(57)【要約】【課題】アルカリ性または中性のＨ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に、水素生成菌を添加する方法により、常温・常圧・溶存酸素濃度が検出される水の下で、容易で安価に水中に水素を発生させる方法を提供する。【解決手段】アルカリ性または中性のＨ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させる水素発生方法であって、微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する根粒菌である。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドリド（Ｈ−）イオンを含む水である電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させる水素発生方法。
【請求項２】
前記微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する、藍藻類、根粒菌あるいは光合成細菌である。
【請求項３】
前記根粒菌はＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株である、請求項１に記載の水素発生方法。
【請求項４】
アルカリ性および中性の電離水素水から請求項２または請求項３の微生物を添加して水素を発生させる方法
【請求項５】
常温・常圧下で溶存酸素濃度が存在する水で作製したヒドリド（Ｈ−）イオンを含む水である電離水素水へ請求項２または請求項３の微生物を添加して、溶存酸素濃度を消去させ、水素を発生させる方法
【請求項６】
請求項２または請求項３の微生物を用いて請求項１の方法で製造された水素を含む水を用いて植物を栽培する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、常温・常圧下で溶存酸素濃度が検出されるアルカリ性または中性でかつ水中にＨ−水素イオンを含む電離水素水から水素を発生させる方法、および電離水素水からの水素発生に用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】  水素の陰イオンであるヒドリド（Ｈ−）イオンを含む水は、アルカリ金属やアルカリ土類金属などの水素化金属、水素化物、水素吸蔵金属等を水中へ投入した際に、水中に生成される。水中のヒドリドを定性分析する方法として、酢酸や塩酸などを添加した際に、溶存水素を検出する方法が知られるが、これまで定量方法は知られていない。ヒドリドを生成する水素化金属としては、ＣａＨ２、ＬｉＨ、ＭｇＨ２、ＮａＨ、ＮａＢＨ４、ＴｉＨ２などが知られており、これらを加えた水はアルカリ性を示し、常温・常圧下では溶存酸素濃度が検出される。【０００３】  ヒドロゲナーゼは、水中の水素分子Ｈ２の分解による水素イオン生成反応と、この逆反応の水素イオンから水素分子の合成反応を触媒する酵素である。以下に反応式を示す。Ｈ２分子の分解反応の生成物は、Ｈ＋イオンとＨ−イオンが等量生成されると考えられているが、Ｈ−イオンの存在量を明確に示す測定法がなく、（１）式で示される場合が多い。本発明者らは、（２）式により示される反応式であることを前提としている。しかし、実験的にヒドロゲナーゼにより電離水素水が作製されることを示した報告はこれまでにない。
（１）Ｈ２⇔２Ｈ＋＋２ｅ−
（２）Ｈ２⇔Ｈ＋＋Ｈ−＋２ｅ−【０００４】  ヒドロゲナーゼは、膜結合性でｕｐｔａｋｅ型（Ｈ２の取り込みとイオン化；Ｈ２→２Ｈ＋＋２ｅ−を行う）と呼ばれるヒドロゲナーゼと細胞質にある双方向性ヒドロゲナーゼ（Ｈ２のイオン化とＨ２の合成；Ｈ２⇔２Ｈ＋＋２ｅ−）が知られる。Ｕｐｔａｋｅ型ヒドロゲナーゼはＮｉＦｅを活性中心に持ち、酸素分子Ｏ２がある条件では、ＮｉＦｅ活性中心の立体構造を変化させて酸素分子を分解し、水に変えてＯ２耐性を獲得している（非特許文献１）。双方向性ヒドロゲナーゼは酸素Ｏ２に極めて敏感でありＵｐｔａｋｅ型と異なる。【０００５】  また、ヒドロゲナーゼはパラ型水素分子ｐ−Ｈ２をオルト型水素分子ｏ−Ｈ２に転換する反応を触媒することが知られている（非特許文献２）。しかし、水素分子のイオン化とオルト型水素分子およびパラ型水素分子の関係については知られていなかった。このような中、発明者らは（ａ）オルト型水素分子はイオン結合性水素分子であり、パラ型水素分子は共有結合性水素分子であること。（ｂ）イオン結合性のオルト型水素分子はイオン化（Ｈ２→Ｈ＋＋Ｈ−）する水素分子であるが、共有結合性のパラ型水素分子はイオン化しない水素分子であること。（ｃ）従って、ｕｐｔａｋｅ型ヒドロゲナーゼによる水中の水素分子のイオン化反応は、初めにヒドロゲナーゼ酵素が水中のパラ型水素をオルト型水素分子に転換させ、次にイオン化反応を起こさせるのではないかと考えるに至った。（ｄ）電離水素水はｕｐｔａｋｅ型ヒドロゲナーゼによるＨ２分解の際生じたＨ＋イオンとＨ−イオンによって生成されると考えられるが、これまで実験的に証明されていない。【０００６】  一方、Ｈ２分子がＨ＋イオンとＨ−イオンにイオン化された水分子を再びＨ２分子に戻す反応を触媒するのは、双方向性ヒドロゲナーゼによると考えられるが、実験的に証明されていない。また、窒素固定能を持つ根粒菌や一部の藍藻類は大気中の窒素ガスをアンモニアに変換する反応を触媒するニトロゲナーゼ酵素によりＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素分子Ｈ２の合成を触媒していると考えられるが、水中のＨ−イオンの定量法が知られていないこともあり実験的に証明されていない。【０００７】  ニトロゲナーゼは、根粒菌などの窒素固定菌や窒素固定能を有する一部の藍藻類（シアノバクテリア）や光合成細菌が有する酵素で、大気中の窒素分子Ｎ２をアンモニアＮＨ３に変換する酵素である。酵素反応は窒素ガスの有無により２通りあり、どちらも不可逆的に水素発生を行う反応が起こる。以下に既存の研究の反応式を示す。
・窒素ガスが有る場合の反応
（既存の研究）Ｎ２＋８ｅ−＋８Ｈ＋＋１６ＡＴＰ→Ｈ２＋２ＮＨ３＋１６（ＡＤＰ＋Ｐｉ）
・窒素ガスが無い場合の反応
（既存の研究）２Ｈ＋＋２ｅ−＋４ＡＴＰ→Ｈ２＋４（ＡＤＰ＋Ｐｉ）【０００８】  ニトロゲナーゼは、酸素感受性が高く、酸素共存下で失活しやすい性質を有する。その失活性は高く、失活反応が不可逆的であるため、ニトロゲナーゼを扱う際には注意が必要であるとされて来た。【０００９】  一般的に、ニトロゲナーゼを有する微生物は同時にヒドロゲナーゼを有していることが多い。これは、ニトロゲナーゼによって生成した水素をヒドロゲナーゼの水素取り込み反応によってエネルギー源として利用し、効率を高めているためである。このため、ニトロゲナーゼを有している微生物でも、水素発生が微量しか観測できないことが多い。そこで、非特許文献３は、ニトロゲナーゼを有する藍藻類からｕｐｔａｋｅ型ヒドロゲナーゼのみを遺伝子操作で除去したところ、水素生産能力を格段に高めたという研究結果が出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｏｍｕｒａ  Ｙ，Ｙｏｏｎ  Ｋ．Ｓ，Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｈ，ａｎｄ  Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｙ（２０１１）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａ  ［４Ｆｅ−３Ｓ］ｃｌｕｓｔｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ［ＮｉＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．４７９：２５３−２５６．
【非特許文献２】Ｍａｓｕｋａｗａ  Ｈ．，Ｍｏｃｈｉｍａｒｕ  Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｋｕｒａｉ  Ｈ．（２００２）Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ，ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｉｔｏｒｏｇｅｎ  ｆｉｘｉｎｇ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：６１８−６２４．
【非特許文献３】Ｂｅｒｌｉｅｒ  Ｙ．，Ｌｅｓｐｉｎａｔ  Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｄｉｍｏｎ  Ｂ．（１９９０）Ａ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｄｅｕｔｅｒｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｐａｒａ−Ｏｒｔｈｏｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：４２７−４３１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  これまで、微生物を用いて水素を発生させる方法は、光合成細菌などにより有機物や硫黄化合物をエネルギー源にして増殖の過程で発生させたり、太陽光を照射しながら藍藻類や藻類を培養し、培養液中の水分解の過程で水素発生させる方法が取られて来た。しかし、現状では有機物や太陽光エネルギーから水素ガスへの変換効率や水素ガスの回収効率が低いことや、微生物の培養のために広大な敷地を要することの課題があった。
さらに、水素合成酵素であるヒドロゲナーゼやニトロゲナーゼは酸素に極めて敏感であるため、水素発生の条件は嫌気的な条件のみと考えられており、溶存酸素が有る好気的な条件では難しいと考えられて来た。【００１２】  そこで、本発明は、Ｈ−イオンとＨ＋イオンを含む電離水素水に、水素生成菌を添加する方法により、酸素が溶存する常温・常圧下で、容易で安価に水中に水素を発生させる方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、この電離水素水に水素を発生させた水を用いて植物を容易に延命させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  環境中から単離したＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株等を水に投入して、水中の水素分子を分解させて電離水素水を製造するか、あるいは有機物の代謝経路のクエン酸サイクルで生成した水素Ｈ２分子を原子化を経てイオン化させて製造するか（Ｈ２→原子化２Ｈ０→Ｈ−＋Ｈ＋）、さらに水素吸蔵金属を含む強還元性セラミックボールを水に投入してイオン結合性水素分子を放出させることにより電離水素水を製造した。微生物で製造した電離水素水はｐＨが中性であり、水素吸蔵金属（水素化金属）で製造した水はアルカリ性であり、常温・常圧下で製造した水はいずれも大気中の酸素が溶けることから溶存酸素濃度が検出された。この電離水素水に窒素固定能を有する根粒菌を添加することにより、アルカリ性が中性に変わり、酸素濃度が消去される（酸素が還元され水に変わったと考えられる）水素発生法を開発した。この水素水で夾竹桃（キョウチクトウ）の切り花を生育させたところ、水道水に較べて花が枯れずに長持ちしたり、つぼみが開花するなどの延命効果が示された。【００１４】  本発明に係る水素発生方法は、電離水素水に微生物を添加してＨ＋イオンおよびＨ−イオンから水素を発生させるものである。好ましくは前記微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。好ましくは前記電離水素水は、上記の電離水素水の製造方法によって製造された電離水素水である。好ましくは前記ニトロゲナーゼ酵素を有する微生物は、藍藻類、根粒菌あるいは光合成細菌である。好ましくは前記根粒菌はＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株である。【００１５】  本発明に係る電離水素水から水素を発生させるために用いられる微生物は、ニトロゲナーゼ酵素活性またはヒドロゲナーゼ酵素活性を有する。さらに本発明に係る植物を栽培する方法は、上記の製造方法によって製造された電離水素水を用いて行われる。
【発明の効果】
【００１６】  常温・常圧下で安価で容易に水素を発生させる方法を開発した。この方法の水素発生工程では、微生物の培養槽は必要でなく、常温・常圧で電離水素水にＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株やＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ１４７９２株などの窒素固定能を有する菌株（根粒菌）を添加するだけで水素を発生させることができる。発生させた水素は、燃やしたり、貯蔵したり、プロトン交換膜を通すことにより燃料電池等に用いることができる。また、この水で切り花を生育すると花が長持ちしたり、つぼみが開花したりするなどの延命効果が示される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】  実験装置の概略構成を説明する図である。
【図２】  Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株で作製した電離水素水に、大腸菌ＢＷ２５１１３株、根粒菌Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ１４７９２株、根粒菌Ｍｅｓｏｒｈｙｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株を添加した場合の水中の溶存水素濃度（ＤＨ）の経時変化（時間）を示すグラフである。
【図３】  ＴｉＨ２、ＣａＨ２および水素吸蔵強還元性セラミックボールでそれぞれ作製した電離水素水に、根粒菌を添加した場合の水中の溶存水素濃度（ＤＨ）の経時変化（時間）を示すグラフである。
【図４】  水素吸蔵強還元性セラミックボール１１個で作製した電離水素水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の写真である。
【図５】  水素吸蔵強還元性セラミックボール１１個で作製した電離水素水により植物の栽培したとき（６日目）の写真である。
【図６】  水道水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の比較例としての写真である。
【図７】  水道水により植物の栽培したとき（６日目）の比較例としての写真である。
【図８】  Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株と根粒菌により作製した電離水素水により植物の栽培したとき（コントロール：０日目）の写真である。
【図９】  Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株と根粒菌により作製した電離水素水により植物の栽培したとき（６日目）の写真である。
【図１０】  常温・常圧下で溶存酸素濃度が存在する水で、水素化金属ＣａＨ２を用いて作製したヒドリド（Ｈ−）イオンを含むアルカリ性の電離水素水へ根粒菌を添加して、ｐＨを中性に変えた上で溶存酸素濃度を消去させて、水素を発生させた結果を示す。ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）、溶存水素濃度（ＤＨ）、酸化還元電位（ＯＲＰ）の経時変化（時間）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】  本願発明者らが出願した、特願２０１２−０４７１４６「微生物による電離水素水の製造法およびこれに用いる微生物」においては、蔵王山の湧水から単離した各種の菌株用いられた。その後の研究で、電離水素水を製造する菌として、同じ蔵王山の湧水から単離されたＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株が増殖も早く、より電離水素水製造に適した微生物として示された。今回は、このＧ株を用いて製造した電離水素水（Ｈ２→Ｈ＋＋Ｈ−）に窒素固定能を有する水素生成菌Ｍｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株等の根粒菌を添加することによって水素を発生させる方法（Ｈ＋＋Ｈ−→Ｈ２）を開発した。これまで、微生物を用いた水素の生成や製造法は、藍藻類、藻類、硫黄酸化細菌などの光合成細菌、水素菌等の水素生成菌のみを用いた方法であり、電離水素水に微生物を添加して水素を発生させる方法は知られていない。一方で、（株）ＴＡＡＮＥの開発した水素化金属を含む強還元性セラミックボール（特許公開２００４−１７４４８０（特第４２１８９３９））で製造した電離水素水（ＣａＨ２＋２Ｈ２Ｏ→Ｃａ（ＯＨ）２＋Ｈ２↑＋Ｈ＋＋Ｈ−、なおＣＢには他の水素化金属も微量含まれる）に根粒菌を添加する方法によっても水素生成が確認された。
【００１９】  この水素を発生させた電離水素水の用途の一つとして、植物の延命効果を分析した。そこで、夾竹桃（キョウチクトウ）の切り花に、Ｇ株のみを添化した場合（電離水素水であるが水素発生は無いか低い）とＧ株と根粒菌を同時に添加した場合（水素発生あり）で、キョウチクトウを生育し、延命効果を分析した。この結果、５日〜６日間の生育後にコントロールの水道水では、花はしぼんで枯れてしまったり、つぼみは開花することがなかったが、Ｇ株による電離水素水およびＧ株に根粒菌を加えて作った水素を発生させた電離水素水では、花は枯れずに咲き続けたり、つぼみは開花するなどの延命効果が検出された。
【実施例】
【００２０】使用菌株：今回の実験で使用した菌株は次の４株である。
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株およびＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１は山形県蔵王山中腹の湧水から単離された微生物であり、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにそれぞれ寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２６８、ＮＩＴＥ  Ｐ−１２４０として寄託してある。【００２１】  大腸菌は国立遺伝学研究所ＭＥコレクションＳｔｒａｉｎ  ＮＯ．９０６２、Ｓｔｒａｉｎ  Ｎａｍｅ  ＢＷ２５１１３株として保存されており、入手することが可能である。【００２２】  Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍは独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー分野生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ）でＳｔｒａｉｎ  ＮＯ．ＮＢＲＣ１４７９２株として保存されており、入手することが可能である。【００２３】  実験に用いた植物は、広島県呉市の呉工業高等専門学校の校庭に植えてある夾竹桃（キョウチクトウ）であり、この夾竹桃のつぼみが多く含まれる枝を切って用いた。【００２４】  還元性セラミックボールは特許公開２００４−１７４４８０（特第４２１８９３９）の方法で製造されたものを株式会社ＴＡＡＮＥより譲与されたものを用いた。【００２５】使用培地：
微生物培養の培地としてはＰＢ培地（蔵王山湧水由来株およびＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ用）とＬＢ培地（大腸菌用）の２種類を用いた。ＰＢ培地の組成は、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇ、寒天１５ｇ（寒天培地の場合）、蒸留水１Ｌであり、これをオートクレーブ滅菌処理（２０ｍｉｎ、１２１℃、２ａｔｍ）して用いた。ＬＢ培地の組成は、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、グルコース１ｇ、寒天１５ｇ（寒天培地の場合）、蒸留水１Ｌであり、これをオートクレーブ滅菌（２０ｍｉｎ、１２１℃、２ａｔｍ）して用いた。【００２６】使用試薬：
培養液を集菌した後の菌体の凍結保存液として、スキムミルク（１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム溶液：ＳＧ溶液）を用いた。スキムミルクの組成は、スキムミルク１０ｇ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ、蒸留水１００ｍＬ（ｕｐ  ｔｏ  １００ｍＬ）であり、これをオートクレーブ滅菌（２０ｍｉｎ、１２１℃、２ａｔｍ）して用いた。【００２７】実験装置：
実験装置の概略構成を図１に示す。同図に示すように、実験装置は、３０℃の恒温槽１００、恒温槽１００内に収容されたビーカー１１０、菌体入りの透析膜チューブ１２０（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ／Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  社）、ｐＨ  計１３０（ＨＭ−３１Ｐ＋ＧＳＦ−２７３９Ｃ／東亜ディーケーケー株式会社）、ＯＲＰ（酸化還元電位）計１４０（ＨＭ−３１Ｐ＋ＰＳＴ−２７２９Ｃ／東亜ディーケーケー株式会社）、ＤＨ（溶存水素）計１５０（ＫＭ２１００  ＤＨ／有限会社共栄電子研究所）、ＤＨ用ＰＣ（パーソナルコンピュータ）１６０、ｐＨ用ＰＣ１７０、ＯＲＰ用ＰＣ１８０を含む。但し、図に示す縮尺比は実際のものと異なる。【００２８】実験手順：
実験の基本フローは、（１）微生物の培養（前培養・本培養）、（２）菌体の集菌・スキムミルク保存液に懸濁して−８５℃凍結、（３）実験装置の調整、（４）菌体入り透析膜の調整と溶存水素濃度の計測である。その他、強還元性セラミックボールの投入など以下に示す手順（５）〜（７）で行った。【００２９】（１）微生物の培養（前培養・本培養）
微生物の培養は、次の手順で行った。（ａ）−８５℃に凍結保存しておいた各菌株を白金耳でかきとり、寒天培地へ画線植菌し、３０℃で約７日間、静置培養した。（ｂ）出現した単一のコロニーを白金耳でかき取り、１００ｍＬの液体培地を加えた２００ｍＬ容の三角フラスコに植え継ぎ、３０℃、７０ｒｐｍ（大腸菌１１０ｒｐｍ）で約７日間（大腸菌２日間）、振とう培養した（前培養）。（ｃ）この培養液１０ｍＬを新しい１Ｌの液体培地を加えた２Ｌ容の三角フラスコに植え継ぎ、３０℃、７０ｒｐｍ（大腸菌１１０ｒｐｍ）で７日〜１０日間（大腸菌２日間）、振とう培養した（本培養）。【００３０】（２）菌体の集菌・スキムミルク懸濁液の調整
菌体の集菌・調整は、次の手順で行った。（ａ）１Ｌの培養液を４５０ｍＬ容の遠心管３本に移し、４℃、５，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心した。（ｂ）上澄み（培地）を捨て、菌体を５ｍｌのスキムミルクに懸濁した。（ｃ）懸濁液を５００μＬずつ分取し、１．５ｍＬ容マイクロチューブに入れ（１本あたり１００ｍＬの培養液量）、測定実験に使用するまで−８５℃で凍結保存した。【００３１】（３）実験装置の調整
実験装置の調整は、次の手順で行った。（ａ）恒温槽に水を適当量補充し、３０℃に設定した。（ｂ）４００ｍＬの蒸留水を入れた１Ｌビーカーを用意し、恒温槽の中に設置した。（ｃ）ビーカー中の蒸留水に水素イオン（ｐＨ）計、酸化還元電位（ＯＲＰ）計、溶存水素（ＤＨ）計の電極を浸漬した。なお、実験は太陽光が入る窓際に装置を設置し、ブラインドを開けて行った。【００３２】（４）菌体入り透析膜の調整と溶存水素濃度の計測
電離水素水から水素発生実験は、次の手順で行った。（ａ）保存しておいた菌体懸濁液を使用する本数分だけ氷中で解凍し、マイクロピペットで透析膜チューブ（スペクトラ、分画分子量６，０００〜８，０００、長さ７〜９ｃｍ×幅４０ｍｍ）に注入した。（ｂ）透析膜の両端を専用のポリプロピレン製のクリップ（スペクトラ）で留めた。（ｃ）（ｂ）の菌体入り透析膜を４００ｍＬの蒸留水を加えた１Ｌ容ビーカーに投入した。（ｄ）菌体入り透析膜が浮かないようにガラス棒で抑えた。（ｅ）ｐＨ計、ＯＲＰ計のデータを、専用のソフトウェア（東亜ＤＫＫ）を用いて、３０分おきにパソコンのハードウェアに収集した。ＤＨ計のデータはパソコンに内蔵されているデジタルビデオカメラを用いて、１時間置きに１分間録画した。【００３３】（５）Ｇ株で作製した電離水素水から水素発生量の測定
予め菌体懸濁液を加える３０分以上前にｐＨ計、ＤＨ計、ＯＲＰ計の電極を４００ｍＬの蒸留水を加えたビーカーに浸漬して安定化させておくと同時に計測を開始する。−８５℃で凍結保存したＧ株菌体懸濁液を使用する本数分だけ氷中で解凍した。次に菌体懸濁液を透析膜に移し、クリップで留めた。菌体懸濁液を入れた透析膜を４００ｍＬの蒸留水を加えた１Ｌ容ビーカーに投入した。ビーカーの水温は恒温槽を３０℃に設定することにより調節した。２２時間〜２４時間後に、同様に大腸菌、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ１４７９２株、Ｍｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株のそれぞれの菌体懸濁液を加えた。コントロールとしてＧ株で作った電離水素水にスキムミルクのみを加えた試料を用いた。【００３４】（６）水素化金属や水素化金属を含む強還元性セラミックボール（ＣＢ）で作製した電離水素水から水素発生量の測定
予め水素化金属ＴｉＨ２やＣａＨ２あるいは強還元性セラミックボール（ＣＢ）を加える３０分以上前にｐＨ計、ＤＨ計、ＯＲＰ計の電極を４００ｍＬの蒸留水を加えたビーカーに浸漬して安定化させておくと同時に計測を開始する。ビーカーはＧ株を添加えないコントロールを含め４個用意した。各計測器が安定した後にそれぞれのビーカーに０．１ｇのＴｉＨ２（和光純薬）、０．０１ｇのＣａＨ２（ナカライテスク）、ＣＢを１コ（０．０８ｇ）添加した。２２時間〜２４時間後に、Ｇ株を用いた電離水素水から水素発生の実験と同様にＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株などの根粒菌の菌体懸濁液を１．５ｍＬ（３００ｍＬの培養液に相当）加えた。コントロールとして水素化金属で製造した電離水素水にスキムミルクのみを加えた試料、水素化金属で製造した電離水素水に根粒菌やスキムミルクを添加しないで放置した試料を用いた。【００３５】（７）微生物で製造した電離水素水の植物の延命作用観察実験
予め使用ずみの２Ｌ用ペットボトルを良く水で洗い、乾燥させた。乾燥後のペットボトルは切り花を挿し易いように上部をはさみで切った。９月中旬〜１０月下旬の夾竹桃の木からつぼみが多い枝を３０ｃｍ程度の長さに切り、この枝は直ちに予め５００ｍＬの水道水を加えておいたペットボトル容器に移した。この夾竹桃の枝を挿した容器は次の試料分用意した。（ａ）水道水のみのコントロール、（ｂ）セラミックボールを６〜１１個加えたもの、（ｃ）透析膜に入れたＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株のみを添化したもの、（ｄ）透析膜に入れたＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株とＭｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株などの根粒菌を同時に添加したもの。（ｅ）Ｇ株のみで一晩栽培後に、翌日根粒菌を添加して水素を発生させたもの。なお、微生物量は変えて実験を行った。これらの試料を室温２８℃〜３２℃で、６日〜２週間程度ブラインドを開けて日光が入る条件にした実験室に静置した。夾竹桃の生育状態はデジタルカメラで撮影した。
【実施例】
【００３６】  Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．Ｇ株で作製した電離水素水から水素発生量の測定
実験はスキムミルク５００μＬ（１００ｍＬ培養液に相当）のＧ株で作製した電離水素水に、大腸菌、Ｍｅｓｏｒｈｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＧＮ１株、Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍをそれぞれ１．５ｍＬ（３００ｍＬ培養液に相当）を添加して行った。この結果、すべての菌株に水素発生が検出された。電離水素水に微生物菌体を添加することによって、水素を発生させることができることが示された。また、水素発生量は大腸菌と較べて、根粒菌のＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍが約３倍でＧＮ１株が約１０倍であり、微生物種により異なることが示された。大腸菌と根粒菌の水素生成に関わる性質の大きな違いは、根粒菌にみがニトロゲナーゼ酵素による水素生成を伴う窒素固定能を有している点が挙げられ、このニトロゲナーゼが水素生成に関与する可能性がある。同じ根粒菌でＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍとＧＮ１株で水素生成能が異なるのは、ニトロゲナーゼ酵素活性の違いによるかも知れない。また、大腸菌の水素生成能が低い理由として、大腸菌の有する水素分解型ヒドロゲナーゼと水素分解と水素合成の両方を担う双方向性ヒドロゲナーゼによる、水素生と水素合成の割合が中立しているためであることも考えられる。始めに根粒菌を添加し、一晩静置した試料に後からＧ株を添加した場合は、水素発生が検出されなかった。【００３７】  これらの結果より、今後はＧＮ１株などの水素生成能の高い菌株を担体に固定化したり、バイオリアクターで連続培養するなどして、電離水素水に供給することによって、電離水素水から容易に連続的に水素を発生させる装置に応用可能であると考えられる。また、既存のあらゆる方法で培養条件などを調節することにより、菌体量調節すれば水素発生量をコントロールすることが可能となる。
【実施例】
【００３８】  水素化金属や水素化金属を含む強還元性セラミックボール（ＣＢ）で作製した電離水素水から水素発生量の測定
ＴｉＨ２等の水素化金属およびＣａＨ２、ＮａＢＨ４、ＭｇＨ２などの水素化金属を含む強還元性セラミックボール（ＣＢ）は水と反応すると水素ガスが発生すると伴にＨ＋イオンとＨ−イオンを生成し、電離水素水が製造されると考えられている。Ｇ株による水分解の際もヒドロゲナーゼにより、ＣＢと同様にＨ＋イオンとＨ−イオンが生成され、電離水素水が製造されると考えられる。違う点はＧ株で作った電離水素水はｐＨが７付近の中性であるが、水素化金属やＣＢで作製した電離水素水はＣａ（ＯＨ）２やＭｇ（ＯＨ）２の影響でアルカリ性を示すことである。【００３９】  実験は４００ｍＬの蒸留水に０．１ｇのＴｉＨ２、０．０１ｇのＣａＨ２、ＣＢを１個（約０．０８ｇ）をそれぞれ添加して電離水素水を製造した。ここで、水素化金属を水に添加した際は速やかに水と反応を起こし、水素が発生したが、数分程度で水素の発生は検出されなくなり、根粒菌添加時の溶存水素濃度は０ｐｐｂであった。翌日作製した電離水素水に、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、ＧＮ１株などの根粒菌を添加した。この結果、すべての根粒菌に溶存水素濃度が検出された。この反応はニトロゲナーゼかヒドロゲナーゼによる触媒反応によるものと考えられる。スキムミルクのみを添加した場合は、微生物を添加した場合より、１０時間程度遅く、根粒菌の水素生成より低い２０ｐｐｂ程度の水素濃度が検出された。スキムミルクのみに水素が検出された理由は、混入した雑菌によるものと考えられた。１０時間遅れて検出された理由は、解放系で実験しているために、非滅菌の透析膜などに付着していた雑菌がスキムミルクをえさにして増殖し、水素濃度が検出されるまでに時間がかかったからであると考えられた。なお、すべて水素化金属で製造した電離水素水に微生物やスキムミルクを添加しないで放置した場合は、水素発生が検出されなかった。【００４０】  これより、ＣＢで製造した電離水素水に微生物を添加する方法により水素を発生させる方法を開発することができた。水素を発生させる微生物としては、Ｇ株による電離水素水製造と同様にニトロゲナーゼ酵素を有する根粒菌や一部の藍藻類や光合成細菌などが適当である。
【実施例】
【００４１】  微生物で製造した電離水素水の植物の延命作用観察実験
強還元性セラミックボール（ＣＢ）で製造した電離水素水に植物に対する延命作用や開花制御作用があることが特開２０１２−５５２２５「水素化金属を含む水を用いた植物の栽培法」に示されている。ＣＢで製造した電離水素水には水素濃度は検出されない。そこで、水素濃度が検出されると考えられる電離水素水においても延命作用が検出されるか調べるために、Ｇ株で製造した電離水素水に根粒菌を添加することにより、水素濃度を発生させた水素水を用いて、水素濃度がある場合の電離水素水と無い場合の電離水素水での、植物に対する延命作用を比較した。水素濃度が検出されない場合の電離水素水の試料としてはＧ株のみを添加したものを用いた。また、Ｇ株と根粒菌を同時に添加した水も用いた。なお、切り花は水の入った容器に微生物を投入した２時間後までに挿した。水素を発生させた試料は、Ｇ株で作った電離水素水に切り花を加えた翌日に根粒菌を加えることによって作製した。これらの栽培結果の写真を図４ないし図９にそれぞれ示す。この結果、水道水のみに較べ、ＣＢを６個〜１１個添加した場合と、Ｇ株のみ（スキムミルク懸濁液５００μＬ（１００ｍＬの培養液に相当）添加した場合、Ｇ株と根粒菌（スキムミルク懸濁液５００μＬまたは１ｍＬ（それぞれ培養液１００ｍＬまたは２００ｍＬに相当））を同時に添加した場合（いずれも翌日に水素濃度が検出されない）に、花が枯れずに咲き続けたり、つぼみが開花したりする延命作用が示された。一方で、水道水のみとＧ株を添加した翌日に根粒菌を加えて水素を発生させた試料は花が枯れ、つぼみもしぼんで枯れてしまった。【００４２】  これらの結果より、Ｇ株のみとＧ株と根粒菌を同時に添加して作製した水にＣＢと同様な延命効果が示された。今後の実施形態としては、まずＧ株やＧＮ１株を凍結乾燥させて、常温保存できる状態にする。次にこれを透析膜等に入れ、用事に切り花などの挿した水に投入して、切り花を延命させるための植物延命剤として用いる利用法が考えられる。【００４３】  以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】  本発明は、水素を水中に水素陰イオンＨ−と水素陽イオンＨ＋として保存した水溶液から微生物を用いて容易に水中に溶存水素として発生させる方法の開発である。水素の新たな貯蔵と発生利用法を提案すると伴に、燃料電池開発技術へ応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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