(57)【要約】【課題】バイオ燃料の原料となり得るトリアシルグリセロールの生産性が向上した微細藻類遺伝子組換え株及びトリアシルグリセロールの生産方法を提供する。【解決手段】本発明は、シロイヌナズナで報告された葉緑体内膜タンパク質FAX1（AtFAX1）と相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた微細藻類遺伝子組換え株であって、野生株と比較してトリアシルグリセロール蓄積量が向上しており、前記FAX1タンパク質はAtFAX1と少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質である、微細藻類遺伝子組換え株に関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
FAX1タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた微細藻類遺伝子組換え株であって、野生株と比較してトリアシルグリセロール蓄積量が向上しており、前記FAX1タンパク質は配列番号１に示すシロイヌナズナ由来の葉緑体内膜局在タンパク質AtFAX1と少なくとも２５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質である、微細藻類遺伝子組換え株。
【請求項２】
前記微細藻類が、イデユコゴメ科に属する紅藻である請求項１記載の微細藻類遺伝子組換え株。
【請求項３】
前記微細藻類が、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）であることを特徴とする請求項１記載の微細藻類遺伝子組換え株。
【請求項４】
前記FAX１タンパク質をコードする遺伝子の導入がセルフクローニングであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微細藻類遺伝子組換え株。
【請求項５】
前記FAX1タンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の微細藻類遺伝子組換え株。 
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列の第1番目〜第172番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列の第1番目〜第172番目のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換，欠失，挿入，及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質
【請求項６】
前記FAX1タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列の第1番目〜第516番目の塩基配列
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列の第1番目〜第516番目の塩基配列において、１又は数個の塩基が置換，欠失，挿入，及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微細藻類遺伝子組換え株を培養する工程を含む、トリアシルグリセロールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ燃料の原料となり得るトリアシルグリセロールの生産性が向上した微細藻類遺伝子組換え株及びトリアシルグリセロールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料の枯渇や環境への影響等の問題から、代替燃料への期待が高まっている。代替燃料の１つとして期待されるバイオ燃料は、輸送用燃料の代替物としての利用が可能なエネルギー資源である。特に、光合成生物由来バイオ燃料の利用は、概念的に大気中の二酸化炭素量を増加させることがなく、カーボンニュートラルとして扱われる。二酸化炭素が地球温暖化の主因とされることを念頭に置くと、バイオ燃料利用は地球温暖化の防止にも微力ながら寄与することができる。植物由来バイオ燃料の例としてサトウキビ、トウモロコシ等を原料としたバイオ燃料の生産が行われているが、これらは食品としても利用されるため競合による価格高騰や倫理面が問題となる。その問題へのアプローチとしてジャトロファ等の非可食性植物を用いたバイオ燃料研究も進んでいるが、高コストという問題に加え、食糧のための耕地と競合するという問題が指摘されている。これらの問題意識を背景として近年、欧米を含む世界中で微細藻類由来バイオ燃料の研究が進められている。微細藻類は植物と比較して、成長が早く、単位面積当たりの油脂生産量が10倍以上高い利点がある。さらに耕地不適応の土地でも太陽光が得られれば培養が可能であるため、植物用耕地を使用せずに済む利点もある。
【０００３】
微細藻類の一種であるCyanidioschyzon merolae （以下、「シゾン」とする）はイタリア原産、硫酸酸性の温泉に棲息する単細胞性の紅藻（真核藻類）である。一般的な真核細胞では、一つの細胞の中に沢山のミトコンドリアや葉緑体が含まれているが、シゾンは細胞中にミトコンドリアと葉緑体が一つずつしかない。細胞が増殖する際には、細胞の中でまず葉緑体が二つに増え、次にミトコンドリア、最後に核が複製し、二分裂する細胞に一つずつ分配される。このような細胞の特徴は、核とオルガネラ間の相互作用の解析に非常に便利であり、理想的な研究材料となっている。核、ミトコンドリア、葉緑体のそれぞれのゲノムDNAの配列構造が完全解読され、核遺伝子の特異的破壊も可能となったため、今後の細胞生物学のモデル系として大きな期待が寄せられている。シゾンに含まれる脂質にはトリアシルグリセロール（Triacylglycerol、以下「TAG」とする）が多く含まれており、軽油等のバイオ燃料原料として注目されている。
【０００４】
トリアシルグリセロールは３つの脂肪酸がグリセロ骨格に結合した中性脂質であり、したがってトリアシルグリセロールの生合成のためには脂肪酸種の供給が必須である。しかしながら、植物細胞において葉緑体で合成された脂肪酸がトリアシルグリセロール合成をおこなうために小胞体へと輸送されるメカニズムは未解明な部分が多く残されている。高等植物であるシロイヌナズナにおいて葉緑体内膜タンパク質FAX1（AtFAX1）が葉緑体からの脂肪酸輸送に関与しており、過剰発現は細胞内のトリアシルグリセロール蓄積をもたらすことが報告されていたが（非特許文献１）、微細藻類において同様の機能を有するタンパク質の報告はなかった。
【０００５】
シゾンを含む藻類のTAG蓄積量を向上させるため、窒素含有培地において赤色光照射環境下または青色光照射環境下で藻類を培養する工程を含むTAG高生産藻類の生産方法が報告されていた（特許文献１）。しかしながら、この方法では赤色光もしくは青色光を照射するための特別な照明設備が必要であり、設備費、照明の電気代等のコスト負担を考えると、産業利用するためには現実的に困難である。
このような状況下において、低コストで藻類のTAG蓄積量を向上させる技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６-２９９０１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nannan Li, Irene Luise Gugel, Patrick Giavalisco, Viktoria Zeisler, Lukas Schreiber, JurgenSoll, Katrin Philippar(2015) FAX1, a Novel Membrane Protein Mediating Plastid Fatty Acid Export. PloS Biol. 13:e1002053 10.1371/journal.pbio.1002053
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微細藻類は細胞内に脂質を蓄積するが、その脂質をバイオ燃料として利用するためにはさらなる蓄積量の向上が求められる。一方で、一般的に脂質の蓄積と細胞の増殖はトレードオフの関係があり、窒素欠乏培養等のストレス環境下で培養した微細藻類は、脂質含有率は増加するが増殖速度は低下することが知られている。
【０００９】
本発明は、微細藻類の増殖速度を維持しながら脂質の蓄積量を向上させる微細藻類の遺伝子組換え株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討の結果、シロイヌナズナで報告された葉緑体内膜タンパク質FAX1（AtFAX1）と相同性のあるタンパク質をコードする遺伝子を微細藻類のゲノムから特定し、その遺伝子を微細藻類内で過剰発現させることでTAGの蓄積量が増加することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供する。
（１）FAX1タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させた微細藻類遺伝子組換え株であって、野生株と比較してトリアシルグリセロール蓄積量が向上している。前記FAX1タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示すシロイヌナズナ由来の葉緑体内膜局在タンパク質AtFAX1と少なくとも２５％の配列同一性を有し、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質である。
（２）前記微細藻類が、イデユコゴメ科に属する紅藻である（１）に記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（３）前記微細藻類が、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）であることを特徴とする（１）記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（４）前記FAX1タンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子組換え株自身のゲノムに内在する遺伝子であることを特徴とする（１）〜（３）に記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（５）前記FAX1タンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列の第1番目〜第172番目のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列の第1番目〜第172番目のアミノ酸配列において、１又は数個（例えば、２以上１０未満）のアミノ酸が置換，欠失，挿入，及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質
（６）前記FAX1タンパク質をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列を含むことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の微細藻類遺伝子組換え株。
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列の第1番目〜第516番目の塩基配列
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列の第1番目〜第516番目の塩基配列において、１又は数個（例えば、２以上１０未満）の塩基が置換，欠失，挿入，及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸の膜透過機能を有するタンパク質をコードする塩基配列
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の微細藻類遺伝子組換え株を培養する工程を含む、トリアシルグリセロールの生産方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、通常培養条件、窒素欠乏培養条件共にトリアシルグリセロールが高蓄積する微細藻類遺伝子組換え株を作製することができる。
トリアシルグリセロールの蓄積と微細藻類の細胞増殖には一般的にトレードオフの関係があり、トリアシルグリセロール高蓄積株ではしばしば増殖が遅延するが、本発明の微細藻類遺伝子組換え株は通常培養条件において増殖の遅延は起こらない。
さらに、本発明の微細藻類遺伝子組換え株のクロロフィル量は野生株より少なく、光を透過しやすいため、より深部の細胞まで光が届きやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】AtFAX1タンパク質とCMA070Cタンパク質のアミノ酸配列のアラインメント比較を示す図である。
【図２】CmFAX1遺伝子を発現させた酵母相補実験の結果を示す図である。
【図３】CmFAX1遺伝子過剰発現シゾン株のTAGの顕微鏡観察写真である。
【図４】通常培養条件におけるシゾンの吸光度を測定した増殖曲線を示すグラフである。
【図５】通常培養条件におけるシゾンの細胞数を測定した増殖曲線を示すグラフである（グラフ中の数値は、CmFAX1 ox/Controlである）。
【図６】シゾンのコントロール株（野生株）とCmFAX1遺伝子過剰発現株の通常培養条件における乾燥重量あたりのTAG蓄積量を示すグラフである。
【図７】シゾンの細胞数あたりのクロロフィル量を比較したグラフである。
【図８】シゾンのコントロール株（野生株）とCmFAX1遺伝子過剰発現株の窒素欠乏培養条件における乾燥重量あたりのTAG蓄積量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、バイオ燃料の原料となり得るトリアシルグリセロール（Triacylglycerol、以下「TAG」とする）の生産性が向上した微細藻類遺伝子組換え株及びTAGの生産方法に関する。以下、本発明に係る微細藻類遺伝子組換え株の作製方法およびTAGの生産方法について、詳細に説明する。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００１５】
本発明において、微細藻類とは、酸素発生型光合成を行う微生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物および多細胞生物である海藻類を除いたものの総称である。すなわち、真正細菌であるシアノバクテリア（藍藻）から、真核生物で単細胞生物であるもの（珪藻、黄緑藻、渦鞭毛藻など）など、進化的に異なるグループを含む。酸素非発生型光合成を行う硫黄細菌などの光合成細菌は微細藻類に含まれない。一方、ラビリンチュラ類ヤブレツボカビ目ヤブレツボカビ科のオーランチオキトリウム属に属する微生物は葉緑体を持たず光合成をしない従属栄養生物であるが、シゾキトリウム属から分離・再編されてできた属であるため、系統学的には微細藻類に分類される。
【００１６】
本発明における微細藻類は、脂質を合成・蓄積する藻類であればよく、具体的には藍色植物門（Cyanobacteria）、緑藻植物門（Chlorophyta）、ユーグレナ植物（Euglenophyta）、不当毛植物門（Heterokontophyta）、紅色植物門（Rhodophyta）等を挙げることができ、好ましくは紅色植物門（Rhodophyta）イデユコゴメ亜門（Cyanidiophytina）イデユコゴメ綱（Cyanidiophyceae）イデユコゴメ目（Cyanidiales）イデユコゴメ科（Cyanidiaceae）に属する、シアニディオシゾン属（Cyanidioschyzon）、シアニジウム属（Cyanidium）、ガルデリア属（Galdieria）を挙げることができる。
【００１７】
＜イデユコゴメ科に属する紅藻＞
紅藻とは、紅色植物門に属する藻類をいう。本明細書では、特にイデユコゴメ科に属する藻類のことを狭義の意味で紅藻と呼ぶ。高温酸性の環境を好む温泉藻で、至適生育条件は温度42℃、pH2.5である。
【００１８】
本発明にはイデユコゴメ科に属するいずれの紅藻を用いてもよいが、たとえばシアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）等のシアニディオシゾン属の紅藻、シアニジウム・カルダリウム（Cyanidium caldarium）等のシアニジウム属の紅藻、ガルデリア・スルフラリア（Galdieria sulphuraria）等のガルデリア属の紅藻、およびこれらの変異株および形質転換体、ならびに一以上のこれらの組み合わせを用いることができる。
【００１９】
また、シアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）については、独立行政法人  国立環境研究所  微生物系統保存施設に株番号NIES-3377として寄託されたシアニディオシゾン・メローラエ 10D株を用いてもよいし、自然環境から単離したシアニディオシゾン・メローラエを用いてもよい。
イデユコゴメ科に属する紅藻は、細胞内に「油滴」と呼ばれる細胞小器官を有し、その中に脂質を蓄積する。本発明のCmFAX1遺伝子過剰発現株を用いて紅藻を培養することにより、油滴の数、体積、または油滴の数および体積が増加し、紅藻の細胞内に脂質が大量に蓄積される。
【００２０】
遺伝子組換えとは、遺伝子を人工的に操作する技術を指し、特に生物の自然な生育過程では起こらない人為的な型式で行うことを意味している。遺伝子導入や遺伝子組換えなどの技術で生物に遺伝子操作を行う事を一般に指す。遺伝子組換え技術としては、外来DNAをポリエチレングリコール（PEG）の浸透圧による作用にて導入するPEG法を用いても良いし、電気パルスで細胞膜に孔をあけ物質を導入する電気穿孔法（Electroporation）を用いても良いし、金やタングステンなどの金属の微粒子にDNAをコーティングしたものを弾丸として高速で射出して細胞内にDNAを導入するパーティクル・ガン法を用いても良いし、土壌細菌のアグロバクテリウムを利用したアグロバクテリウム法を用いても良い。また、TALEN（タレン）、CRISPR/Cas9（クリスパー・キャスナイン）等の部位特異的なヌクレアーゼを利用して、思い通りに標的遺伝子を改変するゲノム編集技術も本明細書における遺伝子組換えに含まれる。
【００２１】
セルフクローニングとは、組換えDNA技術によって最終的に宿主に導入されたDNAが、当該宿主と分類学上同一の種に属する微生物のDNAのみであるものをいう。宿主本来の遺伝子とは異なる外来の遺伝子を導入する遺伝子組換えは、自然界では起こり得ない変異を引き起こすため、人体に害をもたらすような予期せぬ効果が起こる可能性や、導入した外来遺伝子が周辺環境に拡散するリスクがあり問題視される。一方、セルフクローニングは宿主自身の遺伝子を導入するため、自然界でも遺伝子の交換が起こり得る（ナチュラルオカレンス）。そのため、セルフクローニングはカルタヘナ議定書やカルタヘナ法上の条文上では規制対象外とされており、外来遺伝子の導入に比べて比較的商業利用し易い。
【００２２】
＜CmFAX1タンパク質の同定＞
C. merolae（；シゾン）データベース（http://merolae.biol.s.u-tokyo.ac.jp/）において、シロイヌナズナ由来のAtFAX1タンパク質（Nannnan et al., 2015）とアミノ酸配列の同一性で２５％を示すタンパク質をコードする遺伝子CMA070Cを同定し、CmFAX1と命名した。CmFAX1タンパク質（CMA070C）とAtFAX1タンパク質のアミノ酸配列のアラインメント比較を行った結果を図１に示す。
【００２３】
＜酵母相補実験＞
CmFAX1タンパク質のコード配列のうち葉緑体移行ペプチドと予測（ChloroP 1.1 Prediction Server - DTU CBS）された部分を除いた配列を、酵母発現プラスミドp416-GPDにクローニングし、酵母変異株fat1へと形質転換した(Murberg et al., 1998, Zou et al., 2003)。0.1％（w / v）グルコース、0.7％（w / v）酵母窒素ベースを含有する合成画分培地（SD-uracil）に、3.6 mMのα-リノレン酸（0.1％、エタノール中w / v）および1％テルチトールを添加したSD-Uraプレート（2％ Agar）上に異なる希釈液で2μlの酵母培養液滴をスポットし、30℃で6日間培養した。結果を図２に示す。
【００２４】
脂肪酸取り込み能が欠如した酵母変異株fat1は酵母において致死性を示す脂肪酸種（α-リノレン酸）の存在下でも生育することができたが、この酵母変異株でCmFAX1遺伝子を発現させた株はα-リノレン酸存在下で生育できなかった。このことからCmFAX1タンパク質が脂肪酸の膜透過機能を有することが明らかとなった。植物細胞において、脂肪酸の合成は葉緑体でなされ、トリアシルグリセロールなどの中性脂質やリン脂質の合成は小胞体でなされる。この位置関係を考えるとFAX1タンパク質の機能は葉緑体内部からの脂肪酸の排出に関わっていることが考えられる。
【００２５】
＜CmFAX1遺伝子過剰発現シゾン株の構築＞
CmFAX1タンパク質をコードする遺伝子CMA070CのOpen Reading Frame領域を、シゾンにおける過剰発現ベクターpSUGA (Fujii et al., 2013)にクローニングし、pSUGA-CmFAX1ベクターを作製した。pSUGA-CmFAX1ベクター5 μgを用いて、シゾンのT１株に形質転換を行なった（Taki et al., 2015, Ohnuma et al., 2008）。対照区として、pSUGAベクター5 μgを用いて、シゾンのT１株に形質転換を行った。形質転換株からDNAを抽出し、導入したプラスミドベクターに特異的なプライマーを用いたPCRを行い、形質転換が起きていることを確認した。また形質転換体からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットを行うことで、形質転換株がCmFAX1遺伝子の過剰発現株であることを確認した。
【実施例】
【００２６】
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
各実験において、試薬は特に記載の無い限り、市販の特級試薬を用い、その他の材料及び装置は、文中に記載した。
【００２７】
＜材料及び方法＞
シゾン細胞として独立行政法人  国立環境研究所  微生物系統保存施設に寄託された株番号NIES-3377のシアニディオシゾン・メローラエ（Cyanidioschyzon merolae）10D株を元に遺伝子組換えを行ったCmFAX1遺伝子過剰発現株（以下、「過剰発現株」とする）と、対照区であるpSUGAベクター形質転換株（以下、「対照株」とする）の２株を用いて培養実験を行った。本明細書において、「通常培養条件」とはMA2培地を用いた培養条件のことをいい、「窒素欠乏培養条件」とは、MA2培地から窒素源である(NH4)2SO4の代わりにNa2SO4を添加した窒素欠乏培地を用いた培養条件のことをいう。
【００２８】
MA2培地の組成
40 mM (NH4)2SO4 * 窒素欠乏培地の場合はこれを40 mM Na2SO4に変える。
4 mM MgSO4・7H2O
8 mM KH2PO4
1 mM CaCl2
0.1 mM FeCl3
0.08 mM Na2EDTA
A6 minor salt 4 mL
H2SO43 mL
H2O up to 1 L
【００２９】
A6 minor saltの組成
H2BO3 2.85 g
MnCl2・4H2O 1.8 g
ZnCl2 0.105 g
Na2MoO4・2H2O 0.39 g
CoCl2・6H2O 0.04 g
CuCl2 0.043 g
H2O up to 1 L
【００３０】
（シゾンの独立栄養培養）
白色蛍光灯光源を用いて光量100 μmol/(m2・sec)を照射し、試験管に入れたMA2培地もしくは窒素欠乏培地50 ｍｌにシゾン細胞をO.D.750=0.1となるよう添加した。培養は42℃、連続明条件下で行った。培養は最大３５０時間行い、１日に１回、細胞濁度と細胞数の計測を行った。
【００３１】
（細胞濁度の計測と細胞数の計測）
細胞培養液を1 mL分取し、分光光度計（Beckman Coulter DU700）を用いて波長750 nmを計測した。細胞数の計測は、C-Chip (LMS)を用いて、顕微鏡による実測を行なった。改良ノイバウエル区画の一番大きな区画内の細胞数を計測した。各サンプルごとに16箇所において計測を行い、それらの平均を各サンプルの細胞数とした。
【００３２】
（トリアシルグリセロール（TAG）の定量）
培養開始後72時間におけるO.D.750＝0.5の細胞培養液100 mLから細胞を遠心分離により回収し、凍結乾燥した。滅菌水を600 μlとchloroform : methanol = 1:2溶液を3 ml加え、45min静置した。遠心分離をしたのち、上清を別の試験管に回収し、残ったペレットにchloroform : methanol = 1:2溶液を3 ml、1% KClを800 μl加え再度遠心した。上清を回収し、集めた上清にChloroformを2 ml、1% KClを1.2 ml加え、遠心した。下層を別の試験管に移し、N2ガスにて完全に乾燥させたのち、chloroform : methanol = 2:1溶液で溶解した後、TLCプレートを用いて脂質を分画した。展開溶媒はhexane: dietyl ester: acetiuc acid=160: 40: 4であった。分画後のTLCプレートにおけるTAGの位置を取得し、1 mM pentadecanoic acid (SIGMA)を100 μl、metanol-HCl（WAKO）を500 μl加え、85°Cにて1h静置した。その後、ヘキサンにて脂肪酸種を抽出したのち、再度N2ガスにて乾燥させ、60 μlのヘキサンに溶解した。この試料をGC-FID（SHIMAZU GC-2014）にて解析した（Imamura et al., 2015）。
【００３３】
（クロロフィルの定量）
シゾンにはクロロフィルbが存在しないため、クロロフィルaのみを定量した。培養したシゾンの細胞溶液1 mLをとり、遠心分離により細胞を回収した。100 mLの蒸留水で細胞を懸濁し、400 mLの100 % acetoneを加え1分間Voltexにて撹拌した。その後15,000 rpmにて遠心し、上清を回収した。沈殿に1 mLの80 % acetoneを加え再度Voltexし、遠心したのち上清を回収した。この操作を繰り返し、上清の色が無色透明になるまで行なった。回収した上清の、波長663 nmにおける吸光度（A663）、647 nmにおける吸光度（A647）、750 nmにおける吸光度（A750）を測定し、以下の式に当てはめることでクロロフィル量を算出した (Porra et al., 1989)。
【００３４】
クロロフィルa = 12.25 × (A663 - A750) - 2.55 × (A647 - A750)
【００３５】
＜実験結果＞
（実験１  通常培養条件）
過剰発現株と対照株の培養実験を、上記の通常培養条件で行った。図３は、CmFAX1遺伝子過剰発現シゾン株及び対照区であるpSUGAベクター形質転換株（対照株）のTAGの顕微鏡観察写真である。細胞濁度の増殖曲線を図４に、細胞数の増殖曲線を図５にそれぞれ示す。本実験の結果、細胞濁度の増殖曲線は過剰発現株と対照株で差がないことがわかった（図４）。一方、細胞数の増殖曲線をみると、過剰発現株の方が対照株と比較して１．６２倍〜２．４１倍細胞数が多いことがわかった（図５）。
【００３６】
通常培養条件下で培養した過剰発現株と対照株の培養72時間におけるTAG蓄積量を測定した。得られたTAG蓄積量の測定値を乾燥重量あたりの値に換算した結果を図６に示す。過剰発現株は、通常培養条件においてもTAGの蓄積量が対象株に比べて２．９８倍程度（約３倍）上昇した。
【００３７】
通常培養条件下で培養した過剰発現株と対照株の培養72時間におけるクロロフィル量を測定した。得られたクロロフィル量の測定値を細胞数あたりの値に換算した結果を図７に示す。過剰発現株において、一細胞あたりのクロロフィル量が対照株と比べて約37 %低下していた。
【００３８】
（実験２  窒素欠乏培養条件）
過剰発現株と対照株の培養実験を、上記の窒素欠乏培養条件で行った。培養時の増殖曲線は省略する。窒素欠乏培養条件下で培養した過剰発現株と対照株の培養72時間におけるTAG蓄積量を測定した。得られたTAG蓄積量の測定値を乾燥重量あたりの値に換算した結果を図８に示す。過剰発現株は、TAGを蓄積する条件である窒素欠乏状態に晒すと、TAG蓄積量が対象株と比較して１．８６倍（約２倍）に上昇していた。
【００３９】
＜考察＞
TAG蓄積と細胞増殖にはトレードオフの関係があり、TAG蓄積時には細胞増殖が遅滞することがあるが、過剰発現株では細胞増殖は抑制されなかった。むしろ対数増殖期の過剰発現株の細胞数は対照株と比較して１．６２倍〜２．４１倍に上昇していたことから、過剰発現株はTAG蓄積と細胞増殖が両立して起こることが示唆された。
【００４０】
大量培養では、細胞自身のクロロフィルの影響で、光透過阻害が起きることで下層の細胞に光が届きにくくなり増殖抑制が生じる。しかしながらCmFAX1遺伝子過剰発現株はクロロフィルの低下が見られたことから、光透過阻害を起こしにくく、下層の細胞の増殖を抑制しにくいことが考えられる。実際に、対数増殖期において過剰発現株の細胞数が対象株と比べて増加したことは、クロロフィルの低下によって細胞全体に効率的に光が届いた結果、生じているのかもしれない。細胞増殖が減衰しない状態で、TAG高蓄積するという点から、本研究の成果（FAX1遺伝子の過剰発現）はバイオ燃料生産のためのツールとして有力であると考えられる。
【００４１】
シゾンは真核生物として最も単純な細胞構造を有しており、進化的な視点からも真核細胞に葉緑体が共生して植物細胞の祖先が誕生した直後の形態を保持していると考えられている(Kuroiwa et al., 1998)。FAX1遺伝子が原始的なシゾンと高等植物シロイヌナズナで同定されたことにより、FAX1遺伝子自体が緑藻など植物細胞に広く保存されていることが推測される。従って、他の藻類においてもFAX1遺伝子の過剰発現によりTAG高蓄積が実現できる可能性がある。現在バイオ燃料開発の分野では様々な藻類を用いた研究が展開されており、それらの実験モデル生物のゲノム情報も急速に明らかにされつつある。これらのことから、本発明はバイオ燃料開発研究の分野に広く影響を与えうるものであると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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