(57)【要約】【課題】十分な保存安定性を備える新規ワクチン用製剤を提供すること。【解決手段】少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；ｐＨ調整剤と；薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物により、上記課題を解決する。【選択図】図５
2019131568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；
（ｂ）ｐＨ調整剤と；
（ｃ）薬学的に許容可能な担体と
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び参照による援用
本願は、２０１３年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，１７２号明細書の利益及びそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
前述の出願、及び当該出願の又はその審査手続における全ての引用文献（「出願引用文献」）及び出願引用文献で引用又は参照される全ての文献、及び本明細書で引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書引用文献で引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照によって本明細書に援用される任意の文献で言及される任意の製品に関する任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、及び本発明の実施において用いられ得る。より具体的には、参照される文献は全て、個別の文献それぞれが参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとみなすのと同程度に参照によって援用される。
【０００３】
本発明は、新生物の治療用製剤に関する。より詳細には、本発明は、対象における新生物を治療するための腫瘍ワクチン用製剤に関する。
【０００４】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成金番号第ＮＩＨ／ＮＣＩ−１Ｒ０１ＣＡ１５５０１０−０２号及び同第ＮＨＬＢＩ−５Ｒ０１ＨＬ１０３５３２−０３号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
毎年約１６０万人の米国人が新生物と診断され、２０１３年には米国内で約５８万人がこの疾患により死亡することが予想される。ここ数十年で新生物の検出、診断、及び治療は著しく向上しており、それにより多くの種類の新生物に関して生存率が著しく上昇している。しかしながら、新生物と診断された人のうち、治療開始後５年でなおも生存している者は約６０％に過ぎず、そのため新生物は米国における主な死亡原因の第２位となっている。
【０００６】
現在、種々の既存の癌療法が、アブレーション技法（例えば、外科手技、極低温／熱処置、超音波、高周波、及び放射線）及び化学的技法（例えば、医薬品、細胞傷害剤／化学療法剤、モノクローナル抗体、及びそれらの様々な組み合わせ）を含め、いくつも存在している。残念ながら、かかる治療法は多くの場合に深刻なリスク、毒性の副作用、及び極めて高いコストを伴うことに加え、有効性も不確かである。
【０００７】
患者自身の免疫系によって癌性細胞を標的化しようとする癌療法（例えば、癌ワクチン）について、かかる治療法は本明細書に記載する欠点のいくつかを軽減／解消し得ることから、関心が高まっている。癌ワクチンは、典型的には腫瘍抗原及び免疫刺激性分子（例えば、サイトカイン又はＴＬＲリガンド）で構成され、これらが一緒になって働き抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することで、Ｔ細胞が腫瘍細胞を標的化して破壊する。現在の癌ワクチンは、典型的には共通腫瘍抗原を含有し、これは多くの個体に見られる腫瘍で選択的に発現又は過剰発現する天然タンパク質（即ち、−個体における全ての正常細胞のＤＮＡによりコードされるタンパク質）である。かかる共通腫瘍抗原は特定の型の腫瘍を同定するには有用であるが、特定の腫瘍型に対するＴ細胞応答を標的化する免疫原としては、免疫を弱める自己トレランス効果に供されるため理想的でない。腫瘍特異的及び患者特異的ネオ抗原を含有するワクチンは、共通腫瘍抗原を含むワクチンの欠点の幾つかを解消し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１０２９３６３７号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１２／１５９６４３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１２／１５９７５４号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１））」．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１３  Ｊａｎ  １５；２０７（２）：２４０−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一般に、どのワクチンも、使用前にワクチンが分解したり、又は劣化したりすることが決してないように十分な長さの有効期間を有しなければならない。保存安定性にはまた、保存中にワクチンの成分が溶液から沈殿してはならないことも要求される。しかしながら、十分な保存安定性を実現することは困難であり得る。従って、新規ワクチン用製剤が必要とされている。
【００１１】
本願における任意の文献の引用又は特定は、かかる文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、新生物の治療用新生物ワクチン又は免疫原性組成物に関し、より詳細には、対象における腫瘍を治療するための腫瘍特異的且つ患者特異的ネオ抗原のプールを含むワクチン製剤に関する。
【００１３】
一態様において、本発明は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；ｐＨ調整剤と；薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
特定の実施形態において、本医薬組成物はワクチン組成物である。
【００１５】
特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも２つのネオ抗原ペプチドを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも３つのネオ抗原ペプチドを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも４つのネオ抗原ペプチドを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも５つのネオ抗原ペプチドを含む。新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、有利には少なくとも４つの異なるネオ抗原を含み（及び異なる抗原とは、各抗原が異なるネオエピトープを有することが意図される）、例えば、少なくとも４又は５又は６又は７又は８又は９又は１０又は１１又は１２又は１３又は１４又は１５又は１６又は１７又は１８又は１９又は２０又は２１又は２２又は２３又は２４又は２５又は２６又は２７又は２８又は２９又は３０又は３１又は３２又は３３又は３４又は３５又は３６又は３７又は３８又は３９又は４０又はそれ以上の異なるネオ抗原が、新生物ワクチン又は免疫原性組成物中にあってもよい。
【００１６】
特定の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは約５〜約５０アミノ酸長の範囲である。別の関連する実施形態において、ネオ抗原ペプチドは約１５〜約３５アミノ酸長の範囲である。典型的には、長さは約１５又は２０アミノ酸超、例えば１５〜５０又は約７５アミノ酸である。
【００１７】
一実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物はｐＨ調整剤と薬学的に許容可能な担体とをさらに含む。
【００１８】
特定の実施形態において、ｐＨ調整剤は塩基である。特定の実施形態において、ｐＨ調整剤はジカルボン酸塩又はトリカルボン酸塩である。特定の実施形態において、ｐＨ調整剤はコハク酸塩である。特定の実施形態において、ｐＨ調整剤はクエン酸塩である。
【００１９】
特定の実施形態において、コハク酸又はその薬学的に許容可能な塩はコハク酸二ナトリウムを含む。
【００２０】
特定の実施形態において、コハク酸塩は製剤中に約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する。特定の実施形態において、コハク酸塩は製剤中に約２ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する。
【００２１】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は水を含む。
【００２２】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はデキストロースをさらに含む。
【００２３】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はトレハロースをさらに含む。
【００２４】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はスクロースをさらに含む。
【００２５】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はジメチルスルホキシドをさらに含む。
【００２６】
特定の実施形態において、本医薬組成物は免疫調節薬又はアジュバントをさらに含む。一実施形態において、本方法は、免疫調節薬又はアジュバントの投与をさらに含む。別の関連する実施形態において、免疫調節薬又はアジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳ  Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、及びＡｑｕｉｌａ社のＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。別のさらなる実施形態において、免疫調節薬又はアジュバントはポリＩＣＬＣである。
【００２７】
これらのポリマーを水に溶解させると酸性溶液になり、これを好ましくは生理的ｐＨに中和することにより、ワクチン又は免疫原性組成物又はその抗原若しくはベクターを配合するためのアジュバント溶液が得られる。このときポリマーのカルボキシル基は部分的にＣＯＯ−である。
【００２８】
好ましくは、本発明に係るアジュバントの溶液、特にカルボマーの溶液は、蒸留水中に好ましくは塩化ナトリウムの存在下で調製され、得られる溶液は酸性ｐＨである。このストック溶液は、ＮａＣｌなどの塩を入れた水、好ましくは生理食塩水（ＮａＣｌ  ９ｇ／ｌ）の（所望の終濃度に達するための）所要分量、又はその実質的な一部にそれを一度に又は幾つかの部分量ずつ加え、同時に又は続いて好ましくはＮａＯＨなどの塩基で中和（ｐＨ７．３〜７．４）することにより希釈される。この生理的ｐＨの溶液は、特にフリーズドライ又は凍結乾燥形態で保存されたワクチンの再構成時に用いられる。
【００２９】
最終的なワクチン組成物のポリマー濃度は、０．０１％〜２％ｗ／ｖ、より詳細には０．０６〜１％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜０．６％ｗ／ｖである。
【００３０】
別の態様において、本発明は、新生物ワクチンである医薬組成物を提供し、これは、１つ〜５つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩；１〜３％ジメチルスルホキシド；３．６〜３．７％デキストロース水溶液；３．６〜３．７ｍＭコハク酸又はその塩；０．５ｍｇ／ｍｌポリＩ：ポリＣ；０．３７５ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン；１．２５ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロースナトリウム；及び０．２２５％塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態において、１つ〜５つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩の各々は、各々約３００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、新生物ワクチン用ネオ抗原ペプチド溶液の調製方法を提供し、本方法は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含む溶液を提供するステップと；少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含む溶液をコハク酸又はその薬学的に許容可能な塩を含む溶液と組み合わせるステップであって、それにより新生物ワクチン用ペプチド溶液を調製するステップを含む。
【００３２】
特定の実施形態において、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩を含む溶液は、少なくとも２つ（又は３つ、又は４つ、又は５つ）のネオ抗原ペプチドを含む。特定の実施形態において、新生物ワクチン用ペプチド溶液は、水、デキストロース又はトレハロース又はスクロース、コハク酸塩、及びジメチルスルホキシドを含む。特定の実施形態において、本方法は、組み合わせるステップの後に、新生物ワクチン用ペプチド溶液をろ過するステップをさらに含む。
【００３３】
別の態様において、本発明は、新生物ワクチンの調製方法を提供し、本方法は、新生物ワクチン用ペプチド溶液を提供するステップと；ペプチド溶液を免疫調節薬（ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｏｒ）又はアジュバントの溶液と組み合わせるステップであって、それにより新生物ワクチンを調製するステップとを含む。
【００３４】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるいずれかの方法（例えば、上記に記載する方法）によって作製される新生物ワクチンを提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；コハク酸又はその薬学的に許容可能な塩とを含む新生物ワクチン用ネオ抗原ペプチド溶液を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、新生物を有すると診断された対象の治療方法を提供し、本方法は、本発明の医薬組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）を対象に投与するステップであって、それにより新生物を治療するステップを含む。
【００３７】
特定の実施形態において、本方法は、本発明の第２の医薬組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）を対象に投与するステップをさらに含む。
【００３８】
特定の実施形態において、本方法は、本発明の第３の医薬組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）を対象に投与するステップをさらに含む。
【００３９】
特定の実施形態において、本方法は、本発明の第４の医薬組成物（例えば、本明細書に記載される医薬組成物）を対象に投与するステップをさらに含む。
【００４０】
新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は、ワンタイムスケジュール（ｏｎｅ  ｔｉｍｅ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）、例えば、毎週、隔週、３週間毎、毎月、隔月、１年の４分の１毎（３ヵ月毎）、１年の３分の１毎（４ヵ月毎）、５ヵ月毎、年２回（６ヵ月毎）、７ヵ月毎、８ヵ月毎、９ヵ月毎、１０ヵ月毎、１１ヵ月毎、毎年などであり得る。
【００４１】
新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、各々がネオ抗原の一部を含有するサブ組成物によって投与することができ、サブ組成物は対象又は患者の異なる場所に投与することができる；例えば、２０の異なるネオ抗原を含む組成物は、各々が２０の異なるネオ抗原のうちの５つを含有する４つのサブ組成物で投与することができ、及びこの４つのサブ組成物は、患者又は対象の流入領域リンパ節又はその近傍に各サブ組成物の送達を試みて、患者の流入領域リンパ節又はその近傍、例えば上下肢の各々（例えば、患者の各体側の大腿又は大腿上部又は殿部近傍又は腰部）に各サブ組成物の送達を試みるように投与することができる。当然ながら、位置の数、ひいてはサブ組成物の数は様々であってよく、例えば、当業者は、脾臓又はその近傍に第５の投与点を有するような投与を考えてもよく、当業者は、１つのみ、２つ又は３つ（例えば、各上肢及び片方の下肢、下肢の各々及び片方の上肢、下肢の各々及び上肢なし、又は両上肢のみ）が使用されるように位置を変えることができる。
【００４２】
前述の様々な間隔で投与されるワクチン又は免疫原性組成物は異なる製剤であってもよく、単回投与の間に対象又は患者の異なる場所に投与されるサブ組成物は異なる組成物であってもよい。例えば、初回投与が全抗原ワクチン又は免疫原性組成物であってもよく、及び次の又は以降の投与が、インビボで１つ又は複数の抗原の発現を有するベクター（例えば、ウイルスベクター又はプラスミド）であってもよい。同様に、異なるサブ組成物を患者又は対象の異なる場所に投与するに際しては、一部のサブ組成物が全抗原を含んでもよく、及び一部のサブ組成物が、インビボで１つ又は複数の抗原の発現を有するベクター（例えば、ウイルスベクター又はプラスミド）を含んでもよい。また、一部の組成物及びサブ組成物が、インビボで１つ又は複数の抗原の発現を有するベクター（例えば、ウイルスベクター又はプラスミド）と全抗原との両方を含んでもよい。インビボで１つ又は複数の抗原の発現を有する一部のベクター（例えばポックスウイルス）が免疫刺激効果又はアジュバント効果を有することができ、ひいてはかかるベクターを含有する組成物又はサブ組成物は自己アジュバント性であり得る。また、投与によって免疫系に対する抗原の提示のされ方の性質を切り替えることにより、免疫系を「プライミング」し、次に「ブースト」することができる。また本文書では、「ワクチン」と言うとき、本発明は免疫原性組成物を包含することが意図され、及び患者又は対象と言うとき、かかる個体は本明細書に開示される治療、投与、組成物、及び概して本発明を必要としている患者又は対象であることが意図される。
【００４３】
さらに、本発明は、任意のタイプの発現ベクター、例えばウイルス発現ベクター、例えば、ポックスウイルス（例えば、オルトポックスウイルス又はアビポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、例えば改変ワクシニアアンカラ又はＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ、国際公開第Ａ−９２／１５６７２号パンフレットに係るＮＹＶＡＣ、鶏痘、例えば、ＴＲＯＶＡＸ、カナリア痘、例えば、ＡＬＶＡＣ（国際公開第Ａ−９５／２７７８０号パンフレット及び国際公開第Ａ−９２／１５６７２号パンフレット）、鳩痘、豚痘など）、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルス；又はプラスミド又はＤＮＡ又は核酸分子ベクターの使用に適用される。ポックスウイルスベクターなどの、細胞質である一部のベクターが有利であり得る。しかしながらアデノウイルス、ＡＡＶ及びレンチウイルスもまた、本発明の実施において使用するのに有利であり得る。
【００４４】
即時使用可能な、特に再構成されるワクチン又は免疫原性組成物において、ベクター、例えばウイルスベクターは、本開示及び当該技術分野における知識（本明細書に引用される特許及び科学文献にあるものなど）からの当業者の範囲内にある分量で存在する。
【００４５】
全抗原又はベクター、例えば組換え生ワクチンは、概してその保存を可能にするフリーズドライ形態で存在し、使用直前に、本明細書で考察するとおりのアジュバントを含み得る溶媒又は賦形剤中に再構成される。
【００４６】
従って本発明の主題はまた、別個に包装されたフリーズドライワクチンと、有利には本明細書で考察するとおりのアジュバント化合物を含む、フリーズドライワクチンの再構成用溶液とを含むワクチン接種又は免疫化セット又はキットである。
【００４７】
本発明の主題はまた、本発明におけるワクチン又は免疫原性組成物を、例えば非経口経路、好ましくは皮下、筋肉内又は皮内経路によるか又は粘膜経路によって１つ以上の投与速度で投与するステップを含むか又はそれから本質的になるか又はそれからなるワクチン接種又は免疫化方法である。任意選択で、この方法は、フリーズドライワクチン又は免疫原性組成物（例えば、凍結乾燥全抗原又はベクターの場合）を、有利にはアジュバントも含む溶液に再構成する予備ステップを含む。
【００４８】
一実施形態において、対象は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、メラノーマ、肉腫、白血病又は膀胱癌、結腸癌、脳癌、乳癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、肺癌、卵巣癌、膵癌又は前立腺癌からなる群から選択される新生物に罹患している。別の実施形態において、新生物は転移性である。さらなる実施形態において、対象は検出可能な新生物を有しないが、疾患再発リスクが高い。さらなる関連する実施形態において、対象は過去に自家造血幹細胞移植（ＡＨＳＣＴ）を受けたことがある。
【００４９】
一実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与はプライム／ブースト投薬レジメンである。別の実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は、プライミングとしては１週目、２週目、３週目又は４週目である。別のさらなる実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は、ブーストとしては２ヵ月目、３ヵ月目、４ヵ月目又は５ヵ月目である。
【００５０】
一実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物は、各ネオ抗原ペプチドに関して７０ｋｇの個体当たり約１０μｇ〜１ｍｇの用量で投与される。別の実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物は、各ネオ抗原ペプチドに関して７０ｋｇの個体当たり約１０μｇ〜２０００μｇの平均週用量レベルで投与される。
【００５１】
一実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物は静脈内投与又は皮下投与される。
【００５２】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；コハク酸又はその薬学的に許容可能な塩とを含む新生物ワクチン用ネオ抗原ペプチド溶液を提供する。
【００５３】
本発明は、米国特許出願公開第２０１１０２９３６３７号明細書（参照により本明細書に援用される）にあるとおりの方法、例えば、複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドを同定して、投与時に複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドを対象の免疫系に提示する対象特異的免疫原性組成物を調製する方法であって、対象が腫瘍を有し、及び対象特異的ペプチドが対象及び対象の腫瘍に特異的であり、前記方法が、
（ｉ）非腫瘍試料には存在しない複数の少なくとも４つの腫瘍特異的非サイレント突然変異を、
対象の腫瘍の試料の核酸配列決定及び
対象の非腫瘍試料の核酸配列決定
によることを含め、同定するステップと；
（ｉｉ）同定された非サイレント突然変異から、対象の腫瘍に特異的なエピトープである異なる腫瘍ネオエピトープを各々が有する複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドを、同定された複数の腫瘍特異的突然変異から選択するステップであって
各ネオエピトープが非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非サイレント突然変異の発現産物であり、各ネオエピトープが対象のＨＬＡタンパク質に結合し、
対象特異的ペプチドとＨＬＡタンパク質の結合を決定するステップ
を含む、選択するステップと
（ｉｉｉ）投与時に複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドが対象の免疫系に提示されるように対象特異的免疫原性組成物を対象への投与用に製剤化するステップと
を含み、
選択するステップ又は製剤化するステップは、
対象特異的免疫原性組成物に、同定されたネオＯＲＦの発現産物を含む対象特異的ペプチドを含めるステップであって、ネオＯＲＦが、新規オープンリーディングフレームを作り出す非腫瘍試料に存在しない腫瘍特異的非サイレント突然変異である、ステップと、
対象特異的免疫原性組成物に、同定された点突然変異の発現産物を含み且つ決定された５００ｎＭ未満のＩＣ５０での対象のＨＬＡタンパク質との結合性を有する対象特異的ペプチドを含めるステップ
の少なくとも１つを含み、
それにより、複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドが同定され、及び投与時に対象の免疫系に複数の少なくとも４つの対象特異的ペプチドを提示する対象特異的免疫原性組成物（対象特異的ペプチドは対象及び対象の腫瘍に特異的である）が調製される、方法；又はネオ抗原の同定方法であって、
ａ．癌を有する対象の発現遺伝子における腫瘍特異的突然変異を同定するステップ；
ｂ．ステップ（ａ）で同定された前記突然変異が点突然変異である場合：
ｉ．ステップ（ａ）で同定された突然変異を有する変異ペプチドを同定するステップであって、前記変異ペプチドは野生型ペプチドより高い親和性でクラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合し；及び５００ｎｍ未満のＩＣ５０を有する、ステップ；
ｃ．ステップ（ａ）で同定された前記突然変異がスプライス部位、フレームシフト、リードスルー又は遺伝子融合突然変異である場合：
ｉ．ステップ（ａ）で同定された突然変異によってコードされる変異ポリペプチドを同定するステップであって、前記変異ポリペプチドはクラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合する、ステップを含む方法；又は対象において腫瘍特異的免疫応答を誘導する方法であって、同定された１つ以上のペプチド又はポリペプチドとアジュバントとを投与するステップを含む方法；又は癌に関して対象をワクチン接種するか又は治療する方法であって、
ａ．対象の発現遺伝子における複数の腫瘍特異的突然変異を同定するステップであって、前記同定された突然変異が：
ｉ．点突然変異であるとき、その点突然変異を有する変異ペプチドをさらに同定するステップ；及び／又は
ｉｉ．スプライス部位、フレームシフト、リードスルー又は遺伝子融合突然変異であるとき、その突然変異によってコードされる変異ポリペプチドをさらに同定するステップ；
ｂ．クラスＩ  ＨＬＡタンパク質に結合するステップ（ａ）で同定された１つ以上の変異ペプチド又はポリペプチドを選択するステップと；
ｃ．抗腫瘍ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化させる能力を有するステップ（ｂ）で同定された１つ以上の変異ペプチド又はポリペプチドを選択するステップと；
ｄ．ステップ（ｃ）で選択された１つ以上のペプチド又はポリペプチドでパルスした１つ以上のペプチド又はポリペプチド、自家樹状細胞又は抗原提示細胞を対象に投与するステップ；又はある１つ又は複数の同定されたペプチドを含む医薬組成物を調製するステップとを含む方法を実施すること、及び本明細書で考察するとおりの１つ又は複数の方法を実施することを含む。従って、本明細書における新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、米国特許出願公開第２０１１０２９３６３７号明細書にあるとおりであってもよい。
【００５４】
従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス、又は方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するように、以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。さらに、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法のディスクレーマー（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）を本明細書によって開示するように、米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）（米国特許法第１１２条第一段落）又は欧州特許庁（ＥＰＯ）（ＥＰＣ第８３条）の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。
【００５５】
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法に帰する意味を有し得る；例えば、それらは、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含された（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などの用語は、米国特許法に帰する意味を有し、例えば、それらは明示的に記載されない要素を許容するが、先行技術に見られる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を与える要素は除外することが注記される。
【００５６】
これら及び他の実施形態が開示され、又は以下の詳細な説明から明らかであり、及びそこに包含される。
【００５７】
特許又は出願書類には、少なくとも１つのカラーで作成された図面が含まれる。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公報の写しは、請求に応じて必要な手数料が支払われ次第当局によって提供される。
【００５８】
以下の詳細な説明は、本発明を記載される具体的な実施形態のみに限定することは意図せず、例として提供されるものであり、参照により本明細書に援用される添付の図面と併せることで最良に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】個別化された癌ワクチン又は免疫原性組成物の作製のフロープロセスを示す。
【図２】癌患者用の癌ワクチン又は免疫原性組成物を作成するための治療前ステップのフロープロセスを示す。
【図３】本発明の例示的実施形態に係る、プライムブースト法に基づく免疫スケジュールを示す。最初の約３週間にわたって頻回の免疫化が行われ、免疫応答のプライミング期の間における初期の高い抗原曝露が維持され得る。次に患者を８週間休ませることにより記憶Ｔ細胞を生じさせ、次にそれらのＴ細胞をブーストすることにより、強力な継続的応答が維持される。
【図４】本発明の例示的態様に係る、一次免疫学的エンドポイントを指示するタイムラインを示す。
【図５】本発明の例示的実施形態に係る、個別のネオ抗原ペプチドを４つのサブグループのプールにする製剤処理を示す略図を示す。
【図６】ネオ抗原製剤を使用してマウス樹状細胞を刺激した後の複数の主要免疫マーカーの誘導レベルを評価する定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図７】５％デキストロース及び０．８％ＤＭＳＯのＭＤＳＣ分析を示す。
【図８】１０％トレハロース及び０．８％ＤＭＳＯのＭＤＳＣ分析を示す。
【図９】１０％スクロース及び０．８％ＤＭＳＯのＭＤＳＣ分析を示す。
【図１０】例示的凍結乾燥の圧力プロファイルを示す。
【図１１】例示的凍結乾燥の温度プロファイルを示す。
【図１２】本発明の例示的製剤を使用した凍結乾燥ケーキの外観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
定義
本発明の理解を助けるため、本明細書にいくつかの用語及び語句を定義する：
【００６１】
具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「約」は、当該技術分野における通常の許容差の範囲内、例えば平均値の２標準偏差以内であると理解される。約は、記載される値の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から別段明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値が約の用語によって修飾されている。
【００６２】
具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「又は」は、包含的であるものと理解される。具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用されるとき、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、単数形又は複数形であるものと理解される。
【００６３】
「薬剤」とは、任意の小分子化学的化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、又はそれらの断片が意味される。
【００６４】
「改善する」とは、疾患（例えば、新生物、腫瘍等）の発症又は進行を低下させ、抑制し、減弱させ、減少させ、停止させ、又は安定化させることが意味される。
【００６５】
「改変」とは、本明細書に記載されるような当該技術分野で公知の標準的な方法により検出するときの遺伝子又はポリペプチドの発現レベル又は活性の変化（増加又は減少）が意味される。本明細書で使用されるとき、改変には、発現レベルの１０％の変化、好ましくは発現レベルの２５％の変化、より好ましくは４０％の変化、及び最も好ましくは５０％又はそれ以上の変化が含まれる。
【００６６】
「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的又は構造的特徴を有する分子が意味される。例えば、腫瘍特異的ネオ抗原ポリペプチド類似体は、対応する天然に存在する腫瘍特異的ネオ抗原ポリペプチドの生物学的活性を保持する一方で、天然に存在するポリペプチドと比べて類似体の機能を増強する特定の生化学的修飾を有する。かかる生化学的修飾は、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、又は半減期を、例えばリガンド結合を変えることなしに増加させ得る。類似体には非天然アミノ酸が含まれ得る。
【００６７】
用語「ネオ抗原」又は「ネオ抗原性の」は、ゲノムによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変する１つ又は複数の腫瘍特異的突然変異によって生じる腫瘍抗原クラスを意味する。
【００６８】
「新生物」とは、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス、又はその両方によって引き起こされるか又はそれをもたらす任意の疾患が意味される。例えば癌は、新生物の例である。癌の例としては、限定なしに、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、及び固形腫瘍、例えば肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ）癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。リンパ増殖性障害もまた増殖性疾患と考えられる。
【００６９】
用語「新生物ワクチン」は、新生物／腫瘍特異的ネオ抗原、例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はそれ以上のネオ抗原ペプチドのプール試料を指すことが意図される。「ワクチン」は、疾患（例えば、新生物／腫瘍）の予防及び／又は治療用の免疫を生じさせる組成物を意味するものと理解されるべきである。従って、ワクチンは、抗原を含む薬剤であって、ヒト又は動物においてワクチン接種により特定の防御及び保護物質を生じさせるために使用されることが意図される薬剤である。「新生物ワクチン組成物」は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤を含み得る。
【００７０】
用語「薬学的に許容可能」は、ヒトを含めた動物における使用が連邦政府又は州政府の規制当局によって承認済み又は承認見込みであるか、或いは米国薬局方又は他の一般に認められている薬局方に収載されていることを指す。
【００７１】
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体又は希釈剤」は、対象に薬剤と共に投与することのできる、且つ治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与したときにも薬剤の薬理活性を損なわず非毒性である賦形剤、担体又は希釈剤を指す。
【００７２】
本明細書に記載されるとおりのプールされた腫瘍特異的ネオ抗原の「薬学的に許容可能な塩」は、ヒト又は動物の組織と接触して使用しても過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題又は合併症なしに好適であると当該技術分野で一般に考えられている酸性塩又は塩基性塩であってもよい。かかる塩としては、アミンなどの塩基性残基の無機塩類及び有機酸塩類、並びにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩類又は有機塩類が挙げられる。具体的な薬学的塩としては、限定はされないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、アルカン酸、例えば、酢酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは０〜４である）などの酸の塩が挙げられる。同様に、薬学的に許容可能なカチオンとしては、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムが挙げられる。当業者は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）に掲載されるものを含め、本明細書に提供されるプールされた腫瘍特異的ネオ抗原のさらなる薬学的に許容可能な塩を、この開示及び当該技術分野における知識から認識するであろう。一般に、薬学的に許容可能な酸性塩又は塩基性塩は、任意の従来の化学的方法により、塩基部分又は酸部分を含有する親化合物から合成することができる。簡潔に言えば、かかる塩は、遊離酸又は遊離塩基の形態のこれらの化合物を適切な溶媒中で化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることにより調製し得る。
【００７３】
「ポリペプチド」又は「ペプチド」とは、天然でそれに付随する成分から分離されているポリペプチドが意味される。典型的には、ポリペプチドに天然でそれと結び付いているタンパク質及び天然に存在する有機分子の少なくとも６０重量％が存在しないとき、そのポリペプチドは単離されている。好ましくは、この調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、及び最も好ましくは少なくとも９９重量％がポリペプチドである。単離ポリペプチドは、例えば、天然の供給源から抽出することによるか、かかるポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させることによるか；又はタンパク質を化学的に合成することによって入手し得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるか、又はＨＰＬＣ分析によって計測することができる。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」、「予防している」、「予防」、「予防的治療」などは、疾患又は病態に罹っていないが、それを発症するリスクがある又はそれを発症し易い対象において疾患又は病態が発症する可能性を低減することを指す。
【００７５】
用語「プライム／ブースト」又は「プライム／ブースト投薬レジメン」は、ワクチン又は免疫原性若しくは免疫学的組成物の逐次投与を指すことが意図される。プライミング投与（プライミング）は、第１のワクチン又は免疫原性若しくは免疫学的組成物タイプの投与であり、１回、２回以上の投与を含み得る。ブースト投与は、第２のワクチン又は免疫原性若しくは免疫学的組成物タイプの投与であり、１回、２回以上の投与を含み得るとともに、例えば、年１回の投与を含み得るか、又はそれから本質的になり得る。特定の実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与はプライム／ブースト投薬レジメンである。
【００７６】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲、並びに前述の整数の間に介在する全ての小数値、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９などを含むものと理解される。部分範囲に関して、その範囲のいずれかの端点から延びる「入れ子の部分範囲」が特に企図される。例えば、１〜５０の例示的範囲の入れ子の部分範囲は、一方の向きに１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、又は他方の向きに５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０を含み得る。
【００７７】
「受容体」は、リガンド結合能を有する生体分子又は分子分類を意味すると理解されるべきである。受容体は、細胞、細胞形成又は生物において情報を伝達する働きをし得る。受容体は少なくとも１つの受容体単位を含み、２つ以上の受容体単位を含むことが多く、ここで各受容体単位は、タンパク質分子、詳細には糖タンパク質分子からなり得る。受容体はリガンドの構造を補完する構造を有し、リガンドを結合パートナーとして複合体を形成し得る。細胞の表面上でリガンドと結合した後、受容体の立体構造が変化することによってシグナル情報が伝達され得る。本発明によれば、受容体は、リガンド、詳細には好適な長さのペプチド又はペプチド断片と受容体／リガンド複合体を形成する能力を有するＭＨＣクラスＩ及びＩＩの特定のタンパク質を指し得る。
【００７８】
「受容体／リガンド複合体」はまた、「受容体／ペプチド複合体」又は「受容体／ペプチド断片複合体」、詳細にはクラスＩ又はクラスＩＩのペプチド提示又はペプチド断片提示ＭＨＣ分子も意味すると理解されるべきである。
【００７９】
「低減する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変化が意味される。
【００８０】
「参照」とは、標準又は対照条件が意味される。
【００８１】
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセット、又はその全体；例えば、完全長ｃＤＮＡ又はゲノム配列のセグメント、又は完全なｃＤＮＡ又はゲノム配列であってもよい。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは概して少なくとも約１０〜２，０００アミノ酸、１０〜１，５００、１０〜１，０００、１０〜５００、又は１０〜１００であり得る。好ましくは、参照ポリペプチド配列の長さは少なくとも約１０〜５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜４０アミノ酸、さらにより好ましくは約１０〜３０アミノ酸、約１０〜２０アミノ酸、約１５〜２５アミノ酸、又は約２０アミノ酸であり得る。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは概して少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、及びさらにより好ましくは約１００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチド又はそれに近い若しくはそれらの間にある任意の整数であり得る。
【００８２】
「特異的に結合する」とは、ポリペプチドを認識及び結合するが、試料中、例えば生体試料中の他の分子は実質的に認識及び結合しない化合物又は抗体が意味される。
【００８３】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。かかる核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を呈し得る。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とのハイブリダイズ能を有する。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下において相補的なポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）、又はその一部分の間で対合して二本鎖分子を形成することが意味される（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照）。
【００８４】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満であり得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドが存在しないときに達成することができ、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を挙げることができる。種々のさらなるパラメータ、例えばハイブリダイゼーション時間、デタージェント、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡを含めるか又は含めないかは、当業者に周知されている。これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることにより、様々なストリンジェンシーレベルが実現する。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中３０℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中３７℃で行われ得る。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中４２℃で行われ得る。これらの条件に関する有用な変形例は、当業者には容易に明らかであろう。
【００８５】
多くの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまたストリンジェンシーの点で異なり得る。洗浄ストリンジェンシー条件は塩濃度及び温度によって規定され得る。上記のとおり、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させるか、又は温度を上昇させることにより増加させることができる。例えば、洗浄ステップに関するストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ  ＮａＣｌ及び３ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム未満であり得る。洗浄ステップに関するストリンジェントな温度条件としては、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を挙げることができる。好ましい実施形態において、洗浄ステップは、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中２５℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中４２℃で行われ得る。より好ましい実施形態において、洗浄ステップは、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中６８℃で行われ得る。これらの条件に関するさらなる変形例は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知されており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００８６】
用語「対象」は、治療、観察、又は実験の対象となる動物を指す。単に例として、対象には、限定はされないが、哺乳動物、例えば限定はされないがヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコが含まれる。
【００８７】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか一つ）又は核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか一つ）と少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチド又は核酸分子が意味される。好ましくは、かかる配列は、比較に使用される配列とアミノ酸又は核酸レベルで少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、及びより好ましくは９０％、９５％又はさらには９９％同一である。
【００８８】
配列同一性は、典型的には配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、又はＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測られる。かかるソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に相同性の程度を割り当てることにより、同一の又は類似した配列をマッチさせる。保存的置換は、典型的には以下のグループ内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定する例示的手法では、ＢＬＡＳＴプログラムが、近縁の配列を示すｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアで用いられ得る。
【００８９】
「Ｔ細胞エピトープ」は、クラスＩ又はＩＩのＭＨＣ分子によってペプチド提示ＭＨＣ分子又はＭＨＣ複合体の形態で結合され得るとともに、次にこの形態でナイーブＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球又はＴヘルパー細胞によって認識及び結合され得るペプチド配列を意味すると理解されるべきである。
【００９０】
用語「治療する」、「治療された」、「治療すること」、「治療」などは、障害及び／又はそれに関連する症状（例えば、新生物又は腫瘍）の低減又は改善を指すことが意図される。「治療すること」には、「軽減すること」という概念が含まれ、軽減とは、癌に関連する任意の症状又は他の病的影響及び／又は癌療法に関連する副作用の発生若しくは再発頻度、又は重症度を低下させることを指す。用語「治療すること」にはまた、「管理すること」という概念も包含され、管理とは、患者における特定の疾患又は障害の重症度を低減すること又はその再発を遅延させること、例えば疾患に罹患していたことのある患者における寛解期間を延長させることを指す。除外されるわけではないが、障害又は病態を治療するとは、障害、病態、又はそれに関連する症状の完全な消失を要するものではないことは理解されるであろう。
【００９１】
用語「治療効果」は、障害（例えば、新生物又は腫瘍）の症状の１つ以上又はそれに関連する病理の何らかの軽減程度を指す。「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、かかる治療がない場合に予想される以上に、かかる障害を有する患者の生存を延ばし、障害の１つ以上の徴候又は症状を低減し、予防し又は遅延させるなどにおいて細胞又は対象への単回又は頻回用量投与時に有効となる薬剤の量を指す。「治療有効量」は、治療効果を実現するために必要な量の適格性を決めることが意図される。当該技術分野の通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の「治療有効量」（例えば、ＥＤ５０）を容易に決定し及び処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、医薬組成物中に用いられる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を実現するために必要な用量より低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させてもよい。
【００９２】
医薬組成物は、典型的には１日体重１キログラム当たり約０．０００１ｍｇ〜約２００ｍｇの化合物の投薬量を提供しなければならない。例えば、ヒト患者に対する全身投与の投薬量は、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ、２０〜８０μｇ／ｋｇ、５〜５０μｇ／ｋｇ、７５〜１５０μｇ／ｋｇ、１００〜５００μｇ／ｋｇ、２５０〜７５０μｇ／ｋｇ、５００〜１０００μｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１５００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。医薬投薬量単位剤形は、投薬量単位剤形当たり約０．００１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、例えば約１００〜約２５００ｍｇの化合物又は必須成分の組み合わせを提供するように調製される。
【００９３】
「ワクチン」は、疾患（例えば、新生物／腫瘍）の予防及び／又は治療のための免疫を生じさせる組成物を意味すると理解されるべきである。従って、ワクチンは、抗原を含み、且つヒト又は動物においてワクチン接種により特定の防御及び保護物質を生じさせるために使用されることが意図される薬剤である。
【００９４】
本明細書の可変基の任意の定義における化学基のリストの記載には、列挙される基の任意の単一の基又は組み合わせとしての当該可変基の定義が含まれる。本明細書における可変基又は態様に関する実施形態の記載には、任意の単一の実施形態としての実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその一部と組み合わせた実施形態が含まれる。
【００９５】
本明細書に提供される任意の組成物又は方法は、本明細書に提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【００９６】
本発明は、複数の新生物／腫瘍特異的ネオ抗原を含む医薬組成物（例えば、癌ワクチン）の治療有効量を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによる、新生物、より詳細には腫瘍を治療するためのワクチン及び方法に関する。本明細書にさらに詳細に記載するとおり、全ゲノム／エクソームシーケンシングを用いることにより個々の患者の新生物／腫瘍にユニークに存在する全ての又はほぼ全ての突然変異ネオ抗原を同定することができ、この一群の突然変異ネオ抗原を分析することにより、患者の新生物／腫瘍を治療するための個別化された癌ワクチン又は免疫原性組成物として使用される特異的な最適化されたネオ抗原サブセットを同定し得る。例えば、各患者の新生物／腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡをシーケンシングして腫瘍特異的突然変異を同定することにより、新生物／腫瘍特異的ネオ抗原の集団を同定してもよく、及び患者のＨＬＡアロタイプを同定することができる。次に新生物／腫瘍特異的ネオ抗原及びそれらのコグネイト天然抗原の集団を、バリデートされたアルゴリズムを使用してどの腫瘍特異的突然変異が患者のＨＬＡアロタイプに結合し得るエピトープを作り出すかを予測するバイオインフォマティクス解析に供し得る。この解析に基づき、患者毎にそれらの突然変異のサブセットに対応する複数のペプチドが設計及び合成され、患者を免疫する際の癌ワクチン又は免疫原性組成物として使用するためまとめてプールされ得る。このネオ抗原であるペプチドは、アジュバント（例えば、ポリＩＣＬＣ）又は別の抗新生物剤と併用し得る。理論によって拘束されるものではないが、これらのネオ抗原は中枢性胸腺トレランスを回避し（従ってより強力な抗腫瘍Ｔ細胞応答が可能となる）、一方で自己免疫の可能性を（例えば、正常な自己抗原の標的化を回避することにより）低下させるものと予想される。
【００９７】
免疫系は、２つの機能的サブシステムに分類することができる：自然免疫系及び獲得免疫系。自然免疫系は感染に対する防御の最前線であり、最も潜在的能力のある病原体が、例えば認識し得る感染を引き起こし得る前にこの系によって速やかに中和される。獲得免疫系は、抗原と称される、侵入生物の分子構造に応答する。獲得免疫応答には、体液性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答を含む２種類がある。体液性免疫応答では、Ｂ細胞によって体液中に分泌される抗体が病原体由来抗原に結合し、種々の機序、例えば補体媒介性溶解を介した病原体の排除をもたらす。細胞媒介性免疫応答では、他の細胞を破壊する能力を有するＴ細胞が活性化される。例えば、疾患に関連するタンパク質が細胞中に存在する場合、それらのタンパク質が細胞内でタンパク質分解によってペプチドに断片化される。次にこのように形成された抗原又はペプチドに特定の細胞タンパク質が付着してそれらを細胞の表面に輸送し、そこでそれらの抗原又はペプチドが身体の分子防御機構、詳細にはＴ細胞に提示される。細胞傷害性Ｔ細胞はこれらの抗原を認識し、そうした抗原を有する細胞を死滅させる。
【００９８】
ペプチドを細胞表面に輸送して提示する分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質と称される。ＭＨＣタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩと称される２種類に分類される。これらの２つのＭＨＣクラスのタンパク質の構造は極めて類似している；しかしながら、これらは非常に異なる機能を有する。ＭＨＣクラスＩのタンパク質は、多くの腫瘍細胞を含め、体のほぼ全ての細胞の表面上に存在する。ＭＨＣクラスＩタンパク質には、通常、内因性タンパク質由来又は細胞内に存在する病原体由来の抗原が負荷され、次にそれがナイーブ又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、樹状細胞、Ｂリンパ球、マクロファージ及び他の抗原提示細胞上に存在する。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は主に、外部抗原供給源から、即ち細胞の外側でプロセシングされるペプチドをＴヘルパー（Ｔｈ）細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩタンパク質が結合するペプチドのほとんどは、生物自身の健常宿主細胞に生じる細胞質タンパク質に由来し、通常は免疫応答を刺激しない。従って、クラスＩのかかる自己ペプチド提示ＭＨＣ分子を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球は胸腺（中枢性トレランス）で除去されるか、又は胸腺から放出された後に除去又は不活性化され、即ち寛容化される（末梢性トレランス）。ＭＨＣ分子は、非寛容化Ｔリンパ球にペプチドを提示するとき、免疫応答を刺激する能力を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、その表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ８分子の両方を有する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩの分子と複合体化したペプチドを認識及び結合する能力を有する。各細胞傷害性Ｔリンパ球は、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体との結合能を有するユニークなＴ細胞受容体を発現する。
【００９９】
ペプチド抗原は、細胞表面に提示される前に、小胞体内で競合的親和性結合によってＭＨＣクラスＩの分子に付着する。ここで、個々のペプチド抗原の親和性は、そのアミノ酸配列及びアミノ酸配列内の定義された位置における特異的結合モチーフの存在に直接関係する。かかるペプチドの配列が分かっている場合、罹患細胞に対する免疫系を、例えばペプチドワクチンを使用して操作することが可能である。
【０１００】
治癒的且つ腫瘍特異的免疫療法薬の開発を妨げる重大な障害の一つは、自己免疫を回避するための高度に特異的且つ制限的な腫瘍抗原の同定及び選択である。悪性細胞内での遺伝子変化（例えば、逆位、転座、欠失、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異等）の結果として生じる腫瘍ネオ抗原は、最も腫瘍特異的な抗原クラスに相当する。ネオ抗原は、その同定、最適化されたネオ抗原の選択、及びワクチン又は免疫原性組成物に使用されるネオ抗原の作製が技術的に困難であるため、癌ワクチン又は免疫原性組成物に使用されることはほとんどなかった。これらの問題は以下によって対処され得る：
・各患者の対応する生殖系列試料に対する腫瘍の全ゲノム、全エクソーム（例えば、捕捉されたエクソンのみ）、又はＲＮＡシーケンシングを用いてＤＮＡレベルで新生物／腫瘍における全ての又はほぼ全ての突然変異を同定すること；
・同定された突然変異を１つ以上のペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズムで解析し、新生物／腫瘍内で発現する、且つ患者ＨＬＡ対立遺伝子と結合し得る複数の候補ネオ抗原Ｔ細胞エピトープを作成すること；及び
・一組のあらゆるネオＯＲＦペプチド及び予測結合ペプチドから選択された複数の候補ネオ抗原ペプチドを、癌ワクチン又は免疫原性組成物で使用するために合成すること。
【０１０１】
例えば、シーケンシング情報を治療ワクチンに変えるには、以下が含まれる：
（１）個体のＨＬＡ分子に結合し得る個人的突然変異ペプチドの予測。どの特定の突然変異を免疫原として利用するべきかを効率的に選択するには、患者ＨＬＡ型の同定と、どの突然変異ペプチドが患者のＨＬＡ対立遺伝子に効率的に結合し得るかを予測する能力とが必要である。近年、バリデートされた結合及び非結合ペプチドによるニューラルネットワークベースの学習手法によって、主要なＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に関する予測アルゴリズムの精度が進歩している。
（２）薬物をロングペプチドのマルチエピトープワクチンとして製剤化すること。現実に可能な限り多くの突然変異エピトープを標的にすることにより、免疫系の多大な能力が活用され、特定の免疫標的化遺伝子産物の下方制御による免疫エスケープの機会が阻止され、及びエピトープ予測手法の既知の不正確さが補償される。合成ペプチドは、複数の免疫原を効率的に調製し且つ突然変異体エピトープの同定を有効なワクチンに迅速に変えるための特に有用な手段を提供する。ペプチドは夾雑細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成し、簡単に精製することができる。サイズが小さいため、タンパク質の突然変異領域に明確に焦点を合わせることが可能であり、また、他の成分（非突然変異タンパク質又はウイルスベクター抗原）からの無関係な抗原競合も低下する。
（３）強力なワクチンアジュバントとの併用。有効なワクチンには、免疫応答を惹起する強力なアジュバントが必要である。以下に記載するとおり、ＴＬＲ３アゴニスト並びにＭＤＡ５及びＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインであるポリＩＣＬＣが、ワクチンアジュバントに望ましい幾つかの特性を示している。それらの特性には、インビボでの免疫細胞の局所及び全身活性化の誘導、刺激ケモカイン及びサイトカインの産生、並びにＤＣによる抗原提示の刺激が含まれる。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトにおいて持続的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なことに、ポリＩＣＬＣを伴いワクチン接種した対象と、極めて有効性の高い複製コンピテント黄熱病ワクチンの投与を受けたことがあるボランティアとにおいて、転写経路及びシグナル伝達経路の上方調節の点で顕著な類似性が認められた。さらに、最近の第１相研究では、（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅに加えて）ＮＹ−ＥＳ０−１ペプチドワクチンと組み合わせてポリＩＣＬＣで免疫した卵巣癌患者の９０％超がＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導並びにペプチドに対する抗体反応を示した。同時に、ポリＩＣＬＣは現在までに２５件を上回る臨床試験で広範に試験されており、比較的安全な毒性プロファイルを呈している。本発明の利点は本明細書にさらに記載される。
【０１０２】
本明細書に記載されるとおり、動物及びヒトの両方において、免疫応答の誘導に突然変異エピトープが有効であること及び自発的腫瘍退縮又は長期生存の症例が突然変異エピトープに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞応答と相関すること（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＰＫ．「「それが抗原である、ばかげたことに」及びヒト癌のワクチン療法の１０年にわたる他のレッスン（“Ｉｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｓ），ｓｔｕｐｉｄ”  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｖｅｒ  ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：２９６−３００（２００８）；Ｋａｒａｎｉｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，「長期生存肺癌患者の血中におけるＨＬＡ四量体で検出可能な腫瘍特異的突然変異抗原に対する細胞溶解性Ｔリンパ球の高頻度（Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ａ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３７１８−３７２４（２００１）；Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ，「ヒトメラノーマに対する自己Ｔ細胞の応答は突然変異ネオ抗原によって支配される（Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：１６０１３（２００５））及びマウス及びヒトにおける優勢な突然変異抗原の発現の改変に対する「免疫編集」を追跡し得ること（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，「癌エクソーム解析は癌免疫編集のＴ細胞依存性機序を明らかにする（Ｃａｎｃｅｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」  Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４００（２０１２）；ＤｕＰａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，「腫瘍特異的抗原の発現が癌免疫編集の根底にある（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」  Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４０５（２０１２）；及びＳａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，「新しく診断された膠芽腫患者の上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩペプチドワクチン接種に伴う長期無進行生存後の免疫エスケープ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｅｓｃａｐｅ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）」  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：４７２２−４７２���（２０１０））のエビデンスが多数ある。一実施形態において、癌患者の突然変異エピトープが決定される。
【０１０３】
一実施形態において、突然変異エピトープは、癌患者由来の腫瘍組織及び健常組織のゲノム及び／又はエクソームを次世代シーケンシング技術を用いてシーケンシングすることにより決定される。別の実施形態において、その突然変異頻度及びネオ抗原として働く能力に基づき選択される遺伝子が、次世代シーケンシング技術を用いてシーケンシングされる。次世代シーケンシングは、ゲノムシーケンシング、ゲノムリシーケンシング、トランスクリプトームプロファイリング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）、ＤＮＡ−タンパク質相互作用（ＣｈＩＰシーケンシング）、及びエピゲノムキャラクタリゼーションに適用される（ｄｅ  Ｍａｇａｌｈａｅｓ  ＪＰ，Ｆｉｎｃｈ  ＣＥ，Ｊａｎｓｓｅｎｓ  Ｇ（２０１０）．「加齢研究における次世代シーケンシング：新たに現れつつある手法、問題、落とし穴及び可能な解決法（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｐｉｔｆａｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）」．Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９（３）：３１５−３２３；Ｈａｌｌ  Ｎ（Ｍａｙ  ２００７）．「最新シーケンシング技術及び微生物学におけるその広範な影響（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｗｉｄｅｒ  ｉｍｐａｃｔ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２０９（Ｐｔ  ９）：１５１８−１５２５；Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ（Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６）．「皆のためのゲノム（Ｇｅｎｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ）」．Ｓｃｉ．Ａｍ．２９４（１）：４６−５４；ｔｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ＪＲ，Ｇｒｏｄｙ  ＷＷ（２００８）．「次世代の最新情報（Ｋｅｅｐｉｎｇ  Ｕｐ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  １０（６）：４８４−４９２；Ｔｕｃｋｅｒ  Ｔ，Ｍａｒｒａ  Ｍ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ（２００９）．「超並列シーケンシング：ゲノムマシーンにおける次なる目玉（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｂｉｇ  Ｔｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５（２）：１４２−１５４）。次世代シーケンシングは、現在、個々の腫瘍におけるコード突然変異、最も一般的には単一アミノ酸変化（例えばミスセンス突然変異）及び頻度は低いが、フレームシフト挿入／欠失／遺伝子融合、終止コドンにおけるリードスルー突然変異、及び不適切にスプライスされたイントロンの翻訳（例えば、ネオＯＲＦ）により生成されるアミノ酸の新規ストレッチなど、特徴的な突然変異の存在を迅速に明らかにすることができる。ネオＯＲＦは、その配列の全体が免疫系にとって完全に新規であり、従ってウイルス性又は細菌性の外来抗原に類似しているため、免疫原として特に有益である。従って、ネオＯＲＦは：（１）腫瘍に対して高度に特異的である（即ちいかなる正常細胞においても発現がない）；及び（２）中枢性トレランスを回避し、それによりネオ抗原特異的ＣＴＬの前駆体頻度を増加させることができる。例えば、最近、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）から誘導されたペプチドで、治療的抗癌ワクチン又は免疫原性組成物において類似外来配列を利用する力が実証された。ウイルス性癌遺伝子Ｅ６及びＥ７に由来するＨＰＶペプチド混合物のワクチン接種を３〜４回受けた新生物発生前のウイルス誘導性疾患を有する１９人の患者の約５０％が、完全寛解を２４ヶ月以上維持した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，「外陰上皮内新生物に関するＨＰＶ−１６オンコプロテインに対するワクチン接種（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｖｕｌｖａｒ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」  ＮＥＪＭ  ３６１：１８３８（２００９））。
【０１０４】
シーケンシング技術により、腫瘍は各々、遺伝子のタンパク質コード内容を改変する複数の患者特異的突然変異を含むことが明らかになっている。かかる突然変異は、単一アミノ酸変化（ミスセンス突然変異によって引き起こされる）から、フレームシフト、終止コドンのリードスルー又はイントロン領域の翻訳（新規オープンリーディングフレーム突然変異；ネオＯＲＦ）に起因する新規アミノ酸配列の長い領域の付加にまで及ぶ改変タンパク質を作り出す。これらの突然変異タンパク質は、天然タンパク質と異なり自己トレランスの免疫抑制効果を受けないため、腫瘍に対する宿主の免疫応答にとって有用な標的である。従って、突然変異タンパク質は免疫原性である可能性が一層高く、また患者の正常細胞と比較して腫瘍細胞に対する特異性もより高い。
【０１０５】
腫瘍特異的ネオ抗原を同定する代替的方法は、タンパク質の直接シーケンシングである。タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ））を含めた多次元ＭＳ技法（ＭＳｎ）を用いる酵素消化物のタンパク質シーケンシングもまた、本発明のネオ抗原の同定に用いることができる。かかるプロテオミクス手法は、迅速で高度に自動化された解析を可能にする（例えば、Ｋ．Ｇｅｖａｅｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１４５−１１５４（２０００）を参照）。さらに、本発明の範囲内で、未知のタンパク質のハイスループットなデノボシーケンシング方法を用いて患者の腫瘍のプロテオームを解析し、発現したネオ抗原を同定し得ることが企図される。例えば、メタショットガンタンパク質シーケンシングを用いて発現したネオ抗原を同定し得る（例えば、Ｇｕｔｈａｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「メタコンティグアセンブリによるショットガンタンパク質シーケンシング（Ｓｈｏｔｇｕｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａ−ｃｏｎｔｉｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １１（１０）：１０８４−９６を参照）。
【０１０６】
腫瘍特異的ネオ抗原はまた、ＭＨＣ多量体を使用してネオ抗原特異的Ｔ細胞応答を同定して同定することもできる。例えば、患者試料におけるネオ抗原特異的Ｔ細胞応答のハイスループット解析を、ＭＨＣ四量体ベースのスクリーニング技法を用いて実施してもよい（例えば、Ｈｏｍｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）「ＭＨＣ四量体ベースのスクリーニングによる潜在的マイナー組織適合抗原のハイスループット同定：実現可能性と限界（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｉｎｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ＭＨＣ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ）」６（８）：１−１１；Ｈａｄｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「ＭＨＣ多量体の多次元コーディングによる抗原特異的Ｔ細胞応答の並列検出（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６（７）：５２０−２６；ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「腫瘍エクソーム解析がイピリムマブ応答性メラノーマにおけるネオ抗原特異的Ｔ細胞応答性を明らかにする（Ｔｕｍｏｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３１：１−４；及びＨｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「癌アンチゲノム（Ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ）」，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３２（２）：１９４−２０３を参照）。かかる四量体ベースのスクリーニング技法は腫瘍特異的ネオ抗原の初期同定に用いられるか、或いは患者がどのようなネオ抗原に既に曝露されたことがあるかを評価する二次スクリーニングプロトコルとして用いられ、それにより本発明の候補ネオ抗原の選択を促進し得る。
【０１０７】
一実施形態において、癌患者における突然変異の存在を決定することから得られるシーケンシングデータを分析して、個人のＨＬＡ分子に結合することができる個人的な突然変異ペプチドが予測される。一実施形態において、データはコンピュータを使用して分析される。別の実施形態において、配列データはネオ抗原の存在に関して分析される。一実施形態において、ネオ抗原は、ＭＨＣ分子に対するその親和性によって決定される。どの特定の突然変異を免疫原として利用するべきかを効率的に選択するには、患者ＨＬＡ型の同定と、どの突然変異ペプチドが患者のＨＬＡ対立遺伝子に効率的に結合し得るかを予測する能力とが必要である。近年、バリデートされた結合及び非結合ペプチドによるニューラルネットワークベースの学習手法によって、主要なＨＬＡ−Ａ及び−Ｂ対立遺伝子に関する予測アルゴリズムの精度が進歩している。どのミスセンス突然変異が患者のコグネイトＭＨＣ分子との強力な結合ペプチドを生じるかを予測する近年改良されたアルゴリズムを利用して、各患者に最適な突然変異エピトープ（ネオＯＲＦ及びミスセンスの両方）を代表する一組のペプチドを同定し、優先順位を付けることができる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，「免疫学における機械学習競争−ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの予測（Ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：１（２０１１）；Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  「ニューラルネットワークベースの方法を用いたエピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：２６（２０１１））。
【０１０８】
現実に可能な限り多くの突然変異エピトープを標的にすることにより、免疫系の多大な能力が活用され、特定の免疫標的化遺伝子産物の下方制御による免疫エスケープの機会が阻止され、及びエピトープ予測手法の既知の不正確さが補償される。合成ペプチドは、複数の免疫原を効率的に調製し且つ突然変異体エピトープの同定を有効なワクチン又は免疫原性組成物に迅速に変えるための特に有用な手段を提供する。ペプチドは夾雑細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成し、簡単に精製することができる。サイズが小さいため、タンパク質の突然変異領域に明確に焦点を合わせることが可能であり、また、他の成分（非突然変異タンパク質又はウイルスベクター抗原）からの無関係な抗原競合も低下する。
【０１０９】
一実施形態において、薬物製剤はロングペプチドのマルチエピトープワクチン又は免疫原性組成物である。かかる「ロング」ペプチドは樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞において効率的なインターナリゼーション、プロセシング及び交差提示を受け、且つヒトにおいてＣＴＬを誘導することが示されている（Ｍｅｌｉｅｆ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，「合成ロングペプチドワクチンによる樹立された（前）悪性疾患の免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  （ｐｒｅ）ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：３５１（２００８））。一実施形態において、少なくとも１つのペプチドが免疫化用に調製される。好ましい実施形態において、２０以上のペプチドが免疫化用に調製される。一実施形態において、ネオ抗原ペプチドは約５〜約５０アミノ酸長の範囲である。別の実施形態において、約１５〜約３５アミノ酸長のペプチドが合成される。好ましい実施形態において、ネオ抗原ペプチドは約２０〜約３５アミノ酸長の範囲である。
【０１１０】
腫瘍特異的ネオ抗原の作製
本発明は、少なくとも一部には、患者の免疫系に腫瘍特異的ネオ抗原のプールを提示する能力に基づく。当業者は、本開示及び当該技術分野における知識から、かかる腫瘍特異的ネオ抗原を作製する種々の方法があることを理解するであろう。一般に、かかる腫瘍特異的ネオ抗原は、インビトロ又はインビボのいずれでも作製し得る。腫瘍特異的ネオ抗原はインビトロでペプチド又はポリペプチドとして作製されてもよく、次にそれが個別化された新生物ワクチン又は免疫原性組成物に製剤化され、対象に投与されてもよい。本明細書にさらに詳細に記載するとおり、かかるインビトロ作製は、例えば、種々の細菌、真核生物、又はウイルス組換え発現系のいずれかにおけるＤＮＡ又はＲＮＡ分子からのペプチド／ポリペプチドのペプチド合成又は発現と、続く発現したペプチド／ポリペプチドの精製など、当業者に公知の種々の方法によって行われ得る。或いは、腫瘍特異的ネオ抗原は、腫瘍特異的ネオ抗原をコードする分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス発現系など）を対象に導入し、導入後にコードされた腫瘍特異的ネオ抗原が発現することによりインビボで作製されてもよい。ネオ抗原のインビトロ及びインビボ作製方法はまた、本明細書において、それが医薬組成物及び送達方法に関するときさらに記載される。
【０１１１】
インビトロペプチド／ポリペプチド合成
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的技法によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現、天然供給源からのタンパク質又はペプチドの単離、インビトロ翻訳、又はタンパク質又はペプチドの化学合成を含め、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド及びペプチド配列は既に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースを参照することができる。一つのかかるデータベースは、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）ウェブサイトにある国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示される技法を用いて、又は当業者に公知であろうとおりに増幅し及び／又は発現させることができる。或いは、様々な市販のタンパク質、ポリペプチド及びペプチド調製物が当業者に公知である。
【０１１２】
ペプチドは、夾雑細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）。特定の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、（１）均一合成及び開裂条件を用いたマルチチャネル機器でのパラレル固相合成；（２）ＲＰ−ＨＰＬＣカラムでのカラムストリッピングによる精製；及びペプチド間での再洗浄、但し交換なし；続いて（３）最も情報価値の高い、限られた一組のアッセイによる分析によって調製される。個々の患者の一組のペプチドに関して医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）のフットプリントを定義付けることができ、従ってスイート切り替え手順が必要となるのは、異なる患者のペプチド合成間のみである。
【０１１３】
或いは、本発明のネオ抗原ペプチドをコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を使用して、ネオ抗原ペプチドをインビトロで作製してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖及び／又は二本鎖のいずれかの、又は天然の若しくは安定化した形態のポリヌクレオチド、例えばホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）骨格を有するポリヌクレオチドなど、又はそれらの組み合わせであってよく、それがペプチドをコードする限りはイントロンを含んでも、又は含まなくてもよい。一実施形態では、インビトロ翻訳を用いてペプチドが作製される。当業者が利用し得る多くの例示的システムが存在する（例えば、Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
【０１１４】
ポリペプチドの発現能を有する発現ベクターもまた調製することができる。種々の細胞型に対する発現ベクターが当該技術分野において周知されており、過度の実験を行うことなく選択し得る。概して、ＤＮＡがプラスミドなどの発現ベクターに、発現に適切な向き及び正しいリーディングフレームで挿入される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主（例えば、細菌）によって認識される適切な転写及び翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよく、しかしかかる制御は概して発現ベクターにおいて利用可能である。次にベクターは、標準的な技法を用いてクローニング用の宿主細菌に導入される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。
【０１１５】
単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに発現ベクターを含む宿主細胞もまた企図される。ネオ抗原ペプチドは、所望のネオ抗原ペプチドをコードするＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子の形態で提供され得る。本発明の１つ以上のネオ抗原ペプチドが、単一の発現ベクターによって提供され得る。
【０１１６】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド並びにさらなるコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ；二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合にはコード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【０１１７】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現及び／又は分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）と同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟形態のポリペプチドを形成するため宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有し得る。
【０１１８】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にして、次にそれが個別化された新生物ワクチン又は免疫原性組成物に組み込まれ得るようにするマーカー配列に同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドのコード配列を含み得る。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーと融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであってよく、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用されるとき、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。さらなるタグとしては、限定はされないが、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ（Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ）、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質タグ）、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、チオレドキシンタグ、ＴＣタグ、Ｔｙタグなどが挙げられる。
【０１１９】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、複数のネオ抗原ペプチドの産生能を有する単一のコンカテマー化したネオ抗原ペプチドコンストラクトを作成するため同じリーディングフレームで融合した腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドの１つ以上のコード配列を含み得る。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列を有する単離核酸分子が提供され得る。
【０１２１】
参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に対して、ポリヌクレオチド配列に参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドにつき最大５個の点突然変異が含まれ得ることを除き同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列中のヌクレオチドの最大５％が欠失しているか又は別のヌクレオチドに置換されていてもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの突然変異は参照ヌクレオチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端位置又はそれらの末端位置の間のどこかに、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在して、或いは参照配列内で１つ以上の隣接するまとまりとして存在し得る。
【０１２２】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が参照配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、及び一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８  Ｕｎｉｘ版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを使用して従来法で決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用して２つの配列間における最良の相同性セグメントを見付け出す。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して特定の配列が本発明に係る参照配列と例えば９５％同一であるかどうかを決定するとき、パラメータの設定は、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算され、且つ参照配列中のヌクレオチド総数の最大５％の相同性のギャップが許容されるように行われる。
【０１２３】
本明細書に記載される単離された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法によりインビトロで（例えば実験室で）産生することができる。かかる方法は、直接のタンパク質合成方法から、単離ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し且つそれらの配列を好適な形質転換宿主において発現させるにまでに及ぶ。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は組換え技術を用いて、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離又は合成することにより構築される。場合により、部位特異的突然変異誘発によって配列に突然変異を誘発し、その機能性類似体を提供し得る。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−５０６６（１９８４）及び米国特許第４，５８８，５８５号明細書を参照のこと。
【０１２４】
実施形態において、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用した化学合成によって構築され得る。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、且つ目的の組換えポリペプチドを産生する宿主細胞に好ましいコドンを選択して設計することができる。目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列の合成には、標準方法を適用し得る。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードするいくつかの小型オリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための５’又は３’オーバーハングを含む。
【０１２５】
アセンブリ（例えば、合成、部位特異的突然変異誘発、又は別の方法による）の後、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、場合により所望の宿主でのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に動作可能に連結される。アセンブリが適切であることは、ヌクレオチドシーケンシング、制限酵素マッピング、及び好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野において周知のとおり、宿主においてトランスフェクト遺伝子の高い発現レベルを達成するため、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に動作可能を遺伝子に連結することができる。
【０１２６】
組換え発現ベクターを使用して、腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドをコードするＤＮＡを増幅し及び発現させてもよい。組換え発現ベクターは複製可能なＤＮＡコンストラクトであり、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに動作可能に連結された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド又は生物学的に同等な類似体をコードする合成の又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する。転写単位は概して、本明細書にさらに詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝子エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造配列又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列とのアセンブリを含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含み得る。宿主での複製能（通常は複製起点によって付与される）、及び形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子が、さらに組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関係しているとき、動作可能に連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合には、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結されている；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合には、コード配列に動作可能に連結されている；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にする位置にある場合には、コード配列に動作可能に連結されている。概して、動作可能に連結されているとは、隣接することを意味し、分泌リーダーの場合には、隣接すること及びリーディングフレームにあることを意味する。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、それはＮ末端メチオニン残基を含み得る。場合により、発現した組換えタンパク質からこの残基が続いて切断されることで、最終産物がもたらされ得る。
【０１２７】
真核生物宿主、特に哺乳動物又はヒトに有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ  １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド及びそれらの誘導体、より広い宿主域のプラスミド、例えばＭ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【０１２８】
ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターの制御下にある原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物には、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）が含まれる。高等真核細胞には、哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系もまた用いることができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、当該技術分野において周知されている（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５を参照）。
【０１２９】
様々な哺乳類又は昆虫細胞培養系もまた、有利には組換えタンパク質を発現させるために用いられる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現は、かかるタンパク質が概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるため、実施することができる。好適な哺乳類宿主細胞系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，１９８１）によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７系、並びに適切なベクターの発現能を有する他の細胞系、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、２９３、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳類発現ベクターは非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させる遺伝子に連結される好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列を含み得る。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルスシステムが、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）によってレビューされている。
【０１３０】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は、任意の好適な方法により精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーなど）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によることが含まれる。アフィニティータグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどをタンパク質に結合させると、適切なアフィニティーカラムに通すことによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることができる。
【０１３１】
例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌するシステムからの上清を、初めに、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮することができる。濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに加えることができる。或いは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他の種類であってもよい。或いは、陽イオン交換ステップを用いることができる。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて癌幹細胞タンパク質−Ｆｃ組成物をさらに精製することができる。前述の精製ステップの一部又は全てを様々な組み合わせで用いて均一な組換えタンパク質を提供することもできる。
【０１３２】
細菌培養物において産生された組換えタンパク質は、例えば、初めに細胞ペレットから抽出し、続いて１回以上濃縮し、塩析し、水溶性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップを行うことにより単離し得る。最終的な精製ステップには高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が用いられてもよい。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法によって破壊することができる。
【０１３３】
インビボペプチド／ポリペプチド合成
本発明はまた、ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをそれを必要としている対象に例えばＤＮＡ／ＲＮＡワクチンの形態でインビボで送達するための媒体としての核酸分子の使用も企図する（例えば、本明細書によって全体として参照により援用される国際公開第２０１２／１５９６４３号パンフレット、及び国際公開第２０１２／１５９７５４号パンフレットを参照）。
【０１３４】
一実施形態において、ネオ抗原は、それを必要としている患者にプラスミドを使用して投与され得る。これらは、通常は強力なウイルスプロモーターからなって目的の遺伝子（又は相補ＤＮＡ）のインビボ転写及び翻訳を駆動するプラスミドである（Ｍｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５（４）：２０３９−２０４６）。時に、ｍＲＮＡ安定性を改善し、ひいてはタンパク質発現を増加させるため、イントロンＡが含まれ得る（Ｌｅｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５９（１２）：６１１２−６１１９）。プラスミドはまた、ウシ成長ホルモン又はウサギβ−グロブリンポリアデニル化配列などの強力なポリアデニル化／転写終結シグナルも含む（Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ４２：３４３−４１０；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：１−７４；Ｂｏｅｈｍｅｔ  ａｌ．，（１９９６）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９３（１）：２９−４０）。時に、２つ以上の免疫原を発現させるため、又は免疫原と免疫刺激性タンパク質とを発現させるため、マルチシストロンベクターが構築される（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９−８８）。
【０１３５】
プラスミドは、免疫原がそこから発現する「媒体」であるため、タンパク質発現が最大となるようにベクター設計を最適化することは必須である（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９−８８）。タンパク質発現を増強する一つの方法は、病原性ｍＲＮＡのコドン使用頻度を真核細胞に対して最適化することによる。別の考慮すべき点は、プロモーターの選択である。かかるプロモーターはＳＶ４０プロモーター又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）であり得る。
【０１３６】
プラスミドは、幾つもの異なる方法によって動物組織に導入し得る。２つの最も一般的な手法は、標準的な皮下針を使用した生理食塩水中のＤＮＡの注射、及び遺伝子銃送達である。ＤＮＡワクチンプラスミドの構築及び続くこれらの２つの方法による宿主へのその送達に関する基本的な概略が、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２８１（１）：３４−４１）に示される。生理食塩水中での注射は、通常、骨格筋において筋肉内に（ＩＭ）行われるか、又は皮内に（ＩＤ）行われ、ＤＮＡは細胞外間隙に送達される。これは電気穿孔によるか、ブピバカインなどのミオトキシンで筋繊維に一時的に損傷を与えることによるか；又は生理食塩水若しくはショ糖の高張液を使用することにより補助し得る（Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ４２：３４３−４１０）。この送達方法に対する免疫応答は、針の種類、針の位置合わせ、注射速度、注射容積、筋肉型、並びに注射を受ける動物の年齢、性別及び生理的条件を含め、多くの要因の影響を受け得る（Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ４２：３４３−４１０）。
【０１３７】
もう一つの一般的に用いられる送達方法である遺伝子銃送達は、金又はタングステンマイクロパーティクル上に吸着させたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を、加速剤として圧縮ヘリウムを使用して弾道学的に加速させて標的細胞に入れ込む（Ａｌａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ４２：３４３−４１０；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９−８８）。
【０１３８】
代替的な送達方法としては、鼻粘膜及び肺粘膜などの粘膜表面に対するネイキッドＤＮＡのエアロゾル滴下（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９−８８）、並びに眼及び腟粘膜に対するｐＤＮＡの局所投与（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）５４：１２９−８８）を挙げることができる。粘膜表面送達はまた、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ調製物、生分解性ミクロスフェア、腸粘膜に対する経口投与用の弱毒化赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）又はリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）ベクター、及び組換えアデノウイルスベクターを使用しても実現されている。
【０１３９】
有効な免疫応答を生じさせるために必要なＤＮＡの用量は送達方法によって決まる。生理食塩水注射では１０μｇ〜１ｍｇの様々な量のＤＮＡが必要となるが、遺伝子銃送達では有効な免疫応答を生じさせるために筋肉内生理食塩水注射の１００〜１０００分の１のＤＮＡでよい。概して、０．２μｇ〜２０μｇが必要であり、しかしながら１６ｎｇ程の少ない分量も報告されている。これらの分量は種毎に異なり、例えばマウスで必要なＤＮＡは霊長類の約１０分の１である。生理食塩水注射では、ＤＮＡが標的組織の細胞外間隙（通常は筋肉）に送達され、そこで細胞によって取り込まれる前に物理的障壁（少し例を挙げるだけでも、基底膜及び大量の結合組織など）を乗り越えなければならないため、より多くのＤＮＡが必要であるが、遺伝子銃送達では、ＤＮＡが細胞に直接撃ち込まれ、従って「無駄」は少なくなる（例えば、Ｓｅｄｅｇａｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ    ９１（２１）：９８６６−９８７０；Ｄａｈｅｓｈｉａｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５９（４）：１９４５−１９５２；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０（５）：２４２５−２４３２；Ｓｉｚｅｍｏｒｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３４）：２９９−３０２；Ｆｙｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２４）：１１４７８−８２を参照）。
【０１４０】
一実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、例えば本発明に従い同定されるとおりの１つ以上のネオ抗原ペプチド／ポリペプチドをコードする別個のＤＮＡプラスミドを含み得る。本明細書において考察するとおり、発現ベクターの正確な選択は、発現させるペプチド／ポリペプチドに依存することができ、十分に当業者の技術の範囲内である。ＤＮＡコンストラクト（例えば、筋細胞においてエピソーム性、非複製、非組込み形態のもの）の予想される持続性が、防御期間の増加をもたらすと予想される。
【０１４１】
本発明の１つ以上のネオ抗原ペプチドは、ウイルスベースのシステム（例えば、アデノウイルスシステム、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ポックスウイルス、又はレンチウイルス）を使用してインビボでコードされ及び発現してもよい。一実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、例えばアデノウイルスなど、それを必要としているヒト患者で使用されるウイルスベースのベクターを含み得る（例えば、Ｂａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．「組換えアデノウイルス血清型２６型ＨＩＶ−１  Ｅｎｖワクチン（ＩＰＣＡＶＤ  ００１）の安全性及び免疫原性のファースト・イン・ヒューマン評価（Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｖａｃｃｉｎｅ（ＩＰＣＡＶＤ  ００１））」．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１３  Ｊａｎ  １５；２０７（２）：２４０−７（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照）。アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、及びレンチウイルス送達に使用することのできるプラスミドは、以前記載されている（例えば、米国特許第６，９５５，８０８号明細書及び同第６，９４３，０１９号明細書、及び米国特許出願公開第２００８０２５４００８号明細書（本明細書によって参照により援用される）を参照）。
【０１４２】
本発明の実施において使用し得るベクターの中でも、レトロウイルス遺伝子導入方法では細胞の宿主ゲノムに組込みが可能であり、多くの場合に、挿入されたトランス遺伝子の長期発現をもたらす。好ましい実施形態において、レトロウイルスはレンチウイルスである。加えて、多くの異なる細胞型及び標的組織において高い形質導入効率が観察されている。レトロウイルスの向性は外来性エンベロープタンパク質を導入して変えることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大し得る。レトロウイルスはまた、挿入されたトランス遺伝子の条件付き発現が可能となるように操作することもでき、従って特定の細胞型のみをレンチウイルスに感染させ得る。細胞型特異的プロモーターを使用して特定の細胞型における発現を標的化することができる。レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターである（ひいては本発明の実施においてはレンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの両方を使用し得る）。さらに、レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し又は感染させることが可能であり、且つ典型的には高ウイルス価を生じるため好ましい。従ってレトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性長末端反復配列を含む。ベクターの複製及びパッケージングには最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にはこれを使用して所望の核酸を標的細胞に組み込むと、永続的な発現がもたらされる。本発明の実施において使用し得る広く用いられているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、及びそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．は、くも膜下腔内カテーテルによって１×１０９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスを投与した。この種の投薬量は、本発明におけるレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの使用向けに適合させ又は推定することができる。
【０１４３】
また、本発明の実施においては、最小非霊長類レンチウイルスベクター、例えばウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとするレンチウイルスベクターも有用である（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，（２００６）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ；８：２７５−２８５，オンライン発行  ２１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５  ｉｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照）。このベクターは、標的遺伝子の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し得る。従って、本発明は、本発明の実施において有用なベクターの中でも特に：レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターを企図する。
【０１４４】
また、本発明の実施においてはアデノウイルスベクターも有用である。一つの利点は、組換えアデノウイルスがインビトロ及びインビボで種々の哺乳類細胞及び組織において組換え遺伝子を効率的に移入して発現させることが可能で、移入された核酸の高発現をもたらす点である。さらに、静止細胞を生産的に感染させる能力が、組換えアデノウイルスベクターの有用性を広げる。加えて、発現レベルが高く、免疫応答を生じさせるのに十分なレベルの核酸産物の発現が確実となる（例えば、米国特許第７，０２９，８４８号明細書（本明細書によって参照により援用される）を参照）。
【０１４５】
本明細書のある実施形態において、送達はアデノウイルスを介し、アデノウイルスは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位、ｐｕとも称される）のアデノウイルスベクターを含有する単一ブースター用量であり得る。本明細書のある実施形態において、用量は、好ましくは少なくとも約１×１０６粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１粒子又は約１×１０８〜１×１０１２粒子）、及び最も好ましくは少なくとも約１×１０９粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０粒子又は約１×１０９〜１×１０１２粒子）、又はさらには少なくとも約１×１０１０粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２粒子）のアデノウイルスベクターである。或いは、用量は、約１×１０１４粒子以下、好ましくは約１×１０１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０１１粒子以下、及び最も好ましくは約１×１０１０粒子以下（例えば、約１×１０９粒子（ａｒｔｉｃｌｅｓ）以下）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１ｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを有する単一用量のアデノウイルスベクターを含み得る。例えば、２０１３年６月４日に付与されたＮａｂｅｌ，ｅｔ．ａｌ．に対する米国特許第８，４５４，９７２  Ｂ２号明細書（参照によって本明細書に援用される）のアデノウイルスベクター、及びその第２９欄３６〜５８行にある投薬量を参照のこと。本明細書のある実施形態において、アデノウイルスは複数回用量で送達される。
【０１４６】
インビボ送達の観点では、ＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれないため毒性が低く、且つ挿入突然変異誘発を引き起こす可能性が低いことが理由で、他のウイルスベクターと比べて有利である。ＡＡＶはパッケージング限界が４．５又は４．７５Ｋｂである。コンストラクトが４．５又は４．７５Ｋｂより大きいと、ウイルス産生が大幅に低下する。核酸分子発現の駆動に使用することのできるプロモーターが多数ある。ＡＡＶ  ＩＴＲはプロモーターとして働くことができ、追加のプロモーターエレメントの必要性がないため有利である。遍在的な発現には、以下のプロモーターを使用することができる：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖等。脳での発現には、以下のプロモーターを使用することができる：あらゆるニューロンに対するシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対するＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに対するＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴ等。ＲＮＡ合成の駆動に使用されるプロモーターとしては、Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターを挙げることができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現に、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター及びイントロンカセットを使用することができる。
【０１４７】
ＡＡＶに関して、ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせであってもよい。ＡＡＶは、標的とする細胞に関連して選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化には、ＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織の標的化には、ＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は肝臓への送達に有用である。上記のプロモーター及びベクターは、個々に好ましい。
【０１４８】
本明細書のある実施形態において、送達はＡＡＶを介する。ヒトに対するＡＡＶのインビボ送達の治療上有効な投薬量は、約１×１０１０〜約１×１０５０個の機能性ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含有する約２０〜約５０ｍｌの範囲の生理食塩水であると考えられる。投薬量は、治療利益と任意の副作用との均衡をとるように調整され得る。本明細書のある実施形態において、ＡＡＶ用量は、概して約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶの濃度範囲にある。ヒト投薬量は約１×１０１３ゲノムＡＡＶであり得る。かかる濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。好ましい実施形態において、約２×１０１３ウイルスゲノム／ミリリットルの力価のＡＡＶが使用され、マウスの線条体半球の各々が１回の５００ナノリットル注射を受ける。他の有効な投薬量は、当業者であれば用量反応曲線を作成する常法の試験によって容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日に付与されたＨａｊｊａｒ，ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第８，４０４，６５８  Ｂ２号明細書、第２７欄４５〜６０行を参照のこと。
【０１４９】
別の実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物に対する細胞性免疫応答の有効な活性化は、非病原性微生物においてワクチン又は免疫原性組成物中の関連性のあるネオ抗原が発現することによって実現し得る。かかる微生物の周知されている例は、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）である（米国特許第６，９９１，７９７号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照）。
【０１５０】
別の実施形態では、新生物ワクチン又は免疫原性組成物にポックスウイルスが使用される。ポックスウイルスには、オルトポックスウイルス、アビポックス、ワクシニア、ＭＶＡ、ＮＹＶＡＣ、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ、鶏痘、ＴＲＯＶＡＣ等が含まれる（例えば、Ｖｅｒａｒｄｉｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２  Ｊｕｌ；８（７）：９６１−７０；及びＭｏｓｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１３；３１（３９）：４２２０−４２２２を参照）。ポックスウイルス発現ベクターは１９８２年に報告され、すぐにワクチン開発並びに数多くの分野の研究で広く使用されるようになった。このベクターの利点としては、簡単な構築、多量の外来ＤＮＡを収容する能力、及び高い発現レベルが挙げられる。
【０１５１】
別の実施形態では、新生物ワクチン又は免疫原性組成物にワクシニアウイルスを使用してネオ抗原を発現させる（Ｒｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，「ワクチン及び免疫学的ツールとしての組換えウイルス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｏｌｓ）」．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：５１７−５２４，１９９７）。組換えワクシニアウイルスは感染宿主細胞の細胞質内での複製能を有し、従って目的のポリペプチドが免疫応答を誘導し得る。さらに、ポックスウイルスが、免疫細胞、詳細には抗原提示細胞に直接感染することにより主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ経路によって処理するためのコードされた抗原を標的化することが可能であるため、またその自己アジュバント能力のため、ワクチン又は免疫原性組成物ベクターとして広く用いられている。
【０１５２】
別の実施形態では、ＡＬＶＡＣが新生物ワクチン又は免疫原性組成物におけるベクターとして使用される。ＡＬＶＡＣは、外来性トランス遺伝子を発現するように修飾することのできるカナリア痘ウイルスであり、原核生物抗原及び真核生物抗原の両方に対するワクチン接種方法として用いられている（Ｈｏｒｉｇ  Ｈ，Ｌｅｅ  ＤＳ，Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．「ヒト癌胎児性抗原及びＢ７．１共刺激分子を発現する組換えカナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ）ワクチンの第Ｉ相臨床試験（Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｎａｒｙｐｏｘｖｉｒｕｓ  （ＡＬＶＡＣ）  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｂ７．１  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００；４９：５０４−１４；ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎ  Ｍ，Ａｒｌｅｎ  Ｐ，Ｔｓａｎｇ  ＫＹ，ｅｔ  ａｌ．「再発性ＣＥＡ発現腺癌患者における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＢ７．１トランス遺伝子の両方を含むデュアル遺伝子組換えアビポックスワクチンのパイロットスタディ（Ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｄｕａｌ  ｇｅｎｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｖｉｐｏｘ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＣＥＡ）  ａｎｄ  Ｂ７．１  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＣＥＡ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）」．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６：２２１９−２８；Ｍｕｓｅｙ  Ｌ，Ｄｉｎｇ  Ｙ，Ｅｌｉｚａｇａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．「筋肉内投与したＨＩＶ−１ワクチン接種はＨＩＶ−１未感染個体において全身及び粘膜Ｔ細胞免疫の両方を誘発することができる（ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｂｏｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ＨＩＶ−１−ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）」．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７１：１０９４−１０１；Ｐａｏｌｅｔｔｉ  Ｅ．「ワクチン接種に対するポックスウイルスベクターの適用：最新情報（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６；９３：１１３４９−５３；米国特許第７，２５５，８６２号明細書）。第Ｉ相臨床試験では、腫瘍抗原ＣＥＡを発現するＡＬＶＡＣウイルスが選択された患者において優れた安全性プロファイルを示し、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答の増加をもたらした；しかしながら、他覚的臨床反応は観察されなかった（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＪＬ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＭＪ，Ｔｓａｎｇ  ＫＹ，ｅｔ  ａｌ．「ヒト癌胎児性抗原を発現する複製欠損アビポックス組換えワクチンの癌患者における第Ｉ相試験（Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ���−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｖｉｐｏｘ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）」．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９９；１７：３３２−７）。
【０１５３】
別の実施形態では、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスが、ネオ抗原ワクチン又は免疫原性組成物のウイルスベクターとして用いられ得る。ＭＶＡはオルトポックスウイルスファミリーのメンバーであり、ニワトリ胚線維芽細胞でワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を約５７０代にわたり連続継代することによって作成されている（レビューは、Ｍａｙｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４，１９７５を参照）。このような継代の結果として、得られるＭＶＡウイルスはＣＶＡと比較して３１キロベース少ないゲノム情報を含み、極めて宿主細胞制限的である（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８，１９９１）。ＭＶＡは、その極度の弱毒化、即ちビルレンス又は感染能の低下によって特徴付けられ、しかし優れた免疫原性はなおも保持している。種々の動物モデルで試験したとき、免疫抑制個体であってもＭＶＡは無毒性であることが証明された。さらに、ＭＶＡ−ＢＮ（登録商標）−ＨＥＲ２が、ＨＥＲ−２陽性乳癌の治療用に設計された免疫療法薬候補であり、現在、臨床試験中である（Ｍａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｊａｎ  ２０１２；６１（１）：１９−２９）。組換えＭＶＡを作製及び使用する方法は記載されている（例えば、米国特許第８，３０９，０９８号明細書及び同第５，１８５，１４６号明細書（本明細書によってその全体が援用される）を参照）。
【０１５４】
別の実施形態では、改変ワクシニアウイルスコペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣ及びＮＹＶＡＣ変種が、ベクターとして用いられる（米国特許第７，２５５，８６２号明細書；国際公開第９５／３００１８号パンフレット；米国特許第５，３６４，７７３号明細書及び同第５，４９４，８０７号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照）。
【０１５５】
一実施形態では、ワクチン又は免疫原性組成物の組換えウイルス粒子が、それを必要としている患者に投与される。発現するネオ抗原の投薬量は、数マイクログラム〜数百マイクログラム、例えば５〜５００μｇの範囲であり得る。ワクチン又は免疫原性組成物は、そのような投薬量レベルで発現を実現するのに好適な任意の量で投与することができる。ウイルス粒子は少なくとも約１０３．５ｐｆｕの量でそれを必要としている患者に投与され、又は細胞にトランスフェクトされ得る；従って、ウイルス粒子は、好ましくは少なくとも約１０４ｐｆｕ〜約１０６ｐｆｕでそれを必要としている患者に投与されるか、又は細胞を感染させ若しくは細胞にトランスフェクトされる；しかしながら、それを必要としている患者に少なくとも約１０８ｐｆｕを投与することができ、より好ましい投与量を少なくとも約１０７ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕとし得る。ＮＹＶＡＣに関する用量は、ＡＬＶＡＣ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ、及びアビポックス、例えばカナリア痘及び鶏痘に関して適用可能である。
【０１５６】
ワクチン又は免疫原性組成物アジュバント
有効なワクチン又は免疫原性組成物は、有利には、免疫応答を惹起するため強力なアジュバントを含む。本明細書に記載されるとおり、ＴＬＲ３アゴニスト並びにＭＤＡ５及びＲＩＧ３のＲＮＡヘリカーゼドメインであるポリＩＣＬＣが、ワクチン又は免疫原性組成物アジュバントに望ましい幾つかの特性を示している。それらの特性には、インビボでの免疫細胞の局所及び全身活性化の誘導、刺激ケモカイン及びサイトカインの産生、並びにＤＣによる抗原提示の刺激が含まれる。さらに、ポリＩＣＬＣは、ヒトにおいて持続的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答を誘導することができる。重要なことに、ポリＩＣＬＣをワクチン接種した対象と、極めて有効性の高い複製コンピテント黄熱病ワクチンの投与を受けたことがあるボランティアとにおいて、転写経路及びシグナル伝達経路の上方調節の点で顕著な類似性が認められた。さらに、最近の第１相研究では、（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅに加えて）ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドワクチンと組み合わせてポリＩＣＬＣで免疫した卵巣癌患者の９０％超がＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導並びにペプチドに対する抗体反応を示した。同時に、ポリＩＣＬＣは現在までに２５件を上回る臨床試験で広範に試験されており、比較的安全な毒性プロファイルを呈している。強力且つ特異的な免疫原に加え、ネオ抗原ペプチドはアジュバント（例えばポリＩＣＬＣ）又は別の抗新生物剤と併用し得る。理論によって拘束されるものではないが、これらのネオ抗原は中枢性胸腺トレランスを回避し（従ってより強力な抗腫瘍Ｔ細胞応答が可能となる）、一方で自己免疫の可能性を（例えば、正常な自己抗原の標的化を回避することにより）低下させるものと予想される。有効な免疫応答は、有利には免疫系を活性化させるため強力なアジュバントを含む（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｒｏ，「癌免疫療法のための分子的に定義されたワクチン、及び防御Ｔ細胞免疫（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１４４（２０１０））。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が、自然免疫系、次には適応免疫系を有効に誘導する、微生物性及びウイルス性病原体「危険シグナル」の強力なセンサーとして登場している（Ｂｈａｒｄｗａｊ  ａｎｄ  Ｇｎｊａｔｉｃ，「ＴＬＲアゴニスト：それは優れたアジュバントか？（ＴＬＲ  ＡＧＯＮＩＳＴＳ：Ａｒｅ  Ｔｈｅｙ  Ｇｏｏｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ？）」  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１６：３８２−３９１（２０１０））。ＴＬＲアゴニストの中でも、ポリＩＣＬＣ（合成二本鎖ＲＮＡ模倣体）は、骨髄由来樹状細胞の最も強力なアクチベータの一つである。ヒトボランティア試験において、ポリＩＣＬＣは安全で、且つ末梢血細胞において、最も強力な弱毒生ウイルスワクチンの一つである黄熱病ワクチンＹＦ−１７Ｄによって誘導されるものと同等の遺伝子発現プロファイルを誘導することが示されている（Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，「合成二本鎖ＲＮＡはヒトにおいて生菌ウイルスワクチンと同様の自然免疫応答を誘導する（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）」  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８：２３５７（２０１１））。好ましい実施形態において、Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃにより調製されるポリＩＣＬＣのＧＭＰ製剤であるＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）がアジュバントとして利用される。他の実施形態では、本明細書に記載される他のアジュバントが想定される。例えば、水中油、油中水又は多相Ｗ／Ｏ／Ｗ；例えば、米国特許第７，６０８，２７９号明細書及びＡｕｃｏｕｔｕｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（２００１），２６６６−２６７２、及びそれらの引用文献を参照のこと。
【０１５７】
適応
本明細書の免疫原性組成物又はワクチンによって治療し得る癌及び癌病態の例としては、限定はされないが、癌である、又は癌の発症リスクがあると診断された、それを必要としている患者が挙げられる。対象は、固形腫瘍、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、メラノーマ、及び他の組織臓器腫瘍、並びに血液腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含めたリンパ腫及び白血病、脳及び中枢神経系の腫瘍（例えば、髄膜、脳、脊髄、脳神経及び他のＣＮＳ部位の腫瘍、例えば、膠芽腫又は髄芽細胞腫）；頭部及び／又は頸部癌、乳房腫瘍、循環系の腫瘍（例えば、心臓、縦隔及び胸膜、及び他の胸腔内臓器、血管腫瘍、及び腫瘍関連血管組織）；血液及びリンパ系の腫瘍（例えば、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、悪性免疫増殖性疾患、多発性骨髄腫、及び悪性形質細胞新生物、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性又は慢性リンパ性白血病、単球性白血病、特定の細胞型の他の白血病、不特定細胞型の白血病、リンパ組織、造血組織及び関連組織の不特定の悪性新生物、例えばびまん性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫）；排泄系（例えば、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、及び他の泌尿器）の腫瘍；胃腸管（例えば、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、及び肛門管）の腫瘍；肝臓及び肝内胆管、胆嚢、及び他の胆道部位、膵臓、及び他の消化器に関わる腫瘍；口腔（例えば、口唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、耳下腺、唾液腺、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状窩（ｐｕｒｉｆｏｒｍ  ｓｉｎｕｓ）、下咽頭、及び他の口腔部位）の腫瘍；生殖器系（例えば、外陰部、腟、子宮頸、子宮、卵巣、及び他の女性生殖器関連部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、及び他の男性生殖器関連部位）の腫瘍；気道（例えば、鼻腔、中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支及び肺、例えば小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）の腫瘍；骨格系（例えば、体肢、骨関節軟骨及び他の部位の骨及び関節軟骨）の腫瘍；皮膚の腫瘍（例えば、皮膚悪性メラノーマ、非メラノーマ皮膚癌、皮膚基底細胞癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫）；及び末梢神経及び自律神経系を含む他の組織、結合組織及び軟部組織、後腹膜（ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅｏｕｍ）及び腹膜、眼、甲状腺、副腎、並びに他の内分泌腺及び関連構造が関わる腫瘍、リンパ節の二次性及び不特定悪性新生物、呼吸器系及び消化器系の二次性悪性新生物及び他の部位の二次性悪性新生物を有し得る。
【０１５８】
特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、転移性メラノーマ、肉腫、白血病又は膀胱癌、結腸癌、脳癌、乳癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、肺癌、卵巣癌、膵癌又は前立腺癌の治療が興味深い。特定の実施形態において、メラノーマは高リスクメラノーマである。
【０１５９】
本免疫原性組成物又はワクチンを使用して治療することのできる癌には、とりわけ、他の化学療法薬による治療に難治性の症例が含まれ得る。用語「難治性」は、本明細書で使用されるとき、別の化学療法剤による治療後に抗増殖反応を全く又はごく弱くしか示さない（例えば、腫瘍成長の阻害が全く又はごく弱くしかない）癌（及び／又はその転移）を指す。これらは、他の化学療法薬では十分に治療できない癌である。難治性の癌には、（ｉ）患者の治療において１つ以上の化学療法薬が既に不奏効となっている癌のみならず、（ｉｉ）他の手段、例えば生検及び化学療法薬の存在下における培養によって難治性であることが示され得る癌もまた包含される。
【０１６０】
本明細書に記載される免疫原性組成物又はワクチンはまた、それを必要としている患者であって、これまでに治療を受けたことのない患者の治療にも適用可能である。
【０１６１】
本明細書に記載される免疫原性組成物又はワクチンはまた、対象に新生物は検出されないものの疾患再発リスクが高い場合にも適用可能である。
【０１６２】
また、自家造血幹細胞移植（ＡＨＳＣＴ）を受けたことのあるそれを必要としている患者、詳細には、ＡＨＳＣＴを受けた後に残存疾患を示す患者の治療も特に興味深い。ＡＨＳＣＴ後の状況は、少量の残存疾患、恒常性増殖状態に対する免疫細胞の注入、及びいかなる再発を遅延させる標準治療もないことによって特徴付けられる。これらの特徴は、記載される新生物ワクチン又は免疫原性組成物を使用して疾患再発を遅延させるまたとない機会を提供する。
【０１６３】
医薬組成物／送達方法
本発明はまた、本発明に係る１つ以上の化合物（その薬学的に許容可能な塩を含む）の有効量を、場合により薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は添加剤との組み合わせで含む医薬組成物にも関する。
【０１６４】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは単独の医薬活性薬剤として投与することができるが、また１つ以上の他の薬剤及び／又は補助剤と組み合わせて使用されてもよい。組み合わせとして投与される場合、治療剤は、同じ又は異なる時点で投与される別個の組成物として製剤化されてもよく、又は治療剤は単一の組成物として投与されてもよい。
【０１６５】
本組成物は、１日１回、１日２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、２ヵ月に１回、６ヵ月に１回、又は１年に１回投与され得る。投与間隔は、個々の患者の必要性に応じて調整することができる。長い投与間隔には、徐放製剤又はデポー製剤を使用することができる。
【０１６６】
本発明の組成物は急性の疾患及び疾患病態の治療に使用することができ、また慢性病態の治療にも使用し得る。詳細には、本発明の組成物は、新生物の治療又は予防方法において使用される。特定の実施形態において、本発明の化合物は、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、又は５年、１０年、又は１５年を超える期間；又は例えば、範囲の下端が１４日〜１５年の間の任意の期間であり、且つ範囲の上端が１５日〜２０年の間である日単位、月単位又は年単位の任意の期間範囲（例えば、４週間〜１５年、６ヶ月〜２０年）にわたり投与される。ある場合には、患者の生涯にわたり本発明の化合物が投与されることが有利であり得る。好ましい実施形態において、患者は疾患又は障害の進行を確認するためモニタされ、それに従い用量が調整される。好ましい実施形態において、本発明に係る治療は、少なくとも２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、又は５年間、１０年間、１５年間、２０年間、又は対象の生涯にわたり有効である。
【０１６７】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、従来の薬学的に許容可能な担体、補助剤、及び媒体を含有する投薬量単位製剤で、注入により、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、経直腸的に、経腟的に、又は局所的に投与されてもよい。用語の非経口とは、本明細書で使用されるとき、１つ又は複数のリンパ節内、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液法、腹腔内、眼又は眼球、硝子体内、頬内、経皮、鼻腔内、頭蓋内及び硬膜内を含む脳内、足首関節、膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手首関節を含む関節内、腫瘍内に直接など、及び坐薬形態を含む。
【０１６８】
外科的切除は、手術を用いて縦隔腫瘍、神経原性腫瘍、又は胚細胞腫瘍、又は胸腺腫などの癌の異常組織を除去する。特定の実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は腫瘍切除の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５週間後又はそれ以上後に開始される。好ましくは、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は腫瘍切除の４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２週間後に開始される。
【０１６９】
プライム／ブーストレジメンは、ワクチン又は免疫原性若しくは免疫学的組成物の逐次投与を指す。特定の実施形態において、新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与はプライム／ブースト投薬レジメンであり、例えば新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は、プライミングとしては１週目、２週目、３週目又は４週目であり、及び新生物ワクチン又は免疫原性組成物の投与は、ブーストとしては２ヵ月目、３ヵ月目又は４ヵ月目である。別の実施形態において、異種プライム−ブースト戦略を用いてより高い細胞傷害性Ｔ細胞応答が誘発される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「異種プライム−ブースト免疫化戦略を用いたＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １７０，Ｉｓｓｕｅ  １，ｐａｇｅｓ  ２９−３８，Ａｕｇｕｓｔ  １９９９を参照）。別の実施形態では、ネオ抗原をコードするＤＮＡを使用したプライミングの後に、タンパク質のブーストが続く。別の実施形態では、タンパク質を使用したプライミングの後に、ネオ抗原をコードするウイルスによるブーストが続く。別の実施形態では、ネオ抗原をコードするウイルスを使用してプライミングが行われ、別のウイルスを使用してブーストが行われる。別の実施形態において、タンパク質を使用してプライミングが行われ、ＤＮＡを使用してブーストが行われる。好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチン又は免疫原性組成物を使用してＴ細胞応答がプライミングされ、組換えウイルスワクチン又は免疫原性組成物を使用してその応答がブーストされる。別の好ましい実施形態において、ウイルスワクチン又は免疫原性組成物はタンパク質又はＤＮＡワクチン又は免疫原性組成物と共投与され、タンパク質又はＤＮＡワクチン又は免疫原性組成物のアジュバントとして働く。次に患者は、ウイルスワクチン又は免疫原性組成物、タンパク質、又はＤＮＡワクチン又は免疫原性組成物のいずれかでブーストされ得る（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，「タンパク質とウイルスワクチンとの併用は強力な細胞性及び体液性免疫応答並びにマウスマラリア攻撃感染からの防御の増強を誘導する（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００７  Ｄｅｃ；７５（１２）：５８１９−２６．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｏｃｔ  １を参照）。
【０１７０】
医薬組成物は、ヒト及び他の哺乳動物を含めた、それを必要としている患者への投与用医薬剤を作製するための従来の薬学方法に従い処理することができる。
【０１７１】
ネオ抗原ペプチドの改変はペプチドの溶解度、バイオアベイラビリティ及び代謝速度に影響を及ぼし、従って活性種の送達の制御をもたらし得る。溶解度は、ネオ抗原ペプチドを調製し、且つ十分に当業者の常法の技術の範囲内にある公知の方法によって試験することにより評価し得る。
【０１７２】
予想外にも、コハク酸又はその薬学的に許容可能な塩（コハク酸塩）を含む医薬組成物が、ネオ抗原ペプチドに関して溶解度の向上をもたらし得ることが分かっている。従って、一態様において、本発明は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド又はその薬学的に許容可能な塩と；ｐＨ調整剤（塩基、例えばジカルボン酸塩又はトリカルボン酸塩、例えばコハク酸又はクエン酸の薬学的に許容可能な塩など）と；薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、少なくとも１つのネオ抗原ペプチドを含む溶液を塩基、例えばジカルボン酸塩又はトリカルボン酸塩、例えばコハク酸又はクエン酸の薬学的に許容可能な塩（コハク酸ナトリウムなど）と組み合わせることによるか、又は少なくとも１つのネオ抗原ペプチドを含む溶液を、塩基、例えばジカルボン酸塩又はトリカルボン酸塩、例えばコハク酸又はクエン酸の薬学的に許容可能な塩（例えばコハク酸塩緩衝溶液を含む）を含む溶液と組み合わせることによって調製し得る。特定の実施形態において、本医薬組成物はコハク酸ナトリウムを含む。特定の実施形態において、ｐＨ調整剤（クエン酸塩又はコハク酸塩など）は組成物中に約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在し、及び特定の実施形態において、約１．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ、又は約２．０〜約６．０ｍＭ、又は約３．７５〜約５．０ｍＭの濃度で存在する。
【０１７３】
本医薬組成物の特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は水を含む。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はデキストロースをさらに含む。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体はジメチルスルホキシドをさらに含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は免疫調節薬又はアジュバントをさらに含む。特定の実施形態において、免疫調節薬（ｉｍｍｕｎｏｄｕｌａｔｏｒ）又はアジュバントは、ポリＩＣＬＣ、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳ  Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ、ベクター系、ＰＬＧＡマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、及びＡｑｕｉｌａ社のＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫調節薬又はアジュバントはポリＩＣＬＣを含む。
【０１７４】
キサンテノン誘導体、例えば、バジメザン又はＡｓＡ４０４（５，６−ジメチルキサンテノン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ）−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）としても知られる）などもまた、本発明の実施形態に係るアジュバントとして用いられ得る。或いは、かかる誘導体はまた、本発明のワクチン又は免疫原性組成物と並行して例えば全身性又は腫瘍内送達を介して投与され、腫瘍部位で免疫を刺激し得る。理論によって拘束されるものではないが、かかるキサンテノン誘導体は、ＩＦＮ遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体を介してインターフェロン（ＩＦＮ）産生を刺激することにより作用すると考えられる（例えば、Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「マウスＳＴＩＮＧは血管破裂剤５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸に応答して結合し及びシグナル伝達するが、ヒトＳＴＩＮＧはこれを行わない（Ｍｏｕｓｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ，Ｂｉｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ  ５，６−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｏｎｅ−４−Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９０：５２１６−２５及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「抗癌フラボノイドはマウス選択的ＳＴＩＮＧアゴニストである（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｒｅ  Ｍｏｕｓｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＳＴＩＮＧ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ）」，８：１３９６−１４０１）を参照）。
【０１７５】
ワクチン又は免疫学的組成物はまた、アクリル系又はメタクリル系ポリマー及び無水マレイン酸・アルケニル誘導体共重合体から選択されるアジュバント化合物も含み得る。詳細には、それは、アクリル酸又はメタクリル酸が糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されたポリマー（カルボマー）、詳細にはアリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されたポリマーである。それはまた、無水マレイン酸及びエチレンが例えばジビニルエーテルで架橋された共重合体であってもよい（米国特許第６，７１３，０６８号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照）。
【０１７６】
特定の実施形態において、ｐＨ調整剤は、本明細書に記載されるとおりのアジュバント又は免疫調節薬を安定化させることができる。
【０１７７】
特定の実施形態において、医薬組成物は、１つ〜５つのペプチド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デキストロース（又はトレハロース又はスクロース）、水、コハク酸塩、ポリＩ：ポリＣ、ポリ−Ｌ−リジン、カルボキシメチルセルロース、及び塩化物を含む。特定の実施形態において、１つ〜５つのペプチドの各々は３００μｇ／ｍｌの濃度で存在する。特定の実施形態において、本医薬組成物は≦３体積％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は水中３．６〜３．７％のデキストロースを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は３．６〜３．７ｍＭのコハク酸塩（例えばコハク酸二ナトリウム）又はその塩を含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は０．５ｍｇ／ｍｌのポリＩ：ポリＣを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は０．３７５ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は１．２５ｍｇ／ｍｌのカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。特定の実施形態において、本医薬組成物は０．２２５％の塩化ナトリウムを含む。
【０１７８】
医薬組成物は、本明細書に記載される腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを、本明細書に記載されている疾患及び病態（例えば、新生物／腫瘍）の治療に治療上有効な量で、場合により薬学的に許容可能な添加剤、担体及び／又は賦形剤と組み合わせて含む。当業者は、本開示及び当該技術分野における知識から、本発明に係る１つ以上の化合物の治療有効量が、治療しようとする病態、その重症度、用いられる治療レジメン、使用する薬剤の薬物動態、並びに治療される患者（動物又はヒト）によって異なり得ることを認識するであろう。
【０１７９】
本発明に係る医薬組成物を調製するため、本発明に係る化合物の１つ以上の治療有効量は、好ましくは、用量が作製されるように従来の医薬配合技法に従い薬学的に許容可能な担体と徹底的に混合される。担体は、例えば、数ある中でもとりわけ、眼球、経口、局所又は非経口、例えば、ゲル、クリーム、軟膏、ローション及び時限放出植込み型製剤など、投与に望ましい調製形態に応じて多種多様な形態をとり得る。経口剤形として医薬組成物を調製する際には、任意の通常の医薬媒体が用いられ得る。従って、懸濁液、エリキシル剤及び溶液などの液体経口製剤には、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを含めた好適な担体及び添加剤が用いられ得る。散剤、錠剤、カプセルなどの固形経口製剤には、及び坐薬などの固形製剤には、デンプン、糖担体、例えばデキストロース、マンニトール、ラクトース及び関連する担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを含めた好適な担体及び添加剤が用いられ得る。必要であれば、錠剤又はカプセルは腸溶性コーティングされてもよく、又は標準的な技法によって徐放性であってもよい。
【０１８０】
活性化合物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤中に、治療される患者に重大な毒性作用を引き起こすことなしに所望の徴候に治療上有効な量を患者に送達するのに十分な量で含まれる。
【０１８１】
経口組成物は、概して不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口組成物はゼラチンカプセルに封入されるか又は錠剤に圧縮され得る。経口治療薬投与の目的上、活性化合物又はそのプロドラッグ誘導体は賦形剤と添合され、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。薬剤適合性を有する結合剤、及び／又は補助剤材料が組成物の一部として含まれてもよい。
【０１８２】
錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分、又は類似した性質の化合物のいずれかを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸又はコーンスターチなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味剤。投薬量単位剤形がカプセルである場合、それは、本明細書に記載される材料に加えて、脂肪油などの液体担体を含有し得る。加えて、投薬量単位剤形は、投薬量単位の物理的形態を修飾する様々な他の材料、例えば、糖、シェラック、又は腸溶剤のコーティングを含有し得る。
【０１８３】
経口投与に好適な本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤又は錠剤など、各々が所定量の活性成分を含有する個別的な単位として；散剤又は顆粒として；水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として；又は水中油型液体エマルション又は油中水型エマルションとして及びボーラスとして等、提供されてもよい。
【０１８４】
錠剤は、圧縮又は成形によって、場合により１つ以上の補助成分を伴い作製されてもよい。圧縮錠剤は、散剤又は顆粒などの自由流動形態の活性成分を、場合により結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤又は分散剤と混合して、好適な機械で圧縮することにより調製し得る。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を好適な機械で成形することにより作製し得る。錠剤は場合によりコーティングされるか又は割線が入れられてもよく、中の活性成分の持続放出又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【０１８５】
薬学的に活性な成分のかかる持続放出又は制御放出組成物を製剤化する方法は当該技術分野において公知であり、いくつかの交付済み米国特許に記載されており、その一部としては、限定はされないが、米国特許第３，８７０，７９０号明細書；同第４，２２６，８５９号明細書；同第４，３６９，１７２号明細書；同第４，８４２，８６６号明細書及び同第５，７０５，１９０号明細書（これらの開示は全体として参照により本明細書に援用される）が挙げられる。コーティングは、化合物を腸に送達するために使用することができる（例えば、米国特許第６，６３８，５３４号明細書、同第５，５４１，１７１号明細書、同第５，２１７，７２０号明細書、及び同第６，５６９，４５７号明細書、及びこれらに引用される文献を参照のこと）。
【０１８６】
活性化合物又はその薬学的に許容可能な塩はまた、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラート、チューインガムなどの構成成分として投与されてもよい。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース又はフルクトース及び特定の保存剤、色素並びに着色料及び香味料を含有し得る。
【０１８７】
眼球、非経口、皮内、皮下、又は局所適用に使用される溶液又は懸濁液は以下の構成成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注入用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調整する薬剤。
【０１８８】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、任意選択で追加的な共溶媒を伴う水性溶媒、即ち水を含む溶媒である。例示的な薬学的に許容可能な担体としては、水、緩衝水溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など、及び５％デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）又は１０％トレハロース又は１０％スクロースが挙げられる。特定の実施形態において、水性溶媒には、例えば約１〜４％、又は１〜３％の量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）がさらに含まれる。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は等張性である（即ち、血漿などの体液と実質的に同じ浸透圧を有する）。
【０１８９】
一実施形態において、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化されたデリバリーシステムを含め、制御放出製剤など、化合物を体内からの急速な排出から保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、及びポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）などの生分解性生体適合性ポリマーが用いられてもよい。かかる製剤の調製方法は、この開示及び当該技術分野における知識を考慮して当業者の範囲内である。
【０１９０】
当業者は、錠剤に加えて、活性成分の持続放出又は制御放出を提供するため他の剤形を製剤化し得ることを、この開示及び当該技術分野における知識から認識する。かかる剤形としては、限定はされないが、カプセル、顆粒及びジェルキャップが挙げられる。
【０１９１】
リポソーム懸濁液もまた薬学的に許容可能な担体であり得る。これは当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、適切な１つ又は複数の脂質を無機溶媒中に溶解し、次に溶媒を蒸発させて、容器の表面に乾燥した脂質の薄膜を残すことにより調製し得る。次に容器に活性化合物の水溶液が導入される。次に容器を手で旋回させて容器の側面から脂質材料を遊離させ、脂質凝集物を分散させると、それによりリポソーム懸濁液が形成される。当業者に周知されている他の調製方法もまた、本発明のこの態様で用いることができる。
【０１９２】
製剤は、好都合には単位投薬量剤形で提供されてもよく、従来の製薬技法によって調製されてもよい。かかる技法は、活性成分と１つ又は複数の医薬担体又は１つ又は複数の賦形剤とを会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体と一様に且つ徹底的に会合させることによるか、又は固体担体を微粉化することによるか又は両方により、及び次に、必要であれば生成物を成形することにより調製される。
【０１９３】
口内における局所投与に好適な製剤及び組成物には、香味付けされた基剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中に成分を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリンなどの不活性基剤、又はスクロース及びアカシア中に活性成分を含むトローチ；及び投与しようとする成分を好適な液体担体中に含む洗口剤が含まれる。
【０１９４】
皮膚への局所投与に好適な製剤は、投与しようとする成分を薬学的に許容可能な担体中に含む軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとして提供され得る。好ましい局所デリバリーシステムは、投与しようとする成分を含有する経皮パッチである。
【０１９５】
直腸投与用の製剤は、例えばカカオ脂又はサリチル酸塩を含む好適な基剤を伴う坐薬として提供され得る。
【０１９６】
担体が固体である場合の経鼻投与に好適な製剤は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒度を有する粗末を含み、これは、嗅薬の投与方法で、即ち鼻に当てるように保持された粉末の容器から鼻道を介して急速吸入することにより投与される。担体が液体である場合の好適な製剤は、例えば鼻腔内スプレーとして又は点鼻液としての投与用液体であり、活性成分の水性又は油性溶液を含む。
【０１９７】
腟内投与に好適な製剤は、活性成分に加えて、当該技術分野において適切であることが知られているとおりの担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤として提供され得る。
【０１９８】
非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は頻回用量バイアルに封入され得る。静脈内投与される場合、好ましい担体としては、例えば生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【０１９９】
非経口製剤については、担体は通常、滅菌水又は塩化ナトリウム水溶液を含むが、分散を助けるものを含めた他の成分が含まれてもよい。当然ながら、滅菌水が使用され、且つ無菌のまま維持される場合、組成物及び担体もまた滅菌される。また注射用懸濁液が調製されてもよく、この場合、適切な液体担体、懸濁剤などが用いられ得る。
【０２００】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。これらの製剤は、単位用量又は複数用量容器、例えば密閉されたアンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即時調合注射溶液及び懸濁液は、これまでに記載されている種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。
【０２０１】
活性化合物の投与は連続投与（静脈内点滴）から１日数回の経口投与（例えば、Ｑ．Ｉ．Ｄ．）にまで及び得るとともに、眼内又は眼球経路を含め、数ある投与経路の中でもとりわけ、経口、局所、眼内又は眼球、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、経皮（浸透促進剤を含み得る）、頬側及び坐薬投与を含み得る。
【０２０２】
新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、従来の薬学的に許容可能な担体、補助剤、及び媒体を含有する投薬量単位製剤で、注射により、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、直腸内に、腟内に、又は局所的に投与されてもよい。用語の非経口とは、本明細書で使用されるとき、１つ又は複数のリンパ節内、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、輸液法、腹腔内、眼又は眼球、硝子体内、頬内、経皮、鼻腔内、頭蓋内及び硬膜内を含む脳内、足首関節、膝関節、股関節、肩関節、肘関節、手首関節を含む関節内、腫瘍内に直接など、及び坐薬形態を含む。
【０２０３】
目的の部位に主題の組成物を提供するため、注入、カテーテルの使用、トロカール、プロジェクタイル、プルロニックゲル、ステント、持続性薬物放出ポリマー又は内部アクセスを提供する他の装置など、様々な技法を用いることができる。患者から摘出したため臓器又は組織にアクセス可能である場合、かかる臓器又は組織が主題の組成物を含有する媒体浴中に入れられてもよく、主題の組成物が臓器に塗布されてもよく、又は任意の好都合な方法で適用されてもよい。
【０２０４】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、所望の局所的又は全身性生理又は薬理効果の達成において有効な組成物の制御及び持続放出に好適な装置によって投与され得る。この方法は、薬剤の放出が所望される領域に持続放出型薬物送達システムを位置決めするステップと、薬剤を装置から所望の治療領域へと移動させるステップとを含む。
【０２０５】
腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドは、少なくとも１つの公知の他の治療剤、又は前記薬剤の薬学的に許容可能な塩と併用して利用されてもよい。用いることのできる公知の治療剤の例としては、限定はされないが、コルチコステロイド（例えば、コルチゾン、プレドニゾン、デキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）（例えば、イブプロフェン、セレコキシブ、アスピリン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈｉｃｉｎ）、ナプロキセン）、アルキル化剤、例えば、ブスルファン、シスプラチン、マイトマイシンＣ、及びカルボプラチン；抗有糸分裂剤、例えば、コルヒチン、ビンブラスチン、パクリタキセル、及びドセタキセル；トポＩ阻害薬、例えば、カンプトテシン及びトポテカン；トポＩＩ阻害薬、例えば、ドキソルビシン及びエトポシド；及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル及びメトトレキサート；ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン、ａｒａ−Ｃ、ヒドロキシウレア及びチオグアニン；抗体、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ及びＲＩＴＵＸＡＮが挙げられる。
【０２０６】
本明細書に詳細に挙げた成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤タイプを考慮した当該技術分野における従来の他の薬剤を含み得ることが理解されなければならず、例えば、経口投与に好適なものが香味剤を含み得る。
【０２０７】
薬学的に許容可能な塩の形態は、本発明に係る医薬組成物に含めるのに好ましい化学的形態の本発明に係る化合物であり得る。
【０２０８】
本化合物又はその誘導体は、これらの薬剤のプロドラッグ形態を含め、薬学的に許容可能な塩の形態で提供されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語の薬学的に許容可能な塩又は複合体とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し且つ正常細胞に対して限られた毒性効果を呈する本発明に係る活性化合物の適切な塩又は複合体を指す。かかる塩の非限定的な例は、とりわけ、（ａ）無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、及び酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、及びポリグルタミン酸などの有機酸と形成される塩；（ｂ）数ある中でもとりわけ、亜鉛、カルシウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンと形成される塩基付加塩などである。
【０２０９】
本明細書における化合物は市販されており、又は合成することができる。当業者は理解し得るとおり、本明細書の式の化合物を合成するさらなる方法が当業者には明らかである。加えて、様々な合成のステップを別の順番又は順序で実施して所望の化合物を得てもよい。本明細書に記載される化合物の合成において有用な合成化学変換及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ．Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、及びこれらの続版に記載されるものが含まれる。
【０２１０】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドと共に含まれ得るさらなる薬剤は、１つ以上の不斉中心を含有してもよく、従ってラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在し得る。これらの化合物のかかる異性体形態は全て、本発明に明示的に含まれる。本発明の化合物はまた、複数の互変異性型で表されてもよく、そのような場合、本発明は、本明細書に記載される化合物の全ての互変異性型を明示的に含む（例えば、環系のアルキル化は複数の部位のアルキル化をもたらすことができ、本発明はかかる反応生成物の全てのを明示的に含む）。かかる化合物の全てのかかる異性体形態が、本発明に明示的に含まれる。本明細書に記載される化合物の全ての結晶形態が、本発明に明示的に含まれる。
【０２１１】
投薬量
本明細書に記載される薬剤が医薬品としてヒト又は動物に投与されるとき、それらはそれ自体で投与することも、又は薬学的に許容可能な担体、賦形剤、若しくは希釈剤と組み合わせた活性成分を含有する医薬組成物として投与することもできる。
【０２１２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベル及び時間的投与経過は、特定の患者、組成物、及び投与方法について、患者に毒性となることなく所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量が達成されるように変えることができる。概して、本発明の薬剤又は医薬組成物は、ウイルス感染症及び／又は自己免疫疾患に関連する症状を軽減し又は消失させるのに十分な量で投与される。
【０２１３】
薬剤の好ましい用量は、患者が忍容し得る、且つ重篤な又は許容できない副作用を生じない最大量である。例示的用量範囲としては、１日０．０１ｍｇ〜２５０ｍｇ、１日０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１日１ｍｇ〜１０ｍｇ、及び１日０．０１ｍｇ〜１０ｍｇが挙げられる。薬剤の好ましい用量は、患者が忍容し得る、且つ重篤な又は許容できない副作用を生じない最大量である。実施形態において、薬剤は、１日体重１キログラム当たり約１０マイクログラム〜約１００ｍｇ、１日約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は１日約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される。
【０２１４】
実施形態において、医薬組成物は、１〜１０ｍｇの範囲の量、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇの薬剤を含む。
【０２１５】
実施形態において、治療上有効な投薬量は、約０．１ｎｇ／ｍｌ乃至約５０〜１００ｍｇ／ｍｌの血清中薬剤濃度を生じる。医薬組成物５は、典型的には１日体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇ〜約２０００ｍｇの化合物の投薬量を提供しなければならない。例えば、ヒト患者に対する全身投与の投薬量は、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２０〜８０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０μｇ／ｋｇ、７５〜１５０μｇ／ｋｇ、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜７５０ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜５０ｍｇ／ｋｇ、２５〜７５ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２５０ｍｇ／ｋｇ、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜７５０ｍｇ／ｋｇ、７５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１０００〜１５００ｍｇ／ｋｇ、１０  １５００〜２０００ｍｇ／ｋｇの範囲、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、又は２０００ｍｇ／ｋｇであり得る。医薬投薬量単位剤形は、投薬量単位剤形当たり約１ｍｇ〜約５０００ｍｇ、例えば約１００〜約２５００ｍｇの化合物又は必須成分の組み合わせを提供するように調製される。
【０２１６】
実施形態において、約５０ｎＭ〜約１μＭの薬剤が対象に投与される。関連する実施形態において、約５０〜１００ｎＭ、５０〜２５０ｎＭ、１００〜５００ｎＭ、２５０〜５００ｎＭ、２５０〜７５０ｎＭ、５００〜７５０ｎＭ、５００ｎＭ〜１μＭ、又は７５０ｎＭ〜１μＭの薬剤が対象に投与される。
【０２１７】
有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を踏まえれば、十分に当業者の能力の範囲内にある。概して、薬剤の効果のある又は有効な量は、初めに低用量の薬剤を投与し、次に治療対象において所望の効果（例えば、ウイルス感染症又は自己免疫疾患に関連する症状の軽減又は消失）が最小の又は許容される毒性の副作用で観察されるまで投与用量又は投薬量を漸増させることにより決定される。本発明の医薬組成物の投与に適切な用量及び投薬スケジュールを決定するために適用可能な方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００５、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ａｎｄ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００３及び２００５）（これらの各々が本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２１８】
好ましい単位投薬量製剤は、投与される成分の１日用量又は単位、本明細書に記載されるとおりの、１日サブ用量、又はそれらの適切な割合を含有するものである。
【０２１９】
本発明の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド及び／又は本発明の組成物で障害又は疾患を治療するための投薬量レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、病態の重症度、投与経路、及び用いられる詳細な化合物を含めた種々の要因に基づく。従って、投薬量レジメンは幅広く異なり得るが、標準方法を用いて常法で決定することができる。
【０２２０】
対象に投与される量及び投薬レジメンは、投与方法、治療される病態の性質、治療される対象の体重及び処方医師の判断など、多くの要因に依存し得る；かかる要因は全て、この開示及び当該技術分野における知識から当業者の範囲内にある。
【０２２１】
本発明に係る治療活性を有する製剤中に含まれる化合物の量は、疾患又は病態の治療に有効な量である。一般に、剤形中における好ましい本化合物の治療有効量は、通常、使用される化合物、治療される病態又は感染及び投与経路に応じて、患者の約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／日弱〜約２．５ｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日又はそれよりかなり多い範囲であるが、この投薬量範囲の例外が本発明により企図され得る。その最も好ましい形態では、本発明に係る化合物は約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で投与される。化合物の投薬量は、治療される病態、詳細な化合物、及び他の臨床学的因子、例えば患者の体重及び状態並びに化合物の投与経路に依存し得る。本発明はヒト及び家畜の両方への使用に適用を有することが理解されるべきである。
【０２２２】
ヒトへの経口投与について、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量が概して十分である。
【０２２３】
薬物送達が局所的ではなく全身性である場合、この投薬量範囲は、概して患者において約０．０４未満〜約４００マイクログラム／ｃｃ血液又はそれ以上の範囲の活性化合物の有効血中レベル濃度を生じる。
化合物は、好都合には、限定はされないが、単位投薬量剤形当たり０．００１〜３０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの活性成分を含有するものを含め、任意の好適な単位投薬量剤形で投与される。１０〜２５０ｍｇの経口投薬量が通常好都合である。
【０２２４】
特定の例示的実施形態によれば、本ワクチン又は免疫原性組成物は、ネオ抗原ペプチド当たり約１０μｇ〜１ｍｇの用量で投与される。特定の例示的実施形態によれば、本ワクチン又は免疫原性組成物は、ネオ抗原ペプチド当たり約１０μｇ〜２０００μｇの平均週用量レベルで投与される。
【０２２５】
薬物組成物中の活性化合物の濃度は、薬物の吸収、分布、不活性化、及び排泄率並びに当業者に公知の他の要因に依存し得る。投薬量の値はまた、軽減しようとする病態の重症度によっても変わり得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象について、具体的な投薬量レジメンは個別の必要性及び組成物投与の投与者又は監督者の専門的な判断に従い時間とともに調整されなければならないこと、及び本明細書に示す濃度範囲は例示に過ぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を限定する意図はないことが理解されるべきである。活性成分は一度に投与されてもよく、又は複数の少量の用量に分割して種々の時間間隔で投与されてもよい。
【０２２６】
本発明は、本明細書に記載される少なくとも１つの腫瘍特異的ネオ抗原を含有する医薬組成物を提供する。実施形態において、この医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤を含有し、これには、それ自体は組成物の投与を受ける対象に有害な免疫応答の発生を引き起こさない、且つ過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能」は、哺乳動物、より詳細にはヒトでの使用について連邦政府若しくは州政府の規制当局によって承認済みであるか、又は米国薬局方、欧州薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物はウイルス感染症及び／又は自己免疫疾患の治療及び／又は予防に有用であり得る。
【０２２７】
薬学的に許容可能な担体、希釈剤、及び他の賦形剤に関する周到な考察が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）（これらは本明細書によって参照により援用される）に提供されている。医薬組成物の配合は投与方法に適していなければならない。実施形態において、医薬組成物はヒトへの投与に好適であり、無菌、粒子状物質不含及び／又は非発熱性であり得る。
【０２２８】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤としては、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、滅菌等張緩衝水溶液、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２２９】
湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤、及び抗酸化剤もまた組成物中に存在し得る。
【０２３０】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【０２３１】
実施形態において、医薬組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末などの固体形態、液体溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、又は散剤で提供される。
【０２３２】
実施形態において、医薬組成物は液体形態で、例えば、医薬組成物中の活性成分の分量及び濃度を指示する密閉容器内に提供される。関連する実施形態では、液体形態の医薬組成物がハーメチックシール容器に提供される。
【０２３３】
本発明の医薬組成物を製剤化する方法は従来どおりであり、当該技術分野において周知されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓを参照）。当業者は、所望の特性（例えば、投与経路、バイオセーフティ、及び放出プロファイル）を有する医薬組成物を容易に製剤化することができる。
【０２３４】
医薬組成物の調製方法は、活性成分と薬学的に許容可能な担体、及び場合により１つ以上の補助成分とを会合させるステップを含む。医薬組成物は、活性成分を液体担体と一様に且つ徹底的に会合させることによるか、又は固体担体を微粉化することによるか、又は両方により、及び次に、必要であれば生成物を成形することにより調製し得る。医薬組成物の調製に関するさらなる方法論が、多層剤形の調製を含め、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（９ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）（本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０２３５】
経口投与に好適な医薬組成物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、ロゼンジ（香味付けされた基剤、通常スクロース及びアカシア又はトラガカントを使用する）、散剤、顆粒の形態であっても、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、或いは水中油型又は油中水型液体エマルションとして、又はエリキシル剤又はシロップとして、又はトローチとして（ゼラチン及びグリセリンなどの不活性基剤、又はスクロース及びアカシアを使用する）及び／又は洗口剤としての形態などであってもよく、各々が、１つ又は複数の活性成分として本明細書に記載される１つ又は複数の化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容可能な塩又はプロドラッグの所定量を含有する。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして投与されてもよい。
【０２３６】
経口投与用の固形剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸薬、糖衣剤、散剤、顆粒など）では、活性成分は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は希釈剤、例えば、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び／又は以下のいずれかと混合される：（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解抑制剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの混合物；及び（１０）着色剤。カプセル、錠剤、及び丸薬の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物はまた、ソフト及びハード充填ゼラチンカプセル中における充填剤、及び賦形剤、例えばラクトース又は乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して調製することもできる。
【０２３７】
錠剤は、圧縮又は成形によって、場合により１つ以上の補助成分を伴い作製されてもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤、及び／又は分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状活性成分の混合物を好適な機械で成形することにより作製し得る。
【０２３８】
錠剤、並びに糖衣剤、カプセル、丸薬、及び顆粒などの他の固形剤形は、場合により割線が入れられてもよく、又は腸溶性コーティング及び当該技術分野において周知されている他のコーティングなどのコーティング及びシェルを伴い調製されてもよい。
【０２３９】
一部の実施形態では、活性成分の効果を延ばすため、皮下又は筋肉内注射からの化合物の吸収を遅延させることが望ましい。これは、難水溶性である結晶性又は非晶質物質の液体懸濁物を使用することにより達成し得る。このとき活性成分の吸収速度はその溶解速度に依存し、次に溶解速度は結晶の大きさ及び結晶形に依存し得る。或いは、非経口投与される活性成分の吸収遅延は、化合物を油媒体中に溶解又は懸濁することにより達成される。加えて、注射用医薬剤形の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を取り入れることによりもたらされ得る。
【０２４０】
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁性マイクロスフェア、油剤、油懸濁液、エマルションの形態であってもよく、又は活性成分が１つ又は複数の生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント又は輸液用器具に組み込まれてもよい。
【０２４１】
マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製に使用される材料には、生分解性／生体内侵食性ポリマー、例えば、ポリグラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）及びポリ（乳酸）が含まれる。
【０２４２】
制御放出非経口製剤を製剤化する際に用い得る生体適合性担体には、デキストランなどの炭水化物、アルブミン、リポタンパク質又は抗体などのタンパク質が含まれる。
【０２４３】
インプラントに使用される材料は、非生分解性、例えば、ポリジメチルシロキサンであるか、又は生分解性、例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）又はポリ（オルトエステル）などであり得る。
【０２４４】
実施形態において、１つ又は複数の活性成分はエアロゾルによって投与される。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム製剤、又は固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液が用いられてもよい。医薬組成物はまた、化合物の分解をもたらし得る剪断に薬剤が曝露されることを最小限に抑え得る音波ネブライザーを使用して投与することもできる。
【０２４５】
通常、水性エアロゾルは、１つ又は複数の活性成分の水溶液又は水性懸濁液を従来の薬学的に許容可能な担体及び安定剤と共に配合することにより作製される。担体及び安定剤は特定の化合物の要件によって異なるが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、又はポリエチレングリコール）、無害のタンパク質、例えば、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝剤、塩類、糖類又は糖アルコール類を含む。エアロゾルは概して等張液から調製される。
【０２４６】
１つ又は複数の活性成分の局所投与又は経皮投与用剤形には、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入薬が含まれる。１つ又は複数の活性成分は、無菌条件下で薬学的に許容可能な担体と、及び適宜、任意の保存剤、緩衝剤、又は噴射剤と混合することができる。
【０２４７】
本発明での使用に好適な経皮パッチが、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９８９）及び米国特許第４，７４３，２４９号明細書、同第４，９０６，１６９号明細書、同第５，１９８，２２３号明細書、同第４，８１６，５４０号明細書、同第５，４２２，１１９号明細書、同第５，０２３，０８４号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に開示されている。経皮パッチはまた、経陰嚢パッチを含め、当該技術分野において周知されている任意の経皮パッチであってよい。かかる経皮パッチ中の医薬組成物は、当該技術分野において周知の１つ以上の吸収促進剤又は皮膚透過促進剤を含有し得る（例えば、米国特許第４，３７９，４５４号明細書及び同第４，９７３，４６８号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）を参照）。本発明で使用される経皮的治療薬システムは、イオントフォレシス、拡散、又はこれらの２つの効果の併用に基づき得る。
【０２４８】
経皮パッチは、身体への１つ又は複数の活性成分の制御送達を提供するというさらなる利点を有する。かかる剤形は、１つ又は複数の活性成分を適切な媒体中に溶解又は分散させることにより作製し得る。吸収促進剤を使用して、皮膚を通じた活性成分のフラックスを増加させることもできる。かかるフラックスの速度は、律速膜を提供するか、或いは１つ又は複数の活性成分をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させるかのいずれかによって制御し得る。
【０２４９】
かかる医薬組成物は、クリーム、軟膏、ローション、リニメント剤、ゲル、ハイドロゲル、溶液、懸濁液、スティック、スプレー、ペースト、硬膏及び他の種類の経皮薬物デリバリーシステムの形態であってもよい。この組成物はまた、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤、例えば、乳化剤、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透促進剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、香料、及び皮膚保護剤も含み得る。
【０２５０】
乳化剤の例としては、限定はされないが、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆レシチン及びモノオレイン酸ソルビタン誘導体が挙げられる。
【０２５１】
抗酸化剤の例としては、限定はされないが、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、及びシステインが挙げられる。
【０２５２】
保存剤の例としては、限定はされないが、パラベン、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル及び塩化ベンザルコニウムが挙げられる。
【０２５３】
保湿剤の例としては、限定はされないが、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及び尿素が挙げられる。
【０２５４】
浸透促進剤の例としては、限定はされないが、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−ピロリドン及びその誘導体、テトラヒドロフルフリルアルコール、プロピレングリコール、モノラウリン酸プロピレングリコール又はラウリン酸メチルを含むジエチレングリコールモノエチル又はモノメチルエーテル、ユーカリプトール、レシチン、ＴＲＡＮＳＣＵＴＯＬ、及びＡＺＯＮＥが挙げられる。
【０２５５】
キレート剤の例としては、限定はされないが、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸及びリン酸が挙げられる。
【０２５６】
ゲル形成剤の例としては、限定はされないが、カルボポール、セルロース誘導体、ベントナイト、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０２５７】
１つ又は複数の活性成分に加えて、本発明の軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、賦形剤、例えば、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含有し得る。
【０２５８】
散剤及びスプレーは、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有し得る。スプレーは、従来の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素、及び揮発性非置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンをさらに含有し得る。
【０２５９】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に本発明の１つ又は複数の化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することにより作製される。化合物とポリマーの比率、及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、生体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロエマルション中に薬物を封入することによっても調製される。
【０２６０】
皮下インプラントは当該技術分野において周知されており、本発明での使用に好適である。皮下植え込み方法は、好ましくは非刺激性で、機械的に弾性がある。インプラントは、マトリックスタイプ、リザーバタイプ、又はそれらのハイブリッドであってもよい。マトリックスタイプの装置において、担体材料は多孔質又は非多孔質、固体又は半固体、及び１つ又は複数の活性化合物に対して透過性又は不透過性であってもよい。担体材料は生分解性であってもよく、又は投与後にゆっくりと侵食し得る。場合によっては、マトリックスは非分解性であって、しかし代わりに担体材料が分解するマトリックスを通じた活性化合物の拡散に頼る。代替的な皮下インプラント方法はリザーバ装置を利用し、ここでは１つ又は複数の活性化合物が律速膜、例えば、成分濃度と無関係な（ゼロ次動態を有する）膜に取り囲まれている。律速膜に取り囲まれたマトリックスからなる装置もまた使用に好適である。
【０２６１】
リザーバタイプ及びマトリックスタイプの両方の装置とも、ポリジメチルシロキサン、例えばＳＩＬＡＳＴＩＣ、又は他のシリコーンゴムなどを含有し得る。マトリックス材料は、不溶性ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、エチルビニルアセテート、ポリスチレン及びポリメタクリレート、並びにパルミトステアリン酸グリセロール、ステアリン酸グリセロール、及びベヘン酸グリセロールタイプのグリセロールエステルであってもよい。材料は疎水性又は親水性ポリマーであってもよく、場合により可溶化剤を含有する。
【０２６２】
皮下インプラント装置は、例えば米国特許第５，０３５，８９１号明細書及び同第４，２１０，６４４号明細書（これらは本明細書によって参照により援用される）に記載されるとおりの、任意の好適なポリマーで作製された遅延放出カプセルであってもよい。
【０２６３】
一般には、放出の律速及び薬物化合物の皮膚透過を提供するために、少なくとも４つの異なる手法を適用することが可能である。これらの手法は以下である：膜による抑制システム、接着拡散制御システム、マトリックス分散型システム及びマイクロリザーバシステム。制御放出性の経皮及び／又は局所組成物は、これらの手法を好適に取り合わせることにより達成し得ることが理解される。
【０２６４】
膜による抑制システムでは、活性成分は、金属プラスチックラミネートなどの薬物不透過性ラミネートから成形された浅いコンパートメントと、微孔性又は非多孔質高分子膜、例えばエチレン−酢酸ビニル共重合体などの律速高分子膜とに完全にカプセル化されたリザーバ中に存在する。活性成分は律速高分子膜を通って放出される。薬物リザーバでは、活性成分は固体ポリマーマトリックス中に分散しているか、又はシリコーン液などの浸出不可能な粘稠液体媒体中に懸濁されているかのいずれかであり得る。高分子膜の外表面に接着性ポリマーの薄層が貼り付けられており、この経皮システムと皮膚表面との密着した接触を実現する。接着性ポリマーは、好ましくは、低アレルギー性で且つ活性薬物物質と適合性を有するポリマーである。
【０２６５】
接着拡散制御システムでは、活性成分のリザーバは、活性成分を接着性ポリマー中に直接分散させて、次に、例えば溶媒キャスティングにより、活性成分を含有する接着剤を実質的に薬物不透過性の金属プラスチック裏当てのフラットシート上に塗布して薄い薬物リザーバ層を形成することにより形成される。
【０２６６】
マトリックス分散型システムは、活性成分を親水性又は親油性ポリマーマトリックス中に実質的に均一に分散させることにより活性成分のリザーバが形成されることを特徴とする。次に薬物含有ポリマーが、実質的に十分に定義された表面積及び制御された厚さを有する円板に成形される。接着性ポリマーが周囲に沿って塗布され、円板の周りに接着剤のストリップが形成される。
【０２６７】
マイクロリザーバシステムは、リザーバシステムとマトリックス分散型システムとの組み合わせと考えることができる。この場合、活性物質のリザーバは、初めに薬物固体を水溶性ポリマーの水溶液中に懸濁し、次にこの薬物懸濁液を親油性ポリマー中に分散させて、非常に多数の浸出不可能な微小球体の薬物リザーバを形成することにより形成される。
【０２６８】
本明細書に記載の制御放出、長期放出、及び持続放出組成物のいずれも、約３０分〜約１週間、約３０分〜約７２時間、約３０分〜２４時間、約３０分〜１２時間、約３０分〜６時間、約３０分〜４時間、及び約３時間〜１０時間で活性成分を放出するように製剤化することができる。実施形態において、１つ又は複数の活性成分の有効濃度は、医薬組成物を対象に投与した後、対象体内で４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、又はそれ以上持続する。
【０２６９】
ワクチン又は免疫原性組成物
本発明は、特定のＴ細胞応答を生じさせる能力を有する免疫原性組成物、例えば新生物ワクチン又は免疫原性組成物に関する。新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、本明細書に記載される方法によって同定される腫瘍特異的ネオ抗原に対応するネオ抗原ペプチド及び／又はネオ抗原ポリペプチドを含む。
【０２７０】
好適な新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、好ましくは複数の腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを含み得る。ある実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物は、１〜１００組のペプチド、より好ましくは１〜５０のかかるペプチド、さらにより好ましくは１０〜３０組のペプチド、さらにより好ましくは１５〜２５のペプチドを含み得る。別の好ましい実施形態によれば、ワクチン又は免疫原性組成物は、少なくとも１つのペプチド、より好ましくは２つ、３つ、４つ、又は５つのペプチドを含むことができる。特定の実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の異なるペプチドを含むことができる。
【０２７１】
ワクチン又は免疫原性組成物に含める各ペプチドの最適量及び最適投与レジメンは、当業者が過度の実験を行うことなく決定することができる。例えば、ペプチド又はその変異体は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射用に調製され得る。ペプチド注射の好ましい方法には、ｓ．ｃ、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．が含まれる。ＤＮＡ注射の好ましい方法には、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．が含まれる。例えば、１〜５００ｍｇ、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５００μｇのペプチド又はＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチド又はＤＮＡに依存し得る。この範囲の用量は、過去の試験で成功裏に用いられた（Ｂｒｕｎｓｖｉｇ  Ｐ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；５５（１２）：１５５３−１５６４；Ｍ．Ｓｔａｅｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＣＯ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００７；Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ  ３０１７）。ワクチン又は免疫原性組成物の他の投与方法は当業者に公知である。
【０２７２】
本発明の一実施形態において、異なる腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド及び／又はポリペプチドは、新生物ワクチン又は免疫原性組成物中に使用するために、患者の新生物／腫瘍に対する免疫攻撃が生じる可能性が最大となるように選択される。理論によって拘束されるものではないが、多様な腫瘍特異的ネオ抗原ペプチドを含めると、新生物／腫瘍に対して幅広いスケールの免疫攻撃が生じ得ると考えられる。一実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはミスセンス突然変異によりコードされる。第２の実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはミスセンス突然変異とネオＯＲＦ突然変異との組み合わせによりコードされる。第３の実施形態において、選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドはネオＯＲＦ突然変異によりコードされる。
【０２７３】
選択された腫瘍特異的ネオ抗原ペプチド／ポリペプチドがミスセンス突然変異によりコードされる一実施形態において、ペプチド及び／又はポリペプチドは、患者の特定のＭＨＣ分子と会合するその能力に基づき選択される。ネオＯＲＦ突然変異から誘導されるペプチド／ポリペプチドもまた、患者の特定のＭＨＣ分子と会合するその能力に基づき選択され得るが、また患者の特定のＭＨＣ分子と会合しないと予測される場合であっても選択することができる。
【０２７４】
ワクチン又は免疫原性組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答及び／又は特異的なヘルパーＴ細胞応答を生じさせる能力を有する。
【０２７５】
ワクチン又は免疫原性組成物はアジュバント及び／又は担体をさらに含み得る。有用なアジュバント及び担体の例を本明細書に提供する。組成物中のペプチド及び／又はポリペプチドは、担体、例えば、ペプチドをＴ細胞に提示する能力を有するタンパク質又は例えば樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞と会合することができる。
【０２７６】
アジュバントは、ワクチン又は免疫原性組成物に混合すると突然変異体ペプチドに対する免疫応答が増加するか又は他の形で修飾される任意の物質である。担体は、ネオ抗原ペプチドを会合させることが可能な足場構造、例えばポリペプチド又は多糖である。場合により、アジュバントは本発明のペプチド又はポリペプチドと共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートする。
【０２７７】
抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には免疫介在性応答の顕著な増加、又は疾患症状の低減に現れる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には抗原に対して生じる抗体の力価の顕著な増加に現れ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には細胞増殖、又は細胞傷害性、又はサイトカイン分泌の増加に現れる。アジュバントはまた、例えば、一次体液性応答又はＴｈ２応答を一次細胞性応答又はＴｈ１応答に変化させることにより免疫応答も変え得る。
【０２７８】
好適なアジュバントとしては、限定はされないが、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、Ｊｕｖｌｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰＥＰＴＥＬ．ベクター系、ＰＬＧマイクロパーティクル、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、βグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ社のＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．，米国）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣体、及び他の専売アジュバント、例えば、ＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓが挙げられる。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの製剤が以前記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８−２７；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ａ  Ｃ；Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３−１１）。また、サイトカインを使用してもよい。いくつかのサイトカインが、リンパ組織への樹状細胞遊走に影響を及ぼすこと（例えば、ＴＮＦ−α）、Ｔリンパ球に効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速させること（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１及びＩＬ−４）（米国特許第５，８４９，５８９号明細書（具体的に全体として参照により本明細書に援用される））及び免疫アジュバントとして働くこと（例えば、ＩＬ−１２）と直接関係付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４−４１８）。
【０２７９】
トール様受容体（ＴＬＲ）もまたアジュバントとして使用することができ、これは、「病原体関連分子パターン」（ＰＡＭＰｓ）と称される多くの微生物が共有する保存モチーフを認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ）のファミリーの重要なメンバーである。これらの「危険シグナル」の認識により、自然及び適応免疫系の複数の要素が活性化する。ＴＬＲは、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｔ及びＢ細胞、マスト細胞、及び顆粒球などの自然及び適応免疫系の細胞により発現され、細胞膜、リソソーム、エンドソーム、及びエンドリソソームなどの種々の細胞内コンパートメントに局在する。異なるＴＬＲは別のＰＡＭＰｓを認識する。例えば、ＴＬＲ４は、細菌細胞壁に含まれるＬＰＳによって活性化され、ＴＬＲ９は、非メチル化細菌又はウイルスＣｐＧ  ＤＮＡによって活性化され、及びＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡによって活性化される。ＴＬＲリガンド結合は１つ以上の細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こし、最終的に炎症及び免疫に関連する多くの主要分子（特に転写因子ＮＦ−κＢ及びＩ型インターフェロン）の産生をもたらす。ＴＬＲ介在性ＤＣ活性化は、ＤＣ活性化の増進、食作用、活性化及び共刺激マーカー、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の上方制御、流入領域リンパ節へのＤＣの遊走を可能にし且つＴ細胞に対する抗原提示を促進するＣＣＲ７の発現、並びにＩ型インターフェロン、ＩＬ−１２、及びＩＬ−６などのサイトカインの分泌増加を引き起こす。これらの下流イベントは全て、適応免疫応答の誘導に決定的に重要である。
【０２８０】
現在臨床開発中の最も有望な癌ワクチン又は免疫原性組成物アジュバントの中には、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ及び合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ＴＬＲ３リガンドポリＩＣＬＣがある。前臨床試験では、ポリＩＣＬＣが、ＬＰＳ及びＣｐＧと比較したとき、炎症誘発性サイトカインのその誘導及びＩＬ−１０の刺激の欠如、並びにＤＣｌにおける高レベルの共刺激分子の維持に起因して最も効力のあるＴＬＲアジュバントであるものと見られる。さらに、ポリＩＣＬＣは、最近、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６カプソマーからなるタンパク質ワクチン又は免疫原性組成物のアジュバントとして非ヒト霊長類（アカゲザル）においてＣｐＧと直接比較された（Ｓｔａｈｌ−Ｈｅｎｎｉｇ  Ｃ，Ｅｉｓｅｎｂｌａｔｔｅｒ  Ｍ，Ｊａｓｎｙ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．「合成二本鎖ＲＮＡはアカゲザルにおいてヒトパピローマウイルスに対するＴヘルパー１及び体液性免疫応答を誘導するためのアジュバントである（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ａｒｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）」．ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ａｐｒ  ２００９；５（４））。
【０２８１】
ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン又は免疫原性組成物セッティングでアジュバントの効果を増強することが報告されている。理論によって拘束されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主としてＴＬＲ９を介して自然（非適応）免疫系を活性化させることにより作用する。ＣｐＧにより惹起されたＴＬＲ９活性化は、ペプチド又はタンパク質抗原、生ウイルス又は死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、並びに予防ワクチン及び治療ワクチンの両方の中の多糖コンジュゲートを含めた多様な抗原に対する抗原特異的体液性及び細胞性応答を増強する。さらに重要なことには、これは樹状細胞成熟及び分化を増強し、ＣＤ４  Ｔ細胞ヘルプがない場合であっても、Ｔｈｌ細胞の活性化の増進及び強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴｈｌバイアスは、通常Ｔｈ２バイアスを促進するミョウバン又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバントの存在下であっても維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと共に、又は抗原が比較的弱い場合に強力な応答を誘導するために特に必要な製剤、例えばマイクロパーティクル、ナノ粒子、脂質エマルション又は同様の製剤中にあって製剤化又は共投与されるとき、さらに高いアジュバント活性を示す。ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、免疫応答を加速させ、いくつかの実験におけるＣｐＧを含まない完全用量ワクチンに対する応答と同等の抗体応答で、抗原用量を約２桁低減することも可能にする（Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，Ｊｕｎ．２００６，４７１−４８４）。米国特許第６，４０６，７０５  Ｂ１号明細書は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント及び抗原の併用により抗原特異的免疫応答が誘導されることを記載している。市販のＣｐＧ  ＴＬＲ９アンタゴニストはＭｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ、独国）によるｄＳＬＩＭ（ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｅｍ  Ｌｏｏｐ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ：二重ステムループ免疫調節薬）であり、これは本発明の医薬組成物の好ましい成分である。他のＴＬＲ結合分子、例えば、ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／又はＴＬＲ９もまた用いられ得る。
【０２８２】
有用なアジュバントの他の例としては、限定はされないが、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えばＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えばポリｉ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡ又はＲＮＡ並びに免疫活性小分子及び抗体、例えば、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ（ｓｏｒａｆｉｎｉｂ）、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５が挙げられ、これらは治療的に及び／又はアジュバントとして作用し得る。本発明との関連において有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度は、当業者により必要以上に実験を行うことなく容易に決定され得る。さらなるアジュバントとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子が挙げられる。
【０２８３】
ポリＩＣＬＣは、約５０００ヌクレオチドの平均長さのポリＩ鎖とポリＣ鎖とからなる合成的に調製された二本鎖ＲＮＡであり、ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースを添加することにより熱変性及び血清ヌクレアーゼによる加水分解に対して安定化されている。この化合物は、いずれもＰＡＭＰｓファミリーのメンバーであるＴＬＲ３及びＭＤＡ５のＲＮＡヘリカーゼドメインを活性化し、ＤＣ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化並びにＩ型インターフェロン、サイトカイン、及びケモカインの「天然混合物」の産生を引き起こす。さらには、ポリＩＣＬＣは、２つのＩＦＮ誘導性核酵素系２’５’−ＯＡＳ及びＰ１／ｅＩＦ２ａキナーゼ（ＰＫＲ（４−６）としても知られる）、並びにＲＩＧ−Ｉヘリカーゼ及びＭＤＡ５によって媒介されるより直接的な、広域宿主が標的化される抗感染効果、及び場合により抗腫瘍効果を及ぼす。
【０２８４】
げっ歯類及び非ヒト霊長類において、ポリＩＣＬＣは、ウイルス抗原に対するＴ細胞応答、交差プライミング、並びに腫瘍特異的、ウイルス特異的、及び自己抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を増強することが示された。非ヒト霊長類における最近の研究では、ポリＩＣＬＣは、ＤＣ標的化又は非標的化ＨＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２４タンパク質に対する抗体反応及びＴ細胞免疫の発生に必須であることが分かっており、ワクチンアジュバントとしてのその有効性が強調される。
【０２８５】
ヒト対象では、連続全血試料の転写解析により、ポリＩＣＬＣの１回の単回皮下投与を受けた８人の健常ヒトボランティア間で遺伝子発現プロファイルが同様であり、プラセボを受ける４人の対象に対してこれらの８人の対象間に最大２１２個の遺伝子の発現差異があることが明らかになった。顕著なことに、ポリＩＣＬＣ遺伝子発現データを、極めて有効性の高い黄熱病ワクチンＹＦ１７Ｄで免疫されたボランティアからの先行データと比較すると、多数のカノニカルな転写及びシグナル伝達経路が、自然免疫系のものを含め、同じようにピーク時点で上方制御されたことが示された。
【０２８６】
つい最近、癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の合成オーバーラップロングペプチド（ＯＬＰ）単独によるか又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ−ＩＳＡ−５１との併用、又は１．４ｍｇのポリＩＣＬＣ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅとの併用による皮下ワクチン接種の第１相研究で治療された２回目又は３回目の完全臨床寛解中の卵巣癌、卵管癌、及び原発性腹膜癌患者に関する免疫学的分析が報告された。ポリＩＣＬＣ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅを加えると、ＯＬＰ単独又はＯＬＰ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅと比較してＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の生成及び抗体反応が顕著に増強された。
【０２８７】
本発明に係るワクチン又は免疫原性組成物は２つ以上の異なるアジュバントを含み得る。さらに、本発明は、本明細書に記載のもののいずれかを含めた任意のアジュバント物質を含む治療組成物を包含する。また、ペプチド又はポリペプチドとアジュバントとを任意の適切な順番で別個に投与し得ることも企図される。
【０２８８】
担体は、アジュバントと独立して存在してもよい。担体は抗原に共有結合的に連結されてもよい。担体はまた、担体をコードするＤＮＡを、抗原をコードするＤＮＡとインフレームで挿入することにより、抗原に付加することもできる。担体の機能は、例えば、安定性を付与すること、生物学的活性を増加させること、又は血清中半減期を増加させることであり得る。半減期の延長は、適用回数を減らし、且つ用量を低減する助けとなり得るため、従って治療上の理由、また経済的理由からも有益である。さらに、担体は、Ｔ細胞に対するペプチドの提示を助け得る。担体は、当業者に公知の任意の好適な担体、例えばタンパク質又は抗原提示細胞であってよい。担体タンパク質は、限定はされないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリン又はオボアルブミン、免疫グロブリン、又はホルモン、例えば、インスリン又はパルミチン酸であってもよい。ヒトの免疫化には、担体は、ヒトにとって許容可能且つ安全な生理学的に許容可能な担体であってもよい。しかしながら、破傷風トキソイド及び／又はジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイドが、本発明の一実施形態において好適な担体である。或いは、担体はデキストラン、例えばセファロースであってもよい。
【０２８９】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、インタクトな外来抗原それ自体というよりむしろ、ＭＨＣ分子に結合したペプチドの形態の抗原を認識する。ＭＨＣ分子それ自体は抗原提示細胞の細胞表面に位置する。従って、ＣＴＬの活性化は、ペプチド抗原、ＭＨＣ分子、及びＡＰＣの三量体複合体が存在する場合に限り可能である。それに対応して、ＣＴＬは、ＣＴＬの活性化にペプチドのみが用いられる場合でなく、さらにそれぞれのＭＨＣ分子を有するＡＰＣが加わる場合に免疫応答が増強され得る。従って、一部の実施形態では、本発明に係るワクチン又は免疫原性組成物は少なくとも１つの抗原提示細胞をさらに含有する。
【０２９０】
抗原提示細胞（又は刺激細胞）は、典型的にはその表面上にＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子を有し、一実施形態では、それ自体はＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に選択の抗原を負荷する能力を実質的に有しない。本明細書にさらに詳細に記載するとおり、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子にインビトロで選択の抗原を容易に負荷し得る。
【０２９１】
ＣＤ８＋細胞活性は、ＣＤ４＋細胞を使用して増進させてもよい。多くの免疫ベースの抗癌療法が、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔリンパ球の両方を使用して患者の腫瘍を標的化する場合に有効性が高まり得るため、腫瘍抗原のＣＤ４Ｔ＋細胞エピトープの同定が関心を集めている。ＣＤ４＋細胞はＣＤ８  Ｔ細胞応答を増強する能力を有する。動物モデルにおける多くの研究で、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方が抗腫瘍応答に関与するとき結果が良好になることが明確に実証されている（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）「生体内での腫瘍根絶における抗原特異的Ｔヘルパー１型（ＴＨ１）及びＴｈ２細胞の特徴的な役割（Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １（ＴＨ１）  ａｎｄ  Ｔｈ２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）」．Ｊ  Ｅｘ  Ｍｅｄ  １９０：６１７−２７を参照）。異なる種類の癌に対する治療法の開発に適用可能な普遍的なＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープが同定されている（例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：２２１−２７を参照）。例えば、破傷風トキソイド由来のＨＬＡ−ＤＲ制限ヘルパーペプチドをメラノーマワクチンに使用したところ、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が非特異的に活性化された（例えば、Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）「アジュバントセッティングにおけるメラノーマに対する２つの多ペプチドワクチンの無作為化第ＩＩ相試験の免疫学的及び臨床的結果（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍｕｌｔｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｅｔｔｉｎｇ）」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（２１）：６３８６−９５を参照）。本発明の範囲内で、かかるＣＤ４＋細胞は、その腫瘍特異性が異なる３つのレベルで適用可能であり得ることが企図される：１）普遍的ＣＤ４＋エピトープ（例えば、破傷風トキソイド）を使用してＣＤ８＋細胞を増進し得る広域レベル；２）天然の腫瘍関連ＣＤ４＋エピトープを使用してＣＤ８＋細胞を増進し得る中間的レベル；及び３）ネオ抗原ＣＤ４＋エピトープを使用してＣＤ８＋細胞を患者特異的に増進し得る患者特異的レベル。
【０２９２】
ＣＤ８＋細胞免疫はまた、ネオ抗原を負荷した樹状細胞（ＤＣ）ワクチンによっても生じさせ得る。ＤＣはＴ細胞免疫を惹起する強力な抗原提示細胞であり、目的の１つ以上のペプチドを例えば直接的なペプチド注射によって負荷すると、癌ワクチンとして使用することができる。例えば、新しく転移性メラノーマと診断された患者が、３つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１限定ｇｐ１００メラノーマ抗原由来ペプチドに対し、ＩＬ−１２ｐ７０産生患者ＤＣワクチンを用いて、自己ペプチドでパルスしたＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ−ｇ活性化成熟ＤＣにより免疫化されることが示された（例えば、Ｃａｒｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）「Ｌ−１２ｐ７０産生患者ＤＣワクチンはＴｃ１分極免疫を誘発する（Ｌ−１２ｐ７０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔ  ＤＣ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｌｉｃｉｔｓ  Ｔｃ１−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２３（８）：３３８３−９４及びＡｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「ＤＣサブセット及びＴ細胞のインサイチュ調節がマウスにおいて腫瘍退縮を媒介する（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＣ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１（８）：１−１０を参照）。本発明の範囲内で、ネオ抗原を負荷したＤＣは、合成ＴＬＲ３アゴニストのポリイノシン・ポリシチジン酸−ポリ−Ｌ−リジンカルボキシメチルセルロース（ポリＩＣＬＣ）を使用してＤＣを刺激することで調製され得ることが企図される。ポリＩＣＬＣは、ＣＤ８３及びＣＤ８６の上方調節、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、及びＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の誘導、及び最小限のインターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生によって評価するとき、ヒトＤＣに対する強力な個別的成熟刺激である。ＤＣは、白血球アフェレーシスによって得られる凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分化させることができ、一方ＰＢＭＣはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心法によって単離し、アリコートで凍結し得る。
【０２９３】
例示として、以下の７日間活性化プロトコルを使用し得る。１日目−ＰＢＭＣを解凍して組織培養フラスコにプレーティングし、組織培養インキュベーターにおいて３７℃で１〜２時間インキュベートした後、プラスチック表面に接着する単球を選択する。インキュベーション後、リンパ球を洗い流し、接着した単球をインターロイキン−４（ＩＬ−４）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で５日間培養して未熟ＤＣに分化させる。６日目、未熟ＤＣを、ワクチンの品質に関する対照として働き、且つワクチンの免疫原性をブーストし得るキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質でパルスする。ＤＣは刺激されると成熟し、それにペプチド抗原を負荷して一晩インキュベートする。７日目、細胞を洗浄し、４〜２０×１０（６）個の細胞を含む１ｍｌアリコートで速度制御フリーザーを使用して凍結する。ＤＣを患者に注入する前に、最小限の規格に適合するようにＤＣのバッチに対するロット出荷試験を実施し得る（例えば、Ｓａｂａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）「免疫療法のための腫瘍抗原を負荷した成熟樹状細胞の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｊ．Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．Ａｕｇ  １；（７８）．ｄｏｉ：１０．３７９１／５００８５を参照）。
【０２９４】
ＤＣワクチンを足場システムに組み込み、患者への送達を促進し得る。ＤＣワクチンによる患者の新生物の治療的処置は生体材料システムを利用することができ、これが装置内に宿主樹状細胞を動員する因子を放出し、抗原が放出される間にアジュバント（例えば、危険シグナル）を局所的に提示することにより常在性の未熟ＤＣを分化させ、且つ活性化された抗原負荷ＤＣのリンパ節（又は所望の作用部位）への放出を促進し、そこでＤＣがＴ細胞と相互作用して、癌ネオ抗原に対する強力な細胞傷害性Ｔリンパ球応答が生じ得る。植込み型生体材料を使用して、新生物に対する強力な細胞傷害性Ｔリンパ球応答を患者特異的に生じさせてもよい。次にこの生体材料常在性樹状細胞が、生体材料からの抗原の放出に合わせて、感染を模倣する危険シグナルへの曝露により活性化され得る。活性化された樹状細胞は、次に生体材料からリンパ節に遊走し、細胞傷害性Ｔエフェクター応答を誘導する。この手法は、以前、腫瘍生検から調製したライセートを使用した前臨床試験において樹立メラノーマの退縮を引き起こすことが実証されており（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２２０９）「ＤＣサブセット及びＴ細胞のインサイチュ調節がマウスにおいて腫瘍退縮を媒介する（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＣ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １（８）：１−１０；Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）「インサイチュで樹状細胞をプログラムする感染模倣材料（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）」．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  ８：１５１−８）、かかるワクチンは現在、ダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で最近開始された第Ｉ相臨床試験で試験されているところである。現在の提言では、この手法はまた、Ｃ６ラット神経膠腫モデルを使用して２４、膠芽腫の退縮、並びに再燃を予防する強力な記憶応答の誘導をもたらすことも示されている。かかる植込み型のバイオマトリックスワクチンデリバリー足場が腫瘍特異的樹状細胞活性化を増幅し及び維持する能力は、従来の皮下又は節内ワクチン投与により達成され得るものと比べてよりロバストな抗腫瘍免疫感作をもたらし得る。
【０２９５】
好ましくは、抗原提示細胞は樹状細胞である。好適には、樹状細胞は、ネオ抗原ペプチドでパルスした自己樹状細胞である。このペプチドは、適切なＴ細胞応答を生じさせる任意の好適なペプチドであってもよい。腫瘍関連抗原由来のペプチドでパルスした自己樹状細胞を使用するＴ細胞療法が、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９，３７１−３８０及びＴｊｕａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３２，２７２−２７８に開示されている。
【０２９６】
従って、本発明の一実施形態では、少なくとも１つの抗原提示細胞を含有するワクチン又は免疫原性組成物が本発明の１つ以上のペプチドでパルスされるか又はそれを負荷される。或いは、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）がエキソビボでペプチドを負荷され、患者に注入し戻されてもよい。代替例として、抗原提示細胞が、本発明のペプチドをコードする発現コンストラクトを含む。ポリヌクレオチドは任意の好適なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞を形質導入する能力を有し、従ってペプチドの提示及び免疫の誘導をもたらすことが好ましい。
【０２９７】
本発明の医薬組成物は、組成物中に存在するペプチドの選択、数及び／又は量が組織、癌、及び／又は患者特異的となるように作ることができる。例えば、ペプチドの正確な選択は、副作用を回避するように所与の組織における親タンパク質の発現パターンを指針とし得る。選択は、癌の具体的なタイプ、疾患の状態、以前の治療レジメン、患者の免疫状態、及び当然ながら、患者のＨＬＡ−ハプロタイプに依存し得る。さらに、本発明に係るワクチン又は免疫原性組成物は、特定の患者の個人的な必要性に従い、個人に合わせた成分を含有し得る。例として、特定の患者における関連するネオ抗原の発現、個人的なアレルギー又は他の治療に起因する望ましくない副作用、及び初回治療ラウンド又はスキーム後の二次治療の調整に従いペプチドの量を変えることが挙げられる。
【０２９８】
本発明のペプチドを含む医薬組成物は、既に癌に罹患している個体に投与され得る。治療上の適用では、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発し且つ症状及び／又は合併症を治癒し又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この用途に有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与方法、治療される疾患の病期及び重症度、患者の体重及び全般的な健康状態、並びに処方医師の判断に依存し得るが、概して（治療的又は予防的投与のための）初回免疫化について、７０ｋｇの患者に対し約１．０μｇ〜約５０，０００μｇのペプチドの範囲であり、ブースト投薬量が続き、又は約１．０μｇ〜約１０，０００μｇのペプチドの範囲であり、患者の反応及び状態に応じて、及び場合により患者の血中の特定のＣＴＬ活性を計測することにより、数週間乃至数ヶ月間にわたりブーストレジメンが続く。本発明のペプチド及び組成物は、概して重篤な病状、即ち生命を脅かす又は潜在的に生命を脅かす状況、特に癌が転移している場合に用いられ得ることに留意しなければならない。治療用途では、腫瘍の検出又は外科的切除後可能な限り早期に投与を開始しなければならない。この後、少なくとも症状が実質的に寛解するまで、及びその後の期間にわたり、ブースト用量が続く。
【０２９９】
治療処置用の医薬組成物（例えば、ワクチン組成物）は、非経口、局所、経鼻、経口又は局所投与用であることが意図される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内に投与される。組成物は、腫瘍に対する局所的免疫応答を誘導するため外科的切除部位に投与されてもよい。本発明は、ペプチドの溶液を含む非経口投与用の組成物を提供し、ワクチン又は免疫原性組成物は、許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁される。種々の水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用し得る。これらの組成物は、従来の周知されている滅菌技法により滅菌され得るか、又は滅菌ろ過され得る。得られた水溶液はそのまま使用するために包装されるか、又は凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液と組み合わされる。組成物は、生理学的条件を近似するため必要に応じて薬学的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有し得る。
【０３００】
ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与方法、送達されるペプチド、及び治療される疾患ステージにより異なる用量で、静脈内投与、局所（ｌｏｃａｌｌｙ）投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）投与等され得る。免疫細胞に標的化するため、リガンド、例えば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はその断片などをリポソームに組み込むことができる。
【０３０１】
固体組成物には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の又はナノ粒子の非毒性固体担体を使用することができる。経口投与に関して、薬学的に許容可能な非毒性組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば既に列挙した担体のいずれか、及び略１０〜９５％の活性成分、即ち本発明の１つ以上のペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で添合することにより形成される。
【０３０２】
エアロゾル投与には、免疫原性ペプチドは好ましくは界面活性剤及び噴射剤と共に微粉化した形態で提供される。ペプチドの典型的な割合は重量単位で０．０１％〜２０％、好ましくは１％〜１０％である。界面活性剤は当然ながら非毒性であり、好ましくは噴射剤に対して可溶性であり得る。かかる薬剤の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）及びオレイン酸などと脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルである。混合エステル、例えば混合又は天然グリセリドが用いられてもよい。界面活性剤は重量単位で組成物の０．１％〜２０％、好ましくは０．２５〜５％を占め得る。組成物の残りは通常の噴射剤である。例えば鼻腔内送達に対するレシチンのように、担体もまた必要に応じて含まれ得る。
【０３０３】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、細菌又は動物性物質を含有しない試薬を利用して容易に化学的に合成することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）。
【０３０４】
本発明のペプチド及びポリペプチドはまた、ベクター、例えば、本明細書において考察するとおりの核酸分子、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター、例えばポックスウイルス、例えば、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、又はアデノウイルス、ＡＡＶ又はレンチウイルスによって発現させてもよい。この手法には、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターの使用が関わる。急性的若しくは慢性的に感染させた宿主又は非感染宿主に導入すると、ベクターが免疫原性ペプチドを発現し、従って宿主ＣＴＬ応答を誘発する。
【０３０５】
治療又は免疫化のため、本発明のペプチドをコードする核酸及び任意選択で本明細書に記載されるペプチドの１つ以上を患者に投与することもできる。核酸を患者に送達するため、多くの方法が好都合に用いられている。例えば、核酸は「ネイキッドＤＮＡ」として直接送達することができる。この手法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）並びに米国特許第５，５８０，８５９号明細書及び同第５，５８９，４６６号明細書に記載されている。核酸はまた、例えば米国特許第５，２０４，２５３号明細書に記載されるとおりのバリスティックデリバリーを用いて投与されてもよい。ＤＮＡ単独で構成される粒子が投与されてもよい。或いは、ＤＮＡは、金粒子などの粒子に接着させてもよい。概して、ワクチン又は免疫学的組成物のプラスミドは、宿主細胞、例えば哺乳類細胞からの抗原の発現又は発現及び分泌を制御する調節配列に作動可能に連結された抗原（例えば、１つ以上のネオ抗原）をコードするＤＮＡを含むことができる；例えば、上流から下流に、プロモーター、例えば哺乳類ウイルスプロモーター（例えば、ｈＣＭＶ又はｍＣＭＶプロモーターなどのＣＭＶプロモーター、例えば初期中間プロモーター、又はＳＶ４０プロモーター−有用なプロモーターについては本明細書に引用又は援用される文書を参照）のＤＮＡ、分泌のための真核生物リーダーペプチドのＤＮＡ（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子）、１つ又は複数のネオ抗原のＤＮＡ、及びターミネーターをコードするＤＮＡ（例えば、ウシ成長ホルモン即ちｂＧＨポリＡをコードする遺伝子由来の３’ＵＴＲ転写ターミネーター）。組成物は２つ以上のプラスミド又はベクターを含むことができ、従って各ベクターが異なるネオ抗原を含み、及びそれを発現する。また、そのテキストが有用であり得るＷａｓｍｏｅｎの米国特許第５，８４９，３０３号明細書、及びＤａｌｅの米国特許第５，８１１，１０４号明細書も言及される。ＤＮＡ又はＤＮＡプラスミド製剤は、カチオン性脂質と共に、又はその中に製剤化することができる；及び、カチオン性脂質、並びにアジュバントに関しては、Ｌｏｏｓｍｏｒｅの米国特許出願公開第２００３／０１０４００８号明細書もまた言及される。また、インビボで含み及び発現するＤＮＡプラスミドの構築及び使用において用いることのできるＤＮＡプラスミドの教示に関して、Ａｕｄｏｎｎｅｔの米国特許第６，２２８，８４６号明細書及び同第６，１５９，４７７号明細書における教示も頼ることができる。
【０３０６】
また、カチオン性化合物、例えばカチオン性脂質に複合体化した核酸を送達することもできる。脂質媒介性遺伝子デリバリー方法が、例えば、国際公開第１９９６／１８３７２号パンフレット；国際公開第１９９３／２４６４０号パンフレット；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２−６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号明細書；国際公開第１９９１／０６３０９号パンフレット；及びＦｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１４（１９８７）に記載されている。
【０３０７】
目的のペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）もまた送達に使用することができる（例えば、Ｋｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１を参照；また、米国特許第８２７８０３６号明細書；Ｈａｌａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ（２００３）２１：１２３２−１２３７；Ｐｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  Ｄｅｃ  ７；３０（１２）：１２１０−６も参照）。
【０３０８】
本発明の実施において使用し得るポックスウイルス、例えば、とりわけ、チョルドポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）ポックスウイルス（脊椎動物のポックスウイルス）、例えば、オルソポックスウイルス及びアビポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス（例えば、ワイス株、ＷＲ株（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１３５４）、コペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ＢＮ）、カナリア痘ウイルス（例えば、ホイートリーＣ９３株、ＡＬＶＡＣ）、鶏痘ウイルス（例えば、ＦＰ９株、ウェブスター株、ＴＲＯＶＡＣ）、鳩痘（ｄｏｖｅｐｏｘ）、鳩痘（ｐｉｇｅｏｎｐｏｘ）、ウズラ痘、及びアライグマ痘、その合成の又は天然に存在しない組換え体、その使用、並びにかかる組換え体の作製及び使用方法に関する情報は、以下などの科学文献及び特許文献に見出され得る：
・米国特許第４，６０３，１１２号明細書、同４，７６９，３３０号明細書、同５，１１０，５８７号明細書、同５，１７４，９９３号明細書、同５，３６４，７７３号明細書、同５，７６２，９３８号明細書、同５，４９４，８０７号明細書、同５，７６６，５９７号明細書、同７，７６７，４４９号明細書、同６，７８０，４０７号明細書、同６，５３７，５９４号明細書、同６，２６５，１８９号明細書、同６，２１４，３５３号明細書、同６，１３０，０６６号明細書、同６，００４，７７７号明細書、同５，９９０，０９１号明細書、同５，９４２，２３５号明細書、同５，８３３，９７５号明細書、同５，７６６，５９７号明細書、同５，７５６，１０１号明細書、同７，０４５，３１３号明細書、同６，７８０，４１７号明細書、同８，４７０，５９８号明細書、同８，３７２，６２２号明細書、同８，２６８，３２９号明細書、同８，２６８，３２５号明細書、同８，２３６，５６０号明細書、同８，１６３，２９３号明細書、同７，９６４，３９８号明細書、同７，９６４，３９６号明細書、同７，９６４，３９５号明細書、同７，９３９，０８６号明細書、同７，９２３，０１７号明細書、同７，８９７，１５６号明細書、同７，８９２，５３３号明細書、同７，６２８，９８０号明細書、同７，４５９，２７０号明細書、同７，４４５，９２４号明細書、同７，３８４，６４４号明細書、同７，３３５，３６４号明細書、同７，１８９，５３６号明細書、同７，０９７，８４２号明細書、同６，９１３，７５２号明細書、同６，７６１，８９３号明細書、同６，６８２，７４３号明細書、同５，７７０，２１２号明細書、同５，７６６，８８２号明細書、及び同５，９８９，５６２号明細書、並びに
・Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８２；７９；４９２７−４９３，Ｐａｎｉｃａｌｉ  Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８３；８０（１７）：５３６４−８，Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８２；７９：７４１５−７４１９，Ｓｍｉｔｈ  ＧＬ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８３；８０（２３）：７１５５−９，Ｓｍｉｔｈ  ＧＬ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８３；３０２：４９０−５，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＶＪ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．１９８７；６８：２５８７−９８，Ｐｅｒｋｕｓ  Ｍ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；５８：１−１３，Ｙｉｌｍａ  ＴＤ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９８９；７：４８４−４８５，Ｂｒｏｃｈｉｅｒ  Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５４：５２０−２２，Ｗｉｋｔｏｒ，ＴＪ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃｄ．Ｓｃｉ．１９８４；８１：７１９４−８，Ｒｕｐｐｒｅｃｈｔ，ＣＥ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃｄ．Ｓｃｉ．１９８６；８３：７９４７−５０，Ｐｏｕｌｅｔ，Ｈ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７；２５（Ｊｕｌ）：５６０６−１２，Ｗｅｙｅｒ  Ｊ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００９；２７（Ｎｏｖ）：７１９８−２０１，Ｂｕｌｌｅｒ，ＲＭ  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；３１７（６０４０）：８１３−５，Ｂｕｌｌｅｒ  ＲＭ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８８；６２（３）：８６６−７４，Ｆｌｅｘｎｅｒ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ  １９８７；３３０（６１４５）：２５９−６２，  Ｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８８；６２（１２）：４４７４−８０，Ｋｏｔｗａｌ，ＧＪ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８９；６３（２）：６００−６，Ｃｈｉｌｄ，ＳＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９０；１７４（２）：６２５−９，Ｍａｙｒ  Ａ．Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ  １９７８；１６７（５，６）：３７５−９，Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｇ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８；２４４（２）：３６５−９６，Ｗｙａｔｔ，ＬＳ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８；２５１（２）：３３４−４２，Ｓａｎｃｈｏ，ＭＣ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６（１６）；８３１３−３４，Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｇｏｍｅｚ，ＪＣ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７（１９）；１０６０６−２２），Ｇｏｅｂｅｌ  ＳＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９０；（ａ，ｂ）  １７９：２４７−６６，Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２；１８８（１）：２１７−３２，Ｎａｊｅｒａ  ＪＬ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０（１２）：６０３３−４７，Ｎａｊｅｒａ，ＪＬ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０：６０３３−６０４７，Ｇｏｍｅｚ，ＣＥ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８８：２４７３−７８，Ｍｏｏｉｊ，Ｐ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：２９７５−２９８８，Ｇｏｍｅｚ，ＣＥ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１；１１：１８９−２１７，Ｃｏｘ，Ｗ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９３；１９５：８４５−５０，Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；５８：１−１３，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  ＴＪ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８；７９（５）：１１５９−６７，Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ���００１；２９２：６９−７４，  Ｈｅｌ，Ｚ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７：７１８０−９，Ｇｈｅｒａｒｄｉ  ＭＭ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７：７０４８−５７，Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００４；２２：３３９５−３４０３，  Ｂｉｓｓｈｔ  Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．２００４；１０１：６６４１−４６，ＭｃＣｕｒｄｙ  ＬＨ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ  ２００４；３８：１７４９−５３，Ｅａｒｌ  ＰＬ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００４；４２８：１８２−８５，Ｃｈｅｎ  Ｚ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：２６７８−２６８８，Ｎａｊｅｒａ  ＪＬ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０（１２）：６０３３−４７，Ｎａｍ  ＪＨ．Ａｃｔａ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；５１：１２５−３０，Ａｎｔｏｎｉｓ  ＡＦ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７；２５：４８１８−４８２７，Ｂ  Ｗｅｙｅｒ  Ｊ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７；２５：４２１３−２２，Ｆｅｒｒｉｅｒ−Ｒｅｍｂｅｒｔ  Ａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００８；２６（１４）：１７９４−８０４，Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８；１０５（６）：２０４６−５１，Ｋａｕｆｍａｎ  ＨＬ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００４；２２：２１２２−３２，Ａｍａｔｏ，ＲＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；１４（２２）：７５０４−１０，Ｄｒｅｉｃｅｒ  Ｒ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２００９；２７（４）：３７９−８６，Ｋａｎｔｏｆｆ  ＰＷ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１０，２８，１０９９−１１０５，Ａｍａｔｏ  ＲＪ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．２０１０；１６（２２）：５５３９−４７，Ｋｉｍ，ＤＷ．Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１０；６：７８４−７９１，Ｏｕｄａｒｄ，Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１；６０：２６１−７１，Ｗｙａｔｔ，ＬＳ．Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．２００４；２０：６４５−５３，Ｇｏｍｅｚ，ＣＥ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４；１０５：１１−２２，Ｗｅｂｓｔｅｒ，ＤＰ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００５；１０２：４８３６−４，Ｈｕａｎｇ，Ｘ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７；２５：８８７４−８４，Ｇｏｍｅｚ，ＣＥ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７ａ；２５：２８６３−８５，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｍ．Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００９；５：８６７−８７１，Ｇｏｍｅｚ，ＣＥ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８；８（２）：９７−１２０，Ｗｈｅｌａｎ，ＫＴ．Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ  ２００９；４（６）：５９３４，Ｓｃｒｉｂａ，ＴＪ．Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏ．２０１０；４０（１）：２７９−９０，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８；１０５：２０４６−２０５１，Ｍｉｄｇｌｅｙ，ＣＭ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８９：２９９２−９７，Ｖｏｎ  Ｋｒｅｍｐｅｌｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１０；２８：１２０９−１６，Ｐｅｒｒｅａｕ，Ｍ．Ｊ．Ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．２０１１；Ｏｃｔ：９８５４−６２，Ｐａｎｔａｌｅｏ，Ｇ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  ＨＩＶ−ＡＩＤＳ．２０１０；５：３９１−３９６，
（この各々が参照により本明細書に援用される）。
【０３０９】
本発明の実施において有用なアデノウイルスベクターに関しては、米国特許第６，９５５，８０８号明細書が言及される。使用されるアデノウイルスベクターは、Ａｄ５、Ａｄ３５、Ａｄ１１、Ｃ６、及びＣ７ベクターからなる群から選択することができる。アデノウイルス５（「Ａｄ５」）ゲノムの配列は公開されている（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．，Ｂｉｅｂｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｊａｃｒｏｔ，Ｂ．（１９９２）「アデノウイルス５型のゲノムの配列及びアデノウイルス２型のゲノムとのその比較（Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  ２）」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６，２８０−２８５；その内容は本明細書によって参照により援用される）。Ａｄ３５ベクターは、米国特許第６，９７４，６９５号明細書、同第６，９１３，９２２号明細書、及び同第６，８６９，７９４号明細書に記載される。Ａｄ１１ベクターは、米国特許第６，９１３，９２２号明細書に記載される。Ｃ６アデノウイルスベクターは、米国特許第６，７８０，４０７号明細書；同第６，５３７，５９４号明細書；同第６，３０９，６４７号明細書；同第６，２６５，１８９号明細書；同第６，１５６，５６７号明細書；同第６，０９０，３９３号明細書；同第５，９４２，２３５号明細書及び同第５，８３３，９７５号明細書に記載される。Ｃ７ベクターは、米国特許第６，２７７，５５８号明細書に記載される。Ｅ１欠損又は欠失、Ｅ３欠損又は欠失、及び／又はＥ４欠損又は欠失のアデノウイルスベクターもまた用いられ得る。Ｅ１欠損アデノウイルス突然変異体は非許容細胞において複製欠損であるか、或いはごく最低限でも高度に弱毒化されているため、Ｅ１領域に突然変異を有する特定のアデノウイルスは安全性マージンが改善されている。Ｅ３領域に突然変異を有するアデノウイルスは、アデノウイルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方調節する機構の破壊によって免疫原性が増強されている。Ｅ４突然変異を有するアデノウイルスは、後期遺伝子発現の抑制に起因して低いアデノウイルスベクターの免疫原性を有し得る。かかるベクターは、同じベクターを利用した反復的な再ワクチン接種が所望される場合に特に有用であり得る。本発明においては、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ１及びＥ３、及びＥ１及びＥ４が欠失した又は突然変異したアデノウイルスベクターを使用することができる。さらに、全てのウイルス遺伝子が欠失されている「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターもまた、本発明において使用することができる。かかるベクターは、その複製にヘルパーウイルスを必要とし、且つ天然の環境には存在しない条件であるＥ１ａ及びＣｒｅの両方を発現する特定のヒト２９３細胞株を必要とする。かかる「ガットレス」ベクターは非免疫原性であり、従ってこのベクターは再ワクチン接種のため複数回接種し得る。「ガットレス」アデノウイルスベクターは、本発明のトランス遺伝子などの異種インサート／遺伝子の挿入に使用することができ、さらには、多数の異種インサート／遺伝子の共送達に使用することができる。
【０３１０】
本発明の実施において有用なレンチウイルスベクター系に関しては、米国特許第６４２８９５３号明細書、同第６１６５７８２号明細書、同第６０１３５１６号明細書、同第５９９４１３６号明細書、同第６３１２６８２号明細書、及び同第７，１９８，７８４号明細書、及びそれらの中の引用文献が言及される。
【０３１１】
本発明の実施において有用なＡＡＶベクターに関しては、米国特許第５６５８７８５号明細書、同第７１１５３９１号明細書、同第７１７２８９３号明細書、同第６９５３６９０号明細書、同第６９３６４６６号明細書、同第６９２４１２８号明細書、同第６８９３８６５号明細書、同第６７９３９２６号明細書、同第６５３７５４０号明細書、同第６４７５７６９号明細書及び同第６２５８５９５号明細書、及びそれらの中の引用文献が言及される。
【０３１２】
別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載される。本発明のペプチドの治療的投与又は免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクターなどが、本明細書の記載から当業者には明らかである。
【０３１３】
ベクターは、抗原投与によって誘発される用量及び／又は応答と同様のインビボ発現及び応答を有するように共投与することができる。
【０３１４】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段では、複数のエピトープをコードするミニ遺伝子コンストラクトが用いられる。ヒト細胞での発現用に選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作成するため、エピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。各アミノ酸のコドン選択の指針とするためヒトコドン使用頻度表を使用する。エピトープをコードするこれらのＤＮＡ配列は直接隣接しており、連続的なポリペプチド配列を作り出す。発現及び／又は免疫原性を最適化するため、ミニ遺伝子設計にさらなるエレメントを組み込んでもよい。逆翻訳され、且つミニ遺伝子配列に含めることのできるアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴリンパ球、エピトープ、リーダー（シグナル）配列、及び小胞体保留シグナル。加えて、ＣＴＬエピトープに隣接する合成の（例えばポリアラニン）又は天然に存在するフランキング配列を含めることにより、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示を向上させ得る。
【０３１５】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによりＤＮＡに変換される。オーバーラップオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知の技法を用いて適切な条件下で合成され、リン酸化され、精製され及びアニールされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してつなぎ合わされる。ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、次に所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【０３１６】
標的細胞における発現を確実にするため、当業者に周知の標準的な調節配列がベクターに含められる。いくつかのベクターエレメントが必要である：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を含むプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点；及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択可能マーカー（例えばアンピシリン又はカナマイシン耐性）。この目的のため数多くのプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。他の好適なプロモーター配列に関しては、米国特許第５，５８０，８５９号明細書及び同第５，５８９，４６６号明細書を参照のこと。
【０３１７】
ミニ遺伝子発現及び免疫原性を最適化するため、さらなるベクター修飾が望ましいこともある。ある場合には、効率的な遺伝子発現のためイントロンが必要であり、１つ以上の合成の又は天然に存在するイントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ミニ遺伝子発現を増加させるため、ｍＲＮＡ安定化配列を含めることもまた考えられ得る。最近、免疫刺激配列（ＩＳＳ又はＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすことが提唱されている。これらの配列は、免疫原性を増強させることが見出された場合には、ベクター中、ミニ遺伝子コード配列の外側に含められ得る。
【０３１８】
一部の実施形態では、ミニ遺伝子によりコードされるエピトープと、免疫原性を増強又は低下させるために含められる第２のタンパク質との産生を可能にするバイシストロニック発現ベクターを使用することができる。有利には共発現した場合に免疫応答を増強し得るタンパク質又はポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えばＬｅＩＦ）又は副刺激分子が含まれる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルにつなぎ合わせ、ＣＴＬエピトープと別個に発現させてもよい。これは、ＣＴＬエピトープと異なる細胞コンパートメントへのＨＴＬエピトープの誘導を可能にし得る。必要であれば、これはＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な侵入、従ってＣＴＬ誘導の向上を促進し得る。ＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ−β）の共発現により免疫応答を特に低下させることが、特定の疾患においては有益であり得る。
【０３１９】
発現ベクターが選択された後、ミニ遺伝子はプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換され、標準的な技法を用いてＤＮＡが調製される。ミニ遺伝子並びにベクター中に含まれる他の全てのエレメントの向き及びＤＮＡ配列は、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列解析を用いて確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞をマスターセルバンク及びワーキングセルバンクとして保存することができる。
【０３２０】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の製剤を使用して注射用に調製することができる。それらのうち最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥ＤＮＡの再構成である。種々方法が記載されており、新技術が利用可能になり得る。本明細書に記載のとおり、核酸は好都合にはカチオン性脂質と製剤化される。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド及び保護性相互作用性非縮合性（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ，ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ：ＰＩＮＣ）と総称される化合物を複合体化してプラスミドＤＮＡを精製し、安定性、筋内分散、又は特定の臓器若しくは細胞型への輸送などの変数に影響を与えることもできる。
【０３２１】
標的細胞感作を、ミニ遺伝子によりコードされるＣＴＬエピトープの発現及びＭＨＣクラスＩ提示に関する機能アッセイとして用いることができる。プラスミドＤＮＡが、標準的なＣＴＬクロム遊離アッセイの標的として好適な哺乳類細胞系に導入される。使用されるトランスフェクション方法は最終的な製剤に依存する。「ネイキッド」ＤＮＡには電気穿孔が使用されてもよく、一方、カチオン性脂質は直接的なインビトロトランスフェクションを可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドをコトランスフェクトして、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いたトランスフェクト細胞のエンリッチメントを可能にし得る。これらの細胞は、次にクロム−５１標識され、エピトープ特異的ＣＴＬ系の標的細胞として用いられる。５１  Ｃｒ遊離によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子によりコードされるＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示が生じたことを示す。
【０３２２】
生体内免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能を試験する第２の手法である。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスをＤＮＡ製剤で免疫する。用量及び投与経路は製剤に依存する（例えばＰＢＳ中ＤＮＡにはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡにはＩＰ）。免疫化の２１日後、脾細胞を回収し、各被験エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間にわたり再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）を、ペプチドが負荷されたクロム−５１標識標的細胞の細胞溶解に関して標準的な技法を用いてアッセイする。ミニ遺伝子によりコードされるエピトープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷により感作された標的細胞の溶解が、ＣＴＬの生体内誘導に関するＤＮＡワクチン機能を実証する。
【０３２３】
ペプチドは、エキソビボでＣＴＬを誘発するためにも用いられ得る。得られたＣＴＬを使用して、他の従来型の治療法に応答しないか又はペプチドワクチン治療手法に応答しない、それを必要とする患者の慢性腫瘍を治療することができる。特定の腫瘍抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答は、組織培養で患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）供給源及び適切なペプチドと共にインキュベートすることにより誘導される。適切なインキュベーション時間（典型的には１〜４週間）の間にＣＴＬｐが活性化され、エフェクターＣＴＬに成熟して拡大した後、細胞が患者に注入し戻され、そこでそれらがその特異的標的細胞（即ち、腫瘍細胞）を破壊する。特定の細胞傷害性Ｔ細胞の生成にインビトロ条件を最適化するため、刺激細胞の培養物は適切な無血清培地中に維持される。
【０３２４】
活性させる細胞、例えば前駆ＣＤ８＋細胞と刺激細胞をインキュベートする前、刺激細胞の表面上で発現するヒトクラスＩ分子に負荷された状態となるのに十分な分量の、ある量の抗原ペプチドが刺激細胞培養物に加えられる。本発明では、ペプチドの十分な量とは、ペプチドが負荷された約２００個、及び好ましくは２００個以上のヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子を各刺激細胞の表面上で発現させることが可能な量である。好ましくは、刺激細胞は、＞２μｇ／ｍｌのペプチドとインキュベートされる。例えば、刺激細胞は、＞３、４、５、１０、１５μｇ／ｍｌ、又はそれ以上のペプチドとインキュベートされる。
【０３２５】
次に静止細胞又は前駆ＣＤ８＋細胞は、培養下で、ＣＤ８＋細胞を活性化するのに十分な期間にわたり適切な刺激細胞と共にインキュベートされる。好ましくは、ＣＤ８＋細胞は抗原特異的様式で活性化される。静止細胞又は前駆ＣＤ８＋（エフェクター）細胞と刺激細胞との比は個体毎に異なり得るとともに、さらに、培養条件に対する個体のリンパ球の従順さ並びに疾患状態の性質及び重症度又は記載の範囲内の治療様式が用いられる他の条件などの変数に依存し得る。しかしながら、好ましくは、リンパ球：刺激細胞比は約３０：１〜３００：１の範囲である。エフェクター／刺激培養物は、治療上使用可能な又は有効な数のＣＤ８＋細胞を刺激するのに必要な時間にわたり維持され得る。
【０３２６】
インビトロでのＣＴＬ誘導には、ＡＰＣ上の対立遺伝子特異的ＭＨＣクラスＩ分子に結合しているペプチドの特異的認識が必要である。ＣＴＬの、特に一次免疫応答における刺激には、ＡＰＣ当たりの特異的ＭＨＣ／ペプチド複合体の数が決定的に重要である。細胞当たりのペプチド／ＭＨＣ複合体は少量であっても、ＣＴＬによる溶解を受け易い細胞にしたり、又は二次ＣＴＬ応答を刺激したりするには十分であるが、一次応答中のＣＴＬ前駆体（ｐＣＴＬ）の活性化を成功させるには、大幅に多い数のＭＨＣ／ペプチド複合体が必要である。細胞上の空の主要組織適合性複合体分子にペプチドを負荷することにより、一次細胞傷害性Ｔリンパ球応答の誘導が可能となる。
【０３２７】
ヒトＭＨＣ対立遺伝子毎に変異細胞系が存在するわけではないため、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ関連ペプチドを取り除き、次に得られた空のＭＨＣ分子に目的の免疫原性ペプチドを負荷する技法を用いることが有利である。形質転換されていない（非腫瘍形成性の）非感染細胞、好ましくは患者の自己細胞をＡＰＣとして使用することが、エキソビボＣＴＬ療法の開発に向けたＣＴＬ誘導プロトコルの設計に望ましい。本願は、ＡＰＣの表面から内因性ＭＨＣ関連ペプチドをストリッピングし、続いて所望のペプチドを負荷する方法を開示する。
【０３２８】
安定したＭＨＣクラスＩ分子は、以下のエレメントで形成される三量体複合体である：１）通常８〜１０残基のペプチド、２）そのａｌ及びａ２ドメインにペプチド結合部位を有する膜貫通重鎖多型タンパク質鎖、及び３）非共有結合的に会合した非多型軽鎖、ｐ２ミクログロブリン（ｐ２ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｉｉｎ）。複合体から結合したペプチドを取り除き及び／又はｐ２ミクログロブリンを解離させるとＭＨＣクラスＩ分子が非機能性になって不安定化し、急速な分解がもたらされる。ＰＢＭＣから単離される全てのＭＨＣクラスＩ分子が、それらに結合する内因性ペプチドを有する。従って、第１のステップは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子に結合する全ての内因性ペプチドを、その分解を引き起こすことなく取り除くことであり、その後それらに外来性ペプチドを加えることができる。
【０３２９】
ＭＨＣクラスＩ分子から結合したペプチドを取り除く２つの可能な方法として、培養温度を３７℃から２６℃に一晩下げてｐ２ミクログロブリンを不安定化させること、及び弱酸処理を用いて細胞から内因性ペプチドをストリッピングすることが挙げられる。これらの方法により、それまで結合していたペプチドが細胞外環境に遊離し、新しい外来性ペプチドが空のクラスＩ分子に結合することが可能になる。低温インキュベーション方法は、外来性ペプチドをＭＨＣ複合体に効率的に結合させることが可能であるが、２６℃で一晩インキュベートする必要があり、これが細胞の代謝速度を減速させ得る。また、ＭＨＣ分子を能動的に合成しない細胞（例えば、静止ＰＢＭＣ）は、低温手順によっては多量の空の表面ＭＨＣ分子を生じない可能性もある。
【０３３０】
苛酷な酸ストリッピングには、トリフルオロ酢酸、ｐＨ２によるペプチドの抽出、又はイムノアフィニティー精製クラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が関わる。ＡＰＣのバイアビリティー及び抗原提示にとって決定的に重要な最適な代謝状態を維持しながら内因性ペプチドを取り除くことが重要であるため、これらの方法はＣＴＬ誘導には実現不可能である。グリシン又はクエン酸リン酸緩衝液などのｐＨ３の弱酸性溶液が、内因性ペプチドの同定及び腫瘍関連Ｔ細胞エピトープの同定に用いられている。この処理は、ＭＨＣクラスＩ分子のみが不安定化する（及び関連ペプチドが遊離する）一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含め、他の表面抗原はインタクトなままである点で特に有効である。最も重要なことに、弱酸性溶液による細胞の処理は細胞のバイアビリティー又は代謝状態に影響を及ぼさない。内因性ペプチドのストリッピングは４℃、２分間で行われ、且つＡＰＣは適切なペプチドが負荷された後直ちにその機能を果たすことのできる状態にあるため、弱酸処理は迅速である。この技法は、本明細書では、一次抗原特異的ＣＴＬを生じさせるペプチド特異的ＡＰＣの作製に利用される。得られるＡＰＣは、ペプチド特異的ＣＤ８＋  ＣＴＬの誘導において効率が良い。
【０３３１】
活性化ＣＤ８＋細胞は、種々の公知の方法の一つを用いて刺激細胞と効果的に分離し得る。例えば、刺激細胞、刺激細胞に負荷されたペプチド、又はＣＤ８＋細胞（又はそのセグメント）に特異的なモノクローナル抗体を利用して、その適切な相補リガンドに結合させ得る。次に抗体タグ標識分子を適切な手段、例えば周知されている免疫沈降又はイムノアッセイ方法で刺激エフェクター細胞混合物から抽出し得る。
【０３３２】
活性化ＣＤ８＋細胞の細胞傷害性の有効量は、インビトロ使用とインビボ使用との間で、並びにこれらのキラー細胞の最終的な標的である細胞の量及びタイプによって異なり得る。量はまた、患者の状態に応じても異なり、専門家によりあらゆる適切な要因を考慮して決定されなければならない。しかしながら、好ましくは、マウスで使用される約５×１０６〜５×１０７細胞と比較して、成人ヒトに対して約１×１０６〜約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８〜約１×１０１１、さらにより好ましくは約１×１０９〜約１×１０１０の活性化ＣＤ８＋細胞が利用される。
【０３３３】
好ましくは、本明細書で考察したとおり、活性化ＣＤ８＋細胞は、治療しようとする個体にＣＤ８＋細胞を投与する前に細胞培養物から回収される。しかしながら、他の現行の提案される治療様式とは異なり、本方法は、非腫瘍形成性の細胞培養系を使用する点に留意することが重要である。従って、刺激細胞及び活性化ＣＤ８＋細胞の完全な分離が実現される場合、少数の刺激細胞の投与に関連することが知られる固有の危険性はなく、一方、哺乳類腫瘍促進細胞の投与は極めて危険であり得る。
【０３３４】
細胞成分を再導入する方法は当該技術分野において公知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号明細書及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号明細書に例示されるような手順が挙げられる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＤ８＋細胞の投与が適切である。
【０３３５】
本発明の実施には、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技法を使用し、これらは十分に当業者の範囲内である。かかる技法は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献中に詳しく説明されている。これらの技法は本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、従って、本発明の作製及び実施において考慮され得る。詳細な実施形態に特に有用な技法を次節で考察する。
【０３３６】
治療法
本発明は、本発明の新生物ワクチン又はネオ抗原ペプチド若しくは組成物を対象に投与することによって、対象において新生物／腫瘍特異的免疫応答を誘導する方法、新生物／腫瘍に対するワクチンを接種する方法、対象における癌の症状を治療及び／又は軽減する方法を提供する。
【０３３７】
本発明によれば、本明細書に記載される新生物ワクチン又は免疫原性組成物は、癌である、又は癌の発症リスクがあると診断された患者に用いられ得る。一実施形態において、患者は、固形腫瘍、例えば、乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、胃、結腸、精巣、頭頸部、膵臓、脳、メラノーマ、及び他の組織臓器腫瘍、並びに血液腫瘍、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｔ細胞リンパ性白血病、及びＢ細胞リンパ腫を含めたリンパ腫及び白血病を有し得る。
【０３３８】
本発明のペプチド又は組成物は、ＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量で投与される。
【０３３９】
本明細書に記載される組成物及び方法は、任意の癌を有するそれを必要としている患者に対し、図２に示す一般的なフロープロセスに従い使用され得る。それを必要としている患者は、個別化された腫瘍特異的ペプチドの混合物による一連のプライミングワクチン接種を受け得る。加えて、４週間の期間にわたるプライミングの後、維持期の間に２回のブーストが続き得る。ワクチン接種は全て皮下送達される。ワクチン又は免疫原性組成物は、患者における安全性、忍容性、免疫応答及び臨床効果に関して、並びにワクチン又は免疫原性組成物の作製及び適切な時間フレーム内におけるワクチン接種開始の成功の実現可能性に関して評価され得る。第１コホートは５人の患者からなってもよく、安全性が十分に実証された後、１０人の患者のさらなるコホートが登録され得る。ペプチド特異的Ｔ細胞応答に関して末梢血が広範にモニタされ、疾患再発を評価するため患者は最長２年間にわたり追跡される。
【０３４０】
ワクチン又は免疫原性組成物キット及び共包装
ある態様において、本発明は、免疫原性組成物又はワクチンの投与を可能にするため本明細書で考察される要素の任意の１つ以上を含むキットを提供する。要素は、個々に又は組み合わせで提供されてもよく、及び任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、又はチューブに提供されてもよい。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される要素の１つ以上を利用するプロセスで使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は任意の好適な容器中に提供されてもよい。例えば、キットは１つ以上の送達又は保存緩衝液を提供し得る。試薬は、特定のプロセスで使用可能な形態で提供されてもよく、又は使用前に１つ以上の他の構成成分の添加が必要な形態（例えば濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供されてもよい。緩衝液は、限定はされないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びそれらの組み合わせを含めた任意の緩衝液であり得る。一部の実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態において、緩衝液は約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるベクター、タンパク質の１つ以上及び／又はポリヌクレオチドの１つ以上を含む。キットは、有利には、本発明のシステムの全ての要素の提供を可能にし得る。キットは、動物、哺乳動物、霊長類、げっ歯類等に投与される１〜５０個又はそれ以上のネオ抗原突然変異のＲＮＡを含むか又はそれをコードするベクター及び／又は粒子及び／又はナノ粒子を含むことができ、かかるキットは、かかる真核生物に対する投与についての説明書、並びに本発明の方法のいずれかでの使用に関する説明書を含む。
【０３４１】
一実施形態において、キットは、免疫原性組成物又はワクチンを有する少なくとも１つのバイアルを含む。一実施形態において、キットは、混合される且つ即時使用可能な即時使用可能成分を含み得る。即時使用可能な免疫原性組成物又はワクチン組成物は、免疫原性組成物の種々のプールが入った別個のバイアルを含み得る。免疫原性組成物は、ウイルスベクター又はＤＮＡプラスミドが入った一つのバイアルを含むことができ、及びもう一つのバイアルが免疫原性タンパク質を含むことができる。別の実施形態において、キットは、即時再構成可能な形態の免疫原性組成物又はワクチンを含み得る。免疫原性組成物又はワクチン組成物はフリーズドライ又は凍結乾燥されていてもよい。キットは、凍結乾燥組成物を即時投与可能にするためそれに加えることのできる再構成緩衝液を有する別個のバイアルを含み得る。緩衝液は、有利には本発明に係るアジュバント又はエマルションを含み得る。別の実施形態において、キットは、ある用量の免疫原性組成物が入った単一のバイアルを含み得る。別の態様では複数のバイアルが含まれ、一つのバイアルが治療タイムラインに従い投与される。さらなる実施形態において、バイアルには、それを必要としている患者に対するその適切な投与の表示が付される。免疫原は、本明細書に記載されるとおりの凍結乾燥形態、乾燥形態又は水溶液であってもよい。免疫原は、本明細書に記載されるとおりの弱毒生ウイルス、タンパク質、又は核酸であってもよい。
【０３４２】
別の実施形態において、キットは、免疫応答のプライミングに使用される免疫原性組成物とブーストに使用される別の免疫原性組成物との別個のバイアルを含み得る。一実施形態において、プライミング免疫原性組成物はＤＮＡ又はウイルスベクターであってもよく、及びブースト免疫原性組成物はタンパク質であってもよい。いずれの組成物も、凍結乾燥されていてもよく、又は即時投与可能であってもよい。
【０３４３】
本発明及びその利点が詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲に定義されるとおりの本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく本明細書において様々な変更、置換及び改変を行い得ることは理解されなければならない。
【０３４４】
本発明は以下の実施例にさらに例示され、実施例は例示を目的として提供されるに過ぎず、いかなる形であれ本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【０３４５】
実施例１
癌ワクチン試験プロトコル
本明細書に記載される組成物及び方法は、図２に示す一般的なフロープロセスに従い高リスクメラノーマ（完全切除ステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶＭ１ａ，ｂ）の１５人の患者で試験され得る。患者は、個別化された腫瘍特異的ペプチドとポリＩＣＬＣとの混合物による一連のプライミングワクチン接種を４週間の期間にわたり受け、続いて維持期の間に２回のブーストを受け得る。ワクチン接種は全て皮下送達される。ワクチン又は免疫原性組成物は、患者における安全性、忍容性、免疫応答及び臨床効果に関して、並びにワクチン又は免疫原性組成物の作製及び適切な時間フレーム内におけるワクチン接種開始の成功の実現可能性に関して評価され得る。第１コホートは５人の患者からなってもよく、安全性が十分に実証された後、１０人の患者のさらなるコホートが登録され得る。ペプチド特異的Ｔ細胞応答に関して末梢血が広範にモニタされ、疾患再発を評価するため患者は最長２年間にわたり追跡される。
【０３４６】
本明細書に記載したとおり、動物及びヒトの両方において、免疫応答の誘導において突然変異エピトープが有効であること及び自発的腫瘍退縮又は長期生存の症例が突然変異エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答と相関することのエビデンスが多数ある（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＰＫ．「「それが抗原である、ばかげている」及びヒト癌のワクチン療法の１０年にわたる他のレッスン（“Ｉｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｓ），ｓｔｕｐｉｄ”  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｏｖｅｒ  ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０：２９６−３００（２００８）；Ｋａｒａｎｉｋａｓ  ｅｔ  ａｌ，「長期生存肺癌患者の血中においてＨＬＡ四量体で検出可能な腫瘍特異的突然変異抗原に対する細胞溶解性Ｔリンパ球の高頻度」．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３７１８−３７２４（２００１）；Ｌｅｎｎｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ，「ヒトメラノーマに対する自己Ｔ細胞の応答は突然変異ネオ抗原によって支配される（Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｓ  ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎｓ）」．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０２：１６０１３（２００５））及びマウス及びヒトにおける優勢な突然変異抗原の発現の改変に対して「免疫編集」を追跡し得ること（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，「癌エクソーム解析は癌免疫編集のＴ細胞依存性機序を明らかにする（Ｃａｎｃｅｒ  ｅｘｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４００（２０１２）；ＤｕＰａｇｅ  ｅｔ  ａｌ，「腫瘍特異的抗原の発現が癌免疫編集の根底にある（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：４０５（２０１２）；及びＳａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，「新しく診断された膠芽腫患者の上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩペプチドワクチン接種に伴う長期無進行生存後の免疫エスケープ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｅｓｃａｐｅ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ＩＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８：４７２２−４７２９（２０１０））。
【０３４７】
次世代シーケンシングは、現在、個々の腫瘍におけるコード突然変異、最も一般的には単一アミノ酸変化（例えばミスセンス突然変異）及び頻度は低いが、フレームシフト挿入／欠失／遺伝子融合、終止コドンにおけるリードスルー突然変異、及び不適切にスプライスされたイントロンの翻訳（例えば、ネオＯＲＦ）により生成されるアミノ酸の新規ストレッチなど、個別的な突然変異の存在を迅速に明らかにすることができる。ネオＯＲＦは、その配列の全体が免疫系にとって完全に新規であり、従ってウイルス性又は細菌性の外来抗原に類似しているため、免疫原として特に有益である。従って、ネオＯＲＦは：（１）腫瘍に対して高度に特異的である（即ちいかなる正常細胞においても発現がない）；（２）中枢性トレランスを迂回し、それによりネオ抗原特異的ＣＴＬの前駆体頻度を増加させることができる。例えば、最近、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来するペプチドで、治療的抗癌ワクチンにおいて類似の外来配列を利用する力が実証された。ウイルス性癌遺伝子Ｅ６及びＥ７に由来するＨＰＶペプチド混合物のワクチン接種を３〜４回受けた新生物発生前のウイルス誘導性疾患を有する１９人の患者の約５０％が、完全寛解を２４ヶ月以上維持した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，「外陰上皮内新生物に関するＨＰＶ−１６オンコプロテインに対するワクチン接種（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｖｕｌｖａｒ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」ＮＥＪＭ  ３６１：１８３８（２００９））。
【０３４８】
シーケンシング技術により、各腫瘍が、遺伝子のタンパク質コード内容を改変する複数の患者特異的突然変異を含むことが明らかになっている。かかる突然変異は、単一アミノ酸変化（ミスセンス突然変異によって引き起こされる）から、フレームシフト、終止コドンのリードスルー又はイントロン領域の翻訳（新規オープンリーディングフレーム突然変異；ネオＯＲＦ）に起因する新規アミノ酸配列の長い領域の付加にまで及ぶ改変タンパク質を作り出す。これらの突然変異タンパク質は、天然タンパク質と異なり自己トレランスの免疫抑制効果に供されないため、腫瘍に対する宿主の免疫応答にとって有用な標的である。従って、突然変異タンパク質は免疫原性である可能性が一層高く、また患者の正常細胞と比較して腫瘍細胞に対する特異性もより高い。
【０３４９】
どのミスセンス突然変異が患者のコグネイトＭＨＣ分子との強力な結合ペプチドを生じるかを予測する近年改良されたアルゴリズムを利用して、各患者に最適な突然変異エピトープ（ネオＯＲＦ及びミスセンスの両方）を代表する一組のペプチドを同定し、優先順位を付け、及び最大２０個又はそれ以上のペプチドを免疫化用に調製する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，「免疫学における機械学習競争−ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの予測（Ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：１（２０１１）；Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  「ニューラルネットワークベースの方法を用いたエピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：２６（２０１１））。約２０〜３５アミノ酸長のペプチドが合成され、なぜならこのような「長い」ペプチドは樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞において効率的なインターナリゼーション、プロセシング及び交差提示を受け、且つヒトにおいてＣＴＬを誘導することが示されているためである（Ｍｅｌｉｅｆ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，「合成ロングペプチドワクチンによる樹立された（前）悪性疾患の免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ（ｐｒｅ）ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：３５１（２００８））。
【０３５０】
強力且つ特異的な免疫原に加え、有利には、有効な免疫応答は免疫系を活性化させるために強力なアジュバントを含む（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｒｏ，「癌免疫療法のための分子的に定義されたワクチン、及び防御Ｔ細胞免疫（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１４４（２０１０））。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）が、自然免疫系、次には適応免疫系を有効に誘導する、微生物性及びウイルス性病原体「危険シグナル」の強力なセンサーとして登場している（Ｂｈａｒｄｗａｊ  ａｎｄ  Ｇｎｊａｔｉｃ，「ＴＬＲアゴニスト：それは良好なアジュバントか？（ＴＬＲ  ＡＧＯＮＩＳＴＳ：Ａｒｅ  Ｔｈｅｙ  Ｇｏｏｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ？）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１６：３８２−３９１（２０１０））。ＴＬＲアゴニストの中でも、ポリＩＣＬＣ（合成二本鎖ＲＮＡ模倣体）は、骨髄由来樹状細胞の最も強力なアクチベータの一つである。ヒトボランティア試験において、ポリＩＣＬＣは安全で、且つ末梢血細胞において、最も強力な弱毒生ウイルスワクチンの一つである黄熱病ワクチンＹＦ−１７Ｄにより誘導されるものと同等の遺伝子発現プロファイルを誘導することが示されている（Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ，「合成二本鎖ＲＮＡはヒトにおいて生菌ウイルスワクチンと同様の自然免疫応答を誘導する（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ）」Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８：２３５７（２０１１））。Ｏｎｃｏｖｉｒ，Ｉｎｃにより調製されるポリＩＣＬＣのＧＭＰ製剤であるＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）をアジュバントとして利用する。
【０３５１】
実施例２：標的患者集団
ステージＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶＭ１ａ，ｂのメラノーマを有する患者は、疾患を完全に外科的に切除したとしても、疾患再発及び死亡のリスクが著しく高い（（Ｂａｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ，「２００９年ＡＪＣＣメラノーマ病期診断及び分類の最終版（Ｆｉｎａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ２００９  ＡＪＣＣ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｓｔａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：６１９９−６２０６（２００９））。この患者集団に利用可能な全身アジュバント療法はインターフェロン−α（ＩＦＮα）であり、これは測定可能な、しかし最低限度の利益を提供し、顕著な、多くの場合に用量制限となる毒性を伴う（Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，「高リスク切除皮膚メラノーマのインターフェロンα−２ｂアジュバント療法：米国東海岸癌臨床試験グループ試験ＥＳＴ  １６８４（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ｂ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｒｅｓｅｃｔｅｄ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｔｈｅ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔｒｉａｌ  ＥＳＴ  １６８４）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４：７−１７（１９９６）；Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，「高リスクメラノーマにおける高用量及び低用量インターフェロンα−２ｂ：群間比較試験Ｅ１６９０／Ｓ９１１１／Ｃ９１９０の初回分析（Ｈｉｇｈ−  ａｎｄ  Ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ−２ｂ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｆｉｒｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｇｒｏｕｐ  Ｔｒｉａｌ  Ｅ１６９０／Ｓ９１１１／Ｃ９１９０）」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：２４４４−２４５８（２０００））。これらの患者は、過去の癌を標的化した治療法によるか又は活動中の癌により免疫無防備状態ではなく、従ってワクチンの安全性及び免疫学的影響を評価するための優れた患者集団に相当する。最後に、これらの患者に対する現行の標準治療は、手術後にいかなる治療も指示しないため、ワクチン製剤について８〜１０週間のウィンドウが可能となる。
【０３５２】
標的集団は、完全に切除されていて発病していない、臨床的に検出可能な組織学的に確認されたリンパ節（局所又は遠隔）又はイントランジット転移を有する皮膚メラノーマ患者である（ステージＩＩＩＢの多く（シーケンシング及び細胞系発生に十分な腫瘍組織を有する必要があるため、潰瘍化した原発腫瘍であって但し微小転移リンパ節を有する患者（Ｔ１−４ｂ、Ｎ１ａ又はＮ２ａ）は除外される）、ステージＩＩＩＣの全て、及びステージＩＶＭ１ａ、ｂ）。これらは、初期ステージのメラノーマの初回診断患者又は前回の診断後の疾患再発患者であり得る。
【０３５３】
腫瘍摘出：患者をメラノーマに罹患していない状態にする目的で、患者がその原発性メラノーマ（まだ取り除かれていない場合）及び全ての局所転移性疾患の完全切除を受け得る。病理学的評価に十分な腫瘍が摘出された後、残りの腫瘍組織を滅菌容器内の滅菌媒体中に置き、脱凝集用に調製する。腫瘍組織の一部を使用して全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシング及び細胞株作成を行い、残った腫瘍は凍結する。
【０３５４】
正常組織摘出：全エクソームシーケンシング用に正常組織試料（血液又は喀痰試料）を採取する。
【０３５５】
臨床的に明らかな局所領域の転移性疾患又は完全に切除可能な遠隔リンパ節、皮膚又は肺転移性疾患を有する（しかし切除不能な遠隔又は内臓転移性疾患はない）患者を同定し、試験に組み入れる。メラノーマ細胞系樹立用の新鮮な腫瘍組織を得るため（それにより免疫モニタリング計画の一環としてのインビトロ細胞傷害性アッセイ用の標的細胞を作成するため）、手術前の患者の登録が必要である。
【０３５６】
実施例３：用量及びスケジュール
全ての治療前基準を満たした患者について、試験薬が到着し、受入規格に適合した後、可能な限り速やかにワクチン投与を開始する。各患者につき４つの別個の試験薬があり、各々が２０個の患者特異的ペプチドのうちの５個を含有する。免疫化は、概して図３に示すスケジュールに従い進め得る。
【０３５７】
患者は外来患者診療部で治療される。各治療日の免疫化は４回の１ｍｌ皮下注射からなり、リンパ系の異なる領域を標的化して抗原競合を低減するため、各注射を別々の四肢に行い得る。患者が完全腋窩又は鼠径リンパ節郭清を受けたことがある場合、ワクチンは代替として右又は左横隔膜に投与される。各注射は、当該患者用の４つの試験薬のうちの１つからなり、各サイクルについて同じ試験薬を同じ四肢に注射し得る。各１ｍｌ注射の組成は以下である：
５個の患者特異的ペプチドを各３００μｇずつ含有する０．７５ｍｌ試験薬
０．２５ｍｌ（０．５ｍｇ）の２ｍｇ／ｍｌポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））
【０３５８】
誘導期／プライミング期の間、患者は１、４、８、１５及び２２日目に免疫される。維持期には、患者は１２及び２４週目にブースター用量を受け得る。
【０３５９】
血液試料を複数の時点で採取し得る：前（ベースライン；異なる日の２つの試料）；プライミングワクチン接種の間の１５日目；誘導／プライミングワクチン接種後４週間（８週目）；初回ブーストの前（１２週目）及び後（１６週目）；２回目のブーストの前（２４週目）及び後（２８週目）に、各試料につき５０〜１５０ｍｌの血液を採取する（１６週目を除く）。一次免疫学的エンドポイントは１６週目であり、従って患者は（患者及び医師の評価に基づき特に指示されない限り）白血球アフェレーシスを受け得る。
【０３６０】
実施例４：免疫モニタリング
免疫戦略は、免疫応答を誘導するための初期の一連の密な間隔の免疫化と、続く記憶Ｔ細胞を樹立させるための休止期間とを含む「プライム−ブースト」手法である。これにブースター免疫化が続き、このブーストの４週間後のＴ細胞応答が最も強い応答を生じるものと予想され、一次免疫学的エンドポイントとなる。初めに大域的免疫応答が末梢血単核細胞を使用してこの時点から１８時間エキソビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、全ての免疫エピトープを含むオーバーラップ１５ｍｅｒペプチド（１１ａａオーバーラップ）のプールで刺激してモニタされる。このペプチドプールに対するベースライン応答を確立するため、ワクチン接種前試料を評価する。必要に応じてさらなるＰＢＭＣ試料を評価し、全ペプチド混合物に対する免疫応答の動態を調べる。ベースラインを有意に上回る応答を示す患者については、全１５ｍｅｒのプールをデコンボリューションして、どの特定の免疫ペプチドが免疫原性であったかを決定する。加えて、適切な試料に関して個別の場合に応じていくつかのさらなるアッセイを行う：
・全１５ｍｅｒプール又はサブプールを細胞内サイトカイン染色アッセイの刺激ペプチドとして使用して、抗原特異的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、中枢記憶及びエフェクター記憶集団を同定及び定量化する
・同様に、これらのプールを使用してこれらの細胞により分泌されるサイトカインのパターンを評価し、ＴＨ１対ＴＨ２表現型を決定する
・未刺激細胞の細胞外サイトカイン染色及びフローサイトメトリーを使用してＴｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を定量化する。
・応答した患者からのメラノーマ細胞系の樹立に成功し、且つ活性化エピトープを同定することができた場合、突然変異ペプチド及び対応する野生型ペプチドを使用してＴ細胞の細胞傷害性アッセイを行う
・一次免疫学的エンドポイントのＰＢＭＣを、図４に示されるとおり、既知のメラノーマ腫瘍関連抗原を刺激剤として使用し、且つ免疫原の中には選択されなかったいくつかのさらなる同定済みの突然変異エピトープを使用することにより、「エピトープの広がり」に関して評価する。
【０３６１】
腫瘍試料の免疫組織化学を行い、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＭＤＳＣ、及びＴｒｅｇ浸潤集団を定量化する。
【０３６２】
実施例５
ネオ抗原調製
腫瘍を外科的に切除した後、腫瘍組織の一部及び血液試料を直ちに施設に移し、そこで以降のトラッキング用に一意の識別コードを割り当てる。腫瘍組織はコラゲナーゼで脱凝集させ、別々の一部を核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）抽出用に凍結する。血液試料は核酸抽出のため直ちに施設に移す。腫瘍組織から抽出されるＤＮＡ及び／又はＲＮＡは全エクソームシーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォームを使用することによる）に使用し、ＨＬＡタイピング情報を決定する。本発明の範囲内では、ミスセンス又はｎｅｏＯＲＦネオ抗原ペプチドはタンパク質ベースの技術（例えば、質量分析法）によって直接同定し得ることが企図される。
【０３６３】
バイオインフォマティクス解析は以下のとおり行われる。エクソーム及びＲＮＡ−ＳＥＱ  ｆａｓｔ  Ｑファイルの配列解析は、多くの患者試料に関するＴＣＧＡなどの大規模プロジェクトで広範に使用され及び検証されている既存のバイオインフォマティクスパイプラインを利用する（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｓｔｒａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。２つの連続的な解析カテゴリー：データ処理及び癌ゲノム解析がある。
【０３６４】
データ処理パイプライン：Ｐｉｃａｒｄデータ処理パイプライン（ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）はシーケンシングプラットフォームにより開発された。各腫瘍及び正常試料について（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンサーから抽出された生データがＰｉｃａｒｄパイプラインの様々なモジュールを使用して以下の処理に供される：
（ｉ）データ変換：Ｉｌｌｕｍｉｎａ生データを標準ＢＡＭフォーマットに変換し、種々のクオリティ閾値を超える塩基の分布に関する基本ＱＣメトリックを作成する。
（ｉｉ）アラインメント：バローズ・ホイーラーアラインメントツール（ＢＷＡ）を用いてリードペアをヒトゲノム（ｈｇ１９）にアラインメントする。
（ｉｉｉ）デュプリケートのマーキング：リードペアマッピング位置に基づきＰＣＲ及び光学的デュプリケートを同定し、最終ＢＡＭファイルにマーキングする。
（ｉｖ）インデルリアラインメント：ゲノムにおける既知の挿入及び欠失多型部位と整列するリードを調べ、リアラインメント時の改善の対数オッズ（ＬＯＤ）スコアが少なくとも０．４である部位を修正する。
（ｖ）クオリティリキャリブレーション：Ｉｌｌｕｍｉｎａパイプラインによって報告された元の塩基クオリティスコアを、リードサイクル、レーン、フローセルタイル、問題の塩基及び先行する塩基に基づきリキャリブレーションする。リキャリブレーションは、非ｄｂＳＮＰ位置にあるミスマッチが全て、総観察数の中のミスマッチの割合としての目的のカテゴリー毎のエラー確率のリキャリブレーションを可能にするエラーに起因すると仮定する。
（ｖｉ）クオリティコントロール：最終ＢＡＭファイルを処理することにより、サイクル毎のリードクオリティ、クオリティスコアの分布、アラインメントのサマリー及びインサートサイズ分布を含む広範なＱＣメトリックを作成する。クオリティＱＣに適合しないデータはブラックリストに載る。
（ｖｉｉ）同一性検証：約１００個の既知のＳＮＰ位置における直交的に収集した試料遺伝子型データを配列データと照合し、試料の同一性を確認する。同一性確認用の閾値として≧１０のＬＯＤスコアを使用する。同一性ＱＣに適合しないデータはブラックリストに載る。
（ｖｉｉｉ）データ集約：同じ試料からの全てのデータをマージし、デュプリケートのマーキングステップを繰り返す。推定上の短い挿入及び欠失領域を含む新規標的領域を特定し、それらの遺伝子座でインデルリアラインメントステップを行う。
（ｉｘ）集約データにおける推定インデルの周りの局所的リアラインメント：推定上の短い挿入及び欠失を含む新規標的領域を特定し、それらの遺伝子座で局所的リアラインメントステップを（例えば、ＧＡＴＫ  ＲｅａｌｉｇｎｅｒＴａｒｇｅｔＣｒｅａｔｏｒ及びＩｎｄｅｌＲｅａｌｉｇｎｅｒモジュールを用いて）行い、インデルコールの一貫性及び正しさを確保する。
（ｘ）集約データに対するクオリティコントロール：アラインメントサマリー及びインサートサイズ分布などのＱＣメトリックを再計算する。加えて、抽出プロセスからの反応性夾雑物の存在下でのＤＮＡの音響せん断によって引き起こされるライブラリ構築プロセスの初期段階における酸化損傷の割合を評価する一組のメトリックを作成する。
【０３６５】
Ｐｉｃａｒｄの出力はｂａｍファイルであり（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ＳＡＭ１．ｐｄｆを参照）、これは所与の試料に関する全てのリードの塩基配列、クオリティスコア、及びアラインメントの詳細を保存する。
【０３６６】
癌突然変異検出パイプライン：Ｐｉｃａｒｄパイプラインからの腫瘍ｂａｍファイル及び対応する正常ｂａｍファイルは本明細書に記載するとおり解析される：
１．クオリティコントロール
（ｉ）．Ｃａｐｓｅｇプログラムを腫瘍及び対応する正常エクソーム試料に適用してコピー数プロファイルを得る。次にＣｏｐｙＮｕｍｂｅｒＱＣツールを用いて作成されたプロファイルを手動で調べ、腫瘍／正常試料のミックスアップを評価することができる。ノイズのあるプロファイルを有する正常試料並びに腫瘍試料が対応する正常試料よりも低いコピー数変異を有するケースにはフラグを付し、データ生成及び分析パイプライン全体を通じて追跡して、ミックスアップを確認する。
（ｉｉ）．ＡＢＳＯＬＵＴＥツール１５によって、Ｃａｐｓｅｇで生成されたコピー数プロファイルに基づき腫瘍純度及び倍数性を推定する。極めてノイズが多いプロファイルは、高度に劣化した試料のシーケンシングによって生じ得る。そのような場合には、腫瘍純度及び倍数性の推定は不可能であり、対応する試料にフラグを付す。
（ｉｉｉ）．ＣｏｎｔＥｓｔ（Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を使用して試料における交差試料汚染レベルを決定する。汚染が４％を超える試料は破棄する。
２．体細胞性単一ヌクレオチド変異（ＳＳＮＶ）の同定
ｍｕＴｅｃｔと称されるベイズ統計のフレームワークを使用して患者の腫瘍及び対応する正常ｂａｍを分析することにより、体細胞性塩基対置換を同定する（Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。前処理ステップにおいて、圧倒的多数の低クオリティ塩基又はゲノムとのミスマッチを有するリードがフィルタリングで除かれる。次にＭｕｔｅｃｔは２つの対数オッズ（ＬＯＤ）スコアが計算され、これは、それぞれ腫瘍試料及び正常試料中における変異体の存在及び非存在の信頼度を包含（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）する。処理後段階では、候補突然変異が、キャプチャー、シーケンシング及びアラインメントのアーチファクトを説明するため６つのフィルタによってフィルタリングされる：
（ｉ）近接ギャップ：イベントの近傍におけるミスアラインメントされたインデルの存在に起因して生じる偽陽性を除去する。候補突然変異の周りの１１ｂｐウィンドウに≧３の挿入又は欠失リードを有する試料を棄却する。
（ｉｉ）マッピング不良：ゲノムにおけるリードの不明瞭な配置のために生じる偽陽性を破棄する。腫瘍及び正常試料の≧５０％のリードのマッピングクオリティがゼロである場合又はマッピングクオリティ≧２０の突然変異対立遺伝子を有するリードがない場合、その候補は棄却する。
（ｉｉｉ）三対立遺伝子部位：正常におけるヘテロ接合部位は、多くの偽陽性を生じさせる傾向があるため破棄する。
（ｉｖ）ストランドバイアス：突然変異を有するリードの大部分が同じ向きを有するコンテクスト特異的シーケンシングエラーによって生じる偽陽性を除去する。ストランド特異的ＬＯＤが＜２である候補は棄却する（当該閾値に適合するための感度は≧９０％である）。
（ｖ）クラスター化位置：リードアラインメントの始点又は終点から一定の距離を置いて現れる代替的な対立遺伝子を特徴とするアラインメントエラーに起因する偽陽性を破棄する。リードの始点又は終点からの距離の中央値が≦１０である場合（これは突然変異が又はアラインメントの始点又は終点にあることを意味する）、又は距離の絶対偏差中央値が≦３である場合（これは突然変異がクラスター化していることを意味する）、棄却する。
（ｖｉ）コントロールで観察される：シーケンシングの偶然誤差によって予想されるものを超えて正常試料中の代替的な対立遺伝子が現れているエビデンスがある腫瘍における偽陽性を破棄する。正常試料中の代替的な対立遺伝子を含む≧２のリードがある場合又はそれらがリードの≧３％である場合、及びそれらのクオリティスコアの合計が＞２０である場合、棄却する。
これらの６つのフィルタに加え、候補を正常試料のパネルと比較し、２つ以上の正常試料で生殖細胞系列変異体として存在することが見られるものは棄却する。次に最終的な一組の突然変異を、Ｏｎｃｏｔａｔｏｒツールを用いて、ゲノム領域、コドン、ｃＤＮＡ及びタンパク質変化を含めた幾つかのフィールドによってアノテートすることができる。
３．体細胞性の小さい挿入及び欠失の同定
本明細書に記載される局所的リアラインメントの出力（「集約データにおける推定インデルの周りの局所的リアラインメント」、上掲を参照）を使用して、それぞれ腫瘍ｂａｍ単独又は腫瘍及び正常の両方のｂａｍにおいて変異体を裏付けるリードの評価に基づき候補体細胞及び生殖系列インデルを予測し得る。ミスマッチの数及び分布並びに塩基クオリティスコアに基づくさらなるフィルタリングが行われる（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，ＤｅＰｒｉｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。全てのインデルを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｉｇｖ）を使用して手動で調べ、高フィデリティのコールを確実にする。
４．遺伝子融合検出
遺伝子融合検出パイプラインの最初のステップは、既知の遺伝子配列のライブラリに対する腫瘍ＲＮＡ−Ｓｅｑリードのアラインメントと、続くゲノム座標へのこのアラインメントのマッピングである。ゲノムマッピングは、エクソンを共有する異なる転写変異体にマッピングされる複数のリードペアを共通のゲノム位置に縮める助けとなる。ＤＮＡをアラインメントしたｂａｍファイルは、異なる染色体上にあるか、或いは同じ染色体上の場合少なくとも１ＭＢ離れている２つの異なるコード領域に２つのメイトがマッピングされるリードペアに関して問い合わせを受ける。また、そのそれぞれ遺伝子においてアラインメントされるペアエンドが（推定）融合ｍＲＮＡ転写物のコーディング−−＞コーディング５’−＞３’の向きと一致する向きであることも必要となり得る。少なくとも２つのかかる「キメラ」リードペアがある遺伝子ペアのリストを、さらなる精緻化に供する最初の推定イベントリストとして列挙する。次に、全てのアラインメントされていないリードを、そのメイトが当初アラインメントされたという制約を加えて元のｂａｍファイルから抽出し、本明細書に記載したとおり得られた遺伝子ペアの遺伝子の１つにマッピングする。次に当初アラインメントされなかった全てのかかるリードを、発見された遺伝子ペア間の可能な全てのエクソン−エクソン接合部（完全長、境界から境界まで、コーディング５’−＞３’向き）で作られるカスタムの「参照」とアラインメントする試みが行われ得る。当初アラインメントされなかったかかるリードの一つが遺伝子Ｘのエクソンと遺伝子Ｙのエクソンとの間の接合部に（ユニークに）マッピングされ、且つそのメイトが実際に遺伝子Ｘ又はＹの一方にマッピングされた場合、かかるリードは「融合」リードとしてマークされる。遺伝子融合イベントは、エクソン：エクソン接合部の周りに過剰な数のミスマッチがなく、及びいずれの遺伝子においても少なくとも１０ｂｐのカバレッジで、そのメイトに対して正しい相対的向きの少なくとも１つの融合リードがある場合にコールされる。高度に相同の遺伝子（例えばＨＬＡファミリー）の間の遺伝子融合は誤りである可能性が高く、フィルタリングで除かれる。
５．クロナリティーの推定
バイオインフォマティクス解析を用いて突然変異のクロナリティーを推定し得る。例えば、ＡＢＳＯＬＵＴＥアルゴリズム（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２、Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を用いて、腫瘍純度、倍数性、絶対コピー数及び突然変異のクロナリティーを推定し得る。各突然変異の対立遺伝子率の確率密度分布を作成し、続いて突然変異の癌細胞率（ＣＣＦ）に変換する。突然変異は、それらのＣＣＦが０．９５を超える事後確率がそれぞれ０．５より大きいか又は小さいかに基づきクローナル又はサブクローナルとして分類される。
６．発現の定量化
ＴｏｐＨａｔスイート（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ，２００９）を使用して、ｈｇ１９ゲノムに対して腫瘍ｂａｍ及び対応する正常ｂａｍのＲＮＡ−Ｓｅｑリードをアラインメントする。ＲＮＡ−ＳｅＱＣ（ＤｅＬｕｃａ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）パッケージによりＲＮＡ−Ｓｅｑデータのクオリティを評価し得る。次にＲＳＥＭツール（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を使用して遺伝子及びアイソフォーム発現レベルを推定する。キロベース当たりの生成されたリードの百万分率及びτ推定値を使用して、他の部分に記載されるとおりの各患者において同定されたネオ抗原に優先順位を付ける。
７．ＲＮＡ−Ｓｅｑにおける突然変異の検証
８．本明細書に記載されるとおりの全エクソームデータの解析によって同定される体細胞突然変異（単一ヌクレオチド変異、小さい挿入及び欠失並びに遺伝子融合を含む）の確認を、患者の対応するＲＮＡ−Ｓｅｑ腫瘍ＢＡＭファイルを調べることによって評価する。各変異遺伝子座について、ベータ二項分布に基づく検出力計算を実施し、それをＲＮＡ−Ｓｅｑデータ中に検出する少なくとも９５％の検出力があることを確実にする。キャプチャーにより同定された突然変異は、適切な検出力の部位について突然変異を有するリードが少なくとも２つある場合に検証されたと見なす。
【０３６７】
腫瘍特異的突然変異含有エピトープの選択：Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、デンマーク工科大学（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ）、オランダによって提供及び管理されるニューラルネットワークベースのアルゴリズムｎｅｔＭＨＣを使用して、全てのミスセンス突然変異及びネオＯＲＦを突然変異含有エピトープの存在に関して解析する。この一群のアルゴリズムは、一連の関連手法の間で最近完了したコンペティションに基づき最高位のエピトープ予測アルゴリズムと評価された（参照）。これらのアルゴリズムを、地域の標的患者集団における主要な民族集団である白人集団に見られるＨＬＡ−Ａ対立遺伝子の９９％及びＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の８７％を網羅する６９個の異なるヒトＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子に関して人工ニューラルネットワークベースの手法を用いて訓練した。最新バージョンを利用する（ｖ２．４）。
【０３６８】
アルゴリズムの正確さは、ＨＬＡアロタイプが既知のＣＬＬ患者に見出される突然変異から予測を実施することにより評価した。含まれたアロタイプは、Ａ０１０１、Ａ０２０１、Ａ０３１０、Ａ１１０１、Ａ２４０２、Ａ６８０１、Ｂ０７０２、Ｂ０８０１、Ｂ１５０１であった。予測は各突然変異にわたる全ての９ｍｅｒ及び１０ｍｅｒペプチドについて、ｍｉｄ−２０１１でｎｅｔＭＨＣｐａｎを使用して、行った。これらの予測に基づき、７４個の９ｍｅｒペプチド及び６３個の１０ｍｅｒペプチド（ほとんどが５００ｎＭ未満の予測親和性を有した）を合成し、競合的結合アッセイ（Ｓｅｔｔｅ）を用いて結合親和性を測定した。
【０３６９】
これらのペプチドの予測を、２０１３年３月に最新版のｎｅｔＭＨＣサーバの各々（ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ｎｅｔＭＨＣ及びｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓ）を使用して繰り返した。これらの３つのアルゴリズムは、２０１２年のコンペティションで使用された２０のグループの中で最高位のアルゴリズムであった（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）。次に新しい予測の各々に関して、実測結合親和性を評価した。各一組の予測値及び実測値について、範囲毎の正しい予測の％、並びに試料の数が得られる。各範囲の定義は以下のとおりである：
０−１５０：１５０ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ１５０ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
０−１５０＊：１５０ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
１５１−５００ｎＭ：１５０ｎＭより高いが５００ｎＭ以下の親和性を有すると予測され、且つ５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
ＦＮ（＞５００ｎＭ）：偽陰性−５００ｎＭより高い親和性を有すると予測されるが、５００ｎＭ以下の親和性を有することが計測される。
【０３７０】
９ｍｅｒペプチド（表１）については、アルゴリズム間の差はほとんどなく、ｎｅｔＭＨＣ  ｃｏｎｓの１５１〜５００ｎＭ範囲が僅かに高い値であったが、試料数が少ないため重大ではないと判断された。
【０３７１】
【表１】
2019131568.tif 000003
【０３７２】
１０ｍｅｒペプチド（表２）についても同様に、アルゴリズム間の差はほとんどなかったが、但しｎｅｔＭＨＣはｎｅｔＭＨＣｐａｎ又はｎｅｔＭＭＨＣｃｏｎｓと比べて大幅に多い偽陽性を生じた。しかしながら、９ｍｅｒと比較して１０ｍｅｒ予測精度は０〜１５０ｎＭ及び０〜１５０＊ｎＭ範囲で僅かに低く、及び１５１〜５００ｎＭ範囲で大幅に低い。
【０３７３】
【表２】
2019131568.tif 000004
【０３７４】
１０ｍｅｒについては、１５１〜５００ｎＭ範囲では結合体に関して５０％未満の精度であるため、０〜１５０ｎＭ範囲の予測のみを利用する。
【０３７５】
任意の個々のＨＬＡ対立遺伝子の試料数が、種々の対立遺伝子についての予測アルゴリズムの正確さに関する任意の結論を引き出すには少な過ぎた。利用可能な最大のサブセット（０〜１５０＊ｎＭ；９ｍｅｒ）のデータを例として表３に示す。
【０３７６】
【表３】
2019131568.tif 000005
【０３７７】
ＨＬＡ  Ｃ対立遺伝子に関しては予測の正確さを判断する利用可能なデータがほとんどないため、ＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子の予測のみを利用する（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）。
【０３７８】
メラノーマ配列情報及びペプチド結合予測の評価は、ＴＣＧＡデータベースからの情報を用いて実施した。種々の患者の２２０例のメラノーマからの情報により、平均して患者当たり約４５０個のミスセンス及び５個のネオＯＲＦがあることが明らかになった。２０人の患者を無作為に選択し、ｎｅｔＭＨＣを使用して全てのミスセンス及びネオＯＲＦ突然変異の予測結合親和性を計算した（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  「ニューラルネットワークベースの方法を用いたエピトープの予測（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７４：２６（２０１１））。これらの患者はＨＬＡアロタイプが未知であったため、当該のアロタイプの頻度に基づきアロタイプ毎の予測結合ペプチドの数を調整し（地理的範囲における予想される罹患優性集団［メラノーマについて白人］の骨髄登録データセット）、患者当たりの予測される作用可能な突然変異体エピトープ数を求めた。これらの突然変異体エピトープ（ＭＵＴ）の各々について、対応する天然（ＮＡＴ）エピトープ結合もまた予測した。Ｋｄ≦５００ｎＭ及び５倍より大きいＷＴ／ＭＵＴ  Ｋｄ比を有する予測ミスセンス結合体の単一のペプチド及び各ネオＯＲＦの完全長にわたるオーバーラップペプチドを利用して、８０％（２０人中１６人）の患者が、ワクチン接種に適切な少なくとも２０個のペプチドを有すると予測された。患者の四分の一は、２０個のペプチドの約半分乃至全てをネオＯＲＦペプチドが構成し得た。従って、メラノーマには、患者の高い割合が十分な数の免疫原性ペプチドを生じると予想するのに十分な突然変異負荷がある。
本明細書に記載される優先順位付けを利用して：
・９０％（２０人中１８人）の患者が、ワクチン接種に適切な少なくとも２０個のペプチドを有すると予測された；
・患者の約４分の１は、それらの２０個のペプチドの半分乃至全てをｎｅｏＯＲＦペプチドが占めた；
・半数を少し上回る患者には、カテゴリー１及び２のペプチドのみが用いられ得た；
・８０％の患者には、カテゴリー１、２、及び３のペプチドのみが用いられ得た。
【０３７９】
従って、メラノーマには、患者の高い割合が十分な数の免疫原性ペプチドを生じると予想するのに十分な数の突然変異がある。
【０３８０】
実施例６
ペプチド作製及び製剤
免疫用のＧＭＰネオ抗原ペプチドを、ＦＤＡの規定に従い化学合成、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ：「固相ペプチド合成Ｉ．テトラペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ）」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４，１９６３）によって調製する。２０個の各約２０〜３０ｍｅｒペプチドの３つの開発ランを実施している。各ランは同じ施設で実施され、ドラフトＧＭＰバッチ記録を利用して、ＧＭＰランに使用されるものと同じ機器が利用された。各ランで＞５０ｍｇの各ペプチドを作製することに成功し、現在計画されている全ての出荷試験（例えば、外観、ＭＳによるアイデンティティ、ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、窒素元素による含量、及びＲＰ−ＨＰＬＣによるＴＦＡ含量）によってそれらを試験し、適宜目標規格に適合させた。生成物はまた、プロセスのこの部分に見込まれる時間フレーム（約４週間）の範囲内で作製した。凍結乾燥バルクペプチドを長期安定性試験にかけており、これは最長１２ヶ月までの種々の時点で評価される。
【０３８１】
これらのランからの材料を使用して、計画された溶解及び混合手法を試験している。簡潔に言えば、各ペプチドを１００％ＤＭＳＯ中に高濃度（５０ｍｇ／ｍｌ）で溶解し、水性溶媒中に２ｍｇ／ｍｌに希釈する。当初、希釈剤としてＰＢＳを使用し得ると見込まれたが、しかしながら少数のペプチドの塩析によって目に見える混濁が生じた。Ｄ５Ｗ（５％デキストロース水溶液）は、はるかに有効性が高いことが示された；４０個中３７個のペプチドで、澄明な溶液に希釈することに成功した。１０％スクロース又は１０％トレハロース水溶液もまた有効である。５％デキストロースを含有する製剤と異なり、１０％スクロース又は１０％トレハロースを含有する製剤は凍結乾燥可能である。唯一問題のあるペプチドは、極めて疎水性のペプチドである。
【０３８２】
表４は、疎水性アミノ酸の割合の計算値に基づきソートした６０個の潜在的なネオ抗原ペプチドの溶解度評価の結果を示す。示されるとおり、疎水性割合が０．４より低いほぼ全てのペプチドがＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗに可溶性であり、しかし疎水性割合が０．４以上の複数のペプチドがＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗに不溶性であった（表頭名「ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ中溶解度」の列中に赤色のハイライトで示す）。これらのうち複数は、コハク酸塩を加えることによって可溶化し得る（「ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ／コハク酸塩中溶解度」の列に緑色のハイライトで示す）。これらのペプチドの４個中３個は、０．４〜０．４３の疎水性割合を有した。４個のペプチドは、コハク酸塩を加えると可溶性が低下した；これらのペプチドの４個中３個は０．４５以上の疎水性割合を有した。
【０３８３】
【表４】
2019131568.tif 000006
【０３８４】
【表５】
2019131568.tif 000007
【０３８５】
【表６】
2019131568.tif 000008
【０３８６】
【表７】
2019131568.tif 000009
【０３８７】
【表８】
2019131568.tif 000010
【０３８８】
【表９】
2019131568.tif 000011
【０３８９】
【表１０】
2019131568.tif 000012
【０３９０】
計画された免疫ペプチドの予測される生化学的特性を評価し、それに従い合成計画を変更してもよく（より短いペプチドを使用するか、合成する領域を予測エピトープの周りでＮ末端又はＣ末端方向にシフトさせるか、又は潜在的に代替的ペプチドを利用する）、それにより疎水性割合が高いペプチドの数を制限し得る。
【０３９１】
ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ中の１０個の別個のペプチドを２回の凍結／融解サイクルに供し、完全な回復が示された。２つの個々のペプチドをＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ中に溶解し、２つの温度（−２０℃及び−８０℃）で安定性を試みた。これらのペプチドは最長２４週間にわたり評価した（ＲＰ−ＨＰＬＣ及び目視検査）。両方のペプチドとも２４週間にわたり安定している；いずれのペプチドについても、ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイによって検出されたパーセント不純物は、−２０℃又は−８０℃のいずれで保存したときにも大幅には変化しなかった。評価するべき傾向は認められなかったため、任意の小さい変化はアッセイのばらつきに起因するものと思われる。
【０３９２】
図５に示されるとおり、剤形プロセスの設計は、各５個のペプチドからなる患者特異的ペプチドの４つのプールを調製することである。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイが調製されており、これらのペプチド混合物の評価に適格であるとされている。このアッセイは、単一混合物内の複数のペプチドの良好な分解能を達成し、また個々のペプチドの定量にも用いられ得る。
【０３９３】
膜ろ過（０．２μｍ細孔径）を使用してバイオバーデンを低下させ、最終ろ過滅菌を行う。初めに４つの異なる適切なサイズのフィルタタイプを評価し、Ｐａｌｌ、ＰＥＳフィルタ（４６１２番）を選択した。現在までに、５つの異なる各ペプチドの４つの異なる混合物が調製されており、個々に２つのＰＥＳフィルタで順次ろ過した。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを利用して各個々のペプチドの回収率を評価した。２０個中１８個のペプチドについては、２回のろ過後の回収率は９０％超であった。２つの極めて疎水性のペプチドについては、小規模で評価したとき回収率は６０％未満であったが、規模を拡大するとほぼ完全に回収された（８７及び９７％）。本明細書に記載のとおり、選択した配列の疎水性の性質を制限する手法が取られる。
【０３９４】
ＤＭＳＯ中に溶解し、２ｍｇ／ｍｌとなるようにＤ５Ｗ／コハク酸塩（５ｍＭ）で希釈し、及び４００μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度及び４％の最終ＤＭＳＯ濃度にプールすることにより、５つのペプチドからなるペプチドプール（プール４）を調製した。調製後、ペプチドを２５ｍｍ  Ｐａｌｌ  ＰＥＳフィルタ（カタログ番号４６１２）でろ過し、１ｍｌアリコートでＮｕｎｃクライオバイアル（＃３７５４１８）に分注した。現在までに時点０並びに２週間及び４週間の時点で試料を分析した。さらに試料は、８週間及び２４週間の時点で分析する。−８０℃では、４週時点でペプチドプール４のＨＰＬＣプロファイル又は不純物プロファイルに大きい変化は認められていない。４週時点まで、ペプチドプールの目視観察及びｐＨは変化しなかった。
【０３９５】
実施例７
ペプチド合成
ＧＭＰペプチドは標準的な固相合成ペプチド化学により（例えば、ＣＳ５３６ＸＴペプチド合成を使用して）合成し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。各個々のペプチドは、種々の適格なアッセイにより分析して外観（目視）、純度（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、アイデンティティ（質量分析法による）、量（窒素元素）、及びトリフルオロ酢酸対イオン（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を評価し、リリースする。
【０３９６】
個別化されたネオ抗原ペプチドは、各患者にユニークな最大２０個の別個のペプチドから構成され得る。各ペプチドが、標準的なペプチド結合によりつながった約２０〜約３０個のＬ−アミノ酸の線状ポリマーであり得る。アミノ末端は第一級アミン（ＮＨ２−）であってもよく、カルボキシ末端はカルボニル基（−ＣＯＯＨ）である。哺乳類細胞に一般に見出される標準２０アミノ酸が利用される（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）。各ペプチドの分子量はその長さ及び配列に基づき異なり、各ペプチドについて計算される。
【０３９７】
全ての合成反応に、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｙｌｏｘｙｃａｒｂｎｙｌ））でＮ末端が保護されたアミノ酸を利用する。アミノ酸の側鎖は、必要に応じて、２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）基、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基又はｔ−ブチルエーテル（ｔＢｕ）基で保護される。全てのバルクアミノ酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解する。縮合は、別個の反応に対する以下の２つの触媒の組み合わせを利用する：
ジイソプロピルカルボジイミド（ｄｉｉｓｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＩＣ／ＨＯＢＴ）
ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｌｙｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＤＩＥＡ／ＨＢＴＵ）
【０３９８】
高い取込みレベルを確保するため、各アミノ酸は２回カップリングさせる。第１のカップリングではＤＩＣ／ＨＯＢＴを２〜６時間利用し、第２のカップリングではＤＩＥＡ／ＨＢＴＵを１〜２時間利用する。これらの２つのカップリングの各々はＵＶ吸光度によってモニタし、カップリングサイクルの合間に樹脂をＤＭＦで十分に洗浄して効率を向上させる。２サイクルのカップリング後、次のサイクルに進めるには、カップリング効率計算値が少なくとも９５％でなければならない。この最低カップリング効率を満たさないペプチドは、さらなる合成を中止する。
【０３９９】
全てのアミノ酸をカップリングし終えた後、樹脂をＤＭＦで２回洗浄し、続いてメタノールで３回洗浄する。次になおも反応槽中にある間に樹脂を短時間真空乾燥し、次に新しい風袋計量済み容器に移し入れて、それが自由に流動するまで真空乾燥する（１２時間超）。乾燥させた樹脂が入った容器を秤量し、風袋計量済み容器の質量を減じ、及び樹脂質量を調整することによって、合成された粗ペプチドの質量を決定する。予想質量収率は６０％〜９０％の範囲である。少なくとも２００ｍｇの粗ペプチドを生成しなかった合成は終了させる。乾燥樹脂は切断開始まで４℃で最長２８日間保存し得る。
【０４００】
切断反応は単一の部屋で行う。一組の患者特異的乾燥樹脂を合成室から切断室に移す前に、切断室をＱＡによって新規ＧＭＰ製品の合成に完全に適格と認められたものにする。適格性認定には、ラインクリアランス点検、ＧＭＰスイートクリーニングの確認、全ての必要材料及びガラス器具類のステージング、機器の適切さ及び表示の確認、及び全ての必要人員が適切な訓練を受けていて作業を行う適格性を有し、且つ適切に更衣がなされ、明白な疾患を有しないことの確認が含まれる。
【０４０１】
部屋の準備作業は、使用する機器の確認（ロータリーエバポレータ、真空ポンプ、はかり）及び機器が適切に清掃及び校正されていることを示す文書の点検（適宜）から開始する。全ての必要な原材料（ＴＦＡ、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び１，２−エタンジチオール）の完全なリストがＱＡによって発行され、製造が、利用すべきロット番号、再試験日又は有効期限及びそれぞれの日の反応に使われる材料の分量を特定する。
【０４０２】
樹脂からのペプチド鎖の切断及び側鎖保護基の切断は、酸によって生成されるフリーラジカルのスカベンジャーとしての２％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）及び１％１，２−エタンジチオールの存在下の酸性条件下（９５％ＴＦＡ）において室温で３〜４時間で達成される。
【０４０３】
遊離粗ペプチドからろ過によって樹脂を分離する。遊離し且つ脱保護されたペプチドの最終的な溶液にエーテルで沈殿を生じさせ、沈殿物を１２時間フリーズドライする。フリーズドライ粉末を秤量して遊離粗ペプチド／樹脂結合ペプチドの比を計算することにより、遊離粗ペプチドの収量を決定する。粗ペプチドの予想収量は２００ｍｇ〜１０００ｍｇである。少なくとも２００ｍｇの粗ペプチドが得られない切断反応は終了とする。次に粗ペプチドを精製スイートに移す。
【０４０４】
精製は単一の部屋で行う。一組の乾燥粗ペプチドを切断室から精製室に移す前に、精製室を品質保証（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ）によって新規ＧＭＰ製品の合成に完全に適格と認められたものにする。適格性認定には、ラインクリアランス点検、ＧＭＰスイートクリーニングの確認、全ての必要材料及びガラス器具類のステージング、機器の適切さ及び表示の確認、及び全ての必要人員が適切な訓練を受けていて作業を行う適格性を有し、且つ適切に更衣がなされ、明白な疾患を有しないことの確認が含まれる。
【０４０５】
部屋の準備作業は、使用する機器の確認（分取逆相高速液体クロマトグラフィー［ＲＰ−ＨＰＬＣ］、はかり、分析用液体クロマトグラフィー／質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、凍結乾燥器、はかり）及び機器が適切に清掃及び校正されていることを示す文書の点検（適宜）から開始する。全ての必要な原材料（トリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］、アセトニトリル［ＡＣＮ］、水）の完全なリストがＱＡによって発行され、製造が、利用すべきロット番号、再試験日又は有効期限及びそれぞれの日の反応に使われる材料の分量を特定する。
【０４０６】
精製は、ＡＣＮ中に２００ｍｇ以下のフリーズドライ遊離ペプチドを溶解することによって開始する。次に試料を水で５％〜１０％ＡＣＮにさらに希釈する。ＴＦＡを加えて０．１％の終濃度にする。患者特異的ペプチドの各セットの開始前に１つのＣ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１０ｃｍ×２５０ｃｍ）を新鮮に充填する。カラムを０．１％ＴＦＡ含有５％アセトニトリルで十分に洗浄した後、患者ペプチドをロードする。単一のカラムにロードされるペプチドの最大量は２００ｍｇである。カラムは２２０ｎｍでのＵＶ観測によってモニタする。単一ペプチドをロードした後、試料をカラムに流入させ、５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡでカラムを洗浄する。０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの１０％〜５０％勾配を使用してペプチドを溶出させる。ＵＶ観測がベースラインを２０％上回る時点で始まる画分を収集する（各５０ｍｌ）。カラムからそれ以上ＵＶ吸収材料が溶出しなくなるまで、又は勾配が完了するまで、画分を収集し続ける。典型的には、主溶出ピークは４〜８画分に分かれる。
【０４０７】
個々の画分はそれぞれ、分析用ＬＣ／ＭＳによって評価する。選択される分析条件は、ピーク溶出生成物に関連するパーセントアセトニトリルに基づく。予想質量及び９５％以上の純度を有する画分を、ペプチド生成物としてプールする。典型的には２〜４画分がこのプール要件を満たす。プールされたペプチドはフリーズドライ用の風袋計量済みジャーに入れ、２４〜７２時間フリーズドライする。フリーズドライペプチドが入ったジャーの質量を決定し、風袋計量済みジャーの質量を減じることにより、凍結乾燥ペプチドの質量を決定する。
【０４０８】
フリーズドライペプチドの一部をクオリティコントロールに移して分析及び処分する。残りはさらなる処理まで−２０℃で保存する。
【０４０９】
いずれの画分も９５％純度の要件を満たさないペプチドは破棄する。ＲＰ−ＨＰＬＣ画分の再処理は行うことができない。十分な未精製フリーズドライ切断ペプチドが利用可能な場合、第２のペプチド試料を、溶出ペプチドの純度が改善されるように勾配条件を調整してカラムで精製してもよい。
【０４１０】
次にカラムは、４カラム容積の１００％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで十分に洗浄し、次に５％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで再平衡化させることによって残りのペプチドを取り除いた後、次のペプチドをロードすることができる。
【０４１１】
個々の患者のペプチドが同じカラムで順次処理される。単一のカラムで２５以下のペプチドが処理される。
【０４１２】
従って薬物物質製造の単位作業は以下からなる：
合成：
各アミノ酸の縮合、洗浄及び再縮合
樹脂洗浄及び真空乾燥
切断スイートに移す
切断：
樹脂からの酸切断
樹脂からの遊離ペプチドの分離及びペプチド沈殿
精製スイートに移す
精製：
アセトニトリル中への溶解及びＲＰ−ＨＰＬＣ精製
２４〜７２時間にわたるピーク画分のフリーズドライ
ＱＣ試験のためアリコートの取り出し及び残りの凍結乾燥生成物の保存。
【０４１３】
個別化されたネオ抗原ペプチドは、色分けされたキャップを備える２ｍｌ  Ｎｕｎｃ  Ｃｒｙｏバイアルが入った箱として供給されてもよく、各バイアルに約４００ｕｇ／ｍｌの濃度の最大５個のペプチドを含有する１．５ｍｌの凍結ＤＭＳＯ／Ｄ５Ｗ溶液が入っている。４つのグループのペプチドの各々につき１０〜１５本のバイアルがあり得る。バイアルは使用時まで−８０℃で保存すべきである。進行中の安定性試験は保存温度及び期間を裏付けている。
【０４１４】
保存及び安定性：個別化されたネオ抗原ペプチドは−８０℃で凍結して保存される。個別化されたネオ抗原ペプチド及びポリＩＣＬＣの解凍して滅菌ろ過したインプロセス中間体及び最終混合物は室温で保つことができるが、４時間以内に使用しなければならない。
【０４１５】
適合性：個別化されたネオ抗原ペプチドは、３分の１の容積のポリＩＣＬＣと使用直前に混合する。
【０４１６】
実施例８
製剤試験
条件によっては、特定のペプチドでペプチドプール溶液に混濁又は沈殿が見られた。従って、弱緩衝液がペプチド溶解度及び安定性に及ぼす効果を評価した。
【０４１７】
ポリＩＣＬＣとペプチドプール（ＤＭＳＯ含有Ｄ５Ｗ中）とを混合すると、特に疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｂｉｃ）ペプチドについて、恐らくはポリＩＣＬＣ溶液の低いｐＨに起因して、時に混濁又は沈殿がもたらされることが分かった。ペプチド溶液のｐＨを上昇させるため、緩衝液を試験し、ペプチド溶解度に対する効果を評価した。初期試験に基づき、クエン酸塩及びコハク酸塩緩衝液を試験した。
【０４１８】
Ｄ５Ｗ単独では溶解度の問題を有した４個中３個のペプチドについて溶解度の改善が見られたことが分かった。この初期観察結果に基づき、１９個の追加のペプチドをクエン酸塩又はコハク酸塩で評価し、及び４個のさらなるペプチドをコハク酸塩単独で評価した。緩衝液としてクエン酸ナトリウム（試験される場合）又はコハク酸ナトリウムのいずれかを使用したとき、１９個中１８個の供試ペプチドの溶液が澄明であったことが分かった（コハク酸塩単独で評価した４個のペプチドのいずれも混濁を示さなかった）。
【０４１９】
２ｍＭ〜５ｍＭコハク酸塩の濃度が有効であることが分かった。コハク酸塩緩衝液中の１つのペプチドについてペプチドの回収率が向上したが、クエン酸塩緩衝液中では向上しなかった。ペプチドプール及び使用するコハク酸塩緩衝液の濃度に応じて、Ｄ５Ｗ／コハク酸塩中のペプチド溶液のｐＨは約４．６４〜約６．９６の範囲であった。
【０４２０】
合計２７のペプチド（初期の４つのペプチドの難溶性群を含む）を評価した後、１つのペプチドは全ての条件で混濁を再現性のある形で示し、及びもう１つのペプチドは僅かな混濁を示したが、ろ過すると完全に回復可能であったことが分かった。これらの２つのペプチドは両方ともに高い疎水性を有した。
【０４２１】
一般に、コハク酸塩緩衝液を含むＤ５Ｗ中に２ｍｇ／ｍｌに希釈したときに澄明なペプチドは、他のペプチドとの混合時にも澄明性を維持することが分かった（これは概してＤ５Ｗ単独中のペプチドに当てはまる）。
【０４２２】
代表的な手順では、ペプチドを秤量し、％ペプチド含量に補正し、次にＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。次にこのＤＭＳＯ／ペプチド溶液をＤ５Ｗ中の５ｍＭコハク酸ナトリウムで２ｍｇ／ｍＬペプチド濃度に希釈した。
【０４２３】
さらなるペプチド溶解度条件を試験した。ペプチドＣＳ６７０９、ＣＳ６７１２、ＣＳ６７２０、ＣＳ６７２６、及びＣＳ６７８３をそれぞれ約１０ｍｇに秤量した。次にこれらのペプチドを約２００μＬ  ＵＳＰグレードＤＭＳＯ中に、各ペプチドが５０ｍｇ／ｍＬ濃度となるように溶解した。本出願人らは、１０．０２ｍｇのペプチドＣＳ６７０９が、５０ｍｇ／ｍＬを提供すると計算される２００μＬ量のＤＭＳＯに完全には溶解しなかったことを観察した。この試料は濁っているように見えた。ペプチドＣＳ６７０９にＤＭＳＯをさらに５０μＬずつ４００μＬとなるまで加えた；合計６００μＬのＤＭＳＯとなった。ＤＭＳＯの量が６００μＬに達したときＣＳ６７０９は溶液（澄明）になり、濃度は１６．６７ｍｇ／ｍＬであった。
【０４２４】
ペプチドを４００μｇに希釈するため、カリウム不含ＰＢＳ  ｐＨ７．４溶液を調製した。５つ全てのＤＭＳＯペプチド試料（５０ｍｇ／ｍＬ）を単一のバイアルに入れ、４００μｇ／ｍＬに希釈した。このバイアルに各ＤＭＳＯペプチドを４０μＬで加え、但しＣＳ６７０９は１６．６７ｍｇ／ｍＬの濃度とした。単一バイアルに加えたＣＳ６７０９の容積は１２０μＬであった。４．７２ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４を加えることにより試料を４００μｇに希釈した。ＰＢＳ  ｐＨ７．４を加えると、ペプチドの１つ以上が析出したことが観察された。
【０４２５】
ペプチドのうちどれが沈殿したのかを決定するため、本出願人らは、ごく少量（１０〜２０μＬ）のＤＭＳＯに溶解したペプチドを使用し、且つこれらのペプチドを種々の液体に加えて、以下の表５のマトリックスをフォローした。
【０４２６】
【表１１】
2019131568.tif 000013
【０４２７】
ＣＳ６７８３は、ペプチド混合物に希釈剤としてＰＢＳ  ｐＨ７．４を加えると沈殿することが分かった。注射用ＵＳＰグレードＤ５Ｗは、ＰＢＳ  ｐＨ７．４の代用希釈剤である。
【０４２８】
加えて、本出願人らは、５つのペプチドのうちＤＭＳＯを使用しなくてもＤ５Ｗに溶解し得るものはあるかどうかを確かめるため、少量の各ペプチド（＜１ｍｇ）を試験した。ペプチドＣＳ６７０９、ＣＳ６７１２、ＣＳ６７２０、及びＣＳ６７２６はＤ５Ｗに直接溶解させることができた。ＣＳ６７８３は、Ｄ５Ｗを使用して溶解させることはできなかった。
【０４２９】
実施例９
製剤
各患者の製剤は、免疫原として個別に作製された最大２０のペプチドを含む。ワクチン接種のため、４つのプール（それぞれ最大５つのペプチド）を、本明細書で考察するとおりリンパ系の異なる部位を標的とする別々の部位への注射用に調製する。個々のペプチドを秤量し、ＤＭＳＯに高濃度で溶解し、水（Ｄ５Ｗ）及びコハク酸ナトリウム（４．８〜５ｍＭ）中５％デキストロースで希釈し、４つのプールに混合する。０．２μｍフィルタで個々のプールをろ過してバイオバーデンを低減し、アリコートに分けてバイアルに入れ、凍結する。これらの凍結バイアルは使用時まで凍結保存する。
【０４３０】
本明細書に記載されるとおり、薬物物質を構成する一組の患者特異的ペプチドを個々に調製し、凍結乾燥し、試験して出荷し、及び製造後に保存する。これらのペプチドを注射用に調製するため、最大５つの異なるペプチドで構成される４つの群の各々を特定し、プールする。
【０４３１】
実施例１０
ワクチンの調製
秤量及び溶解：総重量及びペプチド含量に基づき、１５ｍｇ（正味重量）又はそれよりやや多い個別のペプチドの各々を秤量し、５０ｍｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度に達するように１００％ＵＳＰグレードＤＭＳＯ（２：２５０μｌ）を加える。開発試験に基づけば、＞９５％の溶解ペプチドがこの時点において澄明性を示す。
【０４３２】
希釈及び混合：希釈剤として使用するため５ｍＭコハク酸ナトリウムを含有するＵＳＰグレードＤ５Ｗ（Ｄ５Ｗ／Ｓｕｃｃ）を調製し、ろ過する（０．２Ｊ．．ｔｍ）。各２５０μｌの溶解ペプチドをＤ５Ｗ／Ｓｕｃｃで希釈してペプチド濃度を２ｍｇペプチド／ｍｌに低下させ、ｐＨを約６．０に調整する。澄明な溶液を示さないペプチドは別のペプチド（又はそれ以上ペプチドが利用可能でない場合、Ｄ５Ｗ／コハク酸塩溶液のみ）に交換する。次に５．５ｍｌの各希釈ペプチド溶液を、各ペプチドが４００μｇペプチド／ｍｌの濃度の単一の５ペプチド含有プールに合わせる。次に２回の０．２μｍ膜ろ過ステップの１回目を行う。各プールを、ルアーロック（ｌｅｕｒ  ｌｏｃｋ）先端及び１８ゲージ鈍針を備える６０ｍｌ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ（又は等価な）シリンジに抜き取る。針を取り外し、２５ｍｍ  ＰＡＬＬ  ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）０．２μｍメンブランフィルタ（ＰＡＬＬカタログＨＰ１００２）に交換する。シリンジの内容物をフィルタを介して５０ｍｌ滅菌ポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２０７０又は等価物）に移す。試験用に各プールのアリコートを取り出し、残りを−８０℃で凍結する。個々の希釈ペプチドそれぞれの残りは、全ての分析が完了するまで−２０℃で保存する。
【０４３３】
出荷：凍結ペプチドプールは、バリデートされた搬送容器を使用して、及び一晩空気中で出荷する。
【０４３４】
ろ過及び保存：凍結プールを解凍し、バイオセーフティキャビネットに移す。解凍したプールからの２ｍｌ試料を無菌性及びエンドトキシン試験に関して試験する。残りのバルク溶液を、２回の０．２μｍ膜ろ過ステップの２回目用に処理する。バルクプールペプチドを、ルアーロック先端及び１８ゲージ鈍針を備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（又は等価な）６０ｍｌシリンジに抜き取る。針を取り外し、２５ｍｍ  ＰＡＬＬ  ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）０．２μｍメンブランフィルタ（ＰＡＬＬカタログＨＰ１００２）に交換する。シリンジの内容物をフィルタを介して５０ｍｌ滅菌ポリプロピレンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ＃３５２０７０又は等価物）に移す。次にペプチド溶液の１．５ｍｌアリコートを１５個の予め表示を付した滅菌１．８ｍｌ  Ｎｕｎｃクライオバイアル（カタログ番号３７５４１８）に無菌的に移す。バイアルは、４色に色分けされたキャップのうちの１つで蓋をする。単一の患者の４つのペプチドプールの各々に異なる色のキャップを使用して、識別し易くする。バイアルには、患者の氏名、診療記録番号、試験番号、元の製品／試料の英数字識別名及び一意の英数字識別名（Ａ〜Ｄ）の表示を付す。バイアルは全て−８０℃で凍結する。残りの凍結バイアルは、全ての出荷試験が受入れ基準に適合するまで保存する。全ての出荷試験が完了し、製品が薬局に出荷されるまで、患者の免疫化は予定されない。
【０４３５】
或いは、各免疫日に、まだ本明細書に記載されるとおりのバイオセーフティキャビネット内での滅菌ろ過に供されていない１組（４つ）のバイアルを解凍し、バイオセーフティキャビネットに移す。各バイアルの内容物を別々のシリンジに抜き取る。０．２μｍの滅菌フィルタを取り付け、内容物をフィルタを介して滅菌バイアルに移す。フィルタを取り外し、完全性を確かめる。次に滅菌シリンジを使用して０．７５ｍｌのペプチド混合物を抜き取り、及びシリンジ間で移し替えることにより０．２５ｍｌポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））と混合する。
【０４３６】
分析：プールペプチドのアリコートに関して、インプロセス試験として３つの試験（外観、アイデンティティ及び残留溶媒）を行う。最終的なろ過の前に、解凍したペプチドプールのアリコートに関してエンドトキシンを試験する。最終製品の２つのバイアルを合わせた試料に関して無菌性を分析する。この手法をとるのは、最終的なろ過を行う前に、重要な生化学的情報（ペプチド溶解度、各プールにおける各ピークのアイデンティティ及び任意の残留溶媒のレベル）が利用可能であることを確実にするためである。プールされ及びろ過されたバルクペプチドプールの受け取り時、エンドトキシン試験及び微生物培養を実施して、微生物学的純度を評価する。製品の使用には、エンドトキシン規格に適合することが要求される。微生物培養試験において陽性結果があれば、製品使用に対するその影響を調べる。患者使用に最も近い試料である最終ろ過及びバイアル詰め後のバイアルに入った試料に関して、重要な安全性試験である無菌性の試験が行われる。
【０４３７】
実施例１１
投与
個別化されたネオ抗原ペプチド／ポリペプチドとの混合後、ワクチン（例えば、ペプチド＋ポリＩＣＬＣ）は皮下投与されることになる。
【０４３８】
個別化されたネオ抗原ペプチド／ポリペプチドプールの調製：ペプチドは、各々最大５個のペプチドの４つのプールに共に混合する。各プールの選択基準は、ペプチドが結合すると予測される詳細なＭＨＣ対立遺伝子に基づく。
【０４３９】
プール組成：プールの組成は、各ペプチドが結合すると予測される詳細なＨＬＡ対立遺伝子に基づき選択し得る。４つのプールは、別個のリンパ節流域（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂａｓｉｎ）に流れ出る解剖学的部位に注入される。同じＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチド間の抗原競合を可能な限り潜在的に低下させるためにこの手法が選択されたとともに、これには免疫応答の発生における患者の免疫系の幅広いサブセットが関わる。各患者について、最大４つの異なるＨＬＡ  Ａ及びＢ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドを同定する。一部のネオＯＲＦ由来ペプチドはいかなる特定のＨＬＡ対立遺伝子とも関連しない。ペプチドを異なるプールに分配する手法は、特定のＨＬＡ対立遺伝子に関連する各組のペプチドを４つのプールの可能な限り多くに広げることである。所与の対立遺伝子について４つより多くの予測ペプチドがある状況がある可能性が極めて高く、そのような場合、特定の対立遺伝子に関連する２つ以上のペプチドを同じプールに割り当てることが必要になる。いかなる特定の対立遺伝子にも関連しないネオＯＲＦペプチドは、残りのスロットに無作為に割り当てられる。一例を以下に示す。
【０４４０】
【表１２】
2019131568.tif 000014
【０４４１】
可能な場合は常に、同じＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドを別個のプールに置く。一部のネオＯＲＦペプチドは、患者のいかなるＭＨＣ対立遺伝子にも結合しないと予測される。しかしながらこれらのペプチドはなおも利用することができ、その主な理由は、それらが完全に新規であり、従って中枢性トレランスの免疫抑制効果に供されず、従って免疫原性である確率が高いことである。ネオＯＲＦペプチドはまた、いかなる正常細胞にも等価な分子がないため、それの持つ自己免疫の可能性も劇的に低下している。加えて、予測アルゴリズムから生じる偽陰性があり、このペプチドがＨＬＡクラスＩＩエピトープを含む可能性がある（ＨＬＡクラスＩＩエピトープは現在のアルゴリズムに基づくと高い信頼性では予測されない）。特定のＨＬＡ対立遺伝子で同定されない全てのペプチドは、個々のプールに無作為に割り当てられる。各ペプチドの量は、注入１回当たり３００μｇの各ペプチドの最終用量に基礎を置いている。
【０４４２】
各患者について、製造者により各々５つの合成ペプチドの４つの個別的なプール（「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」の表示を付す）が調製され、これらを−８０℃で保存する。免疫当日、１つ又は複数のペプチド成分とポリＩＣＬＣとからなる完全なワクチンが研究薬局において調製される。各一つのバイアル（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を室温で解凍し、残りのステップのためバイオセーフティキャビネット内に移す。０．７５ｍｌの各ペプチドプールをバイアルから別々のシリンジに抜き取る。別途、ポリＩＣＬＣの４つの０．２５ｍｌ（０．５ｍｇ）アリコートを別々のシリンジに抜き取る。次に、各ペプチド−プールが入ったシリンジの内容物を０．２５ｍｌアリコートのポリＩＣＬＣと、シリンジ間で移し替えることにより穏やかに混合する。この１ｍｌの混合物全てを注射に使用する。これらの４つの調製物に「試験薬Ａ」、「試験薬Ｂ」、「試験薬Ｃ」、及び「試験薬Ｄ」の表示を付す。
【０４４３】
各免疫日に、患者は、ポリＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））と混合された個別化ネオ抗原ペプチドの最大４つのプールの皮下注射を受ける。
ペプチドとＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）との各混合物の注射容積は１ｍｌである。
各ペプチドプールは、各々４００μｇ／ｍｌの濃度の最大５つのペプチドからなる。
ペプチドプールの組成は以下である：
各々４００μｇ／ｍｌの濃度の最大５つのペプチド
４％ＤＭＳＯ
４．８〜５％デキストロース水溶液
４．８〜５ｍＭコハク酸ナトリウム
Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）は以下からなる：
２ｍｇ／ｍｌポリＩ：ポリＣ
１．５ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン
５ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロースナトリウム
０．９％塩化ナトリウム
【０４４４】
各１ｍｌ注射容積は、４つのペプチドプールのうちの１つ０．７５ｍｌを０．２５ｍｌ  Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）と混合したものからなる。混合後、この組成は以下となる：
各々３００μｇ／ｍｌの濃度の最大５つのペプチド。
≦３％ＤＭＳＯ
３．６〜３．７％デキストロース水溶液
３．６〜３．７ｍＭコハク酸ナトリウム
０．５ｍｇ／ｍｌポリＩ：ポリＣ
０．３７５ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン
１．２５ｍｇ／ｍｌカルボキシメチルセルロースナトリウム
０．２２５％塩化ナトリウム
【０４４５】
注射：免疫化毎に、４つの試験薬の各々を一つの四肢に皮下注射する。個々の試験薬それぞれについて、治療期間全体にわたり免疫化毎に同じ四肢に投与する（即ち試験薬Ａを１日目、４日目、８日目等に左腕に注射し、試験薬Ｂを１日目、４日目、８日目等に右腕に注射し得る）。完全腋窩又は鼠径リンパ節郭清後の状態にある患者の代替的な解剖学的部位は、それぞれ左及び右横隔膜である。
【０４４６】
ワクチンはプライム／ブーストスケジュールに従い投与する。ワクチンのプライミング用量は、本明細書に示すとおり１、４、８、１５、及び２２日目に投与する。ブースト期には、ワクチンは８５日目（１３週目）及び１６９日目（２５週目）に投与する。
【０４４７】
少なくとも１用量のワクチン投与を受ける患者は全て、毒性に関して評価可能である。患者が誘導期の間に全てのワクチン接種を受け、且つ維持期に初回ワクチン接種（ブースト）を受けた場合、それらの患者は免疫学的活性に関して評価可能である。
【０４４８】
実施例１２
最終剤形の短期室温安定性
ペプチド安定性。ＤＭＳＯ中に溶解し、且つＤ５Ｗ／コハク酸塩（２ｍＭ）で２ｍｇ／ｍｌに希釈して４００μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度及び４％の最終ＤＭＳＯ濃度にプールすることにより、以下の表６に示す５つのペプチドからなるペプチドプール（プール３）を調製した。調製後、ペプチドは２５ｍｍ  Ｐａｌｌ  ＰＥＳフィルタ（カタログ番号４６１２）でろ過し、Ｎｕｎｃクライオバイアル（＃３７５４１８）に１ｍｌアリコートで分注した。
【０４４９】
【表１３】
2019131568.tif 000015
【０４５０】
剤形調製の計画どおり０．７５ｍｌのプール３を０．２５ｍｌ  Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）と混合することにより、３つの試料を調製した。次に試料を室温に０、４及び６時間放置し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した（表７）。５個中４個のペプチドについて変化は認められなかった。ペプチドＣＳ６９１９に関して第２のピークの僅かな増加が認められたとおり、４時間及び６時間で１４％からそれぞれ１７％及び１８％に増加した。−２０℃安定性試験で認められたとおり、ペプチドＣＳ６９１９及びＣＳ６９３４（両方ともにプール４に存在）は、ヘテロ二量体（質量分析法によって示されるとき）を形成することができ、これはこの不純物の位置で溶出する。全てのペプチドの回収率は９０％を上回ったことから、室温で６時間インキュベートした後に最終剤形中のペプチドの分解及び損失がないことが示される。
【０４５１】
【表１４】
2019131568.tif 000016
【０４５２】
ポリＩＣＬＣ安定性。第２の試験では、別のペプチドプール（プール４）を使用し、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）と混合し（０．７５ｍｌペプチドプール＋０．２５ｍｌ  Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、室温で６時間保存した。次に室温でインキュベートしたペプチド＋Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）混合物及びＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）単独（４℃で連続的に保存した）を２０ｕｇ／ｍｌポリＩＣＬＣとなるように希釈し、既発表の方法に従いマウス樹状細胞を使用してＴＬＲ刺激に関してアッセイした。２４時間の刺激後、定量的ＰＣＲを使用して、図６に示すとおり複数の重要な免疫マーカーの誘導レベルをアッセイした。最終製剤中のペプチドプールで室温で６時間後のポリＩＣＬＣの刺激能力に違いはなかったことから、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）はいかなる製剤成分（ＤＭＳＯ［４％］、Ｄ５Ｗ、５ｍＭコハク酸塩、ペプチド）によっても影響を受けず、最終剤形中において室温で６時間まで安定していたことが示される。
【０４５３】
実施例１３
最終製剤形態の凍結乾燥
ペプチドの製剤は以下のとおりである：各ペプチドプールは、各々が４００μｇ／ｍｌの濃度の最大５つのペプチドからなる。ペプチドプールの組成は以下である：
各々が４００μｇ／ｍｌの濃度の最大５つのペプチド
４〜８％ＤＭＳＯ
４．６〜４．８％デキストロース水溶液
５ｍＭコハク酸ナトリウム
【０４５４】
安定化に使用される増量剤は、デキストロース水溶液（Ｄ５Ｗ）である。最終製剤は、製剤マトリックスの熱的特性に基づく。変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）データから、ＤＭＳＯの融解に起因するそれぞれ−２４℃及び−５６℃の２つのガラス転移温度（Ｔｇ’）及び−６７℃での発熱反応の存在が示唆された。文献に基づけば、Ｄ５Ｗのガラス転移は−４３℃である。ＭＤＳＣデータは、ＤＭＳＯの存在がガラス転移温度をさらに低下させることを示唆する。この情報に基づき、２つのさらなる増量剤、スクロース及びトレハロースを使用してペプチドの凍結乾燥の実現可能性を確認した。以下の製剤をＭＤＳＣ分析で評価した（図７〜図９）：
１．５％Ｄ５Ｗ及び０．８％ＤＭＳＯ
２．１０％スクロース及び０．８％ＤＭＳＯ
３．１０％トレハロース及び０．８％ＤＭＳＯ
【０４５５】
保存的凍結乾燥サイクルを使用して−５０℃で３時間凍結し、−３５℃、７５ミリトルで３０時間及び−３０℃で３０時間一次乾燥することによって上記の製剤を凍結乾燥した（図１０及び図１１）。Ｄ５Ｗ−ＤＭＳＯを含有する製剤は完全に崩壊したが、しかしＤ５Ｗ単独を含有する製剤については部分的なケーキが見られる。この凍結乾燥結果から、０．８％ＤＭＳＯの存在下では、トレハロース又はスクロースを含有する製剤は、デキストロースを含有する製剤と比べて凍結乾燥に適合性がより高いことが示唆される（図１２）。
【０４５６】
試料（２５μＬ）を、以下のプログラムを使用したＭＤＳＣによって分析した。以下のパラメータを使用して熱イベントをモニタした：
１．２０．００℃に平衡化させる
２．等温５．００分間
３．６０秒毎に±１．００℃調節する
４．データ保存：オン
５．−７０℃までランプ１．００℃／分
６．−７０℃に平衡化させる
７．等温５．００分間
８．２０．００℃までランプ１．００℃／分
９．２０．００℃に平衡化させる
１０．データ保存：オフ
１１．等温５分間
１２．方法終了
【０４５７】
凍結乾燥。ＭＤＳＣを用いて、製品の一次乾燥及び凍結温度を選択するために使用するガラス転移温度（Ｔｇ）を決定した（表８及び図７〜図９）。データは、全ての製剤においてＤＭＳＯの融解が約−６８℃で起こることを示している。３つ全ての製剤について、２つのガラス転移がある。デキストロース、トレハロース又はスクロースを含有する製剤は、それぞれ−５９℃、−４２℃及び−５０℃の最低ヒートフローガラス転移を有することから、崩壊／融解なしにＤ５Ｗ−ＤＭＳＯを含有する製剤を凍結乾燥することは困難であると示唆される。
【０４５８】
【表１５】
2019131568.tif 000017
【０４５９】
凍結乾燥は、最初にＮｕｎｃバイアルで試し、ｎｕｎｃバイアルの構成は製剤マトリックスの凍結乾燥に適切でないことが分かった。４つの１．８ｍＬ滅菌Ｎｕｎｃバイアル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の１ｍｌの５％Ｄ５Ｗ及び０．８％ＤＭＳＯ製剤を、凍結乾燥サイクル（−５０℃に凍結して２時間保持し、−１５℃で２０時間、７５ミリトルでの一次乾燥、及び８時間の２０℃、７５ミリトル圧力での二次乾燥）を使用して凍結乾燥した。バイアル中にケーキはないことが観察され、Ｎｕｎｃバイアルの底に小さい液滴の形態の液状残留ＤＭＳＯ及びＤ５Ｗが認められた。
【０４６０】
凍結乾燥に好適なフリントバイアルを選択し、リード製剤の凍結乾燥の実現可能性を決定した。１．５ｍｌの各製剤が入った５つのバイアルを３ｍＬ  １３ｍｍフリントバイアルに充填し、１３ｍｍ凍結乾燥用栓で部分的に閉鎖し、凍結乾燥のためＬｙｏｓｔａｒ  ＩＩの中段の棚に保管した。
【０４６１】
−５０℃未満のガラス転移を有する製剤を凍結乾燥することは困難である。ガラス転移温度に基づき、凍結乾燥について以下の保存的凍結乾燥パラメータを設定した（表９）。圧力プロファイル及び温度プロファイルに関して得られた結果をそれぞれ図１０及び図１１に提供する。一次及び二次乾燥の間にピラニ圧力は棚の設定圧力未満に達したことから、チャンバ内に水分がなく（図１０）、凍結乾燥サイクルが完了していることが示唆される。
【０４６２】
【表１６】
2019131568.tif 000018
【０４６３】
ケーキの外観。Ｄ５Ｗ及びＤＭＳＯを含有する製剤は完全に崩壊して融解し、一方、トレハロース−ＤＭＳＯ又はスクロース−ＤＭＳＯを含有する製剤は、やや崩壊した白色の非晶質ケーキを有する（図１２）。
【０４６４】
このように本発明の好ましい実施形態が詳細に記載されているが、上記の段落によって定義される本発明は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなくその多くの明らかな変形例が可能であるため、上記の記載に示される特定の詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。
【図１】
2019131568.tif 000019
【図２】
2019131568.tif 000020
【図３】
2019131568.tif 000021
【図４】
2019131568.tif 000022
【図５】
2019131568.tif 000023
【図６】
2019131568.tif 000024
【図７】
2019131568.tif 000025
【図８】
2019131568.tif 000026
【図９】
2019131568.tif 000027
【図１０】
2019131568.tif 000028
【図１１】
2019131568.tif 000029
【図１２】
2019131568.tif 000030
【配列表】
2019131568000001.app
【外国語明細書】
2019131568000001.pdf