(57)【要約】【課題】保存安定性をさらに向上させ、検体に含まれる被検出物質を高感度に検出でき、製造上の煩雑さも改善し得る、イムノクロマトグラフィー装置に用いるためのパッドを提供する。【解決手段】検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置に用いられるパッドにおいて、前記パッドは、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物を含有することを特徴とするパッド。【選択図】図１
2019219394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置に用いられるパッドにおいて、
前記パッドは、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物を含有することを特徴とするパッド。
【請求項２】
前記酸無水物の２５℃の蒸気圧が、２×１０−２Ｐａ以下であることを特徴とする請求項１に記載のパッド。
【請求項３】
前記酸無水物が、ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物、ピロメリット酸無水物、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、４−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１，２−ジカルボン酸無水物、３−アセトアミドフタル酸無水物、及び４−（１−プロピニル）フタル酸無水物から選択された１種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のパッド。
【請求項４】
前記パッド中の前記酸無水物の含有量が、１パッドあたり０．４μｍｏｌ〜８．４μｍｏｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のパッド。
【請求項５】
検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置において、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のパッドを備えてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。
【請求項６】
試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物とを含有する、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、
前記検出部よりも上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記酸無水物を含有する部位とを有し、
前記酸無水物を含有する部位が、請求項１〜４のいずれか１項に記載のパッドによって構成されることを特徴とする請求項５に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
【請求項７】
前記亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする請求項６に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、イムノクロマトキット。
【請求項９】
請求項８に記載のイムノクロマトキットを用いて、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｖ）を含むイムノクロマト検出方法。
（ｉ）検体希釈液により前記検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
（ｉｉ）亜硝酸化合物と、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、前記検体から被検出物質を抽出する工程
（ｉｉｉ）標識物質保持部材において前記被検出物質を標識化する工程
（ｉｖ）前記検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において前記被検出物質を検出する工程
（ｖ）前記検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー装置用パッド、これを用いたイムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトキット並びにイムノクロマト検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、イムノクロマトグラフ用ストリップ形式のイムノアッセイは、抗体の持つ特異的反応性を利用して、検体中の検出対象を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として汎用性が高まっている。
【０００３】
特に、最近では、インフルエンザウイルスや細菌といった病原体に対する感染の有無を検査するためのイムノクロマト法に基づく簡便な検査具についても関心が高まり、研究開発が進められてきた。
【０００４】
例えば、溶血性連鎖球菌（以下、単に「溶連菌」と言うことがある）の診断は、群特異的である多糖体を抗原として検査することで行う。多糖体の抽出法としては、酵素やファージ、塩酸や次亜塩素酸などを用いた方法が知られているが、亜硝酸を用いる抽出法が最も一般的である。
【０００５】
亜硝酸による抽出法は、多糖体の抽出効率が高い点と亜硝酸が低価格で取り扱いが容易である点にメリットがある。しかしながら、亜硝酸自体が不安定で分解しやすい化合物であるため、抽出前に亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸化合物と有機酸とを混合し、その都度亜硝酸を調製しなければならない点にデメリットがある。なお、有機酸としては、酢酸、クエン酸、酒石酸、イタコン酸、シュウ酸、コハク酸、グリコール酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸等が挙げられる（例えば下記特許文献１、２参照）。
【０００６】
また、有機酸および亜硝酸化合物を含有させた従来の検査デバイスにおいては、検査デバイスの保存中に、一部の有機酸と亜硝酸化合物とが検査デバイス内で拡散することによって、両者が接触し、亜硝酸が発生してしまう恐れがある。検査デバイスの保存中に亜硝酸の発生が進行すると、実際に検査デバイスを使用する際には、亜硝酸の発生が不十分となって検出対象の抽出効率が低下してしまい、検出感度が落ちてしまう。したがって、この点で検査デバイスの保存安定性を向上させる余地があった。
【０００７】
そこで下記特許文献３は、前記問題点を解消するため、試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、有機酸又は有機酸誘導体とを含有する、検体中の検出対象を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、前記標識物質含有部位より上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記有機酸又は有機酸誘導体を含有する部位とを有し、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記有機酸又は有機酸誘導体を含有する部位とが、厚み方向に実質的に接触しないイムノクロマトグラフィー装置が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−２３２０６４号公報
【特許文献２】特開２０１５−３４７１９号公報
【特許文献３】国際公開第２０１７／１５０７３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、本発明者の検討によれば、特許文献３に記載のイムノクロマトグラフィー装置では保存安定性に一定の効果がみられるものの、使用する酸の種類によっては装置内で酸が分解、揮発、昇華するなどの問題が生じ、これが保存中の亜硝酸化合物と反応する場合もあった。したがって、保存安定性に改善の余地がある。また、亜硝酸化合物を含有する部位と有機酸又は有機酸誘導体を含有する部位とが厚み方向に実質的に接触しないような特別な構造を必要とし、製造上の煩雑さが生じる。さらに、検出感度についても改善の余地があった。
【００１０】
したがって本発明の目的は、保存安定性をさらに向上させ、検体に含まれる被検出物質を高感度に検出でき、製造上の煩雑さも改善し得る、イムノクロマトグラフィー装置に用いるためのパッド、これを用いたイムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトキット並びにイムノクロマト検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、従来のイムノクロマトグラフィー装置に使用されていた有機酸に替えて、特定の蒸気圧及び溶解度を有する酸無水物を使用することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の通りである。
【００１２】
１．検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置に用いられるパッドにおいて、
前記パッドは、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物を含有することを特徴とするパッド。
２．前記酸無水物の２５℃の蒸気圧が、２×１０−２Ｐａ以下であることを特徴とする前記１に記載のパッド。
３．前記酸無水物が、ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物、ピロメリット酸無水物、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、４−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１，２−ジカルボン酸無水物、３−アセトアミドフタル酸無水物、及び４−（１−プロピニル）フタル酸無水物から選択された１種以上であることを特徴とする前記１または２に記載のパッド。
４．前記パッド中の前記酸無水物の含有量が、１パッドあたり０．４μｍｏｌ〜８．４μｍｏｌであることを特徴とする前記１〜３のいずれか１に記載のパッド。
５．検体中の検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置において、
前記１〜４のいずれか１に記載のパッドを備えてなることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。
６．試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物とを含有する、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、
前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、
前記検出部よりも上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記酸無水物を含有する部位とを有し、
前記酸無水物を含有する部位が、前記１〜４のいずれか１に記載のパッドによって構成されることを特徴とする前記５に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
７．前記亜硝酸化合物が、亜硝酸塩であることを特徴とする前記６に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
８．前記５〜７のいずれか１に記載のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、イムノクロマトキット。
９．前記８に記載のイムノクロマトキットを用いて、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出する方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｖ）を含むイムノクロマト検出方法。
（ｉ）検体希釈液により前記検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
（ｉｉ）亜硝酸化合物と、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、前記検体から被検出物質を抽出する工程
（ｉｉｉ）標識物質保持部材において前記被検出物質を標識化する工程
（ｉｖ）前記検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において前記被検出物質を検出する工程
（ｖ）前記検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
【発明の効果】
【００１３】
本発明のパッドは、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下である酸無水物を含有することを特徴としているので、パッドからの酸無水物の昇華が抑制される。そのため、本発明のパッドを、亜硝酸を装置内で発生させるイムノクロマトグラフィー装置に適用した場合は、当該装置の保管中に酸無水物の昇華が抑制され、酸無水物が亜硝酸塩と反応し亜硝酸が生成してしまうことを抑制できるため、保存安定性が向上する。また、パッドからの酸無水物の昇華が抑えられる結果、上記装置に適用して試験を行った場合の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度で検出することができる。
また、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物を使用することにより、当該装置の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度で検出することができる。
【００１４】
本発明のイムノクロマトグラフィー装置およびイムノクロマトキットは、保存安定性および検出感度が向上するとともに、亜硝酸化合物を含有する部位と有機酸又は有機酸誘導体を含有する部位とが厚み方向に実質的に接触しないような特別な構造を必ずしも要さず、製造上の煩雑さを避けることができる。
【００１５】
本発明のイムノクロマト検出方法は、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下である酸無水物を使用しているので、イムノクロマトグラフィー装置内での酸無水物の昇華が防止され、これにより、亜硝酸の生成も抑制され、保存安定性が向上する。また、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物を使用することにより、当該装置の使用時の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の一実施形態のイムノクロマトグラフィー装置の構造を説明するための断面図である。
【図２】図２は、本発明の別の実施形態のイムノクロマトグラフィー装置の構造を説明するための断面図である。
【図３】図３は、実施例で使用されたイムノクロマトグラフィー装置の構造を説明するための断面図である。
【図４】図４は、実施例１、実施例７、比較例１０で測定された検出部（４）の赤いラインの発色強度の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
本発明の一実施形態は、検体中の検出対象から被検出物質（抗原）を抽出し、その被検出物質（抗原）に特異的に結合する結合物質（抗体）との反応（抗原−抗体反応）により形成される複合体をクロマトグラフ媒体に展開させることで、検出対象を各種の検出手段により確認するためのイムノクロマトグラフィー装置に用いるためのパッド、これを用いたイムノクロマトグラフィー装置、イムノクロマトキット、イムノクロマト検出方法（以下、単に「イムノクロマト検出系」と言うことがある）に基づくものである。
【００１８】
その抗原と最も特異的に反応して結合する抗体としては、それと特異的に結合する、例えばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体若しくはその他の公知の抗体を任意に使用することができる。
【００１９】
上記抗体には標識を付けておくことで、検出対象の検出が可能となる。標識としては、酵素、発色物質、蛍光物質、または放射性物質などを任意に使用することができる。例えば、操作が簡単で検定時間も短くするというイムノクロマト検出方法の特色を出すためや、抗体および抗原等の種類を考慮して決めればよい。
【００２０】
また、検出手段は、操作が簡単で、比較的短時間で判定できるという、イムノクロマト検出方法の特色を表すためには、目視判定で、正確に判定できると言う性能を有することを特徴とする。一方、時間、精度などが要求される場合には、分光光度検出および放射線検出など、各種の検出手段を付帯させて検出することができる。
【００２１】
本発明における検出対象としては、本発明のイムノクロマト検出系により生成する亜硝酸によって、細菌に特異な抗原が抽出されるような細菌であれば適用可能である。特に厚いペプチドグリカン層を有するグラム陽性菌を含む検出対象において好ましく用いられる。
【００２２】
例えば、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、かん菌、たんそ菌、セレウス菌、ジフテリア菌、リステリア、破傷風菌、ボツリヌス菌、およびウェルシュ菌などが挙げられる。なかでも球菌類であるブドウ球菌、連鎖球菌、および肺炎球菌において好ましく用いられる。最適には連鎖球菌、特に溶血性連鎖球菌において好ましく用いられる。
【００２３】
上記検出対象を含有する検体としては、例えば、唾液、鼻汁、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、痰、咽頭拭い液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、便懸濁液、尿、および羊水等の生体試料のみならず、食品抽出液、上水、下廃水、および培養液等といった試料であることができ、特に限定されるものではない。
【００２４】
なかでも、本発明はこれらの検体中に含まれ、原因となる菌がグラム陽性菌、特に、溶連菌を含む場合に有用である。本発明は、呼吸器疾患患者等から採取される唾液等に含まれる溶連菌を検出対象とし、溶連菌から抽出された多糖体を被検出物質として、検出対象の溶連菌を検出することができる。
【００２５】
以下、本発明のイムノクロマト検出系の実施形態を順次説明をするが、本発明は以下に示す実施形態に限られるものではない。
【００２６】
本発明のパッドは、検出対象に含まれる被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置に用いられるとともに、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物（以下、単に「酸無水物」と言うことがある）を含有することを特徴とする。
【００２７】
本発明におけるパッドとは、イムノクロマトグラフィー装置に用いられる部材のうち、液体の試料が通過（展開）する部材として用いられるものである。当該パッドは、液体の試料を吸収し、液体と検出対象とが通り抜けることができるのであれば、その材質および形態等は特に制限されない。なかでも多孔質である部材が好適に用いられ、例えば、セルロース濾紙、再生セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等が挙げられる。これらの部材の形状としては、例えばシート状のものを使用することができる。
【００２８】
前記酸無水物の２５℃の蒸気圧は、５×１０−２Ｐａ以下であり、２×１０−２Ｐａ以下が好ましく、１×１０−２Ｐａ以下がさらに好ましく、５×１０−３Ｐａ以下がとくに好ましい。
蒸気圧を上記のように設定することにより、パッドからの酸無水物の昇華が抑制され、パッド使用時の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度に検出できる。
なお、蒸気圧は公知のデータベースの値（計算値）を用いることができる。また、前記酸無水物は２５℃、２０Ｐａで１２時間減圧したときの重量増減が５％以内であるものが好ましい。
【００２９】
また本発明に使用される酸無水物は、２５℃の水に対する溶解度が、０．１ｍｇ／Ｌ以上であり、１ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましく、１０ｍｇ／Ｌ以上であることがより好ましい。
溶解度を上記のように設定することにより、酸無水物が検体含有液に速やかに溶解することができるため、亜硝酸の発生効率が高まり、被検出物質の検出感度をさらに向上させることができる。
なお、溶解度は、データベースの値（計算値）を用いることができる。
【００３０】
本発明に使用される酸無水物は、一分子中に２以上の酸無水物基を有する化合物であることが好ましい。酸無水物の蒸気圧はその分子量が関係しており、分子量が大きいほど蒸気圧が低くなる傾向にある。しかし分子量が大きくなると、疎水性の炭素鎖等の影響により、酸無水物の水への溶解度が低下する傾向にある。一方、一分子中に２以上の酸無水物基を有する化合物は、単位重量あたりの酸無水物量が比較的大きく、高い親水性を有することになるため、良好な保存安定性を維持しつつ、かつ検出感度をより向上させることが可能となる。ただし、単位重量あたりの酸無水物量が大きすぎると、検体含有液のｐＨが低下し抗原抗体反応を阻害するという問題が生じるおそれがあるため、一分子中に含まれる酸無水物基は３以下であることが好ましい。もっとも好ましくは一分子中に２つの酸無水物基を有する化合物（酸二無水物）である。
【００３１】
なお、本発明に使用される酸無水物は、溶解度が高く、被検出物質を感度良く検出するという観点から、ベンゼン環を２つ以上有する酸無水物を含まないものが好ましい。
【００３２】
本発明に使用される酸無水物の具体例としては、ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸無水物、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、等のテトラカルボン酸二無水物、４，４’−ビフタル酸無水物、４−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１，２−ジカルボン酸無水物、３−アセトアミドフタル酸無水物、４−（１−プロピニル）フタル酸無水物、２，３−ナフタレンジカルボン酸無水物、及び１，２−ナフタレンジカルボン酸無水物等が挙げられ、これらは１種または２種以上を組み合わせて用いてもよい。特に、一分子中に２つの酸無水物基を有する化合物である、ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物、ピロメリット酸無水物、１，２，４，５−シクロヘキサンテトラカルボン酸二無水物、４−（２，５−ジオキソテトラヒドロフラン−３−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１，２−ジカルボン酸無水物が好ましい。
【００３３】
また、本発明のパッド中の酸無水物の含有量は、１パッドあたり０．４μｍｏｌ〜８．４μｍｏｌであることが好ましく、０．６μｍｏｌ〜４．０μｍｏｌであることがさらに好ましく、０．８μｍｏｌ〜２．０μｍｏｌであることがとくに好ましい。また、パッド単位面積あたりの酸無水物の含有量は、０．４μｍｏｌ／ｃｍ２〜８．４μｍｏｌ／ｃｍ２であることが好ましく、０．６μｍｏｌ／ｃｍ２〜４．０μｍｏｌ／ｃｍ２であることがさらに好ましく、０．８μｍｏｌ／ｃｍ２〜２．０μｍｏｌ／ｃｍ２であることがとくに好ましい。このような含有量によれば、被検出物質の抽出効率が高まり、その結果、被検出物質の検出感度をさらに向上させることができる。
【００３４】
本発明のパッドは、特定の蒸気圧を有する酸無水物を使用しているので、従来技術に見られる酸の昇華が起こりにくく、保存中の亜硝酸化合物との反応を抑制できるため、保存安定性が向上する。また、特定の溶解度を有する酸無水物を使用することにより、イムノクロマトグラフィー装置の使用時の亜硝酸生成効率が高まり、被検出物質を高感度で検出することができる。
【００３５】
＜イムノクロマトグラフィー装置＞
本発明のイムノクロマトグラフィー装置は、被検出物質を亜硝酸によって抽出するイムノクロマトグラフィー装置であって、前記本発明のパッドを備えてなることを特徴とする。
【００３６】
好ましい実施形態として、本発明のイムノクロマトグラフィー装置は、試料滴下部材と、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とを含み、亜硝酸化合物と、２５℃の蒸気圧が５×１０−２Ｐａ以下であり、２５℃の水に対する溶解度が０．１ｍｇ／Ｌ以上である酸無水物とを含有する、検体中の検出対象に含まれる被検出物質を検出するためのイムノクロマトグラフィー装置であって、前記試料滴下部材、前記標識物質保持部材、前記クロマトグラフ媒体部材および前記吸収部材がこの順に試料が展開されるように配設され、前記検出部よりも上流側に、前記亜硝酸化合物を含有する部位と、前記酸無水物を含有する部位とを有し、前記酸無水物を含む部位が、本発明のパッドによって構成されることを特徴とする。
【００３７】
本明細書において、「部材」と、「部位」とは意味が異なるものとして用いる。例えば、「亜硝酸化合物（酸無水物）を含有する部材」とは、亜硝酸化合物（酸無水物）を含有する「部材」全体を意味し、「亜硝酸化合物（酸無水物）を含有する部位」とは、亜硝酸化合物（酸無水物）を含有する部材の中で、実際に亜硝酸化合物（酸無水物）を含有する領域を意味することとする。なお、「部位」が部材の一部の領域ではなく部材全体を示す場合もある。
【００３８】
また本明細書においては、亜硝酸化合物を含有する部位を有する部材を亜硝酸化合物含有部材、酸無水物を含有する部位を有する部材を酸無水物含有部材ということがある。
【００３９】
本明細書において、「試料展開方向」とは、試料が、試料滴下部材に滴下されてから吸収部材で吸収されるまでに展開（移動）する方向をいい、例えば、図１に示すイムノクロマトグラフィー装置においては、矢印（右矢印）で示す方向をいう。また、本発明において「上流側」とは、上記「試料展開方向」と正反対の方向をいい、吸収部材を基準として試料滴下部材方向（側）をいう。
【００４０】
以下図面を参照しながら本発明のイムノクロマトグラフィー装置について具体的に説明する。
【００４１】
本発明のイムノクロマトグラフィー装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料滴下部位１１を有する試料滴下部材（１）、本発明のパッドからなる酸無水物含有部材（７）、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材（２）、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体部材（３）、および吸収部材（５）を含む複数の部材から構成されている。そして本実施形態では、試料滴下部材（１）は、亜硝酸化合物を含有する部位１２を有し、前記試料滴下部材（１）が亜硝酸化合物含有部材の機能を兼ね備えている。
【００４２】
そして、上記装置は、試料滴下部材（１）、本発明のパッドからなる酸無水物含有部材（７）、標識物質含有部位を有する標識物質保持部材（２）、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体部材（３）、および吸収部材（５）の各部材がこの順に試料が展開されるように、イムノクロマトグラフィー装置を構成する各部材が連結して配設されている。当該実施形態においては、上記順に試料が展開されるのであれば、上記各部材間に他の部材を任意に設けてもよく、必ずしも、試料滴下部材と、酸無水物含有部材と、標識物質保持部材と、クロマトグラフ媒体部材と、吸収部材とが連続的に設けられている必要はない。
【００４３】
また、図２に示すように、亜硝酸化合物を含有する部位は、亜硝酸化合物含有部材（８）として、別個に設けてもよい。亜硝酸化合物含有部材（８）としては、ガラスファイバーまたはセルロースの膜等が通常使用される。亜硝酸化合物含有部材（８）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００４４】
また、酸無水物含有部材（７）および亜硝酸化合物含有部材（８）は、検出部（４）よりも上流側に設けられるのであれば、その設置位置および順番は任意である。例えば、酸無水物含有部材（７）および亜硝酸化合物含有部材（８）は、それぞれ独立して、標識物質保持部材（２）の上流側または下流側に設けることができる。
また、必要に応じて酸無水物含有部材（７）を設けずに、試料滴下部材（１）として、本発明のパッドを使用することができる。さらに、酸無水物含有部材（７）に、亜硝酸化合物を含有する部位１２を設けてもよいが、亜硝酸化合物を含有する部位１２と酸無水物を含有する部位とは同一箇所となることはない。
【００４５】
各部材が連結される態様としては、図１に示すように各部材同士が重なって連結されていてもよいし、各部材同士は重ならず、部材の側面同士が試料展開方向の側で接触して連結されていてもよい。
【００４６】
酸無水物含有部材（７）は、多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、再生セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等が挙げられる。酸無水物含有部材（７）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００４７】
試料滴下部材（１）とは、イムノクロマトグラフィー装置において検体を含有する試料（以下、単に「試料」と言うことがある）を滴下する部位（以下、単に「試料滴下部位１１」と言うことがある）を有する部材をいい、図１の符号１で示す部材をいう。
【００４８】
試料滴下部位１１は、試料滴下部材（１）のうち、試料を滴下する一部分の領域を指す。試料滴下部材（１）における試料滴下部位１１の位置は特に制限はなく、例えば、試料滴下部材（１）の両端又はその付近であってもよいし、試料滴下部材（１）の中央又はその付近であってもよい。試料滴下部材（１）には、本発明の効果を損なわない任意の試薬を含有させることができる。
なお試料滴下部位１１は、通常、亜硝酸化合物を含有する部位１２よりも上流側に設けられる。
【００４９】
試料滴下部材（１）は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、再生セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等が挙げられる。試料滴下部材（１）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００５０】
標識物質保持部材（２）とは、標識成分によって試薬成分を標識した標識物質を含有する部位（以下、単に「標識物質含有部位２１」と言うことがある）を有する部材であり、図１の符号２で示す部材をいう。
【００５１】
標識物質含有部位２１は、標識物質保持部材（２）のうち、実際に標識物質を含有する領域を指す。標識物質含有部位２１は図１に示すように標識物質保持部材（２）の一部分の領域を占めるものであってもよいし、標識物質保持部材（２）の部材全体の領域を占めるものであってもよい。
【００５２】
標識物質含有部位２１が標識物質保持部材（２）の一部分の領域を占めるものである場合、標識物質保持部材（２）における標識物質含有部位２１の位置は特に制限はなく、例えば標識物質保持部材（２）の両端又はその付近であってもよいし、標識物質保持部材（２）の中央又はその付近であってもよい。標識物質保持部材（２）には、本発明の効果を損なわない任意の試薬を含有させることができる。
【００５３】
標識成分としては、例えば、金属粒子、ラテックス粒子、酵素、および蛍光化合物等があり、なかでも金属粒子が好ましい。試薬成分としては、分析物を認識する能力を有する粒子又は分子であり、好ましくはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントである（第一試薬）。
【００５４】
金属粒子としては、金、銀、白金、ゲルマニウム、ロジウム、およびパラジウムのような貴金属の単粒子、ならびに複合粒子が任意に好ましく使用できる。なかでも、金が色相の変化に敏感であり、特に好ましい。
【００５５】
金属粒子の平均粒径は、好ましくは１ｎｍ〜５００ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、さらに好ましくは３５ｎｍ〜１００ｎｍである。なお、上記平均粒径を有する、金のナノ径の各種金粒子を金ナノ粒子という。
【００５６】
イムノクロマト検出方法においては、この金の粒径、粒度分布、および色調などを考慮して、金粒子の表面に白金粒子を担持させた、金複合粒子とすることにより、イムノクロマト検出方法の標識とすること、タンパク質の染色剤としての有用性を高めるために使用することができる。さらに、金属粒子表面に結合できる官能基と抗体と結合できる反応基を有する金標識増幅剤のような、いわゆる増感剤を使用すれば測定感度を高めることができる。
【００５７】
標識物質保持部材（２）としては、例えば、ガラスファイバーまたはセルロースの膜等が通常使用される。標識物質保持部材（２）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００５８】
図１に示す実施形態では、標識物質含有部位２１より上流側で亜硝酸化合物と酸無水物とが反応して亜硝酸を発生させ、検出対象から被検出物質を抽出することができる。このため、検出対象は被検出物質が抽出された状態で標識物質含有部位２１へと移動し、被検出物質を標識化することが可能となる。
【００５９】
また、図３に示す実施形態では、標識物質保持部材（２）の上流側に亜硝酸化合物を含有する部位１２（図示せず）を設け、標識物質保持部材（２）の下流側に酸無水物を含有する部位を設けており、試料滴下部材（１）に試料を滴下すると、試料は、試料滴下部材（１）に含まれる亜硝酸化合物および標識物質とともに酸無水物含有部材（７）に向かって移動する。すると酸無水物含有部材（７）において、亜硝酸化合物と酸無水物とが反応することで亜硝酸が生成し、試料から被検出物質が抽出されると同時に、標識物質によって被検出物質が標識化される。
【００６０】
標識物質保持部材（２）の上流側に亜硝酸化合物を含有する部位１２を設け、標識物質保持部材（２）の下流側に酸無水物を含有する部位を設ける態様は、試料から被検出物質を抽出すると同時に、標識物質によって被検出物質を標識化することができるため、被検出物質に結合しない標識物質のロスを減らすことができ、検出感度を向上させることができるという点で好ましい。
【００６１】
本発明において、亜硝酸化合物を含有する部位と酸無水物を含有する部位とは、厚み方向に実質的に接触しないようにすることもできる。ここで、「厚み方向」とは、本発明のイムノクロマトグラフィー装置において、上述した各部材の厚みの方向を意味する。上記部材がシート状の部材である場合は、そのシートの厚み方向を示す。例えば、図１に示すイムノクロマトグラフィー装置においては、矢印（上下矢印）で示す方向をいう。また、「接触」とは、亜硝酸化合物を含有する部位と酸無水物を含有する部位が、物理的に接触することを意味する。そして、「亜硝酸化合物を含有する部位と酸無水物を含有する部位とが、厚み方向に実質的に接触しない」とは、亜硝酸化合物を含有する部位と酸無水物を含有する部位との、厚み方向に接触する領域の試料展開方向の長さが、０．５ｍｍ以下である場合をいう。
【００６２】
本発明における亜硝酸化合物は、酸と反応して亜硝酸を生成するものであって、検査に悪影響が及ばないものであれば特に制限されない。好ましくは、亜硝酸塩である。亜硝酸塩としては、例えば、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸カルシウム、および亜硝酸マグネシウム等の無機亜硝酸塩、亜硝酸メチル、亜硝酸エチル、亜硝酸ブチル、および亜硝酸アミル等の有機亜硝酸化合物が挙げられる。さらには、それらを混合して使用することも可能である。好ましくは、無機亜硝酸塩であって、なかでも、亜硝酸のアルカリ金属塩が好ましく、亜硝酸ナトリウムが最も好ましい。
【００６３】
本発明のイムノクロマトグラフィー装置における亜硝酸化合物の含有量は、検出感度向上の観点から、好ましくは１２．５μｍｏｌ／装置〜１６０μｍｏｌ／装置であり、より好ましくは５０μｍｏｌ／装置〜１００μｍｏｌ／装置である。また、亜硝酸化合物を含有させる部位の単位面積あたりの亜硝酸化合物の含有量は、好ましくは１２．５μｍｏｌ／ｃｍ２〜１６０μｍｏｌ／ｃｍ２であり、より好ましくは５０μｍｏｌ／ｃｍ２〜１００μｍｏｌ／ｃｍ２である。このような含有量によれば、被検出物質の抽出効率が高まり、その結果、被検出物質の検出感度をさらに向上させることができる。
【００６４】
クロマトグラフ媒体部材（３）は、膜担体上に検出部（４）を作製したものである。膜担体としては、毛細管現象により試料を吸収し移動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。
【００６５】
クロマトグラフ媒体部材（３）は、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、およびこれらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択して使用することができる。クロマトグラフ媒体部材（３）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００６６】
検出部（４）には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント（第二試薬）が、ニトロセルロースのシート上に担持固定されている。
【００６７】
吸収部材（５）には、過剰の試料を迅速に吸収する能力を有する材料であるガラス繊維、およびセルロース繊維等からなる濾紙が汎用されているが、さらに吸収した液体が逆流しないように保持する能力を有する材料を用いればより好ましい（特開２０１２−１８９３４６号公報）。吸収部材（５）の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００６８】
また上述したように、上記以外の他の部材を本発明の装置の任意の位置に備えていてもよい。これらの部材としては、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに検体（検体試料）が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。
【００６９】
多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、再生セルロース濾紙、ガラスファイバー濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布等が挙げられる。これらの部材の形状としては、シート状のものを使用することができる。
【００７０】
また、本発明のイムノクロマトグラフィー装置は、バッキングシート（６）を含有することができる。バッキングシート（６）は基材である。バッキングシート（６）の片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより片面が粘着性を有する。この粘着面上に各部材の一部または全部が密着して設けられている。
【００７１】
また、バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては特に限定されない。
【００７２】
検出部（４）に用いる試薬成分（第二試薬）および標識試薬に用いる試薬成分（第一試薬）は、その一方又は両方がモノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。好ましくは、検出部（４）に用いる試薬成分（第二試薬）がポリクローナル抗体であり、標識試薬に用いる試薬成分（第一試薬）がモノクローナル抗体である場合である。
【００７３】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知であり、入手可能であり、公知の方法により調製することができる。抗体産生動物種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、およびウマ等である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれでもよい。
【００７４】
なかでも、標識物質保持部材（２）に用いる試薬成分（第一試薬）および検出部（４）に用いる試薬成分（第二試薬）の両方に、ウサギ由来の抗体を用いることが好ましい。
【００７５】
＜イムノクロマトキット＞
本発明のイムノクロマトキットは、上記のイムノクロマトグラフィー装置と、検体を希釈するための検体希釈液とを含む。
【００７６】
本発明のイムノクロマトキットにおいて検体希釈液は、展開液としても使用することができる。検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体と検体希釈液（展開液）を予め混合した検体含有液を試料として、試料滴下部材に供給・滴下して展開させることもできる。または、先に検体を試料滴下部材に供給・滴下した後、検体希釈液（展開液）を試料滴下部材に供給・滴下して展開させてもよい。
【００７７】
通常、展開液のｐＨ条件は酸性である方が、亜硝酸化合物と酸無水物とが反応して生成される亜硝酸の生成効率が高く、抗原の抽出効率を高めることができる。一方、ｐＨ条件が酸性であると、イムノクロマトグラフィー装置や後述する検体希釈液中に存在する、例えば、カゼイン等のタンパク質、またはその塩や検体中に含まれる高粘性タンパク質などが析出してくる、または標識物質の凝集が起こり展開不良となるといった問題が生じる可能性がある。
【００７８】
したがって、本発明における展開液のｐＨ条件としては、亜硝酸が生成するｐＨであって、カゼイン等のタンパク質や検体中に含まれる高粘性タンパク質などが析出せず、かつ、標識物質の凝集が起こらないｐＨが好ましい。上記ｐＨ条件としては、ｐＨが６．５〜８．５、好ましくは６．６〜８．０、最も好ましくは６．８〜７．５である。上記ｐＨであればタンパク質の析出や標識物質の凝集が起こりにくい。
【００７９】
また、本発明のイムノクロマトキットにおいて、検体希釈液中やイムノクロマトグラフィー装置の各部位には、上述した試薬以外にも、本発明の効果を損なわない範囲で、各種試薬、例えば、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤、塩、緩衝剤、その他各種添加剤等を含有させることができる。
【００８０】
本発明のイムノクロマトキットに使用できる非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、およびアルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。また、悪影響を及ぼさない範囲内において非イオン性界面活性剤以外のイオン性界面活性剤などを配合して使用することも可能である。
【００８１】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置に使用する非イオン性界面活性剤の含有量としては、１装置あたり好ましくは０．２４ｍｇ〜２．４ｍｇの範囲であり、より好ましくは０．６ｍｇ〜１．８ｍｇの範囲で含有させることができる。
【００８２】
１装置あたり０．２４ｍｇ未満では展開が不安定となり正確な判定が行えない、または、非特異的反応を抑制できず正確な判定がやや難しくなる傾向を示す。１装置あたり２．４ｍｇを超えると、必要以上の濃度となり、非特異的反応の抑制には好ましい影響を与えることがないばかりか、技術的に無意味になり、経済的でなく無駄となる。
【００８３】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置に使用される塩としては、代表的なものとしては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシウム等が挙げられる。好ましくは塩化ナトリウムである。
【００８４】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置に使用される塩の濃度としては、１装置あたり１ｍＭ〜５００ｍＭの範囲が好ましく、５ｍＭ〜２００ｍＭの範囲がより好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲がさらに好ましい。濃度が１ｍＭより低くなると、例えば０．１ｍＭ程度に少なくなるとタンパク質の抽出作用が不十分になる。５００ｍＭ超では、例えば、１Ｍ、２Ｍと多くなれば、技術的に無意味な量であり、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
【００８５】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置に使用される塩としては、１種のみならず２種以上配合して使用することもできる。
【００８６】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置に使用する緩衝剤としては、試料の添加や試料の蒸発や希釈による濃度の変化、外部からの多少の異物の混入によっても致命的な影響を生じない作用（緩衝作用）を持つものであれば特に制限はない。
【００８７】
本発明において、緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液（リン酸＋リン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム）、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン＋塩酸）、ＴＥ緩衝液（トリス＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＡＥ緩衝液（トリス＋酢酸＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス＋ホウ酸＋エチレンジアミン四酢酸）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸）、およびＢｉｃｉｎｅ緩衝液（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン緩衝剤）等が挙げられる。
【００８８】
好ましくは、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、および酢酸緩衝液などであり、より好ましくは、トリス塩酸緩衝液である。本発明のイムノクロマト検出系においては、悪影響を及ぼさない範囲内であれば２種以上の緩衝剤を用いることも可能であって、何ら制限されない。
【００８９】
本発明で使用する緩衝剤の濃度としては、１装置あたり１０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲が好ましく、１０ｍＭ〜３００ｍＭの範囲がより好ましく、３０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲がさらに好ましい。
【００９０】
濃度が１０ｍＭより低くなると緩衝作用が不十分になり、タンパク質成分の析出抑制や標識粒子の凝集抑制も不十分となる。５００ｍＭを超えると、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
また、緩衝液のｐＨ範囲は７．１〜９．８が最適である。
【００９１】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置中には、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異的反応を抑制することが公知の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するためのタンパク質（例えば、牛血清アルブミン、ゼラチン、およびカゼイン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびデキストラン等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、およびコンドロイチン硫酸等）、あるいは抗菌剤等の１種もしくは２種以上を添加して使用することも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
【００９２】
また、これらの抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物、イオン性界面活性剤又はポリアニオン、あるいは、抗菌剤等の１種もしくは２種以上を、固定相を構成するクロマトグラフ媒体部材上の、移動相の移動経路上に保持させておくことも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
【００９３】
本発明の検体希釈液やイムノクロマトグラフィー装置中に含有させる上記添加剤の濃度としては、１装置あたり０．０１質量％〜２０質量％の範囲が好ましく、０．１質量％〜１０質量％の範囲がより好ましく、０．５質量％〜５質量％の範囲がさらに好ましい。０．０１質量％未満では、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行えない。２０質量％を超えると、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
【００９４】
検体希釈液は、通常、溶媒として水を用い、上記の非イオン性界面活性剤、塩、および緩衝剤等の他に、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等の１種もしくは２種以上を加えてもよい。
【００９５】
加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。検出する検体と検体希釈液を予め混合した検体含有液を、試料滴下部材上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体を試料滴下部材上に供給・滴下した後、検体希釈液を試料滴下部材上に供給・滴下して展開させてもよい。
【００９６】
各種試薬をイムノクロマトグラフィー装置に含有させる場合、その方法としては、例えば、各種試薬を含有させる部位に塗布又は含浸させた後、乾燥させる方法により、当該部位に担持または保持させる態様とすることができる。
また、各部材の全体ではなく一部分にスポット的に各種試薬を含有させる場合は、例えば、部材をマスクした後にスプレーにより噴霧する方法などが挙げられる。
【００９７】
本発明の典型的なキット構成における判定の原理を以下の１〜６に説明する。下記は図１の装置を例とした説明である。
【００９８】
１．検体を検体希釈液で希釈処理した検体含有液を試料として、イムノクロマトグラフィー装置の試料滴下部材（１）（試料滴下部位１１）に、所定量（通常、０．１ｍＬ〜２．０ｍＬ）滴下する。検体含有液が滴下されると、検体含有液は試料滴下部材（１）に迅速に吸収され、速やかに酸無水物含有部材（７）へと移動を始める。
【００９９】
２．試料滴下部材（１）に設けられた亜硝酸化合物を含有する部位１２に保持された亜硝酸化合物は、移動してきた検体含有液の水分に溶解し、検体と共に移動する。
【０１００】
３．次いで、亜硝酸化合物を溶解して含有した検体含有液は、酸無水物含有部材（７）に保持された酸無水物と接触し、亜硝酸化合物と酸無水物とが反応して亜硝酸を生成する。この亜硝酸は検体中の検出対象に含まれる被検出物質を抽出する。
【０１０１】
４．次いで、標識物質保持部材（２）において、抽出された被検出物質は、標識物質含有部位２１に保持されていた標識試薬（第一試薬）によって標識化され、検体と共に移動する。
【０１０２】
５．次いで、検体含有液の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部材（３）上の検出部（４）を通過する。ここでは、検体含有液中に被検出物質が存在する場合、当該被検出物質は、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部（４）に担持固定されている抗体（第二試薬）と標識試薬（第一試薬）とによってサンドイッチ状に挟まれるように検出部に固定され、検出部（４）が着色することで、検出対象を検出できる。検体中に被検出物質が存在しない場合には、検体含有液の水分に溶解した標識試薬（第一試薬）は、クロマトグラフ媒体部材（３）上の検出部（４）を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部（４）が着色しない。
【０１０３】
６．最後に、検体含有液は、吸収部材（５）へと移動し吸収される。
【０１０４】
このようにして、検体中の被検出物質の有無を正確に判定することができる。
【０１０５】
＜イムノクロマト検出方法＞
本発明のイムノクロマト検出方法は以下の工程（ｉ）〜（ｖ）を含み、上記のイムノクロマトキットを用いて検体中の検出対象を検出する。
（ｉ）検体希釈液により検体を希釈して得られる検体含有液を試料滴下部材に滴下する工程
（ｉｉ）亜硝酸化合物と、酸無水物との反応により生成した亜硝酸により、検体中の検出対象から被検出物質を抽出する工程
（ｉｉｉ）標識物質保持部材において被検出物質を標識化する工程
（ｉｖ）検体含有液がクロマトグラフ媒体部材上を移動して、検出部において検出対象を検出する工程
（ｖ）検体含有液が、吸収部材により吸収される工程
各工程についての詳細は、判定の原理で上述した内容と同様である。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明の実施形態を実施例および比較例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
［実施例１］
＜イムノクロマトキットの作製＞
本実施例では、検体希釈液、および、亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部材（１）と、標識物質保持部材（２）と、ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物を含む酸無水物含有部材（７）と、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体部材（３）と、吸収部材（５）とをこの順に試料が展開されるように各部材を有するイムノクロマトグラフィー装置を含むイムノクロマトキットを作製した。
【０１０８】
（１）クロマトグラフ媒体部材（３）上への検出部（４）の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、２５０ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。５質量％のイソプロパノールを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにウサギ由来抗溶連菌ポリクローナル抗体（第二試薬）（Ｍｅｒｉｄｉａｎ社製）を希釈し、その希釈された溶液１５０μＬを抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）によりメンブレン上に１ｍｍの幅で塗布し、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部材（３）上に検出部（４）を作製した。
【０１０９】
（２）標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：平均粒子径４０ｎｍ）０．９ｍＬに、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で０．０３ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈したウサギ由来抗溶連菌モノクローナル抗体（Ｖｉｒｏｓｔａｔ社製）０．１ｍＬを加え、４℃で１０分間静置した。
次いで、０．０１質量％の片末端チオール化ポリエチレングリコール（日本油脂社製、分子量２０，０００）を含む、５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．１ｍＬ加え、十分撹拌した後、１５，０００Ｇで５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％の牛血清アルブミンを含む２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を０．１ｍＬ加え、標準物質溶液を作製した。
【０１１０】
（３）亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部材（１）の作製
２０ｍｍ×１００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に、３Ｍの亜硝酸ナトリウム水溶液０．５ｍＬを塗布し、減圧乾燥機にて室温で４時間乾燥させ、亜硝酸ナトリウムを含む試料滴下部材（１）を作製した。試料滴下部材（１）が含有する亜硝酸ナトリウムの量は１．５ｍｍｏｌである。また、７５μｍｏｌ／ｃｍ２である。
【０１１１】
（４）酸無水物含有部材（７）の作製
ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物をジエチルホルムアミドに溶解させ、５０ｍＭとした。調製した溶液を２０ｍｍ×１００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に含浸させ、２４時間減圧乾燥させ、酸無水物含有部材（７）を作製した。酸無水物含有部材（７）が含有するビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物の量は２０μｍｏｌである。また、１μｍｏｌ／ｃｍ２である。
【０１１２】
（５）イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記作製した標識物質溶液５０μＬに５０μＬの３０質量％トレハロース水溶液と４００μＬの脱イオン水を加えたものを８ｍｍ×１５０ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように塗布した後、減圧乾燥機にて室温で４時間乾燥させ、標識物質保持部材（２）を作製した。
【０１１３】
次に、バッキングシート（６）から成る基材に、試料滴下部材（１）、標識物質保持部材（２）と、酸無水物含有部材（７）、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体部材（３）、吸収部材（５）を試料展開方向に沿って、この順で連結するように貼り合わせ、実施例１で用いる装置とした（図３に示す順）。
【０１１４】
続いて、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー装置とした。当該装置における試料滴下部材（１）が含有する亜硝酸ナトリウムの量は７５μｍｏｌであり、７５μｍｏｌ／ｃｍ２である。また、当該装置における酸無水物含有部材（７）が含有する酸無水物の量は１μｍｏｌであり、１μｍｏｌ／ｃｍ２である。
【０１１５】
（６）検体希釈液の作製
０．５質量％のＴｗｅｅｎ２０、０．６質量％ポリビニルピロリドン（平均分子量３６万）、１質量％の牛血清アルブミンと１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのトリス緩衝溶液（ｐＨ８．０）からなる、検体を希釈しイムノクロマトグラフィー装置へ滴下し展開するための検体希釈液とした。
【０１１６】
＜測定＞
上記作製したイムノクロマトグラフィー装置および検体希釈液を用い、不活化したＡ群β溶血性連鎖球菌（溶連菌）を５×１０５ｏｒｇ／ｍＬとなるように加えたものを陽性検体試料とした。
該検体試料１５０μＬを前記装置の試料滴下部位に滴下し展開させ、５分後、目視判定を行った。検出部（４）上の赤い線を目視確認できるものを「＋」（陽性）、鮮明に目視確認できるものを「＋＋」（強陽性）、赤い線をうっすら目視確認できるものを「±」（弱陽性）、赤い線を目視確認できないものを「−」（陰性）とした。結果を表１に示す。
また上記とは別に、上記作製したイムノクロマトグラフィー装置を５０℃で２４時間保管した後、上記測定及び目視判定を行った。結果を表１に示す。
なお、上記溶連菌を加えない検体希釈液を陰性検体試料として測定も行ったところ、すべての例において陰性が確認された。
【０１１７】
また、本実施例及び比較例で使用した酸について、２５℃、２０Ｐａで昇華するか否かについて次の方法で確認した。まず、ガラスバイアルに各酸を１ｇ秤量し、２５℃、２０Ｐａで１２時間減圧した後の重量を測定した。重量の増減が５％以内である場合を昇華しないとし、重量の増減が５％を超える場合昇華するとして評価を行った。結果を表１に示す。表１中、「〇」は昇華しない、「×」は昇華する、「―」は未計測であることを示す。
【０１１８】
なお、本実施例及び比較例で使用した酸について、２５℃での蒸気圧及び２５℃の水に対する溶解度は、データベースの値（計算値）を用いた。表１中「―」で示す箇所の値は未確認である。
【０１１９】
また、展開を開始して５分後の検出部（４）上の赤い線の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス（株）製）で測定した。その結果、発色強度は８３．７ｍＡｂｓであった。結果をグラフとして図４に示す。
【０１２０】
［実施例２］〜［実施例６］、［参考例１］、［参考例２］、および［比較例１］〜［比較例９］
実施例１において、酸無水物の種類を表１に記載したものに変更したこと以外は、実施例１と同様にイムノクロマトキットを作製し、各種測定を行った。結果を表１に示す。
【０１２１】
［実施例７］
バッキングシート（６）から成る基材に、試料滴下部材（１）、酸無水物含有部材（７）、標識物質保持部材（２）、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体部材（３）、吸収部材（５）を試料展開方向に沿って、この順で連結するように貼り合わせた（図１に示す順）こと以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマトキットを作製し、発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス（株）製）で測定した。その結果、５分後の発色強度は４８．１ｍＡｂｓであった。結果をグラフとして図４に示す。
【０１２２】
［比較例１０］
酸無水物の「ビシクロ［２，２，２］オクト−７−エン−２，３，５，６−テトラカルボン酸二無水物」に替えて「りんご酸」を使用したこと以外は、実施例７と同様にしてイムノクロマトキットを作製し、５分後の発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス（株）製）で測定した。その結果、発色強度は４．１ｍＡｂｓであった。結果をグラフとして図４に示す。
【０１２３】
【表１】
2019219394.tif 000003
【０１２４】
表１および図４の結果から、実施例のイムノクロマトグラフィー装置は、従来の有機酸に替えて、特定の蒸気圧及び溶解度を有する酸無水物を含むパッドを使用しているので、比較例に比べて、保存安定性および検出感度が向上した。特に、一分子中に２以上の酸無水物基を有する酸無水物を含むパッドを使用した実施例１、２、５、６は、より良好な結果となった。
【符号の説明】
【０１２５】
１    試料滴下部材
１１  試料滴下部位
１２  亜硝酸化合物含有部位
２    標識物質保持部材
２１  標識物質含有部位
３    クロマトグラフ媒体部材
４    検出部
５    吸収部材
６    バッキングシート
７    酸無水物含有部材
８    亜硝酸化合物含有部材
【図１】
2019219394.tif 000004
【図２】
2019219394.tif 000005
【図３】
2019219394.tif 000006
【図４】
2019219394.tif 000007