔部分を塗り潰し、透明シートを白紙にコピーした。その後、画像解析ソフトＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事株式会社）を利用して任意に選んだ細孔１００個の孔径を求め、その相加平均値を出すことで平均孔径を算出した。
【００３６】
（選択透過性膜の最大孔径）
選択透過性膜の最大孔径の測定は、Ｐｏｒｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製 パームポロメーター（ＰＰＭ、ＣＦＰ−１２００ＡＥＸ）装置を用いて行った。試験タイプは、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｆｌｏｗ ＰｏｒｏｍｅｔｏｒｙのＷｅｔ Ｕｐ／Ｄｒｙ Ｕｐとし、試液としてＧａｌＷｉｃｋ（表面張力１５．７ｄｙｎｅ／ｃｍ）を使用した。下記に記した測定パラメーターを装置付属の測定用ソフトに入力後、予めＧａｌＷｉｃｋに５分間浸漬させてよく馴染ませた試料をサンプルホルダーにセットし、さらに該ホルダーを装置にセットした。測定はまずＷｅｔ下で実施し、その後に続けてＤｒｙ下での測定を実施した。
＜細孔直径分布測定試験の自動試験パラメーター値＞
最小圧力；０（ＫＰＡ）、最大圧力；３００（ＫＰＡ）
（ｉ）バブルポイント試験／インテグリティ試験；１０ｂｕｂｌｆｌｏｗ（ｃｃ／ｍ）、５０Ｆ／ＰＴ（ｏｌｄ ｂｕｂｌｔｉｍｅ）、０ｍｉｎｂｐｐｒｅｓ（ＫＰＡ）、０ｍｉｎｂｐｐｒｅｓ（ＫＰＡ）、１．０ｚｅｒｏｔｉｍｅ（ｓｅｃ）
（ｉｉ）モータバルブ制御；１０ｖ２ｉｎｃｒ（ｃｔｓ＊３）
（ｉｉｉ）レギュレータ制御；１ｐｒｅｇｉｎｃ、２ｐｕｌｓｅ ｄｅｌａｙ
（ｉｖ）Ｌｏｈｍの校正；１３７８．９４６６ｍａｘｐｒｅｓ（ＫＰＡ）、０．２ｐｕｌｓｅｗｉｄｔｈ（ｓｅｃ）
（ｖ）データ確定ルーチン；３０ｍｉｎｅｑｔｉｍｅ（ｓｅｃ）、１０ｐｒｅｓｓｌｅｗ（ｃｔｓ＊３）、５０ｆｌｏｗｓｌｅｗ（ｃｔｓ＊３）、２０ｅｑｉｔｅｒ（０．１ｓｅｃ）、２０ａｖｅｉｔｅｒ（０．１ｓｅｃ）、０．６９ｍａｘｐｄｉｆ（ＫＰＡ）、５０ｍａｘｆｄｉｆ（ｃｃ／ｍ）
【００３７】
［実施例１］
（選択透過性膜の作製）
ポリエーテルスルホン（ＢＡＳＦ社製、６０２０Ｐ）１６．５質量％、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製、コリドンＫ−９０）８．０質量％、溶媒としてジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）７０．５質量％、非溶媒としてＲＯ水５．０質量％を６０℃で混練、溶解し、紡糸原液を作製した。得られた紡糸原液を５０質量％のＤＭＡｃ水溶液とともに二重管ノズルより吐出し、７０℃の３０質量％ＤＭＡｃ水溶液中で凝固させ、水洗浴を通過させた後に綛に捲き上げた。得られた中空糸型選択透過性膜１６０本の束を長さ４０ｃｍに切断し、ガーゼを巻いた後、熱風乾燥機にて６０℃で１８時間乾燥させた。
得られた中空糸型選択透過性膜の内径は２５０μｍ、外径は４００μｍであった。また、内表面の平均孔径は２４０ｎｍ、膜の最大孔径は８５ｎｍであり、膜の断面において内表面側（第１室側）から外表面側（第２室側）に向かって細孔径が小さくなる傾斜構造を有していた。
【００３８】
（細胞培養容器の作製）
試験用の細胞培養容器を以下のように作製した。内径１１ｍｍ、長さ２５４ｍｍの円筒状のポリカーボネート製の容器（ケース）内に、前記中空糸型選択透過性膜１６０本を収納した後、中空糸型選択透過性膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をケースに固定し、図２に示すような形状の細胞培養容器を作製した。得られた細胞培養容器を用いて３７℃純水で測定した選択透過性膜の透水性は９７０ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇであった。
【００３９】
（リンパ球の分離）
ヒト血液をヘパリンを含んだチューブに採取し、これを等量のＰＢＳと混和して調製した血液溶液を１５ｍＬ遠心チューブに３ｍＬ分注した。次に、この分注した血液溶液の上に、液面が乱れないように注意しながら密度勾配分離媒体（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）、コスモバイオ、型番：ＣＬ５０１０）６ｍＬを静かに重層した。これを８００×ｇで２０分間、遠心分離を行って出来たリンパ球層を採取し、ＰＢＳに懸濁した。再度、８００×ｇで２０分間の遠心分離を行い、リンパ球のペレットを得た。上記操作を繰り返し、約２．０×１０７個のリンパ球を得た。
【００４０】
（細胞培養実験）
細胞培養実験は、図３に示す細胞培養装置において、細胞培養容器を図２に示すものに置き換えて行った。なお、細胞培養容器において、中空糸型選択透過性膜の内腔側（中空部）を第１室とし、外腔側を第２室とした。前記得られたリンパ球をヒトリンパ球用無血清培養液（株式会社細胞科学研究所、コード：１０２０Ｐ１０）１００ｍＬに懸濁した細胞懸濁液を細胞培養装置の導入口４０より送液し、中空糸型選択透過性膜の中空部（第１室）に充填した。充填後、バルブ２０および２１を閉止し、ポンプ３０を起動して中空糸型選択透過性膜の外腔側（第２室）に前記同様の培養液を流しながらＣＯ２インキュベーター内で３７℃、４日間培養を行った。培養液の流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００４１】
（培養液の除去）
４日間培養後、培養液灌流を停止し、バルブ２０を切替えて細胞洗浄液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を洗浄した。
【００４２】
（細胞回収）
培養した細胞を洗浄した後、ポンプ３０を停止し、バルブ２１、２２を切替えて、ポンプ３１を起動し、培養した細胞を細胞洗浄液とともに細胞回収容器１０に回収した。回収した細胞について、細胞数を計測した。
【００４３】
（細胞回収数の測定）
細胞培養容器からの細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１０ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、以下の手順により顕微鏡下で細胞数（個）および細胞生存率（％）の計測を行った。
（１）血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾した。
（２）Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつけた。
（３）細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たした。
（４）１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行った（２回測定し平均をとる）。
（５）顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせた（１０×対物レンズ）。
（６）カウンターを用いて１ｍｍ２エリアの細胞数を速やかに計測した。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算法：
Ｃ＝Ｎ×１０４
Ｃ：１ｍＬ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０４：１ｍｍ２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量
【００４４】
［実施例２］
（選択透過性膜の作製）
ポリエーテルスルホン（ＢＡＳＦ社製、６０２０Ｐ）１５．０質量％、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製、コリドンＫ−９０）９．０質量％、溶媒としてジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）７１．０質量％、非溶媒としてＲＯ水５．０質量％を６０℃で混練、溶解し、紡糸原液を作製した。得られた紡糸原液を５０質量％のＤＭＡｃ水溶液とともに二重管ノズルより吐出し、７０℃の３０質量％ＤＭＡｃ水溶液中で凝固させ、水洗浴を通過させた後に綛に捲き上げた。得られた中空糸型選択透過性膜１６０本の束を長さ４０ｃｍに切断し、ガーゼを巻いた後、熱風乾燥機にて６０℃で１８時間乾燥させた。
得られた中空糸型選択透過性膜の内径は２５０μｍ、外径は４００μｍであった。また、内表面の平均孔径は４７０ｎｍ、膜の最大孔径は１３０ｎｍであり、膜の断面において内表面側から外表面側に向かって細孔径が小さくなる傾斜構造を有していた。また、得られた選択透過性膜の透水性は１８４０ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇであった。
【００４５】
得られた中空糸型選択透過性膜を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００４６】
［実施例３］
（選択透過性膜の作製）
ポリエーテルスルホン（ＢＡＳＦ社製、６０２０Ｐ）１８．０質量％、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製、コリドンＫ−９０）７．０質量％、溶媒としてジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）７０．０質量％、非溶媒としてＲＯ水５．０質量％を６０℃で混練、溶解し、紡糸原液を作製した。得られた紡糸原液を５０質量％のＤＭＡｃ水溶液とともに二重管ノズルより吐出し、７０℃の３０質量％ＤＭＡｃ水溶液中で凝固させ、水洗浴を通過させた後に綛に捲き上げた。得られた中空糸型選択透過性膜１６０本の束を長さ４０ｃｍに切断し、ガーゼを巻いた後、熱風乾燥機にて６０℃で１８時間乾燥させた。
得られた中空糸型選択透過性膜の内径は２５０μｍ、外径は４００μｍであった。また、内表面の平均孔径は１２６ｎｍ、膜の最大孔径は１７ｎｍであり、膜の断面において内表面側から外表面側に向かって細孔径が小さくなる傾斜構造を有していた。また、得られた選択透過性膜の透水性は５１０ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇであった。
【００４７】
得られた中空糸型選択透過性膜を用いて、実施例１と同様の実験を行った。
【００４８】
［実施例４］
内径を１８０μｍ、外径を３２０μｍとした以外は実施例１と同様にして選択透過性中空糸膜を作製し、実施例１と同様の実験を行った。
【００４９】
［実施例５］
内径を１２５０μｍ、外径を１７５０μｍとした以外は実施例１と同様にして選択透過性中空糸膜を作製し、実施例１と同様の実験を行った。なお、内径３０ｍｍのケースを用いた。
【００５０】
［比較例１］
Ｔ−２２５フラスコ（細胞培養面積２２５ｃｍ２）５本に、ヒトリンパ球を０．６×１０６個ずつ播種（計３．０×１０６個）し、実施例１と同様にヒトリンパ球用無血清培養液（株式会社細胞科学研究所、コード：１０２０Ｐ１０）を用いて、ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃、４日間培養した。培養終了後、培養液とともにすべてのフラスコから細胞を回収した。回収した細胞は、５０ｍＬ遠心チューブに分注し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清の培養液を吸引除去し、細胞を２０ｍＬのＰＢＳに懸濁した。この操作を計４回繰り返し、最終的に１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、細胞数および細胞生存率を測定した。
【００５１】
実施例１および比較例１の同じ実験をそれぞれ８回繰り返し、回収された細胞数および細胞生存率を求めた（表１）。この結果、実施例は、回収細胞数および細胞生存率のいずれにおいても良好な結果であった。一方、比較例では、回収細胞数および細胞生存率のいずれにおいても実施例より低い結果となった。また、実験間の誤差が大きくなっており再現性に問題があることがわかった。このことから、本発明では浮遊細胞を高密度で効率よく培養できるだけでなく、細胞にダメージを与えず、細胞回収のロスも少ない培養細胞の製造方法を提供できるといえる。
【００５２】
【表１】
2019135967.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、浮遊性細胞の培養、洗浄、回収までを一気通貫に実施することができるため、高額になりがちな浮遊性細胞の培養細胞の製造コストを抑えることが可能となる。
【符号の説明】
【００５４】
１      選択透過性膜
２      容器（ケース）
３      第１室
４      第２室
５ａ、６ａ、４０      導入口
５ｂ、６ｂ、５０      排出口
７        細胞洗浄液容器
８        培養液貯留容器
９        回収容器
１０      細胞回収容器
２０、２１、２２、２３      バルブ
３０、２１      送液ポンプ
【図１】
2019135967.tif 000003
【図２】
2019135967.tif 000004
【図３】
2019135967.tif 000005