(57)【要約】【課題】低侵襲であって、矯正歯科治療期間の短縮化を可能とする歯牙移動促進剤及び矯正歯科治療用キットを提供する。【解決手段】歯牙移動促進剤ＲＯＣＫ阻害剤を有効成分として含有する。前記ＲＯＣＫ阻害剤がＨＡ−１０７７又はＹ−２７６３２であってもよい。矯正歯科治療用キットは、前記歯牙移動促進剤と、歯列矯正具と、を備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＣＫ阻害剤を有効成分として含有する歯牙移動促進剤。
【請求項２】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＨＡ−１０７７、Ｙ−２７６３２又はそれらの薬学的に許容できる塩である請求項１に記載の歯牙移動促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の歯牙移動促進剤と、
歯列矯正具と、
を備える矯正歯科治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯牙移動促進剤及び矯正歯科治療用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
矯正歯科治療は、歯に機械的及び物理的な力を付与することで歯の移動を行い、歯並び及びかみ合わせを改善する専門性の高い歯科治療である。矯正歯科治療を受診する患者数は、年々増加傾向にあり、従来の若年者の矯正歯科治療希望患者に加えて、近年は成人の矯正歯科治療希望者数の増加が顕著である。しかしながら、成人患者では、若年患者と比較して、物理的力を介して生じる歯槽骨、歯根膜等の歯周組織の改造が遅延することで歯の移動が遅くなり、結果として治療が長期化する傾向にある。治療の長期化は装置装着期間が長くなることを意味し、歯の刷掃性低下による歯肉炎、歯周炎のリスクが高くなることが懸念される。
【０００３】
現在の矯正歯科治療の主たる装置としては、マルチブラケット装置やマウスピース型装置が挙げられる。これら装置は、曲げられたワイヤーや、変形した高分子弾性材の戻り力で歯に持続的な力を付与するものである。しかしながら、この持続的な力を用いた矯正歯科治療では、数年に及ぶ治療期間中、常に装置を歯列に装着する必要があり、患者の肉体的及び心理的負担は大きい。
これに対し、矯正治療による歯の移動を促進するための従来技術として、歯槽骨に外科的手術を加えるコルチコトミー（歯槽骨皮質骨切除術）がある（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
一方、これまで、ＲＯＣＫ阻害剤は、抗がん剤、関節炎等の骨関連疾患の治療薬（例えば、特許文献１参照）、疼痛の治療薬（例えば、特許文献２参照）等として用いられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５１０９０２号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０８８０８８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hassan A H et al., “Corticotomy-Assisted Orthodontic Treatment: Review.”, Open Dent J., Vol. 4, p159-164, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、コルチコトミーは、高度な治療技術を要し、外科的侵襲を加えるため、患者への負担が大きく、一般的手法には至っていない。また、ＲＯＣＫ阻害剤は、骨関連疾患の治療薬として用いられてきたが、これまで矯正歯科治療に用いられた事例はなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、低侵襲であって、矯正歯科治療期間の短縮化を可能とする歯牙移動促進剤及び矯正歯科治療用キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る歯牙移動促進剤は、ＲＯＣＫ阻害剤を有効成分として含有する。
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＨＡ−１０７７、Ｙ−２７６３２又はそれらの薬学的に許容できる塩であってもよい。
【００１０】
本発明の第２態様に係る矯正歯科治療用キットは、上記第１態様に係る歯牙移動促進剤と、歯列矯正具と、を備える。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様の歯牙移動促進剤及び矯正歯科治療用キットは、低侵襲であり、矯正歯科治療期間を短縮化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例２における濃度の異なる２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）をそれぞれ含む培地で３週間培養したマウス由来前駆骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）でのアリザリンレッドＳ染色を用いた骨芽細胞石灰化能の評価結果を示す画像である。
【図２Ａ】実施例３における２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有、並びに、ＲＯＣＫ阻害剤不含（コントロール）の培地で４日間培養したマウス由来マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）での酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）染色を用いた破骨細胞分化促進能の評価結果を示す画像である。
【図２Ｂ】実施例３における２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有、並びに、ＲＯＣＫ阻害剤不含（コントロール）の培地で４日間培養したＲＡＷ２６４．７細胞でのＴＲＡＰ染色によって染色された破骨細胞の数を比較したグラフである。
【図３Ａ】実施例３における２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有、並びに、ＲＯＣＫ阻害剤不含（コントロール）の培地で４日間培養したマウス大腿骨骨芽細胞でのＴＲＡＰ染色を用いた破骨細胞分化促進能の評価結果を示す画像である。
【図３Ｂ】実施例３における２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有、並びに、ＲＯＣＫ阻害剤不含（コントロール）の培地で４日間培養したマウス大腿骨骨芽細胞でのＴＲＡＰ染色によって染色された破骨細胞の数を比較したグラフである。
【図４】実施例３における２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有、並びに、ＲＯＣＫ阻害剤不含（コントロール）の培地で３週間培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス大腿骨骨芽細胞でのアリザリンレッドＳ染色及びアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）染色を用いた骨芽細胞分化促進能の評価結果を示す画像である。
【図５Ａ】実施例４におけるＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）含有、及び、０．１％ＤＭＳＯ含有（コントロール）の骨芽細胞分化誘導培地で７日間培養したラット大腿骨骨芽細胞での血管新生マーカーであるＡＮＧＰＴ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を比較したグラフである。
【図５Ｂ】実施例４におけるＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）含有、及び、０．１％ＤＭＳＯ含有（コントロール）の骨芽細胞分化誘導培地で７日間培養したラット大腿骨骨芽細胞での血管新生マーカーであるＶＥＧＦＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を比較したグラフである。
【図６Ａ】参考例１におけるＲＯＣＫ阻害剤を用いたラット頭蓋骨欠損部での骨形成への影響確認試験のプロトコールを示す概略工程図である。
【図６Ｂ】参考例１における試験開始から４週間後のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを含むアテロコラーゲンスポンジを填入したラット頭蓋骨欠損部での骨形成の様子を比較した画像である。左側は、μＣＴ像であり、真ん中はＴＲＡＰ染色像であり、右側は抗ＲＵＮＸ２抗体による免疫染色像である。黒矢印はそれぞれ骨形成部を示す。
【図６Ｃ】参考例１における試験開始から４週間後のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを含むアテロコラーゲンスポンジを填入したラット頭蓋骨欠損部のμＣＴ像を用いてＩｍａｇｅ  Ｊにより解析された新生骨部の面積を比較したグラフである。
【図７Ａ】実施例５におけるＲＯＣＫ阻害剤を用いたラットの歯の移動への影響確認試験のプロトコールを示す概略工程図である。
【図７Ｂ】実施例５における試験開始から７日目のコイルを装着し、ＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを投与したラットの上顎右側第一臼歯、第二臼歯及び第三臼歯のμＣＴ像である。
【図７Ｃ】実施例５における試験開始から７日目のコイルを装着し、ＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを投与したラットの上顎右側第一臼歯の移動距離を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪歯牙移動促進剤≫
本実施形態の歯牙移動促進剤は、ＲＯＣＫ阻害剤を有効成分として含有する。
【００１４】
矯正歯科治療は、歯へ機械的刺激を与えることで、歯の支持組織である歯槽骨や歯根膜の組織改造を利用したものである。歯に機械的刺激が加わると、移動方向の歯根膜は圧迫され、それに面した歯槽骨表面においては破骨細胞による骨吸収が、その反対側の歯根膜では歯根膜線維の伸展により歯槽骨表面において骨芽細胞による骨添加が起こる。そこで、本発明者らは、破骨細胞と骨芽細胞との両方を活性化し、骨代謝回転を早めることで、骨の改造現象を促進させ、歯の移動速度を高めることができる薬剤の探索を行った。その結果、ＲＯＣＫ阻害剤が歯牙において破骨細胞と骨芽細胞との両方の分化を促進させることで、歯の移動速度を高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
本実施形態の歯牙移動促進剤によれば、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことで、後述する実施例に記載のとおり、破骨細胞及び骨芽細胞両方の分化促進することができ、さらに、血管新生が促進される。これにより、マルチブラケット装置やマウスピース型装置等の従来の歯列矯正具のみを用いた矯正歯科よりも、これら従来の歯列矯正具と本実施形態の歯牙移動促進剤とを併用することで、矯正歯科治療期間を短縮化することができる。
また、本実施形態の歯牙移動促進剤を用いた矯正歯科治療は外科的侵襲を必要とせず、低侵襲で治療を行えるため、患者への負担を軽減することができる。
【００１６】
＜ＲＯＣＫ阻害剤＞
本実施形態の歯牙移動促進剤に含まれるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）を阻害するものであればよく、特別な限定はない。ＲＯＣＫ阻害剤として具体的には、例えば、ＨＡ−１０７７、Ｙ−２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ−１４４７、ＧＳＫ１８０７３６Ａ、ＨＡ−１１００、Ｙ−３９９８３、ＡＲ−１３３２４、ＧＳＫ２６９９６２、ＡＴ１３１４８、Ｋ−１１５、ＫＤ０２５、ＺＩＮＣ００８８１５２４、及び、それらの薬学的に許容できる塩が挙げられる。中でも、本実施形態の歯牙移動促進剤に含まれるＲＯＣＫ阻害剤としては、ＨＡ−１０７７、Ｙ−２７６３２、又はそれらの薬学的に許容できる塩が好ましく、Ｙ−２７６３２又はその薬学的に許容できる塩がより好ましい。
【００１７】
本明細書において、「薬学的に許容できる」とは、被検動物に適切に投与された場合に、概して、人体に害を及ぼさない程度を意味する。
【００１８】
塩としては、薬学的に許容できる酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩としては、無機酸との塩であってもよく、有機酸との塩であってもよい。無機酸としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる。
塩基性塩としては、無機塩基との塩であってもよく、有機塩基との塩であってもよい。無機塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。有機塩基としては、例えば、カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等が挙げられる。
【００１９】
＜その他の成分＞
本実施形態の歯牙移動促進剤は、ＲＯＣＫ阻害剤に加えて、その他の成分を含んでもよい。その他の成分としては、例えば、添加剤、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤が挙げられる。
添加剤としては、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム、グリセロール等が挙げられる。
薬学的に許容されうる担体又は希釈剤としては、例えば、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、液剤、懸濁剤又は乳剤等の形態の歯牙移動促進剤を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、ＲＯＣＫ阻害剤の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は、細胞（特に、破骨細胞、骨芽細胞及びそれらの前駆細胞）へ、ＲＯＣＫ阻害剤の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えば、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができる。中でも、特定の臓器、組織、又は、細胞へ、ＲＯＣＫ阻害剤を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００２０】
本実施形態の歯牙移動促進剤における製剤化の例としては、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、懸濁液剤、注射剤若しくは口腔洗浄剤（マウスウォッシュ）、又は、ゲル状、ペースト状の口腔用軟膏若しくは口腔用ゼリーの形で非経口的に使用されるものが挙げられる。
【００２１】
さらには、薬理学上許容される担体又は希釈剤として、具体的には、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００２２】
本実施形態の歯牙移動促進剤が無菌性溶液又は懸濁液剤である場合、例えば、歯肉圧排糸又は圧排ペーストに本実施形態の歯牙移動促進剤を含侵させて歯頸部に巻くことで、本実施形態の歯牙移動促進剤を歯肉溝から患部に投与することができる。歯肉圧排糸の材質としては、例えば、綿、絹等が挙げられる。また、圧排ペーストとしては、例えば、スリーエムヘルスケア社製のＥＳＰＥ（登録商標）圧排ペースト等を用いることができる。
また、本実施形態の歯牙移動促進剤が無菌性溶液又は懸濁液剤である場合、例えば、歯周パックに本実施形態の歯牙移動促進剤を含侵させて歯周組織をパックすることで、本実施形態の歯牙移動促進剤を患部に投与することができる。本実施形態の歯牙移動促進剤を含侵させた吸水性のスポンジで歯周組織を覆い、さらにその上から歯周パックで覆うことで投与してもよい。歯周パックは、促進材（キャタリスト）と基材（ベース材）とを練和して硬化させることで得られる。歯周パックにおける促進材（キャタリスト）としては、例えば、酸化亜鉛、植物油、鉱油、酸化マグネシウム等が挙げられる。歯周パックにおける基材（ベース材）としては、例えば、ロジン、ラウリン酸、天然ゴム、ラノリン、エチルセルロース等が挙げられる。
【００２３】
本実施形態の歯牙移動促進剤が注射剤である場合、無菌組成物は、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、適当な溶解補助剤、又は、非イオン性界面活性剤と併用してもよい。
前記その他の補助薬としては、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられる。
前記適当な溶解補助剤としては、例えば、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコールが挙げられる。
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等が挙げられる。
【００２４】
また、油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤、無痛化剤、安定剤、又は、酸化防止剤をさらに配合してもよい。
前記緩衝剤としては、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
前記無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン等が挙げられる。
前記安定剤としては、例えば、ベンジルアルコール、フェノール等が挙げられる。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００２５】
また、注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類等）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法等によって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００２６】
本実施形態の歯牙移動促進剤が口腔洗浄剤（マウスウォッシュ）である場合、例えば、本実施形態の歯牙移動促進剤と基材等とを混合して口腔洗浄剤を調製することできる。得られた口腔洗浄剤を用いて口腔内をゆすぐことで、本実施形態の歯牙移動促進剤を患部に投与することができる。口腔洗浄剤（マウスウォッシュ）における基材としては、例えば、水、ポリエチレングリコール、デキストリン等が挙げられる。
【００２７】
本実施形態の歯牙移動促進剤が口腔用軟膏又は口腔用ゼリーである場合、本実施形態の歯牙移動促進剤の効果を阻害しない範囲で、発泡剤、発泡助剤、研磨剤、湿潤剤、甘味剤、保存料、フッ化ナトリウム等のフッ素イオン供給化合物、顔料、色素、香料等を適宜含有させることができる。
【００２８】
また、本実施形態の歯牙移動促進剤が口腔用軟膏又は口腔用ゼリーである場合、本実施形態の歯牙移動促進剤と基材とを混合して、口腔用軟膏又は口腔用ゼリーを調製することができる。得られた口腔用軟膏又は口腔用ゼリーをマウスピースに塗布して歯に装着することで、本実施形態の歯牙移動促進剤を患部に投与することができる。このとき、口腔用軟膏又は口腔用ゼリーにおける基材としては、例えば、ワセリン、パラフィン、ポリエチレン樹脂、ミツロウ、ポリエチレングリコール、セルロース等が挙げられる。
【００２９】
＜投与量及び投与方法＞
本実施形態の歯牙移動促進剤は、矯正歯科治療に用いることができる。
本実施形態の歯牙移動促進剤の投与量は、被検動物の年齢、性別、体重、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
被検動物としては、哺乳動物が好ましく、具体的には、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられる。中でも、被検動物としては、ヒトが好ましい。
【００３０】
本実施形態の歯牙移動促進剤を非経口的に投与する場合には、その１回の投与量は症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、ＲＯＣＫ阻害剤の量が、１日当り０．５ｎｇ以上１ｍｇ以下、好ましくは１ｎｇ以上０．５ｍｇ以下、より好ましくは５ｎｇ以上０．１ｍｇ以下程度となるように局所注射により投与するのが好適である。
【００３１】
投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与時期としては、矯正歯科治療中であればいつでもよく、例えば、歯列矯正具による矯正歯科治療を開始した時点であってもよく、歯列矯正具を装着している間であってもよい。
投与形態としては、移動したい歯牙の周囲の組織（歯周組織）に直接投与することが好ましい。例えば、口腔粘膜への注射、又は、口腔内軟膏の塗布による経粘膜的投与等の当業者に公知の方法が挙げられる。
【００３２】
＜治療方法＞
本実施形態において、矯正歯科治療のための上記歯牙移動促進剤を提供する。
また、本実施形態において、治療的に有効量の上記ＲＯＣＫ阻害剤、並びに、薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む歯牙移動促進剤を提供する。
また、本実施形態において、上記ＲＯＣＫ阻害剤の有効量を、矯正歯科治療を必要とする患者に投与することを含む、矯正歯科治療方法を提供する。
【００３３】
≪矯正歯科治療用キット≫
本実施形態の矯正歯科治療用キットは、上記実施形態に係る歯牙移動促進剤と、歯列矯正具と、を備える。
【００３４】
本実施形態の矯正歯科治療用キットによれば、上記歯牙移動促進剤を含むことで、従来の歯列矯正具のみを用いた矯正歯科よりも、矯正歯科治療期間を短縮化することができる。
また、本実施形態の矯正歯科治療用キットを用いた矯正歯科治療は外科的侵襲を必要とせず、低侵襲で治療を行えるため、患者への負担を軽減することができる。
【００３５】
＜歯列矯正具＞
本実施形態の矯正治療用キットに含まれる歯列矯正具としては、特別な限定はなく、例えば、マルチブラケット装置、マウスピース型装置等、公知のものが挙げられる。
【００３６】
本実施形態の矯正歯科治療用キットの使用方法としては、まず、患者に歯列矯正具を装着する。次いで、移動させた歯の周辺組織に上記歯牙移動促進剤を投与する。具体的には、上記歯牙移動促進剤が注射剤である場合には、該注射剤を移動させたい歯の周辺組織に皮下注射（特に、口腔粘膜への注射）すればよい。また、上記歯牙移動促進剤が口腔内軟膏である場合には、該口腔内軟膏を移動させたい歯の周辺組織に塗布して経粘膜的に投与すればよい。また、上記歯牙移動促進剤が口腔内軟膏である場合には、処方薬として患者自身が処方に従って患部に投与することもできる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］破骨細胞分化促進能を有する化合物のスクリーニング
まず、歯の移動促進剤の候補となる低分子化合物のスクリーニングを行った。
【００３９】
（１）破骨細胞分化促進能を有する化合物のスクリーニング
スクリーニング対象の化合物として、３７８種類の低分子化合物を含み、既存の抗がん剤であって、標的分子が明白な阻害剤を含む標準阻害剤キット（「文部科学省科学研究費補助金・がんの特性等を踏まえた総合支援活動・化学療法基盤支援活動」からの提供）を用いた。
予め培養しておいたマウス由来マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）を、上記キットに含まれる各低分子化合物及び対照として破骨細胞分化因子であるサイトカインＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬずつ含む培地に交換して、４日間培養した。
次いで、培養５日目に酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）染色液（自ら調製）を用いて、破骨細胞への分化を評価した。結果を以下の表１に示す。表１において、ＲＡＮＫＬを添加した細胞中の破骨細胞へ分化した細胞数を１とした場合に対する、各化合物を添加した細胞中の破骨細胞へ分化した細胞数の相対的な比率（倍）を「破骨細胞分化促進効果」として記載している。また、破骨細胞への促進効果（８種類）又は抑制効果（７種類）がみられた代表的な１５種類の化合物のみを記載している。また、表１における各略称の意味は以下のとおりである。
ＧＳＫ：Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅの略称であり、グリコーゲン合成酵素キナーゼを意味する。
ＣＤＫ：Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅの略称であり、サイクリン依存性キナーゼを意味する。
ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅの略称であり、活性型Ｒｈｏにより活性化されるセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素を意味する。
ＣＫ：Ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅの略称であり、カゼインキナーゼを意味する。
ＰＫＣ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃの略称であり、プロテインキナーゼＣを意味する。
ＰＫＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａの略称であり、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）依存性プロテインキナーゼ（プロテインキナーゼＡ）を意味する。
Ｗｎｔ：分泌性糖タンパク質である。７回膜貫通型受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）、共役受容体として機能する１回膜貫通型受容体ＬＲＰ５／６（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５／６）、チロシンキナーゼ活性を有する１回膜貫通型受容体であるＲｏｒやＲＹＫと結合し、β−カテニン経路、平面内細胞極性（ｐｌａｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ：ＰＣＰ）経路及びカルシウム経路の３種類の経路を活性化させる。
Ｐ３８：細胞外の刺激を核内の転写制御機構へとつなぐシグナル分子である。ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーの１つであり、特に、ストレスや炎症性サイトカインにより活性化される。このため、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）やＥＲＫ５とともにストレス活性化プロテインキナーゼ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：ＳＡＰＫ）とも呼ばれている。
ＣＡＭＫＩＩ：Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩの略称であり、Ｃａ２＋カルモジュリン依存性プロテインキナーゼを意味する。
Ｍｕｌｔｉ−ｋｉｎａｓｅｓ：複数のキナーゼが阻害対象であることを意味する。
ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの略称であり、上皮成長因子受容体を意味する。
ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ：ビタミンＡの活性本体であるａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ、レチノイン酸）とそれと同等の活性を示す化合物群の総称を意味する。
Ｇ９ａ：ヒトのヒストンメチル基転移酵素である。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１から、破骨細胞分化促進能を有することが明らかとなった８種類の化合物のうちＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）に着目し、続く骨芽細胞石灰化能への濃度依存性の検討に用いた。
【００４２】
［実施例２］ＲＯＣＫ阻害剤の骨芽細胞石灰化能への濃度依存性の検討
次いで、実施例１で同定された２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）の骨芽細胞石灰化能への濃度依存性について検討した。具体的には、２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）について、培地中に含まれる各化合物の濃度を０．２、１及び５μＭとふった以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を３週間培養し、アリザリンレッドＳ染色液（自ら調製）を用いて、骨芽細胞の石灰化能を評価した。結果を図１に示す。図１において、「ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、ＲＯＣＫ阻害剤を添加せずに３週間培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞である。
【００４３】
図１から、ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２のいずれの化合物においても、０．２μＭ〜５μＭの濃度において、一様に骨芽細胞の石灰化能の活性化がみられた。特に、Ｙ−２７６３２において、石灰化能の亢進が顕著であった。
以上のことから、ＲＯＣＫ阻害剤であるＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２が破骨細胞及び骨芽細胞の両方への分化を促進する化合物として同定された。
【００４４】
［実施例３］ＲＯＣＫ阻害剤の破骨細胞及び骨芽細胞の分化促進能確認試験
次いで、実施例１で同定された２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）の破骨細胞及び骨芽細胞の分化促進能を再度確認した。
【００４５】
（１）ＲＯＣＫ阻害剤の破骨細胞の分化促進能確認試験
予め培養しておいたＲＡＷ２６４．７細胞及びマウス大腿骨骨髄細胞を、２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）をそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬずつ含む培地に交換して、４日間培養した。また、対照（コントロール）として、ＲＯＣＫ阻害剤不含の培地で同様に４日間培養した。
次いで、培養５日目にＴＲＡＰ染色液を用いて、破骨細胞への分化を評価した。ＲＡＷ２６４．７細胞での結果を図２Ａ及び図２Ｂに、マウス大腿骨骨髄細胞での結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図２Ａ及び図３Ａは、それぞれＴＲＡＰ染色した各細胞を撮影した画像である。また、図２Ｂ及び図３Ｂは、各培養条件での、ＴＲＡＰ染色によって染色された細胞、すなわち、破骨細胞に分化した細胞数を示すグラフである。
【００４６】
図２Ａ〜図３Ｂから、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることで、破骨細胞への分化が促進されていることが確かめられた。
【００４７】
（２）ＲＯＣＫ阻害剤の骨芽細胞の分化促進能確認試験
次いで、予め培養しておいたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞及びマウス大腿骨骨髄細胞を、２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）をそれぞれ５μＭずつ含む培地に交換して、３週間培養した。また、対照（コントロール）として、ＲＯＣＫ阻害剤不含の培地で同様に３週間培養した。
次いで、アリザリンレッドＳ染色液を用いて、骨芽細胞の石灰化能を評価した。また、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞については、アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）染色液（自ら調製）を用いて、骨芽細胞におけるＡＬＰ活性についても評価した。結果を図４に示す。
【００４８】
図４から、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることで、石灰化が促進されており、また、ＡＬＰ活性が上昇しており、骨芽細胞への分化が促進されていることが確かめられた。
【００４９】
［実施例４］ＲＯＣＫ阻害剤の血管新生マーカー発現への影響確認試験
予め培養しておいたラット大腿骨骨髄由来間質細胞を、５μＭのＹ−２７６３２含有骨芽細胞分化誘導培地、又は、対照（コントロール）として、０．１％ＤＭＳＯ含有培地に交換して、７日間培養した。骨芽細胞分化誘導培地の組成は、α−ＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍＭのβ−グリセロフォスフェート、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸及び１０ｎＭのデキサメタゾンである。
培養開始から７日後に、細胞から全ＲＮＡを回収した。次いで、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて、血管新生マーカーであるＡＮＧＰＴ１遺伝子及びＶＥＧＦＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現についてリアルタイムＰＣＲで解析した。結果を図５Ａ（ＡＮＧＰＴ１遺伝子）及び図５Ｂ（ＶＥＧＦＡ遺伝子）に示す。
【００５０】
図５Ａ及び図５Ｂから、Ｙ−２７６３２存在下では、コントロールに比べて、ＡＮＧＰＴ１遺伝子で約５．６倍、ＶＥＧＦＡ遺伝子で約２．７倍の有意なｍＲＮＡの発現上昇がみられた。
このことから、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることで、破骨細胞及び骨芽細胞の分化促進だけでなく、血管新生が促進されて栄養分が供給されるため、より効果的に、歯の移動が促進されると推察された。
【００５１】
［参考例１］ＲＯＣＫ阻害剤の骨形成への影響確認試験
次いで、ＲＯＣＫ阻害剤の骨形成への影響を、ラットを用いて確認した。具体的なプロトコールを図６Ａに示す。
まず、８週齢のＳＤラット（オス）の頭蓋骨に欠損部（直径５ｍｍ）を形成させ、そこに２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを含むアテロコラーゲンスポンジを填入した。次いで、１週間に２度の頻度で、２種類のＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）又はＰＢＳを含むアテロコラーゲンスポンジを填入し、試験開始から４週間飼育した。４週間後、μＣＴ解析及び組織像解析を行った。結果を図６Ｂ（画像）及び図６Ｃ（グラフ）に示す。図６Ｂにおいて、左側は、μＣＴ像であり、真ん中はＴＲＡＰ染色像であり、右側は抗ＲＵＮＸ２抗体による免疫染色像である。なお、一般に、「ＲＵＮＸ２」は、骨芽細胞の分化に必須な転写因子である。黒矢印はそれぞれ骨形成部を示す。また、図６Ｃは、各μＣＴ像を用いてＩｍａｇｅ  Ｊにより新生骨部の面積を解析し、得られたものである。
【００５２】
図６Ｂ及び図６Ｃから、ＲＯＣＫ阻害剤を用いることで、破骨細胞及び骨芽細胞両方の分化促進が促進されており、骨形成が促進されることが確かめられた。
【００５３】
［実施例５］ＲＯＣＫ阻害剤の歯の移動への影響確認試験
次いで、ＲＯＣＫ阻害剤の歯の移動への影響を、ラットを用いて確認した。具体的なプロトコールを図７Ａに示す。
まず、８週齢のＳＤラット（オス）の上顎切歯と上顎右側第一臼歯とに２５ｇの持続的けん引力がかかるコイルを装着した。次いで、ラットをコントロール群とＲＯＣＫ阻害剤投与群とに分け、実験開始から０、３及び５日後に、コントロール群にはＰＢＳを、ＲＯＣＫ阻害剤投与群には０．５μＭのＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）含有ＰＢＳを、それぞれ１０μＬずつ上顎右側第一臼歯の口蓋側粘膜に注射器を用いて投与した。開始後７日目に上顎骨を４％パラホルムアルデヒドで固定し、μＣＴで観察した。結果を図７Ｂに示す。次いで、上顎右側第一臼歯の移動距離を計測した。なお、移動距離としては、上顎右側第一臼歯と第二臼歯との間の距離を測定した。結果を図７Ｃ及び表３に示す。図７Ｃは、表３に示す移動距離（ｎ＝５）を平均したものである。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
図７Ｂ、図７Ｃ及び表３から、ＲＯＣＫ阻害剤（ＨＡ−１０７７及びＹ−２７６３２）の投与により、歯の移動が顕著に促進されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本実施形態の歯牙移動促進剤及び矯正歯科治療用キットは、低侵襲であり、矯正歯科治療期間を短縮化することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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