(57)【要約】      （修正有）【課題】プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する、新規なモノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列ｋｒｖｄａｄａｄｐｒからなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４；
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２：ＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３；及び
（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６；並びに
（ｉｖ）軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１：Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３
Ｘ２４；
（ｖ）ＶＬ  ＣＤＲ２：ＫＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｓ；及び
（ｖｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３：Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２ＹＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７；を含
み、
Ｘ１〜Ｘ３７は、以下に選択肢として記載の１または複数個のアミノ酸配列であり、Ｘ１
＝任意の１個のアミノ酸、Ｘ２＝Ｙ又はＦ、Ｘ３＝Ｔ、Ａ又はＷ、Ｘ４＝Ｇ又はＳ；
Ｘ５＝Ｉ又はＶ、Ｘ６＝ＮＳＧＡ、ＹＲＮＩＫ、ＡＮＳＧＡ、ＳＳＤＧＧ、ＳＤＩＤＱ又
はＳＤＩＤＤ、Ｘ７＝Ｔ、Ｉ又はＬ、Ｘ８＝Ｙ、Ｖ又はＦ、Ｘ９＝Ｓ又はＴ，Ｘ１０＝Ｗ
又はＡ、Ｘ１１＝Ａ又はＧ、Ｘ１２＝Ｋ又はＡ、Ｘ１３＝Ｇ又はＡ；
Ｘ１４＝Ｇ、Ａ、Ｌ又はＳ、Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｇ又はＬ、
Ｘ１６＝Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、Ｅ又はＨ；
Ｘ１７＝Ｑ又はＡ、Ｘ１８＝Ａ又はＧ、Ｘ１９＝Ｓ又はＡ、Ｘ２０＝ＱＳ、ＥＤ又はＱＮ
、Ｘ２１＝Ｉ又はＡ、Ｘ２２＝ＧＳＮ、ＩＳＮ、ＧＳＤ又はＳＮＹ、Ｘ２３＝Ｌ又はＡ、
Ｘ２４＝Ａ又はＳ；
Ｘ２５＝Ａ又はＴ、Ｘ２６＝Ｓ又はＡ、Ｘ２７＝Ｋ又はＴ、Ｘ２８＝Ｌ又はＡ、Ｘ２９＝
Ａ又はＥ；
Ｘ３０＝Ｑ又はＡ、Ｘ３１＝Ｃ又はＳ、Ｘ３２＝Ｓ又はＴ、Ｘ３３＝Ｔ又はＹ、Ｘ３４＝
ＡＩＧＮＹ、ＥＳＴＴＦ、ＡＩＧＮＡＹ又はＲＳＴＴＴＹ、Ｘ３５＝Ｇ又はＡ、Ｘ３６＝
Ｈ又はＮ、Ｘ３７＝Ｖ、Ａ又はＴ；
配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体
又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  Ｃ
ＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  
ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３は、以下に選択肢として記載の複数個のアミノ酸配列である
、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１＝ＲＹＡＭＧ、ＲＹＴＭＧ、ＳＦＷＭＳ、ＳＹＴＭＧ、ＡＹＴＭＧ
、ＭＹＴＭＧ、ＰＹＴＭＧ、ＶＹＴＭＧ、ＩＹＴＭＧ、ＤＹＴＭＧ、ＥＹＴＭＧ、ＨＹＴ
ＭＧ、ＴＹＴＭＧ、ＱＹＴＭＧ、ＹＹＴＭＧ、ＧＹＴＭＧ、ＫＹＴＭＧ、ＮＹＴＭＧ又は
ＷＹＴＭＧ；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２＝ＩＩＡＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＡ
ＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＡＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＡ、ＩＩＮＳ
ＧＡＴＹＹＡＳＷＧＫＧ、ＩＩＹＲＮＩＫＴＹＹＡＴＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳ
ＷＡＫＧ、ＩＶＳＳＤＧＧＩＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＳＤＩＤＱＩＶＹＡＴＷＡＫＧ又は
ＩＩＳＤＩＤＤＬＦＹＡＳＷＡＫＧ；及び
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３＝ＧＤＦ、ＧＧＬ、ＡＤＦ、ＧＤＡ、ＬＤＦ、ＳＤＦ、ＧＦＦ、Ｇ
ＳＦ、ＧＰＦ、ＧＨＦ、ＧＩＦ、ＧＮＦ、ＧＲＦ、ＧＤＳ、ＧＤＰ、ＧＤＨ、ＧＤＤ、Ｇ
ＤＩ、ＧＤＮ、ＧＤＲ、ＧＶＬ、ＧＧＥ又はＧＬＨ；並びに
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１＝ＱＡＳＥＤＩＩＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳ
ＡＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＳＮＹＬＡ、ＱＡＡＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＧＳＱＳＩＧＳＮ
ＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＡＡ、ＡＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ又はＱＡＳＱＮＩＧＳＤＬＳ；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２＝ＫＡＳＴＬＡＳ、ＫＡＳＫＬＡＳ、ＫＴＳＴＬＥＳ、ＫＡＳＫＡ
ＡＳ又はＫＡＡＫＬＡＳ；及び
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３＝ＱＳＳＹＴＥＳＴＴＦＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶ、Ｑ
ＳＴＹＹＲＳＴＴＴＹＧＮＴ  、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＡＹＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹ
ＧＨＡ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＡＨＶ又はＡＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶである、前記抗体
又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  Ｃ
ＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、ＶＨ  Ｃ
ＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２
及びＶＬ  ＣＤＲ３は、以下の１）〜  ６８）のいずれかである、請求項１又は２のいず
れかに記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号９７、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号４、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号５、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１９、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２０、ＶＬ  ＣＤＲ
３が配列番号２１の各アミノ酸配列からなる；
４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤＲ
３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１０、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１、ＶＨ  ＣＤＲ３が
配列番号１２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２５、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２６、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２７の各アミノ酸配列からなる；
６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９５、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号９９の各アミノ酸配列からなる；
１１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１００、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
１３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１０２、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１０３、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
１６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０４、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０５、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０６、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０７、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０９、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１０、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１１、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１２の各アミノ酸配列からなる；
２５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１３の各アミノ酸配列からなる；
２６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１４、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１５、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１６の各アミノ酸配列からなる；
２９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１１７、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１１８、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１９、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２０、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２３、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１２４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１２５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２９、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３０、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３１、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３２、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３３、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３４、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３５、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３９、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４０、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４１、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４７、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４８、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５０、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５１、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；または、
６８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる、である、前記抗体又はその抗原結合
性抗体断片。
【請求項４】
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９７のアミノ酸配列
からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含む
ＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０のア
ミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ  Ｃ
ＤＲ３を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶ
Ｈ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３のアミ
ノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤ
Ｒ３を含むＶＬ；または
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配
列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を
含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６
のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項５】
前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０−８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する
、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項６】
前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１の配列からな
るアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンと
の結合が５０％以上競合阻止される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又は
その抗原結合性抗体断片。
【請求項７】
前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応
させる反応系（吸光度）において、配列番号１の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換
した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が２
０％未満である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体
断片。
【請求項８】
配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、請求項１ないし７のいずれか
１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項９】
前記抗体は、高分子量可溶型ＣＤ１４とは特異的には結合しない、請求項１ないし８のい
ずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項１０】
前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド（ＴＧ）干渉試験を行うとき、
検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下
を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし９のいずれか１に記載の抗体又はそ
の抗原結合性抗体断片。
【請求項１１】
前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用いて得られた
検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、０．９以上を示す、請求項１ないし１０の
いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項１２】
前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ
）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、ｓｃ
（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変
領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、請求項１な
いし１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコード
するポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１６】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の形質転換株。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその
抗原結合性抗体断片の製造方法。
【請求項１８】
少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断
片を含む、プレセプシン測定用キット。
【請求項１９】
少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断
片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助する
ためのキット。
【請求項２０】
少なくとも前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断
片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
【請求項２１】
少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診断を補
助するための方法であって、
１）前記請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用
いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）  １）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判
定する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のスクリー
ニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸
残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競
合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のプレセプシン測定に有用な、抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性
抗体断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ１４分子は、単核球細胞の膜表面に発現している糖タンパク質であり、ＬＰＳ（リポ
ポリサッカライド）のレセプターとしての機能を有することが知られている。ＣＤ１４分
子には、細胞表面上に発現している膜結合型ＣＤ１４（ｍＣＤ１４）と、可溶型ＣＤ１４
（ｓＣＤ１４）の２種類が存在する。ｓＣＤ１４として、分子量約５５ｋＤａおよび約４
９ｋＤａのｓＣＤ１４（以下「高分子量ｓＣＤ１４」という。）が知られており、敗血症
（ＳＥＰＳＩＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、急性呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ
）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等、多くの疾患における患者の血中で高値を示す
事が報告されている。そのため、これらの高分子量ｓＣＤ１４は疾患特異的なマーカーで
はないと考えられている（非特許文献１〜２）。
【０００３】
一方、敗血症患者において特徴的に血中濃度が上昇する、新たなｓＣＤ１４の分子種とし
て、ｓＣＤ１４−ＳＴ（可溶性ＣＤ１４抗原サブタイプ，プレセプシンともいう）が存在
することが報告されている。
【０００４】
ｓＣＤ１４−ＳＴ（プレセプシン）とは、ｓＣＤ１４のうち、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにおいて分子量１３±２ｋＤａに泳動されることを特徴とし、ＣＤ１４のＮ端部を保
持しているものである。高分子量ｓＣＤ１４と比べると、Ｃ端側が大きく欠失したアミノ
酸配列を有しており、高分子量ｓＣＤ１４とは異なりＬＰＳ結合能を有していない。また
、プレセプシンは高分子量ｓＣＤ１４とは異なる免疫原性を示すため、抗体を用いて両者
を区別できる。プレセプシンは敗血症患者において特異的に血中濃度が上昇する（特許文
献１）。また、敗血症との判別が難しい、全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）を示す患者と比較
しても、敗血症患者の血中で高値を示すという報告があり、プレセプシンは敗血症の特異
的な診断マーカーであると考えられている（非特許文献３）。
【０００５】
プレセプシンを特異的に認識するウサギ由来ポリクローナル抗体（Ｓ６８抗体）及びラッ
ト由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２）が開示されている（特許文献１、２
）。
【０００６】
現在、プレセプシンの測定には、プレセプシンに対する特異抗体としてウサギ由来ポリク
ローナル抗体を用いた測定系が実用化され、測定キットが欧州及び日本で上市されている
（ＰＡＴＨＦＡＳＴ(R)  Ｐｒｅｓｅｐｓｉｎ，三菱化学メディエンス株式会社）
【０００７】
これまで、実用化し得る抗ヒトプレセプシンモノクローナル抗体の取得が試みられてき
たが、満足いく性能を備えた抗体は得られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１０８４２９
【特許文献２】国際公報ＷＯ２００４／０４４００５
【０００９】
【非特許文献１】Ｈａｙａｓｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７：４１７−４２０、１９９９年
【非特許文献２】Ｌａｗｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２０：４８３−４８７，２０００年
【非特許文献３】Ｙａｅｇａｓｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  １１：２３４−２３８、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する、
新規なモノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提供することである。
【００１１】
また、プレセプシンの測定値が、Ｓ６８抗体（ＷＯ２００４／０４４００５の実施例１
に記載のＳ６８ペプチドを投与抗原としてウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体
）による測定値との相関のよい、モノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を提
供することである。
【００１２】
また、抗体を用いて測定したプレセプシン測定値が、検体中の干渉物質（例えば、トリ
グリセライド）の影響を受けにくく、様々な背景因子をもつ被験者の検体であっても、精
度よくプレセプシンを測定しうる、モノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片を
提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
Ｓ６８ペプチドでウサギを免疫して得られた複数のハイブリドーマから、Ｓ６８ペプチ
ドへの結合活性、プレセプシンに対する結合活性など複数の選別工程を経て、複数のモノ
クローナル抗体を得た。プレセプシン測定のためのＥＬＩＳＡ系を構築し、プレセプシン
との反応性を検討したところ、Ｆ１１４６−１７−２（ＷＯ２００４／０４４００５の実
施例２に記載のＳ６８ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体：配列番
号４２〜４７）を用いたＥＬＩＳＡ系と比較して、プレセプシンとの反応性が約１万倍改
善した抗体が得られたことが分かった。
【００１４】
これらの各ウサギモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系において、複数の敗血症患
者の血中プレセプシン値を測定し、Ｓ６８抗体を用いたＥＬＩＳＡ系による測定値との相
関分析を行ったところ、相関性に優れる抗体と劣る抗体が存在することが判明した。さら
に検討を進めたところ、その違いには、検体中のトリグリセライド（ＴＧ）の干渉が関与
していることを見出した。Ｓ６８抗体によるプレセプシン測定値との相関がよく、検体中
のＴＧ干渉を受けにくい、検体中のプレセプシン測定に適するモノクローナル抗体を得る
べく研究を続けたところ、抗体が認識するエピトープによって、その抗体の性能に差が生
じることを見出した。すなわち、その違いには検体中のトリグリセライド（ＴＧとも記す
）の干渉及び／又はエピトープが関与していることを見出した。
【００１５】
プレセプシン測定に好ましい性能を有する抗体は、プレセプシンにおける、配列番号１
で表されるアミノ酸配列（ｋｒｖｄａｄａｄｐｒ：配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４
）の５２位〜６１位に相当する領域：Ｐ０３配列ともいう）をエピトープとすることを見
出した。このエピトープは、本発明で初めて見出された新規なエピトープである。
【００１６】
このＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体とプレセプシンとの結合は、Ｐ０３配列
からなるアミノ酸残基により５０％以上競合阻止された。一方、配列番号３５〜４１の各
アミノ酸残基による該抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止は２０％未満であった。す
なわち、配列番号３６（ヒト全長可溶型ＣＤ１４の４９位〜５８位に相当：Ｐ０２配列と
もいう）からなるアミノ酸残基、配列番号３７（ヒト全長可溶型ＣＤ１４の５５位〜６４
位に相当：Ｐ０４配列ともいう）からなるアミノ酸残基、又は、配列番号３８（ヒト全長
可溶型ＣＤ１４の５８位〜６７位に相当：Ｐ０５配列ともいう）からなるアミノ酸残基に
よる、該抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止は２０％未満であった。この結果から、
このＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体は、Ｐ０３配列に対する特異性が高いこ
とが分かった。
【００１７】
同時にハイブリドーマから取得した抗体のうち、プレセプシンにおけるＰ０４配列及び
Ｐ０５配列をエピトープとして認識する抗体は、プレセプシン測定時に検体中のＴＧの干
渉を受けやすい等、プレセプシン測定には適さないことが分かった。このように、抗体が
認識するエピトープ位置のわずかな違いが、抗体のプレセプシン測定のための性能に影響
を与えることは予想外であった。
【００１８】
また、Ｐ０３配列（配列番号１）の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換したアミノ酸
残基では、前記抗体とプレセプシンとの反応の競合阻止が２０％未満となった。一方、Ｐ
０３配列（配列番号１）の２位から７位、９位及び１０位のいずれかのアミノ酸をアラニ
ン（又はグリシン）に置換したアミノ酸残基は、前記抗体とプレセプシンとの反応を５０
％以上競合阻止することが分かった。
【００１９】
さらに、プレセプシン測定に好ましい性能を有する抗体を作製すべく、Ｐ０３配列をエ
ピトープとして認識する抗体の配列をもとに、ＣＤＲ配列の改変を行った。また、ファー
ジディスプレイ法を用いて抗体を作製した。得られた抗体を一定の基準で選別し、ハイブ
リドーマから得られた抗体と同等又はより性能のよい抗体を得た。
【００２０】
ハイブリドーマから得られたＰ０３配列をエピトープとして認識する抗体、及び、選択さ
れた改変体は、プレセプシンに対する親和性が極めて高く、プレセプシン測定のためのサ
ンドイッチＥＬＩＳＡ系において、検体中の干渉物質（特に、トリグリセリド）の影響を
受けにくい、Ｓ６８抗体による測定系との相関のよい、検体中のプレセプシン測定に適す
る抗体であることが確認された。
【００２１】
つまり、本発明は以下のとおりである。
１．配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン
抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、
（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４；
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２：ＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３；及び
（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６；並びに
（ｉｖ）軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１：Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３
Ｘ２４；
（ｖ）ＶＬ  ＣＤＲ２：ＫＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｓ；及び
（ｖｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３：Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２ＹＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７；を含
み、
Ｘ１〜Ｘ３７は、以下の表１〜表６に記載の１または複数個のアミノ酸配列である、上記
１）に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【表１】
2019205458.tif 000002
【表２】
2019205458.tif 000003
【表３】
2019205458.tif 000004
【表４】
2019205458.tif 000005
【表５】
2019205458.tif 000006
【表６】
2019205458.tif 000007
３．Ｘ１＝Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｔ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｋ、Ｎ又はＷで
ある、前記２に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
４．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ
ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、ＶＨ
ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３は表７に記載のアミノ酸配列から選択さ
れ、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３は表８に記載のアミノ酸配列か
ら選択される、前記１ないし３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【表７】
2019205458.tif 000008
【表８】
2019205458.tif 000009
５．前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ
ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、ＶＨ
ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ２及びＶＬ  ＣＤＲ３は、表９−１、表９−２および表９−３に記載のアミノ酸配列か
ら選択される、前記１ないし４のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【表９−１】
2019205458.tif 000010
【表９−２】
2019205458.tif 000011
【表９−３】
2019205458.tif 000012
６．（ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９７のアミノ酸
配列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３
を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２
３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなる
ＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ；
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
７．（ａ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配
列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を
含むＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０
のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶ
Ｈ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３のアミ
ノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤ
Ｒ３を含むＶＬ；または
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配
列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を
含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６
のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
８．前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０−８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合
する、前記１ないし７のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
９．前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１の配列か
らなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシ
ンとの結合が５０％以上競合阻止される、前記１ないし８のいずれか１に記載の抗体又は
その抗原結合性抗体断片。
１０．前記反応系が、（ａ）前記抗体又は断片と、（ｂ）Ｆ１１０６−１３−３抗体又は
Ｆ１０３１−８−３抗体とが用いられるサンドイッチＥＬＩＳＡである、前記９に記載の
抗体又はその抗原結合性抗体断片。
１１．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応さ
せる反応系（吸光度）において、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１
のいずれかの配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合
阻止は２０％未満である、前記１ないし１０のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合
性抗体断片。
１２．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応さ
せる反応系（吸光度）において、配列番号１の８位のアスパラギン酸をアラニンに置換し
た配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合阻止が２０
％未満である、前記１ないし１１のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片
。
１３．前記抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応さ
せる反応系（吸光度）において、配列番号１の２位から７位、９位及び１０位のいずれか
のアミノ酸をアラニン（又はグリシン）に置換した配列からなるアミノ酸残基により、前
記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止される、前記１ないし１２のいずれ
か１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
１４．前記抗体が、固相に固定化された配列番号１の配列からなるアミノ酸残基との結合
活性を有する、前記１ないし１３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片
。
１５．配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、前記１ないし１４のい
ずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
１６．前記抗体は、高分子量可溶型ＣＤ１４とは特異的には結合しない、前記１ないし１
５のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
１７．前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド（ＴＧ）干渉試験を行う
とき、検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０
％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし１６のいずれか１に記載の抗
体又はその抗原結合性抗体断片。
１８．前記抗体を用いて、複数の検体についてＴＧ干渉試験を行うとき、検体中のＴＧ濃
度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度の平均が±２０％以下である、
前記１ないし１７のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
１９．前記抗体を用いて、複数の検体についてＴＧ干渉試験を行うとき、検体が正常人ヒ
ト血清であり、検体中のＴＧ濃度が１０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度
が±１００％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし１８のいずれか１
に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２０．前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用いて得
られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、０．９以上を示す、前記１ないし１
９のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２１．前記相関係数が、０．９５以上である、前記２０に記載の抗体又はその抗原結合性
抗体断片。
２２．前記抗体は、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃに対して、１．０８Ｅ−０８未満の親和性（
ＫＤ値）で結合する、前記１ないし２１のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗
体断片。
２３．前記抗体とプレセプシンとの結合活性が、ラット由来抗プレセプシン抗体（Ｆ１１
４６−１７−２）とプレセプシンとの結合活性と比較して、プレセプシン濃度比で１００
００倍以上の向上を示す、前記１ないし２２のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合
性抗体断片。
２４．前記抗体と、固相に固定化したｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃとの結合活性（吸光度）が
、Ｓ６８抗体と、固相に固定化したｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃとの結合活性の２倍以上であ
る、前記１ないし２３のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２５．前記抗体または断片が、モノクローナル抗体である、前記１ないし２４のいずれか
１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２６．前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓ
ｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）
、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽
鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、前記
１ないし２５のいずれか１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
２７．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコー
ドするポリヌクレオチド。
２８．前記２７に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
２９．前記２８に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
３０．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、前記２９に記載の形質転換株。
３１．前記２９又は３０に記載の形質転換株を培養することを含む、抗体またはその抗原
結合性抗体断片の製造方法。
３２．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片
を含む、プレセプシン測定用キット。
３３．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または断片を含む、敗血症
を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しくは診断を補助するためのキット。
３４．前記プレセプシン測定用キットが、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inf
lammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症
の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固
症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心
疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大
腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候
群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくと
も１つの疾患の検出又は評価のためのキットである、前記３２に記載のプレセプシン測定
用キット。
３５．プレセプシン測定用キットにおける、前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体
または抗原結合性抗体断片の使用。
３６．少なくとも前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片
と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプシンの測定方法。
３７．少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しくは診
断を補助するための方法であって、
１）前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検
体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）  １）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判
定する工程を含む、前記方法。
３８．少なくとも以下の工程を含む、疾患の検出又は評価のための方法であって、該疾患
の検出又は評価が、敗血症と全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response s
yndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、敗血症の予後予測（死亡率予
測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管内凝固症候群（disseminated
intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検出、心疾患の検出、細菌感染
を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性
好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪食症候群（hemophagocytic sy
ndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少なくとも１つであり、
１）前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、検
体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）  １）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判
定する工程を含む、前記方法。
３９．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のス
クリーニング方法であって、
１）候補の抗体または抗原結合性抗体断片を用いてプレセプシン測定系を構築する工程
２）該測定系を用いて、検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する
工程をを含む、前記方法。
４０．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のス
クリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸
残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競
合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
４１．少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片のス
クリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）プレセプシンにおける配列番号１のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識す
る前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
４２．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて被
験者の検体中のプレセプシン濃度を測定することにより、敗血症の検出、又は、検出若し
くは診断の補助がなされた患者に対して敗血症治療が施される、敗血症の治療方法。
４３．前記１ないし２６のいずれか１に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を用いて、
被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被検薬の
スクリーニング方法。
４４．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆ
ｃ領域を含む、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ。
４５．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆ
ｃ領域の間に、切断を容易にする配列が挿入された、前記４４に記載のｒｓＣＤ１４ＳＴ
−Ｆｃ。
４６．前記切断を容易にする配列が、トロンビン認識配列である、前記４５に記載のｒｓ
ＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ。
４７．前記抗体の重鎖Ｆｃ領域が、ヒト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域である、前記４
４ないし４６のいずれか１に記載のｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ。
４８．配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位の配列と、抗体の重鎖Ｆ
ｃ領域の配列を含むベクターを、宿主細胞へ導入し、その宿主細胞を培養する工程を含む
、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの製造方法。
４９．前記４８に記載のｒｓＣＤＳＴ−ＦｃのＦｃ領域を切断する工程を含む、ｒｓＣＤ
１４−ＳＴの製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中のプレセプシン測定に適する抗
体及びその抗原結合性抗体断片が提供されることにより、プレセプシン測定の質および精
度を高めることが可能となる。プレセプシンに対する親和性の高い抗体を提供できること
により、該抗体は、正常人レベルの微量なプレセプシンの定量にも適し、高感度化が可能
となる。また、検体中の干渉物質の影響を受けにくい抗体を提供できることにより、サン
ドイッチＥＬＩＳＡ系での測定値が血清サンプルの個体差（被験者の背景因子）の影響を
受けにくく、精度の高い測定が可能となる。サンドイッチＥＬＩＳＡ系において、プレセ
プシンのみと特異的に結合し、ヒト血中に存在する高分子量ｓＣＤ１４とは特異的には結
合しない、特異性の高い測定が可能である。
【００２３】
ポリクローナル抗体によるプレセプシン測定の課題（ロット間の均一性の確保、生産困
難性・コスト等）を解決し、実用性に優れる抗体の提供が可能となる。すなわち、モノク
ローナル抗体は、安価で安定的に効率よく生産ができ、抗体の均一な品質が維持できると
いう利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｆ１４６６−２６（Ａ）、Ｆ１４６６−５（Ｂ）及び、Ｆ１４６６−１９（Ｃ）の抗体を用いて、正常人ヒト血清のＴＧ干渉試験を実施した結果を示す図である。
【図２】実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。
【図２−１】実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。図２から続いている図である。
【図２−２】実施例８及び実施例１２で得られた各改変体を示す図である。図２、図２−１から続いている図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、より詳細に発明を説明する。
【００２６】
１．配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン
抗体又はその抗原結合性抗体断片
本発明の第一の態様は、プレセプシン上の新規なエピトープである、配列番号１のアミ
ノ酸配列を特異的に認識する、抗プレセプシン抗体またはその抗原結合性抗体断片である
。
【００２７】
「配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する」とは、抗体が、
プレセプシンの配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列に相当する配列をエピトープとし
て特異的に認識することをいう。
【００２８】
「抗原結合性抗体断片」は、配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に
認識する抗体の部分断片の中で、元の抗体と同じ抗原結合性を有する断片のことをいう。
【００２９】
「配列の同一性」又は「配列の相同性（ホモロジー）」は、２つ又はそれ以上のポリヌ
クレオチド配列又はアミノ酸配列の間、すなわち、参照配列と、参照配列と比較されるべ
き対象となる配列との間の関係に対して言及される。配列間の一致により決定される、高
度な配列類似性を作り出すように、配列が最適に調整された後、配列同一性又は相同性は
、対象となる配列と参照配列を比較することにより決定される。そのような調整に関し、
配列同一性は、位置毎に決定される。例えば、ある位置で、核酸又はアミノ酸が同一であ
るとき、特定の位置で配列は同一である。このような同一性を示す位置の総数を、参照配
列の核酸又は残基の総数で割ることにより、配列同一性％が得られる。配列同一性は、公
知の方法により簡易に計算でき、特に限定されないが、それらは、Computational Molecu
lar Biology, Lesk A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocompu
ting: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., ed., Academic Press, New Yor
k (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, GrifEn A. M., and GrifEn H
. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biol
ogy, von Heinge G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov M.
and Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo H., and 
Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)などに記載されている。配列同一性
を決定する好ましい方法は、試験される配列間で、最大の一致を与えるように設計される
。配列同一性の決定方法は、公然に利用可能なコンピュータープログラムにおいて体系化
され、与えた配列間の配列同一性を決定する。そのようなプログラムの例は、特に限定さ
れないが、the GCG program package (Devereux et al., Nuc. Ac. Res., 12(1):387 (19
84)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul et al, J. Molec. Biol, 215:403-410 (199
0)). 等が挙げられる。 NCBIらのBLASTX プログラムは、公然に利用可能である。
【００３０】
本発明においてエピトープの決定方法は、特に限定されないが、例えば、実施例６に記
載の方法により確認しうる。
【００３１】
本発明の抗体は、該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、Ｐ０３ペプチド
（配列番号１で表されるアミノ酸配列）を競合反応させる（好ましくは、吸光度を利用す
る）反応系において、抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競合阻止されることで特
徴づけられてもよい。当該反応系は、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡである。より好
ましくは、（a）本発明の抗体又は断片と、(b)Ｆ１１０６−１３−３抗体又はＦ１０３１
−８−３抗体が用いられるサンドイッチＥＬＩＳＡである。配列番号１のアミノ酸配列は
、ヒト全長可溶型ＣＤ１４のアミノ酸配列（配列番号３）の５２位〜６１位に相当する。
好ましくは、本発明の抗体とプレセプシンとの結合に対する、Ｐ０１ペプチド（配列番号
３の４６位〜５５位で表されるアミノ酸配列）、Ｐ０２ペプチド（同配列の４９位〜５８
位で表されるアミノ酸配列）、Ｐ０５ペプチド（同配列の５８位〜６７位）、Ｐ０６ペプ
チド（同配列の６１位〜７０位）、又は、Ｐ０７ペプチド（同配列の６４位〜７３位）、
Ｐ０８ペプチド（同配列の６７位〜７６位）による競合阻止は２０％未満である。好まし
くは、本発明の抗体とプレセプシンとの結合に対する、Ｐ０４ペプチド（同配列の５５位
〜６４位）による競合阻止は２０％未満である。
【００３２】
また、エピトープ決定のための他の方法としては、例えば、実施例９−（４）に記載す
るように、目的とする抗原の部分配列（例えば、Ｐ０３ペプチド）と、抗体との結合活性
をみることも可能である。
【００３３】
本発明のひとつの態様では、Ｐ０３配列（配列番号１）の８位のアスパラギン酸以外の
アミノ酸配列が１又は複数個置換された配列に結合する抗プレセプシン抗体を提供する。
置換されるアミノ酸の数は、好ましくは２アミノ酸以内、さらに好ましくは１アミノ酸で
ある。
【００３４】
例えば、本発明のひとつの態様では、Ｐ０３配列又はその９０％以上の配列同一性を有
するアミノ酸配列に結合する抗プレセプシン抗体を提供する。対象となるエピトープは、
Ｐ０３配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上
、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の同一
性を有する配列であってもよい。ある態様では、Ｐ０３配列と９０％以上の同一性を有す
る配列に特異的な抗プレセプシン抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００３５】
本発明の抗体は、プレセプシンを特異的に認識する抗体である。
プレセプシン（ｓＣＤ１４−ＳＴ）は、ＣＤ１４の可溶型の断片であって、以下の１）
〜３）の性質を有する物質をいう。
・  非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量１３±２ｋＤａ、
・  Ｎ末端配列に配列番号３の１位〜１１位のアミノ酸配列を有する、及び、
・  配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した
抗体に特異的に結合する。
すなわち、本発明において、プレセプシンとは、特に説明しない限り、ヒトプレセプシ
ンである。
【００３６】
また、本発明においては、プレセプシンとして、プレセプシン標準品（ＷＯ２００５／
１０８４２９の実施例１６に記載のｒｓＣＤ１４−ＳＴ）だけでなく、ｒｓＣＤ１４ＳＴ
−Ｆｃ（実施例９−（２）に記載）など、プレセプシンとしての活性を有する物質が用い
られてもよい。
【００３７】
本発明において、「特異的に認識する抗体」とは、特異的に認識する対象を免疫学的に
認識する抗体および／または特異的に認識する対象と通常の抗原抗体反応を示す抗体であ
る。特異的に認識する対象と該抗体との結合を親和性として表した場合、通常、平衡解離
定数（ＫＤ）は、１０−７Ｍ未満である。本発明の抗体は、プレセプシンのみを特異的に
認識する。ヒト血中に存在する主要な可溶型ＣＤ１４には、約５５ｋＤａ及び約４９ｋＤ
ａの可溶型ＣＤ１４（高分子量ｓＣＤ１４）がある。本発明の抗体は、高分子量ｓＣＤ１
４と特異的には結合しない。高分子量ｓＣＤ１４は、配列番号３に記載のアミノ酸配列か
らなるヒト全長可溶型ＣＤ１４を用いてもよく、また、例えば、正常人の体液の３Ｃ１０
抗体アフィニティーカラム吸着により作製してもよい（ＷＯ２００５／１０８４２９実施
例２３参照）。
【００３８】
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシンとの反応性に優れ、検体中
のプレセプシン測定に適する。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片を用い
てサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築し、検体中のプレセプシンを測定しうる。
【００３９】
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、Ｆ１１４６−１７−２（ＷＯ２００４／
０４４００５の実施例２に記載のラット由来モノクローナル抗体）と比較して、サンドイ
ッチＥＬＩＳＡ系においてプレセプシンとの反応性が約１万倍向上したことから（実施例
４）、検体中の微量のプレセプシンの検出に適する。すなわち、本発明の抗体又はその抗
原結合性抗体断片は、Ｆ１１４６−１７−２と比較して、プレセプシンとの反応性が、プ
レセプシンの濃度比で１万倍以上向上することで特徴づけられてもよい。
【００４０】
敗血症患者では、特徴的にプレセプシン血中濃度が上昇することが報告されており、本
発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、敗血症の検出のために好ましく用いられる。
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、実施例１で示されるように、本抗体を用い
てサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、敗血症患者検体と正常人検体を測定したとき、プレ
セプシン測定値に差がみられる抗体又はその抗原結合性抗体断片が好ましい。
【００４１】
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、測定系を構築して検体中のプレセプシン
を測定するとき、検体中の干渉物質の影響が問題とならない程度である抗体が好ましい。
【００４２】
本発明において、干渉物質とは、その物質の存在が、プレセプシンの測定値に影響を与
える（以下、干渉ともいう）可能性のある物質をいい、例えば、トリグリセライド（Trig
lycerides：ＴＧともいう）、ビリルビン、ヘモグロビン、リウマチ因子、コレステロー
ル等が挙げられる。本発明において、抗体の評価のために好ましい干渉物質はトリグリセ
ライド（ＴＧ）である。
【００４３】
干渉の試験の評価指標の一つとして、干渉物質無添加の検体のプレセプシン測定値に対
する、同検体に干渉物質を一定量添加したときのプレセプシン測定値のずれを解離度（％
）として表し、用いることができる。干渉物質添加による測定値の解離度は次のように表
す。
解離度（％）＝｛（干渉物質添加後のプレセプシン測定値）−（干渉物質無添加のプレ
セプシン測定値）｝／（干渉物質無添加のプレセプシン測定値）×１００
【００４４】
干渉物質の影響が問題とならない程度とは、例えば、複数の検体を用いた干渉試験にお
いて、一定量の干渉物質添加によるプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下、より好
ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いことで示すことができる。複数の検体中の
「検体の比率が高い」とは、通常、複数の検体中の５０％以上、好ましくは６０％以上、
より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、とりわけ好ましくは９０％以
上である。
【００４５】
ＴＧの干渉試験では、例えば、複数の検体について干渉試験を行い、ＴＧ添加により検
体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下
、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いことを一つの指標としてもよい。
本発明の抗体の好ましい態様の一つは、該抗体を用いた測定系によりＴＧ干渉試験を実施
するとき、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が
±２０％以下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高い抗体である。
【００４６】
あるいは、例えば、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離
度を、複数の検体で求め、その解離度の平均値が±２０％以下、より好ましくは±１０％
以下であることを一つの指標としてもよい。本発明の抗体の好ましい態様の一つは、該抗
体を用いた測定系により、複数の検体についてＴＧ干渉試験を実施するとき、検体中のＴ
Ｇ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度の平均値が±２０％以下
、より好ましくは±１０％以下を示す抗体である。
【００４７】
米国の脂質異常症のガイドラインであるＮＣＥＰ‐ＡＴＰIIIでは、ＴＧ１５０ｍｇ／
ｄＬ未満は正常、ＴＧ１５０〜２００ｍｇ／ｄＬがボーダーライン、ＴＧ２００〜４９９
ｍｇ／ｄＬは高値（high）、５００ｍｇ／ｄＬ以上は、顕著な高値（very high）とされ
ている。検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬ（＝２０００ｍｇ／ｄＬ）とは、上記基準に照
らすと、極めてＴＧ濃度が高い状態であるといえる。
【００４８】
本実施例におけるＴＧ干渉試験は、検体のＴＧ濃度６．７ｍｇ／ｍＬ、１３．３ｍｇ／
ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬの３点で、プレセプシン測定値の解離度を測定している。検体のＴ
Ｇ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときに解離度が小さい抗体（測定系）は、解離度が大きい抗体と
比較して、検体のＴＧ濃度６．７ｍｇ／ｍＬ及び１３．３ｍｇ／ｍＬのときも解離度が小
さい傾向がみられた。
【００４９】
ＴＧ干渉試験は、正常人ヒト血清を用いて実施されてもよい。正常人の検体は、プレセ
プシン濃度が低いため、ＴＧ干渉を受けると、測定値の解離度が大きくなりやすい。本試
験により、検体中の微量なプレセプシンを精度よく測定できるかを試験することができる
。例えば、検体中のＴＧ濃度１０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が、±
１００％以下であることが好ましく、より好ましくは±７０％以下、さらに好ましくは±
５０％以下、とりわけ好ましくは±２０％以下である。前記試験と同様に、複数検体を用
いて試験を行うことが望ましい。
【００５０】
また、本発明の抗体または抗原結合性抗体断片は、該抗体の干渉物質添加によるプレセ
プシン測定値の解離度とＳ６８抗体の同条件下の解離度との比較により評価されてもよい
。好ましい態様の一つでは、本発明の抗体とＳ６８抗体において、該解離度は類似する。
【００５１】
ＴＧの干渉試験については、例えば、本発明の抗体を用いた測定系において、ＴＧ添加
により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度と、Ｓ
６８抗体の同条件での解離度との差が、２０％以下、より好ましくは１０％以下を示す検
体の比率が高いことで評価されてもよい。解離度の差は、例えば、本発明の抗体による測
定値の解離度が＋５％、Ｓ６８抗体による測定値の解離度が−１０％のとき、解離度の差
は１５％と計算した。
【００５２】
干渉試験に用いる検体は、本発明の第二の態様に記載の検体を用いることができる。Ｔ
Ｇ干渉試験の場合は、好ましくは、血清又は血漿である。
【００５３】
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、測定系を構築して、検体中のプレセプシ
ンを測定するとき、Ｓ６８抗体を用いた測定値との相関のよい抗体が好ましい。相関がよ
いとは、好ましくは、相関係数が０．９以上であり、より好ましくは、０．９５以上であ
る。
【００５４】
本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片は、プレセプシンに対して特異的に結合し、
プレセプシンに対する親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）は、１０−７M未満であることが
好ましく、より好ましくは１０−８M未満、さらに好ましくは１０−９M未満、とりわけ好
ましくは１０−１０M未満、最も好ましくは１０−１１M以下である。本発明の抗体又はそ
の抗原結合性抗体断片のプレセプシンに対する平衡解離定数は、好ましくは、１０−７M
〜１０−１４M、より好ましくは、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍの範囲である。プレセプシ
ンは、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃが用いられてもよい。
【００５５】
親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケア）を用
いて測定することができる。
【００５６】
本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のプレセ
プシンに対する親和性（ＫＤ値）は、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する親和性と比較し
て優れる。本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ（プレセ
プシン：実施例９−（２）に記載）に対する親和性（ＫＤ値）は、Ｓ６８抗体のｒｓＣＤ
１４ＳＴ−Ｆｃに対する親和性（ＫＤ値）の１．０８Ｅ−０８と同程度か、より低い数値
を示すことが望ましく、より好ましくは、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／２（５．４０Ｅ−０
９）以下、さらに好ましくは、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／１０（１．０８Ｅ−０９）以下
を示すことが望ましい。
【００５７】
本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のプレセ
プシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体と比較して優れる。
【００５８】
例えば、実施例１０−（２）に記載するように、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ（プレセプシ
ン）を固相に固定して抗体と反応させ、吸光度等により、抗体のプレセプシンに対する結
合活性を評価してもよい。
【００５９】
例えば、実施例１０に準じて試験を実施し、Ｓ６８抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃを反
応させたときの吸光度を１としたときの、本発明の抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃを反応
させたときの吸光度の比は、好ましくは１以上であり、より好ましくは２以上、さらに好
ましくは４以上、とりわけ好ましくは５．５以上である。
【００６０】
本発明は、以下のいずれかに記載の抗体を提供する。
これらは、抗プレセプシン抗体である。以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）の抗体又はその抗原
結合性抗体断片は、プレセプシ上の、配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特
異的に認識するため、第一の態様における好ましい例である。より好ましくは、（ａ）又
は（ｂ）の抗体又はその抗原結合性抗体断片である。
（ａ）  配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列
からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
（ｂ）  配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列
からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
（ｃ）  配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸
配列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ
３を含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号
２６のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２７のアミノ酸配列からな
るＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【００６１】
また、本発明は、図２〜図２−２に記載のＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合性抗
体断片を提供する。これらの抗体は、プレセプシン上の配列番号１のアミノ酸配列からな
るエピトープを特異的に認識する。より好ましくは、５７９３、５８１０、５８６４、５
９７９、５９８３、５９８８、６０２８のＣＤＲ配列を含む抗体又はその抗原結合性抗体
断片である。
【００６２】
本発明は、以下のいずれかに記載のＣＤＲを含むポリペプチドを提供する。より好まし
くは、（ｉ）（ｉｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）のポリペプチドである。
（ｉ）配列番号４の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５の配列からなるＶＨ  ＣＤ
Ｒ２、及び配列番号６の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号７の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８の配列からなるＶＨ  Ｃ
ＤＲ２、及び配列番号９の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号１０の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１の配列からなるＶ
Ｈ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｉｖ）配列番号１９の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０の配列からなるＶＬ
ＣＤＲ２、及び配列番号２１の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｖ）配列番号２２の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の配列からなるＶＬ  
ＣＤＲ２、及び配列番号２４の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
（ｖｉ）配列番号２５の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６の配列からなるＶＬ
ＣＤＲ２、及び配列番号２７の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド。
【００６３】
また、本発明は、図２〜図２−２に記載の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ
２及びＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチドを提供する。
また、本発明は、図２〜図２−２に記載の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２
、ＶＬ  ＣＤＲ３を含むポリペプチドを提供する。
より好ましくは、配列番号７の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８の配列からなる
ＶＨ  ＣＤＲ２及び配列番号９４の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチド（５
７９３）、又は、配列番号７の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９７の配列からな
るＶＨ  ＣＤＲ２及び配列番号９の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むポリペプチドであ
る（５８１０）。
【００６４】
本発明は、以下のいずれかに記載の可変領域を含むポリペプチドを提供する。より好ま
しくは、（ｉ）（ｉｉ）（ｉｖ）又は（ｖ）を含むポリペプチドである。
（ｉ）配列番号４の配列からなるＣＤＲ１、配列番号５の配列からなるＣＤＲ２、配列番
号６の配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）。
（ｉｉ）配列番号７の配列からなるＣＤＲ１、配列番号８の配列からなるＣＤＲ２、配列
番号９の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ。
（ｉｉｉ）配列番号１０の配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１の配列からなるＣＤＲ２
、配列番号１２の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＨ。
（ｉｖ）配列番号１９の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０の配列からなるＣＤＲ２、
配列番号２１の配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）。
（ｖ）配列番号２２の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２３の配列からなるＣＤＲ２、配
列番号２４の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ。
（ｖｉ）配列番号２５の配列からなるＣＤＲ１、配列番号２６の配列からなるＣＤＲ２、
配列番号２７の配列からなるＣＤＲ３を含むＶＬ。
【００６５】
また、本発明は、図２〜図２−２に記載の配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ
２及びＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。
また、本発明は、図２〜図２−２に記載の配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ
２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むポリペプチドを提供する。
【００６６】
本発明において、前記ポリペプチドは、プレセプシンへの結合活性を有する抗原結合物
質であることが好ましい。
【００６７】
上述の抗体又はポリペプチドは、ＣＤＲ配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、
欠失、付加及び／又は挿入等（置換等という）されていてもよい。１又は複数のアミノ酸
を置換等された後の抗体又はポリペプチドは、抗原との結合活性、プレセプシン測定時の
特徴等について、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有していることが好ましい。こ
こで、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有する、置換等された後の抗体又はポリペ
プチドには、公知の遺伝工学的手法によって人工的に改変した変異体、天然に生じた変異
体（いわゆるアレル変異体）のいずれもが含まれている。置換等されるアミノ酸の数が複
数であることは、１より多い数であれば、特に限定されないが、好ましくは、１つのＣＤ
Ｒにつき３アミノ酸以内、さらに好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸
である。ある実施態様では、本発明の抗体又はポリペプチドは、上記のように配列番号で
特定されるＣＤＲのアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すＣＤＲ配列を有して
もよい。その同一性は、９２％以上, ９５％以上, ９７％以上, 又は９９%以上であって
もよい。このような抗体又はポリペプチドは、配列番号で特定されるＣＤＲ酸配列を有す
る抗体又はポリペプチドと同等の活性又は性能を有していることが好ましい。
【００６８】
ＣＤＲと連結される抗体のフレームワーク領域（framework region：ＦＲ）は、ＣＤＲ
が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の可変領域に用いられるＦＲ
は特に限定されず、いかなるＦＲが用いられてもよい。必要に応じて、ＣＤＲが適切な抗
原結合部位を形成するように、ＦＲの１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又
は挿入等されていてもよい。ある実施態様では、ＦＲは、各配列番号で示されるアミノ酸
配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。その同一性は、
８５％以上, ９０％以上, ９５％以上, ９７％以上、又は９９％以上であってもよい。例
えば、アミノ酸を置換したＦＲを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することに
よって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列を選択してもよい。
【００６９】
本発明において、抗体のＦＲ領域は、データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）等から
得られる公知のＦＲ（アミノ酸配列としては、例えば、ＡＡＯ０６５１１．１、ＡＡＴ０
２３９１．１、ＡＡＧ１３９７３．１、ＡＧＴ２９８１６．１等、塩基配列としては、例
えば、ＡＹ５９６４２９．１、ＡＹ１７１７７２．１、ＫＣ０２００５６．１、ＡＦ２９
４９６６．１等）、本発明で得られた抗体のＦＲ等を用いることができる。当業者は、技
術常識に基づいて、望ましいＦＲを選択することができる。本発明において、好ましく用
いられる抗体のＦＲは、例えば、配列番号４８〜８４のＦＲが挙げられる。これらは、デ
ータベース等で得られるＦＲ、又は、本発明で得られた抗体のＦＲである。本発明の抗体
には、様々な動物由来のＦＲが利用可能であるが、特に、ウサギ由来の抗体のＦＲが好ま
しい。中でも、配列番号６４〜８４が好ましく、より好ましくは、配列番号６５又は６６
、配列番号６８又は６９、配列番号７１又は７２、配列番号７３、配列番号７５又は７６
、配列番号７８又は７９、配列番号８１、８２又は８３、配列番号８４のＦＲである。
【００７０】
ある実施態様では、本発明の抗体の可変領域の好ましい例は以下のとおりである。
（１）（ｉ）図２〜図２−２に記載の改変体の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０の
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３）並びに、配列番号６４、配列番号
６７、配列番号７０、及び配列番号７３の配列を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）図２〜図２−２に記載の改変体の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＬ
ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３）並びに、配列番号７４、配列番号７７
、配列番号８０、及び配列番号８４の配列を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
（２）（ｉ）Ｆ１４６６−５、Ｆ１４６６−２６、又はＦ１４６６−１６の重鎖ＣＤＲ配
列（例えば、Ｆ１４６６−２６のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３）
、並びに、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、及び配列番号７３の配列を含む
ＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｆ１４６６−５、Ｆ１４６６−２６、又はＦ１４６６−１６の軽鎖ＣＤＲ配列（
例えば、Ｆ１４６６−２６のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３）、並
びに、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、及び配列番号８４の配列を含むＦＲ
を有する軽鎖可変領域。
（３）（ｉ）図２〜図２−２に記載の改変体の重鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０の
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３）並びに、配列番号６５（又は６６
）、配列番号６８（又は６９）、配列番号７１（又は７２）、及び配列番号７３を含むＦ
Ｒを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）図２〜図２−２に記載の改変体の軽鎖ＣＤＲ配列（例えば、抗体５８１０のＶＬ
ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３）並びに、配列番号７５（又は７６）、
配列番号７８（又は７９）、配列番号８１（又は８２又は８３）、及び配列番号８４を含
むＦＲを有する軽鎖可変領域。
（４）（ｉ）Ｆ１４６６−５、Ｆ１４６６−２６、又はＦ１４６６−１６の重鎖ＣＤＲ配
列（例えば、Ｆ１４６６−２６のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３）
、並びに、配列番号６５（又は６６）、配列番号６８（又は６９）、配列番号７１（又は
７２）、及び配列番号７３を含むＦＲを有する重鎖可変領域；
（ｉｉ）Ｆ１４６６−５、Ｆ１４６６−２６、又はＦ１４６６−１６の軽鎖ＣＤＲ配列（
例えば、Ｆ１４６６−２６のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３）、並
びに、配列番号７５（又は７６）、配列番号７８（又は７９）、配列番号８１（又は８２
又は８３）、及び配列番号８４を含むＦＲを有する軽鎖可変領域。
【００７１】
可変領域は１又は複数（例えば５アミノ酸以内、好ましくは３アミノ酸以内）のアミノ
酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。１又は複数のアミノ酸を置換等
されたた後の抗体又はポリペプチドは、抗原との結合活性、プレセプシン測定時の特徴等
について、置換等を行う前と同等の活性又は性能を有していることが好ましい。ある実施
態様では、可変領域が上記のようにアミノ酸配列で特定される場合、可変領域は、配列番
号により特定された配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよ
い。その同一性は、８５％以上, ９０％以上, ９５％以上, ９７%以上、又は９９％以上
であってもよい。このような可変領域は、配列番号により特定された可変領域と同等の活
性又は性能を有していることが好ましい。
【００７２】
本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、いかなる定常領域が用いられて
もよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、例えば、マウス、ラ
ット、ウサギ又はヒト由来のＩｇＧの定常領域などを使用しうる。定常領域は、抗原との
結合活性、プレセプシン測定時の特徴等に影響を与えない範囲で、１又は複数のアミノ酸
が置換、欠失、付加及び／又は挿入してもよい。
【００７３】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、すなわち、抗プレセプシンモ
ノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、単一クローンの抗体産生細胞が分泌す
る抗体である。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、均一な抗原特異
性をもつ、高力価の抗体が得られる等の特性を有する。理論的には、モノクローナル抗体
は、ポリクローナル抗体と比較して、抗原測定に必要な抗体重量が少なくてよいという利
点がある。本明細書における「抗体」の語は、「抗体又はその抗原結合性抗体断片」の意
味で用いられる場合がある。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、配列番号２に記載のＳ６８ペプチドを投
与抗原として作製される。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、Ｓ６８ペプチドを動
物に免疫し、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製
し、次いで単一細胞化したハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清を精製する
ことにより得ることができる。
【００７５】
抗体が由来する動物種は特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、
ウサギ等が挙げられる。好ましくは、ウサギである。すなわち、本発明の抗体は、好まし
くは、ウサギ由来抗プレセプシンモノクローナル抗体（ウサギ抗プレセプシンモノクロー
ナル抗体ともいう）である。
【００７６】
ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。例えば、ヒト由来のＳＫＯ−
００７、ヒトマウスヘテロミエローマのＳＨＭ−Ｄ３３，マウス由来のＰ３、ＮＳ−１，
Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／０、ラット由来のＹＢ２／０、Ｙ３−Ａｇ１，２，３等が挙げられる
。ウサギ由来不死化Ｂリンパ球等が用いられてもよい。
【００７７】
本発明においては、好ましくは、ウサギ脾細胞とウサギ由来不死化Ｂリンパ球との融合
によりウサギ−ウサギハイブリドーマ、または不死化したマウス細胞株由来の細胞との融
合によりウサギ−マウスハイブリドーマを作製してもよい。
【００７８】
抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合は、公知の方法により行うことができ、融合促進
剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス等を使用す
ることができる。細胞融合に用いる培養液は、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ
培養液等を用いることができる。
【００７９】
融合により形成されたハイブリドーマは数日〜３週間程度培養され、例えば、ヒポキサ
ンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地を用いて、
未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマは、その産生する抗体により更に選択さ
れる。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、抗体産生
ハイブリドーマとして樹立する。
【００８０】
抗体の精製は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー（プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等）、塩析法、アルコール沈殿法、等
電点沈殿法、電気泳動法、遠心分離、ゲルろ過法等の公知の方法により行うことができる
。
【００８１】
本発明の抗体またはその抗原結合性抗体断片は、当業者が用いうる遺伝子組換え技術を
用いて作製することもできる。例えば、得られた抗プレセプシン抗体の配列を基に、抗体
又はその一部をコードするポリヌクレオチドを構築し、これを発現ベクターに導入した後
、適当な宿主で発現させることができる。
【００８２】
抗体又はその一部をコードするポリヌクレオチドの構築は、例えば、本発明の抗体を産
生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することができる。これら
は市販のキット等を用いて実施可能である。
【００８３】
また、当業者が用いうる遺伝子組換え技術を用いて、抗プレセプシン抗体の配列を基に
、その配列の一部を改変した抗体を作製することもできる。目的の配列を含むベクターを
調製し、適当な宿主で発現させることができる。
【００８４】
本発明に用いられるベクターは、特に限定されないが、抗体遺伝子の発現に適合するベ
クター及び／または発現ベクターが好ましい。例えば、ＥＦ−１αプロモーター及び／ま
たはＣＭＶエンハンサーを含有するベクター等が挙げられる。
【００８５】
ベクターとして、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ
１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９
４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリ
オファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス等
が用いられてもよい。
【００８６】
本発明に用いられるプロモーターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロ
モーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ
４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター
、サイトメガロウイルスプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等を用いることができる。
【００８７】
ベクターは、必要に応じて、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグ
ナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン等を含有しうる。
【００８８】
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）、メソトレキセー
ト（ＭＴＸ）耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等を用いることができる。
【００８９】
本発明に用いられる宿主細胞は、特に限定されないが、例えば、細菌細胞（大腸菌等）
、酵母、両生類細胞（アメリカツメガエル卵母細胞等）、昆虫または昆虫細胞（ｓｆ９等
）、動物細胞等が用いられる。動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７
細胞、ＣＨＯ細胞、ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞）、マウス３
Ｔ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞、ミエローマ細胞等が用いられる。
【００９０】
発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、公知の方法により実施可能であり、例えば、
リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポーション法、マイクロインジェ
クション法等が挙げられる。
【００９１】
発現ベクターの宿主細胞への導入後、各宿主細胞に適した培養培地で細胞を培養する。
例えば、動物細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＧＩＴ培地等の動物細胞培養用培地
、または、これらにＦＣＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。
得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中に抗体を発現蓄積することが
できる。培養上清中の抗体の精製は、前記に記載した方法を使用しうる。また、抗体の発
現量および抗原抗体活性はＥＬＩＳＡ等により測定できる。
【００９２】
本発明の抗体またはその抗原結合性抗体断片は、ファージディスプレイ法を用いて作製
されてもよい。ファージディスプレイ法による抗体取得は、当業者が用いうる技術により
実施できる（ＣＡＲＬＯＳ  Ｆ．ＢＡＲＢＡＳ等  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）等参照）。例えば、本発明の実施例１１に記載の方法を用い
ることができる。Ｓ６８ペプチドを動物に免疫して得られた脾臓リンパ球から遺伝子を取
得してファージミドベクター等と連結する等して、その後は常法により作製しうる。
【００９３】
また、特定のＣＤＲ（例えば、ＶＨ  ＣＤＲ３）の配列のみ変更した改変体を作製する
ため、ファージディスプレイ法を用いることも可能である。これも鋳型とする抗体の重鎖
および軽鎖を含むプラスミドと特定のプライマーを用いて、当業者が用いうる技術を用い
て実施しうる。例えば、実施例１２に記載の方法を用いることができる。
【００９４】
本発明の抗原結合性抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗
体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓ
Ｆｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド
及び軽鎖可変領域を含むポリペプチド等が挙げられる。いずれの抗体断片も、配列番号１
のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する本発明の抗体と同じ抗原結合性を有してい
る。これらの抗体断片は、当業者が用いうる遺伝子組換え技術等を用いて作製することが
できる。
【００９５】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ
末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した抗原結合活性を有する抗体断片で
ある。
【００９６】
Ｆ（ａｂ´）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、
Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものである。
【００９７】
Ｆａｂ´は、Ｆ（ａｂ´）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗原
結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ´は、Ｆ（ａｂ´）２を還元剤ジチオスレイト
ール処理して得ることができる。
【００９８】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカーで連結したポリペプ
チドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９９】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量化し、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である
。
【０１００】
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポ
リペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。
【０１０１】
ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした抗
原断片である。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで結合することにより作
製できる。
【０１０２】
ＣＤＲを含むポリペプチドは、好ましい態様は前述のとおりであり、抗原結合活性を有
する断片である。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なリンカーを介して結合
させることができる。
【０１０３】
重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、前記に記載
のとおりである。
【０１０４】
本発明において、リンカーは、遺伝子工学により導入しうる任意のペプチドリンカーを
用いることができる。本発明において好ましいリンカーは、ペプチドリンカーである。ペ
プチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて適宜選択することが可能であるが
、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは３〜５０アミノ酸、より好ましくは５〜２０ア
ミノ酸である。４つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要と
なる。複数のリンカーは同じでもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。
【０１０５】
本発明の抗体には、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。キメラ抗体は、２種類また
はそれ以上の種の異なった抗体分子の一部ずつを組合せて作製された抗体分子である。本
発明において好ましいキメラ抗体は、本発明のウサギモノクローナル抗体由来の可変領域
及び他の種（例えばヒト）の定常領域を有する抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト種から
のＣＤＲをヒト抗体へ移植した抗体である。キメラ抗体及びヒト化抗体は、常法に従い作
製することができる。
【０１０６】
本発明の抗体には、本発明のアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸残基が付加された
抗体も含まれる。また、これらの抗体と他のペプチド又はポリペプチドが融合した融合タ
ンパク質も含まれる。融合タンパク質の作製は、当業者に公知の手法を用いて作製するこ
とが可能であり、例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又
はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれ
を発現ベクターに導入し、宿主で発現させることができる。本発明の抗体との結合に用い
られる他のペプチド又はポリペプチドは、特に限定されないが、例えば、ＦＬＡＧ，６個
のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、ポリヒスチジンセグメント、インフル
エンザ凝集素（ＨＡ）、Ｔ７−ｔａｇ，ＨＳＶ−ｔａｇ，ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ）、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、β−ガラクトシダーゼ、
マルトース結合性タンパク質等が挙げられる。
【０１０７】
２．プレセプシンの測定方法
本発明の第二の態様は、少なくとも本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片を用いて
、プレセプシンを免疫学的に測定する方法であり、少なくとも本発明の抗体又は抗原結合
性抗体断片とプレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む。本発明において「測
定」の語は、「検出」「定量」「アッセイ」等の語と相互に変換して用いることができ、
定量的及び定性的な決定を含む意味で用いられる。プレセプシンの測定は、好ましくは、
in vitroで行う。
【０１０８】
プレセプシンは敗血症の検出に用いられるマーカーとして知られているため、この方法
は、少なくとも本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片とプレセプシンを含有する検体を接
触させる工程を含む、敗血症を検出するための方法ということもできる。
【０１０９】
すなわち、少なくとも、１）本発明の抗体を用いて、被験者の検体中のプレセプシン濃
度を測定する工程、及び、２）１）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較し
て高値であるか否かを判定する工程を含む、敗血症を検出する方法、あるいは、敗血症の
検出若しくは診断を補助するための方法ということもできる。このときのカットオフ値は
、３１４〜６００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは４００〜５８０ｐｇ／ｍＬ、より好まし
くは４５０〜５５０ｐｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００ｐｇ／ｍＬである。
【０１１０】
本発明において、「疾患の検出」は、「疾患の検出の補助」あるいは「疾患の診断の補
助」に読み替えて用いられてもよい。
【０１１１】
また、抗体又は抗原結合性抗体断片は、例えば、敗血症と全身性炎症反応症候群（syst
emic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価
、敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血
管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの
検出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、
潰瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球
貪食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる
少なくとも１つの疾患の検出又は評価のために使用することができる。
【０１１２】
術後感染症は、術後に発症した感染症を総称し、手術およびそれに必要な補助療法によ
る全ての感染症を意味する。また、術後感染症は、Guideline for prevention of surgic
al site infection,1999 (CDC)に基づき術後感染症と診断される疾患全てを含むものであ
る。
【０１１３】
心疾患としては、例えば、急性冠症候群（ACS）、急性心不全、急性非代償性心不全（A
DHF）、慢性心不全、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性脳卒中、出血性脳卒中及び
一過性脳虚血発作が挙げられる。
【０１１４】
細菌感染を伴う呼吸器感染症としては、下気道感染症又は肺炎が挙げられる。下気道感
染症には急性下気道感染症と慢性下気道感染症が含まれる。急性下気道感染症には急性気
管炎、急性気管支炎、急性細気管支炎が含まれ、多くは上気道へのウイルス感染が下気道
に波及することにより発症するが、一部で細菌による二次感染が続発する。細菌二次感染
の兆候が見られた場合は抗生剤投与の適応となる。慢性下気道感染症は、気管支拡張症や
慢性閉塞性肺疾患などで器質的障害を有する下気道に細菌の持続的な感染が成立した病態
であり、持続感染と急性憎悪が存在する。下気道の器質的障害を発生させる疾患には、気
管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、びまん性汎細気管支炎、陳旧性肺結核、
じん肺、非結核性抗酸菌症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、肺線維症、慢性気
管支喘息などが含まれる。持続感染、急性憎悪ともに抗生剤投与の適応となる。肺炎には
市中肺炎、院内肺炎が含まれる。好ましくは市中肺炎である。
【０１１５】
食細胞の機能評価としては、（ａ）好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測
定、（ｂ）好中球、顆粒球および／または白血球の貪食能の測定することによる、免疫機
能の評価、（ｃ）自家細胞移植又は他家細胞移植の際の移植用細胞の品質評価、及び、（
ｄ）食細胞による貪食が関連する疾患の検出等が挙げられる。食細胞による貪食が関連す
る疾患としては、例えば、自己免疫疾患、関節リウマチ、乳房炎、痛風、糸球体腎炎、潰
瘍性大腸炎、地中海熱、中耳炎、鼻炎、肺炎、結核、膀胱炎、羊水感染症、及び膿精液症
が挙げられる。食細胞による貪食が関連する疾患を検出する際に用いる検体としては、組
織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、尿、腹水
、羊水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨な
どを洗浄した後の洗浄液を用いうる。
【０１１６】
本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いて、プレセプシンを免疫学的に測定する方
法としては、例えば、エンザイムイムノアッセイ（（以下、ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡとも記
す）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ），蛍光
抗体法（ＦＡＴ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ
ＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、イムノクロマト法、凝集法、競合法等が挙げられる
が、これらに限定されない。本発明においては、直接法と間接法のいずれが用いられても
よい。ビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）複合体を形成させて検出する増感法が
用いられてもよい。
【０１１７】
ＥＩＡは、酵素標識抗体を用いた免疫測定法の一つであり、直接法、間接法等が挙げら
れる。好ましい例としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent as
say）である。
【０１１８】
サンドイッチＥＬＩＳＡとは、抗原認識部位の異なる２種類以上の抗体を用いて、あら
かじめ一方の抗体は固相に固定し、検出したい抗原を２種類の抗体で挟んで、抗体−抗原
−抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。
【０１１９】
化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ：Chemiluminescent Enzyme Immunoassay）は、
検体中の抗原と、磁性粒子やビーズ等に固相した抗体を反応させた後、酵素標識抗体を反
応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、化学発光基質を加えて酵素反応後、発光強度を測定する
方法である。
例えば、検体中の抗原とビオチンを結合させた抗体を液相で反応させ、ストレプトアビ
ジンを結合させた磁性粒子へ抗体をトラップし、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、酵素標識抗体を
反応させ、上記同様の処理を行ってもよい。
【０１２０】
標識酵素としてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いるとき、化学発光基質は、Ｃ
ＤＰ−ＳｔａｒＴＭ，ＡＭＰＰＤ(R)，ＣＳＰＤ(R)が用いられることが好ましい。標識酵
素がＨＲＰのときは、化学発光基質は、ルミノールが用いられることが好ましい。
【０１２１】
検出感度は、一般的に、化学発光＞蛍光＞吸光（呈色）の順に高いといわれ、求める感
度に応じて測定法を選択しうる。
【０１２２】
化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ：Chemiluminescent Immunoassay）は、検体中の抗原と
磁性粒子などに固相した抗体を反応させた後、化学発光物質で標識した抗体を反応させ、
洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、発光強度を測定する方法である。標識物質は、アクリジニウム等
が用いられる。
【０１２３】
蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ：Fluorescent Enzyme Immunoassay）は、検体中の抗原
と固相化した抗体を反応させた後、酵素標識抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、蛍
光基質を加えて酵素反応後、蛍光強度を測定する方法である。標識酵素には、ＨＲＰやＡ
ＬＰ等が用いられる。蛍光基質は、標識酵素がＨＲＰのときは、Ａｍｐｌｅｘ(R)Ｒｅｄ
等が用いられ、標識酵素がＡＬＰのときは、４−ＭＵＰ（４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌ
ｉｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＡｔｔｏＰｈｏｓ(R)等が用いられることが好
ましい。
【０１２４】
電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ：Electro Chemiluminescence Immunoassay）は
、検体中の抗原と磁性粒子に固相した抗体及び電気化学発光物質で標識した抗体を反応さ
せた後、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）し、電気エネルギーによる発光強度を測定する方法である。
標識物質にはルテニウム等が用いられる。標識物質には、Ｒｕ（ｂｐｙ）３等が用いられ
、電極への荷電による酸化と、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）等による還元反応により励
起発光を繰り返す。
【０１２５】
放射免疫測定法（（ＲＩＡ：Radioimmunoassay）は、放射性同位元素による標識体を用
いた測定方法である。例えば、検体中の抗原とビーズ等に固相した抗体を反応された後、
放射性同位元素（１２５Ｉ等）で標識した抗体を反応させ、洗浄（Ｂ／Ｆ分離）後、１２
５Ｉの放射線量を測定することができる。
【０１２６】
イムノクロマト法は、被検体が、試験ストリップ上を試薬を溶解しながら移動する毛細
管現象を応用した免疫測定法である。検体中の抗原が、試験ストリップ上の標識抗体及び
キャプチャー抗体の３者と免疫複合体を形成し、標識物の色を確認する方法である。抗体
の標識は、金コロイド、酵素、蛍光物質等が用いられる。酵素標識抗体を用いる場合は、
試験ストリップ上に酵素基質を配置し発色させる。
【０１２７】
フロースルー法は、不溶性担体であるメンブレン上で、検体中の溶液と共に被験物質で
ある抗原が、抗体−抗原−抗体複合体を形成させる方法である。このとき、メンブレンに
固定されなかった物質は、通常は垂直にメンブレンの表から裏を通って除去される。
【０１２８】
凝集法は、検体中の抗原と試薬中の抗体を反応させ、凝集を観察する方法である。固相
を用いない方法、固相として人工的に作製された粒子を用いる粒子凝集法（particle agg
lutination：ＰＡ）、ＰＡの中でもラテックス粒子を用いたラテックス凝集法（latex ag
glutination：ＬＡ）等が挙げられる。
【０１２９】
競合法は、例えば、固相に抗体を結合させ、被検試料と一定量の標識抗原を同時に反応
させ、結合した標識物の量から試料中の抗原の量を測定することができる。
【０１３０】
第一の態様に記載の本発明の抗体又は断片は、上述の測定方法に好ましく用いられる。
プレセプシン測定に用いられる検体は、特に限定されないが、水性の検体が好ましく、
例えば、血液（全血、血漿、血清等）、尿、組織液、リンパ液、関節液、乳汁、脳脊髄液
、膿、唾液、涙液、粘液、鼻水、痰、腹水、用水、精液などの体液、また、鼻腔、気管支
、肺、皮膚、腹腔、各種臓器、関節、骨などを洗浄した後の洗浄液、あるいは、細胞培養
上清、またはカラム溶出液等が挙げられる。これらの試料は、そのまま、あるいは各種緩
衝液等で希釈あるいは抽出後濃縮され、測定に用いられる。
【０１３１】
また、検体として、全血検体を用いる場合には、全血検体を採取してから72時間、48時
間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、又は4時間以内に分析を実施されてもよい
。また、EDTA採血管又はヘパリン採血管により全血検体を採取されてもよい。好ましくは
、EDTA採血管に全血検体を採取して6時間以内に分析すること、又は、ヘパリン採血管に
より全血検体を採取して4時間以内に分析することが挙げられる。
【０１３２】
３．ｓＣＤ１４−ＳＴ測定用キット
本発明の第三の態様は、第一の態様の抗体またはその抗原結合性抗体断片を必須の構成
要素するプレセプシン測定用キットである。
【０１３３】
本発明の測定キットは、好ましくは、プレセプシン測定のための補助試薬を含む。補助
試薬としては、例えば、一次抗体、二次抗体、標識抗体、標識酵素、金コロイド等の標識
物質、発色基質、蛍光基質（Ａｍｐｌｅｘ(R)  Ｒｅｄ，ＡｔｔｏＰｈｏｓ(R)，４−ＭＵ
Ｐ等）、化学発光基質（ルミノール、ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ，ＡＭＰＰＤ(R)，ＣＳＰＤ(
R)等）、ビオチン−ストレプトアビジン等の特異結合物質、不溶性担体、ブロッキング剤
、希釈液、洗浄液、標準物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
第二の態様の、プレセプシン測定法に合わせて、適宜組み合わせて用いられる。
一次抗体は、好ましくは、プレセプシンに結合する抗体であり、より好ましくは、本発
明の抗体と異なるエピトープを認識する抗体が好ましい。例えば、ＷＯ２００４／０４４
００５の実施例３に記載のＦ１１０６−１３−３抗体やＦ１０３１−８−３抗体などが挙
げられる。
【０１３５】
本発明の抗体と一次抗体のいずれを標識抗体としてもよい。本発明の抗体と一次抗体の
いずれも標識されていない場合は、標識された二次抗体を用いてもよい。
【０１３６】
不溶性担体としては、例えば、磁性粒子、ビーズ、ガラス、セルロース、ニトロセルロ
ース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリス
チレン、ポリビニルクロライド、ポリプロピレン、プラスチックプレート、ラテックス粒
子、不織布、濾紙等が挙げられる。
【０１３７】
抗体の標識は、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、
β−ガラクトシダーゼ等の酵素、金コロイド等、好ましく用いられるが、これらに限定さ
れない。
【０１３８】
例えば、ＨＲＰを用いる場合は、発色基質として、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）等が挙げられる。ＡＬＰを用いる場合は
、発色基質としてｐ−ニトロフェニルフォスフェート（ｐＮＰＰ）等が挙げられる。β−
ガラクトシダーゼを用いる場合の発色基質としては、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド（ｏ−Nitrophenyl −β−D-Galactopyranoside：ＯＮＰＤ）等が例示さ
れる。
【０１３９】
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法用の測定キットは、本発明の抗体及び一次抗体（い
ずれかの抗体が酵素標識されていてもよい）、発色基質、希釈液、標準物質等を含有しう
る。本発明の抗体及び一次抗体が標識されていない場合、標識された二次抗体を含有して
もよい。
【０１４０】
化学発光酵素免疫法（ＣＬＥＩＡ）用の測定キットは、例えば、磁性粒子等に固相化し
た抗体、酵素標識抗体、化学発光基質、希釈液、洗浄液等を含有しうる。
【０１４１】
蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）の測定キットは、例えば、磁性粒子等に固相化した抗
体、酵素標識抗体、蛍光基質、希釈液、洗浄液等を含有しうる。
【０１４２】
電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）の測定キットは、例えば、ビオチン化抗体、Ｒ
ｕ（ｂｐｙ）３標識抗体、ストレプトアビジンコーティング磁性粒子、トリプロピルアミ
ン等を含有しうる。
【０１４３】
イムノクロマト法による測定キットは、試料添加部、試薬部、検出部及び吸収部を、試
験添加部に添加される液性検体が上記の順に移動するように設けた試験ストリップである
。例えば、試薬部に標識した第二の抗体を含浸させ、検出部に第一の抗体が結合した不溶
性担体を設置することができる。
【０１４４】
試験ストリップは、多孔性担体等を用いることが例示される。多孔性担体は、例えば、
ニトロセルロース、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、ナイロン繊維、ガラス線
維、多孔性合成ポリマー等が挙げられる。吸収部は、水吸収性材料のスポンジ等の吸収ポ
リマー、セルロース濾紙、濾紙等が挙げられる。
【０１４５】
敗血症患者では、特徴的にプレセプシン血中濃度が上昇することが報告されているため
、本発明の第三の態様のプレセプシン測定用キットは、敗血症の検出用キット、又は、敗
血症の検出若しくは診断を補助するためのキットであってもよい。
【０１４６】
また、本発明の第三の態様のプレセプシン測定用キットは、敗血症の診断薬、あるいは
、敗血症診断の補助薬として用いることができる。プレセプシン測定用キットは、このよ
うな敗血症の検出等を目的とするとき、本発明の抗体を用いて測定した、被験者の検体中
のプレセプシン濃度が、カットオフ値より高値であるときに、被験者を敗血症の可能性が
あると判定し、検出又は診断を補助することができる。このとき、カットオフ値は、３１
４〜６００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは４００〜５８０ｐｇ／ｍＬ、より好ましくは４
５０〜５５０ｐｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５００ｐｇ／ｍＬである。
【０１４７】
また、プレセプシン測定用キットは、例えば、敗血症と全身性炎症反応症候群（system
ic inflammatory response syndrome、SIRS）との判別、敗血症の重症化のリスク評価、
敗血症の予後予測（死亡率予測）、敗血症の重症度評価、術後感染症の検出、播種性血管
内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation、DIC）の検出、感染性DICの検
出、心疾患の検出、細菌感染を伴う呼吸器感染症の検出、炎症性腸疾患（クローン病、潰
瘍性大腸炎）の検出、発熱性好中球減少症（febrile neutropenia、FN）の検出、血球貪
食症候群（hemophagocytic syndrome、HPS）の検出及び食細胞の機能評価から選ばれる少
なくとも１つの疾患の検出又評価のために使用することができる。プレセプシン測定用キ
ットは、上記に記載の少なくとも１つの疾患の検出又は評価のためのキットであってもよ
い。
【０１４８】
４．第一の態様に記載の抗体またはその抗原結合性抗体断片をコードするポリヌクレオチ
ド
本発明の第四の態様として、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片の
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。該ポリヌクレオチ
ドには、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等）及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）が
含まれる。 ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖
であってもよい。例えば、市販のキットを用いて、本発明の抗体を産生するハイブリドー
マよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することができる。ＰＣＲ法等により目的とす
る遺伝子を増幅してもよい。
【０１４９】
ある実施態様では、本発明の抗体は、可変領域の重鎖又は軽鎖をコードする塩基配列に
対して、少なくとも８０％以上の同一性を有することを要する。また、ＣＤＲ配列につい
ても、抗体のＣＤＲ全体（ＶＨ  ＣＤＲ１〜３及びＶＬ  ＣＤＲ１〜３）をコードする塩
基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有することを要する。これらは、検出
感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６
％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示
してもよい。
また、ある実施態様では、本発明の抗体は、可変領域の重鎖又は軽鎖をコードする塩基
配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によって
コードされる抗体も包含される。
【０１５０】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏ
ｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方
法等に従って行うことができる。
【０１５１】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリ
ッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウ
ム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ
中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。当業者は、ハイブリダイ
ゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって
、このような条件を容易に選択することができる。
【０１５２】
５．第四の態様に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター
第五の態様は、本発明の抗体又は抗原結合性抗体断片のアミノ酸をコードするポリヌク
レオチドを導入したベクターである。ベクターは、好ましくは、第一の態様に記載した抗
体遺伝子の発現に適合するベクター及び／または発現ベクターであり、当業者が用いうる
技術を用いて作製することができる。
【０１５３】
６．第一の態様に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を産生する細胞
本発明の第六の態様として、本発明の第一の抗体又はその抗原結合性抗体断片を産生す
る細胞が提供される。このような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換株、また
は、本発明の抗体の遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。
【０１５４】
抗体を産生するハイブリドーマとしては、具体的には、実施例１に示されたクローンが
挙げられる。
【０１５５】
形質転換株は、例えば、第一の態様に記載した宿主細胞（例えば、ＣＯＳ−１細胞、Ｃ
ＨＯ細胞等）に、前記記載の本発明の抗体又はその抗原結合性抗体断片のアミノ酸をコー
ドするポリヌクレオチドを導入したベクターを導入することにより得ることができる。
【０１５６】
ハイブリドーマや形質転換株の作製方法は、第一の態様に記載のとおりである。
【０１５７】
７．形質転換株を用いる抗体または抗原結合性抗体断片の製造方法
本発明の第七の態様は、第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片をコードするヌ
クレオチドが導入されたベクターを含む形質転換株を培養する工程を含む、抗体又は抗原
結合性抗体断片の製造方法である。
【０１５８】
形質転換株の培養物中に、第一の態様の抗体又は抗原結合性抗体断片を生成させ、培養
物中から抗体又は抗原結合性抗体断片を採取する。詳細は、第一の態様で説明したとおり
である。
【０１５９】
８．抗プレセプシン抗体のスクリーニング方法
本発明の第八の態様は、少なくとも下記の工程を含む、検体中のプレセプシン測定に有
用な抗プレセプシン抗体を得るための、抗体のスクリーニング方法である。
・  候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築する工程、
・  該測定系を用いて、検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を
決定する工程
すなわち、この方法は、抗体を用いた測定系でＴＧの干渉試験を行うことを特徴として
いる。候補の抗体（好ましくは、抗プレセプシン抗体）を得る方法は、本発明の第一の態
様あるいは第七の態様に記載のとおりである。プレセプシン測定系は、検体のプレセプシ
ン値を測定する測定系であればよく特に限定されないが、例えば、第二の態様に記載した
測定系が挙げられ、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ等を用いうる。
【０１６０】
検体中のＴＧ濃度がプレセプシン測定値に与える影響を決定する工程は、例えば、ＴＧ
無添加の検体のプレセプシン測定値と、同検体にＴＧを一定量添加したときのプレセプシ
ン測定値とを比較し、両測定値の解離から影響を決定しうる。例えば、一つの例としては
、複数の検体を用いてＴＧ干渉試験を行い、ＴＧ無添加時のプレセプシン測定値に対し、
検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以
下、より好ましくは±１０％以下を示す検体の比率が高いときに、検体中のＴＧがプレセ
プシン測定値に与える影響は小さいと決定してもよく、当該抗体はＴＧ干渉を受けにくく
、プレセプシン測定に有用な抗体であると決定してもよい。
【０１６１】
あるいは、別の評価方法として、候補の抗体とＳ６８抗体とでＴＧ干渉試験を実施して
解離度を比較することにより評価してもよい。好ましい態様の一つとして、候補の抗体を
用いてＴＧ干渉試験を実施したときのプレセプシン測定値の解離が、Ｓ６８抗体の同条件
における解離度と類似するとき、当該抗体は検体中のプレセプシン測定に有用な抗体であ
ると決定しうる。例えば、一つの例としては、複数の検体を用いてＴＧ干渉試験を行い、
候補の抗体を用いた測定系において、ＴＧ添加により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬと
したときの解離度と、Ｓ６８抗体を用いた測定系における同条件下の解離度とから解離度
の差を決定し、解離度の差が２０％以下、好ましくは１０％以下を示す検体の比率が高い
とき、当該抗体は検体中のプレセプシン測定に有用な抗体であると決定してもよい。
【０１６２】
本発明のスクリーニング方法は、任意に、候補の抗体とＳ６８ペプチドあるいはプレセ
プシンとの結合活性を決定する工程を含んでもよい。また、本発明のスクリーニング方法
は、任意に、候補の抗体を用いたプレセプシン測定系により正常人と敗血症患者の検体を
測定し、測定値の差を比較する工程を含んでもよい。これらは実施例１の記載に従い、実
施しうる。
【０１６３】
前記スクリーニング方法の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を含む方法
である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
２）当該候補の抗体を用いてプレセプシン測定系を構築し、ＴＧ添加により検体中のＴＧ
濃度を２０ｍｇ／ｍＬとしたとき、プレセプシン測定値の解離度が±２０％以下を示す検
体比率が５０％以上である前記抗体を選択する工程。
【０１６４】
前記方法において、検体中のＴＧ濃度（ここでは２０ｍｇ／ｍＬ）、プレセプシン測定
値の解離度（ここでは±２０％）、及び、検体比率は適宜変更可能である。また、前記２
）の工程は、本発明の第一の態様に記載の、他のＴＧ干渉試験及び／又は評価方法に置き
換えても実施可能である。
【０１６５】
本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の工程を
含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および
２）当該抗体が、プレセプシンの配列のうち、配列番号１のアミノ酸配列をエピトープと
して特異的に認識する前記抗体を選択する工程。
【０１６６】
前記方法において、２）の工程では、特に限定されないが、本発明の第一の態様に記載
のエピトープの決定方法等を用いることができる。
例えば、２）は、以下の工程であってもよい。
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸
残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５
０％以上競合阻止される前記抗体を選択する工程。
上記エピトープの決定方法は、任意で以下の３）の工程を加えてもよい。
３）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を競合反応させ
る反応系（吸光度）において、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１の配
列からなるアミノ酸残基の少なくとも１つによる、前記抗体とプレセプシンとの結合の競
合阻止は２０％未満である前記抗体を選択する工程。
【０１６７】
また、本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の
工程を含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程、および、
２）当該候補の抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用い
て得られた同検体中のプレセプシン測定値との相関係数が０．９以上を示す前記抗体を選
択する工程。
【０１６８】
前記方法は、本発明の第一の態様、及び、実施例５の記載に従い、実施可能である。相
関係数も適宜変更可能である。
【０１６９】
また、本発明の第八の態様において、別の好ましい態様のひとつは、少なくとも下記の
工程を含む本発明の抗体のスクリーニング方法である。
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る、および
２）プレセプシンに対して、１０−８Ｍ未満の親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）で結合す
る抗体を選択する工程。
前記  ２）の工程は、以下の工程に置き換えられてもよい。
２）該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する結合
活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
【０１７０】
親和性（平衡解離定数、ＫＤ値）や結合活性の測定は、本発明の第一の態様の記載に従
い実施可能である。結合活性は、吸光度比で評価してもよい。好ましくは、Ｓ６８抗体と
プレセプシンを反応させたときの吸光度を１としたときの、本発明の抗体とプレセプシン
を反応させたときの吸光度の比は２以上である。
【０１７１】
以上の本発明の抗体のスクリーニング方法は、各工程を組み合わせて実施されてもよい
。好ましい組み合わせは、例えば、以下のとおりである。
少なくとも以下の工程を含む、抗プレセプシン抗体のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体を得る工程
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸
残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５
０％以上競合阻止される前記抗体を選択する工程、および、
３）該抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体のプレセプシンに対する結合
活性と比較して優れる抗体を選択する工程。
【０１７２】
９．敗血症患者の治療方法
本発明の第九の態様は、本発明の第一の態様の抗体又は抗原結合性抗体断片を用いて、
敗血症の検出を補助するための方法が施行された被験者に対して、敗血症治療を行う、敗
血症患者の治療方法である。
【０１７３】
敗血症の検出を補助するための方法は、本発明の第二の態様に記載のとおりである。敗
血症治療は、特に限定されないが、例えば、抗菌薬やステロイドの投与、昇圧剤、補液、
酸素投与、人工呼吸管理、持続的血液濾過透析、血漿交換などが挙げられる。
【０１７４】
１０．被験薬（又は治療薬）のスクリーニング方法
本発明の第十の態様は、本発明の第一の態様の抗体又はその抗原結合性抗体断片、ある
いは、第三の態様のキットを用いて、被験薬（又は治療薬）が投与された被験者の検体中
のプレセプシン濃度を決定する工程を含む、被験薬（又は治療薬）のスクリーニング方法
である。被験薬が対象とする疾患は、被験者の検体中のプレセプシン濃度が上昇する疾患
であれば特に限定されない。好ましくは、被験薬の投薬前と投与後で被験者の検体中のプ
レセプシン濃度を比較して、被験薬投与後のプレセプシン濃度が投与前と比較して低下す
るか否かを決定する。あるいは、被験薬投与後の被験者の検体中のプレセプシン濃度が正
常人レベルまで低下するか否かを決定してもよい。
【０１７５】
すなわち、以下の工程を含む被検薬のスクリーニング方法である。
１)被検薬が投与された被験者の検体中のプレセプシン濃度を決定する工程
【０１７６】
１１．ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、配列番号３（ヒト全長可溶型ＣＤ１４）の１位から６４位
の配列と抗体重鎖のＦｃ領域を含む構造を有する。
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの作製は、例えば、実施例９−（２）に記載するように、ヒト
ｓＣＤ１４の１位から６４位の配列の下流にトロンビン認識配列を有する配列、及び、ヒ
ト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域の配列を有する、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃを発現する
一過性発現用プラスミドを、ＣＯＳ−１細胞のような宿主細胞にトランスフェクションし
、その宿主細胞を培養し、得られた培養上清を回収して精製することにより得ることがで
きる。
【０１７７】
ヒトｓＣＤ１４の１位から６４位の配列とＦｃの間には、切断を容易にする配列が挿入
されることが望ましく、特に限定されないが、トロンビン認識配列の他にも、例えば、Fa
ctor Xa認識配列、PreScission Protease認識配列などが用いられてもよい。ｒｓＣＤ１
４ＳＴ−Ｆｃは、切断を容易にする配列を有することは必須ではない。
【０１７８】
抗体重鎖のＦｃ領域は、ヒト由来ＩｇＧ１抗体由来の他にも、あらゆる抗体のＦｃ領域
が使用可能である。宿主細胞も特に限定されない。
【０１７９】
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、ＣＯＳ−１細胞等の宿主細胞を培養することで得られるた
め発現が容易であり、また、ＦｃはプロテインＡと特異的に結合し、精製にプロテインＡ
カラムを用いることができるため、精製も容易であるという製造上の利点を有する。Ｆｃ
領域を切断後の精製は、プロテインＡカラムの他にも常法を用いて精製が可能であり、例
えば、ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１３に記載の方法等を用いて精製してもよい
。
【０１８０】
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、Ｆｃ領域を切断してｒｓＣＤ１４−ＳＴとして用いること
もできるし、Ｆｃ領域を切断しないでｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃのまま用いることもでき、
両者とも抗プレセプシン抗体と特異的に結合する。
【０１８１】
実施例９−（２）で作製したｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、ｒｓＣＤ１４ＳＴとＦｃの間
に、ｒｓＣＤ１４−ＳＴ標準品調製時と同じトロンビン配列を挿入している。Ｆｃ領域を
トロンビンで切断して得られるｒｓＣＤ１４ＳＴは、ｒｓＣＤ１４ＳＴ標準品と同一配列
を有し、同等の特性を有する（ＷＯ２００５／１０８４２９参照）。
【０１８２】
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−ＦｃからのｒｓＣＤ１４の調製は、Ｆｃ領域の切断後、プロテイン
Ａカラムを通すことでＦｃのみを容易に除去することができ、調製も容易である。ｒｓＣ
Ｄ１４ＳＴ−ＦｃのＦｃ領域の切断手段は、挿入した切断を容易にする配列に合わせて適
宜選択しうる。
【０１８３】
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、Ｆｃ領域を切断しないでｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃのままで
も、ｒｓＣＤ１４−ＳＴの活性を有するため、抗原として利用可能である。
【０１８４】
従来のｒｓＣＤ１４−ＳＴ標準品は、ヒトｓＣＤ１４の６４位と６５位の間にトロンビ
ン認識部位を挿入したｒｓＣＤ１４を宿主細胞で発現させて、トロンビン認識部位で切断
して得られる。ｒｓＣＤ１４の構造は、ｒｓＣＤ１４−ＳＴを含むが、そのままではｒｓ
ＣＤ１４−ＳＴとしての反応性をほとんど示さず、切断して精製した後、ｒｓＣＤ１４−
ＳＴの活性が得られ、使用可能となる。一方、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃは、Ｆｃ領域を切
断しなくてもｒｓＣＤ１４−ＳＴと同様に用いることができるため、切断の手間を削減で
き、簡易に使用できる。
【実施例】
【０１８５】
（実施例１）合成ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の作製
１−（１）ウサギの免疫
ＷＯ２００４／０４４００５の実施例１に記載の方法に従い、投与抗原の作製、ウサギ
の免疫を行った。すなわち、配列番号２に記載の配列（配列番号３に記載の５３位から６
８位の配列に該当）からなるペプチド（以下、Ｓ６８ペプチドと記載）のＮ末端にシステ
インを挿入したペプチドを作製した。このペプチドにＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ）を結合し、
投与抗原とした（以下、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨと記載）。
【０１８６】
Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ１００μｇを等量のフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ
）と混合後、ニュージーランド白色ウサギ（３月齢）の背部皮内に投与した。その２週間
後とさらにその１週間後にそれぞれ、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ１００μｇをフロインド不
完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮内に投与した。さらに２回Ｓ６８
ペプチド−ＫＬＨ２０μｇを耳静脈内に投与した。
【０１８７】
投与終了１週間後耳静脈より採血し、定法に従い抗血清を分離し、抗体価及びプレセプ
シンに対する反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて確認した。すなわち、イムノプレ
ート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１、Ｎｕｎc社）に、Ｆ１１０６−１３−
３を固定化後、ブロッキングした。ウサギの各抗血清をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈
し、×1/1000〜×1/32000倍までの倍々希釈列（8ポイント）を調製した。プレセプシン標
準品（ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１６に記載のｒｓＣＤ１４−ＳＴ）を希釈液
（0.1％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈し3ng/mLの標準液を調製した。抗血清希釈列をプレー
トに添加し、続いて3ng/mLの標準液を添加した。プレートを1時間反応させ、続けてプレ
ートを0.05％Tween20を含む生理食塩水で5回洗浄した。次に抗ウサギIgs-HRP（DAKO、P44
8）を希釈した溶液を100μL添加し、25℃で1時間反応させた。同様に5回プレートを洗浄
後、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を添加し、室温10分間反応さ
せた。反応終了後、1M硫酸溶液で反応を停止した。450/650nmの吸光度をＭｕｌｔｉｓｋ
ａｎＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。吸光度測定の結果に基づ
き、抗体価の高い個体を選択した。
【０１８８】
脾臓の採取4日前にＳ６８ペプチド−ＫＬＨ４００μｇを耳静脈内に投与し、脾臓を無
菌的に採取し、リンパ球を回収した。
【０１８９】
１−（２）細胞融合およびクローニング
米国特許第７４２９４８７号に記載の方法に従って、２×１０８cellsのリンパ球とウ
サギ由来不死化Ｂリンパ球融合パートナーの１×１０８cellsとを混合し、２回に分けて
細胞融合を実施した。融合した細胞を９６穴プレートに播種し、常法に従って培養した。
【０１９０】
得られた２８６クローンの培養上清について、投与抗原との結合活性をS６８ペプチド-
ＢＳＡを用いて確認し、結合活性が確認された７２クローンを選択した。
【０１９１】
投与抗原との結合活性が確認された７２クローンについて、１−（１）と同様のサンド
イッチＥＬＩＳＡ系により、プレセプシン標準品との結合活性を確認し、結合活性が確認
されたクローンを選択した。
【０１９２】
プレセプシン標準品との結合活性が確認されたクローンについて、患者の血中のプレセ
プシンに対する特異性の確認を行った。すなわち、正常人血清３例（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社
）及び敗血症患者血清３例（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社）を希釈液で5倍希釈し、
１−（１）と同様のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて同様に測定した。その結果、プレ
セプシン標準品との反応性が良好であり、かつ、正常人検体で吸光度が上昇せず、敗血症
患者検体で吸光度が上昇する５クローンを選択した。各クローンを限界希釈法にてクロー
ニングしたのち、凍結アンプルをそれぞれ調製した。
【０１９３】
１−（３）ＢＩＡＣＯＲＥによる結合様式の解析
選択したクローンから得られる各抗体とプレセプシンとの結合様式を確認するため、Ｂ
ＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥヘルスケア）を用いて解析を行った。ＣＭ５チップ（ＧＥヘ
ルスケア）にＦ１１０６−１３−３抗体を定法により固定化し、そこにプレセプシン標準
品（１μｇ／ｍｌ）を添加した。さらに希釈した培養上清（0.5μg/mｌ）を添加し、セン
サーグラムをプロットした。どのクローンも解離相での解離が認められない良好な結合様
式を示した。
【０１９４】
１−（４）ウサギモノクローナル抗体の調製
作製したウサギ抗プレセプシンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを用いてウサギ
モノクローナル抗体を調製した。すなわち、定法に従い凍結アンプルを解凍し、１０％牛
胎児血清、８％サプリメントＡ（Ａｂｃａｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）で
培養後、細胞を回収しＣＥＬＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のプロ
トコールに従いＩＳ−ＭＡＢ-ＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ）で培養し抗体を含む培養上清を
回収した。次に得られた培養上清からｒｍｐ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＦＦ（ＧＥヘルスケア）を用いて抗体を精製した。精製抗体を含む溶出液を濃縮し、続
けてＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。抗体のタンパク濃度は牛ＩｇＧ（Ｂｉ
ｏＲａｄ）を標準品としてＢｒａｄｆｏｒｄ法で求めた。得られた抗体をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分析したところ、分子量約１５０ｋＤａの単一バンドが確認され、また還元すること
で約５０ｋＤａの重鎖と約２５ｋＤａの軽鎖が確認された。
【０１９５】
（実施例２）組換え抗体の作製
２−（１）ウサギモノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列の決定と発現用プラスミド
の構築
実施例１で得られた、各ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キア
ゲン）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した
。得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＲａｂｂｉｔ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｒ
ａｄｅｒ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  ＪＢＣ  ２０００；２７５：１３６６８−７６、および
Ｌａｎｇ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９９６；１７２：２９５−８）によるＰＣ
Ｒで可変領域を増幅し、常法に従い、重鎖および軽鎖の各可変領域の塩基配列を決定した
。
【０１９６】
可変領域以外の配列情報はデータベース上を検索し、５’側プライマーおよび３’側プ
ライマーを設計した。これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、重鎖全長お
よび軽鎖全長をそれぞれ増幅し、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであり、ＥＦ−１α
プロモーター及びＣＭＶエンハンサーを有するｐＴＫ−２４３３へクローニングした。常
法に従い、重鎖全長および軽鎖全長の塩基配列及びそれらにコードされるアミノ酸配列を
決定した。抗体の可変領域のＣＤＲ部分のアミノ酸配列を表１０および表１１に示した。
【０１９７】
【表１０】
2019205458.tif 000013
【０１９８】
【表１１】
2019205458.tif 000014
【０１９９】
２−（２）一過性発現組換え抗体の調製
前記２−（１）で作成した一過性発現用プラスミド（重鎖配列を含む発現プラスミドと
軽鎖配列を含む発現プラスミド）を等量混合しＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６
５０）に、トランスフェクションした。すなわち、トランスフェクション試薬２μＬ/ｍ
Ｌ及びプラスミド４μg/ｍＬを混合し、培地に添加した後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７
℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収し、さらに新しい培地を添加した。９６時間
後、培養上清を回収し２回分を混合後、０．２２μｍのフィルター（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、
ミリポア）でろ過した。得られた培養上清は、前記１−（４）に記載の方法に従って精製
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、約１５０ｋＤａの単一バンドの組換え抗体が確
認された。
【０２００】
２−（３）組換え抗体安定発現用プラスミドの構築
前記２−（２）で作成した一過性発現用プラスミドから制限酵素を用いて重鎖をコード
する遺伝子断片と軽鎖をコードする遺伝子断片を切り出し、ＥＦ−１αプロモーター、お
よびマウスＤＨＦＲ発現ユニット〔プロモーターとしてＳＶ４０プロモーター（エンハン
サー領域は含まない）、ＳＶ４０由来ｐｏｌｙＡシグナル〕を有するプラスミド（ｐＴＫ
-２５７７；特開２００７−２１５５４６に記載）に組み込み、哺乳動物細胞での安定発
現用プラスミドを作製した。
【０２０１】
（実施例３）ＣＨＯ細胞による抗体の作製
３−（１）ウサギモノクローナル抗体の遺伝子組換え抗体産生ＣＨＯ細胞の調製
ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ  ＤＸＢ１１）に、前記２−（３）で構築した
安定発現用プラスミドをトランスフェクションし、ウサギ抗体産生形質転換ＣＨＯ株を樹
立した。即ち、ＨＴ  ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  （５０×）  Ｈｙｂｒｉ−Ｍ
ａｘ（Ｓｉｇｍａ；終濃度１×で使用）及び２００ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉ
ｇｍａ；終濃度４ｍＭで使用）を含むＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２  ＰＦ  ＣＨＯ（ＪＲＨ  
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて馴化培養したＣＨＯ  ＤＸＢ１１をトランスフェクション当
日に遠心後、８×１０６ｃｅｌｌｓ／１５０ｃｍ２  Ｒｏｕｘの濃度でフラスコに植え込
んだ。ＦｕＧＥＮＥ６（プロメガ）１２５μｌを用いて、発現プラスミド１２．５μｇを
ＦｕＧＥＮＥ６添付プロトコールに準じ調製し、先のＣＨＯ  ＤＸＢ１１へ導入した。５
％ＣＯ２で３７℃、２日間培養した後に、細胞を回収し、ＨＴ不含４ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔ
ａｍｉｎｅ含有ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３０２  ＰＦ  ＣＨＯ培地（以下ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＨＴ
−）と記載）で二度洗浄し、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に再度懸濁した。次に１２，５０
０〜５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに細胞を蒔き直し、
５％ＣＯ２、３７℃で培養を続け、３日あるいは４日毎に培地の半量を新しいＥＸ−ＣＥ
ＬＬ（ＨＴ−）に交換した。約２週間培養を続けた後、コロニーが発生したウェル内の細
胞を新しいプレートに移した。
【０２０２】
ＣＨＯ細胞の培養上清中の抗体を、Ｓ６８ペプチド抗原を固相に使用したＥＬＩＳＡ法
でスクリーニングしＳ６８ペプチドと結合する抗体を産生するＣＨＯ細胞を５種類選択し
た。
【０２０３】
３−（２）Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅを用いた遺伝子増幅
３−（１）で得られた組換え抗体発現形質転換ＣＨＯ株を、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ
（以下ＭＴＸと表記）を含むＥＸ−ＣＥＬＬ（ＨＴ−）培地で選択培養することにより、
遺伝子増幅作業を行い目的の組換え抗体の生産量が上昇しているクローンの選択を行った
。  即ち、実施例３−（１）で得られた形質転換株を３０ｎＭ  ＭＴＸ含有ＥＸ−ＣＥＬ
Ｌ（ＨＴ−）培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに巻き込んだ。３日あるいは４日
毎に培地の半量を新しい３０ｎＭ  ＭＴＸ含有ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＨＴ−）に交換し、コロ
ニーが生じるまで５％ＣＯ２、３７℃で培養を続けた。得られたコロニーの培養上清中へ
のＩｇＧ濃度をＥＩＡ法で確認し、生産量の増加しているクローンを選択した。その結果
、生産量が約２ないし１０倍上昇した形質転換株を得ることができた。尚、この遺伝子増
幅した形質転換株を、ＭＴＸ濃度を３ないし１０倍上げた培地で選択培養を繰り返すこと
により、さらに生産量が増加するクローンを得ることができる。
【０２０４】
３−（３）ＣＨＯ細胞による組換え抗体の生産
３−（２）で得られたクローンを３０ｎＭ  ＭＴＸ含有ＣＨＯ−ＳＦＭ（ＨＴ−）培地
（ＧＩＢＣＯ）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで植え込み、３７℃で７日間培養した。得
られた培養上清を以下の精製に用いた。培養上清を、プロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ
−Ａ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精製した組換え抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析したところハイブリドーマ由来の抗体と同等の分子量を示す抗体が確認された。
【０２０５】
（実施例４）サンドイッチＥＬＩＳＡ系での各抗体の反応性評価
実施例２で調製したウサギモノクローナル抗体５種、ＷＯ２００４／０４４００５の実施
例１に記載のＳ６８抗体（Ｓ６８ペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗
体）及びＷＯ２００４／０４４００５の実施例２に記載のＦ１１４６−１７−２（Ｓ６８
ペプチドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体）について、プレセプシンとの
反応性評価を行った。
すなわち、各抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（
Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一夜反応後、イオ
ン交換水で５回洗浄し、０．1％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ
）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬）を含むＰＢＳを各ウエルに２００μＬ添加しブ
ロッキングした。次に、プレセプシン標準品を希釈液で１０００ｎｇ／ｍＬに希釈し、続
けて３倍公比により希釈し、標準品の希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当た
り５０μＬ添加し、２５℃で１時間反応した。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む生理食塩水で５回洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１
１０６−１３−３抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。２５℃で２時間反応後、同様に５
回洗浄し、ＴＭＢ溶液を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液
で反応を停止し、プレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０
ｎｍ（副波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。
【０２０６】
測定結果を表１２に示す。実施例２で調製した各ウサギモノクローナル抗体を用いた測
定系はいずれもプレセプシン標準品との反応性に優れ、Ｓ６８抗体を用いた測定系とほぼ
同等の反応性を示した。
【０２０７】
一方、Ｆ１１４６−１７−２を用いた測定系は反応性が低く、プレセプシン濃度が１０
００ｎｇ／ｍＬのときの吸光度は０．３６８であった。この吸光度は、ウサギモノクロー
ナル抗体を用いた測定系では、プレセプシン濃度が０．０３〜０．１ｎｇ／ｍＬのときの
吸光度とほぼ同等であった。このことから、ウサギモノクローナル抗体を用いた測定系は
、Ｆ１１４６−１７−２を用いた測定系と比較して、約１万倍反応性を改善したことが明
らかとなった。正常人検体のプレセプシン濃度は、通常、約５０〜３００ｐｇ／ｍＬであ
るため、Ｆ１１４６−１７−２を用いた測定系では測定不能であることが示された。
【０２０８】
【表１２】
2019205458.tif 000015
【０２０９】
（実施例５）患者検体の測定と干渉試験
実施例２で作製した各抗体を用いて、実施例４に記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ系によ
り、敗血症患者検体３０例の血中プレセプシン値の測定を行い、Ｓ６８抗体を用いたサン
ドイッチＥＬＩＳＡ系による測定値との相関分析を行った。
【０２１０】
その結果、各ウサギモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系において、Ｓ６８抗体を
用いたＥＬＩＳＡ系による測定値と相関のよい系と劣る系が存在した。ウサギモノクロー
ナル抗体のＦ１４６６−１２、Ｆ１４６６−１９の相関係数は、他と比較して劣る結果で
あった。それぞれの抗体の相関係数は、Ｆ１４６６−１２は０．８９、Ｆ１４６６−１９
は０．９３、Ｆ１４６６−２６は０．９８であった。
【０２１１】
次に、各ウサギモノクローナル抗体、及び、Ｓ６８抗体を用いて、それぞれ作製したサ
ンドイッチＥＬＩＳＡ系において、血中の干渉物質（ビリルビンF、ビリルビンC、ヘモグ
ロビン、リウマチ因子、及びトリグリセライド）がプレセプシン測定値に与える影響を検
討した。一定量のプレセプシンを添加した健常人の血清に、段階的な濃度の各干渉物質を
添加してプレセプシン濃度を測定し、各干渉物質が測定値に与える影響を、干渉物質無添
加のときの測定値を基準として評価した。
【０２１２】
その結果、いずれの抗体を用いた測定系においても、ビリルビンＦ、ビリルビンＣ、ヘ
モグロビン及びリウマチ因子の干渉は問題とならないレベルであった。
【０２１３】
一方、トリグリセリド（ＴＧ）については、一部の抗体を用いた測定系に影響を与えた
。ＴＧ干渉試験は次のように実施した。検体は一定量のプレセプシンを添加した正常人ヒ
ト血清を用いた。イントラリピッド輸液２０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社）を用いて検体中
のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬまで段階的に希釈サンプルを作製した。このＴＧ濃度は検体の
血清に元々含まれるＴＧは考慮していない。希釈サンプルを検体希釈液で２０倍希釈し、
ＥＬＩＳＡによりプレセプシン値を測定した。複数の検体についてこのＴＧ干渉試験を実
施した。
【０２１４】
この結果、Ｆ１４６６−１２、Ｆ１４６６−１９の抗体を用いた測定系については、Ｔ
Ｇ添加がプレセプシン測定値に影響を与え、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプ
レセプシン測定値の解離度は±２０％より大きい検体の比率が高かった。
【０２１５】
また、検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度を、複数
の検体で求め、その解離度の平均値を各抗体について算出した。その結果、解離度の平均
値が±２０％以下を示すのは、Ｓ６８抗体、Ｆ１４６６−５、及び、Ｆ１４６６−２６を
用いた測定系であった。
【０２１６】
一方、Ｆ１４６６−１２、Ｆ１４６６−１９、及びＦ１４６６−１６の抗体を用いた測
定系においては、解離度の平均値は±２０％を超える結果であった。
【０２１７】
さらに、各ウサギモノクローナル抗体を用いたアッセイ系とＳ６８抗体を用いたアッセ
イ系の間で、ＴＧ添加によるプレセプシン測定値の解離度を比較した。すると、ＴＧ添加
により検体中のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬとしたときの、Ｆ１４６６−１２の測定系の解離
度とＳ６８抗体の測定系の解離度の差、及び、Ｆ１４６６−１９の測定系の解離度とＳ６
８抗体の測定系の解離度の差は、いずれも２０％より大きい差を示す検体の比率が高かっ
た。
【０２１８】
このことから、ＴＧ干渉試験における抗体の性能の違いが、前記相関分析の結果に影響
を与えている可能性が示唆された。
【０２１９】
Ｆ１１４６−１７−２についても干渉物質の試験を試みたが、反応性が低いため、デー
タが得られなかった。
【０２２０】
（実施例６）抗体の特異性  エピトープ解析
実施例２で作製した各ウサギモノクローナル抗体及びＦ１１４６−１７−２（Ｓ６８ペプ
チドをラットに免疫して得られたモノクローナル抗体）のエピトープの解析を行った。
【０２２１】
実施例１で投与抗原とした配列番号２のペプチド配列の部分断片を含む１０アミノ酸か
らなるペプチドを８種類合成し（表１３参照）、実施例４に記載のサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ系によりプレセプシン標準品との競合阻止反応を見ることでエピトープ配列を検討した
。すなわち、実施例４に記載の方法にしたがって、各抗体の固定化プレートを調製した。
次にプレセプシン標準品４００ｐｇ／ｍＬと表１３に示した合成ペプチド（Ｐ０１〜Ｐ０
８）２０μｇ／ｍＬを各２５μＬプレートに添加し、反応させた。陰性コントロールとし
てペプチド無添加（ＰＢＳと記載）及びネガティブコントロール用ペプチド（ＮＣと記載
：配列ＣＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥ（配列番号３４））を用いた。また、陽性コントロ
ールとしてＳ６８ペプチドを用いた。反応終了後、ＴＭＢで発色させた。合成ペプチドが
抗体と反応すると、プレセプシン標準品の抗体への結合が阻害されることから、吸光度が
低下した。ＰＢＳの吸光度を１００％として各ペプチドの阻止率を計算した。
【０２２２】
その結果、表１４に示すようにＰ０３のみを認識する抗体、Ｐ０３からＰ０４を認識す
る抗体、Ｐ０４からＰ０５を認識する抗体が確認された。また、Ｆ１１４６−１７−２は
Ｐ０４からＰ０５を認識することが明らかになった。この結果、Ｐ０３の位置をエピトー
プとして認識するモノクローナル抗体が得られたことが明らかとなった。実施例５におい
て、ＴＧ干渉試験及びＳ６８抗体を用いた測定系との相関に劣る結果であったＦ１４６６
−１２、Ｆ１４６６−１９は、ラットモノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２）と同
じくＰ０４からＰ０５を認識し、Ｐ０３をエピトープとしないことが分かった。その他の
抗体は、Ｐ０３をエピトープとして認識していた。このことから、抗体がプレセプシン測
定に適する性能を有することと、抗体が認識するエピトープとの関連性が示唆された。ま
た、プレセプシンは、高分子量ｓＣＤ１４のＣ端部を大きく欠損したアミノ酸配列を有し
ており、そのアミノ酸の長さにはバリエーションがあると想定される。抗体の特異性の違
いが、実施例５におけるＳ６８抗体を用いた測定値との相関に影響を与えた可能性も考察
された。
【０２２３】
【表１３】
2019205458.tif 000016
【０２２４】
【表１４】
2019205458.tif 000017
【０２２５】
（実施例７）エピトープの詳細解析
Ｐ０３ペプチドを認識するウサギモノクローナル抗体について、Ｐ０３ペプチドを１ア
ミノ酸ずつ改変したペプチドとの反応性を検討した。
Ｐ０３ペプチド（配列番号１のアミノ酸配列、かつ、配列番号３の配列の５２位から６
１位からなるアミノ酸配列に該当）において、５３位から６１位のアミノ酸を、１アミノ
酸ずつ、アラニン（元のアミノ酸がアラニンの場合にはグリシン）で置換したペプチド（
Ｐ０３１〜Ｐ０３９ペプチド）を作製し、Ｐ０３１〜Ｐ０３９ペプチドと抗体の反応性を
、実施例４の記載に従い、サンドイッチＥＬＩＳＡ系により確認した。
【０２２６】
その結果、Ｐ０３ペプチドにおける配列番号３の５９位のアスパラギン酸（配列番号１
の８位に該当）をアラニンに置換したとき、抗体との結合活性が消失した。
【０２２７】
Ｐ０３ペプチドにおける配列番号３の５３位〜５８位（配列番号１の２〜７位に該当）
、配列番号３の６０位及び６１位（配列番号１の９位及び１０位）のアミノ酸をアラニン
（又はグリシン）に置換しても、抗体との結合活性は維持された。
【０２２８】
以上より、Ｐ０３ペプチドをエピトープとして認識する抗体は、Ｐ０３ペプチドにおけ
る配列番号３に記載の５３位〜５８位、６０位及び６１位のアミノ酸を１アミノ酸ずつア
ラニン（又はグリシン）に置換したペプチドもまたエピトープとして認識することが確認
された。
【０２２９】
（実施例８）ウサギ由来抗プレセプシンモノクローナル抗体の改変体の作製
実施例１に記載のウサギから得られた抗プレセプシンモノクローナル抗体の配列をもと
に改変体を作製した。
【０２３０】
８−（１）ＣＤＲ配列の解析
実施例１で得た抗プレセプシン抗体５種類のＣＤＲ配列を解析したところ、各抗体の配列
には、抗体の活性に影響する配列と、影響しない配列があることが推測された。そこで、
実施例６でＰ０３（配列番号１）の配列をエピトープとして認識していることが明らかと
なった抗体のひとつであるＦ１４６６−２６抗体のＣＤＲ配列を基本に、各ＣＤＲ配列の
アミノ酸の改変を行って改変体を調製し、改変体の活性を評価した。約１００個の改変体
を作製した。アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失、あるいは、数個のアミ
ノ酸配列の置換等を行った。
【０２３１】
また、Ｆ１４６６−２６抗体の重鎖全長とＦ１４６６−５抗体の軽鎖全長を含む改変体
も調製し、同様に評価した。
【０２３２】
８−（２）重鎖改変体調製用プラスミドの調製
重鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドｐＴＫ−５７９３について
示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例２で得られたＦ１４６６−２６
の重鎖全長を含む重鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ−５６０５）を鋳型とし、プライ
マー対（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１４−１２）−ｅ：３‘側プライマーおよびＡｏｒ１３
ＨＩ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＶ２：５’側プライマー）でＰＣＲを行った。さらに得られた
増幅断片を鋳型にしてプライマー対（ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１４−１２）−ｅ、Ａｏｒ
１３ＨＩ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＶ２）でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をプラスミド
ｐＴ７−Ｂｌｕｅへクローニングし、制限酵素Ａｏｒ１３ＨＩで目的の配列を含む断片を
調製した。また、ＥＦ−１αプロモーター及びＣＭＶエンハンサーを有し、ウサギＩｇＧ
のＨ鎖可変領域以外の部位を含む遺伝子配列を有する、哺乳細胞での一過性発現用ベクタ
ーであるｐＴＫ−４２７３（自社）を制限酵素Ａｏｒ１３ＨＩで切断し、ベクター断片を
調製した。調製した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、ｐＴＫ−５
７９３を調製した。
【０２３３】
８−（３）軽鎖改変体調製用プラスミドの調製
軽鎖改変体用プラスミドを以下のように調製した。プラスミドｐＴＫ−５８４４について
示すが、他のプラスミドも同様の方法で構築した。実施例２で得られたＦ１４６６−２６
の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ−５６０８）を鋳型とし、プライ
マー対（ｐＥＦ２ｃｅ−２８：３‘側プライマーおよびｐＥＦ２ｃｅ−４９：５’側プラ
イマー）でＰＣＲを行った。さらに得られた増幅断片を鋳型にしてプライマー対（ｐＥＦ
２ｃｅ−２８、ｐＥＦ２ｃｅ−４９）でＰＣＲを行った。得られた増幅断片をプラスミド
ｐＴ７−Ｂｌｕｅへクローニングし、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで目的の配列を
含む断片を調製した。また、哺乳細胞での一過性発現用ベクターであるｐＴＫ−２４３３
（自社）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、ベクター断片を調製した。調製
した目的の配列を含む断片をベクター断片にクローニングし、ｐＴＫ−５８４４を調製し
た。
【０２３４】
プライマーの配列
ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１４−１２）−ｅ  ：  ５’ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  
ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  Ｇ  ３’(配列番号８５)
Ａｏｒ１３ＨＩ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＶ２  ：  ５’ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  
ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ３’ (配列番号８６)
ｐＥＦ２ｃｅ−２８  ：  ５’ ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ａ
Ｃ  ３’ (配列番号８７)
ｐＥＦ２ｃｅ−４９  ：  ５’ ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＴ  Ｔ
ＧＴ  ＧＧＴ  ３’ (配列番号８８)
【０２３５】
８−（４）一過性発現組換え抗体の調製
以下、代表例として重鎖改変体調製用プラスミドｐＴＫ−５７９３を用いた抗体の一過性
発現の方法を示した。実施例８−（２）で調製した重鎖改変体調製用プラスミド（ｐＴＫ
−５７９３）と、実施例８−（３）記載の軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ−５６０
８）とを等量混合し、ＣＯＳ―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）に、トランスフェ
クション試薬（ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６、プロメガ社）を用いてトランスフェクショ
ンした。すなわち、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄ
ｉｕｍ（ライフテクノロジーズ製）を希釈液として、トランスフェクション試薬０．９６
μＬ／２５μＬ及びプラスミド０．４８μg／２５μLを調製して混合し、培地に添加した
後、ＣＯＳ―１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収した。
【０２３６】
同様に、各重鎖改変体調製用プラスミドは、軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ−５
６０８）と混合して用いた。各軽鎖改変体調製用プラスミドは、重鎖一過性発現用プラス
ミド（ｐＴＫ−５６０５）と混合して用いた。Ｆ１４６６−２６抗体の重鎖全長とＦ１４
６６−５抗体の軽鎖全長を含む改変体は、ｐＴＫ−５６０５と、Ｆ１４６６−５の軽鎖全
長を含む軽鎖一過性発現用プラスミドとを混合して作製した。
【０２３７】
（実施例９）改変体の評価（１）
実施例８において、ＣＯＳ−１細胞で発現させて得られた改変体（ＩｇＧ抗体）１６種
類を精製し、各抗体のプレセプシンとの反応性、特異性、親和性（ＫＤ値）を評価した。
【０２３８】
９−（１）抗体の精製
８−（４）で得られたＣＯＳ−１細胞の培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター
（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、ミリポア）でろ過した。得られた培養上清からＰｒｏｓｅｐ  ｖＡ
（ミリポア）を用いて精製した。精製物を含む溶出液を濃縮し、続けてＤ−ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）に対して透析した。タンパク濃度はＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を標準品としてＬｏ
ｗｒｙ法で求めた。得られた抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、約１５０ｋＤａ
の単一バンドの組換え抗体が確認された。
【０２３９】
９−（２）一過性発現ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの調製
まず、ｐＴＫ３５６Ｈ（ＴＢ６４）（ＷＯ２００５／１０８４２９の実施例１３に記載
のｒｓＣＤ１４をコードする配列を有するプラスミド）を鋳型とし、プライマー対（ｈＣ
Ｄ１４‐ａ，ｈＣＤ１４‐ｄ）とＴａｑ酵素（タカラバイオ）によりＰＣＲ反応を行った
。得られた増幅断片（シグナル配列を含む配列番号３のヒトｓＣＤ１４の１〜６４位の配
列の下流にトロンビン認識配列を有し、両端に制限酵素部位をもつ）をｐＴ７Ｂｌｕｅベ
クター（ミリポア）にＴＡクローニングし、配列を確認し、これをｐＴＫ‐３０４７とし
た。次に、ｐＴＫ‐３０４７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して得られた
断片を、予めｐＴＫ‐２２３３（ヒト由来ＩｇＧ１抗体重鎖のＦｃ領域をコードする配列
を有する哺乳細胞用発現プラスミド）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して調製して
おいたベクター断片に挿入し、得られたクローンをｐＴＫ‐３０５３とした。
【０２４０】
ｈＣＤ１４‐ａの配列  ５´‐ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＣ
ＧＣＧＴＣＣＴＧＣ‐３´(配列番号８９)
ｈＣＤ１４‐ｄの配列  ５´‐ＧＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＴＧＣＣＧＣＧＧＧ‐３´(配列番号９０)
【０２４１】
ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃを発現する一過性発現用プラスミドｐＴＫ−３０５３をＣＯＳ
―１細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）に、トランスフェクションした。すなわち、ト
ランスフェクション試薬２μＬ/ｍＬ及びプラスミド４μg/ｍＬを混合し、培地に添加し
た後、ＣＯＳ−１細胞に添加し３７℃で培養した。７２時間後、培養上清を回収し、さら
に新しい培地を添加した。９６時間後、培養上清を回収し２回分を混合後、０．２２μｍ
のフィルター（Ｓｔｅｒｉｖａｃ、ミリポア）でろ過した。得られた培養上清を、Ｐｒｏ
ｓｅｐ  ｖＡ（ミリポア）を用いて精製した。精製物を含む溶出液を濃縮し、続けてＤ−
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。タンパク濃度は、ＢＳＡ（ＢｉｏＲａｄ）を標
準品としてＬｏｗｒｙ法で求めた。得られたｒｓＣＤ１４ＳＴ−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で分析したところ、分子量約７５ｋＤａの単一バンドが確認された。調製したｒｓＣＤ１
４ＳＴ−Ｆｃの抗プレセプシン抗体との結合活性は、抗原を固相に固定化したＥＬＩＳＡ
により確認した。
【０２４２】
９−（３）サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
９−（１）で精製した改変体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。すなわち、
Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に各改変体を固
定化し、ブロッキングした。次に、プレセプシン標準品（０〜３００ｐｇ／ｍＬ）を添加
し、プレートを２５℃で１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を
含む生理食塩水で５回洗浄した。次にＦ１１０６−１３−３  Ｆ（ａｂ´）２−ＨＲＰを
希釈した溶液を各ウェルに添加し、２５℃で２時間反応させた。同様に５回プレートを洗
浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温２０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応
を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。
【０２４３】
９−（４）特異性の評価（１）
９−（１）で精製した改変体の特異性を評価するため、Ｐ０３ペプチド（実施例６で作製
、配列番号１）を固定したプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。比較のため、Ｆ１４
６６−２６の評価も行った。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢ
ＳＡ、又は、Ｐ０３ペプチド−ＢＳＡをそれぞれプレートに固定化後、ブロッキングした
。
【０２４４】
９−（１）で得られたタンパク濃度の結果よりＤ−ＰＢＳで希釈し、５００ｎｇ／ｍＬ
に調製した。各希釈液を１ウェル当たり５０μＬ添加し、プレートを１時間反応させ、続
けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサ
ギＩｇｓ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ４４８）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温で１
時間反応させた。同様にプレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３−５分間反応さ
せた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレ
ートリーダー（モレキュラーデバイス）で測定した。改変体の改変したＣＤＲ配列ととも
に、結果を表１６〜表２２に示す。
【０２４５】
その結果、改変体の８７％が、Ｐ０３ペプチドと結合することが分かり、Ｐ０３の位置
をエピトープとして認識していることが示唆された。すなわち、得られた改変体のうち、
５７９５、５８０３、５８１１、５８１０、５７８４、５７９３、５８５８、５８７８、
５８７５、５８７６、５８４４、５８７４、及び、５６８４は、Ｐ０３の位置をエピトー
プとして認識していることが示唆された。
【０２４６】
９−（５）親和性の評価
改変体の、プレセプシン（９−（２）で調製したｒｓＣＤ１４ＳＴ−ＦＣを用いた）、Ｐ
０３ペプチドおよびＳ６８ペプチドとの親和性（ＫＤ）を評価した。また、Ｓ６８抗体、
ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２）、及び、Ｆ１４６６−２６につ
いても同様に評価を行った。
【０２４７】
親和性の測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ＧＥヘルスケア）を用いて行った。ＣＭ５
チップ（ＧＥヘルスケア）にｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ、Ｐ０３−ＢＳＡおよびＳ６８−Ｂ
ＳＡを常法によりそれぞれ固定化し、各抗体希釈列（１．６−１０００ｎＭ）を添加し、
それぞれの抗原に対する結合様式を測定した。センサーグラムをプロットし、結合速度定
数（Ｋａ）及び解離速度定数（Ｋｄ）を求め、平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。  
【０２４８】
Ｓ６８抗体、ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２）、及びＦ１４６
６−２６のｒｓＣＤ１４ＳＴ−ＦＣに対する親和性（ＫＤ）測定の結果を表１５に示した
。
【０２４９】
その結果、Ｆ１４６６−２６は（ＫＤ値は１．４８Ｅ−０９）、Ｓ６８抗体（ＫＤ値は
１．０８Ｅ−０８）と比較して、プレセプシンとの親和性がＫＤ値で約１０倍高かった。
また、Ｆ１４６６−２６は、ラット由来モノクローナル抗体（Ｆ１１４６−１７−２：Ｋ
Ｄ値は１．０８Ｅ−０５）と比較すると、プレセプシンとの親和性（ＫＤ値）が約１００
００倍高いことが分かった。
【０２５０】
各改変体のｒｓＣＤ１４ＳＴ−ＦＣに対する親和性（ＫＤ）測定の結果を、改変したＣ
ＤＲ配列とともに表１６〜表２２に示した。その結果、改変体の８０％が、Ｓ６８抗体と
比較して同等以上の親和性を有することが分かった。Ｆ１４６６−２６のＣＤＲ配列の改
変により、プレセプシンとの親和性（ＫＤ値）が、Ｆ１４６６−２６に比して、約１００
０倍上昇した改変体（５８１０）が得られた。
【０２５１】
本発明の望ましい態様のひとつは、抗体のプレセプシンに対する親和性が、Ｓ６８抗体
のプレセプシンに対する親和性と比較して優れる抗体であり、ＫＤ値で比較すると、好ま
しい抗体としては、例えば、Ｆ１４６６−２６，改変体の５７９５、５８０３、５８１０
、５７８４、５７９３、５８５８、５８４４、５６８４が挙げられた。また、抗体のＫＤ
値が、１０−８未満を示す抗体も好ましく、Ｆ１４６６−２６、５７９５、５８０３、５
８１０、５７８４、５７９３、５８５８、５８４４、５６８４が挙げられた。また、抗体
のＫＤ値が、Ｓ６８抗体のＫＤ値の１／２以下を示すプレセプシンとの親和性に優れる抗
体も好ましく、Ｆ１４６６−２６、５７９５、５８０３、５８１０、５７８４、５７９３
が挙げられる。特に優れたＫＤ値を示したのは、５７９３（７．３Ｅ−１０）と５８１０
（６．５２Ｅ−１２）であった。
【０２５２】
Ｆ１４６６−２６の重鎖全長とＦ１４６６−５の軽鎖全長を組み合わせた改変体５６８
４は、Ｐ０３特異性及びプレセプシンとの結合活性が維持されることが分かった。Ｆ１４
６６−２６とＦ１４６６−５は、同じＰ０３の位置をエピトープとして認識する抗体であ
ることから、同じ特異性をもつ抗体間で配列を置換しても、抗体の活性は維持される可能
性が示唆された。
【０２５３】
実施例２で示したとおり、Ｐ０３をエピトープとして認識するＦ１４６６−５及びＦ１
４６６−２６の重鎖ＣＤＲ３配列は、いずれもＧＤＦであり、３アミノ酸という比較的短
い配列により構成されており、本抗体の特徴的な点と考えられた。
【０２５４】
また、改変体の５７９３では、重鎖ＣＤＲ３の３番目の改変により親和性の上昇がみら
れたことから、重鎖ＣＤＲ３の３番目のアミノ酸は、抗体の活性に影響する可能性が示唆
された。
【０２５５】
【表１５】
2019205458.tif 000018
【０２５６】
【表１６】
2019205458.tif 000019
【０２５７】
【表１７】
2019205458.tif 000020
【０２５８】
【表１８】
2019205458.tif 000021
【０２５９】
【表１９】
2019205458.tif 000022
【０２６０】
【表２０】
2019205458.tif 000023
【０２６１】
【表２１】
2019205458.tif 000024
【０２６２】
【表２２】
2019205458.tif 000025
【０２６３】
９−（６）特異性の評価（２）  ペプチド競合阻止反応
実施例６に準じて、各改変体とプレセプシンとの反応に対する、Ｐ０１からＰ０８ペプ
チドによる競合阻止反応試験を行った。
試験は、改変体を固相に固定化したＥＬＩＳＡを用いて実施した。すなわち、Ｎｕｎｃ
社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に改変体を固定化後、ブ
ロッキングした。プレセプシン標準品（３００ｐｇ／ｍＬ）を１ウェル当たり２５μＬ添
加した。続いて希釈した各ペプチドを（０．０１−１０μｇ／ｍＬ）を２５μＬ添加した
。プレートを２５℃で１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む生理食塩水で５回洗浄した。次にＦ１１０６−１３−３  Ｆ（ａｂ´）２−ＨＲＰを希
釈した溶液を各ウェル５０μＬ添加し、２５℃で２時間反応させた。同様に５回プレート
を洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３０−４０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸
溶液で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。陰
性コントロールとしてペプチド無添加（ＰＢＳと記載）、陽性コントロールとしてＳ６８
ペプチドを用いた。ＰＢＳの吸光度を１００％として各ペプチドの阻止率を計算した。そ
の結果、表２３に示すように、試験を実施した改変体は全てＰ０３配列を特異的に認識し
ていることが確認された。
【０２６４】
【表２３】
2019205458.tif 000026
【０２６５】
（実施例１０）改変体の評価（２）
実施例８で調製した改変体のうち、実施例９で評価を行っていない改変体について、プ
レセプシンに対する結合活性及び特異性の評価を行った。
【０２６６】
１０−（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の測定
実施例８−（４）で得られた培養上清中のＩｇＧ濃度を確認するため、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡを用いてＩｇＧ濃度を測定した。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩ
ＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、Ｚ１９６）をプレートに
固定化後、ブロッキングした。精製ウサギモノクローナル抗体を標準品として希釈液（０
．１％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈し１００−１．５６ ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。
次に、回収した培養上清を希釈液（０．１％ＢＳＡ/Ｄ-ＰＢＳ）で希釈した。培養上清希
釈液又は標準品希釈列をウェルに添加し、プレートを１時間反応させ、続けてプレートを
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサギＩｇｓ−ＨＲ
Ｐ（ＤＡＫＯ、Ｐ３９９）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温１時間反応させた。
同様に５回プレートを洗浄後、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を
添加し、室温１０分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、４５０／
６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で測定した。各培養上
清中の抗体濃度は標準品濃度希釈列の検量線を用いて算出した。
【０２６７】
１０−（２）プレセプシンに対する結合活性及び特異性の評価
改変体のプレセプシンに体する結合活性及び特異性を評価するため、抗原を固相に固定
したプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢ
ＳＡ、ｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ、又はＰ０３ペプチド−ＢＳＡをそれぞれプレートに固定
化後、ブロッキングした。
【０２６８】
培養上清のＩｇＧ濃度の結果より培養上清をＤ−ＰＢＳで希釈し、５００ｎｇ／ｍＬに
調製した（抗体濃度が薄いものは培養上清の原倍を使用した）。各上清希釈液を１ウェル
当たり５０μＬ添加し、プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄した。次に抗ウサギＩｇｓ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ、Ｐ
４４８）を希釈した溶液を各ウェルに添加し、室温で１時間反応させた。同様にプレート
を洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温３−５分間反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液
で反応を停止した。４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（モレキュラーデバ
イス）で測定した。
【０２６９】
プレセプシンに対する結合活性の評価では、比較のため、Ｓ６８抗体の評価も行った。
プレセプシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体とｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの反応時の吸光度
を１としたときの、各抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの反応時の吸光度の比で表した。結
果を、各改変体の改変した配列とともに表２４〜表２９に示す。
【０２７０】
その結果、抗体のほとんどがＰ０３と結合することが確認され、７６％の抗体がＰ０３
をエピトープとして認識していることが示唆された。
【０２７１】
また、Ｆ１４６６−２６及び改変体の多くは、Ｓ６８抗体と比較して、吸光度比で約４
〜５倍高い、プレセプシンに対する優れた結合活性を有していた。Ｆ１４６６−２６のプ
レセプシンに対するＫＤ値及び吸光度比と比較すると、これらの抗体のプレセプシンに対
するＫＤ値は、実施例９で測定された、抗体のプレセプシンに対する好ましいＫＤ値と同
程度と考えられた。
【０２７２】
本発明の望ましい態様のひとつは、抗体のプレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗
体の同活性と比較して優れる抗体である。例えば、本実施例に準じて吸光度を用いる場合
、Ｓ６８抗体以上の吸光度を示す抗体、好ましくは、Ｓ６８抗体の２倍以上の吸光度を示
す抗体が望ましいと考えられた。
得られた抗体のうち、プレセプシンに対する結合活性が、Ｓ６８抗体の５倍以上の吸光
度を示す、特に結合活性に優れた抗体は、５９３４、５９３５、５９３９、５９４４、５
８０８、５８０９、５８２４、５９７９，５９８０、５９８３、５９８４、５９８７、５
９８８、５８６０、５８６４、５８６３であった。中でも、５９７９、５９８３、５９８
８、５８６４は、Ｓ６８抗体の５．５倍以上の吸光度を示し、特に優れたプレセプシンに
対する結合活性を有していた。
【０２７３】
【表２４】
2019205458.tif 000027
【０２７４】
【表２５】
2019205458.tif 000028
【０２７５】
【表２６】
2019205458.tif 000029
【０２７６】
【表２７】
2019205458.tif 000030
【０２７７】
【表２８】
2019205458.tif 000031
【０２７８】
【表２９】
2019205458.tif 000032
【０２７９】
（実施例１１）
合成ペプチドを抗原としたファージディスプレイ法を用いたモノクローナル抗体の作製
実施例１−（１）において、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨを投与抗原としてウサギに免疫し
て回収した脾臓からのリンパ球を用いて、ファージディスプレイ法によりモノクローナル
抗体を作製しうる。
【０２８０】
１１−（１）免疫Ｆ（ａｂ）ファージライブラリーの構築
ＣＡＲＬＯＳ  Ｆ．  ＢＡＲＢＡＳIII等  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ａ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って実施しうる。実施例１−（１）で回収したリ
ンパ球よりＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用
いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔ
ｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡからＢＡＲＢＡＲ
ＳIII等より報告されているウサギ抗体遺伝子特異的プライマーを用いて重鎖可変領域を
含む断片と軽鎖可変領域を含む断片を調製する。得られたウサギ重鎖可変領域およびヒト
重鎖ＣＨ１の増幅断片を鋳型にしてＰＣＲによりウサギ／ヒトキメラ重鎖断片を増幅し、
ウサギ軽鎖可変領域（カッパ型又はラムダ型）およびヒト軽鎖定常領域の増幅断片を鋳型
にしてウサギ／ヒトキメラ軽鎖断片を増幅する。得られたこれらウサギ／ヒトキメラ重鎖
およびウサギ／ヒトキメラ軽鎖の断片を鋳型にして最終的にウサギ／ヒトキメラＦａｂ断
片を調製する。次に、抗体発現用ファージミドであるｐＣＤｉｓｐｌａｙ−４（Ｃｒｅａ
ｔｉｖｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅ）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断し、ファージミド
断片を調製する。同様にウサギ／ヒトキメラＦａｂ断片をＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断
し、調製したファージミド断片にｃＤＮＡ断片を挿入し、ファージライブラリー発現用プ
ラスミドを調製する。
【０２８１】
１１−（２）ファージディスプレイ用ファージ溶液の調製
１１−（１）で調製したプラスミドを大腸菌ＴＧ１株（Ａｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）に常法により形質転換させ、大腸菌を含む溶液をアンピシリンを添加したＬＢ
培地のプレートに播種する。３７℃で培養後、形成されたコロニーを回収し大腸菌のライ
ブラリーを調製する。ライブラリーの一部を培養し、この大腸菌懸濁液に、Ａｍｐｉｃｉ
ｌｌｉｎおよびＧｌｕｃｏｓｅを添加し、３７℃で１時間、振とう培養する。その後、ヘ
ルパーファージＭ１３ＫＯ７（ライフテクノロジーズ）を感染させ、さらに１時間、振と
う培養を続ける。遠心分離により集菌し、培養液を捨てた後、１０ｍＬの２×ＹＴ培養液
に懸濁し、３７℃で振とう培養する。翌日、培養上清を遠心分離後、上清８ｍＬを別のチ
ューブへ移し、２ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を加えて混合し、氷上に１時間静置した後
に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、これをファージディスプレイ用のファー
ジ溶液とする。
【０２８２】
１１−（３）パンニング法による目的抗体の選択
１１−（２）で調製したファージ溶液からパンニング法により抗体を選択する。パンニ
ングは２種類の方法で実施する。第一の方法としてＢＡＲＢＡＳ等の記載の方法に準じて
実施する。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３
４１）にＳ６８−ＢＳＡをプレートに固相化後、ブロッキングする。４％スキムミルク０
．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＤ−ＰＢＳを１ウエル当たり５０μＬ添加後、１１
−（２）で得たファージ液を５０μＬ添加する。プレートを１時間反応させ、続けてプレ
ートを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＤ−ＰＢＳで洗浄する。次に１００ｍＭ  
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で１０分間溶出し、回収した溶液を１Ｍ  Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和する。この溶出液と大腸菌ＴＧ１株を混合し、３７℃で
反応させ、Ｓ６８ペプチド抗原に結合したファージをＴＧ１株に再感染させる。培養液に
アンピシリン、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、３７℃で反応させた後、大腸菌
を回収し、培地及びカナマイシンを添加し、一晩培養する。培養液から遠心分離により上
清を回収し、ＰＥＧ処理によりファージ液を調製する。同様な操作を３回繰り返し、Ｓ６
８ペプチドに結合する特異的なファージを濃縮する。
【０２８３】
第２の方法として実施例１２−（２）記載の方法を用いて同様にパンニングを３回行い
、プレセプシンに特異的なファージを濃縮する。
【０２８４】
１１−（４）抗体の結合活性の測定とＣＤＲ配列の解析
１１−（３）の、ファージを感染させたＴＧ１培養液を、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを含むＬ
Ｂプレートに播種しコロニーを形成させる。それぞれのコロニーから再度ファージ溶液を
調製し、ＥＩＡで反応性の確認を行う。すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩ
ＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にＢＳＡ、Ｓ６８−ＢＳＡ、Ｐ０３−ＢＳＡ及びｓＣ
Ｄ１４ＳＴ−Ｆｃをプレートにそれぞれ固定化後、ブロッキングする。４％スキムミルク
、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＤ−ＰＢＳを添加後、回収したファージ液を添
加する。プレートを１時間反応させ、続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
生理食塩水で５回洗浄する。次にＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を希釈した溶液を各ウエルに添加し、
室温１時間反応させる。同様に５回プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温１０−
２０分間反応させる。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反応を停止する。４５０／６５０ｎｍ
の吸光度をプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ
ｓ）で測定する。その結果、複数のファージで結合が確認される。それらコロニーからフ
ァージミドを単離し、配列を確認する。
【０２８５】
ファージディスプレイ法により、ハイブリドーマ法で得られたＣＤＲ配列とは異なる配
列を有する、Ｐ０３及びプレセプシンと特異的に結合する抗プレセプシン抗体が得られる
。
【０２８６】
（実施例１２）ファージディスプレイ法を用いた重鎖ＣＤＲ３配列の改変体の作製
重鎖ＣＤＲ３配列は、抗体の活性に影響することが予測されたため、ファージディスプ
レイ法を用いて、重鎖ＣＤＲ３配列の改変体を作製し、評価した。
【０２８７】
１２−（１）ファージディスプレイ法を用いたＶＨ鎖ＣＤＲ３配列の改変体の調製
ＶＨ  ＣＤＲ３ランダムミューテーションライブラリーを調製するため、Ｆ１４６６−２
６の重鎖と軽鎖を含むプラスミドｐＴＫ‐５９５６を鋳型とし、プライマー対（ｐ‐ｎｎ
ｋ３‐２ｓ；５’リン酸化‐ＧＧＴ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＡ
ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  Ｔ‐３’：配列番号９１，ｐ‐ｎ
ｎｋ３‐２ａ；５’リン酸化‐ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＣＧ
Ｔ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  Ｇ‐３’配列番号９２（ＮはＧ
，Ａ，Ｔ，Ｃのいずれかを、ＫはＧあるいはＴを表す））と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（
タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片をＤＮＡリガーゼによって
自己結合させた。これを大腸菌ＸＬ１‐Ｂｌｕｅ（アジレントテクノロジー）に形質転換
し、ＬＢ／Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ／Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ寒天プレート上で培養し、
翌日生じたコロニーを、２×ＹＴ培養液で回収した。この大腸菌懸濁液に、Ａｍｐｉｃｉ
ｌｌｉｎ、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ、およびＧｌｕｃｏｓｅを添加し、３７℃で１時間
、振とう培養を行った。その後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ライフテクノロジーズ
）を感染させ、さらに１時間、振とう培養を続けた。遠心分離により集菌し、培養液を捨
てた後、１０ｍＬの２×ＹＴ培養液に懸濁し、３２℃で振とう培養を行った。翌日、培養
上清を遠心分離後、上清８ｍＬを別のチューブへ移し、２ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を
加えて混合し、氷上に１時間静置した後に、沈殿したファージを遠心分離により回収し、
これをＶＨ  ＣＤＲ３ランダムミューテーションライブラリーのファージ溶液とした。
【０２８８】
１２−（２）パンニング法による目的抗体の選択
１２−（１）で調製したライブラリーよりパンニングを実施し、抗体を選択した。すなわ
ち、１２−（１）で得られたファージ液（２ｍＬ）とｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ  ６μｇと３
７℃で反応させ、２時間後プロテインＡ樹脂（Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡ、ミリポア）２００μ
Ｌを添加し、２０分間反応させた。０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄し
た後、樹脂に溶出液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．２））を添加し８分
間静置後、溶出したファージ液を回収し、溶液を中和した。この回収液と大腸菌ＸＬ−１
Ｂｌｕｅ培養液を混合し、３７℃で反応させた。１時間後、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、
アンピシリンおよびヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（インビトロジェン）を添加し、３７
℃で反応させた。さらに１時間後、培地を２ｘＹＴ培地に交換し、一晩培養しｒｓＣＤ１
４ＳＴ−Ｆｃに特異的に結合したファージを回収した。この操作を３回くり返し、目的の
抗体を濃縮した。
【０２８９】
１２−（３）プレセプシン特異的配列を含むファージの調製およびＣＤＲ配列の決定
１２−（２）で最終的に得られたファージ液を再度ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに感染させ、その
培養上清を２×ＹＴのプレートに播種し、コロニーを作製した。このコロニーを再度ＸＬ
−1  Ｂｌｕｅと培養し、ヘルパーファージを添加し単一ファージを含むファージ溶液を
調製した。次に得られたファージ液を用いて、ＥＬＩＳＡで反応性の確認をおこなった。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）にｓ
ＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃをプレートに固定化後、ブロッキングした。４％スキムミルク、０．
２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＤ−ＰＢＳでファージ液を２倍希釈し、プレートで１
時間反応させた。続けてプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗
浄し、希釈したＨＲＰ／Ａｎｔｉ−Ｍ１３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
（ＧＥヘルスケア）を各ウェル５０μＬ添加し、室温１時間反応させた。同様に５回プレ
ートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し、室温で反応させた。反応終了後、１Ｍ硫酸溶液で反
応を停止し、４５０／６５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＭａｘ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。結合活性の確認できたファージ液を大
腸菌に感染させ、プラスミドを常法により回収し、遺伝子配列を確認した。
【０２９０】
１２−（４）ＩｇＧ抗体の調製
得られた候補ファージからファージミドを回収し、重鎖の可変領域をコードする断片を
調製した。実施例８に記載の方法に従って、重鎖改変体調製用プラスミドを調製し、Ｆ１
４６６−２６の軽鎖全長を含む軽鎖一過性発現用プラスミド（ｐＴＫ−５６０８）ととも
に、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。ＣＯＳ−１細胞を３７℃で培養し、７
２時間後、培養上清を回収した。
【０２９１】
１２−（５）重鎖ＣＤＲ３配列の改変体の評価
得られた改変体について、実施例１０−（２）と同様の試験を実施し、プレセプシン（ｒ
ｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃ）に対する結合活性及びＰ０３特異性を評価した。改変した重鎖Ｃ
ＤＲ３のＣＤＲ配列とともに、結果を表３０に示す。
【０２９２】
その結果、重鎖ＣＤＲ３の３アミノ酸とも置換された改変体６０２７は、他の改変体と
比較して、プレセプシンに対する反応性がやや低かったが、Ｓ６８抗体との比較ではほぼ
同等の反応性を有していた。改変体の６０２６、６０２８及び６０２９は、２アミノ酸が
置換されたが、プレセプシンに対する反応性に優れていた。このことから、重鎖ＣＤＲ３
が３アミノ酸で構成されるとき、２アミノ酸が置換された場合でも抗体の活性が維持され
る可能性が示唆された。改変体の６０２８は、プレセプシンとの結合活性が特に優れてい
た。
【０２９３】
【表３０】
2019205458.tif 000033
【０２９４】
（実施例１３）トリグリセライド（ＴＧ）干渉試験
実施例５及び実施例６では、Ｐ０４−０５をエピトープとして認識する抗体によるプレ
セプシン測定は、検体中のＴＧによる干渉を受けやすいが、Ｐ０３をエピトープとして認
識する抗体によるプレセプシン測定は、ＴＧ干渉を受けにくいことが示唆された。
【０２９５】
１３−（１）正常人ヒト血清を用いたＴＧ干渉試験（１）
さらに確認を進めるため、正常人検体におけるＴＧの影響を確認した。Ｆ１４６６−２
６（特異性：Ｐ０３）、Ｆ１４６６−５（Ｐ０３）及び、Ｆ１４６６−１９（Ｐ０４−０
５）について、正常人ヒト血清を用いてＴＧ干渉試験を実施した。
【０２９６】
正常人検体（８検体）（ＥＤＴＡ血漿、ＴＥＮＥＣＥＥ  ＢＬＯＯＤ  ＳＥＲＶＩＣＩ
ＥＳ）に、ＴＧを最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、添加前後のプレセプシン
測定値を比較した。このときのＴＧ濃度は、検体中の元々含まれるＴＧは考慮していない
。各抗体をそれぞれ固相に固定化したプレートを用いて、実施例９−（３）に記載のサン
ドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて評価した。結果を図１に示す。
【０２９７】
その結果、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体であるＦ１４６６−２６及びＦ１４
６６−５は、ＴＧ添加前後で、測定値の変動がほとんど見られなかったのに対して、Ｐ０
４-０５をエピトープとして認識する抗体であるＦ１４６６−１９では、測定値がＴＧ添
加の影響を強く受けた。プレセプシン測定値が検体中のＴＧの影響を強く受ける抗体によ
る測定は、Ｆ１４６６−１９のように、本来、低値を示す健常者の測定値が高めに出るこ
とが予想される。この場合、正常値と異常値の差がつきにくくなる。このような抗体は、
検体中のプレセプシン測定には適さないといえる。一方、Ｐ０３をエピトープとして認識
する抗体は、検体中のＴＧの影響を受けにくく、検体中のプレセプシン測定に適する抗体
であることが確認された。
【０２９８】
また、この正常人ヒト血清を用いた試験は、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体を
用いたアッセイ系では、高分子量ｓＣＤ１４との交差反応は問題とならない程度であるこ
とを裏付けるものである。
【０２９９】
正常人ヒト血清中、プレセプシンは数百ｐｇ／ｍＬであるのに対して、高分子量ｓＣＤ
１４は５．６〜１１．２μｇ／ｍＬ程度存在しており（ＷＯ２００５／１０８４２９、実
施例１２）、もし当該抗体が高分子量ｓＣＤ１４と反応するのであれば微量なプレセプシ
ンは測定不可能である。
【０３００】
本実施例により、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体を用いたアッセイ系では、高
分子量ｓＣＤ１４との交差反応を起こさず、数百ｐｇ／ｍＬ程度の微量のプレセプシンの
測定が可能であることが確認された（図１）。
【０３０１】
１３−（２）改変体のＴＧ干渉試験（２）
新規に得られた改変体について、実施例５と同様にＴＧ干渉試験を実施し、検体中のＴ
Ｇの影響を確認した。改変体は精製して用いた。
すなわち、Ｎｕｎｃ社イムノプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＰ、Ｃ９６、４３０３４１）に改
変体を固定化後、ブロッキングした。プレセプシン標準品を希釈液で希釈しプレセプシン
の濃度系列（１５．６−５００ｐｇ／ｍＬ）を調製した。ヒト検体３種類にトリグリセラ
イド（イントラピッド、フレゼニウス  カービ  ジャパン）を添加し、最終濃度６．７、
１３．３、２０ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。ヒト検体は、敗血症患者の血清１例と
正常人ヒト血清に一定量のプレセプシンを添加した検体２例を用いた。また、このＴＧ濃
度は、検体に元々含まれるＴＧは考慮していない。検体を希釈液で２０倍希釈し、ＴＧ無
添加若しくは各濃度のＴＧを添加したサンプル、又は標準品希釈列を各ウエルに添加した
。実施例９−（３）と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定を実施した。検体中
のＴＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±２０％以下の検体の
割合（％）を表３１に示す。
その結果、Ｐ０３をエピトープとして認識する抗体はトリグリセライドの影響を受けにく
いことが確認された。
【０３０２】
【表３１】
2019205458.tif 000034
【０３０３】
（実施例１４）好ましい性能を有する改変体のリスト
本発明の実施例８および１２で得られた、好ましい性能を有する抗体のＣＤＲ配列を図
２〜図２−２に示す（配列番号９３〜１５６）。実施例８および１２において作製した抗
体の数の合計は１０９個であり、好ましい抗体の数は６５個であった。
抗体のプレセプシンに対する親和性（ＫＤ値）が１０−８Ｍ未満の抗体は○、１０−９
Ｍ未満の抗体は◎として評価した。ＫＤ値が１０−７Ｍ未満であるが、Ｓ６８抗体のプレ
セプシンに対する親和性とほぼ同等の親和性を有する抗体は△として評価した。ＫＤ値に
よる評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、５７９３と５８１０であっ
た。
プレセプシンに対する結合活性は、Ｓ６８抗体とｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの反応時の吸光度
を１としたときの、各抗体とｒｓＣＤ１４ＳＴ−Ｆｃの反応時の吸光度の比で評価された
。抗体は、吸光度比が４以上の抗体は○、５．５以上の抗体は◎として評価した。吸光度
比による評価で、特にプレセプシンとの結合活性に優れる抗体は、５８６４、５９７９、
５９８３、５９８８、及び、６０２８であった。
【０３０４】
本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］  （ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１：Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＭＸ４
；
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２：ＩＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＡＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３；及び
（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６；並びに
（ｉｖ）軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１：Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３
Ｘ２４；
（ｖ）ＶＬ  ＣＤＲ２：ＫＸ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｓ；及び
（ｖｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３：Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２ＹＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７；を含
み、
Ｘ１〜Ｘ３７は、以下に選択肢として記載の１または複数個のアミノ酸配列であり、Ｘ１
＝任意の１個のアミノ酸、Ｘ２＝Ｙ又はＦ、Ｘ３＝Ｔ、Ａ又はＷ、Ｘ４＝Ｇ又はＳ；
Ｘ５＝Ｉ又はＶ、Ｘ６＝ＮＳＧＡ、ＹＲＮＩＫ、ＡＮＳＧＡ、ＳＳＤＧＧ、ＳＤＩＤＱ又
はＳＤＩＤＤ、Ｘ７＝Ｔ、Ｉ又はＬ、Ｘ８＝Ｙ、Ｖ又はＦ、Ｘ９＝Ｓ又はＴ，Ｘ１０＝Ｗ
又はＡ、Ｘ１１＝Ａ又はＧ、Ｘ１２＝Ｋ又はＡ、Ｘ１３＝Ｇ又はＡ；
Ｘ１４＝Ｇ、Ａ、Ｌ又はＳ、Ｘ１５＝Ｄ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｇ又はＬ、
Ｘ１６＝Ｆ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｈ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｌ、Ｅ又はＨ；
Ｘ１７＝Ｑ又はＡ、Ｘ１８＝Ａ又はＧ、Ｘ１９＝Ｓ又はＡ、Ｘ２０＝ＱＳ、ＥＤ又はＱＮ
、Ｘ２１＝Ｉ又はＡ、Ｘ２２＝ＧＳＮ、ＩＳＮ、ＧＳＤ又はＳＮＹ、Ｘ２３＝Ｌ又はＡ、
Ｘ２４＝Ａ又はＳ；
Ｘ２５＝Ａ又はＴ、Ｘ２６＝Ｓ又はＡ、Ｘ２７＝Ｋ又はＴ、Ｘ２８＝Ｌ又はＡ、Ｘ２９＝
Ａ又はＥ；
Ｘ３０＝Ｑ又はＡ、Ｘ３１＝Ｃ又はＳ、Ｘ３２＝Ｓ又はＴ、Ｘ３３＝Ｔ又はＹ、Ｘ３４＝
ＡＩＧＮＹ、ＥＳＴＴＦ、ＡＩＧＮＡＹ又はＲＳＴＴＴＹ、Ｘ３５＝Ｇ又はＡ、Ｘ３６＝
Ｈ又はＮ、Ｘ３７＝Ｖ、Ａ又はＴ；
配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシン抗体
又はその抗原結合性抗体断片。
［２］  前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及び
ＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  
ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３は、以下に選択肢として記載の複数個のアミノ酸配列である
、上記［１］に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１＝ＲＹＡＭＧ、ＲＹＴＭＧ、ＳＦＷＭＳ、ＳＹＴＭＧ、ＡＹＴＭＧ
、ＭＹＴＭＧ、ＰＹＴＭＧ、ＶＹＴＭＧ、ＩＹＴＭＧ、ＤＹＴＭＧ、ＥＹＴＭＧ、ＨＹＴ
ＭＧ、ＴＹＴＭＧ、ＱＹＴＭＧ、ＹＹＴＭＧ、ＧＹＴＭＧ、ＫＹＴＭＧ、ＮＹＴＭＧ又は
ＷＹＴＭＧ；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２＝ＩＩＡＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＡ
ＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＡＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳＷＡＫＡ、ＩＩＮＳ
ＧＡＴＹＹＡＳＷＧＫＧ、ＩＩＹＲＮＩＫＴＹＹＡＴＷＡＫＧ、ＩＩＮＳＧＡＴＹＹＡＳ
ＷＡＫＧ、ＩＶＳＳＤＧＧＩＹＹＡＳＷＡＫＧ、ＩＩＳＤＩＤＱＩＶＹＡＴＷＡＫＧ又は
ＩＩＳＤＩＤＤＬＦＹＡＳＷＡＫＧ；及び
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３＝ＧＤＦ、ＧＧＬ、ＡＤＦ、ＧＤＡ、ＬＤＦ、ＳＤＦ、ＧＦＦ、Ｇ
ＳＦ、ＧＰＦ、ＧＨＦ、ＧＩＦ、ＧＮＦ、ＧＲＦ、ＧＤＳ、ＧＤＰ、ＧＤＨ、ＧＤＤ、Ｇ
ＤＩ、ＧＤＮ、ＧＤＲ、ＧＶＬ、ＧＧＥ又はＧＬＨ；並びに
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１＝ＱＡＳＥＤＩＩＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳ
ＡＧＳＮＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＳＮＹＬＡ、ＱＡＡＱＳＩＧＳＮＬＡ、ＱＧＳＱＳＩＧＳＮ
ＬＡ、ＱＡＳＱＳＩＧＳＮＡＡ、ＡＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡ又はＱＡＳＱＮＩＧＳＤＬＳ；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２＝ＫＡＳＴＬＡＳ、ＫＡＳＫＬＡＳ、ＫＴＳＴＬＥＳ、ＫＡＳＫＡ
ＡＳ又はＫＡＡＫＬＡＳ；及び
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３＝ＱＳＳＹＴＥＳＴＴＦＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶ、Ｑ
ＳＴＹＹＲＳＴＴＴＹＧＮＴ  、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＡＹＧＨＶ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹ
ＧＨＡ、ＱＣＳＹＴＡＩＧＮＹＡＨＶ又はＡＣＳＹＴＡＩＧＮＹＧＨＶである、前記抗体
又はその抗原結合性抗体断片。
［３］  前記抗体又はその抗原結合性抗体断片が、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及び
ＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２及びＶＨ  ＣＤＲ３、並びに、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  
ＣＤＲ２及びＶＬ  ＣＤＲ３は、以下の１）〜  ６８）のいずれかである、上記［１］又
は［２］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片であって、
１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号９７、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号４、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号５、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１９、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２０、ＶＬ  ＣＤＲ
３が配列番号２１の各アミノ酸配列からなる；
４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤＲ
３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１０、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１、ＶＨ  ＣＤＲ３が
配列番号１２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２５、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２６、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２７の各アミノ酸配列からなる；
６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配列
番号９３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９５、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号９８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号９９の各アミノ酸配列からなる；
１１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１００、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
１３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１０２、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１０３、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号１０１の各アミノ酸配列からなる；
１６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０４、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０５、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０６、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
１９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０７、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１０９、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１０、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号１１１、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１２の各アミノ酸配列からなる；
２５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１３の各アミノ酸配列からなる；
２６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１４、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１５、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
２８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  ＣＤ
Ｒ３が配列番号１１６の各アミノ酸配列からなる；
２９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１１７、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１１８、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１１９、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２０、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号１２１、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号１２３、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  Ｃ
ＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１２４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１２５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
３９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１２９、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３０、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３１、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３２、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３３、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３４、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３５、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３６、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
４９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３８、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号１３９、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３
が配列番号９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４０、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４１、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
５９）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４７、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６０）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４８、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６１）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１４９、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６２）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５０、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６３）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５１、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６４）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５２、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６５）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５３、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６６）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５４、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；
６７）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５５、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる；または、
６８）ＶＨ  ＣＤＲ１が配列番号７、ＶＨ  ＣＤＲ２が配列番号８、ＶＨ  ＣＤＲ３が配
列番号１５６、ＶＬ  ＣＤＲ１が配列番号２２、ＶＬ  ＣＤＲ２が配列番号２３、ＶＬ  
ＣＤＲ３が配列番号２４の各アミノ酸配列からなる、である、前記抗体又はその抗原結合
性抗体断片。
［４］  （ａ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９７のアミ
ノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤ
Ｒ３を含むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番
号２３のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列から
なるＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号９４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含
むＶＨ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３の
アミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び、配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び、配列番号６のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含む
ＶＨ、並びに、配列番号１９のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０のア
ミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列からなるＶＬ  Ｃ
ＤＲ３を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列か
らなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶ
Ｈ、並びに、配列番号２２のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３のアミ
ノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤ
Ｒ３を含むＶＬ；または
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配
列からなるＶＨ  ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ３を
含むＶＨ、並びに、配列番号２５のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６
のアミノ酸配列からなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＬ
ＣＤＲ３を含むＶＬ、
を含む抗プレセプシン抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［５］  前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０−８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で
結合する、上記［１］ないし［４］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体
断片。
［６］  前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１の配
列からなるアミノ酸残基を競合反応させる反応系（吸光度）において、前記抗体とプレセ
プシンとの結合が５０％以上競合阻止される、上記［１］ないし［５］のいずれか１項に
記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［７］  前記抗体又は断片とプレセプシンとの結合が阻止されるように、アミノ酸残基を
競合反応させる反応系（吸光度）において、配列番号１の８位のアスパラギン酸をアラニ
ンに置換した配列からなるアミノ酸残基による、前記抗体とプレセプシンとの結合の競合
阻止が２０％未満である、上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の抗体又はその
抗原結合性抗体断片。
［８］  配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、上記［１］ないし［
７］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［９］  前記抗体は、高分子量可溶型ＣＤ１４とは特異的には結合しない、上記［１］な
いし［８］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［１０］  前記抗体を用いて、複数の検体についてトリグリセライド（ＴＧ）干渉試験を
行うとき、検体中のＴＧ濃度が２０ｍｇ／ｍＬのときのプレセプシン測定値の解離度が±
２０％以下を示す検体の比率が５０％以上である、前記１ないし９のいずれか１に記載の
抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［１１］  前記抗体を用いて得られた検体中のプレセプシン測定値と、Ｓ６８抗体を用い
て得られた検体中のプレセプシン測定値との相関係数が、０．９以上を示す、上記［１］
ないし［１０］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［１２］  前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体
（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦ
ｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ＣＤＲを含むポリペプチド、重鎖可変領域を含むポリペプチド及
び軽鎖可変領域を含むポリペプチドからなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、
上記［１］ないし［１１］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
［１３］  上記［１］ないし［１２］のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性
抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
［１４］  上記［１３］に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
［１５］  上記［１４］記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株
。
［１６］  前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、上記［１５］に記載の形質転換株。
［１７］  上記［１５］または上記［１６］に記載の形質転換株を培養することを含む、
抗体またはその抗原結合性抗体断片の製造方法。
［１８］  少なくとも前記上記［１］ないし［１２］のいずれか１項に記載の抗体または
抗原結合性抗体断片を含む、プレセプシン測定用キット。
［１９］  少なくとも前記上記［１］ないし［１２］のいずれか１項に記載の抗体または
抗原結合性抗体断片を含む、敗血症を検出するためのキット、又は、敗血症の検出若しく
は診断を補助するためのキット。
［２０］  少なくとも前記上記［１］ないし［１２］のいずれか１項に記載の抗体または
抗原結合性抗体断片と、プレセプシンを含有する検体を接触させる工程を含む、プレセプ
シンの測定方法。
［２１］  少なくとも以下の工程を含む、敗血症の検出方法、又は、敗血症の検出若しく
は診断を補助するための方法であって、
１）上記［１］ないし［１２］のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性抗体断片を
用いて、検体中のプレセプシン濃度を測定する工程、及び、
２）  １）で得られたプレセプシン濃度がカットオフ値と比較して高値であるか否かを判
定する工程を含む、前記方法。
［２２］  少なくとも下記の工程を含む、抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片
のスクリーニング方法であって、
１）候補の抗プレセプシン抗体または抗原結合性抗体断片を得る工程、及び
２）当該抗体とプレセプシンとの結合が阻止されるように、配列番号１からなるアミノ酸
残基を競合反応させる反応系において、前記抗体とプレセプシンとの結合が５０％以上競
合阻止される前記抗体または抗原結合性抗体断片を選択する工程を含む、前記方法。
【図１】
2019205458.tif 000035
【図２】
2019205458.tif 000036
【図２−１】
2019205458.tif 000037
【図２−２】
2019205458.tif 000038
【配列表】
2019205458000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月5日(2019.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるエピトープを特異的に認識する、抗プレセプシンモノクローナル抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項２】
前記抗体又は断片は、プレセプシンに対して１０−８Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項３】
配列番号２に記載のペプチドを投与抗原として作製される、請求項１または２に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。
【請求項４】
前記抗原結合性抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびｓｃ（Ｆｖ）２からなる群から選ばれる抗原結合性抗体断片である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性抗体断片。