(57)【要約】【課題】顕微ラマン分光測定におけるレーザ光の試料への合焦を速やかに行い、分光測定の非専門家であっても効率的に多数の試料の顕微ラマン分光測定を行えるようにする。【解決手段】顕微ラマン分光測定装置１００の制御部１１０は、機械的駆動部１０９によりステージ１０１の高さを変化させて対物レンズ１０４及びステージ１０１間の対向距離を変化させながら、レーザ光源１０２から出射させたレーザ光を固定部材５０１及び５０２に挟まれた試料５０３に照射し、分光部１０８から固定部材５０１又は５０２と試料５０３のラマン散乱光の強度を抽出して、レーザ光の試料への合焦が推定されるときの対向距離の値を合焦距離として確定する。【選択図】図１
2019109180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を照射された試料から散射されるラマン散乱光を検出して分析することができる顕微ラマン分光測定装置において、
レーザ光源と、
試料載置面を有し、前記試料を光透過性の固定部材に固定して前記試料載置面に載置することができるステージと、
前記ステージに対向すると共に、前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの向きに合焦させるように配置された対物レンズと、
前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部と、
前記ラマン散乱光のスペクトルを計測することができる分光部と、
前記レーザ光源から出射したレーザ光を、前記対物レンズを経て前記ステージに向かわせると共に、前記対物レンズを経て入射した前記ラマン散乱光を前記分光部に向かわせることができる光弁別部と、
前記機械的駆動部を制御して前記対向距離を変化させる度に前記レーザ光源を制御してレーザ光を出射させると共に前記分光部が計測したスペクトルのデータを取得することができ、かつ、前記スペクトルのデータから抽出した前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件を満たすときの前記対向距離の値を合焦距離として確定することができる制御部とを
備えたことを特徴とする顕微ラマン分光測定装置。
【請求項２】
前記制御部は、前記機械的駆動部を制御して前記対向距離を単調増加又は単調減少の向きに変化させることができ、かつ、前記対向距離を単調増加又は単調減少の向きに変化させる度に抽出した前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度が予め与えたしきい値を超えた後に前記しきい値を下回ることを前記合焦条件とすることを特徴とする請求項１に記載の顕微ラマン分光測定装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記機械的駆動部を制御して前記対向距離を単調増加又は単調減少の向きに変化させることができ、かつ、前記対向距離を単調増加又は単調減少の向きに変化させる度に前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度を抽出して、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度が予め与えた第１のしきい値を超えた後に前記第１のしきい値を下回ると共に前記試料に固有のラマン散乱光の強度が予め与えた第２のしきい値を超えることを前記合焦条件とすることを特徴とする請求項１に記載の顕微ラマン分光測定装置。
【請求項４】
前記機械的駆動部は、圧電式アクチュエータ又は光学式アクチュエータを有して構成されたことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の顕微ラマン分光測定装置。
【請求項５】
前記機械的駆動部は、前記試料載置面に平行に前記ステージの前記対物レンズに対する相対位置を変化させることができ、
前記制御部は、前記合焦距離を確定した後に、前記機械的駆動部を制御して前記試料載置面に平行に前記ステージの前記対物レンズに対する相対位置を変化させる度に前記レーザ光源を制御してレーザ光を出射させると共に前記分光部が計測したスペクトルのデータを取得することができる
ことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の顕微ラマン分光測定装置。
【請求項６】
レーザ光源、ステージ、前記ステージに対向すると共に前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの方向へ合焦させるように配置された対物レンズ、前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部、光弁別部並びに分光部を有してなる顕微ラマン分光測定装置を用いて行う顕微ラマン分光測定の方法において、
試料を光透過性の固定部材に固定して前記ステージの試料載置面に載置し、
前記機械的駆動部により前記対向距離の初期値を設定し、
指定した時間にわたり前記レーザ光源からレーザ光を出射させ、
前記レーザ光が前記光弁別部及び前記対物レンズを経て、前記固定部材に固定されて前記試料載置面に載置された前記試料を照射したとき、前記固定部材及び前記試料の少なくともいずれか一方から散射されたラマン散乱光を含み前記対物レンズ及び前記光弁別部を経て前記分光部に計測された光のスペクトルから、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度を抽出し、
前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件を満たしたか否かを判定し、
前記合焦条件が満たされたと判定するまで、前記機械的駆動部により前記対向距離の値を変更する度に、前記レーザ光の出射並びに前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の抽出を繰り返し、
前記合焦条件が満たされたと判定したときの前記対向距離の値を合焦距離として確定する
ことを特徴とする顕微ラマン分光測定の方法。
【請求項７】
レーザ光源、ステージ、前記ステージに対向すると共に前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの向きに合焦させるように配置された対物レンズ、前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部、光弁別部並びに分光部を有してなる顕微ラマン分光測定装置を用いて行う顕微ラマン分光測定の方法において、
試料を光透過性の固定部材に固定して前記ステージの試料載置面に載置するステップと、
前記機械的駆動部により前記対向距離の初期値を設定する第１のステップと、
指定した時間にわたり前記レーザ光源からレーザ光を出射させる第２のステップと、
前記レーザ光が前記光弁別部及び前記対物レンズを経て、前記固定部材に固定されて前記試料載置面に載置された前記試料を照射したとき、前記固定部材及び前記試料の少なくともいずれか一方から散射されたラマン散乱光を含み前記対物レンズ及び前記光弁別部を経て前記分光部に計測された光のスペクトルから、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度を抽出する第３のステップと、
前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件が満たされたか否かを判定する第４のステップと、
前記第４のステップにおいて前記合焦条件が満たされていないと判定すれば、前記対向距離の値を更新して設定した後、前記第２のステップないし前記第４のステップを繰り返して実行する第５のステップと、
前記第４のステップにおいて前記合焦条件が満たされたと判定したときの対向距離の値を合焦距離として確定する第６のステップとを
備えたことを特徴とする顕微ラマン分光測定の方法。
【請求項８】
前記第５のステップにおいて前記対向距離の値を単調増加又は単調減少の向きに更新し、
前記合焦条件は、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度が予め与えたしきい値を超えた後に前記しきい値を下回ることである
ことを特徴とする請求項７に記載の顕微ラマン分光測定の方法。
【請求項９】
前記第５のステップにおいて前記対向距離の値を単調増加又は単調減少の向きに更新し、
前記合焦条件は、前記第５のステップにおいて前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度が予め与えた第１のしきい値を超えた後に前記第１のしきい値を下回り、かつ、前記試料に固有のラマン散乱光の強度が予め与えた第２のしきい値を超えることである
ことを特徴とする請求項７に記載の顕微ラマン分光測定の方法。
【請求項１０】
前記機械的駆動部が前記試料載置面に平行に前記ステージの前記対物レンズに対する相対位置を変化させることができる場合において、
前記第６のステップの後、前記試料載置面に平行に前記ステージの前記対物レンズに対する相対位置を変化させる度に、前記第２のステップ及び前記第３のステップを繰り返す第７のステップを、
さらに備えたことを特徴とする請求項７ないし請求項９のいずれか１項に記載の顕微ラマン分光測定の方法。
【請求項１１】
レーザ光源、ステージ、前記ステージに対向すると共に前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの向きに合焦させるように配置された対物レンズ、前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部、光弁別部並びに分光部を有してなる顕微ラマン分光測定装置をコンピュータに制御させるプログラムにおいて、
前記機械的駆動部により前記対向距離の初期値を設定する第１のステップと、
指定した時間にわたり前記レーザ光源からレーザ光を出射させる第２のステップと、
前記レーザ光が前記光弁別部及び前記対物レンズを経て、光透過性の固定部材に固定されて前記ステージの試料載置面に載置された試料を照射したとき、前記固定部材及び前記試料の少なくともいずれか一方から散射されたラマン散乱光を含み前記対物レンズ及び前記光弁別部を経て前記分光部に計測された光のスペクトルから、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度を抽出する第３のステップと、
前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件が満たされたか否かを判定する第４のステップと、
前記第４のステップにおいて前記合焦条件が満たされなければ、前記対向距離の値を更新して設定した後、前記第２のステップないし前記第４のステップを繰り返して実行する第５のステップと、
前記第４のステップにおいて前記合焦条件が満たされたと判定したときの対向距離の値を合焦距離として確定する第６のステップとを
前記コンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラマン分光測定に係り、特に光学系に顕微鏡を用いる顕微ラマン分光測定のための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光技術を用いれば、試料に対する前処理を行わなくても、試料の分子構造や分子環境に関する詳細な知見を低侵襲的に得ることができる。このため、ラマン分光技術を活用した非生検的な新規医療診断法の開発が，国内外で盛んに行われている。特に、光学系に顕微鏡を用いる顕微ラマン分光測定によれば、試料中の微細な領域の情報を取り出すことができるので、分解能の高い精緻な測定、診断を行うことができる。
【０００３】
顕微ラマン分光測定により、例えば疾患の病態診断をラマンスペクトルに基づき精度よく行うためには、その疾患の病態を示す生検試料と健康な生検試料のラマンスペクトルを多数測定して、データを蓄積する必要がある。そのためには、多数回のラマンスペクトル測定を良好な条件の下で迅速に行う必要がある。
【０００４】
顕微ラマン分光測定を行う場合、まず生検試料を光透過性の固定部材に固定して（例えば、板状の石英ガラス（スライドガラス及びカバーガラス）にはさんで）、顕微鏡のステージの試料載置面に載置する。そこに顕微鏡の光学系を通してレーザ光を照射し、試料から散射されたラマン散乱光を集光する（照射と集光には光学系の一部を共用する。）。ステージに対向する対物レンズを試料の下方に配置する倒立配置の場合、レーザ光の光軸に沿って下から順に対物レンズ、スライドガラス、生検試料、カバーガラスが並ぶことになる。生検試料の典型的な厚みは、例えば１ｍｍ程度である。
【０００５】
上記の配置において良好な条件で顕微ラマン分光測定を行うには、光軸上の対物レンズの焦点を生検試料の位置（例えば１ｍｍ厚の範囲内）に合わせる合焦のための調整が必要である。試料ではなく固定部材に対物レンズの焦点が合っている状態では、試料よりも固定部材のラマンスペクトルが優勢となって、測定の目的を果たすことができない。そのため従来は、対物レンズとステージ間の光軸方向の距離（以下、対向距離という。）を手動で少しずつ変えて（ステージを固定して対物レンズが取り付けられた鏡筒を少しずつ上下に動かすか、又は鏡筒を固定してステージを少しずつ上下に動かして）、その都度測定されるラマンスペクトルの変化を読み取り、合焦の条件を満たす対向距離(以下、合焦距離という。）を確定するという調整が行われてきた。
【０００６】
しかし、生検試料の測定を行う医師や医療技師はほとんどの場合分光測定の専門家ではないので、上述の調整作業をすばやく効率的に行うのには限界がある（例えば１０分以上を要することがある。）。特に、厚みが一様ではない多数の生検試料をとりかえながらそれぞれの顕微ラマン分光測定を行おうとすると、その作業負荷が過大となるおそれがある。
【０００７】
顕微ラマン分光測定において、ガラス等の試料保持用の透明体から生じる背景光の影響を軽減するための技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１によれば、試料保持用の透明体は、ＣａＦ２単結晶、合成石英、又はフッ化物ガラスからなることが記載されている。特許文献１の技術は、透明体から発する蛍光のレベルを下げられるような材料を選ぶことによって背景光の影響を軽減するものであるが、レーザ光の焦点を迅速に試料に合わせられるようにするという課題を解決するには異なるアプローチが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−２３７６４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、光透過性の固定部材に固定してステージに載置した試料に対してレーザ光を迅速に合焦させ、分光測定の非専門家であっても効率的に多数の試料の顕微ラマン分光測定を行えるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決するため、本発明に係る顕微ラマン分光測定装置は、レーザ光を照射された試料から散射されるラマン散乱光を検出して分析することができる顕微ラマン分光測定装置において、レーザ光源と、試料載置面を有し、前記試料を光透過性の固定部材に固定して前記試料載置面に載置することができるステージと、前記ステージに対向すると共に、前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの向きに合焦させるように配置された対物レンズと、前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部と、前記ラマン散乱光のスペクトルを計測することができる分光部と、前記レーザ光源から出射したレーザ光を、前記対物レンズを経て前記ステージに向かわせると共に、前記対物レンズを経て入射したラマン散乱光を前記分光部に向かわせることができる光弁別部と、前記機械的駆動部を制御して前記対向距離を変化させる度に前記レーザ光源を制御してレーザ光を出射させると共に前記分光部が計測したスペクトルのデータを取得することができ、かつ、前記スペクトルのデータから抽出した前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件を満たすときの前記対向距離の値を合焦距離として確定することができる制御部とを備えたことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る顕微ラマン分光測定の方法は、レーザ光源、ステージ、前記ステージに対向すると共に前記ステージと反対側から入射する光を前記ステージの向きに合焦させるように配置された対物レンズ、前記対物レンズ及び前記ステージ間の対向距離を変化させることができる機械的駆動部、光弁別部並びに分光部を有してなる顕微ラマン分光測定装置を用いて行う顕微ラマン分光測定の方法において、試料を光透過性の固定部材に固定して前記ステージの試料載置面に載置し、前記機械的駆動部により前記対向距離の初期値を設定し、指定した時間にわたり前記レーザ光源からレーザ光を出射させ、前記レーザ光が前記光弁別部及び前記対物レンズを経て、前記固定部材に固定されて前記試料載置面に載置された前記試料を照射したとき、前記固定部材及び前記試料の少なくともいずれか一方から散射されたラマン散乱光を含み前記対物レンズ及び前記光弁別部を経て前記分光部に計測された光のスペクトルから、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度を抽出し、前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の少なくともいずれか１の値から前記レーザ光の前記試料への合焦が推定される合焦条件を満たしたか否かを判定し、前記合焦条件が満たされたと判定するまで、前記機械的駆動部により前記対向距離の値を変更する度に、前記レーザ光の出射並びに前記固定部材に固有のラマン散乱光の強度及び前記試料に固有のラマン散乱光の強度の抽出を繰り返し、前記合焦条件が満たされたと判定したときの前記対向距離の値を合焦距離として確定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、光透過性の固定部材に固定してステージに載置した試料に対してレーザ光を迅速に合焦させ、分光測定の非専門家であっても効率的に多数の試料の顕微ラマン分光測定を行えるようにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例に係る顕微ラマン分光測定装置のブロック図である。
【図２】図２は、本発明の実施例に係る顕微ラマン分光測定の方法を説明するフローチャートである。
【図３】図３は、本発明の実施例における対向距離の設定を説明する概念図である。
【図４】図４は、図２のフローの一部を詳細に説明するフローチャートである。
【図５】図５は、図２のフローの一部を実行して得たラマンスペクトルの実測データである。
【図６】図６は、鶏肉片を試料とする本発明の実施例における合焦条件成立の実験例を示す図である。
【図７】図７は、シリコン片を試料とする本発明の実施例における合焦条件成立の実験例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して、本発明の実施例を説明する。以下に説明する実施例は、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【００１５】
図１は、本発明の実施例に係る顕微ラマン分光測定装置１００のブロック図である。顕微ラマン分光測定装置１００が備えるステージ１０１の試料載置面１０１Ｓに、カバーガラス５０１とスライドガラス５０２からなる光透過性の固定部材に挟まれて固定された試料５０３を載置することができる。顕微ラマン分光測定装置１００は倒立配置をとるから、ステージ１０１の中央を開口するなどして、顕微ラマン分光測定装置１００の後述する光学系と試料５０３の間の光路を確保している。なお、カバーガラス５０１、スライドガラス５０２及び試料５０３は、顕微ラマン分光測定装置１００の構成に含まれない。
【００１６】
顕微ラマン分光測定装置１００の光学系は、レーザ光源１０２、光弁別部１０３、対物レンズ１０４、ミラー１０５及びミラー１０６を備えている。光弁別部１０３は、例えばレーザ光源１０２から出射するレーザ光と同じ波長の光を反射し、その他の波長の光を透過するダイクロイックミラーである。図１に示した構成においては、光弁別部１０３が、レーザ光源１０２から出射しミラー１０５を経て光弁別部１０３に到来したレーザ光をミラー１０６の方向に反射することができる。また、光弁別部１０３は、レーザ光を照射された試料５０３等から生じて対物レンズ１０４を経由しミラー１０６に反射された光（レーザ光と波長が異なるラマン散乱光等を含む。）を透過して、後述する分光部１０８に向かわせることができる。
【００１７】
対物レンズ１０４は、ミラー１０６から到来したレーザ光の光束を焦点に向けて収束させ、焦点の位置に配置されたと期待される試料５０３に対して照射する。また、試料５０３等から生じたラマン散乱光を含む光を受光して、その光束をレーザ光の進行方向と逆の向きに光弁別部１０３へ向かわせる。
【００１８】
顕微ラマン分光測定装置１００の光学系の構成は、図１に示したものに限られない。例えば光弁別部１０３は、レーザ光と同じ波長の光を選択的に対物レンズ１０４を経て試料照射に向かわせ、対物レンズ１０４から到来するレーザ光と異なる波長の光を分光部１０８に向かわせることができるものであれば、どのようなものでもよい。光学系の各構成は、図１に示したような位置関係になくてもよいし、そもそも倒立配置に限るものでもない。ミラー１０５及びミラー１０６のようなミラー、各種のレンズ、エッジフィルタ等の光学素子を、光学系の各構成の配置に合わせて適宜取捨選択して配置してもよい。
【００１９】
顕微ラマン分光測定装置１００は、分光部１０８と機械的駆動部１０９を備えている。分光部１０８は、入射光を波長ごとの成分に分解する分光器と、例えばＣＣＤ等の素子からなる検出器を含む公知の構成を有する。機械的駆動部１０９は、例えば圧電式アクチュエータ（ピエゾ素子等）又は光学式アクチュエータ（オプトマイクロメータ等）を有して構成され、ステージ１０１と対物レンズ１０４の間の対向距離を変化させることができる。例えば対物レンズ１０４を含む鏡筒が固定された構成の場合、機械的駆動部１０９はステージ１０１を図１における上下の向きに移動させることができる。
【００２０】
機械的駆動部１０９は、さらに、試料載置面１０１Ｓに平行に、ステージ１０１の対物レンズ１０４に対する相対位置を変化させることができる。例えば対物レンズ１０４を含む鏡筒が固定された構成の場合、機械的駆動部１０９はステージ１０１を図１における左右方向及び紙面に垂直な方向に移動させることができる。このような構成は、スキャン対応の顕微鏡ステージとして公知であり商用化されたものである。
【００２１】
顕微ラマン分光測定装置１００は、制御部１１０を備えている。制御部１１０は、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）に、実施例に係る顕微ラマン分光測定の方法を実行させるプログラムを実装したものである。制御部１１０は、レーザ光源１０２、分光部１０８及び機械的駆動部１０９と、それぞれ有線又は無線を介して接続されている（インターネット等のネットワークを介して接続される場合を含む。）。これらの接続は、図１に破線の両向き矢線によって表されている。
【００２２】
制御部１１０は機械的駆動部１０９を制御して、ステージ１０１と対物レンズ１０４の間の対向距離を変化させることができる。制御部１１０は機械的駆動部１０９を制御して、さらに、試料載置面１０１Ｓに平行にステージ１０１の対物レンズ１０４に対する相対位置を変化させることができる。制御部１１０はレーザ光源１０２を制御して、指定した時間にわたってレーザ光を出射させることができる。制御部１１０は分光部１０８を制御して、分光部１０８が計測したスペクトルのデータを取得することができる。
【００２３】
顕微ラマン分光測定装置１００を用いて行われる顕微ラマン分光測定の実施例に係る方法を、以下に説明する。図２は、実施例に係る方法を説明するフローチャートである。初めに（ＳＴＡＲＴ）、試料５０３を固定部材（カバーガラス５０１及びスライドガラス５０２）に挟んで固定し、ステージ１０１の試料載置面１０１Ｓに載置する（ステップＳ２０）。続いて制御部１１０が機械的駆動部１０９に指示して、対向距離を初期値（例えばステージ１０１を可動範囲中の最も低い位置に設定したときの対向距離の値）に設定する(ステップＳ２１)。このとき制御部１１０は機械的駆動部１０９に指示して、試料載置面１０１Ｓに平行な面内でのステージ１０１の対物レンズ１０４に対する相対位置（以下、二次元位置という。）の初期値も設定する。
【００２４】
制御部１１０は、ラマンスペクトルの測定を連続的に行う時間を指定して、その指定した時間にわたりレーザ光源１０２からレーザ光を出射させる（ステップＳ２２）。指定する時間は、測定の目的により装置の条件の範囲内で任意に選ぶことができる（通常は秒単位の時間を選ぶが、蛍光強度の減衰（ブリーチ）を待つ必要がある場合等に分単位の時間を選ぶことがある。）。
【００２５】
レーザ光源１０２から出射したレーザ光は、図１を参照して説明した顕微ラマン分光測定装置１００の光学系を経て、対物レンズ１０４から試料５０３を照射する方向へ向かう。レーザ光に照射された試料５０３又はカバーガラス５０１とスライドガラス５０２からなる固定部材から生じたラマン散乱光又は背景光を含む光は対物レンズ１０４で集光され、光弁別部１０３を通過して分光部１０８へ到達する。
【００２６】
分光部１０８は、上記のラマン散乱光又は背景光を含む光を分光して、波数を単位とするラマンシフトに対してプロットされたスペクトルのデータを得る。制御部１１０は、固定部材（カバーガラス５０１又はスライドガラス５０２）に固有のラマンシフトの値と試料５０３に固有のラマンシフトの値が既知であるとの前提の下で、当該スペクトルのデータから固定部材（カバーガラス５０１又はスライドガラス５０２）に固有のラマン散乱光の強度及び試料５０３に固有のラマン散乱光の強度を抽出することができる（ステップＳ２３）。
【００２７】
顕微ラマン分光測定の対象は試料５０３に固有のラマン散乱光の強度であるから、固定部材（カバーガラス５０１又はスライドガラス５０２）に固有のラマン散乱光の強度が支配的でないように対向距離を設定することが望ましい。図３は、対向距離の設定を説明する概念図である。横軸は対向距離を表し、縦軸はラマン散乱光の強度を表す（いずれも任意単位とする。）。固定部材及び試料のラマン散乱光の強度を、それぞれ実線カーブ及び破線カーブで表す。
【００２８】
図３においては、対向距離をある単位長ずつ単調増加させる（図１の例では、対物レンズ１０４の位置を固定してステージ１０１の高さを徐々に上げる。）とき、レーザ光が初めに固定部材（図１の例ではカバーガラス５０１）に合焦して、固定部材のラマン散乱光の強度（実線カーブ）が試料（図１の例では試料５０３）のラマン散乱光の強度（破線カーブ）を上回ると共にピークに達する。その後も対向距離を増加させていくと、レーザ光の焦点は次第に試料５０３に移るから、破線カーブが実線カーブを上回ると共にピークに達する。
【００２９】
実線カーブに対してしきい値“ＴＨ１”を与え、破線カーブに対してしきい値“ＴＨ２”を与えるものとする。さらに、固定部材に固有のラマン散乱光の強度が支配的でなくレーザ光の試料５０３への合焦が推定される対向距離の条件（以下、合焦条件という。）として、対向距離を単調増加の向きに変化させたとき実線カーブがしきい値“ＴＨ１”を超えた後にしきい値“ＴＨ１”を下回り、かつ、破線カーブがしきい値“ＴＨ２”を超えることとする。
【００３０】
図３においては、対向距離を横軸左方の小さい値から単調増加させて値“Ｄ１”に達したとき、固定部材のラマン散乱光の強度がしきい値“ＴＨ１”を超える。その後、固定部材のラマン散乱光の強度は対向距離“Ｄ２”においてピークに達し、さらに対向距離を増加させていくと“Ｄ３”においてしきい値“ＴＨ１”を下回る。対向距離が“Ｄ３”に達するまでは、上記の合焦条件が満たされない（ステップＳ２４の“ＮＯ”）。上記の合焦条件が満たされなければ、制御部１１０は機械的駆動部１０９を制御して、対向距離を１単位長だけ増加させる（ステップＳ２５）。その後、フローをステップＳ２２に戻して、対向距離が“Ｄ３”に達するまでステップＳ２２ないしステップＳ２４を繰り返し実行する。
【００３１】
その後、制御部１１０は、対向距離が“Ｄ３”に達した状態でステップＳ２４を実行する。対向距離“Ｄ３”においては、実線カーブがしきい値“ＴＨ１”を超えた後にしきい値“ＴＨ１”を下回っており、かつ、破線カーブがしきい値“ＴＨ２”を超えているから、上記の合焦条件が満たされる（ステップＳ２４の“ＹＥＳ”）。合焦条件が満たされていれば、固定部材に固有のラマン散乱光の強度が支配的でなくレーザ光の試料５０３への合焦が推定される状態で、試料５０３のラマン散乱光の強度を測定することができる。したがって、制御部１１０は対向距離“Ｄ３”を、それ以降の顕微ラマン分光測定の合焦距離として確定する（ステップＳ２６）。
【００３２】
次に制御部１１０は機械的駆動部１０９を制御して、ステージ１０１の二次元位置を試料載置面１０１Ｓに平行に繰り返し移動させ、移動の度に図２のステップＳ２２及びステップＳ２３と同じプロセスを実行する（ステップＳ２７）。図４は、ステップＳ２７を詳細に説明するフローチャートである。
【００３３】
二次元位置として、予め（Ｎ＋１）とおりの位置が定められていると仮定する。これらの二次元位置を、符号“Ｐ０”、“Ｐ１”、…、“ＰＮ”で表し、“Ｐｉ”と総称する。（Ｎ＋１）とおりの“Ｐｉ”のうちの“Ｐ０”が、図４のステップＳ２１と同時に設定した二次元位置の初期値である。図４を参照すると、開始の時点における“Ｐｉ”の値が”Ｐ０“である（ステップＳ４０）。
【００３４】
制御部１１０は、ラマンスペクトルの測定を連続的に行う時間を指定して、その指定した時間にわたりレーザ光源１０２からレーザ光を出射させる（ステップＳ４１）。このステップは、図２におけるステップＳ２２と同じである。次に制御部１１０は、図２におけるステップＳ２３と同様に、分光部１０８が得たスペクトルのデータから、固定部材（カバーガラス５０１又はスライドガラス５０２）に固有のラマン散乱光の強度及び試料５０３に固有のラマン散乱光の強度を抽出することができる（ステップＳ４２）。このステップは、図２におけるステップＳ２３と同じである。ただしステップＳ４２では、すべての二次元位置において、レーザ光の試料５０３への合焦が推定される状態で後者を抽出することができる。
【００３５】
制御部１１０は、二次元位置Ｐｉが終点のＰＮに達していなければ（ステップＳ４３の“ＮＯ”）、Ｐｉを次の二次元位置へ更新して（ステップＳ４４）フローをステップＳ４１に戻す。制御部１１０は、二次元位置Ｐｉが終点のＰＮに達していれば（ステップＳ４３の“ＹＥＳ”）、フローを終了する。この時点で図２に表したフローも終了し、固定部材（カバーガラス５０１又はスライドガラス５０２）に固有のラマン散乱光が支配的でなくレーザ光の試料５０３への合焦が推定される状態で、試料５０３の（Ｎ＋１）とおりの二次元位置に対する顕微ラマン分光測定が終了する。
【００３６】
ここまでの説明において、合焦条件は図３に示したように対向距離を単調増加の向きに変化させたとき実線カーブがしきい値“ＴＨ１”を超えた後にしきい値“ＴＨ１”を下回り、かつ、破線カーブがしきい値“ＴＨ２”を超えることであるとした。しかし、対向距離の変化を単調減少の向きにしてもよい（図１の例で説明すると、レーザ光が初めにスライドガラス５０２に合焦し、その後徐々に焦点が試料５０３に移る場合である。）。
【００３７】
また、測定の条件により背景光等が強くて明瞭な破線カーブを得にくいことがある。そのような場合には、実線カーブがしきい値“ＴＨ１”を超えた後にしきい値“ＴＨ１”を下回ることだけをもって合焦条件としてもよい。合焦距離を確定した後に試料を自動的に二次元走査せず、試料の二次元位置を人為的に適宜選んで顕微ラマン分光測定を行ってもよい。
【００３８】
以下、図５ないし図８を参照して、上述した実施例による実測データの例を説明する。図５は、生検試料の鶏肉片を石英ガラスからなる固定部材に挟んで、図２のステップＳ２２ないしステップＳ２４を繰り返し実行したときの、ラマンスペクトルの実測データである（最も下のカーブが対向距離の初期値に対応し、最も上のカーブが合焦条件を満たした対向距離の値に対応する。）。
【００３９】
図５の横軸はラマンシフト（単位はｃｍ−１）、縦軸は光の強度（任意単位）である。図中の実線の矢線は、対向距離を単調増加させた向きを表す。石英ガラスのラマンスペクトル（４２０ｃｍ−１）及び鶏肉のラマンスペクトル（１４４８ｃｍ−１）がともに観測されているが、この実測では背景光等の影響を考慮して石英ガラスのラマンスペクトルの変化のみに基づき合焦条件を判定した。
【００４０】
図６は、上記の石英ガラスで挟んだ鶏肉片を試料として、対向距離を初期値から単調増加させたときにどこで合焦条件を満たすと判定したかの実験例を示す図である。実験に用いた顕微ラマン分光装置は図１と同じ倒立配置をとり、図６の横軸はある基準の高さを０としたときのステージの高さ（単位はμｍ）を表す（横軸を左から右に向かう方向が対向距離の単調増加の方向である。）。
【００４１】
対向距離を２５μｍステップ（最大３６点）で変化させたときの鶏肉のラマンスペクトル（１４４８ｃｍ−１）の強度（計測した範囲内の最大値で正規化した値）の変化を、図６の濃い色のカーブで表す。同じ対向距離の変化に伴う石英ガラスのラマンスペクトル（４２０ｃｍ−１）の強度（計測した範囲内の最大値で正規化した値）の変化を、図６の淡い色のカーブで表す。なお、濃淡のカーブは共にそれぞれの最大値で正規化した値を示し、両者の絶対値の比較を示すものではない。
【００４２】
図６の実験例では、出力４０ｍＷのレーザ光を１秒間（図２のステップＳ２２で指定した時間）照射して測定を行った。図６に示した「合焦条件ＯＫ」の矢線が示すステージ高さに対応する対向距離が、合焦距離として確定された値である。この合焦距離は、石英ガラスのラマンスペクトル強度が最大値を経過して下降しつつある局面に表れており、狙った値に近いものと評価される。
【００４３】
鶏肉片を試料とする実験では、蛍光等の背景光の影響により合焦距離を適切に確定できないこともあったので、その影響がより小さいと予想されるシリコン片を石英ガラスの固定部材に挟んで同様の実験を行った。その結果を、図７に示す。図７の横軸は図６の横軸と同じで、縦軸はラマンスペクトルの強度（任意単位）である。
【００４４】
対向距離の変化に伴うシリコンのラマンスペクトル（５２０ｃｍ−１）の強度の変化を、図７の濃い色のカーブで表す。対向距離の変化に伴う石英ガラスのラマンスペクトル（４２０ｃｍ−１）の強度の変化を、図７の淡い色のカーブで表す。なお、濃淡のカーブは共にそれぞれ適宜規格化した値を示し、両者の絶対値の比較を示すものではない。図７に示した「合焦条件ＯＫ」の矢線が示すステージ高さに対応する対向距離が、合焦距離として確定された値である。この合焦距離は、石英ガラスのラマンスペクトル強度が最大値を経過して下降しつつある局面に表れており、狙った値に近いものと評価される。
【００４５】
本発明の実施例によれば、固定部材由来のラマンスペクトルが支配的でない状態で試料由来のラマンスペクトルを測定することができる対向距離（試料と対物レンズ間の距離）を自動的に確定することができるので、分光測定の非専門家が１０分近くを要することもある作業を典型的には数十秒で終えることができる（蛍光が強い試料に対して蛍光強度の減衰（ブリーチ）を待つ必要がある場合でも、ブリーチの時間を含めて４分程度である。）。
【００４６】
合焦距離の確定後に試料の１００点程度の二次元走査を行う場合でも、合焦距離の確定までの時間と合計して５分程度で自動測定を完了する。したがって、分光測定の専門家でなくても、効率的に顕微ラマン分光測定を行うことができる。上述した実施例に係る顕微ラマン分光測定装置の構成や顕微ラマン分光測定の方法は、試料、器具、測定環境等の条件に応じて、発明の要旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
【符号の説明】
【００４７】
１００    顕微ラマン分光測定装置
１０１    ステージ
１０１Ｓ    試料載置面
１０２    レーザ光源
１０３    光弁別部
１０４    対物レンズ
１０５、１０６    ミラー
１０８    分光部
１０９    機械的駆動部
１１０    制御部
５０１    カバーガラス
５０２    スライドガラス
５０３    試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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