(57)【要約】【課題】  抗体の結合活性および変性度合を従来よりも短時間かつ簡便に評価可能な方法を提供すること。【解決手段】  一定量の抗体を含む溶液に前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させる第一の工程、前記第一の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る第二の工程、および前記第二の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体または前記複合体を形成しない前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する第三の工程を含む方法により、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）一定量の未変性抗体Ａを含む溶液に、抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し、抗体Ａと前記タンパク質との複合体を形成させる工程、
（２）（１）の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程、
（３）（２）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体または前記複合体を形成しない前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程、
（４）一定量の被検抗体Ａを含む溶液に、抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し、抗体Ａと前記タンパク質との複合体を形成させる工程、
（５）（４）の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程、
（６）（５）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体または前記複合体を形成しない前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程、および
（７）（３）の工程での算出結果と（６）の工程での算出結果とを比較する工程、
を含む、被検抗体Ａの変性度合を評価する方法。
【請求項２】
抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される何れかである、請求項１に記載の評価方法：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。
【請求項３】
様々な濃度の未変性抗体Ａについて前記工程（１）〜（３）を行い、前記複合体量または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質量と前記抗体量とで検量線Ｉを作成する工程、
様々な濃度の被検抗体Ａについて前記工程（４）〜（７）を行い、前記複合体量または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質量と前記抗体量とで検量線ＩＩを作成する工程、並びに
前記検量線ＩおよびＩＩを比較する工程
を含む、請求項１又は２に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の変性度合をゲル濾過クロマトグラフィを用いて評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品市場の成長に伴い、安定性試験や品質評価などの規制への迅速な技術対応が求められている。抗体医薬品をはじめとする生物薬品は生体による生合成過程を生産に利用していることから、原理的に分子構造上不均一なものが産生される可能性が存在する。故に生物薬品の規格（非特許文献１）には、開発段階での広範かつ詳細な特性解析が必要であることが記載されており、前記特性解析の一つとして特定の生物学的効果を発揮するための特異的な機能やその程度を表す生物活性をあげている。
【０００３】
抗体医薬品の生物活性、すなわち抗体（免疫グロブリン）の結合活性の評価方法として、従来よりＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法や表面プラズモン共鳴法を用いた方法が知られている。しかしながら、これらの方法は、酵素やセンサーチップなどの高価な試薬や備品が必要なこと、および複数の工程を必要とし操作が煩雑なことが問題であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドライン  Ｑ６Ｂ  （通知日２００１年５月１日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、抗体の結合活性より変性度合を従来よりも短時間かつ簡便に評価可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者らは、抗体を含む溶液に当該抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を添加し、前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させることで、ゲル濾過クロマトグラフィを用いた短時間かつ簡便な方法で抗体の結合活性および変性度合を評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下の［１］〜［３］の態様を包含する。
［１］
（１）一定量の未変性抗体Ａを含む溶液に、抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し、抗体Ａと前記タンパク質との複合体を形成させる工程、
（２）（１）の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程、
（３）（２）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体または前記複合体を形成しない前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程、
（４）一定量の被検抗体Ａを含む溶液に、抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し、抗体Ａと前記タンパク質との複合体を形成させる工程、
（５）（４）の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程、
（６）（５）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体または前記複合体を形成しない前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程、および
（７）（３）の工程での算出結果と（６）の工程での算出結果とを比較する工程、
を含む、被検抗体Ａの変性度合を評価する方法。
［２］
抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される何れかである、［１］に記載の評価方法：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するタンパク質。
［３］
様々な濃度の未変性抗体Ａについて前記工程（１）〜（３）を行い、前記複合体量または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質量と前記抗体量とで検量線Ｉを作成する工程、
様々な濃度の被検抗体Ａについて前記工程（４）〜（７）を行い、前記複合体量または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質量と前記抗体量とで検量線ＩＩを作成する工程、並びに
前記検量線ＩおよびＩＩを比較する工程
を含む、［１］又は［２］に記載の評価方法。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
抗体を含む溶液に前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を添加すると、前記抗体と前記タンパク質との複合体が形成される。前記複合体と前記タンパク質とは分子量が異なるため、ゲル濾過クロマトグラフィに供することで前記複合体と前記タンパク質とを分離できる。ここで用いるゲル濾過クロマトグラフィ用担体は抗体や前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質および前記抗体と前記タンパク質との複合体に対し反応性や吸着性をもたないものであればよく、個々の試料成分を分離するために十分な細孔径を有していればよい。例えば、担体の平均粒子径は２μｍ〜１０μｍ、より好ましくは４μｍ〜８μｍであり、担体の平均細孔径は２０ｎｍ〜５０ｎｍ、より好ましくは２５ｎｍ〜３０ｎｍであってよいが、これらに限定されない。本発明は、当該分離で得られた前記複合体または（前記複合体を形成しない）前記抗体もしくは前記タンパク質を定量することで、抗体の結合活性を評価する。なお本抗体結合活性評価を、前記複合体を形成しない前記抗体または前記タンパク質を定量することで評価する場合、抗体が前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質に対し過剰量の場合は前記複合体を形成しない前記抗体を定量すればよく、抗体に対し前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質が過剰量の場合は前記複合体を形成しない前記タンパク質を定量すればよい。
【０００９】
抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質としては、抗体精製用アフィニティリガンドとして広く用いられている黄色ブドウ球菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、連鎖球菌由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ由来のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ、Ｆｃ受容体が例示できる。Ｆｃ受容体は、抗体が単に結合するための器としての役割だけでなく生体内の免疫機構に関与するタンパク質であり、ＩｇＧに対する受容体であるＦｃγ受容体、ＩｇＥに対する受容体であるＦｃε受容体、ＩｇＡに対する受容体であるＦｃα受容体、等いくつかのサブタイプに分類される。また各サブタイプの受容体は更に細かく分類されており、例えばＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８−３２６，２００５）。
【００１０】
抗体（免疫グロブリン）がＩｇＧであり、抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質がＦｃγ受容体の場合、当該Ｆｃγ受容体として、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂのいずれも用いることができる。前記Ｆｃγ受容体の好ましい態様として、
（Ａ）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質、および
（Ｂ）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、１以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されたポリペプチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質、
があげられる。また前記（Ｂ）の好ましい態様として、
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質、
配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、１９２番目のバリンがフェニルアラニンに置換されたポリペプチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質、
特開２０１５−０８６２１６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１６−１６９１９７号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
特開２０１７−１１８８７１号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質、
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７６番目のフェニルアラニンがイソロイシン、アラニン、チロシンのいずれかにアミノ酸置換された、Ｆｃ結合性タンパク質、
があげられる。上記列挙したＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、さらに１以上のアミノ酸残基が欠失、他のアミノ酸残基に置換、または付加されていてもよい。１以上のアミノ酸残基とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個を意味する。上記のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。また、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体結合活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対し、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００１１】
なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ（この表記は配列番号１の２７番目（配列番号２では４３番目）のバリンがグルタミンに置換していることを表す、以下同じ）、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
【００１２】
抗体と前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質との複合体形成工程で用いる緩衝液としては、通常当業者が緩衝液として用いる、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を用いてもよいが、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２ＯとＮａ２ＳＯ４とを含む緩衝液が好ましい。前記緩衝液成分の濃度は３０ｍＭから２００ｍＭまでの間とすると好ましく、５０ｍＭから１５０ｍＭまでの間とするとより好ましい。緩衝液のｐＨまたは反応温度は抗体の抗原への結合活性を損なわない範囲で設定すればよい。
【００１３】
本抗体結合活性評価法は、例えば以下の（Ｉ−１）から（Ｉ−６）に示す工程または（ＩＩ−１）から（ＩＩ−６）に示す工程に基づき行なえばよい。
【００１４】
（Ｉ−１）種々の量、好ましくは０〜１５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０〜１０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０〜５ｍｇ／ｍＬの抗体を含む溶液に、一定量の前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質をそれぞれ添加し、前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させる工程
（Ｉ−２）（Ｉ−１）の工程で得られた溶液をそれぞれゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程
（Ｉ−３）（Ｉ−２）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体（または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質）に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程
（Ｉ−４）（Ｉ−３）の算出結果に基づき、前記複合体量（または前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質量）と、前記抗体量とで検量線を作成する工程
（Ｉ−５）（Ｉ−４）で作成した検量線に基づき、前記一定量の抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質全てを前記複合体（以下、完全複合体化とも表記）にするために必要な抗体量を算出する工程
（Ｉ−６）（Ｉ−５）で算出した抗体量に基づき、抗体の結合活性を評価する工程
（ＩＩ−１）一定量の抗体を含む溶液に、種々の量の前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質をそれぞれ添加し、前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させる工程
（ＩＩ−２）（ＩＩ−１）の工程で得られた溶液をそれぞれゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程
（ＩＩ−３）（ＩＩ−２）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体（または前記複合体を形成しない前記抗体）に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程
（ＩＩ−４）（ＩＩ−３）の算出結果に基づき、前記複合体量（または前記複合体を形成しない前記抗体）と、前記タンパク質量とで検量線を作成する工程
（ＩＩ−５）（ＩＩ−４）で作成した検量線に基づき、前記一定量の抗体を完全複合体化するために必要な前記タンパク質量を算出する工程
（ＩＩ−６）（ＩＩ−５）で算出した前記タンパク質量に基づき、抗体の結合活性を評価する工程
本抗体結合活性評価法を利用して、抗体の変性度合も評価できる。抗体が、熱、酸、アルカリ、撹拌、凍結融解などのストレスにさらされると、二次構造などが変化し、変性することがある。当該変性した抗体は、未変性の抗体と比較し、結合活性が低下している。そこで変性した抗体を含む抗体溶液に対し、本抗体結合活性評価法を適用した。その結果、未変性の抗体のみを含む抗体溶液と比較し、抗体と当該抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質との複合体の量が低下（前記複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質の量が増加）していた（後述の実施例２参照）。このことから、本抗体結合活性評価法により、抗体の変性度合の評価もできることがわかった。
【００１５】
本抗体結合活性評価法を利用した抗体の変性度合評価法（以下、単に本発明の抗体変性度合評価法とも表記する）は、例えば以下に示す工程に基づき行なえばよい。
【００１６】
（ｉ−１）一定量の未変性抗体Ａを含む溶液および前記と同量の被検抗体Ａを含む溶液に対し、抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質をそれぞれ一定量添加し、抗体Ａと前記タンパク質との複合体を形成させる工程
（ｉ−２）（ｉ−１）の工程で得られた溶液をそれぞれゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る工程
（ｉ−３）（ｉ−２）の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体（または前記複合体を形成しない抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質）に相当するピークの高さまたは面積を算出する工程
（ｉ−４）未変性抗体Ａを含む溶液を用いたときの（ｉ−３）の算出結果と、被検抗体Ａを含む溶液を用いたときの（ｉ−３）の算出結果との差に基づき、抗体Ａの変性度合を評価する工程
前述した本発明の抗体変性度合評価法では、ある一点の（抗体Ａ量および抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質量を固定した）条件における、抗体Ａと前記タンパク質との複合体（または前記複合体を形成しない抗体ＡのＦｃ領域と結合可能なタンパク質）の量の変化に基づき評価しているが、前記（Ｉ−１）から（Ｉ−４）の工程により作成した検量線の変化に基づき、抗体の変性度合を評価してもよい。前記検量線の変化に基づく、本発明の抗体変性度合評価法は、例えば以下の（ｉｉ−１）から（ｉｉ−３）に示す工程または（ｉｉｉ−１）または（ｉｉｉ−３）に示す工程に基づき行なえばよい。
【００１７】
（ｉｉ−１）種々の量の未変性抗体Ａを含む溶液に対し、前記（Ｉ−１）から（Ｉ−４）の工程を実施し、検量線を作成する工程
（ｉｉ−２）（ｉｉ−１）と同じ種々の量の被検抗体Ａを含む溶液に対し、前記（Ｉ−１）から（Ｉ−４）の工程を実施し、検量線を作成する工程
（ｉｉ−３）（ｉｉ−１）で作成した検量線の傾きと、（ｉｉ−２）で作成した検量線の傾きとを比較し、抗体Ａの変性度合を評価する工程
（ｉｉｉ−１）種々の量の未変性抗体Ａを含む溶液に対し、前記（Ｉ−１）から（Ｉ−４）の工程を実施し、検量線を作成する工程
（ｉｉｉ−２）（ｉｉｉ−１）と同じ種々の量の被検抗体Ａを含む溶液に対し、前記（Ｉ−１）から（Ｉ−４）の工程を実施し、検量線を作成する工程
（ｉｉｉ−３）（ｉｉｉ−１）および（ｉｉｉ−２）で作成した検量線をそれぞれ外挿して求められる、抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を完全複合体化するために必要な抗体量の差に基づき、抗体Ａの変性度合を評価する工程
本発明の抗体変性度合評価法に基づく、被検抗体Ａが変性しているか否かの判断は、前記（ｉ−１）から（ｉ−４）の工程に基づき実施する場合は、例えば未変性抗体Ａを含む溶液を用いたときの結果から一定値以上乖離しているとき、変性していると判断すればよい。また前記（ｉｉ−１）から（ｉｉ−３）の工程に基づき実施する場合は、例えば未変性抗体Ａを含む溶液を用いたときの検量線の傾きから一定値以上または一定の割合以上乖離しているとき、変性していると判断すればよい。また前記（ｉｉｉ−１）から（ｉｉｉ−３）の工程に基づき実施する場合は、例えば未変性抗体Ａを含む溶液を用いたときの、抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を完全複合体化するのに必要な抗体量から一定値以上または一定の割合乖離しているとき、変性していると判断すればよい。
【発明の効果】
【００１８】
本抗体結合活性評価法は、一定量の抗体を含む溶液に前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させる第一の工程、前記第一の工程で得られた溶液をゲル濾過クロマトグラフィに供し、クロマトグラムを得る第二の工程、および前記第二の工程で得られたクロマトグラムのうち、前記複合体、前記抗体または前記タンパク質に相当するピークの高さまたは面積を算出する第三の工程を含むことを特徴としている。本抗体結合活性評価法は、溶液中に含まれる抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を添加後、ゲル濾過クロマトグラフィに供し、得られた画分中に含まれる前記複合体または前記タンパク質を定量するのみで抗体の結合活性を評価でき、抗体の結合活性を従来の方法（ＥＬＩＳＡ法や表面プラズモン共鳴法など）よりも短時間かつ煩雑な実験操作なしに評価できる。したがって、抗体の開発コストの削減に寄与できる。
【００１９】
また本抗体結合活性評価法を利用して、溶液中に含まれる抗体の変性度合も評価できる。したがって、本発明は変性しにくい抗体の開発や抗体製造における工程分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１の結果を示すクロマトグラムのうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのピークに相当する、保持時間９．５分から１２分までの領域の拡大図。
【図２】実施例１の結果をまとめた検量線。
【図３】実施例２の結果をまとめた検量線。黒丸実線は熱変性処理前の（熱変性処理しない）抗体を用いたときの結果。白丸点線は熱変性処理した抗体を用いたときの結果。
【実施例】
【００２１】
以下、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸置換体（以下、ＦｃＲ９＿Ｆとも表記）を含むポリペプチドである、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質としたときの実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  抗体結合活性評価法
以下に示す方法で、抗体結合活性評価法を検証した。
【００２３】
（１）下記（Ａ−１）から（Ａ−６）に示す、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは前記ポリペプチドと抗体との混合物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１０００μＬにメスアップし、３０℃で３０分間静置し、測定試料を調製した。なお配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９＿Ｆ（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。またＦｃＲ９＿ＦはヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０８６３７）の１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（Ａ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ
（Ａ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン（全薬工業製）１，０００μｇ
（Ａ−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン２，０００μｇ
（Ａ−４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン３，０００μｇ
（Ａ−５）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン４，０００μｇ
（Ａ−６）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン５，０００μｇ
（２）高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＬＣ−８０２０、東ソー製）にゲル濾過クロマトグラフィ用カラムであるＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（東ソー製）を接続し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を流速１ｍＬ／分で流すことにより平衡化した後、（１）の試料５０μＬ（下記（Ａ−７）から（Ａ−１２））を注入し、３０分間分析した。
（Ａ−７）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ
（Ａ−８）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン（全薬工業製）５０μｇ
（Ａ−９）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン１００μｇ
（Ａ−１０）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン１５０μｇ
（Ａ−１１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン２００μｇ
（Ａ−１２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン２５０μｇ
得られたクロマトグラム中、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち抗体（リツキサン）との複合体を形成しない前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質）に相当するピーク部分（保持時間９．５分から１２分の位置）を拡大した図を図１に示す。抗体（リツキサン）を添加すると、抗体未添加時と比較し、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当するピークの高さおよび面積が減少すること、および抗体（リツキサン）の添加量が増加すると、前記ピークの高さおよび面積がより減少することがわかる。この結果から、種々の量の抗体を含む溶液に、前記抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質を一定量添加し、前記抗体と前記タンパク質との複合体を形成させた後、ゲル濾過クロマトグラフィにより得られた、前記抗体との複合体を形成しない前記タンパク質を定量することで、前記抗体の結合活性を評価できることがわかる。
【００２４】
また抗体（リツキサン）添加量（横軸）に対する、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当するピーク面積（縦軸）を前記クロマトグラフィー装置の自動計算により算出してプロットした結果を図２に示す。前記（Ａ−７）から前記（Ａ−１１）の結果では、抗体添加量と前記ピーク面積との間に良好な直線性が得られ（Ｒ２＝０．９９９７）、前記ピーク面積の減少が添加した抗体量に依存していることがわかる。またこの結果から、抗体の結合活性を図２で得られた検量線の傾きから評価できることもわかる。さらに前記検量線を外挿して求められる、抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質全てが複合体を形成（完全複合体化）するのに必要な抗体量からも、抗体の結合活性を評価できる。
【００２５】
なお前記（Ａ−１２）の結果が前記検量線から外れた結果となっているが、前記検量線を外挿して求められる、完全複合体化するのに必要な、抗体量が２４３μｇであることから、前記（Ａ−１２）の結果（抗体添加量：２５０μｇ）は抗体を過剰量添加したときの結果といえる。
【００２６】
実施例２  本発明の抗体変性度合評価法
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは下記（Ｂ−１）から（Ｂ−５）および（Ｃ−１）から（Ｃ−５）に示す前記ポリペプチドと抗体との混合物を、０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４を含むｐＨ６．７の０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを用いて１０００μＬにメスアップし、３０℃で３０分間静置し、測定試料を調製した。なお熱変性処理したリツキサンは、リツキサンを５０℃で１８時間処理して調製した。
（Ｂ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン２６０μｇ
（Ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン１，３２０μｇ
（Ｂ−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン３，３２０μｇ
（Ｂ−４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン５，５２０μｇ
（Ｂ−５）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋リツキサン６，９００μｇ
（Ｃ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋熱変性処理したリツキサン２６０μｇ
（Ｃ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋熱変性処理したリツキサン１，３２０μｇ
（Ｃ−３）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋熱変性処理したリツキサン３，３２０μｇ
（Ｃ−４）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋熱変性処理したリツキサン５，５２０μｇ
（Ｃ−５）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド６２０μｇ＋熱変性処理したリツキサン６，９００μｇ
（２）高速液体クロマトグラフィー装置（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、島津製作所製）にゲル濾過クロマトグラフィ用カラムであるＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを接続し、０．１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４を含むｐＨ６．７の０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを流速１ｍＬ／分で流すことにより平衡化した後、（１）の試料５０μＬ（下記（Ｂ−６）から（Ｂ−１０）および（Ｃ−６）から（Ｃ−１０））を注入し、３０分間分析した。
（Ｂ−６）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン１３μｇ
（Ｂ−７）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン６６μｇ
（Ｂ−８）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン１６６μｇ
（Ｂ−９）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン２７６μｇ
（Ｂ−１０）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋リツキサン３４５μｇ
（Ｃ−６）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋熱変性処理したリツキサン１３μｇ
（Ｃ−７）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋熱変性処理したリツキサン６６μｇ
（Ｃ−８）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋熱変性処理したリツキサン１６６μｇ
（Ｃ−９）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋熱変性処理したリツキサン２７６μｇ
（Ｃ−１０）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド３１μｇ＋熱変性処理したリツキサン３４５μｇ
実施例１と同様に配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに相当するピーク面積（縦軸）を前記クロマトグラフィー装置の自動計算により算出し、得られた検量線を図３に示す。熱変性処理したリツキサンを用いたとき（前記（Ｃ−６）から前記（Ｃ−１０）の結果）に得られた検量線の傾きは、熱変性処理しない（熱変性処理前の）リツキサンを用いたとき（前記（Ｂ−６）から前記（Ｂ−１０）の結果）と比較し、小さく（緩やかに）なった。さらに、熱変性処理したリツキサンを用いたときの完全複合体化に必要な抗体量は３３２μＬ、熱変性処理しないリツキサンを用いたときの完全複合体化に必要な抗体量は３０７μＬであり、完全複合体化に必要な抗体量は熱変性処理により７％増加した。つまり、リツキサンを熱変性処理することにより、抗体と当該抗体のＦｃ領域と結合可能なタンパク質との結合活性が低下していることがわかる。以上の結果から、本抗体結合活性評価法を用いて、検量線の傾きや完全複合体化に必要な抗体量を比較することで、被検抗体の変性度合を評価できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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