(57)【要約】【課題】植物からフラボノイドをより効率的に回収できるフラボノイドの抽出・単離方法を提供する。【解決手段】イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、及び前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出することを含む、フラボノイドの抽出方法。
【請求項２】
イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、及び
前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収することを含む、フラボノイドの単離方法。
【請求項３】
前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層との分離を、遠心分離により行う、請求項２に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項４】
前記抽出液と前記第二の有機溶媒との混合を、水と共に行う、請求項２又は３に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項５】
前記イオン液体が、セルロースを溶解できるイオン液体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項６】
前記イオン液体が、イミダゾリウム系イオン液体である、請求項２〜５のいずれか１項に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項７】
前記第一の有機溶媒が、ケトン類、アルコール類及びエステル類からなる群から選ばれる、請求項２〜６のいずれか１項に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項８】
前記フラボノイドが、ポリメトキシフラボノイドである、請求項２〜７のいずれか１項に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項９】
前記ポリメトキシフラボノイドが、ノビレチン及びタンゲレチンからなる群から選ばれる、請求項８に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項１０】
前記植物が、柑橘類である、請求項２〜９のいずれか１項に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項１１】
前記柑橘類が、シークヮーサー及びポンカンからなる群から選ばれる、請求項１０に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項１２】
前記植物が、その果皮部分である、請求項１０又は１１に記載のフラボノイドの単離方法。
【請求項１３】
イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、
前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収すること、及び
前記第二の有機溶媒を含む層から溶媒成分を除去して、フラボノイド含有組成物を得ることを含む、フラボノイド含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン液体を用いるフラボノイドの抽出方法及び単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドは、植物界に広く存在する（イソ）フラバン骨格を有する天然有機化合物群であり、現在までに数千種類のフラボノイドが同定されており、それぞれに様々な生理活性が知られている。
【０００３】
例えば、ノビレチン及びタンゲレチンは、柑橘類に含まれるフラボノイドであり、それぞれ１９３８年、１９４２年に陳皮から単離された有機化合物である。ノビレチン及びタンゲレチンは、発がん抑制作用や抗炎症作用、記憶障害改善作用、脳コリン作動性神経変性抑制効果、アルツハイマー病の原因物質アミロイドβ（Ａβ）の脳内での蓄積抑制作用、神経毒性抑制作用などの多様な薬理作用を有することが報告されている。そのため、生活習慣病の治療および予防薬として期待されている。
【０００４】
【化１】
2019196313.tif 000002
【０００５】
ところで、近年、イオンのみで構成される低融点の有機塩であるイオン液体（「イオン性液体」ともいう。）についての研究が脚光を浴びている。イオン液体は、高い極性を示し、不揮発性、高い熱安定性、化学的安定性などの特性を有する。イオン液体には、室温付近で液体状態となる「常温溶融塩」又は「室温溶融塩」とも称されるものもある。また、イオン液体には、一般的な有機溶媒や水への溶解が難しいセルロースを溶解可能なものもあり、イオン液体を用いてコーヒー豆などに含まれるカフェオイルキナ酸を抽出・単離する技術が提案されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−２０９４０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｙｏｎｏｂｕ  Ｕｓｕｋｉ,  Ｓｈｉｎｇｏ  Ｏｎｄａ,  Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｙｏｓｈｉｚａｗａ−Ｆｕｊｉｔａ,  Ｍａｓａｈｉｒｏ  Ｒｉｋｕｋａｗａ  “Ｕｓｅ  ｏｆ  ［Ｃ４ｍｉｍ］Ｃｌ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｗｅｅｔ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｌｅａｖｅｓ”  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１７,  ７,  ６８９０.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の有機溶媒を用いたフラボノイドの抽出・単離方法は、回収効率が不十分なものであった。そのため、より効率的に回収できる抽出・単離方法の開発が望まれている。
【０００９】
本発明は、植物からフラボノイドをより効率的に回収できるフラボノイドの抽出・単離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るフラボノイドの抽出方法は、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出することを含む。
【００１１】
本発明に係るフラボノイドの単離方法は、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、及び
前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収することを含む。
【００１２】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層との分離を、遠心分離により行うことが好ましい。
【００１３】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記抽出液と前記第二の有機溶媒との混合を、水と共に行うことが好ましい。
【００１４】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記イオン液体が、セルロースを溶解できるイオン液体であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記イオン液体が、イミダゾリウム系イオン液体であることが好ましい。
【００１６】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記第一の有機溶媒が、ケトン類、アルコール類及びエステル類からなる群から選ばれることが好ましい。
【００１７】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記フラボノイドが、ポリメトキシフラボノイドであることが好ましい。前記ポリメトキシフラボノイドは、ノビレチン及びタンゲレチンからなる群から選ばれることが好ましい。
【００１８】
本発明に係るフラボノイドの単離方法においては、前記植物が、柑橘類であることが好ましい。前記柑橘類は、シークヮーサー及びポンカンからなる群から選ばれることが好ましい。さらに、前記植物は、その果皮部分であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明は、本発明に係るフラボノイドの単離方法を用いるフラボノイド含有組成物の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明に係るフラボノイド含有組成物の製造方法においては、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、
前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収すること、及び
前記第二の有機溶媒を含む層から溶媒成分を除去して、フラボノイド含有組成物を得ることを含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のフラボノイドの抽出方法及び単離方法によれば、植物からフラボノイドを効率良く回収できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例２における高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」という）分析によるクロマトグラムを示す。
【図２】実施例１及び２及び比較例１〜４におけるシークヮーサーからのノビレチンの抽出率を示す。
【図３】実施例１及び２及び比較例１〜４におけるシークヮーサーからのタンゲレチンの抽出率を示す。
【図４】実施例３におけるＨＰＬＣ分析によるクロマトグラムを示す。
【図５】実施例３〜５及び比較例５〜８におけるポンカンからのノビレチンの抽出率を示す。
【図６】実施例３〜５及び比較例５〜８におけるポンカンからのタンゲレチンの抽出率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態によって何ら限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出することを含むフラボノイドの抽出方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、前記フラボノイドを前記植物から前記抽出溶媒中に抽出液として抽出すること、及び前記抽出液を第二の有機溶媒と混合し、前記イオン液体を含む層と前記第二の有機溶媒を含む層とを分離し、前記第二の有機溶媒を含む層中の前記フラボノイドを回収することを含むフラボノイドの単離方法を提供する。
【００２６】
（フラボノイド及びそれを含む植物）
本発明においてフラボノイドとは、フラバン、イソフラバン又はそれらの２，３−ジデヒドロ構造を基本骨格とする化合物をいう。フラボノイドは、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒によって植物から抽出できるものであれば特に制限はない。
【００２７】
フラボノイドとしては、例えば、下記式（Ｉ）：
【００２８】
【化２】
2019196313.tif 000003
【００２９】
［式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基、グリコシル基、又はグリコシル−オキシ基を示し、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、又はアルコキシ基であり、より好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基、又はメトキシ基であり、さらに好ましくは、水素原子、又はメトキシ基である。］
で表される化合物が挙げられる。
【００３０】
アルキル基とは、直鎖又は分枝鎖の脂肪族飽和炭化水素基をいう。炭素数が１以上１０以下のものが好ましく、炭素数が１以上５以下のものがより好ましい。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピルが挙げられる。
【００３１】
アルケニル基とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖又は分枝鎖の不飽和炭化水素基をいう。炭素数が２以上１０以下のものが好ましく、炭素数が２以上５以下のものがより好ましい。例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニルが挙げられる。
【００３２】
アルコキシ基とは、酸素原子にアルキル基が結合して形成される１価の基（アルキル−Ｏ−）をいう。炭素数が１以上１０以下のものが好ましく、炭素数が１以上５以下のものがより好ましい。例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシが挙げられる。
【００３３】
グリコシル基とは、単糖、二糖、三糖等のような低分子量の少糖からなる基であって、糖部分のヘミアセタール性ヒドロキシ基を除去して形成される１価の基をいう。グリコシル−オキシ基とは、酸素原子にグリコシル基が結合して形成される１価の基（グリコシル−Ｏ−）をいう。
【００３４】
フラボノイドは、ポリメトキシフラボノイドであることが好ましい。本発明においてポリメトキシフラボノイドとは、３以上のメトキシ基を有するフラボノイドをいう。中でも、Ｒ１〜Ｒ１０のうち３以上がメトキシ基である式（Ｉ）の化合物がより好ましく、Ｒ１〜Ｒ１０のうち４以上がメトキシ基である式（Ｉ）の化合物がさらに好ましく、Ｒ１〜Ｒ１０のうち５以上がメトキシ基である式（Ｉ）の化合物が特に好ましい。
【００３５】
ポリメトキシフラボノイドとしては、例えば、ノビレチン、タンゲレチン、シネンセチン、３，５，６，７，３’，４’−ヘキサメトキシフラボン、５，６，７，４’−テトラメトキシフラボン、３，５，６，７，８，３’，４’−ヘプタメトキシフラボン、ナツダイダイン、スダチチン、アヤニン、パキポドール、レツシンなどが挙げられる。中でも、ノビレチン及びタンゲレチンが特に好ましい。
【００３６】
フラボノイドを含む植物は、フラボノイドを含むものであれば特に制限はない。フラボノイドを含む植物としては、例えば、シークヮーサー、ポンカン、ウンシュウミカン、カボス、スダチ、ユズ、イヨカン、バレンシアオレンジ、ハッサク、グレープフルーツ、ブンタン、レモン、ライムなどの柑橘類が挙げられる。中でも、シークヮーサー及びポンカンが好ましい。
【００３７】
フラボノイドを含む植物は、フラボノイドを含む任意の植物の中の一部、或いは植物全体のいずれであってもよいが、フラボノイドを効率良く抽出するという観点から、植物の中の一部のうち果肉及び果皮を含む果実部分であることが好ましく、果皮部分であることがより好ましい。食品加工において、食用とすることが困難な植物の果皮部分は大量に廃棄処分されているのが実態であり、このような部分からフラボノイドを回収する本発明の好ましい形態は、有機合成法によりフラボノイドを製造する方法に比べて、経済的又は環境的側面からより優れているといえる。
【００３８】
フラボノイドを含む植物は、乾燥物或いは未乾燥物のどちらであってもよい。したがって、本明細書で植物の質量について言及するときは、乾燥物或いは未乾燥物のどちらを基準にしていてもよい。また、フラボノイドを含む植物は、抽出効率を高めるという観点から、粉砕された植物を用いることが好ましい。植物の粉砕の方法としては、ミキサーを用いる方法などの任意の周知の方法を用いてよい。また、予め粉砕されたものを購入して用いてもよい。粉砕の程度は、抽出溶媒が十分に浸透して、フラボノイドを抽出できる程度であれば限定されない。
【００３９】
（抽出工程）
本発明に係るフラボノイドの抽出方法及び単離方法には、それぞれ、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む抽出溶媒と、フラボノイドを含む植物とを混合し、フラボノイドを植物から抽出溶媒中に抽出液として抽出すること（以下、「抽出工程」という）が含まれる。
【００４０】
抽出工程において、抽出溶媒は、イオン液体と第一の有機溶媒とを含む。第一の有機溶媒が含まれていることにより、イオン液体の粘性が下がるため、フラボノイドの抽出率をより向上させることができる。
【００４１】
イオン液体とは、幅広い温度範囲で流動性があり、完全にイオンからなる液体をいう。イオン液体としては、１００℃以下の温度（例えば、室温）で液体状態のものが用いられる。イオン液体としては、セルロースを溶解できるものが好ましい。セルロースを溶解できるイオン液体を用いることにより、セルロースで構成される植物の細胞壁の内部に存在するフラボノイドをより効率的に抽出することができる。
【００４２】
イオン液体は、塩であり、カチオンとアニオンとからなる。イオン液体を構成するカチオンとしては、例えば、４級アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、ピペリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオンなどの有機カチオンが挙げられる。これらの有機カチオンは、１種を単独であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。イオン液体を構成するカチオンは、イミダゾリウムカチオンが好ましい。すなわち、イオン液体は、イミダゾリウム系イオン液体が好ましい。
【００４３】
イミダゾリウムカチオンとしては、例えば、下記式（ＩＩ）：
【００４４】
【化３】
2019196313.tif 000004
【００４５】
［式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、アルキル基、又はアルケニル基を示し、好ましくは、Ｒ１１が、メチル基であり且つＲ１２が、アルキル基、又はアルケニル基であり、より好ましくは、Ｒ１１が、メチル基であり且つＲ１２が、アルキル基である。］
で表されるカチオンであることが好ましい。
【００４６】
イミダゾリウムカチオンの具体例としては、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン及び１−アリル−３−メチルイミダゾリウムカチオンが挙げられる。これらの中でも、植物からフラボノイドを効率良く抽出するという観点から、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムカチオン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンが好ましく、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムカチオンがより好ましい。
【００４７】
イオン液体を構成するアニオンとしては、例えば、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＡｓＦ６−、ＳｂＦ６−、ＡｌＣｌ４−、ＨＳＯ４−、ＣｌＯ４−、スルホン酸系イオン（ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−など）、硫酸系イオン（ＣＨ３ＯＳＯ３−、ＣＦ３ＯＳＯ３−など）、スルホンイミド系イオン（例えば、（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｎ−、（Ｃ２Ｆ５ＳＯ２）２Ｎ−など）、ホスホン酸系イオン（例えば、ＨＰＯ３２−；（ＣＨ３Ｏ）ＨＰＯ２−、（Ｃ２Ｈ５Ｏ）ＨＰＯ２−、（Ｃ３Ｈ７Ｏ）ＨＰＯ２−、（ＣＨ３Ｏ）ＣＨ３ＰＯ２−、（Ｃ２Ｈ５Ｏ）ＣＨ３ＰＯ２−、（Ｃ２Ｈ５Ｏ）Ｃ２Ｈ５ＰＯ２−などのアルキルホスホネートアニオン（例えば、（Ｒ１３Ｏ）Ｒ１４ＰＯ２−（式中Ｒ１３は、アルキル基を示し、Ｒ１４は、水素原子又はアルキル基を示す。））など）、リン酸系イオン（例えば、（ＣＨ３Ｏ）２ＰＯ２−、（ＣＨ３Ｏ）Ｃ２Ｈ５ＯＰＯ２−、（Ｃ２Ｈ５Ｏ）２ＰＯ２−など）、ハロゲン化物イオン（例えば、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−など）、カルボン酸系イオン（ＨＣＯＯ−、ＣＨ３ＣＯ２−、Ｃ２Ｈ５ＣＯ２−、Ｃ３Ｈ７ＣＯ２−、ＣＦ３ＣＯ２−、Ｃ２Ｆ５ＣＯ２−など）、擬ハロゲン化物イオン（例えば、ＣＮ−、ＳＣＮ−、ＯＣＮ−、ＯＮＣ−、Ｎ３−、ＮＣＮ−、Ｎ（ＣＮ）２−など）が挙げられる。
【００４８】
これらの中でも、ホスホン酸系アニオンが好ましく、アルキルホスホネートアニオンがより好ましく、（ＣＨ３Ｏ）ＨＰＯ２−、（Ｃ２Ｈ５Ｏ）ＨＰＯ２−、（Ｃ３Ｈ７Ｏ）ＨＰＯ２−がさらに好ましく、（ＣＨ３Ｏ）ＨＰＯ２−が特に好ましい。
【００４９】
また、イオン液体を構成するカチオンとアニオンとの組み合わせの具体例としては、例えば、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムメチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムエチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムプロピルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムブチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムペンチルホスホネート及び１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジシアナミドなどが挙げられる。これらは、さらに、ヒドロキシ基及びハロゲン原子などの置換基を有するものであってもよい。
【００５０】
ある実施形態では、イオン液体は、植物からフラボノイドを効率良く抽出するという観点から、下記式（１）：
【００５１】
【化４】
2019196313.tif 000005
【００５２】
［式中、Ｒは、炭素数１以上５以下のアルキル基を表す。］
で表されるものが好ましい。
【００５３】
上記式（１）において、Ｒで表されるアルキル基は、無置換のものであってもよく、或いはヒドロキシ基及びハロゲン原子などの置換基を有するものであってもよい。
【００５４】
Ｒとしては、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基がより好ましく、メチル基及びエチル基がさらに好ましく、メチル基が特に好ましい。すなわち、イオン液体は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムメチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムエチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムプロピルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムイソプロピルホスホネートがより好ましく、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムメチルホスホネート、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムエチルホスホネートがさらに好ましく、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムメチルホスホネート（［Ｃ２ｍｉｍ］［（ＭｅＯ）（Ｈ）ＰＯ２］）が特に好ましい。
【００５５】
なお、イオン液体は、商業的に入手できるものを用いてもよく、公知の手法にて合成したものを用いてもよい。イオン液体は、１種を単独で用いてもよいし、又は２種以上を混合して用いてもよい。
【００５６】
抽出溶媒に含まれ得る第一の有機溶媒としては、例えば、ケトン類、アルコール類、エステル類、エーテル類及びニトリル類などが挙げられ、ケトン類、アルコール類及びエステル類が好ましい。第一の有機溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、又は２種以上を混合して用いてもよい。
【００５７】
アルコール類としては、炭素数１以上５以下のアルコール化合物が好ましく、炭素数１以上３以下のアルコール化合物がより好ましい。アルコール類としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパピルアルコール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール及びｔｅｒｔ−ブタノール及びペンタノールなどが挙げられる。これらの中でも、アルコール類としては、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが好ましく、エタノールがより好ましい。
【００５８】
ケトン類としては、炭素数１以上５以下のケトン化合物が好ましい。ケトン類としては、例えば、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノン、３−ペンタノンなどが挙げられる。これらの中でも、アセトン及び２−ブタノンが好ましく、アセトンがより好ましい。
【００５９】
エステル類としては、炭素数３以上１０以下のエステル基を有するエステル化合物が好ましい。エステル類としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸プロピル、プロピオン酸ブチル及びプロピオン酸ペンチルなどが挙げられる。これらの中でも、エステル類としては、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル及びプロピオン酸プロピルが好ましく、酢酸エチル及びプロピオン酸エチルがより好ましく、酢酸エチルがさらに好ましい。
【００６０】
エーテル類としては、炭素数４以上１０以下のエーテル化合物が好ましい。エーテル類としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルブチルエーテル、エチルブチルエーテル、プロピルブチルエーテル、ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、ジｔｅｒｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，３−ジオキサン及び１，４−ジオキサンなどが挙げられる。
【００６１】
ニトリル類としては、炭素数２以上５以下のニトリル化合物が好ましい。ニトリル類としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリルなどが挙げられる。
【００６２】
抽出溶媒におけるイオン液体と第一の有機溶媒との混合比（体積比）は、フラボノイドの抽出率をより向上させるという観点から、イオン液体：第一の有機溶媒として、１００：１〜１：１００の範囲であることが好ましく、１０：１〜１：１０の範囲であることがより好ましく、５：１〜１：５の範囲であることがさらに好ましく、３：１〜１：３の範囲であることがなお好ましく、２：１〜１：２の範囲であることが特に好ましい。
【００６３】
抽出溶媒におけるイオン液体の含有量は、抽出溶媒の全体積に対して、１体積％以上であることが好ましく、１０体積％以上であることがより好ましく、２０体積％以上であることがさらに好ましく、３０体積％以上であることが特に好ましい。
【００６４】
抽出溶媒における第一の有機溶媒の含有量は、抽出溶媒の全体積に対して、１体積％以上であることが好ましく、１０体積％以上であることがより好ましく、２０体積％以上であることがさらに好ましく、３０体積％以上であることが特に好ましい。
【００６５】
抽出工程において、抽出溶媒は、さらに、水、及び超臨界二酸化炭素などの超臨界流体を含んでいてもよい。
【００６６】
抽出工程において、抽出温度は、植物からフラボノイドを効率的に抽出できる範囲であれば特に制限はなく、０℃以上１００℃以下であることが好ましく、１０℃以上６０℃以下であることがより好ましく、２０℃以上５０℃以下であることがさらに好ましい。特に、室温付近（例えば、２５℃近辺）においても、植物からフラボノイドを効率良く抽出できる。
【００６７】
抽出工程において、抽出時間としては、植物からフラボノイドを十分に抽出できる範囲であれば特に制限はなく、例えば、１分以上である。抽出時間としては、植物からフラボノイドを効率良く抽出するという観点から、１０分以上であることが好ましく、１５分以上であることがより好ましく、３０分以上であることがさらに好ましく、４５分以上であることが特に好ましい。このように、本発明では短い抽出時間でも効率良くフラボノイドを抽出できる。一方、抽出時間としては、植物からフラボノイドをより効率的に抽出する観点から、２００分以下であることが好ましく、１８０分以下であることがより好ましく、１５０分以下であることがさらに好ましく、１２０分以下であることが特に好ましい。
【００６８】
抽出工程において、植物の抽出溶媒に対する質量比は、植物からフラボノイドを抽出できる範囲であれば特に制限はなく、フラボノイドを効率良く抽出するという観点から、植物：抽出溶媒として、１：５０〜１：３の範囲であることが好ましく、１：４０〜１：５の範囲であることがより好ましく、１：３０〜１：１０の範囲であることがさらに好ましく、１：２５〜１：１５の範囲であることが特に好ましい。
【００６９】
抽出工程における抽出法は、自然抽出、すなわち静置抽出であってもよいが、フラボノイドを効率良く抽出するという観点から、撹拌抽出、振盪抽出、超音波抽出、遠心分離抽出、加熱若しくは還流抽出、加圧若しくは減圧抽出、又はそれらの組み合わせであることが好ましい。
【００７０】
（回収工程）
本発明に係るフラボノイドの単離方法には、抽出工程で得られた抽出液を第二の有機溶媒と混合し、イオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層とを分離し、第二の有機溶媒を含む層中のフラボノイドを回収すること（以下、「回収工程」という）が含まれる。
【００７１】
回収工程で用いられる第二の有機溶媒としては、イオン液体と分液可能なもの、或いは抽出液と第二の有機溶媒を水と共に混合する場合は、イオン液体と水の混合液と分液可能なものが用いられる。第二の有機溶媒としては、例えば、エステル類、エーテル類が挙げられる。これらの中でも、エステル類が好ましく、酢酸エチルがより好ましい。第二の有機溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、又は２種以上を混合して用いてもよい。
【００７２】
植物に対する第二の有機溶媒の質量としては、抽出液からフラボノイドを抽出できる範囲であれば制限はなく、抽出液から効率良くフラボノイドを回収するという観点から、植物１質量部に対して、５質量部以上２５質量部以下であることが好ましく、１０質量部以上２０質量部以下であることがより好ましく、１２．５質量部以上１７．５質量部以下であることがさらに好ましい。
【００７３】
回収工程における抽出液と第二の有機溶媒との混合時間は、抽出液からフラボノイドを回収できる範囲であれば特に制限はなく、抽出液から効率良くフラボノイドを回収するという観点から、１分以上であることが好ましく、２分以上であることがより好ましく、３分以上であることがさらに好ましい。
【００７４】
回収工程における抽出液と第二の有機溶媒との混合温度としては、抽出液からフラボノイドを十分に回収できる範囲であれば特に制限はなく、例えば、室温範囲を含む０℃以上１００℃以下である。
【００７５】
回収工程における抽出液と第二の有機溶媒との混合は、抽出液から効率的にフラボノイドを回収するために、撹拌、振盪、超音波処理又はそれらの組み合わせを伴うものであってもよい。
【００７６】
回収工程においては、抽出液と第二の有機溶媒とを、水と共に混合することが好ましい。これにより、フラボノイドのイオン液体への溶解性が低下する一方で、相対的に第二の有機溶媒への溶解性が高くなり、さらには、イオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層との分液性も向上するので、抽出液からフラボノイドをより一層効率良く回収することが可能となる。水としては、特に制限はなく、水道水、イオン交換水及び蒸留水などの各種水を用いることができる。
【００７７】
回収工程においては、水を加える場合、水の量としては、効率的にフラボノイドを抽出できる範囲であれば制限はないが、植物１質量部に対して、０．０１質量部以上１０００質量部以下であることが好ましく、０．１質量部以上５００質量部以下であることがより好ましく、１質量部以上１００質量部以下であることがさらに好ましく、２質量部以上１０質量部以下であることが特に好ましい。
【００７８】
回収工程においては、抽出液と第二の有機溶媒との混合した後に、（１）主に、比較的極性の高い有機溶媒、有機物、植物の抽出残渣、イオン液体、水などを含む層、即ちイオン液体を含む層と、（２）主に、比較的極性の低い第二の有機溶媒を含む有機溶媒及びフラボノイドを含む層、即ち第二の有機溶媒を含む層の２層に分離させる。
【００７９】
回収工程における、イオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層との分離は、撹拌振盪を伴う一般的な分液操作を行ってもよいが、遠心分離器等を用いて遠心分離により行うことが好ましい。遠心分離を行うことにより、短時間、かつ、温和な温度条件で効率良くイオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層とを分離できる。また、植物の抽出残渣の除去も容易になる。遠心分離を行う場合、遠心分離の時間としては、イオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層とを分離できる範囲であれば特に制限はないが、１０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましい。また、遠心分離の温度としては、上述した混合温度と同様であればよい。
【００８０】
回収工程では、フラボノイドをより効率良く回収するために、第二の有機溶媒を含む層をデカンテーションにより回収してもよい。
【００８１】
回収工程では、イオン液体を含む層と第二の有機溶媒を含む層との分離を、一般的な遠心分離器等を用いて遠心分離し、こうして分離された第二の有機溶媒を含む層をデカンテーションにより回収することがより好ましい。これにより、フラボノイドをより一層効率良く回収することができる。
【００８２】
第二の有機溶媒を含む層中のフラボノイドの濃度は、例えば、逆相ＨＰＬＣ絶対検量線法を用いて分析することにより測定でき、これに基づき抽出率を算出することができる。抽出率とは、抽出工程前の植物の全質量に対する回収工程で回収されたフラボノイドの質量の割合をいう。
【００８３】
（溶媒除去工程）
本発明に係るフラボノイドの単離方法には、さらに、回収工程で得られた第二の有機溶媒を含む層から溶媒成分を除去して、固体のフラボノイド含有組成物を得ること（以下、「溶媒除去工程」）が含まれていてもよい。溶媒成分を除去する方法としては、エバポレーション、凍結乾燥、真空乾燥、加熱乾燥又はそれらの組み合わせなどの公知の方法を用いることができる。特定の実施形態では、こうして得られたフラボノイド含有組成物は、例えば図１及び３で示すように、比較的高い純度でフラボノイドが含まれる。
【００８４】
また、本発明は、本発明に係るフラボノイドの単離方法を用いるフラボノイド含有組成物の製造方法を提供する。本発明に係るフラボノイド含有組成物の製造方法は、抽出工程、回収工程及び溶媒除去工程を含む。
【００８５】
（精製工程）
本発明に係るフラボノイドの単離方法には、より純度の高いフラボノイドを得るために、さらに、溶媒除去工程で得られたフラボノイド含有組成物からフラボノイドを精製すること（以下、「精製工程」）が含まれていてもよい。精製方法としては、クロマトグラフ法、再結晶法又はそれらの組み合わせなどの公知の方法を用いることができる。
【００８６】
（再生工程）
本発明に係るフラボノイドの単離方法には、回収工程後に、イオン液体の再生（以下、「再生工程」という）が含まれていてもよい。
【００８７】
再生工程では、回収工程で分離されたイオン液体を含む層に、回収工程で用いた第二の有機溶媒と同様の溶媒を加えて所定時間混合する。混合温度及び時間は、回収工程と同様であればよい。また、混合液を所定時間遠心分離してもよい。遠心分離の時間は、回収工程と同様であればよい。再生工程では、これらの操作を所定回数繰り返した後、濾過及び揮発分の濃縮を行うことによりイオン液体を再生する。
【００８８】
再生工程により、フラボノイドの単離方法は、フラボノイドの抽出後に排出されるイオン液体を削減できるので、フラボノイドの抽出に伴うコストを低減することができる。また、イオン液体と有機溶媒とを混合及び遠心分離するだけで再生できるので、イオン液体の水洗などに伴って排出される排水を削減することもできる。
【００８９】
本発明によれば、イオン液体を使用しない有機溶媒のみによる抽出と比較して、植物から高い抽出率で効率良くフラボノイドを抽出し、回収することが可能となる。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例及び比較例によって何ら限定されるものではない。
【００９１】
まず、シークヮーサーの果皮からのノビレチン及びタンゲレチンの抽出について、抽出溶媒の検討を行った。
【００９２】
（実施例１）
ミキサーにより粉砕したシークヮーサー（琉球フロント沖縄から購入）の果皮（０．０２５ｇ）、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムメチルホスホネート（以下、実施例及び比較例において「イオン液体」という）（２１１μＬ）及びエタノール（２１１μＬ）をサンプル管に加え、２５℃で６０分間撹拌した。その後、蒸留水（２１１μＬ）及び酢酸エチル（６３３μＬ）を加えて５分間撹拌した後、１分間遠心分離を行うことでイオン液体層と酢酸エチル層とを分離し、酢酸エチル層をデカンテーションにより回収した。酢酸エチルの添加、遠心分離及び酢酸エチル層の分離の操作を、３回繰り返した。得られた酢酸エチル層を一旦除媒後、メタノールに溶解して、下記のＨＰＬＣの分析条件１に基づき、逆相ＨＰＬＣにより分析を行った。さらに、絶対検量線法を用いてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ２．０％、０．２５％であった。
【００９３】
（ＨＰＬＣの分析条件１）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（４．６×１５０ｍｍ）
溶媒：０〜１０ｍｉｎ：ＭｅＯＨ／蒸留水＝５０：５０
１０〜３５ｍｉｎ：ＭｅＯＨ／蒸留水＝５０：５０〜９８：２
３５〜４０ｍｉｎ：ＭｅＯＨ／蒸留水＝９８：２
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
ＵＶ検出：３３０ｎｍ
（実施例２）
エタノールに代えて、アセトン（２１１μＬ）を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、２．３％、０．２９％であった。逆相ＨＰＬＣによる分析結果のクロマトグラムを図１に示す。
【００９４】
（比較例１）
エタノールを使用しなかったこと、イオン液体の使用量を４２２μＬに変更したこと以外は、実施例１と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、１．５％、０．１５％であった。
【００９５】
（比較例２）
ミキサーにより粉砕したシークヮーサー（琉球フロント沖縄から購入）の果皮（０．０２５ｇ）、及びエタノール（４２２μＬ）をサンプル管に加え、２５℃で６０分間、２５℃で１５分間撹拌した。その後、１０分間遠心分離を行い、エタノール抽出液を回収した。得られたエタノール抽出液について、上記の分析条件１で、逆相ＨＰＬＣにより分析を行い、絶対検量線法を用いてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ１．６％、０．２２％であった。
【００９６】
（比較例３）
エタノールに代えて、アセトン（４２２μＬ）を用いたこと以外は、比較例２と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、１．５％、０．２１％であった。
【００９７】
（比較例４）
エタノールに代えて、酢酸エチル（４２２μＬ）を用いたこと以外は、比較例２と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、１．６％、０．２２％であった。
【００９８】
以上の結果を下記表１、図２及び３にまとめる。図２は、ノビレチンの抽出率を示し、図３は、タンゲレチンの抽出率を示す。
【００９９】
【表１】
2019196313.tif 000006
【０１００】
次に、ポンカンの果皮からのノビレチン及びタンゲレチンの抽出について、抽出溶媒の検討を行った。
【０１０１】
（実施例３）
シークヮーサーの果皮に代えて、ポンカン（南紀くしもと四季彩園より購入）の果皮（０．０２５ｇ）を用いたこと、ＨＰＬＣの分析条件を、上記の分析条件１から下記の分析条件２に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．６７％、０．３１％であった。また、ＨＰＬＣ分析によるクロマトグラムを図３に示す。
【０１０２】
（ＨＰＬＣの分析条件２）
カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）
溶媒：０〜１０ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝５０：５０
１０〜２５ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝５０：５０〜９０：１０
２５〜２６ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝９０：１０〜９３：７
２６〜２６．９ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝９３：７〜９５：５
２６．９〜４０ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝９５：５〜９８：２
４０〜５０ｍｉｎ；ＭｅＯＨ／蒸留水＝５０：５０
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量；１０μＬ
カラム温度：３０℃
ＵＶ検出：３３０ｎｍ
【０１０３】
（実施例４）
エタノールに代えて、アセトン（２１１μＬ）を用いたこと以外は、実施例３と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．６６％、０．２９％であった。
【０１０４】
（実施例５）
エタノールに代えて、酢酸エチル（２１１μＬ）を用いたこと以外は、実施例３と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．７３％、０．３４％であった。
【０１０５】
（比較例５）
エタノールを使用しなかったこと、イオン液体の使用量を４２２μＬに変更したこと以外は、実施例３と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．４８％、０．２２％であった。
【０１０６】
（比較例６）
シークヮーサーの果皮に代えて、ポンカン（南紀くしもと四季彩園より購入）の果皮（０．０２５ｇ）を用いたこと、ＨＰＬＣの分析条件を、上記の分析条件１から下記の分析条件２に変更したこと以外は、比較例２と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．５５％、０．２６％であった。
【０１０７】
（比較例７）
エタノールに代えて、アセトン（４２２μＬ）を用いたこと以外は、比較例６と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．５３％、０．２５％であった。
【０１０８】
（比較例８）
エタノールに代えて、酢酸エチル（４２２μＬ）を用いたこと以外は、比較例６と同様にしてノビレチン及びタンゲレチンの抽出率を定量した。その結果、ノビレチン及びタンゲレチンの抽出率は、それぞれ、０．４６％、０．２３％であった。
【０１０９】
以上の結果を下記表２、図５及び６にまとめる。図５は、ノビレチンの抽出率を示し、図６は、タンゲレチンの抽出率を示す。
【０１１０】
【表２】
2019196313.tif 000007
【０１１１】
上記の結果から、抽出溶媒としてイオン液体と有機溶媒の混合溶媒を用いた場合は、イオン液体単独、有機溶媒単独で抽出した場合に比べて、抽出率が高いことがわかる。図１及び４のＨＰＬＣクロマトグラムの結果からは、回収された酢酸エチル層には、不純物が少なく、精製操作を行わずともフラボノイドの純度が高いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明によれば、植物からフラボノイドをより効率的に回収できる。
【図１】
2019196313.tif 000008
【図２】
2019196313.tif 000009
【図３】
2019196313.tif 000010
【図４】
2019196313.tif 000011
【図５】
2019196313.tif 000012
【図６】
2019196313.tif 000013