(57)【要約】      （修正有）【課題】黄色ブドウ球菌の宿主組織への付着を阻害し、感染の長期的なリザーバーとして機能するバイオフィルム形成を抑止することができる抗黄色ブドウ球菌ワクチンの提供。【解決手段】（１）ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの触媒ドメイン及び／または細胞壁結合ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合部分、並びにそれを含有する医薬組成物。（２）ハイブリドーマを含む、モノクローナル抗体を発現する細胞株。（３）整形外科用インプラント、移植片、または医療装置の取り付けのためのモノクローナル抗体の使用方法、ブドウ球菌感染の治療または予防方法、骨髄炎の治療方法、及び、サンプル中のブドウ球菌を検出するための診察方法。【選択図】図２
2019196353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）自己溶解素コンセンサスＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメイン及び／または細胞壁結合ドメインに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【請求項２】
ブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖並びに／または金属、プラスチック及び有機体表面でのバイオフィルムの確立を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項３】
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）またはスタフィロコッカス・シミアン（Ｓ．ｓｉｍｉａｎ）を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項４】
前記ブドウ球菌株はメチシリン耐性またはバンコマイシン耐性である、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項５】
Ａｍｄの触媒ドメインのエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項６】
ＡｍｄのＲ１またはＲ２細胞壁結合ドメイン内で全体的にまたは部分的にエピトープに結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項７】
Ａｍｄの触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに、１０−８Ｍを超える親和性で結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項８】
Ａｍｄの触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに、約１〜約６ｎＭのＫＤで結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項９】
以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＨドメインを含み：
2019196353.tif 000079
2019196353.tif 000080
、かつ／または、以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＬドメインを含む：
2019196353.tif 000081
2019196353.tif 000082
、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１０】
以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＨドメインを含み：
2019196353.tif 000083
、かつ／または、以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＬドメインを含む：
2019196353.tif 000084
2019196353.tif 000085
、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１１】
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１２】
前記ヒト化モノクローナル抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４クラスである、請求項１１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分。
【請求項１４】
Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項１３に記載のＡｍｄ結合部分。
【請求項１５】
ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）に特異的に結合し、かつＡｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、Ａｍｄ２．２、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗体と交差競合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【請求項１６】
Ａｍｄに結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１７】
Ａｍｄに特異的に結合し、かつ抗体Ａｍｄ１．６と交差競合する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１８】
Ａｍｄに特異的に結合し、かつ抗体Ａｍｄ２．１と交差競合する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項１９】
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分。
【請求項２１】
ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）に特異的に結合し、かつＡｍｄ触媒ドメインに結合する抗体と交差競合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【請求項２２】
Ａｍｄに特異的に結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、請求項２１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２３】
Ａｍｄに特異的に結合し、かつＡｍｄ１．６、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、及びＡｍｄ２．２から選択される抗体と交差競合する、請求項２１に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２４】
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分。
【請求項２６】
Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、Ａｍｄ２．２、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗体が結合するのと、同一の、ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）のエピトープに結合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
【請求項２７】
Ａｍｄに結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、請求項２６に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２８】
抗体Ａｍｄ１．６と同一のエピトープに結合する、請求項２６に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項２９】
抗体Ａｍｄ２．１と同一のエピトープに結合する、請求項２６に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項３０】
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分。
【請求項３２】
請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分を発現する、細胞株。
【請求項３３】
ハイブリドーマである、請求項３２に記載の細胞株。
【請求項３４】
組み換え細胞株である、請求項３２に記載の細胞株。
【請求項３５】
担体、並びに請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載の１つ以上のモノクローナル抗体または請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載の１つ以上のＡｍｄ結合部分を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
前記担体は水溶液である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
抗生物質製剤または免疫療法薬を更に含む、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記抗生物質製剤はバンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、テディゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群から選択される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第２のモノクローナル抗体またはその結合部分である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６、もしくは４Ａ１２、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記第２のモノクローナル抗体の前記ヒト化変異体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラスである、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記第２のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ１．６、またはＡｍｄ１．６と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、または１Ｃ１１と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
整形外科用インプラント、移植片または医療装置を必要とする患者に、請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載の有効量のモノクローナル抗体、請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載の１つ以上のＡｍｄ結合部分、または請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する段階；
前記患者に前記整形外科用インプラント、移植片または医療装置を導入する段階
を含む、患者への整形外科用インプラント、移植片または医療装置の導入方法。
【請求項４６】
前記導入する段階の前に前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記導入する段階の後に前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記投与する段階を全身的に実施する、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記投与する段階を移植部位に直接実施する、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記整形外科用インプラントを導入する、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記整形外科用インプラントは人工関節、移植片または合成インプラントである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記人工関節は全体的または部分的な人工膝関節、人工股関節、手指義手、人工肘関節、人工肩関節、人工顎関節、または人工足関節である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記移植片または合成インプラントは、人工血管、心臓弁インプラント、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種異系の前十字靭帯、内側側副靭帯、外側側幅靭帯、後十字靱帯、アキレス腱、もしくは回旋腱板である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記移植片または医療装置が導入される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記医療装置は心臓ペースメーカー、髄液シャント、透析カテーテル、または人工心臓弁である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者に第２の治療薬を投与することを更に含み、該第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、請求項４５〜５０または５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第２のモノクローナル抗体またはその結合部分である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６、もしくは４Ａ１２、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ１．６、またはＡｍｄ１．６と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、または１Ｃ１１と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記第２のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラスである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
感染した人工関節を患者から取り除き、かつ前記整形外科用インプラントを患者に導入する段階の前に、患者の感染を治療する段階
を更に含み、前記整形外科用インプラントは再関節全置換術用の人工関節である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療する段階は、
有効量の抗生物質製剤を投与すること、
前記投与する段階、または
これらの組み合わせ
を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記再関節全置換術の最中の感染または再感染を予防するのに効果的である、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者はヒトである、請求項４５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者は非ヒト哺乳動物である、請求項４５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
ブドウ球菌感染に罹りやすい、またはブドウ球菌感染を患っている患者に、請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載の有効量のモノクローナル抗体、請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載の１つ以上のＡｍｄ結合部分、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与する段階
を含む、ブドウ球菌感染の治療または予防方法。
【請求項７０】
前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記投与する段階を全身的に実施する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記投与する段階をブドウ球菌感染部位に直接実施する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ブドウ球菌感染部位は、神経系、皮膚、筋肉、心臓、気道、胃腸、眼、腎臓及び尿路、または骨及び関節感染を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記患者に第２の治療薬を投与することを更に含み、該第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつ／またはブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第２のモノクローナル抗体もしくはその結合部分である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６、もしくは４Ａ１２、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ１．６、またはＡｍｄ１．６と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、または１Ｃ１１と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラスである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記第２のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記患者はヒトである、請求項６９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者は非ヒト哺乳動物である、請求項６９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・カプラエまたはスタフィロコッカス・シミアンである、請求項６９〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記投与する段階は、感染速度、感染の重症度、感染期間、もしくはこれらの任意の組み合わせを低減する；膿瘍の総数を減少させるもしくは全て除去する；かつ／または無菌性膿瘍の数を増加させるのに有効である、請求項６９〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ブドウ球菌の骨または関節感染を患う患者に、請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載の有効量のモノクローナル抗体、請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載の１つ以上のＡｍｄ結合部分、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与する段階
を含む、骨髄炎の治療方法。
【請求項８７】
前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記投与する段階を全身的に実施する、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記投与する段階を、黄色ブドウ球菌の骨または関節感染の部位に直接実施する、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記患者に第２の治療薬を投与することを更に含み、該第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第２のモノクローナル抗体またはその結合部分である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６、もしくは４Ａ１２、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ１．６、またはＡｍｄ１．６と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第２のモノクローナル抗体は１Ｃ１１、または１Ｃ１１と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記第２のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４クラスである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記第２のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記患者はヒトである、請求項８６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記患者は非ヒト哺乳動物である、請求項８６〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・カプラエまたはスタフィロコッカス・シミアンである、請求項８６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記投与する段階は、溶骨性病変を部分的または完全に治癒するのに有効である、請求項８６に記載の方法。
【請求項１０２】
サンプル中でのブドウ球菌の存在の決定方法であって、
サンプルを、請求項１〜１２、１５〜１９、２１〜２４、及び２６〜３０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、または請求項１３、１４、２０、２５、及び３１のいずれか一項に記載のＡｍｄ結合部分に曝露する段階；並びに
前記モノクローナル抗体または結合部分と、前記サンプル中に存在するブドウ球菌またはブドウ球菌アミダーゼとの間に免疫複合体が生じるかどうかを検出する段階
を含み、前記曝露する段階の後に該免疫複合体が存在することは、サンプル内にブドウ球菌が存在することを示す、前記方法。
【請求項１０３】
前記検出する段階はイムノアッセイを使用して実施される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記イムノアッセイはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ゲル拡散沈降反応アッセイ、免役拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、または免疫電気泳動アッセイである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記モノクローナル抗体または結合部分は標識を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記標識は放射線標識、フルオロフォア、または化学発光標識である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記サンプルは液体サンプルまたは組織サンプルである、請求項１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年１２月１３日に出願された米国特許仮出願番号第６１／９１５，９５３号の優先権の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
使用分野
ブドウ球菌感染に対する受動免疫のための方法及び組成物、特に骨髄炎の予防または治療のための、及び医療装置、または整形外科用インプラントもしくは移植片の移植により生じる感染に対する受動免疫のための方法及び組成物を本明細書にて開示する。ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの触媒ドメイン及び／または細胞壁結合ドメインに特異的に結合する抗体、並びにそれを含有する医薬組成物を、これらの目的のために使用可能である。
【背景技術】
【０００３】
背景
１年あたりで約１１万２千件の整形外科装置が関係する感染が、一事例あたりおよそ１万５千ドル〜７万ドルの入院費で米国内で発生している（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））ため、慢性骨髄炎（ＯＭ）に対する新規の介入が大変必要とされている。手術手技の改善及び抗生物質による攻撃的予防は、整形外科用インプラント手術後の感染率を１〜５％に下げたが、骨髄炎（ＯＭ）は深刻な問題のままであり、最小侵襲手術により増加しているようにみえる（Ｍａｈｏｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｐ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）；ＷＨＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。８０％が黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に起因する、この再発の深刻さは、臨床分離株の約５０％がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であるという事実により増幅される。この１０年間での、人工関節及び骨折固定装置に対する感染率はそれぞれ、症例のわずか０．３〜１１％、及び５〜１５％である（Ｌｅｗ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ，"Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｌａｎｃｅｔ  ３６４（９４３１）：３６９−７９（２００４）；Ｔｏｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｉ−Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｊｏｉｎｔ  Ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ｂｒ．８８（２）：１４９−５５（２００６））が、この結果は切断手術または死をもたらし得る。更に、待機的関節全置換術（ＴＪＲ）のための「最小侵襲手術」の普及では、ごく小さな切り口が、多くの場合移植中にプロテーゼが接触する皮膚からの合併症をもたらし、ＯＭの罹患率を劇的に増加させている  （Ｍａｈｏｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｐ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｒｅ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８５（Ａ−１）：２７−３２（２００３）；ＷＨＯ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２００１）。これらの感染には大変高価な段階式再置換術が必要であり、近年の報告では、成功率は５０％の低さであり得ることを示唆している（Ａｚｚａｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ  Ｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｋｎｅｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，"  Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．４６７（７）：１７０６−１４（２００９））。しかし最大の懸念は、薬剤耐性ブドウ球菌株（最も著しいのはＭＲＳＡ）の出現であり、この株は、北米で最も死に至らしめる病原体としてＨＩＶを凌駕し、慢性ＯＭの管理を一層困難かつ高価なものにし続け、これらの感染を患う患者を治療するための、新規の治療的介入の大きな需要をもたらしている。特に、ＴＪＲの主要患者である免疫力の低下した高齢者に対する、代替となる介入戦略の大きな必要性が存在する。
【０００４】
現在、最も著しい、米国内で１年にＴＪＲを罹患する１５０万人の大部分を占める高齢の「ベビーブーマー」である、ハイリスクの患者をＭＲＳＡから保護可能な予防的治療は存在しない。ＭＲＳＡの罹患率を５０〜８０％低下させるワクチンは、一番複雑な関節置換及び開口亀裂修復手技を低減するだけでなく、ヘルスケアのための負担を同様の量だけ削減する。
【０００５】
研究は、慢性ＯＭの８０％が黄色ブドウ球菌により引き起こされていることを証明している。これらの細菌は、黄色ブドウ球菌の骨マトリックスへの結合を促進する複数の細胞表面接着分子（Ｆｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"ＥＭＢＯ  Ｊ．６（８）：２３５１−７（１９８７））、骨吸収を刺激可能な毒素（Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｕｒｆａｃｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｒｅｓｏｒｂｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０（５）：７２６−３４（１９９５））、及び増加した破骨細胞活性を刺激することによる骨の劣化（Ｍａｒｒｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））を含む、骨の病因となる複数の因子を含有する。進化における律速段階、及び感染の持続は、移植した装置周辺にバイオフィルムを形成する（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。移植直後に、宿主由来の細胞外マトリックス成分（フィブリノゲン、フィブロネクチン、及びコラーゲンを含む）で構成される調節層（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｌａｙｅｒ）がインプラント表面に形成し、血行性播種に由来する浮遊細菌、または創傷に隣接する皮膚、骨内への細菌の外科的播種、もしくは関係する軟組織骨膜の著しい破壊に伴う傷から等の、感染の近接病巣からの細菌のいずれかの付着を招く（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ，"Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ，"Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０（１４）：１４２２−９（２００４））。次の数日間にわたり、コロニー付着の増加、細菌細胞分裂、更なるプランクトン生物の動員、及び細菌細胞外高分子物質（グリコカリックスを形成するもの等）の分泌により、細菌バイオフィルムが生成する。このバイオフィルムは、抗生物質、食細胞及び抗体の活動から細菌を保護する、機能の優れたバリアとしての役割を果たし、宿主のリンパ球機能を損なう（Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｌｉｍｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，"Ｌａｎｃｅｔ  １（８３７３）：３６５−７（１９８４）；Ｊｏｈｎｓ��ｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｓｌｉｍｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５４（１）：１３−２０（１９８６）；Ｎａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ−Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．２６１：１２６−３３（１９９０））。
【０００６】
近年の別の発見は、黄色ブドウ球菌は、骨マトリックスをコロニー化するだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで造骨細胞に内在化もまたされるということである（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９（９）：５２３５−４２（２００１））、及びｉｎ  ｖｉｖｏで（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂｙ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｃｈｉｃｋ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，"Ｂｏｎｅ  ２６（１）：６３−７０（２０００））。これは、抗体及び抗生物質耐性の更に別の層をもたらす。感染のこの相は、代謝活性が著しく低下した条件下にて発生し、かつ同様に黄色ブドウ球菌の持続性の原因となる、いわゆる小コロニー変異体として現れる場合がある（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｐｓｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｌｌ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０（１）：９５−１０２（１９９５））。この時点で、細菌は抗菌性治療に対する表現型耐性もまた発現する場合があり、短期治療の高い失敗率もまた説明している  （Ｃｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｔｏ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ，"Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６３（６）：１３６９−７３（１９９１））。これらの大規模な病原性機構のため、ＯＭは、数年間の静止状態の後でさえも再発する傾向があることが有名であり、完全な治療をもたらす見込みがないことが認められている（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｈｏｕｎ，"Ｌｏｎｇ−Ｂｏｎｅ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，"Ｈｏｓｐ．  Ｐｒａｃｔ．（Ｏｆｆ  Ｅｄ）２９（１０）：７１−６，９，８３  ｐａｓｓｉｍ（１９９４））。
【０００７】
慢性ＯＭの分野における重要な問題の１つは、慢性ＯＭを制御する因子に関する現在の知見が何故これほど限定的であるのか、ということである。おそらく、細菌の病原性遺伝子を解明するために必要な実験道具は、１世紀以上の間利用が可能であった。この異例の事態に対しては、３つの説が存在する。第１に、骨髄炎の症例の総数は多いが、関節形成再置換術の可能性を除くと、発生率は１〜５％であり、厳密な前向き臨床研究を行うには低すぎる。第２に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は細胞外被膜を合成しない生物の生育を素早く選択することがよく知られており、このため、バイオフィルムの生態はｉｎ  ｖｉｖｏモデルでのみ研究することができる（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ：Ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，"  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１８）：１３１８−２２（１９９９））。これは、本領域における「最大の障害」をもたらし、その障害とは、バイオフィルム形成の前に、細菌の初期のプランクトン様成長段階を評価可能な定量的動物モデルが存在しないことである。現在まで、慢性ＯＭの病因に関する知見の大部分は、動物モデルから得られており（Ｎｏｒｄｅｎ，"Ｌｅｓｓｏｎｓ  Ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，"Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１０（１）：１０３−１０（１９８８））、これらのモデルとしは、ニワトリ（Ｄａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ，Ｓｅｐｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ａｎｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ，"Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．８（６）：８０４−１３（１９９０））、ラット（Ｒｉｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４７（３）：５８１−６（１９８５））、モルモット（Ｐａｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇｓ，"Ｊ．Ｔｒａｕｍａ  ２４（４）：３２３−６（１９８４））、ウサギ（Ｗｏｒｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，"Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．６９（２）：２３５−４４（１９８８））、イヌ（Ｖａｒｓｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｄｏｇｓ，"Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２７（９）：８１６−９（１９８９））、ヒツジ（Ｋａａｒｓｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｎｅｗ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  Ｓｈｅｅｐ，"Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．３３９：２４６−５２（１９９７））、及び最近ではマウス（Ｍａｒｒｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｉｎ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，"Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（４）：１３９９−４０６（２００４））が開発されてきた。これらのモデルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより特定された細菌付着因子の重要性を確認するために使用されてきた（Ｃｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｇｒｏｗｉｎｇ  ｏｎ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，"  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７（４）：６２５−３２（１９９３）；  Ｂｕｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｔｏ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ，"  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８（６）：４４１−８（１９９０）；Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７（１）：９９−１０７（１９９３））が、これらはｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、細菌負荷、または骨溶解に関する、成果となる測定値を有しない。そのため、これらは薬剤効果、細菌の突然変異株、及び宿主因子の役割を評価するために、トランスジェニックマウスと共に効率的に使用することができない。
【０００８】
１５０年にわたる研究に基づき、ブドウ球菌の病因を説明するための明確なパラダイムが現れている。このモデルはＯＭにもまた適用される。感染の初期段階は、単細胞細菌が体に侵入する際に生じる。この時点で、微生物が環境変化に応答し、先天性免疫を打ち負かすことを助け、宿主に付着する付着因子受容体を提供する病原性遺伝子を発現するはずである。細菌はまた、付着及び表面コロニー形成が生じる壊死組織またはインプラント等の異物の宿主付着標的の確率論的可用性に依存する。これらの工程が上手く完了すると、バイオフィルムの指数増殖期に繋がり、この段階は、栄養素の枯渇及び／または適応免疫の進行の時点で終了する。指数増殖期に続き、細菌は、遺伝子発現でのクオラムセンシング由来の変化により、バイオフィルムの一部が浮遊細胞またはバイオフィルム断片の可動セグメントとして分離するまで、多層バイオフィルム内での成長休止条件下にて残存する（Ｙａｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，"Ｑｕｏｒｕｍ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ，"Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６（６）：１８３８−１８５０（２００４））。しかしこの時点で、感染は慢性的なものであり、薬剤または宿主免疫により根絶することはできない。したがって、本領域での焦点は、ＭＳＣＲＡＭＭ（微生物表面成分認識付着性マトリックス分子）として知られる細菌付着因子の一部類と特異的に相互作用する、細胞表面の細胞外マトリックス成分に当てられてきた（Ｐａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，"ＭＳＣＲＡＭＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，"Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：５８５−６１７（１９９４））。実のところ、今日まで開発されてきた実質的に全ての抗黄色ブドウ球菌ワクチンは、宿主組織のコロニー形成及び侵入に重要なＭＳＣＲＡＭＭに対して向けられてきた。これらのワクチンの目標は、これらの細菌表面の抗原に結合する抗体を作製することにより、宿主組織への細菌の付着を阻害し、感染の長期的なリザーバーとして機能するバイオフィルム形成を抑止することである。細菌表面をオプソニン化することにより、これらの抗体は、食細胞による黄色ブドウ球菌の除去を仲介することも可能になる。残念なことに、黄色ブドウ球菌は多くの付着因子を有し、１種以上の阻害は細菌付着を防止するには十分でない場合がある。更に、食細胞による細菌の除去は、骨などの無血管組織に限定されており、抗体のみでは、黄色ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏでのプランクトン様増殖を有意に低下し、再関節全置換術の間、慢性ＯＭの確立または再感染を予防するための、追加の抗微生物作用機序が必要となる場合がある。
【０００９】
ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１１／１４０１１４及びＷＯ２０１３／０６６８７６（Ｓｃｈｗａｒｚら）は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼに特異的に結合し、ブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する複数のモノクローナル抗体（以下「ｍＡｂ」）を説明しているが、異なるブドウ球菌標的に特異的に結合し、その機能を阻害する追加のｍＡｂを特定する必要性が残っている。
【００１０】
開示する本発明は、当該技術分野におけるこれら及び他の欠点を克服することに関する。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様は、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼの触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその結合部分に関する。
【００１２】
第２の態様は、本明細書で開示するモノクローナル抗体または結合部分を発現する細胞株に関する。
【００１３】
第３の態様は、担体、及び本明細書で開示した１つ以上のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体結合部分を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
第４の態様は、整形外科用インプラントを必要する患者に、本明細書で開示した第１の態様に係る、有効量のモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体結合部分、本明細書で開示した第３の態様に係る医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与すること、及び、患者内に整形外科用インプラント、組織移植片、または医療装置を導入することを伴う、患者内に整形外科用インプラントまたは医療装置を導入する方法に関する。
【００１５】
第５の態様は、ブドウ球菌感染に罹りやすい、またはブドウ球菌感染を患う患者に、本明細書で開示した第１の態様に係る、有効量のモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体結合部分、本明細書で開示した第３の態様に係る医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与することを含む、ブドウ球菌感染の治療または予防方法に関する。
【００１６】
第６の態様は、ブドウ球菌による骨または関節の感染を患う患者に、本明細書で開示した第１の態様に係る、有効量のモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体結合部分、本明細書で開示した第３の態様に係る医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与することを伴う、骨髄炎の治療方法に関する。
【００１７】
第７の態様は、サンプルを、本明細書で開示した第１の態様に係るモノクローナル抗体または結合部分に曝露し、かつ、モノクローナル抗体または結合部分と、サンプル内に存在するブドウ球菌またはブドウ球菌アミダーゼとの間で免疫複合体が形成するかどうかを検出することを伴う、サンプル内でのブドウ球菌の存在の測定方法に関し、前記曝露後の免疫複合体の存在は、サンプル内にブドウ球菌が存在することを示す。
【００１８】
ブドウ球菌Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（以下「Ａｍｄ」または「アミダーゼ」）は、ブドウ球菌を受動免疫のための魅力的な標的とする複数の性質を有する。アミダーゼは、細菌細胞付着、細胞分裂、分泌、及びグリコカリックス細胞外ＤＮＡを産生する自己溶解におけるその仲介によるバイオフィルムグリコカリックス形成を含む複数の非常に重要な細胞機能に関与し、黄色ブドウ球菌臨床分離株間では非常に保存され、バンコマイシンの標的であり、細胞周期全体において発現する。更に、Ａｍｄは細胞壁上に発現するため、細胞外環境に存在する抗体に接近可能である。
【００１９】
モノクローナル抗体及びその結合部分、並びにそれらを含有する医薬組成物は、ブドウ球菌株により感染を患うかまたはそのリスクを有する患者における免疫療法に好適な治療薬である。これらのモノクローナル抗体の力は、ブドウ球菌株の増殖、付着、及び免疫回避を妨げる複数の活性に由来する。第１に抗体として、これらは初期のブドウ球菌感染部位における、好中球によるファゴサイトーシスを促進する。第２に、ブドウ球菌の生残及び表面コロニー形成にて複数の役割を有する酵素であるブドウ球菌アミダーゼの阻害剤として、これらの抗体は潜在的に、細胞分裂及びバイオフィルム形成の一方または両方を阻害する。最後に、本明細書で説明するとおり、開示した抗体は、より少ない膿瘍の形成によって明示されるように、ブドウ球菌の拡散を減少させ、膿瘍にマクロファージを侵入させ、無菌性膿瘍の形成を促進し、骨の治癒を加速させる。
[本発明1001]
ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）自己溶解素コンセンサスＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメイン及び／または細胞壁結合ドメインに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1002]
ブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖並びに／または金属、プラスチック及び有機体表面でのバイオフィルムの確立を阻害する、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1003]
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）またはスタフィロコッカス・シミアン（Ｓ．ｓｉｍｉａｎ）を含む、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1004]
前記ブドウ球菌株はメチシリン耐性またはバンコマイシン耐性である、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1005]
Ａｍｄの触媒ドメインのエピトープに結合する、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1006]
ＡｍｄのＲ1またはＲ2細胞壁結合ドメイン内で全体的にまたは部分的にエピトープに結合する、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1007]
Ａｍｄの触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに、10−8Ｍを超える親和性で結合する、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1008]
Ａｍｄの触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに、約1〜約6ｎＭのＫＤで結合する、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1009]
以下のアミノ酸配列の1つを含むＶＨドメインを含み：
2019196353.tif 000003
2019196353.tif 000004
、かつ／または、以下のアミノ酸配列の1つを含むＶＬドメインを含む：
2019196353.tif 000005
2019196353.tif 000006
、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1010]
以下のアミノ酸配列の1つを含むＶＨドメインを含み：
2019196353.tif 000007
、かつ／または、以下のアミノ酸配列の1つを含むＶＬドメインを含む：
2019196353.tif 000008
2019196353.tif 000009
、本発明1001のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1011]
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、本発明1001〜1010のいずれかのモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1012]
前記ヒト化モノクローナル抗体はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、またはＩｇＧ4クラスである、本発明1011のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかのＡｍｄ結合部分。
[本発明1014]
Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1013のＡｍｄ結合部分。
[本発明1015]
ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）に特異的に結合し、かつＡｍｄ1．1、Ａｍｄ1．2、Ａｍｄ1．5、Ａｍｄ1．6、Ａｍｄ1．7、Ａｍｄ1．8、Ａｍｄ1．9、Ａｍｄ1．10、Ａｍｄ1．11、Ａｍｄ1．12、Ａｍｄ1．13、Ａｍｄ1．14、Ａｍｄ1．15、Ａｍｄ1．16、Ａｍｄ1．17、Ａｍｄ2．1、Ａｍｄ2．2、Ａｍｄ2．4、及びＡｍｄ2．5から選択される抗体と交差競合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1016]
Ａｍｄに結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、本発明1015のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1017]
Ａｍｄに特異的に結合し、かつ抗体Ａｍｄ1．6と交差競合する、本発明1015のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1018]
Ａｍｄに特異的に結合し、かつ抗体Ａｍｄ2．1と交差競合する、本発明1015のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1019]
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、本発明1015〜1018のいずれかのモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1020]
本発明1015〜1019のいずれかのＡｍｄ結合部分。
[本発明1021]
ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）に特異的に結合し、かつＡｍｄ触媒ドメインに結合する抗体と交差競合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1022]
Ａｍｄに特異的に結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、本発明1021のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1023]
Ａｍｄに特異的に結合し、かつＡｍｄ1．6、Ａｍｄ1．10、Ａｍｄ1．13、Ａｍｄ1．16、Ａｍｄ1．17、Ａｍｄ2．1、及びＡｍｄ2．2から選択される抗体と交差競合する、本発明1021のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1024]
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、本発明1021〜1023のいずれかのモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1025]
本発明1021〜1024のいずれかのＡｍｄ結合部分。
[本発明1026]
Ａｍｄ1．1、Ａｍｄ1．2、Ａｍｄ1．5、Ａｍｄ1．6、Ａｍｄ1．7、Ａｍｄ1．8、Ａｍｄ1．9、Ａｍｄ1．10、Ａｍｄ1．11、Ａｍｄ1．12、Ａｍｄ1．13、Ａｍｄ1．14、Ａｍｄ1．15、Ａｍｄ1．16、Ａｍｄ1．17、Ａｍｄ2．1、Ａｍｄ2．2、Ａｍｄ2．4、及びＡｍｄ2．5から選択される抗体が結合するのと、同一の、ブドウ球菌属種Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）のエピトープに結合する、モノクローナル抗体またはその結合部分。
[本発明1027]
Ａｍｄに結合し、かつＡｍｄの触媒活性を阻害する、本発明1026のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1028]
抗体Ａｍｄ1．6と同一のエピトープに結合する、本発明1026のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1029]
抗体Ａｍｄ2．1と同一のエピトープに結合する、本発明1026のモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1030]
部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである、本発明1026〜1030のいずれかのモノクローナル抗体またはそのＡｍｄ結合部分。
[本発明1031]
本発明1026〜1030のいずれかのＡｍｄ結合部分。
[本発明1032]
本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかのモノクローナル抗体または本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかのＡｍｄ結合部分を発現する、細胞株。
[本発明1033]
ハイブリドーマである、本発明1032の細胞株。
[本発明1034]
組み換え細胞株である、本発明1032の細胞株。
[本発明1035]
担体、並びに本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかの1つ以上のモノクローナル抗体または本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかの1つ以上のＡｍｄ結合部分を含む、医薬組成物。
[本発明1036]
前記担体は水溶液である、本発明1035の医薬組成物。
[本発明1037]
抗生物質製剤または免疫療法薬を更に含む、本発明1035の医薬組成物。
[本発明1038]
前記抗生物質製剤はバンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、テディゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群から選択される、本発明1037の医薬組成物。
[本発明1039]
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、本発明1037の医薬組成物。
[本発明1040]
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第2のモノクローナル抗体またはその結合部分である、本発明1037の医薬組成物。
[本発明1041]
前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、3Ｈ6、もしくは4Ａ12、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、本発明1040の医薬組成物。
[本発明1042]
前記第2のモノクローナル抗体の前記ヒト化変異体はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4クラスである、本発明1041の医薬組成物。
[本発明1043]
前記第2のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1041の医薬組成物。
[本発明1044]
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ1．6、またはＡｍｄ1．6と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、または1Ｃ11と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、本発明1040の医薬組成物。
[本発明1045]
整形外科用インプラント、移植片または医療装置を必要とする患者に、本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかの有効量のモノクローナル抗体、本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかの1つ以上のＡｍｄ結合部分、または本発明1035〜1044のいずれかの医薬組成物を投与する段階；
前記患者に前記整形外科用インプラント、移植片または医療装置を導入する段階
を含む、患者への整形外科用インプラント、移植片または医療装置の導入方法。
[本発明1046]
前記導入する段階の前に前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記導入する段階の後に前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、本発明1045の方法。
[本発明1048]
前記投与する段階を全身的に実施する、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記投与する段階を移植部位に直接実施する、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記整形外科用インプラントを導入する、本発明1045〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記整形外科用インプラントは人工関節、移植片または合成インプラントである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記人工関節は全体的または部分的な人工膝関節、人工股関節、手指義手、人工肘関節、人工肩関節、人工顎関節、または人工足関節である、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記移植片または合成インプラントは、人工血管、心臓弁インプラント、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種異系の前十字靭帯、内側側副靭帯、外側側幅靭帯、後十字靱帯、アキレス腱、もしくは回旋腱板である、本発明1051の方法。
[本発明1054]
前記移植片または医療装置が導入される、本発明1045〜1049のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記医療装置は心臓ペースメーカー、髄液シャント、透析カテーテル、または人工心臓弁である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
前記患者に第2の治療薬を投与することを更に含み、該第2の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、本発明1045〜1050または1054のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群から選択される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、本発明1056の方法。
[本発明1059]
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第2のモノクローナル抗体またはその結合部分である、本発明1056の方法。
[本発明1060]
前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、3Ｈ6、もしくは4Ａ12、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ1．6、またはＡｍｄ1．6と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、または1Ｃ11と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、本発明1059の方法。
[本発明1062]
前記第2のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4クラスである、本発明1059の方法。
[本発明1063]
前記第2のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1059の方法。
[本発明1064]
感染した人工関節を患者から取り除き、かつ前記整形外科用インプラントを患者に導入する段階の前に、患者の感染を治療する段階
を更に含み、前記整形外科用インプラントは再関節全置換術用の人工関節である、本発明1045の方法。
[本発明1065]
前記治療する段階は、
有効量の抗生物質製剤を投与すること、
前記投与する段階、または
これらの組み合わせ
を含む、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記再関節全置換術の最中の感染または再感染を予防するのに効果的である、本発明1064または1065の方法。
[本発明1067]
前記患者はヒトである、本発明1045〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記患者は非ヒト哺乳動物である、本発明1045〜1066のいずれかの方法。
[本発明1069]
ブドウ球菌感染に罹りやすい、またはブドウ球菌感染を患っている患者に、本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかの有効量のモノクローナル抗体、本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかの1つ以上のＡｍｄ結合部分、本発明1035〜1044のいずれかの医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与する段階
を含む、ブドウ球菌感染の治療または予防方法。
[本発明1070]
前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記投与する段階を全身的に実施する、本発明1069または1070の方法。
[本発明1072]
前記投与する段階をブドウ球菌感染部位に直接実施する、本発明1069または1070の方法。
[本発明1073]
前記ブドウ球菌感染部位は、神経系、皮膚、筋肉、心臓、気道、胃腸、眼、腎臓及び尿路、または骨及び関節感染を含む、本発明1072の方法。
[本発明1074]
前記患者に第2の治療薬を投与することを更に含み、該第2の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、本発明1069〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群から選択される、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、本発明1074の方法。
[本発明1077]
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつ／またはブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第2のモノクローナル抗体もしくはその結合部分である、本発明1074の方法。
[本発明1078]
前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、3Ｈ6、もしくは4Ａ12、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ1．6、またはＡｍｄ1．6と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、または1Ｃ11と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、本発明1077の方法。
[本発明1080]
前記第2のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4クラスである、本発明1077の方法。
[本発明1081]
前記第2のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1077の方法。
[本発明1082]
前記患者はヒトである、本発明1069〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記患者は非ヒト哺乳動物である、本発明1069〜1081のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・カプラエまたはスタフィロコッカス・シミアンである、本発明1069〜1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
前記投与する段階は、感染速度、感染の重症度、感染期間、もしくはこれらの任意の組み合わせを低減する；膿瘍の総数を減少させるもしくは全て除去する；かつ／または無菌性膿瘍の数を増加させるのに有効である、本発明1069〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
ブドウ球菌の骨または関節感染を患う患者に、本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかの有効量のモノクローナル抗体、本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかの1つ以上のＡｍｄ結合部分、本発明1035〜1044のいずれかの医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与する段階
を含む、骨髄炎の治療方法。
[本発明1087]
前記投与する段階を繰り返すことを更に含む、本発明1086の方法。
[本発明1088]
前記投与する段階を全身的に実施する、本発明1086または1087の方法。
[本発明1089]
前記投与する段階を、黄色ブドウ球菌の骨または関節感染の部位に直接実施する、本発明1086または1087の方法。
[本発明1090]
前記患者に第2の治療薬を投与することを更に含み、該第2の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である、本発明1086〜1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
前記抗生物質製剤は、バンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、トレゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、及びカルバペネムＣＳ−023／ＲＯ−4908463からなる群から選択される、本発明1090の方法。
[本発明1092]
前記免疫療法薬はテフィバズマブまたはパギバキシマブである、本発明1090の方法。
[本発明1093]
前記免疫療法薬は、ブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、かつブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第2のモノクローナル抗体またはその結合部分である、本発明1090の方法。
[本発明1094]
前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、1Ｅ12、2Ｄ11、3Ａ8、3Ｈ6、もしくは4Ａ12、これらのヒト化変異体、またはこれらのＧｍｄ結合部分である、本発明1093の方法。
[本発明1095]
前記モノクローナル抗体はＡｍｄ1．6、またはＡｍｄ1．6と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体であり、かつ前記第2のモノクローナル抗体は1Ｃ11、または1Ｃ11と同一の可変ドメインもしくは相補性決定領域を含むヒト化変異体である、本発明1093の方法。
[本発明1096]
前記第2のモノクローナル抗体のヒト化変異体はＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3またはＩｇＧ4クラスである、本発明1095の方法。
[本発明1097]
前記第2のモノクローナル抗体の前記Ｇｍｄ結合部分はＦａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む、本発明1095の方法。
[本発明1098]
前記患者はヒトである、本発明1086〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記患者は非ヒト哺乳動物である、本発明1086〜1097のいずれかの方法。
[本発明1100]
前記ブドウ球菌株は黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・カプラエまたはスタフィロコッカス・シミアンである、本発明1086〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
前記投与する段階は、溶骨性病変を部分的または完全に治癒するのに有効である、本発明1086の方法。
[本発明1102]
サンプル中でのブドウ球菌の存在の決定方法であって、
サンプルを、本発明1001〜1012、1015〜1019、1021〜1024、及び1026〜1030のいずれかのモノクローナル抗体、または本発明1013、1014、1020、1025、及び1031のいずれかのＡｍｄ結合部分に曝露する段階；並びに
前記モノクローナル抗体または結合部分と、前記サンプル中に存在するブドウ球菌またはブドウ球菌アミダーゼとの間に免疫複合体が生じるかどうかを検出する段階
を含み、前記曝露する段階の後に該免疫複合体が存在することは、サンプル内にブドウ球菌が存在することを示す、前記方法。
[本発明1103]
前記検出する段階はイムノアッセイを使用して実施される、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記イムノアッセイはＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ゲル拡散沈降反応アッセイ、免役拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、または免疫電気泳動アッセイである、本発明1103の方法。
[本発明1105]
前記モノクローナル抗体または結合部分は標識を含む、本発明1102の方法。
[本発明1106]
前記標識は放射線標識、フルオロフォア、または化学発光標識である、本発明1104の方法。
[本発明1107]
前記サンプルは液体サンプルまたは組織サンプルである、本発明1102の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】全てのブドウ球菌属種二機能性自己溶解素タンパク質の代表である、黄色ブドウ球菌二機能性自己溶解素（ＡｔｌＡ）のドメイン構造の模式図である。二官能性自己溶解素は１２７６アミノ酸プレプロ酵素として合成される。３１アミノ酸シグナルペプチド（ａａ１〜３１）は分泌中に除去され、１６７アミノ酸プロペプチド（ａａ３２〜１９７）は、自己溶解素が細胞壁内に挿入された際に除去される。細胞分裂後、成熟自己溶解素がアミノ酸７７５にて切断し、独立したＡｍｄＲ１Ｒ２（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、即ちアミダーゼ（Ａｍｄ）ａａ１９８〜７７５）、及びＲ３Ｇｍｄ（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）：ａａ７７６〜１２７６）となる。
【図２】８つの抗Ａｍｄモノクローナル抗体、及び無関係の特異性を有するアイソタイプ適合抗体の、Ａｍｄ酵素活性の阻害を示すグラフである。組み換えＡｍｄ（ｒＡｍｄ）を大腸菌（表１のＨｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２−Ｂ）内で作製した。ｒＡｍｄ（１．５μｇ／ｍＬ）を、黄色ブドウ球菌の細胞壁から調製したペプチドグリカンの混濁した懸濁液と共にＰＢＳ中で混合し、その溶解作用を、３７℃における６０分間のインキュベーション（Δ６０）後の濁度の低下（Ａ４９０として測定）により測定した。阻害試験について、ｒＡｍｄの濃度はＡ４９０を７０％低下するほど十分なものであった。精製した抗Ａｍｄ  ｍＡｂを、指示した濃度にてｒＡｍｄに添加し、Ｍａｂ：ｒＡｍｄ混合物によるペプチドグリカンの溶解を測定した。阻害率は、１００×（１−（Δ６０Ａ４９０阻害剤／Δ６０Ａ４９０阻害剤非含有の対照））として計算した。
【図３】代表的な抗Ａｍｄ抗体による黄色ブドウ球菌沈殿の画像である。黄色ブドウ球菌細胞が最もブドウ球菌特異的なｍＡｂの存在下で培養された場合、これらは懸濁液から沈降して大型のクラスターを形成し、比較的透明な上清が得られる。ＵＳＡ３００ＬＡＣ黄色ブドウ球菌はそれぞれ２５μｇ／ｍＬにて、指示した抗Ａｍｄ  ｍＡｂの存在下で８時間、ＴＳＢの中で３７℃にて培養した。抗体非含有（Ａｂなし）のサンプル、及び無関係のアイソタイプ適合抗体（アイソタイプ対照）は、明らかに細胞ペレットを含まない混濁した上清を有し、ｍＡｂ  Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．１１、及びＡｍｄ１．１６は透明な上清及び細胞ペレットを有した。透明な上清及び細胞ペレットを作製した他のｍＡｂを以下の表２に一覧にし、これらは懸濁液から黄色ブドウ球菌を沈殿しなかったｍＡｂである。
【図４】固定ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６と可溶性Ａｍｄとの生体分子相互作用の分析を示す。ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６と可溶性Ａｍｄとの相互作用の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−２００で測定した。ウサギ抗マウスＦｃ  ＩｇＧをＣＭ−５バイオセンサチップの表面に固定して使用し、ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６を捕捉した後、流動領域からＡｍｄを捕捉した。ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６により結合されたＡｍｄの質量を、ｘ軸の時間に対するレゾナンスユニット（ｙ軸）に測定した。捕捉（会合、ｔ＝０〜１２０秒）と放出（解離、ｔ＝１２０〜４２０秒）段階が示される。この実験を１．５６から２５ｎＭまで、２倍ずつの増加で変化するＡｍｄ濃度で繰り返した。メーカーの取扱説明書に従って測定を行い、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ製の生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）評価ソフトウェア（バージョン３．１）を使用して、動力学データを分析した。
【図５】Ａｍｄ、Ｇｍｄ、及び自己溶解素欠失変異株と比較した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルム形成での抗Ａｍｄ抗体の阻害効果を示すグラフである。カルガリープレートを使用するバイオフィルムアッセイを、プレート及び蓋の留め金をヒト血漿で４℃にて１６時間コーティングし、実施した。次に、２５μｇ／ｍＬの抗Ａｍｄ（Ａｍｄ１．６）、抗Ｇｍｄ（１Ｃ１１）、及び抗Ａｍｄ＋抗Ｇｍｄ（Ａｍｄ１．６＋１Ｃ１１）ｍＡｂの組み合わせの存在下または不存在下にて、黄色ブドウ球菌を６００ｎｍのＯＤ  ０．０５で播種した。３７℃にて２４時間、バイオフィルムを形成した。洗浄後、バイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色し、バイオフィルムの含量を分光測光法（５９５ｎｍ）により測定した。バイオフィルム阻害の陽性対照として、アミダーゼ（Δａｍｄ）、グルコサミニダーゼ（Δｇｍｄ）、または自己溶解素（Δａｔｌ）に対するＵＡＭＳ−１欠失株を同一のＯＤにて播種した。結果は、野生型（ＷＴ）、未処理のＵＡＭＳ−１培養物（Ａ）の割合として、バイオフィルム形成（即ちクリスタルバイオレット染色）量として報告する（*ＷＴと比較してｐ＜０．０５）。
【図６】自己溶解素欠失と比較しての、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、インプラントでのバイオフィルム形成における、抗Ａｍｄモノクローナル抗体、及び抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄモノクローナル抗体との組み合わせによる受動免疫効果を示す。６〜１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ≧３）を、４０ｍｇ／ｋｇの用量の抗Ａｍｄ（Ａｍｄ１．６）、抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄ（Ａｍｄ１．６＋１Ｃ１１）の組み合わせ、またはＩｇＧアイソタイプ適合対照ｍＡｂにより、腹腔内で受動免疫化した。１日後、各マウスをＵＳＡ３００  ＬＡＣ  ＣＡ−ＭＲＳＡ株またはその同質遺伝子的なΔａｔｌ変異体で汚染された下腿用ステンレス鋼ピンで感染させた。ピンを所定位置に残して、バイオフィルムがベースとなる感染を成熟させた。感染後１４日の時点で、ピンを取り外し走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により調査した。感染したインプラント（ピン）におけるバイオフィルム形成の程度を示す代表的な顕微鏡写真を示す：ＩｇＧ対照（図６Ａ）；抗Ａｍｄ（Ａｍｄ１．６、図６Ｂ）；抗Ａｍｄ＋抗Ｇｍｄ（Ａｍｄ１．６＋１Ｃ１１、図６Ｃ）；及びΔａｔｌ変異体で感染（図６Ｄ）。バイオフィルムで覆われた対象領域（平板状ピンの０．５×２．０ｍｍ面）の割合をＮＩＨソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）で定量化し、図６Ｅに示す（*ｐ≦０．０５）。
【図７】骨損傷の量の減少における、抗Ａｍｄ、抗Ｇｍｄ、及び抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄモノクローナル抗体の組み合わせを用いた受動免疫の効果を示す。メスＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）を、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、上述したように、ＰＢＳまたは抗Ｇｍｄ（１Ｃ１１）、抗Ａｍｄ（１．６）、もしくは組み合わせ（１Ｃ１１＋１．６）により腹腔内で受動免疫化した（Ｖａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｍｉｃｅ  Ｆｒｏｍ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｅｇａｃｌｕｓｔｅｒｓ，"Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ３２（１０）：１３８９−９６（２０１４）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。２４時間後、全てのマウスがＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染された下腿用ピンを受け、生物発光像を３日目に実施して感染を確認した（図７Ａ）。マウスは感染後１４日で安楽死させ、脛骨をマイクロＣＴ分析のために回収した。感染した脛骨の代表的な３Ｄレンダリングを内側及び外側から示し（図７Ｂ）、脛骨の各群（Ｂ）における骨溶解の相対レベルを表す。各脛骨の骨溶解容積を、式：骨溶解容積（ｍｍ３）＝［内側の骨溶解領域＋外側の骨溶解領域（ｍｍ２）×皮質圧（ｍｍ）（*ＰＢＳに対してｐ＜０．０５）を使用して定量化した。結果を図７Ｃにグラフで示す。
【図８】Ａｍｄ１．６による受動免疫の効果を示し、髄管内でのより少数の膿瘍形成によって明示されるように、細菌拡散の有意な減少を示している。６〜１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）を、４０ｍｇ／ｋｇの合計用量のＰＢＳ（陰性対照）、抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  １Ｃ１１、抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６、または組み合わせ（１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６）で腹腔内で免疫化した。２４時間後、右側脛骨を通して、各マウスに生物発光ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染したピンを挿入した。得られた感染を１４日間進行させ、この時に動物を犠牲にし、感染した脛骨を組織学的分析のために回収、固定、脱灰及び切断した。オレンジＧ／アルシアンブルー（ＡＢＧ／ＯＨ）で染色した代表的な感染脛骨を、（図８Ａ）未治療の対照及び（図８Ｂ）抗Ｇｍｄ  １Ｃ１１と抗Ａｍｄ  Ａｍｄ１．６との組み合わせで治療したマウスに関して示す。マウスの各群で観察した膿瘍の数を図８Ｃに示す（*ｐ≦０．０５；**ｐ≦０．０１）。
【図９】ブドウ球菌膿瘍コミュニティ（ＳＡＣ）の形成を予防して無菌性膿瘍をもたらす、抗Ａｍｄ、抗Ｇｍｄ、及び抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄモノクローナル抗体との組み合わせによる、受動免疫の効果を示す。マウス（ｎ＝５）を、４０ｍｇ／ｋｇの用量にてＰＢＳ（陰性対照）またはｍＡｂ  １Ｃ１１、Ａｍｄ１．６もしくは組み合わせ（１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６）で腹腔内で免疫化した。２４時間後、全てのマウスは、生物発光ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染された下腿用ピンを受けた。感染後１４日目の代表的な感染脛骨を、細菌を表すためにグラム染色した組織学的切断面として示す。ＰＢＳ処理した脛骨は、典型的なＳＡＣの病状を示し、以下のｍＡｂ：１Ｃ１１（図９Ｃ〜Ｄ）、Ａｍｄ１．６（図９Ｅ〜Ｆ）、及び１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６の組み合わせ（図９Ｇ〜Ｈ）で治療したマウスでは存在しない膿瘍領域（図９Ａ〜Ｂ）内に、エオシン好性仮性被膜により包囲された細菌の中心病巣を含有する。
【図１０】膿瘍内でのマクロファージ様細胞の動員における、抗Ａｍｄ、抗Ｇｍｄ、及び抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄモノクローナル抗体との組み合わせによる受動免疫の効果を示す。６〜１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）を、４０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＢＳ、またはｍＡｂ  １Ｃ１１、Ａｍｄ１．６、もしくは組み合わせ（１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６）により腹腔内で免疫化した。２４時間後、全てのマウスは、生物発光ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染された下腿用ピンを受けた。感染後１４日目からの、代表的な感染脛骨を、オレンジＧ／アルシアンブルー（ＡＢＧ／ＯＨ）で染色した組織学切断面として示す。抗Ａｍｄ、抗Ｇｍｄ、及び抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄ  ｍＡｂとの組み合わせによる受動免疫は、マクロファージ様細胞を膿瘍の中心に動員する（図１０Ｃ〜Ｈ、矢印）一方で、ＰＢＳで免疫化されたマウスは、膿瘍内でマクロファージ様細胞の動員を示さず（図１０Ａ〜Ｂ）、形態的に好中球に類似する細胞を示す。Ａｍｄ１．６及び１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６の組み合わせで治療したマウス（それぞれ図１０Ｅ及び１０Ｇ）での単一の膿瘍、または１Ｃ１１で治療したマウスの２つの膿瘍構造（図１０Ｃ）と比較して、ＰＢＳで治療した脛骨には、複数の膿瘍が髄管及び骨周辺の軟組織に存在する（図１０Ａ）。
【図１１】抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄモノクローナル抗体との組み合わせによる受動免疫の効果を示し、無菌性膿瘍内でＭ２マクロファージを動員することにより、骨の治癒を加速させる。６〜１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）を、４０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＢＳ、またはｍＡｂ  １Ｃ１１、Ａｍｄ１．６、もしくは組み合わせ（１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６）により腹腔内で免疫化した。２４時間後、全てのマウスは、生物発光ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染された下腿用ピンを受けた。手術後１４日目の代表的な脛骨を、オレンジＧ／アルシアンブルー（ＡＢＧ／ＯＨ）で染色した組織学切断面として示す（図１１Ａ〜Ｃ）。無菌ピン対照を受けるマウスと比較して、ｍＡｂで免疫化したマウスでの著しい治癒が明らかである（図１１Ａ〜Ｃ）。再構築及び創傷治癒プロセスと関係するマクロファージ表現型による治癒の相関関係を測定するため、抗アルギナーゼ−１抗体について、Ｍ２マクロファージを染色して免疫組織化学法を実施した。受動免疫化したマウスの膿瘍（茶色の染色）の中心にＭ２マクロファージが動員された（図１１Ｅ）が、陰性対照のＰＢＳ群の膿瘍の中心からは除外された（図１１Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに特異的に結合する、１つ以上のモノクローナル抗体またはその結合部分を本明細書にて開示する。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、天然源または組み換え源由来の免疫グロブリン、及び免疫グロブリンの免疫反応性部分（即ち抗原結合部分）を含むことを意味する。本明細書で開示するモノクローナル抗体は、例えば実質的に純粋なモノクローナル抗体、抗体断片または結合部分、キメラ抗体、及びヒト化抗体を含む、種々の形態内に存在してよいし、またはこれらから単離することができる（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００２３】
本明細書にて開示したモノクローナル抗体は、ブドウ球菌Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼまたはその断片に結合する特異性を特徴とする。抗体は、ブドウ球菌自己溶解素（Ａｔｌ）のアミダーゼサブユニット内のエピトープに特異的に結合するが、通常は免疫優性エピトープには限らない。特定の実施形態において、これらのモノクローナル抗体はブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する。別の実施形態において、これらのモノクローナル抗体は金属、プラスチック及び／または有機体表面でのバイオフィルム生成を阻害する。更に別の実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体を共に使用して、ブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、並びに金属、プラスチック及び／または有機体表面でのバイオフィルム生成の両方を阻害することができる。
【００２４】
本明細書にて開示したこの態様及び他の全ての態様によれば、ブドウ球菌株はヒトまたは動物に対して病原性であるかまたは病原性となり得る株である。ブドウ球菌はコアグラーゼ陽性またはコアグラーゼ陰性のいずれかとすることができる。代表的なブドウ球菌株としては、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・カプラエ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）またはスタフィロコッカス・シミアン（Ｓ．ｓｉｍｉａｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、本明細書にて開示したモノクローナル抗体は、メチシリン耐性またはバンコマイシン耐性株を含むブドウ球菌の抗生物質耐性株に対して効果的である。
【００２５】
ある種の実施形態において、アミダーゼサブユニットのエピトープ（ｍＡｂまたはその結合断片により結合されている）は、免疫優性エピトープである。免疫優性抗原は、免疫系により最も容易に認識される抗原決定基の一部であるため、誘導した抗体の特異性に最も影響を及ぼす。「免疫優性エピトープ」とは、宿主生物の免疫応答を選択的に誘発する抗原のエピトープであり、その抗原の他のエピトープを実質的に排除するエピトープを意味する。
【００２６】
通常、免疫優性エピトープを有すると思われる抗原は、病原性生物の外表面にて抗原を選択することにより特定可能である。例えば、真菌、細菌及びウイルス等の最も単純な生物は、病原性生物の外表面に曝される１種または２種のタンパク質を有する。これらの外表面タンパク質は、適切な抗原を有する可能性が最も高い。免疫優性エピトープを有する可能性が最も高いタンパク質は、病原性生物で感染した生物の全てのタンパク質をゲル上で、血清に対して移動させるウェスタンアッセイにより特定することができる。血清からの固定抗体は、周知のＥＬＩＳＡ技術の１つ等の標識抗抗体により特定することができる。免疫優性エピトープは、病原性生物で感染した宿主生物の血清調査により特定することができる。宿主生物の免疫応答を引き起こし得る特定された抗原に結合する抗体量について血清を測定した。免疫優性エピトープがこれらの抗原に存在する場合、血清中の実質的に全ての抗体が免疫優性エピトープに結合し、抗原に存在する他のエピトープには殆ど結合しない。
【００２７】
ＡｔｌＡは、有糸分裂中に細胞壁を消化するのに必要な、黄色ブドウ球菌の触媒的に異なるペプチドグリカン加水分解酵素の１つである（Ｂａｂａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"ＥＭＢＯ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。増殖のために不可欠な遺伝子であることに加え、走査型電子顕微鏡調査では、二分裂中に黄色ブドウ球菌に結合した抗ＡｔｌＡ抗体は、細胞壁により覆われていない細菌の領域に局在化することを示した（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｒｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（６）：１５６５−７１（１９９６）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００２８】
ＡｔｌＡ酵素はアミダーゼ（６２ｋＤ）及びグルコサミニダーゼ（５３ｋＤ）を含み、これらは分裂プロセスを通して、同一のＡｔｌＡ前駆体タンパク質より作製されている（Ｂａｂａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒａｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｒｅｐｅａｔ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｅｍｂｏ．Ｊ．１７（１６）：４６３９−４６（１９９８）；Ｋｏｍａｔｓｕｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ，ＡＴＬ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：４６９−７９（１９９７）；Ｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  Ｔｈａｔ  Ｈａｓ  ａｎ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｏｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ａｎ  Ｅｎｄｏ−ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｄｏｍａｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２（１）：２８５−９（１９９５）、それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。自己溶解素は３つの約１５０のアミノ酸の細胞壁結合ドメインにより細胞壁に保持されており、これらのアミノ酸はＲ１、Ｒ２及びＲ３と呼ばれている。最終の成熟工程において、タンパク質の分解的切断は、アミダーゼドメインとそれに関係するＲ１及びＲ２ドメイン（合わせて「Ａｍｄ」）を、グルコサミニダーゼ及びそれに関係するＮ末端Ｒ３ドメイン（合わせて「Ｇｍｄ」）から分離する。図１を参照のこと。
【００２９】
Ｈｉｓ−Ａｍｄに関する代表的な、コードされたコンセンサスタンパク質及びコードするオープンリーディングフレーム配列を、以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２として示す。
2019196353.tif 000010
【００３０】
ブドウ球菌Ａｍｄは、固相もしくは液相ペプチド合成、組み換え発現により合成可能であるか、または天然源より入手可能である。自動ペプチドシンセサイザーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ等の多くの供給業者から市販されている。化学的ペプチド合成の標準技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ９３−２１０（Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｇｒａｎｔ  ｅｄ．，１９９２）を参照のこと：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。組み換え発現によるタンパク質またはペプチド作製は、大腸菌等の細菌、酵母菌、昆虫または哺乳動物細胞、及び発現系を使用して実施することができる。組み換えタンパク質／ペプチド発現の手順は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ２ｄ  ｅｄ．，１９８９）により説明されている。
【００３１】
組み換え発現したペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、及び逆相クロマトグラフィー等の当該技術分野において周知の複数の方法のいずれかを使用して精製することができる。ペプチドは、従来技術によって精製形態（好ましくは少なくとも約８０％または８５％の純度、より好ましくは少なくとも約９０％または９５％の純度）で作製されるのが好ましい。組み換え宿主細胞を作製してペプチドを増殖用培地に分泌する（米国特許第６，５９６，５０９号（Ｂａｕｅｒら）を参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）かどうかに応じて、ペプチドを遠心分離（して、分泌ペプチドを含有する上清から細胞成分を分離）した後、連続的に上清を硫酸アンモニウム沈殿させて単離及び精製することができる。ペプチドを含有する画分を、適切な寸法のデキストランまたはポリアクリルアミドカラムでゲル濾過して、ペプチドを他のタンパク質から分離する。必要であれば、ペプチド画分をＨＰＬＣ及び／または透析により更に精製してよい。
【００３２】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体または結合部分はＡｍｄ触媒ドメインのエピトープに特異的に結合してよい。本明細書で使用する場合、Ａｍｄ触媒ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸９〜２５２に少なくとも７０％同一、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸９〜２５２に少なくとも７５％もしくは８０％同一、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸９〜２５２に少なくとも８５％もしくは９０％同一である。特定の実施形態において、アミダーゼ触媒ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸９〜２５２に少なくとも９５％同一である。
【００３３】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体または結合部分は、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、またはＡｍｄ２．２として示されるハイブリドーマ細胞株により作製される。
【００３４】
別の実施形態において、モノクローナル抗体または結合部分は、ＡｍｄのＲ１またはＲ２細胞壁結合ドメイン内で、エピトープに全体的にまたは部分的に結合する。本明細書で使用する場合、Ｒ１またはＲ２細胞壁結合ドメインは、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５３〜３９９もしくは４２１〜５６８に少なくとも７０％同一、またはそれぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５３〜３９９もしくは４２１〜５６８に少なくとも７５％もしくは８０％同一、あるいはそれぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５３〜３９９もしくは４２１〜５６８に少なくとも８５％もしくは９０％同一である。特定の実施形態において、細胞壁結合ドメインはそれぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２５３〜３９９または４２１〜５６８に少なくとも９５％同一である。
【００３５】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体または結合部分は、Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ２．４、またはＡｍｄ２．５として示されるハイブリドーマ細胞株により作製される。
【００３６】
特定の実施形態において、本明細書にて開示したモノクローナル抗体は、Ａｍｄ触媒ドメインまたは細胞壁結合ドメインに、１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ、ただし好ましくは１０−１０Ｍを超える親和性で結合する。
【００３７】
上記の通り、特定の実施形態において、モノクローナル抗体または結合部分はブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖もまた阻害する。ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖の阻害は、多数の好適な規格に従って測定可能である。かかる一実施形態において、ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖は、生物発光アッセイにしたがって評価可能である。例として、生物発光黄色ブドウ球菌（Ｘｅｎ  ２９；ＡＴＣＣ  １２６００）（Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ｌｕｘＡＢＣＤＥ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ，"Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３５９４−６００（２０００）；Ｃｏｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｈｏｓｔｓ，"Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８（４）：５９３−６０３（１９９５）もまた参照のこと：それら全体が参照として本明細書に組み込まれている）を使用して、外科移植の前に５０万のＣＦＵで下腿インプラントに投与する。５週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＪマウスは、手術の３日前に、生理食塩水、または０．２５ｍＬ生理食塩水中の精製抗体／抗体断片１ｍｇの腹腔内注射を受けることができる。マウスは種々の日数（例えば０、３、５、７、１１、及び１４日）で生物発光を評価して画像化することができ、ＢＬＩ画像を比較することにより、生理食塩水対照、またはプラシーボ抗体を注射した対照マウスと比較して、抗体が黄色ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害するかどうかを評価することができる。
【００３８】
別の実施形態において、ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖はバイオフィルム形成により評価可能である。例として、メスＢａｌｂ／ｃマウスを、４０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体／抗体断片または対照により腹腔内で受動免疫化することができ、１日後、各マウスをＭＲＳＡ株で汚染された下腿用ステンレス鋼ピンで感染させることができる。感染後１４日目に、ピンを取り除いて走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により検査することができ、バイオフィルムで覆われた対象の領域（例えば、平板上ピンの０．５×２．０ｍｍ面）の割合を、ＮＩＨソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）で定量化することができる。
【００３９】
更に他の実施形態では、感染した骨の骨溶解容積を、ＭｉｃｒｏＣＴイメージングを使用して測定することができる。例として、メスＢａｌｂ／ｃマウスを、４０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体／抗体断片または対照により腹腔内で受動免疫化することができ、１日後、各マウスをＭＲＳＡ株で汚染された下腿用ステンレス鋼ピンで感染させることができる。１４日後、マウスを安楽死させ、脛骨を回収することができる。得られた画像を使用して、損傷領域を２つの異なる視野（例えば内側及び外側）から測定することができ、これらを加えて皮質厚を掛け合わせる（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｍｉｃｅ  Ｆｒｏｍ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｍｅｇａｃｌｕｓｔｅｒｓ，"Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ３２（１０）：１３８９−９６（２０１４）を参照：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００４０】
更に他の実施形態において、ブドウ球菌のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖は、髄管または骨を取り巻く軟組織内のブドウ球菌膿瘍コミュニティ（ＳＡＣ）の有無（有る場合、出現率を含む）により評価可能である。例として、メスＢａｌｂ／ｃマウスを、４０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体／抗体断片または対照により腹腔内で受動免疫化することができ、１日後、各マウスをＭＲＳＡ株で汚染された下腿用ステンレス鋼ピンで感染させることができる。１４日後、マウスを安楽死させ、脛骨及び関係する軟組織を回収することができる。組織学的サンプルを調製してオレンジＧ／アルシアンブルー（ＡＢＧ／ＯＨ）で染色することができ、その後、膿瘍の有無を組織学的サンプルの分析により測定可能である。
【００４１】
一実施形態によれば、モノクローナル抗体または結合部分は、以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＨドメインを含む（ＣＤＲドメインは下線で示した）：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（Ａｍｄ１．２）：
2019196353.tif 000011
ここで、Ｘは任意のアミノ酸とすることができる。このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）によりコードされる：
2019196353.tif 000012
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（Ａｍｄ１．１）：
2019196353.tif 000013
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）によりコードされる：
2019196353.tif 000014
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（Ａｍｄ１．５）：
2019196353.tif 000015
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）によりコードされる：
2019196353.tif 000016
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（Ａｍｄ１．６）：
2019196353.tif 000017
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）によりコードされる：
2019196353.tif 000018
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（Ａｍｄ１．７）：
2019196353.tif 000019
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）によりコードされる：
2019196353.tif 000020
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（Ａｍｄ１．９）：
2019196353.tif 000021
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）によりコードされる：
2019196353.tif 000022
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７（Ａｍｄ１．１１）：
2019196353.tif 000023
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）によりコードされる：
2019196353.tif 000024
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９（Ａｍｄ１．１２）：
2019196353.tif 000025
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）によりコードされる：
2019196353.tif 000026
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（Ａｍｄ１．１３）：
2019196353.tif 000027
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）によりコードされる：
2019196353.tif 000028
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３（Ａｍｄ１．１６）：
2019196353.tif 000029
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）によりコードされる：
2019196353.tif 000030
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（Ａｍｄ１．１７）：
2019196353.tif 000031
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）によりコードされる：
2019196353.tif 000032
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（Ａｍｄ２．１）：
2019196353.tif 000033
ここで、Ｘは任意のアミノ酸とすることができる。このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）によりコードされる：
2019196353.tif 000034
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９（Ａｍｄ２．２）：
2019196353.tif 000035
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）によりコードされる：
2019196353.tif 000036
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１（Ａｍｄ２．４）：
2019196353.tif 000037
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）によりコードされる：
2019196353.tif 000038
【００４２】
一実施形態によれば、モノクローナル抗体または結合部分は、以下のアミノ酸配列の１つを含むＶＬドメインを含む（ＣＤＲドメインは下線で示した）：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３（Ａｍｄ１．１）：
2019196353.tif 000039
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）によりコードされる：
2019196353.tif 000040
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（Ａｍｄ１．２）：
2019196353.tif 000041
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）によりコードされる：
2019196353.tif 000042
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（Ａｍｄ１．６）：
2019196353.tif 000043
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）によりコードされる：
2019196353.tif 000044
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（Ａｍｄ１．７）：
2019196353.tif 000045
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）によりコードされる：
2019196353.tif 000046
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（Ａｍｄ１．８）：
2019196353.tif 000047
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）によりコードされる：
2019196353.tif 000048
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（Ａｍｄ１．９）：
2019196353.tif 000049
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）によりコードされる：
2019196353.tif 000050
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５（Ａｍｄ１．１０）：
2019196353.tif 000051
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）によりコードされる：
2019196353.tif 000052
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７（Ａｍｄ１．１１）：
2019196353.tif 000053
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）によりコードされる：
2019196353.tif 000054
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９（Ａｍｄ１．１２）：
2019196353.tif 000055
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）によりコードされる：
2019196353.tif 000056
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１（Ａｍｄ１．１３）：
2019196353.tif 000057
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）によりコードされる：
2019196353.tif 000058
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３（Ａｍｄ１．１５）：
2019196353.tif 000059
ここで、Ｘは任意のアミノ酸とすることができる。このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）によりコードされる：
2019196353.tif 000060
ここで、各Ｎは、核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３のアミノ酸配列をコードするのであれば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧとすることができる。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５（Ａｍｄ１．１７）：
2019196353.tif 000061
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）によりコードされる：
2019196353.tif 000062
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７（Ａｍｄ２．１）：
2019196353.tif 000063
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）によりコードされる：
2019196353.tif 000064
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９（Ａｍｄ２．２）：
2019196353.tif 000065
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）によりコードされる：
2019196353.tif 000066
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１（Ａｍｄ２．４）：
2019196353.tif 000067
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）によりコードされる：
2019196353.tif 000068
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３（Ａｍｄ２．５）：
2019196353.tif 000069
このアミノ酸配列は、以下のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）によりコードされる：
2019196353.tif 000070
【００４３】
本開示はまた、開示した抗Ａｍｄ抗体の１つ以上と同じＡｍｄのエピトープに結合するＡｍｄ抗体、及びそのＡｍｄ結合部分も包含する。したがって、追加の抗体及びＡｍｄ結合抗体部は、Ａｍｄ結合アッセイにおける、開示した抗体とのそれらの交差競合（例えば、統計的に有意な方法で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて特定することができる。本明細書にて開示した抗Ａｍｄリファレンス抗体の、Ａｍｄタンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の少なくとも一部（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の触媒ドメインもしくはアミノ酸９〜２５２、または細胞壁結合ドメイン等）を有するＡｍｄタンパク質またはポリペプチド）に対する結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＡｍｄへの結合についてリファレンス抗体と競合可能であることを示している。かかる抗体は、理論に制限されることなく、競合するリファレンス抗体のＡｍｄタンパク質の同一または関係する（例えば構造的に類似した、もしくは空間的に近位の）エピトープに結合する。特定の実施形態において、本明細書にて開示したリファレンス抗体と同一のＡｍｄのエピトープに結合する抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態において、本明細書にて開示したリファレンス抗体と同一のＡｍｄのエピトープに結合する抗体は、ヒト抗体である。Ａｍｄ結合抗体及びＡｍｄ結合抗体部はまた、リファレンス抗体と同じエピトープに結合する、他のマウスまたはキメラＡｍｄ結合抗体及びＡｍｄ結合抗体部とすることもできる。
【００４４】
リファレンス抗体の結合をブロックまたはその結合と競合する能力は、Ａｍｄ結合試験抗体またはＡｍｄ結合抗体部が、リファレンス抗体により規定されるのと同一もしくは類似のエピトープ、またはリファレンスＡｍｄ結合抗体が結合するエピトープに十分に近位であるエピトープに結合することを示す。かかる抗体は、リファレンス抗体で特定された有利な性質を特に共有する傾向にある。
【００４５】
リファレンス抗体をブロックまたはリファレンス抗体と競合する能力は、競合結合アッセイ等の当該技術分野において周知の技術を使用して測定してよい。競合結合アッセイを用いて、試験用抗体またはＡｍｄ結合抗体部は、リファレンス抗体がＡｍｄタンパク質またはＡｍｄタンパク質の一部（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の触媒ドメインもしくはアミノ酸９〜２５２、もしくは細胞壁結合ドメイン）に特異的に結合する能力について調査を行う。試験抗体は、過剰の試験抗体が実質的にリファレンス抗体の結合を阻害する場合、抗原としてのＡｍｄタンパク質またはその一部との特異的結合に関してリファレンス抗体と競合する。実質的な阻害とは、試験抗体がリファレンス抗体の特異的結合を、通常少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減することを意味する。
【００４６】
周知の競合結合アッセイは通常、Ａｍｄ結合抗体またはＡｍｄ結合抗体部とリファレンスＡｍｄ結合抗体との、Ａｍｄタンパク質またはその一部への結合についての競合を評価するために適用するか、またはルーチンに適合することができる。かかる競合結合アッセイとしては、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９２：２４２−２５３，（１９８３）を参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ｌｉｐｉｄ  Ａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，"Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９（１９８６）を参照、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ，"Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５（１９８８）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ．Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｄｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｄｕｃｋｓ，"Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２（１９９０）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ＨＭＬ−１  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｆ  Ｂ−ｌｙ７  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  Ｈａｉｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ，"Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２（１９９０）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）が挙げられるが、これらに限定されない。通常、かかるアッセイは、非標識試験Ａｍｄ結合抗体及び標識リファレンス抗体のいずれかを有する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を伴う。競合阻害は、試験抗体が存在する固体表面または細胞に結合した標識の量を求めることにより測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイにより特定された抗体及び抗原結合抗体部（競合抗体）としては、リファレンス抗体と同じエピトープに結合するリファレンス抗体及び抗原結合抗体部、並びに、リファレンス抗体が結合して立体障害が生じるエピトープに十分近位な隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
【００４７】
幾つかの実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、Ａｍｄに特異的に結合し、本明細書で記載される抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、Ａｍｄに特異的に結合し、Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、Ａｍｄ２．２、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。特定の実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、抗体Ａｍｄ１．６と交差競合する。他の実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、抗体Ａｍｄ２．１と交差競合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、上記抗Ａｍｄ抗体の１つ以上と交差競合し、Ａｍｄの触媒活性を阻害する。
【００４８】
更なる実施形態において、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、本明細書で記載される抗体と同一のエピトープに結合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、Ａｍｄ２．２、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗体と同一のエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は抗体Ａｍｄ１．６と同一のエピトープに結合する。その他の実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は抗体Ａｍｄ２．１と同一のエピトープに結合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は上記抗Ａｍｄ抗体の１つ以上と同一のエピトープに結合し、Ａｍｄの触媒活性を阻害する。
【００４９】
幾つかの実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、ブドウ球菌属種のＡｍｄ触媒ドメインに結合する抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、及びＡｍｄ２．２から選択される抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、上で特定した抗Ａｍｄ抗体の１つ以上と交差競合し、Ａｍｄの触媒活性を阻害する。
【００５０】
更なる実施形態において、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、本明細書で記載される抗体と同一の、Ａｍｄ触媒ドメインのエピトープに結合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、及びＡｍｄ２．２から選択される抗体と同一の、Ａｍｄ触媒ドメインのエピトープに結合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、上で特定した抗Ａｍｄ抗体の１つ以上と同一のエピトープに結合し、Ａｍｄの触媒活性を阻害する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、ブドウ球菌Ａｍｄ細胞壁結合ドメインに結合する抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。更なる実施形態において、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、細胞壁結合ドメインに結合する本明細書で記載される抗Ａｍｄ抗体と交差競合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分はＡｍｄに特異的に結合し、Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗体と交差競合する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、本明細書で記載される抗Ａｍｄ抗体と同一の、Ａｍｄ細胞壁結合ドメインのエピトープに結合する。更なる実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、Ａｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５から選択される抗体と同一の、Ａｍｄ細胞壁結合ドメインのエピトープに結合する。
【００５３】
本明細書にて開示した抗体はまた、合成抗体であってもよい。合成抗体は、例えばバクテリオファージにより発現される抗体等の、組み換えＤＮＡ技術を使用して作製される抗体である。あるいは、合成抗体は、抗体をコードするＤＮＡ分子を合成した後で抗体を発現すること（即ち、抗体を指定するアミノ酸の合成）により作製され、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、入手可能であり当該技術分野において周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して入手される。
【００５４】
特定の実施形態において、合成抗体は、上で特定した重鎖可変ドメインのＣＤＲの１つ以上、上で特定した異なる重鎖可変ドメインのＣＤＲの組み合わせ、特定した軽鎖可変ドメインのＣＤＲの１つ以上、または上で特定した異なる軽鎖可変ドメインのＣＤＲの組み合わせを使用して作製される。例として、Ａｍｄ１．６及びＡｍｄ２．１は以下のＣＤＲを含む。
2019196353.tif 000071
Ａｍｄ２．１  ＶＨ、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）において、Ｘは任意のアミノ酸とすることができる。
【００５５】
一実施形態では、モノクローナル抗体または結合部分は部分的にヒト化されているか、または完全にヒトのものである。
【００５６】
ヒト化抗体は、可変領域内に非ヒト（例えばマウス）抗体の最小限の配列を含有する抗体である。かかる抗体は、ヒト対象に投与された場合に、治療的に抗原性及びヒト抗マウス抗体応答を低下させるために使用される。実際には、ヒト化抗体は通常、非ヒト配列を最小限からゼロまで有するヒト抗体である。ヒト抗体は、ヒトにより作製された抗体、またはヒトにより作製された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。
【００５７】
抗体は、ヒト抗体の相補的決定領域（ＣＤＲ）を、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト抗体（例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター等）のＣＤＲで置き換えることによりヒト化することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｏｕｓｅ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。抗体の特異性、親和性、及び／または能力を改良及び最適化するために、ヒト化抗体は更に、Ｆｖフレームワーク領域内及び／または置き換えた非ヒト残基内のいずれかを、追加の残基で置換することにより改変することができる。
【００５８】
ヒト化抗体は、当該技術分野において周知の技術を使用して作製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化されたか、標的抗原に対する抗体を産生する免疫化した個体から単離した不死化ヒトＢリンパ球を作製することができる（例えば、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７７（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  ｅｄ．，１９８５）及び米国特許第５，７５０，３７３号（Ｇａｒｒａｒｄ）を参照のこと：その全体が参考として本明細書に組み込まれる）。また、ヒト化抗体はファージライブラリーから選択することができ、このファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂ−Ｎａｎｏｍｏｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−８（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７（１９９１）、これら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン産生を有しないヒト抗体の全レパートリーを作製可能な、ヒトイムノグロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスでも作製することができる。本手法は米国特許第５，５４５，８０７号（Ｓｕｒａｎｉら）；同第５，５４５，８０６号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）；同第５，５６９，８２５号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）；同第５，６２５，１２６号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）；同第５，６３３，４２５号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）；及び同第５，６６１，０１６号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）に記載されており、これら全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００５９】
特定の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３クラスまたはＩｇＧ４クラスである。そのプロテインＡ結合の低下のため、ＩｇＧ３クラスが特に好ましい（Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ１／ＩｇＧ３  Ｍｉｘｅｄ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，"Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８（１０）：３８６３−７２（２００８）を参照：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００６０】
これらの抗体クラスの循環半減期は、Ｐｅｔｋｏｖａら（"Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＦｃＲｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍｏｒａｌｌｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）その全体が参照として本明細書に組み込まれている）により記載されている、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換等のＦｃドメインの改変、またはＢａｌｓｉｔｉｓら（"Ｌｅｔｈａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，"ＰｌｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ６（２）：ｅ１０００７９０（２０１０）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）により記載されているＮ２９７Ｑ置換により向上させることができる。
【００６１】
上で、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１及び６３として特定されている重鎖及び軽鎖配列を、コドン最適化ＤＮＡ配列を特定するために使用可能であり、これを、本発明における組み換え、キメラ抗体の作製のために好適な発現系内に導入することができる。あるいは、上で特定したＤＮＡ配列を、本発明における組み換え、キメラ抗体の作製のために好適な発現系の調製のために使用することができる。
【００６２】
抗体全体に加えて、本発明は、かかる抗体のＡｍｄ結合部分を包含する。かかるＡｍｄ結合部分としては、一価のＦａｂ断片、Ｆｖ断片（例えば一本鎖抗体、ｓｃＦｖ）、単一の可変ＶＨ及びＶＬドメイン、並びに二価のＦ（ａｂ'）２断片、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び低分子抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体断片は、Ｊａｍｅｓ  Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ    ９８−１１８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８３）；Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎａｌｏｇｕｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，"Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）（それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）に記載されているタンパク質分解断片化処理、または当該技術分野において周知の他の方法等の従来の手順で作製可能である。
【００６３】
幾つかの実施形態では、抗体またはそのＡｍｄ結合部分は、アミノ酸が、それぞれヒトＶＨまたはＶＬ生殖細胞系配列の抗体フレームワークに置換されているフレームワークを含む。以下の実施例６は、本明細書で記載される多数の抗体に対する生殖細胞系配列を特定している。
【００６４】
特に抗体断片の場合は、抗体を改変して血清半減期を増加させるのが更に好ましい場合がある。この改変は、例えば抗体断片の適切な領域の突然変異によって、サルベージレセプター結合エピトープを抗体断片内に導入することにより、またはエピトープ結合部分位をペプチドタグ内に導入した後、両端もしくは中間にて抗体断片に融合させることにより（例えば、ＤＮＡもしくはペプチド合成により）達成することができる。
【００６５】
抗体模倣物もまた、本発明における使用に好適である。非限定的に、１０番目のヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に由来する、アドネクチンまたはモノボディとして知られるもの（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  ａ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：１１４１−１１５１（１９９８）；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２５３−１２５８（２００２）、これらそれぞれの全体が参照として本明細書に組み込まれている）；  及びブドウ球菌プロテインＡの安定したαヘリックス細菌受容体ドメインＺに由来する、アフィボディとして知られているもの（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｏｍａｉｎ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（８）：７７２−７７７（１９９７）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）を含む多数の抗体模倣物が、当技術分野において周知である。
【００６６】
これらの抗体模倣物の作製において、ＶＨ及び／またはＶＬ鎖のＣＤＲを、これらの抗体模倣物の可変ループ領域内に接合または移植することができる。移植は、ＣＤＲ配列の置換に加え、特定のループ領域に現れる、少なくとも２つのアミノ酸残基から、１つを除く実質的に全てのアミノ酸残基までの欠失を伴うことができる。挿入は、例えば、１つのループ領域における１つのＣＤＲの挿入、任意に第２のループ領域における第２のＣＤＲの挿入、及び任意に、第３のループ領域における第３のＣＤＲの挿入であることができる。ポリペプチドにおける任意の欠失、挿入、及び置換は、既知のヌクレオチド配列から始まる組み換え技術を使用して達成することができる（以下参照）。
【００６７】
モノクローナル抗体の作製方法は、本明細書で記載される技術、または他の当該技術分野において公知の技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  −  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｒｙ  Ａ．Ｒｉｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅａｔｈｅｒ  Ｍ．Ｌａｄｙｍａｎ  ｅｄｓ．，１９９５）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）を使用して達成してよい。通常、このプロセスは、対象の抗原（即ち、ブドウ球菌Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼまたはそのペプチド断片）で事前に免疫化した動物の脾臓から、免疫細胞（リンパ球）を入手することを伴う。
【００６８】
次に、抗体分泌リンパ球を、細胞培養中に無限に複製可能な骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合させることにより、不死化免疫グロブリン分泌細胞株を作製する。細胞培養中での、無限に複製可能な哺乳動物骨髄腫細胞または他の融合パートナーとの融合は、標準的かつ周知の技術により、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の融合剤を使用すること（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｏｈｌｅｒ，"Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ，"Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）により、達成される。好ましくはマウス、しかし他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい不死化細胞株は、特定の栄養素の利用のために必要な酵素中で欠失し、急速な増殖が可能であり、かつ良好な融合能を有するように選択される。得られる融合細胞またはハイブリドーマを培養し、得られるコロニーを、所望のモノクローナル抗体の作製のためにスクリーニングする。かかる抗体を作製するコロニーをクローニングし、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで増殖させて大量の抗体を作製する。
【００６９】
したがって、本発明の第２の態様は、本明細書にて開示したモノクローナル抗体または結合部分を発現する細胞株に関する。一実施形態では、本明細書にて開示したモノクローナル抗体は、指定されたハイブリドーマ細胞株であるＡｍｄ１．１、Ａｍｄ１．２、Ａｍｄ１．３、Ａｍｄ１．５、Ａｍｄ１．６、Ａｍｄ１．７、Ａｍｄ１．８、Ａｍｄ１．９、Ａｍｄ１．１０、Ａｍｄ１．１１、Ａｍｄ１．１２、Ａｍｄ１．１３、Ａｍｄ１．１４、Ａｍｄ１．１５、Ａｍｄ１．１６、Ａｍｄ１．１７、Ａｍｄ２．１、Ａｍｄ２．２、Ａｍｄ２．４、及びＡｍｄ２．５より作製される。
【００７０】
上記の通り、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）で記載されている組み換えＤＮＡ法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖配列をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離する。重鎖及び軽鎖配列をコードする単離したポリヌクレオチドを次に、好適な発現ベクター内にクローニングし、このベクターは、別様では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞内にトランスフェクションした際、モノクローナル抗体を発現及び分泌する宿主細胞を生成する。また、所望の種の組み換えモノクローナル抗体またはその断片は、ファージディスプレイライブラリーから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−Ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  Ｐｈａｇｅ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
また更なる態様は、本明細書にて開示した抗体または結合部分をコードするＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子の５'に機能的に結合したプロモーター有効性ＤＮＡ分子、及びＤＮＡ分子の３'に機能的に結合した転写終結ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物に関する。本発明はまた、ＤＮＡ構築物が挿入される発現ベクターを包含する。ポリペプチド用の合成遺伝子は、突然変異誘発を容易にするために便利な制限酵素切断部位を含み、高レベルのタンパク質発現のための特異的コドンを使用するように設計することができる（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｌｏｔ：  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，"Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：５３９−５４９（１９８４）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００７２】
遺伝子は、以下のように組み立ててよい：まず、遺伝子配列を設計した制限酵素切断部位にて隔て、複数の部分に分断してよい；各部分について、反対側の鎖をコードし、約１５塩基の相補性重複を有する一対のオリゴヌクレオチドを合成してよい；２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を使用して、一本鎖領域を満たしてよい；断片の末端にて制限酵素部位を使用して、二本鎖オリゴヌクレオチドをｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）等のベクター内にクローニングし、その配列をＤＮＡシーケンサーにより確認してよい；及び、これらの工程を各部分について繰り返し、遺伝子全体を入手してよい。本手法は、一工程のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法よりも、遺伝子をアセンブルするのに一層長い時間がかかる（Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｄｕａｌ  Ａｓｙｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲ：Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ，"ＢｉｏＴｅｃｈ．１２：１４−１６（１９９２）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。突然変異も同様に、Ｔａｑポリメラーゼによる低忠実度複製により導入可能であり、時間のかかる遺伝子編集を必要とする。組み換えＤＮＡ操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．１９８９）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に従って実施することができる。一工程ＰＣＲ中での突然変異の導入を避けるために、当該技術分野において周知の高忠実度／低エラーポリメラーゼを用いることができる。
【００７３】
所望の突然変異は、カセット突然変異誘発、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発技術（（Ｄｅｎｇ  ＆  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，"Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｔｕａｌｌｙ  ａｎｙ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｂｙ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ａ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｓｉｔｅ，"Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１−８８（１９９２）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）、またはＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）、それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）のいずれかを使用してポリペプチド配列に導入することができる。
【００７４】
カセット突然変異誘発及び部位特異的突然変異誘発は共に、所望の特異的なヌクレオチドコード配列を作製するために使用可能である。上記遺伝子構築物と同一のプロトコルを使用してカセット突然変異誘発を実施することができ、新しい配列をコードする二本鎖ＤＮＡフラグメントを、好適な発現ベクター内にクローニングすることができる。新たに合成した（突然変異をコードする）鎖、及び遺伝子合成に使用したオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、多くの突然変異を作製することができる。本発明に係るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入するのに使用する手法に関係なく、配列決定を行い、突然変異誘発反応により設計した突然変異が導入された（かつ、他の突然変異は導入されない）ことを確認することができる。
【００７５】
対照的に、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を使用して、スクリーニング用ポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用可能な、複数の突然変異ポリペプチドのコード配列を無作為に産生することができる。一般的に、標的化したループ領域（またはＣ末端もしくはＮ末端尾部領域）を、ＮＮＫコドン（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの混合物を示し、ＫはＧとＴの混合物を示す）を使用して無作為化することができる（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２（１９８７）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００７６】
抗体またはＡｍｄ結合部分をコードする核酸分子を作製するために使用する手法に関係なく、核酸は、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して宿主細胞内に導入することができる。通常、これはＤＮＡ分子が異種（即ち、通常存在しない）発現系にＤＮＡ分子を挿入することを伴う。異種ＤＮＡ分子は、センス方向かつ正しいリーディングフレームで、発現系またはベクター内に挿入される。ベクターは、挿入したタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必要な要素（プロモーター、サプレッサー、オペレーター、転写終結配列等）を含有する。組み換え遺伝子またはＤＮＡ構築物は、発現ベクター内への挿入前に調製することができる。例えば、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して、プロモーター有効性ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子の５'に機能的に結合することができ、転写終結（即ちポリアデニル化配列）は、その３'に機能的に結合することができる。
【００７７】
この態様に関して、ポリヌクレオチドは、分子が異種である発現系またはベクターに挿入される。異種核酸分子は、発現系またはベクターに、プロモーター及び任意の他の５'制御分子に対して適切なセンス（５'→３'）方向、かつ正しいリーディングフレームで挿入される。核酸構築物の作製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているような当技術分野において標準的なクローニング法を使用して実施することができる。米国特許第４，２３７，２２４号（Ｃｏｈｅｎ及びＢｏｙｅｒ）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）もまた、制限酵素切断及びＤＮＡリガーゼによるライゲーションを使用した組み換えプラスミドの形態での、発現系の作製について記載している。
【００７８】
好適な発現ベクターとしては、宿主細胞と互換性を有する種に由来するレプリコン及び対照配列を含有するものが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８またはｐＢＲ３２２等のプラスミドを使用してよい。昆虫宿主細胞を使用する場合、昆虫宿主細胞と互換性がある適切な転写ベクターとしては、所望のタンパク質に融合した分泌シグナルを組み込んだｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＡｃＧＰ６７及びｐＡｃＳｅｃＧ２Ｔ、並びにＧＳＴ及び６つのＨｉｓタグを含有するｐＡｃＧＨＬＴ及びｐＡｃＨＬＴ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）が挙げられる。本態様の実施のために使用するのに好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ノダウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられる。他の好適な発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれている。例えば核酸構築物の作製における核酸操作、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞内導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質分析のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）に詳細に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれている。
【００７９】
異なる遺伝信号及びプロセッシング事象は、遺伝子発現の多くのレベル（例えばＤＮＡ転写及びメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）翻訳）、及びそれに続く、宿主細胞により産生され発現される抗体または抗体断片の量を制御する。ＤＮＡの転写はプロモーターの存在に依存し、プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼの結合を指示することによりｍＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。プロモーターは、その「強さ」（即ち、転写を促進する能力）が異なっている。クローニングした遺伝子を発現する目的では、高レベルの転写、及びそれ故発現を得るために、強力なプロモーターを使用するのが望ましい。使用した宿主系に応じて、多数の好適なプロモーターのいずれか１つを使用してよい。例えば、大腸菌：そのバクテリオファージ：またはプラスミド：Ｔ７ファージプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター等のプロモーターを使用する場合、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ等が挙げられるがこれらに限定されない、大腸菌ファージλ及びその他のＰＲ及びＰＬプロモーターを使用して、隣接するＤＮＡ断片の高レベルの転写を指示してよい。更に、組み換えＤＮＡまたはその他合成ＤＮＡ技術により作製されたハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモーターまたはその他大腸菌プロモーターを使用して、挿入遺伝子の転写を提供してよい。昆虫細胞を使用する場合、好適なバキュロウイルスプロモーターとしては、３９Ｋタンパク質プロモーターまたは塩基性タンパク質プロモーター等の後期プロモーター、並びにｐ１０及びポリへドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター等の最後期プロモーターが挙げられる。場合によっては、複数のバキュロウイルスプロモーターを含有する転写ベクターを使用するのが望ましい場合がある。哺乳動物細胞での発現を指示するのに好適な一般的なプロモーターとしてはＳＶ４０、ＭＭＴＶ、メタロチオネイン−１、アデノウイルスＥｌａ、ＣＭＶ、前初期免疫グロブリン重鎖プロモーター及びエンハンサー、並びにＲＳＶ−ＬＴＲが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは構造的、あるいは組織特異的または組織誘発性であることができる。加えて、幾つかの場合において、誘発性（ＴｅｔＯｎ）プロモーターを使用することができる。
【００８０】
原核生物中でのｍＲＮＡ翻訳は、適切な原核細胞シグナルの存在に依存し、このシグナルは真核生物のものと異なる。原核生物での効率的なｍＲＮＡ翻訳には、ｍＲＮＡ上に、シャイン・ダルガノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部分位を必要とする。この配列は、開始コドン、通常ＡＵＧの前に位置する、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＡＵＧはタンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする。ＳＤ配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３'末端に相補的であり、ｒＲＮＡと二重鎖を形成することにより、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進し、リボソームの正しい配置を可能にする。遺伝子発現の最大化に関する確認については、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｌａｕｅｒ，"Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：４７３−８２（１９７９）を参照のこと（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【００８１】
本発明はまた、本明細書にて開示したＤＮＡ構築物で形質転換した宿主細胞も含む。宿主細胞は原核生物または真核生物であることができる。本明細書にて開示したポリペプチドを発現するのに好適な宿主細胞としては、より一般に入手可能なグラム陰性菌のいずれか１つが挙げられる。好適な微生物としては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ胃腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（ネズミチフス菌（ｔｙｐｈｉｍｉｒｉｕｍ））、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、腸炎菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ菌（Ｓ．ｓｏｎｎｉｅ）、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・プレウロプネウモニエ（Ｈ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｉｌｏｃｉｄａ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、トレポネーマ・オラール（Ｔ．ｏｒａｌｅｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア菌種（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、クレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・モルガニイ（Ｐ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒ．ｒｉｃｈｅｔｔｓｉｉ）、ポルフィロモナス（バクテリオデス）ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、クラミジア・シッタシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・インターメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｓ）、カンピロバクター・フィタス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｉｓｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉｅ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・スシ（Ｂ．ｓｕｓｉ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、鼠咬症スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｍｉｎｕｓ）、鼻疽菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、及びペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）が挙げられる。
【００８２】
細菌細胞に加えて、動物細胞（特に哺乳動物及び昆虫細胞）、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、または藻細胞もまた、本明細書にて開示した種類の単離ポリペプチド分子を有する組み換え発現ベクターのトランスフェクション／形質転換に好適な宿主細胞である。当該技術分野において一般的に使用される哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞、及びその他多数が挙げられる。好適な昆虫細胞は、バキュロウイルス感染に罹りやすいものを含み、Ｓｆ９及びＳｆ２１細胞が挙げられる。
【００８３】
宿主細胞を発現ベクターで形質転換／トランスフェクションする方法は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載のとおり、選択した宿主系に依存する。細菌細胞に関しては、好適な技術としては塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられる。真核細胞に関しては、好適な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソームによるトランスフェクション、並びにレトロウイルスまたは任意のその他のウイルスベクターを使用する形質導入が挙げられる。昆虫細胞に関しては、ポリヌクレオチド構築物を含有する転写ベクターを、ＡｃＮＰＶ等のバキュロウイルスＤＮＡと共にトランスフェクションし、組み換えウイルスの作製を促進する。続いてＳｆ細胞の組み換えウイルス感染により、高率での組み換えタンパク質産生をもたらす。タンパク質産生を促進するために使用する発現系及び宿主細胞に関係なく、発現した抗体、抗体断片、または抗体模倣物を、当該技術分野において公知であり、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｌ．Ｒ．Ｂｏｎｎｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ２００７）（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載されている標準的な精製方法を使用して、速やかに精製することができる。
【００８４】
組み換えＤＮＡ技術を使用して、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを更に改変し、代替の抗体を作製することができる。例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、ヒト抗体のこれらの領域に置換して、上述のヒト化（またはキメラ）抗体を作製することができる。あるいは、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを非免疫グロブリンポリペプチドに置換して、融合抗体を作製することができる。他の実施形態では、定常領域を切断または除去して、所望のモノクローナル抗体の抗体断片を作製する。更に、可変領域の部位特異的または高密度の組み合わせ突然変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性及び親和性を最適化することができる。
【００８５】
更なる態様は、担体、及び本発明における１つ以上のモノクローナル抗体またはその１つ以上のＡｍｄ結合部分を含む医薬組成物に関する。本医薬組成物は２つ以上の抗体または結合断片を含有してよく、全ての抗体または結合断片は同一のエピトープを認識する。あるいは、医薬組成物は、抗体または結合断片混合物を含有してよく、１つ以上の抗体または断片はブドウ球菌Ａｍｄの１つのエピトープを認識し、１つ以上の抗体または結合断片はブドウ球菌Ａｍｄの異なるエピトープを認識する。例えば、混合物はブドウ球菌ＡｍｄのＲ１またはＲ２ドメインに特異的に結合する１つ以上の抗体と共に、Ａｍｄの結合する任意の他の抗体（Ａｍｄの触媒ドメインに結合する抗体等）を含有してよい。医薬組成物は、以下に記載する製薬上許容できる担体または他の製薬上許容できる成分を更に含有してよい。好ましい実施形態では、担体は水溶液である。
【００８６】
本明細書にて開示した抗体を含有する医薬組成物を、ブドウ球菌感染を患う、または患うリスクのある対象に投与することができる。種々のデリバリーシステムが公知であり、本明細書にて開示した抗体を投与するために使用することができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻孔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬は、例えば点滴またはボーラス注射により、上皮内層または粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収により投与することができ、化学療法剤、抗生物質製剤、またはその他免疫療法薬等のその他の生物学的活性剤と共に投与することができる。投与は全身的または局所的とすることができる、即ち、ブドウ球菌感染部位にて、または手術もしくは移植部位に直接行うことができる。
【００８７】
医薬組成物はまた、患者への第２の治療薬を含んでよく、第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬である。代表的な抗生物質製剤としてはバンコマイシン、トブラマイシン、セファゾリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、ゲンタマイシン、フシジン酸、ミノサイクリン、コトリモキサゾール、クリンダマイシン、リネゾリド、キヌプリスチン−ダルホプリスチン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシン、セフトビプロール、セフタロリン、イクラプリム、カルバペネムＣＳ−０２３／ＲＯ−４９０８４６３、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な免疫療法薬としてはテフィバズマブ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０、Ａｕｒｅｘｉｓ（商標）、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。上の一覧の抗生物質製剤及び免疫療法薬は、非限定とすることを目的としている。したがって、他の抗生物質製剤または免疫療法薬もまた検討される。第２の治療薬の組み合わせまたは混合物もまた、これらの目的のために使用される。これらの作用物質は同時に、または単一の製剤として投与することができる。
【００８８】
一実施形態では、免疫療法薬はブドウ球菌グルコサミニダーゼ（Ｇｍｄ）に特異的に結合し、ブドウ球菌株のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を阻害する第２のモノクローナル抗体または結合部分を含む。好ましくは、第２のモノクローナル抗体は指定されたハイブリドーマ細胞株１Ｃ１１、１Ｅ１２、２Ｄ１１、３Ａ８、３Ｈ６、もしくは４Ａ１２、これらのヒト化変異体、またはこれらの結合部分により作製される（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１１／１４０１１４及びＷＯ２０１３／０６６８７６（Ｓｃｈｗａｒｚら）、それら全体が参考として本明細書に組み込まれる）。また、本態様によれば、第２のモノクローナル抗体のヒト化変異体は好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４クラスである。
【００８９】
別の実施形態において、第２のモノクローナル抗体の結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体、ＶＨドメイン、またはＶＬドメインを含む。
【００９０】
医薬組成物としては通常、１つ以上の医薬担体（例えば水、及び石油、動物、植物または合成由来のものを含む油（例えばピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ゴマ油等）等の滅菌液）が挙げられる。医薬組成物を静脈内投与する場合、水がより一般的な担体である。食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、液状担体として、特に注射可能な溶液として用いることができる。好適な医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂牛乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は所望する場合、微量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性剤等の形態を取ることができる。組成物は、従来のトリグリセリド等の結合剤及び担体と共に座薬として製剤化することができる。経口製剤としては、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）に記載されている。かかる組成物は、患者に適切な投与形態を提供するように、好適な量の担体と共に、治療に有効な量の、通常は精製形態の核酸またはタンパク質を含有する。製剤は投与方法に対応する。
【００９１】
上述の細菌感染の治療に関する組成物の有効量は、投与方法、標的部位、患者の生理学的状態、投与される他の薬剤、及び治療が予防的であるか治療的であるか、を含む多くの異なる因子に依存し得る。予防用途において、長期間にわたり、比較的低頻度の間隔で比較的少ない用量を投与する。余命期間に治療を受け続ける患者もいる。治療用において、病気の進行が減少または停止するまで、かつ好ましくは、患者が病気の症状の部分的または完全な回復を示すまで、比較的短い間隔で、比較的多くの用量が場合によって必要である。その後、患者に予防レジメンを投与することができる。ブドウ球菌細菌感染に対する予防的治療については、本明細書にて開示した医薬組成物を、個々を細菌に曝露する前に投与することができ、得られる免疫応答が、細菌を個体から除去可能となるように細菌感染の重症度を阻害または低下することができることを意味する。例えば、モノクローナル抗体または医薬組成物を、関節置換術、またはプロテーゼ移植を伴う任意の手術等の外科的治療の前、最中、及び／または直後に投与することができる。
【００９２】
本明細書にて開示した抗体または結合断片による受動免疫については、用量は、宿主の体重の約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、及びより一般的には約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は約１ｍｇ／体重ｋｇもしくは約１０ｍｇ／体重ｋｇ、または約１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。代表的な治療レジメンは、２週間に一度、または１ヶ月に一度、または３〜６ヶ月に一度の投与を必要とする。幾つかの方法においては、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の用量は、指示した範囲内に収まる。抗体は通常、複数の機会に投与される。一回用量の間隔は毎日、毎週、毎月、または毎年とすることができる。幾つかの方法においては、用量は、１〜１０００μｇ／ｍＬ、及び幾つかの方法では２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度に達するように調整される。あるいは、抗体は持続放出性製剤として投与することができ、この場合、より頻度の低い投与が必要となる。用量及び頻度は、患者内の抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。
【００９３】
更なる態様は、患者に整形外科用インプラント、組織移植片または医療装置を導入する方法であって、かかるインプラントを必要とする患者に、本明細書にて開示した有効量のモノクローナル抗体、結合部分、または医薬組成物を投与し、かつ、患者に整形外科用インプラントまたは医療装置を導入することを含む方法、に関する。
【００９４】
本明細書で使用する場合、医療装置を「導入すること」とは、装置または移植片をはじめて導入するかまたは取り付けること、及び以前に取り付けた装置もしくは移植片の表面を修復するかもしくは改変すること、以前に取り付けた装置もしくは移植片の全部もしくは一部を置き換えること、または以前に取り付けた装置もしくは移植片を外科的に変更することと定義される。
【００９５】
一実施形態では、整形外科用インプラント、医療装置または移植片の導入方法は、整形外科用インプラント、医療装置または移植片を必要とする患者に、有効量のモノクローナル抗体もしくは結合断片、またはそれらを含有する医薬組成物を全身に、または移植部位に直接投与することを含む。あるいは、または更に、移植部位にて、整形外科用インプラント、医療装置または移植片を、移植の前、最中または直後にモノクローナル抗体もしくは結合断片、またはそれらを含有する医薬組成物で覆うかまたは処理することができる。
【００９６】
整形外科用インプラントは、人工関節、移植片または合成インプラント等の、ブドウ球菌感染に罹りやすい任意の種類のインプラントとすることができる。代表的な人工関節としては、人工膝関節、人工股関節、手指義手、人工肘関節、人工肩関節、人工顎関節、及び人工足関節が挙げられるが、これらに限定されない。その他のプロテーゼもまた使用することができる。代表的な移植片または合成インプラントとしては人工血管、心臓弁インプラント、人工椎間板、半月板インプラント、または合成もしくは同種異系の前十字靭帯、内側側副靭帯、外側側幅靭帯、後十字靱帯、アキレス腱、及び回旋腱板が挙げられるが、これらに限定されない。他の移植片またはインプラントもまた使用することができる。
【００９７】
医療装置は、ブドウ球菌感染に罹りやすい任意の医療装置とすることができる。代表的な医療装置としては心臓ペースメーカー、髄液シャント、透析カテーテル、または人工心臓弁が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
この態様に関して、第２の治療薬もまた患者に投与してよい。第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬であってよい。代表的な抗生物質製剤及び免疫療法薬については、上述した通りである。
【００９９】
一実施形態では、整形外科用インプラントまたは医療装置の導入方法は、再関節全置換術の取り付けプロセスを包含することを意図している。元の関節置換術において感染、特にブドウ球菌属種感染が発生する場合、唯一の有効な治療は、再関節全置換術である。この実施形態では、感染した人工関節をまず取り外した後、患者の根本的な感染を治療する。感染の治療は長期間（即ち６ヶ月）にわたり、この間、患者は動けず（または制限される移動性のみを有する）、根本的な感染を治療するために抗生物質、及び所望により本明細書にて開示した１つ以上のモノクローナル抗体もしくは結合部分、または医薬組成物を受ける。根本的な感染の治療の際に、新しい人工関節を取り付ける。新しい人工関節の取り付けの直前（即ち、新しい人工関節の取り付け前二週間以内）、及び所望により取り付け後に、本明細書にて開示した１つ以上のモノクローナル抗体もしくは結合部分、または医薬組成物を患者に投与する。この治療は、取り付け後の期間に一度以上繰り返すことができる。抗生物質治療薬を、本明細書にて開示した１つ以上のモノクローナル抗体もしくは結合部分、または医薬組成物と組み合わせて、または同時に投与してよい。これらの治療は、再関節全置換術中の感染または再感染を予防するのに効果的である。
【０１００】
別の態様は、ブドウ球菌感染に罹りやすい、または患う患者に、本明細書にて開示した有効量のモノクローナル抗体、モノクローナル抗体結合部分、もしくは医薬組成物、またはこれらの組み合わせを投与することを伴う、ブドウ球菌感染の治療または予防方法に関する。
【０１０１】
ブドウ球菌感染治療の一実施形態では、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体結合部分、医薬組成物、またはこれらの組み合わせの投与を繰り返す。初期投与及び反復投与は、他の治療法と比較して同時または連続とすることができ、全身に実施するか、もしくはブドウ球菌感染の部位に直接実施するか、またはその両方とすることができる。
【０１０２】
ブドウ球菌感染の治療方法を使用して、皮膚、筋肉、心臓、気道、胃腸管、眼、腎臓及び尿路感染、並びに骨または関節感染を含むがこれらに限定されない部位にてブドウ球菌感染を治療することができる。
【０１０３】
一実施形態では、本方法を実施して、骨または関節でのブドウ球菌感染を有する患者に、有効量のモノクローナル抗体もしくはその結合断片、または医薬組成物を投与することにより骨髄炎を治療する。これらの作用物質または組成物の投与を、上で説明した経路のいずれかを使用して実施することができる。特定の実施形態において、骨または関節感染の部位への直接投与を実施することができる。
【０１０４】
上記実施形態のそれぞれにおいて、第２の治療薬もまた患者に投与してよい。第２の治療薬は抗生物質製剤または免疫療法薬であってよい。代表的な抗生物質製剤及び免疫療法薬については、上述した通りである。
【０１０５】
本明細書にて開示する治療方法を使用して、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む、必要とする任意の患者を治療することができるが、この方法は特に、任意の年齢の免疫不全の患者、及び５０歳を超える患者に有用である。
【０１０６】
上記実施形態において、処理の予防的または治療的方法は、感染速度、感染の重症度、感染期間、またはこれらの任意の組み合わせを低減することができる。特定の実施形態において、処理の予防的または治療的方法は、ＳＲＣもしくは膿瘍の合計数を減少させるかもしくは全て除去し、かつ／または無菌ＳＲＣもしくは膿瘍の数を増加させることができる（ＳＲＣまたは膿瘍と推定されるものは存在する）。特定の実施形態において、損傷寸法または容積の減少により示される、溶骨性病変の完全または部分的な治癒が企図される。
【０１０７】
別の態様は、サンプルを本明細書にて開示したモノクローナル抗体または結合部分に曝し、  かつモノクローナル抗体または結合部分と、サンプル内に存在するブドウ球菌またはブドウ球菌アミダーゼとの間に免疫複合体が形成するかどうかを検出することを伴う、サンプル内でのブドウ球菌の存在の測定方法に関し、前記曝露後に免疫複合体が存在することは、サンプル内にブドウ球菌が存在することを示す。
【０１０８】
サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）サンプル、脳脊髄液サンプル、関節液サンプル、胸膜液サンプル、唾液サンプル、尿サンプル、または組織生検サンプルとすることができる。
【０１０９】
免疫複合体の形成の検出は、当該技術分野における周知の方法により実施することができる。一実施形態では、検出はイムノアッセイを使用して実施する。使用するイムノアッセイ法は、周知のイムノアッセイ法、例えばラテックス凝集法、比濁分析法、ラジオイムノアッセイ法（例えばＲＩＡ及びＲＩＭＡ）、酵素イムノアッセイ法（例えばＥＬＩＳＡ及びＥＩＡ）、ゲル核酸沈殿反応、フローサイトメトリー、免疫電気泳動（例えばウェスタンブロッティング）、ドットブロット法、免役拡散アッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ（例えばＦＩＡ及びＩＦＭＡ）、免疫クロマトグラフィー法等の一般的なイムノアッセイ法であってよく、かつ抗体アレイ法を言及してもよいが、これらに限定されない。これらのイムノアッセイ法は、これら自体が当分野で既知であり、当業者により容易に実施されることができる。
【０１１０】
モノクローナル抗体または結合部分を、当該技術分野において公知の各種方法により直接標識することができる。標識は、モノクローナル抗体または結合部分に、イムノアッセイ中に検体が結合する程度を測定するための試薬の手段として機能する。標識は非限定的に、放射性同位体、酵素、発色団、フルオロフォア、光吸収または屈折粒子とすることができる。標識は、放射線標識、フルオロフォア、または化学発光標識であるのが好ましい。抗体または結合部分を、その免疫反応性をできる限り広範にわたり破壊することなく標識することが好ましい。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、特許請求の範囲の主題の実践を例示するが、その範囲をいかなる方法でも制限しないことを意図している。
【０１１２】
実施例１−抗原の調製
Ｎ末端付近にヘキサ−ヒスチジン配列を含む黄色ブドウ球菌自己溶解素のアミダーゼドメイン（Ｈｉｓ−Ａｍｄ）全体の組み換え形態を調製した。Ｈｉｓ−Ａｍｄのオープンリーディングフレームは、黄色ブドウ球菌自己溶解素の既知の配列を収集し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（商標）ソフトウエアを使用して、コンセンサスタンパク質配列を測定し、次いで大腸菌内での発現のためにコドンの使用を最適化することにより設計した。Ｈｉｓ−Ａｍｄに関して、コードされるコンセンサスタンパク質及びコードするオープンリーディングフレーム配列を、以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２として示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ヘキサ−ヒスチジンリーダー配列に加え、自己溶解素ａａ１９８−７７５）
2019196353.tif 000072
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
2019196353.tif 000073
【０１１３】
Ｈｉｓ−ＡｍｄをコードするＤＮＡ分子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により新規に合成した後、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ大腸菌発現ベクター内に挿入した。
【０１１４】
大腸菌内で発現したＨｉｓ−Ａｍｄタンパク質は主に不溶性封入体の形態であり、これを回収し、８Ｍの尿素を含むＰＢＳ中に可溶化した。ＴＡＬＯＮ樹脂上での金属錯体化クロマトグラフィーによる更なる精製の後、Ｈｉｓ−Ａｍｄを、１ｍＭのＺｎ２＋を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対する透析の全体プロセス、及び尿素量の段階的な減少により、復元した。
【０１１５】
Ｒ１及びＲ２ドメインをコードするオープンリーディングフレーム部分を取り除いたことを除き、Ａｍｄ触媒ドメイン（Ｈｉｓ−Ａｍｄ−触媒）を同一の方法で調製した（図１を参照）。Ｈｉｓ−Ａｍｄ−触媒に関して、コードされるコンセンサスタンパク質及びコードするオープンリーディングフレーム配列を、以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及び４として示す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ヘキサ−ヒスチジンリーダー配列に加え、自己溶解素ａａ１９８−４４１）
2019196353.tif 000074
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
2019196353.tif 000075
【０１１６】
実施例２−マウスの接種及びハイブリドーマの調製
初期のハイブリドーマ融合（融合番号１）に関して、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ６３２２）内で、６匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｈｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２  ７５μｇで７週間間隔の二度の腹腔内注射により免疫化した。固定化したＨｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２のＥＬＩＳＡにおいて、最高の力価を有するマウス２匹をハイブリドーマ融合のために選択した。各マウスは、Ｈｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２  ３５０μｇの腹腔内での最終的な免疫化を受け、４日後に犠牲にし、ハイブリドーマ融合を行った。
【０１１７】
第２のハイブリドーマ融合（融合番号２）について、Ｂａｌｂ／ｃマウスを二度免疫化した：最初の用量は、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ６３２２）内でＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ロット番号２２２９３３Ｓ０５／Ｐ２００１１３０３）のＨｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２−Ｂ  １２０μｇ、第２の免疫化は、１２週間の間隔で、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（Ｉｍｊｅｃｔ  ＥＤＣ  ｍｃＫＬＨ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号７７６７１）とコンジュゲートしたＨｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２−Ｂ  １００μｇであった。固定化したＨｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２のＥＬＩＳＡにおいて、最高の力価を有するマウス２匹をハイブリドーマ融合のために選択した。各マウスは、Ｈｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２  １００μｇの腹腔内での最終的な免疫化を受け、４日後に犠牲にし、ハイブリドーマ融合を行った。
【０１１８】
従来の方法により、脾細胞からハイブリドーマを調製した。
【０１１９】
実施例３−モノクローナル抗体の性質決定
新しいモノクローナル抗体を複数の関連タンパク質についてスクリーニングし、これらは内在性Ａｍｄ（かつ組み換え形態ではない）を認識したこと、及びこれらのエピトープが触媒ドメイン（Ｃ）または細胞壁結合ドメイン（Ｒ１、Ｒ２もしくはＲ３）に存在するかを測定した。モノクローナル抗体のスクリーニングに使用したタンパク質を下表１に示す。
【０１２０】
（表１）モノクローナル抗体のスクリーニングに使用したタンパク質
2019196353.tif 000076
【０１２１】
表１に示したタンパク質を捕捉抗原として使用するＥＬＩＳＡにより、スクリーニングアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡ試験は、幅広く実践されている伝統的手法を使用して実施した。具体的には、抗原をＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェル上に吸着させた。各抗原を、２μｇ／ｍＬのリン酸塩−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液として調製し、１００μＬを割り当てたマイクロタイターウェルに加え、抗原を室温で１時間、または４℃で一晩のいずれかで吸着させた。覆っている抗原を除去せずに、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μＬを添加してウェルをブロックし、室温で１時間、または４℃で一晩のいずれかでインキュベーションした。次に、コーティング及びブロックしたプレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、直ちに使用したか、４℃で保管した。
【０１２２】
細胞非含有ハイブリドーマ培養上清液を割り当てたウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。次に、二次抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、ＰＢＳ−Ｔ中に０．１〜０．５μｇ／ｍＬにてウェルあたり１００μＬで加え、室温で１時間インキュベーションした。マイクロタイタープレートを再度、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した後、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）または２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）のいずれか１００μＬを加えることにより、顕色した。これらのＥＬＩＳＡの結果を、下表２に示す。
【０１２３】
（表２）クローニング成功及び特性決定した抗Ａｍｄ  ｍＡｂの概要
2019196353.tif 000077
ＮＤ＝測定されず。
【０１２４】
実施例４−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡｍｄの触媒活性の阻害
治療用モノクローナル抗体の効力に寄与しうる特質は、細菌増殖及び生残に不可欠な、アミダーゼ等の酵素の活性を直接阻害することである。抗Ａｍｄ  ｍＡｂの幾つかを、黄色ブドウ球菌ペプチドグリカンの混濁した懸濁液を透明にするアミダーゼの能力を阻害した程度を測定することにより、アミダーゼ活性の阻害について試験した。融合番号１からの８つの抗体の結果を図２に示す。ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６はアミダーゼ活性の強力阻害剤である一方で他はそうではなく、低い親和性阻害剤であるようであるＡｍｄ１．１６は例外の可能性がある。全ての抗体についての結果を表２にまとめている。
【０１２５】
実施例５−抗Ａｍｄ  ｍＡｂの大部分が黄色ブドウ球菌を沈殿させる
治療用モノクローナル抗体の効力に関して重要であろう別の特質は、無傷の細菌細胞の外側から接近可能な抗原構造（エピトープ）の認識である。この認識の可視的な発現は、懸濁液から沈殿する巨大な凝集体内への、抗体が仲立ちする個々の細菌のクラスタリングにより、細胞リッチなペレット及びさほど混濁していない上清を得ることである。候補ｍＡｂの多くは、図３に示すようにはっきりとした沈殿物を形成した。融合１及び２からの候補ｍＡｂの沈殿活性の一覧は、表２にある。
【０１２６】
実施例６−各ｍＡｂの独自性、及び配列決定に基づく生殖細胞系の割り当ての特定
遺伝子の割り当ては、抗Ａｍｄ重鎖及び軽鎖配列のヌクレオチド配列を、国立生物工学情報センターのＩｇＢＬＡＳＴ内にある、既知のマウスＶ領域配列のファイルとマッチングすることにより特定した。本分析の結果を下表３に表す。融合番号１のそれぞれの抗体は、同一の生殖細胞系ＶＨ遺伝子断片に由来した可能性のあるＡｍｄ１．１及び１．４を除いて独自的であった。融合番号２からの２つの抗体は、融合番号１で単離したｍＡｂと重鎖ＶＨ及びＪＨ遺伝子断片を共有する（ｍＡｂ  Ａｍｄ２．４とｍＡｂ  Ａｍｄ１．１１；ｍＡｂ  Ａｍｄ２．２とｍＡｂ  Ａｍｄ１．７）。各場合において、軽鎖が異なる。
【０１２７】
（表３）最も可能性の高い生殖細胞系ＶＨ、ＪＨ、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント
2019196353.tif 000078
括弧内の数字は、抗Ａｍｄ配列と推定上の生殖細胞系前駆体との間に見られる非同義の塩基変化の数である。ＮＡ＝配列決定が成功しなかった。
【０１２８】
実施例７−黄色ブドウ球菌アミダーゼに対する抗Ａｍｄ  ｍＡｂの親和性の測定
抗菌抗体に必要不可欠な特質は、細菌抗原に対する高親和性である。親和性が高ければ高いほど、予防または治療に必要な投与量は少なくなる。幾つかの治療用抗体は、ＫＤとして表される親和性を、１０ｎＭ（ＫＡ＝１０８Ｍ−１）の範囲で有するが、ＫＤが約１ｎＭ（ＫＡが約１０９Ｍ−１）の抗体を有するのが一般的に望ましい。可溶性Ｈｉｓ−ＡｍｄＲ１Ｒ２−Ｂに対する固定化抗Ａｍｄ  ｍＡｂの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−２００で表面プラズモン共鳴技術を使用して測定した。ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６の代表的なデータを図４に示す。Ａｍｄに対するこの平均親和性は約２．１ｎＭであるが、図４は、約１ｎＭの測定親和性を示す。他の候補ｍＡｂに対して測定した親和性を、表２に一覧にしている。
【０１２９】
実施例８−抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６は、黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１によるｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオフィルム形成を阻害する
Ａｍｄは、バイオフィルム形成に関与することが報告されている（Ｂｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｔｌ  ＡＭ  ａｎｄ  ＧＬ  Ｍｕｒｅｉｎ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｕｔｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４２２４４（２０１２）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，"Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８８：２９４４０−２９４５２（２０１３）；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ａｕｔｏｌｙｓｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，"Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７９：１１５３−１１６５（２０１１）、それら全体が参照として本明細書に組み込まれている）。バイオフィルム形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、特に整形外科用インプラントに関係する黄色ブドウ球菌感染の持続性の中核をなすと考えられているプロセスである（Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｎｄ  Ａｒｃｉｏｌａ，"Ｆｒｏｍ  Ｋｏｃｈ'ｓ  Ｐｏｓｔｕｌａｔｅｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｔｈｅｏｒｙ：Ｔｈｅ  Ｌｅｓｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｌｌ  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，"Ｉｎｔｅｒｎａｔ'ｌ  Ｊ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ  ３５：６９５−６９９（２０１２）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。抗Ａｍｄ  ｍＡｂ１．６がバイオフィルム形成を阻害する能力を測定するために、バイオフィルム形成測定用に特異的に設計した黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１をカルガリープレート内で増殖させた（Ｃｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｃａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ：Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｂｉｏｆｉｌｍｓ，"Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１７７１−１７７６（１９９９）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。自己溶解素遺伝子（Δａｔｌ）並びにそのＡｍｄ（Δａｍｄ）及びＧｍｄ（Δｇｍｄ）サブドメインの欠失変異体はそれぞれ、ＷＴ  ＵＡＭＳ−１よりも実質的に少ないバイオフィルムを形成した（ＷＴの２０〜３５％）。Ａｍｄ１．６単独、または抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  １Ｃ１１と組み合わせたＡｍｄ１．６（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１１／１４０１１４（Ｓｃｈｗａｒｚら）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）は５０％を超えてバイオフィルム形成を減少させたが、特異性が無関係のアイソタイプ適合ｍＡｂは効果を有しなかった（図５）。外因性抗Ａｍｄ  ｍＡｂによる細胞外Ａｍｄの阻害は、自己溶解素遺伝子の欠失とほぼ同じ程度に効果的である。
【０１３０】
実施例９−抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６はインプラントが関係する骨髄炎のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるバイオフィルム形成を減少させる
インプラントが関係するバイオフィルムは、整形外科が示す持続性感染の主な原因と考えられているため、モデルインプラントにおけるバイオフィルム形成の程度を減少させる能力は、抗Ａｍｄ予防の潜在的な臨床的利益の評価基準として解釈することができる。インプラントが関係する骨髄炎を患う、モデルインプラントが関心対象の画定された領域（インプラント上の０．５×２．０ｍｍの平面）を有するマウスモデルを使用して、黄色ブドウ球菌による１４日間の感染中に、バイオフィルムで覆われた領域を測定した。図６Ａに示すとおり、最大の感染範囲は約４０〜５０％であり、マウスは無関係な特異性を有するアイソタイプ適合抗体で処理されていた。ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６単独、または抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  １Ｃ１１と組み合わせたｍＡｂ  Ａｍｄ１．６は、対照と比較して約５０％、バイオフィルム形成を減少させた（図６Ｂ、６Ｃ、６Ｅ）。バイオフィルム形成のこの減少の程度は、自己溶解素遺伝子（Δａｔｌ）の遺伝的欠失により得られる減少の程度に相当し（図６Ｂ、６Ｄ、６Ｅ）、バイオフィルム形成の観点において、内部遺伝子欠失及び外因性抗Ａｍｄ抗体による干渉が機能的に等価であることを示している。
【０１３１】
実施例１０−抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６による受動免疫は、黄色ブドウ球菌感染から生じる骨溶解の容積を減少させる
骨の黄色ブドウ球菌感染による特徴的な形質の１つは、感染細菌により誘発される炎症反応から生じる骨溶解である。したがって、溶解した骨の容積（骨溶解容積）の減少は、感染の制限の尺度として受け取られる。抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６が骨の損傷を制限するかどうかを確認するために、５匹の６〜１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスのグループを、合計用量４０ｍｇ／ｋｇにて、ＰＢＳ（未治療対照）、抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  １Ｃ１１、抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６、または組み合わせ（１Ｃ１１＋Ａｍｄ１．６）で腹腔内にて免疫化した。２４時間後、右側脛骨を通して、各マウスに生物発光ＣＡ−ＭＲＳＡ株であるＵＳＡ３００  ＬＡＣ：：ｌｕｘで汚染したピンを挿入した。
【０１３２】
Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、０、３、５、７、１０、及び１４日目に、全てのマウスに生物発光イメージングを実施し、３日目のピークＢＬＩを上述したように定量化した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ２６：９６−１０５（２００８）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。各治療群の代表的なＢＬＩを図７Ａに示し、各治療群に細菌負荷が存在することを示した。
【０１３３】
得られた感染を１４日間進行させてから動物を犠牲にし、感染した脛骨を、上述したマイクロＣＴによる分析のために回収した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｒｅｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｗ，"Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１９２：８４−９４（２０１０）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。未治療の対照では、内側及び外側の両方で骨溶解が広範囲にわたっており（図７Ｂ）、骨溶解容積は平均で０．４ｍｍ３を超えた。骨溶解容積の低下は、抗体で治療したマウスの３つの群全てにおいて測定した（図７Ｃ）。併用療法を受ける１匹の個体では、骨溶解容積は０と計算され、これは感染したインプラント部位の完全な治癒を示している。この個体における併用抗体療法の効果は、無菌のピン、及び効果的な抗生物質療法で治療した感染ピンの療法（即ち、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ２６：９６−１０５（２００８）に記載されているゲンタマイシン治療：その全体が参照として本明細書に組み込まれている）と同等である。この個体は抗生物質療法なしで、感染したインプラントの見事な治療を初めて示したと考えられている。
【０１３４】
実施例１１−抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６による受動免疫は細菌の伝播を有意に低下させる
膿瘍の形成は、感染の重症度の別の指標である。形成した膿瘍の数を、実施例１０で試験したのと同じマウスで測定した。組織学的部分をオレンジＧ／アルシアンブルー（ＡＢＧ／ＯＨ）で染色すると、膿瘍を、非染色領域により区切られた炎症性宿主細胞の円形領域として表し、場合によっては中心に濃い赤色で染色された病巣を表す。通常、病巣はブドウ球菌膿瘍コミュニティ（ＳＡＣ）である。炎症細胞は好中球であり、殆どは中心付近で死んでおり、かつ殆どは周辺部で生きており、非染色領域はフィブリンから形成されるカプセルである。未治療のマウスでは、複数の膿瘍が形成し（図８Ａ）、脛骨１つあたり、平均でおよそ４．５個であった（図８Ｃ）。対照的に、ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６で治療したマウスでは、平均わずか２個の膿瘍であり、抗Ｇｍｄ  ｍＡｂ  １Ｃ１１または組み合わせで治療したマウスも同様であった（図８Ｂ、８Ｃ）。
【０１３５】
実施例１２−抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６のみ、または抗Ｇｍｄ  １Ｃ１１との組み合わせによる受動免疫は、無菌性膿瘍の形成を促進し、骨の治癒を加速させる
図８Ｂに表される同じ組織学的部分の詳細な調査は、予想しない発見をもたらした。一貫して、髄内のグラム染色膿瘍は、ＰＢＳで治療したマウスの脛骨で発見されたのみであった（図９Ａ−Ｂ）が、抗Ａｔｌで治療したマウスの脛骨における損傷は、グラム陽性細菌を含有しない無菌性膿瘍の特徴を有していた（図９Ｃ−Ｈ）。更に、プラシーボ治療のマウスの脛骨における損傷は、ブドウ球菌膿瘍コミュニティ（ＳＡＣ）のはっきりとした組織学的特徴を有していた（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａｂｓｃｅｓｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｈｏｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，"ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２３（１０）：３３９３−３４０４（２００９）；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏａｇｕｌａｓｅｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，"ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ６（８）：ｅ１００１０３６（２０１０）、それらそれぞれの全体が参照として本明細書に組み込まれている）が、抗Ａｔｌ治療マウスの脛骨には、ＳＡＣは見られなかった（図１０Ａ−Ｂと図１０Ｃ−Ｈを比較）。最終的に、そして最も驚くべきことに、抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄを組み合わせた受動免疫は、１４日目にＭＲＳＡ感染を消す（３日目に代謝活性であることが確認された）（図７Ａ）だけでなく、インプラントが関係する骨髄炎を有するこのマウスモデルでは決して発生することが確認されなかった骨の治癒も可能にした（図１１Ａ−Ｃを比較）ことが判明した。具体的には、黄色ブドウ球菌で汚染されたインプラントの骨との一体化は図１１Ｂに記録されており、これは、無菌ピン対照（図１１Ｃ）に見られる、ピン及び毛皮質周辺での新しい骨の形成と同等の程度を表している。アルギナーゼ−１陽性染色を使用して、組織を治癒するＭ２マクロファージの有無もまた分析した。ＰＢＳで治療したマウス（図１１Ｄ）の脛骨にＳＡＣを入れることができないＭ２マクロファージは、抗Ａｍｄと抗Ｇｍｄを組み合わせて治療したマウスの脛骨にある無菌性膿瘍全体に侵入し、従来の組織治癒を促進した（図１１Ｅ）（Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ，"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｓｕｂｓｅｔｓ，"Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（１１）：７２３−７３７（２０１１）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）。
【０１３６】
実施例１３−ヒト化抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ１．６の作製
Ａｍｄ１．６抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を、プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、Ｔｉｌｌｅｒらにより説明されているヒト抗体発現ベクター（"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，"  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−２）：１１２−２４（２００８）、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）の中へのクローニングを可能にする。Ａｍｄ１．６軽鎖及び重鎖可変領域、並びにヒトκ及びＩｇＧ１定常領域を含有するプラスミドを作製し、ＨＥＫ２９３細胞内に同時にトランスフェクションする。３日後、培地を細胞から除去し、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＧの存在、及び固定化したＡｍｄタンパク質をアッセイする。結合した抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン基質に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出する。
【０１３７】
ヒト：マウスキメラＡｍｄ１．６が親マウスＡｍｄ１．６と同様にＡｍｄと反応したことを証明するために、Ｈｉｓ−Ａｍｄの酵素活性を阻害する能力について、それぞれを試験する。
【０１３８】
ヒト化Ａｍｄ１．６抗体を、主に関節全置換術を受けた高齢の（６５歳を超える）患者の第Ｉ相臨床試験で使用することができる。ヒト化Ａｍｄ１．６抗体は、単独で、及び特許出願公報第２０１３０１１０２４９号（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているヒト化１Ｃ１１抗Ｇｍｄ抗体と組み合わせて使用する。
【０１３９】
実施例１４−ヒト化抗Ａｍｄ  ｍＡｂ  Ａｍｄ２．１の作製
Ａｍｄ２．１抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を、プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、Ｔｉｌｌｅｒら（"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，"  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（１−２）：１１２−２４（２００８）により説明されているヒト抗体発現ベクター、その全体が参照として本明細書に組み込まれている）の中へのクローニングを可能にする。Ａｍｄ２．１軽鎖及び重鎖可変領域、並びにヒトκ及びＩｇＧ１定常領域を含有するプラスミドを作製し、ＨＥＫ２９３細胞内に同時にトランスフェクションする。３日後、培地を細胞から除去し、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＧの存在、及び固定化したＡｍｄタンパク質をアッセイする。結合した抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及び３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン基質に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して検出する。
【０１４０】
ヒト：マウスキメラＡｍｄ２．１が親マウスＡｍｄ２．１と同様にＡｍｄと反応したことを証明するため、Ｈｉｓ−Ａｍｄの酵素活性を阻害する能力について、それぞれを試験する。
【０１４１】
ヒト化Ａｍｄ２．１抗体を、主に関節全置換術を受けた高齢の（６５歳を超える）患者の第Ｉ相臨床試験で使用することができる。ヒト化Ａｍｄ２．１抗体は、単独で、及び特許出願公開第２０１３０１１０２４９号（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）に記載されているヒト化１Ｃ１１抗Ｇｍｄ抗体と組み合わせて使用する。
【０１４２】
好ましい実施形態を本明細書において詳細に記述及び記載したが、関連分野の当業者には、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更、追加、置換等を行うことができ、したがってこれらは、以下に続く特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内であると考えられることが明らかとなるであろう。
【図１】
2019196353.tif 000086
【図２】
2019196353.tif 000087
【図３】
2019196353.tif 000088
【図４】
2019196353.tif 000089
【図５】
2019196353.tif 000090
【図６】
2019196353.tif 000091
【図７】
2019196353.tif 000092
【図８】
2019196353.tif 000093
【図９】
2019196353.tif 000094
【図１０】
2019196353.tif 000095
【図１１】
2019196353.tif 000096
【配列表】
2019196353000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月21日(2019.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染を治療するための、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む組成物であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含む、前記組成物。
【請求項２】
骨髄炎を治療するための、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む組成物であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含む、前記組成物。
【請求項３】
整形外科用インプラントを導入するための、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む組成物であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含む、前記組成物。
【請求項４】
整形外科用インプラントを必要とする患者に投与するための医薬の製造における、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含む、前記使用。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌感染を有する患者に投与するための医薬の製造における、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含み、該投与が黄色ブドウ球菌感染の治療のために有効である、前記使用。
【請求項６】
黄色ブドウ球菌の骨髄炎、骨または関節での感染を有する患者に投与するための医薬の製造における、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用であって、該ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、ブドウ球菌属種自己溶解素Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（Ａｍｄ）の触媒ドメインに特異的に結合し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のＶＨドメインの相補性決定領域配列とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のＶＬドメインの相補性決定領域配列とを含み、該投与が骨髄炎の治療のために有効である、前記使用。