(57)【要約】【課題】宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制可能な方法を提供する。【解決手段】αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、該細胞内のＵＬ４１遺伝子を、該ガイドＲＮＡの存在下に該Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断することと、を含む、αヘルペスウイルス感染を処置する方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、
該細胞内のＵＬ４１遺伝子を、該ガイドＲＮＡの存在下に該Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断することと、
を含む、αヘルペスウイルス感染を処置する方法。
【請求項２】
前記ウイルス宿主におけるαヘルペスウイルスの増殖を抑制する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス宿主が、αヘルペスウイルスが潜伏感染している動物であり、潜伏αヘルペスウイルスの再活性化を抑制する請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の遺伝子が、ベクターに組み込まれている請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の遺伝子が、改変ウイルスに組み込まれている請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＵＬ４１遺伝子に特異的な配列が、配列番号２から１１のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１３から２２のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドＲＮＡ。
【請求項８】
配列番号１３から２２のいずれかの塩基配列を有する核酸分子。
【請求項９】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列と、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列とを有する核酸分子。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡをコードする塩基配列が、配列番号２から１１のいずれかの塩基配列を含む請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
【請求項１２】
αヘルペスウイルス感染の処置に用いられる請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、αヘルペスウイルス感染を処置する方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ウイルス感染に対する抗ウイルス処置の標的は、ウイルスの複製サイクルの阻止を目的とし、ウイルスのタンパク質が標的となっている。一方、宿主細胞から潜伏感染したウイルスを根絶するための有効な処置は未だ存在していない。潜伏ウイルスによる潜伏感染においては、宿主の免疫作用が回避され、任意の時点でウイルスが再活性化されるため、宿主の生涯にわたる持続的なリスクとなる。潜伏性ウイルスの一例としては、ヘルペスウイルスが挙げられ、ヘルペスウイルスは最も蔓延している病原体の１つである。
【０００３】
豚の神経疾患であるオーエスキー病の病原体であるブタヘルペスウイルス１型、水疱瘡の病原体である水痘−帯状疱疹ウイルスなどのαヘルペスに対する現行ワクチンは、いずれも発症予防を目的とするものであり、ウイルスの潜伏感染およびその後の再活性化を防ぐことはできず、疾病の根絶には繋がらない。例えば、特許文献１には、ガイドされたヌクレアーゼシステムを用いてウイルス感染を選択的に処置するための組成物及び方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１７−５１８０７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の組成物及び方法では、ヘルペスウイルスの潜伏感染を完全に防ぐことは困難であり、ひとたび潜伏感染が成立するとウイルスの再活性化を抑制することは困難であった。本発明の一態様は、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一態様は、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、該細胞内のＵＬ４１遺伝子を、該ガイドＲＮＡの存在下に該Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断することを含む、αヘルペスウイルス感染を処置する方法である。
【０００７】
前記方法は、ウイルス宿主におけるαヘルペスウイルスの増殖を抑制する方法であってもよく、αヘルペスウイルスが潜伏感染しているウイルス宿主における潜伏αヘルペスウイルスの再活性化を抑制する方法であってもよい。また前記第一の遺伝子は、ベクターに組み込まれていてもよく、改変ウイルスに組み込まれていてもよい。また前記ＵＬ４１遺伝子に特異的な配列は、配列番号２から１１のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を含んでいてもよい。
【０００８】
第二態様は、配列番号１３から２２のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドＲＮＡである。
【０００９】
第三態様は、配列番号１３から２２のいずれかの塩基配列を含む核酸分子である。
【００１０】
第四態様は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列と、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列とを有する核酸分子である。前記ガイドＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号２から１１のいずれかの塩基配列を含んでいてもよい。
【００１１】
第五態様は、前記核酸分子を含む医薬組成物である。前記医薬組成物は、αヘルペスウイルス感染の処置に用いられてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制可能な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プラスミドの構成例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
αヘルペスウイルス感染の処置方法
αヘルペスウイルス感染の処置方法は、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含む第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入することと、該細胞内のＵＬ４１遺伝子を、該ガイドＲＮＡの存在下に該Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断することと、を含む。導入された第一の遺伝子によってガイドＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼがウイルス宿主の細胞内で発現することで、例えば、αヘルペスウイルスの活性化の初期に発現するＵＬ４１遺伝子を選択的に破壊することができる。これにより、ウイルス宿主におけるαヘルペスウイルスの増殖を抑制することができる。また、αヘルペスウイルスが潜伏感染しているウイルス宿主における潜伏αヘルペスウイルスの再活性化を抑制することができる。
【００１５】
αヘルペスウイルス感染の処置方法は、感染に対して施される何らかの処置であればよく、例えば、発症の予防、感染症の治療、改善及び進行の抑制（悪化の防止）、潜伏感染における再活性化の抑制等が挙げられる。
【００１６】
処置方法の対象となるαヘルペスウイルスとしては、単純ヘルペスウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １，  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １；ＨＳＶ−１、Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ２，  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２；ＨＳＶ−２）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ；ＶＺＶ）、ブタヘルペスウイルス１型（Ｓｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ；ＰＲＶ）、ヒヒヘルペスウイルス２型（Ｐａｐｉｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ２）、オナガザルヘルペスウイルス１６型（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １６）、Ｂウイルス（Ｍａｃａｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １，Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、ウマヘルペスウイルス１型（Ｅｑｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、ウシヘルペスウイルス１型（Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）、ウシヘルペスウイルス２型（Ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ２）等を挙げることができる。
【００１７】
αヘルペスウイルスにおけるＵＬ４１遺伝子は、例えば、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．  ７２（９）：１１７９−１１８７，２０１０等に記載されているように、種々のαヘルペスウイルス株間においてよく保存されており、その遺伝子産物は宿主細胞のタンパク質合成を阻害することが知られている。本発明者らは、αヘルペスウイルスの一種であるＰＲＶの潜伏感染における再活性化機構を解析した結果、再活性化の初期にＵＬ４１遺伝子が発現することを見出した。この新たな知見を元に、宿主細胞におけるＵＬ４１遺伝子の発現を選択的に抑制することで、宿主に潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制する方法の開発に成功した。ＵＬ４１遺伝子は、種々のαヘルペスウイルス株間における保存性が高いことから、特に相同性の高い配列を標的とすることで、汎用性の高いαヘルペスウイルス感染の処置方法が実現できる。
【００１８】
ＵＬ４１遺伝子の塩基配列の具体例としては、例えば、ＰＲＶ野生株ＹＳ−８１に由来するＵＬ４１遺伝子の塩基配列（配列番号１）等を挙げることができる。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
ＰＲＶ野生株ＹＳ−８１に由来するＵＬ４１遺伝子に対する、他株のＵＬ４１遺伝子の相同性は、例えば、ブタヘルペスウイルスにおいては９３％以上であり、サルヘルペスウイルスにおいては７４％以上、ウマヘルペスウイルスにおいては７０％以上、ウシヘルペスウイルスにおいては７６％以上、ヒトヘルペスウイルスにおいても７０％以上を示す。なお、遺伝子の相同性は、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて算出される。
【００２１】
本実施態様の処置方法では、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な配列を有するガイドＲＮＡをコードする塩基配列およびＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有する第一の遺伝子を、ウイルス宿主の細胞内に導入する。ガイドＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを用いて標的遺伝子を切断する方法は、ＣＲＩＳＰＥＲ−Ｃａｓ９システムとして知られている。ＣＲＩＳＰＥＲ−Ｃａｓ９システムでは、任意のゲノム位置におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で配列特異的にＤＮＡを切断するため、短鎖のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、それと複合体化するＣａｓ９ヌクレアーゼを利用する。ＣＲＩＳＰＥＲ−Ｃａｓ９システムの詳細については、例えば、Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２３：４６５−４７２，２０１３；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７−２２９，２０１３；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１−１１，２０１３、特開２０１６−０９３１９６号公報等を参照することができる。
【００２２】
野生型のＣａｓ９ヌクレアーゼは、標的遺伝子の少なくとも２箇所において２本鎖切断を引き起こす。これにより、例えば非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子に小さな挿入欠損が導入されて、標的遺伝子であるＵＬ４１遺伝子の発現を抑制することができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型を用いてもよいし、変異型を用いてもよい。
【００２３】
ガイドＲＮＡは、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な塩基配列と、さらにＣａｓ９ヌクレアーゼをリクルートするのに必要な塩基配列、例えば足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）機能を有する塩基配列とを有する。ガイドＲＮＡがＵＬ４１遺伝子に特異的な塩基配列を有することで、ＵＬ４１遺伝子の特定部位にＣａｓ９ヌクレアーゼをリクルートすることができる。リクルートされたＣａｓ９ヌクレアーゼによりＵＬ４１遺伝子が配列特異的に切断されて、ＵＬ４１遺伝子の発現が抑制される。
【００２４】
ＵＬ４１遺伝子に特異的な配列とは、ＵＬ４１遺伝子の対応する塩基配列に対して相補的な塩基配列である。具体的には、ＵＬ４１遺伝子の塩基配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列から５’末端側への、例えば２０塩基分の塩基配列に相補的な塩基配列を挙げることができる。すなわち、ガイドＲＮＡの３’末端側の２０塩基分の塩基配列は、標的遺伝子であるＵＬ４１遺伝子の標的位置である塩基配列を特異的に認識し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置するＤＮＡ標的部位へ、ＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対形成を介してＣａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体をリクルートする。
【００２５】
ＵＬ４１遺伝子に特異的な配列は、ＵＬ４１遺伝子の塩基配列からＰＡＭ配列を検索して選択し、選択されたＰＡＭ配列に基づいて決定することができる。ＵＬ４１遺伝子に特異的な配列は、具体的には、選択されたＰＡＭ配列から５’末端側への、例えば２０塩基分の塩基配列に相補的な塩基配列とすることができる。選択されるＰＡＭ配列としては、ＵＬ４１遺伝子の発現を抑制できるＰＡＭ配列であれば、いずれを選択してもよく、中でもＵＬ４１遺伝子の上流側（例えば、５’側から３００塩基前後）に位置するＰＡＭ配列を選択することが好ましい。またＰＡＭ配列は、例えば、配列番号１の塩基配列から選択されてもよいし、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列から選択されてもよい。
【００２６】
ガイドＲＮＡにおけるＵＬ４１遺伝子に特異的な配列の認識対象となるＵＬ４１遺伝子の塩基配列の具体例としては、例えば下表に示すＰＲＶｖｈｓ（配列番号２）、ＰＲＶｖｈｓ１１（配列番号３）、ＰＲＶｖｈｓ２６（配列番号４）、ＰＲＶｖｈｓ３４（配列番号５）、ＰＲＶｖｈｓ４１（配列番号６）、ＰＲＶｖｈｓ５１（配列番号７）、ＰＲＶｖｈｓ６１（配列番号８）、ＰＲＶｖｈｓ８１（配列番号９）、ＰＲＶｖｈｓ９３（配列番号１０）、ＰＲＶｖｈｓ１０３（配列番号１１）等を挙げることができる。中でもＰＲＶｖｈｓ、ＰＲＶｖｈｓ３４、ＰＲＶｖｈｓ４１、ＰＲＶｖｈｓ６１、ＰＲＶｖｈｓ８１、ＰＲＶｖｈｓ９３、及びＰＲＶｖｈｓ１０３からなる群から選択される少なくとも１つが好ましく、ＰＲＶｖｈｓ、ＰＲＶｖｈｓ３４、ＰＲＶｖｈｓ６１、ＰＲＶｖｈｓ８１、ＰＲＶｖｈｓ９３及びＰＲＶｖｈｓ１０３からなる群から選択される少なくとも１つがより好ましい。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
ガイドＲＮＡは、ＵＬ４１遺伝子に特異的な塩基配列に加えて、好ましくは足場配列を含む。足場配列をコードする塩基配列としては、例えば以下の塩基配列を挙げることができる。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
したがってガイドＲＮＡをコードする塩基配列の具体例としては、以下に示す塩基配列が挙げられる。
【００３１】
【表４】
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【００３２】
第一の遺伝子が含むガイドＲＮＡをコードする塩基配列としては、ガイドＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。またＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列としては、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子が組み込まれた市販のベクター等（例えば、ｐＧｕｉｄｅ−ｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｉｎｅａｒ）：タカラバイオ社製等）に含まれる塩基配列を用いることができる。第一の遺伝子は、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列が組み込まれたベクターに、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を有する遺伝子を組み込むことで容易に構築することができる。これにより、同一の核酸分子上にガイドＲＮＡをコードする塩基配列及びＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有する第一の遺伝子が得られる。またガイドＲＮＡをコードする塩基配列及びＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列は異なる核酸分子上に存在してもよい。
【００３３】
第一の遺伝子が導入されるウイルス宿主には、αヘルペスウイルスが感染し得る動物、αヘルペスウイルスに感染し発症している動物、αヘルペスウイルスが潜伏感染している動物等が含まれる。また動物には哺乳動物が含まれ、哺乳動物にはヒトが含まれる。
【００３４】
ウイルス宿主の細胞内への第一の遺伝子の導入は、非ウイルスベクター及びウイルスベクターを含む当該技術分野において公知である様々な方法によって行うことができる。非ウイルスベクターによる方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン等が挙げられ、いずれも公知の方法から適宜選択すればよい。
【００３５】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の通常用いられるウイルスベクターに加えて、αヘルペスウイルスを用いることができる。ウイルスベクターを用いる方法は、ウイルスに第一の遺伝子を発現可能に組み込んだ改変ウイルスを構築することで行うことができる。例えば、αヘルペスウイルスを用いる場合、ＵＬ４１遺伝子の領域に第一の遺伝子を組み換えることで改変ウイルスを構築することができる。具体的には例えば、サムブロックら(J. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Press)によって記載されている公知の遺伝子操作技術ならびに細胞工学技術によって行うことができる。
【００３６】
ガイドＲＮＡ
本発明の別の態様は、αウイルス感染を処置する方法に用いられるガイドＲＮＡである。ガイドＲＮＡは、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子に特異的な塩基配列と、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的部位へのリクルートを可能にする塩基配列とを有して構成される。ガイドＲＮＡの具体例としては、配列番号１３から２２のいずれかの塩基配列でコードされる核酸分子（例えば、ＲＮＡ）を挙げることができる。
【００３７】
核酸分子
本発明の別の態様は、前記ガイドＲＮＡをコードする塩基配列を含む核酸分子である。当該核酸分子は、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列に加えてＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を含んでいてもよく、さらに必要に応じてこれらの遺伝子を効率的に発現させるのに必要なプロモーター等の遺伝子群を含んでいてもよい。
【００３８】
本発明に係るαヘルペスウイルス感染を処置する方法は、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子の発現を抑制することで、ウイルスの増殖を抑制とそれによる初感染における発症防御、並びに潜伏ウイルスの再活性化をも抑制するという利点を有する。本方法に用いられる非ウイルスベクターまたはウイルスベクターは、一次投与によってαヘルペスウイルス感染症の発症を抑制することができる。さらに二次投与によって潜伏感染したαヘルペスウイルスの再活性化を抑制することができる。
【００３９】
ところでαヘルペスウイルス感染を処置する方法は、αヘルペスウイルスのＵＬ４１遺伝子の発現を抑制する方法であれば、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９システム以外のヌクレアーゼシステムを適用して実施することもできる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ等を適用して実施することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
ＹＳ−８１  ＵＬ４１遺伝子のクローニング及び塩基配列決定
ＰＲＶ野外株ＹＳ−８１ゲノムを鋳型とし、以下に示すプライマー（配列番号２３及び２４）を用い、９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×１分のサイクルを４５サイクルのＰＣＲにより、ＵＬ４１遺伝子を増幅し、ｐＴＡ２クローニングベクターにダイレクトクローニングした。得られたベクターについて、北海道システムサイエンス社にシークエンスを依頼し、全塩基配列を決定した。決定された塩基配列は、配列番号１として示される塩基配列であった。
【００４２】
【表５】
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【００４３】
ｐＧｕｉｄｅ−ｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターの構築
ＵＬ４１の塩基配列の情報を元にＰＡＭ配列を検索し、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のＵＬ４１遺伝子に特異的な配列（以下、ガイド配列ともいう）に対応するＵＬ４１遺伝子の塩基配列として以下のＰＲＶｖｈｓ配列（配列番号２）を選択した。選択した塩基配列を有するオリゴＤＮＡをシグマ−アルドリッチ社に依頼して合成し、得られたオリゴＤＮＡをｐＧｕｉｄｅ−ｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎ１プラスミドベクター（タカラバイオ社製）にクローニングして、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有するプラスミド（ｐＧｕｉｄｅ−ｉｔＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＹＳｖｈｓ；以下、単に「ＹＳｖｈｓ」ともいう）を作製した。得られたプラスミドの構成図を図１に示す。
【００４４】
【表６】
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【００４５】
同様にして、ガイド配列に対応するＵＬ４１遺伝子の塩基配列として下表に示す塩基配列（配列番号３から１１）を有するプラスミド（ＹＳｖｈｓ１１からＹＳｖｈｓ１０３）をそれぞれ作製した。
【００４６】
【表７】
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【００４７】
プラーク抑制試験
上記で得られたプラスミド１μｇ／穴をｊｅｔＰＲＩＭＥ４μｌと専用バッファー１００μｌに混和して、６穴プレートに１×１０６ｃｅｌｌｓで播種したブタ腎臓細胞ＰＫ−１５に接種して、プラスミドを導入した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後に、ＹＳ−８１  １００ＰＦＵ／穴を接種し、培養５日後にクリスタルバイオレット添加１０％ホルマリン溶液で染色して現れたプラークの数を計測した。コントロールとしては、ガイド配列を組み込んでいないｐＧｕｉｄｅ−ｉｔ−ＺｓＧｒｅｅｎ１プラスミドを用いた。結果を下表に示す。なお、プラーク数が少ないほどＹＳ−８１に対する抑制効果が大きいことを意味する。
【００４８】
【表８】
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【００４９】
表８から、ガイドＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする塩基配列を有するプラスミドを、ブタ腎臓細胞ＰＫ−１５に導入しておくことで、ＹＳ−８１の増殖が抑制されることがわかる。
【００５０】
潜伏感染モデルマウスの作製
４週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、ＰＢＳ（−）を用いて１：１２８相当に希釈したブタ抗ウイルス血清を０．２５ｍｌ前投与した。３０分後に同じくＰＢＳ（−）で１０２ＬＤ５０相当に希釈した野外ウイルスＹＳ−８１  ０．５ｍｌで腹腔内に投与して攻撃した。攻撃から２カ月以上生残したマウスを潜伏感染モデルマウスとして使用した。
【００５１】
脳室内投与による潜伏ＰＲＶ再活性化抑制試験
潜伏感染モデルマウスの脳内に、プラスミド（ｐＧｕｉｄｅ−ｉｔＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＹＳｖｈｓ）１μｇをＴｒａｎｓＩＴ−Ｎｅｕｒａｌ１００μｌに混和して接種した。２４時間後に塩化アセチルコリン腹腔内接種により潜伏ウイルスの再活性化を行った。以下のようにして、継日的に鼻腔スワブを採取してＰＣＲによりウイルスＤＮＡの検出を行った。
【００５２】
鼻腔スワブは、三種混合麻酔（メデトミジン０．３ｍｇ／ｋｇ、ミダゾラム４ｍｇ／ｋｇ、ブトルファノール５ｍｇ／ｋｇ）下で、右鼻孔からＭＥＭ培養液１００μｌを、マイクロピペットを用いて流入させ、洗浄液を綿棒で採取してＭＥＭ培養液３００μｌに混和し、これを鼻腔スワブとした。得られた鼻腔スワブのサンプルは、２倍量のＩＳＯＧＥＮ（ＬＳ）（和光純薬社製）に混和し、キットのプロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
【００５３】
ウイルスＤＮＡの検出として、抽出したＤＮＡを鋳型としてｇＧ遺伝子に対するＰＣＲ反応を行った。下表に示すプライマーを用い、プログラムは９４℃×２分、９４℃×１分、５６℃×１分、及び７２℃×２分のサイクルを３０サイクル行い、７２℃×７分で伸展させた。増幅産物について１．０％アガロースを用いた電気泳動法により５３１ｂｐの特異バンドの有無を確認した。結果を表１０に示す。なお、表中のＭｏｃｋは、潜伏感染していないＢａｌｂ／ｃマウスを意味する。
【００５４】
【表９】
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【００５５】
【表１０】
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【００５６】
表１０から、ガイドＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするプラスミドを脳内に接種することで、潜伏感染モデルマウスに再活性化刺激を与えてもウイルスを排泄しないことが分かる。すなわち、プラスミド接種により、潜伏感染モデルマウスにおけるウイルスの再活性化が抑制されることが分かる。なお、χ２検定の結果はｐ＝０．００５６１３であった。
【図１】
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【配列表】
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