(57)【要約】      （修正有）【課題】キメラスパイダーシルク生産のためのトランスジェニックカイコ産生系の提供。【解決手段】キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸であって、前記キメラスパイダーシルクポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、（ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）シルクポリペプチドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、（ｂ）１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフを含む１つ又は複数の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１つ又は複数のコピーの弾性モチーフ、任意的なリンカーおよび１つ又は複数の強度モチーフを含む反復セグメント、（ｃ）Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む核酸。【選択図】図５
2019205463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸であって、
前記キメラスパイダーシルクポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、
（ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）シルクポリペプチドのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、
（ｂ）１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフを含む１つ又は複数の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１つ又は複数のコピーの弾性モチーフ、任意的なリンカーおよび１つ又は複数の強度モチーフを含む反復セグメント、
（ｃ）Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）
を含み、
前記弾性モチーフが、１つ又は複数のＧＰＧＧＡ（配列番号２）弾性モチーフ、鞭毛状様弾性モチーフ、大スピドロイン様（ＭａＳｐ様）弾性モチーフ、又は小スピドロイン様（ＭｉＳｐ様）弾性モチーフを含み、
前記鞭毛状様弾性モチーフが、配列番号２７乃至２９からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフであり、
前記ＭａＳｐ様弾性モチーフが、配列番号１８乃至２３からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフであり、
前記ＭｉＳｐ様弾性モチーフが、配列番号２４乃至２６からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフである
ことを特徴とする核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸において、前記１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフを含む１つ又は複数の反復セグメントが、スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントを含み、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、４〜１６コピーの弾性モチーフ、任意的なリンカーおよび強度モチーフを含むことを特徴とする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸において、前記弾性モチーフの配列がＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり、かつ、前記強度モチーフの配列がＧＧＰＳＧＰＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３）であることを特徴とする核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸において、前記キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸が、その５’末端に、前記Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃ遺伝子の主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント、及び基本プロモーターを含む核酸が配置されており、その３’末端に、前記Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃ遺伝子の転写終結部位及びポリアデニル化部位を含む核酸が配置されていることを特徴とする核酸。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸によって形質転換されたカイコ細胞であって、
前記カイコ細胞が、受精卵又は分化全能性幹細胞ではなく、
前記改質転換されたカイコ細胞が、非キメラカイコ繊維の引張強度の少なくとも２倍の引張強度を有するキメラ繊維の製造に適したキメラスパイダーシルクポリペプチドを産出することができ、
前記キメラスパイダーシルクポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向に：
（ｉ）Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃシルクポリペプチドのＮ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、４〜１６コピーの弾性モチーフ、任意的なリンカーおよび強度モチーフを含み、前記弾性モチーフがＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり、前記強度モチーフがＧＧＰＳＧＰＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３）である反復セグメント；及び
（ｉｉｉ）Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
を含むことを特徴とするカイコ細胞。
【請求項６】
請求項５に記載のカイコ細胞において、前記４〜１６コピーの弾性モチーフが：
４コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
８コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
１２コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；及び
１６コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
からなる群から選択されることを特徴とするカイコ細胞。
【請求項７】
請求項５に記載のカイコ細胞において、スパイダーシルクモチーフの少なくとも１つの前記反復セグメントが：
１６コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ及び１コピーの配列番号３の強度モチーフを含む配列；並びに
８コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ及び１コピーの配列番号３の強度モチーフを含む配列；
からなる群から選択されることを特徴とするカイコ細胞。
【請求項８】
以下の配列：
（ａ）トランスポゾンの第一末端反復を含む配列；
（ｂ）Ｂ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）遺伝子の主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント及び基本プロモーターを含む第一調節配列であって、前記プロモーターが動作可能に連結している第一調節配列；
（ｃ）キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記キメラポリペプチドが：
（ｉ）Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃシルクポリペプチドのＮ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、４〜１６コピーの弾性モチーフ、任意的なリンカー及び強度モチーフを含み、前記弾性モチーフがＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり、前記強度モチーフがＧＧＰＳＧＰＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３）である反復セグメント；
（ｉｉｉ）Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をこの順序で含む核酸配列；
（ｄ）Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃ遺伝子の転写終結部位及びポリアデニル化部位を含む第二調節配列；並びに
（ｅ）トランスポゾンの第二末端反復を含む配列；
を５’から３’方向に含む核酸であって、
前記プローモーターの少なくとも１つが、形質転換したＢ．ｍｏｒｉの細胞又は組織内で活性であり、前記末端反復の少なくとも１つが、配列（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）の、形質転換したＢ．ｍｏｒｉカイコのゲノムへの転位を促進することを特徴とする核酸。
【請求項９】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン；及び
キメラスパイダーシルクポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸が：
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフィブロイン重鎖シルクポリペプチドのＮ末端断片；
弾性モチーフ及び強度モチーフからなる群から選択される１又は複数のスパイダーシルクモチーフ；並びに
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉフィブロイン重鎖シルクポリペプチドのＣ末端断片；
を含む核酸；
を含むベクターであって、前記ベクターが、配列番号３４に記載の配列を含むベクターｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ１６、及び配列番号３５に記載の配列を含むベクターｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４からなる群から選択されることを特徴とするベクター。
【請求項１０】
（ａ）配列番号３０に記載の配列を含む、ベクターｐＳＬ−スパイダー＃４；
（ｂ）配列番号３１に記載の配列を含む、ベクターｐＳＬ−スパイダー＃４＋ＥＧＦＰ；
（ｃ）配列番号３２に記載の配列を含む、ベクターｐＳＬ−スパイダー＃６；及び
（ｄ）配列番号３３に記載の配列を含む、ベクターｐＳＬ−スパイダー＃６＋ＥＧＦＰ
からなる群から選択されるベクター。
【請求項１１】
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）シルクポリペプチドのＮ末端ドメイン；
１つ又は複数のスパイダーシルクモチーフを含む１つ又は複数の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、１つ又は複数のコピーの弾性モチーフ、任意的なリンカー及び１つ又は複数の強度モチーフを含む反復セグメント；並びに
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をＮ末端からＣ末端の方向に含むキメラスパイダーシルクポリペプチドであって、
前記弾性モチーフが、１つ又は複数のＧＰＧＧＡ（配列番号２）弾性モチーフ、鞭毛状様弾性モチーフ、大スピドロイン様（ＭａＳｐ様）弾性モチーフ、又は小スピドロイン様（ＭｉＳｐ様）弾性モチーフを含み、
前記鞭毛状様弾性モチーフが、配列番号２７乃至２９からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフであり、
前記ＭａＳｐ様弾性モチーフが、配列番号１８乃至２３からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフであり、
前記ＭｉＳｐ様弾性モチーフが、配列番号２４乃至２６からなる群から選択されるコンセンサス配列中の反復アミノ酸モチーフである
ことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドにおいて、前記キメラポリペプチドが：
（ｉ）前記ｆｈｃシルクポリペプチドのＮ末端ドメイン；
（ｉｉ）スパイダーシルクモチーフの１４〜４２個の反復セグメントであって、各反復セグメントが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、４〜１６コピーの弾性モチーフ、任意のリンカー及び強度モチーフを含み、前記弾性モチーフがＧＰＧＧＡ（配列番号２）であり、前記強度モチーフがＧＧＰＳＧＰＧＳＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号３）である、反復セグメント；並びに
（ｉｉｉ）前記Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｆｈｃシルクポリペプチドのＣ末端ドメイン；
をこの順序で含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記４〜１６コピーの弾性モチーフが：
４コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
８コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
１２コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；及び
１６コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ；
からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のキメラポリペプチドにおいて、スパイダーシルクモチーフの少なくとも１つの前記反復セグメントが、１６コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ及び１コピーの配列番号３の強度モチーフを含む配列からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のキメラポリペプチドにおいて、スパイダーシルクモチーフの少なくとも１つの前記反復セグメントが、８コピーの配列番号２の弾性モチーフＧＰＧＧＡ及び１コピーの配列番号３の強度モチーフを含む配列であることを特徴とするキメラポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１２に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドが、成長因子をさらに含むことを特徴とするキメラスパイダーシルクポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１２に記載のキメラスパイダーシルクポリペプチドを含む複合繊維であって、前記繊維が、天然カイコのシルク繊維よりも引張強度が高いことを特徴とする複合繊維。
【請求項１８】
請求項１７に記載の複合繊維において、１つ又は複数の治療剤をさらに含むことを特徴とする複合繊維。
【請求項１９】
請求項１８に記載の複合繊維において、前記１つ又は複数の治療剤の少なくとも１つが、抗感染剤、化学療法剤、抗拒絶剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン剤、及び成長因子からなる群から選択されることを特徴とする複合繊維。
【請求項２０】
請求項１８に記載の複合繊維において、前記１つ又は複数の治療剤の少なくとも１つが、成長因子であることを特徴とする複合繊維。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３７６０号明細書の継続出願であって、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／３８７，３３２号明細書に対する、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。
連邦政府支援の研究または開発に関するステートメント
【０００２】
本研究は国立画像生物医学・生物工学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＤＬＪ）からの助成金Ｒ２１  ＥＢ００７２４７により支援されたものであるため、米国政府は、本出願の技術に権利を有しうる。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＭＪＦ）との間の共同研究協定、およびＫｒａｉｇ  ＢｉｏＣｒａｆｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＭＪＦ）との研究協定が締結されている。
【０００３】
配列表の参照による組み込み
２０１３−０３−２１に作成、２０１３−０３−２１に修正された、ファイルサイズ１８０，２６５バイトのファイル「［１２７１９１＿００１１＿ＵＳ＿ＳＴ２５］」に含まれる配列表は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５３７６０号明細書および米国仮特許出願第６１／３８７，３３２号明細書の配列表もまた、もしあれば、それらの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００４】
本発明は、改善した強度および柔軟性の特性を備えたキメラスパイダーシルク繊維を提供するので、シルク繊維の分野に関する。さらに、本発明は、特定のスパイダーシルク遺伝子配列（スパイダーシルク強度および／またはスパイダーシルク柔軟性および／または弾性のモチーフ配列）を有する、遺伝子操作によるトランスジェニックカイコを使用して、改善されたシルク繊維（具体的には、カイコ／スパイダーシルクのキメラ繊維）を製造するための方法を提供するので、キメラシルク繊維の製造方法の分野に関する。本発明はまた、スパイダーシルクの柔軟性および／または弾性のモチーフならびにスパイダーシルク強度のモチーフに特異的なスパイダーシルク遺伝子配列を含むキメラカイコ配列を含むように遺伝子操作されたトランスジェニックカイコ、ならびに特別に設計されたｐｉｇｇｙＢａｃベクターを使用してこれらのトランスジェニックカイコを作製するための方法が記載されるので、トランスジェニック生物に関する。記載のトランスジェニックカイコを使用する、キメラシルク繊維についての商業生産方法も提供される。
【背景技術】
【０００５】
シルク繊維は、多種多様の重要な外科手術用の縫合糸として長い間使用されてきた。より微細な繊維が、眼、神経、および美容外科の手術用の縫合糸として必要とされる。シルク繊維はまた、人工靭帯、人工腱、熱傷患者における皮膚移植用の弾性包帯、および支持体となり、一部の症例では、骨、歯周囲、および結合組織の再生中に一時的に機能しうるスキャフォールドのための材料として極めて有望である。外科的修復を必要とする前十字靭帯（ＡＣＬ）および他の関節損傷の発生が高齢者層において増加するため、靭帯および腱の材料としてのシルク繊維の開発はますます重要になると予想される。縫合糸として現在使用される繊維は、少数のものが天然のカイコシルクに由来するが、大部分は化学工業により合成ポリマーとして製造される。この手法の大きな制限は、直径、強度、および弾性などの物理的性質の幅が狭いシルク繊維しか提供できないということである。
【０００６】
細菌（Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９６）、酵母（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｅｄｚｙｋ，１９９７）、バキュロウィルス感染昆虫細胞（Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．２００４）、哺乳類細胞（Ｌａｚａｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．２００２）、およびトランスジェニック植物（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００１）を含む多種多様な組換え系が、種々のシルクタンパク質の産生に使用されている。しかしながら、これらの系はいずれも、天然には、シルクを紡ぐようには設計されておらず、したがって、いずれも、有用なシルク繊維を信頼性高く産生することはない。シルク繊維が商業的見地から有用であると見なされるためには、繊維は、適度な張力（強度）および柔軟性および／または弾性の特性を有し、所望の商業用途での繊維の創製に適していなければならない。したがって、この目的のために使用できる系に対する必要性は依然として存在する。
【０００７】
スパイダーシルクタンパク質はいくつかの異種タンパク質産生系で産生されている。それぞれの場合において、産生されるタンパク質量は、実際的な商業レベルをはるかに下回っている。トランスジェニック植物および動物の発現系は、スケールアップすることができるが、これらの系でも、費用効率を高めるため、組換えタンパク質産生レベルを実質的に増加させなければならないであろう。一層困難な問題は、これまでの製造努力が繊維ではなくタンパク質の産生にあったことである。したがって、ポストプロダクション法を使用して、タンパク質は繊維に紡がなければならない。これらの産生および紡糸の問題のため、商業的興味を引くほど長いスパイダーシルク繊維、すなわち「有用な」繊維を製造することができる組換えタンパク質産生系の例は依然として存在しない。
【０００８】
繊維を製造するための以前に報告された試みでは、クモのニワオニグモ（Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）由来のＭａＳｐｌ、ＭａＳｐ２、および関連シルクタンパク質をコードする遺伝子を発現するために哺乳類細胞系が使用された（Ｌａｚａｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ．２００２）。この研究では、６０Ｋｄのスパイダーシルクタンパク質ＡＤＦ−３の産生が得られ、このタンパク質は精製され、ポストプロダクション紡糸方法を用いて繊維を製造するために使用された。しかしながら、この系では有用な繊維が一貫して製造されることはない。さらに、この手法は、タンパク質の可溶化、紡糸が成功する条件の開発、有用な性質を有する繊維を得るためのポストスピンドロー（ｐｏｓｔ−ｓｐｉｎ  ｄｒａｗ）の実施が必要となるため、問題がある。
【０００９】
当技術分野には、生産に使用するために必要とされる要件である張力および柔軟性の特性を有するシルク繊維の製造を一貫して提供するための商業的方法が依然として存在しない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、当技術分野における上記および他の問題点を克服するものである。具体的には、シルク繊維を紡ぐために天然に備わっているように、タンパク質精製、可溶化、および人為的なポストプロダクションの紡糸に関連した問題を回避する、商業規模に適合可能なトランスジェニックカイコ産生系を提供する。
【００１１】
一般的および全体的な意味において、本発明は、優れた張力および柔軟性の特性を有する商業的に有用なキメラシルク繊維の異種シルクタンパク質産生用のプラットフォームとしてトランスジェニックカイコを使用して、キメラスパイダーシルク繊維を製造するための生物工学的手法を提供する。キメラシルク繊維は、特定範囲の所望の物理的性質または所望の生物医学的用途のために最適化された所定の性質を有する繊維を提供するようにカスタムデザインすることができる。
【００１２】
スパイダー／カイコシルクタンパク質およびキメラスパイダーシルク繊維：
一態様では、本発明は、１つまたは複数のスパイダーシルク柔軟性および／または弾性モチーフ／ドメイン配列および／または１つまたは複数のスパイダーシルク強度ドメイン配列を含む配列によりコードされる組換えキメラスパイダーシルク／カイコシルクタンパク質を提供する。一部の実施形態では、キメラスパイダー／カイコシルクタンパク質は、スパイダー２、スパイダー４、スパイダー６、またはスパイダー８のキメラスパイダー／カイコシルクタンパク質をコードするとしても記載される。
【００１３】
さらに、本発明は、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質から調製されるキメラスパイダーシルク繊維のために提供される。特定の実施形態では、キメラスパイダーシルク繊維は、天然カイコシルク繊維と比較して、より大きな張力強度を有するとして、また一部の実施形態では、天然カイコ繊維と比較して最大２倍の張力強度を有するとして記載される。
【００１４】
トランスジェニックカイコ：
別の態様では、本発明は、トランスジェニック生物、特に組換え昆虫およびトランスジェニック動物を提供する。一部の実施形態では、トランスジェニック生物は、トランスジェニックカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などのトランスジェニックカイコである。特定の実施形態では、トランスジェニックカイコを提供するために形質転換されることになる宿主カイコは、天然シルク繊維を産生する能力を欠損する変異体カイコである。一部の実施形態では、カイコ変異体はｐｎｄ−ｗｌである。
【００１５】
一部の実施形態では、変異体カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）はｐｉｇｇｙＢａｃ系を使用して形質転換されることになるが、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、Ｂ．ｍｏｒｉのｆｈｃタンパク質のＮ末端断片およびＣ末端断片により挟まれた合成スパイダーシルクタンパク質配列を含有する発現カセットを使用して調製される。一般に、カイコの形質転換は、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするヘルパープラスミドとの混合物を、カイコの卵に微量注入することにより前胚盤葉胚に導入することを含む。卵殻に穴をあけるために調整された、エッペンドルフのロボット注射針マニピュレーターを使用して、それを通してガラス毛細管が挿入され、ＤＮＡ溶液がカイコの卵に注入される微小挿入孔を作製する。次いで、注入された卵を成熟させて、幼虫に孵化させる。幼虫は成熟カイコに成熟して、カイコの定型的生活環に従って繭を紡ぐことが可能になる。
【００１６】
これらのトランスジェニック昆虫を互いと、または非トランスジェニック昆虫／カイコと交雑育種することも、本発明の一部として提供される。
【００１７】
スパイダーシルク遺伝子発現カセット：
別の態様では、本明細書で開示される、いくつかの特定のスパイダーシルク柔軟性および／もしくは弾性モチーフ配列ならびに／またはスパイダーシルク強度モチーフ配列の１つまたは複数に対応する１つまたは複数のスパイダーシルクタンパク質配列モチーフを含む、キメラカイコ／スパイダーシルク発現カセットが提供される。別の態様では、キメラスパイダーシルク／カイコタンパク質および繊維を産生するための方法が提供される。図５に示されるように、ＮＴＤとスパイダーシルク配列との間にインフレームで挿入されたＥＧＦＰがあるまたはない４つの異なる合成スパイダーシルクタンパク質をコードする少なくとも（８）種の異なるバージョンの発現カセットが提供される。これらの配列は、本明細書では、「スパイダー２」、「スパイダー４」、「スパイダー６」、および「スパイダー８」として識別される。
【００１８】
トランスジェニックカイコ：
さらに別の態様では、トランスジェニックカイコおよびトランスジェニックカイコを作製するための方法が提供される。一部の実施形態では、トランスジェニックカイコを作製する方法は、カイコ配列、１つまたは複数のスパイダーシルク強度モチーフ配列ならびに１つまたは複数のスパイダーシルク柔軟性および／または弾性モチーフ配列をコードするキメラスパイダーシルク配列を含む配列を有する発現カセットを調製すること、前記カセット配列をｐｉｇｇｙＢａｃベクター（ｐｉｇｇｙＢａｃベクターｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄａｆ］など）にサブクローニングすること（図６を参照のこと、親プラスミドについては図１０〜１１を参照のこと、親プラスミドからサブクローニングされたプラスミドについては図１２Ａ〜１２Ｅを参照のこと）、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするヘルパープラスミドとの混合物を、前胚盤葉のカイコの卵に（例えば、カイコの卵に微量注入することにより）導入すること、通常の育成条件（約２８℃および湿度７０％）の下で幼虫孵化まで、注入されたカイコ胚を維持すること、およびトランスジェニックカイコを得ることを含む。
【００１９】
これらのトランスジェニックカイコは、さらに交配してＦｌ世代胚を生成させた後、Ｓ−Ｒｅｄ眼マーカーの発現に基づいて、推定上の形質転換体を同定することができる。次いで、この方法により同定された推定上の雄性および雌性形質転換体を交配して、ホモ接合型の血統を作製し、さらに詳細な遺伝子分析を行う。具体的には、カイコの形質転換は、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとヘルパープラスミドＤＮＡの混合物を、透明な表皮のカイコ変異体であるｐｎｄ−ｗｌのカイコ卵に注入することを含む。カイコ変異体であるｐｎｄ−ｗｌについては、Ｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０００に記載されており、この文献は、その全体が具体的に本明細書に組み込まれる。この変異体には、蛍光遺伝子を使用するスクリーニングを極めて容易にするメラニン沈着欠乏症がある。いったん赤目の推定上のＦｌ形質転換体が同定されると、ホモ接合型の血統がシルク腺タンパク質のウエスタンブロッティングを使用して確認され、繭シルクが採取された。
【００２０】
キメラスパイダーシルク／カイコシルク繊維を製造する方法：
さらに別の態様では、本発明は、トランスジェニックカイコにおいてキメラスパイダーシルク／カイコ繊維を製造する商業生産方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載のトランスジェニックカイコを作製すること、およびトランスジェニックカイコが成長し、繭を形成することを可能にする条件下でそれらを飼育すること、繭を採取すること、ならびに繭からキメラスパイダーシルク繊維を得ることを含む。シルク繭からシルク繊維をほぐす、かつ／またはそうでなければ採取する標準的手法を使用することができる。
【００２１】
製品およびそれらを使用する方法：
さらに別の態様では、本発明のキメラスパイダーシルク繊維から作られる種々の製品が提供される。例えば、組換えキメラスパイダー／カイコ繊維は、アイテムの中でも、医療縫合材料、創傷被覆および組織／関節置換および再建の材料および装置、薬物送達パッチおよび／または他の送達アイテム、保護服（防弾チョッキおよび他の用品）、レクリエーション用品（テント、パラシュート、キャンプ用具等）で使用することができる。
【００２２】
別の態様では、種々の医療手技において組換えキメラスパイダーシルク／カイコ繊維を使用する方法が提供される。例えば、この繊維は、組換え繊維を用いて作製された組織工学的生体適合性構築物におけるスキャフォールドとして成長または再生において組織修復を促進するために、または繊維に組み込まれたタンパク質または治療剤を送達するために使用することができる。
【００２３】
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができるが、以下では好ましい方法および材料を記載する。本明細書に記載の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、参照により組み込まれる。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、限定することを意図するものではない。矛盾がある場合は、本明細書が、定義を含めて、統制するものとする。
【００２４】
本発明の他の目的及び利点は、添付の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態を読むことにより当業者には明らかになるであろう。図面では、参照数字等が要素等を指定するために使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、多岐にわたるコガネグモ類または派生コガネグモ類に由来する２つの大瓶状シルクタンパク質のアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号１８〜２３）を示す（Ｇａｔｅｓｙ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。比較すると、特に上記の配列モチーフ内に、高レベルの配列保存が示され、この配列保存は、これらの種が互いから分岐して以来、１億２５００万年にわたって維持されてきた。種々のコガネグモ種における大瓶状シルクタンパク質のコンセンサス反復アミノ酸配列（−）は他の配列と比較されたときにアミノ酸が存在しないことを示す。クモは次のとおりである：Ｎｅｐ．ｃは、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）；Ｌａｔ．ｇは、ハイイロゴケグモ（Ｌａｃｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）；Ａｒｇ．ｔは、シマニワオニグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）。
【図２】図２は、コガネグモに由来する小瓶状シルクタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列（出現順にそれぞれ配列番号２４〜２６）を示す。最初の大瓶状シルクタンパク質配列が公表された直後に、ジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来の小瓶状シルク（Ｍｉ）タンパク質転写物を表わすｃＤＮＡが単離されて、配列決定された（Ｃｏｌｇｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，１９９８）。この図に示されるＭｉＳｐ配列には、ＭａＳｐタンパク質に対して、類似の配列および著しく異なる配列がある。ＭｉＳｐにはＧＧＸおよび短いｐｏｌｙＡｌａ配列が含まれるが、ＭａＳｐ中のより長いｐｏｌｙＡｌａモチーフは、（ＧＡ）ｎ反復に置き換えられている。コンセンサス反復は類似の構成を有するが、ＧＧＸおよびＧＡの数はかなり異なる。
【図３】図３は、鞭毛状シルクタンパク質ｃＤＮＡコンセンサス配列（出現順にそれぞれ配列番号２７〜２９）を示す。これらのシルクタンパク質ｃＤＮＡは、ジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）の鞭毛状腺由来の捕獲用らせん状シルクタンパク質をコードする（図３；Ｈａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，２０００）。これらのｃＤＮＡは、５’非翻訳領域および分泌シグナルペプチド、５個アミノ酸モチーフの数多くの反復、ならびにＣ末端をコードする配列を含有していた。ノーザンブロッティング分析は、ほぼ５００Ｋｄのタンパク質をコードする、大きさが約１５ｋｂのｍＲＮＡを示した。遺伝子配列から予測されるアミノ酸配列は、スパイダーシルクの弾性の物理的基礎の説明に役立つ、タンパク質構造のモデルを示唆し、これは、ＭａＳｐ２の性質とも一致する（本明細書でさらに説明される）。
【図４】図４は、βらせんのコンピュータモデルを示す。これは、各ペンタマー配列にタイプＩＩβターンがある構造から出発して、エネルギー最小化された（ＧＰＧＧＱＧＰＧＧＹ）（配列番号１）２配列のモデルである。
【図５】図５は、構築された基本的なカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）シルクフィブロイン重鎖発現カセットに関するいくつかのバリエーションを示す。この設計には、フィブロイン重鎖（ｆｈｃ）−スパイダーシルクキメラを発現するように設計された構築物のアセンブリが含まれており、合成スパイダーシルクタンパク質配列が、Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃタンパク質のＮ末端およびＣ末端の断片により挟まれている。各発現カセット内の機能的に関連する遺伝エレメントには、左から右にかけて次のものが含まれる：Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃ遺伝子に由来する主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント（ＵＥＥ）、基本プロモーター、およびＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、その後に、ＮＴＤの上流に位置する翻訳開始部位とインフレームで位置する種々の合成スパイダーシルクタンパク質配列、その後に、翻訳終結部位およびＲＮＡポリアデニル化部位を含むｆｈｃのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）。
【図６】図６は、これらのカセットをｐｉｇｇｙＢａｃにサブクローニングするための図を示す。図示された発現カセットの８つの異なるバージョンのそれぞれを、ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩを使用して、親プラスミドから切除し、ｐＢＡＣ［３ｘＰ３−ＤＳＲｅｄａｆ］の対応する部位にサブクローニングした。このｐｉｇｇｙＢａｃベクターのマップを示す。
【図７】図７は、トランスジェニックカイコシルクのウエスタンブロットを示す。これらのシルクについて、スパイダーシルクに特異的な抗体を使用して、カイコシルク腺タンパク質含有物およびトランスジェニックカイコ繭からのシルク繊維の両方のウエスタンブロッティングにより、スパイダーシルクキメラタンパク質の存在を分析した。両方の場合において、トランスジェニックカイコはキメラタンパク質を産生することが確認され、微分抽出試験から、これらのタンパク質はトランスジェニックシルク繊維の不可欠な成分であることがわかった。さらに、蛍光実体顕微鏡を使用する、シルク腺またはシルク繊維の直接検査により、キメラ緑色蛍光タンパク質融合物のそれぞれの発現がシルク腺および繊維の両方において明らかになった。ほとんどの場合において、繊維中の蛍光タンパク質の量は、通常の照明下で、繭を緑色により視覚化するのに十分高いものであった。
【図８】図８は、大きさが１７，３８８ｂｐである親プラスミドｐＳＬ−スパイダー＃４を示す。この親プラスミドは、キメラスパイダーシルクタンパク質＃４カセットであるスパイダーシルク（Ａ４Ｓ８）×４２を保持する。
【図９】図９は、親プラスミドｐＳＬ−スパイダー＃４＋ＧＦＰを示す。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質である。このベクターの大きさは、１８，１０２ｂｐである。この親プラスミドは、キメラスパイダーシルクタンパク質＃４に加えて、マーカータンパク質のＧＦＰ、カセットのスパイダーシルク（Ａ４Ｓ８）×４２を保持する。
【図１０】図１０は、親プラスミドｐＳＬ−スパイダー＃６を示す。この親プラスミドの大きさは、１２，５１６ｂｐである。この親プラスミドは、キメラスパイダーシルクタンパク質＃６カセットのスパイダーシルク（Ａ２Ｓ８）×ｌ４）×４２を保持する。
【図１１】図１１は、親プラスミドｐＳＬ−スパイダー＃６＋ＧＦＰを示す。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質である。この親プラスミドの大きさは、１３，２３０ｂｐである。この親プラスミドは、キメラスパイダーシルクタンパク質＃６に加えて、マーカータンパク質のＧＦＰ、カセットのスパイダーシルク（Ａ４Ｓ８）×ｌ４を保持する。
【図１２】図１２Ａは、ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドであって、大きさが１０，４５８ｂｐであるｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ１６構築物を示す。図１２Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃプラスミドであって、大きさが１１，２５０ｂｐであるｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４構築物を示す。
【図１３】図１３は、ｐＳＬ−スパイダー＃４の配列を示す（配列番号３０）。
【図１４】図１４は、ｐＳＬ−スパイダー＃４＋ＧＦＰの配列を示す（配列番号３１）。
【図１５】図１５は、ｐＳＬ−スパイダー＃６の配列を示す（配列番号３２）。
【図１６】図１６は、ｐＳＬ−スパイダー＃６＋ＧＦＰの配列を示す（配列番号３３）。
【図１７】図１７Ａは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの設計であって、Ａ２Ｓ８１４合成スパイダーシルク遺伝子を示す。図１７Ｂは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの設計であって、スパイダー６キメラカイコ／スパイダーシルク遺伝子を示す。図１７Ｃは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの設計であって、スパイダーシルク６−ＧＦＰキメラカイコ／スパイダーシルク遺伝子を示す。図１７Ｄは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの設計であって、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターを示す。図１７Ｅは、以下のシンボルを示す。鞭毛状弾性モチーフ（Ａ２；１２０ｂｐ）；大瓶状スピドロイン−２；スパイダーモチーフ（Ｓ８；５５ｂｐ）Ｆｈｃ主要プロモーター（１，１５７ｂｐ）、Ｆｈｃエンハンサー（７０ｂｐ）；Ｆｈｃ基本プロモーター、Ｈｈｃ５’翻訳領域（エキソン１／イントロン／エキソン２；Ｆｈｃ  Ｎ末端コード領域＝１，７４４ｂｐ）；ＥＧＦ（７２０ｂｐ）；Ａ２ＳＢ１４  スパイダーシルク配列（２，４６２ｂｐ）、Ｆｈｃ  Ｃ末端コード領域（１８０ｂｐ）、Ｆｈｃポリアデニル化シグナル（３００ｂｐ）。
【図１８】図１８Ａは、繭中のキメラカイコ／スパイダーシルク／ＥＧＦＰタンパク質の発現を示す。カイコシルク腺におけるキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の発現および局在化。方法に記載のように、シルク腺を切除し、スパイダー６またはスパイダー６−ＧＦＰのｐｉｇｇｙＢａｃベクターを打ち込んで、蛍光顕微鏡下で検査した。図１８Ｂは、シルク腺を示す。カイコシルク腺におけるキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の発現および局在化。方法に記載のように、シルク腺を切除し、スパイダー６またはスパイダー６−ＧＦＰのｐｉｇｇｙＢａｃベクターを打ち込んで、蛍光顕微鏡下で検査した。図１８Ｃは、シルク腺を示す。カイコシルク腺におけるキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の発現および局在化。方法に記載のように、シルク腺を切除し、スパイダー６またはスパイダー６−ＧＦＰのｐｉｇｇｙＢａｃベクターを打ち込んで、蛍光顕微鏡下で検査した。図１８Ｄは、スパイダー６−ＧＦＰカイコに由来するシルク繊維を示す。カイコシルク腺におけるキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の発現および局在化。方法に記載のように、シルク腺を切除し、スパイダー６またはスパイダー６−ＧＦＰのｐｉｇｇｙＢａｃベクターを打ち込んで、蛍光顕微鏡下で検査した。
【図１９】図１９は、シルク繊維の連続抽出を示す。本明細書に記載のように、ｐｎｄ−ｗｌ（レーン３〜６）、スパイダー６（レーン８〜１１）、またはスパイダー６−ＧＦＰ（レーン１３〜１６）カイコから産生された繭はデガミングして、連続抽出プロトコールに付した。各抽出ステップで可溶化されたタンパク質は、ＳＤＳＰＡＧＥおよび（１９Ａ）クーマシーブルー染色または（１９Ｂ）スパイダーシルクタンパク質−特異抗血清による免疫ブロッティングによって分析した。Ｍ：分子量マーカー。＋：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され精製されたＡ２Ｓ８１４スパイダーシルクタンパク質。レーン３、８、および１３：生理食塩水抽出物。レーン４、９、および１４：ＳＤＳ抽出物。レーン５、１０、および１５：８Ｍ  ＬｉＳＣＮ／２％メルカプトエタノール抽出物。レーン６、１１、および１６：１６Ｍ  ＬｉＳＣＮ／５％メルカプトエタノール抽出物。矢印はキメラスパイダーシルクタンパク質を示す。見かけの分子量は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＡ２Ｓ８１４については約７５ｋＤａ、スパイダー６については約１０６ｋＤａ、スパイダー６−ＧＦＰについては約１３０ｋＤａおよび約１１０ｋＤａであった。
【図２０】図２０は、トランスジェニックカイコ由来の複合繊維、親カイコ由来の天然繊維、および代表的な天然（牽引糸）スパイダーシルク繊維について観察された最良の機械的性能の比較を示す。繊維の靭性は、応力／歪み曲線下面積により定義される。練り天然および複合シルク繊維の機械的性質。天然カイコ（ｐｎｄ−ｗｌ）および代表的なスパイダー（ジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）牽引糸）シルク繊維について測定された最良の機械的性能を、トランスジェニックカイコにより産生された複合シルク繊維で得られたものと比較する。繊維はすべて、同じ条件下で試験した。最大靱性値は次のとおりである：天然カイコｐｎｄ−ｗｌ（４３．９ＭＪ／ｍ３）と比較すると、スパイダー６系７（８６．３ＭＪ／ｍ３）；スパイダー６−ＧＦＰ系１（９８．２ＭＪ／ｍ３）、（スパイダー６−ＧＦＰ系４（１６７．２ＭＪ／ｍ３）；およびジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）牽引糸（１３８．７ＭＪ／ｍ３）。これらのデータから、トランスジェニックカイコ由来の複合シルク繊維はすべて、非トランスジェニックカイコ由来の天然繊維よりも靱性が高いことがわかる。
【図２１】図２１は、構築物ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐｌＸ１６（１０，４５８ｐｂ）の核酸配列を示す（配列番号３４）。
【図２２】図２２は、構築物ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４（１１，２５０ｂｐ）の核酸配列を示す（配列番号３５）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明で使用されるカイコ染色体に遺伝子を挿入する方法により、その遺伝子が染色体に安定に組み込まれ、発現され、かつ交配により同様に子孫に安定に受け継がれることが可能になる。カイコ卵への微量注入を使用する方法または遺伝子銃を使用する方法が使用できるが、使用される方法は、カイコ染色体への外来遺伝子の挿入のための標的遺伝子含有ベクターおよびトランスポゾン遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）を含有するヘルパープラスミドを同時にカイコ卵に微量注入することからなることが好ましい。
【００２７】
標的遺伝子は、微量注入されたカイコ卵から孵化し成長した組換えカイコの生殖細胞に挿入される。このようにして得られた組換えカイコの子孫は、その染色体中に標的遺伝子を安定に保持することができる。本発明で得られた組換えカイコの遺伝子は、通常のカイコと同じ方法で維持することができる。すなわち、通常条件下で卵を孵化させ、孵化した幼虫を人工飼料に集め、次いで、通常のカイコと同じ条件下でそれらを生育させることにより、第５齢のカイコまで生育させることができる。
【００２８】
本発明では得られた組換えカイコは、カイコの発育および成長を最大化するために、通常のカイコと同じ方法で生育させることができ、通常条件下で生育させることにより外来タンパク質を産生することができる。
【００２９】
本発明で得られた遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同じように、蛹になり繭を産生することができる。雄と雌は蛹段階で識別され、蛾に変態した後に、雄と雌を交配し、その翌日に卵を収集する。卵は、通常のカイコ卵と同じ方法で保存することができる。本発明の遺伝子組換えカイコは、上記のように、繁殖を繰り返すことによりその後の世代に継続することができ、かつ大量に増加させることができる。
【００３０】
本明細書で使用されるプロモーターに関して特に限定はなく、任意の生物に由来するいかなるプロモーターもカイコ細胞内で効果的に作用するならば使用することができるが、カイコシルク腺中でタンパク質を特異的に誘導するように設計されたプロモーターが好ましい。カイコシルク腺タンパク質プロモーターの例としては、フィブロイン重鎖プロモーター、フィブロイン軽鎖プロモーター、ｐ２５プロモーター、およびセリシンプロモーターが挙げられる。
【００３１】
本発明では、「キメラスパイダーシルクタンパク質を発現するための遺伝子カセット」は、昆虫細胞に挿入される場合には、キメラタンパク質の合成に必要な１組のＤＮＡを指す。キメラスパイダーシルクタンパク質を発現するこの遺伝子カセットは、キメラスパイダーシルクタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進するプロモーターを含有する。通常、遺伝子カセットは、さらにターミネーターおよびポリＡ付加領域を含有し、好ましくは、プロモーター、外来タンパク質構造遺伝子、ターミネーター、およびポリＡ付加領域を含有する。さらに、遺伝子カセットは、プロモーターと外来タンパク質構造遺伝子との間に連結された分泌シグナル遺伝子を含有してもよい。任意の遺伝子配列を、ポリＡ付加配列と外来タンパク質構造遺伝子との間に連結してもよい。さらに、人工的に設計および合成された遺伝子配列も連結することができる。
【００３２】
さらに、「キメラスパイダーシルク／カイコ遺伝子を挿入するための遺伝子カセット」は、両側に１対のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの逆方向反復配列を有し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの作用を介して昆虫細胞染色体に挿入される１組のＤＮＡからなる、キメラスパイダーシルク／カイコ遺伝子を発現するための遺伝子カセットを指す。
【００３３】
本発明におけるベクターは、環状または線状のＤＮＡ構造を有するものを指す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製することができ、かつ環状ＤＮＡ構造を有するベクターが特に好ましい。このベクターには、形質転換体の選択を容易にする目的で、抗生物質耐性遺伝子またはクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子などのマーカー遺伝子も組み込むことができる。
【００３４】
本発明で使用される昆虫細胞に関して特に限定はないが、それらは、好ましくは鱗翅類細胞、より好ましくはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）細胞、さらに一層好ましくはカイコシルク腺細胞またはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）卵に含まれる細胞である。シルク腺細胞の場合には、フィブロインタンパク質が活性に合成され、かつその細胞の取り扱いが容易であるので、第５齢カイコ幼虫の後部シルク腺細胞が好ましい。
【００３５】
昆虫細胞によるキメラスパイダーシルクタンパク質の発現のための遺伝子カセットを組み込むために使用される方法に関して特に限定はない。遺伝子銃を使用する方法および微量注入を使用する方法は、培養昆虫細胞への組み込みのために使用することができ、カイコシルク腺細胞に組み込む場合には、例えば、遺伝子銃を使用して、第５齢カイコ幼虫の体から取り出された後部シルク腺組織に遺伝子を容易に組み込むことができる。
【００３６】
遺伝子銃を使用する後部シルク腺への遺伝子組み込みは、例えば、粒子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、モデル番号ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）を１，１００〜１，８００ｐｓｉのヘリウムガス圧で使用するなどして、外来タンパク質を発現するための遺伝子カセットを含有するベクターでコーティングされた金粒子を寒天プレート上に固定された後部シルク腺に打ち込むことにより実行することができる。
【００３７】
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵に含まれる細胞に遺伝子を組み込む場合は、微量注入を使用する方法が好ましい。ここで、卵に微量注入する場合、卵の細胞に直接微量注入することは必要でなく、それどころか、卵に単純に微量注入することにより遺伝子を組み込むことができる。
【００３８】
その染色体に本発明の「キメラスパイダーシルクタンパク質を発現するための遺伝子カセット」を含有する組換えカイコは、「キメラスパイダーシルク遺伝子を挿入するためのカセット」を有するベクターを、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵に微量注入することにより得ることができる。例えば、第一世代（Ｇｌ）カイコは、Ｔａｍａｒａらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）に従って、「キメラスパイダーシルク遺伝子を挿入するための遺伝子カセット」を有するベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼ遺伝子がカイコアクチンプロモーターの制御下に配置されたプラスミドとを、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）卵に同時に微量注入し、その後、孵化した幼虫を生育して、その結果得られた同じ群内の成虫（Ｇ０）と交配することにより得られる。組換えカイコは、このＧｌ世代の中で１〜２％の頻度で通常出現する。
【００３９】
組換えカイコの選択は、Ｇｌ世代カイコの組織からＤＮＡを単離した後、外来タンパク質遺伝子配列に基づいて設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲにより行うことができる。あるいは、組換えカイコは、カイコ細胞で発現されうる、プロモーターの下流に連結された、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、「遺伝子を挿入するための遺伝子カセット」にあらかじめ挿入し、次いで、第１齢段階のＧｌ世代カイコの中から紫外線下で緑色蛍光を発光する個体を選択することにより容易に選択することができる。
【００４０】
さらに、その染色体中に「外来タンパク質を発現するための遺伝子カセット」を含有する組換えカイコを得る目的で、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）卵に、「遺伝子を挿入するための遺伝子カセット」を有するベクターを微量注入する場合も、組換えカイコは、上記と同じ方法で、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼタンパク質を同時に微量注入することにより得ることができる。
【００４１】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、両末端上の１３塩基対の逆方向配列と約２．１ｋの塩基対の内部にあるＯＲＦとを有するＤＮＡの転移因子を指す。本発明で使用されるｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに関して特に限定はないが、使用可能なものの例としては、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞株ＴＮ−３６８、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、およびガレリア・メロネア（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅａ）ＮＰＶ（ＧｍＭＮＰＶ）に由来するものが挙げられる。好ましくは、遺伝子およびＤＮＡ転移活性を有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、プラスミドｐＨＡ３ＰＩＧおよびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞株ＴＮ−３６８（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）に由来するｐｉｇｇｙＢａｃの一部を有するｐＰＩＧＡ３ＧＦＰを使用して調製することができる。ｐｉｇｇｙＢａｃに由来するＤＮＡ配列の構造は、ＴＴＡＡ配列を含有する１対の逆方向末端配列を有することが必要とされ、それらのＤＮＡ配列の間に挿入されたサイトカイン遺伝子などの外来遺伝子を有する。トランスポゾンに由来するＤＮＡ配列を使用してカイコ染色体に外来遺伝子を挿入するためにトランスポサーゼを使用することがより好ましい。例えば、遺伝子がカイコ染色体に挿入される頻度は、カイコ細胞内で転写および翻訳されたトランスポサーゼが２対の逆方向末端配列を認識し、それらの間の遺伝子断片を切り取って、カイコ染色体にそれを転移できるように、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼを発現することができるＤＮＡを同時に挿入することによりかなり改善することができる。
【００４２】
本発明は、以下の説明によりさらに一層完全に認識することができる。
【００４３】
生物医学領域におけるキメラシルクタンパク質：
キメラスパイダーシルク繊維は、極めて細い繊維を必要とする眼科手術、神経修復、および形成外科などの手技の一部に広く用いられている材料の一部として提供される。さらなる使用としては、骨、靭帯、および腱の再生のためのスキャフォールド材料ならびに薬物送達のための材料が挙げられる。
【００４４】
本発明の方法により製造される組換えスパイダーシルク繊維は、血管創傷治癒装置、止血包帯、パッチ、および接着剤を含む創傷閉鎖システム、縫合糸、薬物送達などの種々の医療用途、ならびに例えば、スキャフォールド材料、靭帯人工器官などの組織工学用途、ならびに人体への長期的または生物分解性移植のための製品に使用することができる。好ましい組織工学的スキャフォールドは、本明細書に記載の組換えスパイダーシルク／カイコ繊維を用いて作製された繊維の不織ネットワークである。
【００４５】
さらに、本発明の組換えキメラシルク繊維は、これらに限定されないが、脊椎ディスク、頭蓋組織、硬膜、神経組織、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、心筋、骨格筋、腱、靭帯、および胸部組織を含む、これらのユニークなスキャフォールドから恩恵を受けうる、器官の修復、置換または再生の戦略に使用することができる。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、組換えスパイダーシルク繊維材料は治療剤を含有することができる。これらの材料を形成するために、治療剤は、材料形成に先立って繊維の中に組み込んでもよく、形成後に材料に負荷してもよい。本発明の組換えキメラシルク繊維と併せて使用することができる異なる治療剤の種類は莫大である。一般に、本発明の医薬組成物を介して投与することができる治療剤としては、限定はされないが、抗生物質および抗ウイルス剤などの抗感染剤；化学療法剤（すなわち制癌剤）；抗拒絶剤；鎮痛剤および鎮痛配合剤；抗炎症剤；ステロイドなどのホルモン剤；増殖因子（骨形態形成タンパク質（すなわちＢＭＰ１〜７）、骨形態形成様タンパク質（すなわちＧＦＤ−５、ＧＦＤ−７、およびＧＦＤ−８）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（すなわちＦＧＦ１〜９）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換増殖因子（すなわちＴＧＦ−βＩ〜ＩＩＩ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）；および他の天然由来または遺伝子改変のタンパク質、多糖、糖タンパク質、またはリポタンパク質が挙げられる。これらの増殖因子は、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙが出版したＴｈｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  Ｖｉｃｋｉ  Ｒｏｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓｃｏｔｔ  Ｔｈｉｅｓに記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４７】
生理活性物質を含有するスパイダーシルク／カイコ繊維は、１つまたは複数の治療剤をこの材料を作製するために使用される繊維と混合することにより製剤化することができる。あるいは、治療剤は、好ましくは医薬として許容される担体を用いて繊維上にコーティングすることができる。繊維を溶解しない任意の医薬担体を使用することができる。治療剤は、液体、微粉固体、または他のいかなる適切な物理的形態として存在してもよい。
【００４８】
治療剤の量は、使用される特定の薬物および治療されている病状に依存することになる。典型的には、薬物量は、材料重量の約０．００１パーセント〜約７０パーセント、より典型的には約０．００１パーセント〜約５０パーセント、最も典型的には約０．００１パーセント〜約２０パーセントを占める。体液または組織と接触すると、例えば、薬物は放出されることになる。
【００４９】
組換えスパイダーシルク／カイコ繊維で作製された組織工学スキャフォールドは、作製後にさらに改変することができる。例えば、スキャフォールドは、所望の細胞集団のための受容体または化学誘引物質として機能する生理活性物質でコーティングすることができる。このコーティングは、吸収または化学結合を介して施すことができる。
【００５０】
本発明による使用に適した添加物は、生物学的または医薬的に活性な化合物を含む。生物学的に活性な化合物の例としては、細胞接着に影響を及ぼすことが知られている「ＲＧＤ」インテグリン結合配列のバリエーションを含有するペプチドなどの細胞接着メディエーター、生物学的に活性なリガンド、および特定の種類の細胞または組織の内殖を促進または排除する物質が挙げられる。そのような物質としては、例えば、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの骨形成誘導物質、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＩ）、ＴＧＦ−、ＹＩＧＳＲペプチド、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、インテグリン、セレクチン、およびカドヘリンが挙げられる。
【００５１】
スキャフォールドは、再建手術を含む、組織工学的および組織先導的再生用途に向けた用品に形成される。スキャフォールドの構造は、細胞内殖を可能にし、細胞の前播種の必要性を除去する。スキャフォールドはまた、成型して、外部支持器官を形成する細胞のインビトロ培養の支持体のための外部スキャフォールド材料を形成することができる。
【００５２】
スキャフォールドは、体内の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣するように機能する。スキャフォールドは、インビトロ培養およびその後の移植期間中の、単離細胞ための物理的支持体および接着基質の両方として役立つ。移植された細胞集団が増殖して、細胞が正常に機能するにつれて、細胞はそれ自体のＥＣＭ支持体を分泌し始める。
【００５３】
軟骨および骨のような構造組織の再建では、組織形状が機能するのに不可欠であり、種々の厚さおよび形状の用品にスキャフォールドを成形する必要がある。３次元構造に所望されるいかなる凹部、開口部、または精密部分も、はさみ、メス、レーザービーム、または他の切断器具でマトリックスの一部を除去することにより作製することができる。スキャフォールドの用途としては、神経、筋骨格、軟骨、腱、肝臓、膵臓、眼、外皮、動静脈、泌尿器、または任意の他の組織形成固体または中空器官などの組織の再生が挙げられる。
【００５４】
スキャフォールドはまた、３次元の組織または器官を形成させるために、分離細胞、例えば軟骨細胞または肝細胞のためのマトリックスとして移植で使用することができる。任意のタイプの細胞を、培養および可能な移植のためのスキャフォールドに加えることができ、これらの細胞には、筋肉および骨格系の細胞、例えば軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞、および骨細胞、実質細胞、例えば肝細胞、膵細胞（膵島細胞を含む）、腸起源の細胞、および他の細胞、例えば神経細胞、骨髄細胞、皮膚細胞、多能性細胞、および幹細胞、ならびにそれらの組合せが含まれ、これらは、ドナー由来、樹立された株化細胞由来、または遺伝子操作の前もしくは後のものであってもよい。組織の断片も使用することができ、同じ構造の中にいくつかの異なる細胞タイプを用意することができる。
【００５５】
細胞は、適切なドナーまたはその細胞が移植されることになる患者から入手して、標準的手法を使用して分離し、スキャフォールドの上および中に播種する。インビトロでの培養を、場合によっては移植前に実行してもよい。あるいは、スキャフォールドを移植して血管新生させ、次いで、細胞をスキャフォールドに注入する。インビトロでの細胞培養および組織スキャフォールドの移植のための方法および試薬は、当業者には公知である。
【００５６】
本意図の組換えスパイダーシルク／カイコ繊維は、放射線滅菌（すなわちガンマ線）、化学滅菌（エチレンオキシド）、または他の適切な手段等の従来の滅菌方法を使用して滅菌することができる。好ましくは、滅菌工程は５２〜５５℃の間の温度で８時間以下の時間エチレンオキシドを用いてなされる。滅菌後、生体材料は、輸送ならびに病院および他の医療施設での使用のために、適切な滅菌耐湿性パッケージの中に詰められる。
【００５７】
本発明のキメラシルク繊維はまた、運動用衣類および防弾チョッキの製造／製作など、種々の形態の運動用および防護用衣服の製造において要請を受ける可能性がある。本明細書で開示のキメラスパイダーシルク繊維はまた、改善されたエアバッグの製作など、自動車産業で使用することができる。開示のキメラシルク繊維を使用するエアバッグは、クモの巣の餌食になる、飛んでいる昆虫のエネルギーをクモの巣が吸収するときよりも、自動車事故でのより大きな衝撃エネルギーに備える。
【００５８】
定義
本明細書で使用される場合、生体適合性は、シルク繊維またはそれから作製される材料が、無毒で、突然変異性がなく、最小から中程度の炎症反応を誘発することを意味する。本発明で使用される好ましい生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、アルギネート、キトサン、キチン、ヒアルロン酸、ペクチン、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、およびポリ酸無水物が挙げられる。本発明によると、２つ以上の生体適合性ポリマーを水溶液に加えることができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、柔軟性および／または弾性モチーフおよび／またはドメイン配列は、シルク繊維などの材料に弾性および／または柔軟性の特性を付与することに関連するスパイダーシルクをコードする遺伝子またはタンパク質の断片の同定可能な遺伝子配列として定義される。例として、柔軟性および／または弾性モチーフおよび／またはドメインはＧＰＧＧＡである（配列番号２）。
【００６０】
本明細書で使用される場合、強度モチーフは、シルク繊維の張力強度を増加および／または向上させるなど、材料に強度特性を付与することに関連するスパイダーシルクをコードする遺伝子またはタンパク質の断片の同定可能な遺伝子配列として定義される。例として、これらのスパイダー強度モチーフの一部は、ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８（Ａはポリアラニン配列である）である（配列番号３）。
【００６１】
本発明は、本発明の代表例となるように意図する、以下の実施例によりさらに特徴づけられるであろう。
【００６２】
実施例１−材料および方法
本実施例は、トランスジェニックカイコの作製に使用する材料および方法／手法、使用する遺伝子構築物の作製に使用する基本手順、ならびにトランスジェニックスパイダーシルク繊維の張力強度の評価に使用する参照表を説明するために提供する。
【００６３】
１．使用する遺伝子配列。使用する遺伝子は、本明細書に提示の図１３〜１６に示す。保存的置換を有する、例えば実質的に同じキメラスパイダーシルクタンパク質特性を有する、これらの配列のより短いおよび／またはより長いバージョンを使用することが可能であると考えられるので、これらのバリエーションは本発明の一部として構想される。
【００６４】
２．キメラシルクタンパク質およびこれらのキメラスパイダーシルクタンパク質を用いて得られる繊維は、張力強度のために評価される。表１に、キメラスパイダーシルク繊維の評価に対する一般的な基準を示す。本発明のキメラスパイダーシルク繊維は、天然スパイダーシルクに類似の張力および他の機械的強度特性を有することが見出された。
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【００６５】
実施例２−個々の形質転換されたカイコシルクの張力強度特性の分析
トランスジェニックカイコシルクについて、スパイダーシルク特異抗体を使用して、カイコシルク腺タンパク質含有物およびトランスジェニックカイコ繭からのシルク繊維の両方のウエスタンブロッティングによりスパイダーシルクキメラタンパク質の存在を分析した。両方の場合に、トランスジェニックカイコがキメラタンパク質を産生すると確認され、微分抽出試験から、これらのタンパク質がそれらの繭のトランスジェニックシルク繊維の不可欠な成分であることがわかった。さらに、蛍光実体顕微鏡を使用する、シルク腺またはシルク繊維の直接検査により、キメラ緑色蛍光タンパク質融合物のそれぞれの発現がシルク腺および繊維の両方において明らかになった。ほとんどの場合において、繊維中の蛍光タンパク質の量は、通常の照明下で、繭を緑色により視覚化するのに十分高いものであった。
【００６６】
表２に、個々のトランスジェニックカイコから産生されたトランスジェニックシルクの分析を示す。これらの分析から、スパイダー４またはスパイダー６構築物を用いて形質転換されたトランスジェニック系は、形質転換されていないカイコからのシルク繊維と比較すると強度が改善したキメラスパイダーシルク／カイコ繊維を産生することが明確にわかる。これらの繊維が、ある場合には天然シルクのほぼ２倍の強度があることは意義がある。カイコ／スパイダーシルクキメラ繊維の強度における２倍の改善は、カイコシルクをスパイダーシルクと同様の強度および柔軟性にするのに必要と考えられる改善にほぼ近い。したがって、これらの結果から、カイコを遺伝子操作して、スパイダーシルクの特定の強度および／または柔軟性ドメインをコードするｐｉｇｇｙＢａｃベクターを使用してＢｏｍｂｙｘ／スパイダーシルクキメラタンパク質を構築することにより、天然スパイダーシルクと有利に競争することができるキメラスパイダーシルク／カイコ繊維を産生させることができることが判明する。
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【００６７】
実施例３−トランスジェニックカイコにおけるキメラスパイダーシルク／カイコタンパク質発現のためのカイコキメラ遺伝子発現カセットおよびｐｉｇｇｙＢａｃベクター
本実施例は、種類が莫大なカイコキメラスパイダーシルク遺伝子発現カセットを用意する際の本発明の有用性および範囲を実証するために提供する。本実施例はまた、カイコの形質転換が成功することが示されたｐｉｇｇｙＢａｃベクターの完成、および生産において商業的に有用な長さの繊維の製造に適している、商業的に有用なキメラスパイダーシルクタンパク質の製造の成功を実証する。
【００６８】
発現カセット。
以下に示す基本的な発現カセットに関していくつかのバリエーションを構築した。これらの構築物は、フィブロイン重鎖（ｆｈｃ）−スパイダーシルクキメラを発現するように設計された構築物のアセンブリを表しており、合成スパイダーシルクタンパク質配列が、Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃタンパク質のＮ末端およびＣ末端の断片により挟まれている。この点に関し、図５に示す基本的なカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）シルクフィブロイン重鎖発現カセットに関するいくつかのバリエーションを構築した。この設計には、フィブロイン重鎖（ｆｈｃ）−スパイダーシルクキメラを発現するように設計された構築物のアセンブリが含まれており、合成スパイダーシルクタンパク質配列が、Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃタンパク質のＮ末端およびＣ末端の断片により挟まれている。各発現カセット内の機能的に関連する遺伝エレメントには、左から右にかけて次のものが含まれる：Ｂ．ｍｏｒｉ  ｆｈｃ遺伝子に由来する主要プロモーター、上流エンハンサーエレメント（ＵＥＥ）、基本プロモーター、およびＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、その後に、ＮＴＤの上流に位置する翻訳開始部位とインフレームで位置する種々の合成スパイダーシルクタンパク質配列（以下を参照）、その後に、翻訳終結部位およびＲＮＡポリアデニル化部位を含むｆｈｃのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）。
【００６９】
８つの異なるバージョンの発現カセットが図５に図示されており、これらは、ＮＴＤとスパイダーシルクとの間にインフレームでのＥＧＦＰの挿入があるまたはない４つの異なる合成スパイダーシルク／カイコタンパク質をコードする。これらの配列を、「スパイダー２」、「スパイダー４」、「スパイダー６」、および「スパイダー８」と名付け、以下のように定義する。
ａ）スパイダー２：（Ａ４Ｓ８）２４からなる７，１０４ｂｐ。Ａ１は、推定上の鞭毛状シルク弾性モチーフ（ＧＰＧＧＡ）（配列番号２）の４コピーを示す；したがって、Ａ４は、この同じ配列の１６コピーを示す。Ｓ８は、推定上の牽引糸シルク強度モチーフ［ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］（配列番号３）を示し、「リンカー−ポリアラニン」配列としても記載される。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）融合タンパク質のおよその大きさは１６１．９＋５０．４＝２１２．３Ｋｄである。
ｂ）スパイダー４：（Ａ２Ｓ８）４２からなる７，３８６ｂｐ。Ａ２は、推定上の鞭毛状シルク弾性モチーフ（ＧＰＧＧＡ）（配列番号２）の８コピーを示す；Ｓ８は、上記のように、推定上の牽引糸シルク強度モチーフ［ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］（配列番号３）を示す。ＧＦＰ融合タンパク質のおよその大きさは１６９．４＋５０．４＝２１９．８Ｋｄである。
ｃ）スパイダー６：（Ａ２Ｓ８）１４からなる２，４６２ｂｐ。上記のように、Ａ２は弾性モチーフ（ＧＰＧＧＡ）（配列番号２）の８コピーを示し、Ｓ８は強度モチーフ［ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］（配列番号３）を示す。ＧＦＰ融合タンパク質のおよその大きさは５６．４＋５０．４＝１０６．８Ｋｄである。
ｄ）スパイダー８：（Ａ２Ｓ８）２８からなる４，９２４ｂｐ。上記のように、Ａ２は弾性モチーフ（ＧＰＧＧＡ）（配列番号２）の８コピーを示し、Ｓ８は強度モチーフ［ＧＧＰＳＧＰＧＳ（Ａ）８］（配列番号３）を示す。ＧＦＰ融合タンパク質のおよその大きさは１１２．８＋５０．４＝１６３．２Ｋｄである。
【００７０】
ＮＴＤエキソンＩおよびＩＩの大きさ（１６２５＋１５１６１）；ｅＧＦＰ（２７１３５）；ＣＴＤ（６４７０）＝５０，３９１Ｋｄ。
【００７１】
実施例４−ｐｉｇｇｙＢａｃへの発現カセットのサブクローニング
図５に図示した（そして実施例３に記載した）８つの異なるバージョンの発現カセットのそれぞれを、ＡｓｃＩおよびＦｓｅＩを使用して親プラスミドから切除し、ｐＢＡＣ［３ｘＰ３−ＤＳＲｅｄａｆ］の対応する部位にサブクローニングした。このｐｉｇｇｙＢａｃベクターのマップを図６に示す。
【００７２】
ＥＧＦＰを有するおよびＥＧＦＰを有さない、上記のすべてのｐｉｇｇｙＢａｃベクターを、個々の成分に関してＰＣＲにより試験すると、予測された大きさの生成物が示された。
【００７３】
ＥＧＦＰに融合したスパイダーシルクタンパク質をコードするｐｉｇｇｙＢａｃベクターのそれぞれは、Ｂ．ｍｏｒｉシルク腺においてＥＧＦＰ発現を誘導するそれらの能力をアッセイすることにより機能的に評価した。手短に言えば、シルク腺をカイコから取り出し、粒子銃を使用して、ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＤＮＡ（または対照）でコーティングされたタングステン粒子をこの腺に打ち込んだ。次いで、打ち込まれた組織を、培養皿のグレース培地中で培養し、２日および３日後に、共同研究者の研究室で利用可能なＥＧＦＰ蛍光のための装備がある実体顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ発現についてシルク腺を検査した。各ベクターはＥＧＦＰ蛍光を誘導することが示された。
【００７４】
ＥＧＦＰ挿入があるおよび挿入がないスパイダー４および６をコードする４つのｐｉｇｇｙＢａｃベクターのセットを使用して、トランスジェニックカイコを作製した。
【００７５】
実施例５−トランスジェニックカイコの単離。
一般に、カイコの形質転換は、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするヘルパープラスミドとの混合物を、カイコの卵に微量注入することにより前胚盤葉胚に導入することを含む。卵が産まれた後４時間の間は、胚盤葉形成は起こらない。したがって、胚の収集および注入は、比較的長時間にわたって室温で行うことができる。微量注入の技術的なハードルは、硬い障壁となる卵殻を突破する必要があることである。Ｔａｍｕｒａおよび共同研究者は、鋭利なタングステン針を用いて卵殻を貫通し、次いで、得られた穴にガラス毛細管注射針を正確に挿入することによりカイコの微量注入手法を完成した。これは現在では比較的ルーチン的な手技になっており、卵殻に穴をあけ、タングステン針を除去し、ガラス毛細管を挿入し、そしてＤＮＡ溶液を注入するように調整されたエッペンドルフのロボット注射針マニピュレーターを用いて実行される。次いで、Ｋｒａｚｙ接着剤を小滴使用して卵を再密封し、幼虫に孵化するまで２８℃および湿度７０％の通常の生育条件下で維持した。次いで、生存する注入された昆虫は、交配してＦｌ世代の胚を生成し、その後続いてＤＳ−Ｒｅｄ眼マーカーの発現に基づいて推定上の形質転換体を同定する。次いで、この方法により同定された推定上の雄性および雌性形質転換体を交配して、ホモ接合型の血統を作製し、さらに詳細な遺伝子分析を行う。
【００７６】
具体的には、本プロジェクトに関するカイコの形質転換は、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとヘルパープラスミドＤＮＡの混合物を、透明な表皮のカイコ変異体であるカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ｐｎｄ−ｗｌの卵に注入することを含む。この変異体カイコについては、Ｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０００に記載されており、この文献は、参照によって具体的に本明細書に組み込まれる。この変異体には、蛍光遺伝子を使用するスクリーニングを極めて容易にするメラニン沈着欠乏症がある。いったん赤目の推定上のＦｌ形質転換体を同定すると、ホモ接合型の血統を確立して、本物の形質転換体をシルク腺タンパク質のウエスタンブロッティングを使用して確認し、繭シルクを採取した。
【００７７】
実施例６−トランスジェニックカイコによるキメラスパイダーシルク／カイコ産生の分析
トランスジェニックカイコシルクについて、スパイダーシルク特異抗体を使用して、カイコシルク腺タンパク質含有物およびトランスジェニックカイコ繭からのシルク繊維の両方のウエスタンブロッティングによりスパイダーシルクキメラタンパク質の存在を分析した。両方の場合において、トランスジェニックカイコはキメラタンパク質を産生することが確認され、微分抽出実験から、これらのタンパク質は、それらの繭のトランスジェニックシルク繊維の不可欠な成分であることがわかった。
【００７８】
さらに、蛍光実体顕微鏡を使用する、シルク腺またはシルク繊維の直接検査により、キメラ緑色蛍光タンパク質融合物のそれぞれの発現がシルク腺および繊維の両方において明らかになった（図７）。ほとんどの場合において、繊維中の蛍光タンパク質の量は、通常の照明下で、繭を緑色により視覚化するのに十分高いものであった。
【００７９】
実施例７−ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの設計
ｐｉｇｇｙＢａｃは、効率的にカイコを形質転換するために使用することができるので、本プロジェクトのために選択したベクターになった４，１１，４３。本プロジェクトで使用した特定のｐｉｇｇｙＢａｃベクターは、いくつかの重要な特徴を備えた遺伝子を保有するように設計した。図１７に強調表示されているように、これらには、外来スパイダーシルクタンパク質の発現を後部シルク腺でさせるであろうＢ．ｍｏｒｉフィブロイン重鎖（ｆｈｃ）プロモーター９１，９２、ならびに外来シルクタンパク質の発現レベルおよび繊維へのそのアセンブリを促進するであろうｆｈｃエンハンサー９３が含まれた。ｐｉｇｇｙＢａｃベクターはまた、弾性（ＧＰＧＧＡ）８（配列番号４）および強度（リンカー−アラニン８）の両モチーフを有する比較的大きな合成スパイダーシルクタンパク質であるＡ２Ｓ８１４をコードした（“アラニン８”配列番号５として記載）（図１７Ａ）。合成スパイダーシルクタンパク質配列は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ｆｈｃタンパク質のＮ末端およびＣ末端ドメインをコードする配列の内側に埋め込んだ（図１７Ｂ〜１７Ｃ）。このキメラカイコ／スパイダーシルクの設計は、外来タンパク質をＢ．ｍｏｒｉシルク腺における新生内因性シルク繊維に組み込むように仕向けて、複合シルク繊維を産生するために使用されてきた９１、９２。
【００８０】
本研究で構築されたｐｉｇｇｙＢａｃベクターの１つでは、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質が単独でコードされたが（図１７Ｂ）、別のベクターでは、Ｎ末端高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）タグを有するこの同じタンパク質がコードされた（図１７Ｃ）。本明細書で記載のように、後者の構築物は、形質転換した子孫により産生されるシルク繊維の分析を容易にし、さらに、シルク腺におけるキメラスパイダーシルクタンパク質の発現を検討ための予備的な生体外シルク腺打ち込みアッセイのために使用された。
【００８１】
方法：
いくつかの遺伝子断片を、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）株Ｐ５０／Ｄａｉｚｏのシルク腺から単離されたゲノムＤＮＡと図１７に示す遺伝子特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。これらの断片には、ｆｈｃの主要プロモーターおよび上流エンハンサーエレメント（ＭＰ−ＵＥＥ）、異なる５’−および３’−フランキング制限部位を有する、２バージョンのｆｈｃの基本プロモーター（ＢＰ）およびＮ末端ドメイン（ＮＴＤ；エキソン１／イントロン１／エキソン２）、ｆｈｃのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ；３’コード配列およびポリＡシグナル）、ならびにＥＧＦＰが含まれる。それぞれの場合において、増幅産物をゲル精製し、予測された大きさのＤＮＡ断片を切除して回収した。続いて、ｆｈｃのＭＰ−ＵＥＥ、ｆｈｃのＣＴＤ、およびＥＧＦＰ断片をｐＳＬｆａｌｌ８０ｆａ（ｐＳＬ）（Ｙ．Ｍｉａｏ）にクローニングし、２つの異なるＮＴＤ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、そして適切な増幅産物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を制限酵素マッピングにより同定し、配列決定により確認した。
【００８２】
次いで、以下のように、これらの断片を使用して、本研究で使用するｐｉｇｇｙＢａｃベクターを組み立てた。合成Ａ２Ｓ８１４スパイダーシルク配列を、ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＥＩを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋プラスミド前駆体（Ｆ．Ｔｅｕｌｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｖ．Ｌｅｗｉｓ）から切除し、ゲル精製して回収し、上記のｐＳＬ中間プラスミドにおいてＣＴＤ上流の対応する部位にサブクローニングした。このステップにより、ｐＳＬ−スパイダー６−ＣＴＤと名付けたプラスミドを得た。次いで、Ｎｏｔ１  ＢａｍＨＩ断片を上記のｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＮＴＤ中間プラスミドの１つから切除し、ゲル精製して回収し、そしてｐＳＬスパイダー６−ＣＴＤにおいてスパイダー６−ＣＴＤ配列上流の対応する部位にサブクローニングして、ｐＳＬ−ＮＴＤ−スパイダー６−ＣＴＤを作製した。並行して、Ｎｏｔ１／Ｘｂａｌ断片を上記のｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＮＴＤ中間プラスミドから切除し、ゲル精製して回収し、上記のｐＳＬ−ＥＧＦＰ中間プラスミドにおいてＥＧＦＰアンプライマー上流の対応する部位にサブクローニングした。これにより、ＮＴＤ−ＥＧＦＰ断片を含有するプラスミドが得られ、この断片をＮｏｔｌおよびＢａｍＨＩを用いて切除し、ｐＳＬ−スパイダー６−ＣＴＤにおいてスパイダー６−ＣＴＤ配列上流の対応する部位にサブクローニングした。次いで、ＭＰ−ＵＥＥ断片を上記のｐＳＬ中間プラスミドからＳｆｉＩおよびＮｏｔ１を用いて切除し、ゲル精製して回収し、上記の２つの異なる中間ｐＳＬプラスミドにおいてＮＴＤ−スパイダー６−ＣＴＤおよびＮＴＤ−ＥＧＦＰ−スパイダー６−ＣＴＤ配列の上流の対応する部位にサブクローニングした。最後に、完全に組み立てられたＭＰ−ＵＥＥ−ＮＴＤ−Ａ２Ｓ８１４−ＣＴＤまたはＭＰ−ＵＥＥ−ＮＴＤ−ＥＧＦＰＡ２Ｓ８１４−ＣＴＤカセットを、それぞれの最終的なｐＳＬプラスミドからＡｓｃＩおよびＦｓｅＩを用いて切除し、ｐＢＡＣ［３ｘＰ３−ＤＳＲｅｄａｆ］９８の対応する部位にサブクローニングした。この最後のサブクローニングステップにより、ＥＧＦＰマーカーの有無を示すためにスパイダー６およびスパイダー６−ＥＧＦＰと名付けられた、２つの別々のｐｉｇｇｙＢａｃベクターが得られた。下記に記載のように、これらのベクターは、生体外シルク腺打ち込みアッセイおよびカイコ遺伝子組換えのために使用した。
【００８３】
結果：
生体外アッセイの結果は、ＧＦＰタグ付きキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質をコードするｐｉｇｇｙＢａｃベクターが後部シルク腺領域で緑色蛍光を誘導することを示した。ＧＦＰ特異抗体を用いる免疫ブロッティングアッセイはさらに、打ち込まれたシルク腺が、約１１６ｋＤａの見かけの分子量（Ｍｒ）を有する免疫反応性タンパク質を含有することを実証した。予測（１０６ｋＤａ）よりわずかに大きいが、これらの結果は、本ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの基本設計の検証となり、これらの構築物を使用する、トランスジェニックカイコの単離を促した。
【００８４】
実施例８−トランスジェニックカイコの単離
各ｐｉｇｇｙＢａｃベクターを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするプラスミドと混合し、その混合物をカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ｐｎｄ−ｗｌ４３から単離した卵に独立に微量注入した。形質転換体におけるＥＧＦＰタグ付きキメラカイコ−スパイダーシルクタンパク質の検出を容易にする、透明な表皮表現型を生じるメラニン沈着欠乏症を有するので、このカイコ株を使用した。推定上のＦｌ形質転換体は、各ｐｉｇｇｙＢａｃベクター（図１７Ｄ）に含まれる神経特異的３ＸＰ３プロモーター２７の制御下にあるＤＳ−Ｒｅｄの発現に起因する赤眼表現型により最初に同定した。方法に記載のように、これらの動物は、いくつかのホモ接合型トランスジェニックカイコの血統を樹立するために使用し、それらの形質転換に使用したｐｉｇｇｙＢａｃベクターを表して、スパイダー６およびスパイダー６−ＧＦＰと名付けた。
【００８５】
方法：
生体外シルク腺打ち込みアッセイ
第５齢の３日目に入っている、生きているカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）株ｐｎｄ−ｗｌカイコを、７０％エタノールに数秒間液浸して滅菌し、０．７％ｗ／ｖのＮａＣＩ中に置いた。次いで、シルク腺全体を各動物から無菌的に切り離し、抗生物質添加のグレース培地を含有するペトリ皿に移し、ＤＮＡ打ち込み工程までそこに保持した。並行して、タングステンミクロ粒子（１．７μｍ  Ｍ−２５マイクロキャリヤー；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を、以下のように、打ち込み用にＤＮＡでコーティングした。ミクロ粒子を、製造業者の説明書に従って前処理し、３ｍｇ／５０μｌアリコートで５０％グリセロール中に−２０℃で保存した。各打ち込み実験の直前に、製造業者の説明書に従って、ミクロ粒子アリコート３ｍｇを最大容量５μｌ中で適切なｐｉｇｇｙＢａｃ  ＤＮＡ５μｇでコーティングした。ミクロ粒子アリコートの一部を、ＤＮＡ陰性対照として使用するために蒸留水でコーティングした。各打ち込み実験を６回反復し、個々の打ち込みにはそれぞれ１対のインタクトシルク腺が含まれた。打ち込みの場合、グレース培地中での保持状態から１％ｗ／ｖの滅菌寒天を含有する９０ｍｍペトリ皿上にこれらの腺を移し、ペトリ皿を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍチャンバーの中に置いた。以前に記載されているように２６、チャンバーを２０〜２２Ｈｇに排気し、シルク腺に、１，１００ｐｓｉのヘリウム圧力を使用して、粒子源から標的組織まで６ｃｍの距離で、前コーティングしたタングステンミクロ粒子を打ち込んだ。打ち込み後、シルク腺を、２×抗生物質添加のグレース培地を含有する新たなペトリ皿に置き、２８℃でインキュベートした。スパイダー６−ＧＦＰのｐｉｇｇｙＢａｃベクターにおけるＥＧＦＰマーカーの一過性発現を、打ち込み後４８および７２時間に蛍光顕微鏡で評価した。画像を、倍率４．２倍、位相１／１２０秒、緑色蛍光１／１１０秒（捕捉）でオリンパスＦＳＸ１００顕微鏡を用いて取得した。さらに、下記に記載されるように、ＥＧＦＰタグ付きおよびタグなしキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の一過性発現を、打ち込まれたシルク腺抽出物をＥＧＦＰ−またはスパイダーシルク−特異抗血清を用いて免疫ブロッティングすることにより評価した。
【００８６】
カイコの形質転換
ｐｎｄ−ｗｌガによる産卵１時間後に卵を集め、スライドガラス上に並べた。ベクターおよびヘルパープラスミドをそれぞれ、０．２μｇ／ｕｌの最終濃度で注入緩衝液（０．１ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＫＣ１、ｐＨ６．８）中に再懸濁し、１〜５ｎｌを、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＰＶ８２０圧力調節器（米国）、Ｓｕｒｕｇａ  Ｓｅｉｋｉ  Ｍ３３１マイクロマニピュレーター（日本）、およびＮａｒｉｓｈｉｇｅ  ＨＤ−２１ダブルピペットホルダー（日本）からなる注入システムを使用して、各前胚盤葉カイコ胚に注入した。穴をあけられた卵は、Ｈｅｌｐｉｎｇ  Ｈａｎｄ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇｌｕｅゲル（Ｔｈｅ  Ｆａｕｃｅｔ  Ｑｕｅｅｎｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて密封し、次いで、胚発生のために２５℃および湿度７０％の成長チャンバーの中に置いた。孵化後、幼虫を人工飼料（日本農産工業株式会社、日本）で飼育し、同じ系内の同胞を交配することによりその後の世代を得た。トランスジェニック子孫は、５５０〜７００ｎｍの間のフィルターを備えたオリンパスＳＸＺ１２顕微鏡（東京、日本）を使用して、ＤｓＲｅｄの蛍光眼マーカーの存在により試験的に同定した。
【００８７】
結果：
特別にＥＧＦＰを励起せずに白色光の下で目視検査を行っても、ＥＧＦＰの発現は、スパイダー６−ＧＦＰ形質転換体により産生される繭で観察された（図１８Ａ）。さらに、これらの動物に由来するシルク腺（図１８Ｂ〜１８Ｃ）および繭（図１８Ｄ）を蛍光顕微鏡下で検査すると、ＥＧＦＰの強い発現が観察された。繭は、ＥＧＦＰシグナルと融合したシルク繊維を少なくとも一部含むように見えた。スパイダー６−ＧＦＰのシルク腺および繭におけるＥＧＦＰタグ付きキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の発現は、ＥＧＦＰおよびスパイダーシルクタンパク質に対する特異抗血清を用いて、シルク腺および繭の抽出物を免疫ブロッティングすることにより確認した（図１９）。スパイダー６のシルク腺および繭の抽出物に関しても同様の結果が、スパイダーシルクタンパク質特異抗血清を用いる免疫ブロッティングにより得られた（図１９）。これらの結果は、我々が、ＥＧＦＰタグ付きまたはタグなし形態のキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質をコードするトランスジェニックカイコの単離に成功したこと、およびこれらのタンパク質が、それらのトランスジェニック動物により産生されるシルク繊維に結合していることを示した。
【００８８】
実施例９−複合シルク繊維の分析
連続タンパク質抽出法を使用して、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質とトランスジェニックカイコから産生される複合シルク繊維との関連を分析した。緩く結合したセリシン層を除去した後、方法に記載のように、この練りシルク繊維を、苛酷さを増していく一連の抽出に付した。
【００８９】
方法：
カイコ繭タンパク質の連続抽出
親カイコおよびトランスジェニックカイコから産生された繭を採取し、セリシン層を、０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａ２ＣＯ３中で、材料：溶媒比を１：５０（ｗ／ｖ）にして、８５℃にて１５分間繭を穏やかに撹拌することにより除去した４０。この練りシルクを、槽から取り出し、同じ材料：溶媒比で、熱水（５０〜６０℃）を用いて注意深く撹拌しながら２回洗浄した。次いで、練りシルク繊維を凍結乾燥して秤量し、セリシン層除去の効率を評価した。この練り繊維を使用して、確実に一定の撹拌を行う混合ホイール上での回転による連続タンパク質抽出プロトコールを、以下のように行った。練りシルク繊維３０ｍｇを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣ１、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｐ０４、１．８ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４）中で、４℃にて１６時間処理した。この材料を遠心分離により不溶性分画と可溶性分画に分離し、上清を取り出し、ＰＢＳ可溶性分画として−２０℃に保存し、ペレットを次の抽出に付した。このペレットを２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ１ｍｌに再懸濁し、室温で１６時間インキュベートした。再び、材料を遠心分離により不溶性画分と可溶性分画に分離し、上清を取り出し、ＳＤＳ可溶性分画として−２０℃に保存し、ペレットを次の抽出に付した。このペレットを、２％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含有する９Ｍ  ＬｉＳＣＮ１ｍｌに再懸濁し、室温で１６〜４８時間インキュベートした。遠心分離後、上清を９Ｍ  ＬｉＳＣＮ／ＢＭＥ可溶性分画として−２０℃に保存した。このステップで得られた最終ペレットを、５％（ｖ／ｖ）ＢＭＥを含有する１６Ｍ  ＬｉＳＣＮ１ｍｌに再懸濁し、室温で約１時間インキュベートした。これにより完全に溶解し、最終抽出物が得られ、この抽出物は、１６Ｍ  ＬｉＳＣＮ可溶性分画として、免疫ブロッティングアッセイを実施するまで−２０℃に保存した。
【００９０】
シルクタンパク質の分析
生体外打ち込みアッセイに由来するシルク腺およびさらに未処置の親カイコおよびトランスジェニックカイコに由来するシルク腺を、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび５Ｍ尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（３０ｍＭ  Ｎａ２Ｐ０４、ｐＨ７．４）中で、氷上ホモジナイズし、次いで、４℃の微量遠心機で、１３，５００ｒｐｍにて５分間、澄明化した。上清をシルク腺抽出物として収集し、これらの抽出物および上記の連続繭抽出物を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／２％ＳＤＳ／５％ＢＭＥ緩衝液で４倍に希釈し、約９０μｇの総タンパク質を含有する試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液と１：１で混合し、９５℃で５分間煮沸し、４〜２０％グラジエントゲル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）上に負荷した。分離後、製造業者の説明書に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ転写セルを使用して、タンパク質をゲルからＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に転写した。ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）の鞭毛状シルク様Ａ２ペプチドに対して産生された、スパイダーシルクタンパク質特異ポリクローナルウサギ抗血清（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）または商用ＥＧＦＰ特異マウスモノクローナル抗体（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｓ（登録商標）ＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を一次抗体として使用して、免疫検出を実施した。二次抗体はそれぞれ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ  ＨＲＰコンジュゲート（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）とした。抗体はすべて、標準ブロッキング緩衝液（ｌ×ＰＢＳＴ／０．０５％脱脂粉乳）中で、１：１０，０００希釈で使用し、抗体抗原反応を、商用キット（ＥＣＬ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ；ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して化学発光により可視化した。
【００９１】
結果：
この手順の各ステップの後に、可溶性分画と不溶性分画を遠心分離により分離し、可溶性分画は免疫ブロッティングのために保存し、不溶性分画は次の抽出のために使用した。最終抽出溶媒は残存するシルク繊維を完全に溶解した。免疫ブロッティングの対照から、スパイダーシルクタンパク質特異抗血清は、ｐｎｄ−ｗｌシルク繊維中のいずれのタンパク質も認識しないが（図１９Ｂ、レーン３〜６）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されたキメラカイコ／Ａ２Ｓ８１４スパイダーシルクタンパク質を認識する（図１９Ｂ、レーン２）ことが確認された。生理食塩水（図１９Ｂ、レーン８および１３）、ＳＤＳ（図１９Ｂ、レーン９および１４）、および８Ｍ  ＬｉＳＣＮ／２％β−メルカプトエタノール（図１９Ｂ、レーン１０および１５）を使用して、トランスジェニック動物由来の練り繭を連続抽出しても、いかなる検出可能な免疫反応性のタンパク質も放出されなかった。しかしながら、残留シルク繊維を１６Ｍ  ＬｉＳＣＮ／５％β−メルカプトエタノールによりその後抽出すると、残留スパイダー６から分子量約１０６ｋＤａの免疫反応性タンパク質（図１９、レーン１１）、そして残留スパイダー６−ＧＦＰ繊維から分子量約１３０および約１１０ｋＤａの免疫反応性タンパク質（図１９、レーン１６）が放出された。これらのタンパク質はすべて、予測されたもの（スパイダー６およびスパイダー６−ＧＦＰについてそれぞれ、７８ｋＤａおよび１０６ｋＤａ）より大きかった。これらの差異についての可能な説明としては、高度に反復性のスパイダーシルク配列による転写／翻訳の「スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）」、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのタンパク質産物の異常な泳動、および／またはキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の翻訳後修飾が挙げられる。免疫ブロッティングの陽性対照である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されたキメラカイコ／Ａ２Ｓ８１４スパイダーシルクタンパク質もまた、分子量が予測されたもの（６０ｋＤａ）よりも大きかった（約７５ｋＤａ）。両トランスジェニックカイコ系の練り繭に由来する１６Ｍ  ＬｉＳＣＮ／５％β−メルカプトエタノール抽出物はまた、分子量が約４０〜約７５ｋＤａの免疫反応性スメアを含んでおり、これはキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の分解および／または翻訳の早期終結をおそらく反映している。導入遺伝子産物の大きさまたはその出現の理由にもかかわらず、連続抽出結果により、ここに記載のように提供されたトランスジェニックカイコは、複合シルク繊維に極めて安定に組み込まれたキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質を発現することが明確に実証された。
【００９２】
実施例１０−複合シルク繊維の機械的性質
トランスジェニックカイコにより産生された複合シルク繊維の練り天然および複合シルク繊維の機械的性質をここに記載する。
【００９３】
試験のための複合シルク繊維の調製方法および試験の実施方法を以下の方法に示す。
【００９４】
方法：
機械的性質の試験に使用する練りカイコシルク繊維は、初期長（Ｌ０）が１９ｍｍであった。単繊維試験は、ＭＴＳ  標準５０Ｎセルおよび特注品の１０ｇ荷重セル（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ  ＣＡ）の両方が装着されたＳｙｎｅｒｇｉｅ  １００システム（ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ  ＭＮ）を使用して、周囲条件（２０〜２２℃および湿度１９〜２２％）で実施した。機械的性質データ（荷重および伸長）は、歪み速度５ｍｍ／分および周波数２５０ＭＨｚで、ＴｅｓｔＷｏｒｋｓ（登録商標）４．０５ソフトウェア（ＭＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，ＭＮ）を用いて両方の荷重セルで記録し、これにより応力値および歪み値を計算した。各繊維について収集したデータセットから応力／歪み曲線を、ＭＡＴＬＡＢ（バージョン７．１）を使用してプロットし、靭性（または切断エネルギー）、ヤング率（初期剛性）、最大応力、および最大伸張（＝最大％歪み）を決定した。
【００９５】
結果：
これらの結果から、ＥＧＦＰタグ付きまたはタグなしのいずれかのキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質を含有する練り複合繊維は、ｐｎｄ−ｗｌカイコ由来の天然繊維よりも顕著に大きな伸長性および幾分改善した強度および剛性を有することが実証された（表３および図２０）。表３：親カイコおよびトランスジェニックカイコにより産生された１２〜１５シルク繊維の機械的性質を、正確に調整した温度、湿度、および試験速度の条件下で測定し、その平均値および標準偏差を表に示す。同じ条件下で並行して決定されたスパイダー（ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）牽引糸シルク繊維の平均の機械的性質を比較のために含む。
2019205463.tif 000005
【００９６】
したがって、これらの複合繊維は天然カイコシルク繊維よりも靱性が高い。トランスジェニック動物により産生された複合シルクの機械的性質は、親株により産生された天然繊維のものより変動しやすかった。さらに、２つの異なるスパイダー６−ＧＦＰ系により産生された複合繊維は同様の伸長性を示したが、張力強度は異なっていた。個々のトランスジェニック系内の複合シルク繊維の機械的性質について観察された変動および系間の変動は、複合繊維における不均一性を表わしている可能性があり、この不均一性は、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質比および／または繊維に沿ったこれらのタンパク質の局在化の差による可能性がある。図１８Ｄにおいて、複合繊維に不均一性がある証拠を見ることができる。トランスジェニックカイコ由来の複合繊維、親カイコ由来の天然繊維、および代表的な牽引糸スパイダーシルク繊維について観察された最良の機械的性能の比較を図２０に示す。この結果から、複合繊維はすべて、ｐｎｄ−ｗｌカイコ由来の天然シルク繊維よりも靱性が高いことがわかる。また、トランスジェニックスパイダー６−ＧＦＰ系４カイコ由来の複合繊維は、同じ条件下で試験された天然スパイダー牽引糸シルク繊維よりもさらに靱性が高かった。これらの結果は、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の組み込みにより、トランスジェニックカイコプラットフォームを使用して産生される複合シルク繊維の機械的性質が顕著に改善されうることを実証する。
【００９７】
天然カイコ（ｐｎｄ−ｗｌ）およびスパイダー（ジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）牽引糸）シルク繊維について測定された最良の機械的性能を、トランスジェニックカイコにより産生された複合シルク繊維で得られたものと比較する。繊維はすべて、同じ条件下で試験した。最大靱性値は次のとおりである：カイコｐｎｄ−ｗｌ（青線、４３．９ＭＪ／ｍ３））；スパイダー６系７（オレンジ線、８６．３ＭＪ／ｍ３）；スパイダー６−ＧＦＰ系１（濃緑線、９８．２ＭＪ／ｍ３）、（スパイダー６−ＧＦＰ系４（淡緑線、１６７．２ＭＪ／ｍ３）；およびジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）牽引糸（赤線、１３８．７ＭＪ／ｍ３）。（表３を参照のこと）。
【００９８】
実施例１１−安定に組み込まれたキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質を含有する複合繊維
スパイダーシルクには、多くの異なる用途に向けた生体材料として非常に多くの使用法がある。これまで、クモ飼育に対する深刻な障害が天然生産活動等を損なっていた。スパイダーシルク繊維産生にとって有効な生物工学的手法を開発する必要性が、本開示で提供されたプラットフォームで示される。組換えスパイダーシルクタンパク質の産生に使用するための他のプラットフォームが記載されてきたが、これらのタンパク質を有用な繊維に効率的に加工することは困難であった。単なるタンパク質ではなく繊維を製造する必要性のため、この特定の生物工学的用途に適任のプラットフォームとしてカイコが位置づけられる。
【００９９】
スパイダーシルクタンパク質を産生するために遺伝子操作されたトランスジェニックカイコは、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）セリシン（Ｓｅｒｌ）プロモーターの転写制御下にある、天然ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）の大瓶状スピドロイン−１シルクタンパク質をコードするｐｉｇｇｙＢａｃベクターを使用して単離された。スピドロイン配列はＣ末端ｆｈｃペプチドをコードする下流配列と融合された。このｐｉｇｇｙＢａｃ構築物を使用して単離されたトランスジェニックカイコは、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質を含有する繭を産生したが、このタンパク質は緩く結合したセリシン層でのみ見出された。これに対して、本開示のトランスジェニックカイコにより産生されたキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質は、複合繊維の不可欠な成分であった。他の研究者により設計されたキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の比較的緩い結合は、とりわけＮ末端カイコｆｈｃドメインの欠如を反映している可能性がある。あるいは、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターにおけるＳｅｒ１プロモーターの使用は、このプロモーターが中部シルク腺で転写活性であるため、適切な繊維アセンブリととりわけ調和しない可能性があるが、一方、ｆｈｃ、フィブロイン軽鎖、およびヘキサメリンタンパク質の発現を制御するｆｈｃ、ｆｌｃ、およびｆｈｘのプロモーターはそれぞれ、後部シルク腺において活性である。カイコシルクタンパク質の繊維へのアセンブリは、シルク遺伝子発現の厳格な空間的および時間的調節により部分的に制御される。したがって、本開示のベクターは、キメラタンパク質が新たにアセンブリされた複合シルク繊維に安定して組み込まれることを促進するために、天然シルクタンパク質と同じ場所および同じ時間にキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質の蓄積を促すようにｆｈｃプロモーターで巧妙に仕組まれている。他の研究者が、いくつかのトランスジェニックカイコにより産生された繭に由来する繊維の弾性および張力強度が少し増加することを記載している。しかしながら、セリシン層は機械的性質試験の前に除去されておらず、このデガミングステップは、商業シルク繊維生産のための繭の処理において不可欠である。したがって、繭が従来の様式で処理された場合、組換えスパイダーシルク／カイコタンパク質は除去され、得られるシルク繊維には、機械的性質の改善が期待されないであろう。
【０１００】
スパイダーシルクタンパク質を産生するトランスジェニックカイコは、ヘキサフルオロ溶媒に溶解するシルクタンパク質から繊維を再生することに焦点を当てた他の研究の比較的微量な構成要素として報告された。それにもかかわらず、この研究では、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）の大瓶状スピドロイン−１または鞭毛状シルクタンパク質に由来する極端に短い合成「シルク様」配列をコードするｐｉｇｇｙＢａｃベクターを用いて生成された２つのトランスジェニックカイコが記載されていた。両方のシルク様ペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端ｆｈｃドメインの内側に埋め込まれていた。機械的性質試験から、これらのトランスジェニック動物により産生されたシルク繊維は、幾分大きな張力強度（４１〜７３ＭＰａ）を有し、かつ弾性には変化がないことがわかった。これらの研究者はまた、それらの複合繊維の機械的性質において観察された比較的小さな変化は、組換えタンパク質の組み込みが低レベルであることを反映していると報告している。また、それらの構築物に使用された特定のスパイダーシルク様ペプチド配列および／またはそれらの大きさが小さいことによって、それらのトランスジェニックカイコにより産生された複合繊維の機械的性質の比較的小さな変化が少なくとも部分的に説明されうる可能性もある。
【０１０１】
本トランスジェニックカイコおよび複合繊維は最初のものであり、それらの機械的性質を顕著に改善する、安定に組み込まれたキメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質を含有する複合シルク繊維を産生するトランスジェニックカイコ系が得られた。本トランスジェニックカイコ系により産生される複合スパイダーシルク／カイコ繊維は、天然牽引糸スパイダーシルク繊維よりも靱性が一層高かった。これは、他の要因の中でも、少なくとも部分的には、反復鞭毛状様（ＧＰＧＧＡ）４（配列番号６）弾性モチーフおよび大瓶状スピドロイン−２［リンカー−アラニン８］結晶モチーフをコードする、２．４ｋｂｐのＡ２Ｓ８１４合成スパイダーシルク配列の使用による可能性がある（“アラニン８”配列番号５として記載）。この比較的大きな合成スパイダーシルクタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された後、押出しにより繊維に紡ぐことができ、このタンパク質が繊維にアセンブルする天然の能力を保持していることが示される。しかしながら、このタンパク質は、シルク繊維に組み込まれるために、一斉に発現され、内因性のカイコｆｈｃ、ｆｌｃ、およびｆｈｘタンパク質と相互作用しなければならないであろう。したがって、Ａ２Ｓ８１４スパイダーシルク配列は、アセンブリ過程を指向して、Ｎ末端およびＣ末端ｆｈｃドメインの内側に埋め込まれた。ｆｈｃプロモーターが内因性カイコシルクタンパク質に空間的および時間的に接近してそれらの発現を駆動する能力と共に、これらの特徴は、キメラカイコ／スパイダーシルクタンパク質が複合シルク繊維のアセンブリに参加し、その機械的性質に顕著に寄与する能力を少なくとも部分的に説明することができる。
【０１０２】
実施例１２−ｐｉｇｇｙＢａｃベクター構築物およびｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構成要素のＰＣＲ増幅
いくつかの遺伝子断片を、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）株Ｐ５０／Ｄａｉｚｏのシルク腺から単離したゲノムＤＮＡおよび表４に示す遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離した。これらの断片には、ｆｈｃの主要プロモーターおよび上流エンハンサーエレメント（ＭＰ−ＵＥＥ）、異なる５’−および３’−フランキング制限部位を有する、２バージョンのｆｈｃの基本プロモーター（ＢＰ）およびＮ末端ドメイン（ＮＴＤ；エキソン１／イントロン１／エキソン２）、ｆｈｃのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ；３’コード配列およびポリＡシグナル）、ならびにＥＧＦＰが含まれる。それぞれの場合において、増幅産物をゲル精製し、予測された大きさのＤＮＡ断片を切除して回収した。続いて、ｆｈｃのＭＰ−ＵＥＥ、ｆｈｃのＣＴＤ、およびＥＧＦＰ断片をｐＳＬｆａｌｌ８０ｆａにクローニングし、２つの異なるＮＴＤ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、そして適切な増幅産物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を制限酵素マッピングにより同定し、配列決定により確認した。次いで、以下のように、これらの断片を使用して、この研究で使用するｐｉｇｇｙＢａｃベクターを組み立てた。合成Ａ２Ｓ８１４スパイダーシルク配列を、ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＥＬを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫＩＩ＋プラスミド前駆体から切除し、ゲル精製して回収し、上記のｐＳＬ中間プラスミドにおいてＣＴＤ上流の対応する部位にサブクローニングした。このステップにより、ｐＳＬ−スパイダー６−ＣＴＤと名付けたプラスミドを得た。次いで、Ｎｏｔ１／ＢａｍＨＩ断片を上記のｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＮＴＤ中間プラスミドの１つから切除し、ゲル精製して回収し、そしてｐＳＬ−スパイダー６−ＣＴＤにおいてスパイダー６−ＣＴＤ配列上流の対応する部位にサブクローニングして、ｐＳＬ−ＮＴＤ−スパイダー６−ＣＴＤを作製した。並行して、Ｎｏｔ１／Ｘｂａｌ断片を上記のｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＮＴＤ中間プラスミドから切除し、ゲル精製して回収し、上記のｐＳＬ−ＥＧＦＰ中間プラスミドにおいてＥＧＦＰアンプライマー上流の対応する部位にサブクローニングした。これにより、ＮＴＤ−ＥＧＦＰ断片を含有するプラスミドが得られ、この断片をＮｏｔｌおよびＢａｍＨＩを用いて切除し、ｐＳＬ−スパイダー６−ＣＴＤにおいてスパイダー６−ＣＴＤ配列上流の対応する部位にサブクローニングした。次いで、ＭＰ−ＵＥＥ断片を上記のｐＳＬ中間プラスミドからＳｆｉ１およびＮｏｔ１を用いて切除し、ゲル精製して回収し、上記の２つの異なる中間ｐＳＬプラスミドにおいてＮＴＤ−スパイダー６−ＣＴＤおよびＮＴＤ−ＥＧＦＰ−スパイダー６−ＣＴＤ配列の上流の対応する部位にサブクローニングした。最後に、完全に組み立てられたＭＰ−ＵＥＥ−ＮＴＤ−Ａ２Ｓ８１４−ＣＴＤまたはＭＰ−ＵＥＥ−ＮＴＤ−ＥＧＦＰＡ２Ｓ８１４−ＣＴＤカセットを、それぞれの最終的なｐＳＬプラスミドからＡｓｃ１（ＡＳｃ１）およびＦｓｅ１を用いて切除し、ｐＢＡＣ［３ｘＰ３−ＤＳＲｅｄａｆ］の対応する部位にサブクローニングした（Ｈｏｒｎ，ｅｔ  ａｌ���（２００２），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２：１２２１−１２３５）。この最後のサブクローニングステップにより、ＥＧＦＰマーカーの有無を示すためにスパイダー６およびスパイダー６−ＥＧＦＰと名付けられた、２つの別々のｐｉｇｇｙＢａｃベクターが得られた。以下の表に、使用されたｐｉｇｇｙＢａｃベクターの重要な構成要素の一部を収戴する。表４は、出現順にそれぞれ配列番号７〜１７を開示する。
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【０１０３】
実施例１３−ｍａｓｐクローニング
本実施例は、プラスミド、具体的にはｐＸＬＢａｃＩＩ  ＥＣＦＰプラスミドの内部にＮＴＤ領域を含有する遺伝子構築物を提供することにより本発明の有用性を実証する。
【０１０４】
ｐＸＬＢａｃＩＩ  ＥＣＦＰプラスミドに加えてＮＴＤ領域を含有する潜在的に陽性のクローンは、ＰＣＲによるコロニースクリーニングにより示される。
【０１０５】
ｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ１６（１０，４５８ｂｐ）（図１２Ａ）およびｐＸＬＢａｃＩＩ−ＥＣＦＰ  ＮＴＤ  ＣＴＤ  ｍａｓｐＸ２４（１１，２５０  ｂｐ）（図１２Ｂ）の遺伝子構築物ｍａｓｐを作製した。
【０１０６】
当業者にとって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の修正および変更をなすことができることは明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその等価形態の範囲に入るならば、本発明の修正および変更を包含することが意図される。
【０１０７】
参考文献
以下の参考文献は、参照によって具体的に本明細書に組み込まれる。
１．Ｂｅｒｇｈａｍｍｅｒ，Ａ．，Ｂｕｃｈｅｒ，Ｇ．，Ｍａｄｅｒｓｐａｃｈｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｋｌｉｎｇｌｅｒ，Ｍ．（１９９９），Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ．，２０９：  ３８２−３８９．  
２．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ，ａｎｄ  Ｄｏｌｙ，Ｊ．（１９７９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７：１５１３−１５２３．
３．Ｂｒｏｏｋｓ，Ａ．Ｅ．，Ｃｒｅａｇｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（２００５），Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｐｉｄｅｒ  Ｓｉｌｋ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｏｓｔ−ｓｐｉｎ  Ｄｒａｗ．Ｉｎ“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，Ｖｏｌ．４１，ｐｐ．１−６．  
４．Ｃａｒｙ，Ｌ．Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７２：１５６−１６９．
５．Ｃｈｏｕｄａｒｙ，Ｐ．Ｖ．，Ｋａｍｉｔａ，Ｓ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｅｄａ，Ｓ．（１９９５），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｌａｒｖａｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｃ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄ．），Ｖｏｌ．３９，ｐｐ．２４３−２６４．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．
６．Ｃｏｌｇｉｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７：６６７−６７２．  
７．Ｄｅｎｎｙ，Ｍ．Ｗ．（１９８０），Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，３４：２４７−２７２．  
８．Ｄｏｏｌｉｎｇ，Ｄ．（２００５），Ｇｒｏｗｉｎｇ  ｙｏｕｒ  ｏｗｎ  ｓｐａｒｅ  ｐａｒｔｓ：ＮＡＳＡ  ａｓｓｉｓｔｓ  ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  
９．Ｅｌｉｃｋ，Ｔ．Ａ．，Ｂａｕｓｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｅ，Ｎ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｒ．（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃａ，９７：１２７−１３９．  
１０．Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｅｄｚｙｋ，Ｌ．Ａ．（１９９７），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４７：３３−３９．  
１１．Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（２０００），Ｔｈｅ  ＴＴＡＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｉｎ“Ｉｎｓｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”（Ａ．Ａ．Ｊａｍｅｓ，ａｎｄ  Ａ．Ｈ．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ｅｄｓ．）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ．  
１２．Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｕｓｃａ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．（１９８５），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４５：３５６−３６１．
１３．Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｒｙ，Ｌ．，Ｂｏｏｎｖｉｓｕｄｈｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．（１９９５），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：３９７−４０７．  
１４．Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．（１９８３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４７：２８７−３００．
１５．Ｇａｔｅｓｙ，Ｊ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｃ，Ｍｏｔｒｉｕｋ，Ｄ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：２６０３−２６０５．  
１６．Ｇｏｓｌｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｎｎｙ，Ｍ．Ｗ．，ａｎｄ  ＤｅＭｏｎｔ，Ｍ．Ｅ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：５５１−５５２．  
１７．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｏｍｅｚ，Ｓ．Ｐ．（１９９５），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４７：３９９−４０８．  
１８．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｏｍｅｚ，Ｓ．Ｐ．（１９９６），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４３：１３３９−１３４７．  
１９．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ａ．，２ｎｄ（１９９９），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８：４４９−４５７．
２０．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ａ．，２ｎｄ（２００１），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３１：１９９−２０５．  
２１．Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，ＭｃＣｏｍｂｓ，Ｓ．Ｄ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓａｕｌ，Ｓ．Ｈ．（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５：７５２０−７５２５．  
２２．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｃ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：１４７７−１４７９．  
２３．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｃ．Ｙ．，Ｓｈｉｐｌｅｙ，Ｎ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（１９９９），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，２４：２７１−２７５．  
２４．Ｈｉｎｍａｎ，Ｍ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（１９９２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１９３２０−１９３２４．
２５．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｃ，Ｔｅｒｒｙ，Ａ．Ｅ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｖｏｌｌｒａｔｈ，Ｆ．（２００６），Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，５：８７０−８７４．  
２６．Ｈｏｒａｒｄ，Ｂ．，Ｍａｎｇｅ，Ａ．，Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｕｂｌｅ，Ｐ．（１９９４），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２６１−２６５．
２７．Ｈｏｒｎ，Ｃ，Ｊａｕｎｉｃｈ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ，Ｅ．Ａ．（２０００），Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  ＥｖｏＬ，２１０：６２３−６２９．  
２８．Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｕｒｒ．，Ｂｉｏｌ．１４：２０７０−２０７４．  
２９．Ｉｍａｍｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６５：１３２９−１３４０．  
３０．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５：５１−５９．  
３１．Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０５１７−４０５２８．  
３２．Ｌａｚａｒｉｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：４７２−４７６．  
３３．Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，７：４００−４０６．  
３４．Ｌｏｂｏ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｒ．（１９９９），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２６１：８０３−８１０．  
３５．Ｍａｅｄａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２−５９４．  
３６．Ｍｏｒｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１７−２２８．  
３７．Ｏ’Ｂｒｏｃｈｔａ，Ｄ．Ａ．，Ｇｏｍｅｚ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｍ．（１９９１），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：３８７−３９４．  
３８．Ｐｅｌｏｑｕｉｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３２３−３３３．  
３９．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．”２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  
４０．Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｇｕｈｒｓ，Ｋ．Ｈ．，Ｇｒｏｓｓｅ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｃｏｎｒａｄ，Ｕ．（２００１），Ｎａｔ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ，１９：５７３−５７７．  
４１．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（１９７５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７．  
４２．Ｔａｋｅｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９９：２００５−２０１０．  
４３．Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：８１−８４．  
４４．Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｓ．Ｔ．，Ｌｕｕ，Ｈ．Ｔ．，Ｖａｎｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．（１９９９），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８：１１９−１２３．  
４５．Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２，２４７−２５３．  
４６．Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：５２−５６．  
４７．Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，ｏｆ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６：４３５０−４３５４．
４８．Ｕｒｒｙ，Ｄ．Ｗ．（２００２），Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｂ  ３５７：１６９−１８４．  
４９．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．（１９９３），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１：１０９−１１６．  
５０．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｈ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｃａｒｙ，Ｌ．Ｃ．（１９８９），Ｇｅｎｅ．，８１：９７−１０８．  
５１．Ｗｏｎｇ  Ｐｏ  Ｆｏｏ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．，８２：２２３−２３３．  
５２．Ｗｕｒｍ，Ｆ．Ｍ．（２００３），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：３４−３５．  
５３．Ｘｕ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：７１２０−７１２４．  
５４．Ｙａｍａｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．，１３：５１１−５１６．  
５５．Ｙｕｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），“Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，”Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｈｕａｘｅ  ｙｕ  Ｓｈｅｎｇｗｕ  Ｗｕｌｉ  Ｘｕｅｂａｏ  ３３（１）：１１２−１１６．  
５６．ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＦ２２６６８８，Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．“Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｆｉｂ−Ｈ（ｆｉｂ−Ｈ）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．，”ＵＳ  Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ，Ｊｕｎ．１９，２０００．  
５７．Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，３３（１）：１１２−１１６．
５８．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，３１（２）：１１９−１２３．
５９．Ｚｈｏｕ，Ｃ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８．（１２）：２４１３−２４１９．  
６０．Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（１）：５２−５６．  
６１．Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ，Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ，“Ａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｎｓｅｃｔｓ（Ｋｕｍｉｋａｅｔａｉ  Ｋｏｎｃｈｕ  Ｒｉｙｏ  Ｅｎｏ  Ｔｅｉｇｅｎ）”，Ｓａｎｓｈｉ  Ｋｏｎｃｈｕｋｅｎ  Ｓｈｉｒｙｏ，Ｎｏ．２８，ｐｐ．９３−９５．  
６２．Ｔｏｓｈｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：８１−８５．  
６３．Ｏｋａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：１０１５−１０２２．  
６４．Ｘｉａｏ−Ｈｕｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２１（９）：７９７−８０１．  
６５．Ｉｓｈｉｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１４５１：４８−５８．  
６６．Ｔ．Ｔａｍｕｒａ，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ”，Ｆｉｂｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．２，２００１，ｐ．３８−４１．Ａ．Ｙａｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２５（２）：３０−３３．  
６７．Ｔ．Ｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，７５（８）：１７−２４．  
６８．Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ，Ｋａｔｓｕｔｏｓｈｉ（２００１），“Ａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｉｎｓｅｃｔｓ（Ｋｕｍｉｋａｅｔａｉ  Ｋｏｎｃｈｕ  Ｒｉｙｏ  Ｅｎｏ  Ｔｅｉｇｅｎ）”，Ｓａｎｓｈｉ  Ｋｏｎｃｈｕｋｅｎ  Ｓｈｉｒｙｏ，２８：９３−９５．  
６９．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ７，６７４，８８２  −  Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．
７０．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ７，６５９，１１２  −  Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．  
７１．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ７，５２１，２２８  −  Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．  
７２．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，２６８，１６９  −  Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ．  
７３．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，９９４，０９９  −  Ｌｅｗｉｓ．  
７４．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，９８９，８９４  −  Ｌｅｗｉｓ．  
７５．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，７５６，６７７  −  Ｌｅｗｉｓ  
７６．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，７３３，７７１  −  Ｌｅｗｉｓ．  
７７．Ｋｌｕｇｅ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｂｏｔｙａｇｏｖａ，Ｏ．，Ｌｅｉｓｋ，Ｇ．Ｇ．＆  Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ｌ．（２００８），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２６：２４４−２５１．  
７８．Ｓｃｈｅｉｂｅｌ，Ｔ．（２００４），Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔ．３，１４．  
７９．Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ，Ａ．Ｃ．，Ｋｅａｒｎｓ，Ｖ．Ｒ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ａ．＆Ｈａｔｔｏｎ，Ｐ．Ｖ．（２００８），／．Ｔｉｓｓ．Ｅｎｇｒ．Ｒｅｇ．Ｍｅｄ．，２：７１−８０．  
８０．Ｇｏｓｌｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕｅｒｅｔｔｅ，Ｐ．Ａ．，Ｏｒｔｌｅｐｐ，Ｃ．Ｓ．＆Ｓａｖａｇｅ，Ｋ．Ｎ．（１９９９），／．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２０２：３２９５−３３０３．  
８１．Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｖ．（２００６），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０６：３７６２−３７７４．  
８２．Ｈａｒｄｙ，Ｊ．Ｇ．，Ｌ．Ｍ．，Ｒ．＆Ｔ．Ｒ．（２００８），Ｓ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，４９：４３０９−４３２７．  
８３．Ｔｅｕｌｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７），／．Ｍａｔ．Ｓｅｔ，４２：８９７４−８９８５．  
８４．Ｔｅｕｌｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．４：３４１−３５５．  
８５．Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆Ｉｒｗｉｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９７），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４７：２３−３２．  
８６．Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．＆Ｂｅｄｚｙｋ，Ｌ．Ａ．（１９９７），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４７：３３−３９．  
８７．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３５：３２９−３３５．  
８８．Ｍｉａｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７１：１９２−１９９．  
８９．Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｋａｊｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｍａｅｎａｋａ，Ｋ．＆Ｐａｒｋ，Ｅ．Ｙ．（２０１０），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８５：４５９−４７０．  
９０．Ｒｏｙｅｒ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．，１４：４６３−４７２．  
９１．Ｋｏｊｉｍａ，Ｋ，．ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１，２９４３−２９５１．
９２．Ｋｕｒｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｓｅｚｕｔｓｕ，Ｈ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．＆Ｙａｍａｄａ，Ｋ．（２００７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３５５：９７６−９８０．  
９３．Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，３７：７１３−７２５．  
９４．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８：３４８７−３４９２．  
９５．Ｗｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，３７：１８１５−１８２１．  
９６．Ｚｈｕ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．ｏｌｙｍ．Ｅｄ．，２１：３９５−４１１．  
９７．Ｓｅｈｎａｌ，Ｆ．＆Ａｋａｉ，Ｈ．（１９９０），Ｉｎｔ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｒｐｈ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．，１９：７９−１３２．  
９８．Ｈｏｒｎ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２：１２２１−１２３５．  
９９．Ｙａｍａｄａ，Ｈ．，Ｎａｋａｏ，Ｈ．，Ｔａｋａｓｕ，Ｙ．＆Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｋ．（２００１），Ｍａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇｒ．Ｃ，１４：，４１−  ４６．  
１００．ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ５，７２８，８１０  Ｌｅｗｉｓ．
【図１】
2019205463.tif 000007
【図２】
2019205463.tif 000008
【図３】
2019205463.tif 000009
【図４】
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【図５】
2019205463.tif 000011
【図６】
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【図７】
2019205463.tif 000013
【図８】
2019205463.tif 000014
【図９】
2019205463.tif 000015
【図１０】
2019205463.tif 000016
【図１１】
2019205463.tif 000017
【図１２】
2019205463.tif 000018
【図１３−１】
2019205463.tif 000019
【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１５−１】
2019205463.tif 000031
【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
2019205463.tif 000039
【図１６−５】
2019205463.tif 000040
【図１７】
2019205463.tif 000041
【図１８】
2019205463.tif 000042
【図１９】
2019205463.tif 000043
【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【配列表】
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