(57)【要約】      （修正有）【課題】患者への投与後に標的化された細胞毒性を示す新しい治療剤を作製するためのキメラ分子を提供する。【解決手段】細胞型特異的標的化を媒介するための免疫グロブリン型結合領域と、細胞毒性を生じさせるための志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域とを含む細胞毒性タンパク質を開示する。この細胞毒性タンパク質は、特定の細胞型の選択的死滅にも、がん、免疫障害、及び微生物感染症などの様々な疾患の治療のための治療剤としても有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）
１又は２以上のポリペプチドを含み、かつＣＤ２０，ＣＤ３８、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ７９、ＣＤ４０、ＳＬＡＭＦ７及びムチンからなる群から選択される、少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる、免疫グロブリン型結合領域と、
ｂ）
（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１；
（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１；
（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１；及び
（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１；
から選択される配列と少なくとも８５％同一なアミノ酸配列を含む、
細胞毒性志賀毒素Ａサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域と
を含む細胞毒性タンパク質であって、
前記志賀毒素エフェクター領域が、前記志賀毒素Ａサブユニットの細胞毒性活性を維持しており、
前記細胞毒性タンパク質が志賀毒素Ｂサブユニットを含まず、
かつ、細胞表面に前記少なくとも１つの細胞外標的生体分子を発現する細胞に投与すると前記細胞の死を引き起こすことができる、前記細胞毒性タンパク質。
【請求項２】
免疫グロブリン型結合領域が、相補性決定領域３断片、拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、抗体又は抗原結合断片、Ｆｄ断片、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新抗原受容体、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テナシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂ結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、及び操作された抗体模倣物からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項３】
免疫グロブリン型結合領域が、抗体又はその抗原結合断片、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合断片、Ｆｄ断片、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメインＶＨＨ断片又はＶＨドメイン断片、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新抗原受容体、及びＶＮＡＲ断片からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項２に記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項４】
免疫グロブリン型結合領域が、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン又はプロテインＡ由来Ｚドメインを含む、請求項２に記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項５】
フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメインがＡｄＮｅｃｔｉｎ（登録商標）又はＡｄＮｅｘｉｎ（登録商標）であり、プロテインＡ由来ＺドメインがＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）である、請求項４に記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項６】
少なくとも１つの細胞外標的生体分子が、ＣＤ２０、ＣＤ３８及びＨＥＲ２からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項７】
細胞毒性タンパク質を、メンバーが免疫グロブリン型結合領域と結合した細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした第１の細胞集団、及びメンバーが前記免疫グロブリン型結合領域と結合した任意の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングしていない第２の細胞集団へ投与すると、前記第２の細胞集団のメンバーと比較した前記第１の細胞集団のメンバーに対する前記細胞毒性タンパク質の細胞毒性効果が少なくとも３倍高い、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項８】
細胞外標的生体分子、又はその一部を、細胞の外側にカップリングさせる共有及び／又は非共有分子間相互作用により、第１の細胞集団が前記細胞外標的生体分子と物理的にカップリングしているか、或いは
前記細胞外標的生体分子が、前記細胞又は第１の細胞集団により発現する内在性膜タンパク質又は表在性膜タンパク質である、請求項７に記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項９】
細胞毒性志賀毒素Ａサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域が、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１；
（ii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４１；
（iii）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２５１；又は
（iv）配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１
に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むか、若しくはそれからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項１０】
細胞毒性志賀毒素Ａサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域が、細胞毒性活性を維持しながら前記志賀毒素エフェクター領域の酵素活性を変化させる、天然の志賀毒素Ａサブユニットに対する変異であって、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失又は置換から選択される変異を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項１１】
ホモ多量体又はヘテロ多量体の形態である、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項１２】
薬学的に許容される溶媒和物又は塩の形態である、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体が、生理学的に許容される溶媒又は分散媒体を含み；及び／又は前記薬学的に許容される担体が、水、アルコール、ポリオール、及びその好適な混合物；植物性油；又は注射可能な有機エステルを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
アジュバント；コーティング；抗微生物剤、抗細菌剤又は抗真菌剤；等張剤；ポリアルコール；吸収遅延剤；安定剤；バッファー；界面活性剤；及び／又は薬学的に許容される酸化防止剤をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
アジュバントが、保存剤、湿潤剤、乳化剤又は分散剤であり;
コーティングが、レシチンであり;
抗細菌剤又は抗真菌剤が、パラベン、クロロブタノール、フェノール又はソルビン酸であり;
等張剤が、糖又は塩化ナトリウムであり;
ポリアルコールが、マンニトール又はソルビトールであり;及び／又は
薬学的に許容される抗酸化剤が、水溶性酸化防止剤、油溶性酸化防止剤、又は金属キレート剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
水溶性酸化防止剤が、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸ナトリウムであり；
油溶性酸化防止剤が、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、又はアルファ−トコフェロールであり；及び／又は
金属キレート剤が、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、又はリン酸である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質をコードすることができるポリヌクレオチド、又はその相補体。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載の発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
細胞を、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質又は請求項１３〜１７のいずれかに記載の医薬組成物とインビトロで接触させるステップを含む、前記細胞をインビトロで死滅させる方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質又は請求項１３〜１７のいずれかに記載の医薬組成物を含む、それを必要とする患者における疾患、障害、又は状態の治療剤。
【請求項２３】
疾患、障害、又は状態ががん、腫瘍、免疫障害、及び微生物感染症からなる群から選択される、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
がんが、骨のがん、乳がん、中枢／末梢神経系のがん、消化管のがん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓−尿路のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択されるか、或いは、
免疫障害が、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患と関連する、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２５】
がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質又は請求項１３〜１７のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
がん、腫瘍、又は免疫障害の治療又は予防のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞毒性タンパク質又は請求項１３〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域とを含む細胞毒性タンパク質に関する。本発明の細胞毒性タンパク質は、特定の細胞型の選択的死滅にも、がん、免疫障害、及び微生物感染症などの様々な疾患の治療のための治療剤としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
天然毒素に基づく合成的に操作された組成物は、患者への投与後に標的化された細胞毒性を示す新しい治療剤を作製するための試みにおいて設計されてきた（Pastan I, et al., Annu Rev Med 58: 221-37(2007)）。天然毒素又はトランケートされたバージョンは組換えタンパク質工学により免疫グロブリンドメイン又は受容体リガンドに融合されてきた（Chaudhary V et al., Nature 339: 394-97(1989)；Strom T et al., Semin Immunol 2: 467-79 (1990)；Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992)；Foss F et al., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998)）。そのような分子操作の目的は、１）全身投与後に生物内の特定の細胞型又は場所に毒素を送達する、及び２）真核細胞において有効な強力な細胞毒性機構を用いて特定の細胞に標的化された細胞毒性を生じさせる、二重の機能を有するキメラ分子を設計することである。
【０００３】
志賀毒素ファミリーの関連タンパク質毒素、特に、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）及び大腸菌（E. coli）から単離された毒素は、構造的及び機能的に関連する様々な天然毒素から構成される（Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。例えば、志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌血清型１から単離された真の志賀毒素（Ｓｔｘ）、腸管出血性大腸菌の血清型から単離された志賀様毒素１バリアント（ＳＬＴ１又はＳｔｘ１又はＳＬＴ−１又はＳｌｔ−１）、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離された志賀様毒素２バリアント（ＳＬＴ２又はＳｔｘ２又はＳＬＴ−２）を包含する。ＳＬＴ１は、ただ１個の残基でＳｔｘと異なり、両方ともベロサイトトキシン又はベロ毒素（ＶＴ、Verotoxin）と呼ばれてきた（O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)）。志賀毒素ファミリーのメンバーは、同じ全体的な構造及び作用機構を共有する（Engedal, N et al., Microbial Biotech 4:32-46 (2011)）。志賀毒素ファミリーのメンバーは、いくつかの宿主細胞の表面上に存在する特定の糖スフィンゴ脂質に優先的に結合する標的化ドメインと、一度細胞の内部に入ればリボソームを永続的に不活化することができる酵素ドメインとを含有する（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。
【０００４】
志賀毒素ファミリーのメンバーは、宿主の感染中にビルレンス因子として細菌によって用いられる（Johannes,Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。感染した宿主中で、タンパク質合成を阻害し、アポトーシス細胞死を誘発する毒素の強力な能力のため、志賀毒素は細胞毒性的である（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。宿主細胞に対する志賀毒素の強力な細胞毒性効果は、出血性大腸炎及び溶血性尿毒症症候群をもたらし得る（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。
【０００５】
志賀毒素ファミリーのメンバーは、志賀タンパク質サブユニットのＡ（Ｂ）５配置を特徴とする共通の多量体タンパク質構造を共有する（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。それぞれの志賀毒素は、２つのタンパク質サブユニットＡ及びＢから構成され、Ａ（Ｂ）５配置に会合してホロ毒素タンパク質複合体を形成する。志賀毒素Ａサブユニットは酵素ドメインを含有する３２キロダルトンの単量体であり、志賀毒素Ｂサブユニットは他の４つの志賀毒素Ｂサブユニットと会合して志賀毒素Ｂサブユニットの五量体を形成する７．７キロダルトンのサブユニットである。Ｂサブユニットの五量体は１つのＡサブユニットと会合して、約７０キロダルトンである志賀ホロ毒素を形成する（O'Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)）。
【０００６】
志賀毒素ファミリーのメンバーは、宿主細胞の中毒のための共通のプロセスを共有し、５つの主要な段階：細胞表面結合、エンドサイトーシス、小胞体への逆行的細胞内移動、小胞体から細胞質ゾルへの転移、及び細胞質ゾル中でのリボソームの酵素的不活化に分割することができる。第１に、志賀ホロ毒素は、細胞質外膜リーフレット上の存在する、ＣＤ７７としても知られる、糖スフィンゴ脂質グロボトリアオシルセラミドＧｂ３に特異的に結合するＢサブユニットの能力により、特定の宿主細胞の細胞表面を指向する（Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88 (1998)；Thorpe C et al., Infect Immun 67: 5985-93 (1999)；Soltyk A et al., J BiolChem 277: 5351-59 (2002)）。第２に、志賀ホロ毒素は、宿主細胞中に進入する宿主細胞の細胞質内機構を利用し、そこでホロ毒素はエンドソーム内に最初に含有される（Sandvig K et al., J Cell Biol 108: 1331-43(1989)；Sandvig K et al.,Histochem Cell Biol 117: 131-141 (2002)）。第３に、志賀ホロ毒素は、小胞体に到達し、細胞質ゾルへのアクセスを獲得する宿主細胞の細胞内輸送機構を利用する（Nichols B et al., J Cell Biol 153: 529-41(2001)；Lauvrak S et al., JCell Sci 117: 2321-31 (2004)； Saint-Pol A et al., Dev. Cell 6: 525-38 (2004)）。第４に、志賀ホロ毒素の酵素活性断片は、小胞体の内腔から細胞質ゾルに逆輸送される（Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005)；LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)； Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006)；Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)）。第５に、志賀毒素酵素活性断片の細胞質ゾル画分は、宿主細胞リボソームを不活化することにより細胞毒性を引き起こす（Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)）。
【０００７】
志賀毒素中毒プロセスの間に、志賀毒素Ａサブユニットは、宿主細胞エンドプロテアーゼであるフリンによって、保存的アルギニン残基とメチオニン残基との間（例えば、ＳｔｘＡ中のＡｒｇ２５１−Ｍｅｔ２５２）でタンパク質分解的に切断される（Garred O et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995)）。フリンにより切断される志賀毒素Ａサブユニットのアミノ末端断片は、志賀毒素「Ａ１断片」（又はＳｔｘｎ−Ａ１、ＳＬＴｎ−Ａ１、ＳＬＴ−ｎＡ１）と呼ばれる。志賀毒素Ａ１断片は、志賀毒素の触媒ドメインを含有する２８キロダルトンのタンパク質である（Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)）。宿主細胞に対する志賀毒素細胞毒性の機構は、主に真核リボソームのＡ１断片の強力な触媒的不活化及びタンパク質合成の細胞に及ぶ阻害によるものである（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。
【０００８】
志賀毒素Ａ１断片は、真核リボソームの２８ＳリボソームＲＮＡのアルファ−サルシン−リシンループ中の位置４，３２４の広く保存されたアデニンヌクレオ塩基に対するその強力な脱プリン反応活性によりタンパク質翻訳を阻害する（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。閾値数のリボソームが不活化された後、宿主細胞はタンパク質合成の十分な減少を経験し、アポトーシスによる細胞死を誘導すると予測される（Iordanov M et al., Mol Cell Biol 17: 3373-81 (1997)；Smith W et al.,Infect Immun 71: 1497-504 (2003)；Lee S et al., Cell Microbiol 10: 770-80 (2008)；Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53 (2010)。
【０００９】
リボソーム不活化Ａ−Ｂ毒素は、１分あたり約１，５００個のリボソームの速度で同じ細胞内で次々とリボソームを永続的に損なわせる（Endo Y, Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988)；Endo Y et al., J Biol Chem 263: 8735-9 (1988)）。Ａ−Ｂ毒素の効力は極端に高いと報告されており、１個の毒素分子は１個の細胞を死滅させることができる（Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50 (1978)；Antignani A, Fitzgerald D, Toxins 5: 1486-502 (2013)）。単一分子のＡ−Ｂ毒素は３５分で３００個のリボソームを不可逆的に不活化することができ、これは１個のがん細胞を死滅させるのに十分なものであると考えられる（Weldon J, Pastan I, FEBS Journal 278: 4683-700 (2011)）。このレベルの細胞毒性効力は、志賀毒素Ａサブユニットについてさらに予測され、細胞質ゾル中に転移した１個の分子が１個の細胞を死滅させるのに十分であることが示唆された（Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)）。
【００１０】
志賀毒素ファミリーのホロ毒素は、治療剤としての非標的化使用にとっては毒性が高すぎると予測される（Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46(1990)）。しかしながら、志賀毒素ファミリーのメンバーは、毒素の構造、特徴、及び生物学的活性に対する合理的変更により治療的適用のために合成的に操作される能力を有する（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)；Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)）。志賀ホロ毒素は、２つの非共有結合したモジュラー式部分：酵素活性Ａ１断片を含有するＡ部分と、細胞表面標的Ｇｂ３への結合部位を含有するＢ部分とから構成される二部分構造を有する。志賀毒素サブユニットはモジュラー式であるため、Ａ及びＢ部分の別々の構造及び機能に基づいて治療組成物を作製することができると仮定されている（全体が参照により本明細書に組込まれる、米国特許出願第２００９０１５６４１７Ａ１号明細書；Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)；Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46(2011)；欧州特許出願第２４０２３６７Ａ１号明細書；米国特許出願第２０１３０１９６９２８Ａ１号明細書）。
【００１１】
志賀毒素ファミリーのメンバーのＡ部分は、Ｂ部分とは関係なく安定的であり、酵素活性であり、細胞毒性である（Engedal,Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)）。志賀毒素１Ａサブユニットは、触媒的に活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活化することができ、及び他のタンパク質ドメインにトランケート又は融合された場合であっても細胞毒性である（Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)；Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)；Al-Jaufy A et al., Infect Immun 63: 3073-8 (1995)；LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)；Di R et al., Toxicon 57: 535-39 (2011)）。志賀様毒素１Ａサブユニットトランケーションは、触媒的に活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活化することができ、及び細胞内で発現された場合、細胞毒性である（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【００１２】
がん細胞を選択的に死滅させるキメラ分子を作製するために毒素を標的化ドメインに連結するという発想は、新しいものではない（Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)）。例えば、１９７０年代以来、免疫毒素は３つの主要な毒素候補：細菌ジフテリア毒素、細菌シュードモナス（Pseudomonas）外毒素、及びリシンを例とする植物毒素を用いて開発されてきた（Antignani,Toxins 5: 1486-502 (2013)）。しかしながら、２０１３年まで、これらの３つの毒素は、「免疫毒素開発のための第１選択」のままであった（Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)）。現在まで、脊椎動物又はさらには実験室での細胞培養環境中で標的細胞型を特異的かつ選択的に死滅させることができる、細胞を標的化する免疫グロブリン由来結合領域と組み合わせた志賀毒素に由来するアミノ酸配列を含む細胞毒性タンパク質を誰も記載していない。有効な治療分子の開発のため、及び様々な疾患の治療のための治療分子としての使用のために標的細胞を死滅させることができる志賀毒素領域を含む細胞毒性タンパク質を有することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願第２００９０１５６４１７Ａ１号明細書
【特許文献２】欧州特許出願第２４０２３６７Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２０１３０１９６９２８Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Pastan I, et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)
【非特許文献２】Chaudhary V et al., Nature 339: 394-97 (1989)
【非特許文献３】Strom T et al., Semin Immunol 2: 467-79 (1990)
【非特許文献４】Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992)
【非特許文献５】Foss F et al., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998)
【非特許文献６】Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)
【非特許文献７】O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)
【非特許文献８】Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)
【非特許文献９】O'Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)
【非特許文献１０】Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88(1998)
【非特許文献１１】Thorpe C et al., Infect Immun 67: 5985-93 (1999)
【非特許文献１２】Soltyk A et al., JBiol Chem 277: 5351-59 (2002)
【非特許文献１３】Sandvig K et al., JCell Biol 108: 1331-43 (1989)
【非特許文献１４】Sandvig K et al., Histochem Cell Biol 117: 131-141 (2002)
【非特許文献１５】Nichols B et al., JCell Biol 153: 529-41 (2001)
【非特許文献１６】Lauvrak S et al., JCell Sci 117: 2321-31 (2004)
【非特許文献１７】Saint-Pol A et al., Dev. Cell 6: 525-38 (2004)
【非特許文献１８】Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32(2005)
【非特許文献１９】LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)
【非特許文献２０】Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98:125-34 (2006)
【非特許文献２１】Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10(2007)
【非特許文献２２】Garred O et al., JBiol Chem 270: 10817-21 (1995)
【非特許文献２３】Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)
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【非特許文献２５】Smith W et al., Infect Immun 71: 1497-504 (2003)
【非特許文献２６】Lee S et al., CellMicrobiol 10: 770-80 (2008)
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【非特許文献２９】Endo Y et al., J Biol Chem 263: 8735-9 (1988)
【非特許文献３０】Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50 (1978)
【非特許文献３１】Antignani A, Fitzgerald D, Toxins 5: 1486-502 (2013)
【非特許文献３２】Weldon J, Pastan I, FEBS Journal 278: 4683-700 (2011)
【非特許文献３３】Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46 (1990)
【非特許文献３４】Haddad J et al., JBacteriol 175: 4970-8 (1993)
【非特許文献３５】Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)
【非特許文献３６】Al-Jaufy A et al., Infect Immun 63: 3073-8 (1995)
【非特許文献３７】LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)
【非特許文献３８】Di R et al., Toxicon 57: 535-39 (2011)
【非特許文献３９】Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、１）免疫グロブリンなどに由来する免疫グロブリン型結合領域と、２）ＳＬＴ−１Ａのトランケーションなどの志賀毒素エフェクター領域とを含む、特定の細胞型の選択的死滅のための様々な細胞毒性タンパク質を提供する。結合領域と志賀毒素サブユニットＡ由来ポリペプチドとの連結は、特定の細胞型に標的化され得る細胞毒性志賀毒性に基づく分子の操作を可能にした。本発明の細胞毒性タンパク質は、標的化された細胞死滅にも、がん、免疫障害、及び微生物感染症などの様々な疾患、障害、及び状態の治療のための治療剤としても有用である。
【００１６】
本発明の細胞毒性タンパク質は、（ａ）１又は２以上のポリペプチドを含み、少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる免疫グロブリン型結合領域と、（ｂ）志賀毒素ファミリーの少なくとも１つのメンバーのＡサブユニットのアミノ酸配列に由来するポリペプチドとを含む志賀毒素エフェクター領域とを含む。
【００１７】
本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態について、免疫グロブリン型結合領域は、相補性決定領域３断片、拘束された(constrained)ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、単一ドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、抗原結合断片、Ｆｄ断片、フィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テナシンIII型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂ結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、操作された抗体模倣物、及び結合機能を保持する前記のいずれかの任意の遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【００１８】
本発明のある特定の実施形態について、細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞への細胞毒性タンパク質を投与すると、細胞毒性タンパク質は細胞死を引き起こすことができる。
【００１９】
ある特定の実施形態においては、細胞外標的生体分子の存在に関して２つの異なる集団の細胞型に細胞毒性タンパク質を投与すると、細胞毒性タンパク質は、その免疫グロブリン型結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングしていない細胞型に対するＣＤ５０よりも少なくとも３倍又はそれ以上低いＣＤ５０でその免疫グロブリン型領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞型の細胞死を引き起こすことができる。
【００２０】
ある特定の実施形態においては、免疫グロブリン型結合領域は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、Ｍｕｃｉｎｓ、ＴＡＧ−７２、IX型炭酸脱水酵素、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＬｅｗｉｓ−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テナシン、ＣＤ６４、及びメソテリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、キャスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、がん胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ関連抗原、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン−バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトタンパク質抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、Ｃｄ４４、Ｃｄ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、及び前記のいずれかの任意の免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子に結合するその能力によって設計又は選択される。
【００２１】
ある特定の実施形態について、細胞毒性タンパク質は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のアミノ酸７５〜２５１を含むか、又はそれから本質的になる志賀毒素エフェクター領域を含む。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域が、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３のアミノ酸１〜２４１；配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３のアミノ酸１〜２５１；及び／又は配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３のアミノ酸１〜２６１を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。
【００２２】
ある特定の実施形態においては、細胞毒性タンパク質は、配列番号４のアミノ酸２６９〜５０８を含むか、又はそれから本質的になる免疫グロブリン型結合領域を含む。さらなる実施形態は、配列番号４を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。
【００２３】
ある特定の実施形態においては、細胞毒性タンパク質は、配列番号５のアミノ酸１〜１１９を含むか、又はそれから本質的になる免疫グロブリン型結合領域を含む。さらなる実施形態は、配列番号５を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。
【００２４】
ある特定の実施形態においては、細胞毒性タンパク質は、志賀毒素エフェクター領域の酵素活性を変化させる、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然のＡサブユニットに対する変異であって、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失又は置換から選択される変異を含む志賀毒素エフェクター領域を含む。
【００２５】
本発明はまた、本発明の細胞毒性タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物；及び本明細書にさらに記載されるような本発明の方法におけるそのような細胞毒性タンパク質又はそれを含む組成物の使用も含む。
【００２６】
本発明の細胞毒性タンパク質を超えて、本発明の細胞毒性タンパク質をコードすることができるポリヌクレオチド、並びに本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞も、本発明の範囲内にある。
【００２７】
さらに、本発明は、細胞を、本発明の細胞毒性タンパク質又は本発明の医薬組成物と接触させるステップを含む、細胞を死滅させる方法を提供する。ある特定の実施形態においては、細胞を接触させるステップを、インビトロで行う。ある特定の他の実施形態においては、細胞を接触させるステップを、インビボで行う。
【００２８】
また、本発明は、治療上有効量の細胞毒性タンパク質又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、患者における疾患、障害、及び状態を治療する方法を提供する。ある特定の実施形態においては、本発明の方法を用いて治療される疾患、障害、又は状態は、がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染症のいずれかから選択される。この方法のある特定の実施形態においては、治療されるがんは、骨のがん、乳がん、中枢／末梢神経系のがん、消化管のがん、生殖細胞がん、腺がん、頭頸部がん、血液がん、腎臓−尿路のがん、肝臓がん、肺／胸膜がん、前立腺がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される。この方法のある特定の実施形態においては、治療される免疫障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患と関連する免疫障害である。
【００２９】
特に、本発明のある特定の実施形態は、がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染症の治療又は予防のための医薬組成物又は医薬の製造における、本発明の細胞毒性タンパク質の使用である。特に、本発明のある特定の実施形態は、がん、免疫障害、又は微生物感染症の治療又は予防における使用のための、細胞毒性タンパク質又は前記タンパク質を含む医薬組成物である。
【００３０】
本発明のこれらの及びその他の特徴、態様及び利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付の図面に関してより良好に理解されるようになる。本発明の上記要素を自由に組み合わせるか、又は除去して、以後、そのような組合せ又は除去に反対する記述がなくても、他の実施形態を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】例示的細胞毒性タンパク質の一般的構造を示す図である。
【図２】「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」がＣＤ３８−細胞と比較してＣＤ３８＋細胞に対して特異的に細胞毒性であったことを示すグラフである。細胞の生存能力（％）を、細胞毒性タンパク質濃度の１０を底とする対数に対してプロットした。
【図３】「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」がＨＥＲ２−細胞と比較してＨＥＲ２＋細胞に対して特異的に細胞毒性であったことを示すグラフである。細胞の生存能力（％）を、細胞毒性タンパク質濃度の１０を底とする対数に対してプロットした。
【図４】播種性Raji-luc異種移植片モデルにおいてＳＬＴ−１Ａバージョン１及び２と融合したαＣＤ２０ｓｃＦｖを投与した場合の総身体発光の変化を示すグラフである。
【図５】ＳＬＴ−１Ａバージョン１及び２と融合したαＣＤ２０ｓｃＦｖを投与した場合のRaji-luc異種移植片モデルマウスの生存の増加を示すグラフである。
【図６】Raji皮下異種移植片モデルにおいてＳＬＴ−１Ａバージョン１及び２と融合したαＣＤ２０ｓｃＦｖを投与した場合の腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図７】αＣＤ２０ｓｃＦｖ：：ＳＬＴ−１Ａバージョン１を投与した場合の非ヒト霊長類試験におけるＢ細胞枯渇を示す図である。特に、ＣＤ２１を発現するＣＤ２０＋Ｂ細胞のサブセットを分析した。
【図８】αＣＤ２０ｓｃＦｖ：：ＳＬＴ−１Ａバージョン１を投与した場合の非ヒト霊長類試験におけるＢ細胞枯渇を示す図である。特に、ＣＤ２１を発現しないＣＤ２０＋Ｂ細胞のサブセットを分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、例示的な非限定的実施形態、及び添付の図面の参照を用いて、以後、より完全に説明される。本発明は、多くの異なる形態で具体化することができるが、以下に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完全なものとなり、本発明の範囲を当業者に伝達するように提供される。
【００３３】
本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語を以下に定義する。さらなる定義は、本発明の詳細な説明内に見出すことができる。
【００３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる用語「a」、「an」及び「the」は、文脈が別途明確に区別しない限り、単数と複数の両方の指示対象を含む。
【００３５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、２つの種、Ａ及びＢを参照する場合の用語「及び／又は」は、Ａ及びＢの少なくとも１つを意味する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、２つより多い種、Ａ、Ｂ、及びＣなどを参照する場合の用語「及び／又は」は、Ａ、Ｂ、若しくはＣの少なくとも１つ、又はＡ、Ｂ、若しくはＣの任意の組合せの少なくとも１つを意味する（それぞれの種は単数又は複数の可能性がある）。
【００３６】
本明細書を通して、単語「含む（comprise）」又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」などの変形は、記述される整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群の含有を意味するが、任意の他の整数（若しくは成分）又は整数（若しくは成分）の群の排除を意味しないと理解される。
【００３７】
本明細書を通して、用語「含む（including）」は、「限定されるものではないが、含む（including but not limited to）」を意味するために用いられる。「含む（including）」と「限定されるものではないが、含む（including but not limited to）」とは、互換的に用いられる。
【００３８】
用語「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに組み込まれるアミノ酸に対する参照を含む。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸又はアミノ酸残基の任意のポリマーを含む。用語「ポリペプチド配列」とは、ポリペプチドを物理的に含む一連のアミノ酸又はアミノ酸残基を指す。「タンパク質」は、１又は２以上のポリペプチド鎖を含む大分子である。「ペプチド」は、合計１５〜２０未満のアミノ酸残基のサイズの小さいポリペプチドである。
【００３９】
用語「アミノ酸」、「アミノ酸残基」又はポリペプチド配列は、別途限定しない限り、天然のアミノ酸を含み、天然のアミノ酸と同様の様式で機能することができる天然アミノ酸の既知のアナログも含む。本明細書に記載のアミノ酸は、以下の表Ａのように短縮された記号で記載される。
【００４０】
【表１】
2019205435.tif 000002
【００４１】
ポリペプチドに関する語句「保存的置換」とは、ポリペプチド全体の機能及び構造を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す（Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2nd ed., 1992))を参照されたい）。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「発現された（expressed）」、「発現する（expressing）」又は「発現する（expresses）」とは、ポリヌクレオチド又は核酸の、ポリペプチド又はタンパク質への翻訳を指す。発現されたポリペプチド又はタンパク質は、細胞内に残存し、細胞表面膜の成分になるか、又は細胞外空間に分泌されてもよい。
【００４３】
本明細書で用いられる記号「α」は、記号の後の生体分子に結合することができる免疫グロブリン型結合領域の省略表現である。記号「α」は、記号の後の生体分子に結合するその能力に基づく免疫グロブリン型結合領域の機能的特徴を指すために用いられる。
【００４４】
細胞毒性タンパク質の細胞毒性活性に関する用語「選択的細胞毒性」とは、標的細胞集団と非標的バイスタンダー細胞集団との間の細胞毒性の相対レベルを指し、標的細胞型の細胞死滅の優先性を示すために、標的細胞型の最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）と非標的細胞型のＣＤ５０の比として表すことができる。
【００４５】
本発明の目的のために、用語「エフェクター」は、細胞毒性、生物学的シグナリング、酵素触媒作用、細胞内ルーティング、並びに／又は因子及び／若しくはアロステリック効果の動員をもたらす分子間結合などの生物学的活性を提供することを意味する。
【００４６】
本発明の目的のために、語句「に由来する」は、ポリペプチド領域がタンパク質中に元々見出されるアミノ酸配列を含み、ここで、全体的な機能及び構造が実質的に保存されるような元の配列からの付加、欠失、トランケーション、又は他の変化を含んでもよいことを意味する。
【００４７】
Ｉ．細胞毒性タンパク質の一般構造
本発明は、タンパク質が、１）細胞標的化のための免疫グロブリン型結合領域と、２）志賀毒素エフェクター領域とをそれぞれ含む、特定の細胞型の選択的死滅のための様々な細胞毒性タンパク質を提供する。細胞標的化免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素サブユニットＡ由来領域との連結は、強力な志賀毒素細胞毒性の細胞型特異的標的化の操作を可能にする。本発明の細胞毒性タンパク質は、細胞表面上に発現される標的生体分子などの、細胞と物理的に会合している少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる免疫グロブリン型結合領域に連結された、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域を含む。この一般構造は、任意数の多様な免疫グロブリン型結合領域を、志賀毒素サブユニットＡ由来エフェクター領域に連結して、同じ一般構造の変動をもたらすことができる点でモジュラー式である。
【００４８】
Ａ．免疫グロブリン型結合領域
本発明の細胞毒性タンパク質は、細胞外標的生体分子に選択的及び特異的に結合することができる１又は２以上のポリペプチドを含む免疫グロブリン型結合領域を含む。本明細書で用いられる用語「免疫グロブリン型結合領域」とは、抗原又はエピトープなどの、１又は２以上の標的生体分子に結合することができるポリペプチド領域を指す。免疫グロブリン型結合領域は、標的分子に結合するその能力によって機能的に定義される。免疫グロブリン型結合領域は、抗体又は抗体様構造から一般的に由来するが、他の起源に由来する代替足場もこの用語の範囲内に企図される。
【００４９】
免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質は、Ｉｇドメインとして知られる構造ドメインを有する。Ｉｇドメインは長さ約７０〜１１０アミノ酸残基の範囲であり、特徴的なＩｇ折畳みを有し、典型的には、７〜９個の逆平行ベータ鎖が２つのベータシートに整列し、サンドイッチ様構造を形成する。Ｉｇ折畳みは、サンドイッチの内部表面上での疎水性アミノ酸相互作用と、鎖中のシステイン残基間の高度に保存されたジスルフィド結合とにより安定化される。Ｉｇドメインは、可変（ＩｇＶ若しくはＶ−ｓｅｔ）、定常（ＩｇＣ若しくはＣ−ｓｅｔ）又は中間（ＩｇＩ若しくはＩ−ｓｅｔ）であってもよい。いくつかのＩｇドメインは、抗体のエピトープに結合する抗体の特異性にとって重要である、抗原結合領域（ＡＢＲ、antigen binding region）とも呼ばれる、相補性決定領域（ＣＤＲ、complementarity determining region）と会合することができる。Ｉｇ様ドメインも非免疫グロブリンタンパク質中に見出され、Ｉｇスーパーファミリーのタンパク質のメンバーに基づいて分類される。ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ、Gene Nomenclature Committee）は、Ｉｇ様ドメイン含有ファミリーのメンバーの一覧を提供する。
【００５０】
免疫グロブリン型結合領域は、アミノ酸配列が、例えば、分子操作又はライブラリースクリーニングにより、天然抗体又は非免疫グロブリンタンパク質のＩｇ様ドメインのものから変化した、抗体又はその抗原結合断片のポリペプチド配列であってもよい。免疫グロブリン型結合領域の生成における組換えＤＮＡ技術及びインビトロでのライブラリースクリーニングの関連性のため、抗体を再設計して、より小さいサイズ、細胞進入、又は他の治療的改善などの所望の特徴を得ることができる。可能な変動は多く、ちょうど１アミノ酸の変化から、例えば、可変領域の完全な再設計までの範囲であってもよい。典型的には、可変領域の変化を作製して、抗原結合特性を改善する、可変領域安定性を改善する、又は免疫原性応答の可能性を低下させることができる。
【００５１】
本発明の成分として企図されるいくつかの免疫グロブリン型結合領域が存在する。ある特定の実施形態においては、免疫グロブリン型結合領域は、細胞外標的生体分子に結合することができる抗体パラトープなどの、免疫グロブリン結合領域に由来する。ある特定の他の実施形態においては、免疫グロブリン型結合領域は、任意の免疫グロブリンドメインに由来しないが、細胞外標的生体分子に対して高親和性結合を提供することにより免疫グロブリン結合領域のように機能する操作されたポリペプチドを含む。この操作されたポリペプチドは、場合により、本明細書に記載の免疫グロブリンに由来する相補性決定領域を含むか、又はそれから本質的になるポリペプチド足場を含んでもよい。
【００５２】
高親和性結合能力により特定の細胞型にポリペプチドを標的化するのに有用である先行技術におけるいくつかの免疫グロブリン由来結合領域及び非免疫グロブリン操作ポリペプチドが存在する。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域は、単一ドメイン抗体ドメイン（ｓｄＡｂ、single-domain antibody domain）、ナノボディ、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体ドメイン（ＶＨＨ断片）、二価ナノボディ、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新抗原受容体（ＩｇＮＡＲ、immunoglobulin new antigen receptor）、ＶＮＡＲ断片、一本鎖可変（ｓｃＦｖ、single-chain variable）断片、多量体化ｓｃＦｖ断片（ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、二特異的タンデムｓｃＦｖ断片、ジスルフィド安定化抗体可変（Ｆｖ）断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるジスルフィド安定化抗原結合（Ｆａｂ）断片、二価Ｆ（ａｂ’）２断片、重鎖及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、一本鎖Ｆｖ−ＣＨ３ミニボディ、二特異的ミニボディ、二量体ＣＨ２ドメイン断片（ＣＨ２Ｄ、CH2 domain）、Ｆｃ抗原結合ドメイン（Ｆｃａｂ、Fcantigen binding）、単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３、complementary determining region 3）断片、拘束された(constrained)フレームワーク領域３、ＣＤＲ３、フレームワーク領域４（ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）ポリペプチド、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ、small modular immunopharmaceutical）ドメイン、並びにそのパラトープ及び結合機能を保持する前記の任意の遺伝子操作された対応物を含む群から選択される（概説については、Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)を参照されたい）。
【００５３】
ある特定の他の実施形態と一致して、免疫グロブリン型結合領域は、標的生体分子の高親和性及び特異的結合などの類似する機能的特徴を示し、より高い安定性又は低下した免疫原性などの、改善された特徴の操作を可能にする免疫グロブリンドメインに対する操作された代替足場を含んでもよい。本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態については、免疫グロブリン型結合領域は、操作されたフィブロネクチン由来第１０フィブロネクチンIII型（１０Ｆｎ３）ドメイン（モノボディ；AdNectin（商標）、又はAdNexin（商標））；操作されたテナシン由来テナシンIII型ドメイン（Centryn（商標））；操作されたアンキリンリピートモチーフ含有ポリペプチド（DARPin（商標））；操作された低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン（ＬＤＬＲ−Ａ、low-density-lipoprotein-receptor-derived, A domain）（Avimer（商標））；リポカリン（アンチカリン）；操作されたプロテアーゼ阻害剤由来Ｋｕｎｉｔｚドメイン；操作されたプロテインＡ由来Ｚドメイン（Affibody（商標））；操作されたガンマ−Ｂ結晶由来足場又は操作されたユビキチン由来足場（Affilin）；Ｓａｃ−７ｄ由来ポリペプチド（Nanoffitin（登録商標）又はアフィチン）；操作されたＦｙｎ由来ＳＨ２ドメイン（Fynomer（登録商標））；及び操作された抗体模倣物並びにその結合機能を保持する前記の任意の遺伝子操作された対応物を含む群から選択される（Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., NatBiotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36(2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)）。
【００５４】
結合領域成分が、本明細書に記載の細胞外標的生体分子に対する、１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは、２００ｎＭ未満の解離定数を有する限り、任意の上記の免疫グロブリン型結合領域を本発明の成分として用いることができる。
【００５５】
本発明のこのシステムは、様々な多様な免疫グロブリン型結合領域を同じ志賀毒素エフェクター領域と共に用いて、様々な細胞外標的生体分子の多様な標的化、及びかくして、様々な多様な細胞型への細胞毒性又は細胞増殖抑制の標的化を提供することができる点でモジュラー式である。
【００５６】
Ｂ．志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域
本発明の目的のために、語句「志賀毒素エフェクター領域」とは、リボソームを不活化し、細胞毒性効果及び／又は細胞増殖抑制効果をもたらすことができる志賀毒素ファミリーのメンバーの志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチド領域を指す。志賀毒素ファミリーのメンバーとは、構造的及び機能的に関連する、特に、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）及び大腸菌（E. coli）から単離される毒素（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）である天然タンパク質毒素のファミリーの任意のメンバーを指す。例えば、志賀毒素ファミリーは、志賀赤痢菌血清型１から単離される真の志賀毒素（Ｓｔｘ）、腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素１バリアント（ＳＬＴ１又はＳｔｘ１又はＳＬＴ−１又はＳｌｔ−Ｉ）、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離される志賀様毒素２バリアント（ＳＬＴ２又はＳｔｘ２又はＳＬＴ−２）を包含する。ＳＬＴ１はＳｔｘとただ１個の残基で異なり、両方ともベロ細胞毒素又はベロ毒素（ＶＴ、Verotoxin）と呼ばれている（O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)）。ＳＬＴ１及びＳＬＴ２バリアントはアミノ酸配列レベルでは互いに約５３〜６０％類似するに過ぎないが、それらは志賀毒素ファミリーのメンバーと共通の酵素活性及び細胞毒性の機構を共有する（Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)）。定義されたサブタイプＳｔｘ１ａ、Ｓｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、及びＳｔｘ２ａ〜ｇなどの、３９を超える異なる志賀毒素が記載されている（Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)）。志賀毒素をコードする遺伝子は水平遺伝子伝播により細菌種間で拡散し得るため、志賀毒素ファミリーのメンバーは任意の細菌種に自然に限定されない（Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol. 21: R242-6 (2011)）。種間伝播の一例として、志賀毒素は患者から単離されたアシネトバクター・ヘモリティクス（A. haemolyticus）の株中で発見された（Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)）。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが新しい亜種又は種に進入すると、志賀毒素アミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーと共通の細胞毒性の機能を依然として維持しながら、遺伝子ドリフト及び／又は選択圧のためわずかな配列変化を生じることができると推定される（Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)を参照されたい）。
【００５７】
本発明の志賀毒素エフェクター領域は、任意の形態のその天然志賀毒素Ｂサブユニットから解離した志賀毒素Ａサブユニットに由来するポリペプチドを含むか、又はそれから本質的になる。さらに、本発明の細胞毒性タンパク質は、天然志賀毒素Ｂサブユニットの機能的結合ドメインを含むか、又はそれから本質的になる任意のポリペプチドを含まない。むしろ、志賀毒素Ａサブユニット由来領域は、異種免疫グロブリン型結合領域と機能的に関連し、細胞標的化をもたらす。
【００５８】
ある特定の実施形態においては、本発明の志賀毒素エフェクター領域は、完全長志賀毒素Ａサブユニット（例えば、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ  配列番号２、又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３））を含むか、又はそれから本質的になってもよく、天然志賀毒素Ａサブユニットは、そのアミノ末端に約２２アミノ酸のシグナル配列を含有する前駆体形態を含んでもよく、このシグナル配列は除去されて成熟志賀毒素Ａサブユニットを産生することに留意されたい。他の実施形態においては、本発明の志賀毒素エフェクター領域は、完全長志賀毒素Ａサブユニットよりも短いトランケート型志賀毒素Ａサブユニットを含むか、又はそれから本質的になる。
【００５９】
志賀様毒素１Ａサブユニットトランケーションは触媒的に活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活化し、細胞内で発現された場合に細胞毒性である（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。完全な酵素活性を示す最も小さい志賀毒素Ａサブユニット断片は、Ｓｌｔ１Ａの残基１〜２３９から構成されるポリペプチドである（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。実質的な触媒活性を保持すると報告された志賀毒素Ａサブユニットの最も小さい断片は、ＳｔｘＡの残基７５〜２４７（Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)）であり、真核細胞内でデノボで発現されるＳｔｘＡトランケーションは細胞質ゾルに到達し、リボソームの触媒的不活化を示すためには最大でも残基２４０のみを必要とする（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【００６０】
志賀毒素エフェクター領域は一般に、完全長Ａサブユニットより小さくてもよい。志賀毒素エフェクター領域は、アミノ酸位置７７〜２３９に由来するポリペプチド領域（ＳＬＴ−１Ａ  配列番号１又はＳｔｘＡ  配列番号２）又は志賀毒素ファミリーのメンバーの他のＡサブユニットにおける等価物を維持することが好ましい。例えば、本発明のある特定の実施形態においては、ＳＬＴ−１Ａに由来する志賀毒素エフェクター領域は、配列番号１のアミノ酸７５〜２５１、配列番号１の１〜２４１、配列番号１の１〜２５１、又は配列番号１のアミノ酸１〜２６１を含むか、又はそれから本質的になってもよい。同様に、Ｓｔｘに由来する志賀毒素エフェクター領域は、配列番号２のアミノ酸７５〜２５１、配列番号２の１〜２４１、配列番号２の１〜２５１、又は配列番号２のアミノ酸１〜２６１を含むか、又はそれから本質的になってもよい。さらに、ＳＬＴ−２に由来する志賀毒素エフェクター領域は、配列番号３のアミノ酸７５〜２５１、配列番号３の１〜２４１、配列番号３の１〜２５１、又は配列番号３のアミノ酸１〜２６１を含むか、又はそれから本質的になってもよい。
【００６１】
本発明はさらに、志賀毒素エフェクター領域が最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０以上のアミノ酸残基によって（しかし、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を保持するもの以下によって）天然志賀毒素Ａサブユニットと異なる、本発明の細胞毒性タンパク質のバリアントを提供する。かくして、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来するポリペプチド領域は、天然志賀毒素Ａサブユニットに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％以上のアミノ酸配列同一性が維持される限り、元の配列からの付加、欠失、トランケーション、又は他の変化を含んでもよい。
【００６２】
従って、ある特定の実施形態においては、志賀毒素エフェクター領域は、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）などの、天然志賀毒素Ａサブユニットに対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．７％の全体的配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれから本質的になる。
【００６３】
場合により、完全長又はトランケート型の志賀毒素Ａサブユニットは、１又は２以上の
変異（例えば、置換、欠失、挿入又は逆位）を含んでもよい。本発明のある特定の実施形態においては、志賀毒素エフェクター領域は、宿主細胞形質転換、トランスフェクション、感染若しくは誘導の周知の方法によるか、又は志賀毒素エフェクター領域と連結された免疫グロブリン型結合領域を標的化することにより媒介される内在化により、細胞中への進入後に細胞毒性を保持する天然の志賀毒素Ａサブユニットに対する十分な配列同一性を有することが好ましい。志賀毒素Ａサブユニットにおける酵素活性及び／又は細胞毒性にとって最も重要な残基は、以下の残基位置：特に、アスパラギン−７５、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、及びアルギニン−１７６にマッピングされた（Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)）。本発明の実施形態のいずれかにおいて、志賀毒素エフェクター領域は、必須ではないが、好ましくは、ＳｔｘＡ、ＳＬＴ−１Ａ中の位置７７、１６７、１７０、及び２０３に見出されるものなどの位置の１若しくは２以上の保存されたアミノ酸、又は細胞毒性活性にとって典型的に必要とされる志賀毒素ファミリーの他のメンバー中の等価な保存された位置を維持してもよい。細胞死を引き起こす本発明の細胞毒性タンパク質の能力、例えば、その細胞毒性を、当業界で周知のいくつかのアッセイの任意の１又は２以上を用いて測定することができる。
【００６４】
本発明のある特定の実施形態においては、１又は２以上のアミノ酸残基を変異又は欠失させて、志賀毒素エフェクター領域の細胞毒性活性を低下させるか、又は除去することができる。志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの細胞毒性を、変異又はトランケーションによって無効化又は除去することができる。位置標識されたチロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、チロシン−１１４、及びトリプトファン−２０３は、Ｓｔｘ、Ｓｔｘ１、及びＳｔｘ２の触媒活性にとって重要であることが示されている（Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988)；Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992)；Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241:467-73 (1993)；Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993)；Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994)；Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させると、無細胞リボソーム不活化アッセイにおいてＳｌｔ−ＩＡ１の酵素活性が除去された（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体におけるＳｌｔ−ＩＡ１のデノボ発現を用いる別の手法において、グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させると、その発現レベルでＳｌｔ−ＩＡ１断片の細胞毒性が除去された（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。トランケーション分析により、残基７５〜２６８のＳｔｘＡの断片は依然としてインビトロで有意な酵素活性を保持することが示された（Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)）。残基１〜２３９を含有するＳｌｔ−ＩＡ１のトランケートされた断片は、インビトロで有意な酵素活性及び細胞質ゾル中でのデノボ発現による細胞毒性を示した（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体における残基１〜２３９にトランケートされたＳｌｔ−ＩＡ１断片の発現は、それが細胞質ゾル中に逆輸送することができないため、細胞毒性的ではなかった（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【００６５】
本発明の目的のために、志賀毒素エフェクター領域及び免疫グロブリン型結合領域について互いに、又は細胞毒性タンパク質全体のＮ末端及びＣ末端に関して、特定の順序又は向きは固定されない（例えば、図１を参照されたい）。上記の細胞毒性タンパク質において、免疫グロブリン型領域と志賀毒素エフェクター領域を、互いに直接連結する、及び／又は当業界で周知の１若しくは２以上のリンカーなどの、１若しくは２以上の介在ポリペプチド配列を介して互いに好適に連結することができる。
【００６６】
細胞外標的生体分子
本発明の細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域は、好ましくは、がん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染した細胞、又は細胞内病原体を担持する宿主細胞などの、所望の細胞型の表面に物理的にカップリングした細胞外標的生体分子に特異的に結合することができるポリペプチド領域を含む。
【００６７】
用語「標的生体分子」とは、特定の細胞型又は生物内の位置に細胞毒性タンパク質を標的化する免疫グロブリン型結合領域により結合され得る生物分子、一般にはタンパク質又はグリコシル化などの翻訳後改変により改変されるタンパク質を指す。細胞外標的生体分子は、非改変ポリペプチド、生化学的官能基の付加により改変されたポリペプチド、及び糖脂質などの、様々なエピトープを含んでもよい。細胞外標的生体分子は、内因的に内在化されるか、又は細胞毒性タンパク質との相互作用時に容易に内在化させられるのが望ましい。
【００６８】
本発明の目的のために、標的生体分子の改変に関する用語「細胞外」とは、その構造の少なくとも一部が細胞外環境に曝露される生体分子を指す。細胞外標的生体分子は、細胞膜成分、膜貫通タンパク質、細胞膜に固定される生体分子、細胞表面に結合する生体分子、及び分泌される生体分子を含む。
【００６９】
本発明に関して、標的生体分子を記述するために用いられる場合の用語「物理的にカップリングした」とは、それぞれ単一の相互作用のエネルギーが約１〜５キロカロリーの規模にある標的生体分子と細胞との複数の非共有的相互作用などの、標的生体分子、又はその一部を、細胞の外側にカップリングさせる共有及び／又は非共有分子間相互作用（例えば、静電結合、水素結合、Van der Walls相互作用、疎水性力など）を意味する。全ての内在性膜タンパク質並びに表在性膜タンパク質は、細胞膜と物理的にカップリングすることを見出すことができる。例えば、細胞外標的生体分子は、膜貫通領域、脂質アンカー、糖脂質アンカーを含む、並びに／又は前記のいずれかを含む因子と非共有結合（例えば、非特異的疎水性相互作用及び／若しくは脂質結合相互作用による）していてもよい。
【００７０】
本発明の細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域を、その標的生体分子の細胞型特異的発現及び／又は特定の細胞型に関するその標的生体分子の物理的局在化などの、いくつかの基準に基づいて設計又は選択することができる。例えば、本発明のある特定の細胞毒性タンパク質は、ただ１つの細胞型によってのみ発現される細胞表面標的を細胞表面に結合させることができる免疫グロブリン型結合ドメインを含む。これにより、細胞外標的生体分子を発現しない「バイスタンダー」細胞型と比較して高い優先性（少なくとも３倍の細胞毒性効果）での特定の細胞型の標的化された細胞死滅が可能になる。あるいは、免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子の発現は、細胞外標的生体分子が十分に低い量で発現される、及び／又は標的化されない細胞型と低量で物理的にカップリングする場合、ある細胞型に対して非排他的であってもよい。また、これにより、有意な量の細胞外標的生体分子を発現しないか、又は有利な量の細胞外標的生体分子に物理的にカップリングしない「バイスタンダー」細胞型と比較して、高い優先性（少なくとも３倍の細胞毒性効果）での特定の細胞型の標的化された細胞死滅も可能になる。標的細胞を、エクスビボ、インビトロでの培養、又は多細胞生物内のその天然の位置におけるインサイチュの細胞を含むインビボなどの、細胞の様々な条件下で本発明の細胞毒性タンパク質を用いて死滅させることができる。
【００７１】
本発明の細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域の細胞外標的生体分子は、がん細胞、免疫細胞、並びにウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原生動物などの細胞内病原体に感染した細胞上に過剰な比率で、又は専ら存在するバイオマーカーを含んでもよい。
【００７２】
ある特定の実施形態においては、免疫グロブリン型結合領域は、がん細胞の細胞表面上の表面抗原への特異的及び高親和性結合について選択され、その場合、抗原はその発現ががん細胞に限定される（Glokler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010)；Liu Y et al., Lab Chip9: 1033-6 (2009)を参照されたい）。他の実施形態によれば、免疫グロブリン型結合領域は、がん細胞の細胞表面上の表面抗原への特異的及び高親和性結合について選択され、その場合、抗原は非がん細胞と比較してがん細胞により過剰発現されるか、又は優先的に発現される。いくつかの代表的な標的生体分子としては、限定されるものではないが、がん及び／又は特定の免疫細胞型と関連する以下に列挙される標的が挙げられる。Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ２０（ＣＤ２０）、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７９、ＣＤ２４８（エンドシアリン）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ−３）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原）、がん胎児抗原タンパク質（ＣＥＡ、carcinoembryonic antigen protein）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２／ＣＤ３４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ、epithelial cell adhesion molecule）、エフリンＢ型受容体２（ＥｐｈＢ２、Ephrin type-B receptor 2）、エプスタイン−バーウイルス抗原タンパク質、前立腺特異的膜抗原タンパク質（ＰＳＭＡ、prostate-specific membrane antigen protein）、エンドグリン（ＥＮＤ／ＣＤ１０５）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、fibroblast activation protein／セプラーゼ）、及び血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ、vascular endothelial growth factor receptor）を標的とする結合領域などの、がん細胞と関連するエピトープを認識する多くの免疫グロブリン型結合領域が先行技術に存在する（Bagley R et al., Int J Oncol 34: 619-27 (2009)を参照されたい）。標的生体分子のこの一覧は、非限定的であることが意図される。当業者であればがん細胞型と関連する任意の所望の標的生体分子を用いて、志賀毒素エフェクター領域とカップリングされる免疫グロブリン型結合領域を設計又は選択して、本発明の細胞毒性タンパク質を産生することができることを理解できる。
【００７３】
がん細胞と強く関連する他の標的生体分子の例は、Ｂリンパ球抗原タンパク質ＣＤ１９（ＣＤ１９）、ＣＤ２１、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７又はＳＬＡＭＦ７）、細胞表面Ａ３３抗原タンパク質（ｇｐＡ３３）、ムチン（ＭＵＣ１など）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、IX型炭酸脱水酵素（ＣＡ９、carbonic anhydrase IX／ＣＡＩＸ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ、folate binding protein）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、インテグリンアルファ−Ｖベータ−３（αｖβ３）、インテグリンアルファ−５ベータ−１（α５β１）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒＢ−３、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ、insulin-like growth factor 1 receptor）、エフリンＡ型受容体３（ＥｐｈＡ３）、腫瘍壊死因子受容体１０Ａ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＤＲ４）、腫瘍壊死因子受容体１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、核因子カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、receptor activator of nuclear factor kappa B）、テナシンＣ、クラウジンタンパク質（ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４）、メソテリン（ＭＳＬＮ）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）である（Hough C et al., Cancer Res 60: 6281-7 (2000)；Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000)；Pastan I et al., NatRev Cancer 6: 559-65 (2006)； Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)； Fitzgerald D et al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011)；Scott et al., Cancer Immun 12: 14-22 (2012)を参照されたい）。標的生体分子のこの一覧は、非限定的であることが意図される。
【００７４】
さらに、Ｔ細胞タンパク質により認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ−１／メランＡ）、メラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ（ｇｐ１００）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）、メラノーマ関連抗原１タンパク質（ＭＡＧＥ−１）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ−３）、ＧＡＧＥ／ＰＡＧＥタンパク質、ＢＡＧＥタンパク質、メラノーマの優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ、Preferentially Expressed Antigen of Melanoma）タンパク質、糖化最終産物のための受容体（ＲＡＧＥ、receptor for advanced glycation end product）、がん精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん精巣抗原ＬＡＧＥタンパク質、リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＬＰＧＡＴ１、lysophosphatidlglycerolacyltransferase 1／ＩＡＡ０２０５）、ＳＡＲＴタンパク質、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＴ１、ＡＲＴ４）、ウィルムス腫瘍抗原、前立腺特異的抗原タンパク質（ＰＳＡ、prostate specific antigen）、前立腺幹細胞抗原タンパク質（ＰＳＣＡ、prostate stem cell antigen）、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ、human aspartyl (asparaginyl) beta-hydroxylase）、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−３、Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原１タンパク質（ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ）、チロシナーゼ関連抗原（ＴＡＡ、tyrosinase associated antigen）、破壊点クラスター領域−ｃ−ａｂｌがん遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ、break point cluster region-c-abl oncogene）タンパク質、アルファ−フェトタンパク質抗原１７−Ａ１タンパク質、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ、bladder tumor antigen）、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５、Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、ｓｉｇｌｅｃ−８、ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＦｃｅＲＩａ、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ〜ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２８４−ＴＬＲ４、ＣＤ１０７−Ｍａｃ３、ＣＤ１９５−ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２−ＴＬＲ２、及びＣＤ１２３などの標的生体分子のいくつかの他の例が存在する（標的生体分子については、Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14(2012)；Cheever M et al., Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009)を参照されたい、また、そこに記載される標的分子は非限定例であることに留意されたい）。当業者であれば、任意の所望の標的生体分子を用いて、志賀毒素エフェクター領域とカップリングされる免疫グロブリン型結合領域を設計又は選択して、本発明の細胞毒性タンパク質を産生することができることを理解できる。
【００７５】
II．細胞毒性タンパク質の特定の構造変化の例
本発明のある特定の実施形態のうち、細胞毒性タンパク質は、ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸７５〜２５１を含むか、又はそれから本質的になる志賀毒素エフェクター領域を含む。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２４１を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２５１を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。さらなる実施形態は、志賀毒素エフェクター領域がＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、ＳｔｘＡ（配列番号２）、及び／又はＳＬＴ−２Ａ（配列番号３）のアミノ酸１〜２６１を含むか、又はそれから本質的になる細胞毒性タンパク質である。
【００７６】
本発明のある特定の実施形態について、免疫グロブリン型結合領域は、配列番号４のアミノ酸２６９〜５０８を含むか、又はそれから本質的になり、ヒトＣＤ３８に対して特異的な高親和性結合を示す。本発明のある特定の実施形態のうち、免疫グロブリン型結合領域は、配列番号５のアミノ酸１〜１１９を含むか、又はそれから本質的になり、ヒトＨＥＲ２に対して特異的な高親和性結合を示す。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「重鎖可変（ＶＨ）ドメイン」又は「軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン」はそれぞれ、任意の抗体ＶＨ又はＶＬドメイン（例えば、ヒトＶＨ又はＶＬドメイン）並びに対応する天然抗体の少なくとも定性的抗原結合能力を保持するその任意の由来体（例えば、天然マウスＶＨ又はＶＬドメインに由来するヒト化ＶＨ又はＶＬドメイン）を指す。ＶＨ又はＶＬドメインは、３つのＣＤＲ又はＡＢＲにより中断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域は、抗原のエピトープへの特異的結合のためにＣＤＲを整列させるように働く。アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＶＨとＶＬドメインは両方とも、以下のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ領域：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。
【００７８】
機構的細胞外標的生体分子結合部位を含有し、さらにより好ましくは、高い親和性（例えば、ＫＤにより示される）で標的生体分子に結合することができる本発明の細胞毒性タンパク質のポリペプチドの断片、バリアント、及び／又は由来体を用いることは本発明の範囲内にある。例えば、本発明は、ＣＤ３８に結合するポリペプチド配列及びＨＥＲ２に結合することができるポリペプチド配列を提供する。ポリペプチドを含む任意の免疫グロブリン型結合領域を、１０−５〜１０−１２モル／リットル、好ましくは２００ｎＭ未満の解離定数で、細胞表面上に発現されるＣＤ３８又はＨＥＲ２に結合するこの領域に置換することができる。
【００７９】
本発明のある特定の実施形態のうち、免疫グロブリン型結合領域は、ナノボディ又は単一ドメイン免疫グロブリン由来領域ＶＨＨに由来する。一般に、ナノボディは、ラクダ科動物及び軟骨魚類（軟骨魚綱）に見出される種類の天然の単一単量体可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の断片から構築される。ナノボディは、単一単量体可変ドメインをトランケートして、より小さく、より安定な分子を作製することにより、これらの天然抗体から操作される。その小さいサイズのため、ナノボディは全抗体に接近可能ではない抗原に結合することができる。本発明のある特定の実施形態のうち、免疫グロブリン型結合領域は、ヒトＨＥＲ２タンパク質に対する特異的な高親和性結合を示す、ナノボディ又は単一ドメイン免疫グロブリン由来領域ＶＨＨ（例えば、配列番号５のアミノ酸１〜１１９）に由来する。
【００８０】
III．細胞毒性タンパク質の一般機能
本発明は、タンパク質が、１）細胞標的化のための免疫グロブリン型結合領域と、２）細胞死滅のための志賀毒素エフェクター領域をそれぞれ含む、特定の細胞型の選択的死滅のための様々な細胞毒性タンパク質を提供する。細胞標的化免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素サブユニットＡ由来領域との連結により、強力な志賀毒素細胞毒性又は細胞増殖抑制の細胞型特異的標的化の操作が可能になる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質は、特定の細胞型の細胞表面と結合した細胞外標的生体分子に結合し、これらの細胞に進入することができる。標的化された細胞型内に内在化されると、本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態は、細胞毒性志賀毒素エフェクターポリペプチド断片を標的細胞の細胞質ゾル中に送ることができる。標的化された細胞型の細胞質ゾル中に入ると、本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態は、リボソームを酵素的に不活化し、最終的に細胞を死滅させることができる。このシステムは、任意数の多様な免疫グロブリン型結合領域を用いて、この強力な細胞毒性を様々な多様な細胞型に標的化することできる点で、また、様々な志賀毒素サブユニットＡ由来エフェクター領域が一度真核細胞内に入ると強力に細胞毒性となるため、モジュラー式である。
【００８１】
Ａ．標的化された志賀毒素細胞毒性による細胞死滅
志賀毒素ファミリーのメンバーは真核細胞を死滅させるように適合化されるため、志賀毒素エフェクター領域を用いて設計される細胞毒性タンパク質は、強力な細胞死滅活性を示すことができる。志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットは、細胞の細胞質ゾル中に入ると、真核細胞を死滅させることができる酵素ドメインを含む。本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態は、この細胞毒性機構を利用する。
【００８２】
本発明の細胞毒性タンパク質のある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質の免疫グロブリン型結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞を接触させる際に、細胞毒性タンパク質は細胞死を引き起こすことができる。細胞死滅を、エクスビボで操作された標的細胞、インビトロで培養された標的細胞、インビトロで培養された組織試料内の標的細胞、又はインビボでの標的細胞などの、標的細胞の様々な条件下で本発明の細胞毒性タンパク質を用いて達成することができる。
【００８３】
Ｂ．細胞型間の選択的細胞毒性
高親和性免疫グロブリン型結合領域を用いて特定の細胞型への酵素的に活性な志賀毒素領域の送達を標的化することにより、この強力な細胞死滅活性を、選択された細胞型を優先的に死滅させるように限定することができる。
【００８４】
ある特定の実施形態においては、細胞型の混合物への本発明の細胞毒性タンパク質を投与すると、細胞毒性タンパク質は、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングしていない細胞型と比較して細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞を選択的に死滅させることができる。志賀毒素ファミリーのメンバーは真核細胞を死滅させるために適合化されているため、志賀毒素エフェクター領域を用いて設計される細胞毒性タンパク質は、強力な細胞毒性活性を示すことができる。高親和性免疫グロブリン型結合領域を用いて特定の細胞型への酵素的に活性な志賀毒素領域の送達を標的化することにより、この強力な細胞死滅活性を、選択された免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子とのその物理的会合により標的化されることが望まれる細胞型のみを優先的に死滅させるように限定することができる。
【００８５】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質は、２又は３以上の異なる細胞型の混合物内で特定の細胞型の死滅を選択的又は優先的に引き起こすことができる。これにより、標的生体分子を発現しない「バイスタンダー」細胞型と比較して、３倍の細胞毒性効果などの、高い優先性での特定の細胞型への標的化された細胞毒性活性が可能になる。あるいは、免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子の発現は、標的生体分子が十分に低い量で発現される、及び／又は標的化されない細胞型と低量で物理的にカップリングする場合、ある細胞型にとって非排他的であってもよい。これにより、有意な量の標的生体分子を発現しないか、又は有意な量の標的生体分子に物理的にカップリングしない「バイスタンダー」細胞型と比較して、３倍の細胞毒性効果などの高い優先性での特定の細胞型の標的化された細胞死滅が可能になる。
【００８６】
ある特定のさらなる実施形態においては、２つの異なる集団の細胞型に細胞毒性タンパク質を投与すると、細胞毒性タンパク質は、メンバーが細胞毒性タンパク質の結合領域の細胞外標的生体分子を発現しない細胞集団に対する同じ細胞毒性タンパク質の最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）用量よりも少なくとも３倍低い用量で、メンバーが細胞毒性タンパク質の結合領域の細胞外標的生体分子を発現する標的細胞の集団に対するＣＤ５０により定義される細胞死を引き起こすことができる。
【００８７】
ある特定の実施形態においては、細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞型の集団に対する細胞毒性活性は、免疫グロブリン型結合領域の任意の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングしていない細胞型の集団に対する細胞毒性活性よりも少なくとも３倍高い。本発明によれば、選択的細胞毒性を、（ａ）結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングした特定の細胞型の細胞集団に対する細胞毒性と、（ｂ）免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングしていない細胞型の細胞集団に対する細胞毒性との比（ａ／ｂ）を単位として定量することができる。ある特定の実施形態においては、細胞毒性比は、免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングしていない細胞又は細胞型の集団と比較して、免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングした細胞又は細胞型の集団について少なくとも３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、又は１０００倍高い選択的細胞毒性を示す。
【００８８】
この優先的細胞死滅機能により、様々な条件下で、及びエクスビボで操作された細胞型の混合物、細胞型の混合物と共にインビトロで培養された組織などの非標的化バイスタンダー細胞の存在下、又は複数の細胞型の存在下でインビボで（例えば、インサイチュで、若しくは多細胞生物内のその天然の位置で）、本発明のある特定の細胞毒性タンパク質により標的細胞を死滅させることができる。
【００８９】
さらに、触媒的に不活性な形態の本発明の細胞毒性タンパク質を、場合により診断機能のために用いることができる。当業界で公知のさらなる診断剤の、本発明の細胞毒性タンパク質へのコンジュゲーションは、患者又は生検試料における、個々のがん細胞、免疫細胞、又は微生物感染細胞の細胞内器官（例えば、ゴルジ体、小胞体、及び細胞質ゾル画分）の画像化を可能にしてもよい。例えば、これは、新生物細胞型の診断、経時的な抗がん剤療法の進行のアッセイ、及び／又は腫瘍塊の外科的切除後の残存がん細胞の存在の評価において有用であり得る。
【００９０】
全体的な構造及び機能を維持する細胞毒性タンパク質のポリペプチド配列の変化
特定の上記実施形態において、本発明の細胞毒性タンパク質は、ポリペプチド領域中に導入された１又は２以上のアミノ酸置換が存在するバリアントである。本明細書で用いられる用語「保存的置換」は、１又は２以上のアミノ酸が別の生物学的に類似するアミノ酸残基により置き換えられることを示す。例としては、類似する特性を有するアミノ酸残基、例えば、小さいアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の置換を含む（例えば、以下の表Ｂを参照されたい）。通常は内因性の哺乳動物ペプチド及びタンパク質中には見出されない残基との保存的置換の例は、アルギニン又はリシン残基の、例えば、オルニチン、カナバリン、アミノエチルシステイン、又は別の塩基性アミノ酸との保存的置換である。ペプチド及びタンパク質における表現型的にサイレントな置換に関するさらなる情報については、例えば、Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)を参照されたい。以下の図表は、物理化学的特性により分類されたアミノ酸の保存的置換である。Ｉ：中性、親水性、II：酸性及びアミド、III：塩基性、IV：疎水性、Ｖ：芳香族、嵩高いアミノ酸。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質は、それが単独で、又は細胞毒性タンパク質の成分として測定可能な生物学的活性を保持する限り、本明細書に記載のポリペプチド配列と比較して、多くても２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１アミノ酸の置換を有する本発明のポリペプチド領域の機能的断片又はバリアントを含んでもよい。細胞毒性タンパク質のバリアントは、細胞毒性の変化、細胞増殖抑制効果の変化、免疫原性の変化、及び／又は血清半減期の変化などの所望の特性を達成するために、免疫グロブリン型結合領域又は志賀毒素エフェクター領域の中などの、１若しくは２以上のアミノ酸を変化させるか、又は１若しくは２以上のアミノ酸を欠失させるか、若しくは挿入することにより、細胞毒性タンパク質のポリペプチドを変化させる結果として、本発明の範囲内にある。本発明の細胞毒性タンパク質のポリペプチドはさらに、シグナル配列を含むか、又は含まなくてもよい。
【００９３】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質は、それが細胞毒性、細胞外標的生体分子結合、酵素的触媒作用、又は細胞内ルーティングなどの、測定可能な生物学的活性を保持する限り、本明細書に記載の細胞毒性タンパク質のアミノ酸配列のいずれか一つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。免疫グロブリン型結合領域は、それがその細胞外標的生体分子への結合機能を保持する限り、本明細書に記載の細胞毒性タンパク質のアミノ酸配列と異なっていてもよい。ＣＤＲ又はＡＢＲのアミノ酸配列が同一である場合、結合機能が保持される可能性が最も高い。例えば、細胞毒性タンパク質は、アミノ酸同一性の程度を決定するために、ＣＤＲ又はＡＢＲを形成するアミノ酸残基を無視する、本明細書に記載の細胞毒性タンパク質に対する８５％のアミノ酸同一性から本質的になる細胞毒性タンパク質は、特許請求の範囲内にある。当業者であれば、結合機能を、標準的な技術を用いて決定することができる。
【００９４】
ある特定の実施形態においては、志賀毒素エフェクター領域を変化させて、志賀毒素エフェクター領域の酵素活性及び／又は細胞毒性を変化させることができる。この変化は、変化した志賀毒素エフェクター領域が成分である細胞毒性タンパク質の細胞毒性の変化をもたらしても、又はもたらさなくてもよい。可能な変化としては、トランケーション、欠失、逆位、挿入及び置換からなる群から選択される志賀毒素エフェクター領域に対する変異が挙げられる。
【００９５】
志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットの細胞毒性を、変異又はトランケーションにより無効化又は除去することができる。位置標識されたチロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、チロシン−１１４、及びトリプトファン−２０３は、Ｓｔｘ、Ｓｔｘ１、及びＳｔｘ２の触媒活性にとって重要であることが示されている（Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988)；Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992)；Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241:  467-73 (1993)；Ohmura M et al.,Microb Pathog 15: 169-76 (1993)；Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994)；Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)）。グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させると、無細胞リボソーム不活化アッセイにおいてＳｌｔ−ＩＡ１の酵素活性が除去された（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体におけるＳｌｔ−ＩＡ１のデノボでの発現を用いる別の手法において、グルタミン酸−１６７とアルギニン−１７０の両方を変異させると、その発現レベルでＳｌｔ−ＩＡ１断片細胞毒性が除去された（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。トランケーション分析により、残基７５〜２６８のＳｔｘＡの断片がインビトロで有意な酵素活性を依然として保持することが示された（Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)）。残基１〜２３９を含有するＳｌｔ−ＩＡ１のトランケートされた断片は、インビトロで有意な酵素活性及び細胞質ゾル中でのデノボでの発現による細胞毒性を示した（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。小胞体中での残基１〜２３９にトランケートされたＳｌｔ−ＩＡ１断片の発現は、それが細胞質ゾル中に逆輸送することができないため、細胞毒性ではなかった（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【００９６】
志賀毒素Ａサブユニット中の酵素活性及び／又は細胞毒性にとって最も重要な残基は、以下の残基位置：特に、アスパラギン−７５、チロシン−７７、グルタミン酸−１６７、アルギニン−１７０、及びアルギニン−１７６にマッピングされた（Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)）。特に、グルタミン酸−Ｅ１６７からリシン及びアルギニン−１７６からリシンへの変異を含有するＳｔｘ２Ａの二重変異体構築物は、完全に不活化されたが、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２中の多くの単一の変異は、細胞毒性の１０倍の低下を示した。さらに、Ｓｔｘ１Ａの１〜２３９又は１〜２４０へのトランケーションはその細胞毒性を低下させ、同様に、Ｓｔｘ２Ａの保存的疎水性残基へのトランケーションはその細胞毒性を低下させた。
【００９７】
志賀様毒素１Ａサブユニットトランケーションは触媒的に活性であり、インビトロでリボソームを酵素的に不活化することができ、及び細胞内で発現された場合に細胞毒性的である（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。完全な酵素活性を示す最も小さい志賀毒素Ａサブユニット断片は、Ｓｌｔ１Ａの残基１〜２３９から構成されるポリペプチドである（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。実質的な触媒活性を保持すると報告された志賀毒素Ａサブユニットの最も小さい断片はＳｔｘＡの残基７５〜２４７であったが（Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)）、真核細胞内でデノボで発現されるＳｔｘＡトランケーションは、細胞質ゾルに到達し、リボソームの触媒的不活化を示すためには最大で残基２４０のみを必要とする（LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)）。
【００９８】
ＳＬＴ−１Ａ（配列番号１）、又はＳｔｘＡ（配列番号２）に由来する特定の実施形態においては、これらの変化は、位置７５のアスパラギン、位置７７のチロシン、位置１１４のチロシン、位置１６７のアスパラギン酸、位置１７０のアルギニン、位置１７６のアルギニンの置換、及び／又は位置２０３のトリプトファンの置換を含む。位置７５のアスパラギンからアラニンへの置換、位置７７のチロシンからセリンへの置換、位置１１４のチロシンからアラニンへの置換、位置１６７のアスパラギン酸からグルタミン酸への置換、位置１７０のアルギニンからアラニンへの置換、位置１７６のアルギニンからリシンへの置換、及び／又は位置２０３のトリプトファンからアラニンへの置換などの、そのような置換の例は、先行技術に基づけば当業者には公知である。
【００９９】
本発明の細胞毒性タンパク質は、場合により、当業界で公知の治療剤及び／又は診断剤を含んでもよい１又は２以上のさらなる薬剤にコンジュゲートさせてもよい。
【０１００】
細胞毒性タンパク質の産生、製造、及び精製
本発明の細胞毒性タンパク質を、当業者には周知の生化学的操作技術を用いて産生することができる。例えば、本発明の細胞毒性タンパク質を、標準的な合成方法により、組換え発現系の使用により、又は任意の他の好適な方法により製造することができる。かくして、細胞毒性タンパク質を、例えば、（１）標準的な固相若しくは液相方法を用いて、段階的に、若しくは断片集合により細胞毒性タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分を合成し、最終ペプチド化合物産物を単離及び精製するステップ；（２）宿主細胞中で細胞毒性タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを発現させ、宿主細胞若しくは宿主細胞培養物から発現産物を回収するステップ；又は（３）細胞毒性タンパク質のポリペプチド若しくはポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞でインビトロで発現させ、発現産物を回収するステップ；又は（１）、（２）若しくは（３）の方法の任意の組合せによりペプチド成分の断片を取得した後、その断片を接続（例えば、ライゲート）して、ペプチド成分を取得し、ペプチド成分を回収するステップを含む方法などのいくつかの方法で合成することができる。
【０１０１】
固相又は液相ペプチド合成を用いて本発明の細胞毒性タンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成することが好ましい。本発明の細胞毒性タンパク質を、好適には、標準的な合成方法により製造することができる。かくして、ペプチドを、例えば、標準的な固相又は液相方法により、段階的に、又は断片集合によりペプチドを合成し、最終ペプチド産物を単離及び精製するステップを含む方法により合成することができる。この文脈において、国際公開第ＷＯ１９９８／１１１２５号パンフレット、又は特に、Fields, G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Gregory A. Grant (ed.), Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002)及びその中の合成例を参照することができる。
【０１０２】
本発明の細胞毒性タンパク質を、当業界で周知の組換え技術を用いて調製（産生及び精製）することができる。一般に、コードするポリヌクレオチドを含むベクターを形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによりポリペプチドを調製する方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989)；Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995)に記載されている。任意の好適な宿主細胞を用いて、本発明の細胞毒性タンパク質を産生させることができる。宿主細胞は、本発明のポリペプチドの発現を誘導する１又は２以上の発現ベクターを安定的に、若しくは一過的にトランスフェクトされた、形質転換された、形質導入された、又は感染させた細胞であってもよい。さらに、本発明の細胞毒性タンパク質を、細胞毒性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを改変し、１若しくは２以上のアミノ酸の変化又は１若しくは２以上のアミノ酸の挿入をもたらし、細胞毒性の変化、細胞増殖抑制効果の変化、免疫原性の変化、及び／又は血清半減期の変化などの所望の特性を達成することによって産生することができる。
【０１０３】
従って、本発明はまた、上記の方法に従って本発明の細胞毒性タンパク質を産生し、本発明のポリペプチドの一部又は全部をコードするポリヌクレオチド、宿主細胞中に導入された場合に本発明のポリペプチドの一部若しくは全部をコードすることができる本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又は本発明のポリヌクレオチド若しくは発現ベクターを含む宿主細胞を使用する方法も提供する。
【０１０４】
ポリペプチド又はタンパク質を宿主細胞又は無細胞系において組換え技術を用いて発現させる場合、高純度のものであるか、又は実質的に均一である調製物を得るために、宿主細胞因子などの他の成分から所望のポリペプチド又はタンパク質を分離（又は精製）することが有利である。遠心分離技術、抽出技術、クロマトグラフィー技術及び分画技術（ゲル濾過によるサイズ分離、イオン交換カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＤＥＡＥなどのシリカ若しくは陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、及び夾雑物を除去するためのプロテインＡセファロースクロマトグラフィーによる電荷分離）、並びに沈降技術（例えば、エタノール沈降又は硫酸アンモニウム沈降）などの、当業界で周知の方法により、精製を達成することができる。任意数の生化学的精製技術を用いて、本発明の細胞毒性タンパク質の純度を増加させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質を、場合によりホモ多量体形態（すなわち、２又は３以上の同一の細胞毒性タンパク質のタンパク質複合体）で精製することができる。
【０１０５】
以下の実施例は、本発明の細胞毒性タンパク質を産生するための方法の非限定例、並びに開示される例示的細胞毒性タンパク質に関する細胞毒性タンパク質産生の特異的であるが、非限定的な態様の説明である。
【０１０６】
細胞毒性タンパク質を含む医薬組成物
本発明は、以下にさらに詳細に説明される状態、疾患、障害、又は症状（例えば、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、免疫障害及び微生物感染症）の治療又は予防のための、医薬組成物における、単独での、又は１若しくは２以上のさらなる治療剤と組み合わせた使用のための細胞毒性タンパク質を提供する。本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と一緒に、本発明の細胞毒性タンパク質、又は本発明によるその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、ホモ多量体及び／又はヘテロ多量体形態の本発明の細胞毒性タンパク質を含んでもよい。医薬組成物は、以下にさらに詳細に説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療、改善、又は予防する方法において有用である。それぞれのそのような疾患、状態、障害、又は症状は、本発明による医薬組成物の使用に関して別々の実施形態であると想定される。本発明は、以下により詳細に説明されるような、本発明による治療の少なくとも１つの方法における使用のための医薬組成物をさらに提供する。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「患者」と「対象」は、少なくとも１つの疾患、障害、又は状態の症状、兆候、及び／又は指示を呈する、任意の生物、一般には、ヒト及び動物などの脊椎動物を指すように互換的に用いられる。これらの用語は、霊長類、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、ペット（例えば、ネコ、イヌなど）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラットなど）の非限定例などの哺乳動物を含む。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、「治療する」、「治療すること」又は「治療」及びその文法的なバリアントは、有益な、又は望ましい臨床結果を得るための手法を指す。この用語は、状態、障害若しくは疾患の開始若しくは発症速度を減速させること、それと関連する症状を軽減若しくは緩和すること、状態の完全若しくは部分的な退縮を生成すること、又は上記のいずれかのいくつかの組合せを指してもよい。本発明の目的のために、有益な、又は望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であっても、又は検出不可能であっても、症状の軽減若しくは緩和、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化（例えば、悪化しないこと）、疾患進行の遅延若しくは減速、疾患状態の改善若しくは緩和、及び寛解（部分的又は全体的）が挙げられる。「治療する」、「治療すること」又は「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較した生存の延長を意味してもよい。かくして、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）は、問題の疾患又は障害に既に罹患した対象であってもよい。用語「治療する」、「治療すること」又は「治療」は、治療の非存在下と比較した病的状態又は症状の重篤度の増加の阻害又は軽減を含み、関連する疾患、障害、又は状態の完全な停止を含意することを必ずしも意味しない。
【０１０９】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」及びその文法的なバリアントは、状態、疾患、又は障害の発生を予防するか、又はその病状を変化させるための手法を指す。したがって、「予防」は、予防的又は予防的手段を指し得る。本発明の目的のために、有益な、又は望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であっても、又は検出不可能であっても、疾患の症状、進行又は発達の予防又は減速が挙げられる。かくして、予防を必要とする対象（例えば、ヒト）は、問題の疾患又は障害にまだ罹患していない対象であってもよい。用語「予防」は、治療の非存在下と比較した疾患の開始の減速を含み、関連する疾患、障害又は状態の永続的な予防を含意することを必ずしも意味しない。かくして、状態を「予防すること」又はその「予防」は、ある特定の文脈では、状態を発生する危険性を低下させること、又は状態と関連する症状の発達を予防するか、若しくは遅延させることを指してもよい。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、「有効量」又は「治療上有効量」は、標的状態を予防若しくは治療すること、又は状態と関連する症状を有益に緩和することなどの、対象において少なくとも１つの望ましい治療効果をもたらす組成物（例えば、治療組成物又は薬剤）の量又は用量である。最も望ましい治療上有効量は、それを必要とする所与の対象のために当業者により選択される特定の治療の所望の有効性をもたらす量である。この量は、限定されるものではないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティなど）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類、疾患の段階、一般的な身体状態、所与の用量に対する応答性、及び医薬の種類など）、製剤中の薬学的に許容される担体の性質、並びに投与経路などの、当業者によって理解される様々な因子に応じて変化する。臨床及び薬学業界の当業者であれば、日常的な実験を介して、すなわち、化合物の投与に対する対象の応答をモニタリングし、それに従って用量を調整することにより、治療上有効量を決定することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)を参照されたい）。
【０１１１】
細胞毒性タンパク質を含む医薬組成物の産生又は製造
本発明の細胞毒性タンパク質のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物は同様に本発明の範囲内にある。
【０１１２】
本発明の文脈における用語「溶媒和物」とは、溶質（この場合、本発明によるポリペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩）と溶媒との間で形成される規定の化学量論の複合体を指す。この文脈では、溶媒は、例えば、水、エタノール又は別の薬学的に許容される、典型的には、低分子有機種、例えば、限定されるものではないが、酢酸若しくは乳酸であってもよい。問題の溶媒が水である場合、そのような溶媒和物は通常、水和物と呼ばれる。
【０１１３】
本発明の細胞毒性タンパク質、又はその塩を、典型的には、薬学的に許容される担体中に、治療上有効量の本発明の化合物、又はその塩を含む、保存又は投与のために調製される医薬組成物として製剤化することができる。用語「薬学的に許容される担体」は、任意の標準的な医薬担体を含む。治療的使用のための薬学的に許容される担体は、製薬業界で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)に記載されている。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、任意かつ全ての生理学的に許容される、すなわち、適合性の、溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤、等張剤、及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、経口、直腸、経鼻又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮など）投与にとって好適な製剤において用いられるものが挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、滅菌注射溶液又は分散物の即興での調製のための滅菌水性溶液又は分散物及び滅菌粉末が挙げられる。本発明の医薬組成物中で用いることができる好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びその好適な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散物の場合は必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。ある特定の実施形態においては、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は輸注による）にとって好適なものである。選択される投与経路に応じて、細胞毒性タンパク質又は他の薬学的成分を、活性細胞毒性タンパク質が特定の投与経路により患者に投与された場合に遭遇し得る、低いｐＨの作用及びその他の自然の不活化条件から化合物を保護することを意図される材料中でコーティングすることができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物の製剤を、単位投与形態で都合良く提供し、製薬業界において周知の任意の方法により調製することができる。そのような形態では、組成物は適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割される。単位投与形態は、包装された調製物、個別量の調製物を含有する包装、例えば、パケット化された錠剤、カプセル、及びバイアル又はアンプル中の粉末であってもよい。単位投与形態はまた、カプセル、カシェ、若しくは錠剤自体であってもよく、又はそれは適切な数のこれらの包装された形態のいずれかであってもよい。それを、単一用量の注射可能な形態で、例えば、ペンの形態で提供することができる。組成物を、任意の好適な経路及び投与手段のために製剤化することができる。皮下又は経皮様式の投与が、本明細書に記載の治療的細胞毒性タンパク質にとって特に好適であり得る。
【０１１５】
本発明の医薬組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の予防を、滅菌手順と、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有との両方によって確保することができる。組成物中の糖、塩化ナトリウムなどの等張剤も望ましい。さらに、注射可能な医薬形態の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によりもたらすことができる。
【０１１６】
本発明の医薬組成物はまた、場合により薬学的に許容される酸化防止剤を含む。例示的な薬学的に許容される酸化防止剤は、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤である。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、本発明の異なる細胞毒性タンパク質の１つ若しくは組合せ、又は前記のいずれかのエステル、塩若しくはアミドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１１８】
治療組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定である。組成物を、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度にとって好適な他の規則的構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノールなどのアルコール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、又は任意の好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合は必要な粒径の維持により、及び当業界で周知の製剤化学による界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。ある特定の実施形態においては、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムが組成物中で望ましい。注射可能組成物の吸収の延長を、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【０１１９】
皮内又は皮下適用のために用いられる溶液又は懸濁液は、典型的には、注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などのバッファー；及び例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性調整剤のうちの１又は２以上を含む。ｐＨを、塩酸若しくは水酸化ナトリウムなどの酸若しくは塩基、又はクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩などのバッファーを用いて調整することができる。そのような調製物を、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射筒又は複数用量バイアル中に封入することができる。
【０１２０】
必要な量の本発明の細胞毒性タンパク質を、適切な溶媒中に、上記の成分の１つ又は組合せと共に組込み、必要に応じて、次いで、滅菌精密濾過を行うことにより、滅菌注射溶液を調製することができる。活性化合物を、分散媒体及び他の成分、例えば、上記のものなどを含有する滅菌媒体中に組込むことにより、分散物を調製することができる。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分に加えて活性成分の粉末をもたらす減圧乾燥又は凍結−乾燥（凍結乾燥）である。
【０１２１】
治療上有効量の本発明の細胞毒性タンパク質を、例えば、静脈内、皮膚又は皮下注射により投与されるよう設計する場合、結合剤は発熱原を含まない、非経口的に許容される水性溶液の形態にある。適切なｐＨ、等張性、安定性などを考慮に入れて、非経口的に許容されるタンパク質溶液を調製するための方法は、当業者の技術の範囲内にある。静脈内、皮膚、又は皮下注射のための好ましい医薬組成物は、結合剤に加えて、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液、又は当業界で公知の他の媒体などの等張性媒体を含有する。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、保存剤、バッファー、酸化防止剤、又は当業者には周知の他の添加剤を含有してもよい。
【０１２２】
本明細書の他の場所に記載のように、化合物を、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な放出に対して化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製のための多くの方法が特許されており、当業者には一般に公知である（例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)を参照されたい）。
【０１２３】
ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物を、インビボで所望の分布を確保するために製剤化することができる。例えば、血液脳関門は多くの大きい、及び／又は親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物又は組成物を特定のインビボでの位置に標的化するために、例えば、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送され、かくして、標的化薬物送達を増強する１又は２以上の部分を含んでもよいリポソーム中でそれらを製剤化することができる。標的化部分の例としては、葉酸又はビオチン；マンノシド；抗体；界面活性プロテインＡ受容体；ｐ１２０カテニンなどが挙げられる。
【０１２４】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
本発明の細胞毒性タンパク質を超えて、そのような細胞毒性タンパク質、又はその機能的部分をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と等価であり、両方ともデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマー、リボ核酸（ＲＮＡ）のポリマー、ヌクレオチドアナログを用いて生成されるこれらのＤＮＡ又はＲＮＡのアナログ、並びにその由来体、断片及びホモログを含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であってもよい。開示されるポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡコドンの３番目の位置で許容されることが知られる揺れを考慮に入れて、例示的細胞毒性タンパク質をコードすることができるが、依然として異なるＲＮＡコドンと同じアミノ酸をコードする全てのポリヌクレオチドを含むように特に開示される。
【０１２５】
一態様において、本発明は、本発明の細胞毒性タンパク質、又はその断片若しくは由来体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、例えば、細胞毒性タンパク質のアミノ酸配列の１つを含むポリペプチドと、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上同一であるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。本発明はまた、本発明の細胞毒性タンパク質、又はその断片若しくは由来体をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、又は任意のそのような配列のアンチセンス若しくは相補体を含むポリヌクレオチドを含む。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチド（又は細胞毒性タンパク質）の由来体又はアナログは、特に、例えば、同じサイズのポリヌクレオチド若しくはポリペプチド配列と比較して、又はアラインメントが当業界で公知のコンピュータ相同性プログラムにより行われる整列された配列と比較した場合、少なくとも約４５％、５０％、７０％、８０％、９５％、９８％、又はさらには９９％の同一性（８０〜９９％の好ましい同一性）により、本発明のポリヌクレオチド又は細胞毒性タンパク質と実質的に相同である領域を有するポリヌクレオチド（又はポリペプチド）分子を含む。例示的プログラムは、Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math. 2: 482-9 (1981)のアルゴリズムを用いる、デフォルト設定を用いるＧＡＰプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.）である。また、ストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも含まれる（例えば、Ausubel F, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)及び以下を参照されたい）。ストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989))に見出すことができる。
【０１２７】
本発明は、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。本発明の細胞毒性タンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドを、発現ベクターを産生するための当業界で周知の材料及び方法を用いて、細菌プラスミド、ウイルスベクター及びファージベクターなどの公知のベクター中に挿入することができる。そのような発現ベクターは、選択される任意の宿主細胞又は無細胞発現系（例えば、以下の実施例に記載されるpTxb1及びpIVEX2.3）内での企図される細胞毒性タンパク質の産生を支援するのに必要なポリヌクレオチドを含む。特定の種類の宿主細胞又は無細胞発現系と共に使用するための発現ベクターを含む特定のポリヌクレオチドは、当業者には周知であり、日常的な実験を用いて決定するか、又は購入することができる。
【０１２８】
本明細書で用いられる用語「発現ベクター」とは、１又は２以上の発現単位を含む、線状又は環状のポリヌクレオチドを指す。用語「発現単位」は、所望のポリペプチドをコードし、宿主細胞中での核酸セグメントの発現を提供することができるポリヌクレオチドセグメントを示す。典型的には、発現単位は、転写プロモーター、所望のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及び転写ターミネーターを含み、全て作動可能な構成にある。発現ベクターは、１又は２以上の発現単位を含有する。かくして、本発明の文脈において、単一ポリペプチド鎖（例えば、志賀毒素エフェクター領域を用いて遺伝子組換えされたｓｃＦｖ）を含む細胞毒性タンパク質をコードする発現ベクターは、単一ポリペプチド鎖のための少なくとも発現単位を含むが、例えば、２又は３以上のポリペプチド鎖（例えば、ＶＬドメインと、毒素エフェクター領域に連結されたＶＨドメインを含む第２のドメインとを含む１つの鎖）を含む細胞毒性タンパク質は、１つがタンパク質の２つのポリペプチド鎖のそれぞれのものである少なくとも２つの発現単位を含む。多鎖細胞毒性タンパク質の発現のためには、各ポリヌクレオチド鎖のための発現単位を異なる発現ベクター上に別々に含有させることもできる（例えば、発現を、各ポリペプチド鎖のための発現ベクターが導入された単一の宿主細胞を用いて達成することができる）。
【０１２９】
ポリペプチド及びタンパク質の一過的又は安定的な発現を指令することができる発現ベクターが、当業界で周知である。発現ベクターとしては一般に、限定されるものではないが、異種シグナル配列又はペプチド、複製起点、１又は２以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１又は２以上が挙げられ、これらはそれぞれ当業界で周知である。用いることができる任意選択の調節制御配列、組込み配列、及び有用なマーカーが当業界で公知である。
【０１３０】
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターの複製又は発現を支援することができる細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞又は真核細胞（例えば、酵母、昆虫、両生類、鳥類、又は哺乳動物細胞）であってもよい。本発明のポリヌクレオチドを含むか、又は本発明の細胞毒性タンパク質を産生することができる宿主細胞株の作製及び単離を、当業界で公知の標準的な技術を用いて達成することができる。
【０１３１】
本発明の範囲内にある細胞毒性タンパク質は、宿主細胞によるより最適な発現などの、所望の特性を達成するのにより好適にすることができる、１若しくは２以上のアミノ酸を変化させるか、又は１若しくは２以上のアミノ酸を欠失させるか、若しくは挿入することによって細胞毒性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを改変することにより産生される本明細書に記載の細胞毒性タンパク質のバリアント又は由来体であってもよい。
【０１３２】
細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物の使用方法
一般に、本発明の目的は、ある特定のがん、腫瘍、免疫障害、又は本明細書に記載のさらなる病状などの、疾患、障害、及び状態の予防及び／又は治療において用いることができる、薬理活性剤、並びにそれを含む組成物を提供することである。従って、本発明は、細胞を死滅させるため、並びに本明細書に記載の疾患、障害、及び状態を治療するための本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物の使用方法を提供する。
【０１３３】
特に、本発明の目的は、現在当業界で公知である薬剤、組成物、及び／又は方法と比較してある特定の利点を有するそのような薬理活性剤、組成物、及び／又は方法を提供することである。従って、本発明は、特定のポリペプチド配列を有する細胞毒性タンパク質及びその医薬組成物の使用方法を提供する。例えば、配列番号１、２、３、４、又は５中のポリペプチド配列のいずれかを、以下の方法において用いられる細胞毒性タンパク質の成分として特に用いることができる。
【０１３４】
本発明は、細胞を、インビトロ又はインビボのいずれかで、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物と接触させるステップを含む、細胞を死滅させる方法を提供する。本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物を用いて、１又は２以上の細胞を、特許請求される組成物の１つと接触させる際に特定の細胞型を死滅させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて、がん細胞、感染細胞、及び／又は血液細胞を含む混合物などの、異なる細胞型の混合物中の特定の細胞型を死滅させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて、異なる細胞型の混合物中のがん細胞を死滅させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて、移植前組織などの、異なる細胞型の混合物中の特定の細胞型を死滅させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて、治療目的のための投与前組織材料などの、細胞型の混合物中の特定の細胞型を死滅させることができる。ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて、ウイルス若しくは微生物により感染した細胞を選択的に死滅させるか、又はさもなければ、細胞表面生体分子などの特定の細胞外標的生体分子を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物は、例えば、インビトロ又はインビボで組織からの望ましくない細胞型の枯渇における使用、移植片対宿主を治療するための免疫応答の調節における使用、抗ウイルス剤としての使用、抗寄生虫剤としての使用、及び移植組織からの望ましくない細胞型の除去における使用などの、様々な適用を有する。
【０１３５】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物は、単独で、又は他の化合物若しくは医薬組成物と共に、治療を必要とする患者などの対象中の、細胞の集団に、インビトロ又はインビボで投与した場合、強力な細胞死滅活性を示すことができる。がん細胞型への高親和性免疫グロブリン型結合領域を用いる酵素的に活性な志賀毒素領域の送達を標的化することにより、この強力な細胞死滅活性を、ある特定のがん細胞、新生物細胞、悪性細胞、非悪性腫瘍細胞、又は感染細胞などの、生物内のある特定の細胞型を特異的かつ選択的に死滅させるように制限することができる。
【０１３６】
本発明は、本発明の少なくとも１つの細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を患者に投与するステップを含む、患者における細胞を死滅させる方法を提供する。
【０１３７】
細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物のある特定の実施形態を用いて、がん又は腫瘍細胞と物理的にカップリングすることが見出された細胞外生体分子を標的化することにより、患者におけるがん細胞を死滅させることができる。用語「がん細胞」又は「がん性細胞」とは、異常に加速された様式で増殖及び分裂する様々な新生物細胞を指し、当業者には明らかである。がん細胞の用語は、悪性細胞と非悪性細胞との両方を含む。一般に、がん及び／又は腫瘍は、治療及び／又は予防の影響を受けやすい疾患、障害、又は状態と定義することができる。がん細胞及び／又は腫瘍細胞を含むがん及び腫瘍（悪性又は非悪性）は、当業者には明らかである。
【０１３８】
細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物のある特定の実施形態を用いて、免疫細胞と物理的にカップリングすることが見出された細胞外生体分子を標的化することにより患者における免疫細胞（健康なもの、又は悪性のもの）を死滅させることができる。
【０１３９】
細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物のある特定の実施形態を用いて、感染細胞と物理的にカップリングすることが見出された細胞外生体分子を標的化することにより患者における感染細胞を死滅させることができる。
【０１４０】
患者から取り出された単離された細胞集団からエクスビボでＴ細胞を枯渇させるために、本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を使用することは、本発明の範囲内にある。１つの非限定例においては、細胞毒性タンパク質を、ドナー臓器を本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を用いて移植前にかん流して臓器からドナーＴ細胞を除去する、臓器移植拒絶の予防のための方法において用いることができる。
【０１４１】
また、患者細胞集団（例えば、骨髄）から、悪性新生物又はさもなければ望ましくないＴ細胞を除去した後、Ｔ細胞が枯渇した材料を患者に再注入するために、本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を用いることも本発明の範囲内にある。
【０１４２】
また、骨髄及び／又は幹細胞移植を受ける患者における、移植片対宿主疾患に対する予防としてドナー細胞集団からＴ細胞を枯渇させるため、及び寛容の誘導のために本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を用いることも本発明の範囲内にある。
【０１４３】
細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物のある特定の実施形態を用いて、感染細胞と物理的にカップリングすることが見出された細胞外生体分子を標的化することにより、患者における感染細胞を死滅させることができる。
【０１４４】
さらに、本発明は、治療上有効量の少なくとも１つの本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、患者における疾患、障害、又は状態を治療する方法を提供する。この方法を用いて治療することができる企図される疾患、障害、及び状態としては、がん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、免疫障害、及び微生物感染症が挙げられる。「治療上有効用量」の本発明の化合物の投与は、疾患症状の重篤度の低下、疾患の無症状期間の頻度及び持続期間の増加、又は疾患の罹患に起因する機能障害若しくは身体障害の予防をもたらすことができる。
【０１４５】
本発明の化合物の治療上有効量は、投与経路、治療される哺乳動物の種類、及び考慮される特定の患者の身体的特徴に依存する。これらの因子及びこの量の決定とのその関係は、医学界における当業者には周知である。この量及び投与方法は、最適な有効性を達成するように調整することができ、体重、食事、併用薬物などの因子及び医学界の当業者には周知の他の因子に依存してもよい。ヒトでの使用にとって最も適切な用量サイズ及び投薬レジメンを、本発明により得られる結果によって誘導し、適切に設計された臨床試験において確認することができる。有効用量及び治療プロトコールを、実験動物における低用量から出発して、次いで、効果をモニタリングしながら用量を増加させ、同様に投薬レジメンを体系的に変化させる従来の手段によって決定することができる。所与の対象のための最適な用量を決定する場合には、医師はいくつかの因子を考慮に入れることができる。そのような考慮は、当業者には公知である。
【０１４６】
許容される投与経路は、限定されるものではないが、エアロゾル、腸内、経鼻、眼、経口、非経口、直腸、経膣、又は経皮（例えば、クリーム、ゲル若しくは軟膏の局所投与、又は経皮パッチを用いる）などの、当業界で公知の任意の投与経路を指してもよい。「非経口投与」は、典型的には、腫瘍内注射、眼窩下、輸注、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、被膜下、皮下、経粘膜、又は経器官投与などの、意図される作用部位での、又はそれと連絡する注射と関連する。
【０１４７】
本発明の医薬組成物の投与のために、用量範囲は一般に、宿主の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、及びより通常は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。例示的用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にあってもよい。例示的治療レジメンは、１日１回若しくは２回投与、又は週に１回若しくは２回投与、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月１回、２若しくは３ヶ月毎に１回、又は３〜６ヶ月毎に１回である。特定の患者のための治療利益を最大化するのに必要とされる知識のある医療専門家であれば、用量を選択及び再調整することができる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、典型的には、複数の機会に同じ患者に投与される。単一用量間の間隔は、例えば、２〜５日、毎週、毎月、２〜３ヶ月毎、６ヶ月毎、又は毎年であってもよい。投与間の間隔はまた、対象又は患者における血中レベル又は他のマーカーの調節に基づいて、不規則なものであってもよい。本発明の化合物のための用量レジメンは、６回の用量について２〜４週間毎に投与される化合物を用いる１ｍｇ／ｋｇ体重又は３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで、３ｍｇ／ｋｇ体重又は１ｍｇ／ｋｇ体重での３ヶ月毎の静脈内投与を含む。
【０１４９】
本発明の医薬組成物を、１又は２以上の当業界で公知の様々な方法を用いて、１又は２以上の投与経路により投与することができる。当業者であれば理解できるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物の投与経路としては、例えば、意図される作用部位（例えば、腫瘍内注射）で
の、又はそれと連絡する注射又は輸注による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は他の非経口投与経路が挙げられる。他の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、局所、表皮又は粘膜投与経路などの非経口経路により、例えば、鼻内、経口、経膣、直腸、舌下、又は局所投与により投与することができる。
【０１５０】
本発明の治療的細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、１又は２以上の当業界で公知の様々な医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、一実施形態においては、本発明の医薬組成物を、針のない皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は当業界にあり、例えば、制御速度送達のための埋込み式マイクロ輸注ポンプ；皮膚を介する投与のためのデバイス；正確な輸注速度での送達のための輸注ポンプ；連続薬物送達のための可変流動性埋込み式輸注デバイス；及び浸透圧薬物送達システムを含む。これらの及びその他のそのようなインプラント、送達システム、及びモジュールは、当業者には公知である。
【０１５１】
本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、単独で、又は１若しくは２以上の他の治療剤若しくは診断剤と共に投与することができる。組合せ療法は、特定の患者、治療しようとする疾患又は状態に基づいて選択される少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた、本発明の細胞毒性タンパク質又はその医薬組成物を含んでもよい。他のそのような薬剤の例としては、特に、細胞毒性的な抗がん剤若しくは化学療法剤、抗炎症剤若しくは抗増殖剤、抗微生物剤若しくは抗ウイルス剤、増殖因子、サイトカイン、鎮痛剤、治療活性低分子若しくはポリペプチド、一本鎖抗体、古典的抗体若しくはその断片、又は１若しくは２以上のシグナリング経路を調節する核酸分子、及び治療的若しくは予防的治療レジメンを補完するか、若しくはそうでなければそれにおいて有益であってもよい同様の調節治療剤が挙げられる。
【０１５２】
本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いる患者の治療は、標的細胞の細胞死及び／又は標的細胞の増殖阻害を好ましくはもたらす。そのようなものとして、本発明の細胞毒性タンパク質、及びそれらを含む医薬組成物は、標的細胞の死滅又は枯渇が有益であり得る様々な病理学的障害、例えば、特に、がん、免疫障害、及び感染細胞を治療するための方法において有用である。本発明は、細胞増殖を抑制し、新生物、過活動Ｂ細胞、及び過活動Ｔ細胞などの、細胞障害を治療するための方法を提供する。
【０１５３】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物を用いて、がん、腫瘍（悪性及び非悪性）、免疫障害、及び微生物感染症を治療又は予防することができる。さらなる態様において、上記のエクスビボでの方法を上記のインビボでの方法と組み合わせて、骨髄移植レシピエントにおける拒絶を治療又は予防する方法、及び免疫寛容を達成するための方法を提供することができる。
【０１５４】
ある特定の実施形態においては、本発明は、治療上有効量の本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ヒトなどの哺乳動物対象における悪性腫瘍又は新生物及び他の血液細胞関連がんを治療するための方法を提供する。
【０１５５】
本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物は、例えば、望ましくないＴ細胞の除去における使用、移植片対宿主を治療するための免疫応答の調節における使用、抗ウイルス剤としての使用、抗微生物剤としての使用、及び移植組織からの望ましくない細胞型の除去における使用などの、様々な適用を有する。本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物は、一般に抗新生物剤である−これは、それらががん又は腫瘍細胞の増殖を阻害する、及び／又はその死滅を引き起こすことによって新生物細胞又は悪性細胞の発生、成熟、又は拡散を治療及び／又は予防することができることを意味する。
【０１５６】
ある特定の実施形態においては、本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物は、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎などのＢ細胞により媒介される疾患、形質細胞により媒介される疾患若しくは抗体により媒介される疾患、又は障害を治療するために用いられる。
【０１５７】
別の態様において、本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物のある特定の実施形態は、抗微生物剤である。これは、それらがウイルス、細菌、真菌、プリオン、又は原生動物により引き起こされるものなどの、微生物病原体感染の獲得、発生、又は結果を治療及び／又は予防することができることを意味する。
【０１５８】
患者においてＴ細胞又はＢ細胞を系統的に死滅させる目的で、本発明の細胞毒性タンパク質、又はその医薬組成物を患者に投与することにより、Ｔ細胞又はＢ細胞により媒介される疾患又は状態のための予防又は治療を提供することは、本発明の範囲内にある。この使用は、移植される材料の供給源、例えば、ヒト又は非ヒト供給源に関係なく、骨髄移植、幹細胞移植、組織移植、又は臓器移植のために患者を準備又は条件付けすることと適合する。
【０１５９】
本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を用いて宿主Ｔ細胞の標的化された細胞死滅による宿主対移植片疾患の予防又は治療のための骨髄レシピエントを提供することは、本発明の範囲内にある。
【０１６０】
本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物を、治療上有効量の本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法において用いることができる。本発明の方法のある特定の実施形態においては、治療されるがんは、骨のがん（多発性骨髄腫又はユーイング肉腫など）、乳がん、中枢／末梢神経系のがん（脳のがん、神経線維腫症、又はグリア芽腫など）、消化管のがん（胃がん又は結腸直腸がんなど）、生殖細胞がん（卵巣がん及び精巣がんなど）、腺がん（膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がんなど）、頭頸部がん（鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がんなど）、血液のがん（白血病、リンパ腫、又は骨髄腫など）、腎臓−尿路がん（腎臓がん及び膀胱がんなど）、肝臓がん、肺／胸膜がん（中皮腫、小細胞肺がん、又は非小細胞肺がんなど）、前立腺がん、肉腫（血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫など）、皮膚がん（基底細胞がん、扁平上皮がん、又はメラノーマなど）、及び子宮がんからなる群から選択される。
【０１６１】
本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物を、治療上有効量の本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫障害を治療する方法において用いることができる。本発明の方法のある特定の実施形態においては、免疫障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ関連疾患、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、敗血性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、及び血管炎からなる群から選択される疾患と関連する炎症と関連する。
【０１６２】
特に、本発明のある特定の実施形態は、がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染症の治療又は予防のための医薬の成分としての細胞毒性タンパク質の使用である。例えば、患者の皮膚上で提示する免疫障害を、炎症を減少させる努力においてそのような医薬を用いて
治療することができる。別の例においては、皮膚腫瘍を、腫瘍サイズを減少させるか、又は腫瘍を完全に除去する努力においてそのような医薬を用いて治療することができる。
【０１６３】
特に、本発明のある特定の実施形態は、がん細胞及び／又は免疫細胞型の内部を標識又は検出するための本発明の細胞毒性タンパク質又は医薬組成物の使用方法である。本発明の細胞毒性タンパク質及び医薬組成物が特定の細胞型に進入し、細胞内逆輸送により細胞内に送る能力に基づいて、特定の細胞型の内部区画を検出のために標識する。これは、患者内のインサイチュの細胞上又は細胞上で実施されて、組織を、生物、例えば、生検材料から取り出されることができる。
【０１６４】
本発明を、志賀毒素ファミリーのメンバーのＡサブユニットに由来する志賀毒素エフェクター領域と、特定の細胞型に物理的にカップリングした細胞外標的生体分子に結合することができる免疫グロブリン型結合領域とを含む選択的細胞毒性タンパク質の以下の非限定例によりさらに例示する。
［実施例］
【０１６５】
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態を示す。しかしながら、これらの実施例は例示目的のためのものに過ぎず、本発明の条件及び範囲に関して全体的に明確であると意図されるものではなく、解釈されるべきでもないと理解される。実施例は、そうでなければ詳細に説明される場合を除いて、当業者には周知であり、日常的である標準的な技術を用いて実行された。
【０１６６】
以下の実施例は、免疫グロブリン型結合領域の細胞外標的生体分子と物理的にカップリングした細胞を選択的に死滅させる例示的細胞毒性タンパク質の能力を示す。例示的細胞毒性タンパク質は、標的細胞型により発現される標的生体分子に結合し、標的細胞に進入した。内在化された細胞毒性タンパク質は、その志賀毒素エフェクター領域を細胞質ゾルに送り、リボソームを不活化した後、標的細胞のアポトーシスによる死滅を引き起こした。かくして、例示的細胞毒性タンパク質は、細胞毒性タンパク質を担持するその免疫グロブリン型結合領域が免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子と物理的にカップリングした細胞型に近いところにあるため、特定の細胞型を標的化することができた。
【０１６７】
１つの例示的実施形態は、高い親和性でＣＤ３８に結合することができる一本鎖、可変断片、結合領域と組み合わせた志賀毒素Ａサブユニット断片を含む。この例示的細胞毒性タンパク質は、その表面上にＣＤ３８を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。第２の例示的細胞毒性タンパク質は、高い親和性でＨＥＲ２に結合することができる単一ドメイン抗体断片結合領域と組み合わせた志賀毒素Ａサブユニット断片を含む。この第２の例示的細胞毒性タンパク質は、その表面上にＨＥＲ２を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。第３の例示的実施形態は、高い親和性でＣＤ２０に結合することができる単一ドメイン抗体断片結合領域と組み合わせた志賀毒素Ａサブユニット断片を含む。この第３の例示的細胞毒性タンパク質は、その表面上にＣＤ２０を発現する細胞を選択的に死滅させることができる。他の例示的細胞毒性タンパク質としては、エプスタイン−バー抗原、リーシュマニア（Leishmania）抗原、ニューロテンシン受容体、上皮増殖因子受容体、及びＣＣＲ５を標的とする結合領域を有するものが挙げられる。
【実施例１】
【０１６８】
志賀様毒素−１のＡサブユニットに由来するＣＤ３８標的化細胞毒性タンパク質（「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」）
細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の構築、産生、及び精製
第１に、志賀毒素エフェクター領域と、免疫グロブリン型結合領域とを設計又は選択した。本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来した。ＳＬＴ−１Ａのアミノ酸１〜２５１をコードするポリヌクレオチドを得た（Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)）。免疫グロブリン型結合領域αＣＤ３８ｓｃＦｖは、モノクローナル抗体αＣＤ３８  ＨＢ７に由来ものであり（Peng et al., Blood 101: 2557-62 (2003)；GenBank受託番号ＢＤ３７６１４４、National Center forBiotechnology Information、U.S.も参照されたい）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、当業界で公知のリンカーにより隔てられた２つの免疫グロブリン可変領域（ＶＬ及びＶＨ）を用いて作製する。
【０１６９】
第２に、免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、融合タンパク質を形成させた。本実施例では、配列番号１のアミノ酸１〜２５１を含む志賀毒素エフェクター領域をコードするポリヌクレオチドを、マウスＩｇＧ３分子に由来するリンカーをコードするポリヌクレオチドと読み枠を合わせて、また配列番号４のアミノ酸２６９〜５０８を含む免疫グロブリン型結合領域αＣＤ３８ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと読み枠を合わせてクローニングした。ある特定の実験においては、本実施例の細胞毒性タンパク質の完全長コード配列は、検出及び精製を容易にするためのStrep-tag（登録商標）をコードするポリヌクレオチドから開始していた。本実施例の細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」をコードするポリヌクレオチド配列を、DNA 2.0, Inc.社（Menlo Park、CA、U.S.）からのサービスを用いて、大腸菌中での効率的な発現のためにコドン最適化した。
【０１７０】
第３に、細胞毒性タンパク質、ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」細胞毒性タンパク質（配列番号４）の発現を、細菌及び無細胞の両方のタンパク質翻訳系を用いて達成した。
【０１７１】
大腸菌発現系による「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」産生の本実施例において、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」をコードするポリヌクレオチド「挿入」配列を、標準的な手順を用いてpTxb1ベクター（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）中にクローニングし、ベクターのアミノ末端インテインをコードするポリヌクレオチド配列と読み枠を合わせてライゲートされた細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」をコードするポリヌクレオチド配列を産生した。Sanger配列決定（Functional Biosciences社、Madison、WI、U.S.）によりプラスミド挿入ポリヌクレオチド配列を検証し、T7 Shuffle（登録商標）細胞（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）中に形質転換した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質を、IMPACT（商標）（Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag）システムマニュアル（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）に従って産生及び精製した。Strep-tag（登録商標）又は免疫グロブリン型結合領域の固定された標的の使用などの、当業界で公知の標準的な技術を用いて、精製を達成した。
【０１７２】
無細胞タンパク質翻訳系による「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」産生の本実施例においては、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」をコードするポリヌクレオチド「挿入」配列を、製造業者の説明書に従ってIn-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（Clonetech社、Mountain View、CA、U.S.）を用いてコード領域の直後に、停止コドンを含むpIVEX2.3ベクター中にクローニングした。Sanger配列決定（Functional Biosciences社、Madison、WI、U.S.）によりプラスミド挿入ポリヌクレオチド配列を検証した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質を、製造業者の説明書に従って迅速翻訳系5 Prime（商標）RTS 100 E.coli Disulfide Kit（5 Prime社、Gaithersburg、MD、U.S.）を用いて産生した。Strep-tag（登録商標）又は免疫グロブリン型結合領域の固定された標的の使用などの、当業界で公知の標準的な技術を用いて、精製を達成した。
【０１７３】
標的細胞型に結合する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の最大特異的結合（Ｂｍａｘ）及び平衡結合定数（ＫＤ）の決定
上記のように産生された「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質の結合特性を、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定した。ＣＤ３８陽性（＋）細胞及びＣＤ３８陰性（−）細胞を含有する試料を、以後「1XPBS+1%BSA」と呼ばれる、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovineserum albumin）（Calbiochem社、SanDiego、CA、U.S.）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（1XPBS）（Hyclone Brand、Fisher Scientific社、Waltham、MA、U.S.）中に懸濁し、アッセイしようとする「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質の様々な希釈液１００μＬと共に、４℃で１時間インキュベートした。結合反応の飽和をもたらすために、最も高い濃度の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質を選択した。１時間のインキュベーション後、細胞試料を1XPBS+1%BSAで２回洗浄した。細胞試料を、０．３μｇのαStrep-tag（登録商標）mAb-FITC（＃Ａ０１７３６−１００、Genscript社、Piscataway、NJ、U.S.）を含有する1XPBS+1%BSA  １００μＬと共に、４℃で１時間インキュベートした。
【０１７４】
次に、細胞試料を1XPBS+1%BSAで２回洗浄し、２００μＬの1XPBS中に再懸濁し、蛍光に基づくフローサイトメトリーにかけた。陰性対照としてFITCのみの試料を用いてデータをゲート化することにより、全ての試料に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ、mean fluorescence intensity）データを取得した。Prismソフトウェア（GraphPad Software社、San Diego、CA、U.S.）を用いて、グラフをＭＦＩ対「細胞濃度」としてプロットした。見出し結合−飽和の下での１部位結合［Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（ＫＤ＋Ｘ）］のPrismソフトウェア機能を用いてＢｍａｘ及びＫＤをベースライン補正されたデータを用いて算出した。Ｂｍａｘは、ＭＦＩで報告される最大特異的結合である。ＫＤは、ナノモル濃度（ｎＭ）で報告される平衡結合定数である。
【０１７５】
ＣＤ３８＋細胞に結合する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」に関するＢｍａｘは約１００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは約１３ｎＭであると測定されたが（表１）、このアッセイにおいてはＣＤ３８−細胞への結合は観察されなかった。
【０１７６】
【表３】
2019205435.tif 000004
【０１７７】
インビトロでの真核リボソームに対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）の決定
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」のリボソーム不活化能力を、TNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translation Kit（L1170 Promega社、Madison、WI、U.S.）を用いる無細胞インビトロタンパク質翻訳アッセイにおいて決定した。このキットは、Luciferase T7 Control DNA及びTNT（登録商標）Quick Master Mixを含む。リボソーム活性反応を、製造業者の説明書に従って調製し、「TNT」反応混合物を作製した。
【０１７８】
試験しようとする「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の１０倍希釈系列を適切なバッファー中で調製し、同一のTNT反応混合物成分の系列を「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の各希釈液について作製した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質の希釈系列中の各試料を、Luciferase T7 Control DNAと共にそれぞれのTNT反応混合物と混合した。被験試料を３０℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、Luciferase Assay Reagent（E1483 Promega社、Madison、WI、U.S.）を全ての被験試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質翻訳量を製造業者の説明書に従って発光により測定した。翻訳阻害のレベルを、相対発光単位に対する総タンパク質の対数変換された濃度の非線形回帰分析により決定した。統計ソフトウェア（GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.）を用いて、最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を各試料について算出した。次いで、見出し用量応答阻害の下でｌｏｇ（阻害剤）対応答（３つのパラメータ）のPrismソフトウェア関数［Ｙ＝最低値＋（（最高値−最低値）／（１＋１０＾（Ｘ−ＬｏｇＩＣ５０）））］を用いて「ＳＬＴ−１Ａのみの対照タンパク質のパーセント」を算出することにより、データを正規化した。実験タンパク質及びＳＬＴ−１Ａのみの対照タンパク質のＩＣ５０を算出した。ＳＬＴ−１Ａのみの対照タンパク質のパーセントを、［（ＳＬＴ−１Ａ対照タンパク質のＩＣ５０／実験タンパク質のＩＣ５０）×１００］により算出した。
【０１７９】
無細胞タンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の阻害効果は強力であった。用量依存性実験により、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」のＩＣ５０が約１４ピコモル濃度（ｐＭ）又はＳＬＴ−１Ａのみの陽性対照の１０％以内であると決定された（表２）。
【０１８０】
【表４】
2019205435.tif 000005
【０１８１】
細胞死滅アッセイ(Cell-Kill Assay)を用いる「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の選択的細胞毒性及び最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）の決定
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」の細胞毒性特性を、以下の細胞死滅アッセイにより決定した。このアッセイは、標的生体分子を発現しない細胞と比較してその免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子を発現する細胞を死滅させる細胞毒性タンパク質の能力を決定する。細胞を、３８４穴プレート中の２０μＬの培地中に播種（２×１０３個／ウェル）した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質を1XPBS中に５倍又は１０倍に希釈し、５μＬの希釈液を細胞に添加した。培地のみを含有する対照ウェルを、ベースライン補正のために用いた。細胞試料を、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」、又はバッファーのみと共に、３７℃で３日間、５％二酸化炭素（ＣＯ２）の雰囲気中でインキュベートした。全細胞生存又は生存率を、製造業者の説明書に従ってCellTiter-Glo（登録商標）Luminescent CellViability Assay（G7573 Promega社、Madison,WI, U.S.）を用いる発光読出しを用いて決定した。実験ウェルの生存率を、以下の式：（試験ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）／（平均細胞ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）＊１００を用いて算出した。Ｌｏｇポリペプチド濃度対生存率を、Prism（GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.）中にプロットし、ｌｏｇ（阻害剤）対正規化された応答（変動勾配）分析を用いて、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」に関する最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）値を決定した。
【０１８２】
用量依存性実験により、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」タンパク質のＣＤ５０が、ＣＤ３８−細胞系に関する４７０ｎＭと比較して細胞株に依存してＣＤ３８＋細胞に関して約０．２〜０．７ｎＭであり、ＳＬＴ−１Ａのみの陰性対照に関するＣＤ５０と類似することが決定された（表３；図２）。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ３８−ｓｃＦｖ」のＣＤ５０は、細胞外標的生体分子ＣＤ３８と物理的にカップリングした細胞、例えば、その細胞表面上にＣＤ３８を発現する細胞株と比較して、細胞外標的生体分子ＣＤ３８と物理的にカップリングしていない細胞について、約７００〜３０００倍高かった（細胞毒性が低かった）。
【０１８３】
【表５】
2019205435.tif 000006
【実施例２】
【０１８４】
志賀様毒素１のＡサブユニットに由来するＨＥＲ２標的化細胞毒性タンパク質（ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ）
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の構築、産生、及び精製
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来した。ＳＬＴ−１Ａのアミノ酸１〜２５１をコードするポリヌクレオチドを得た（Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)）。免疫グロブリン型結合領域は、米国特許出願公開第２０１１／００５９０９０号に記載のような、ラクダ科抗体の単一ドメイン可変領域（ＶＨＨ）タンパク質５Ｆ７に由来するαＨＥＲ２ＶＨＨである。
【０１８５】
第２に、免疫グロブリン型結合領域と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、融合タンパク質を形成させた。本実施例では、配列番号５のアミノ酸１〜１１９を含むタンパク質５Ｆ７に由来するαＨＥＲ２−ＶＨＨ可変領域をコードするポリヌクレオチドを、当業界で公知のリンカーをコードするポリヌクレオチドと読み枠を合わせて、また配列番号１のアミノ酸１〜２５１を含む志賀毒素エフェクター領域をコードするポリヌクレオチドと読み枠を合わせてクローニングした。ある特定の実験においては、本実施例の細胞毒性タンパク質の完全長コード配列は、検出及び精製を容易にするためのStrep-tag（登録商標）をコードするポリヌクレオチドから開始していた。本実施例の細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」をコードするポリヌクレオチド配列を、DNA 2.0, Inc.社（Menlo Park、CA、U.S.）からのサービスを用いて大腸菌中での効率的な発現のためにコドン最適化した。
【０１８６】
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」融合タンパク質（配列番号５）を、それをコードするポリヌクレオチドからの発現により産生した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」細胞毒性タンパク質の発現を、細菌及び無細胞の両方のタンパク質翻訳系を用いて達成した。
【０１８７】
大腸菌発現系による「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」産生の本実施例においては、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」をコードするポリヌクレオチド「挿入」配列を、標準的な手順を用いてpTxb1ベクター（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）中にクローニングし、ベクターのアミノ末端インテインをコードするポリヌクレオチド配列と読み枠を合わせてライゲートされた細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」をコードするポリヌクレオチド配列を産生した。Sanger配列決定（Functional Biosciences社、Madison、WI、U.S.）によりプラスミド挿入ポリヌクレオチド配列を検証し、T7 Shuffle（登録商標）細胞（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）中に形質転換した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質を、IMPACT（商標）（Intein Mediated Purification withan Affinity Chitin-binding Tag）システムマニュアル（New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.）に従って産生及び精製した。Strep-tag（登録商標）又は免疫グロブリン型結合領域の固定された標的の使用などの、当業界で公知の標準的な技術を用いて、精製を達成した。
【０１８８】
無細胞タンパク質翻訳系による「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」産生の本実施例においては、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」をコードするポリヌクレオチド「挿入」配列を、製造業者の説明書に従ってIn-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（Clonetech社、Mountain View、CA、U.S.）を用いてコード領域の直後に、停止コドンを含むpIVEX2.3ベクター中にクローニングした。Sanger配列決定（Functional Biosciences社、Madison、WI、U.S.）によりプラスミド挿入ポリヌクレオチド配列を検証した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質を、製造業者の説明書に従って迅速翻訳系5 Prime（商標）RTS 100 E.coli Disulfide Kit（5 Prime社、Gaithersburg、MD、U.S.）を用いて産生した。Strep-tag（登録商標）又は免疫グロブリン型結合領域の固定された標的の使用などの、当業界で公知の標準的な技術を用いて、精製を達成した。
【０１８９】
標的細胞型に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の最大特異的結合（Ｂｍａｘ）及び平衡結合定数（ＫＤ）の決定
上記のように産生された「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質の結合特性を、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定した。ＨＥＲ２陽性（＋）細胞及びＨＥＲ２陰性（−）細胞を含有する試料を、1XPBS+1%BSA中に懸濁し、アッセイしようとする「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質の様々な希釈液１００μＬと共に、４℃で１時間インキュベートした。結合反応の飽和をもたらすために、最も高い濃度の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質を選択した。１時間のインキュベーション後、細胞試料を1XPBS+1%BSAで２回洗浄した。細胞試料を、０．３μｇのαStrep-tag（登録商標）mAb-FITC（＃Ａ０１７３６−１００、Genscript社、Piscataway、NJ、U.S.）を含有する1XPBS+1%BSA  １００μＬと共に、４℃で１時間インキュベートした。
【０１９０】
次に、細胞試料を1XPBS+1%BSAで２回洗浄し、２００μＬの1XPBS中に再懸濁し、蛍光に基づくフローサイトメトリーにかけた。陰性対照としてFITCのみの試料を用いてデータをゲート化することにより、全ての試料に関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを取得した。Prismソフトウェア（GraphPad Software、San Diego、CA、U.S.）を用いてＭＦＩ対「細胞の濃度」をグラフにプロットした。見出し結合−飽和の下で１部位結合のPrismソフトウェア関数［Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（ＫＤ＋Ｘ）］を用いて、Ｂｍａｘ及びＫＤを、ベースライン補正されたデータを用いて算出した。Ｂｍａｘは、ＭＦＩで報告される最大特異的結合である。ＫＤは、ｎＭで報告される平衡結合定数である。
【０１９１】
ＨＥＲ２＋細胞に結合する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」に関するＢｍａｘは、約１１０，００ＭＦＩであり、ＫＤは約２．４ｎＭであると測定された（表１）が、ＨＥＲ２−細胞に結合する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」に関するＢｍａｘは、約１２，０００ＭＦＩであり、ＫＤは約８１０ｎＭであると測定された（表１）。
【０１９２】
インビトロで真核リボソームに対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）の決定
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」のリボソーム不活化能力を、TNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translation Kit（L1170 Promega社、Madison、WI、U.S.）を用いて無細胞インビトロタンパク質翻訳アッセイにおいて決定した。このキットは、LuciferaseT7 Control DNA及びTNT（登録商標）QuickMaster Mixを含む。リボソーム活性反応を、製造業者の説明書に従って調製し、「TNT」反応混合物を作製した。
【０１９３】
試験しようとする「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の１０倍希釈系列を適切なバッファー中で調製し、一連の同一のTNT反応混合物成分を、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の各希釈液について作製した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質の希釈系列中の各試料を、Luciferase T7 Control DNAと共に、それぞれのTNT反応混合物と混合した。被験試料を、３０℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、Luciferase Assay Reagent（E1483 Promega社、Madison、WI、U.S.）を全ての被験試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質翻訳量を製造業者の説明書に従って発光により測定した。翻訳阻害のレベルを、全タンパク質の対数変換された濃度対相対発光単位の非線形回帰分析により決定した。統計ソフトウェア（GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.）を用いて、各試料について最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を算出した。次いで、見出し用量応答阻害の下でｌｏｇ（阻害剤）対応答（３つのパラメータ）のPrismソフトウェア関数［Ｙ＝最低値＋（（最高値−最低値）／（１＋１０＾（Ｘ−ＬｏｇＩＣ５０）））］を用いて「ＳＬＴ−１Ａのみの対照タンパク質のパーセント」を算出することにより、データを正規化した。実験タンパク質及びＳＬＴ−１Ａのみの陽性対照タンパク質のＩＣ５０を算出した。ＳＬＴ−１Ａのみの陽性対照タンパク質のパーセントを、［（ＳＬＴ−１Ａ対照タンパク質のＩＣ５０／実験タンパク質のＩＣ５０）×１００］により算出した。
【０１９４】
無細胞タンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の阻害効果は強力であった。用量依存性実験により、この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」のＩＣ５０が約１３ｐＭであるか、又はＳＬＴ−１Ａのみの陽性対照と類似すると決定された（表２）。
【０１９５】
細胞死滅アッセイを用いる「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の選択的細胞毒性及び最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）の決定
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」の細胞毒性特性を、以下の細胞死滅アッセイにより決定した。このアッセイは、標的生体分子を発現しない細胞と比較してその免疫グロブリン型結合領域の標的生体分子を発現する細胞を死滅させる細胞毒性タンパク質の能力を決定する。細胞を、３８４穴プレート中の２０μＬの培地中に播種（２×１０３個／ウェル）した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質を1XPBS中に５倍又は１０倍に希釈し、５μＬの希釈液を細胞に添加した。培地のみを含有する対照ウェルを、ベースライン補正のために用いた。細胞試料を、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」、又はバッファーのみと共に、３７℃で３日間、５％二酸化炭素（ＣＯ２）の雰囲気中でインキュベートした。全細胞生存又は生存率を、製造業者の説明書に従ってCellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（G7573 Promega社、Madison、WI、U.S.）を用いる発光読出しを用いて決定した。実験ウェルの生存率を、以下の式：（試験ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）／（平均細胞ＲＬＵ−平均培地ＲＬＵ）＊１００を用いて算出した。生存率に対するＬｏｇポリペプチド濃度を、Prism（GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.）中でプロットし、対数（阻害剤）対正規化応答（可変勾配）分析を用いて、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」に関する最大半量細胞毒性濃度（ＣＤ５０）値を決定した。
【０１９６】
用量依存性実験により、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質のＣＤ５０が、ＨＥＲ２−細胞系に関する約１７００ｎＭと比較してＨＥＲ２＋細胞株に関して約１５ｎＭであると決定された（表４；図３）。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＨＥＲ２−ＶＨＨ」タンパク質のＣＤ５０は、細胞外標的生体分子ＨＥＲ２と物理的にカップリングした細胞、例えば、その細胞表面上にＨＥＲ２を発現する細胞株と比較して、細胞外標的生体分子ＨＥＲ２と物理的にカップリングしていない細胞について、約１１０倍高かった（細胞毒性が低かった）。
【０１９７】
【表６】
2019205435.tif 000007
【実施例３】
【０１９８】
志賀様毒素１のＡサブユニットに由来するＣＤ２０標的化細胞毒性タンパク質（ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ）
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αＣＤ２０−ｓｃＦｖを、ヒトＣＤ２０に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む、１Ｈ４  ＣＤ２０モノクローナル抗体（Haisma et al. (1999), Blood 92: 184-90）に由来する組換えｓｃＦｖとして設計した。これらの異種領域を、実施例１〜２において上記されたように組み合わせた。簡単に述べると、１Ｈ４  ＣＤ２０モノクローナル抗体に由来する組換えｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを、マウスＩｇＧ３分子に由来する「マウスヒンジ」をコードするポリヌクレオチドと読み枠を合わせて、またＳＬＴ−１Ａをコードするポリヌクレオチド（配列番号１の残基１〜２５１）と読み枠を合わせてクローニングした。αＣＤ２０−ｓｃＦｖとＳＬＴ１−Ａ由来志賀毒素エフェクター領域との間のリンカー領域においてのみ異なる、異なるＣＤ２０標的化細胞毒性タンパク質、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０ｓｃＦｖ」バージョン２を、同様の様式で構築及び産生した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」細胞毒性タンパク質の両バージョンの発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系を用いて達成した。
【０１９９】
細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０ｓｃＦｖ」の細胞結合特性を、実施例１〜２に記載のような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定した。複数の実験にわたって、Raji（ＣＤ２０＋）細胞に関する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」のＫＤは、約８０〜１００ｎＭであると決定された。ある実験においては、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」に関するＢｍａｘは約１４０，０００ＭＦＩであり、ＫＤは約８３ｎＭであると測定されたが、ＣＤ２０−細胞への意味ある結合はこのアッセイにおいては観察されなかった（表１）。
【０２００】
無細胞タンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」の阻害効果は強力であった。複数の実験により、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」のＩＣ５０は約５０ｐＭであると決定された。ある実験において、タンパク質合成に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」のＩＣ５０は、約３８ｐＭであるか、又はＳＬＴ−１Ａのみの陽性対照の１９％以内であった（表２）。
【０２０１】
「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」の細胞毒性プロファイルを、実施例１〜２に記載の細胞死滅アッセイにより決定したが、ＣＤ２０＋細胞を標的とした。複数の実験にわたって、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」は、ＣＤ２０特異的細胞死滅がＣＤ２０陰性細胞株の細胞死滅と比較して１０〜１０００倍の特異性を有することを示した。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」タンパク質のＣＤ５０は、ＣＤ２０−細胞株について６００〜２，０００を超えるものと比較して、細胞株に応じて、ＣＤ２０＋細胞については約３〜７０ｎＭであると測定された（表５）。「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」タンパク質のＣＤ５０は、細胞外標的生体分子ＣＤ２０と物理的にカップリングした細胞と比較してＣＤ２０細胞外標的と物理的にカップリングしていない細胞について１００〜４００倍を超えて高かった（細胞毒性が低かった）。
【０２０２】
【表７】
2019205435.tif 000008
【０２０３】
インビボでの異種移植片試験を用いる細胞毒性タンパク質の標的化された細胞毒性の決定
免疫不全マウス株に基づく２つの異種移植片モデル系を用いて、インビボ及び腫瘍環境中でＣＤ２０＋腫瘍細胞を死滅させる細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１及び２の能力を経時的に、及び様々な用量について試験した。これらの異種移植片モデル系は、移植片対宿主応答、を欠く、特に、免疫系不全であるよく特徴付けられたマウス株に依拠する。第１に、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全、severe combined immune deficiency）マウスを用いて静脈内腫瘍モデルを試験して、マウスを通じて播種された腫瘍を作製し、ヒト腫瘍細胞に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」のインビボでの効果を試験した。第２に、ＢＡＬＢｃ／ヌードマウスを用いて皮下腫瘍モデルを試験して、マウス上で皮下腫瘍を作製し、再度、ヒト腫瘍細胞に対する「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」のインビボでの効果を試験した。
【０２０４】
第１の異種移植片系について、３２匹のＣ．Ｂ．−１７ＳＣＩＤマウス（８匹の動物の４群）を、２００μＬのPBS中の１×１０７個のRaji-lucヒトリンパ腫由来細胞（Molecular Imaging社、Ann Arbor、MI、U.S.）でチャレンジした。腫瘍チャレンジ後５〜９日目及び１２〜１６日目で、群は、群毎に以下のものを静脈内投与により受容した：１群：PBS；２群：２ｍｇ／ｋｇの用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン２；３群：２ｍｇ／ｋｇの用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１；及び４群：４ｍｇ／ｋｇの用量のαＣＤ２０ｓｃＦｖ：：ＳＬＴ−１Ａバージョン１（５〜９日目のみ）。１Ｘ１０６個の光子／秒単位（ｐ／ｓ）で、生物発光を、Caliper IVIS 50光学画像化システム（Perkin Elmer社、Waltham、MA、U.S.）を用いて５、１０、１５及び２０日目に測定した。図４は、両用量レベルの「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」の両バージョンと、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１が、PBS対照と比較して統計的に有意に低い全生物発光をどのようにもたらしたかを示す。全生物発光の低下は、本発明の細胞毒性タンパク質を用いる治療後に播種性全身腫瘍組織量の統計的に有意な減少を反映していた。図５は、αＣＤ２０ｓｃＦｖ：：ＳＬＴ−１Ａのいずれかのバージョンを投与した場合の生存の統計的に有意な増加を示す。平均生存年齢はPBS対照と比較して全ての治療に関して５日増加した。
【０２０５】
第２の異種移植片モデルについては、２８匹のＢＡＬＢｃ／ヌードマウス（６又は７匹の動物の４群）を、２．５×１０６個のRajiヒトリンパ腫細胞（Washington Biotechnology社、Simpsonville、MD、U.S.）で皮下的にチャレンジした。腫瘍体積を、カリパスを用いる当業界で公知の標準的な方法を用いて決定した。それぞれのマウスの平均腫瘍体積が約１６０ｍｍ３に到達した時点を０日目に設定した（各群に由来する１匹のマウスは２６０ｍｍ３を超える腫瘍を有していたため、それを除外した）。０〜４日目及び７〜１１日目に、群は、群毎に以下のものの静脈内投与を受容した：群１：PBS；群２：２ｍｇ／ｋｇの用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン２；群３：２ｍｇ／ｋｇの用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１；群４：４ｍｇ／ｋｇの用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１。腫瘍体積を測定し、試験日数の関数としてグラフ化した。図６は、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」を用いる治療（両用量レベルの）が２４日目までにPBS対照と比較して有意に減少した腫瘍体積をどのようにもたらしたかを示す。これはまた、表６に報告されるように、５４日目までの無腫瘍マウスの数に反映される。
【０２０６】
【表８】
2019205435.tif 000009
【０２０７】
非ヒト霊長類における細胞毒性タンパク質のインビボでの効果の決定
例示的細胞毒性タンパク質「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１を、非ヒト霊長類に投与して、インビボでの効果について試験した。カニクイザル霊長類における末梢血Ｂリンパ球のインビボでの枯渇を、様々な用量の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１の非経口投与後に観察した。
【０２０８】
ある実験において、１０頭のカニクイザル霊長類に、２週間にわたって隔日にPBS又は様々な用量（５０、１５０及び４５０マイクログラムの薬物／キログラム体重（ｍｃｇ／ｋｇ））の「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１を静脈内注射した。次いで、３日目及び８日目に投与する前に採取された末梢血試料を、ＣＤ２０を発現するＢリンパ球のパーセンテージについて分析した（図７及び図８）。カニクイザルにおいては、２つの異なるＢ細胞サブセットが記載されている；ＣＤ２１陰性、高レベルのＣＤ２０を発現するＣＤ４０陽性細胞、並びにフローサイトメトリーによるものよりも低レベルのＣＤ２０を発現するＣＤ２１陽性及びＣＤ４０陽性（Vugmeyster et al.., Cytometry 52: 101-9(2003)）。治療前に採取された血液試料に由来するベースラインレベルと比較した用量依存的Ｂ細胞枯渇が、３日目（５０、１５０及び４５０ｍｃｇ／ｋｇで投与した動物における４、１４及び４５％の低下）及び８日目（５０、１５０及び４５０ｍｃｇ／ｋｇで投与した動物における３２、５２及び７５％の低下）に観察された（表７）。この実験により、「ＳＬＴ−１Ａと融合したαＣＤ２０−ｓｃＦｖ」バージョン１がＣＤ２０陽性の霊長類Ｂ細胞をインビボで死滅させることができることが示された。
【０２０９】
【表９】
2019205435.tif 000010
【実施例４】
【０２１０】
志賀様毒素１のＡサブユニットと抗体αエプスタイン−バー抗原とに由来する細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン−バー抗原は、エプスタイン−バー抗原に対するモノクローナル抗体に由来し（Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30(2004)）、これはエプスタイン−バーウイルスにより感染したヒト細胞又はエプスタイン−バー抗原を発現する形質転換された細胞に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む。エプスタイン−バー抗原は、エプスタイン−バーウイルスにより感染した細胞及びがん細胞（例えば、リンパ腫及び鼻咽頭がん細胞）などの、複数の細胞型上で発現される。さらに、エプスタイン−バー感染は、他の疾患、例えば、多発性硬化症と関連する。
【０２１１】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒの構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン−バー抗原と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、αエプスタイン−バー抗原結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような、細菌及び／又は無細胞のタンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２１２】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒのインビトロでの特性の決定
エプスタイン−バー抗原陽性細胞及びエプスタイン−バー抗原陰性細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に上記されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。エプスタイン−バー抗原陽性細胞に結合するＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒのＢｍａｘは、約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるエプスタイン−バー抗原陰性細胞への有意な結合はない。
【０２１３】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に上記されたような無細胞インビトロタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に関するＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒのＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２１４】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒの細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒの細胞毒性特性を、エプスタイン−バー抗原陽性細胞を用いて以前の実施例に上記されたような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒの選択的細胞毒性特性を、エプスタイン−バー抗原陽性細胞との比較として、エプスタイン−バー抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じてエプスタイン−バー抗原陽性細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にエプスタイン−バー抗原を発現する細胞と比較して、細胞表面上にエプスタイン−バー抗原を発現しない細胞について約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【０２１５】
動物モデルを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒのインビボでの効果の決定
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にエプスタイン−バー抗原を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。
【実施例５】
【０２１６】
志賀様毒素１のＡサブユニットと抗体αリーシュマニア抗原とに由来する細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原は、細胞内トリパノソーマ科原性動物上に担持するヒト細胞上に存在する細胞表面リーシュマニア抗原に対して当業界で公知の技術を用いて生成された抗体に由来する（Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001)；Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6 (1999)；Berman J and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)を参照されたい）。
【０２１７】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａの構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、リーシュマニア抗原結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２１８】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａのインビトロでの特性の決定
リーシュマニア抗原陽性細胞及びリーシュマニア抗原陰性細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に記載されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。リーシュマニア抗原陽性細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａのＢｍａｘは、約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおいてリーシュマニア抗原陰性細胞への有意な結合はない。
【０２１９】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａ細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に記載のような無細胞でのインビトロタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａのＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２２０】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａの細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａの細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞を用いて以前の実施例に記載された一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＬｅｉｓｈｍａｎｉａの選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してリーシュマニア抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じて、リーシュマニア抗原陽性細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現する細胞と比較して、細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現しない細胞について、約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【実施例６】
【０２２１】
志賀様毒素１のＡサブユニット及び免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシン受容体に由来する細胞毒性タンパク質
本実施例においては、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシン受容体は、DARPin（商標）（GenBank受託番号２Ｐ２Ｃ＿Ｒ）又はヒトニューロテンシン受容体に結合するモノクローナル抗体（Ovigne J et al., Neuropeptides 32: 247-56(1998)）に由来する。ニューロテンシン受容体は、乳がん、結腸がん、肺がん、メラノーマ、及び膵臓がん細胞などの様々ながん細胞により発現される。
【０２２２】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲの構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲと、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、ニューロテンシン受容体結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲ細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２２３】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲのインビトロでの特性の決定
ニューロテンシン受容体陽性細胞及びニューロテンシン受容体陰性細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に記載のような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。ニューロテンシン受容体陽性細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲのＢｍａｘは約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるニューロテンシン受容体陰性細胞への有意な結合はない。
【０２２４】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲ細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に記載のような無細胞でのインビトロタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲのＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２２５】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲの細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲの細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞を用いて以前の実施例に記載のような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲの選択的細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞と比較してニューロテンシン受容体陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ニューロテンシン受容体陽性細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現する細胞と比較して細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現しない細胞について約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【０２２６】
動物モデルを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲのインビボでの効果の決定
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＮｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎＲのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現するヒト新生物細胞のこれらのマウスへの注入の結果得られるマウスにおける異種移植片腫瘍に対する、静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。
【実施例７】
【０２２７】
志賀様毒素１のＡサブユニット及び免疫グロブリン型結合領域αＥＧＦＲに由来する細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αＥＧＦＲは、AdNectin（商標）（GenBank受託番号３ＱＷＱ＿Ｂ）、Affibody（商標）（GenBank受託番号２ＫＺＩ＿Ａ；米国特許第８，５９８，１１３号明細書）、又は抗体に由来し、これらは全て１又は２以上のヒト上皮増殖因子受容体に結合する。上皮増殖因子受容体の発現は、例えば、肺がん細胞、乳がん細胞、及び結腸がん細胞などの、ヒトがん細胞と関連する。
【０２２８】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲの構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αＥＧＦＲと、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、ＥＧＦＲ結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲ細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２２９】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲのインビトロでの特性の決定
ＥＧＦＲ＋細胞及びＥＧＦＲ−細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に記載されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。ＥＧＦＲ＋細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲのＢｍａｘは約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるＥＧＦＲ−細胞への有意な結合はない。
【０２３０】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲ細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に記載のような無細胞のインビトロでのタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲのＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２３１】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲの細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲの細胞毒性特性を、ＥＧＦＲ＋細胞を用いて以前の実施例に記載のような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲの選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してＥＧＦＲ−細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ＥＧＦＲ＋細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にＥＧＦＲを発現する細胞と比較して細胞表面上にＥＧＦＲを発現しない細胞について約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【０２３２】
動物モデルを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲのインビボでの効果の決定
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＥＧＦＲのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にＥＧＦＲを発現するヒト新生物細胞のこれらのマウスへの注入の結果得られるマウスにおける異種移植片腫瘍に対する、静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。
【実施例８】
【０２３３】
志賀様毒素１のＡサブユニット及び抗体αＣＣＲ５に由来する細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αＣＣＲ５は、ヒトＣＣＲ５（ＣＤ１９５）に対するモノクローナル抗体に由来する（Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19 (2012)）。ＣＣＲ５は主にＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びミクログリア上に発現される。さらに、ＣＣＲ５は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発症及び拡散において役割を果たす。
【０２３４】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αＣＣＲ５と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、αＣＣＲ５結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２３５】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のインビトロでの特性の決定
ＣＣＲ５＋細胞及びＣＣＲ５−細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に記載されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。ＣＣＲ５＋陽性細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のＢｍａｘは約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるＣＣＲ５−細胞への有意な結合はない。
【０２３６】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に記載のような無細胞のインビトロでのタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２３７】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の細胞毒性特性を、ＣＣＲ５＋細胞を用いて以前の実施例に記載のような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の選択的細胞毒性特性を、ＣＣＲ５＋細胞と比較してＣＣＲ５−細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じて、ＣＣＲ５＋細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にＣＣＲ５を発現する細胞と比較して細胞表面上にＣＣＲ５を発現しない細胞について約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【０２３８】
動物モデルを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のインビボでの効果の決定
動物モデルを用いて、ドナー材料からのＴ細胞の枯渇に対する細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のインビボでの効果を決定する（Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)）。非ヒト霊長類を用いて、ＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５のインビボでの効果を決定する。移植片対宿主疾患を、ドナー臓器をＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５で予備処理した場合の腎臓移植後にアカゲザルにおいて分析する（Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009)を参照されたい）。カニクイザル霊長類における末梢血Ｔリンパ球のインビボでの枯渇を、異なる用量のＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の非経口投与後に観察する。ＨＩＶ感染を遮断するためのＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５の使用を、非ヒト霊長類に急性用量のＳＬＴ−１Ａ：：αＣＣＲ５を投与することにより試験して、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）への曝露の際に循環Ｔ細胞を大幅に枯渇させる（Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)を参照されたい）。
【実施例９】
【０２３９】
志賀様毒素１のＡサブユニット及び抗体αＵＬ１８に由来する細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域αＵＬ１８は、サイトメガロウイルスに感染したヒト細胞上に存在する、細胞表面サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８に対する、当業界で公知の技術を用いて生成された抗体に由来する（Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100 (2008)）。ヒトサイトメガロウイルス感染は、様々ながん及び炎症障害と関連する。
【０２４０】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８の構築、産生、及び精製
免疫グロブリン型結合領域αＵＬ１８と、志賀毒素エフェクター領域とを一緒に連結して、タンパク質を形成させる。例えば、αＵＬ１８結合タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８をコードするポリヌクレオチドを発現させることにより、融合タンパク質を産生する。ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８細胞毒性タンパク質の発現を、以前の実施例に記載のような細菌及び／又は無細胞タンパク質翻訳系を用いて達成する。
【０２４１】
細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８のインビトロでの特性の決定
サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陽性細胞及びサイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陰性細胞に関する本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性を、以前の実施例に記載されたような蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陽性細胞に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８のＢｍａｘは約５０，０００〜２００，０００ＭＦＩであり、ＫＤは０．０１〜１００ｎＭの範囲内にあると測定されるが、このアッセイにおけるサイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陰性細胞への有意な結合はない。
【０２４２】
ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８細胞毒性タンパク質のリボソーム不活化能力を、以前の実施例に記載のような無細胞のインビトロでのタンパク質翻訳において決定する。無細胞タンパク質合成に対する本実施例の細胞毒性タンパク質の阻害効果は有意である。この無細胞アッセイにおけるタンパク質合成に対するＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８のＩＣ５０は、約０．１〜１００ｐＭである。
【０２４３】
細胞死滅アッセイを用いる細胞毒性タンパク質ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８の細胞毒性の決定
ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８の細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陽性細胞を用いて以前の実施例に記載のような一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。さらに、ＳＬＴ−１Ａ：：αＵＬ１８の選択的細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陽性細胞と比較してサイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞死滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞株に応じて、サイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８陽性細胞について約０．０１〜１００ｎＭである。細胞毒性タンパク質のＣＤ５０は、細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８を発現する細胞と比較して細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質ＵＬ１８を発現しない細胞について約１０〜１０，０００倍高い（細胞毒性が低い）。
【実施例１０】
【０２４４】
様々な細胞型を標的化する様々な細胞毒性タンパク質
本実施例では、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素１のＡサブユニット（ＳＬＴ−１Ａ）、志賀毒素（ＳｔｘＡ）、及び／又は志賀様毒素２（ＳＬＴ−２Ａ）に由来する。免疫グロブリン型結合領域は、表８の第１列から選択され、表８の第２列に示される細胞外標的生体分子に結合する分子に由来する免疫グロブリンドメインに由来する。本実施例の例示的細胞毒性タンパク質を、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を用いて以前の実施例に記載のように作製及び試験する。本実施例の例示的タンパク質を用いて、表８の第３列に示される疾患、状態、又は障害を診断及び治療することができる。
【０２４５】
【表１０】
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【０２４６】
本発明のいくつかの実施形態を例示によって説明してきたが、本発明を多くの改変、変更及び適合化と共に実行することができ、本発明の精神から逸脱するか、又は特許請求の範囲を超えることなく、いくつかの等価物又は代替的な解決法の使用が当業者の範囲内にあることが明らかである。
【０２４７】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願の全体が参照により組込まれると具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組込まれる。米国仮特許出願第６１／７７７，１３０号明細書は、その全体が参照により組込まれる。本明細書で引用されるアミノ酸及びヌクレオチド配列に関するGenBank（National Center for BiotechnologyInformation、U.S.）からの全ての電子的に利用可能な生物学的配列情報の完全な開示は、参照により組込まれる。
【０２４８】
【表１１】
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2019205435.tif 000015
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019205435.tif 000022
【図８】
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【配列表】
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