(57)【要約】【課題】毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットを提供する。【解決手段】毛包上皮幹細胞の培養方法は、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、を備える。毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、
前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、
前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、
を備える毛包上皮幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである請求項１に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
【請求項３】
前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなる請求項１又は２に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである請求項３に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
【請求項５】
酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、
細胞外マトリックス成分と、
培地と、
を備える毛包上皮幹細胞の培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
毛包上皮幹細胞は、毛髪をつくるための幹細胞であり、通常の培養基板上では、強く接着及び伸展し、強烈な増殖スイッチが入ることで、毛髪再生能を有しない細胞に分化することが知られている。従来では、培養液に成長因子や各種阻害剤を添加して毛包上皮幹細胞を培養する方法（例えば、特許文献１参照）や、毛包上皮幹細胞をマトリゲルで包埋して培養する方法（例えば、非特許文献１参照）により、毛包上皮幹細胞の毛髪再生能を維持する工夫が検討されてきた。
【０００３】
一方、本発明者らはこれまで、再生毛包原基の集合体の製造方法を開発してきた（例えば、特許文献２参照）。具体的には、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら共培養することで、毛包原基を形成させる工程を備える方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５５６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０７３６２５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chacon-Martinez C A et al., “Hair follicle stem cell cultures reveal self-organizing plasticity of stem cells and their progeny.”, EMBO, Vol. 36, No. 2, p151-164, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる、よりよい培養方法が求められていた。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法は、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、を備える方法である。
上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンであってもよい。
上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなってもよい。
上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンであってもよい。
【０００９】
本発明の第２態様に係る毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。
【発明の効果】
【００１０】
上記態様の毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における毛包上皮幹細胞の調製方法を示す概略工程図である。
【図２】実施例１における成体マウスから採取された表皮細胞中の毛包上皮幹細胞の存在率を示すグラフ及び表である。
【図３Ａ】実施例１における細胞Ｆ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）法で分離されたＣＤ３４陽性細胞）をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により解析した結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】実施例１における免疫染色した細胞Ｆ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）法で分離されたＣＤ３４陽性細胞）の位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（上：核染色像、下：ＣＤ３４染色像）である。各スケールバーは２５０μｍを示す。
【図４】実施例１及び比較例１における毛包上皮幹細胞の培養方法を比較した概略工程図である。
【図５】実施例１における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
【図６】実施例１及び比較例１における培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図７Ａ】比較例１における平面培養法で培養した培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
【図７Ｂ】比較例１における従来のマトリゲル包埋培養法で培養した培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
【図８】比較例１における培養前及び培養１４日目の毛包上皮幹細胞（平面培養及びマトリゲル包埋培養）でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図９】実施例２における酸素透過性細胞培養容器（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スフェロイドチップ）の作製方法を示す概略工程図である。
【図１０】実施例２における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
【図１１】実施例１、２及び比較例１、２における培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１２】比較例１及び比較例２における細胞培養容器（培養条件）を比較した概略構成図である。
【図１３】比較例２における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜毛包上皮幹細胞の培養方法＞
本実施形態の毛包上皮幹細胞の培養方法は、集積工程と、混合工程と、培養工程と、を備える方法である。
前記集積工程では、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる。
前記混合工程では、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する。
前記培養工程では、前記混合物に培地を加えて培養する。
【００１３】
本実施形態の培養方法によれば、後述の実施例に示すように、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
従来の毛包上皮幹細胞の培養方法では、細胞を播種する時点から、毛包上皮幹細胞とマトリゲル等の細胞外マトリックス成分とを混合し、毛包上皮幹細胞を分散させた状態で培養を行う。
一方、毛包上皮幹細胞は、生体内において細胞が密集した環境で存在しており、さらに、細胞間には細胞外マトリックス成分が存在している。そのため、本実施形態の培養方法における集積工程で、細胞集積体を形成させた後に、続く混合工程において、細胞集積体に細胞外マトリックス成分を混合することで、生体内に近しい環境を再現することができる。これにより、後述の実施例に示すように、従来の毛包上皮幹細胞の培養方法よりも、優れた毛髪再生能を有する毛包上皮幹細胞を得ることができる。
なお、ここでいう「細胞集積体」とは、細胞培養容器内に播種された細胞が、重力等により底面に積み重なって集まったものを意味する。
本実施形態の培養方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
【００１４】
［集積工程］
まず、毛包上皮幹細胞を細胞培養容器に播種し、静置培養する。細胞を重力で沈殿させることで、細胞の集積体を形成させる。播種する細胞数は細胞培養容器の大きさに応じて適宜調整することができる。
【００１５】
（毛包上皮幹細胞）
本実施形態の培養方法で用いられる毛包上皮幹細胞の由来としては、動物であり、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、細胞の由来としては、ヒトであることが好ましい。
毛包上皮幹細胞は、被検動物の皮膚組織から単離されたものであってもよく、万能細胞から誘導されたものであってもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等が挙げられる。
また、本実施形態の培養方法で用いられる毛包上皮幹細胞は、単一細胞であってもよく、皮膚組織において毛包上皮幹細胞の周囲に存在する細胞（例えば、色素幹細胞、表皮細胞等）を含む混合細胞であってもよい。
毛包上皮幹細胞であることは、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質（例えば、ＣＤ３４等）を発現しているか否かで確認することができる。具体的には、例えば、ＣＤ３４を発現している細胞は、公知の方法（例えば、抗ＣＤ３４抗体を用いたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）分析、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）分析、及び、免疫染色法等）を用いて、確認することができる。
【００１６】
集積工程における培養条件としては、培養時間は、１０分間以上２４時間以下（好ましくは、１時間以上２時間以下）とすることができ、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。また、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
【００１７】
（細胞培養容器）
細胞培養容器は、観察のしやすさ、スクリーニング効率から、複数のウェルが規則的に１つの基板に配置されているものが好ましい。本明細書においては、基板に配置された個々のウェルを細胞培養容器と想定する。このようなものとしては、市販のものを用いてもよいし、特許文献３（国際公開第２０１７／０７３６２５号）に記載の方法等で作製してもよい。
【００１８】
また、基板におけるウェルの密度は、例えば２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下とすることができる。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴（特に、ヒトを含む霊長類の毛穴）の密度と同程度の密度で毛包上皮幹細胞が配置された状態で培養することができる。
【００１９】
ウェルの開口部の直径及び深さについて、毛包上皮幹細胞の集積体を収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさとすることができ、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下とすることができる。また、深さについては、例えば１ｍｍ以下とすることができる。
【００２０】
細胞培養容器の材質は、細胞培養に適したものとすることができ、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００２１】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、細胞培養容器のウェル内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧をの単位を意味する。すなわち、上記単位「ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ」は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量（ｃｍ３）を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなる細胞培養容器を使用することにより、十分な量の酸素を毛包上皮幹細胞に供給でき、毛髪再生能がより優れる毛包上皮幹細胞が得られる。
【００２２】
また、細胞培養容器は、後述の実施例に示すように、市販の細胞培養容器を用いてもよく、鋳型を作製し、ＰＤＭＳを原料として細胞培養容器を一から作製してもよい。市販の細胞培養容器としては、例えば、住友ベークライト社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標） ９６Ｕプレート等が挙げられる。
【００２３】
（培地）
培地としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地とすることができる。
【００２４】
培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、及び、膜電位の調節を助けるためのものである。
無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び、重炭酸塩の形で用いられる。
一般的に、培地中の無機塩の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとすることができる。
【００２５】
炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ−グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００２６】
アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、及び、それらの組み合わせ等が挙げられる。
一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。アミノ酸は合成由来でもよい。
【００２７】
ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ−パントテン酸ヘミカルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ−αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ−イノシトール等が挙げられる。
【００２８】
培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、ホルモン、又は、ＲＯＣＫ阻害剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００３０】
血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下とすることができる。
【００３１】
成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＩＧＦ−１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００３２】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
【００３３】
また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
【００３４】
ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ＨＡ−１０７７、Ｙ−２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ−１４４７、ＧＳＫ１８０７３６Ａ、ＨＡ−１１００、Ｙ−３９９８３、ＡＲ−１３３２４、ＧＳＫ２６９９６２、ＡＴ１３１４８、Ｋ−１１５、ＫＤ０２５、ＺＩＮＣ００８８１５２４、及び、それらの塩が挙げられる。
【００３５】
培地として具体的には、塩化カルシウムを含み、無血清であって、上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモンを添加した公知の上皮系細胞用基本培地を用いることができる。
前記公知の上皮系細胞用基本培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。
また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び、任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２）（Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。また、これら上皮成長因子、任意の抗生物質、及び、任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地に、さらに、任意の成長因子及び任意のＲＯＣＫ阻害剤等を添加してもよい。
【００３６】
［混合工程］
次いで、毛包上皮幹細胞の集積体に、細胞外マトリックス成分を加えて、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する。これにより、続く培養工程において、毛包上皮幹細胞を生体内と近しい環境で培養することができる。混合工程において、細胞外マトリックス成分をゲル化させてもよく、ゲル化させなくてもよい。
【００３７】
溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、ゲル化の有無及びゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、細胞外マトリックス成分をゲル化させる場合、ゲル化時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化温度等の各種条件については、特別な限定はなく、例えば、３７℃のＣ０２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。また、混合工程で用いられる細胞培養容器としては、上記「［集積工程］」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３８】
（細胞外マトリックス成分）
細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＸＩ型、ＸＶＩＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等が挙げられる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロース等を使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの天然物由来の高分子を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
中でも、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン（特に、Ｉ型コラーゲン）が好ましい。コラーゲンを含有することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００４０】
細胞外マトリックス成分は溶媒に懸濁して用いてもよい。細胞外マトリックス成分を懸濁する溶媒としては、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、細胞外マトリックス成分再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等が挙げられる。
【００４１】
［培養工程］
次いで、混合工程で作製された混合物に培地を加えて培養する。培養工程で用いられる細胞培養容器及び培地としては、上記「［集積工程］」において例示されたものと同様のものが挙げられる。培養条件としては、培養時間は、３日間以上２１日間以下（好ましくは、１０日間以上１４日間以下）とすることができ、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。また、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
培養工程において、後述の実施例に示すように、培養日数を経るにつれて、毛包上皮幹細胞同士が接着及び凝集し、一つの凝集体を形成する。
この培養工程を経ることで、毛髪再生能に優れる毛包上皮幹細胞を大量に得ることができる。
【００４２】
［その他の工程］
また、本実施形態の培養方法は、培養工程の後に、さらに、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質の発現を確認する確認工程等を備えてもよい。
毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質の発現の確認方法としては、上記「（毛包上皮幹細胞）」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
【００４３】
また、本実施形態の培養方法は、培養工程の後に、さらに、得られた毛包上皮幹細胞を１細胞ずつに単離する単離工程等を備えてもよい。単離方法としては、例えば、トリプシン等の酵素処理を行う方法等が挙げられる。
【００４４】
＜毛包上皮幹細胞の培養キット＞
本実施形態の毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。
【００４５】
本実施形態の培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
【００４６】
本実施形態の培養キットが備える、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、細胞外マトリックス成分及び培地は、上記「＜毛包上皮幹細胞の培養方法＞」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４７】
［その他構成］
本実施形態の培養キットは、上記酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、上記細胞外マトリックス成分及び上記培地に加えて、さらに、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質に対する抗体（例えば、抗ＣＤ３４抗体）等を備えていてもよい。これにより、培養して得られた細胞が毛包上皮幹細胞であるか否か（毛髪再生能を維持しているか否か）を確認することができる。
また、本実施形態の培養方法は、上記酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、上記細胞外マトリックス成分及び上記培地に加えて、さらに、トリプシン等の酵素を備えてもよい。これにより、本実施形態の培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞を１細胞ずつに単離することができる。
【００４８】
＜毛包上皮幹細胞の使用用途＞
本実施形態の培養方法及び培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞は、例えば、毛乳頭細胞等の間葉系細胞と共培養することで毛包原基を構築することができる。この毛包原基を移植することで、毛髪を再生できる。
【００４９】
本実施形態の培養方法及び培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞は、例えば、被検動物の創傷部に移植することで、皮膚を再生することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１］毛包上皮幹細胞の培養１
まず、成体マウスから皮膚細胞を採取し、毛包上皮幹細胞の存在率を評価した後に、単離して続く試験に用いた（図１参照）。
【００５２】
１．毛包上皮幹細胞の調製
（１）マウス上皮細胞の採取
６〜８週齢の雄の成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ、チャールズリバー社より購入）より背部皮膚を採取し、１００ｍｇ／Ｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ：Ｐ／Ｓ）（ＧＩＢＣＯ社製）を含むダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＤＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄した。次いで、脂肪組織をメスで外科的に除去し、皮膚組織を得た。この皮膚組織を１〜１．５ｃｍ角に細断し、真皮側を下にして０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、３７℃で７０分間インキュベートした。次いで、ピンセットを用いて真皮層を外科的に除去した。５０ｍＬ遠心管に皮膚組織を酵素処理した溶液とともに加え、ピペッティングすることで細胞をバラバラにした。次いで、細胞を含む溶液ごと、７０μｍセルストレイナー（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）を通し、さらに４０μｍセルストレイナーを通した（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）。次いで、１０００ｒｐｍで３分間遠心することで、細胞を回収した。回収した細胞はＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）に懸濁した。
【００５３】
（２）ＣＤ３４陽性細胞の存在率の確認
（１）で調製した細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。次いで、５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことで培地を完全に除去した。ここにＰＢＳを加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／５００ｍＬになるように１．５ｍＬチューブに分注した。次いで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）用抗体としてＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ社製）及びＰＥ標識抗ＣＤ４９ｆ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、暗所、ｏｎ  ｉｃｅで３０分間染色した。染色後、１０００ｒｐｍで、３分間遠心し上清を取り除いた。次いで、５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことでＦＡＣＳ用抗体を含む溶液を完全に除去した。死細胞の核染色を行うために、７−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（７−ＡＡＤ）を添加した。次いで、３０μｍフィルター付きの試験管に通した後、自動細胞解析分離装置（ＦＡＣＳ装置）（ベックマン・コールター社製）を用いて分析を行った。結果を図２示す。
【００５４】
図２から、ＣＤ３４及びＣＤ４９ｆの両方発現している細胞は、マウス皮膚から採取した表皮系細胞群において６．９４％存在することが分かった。また、先行研究（上記非特許文献１参照）において、使用した系統のマウスの表皮細胞群中のＣＤ３４及びＣＤ４９ｆの両方発現している細胞の存在率は約５〜１０％程度であることが報告されており、今回の結果は、この値の範囲であった。
また、図２の「４」の範囲にあたるＣＤ３４（＋）、ＣＤ４９ｆ（−）細胞の存在率は０．６６％であり、無視できるほど小さいと判断した。そのため、以降の実験において、ＣＤ３４陽性（＋）細胞（図２中の「１」及び「４」の範囲に分類された細胞）を用いるとした。
【００５５】
（３）ＣＤ３４陽性細胞の単離
次いで、以下の手順でＣＤ３４陽性（＋）細胞の回収を行った。全ての操作は氷上で行った。
（３−１）採取したマウス上皮細胞１．０〜１．５×１０７ｃｅｌｌｓを含む細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで、３分間遠心した後、上清を除去した。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を加えた。
（３−２）５ｍＬチューブを３つ用意し、（３−１）で調製した細胞懸濁液をそれぞれに１０〜１５μＬずつ分注した。各チューブをチューブ１、チューブ２及びチューブ３とし、以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３−３）次いで、（３−２）の分注後、残った細胞懸濁液に３ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた。その後、抗マウスＣＤ３４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３０μＬ加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３−４）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、３０μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３−５）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで、３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことでＦＩＴＣ標識抗ラット抗体を完全に除去した。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、３０μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３−６）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、４℃で保管した。磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ装置）（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）でサンプルを流す前に、１５μＬのサンプルを１５ｍＬチューブに移動し、６００μＬまでＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えてメスアップした（以下、このサンプルを含むチューブを「チューブ４」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３−７）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社の手順書に従って、（３−６）で調製したサンプルからラベリングした細胞とラベリングされなかった細胞とに分離した。
（３−８）ラベリングされなかった細胞懸濁液６００μＬを１５ｍＬチューブに回収し、４℃で保存した（以下、このラベリングされなかった細胞懸濁液を含むチューブを「チューブ５」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３−９）ラベリングされた細胞懸濁液４００μＬを１５ｍＬチューブに回収し、４℃で保存した（以下、このラベリングされた細胞懸濁液を含むチューブを「チューブ６」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
【００５６】
（４）各チューブに関する手順（ＦＡＣＳ用サンプルの調製）
（４−１）チューブ１（未染色コントロールの調製）
チューブ１に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００５７】
（４−２）チューブ２（バックグラウンドコントロールの調製）
（４−２−１）チューブ２の細胞懸濁液が５０μＬになるようにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、さらに５μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４−２−２）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズを加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４−２−３）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００５８】
（４−３）チューブ３（アイソタイプコントロールの調製）
（４−３−１）チューブ３の細胞懸濁液が５０μＬになるようにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、さらに５μＬのラットＩｇＧアイソタイプ抗体（ＰＥ標識ラットＩｇＧ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４−３−２）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４−３−３）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズを加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４−３−４）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００５９】
（４−４）チューブ４（プレソートサンプルの調製）
チューブ４に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００６０】
（４−５）チューブ５（ラベリングされなかった細胞の調製）
チューブ５に４００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００６１】
（４−６）チューブ６（ラベリングされた細胞の調製）
チューブ６に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
【００６２】
（５）ＦＡＣＳ分析
次いで、（４）で調製したチューブ１〜６のＦＡＣＳ分析用の各サンプルを用いて、ＦＡＣＳ装置を用いて分析し、蛍光強度ごとの細胞数をカウントした。結果を以下の表１及び図３Ａ（ラベリングされた細胞のＦＡＣＳ解析結果のグラフ）に示す。
【００６３】
（６）免疫蛍光染色
また、チューブ６の細胞懸濁液を用いて、ＣＤ３４の免疫蛍光染色を行い、倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図３Ｂに示す。
【００６４】
【表１】
2019135947.tif 000002
【００６５】
表１及び図３Ａから、ＣＤ３４陽性（＋）細胞の純度は、９８．２６％であることが分かった。
また、図３Ｂから、細胞は培養皿上で接着し生存しており、細胞接着後もＣＤ３４の発現を維持していた。
以上のことから、マウス皮膚組織からＣＤ３４の発現が維持された毛包上皮幹細胞が単離できたことが確認された。
【００６６】
２．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）に、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）（ＳＩＧＭＡ社製）を５ｍＬ、Ｌ−グルタミン（和光純薬工業社製）を１６ｍｇ、１０ｎｇ／μＬの組換えマウス繊維芽細胞成長因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２：ＦＧＦ２）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ、１００μｇ／ｍＬの血管内皮細胞成長因子Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ａ：ＶＥＧＦ−Ａ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１０μＬ及び１ｍＭのＹ−２７６３２（和光純薬工業社製）を２７５μＬ加え、よく攪拌した。次いで、滅菌フィルターに通して、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ及び５μＭのＹ−２７６３２を含むＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（以下、「上皮系細胞培養培地」と称する場合がある）を調製した。
【００６７】
（２）集積工程
「１．」で得られた８．０×１０４ｃｅｌｌｓの毛包上皮幹細胞を１００μＬの（１）で調製した上皮系細胞培養培地に懸濁して細胞懸濁液を調製した。次いで、細胞懸濁液を非接着９６Ｕウェルプレート（住友ベークライト社製、曲率半径：４．５ｍｍ）の各ウェルに分注し、３７℃で３０分間以上２４時間以下程度インキュベートし、重力によって細胞が培養容器の底面に沈殿し、細胞の集積体が形成されたのを確認した（図４参照）。
【００６８】
（３）混合工程
次いで、培地のみを静かに除去し、細胞の集積体の上からマトリゲル（登録商標）（なお、以下、「登録商標」との記載を省略する）（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）を静かに加え、３７℃で３０分間インキュベートすることでゲルを硬化させてマトリゲルと毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を得た。
【００６９】
（４）培養工程
次いで、マトリゲルと毛包上皮幹細胞の集積体との混合物に上皮系細胞培養培地を加え、１４日間培養することで、細胞の密度が毛包上皮幹細胞の再生効率の維持に有用であるかどうかを評価した。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図５に示す。
【００７０】
図５から、細胞は培養１日目では密集こそしていたが、細胞同士は離れた状態でいた。しかし、培養４日目から細胞同士が接着及び凝集し始め、培養７日目にはほとんど全ての細胞が一つの凝集体を形成した。
【００７１】
（５）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
次いで、培養１４日目の細胞を回収し、ＣＤ３４の遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により、リアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ  ＯｎｅＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、測定した。手順は、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘｅｓのプロトコルに従って行った。また、以下の表２に示すプライマーを用いた。結果を図６に示す。図６において、後述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１（高密度）での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。なお、図６に示す実施例１でのＣＤ３４の遺伝子発現量の考察は、後述する比較例１に記載する。
【００７２】
【表２】
2019135947.tif 000003
【００７３】
［比較例１］毛包上皮幹細胞の培養２
１．毛包上皮幹細胞の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
【００７４】
２．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
【００７５】
（２）従来法による毛包上皮幹細胞の培養
「１．」で得られた８．０×１０４ｃｅｌｌｓの毛包上皮幹細胞を２０μＬの（１）で調製した上皮系細胞培養培地に懸濁し、さらにマトリゲル２０μＬを加えて、合計４０μＬの細胞−ゲル混合液を調製した。次いで、細胞−ゲル混合液を２４ウェルプレート（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）に滴下し、３７℃で３０分間インキュベートすることでマトリゲルを硬化させた（図４参照）。次いで、上皮系細胞培養培地を５００μＬ加えて、１４日間培養した（以下、「従来のマトリゲル包埋培養法」と称する場合がある）。対象として、マトリゲルで包埋せずに２４ウェルプレート（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）に毛包上皮幹細胞を播種して、同様に１４日間培養した（以下、「平面培養法」と称する場合がある）。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図７Ａ（平面培養法）及び図７Ｂ（従来のマトリゲル包埋培養法）に示す。
【００７６】
図７Ｂから、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞は培養１〜４日目では分散しているが、培養７日目には小さな凝集体を形成し始めた。その凝集体は徐々に大きくなり、培養１４日目には１００〜１５０μｍ程度の大きさになった。
一方、図７Ａ及び図７Ｂから、平面培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞と比較して、細胞増殖が早かった。
【００７７】
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
試料として、培養前の毛包上皮幹細胞、並びに、従来のマトリゲル包埋培養法及び平面培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図６及び図８に示す。図６において、比較例１（低密度）は、マトリゲル包埋培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４の遺伝子発現量を示す。また、図８において、平面培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、マトリゲル包埋培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞及び培養前の毛包上皮幹細胞の相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。
【００７８】
図８から、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、培養１４日目でも、培養前の毛包上皮幹細胞とほぼ同様のＣＤ３４の遺伝子発現量を示すことがわかった。一方で、平面培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、かなり毛髪再生能が低下することがわかった。
【００７９】
一般に、毛包上皮幹細胞は、傷等で隣接する細胞との接触が切れると強烈な増殖スイッチが入り、表面を覆うまで増殖することで外界からの細菌侵入を防ぐことが知られている。ただし、この場合、毛包形成能を有していた細胞は単に表面を覆うための細胞へと分化する。平面培養法では、このような環境を意図せず再現していたために、毛髪再生能が低下し、従来のマトリゲル包埋培養法では、比較的温和な速度で増殖させることができたため、毛髪再生能を維持しながら培養できたと考えられる。
【００８０】
また、図６から、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞よりも、本実施形態の培養方法で培養した毛包上皮幹細胞では、ＣＤ３４の遺伝子発現量がおよそ２．９倍も向上することが分かった。
以上のことから、マトリゲルを用いて、上皮幹細胞を培養する場合には、細胞を均一に分散させた状態でマトリゲルを用いるよりも、細胞を一か所に集積させた後にマトリゲルを用いて培養したほうが機能維持に有効であることが明らかとなった。
【００８１】
［実施例２］酸素透過性細胞培養容器を用いた毛包上皮幹細胞の培養１
１．毛包上皮幹細胞の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
【００８２】
２．酸素透過性細胞培養容器の作製
図９は、酸素透過性細胞培養容器（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スフェロイドチップ）の作製方法を示す概略工程図である。図９を参照しながら、酸素透過性細胞培養容器の作製方法について、以下に詳細を説明する。
まず、ＣＡＤソフト、Ｖ  Ｃａｒｖｅ  Ｐｒｏ  ６．５を用いて、作製するスフェロイド容器のパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターンどおりにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した。この凹鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン：日新レジン社製）を流しこみ、１日硬化させた。次いで、凹鋳型を離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した。次いで、形成した凸鋳型を２４ウェルプレート（ＢＤ  ｆａｌｃｏｎ社製）の底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込み、固化した。次いで、凸鋳型を離型することで、酸素透過性細胞培養容器として、ＰＤＭＳに規則的なパターンが形成されたＰＤＭＳスフェロイドチップを作製した。得られたＰＤＭＳスフェロイドチップにおいて、ウェルの深さ（図９中の「Ｈ」）は０．５ｍｍ、ウェル開口部の直径（図９中の「Φ」）は１．０ｍｍ、ウェル開口部の中心部から隣接するウェル開口部の中心部までの距離（図９中の「Ｐ」）は１．５ｍｍ、曲率半径（図示せず）は０．５ｍｍであった。
【００８３】
３．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
【００８４】
（２）毛包上皮幹細胞の培養
細胞培養容器として、「２．」で作製した酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を用いた以外は、実施例１の「２．（２）〜（４）」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を１４日間培養した。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図１０に示す。
【００８５】
図１０から、毛包上皮幹細胞は培養１日目ではウェル底面に沈殿しており、培養４日目から次第に凝集しはじめ、培養７日目には一つの凝集体を形成し、培養１４日目までその形状を維持していた。
【００８６】
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
試料として、上記（２）で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図１１に示す。図１１において、上述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１、実施例２及び後述する比較例２での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。なお、図１１に示す実施例２でのＣＤ３４の遺伝子発現量の考察は、後述する比較例２に記載する。
【００８７】
［比較例２］酸素透過性細胞培養容器を用いた毛包上皮幹細胞の培養２
１．毛包上皮幹細胞の調製
実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
【００８８】
２．酸素透過性細胞培養容器の作製
実施例２の「２．」と同様の方法を用いて、酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を作製した。
３．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
【００８９】
（２）毛包上皮幹細胞の培養
細胞培養容器として、「２．」で作製した酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を用いた以外は、比較例１の「２．（２）」に記載の従来のマトリゲル包埋培養法と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を１４日間培養した（図１２参照）。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）を用いて観察した。結果を図１３に示す。
【００９０】
図１３から、毛包上皮幹細胞は、培養１〜４日目では分散していたが、培養７日目に小さな凝集体を形成し、培養１４日目には１００〜１５０μｍ程度の大きさになった。
【００９１】
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
試料として、上記（２）で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図１１に示す。図１１において、上述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１、実施例２及び比較例２での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。
【００９２】
図７Ｂ及び図１３の顕微鏡像の比較から、酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）での培養結果と、２４ウェルプレートでの培養結果との差は確認できなかった。
しかしながら、図１１に示す比較例１及び比較例２でのＣＤ３４の遺伝子発現量の比較から、ＣＤ３４の遺伝子発現量に大きな差が出ることが分かった。このことから、より酸素が豊富に供給される高酸素環境の方が、毛包上皮幹細胞の機能維持に有効であることが分かった。
【００９３】
我々は、呼吸により酸素を取り込み、その酸素は、赤血球と人体に張り巡らされた血管によって体中を巡り細胞まで運搬される。細胞は、この酸素を消費し、ミトコンドリアのクエン酸回路と電子伝達系によって、グルコースからＡＴＰを産生する。このエネルギー効率は熱力学的に概算すると約４３％となる。一方で、酸素がない嫌気環境下においては、細胞の解糖系のみが働くため、エネルギー効率は急激に減少し２％程度と概算できる。したがって、酸素がうすい状態が続けば、細胞は増殖や機能維持するためのエネルギーを得ることができなくなることが予想される。
一方、通常の培養環境下では、細胞は培地から酸素を受け取るが、その培地への酸素供給は培養上面の気液界面からのみであるため、物質収支が間に合わず酸素は培養とともに消費される。実施例２及び比較例２で用いられたＰＤＭＳスフェロイドチップは酸素透過性材料であるため、培養器全体から培地への酸素供給が可能となる。そのため、毛包上皮幹細胞を酸素透過性の高いＰＤＭＳスフェロイドチップで培養することで、培養培地への酸素供給を増加させ、細胞の増殖や機能維持に必要な十分なエネルギーを細胞が産生できるようになったのではないかと考えられる。
【００９４】
また、図１１から、ＰＤＭＳスフェロイドチップを用いた本実施形態の培養方法で培養した毛包上皮幹細胞（実施例２）は、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞（比較例１）よりも約４．２倍のＣＤ３４の遺伝子発現量を示した。
以上のことから、ＰＤＭＳスフェロイドチップは毛包上皮幹細胞の培養に有用である可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本実施形態の培養方法及び培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。本実施形態の培養方法及び培養キットにより得られた毛包上皮幹細胞を用いて、優れた毛髪再生能を有する再生毛包原基を作製することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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