(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、グリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法を提供するものである。【解決手段】  グリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法であって、前記測定試料及び前記標準試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う２以上の区間のドリフトを除去した後、各区間における両者の類似度を区間類似度として算出し、前記区間類似度に重みをもたせた平均値を、両者の最終的な類似度とする前記方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、
取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法であって、
前記測定試料及び前記標準試料のクロマトグラムに対して、
類似度計算を行う２以上の区間のドリフトを除去した後、
各区間における両者の類似度を区間類似度として算出し、
前記区間類似度に重みをもたせた平均値を、両者の最終的な類似度とする前記方法。
【請求項２】
前記区間類似度への重みの設定方法が、クロマトグラムの成分ピークの強度を基に決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記区間類似度の計算を以下の式で算出することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【数１】
2019219309.tif 000003
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法で算出された両者の最終的な類似度が、任意の閾値以上となるか否かで、前記測定試料が正常か異常かを判断する方法。
【請求項５】
前記測定試料として前記標準試料と同等の組成を有する試料を用いて、請求項１〜３のいずれかに記載の方法で算出された両者の最終的な類似度が、任意の閾値以上となるか否かで、前記液体クロマトグラフィの装置異常の有無を判断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラムの類似度の計算方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルコースがヘモグロビンに結合したヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の値は糖尿病の診断や治療において血糖状態を評価する指標として利用されている。ＨｂＡ１ｃは過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映しており、糖尿病患者における血糖コントロールマーカーとして有用である。
【０００３】
ヘモグロビン分子を構成するα鎖グロビンあるいはβ鎖グロビンのアミノ酸配列にアミノ酸置換、脱落、挿入がみられるものや、遺伝子融合による融合グロビン鎖を含んだもののように、その構成成分が通常とは異なるものは異常ヘモグロビンと呼ばれ、稀に存在することが知られている。このような検体を液体クロマトグラフィにより測定を行った場合、正常な検体とは異なる分離パターンを示すことが知られている。
【０００４】
また、分光分析の分野や質量分析の分野では、測定試料の特定／同定を目的として、「類似度」を用いた手法が頻繁に用いられている。これは比較対象となるスペクトルと、未知試料を測定して得られたスペクトルとを比較して、その類似性を数値で評価する手法である。ｘ軸に波長または分子量をとって、それに対応した吸光度または強度をｙ軸とし、両者を比較し類似度計算に使用する。比較対象のデータのｘ軸、つまり、波長または分子量は、不確実性を含まないことが望まれる。
【０００５】
特許文献１は液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビンの分析に類似度の考えを適用し、クロマトグラムが正常であるか、異常であるかを判別する方法に適用した例である。グリコヘモグロビンの分離では、指標となるＳ−Ａ１ｃピークの面積比率は全体の５％程度であり、９０％程度はＡ０ピークで占められる。このような、不均等なクロマトグラムに対して類似度を計算すると、比率の高いＡ０ピークの形状の僅かな変化が、類似度の値を大きく変化させることになり、正確な指標とはならないという課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９―２５１０１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、グリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係るグリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、取得されるクロマトグラムに基づく、測定試料と標準試料との類似度の計算方法は、前記測定試料及び前記標準試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う２以上の区間のドリフトを除去した後、各区間における両者の類似度を区間類似度として算出し、前記区間類似度に重みをもたせた平均値を、両者の最終的な類似度とすることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る計算方法の一態様においては、前記区間類似度への重みの設定方法を、クロマトグラムの成分ピークの強度を基に決定する。
【００１０】
また、本発明に係る計算方法の一態様においては、前記区間類似度の計算を以下の式で算出する。
【００１１】
【数１】
2019219309.tif 000002
【００１２】
さらに、上述の計算方法で算出された両者の最終的な類似度が、任意の閾値以上となるか否かで、前記測定試料が正常か異常かを判断する方法を本発明は含んでいる。
【００１３】
また、前記測定試料として前記標準試料と同等の組成を有する試料を用いて、上述の計算方法で算出された両者の最終的な類似度が、任意の閾値以上となるか否かで、前記液体クロマトグラフィの装置異常の有無を判断する方法も本発明は含んでいる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、不均等なクロマトグラムであっても、区間ごとの類似度に重みをもたせた平均値を、測定試料と標準試料との最終的な類似度とするため、正確な指標を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明におけるクロマトグラムのドリフト除去の効果を模式的に示した図である。
【図２】本発明における、類似度計算における時間区分を模式的に示した図である。
【図３】実施例で用いたシステム構成を示した図である。
【図４】実施例１の検証に使用した検体のクロマトグラムの一例を示した図である。
【図５】（ａ）実施例１で用いた標準試料のクロマトグラム、（ｂ）類似度計算の対象区間を示した図である。
【図６】実施例１での３区間の重み平均類似度の一覧を示した図である。
【図７】実施例１での３区間の単純平均類似度の一覧を示した図である。
【図８】実施例１での全区間を一つの区間とした類似度の一覧を示した図である。
【図９】実施例２での３区間の重み平均類似度の一覧を示した図である。
【図１０】実施例２での全区間を一つの区間とした類似度の一覧を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の計算方法は、測定試料及び標準試料のクロマトグラムに対して、類似度計算を行う２以上の区間のドリフトを除去した後、各区間における両者の類似度を区間類似度として算出し、前記区間類似度に重みをもたせた平均値を、両者の最終的な類似度とするものである。以下、本発明の一実施形態について説明する。
【００１７】
なお、本発明における「クロマトグラム」とは、グリコヘモグロビンを測定対象とした液体クロマトグラフィにおいて、取得されるクロマトグラムを指す。また、標準試料のクロマトグラムを「基準クロマトグラム」、測定試料のクロマトグラムを「比較対象クロマトグラム」と言うことがある。
【００１８】
類似度計算を行う区間のドリフトを除去する工程の一例としては、類似度計算を行う区間の開始点（ｘ１、ｙ１）及び終了点（ｘ２、ｙ２）［ｘ：時間、ｙ：出力］を決めて、直線式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を算出し、クロマトグラムの各データ点（時間、出力）から前記直線式のｙ値を差し引く方法などが挙げられる。しかし、本工程はこの方法に限定されるものではない。開始点および終了点以外のピークが溶出していない複数の点を基に、多項式を算出し、クロマトグラムの各データ点（時間、出力）から前記多項式のｙ値を差し引く方法なども有用である。
【００１９】
本発明において、類似度計算を行う区間は２以上であるが、区間ごとに上述したような手順でドリフトを除去してもよく、複数の区間を含んだ範囲でドリフトを除去してもよい。例えば、開始点として測定開始点、終了点として測定終了点を指定すれば簡便なため、好適である（図１参照）。
【００２０】
ドリフトを除去した後、各区間における両者の類似度を区間類似度として算出する。グリコヘモグロビンのクロマトグラムでは、面積比率が健常人で５〜６％程度であるＳ−Ａ１ｃ成分ピーク、面積比率が９０％程度であるＡ０成分ピークを含んでいる。そのため、類似度計算を行う区間としては、Ｓ−Ａ１ｃ成分ピークを含む区間、Ａ０成分ピークを含む区間、特異的に出現する成分ピークを含む区間の３つに分割することが好適である（図２参照）。また、類似度計算を行う区間は連続であっても、不連続であってもよい。
【００２１】
「区間類似度」の計算方法は、式１で挙げるような方法が代表的であるが、波形の類似性の指標となれば良く、特に限定するものではない。式１を用いて計算される類似度は、最大で１０００であり、１０００に近いほど、同一性が高いことを示す。
【００２２】
各区間における区間類似度を算出したら、前記区間類似度に重みをもたせた平均値を、測定試料と標準試料との最終的な類似度とする。重み係数を全て１あるいは同じ値にする「単純平均類似度」としても問題ないが、区間類似度に対する重み係数は、成分ピークの比率が小さい区間の係数を大きくし、成分ピークの比率が高い区間の係数を小さくすることで、比率の低い成分の変動に伴う類似度の変動を大きく見ることができるため、好ましい。
【００２３】
区間類似度への重みの設定方法としては、クロマトグラムの変化を明確に反映することを目的として、任意の重み係数を測定者が設定しても良い。また、クロマトグラムの成分ピークの強度を基に、つまり、強度の高いピークが含まれる区間の重みを小さくし、強度の低いピークが含まれる区間の重みを大きくしても良い。さらに、多種検体での平均的な区間毎の面積比率の逆数に応じて、区間の重みを決定することも良い（例えば第一区間面積比率：２０％、第二区間面積比率：７０％、第三区間面積比率：１０％の場合、第一区間重み：３．５、第二区間重み：１．０、第三区間重み：７．０）。
【００２４】
上述した方法で得られた測定試料と標準試料との最終的な類似度は、任意の閾値以上となるか否かで、測定試料が正常か異常かを判断することが可能である。また、測定試料として標準試料と同等の組成を有する試料を用いれば、すなわち標準試料同士のクロマトグラムに対して類似度計算を行えば、任意の閾値以上となるか否かで、測定に用いた液体クロマトグラフィの装置異常の有無を判断することも可能である。
【００２５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００２６】
図３に示すシステムを使用し、実際の測定を行った。グリコヘモグロビン分析計は東ソー（株）製ＨＬＣ−７２３Ｇ８および専用のカラム、溶離液を使用した。なお、測定モードは異常ヘモグロビン種の特定が容易とされる「バリアントモード」で行った。
異なる３種の溶離液（１、２、３）を指定した時間で切り替え、分析カラム（１０）へ送液することで、注入された試料を、溶出力を変えて各々の成分に分離し、可視検出器（１２）でその量を計測するものである。なお、試料注入装置（８）は、採血管で採取された全血をそのまま自動で溶血／希釈し注入すること、および標準試料やコントロール試料のような希釈検体も注入できる構成となっている。
【００２７】
（実施例１）
本実施例では、クロマトグラムの同一性判断により正常な検体と異常ヘモグロビン種が識別できるか検証を行った。
正常検体（１０検体、うち１検体を標準試料とした）、ＨｂＡｌｃキャリブレータ（Ｌｅｖｅｌ１、２  東ソー（株）製）、ＨｂＡｌｃコントロール（Ｌｅｖｅｌ１、２  東ソー（株）製）、および、前記正常検体にバリアントヘモグロビンコントロール２種を添加した検体（２８検体）を使用して評価を実施した。なお、前記バリアントヘモグロビンコントロールはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、バリアントヘモグロビンコントロールＡＳ（ＨＣ−１０４）、およびバリアントヘモグロビンコントロールＡＣ（ＨＣ−１０５）を使用した。また、臨床的に測定された異常ヘモグロビン検体（２９検体）のクロマトグラムも併せて評価した。
以上の検体を測定し、クロマトグラムを取得し、測定開始点および測定終了点でドリフト除去処理を施した。
【００２８】
図４に（ａ）正常検体、（ｂ）バリアントヘモグロビンコントロールＡＳ（ＨＣ−１０４）添加検体、（ｃ）バリアントヘモグロビンコントロールＡＣ（ＨＣ−１０５）添加検体のクロマトグラムを示す。
本実施例では、クロマトグラムの特徴の変化が顕著に表れると想定される第一区間（０．０分〜０．７分）、第二区間（０．７分〜１．０分）、第三区間（１．０分〜１．６分）の３つの区間に分割して区間類似度を算出した（図５（ｂ）参照）。なお、第一区間はＳ−Ａ１ｃピークを含む時間領域、第二区間はＡ０ピークを含む時間領域、第三区間は異常ヘモグロビン種の成分ピークが出現しやすい時間領域である。重み係数は、第一区間を２、第二区間を１、第三区間を３とした。すなわち、区間類似度に区間ごとの重み係数（１、２、３）を掛けた値の合計を、重み係数の総和（１＋２＋３）で除した値を重み平均類似度とした。
【００２９】
図６に３区間の重み平均類似度、図７に３区間の単純平均類似度の結果一覧を示す。いずれの計算方法でも、正常検体と異常ヘモグロビン種との間では優位差が見られるが、重み平均類似度での結果の方が、その差がより明確になっている。一方、全区間を一つの区間として類似度計算を実施した場合、図８の如く、正常検体と異常ヘモグロビン種の区別ができない所が多々出てくる。なお、図中の「Ｎ」は正常検体、「＋（１）」は正常検体にＨＣ−１０４を添加した検体、「＋（２）」は正常検体にＨＣ−１０５を添加した検体、「Ｕ」は異常ヘモグロビン検体を示している。
【００３０】
単純平均類似度の計算の場合、類似度の閾値を９００程度、重み平均類似度の計算の場合は、類似度の閾値をより低い８５０程度に設定しても、明確に正常検体と異常ヘモグロビン種検体のクロマトグラムの区別ができる。
【００３１】
（実施例２）
本実施例では、クロマトグラムの同一性判断により測定装置の異常（流量の変動）が検出できるか検証を行った。
試料として正常検体（Ｓａｍｐｌｅ＿Ａ）と、前記正常検体にバリアントヘモグロビンコントロール２種を添加した検体（Ｓａｍｐｌｅ＿Ｉ、Ｊ）も併せて使用した。なお、前記バリアントヘモグロビンコントロールはＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、バリアントヘモグロビンコントロールＡＳ（ＨＣ−１０４）、およびバリアントヘモグロビンコントロールＡＣ（ＨＣ−１０５）を使用した。
標準的な測定時の流量ファクター（流量の相対値）は１．００で運用され、０．９８〜１．０２であれば正常な測定が行えると言える。ファクターを１．００、１．０２、１．０４、１．０６、０．９８、０．９６、０．９４で測定を実施し、装置異常の有無について閾値を類似度８５０と設定した。本実施例ではファクターを１．００で測定した正常検体Ｓａｍｐｌｅ＿Ａの結果を基準クロマトグラム（標準試料）とし、類似度を算出する時間区分及び重み係数等の条件は実施例１と同様とした。
【００３２】
図９に３区間の重み平均類似度の結果一覧、図１０に全区間を一つの区間とした類似度の結果一覧を示す。
図９から分かるように、３区間重み平均類似度では、流量ファクターが１．００で測定したＳａｍｐｌｅ＿Ａ、Ｉ、Ｊの３種で２つのグループが存在していることが見てとれる。そして、流量ファクター０．９８、１．００、１．０２で測定を行った場合、Ｓａｍｐｌｅ＿Ａの類似度は８５０以上となったが、それ以外の流量ファクターで測定を行った場合は、Ｓａｍｐｌｅ＿Ａの類似度は８５０未満であり、装置異常の判断が正常に行われていることが確認できた。
一方、図１０から分かるように、全区間を一つの区間として計算した場合の類似度では、例えば、流量ファクターが１．００で測定したＳａｍｐｌｅ＿Ａ、Ｉ、Ｊの３種で殆ど差異が見られない。そして、流量ファクター１．０２で測定を行った場合、Ｓａｍｐｌｅ＿Ａの類似度は８５０未満となり、装置異常と判断されてしまった。
【符号の説明】
【００３３】
１．第一溶離液
２．第二溶離液
３．第三溶離液
４．溶血洗浄液
５．脱気装置
６．電磁弁
７．送液ポンプ
８．試料注入機構
９．プレフィルタ
１０．分析カラム
１１．抵抗管
１２．可視吸収検出器
１３．恒温槽
１４．検体
１５．廃液
【図１】
2019219309.tif 000004
【図２】
2019219309.tif 000005
【図３】
2019219309.tif 000006
【図４】
2019219309.tif 000007
【図５】
2019219309.tif 000008
【図６】
2019219309.tif 000009
【図７】
2019219309.tif 000010
【図８】
2019219309.tif 000011
【図９】
2019219309.tif 000012
【図１０】
2019219309.tif 000013