(57)【要約】      （修正有）【課題】被験体における心不全の診断方法及び被験体における心不全の進行又は回復のモニタリング方法を提供する。【解決手段】被験体において心不全を診断する方法であって、a)心不全に罹患していることが疑われる被験体のサンプルにおける、特定表に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ；（b）少なくとも1つのバイオマーカーの量を参照と比較するステップであって、それにより心不全が診断されることになるステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において心不全を診断する方法であって、
a) 心不全に罹患していることが疑われる被験体のサンプルにおける、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ；（b）前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を参照と比較するステップであって、それにより心不全が診断されることになるステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が無症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのバイオマーカーが、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無症候性心不全が、NYHAクラスIの心不全である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記無症候性心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表2A1、2A2、2B1又は2B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記無症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表3A1、3A2、3B1又は3B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記無症候性心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体が症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのバイオマーカーが、表5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記症候性心不全が、NYHAクラスII及び/又はIIIの心不全である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記症候性心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表6A1、6A2、6B1又は6B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表7A1、7A2、7B1又は7B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
前記症候性心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１２】
被験体における心不全の進行又は回復をモニタリングする方法であって：
a) 前記被験体の第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、表9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップであって、ここで前記第1のサンプルが前記第2のサンプルに先立って得られたものである、前記ステップ；及び
c) 第1のサンプル中で測定された量を、第2のサンプル中で測定された量と比較し、それにより心不全の進行又は回復が診断されることになるステップ
を含む、方法。
【請求項１３】
前記心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表10A1、10A2、10B1又は10B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表11A1、11A2、11B1又は11B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表12A1、12A2、12B1又は12B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記心不全の進行又は回復が、LVEFの低下の進行又は回復を伴い、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断方法の分野に関する。具体的には、本発明は、被験体における心不全の診断方法、及び被験体における心不全の進行又は回復をモニタリングする方法を意図する。本発明はまた、上記方法を実施するためのツール、例えば診断デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は近代医学において重篤な問題である。心臓の機能障害は、生命に関わる状態を生じ、心不全を患う患者にとって不快症状をもたらす。心不全は、右心又は左心のそれぞれに影響を及ぼす可能性があり、強度も異なりうる。ニューヨーク心臓協会（New York Heart association：NYHA）によって最初に分類システムが開発された。この分類システムによると、軽症の心不全はクラスIの症例として分類される。これらの患者は、過度の運動時にのみ症候を示す。中程度の症例は、より少ない運動時にさえより顕著な症候を示す（クラスII及びIII）が、クラスIVは、安静時にさえ症候を示す（New York Heart Association. Diseases of the heart and blood vessels. Nomenclature and criteria for diagnosis、6th ed. Boston: Little、Brown and co、1964;114）。
【０００３】
心不全の有病率は、過去数年にわたって、欧米先進国の集団において着実に増加している。この増加の理由の1つは、近代医学による平均余命の上昇にあるとみられている。しかしながら、心不全による死亡率は、診断及び治療方法の改善によってさらに低下している。いわゆる「フライミンガム（Framingham）」研究は、1950〜1969年と1990〜1999年の時間枠で比較した場合に、5年死亡率が男性では70％から59％に、女性では57％から45％に低下したことを報告している。「メイヨー（Mayo）」研究は、1979〜1984年と比較して1996〜2000年の時間枠では、男性では65％から50％に、女性では51％から46％に低下したことを示している。このような死亡率の低下にもかかわらず、心不全による全体的な死亡率は依然として主要な社会的負担である。ACE阻害剤治療を受けたNYHAクラスII〜III患者の1年死亡率は依然として9〜12％（SOLVED）であり、ACE阻害剤治療を受けていないNYHAクラスIVの場合には52％（Consensus）である。
【０００４】
心エコー検査などの診断技術は、検査者個人の経験に依存し、それゆえ常に信頼性があるわけではない。さらに、これらの技術は心不全の初期発症では診断を誤ることがある。心臓ホルモン、例えば脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）などに基づく生化学アッセイもまた、他の疾患及び障害（腎不全など）の影響を受けたり、又は患者の全体的な健康状態によって異なる。それでもなお、脳性ナトリウム利尿ペプチドは、心不全を生化学的に評価するための現在の代表的基準である。心不全の診断におけるBNPとN-末端pro-BNP（NT-proBNP）とを比較する最近の研究では、BNPが、心不全及び左心室収縮機能障害についてNT-proBNPよりも良好な指標となっている。症候を示す患者群において、BNPの診断オッズ比27を、心不全の検出における感度85％及び特異度84％と比較している（Ewald 2008、Intern Med J 38 (2):101-13.）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、近代医学の目的は、心不全を有する患者を信頼性をもって特定及び治療すること、特に心不全の初期発症時、すなわち初期のNYHAステージI〜III、特にNYHAステージIの時点で心不全患者を特定することである。従って、心不全を信頼性をもって診断するための手段及び方法が高く望まれているが、まだ利用可能ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、被験体において心不全を診断する方法であって、
（a）心不全に罹患していることが疑われる被験体のサンプルにおける、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ、及び
（b）前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を参照と比較するステップであって、それにより心不全が診断されることになるステップ
を含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明により言及される方法は、本質的に上述のステップよりなる方法又はさらなるステップを含む方法を包含する。しかしながら、本方法は、好ましい実施形態では、ex vivoで行われる方法、すなわち、人体又は動物体に対して実施されない方法であることを理解されたい。本方法は、好ましくは自動化により支援することができる。
【０００８】
本明細書において用いられる「診断する」という用語は、被験体が心不全に罹患しているか否かを評価することを指す。当業者であればわかるであろうが、そのような評価は、検査される被験体の100％に対して正しいことが好ましいが、通常はそうでない可能性がある。しかしながら、この用語は、統計学的に有意な一部の被験体を正確に評価でき、従って診断できることを必要とする。当業者であれば、労苦もなく、種々の周知の統計学的評価ツールを用いて、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定などを行って、その一部が統計学的に有意であるかどうかを判定することが可能である。詳細は、Dowdy and Wearden、Statistics for Research、John Wiley & Sons、New York 1983に見いだされる。好ましい信頼区間は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％である。p値は、好ましくは、0.2、0.1、又は0.05である。
【０００９】
この用語は、心不全又はその症候の個々の診断、並びに患者の継続的なモニタリングを含む。モニタリング、すなわち種々の時点における心不全又はそれに付随する症候の存在又は不在の診断には、心不全に罹患していることがわかっている患者のモニタリング、並びに心不全を発症するリスクを有することがわかっている被験体のモニタリングが含まれる。さらに、モニタリングは、患者の治療が成功したかどうか、又は少なくとも心不全の症候が特定の治療によって徐々に改善しうるかどうかを判定するためにも用いられる。さらにこの用語は、心不全に関するニューヨーク心臓協会（NYHA）クラスに従って被験体を分類することも含む。この分類に従って、心不全を4つのクラスに細分類することができる。クラスIを示す被験体は、激しい運動時を除いて活動に制限がない。クラスIIを示す被験体は、運動にわずかで軽度な制限を示すが、安静時又は軽度の動作時には苦痛がない。クラスIIIを示す被験体は、どのような動作にも顕著な制限があるが、安静時にのみ苦痛がない。クラスIVを示す被験体は、安静時にさえ苦痛があり、症候を示す。好ましくは、本発明に従って判定する心不全は、無症候性心不全、すなわちNYHAクラスIの心不全、又は症候性心不全、すなわち少なくともNYHAクラスII及び／若しくはIIIの心不全である。
【００１０】
本発明の方法の好ましい実施形態において、該被験体は、無症候性心不全に罹患しており、少なくとも1つのバイオマーカーが、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである。さらに好ましくは、該被験体における無症候性心不全は、NYHAクラスIの心不全である。
【００１１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、該被験体は、症候性心不全に罹患しており、少なくとも1つのバイオマーカーが、表5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである。さらに好ましくは、被験体における該症候性心不全は、NYHAクラスII及び/又はIIIの心不全である。
【００１２】
米国心臓協会（American Heart Association）によって別のステージ決定システムが提供されている。心不全が4つのステージに細分類されている。ステージA：将来的にHFを発症するリスクが高いが、機能的又は器質的心疾患がない患者。ステージB：器質的心疾患があるが、いずれのステージの症候もない患者。ステージC：原因となっている器質的心臓の問題に関連して心不全の以前の又は現在の症候を示すが、治療により抑えられている。ステージD：病院での支援、心臓移植又は緩和ケアが必要な進行疾患である。本発明の方法はまたこのシステムによる心不全のステージ決定のために用いることも可能であり、好ましくは、同定されたバイオマーカーによって、ステージA〜Cの心不全を診断し、また無症候性ステージA及びBとより重症なステージC（すなわち症候性心不全）とを区別することが可能となることが理解されよう。
【００１３】
本明細書において用いられる「心不全」という用語は、心臓の機能障害に関する。この障害は、心臓からの血液の駆出率が有意に低下し、このため血流が低下する収縮機能障害でありうる。具体的には、収縮期心不全は、有意に低下した左心室駆出分画率（LEVF）、好ましくは55％未満の駆出分画率を特徴とする。あるいは、この障害は、拡張機能障害、すなわち適切に弛緩する心室の不全でありうる。後者は通常、心室壁の硬化を伴う。拡張機能障害は、心室の不十分な充満を引き起こし、それゆえ一般的には血流に対する影響を生じる。従って、拡張機能障害はまた拡張終期圧の上昇を生じ、結末は収縮機能障害の場合と同等である（左心不全における肺水腫、右心不全における末梢浮腫）。従って、心不全は、右心（肺循環）、左心（体循環）、又は両方に影響を及ぼしうる。心機能の障害、すなわち心不全を測定するための技術は当技術分野で周知であり、心エコー検査、電気生理学、血管造影、及び血中のペプチドバイオマーカー（脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）又はそのプロペプチドのN-末端断片など）の測定などが含まれる。心臓の機能障害は、永続的に生じることもあるし、又は特定のストレス若しくは運動条件下でのみ生じることもあることが理解されよう。症候の強度に応じて、心不全は本明細書の他の部分で記載したように分類することができる。心不全の典型的な症候としては、呼吸困難、胸痛、めまい、錯乱、肺及び／又は末梢浮腫が挙げられる。症候の発生並びにその重度は、心不全の重度、心不全の特徴及び原因、収縮期又は拡張期又は限定的な（すなわち右心若しくは左心に位置している）心不全に応じて異なることが理解されよう。心不全のさらなる症候は当技術分野で周知であり、医学の標準的なテキスト、例えばStedman又はBrunnwaldなどに記載されている。
【００１４】
好ましくは、本明細書において用いられる心不全は、拡張型心筋症(DCMP)、虚血性心筋症(ICMP)又は肥大型心筋症(HCMP)に関する。
【００１５】
好ましくは、前記無症候性心不全はDCMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表2A1、2A2、2B1又は2B2に記載されたバイオマーカーから選択される。好ましくは、前記無症候性心不全はICMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表3A1、3A2、3B1又は3B2に記載されたバイオマーカーから選択される。好ましくは、前記無症候性心不全はHCMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択される。
【００１６】
さらに好ましくは、前記症候性心不全はDCMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表6A1、6A2、6B1又は6B2に記載されたバイオマーカーから選択される。好ましくは、前記症候性心不全はICMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表7A1、7A2、7B1又は7B2に記載されたバイオマーカーから選択される。好ましくは、前記症候性心不全はHCMPであり、前記少なくとも1つのバイオマーカーは、表8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される。
【００１７】
本明細書において用いられる「バイオマーカー」という用語は、本明細書において言及され疾患又は効果の指標として機能する分子種を意味する。該分子種は、被験体のサンプル中に見いだされる代謝物質自体であってもよい。さらに、バイオマーカーはまた、該代謝物質に由来する分子種であってもよい。そのような場合、実際の代謝物質は、サンプル中で又は測定方法の過程で化学的に修飾され、その修飾の結果として、化学的に異なる分子種、すなわちアナライト、が測定される。そのような場合、アナライトは実際の代謝物質を表し、各医学的状態の指標と同じ可能性を有することが理解されよう。
【００１８】
本発明に係る方法において、上述のバイオマーカー群の少なくとも1つの代謝物質が測定される。しかし、より好ましくは、評価の特異性及び／又は感度を強化するために一群のバイオマーカーが測定される。そのような群は、好ましくは、各表に記載されたバイオマーカーの、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも10又は最大全てを含む。本明細書に記載される具体的なバイオマーカーに加えて、他のバイオマーカーを、好ましくは、本発明の方法において同様に測定することもできる。
【００１９】
本明細書において用いられる代謝物質とは、特定の代謝物質の少なくとも1つの分子から該特定の代謝物質の複数の分子までを指す。さらに、代謝物質の群とは、各代謝物質について少なくとも1分子〜複数分子が存在しうる、複数の化学的に異なる分子を意味することが理解されよう。本発明による代謝物質は、生物学的材料（生物など）に含まれるものなどのすべてのクラスの有機又は無機の化学化合物を包含する。好ましくは、本発明による代謝物質は小分子化合物である。より好ましくは、複数の代謝物質が想定される場合、該複数の代謝物質とは、メタボローム、すなわち、特定の時間に特定の条件下で生物、器官、組織、体液又は細胞に含まれる代謝物質の集合を意味する。
【００２０】
代謝物質とは、代謝経路の酵素の基質、そのような経路の中間体、又は代謝経路により得られる産物などの小分子化合物である。代謝経路は当技術分野で周知であり、種間で異なりうる。好ましくは、該経路としては、少なくとも、クエン酸回路、呼吸鎖、解糖、糖新生、ヘキソース一リン酸経路、酸化的ペントースリン酸経路、脂肪酸の産生及びβ酸化、尿素回路、アミノ酸生合成経路、タンパク質分解経路（例えばプロテアソームによる分解）、アミノ酸分解経路、以下の物質の生合成又は分解が挙げられる：脂質、ポリケチド（例えば、フラボノイド及びイソフラボノイドなど）、イソプレノイド（例えば、テルペン、ステロール、ステロイド、カロテノイド、キサントフィルなど）、炭水化物、フェニルプロパノイド及びその誘導体、アルカロイド、ベンゼノイド、インドール、インドール硫黄化合物、ポルフィリン、アントシアン、ホルモン、ビタミン、補因子（例えば補欠分子族又は電子伝達体）、リグニン、グルコシノレート、プリン、ピリミジン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び関連分子、例えば、tRNA、マイクロRNA（miRNA）、又はmRNA。したがって、小分子化合物代謝物質は、好ましくは、以下のクラスの化合物を包含する：アルコール、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、アミン、イミン、アミド、シアニド、アミノ酸、ペプチド、チオール、チオエステル、リン酸エステル、硫酸エステル、チオエーテル、スルホキシド、エーテル、又は上述の化合物の組合せ若しくは誘導体。代謝物質のうちの小分子は、正常な細胞機能、器官機能、又は動物の成長、発達若しくは健康に必要とされる一次代謝物質でありうる。さらに、小分子代謝物質は、不可欠な生態学的機能を有する二次代謝物質、例えば、生物をその環境に適応できるようにする代謝物質をさらに包含する。そのうえさらに、代謝物質は、一次代謝物質及び二次代謝物質に限定されるものではなく、人工小分子化合物をさらに包含する。該人工小分子化合物は、投与されるか又は生物により摂取されるが上で定義したような一次代謝物質でも二次代謝物質でもない外因的に供給される小分子に由来する。例えば、人工小分子化合物は、動物の代謝経路により薬物から得られる代謝産物でありうる。さらに、代謝物質は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチド（例えば、RNA又はDNA）をさらに包含する。より好ましくは、代謝物質は、50Da（ダルトン）〜30,000Da、最も好ましくは30,000Da未満、20,000Da未満、15,000Da未満、10,000Da未満、8,000Da未満、7,000Da未満、6,000Da未満、5,000Da未満、4,000Da未満、3,000Da未満、2,000Da未満、1,000Da未満、500Da未満、300Da未満、200Da未満、100Da未満の分子量を有する。しかしながら、好ましくは、代謝物質は少なくとも50Daの分子量を有する。最も好ましくは、本発明による代謝物質は50Da〜1,500Daの分子量を有する。
【００２１】
本明細書において用いられる「サンプル」という用語は、体液、好ましくは、血液、血漿、血清、唾液、若しくは尿、又は生検などにより細胞、組織、若しくは器官、特に心臓から得られるサンプルを指す。より好ましくは、サンプルは、血液、血漿又は血清サンプルであり、最も好ましくは血漿サンプルである。このような血液、血漿又は血清サンプルの場合、好ましくは、本発明の方法により測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表1A1、1A2、2A1、2A2、3A1、3A2、4A1、4A2、5A1、5A2、6A1、6A2、7A1、7A2、8A1又は8A2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーである。さらに好ましくは、このサンプルは尿サンプルである。このような尿サンプルの場合、好ましくは、本発明の方法により測定される少なくとも1つのバイオマーカーは、表1B1、1B2、2B1、2B2、3B1、3B2、4B1、4B2、5B1、5B2、6B1、6B2、7B1、7B2、8B1又は8B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーである。生物学的サンプルは、本明細書の他の箇所で特定される被験体に由来し得る。上述のさまざまなタイプの生物学的サンプルを取得するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、血液サンプルは、血液採取により取得することができるが、組織又は器官のサンプルは、例えば生検により取得される。
【００２２】
上述のサンプルは、好ましくは、本発明の方法に使用される前に前処理される。以下にさらに詳細に記載されるとおり、この前処理としては、化合物を放出若しくは分離し、又は過剰の材料若しくは廃物を除去するために必要とされる処理が挙げられる。好適な技術には、化合物の遠心分離、抽出、分画、限外濾過、タンパク質沈殿とそれに続く濾過及び精製、並びに／又は濃縮が含まれる。さらに、化合物の分析に好適な形態又は濃度で化合物を提供するために、他の前処理が行われる。例えば、本発明の方法においてガスクロマトグラフィー連結質量分析を使用する場合、該ガスクロマトグラフィーを行う前に化合物を誘導体化する必要があろう。好適な所要の前処理は、本発明の方法を実施するために使用される手段に応じて異なり、当業者に周知である。上に記載したように前処理されたサンプルもまた、本発明により用いられる「サンプル」という用語に包含される。
【００２３】
本明細書において用いられる「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物に関する。より好ましくは、被験体は霊長類であり、最も好ましくはヒトである。好ましくは、被験体は、心不全に罹患していることが疑われるもの、より好ましくは、該疾患に伴う症候の一部又は全てを既に示しているものであり得る。しかしながら、心不全に罹患していることが疑われる被験体として、リスク群に属する被験体又は疾患スクリーニングプロジェクト又は疾患スクリーニング方法に含まれる被験体も包含される。より好ましくは、被験体は、NYHAクラスIの症候を示す無症候性被験体又はNYHAクラスII及び/又はIIIの症候を示す症候性被験体である。さらに、被験体はまた、好ましくは、収縮不全、例えば拡張型心筋症などによる鬱血性収縮期心不全を示すであろう。しかしながら被験体は、好ましくは、上記疾患及び障害以外は一見したところ健康である。特に、被験体は、NYHAクラスIV患者の症候を示さないか、又はサンプル取得前の最後の4ヶ月以内に卒中、心筋梗塞に罹患していないか、又は急性若しくは慢性炎症疾患及び悪性腫瘍に罹患していないことが好ましい。さらに被験体は、サンプル取得前の最後の4週間以内に安定した薬物治療を受けていることが好ましい。
【００２４】
本明細書において用いられる「量を測定する」という用語は、サンプル中の本発明の方法によって測定すべきバイオマーカーの少なくとも1つの特徴的特性を測定することを指す。本発明による特徴的特性とは、バイオマーカーの物理的性質及び／又は化学的性質（生化学的性質を含む）を特徴付ける特性のことである。このような性質としては、例えば、分子量、粘度、密度、電荷、スピン、光学活性、色、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物と反応する能力、生物学的読取り系で応答を引き起こす能力（例えば、レポーター遺伝子の誘導）などが挙げられる。該性質の値は、特徴的特性としての役割を果たすことが可能であり、当技術分野で周知の技術によって測定することができる。さらに、特徴的特性は、標準的操作、例えば、乗算、除算、又は対数計算のような数学的計算により、バイオマーカーの物理的性質及び／又は化学的性質の値から導かれる任意の特性でありうる。最も好ましくは、少なくとも1つの特徴的特性は、該少なくとも1つのバイオマーカー及びその量の測定及び／又は化学的同定を可能にする。従って、特性値はまた、好ましくは、その特性値が導かれるバイオマーカーの存在量に関する情報も含む。例えば、バイオマーカーの特性値は、質量スペクトルにおけるピークでありうる。かかるピークは、バイオマーカーの特徴的な情報、すなわちm/z情報、並びにサンプル中の当該バイオマーカーの存在量（すなわちその量）に関する強度値を含む。
【００２５】
上述したように、サンプルに含まれる各バイオマーカーは、好ましくは、本発明に従って定量的又は半定量的に測定することができる。定量的測定では、本明細書において上記に言及される特徴的特性（複数可）に関して測定される値に基づいて、バイオマーカーの絶対量若しくは正確な量が測定されるか又はバイオマーカーの相対量が測定されるかのいずれかであろう。バイオマーカーの正確な量を測定できないか又は測定しない場合、相対量を測定しうる。この場合、バイオマーカーの存在量が、該バイオマーカーを第2の量で含む第2のサンプルに対して増加又は減少しているかどうかを、測定することが可能である。好ましい実施形態において、該バイオマーカーを含む第2のサンプルは、本明細書の他の箇所に記載されるように計算参照であるべきである。従って、バイオマーカーの定量的分析は、バイオマーカーの半定量的分析と呼ばれることもある分析も包含する。
【００２６】
さらに、本発明の方法に使用される測定は、好ましくは、上で言及される分析ステップの前に化合物分離ステップを使用することを含む。好ましくは、該化合物分離ステップでは、サンプルに含まれる代謝物質の時間分解分離が得られる。したがって、本発明により好ましく使用される分離に好適な技術としては、すべてのクロマトグラフィ分離技術、例えば、液体クロマトグラフィ（LC）、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）、ガスクロマトグラフィ（GC）、薄層クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、又はアフィニティークロマトグラフィが挙げられる。これらの技術は、当技術分野で周知であり、当業者であれば労苦もなく適用可能である。最も好ましくは、LC及び／又はGCが、本発明の方法で想定されるクロマトグラフィ技術である。バイオマーカーのそのような測定に好適なデバイスは、当技術分野で周知である。好ましくは、質量分析、特には、ガスクロマトグラフィ質量分析（GC-MS）、液体クロマトグラフィ質量分析（LC-MS）、直接注入質量分析若しくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（FT-ICR-MS）、キャピラリー電気泳動質量分析（CE-MS）、高速液体クロマトグラフィ連結質量分析（HPLC-MS）、四重極質量分析、任意の逐次連結質量分析、例えばMS-MS若しくはMS-MS-MSなど、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）、熱分解質量分析（Py-MS）、イオン移動度質量分析、又は飛行時間質量分析（TOF）が使用される。最も好ましくは、以下に詳細に記載されるようにLC-MS及び／又はGC-MSが使用される。これらの技術については、例えば、Nissen、1995、Journal of Chromatography A、703:37-57、米国特許第4、540、884号、又は米国特許第5、397、894号（その開示内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする）に開示されている。質量分析技術の他の選択肢として又はそれに追加して、以下の技術を化合物測定に使用可能である：核磁気共鳴（NMR）、磁気共鳴イメージング（MRI）、フーリエ変換赤外分析（FT-IR）、紫外（UV）分光、屈折率（RI）、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱（LS）、分散ラマン分光、又はフレームイオン化検出（FID）。これらの技術は、当業者に周知であり、労苦もなく適用可能である。本発明の方法は、好ましくは、自動化により支援されるだろう。例えば、サンプルの処理又は前処理をロボット工学により自動化することが可能である。データの処理及び比較は、好ましくは、好適なコンピュータプログラム及びデータベースにより支援される。本明細書において前に記載される自動化を行えば、本発明の方法をハイスループット方式で使用することが可能である。
【００２７】
さらに、少なくとも1つのバイオマーカーはまた、特定の化学的アッセイ又は生物学的アッセイにより測定することもできる。該アッセイは、サンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーを特異的に検出することを可能とする手段を含むだろう。好ましくは、該手段は、バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することができるか、又は他の化合物と反応する能力若しくは生物学的読取り系で応答を引き起こす能力（例えば、レポーター遺伝子の誘導）に基づいてバイオマーカーを特異的に同定することができる。バイオマーカーの化学構造を特異的に認識することができる手段は、好ましくは、化学構造（例えば、レセプター若しくは酵素）と特異的に相互作用する抗体又は他のタンパク質である。例えば、特異的抗体は、当技術分野で周知の方法によりバイオマーカーを抗原として用いて得ることができる。本明細書中で言及される抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体の両方、並びにそれらのフラグメント、例えば、抗原又はハプテンに結合し得るFv、Fab、及びF(ab)2フラグメントを包含する。本発明はまた、所望の抗原特異性を示す非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列とヒトアクセプター抗体の配列とが組み合わされたヒト化ハイブリッド抗体も包含する。さらに、一本鎖抗体も包含される。ドナー配列は、通常、ドナーの少なくとも抗原結合性アミノ酸残基を含むであろうが、ドナー抗体の他の構造上及び／又は機能上関連するアミノ酸残基をも含みうる。そのようなハイブリッドは、当技術分野で周知のいくつかの方法により調製することができる。バイオマーカーを特異的に認識することができる好適なタンパク質は、好ましくは、該バイオマーカーの代謝変換に関与する酵素である。該酵素は、バイオマーカーを基質として使用することができるか又は基質をバイオマーカーに変換することができる。さらに、該抗体は、バイオマーカーを特異的に認識するオリゴペプチドを生成する基礎として使用することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、該バイオマーカーに対する酵素の結合ドメイン又は結合ポケットを含むだろう。好適な抗体及び／又は酵素に基づくアッセイは、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ酵素免疫検査、電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（ECLIA）、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（DELFIA）、又は固相免疫検査でありうる。さらに、他の化合物と反応する能力に基づいて、すなわち、特異的な化学反応により、バイオマーカーを測定することもできる。さらに、生物学的読取り系で応答を引き起こす能力により、サンプル中のバイオマーカーを測定することが可能である。生物学的応答は、サンプルに含まれるバイオマーカーの存在及び／又は量を示す読取り値として検出されるだろう。生物学的応答は、例えば、遺伝子発現の誘導又は細胞若しくは生物の表現型応答でありうる。好ましい実施形態において、少なくとも1つのバイオマーカーの測定は、定量的方法、例えばサンプル中の少なくとも1つのバイオマーカーの量の測定も可能とする方法である。
【００２８】
上記のとおり、少なくとも1つのバイオマーカーの測定は、好ましくは、質量分析（MS）を含む。本明細書において用いられる質量分析は、本発明により測定しようとする化合物（すなわちバイオマーカー）に対応する分子量（すなわち質量）又は質量変数の測定を可能にする全ての技術を包含する。好ましくは、本明細書において用いられる質量分析は、GC-MS、LC-MS、直接注入質量分析、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析、任意の逐次連結質量分析、例えばMS-MS若しくはMS-MS-MS、ICP-MS、Py-MS、TOF、又は上記技術を用いた任意の併用手法に関する。これらの技術を適用する方法は当業者に周知である。さらに、好適なデバイスは市販されている。より好ましくは、本明細書において用いられる質量分析はLC-MS及び／又はGC-MS、すなわち、前のクロマトグラフィー分離ステップと動作可能に連結された質量分析に関する。より好ましくは、本明細書において用いられる質量分析には四重極MSが含まれる。最も好ましくは、四重極MSは以下のように実施する：（a）質量分析器の最初の分析四重極におけるイオン化により生じるイオンの質量／電荷比（m/z）の選択、（b）衝突ガスで満たされ、衝突室として機能する、追加の後続四重極に加速電圧を印加することによる、ステップ（a）で選択されたイオンのフラグメンテーション、（c）追加の後続四重極における、ステップ（b）のフラグメンテーションプロセスにより生じるイオンの質量／電荷比の選択であって、これにより上記方法のステップ（a）〜（c）は、イオン化プロセスの結果として物質の混合物中に存在する全てのイオンの質量／電荷比の分析を少なくとも1回行い、それにより四重極が衝突ガスで満たされるが、加速電圧は分析中には印加されない。本発明において用いるべき最も好ましい質量分析についての詳細はWO 03/073464号に見出すことができる。
【００２９】
より好ましくは、質量分析は、液体クロマトグラフィ（LC）MS及び／又はガスクロマトグラフィ（GC）MSである。本明細書において用いられる液体クロマトグラフィとは、液相又は超臨界相における化合物（すなわち代謝物質）の分離を可能にする全ての技術を意味する。液体クロマトグラフィは、移動相中の化合物が固定相を通過することを特徴とする。化合物が異なる速度で固定相を通過する場合には、これらは、個々の化合物の各々がその特異的な保持時間（すなわち、化合物がシステムを通過するのに必要な時間）を有するため、所定時間で分離される。本明細書において用いられる液体クロマトグラフィにはHPLCも含まれる。液体クロマトグラフィ用の装置は市販されており、例えばAgilent Technologies、USAから入手可能である。本発明により利用されるガスクロマトグラフィは、原理上、液体クロマトグラフィと同等に動作する。しかし、液体移動相中の化合物（すなわち代謝物質）を固定相に通過させるのではなく、化合物は気体容積中に存在する。化合物は、固定相として固体支持体材料を含むカラム、又は固定相として機能する若しくは固定相でコーティングされた壁を通過する。同様に、各化合物は、カラムを通過するのに要する特定の時間を有する。さらにガスクロマトグラフィの場合には、好ましくは、ガスクロマトグラフィの前に化合物を誘導体化することが想定される。誘導体化の好適な技術は当技術分野で周知である。好ましくは、本発明による誘導体化は、好ましくは極性化合物のメトキシ化（methoxymation）及びトリメチルシリル化、並びに、好ましくは非極性（すなわち親油性）化合物のメチル基転移、メトキシ化（methoxymation）及びトリメチルシリル化に関する。
【００３０】
「参照」という用語は、本明細書において言及される医学的症状、すなわち疾患の有無、疾患の状態又は効果に相関付けることのできる、各バイオマーカーの特徴的特性の値を指す。好ましくは、参照は、バイオマーカーの閾値（例えば、量又は量の比）であって、検査対象のサンプル中に見られる、閾値より高い値又は本質的に同じ値は医学的状態の存在を示し、一方、閾値より低い値は医学的状態の不在を示す、上記の閾値である。また好ましくは、参照は、バイオマーカーの閾値であって、検査対象のサンプル中に見られる、閾値より低いか又は同じ値が医学的状態の存在を示し、一方、閾値より高い値は医学的状態の不在を示す、上記の閾値であってもよいことが理解されよう。
【００３１】
上述の本発明の方法において、参照は、好ましくは、心不全に罹患していることがわかっている被験体又は被験体群由来のサンプルから得られる参照である。このような場合、試験サンプル中に見いだされる少なくとも1つのバイオマーカーの本質的に同じ値は、疾患の存在を示す。さらに、参照は、好ましくは、心不全に罹患していないことがわかっている被験体又は被験体群、好ましくは一見して健康な被験体からも得られる。このような場合、試験サンプル中に見られる少なくとも1つのバイオマーカーの、参照と比較して変化した値は、疾患の存在を示す。同じことは、計算参照、最も好ましくは、検査対象の被験体を含む個体集団の少なくとも1つのバイオマーカーの相対値又は絶対値の平均値又は中央値にも、必要な変更を加えて当てはまる。該集団の個体の少なくとも1つのバイオマーカーの絶対値又は相対値は、本明細書中の他の箇所に明記されるように測定することができる。好適な参照値、好ましくは平均値又は中央値の計算方法は、当技術分野で周知である。上で言及される被験体集団は、複数の被験体、好ましくは、少なくとも5、10、50、100、1,000、又は10,000の被験体を含むだろう。本発明の方法により診断される被験体と該複数の被験体とは、同一生物種であることが理解されよう。
【００３２】
特徴的特性の値、及び定量的測定の場合は強度値が、本質的に同一であれば、試験サンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの値と参照値とは本質的に同一である。本質的に同一とは、2つの値の差が、好ましくは、有意ではないことを意味し、強度の値が参照値に基づいて少なくとも1〜99パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、40〜60パーセンタイルの間隔の範囲内、好ましくは参照値に基づいて50、60、70、80、90、若しくは95パーセンタイルの間隔であることを特徴とする。2つの量が本質的に同じであるかどうかを決定するための統計学的検定は当技術分野で周知であり、また本明細書の他の箇所において記載されている。
【００３３】
一方、2つの値について観察される差は統計学的に有意であるべきである。相対値又は絶対値の差は、好ましくは、参照値に基づいて、45〜55パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、1〜99パーセンタイルの間隔からかなり外側にある。中央値の好ましい変化及び比は、添付の表並びに実施例に記載されている。
【００３４】
好ましくは、参照、すなわち少なくとも1つのバイオマーカーの少なくとも1つの特徴的特性の値又はその比は、データベースなどの好適なデータ記憶媒体中に記憶され、このため将来の評価にも利用することができる。
【００３５】
「比較する」という用語は、バイオマーカーの測定値が、参照と本質的に同一であるか、又は参照と差がある（異なっている）かを判定することを指す。好ましくは、バイオマーカーの値は、観察される差が本明細書の他の箇所で記載する統計学的手法により決定することが可能であり、統計学的に有意である場合に、参照と差がある（異なる）とみなされる。差が統計学的に有意ではない場合には、バイオマーカーの値と参照とは本質的に同一である。上に記載した比較に基づいて、被験体は、疾患に罹患しているか又は罹患していないと評価することができる。
【００３６】
本明細書中で言及される特定のバイオマーカーについて、相対量若しくは比の変化（すなわち、平均値の比として表される変化）の好ましい値、又は調節の種類（すなわち、より高い若しくはより低い相対量若しくは比及び／若しくは絶対量若しくは比をもたらす「上方」調節若しくは「下方」調節又は増加若しくは減少）は、以下の表及び実施例に示される。平均値の比は、増加又は減少の度合いを示す。例えば、値2は、量が、参照と比較してバイオマーカーの量の2倍であることを意味する。さらに、「上方調節」又は「下方調節」が存在するかどうかも明らかである。「上方調節」の場合には、平均値は1.0を超えるのに対し、「下方調節」の場合には1.0以下となるだろう。従って、調節の方向も同様に表から導くことができる。平均値の代わりに、中央値も使用し得ることが理解されよう。
【００３７】
好ましくは、本発明により、被験体のサンプル中で測定される値又は比は、年齢、BMI、性別又は他の既存の疾患(例えば、参照と比較する前の、糖尿病の存在又は不存在)に応じて調整される。あるいは、参照は、年齢、BMI、性別又は他の疾患(例えば、参照と比較する前の糖尿病の存在又は不存在)に応じて同様に調整された値又は比から導くことができる。このような調整は、参照及び潜在値又は比を、個々の被験体がこれらのパラメーターに関して検査対象の被験体と本質的に同一である被験体の群から導くことによって行うことができる。他の選択肢として、この調整は、統計的計算によって行うことができる。
【００３８】
好ましくは、心不全に罹患していないことがわかっている被験体又は被験体群から得られた参照を用いる場合、表1A1、1B1、2A1、2B1、3A1、3B1、4A1、4B1、5A1、5B1、6A1、6B1、7A1、7B1、8A1又は8B1のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについての少なくとも1つのバイオマーカーの量の増加は、心不全を示す。好ましくは、心不全に罹患していないことがわかっている被験体又は被験体群から得られた参照を用いる場合、表1A2、1B2、2A2、2B2、3A2、3B2、4A2、4B2、5A2、5B2、6A2、6B2、7A2、7B2、8A2、又は8B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについての少なくとも1つのバイオマーカーの量の減少は、心不全を示す。
【００３９】
比較は、好ましくは、自動化により支援される。例えば、2つの異なるデータセット（例えば、特徴的特性（複数可）の値を含むデータセット）を比較するためのアルゴリズムを含む好適なコンピュータプログラムを使用することが可能である。そのようなコンピュータプログラム及びアルゴリズムは、当技術分野で周知である。上に述べたとおりであるが、手動で比較を行うことも可能である。
【００４０】
有利なことに、本発明の基礎となる研究において、前述した具体的バイオマーカーの量は、心不全の指標であることが見いだされた。従って、原理上、サンプル中の前記に特定されるバイオマーカーの少なくとも1つを用いて、被験体が心不全に罹患しているかどうかを評価することができる。これは、特に、疾患の効率的な診断、並びに心不全の前臨床及び臨床管理の改善、並びに患者の効率的なモニタリングに役立つ。さらに、本発明の基礎となる知見はまた、以下に詳しく記載するように、心不全に対するさらに効果的な薬物療法又は他の介入処置（栄養食事を含む）の開発も促進する。
【００４１】
前文に記載した用語の定義及び説明は、以下に別途記載しない限り、必要な変更を加えて、以下に示す本発明の実施形態に準用する。
【００４２】
本発明はまた、被験体が心不全の治療又は治療の変更を必要とするかどうかを特定する方法であって、本発明の方法のステップと、心不全が診断された場合に被験体をその必要があると特定するさらなるステップを含む、前記方法にも関する。
【００４３】
本明細書において用いられる「心不全の治療を必要とする」という表現は、被験体における疾患が、心不全又はそれに付随する症候の改善又は治療のために治療的介入が必要である又は有益である状態にあることを意味する。従って、本発明の基礎となる研究の知見は、被験体における心不全の診断を可能とするだけではなく、心不全治療によって処置すべき又はその心不全治療に調整を要する被験体の特定をも可能とする。その被験体が特定された場合には、本方法は、心不全の治療について推奨するステップをさらに含みうる。
【００４４】
本発明に従って使用される心不全の治療は、好ましくは、以下：ACE阻害剤（ACEI）、ベータブロッカー、AT1阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト、レニンアンタゴニスト、利尿薬、Ca増感剤、ジギタリス配糖体、タンパク質S100ファミリーのポリペプチド（DE000003922873A1、DE000019815128A1又はDE000019915485A1により開示されているようなもの、参照により本明細書に組み入れる）、ナトリウム利尿ペプチド、例えばBNP（ネシリチド（Nesiritide）ヒト組換え脳性ナトリウム利尿ペプチド- BNP）若しくはANPからなる群より選択される少なくとも1つの薬剤の投与を含む又はその投与からなる治療に関する。
【００４５】
さらに本発明は、被験体において心不全に対する治療が成功したかどうかを判定する方法であって、本発明の方法のステップと、心不全が診断されない場合に治療が成功したかどうかを判定するさらなるステップを含む、前記方法に関する。
【００４６】
心不全又は少なくともその一部の症候が、非処置被験体と比較して治療又は改善することができた場合に、心不全治療は成功していると理解されうる。さらに、本明細書では、疾患の進行が阻止されるか又は非処置被験体と比較して少なくとも減速している場合にも治療は成功していると意味される。
【００４７】
本発明は、被験体における心不全の進行又は回復をモニタリングする方法であって：
a)  該被験体の第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、表9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップであって、ここで該第1のサンプルが、該第2のサンプルに先立って得られたものである、前記ステップ；及び
c)  第1のサンプルにおいて測定された量と第2のサンプルにおいて測定された量とを比較し、これにより心不全の進行又は回復が診断されることになるステップ
を含む、前記方法にも関する。
【００４８】
本明細書において用いられる「モニタリングする」という用語は、第1のサンプルが採取された時点から第2のサンプルが採取された時点までの間の心不全の進行又は心不全の回復を測定することを指す。モニタリングは、患者が成功裏に治療されたか否か又は少なくとも心不全の症状が、特定の治療によって時間とともに改善され得たか否かを判定するために使用することもできる。
【００４９】
本明細書において用いられる「進行」という用語は、心不全又はそれに伴う症状の悪化を指す。好ましくは、本明細書において言及される進行は、無症候性心不全から症候性心不全への進行、より好ましくは、NYHAクラスIからNYHAクラスIIIへの進行を指す。同様に、本明細書において用いられる「回復」という用語は、心不全又はそれに伴う症状の改善を指す。好ましくは、本明細書において言及される「回復」は、症候性心不全から無症候性心不全への回復及び、より好ましくは、NYHAクラスIIIからNYHAクラスI又はさらに健康な状態への回復をも指す。心不全の回復は、好ましくは、本明細書中の他の箇所に特定される心不全の治療の適用の後に生じることが理解されよう。従って、上記の方法は、好ましくは、心不全に対する治療が被験体において成功したか否かを判定するために適用することもできる。
【００５０】
好ましくは、心不全はDCMPであり、該少なくとも1つのバイオマーカーは、表10A1、10A2、10B1又は10B2に記載されたバイオマーカーから選択される。また好ましくは、該心不全はICMPであり、該少なくとも1つのバイオマーカーは、表11A1、11A2、11B1又は11B2に記載されたバイオマーカーから選択される。さらにより好ましくは、該心不全はHCMPであり、該少なくとも1つのバイオマーカーは、表12A1、12A2、12B1又は12B2に記載されたバイオマーカーから選択される。
【００５１】
さらに好ましくは、血漿又は血清サンプルを用いる場合、少なくとも1つのバイオマーカーは、表9A1、9A2、10A1、10A2、11A1、11A2、12A1、12A2、13A1又は13A2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択される。さらにより好ましくは、尿サンプルを用いる場合、少なくとも1つのバイオマーカーは、表9B1、9B2、10B1、10B2、11B1、11B2、12B1、12B2、13B1又は13B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択される。
【００５２】
好ましくは、第2のサンプルにおいて第1のサンプルと比較して測定される少なくとも1つのバイオマーカーの量の増加は、表9A1、9B1、10A1、10B1、11A1、11B1、12A1又は12B1のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについて、心不全を示す。好ましくは、第2のサンプルにおいて第1のサンプルと比較して測定される少なくとも1つのバイオマーカーの量の減少は、表9A2、9B2、10A2、10B2、11A2、11B2、12A2又は12B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについて、心不全を示す。
【００５３】
また好ましくは、前記モニタリングしている心不全の進行又は回復は、表13A1、13A2、13B1、又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量が上記のモニタリング方法において測定される場合、左室駆出率低下の進行又は回復を伴う。
【００５４】
上記の方法により言及されるLVEFの低下は、好ましくは、本明細書中の他の箇所に特定される著しく低下したLVEFである。
【００５５】
好ましくは、上記の方法によって検査される被験体は、DCMP及び/又はICMPに罹患しているか、又は罹患していることが疑われる被験体である。
【００５６】
さらに好ましくは、血漿又は血清サンプルを用いる場合、少なくとも1つのバイオマーカーは、表13A1又は13A2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択される。さらにより好ましくは、尿サンプルを用いる場合、少なくとも1つのバイオマーカーは、表13B1又は13B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択される。
【００５７】
好ましくは、第2のサンプルを第1のサンプルと比較して測定される少なくとも1つのバイオマーカーの量の増加は、表13A2又は13B2のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについて、心不全の進行を示す。好ましくは、第2のサンプルを第1のサンプルと比較して測定される少なくとも1つのバイオマーカーの量の減少は、表13A1又は13B1のいずれか1つに記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーについて、心不全の進行を示す。
【００５８】
好ましくは、上記の方法により言及される第1のサンプルと第2のサンプルとの比較は、所与のバイオマーカーの調節の強度及び方向の指標としての平均の比を計算することによって実施される。平均の比は、心不全群におけるバイオマーカーの量の平均を、参照平均（すなわち、被験体の参照群におけるバイオマーカーの平均量）で割ることによって計算された。代謝物質レベルとLVEFとの相関関係に関する結果は、相関関係についてのp値及び、各代謝物質の標準偏差ユニットにおいて表される回帰線の傾きを示す推定値などの統計的パラメーターによって説明される。
【００５９】
少なくとも1つのバイオマーカーを測定するための前述の方法は、デバイスに組み込むことができる。本明細書において用いられるデバイスは、少なくとも前述の手段を含むものである。さらにこのデバイスは、好ましくは、少なくとも1つのバイオマーカーの検出された特徴的特性及び、また好ましくは測定されたシグナル強度の比較及び評価のための手段をも含む。デバイスの手段は、好ましくは、互いに動作可能に連結されている。これらの手段を動作可能に連結する方法は、デバイスに組み込まれる手段の種類に応じて異なる。例えば、自動で定性的又は定量的にバイオマーカーを測定する手段を適用する場合には、評価を容易にするため、該自動動作手段により得られるデータを例えばコンピュータプログラムによって処理することが可能である。好ましくは、そのような場合、上記手段は単一のデバイスに組み込まれる。従って、上記デバイスは、バイオマーカーの分析ユニットと、得られたデータを評価のために処理するコンピュータユニットとを備えていてもよい。好ましいデバイスは、専門臨床医の特別な知識がなくても適用可能なデバイス、例えば単にサンプルをロードするだけでよい電子デバイスである。
【００６０】
他の選択肢として、少なくとも1つのバイオマーカーの測定方法は、好ましくは互いに動作可能に連結されたいくつかのデバイスを含むシステムに組み込むことが可能である。具体的には、上記の手段は、上に詳細に記載したように本発明の方法を実施できるように連結されていなければならない。したがって、本明細書において用いられる「動作可能に連結された（operatively linked）」とは、好ましくは、機能的に連結された（functionally linked）ことを意味する。本発明のシステムに使用される手段に応じて、該手段間のデータ伝送を可能にする手段、例えば、ガラスファイバーケーブル及びハイスループットデータ伝送用の他のケーブルを用いて各手段を他の手段と接続することにより、該手段を機能的に連結することができる。それにもかかわらず、本発明では、例えばLAN（無線LAN、W-LAN）を介する手段間の無線データ転送も想定される。好ましいシステムは、バイオマーカーを測定する手段を含む。本明細書において用いられるバイオマーカーを測定する手段は、バイオマーカーの分離手段（例えばクロマトグラフィデバイス）、及び代謝物質の測定手段（例えば質量分析デバイス）を包含する。好適なデバイスについては、上に詳細に記載されている。本発明のシステムに使用される好ましい化合物分離手段としては、クロマトグラフィデバイス、より好ましくは液体クロマトグラフィ用、HPLC用、及び／又はガスクロマトグラフィ用のデバイスが挙げられる。好ましい化合物測定デバイスは、質量分析デバイス、より好ましくはGC-MS、LC-MS、直接注入質量分析器、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析器、逐次連結質量分析器（例えばMS-MS若しくはMS-MS-MS）、ICP-MS、Py-MS又はTOFを含む。分離手段及び測定手段は、好ましくは互いに連結している。最も好ましくは、本明細書中の他の箇所に詳細に記載されるように、LC-MS及び／又はGC-MSを本発明のシステムに使用する。さらに、バイオマーカーの測定手段から得られた結果の比較手段及び／又は分析手段も含まれるだろう。結果の比較手段及び／又は分析手段は、少なくとも1つのデータベース、及び結果を比較するために実装されたコンピュータプログラムを含みうる。また、上述のシステム及びデバイスの好ましい実施形態についても、以下に詳細に記載される。
【００６１】
従って、本発明は、以下：
（a）表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1、8B2、9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2のいずれかに記載された少なくとも1つのバイオマーカーについての検出器を含む分析ユニットであって、該検出器により検出される該バイオマーカーの量を測定するために適合されている分析ユニット及び、これに動作可能に連結された、
（b）少なくとも1つのバイオマーカーの測定量と参照量との比較を実施するための実体的に埋め込まれたコンピュータプログラムコード、及び該バイオマーカーに関する該参照量を含むデータベースを備えたコンピュータを含む評価ユニットであって、それにより、被験体が心不全を罹患しているかどうかが診断されることになる評価ユニットを含む診断デバイスに関する。
【００６２】
好ましくは、上記のコンピュータプログラムコードは、本明細書中の他の箇所において詳細に特定される本発明の方法のステップを実施することができる。
【００６３】
好ましい実施形態において、上記デバイスは、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1、8B2、9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2のいずれかにおける少なくとも1つのバイオマーカーそれぞれについて示された調節の種類及び／又は調節倍率の値を含む追加のデータベース、並びに測定された調節の種類及び／又は調節倍率の値と上記データベースに含まれるものとの比較を実施するための追加の実体的に埋め込まれたコンピュータプログラムコードを備える。
【００６４】
さらに本発明は、上に記載の医学的状態又は効果を示す（すなわち、被験体における心不全を診断する）少なくとも1つのバイオマーカーの特性値を含むデータ集合に関する。
【００６５】
「データ集合」という用語は、物理的及び／又は論理的にグループ化しうるデータの集合を指す。したがって、データ集合は、単一のデータ記憶媒体又は互いに動作可能に連結された物理的に分離されたデータ記憶媒体に組込むことができる。好ましくは、データ集合は、データベースを利用して実装される。したがって、本明細書において用いられるデータベースとは、好適な記憶媒体上のデータ集合を包含するものである。さらにデータベースは、好ましくは、データベース管理システムをも含む。データベース管理システムは、好ましくは、ネットワーク型、階層型、又はオブジェクト指向型のデータベース管理システムである。そのうえさらに、データベースは、連邦データベース又は統合データベースでありうる。より好ましくは、データベースは、分散型（連邦）システムとして、例えばクライアントサーバシステムとして実装されるであろう。より好ましくは、データベースは、検索アルゴリズムにより試験データセットをデータ集合に含まれるデータセットと比較できるように構築される。具体的には、そのようなアルゴリズムを用いて、上に記載した医学的状態又は効果を示す類似又は同一のデータセットが得られるように、データベースを検索することが可能である（例えば、クエリー検索）。したがって、データ集合で同一又は類似のデータセットを同定できれば、試験データセットは、該医学的状態又は効果と関連付けられるであろう。その結果として、データ集合から得られた情報を、例えば上述した本発明の方法のための参照として用いることが可能である。より好ましくは、データ集合は、上で記載した群のいずれかに含まれる全てのバイオマーカーの特性値を含む。
【００６６】
上記を考慮して、本発明は、上述のデータ集合を含むデータ記憶媒体を包含する。
【００６７】
本明細書において用いられる「データ記憶媒体」という用語は、単一の物理的エンティティに基づくデータ記憶媒体、例えば、CD、CD-ROM、ハードディスク、光記憶媒体、又はディスケットを包含する。さらに、この用語は、好ましくはクエリー検索に好適な方式で、上述のデータ集合を提供するように互いに動作可能に連結された物理的に分離されたエンティティよりなるデータ記憶媒体をも包含する。
【００６８】
本発明はまた、
（a）サンプルの少なくとも1つのバイオマーカーの特性値を比較するための手段と、それと動作可能に連結された
（b）上記のデータ記憶媒体
とを含むシステムにも関する。
【００６９】
本明細書において用いられる「システム」という用語は、互いに動作可能に連結された異なる手段に関する。該手段は、単一のデバイスに組み込みうるか、又は互いに動作可能に連結された物理的に分離されたデバイスでありうる。バイオマーカーの特性値を比較するための手段は、好ましくは、上で述べたような比較用のアルゴリズムに基づく。データ記憶媒体は、好ましくは、それぞれの記憶されたデータセットが上で記載した医学的状態又は効果を示す上述のデータ集合又はデータベースを含む。したがって、本発明のシステムを用いれば、データ記憶媒体に記憶されたデータ集合に試験データセットが含まれるかどうかを同定することが可能である。その結果として、本発明の方法は、本発明のシステムにより実施することができる。
【００７０】
システムの好ましい実施形態では、サンプルのバイオマーカーの特性値を測定する手段が含まれる。「バイオマーカーの特性値を測定する手段」という用語は、好ましくは、代謝物質を測定するための上述のデバイス、例えば、質量分析デバイス、NMRデバイス、又はバイオマーカーの化学的アッセイ若しくは生物学的アッセイを行うためのデバイスに関する。
【００７１】
さらに本発明は、上に言及される群のいずれかから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの測定を含む診断用手段に関する。
【００７２】
「診断用手段」という用語は、好ましくは、本明細書中の他の箇所に詳細に特定されるような診断用デバイス、システム、又は生物学的アッセイ若しくは化学的アッセイに関する。
【００７３】
「少なくとも1つのバイオマーカーの測定手段」という表現は、バイオマーカーを特異的に認識することができるデバイス又は作用剤を指す。好適なデバイスは、分光測定デバイス（例えば質量分析デバイス）、NMRデバイス、又はバイオマーカーの化学的アッセイ若しくは生物学的アッセイを行うためのデバイスでありうる。好適な作用剤は、バイオマーカーを特異的に検出する化合物でありうる。本明細書において用いられる検出とは、二工程プロセスであってもよい。すなわち、最初に、化合物を検出対象のバイオマーカーに特異的に結合させ、続いて、検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル、化学発光シグナル、放射性シグナルなど）を発生させることが可能である。検出可能なシグナルを発生させるために、さらなる化合物が必要になる可能性がある。こうした化合物はすべて、「少なくとも1つのバイオマーカーの測定手段」という用語に包含される。バイオマーカーに特異的に結合する化合物は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載されており、好ましくは、酵素、抗体、リガンド、レセプター、又はバイオマーカーに特異的に結合する他の生物学的分子若しくは化学物質などである。
【００７４】
さらに本発明は、上に言及される群のいずれかから選択される少なくとも1つのバイオマーカーを含む診断用組成物に関する。
【００７５】
上述した群のいずれかから選択される少なくとも1つのバイオマーカーは、バイオマーカー、すなわち本明細書の他の箇所に記載したように被験体の医学的状態又は効果についての指標分子としての役割を果たすだろう。従って、バイオマーカー分子自体は、診断用組成物として、好ましくは本明細書において言及される手段によって可視化又は検出する際の診断用組成物としての役割を果たしうる。従って、本発明によるバイオマーカーの存在を示す診断用組成物はまた、該バイオマーカー（物理的には例えば抗体の複合体）を含んでもよく、検出対象のバイオマーカーは診断用組成物としての役割を果たしうる。そのため、診断用組成物はさらに、本明細書の他の箇所に記載される代謝物質の検出用手段を含んでもよい。あるいは、検出手段、例えばMS又はNMRに基づく技術を使用する場合には、リスク状態の指標としての役割を果たす分子種は、検査対象の試験サンプルに含まれる少なくとも1つのバイオマーカーであろう。従って、本発明により言及される少なくとも1つのバイオマーカーは、バイオマーカーとしての識別性のために、それ自体が診断用組成物としての役割を果たす。
【００７６】
一般的に、本発明は、心不全を診断するための、被験体のサンプルにおける、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2のいずれかに記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの使用を意図する。
【００７７】
好ましくは、前記被験体は、無症候性心不全（好ましくはNYHAクラスIの無症候性心不全）に罹患しており、少なくとも1つのバイオマーカーは、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである。特に、本発明の使用において、無症候性心不全は、(i) DCMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表2A1、2A2、2B1又は2B2に記載されたバイオマーカーから選択されるか、(ii) ICMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表3A1、3A2、3B1又は3B2に記載されたバイオマーカーから選択されるか、あるいは(iii) HCMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択される。
【００７８】
さらに、本発明の使用により好ましく想定されるのは、前記心不全が症候性心不全（好ましくはNYHAクラスII及び/又はIIIの心不全）であり、少なくとも1つのバイオマーカーは、表5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである。特に、本発明の使用において、症候性心不全は、(i) DCMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表6A1、6A2、6B1又は6B2に記載されたバイオマーカーから選択されるか、(ii) ICMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表7A1、7A2、7B1又は7B2に記載されたバイオマーカーから選択されるか、あるいは(iii) HCMPであって、該少なくとも1つのバイオマーカーが表8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される。
【００７９】
最終的に、本発明は、心不全の進行又は回復をモニタリングするための、被験体のサンプルにおける表9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの使用を意図する。
【００８０】
好ましくは、本発明の被験体は、DCMP及び/又はICMPに罹患している。また好ましくは、該被験体のサンプルにおける、表13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーは、被験体におけるLVEFの低下の進行又は回復を判定するために使用することができる。
【００８１】
本明細書において引用したすべての参照文献は、その開示内容全般に関して又は上に示した具体的な開示内容に関して、本明細書に参照として組み込むものとする。
【実施例】
【００８２】
以下の実施例により、本発明を説明するが、該実施例によって本発明の範囲を制限又は限定する意図はない。
【００８３】
実施例１：健常対照からCHFのサブタイプであるDCMP（拡張型心筋症）、ICMP（虚血性心筋症）及びHCMP（肥大型心筋症）を区別するための研究設計
81名の男性及び女性DCMP患者と、81名の男性及び女性ICMP患者と、80名の男性及び女性HCMP患者と、83名の男性及び女性健常対照（年齢が35〜75歳の範囲、BMIが20〜35kg/m2の範囲）を研究に含めた。患者のNYHA（ニューヨーク心臓協会）スコアは1〜3の範囲であった。患者及び対照は、年齢、性別及びBMIが一致していた。全ての患者及び対照について、血液及び尿サンプルを採取した。遠心により血漿を調製し、測定を実施するまでサンプルを−80℃で保存した。
【００８４】
CHFの3つのサブグループ（DCMP、ICMP及びHCMP）を、心エコー検査及び血行動態基準に基づいて定義した：
（a）DCMPサブグループ：心肥大を有する収縮ポンプ不全として血行動態的に定義される（心エコーによる55mmを超える左心室拡張末期径の増大、及び50％未満の左心室駆出分画率（LVEF）の制限）
（b）ICMPサブグループ：冠不全による収縮ポンプ不全として血行動態的に定義される（50％を超える冠動脈狭窄、及びストレス誘発性心内膜運動不全、並びに50％未満のLVEF）（c）HCMPサブグループ：求心性心肥大（心エコー検査で11mmを超える中隔、11mmを超える後壁心筋）及び拡張期CHF（50％以上のLVEFを示す、ポンプ機能の機能障害なし又は軽度の機能障害）。
【００８５】
NYHA IV患者、並びに卒中に罹患している患者、試験前の最後の4ヶ月以内に心筋梗塞を有した患者、試験前の最後の4週間以内に薬物治療を変更した患者、及び急性若しくは慢性炎症疾患及び悪性腫瘍に罹患した患者を除外した。
【００８６】
実施例２：代謝物質の測定
ヒト血漿サンプルを、以下に記載するように調製し、LC-MS/MS及びGC-MS又はSPE-LC-MS/MS（ホルモン）分析に供した。
【００８７】
タンパク質を血漿から沈降により分離した。水、及びエタノールとジクロロメタンの混合物を加えた後、残留サンプルを極性の水相と親油性の有機相に分画した。
【００８８】
脂質抽出物のトランスメタノリシスのために、140μlのクロロホルム、37μlの塩酸（37重量％HCl水溶液）、320μlのメタノール及び20μlのトルエンの混合物を、蒸発させた抽出物に加えた。その容器を密封し、100℃にて振とうしながら2時間加熱した。次いで溶液を蒸発乾固させた。残留物を完全に乾燥した。
【００８９】
カルボニル基のメトキシム化を、密封した容器中でメトキシアミン塩酸塩（ピリジン中の20mg/ml、100μl、1.5時間、60℃にて）との反応によって行った。奇数炭素数の直鎖脂肪酸の溶液20μl（3/7(v/v)ピリジン/トルエン中の、7〜25個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.3mg/mLと27、29及び31個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.6mg/mLの溶液）を時間標準として加えた。最後に、100μlのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2、2、2-トリフルオロアセトアミド（MSTFA）による誘導体化を60℃にて30分間、密封した容器中で再び行った。GC中への注入前の最終体積は220μlであった。
【００９０】
極性相については、以下の手順で誘導体化を実施した。カルボニル基のメトキシム化を、密封した容器中でメトキシアミン塩酸塩（ピリジン中の20mg/ml、50 μl、1.5時間、60℃にて）との反応によって行った。奇数炭素数の直鎖脂肪酸の溶液10μl（3/7(v/v)ピリジン/トルエン中の、7〜25個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.3mg/mLと27、29及び31個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.6mg/mLの溶液）を時間標準として加えた。最後に、50μlのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド（MSTFA）による誘導体化を60℃にて30分間、密封した容器中で再び行った。GC中への注入前の最終体積は110μlであった。
【００９１】
GC-MSシステムはAgilent 5973 MSDと連結したAgilent 6890 GCからなる。オートサンプラーはCTCからのCompiPal又はGCPalである。
【００９２】
分析については、分析サンプル材料と相分離ステップからの画分に応じて0％〜35％の芳香族部分を含有する様々なポリメチルシロキサン固定相を有する通常の市販のキャピラリー分離カラム（30m x 0.25mm x 0.25μm）を使用した（例えば： DB-1ms、HP-5ms、DB-XLB、DB-35ms、Agilent Technologies）。1μLまでの最終体積を分割せずに注入し、オーブン温度プログラムを70℃にてスタートし、十分なクロマトグラフィ分離と各アナライトピークの走査数を達成するために、サンプル材料と相分離ステップからの画分に応じて異なる昇温速度で340℃にて終了した。さらにRTL（Retention Time Locking（保持時間ロッキング）、Agilent Technologies）を分析に使用し、通常のGC-MS標準条件、例えば名目上1〜1.7ml/分の定常流、及び移動相ガスとしてヘリウム、イオン化を70eVの電子衝突で行い、m/z範囲15〜600内で2.5〜3走査/secの走査速度及び標準チューン条件により走査した。
【００９３】
HPLC-MSシステムはAPI 4000質量分析計（Applied Biosystem/MDS SCIEX、Toronto、Canada）と連結したAgilent 1100 LCシステム（Agilent Technologies、Waldbronn、Germany）から構成された。HPLC分析は、C18固定相（例えば：GROM ODS 7 pH、Thermo Betasil C18）を備えた市販の逆相分離カラムで実施した。10μLまでの最終サンプル体積の、蒸発させかつ再構成した極性及び親油性相を注入し、分離はメタノール／水／ギ酸又はアセトニトリル／水／ギ酸勾配を用いて200μL/分の流量にて勾配溶出により実施した。
【００９４】
質量分析は、エレクトロスプレーイオン化により非極性画分についてはポジティブモードでそして極性画分についてはネガティブ又はポジティブモードで、多重反応モニタリング（MRM）モード及び100〜1000amuのフル走査を用いて行った。
【００９５】
ステロイドとそれらの代謝物質はオンラインSPE-LC-MS（固相抽出-LC-MS）により測定した。カテコールアミンとそれらの代謝物質はYamada et al.（J. Anal. Toxicol. (26)、2002、17-22）に記載されているオンラインSPE-LC-MSにより測定した。カテコールアミン及び関連する代謝物質、並びにステロイド及び関連する代謝物質の両方について、安定同位体標識標準を用いて定量を行い、絶対濃度を算出した。
【００９６】
血漿サンプル中の複合脂質の分析：
クロロホルム／メタノールを用いる液／液抽出によって、血漿から総脂質を抽出した。続いて、Christie（Journal of Lipid Research (26)、1985、507-512)）に従って、順相液体クロマトグラフィ（NPLC）によって脂質抽出物を11の異なる脂質群へと分画した。
【００９７】
コレステロールエステル（CE）、遊離ステロール(FS)、スフィンゴミエリン（SM）及びセラミド（CER）についてそれぞれ特異的な多重反応モニタリング（MRM）遷移の検出を有するエレクトロスプレーイオン化（ESI）及び大気圧化学イオン化（APCI）を用いて、画分をLC-MS/MSにより分析した。スフィンゴシン及びスフィンゴシン-1-リン酸（SP）を、Schmidt H et.al., Prostaglandins & other Lipid Mediators 81(2006)、162-170に記載されているように、特異的な多重反応モニタリング（MRM）遷移の検出を有するエレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いてLC-MS/MSにより分析した。以下の表中の代謝物質はこれらの画分の1つに由来し、それらの名称中にそれぞれの略称を含む。
【００９８】
脂質クラスとして、モノアクリルグリセリド(MAG)、トリアシルグリセリド(TAG)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、リソホスファチジルコリン(LPC)、ジアシルグリセロール(DAG)、遊離脂肪酸(FFA)をGC-MSによって測定した。
【００９９】
TMSH(トリメチルスルホニウムヒドロキシド)を用いて誘導体化し、クラス分離した脂質のアシル部分に対応する脂肪酸メチルエステル(FAME)を生じた後、上記の画分をGC-MSによって分析した。C14〜C24のFAMEの濃度は、各画分中で測定される。
【０１００】
以下の表中の代謝物質は、これらの画分の1つから誘導され、それらの名称の前にそれぞれの略称を含み、下線によって分けられる。
【０１０１】
エイコサノイド及び関連物質は、オフライン及びオンラインSPE LC-MS/MS（固相抽出-LC-MS/MS）により血漿から測定した（Masoodi M and Nicolaou A: Rapid Commun Mass Spectrom. 2006 ; 20(20): 3023-3029）。絶対的定量は、安定同位体標識標準を用いて実施した。
【０１０２】
全患者から得たサンプルを、代謝物質プロファイリングのフルスペクトル法に供して上述のように分析したが、対照、DCMP NYHA I、DCMP NYHA III、HCMP NYHA II及びICMP NYHA III患者を含む75サンプルのサブセットに適用された、陽極エレクトロスプレーイオン化モードを用いたLC-MS/MSによる血漿の極性相の代謝物質プロファイリングは行わなかった。
【０１０３】
ヒト尿サンプルを調製し、以下のとおり、LC-MS/MS及びGC-MS又はSPE-LC-MS/MS(ホルモン)分析に供した。
【０１０４】
ウレアーゼとの反応（30℃で1時間）により、尿分解を行った。メタノールを添加した後、抽出物を蒸発乾固させた。
【０１０５】
以下のとおりに誘導体化を行った：密封容器中で、メトキシアミン塩酸塩と反応させる(ピリジン中20 mg/ml、50 l、60℃で1.5時間)ことによってカルボニル基のメトキシム化を行った。奇数炭素数の直鎖脂肪酸の溶液10 μl(3/7 (v/v) ピリジン/トルエン中の、7〜25個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.3 mg/mLと、27、29及び31個の炭素原子の脂肪酸それぞれ0.6 mg/mLの溶液)を時間標準として加えた。最終的に、同様に密封容器中で、50 μlのN-メチル-N-(トリメチルシリル)-2,2,2-トリフルオロアセトアミド(MSTFA)を用いた誘導体化を60℃で30分間行った。GCへの注入前の最終容量は110 μlであった。
【０１０６】
本発明のGC-MSシステムは、Agilent 5973 MSDに連結されたAgilent 6890 GCからなる。オートサンプラーは、CTC社製のCompiPal又はGCPalである。
【０１０７】
本発明の分析のため、相分離ステップから得られる分析対象のサンプル物質及び画分に応じて0%〜35%の芳香族部分を含む様々なポリメチルシロキサン固定相を備えた通常の市販のキャピラリー分離カラム(30 m x 0,25 mm x 0,25 μm)を使用した(例えば：DB-1ms, HP-5ms, DB-XLB, DB-35ms, Agilent Technologies)。1 μLまでの最終体積を分割せずに注入し、オーブン温度プログラムを70℃にてスタートし、十分なクロマトグラフィ分離と各アナライトピークの走査数を達成するために、サンプル材料と相分離ステップからの画分に応じて異なる昇温速度で340℃にて終了した。さらに、RTL(Retention Time Locking（保持時間ロッキング）、Agilent Technologies社)を分析に使用し、通常のGC-MS標準条件、例えば名目上1〜1.7 ml/分の定常流、さらに移動相ガスとしてヘリウム、イオン化を70 eVの電子衝突で行い、m/z範囲15〜600内で2.5〜3走査/secの走査速度及び標準チューン条件により走査した。
【０１０８】
HPLC-MSシステムは、API 4000質量分析計(Applied Biosystem/MDS SCIEX, Toronto, Canada)と連結したAgilent 1100 LCシステム(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)からなる。HPLC分析は、C18固定相(例えば：GROM ODS 7 pH、Thermo Betasil C18)を備えた市販の逆相分離カラムで実施した。10 μL以下の最終サンプル体積の、蒸発させかつ再構成した極性及び親油性相を注入し、メタノール/水/ギ酸又はアセトニトリル/水/ギ酸勾配を用いて200 μL/分の流量にて勾配溶出により分離を実施した。
【０１０９】
質量分析は、エレクトロスプレーイオン化により、ネガティブモード又はポジティブモードで、多重反応モニタリング(MRM)モード及び100〜1000 amuのフルスキャンを用いて行った。
【０１１０】
グルクロニダーゼ/スルファターゼの混合物を用いて、ステロイドの脱抱合を行った。ステロイド及びこれらの代謝物質を、オンラインSPE-LC-MS(固相抽出-LC-MS)によって測定した。カテコールアミン及びこれらの代謝物質を、Yamadaら(J. Anal.Toxicol. (26), 2002, 17-22)により記載されるとおり、オンラインSPE-LC-MSによって測定した。カテコールアミンと関連代謝物質及びステロイドと関連代謝物質の両方について、安定同位体標識標準を用いて定量化を達成した。
【０１１１】
実施例３：データ分析及び統計学的評価
血漿及び尿サンプルは無作為化分析シーケンス設計で、各サンプルのアリコートから作製したプールサンプル（いわゆる「プール」）を用いて分析した。包括的分析検証ステップの後、各アナライトの生ピークデータを、分析シーケンス当たりのプールの中央値に対して正規化して、プロセスの変動性を説明した（いわゆる「プール正規化比」）。利用可能な場合には、代謝物質の絶対濃度を統計学的分析に用いた。他の全ての場合には、プールの正規化された比を用いた。全てのデータは、log10変換して正規分布を達成した。
【０１１２】
実施例１に記載の研究は、年齢、BMI、性別（全ての二体相互作用を含む）、診断群及び蓄積時間（任意）の因子を含むANOVAモデルにより分析した。診断群の因子のレベルは、CHFサブタイプ/グレード(DCMP NYHA I、DCMP NYHA II〜III、ICMP NYHA I、ICMP NYHA II〜III、HCMP NYHA I、HCMP NYHA II〜III)、及び対照（参照として設定）であった。対応する結果は、表1〜8に示される。
【０１１３】
NYHA段階によって表されるCHF進行のバイオマーカーを同定するため、診断群の以下のレベル：CHF NYHA I、CHF NYHA II-III、対照(参照として設定)を用いてこの分析を改良した。疾病進行のサブタイプ特異的マーカーに関して、以下の診断群のレベル：DCMP NYHA I、DCMP NYHA II、DCMP NYHA III、HCMP NYHA I、HCMP NYHA II、HCMP NYHA III、ICMP NYHA I、ICMP NYHA II、ICMP NYHA III、対照(参照として設定)を用いて、この分析を改良した。疾患の進行をモニタリングするのに適したバイオマーカーを、NYHA I群において対照と比較して10%以上の増加、及びNYHA I〜NYHA IIIまでさらに10%以上の増加、又はNYHA I群において対照と比較して10%超の減少、及びNYHA I〜NYHA IIIまで10%超のさらに減少、のいずれかとして定義した。さらに、代謝物質は、以下の3つの比較（NYHA I 対 対照、NYHA II 対 対照、NYHA III 対 対照）のうち少なくとも2つについてp値が< 0.05であった場合のみ、進行モニタリングバイオマーカーとして選択される。
【０１１４】
左心室駆出分画率(LVEF)によって定義される進行の代謝物質マーカーを同定するため、LVEFの数値を代謝物質データとの相関づけに使用した。LVEF相関は、DCMP患者及びICMP患者並びに対照を含むデータセットについて実施した(注記：この研究の定義によるHCMPは、DCMP及びICMPとは対照的に、LVEFの減少によっては特徴付けられない)。
【０１１５】
以下の表において、平均の比は、調節の強度及び方向を示す。平均の比は、CHF群における代謝物質レベルの平均を、健常対照群における代謝物質レベルの平均で除することにより算出した。代謝物質レベルとLVEFとの相関に関する結果は、この相関についてのp値、及び各代謝物質の標準偏差のユニット中に表される回帰線の傾きを示す推定値によって表される。
【０１１６】
本発明の方法により測定されるバイオマーカーを以下の表に列挙する。その名称で正確に定義されないバイオマーカーは以下のさらなる表においてさらに特徴付けられる。
【表１Ａ１】
2019109257.tif 000002
2019109257.tif 000003
【表１Ａ２】
2019109257.tif 000004
2019109257.tif 000005
【０１１７】
【表２Ａ１】
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【表２Ａ２】
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【０１１８】
【表３Ａ１】
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【表３Ａ２】
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【０１１９】
【表４Ａ１】
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【表４Ａ２】
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【０１２０】
【表５Ａ１】
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【表５Ａ２】
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【０１２１】
【表６Ａ１】
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【表６Ａ２】
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【０１２２】
【表７Ａ１】
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【表７Ａ２】
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【０１２３】
【表８Ａ１】
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【表８Ａ２】
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【０１２４】
【表９Ａ１】
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【表９Ａ２】
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【０１２５】
【表１０Ａ１】
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【表１０Ａ２】
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【０１２６】
【表１１Ａ１】
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【表１１Ａ２】
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【０１２７】
【表１２Ａ１】
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【表１２Ａ２】
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【０１２８】
【表１３Ａ１】
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【表１３Ａ２】
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【０１２９】
【表１Ｂ１】
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【表１Ｂ２】
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【０１３０】
【表２Ｂ１】
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【表２Ｂ２】
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【０１３１】
【表３Ｂ１】
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【表３Ｂ２】
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【０１３２】
【表４Ｂ１】
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【表４Ｂ２】
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【０１３３】
【表５Ｂ１】
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【表５Ｂ２】
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【０１３４】
【表６Ｂ１】
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【表６Ｂ２】
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【０１３５】
【表７Ｂ１】
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【表７Ｂ２】
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【０１３６】
【表８Ｂ１】
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【表８Ｂ２】
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【０１３７】
【表９Ｂ１】
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【表９Ｂ２】
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【０１３８】
【表１０Ｂ１】
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【表１０Ｂ２】
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【０１３９】
【表１１Ｂ１】
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【表１１Ｂ２】
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【０１４０】
【表１２Ｂ１】
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【表１２Ｂ２】
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【０１４１】
【表１３Ｂ１】
2019109257.tif 000066
【表１３Ｂ２】
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【０１４２】
【表１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月8日(2019.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における心不全の診断を補助するための方法であって、
a) 心不全に罹患していることが疑われる被験体のサンプルにおける、SM_スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)の量を測定するステップ；（b）前記SM_スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)の量を参照と比較するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
さらに、
a) 前記心不全に罹患していることが疑われる被験体の前記サンプルにおける、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される、SM_スフィンゴミエリン(d18:1,C23:1)以外の少なくとも1つのさらなるバイオマーカーの量を測定するステップ；（b）前記少なくとも1つのさらなるバイオマーカーの量を参照と比較するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が無症候性心不全に罹患している請求項１に記載の方法、または前記被験体が無症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのさらなるバイオマーカーが、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記無症候性心不全が、NYHAクラスIの心不全である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記無症候性心不全がICMPである請求項３若しくは４に記載の方法、又は前記無症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのさらなるバイオマーカーが、表3A1、3A2、3B1又は3B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が症候性心不全に罹患している請求項１に記載の方法、または前記被験体が症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのさらなるバイオマーカーが、表5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記症候性心不全が、NYHAクラスII及び/又はIIIの心不全である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記症候性心不全がICMPである請求項６若しくは７に記載の方法、又は、前記症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのさらなるバイオマーカーが、表7A1、7A2、7B1又は7B2に記載されたバイオマーカーから選択される、請求項６若しくは７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
【表１４】
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本発明は以下を含む：
[１]  被験体において心不全を診断する方法であって、
a) 心不全に罹患していることが疑われる被験体のサンプルにおける、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1、4B2、5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップ；（b）前記少なくとも1つのバイオマーカーの量を参照と比較するステップであって、それにより心不全が診断されることになるステップ
を含む、方法。 
[２]  前記被験体が無症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのバイオマーカーが、表1A1、1A2、1B1、1B2、2A1、2A2、2B1、2B2、3A1、3A2、3B1、3B2、4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、１に記載の方法。 
[３]  前記無症候性心不全が、NYHAクラスIの心不全である、２に記載の方法。 
[４]  前記無症候性心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表2A1、2A2、2B1又は2B2に記載されたバイオマーカーから選択される、２又は３に記載の方法。 
[５]  前記無症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表3A1、3A2、3B1又は3B2に記載されたバイオマーカーから選択される、２又は３に記載の方法。 
[６]  前記無症候性心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表4A1、4A2、4B1又は4B2に記載されたバイオマーカーから選択される、２又は３に記載の方法。 
[７]  前記被験体が症候性心不全に罹患しており、かつ少なくとも1つのバイオマーカーが、表5A1、5A2、5B1、5B2、6A1、6A2、6B1、6B2、7A1、7A2、7B1、7B2、8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択されるバイオマーカーである、１に記載の方法。 
[８]  前記症候性心不全が、NYHAクラスII及び/又はIIIの心不全である、７に記載の方法。 
[９]  前記症候性心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表6A1、6A2、6B1又は6B2に記載されたバイオマーカーから選択される、７又は８に記載の方法。 
[１０]  前記症候性心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表7A1、7A2、7B1又は7B2に記載されたバイオマーカーから選択される、７又は８に記載の方法。 
[１１]  前記症候性心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表8A1、8A2、8B1又は8B2に記載されたバイオマーカーから選択される、７又は８に記載の方法。  
[１２]  被験体における心不全の進行又は回復をモニタリングする方法であって：
a) 前記被験体の第1のサンプル及び第2のサンプルにおいて、表9A1、9A2、9B1、9B2、10A1、10A2、10B1、10B2、11A1、11A2、11B1、11B2、12A1、12A2、12B1、12B2、13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を測定するステップであって、ここで前記第1のサンプルが前記第2のサンプルに先立って得られたものである、前記ステップ；及び
c) 第1のサンプル中で測定された量を、第2のサンプル中で測定された量と比較し、それにより心不全の進行又は回復が診断されることになるステップ
を含む、方法。 
[１３]  前記心不全がDCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表10A1、10A2、10B1又は10B2に記載されたバイオマーカーから選択される、１２に記載の方法。  
[１４]  前記心不全がICMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表11A1、11A2、11B1又は11B2に記載されたバイオマーカーから選択される、１２に記載の方法。  
[１５]  前記心不全がHCMPであり、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表12A1、12A2、12B1又は12B2に記載されたバイオマーカーから選択される、１２に記載の方法。  
[１６]  前記心不全の進行又は回復が、LVEFの低下の進行又は回復を伴い、かつ前記少なくとも1つのバイオマーカーが、表13A1、13A2、13B1又は13B2に記載されたバイオマーカーから選択される、１２に記載の方法。