(57)【要約】【課題】主走査方向の走査速度の高速性を生かしつつ高精度な３次元的な画像を取得する。【解決手段】対物レンズ、ＸＹ走査部と、対物レンズの光軸に沿う方向の走査位置を変更するＺ走査部と、サンプルからの蛍光を検出し輝度情報を出力する検出器と、輝度情報と走査位置情報とに基づいて画像を生成する画像処理部と、これらを制御する制御部とを備え、制御部が、ＸＹ走査部により対物レンズの光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査するごとに副走査方向（Ｙ方向）に走査ラインをずらしながら、Ｚ走査部により対物レンズの光軸に沿う方向に走査位置を往復で変更させていき、その往路と復路とでＸＹ走査部による副走査方向（Ｙ方向）の走査ラインをずらす向きを反転させるとともに、画像処理部により生成される往路の平面の画像と復路の平面の画像の一方を主走査方向に沿う軸線回りに反転させる走査型レーザ顕微鏡を提供する。【選択図】図４
2019109403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で２次元的に走査させる走査部と、
該走査部による前記対物レンズの光軸に沿う方向のレーザ光の走査位置を変更する走査位置変更部と、
レーザ光が照射された前記標本からの観察光を検出しその観察光の輝度に相当する輝度情報を出力する検出部と、
該検出部から出力される前記輝度情報と前記走査部および前記走査位置変更部によるレーザ光の前記走査位置に関する走査位置情報とに基づいて画像を生成する画像生成部と、
前記走査部、前記走査位置変更部および前記画像生成部を制御する制御部とを備え、
該制御部が、前記走査部により前記対物レンズの光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査するごとに前記主走査方向に交差する副走査方向に走査ラインをずらしながら、前記走査位置変更部により前記光軸に沿う方向に前記走査位置を往復で変更させていき、かつ、前記光軸に沿う方向の往路と復路とで前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させるとともに、前記画像生成部により生成される前記往路の前記平面の画像と前記復路の前記平面の画像の一方を前記主走査方向に沿う軸線回りに反転させる走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記制御部が、前記走査部により前記副走査方向の最後まで前記走査ラインをずらしたら、前記レーザ光を走査させずに前記副走査方向の最初の前記走査ラインに戻すことを繰り返すとともに、前記走査位置変更部により変更する前記走査位置が前記往路の最後に達したら、前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させて、前記走査位置変更部により変更する前記走査位置を前記復路に折り返す請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、前記走査部により前記副走査方向の往復で前記主走査方向に前記レーザ光を走査させるとともに、前記副走査方向の折り返しごとに前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させる請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部が、前記光軸に沿う方向の前記往路と前記復路とで前記走査部により共通の信号波形の撮像タイミング信号によって同じ前記平面を走査させるように、前記往路と前記復路とで前記撮像タイミング信号のタイミングをずらす請求項１から請求項３のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、３次元的な走査を行う走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、対物レンズの光軸に交差するＸ，Ｙ方向へのレーザ光の２次元的な走査と、対物レンズの光軸に沿うＺ方向への対物レンズと標本との相対的な距離の変更とを同時に行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−７３５５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡のように、Ｚ方向に移動しながらＸＹ画像を取得すると、ＸＹ画像上のＹ位置ごとに標本におけるＺ位置が異なる。例えば、Ｚ方向を浅い方から深い方に移動させたとすると、画像上部は標本の浅い位置で画像下部は標本の深い位置となる。撮像時のＺ方向の移動を常に一方向とすればＺ位置の違いは問題にはならないが、主走査方向を走査させるレゾナントスキャナの高速性を生かすためにＺ方向を連続的に往復動作させると、Ｚ方向の往路と復路とで標本における撮像位置が異なってしまうという問題がある。例えば、往路はＺ方向を浅い方から深い方に移動させ、復路はその逆に移動させたとすると、往路の画像上部は標本の浅い位置で画像下部は標本の深い位置となるが、復路の画像上部は標本の深い位置で画像下部は標本の浅い位置となる。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、主走査方向の走査速度の高速性を生かしつつ高精度な３次元的な画像を取得することができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で２次元的に走査させる走査部と、該走査部による前記対物レンズの光軸に沿う方向のレーザ光の走査位置を変更する走査位置変更部と、レーザ光が照射された前記標本からの観察光を検出しその観察光の輝度に相当する輝度情報を出力する検出部と、該検出部から出力される前記輝度情報と前記走査部および前記走査位置変更部によるレーザ光の前記走査位置に関する走査位置情報とに基づいて画像を生成する画像生成部と、前記走査部、前記走査位置変更部および前記画像生成部を制御する制御部とを備え、該制御部が、前記走査部により前記対物レンズの光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査するごとに前記主走査方向に交差する副走査方向に走査ラインをずらしながら、前記走査位置変更部により前記光軸に沿う方向に前記走査位置を往復で変更させていき、かつ、前記光軸に沿う方向の往路と復路とで前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させるとともに、前記画像生成部により生成される前記往路の前記平面の画像と前記復路の前記平面の画像の一方を前記主走査方向に沿う軸線回りに反転させる走査型レーザ顕微鏡である。
【０００７】
本態様によれば、走査部により、光源から発せられたレーザ光が標本上で対物レンズの光軸に交差する平面に沿って２次元的に走査されながら、走査位置変更部により、対物レンズの光軸に沿う方向に往復でレーザ光の走査位置がずらされていき、画像生成部により、検出部によって検出される観察光の輝度情報と走査部および走査位置変更部による走査位置情報とに基づいて標本の３次元的な画像が生成される。これにより、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路とで、それぞれ標本の３次元的な画像を取得することができる。
【０００８】
この場合において、制御部により、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路とで走査部による副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることで、往路と復路の撮像面を一致させることができる。また、副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることにより、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路とで対物レンズの光軸に交差する平面の画像が反転してしまうが、制御部により、画像生成部によって生成される往路の平面の画像と復路の平面の画像の一方を主走査方向に沿う軸線回りに反転させることで、往路と復路の平面の画像の副走査方向の向きを一致させることができる。これにより、主走査方向の走査速度の高速性を生かしつつ高精度な３次元的な画像を取得することができる。
【０００９】
上記態様においては、前記制御部が、前記走査部により前記副走査方向の最後まで前記走査ラインをずらしたら、前記レーザ光を走査させずに前記副走査方向の最初の前記走査ラインに戻すことを繰り返すとともに、前記走査位置変更部により変更する前記走査位置が前記往路の最後に達したら、前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させて、前記走査位置変更部により変更する前記走査位置を前記復路に折り返すこととしてもよい。
【００１０】
このように構成することで、対物レンズの光軸に交差する平面の２次元的な画像を対物レンズの光軸に沿う方向に段階的にずらしながら取得することができる。この場合において、走査位置変更部により変更する対物レンズの光軸に沿う方向の走査位置を往路から復路に折り返す際に走査部による副走査方向の走査ラインをずらす向きを反対方向に切り替えるだけで、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路とで走査部による副走査方向の向きを反転させた画像を取得することができる。
【００１１】
上記態様においては、前記制御部が、前記走査部により前記副走査方向の往復で前記主走査方向に前記レーザ光を走査させるとともに、前記副走査方向の折り返しごとに前記走査部による前記副走査方向の前記走査ラインをずらす向きを反転させることとしてもよい。
【００１２】
このように構成することで、副走査方向の片方向のみでレーザ光を走査させる場合と比較して、レーザ光を走査させずに走査ラインに戻す時間の無駄を省くことができる。例えば、副走査方向の走査速度が十分に高速でない場合は、レーザ光を走査させずに走査ラインを戻す間に走査位置変更部による対物レンズの光軸に沿う方向の走査位置の変更が生じ、その間の領域の撮像ができなくなる。副走査方向の往復でレーザ光を走査させることで、対物レンズの光軸に沿う方向の走査位置の変更によって撮像できなくなる領域をなくすことができる。
【００１３】
上記態様においては、前記制御部が、前記光軸に沿う方向の前記往路と前記復路とで前記走査部により共通の信号波形の撮像タイミング信号によって同じ前記平面を走査させるように、前記往路と前記復路とで前記撮像タイミング信号のタイミングをずらすこととしてもよい。
【００１４】
このように構成することで、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路とで一致しない無駄な画像を取得しなくて済み、対物レンズの光軸に沿う方向の往路と復路の両方で一致する画像を効率的に取得することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、主走査方向の走査速度の高速性を生かしつつ高精度な３次元的な画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の制御部の詳細を示すブロック図である。
【図３】図２の記憶部に記憶されているプログラムの一例を示す図である。
【図４】（ａ）は本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のＺ往路とＺ復路のＺ走査部の移動方向と撮像区間および非撮像区間との関係を示す図であり、（ｂ）は本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のＺ往路とＺ復路の撮像タイミング信号の一例を示す図である。
【図５】Ｚ往路で取得されるサンプルのＸＹ画像の一例を示す図である。
【図６】Ｚ復路で取得されるサンプルのＸＹ画像とそれを反転処理したＸＹ画像の一例を示す図である。
【図７】図１の走査型レーザ顕微鏡によりサンプルの３次元的な画像を取得する工程を説明するフローチャートである。
【図８】（ａ）は本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のＺ往路とＺ復路のＺ走査部の移動方向とＹ往路撮像区間およびＹ復路撮像区間との関係を示す図であり、（ｂ）は本発明の第２実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡のＺ往路とＺ復路の撮像タイミング信号の一例を示す図である。
【図９】図２の走査型レーザ顕微鏡によりサンプルの３次元的な画像を取得する工程を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、例えば、正立型の顕微鏡である。この走査型レーザ顕微鏡１は、レーザ光を発生する光源部（光源）３と、光源部３から発せられたレーザ光をサンプル（標本）Ｓに照射する対物レンズ５と、サンプルＳ上で対物レンズ５の光軸に交差する方向にレーザ光を２次元的に走査させるＸＹ走査部７と、対物レンズ５の光軸に沿う方向のレーザ光の走査位置を変更するＺ走査部（走査位置変更部）９と、サンプルＳから発せられる蛍光（観察光）を検出する検出器（検出部）１１と、サンプルＳの画像を生成する画像処理部（画像生成部）１３と、画像処理部１３により生成された画像等を表示する表示部１５と、これらを制御する制御部１７と、ユーザが指示を入力する入力部１９とを備えている。符号２１はダイクロイックミラーである。以下、対物レンズ５の光軸に沿う方向をＺ方向とし、Ｚ方向に直交しかつ互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。
【００１８】
ＸＹ走査部７は、互いに直交する揺動平面内で揺動させられる１枚のレゾナントミラー（図示略）と１枚のガルバノミラー（図示略）とを近接配置してなるレゾナントスキャナである。このＸＹ走査部７は、レゾナントミラーにより主走査方向（例えばＸ方向とする。）に高速でレーザ光を走査させるとともに、ガルバノミラーにより副走査方向（例えばＹ方向とする。）に比較的低速でレーザ光を走査させることができるようになっている。ＸＹ走査部７によるＸ方向およびＹ方向のレーザ光の走査により、対物レンズ５の光軸に交差する２次元的なＸＹ画像を取得することができる。
【００１９】
Ｚ走査部９は、サンプルＳを載置可能なステージである。このＺ走査部９は、図示しないステッピングモータやピエゾアクチュエータ等の駆動部を備え、サンプルＳを搭載した状態でＺ方向に移動することができるようになっている。Ｚ走査部９をＺ方向に移動させることで、サンプルＳにおける対物レンズ５の焦点位置をＺ方向に変化させることができる。
【００２０】
ダイクロイックミラー２１は、光源部３から発せられたレーザ光をＸＹ走査部７に向けて透過させる一方、サンプルＳにおいて発生し対物レンズ５により集光されてＸＹ走査部７を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を検出器１１に向けて反射するようになっている。
検出器１１は、例えば、光電子増倍管であり、検出した蛍光の輝度に相当する輝度情報を出力するようになっている。
【００２１】
画像処理部１３は、検出器１１から出力される輝度情報と、ＸＹ走査部７によるレーザ光のＸＹ方向の走査位置およびＺ走査部９によるレーザ光のＺ方向の走査位置に関する走査位置情報とに基づいて画像を生成するようになっている。
【００２２】
入力部１９は、例えば、マウスやキーボード等であり、ユーザが、ＸＹ画像を複数枚取得しながらＺ走査部９をＺ方向に移動させていくＺ移動距離、および、そのＺ移動距離の往復移動を繰り返すＺ往復回数等の撮像条件を入力することができるようになっている。
【００２３】
制御部１７は、図２に示すように、光源部３、ＸＹ走査部７、Ｚ走査部９、検出器１１および表示部１５との間で信号をやりとりするインターフェース回路２３と、各種プログラム等を記憶するＨＤＤ（Hard  Disk  Drive）等の記憶部２５と、記憶部２５に記憶されている各種プログラムを実行するＣＰＵ（Central  Processing  Unit）２７と、記憶部２５から読み出されるプログラムを一時的に記憶するＲＡＭ（Random  Access  Memory）２９とを備えている。
【００２４】
記憶部２５には、図３に示すように、光照射制御プログラム、走査部制御プログラム、検出器制御プログラムおよび画像処理制御プログラムが記憶されている。また、記憶部２５には、画像処理部１３により生成される画像情報が記憶されるようになっている。
【００２５】
ＣＰＵ２７は、記憶部２５に記憶されている上記の各プログラムをＲＡＭ２９に読み出して、読み出した各プログラムを実行するようになっている。例えば、ＣＰＵ２７は、光照射制御プログラムの実行により、光源部３のレーザパワーを設定してレーザ光の発生を制御するようになっている。
【００２６】
また、ＣＰＵ２７は、走査部制御プログラムの実行により、ＸＹ走査部７によるレーザ光の走査およびＺ走査部９のＺ方向の移動を制御するようになっている。具体的には、ＣＰＵ２７は、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向（Ｘ方向）に１ライン走査するごとに、ガルバノミラーにより副走査方向（Ｙ方向）に走査ラインをずらすようになっている。
【００２７】
また、ＣＰＵ２７は、上記のようにＸＹ走査部７によりレーザ光をＸ方向およびＹ方向に走査させながら、Ｚ走査部９をＺ方向に往復で移動させてＺ方向のレーザ光の走査位置を変更させるようになっている。また、ＣＰＵ２７は、Ｚ方向におけるＺ走査部９の移動の往路（以下、Ｚ往路という。）と復路（以下、Ｚ復路という。）とで、ＸＹ走査部７のガルバノミラーによる副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させるようになっている。
【００２８】
つまり、ＣＰＵ２７は、図４（ａ）に示すように、ＸＹ走査部７により副走査方向の最後まで走査ラインをずらしたら、レーザ光を走査させずに副走査方向の最初の走査ラインに戻すことを繰り返すとともに、Ｚ走査部９により変更するレーザ光の走査位置がＺ往路の最後に達したら、ＸＹ走査部７による副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させて、Ｚ走査部９により変更するレーザ光の走査位置をＺ復路に折り返すようになっている。
【００２９】
図４（ａ）において、Ｚ方向におけるＺ走査部９の移動の向きと、副走査方向の撮像区間および非撮像区間との関係を示している。本実施形態においては、Ｚ往路では、Ｙ方向の往路（以下、Ｙ往路という。）で主走査方向にレーザ光を走査させながら走査ラインを副走査方向にずらしていき（Ｙ往路撮像区間に相当、紙面に向かって右向きの実線の矢印）、Ｙ方向の復路（以下、Ｙ復路という。）でレーザ光を走査させずに副走査方向の最初の走査ライン（１）に戻す（Ｙ復路非撮像区間に相当、紙面に向かって左向きの二点鎖線の矢印）ようになっている。また、Ｚ復路では、Ｙ往路でレーザ光を走査させずに副走査方向の最後の走査ライン（Ｎ）に移動し（Ｙ往路非撮像区間に相当、紙面に向かって右向きの二点鎖線の矢印）、Ｙ復路で主走査方向にレーザ光を走査させながら走査ラインを副走査方向とは反対方向にずらしていく（Ｙ復路撮像区間に相当、紙面に向かって左向きの実線の矢印）ようになっている。さらに、図４（ａ）において、破線の矢印は、Ｚ往路の撮像が終了し、Ｚ復路の撮像に切り替わるタイミング、つまりＺ方向におけるＺ走査部９の移動の向きを転換する区間（Ｚ方向のみ駆動（Ｙ方向走査停止）非撮像区間）を示している。この区間は非撮像区間であり、この区間では、ＸＹ走査部７の副走査方向の走査用のガルバノミラーは停止されるようになっている。
【００３０】
また、ＣＰＵ２７は、図４（ａ）に示すような撮像パターンを実現するために、入力部１９によりユーザが入力する撮像条件に基づいて、図４（ｂ）に示すような撮像タイミング信号、および、ＸＹ走査部７のＹ軸駆動信号等の撮像パターン信号を生成するようになっている。
【００３１】
撮像タイミング信号は、図４（ｂ）に示すように、Ｚ往路とＺ復路で信号波形が共通になっている。Ｚ往路の撮像タイミング信号は、図４（ｂ）の左側の紙面上から下に向かう信号であり、Ｚ復路の撮像タイミング信号は、図４（ｂ）の右側の紙面下から上に向かう信号となる。撮像タイミングは、Ｚ往路およびＺ復路ともに、波形信号の立ち上がりおよび立ち下がりの両方である。また、Ｚ往路とＺ復路とで共通の信号波形の撮像タイミング信号によって同じ平面が走査されるように、これら撮像タイミング信号はＺ往路とＺ復路とでそのタイミングがずらされている。具体的には、Ｚ往路とＺ復路で撮像を開始するＺ位置が、１枚のＸＹ画像を取得する間にＺ走査部９が移動するＺ方向の移動量の分だけずれるように、撮像タイミング信号のタイミングがずらされている。
【００３２】
Ｙ軸駆動信号は、ＸＹ走査部７のガルバノミラーにより、Ｚ往路では副走査方向に走査ラインをずらしていき、Ｚ復路では副走査方向とは反対方向に走査ラインをずらしていく駆動パターンとなっている。図４（ａ）に示すように、Ｚ往路では、Ｙ往路が撮像区間でＹ復路が非撮像区間（帰線期間）となり、Ｚ復路では、Ｙ往路が非撮像区間（帰線期間）でＹ復路が撮像区間となる。
【００３３】
また、ＣＰＵ２７は、検出器制御プログラムの実行により、検出器１１に印加するＨＶ（High  Voltage、電圧）を制御するようになっている。また、ＣＰＵ２７は、画像処理プログラムの実行により、画像処理部１３による画像生成を制御するようになっている。具体的には、ＣＰＵ２７は、図５に示すようなＺ往路で取得されるサンプルＳにおける対物レンズ５の光軸に交差する平面のＸＹ画像と、図６の紙面に向かって左側の図に示すようなＺ復路で取得されるサンプルＳにおける対物レンズ５の光軸に交差する平面のＸＹ画像の一方を画像処理で主走査方向（Ｘ方向）に沿う軸線回りに反転させるようになっている。本実施形態においては、Ｚ復路で取得されるＸＹ画像（図６の紙面に向かって左側の図）を反転させることとする。なお、図６の紙面に向かって右側の図（Ｚ復路のＸＹ処理後画像）は反転された画像を示している。
【００３４】
このように構成された走査型レーザ顕微鏡１の作用について図７のフローチャートを参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１を用いてサンプルＳの蛍光観察を行うには、まず、ユーザが、入力部１９により、Ｚ走査部９のＺ方向の移動距離およびＺ往復回数等の撮像条件を入力する（ステップＳＡ１）。
【００３５】
次いで、制御部１７のＣＰＵ２７の作動により、入力部１９により入力された撮像条件に応じて、図４（ｂ）に示すような撮像タイミング信号、および、Ｚ走査部９のＹ軸駆動信号等の撮像パターン信号が生成される（ステップＳＡ２）。
【００３６】
次いで、サンプルＳのＸＹＺ撮像（３次元的な撮像）を開始する（ステップＳＡ３）。まず、制御部１７のＣＰＵ２７により、ＸＹ走査部７が駆動されるとともにＺ走査部９がＺ往路を移動させられ、光源部３からレーザ光が発せられる。光源部３から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー２１を透過して、ＸＹ走査部７により対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って２次元的に走査され、Ｚ往路を移動するＺ走査部９上のサンプルＳに照射される。
【００３７】
そして、図４（ａ）に示すように、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ往路を変更されていく。
【００３８】
レーザ光が照射されることによりサンプルＳにおいて発生する蛍光は、対物レンズ５により集光されてＸＹ走査部７を介してレーザ光の光路を戻り、ダイクロイックミラー２１により反射されて検出器１１により検出される。そして、検出した蛍光の輝度に相当する輝度情報が検出器１１から出力され、画像処理部１３に送られる。また、制御部１７のＣＰＵ２７により、ＸＹ走査部７によるレーザ光のＸＹ方向のレーザ光の走査位置およびＺ走査部９によるレーザ光のＺ方向の走査位置に関する走査位置情報が画像処理部１３に送られる。これにより、画像処理部１３において、サンプルＳのＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ４）。
【００３９】
そして、Ｚ往路を走査位置が変更されながら、ＸＹ走査部７によりＹ往路の最後まで走査ラインがずらされたらレーザ光を走査させずにＹ往路の最初の走査ラインに戻すことが繰り返されて、サンプルＳにおけるＺ方向の位置が異なる複数のＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ４、ＳＡ５「ＹＥＳ」、ＳＡ７「ＮＯ」）。
【００４０】
そして、図４（ａ）において破線の矢印で示すように、Ｚ往路の最後の撮像ラインが終了したら、Ｚ走査部９のみ駆動されてＸＹ走査部７の副走査方向の走査を行うガルバノミラーは停止され、Ｚ走査部９がＺ復路に折り返されるとともに、ＸＹ走査部７による副走査方向の走査ラインをずらす向きが反転される。
【００４１】
次いで、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向とは反対方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ復路を変更されていく。
【００４２】
そして、Ｚ往路と同様に、レーザ光が照射されることによりサンプルＳにおいて発生する蛍光が検出器１１により検出され、その輝度情報と走査位置情報とに基づいて画像処理部１３によりサンプルＳのＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ４）。
【００４３】
そして、Ｚ復路では（ステップＳＡ５「ＮＯ」）、画像処理部１３により、Ｚ復路で取得されるＸＹ画像が画像処理によって主走査方向に沿う軸線回りに反転される（ステップＳＡ６、ＸＹ画像反転処理。）。
【００４４】
そして、Ｚ復路を走査位置が変更されながら、ＸＹ走査部７によりＹ復路の最後まで走査ラインがずらされたら、レーザ光を走査させずにＹ復路の最初の走査ラインに戻すことが繰り返されて、サンプルＳにおけるＺ方向の位置が異なる複数のＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ４、ＳＡ５「ＮＯ」、ＳＡ６，ＳＡ７「ＮＯ」）。そして、Ｚ復路の最後の撮像ラインが終了したら（ステップＳＡ７「ＹＥＳ」）、撮像は終了する。
【００４５】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、制御部１７のＣＰＵ２７により、図４（ａ）に示すように、Ｚ往路とＺ復路とでＸＹ走査部７による副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることで、Ｚ往路とＺ復路の撮像面を一致させることができる。また、副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることにより、Ｚ往路とＺ復路とで対物レンズ５の光軸に交差する平面のＸＹ画像が反転してしまうが、制御部１７により、図６に示すように、画像処理部１３によって生成されるＺ往路のＸＹ画像とＺ復路のＸＹ画像の一方を主走査方向に沿う軸線回りに反転させることで、Ｚ往路とＺ復路のＸＹ画像の副走査方向の向きを一致させることができる。これにより、主走査方向の走査速度の高速性を生かしつつ高精度な３次元的な画像を取得することができる。
【００４６】
また、本実施形態においては、副走査方向の片方向のみでレーザ光を走査させることで、対物レンズ５の光軸に交差する平面のＸＹ画像をＺ方向に段階的にずらしながら取得することができる。この場合において、Ｚ方向の走査位置をＺ往路からＺ復路に折り返す際にＸＹ走査部７による副走査方向の走査ラインをずらす向きを反対方向に切り替えるだけで、Ｚ往路とＺ復路とでＸＹ走査部７による副走査方向の向きを反転させた画像を取得することができる。
【００４７】
また、本実施形態においては、制御部１７が、Ｚ往路とＺ復路とでＸＹ走査部７により共通の信号波形の撮像タイミング信号によって同じ平面を走査させるように、Ｚ往路とＺ復路とで撮像タイミング信号のタイミングをずらすことで、Ｚ往路とＺ復路とで一致しない無駄な画像を取得しなくて済み、Ｚ往路とＺ復路の両方で一致する画像を効率的に取得することができる。
【００４８】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、図８（ａ）に示すように、ＸＹ走査部７により副走査方向の往復で主走査方向にレーザ光を走査させる点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００４９】
本実施形態においては、ＣＰＵ２７は、図８（ａ）に示すように、ガルバノミラーによる副走査方向の往復でレゾナントミラーにより主走査方向にレーザ光を走査させるとともに、副走査方向の折り返しごとにガルバノミラーによる副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させるようになっている。
【００５０】
そして、Ｚ往路とＺ復路のいずれにおいても、Ｙ往路で副走査方向の最初の走査ライン（１）から最後の走査ライン（Ｎ）までずらしていき、Ｙ復路で副走査方向の最後の走査ライン（Ｎ）から最初の走査ライン（１）までずらしていくようになっている。Ｙ往路をＹ奇数ラインともいい、Ｙ復路をＹ偶数ラインともいう。ここでは、図８（ａ）に実線の矢印で示すように、Ｚ往路とＺ復路のいずれにおいても、Ｙ往路とＹ復路ともに撮像区間となっている。さらに、図８（ａ）において、破線の矢印は、Ｚ往路の撮像が終了し、Ｚ復路の撮像に切り替わるタイミング、つまりＺ方向におけるＺ走査部９の移動の向きを転換する区間（Ｚ方向のみ駆動（Ｙ方向走査停止）非撮像区間）を示している。この区間は非撮像区間であり、この区間では、ＸＹ走査部７の副走査方向の走査用のガルバノミラーは停止されるようになっている。
【００５１】
また、本実施形態においては、図８（ｂ）に示すように、撮像タイミングは、Ｚ往路およびＺ復路ともに、波形信号の立ち上がりおよび立ち下がりの両方である。そして、Ｚ往路とＺ復路とで共通の信号波形の撮像タイミング信号によって同じ平面が走査されるように、撮像タイミング信号はＺ往路とＺ復路とでそのタイミングがずらされている。具体的には、Ｚ往路とＺ復路で撮像を開始するＺ位置が、１枚のＸＹ画像を取得する間にＺ走査部９が移動するＺ方向の移動量の分だけずれるように、撮像タイミング信号のタイミングがずらされている。
【００５２】
また、Ｙ軸駆動信号は、ＸＹ制御部７のガルバノミラーにより、Ｚ往路とＺ復路のいずれにおいても、Ｙ往路では副走査方向に走査ラインをずらしていき、Ｙ復路では副走査方向とは反対方向に走査ラインをずらしていく駆動パターンとなっている。図８（ａ）に示すように、Ｚ往路のＹ往路とＹ復路およびＺ復路のＹ往路とＹ復路のすべてがそれぞれ撮像区間となる。
【００５３】
また、ＣＰＵ２７は、画像処理プログラムの実行により、画像処理部１３による画像生成を制御して、Ｙ往路（Ｙ奇数ライン）の画像とＹ復路（Ｙ偶数ライン）の画像の一方を画像処理で主走査方向（Ｘ方向）に沿う軸線回りに反転させるようになっている。本実施形態においては、Ｙ往路で取得されるＸＹ画像を基準として、Ｙ復路で取得されるＸＹ画像を画像処理で反転させるようになっている。
【００５４】
このように構成された走査型レーザ顕微鏡１の作用について、図９のフローチャートを参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によりサンプルＳを観察する場合は、まず、ステップＳＡ１〜ＳＡ４により、図８（ａ）に示すように、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ往路を変更されていき、サンプルＳのＸＹ画像が取得される。この場合は、Ｚ往路でかつＹ奇数ラインなので（ステップＳＡ５「ＹＥＳ」，ＳＢ５−１「ＹＥＳ」）、画像処理部１３によるＸＹ画像の反転処理は行われない。
【００５５】
次いで、Ｙ往路の最後まで走査ラインがずらされたら、副走査方向の走査ラインをずらす向きが反転されて、Ｙ復路に折り返される。そして、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向とは反対方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ往路を変更されていき、サンプルＳのＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ７「ＮＯ」，ＳＡ４）。この場合は、Ｚ往路でＹ偶数ラインなので（ステップＳＡ５「ＹＥＳ」，ＳＢ５−１「ＮＯ」）、画像処理部１３によりＹ復路で取得されるＸＹ画像が反転処理される（ステップＳＡ６）。
【００５６】
そして、Ｚ往路を走査位置が変更されながら、ＸＹ走査部７により、副走査方向の往復で主走査方向にレーザ光を走査させるとともに、副走査方向の折り返しごとにガルバノミラーによる副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることが繰り返されて、サンプルＳにおけるＺ方向の位置が異なる複数のＸＹ画像が副走査方向の往復で取得される。そして、図８（ａ）において破線の矢印で示すように、Ｚ往路の最後の撮像ラインが終了したら（ステップＳＡ７「ＮＯ」）、Ｚ走査部９のみ駆動されてＸＹ走査部７の副走査方向の走査を行うガルバノミラーは停止され、Ｚ走査部９がＺ復路に折り返される。
【００５７】
そして、図８（ａ）に示すように、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ復路を変更されていき、サンプルＳのＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ４）。この場合は、Ｚ復路でかつＹ奇数ラインなので（ステップＳＡ５「ＮＯ」，ＳＢ５−２「ＮＯ」）、画像処理部１３によるＸＹ画像の反転処理は行われない。
【００５８】
次いで、Ｙ往路の最後まで走査ラインがずらされたら、副走査方向の走査ラインをずらす向きが反転されて、Ｙ復路に折り返される。そして、ＸＹ走査部７のレゾナントミラーにより、対物レンズ５の光軸に交差する平面に沿って主走査方向に１ライン走査されるごとに、ガルバノミラーにより副走査方向とは反対方向に走査ラインがずらされながら、Ｚ走査部９により、レーザ光の走査位置がＺ復路を変更されていき、サンプルＳのＸＹ画像が取得される（ステップＳＡ７「ＮＯ」，ＳＡ４）。この場合は、Ｚ復路でかつＹ偶数ラインなので（ステップＳＡ５「ＮＯ」，ＳＢ５−２「ＹＥＳ」）、画像処理部１３によりＹ復路で取得されるＸＹ画像が反転処理される（ステップＳＡ６）。
【００５９】
そして、Ｚ復路を走査位置が変更されながら、ＸＹ走査部７により、副走査方向の往復で主走査方向にレーザ光を走査させるとともに、副走査方向の折り返しごとにガルバノミラーによる副走査方向の走査ラインをずらす向きを反転させることが繰り返されて、サンプルＳにおけるＺ方向の位置が異なる複数のＸＹ画像が副走査方向の往復で取得される。そして、Ｚ復路の最後の撮像ラインが終了したら（ステップＳＡ７「ＹＥＳ」）、撮像は終了する。
【００６０】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１によれば、副走査方向の往復で主走査方向にレーザ光を走査させることで、副走査方向の片方向のみでレーザ光を走査させる場合と比較して、レーザ光を走査させずに走査ラインに戻す時間の無駄を省くことができる。
【００６１】
例えば、副走査方向の走査速度が十分に高速でない場合は、レーザ光を走査させずに走査ラインを戻す間にＺ走査部９によるＺ方向の走査位置の変更が生じ、その間の領域の撮像ができなくなる。副走査方向の往復でレーザ光を走査させることで、Ｚ方向の走査位置の変更によって撮像できなくなる領域をなくすことができる。また、Ｙ復路でもＹ往路と同じＸＹ位置関係にでき、より多くのＺ領域を撮像できる。
【００６２】
本実施形態においては、図９のフローチャートに示すように、Ｚ往路かＺ復路か、さらにＹ奇数ラインかＹ偶数ラインかによって、画像処理部１３により反転処理を行うか行わないかを切り替えることとしたが、これに代えて、Ｚ往路かＺ復路かに関わらず、Ｙ往路で取得されたＸＹ画像は反転処理を行わず、Ｙ復路で取得されたＸＹ画像は反転処理を行うよう、ＣＰＵ２７が画像処理部１３を制御することとしてもよい。
【００６３】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００６４】
また、上記各実施形態においては、走査型レーザ顕微鏡として、正立型の走査型レーザ顕微鏡１を例示して説明したが、これに代えて、例えば、倒立型の顕微鏡を採用することとしてもよい。また、上記各実施形態においては、走査位置変更部として、サンプルＳを対物レンズ５の光軸に沿う方向に移動させるステージでもあるＺ走査部９を例示して説明したが、これに代えて、例えば、対物レンズ５を光軸に沿う方向に移動させる駆動機構を採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【００６５】
１        走査型レーザ顕微鏡
５        対物レンズ
７        ＸＹ走査部（走査部）
９        Ｚ走査部（走査位置変更部）
１１      検出器（検出部）
１３      画像処理部（画像生成部）
１７      制御部
Ｓ        サンプル（標本）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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