(57)【要約】      （修正有）【課題】安全かつ簡便な方法で、高純度のＬ−カルノシンを製造する方法。【解決手段】式（１）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法であって、前記保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることを特徴とする、保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法。前記保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことによる、Ｌ−カルノシンの製造方法。2019135220.tif 000027［式中、Ｒ１は、特定の構造を有する保護アミノエチル基；Ｒ２、Ｒ３は、水素、又はアミノ基の保護基；Ｒ４は、水素、又はカルボキシル基の保護基。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2019135220.tif 000020
｛式中、Ｒ１は、下記式（１ａ）で示される基、
【化２】
2019135220.tif 000021
（式中、Ｒ５は、アミノ基の保護基である。）
および下記式（１ａ’）で示される基
【化３】
2019135220.tif 000022
から選ばれる保護アミノエチル基であり、
Ｒ２、Ｒ３は水素原子、またはアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水素原子、またはカルボキシル基の保護基である。｝
で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法であって、
前記式（１）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることを特徴とする、保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記式（１）におけるＲ２，Ｒ３，Ｒ４が水素原子である請求項１記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法
【請求項３】
下記式（２）
【化４】
2019135220.tif 000023
｛式中、Ｒ１は、前記式（１）と同義であり、Ｒ６は、水酸基、ハロゲン原子、
および下記式（２’）
【化５】
2019135220.tif 000024
（式中、ｍは０又は１の整数であり、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれ、水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基であり、ｍが１である場合、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の少なくとも２つの基が炭素数１〜６のアルキル基である。）｝
で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体と、
下記式（３）
【化６】
2019135220.tif 000025
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は前記式（１）と同義である）
で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより前記式（１）記載の保護−Ｌカルノシン誘導体を得る請求項１又は２記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記式（２）で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体１モルに対し、前記式（３）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体を０．２５〜０．９９モル用いる請求項３記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した後、得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことにより、下記式
【化７】
2019135220.tif 000026
で示されるＬ−カルノシンを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ−カルノシン及びその誘導体の新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式
【０００３】
【化１】
2019135220.tif 000002
【０００４】
で示されるＬ−カルノシンは、組織修復促進作用、免疫調整作用、抗炎症作用を有していることから、医薬品や健康食品などの需要が高まっている。また、該Ｌ−カルノシンは、容易に金属とキレート結合をつくることから、亜鉛と錯形成したポラプレジンクなどの抗潰瘍薬、味覚障害治療薬へ応用されている。
【０００５】
Ｌ−カルノシンは、通常、以下の方法で合成されている。具体的には、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体と、シアノ酢酸エステルとを反応させる方法（例えば、特許文献１参照）、Ｌ−ヒスチジン又はその誘導体とＮ−トリフルオロアセチル誘導体とを反応させる方法（例えば、非特許文献１参照）、又は、Ｌ−ヒスチジン誘導体とＮ−フタロイル誘導体とを反応させる方法（特許文献２参照）が知られている。その他、Ｎ−カルベメート保護−カルボキシ無水物とＬ−ヒスチジンメチルエステルとをカップリングする方法（非特許文献２参照）も知られている。
【０００６】
しかしながら、前記従来方法では、以下の点で改善の余地があった。例えば、特許文献１に記載の方法では、比較的高温（例えば、１２０℃）で反応させても、反応収率の点で十分とは言えず、尚改善の余地があった。また、この方法では、シアノ基を有するＬ−カルノシン前駆体を、水素還元によって該シアノ基をアミノ基にするため、製造コストが比較的高くなる傾向にある点でも課題があった。
【０００７】
また、非特許文献１に記載の方法では、活性化剤としてニトロフェノールを使用しており、ニトロフェノールを除去するための精製工程が必要となり、後処理工程が煩雑になるという点で改善の余地があった。さらに、原料となるＮ−トリフルオロアセチル誘導体が高価であり、工業的な生産を考えると他原料での製造が望まれていた。
【０００８】
また、特許文献２の方法は、Ｎ−フタロイル−β−アラニンの酸クロライドと、保護基としてトリメチルシリル基を有するＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させるものである。該反応においては、該酸クロライドから副生する塩化水素により、該Ｌ−ヒスチジン誘導体のトリメチルシリル基の脱保護が生じ易く、多数の生成物が混在するため、精製が困難となる点、またトリメチルシリル基の脱保護を抑制させるためには、反応を厳密に制御しなければならない点で課題があった。
【０００９】
また、非特許文献２の方法では、Ｎ−カルベメート保護−カルボキシ無水物を合成するために多くの工程が必要であり、工程が煩雑になる点及び経済的な観点から尚改善の余地があった。
【００１０】
上記課題に鑑み本発明者らは、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させて保護Ｌ−カルノシン誘導体を検討した結果、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の酸無水物又は、Ｎ−保護β−アラニン誘導体とピバロイルクロライドとで得られる混合酸無水物とＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることで、高収率で保護Ｌ−カルノシン誘導体が得られることを見出した。
【００１１】
しかしながら、かかる方法においても、得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体中に未反応のＮ−保護−β−アラニン誘導体等が残存しており、かかるＮ−保護−β−アラニン誘導体は、保護Ｌ−カルノシン誘導体からＬ−カルノシンを製造する過程において、β−アラニンへと変換されており、Ｌ−カルノシンから、β−アラニン等の不純物を取り除くことが困難であることを見出した。特にＬ−ヒスチジン誘導体が高価であることから、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体を過剰に使用した場合には多量のＮ−保護−β−アラニン誘導体が含有することから、該Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の除去するための精製方法の確立が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００１／６４６３８号パンフレット
【特許文献２】中国公開公報ＣＮ１０１２８４８６２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｒｕｓｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７，  ７  ７（９），  １５７６
【非特許文献２】Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１０，７５，７１０７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
Ｌ−カルノシンは、前記の通り、医薬品にも適用されており、その適用範囲は広い。そのため、なるべく安全かつ簡便な方法で、純度よく製造することができれば、その工業的利用価値はさらに高くなる。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、安全かつ簡便な方法で、高純度のＬ−カルノシンを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。その結果、保護Ｌ−カルノシン誘導体が酸性水溶液に可溶であるのに対し、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物は酸性水溶液に対する溶解性が極めて低く、有機溶媒に可溶であるという知見を得た。そこで保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造後の精製方法について検討を進めた結果、保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液を得た後、該酸性水溶液と有機溶媒を接触させることで、高純度の保護Ｌ−カルノシン誘導体が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、下記式（１）
【００１８】
【化２】
2019135220.tif 000003
【００１９】
｛式中、Ｒ１は、下記式（１ａ）で示される基、
【００２０】
【化３】
2019135220.tif 000004
【００２１】
（式中、Ｒ５は、アミノ基の保護基である。）
および下記式（１ａ’）で示される基
【００２２】
【化４】
2019135220.tif 000005
【００２３】
から選ばれる保護アミノエチル基であり、
Ｒ２、Ｒ３は水素原子、またはアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水素原子、またはカルボキシル基の保護基である。｝
で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法であって、
前記式（１）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることを特徴とする、保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法である。
【００２４】
本発明は以下の様態をとることができる。
【００２５】
（１）前記式（１）におけるＲ２，Ｒ３，Ｒ４が水素原子であること。
【００２６】
（２）下記式（２）
【００２７】
【化５】
2019135220.tif 000006
【００２８】
｛式中、Ｒ１は、前記式（１）と同義であり、Ｒ６は、水酸基、ハロゲン原子、
および下記式（２’）
【００２９】
【化６】
2019135220.tif 000007
【００３０】
（式中、ｍは０又は１の整数であり、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、それぞれ、水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基であり、ｍが０である場合、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の少なくとも２つの基が炭素数１〜６のアルキル基である。）｝
で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体と、下記式（３）
【００３１】
【化７】
2019135220.tif 000008
【００３２】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は前記式（１）と同義である）
で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより前記式（１）記載の保護−Ｌカルノシン誘導体を得ること。
【００３３】
（３）前記式（２）で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体１モルに対し、前記式（３）で示されるＬ−ヒスチジン誘導体を０．２５〜０．９９モル用いること。
【００３４】
さらに、本発明の第２の発明は、上記方法により保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した後、得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことにより、下記式
【００３５】
【化８】
2019135220.tif 000009
【００３６】
で示されるＬ−カルノシンを製造する方法である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の製造方法によれば、該保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることで、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物を除去することが可能であり、高純度の保護Ｌ−カルノシン誘導体を取得できる。特に保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造において、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とピバロイルクロライドとで得られる混合酸無水物等、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体を活性化させる中間体を経由して保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した場合には、該中間体由来の不純物も副生するがこれらも本発明の製造方法において容易に除去できるため高純度の保護Ｌ−カルノシン誘導体を取得できる。上記のとおり本発明の製造方法によって得られる保護Ｌ−カルノシン誘導体は高純度であるため、さらなる精製操作を行うことなく、保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護を行うことにより、容易に高純度のＬ−カルノシンを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の製造方法は、下記式（１）
【００３９】
【化９】
2019135220.tif 000010
【００４０】
｛式中、Ｒ１は、下記式（１ａ）で示される基、
【００４１】
【化１０】
2019135220.tif 000011
【００４２】
（式中、Ｒ５は、アミノ基の保護基である。）
および下記式（１ａ’）で示される基
【００４３】
【化１１】
2019135220.tif 000012
【００４４】
から選ばれる保護アミノエチル基であり、
Ｒ２、Ｒ３は水素原子、またはアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水素原子、またはカルボキシル基の保護基である。｝
で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体（以下、単に「保護Ｌ−カルノシン誘導体」とも言う）を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることが特徴である。保護Ｌ−カルノシン誘導体が酸性水溶液に可溶であるのに対し、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物は酸性水溶液に対する溶解性が極めて低く、有機溶媒に可溶であるため、保護Ｌ−カルノシン誘導体を含有する酸性水溶液と有機溶媒とを接触させることによって、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物が有機溶媒に溶解されるため、その結果、酸性水溶液に溶解している保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度が向上するものと推測される。
さらに該方法で得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応を行うことにより、高純度なＬ−カルノシンを高収率で製造することができる。
以下、本発明の製造方法について詳細に説明する。
【００４５】
＜保護Ｌ−カルノシン誘導体＞
本発明の製造方法における、保護Ｌ−カルノシン誘導体とは前記式（１）で示される化合物である。前記式（１）において、Ｒ２、Ｒ３は水素原子、またはアミノ基の保護基である。ここで、本発明の製造方法におけるアミノ基の保護基とは、窒素原子上の水素に置換して所定反応中にアミノ基を不活性化する基であり、所定反応後、脱保護によりアミノ基が形成される基である。かかるアミノ基の保護基として特に制限はなく、公知の保護基を使用することができる。具体的には、メチル基、エチル基等のアルキル基、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基等のシリル系保護基、アセチル基、ベンゾイル基等のアシル基等が挙げられる。これらの中でも、製造コスト、反応速度の観点から、Ｒ２、Ｒ３は水素原子であることが最も好ましい。またＲ２、Ｒ３としてアミノ基の保護基を用いる場合には、酸性条件下で容易に脱保護されることから、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基等のシリル系保護基であることが好ましく、トリメチルシリル基を用いることが特に好ましい。
【００４６】
Ｒ４は水素原子、またはカルボキシル基の保護基である。ここで、本発明の製造方法におけるカルボキシル基の保護基とは、カルボキシル基の酸素に結合した水素に置換して、所定反応中にカルボキシル基を不活性化する基であり、所定反応後、脱保護により水酸基が形成される基である。かかるカルボキシル基の保護基として具体的には、メチル基、エチル基等のアルキル基、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基等のシリル系保護基、アセチル基、ベンゾイル基等のアシル基等が挙げられる。これらの中でも、製造コスト、精製のしやすさから、Ｒ４は水素原子であることが最も好ましい。またＲ４としてカルボキシル基の保護基を用いる場合には、酸性条件下で容易に脱保護されることから、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基等のシリル系保護基であることが好ましくい。特にトリメチルシリル基は、酸性条件下で容易に脱保護されるため、該保護Ｌ−カルノシン誘導体を精製後に、保護Ｌ−カルノシン誘導体におけるＲ２、Ｒ３、Ｒ４の脱保護反応を行う必要がないため、特に好適に使用することができる。
【００４７】
また本発明の製造方法に好適に使用できる保護Ｌ−カルノシン誘導体に特に制限はないが、上記保護Ｌ−カルノシン誘導体の中でも、製造コストの観点から、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の全てが水素原子である物が最も好ましい。
【００４８】
前記式（１ａ）において、Ｒ５は、アミノ基の保護基である。使用されるアミノ基の保護基としては特に制限はなく、アミノ酸のアミノ基の保護基として公知の保護基を使用することができる。かかる保護基として具体的には、前記Ｒ２、Ｒ３における保護基の他に、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、トリフルオロアセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、又はホルミル基等が挙げられる。
【００４９】
この中でも、脱保護反応が容易であるという観点から、ｔ−ブトキシカルボニル基、又は置換基を有してもよいベンジルオキシカルボニル基が好ましい。ベンジルオキシカルボニル基が有する置換基とは、ベンジルオキシカルボニル基のフェニル基が有する置換基である。該置換基としては、メチル基、メトキシ基、ハロゲン基、ニトロ基、ジメチルアミノ基が挙げられる。中でも、保護基の導入が容易である点、保護基導入剤の入手が容易である点から、非置換のベンジルオキシカルボニル基であることが、最も好ましい。
【００５０】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５はいずれも公知のアミノ基を制限なく使用できるが、得られる保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度を考慮すると、Ｒ５は、Ｒ２、Ｒ３とは異なった保護基であることが好ましく、製造コストの観点から、Ｒ２、Ｒ３は水素原子であることが好ましく、Ｒ５はベンジルオキシカルボニル基であることが好ましい。
【００５１】
上記保護Ｌ−カルノシン誘導体は、公知の方法によって製造すればよい。具体的には、前記特許文献、又は非特許文献に記載の方法や、Ｎ−保護−β−アラニン又はその誘導体とＬ−ヒスチジン又はその誘導体との縮合反応（カップリング反応）による製造方法等が挙げられる。上記縮合反応として具体的には、活性エステル法、（混合）酸無水物法、アジド法、Ｎ，Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール等のカップリング試薬を用いる方法等が挙げられる。これらの縮合反応の中でも、使用する試薬が安価で高収率で保護Ｌ−カルノシン誘導体が得られることから、（混合）酸無水物法により保護Ｌ−カルノシン誘導体により製造することが好ましい。（混合）酸無水物法により保護Ｌ−カルノシン誘導体により製造する方法については後述する。
【００５２】
＜酸性水溶液＞
本発明の製造方法における酸性水溶液としては、該水溶液のｐＨが酸性であればよいが、得られる前記保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度を考慮すると、前記酸性水溶液のｐＨを０〜４の範囲とすることが好ましく、特に１〜３の範囲にすることがさらに好ましい。酸性水溶液の使用量としては、保護Ｌ−カルノシン誘導体が溶解する量であれば良く、通常保護Ｌ−カルノシン誘導体１質量部あたり２〜１０容量部あれば十分である。
また、酸性水溶液とするために使用する酸は特に制限される物ではなく、蟻酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、塩化水素、硫酸、硝酸等の無機酸を使用することができる。またこれらの酸は水溶液として使用することもできる。好ましい酸としては、塩酸、硫酸、硝酸など無機酸が挙げられる。中でも価格、精製の容易さから、塩酸を用いることが最も好ましい。酸の使用量としては、酸性水溶液が所望のｐＨとなるまで添加すれば十分である。
【００５３】
＜有機溶媒＞
本発明の製造方法において保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と接触させる有機溶媒は特に制限される物ではないが、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物を有機溶媒に溶解せしめて保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液から除去することを考慮すると、水と混和しない有機溶媒を使用することが好ましい。かかる有機溶媒としては、有機合成反応後の分液操作に用いられる有機溶媒が好適に挙げられる。好適な有機溶媒として具体的には、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒等が挙げられる。これらの有機溶媒の中でも、水よりも比重の重い有機溶媒を用いると、反応容器の下部から、上記不純物が含有された有機溶媒を取り出すことができるため、操作性の観点から特に好適である。かかる有機溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン系溶媒が挙げられる。
【００５４】
有機溶媒の使用量としては、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体等の不純物を有機溶媒に溶解せしめて保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液から除去することができる量であれば良く、製造装置の容量等を勘案して適宜決定すれば良い。通常、有機溶媒／水の体積比が０．１〜１０の範囲で、より好ましくは０．３〜５の範囲で、特に好ましくは０．５〜２の範囲で使用すれば十分である。
【００５５】
＜保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造方法＞
本発明の製造方法では、保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と有機溶媒を接触させる。保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と有機溶媒との接触方法については、特に制限されるものではなく、製造装置や製造スケール等を勘案して適宜決定すれば良い。保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と有機溶媒との接触方法について具体的には、保護Ｌ−カルノシン誘導体の水溶液を調製後、該水溶液を酸性にした後、有機溶媒を添加する方法、有機溶媒に、予め調製した保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液を添加する方法、或いは、保護Ｌ−カルノシン誘導体の水と有機溶媒との混合溶液を調製し、該混合溶液に酸を添加して酸性水溶液とする方法等が挙げられる。また、上記製造方法において、保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した場合、反応後の溶液から調製を行っても良い。例えば、反応後、保護Ｌ−カルノシン誘導体の有機溶媒溶液となっている場合には、酸性水溶液を接触させればよい。或いは、保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造を水又は水と有機溶媒の混合溶媒で行った場合には、必要に応じて有機溶媒を除去した後、酸を添加して酸性水溶液とすれば良い。また、反応終了後の溶液が酸性となっている場合には、そのまま有機溶媒と接触させれば良い。
【００５６】
保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と有機溶媒を接触させる際には必要に応じて攪拌しても良く、さらに空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、乾燥空気雰囲気下のいずれの雰囲気下で行っても良く、大気圧下、減圧下、加圧下のいずれかの雰囲気下で実施してもよい。
【００５７】
保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液と有機溶媒とを接触させる際の温度については特に制限されず、製造条件を勘案して適宜決定すれば良い。保護Ｌ−カルノシン誘導体の安定性の観点から０〜８０℃の範囲が好ましく、１０〜５０℃の範囲がさらに好ましく、２０〜３０℃の範囲が最も好ましい。
【００５８】
本発明において、該酸性水溶液と該有機溶媒の分離方法に特に制限はなく、公知の方法を使用できる。具体的には、該酸性水溶液と該有機溶媒を攪拌混合した溶液を、静置することにより、該酸性水溶液と該有機溶媒とを分層し、一方の溶液を取り除けばよい。ジクロロメタンやクロロホルムなどの、水よりも比重の重い有機溶媒を用いた場合、反応容器の下部から、該有機溶媒を取り出すことができる。反応容器に残った保護Ｌ−カルノシン誘導体の酸性水溶液は保管することもできるが、そのまま脱保護反応に付すことができる。また酢酸エチル等の水よりも比重の軽い溶媒を用いた場合、該酸性水溶液を反応容器から取り出し、保管することができる。また反応容器から、脱保護反応を行う反応容器へ直接取出すこともでき、その場合、そのまま脱保護反応に付すことができる。
【００５９】
＜保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造；（混合）酸無水物法＞
本発明において、前述したとおり上記式（１）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造する方法は特に制限されるものではないが、使用する試薬が安価で高収率で保護Ｌ−カルノシン誘導体が得られることから、（混合）酸無水物法により保護Ｌ−カルノシン誘導体により製造することが好ましい。
下記式（２）
【００６０】
【化１２】
2019135220.tif 000013
【００６１】
｛式中、Ｒ１は、前記式（１）と同義であり、Ｒ６は、水酸基、ハロゲン原子、
および下記式（２’）
【００６２】
【化１３】
2019135220.tif 000014
【００６３】
（式中、ｍは０又は１の整数であり、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれ、水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基であり、ｍが１である場合、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６の少なくとも２つの基が炭素数１〜６のアルキル基である。）｝
で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体と、下記式（３）
【００６４】
【化１４】
2019135220.tif 000015
【００６５】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は前記式（１）と同義である）
で示されるＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させることにより前記式（１）記載の保護Ｌ−カルノシン誘導体を得る方法である。
【００６６】
前記式（２’）で示される化合物において、特に制限されるものではないが、ｍが０である場合、ｔ−ブチル基であることが好ましく、ｍが１である場合、エトキシカルボニル基、イソブチルカルボニル基であることが好ましい。
上記反応は、水溶媒、有機溶媒中で実施することができ、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記Ｌ−ヒスチジン誘導体、及び塩基を溶解する溶媒を用いることが好ましい。本発明において、塩基、及び水の存在下、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とＬ−ヒスチジン誘導体とを反応させるには、これらの反応容器内（反応系内）で混合攪拌すればよい。これら成分を反応系内に導入する方法は、特に制限されるものではなく、以下の方法を採用できる。
【００６７】
例えば必要に応じて溶媒（水を含む）で希釈した各成分を同時に反応系内に導入して攪拌混合する方法を採用することができる。また、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体、又はＬ−ヒスチジン誘導体の一方の原料を必要に応じて溶媒と一緒にあらかじめ反応系内に入れておき、必要に応じて溶媒で希釈した他方の原料を反応系内に添加して攪拌混合する方法を採用することができる。さらには、両方の原料を必要に応じて溶媒と一緒に予め反応系内に入れておき、必要に応じて溶媒で希釈した塩基を反応系内に添加して攪拌混合する方法を採用することもできる。中でも、最終的に得られる保護Ｌ−カルノシン誘導体の収量を向上させ、後処理工程を容易にするためには、Ｌ−ヒスチジン誘導体、及び塩基を必要に応じて溶媒と一緒に予め反応系内に入れておき、必要に応じて溶媒で希釈した前記酸無水物を反応系内に添加して攪拌混合する方法を採用することが好ましい。
【００６８】
上記塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ金属の水酸化物；重曹、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸カリウム、重炭酸セシウム、炭酸セシウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムなどの４級アンモニウムの水酸化物；トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等のアミン等が挙げられる。中でも、反応の制御のしやすさ、除去のしやすさなどを考慮すると、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属の水酸化物、又はトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等のアミン等を使用することが好ましい。
【００６９】
塩基の使用量、および配合方法は特に制限されるものではないが、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記Ｌ−ヒスチジンとの反応においては、反応系内が塩基性である方が、反応が進行しやすい傾向にあるため、反応系内のｐＨが７〜１５であることが好ましく、８〜１４であることがさらに好ましく、９〜１３であることが最も好ましい。該反応では、反応が進行するに従い、反応系内のｐＨが酸性へ傾く。そのため、塩基を反応系内に追加して、該反応系内のｐＨを調整してもよい。追加する塩基は、水溶液の状態で使用することが好ましい。塩基の水溶液を使用する場合には、反応の制御のしやすさから、該水溶液のｐＨを９〜１０とすることが好ましい。
【００７０】
そのため、塩基の絶対量（合計量）は、反応系内における条件で適宜決定すればよいが、後工程での除去を考慮すると、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１モルに対して、１〜４モルとすることが好ましく、１〜２モルとすることがさらに好ましい。徐々に塩基を追加する場合、反応系内に添加した塩基の全使用量が前記範囲を満足するようにすることが好ましい。
【００７１】
本発明においては、水もしくは有機溶媒を使用することが好ましい。溶媒の使用量は、特に制限されるものではないが、反応系内のｐＨが７〜１５、好ましくは９〜１４で満足するような量を使用することが好ましい。そのため、溶媒の絶対量（合計量）は、適宜決定すればよいが、反応を効率よく行うためには、下記の量とすることが好ましい。水のみを反応媒体として使用する場合には、水の使用量は前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１ｇに対して、０．５〜１００ｍｌとすることが好ましく、１〜２０ｍｌとすることがさらに好ましい。有機塩基の水溶液を徐々に反応系内に追加する場合には、反応系内に添加した水の全使用量が、前記範囲を満足するようにすることが好ましい。なお、この水の量は、塩基の水溶液に使用される水の量を含むものである。
【００７２】
本発明において、溶媒として有機溶媒を使用することもできる。有機溶媒を使用する場合、該有機溶媒は前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体と前記Ｌ−ヒスチジン誘導体との反応を阻害しないものであれば特に制限されるものではない。好適な有機溶媒を例示すると、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、アセトン、ジエチルケトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、ｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン等のヘテロ原子含有溶媒などが挙げられる。これら有機溶媒は単独で用いてもよく、複数組み合わせてもよく、また水と組み合わせて使用してもよい。水と組み合わせて使用する場合、アセトン、酢酸エチル、アセトニトリルから選ばれる溶媒と水との組み合わせが好ましい。
【００７３】
有機溶媒、及び水を含む媒体を使用する場合、該媒体の使用量は、前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体１ｇに対して、０．５〜１００ｍｌであることが好ましく、１〜２０ｍｌであることが好ましい。この際、特に制限されるものではないが、有機溶媒と水（全水の量）との体積比（有機溶媒量／全水量）は１〜１０となることが好ましく、２〜５となることがより好ましい。
【００７４】
前記Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とＬ−ヒスチジン誘導体との反応温度は、特に制限されるものではないが、反応時間、収量、不純物副生の抑制などを考慮すると、−３０〜７０℃とすることが好ましく、さらには−１０〜４０℃とすることが好ましい。
【００７５】
反応時間は、原料の消費量、保護Ｌ−カルノシン誘導体の生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜９６時間であれば十分であり、好ましくは０．５〜２４時間である。
【００７６】
反応雰囲気も、特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下の何れの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下、大気圧雰囲気下で実施することが好ましい。
【００７７】
＜Ｌ−カルノシンの製造；保護Ｌ−カルノシン誘導体の脱保護反応＞
本発明の製造方法のよって得られた保護Ｌ−カルノシン誘導体からＬ−カルノシンを製造するには、保護基を脱保護してやればよい。保護基を脱保護する方法は特に制限される物ではなく、公知の方法を採用できる。
【００７８】
保護基を脱保護するためには、酸処理を行う方法、パラジウム触媒存在下、水素弦を存在させる方法、アミンを接触させる方法が挙げられる。これらの方法は、Ｒ１に含まれる保護基の種類に応じて選択すればよい。
【００７９】
＜Ｌ−カルノシンの製造；酸を使用して保護基を脱保護する場合＞
例えば、Ｒ１が、前記式（１ａ）で示され、且つ式（１ａ）のＲ５がｔ−ブトキシカルボニル基である場合には、酸によって脱保護反応を行うことが好ましい。
【００８０】
使用する酸は、特に制限されるものではなく、塩化水素、硫酸、メタンスルホン酸が好ましい。また、これらの酸は、水溶液の状態で反応系内に導入することができる。
【００８１】
酸の使用量は特に制限されるものではないが、前記保護Ｌ−カルノシン誘導体１モルに対して、酸を０．１〜１００モル使用することが好ましい。中でも前記Ｌ−カルノシン誘導体と酸を接触させる反応系内のｐＨが−１以上４未満であることが好ましい。前記反応系内のｐＨは、使用する酸全量を反応系内に導入した際のｐＨの範囲である。
【００８２】
＜Ｌ−カルノシンの製造；パラジウム系触媒／水素源を使用して保護基を脱保護する場合＞
例えば、Ｒ１が、前記式（１ａ）で示され、且つ式（１ａ）のＲ５が置換基を有してもよいベンジルオキシカルボニル基、又はフルオレニルオキシカルボニル基である場合には、パラジウム系触媒／水素源を使用して脱保護反応を行うことが好ましい。
【００８３】
本発明においては、脱ベンジル化等を実施できる、公知のパラジウム系触媒を使用することができる。具体的には、１〜３０質量％（好ましくは１〜２０質量％）のパラジウムを担持したパラジウム炭素触媒、パラジウム硫酸バリウム触媒、パラジウム炭酸カルシウム触媒、パラジウムブラック触媒が挙げられる。
【００８４】
該パラジウム系触媒の使用量は、特に制限されるものではないが、前記保護Ｌ−カルノシン誘導体１００質量部に対して０．００１〜２０質量部（金属量換算）であれば十分である。好ましいパラジウム触媒としては、市販のものを使用することができ、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍａｔｔｈｅｙ社、Ｎ．Ｅ．ＣＨＥＭＣＡＴ社のパラジウム炭素触媒が挙げられる。これらのパラジウム炭素触媒の中でも、パラジウム等の触媒成分が溶媒中に溶出し難いものが特に好適に使用できる。
【００８５】
本脱保護反応は、水素存在下で実施することが好ましい。水素ガスを使用する場合には、反応系内の水素圧０．５〜１００気圧とすることが好ましく、１〜３０気圧とすることがさらに好ましく、１〜２０気圧とすることが特に好ましい。
【００８６】
パラジウム系触媒を使用する場合、水素ガス存在下、溶媒中で前記Ｌ−カルノシン誘導体（Ｉ）とパラジウム触媒とを混合攪拌することが好ましい。溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール溶媒、１、４−ジオキサン、ＴＨＦ、ジメチルエーテルなどのエーテル系溶媒、水を使用することができる。これらの溶媒は、単独で使用することもできるし、複数種類の混合溶媒として使用することもできる。上記の溶媒の中でも、操作性を考慮すると、アルコール、水、又はアルコールと水との混合溶媒を使用することが好ましい。混合溶媒を使用する場合には、特に制限されるものではないが、アルコールと水との体積比は、２３℃において、０．０１〜１０００の範囲とすることが好ましい。
【００８７】
また溶媒の使用量も、特に制限されるものではなく、通常であれば、前記保護Ｌ−カルノシン誘導体１ｇに対して、該媒体を１〜１００ｍｌ使用することが好ましい。
【００８８】
パラジウム系触媒を使用してＲ１に含まれる脱保護反応を行うに際し、反応系内へ前記保護Ｌ−カルノシン誘導体、パラジウム系触媒、および水素を導入する手順は、特に制限されるものではない。例えば、必要に応じて溶媒で希釈した前記保護Ｌ−カルノシン誘導体、必要に応じて該溶媒に分散させたパラジウム系触媒を同時に反応系内に導入し、さらに、水素ガスを反応系内に導入して攪拌混合する方法が挙げられる。またいずれか一方を必要に応じて溶媒に希釈（分散）して先ず反応系内へ入れておき、必要に応じて溶媒で希釈（分散）したもう一方を反応系内へ添加して、水素ガスを反応系内に導入して攪拌混合する方法が挙げられる。本反応において、反応圧力は制限されるものではなく、大気圧下、減圧下、加圧下のいずれの圧力下で反応を実施してもよい。反応性、操作性を考慮すると、大気圧下もしくは加圧下で実施することが好ましい。
【００８９】
また、前記には水素ガスを使用した場合の例を示したが、蟻酸、蟻酸塩など水素ガスを発生する化合物を使用することもできる。その場合、反応雰囲気は特に制限されるものではなく、乾燥空気雰囲気下、不活性ガス雰囲気下、通常の空気雰囲気下で実施することができる。また、大気圧下、減圧下、加圧下のいずれの圧力下で反応を実施してもよい。そのため、操作性を考慮すると、空気雰囲気下、大気圧下で反応を実施することが好ましい。
【００９０】
該脱保護反応を行う際の反応温度は、特に制限されるものではなく、反応時間、収量、不純物副生の抑制等を考慮すると、−１０〜２００℃とすることが好ましく、さらに好ましくは１０〜１２０℃とすることが好ましい。
【００９１】
脱保護反応の反応時間は、特に制限されるものではないが、原料の消費量、Ｌ−カルノシンの生成量等を確認しながら、適宜決定すればよい。上記条件であれば、通常、０．１〜２００時間あれば十分であり、好ましくは０．２〜１５０時間である。
【００９２】
＜Ｌ−カルノシンの精製方法＞
以上のような方法により、下記式
【００９３】
【化１５】
2019135220.tif 000016
【００９４】
で示されるＬ−カルノシンが製造できる。脱保護反応（後は、公知の方法に従いＬ−カルノシン、またはその塩を取り出すことができる。例えば、抽出、再結晶、カラム精製などの方法により、Ｌ−カルノシン又はその塩を分離精製することができる。この際、塩基、水で洗浄することにより、Ｌ−カルノシン塩はＬ−カルノシンとすることができる。
【００９５】
Ｌ−カルノシンを精製する場合には、以下の方法を採用することが好ましい。具体的には、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）溶媒で再結晶することが好ましい。該アルコールは、水を含んでいてもよい。Ｌ−カルノシンを該再結晶溶媒で溶解させる際の温度は、特に制限されるものではないが、２０〜１２０℃で行うことが好ましく、さらに３０〜８０℃で行うことが好ましい。この際、再結晶溶媒の使用量は、溶解させる対象物（Ｌ−カルノシンを含む対象物）１ｇに対して、１〜５０ｍｌとすることが好ましく、さらに５〜２０ｍｌとすることが好ましい。また、結晶を析出させる際の温度は、−１０〜１００℃が好ましく、さらに−５〜５０℃が好ましい。得られた結晶は、公知の方法で乾燥すればよい。以上のような方法に従えば、比較的柔和な条件であっても、純度の高いＬ−カルノシンを容易に得ることができる。
【実施例】
【００９６】
以下、本発明を、実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本願発明にかかる保護Ｌ−カルノシン誘導体の化学純度の測定は、ＨＰＬＣ法を用いて以下の条件で行った。
【００９７】
装置：ウォーターズ社製２６９５
検出器：紫外吸光光度計（ウォーターズ社製２４８９）
検出波長：２１０ｎｍ
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレス管に５μｍの液体クロマトグラ
フィー用オクタデシルシリル化シリカゲルが充填されたもの
移動相Ａ： アセトニトリル
移動相Ｂ：１％リン酸水溶液
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を下記表１のように変えて濃度勾配制御する。
カラム温度：３５℃付近の一定温度
注入量：５μＬ
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ
【００９８】
【表１】
2019135220.tif 000017
【００９９】
また、Ｌ−カルノシン誘導体の化学純度の測定は、ＨＰＬＣ法を用いて以下の条件で行った。
【０１００】
装置：ウォーターズ社製２６９５
検出器：紫外吸光光度計（ウォーターズ社製２４８９）
検出波長：２１０ｎｍ
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍのステンレス管に５μｍの液体クロマトグラ
フィー用オクタデシルシリル化シリカゲルが充填されたもの
移動相Ａ： アセトニトリル
移動相Ｂ：リン酸水素二カリウム２６．１ｇ、１−デカンスルホン酸ナトリウム３．
７ｇを蒸留水３０００ｍＬに溶解させ、リン酸でｐＨ３．０に調整
移動相の送液：移動相Ａ：移動相Ｂ＝２２：７８
カラム温度：３５℃付近の一定温度
注入量：１０μＬ
サンプル濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ
【０１０１】
実施例１＜Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の製造例＞
以下の反応式に従い式（１’）で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体を製造した。
【０１０２】
大気下において、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニン；２０ｇ、８９．６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（有機塩基；９．０ｇ、８９．６ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（１４０ｍＬ）を含む混合溶液を準備し、該溶液を１℃以下まで冷却した。該冷却した溶液中に、ピバロイルクロリド（１０．８ｇ、８９．６ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（６０ｍＬ）を含む溶液を、反応液中の温度が１０℃以下を維持するように、１５分間かけて滴下した。滴下後の反応液の温度（０〜１０℃）を維持したまま、３０分間攪拌を行った。撹拌後、減圧濾過により、析出した固体を取り除き、酸無水物の溶液を得た。
【０１０３】
【化１６】
2019135220.tif 000018
【０１０４】
実施例２＜Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とＬ−ヒスチジンとの反応（保護Ｌ−カルノシン誘導体の製造）＞
以下の反応式に従い式（１’）で示されるＮ−保護−β−アラニン誘導体を合成し、次いで、該Ｎ−保護−β−アラニン誘導体とＬ−ヒスチジンとを反応させて、式（３ｐ１）で示される保護Ｌ−カルノシン誘導体を製造した。
【０１０５】
【化１７】
2019135220.tif 000019
【０１０６】
Ｌ−ヒスチジン（１０．８ｇ、７２．１ｍｍｏｌ）、水（１００ｍＬ）の水溶液に、水酸化ナトリウム（３．２ｇ、７９．３ｍｍｏｌ）を加え、該水溶液を５℃まで冷却した。Ｌ−ヒスチジンのアルカリ水溶液に、実施例１で調製したＮ−保護−β−アラニン誘導体のアセトニトリル溶液を、反応液の温度が０〜１０℃の範囲となるように滴下した。滴下後、温度を０〜１０℃に保ち２２時間撹拌した。得られた反応液をＨＰＬＣで確認した結果、保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度は６９．５１％、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−β−アラニン）の含量は２２．３１％であった。
【０１０７】
実施例３＜保護Ｌ−カルノシン誘導体製造後の後処理＞
実施例２で調製した溶液にｐＨが３になるように３５％塩酸を加え、塩化メチレン２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間撹拌した。撹拌後、３０分間静置し、有機層と水層を分液した。分液後の有機層、水層をＨＰＬＣで測定し、保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度は８７．１３％、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の含量は１．９６％であった。
【０１０８】
実施例４＜保護Ｌ−カルノシン誘導体製造後の後処理＞
実施例２で調製した溶液にｐＨが６になるように３５％塩酸を加え、塩化メチレン２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間撹拌した。撹拌後、３０分間静置し、有機層と水層を分液した。分液後の有機層、水層をＨＰＬＣで測定し、保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度は７６．３６％、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の含量は１４．１０％であった。
【０１０９】
比較例１＜保護Ｌ−カルノシン誘導体製造後の後処理＞
実施例２で調製した溶液にｐＨが１０になるようにトリエチルアミンを加え、塩化メチレン２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間撹拌した。撹拌後、３０分間静置し、有機層と水層を分液した。分液後の有機層、水層をＨＰＬＣで測定し、保護Ｌ−カルノシン誘導体の純度は７３．７９％、Ｎ−保護−β−アラニン誘導体の含量は１７．１７％であった。
【０１１０】
実施例５＜保護Ｌ−カルノシン誘導体からＬ−カルノシンを製造する方法＞
実施例３で得た保護Ｌ−カルノシン誘導体の水溶液にＰｄ／Ｃ（１５４ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ、５％Ｐｄ，５０％Ｗｅｔ）を加え、水素５気圧下で２５℃、２４時間撹拌した。撹拌後、減圧濃縮により水を留去し、エタノール（１４０ｍＬ）を加えて、Ｌ−カルノシンを結晶化させた後、５℃に冷却し、１８時間撹拌した。析出した結晶を濾過、乾燥することによりＬ−カルノシン（１２．２ｇ、収率：７５％：Ｌ−ヒスチジンからの収率、純度：９９．７９％）を白色固体として得た。