(57)【要約】      （修正有）【課題】異種性のペプチド配列をディスプレイする合成足場タンパク質を提供する。【解決手段】本発明の合成足場タンパク質は、配列：ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（ＶＶＡＧ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（ＰＷＥ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号１）における（ＶＶＡＧ）及び（ＰＷＥ）でなるループ領域の少なくとも１つに挿入された、アミノ酸配列Ｘｎを有する少なくとも１つのペプチドを含んでなる配列であって、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性（配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも１つのペプチドは無視される）を有するアミノ酸配列を有する。【選択図】図２
2019205450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（ＶＶＡＧ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（ＰＷＥ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号１）
における（ＶＶＡＧ）及び（ＰＷＥ）でなるループ領域の少なくとも１つに挿入された、アミノ酸配列Ｘｎ（ここで、Ｘは各種のアミノ酸であり、及びｎは配列におけるアミノ酸の数であり、３〜３０である）を有する少なくとも１つのペプチドを含んでなる配列であって、前記配列番号１の配列と少なくとも８５％の配列同一性（配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも１つのペプチドは無視される）を有する配列（ただし、ホウレンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びＮｉｃｏｔｉａｎａ  ａｌａｔａ由来の植物性シスタチンの配列と同一の配列を除く）を有することを特徴とする合成足場タンパク質。
【請求項２】
ｎが３〜２０である請求項１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項３】
ｎが４〜１５である請求項１又は２に記載の合成足場タンパク質。
【請求項４】
配列が１〜１０個の保存的置換を含有するものである請求項１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項５】
アミノ酸配列Ｘｎを有するペプチドが、ループ領域の両方の位置で挿入されている請求項１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項６】
配列：
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘｎ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘｎ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号４）
（ここで、Ｘｎは、請求項１において定義するとおりである）を有する、請求項５に記載の合成足場タンパク質。
【請求項７】
配列：
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘ５−１３）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘ５−１３）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号５）（ここで、Ｘは、請求項１において定義するとおりである）を有する請求項６に記載の合成足場タンパク質。
【請求項８】
配列：
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘ９）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘ９）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号６）（ここで、Ｘは、請求項１において定義するとおりである）を有する請求項６又は７に記載の合成足場タンパク質。
【請求項９】
タンパク質のＮ末端又はＮ末端からアミノ酸４個内に挿入された追加のアミノ酸配列を含んでなる請求項１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ末端に、追加のアミノ酸配列を含んでなる請求項９に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端における追加のアミノ酸配列が、配列：
ＭＡＴＧＶＲＡＶＰＧＮＥ（配列番号８０）
のいくつか又は全部である請求項１０に記載の合成タンパク質。
【請求項１２】
配列：
ＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（ＶＶＡＧ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（ＰＷＥ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号２）
における（ＶＶＡＧ）及び（ＰＷＥ）でなるループ領域の少なくとも１つに挿入された、アミノ酸配列Ｘｎ（ここで、Ｘｎは、請求項１において定義するとおりである）を有する少なくとも１つのペプチドを含んでなる配列であって、前記配列番号２の配列と少なくとも８５％の配列同一性（配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも１つのペプチドは無視される）を有する配列（ただし、ホウレンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びＮｉｃｏｔｉａｎａ  ａｌａｔａ由来の植物性シスタチンの配列と同一の配列を除く）を有することを特徴とする請求項１１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１３】
配列：
Ｍ（ＡＴＧ）ＶＲＡＶＰＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（ＶＶＡＧ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（ＰＷＥ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号３）
における（ＶＶＡＧ）及び（ＰＷＥ）でなるループ領域の少なくとも１つに挿入された、アミノ酸配列Ｘｎ（ここで、Ｘｎは、請求項１において定義するとおりである）を有する少なくとも１つのペプチドを含んでなる配列であって、前記配列番号３の配列と少なくとも８５％の配列同一性（配列同一性を算定する場合、挿入された少なくとも１つのペプチドは無視される）を有する配列（ただし、ホウレンソウ由来の植物性シスタチンの配列及びＮｉｃｏｔｉａｎａ  ａｌａｔａ由来の植物性シスタチンの配列と同一の配列を除く）を有することを特徴とする請求項１１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１４】
さらに、Ｎ末端における追加のアミノ酸配列における（ＡＴＧ）のループ領域に挿入されたアミノ酸配列Ｘｎ（ここで、Ｘｎは、請求項１において定義したとおりである）を有するペプチドを含んでなる請求項１３に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１５】
７０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する請求項１に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１６】
８０℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する請求項１５に記載の合成足場タンパク質。
【請求項１７】
リンカー又はタグを含んでなる請求項１〜１６のいずれかに記載の合成足場タンパク質。
【請求項１８】
基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質に結合されている請求項１〜１６のいずれかに記載の合成足場タンパク質。
【請求項１９】
リンカー又はタグ、又は基材、又はラベル、キャリヤー又はタンパク質が、Ｃ末端及びＮ末端の一方又は両方に結合されている請求項１７又は１８に記載の合成足場タンパク質。
【請求項２０】
融合タンパク質である請求項１〜１９のいずれかに記載の合成足場タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質の集団を含んでなるライブラリー。
【請求項２２】
１０８以上の複雑度を有する請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２３】
複雑度が１０９以上である請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
複雑度が１０１０以上である請求項２３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
合成足場タンパク質の集団が、バイオパニングに適したディスプレイシステムにおけるディスプレイ用に適するものである請求項２１〜２４のいずれかに記載のライブラリー。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号４、５、又は６のアミノ酸配列を有する合成足場タンパク質をコードする請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
合成足場タンパク質用のコード配列に加えて、更なるコード配列又は非コード配列を含んでなる請求項２６又は２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
更なるコード配列又は非コード配列が、ランダム化したアミノ酸配列をコードする配列、リーダー配列をコードする配列、融合タンパク質部分をコードする配列、リンカーをコードする配列、マーカーをコードする配列、精製用タグをコードする配列、プロモーター配列、又はエンハンサー配列である請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
宿主細胞における発現用に適応されている請求項２６〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換ベクター。
【請求項３１】
合成足場タンパク質の発現を制御するように、合成足場タンパク質をコードする核酸配列に結合されている発現制御配列を含んでなる請求項３０に記載の組換ベクター。
【請求項３２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質を発現する細胞であって、請求項２６〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項３０又は３１に記載の組換ベクターを含んでなる細胞。
【請求項３３】
請求項３２に記載の細胞を含んでなる細胞培養液。
【請求項３４】
標的に結合する合成足場タンパク質をスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項２１〜２５のいずれかに記載のライブラリーを提供し；
ｂ）前記ライブラリーを標的に曝露し；及び
ｃ）前記標的に結合する合成足場タンパク質を選別する
ことを含んでなる方法。
【請求項３５】
標的が、タンパク質／ペプチド、核酸又は小分子である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ディスプレイシステムを用いる請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
ファージディスプレイ法である請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質を、バクテリオファージのコートタンパク質と融合させて、前記合成足場タンパク質がウイルス粒子の表面にディスプレイされるようにすることを含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タンパク質をコードする核酸の、研究における使用。
【請求項４０】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タンパク質をコードする核酸の、合成生物学における使用。
【請求項４１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質、又はこのような合成足場タンパク質をコードする核酸の、標的検出における使用。
【請求項４２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の合成足場タンパク質及び、任意に、薬学上許容されるキャリヤー又は添加剤を含んでなる医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のタンパク質、これらをコードする核酸に係り、及びそれらを使用する方法に係る。特に、本発明は、ペプチド配列をディスプレイするための足場としての用途を有するタンパク質、及び治療、診断、環境及びセキュリティーモニタリング、合成生物学及び研究のような領域におけるこれら足場の使用に係る。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる「タンパク質足場」の使用は、生化学において、研究及び医薬における使用のための新規なリガンド結合タンパク質を生成するための可能性のあるルートとして注目を集めている。１以上のペプチド配列をディスプレイするために使用されるこのような足場タンパク質は、潜在的に、抗体又は抗体フラグメントの代替を提供できる。
【０００３】
用語「タンパク質足場」は、異なる状況で及び独特の生化学的機能をもって観察されるある種のポリペプチドの構造を記述するために使用される。それらの固有の立体配座安定性のため、このような足場はタンパク質工学に受け入れられるであろうと考えられている。
【０００４】
免疫グロブリン（抗体）は、保存されたフレームワーク領域及び高頻度可変性のペプチドセグメント製の空間的に良好に限定された抗原−結合部位の構成に対する機能を有すると慣習的に考えられており、これらのセグメントは、配列及び立体配座の両方において可変である。ライブラリー技術を伴う抗体工学法が、機能性の抗体フラグメントの選択において成功した後は、有用な結合タンパク質を合成するために、他のタンパク質構築を使用することに興味が膨らみ始めている。
【０００５】
好適なタンパク質足場の所望の特性に関する記載としては、下記のものが含まれる：
「好適なタンパク質足場の候補は、可変の配列及び長さの表面ループを提供できるか、又はさもなければ、それらの折りたたみ特性における有意の変更を生ずることなく、近接する表面領域（露出した疎水性残基を含む）における側鎖の交換に耐えられるコンパクト且つ構造的に堅固なコアを提示すべきである。」Ｓｋｅｒｒａ  Ａ：分子認識用の遺伝子組み換えタンパク質足場，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ２０００，１３：１６７−１８７。及び「用語「足場」は、タンパク質工学において使用されるように、典型的には、低減されたサイズ（＜２００ＡＡ）の及び挿入、欠失、又は他の置換を許容する高立体構造耐性の可変部分と関連する高度に構造化されたコアを含有する単鎖のポリペプチドフレームワークをいう。」Ｗｕｒｃｈら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１２，３０，５７５−５８２。
【０００６】
しかし、一見、ループ領域のエンジニアリングにとって魅力的とみられるポリペプチドの折りたたみ構造の必ずしも全ての種類が、実際に、高い親和性及び特異性を有する独立したリガンド結合部位の構築を可能にするわけではない。
【０００７】
従来技術の足場には、ブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメイン，「Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ」、Ａｎｔｉｃａｆｉｎｓ、及びアンキリンリピート、その他のような単離されたタンパク質折りたたみ構造と同様に、不活性化されたブドウ球菌ヌクレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びチオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（「Ｆｎ３」）、リポカリン系タンパク質、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）が含まれる。
【０００８】
国際特許出願公開ＷＯ２００６／１３１７４９号は、足場として改良するために、ステフィンＡにおいて作成された、いくつかの合理的な突然変異を開示している。変性されたステフィンＡ足場は、次の３つの部位、すなわち、Ｌｙｓ７１−Ｌｅｕ７３、Ｖ４８Ｄ及びＧ４Ｗにおける突然変異を含んでなり、ＳＴＭと称される（Ｓｔｅｆｉｎ  Ａ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｍｕｔａｎｔ）。
【０００９】
国際特許出願公開ＷＯ２００９／１３６１８２号は、さらに、ＳＴＭ足場の緻密化を開示している。
【００１０】
改良された足場タンパク質についても、なお要求がある。特に、従来技術の足場は、しばしば、ペプチドアプタマーを充分には安定化させることができず、足場におけるアプタマーの存在は、実際には、足場を顕著に変形させる。例えば、Ｗｏｏｄｍａｎら，「ペプチドアプタマーの提示のための天然のタンパク質足場のデザイン及び検証」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３５２，１１１８−１１３３参照。
【００１１】
理想的に改良された足場タンパク質は、下記の利益の１以上を提供できるはずである：
−変形しない堅固なフレームワークを提供するように改良された安定性；
−より小さいサイズ；
−高い品質及び複雑なライブラリーを支持する改良された能力；
−選ばれた結合タンパク質と、それらの標的との改良された親和性；及び
−利用できるＮ末端及びＣ末端による更なる操作の単純さ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明によれば、植物シスタチンに由来する又は関連する配列を有する合成タンパク質が提供される。
【００１３】
好適な合成タンパク質は、いくつかの（例えば、１０以上、２０以上、又は５０以上）植物シスタチンタンパク質の共通配列を含んでなる。
【００１４】
好適な合成タンパク質は、異種性のペプチド配列の挿入のために採用される又は適した足場タンパク質である。
【００１５】
このように、本発明の足場タンパク質は、好ましくは、単一の天然タンパク質配列に基づくものではなく、天然には存在しない新規なタンパク質であり、共通配列の注意深いデザインを介して、植物シスタチンクラスの代表的なものに由来する。
【００１６】
１具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列：
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号１）、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも５０％、より好ましくは７０％同一である配列を有する。
【００１７】
このような配列を含んでなる合成タンパク質は、高度に安定で及び有用な足場タンパク質を提供するとの知見を得た。
【００１８】
他の具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列：
ＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号２）、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも５０％、より好ましくは７０％同一である配列を有する。
【００１９】
さらに他の具体例では、合成タンパク質は、アミノ酸配列：
ＡＴＧＶＲＡＶＰＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号３）、又はその変異体を含んでなる。好ましくは、変異体は、それと少なくとも５０％、より好ましくは７０％同一である配列を有する。
【００２０】
より好ましくは、本発明の合成タンパク質は、上記配列番号１、２、又は３と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一般に、より高い同一性レベルが好ましい。
【００２１】
いくつかのケースでは、合成タンパク質は、配列番号１、２、又は３と同一、又は実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでなるか、又はアミノ酸配列からなる。
【００２２】
本発明の好適な具体例では、上記の合成タンパク質は、挿入された少なくとも１つの異種性のペプチド配列を含んでなる。本発明の合成タンパク質は、ペプチド配列の構築及びディスプレイするために使用される足場タンパク質として特に有用である。このように、本発明は、「空の」足場タンパク質（すなわち、異種性のペプチド配列が存在しない）及び１以上の挿入された異種性の配列を有する足場タンパク質の両方に係る。
【００２３】
従って、本発明の好適な具体例は、ここに記載する配列を有する合成の足場タンパク質であり、該足場タンパク質は、足場において、好適な部位に挿入された１以上の異種性のペプチドをディスプレイする。「ディスプレイする」とは、ペプチド配列が、適切な条件下、例えば、インビボ又はインビトロアッセイのような非変性条件下において、ペプチドが足場の表面上に露出されることを可能にする位置で、ペプチド配列が足場タンパク質に挿入されることを意味する。１以上の異種性のペプチドをディスプレイするこのような足場タンパク質は、しばしば、ペプチドアプタマー又はマルチプルペプチドアプタマーと称されるが、用語「アプタマー」は、当分野では、ペプチド自体又は完全なタンパク質を参照するために多少一貫することなく使用されることに注意しなければならない。
【００２４】
好ましくは、異種性のペプチド配列は、アミノ酸３〜３０個、より好ましくはアミノ酸４〜２０個、さらに好ましくはアミノ酸４〜１６個の長さである。本発明の合成タンパク質は、長さアミノ酸５〜１３個の異種性の配列をディスプレイすることに特に適していることが知見された。
【００２５】
好ましくは、異種性のペプチド配列は、合成タンパク質のループ領域に又はタンパク質のＮ末端に挿入される。ループ領域は、一般的な条件下では、タンパク質の整列された二次又は三次構造には関わらない（すなわち、タンパク質は、正しく折りたたまれており、）変性条件下にはない）が、タンパク質における機能及び／又は二次構造要素の正確な空間的組織化に寄与できる領域と定義される。足場タンパク質内におけるループ領域の位置は、もちろん、異なるタンパク質変種間で変動できる。合成タンパク質のループ領域は、タンパク質の二次及び三次構造を調査することによって決定され、これを達成する方法は、当分野ではよく知られており、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、及びインシリコ法が含まれる。
【００２６】
本発明では、異種性のペプチドは、タンパク質において、下記の位置の少なくとも一つに挿入されることが好ましい：
−βシートの第１領域と第２領域との間のループ（ＬＯＯＰ１として知られている）；及び
−βシートの第３領域と第４領域との間のループ（ＬＯＯＰ２として知られている）。
【００２７】
第１、第２、第３及び第４は、もちろん、タンパク質配列に関連するもの、すなわち、タンパク質のＮ末端又はＣ末端からのものとして解釈されることを意図するものである。
【００２８】
好ましくは、異種性のペプチドは、これらの位置の両方、すなわち、ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２に挿入される。
【００２９】
βシートの近接する領域間のループの長さは、アミノ酸３〜２０個の長さであることが好ましく、さらに好ましくはアミノ酸５〜１３個の長さであり、アミノ酸約９個の長さのループ長が最適であると考えられる。
【００３０】
ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２への挿入用の異種性のペプチドの模範的なペアを、表２、すなわち、配列番号２５〜７２に提示する。これらの例は、本発明の好適な具体例を構成する。
【００３１】
さらに、異種性のペプチド用の他の挿入ポイントは、タンパク質のＮ末端又はその近傍（例えば、アミノ酸４個内）である。このポイントにおけるペプチド配列は、上記の他の２つの位置における挿入よりも、標的を結合することについてより危険が少ないと考えられるが、それにもかかわらず、結合において役割を有することが明らかであろう。
【００３２】
このように、本発明の１具体例では、合成足場タンパク質は、上述の位置の各々に１個ずつ、異種性のペプチド３個を含んでなる。
【００３３】
上述の特定の配列の場合、タンパク質配列内の好適なループ領域は、下線を付した部分のように位置する。
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号１）
ＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号２）
ＭＡＴＧＶＲＡＶＰＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号３）
下線を付した領域は、異種性のペプチドによって完全に又は部分的に交換されるか、異種性のペプチドは、ループ領域を除去することなく、下線を付した領域内に挿入される。さらに、異種性のペプチドは、配列番号１又は２のＮ末端に付加されてもよい。
【００３４】
しかし、異種性のペプチドは、他のループ領域、例えば、αヘリックスと第１のβシートとの間及び／又はβシートの第２領域と第３領域との間の領域（それぞれ、便宜上、ＬＯＯＰ３及びＬＯＯＰ４と称される）に挿入され得ることも注目されなければならない。足場タンパク質が正しく折りたたまれる場合、これらのループ領域は、上述のもの（ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２）とは足場の反対の側に位置する。足場の両側に異種性のペプチドのループ領域を挿入することによって、二価の部分（足場の一方の側で第１の標的を及び他の側（一般に反対側）で第２の標的を結合できる）を生成することができ、これは、特定の状況では望ましい具体例である。
【００３５】
合成タンパク質が上述のアミノ酸配列を含んでなる場合、配列は、連続性又は非連続性である。例えば、異種性のペプチドが、合成タンパク質内に、例えば、上述のループ領域の１において挿入される場合、配列は非連続性であり、このようにして、異種性のペプチドは、上述の配列の部分を分離することになる。
【００３６】
配列同一性の算定は、本発明にとって、一般に、異種性のペプチドが合成タンパク質に挿入される状況を考慮するように修正されるべきであろう。このような挿入が生じた場合、挿入されたペプチド配列は、配列同一性を算定する場合、一般的に、無視されるであろう。これは、本発明の合成タンパク質が足場として機能し、この場合、挿入されたペプチドは、合成タンパク質において、これらがタンパク質の表面でディスプレイされるポイントで挿入されるためである。挿入されるペプチド配列は、それらの正に高度に可変性の本質及び目的による。このようなケースでは、それは、故意に高度に可変性の挿入されるペプチド配列よりもむしろ、ペプチドのディスプレイのための好適な骨組みを提供するため、重要なタンパク質の足場部分の配列である。
【００３７】
異種性のペプチドは、合成たんぱく質内において通常認められるアミノ酸の除去を伴って又は伴うことなく、合成タンパク質に挿入される。すなわち、異種性のペプチドは、合成タンパク質の末端で又は合成タンパク質内の２つのアミノ酸の間で、合成タンパク質の正常なアミノ酸がいずれも除去されることなく挿入される。或いは、ペプチドが合成タンパク質に挿入される際、合成の足場タンパク質内に正常に存在する１又はそれ以上のアミノ酸が除去／交換される。例えば、「ループ」アミノ酸ＶＶＡＧ、ＰＷＥ、及びＡＴＧ（存在する場合）は、上記の配列１、２及び３、又は配列変異体における対応するループ配列において除去される。
【００３８】
本発明による特に好適な足場タンパク質は、後述の配列番号７４〜７９、及び足場に対する潜在的な変更の関連する記載に提示される。
【００３９】
タンパク質配列に関する用語「同一性」とは、アミノ酸における差異の見地から（ただし、サイズ、親油性、酸性度等を考慮する）タンパク質間の類似度をいう。同一性割合（％）は、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  Ｊ．Ｇ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ａ．  ＵＳＡ  １９９２，８９：１０９１５−１０９１９に記載されたＢｌｏｓｕｍ６２類似性マトリックスのような類似性スコアー化マトリックスを使用する配列の最適な配列比較によって算定される。同一性割合の算定及びＢｌｏｓｕｍ６２類似性マトリックスを使用する２つの配列の最適な配列比較及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７０，４８：  ４４３−４５３）は、プログラムのデフォルトパラメーターを使用するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ，マディソン、ウィスコンシン州，米国）のＧＡＰプログラムを使用して行われる。本発明に関して、タンパク質配列及び核酸配列についての同一性割合を算定するための特殊なパラメーターについては後述する。
【００４０】
本発明の一部を形成するタンパク質の変異体は、前記配列における１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、転化又は付加による、又はタンパク質に科学的に結合する部分に対する変更によるアミノ酸配列における変異を含有できる。例えば、タンパク質変異体は、タンパク質に付着した炭水化物又はＰＥＧ構造を含んでなることができる。本発明のタンパク質は、変異体が所望の機能を保持する限り、Ｎ末端又はＣ末端からの１又はそれ以上のアミノ酸、例えば、アミノ酸１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸の欠失を含んでもよい。
【００４１】
タンパク質の置換変異体は、アミノ酸配列における少なくとも１個の残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されたものである。本発明のタンパク質は、保存的又は非保存的置換を含有できる。
【００４２】
用語「保存的置換」は、類似の生化学的性質を有するアミノ酸残基に代わる１又はそれ以上のアミノ酸置換基の置換に係る。代表的には、保存的置換は、結果として生じたタンパク質の活性に対して少ない衝撃を有するか、又は衝撃を持たない。例えば、タンパク質における保存的置換は、タンパク質の正確に折りたたまれる能力に実質的に影響を及ぼさず、さもなければ、通常の生物学的機能を果たすアミノ酸置換であってもよい。本発明のタンパク質の変異体のスクリーニングは、いずれのアミノ酸残基がアミノ酸置換に耐えられるかを同定するために使用される。１実施例では、１又はそれ以上の保存的アミノ酸置換が行われる場合、修飾されたタンパク質の関連する融解温度又はαへリックス又はβシートの量は、２５％以上は低減されず、好ましくは２０％以下、特に１０％以下である。
【００４３】
１又はそれ以上の保存的置換は、本発明のタンパク質に含まれる。好適な実施例では、１０又はそれ以下の保存的置換がタンパク質に含まれる。従って、本発明のタンパク質は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個以下の保存的置換を含むことができる。１又はそれ以上の保存的置換を含有するポリペプチドを、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲのような標準操作法を使用して、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって生成することができる。或いは、当分野において知られているように、ペプチド合成法を使用することによって、１又はそれ以上の保存的置換を含有するようにポリペプチドを生成できる。
【００４４】
タンパク質において本来のアミノ酸に代わって置換される及び保存的置換とみなされるアミノ酸の例としては、Ａｌａに代わるＳｅｒ；Ａｒｇに代わるＬｙｓ；Ａｓｎに代わるＧｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐに代わるＧｌｕ；Ｇｌｎに代わるＡｓｎ；Ｇｌｕに代わるＡｓｐ；Ｇｌｙに代わるＰｒｏ；Ｈｉｓに代わるＡｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅに代わるＬｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕに代わるＩｌｅ又はＶａｌ；Ｌｙｓに代わるＡｒｇ又はＧｌｎ；Ｍｅｔに代わるＬｅｕ又はＩｌｅ；Ｐｈｅに代わるＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒに代わるＴｈｒ；Ｔｈｒに代わるＳｅｒ；Ｔｒｐに代わるＴｙｒ；Ｔｙｒに代わるＴｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌに代わるＩｌｅ又はＬｅｕが含まれる。１具体例では、置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの間；Ｓｅｒ及びＴｈｒの間、Ａｓｐ及びＧｌｕの間；Ａｓｎ及びＧｌｎの間；Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；及び／又はＰｈｅ及びＴｙｒの間である。さらに、保存的置換に関する情報は、中でも、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら，（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ‘Ｒｅｇａｎら，（Ｇｅｎｅ  ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｌｏｇｙ  ６：１３２１−５，１９８８）、国際特許出願公開００/６７７９６（Ｃｕｒｄら）に及び遺伝学及び分子生物学の標準的な教科書に認められる。
【００４５】
他の変異体は、例えば、塩、アミド、エステル、及び特にＣ末端エステル、及びＮ−アシル誘導体のような機能的変異体である。例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によって、インビボ又はインビトロで修飾されるペプチドも含まれる。
【００４６】
本発明によるタンパク質は、各種の化学的技術によって修飾されて、未修飾ペプチドと本質的に同じ活性を有し、及び任意に他の所望の特性を有する誘導体を生成できる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシル末端又は側鎖にかかわらず、薬学上許容される注意を要する塩の形で提供され、又はエステル化されて、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステルを形成するか、又は例えば、式ＣＯＮＲ１Ｒ２（ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキル基であるか、又は一緒になって、５又は６員環のような複素環を形成する）のアミドに転化される。ペプチドのアミノ基は、アミノ酸末端又は側鎖にかかわらず、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸又は他の有機酸塩のような薬学上許容される酸付加塩の形であるか、又はＣ１〜Ｃ６アルキル又はジアルキルアミノに修飾されるか、又はさらにアミドに転化される。ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、良好に認識された技術を使用して、アルコキシ基又はエステル基、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ又はＣ１〜Ｃ６アルキルエステルに転化される。ペプチド側鎖のフェニル環及びフェノール環は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩのような１以上のハロゲン原子により、又はＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、カルボン酸及びそのエステル、又はそのようなカルボン酸のアミドによって置換される。ペプチド側鎖のメチレン基は、類似のＣ２〜Ｃ４アルキレンに伸展される。チオールは、アセトアミドのような良好に認識された多数の保護基のいずれか１つによって保護される。当業者は、立体構造的制約を選択及び提供して、結果として安定性が増強された構造とするために、ここに開示するペプチドに環構造を導入する方法も良好に認識しているであろう。
【００４７】
本発明の好適な具体例によれば、合成タンパク質は、融解温度（Ｔｍ）少なくとも９０℃、より好ましくは、少なくとも９５℃、最も好ましくは、少なくとも１００℃を有する。タンパク質の場合のＴｍは、５０％に変性が起こる温度（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｉｄｐｏｉｎｔ）として知られており、折りたたみ状態と非折りたたみ状態とが等しく存在する温度として定義される。Ｔｍは、一般に、異種性のペプチド配列が挿入されていない合成タンパク質について測定される。異種性の配列の挿入は、Ｔｍを低下させ可能性がある又はしばしば低下させるため、最も有意の値は、空の足場タンパク質が比較される場合に得られ、これは、上記のＴｍ値に基づく。このように高度に安定なタンパク質が得られたことは、本発明の驚くべき利点である。融解温度は、タンパク質の安定性の特に有効な指標である。折りたたみタンパク質及び非折りたたみタンパク質の相対割合は、当業者に知られた多数の技術（示差走査熱量測定、ＵＶ差分光法、蛍光法、円二色法（ＣＤ）、及びＮＭＲを含む（Ｐａｃｅ，Ｃ．Ｎｉｃｋ，及びＪ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｓｃｈｏｌｔｚ，タンパク質の立体配座安定性の測定，２９９−３２１参照））によって測定される。
【００４８】
本発明の合成タンパク質の極めて高い温度安定性は、普通の温度（例えば、インビトロにおいて約２５℃及びインビボにおいて約３７℃）における場合のタンパク質の非常に高い構造安定性の指標である。これは、本発明の合成タンパク質が、異種性のペプチドをディスプレイするための足場として機能することに非常に良好に適していることを意味している。構造安定性とは、このような異種性のペプチドが、足場タンパク質の構造の崩壊を生ずることなく、一貫して及び正確にディスプレイされることを意味する。本発明の合成タンパク質はこのように安定であるため、これらは、同じ安定性レベルを有していない公知の足場よりも良好に機能するとの表示である。
【００４９】
このような低分子の足場タンパク質が、そのデザインの基礎として使用された陸生植物の親のタンパク質配列の源に基づき、例えば、１０１℃の熱転移温度を有することは驚くべきことである。陸生植物の親は、一般に周囲の外部温度で生育し、イネのようないくつかの作物のみが熱帯温度において生育することが予期され、一方、大部分は、温和〜冷たい北部の気候で生育する。
【００５０】
上述のように、異種性のペプチドの付加は、本発明の合成の足場タンパク質の安定性を低下させる可能性があり、及び典型的には低下させる。しかし、本発明の足場の安定性は、従来技術による足場よりも高いままであることが見出された。従って、好適な具体例では、挿入された少なくとも１つの異種性のペプチドを有する合成の足場タンパク質は、６０℃又はそれ以上、より好ましくは、７０℃又はそれ以上、特に、８０℃又はそれ以上のＴｍを有する。これは、挿入された少なくとも１つの異種性のペプチドを有する足場タンパク質は高度に安定であることを表示している。
【００５１】
好ましくは、本発明の合成タンパク質は、リンカー又はタグを含んでなる。リンカー又はタグは、アミノ酸リンカー又はタグであり、又は他の種のリンカー又はタグである。タグは、合成タンパク質に所望の機能性を提供する各種のタグ、例えば、タンパク質の容易な単離又は精製を許容するタグである。模範的なタグは、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグとして知られている）、及び他の公知のタグとしては、Ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、カルモジュリンタグ等が含まれる。
【００５２】
本発明の他の具体例では、基材又は部分に結合した上述の合成タンパク質が提供される。部分は、ラベル、キャリヤー、タンパク質等である。合成タンパク質は、基材に直接結合でき、又はリンカーを介して結合される。合成タンパク質は、共有結合又は非共有結合によって基材又は部分に結合される。タンパク質を基材又は部分に結合するための非共有結合システムは、ビオチン−アビジン系を含むが、これに限定されない。
【００５３】
部分がラベルである場合、ラベルは、蛍光ラベル、放射性ラベル、酵素系ラベル、又は当業者に知られた各種の他のラベルである。
【００５４】
蛍光ラベルの例としては、有機染料（例えば、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ  Ｄｙｅｓ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｄｙｅｓ等）、生物学的フルオロフォア（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｒ−フィコエリトリン等）、及び量子ドットが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
酵素系ラベルの例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
他の公知のラベルはビオチンラベルである。ビオチンラベルは、代表的には、ビオチニル基、スペーサーアーム、及びタンパク質の標的官能性基への付着を担当する反応性基を含んでなる。ビオチンは、ラベル化タンパク質のアビジン部分を含んでなる他の部分への付着にとって有用である。
【００５７】
タンパク質をラベル化する各種の方法は当業者によく知られており、これらは、本発明の合成タンパク質に容易に適用される。
【００５８】
タンパク質が結合する基材は、各種の好適な表面、例えば、９６ウェルプレートのような容器の表面である。
【００５９】
部分がキャリヤーである場合、キャリヤーは、例えば、ビーズ（例えば、磁気ビーズ）又は他の粒子である。
【００６０】
代表的には、ラベル、リンカー又はタグは、タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端に付加される。しかし、標的の結合を妨げないように、異種性のペプチドが挿入されるループから十分に空間をあけたタンパク質の各種領域を介して、最も好ましくは、挿入を持つループとは反対の側において付加される。
【００６１】
本発明の１具体例では、第２のタンパク質に結合した上述の合成タンパク質を含んでなる融合タンパク質が提供される。第２のタンパク質は、所望の活性を有するタンパク質である。本発明の一定の具体例では、第２のタンパク質は、ファージコートタンパク質又は表面ディスプレイシステムにおいて有用な他のタンパク質であり、このような融合タンパク質に関する走査法における用途を以下に記載する。勿論、第２のタンパク質は他の合成タンパク質でもよく、この場合には、ホモ−又はヘテロマルチマーの足場タンパク質が提供される。
【００６２】
本発明の他の態様では、上述のように、合成タンパク質集団からなるライブラリーが提供され、ここで、集団の各種のメンバーは、異なった配列を有する各種の異種性のペプチドを含んでなる。異種性のペプチドの好適なライブラリーは、当業者に知られたコンビナトリアル技術を使用して創製され、好適な異種性のペプチド配列のセットをコードする核酸配列は、多数の市販の源を介して得られる。このようなライブラリーは、好ましくは、１０８又はそれ以上、より好ましくは、１０９又はそれ以上、及び最も好ましくは、１０１０又はそれ以上の複雑度を有する。
【００６３】
このようなライブラリーは、標的実体に結合する特別な合成足場タンパク質を選択することにおいて有用性を有する。標的実体は、タンパクを特異的に結合することが望ましい各種の実体である。標的の例としては、タンパク質／ペプチド（例えば、レセプター又はリガンド）、小分子（例えば、医薬分子）、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及び無機化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
ライブラリーは、好適なディスプレイシステム、例えば、表面ディスプレイシステム
におけるディスプレイ用に適した本発明の合成タンパク質を含んでなることができる。表面ディスプレイシステムは、好適にはファージディスプレイである。或いは、表面ディスプレイシステムは、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＣＩＳ−ディスプレイ、又は他の非共有又は共有タンパク質ディスプレイシステム、細菌ディスプレイ又は酵母ディスプレイである。酵母二重ハイブリッドシステム又は細菌細胞又は哺乳類細胞システムにおける発現は、標的が結合するアプタマーをスクリーニングするためのインビボシステムに一般に使用される。これらのディスプレイシステムは、まとめて、しばしば、バイオパニングシステムと称される。
【００６５】
例えば、ファージディスプレイは、繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）ディスプレイシステムである。それ故、合成タンパク質は、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ又はｐＩＸタンパク質と融合される。本発明において使用される他のファージディスプレイシステムとしては、Ｔ４、Ｔ７及びλ−ファージディスプレイが含まれる。本発明の合成タンパク質は多様性であり、各種の好適なディスプレイと一緒に使用され、各種の好適なシステムは当業者にとって公知であることは注目されなければならない。一般に、ファージディスプレイは抗体の選別において使用されるが、該技術は本発明のタンパク質に直接適用可能である。ファージディスプレイシステムの概要は、例えば、Ｌｏｗｍａｎ  Ｈ．Ｂ．，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ．（２００４）ファージディスプレイ：実用的アプローチ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ１０−１１に見られる。
【００６６】
本発明の特に好適な具体例では、本発明の合成タンパク質は、特にライブラリーの構築に使用される場合、配列
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘｎ）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘｎ）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号４）
ここで、Ｘは各種のアミノ酸であり、及びｎは、配列におけるアミノ酸の数であり、ｎは、好ましくは、３〜３０、さらに好ましくは、４〜２０、及びさらに好ましくは、４〜１５である。
【００６７】
好ましくは、合成タンパク質は、配列
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘ５−１３）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘ５−１３）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号５）
を含んでなる。
【００６８】
さらに好ましくは、合成タンパク質は、配列
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶＫＡＫＥＱ（Ｘ９）ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫＶＷＶＫ（Ｘ９）ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤＡ（配列番号６）
を含んでなる。
【００６９】
上述のように、その５０％、より好ましくは７０％が、配列番号４、５又は６と同一である配列を含んでなるタンパク質は、本発明の範囲内にある。さらに好ましくは、本発明の合成タンパク質は、その少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％が、配列番号４、５又は６と同一であるアミノ酸配列を含んでなる。一般に、より高いレベルの同一性が好ましい。
【００７０】
上記具体例のいずれにおいても、タンパク質はＮ末端に、追加のアミノ酸配列を含有できる。これは、配列
ＭＡＴＧＶＲＡＶＰＧＮＥ（配列番号８０）
のいくつか又は全部を含んでなる。或いは又は加えて、例えば、長さアミノ酸３〜２０個の他の異種性のペプチド配列を含んでなることができる。
【００７１】
本発明の具体例では、Ｎ末端アミノ酸がメチオニンであることが好ましい。これは、例えば、追加のメチオニンを添加するか又は通常のＮ末端アミノ酸をメチオニンに置き換えることによって達成される。
【００７２】
本発明の特に好ましい足場タンパク質は、配列番号７４〜７９に提示される。上述の判断基準に従うこれらのタンパク質の変異体も、本発明の具体例である。
【００７３】
他の態様では、本発明は、本発明による合成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、一本鎖型又は二本鎖型である。一本鎖は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖である。
【００７４】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、又は６による配列を有するタンパク質をコードする配列、配列番号７４〜７９のいずれか１つ、又は上述のその変異体を含んでなることができる。
【００７５】
１具体例では、ヌクレオチドは、配列番号１に提示されたアミノ酸をコードする、配列
ａａｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａａｔｔｃｇｔｔｃｇｔｇｔｔｇｔｔａａａｇｃｔａａａｇａａｃａｇｇｔｔｇｔｔｇｃｔｇｇｔａｃｃａｔｇｔａｃｔａｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔａａａｇａｃｇｇｔｇｇｔａａａａａｇａａａｃｔｇｔａｃｇａａｇｃｔａａａｇｔｔｔｇｇｇｔｔａａａｃｃｇｔｇｇｇａａａａｃｔｔｃａａａｇａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｔｃａａａｃｃｇｇｔｔｇｇｔｇａｃｇｃｔ
（配列番号７）を含んでなる。
【００７６】
他の具体例では、ヌクレオチドは、配列番号２に提示されたアミノ酸をコードする、配列
ｇｇｔａａｃｇａａａａｃｔｃｃｃｔｇｇａａａｔｃｇａａｇａａｃｔｇｇｃｔｃｇｔｔｔｃｇｃｔｇｔｔｇａｃｇａａｃａｃａａｃａａａａａａｇａａａａｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａａｔｔｃｇｔｔｃｇｔｇｔｔｇｔｔａａａｇｃｔａａａｇａａｃａｇｇｔｔｇｔｔｇｃｔｇｇｔａｃｃａｔｇｔａｃｔａｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔａａａｇａｃｇｇｔｇｇｔａａａａａｇａａａｃｔｇｔａｃｇａａｇｃｔａａａｇｔｔｔｇｇｇｔｔａａａｃｃｇｔｇｇｇａａａａｃｔｔｃａａａｇａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｔｃａａａｃｃｇｇｔｔｇｇｔｇａｃｇｃｔ
（配列番号８）を含んでなる。
【００７７】
他の具体例では、ヌクレオチドは、配列番号３に提示されたアミノ酸をコードする、配列
Ｇｃｔａｃｃｇｇｔｇｔｔｃｇｔｇｃａｇｔｔｃｃｇｇｇｔａａｃｇａａａａｃｔｃｃｃｔｇｇａａａｔｃｇａａｇａａｃｔｇｇｃｔｃｇｔｔｔｃｇｃｔｇｔｔｇａｃｇａａｃａｃａａｃａａａａａａｇａａａａｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇｇａａｔｔｃｇｔｔｃｇｔｇｔｔｇｔｔａａａｇｃｔａａａｇａａｃａｇｇｔｔｇｔｔｇｃｔｇｇｔａｃｃａｔｇｔａｃｔａｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｃｔａａａｇａｃｇｇｔｇｇｔａａａａａｇａａａｃｔｇｔａｃｇａａｇｃｔａａａｇｔｔｔｇｇｇｔｔａａａｃｃｇｔｇｇｇａａａａｃｔｔｃａａａｇａａｃｔｇｃａｇｇａｇｔｔｃａａａｃｃｇｇｔｔｇｇｔｇａｃｇｃｔ
（配列番号９）を含んでなる。
【００７８】
同定された核酸配列の変異体である核酸配列を有するポリヌクレオチドは、ａ）目的の核酸に対してストリンジェントな条件下、配列番号７、８、又は９のいずれか１に示す同定された配列の全て又は一部を含んでなるＤＮＡをハイブリダイズする工程、及びｂ）前記核酸を当業者に知られた方法によって単離する工程を含んでなる方法によって単離できる。ハイブリダイゼーションの条件は、好ましくは、高度にストリンジェントである。
【００７９】
本発明によれば、用語「ストリンジェント」は、温度６５℃における１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの洗浄条件を意味し、「高度にストリンジェント」な条件とは、ＳＳＣにおける０．３×ＳＳＣ、より好ましくは、０．１×ＳＳＣへの低減を言う。好ましくは、最初の２つの洗浄は、引き続いて、それぞれ、１５〜３０分間で２回行われる。高度にストリンジェントな条件下で洗浄する必要がある場合には、０．１×ＳＳＣによる追加の洗浄が１５分間で１回行われる。ハイブリダイゼーションは、ｐＨ７．５の０．５Ｍリン酸塩緩衝液中、６５℃において、７％ＳＤＳにて夜通し行われる。このようなハイブリダイゼーションは、分子クローニングに関する標準的な各種の教本、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３版；編集者：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ，２００１に開示されている。
【００８０】
配列番号７、８、又は９に示された配列の変異体も、インシリコの配列を、コンピューターデータベースに含まれる他の配列と比較することによって同定される。配列は、ＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＤＴＦ  ２．１．２（２０００年１０月１９日）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ，ＴＬ  Ｍａｄｄｅｎ，ＡＡ  Ｓｃｈｆｆｅｒ，Ｊ  Ｚｈａｎｇ，Ｚ  Ｚｈａｎｇ，Ｗ  Ｍｉｌｌｅｒ，及びＤＪ  Ｌｉｐｍａｎ，ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：タンパク質データベースサーチプログラムの新たな創成，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９９７，２５：３３８９−３４０２）を使用して、データベース中の配列と比較される。
【００８１】
本発明の好適な具体例は、配列番号１〜６との、少なくとも５０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは９６％の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、又は６又は配列番号７４〜７９のいずれか１つとの、少なくとも９７％の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、少なくとも９８又は９９％の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドがより好ましい。配列番号１、２、３、４、５、又は６又は配列番号７４〜７９のいずれか１つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。
【００８２】
遺伝子暗号の縮重のため、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、異なった特定のコドンを利用できる。上述のように定義されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの全てが本発明の一部であると考えられる。
【００８３】
この点について、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、簡便な系であり、ファージディスプレイのような技術に関して及び続く選択された結合タンパク質の生産に関して一般的に使用されるため、上述の配列は、細菌宿主である大腸菌における発現用に最適化されていることが注意されなければならない。しかし、当業者であれば、他の宿主系においてタンパク質を発現させることもでき、この場合、選択したタンパク質をコードするヌクレオチド配列における変更（すなわち、コドン最適化）は有益であり、このように、本発明の一部である。特別な宿主についての最適化コドンの使用は、当業者にとっては通例のことである。
【００８４】
特に好適な具体例では、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号７、８、又は９の核酸配列（関連性があれば、異種性のペプチドをコードする配列を除く）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドである。
【００８５】
本発明によるポリヌクレオチドは、もちろん、異種性のペプチドをコードする配列、発現制御配列、又は他のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードする配列のような追加の配列を含有できる。
【００８６】
配列番号７、８、又は９の全配列（関連性があれば、異種性のペプチドをコードする配列を除く）と少なくとも９０％、好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する配列を含んでなるポリヌクレオチドが、より好ましい。
【００８７】
ポリヌクレオチドの定義内には、修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡも含まれる。核酸の塩基における修飾は実施可能であり、イノシンのような塩基が組み入れられる。他の修飾としては、例えば、主鎖の修飾が含まれる。
【００８８】
「％同一性」は、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の、それらの整列された配列の間の比較に基づく関係を定義するものである。
【００８９】
同一性は既知の方法によって算定される。本発明についてここに示す同一性、又は相同性、％は、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｏｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン州、米国）のもとで作動するＧＡＰプログラムのよって算定されるものである。
【００９０】
ポリヌクレオチド配列の比較について：
−整列アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１９７０，４８：４４３−４５３
−アミノ酸の類似性に関する比較マトリックスとして、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｓｕｐｒａ）。
−以下のギャップスコアリングパラメーターを使用する：
−ギャップペナルティー：１２
−ギャップ長さペナルティー：２
−エンドギャップについてはペナルティーなし。
【００９１】
ヌクレオチド配列の比較について：
−整列アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（ｓｕｐｒａ）
−比較マトリックス：
−マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
−ギャップペナルティー：５０
−ギャップ長さペナルティー：３
Ｊａｅｃｋｅｌ，Ｂｌｏｏｍらによって２０１０年に記載された系統学的に不偏性の方法のような他のパラメーターの取り込みを含むコンセンサス安定化タンパク質を開発するアプローチも使用できる。
【００９２】
しかし、上述したように、各種の配列の同一性を算定する方法は、１又はそれ以上の異種性のペプチドが任意に挿入される状況を考慮するために補正されなければならないこと注目される。このような挿入が生ずる場合、ペプチドをコードする挿入された配列は、一般に、上述の理由によって、配列の同一性を算定する際には無視されるであろう。
【００９３】
本発明による核酸、特にＤＮＡは、コードされたタンパク質のインビボ又はインビトロにおける発現には有用であろう。本発明によるポリヌクレオチドがコードされたタンパク質の発現に使用される場合、ポリヌクレオチドは、タンパク質用のコード配列に加えて、他のコード又は非コード配列、例えば、リーダー配列又は融合部分、リンカー配列、マーカー配列、プロモーター、エンハンサー等を含むことができる。
【００９４】
本発明によるポリヌクレオチドは、本発明による組み換えタンパク質の生産において使用される。これは、好適な宿主細胞又は多細胞生物におけるタンパク質の発現を介して達成される。コードされたポリペプチドの発現のために使用される場合、ポリヌクレオチドは、有利には、ポリペプチド用のコード配列に加えて、他のコード配列、例えば、シグナル配列、リーダー配列、ターゲティング配列、融合部分、マーカー配列、精製を援助するための配列等を含むことができる。
【００９５】
クローニング及び発現のために、幅広い種類の宿主細胞及びクローニングベクターの組み合わせが使用される。本発明のポリヌクレオチドは、各種の好適な発現系にクローン化される。好適な発現系としては、細菌発現系（例えば、大腸菌ＤＨ５α及びＢＬ２１（ＤＥ３））、ウイルス発現系（例えば、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））、酵母系（例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））又は真核細胞系（例えば、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨＤ１１、ＤＴ４０、ＣＥＦ、又はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞）が含まれる。代表的には、ポリヌクレオチドは、好適な構成型又は誘導性プロモーターの制御下、好適なベクター内にクローン化され、ついで、発現用の宿主細胞に導入される。
【００９６】
本発明の他の態様では、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる組み換えベクターが提供される。好適なベクターとしては、細菌又は酵母のプラスミド、コスミド、ファージミド、フォスミド、広い宿主範囲のプラスミド、及びプラスミド及びファージの組み合わせ又はウイルスＤＮＡに由来するベクターが含まれる。複製の源及び／又優性の選択マーカーは、適宜、ベクター中に存在する。
【００９７】
本発明によるベクターは、宿主細胞を形質転換することについて好適である。好適なクローニングベクターの例は、ｐＢＲ３２２、各種のｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＥＭＢＬ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのようなプラスミドベクター、又はレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスのようなウイルスのベクターである。
【００９８】
足場タンパク質のライブラリーのクローニング及び発現については、Ｍ１３又はｆｄのような繊維状ファージ又はバクテリオファージＴ７のようなカプシドファージに由来するもののようなファージ又はファージミドベクターが、特に有用である。
【００９９】
本発明のタンパク質の発現に使用される場合、本発明によるベクターは、代表的には、関連するポリヌクレオチドの発現を制御するために、タンパク質をコードする核酸配列に任意に結合された発現制御配列を含んでなる。このような発現制御配列は、一般に、プロモーター配列及び転写及び翻訳を調整する及び／又は発現レベルを増強する追加の配列を含んでなる。好適な発現制御配列は、当分野では知られており、真核生物、原核生物、又はウイルスのプロモーター又はポリアデニル化シグナルが含まれる。発現制御及び他の配列は、もちろん、選択される宿主細胞に応じて大いに変動し、誘導性とされる。有用なプロモーターの例は、ｔａｃプロモーター（Ｄｅｂｏｅｒ，Ｃｏｍｓｔｏｃｋら，１９８３）、Ｔ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔｔ  １９８６）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８３，２２２：５２４−５２７）、メタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ  １９８２，２９６：３９−４２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  １９８５，８２：４９４９−４９５３）、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ及びＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９０，３０：５５−５６）、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号）、Ｒｏｕｓ  ＳａｃｏｍａウイルスＬＴＲプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  １９８２，７９：６７７７−６７８１）、又はヒト伸長因子１α又はユビキチンプロモーターである。原核生物制御配列としては、例えば、ｌａｃ、ｔａｃＴ７、ａｒａ、及び他の公知のプロモーターが含まれる。本発明において使用される原核生物プロモーターは、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＭＡ，Ｄｏｉ  ＲＨ，「バイオテクノロジーにおける原核生物プロモーター」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．１９９５；１：１０５−２８において論じられている。当分野では、他の好適な制御配列も知られており、使用される発現系について好適な配列を選択することは、当業者にとってはルーチンであろう。
【０１００】
ポリヌクレオチドが適切なベクターにクローン化された後、電気穿孔、ＣａＣｌ２形質移入、又はリポフェクチンのような適切な手段によって、コンストラクトを細胞（例えば、細菌又は酵母）に移す。バキュロウイルス発現系を使用する場合には、ポリヌクレオチドを含有する導入ベクターは、完全バキュロウイルスゲノムと一緒に形質導入される。
【０１０１】
これらの技術は当分野において公知であり、分子生物学的物質の製造者（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、及び／又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、好適な試薬及びそれらの使用法に関する指示を提供している。さらに、これに関する他の情報を提供する多数の基準の参考書、例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｔ編，「ベクター：分子クローニングベクターの調査及びそれらの使用」，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；「分子生物学における最新のプロトコル」，編者：Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｌｅら編，Ｗｉｌｅｙ  Ｎ．Ｙ．，１９９５；分子クローニング：実験室マニュアル，上記；及びＤＮＡクローニング，Ｖｏｌ．１−４，２版  １９９５，編者：Ｇｌｏｖｅｒ及びＨａｍｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）が存在する。
【０１０２】
さらに他の態様では、本発明は、組み換えタンパク質を発現できる細胞であって、発現されるべき組み換えタンパク質をコードする本発明によるポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする細胞も提供する。好適には、細胞は、上述のようにポリヌクレオチド又はベクターにて形質転換された宿主細胞である。本発明によるポリヌクレオチド又はベクターは、細胞のゲノム物質に好適に一体化されるか、又は自動的に複製するベクターの部分である。この明細書では、「組み換え体」とは、天然の細胞では発現されないタンパク質を意味する。
【０１０３】
宿主細胞は、例えば、適切な選択、増幅、又は転写の誘導のために、このようにして、組み換えタンパク質の発現のために変更される一般的な栄養培地において培養される。宿主細胞は原核生物性又は真核生物性である。特に、発現されるタンパク質が、ヒト又は哺乳類の対象でのインビボ使用を目的とするものである場合には、哺乳類、例えば、ヒトの株化細胞が好ましい。好適な株化細胞の例としては上述のものであり、各種の好適な細胞型についての適切な培養条件は、当業者には公知である。
【０１０４】
さらに他の態様では、本発明は、本発明による細胞を含んでなる細胞培養物を提供する。
【０１０５】
さらに他の態様では、本発明は、標的に結合する合成タンパク質をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
ａ）上記の１又はそれ以上の異種性のペプチドをコードする配列を含んでなる合成の足場タンパク質集団を含んでなるライブラリーを提供し；
ｂ）前記ライブラリーを標的に曝露し；及び
ｃ）前記標的に結合する合成の足場タンパク質を選別する
ことを含んでなる。
【０１０６】
標的は、好適には、タンパク質／ペプチド、核酸、又は小分子又は興味ある各種の他の標的である。標的は、好適には、基材に、例えば、マイクロタイタープレートのウェルに又は磁気ビーズ又は他の適切な粒子上に不動化される。
【０１０７】
スクリーニング法は、好適にはディスプレイシステム、例えば、表面ディスプレイシステムである。例えば、好適な表面ディスプレイシステムは、ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＣＩＳ（Ｏｄｅｇｒｉｐ，Ｃｏｏｍｂｅｒら，２００４）又は他の非共有結合又は共有結合タンパク質ディスプレイ（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ２０００）、細菌性ディスプレイ（Ｌｏｆｂｌｏｍ  ２０１１）及び酵母ディスプレイ（Ｔｒａｘｌｍａｙｒ及びＯｂｉｎｇｅｒ  ２０１２）又は他の真核生物細胞におけるディスプレイ（Ｍａｋｅｌａ及びＯｋｅｒ−Ｂｌｏｍ  ２００８）（Ｈｏ及びＰａｓｔａｎ  ２００９）である。
【０１０８】
本発明の特定の具体例では、スクリーニング法において使用されるタンパク質は、足場タンパク質がウイルス粒子の表面でディスプレイされるように、バクテリオファージのコートタンパク質との足場タンパク質の融合物である。このように、ウイルス粒子上でディスプレイされるタンパク質は、ファージ粒子内の遺伝子配列に対応する。もちろん、表面ディスプレイシステムがファージディスプレイシステム以外のものである場合には、他の好適な融合タンパク質が提供される。
【０１０９】
標的が基材上に不動化される場合には、表面ディスプレイ化ライブラリーは、その上に不動化された標的を有する基材に曝露され、ファージが標的に結合することを可能にする好適な期間の後、基材をすすぐ。標的に結合するタンパク質は基材に付着したままであり、他のものは洗い落とされる。
【０１１０】
好適には、標的に結合するタンパク質は、その後、溶離されるか、又は標的から関連するファージを分裂し、ファージディスプレイの場合には、好適な細菌性宿主の感染によって、より多くのファージを創製するために使用する。この結果、増強された混合物を含んでなる新規のライブラリーが生成し、このライブラリーは、元のライブラリーよりもかなり少ない不適切なファージ（すなわち、非結合足場タンパク質を含有するファージ）を含有する。
【０１１１】
ライブラリーを標的に曝露する工程、すすぎ工程、溶離工程及び感染工程は、任意に、１又はそれ以上繰り返して行われ、さらに結合するタンパク質においてファージライブラリーを増強する。これは、一般に、パニングと称される。このように、方法は、複数回のパニング工程を含むことができる。
【０１１２】
一旦所望の回数のパニング工程が実施されると、表面ディスプレイ化されたタンパク質に結合する核酸は、標的に結合する足場タンパク質を同定するために配列決定される。
【０１１３】
高い親和性及び高い特異性をもって標的に結合する本発明による足場タンパク質が得られることが知見された。例えば、親和性１×１０−９Ｍをもって結合する足場タンパク質が得られた。意外なことには、本発明による足場タンパク質から形成されたライブラリーは、タンパク質（これに対しては、抗体又は所望の特異性を有する抗体を産生することは不可能であることが証明されている）に結合する足場タンパク質を示した。例えば、足場に基づく人工の結合タンパク質として、特異的にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ５に結合するタンパク質が選択されるが、代わりのタンパク質は、度重なる選択する能力の欠如のため、この標的に対する好適な抗体を欠いている。ＨＰＶは、子宮頸癌の病原体である。ヒト低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）の２つの型、ｈＳＵＭＯ１とｈＳＵＭＯ２とを識別する人工の結合タンパク質も選択されるが、一方、既に選択された抗体は、このような識別をできないことが証明されている。抗体系の技術が好適な解決策を提供できないような他の標的に対して、他の有用な結合タンパク質が産生されることを予測することは妥当である。
【０１１４】
他の態様では、本発明は、上記のスクリーニング法によって得られた合成の足場タンパク質を提供する。
【０１１５】
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の研究における使用を提供する。例えば、このようタンパク質は、一般的に、抗体又は抗体フラグメントが使用される各種の研究分野において使用される。このような方法は、タンパク質／タンパク質相互作用、ラベル化標的（例えば、蛍光性）等の妨害を含むことができる。
【０１１６】
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の環境及びセキュリティーモニター、又は合成生物学における使用を提供する。
【０１１７】
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の標的探知における使用を提供する。
【０１１８】
他の態様では、本発明は、上述の合成足場タンパク質、又はこのような合成タンパク質をコードする核酸の治療又は診断における使用を提供する。例えば、このようなタンパク質は、抗体又は抗体フラグメントが一般的に使用される診断又は治療の分野で使用される。
【０１１９】
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質及び薬学上許容されるキャリヤー又は医薬品添加剤を含んでなる医薬品を提供する。
【０１２０】
他の態様では、本発明は、上述の合成タンパク質を使用して、薬物標的を確認し、及び標的タンパク質について新薬の開発につながるようなドメインを同定する方法を提供する。
【０１２１】
他の態様では、本発明は、有機化合物を含む及び薬剤化合物を含む小分子に結合する合成タンパク質を好適に選択する方法を提供する。
【０１２２】
本発明の合成タンパク質は、好適には、適切な治療薬に結合される。このような状況では、合成タンパク質は、治療用「ペイロード」を所望の標的に送達するためにターゲティング機能を提供する。
【０１２３】
本発明による医薬品の調製は、当業者にとって一般的な手段によって実施される。投与可能な（静脈内又は皮下投与、又は他の投与法による）組成物を調製する方法は、当業者には公知又は明らかであるし、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：科学及び薬学の実践，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＷｉｋｉｎｓ；２１改定版（２００５年５月１日）のような刊行物により詳細に記載されている。
【０１２４】
「合成タンパク質」とは、自然の中では見出せず、組み換え技術を介して形成されたタンパク質を言う。
【０１２５】
用語「タンパク質」は、一般に、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と相互交換可能に使用され、ペプチド結合によって結合された少なくとも２個の共有結合的に付着するアミノ酸を意味する。用語「タンパク質」は、精製された天然生成物、又は組み換え又は合成技術を使用して、部分的又は全体的に生成される生成物を含む。用語「タンパク質」は、二量体又は多量体のようなタンパク質の凝集体、融合タンパク質、タンパク質変異体、又はその誘導体も意味する。用語は、変性タンパク質、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化等によって修飾されたタンパク質も含む。
【０１２６】
タンパク質は、核酸コドンによってコードされていないアミノ酸を含むことができる。非天然のアミノ酸は、翻訳後修飾によって、例えば、特殊な位置におけるシステイン又は他の適切な残基の導入、ついで、タンパク質の生成に続くデヒドロアラニンへの転化、及び続く、好適に修飾した非天然のアミノ酸との反応を介して導入される。或いは、非天然のアミノ酸は、インビトロ又はインビボでの翻訳の間に、適切な異種性のｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼカップル（抑制ｔＲＮＡに非天然のアミノ酸を充填し、ついで、該アミノ酸をＵＡＧコドンの位置でタンパク質に組み入れる）を介する停止コドン、すなわち、ＵＡＧの抑制を通して配列に組み入れられる。
【０１２７】
本発明の合成タンパク質は、単一サブユニット又は多サブユニットタンパク質でも良い（ここで、少なくとも１つのサブユニットは前記配列を含んでなる）。
【０１２８】
特定の具体例では、タンパク質は、２又はそれ以上の上述のタンパク質を、例えば、融合タンパク質の形で含んでなる。このような場合、合成タンパク質の各々は、同じ標的に結合でき、又は異なった標的に結合することができる。同じ標的に結合することは、結合活性及び見かけ上の結合親和性を増強し、一方、異なった標的に結合することは、架橋モジュール又は二重認識モジュールの開発に有用である。
【０１２９】
本発明の明細書における「異種性のペプチド」又は「異種性のペプチド配列」とは、適切な位置において、すなわち、足場タンパク質のループ領域において、普通には見出されないペプチド配列を言う。代表的には、このようなペプチドは、相対的に短く、すなわち、３０個未満のアミノ酸、代表的には２０個又はそれ以下を含有する。このようなペプチドは、本質的に、各種の配列を有することができる。実際、膨大な数の異種性のペプチド配列を含有するライブラリーは、足場タンパク質においてディスプレイされることが望ましい。
【０１３０】
特別な態様、本発明の具体例又は例と合わせて記載する特徴、整数、特性、化合物、化学部分又は基は、矛盾しない限り、ここに記載の各種の他の態様、具体例又は例にも適用されるものと理解されなければならない。この明細書（特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示する特徴の全て、及び／又はここに開示する各種方法の又はプロセスの工程の全ては、このような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、各種の組み合わせで組み合わされる。本発明は、上述の各種具体例に詳細に限定されない。本発明は、この明細書（特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示する特徴のいずれかの新規な１つ又は各種の新規な組み合わせ、又はここに開示する各種の方法又はプロセスの工程のいずれかの新規な１つ又は各種の新規な組み合わせに及ぶ。
【０１３１】
本明細書の読み手の注目は、この出願に含まれ、公衆の調査のために公開される全ての書類及び文献に向けられ、及びこのような全ての書類及び文献の内容は、参照することによってここに組み込まれる。
【０１３２】
本発明の特定の具体例
次に、発明の具体例を、実施例によって、添付図面を参照して記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】５７フィトシスタチンアミノ酸配列に由来するコンセンサスフィトシスタチンＰＨＹＴＣ５７を示す。（Ａ）再帰的ＰＣＲによって遺伝子を生成するために使用されたオーバーラップオリゴヌクレオチド（Ｐ１〜Ｐ６）とともに二本鎖配列として示されたＰＨＹＴＣ５７合成遺伝子。コード配列も、アミノ酸１文字表記として示されている。２つの制限部位ＳｔｉＩ及びＮｏｔＩの位置が示されている。（Ｂ）ｐＨＥＮＩに基づくｐＤＨｉｓＩＩのクローニング領域の略図。ｐｅｌＢシグナル配列、ヘキサヒスチジンタグ、及びＭ１３ファージＰＩＩＩタンパク質のＮ末端配列をコードする適切な領域の位置が示されている。Ｍ１３Ｒ及びＰ１０のための標準的なＭ１３プライマー結合部位の位置も、ユニークなＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位であるため表示されている。
【図２】各種のフィトシスタチン濃度における修飾オリザシスタチン欠損体Ａｓｐ８６（ＯＳＡ−ＩΔＤ８６）及びＰＨＹＴＣ５７に関するパパイン阻害アッセイの結果のグラフであり、ＰＨＹＴＣ５７の増強された効力を示す。
【図３】ＮＴＡセンサーチップ上に不動化したシスタチンとパパインとの間の相互作用の表面プラズモン共鳴測定を示す。いくつかのパパイン濃度において実験を行い、Ｂｉａｅｖａｌｕｔｉｏｎ  ３ソフトウエアパッケージ（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用し、データのＬａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルへの包括的適合によって、データを分析した。ＯＳＡ−ＩΔＤ８６：修飾イネシスタチンＩ、ＣＰＡ：パパイヤシスタチン、ＣＵＮ：オレンジシスタチン、ＣＥＷＣ：鶏卵卵白シスタチン、ＰＨＹＴＣ５７：コンセンサスシスタチン。
【図４】１００℃における表示する各時間でのインキュベーションに続いて、２５℃においてアッセイした、残留酵素活性として示すＯＳＡ−ＩΔＤ８６の熱安定性（灰色の□）及びＰＨＹＴＣ５７の熱安定性（黒色の△）。ＰＨＹＴＣ５７は、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６よりも大きい熱安定性を発揮する。（Ｂ）ＯＳＡ−ＩΔＤ８６及びＰＨＹＴＣ５７の抑制特性についての模擬胃液処理の影響を示す。ＰＨＹＴＣ５７がＯＳＡ−ＩΔＤ８６よりも長い期間にわたって活性を保持することを示している。（Ｃ）模擬胃液によるインキュベーションに対するＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６の安定性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。インキュベーションの時間を秒として示し、マーカータンパク質（Ｍ）の位置を、示されたアッセイからのペプシン及びシスタチンの位置とともに、左にｋＤａで示す。（Ｄ）抗−Ｈｉｓタグ抗体を使用して、表示した時間（秒）での模擬胃液処理に続くＰＨＹＴＣ５７のウエスタンブロット分析。マーカータンパク質（Ｍ）の位置をｋＤａで示す。
【図５】タンパク質ＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６の間のアミノ酸の差異を示すＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６の対比。（Ａ）タンパク質の配列のアラインメント。（Ｂ）ＯＳＡＩの３Ｄ構造における（Ａ）からのアミノ酸の変更の位置を、ラベル化した残基の変更とともに示す。結合領域も、ラベル化したＮ末端、ＱＶＶＡＧ及びＰＷループとともに示す。
【図６】ＰＨＹＴＣ５７に由来するＡｄｈｉｒｏｎ足場のライブラリー及び配列から単離した結晶構造。（Ａ）Ａｄｈｉｒｏｎ足場が示されており、挿入されたループが示されている。（Ｂ）Ａｄｈｉｒｏｎアミノ酸足場のためのコドン最適化核酸配列及びアミノ酸配列。αへリックス、βシート及びループ１及びループ２のための挿入領域が強調されている。
【図７】Ａｄｈｉｒｏｎ足場の生物化学的特徴付け及びライブラリーの配列決定を示す。（Ａ）Ａｄｈｉｒｏｎ足場の融解温度（Ｔｍ１０１℃）を測定するために、示差走査熱量測定を行った。（Ｂ）Ａｄｈｉｒｏｎ足場及びループ挿入を含有する３つの選ばれたＡｄｈｉｒｏｎタンパク質の構造を検討するために円二色法を使用し、及びすべてが非常に高いβ構造を示した。（Ｃ）大腸菌ＥＲ２７３８細胞に感染させるためＡｄｈｉｒｏｎファージライブラリーを使用した。９６個のランダムクローンを単離し、配列決定した。グラフは、ループ領域内の各アミノ酸の割合（％）を示す。理想的なライブラリーは各アミノ酸５．２６％を含有するが、ライブラリーには、システインは含まれなかった。
【図８】良好に特徴付けられた代表的な低分子の可溶性タンパク質であるリゾチーム（Ｂ）と比較するＡｄｈｉｒｏｎ足場（Ａ）の安定性の対比を示す。（Ｃ）は、ｍｙｃ抗体に結合するように選ばれたＡｄｈｉｒｏｎのため、足場へのループの付加がＴｍを８５℃に低下させるが、これは、なお、大部分の足場タンパク質よりも高い融解温度を示している。このＡｄｈｉｒｏｎタンパク質は、一連のスキャンによって示されるように、変性及び復元の繰り返しのサイクルを受けることができる。
【図９】酵母ＳＵＭＯ（ｙＳＵＭＯ）に関するファージＥＬＩＳＡの結果を示す。（Ａ）第３のｐａｎラウンドから単離されたクローン２４個を使用したファージＥＬＩＳＡ。各クローンによって生産されたファージを、ｙＳＵＭＯ又はコントロールを収容するウェルにおいてインキュベートした。画像は、基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加後３分の時点で記録したものである。（Ｂ）ｙＳＵＭＯ（ハッチング）及びコントロール（ハッチングなし）に関するファージＥＬＩＳＡの５６０ｎｍにおける吸収を示すグラフ。
【図１０】酵母ＳＵＭＯに特異的なＡｄｈｉｒｏｎ（Ａｄ−ｙＳＵＭＯ）の精製及び特徴付けを示す。（Ａ）Ａｄ−ｙＳＵＭＯをＢＬ２１細胞において発現させ、細胞可溶化物を、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃及び１００℃に２０分間加熱し、１５，０００×ｇにおける遠心分離によって沈殿物を除去した。各温度について、浄化した可溶化物のアリコート５μｌを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、タンパク質を可視化するためクマシーで染色した。（Ｂ）可溶化物をＮｉ−ＮＴＡビーズとともに１時間インキュベートした。インキュベートした後の可溶化物（５μｌ）及び精製したＡｄ−ｙＳＵＭＯ（１０μｌ）を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開し、可視化のためクマシーで染色した。（Ｃ）ｙＳＵＭＯ（ハッチングバー）を検出するために、ビオチン標識されたＡｄ−ｙＳＵＭＯを使用したが、ビオチン標識されたＡｄ−ｙＳＵＭＯは、ＥＬＩＳＡによっては、ヒトＳＵＭＯ（ハッチングなし）を検出しなかった。（Ｄ）酵母ＳＵＭＯ０．５μｇ（上方パネル）及びＨＥＫ２９３細胞可溶化物２０μｇと混合した酵母ＳＵＭＯ０．５μｇ（下方パネル）に対してＡｄ−ｙＳＵＭＯをクローン１０個、１５個、２０個、及び２２個を使用したウエスタンブロット。
【図１１】一連の標的、すなわち、成長因子タンパク質ＦＧＦ１（Ａ）、細胞表面レセプターＣＤ３１（Ｂ）、及びペプチド（Ｃ）に対するスクリーニングにおいて同定されたＡｄｈｉｒｏｎに関するファージＥＬＩＳＡの結果を示す。グラフは、ＴＭＢの添加後の各ウェルの吸光度を示す。標的を収容するウェルをハッチングして示し、一方、コントロールのウェルをハッチングなしで示す。
【図１２】ＨＰＶ１６Ｅ５ＧＦＰ（標的）及びＡｄｈｉｒｏｎ用のエピトープなしのＨＰＶ１６Ｅ５ＧＦＰ（コントロール）の免疫蛍光像を示す。ＡｄｈｉｒｏｎＥ５を量子ドットに抱合させ、哺乳類の細胞におけるＥ５タンパク質の検出に使用した。細胞を、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染色）、ＧＰＦ、及びＥ５（Ａｄｈｉｒｏｎ−量子ドットを有する）にて染色した。
【図１３】Ａｄｈｉｒｏｎ標的ｈＳＵＭＯ２を示す。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって、ｈＳＵＭＯ１及びｈＳＵＭＯ２に対する特異性を測定するために、ｈＳＵＭＯ２に対して産生されたＡＢＰをテストした。ｈＳＵＭＯ２ＡＢＰは、ｈＳＵＭＯ２に特異的に結合し、これは、結合親和性に反映された。（Ｂ）ＲＮＦ４’ｓ  ＳＵＭＯ−標的化ユビキチンリガーゼ活性を阻害するｈＳＵＭＯ２ＡＢＰの能力を示すブロット。（Ｃ）細胞においてコントロールベクター又はｈＳＵＭＯ２バインダーを発現させ、抗−ＦＬＡＧ抗体を使用して分析し、核内構造体ＰＭＬ（グリーン）を誘導するためにヒ素とともに培養した。ＲＮＦ４は、ＰＭＬの分解を促進する。ｈＳＵＭＯ２とＲＮＦ４との間の相互作用を阻止することはＰＭＬの分解を変更する。これは、ｈＳＵＭＯ２に特異的に結合し、ｈＳＵＭＯ１と相互作用することなくｈＳＵＭＯ２を阻害するｈＳＵＭＯ２結合タンパク質についての最初の記載である。ｈＳＵＭＯ２  Ａｄｈｉｒｏｎも、（Ｃ）において証明されるように、ｈＳＵＭＯ２と相互作用し、ｈＳＵＭＯ２の他の機能に影響を及ぼさないドメインを特異的に妨げる。
【図１４】血栓形成及び溶解濁度アッセイを表すグラフを示す。実線は正常な形成及び溶解を示す。点線は、このプロセスに対する５個の異なったＡｄｈｉｒｏｎの影響を示す。５個の異なったＡｄｈｉｒｏｎは異なったエピトープを含有し、血栓形成及び溶解に異なった影響を及ぼす。いくつかは凝固時間を延長させ、いくつかは溶解時間を延長させ、いくつかは凝固時間及び溶解時間を延長させる。Ａｄｈｉｒｏｎの１つは、血栓形成の阻害を完結する。これは、異なったＡｄｈｉｒｏｎがフィブリノーゲンの異なった領域に結合し、これを阻害することを証明するものであり、従って、タンパク質の機能の研究のまさに新規な路を示すものである。
【図１５】フィブリノーゲン結合Ａｄｈｉｒｏｎ及びフィブリノーゲンと結合しないコントロールＡｄｈｉｒｏｎによる血栓形成後のＦＩＴＣラベル化フィブリノーゲンの共焦点像を示す。これは、正常な凝固応答を変更するＡｄｈｉｒｏｎの能力を証明する。
【図１６】哺乳類の細胞における機能性Ａｄｈｉｒｏｎの発現を証明する蛍光透視画像を示す。ヒトＳＵＭＯ２結合Ａｄｈｉｒｏｎが核リンタンパク質ＰＭＬの分解（これらＰＭＬ核内構造体の増大につながる）を変更することが理解される。
【図１７】ＦｃｙＲＩＩＩａ及び結合したＡｄｈｉｒｏｎの共結晶構造を示す。（Ａ）Ａｄｈｉｒｏｎは、ＩｇＧに結合するレセプターに影響を及ぼすアロステリック部位に結合する。この部位も、小分子薬剤デザインに関する標的として同定されており、Ａｄｈｉｒｏｎが新薬の開発につながるような部位についての重要な情報を提供するとの証拠を提供する。（Ｂ）Ａｄｈｉｒｏｎは、ＦｃｙＲＩＩＩａにおけるＩｇＧの直接結合部位を標的とすることも見出されている。Ａｄｈｉｒｏｎは、２つのループ及び４アミノ酸の不定形Ｎ末端配列を含有する。Ｎ末端ペプチドも、Ａｄｈｉｒｏｎ及びＦｃｙＲＩＩＩａの間の相互作用に寄与している。ＡｄｈｉｒｏｎとＦｃｙＲＩＩＩａとの間の結合作用を理解することによって得られる情報は、インシリコスクリーニングを介する小分子の同定に役立つであろう。これは、将来の創薬方法論についての興味をそそる新規なアプローチを提供する。さらに、結晶構造は、コア足場のβシートのいずれか一方を伸展できるループ又は代わりの立体構造的相互作用表面を創造する、より柔軟なループを提示する足場の能力を証明する。これは、足場の固有のコア安定性によって容易になり、潜在的に、このコアをユニークなものとする。
【図１８】ＮＭＲスペクトル。（Ａ）ＡＢＰ足場（薄い灰色）及び酵母ＳＵＭＯ  Ａｄｈｉｒｏｎ１５（濃い灰色）に関する１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱ指紋スペクトルのオーバーレイ。（Ｂ）酵母ＳＵＭＯ  Ａｄｈｉｒｏｎ１５（濃い灰色）に関する１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱ指紋スペクトル及び酵母ＳＵＭＯタンパク質及び酵母ＳＵＭＯ−Ａｄｈｉｒｏｎ１５複合体（薄い灰色）に関する１Ｈ−１５  ＴＲＯＳＹ  ＮＨＳＱスペクトルのオーバーレイ。
【図１９】ＳＵＭＯ結合Ａｄｈｉｒｏｎのインピーダンス変化対濃度のグラフを示す。これは、インピーダンス系バイオセンサー装置におけるＡｄｈｉｒｏｎの潜在的な使用の例を提供し、表面に結合するＡｄｈｉｒｏｎが、抗体に比べて、より広いダイナミックレンジを有することを示す。
【図２０】図２０〜２４は、広範な標的に対して選ばれたＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。この分析より、所定の標的に対するバインダーの範囲の特定が可能になり、いくつかのケースでは、可能なコンセンサス結合領域の開発が容易になる。図２０は、レクチン様酸化ＬＤＬレセプター−１（ＬＯＸ１）に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２１】ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２２】酵母低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２３】ペニシリン結合タンパク質２ａ（ＰＢＰ２ａ）に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２４】ペプチド標的に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２５】有機化合物ポサコナゾールに対するスクリーニングにおいて同定されたＡｄｈｉｒｏｎに関するファージＥＬＩＳＡの結果を示す。グラフは、ＴＭＢの添加後の各ウェルの吸光度を示す。標的を収容するウェルをハッチングして示し、一方、コントロールのウェルをハッチングなしで示す。
【図２６】フィブリノーゲン結合Ａｄｈｉｒｏｎによるマイクロモル濃度からアトモル濃度までのフィブリノーゲンの各種濃度のインピーダンス変化による検出のグラフ。これは、インピーダンス系バイオセンサー装置におけるＡｄｈｉｒｏｎの潜在的な使用の例を提供し、表面に結合するＡｄｈｉｒｏｎが、１５分間のインキュベーションで、低濃度の標的タンパク質を検出でき、広い線形のダイナミックレンジをディスプレイすることを示している。３×１０−１２μＭにおける２つのデータポイントは、分析物の添加直後（下方データポイント）及び１５分間のインキュベーション直後（情報データポイント）に測定したものである。
【図２７】成長因子レセプター結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）Ｓｒｃホモロジー２ドメインに結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【図２８】シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）Ｓｒｃホモロジー２ドメインに結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２領域の配列アライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
「特別なタンパク質足場についてのより広い興味を促進するためには、異なった種類の関連するリガンドについての特異性が発生されること、誘導された結合タンパク質が特に有用であること、及びそれらが、一般的な抗体フラグメントをしのぐ少なくともいくつかの利益を提供することを証明する必要がある。これらの基準は、これまでに提案されたタンパク質足場の多くによっては満足されておらず、これらの多くについて、単に初期のエンジニアリングの努力が記載されているに過ぎない。」と述べられている（Ｓｋｅｒｒａ  ２００７）。従って、本発明は、以下において証明するように、有用で、多目的で、及び魅力的であるタンパク質足場を提供することにおいて価値がある。
【０１３５】
新規なＡｄｈｉｒｏｎ足場及び由来のライブラリーに寄与する重要な生理活性の結合タンパク質を同定するとの意味で高レベルの成功は、大部分は、高度に堅固なフレームワーク（ここで可変性のループ領域がディスプレイされる）を提供するコア足場の非常に高い安定性によるものである。これらのループ領域は、十分な柔軟性を有していて、広範囲の立体構造を採用することができ、このように、広範囲の分子標的（注目すべき低分子の有機分子を含む）に対する結合する試薬の選択を許容する標的分子についての広範囲の立体構造的特徴と相互作用できる。このユニークな足場のこれらの構造的態様は、他の足場タンパク質では達成されていなかった機能的帰結をもたらす。
【０１３６】
植物タンパク質を多くの用途、特にヒトに関与する用途で使用することには、タンパク質がヒトタンパク質に由来せず、従って、ヒトタンパク質との天然の相互作用に関与しないため、利益がある。潜在的な相互作用はシステインプロテアーゼに対するもののみであるが、このようなタンパク質と相互作用できる活性な結合領域は、一般的には、Ａｄｈｉｒｏｎ足場においては交換又は除去される。しかし、ヒトは、絶えず、例えば、食物、化粧品、及び医薬品を介して、植物由来のタンパク質と接触し、耐用性を示している。
【０１３７】
代表的な足場タンパク質（ＰＨＹＴＣ５７と名付ける）の創造
序文
タンパク質デザインに関するコンセンサスアプローチは、シングルコンセンサス配列（この配列において、各位置は、通常、最も頻繁に生ずる残基によって占められる）を誘導するために、タンパク質ファミリーのメンバーのマルチプル配列アライメントにて開始する。折りたたまれたタンパク質の構造、折りたたみ経路、及び安定性を限定する残基は保存される傾向にあるが、酵素における触媒残基のような共通の生物学的機能が要求されるもの、又は保存された標的タンパク質と相互作用する残基も保存されがちである。タンパク質は十分に安定であり、これにより、インビボにおいて、その生物学的役割を実行できように進化するのみであるため、天然のタンパク質は、通常、保存されたコンセンサス残基の全てを含有しないであろうし、多くの場合、生物学的プロセスのターンオーバー及び規制を容易なものとする不安定度を含むであろう（Ｓｔｅｉｐｅ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒら，１９９４）。
【０１３８】
発明者らは、コンセンサスアプローチが、フィトシスタチンの抑制特性及び安定性の増強のために適用可能であるかどうかを探求することに関心を持った。フィトシスタチンは、システインプロテアーゼの低分子（〜１００ａａ）の強力な阻害剤である（Ｋｏｎｄｏら，１９９１）。シスタチンスーパーファミリーの詳細な系統樹推定分析は、シスタチンの異なったクラス間の関係を明らかにした（Ｋｏｒｄｉｓ及びＴｕｒｋ  ２００９）。フィトシスタチンは、システインプロテアーゼへの結合に関与する３つの領域、すなわち、Ｎ末端領域、ＱＶＶＡＧループ、及びＰＷループを含んでなる（Ｍａｒｇｉｓら，１９９８）。発明者らは、構造モデル及び配列アライメントに基づき、既に、保存されたＰＷループの近くにあり、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６と名付けられた残基Ａｓｐ８６を欠くイネシスタチンの変異体であるオリザシスタチン（ＯＳＡ−Ｉ又はＯＩ）を生成した。この変異体は、パパイン及び線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）腸特異的システインプロテアーゼＧＣＰ−１の両方に対して、Ｋｉにおける１３倍の改善を示した（Ｕｒｗｉｎら，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９８；Ｕｒｗｉｎら，２０００；Ｕｒｗｉｎら，２００１；Ｕｒｗｉｎら，２００３；Ｌｉｌｌｅｙら，２００４）。ついで、発明者らは、線虫が寄生した植物内で発生する特殊化した摂食細胞において発現される際に、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６及び他のシスタチンによって与えられる、植物線虫に対する良好なレベルのトランスジェニック耐性を証明した（Ｕｒｗｉｎら，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９８；Ｕｒｗｉｎら，２０００；Ｕｒｗｉｎら，２００１；Ｕｒｗｉｎら，２００３；Ｌｉｌｌｅｙら，２００４）。
【０１３９】
ここに、発明者らは、５７個のフィトシスタチンのアミノ酸のマルチプル配列アライメントに基づくコンセンサスフィトシスタチンのデザイン、構成及び特徴付けについて記載する。発明者らは、このコンセンサスフィトシスタチンが、システインプロテアーゼであるパパインの効果的な阻害及び熱安定性及び消化性アッセイにおける増強された安定性をディスプレイすることを示す。
【０１４０】
材料及び方法
コンセンサスフィトシスタチン（以下、ＰＨＹＴＣ５７と称する）のデザイン
ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴサーチに続いて、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍａ．ａｄ．ｊｐ／；  ＢＬＯＳＵＭ６２；  ギャップ開始ペナルティー＝１２；ギャップ伸長ペナルティー＝１２）を使用して、フィトシスタチン配列のマルチプルアライメントを実施するとともに、さらに、プログラムＣＩＮＥＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＣＩＮＥＭＡ２．１／）（Ｐａｒｒｙ−Ｓｍｉｔｈら，１９９８；Ｌｏｒｄら，２００２）を使用するマニュアルアライメントを実施した。各位置における最も一般的に使用されるアミノ酸を決定し、長さアミノ酸９５個のコンセンサス配列を与えるために、可変性のＮ末端及びＣ末端を切り詰めた。適切なコドン頻度表（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を使用することによって大腸菌での発現用に最適化したコドン使用頻度を有するコンセンサスフィトシスタチン（ｐｈｙｔｃ５７）をコードするように、合成コード領域をデザインした。それぞれが長さ約７０ｎｔ（近接するオリゴヌクレオチドの間で少なくとも１０ｎｔの領域を含む）のオリゴヌクレオチド６個（Ｐ１−Ｐ６、図１参照）から、コード領域を構築した。隣接のオリゴヌクレオチドＰ１及びＰ６は、ベクターｐＤＨｉｓＩＩ（コード配列は、ベクター由来のｐｅｌＢシグナル配列コード領域に融合する）にクローン化するために、それぞれ、ＳｆｉＩ部位及びＮｏｔＩ部位も含有する。ＰＥＬＢ／ＰＨＹＴＣ５７タンパク質のＮ末端配列を自動シグナル配列予測プログラムＳｉｇｎａｌ  Ｐ（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら，２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）に供することによって、シグナルペプチダーゼ開裂部位の保持をチェックした。オリゴヌクレオチド対（Ｐ１＋Ｐ２）、（Ｐ３＋Ｐ４）及び（Ｐ５＋Ｐ６）をアニールし、セルフプライミングによって、二本鎖フラグメントに転換させた。反応液（１０μｌ）は、各プライマー２５ｐモル、すなわち、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、１×Ｐｗｏ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４）及び５単位ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有しており、９５℃で２分間、２５℃で４分間、ついで、７２℃で５分間の１サイクルに供した。生成物（Ｐ１／Ｐ２）の生成物（Ｐ３／Ｐ４）へ、ついで、（Ｐ１／Ｐ２／Ｐ３／Ｐ４）の（Ｐ５／Ｐ６）への連続する結合を同様にして行い、全長の生成物を作成した。最終反応物のアリコート５μｌを、ＰＣＲ５０μｌにおいて、隣接のプライマーＰ１及びＰ６の各々５０ｐモル、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、１×Ｐｗｏ緩衝剤及び５単位Ｐｗｏとともに、テンプレートとして使用した。反応を、９５℃で１分間行い、ついで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間のサイクル３０回に供した。生成物をＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルから取り出し、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩで制限化されたｐＤＨｉｓＩＩにクローン化した。新たに作成した遺伝子領域を配列決定して、正確なプライマー���築及び予測したＤＮＡ配列を確認した。コンセンサスコード領域の配列を図１Ａに示す。
【０１４１】
他のフィトシスタチン遺伝子の合成
大腸菌での発現用に最適化した合成ＤＮＡ配列を、同様にデザインし、作成し、及びイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａｌ；ｏｓａ−ＩΔＤ８６  Ａｓｐ８６用のコドンを欠くｏｃ−ｌ  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ５４７０２の修飾型（Ｕｒｗｉｎら，１９９５））、温州ミカン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ；ｃｕｎ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｃ９５２６３）及びパパイア（Ｃａｒｃｉａ  ｐａｐａｙａ；ｃｐａ，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ７１１２４（Ｓｏｎｇら，１９９５））からのフィトシスタチンのためにクローン化した。鶏卵卵白シスタチン遺伝子（ｃｅｗｃ）配列を、遺伝子特異性プライマー、
ｃｅｗｃＦ  ５’ＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＴＣＣＣＧＧＣ３’（配列番号１０）
ｃｅｗｃＲ  ５’ＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＣ３’（配列番号１１）
（それぞれ、ＳｆｉＩ部位及びＮｏｔＩ部位（下線で示す）が挿入されている）を使用してｐＱＥ３０誘導組み換えプラスミドから増幅した。
【０１４２】
１×ＳｕｐｅｒＴａｑ緩衝剤（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ｐＨ９．０、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含有する容積５０μｌにおいて、各プライマー５０ｐモル、最終濃度０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びテンプレート約１０ｎｇを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの間に高い忠実度増幅を確保するために、ＳｕｐｅｒＴａｑ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：Ｐｆｕ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）ＤＮＡポリメラーゼの１０：１ミックスを、反応当たりポリメラーゼ１単位の量で使用した。反応を、９５℃で１分間の１サイクル、ついで、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間のサイクル２０回に供した。全ての生成物が全長であることを確保するように、７２℃で３０秒間の最終工程を使用した。
【０１４３】
ｐＤＨｉｓＩＩの作成
初めに、フィトシスタチンコード領域を、遺伝子ＩＩＩ融合物として、ファージミドベクターｐＨＥＮ１の修飾型（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１）へクローン化した。ＮｏｔＩ開裂ベクターによる連結用に好適な一本鎖エンドを有するリンカーを創製するためにリン酸化し、アニールした相補的オリゴヌクレオチドによってコードされるヘキサヒスチジン領域の添加によって、ｐＨＥＮベクターを修飾した。オリゴヌクレオチド配列は、
ＨｉｓＦ：  ５’−ＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１２）
ＨｉｓＲ：  ５’−ＧＧＣＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＡＴＣＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）
であり、ＮｏｔＩ相補的末端を下線で示している。
【０１４４】
ｐＨＥＮ１ベクターをＮｏｔＩで消化し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する反応５０μｌにおいて、エビアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）５単位を使用して、６５℃で１５分間加熱する前に、３７℃において３０分間で脱リン酸化した。プライマー
ＸｈｏＦ：５’ＡＴＣＡＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧ３’（配列番号１４）
ＸｈｏＲ：５’ＴＧＴＴＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＧ３’（配列番号１５）
ＢａｍＨＩＲ：５’ＴＧＧＣＣＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＧ３’（配列番号１６）
Ｍ１３Ｒ：５’ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ３’（配列番号１７）
を使用するＰＣＲ突然変異誘発によって、遠位のＮｏｔＩ部位を破壊した。
【０１４５】
ＸｈｏＦプライマーをＢａｍＨＩＲプライマーと一緒に使用し、及びＸｈｏＲプライマーをＭ１３Ｒプライマーと一緒に使用して、２つのフラグメントを作成し、２つのフラグメントを、プライマーＭ１３Ｒ及びＢａｍＨＩＲを含む第２のＰＣＲにおいてアニールし及び増幅した。導入されたＸｈｏＩ制限部位に下線を付している。得られた生成物を、ＳｆｉＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして、同様にデザインしたｐＨＥＮ１ベクターにクローン化した。ＸｈｏＩ部位の存在を、単離したファージミドＤＮＡの制限分析によってスクリーニングし、陽性クローンにおける挿入物ｐＤＨｉｓＩＩ（図１Ｂ）を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１４６】
ｐＤＨｉｓＩＩにおけるシスタチンの発現
初めに、Ｃ末端ＲＧＳ（Ｈ）６及びｍｙｃタグを追加するベクターｐＤＨｉｓＩＩにおいて、作成物を使用して、シスタチンを発現させた。大腸菌宿主菌株ＨＢ２１５１における発現の研究により、シスタチン−遺伝子ＩＩＩ融合物内におけるアンバーコドンの抑制が可能になり、その結果、周辺質にシスタチンが蓄積された。培養物（１Ｌ）を、０．１％（ｖ／ｖ）グルコース及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌと一緒に、２ｘＴＹ培地において生育し、ついで、１ｍＭまでのＩＰＴＧによって誘導し、３０℃において１６時間生育した。細胞ペレットを、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）、２０％（ｖ／ｖ）ショ糖２０ｍｌに、４℃で再懸濁させ、周辺質の調製を行った。周辺質フラクションにＮｉ−ＮＴＡ樹脂１ｍｌを添加し、４℃において１６時間混合してインキュベートした。樹脂を洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）のアリコート１ｍｌで８回、ついで、４０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＰＢＳに対して透析する前に、シスタチンを、２５０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄緩衝液２００μｌにて、４℃において、１時間で溶離した。タンパク質を分取し、液体窒素中で凍結した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロスプレイ質量分析によって分析した。
【０１４７】
ｐＥＴ１０１におけるシスタチンの発現
可溶性タンパク質のより効果的な発現のため、フィトシスタチン遺伝子を、ｐＤＨｉｓＩＩからのＣ末端６−Ｈｉｓタグと一緒に、方向性ＴＯＰＯクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＥＴ１０１にサブクローン化した。上述の条件を使用して、元のクローニングベクターｐＤＨｉｓＩＩからのフィトシスタチン遺伝子をＰＣＲ増幅するために、プライマー
ｃｙｓｔａＳＤＦＷＤ  ５’ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＣＴＴＡＣＧ３’（配列番号１８）
ｃｙｓｔａＳＤＲＥＶ  ５’ＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧ３’（配列番号１９）
を使用した。陽性のクローンをＤＮＡ配列分析によって確認し、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ  ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。培養物を３０℃において生育し、ＩＰＴＧを１６時間添加する（１ｍＭまで）ことによってフィトシスタチンの発現を惹起した。遠心分離（４，０００×ｇ、１０分）によって細胞を収集し、氷上で超音波処理し（３×１分）、細胞片を遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分）によってペレット化した。上澄みを０．１ｍＭ  ＮｉＣｌ２を充填した金属キレート化カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に負荷した。広範な洗浄の後、１００ｍＭイミダゾールにてフィトシスタチンを溶出し、広範にＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｐ２０）に透析し、−７０℃において保存した。
【０１４８】
パパインアッセイ
システインプロテアーゼ用の合成基質（Ｆｉｌｉｐｐｏｖａら，１９８４）であるｐＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、パパイン（Ｓｉｇｍａ）の阻害をアッセイした。インキュベーション緩衝液（０．１５Ｍ  ＭＥＳ／ＯＨ  ｐＨ５．８、４ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ、４ｍＭ  ＤＴＴ）５０μｌ中のパパイン１００ｎｇを、シスタチンを含有しない又は既知濃度のシスタチンを含有するサンプル５０μｌに添加し、３０分間プレインキュベートした。１ｍＭ  ｐＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐ−ＮＡ（インキュベーション緩衝液及び３０％ＤＭＳＯ中）５０μｌを添加し、パパインの活性を、２５℃において１５分間にわたり、４１５ｎｍにおけるＯＤの線形増加によってモニターした。
【０１４９】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験
パパインをＳｉｇｍａから凍結乾燥粉末として入手した。ＳＰＲ試験のために、１ｍＭ  ＤＴＴを含有するＨＢＳ緩衝液に溶解することによって、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。このストック溶液を、同じ緩衝液にて、所望の濃度に希釈した。全てのＳＰＲ試験を、ＮＴＡセンサーチップを使用する装置ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００にて実施した。ランニング緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｐ２０、ｐＨ７．４）であり、全ての試験を２５℃において実施した。フィトシスタチンを、フローセル２〜４において不動化し（約４００応答単位（ＲＵ））、フローセル１をブランクのままとした。パパインのフィトシスタチンへの結合をモニターするため、ＨＢＳ緩衝液２４０μｌを、全てのフローセル上に、流量８０μｌで注入し（会合フェーズ）、続いて、サブトラクションブランクを提供するため、普通の緩衝液を３分間注入した（解離フェーズ）。この注入をパパインとともに繰り返した。ＥＤＴＡを使用してタンパク質をセンサーチップから剥がし、異なったパパイン濃度で試験を繰り返す前に、表面にニッケルを再充填した。動態解析を可能にするため、各濃度について、少なくとも５サイクルを行った。これらの結合テストからのデータを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３ソフトウエアパッケージ（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用し、データをＬａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルに包括的に適合することによって分析した。
【０１５０】
フィトシスタチンの熱安定性
ＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６のアリコートを、５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において０．５μｇタンパク質／ｍｌで調製した。直ちに、サンプルを沸騰水浴内に置いた。各種の時間でサンプルを取り出し、−７０℃において保存する前に、液体窒素に浸漬した。機能性シスタチンの残留レベルを測定するため、パパイン阻害アッセイによって、残留阻害活性を測定した。
【０１５１】
消化性アッセイ
使用直前に、上述のように、模擬胃液を調製し（Ａｓｔｗｏｏｄら，１９９６）、該胃液は、０．０３Ｍ  ＮａＣｌ中に０．３２％（ｗ／ｖ）ペプシンを含有し、濃ＨＣｌにてｐＨ１．２に調整されている。最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌでＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６の４個のレプリカを、ＳＧＦ中、３７℃においてインキュベートした。間を置いて、アリコート２００μｌを取り出し、直ちに０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３７５μｌと混合して消化を停止させた。各サンプルを３つのサブサンプルに分け、上述のように（Ａｔｋｉｎｓｏｎら，２００４）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。２つのゲルを、全タンパク質について、クマシーブルーで染色し、その内の１つは、ＰＨＹＴＣ５７に対する模擬胃液の効果を示すものであり、他方は、ＰＨＹＴＣ５７の消化性をＯＳＡ−ＩΔＤ８６と比較するものである。第３のゲルを、マウスの抗体を使用するウエスタンブロット分析に供して、アルカリホスファターゼ活性を使用する可視化にてＰＨＹＴＣ５７の６Ｈｉｓタグ（Ｑｉａｇｅｎ）を検出した。各時点からの最終サンプルを、上述する酵素アッセイによってパパインに対する残留阻害活性について分析した。
【０１５２】
結果
フィトシスタチン遺伝子の合成
コンセンサスフィトシスタチンコード領域のデザインのため、探索プローブとしてＯＳＡ−Ｉ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖｅ；Ｕ５４７０２）、ＺＭＡ２（Ｚｅａ  ｍａｙｓ；Ｄ３８１３０）及びＨＡＮ１（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ；Ｑ１０９９３）タンパク質配列を使用して、ＧｅｎｂａｎｋデータベースのｔＢＬＡＳＴＮ探索に着手した。コンセンサス配列を誘導するために使用した配列のリストを表１に示す。ホモロジー検索によって、データベースから配列を同定した。表は、各シスタチンについて、植物の生物名及び慣用名及びＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号とともに、系統名を示す。プログラムＣＬＵＳＲＡＬＷを使用して、コード配列を翻訳及び整列させ、プログラムＣＩＮＥＭＡ（Ｐａｒｒｙ−Ｓｍｉｔｈら，１９９８；Ｌｏｒｄら，２００２）を使用して、アライメントをディスプレイして、手動アライメントによって改善を可能にした。ついで、コンセンサス配列を、各位置における最も一般的なアミノ酸を同定することによって派生させた（図１Ａ）。コンセンサス配列の長さを、保存されたＮ末端グリシン残基の前及びこのようにして第１のβストランド（β１）の前の、Ｎ末端に位置する４つの残基を有するアミノ酸９５個と評価した。Ｃ末端は、保存されたＰＷモチーフの後及びこのようにして最後のβストランド（β５）の後の残基１５個と評価された。これらの基準は、ＣＥＷＣ（Ｂｏｄｅら，１９８８）及びヒトステフィンＢ（Ｓｔｕｂｂｓら，１９９０）のＸ線構造及びＯＳＡ−ＩのＮＭＲ構造（Ｎａｇａｔａら，２０００）に基づくものである。
【０１５３】
【表１−１】
2019205450.tif 000003
【表１−２】
2019205450.tif 000004
【表１−３】
2019205450.tif 000005
【表１−４】
2019205450.tif 000006
【０１５４】
ＰＨＹＴＣ５７をコードする合成遺伝子を、上記「材料及び方法」において記載したように、近接するオリゴヌクレオチド間において少なくとも１０ｎｔのオーバーラップの領域を含むようにデザインされた６個のオリゴヌクレオチド（Ｐ１〜Ｐ６）（それぞれ、約７０ｎｔ）から作成した。天然に産生するフィトシスタチンの比較研究のため、発明者らは、大腸菌コドン使用頻度を反映するためにコドン変更を有する好適なタンパク質のユニーク配列からデザインされた、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６、ｃｕｎ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ；Ｓａｔｓｕｍａ）及びｃｐａ（Ｃａｒｃｉａ  ｐａｐａｙａ；Ｐａｐａｙａ）フィトシスタチンコード領域を使用する同様の合成遺伝子アプローチを採用した。鶏卵卵白シスタチン（ｃｅｗｃ）コード領域は、ｐＱＥ−由来プラスミドから増幅されたＰＣＲであった。初めに、ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ部位を活用することによって、遺伝子を、ファージディスプレイベクターｐＤＨｉｓＩＩにクローン化した（図１Ｂ）。
【０１５５】
シスタチンの発現
初めに、ｐＤＨｉｓＩＩからシスタチンを発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製したシスタチンのエレクトロスプレイイオン化質量分析による分析は、意外にも、各ケースにおいて、発現されたタンパク質のＣ末端欠失があることを示した。表２は、測定した分子質量とともに、全長シスタチン及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒプログラム（ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／〜ｃｄｐｕｔｎａｍ／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｈｔｍｌ）を使用して算定した１６アミノ酸Ｃ末端欠失を有する全長シスタチンの予想した質量を示す。タンパク質のＣ末端エンドの配列が、矢印で示される主要な欠失部位とともに示されている。ＣＵＮを除き、測定した分子質量は、Ｃ末端のアミノ酸１６個を失ってはいるが、Ｈｉｓタグを保持している融合タンパク質の型と良好に一致している（表２）。ＣＵＮの場合、１６個未満の残基の欠失があるが、これを、更に特徴付けることはしなかった。特定されたタンパク質配列の発現を確実にするために、シスタチンコード領域＋Ｈｉｓタグを、ＰＣＲ及びＴＯＰＯ促進性クローニングによって、ｐＥＴ１０１にサブクローン化し、ＢＬ２１（ＣＥ３）Ｓｔａｒ  ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において発現させた。ＩＰＴＧを１６時間で１ｍＭまで添加することによってタンパク質の発現を惹起し、シスタチンを、それらのＣ末端ヘキサヒスチジンタグのため、天然の条件下において、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。シスタチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、それらの純度（＞９８％と予測された）を検査したところ、それらの質量は、ＥＳＩ−ＭＳによって予測された値（データを表示していない）と良好に一致したため、これらのタンパク質を他の分析に使用した。
【表２】
2019205450.tif 000007
【０１５６】
シスタチンの結合活性
人工の基質ｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリドを使用するパパインによる酵素アッセイにより、ＰＨＹＴＣ５７が活性なシスタチンプロテアーゼ阻害剤であることが確認された。Ｋｉ値を測定していないが、ＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６のＩＣ５０値（それぞれ、４．６×１０−８Ｍ及び１．８×１０−７Ｍ）から、ＰＨＹＴＣ５７がＯＳＡ−ＩΔＤ８６よりもより強力な阻害剤であることが明らかである。シスタチンとプロテアーゼとの間の相互作用を直接測定するために、発明者らは、ＢＩＡコア表面プラズモン共鳴分析を使用して、結合速度を測定した。シスタチンを、Ｃ末端Ｈｉｓタグによって、ニッケル被覆センサーチップ上に不動化した。ついで、パパインを、不動化したシスタチンに結合させ、いくつかのパパイン濃度において測定を行った。ＯＳＡ−ＩΔＤ８６、ＣＰＡ、ＣＵＮ、ＣＥＷＣ、及びＰＨＹＴＣ５７の結合に関するセンサーグラムを図３に示す。各濃度におけるデータを、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルに適合させ、速度定数を測定した。データは、シスタチンプロテアーゼのシスタチン阻害の既知の１：１化学量論量と矛盾しないモデルへの良好な適合を示した。これらのシスタチンに関する速度定数の要約を表３に示す。ＰＨＹＴＣ５７は、テストした天然産のシスタチンに比べて、平衡定数ＫＤ６．３×１０−１２Ｍにて、より高い会合速度及びより低い解離速度を発揮する（堅固なパパインとの結合複合体を表示する）。この値は、鶏卵卵白シスタチンについて測定したＫＤ値（３．９×１０−１０Ｍ）よりも２桁低く、改良されたフィトシスタチンＯＳＡ−ＩΔＤ８６（４．７×１０−９Ｍ）よりも３桁、及びフィトシスタチンＣＵＮ（１．４×１０−８Ｍ）及びＣＰＡ（２×１０−８Ｍ）よりも４桁低い。
【０１５７】
【表３】
2019205450.tif 000008
【０１５８】
フィトシスタチンの安定性
発明者らは、ＰＨＹＴＣ５７が、良好に特徴付けられた親のフィトシスタチンＯＳＡ−ＩΔＤ８６と比較する場合、より大きい安定性を発揮するかどうかを調査することに興味を持った。これらのフィトシスタチンのサンプルを、沸騰水浴内で、各種の時間インキュベートし、冷却し、ついで、パパインアッセイにおいて、残留阻害活性についてテストした（図４Ａ）。コンセンサスタンパク質ＰＨＹＴＣ５７（ｔ１／２＝１７分）は、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６（ｔ１／２＝６分）よりも大きい熱安定性を発揮し、阻害活性は、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６について５８分であるのに対して、ＰＨＹＴＣ５７については８０分でも、なお測定された。
【０１５９】
発明者らは、模擬胃液（ＳＧＦ）消化性アッセイを使用して、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６及びＰＨＹＴＣ５７の安定性をテストした。反応を無効にする前に、新たに調製したＳＧＦにおいて、タンパク質を各種の時間でインキュベートした。ついで、サンプルを２つの方法、すなわち、残留阻害活性を測定するための酵素アッセイ（図４Ｂ）及びタンパク質が消化されたかどうかを測定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４Ｃ）によって分析した。消化研究ではＰＨＹＴＣ５７の増強された安定性が観察されるとともに、酵素アッセイでは、ＰＨＹＴＣ５７及びＯＳＡ−ＩΔＤ８６は、それぞれ、２６０秒及び３０秒のｔ１／２値を示した。これらのアッセイデータは、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６の９９％が、インキュベーション後３０〜６０秒で、模擬胃液中で破壊されたことを示している。ＰＨＹＴＣ５７については、このレベルの不活性化は２〜５分までには生ぜず、これは、ＰＨＹＴＣ５７消化条件に耐えられることを証明している。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図４Ｃ）（全長のタンパク質を同定する）は、３０秒では、極微量のＯＳＡ−ＩΔＤ８６が存在し、一方、ＰＨＹＴＣ５７については、１２０秒では、いくらかのタンパク質がなお存在するとのデータを支持している。ＰＨＹＴＣ５７についてのこれらの結果を確認するため、発明者らは、抗−６Ｈｉｓタグ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、ＳＧＦ消化生成物を分析した。図４Ｄに示されているように、３００秒及び４２０秒間のＳＧＦ処理でも、極微量の未変化のＰＨＹＴＣ５７が残留するが、タンパク質に大部分は、３００秒間のＳＧＦ処理によって実際に破壊されたことが明確にされた。仮にＰＨＹＴＣ５７をトランスジェニック植物の発現に使用されたとしても、全長のＰＨＹＴＣ５７タンパク質の大部分及び全ての阻害活性が、ＳＧＦ中での１０分間のインキュベーション後には失われたとの事実は、ＰＨＹＴＣ５７は、いかなる偶発的な宿主の消化後であっても、消化プロセスの間に容易に破壊されることを意味している。
【０１６０】
考察
タンパク質のデザインに関するコンセンサスアプローチは、天然には存在しない配列を作成する方法を提供するものである。このような配列は、１ファミリーの類似のタンパク質の保存された官能性配列パラメーターを最適化するであろう。ファミリーの構造及び折りたたみに関与する特に重要な残基は、高度に保存されがちである（Ｌｅｈｍａｎｎ及びＷｙｓｓ  ２００１；Ｍａｉｎら，２００３ａ；Ｍａｉｎら，２００３ｂ；Ｍａｉｎら，２００５）（Ｆｏｒｒｅｒら，２００４）（Ｓｔｅｉｐｅ  ２００４）。ファミリーの個々のメンバーの生物学的役割に応じて、官能性残基は保存されるか、又は保存されないであろう。システインプロテアーゼ結合性及び阻害性の形の機能的保存を示すフィトシスタチンの場合には、システインプロテアーゼ活性部位との相互作用に関与する高度の保存された配列モチーフの強化が存在する。従って、コンセンサスアプローチは、一般的な安定性とともに、生物学的機能、システインプロテアーゼ結合性が増強された最適化されたタンパク質を生ずるであろう。
【０１６１】
植物は、動物性シスタチン及びステフィンとは異なった特有の特性を有するシスタチンを含有する。特に動物性のシスタチン及びステフィンについては、Ｎ末端Ｇｌｙ配列がシステインプロテアーゼの阻害に関して重要であるが、植物性シスタチンについては当てはまらない（Ａｂｅ，Ｋ．ら，（１９８８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６３，７６５５−７６５９）。さらに、植物性シスタチンは、他のシスタチン又はステフィンには見られない特有の配列
[ＬＶＩ][ＡＧＴ][ＲＫＥ][ＦＹ][ＡＳ][ＶＩ]Ｘ[ＥＤＱＶ][ＨＹＦＱ]Ｎ（配列番号８１）
を含有する。
【０１６２】
パパインによる不動化シスタチンのＳＰＲ分析では、ＰＨＹＴＣ５７が、テストした３つの親のフィトシスタチンよりも、パパインとのタンパク質：タンパク質相互複合体を形成及び維持する点でより効果的であることが明らかにされた。特に、解離速度定数は低減されるが、これは、一旦結合すると、ＰＨＹＴＣ５７：パパイン複合体は、テストした他のシスタチンによって形成されるものよりも安定であることを示している。動物に由来するシスタチン（ジスルフィド結合を含有する）は、特徴付けられたシスタチン（その効力は、パパインに対して、ＯＳＡ−Ｉについて約１０ｎＭ（Ｕｒｗｉｎら，１９９５）から大豆シスタチンについてｐＭ（Ｋｏｉｗａら，２００１）までの範囲である）よりも効果的なシスタチンであることが報告されている。発明者らの研究では、ＰＨＹＴＣ５７が、動物性シスタチンである鶏卵卵白シスタチンよりも、パパインを結合する点でより効果的であることが観察された。さらに、ＰＨＹＴＣ５７は、模擬消化性アッセイにおけるより大きい安定性とともに、増強された熱安定性を発揮する。
【０１６３】
ＰＨＹＴＣ５７が増強された特性を発揮するとの事実は、ＰＨＹＴＣ５７がさらに増強されないことを意味するものではない。結合領域を含んでなる保存されたモチーフの強化は、生物学的に最適な結合配列を提供できるが、恐らく、最も効果的であるわけではない。例えば、Ｋｏｉｗａは、大豆シスタチンにおける第３のループ領域の変更は、生成する変異体の効力を増強することを証明している（Ｋｏｉｗａら，２００１）。ＱＶＶＡＧ領域内の新規な配列が増強された阻害活性を付与するとのレポートがある（Ｍｅｌｏら，２００３）。トランジェニック植物系における可能性のある用途に関して、更なる安定性の増強が、トランスジェニック生成物が環境内に蓄積されないことを確保する必要性のために有益であるとは考え難い。
【０１６４】
発明者らは、ここで、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６と対比してＰＨＹＴＣ５７の相対的な結合効力に焦点を当てた。このイネシスタチン変異体は、作成された第１の増強されたフィトシスタチンであり、トランスジェニック植物の発現及び線虫抵抗性トライアルに至る広範囲の研究に供した（Ｕｒｗｉｎら，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９７；Ｕｒｗｉｎら，１９９８；Ｕｒｗｉｎら，２０００；Ｕｒｗｉｎら，２００１；Ｕｒｗｉｎら，２００３；Ｌｉｌｌｅｙら，２００４）。ＰＨＹＴＣ５７は、ＯＳＡ−ＩΔＤ８６から３４個のアミノ酸の相違を示した。ＯＳＡ−ＩΔＤ８６とＰＨＹＴＣ５７との間のこれらアミノ酸の相違の位置の対比を図５（図において、置換は、色分けされており、ＯＳＡ−Ｉについての構造モデル（ｐｄｂコード１ＥＱＫ）（Ｎａｇａｔａら，２０００）上に表されている）に示す。相違は構造足場の全体にわたって分散しており、保存的変化及び非保存的変化の両方を含む。変化の内の６個は負の電荷を持つアミノ酸の導入を伴うことは興味深い。増強された特性に至る最も重大な「コンセンサス」置換を定義し、このようにして、タンパク質の構造−作用の関係についての理解を深めるために、コンセンサスタンパク質を有する個々の親のシスタチン分子の詳細な比較生化学的配列分析及び変異誘発研究を企てた。
【０１６５】
ＰＨＹＴＣ５７の驚くほど顕著な増強された安定性のため、発明者らは、この低分子のコンセンサスタンパク質を新規な足場と考えた。新規な結合作用の選択のためのタンパク質足場は、医療用を含む（Ｗｕｒｃｈ，Ｐｉｅｒｒｅら，２０１２）抗体の代用物としての幅広い用途（Ｓｋｅｒｒａ  ２００７）において有用であることが証明されている。有望な足場として提案される１５個のフィブロネクチン又はテネイシンＦｎ３様ドメイン配列からのＦｎ３様コンセンサスタンパク質の開発に関する最近のレポートがある（Ｊａｃｏｂｓ，Ｄｉｅｍら，２０１２）。天然産のＦｎ３ドメイン１０は、Ｋｏｉｄｅらによって開発されたよく研究された足場である（Ｋｏｉｄｅ，Ｂａｉｌｅｙら，１９９８；Ｋａｒａｔａｎ，Ｍｅｒｇｕｅｒｉａｎら，２００４；Ｋｏｉｄｅ，Ｇｉｌｂｒｅｔｈら，２００７）。その増強された熱安定性、低分子であること及びシスタチンの欠如のため、発明者らは、コンセンサスＰＨＹＴＣ５７が、新規な人工の結合タンパク質を同定するために標的分子群に対するスクリーニング用の各種のペプチドループライブラリーをディスプレイするための結合タンパク質足場として有用であろうと予測した。
【０１６６】
それ故、ＰＨＹＴＣ５７は、植物線虫のような病原体を標的とする改良されたシステインプロテアーゼ阻害剤として、トランスジェニック植物防御スキームについて、及び新規な結合作用を選択するための足場タンパク質としての開発について有望な利益を提供する。
【０１６７】
足場タンパク質ライブラリーの創成、「Ａｄｈｉｒｏｎ」の機能のスクリーニング及びテスト
序文
発明者らは、上記の５７個の植物由来フィトシスタチン（先に「ＰＨＹＴＣ５７」と名付けたが、以下では、「Ａｄｈｉｒｏｎ」と称する）のコンセンサス配列に基づいて新規で人工の結合（足場）タンパク質をデザインした。この人工のタンパク質は、ペプチド提示用の良好な足場であるための要件（低分子、単量体性、高溶解性及び高安定性、及びジスルフィド結合及びグリコシル化部位の欠如）の全てを満足する。発明者らは、各ループにおける９つのランダムな位置を有する、ペプチド提示用のＡｄｈｉｒｏｎ足場のＶＶＡＧ及びＰＷＥ領域を選択した。
【０１６８】
大腸菌において発現されたＡｄｈｉｒｏｎ足場の高収率に基づき、発明者らは、２つのループ内のペプチドの変更が、足場のタンパク質発現レベル及び安定性に対して容認できる効力を有すると仮定した。それ故、発明者らの足場は、ファージディスプレイ技術（Ｓｍｉｔｈ，１９８５）によるスクリーニング用の組み換えライブラリーの作成において使用されるものと考えられる。ファージディスプレイの成功は、初期のＤＮＡライブラリーの質（主に、その多様に由来する）に左右される。改良されたライブラリーの多様性は、停止コドン及びシステインの回避とともに、理論的に同レベルの異なったアミノ酸の導入を提供する（Ｖｉｒｎｅｋａｓ，Ｇｅら，１９９４；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，２００７）トリヌクレオチド（トリマー）−合成オリゴ（Ｋａｙａｓｈｉｎ，Ｋｏｒｏｓｔｅｌｅｖａら，１９９６）を使用することによって達成される。さらに、トリマー挿入又は欠失は、解読枠突然変異におけるシフトには至らず、これによって、なお機能性タンパク質を潜在的に生成するであろう。従って、発明者らは、ループ−ランダム化オリゴ用に、システインを除く１９個の天然産アミノ酸をコードするトリマー混合物を選択した。
【０１６９】
発明者らの研究により、Ａｄｈｉｒｏｎが、治療剤とともに、研究用試薬、診断試薬の作成において重要な役割を果たす高い能力を有することが証明された（創薬）。
【０１７０】
Ａｄｈｉｒｏｎ足場は、いかなる他の非反復足場タンパク質について報告されているものを上回る明らかに高い熱安定性（Ｔｍ  ｃａ．１０１℃）を示し、再現性良く組み換えタンパク質を生成するために、原核生物性の発現システムにおいて、高いレベルで発現される。発明者らは、Ａｄｈｉｒｏｎ内の２つのループ領域で残基を交換するために、ランダム化したアミノ酸配列の挿入に基づきファージディスプレイライブラリーを構築した。ライブラリーは、ファージ生産後全長クローン８６％より大とともに、複雑度約３×１０１０を有しており、ライブラリーの品質が高いことを示す。ライブラリーの効力の証明として、この標的タンパク質に結合できる人工の結合タンパク質（Ａｄｈｉｒｏｎ）試薬を同定するために、酵母低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）をスクリーニングした。ファージ酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価されるように、酵母ＳＵＭＯ（ｙＳＵＭＯ）へ結合する２０個以上の各Ａｄｈｉｒｏｎを同定した。ＤＮＡ配列決定は、大部分が、２つの領域の一方内で、既知のＳＵＭＯ相互作用的モチーフ（Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｘ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ；ここで、Ｘは各種のアミノ酸である）との部分的な配列相同性を示すことを指摘した。４つのＡｄｈｉｒｏｎコード領域をベクターｐＥＴ１１にサブクローン化し、組み換えタンパク質を発現し、精製し、ＥＬＩＳＡでテストし、ウエスタンブロット分析した。４つのＡｄｈｉｒｏｎは、ｙＳＵＭＯについて低ナノモル親和性を有しており、低レベルのヒトＳＵＭＯ１への結合性とともに、ｙＳＵＭＯに対する高い特異性を示した。さらに、発明者らは、多数の他の標的、すなわち、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ１）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）（表面抗原分類３１（ＣＤ３１）としても知られている）、及びビオチンヘのチオール結合用のＮ末端にシステインを有するアミノ酸１０個のペプチド（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ）に対するＡｄｈｉｒｏｎライブラリーをスクリーニングし、ファージＥＬＩＳＡによって確認されるように、これらの標的に対してＡｄｈｉｒｏｎを同定した。従って、発明者らは、ランダム化ペプチドループをディスプレイできる、多様性で、高度に安定性で且つ良好に発現される足場タンパク質（Ａｄｈｉｒｏｎと名付けた）を開発し、多岐の分野における用途のために一定範囲の標的に対するＡｄｈｉｒｏｎライブラリーから高度に特異的で、高度に親和結合性の試薬を選択する可能性を証明した。
【０１７１】
材料及び方法
Ａｄｈｉｒｏｎライブラリーの構築
５７個のフィトシスタチン配列のアライメントに由来するコンセンサス配列を上記のように同定し、大腸菌での発現用にデザインしたコドン修飾遺伝子を合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。Ａｄｈｉｒｏｎ足場コード領域及びＡｄｈｉｒｏｎライブラリーコード領域を、Ｎｈｅｌ制限部位とＮｏｔＩ制限部位との間でクローン化して、ファージミドｐＢＳＴＧ１（ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，１９９１）に由来し、ＤｓｂＡシグナルペプチドも含有するｐＤＨｉｓＩＩの誘導体である）において、バクテリオファージＭ１３のジーンＩＩＩの３’末端ハーフを有する融合コード領域を作成した（ｐＢＳＴＧ１−ＤｓａＡ−Ａｄｈｉｒｏｎ）。２つのＰＣＲ生成物（Ｈｏｒｔｉｎ，Ｃａｉら，１９９０）のスプライスオーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）によってライブラリーを構築し、全てのプライマーをＥｌｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成した。
【０１７２】
第１のＰＣＲ生成物は、ＤｓｂＡコード配列から第１の挿入されたループまで伸びており、プライマー：
順方向プライマー  ５’−ＴＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣ  −３’（配列番号２１）、
逆方向プライマー  ５’−ＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣ−３’ （配列番号２２）。
によって作成された。
【０１７３】
第２のＰＣＲ生成物は、下記のプライマーを使用することによって、ループ１及びループ２において、足場タンパク質にアミノ酸９個の領域２個を導入した。クローニングに使用したＰｓｔＩ部位に下線を付している。
順方向ループ
５’ＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号２３）、
逆方向ループ
５’ＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＣＴＴＴＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２４）。
【０１７４】
変性位置（ＮＮＮ）を、システインを除く１９個のアミノ酸の各々のシングルコドンを表すトリマーとして導入し、停止コドンはない。移行性のリードスルーがＡｄｈｉｒｏｎ−切り詰めｐＩＩＩ融合タンパク質を創成するために、インフレームアンバー停止コドンを含有するファージミドベクターｐＢＳＴＧ１へのクローニングを容易にするためにＮｈｅＩ（前方）制限部位及びＰｓｔＩ制限部位（後方）を導入するように、プライマーをデザインした。
【０１７５】
Ｐｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、９８℃において５分間、続いて、９８℃に１０秒間、５６℃に１５秒間、７２℃に１５秒間のサイクル２０回、続いて、さらに７２℃に５分間に供してＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物を、ゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、上述のプロトコルを使用する１０サイクルでのＳＯＥｉｎｇのために使用した。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩ及びＰｓｔＩによって消化し、ゲル抽出し、ついで、ＮｈｅＩ及びＰｓｔＩにて消化してＡｄｈｉｒｏｎのＤｓｂＡシグナル配列及びＣ末端コード領域を残したｐＢＳＴＧ１−Ａｄｈｉｒｏｎファージミドにクローン化して、ＤＮＡ系Ａｄｈｉｒｏｎライブラリーを作成した。連結したライブラリー生成物を大腸菌ＥＲ２７３８エレクトロコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に導入するために、電気穿孔を使用した。ＥＲ２７３８の合計２０ｍｌを、ライブラリーＤＮＡ５０ｎｇ／ＥＲ２７３８細胞５０μｌで電気穿孔した。細胞を２ＴＹ培地において１時間回復させ、ついで、２ＴＹ培地２ｌにおいて、３７℃、２２５ｒｐｍで、ＯＤ６０００．６まで生育した。１Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）１μｌ（１０１４／ｍｌ）を添加し、９０ｒｐｍで震盪しながら、１時間、感染させ、ついで、培養物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、２５℃において一夜でファージ粒子を生成した。ファージを６％ポリエチレングリコール８０００及び０．３Ｍ  ＮａＣｌにて沈殿させ、保存のため、５０％グリセリンに懸濁化させた。ライブラリーのサイズは、最小ベクターオンリーバックグラウンドにて、〜３×１０１０であることが測定された。
【０１７６】
標的の調製及びファージディスプレイ
下記のプロトコルは酵母ＳＵＭＯについて記載したものであるが、同じプロトコルを他の標的のスクリーニングに使用した。ＩＰＴＧ誘導を使用して、酵母ＳＵＭＯ（ｙＳＵＭＯ）タンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現し、製造者の説明によるＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を確認した。製造者の説明に従って、ＥＺリンクＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、酵母ＳＵＭＯをビオチン化した。免疫９６Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）プレートに吸収されたｙＳＵＭＯ上のビオチンを検出するために、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合したストレプトアビジンを使用して、ビオチン化を確認した。ファージディスプレイライブラリーのバイオパニングを下記のようにして実施した。
【０１７７】
ファージミドライブラリー（１０１２ファージミド粒子を含有する）５μｌを、リン酸塩緩衝食塩水９５μｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）と混合し、高結合容量ストレプトアビジン被覆細胞（Ｐｉｅｒｃｅ）において、計１時間で、３回プレ−パニングした。プレ−パニングしたファージを、振動するプラットフォームにおいて、２．５時間で添加する前に、速度を３に設定したＨｅｉｄｏｌｐｈ  ＶＩＢＲＡＭＡＸ  １００上で振動しながら、１００ｎＭビオチン化ｙＳＵＭＯ１００μｌをパニングウェルに１時間で添加した。パニングウェルを、プレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ  Ｈｙｄｒｏｆｉｘ）を使用して、ＰＢＳＴ３００μｌ中で１０回洗浄し、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１００μｌで１０分間溶離し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和し、さらに、１００ｍＭトリエチルアミン１００μｌで６分間溶離し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）５０μｌで中和した。溶離されたファージを、指数増殖期のＥＲ２７３８細胞（ＯＤ６００＝０．６）とともに、３７℃及び９０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを補足したＬｙｓｏｇｅｎｙ  Ｂｒｏｔｈ寒天プレート上に細胞を置き、室温において一夜生育させた。翌日、コロニーを２ＴＹ培地５ｍｌにスクレープし、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補足した２ＴＹ培地２５ｍｌに接種してＯＤ６０００．２とし、３７℃、２２５ｒｐｍで１時間インキュベートし、ｃａ．１×１０９  Ｍ１３ＫＯヘルパーファージを感染させた。９０ｒｐｍでの１時間のインキュベーションの後、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを添加し、２５℃、１７０ｒｐｍで細胞を一夜インキュベートし、６％ポリエチレングリコール８０００、０．３Ｍ  ＮａＣｌにてファージを沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ緩衝液）１ｍｌ中に再懸濁した。このファージ懸濁液２μｌを、選択の第２ラウンドに使用した。ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、この回のファージディスプレイを行った。固定速度ローテーターＳｔｕａｒｔ  ＳＢ２上で、洗浄したビーズ１０μｌとともにファージを１時間プレ−パニングし、同じローテーター上において、ビーズ１０μｌを、１００ｎＭビオチン化ｙＳＵＭＯ１００μｌにて４時間ラベル化した。プレ−パニングしたファージを１時間で添加する前に、酵母ＳＵＭＯにてラベル化したベースを、ＰＢＳＴ中で３回洗浄した。各洗浄後に溶液からビーズを分離するために磁石を使用して、ビーズをＰＢＳＴ中で５回洗浄し、ついで、上記のようにして、溶離し及び増幅した。第１のパニングラウンドについて既に記載したようにして、ニュートラビジン高結合容量プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、最後のパニングを行い、ただし、この回では、ＥＲ２７３８細胞の感染前に、１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）１００μｌを使用して、振動プラットフォーム上で、ファージを２０分間溶離した。標的ウェルにおける増幅のレベルを測定するために、標的タンパク質を含有するウェル及びコントロールウェルからファージを回収した。
【０１７８】
ファージＥＬＩＳＡ
最終パニングからの個々のＥＲ２７３８コロニーを採取し、９６ディープウェルプレートにおいて、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含む２ＴＹ１００μｌ中、３７℃（９００ｒｐｍ）で６時間生育した。培養物２５μｌを、カルベニシリンを含有する２ＴＹ２００μｌに１時間で添加した。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（１０１１／ｍｌ）１０μｌを添加し、続いて、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを添加し、細菌を２５℃（４５０ｒｐｍ）で一夜生育した。ストレプトアビジン被覆プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２×カゼインブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ）にて、３７℃で一夜ブロックした。翌日、プレートをビオチン化ｙＳＵＭＯ０．４ｎＭにて１時間ラベル化し、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって細菌を集め、ビオチン化酵母ＳＵＭＯを収容するウェル及びビオチン化リンカーを収容するウェルに、ファージを含有する成長培地４５μｌを添加し、１時間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｈｙｄｒｏｆｌｅｘプレート洗浄機を使用して、ＰＢＳＴ３００μｌ中で３回ウェルを洗浄し、ＨＲＰ−抱合抗−ファージ抗体（Ｓｅｒａｍｕｎ）の１：１０００希釈液を１時間で添加した。ウェルをＰＢＳＴ３００μｌ中で１０回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質（Ｓｅｒａｍｕｎ）にて結合を可視化し、５６０ｎｍにて測定した。
【０１７９】
Ａｄｈｉｒｏｎタンパク質の生産
酵母ＳＵＭＯに結合したＡｄｈｉｒｏｎのＤＮＡコード配列をＰＣＲによって増幅し、生成物をＮｈｅＩ及びＰｓｔＩにて制限消化し、Ａｄｈｉｒｏｎ足場を含有するｐＥＴ１１ａにクローン化し、同じ制限部位で消化した。コロニーを採取し、ＬＢ培地５ｍｌ中、３７℃、２２５ｒｐｍで一夜生育し、プラスミドＤＮＡをミニプレップとして精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、正しい挿入物が存在することを確認するため配列決定した。熱ショックによって、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、コロニーを３７℃において一夜生育した。翌日、培養物をＬＢ培地４００ｍｌに添加し、２５０ｒｐｍ、３７℃においてＯＤ６０００．６まで生育し、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで添加した。細胞を、さらに６時間生育し、３０００ｇでの遠心分離によって採取し、１×Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２５ｍｌ中に再懸濁した。製造者の説明に従って、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを添加し、懸濁液を室温において２０分間混合し、５０℃に２０分間加熱し、９４００ｇで２０分間遠心分離した。透明な上澄みを、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂のスラリー５００μｌと１時間混合し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）３０ｍｌ中で３回洗浄し、溶離緩衝液（５０ｍＭ  ＰＢＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）１ｍｌ中で溶離し、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットでの使用のため、製造者の説明に従って、ＮＨＳ  ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＳＵＭＯ結合Ａｄｈｉｒｏｎ（Ａｄ−ｙＳＵＭＯ）１００μｇをビオチン化した。
【０１８０】
ＥＬＩＳＡ分析
ＰＢＳＴ中の標的タンパク質５ｎｇ（他の表示しない限り）を、免疫９６Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ）プレートのウェルに、４℃において一夜吸収させた。翌日、３×ブロッキング緩衝液２００μｌをウェルに添加し、振動させることなく３７℃において４時間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌのビオチン化酵母ＳＵＭＯを、２×ブロッキング緩衝液を含有するＰＢＳＴ中で１：１０００希釈し、アリコート５０μｌを、標的ウェルにおいて、振動しながら、１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴ３００μｌ中で３回洗浄し、ＰＢＳＴ５０μｌ中で１：１０００希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合したストレプトアビジンをウェルに１時間で添加した。ウェルをＰＢＳＴ３００μｌ中で６回洗浄し、ＴＢＭ液体基質５０μｌにて結合を可視化し、吸光度を５６０ｎｍで測定した。
【０１８１】
ウエスタンブロット分析
標的タンパク質又はＨＥＫ２９３細胞可溶化物と混合した標的タンパク質（２０μｇ）を、添加緩衝液（Ｌａｅｍｍｉ，６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、５％β−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）と混合し、３分間沸騰させ、１５，０００×ｇで１分間遠心分離し、ついで、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、４ワットにおいて４５分間で転写し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％ＢＳＡ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ）中で１時間インキュベートし、続いて、ｙＳＵＭＯ（１００μｇ／ｍｌ、希釈１：１０００ＰＢＳＴ）との１時間のインキュベーションに供した。ストレプトアビジン抱合ＨＲＰ及び蛍光発光法を使用して、結合したＡｄ−ｙＳＵＭＯを検出した。
【０１８２】
タンパク質−タンパク質相互作用親和性の測定
製造者の説明に従って、ビオチン化Ａｄ−ｙＳＵＭＯバインダーの結合の親和性を見積もるために、ＢＬｉｔｚ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）ディップ及び解読ストレプトアビジンバイオセンサーを使用した。要するに、異なったｙＳＵＭＯ濃度における少なくとも４つの読み使用して、各Ａｄ−ｙＳＵＭＯの親和性を測定した。各Ａｄ−ｙＳＵＭＯの親和性を算定するために、包括的なフィットを使用した。これらの読みは、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴装置を使用して行った親和性の測定値に匹敵するものであった。
【０１８３】
結果
Ａｄｈｉｒｏｎのデザイン及びファージディスプレイ
本来、Ａｄｈｉｒｏｎ遺伝子は、より強力なプロテアーゼ阻害剤を創成するようにデザインされたが、その分子認識用の拘束されたペプチド領域を提供するための足場タンパク質としての可能性のため（図６Ａ）、発明者らは、足場のようなその用途を調査することを決定した。遺伝子配列は、大腸菌発現システムにおける発現を増強するように最適化したコドンであった（図６Ｂ）。アンバー停止コドンのトランスレーショナルなリードスルーにより、ＥＲ２７３８細胞のような非サプレッサー細胞において発現される際に、Ａｄｈｉｒｏｎ−切り詰めｐＩＩＩ融合タンパク質が生産されるようにするが、ＪＭ８３のようなサプレッサー細胞中でのみＡｄｈｉｒｏｎの生産が可能になるように、遺伝子のｐＢＳＴＧ１へのクローニングを容易にするために制限部位を導入した。Ａｄｈｉｒｏｎ  ｐＩＩＩ融合タンパク質はファージミドベクターｐＢＳＴＧ１から発現されるが、一方、ファージミドＤＮＡのＭ１３ファージ粒子への複製及びパッケージングを可能にする他の成分を、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを使用して導入した。Ａｄｈｉｒｏｎ−ｐＩＩＩ融合タンパク質の発現を、抗−ｐＩＩＩ抗体を使用するウエスタンブロットによって確認した。Ａｄｈｉｒｏｎ足場の熱安定性を示差走査熱量測定によってテストしたところ、融解温度１０１℃を示した（図７Ａ）。円二色法を使用して、コンセンサス配列の構造統合性を試験したところ、高いβシート／αへリックスの比及びランダムコイルを示した（図７Ｂ）
【０１８４】
ついで、発明者らは、示差走査熱量測定によるＡｄｈｉｒｏｎ足場の熱安定性（図８Ａ）を、代表的な、低分子で、可溶性の良好に特徴付けられたタンパク質であるリゾチーム（図８Ｂ）と比較したところ、リゾチームがＡｄｈｉｒｏｎよりも有意に安定性が劣る（Ｔｍ  ｃａ．６５℃）ことを示した。ついで、発明者らは、ｍｙｃ抗体に結合するように選択したＡｄｈｉｒｏｎをテストしたところ、ループの足場への付加は、Ｔｍを８５℃に低下させるが、これは、たいていの足場タンパク質よりもなお高い融解温度を表している。このＡｄｈｉｒｏｎ足場が、一連のスキャンによって示されるように（図８Ｃ）、変性及び復元の繰り返しのサイクルを受けることができる。
【０１８５】
ライブラリーのデザイン
分子認識に適するペプチドコード配列の導入は、Ａｄｈｉｒｏｎの構造内における予測したループの位置（図６）によって案内される。ループ１は、第１及び第２のβストランドの間に位置し、ループ２は、第３及び第４のβストランドの間に位置する。６個のランダムアミノ酸（システインを除く）を含んでなる配列を両ループの位置に導入して、それぞれ、ループ１及びループ２における４個及び３個のアミノ酸を置き換える。これらループ領域の伸展がＡｄｈｉｒｏｎの構造を破壊するかどうかを測定するため、ループ挿入物を有する３個の個々のＡｄｈｉｒｏｎを単離し、発現させ、円二色法によって検討した（図７Ｂ）。３個のクローンの全てがβ構造の高割合を維持しており、１個のクローンは、おそらく新規なループ領域へのβストランドの伸展を表示するβ構造含量の増加を示した。これは、ループの挿入が足場の構造に影響を及ぼさないことを証明するものでる。発明者らは、複雑度約３×１０１０のファージディスプレイライブラリーを作成した。アミノ酸組成をチェックするため、ライブラリーを感染させたＥＲ２７３８細胞から９６個のクローンを単離した。発明者らは、アミノ酸組成におけるいかなるバイアス又はファージの産生の間に導入された他の望ましくないコンセンサスを測定するために、ファージクローンの配列を検討した（図７Ｃ）。アミノ酸の分布にはバイアスは観察されなかった。８６．５％のクローンは全長の変異体であり、クローンの３．１％は、挿入物を持たないＡｄｈｉｒｏｎ足場であり、クローンの１０．４％はフレームのシフトを示し、おそらくライブラリーにおいては価値のないものであろう。ファージゲノムのレベルにおける全長コード配列のこの非常に高い割合は、作成されたライブラリーが高品質であることを証明している。
【０１８６】
ライブラリーのスクリーニング
標的として酵母ＳＵＭＯを使用して、初めにライブラリーのスクリーニングを実施した。アビジン結合タンパクを介するタンパク質の不動化を可能にし、標的がプラスチック表面又は粒子表面に直接吸着される（時には、標的タンパク質の変性につながることがある）ことがないようにするために、酵母ＳＵＭＯをビオチン化した。これは、標的タンパク質が、線形又は立体構造のいずれかのエピトープを認識する結合タンパク質の選択を可能にする三次元構造を維持することを保証する。パニングラウンド３によるサンプルコントロールと比べて、コロニーの回復において１０００倍を超える増幅が観察された。２４個のクローンを単離し、それらのＳＵＭＯ標的への結合能力を、ファージＥＬＩＳＡによって確認した（図９）。テストした全てのクローンが、酵母ＳＵＭＯへの強い結合を示したが、Ａｄｈｉｒｏｎの特異性を示すコントロールウェルへの結合は、ほとんど認められないか、全く認められなかった。クローンを配列決定したところ、２２個の別個のＡｄｈｉｒｏｎが同定され、これらクローンにおけるループ領域の配列を表４に示す。
【０１８７】
【表４】
2019205450.tif 000009
【０１８８】
クローン４及び５は同一であり、クローン１６及び２２も同一である。興味深いことには、クローン２１及び２２とともに、クローン１５及び２３は、ループ１において同じアミノ酸配列を含有するが、ループ２では、異なった配列を含有する。この配列の変化は、さらに、ライブラリーの複雑な性質を支持する。配列の分析により、クローンの１２におけるＬＯＯＰ１の位置１〜４におけるＩＤＬＴの一般的に生ずる配列が同定されたが、この配列が、ｙＳＵＭＯ上の少なくとも１つのエピトープへの結合において重要なモチーフであることを示している。また、９個の別個のクローンにおける第２ループの位置１にはＰ又はＧが生じ、他の６個のクローンにおける残基２〜６内の位置でＰ又はＧが生じているが、これは、結合には、いくつかの構造的特徴が重要であることを示している。興味深いことには、ＩＤＬＴモチーフは、ＭＥＦ２  Ｅ３リガーゼ  ＰＩＡＳｘ（ＶＤＶＩＤＬＴ（配列番号７３）のヒトＳＵＭＯ１結合部位（Ｓｏｎｇ，Ｄｕｒｒｉｎら，２００４；Ｓｏｎｇ，Ｚｈｎｇら，２００５）に類似している。さらに特徴付けるために、４つのクローンを選択した（クローン１５及び２２（このループ１配列が１回以上生じているため）、クローン２０（ＩＤＬＴモチーフを含有するため）及びクローン１０（ループ１に別個のモチーフを含有するため））。
【０１８９】
Ａｄｈｉｒｏｎ−ｙＳＵＭＯ（Ａｄ−ｙＳＵＭＯ）タンパク質の特徴付け
Ａｄｈｉｒｏｎ足場の高い熱安定性のため（図７Ａ）、発明者らは、精製を援助するためには、発現されたＡｄｈｉｒｏｎの完全性に影響を及ぼすことなく、大腸菌タンパク質の大部分を熱変性し且つ沈殿させることができなければならないと予測した。これをテストするため、発明者らは、可溶化物を、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃及び１００℃において２０分間加熱し、遠心分離して、変性したタンパク質をペレット化し、上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図１０Ａ）。可溶化物の加熱は、上澄みにおける細菌タンパク質の量を劇的に低減させたが、Ａｄｈｉｒｏｎのレベルを有意に低減させなかった。細菌タンパク質の大部分を沈殿させるには温度５０℃が適しており、特性研究ではこれを採用した。図９Ｂは、精製したＡｄ−ｙＳＵＭＯが、バッチ式金属親和性精製法を使用することにより、高い純度を示すこと、及びクローン１０のようないくつかのケースでは、潜在的には、この精製の間に使用される樹脂の限られた量のために、タンパク質の大部分は単離されないことを示す。発現されたタンパク質の見積もりレベルは約１００ｍｇ／Ｌであった。ＢＬｉｔｚ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）Ｄｉｐ及びＲｅａｄバイオセンサーを使用することによって、Ａｄｈｉｒｏｎの親和性を推定した。親和性は、Ａｄ−ｙＳＵＭＯ１０、１５、２０及び２２について、それぞれ、１１．５、２．４、１４．２及び９．０ｎＭであった。これらの値は、良好な抗体についてふつうにみられる親和性と一致している。
【０１９０】
さらに、研究試薬としてのＡｄｈｉｒｏｎの使用を評価するため、Ａｄ−ｙＳＵＭＯをビオチン化し、ＥＬＩＳＡ（図１０Ｃ）及びウエスタンブロット分析（図１０Ｄ）において使用した。Ａｄ−ｙＳＵＭＯは酵母ＳＵＭＯに結合するが、ヒトＳＵＭＯ１には結合しなかった（ＳＵＭＯ１ウエスタンブロットに関しては、データは示されていない）（ｎ＝３）。試薬との特異性を測定するため、酵母ＳＵＭＯをＨＥＫ２９３細胞可溶化物と混合した。興味深いことには、ウエスタンブロット（ｎ＝３）によれば、Ａｄ−ｙＳＵＭＯ１０及び１５は、酵母ＳＵＭＯへの特別な結合を示したが、他のタンパク質へは結合せず、Ａｄ−ｙＳＵＭＯ２０及び２２は、可溶化物中の多くのタンパク質と結合した。
【０１９１】
スクリーニングのさらに他の具体例
一定範囲の標的に結合できる特殊な試薬を同定するＡｄｈｉｒｏｎライブラリーの能力をさらに評価するため、発明者らは、成長因子（ＦＧＦ１）、レセプター（ＣＤ３１）、及びペプチド配列に対してスクリーニングした。興味深いことには、ＦＧＦ１及びＣＤ３１についてテストしたクローンの大部分は特殊な結合を示し、一方、ペプチドのスクリーニングからは、わずかに３つのクローンが特殊な結合を示した。挿入されたペプチドに対する更なるパニングラウンドは、バックグラウンドに対するヒットの割合を増大させ、これにより、選んだクローンの８０％が標的への結合を示した。この結果は、タンパク質のより大きい、及び従って潜在的に多数のエピトープ部位と比べて、ペプチドの適切なエピトープ提示の小さいサイズ及び限られた見込みのため、予期しないものである。
【０１９２】
発現されたＡｄｈｉｒｏｎがそれらの標的に結合することを確認するため、発明者らは、Ｂｉｔｚ（商標）を使用して、ＣＤ３１及びペプチド標的の両方について、３つの別個の組み換えＡｄｈｉｒｏｎを分析した。Ａｄｈｉｒｏｎを発現させ、可溶性タンパク質として精製した。ＣＤ３１Ａｄｈｉｒｏｎに関するＫＤ値は、８．５×１０−８〜６．８×１０−９Ｍであり、一方、ペプチドに関するＫＤ値は、３．３×１０−８〜３．５×１０−８であった。
【０１９３】
さらに、図２５に示すように、発明者らは、有機分子であるポサコナゾールに結合するＡｄｈｉｒｏｎを同定した。
【０１９４】
Ａｄｈｉｒｏｎの結晶構造
図１７は、ＦｃｇＲＩＩＩａレセプタードメインと複合したＡｄｈｉｒｏｎの結晶構造を示す。これは、４つのβストランド及びαへリックスの重要な構造的要素を示すＡｄｈｉｒｏｎの３Ｄ構造を表している。構造は、他のシスタチン（例えば、ステフィンＡを含む）のＸ線構造について見られるよりも、よりコンパクトな性質及び見かけ上少ないねじれ構造の点で、予期しないものである。β構造がループ領域内に変動する度合いまで進展することは興味深い。
【０１９５】
少なくともいくつかの標的のための結合分子の選択について２つのランダム化されたループをディスプレイすることが重要であることは、この構造において、両ループとレセプタータンパク質との密接な相互作用によって強調される。これらのループは、下記に詳述するＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２に相当する。
【０１９６】
考察
発明者らは、植物シスタチンタンパク質（Ａｄｈｉｒｏｎと名付けられている）のコンセンサスデザインに基づき、Ｔｍ１０１℃を有する極めて高い熱安定性をディスプレイする新規の足場タンパク質を開発した。この足場を使用して、２つの９アミノ酸の可変性領域の導入によってライブラリーを作成した。これらの可変性の配列はオリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドにおいて、可変性の位置は、各アミノ酸（システインを除く）用のシングルコドンを含んでなるトリマーのサブセットである）によってコードされる。この結果、各アミノ酸は、ライブラリー内において、非常に類似して分散している。ライブラリーは、クローンの８６．５％が全長の変異体クローンであり、非常に高い品質である。
【０１９７】
ライブラリーを、繊維状ファージ表示フォーマットにおいて、切り詰めｇｐ３融合物として形成し、各種の標的タンパク質に対してスクリーニングした。酵母ＳＵＭＯに対するスクリーニングによって同定されたＡｄｈｉｒｏｎの分析により、それらの可変の領域に別個の配列を有する多数のタンパク質が明らかにされた。いくつかのケースでは、ＳＵＭＯの同じ位置への結合を意味する類似があり、一方、他のクローンは配列保存を示さない。全てのクローンがｙＳＵＭＯに結合し、一定範囲のコントロールタンパク質（特異性を示す）には結合しない。発明者らは、また、成長因子（ヒトＦＧＦ１）、ＣＤ３１からのヒトレセプタータンパク質ドメイン、ペプチド及び有機化合物に特異的に結合するＡｄｈｉｒｏｎを同定した。広範囲のタンパク質とともに、有機化合物に対するバインダーを選択する能力は、多数の足場が、特別なクラスの標的分子を好む構造的特徴を有するため、重要な知見である。
【０１９８】
内在性の大腸菌宿主タンパク質の多くを変性し、このようにして、Ａｄｈｉｒｏｎの親和性精製の効力を増強する、５０℃における温度工程を含めることによって、従来法でＡｄｈｉｒｏｎを精製した。ヒトＦｃｇＲＩＩＩレセプターに結合するＡｄｈｉｒｏｎの複合体のＸ線構造は、複合体についてだけでなく、Ａｄｈｉｒｏｎタンパク質についての有用な情報を提供し、ＣＤデータを支持するよりコンパクトで且つ大きいβ構造を明らかにする。足場のコンパクトな性質（他の構造のステフィン又はシスタチンにおいて見られるものよりもさらに明白である）は、その高い熱安定性に寄与するものと思われる。Ｘ線構造によって明らかにされた相互作用の界面は、両ループ領域がレセプタードメインとの相互作用に関与することを示している。
【０１９９】
一定範囲のタンパク質に対するスクリーニングに関する発明者らの頑強で且つ効果的な戦略と組み合わされた、この高度に安定であり、低分子であり、且つ容易に精製される足場に基づく良好且つ高品質のライブラリーの実証は、発明者らのＡｄｈｉｒｏｎライブラリーを、広い範囲の科学、医薬及び商業的用途のための試薬の開発のための貴重で且つ新規な資源にする。
【０２００】
Ａｄｈｉｒｏｎの変異体
Ａｄｈｉｒｏｎ足場の変異体を作成した。配列番号１及び図６に示された配列は、調査した最短バージョンのＡｄｈｉｒｏｎ用であり、リンカー及びＨｉｓのような更なる機能性配列又は他の配列の付加以前に、長さ内に８１個の残基を含んでなる。しかし、２つのより長い足場タンパク質（配列番号２及び３）も生成されたが、それぞれは、特定の環境では望ましいであろう。足場からの更なる欠失も可能であるが、配列番号１又はその変異体は、足場タンパク質の安定性が過度に損なわれることなく、最適な最小長さに近いものであると考えられる。
【０２０１】
全長「Ａｄｈｉｒｏｎ９２（９２ａａ）」は、下記の配列（足場配列（配列番号３）＋リンカー及びＨｉｓタグ（下線で示す）からなる）を有する。
ＡＴＧＶＲＡＶＰＧＮ  ＥＮＳＬＥＩＥＥＬＡ  ＲＦＡＶＤＥＨＮＫＫ  ＥＮＡＬＬＥＦＶＲＶ  ＶＫＡＫＥＱＶＶＡＧ  ＴＭＹＹＬＴＬＥＡＫ  ＤＧＧＫＫＫＬＹＥＡ  ＫＶＷＶＫＰＷＥＮＦ  ＫＥＬＱＥＦＫＰＶＧ  ＤＡ  ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７４）
短い「Ａｄｈｉｒｏｎ８４（８４ａａ）」は、下記の配列（足場配列（配列番号２）＋リンカー及びＨｉｓタグ（下線で示す）からなる）を有する。
ＧＮＥＮＳＬＥＩＥＥ  ＬＡＲＦＡＶＤＥＨＮ  ＫＫＥＮＡＬＬＥＦＶ  ＲＶＶＫＡＫＥＱＶＶ  ＡＧＴＭＹＹＬＴＬＥ  ＡＫＤＧＧＫＫＫＬＹ  ＥＡＫＶＷＶＫＰＷＥ  ＮＦＫＥＬＱＥＦＫＰ  ＶＧＤＡ  ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７５）
最短の「Ａｄｈｉｒｏｎ８１（８１ａａ）」（図６に示している）は、下記の配列（足場配列（配列番号１）＋リンカー及びＨｉｓタグ（下線で示す）からなる）を有する。
ＮＳＬＥＩＥＥＬＡＲ  ＦＡＶＤＥＨＮＫＫＥ  ＮＡＬＬＥＦＶＲＶＶ  ＫＡＫＥＱＶＶＡＧＴ  ＭＹＹＬＴＬＥＡＫＤ  ＧＧＫＫＫＬＹＥＡＫ  ＶＷＶＫＰＷＥＮＦＫ  ＥＬＱＥＦＫＰＶＧＤ  Ａ  ＡＡＡＨＨＨＨＨＨ（配列番号７６）
下線を付した配列は、追加の３Ａｌａリンカー及び６Ｈｉｓ検出／精製タグを含んでなる。このタグは、足場自体の部分ではなく、明白な理由よるタンパク質への有用な付加である。
【０２０２】
ライブラリー用のＡｄｈｉｒｏｎの特殊な具体例
足場タンパク質ライブラリー、すなわち、各種のペプチドが足場に挿入されているライブラリーの調製に有用であるＡｄｈｉｒｏｎ配列の例は以下のとおりである。
【０２０３】
Ａｄｈｉｒｏｎ９２（示された配列は、追加のＭｅｔ、リンカー及びタグを含む）
2019205450.tif 000010
下記の修飾の１又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基（太字で示す）がＮ末端に付加されている。
−アミノ酸残基２〜４（太字のイタリック書体で示す）にＮ末端が配置され、好適にはこれらの３個のアミノ酸は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。
−ＬＯＯＰ１は、アミノ酸残基４７〜５０（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの４個のアミノ酸は、代表的には４〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−ＬＯＯＰ２は、アミノ酸残基７６〜７８（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの３個のアミノ酸は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−Ｃ末端リンカー及びＨｉｓタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
【０２０４】
Ａｄｈｉｒｏｎ８４（示された配列は、追加のＭｅｔ、リンカー及びタグを含む）
2019205450.tif 000011
下記の修飾の１又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基（太字で示す）がＮ末端に付加されている。
−ＡｄｈｉｒｏｎのＮ末端（すなわち、上に示すように、メチオニン残基と第１のグリシンとの間）に、Ｎ末端ペプチド配列が付加されることができ、この付加物は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸である。
−ＬＯＯＰ１は、アミノ酸残基３９〜４２（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの４個のアミノ酸は、代表的には４〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−ＬＯＯＰ２は、アミノ酸残基６８〜７０（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの３個のアミノ酸は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−Ｃ末端リンカー及びＨｉｓタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
【０２０５】
Ａｄｈｉｒｏｎ８１（Ｍｅｔを除く）
2019205450.tif 000012
下記の修飾の１又はそれ以上が可能であるか、又はなされている。
−翻訳を容易にするため、追加のメチオニン残基（太字で示す）がＮ末端に付加されている。
−ＡｄｈｉｒｏｎのＮ末端にＮ末端ループが付加されることができ、この付加物は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸である。
−ＬＯＯＰ１は、アミノ酸残基３６〜３９（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの４個のアミノ酸は、代表的には４〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−ＬＯＯＰ２は、アミノ酸残基６５〜６７（Ｎ末端ｍｅｔを除くように番号が付けられている）に配置されており（太字のイタリック書体で示す）、好適には、これらの３個のアミノ酸は、代表的には３〜約２０個のアミノ酸の挿入断片によって置き換えられ得る。アミノ酸５〜１３個のループ長が好ましく、アミノ酸９個のループ長が最適と考えられる。
−Ｃ末端リンカー及びＨｉｓタグが存在する。リンカーの長さ及び組成は変化でき、もちろん、タグは、いかなる好適な精製システムにも適合される。
【０２０６】
このように、Ａｄｈｉｒｏｎ９２を例にとれば、ディスプレイシステムでの使用に特に好適な足場タンパク質は、下記の型を取ることができる。
2019205450.tif 000013
一般に、ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２は、結晶構造（図１７）によって支持されるように、標的結合において最も重要である。本発明の特定の具体例では、ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２の一方のみがペプチド配列によって置き換えられるが、一般的には、両方が置き換えられることが好ましい。Ｎ末端は、ＬＯＯＰ１及びＬＯＯＰ２ほど重要ではないため、調査されていないが、多くの状況では、Ｎ末端において好適なペプチドを挿入することにより、結合親和性及び特異性が改善される。
【０２０７】
図２０〜２４は、それぞれ、ＬＯＸ１、ＨＧＨ、酵母ＳＵＭＯ、ＰＢＰ２及びペプチドに結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１領域及びＬＯＯＰ２領域を示している。
【０２０８】
さらに、図２７及び２８は、Ｇｒｂ２及びＳＴＡＴ３に結合するいくつかのＡｄｈｉｒｏｎのＬＯＯＰ１領域及びＬＯＯＰ２領域を示している。
【０２０９】
存在するアミノ酸を除去することなく、任意に、ペプチドをループ領域に挿入ができることも注目されなければならないが、これは一般的にはあまり好ましくない。
【０２１０】
Ａｄｈｉｒｏｎの広い有用性の他の例
免疫蛍光法：
実施例−ウイルスタンパク質を検出するための試薬
多年にわたる繰り返された試みにもかかわらず、ヒトパピローマウイルスＥ５タンパク質を同定する抗体を産生することが可能であることは証明されていない（質量分析による上皮細胞株におけるヒトパピローマウイルスタイプ１６Ｅ５腫瘍性タンパク質レベルの定量測定，Ｓａｈａｂら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１２  Ｓｅｐ；８６（１７）：９４６５−７３；Ｗｅｒｈｅｒｉｌｌ，ＬＦ，  Ｒｏｓｓ，Ｒ及びＭａｃｄｏｎａｌｄ，Ａ  （２０１２），ＨＰＶ  Ｅ５：謎の腫瘍性タンパク質，小さいＤＮＡ腫瘍ウイルス，Ｋ．Ｇａｓｔｏｎ編，Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５５−７０）。
【０２１１】
Ａｄｈｉｒｏｎシステムの有用性が、標的として、Ｅ５タンパク質の領域と同一性を有するペプチドを使用することによって、ＨＰＶ１６Ｅ５ウイルスタンパク質に対してＡｄｈｉｒｏｎが産生されるとの実施例によって証明された。Ｅ５  Ａｄｈｉｒｏｎをビオチン化し、過剰発現された細胞におけるＥ５タンパク質を検出するために、免疫蛍光法において使用した。Ａｄｈｉｒｏｎは、他のＨＰＶ血清型とは交差反応しない。さらに、Ｅ５  ＡｄｈｉｒｏｎをＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓに抱合させ、ヒトサンプルにおけるＥ５タンパク質を検出するために使用した。Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓへの抱合は、試薬の感度を増大させた。図１２参照。ＨＰＶ１６Ｅ５ＧＦＰ（標的）及びＡｄｈｉｒｏｎのためのエピトープなしのＨＰＶ１６Ｅ５ＧＦＰ（コントロール）を、哺乳類の細胞において発現させた。Ａｄｈｉｒｏｎ  Ｅ５をＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓに抱合させ、哺乳類の細胞中のＥ５タンパク質を検出するために使用した。細胞を、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染料）、ＧＦＰ、及びＥ５（Ａｄｈｉｒｏｎ−Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓとともに）にて染色した。Ａｄｈｉｒｏｎのみが、Ｅ５タンパク質に対する当異性を示す標的に結合した。
【０２１２】
タンパク質の阻害及び修飾−タンパク質の相互作用
実施例１（ＳＵＭＯへの結合を阻害する試薬）
ヒトＳＵＭＯ２（ｈＳＵＭＯ２）に特異的且つ差次的に結合できる抗体は存在しなかった。ｈＳＵＭＯ２に対してＡｄｈｉｒｏｎが産生され、ヒトＳＵＭＯ１よりもむしろＳＵＭＯ２に特異的に結合する複数のＡｄｈｉｒｏｎが同定された。図１３は、ｈＳＵＭＯ２  Ａｄｈｉｒｏｎが、ｈＳＵＭＯ２に結合し及びＲＮＦ４（ポリＳＵＭＯ特異性Ｅ３ユビキチンリガーゼ）がｈＳＵＭＯ２と結合することを阻害することによるタンパク質−タンパク質相互作用についての機能的効果を有することを証明するものである。ｈＳＵＭＯ２  Ａｄｈｉｒｏｎは、他のタンパク質のユビキチン化に影響を及ぼすことなく、前記の効果を有する。ＡＴＰの存在下では、通常、ｈＳＵＭＯ２は、標的タンパク質のユビキチンを生ずるＲＮＦ４と結合する（レーン２におけるゲルの頂部における黒のスメア）。増大された濃度のＡｄｈｉｒｏｎの存在下では（レーン３〜９）、ユビキチンのレベルは減少する。
【０２１３】
実施例２（フィブリン血栓を変化させ、溶解する試薬）
血栓の形成を変化させ、溶解させることができるＡｄｈｉｒｏｎを同定するためにフィブリノーゲンをスクリーニングした。血漿サンプルにおいてこのプロセスを変性する多数のＡｄｈｉｒｏｎが同定された。図１４のグラフは、血栓の形成及び溶解濁度アッセイを表す。黒のラインは、血栓の形成及び溶解の正常な経時経過を示す。グレーのラインは、このプロセスに対する異なった５種類のＡｄｈｉｒｏｎの効果を表す。コントロールの非フィブリノーゲン結合Ａｄｈｉｒｏｎは、このアッセイにおいて効果を示さない。Ａｄｈｉｒｏｎの効果としては、減少された血栓の形成、増大された溶解時間、及び増大された凝固時間が含まれる。これは、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害することによってタンパク質の機能を調節するＡｄｈｉｒｏｎの能力を証明するものである。図１５は、フィブリノーゲン結合Ａｄｈｉｒｏｎ及びコントロールＡｄｈｉｒｏｎの存在下における血栓の形成後のＦＩＴＣ蛍光ラベル化フィブリノーゲンの共焦点像を示す。
【０２１４】
哺乳類の細胞におけるＡｄｈｉｒｏｎの発現：
実施例１に記載のように、ヒトＳＵＭＯ２に対してＡｄｈｉｒｏｎを産生し、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。Ａｄｈｉｒｏｎを、ＦＬＡＧタグ及び核移行シグナルと融合させた。コントロール細胞（Ａｄｈｉｒｏｎを発現しない）及びヒトＳＵＭＯ２特異性Ａｄｈｉｒｏｎを発現する細胞をヒ素（Ａｓ）にて２時間処理し、ついで、洗浄し、１２時間及び２４時間回復させた。ヒ素は前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）タンパク粒を増大させるが、ＳＵＭＯはこれらの粒の分解を制御する。Ａｄｈｉｒｏｎを同定するため、及びＰＭＬ（核内構造体の形成体）のために、抗−ＦＬＡＧ抗体を使用して、細胞を染色した。ヒトＳＵＭＯ２  Ａｄｈｉｒｏｎは、ＰＭＬの分解を変化させ、結果として、これらの粒を増大させる。これは、哺乳類の細胞において機能性Ａｄｈｉｒｏｎを発現させる能力を証明するものである。結果を図１６に示す。
【０２１５】
タンパク質における新薬の開発につながるような部位を同定するための共結晶化法及び他の構造生物学的方法：
図１７は、ＦｃｇＲＩＩＩａ（グレー）及び結合したＡｄｈｉｒｏｎ（白）の共結晶構造を示す。ＦｃｇＲＩＩＩａに結合したＡｄｈｉｒｏｎを同定し、ついで、ＩｇＧ結合を阻害することを示すために、細胞−及びＳＰＲ−系アッセイを含む一定範囲のアッセイにおいて使用した。ついで、Ａｄｈｉｒｏｎを共結晶化し、構造を解明した（上の図）。これは、ＦｃｇＲＩＩＩａにおける新薬の開発につながるような部位（アロステリック部位を含む）を同定するものであった。ＡｄｈｉｒｏｎはＮＭＲ研究にも適するものであり、一例として、図１８は、抗−酵母ＳＵＭＯ  Ａｄｈｉｒｏｎ及びＡｄｈｉｒｏｎ−酵母ＳＵＭＯ複合体の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを示す。Ａｄｈｉｒｏｎについての構造データを迅速に集めることができることは、潜在的な医薬結合部位を同定することを含む多くの用途を有するであろう。
【０２１６】
ポイントオブケア装置の開発のための電子デバイスへの組み込み：
ヒトＳＵＭＯ２  Ａｄｈｉｒｏｎ（実施例１に記載）のコード配列の部位特異的変異誘発は、オリゴヒスチジンタグのＣ末端におけるシステインの導入を許容する。これにより、Ａｄｈｉｒｏｎの電子装置への方向性の不動化が可能になり、その結果、分子認識ループが分析物へアクセス可能になる。標的タンパク質が、装置上において、Ａｄｈｉｒｏｎに結合する際、インピーダンスにおける変化を測定できる。変化は濃度依存性であり（図１９に示すように）、Ａｄｈｉｒｏｎの効果的な表示及びバイオセンサーの用途ためのプラットフォームとして電子デバイスに生産的に組み込まれるＡｄｈｉｒｏｎの能力を証明している。
【０２１７】
このプロトコルを、他のＡｄｈｉｒｏｎ（このケースでは、ヒトフィブリノーゲンＡｄｈｉｒｏｎ）についても実施した。この試験の結果を図２６に示す。この場合にも、濃度依存性の変化が観察され、これは、アトモル濃度〜マイクロモル濃度の範囲にわたって証明された。
【０２１８】
一定範囲の標的に結合するＡｄｈｉｒｏｎが同定された：
Ａｄｈｉｒｏｎライブラリーを使用して、この明細書に記載するディスプレイ方法論を使用することによる一定範囲の標的分子に対してスクリーニングした。表５は、Ａｄｈｉｒｏｎが産生された標的の例を示す。これらは、タンパク質及び小分子を含む。これら標的に対して産生されたＡｄｈｉｒｏｎは高い親和性及び特異性を示す。これは、Ａｄｈｉｒｏｎが多用途の足場分子を提供すること及びこの足場を使用して構築されるライブラリーが、広範囲の標的分子に結合できる人工の結合分子を同定することにおいて有効であることを証明している。いくつかの標的に対するスクリーニングから単離された配列のいくつかの例を図２０〜２４に示す。発明者らは、最近、マグネトトロピック（ｍａｇｎｅｔｏｔｒｏｐｉｃ）細菌によって生産された磁性粒子に対してもスクリーニングを行い、これらの多成分性のバイオ−無機複合体においてエピトープに結合するＡｄｈｉｒｏｎを同定した。
【０２１９】
【表５−１】
2019205450.tif 000014
【表５−２】
2019205450.tif 000015
【０２２０】
参考文献
Astwood, J. D., J. N. Leach, ら (1996). "インビトロ消化に対する食物アレルゲンの安定性" Nature Biotechnology 14(10): 1269-1273.
Atkinson, H. J., K. A. Johnston, ら (2004). "線虫に対するトランスジェニック植物用のフィトシスタチンがヒト食物における毒性危険物ではないとの一応の証拠" Journal of Nutrition 134(2): 431 -434.
Bendtsen, J. D., H. Nielsen, ら (2004). "シグナルペプチドの改良された予測：SignalP 3.0." Journal of Molecular Biology 340(4): 783-795.
Binz, H. K., M. T. Stumpp, ら (2003). "反復タンパク質の設計：コンセンサスアンキリン反復タンパク質の組み合わせライブラリーからの良好に発現される、可溶性で及び安定なタンパク質" Journal of Molecular Biology 332(2): 489-503.
Bode, W., R. Engh, ら (1988). "鶏卵卵白システインの２．０ａＸ線結晶構造及びシステインプロテアーゼとの相互作用のその可能なモード" Embo Journal 7(8): 2593-2599.
Carter, P. J. (2011). "現在及び将来のタンパク質治療への案内：タンパク質工学の展望" Experimental Cell Research 317(9): 1261-1269.
Dai, M. H. , H. E. Fisher, ら (2007). "案内されたコンセンサス工学による新規な蛍光タンパク質の創成" Protein Engineering Design & Selection 20(2): 69-79.
Deboer, H. A., L. J. Comstock, ら (1983). "ＴＣＡプロモーター−ＴＲＰプロモーター及びＬＡＣに由来の機能性ハイブリッド" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 80(1): 21 -25.
Filippova, I. Y. , E. N. Lysogorskaya, ら (1984). "Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド−チオールプロテアーゼアッセイ用の発色性基質" Analytical Biochemistry 143(2): 293-297.
FitzGerald, K. (2000). "インビトロディスプレイ技術−医薬発見のための新規な手段" Drug Discovery Today 5(6): 253-258.
Forrer, P., H. K. Binz, ら (2004). "反復タンパク質のコンセンサスデザイン" ChemBioChem 5: 183-189.
Forrer, P., H. K. Binz, ら (2004). "反復タンパク質のコンセンサスデザイン" ChemBioChem 5(2): 183-189. 
Gebauer, M. 及びA. Skerra (2009). "次世代の抗体治療としての遺伝子操作タンパク質足場" Current Opinion in Chemical Biology 13(3): 245-255.
Grebien, F., O. Hantschel, ら (2011). "Ｂｃｒ−ＡｂＩにおけるＳＨ２−キナーゼインターフェースを標的指向化することは白血病誘発を阻害する" Cell 147(2): 306-319.
Ho, M.及びI. Pastan (2009). 抗体工学用の哺乳類細胞ディスプレイ, Methods in Molecular Biology. A. S. Dimitrov. 525: 337-352.
Hoffmann, T., L. K. Stadler, ら (2010). "ステフィンＡ．Ｉ由来の遺伝子操作足場タンパク質の構造−機能の研究：ＳＱＭ変異体の開発" Protein Eng Pes Sel 23(5): 403-413.
Hoogenboom, H. R., A. D. Griffiths, ら (1991 ). "繊維状ファージの表面上のマルチサブユニットタンパク質−抗体（Ｆａｂ）重質及び軽質鎖をディスプレイするための方法論" Nucleic Acids Research 19(15): 4133-4137.
Horton, R., Z. Cai, ら (1990). "オーバーラップエクステンションによる遺伝子スプライシング：ポリメラーゼ連鎖反応を使用する個別化遺伝子" Biotechniques 8: 528-535.
Hutchison, C. A., S. Phillips, ら (1978). "ＤＮＡ配列における特殊な位置での突然変異誘発" Journal of Biological Chemistry 253(18): 6551 -6560.
Jacobs, S. A., M. D. Diem, ら (2012). "コンセンサス配列アプローチによる高い安定性を有する新規なＦＮ３ドメインのデザイン" Protein Engineering Design & Selection 25(3): 107-1 17.
Jacobs, S. A., M. D. Diem, ら (2012). "コンセンサス配列アプローチによる高い安定性を有する新規なＦＮ３ドメインのデザイン" Protein Eng Pes Sel 25(3): 107-117. 
Jaeckel, C, J. D. Bloom, ら (2010). "系統学的バイアスのないコンセンサスタンパク質のデザイン" Journal of Molecular Biology 399(4): 541-546.
Karatan, E. , M. Merguerian, ら (2004). "Ｓｒｃ  ＳＨ３ドメインを結合するＦＮ３モノボディの分子認識特性" Chemistry & Biology 11 (6): 835-844.
Kayushin, A., M. Korosteleva, ら (1996). "オリゴヌクレオチド／ペプチドライブラリーの作成のためのトリヌクレオチドホスホラミダイト−シントンの合成への簡便なアプローチ" Nucleic Acids Res 24: 3748 - 3755.
Knappik, A., L. Ge, ら (2000). "分子コンセンサスフレームワーク及びトリヌクレオチドでランダム化したＣＤＲに基づく完全合成のヒト組み換え抗体ライブラリー(HuCAL)" Journal of Molecular Biology 296(1): 57-86.
Kohler, G.及びC. Milstein (1975). "予め定義された特異性の抗体をスクリーニングする融合細胞の連続培養" Nature 256(5517): 495-497. 
Koide, A. , C. W. Bailey, et al. (1998). "新規な結合タンパク用の足場としてのフィブロネクチンタイプＩＩドメイン" Journal of Molecular Biology 284(4): 1141-1151. 
Koide, A. , C. W. Bailey, ら (1998). "新規な結合タンパク用の足場としてのフィブロネクチンタイプＩＩドメイン" Journal of Molecular Biology 284(4): 1141-1151. 
Koide, A., R. N. Gilbreth, ら (2007). "バイナリ−コードインターフェースを有する高親和性シングルドメイン結合タンパク質" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104(16): 6632-6637.
Koiwa, H., M. P. D'Urzo, ら (2001). "システインプロテアーセの高親和性阻害を仲介するヘアピンループ大豆シスタチンのファージディスプレイ選択" Plant Journal 27(5): 383-391.
Komor, R. S., P. A. Romero, ら (2012). "予測手法を使用して遺伝子操作した高熱安定性の真菌セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７Ａ）" Protein engineering, design & selection : PEPS 25(12): 827-833.
Komor, R. S., P. A. Romero, ら (2012). "予測手法を使用して遺伝子操作した高熱安定性の真菌セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７Ａ）" Protein Engineering Design and Selection 25(12): 827-833.
Kondo, H., K. Abe, ら (1991). "オリザシスタチン−Ｉｉ（植物起源の新規なシスタチンスーパーファミリーのメンバー）の遺伝子機構は、オリザシスタチン−Ｉの遺伝子機構に緊密に関連するが、動物性シスタチンとは異なる" Febs Letters 278(1): 87-90. 
Kordis, D.及びV. Turk (2009). "真核生物及び原核生物におけるシステインスーパーファミリーのフィロゲノミック分析" Bmc Evolutionary Biology 9.
Krumpe, L , K. Schumacher, ら (2007). "トリヌクレオチドカッセットは、Ｔ７ファージ−ディスプレイペプチドライブラリーの多様性を増大する" BMC Biotechnology 7(1): 65.
Lee, S.-C., K. Park, ら (2012). "モジュールエンジニアリングによる無顎脊椎動物の各種のリンパ球受容体に基づく結合足場のデザイン" Proceedings of the National Academy of Sciences 109(9): 3299-3304.
Lehmann, M., C. Loch, ら (2002). タンパク質の熱安定性に関するコンセンサスコンセプト：コンセプトの更なる証拠" Protein Engineering 15(5): 403-41 1.
Lehmann, M., R. Lopez-Ulibarri, ら (2000). "酵素の機能特性を変更するためのフィターゼ間における活性部位の交換" 9(10): 1866-1872.
Lehmann, M.及びM. Wyss, (2001). "熱安定性のためのタンパク質の遺伝子操作：合理的なデザイン及び定向進化に対する配列アライメントの使用" Current Opinion in Biotechnology 12(4): 371-375.
Lilley, C. J., P. E. Urwin, ら (2004). "線虫の採餌場における植物性シスタチンの優先発現は、サツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）及びグロボデラ・パリダ（Globodera pallida）に対する抵抗性を付与する" Plant Biotechnology Journal 2(1): 3-12. 
Lofblom, J. (2011). "組み合わせタンパク質工学における細菌ディスプレイ" Biotechnology Journal 6(9): 1 115-1 129.
Lord, P. W., J. N. Selley, ら (2002). "ＣＩ  ＮＥＭＡ−ＭＸ：モジュラーマルチプルアライメントエディター" Bioinformatics 18(10): 1402-1403.
Main, E. R. G., S. E. Jackson, ら (2003). "反復タンパク質の折りたたみ及びデザイン：合意形成" Current Opinion in Structural Biology 13(4): 482-489.
Main, E. R. G., A. R. Lowe, ら (2005). "タンパク質工学における再発するテーマ：反復タンパク質のデザイン、安定性及び折りたたみ" Current Opinion in Structural Biology 15(4): 464-471.
Main, E. R. G., Y. Xiong, ら (2003). "理想的なＴＰＲモチーフからの安定なアルファへリックスアレイのデザイン" Structure 11 (5): 497-508.
Makela, A. R.及びC. Oker-Blom, (2008). "バキュロウイルスディスプレイ技術−分子スクリーニング及び薬物送達のための進化する機器" Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 11 (2): 86-98.
Margis, R., E. M. Reis, ら (1998). "植物性及び動物性シスタチンにおける構造上の及び系統学的関係" Archives of Biochemistry and Biophysics 359(1): 24-30.
McPherson, M. J., P. E. Urwin, ら (1997). 摂食抑制物質アプローチによる遺伝子操作植物線虫抵抗性, Cellular and Molecular Basis for Plant-Nematode Interactions. C. Fenoll, S. Ohl及びF. Grundler. The Netherlands, Kluwer: 237-249.
Melo, F. R., M. O. Mello, ら (2003). "アカントスセリデス・オブテクタス（Acanthoscelides obtectus）システインプロテアーゼに対して特異的な新規のシステインを選択するためのファージディスプレイの使用" Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1651 (1-2): 146-152.
Mosavi, L. K., T. J. Cammett, ら(2004). "タンパク質認識のための分子構造としてのアンキリン反復" Protein Science 13(6): 1435-1448.
Mosavi, L. K., D. L. Minor, ら (2002). "アンキリン反復モチーフのコンセンサス由来の構造決定因子" Proceedings of the National Academy of Sciences 99(25): 16029-16034.
Mullis, K., F. Faloona, ら (1986). "インビトロにおけるＤＮＡの特異的酵素増幅：ポリメラーゼ連鎖反応" Cold Spring Harb Svmp Quant Biol 51 Pt 1 : 263-273.
Nagata, K., N. Kudo, ら (2000). "イネ（オリザ・サティバ・Ｌ．・ジャポニカ（Oryza sativa L. japonica）のシステインプロテアーゼであるオリザシステイン−１の三次元解析構造" Biochemistry 39(48): 14753-14760.
Nixon AE, W. C. (2006). "プロテアーゼの遺伝子操作タンパク質阻害剤" Curr Opin Drug Discov Devel 9(2): 261 -268.
Nord, K., J. Nilsson, ら (1995). "αへリックスの細菌性レセプタードメインの組み合わせライブラリー" Protein Engineering 8(6): 601 -608.
Odegrip, R., D. Coomber, ら (2004). "ＣＩＳディスプレイ：タンパク質−ＤＮＡ複合体のライブラリーからのペプチドのインビトロ選択" Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101 (9): 2806-2810.
Parizek, P., L. Kummer, ら. (2012). "ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼの新規なアイソフォーム特異性細胞間阻害剤としてデザインされたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）" ACS Chemical Biology 7(8): 1356-1366.
Parmeggiani, F., R. Pellarin, ら (2008). "一般的なペプチド結合足場としてデザインされたアルマジロ反復タンパク質：疎水性コアのコンセンサスデザイン及び計算的な最適化" Journal of Molecular Biology 376(5): 1282-1304.
Parry-Smith, D. J., A. W. R. Payne, ら (1998). "ＣＩＮＥＭＡ−マルチプルアライメント用の新規なカラーインタラクティブエディター（Gene, vol 221 , pg GC57-GC63, 1998からの再版）" Gene 221 (1): GC57-GC63.
Polizzi, K. M., J. F. Chaparro-Riggers, ら (2006). "より熱安定性のペニシリンＧアシラーゼを創成するための構造情報に基づくコンセンサスアプローチ" Biotechnology Journal 1(5): 531- 536.
Reichert, J. M. (2010). "２０１０年において注目される抗体" MAbs. 2(1): 84-100.
Saiki RK, S. S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (1985). "鎌状赤血球貧血の診断のためのβ−グロブリン遺伝子配列の酵素的増幅及び制限部位の分析" Science 230(4732): 1350-1354.
Schlehuber, S.及びA. Skerra (2005). "抗体技術の代替手段としてのＡｎｔｉｃａｌｉｎｓ" Expert Opinion on Biological Therapy 5(1 1): 1453-1462.
Skerra, A. (2007). "分子認識用の別の非−抗体足場" Current Opinion in Biotechnology 18: 295-304.
Smith, G. (1985). "繊維状融合ファージ：ウイルス粒子表面でクローン化抗原をディスプレイする新規な発現ベクター" Science 228(4705): 1315-1317.
Song, I., M. Taylor, ら (1995). "大腸菌において生産されたパパイヤシステインによるシステインプロテアーゼの阻害" Gene 162(2): 221-224.
Song, J., L. K. Durrin, ら (2004). "ＳＵＭＯ修飾タンパク質を認識するＳＵＭＯ結合モチーフの同定" Proc Natl Acad Sci U S A 101 (40): 14373-14378.
Song, J., Z. Zhang, ら (2005). "ＳＵＭＯ結合モチーフの低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）認識：結合配向の逆転" J Biol Chem 280(48): 40122-40129.
Stadler, L. K., T. Hoffmann, ら (201 1). "ステフィンＡＩＩに由来の遺伝子操作足場タンパク質の構造−作用に関する研究：ＳＱＴ変異体の開発及び用途" Protein Eng Pes Sel 24(9): 751 -763.
Steipe, B. (2004). "タンパク質の安定性のコンセンサスに基づくエンジニアリング：細胞内抗体から熱安定性酵素まで" Protein Engineering 388: 176-186.
Steipe, B., B. Schiller, ら (1994). "タンパク質ドメインにおける配列統計学的信頼性予測に基づく安定化突然変異" Journal of Molecular Biology 240(3): 188-192.
Steipe, B, B. Schiller, et al. (1994). "タンパク質ドメインにおける配列統計学的信頼性予測に基づく安定化突然変異" Journal of Molecular Biology 240(3): 188-192. 
Stubbs, M. T., B. Laber, ら (1990). "システインプロテアーゼパパインとの複合体における組み換えヒトステフィン−Ｂの精密な２．４ａＸ線結晶構造−新たなタイプのプロテイナーゼ−阻害剤相互作用" Embo Journal 9(6): 1939-1947.
Studier, F. W.及びB. A. Moffatt (1986). "クローン化遺伝子の選択的高レベル発現を導くためのバクテリオファージＰ７  ＲＮＡポリメラーゼの使用" J Mol Biol 189(1): 113-130.
Theurillat, J. -P., B. Dreier, ら (2010). "デザインされたアンキリン反復タンパク質：乳癌における上皮増殖因子レセプター２発現をテストするための新規な手段" Mod Pathol 23(9): 1289-1297.
Traxlmayr, M. W.及びC. Obinger (2012). "酵母ディスプレイを使用する増大された安定性及び発現のためのタンパク質の定向進化" Archives of Biochemistry and Biophysics 526(2): 174-180.
Urwin, P. E., H. J. Atkinson, ら (1995). "トランスジェニック毛状根において発現された遺伝子操作オリザシステイン−Ｉは、ジャガイモシロシストセンチュウ（Globodera-Pallida）に対する抵抗性を付与する" Plant Journal 8(1): 121 -131.
Urwin, P. E., J. Green, ら (2003). "植物性シスタチンの発現は線虫に対する部分的な抵抗性を付与する。完全抵抗性は、シスタチンに自然抵抗性を積み上げることによって達成される。" Molecular Breeding 12(3): 263-269.
Urwin, P. E., A. Levesley, ら (2000). "プロテアーゼ阻害剤を発現するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物によって付与された線虫ロチレンクルス・レニフォルミス（Rotylenchulus reniformis）に対するトランスジェニック抵抗性" Molecular Breeding 6(3): 257-264.
Urwin, P. E., C. J. Lilley, ら (1997). “修飾植物性シスタチンを発現するトランスジェニックアラビドプシス（Arabidopsis）によって付与されたシスト線虫及び根瘤線虫の両方に対する抵抗性” Plant Journal 12(2): 455-461.
Urwin, P. E., M. J. McPherson, ら (1998)."二重プロテアーゼ阻害剤コンストラクトによる線虫に対する増強されたトランスジェニック植物の抵抗性" Planta 204(4): 472-479.
Urwin, P. E., K. M. Troth, ら (2001). "ジャガイモ畑での実験におけるジャガイモシロシストセンチュウ（Globodera Pallida）に対する有効なトランスジェニック抵抗性" Molecular Breeding 8(1): 95-101.
Virnekas, B., L. Ge, ら (1994). "トリヌクレオチドホスホラミダイド：ランダム突然変異誘発のための混合オリゴヌクレオチドの合成用の理想的な試薬" Nucleic Acids Res 22: 5600 - 5607.
Von Behring, E., Kitasato, S., (1890). "動物におけるジフテリア免疫と破傷風免疫の発生について" Deutsche edizinische Wochenzeitschrift 16: 11 13-1114.
Wojcik, J., O. Hantschel, ら (2010). "ＡｂｌＳＨ２ドメインの強力且つ高度に特異的なＦＮ３モノボディ阻害剤" Nat Struct Mol Biol 17(4): 519-527.
Woodman, R., J. T. H. Yeh, ら (2005). "ペプチドアプタマーの提示のための中性タンパク質足場のデザイン及び検証" Journal of Molecular Biology 352(5): 11 18- 1133.
Wurch, T., A. Pierre, ら (2012). "治療タンパク質を出現させるような新規のタンパク質足場：発見から臨床上の概念証明まで" Trends in Biotechnology 30(1 1 ): 575- 582.
【図１】
2019205450.tif 000016
【図２】
2019205450.tif 000017
【図３】
2019205450.tif 000018
【図４】
2019205450.tif 000019
【図５】
2019205450.tif 000020
【図６】
2019205450.tif 000021
【図７】
2019205450.tif 000022
【図８】
2019205450.tif 000023
【図９】
2019205450.tif 000024
【図１０】
2019205450.tif 000025
【図１１】
2019205450.tif 000026
【図１２】
2019205450.tif 000027
【図１３】
2019205450.tif 000028
【図１４】
2019205450.tif 000029
【図１５】
2019205450.tif 000030
【図１６】
2019205450.tif 000031
【図１７】
2019205450.tif 000032
【図１８】
2019205450.tif 000033
【図１９】
2019205450.tif 000034
【図２０】
2019205450.tif 000035
【図２１】
2019205450.tif 000036
【図２２】
2019205450.tif 000037
【図２３】
2019205450.tif 000038
【図２４】
2019205450.tif 000039
【図２５】
2019205450.tif 000040
【図２６】
2019205450.tif 000041
【図２７】
2019205450.tif 000042
【図２８】
2019205450.tif 000043
【配列表】
2019205450000001.app