(57)【要約】      （修正有）【課題】前駆細胞の増殖を誘導して機能骨、軟骨、腱、および／または靭帯組織にすることができる小分子化合物の提供。【解決手段】テオブロミンを含む細胞培養用の組成物および方法と、それによって誘導される細胞とが提供される。造骨を増進させる、骨密度を増す、内部骨相互の接合を増す、骨量を増す、軟骨および／または骨の異常を治療する、胎児の体重を増す、虫歯を予防する、歯の表面の鉱物成分を回復させる、象牙質知覚過敏症を治療する、また骨部位に施用してその部位で新しい骨の成長を促進させるためのテオブロミン組成物がまた、提供される。【選択図】図１０
2019131608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む培地中の単離細胞。
【請求項２】
前記単離細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１に記載の単離細胞。
【請求項３】
前記単離細胞が幹細胞である、請求項１に記載の単離細胞。
【請求項４】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項３に記載の幹細胞。
【請求項５】
前記テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶が、１〜３００μＭである、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
細胞の培養方法であって、前記細胞を培地中で培養するステップを含み、前記培地が、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む、方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が間葉幹細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記テオブロミンが１〜３００μＭである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む培地。
【請求項１２】
前記テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶が、１〜３００μＭである、請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
前記テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶が、１〜１００μＭである、請求項１１に記載の培地。
【請求項１４】
それを必要としている被験者の骨粗鬆症を治療する、造骨を増進させる、骨密度を増す、内部骨相互の接合を増す、骨量を増す、軟骨および／または骨の異常を治療する、胎児の体重を増す、またはこれらの組合せのための医薬組成物を処方するためのテオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法。
【請求項１５】
それを必要としている被験者の虫歯を予防する、歯の表面の鉱物成分を回復させる、象牙質知覚過敏症を治療する、またはこれらの組合せのための医薬組成物を処方するためのテオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法。
【請求項１６】
妊娠前、妊娠、授乳、および／または産後の段階の間の母親および／または子供の健康を向上させるための医薬組成物を処方するためのテオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法。
【請求項１７】
胎児の体重を増加させる、胎児および／または母親の造骨を増進する、胎児および／または母親の骨密度を増す、胎児および／または母親の内部骨相互の接合を増す、胎児および／または母親の骨量を増す、母親の骨粗鬆症を治療する、またはこれらの組合せのための医薬組成物を処方するためのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法。
【請求項１８】
ａ）約２５０μｍ〜約５ｍｍの粒径を有する鉱物質を除いた骨成形骨粉末と、
ｂ）テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶と
を含む組成物。
【請求項１９】
骨部位に施用して前記部位で新しい骨の成長を促進させるための医薬組成物の調製のための請求項１９に記載の組成物の使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、それを必要としている被験者の造骨を増進させる、骨密度を増す、内部骨相互の接合を増す、骨量を増す、軟骨および／または骨の異常を治療する、あるいはこれらの組合せのための、また妊娠前、妊娠、授乳、および／または産後の段階の間の母親および／または子供の健康を向上させるための、また間葉系幹細胞（ＭＳＣ、「骨髄間質細胞」または「多能性幹細胞」とも呼ばれる）における骨芽細胞／骨成形（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）活性を増すための組成物および方法に関する。より具体的には上記組成物はココアエキスを含む。
【背景技術】
【０００２】
テオブロミン（ＩＵＰＡＣ名：３，７−ジメチル−２，３，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−プリン−２，６−ジオン、また３，７−ジメチルキサンチンとしても知られる）は、２９０〜２９５℃の昇華温度、３５７℃の融点、および１８０．１６ｇ／ｍｏｌの分子量を有する白色（または無色）の苦味がある結晶性粉末である。テオブロミンの水溶解度は、水中では１．０ｇ／２Ｌであり、沸騰水中では１．０ｇ／１５０ｍＬであり、また９５％エタノール中では１．０ｇ／２．２Ｌである。テオブロミンは、化学的にはカフェインおよびテオフィリンと関係があり、チョコレート、カカオ、茶の葉、アサイベリーを含めた非常に多くの食品中に見出される。テオブロミン、テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン）、およびカフェイン（１，３，７−トリメチルキサンチン）の化学構造を、それぞれ式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩとして下記に示す。
【化１】
2019131608.tif 000003
【０００３】
テオブロミンは、天然にはカカオ豆（カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ））中に約１．５％〜約３％の濃度で、またこの豆の殻の中に約０．７％〜約１．２％、すなわち約１５〜約３０ｇ／ｋｇの濃度見出される（Ｗｉｎｈｏｌｄｚ、１９８３）。同じ化学的ファミリーの一部分によってテオブロミンの刺激効果をカフェインのそれと区別しなければならない。カフェインは比較的速やかに作用し、ヒトに与えるその主要な影響は精神的覚醒状態の亢進である。テオブロミンの効果は、カフェインのそれより微妙であり、穏やかで長く続く気分高揚を引き起こす。血流中のテオブロミンの血漿半減期（ｔ1/2）は
６時間であり、一方、カフェインのそれは２時間に過ぎない。別の違いは、テオブロミンが生理的中毒性でなく、長期の日常的消費の後に禁断症状を生じないことである。一方、カフェインは生理的中毒性であることが分かっており、これは多くのケースの分かっている禁断症状と関連している。
【０００４】
本明細書中で使用される「テオブロミン」とは、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、またはテオブロミンを含む共結晶を指す。
【０００５】
１９８０年代に行われた２つの独立した研究により、８種類の市販のココアパウダー中
のテオブロミンの平均レベルが１．８９％であることが発見された（ＳｈｉｖｅｌｙおよびＴａｒｋａ、１９８４、およびＺｏｕｍａｓ等、１９８０）。下記の表１に示すような市販の食料品中に見出されるテオブロミンの通常レベルは格別重要である。
【０００６】
【表１】
2019131608.tif 000004
【０００７】
ブラックチョコレートは、任意の種類のチョコレートの最高レベルの一人分当たりテオブロミンを含有するが、その濃度は、約０．３６％〜約０．６３％の間で変動する傾向がある。表１に示した食料品に関して端的に言えばブラックチョコレートの１オンスバーは、約１３０ｍｇのテオブロミンを含有し、一方、ミルクチョコレートの１オンスバーは、約４４ｍｇのテオブロミンを含有する。したがってブラックチョコレートの１オンスバー中のテオブロミンの濃度は、５オンスカップのホットチョコレート中の量のほぼ２倍である。１４３ポンドの体重のヒトの場合、その血液中で毒性量のテオブロミンに達するには一度にほぼ８６個の１オンスのミルクチョコレートバーを摂取しなければならないはずである。
【０００８】
テオブロミンはまた単離し、そのアミン塩（例えばそのエチレンジアミン塩）またはその複塩（例えば、有機酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば酢酸、グルコン酸、安息香酸、またはサリチル酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩との）として作り出すことができる。複塩は、テオブロミンをより水溶性にするために、または不溶性錯体にするために調製することができる。
【０００９】
１９６６年にＳｔｒａｌｆｏｒｓは、チョコレートを多く含む食餌を与えたハムスターの虫歯の減少について報告した。このＳｔｒａｌｆｏｒｓの研究は、ハムスターの虫歯に及ぼす影響を、ココアパウダー、脱脂ココアパウダー、およびココア油脂を比較することによって調べた。純粋なココアパウダーは、そのココアパウダーがハムスターの食餌の２０％、１０％、５％、および２％を構成した場合、虫歯をそれぞれ８４％、７５％、６０％、および４２％抑制した。脱脂ココアは、油脂含有ココアパウダーよりも著しく高い抗虫歯効果を示したが、ココアバター単独（ハムスターの食餌の１５％を構成する）は、顕
著に虫歯を増加させた（Ｓｔｒａｌｆｏｒｓ  Ａの論文「透析、脱タンニン、または炭素処理したココアの水抽出物がハムスターの虫歯に及ぼす影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｃａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｄｉａｌｙｚｅｄ，Ｄｅｔａｎｎｅｄ  ｏｒ  Ｃａｒｂｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ−Ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｃｏｃｏａ）」Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．１９６６；１１：６０９〜１５）。
【００１０】
追跡研究においてＳｔｒａｌｆｏｒｓは、ココアパウダーの油脂を含まない部分について研究し、水で洗浄したココアパウダーの抗虫歯効果が未洗浄ココアパウダーよりもかなり少ないことを実証した。それにもかかわらずやはりＳｔｒａｌｆｏｒｓは、「非水溶性の齲蝕性因子の存在を示す」洗浄したココアパウダー群におけるかなりの抗虫歯効果を観察し、「ココア中の２種類の虫歯抑制物質、すなわち一方は水溶性の、またもう一方は水にやや溶けにくい物質」の存在をほのめかした（Ｓｔｒａｌｆｏｒｓ  Ａ、１９６６）。
【００１１】
その後の研究は、テオブロミンの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた燐灰石結晶が、テオブロミンの不在下で成長させたものよりも著しく大きいことを示唆した（例えば、米国特許第５，９１９，４２６号明細書および同第６，１８３，７１１号明細書参照。このそれぞれはその全体が参照により援用される）。乳を分泌するラットによるテオブロミンの摂取は、対照と比べて、テオブロミンに曝された哺乳中の仔の全第一大臼歯中の水酸燐灰石の微結晶サイズ（より高い結晶化度）の増大および酸溶解に対する抵抗の増加と相互に関係していた（同上参照）。テオブロミンに曝された哺乳中の雌の仔の大腿骨は、性別の一致した対照よりも高い結晶化度をはっきり示し、またより丈夫でかつ堅かった。しかしながら雄の仔の大腿骨は、この関係を示さなかった（同上参照）。
【００１２】
しかしながらホールペッチの関係式は、固体物質の永久歪み（例えば圧入硬度）に対する抵抗が、粒径が小さくなるに従って増加するということを規定している。結果として、テオブロミンに曝した後に観察される水酸燐灰石の結晶化度の増加−ホールペッチの関係と相まって−は、骨および歯の圧痕および永久歪みに対する抵抗が、テオブロミンに曝した後、そのより大きい結晶サイズのせいで低下して当然であることを示唆する。この示唆は、「［水酸燐灰石］の硬さは、結晶粒サイズがサブミクロンからナノメートルへ小さくなるにつれてホールペッチの関係式に従う」ことを実証した最近の研究で支持を得ている（Ｗａｎｇ  Ｊ．等の論文「硬さおよび靱性の同時強化を伴うナノ結晶性水酸燐灰石（Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｗｉｔｈ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈａｒｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００９；３０：６５６５〜７２）。別の研究は、水酸燐灰石の「硬さ」は粒径とほとんど関係がなく、結晶粒サイズを小さくすることによる硬さの変化をほとんど示さないことを示唆しているが、水酸燐灰石の「破壊靱性」は粒径を小さくするとともに増加することを実証している（Ｍａｚａｈｅｒｉ  Ｍ．等の論文「水酸燐灰石セラミックスの機械的性質に及ぼす新規な焼結法の影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｔｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｅｒａｍｉｃｓ）」Ｊ．Ａｌｌｏｙｓ  Ｃｏｍｐｄ．２００９；４７１：１８０〜４）。ヒトの永久歯および乳歯（乳児歯）の研究は、「永久歯と比較した場合、乳児のエナメル質がより薄く、より柔らかく、より砕けやすく、かつより大きな［水酸燐灰石］結晶粒を有する」ことを実証した（Ｌｏｗ  ＩＭ等の論文「ヒトの歯の構造、組成、および機械的性質のマッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｅｔｈ）」Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．Ｅｎｇ  Ｃ  Ｍａｔｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ａｐｐ．２００８；２８：２４３〜４７）。
【００１３】
このように相反するまた矛盾する結果のために、既知の特性を外挿することができず、
また信頼できるまたは正確な結果を予測する環境要因に対する水酸燐灰石の応答を従来技術の評価または結果の外挿によって簡単に予測することができない。
【００１４】
ＭＳＣは、それらの娘幹細胞を産生する能力、およびこれらに限定されないが骨芽細胞、造血および破骨細胞形成を支える間質細胞、軟骨細胞、筋細胞、骨髄の脂肪細胞、神経細胞、およびβ−膵臓島細胞を含めた多くの異なる細胞型に分化する能力によって特徴づけられる。結果としてＭＳＣは、生涯を通じて骨の発生、骨の再形成、および造血に必要な骨芽細胞および間質細胞をもたらす。
【００１５】
ヒトにおいて造骨は、胎児の発育の最初の６〜８週間の間に始まる。間葉由来の前駆幹細胞は、所定の部位に移動し、そこで（ａ）濃縮し、増殖し、造骨性細胞（骨芽細胞）に分化する（頭蓋骨中で観察され、「膜内造骨」と呼ばれる過程）、または（ｂ）濃縮し、増殖し、中間体としての軟骨形成細胞（軟骨芽細胞）に分化し、続いて造骨性細胞と置き換えられる。より具体的には間葉性幹細胞は軟骨細胞に分化する。次いでその軟骨細胞は、石灰化されるようになり、肥大し、現在その部位に存在している分化した骨芽細胞によって作られる新たに形成された骨に置き換えられる。続いてその石灰化した骨は広範囲にわたって再形成され、その後、機能性骨髄要素で満たされた小骨によって占められるようになる。この過程は、長骨中で観察され、「軟骨内骨形成」と呼ばれる。胎児後の生涯において骨は、胎生軟骨内骨発生の細胞過程を模倣することによって損傷時に自己修復する能力を有する。すなわち骨髄、骨膜、および筋肉由来の間葉性前駆幹細胞を誘導して欠陥部位に移動させ、上記イベントのカスケードを開始することができる。そこでそれらは蓄積し、増殖し、軟骨に分化し、続いて新たに形成される骨と置き換えられる。
【００１６】
ＭＳＣは、骨髄中ではきわめて稀であり、齧歯動物またはヒトの髄からｅｘ  ｖｉｖｏでそれらを増殖させる初期の試みは困難であることが分かった。また、前駆細胞の増殖および分化を誘導して機能骨、軟骨、および／または靭帯組織にすることは、これらに限定されないが骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーおよび成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを含めたさまざまなタンパク質を必要とすることが示されている。このようなタンパク質の製造、単離、および精製は、それらタンパク質が大型、複雑であり、かつ生きている細胞によって合成されるために、小分子化合物よりも必然的に複雑でかつ費用が掛かる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、前駆細胞の増殖を誘導して機能骨、軟骨、腱、および／または靭帯組織にすることができる小分子化合物−特に毒性のないことが知られてもの−に対する必要性は依然として残っている。
【００１８】
この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲中で特徴づけられる実施形態によって与えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本開示は、一実施形態においてテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む培地中の単離細胞を提供する。さらなる実施形態においてこの単離細胞は哺乳動物細胞である。さらなる実施形態においてこの単離細胞は幹細胞である。さらなる実施形態においてこの幹細胞は間葉系幹細胞である。さらなる実施形態においてこのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶は、１〜３００μＭの量で存在する。
【００２０】
本開示は、別の実施形態において、ａ）テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、
あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む培地中で細胞を培養するステップを含む細胞の培養方法を提供する。更なる実施形態においてこの細胞は哺乳動物の細胞である。更なる実施形態においてこの細胞は幹細胞である。さらなる実施形態においてこの幹細胞は間葉系幹細胞である。さらなる実施形態においてこのテオブロミンは、１〜３００μＭである。
【００２１】
本開示は、別の実施形態において、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む培地を提供する。さらなる実施形態においてこのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶は、１〜３００μＭの量で存在する。さらなる実施形態においてこのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶は、１〜１００μＭの量で存在する。
【００２２】
本開示は、別の実施形態において、それを必要としている被験者の造骨を増進させる、骨密度を増す、内部骨相互の接合を増す、骨量を増す、軟骨および／または骨の異常を治療する、胎児の体重を増加する、あるいはこれらの組合せのためのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法を提供する。
【００２３】
本開示は、別の実施形態において、それを必要としている被験者の虫歯を予防する、歯の表面の鉱物成分を回復させる、象牙質知覚過敏症を治療する、またはこれらの組合せのためのテオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物の使用法を提供する。
【００２４】
本開示は、別の実施形態において、ａ）妊娠および／または授乳の間に母親に、またはｂ）産後の段階の間の子供に、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶を含む組成物を投与するステップを含む妊娠前、妊娠、授乳、および／または産後の段階の間の母親および／または子供の健康を向上させるための方法を提供する。さらなる実施形態においてこの組成物が、母親および子供の少なくとも一方の利益になり、上記利益は、胎児の体重を増加すること、造骨を増進させること、骨密度を増すこと、内部骨相互の接合を増すこと、骨量を増すこと、またはこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２５】
本開示は、別の実施形態において、ａ）約２５０μｍ〜約５ｍｍの粒径を有する鉱物質を除いた骨成形骨粉末と、ｂ）テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶とを含む組成物を提供する。
【００２６】
さらなる実施形態において本開示は、ａ）約２５０μｍ〜約５ｍｍの粒径を有する鉱物質を除いた骨成形骨粉末と、ｂ）テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶とを含む組成物の使用法を提供する。
【００２７】
さらなる実施形態において本開示は、骨セメントおよびテオブロミンを含む組成物の使用法を提供する。例えば、限定を意図するわけではないがこの骨セメントは、カルシウムとリン酸を水溶液中で結合させることによって形成することができる。これは最初にペーストの形をするが、次に使用時に硬化させて水酸燐灰石の骨セメントにする。骨セメントは、少なくとも１つのリン酸カルシウムと、少なくとも１つのリン酸ナトリウムと、テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶とを含む組成物であることができる。
【００２８】
本開示の性質、目的、および利点のさらなる理解のために、下記の発明を実施するため
の形態を下記の図面と併せて読むことにより参考にされたい。そこでは似た参照数字は似た要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】早期骨成形マーカーのテオブロミンによる用量依存的上向き調節を示す。２人の異なるドナー（７０１１および７０２２）からのヒトＭＳＣに、骨成形補充剤および指示された用量のテオブロミン（１〜３００μＭ）の存在下で８日間の培養を施した。８日後に単分子層を、ＡＬＰ活性（図１Ａ、任意の速度単位／細胞）、ＯＰＧ分泌（図１Ｂ、μｇ／細胞／４８時間）、および細胞数（図１Ｃ、回収された細胞／ｃｍ2）に関してアッセイした。
【図２】１０〜１００μＭテオブロミンで８日間処理した時のＡＬＰ活性の増加を示す。３人の異なるドナー（２８１、７０２３、および７０５７）からのヒトＭＳＣに、骨成形補充剤および指示された用量のテオブロミン（１〜１００μＭ）の存在下で８日間の培養を施した。８日後に単分子層をＡＬＰ活性（図２Ａ、任意の速度単位／細胞）および細胞数（図２Ｂ、回収された細胞／ｃｍ2）に関してアッセイした。
【図３】ｈＭＳＣドナー２８１の組織のクラスタリング（ｐ値＜０．００１）を示す図である。合計３１のうちエントリー１〜３１。
【図４】ｈＭＳＣドナー７０２３の組織のクラスタリング（ｐ値＜０．００１）を示す。合計１０４のうちエントリー１〜３１。
【図５】ｈＭＳＣドナー７０５７の組織のクラスタリング（ｐ値＜０．００１）を示す。合計１７５のうちエントリー１〜３１。
【図６】ドナー２８１，７０２３、および７０５７の経路のクラスタリング（ｐ値＜０．００１）を示す。接着斑およびＥＣＭ相互作用が３ドナーのうち２ドナーに存在することに注目されたい。
【図７】テオブロミン処理ＭＳＣにおけるコラーゲンおよびαＶインテグリンの上向き調節を実例で示す細胞外基質（ＥＣＭ）の経路を示す（星印は、このデータセット、すなわちＣＤ４７分子、コラーゲンＸＩα１型、インテグリンαＶ［ビトロネクチン受容体、αポリペプチド、抗原ＣＤ５１］、およびラミニンα４において上向き調節された遺伝子を表す）。
【図８】コラーゲン／インテグリン相互作用によるＰ１３キナーゼの上向き調節を実例で示す接着斑の経路を示す（星印は、このデータセット、すなわちＲＡＳオンコジーンファミリーのメンバーのＲＡＰ１Ａ、アクチニンα４、ＸＩ型コラーゲンα１、表皮成長因子受容体［トリの赤芽細胞白血病ウイルス［ｖ−ｅｒｂ−ｂ］オンコジーンホモログ］、βフィラミンＢ［アクチン結合タンパク質２７８］、グルココルチコイド受容体ＤＮＡ結合因子１、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β、インテグリンαＶ［ビトロネクチン受容体、αポリペプチド、抗原ＣＤ５１］、ラミニンα４、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１、ホスファターゼおよびテンシンホモログとホスファターゼおよびテンシンホモログ偽遺伝子１、ホスホイノシチド−３−キナーゼ調節サブユニット１［α］、およびセブンレスホモログ１の息子）。
【図９Ａ−９Ｈ】下記に述べる実施例３のラットから得られた測定値を示す。
【図１０】例えば図９で述べた試験にかけた実施例３からのラットの大腿骨を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
主題の開示内容をさらに説明する前に、本開示は下記に述べる本開示の特定の実施形態に限定されず、したがってこれら特定の実施形態の変形形態を作り出すことができ、それもやはり別添の特許請求の範囲の適用範囲内にあることを理解されたい。使用される術語は特定の実施形態を記述する目的のためであり、制限的であることを意図しないこともまた理解されたい。実際には本開示の範囲は、別添の特許請求の範囲によって規定されることになる。
【００３１】
本明細書および別添の特許請求の範囲において単数形「或る（“ａ”、“ａｎ”）」および「その（“ｔｈｅ”）」には、文脈から明らかにそうでないことが示されない限り、複数形への言及が含まれる。別段の定義がない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の普通の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００３２】
下記のデータによって示されるように骨成形に関わる遺伝子の発現は、テオブロミンと共にインキュベートした後、ＭＳＣに関して顕著に増加する。また下記に示すようにテオブロミンは、それを必要としている被験者の胎児の体重の増加を促進させること、造骨を増進させること、骨密度を増すこと、内部骨相互の接合を増すこと、骨量を増すこと、軟骨および／または骨の異常を治療すること、あるいはこれらの組合せと、妊娠前、妊娠、授乳、および／または産後の段階の間の母親および／または子供の健康を向上させることとに関与する。理論に拘束されることを望むものではないが本出願人は、これらの結果がＭＳＣに及ぼすテオブロミンの作用により生ずると確信している。
【００３３】
出生時の体重が大きい成人ほど、心疾患を患うことまたは心疾患により死亡すること、また高血圧を患うことが起こりにくそうである。したがって成人の心疾患に関係する死の減少および最高血圧の低下は、妊娠前および妊娠の間の適切なテオブロミン補給のあり得る所産である。本開示の一実施形態は、テオブロミンの補給に関係した妊娠成績および／または出生時体重の全体的向上をもたらし、結果として高い胎児の体重増加、造骨の向上、骨密度の増加、内部骨相互の接合の増加、骨量の増大、およびこれらの組合せをもたらす。
【００３４】
本発明の別の実施形態によれば、テオブロミンを含む母親の栄養調合物（栄養補給剤および食品を含めた）が、妊娠前、妊娠、および授乳／産後に与えられる。母親経路の補給は、テオブロミンと共に調合された特殊調整粉乳に追加して、またはその代わりに有効かつ効率的に発育中の幼児にテオブロミンを補給する機会を代表する。
【００３５】
本発明の別の実施形態によれば、テオブロミンを含む幼児の栄養調合物（栄養補給剤および食品を含めた）が提供される。
【００３６】
妊娠前とは、女性が妊娠しようと試みている期間として定義される。妊娠の準備は妊娠の状態と同様に重要であり、妊娠しようと試みている多くの女性は、彼女等がそれを実現する前１ヶ月以上の間妊娠の状態にあるためにこれは重要である。授乳期／産後とは、出産から２年後まで、または授乳が終了するまである。補給は、たとえ母親が子供に授乳しないとしてもその母親にとって利点を有する可能性があることを理解されたい。各段階の間ずっと補給することは好ましいが必要ではなく、また各段階全体を通して連続的に補給することは好ましいが必要ではないことを理解されたい。
【００３７】
本明細書中で述べる栄養補助食品は母親および／または幼児の使用に限定されない。造骨の向上、骨密度の増加、内部骨相互の接合の増加、骨量の増大、軟骨および／または骨の異常の治療、およびこれらの組合せが必要なそれを必要としている任意のヒト（例えば、男性、女性、両方の性別の子供）は、本明細書中で述べる栄養補助食品から恩恵を受けることができる。例えば、また限定なしにこれを必要としている人は、骨粗鬆症を発症するまたはそれと診断されるリスクのある人であることができる。
【００３８】
骨粗鬆症は、骨折の高いリスクにつながる骨の疾患である。骨粗鬆症に罹っている人では、骨塩量（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が減少し、骨のマイクロアーキテクチャが崩壊し、また骨中の非コラーゲンタンパク質の量および種類が変わる。世界保健機構（ＷＨＯ）は、骨粗鬆症（女性における）を、ピーク骨量（平均３０歳の健康な
女性に対する）を標準偏差で２．５下回る骨塩量として定義している。骨粗鬆症は、閉経後の女性では最も一般的であり、それは閉経後骨粗鬆症と呼ばれるが、男性でも発症することがあり、特定のホルモン障害または他の慢性疾患の存在下で、あるいはステロイド誘発またはグルココルチコイド誘発骨粗鬆症と呼ばれる疾患の薬物療法（例えばグルココルチコイド）の結果として、また栄養不足の状態、またはこれに限定されないが低ナトリウム血症を含めた他の代謝異常の結果として、あるいは癌の二次的影響として誰にでも起こる可能性がある。脆弱性骨折のリスクに及ぼすその影響を考えると、骨粗鬆症は推定寿命および生活の質に著しい影響を及ぼす可能性がある。股関節骨折を罹患する年配の市民の約２０％が骨折の１年以内に死亡する。股関節骨折した個体の約２０％が、１年以内に養護施設に入る羽目になる。股関節骨折は、毎年３００，０００日の入院日数を計上する。骨粗鬆症による骨折の直接介護費用だけですでに毎年１８０億ドルに達している。その人数は、骨粗鬆症を予防する行動を直ちに取らないならば増加すると予想される。健康な栄養、毎日の身体的活動、定期的な健康診断、および集団検診により、すべての年齢の人達が強い骨を有し、またより長く健康な生活を送ることができる。したがって骨粗鬆症の罹患率の減少は、それを必要としている人への適切なテオブロミン供給の可能性のある成果である。本開示の一実施形態は、骨粗鬆症を治療するための組成物および方法を提供し、その組成物はテオブロミンを含む。
【００３９】
どのような生物学的に許容できる剤形またはそれらの組合せも本発明の主題で予定されている。そのような剤形の例には、制限なしにチュアブル錠、速溶性錠剤、発泡錠、還元粉末（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔａｂｌｅ  ｐｏｗｄｅｒｓ）、エリキシル錠、液剤、水剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、多層錠、二層錠、カプセル剤、軟ゼラチンカプセル剤、硬ゼラチンカプセル剤、カプレット、トローチ剤、チュアブルトローチ剤、ビーズ剤、散剤、顆粒剤、粒剤、細粒剤、顆粒水和剤、カシェ剤、膣洗浄液、坐剤、軟膏剤、外用薬、吸入剤、エアゾール吸入剤、パッチ貼付剤、粒子吸入剤、インプラント、デポ剤インプラント、摂取剤（ｉｎｇｅｓｔｉｂｌｅｓ）、注射液、輸液、ヘルスバー、砂糖菓子、シリアル、シリアルコーティング、食品、栄養食品、機能性食品、歯科用樹脂、およびこれらの組合せが挙げられる。例えばテオブロミンワニス（少なくとも１本の歯の表面、エナメル質、象牙質、および／またはセメント質に塗布するための濃縮形態のテオブロミン）は、例えば、また限定なしに虫歯の予防し、歯の表面に無機成分を補給し、かつ象牙質知覚過敏症を治療するのを助けるために、それを必要としている人に局所的テオブロミン療法を施すことができる。上記剤形の調製は、当業界の普通の熟練者によく知られている。
【００４０】
好ましくはテオブロミンで強化された食品は、焼成食品および調合品（例えばパン）と、チューインガムと、朝食用シリアルと、チーズ製品と、ナッツおよびナッツ製品と、ゼラチン、プディング菓子、カスタード、およびフィリングと、冷凍乳製品と、乳製品（例えば、ミールリプレースメント飲料、ヨーグルト、ヨーグルト飲料）と、乳製品類似食品と、ハードキャンデート、ソフトキャンデーと、スープおよびスープミックスと、スナック食品と、飲料と、加工果汁と、フルーツスムージーと、粉末果実風味飲料と、加工野菜ジュースと、スポーツまたはアイソトニック飲料と、ミールリプレースメント飲料と、非ミルク系飲料（例えば豆乳）と、ミネラルウォーター（ビタミン強化された容器に入った飲料水）と、コーヒーと、茶と、油脂と、魚製品と、植物タンパク質製品と、家禽生産食品と、肉製品とを含めた群から選択され、より好ましくは焼成食品および調合品と、朝食用シリアルと、ゼラチン、プディング菓子、およびフィリングと、乳製品類似食品と、スープおよびスープミックスと、家禽生産食品と、ナッツおよびナッツ製品と、冷凍乳製品と、乳製品と、ソフトキャンデーと、植物タンパク質製品と、油脂とを含めた群から選択され、より好ましくはナッツおよびナッツ製品と、冷凍乳製品と、乳製品と、ソフトキャンデーと、植物タンパク質製品と、油脂とを含めた群から選択され、より好ましくはナッツおよびナッツ系製品と、乳製品と、ソフトキャンデーとを含めた群から選択される。さらなる要約を表２に示す。
【００４１】
【表２】
2019131608.tif 000005
【００４２】
この栄養補助食品は、好ましくは妊娠の三段階、すなわち妊娠前、妊娠、授乳／産後の間のうちの一段階または複数段階の間に投与される。好ましくはこの栄養補助食品は、妊娠前と妊娠の間、および授乳／産後の間に投与される。好ましくは母親の栄養補助食品は、妊娠前の間、妊娠の間、および授乳／産後の間に投与される。好ましくは母親の栄養補助食品は、授乳／産後の間に投与される。
【００４３】
本発明の別の実施形態によればテオブロミンを含む外科手術用の骨欠損部充填製品が提供される。より具体的にはその外科手術用の骨欠損部充填製品は、テオブロミンおよび自家骨移植片を含む。この外科手術用の骨欠損部充填製品はさらにゼラチンを含むことができ、そのゼラチンはその組成物の凍結乾燥によって架橋されて固体組成物を形成し、後で水を加えて元に戻して骨欠損領域に施用する。この外科手術用の骨欠損部充填製品は成形された骨インプラントであることができ、それは不定の漠然とした形態または形像とは対照的に、予め決められたまたは一定の形態または形像を意味し、例を挙げると楔形、円柱、円盤、板、シート、管などの特徴を示すはずである。この外科手術用の骨欠損部充填製品は、部分的に鉱質除去された骨材料（例えば、約３〜約１０％、好ましくは４〜６％の間の範囲にある残留カルシウム含量を有する）を含むことができる。好適な鉱質除去された骨材料の製造方法は当業界の普通の熟練者に知られており、例えば国際公開第２００７
／１３３７２２号パンフレット（本明細書中で参照により援用される）中で考察されている。
【００４４】
本発明の別の実施形態によれば、骨欠損部位に施用してその部位で新しい骨成長を促進させるための滅菌された展性のある骨組成物が提供される。この組成物は、テオブロミンと、粒径が約２５０〜約７５０μｍの範囲にある鉱質除去された骨成形骨粉末とを含む。別の実施形態では組成物は、テオブロミンと、粒径が約０．１〜約５ｍｍ、約０．１〜約４ｍｍ、約０．１〜約３ｍｍ、約０．１〜約２ｍｍ、および約０．１〜約１ｍｍの範囲にある鉱質除去された骨成形骨粉末とを含む。
【実施例】
【００４５】
実施例１：胎児の頭蓋冠細胞
胎児の頭蓋冠細胞を、Ｄ−ＭＥＭを使用し、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給された２４ウェル培養皿中で培養した。細胞を、様々な濃度（０．１、１．０、１０、２０、４０、６０、および１００μＭ）のテオブロミンを含む培地、およびテオブロミンなしの培地（対照）中で９６時間培養し、次いで培養後にトリパンブルー色素排除法を使用して数を数えた。結果を下記に表３中で示す。
【００４６】
【表３】
2019131608.tif 000006
【００４７】
表３のデータは、１．０〜２０μＭの間のテオブロミン濃度での細胞増殖のわずかな増加を示す。
【００４８】
実施例２：骨芽様細胞（ＵＭＲ  １０６−０１）
ＵＭＲ  １０６−０１ラットの骨芽様細胞を、Ｄ−ＭＥＭを使用し、１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給された２４ウェル培養皿中で培養した。細胞を、様々な濃度（０．００２７、０．０２７、０．２７、２．７、２７、および２７０μＭ）のテオブロミンを有する培地、およびテオブロミンなしの培地（対照）中で９６時間培養し、次いで培養後にトリパンブルー色素排除法を使用して数を数えた。結果を表４中に示す。スチューデントのｔ検定を使用して統計分析を行った。５％未満のｐ値を統計的に有意と見なした。
【００４９】
【表４】
2019131608.tif 000007
【００５０】
表４のデータは、０．０２７〜２７０μＭの間のテオブロミン濃度において骨芽様細胞の増殖の有意な増加を示している。これらの結果は、カフェイン（１，３，７−トリメチルキサンチン、これはテオブロミンよりも１個多いメチル基を１位に有する）が細胞の増殖を阻害することを実証した従来技術の結果（Ｋａｍａｇａｔａ−Ｋｉｙｏｕｒａ，Ｙ．，Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｃｈｅｕｋ，Ｇ．，Ｙａｚｄａｎｉ，Ｍ．，Ｓａｌｚｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｎａｋａｍｏｔｏ，Ｔ．の論文「骨芽様細胞（ＵＭＲ  １０６−０１）の増殖に与えるカフェインとプロスタグランジンＥ２の複合効果（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｆｆｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ（ＵＳＲ  １０６−０１））」Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．１９９９；７０：２８３〜２８８）とは対照的である。
【００５１】
実施例３：齧歯動物の実験計画
動物：妊娠した１０匹のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに発注し、妊娠が確認され次第すぐに出荷された（１日目）。
【００５２】
出生前：７日目を始期とし、テオブロミン（Ｔｈｂ）粉末を含む特別に調製した食物を実験群（５匹の雌のラット）に、またＴｈｂを含まない食物を対照群（５匹の雌のラット）に与えた。Ｔｈｂ用量は、飼料中に体質量１００ｇ当たり約１ｍｇであった。妊娠および授乳している動物の秤量を絶えず続ける必要がないようにするために妊娠の間の平均体重および平均飼料摂取量を近似させた。近似は、研究スポンサーの従来の経験、Ｈａｒｌａｎ研究所からのデータ、およびＫｅｅｎａｎ等の論文「Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの生存に及ぼす飼料過給と食餌制限の影響および老化の早期病変バイオマーカー（Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｓｐａｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ）」Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９４；２２：３００）からのデータに基づいた。体質量１００ｇ当たりＴｈｂ約１ｍｇを達成するために試験用食物は、１ｋｇの粉末状食物とよく混ぜた１１３ｍｇの微粉砕Ｔｈｂ粉末からなった。出産は、２２日目の午後または２３日目の早朝に起こると予想された。出生後のテオブロミン用量は、出生後１〜１４日については８８ｍｇ／ｋｇ、出生後１４〜２２日については５９ｍｇ／ｋｇであった。離乳後、テオブロミンは仔の食物に、出生後２２〜２９日については８９ｍｇ／ｋｇ、出生後２９〜５０日については４２ｍｇ／ｋｇが加えられた。食物中のこれらの濃度は、総食餌摂取量を基準にして体重１００ｇ当たり１日当たり約１ｍｇのテオブロミンを
与えるように計算された。雌の仔のみをデータ取得用に使用した。雄の仔は、致死注射によって人道的に安楽死させるか、別の実験計画に移された。幾つかの例では雄は乳獣産仔数を正規化するために使用された。
【００５３】
出生後：群当たり１６匹の雌の仔が分析用に必要とされたが、最高４０匹までを産仔数の平準化の理由から利用した。授乳の間に母親から導入される変動をできるだけ少なくするために各同腹の仔から得られる雌の同数の新生児をランダム化し、母親のそれぞれに再配分した。適切な食物（Ｔｈｂまたは対照）が出産後の母親に連続的に与えられた。したがってＴｈｂを与えられる母親は授乳期間の間ずっと授乳する仔に乳汁を介してＴｈｂを与えた。子孫および母獣の識別を保つために仔に尾の入れ墨または耳パンチにより印を付けた。
【００５４】
離乳：仔を出生後２２日に離乳し、その時それらは自立した。実験群は、上記のように５０日目まで連続的に食物中でテオブロミンを与えられた。
【００５５】
安楽死：出生後５０日に各群の仔の半分を、ペントバルビタールの腹腔内注射（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＣＯ2吸入、またはイソフルレンの吸入過量投与によって人道的に安楽死
させた。これらの方法は、アメリカ獣医学会のガイドラインの下で容認できる。死を確認した直後に、無傷の大腿骨頭を有する左の後肢を骨盤から切り裂き、生体力学的試験のためにリン酸で緩衝したホルマリン中に入れた。骨鉗子を用いて右の大腿骨を関節丘で切断し、その髄を、２％ウシ血清と共にペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンＢを含有するアルファ最少必須培地（α−ＭＥＭ）中へ流した。骨髄細胞は、滅菌培地中の湿氷上で保存され、分析のためにクーリエ便により再生医療研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）へ発送された。
【００５６】
実施例４：ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）実験計画
テオブロミン（Ｔｈｂ）：Ｔｈｂは、６０℃で１５分間温めてから２５００ｇで１５分間の遠心分離によって水上で１００×−１０００×分割量として調製した。Ｔｈｂの水溶解度は原液の創出のために必要とされる濃度ではしばしば不完全かつ不安定なために、２６０ｎｍにおける分光測定を使用して原液濃度を確認した。温めると５０ｍＬの水中に約５００ｍｇを可溶化することができ、それはメルクインデックスで公表されている溶解度に近い。４℃での貯蔵は溶解度を実質的に下げ、それぞれの培地補充において再可溶化を余儀なくすることが分かった。
【００５７】
最初に、０、１、および１０μｍｏｌ／ｍＬ（０．１８０〜１．８０μｇ／ｍＬ）のテオブロミン（Ｔｈｂ）を、１０ｍＭ  ＮＨ4ＯＨからなるキャリア中でのｈＭＳＣ分化ア
ッセイにおいて使用した。現行のアッセイの場合、細胞は１〜５００μｍｏｌ／ｍＬ（０．１８〜９０μｇ／ｍＬ）で試験される。これらの濃度を達成するために必要なこのキャリア（ＮＨ4ＯＨ）の量は培養物のｐＨには影響を与えなかったが、骨成形分化を実質上
阻害した。したがって、Ｔｈｂの水溶解度はアルカリ性キャリアの約半分であるが、ｈＭＳＣ培養物に加えることができる水の量ははるかに高いので水をキャリアとして使用した。
【００５８】
Ｔｈｂの水溶液は、使用濃度に希釈するまでは不安定である。Ｈ2Ｏ中のＴｈｂの吸光
係数を２６０ｎｍにおいて計算し、加温の後に原液を調べて細胞に加えられた量を確認した。この実験計画に関しては、最高１００μｇ／ｍＬが培地に加えられた。
【００５９】
全般的ＭＳＣ実験計画：ｈＭＳＣについて骨髄細胞は、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の認可に従って、ルイジアナ州ニューオーリンズのＴｕｌａｎｅ成体幹細胞配給施設（Ｔｕｌａｎｅ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅ
ｌｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって回収され、供給された。有核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用する不連続的密度勾配遠心分離によって骨髄から回収した。可塑付着性（ｐｌａｓｔｉｃ  ａｄｈｅｒｅｎｔ）有核細胞を、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ）を含有するα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養することにより吸引液から分離した。１４日間培養した後に付着性細胞を、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）と共に３７℃で５〜７分間インキュベートすることによって単分子層から回収し、細胞１００個／ｃｍ2の密度で再度平板培養した。細胞は２〜３日ごとに培地を変えることにより培
養された。半集密状態において１０7個の細胞が、α−ＭＥＭ、５０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ
、および２％ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含有する１０個の１ｍＬ分割量中で−１８０℃にて凍結された。
【００６０】
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）およびオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）アッセイ：５ｍＭグリセロリン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸を補給される完全培地の添加により６〜２４ウェルプレート中の集密単分子層上で骨芽細胞形成を誘導した。必要に応じてこれら条件にＴｈｂが加えられた。培地は４８時間ごとに変えた。５〜１０日の後、単分子層中のＡＬＰ活性を次のように測定した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで１００ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ2（ＡＬＰ緩衝液）を含有する１
００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）で洗浄した。洗浄後、ウェルにパラ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ：Ｆｉｓｈｅｒ）とＡＬＰ緩衝液の１：２溶液１．５ｍＬを加えて、ウェルの底とメニスカスの間に５ｍｍの経路の長さを作り出した。ｐＮＰＰ代謝の関数としてのＡＬＰ活性（△ＯＤ４０５／分）を、温度制御自動プレートリーダー（ＦｌｕｏＳｔａｒ，ＢＭＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して測定した。その速度を、既知の濃度のＡＬＰを有する基準と比較し、細胞数に対して正規化した。ＯＰＧ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得た抗体セット）を、これらのアッセイから得られる馴化培地上で行った。
【００６１】
細胞数：細胞をトリプシン処理によって回収し、次いでウェル当たりの細胞数を核酸蛍光取込みアッセイ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって測定した。細胞を２ｘ  ＣｙＱｕａｎｔ染料溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に加えた。核酸挿入で誘発される蛍光を、４８０ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光に設定したマイクロプレート蛍光リーダー（ＦＬＸ８００，ＢｉｏＴｅｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して測定した。この蛍光の程度は、既知の基準と比較した場合、細胞数に正比例した。
【００６２】
トランスクリプトーム分析：１×１０6個の細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット
（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ，Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を使用して単離し、二本鎖ｃＤＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ）の合成に使用した。ビオチン標識ｃＲＮＡ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｃｒｉｐｉｏｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を転写し、次いで浄化（ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）し、断片化し、ＨＧ−Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上でハイブリッド形成させた。洗浄後、マイクロアレイチップをスプレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｉｎｖｉｓｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ビオチン化した抗スプレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で増幅し、スプレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、次いでＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．０（ＧＣＯＳ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してスキャンした（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。データをｄＣｈｉｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。発現レベル（アレイスキャンからの任意の濃度測定値の関数としての）を使用して上向き調節遺伝子（少なくとも２倍）のリストを作り出した。上向き調節遺伝子のリストを使用して組織の発現を調べ、またＤＡＶＩＤウェブサイト上で遺伝子オントロジーデータベースをアメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ＮＩＨ（ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖで利用できる）によって実行した。組織発現分析に関してそのデータベースは、或る組織中で高度に発現する遺伝子のクラスターからなる（これはアメリカ、ヨーロッパ、および日本からのすべてのヒト遺伝子／発現データを一つにまとめたものに源を発する）。群のサイズは実質上変わり（例えば、脳の群は骨の群よりも１０倍長い）、したがって各リストと一致する遺伝子の絶対数ではなくリストの比率によって濃縮度を得点する。次いでこのデータベースはｐ値を指定する。ｐ値は、実験遺伝子リスト（例えば、Ｔｈｂで処理したｈＭＳＣ）が、完全に偶然のせいで組織特異的遺伝子の或る比率を有する確率を表す。このようなｐ値は、その過程が数百または数千さえもの転写を伴うためにかなり小さくなる。
【００６３】
ｈＭＳＣに対する予備的生化学アッセイ：用量および処理期間を定めるために、ｈＭＳＣの集密クラスター（２ドナー）を、様々な用量のＴｈｂの存在下で骨成形栄養補助食品に曝した。５〜１０日後、ＡＬＰ活性またはＯＰＧ分泌の測定を単分子層上で行った。その早期骨成形マーカーは、１００μＭ  Ｔｈｂで最大効果に達する用量依存的二相性のやり方でＴｈｂによって上向き制御された（図１Ａおよび１Ｂ）。増加の大きさは４日後に検出できたが、曝露の８日後に最も大きかった（データは示されない）。高用量ではまた、わずかな細胞喪失が明らかに認められたが、大部分のケースでは取るに足らなかった（図１Ｃ）。骨成形マーカーの発現に及ぼすＴｈｂの影響をさらに調べるために、またマイクロアレイ分析のための用量に決着をつけるために３人の追加のドナーをアッセイした。以前に観察されたようにＡＬＰ活性の増加は、細胞を１０〜１００μＭ  Ｔｈｂで８日間処理した場合に明らかに認められた（図２）。
【００６４】
Ｔｈｂ処理ｈＭＳＣに対するマイクロアレイ分析：ｈＭＳＣの大規模な培養物を調製し、上記ＡＬＰおよびＯＰＧアッセイについて使用したものと同一の条件において０、２５、５０、および１００μＭ  Ｔｈｂに８日間曝した。全ＲＮＡを培養物から抽出し、マイクロアレイ分析にかけた。０対２５μＭ  Ｔｈｂ、０対５０μＭ  Ｔｈｂ、０対１００μＭ  Ｔｈｂのトランスクリプトーム比較を各ドナーに対して行った。対照と比較した場合に２倍を超える上向き調節を有する遺伝子をリストアップした。データを調べると多少のドナー間変動は存在したが、用量はリスト中で遺伝子の同一性の変動ではなく倍率変化の変動を引き起こすに過ぎないことは明らかであった。用量応答効果から、そのデータが健全であることが確認された。Ｔｈｂの用量がリスト中の遺伝子の同一性に影響を与えなかったことからして、０対５０μＭ  Ｔｈｂ遺伝子リストをデータベースの調査に使用した。
【００６５】
第一の一連の分析は、「Ｔｈｂに曝されたｈＭＳＣにおいて骨成形に一般に関係している遺伝子の統計的に有意な上向き調節は存在するか？」という前提に対処するように設計された。この目的のために上向き調節された遺伝子のリストを、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）、ＮＩＨ（ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖで利用できる）によって維持されているＤａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （ＤＡＶＩＤ）ｖ６．７  ｄａｔａｂａｓｅ  ｈａｎｄｌｅｒを使用して組織発現データベースと比較した。試験された２人のドナーの場合、「骨遺伝子」濃縮は、統計的に
有意な組織発現の痕跡の上部３．５％中に存在し（図３のドナー２８１および図４のドナー７０２３）、これはリスト上で一番目および二番目を表す。ドナー７０５７の場合、骨の痕跡はリストの上部９％中に存在するが、そのリスト全体はずっと長かった。各ｈＭＳＣ調製物のリストのサイズの変動は、様々な細胞系が様々な可塑度を示すことを表し、最大多能性細胞ではＴｈｂの影響は多面的であるように思われる（例えば７０５７において）のに対し、あまり多能性でないｈＭＳＣでは骨ははるかに好ましい経路である（例えばドナー２８１および７０２３）。様々なドナーからのｈＭＳＣは、ドナーの年齢、性別、増大度、培養条件などに応じてドナー依存性の変動を示すので、これは全く正常である。それにもかかわらず著しく多能性のｈＭＳＣ系においてさえ、骨はリスト上で高い。
【００６６】
可能性のある作用機構を調べるために、次にＴｈｂで上向き調節された遺伝子のリストを使用してシグナル伝達経路データベースをプローブし、Ｔｈｂが選択的な分子作用様式を有するかどうかを試験した。該当項目はほとんどなく、これはＴｈｂが新規な経路によりその作用を変換する可能性があることを示唆する。それにもかかわらず細胞外マトリックスシグナル経路および接着斑シグナル経路は、ドナー２８１および７０２３（高度に有意な骨芽細胞の痕跡を有するもの）中に顕著に表れている。ＥＣＭ相互作用および接着斑シグナルは、一般にはＰＩ３キナーゼによりコラーゲン−インテグリンが介在する経路を通って伝えられる（図７および８参照）。したがってＴｈｂは、コラーゲン、インテグリン、およびＰＩ３キナーゼのシグナルの上向き調節によりフィードフォワードループを生じさせる可能性がある。
【００６７】
実施例５：テオブロミンに曝されたラットからの大腿骨
実施例３から得られた大腿骨の機械的性質は、Ｂｅａｒｙ（Ｂｅａｒｙ  ＤＦ．の論文「ラットの大腿骨の機械的性質に与えるフッ化物および低カルシウムの影響（Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ
ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｆｅｍｕｒ）」Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１９６９；１６４：３０５〜３１６）が述べている実験計画を使用してテキサス大学で検討された。しかしながらＢｅａｒｙの研究に比べてこれら測定値は、測定装置に取り付けられたコンピュータにより自動的に計算された。
【００６８】
手短に言えばインストロン型万能試験装置を使用して実施例３の大腿骨を強度および可撓性について試験した。骨幹が中間点で前側に装着されるように大腿骨用の特殊な金属保持装置が使用された。荷重Ｆを前側の表面のそれらの支持体の中間に加えた。弾性限界の荷重、最大荷重、および破壊点の荷重をｘ軸上で測定し、またこれらの荷重における撓み量をｙ軸上で測定した。この機械的性質の検討において、測定を行うために使用した各試験片の部分の長さは、すべての場合に同じ１５ｍｍであることに留意されたい。この長さは、試験片の各端部にある２個の支持体間の距離によって画定され、したがって試験片は中心を荷重下で置かれ、破壊するまで曲げられる。これは、三点曲げ測定と呼ばれ、横強度の結果をもたらす。それは撓み強さとして知られる。ＵＴＳ＝最高横強度。テオブロミン処理ラットの大腿骨からのデータを表５．１および５．２に示し、一方、その検討パラメータを表５．３および５．４に示す。対照ラットの大腿骨からのデータを表６．１および６．２に示し、一方、その検討パラメータを表６．３および６．４に示す。
【００６９】
【表５】
2019131608.tif 000008
【００７０】
【表６】
2019131608.tif 000009
【００７１】
【表７】
2019131608.tif 000010
【００７２】
【表８】
2019131608.tif 000011
【００７３】
【表９】
2019131608.tif 000012
【００７４】
【表１０】
2019131608.tif 000013
【００７５】
【表１１】
2019131608.tif 000014
【００７６】
【表１２】
2019131608.tif 000015
【００７７】
表５．１、５．２、６．１、および６．２のデータが示すように、試料の幅および厚さは、対照に比べてテオブロミン群では顕著に大きかった。大腿骨の長さもまた、対照に比べてテオブロミン群では顕著に大きかった。
【００７８】
テオブロミン群のＵ横強度（曲げ、６２．４２５２ＭＰａ）は、対照群（６８．３４５４ＭＰａ）よりも顕著に小さかった。
【００７９】
テオブロミン群の弾性（剛性／不撓性、３１６１．３６）は、対照群のそれ（３５３６．８５６）と顕著には違わなかった。この結果は、処理群の平均断面が対照群のそれよりも数値的に大きいせいである可能性がある（断面は、幅および厚さの測定値によって示される）。結果として処理群の骨を破壊するには対照群の骨に比べて数値的により大きな量のエネルギーが必要とされた。すなわち処理群における破壊エネルギーが２８．５１６であるのに対し、対照は２５．２３８であった。強度および弾性係数はその断面積で測定され、したがってこれらは正規化された値である。
【００８０】
テオブロミン処理が骨の断面をより大きくしたが、本質的に強くないのであれば、それはより小さい（断面が）対照の骨よりもより大きい（断面が）処理された骨を破壊するのにより大きな荷重（ピーク荷重によって測定される）を要するはずである。しかし、より大きなピーク荷重をより大きな断面積で除算することは、処理群においてその弾性および強度をより小さくする（しかし統計学的には違わない）。処理群のピーク荷重が６５．３３であったのに対し、対照群は６３．１４であった。
【００８１】
処理群の骨を破壊するためにより大きな荷重（より高いピーク荷重）が必要とされることによって示されるように、処理群では破壊抵抗がより大きくなる傾向がある。したがってデータは、テオブロミン処理ラットからの大腿骨が対照ラットの大腿骨よりも反発弾性がある、すなわちより丈夫であることを示している。
【００８２】
図９Ａは、実施例３の検討におけるラットの仔の示されている日数での体重（ｇ）を示す。３つの最右列の柱はテオブロミン処理ラットの経時的な体重を示し、一方、３つの最左列の柱は対照ラットの経時的な体重を示す。
【００８３】
図９Ｂは、実施例３の検討におけるラットの仔の４０日目の体重（ｇ）を示す。４０日目でテオブロミン群の体重は、対照群よりも顕著に大きかった。４７日目（データは示されない）ではテオブロミン群の平均体重は約１７１ｇであるのに対し、対照群の場合、平均体重は約１６０ｇであった。
【００８４】
図９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、および９Ｈは、高分解能マイクロコンピュータ支援断層撮影を使用して骨質を評価することによって得られた。
【００８５】
図９Ｃは、実施例３からのラットの仔の近位脛骨から得られたデータを示し、これは対照およびテオブロミン処理ラットの梁の数を実例で示す。これらのデータは骨の形成を反映しており、対照と比べてテオブロミン処理ラットの顕著に多量の骨の形成を実例で示している。
【００８６】
図９Ｄは、実施例３からのラットの仔の近位脛骨から得られたデータを示し、これは梁骨の間隔を実例で示す。対照群と比べてテオブロミン処理群では梁骨間の間隔が顕著に小さいことが観察され、これはテオブロミン処理ラットでは梁骨の形成がより大きいことを示唆している。これは、テオブロミンを与えることによる造骨のきわめて重要な側面である。
【００８７】
図９Ｅは、実施例３からのラットの仔の近位脛骨から得られたデータを示し、これは梁骨の厚さを実例で示している。テオブロミン処理群と対照群の間で顕著な違いは観察されなかったが、これらのデータは硬組織内の密度が異なるかどうかを表していない。
【００８８】
図９Ｆは、実施例３からのラットの仔の近位脛骨から得られたデータを示し、これは梁骨の体積％を実例で示している。テオブロミン処理群と対照群の間の違いは統計的に有意ではないが、テオブロミン処理群は対照群よりもわずかに高かった。
【００８９】
図９Ｇは、実施例３からのラットの仔の大腿骨から得られたデータを示し、これは各大腿骨の中央骨幹の骨面積を実例で示している。テオブロミン処理群からの大腿骨の梁骨面積は、対照群の梁骨面積よりも顕著に大きかった（太い骨を表している）。
【００９０】
図９Ｈは、実施例３からのラットの仔の近位脛骨から得られたデータを示し、これは梁骨面積を実例で示している。テオブロミン処理ラットの近位脛骨の梁骨面積は、対照群の梁骨面積よりも顕著に大きかった（太い骨を表している）。
【００９１】
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ、９Ｇ、および９Ｈのデータは、成長の間のテオブロミンの摂取が経時的な体重（図９Ａおよび９Ｂ）を増加させ、全体的な造骨（図９Ｃ）、特に梁骨形成（図９Ｄ）を向上させ、また骨面積（図９Ｇおよび９Ｈ）を増大させる。
【００９２】
本明細書中で引用したすべての参考文献は、あたかも各参考文献が具体的かつ個々に指し示されて参照により組み込まれているかのように本明細書中に参照により組み込まれる。いずれの参考文献の引用も出願日前のその開示についてのものであり、本開示が先行発明を理由としてそのような参考文献に先行する資格がないと認めたものと解釈されるべきではない。
【００９３】
上記の要素のそれぞれが、あるいは２つ以上が一緒になって、上記で述べた型とは異なる他の型の方法において有用な用途を見出すことができることもまた理解されたい。さらなる分析なしに、前に述べたことは本開示の主旨を完全に明らかにしているはずであるので、ほかの人達は、添付の特許請求の範囲の中で述べる本開示の包括的または具体的な態
様の本質的な特徴を、従来技術の観点から適正に構成する主要事項を省略することなく現行の知識を適用することによって容易にそれを様々な用途に適合させることができる。前に述べた実施形態は、例として提示されるに過ぎず、本開示の範囲は別添の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる。
【図１Ａ−Ｃ】
2019131608.tif 000016
【図２Ａ−Ｂ】
2019131608.tif 000017
【図３】
2019131608.tif 000018
【図４】
2019131608.tif 000019
【図５】
2019131608.tif 000020
【図６】
2019131608.tif 000021
【図７】
2019131608.tif 000022
【図８】
2019131608.tif 000023
【図９Ａ−Ｄ】
2019131608.tif 000024
【図９Ｅ−Ｈ】
2019131608.tif 000025
【図１０】
2019131608.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月16日(2019.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）２５０μｍ〜５ｍｍの粒径を有する鉱物質を除いた骨成形骨粉末と、
ｂ）テオブロミン、テオブロミンの塩または複塩、あるいはテオブロミンを含む共結晶と
を含む組成物。
【請求項２】
骨部位に施用して前記部位で新しい骨の成長を促進させるための医薬組成物の調製のための請求項１に記載の組成物の使用法。
【外国語明細書】
2019131608000001.pdf