(57)【要約】      （修正有）【課題】顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダの厚さを特定する方法を提供する。【解決手段】顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダ７の厚さを特定する方法に関し、試料ホルダ７は照明放射ＢＳに対して透明であって、試料を収容するために実装されている。第１側面ＯＳ及び第２側面ＵＳを有する試料ホルダ７は試料平面に配置され、試料ホルダ７の第１側面ＯＳ及び第２側面ＵＳは試料平面と平行に整列される。照明放射ＢＳの少なくとも一つのビームは第１照明角度で第１光軸Ａ１に沿って整列された試料ホルダ７上に方向づけられ、照明放射ＢＳの反射成分ＢＳｒｅｆの少なくとも２つの測定値、又は照明放射ＢＳによって生じる検出放射ＤＳの少なくとも２つの測定値は捕捉される。捕捉された少なくとも２つの測定値に応じて、第１界面ＯＳと第２界面ＵＳとのＺ軸方向における相互の間隔を厚さｄとして特定する。【選択図】図５
2019109513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡（１）のビーム経路内の試料ホルダ（７）の厚さ（ｄ）を決定する方法であって、
前記試料ホルダは、照明放射（ＢＳ）に対して透明であって、試料（５）を収容するために構成されており、
当該方法は、
Ａ：第１界面（ＯＳ）及び第２界面（ＵＳ）を有する前記試料ホルダ（７）を試料平面（４）内に配置するステップであって、前記試料平面（４）はデカルト座標のＸ軸（Ｘ）及びＹ軸（Ｙ）にまたがるＸＹ平面内にある、ステップと、
Ｂ：前記第１界面（ＯＳ）及び前記第２界面（ＵＳ）を前記試料平面（４）と平行に整列させるステップと、
Ｃ：前記照明放射（ＢＳ）の少なくとも１つのビームを第１光軸（Ａ１）に沿って、照明角度において、整列された前記試料ホルダ（７）上に方向づけるステップと、
Ｄ：前記照明放射（ＢＳ）の反射成分（ＢＳｒｅｆ）の少なくとも２つの測定値、又は前記照明放射（ＢＳ）によって生じる検出放射（ＤＳ）の少なくとも２つの測定値を捕捉するステップと、
Ｅ：捕捉された前記少なくとも２つの測定値に応じて、Ｚ軸方向における前記第１界面と第２界面と（ＯＳ，ＵＳ）との相互の間隔を厚さ（ｄ）として特定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記照明放射（ＢＳ）の前記ビーム経路、前記反射成分（ＢＳｒｅｆ）のビーム経路及び／又は前記検出放射（ＤＳ）のビーム経路に配置された光学的に作用する補正素子（１２）は、前記の特定された厚さ（ｄ）に応じて駆動制御され、それぞれのビーム経路内における相対位置が調整される、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記照明放射（ＢＳ）によって前記試料平面（４）内に光シート（６）が生成される、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ステップＣにおいて、前記第１光軸（Ａ１）と、ＸＹ平面に対して垂直な参照軸との間の照明角度は、ゼロと異なり、
ステップＤにおいて、前記試料ホルダ（７）の前記第１界面（ＯＳ）から又は前記第２界面（ＵＳ）から反射される前記照明放射（ＢＳ）の反射成分（ＢＳｒｅｆ）は、所期の相対位置において第１測定値として検出器（９）によって捕捉され、その後、それぞれ他方の界面（ＯＳ，ＵＳ）の反射成分（ＢＳｒｅｆ）が前記所期の相対位置において、第２測定値として前記検出器によって捕捉されるまで、前記試料ホルダ（７）はＸＹ平面に対して垂直に方向づけられた前記Ｚ軸方向に移動され、
ステップＥにおいて、前記Ｚ軸方向における移動経路（ｄ’）は、前記第１測定値及び前記第２測定値に基づいて特定され、前記移動経路は、前記所期の相対位置において、前記第１及び第２界面（ＯＳ，ＵＳ）の反射成分（ＢＳｒｅｆ）を捕捉するために必要であり、前記厚さ（ｄ）が特定される、
請求項１乃至３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
画質尺度が定義され、
複数の前記補正素子（１２）のうちの少なくとも１つの補正素子（１２）の実際の配置が変更され、
前記画質尺度の測定値は、選択された実際の配置のそれぞれに割り当てられて捕捉され、
複数の、前記画質尺度の前記測定値に基づいて、それぞれ１つの、前記画質尺度の現在値が特定され、
前記画質尺度の所望の値が存在する、前記少なくとも１つの補正素子（１２）の実際の配置が選択される、
請求項２乃至４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記測定値は、コントラストの画質尺度、シャープネス尺度、信号対雑音比、信号強度及び点広がり関数のパラメータのうち少なくとも１つを使用する、
請求項５記載の方法。
【請求項７】
分離した点状の蛍光源を含む試料（５）を使用し、複数の前記点状の蛍光源の検出放射（ＤＳ）に基づいて前記画質尺度の少なくとも２つの測定値を捕捉する、
請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記シャープネス尺度は、捕捉された画像の空間的な周波数スペースの分析に基づいて特定され、その際、前記捕捉された画像の空間周波数成分は閾値によって複数のグループに分割され、それぞれのグループに含まれる空間周波数成分の最大値又は最小値がシャープネス尺度として使用される、
請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記シャープネス尺度は、捕捉された画像の空間周波数スペクトラムの第４中心モーメント（尖度）の分析に基づいて特定され、その際、尖度の低い又は最小の値が選択される、
請求項６記載の方法。
【請求項１０】
照明放射（ＢＳ）として、自己再構築ビーム又は回折のないビームを有する放射を使用する、
請求項１乃至９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
顕微鏡（１）の試料平面（４）内に配置された試料（５）の画像データを捕捉する方法であって、
当該方法は、請求項１記載のステップＡ乃至Ｅを備え、
照明放射（ＢＳ）によって試料（５）内で検出放射（ＤＳ）がもたらされ、捕捉される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダの厚さを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光シート顕微鏡の主な用途の１つは、中型の試料、例えば数百μｍから数ミリメートルまでの組織、の画像化にある。概して、これらの試料は、アガロースに埋め込まれ、ガラスキャピラリ内に配置される。試料を調査するために、ガラスキャピラリは水で満たされた試料チャンバー内に導入され、試料を含むアガロースはキャピラリから外に少し押し出される。試料は、光シートによって照明される。試料内で励起され、試料から放出される蛍光は、光シートに対して垂直であり、従って、光シート光学ユニットに対しても垂直である検出対物レンズによって検出器、特にカメラ上へと結像される。
【０００３】
従来技術によれば、光シート顕微鏡（ＳＰＩＭレイアウト；単一平面照射顕微鏡（Single Plane Illumination Microscopy））のための顕微鏡１のレイアウトは、第１光軸Ａ１を有する照明対物レンズ２及び第２光軸Ａ２を有する検出対物レンズ３（以下ではＳＰＩＭ対物レンズとも称される）を有し、それらは、それぞれ、試料平面４に対して４５°の角度で、互いに対して直角に、上方から試料平面４上に方向づけられる（図１ａ参照）。試料平面４に配置された試料５は、例えば、ペトリ皿として構成される試料ホルダ７の基部上に位置している。試料ホルダ７は、液体８、例えば水で充填され、２つのＳＰＩＭ対物レンズ２、３は光シート顕微鏡の使用中、液体８に浸漬される（図示せず）。試料平面４は、デカルトの座標系のＸ軸Ｘ及びＹ軸ＹにわたるＸＹ平面に延在する。第１光軸Ａ１及び第２光軸Ａ２は、デカルトの座標系のＹ軸Ｙ及びＺ軸Ｚにわたる平面ＹＺに延在する。
【０００４】
照明対物レンズ２及び場合によってさらなる光学的有効素子によって薄い光シート６が生成され得るので、このアプローチは軸方向の高分解能の利点を提供する。より高い分解能に基づいて、より小さい試料５が調査されることができる。さらに、妨害的バックグラウンド蛍光は著しく低減され、その結果として信号対雑音比は改善される。
【０００５】
例えばマルチウェルプレートのような、標準的な試料容器におけるより単純な試料準備を可能にするために、４５°構成を維持することは可能であるが、しかしながら、２つのＳＰＩＭ対物レンズ２、３は、倒立配置において、試料ホルダ７の透明な基部を通って下から試料平面４上へ方向づけられる（図１ｂ）。この配置では、光軸Ａ１及びＡ２に関して傾けられ、カバーガラスの形態で存在する試料ホルダ７によって生じる収差を、特別な光学素子を用いて補正する必要がある。試料ホルダ７の基部を介して、試料平面４に配置される試料５が照射され、励起された試料５の蛍光が検出される。それは、例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿及び／又はスライドガラス（Objekttraeger）のような試料ホルダ７が用いられることができ、試料５の汚染が、特に高スループットスクリーニングの場合に、回避されることができる。
【０００６】
例えば、照明対物レンズ２及び／又は検出対物レンズ３のビーム経路内に補正素子１２として、所謂アルバレスプレートが配置される場合に（図１Ｂ）、さらに技術的な問題点が発生する（ＵＳ３，３０５，２９４Ａ）。アルバレスプレート１２は、試料ホルダ７、例えばカバーガラスと、それぞれの対物レンズ２，３の光軸Ａ１，Ａ２との間の固定された角度の場合に発生する収差をちょうど補正するように構成される。小さい角度偏差（例えば＜０．１°）においても、より低い結像品質につながる不所望な収差は発生する。そのため、角度偏差が認められる許容度内にあるように、例えばカバーレンズは、実験の開始前に整列配置されていなければならない。さらに、試料５又はその中の結像されるべき領域が像面ＢＥ内にあるように、角度に加えて、対物レンズ２、３又は場合によって存在する追加のレンズ（例えばメニスカスレンズ）と、カバーガラスとの間の距離も調整可能であると有用である。
【０００７】
カバーガラスによって生じる顕微鏡の収差を補正するための可能性は、ＭｃＧｏｒｔｙ他による刊行物（2015: Open-top selective plane illumination microscope for
conventionally mounted specimens; OPTICS EXPRESS 23: 16142 - 16153）から公知である。倒立ＳＰＩＭ顕微鏡は水プリズムを有し、その効果によって、カバーガラスを介する検出光の傾斜した経路の結果として発生する収差が部分的に補償される。
【０００８】
顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダの配置（Positionierung）のための可能な方法は、現在未発行のＤＥ１０２０１６２１２０１９に記載されている。その中で開示される方法において、照明放射の反射成分は、試料ホルダの現在の実際位置及び実際相対位置を捕捉するために用いられる。
【０００９】
試料ホルダの配置に加えて、収差は、試料ホルダの実際の厚さの、公称厚さからの偏差によっても引き起こされることができる。市販のカバーガラスや、ペトリ皿、マルチウェルプレート並びに類似の試料容器（以下では試料ホルダとして包括される）の基部は、公称厚さ周りにガラス又は材料厚さの許容可能な分散（Streuung）を有する。したがって、厚さ範囲は、例えば、＃１．５のカバーガラスの場合は１６０〜１９０μｍであり、＃１の場合は１３０〜１６０μｍである。したがって、例えば、補正素子が１７５μｍの公称厚さに対して設計され又は設定されていたとすると、１６０μｍの厚さを有するカバーガラス又は基部、例えばガラス基部は、特に高開口数において、倒立構成のために必要な、例えば照明放射の、傾斜経路において、試料ホルダを介して顕著な収差を引き起こす。
【００１０】
ここでの問題は、カバーガラス又は試料ホルダの基部の厚さが事前に未知であるということであり、従って、現在の厚さ及び、任意で適応補正素子のための必要な補正パラメータを特定し設定するための技術的解決が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】2015: Open-top selective plane illumination microscope forconventionally mounted specimens; OPTICS EXPRESS 23: 16142 - 16153
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダの厚さを決定する方法を提案するという目的に基づく。
【００１３】
この目的は、独立請求項１の主題によって達成される。有利な構成は、従属クレーム及び他の独立クレームで定められている。
【００１４】
顕微鏡のビーム経路内の試料ホルダの厚さを決定する方法であって、試料ホルダは照明放射に対して透明であって、試料を収容するために構成されている、方法は、以下のステップを含む。
【００１５】
ステップＡは、第１界面及び第２界面を有する試料ホルダを試料平面内に配置するステップに関する。試料平面はデカルト座標のＸ軸及びＹ軸にまたがるＸＹ平面内にある。
【００１６】
ステップＢにおいて、第１界面及び第２界面は試料平面に対して平行に整列配置されるか又は調整される。
【００１７】
ステップＣにおいて、照明放射の少なくとも１つのビームは、調整された試料ホルダ上に照明角度で第１光軸（照明軸）に沿って方向づけられる。
【００１８】
ステップＤは、照明放射の反射成分の少なくとも２つの測定値を捕捉するか、又は照明放射によって生じる検出放射の少なくとも２つの測定値を捕捉するステップに関する。
【００１９】
その後、ステップＥにおいて、少なくとも２つの捕捉された測定値に応じて、Ｚ軸方向における第１側と第２側面との相互の間隔が、厚さとして特定される。
【００２０】
試料ホルダ、試料ホルダの基部及びカバーガラスの用語は、異なる意味が明示的に指定されない限り、本明細書において同義的に用いられる。
【００２１】
検出放射とは、試料で反射された照明放射及び／又は照明放射によって試料内で発生する放射、特に励起蛍光放射を意味すると解されるべきである。第１界面及び第２界面は、例えば、試料ホルダの側面であって、以下では第１側面及び第２側面とも称される。
【００２２】
本発明による方法では、測定信号が使用され、その値は試料ホルダの厚さによって顕著に影響される。試料ホルダの厚さに関する特定された情報は、有利には、ビーム経路において必要な補正を行うために、例えば収差を低減するために使用することができる。照明放射のビーム経路内、反射成分のビーム経路内及び／又は検出放射のビーム経路内に配置された光学的に有効な補正素子は、特定された厚さに応じて駆動制御されることができ、それらの相対位置及び光学的補正作用はそれぞれのビーム経路内で設定される。
【００２３】
補正素子は、例えば、制御されて相互に移動可能な複数のアルバレスプレート（アルヴァレスマニピュレータとも称される）であり、従って、相互に正確に位置決めされたアルバレスプレートの光学作用として、複数の対物レンズ、照明放射・検出放射の波長及び／又は試料ホルダの特定の組み合わせの収差は、低減され又は完全に補償されることもできる。補正素子として、これに加えて又は代えて、制御されて変形可能なミラーアレイ（変形可能ミラー）、駆動制御可能なミラーアレイ又はマイクロミラーアレイ（デジタルミラーデバイス）及び／又は光変調器（空間光変調器、ＳＬＭ）を使用することができる。
【００２４】
本発明による方法を、その中の１つの構成において実施するために用いられる光学配置、特に倒立光シート配置は、例えば任意に、照明放射のビーム経路内に補正素子を有する。この、複数の部品、例えば２枚のアルバレスプレートを含み得る補正素子は、収差の静的補正のために設計されることができる。検出放射のビーム経路において、補正素子はその光学的作用に関して制御されて変更可能に構成されており、従って、生じ得る収差は、補正素子の相応の駆動制御によって影響を受け、特に低減されることができる。種々のビーム経路内の補正素子は、類似であるか、又は完全に同一であることもできる。照明放射及び検出放射のビーム経路内に、複数の補正素子を設けることもでき、それらは駆動制御可能であり、それらの共同の光学的作用は収差の減少を引き起こす。
【００２５】
本方法のさらなる構成では、光シートの形態の照明放射が試料ホルダ上に方向づけられ、光シートが試料平面内に生成される。検査すべき試料が試料平面内に存在すると、試料は光シートによって照明され、試料の照明された領域の対応する像を捕捉することが可能である。
【００２６】
したがって、例えば、本発明による方法の異なる部分ステップを実行するために、異なる照明放射を使用することが可能である。光シートは、従来技術から当業者に知られているように、静的又は動的光シートとして生成することができる。
【００２７】
照明放射は、個別放射の少なくとも１つのビーム（放射ビーム）（ein Buendel von Einzelstrahlen (Strahlenbuendel)）として提供され、試料ホルダ上へ方向づけられる。所謂ガウシアンビームは、照明放射の典型的形態である。
【００２８】
本発明による方法のさらなる構成において、照明放射として自己再構成ビーム又は非回折ビーム（non-diffractive beams）を用いることができ、それは、例えば、ベッセルビーム、マチュービーム、Ｓｉｎｃ３ビーム、格子光シート、コヒーレントベッセルビーム、セクションベッセルビーム、又はエアリービームの形態で構成されることができ、試料ホルダ上に方向づけられることができる。
【００２９】
マチュービームは、楕円座標を有するヘルムホルツ方程式による伝搬不変光学フィールド（propagation-invariant optical field）であると考えることができる（Gutierrez-Vega, J. C.
et al, 2001: Experimental demonstration of optical Mathieu beams; Optics
Communications 195: 35 - 40）。
【００３０】
以下で詳述するように、ガウシアンビームから逸脱するビーム形状、例えばＳｉｎｃ３ビームは、画質尺度のシャープネス及び／又はコントラストの分析のために（fuer die Analyse der Bildguetemasse Schaerfe und/oder Kontrast）特に適した、固有の構造化を有する。
【００３１】
特に、主に均一な蛍光放出を呈する試料領域においては、構造化されたビーム形状によって構造化された光シート自身がテスト格子として用いられることができる。例えばコントラストは、かかる格子に基づいて最大化されることができる。この目的のために、試料は構造化された光シートで照明され、試料に印加される構造化された照明放射の異なる強度は、相応に、試料内の構造化された蛍光励起を起こさせる又は起こさせることができる。構造化されて励起された蛍光放射の信号は、検出放射として、適切な検出器によって捕捉され、最大信号強度がＩｍａｘとして、最小信号強度がＩｍｉｎとして特定されて記憶される。格子構造の変調深さは、Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ／Ｉｍａｘ＋Ｉｍｉｎの関係によって分析されることができる。しかしながら、このテスト構造に、後述する画質基準（Bildguetekriterien）を適用することも可能である。
【００３２】
試料ホルダの厚さは、少なくとも２つの測定値に基づいて間接的に特定される。１つの選択肢は、照明放射の反射成分（反射）を評価することにある。
【００３３】
照明放射の成分は、主に、界面、例えば試料ホルダの上及び下の側面で反射される。それらの界面における反射は、例えばそれぞれ約３％の、媒質（ガラス浸漬、ガラス試料）間の反射係数の差異及び入射角に依存する反射率で起こる。ここで、照明放射の反射成分は、通常、ほぼ完全に検出ＮＡ（検出対物レンズの開口数）の中にある。これは、反射成分が、検出対物レンズに光学的に結合される検出器上に主に結像されることができるという結果を伴う。ここで、この反射成分は、照明放射及び反射放射に対して透明な試料ホルダ、例えばその基部の厚さを決定するために用いられることができる。この反射成分を検出するために、場合によってはビーム経路内にある蛍光顕微鏡検査のための発光フィルタは、取り除かれることができる。
【００３４】
この目的のために、本発明の有利な構成において、ステップＣでは、照明放射の少なくとも１つのビームは、第１光軸（照明軸）に沿って、ある照明角度において、整列された試料ホルダ上に、進められることができ、第１光軸とＸＹ平面に対して平行な参照軸との間の、この照明角度はゼロと等しくない。したがって、照明角度は、斜めに、例えば４５°又は６０°の照明角度で試料ホルダ上に方向づけられる。ステップＤにおいて、試料ホルダの第１側面から又は第２側面から反射される照明放射の反射成分は、検出器によって、所期の相対位置において、第１測定値として、捕捉される。その後、それぞれ他方の側面の反射成分が所期の相対位置において検出器によって第２測定値として捕捉されるまで、試料ホルダはＸＹ平面に垂直に方向づけられたＺ軸方向において移動される。Ｚ軸方向における移動経路は、試料ホルダと、例えば照明対物レンズ及び／又は検出対物レンズとの相対的な位置の変化であると、解されるべきである。従って、移動経路は、照明対物レンズ、検出対物レンズ及び／又は検出器の動作によって、また、試料ホルダ、照明対物レンズ、検出対物レンズ及び／又は検出器の複合動作によっても実現されることができる。
【００３５】
所期の相対位置は、試料ホルダが所期の又は所望の配置をとるとき、達成される。所期の相対位置の容認できる許容度を設定することができる。
【００３６】
ステップＥにおいて、第１測定値及び第２測定値に基づいて、第１側面及び第２側面の反射成分を所望の相対位置において捕捉するために必要であった、Ｚ軸の方向の移動経路が特定される。第１測定値及び第２測定値に基づいて、厚さが特定される。試料ホルダの材料が、例えば照射対物レンズと試料ホルダとの間にある媒体と異なる屈折率を有する場合、移動経路は試料ホルダの厚さに対応しない。
【００３７】
移動経路が既知である場合に試料ホルダの厚さを特定するために、照明角度と、試料ホルダの材料によって屈折された照明放射の角度とを捕捉することが可能である。角度関数（三角法）を適用して、移動経路を考慮すると、試料ホルダの厚さを算出することができる。
【００３８】
方法のさらなる構成において、補正素子の少なくとも１つを位置決めするための基準（Kriterium）として用いられる画質尺度が定められる。複数の補正素子のうちの少なくとも１つの、現在の実際の配置は、その際、段階的に又は連続的に補正される。複数の補正要素のうちの少なくとも１つの、選択された実際の配置の各々には、関連する実際の配置において捕捉された画質尺度の測定値が割り当てられ、記憶される。画質尺度の現在値は、画質尺度の測定値に基づいてそれぞれ特定される。評価のための画質尺度のこれらの現在値がある場合、所望の画質尺度、即ち画質尺度の所望の値を得られる、少なくとも１つの補正素子の実際の配置が選択される。選択された実際の配置は、将来の所望の配置として設定されることができる。
【００３９】
好ましくは、テーブル又は数学的関係（関数）が参照として特定され、繰り返し呼び出し可能に格納される。この参照は、画質尺度の値を試料ホルダのそれぞれの厚さに割り当てることを可能にする。
【００４０】
方法を実施するために、画質尺度コントラスト、シャープネス尺度、信号対雑音比、信号強度及び点広がり関数のパラメータ、又はこれらの組み合わせ、のうちの少なくとも１つの測定値を用いることができる。
【００４１】
各試料ホルダの厚さは、個別に補正されなければならず、例えば、グレーチング、ＵＳＡＦチャート等のようなテスト試料の使用は、ここでは適用することができない。しかしながら、本発明による方法のさらなる構成において、分離された点状の蛍光源を含む試料を用いることができる。画質尺度の少なくとも２測定値が、多数の点状の蛍光源のうちの少なくとも１つの検出放射に基づいて捕捉され、試料ホルダの厚さを特定するために用いられる。分離された点状の蛍光ソースは、重なり合わない。例えば、非常に明るいナノ球体のみを用いて試料に依存しない画質分析を行うために、分離された蛍光ナノ球体（所謂「ビーズ」）を試料内に導入することができる。ナノ球体が試料に含まれる場合、これらがほぼ点対象物でもあるという知識によって、例えば点広がり関数のＦＷＨＭ（半値全幅）を最小化するために、結像光学系の点広がり関数（point spread function; PSF）を分析することができる。
【００４２】
コントラストは、画質尺度として用いられることができる。均一な背景に対して分離された個別の対象物のコントラストは、Ｃ＝ΔＳ／Ｓ’を介して定義される。ここで、ΔＳは、（均一な）背景信号Ｓに関する信号の増加又は減少である。しかしながら、この定義は、予め既知でない任意の試料の局所的画像コントラストの自動的決定のためには適していない。
【００４３】
画像の又はＲＯＩ（関心領域）の各画素においてコントラストを算出するコントラスト定義は、そのためによりよく適している。さらに、フーリエ変換された画像においては、特定の空間周波数範囲のみが考慮され、その結果、信号、背景及びノイズをよりよく分離することができる（Peli, Eli. (1990), ”Contrast in complex images.” Journal of the
Optical Society of America A, 7: 2032-2040）。
【００４４】
従って、各画素のコントラスト及びそれぞれの周波数帯ｋは、
【００４５】
【数１】
2019109513.tif 000003
として表される。
ここで、Ｂｋ（ｘ，ｙ）は周波数帯ｋの帯域通過フィルタされた画像であり、
【００４６】
【数２】
2019109513.tif 000004
はこの周波数帯以下のエネルギーを含む。この境界は、フーリエ空間における典型的な顕微鏡画像に基づいて適切に設定されることができ、従って、例えば、画像内又はＲＯＩ内におけるＣｋ（ｘ，ｙ）の平均値によって、適応補正素子２を調整することによって最大化することができるメトリックが利用可能になる。
【００４７】
本方法のさらなる可能な態様において、シャープネス尺度は、捕捉された像の空間周波数成分を閾値によって２つのグループにサブ分割することにより、捕捉された像の空間的周波数空間の分析に基づいて求められ、それぞれのグループに含まれる空間周波数成分の最大値又は最小値がシャープネス尺度として用いられる。（例えば、De, Kanjar, and V. Masilamani.”Image sharpness measure for blurred images in frequency domain.” Procedia
Engineering 64 (2013): 149-158）。
【００４８】
さらに、本方法のさらなる可能な構成において、尖度の低値又は最小値が選択されることによって、捕捉された像の空間的周波数スペクトルの第４中心モーメント（尖度、４次中心モーメント、曲率（Kurtosis, zentrales Moment vierter Ordnung, Woelbung））の分析に基づいてシャープネス尺度を特定することが可能である（例えば、in Zhang, Nien Fan, et al. ”Image sharpness measurement in the
scanning electron microscope-Part III.” Scanning 21.4 (1999): 246-252）。
【００４９】
発生する収差の高い補償を達成するために、有利には、測定されるべき試料の像が、対応する画質尺度の反復分析及びその後の適応補正素子又は補正素子の適合のために用いられる。
【００５０】
反復的に検査されるべきパラメータ空間が大きすぎるか、又は、システムが全体的最小‐例えば、試料ホルダ７の最適傾斜及び最適焦点位置‐に向けて反復的に最適化されることができず、その代り局所的最小にとどまることが常に起こり得る。従って、画質評価の方法が、本方法の上述した構成の１つと組み合わせて実施されると有利である。ここで、先ず、例えば上述の方法によって、試料ホルダ７の傾斜及びＺ軸Ｚの方向の実際の位置が粗く位置決めされる。その後、微調整は、画質評価によって実施される。この方法は、従来の顕微鏡システムに適していない。
【００５１】
反復的にテストされるべき可能性があるパラメータ空間の制限に加えて、さらなる利点が生じる：
カバーガラスの厚さが光シート反射によって特定され、補償される場合、適応素子は、画質の反復的最大化によって、場合によっては、試料によって引き起こされるさらなる収差をも補償することができる。
【００５２】
本発明による方法は、画像データを捕捉する方法の一部であることができる。ここで、顕微鏡の試料平面に配置される試料の画像データは、照明放射によって試料内で引き起こされ、捕捉されている検出放射の作用よって得られることができる。かかる方法は、試料ホルダの厚さを決定するための上記に挙げられたステップＡからＥを含む。
【００５３】
倒立顕微鏡として実装された顕微鏡が本発明の有利な構成において使用される。倒立顕微鏡は第１光軸を有する照明対物レンズを有し、第１光軸は、Ｘ軸とＸ軸に対して直交するＹ軸とにわたる試料平面を貫く。さらにまた、試料平面から到来する光を検出するために構成され、第２光軸を有する検出対物レンズがあり、照明対物レンズ及び検出対物レンズは、相互の関係において及び試料平面との関係において、試料平面内で第１光軸と第２光軸とが交差して、互いに対して実質的に直角の角度をなす。第１の光軸及び第２の光軸は、試料平面に対して垂直にＺ軸方向に方向づけられ、参照軸（eine Bezugsachse）として役立つ第３軸に対してそれぞれゼロとは異なる角度をなす。上記に特定される構成は、光シート顕微鏡に特に適している。
【００５４】
本発明による方法は、以下において例示的に述べられる。実際の相対位置又は所期の相対位置として、以下では、検出器上、特に検出器の検出面上での反射成分の像の相対的位置が示される。
【００５５】
ステップＡ及びＢにおいて、試料ホルダは、試料平面において配置され整列される。アライメントは手動又は自動の方式で行われることができる。アライメントのために、照明放射及び／又は補助放射、例えばアライメントプロセスのためにだけ用いられる放射の、反射成分が用いられることができ、従って、ステップＣは試料ホルダをアライメントする過程に結び付けられることができる。その際、例えば、照明放射に対して透明な第１側面及び第２側面を有する基部を備える試料ホルダは、基部の第１側面、例えば上面によって反射された照明放射の成分が検出器によって捕捉されるまで、Ｚ軸方向にずらされる。試料ホルダと検出器との間の相対位置は、好ましくは、互いに、捕捉された成分の実際の相対位置が検出器上の所期の相対位置に近づくように位置決めされる。所期の相対位置は、有利には、所期の相対位置を調整する際に反射成分の実際の相対位置が検出器表面の外に外れてしまうことを回避するために、検出器表面の中央にある。
【００５６】
例えば、基部は、例えばガラス又はプラスチック製の、例えば皿の基部であることができる。第１及び第２側面を有するカバーガラスが、上述した意味の基部であることも可能である。及び、照明放射の屈折及び／又は反射が起きる界面として作用する第１側面及び第２側面、及び照明放射又は複数の照明放射に対する基部材料の十分な透明度が、ここでは重要である。
【００５７】
Ｘ軸についての基部の第１側面の傾斜の存在は、所期の相対位置からの実際の相対位置の角度偏差を特定することによって点検されることができる。許容可能な角度偏差より大きい角度偏差が特定された場合、試料ホルダは、角度偏差が最小化されるまでＸ軸について回転される。任意には、例えば、最短回転経路を介して角度偏差を補償するために、傾斜を補償するための好適な回転方向を特定することが可能である。その後、Ｚ軸の方向において、実際位置からの所期位置の偏差の発生が検査される。許容しがたい偏差が生じた場合、前述のことが任意に繰り返される。これらのプロセスが完了したあと、試料ホルダはＸ軸と平行に配列される。
【００５８】
任意には、さらなるアライメントプロセスにおいて、試料ホルダがＹ軸方向において変位されることによって、及び、検出器上で捕捉された反射成分の移行によるＹ軸方向の偏差が特定されることによって、Ｙ軸方向における第１側面のアライメントが点検される。捕捉された反射成分、すなわち実際の相対位置の移行が発生する場合、試料ホルダは、移行がもう発生しなくなるまで、又は移行が容認できる許容限界内に入るまで、Ｘ軸について回転される。
【００５９】
方法のステップＤにおいて、捕捉される反射成分の像が基部の第２側面、例えば下面から反射される成分が捕捉される第２初期位置に達するまで、調整された試料ホルダは、第１側面からの反射成分が第１所期相対位置において捕捉される第１の（所期の）配置から、Ｚ軸方向において変位される。Ｚ軸方向における第１側面と第２側面との間相互の実際の間隔は、第１所期相対位置と第２所期相対位置との間をＺ軸方向に移動した変位経路に応じて特定される。したがって、特定される間隔は、基部の厚さに対応する。
【００６０】
距離又は基部の厚さは、算出されることができる。算出オプションは、例示的な実施態様との関係において以下で特定される。
【００６１】
反射成分は、検出器によって、例えばＣＣＤチップ又はＣＭＯＳチップを有する例えばカメラによって又は四象限ダイオードによって捕捉される。
【００６２】
本発明による方法は、有利にはビーム経路又は複数のビーム経路の垂直配列を有する顕微鏡にも適用できる。かかる従来の配置における収差はより小さいが、それらの収差は、しかしながら、大きい開口数を有する最新の対物レンズ、特に水浸対物レンズ又はＴＩＲＦ（全反射蛍光顕微鏡検査（total internal reflection fluorescence microscopy））対物レンズの画質にとって非常に重要である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
本発明は、例示的実施形態及び図面に基づいて、以下でさらに詳細に説明される。
【図１ａ】従来技術による、試料平面上方に照明対物レンズ及び検出対物レンズの４５°配列を有し、試料平面下方に広視野対物レンズを有する顕微鏡の概略を示す図である。
【図１ｂ】従来技術による、試料平面下方に照明対物レンズ及び検出対物レンズの倒立４５°配列を有し、試料平面上方に広視野対物レンズを有する顕微鏡の概略を示す図である。
【図２】アルバレスプレート及びメニスカスレンズを有する、光シート顕微鏡法のために実装された顕微鏡の例示的な一実施形態の概略を示す図である。
【図３】倒立光シート顕微鏡の例示的な一実施形態の概略を示す図である。
【図４】検出器表面上の照明放射の反射成分の所期の相対位置と実際の相対位置との概略を示す図である。
【図５】試料ホルダの厚さ決定の原理の概略を示す図である。
【図６】未知の厚さの試料ホルダの場合の、異なって調整された補正素子の関数としてのシャープネス測定の概略を示す図である。
【図７】本発明による方法の一構成のフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下の従来技術からの例の、及び本発明の例示的実施形態の概略図において、同一の参照符号は、同一の技術的な要素を表示する。
【００６５】
図１ａに概略的に示されるように、照明対物レンズ２と、検出対物レンズ３と、任意の広視野対物レンズ２０とを有する直立顕微鏡１は、従来技術から公知である。光シート６は、照明対物レンズ２によって、第１光軸Ａ１に沿って生成され又は生成可能であり、光シートは、試料平面４に配置される試料５を調査するために使用可能である。検出対物レンズ３は第２光軸Ａ２を有し、それに沿って試料平面４から入射する光を捕捉することができる。第１光軸Ａ１及び第２光軸Ａ２は互いに直交するように配列され、参照平面として役立つ試料平面４に対してそれぞれ４５°の角度をなす。
【００６６】
広視野対物レンズ２０は第３光軸Ａ３を有し、それは試料平面４に垂直に方向づけられ、参照軸Ｂとして役立つ。第１乃至第３光軸Ａ１〜Ａ３は、試料５の光シート６の延在領域内で交差する。さらに、第１光軸Ａ１は参照軸Ｂに対する第１角度α１をなし、第２光軸Ａ２は参照軸Ｂに対する第２角度９０°−α１をなし、例えばそれぞれ４５°である。
【００６７】
試料５は、試料ステージ１１にある、流体８で充填された試料ホルダ７内に配置される。
【００６８】
図１ｂは、照明対物レンズ２及び検出対物レンズ３の倒立配置を有する顕微鏡１を概略的に示し、照明対物レンズ２及び検出対物レンズ３は試料平面２０の下方に配列され、広視野対物レンズ２０は試料平面２０の上方に配列される。角度α１及びα２は、それぞれ４５°である。
【００６９】
以下の例示的な実施形態は、倒立顕微鏡１を基礎として例示的に図示されており、さらなる実施形態において、直立顕微鏡１として実施されることもできる。
【００７０】
図２には、光シート顕微鏡のために実装され、アルバレスプレート及びメニスカスレンズ１０の形態の補正素子１２を有する倒立顕微鏡１の例示的実施形態が示される。角度α１及びα２は、それぞれ４５°である。補正素子１２は、主に試料ホルダ７の基部による照明放射ＢＳの傾いた経路のために発生しうる収差の補正に役立つ。任意のメニスカスレンズ１０は、空気から浸漬媒体１８へ及び流体８への照明放射ＢＳの推移（Uebergang）を支援し、検出放射ＤＳのためには流体８から浸漬媒体１８へ及び空気への推移を支援する。
【００７１】
試料ホルダ７は、試料ステージ１１上に保持される。試料ステージ１１自体は、詳細には図示されない駆動部によって、Ｘ軸Ｘ及びＹ軸ＹにまたがるＸＹ平面において制御されて調節可能である。
【００７２】
照明対物レンズ２及び検出対物レンズ３はそれぞれ、この場合ピエゾ駆動部として実装された、対物レンズ駆動部１４によって、第１光軸Ａ１及び第２光軸Ａ２のそれぞれに沿って制御されて調節可能である。
【００７３】
照明放射ＢＳは、レーザーモジュール１５によって供給され、ビーム成形ユニット１６によって成形される。ビーム成形ユニット１６は、例えば、供給された照明放射ＢＳを例えばコリメートする、光学系である。
【００７４】
スキャナ１７はビーム成形ユニット１６の下流に設けられ、成形された照明放射ＢＳは、そのスキャナによって、２方向に制御されて偏向可能である（ＸＹスキャナ）。
【００７５】
スキャナ１７の下流には、照明対物レンズ２が第１の光軸Ａ１上に配列される。スキャナ１７によって偏向する照明放射ＢＳは、照明対物レンズ２に達し、照明対物レンズ２によって成形され及び／又は集束される。
【００７６】
検出放射ＤＳは、第２光軸Ａ２に沿って検出器９上へ方向づけられ、この検出器によって捕捉されることができる。
【００７７】
試料ステージ１１、ピエゾ駆動部１４、補正素子１２、レーザーモジュール１５、ビーム成形部１６、スキャナ１７及び／又は検出器９の駆動制御のために制御ユニット１３が設けられており、制御ユニットは、データ伝送に適した接続で、作動されるべき素子と接続されている。
【００７８】
さらなる実施態様において、制御ユニット１３は、付加的に、測定値を捕捉し、保存し及び／又は評価するように構成されている。顕微鏡１のさらなる素子及びユニットは、制御ユニット１３によって駆動制御可能であることができ、及び／又は、それによって、測定値は取得され評価されることができる。
【００７９】
説明のために、以下では、互いに直交する軸を有する２つの座標系が用いられる。第１座標系は、Ｘ軸Ｘ、Ｙ軸Ｙ及びＺ軸Ｚを有する装置全体の座標系である。理想的には試料ホルダ７は、特にその基部は、Ｘ軸Ｘ及びＹ軸ＹにまたがるＸＹ平面と平行に配列される。第２座標系は、Ｘ軸Ｘ、ｙ軸ｙ’及びｚ軸ｚ’を有する検出器９の座標系である。例えば、像面ＢＥから検出器９の検出器表面９．１（図４参照）上への像は、座標Ｘ及びｙ’を有する。Ｘ軸Ｘは両方の座標系において同一であり、図面の紙面に対して直行するように方向づけられている。２つの他の軸Ｙとｙ’及びＺとｚ’は、それぞれ、Ｘ軸Ｘ周りの回転によって互いに重ね合わせられることができる。
【００８０】
以下の例示的な実施形態では、例えば倒立光シート顕微鏡に基づき、参照軸Ｂに対して、照明対物レンズ２の第１光軸Ａ１は６０°の角度α１をなし、検出対物レンズ３の第２の光軸Ａ２は３０°の角度α２をなす（図３）。任意のメニスカスレンズ１０は、より良い図示のために、すべての図面に示されているわけではない。さらに、例えばカバーガラス又は試料ホルダ７の基部の形態の試料ホルダ７に対しては、例えばｎ＝１．５２の屈折率が仮定され、浸漬媒体１８としての水に対しては、例えば屈折率ｎ＝１．３３が仮定される（図２参照）。光シートｂは、像面ＢＥにおいて生成されるか、又は生成可能である。
【００８１】
図４において、検出器表面９．１は平面図で図示され、試料ホルダ７及び光シート６は側面図で図示される。この相互に回転された見方から、軸Ｘ、ｙ’及びｚ’を有する検出器９の座標系の、図示された配向が生じる。
【００８２】
試料ホルダ７を調整するために、ステップ１において、第１側面ＯＳ、図示の例示的実施形態においては上側面から反射される照明放射の成分ＢＳｒｅｆが捕捉されるまで、試料ホルダ７はＺ軸Ｚの方向にずらされる。ここで、像面ＢＥは固定であるものとする。画像６０として捕捉される照明放射ＢＳｒｅｆの成分の実際の相対位置が、検出器９の検出器表面９．１上の像６０の所期の相対位置に近づくように、試料ホルダ７及び検出器９の互い対する相対位置は変えられる（図４）。
【００８３】
光シート６の横断面の像６０が検出器表面９．１上で中央にあるときに、Ｚ軸Ｚの方向の試料ホルダ７の実際の位置は最適に調整されている。
【００８４】
カバーガラスの第１側面ＯＳ及び第２側面ＵＳからの反射ＢＳｒｅｆがあるので、これらを区別できることが必要である。試料ホルダ７がＺ軸Ｚに沿って正方向（図４において上向き）に移動する場合、まず、第１側面ＯＳにおける反射ＢＳｒｅｆを検出器表面９．１上の中央に配置することができる。第２側面ＵＳによって生じる反射ＢＳｒｅｆは、Ｚ軸Ｚに沿って正方向のさらに移動する場合にのみ中央に調整されることができる。
【００８５】
概略的に図４に図示されるように、光シート７の横断面が中央に調整されると、像６０は、検出器表面９．１上の中央の、所期の相対位置において結像される。
【００８６】
例えば、試料ホルダ７の上記の調整は、例えば試料ホルダ７の基部の、厚さｄを決定することによって補足されることができる。以下では、簡略化のために、試料ホルダ７の基部の厚さｄ、又は、試料ホルダ７として用いられるカバーガラスの厚さｄが、参照される。
【００８７】
照明放射ＢＳの例示的ビーム経路、及び検出放射ＤＳ若しくは照明放射ＢＳの反射成分ＢＳｒｅｆの例示的ビーム経路は、図５に図示される。照明放射ＢＳは、第１光軸Ａ１に沿って、垂直に対して６０°の角度で、試料ホルダ７の下側面ＵＳに方向づけられる。屈折率ｎ＝１．３３を有する空気と屈折率ｎ＝１．５２を有する試料ホルダ７の材料との間に、下側面ＵＳによって形成される界面を照明放射ＢＳが通過するときに、照明放射ＢＳは垂直方向へ屈折し、試料ホルダ７の上側面ＯＳまで４８°の角度において進む。
【００８８】
第１側面ＯＳの所で、像面ＢＥにおいて照明放射ＢＳｒｅｆの部分の反射は第２側面ＵＳへと戻すように行われる。照明放射の反射成分ＢＳｒｅｆが第２側面ＵＳを通過するときには、これは、再び垂直方向から離れるように屈折され、例えば、検出放射ＤＳとして第２光軸Ａ２に沿って検出器９に達する（図示せず、図４参照）。
【００８９】
試料ホルダ７を通過する照明放射ＢＳの傾斜経路の場合に発生する収差は、主に試料ホルダの厚さｄ、即ち第１及び第２の側面ＯＳ、ＵＳの間の距離に依存する。このことから、複数の補正素子１２を互いに対して移動することによって収差補正を厚さｄに適合するために、補正素子１２（図２）は例えば照明対物レンズ２及び／又は検出対物レンズ３内に変位可能に配置される。
【００９０】
試料ホルダの厚さｄは、第１側面ＯＳ及び第２側面ＵＳからの反射ＢＳｒｅｆに基づいて特定されることができる。図５には両方の反射ＢＳｒｅｆが概略的に示されており、ｄは厚さ、ｄ’はＺ軸Ｚに沿った正方向における試料ホルダ７の移動経路である。
【００９１】
厚さｄは、以下のようにして決定される：
最初に、第１側面ＯＳからの反射ＢＳｒｅｆが、像６０として（図４参照）検出器表面９．１上の所期の相対位置、例えば中央になるように、試料ホルダ７が位置決めされ、試料ホルダ７は傾きを有さない。実施例において、照明放射ＢＳと参照軸Ｂとの間の角度は、試料ホルダの外側で６０°であるが、試料ホルダ７の内では発生する屈折のための４８°である。参照軸Ｂは、像面ＢＥ（図３参照）及び簡略化されて図示された第１側面ＯＳ上の照明放射ＢＳの入射点を通って延在する。Ｙ軸Ｙの方向において、Δｙは、第２側面ＵＳを通る照明放射ＢＳの通過点と、第１側面ＯＳ上の入射点との間の経路を表示する。
【００９２】
その後、第２側面ＵＳからの反射ＢＳｒｅｆが像６０として検出器表面９．１の所期の相対位置になるまで（図４参照）、試料ホルダ７はＺ軸Ｚに沿って正方向において移動する。このために必要とされる移動経路ｄ’は、例えば、測定され又は算出されて、特定される。ここで、実施例における非屈折照明放射ＢＳと参照軸Ｂとの間の角度は、実施例において６０°である。
【００９３】
ここで、試料ホルダ７の厚さｄは、以下の三角法の関係及び実施例で指定されている角度によって算出されることができる：
ｔａｎ（６０°）＝Δｙ／ｄ’
ｔａｎ（４８°）＝Δｙ／ｄ
但し、Δｙは、照明放射ＢＳの通路と参照軸Ｂとの間の、Ｘ軸Ｘの方向において測定される経路である。
【００９４】
厚さｄは、ｄ’×ｔａｎ（６０°）／ｔａｎ（４８°）から算出される。
【００９５】
方法のさらなる構成において、例えば赤外線の範囲の、結像のために用いられない波長によって生成される光シート６に基づいて、追加的に傾斜補正を行うことができる。この光シート６は、試料ホルダ７の実際の位置、特にＺ軸Ｚの方向におけるその実際の位置を確認するために、恒久的に又はある時点に、例えば実験中に、使用されることができ、場合によっては、実験中のその実際の位置を補正するために、使用されることができる。光シート６の代わりに、例えば、ガウシアンビーム、ベッセルビーム、またはマチュー（Mathieu）ビームなどのビームを使用することも可能である。四象限ダイオードを、検出器９として使用することができる。
【００９６】
さらなる可能な構成において、オートコリメーションテレスコープは、試料ホルダ７上へ方向づけられることができる。試料ホルダ７の傾斜配置は、オートコリメーションテレスコープの検出器９上での反射ＢＳｒｅｆの変位に変換される。このアプローチを使用して傾斜角度を調整することのみが可能である。
【００９７】
さらなる可能な構成は、試料ホルダ７上に方向づけられる、コリメートされたレーザを必要とする。レーザは、垂直に対して、例えば参照軸Ｂに対して、平行に方向づけられる。例えば、反射ＢＳｒｅｆは、ビームスプリッタ又はポール光学系（Pol-Optik）によってミラーアウトされ（ausgespiegelt）、四象限ダイオードに記録される。ここで、試料ホルダ４の傾斜は、四象限ダイオードの信号を用いて調整され補正されることができる。この構成を用いてＺ軸Ｚの方向における実際の位置を調整することはできない。前述の２つの方法は、従来の顕微鏡システム及び光シート顕微鏡に適している。
【００９８】
さらに、本方法のさらなる構成において、画質尺度に基づく評価を追加的に行うことも可能である。したがって、例えば、選択された画質尺度の測定値を所望の測定値に近づけるため又はこの測定値を最大にするために、検出対物レンズ３の傾斜及び／又は焦点位置を繰り返し調整することができる。このために、測定されるべき試料５自体が使用されることができるか、又は選択された照明放射ＢＳのビームのビームプロファイルが分析される。
【００９９】
さらなる可能な実施形態において、少なくとも３つの点で支持された試料５のシャープネス又は別の画質基準を測定することによって、及び、対物レンズ２、３のうち少なくとも１つの試料５からの距離を相応に再調整する（Nachregelung）ことによって、試料５のトポグラフィが特定され、そこから局所的なカバーガラス傾斜が算出される。
【０１００】
さらなる可能な構成において、試料ホルダ７上にあるナノ粒子（所謂、基準点（Fiducials）、ビーズ）又は試料ホルダ７に付けられたマーキングは、試料５として作用することができる。
【０１０１】
図６には、厚さｄと、予め既知でない厚さｄを有する試料ホルダ７のシャープネス画質尺度と、の間の関係が例示的に示される。複数の補正要素１２又は少なくとも検出放射ＤＳのビーム経路内にある補正要素１２は、インクリメンタルに試料ホルダ７の可能な厚さｄに調整される。インクリメントの幅は、１６０μｍの厚さｄから始まる５μｍとして選択される。検出放射ＤＳによって捕捉された像のシャープネスは、１つ以上の補正素子１２のこのようにして選択された各設定によって特定される。測定値のグラフ図において、１つ以上の補正素子１２の設定におけるシャープネス画質尺度の最大値が達成され、公称厚さ１７５μｍを有する試料ホルダ７の収差が補償されることが認識できる。従って、１７５μｍの実際の厚さｄが推定されることができる。
【０１０２】
図７は、厚さｄを決定し、少なくとも１つの補正要素１２を厚さｄの関数として調整する、本発明による方法の一連の構成のフローチャートを示す。
【０１０３】
任意に、画質尺度（画質メトリック）の初期値は、ユーザによって入力されることができるか、又は、例えば反射成分ＢＳｒｅｆを用いた厚さ決定に基づいて予め与えられることができる。このようにして特定され、又は予め与えられた厚さｄは、初期値として、少なくとも１つの修正素子１２の第１設定として用いられる。その後、補正素子１２は、より大きな厚さｄに対応する設定にされる。この設定で特定された画質尺度の値が増加すると、次々に、より大きな厚さｄに対応する設定が選択される。このループは、画質尺度の値がもう増加しなくなるか、又は再び低下するまで繰り返すことができる。
【０１０４】
少なくとも１つの補正素子１２の設定を選択した後に画質尺度の値が低下すると、前の設定に対して減少した厚さｄに割り当てられた設定が選択される。画質尺度が最大である設定が見つかると、少なくとも１つの補正要素１２が設定され、制御ループは停止されることができる。それを満たすことによって制御ループが終了される、中断基準が設定されていれば有利である。したがって、例えば、画質尺度値の最小差を設定することができ、この最小差を下回る場合に終了が引き起こされる。
【符号の説明】
【０１０５】
１  顕微鏡
２  照明対物レンズ
３  検出対物レンズ
４  試料平面
５  試料
６  光シート
６０  画像（光シート横断面の結像／像）
６０’  （移動された試料ホルダ７の場合における光シート横断面の）画像
Ｂ  参照軸
ＢＳ  照明放射
ＢＳｒｅｆ  （照明放射ＢＳの）反射成分
ＤＳ  検出放射
ＢＥ  像面
７  試料ホルダ
７’  仮想的に移動された試料ホルダ７
８  流体
９  検出器
９．１  検出器表面
１０  メニスカスレンズ
１１  試料ステージ
１２  補正素子
１３  制御ユニット
１４  対物レンズ駆動部
１５  レーザーモジュール
１６  ビーム成形部
１７  ＸＹスキャナ
１８  浸漬媒体
Ａ１  第１光軸
Ａ２  第２光軸
α１  （第１光軸Ａ１と参照軸Ｂとの間の）角度
α２  （第２光軸Ａ２と参照軸Ｂとの間の）角度
ｄ  距離、厚さ
ｄ  移動経路
ＯＳ  第１側面、第１界面（上側）
ＵＳ  第２側面、第２界面（下側）
Δｙ  （Ｙ軸Ｙの方向における）経路
【図１ａ】
2019109513.tif 000005
【図１ｂ】
2019109513.tif 000006
【図２】
2019109513.tif 000007
【図３】
2019109513.tif 000008
【図４】
2019109513.tif 000009
【図５】
2019109513.tif 000010
【図６】
2019109513.tif 000011
【図７】
2019109513.tif 000012
【外国語明細書】
2019109513000001.pdf