(57)【要約】      （修正有）【課題】高精度でMLH1メチル化群を判定することが可能な新たなマーカー、方法、及びキット等の提供。【解決手段】MutL homolog 1（MLH1）メチル化群判定用マーカーであって、以下の（i）〜（iii）：（i）特定の配列で示される塩基配列を含む核酸分子、（ii）特定の配列において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む核酸分子、及び（iii）1以上のCpG配列を含む、（i）又は（ii）の核酸分子の断片のいずれかからなる、前記マーカー。前記マーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出する工程を含む、ＭＬＨ1メチル化群に属するか否かを判定するための方法、およびキット。【選択図】図１
2019135928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MutL homolog 1（MLH1）メチル化群判定用マーカーであって、以下の（i）〜（iii）：
（i）配列番号1で示される塩基配列を含む核酸分子、
（ii）配列番号1において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む核酸分子、及び
（iii）1以上のCpG配列を含む、（i）又は（ii）の核酸分子の断片
のいずれかからなる、前記マーカー。
【請求項２】
被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法であって、
被験体から得られたゲノムDNA又は遊離DNAにおいて、請求項１に記載されたマーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出する検出工程、及び
検出工程においてメチル化が検出された場合に、被験体がMLH1メチル化群に属すると判定する判定工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記検出工程において、配列番号1の1位、38位、47位、95位、122位、133位、148位、217位、305位、340位、371位、398位、425位、466位、476位、513位、515位、528位、530位、536位、548位、590位、及び663位からなる群から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程において、配列番号1の7位、95位、97位、103位、340位、403位、405位、481位、513位、515位、528位、530位、548位、567位、及び593位からなる群から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程において、配列番号1の340位又は548位から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程が、メチル化感受性制限酵素切断法、メチル化アレイ、バイサルファイト法、又はメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用した方法により行われる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化感受性制限酵素切断法が、ＰＣＲを利用して行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体が、大腸癌、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群における皮脂腺腫及び角化棘細胞腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群から選択されるがんを患っているか、又はそのリスクがある、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記大腸癌が、高頻度マイクロサテライト不安定性大腸癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノムDNA又は遊離DNAが、生検組織、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）サンプル、血液、及び体液からなる群から選択されるサンプルから得られる、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載されたマーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出することが可能なMLH1メチル化群判定用キットであって、CpG配列を含む配列を切断可能なメチル化感受性制限酵素、前記マーカーの全部または一部を増幅可能なプライマーセット、及び前記マーカーの全部または一部を検出可能なプローブ又は抗体、の少なくとも1つを含む、前記キット。
【請求項１２】
前記メチル化感受性制限酵素が、Sma I、Ehe I、Hin 6I、Hpa II、Acc II、及びHae II、並びにこれらの酵素のメチル化感受性アイソシゾマー（isoschizomer)からなる群から選択される、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MLH1メチル化群判定用マーカー、被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法、及びMLH1メチル化群判定用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸は、ヒトにおいて約1.6mの長さを有する消化管であり、盲腸、直腸、及び結腸の3つの部位に大別される。大腸は、細菌による食物繊維の発酵及び水分の吸収等の機能を担う重要な器官である。日本において大腸癌の患者数は近年増加傾向にあり、2014年時点で大腸癌の患者数は約25万人以上であると推定されており、死亡者数も多いことから大腸癌の迅速かつ正確な検出法、及び効果的な治療方法が切望されている。
【０００３】
大腸癌のうち約10%が、マイクロサテライトの反復配列に変異が生じている高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）大腸癌に分類される。そして、MSI-H大腸癌は、さらに以下の3つのサブタイプ：（1）MLH1（mutL homolog 1）遺伝子の発現がエピジェネティックに抑制されている群（MLH1メチル化群）、（2）遺伝性の疾患であり、MMR（mismatch repair:ミスマッチリペア）遺伝子の生殖細胞系列に機能喪失型変異を有するLS（Lynch syndrome：リンチ症候群）、及び（3）上記（1）及び（2）のいずれにも属さないLL（Lynch-like：リンチ様）に分類することができる。上記3つのサブタイプは、その原因も治療標的も異なることから、その判定方法が見いだせれば、大腸癌の診断や治療に役立ち得る。また、MLH1メチル化群は、大腸癌以外の癌においても見出され得ることから（例えば、胃癌について非特許文献1、子宮体癌について非特許文献2〜4）、その判定方法を見いだせれば、これらの癌の診断や治療にも役立ち得る。
【０００４】
また、薬剤によっては「MSI-H又はミスマッチ修復機構の欠損(deficient mismatch repair、dMMR)のある進行固形癌」を対象とするものもあるが、このような薬剤を用いる場合、MSI-Hであるか否か不明である場合においては、ミスマッチ修復機構の欠損があるか否かを検討しなければならない。MLH1メチル化はミスマッチ修復機構の欠損の一因となるためその判定方法を見いだせれば、このような薬剤の有効性の判断にも役立ち得る。
【０００５】
非特許文献5には、MLH1遺伝子の上流に存在するEPM2AIP1遺伝子上の領域であるhg38のS: chr3:36,992,827-36,992,855及びAS: chr3:36,992,927-36,992,950の領域（以下、「Herman領域」と記載する）のメチル化が、MLH1メチル化群を特定するのに有効であると記載されている。非特許文献5では、Herman領域で調べた21例のマイクロサテライト安定性(MSS)腫瘍のうち19例は非メチル化群と判定され正しかったが、2例は偽陽性としてMLH1メチル化群に分類されており、判定精度の点で問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】The Cancer Genome Atlas Research Network, Nature, 513, 202-209, 2014
【非特許文献２】D. Scott McMeekin et al., Journal of Clinical Oncology, 34(25):3062-3068,2016
【非特許文献３】Broaddus RR et al., Cancer, 106(1):87-94, 2006
【非特許文献４】House RJ et al., Nature Medicine, 22(11):1342-1350, 2016
【非特許文献５】Herman JG. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 6870-6875, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、非特許文献5で記載された領域は、MLH1メチル化群を判定する精度の点で問題があり、癌の診断や治療のために、さらに高精度なマーカーを提供することが有効である。本発明は、高精度でMLH1メチル化群を判定することが可能な新たなマーカー、方法、及びキット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、メチル化アレイ解析の結果に基づいて、hg38のchr3:36,993,202-36,993,865（配列番号1の塩基配列からなる核酸分子）が、MLH1メチル化群を高精度で判定できるマーカーとして有用であることを見出し、本願発明を完成させた。
【０００９】
したがって、本願発明は、以下の態様を包含する。
（１）MutL homolog 1（MLH1）メチル化群判定用マーカーであって、以下の（i）〜（iii）：
（i）配列番号1で示される塩基配列を含む核酸分子、
（ii）配列番号1において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む核酸分子、及び
（iii）1以上のCpG配列を含む、（i）又は（ii）の核酸分子の断片
のいずれかからなる、前記マーカー。
（２）被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法であって、
被験体から得られたゲノムDNA又は遊離DNAにおいて、（１）に記載されたマーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出する検出工程、及び
検出工程においてメチル化が検出された場合に、被験体がMLH1メチル化群に属すると判定する判定工程
を含む、前記方法。
（３）前記検出工程において、配列番号1の1位、38位、47位、95位、122位、133位、148位、217位、305位、340位、371位、398位、425位、466位、476位、513位、515位、528位、530位、536位、548位、590位、及び663位からなる群から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、（２）に記載の方法。
（４）前記検出工程において、配列番号1の7位、95位、97位、103位、340位、403位、405位、481位、513位、515位、528位、530位、548位、567位、及び593位からなる群から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、（２）に記載の方法。
（５）前記検出工程において、配列番号1の340位又は548位から選択される1以上の位置のシトシンのメチル化を検出する、（４）に記載の方法。
（６）前記検出工程が、メチル化感受性制限酵素切断法、メチル化アレイ、バイサルファイト法、又はメチル化ＤＮＡ特異的結合蛋白質を利用した方法により行われる、（２）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記メチル化感受性制限酵素切断法が、ＰＣＲを利用して行われる、（６）に記載の方法。
（８）前記被験体が、大腸癌、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群における皮脂腺腫及び角化棘細胞腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群から選択されるがんを患っているか、又はそのリスクがある、（２）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記大腸癌が、高頻度マイクロサテライト不安定性大腸癌である、（８）に記載の方法。
（１０）ゲノムDNA又は遊離DNAが、生検組織、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）サンプル、血液、及び体液からなる群から選択されるサンプルから得られる、（２）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）（１）に記載されたマーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出することが可能なMLH1メチル化群判定用キットであって、CpG配列を含む配列を切断可能なメチル化感受性制限酵素、前記マーカーの全部または一部を増幅可能なプライマーセット、及び前記マーカーの全部または一部を検出可能なプローブ又は抗体、の少なくとも1つを含む、前記キット。
（１２）前記メチル化感受性制限酵素が、Sma I、Ehe I、Hin 6I、Hpa II、Acc II、及びHae II、並びにこれらの酵素のメチル化感受性アイソシゾマー（isoschizomer）からなる群から選択される、（１１）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、高精度でMLH1メチル化群を判定することが可能となる。大腸癌においてMLH1メチル化群、リンチ症候群、リンチ様の3つのサブタイプはその原因も治療標的も異なることから、本発明は、癌の診断や治療に役立ち得る。また、大腸癌以外の癌についてもMLH1メチル化群であることの判定は、癌の診断や治療に役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、chr3(hg38)における、Herman JG. et al（上掲）に記載されたMLH1メチル化群を特定するための領域（Herman領域）、及び本願の実施例1で特定した領域を示した模式図である。EPM2AIP1遺伝子及びMLH1遺伝子は、灰色のボックスで示した。EPM2AIP1遺伝子及びMLH1遺伝子の染色体上の位置は、NCBIデータベースに基づく。
【図２】図2は、メチル化アレイの結果（A）とメチル化感受性制限酵素を用いたメチル化の判定結果（B）の比較を示す。図2Aにおいて、縦軸はそれぞれ異なるサンプル（#1〜#13）を用いたことを示し、横軸はメチル化アレイにより解析されたメチル化部位を5'側から3'側に向かって示す。各パネルの色は、メチル化の程度を示し、色が濃い程β値（メチル化の程度）が高いことを意味する。また、NAについては斜線を付した。図2Aでは、Herman領域及び実施例1で特定した領域を点線で示した。図2Bは、図2Aのサンプルと同じサンプルを解析した結果を、図2Aと対応するように示したものである。すなわち、図2Bの電気泳動の結果は、上から順にサンプル#1〜#13に対応する。なお、最下段は水、下から二段目は、ネガティブコントロールであるDLD1（MLH1非メチル化群に属するMSH6変異大腸癌細胞株）、下から三段目は、ポジティブコントロールであるRKO（MLH1メチル化大腸癌細胞株）の結果を示す。BRAFはコントロールであり、メチル化MLH1のバンドが存在する場合、MLH1メチル化群であると判定することができる。図2Bの右側にメチル化感受性制限酵素を用いた際の判定結果を示している（+はMLH1メチル化群、−はMLH1非メチル化群を指す）。制限酵素を用いたMLH1メチル化群判定は、ゲノムワイドメチル化アレイによるMLH1メチル化群の判定結果を正確に反映していることがわかる（実施例1で特定した領域におけるパネルの色が濃いものについて+、実施例1で特定した領域におけるパネルの色が薄いか又はないものについて−と判定されている）。
【図３】図3は、凍結組織又はFFPEを用いた場合の、メチル化感受性制限酵素を用いたメチル化の判定結果を示す。1〜5は、FFPEと凍結組織で同様のサンプルを用いたことを示している。図3は、凍結組織とFFPEで同様の結果が得られていることが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜１．MLH1メチル化群判定用マーカー＞
一態様において、本発明は、MutL homolog 1（MLH1）メチル化群判定用マーカーに関する。
【００１３】
本明細書において、MLH1は、第三染色体に位置するMutL homolog 1を指す。MLH1は、ミスマッチリペアタンパク質の一種であり、リンチ症候群と関連することが知られている。
【００１４】
本明細書において、「MLH1メチル化群」とは、MLH1遺伝子のメチル化により、MLH1遺伝子の発現がエピジェネティックに抑制されている状態の群を指す。MLH1メチル化群は、がん、例えば大腸癌（例えば高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）大腸癌）に加えて、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌等の他のがんにおいても見出され得る。
【００１５】
本明細書において、「MSI-H大腸癌」とは、マイクロサテライトの反復配列に変異が生じている大腸癌を指し、BAT25又はBAT26、好ましくはBAT25及びBAT26の両方においてMSIを示す状態として定義される。MSI-H大腸癌は、大腸癌の約10%を占め、MLH1メチル化群、リンチ症候群、及びリンチ様の3つのサブタイプにさらに分類され得る。
【００１６】
本明細書において、「リンチ症候群」とは、生殖細胞系列において、ミスマッチ修復遺伝子のいずれか1つ以上に機能喪失型変異がある群を指す。ここで、ミスマッチ修復遺伝子とは、MLH1、MSH2（MutS protein homolog 2）、MSH6（MutS protein homolog 6）、及びPMS2（PMS1 homolog 2）を指す。
【００１７】
本明細書において、「リンチ様」とは、MSI-H大腸癌のうち、MLH1の発現がエピジェネティックに抑制されておらず、かつリンチ症候群でもない群を指す。
【００１８】
本発明のMLH1メチル化群判定用マーカーは、（i）配列番号1で示される塩基配列を含む核酸分子、（ii）配列番号1において1若しくは複数個の塩基が付加、欠失、及び／若しくは置換された塩基配列を含む核酸分子、及び（iii）1以上のCpG配列を含む、（i）又は（ii）の核酸分子の断片のいずれかからなる。
【００１９】
配列番号1で示される塩基配列は、ヒトゲノムのhg38のchr3:36,993,202-36,993,865（hg19では37,034,693-37,035,356）の配列を指す。当該塩基配列を含む核酸分子は、MLH1メチル化群の同定に有効であり得る。
【００２０】
（i）の核酸分子は、配列番号1で示される塩基配列に加えて他の配列、例えばヒトゲノムに由来する1000塩基以下、500塩基以下、300塩基以下、又は100塩基以下の配列を含んでいてもよい。一実施形態において、（i）の核酸分子は、配列番号1で示される塩基配列から本質的になるか、又は配列番号1で示される塩基配列からなる。
【００２１】
上記（ii）の核酸分子における「１若しくは複数個」の範囲は、例えば1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、特に好ましくは1から3個、あるいは1個又は2個である。したがって、上記（ii）の核酸分子は、（i）の核酸分子の突然変異体及び一塩基多型（SNP）等を包含する。
【００２２】
上記（iii）の核酸分子の断片の長さは、MLH1メチル化群判定に用い得る限り、特に限定しない。例えば、（iii）の核酸分子の断片の長さは、10塩基以上、15塩基以上、20塩基以上、30塩基以上、40塩基以上、又は50塩基以上であってよく、また、600塩基以下、500塩基以下、400塩基以下、300塩基以下、200塩基以下、又は100塩基以下であってよい。（iii）の核酸分子の断片は、例えば被験体からゲノムDNA又は遊離DNAを抽出し、制限酵素又はヌクレアーゼ等により消化することにより得ることができる。
【００２３】
＜２．被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法＞
一態様において、本発明は、被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法に関する。本方法は、検出工程、及び判定工程を必須の工程として含む。また、本方法は、検出工程の前に、任意工程としてゲノムDNA又は遊離DNA抽出工程を含んでもよい。また、本方法は、判定工程の後に、任意工程として遺伝子変異検出工程を含んでもよい。本発明の方法を構成する各工程を以下に詳細に記載する。
【００２４】
（ゲノムDNA又は遊離DNA抽出工程）
ゲノムDNA又は遊離DNA抽出工程は、被験体からゲノムDNA又は遊離DNAを抽出する工程である。本明細書において、「被験体」とは、本発明の方法が適用される対象をいい、原則としてヒトである。一実施形態において、被験体は、がん（例えば固形癌）、例えば、大腸癌、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群における皮脂腺腫及び角化棘細胞腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群から選択されるがんを患っているか、又はそのリスクがある。被験体は、例えば大腸癌、特に高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-H）大腸癌を患っているか、又はそのリスクがある。被験体は、マイクロサテライト不安定性について、検査を行っていてもよいし、行っていなくてもよい。被験体がこれらの癌を患っているか、又はそのリスクがあるか否かは、当業者に知られる通常の方法、血液検査、画像診断、X線検査、MRI、内視鏡検査、及び病理検査等により調べることができる。
【００２５】
本明細書において、「遊離DNA」とは、血液及び／又は体液中に存在し得るDNAを指し、その例としてセルフリーDNA（cell free DNA、cfDNA）及び循環腫瘍DNA（circulating tumor DNA、ctDNA）が挙げられる。本明細書において、「血液」は、全血、血清、及び血漿のいずれも含むものとする。また、本明細書において、「体液」の例として、組織液及びリンパ液等が挙げられる。
【００２６】
本明細書において、ゲノムDNA又は遊離DNAを抽出するためのサンプルは限定しない。例えば、サンプルは、生検組織、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）サンプル、血液又は体液、細胞のいずれであってもよい。ゲノムDNAは、好ましくは生検組織又はFFPEサンプルに由来し、遊離DNAは、好ましくは担癌患者の血液又は体液等のサンプルに由来する。サンプルは、好ましくはがん（例えば固形癌）、例えば、大腸癌、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群における皮脂腺腫及び角化棘細胞腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群から選択されるがんに由来し、さらに好ましくは大腸癌の組織又は細胞に由来する。
【００２７】
ゲノムDNA及び遊離DNAの抽出方法は当業者に公知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法を参考にすればよい。具体的には、一般的なフェノールクロロフォルム抽出法や、ゲノムDNA又は遊離DNAの抽出が可能な市販のキット、例えばゲノムDNAではPureLink（登録商標） Genomic DNA（Thermo Fisher Scientific）、及びMag ExtractorTM-Genome-（TOYOBO）、遊離DNAではNucleoSnap（登録商標） DNA Plasma等の市販のキットを用いてDNAの抽出を行うことができる。抽出したDNAはそのまま、又は精製した後、以下の検出工程に用いることができる。
【００２８】
（検出工程）
検出工程では、被験体から得られたゲノムDNA又は遊離DNAにおいて、＜１．MLH1メチル化群判定用マーカー＞に記載のMLH1メチル化群判定用マーカーにおける1以上のシトシンのメチル化を検出する。
【００２９】
検出工程においてメチル化を検出するシトシンの位置は、配列番号1に示される塩基配列のCpG配列中のシトシンであれば特に限定しない。検出工程においてメチル化を検出するシトシンとして、配列番号1の塩基配列中の任意のCpGが挙げられ、メチル化を検出するシトシンの位置として、例えば配列番号1の塩基配列の1位、7位、38位、47位、61位、78位、85位、95位、97位、103位、122位、133位、148位、217位、240位、264位、272位、305位、320位、340位、351位、355位、371位、374位、382位、398位、403位、405位、408位、425位、466位、476位、481位、500位、508位、513位、515位、528位、530位、536位、548位、567位、580位、583位、590位、593位、605位、631位、638位、653位、及び663位のシトシンが挙げられる。メチル化を検出するシトシンの位置は、好ましくは配列番号1の1位、38位、47位、95位、122位、133位、148位、217位、305位、340位、371位、398位、425位、466位、476位、513位、515位、528位、530位、536位、548位、590位、及び663位である。これらの位置の1つにおいてメチル化シトシンを検出してもよいし、1以上、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、10以上又は全てにおいてメチル化シトシンを検出してもよい。
【００３０】
以下で記載する様に、メチル化感受性制限酵素を用いてメチル化シトシンを検出することが簡便であるため、特に好ましい。本明細書において、「メチル化感受性制限酵素」とは、CpG配列がメチル化された場合に消化が阻害される制限酵素を意味し、配列番号1で示される塩基配列中に含まれるCpG配列を認識し得るメチル化感受性制限酵素の例として、Sma I、Ehe I、及びHin 6I、Hpa II、Acc II、及びHae II、並びにこれらの酵素のメチル化感受性アイソシゾマー（isoschizomer）が挙げられる。上記メチル化感受性制限酵素により検出され得るメチル化シトシンの位置として、配列番号1の7位、95位、97位、103位、340位、403位、405位、481位、513位、515位、528位、530位、548位、567位、及び593位からなる群から選択される位置が挙げられる。これらの位置の1つにおいてメチル化シトシンを検出してもよいし、1以上、例えば2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、又は全てにおいてメチル化シトシンを検出してもよい。
【００３１】
検出工程で試験されるゲノムDNA又は遊離DNAは、生検組織、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）サンプル、血液、体液又は細胞から得られたものであってよい。ゲノムDNAは、好ましくはがん（例えば固形癌）、例えば、大腸癌、小腸癌、子宮体癌、卵巣癌、胃癌、腎盂・尿管癌、膵臓癌、胆道癌、脳腫瘍、Muir-Torre症候群における皮脂腺腫及び角化棘細胞腫、悪性黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、及び甲状腺癌からなる群から選択されるがんに由来し、さらに好ましくは大腸癌の組織又は細胞に由来する。ゲノムDNAは、好ましくは生検組織又はFFPEサンプルに由来し、遊離DNAは、好ましくは担癌患者の血液又は体液等のサンプルに由来する。
【００３２】
検出工程における検出方法は限定しないが、例えば、メチル化感受性制限酵素切断法、メチル化アレイ、バイサルファイト法、又はメチル化DNA特異的結合蛋白質を利用した方法により行うことができる。各方法について以下に詳細に説明する。
【００３３】
メチル化感受性制限酵素切断法は、簡便且つ短時間で検出でき、また安価であることから、特に好ましい。本明細書において、「メチル化感受性制限酵素切断法」とは、CpG配列がメチル化された場合に消化が阻害されるメチル化感受性制限酵素を用いてメチル化の有無を検出する方法である。メチル化感受性制限酵素切断法は、メチル化感受性制限酵素による切断を行った後に、PCRを利用して、又はプローブを用いて検出を行うことができる。例えば、PCRを利用する場合、被験体から得られたゲノムDNAに対してメチル化感受性制限酵素を作用させ、続いて、メチル化を検出する位置を含む核酸分子が増幅され得るプライマーを用いてPCRを行う。メチル化がなされている場合、CpG配列がメチル化感受性制限酵素で消化されないため、PCR増幅産物が得られ、メチル化がなされていない場合、CpG配列がメチル化感受性制限酵素で消化されるため、PCR増幅産物が得られない。PCR増幅産物の有無を電気泳動等により確かめることによって、メチル化の有無を検出することができる。配列番号1で示される塩基配列中に含まれるCpG配列を認識し得るメチル化感受性制限酵素の例として、Sma I、Ehe I、及びHin 6I、Hpa II、Acc II、及びHae II、並びにこれらの酵素のメチル化感受性アイソシゾマーが挙げられる。好ましくは、メチル化感受性制限酵素はSma I又はHin 6Iである。
【００３４】
「メチル化アレイ」は、マイクロアレイ解析を用いてDNAのメチル化度を調べる手法である。メチル化アレイには、メチル化感受性制限酵素を使用するMIAMI法や、抗メチル化シトシン抗体を用いたMeDIP法、及びバイサルファイトを用いたメチル化アレイ等がある。
【００３５】
「バイサルファイト法」では、バイサルファイトを用いてメチル化シトシンの検出を行う。バイサルファイト処理を行うと、非メチル化シトシンはウラシルに変換されるのに対し、メチル化シトシンはウラシルに変換されないため、これによりメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別することができるが、サンプル量が限られている場合においてはバイサルファイト処理工程におけるDNAの損失がしばしば問題となる。バイサルファイト法の例として、バイサルファイトシーケンシング、パイロシーケンス、メチル化特異的PCR、及びメチル化特異的リアルタイムPCR等が挙げられる。
【００３６】
バイサルファイトシーケンシング法では、サンプルに対してバイサルファイト処理を行った後にシーケンス反応を行い、ウラシルに変換された非メチル化シトシンがチミンとして示される。これに基づき、バイサルファイト処理前後のゲノムDNAの配列データを比較することによってメチル化の有無を検出する。
【００３７】
パイロシーケンス法はバイサルファイトシーケンシング法を定量的なリアルタイムシーケンスに変換した方法である。バイサルファイトシーケンシング同様にゲノムDNAをバイサルファイト処理した後、ポリメラーゼ塩基伸長反応を行い、塩基配列を解読する。伸長反応の際に生成されるピロリン酸と発光強度が比例関係にあるため高精度な定量解析を行うことができる。
【００３８】
メチル化特異的PCR及びメチル化特異的リアルタイムPCRでは、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンがウラシルに変換され得る塩基部位に、メチル化DNA検出用プライマーと非メチル化DNA検出用プライマーを設計してPCR又は（例えば、SYBR Greenを用いた）リアルタイムPCRを行い、増幅の有無又は程度によりメチル化または非メチル化を識別してもよい。あるいは、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンがウラシルに変換され得る塩基部位にメチル化DNA検出用TaqManTM プローブと非メチル化DNA検出用TaqManTM プローブを設計し、さらに、メチル化DNAおよび非メチル化DNAに共通するプライマーをこの塩基部位を挟む位置に設計してリアルタイムPCRを行い、増幅の有無又は程度によりメチル化または非メチル化を識別してもよい。
【００３９】
「メチル化DNA特異的結合蛋白質を利用した方法」では、メチル化DNA特異的結合蛋白質、例えば抗メチル化シトシン抗体又はMBD（Methyl-CpG-binding domain）等により、メチル化されたDNAだけを選択的に分離する。次に分離したDNAに対してPCR、リアルタイムPCR、又はプローブを用いたハイブリダイゼーション等を行い、メチル化シトシンを検出する。
【００４０】
（判定工程）
判定工程では、上記検出工程においてメチル化が検出された場合に、被験体がMLH1メチル化群に属すると判定する。MSI-H大腸癌においてはMLH1メチル化群に属する場合、リンチ症候群やリンチ様ではないことが明らかとなるため、リンチ症候群やリンチ様であるか否かを判定するためのさらなる診断を行う必要がなくなる。
【００４１】
また、判定工程では、上記検出工程においてメチル化が検出されなかった場合に、被験体がMLH1非メチル化群に属すると判定してもよい。ここで、本明細書において、「MLH1非メチル化群」とは、MLH1遺伝子の発現がエピジェネティックに抑制されていない群を指す。
【００４２】
（遺伝子変異検出工程）
本工程は、判定工程後に、被験体をさらに分類するための任意工程である。MLH1メチル化群は、例えば、MSI-H大腸癌においては、BRAF(V600E)、KRAS変異型、融合キナーゼ、及びそれ以外の4つのサブタイプにさらに分類され得る。したがって、判定工程でMLH1メチル化群と判定された被験体に対して、これらの遺伝子の変異について検出を行うことで、さらに被験体を分類することができる。これらのサブタイプは、それぞれ治療剤が異なり得るため（例えば、融合キナーゼであればキナーゼの阻害剤が治療剤となり得る）、その判定を行うことにより疾患の治療に役立ち得る。
【００４３】
また、MSI-H大腸癌においては、「MLH1非メチル化群」はリンチ症候群とリンチ様にさらに分類される。したがって、判定工程でMLH1非メチル化群と判定された被験体に対して、被験体がリンチ症候群又はリンチ様のいずれに属するかを判定するために遺伝子変異の検出工程を行ってもよい。例えば、ミスマッチ修復遺伝子であるMLH1、MSH2、MSH6、及びPMS2のいずれか1つ以上に、生殖細胞系列において機能喪失型変異があるか否かを調べ、変異がある場合には、リンチ症候群に、変異がない場合にはリンチ様に分類することができる。
【００４４】
遺伝子変異検出工程は、公知の遺伝子解析法（例えば遺伝子検出法として常用されるPCR法、RT-PCR法、Real-time PCR法、LCR(Ligase chain reaction)、LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、fluorescent in situ hybridization（FISH）法、及び次世代シークエンサーによる解析等）に従って実施することができる。例えば、被験体由来のサンプルから抽出された核酸、例えばmRNA等を用いて、適当なプライマーを用いる遺伝子増幅技術、又は適当なプローブを用いるハイブリダイゼーション技術等を利用することができる。
【００４５】
＜３．治療方法＞
一態様において、本発明は、＜２．被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定するための方法＞に記載されたMLH1メチル化群判定方法により被験体がMLH1メチル化群に属するか否かを判定する工程、及び抗癌剤を被験体に投与する工程を含む、治療方法に関する。抗癌剤の種類は、MLH1メチル化群判定方法の結果に基づいて適宜選択することができ、例えば抗EGFR抗体、抗VEGF抗体、及びチロシンキナーゼ阻害剤等のキナーゼ阻害剤等が挙げられる。
【００４６】
＜４．キット＞
一態様において、本発明は、＜１．MLH1メチル化群判定用マーカー＞に記載されたMLH1メチル化群判定マーカーにおける一以上のシトシンのメチル化を検出することが可能なMLH1メチル化群判定用キットに関する。本発明のキットは、配列番号1に示される塩基配列中の1以上のCpG配列を含む配列を切断可能なメチル化感受性制限酵素、前記マーカーの全部または一部を増幅可能なプライマーセット、及び前記マーカーの全部または一部を検出可能なプローブ又は抗体、の少なくとも一つを含む。
【００４７】
本発明のキットに含まれ得るメチル化感受性制限酵素の例として、Sma I、Ehe I、Hin 6I、Hpa II、Acc II、及びHae II、並びにこれらの酵素のメチル化感受性アイソシゾマー(isoschizomer)が挙げられる。好ましくは、メチル化感受性制限酵素はSma I又はHin 6Iである。
【００４８】
本発明のキットに含まれ得るプライマーセットは、本明細書に記載されたMLH1メチル化群判定マーカーを特異的に検出できるものであれば特に限定しない。プライマーセットにおけるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、hg38のchr3:36,993,202-36,993,865（配列番号1の塩基配列）又はその近傍（例えば、該領域の外側500bp以下、300bp以下、100bp以下、又は50bp以下）の領域の配列に基づいて、設計することができる。例えば、フォワードプライマーは配列番号1の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーは配列番号1の配列の相補的な配列の連続する14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基を含むヌクレオチドからなってもよい。また、フォワードプライマーは配列番号1の相補的な配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなり、リバースプライマーは配列番号1の配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする14〜30塩基、例えば16〜28塩基、好ましくは18〜26塩基の配列を含むヌクレオチドからなってもよい。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ストリンジェントな条件は、公知のハイブリダイゼーション法の条件を利用することができる。例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定すればよい。具体的には、ハイブリダイゼーション法温度や溶液に含まれる塩濃度、及びハイブリダイゼーション法の洗浄工程における温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定すればよい。より詳細なストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃が挙げられる。より具体的には、5×SSC (750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウム)を適宜希釈したもの、温度42℃が挙げられる。
【００４９】
本発明のキットに含まれ得るプローブは、上記マーカーを検出できるものであれば特に限定せず、hg38のchr3:36,993,202-36,993,865（配列番号1の塩基配列）又はその近傍（例えば、該領域の外側500bp以下、300bp以下、100bp以下、又は50bp以下）の領域の配列に基づいて、設計することができる。例えば、プローブは、配列番号1の連続する14以上、例えば20以上、30以上、50以上又は100以上の塩基配列又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドであってよい。また、プローブは配列番号1の連続する14以上、例えば20以上、30以上、50以上又は100以上の塩基配列又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってよい。
【００５０】
本発明のキットは、上記プライマーセット、プローブ又は抗体に加えて、例えば、バッファー、酵素、及び使用説明書等の少なくとも一つを含んでもよい。
【００５１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
＜実施例1：MLH1メチル化を示す特異的領域の同定＞
（材料と方法）
本実施例では、BAT25とBAT26領域においてマイクロサテライト不安定性を呈する93例のMicrosatellite instability-high (MSI-H、高頻度マイクロサテライト不安定性)大腸癌患者から組織サンプルを収集し、凍結組織から約2 mm角を切り出しDNeasy Blood & Tissue Kit或いはQIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)を用いてゲノムDNAを抽出し、メチル化アレイ解析を行った。
【００５３】
メチル化アレイ解析の方法は、Pidsley R. et al., BMC Genomics, 14:293, 2013に記載の方法に従った。メチル化アレイの方法は、手短には以下の通りである。まず、各サンプルに由来する500ngのゲノムDNAを、EZ96 DNA methylationキット（Zymo Research, CA, USA）を用いて、製造業者の標準的なプロトコルに従って亜硫酸水素ナトリウムで処理した。続いて、ゲノム規模でのDNAメチル化を、Illumina Infinium Human Methylation450 BeadChip（Illumina Inc, CA, USA）を用いて、製造業者の指示に従って評価した。Illumina GenomeStudio softwareを用いて、各プローブのシグナル強度の生データを得た。コンピューター及び統計解析は、Pidsley R. et al（上掲）に記載の通りに行った。
【００５４】
（結果）
メチル化アレイ解析の結果より、MSH2、MSH6、MLH1、EPM2AIP1、及びPMS2のメチル化を調べたところ、MSI-H大腸腫瘍組織サンプルにおいて、ミスマッチ修復遺伝子であるMSH2、MSH6、PMS2のメチル化は検出されなかった（データ示さず）。一方、MSI-H大腸腫瘍組織サンプルについて比較すると、MLH1及びEPM2AIP1の部位において、メチル化の程度の顕著な差が認められた（データ示さず）。
【００５５】
Herman JG. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 6870-6875, 1998には、EPM2AIP1遺伝子上のhg38のS: chr3:36,992,827-36,992,855とAS: chr3:36,992,927-36,992,950の領域（以下、Herman領域とする）のメチル化が、MLH1メチル化を特定するのに有効であると記載されている。しかしながら、以下に示す様に、Herman領域のメチル化を指標にMLH1メチル化を判定した場合、全エクソン解析結果との比較から2例が偽陽性であると考えられた。
【００５６】
偽陽性1：生殖細胞系列のMLH1(E13X)変異、及び同部位に片親性ダイソミー（Uniparental disomy）の体細胞変異を有することから、明らかに「リンチ症候群 (Lynch syndrome)」に分類される症例が、Herman領域に基づく判定ではMLH1メチル化群に分類された（データ示さず）。
【００５７】
偽陽性2：占居部位は直腸S状部であり、VarScanのみのコールを含めても１塩基置換（SNVs） 125個、挿入・欠失変異（Indels） 9個と変異が多くないため、マイクロサテライト安定性（MSS）と考えられる症例が、Herman領域に基づく判定ではMLH1メチル化群に分類された（データ示さず）。
【００５８】
本発明者は、MLHメチル化群をより高精度に判定できる領域を探索した結果、メチル化アレイ解析の結果に基づいて、hg38のchr3:36,993,202-36,993,865（hg19では37,034,693-37,035,356）（配列番号1の塩基配列からなる核酸分子）が、上記偽陽性1及び2をMLH1非メチル化群に分類できる領域として有効であることを新たに同定した（図1）。
以上より、配列番号1を含む核酸配列を、MLH1メチル化の判定に用い得ることが示された。
【００５９】
＜実施例2：MLH1メチル化の特異的検出法＞
（材料と方法）
本実施例では、実施例1で特定した領域について、メチル化感受性制限酵素（CpG配列がメチル化されていると消化が阻害される制限酵素）を用いてメチル化の有無を検出できるか否かを検討した。
【００６０】
実施例1で特定した、MLH1メチル化を同定するための領域hg38 chr3:36,993,202-36,993,865の配列を以下に示す。
2019135928.tif 000003
【００６１】
メチル化が生じ得るシトシンとグアニン連続配列(CpG)を下線で、そのうち実施例2においてメチル化アレイでメチル化の検出を行った部位を太字で、メチル化感受性制限酵素の認識配列の例として、Sma Iの認識配列（CCCGGG）及びEhe Iの認識配列（GGCGCC）を枠で囲み、Hin6Iの認識配列（GCGC）をイタリックで示した。なお、実施例2においてメチル化アレイでメチル化の検出を行った部位は、配列番号1の塩基配列の1位、38位、47位、95位、122位、133位、148位、217位、305位、371位、398位、425位、466位、476位、513位、515位、528位、530位、536位、590位、及び663位であった。
【００６２】
制限酵素による消化及びPCR増幅を利用したMLH1メチル化の検出
以下の組成を有する反応液で、37℃で120分間制限酵素による消化を行い、続いて80℃で20分間熱変性を行った。なお、DNAの調製は実施例1と同様の方法で行った。
【００６３】
【表１】
2019135928.tif 000004
【００６４】
続いて、上記の通り制限酵素で処理を行ったDNAについて、以下の反応液においてPCR反応を行った。
【００６５】
【表２】
2019135928.tif 000005
【００６６】
用いた各プライマーの配列は、以下の通りである：
MLH1 Primer 1：5′-ATCCTTCTAGGTAGCGGGCA-3′（配列番号2）
MLH1 Primer 2：5′-CGGTCTGCGGAAAAGGAGAA-3′（配列番号3）
BRAF Primer 1：5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′（配列番号4）
BRAF Primer 2：5′-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3′（配列番号5）
【００６７】
なお、対照であるBRAFの増幅産物は、Sma Iの認識配列を含まない147塩基長を有する核酸分子である。
また、94℃で1分加熱した後、98℃10秒、62℃15秒、68℃32秒のサイクルを25回行うことによりPCRを行った。
【００６８】
PCR反応後、PCR産物のうちの12.5μlを6 × Loading Buffer Orange G(ニッポンジーン)2.5μlと混合し、2%アガロース/TAEゲルで電気泳動し、写真を白黒反転し、判定に用いた。DNAのサイズマーカーには、50 bp ladder（日本ジェネティクス、日本）2.5μlを用いた。
【００６９】
BRAFの変異の有無の判定
また、下記の手順に従ってBRAFの変異の有無を判定した。
まず、上記PCR反応で得られた産物を、以下の反応液で37℃4分間反応させ、80℃で1分間熱変性を行うことによってクリーンアップした。
【００７０】
【表３】
2019135928.tif 000006
【００７１】
続いて、ExoSAP-IT処理サンプル1μlをQubit dsDNA HS assay（Thermofisher Scientific）により濃度測定した。DNA濃度はMLH1のバンドの有無により0.806 ng/μlから3.08 ng/μlまで異なる値を示したが、BRAF PCR産物のバンドの濃さはほぼ同等であったため、最も低い0.806 ng/μl（ほぼBRAFのバンドのみが存在）に合わせてシーケンス反応のテンプレートに用いた。シーケンスは、以下の反応液で行い、96℃で1分加熱した後、96℃10秒、50℃10秒、60℃2分のサイクルを25回行った。
【００７２】
【表４】
2019135928.tif 000007
【００７３】
上記反応の産物を、BigDye XTerminatorTM Purification Kit（ThermoFisher Scientific, MA, USA）中のSam Solution 45 μl/well、エックス ターミネータ 10 μl/wellにより精製し、キャピラリーシーケンサABI 3130 genetic analyzer（Applied Biosystems，Japan）で配列解析を行った。
【００７４】
（結果）
メチル化アレイの結果と本実施例のメチル化感受性制限酵素を用いたメチル化の判定結果の比較を図2に示す。図2において、実施例1で特定した領域のうち、メチル化アレイを行った部位は、左側から順番に、1位、38位、47位、95位、122位、133位、148位、217位、305位、371位、398位、425位、466位、476位、513位、515位、528位、530位、536位、590位、及び663位であり、SmaIが作用する部位は、548位のシトシンを含む配列であり、矢印で示してある。
【００７５】
制限酵素を用いたMLH1メチル化群判定結果は、電気泳動の結果バンドがほぼ見えない場合を(−)、バンドが見える場合を(＋)とした。（−）の場合のバンドは、内部コントロールであるBRAFのバンドと比べて明らかに薄いため、positive controlであるRKO、及びnegative controlであるDLD1と共に泳動することにより、positiveかnegativeのいずれであるか客観的に判定可能である。
【００７６】
制限酵素を用いたMLH1メチル化群判定は、ゲノムワイドメチル化アレイによる実施例1で特定した領域に基づくMLH1メチル化の判定結果を正確に反映していた（図2）。したがって、(＋)症例がMLH1メチル化されており、(−)症例がリンチ症候群またはリンチ様に属することは明白である。以上の結果は、メチル化感受性制限酵素を用いることによって、簡便かつ正確にMLH1メチル化の有無を判定できることを示している。なお、Herman領域において偽陽性が生じ得ることは、メチル化アレイの上から2番目及び7番目、並びに下から1番目及び2番目のサンプル（#2、#7、#12、#13）の結果から見てとれる。
【００７７】
また、MLH1メチル化の判定に用いたmultiplex PCR産物は、BRAF(V600E)変異の有無を調べるためのシーケンスのテンプレートとして問題なく使うことができた（データ示さず）。したがって、さらにBRAFの変異を調べることによって、MLH1メチル化群に属する被験体をBRAFの変異に基づいてさらに分類できることが示された。
【００７８】
＜実施例3：パラフィン包埋(FFPE)切片から抽出したDNAのMLH1メチル化の特異的検出法＞
（材料と方法）
実施例2では凍結保存組織から抽出したDNAを用いた方法について示したが、臨床検体ではパラフィン包埋(FFPE)切片しか入手できない場合もある。パラフィン包埋(FFPE)切片や血液や体液などから得られるDNAは断片化されているため凍結組織から得られるDNAと比較し塩基長も短く、収量も低い。そこで本実施例では実施例1で特定した領域について、メチル化感受性制限酵素を用いて、パラフィン包埋(FFPE)切片から抽出したDNAのメチル化の有無を検出できるか否かを検討した。
【００７９】
制限酵素による消化及びPCR増幅を利用したMLH1メチル化の検出
大腸癌患者のパラフィン包埋(FFPE)切片3 μm 3-6枚からGeneRead DNA FFPE Kit(Qiagen)或いはQIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)を用いてゲノムDNAを抽出し、以下の組成を有する反応液で、37℃で120分間制限酵素による消化を行い、続いて80℃で20分間熱変性を行った。
また、比較対照として実施例1と同様の方法で抽出した凍結組織由来のDNAを用いた。
【００８０】
【表５】
2019135928.tif 000008
【００８１】
続いて、上記の通り制限酵素で処理を行ったDNAについて、以下の反応液においてPCR反応を行った。
【００８２】
【表６】
2019135928.tif 000009
【００８３】
用いた各プライマーの配列は、以下の通りである：
MLH1 Primer 3：5′-AGCCGGGCTCACTTAAGGG-3′（配列番号6）
MLH1 Primer 4：5′-CATGCGCTGTACATGCCTCT-3′（配列番号7）
BRAF Primer 1：5′-ATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA-3′（配列番号4）
BRAF Primer 2：5′-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3′（配列番号5）
【００８４】
なお、対照であるBRAFの増幅産物は、Hin6Iの認識配列を含まない147塩基長を有する核酸分子である。
また、PCRは、94℃で1分加熱した後、98℃10秒、62℃15秒、68℃9秒のサイクルを30回行った。
PCR反応後、PCR産物のうちの12.5μlを6 × Loading Buffer Orange G(ニッポンジーン) 2.5μlと混合し、3%アガロース/TBEゲルで電気泳動し、写真を白黒反転し、判定に用いた。DNAのサイズマーカーには、50 bp ladder（日本ジェネティクス、日本）を2.5μlを用いた。
【００８５】
（結果）
パラフィン包埋(FFPE)切片から抽出したDNAを用いても、凍結組織から抽出したDNAを用いても同様の結果となった（図3）。以上の結果は、メチル化感受性制限酵素を用いることによって、パラフィン包埋(FFPE)切片から抽出したDNAを用いても、凍結組織を用いた場合と同様に、簡便かつ正確にMLH1メチル化の有無を判定できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2019135928.tif 000012
【配列表】
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