(57)【要約】      （修正有）【課題】未利用資源であるメタンからペンタメチレンジアミンを効率的に生産する技術の提供。特に、ペンタメチレンジアミンの生産に必要な酵素をコードする核酸を導入したメタン資化性菌を用いて、ペンタメチレンジアミンを生産する技術の提供。【解決手段】ペンタメチレンジアミン生産のための酵素をコードする核酸が含まれている、天然に存在しないメタン資化性菌。当該微生物の典型的な例では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする核酸が含まれ、これらの酵素の発現量が高い発現レベルに誘導されることで、高濃度のペンタメチレンジアミンを生産することができるメタン資化性菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペンタメチレンジアミン生産のための酵素をコードする遺伝子を含有する組換えメタン資化性菌であって、当該酵素の発現が誘導されることによって、当該酵素を欠いているメタン資化性菌と比較して、ペンタメチレンジアミンの生産増加をもたらすことを特徴とする、組換えメタン資化性菌。
【請求項２】
前記酵素は、誘導剤の添加により、その発現が誘導されることを特徴とする、請求項１に記載のメタン資化性菌。
【請求項３】
前記酵素の発現が、テオフィリンの添加によって誘導されることを特徴とする、請求項１または２に記載のメタン資化性菌。
【請求項４】
前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のメタン資化性菌。
【請求項５】
前記Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＣａｄＡおよびＬｄｃ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのＣａｄＡ、並びにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣａｄＡからなる群より選択されるいずれか一種以上であることを特徴とする、請求項４に記載のメタン資化性菌。
【請求項６】
前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、アスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤａｐＡ）、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（ＤＤＨ）、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ＬｙｓＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、トランスヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡｓｐＣ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１〜５のいずれかに記載のメタン資化性菌。
【請求項７】
前記ＬｙｓＣ、ＤａｐＡ、ＰＥＰＣ、ＰＹＣは、フィードバック阻害が解除された変異型酵素であることを特徴とする、請求項６に記載のメタン資化性菌。
【請求項８】
前記ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤＰＨ依存性であることを特徴とする、請求項６に記載のメタン資化性菌。
【請求項９】
前記ＧＡＰＤＨは、対応する野生型酵素と比較して、ＮＡＤＰＨに対する親和性が向上した変異型酵素であることを特徴とする、請求項８に記載のメタン資化性菌。
【請求項１０】
前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも１つが、宿主微生物の染色体上に組み込まれていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のメタン資化性菌。
【請求項１１】
前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも１つが、該遺伝子を含むベクターとして宿主微生物に導入されていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のメタン資化性菌。
【請求項１２】
前記宿主微生物は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロアシドフィラム（Ｍｅｔｈｙｌｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のメタン資化性菌。
【請求項１３】
前記宿主微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）であることを特徴とする、請求項１２に記載のメタン資化性菌。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のメタン資化性菌にメタンを接触させ、当該微生物の生育に適した条件下で培養することによりペンタメチレンジアミンを生産させることを特徴とする、ペンタメチレンジアミンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペンタメチレンジアミンの生産が増強されたメタン資化性菌を提供し、さらに、メタンからペンタメチレンジアミンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペンタメチレンジアミン（１，５−ジアミノペンタン、またはカダベリンとも呼ばれる、分子式Ｃ５Ｈ１４Ｎ２を有する化合物である。）は、ポリアミド樹脂などの樹脂原料として需要が見込まれる物質である。石化原料からの効率的な化学合成法はいまだ確立されていない一方、生物的にはＬ−リジンの酵素的脱炭酸により容易に生成することが知られており、環境負荷の低減という観点から工業的に注目されている（非特許文献１）。
【０００３】
これまでは、特にグルコースなどの糖を原料としたペンタメチレンジアミンの発酵生産が盛んに研究されてきた。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍやＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉなどＬ−リジンを高生産できるよう改変された微生物にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現することで、高濃度の生産が達成されてきた（非特許文献１）。しかし、サトウキビ由来の糖などを培養原料とする微生物発酵法では、食料との競合が問題視されてきた。また、Ｌ−リジンから酵素的にペンタメチレンジアミンを製造する方法も広く知られているが（特許文献１）、やはりＬ−リジンも主に糖原料からの微生物発酵により製造されるため、食料との競合という本質的な問題は解決できない。したがって、食料と競合しない原料からの生物的なペンタメチレンジアミン製造法の開発が望まれている。
【０００４】
上記の要請に関連して、例えば、非食用原料としてメタノールを原料としつつ、メタノール資化性菌によってＬ−リジンおよびペンタメチレンジアミンを生産させた場合、それらが１０ｇ／Ｌ以上の高濃度で培養物中に蓄積されることが報告されている（非特許文献２、３）。しかしながら、これらの方法は毒性の高いメタノールを原料として用いるため低環境負荷のプロセスとは言えず、また、メタノールは１分子当たりの炭素比率が低いため、炭素を主成分とする有機物を生産する際に、原料から生産物への重量当たりの転換率が悪いという本質的な課題がある。
【０００５】
このような状況の中、近年微生物によりメタンから直接物質を生産する技術が注目を集めている。この生産技術においては、気体として供給されるメタンは生成物との分離性が良く、生物学的な毒性も低い。また、メタンは１分子当たりの炭素比率が高い原料であることから、当該原料から有機生産物への重量当たりの理論転換率も高い。さらに、メタンは、天然ガスなどに安価な未利用資源として豊富に含まれており、或いは余剰のバイオガスとしても豊富に利用できるため、次世代の炭素原料として期待されている。そして、天然にはメタンを単一の炭素源およびエネルギー源として生育可能なメタン資化性菌という微生物群が存在しており、これらの微生物の代謝を、所望の物質が生産できるように人為的に改変することで、メタンからある種の有用物質の生物的生産が可能であることも知られている（非特許文献４）。
【０００６】
したがって、同技術をペンタメチレンジアミン生産に応用することは大変魅力的な課題だが、これまでのところそのような報告例は無い。この点、ペンタメチレンジアミンの前駆体であるＬ−リジンの生産については、特許文献２に記載がある。当該文献では、メタン資化性菌中でフィードバック阻害を解除した、変異型アスパラギン酸キナーゼおよび変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素を発現し、或いはＬ−リジンのアナログ化合物に対する耐性確立を当該メタン資化性菌において行うことにより、メタンからのＬ−リジンの生産濃度向上を達成している。しかし、それらの改変にもかかわらず、当該メタン資化性菌の３０ｍＬ容試験管を用いたバッチ培養条件におけるＬ−リジンの生産濃度はわずか９．３７ｍｇ／Ｌであり、バイオリアクターで高濃度メタンを連続供給する条件であっても２２３ｍｇ／Ｌにとどまっている。このことは、Ｌ−リジンの脱炭酸生成物であるペンタメチレンジアミンの高生産も、単純に当該物質の生産に必要な遺伝子を発現するだけでは実現できない可能性を示唆している。
【０００７】
一方で、メタンから生物的に生産可能な物質の種類、数はいまだ限定的である（非特許文献５）。また、生産された物質の濃度や生産効率も、グルコースやメタノールを培養原料とした場合に比べると著しく低い。すなわち、物質生産の効率は、菌体濃度の指標であるＯｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）当たりの生産濃度（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）を算出することで評価できるが、実際のところ公知事例の多くにおいて、この生産効率（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）は非常に低い（非特許文献５、６、特許文献３）。例えば、非特許文献６では、乳酸脱水素酵素をメタン資化性菌で発現することで、メタンからの乳酸生産を達成している。しかしながら、その生産効率は３２ｍｇ／Ｌ／ＯＤと著しく低く、原料として供給した全メタンの６０％が菌体生成に浪費されたことになる。
【０００８】
このように、メタンは次世代炭素原料としてその活用が強く期待されながら、メタン資化性菌によるメタンからのペンタメチレンジアミン生産を実現した例はない。そのうえ、他の化合物生産に関する従来技術でも、その生産濃度や汎用性は限定的であったことを考慮すれば、メタン資化性菌によるペンタメチレンジアミン生産が、実用的なプロセスとは言い難かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
特許文献１：  特開２００８−１９３８９９号公報
特許文献２：  特開２００１−１２０２９２号公報
特許文献３：  ＷＯ２０１５／１５５７９１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
非特許文献１：  Ｔｓｕｇｅ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．，Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．，Ｖｏｌ．，１５，１９（２０１６）
非特許文献２：  Ｉｒｌａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ：  ｔｈｅｔａ−  ａｎｄ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．７，１４８１（２０１６）
非特許文献３：  Ｂｒａｕｔａｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ：  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ａｔ  ５０℃．，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．  ７４（２００７）
非特許文献４：  Ｋａｌｙｕｚｈｎａｙａ，Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．２９，１４２−１５２（２０１５）
非特許文献５：  Ｌｅｅ，Ｏ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔｈａｎｅ．，Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，  Ｂｉｏｐｒｏｄ．  Ｂｉｏｒｅｆ．，Ｖｏｌ．  １０，６（２０１６）
非特許文献６：  Ｈｅｎａｒｄ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｔｏ  ｌａｃｔａｔｅ  ｂｙ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．６，２１５８５（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の現状に鑑み、本発明の課題は、次世代炭素原料として期待されるメタンからペンタメチレンジアミンを生産する技術を提供することにある。また、当該ペンタメチレンジアミン生産に有用な組換えメタン資化性菌を提供することにある。好ましい本発明の態様では、メタンからの生物的物質生産では過去に前例のない高い効率でペンタメチレンジアミンを生産する技術が提供されることを意図する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記のとおり、メタン資化性菌によるメタンからのペンタメチレンジアミン直接生産が可能ならば大変有望だが、そのような報告例はなかった。一方、ペンタメチレンジアミンの前駆体であるＬ−リジンのメタン資化性菌による生産は報告されていたものの、その生産濃度は極めて低かったため、ペンタメチレンジアミンの高生産化も困難であろうことが合理的に予想された。しかしながら、本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、本発明のメタン資化性菌を用いることにより、ペンタメチレンジアミンを高生産できることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明者らは、以前からＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子を恒常発現する配列を含むベクターをメタン資化性菌へ導入することを試みていたが、そのような形質転換体自体を得ることすら、実現できていなかった。そこで、本発明者らは、本発明の発現誘導システムを用いることを試み、それによって上記形質転換体の取得効率を著しく向上できることを見出した。それだけでなく、本発明によりＬ−リジン生合成酵素およびＬ−リジン脱炭酸酵素の発現を高レベルに誘導することで、メタンからの生物的物質生産において過去に前例のない高い効率でペンタメチレンジアミンを生産できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
例えば、本発明者らが、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を発現した本発明の組換えメタン資化性菌を培養したところ、わずか２４時間で３１．６ｍｇ／Ｌものペンタメチレンジアミンを生産できることが明らかになった。これは、特許文献４に記載された、６５時間培養によるＬ−リジンの蓄積濃度（９．３７ｍｇ／Ｌ）およびそのような生産速度のいずれをも大きく上回るものであった。さらに、本発明者らは、Ｌ−リジンの生産向上に寄与する遺伝子も当該メタン資化性菌で発現させたところ、物質生産効率（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）はさらに著しく向上し、メタン供給の限られたラボスケール（〜ｍＬ）のバッチ培養であっても１２４ｍｇ／Ｌもの高濃度での物質生産が可能であることを見出した。また、ペンタメチレンジアミンの生産効率は、ペンタメチレンジアミンの生産のための酵素の発現強度に大きく依存することも明らかとなった。この事実は、高い効率でペンタメチレンジアミンの生産を行うためには、ペンタメチレンジアミンの生産に必要な酵素を高いレベルで発現誘導できる技術が重要であることを裏付けるものであった。
【００１５】
すなわち本発明は以下を提供する：
（１）ペンタメチレンジアミン生産のための酵素をコードする遺伝子を含有する組換えメタン資化性菌であって、当該酵素の発現が誘導されることによって、当該酵素を欠いているメタン資化性菌と比較して、ペンタメチレンジアミンの生産増加をもたらすことを特徴とする、組換えメタン資化性菌；
（２）前記酵素は、誘導剤の添加により、その発現が誘導されることを特徴とする、上記（１）のメタン資化性菌；
（３）前記酵素の発現が、テオフィリンの添加によって誘導されることを特徴とする、上記（１）または（２）のメタン資化性菌；
（４）前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする、上記（１）〜（３）いずれかのメタン資化性菌；
（５）前記Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＣａｄＡおよびＬｄｃ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのＣａｄＡ、並びにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣａｄＡからなる群より選択されるいずれか一種以上であることを特徴とする、上記（４）のメタン資化性菌；
（６）前記ペンタメチレンジアミン生産のための酵素は、アスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤａｐＡ）、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（ＤＤＨ）、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ＬｙｓＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、トランスヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡｓｐＣ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）からなる群より選択されるいずれか１種以上である、上記（１）〜（５）いずれかのメタン資化性菌；
（７）前記ＬｙｓＣ、ＤａｐＡ、ＰＥＰＣ、ＰＹＣは、フィードバック阻害が解除された変異型酵素であることを特徴とする、上記（６）のメタン資化性菌；
（８）前記ＧＡＰＤＨが、ＮＡＤＰＨ依存性であることを特徴とする、上記（６）のメタン資化性菌；
（９）前記ＧＡＰＤＨは、対応する野生型酵素と比較して、ＮＡＤＰＨに対する親和性が向上した変異型酵素であることを特徴とする、上記（８）のメタン資化性菌；
（１０）前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも１つが、宿主微生物の染色体上に組み込まれていることを特徴とする、上記（１）〜（９）いずれかのメタン資化性菌；
（１１）前記酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも１つが、該遺伝子を含むベクターとして宿主微生物に導入されていることを特徴とする、上記（１）〜（９）いずれかのメタン資化性菌；
（１２）前記宿主微生物は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロアシドフィラム（Ｍｅｔｈｙｌｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、からなる群から選択されることを特徴とする、上記（１）〜（１１）いずれかのメタン資化性菌；
（１３）前記宿主微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）であることを特徴とする、上記（１２）のメタン資化性菌；
（１４）上記（１）〜（１３）いずれかのメタン資化性菌にメタンを接触させ、当該微生物の生育に適した条件下で培養することによりペンタメチレンジアミンを生産させることを特徴とする、ペンタメチレンジアミンの生産方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ペンタメチレンジアミンの生産に必要な酵素をメタン資化性菌の細胞内に発現誘導することで、高濃度のペンタメチレンジアミンを生産することができる。さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素に加えて、アスパラギン酸キナーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素などのＬ−リジン生合成酵素を発現誘導することで、メタンからペンタメチレンジアミンを高い効率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ｐｍｋ６１Ａのプラスミドマップである。図中、「Ｐｔｒｃ」はｔｒｃプロモーターを、「ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ」はリボスイッチ配列を、「ＲＢＳ」はリボソーム結合配列を、「ＧＦＰ」はｓｆＧＦＰ遺伝子を、「ｍｏｂ」はｍｏｂ遺伝子を、「ｋａｎＲ」はカナマイシン耐性遺伝子を、「Ｒｅｐ］は複製起点を、それぞれ、示している。
【図２】図２は、ｐｍｋ６１Ａを導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける、テオフィリン添加濃度とＧＦＰ蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図３】図３は、ｐｍｋ９６、ｐｍｋ９９、ｐｍｋ１２７、ｐｍｋ１６７、ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２のプラスミドマップである。図中、「Ｐｔｒｃ」はｔｒｃプロモーターを、「Ｐｔｒｃ  Ｅ＊」はリボスイッチ配列と連結されたｔｒｃプロモーターを、「ＲＢＳ」はリボソーム結合配列を、「Ｔ１」はターミネーターを、「ｍｏｂ」はｍｏｂ遺伝子を、「ｋａｎＲ」はカナマイシン耐性遺伝子を、「Ｒｅｐ］は複製起点を、「ｃａｄＡ（Ａ．ｓ）」はＡｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのｃａｄＡを、「ｃａｄＡ（Ｅ．ｃ）」はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡを、「ｃａｄＡ（Ｋ．ｐ）」はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｃａｄＡを、「ｌｙｓＣＴ３５２Ｉ」はフィードバック阻害を解除されたＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのアスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）変異体を、「ｄａｐＡＥ８４Ｔ」はフィードバック阻害を解除されたＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのジヒドロジピコリン酸合成酵素（ｄａｐＡ）変異体を、それぞれ、示している。
【図４】図４は、ｐｍｋ９９（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのｃａｄＡを発現）、ｐｍｋ１２７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡを発現）、ｐｍｋ１６７（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｃａｄＡを発現）をそれぞれ導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの４８時間培養における、細胞増殖（ａ）とペンタメチレンジアミン生産量（ｂ）の関係を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにｐｍｋ１４１（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのｃａｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入したＳｔｒａｉｎ  １、ｐｍｋ１４２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入したＳｔｒａｉｎ  ２の４８時間培養における、細胞増殖（ａ）とペンタメチレンジアミン生産量（ｂ）の関係を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにｐｍｋ１４１（Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのｃａｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入したＳｔｒａｉｎ  １、ｐｍｋ１４２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉのｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入したＳｔｒａｉｎ  ２の９６時間培養における、細胞増殖（ａ）とペンタメチレンジアミン生産量（ｂ）の関係を示すグラフである。図６ｃにおける、「１  本発明」は、Ｓｔｒａｉｎ  ２におけるペンタメチレンジアミンの生産効率（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）を、「２」は非特許文献３に記載されたＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ  ５ＧＢ１の５Ｌバイオリアクター培養による乳酸生産の効率を、「３」はＷＯ２０１５／１５５７９１に記載されたＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの３０ｍＬ試験管培養によるコハク酸生産の効率を、「４」は非特許文献３に記載されたＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ  ５ＧＢ１の０．５Ｌバイオリアクター培養による乳酸生産の効率を、それぞれ示している。
【図７】図７は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにｐｍｋ１４２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡ、ｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入した株を様々な濃度のテオフィリン添加条件下で４８時間培養したときの、テオフィリン濃度とペンタメチレンジアミンの生産効率との関係を示すグラフである。図中、「Ｎ．Ｄ．」はペンタメチレンジアミンが検出下限以下であったことを示す。また、図中の点線は、メタンからの物質生産分野における先行技術の中で最も生産効率の高い、非特許文献３に記載されたＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ  ５ＧＢ１の５Ｌバイオリアクター培養による乳酸生産の効率を示す。
【図８】図８は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにｐｍｋ１４２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｃａｄＡ、ｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔを発現）を導入した株を１Ｌの通気攪拌培養装置にて培養した際の細胞増殖とペンタメチレンジアミンの生産濃度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明について、以下具体的に説明する。
【００１９】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産に使用するためのメタン資化性菌を提供する。上記微生物は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を含んでいる。Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジンのペンタメチレンジアミンおよびＣＯ２への変換を触媒する酵素である。Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、ＥＣ  ４．１．１．１８（Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性）かつＧＯ：０００８９２３の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。上記酵素をコードする遺伝子のソースとしては、メタン資化性菌中で各々の酵素の活性を発現できるいかなる微生物由来のものでも使用できる。その例としては、特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｓａｌｅｎｏｍｏｎａｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｄａｖｅｒｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ等が挙げられる。さらに好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。しかし、今では５００を超える種（これらの半分以上はＮＣＢＩなどの公開データベースで利用可能）について完全なゲノム配列が利用可能であり、例えば、公知配列をもとにした類縁配列の同定や所望の活性を有する変異体の作製を実施できるだけでなく、メタゲノムなどの天然サンプルから新たに分離同定することも当技術分野では日常的であり周知である。よって、Ｌ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子ソースは、上記の微生物に限定されない。
【００２０】
好ましい実施形態において、前記微生物はＬ−リジン生合成酵素のうち少なくとも１つの活性が増強されている。上記酵素は特に限定されないが、例えば、アスパラギン酸キナーゼ（ＬｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ＤａｐＡ）、ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（ＤＤＨ）、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素（ＬｙｓＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡｓｐＣ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）等が挙げられる。
【００２１】
アスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）は、アスパラギン酸およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を４−ホスホアスパラギン酸とアデノシン二リン酸に変換する反応を触媒する酵素である。ｌｙｓＣは、ＥＣ  ２．７．２．４（アスパラギン酸キナーゼ活性）かつＧＯ：０００４０７２の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。この酵素をコードしている遺伝子のソースの例としては、特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等が挙げられる。本酵素活性はすべての生物が保有するため、宿主細胞であるメタン資化性菌由来のものでも良いし、必要に応じて外来遺伝子を導入することも有効である。また、野生型のｌｙｓＣは、Ｌ−リジンによってフィードバック阻害されることが一般的に認知されている。したがって、フィードバック阻害が解除される変異を有するものが好ましい。以下、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ由来のｌｙｓＣを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子はこれらに限定されるものではない。Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型のｌｙｓＣとしては、そのアミノ酸配列において３５２番目のトレオニン残基がイソロイシン残基に置換されたもの、２５３番目のトレオニン残基がアルギニン残基に置換されたものなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
ジヒドロジピコリン酸合成酵素（ｄａｐＡ）は、ピルビン酸およびアスパラギン酸セミアルデヒドを（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２，３，４，５−テトラヒドロ−（２Ｓ）−ジピコリン酸と水に変換する反応を触媒する酵素である。ｄａｐＡは、ＥＣ  ４．３．３．７（ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性）かつＧＯ：０００８８４０の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。この酵素をコードしている遺伝子のソースの例としては、特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等が挙げられる。本酵素活性はすべての生物が保有するため、宿主細胞であるメタン資化性菌由来のものでも良いし、必要に応じて外来遺伝子を導入することも有効である。また、野生型のｄａｐＡの酵素活性は、Ｌ−リジンによってフィードバック阻害されることが一般的に認知されている。したがって、フィードバック阻害が解除される変異を有するものが好ましい。以下、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ由来のｄａｐＡを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子はこれらに限定されるものではない。Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型のｄａｐＡとしては、そのアミノ酸配列において８１番目のアラニン残基がバリン残基に置換されたもの、８４番目のグルタミン酸残基がトレオニン残基に置換されたもの、１１８番目のヒスチジン残基がアルギニン残基またはチロシン残基に置換されたもの、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、リン酸およびＮＡＤ（Ｐ）＋を１，３−ビスホスホグリセリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換する反応を触媒する酵素である。また、当反応は可逆反応であることが一般的に認識されている。ＧＡＰＤＨは、ＥＣ  １．２．１．１２かつＧＯ：０００８９４３の遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語ＩＤに属している酵素反応、もしくはＥＣ  １．２．１．１３かつＧＯ：００４７１００のＧＯ用語ＩＤに属している酵素反応を触媒する。この酵素をコードしている遺伝子のソースの例としては、特に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ等が挙げられる。本酵素活性は数多くの生物が保有するため、宿主細胞であるメタン資化性菌由来のものでも良いし、必要に応じて外来遺伝子を導入することも有効である。
【００２４】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産性を向上するための有効な手段としては、細胞内のＮＡＤＰＨ濃度を上昇させることが挙げられる。１分子のペンタメチレンジアミン（Ｌ−リジン）の生産には４分子ものＮＡＤＰＨを要する。そのため、ペンタメチレンジアミン（Ｌ−リジン）の生産性向上の戦略として、細胞内のＮＡＤＰＨ濃度上昇を企図した代謝改変が数多く利用されてきた。例えば、グルコースを培養原料としたペンタメチレンジアミンの発酵生産においては、主要なグルコース異化経路を酸化的ペントースリン酸経路とすることで細胞内ＮＡＤＰＨ生産、およびペンタメチレンジアミンの生産性を向上させている（Ｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２５，１１３−１２３（２０１４））。メタン資化性菌はグルコースを資化できず、ゆえに酸化的ペントースリン酸経路の代謝フラックスを増強する前記方法が活用できない。好適なＮＡＤＰＨの代替発生源としては、トランスヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨからＮＡＤＰ＋への電子授受反応が挙げられる。あるいは、メタン資化性菌が有するＧＡＰＤＨの多くはＮＡＤＨ依存型であるため、本発明においてはＮＡＤＰＨ依存型のＧＡＰＤＨの過剰発現またはＮＡＤＨ依存型のそれとの置換により、細胞内ＮＡＤＰＨ濃度を上昇させることもできる。ＮＡＤＰＨ依存型のＧＡＰＤＨとしては、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のもの、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ由来のもの、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．由来のもの、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のもの、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来のもの等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本来ＮＡＤＨ依存型であったＧＡＰＤＨをＮＡＤＰＨ依存型へ改変する手法も一般的に認識されており（Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２５，３０−３７（２０１４））、本発明においても適用しうる。以下、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のＧＡＰＤＨを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子はこれらに限定されるものではない。ＮＡＤＰＨ依存性の変異型ＧＡＰＤＨとしては、そのアミノ酸配列において３５番目のアスパラギン酸残基がグリシン残基に置換されたもの、３６番目のロイシン酸残基がアルギニン残基に置換されたもの、１９２番目のプロリン残基がセリン残基置換されたもの、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産効率は、ペンタメチレンジアミンの生産濃度（ｍｇ／Ｌ）と、細胞濃度の指標であるＯＤ６００の比（ｍｇ／Ｌ／ＯＤ）で表現される。微生物による物質生産においては細胞バイオマスは副生物であるため、その生成量を抑え、目的物質の収率を最大化することが望ましい。すなわち、ｍｇ／Ｌ／ＯＤが可能な限り大きいことが望ましい。本発明において提供されるメタン資化性菌においては、ペンタメチレンジアミンの生産効率を最大化できるように酵素の発現量が調節されている。
【００２６】
本発明において、ペンタメチレンジアミンは当業者に周知の技術によって定量できる。例えば、イオンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどによる方法が挙げられる。また、本発明において、ＯＤ６００は、培養サンプル中の細胞密度を間接的に表す指標である。細胞密度（細胞数／ｍＬ）とＯＤ６００は、一定の条件下では相関することが一般的に認識されている（Ｖｏｌｋｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｖｏｌ．６，ｅ２３１２６（２０１１））。ＯＤ６００は、当業者に周知の技術によって定量でき、一般的には光路長１ｃｍとしたときの６００ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定することで決定される。
【００２７】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産に必要な酵素は、上記のＬ−リジンを前駆体とした生産経路に属する酵素群に限定されない。一般にアミンは、対応するアルデヒドからアミノ基転移酵素により生成する。さらに、アルデヒドは、対応するアルコール、カルボン酸、アルカンからの酸化還元反応を設計することで生成することができる。よって、ペンタメチレンジアミンは、５−アミノペンタナール、５−アミノペンタノール、５−アミノ吉草酸、５−アミノペンタン、５−ペンタナール、吉草酸、５−ペンタノール、ペンタン、５−ホルミルペンタナール、５−ホルミルペンタノール、５−ホルミルペンタン酸、５−カルボキシペンタナール、５−カルボキシペンタノール、グルタル酸、５−ヒドロキシペンタナール、５−ヒドロキシペンタノール、５−ヒドロキシ吉草酸などの化合物を前駆体として生成することができる。例えば、脂肪酸生合成で生成しうる吉草酸を、アルカン酸化酵素によって５−ヒドロキシ吉草酸へ変換すれば、ペンタメチレンジアミンの前駆体となりうる。また、吉草酸や５−ペンタナール、５−ペンタノールはＬ−ロイシン生合成経路遺伝子を活用した炭素鎖延長反応によりピルビン酸から生成することも可能である（Ｍａｒｃｈｅｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，６８９−６９７（２０１２）、Ｄｈａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４７，１９６５−１９７１（２０１２））。
【００２８】
本発明における「発現誘導」とは、特定条件および期間においてのみ特定の遺伝子の発現量を増加させることを意味する。具体的な発現誘導の方法としては、誘導剤の添加や培養条件（温度、栄養素濃度、光）などの培養環境を人為的に変化させるものの他、培養に伴う培養環境の非人為的変化を利用するもののいずれか、またはその組み合わせから選択できる。メタン資化性菌では、前記いずれの方法においても発現誘導が可能であることが一般的に認識されている。例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．のゲノムＤＮＡから、特定の培養環境下において、特定の遺伝子の発現を誘導しうる発現プロモーター配列が特定されている（ＷＯ２０１５／１９５９７２号パンフレット）。また、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ  ５ＧＢ１株においては、テトラサイクリン誘導型のプロモーターが発現誘導システムとして良好に機能することが示されている（Ｈｅｎａｒｄ，Ｃ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｔｏ  ｌａｃｔａｔｅ  ｂｙ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．６，２１５８５（２０１６））。すなわち、本発明における発現誘導は、一般的に認知されている発現誘導システムを任意に選択し利用することができる。したがって、本発明における公的な発現誘導の１態様は、後記実施例のリボスイッチであるが、それに限定されない。
【００２９】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産のための酵素は、達成したい生産効率に応じて、その発現量が適宜調節され得る。発現量の調節方法としては、特に限定されないが、人為的な発現誘導システムの利用、動的な発現制御システムの利用（Ｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３１，１０３９−１０４６（２０１４）、Ｄｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．１１５，２９６４−２９６９（２０１８））、発現プロモーター配列の変更、リボソーム結合配列の変更（Ｓａｌｉｓ，Ｈ．Ｍ．，Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．４９８，１９−４２（２０１１））、発現される酵素をコードする遺伝子のコドン最適化（Ｑｕａｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ  Ｂｉａｓ  ａｓ  ａ  Ｍｅａｎｓ  ｔｏ  Ｆｉｎｅ−Ｔｕｎｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，Ｖｏｌ．５９，２（２０１５））、可溶性タグの導入や分子シャペロンの共発現による酵素の可溶性向上（Ｒｏｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，（２０１４））、プロテアーゼの欠失などが挙げられ、またこれらの組み合わせであってもよい。誘導剤の量や添加のタイミングなどで発現の柔軟な調整が可能なことから、人為的な発現誘導システムの利用が好ましい１態様である。人為的な発現誘導の方法としては、特に限定されないが、例えば、ｌａｃＯ、ｔｅｔＯ、Ｔ７などの転写制御型のものや、リボスイッチに代表される翻訳制御型のものが挙げられる。また、細胞間情報伝達機構（クオラムセンシング）を利用した自律的な発現誘導システム（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．４４，３２５−３３６（２０１７））や光を誘導シグナルとして利用した安価な発現誘導方法（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２０１８））等を用いることも可能である。
【００３０】
本発明において、ペンタメチレンジアミンの生産に必要な酵素の発現量は、当業者にとって周知の技術により評価でき、直接的には前述したペンタメチレンジアミンの生産効率で評価できる（図７）。それ以外にも、発現された酵素の比活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫沈降法などにより評価することも可能である。例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の活性は当業者に周知の手法で定量することができ、具体的に例示すれば、無細胞抽出液に基質（Ｌ−リジン）、ピリドキサール−５−リン酸、反応バッファー等を加えることで容易に実施できる（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，Ｖｏｌ．１３３，８８−９４（２０１６））。
【００３１】
本発明において、宿主細胞の増殖阻害がない誘導剤濃度の範囲においてペンタメチレンジアミンの生産効率、生産濃度等、または酵素の比活性が最大付近であるとき、「最適な発現量」を得た、または「高レベルに発現（誘導）」したと判断できる。また、ＧＦＰやＬａｃＺタンパク質などのレポーター遺伝子を導入して間接的に発現量を評価することも可能である。例えば、ＧＦＰであれば、宿主細胞の増殖を阻害しない誘導剤の濃度範囲で、細胞あたりのＧＦＰ蛍光が最大付近であるとき、「最適な発現量」を得た、または「高レベルに発現」したと判断できる（図２）。しかしながら、発現コンストラクトの構造や酵素ごとの発現効率が異なることなどが原因で、発現したい酵素の発現量とレポータータンパク質のそれとが相関しないことも稀に見られる（Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２２，７６−８２（２０１４））。
【００３２】
これらによって特定した最適な発現量は、他の発現誘導システムに置換したり、最適発現量と同等の発現量を実現できることが分かっている恒常発現システムで置換してもよい。以下に、その手順の一例を説明するが、本発明に用いる遺伝子や発現コンストラクト等はこれに限定されない。例えば、発現誘導システムにより得られたペンタメチレンジアミンの生産濃度の最大値を、恒常発現システムで再現する方法は次のとおりである。まず、ペンタメチレンジアミン生産濃度の最大値が得られる誘導剤添加濃度を決定する。次に、発現遺伝子をペンタメチレンジアミンの生産酵素からＧＦＰへ置き換え、同濃度の誘導剤添加で誘導したときのＧＦＰ蛍光強度（ＧＦＰ／ＯＤ）を定量し、これを最適な発現量とする。恒常発現システムに置き換える場合には、この最適発現量と同等の発現を実現しうるプロモーターを選択するか、既存のプロモーターを改変する等によって、恒常発現システムへの置き換えが可能である。すなわち、本発明において、高い生産効率の実現に本質的な酵素の発現は、発現誘導に限定されない。恒常発現システムの例としては、達成したい発現量に応じて、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、メタンモノオキシゲナーゼプロモーター、リボソームタンパク質プロモーター、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素プロモーター、ホスホヘキスロースイソメラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、λファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター等から１種または２種以上の組み合わせとして選択できる。しかしながら、恒常発現システムにより発現したい遺伝子が宿主細胞の生育と競合したり毒性を有する場合には、最適な発現量を恒常的に保とうとすることによって形質転換体を得られないこともありうる。
【００３３】
本発明の発現誘導の好適な１態様で用いられるリボスイッチとは、特定の低分子化合物と選択的に結合するＲＮＡのことをいい、当該低分子化合物をリガンドと呼ぶ。リガンド非存在下ではＲＮＡ塩基対による二次構造を形成し、リボスイッチ周辺の核酸へ影響を与える。特に、リボスイッチの下流にリボソーム結合部位を含む場合には、リボソームのリボソーム結合部位への接近を妨げることで、さらに下流に位置する遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨げる。一方、リガンド存在下では、リガンド結合に伴う二次構造解消を通じて、リボソームがリボソーム結合部位へ接近できる。そのため、リガンド添加時のみ遺伝子のｍＲＮＡが翻訳され、目的遺伝子の発現誘導が達成される。
【００３４】
本発明における「リガンド」は特に限定されるものではない。それは当該リガンド非存在下のリボスイッチの二次構造を解消できるものであればよく、天然由来のもの、これを改変したもの、人工的に設計改変されたもののうち１つもしくはいずれをも選択できる。
【００３５】
本発明におけるリボスイッチは、特に限定されるものではなく、リガンド結合に伴い二次構造変化が生じるＲＮＡであればよい。例えば、テオフィリン応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、サイクリックジＧＭＰ応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチ、グルコサミン−６−リン酸応答性リボスイッチ、グルタミン応答性リボスイッチ、グリシン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、ｐｒｅＱ１応答性リボスイッチ、プリン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、Ｓ−アデノシルホモシステイン＆Ｓ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、モリブデン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチが挙げられるが、これらに限定されない。リボスイッチは、すでに天然に存在することが知られているもの、新たに天然から単離されたもの、人工的に設計されたもの、いずれでもよく、また、１つもしくは複数を組み合わせてもよい。
【００３６】
本発明におけるリボスイッチは、好ましくはテオフィリン応答性リボスイッチである。テオフィリン応答性リボスイッチは、テオフィリン非存在下のＲＮＡ二次構造がテオフィリン結合によって解消されるものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：２）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＴＧＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：３）、５’−ＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：４）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：５）、５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：６）などの配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましくは５’−ＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：１）の配列を有する。
【００３７】
また、リガンドであるテオフィリンはテオフィリンの誘導体であってもよい。リガンドとして本発明の形質転換体の培養に添加されるテオフィリン又はその誘導体の濃度は０．１〜１０ｍＭが好ましいが、これに限定されない。
【００３８】
本発明におけるリボスイッチは、天然もしくは人工のプロモーターの下流に配置され、それにより当該プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、発現遺伝子の上流に位置するＤＮＡであって、宿主微生物のＲＮＡポリメラーゼを鋳型ＤＮＡへ引き寄せるプロモーター配列を含む。
【００３９】
本発明におけるプロモーターは特に限定されず、メタン資化性菌において作動するものであればよい。ゆえに、メタン資化性菌に由来する核酸に限らず天然に存在するもの、または人工的に設計、改変されたものでもよい。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼプロモーター、メタンモノオキシゲナーゼプロモーター、リボソームタンパク質プロモーター、ヘキスロース−６−リン酸合成酵素プロモーター、ホスホヘキスロースイソメラーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、λファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーターなどが挙げられる。また、本発明のプロモーターとしては、達成したい発現量性質に応じて、恒常性、誘導性いずれをも選択でき、１つもしくは複数を組み合わせることができる。本発明における好ましいプロモーターの例として、ｔｒｃプロモーターを挙げることができる。
【００４０】
本発明における核酸は、リボソーム結合配列を含む。リボソーム結合配列は、一般に４塩基から１０塩基の長さからなる核酸であり、リボソームとｍＲＮＡを結合させ翻訳の開始に必要である。アデニンもしくはグアニンに富む特徴を有するが、特に限定されるものではなく、メタン資化性菌において作動可能であればよい。したがって、本発明のリボソーム結合配列は、天然に存在する配列でも、人工的に設計された配列でもよく、達成したい性能や目的に応じて適したものを選択することができる。例えば、非特許文献３に示されるように、達成したい遺伝子発現量に応じて、任意に設計することができる。本発明のリボソーム結合配列の好ましい例としては、５’−ＡＡＧＧＡＧＧ−３’を有する配列を挙げることができる。これらのリボソーム結合配列は、典型的には、本発明のリボスイッチの下流に配置され、それにより当該リボスイッチに作動可能に連結される。したがって、本発明の好適な態様は、リボスイッチが天然もしくは人工的なプロモーターの下流に配置され、リボソーム結合配列がリボスイッチの下流に配置された核酸である。
【００４１】
なお、本発明において、「作動可能に連結される」とは、両配列が直結される場合、および適当な数の塩基を介して連結される場合のいずれも含む。例えば、プロモーターとリボスイッチとの間には、既知のプロモーターの近傍に見出される余剰配列、および更に適当な数の塩基からなるスペーサーが存在していてもよい。また、リボソーム結合配列とリボスイッチが適当な数の塩基からなるスペーサーを介して連結されていてもよい。当該スペーサーの長さは、典型的には１〜２０塩基、好ましくは５〜１０塩基であり得る。
【００４２】
本発明における形質転換体は、メタン資化性菌において遺伝子発現誘導を可能にするＲＮＡをコードする核酸を含む。そのような本発明の核酸は、ベクターもしくは染色体上に組み込むことが可能である。組み込むべき核酸が２以上の場合、それらの全てがベクターに組み込まれてもよいし染色体上に組み込まれてもよく、或いはそのうちの一部をベクターに、他のものを染色体上に組み込んでもよい。
【００４３】
本発明における核酸がベクターに含まれる場合、当該ベクターは特に限定されるものではないが、例えば、メタン資化性菌細胞内での自律的複製を可能にする複製起点、選択マーカー、接合伝達起点を含むことができる。ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の手段により行われ得る。例えば、接合伝達法やエレクトロポレーション法などを挙げることができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７３，  ８１−８８    （１９９８））。
【００４４】
本発明における核酸を、宿主細胞であるメタン資化性菌の染色体上に組み込むことも好適な態様である。そのような組み込みも当業者に公知の手段により行われ得る。例えば、Ｃｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １４９，  １７８５−１７９５  （２００３）に記載の方法などを挙げることができる。
【００４５】
本発明におけるメタン資化性菌としては、既に単離保存されているものでも、新たに天然から分離したもの、遺伝子改変されたもの、メタンを代謝できるよう改変された大腸菌や酵母、メタノール資化性菌といった非メタン資化性菌などいずれをも任意に選択できる。本発明におけるメタン資化性菌としては、特に限定されないが、例えばメチルアシドフィラム（Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｐｈｉｌｕｍ）、メチロセラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ）、メチロテネラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ）、メチロファーガ（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロサーマス（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、メチロマリナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍａｒｉｎｕｍ）、メチロバルム（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｕｌｕｍ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサーモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メタノサルキナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノゲニウム（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノハロフィラス（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノマイクロビウム（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ）、メタノコッコイド（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、メタノサエタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）、メタノロバス（Ｍｅｔｈａｎｏｌｏｂｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などに属する微生物から選択でき、さらに好ましくは、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）である。
【００４６】
本発明の形質転換体は、宿主細胞の生育に適した公知の培養方法により培養することができる。例えば、本発明で用いられる培地は、メタンを炭素源として含み、さらに窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は、好気的もしくは嫌気的いずれも選択することができ、振盪培養、静置培養または通気攪拌培養など目的に応じて選択できる。
【００４７】
例えば、密閉系で振盪あるいは静置培養を行う場合には、培地と接する気相中にメタンガスを１〜７５％添加する。開放系で通気培養を行う場合には、メタンガスを１〜７５％含む混合ガスを吹き込む。上記いずれの例においても、必要に応じて酸素や二酸化炭素、窒素などのガスを添加できる。メタンの代替／追加炭素源としてメタノールを使用してもよく、培地に０．０１〜５％メタノールを添加する。
【００４８】
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸、アンモニアガス、アンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素などを０．０１〜１０％培地に添加して用いる。これらのほかに、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、鉄−ＥＤＴＡ、モリブデン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸銅、塩化銅、硫酸鉄、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化ニッケル、ホウ酸などの成分が微量添加されうる。また、培養する微生物種が従属栄養性である場合には、グルコースやキシロースなどの糖やグリセロール、酢酸、コハク酸などの炭素源を０．０１〜１０％添加してもよい。
【００４９】
本発明のリボスイッチによる発現誘導システムを用いた目的遺伝子の発現誘導は、上記のような形質転換体に対してリボスイッチのリガンドを接触させることにより達成することができる。リガンドは、遺伝子の発現誘導を望む任意のタイミングで外部より人為的に供給するか、宿主細胞により自律的に供給させる方法を選択できる。後者については、例えば生育する細胞内に蓄積する代謝物をリガンドに選択することで達成できる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ４，  １３３５−１３４０  （２０１５））。また、リガンドの生合成に必要な遺伝子を該宿主細胞に導入することで、リガンドを自律的に供給させることも可能である。
【００５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
各実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。
【００５２】
（ＬＢ培地）
組成は次のとおりである：２０ｇ／Ｌ  ＬＢ培地、レノックス（ディフコ社製）。
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩、１．５％  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ（ディフコ社製）を加えた。］
【００５３】
（ＮＭＳ培地）
組成は次のとおりである：０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  ＮａＮＯ３、０．１４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０．７μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１μＭ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭ  ＦｅIII−Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＬ  ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５００ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、２５０ｍｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ）
［必要に応じて、７．５〜１０ｍｇ／Ｌ  カナマイシン硫酸塩、２５ｍｇ／Ｌ  ナリジクス酸、１．５％  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒも加えた。また、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＦｅIII−Ｎａ−ＥＤＴＡ、ＮａＨＣＯ３は、１２０℃、２０分間蒸気滅菌後、添加した。］
【００５４】
［実施例１］  ＧＦＰを指標としたＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける遺伝子発現量の調節・最大化
【００５５】
（プラスミドの構築）
プラスミド構築に必要な核酸断片のＰＣＲ増幅には、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いた。プラスミド構築には、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。広域宿主ベクターであるｐＢＨＲ１（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）へリボスイッチとｔｒｃプロモーターのハイブリッド（Ｐｔｒｃ  Ｅ＊）、ｓｆＧＦＰ遺伝子をクローニングすることによりｐｍｋ６１Ａを構築した。Ｐｔｒｃ  Ｅ＊およびｓｆＧＦＰは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成された。まず、Ｐｔｒｃ  Ｅ＊断片をｍｋ３１６およびｍｋ１７３Ｒにより増幅した。次に、ｓｆＧＦＰ断片をｍｋ１７６およびｍｋ３１７Ｒにより増幅した。最後に、ベクター骨格をｍｋ３１８およびｍｋ３１９Ｒにより増幅した。これらの３つの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ６１Ａを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ニッポン・ジーン社製）のクローンを得た。プラスミドＤＮＡを細胞から抽出・精製後、シーケンス解析により、ｐｍｋ６１Ａが正しく得られていることを確認した。図１にｐｍｋ６１Ａの概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
【００５６】
【化１】
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【００５７】
（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへのｐｍｋ６１Ａの導入）
ｐｍｋ６１Ａは、Ａｌｉらにより報告された接合伝達を用いた形質転換法により、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへ導入した（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２  ，  ２９３１−２９４２（２００９））。
【００５８】
まず、ｐｍｋ６１Ａをエレクトロポレーション法により、接合伝達の供与菌であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へ導入した。形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地での生育を指標に選択し、プラスミドの配列はシーケンス解析により確認した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地に形質転換体のコロニーを懸濁し、３７℃で終夜振盪培養した。５００μＬの終夜培養液を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだ２５ｍＬのＬＢ培地へ植菌し、ＯＤ６００が０．５付近となるまで３７℃で振盪培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地で３回洗浄後、１ｍＬの同培地へ懸濁した。
【００５９】
Ｓ１７−１の培養と同時に、接合伝達の受容菌であるＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ野生株（ＮＣＩＭＢ  １１１３２）を、新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で１８時間培養した。培養菌体を遠心分離により回収し、新鮮なＮＭＳ培地５ｍＬへ懸濁した。
【００６０】
ＯＤ６００と体積の積が、Ｓ１７−１とＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈとで１：５となるよう混合後、０．２２μｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）で濾過した。これを０．０２％のプロテオースペプトン（ディフコ社製）を含んだＮＭＳ寒天培地に載せ、５％メタン雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベートした。メンブレン上の細胞を新鮮なＮＭＳ培地１０ｍＬで洗い流し、遠心分離で菌体を回収した後、２００μＬの同培地に再懸濁した。これを、７．５ｍｇ／Ｌカナマイシン、２５ｍｇ／Ｌナリジクス酸を含んだＮＭＳ寒天培地へ塗布し、５％メタン雰囲気下、４５℃の条件でコロニーが出現するまでインキュベートした。得られたクローンはＰＣＲにより、プラスミドの存在を確認した。
【００６１】
（ＧＦＰを指標としたＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおける遺伝子発現量の調節・最大化）
形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０、０．１、２、５、７．５または１０ｍＭいずれかの濃度のテオフィリンを加えたＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ植菌した。また、コントロールとして、野生株をテオフィリンを含まない同培地へ植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で２４時間培養した。培養液を新鮮なＮＭＳ培地で１０倍希釈し、蛍光強度（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ社製）で測定した。蛍光強度値はそれぞれのＯＤ６００で割った後、野生株（ブランク）におけるそれから差し引いた。図２に結果を示す。非誘導時の蛍光は検出されず、テオフィリン濃度依存的に良好な発現誘導を示し、発現量の調整に最適なシステムであることがわかった（図２）。
【００６２】
［実施例２］および［比較例１］  Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈにおけるＬ−リジン脱炭酸酵素の発現
【００６３】
（プラスミドの構築）
Ｌ−リジン脱炭酸酵素をコードするｃａｄＡ遺伝子をｐｍｋ６１Ａへクローニングすることによりｐｍｋ９６およびｐｍｋ９９を構築した（図３）。Ｋｏｕらの報告をもとに、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来のｃａｄＡは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成された（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ： Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ, Ｖｏｌ. １３３, ８８−９４ （２０１６））。さらに、メタン資化性菌で発現するＬ−リジン脱炭酸酵素として最適なものを選抜するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＬ−リジン脱炭酸酵素をコードするｃａｄＡ遺伝子をｐｍｋ６１Ａへクローニングすることによりｐｍｋ１２７およびｐｍｋ１６７を構築した（図３）。
【００６４】
ｐｍｋ９６の構築のために、ｃａｄＡ遺伝子領域はｍｋ４１２およびｍｋ４１３ＲによりＰＣＲ増幅した。次に、リボスイッチ領域を除いたベクター骨格をｍｋ４１４およびｍｋ４１５Ｒにより増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ９６を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ９６が正しく得られていることを確認した。図３にｐｍｋ９６の概要を示す。
【００６５】
ｐｍｋ９９の構築のために、ｃａｄＡ遺伝子領域はｍｋ４２５およびｍｋ４２６ＲによりＰＣＲ増幅し、ベクター骨格をｍｋ４２７およびｍｋ４２８ＲによりＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ９９を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ９９が正しく得られていることを確認した。図３にｐｍｋ９９の概要を示す。
【００６６】
ｐｍｋ１２７の構築のために、ｃａｄＡ（Ｅ．ｃ）遺伝子領域はｍｋ４７８およびｍｋ４７９Ｒにより、Ｇｅｎｅｗｉｚ社により合成されたｃａｄＡ遺伝子断片を鋳型としてＰＣＲ増幅した。次に、ベクター骨格をｍｋ４６５およびｍｋ４６６Ｒにより増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ１２７を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ１２７が正しく得られていることを確認した。図３にｐｍｋ１２７の概要を示す。
【００６７】
ｐｍｋ１６７の構築のために、ｃａｄＡ（Ｋ．ｐ）遺伝子領域はｍｋ５６７およびｍｋ５６８Ｒにより、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＭＧＨ７８５７８株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅した。次に、ベクター骨格をｍｋ４６５およびｍｋ４６６Ｒによりｐｍｋ６１Ａを鋳型としてＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ１６７を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ１６７が正しく得られていることを確認した。図３にｐｍｋ１６７の概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
【００６８】
【化２】
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【００６９】
（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへのｐｍｋ９６、ｐｍｋ９９、ｐｍｋ１２７およびｐｍｋ１６７の導入）
実施例１に記載の方法と同様に、ｐｍｋ９６、９９、１２７、および１６７のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈへの導入を接合伝達によりそれぞれ試みた。コロニーが得られた場合は、ＰＣＲによりプラスミドの存在を確認した。
【００７０】
形質転換の結果、ｐｍｋ９６の形質転換体は全く得られなかった一方で、ｐｍｋ９９、ｐｍｋ１２７およびｐｍｋ１６７の形質転換体のコロニーは多数獲得された。この結果は、メタン資化性菌の生育と競合するＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子の発現が、発現制御系によって限りなく小さく抑えられたことを意味している。
【００７１】
（各種Ｌ−リジン脱炭酸酵素を発現したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈによるペンタメチレンジアミンの生産）
ｐｍｋ９９、ｐｍｋ１２７、およびｐｍｋ１６７のそれぞれの導入が確認された形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび５ｍＭテオフィリンを含むＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ、ＯＤ６００＝０．２となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で振盪培養し、２４時間ごとに１ｍＬの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とＯＤ６００の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。ＯＤ６００は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により６００ｎｍにおける吸光度を光路長１０ｍｍの条件でＮＭＳ培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を８ｍＭメタンスルホン酸（ＭＳＡ）で４倍希釈したものを用いた。この希釈液をＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＣＳ１９（内径２ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）カラムを装着したＤＩＯＮＥＸ  ＩＣＳ−３０００を用いてカチオンモードで分析した。流速を０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム恒温槽を３０℃、検出器電流は７２ｍＡとし、８ｍＭ  ＭＳＡと７０ｍＭ  ＭＳＡを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図４ａ、ｂに結果を示す。いずれの微生物種由来のｃａｄＡを発現した場合にも、細胞増殖、ペンタメチレンジアミン生産ともに同等であり、４８時間で２９〜３５ｍｇ／Ｌが生産された（図４ａ、ｂ）。また、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈの野生株を同一条件にて培養した場合、ペンタメチレンジアミン濃度は検出下限以下であった。すなわち、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈは、生来ペンタメチレンジアミンを生産する能力を有しておらず、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の発現によってペンタメチレンジアミンの生産増加がもたらされることが明らかとなった。
【００７２】
［実施例３］Ｌ−リジン脱炭酸酵素を導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＢａｔｈへのＬ−リジン生合成酵素の発現
【００７３】
（プラスミドの構築）
フィードバック阻害を解除したアスパラギン酸キナーゼ変異体（ｌｙｓＣＴ３５２Ｉ）およびジヒドロジピコリン酸合成酵素変異体（ｄａｐＡＥ８４Ｔ）の遺伝子をｐｍｋ９９およびｐｍｋ１２７へクローニングすることによりｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２を構築した（図３）。
【００７４】
まず、ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２の構築に先立ち、ｌｙｓＣＴ３５２ＩおよびｄａｐＡＥ８４Ｔをそれぞれｐｍｋ６１Ａにクローニングすることで、各遺伝子をリボスイッチ（図３、「Ｐｔｒｃ  Ｅ＊」）およびターミネーター（図３、「Ｔ１」）に連結した。その後、この連結断片を、ｐｍｋ９９およびｐｍｋ１２７と連結することでｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２を完成した。
【００７５】
ｌｙｓＣＴ３５２Ｉ遺伝子領域はｍｋ４７２およびｍｋ４７３Ｒにより、Ｇｅｎｅｗｉｚ社により合成されたｌｙｓＣＴ３５２Ｉ遺伝子断片を鋳型としてＰＣＲ増幅した。次に、ベクター骨格をｍｋ４６５およびｍｋ４６６Ｒによりｐｍｋ６１Ａを鋳型としてＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。同様に、ｄａｐＡＥ８４Ｔ遺伝子領域はｍｋ４７４およびｍｋ４７５Ｒにより、Ｇｅｎｅｗｉｚ社により合成されたｄａｐＡＥ８４Ｔ遺伝子断片を鋳型としてＰＣＲ増幅した。次に、ベクター骨格をｍｋ４６５およびｍｋ４６６Ｒによりｐｍｋ６１Ａを鋳型としてＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。
【００７６】
それぞれのプラスミドＤＮＡを常法により抽出後、Ｐｔｒｃ  Ｅ＊、ｌｙｓＣＴ３５２Ｉ、Ｔ１からなる連結断片をｍｋ５１５およびｍｋ５１６ＲによりＰＣＲ増幅し、Ｐｔｒｃ  Ｅ＊、ｄａｐＡＥ８４Ｔ、Ｔ１からなる連結断片はｍｋ５１７およびｍｋ５１８ＲによりＰＣＲ増幅した。次に、Ｐｔｒｃ  Ｅ＊、ｃａｄＡ、Ｔ１からなる連結断片を含むベクター骨格をｍｋ５１９およびｍｋ５２０Ｒによりｐｍｋ９９およびｐｍｋ１２７を鋳型としてそれぞれＰＣＲ増幅した。これらの断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットにより連結し、ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅのクローンを得た。プラスミドＤＮＡを常法により抽出後、シーケンス解析により、ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２が正しく得られていることを確認した。図３にｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２の概要を示す。また、上記配列を以下に示す。
【００７７】
【化３】
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【００７８】
（ｐｍｋ１２７、および１４２を導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ形質転換体によるペンタメチレンジアミンの生産）
実施例１と同様の方法で、ｐｍｋ１２７、およびｐｍｋ１４２を導入して得られた形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび５ｍＭ  テオフィリンを含むＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ、ＯＤ６００＝０．２となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。ボトルは、４３℃で振盪培養した。２４時間ごとに１ｍＬの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とＯＤ６００の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。ＯＤ６００は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により６００ｎｍにおける吸光度を光路長１０ｍｍの条件でＮＭＳ培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を８ｍＭメタンスルホン酸（ＭＳＡ）で４倍希釈したものを用いた。この希釈液をＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＣＳ１９（内径２ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）カラムを装着したＤＩＯＮＥＸ  ＩＣＳ−３０００を用いてカチオンモードで分析した。流速を０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム恒温槽を３０℃、検出器電流は７２ｍＡとし、８ｍＭ  ＭＳＡと７０ｍＭ  ＭＳＡを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図５ａ、ｂに結果を示す。アスパラギン酸キナーゼおよびジヒドロジピコリン酸合成酵素の発現に伴い、ペンタメチレンジアミンの生産濃度は向上しなかったが、細胞増殖は著しく低下した（図５ａ、ｂ）。生産効率は、５２ｍｇ／Ｌ／ＯＤから１０３ｍｇ／Ｌ／ＯＤと約２倍の改善を示した。すなわち、Ｌ−リジン生合成酵素（アスパラギン酸キナーゼおよびジヒドロジピコリン酸合成酵素）の発現によって、メタンからペンタメチレンジアミンの生産効率を著しく向上できることが明らかとなった。
【００７９】
（ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２を導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ形質転換体によるペンタメチレンジアミンの生産）
ｐｍｋ１４１、およびｐｍｋ１４２を導入して得られた形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ、ＯＤ６００＝０．１５となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。３７℃で６時間振盪培養した後、５ｍＭ  テオフィリンを添加することで発現誘導を行った。その後、２４時間ごとに１ｍＬの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とＯＤ６００の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。ＯＤ６００は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により６００ｎｍにおける吸光度を光路長１０ｍｍの条件でＮＭＳ培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量には、回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を８ｍＭメタンスルホン酸（ＭＳＡ）で４倍希釈したものを用いた。この希釈液をＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＣＳ１９（内径２ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）カラムを装着したＤＩＯＮＥＸ  ＩＣＳ−３０００を用いてカチオンモードで分析した。流速を０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム恒温槽を３０℃、検出器電流は７２ｍＡとし、８ｍＭ  ＭＳＡと７０ｍＭ  ＭＳＡを移動相としたグラジエント溶出により分析した。ペンタメチレンジアミン濃度は絶対定量法により求めた。図６ａ〜ｃに結果を示す。ｐｍｋ１４１およびｐｍｋ１４２いずれのプラスミドの形質転換体においても、７３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ、９６ｍｇ／Ｌ／ＯＤと高い生産効率を示し、ｐｍｋ１４１の形質転換体により１２４ｍｇ／Ｌものペンタメチレンジアミンの生産が見られた（図６ｂ）。ここで得られた生産効率は、メタンからの生物的な物質生産において過去に前例のない水準を有するものであった（図６ｃ）。
【００８０】
［実施例４］ｐｍｋ１４２を導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈにおけるペンタメチレンジアミン生産のための酵素の発現量調節・最適化
【００８１】
（各種テオフィリン添加濃度条件下でのｐｍｋ１４２を導入したＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈによるペンタメチレンジアミン生産）
実施例３と同様の方法で、ｐｍｋ１４２を導入して得られた形質転換体コロニーを、１０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＮＭＳ培地１０ｍＬを含んだ１３０ｍＬ容の血清ボトルへ、ＯＤ６００＝０．１５となるように植菌した。ボトルはブチルゴムセプタムで密閉し、６０ｍＬのボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換した。３７℃で６時間振盪培養した後、０、０．５、２、５、７．５ｍＭ  テオフィリンをそれぞれ添加することで発現誘導を行った。その後、２４時間ごとに１ｍＬの培養液を回収し、ペンタメチレンジアミン濃度とＯＤ６００の定量に用い、上記と同様にボトル内空気を同体積の１０％メタン／９０％窒素の混合ガスと交換することで培養を継続した。ＯＤ６００は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により６００ｎｍにおける吸光度を光路長１０ｍｍの条件でＮＭＳ培地をブランクとして測定した。ペンタメチレンジアミン濃度の定量は、実施例３と同様に行った。図７に結果を示す。０．５ｍＭテオフィリン添加時にはペンタメチレンジアミンは検出されなかったが、２ｍＭからテオフィリン濃度依存的にペンタメチレンジアミンの生産濃度が上昇した。また、５ｍＭ以上のテオフィリンを添加すると、過去に前例のない生産効率を示した。すなわち、ペンタメチレンジアミン生産に必要な酵素を高いレベルで発現できるよう調節・最適化することが、高い生産効率を得るために本質的であることを示した。
[実施例５］通気攪拌培養でのＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈによるペンタメチレンジアミン生産
メタンガスの連続通気攪拌による培養は、１Ｌの微生物培養装置ＢＭＪ−０１Ｐ１（エイブル株式会社製）を用いて実施した。１０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む５００ｍＬのＮＭＳ１．０培地に、実施例３および実施例４と同様の方法にて培養したペンタメチレンジアミン生産株（ｐｍｋ１４２プラスミドが導入されたＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｂａｔｈ）をＯＤ６００＝０．１となるように懸濁し、培養開始時間とした。培養温度は４３℃、攪拌速度は７５０ｒｐｍにて実施し、混合ガス（５％メタン、４５％窒素、５０％空気）は２００ｍｌ／ｍｉｎにて吹き込んだ。培養液のｐＨは常時ｐＨ７．０を維持するよう１Ｎ硝酸にて都度調整した。培養開始１６時間後、５０ｍｌ培地を除去し、４６ｍＭテオフィリンを含むＮＭＳ培地５０ｍｌを添加して誘導を開始した。また、培養開始２０時間後は、消泡剤ＡＤＥＫＡ  ＮＯＬ  ＬＧ−１０９（ＡＤＥＫＡ） ５０ｍｇを培養中に加えた。排ガスは分離カラムとしてＳＨＩＮＣＡＲＢＯＮ  ＳＴ（信和化工株式会社製）を設置した、ＴＣＤ検出器を有するガスクロマトグラフィー（ＧＣ−２０１４Ｔ；株式会社島津製作所製）にて分析し、メタン消費、および酸素消費のモニタリングを行った。
所定の時間で１ｍｌサンプリングをし、ＯＤ６００の測定、ペンタメチレンジアミン濃度の定量を、実施例３および実施例４と同様に行った。培養開始後４１時間では２５ｍｌの培地を除去し、２０倍に濃縮したＮＭＳ培地２５ｍｌを追加成分として添加した。
図８に結果を示す。６４時間培養時に、９１ｍｇ／Ｌ／ＯＤと実施例３で示した結果と同等の高い生産効率を示し、かつ１８２ｍｇ／Ｌのペンタメチレンジアミンの高い生産が見られ、通気培養においても高い生産効率を実現できることが示された。
【００８２】
（プラスミドの寄託）
本明細書に記載したプラスミドｐｍｋ６１Ａは寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２５として、プラスミドｐｍｋ９６は寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２６として、およびプラスミドｐｍｋ９９は寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６２７として、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構に２０１８年２月１日付けで寄託されている。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、ペンタメチレンジアミンの効率的な生産が可能になるので、当該物質の生産および当該物質を原料（例えば樹脂原料）として用いる産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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