(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的にかつ費用効率が高い様式でCRM197タンパク質を産生するより優れた方法を提供する。【解決手段】組み換えタンパク質の産生のための細胞、組成物、および方法を開示する。特に、大腸菌(E. coli)から高レベルの可溶性組み換えCRM197タンパク質を得るための産生プロセスを開示する。細胞は好ましくは、ジスルフィド還元酵素活性が低下するように、ジスルフィド還元酵素遺伝子の一つまたは複数の変異を含む。また、CRM197のための精製方法および適切に折りたたまれたCRM197タンパク質の特徴づけも開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードするポリシストロン性遺伝子配列に機能的に連結した誘導プロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
【請求項２】
組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、請求項1記載の方法。
【請求項３】
各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリシストロン性遺伝子配列が、一つまたは複数のリボソーム結合部位と一つまたは複数の開始コドンとの間に少なくとも一つのスペーサーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
請求項8記載の方法により単離されたCRMタンパク質。
【請求項１１】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結された誘導プロモーター、リボソーム結合部位と開始コドンなどのスタートコドンとの間のスペーサー配列、該CRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、前記段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
【請求項１２】
組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
組み換え細胞の改変が、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
CRMコード配列がCRM197をコードする、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
スペーサーが9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む、請求項11記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、請求項11記載の方法。
【請求項２２】
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、請求項11記載の方法。
【請求項２３】
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、請求項11記載の方法。
【請求項２４】
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、請求項11記載の方法。
【請求項２５】
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
請求項24記載の方法により単離されたCRMタンパク質。
【請求項２７】
単離されたCRMタンパク質を結合する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項２８】
結合されたCRMタンパク質がワクチンである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
請求項28記載の方法により作製されたCRMタンパク質ワクチン。
【請求項３０】
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
CRMコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
該CRMコード配列からCRMタンパク質を発現する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
【請求項３１】
組み換え細胞が、原核または真核細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
原核細胞が、大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
プロモーターが構成的または誘導性である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
CRMコード配列が、CRM197をコードする、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
改変された組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサー配列を含む、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
スペーサーが、9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
発現ベクターが、発現エンハンサーを含む、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位と開始コドンとを含む、請求項30記載の方法。
【請求項４４】
単離する段階が以下を含む、請求項30記載の方法：
ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムに、CRMタンパク質を負荷する段階、
一種または複数種の洗浄バッファーで該樹脂を洗浄する段階、
溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階。
【請求項４５】
ローディングバッファーおよび洗浄バッファーが同じであってもよい、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ローディングバッファーおよび一種または複数種の洗浄バッファーが、約10 mS/cm以下の伝導率を有する低伝導率バッファーである、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
溶出バッファーが、約10 mS/cm以上の伝導率を有する高伝導率バッファーである、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
樹脂が、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂からなる群より選択される、請求項44記載の方法。
【請求項４９】
以下を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法：
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および
測定された結合の量によって、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が正しい折りたたみを示す、前記段階。
【請求項５０】
ジフテリア毒素またはCRMが受容体結合ドメインを含有する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
CRMタンパク質がCRM197を含む、請求項49記載のCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法。
【請求項５２】
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質およびHB-EGFのうちの少なくとも一つが、固相支持体に結合されている、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量が、ELISAにより決定される、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
HB-EGFに結合するCRMタンパク質がPBSにおいて可溶性であり、かつ約pH7.5のバッファー中5 mg/ml以上に濃縮される、請求項49記載の方法。
【請求項５５】
プロモーターと、それぞれがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンとを含む発現ベクターであって、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードし、各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有している、前記発現ベクター。
【請求項５６】
リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含む、請求項55記載の発現ベクター。
【請求項５７】
スペーサーが、5〜20ヌクレオチドを含む、請求項56記載の発現ベクター。
【請求項５８】
スペーサーが9ヌクレオチドを含まない、請求項56記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、参照によりその全てが具体的に組み入れられる、2014年1月31日に出願された、同じ発明の名称の、米国仮出願第61/934,377号の優先権を主張する。
【０００２】
1.  発明の分野
本発明は、細菌宿主における組み換えタンパク質産生の分野に関する。特に、本発明は、大腸菌(E. coli)から高レベルの可溶性の組み換えCRM197タンパク質を得るための産生プロセスに関する。本発明はまた、CRM197のための精製および特徴づけ方法、ならびに該方法により産生されたCRM197の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
2.  背景の説明
ジフテリア毒素(DT)は、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)の病原性株により合成および分泌されるタンパク性外毒素である。これらの病原性株は、毒素遺伝子を有する、バクテリオファージによる溶原菌を含む。ジフテリア毒素は、535残基の酵素前駆体として分泌されて、トリプシン様プロテアーゼにより2つのフラグメント(AおよびB)の放出を伴ってプロセシングされる、ADP-リボシル化酵素である。フラグメントAは、基質としてNADを使用し、ニコチンアミド環とN-リボースの間のN-グリコシド結合の切断を触媒し、伸長因子EF-2の修飾されたヒスチジン715(ジフタマイド)へのADP-リボースの共有結合転移(covalent transfer) (ADPRT活性)を媒介する。この翻訳後ジフタマイド修飾は、EF-2を不活性化し、タンパク質合成を停止させて、細胞死をもたらす。DTのAフラグメント(Cドメインとも呼ばれる)は触媒活性部位を有しており、かつこれは、中毒の最終段階で必要とされる、毒素の唯一のフラグメントである。Bフラグメント上にあるRドメインは、宿主細胞表面上の受容体への結合を媒介し、および同じくBフラグメント上にあるTドメインは、細胞質へのフラグメントAのpH依存性転移を促進する。アルギニンリッチジスルフィド連結ループはフラグメントAをフラグメントBに(つまり、ドメインCをドメインTRに)結合させる。この鎖間ジスルフィド結合は、鎖の186位でのタンパク分解切断後の、2つのフラグメントの間の唯一の共有連結である。さまざまな非毒性および部分的毒性の免疫学的公差反応型のジフテリア毒素(CRMまたは公差反応性物質)の単離により、CRM197の発見がもたらされた(Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973（非特許文献1）; またGiannini et al. Nucleic Acids Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9（非特許文献2）も参照されたい)。好ましくは、CRMは、任意の大きさのものであり得、かつDTの全てまたは一部を含有する組成物であり得る。
【０００４】
CRM197は、1アミノ酸置換G52Eを含有する主に酵素的に不活性かつ非毒性型のジフテリア毒素である。この変異は、NAD結合部位の前にある活性部位ループの本来備わっている柔軟性を引き起こして、NADに結合するCRM197の能力を低下させ、DTの毒性の性質を取り除く(Malito et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(14): 5229-342012（非特許文献3）)。DT同様に、CRM197は2つのジスルフィド結合を有している。1つ目のジスルフィドは、Cys186をCys201につないで、フラグメントAをフラグメントBに連結させる。2つ目のジスルフィド架橋は、フラグメントB内でCys461をCys471につなぐ。DTとCRM197はいずれも、フラグメントA関連のヌクレアーゼ活性を有している(Bruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2995-8, 1990（非特許文献4）)。
【０００５】
多くの抗原は、化学的にタンパク質に連結(「結合」)して、結合体または結合型ワクチンを形成しない限り、特に幼児において、免疫原性が低い。これらの結合型ワクチンのタンパク質成分はまた「担体タンパク質」とも呼ばれる。CRM197は、一般に、タンパク質-炭水化物およびハプテン-タンパク質結合体のための担体タンパク質として使用される。担体タンパク質として、CRM197は、ジフテリアトキソイドおよび他のトキソイドタンパク質と比較して複数の利点を有しており、その多くは報告されている(Shinefield Vaccine, 28:4335, 2010, Broker et al, Biologicals, 39:195 2011（非特許文献5）)。例えば、CRM197は遺伝的に無毒化されているため、結合のために使用されるが化学トキソイド化(chemical toxoiding)によりブロックされるより多くのリジンを保持する。CRM197に化学的に連結した最大13種類の莢膜多糖体からなるワクチンであるPREVNAR(商標)(Pfizer)の成功により証明されるように、CRM197は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumonia)莢膜多糖体用の効果的な担体タンパク質であることが判明している。破傷風トキソイドと比較すると、特に、同じ担体タンパク質に連結した多くの個々の多糖体がある場合、免疫応答の担体誘導型抑制が弱いことを示唆する証拠もある。
【０００６】
CRM197および天然のDTは、HB-EGF前駆体であるプロHB-EGFと同一のアミノ酸配列を有するジフテリア毒素受容体(DTR)に対して類似の親和性を有している(Mitamura et al., J. Biol. Chem. 272(43):27084-90, 1997（非特許文献6）)。CRM197は、膜型プロHB-EGFだけでなく可溶型HB-EGFにも結合し、そのEGF受容体への結合を防ぐことによりHB-EGFの有糸分裂作用を阻害する。したがって、CRM197はまた、癌治療における今後期待される役割も有し得る(Miyamoto et al., Anticancer Res. Nov-Dec 27(6A):3713-21, 2007（非特許文献7）)。
【０００７】
CRM197は、本来の宿主であるコリネバクテリウム(Corynebacterium)において産生されているが、収率が低く概して50mg/L未満であり、加えて、コリネバクテリウムの増殖は、例えば大腸菌と比べて、比較的遅い。高レベルでCRM197を産生するように設計されたコリネバクテリウムの専売株がある(米国特許第5,614,382号（特許文献1）)。CRM197はまたシュードモナス・フルオレッセンス(Psuedomonas fluorescens)の専売株でも発現され、かつ高レベルで発現されている。大腸菌は、培養および増殖させるのに費用がかからないBL1レベルの生物なので、大腸菌におけるCRM197の産生は有利であろう。大腸菌におけるCRM197の産生は、大部分が不溶性の封入体(一般に不溶性)をもたらし、この事は次に困難なリフォールディング過程を必要とし、低い収率(EP20100742260（特許文献2）)または付加ペプチド配列(タグ)を伴う結果となった(J Biotechnol. 2010 Dec 20; 156(4):245-52, Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli. Stefan A, Conti M, Rubboli D, Ravagli L, Presta E, Hochkoeppler A（非特許文献8）)。大量タンパク質産生に適した大腸菌における可溶性のタグ無しCRM197の過剰発現のための方法は、報告されていない。したがって、効率的にかつ費用効率が高い様式でCRM197を産生するより優れた方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,614,382号
【特許文献２】EP20100742260
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Uchida et al., Journal of Biological Chemistry 248, 3845-3850, 1973
【非特許文献２】Giannini et al. Nucleic Acids Res. 1984 May 25; 12(10): 4063-9
【非特許文献３】Malito et al., Proc Natl Acad Sci USA 109(14): 5229-342012
【非特許文献４】Bruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2995-8, 1990
【非特許文献５】Shinefield Vaccine, 28:4335, 2010, Broker et al, Biologicals, 39:195 2011
【非特許文献６】Mitamura et al., J. Biol. Chem. 272(43):27084-90, 1997
【非特許文献７】Miyamoto et al., Anticancer Res. Nov-Dec 27(6A):3713-21, 2007
【非特許文献８】J Biotechnol. 2010 Dec 20; 156(4):245-52, Overexpression and purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in Escherichia coli. Stefan A, Conti M, Rubboli D, Ravagli L, Presta E, Hochkoeppler A
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、現行のストラテジーおよび設計に関する問題および不利な点を克服して、CRMを産生するための新規な組成物および方法を提供する。
【００１１】
本発明の一つの態様は、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードするポリシストロン性遺伝子配列に機能的に連結した誘導プロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および発現されたCRMタンパク質を単離する段階を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法に指向する。好ましくは、組み換え細胞は、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下しており、および同じく好ましくは、各シストロンはリボソーム結合部位および開始コドンを含む。好ましくは、ポリシストロン性遺伝子配列は、一つまたは複数のリボソーム結合部位と一つまたは複数の開始コドンの間に少なくとも一つのスペーサーを含む。好ましくは、細胞により発現されたCRMタンパク質は可溶性であり、および同じく好ましくは、発現されたCRMタンパク質は、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである。好ましくは、組み換え細胞は、約15℃〜約32℃の温度で増殖し、および同じく好ましくは、CRMタンパク質はクロマトグラフィにより細胞から単離される。好ましいクロマトグラフィ媒体は、例えばデキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む。本発明の別の態様は、本発明の方法により単離されたCRMタンパク質を含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結された誘導プロモーター、リボソーム結合部位とATGコドンの間のスペーサー配列、CRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、前記段階、CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および発現されたCRMタンパク質を単離する段階を含む、好ましくはCRM197などのCRMタンパク質の全体または一部を産生する方法に指向する。組み換え細胞は、真核細胞または原核細胞でもよい。好ましくは、組み換え細胞は、例えば大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株などの原核細胞である。好ましくは、組み換え細胞の改変は、例えば、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシンおよびチオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数などの一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む。好ましくは、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる。好ましくは、CRMコード配列は、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする。好ましくは、スペーサーは、例えば、5から20ヌクレオチドなどの、9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む。好ましくは、発現エンハンサーは、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む。好ましくは、細胞により発現されたCRMタンパク質は可溶性であり、かつ、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである。好ましくは、組み換え細胞は、約15℃〜約32℃の温度で増殖する。
【００１３】
好ましくは、CRMタンパク質は、好ましいクロマトグラフィ媒体としてデキストラン硫酸塩樹脂、活性硫酸塩樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含むクロマトグラフィによって細胞から単離される。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明の方法により単離されたCRMタンパク質に指向する。好ましくは、単離されたCRMタンパク質は結合され、そして該結合したCRMタンパク質がワクチンとして製剤化される。
【００１５】
本発明の別の態様は、例えば、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせ、および好ましくはCRM197をコードするCRMコード配列から産生されたタンパク質またはペプチドなどのCRMタンパク質の全体または一部を産生する方法であって、リボソーム結合部位の後にあるEESコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、リボソーム結合部位の後にあるCRMコード配列からCRMタンパク質を発現する段階、および発現されたCRMタンパク質を単離する段階を含む、方法に指向する。好ましくは、組み換え細胞は原核または真核細胞であり、好ましくは原核細胞は大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である。好ましくは、プロモーターは構成的または誘導性である。好ましくは、組み換え細胞は、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている。好ましくは、改変された組み換え細胞は、チオール-ジスルフィド酸化還元酵素、およびまたはチオレドキシンおよびグルタレドキシン系に関与する酵素(例えば、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、グルタチオン還元酵素)のうちの一つまたは複数の活性が低下している。好ましくは、発現ベクターは、リボソーム結合部位、発現エンハンサー配列(例えば、SEQ ID 15)を含みこれにより制御され、または、例えばCRMコード配列の上流のリボソーム結合部位の上流にT7タグ配列を含む。
【００１６】
本発明の別の態様は、ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムにCRMタンパク質を負荷する段階であって、該樹脂が、好ましくはデキストラン硫酸塩樹脂、活性硫酸塩樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂またはヘパリン様樹脂である、前記段階、一種または複数種の洗浄バッファーで樹脂を洗浄する段階、および溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階を含む、CRMタンパク質を単離するおよび／または精製するための方法に指向する。好ましくは、ローディングバッファーおよび洗浄バッファーは、同一成分であるかまたは同一成分を含有し、および同一もしくは類似の量である。好ましくは、ローディングバッファーと一種または複数種の洗浄バッファーは、例えば、伝導率が約10 mS/cm以下(例えば、1 mS/cm, 2 mS/cm, 3 mS/cm, 4 mS/cm, 5 mS/cm, 6 mS/cm, 7 mS/cm, 8 mS/cm, 9 mS/cm)である、Tris-HCl、HEPES、リン酸ナトリウムバッファーなどの低伝導率バッファーである。好ましくは、溶出バッファーは、例えば、伝導率が約10 mS/cm以上(例えば、12 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 20 mS/cm, 25 mS/cm, 30 mS/cm, 40 mS/cm, 50 mS/cm, 60 mS/cm, 70 mS/cm, 80 mS/cm, 90 mS/cm, 100 mS/cmまたはそれより大きい)である、例えばNaClまたはKClなどの添加された塩を有するバッファーなどの高伝導率バッファーである。
【００１７】
本発明の別の態様は、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および測定された結合の量によってジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が正しい折りたたみを示す、前記段階、を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法に指向する。好ましくは、ジフテリア毒素またはCRMは受容体結合ドメインを含有する。好ましくは、CRMタンパク質は、CRM197を含む。同じく好ましくは、ジフテリア毒素もしくはCRMタンパク質および／またはHB-EGFの少なくとも一つが、固相支持体に結合される。好ましくは、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量はELISAにより決定され、かつHB-EGFに結合するCRMタンパク質はPBS中で可溶性である。
【００１８】
本発明の別の態様は、プロモーター、および少なくとも一つがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンを含む発現ベクターを含み、ここで少なくとも一つシストロンがCRMタンパク質をコードし、かつ各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有する。好ましくは発現ベクターはリボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含み、同じく好ましくは、スペーサーは5〜20ヌクレオチドを含む。好ましくは、スペーサーは9ヌクレオチドを含まない。
【００１９】
[本発明1001]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードするポリシストロン性遺伝子配列に機能的に連結した誘導プロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1002]
組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1001の方法。
[本発明1003]
各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ポリシストロン性遺伝子配列が、一つまたは複数のリボソーム結合部位と一つまたは複数の開始コドンとの間に少なくとも一つのスペーサーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
本発明1008の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1011]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階であって、該組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されており、かつ該発現ベクターが、CRMコード配列に機能的に連結された誘導プロモーター、リボソーム結合部位と開始コドンなどのスタートコドンとの間のスペーサー配列、該CRMコード配列の上流の発現エンハンサー領域を含む、前記段階、
CRMタンパク質を産生するために該発現ベクターを誘導する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1012]
組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
組み換え細胞の改変が、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトさせる、本発明1011の方法。
[本発明1016]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1011の方法。
[本発明1017]
CRMコード配列がCRM197をコードする、本発明1011の方法。
[本発明1018]
スペーサーが9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1011の方法。
[本発明1019]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位とATGコドンとを含む、本発明1011の方法。
[本発明1021]
前記細胞により発現されたCRMタンパク質が可溶性である、本発明1011の方法。
[本発明1022]
発現されたCRMタンパク質が、細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである、本発明1011の方法。
[本発明1023]
組み換え細胞が、約15℃〜約32℃の温度で増殖する、本発明1011の方法。
[本発明1024]
CRMタンパク質が、クロマトグラフィによって前記細胞から単離される、本発明1011の方法。
[本発明1025]
クロマトグラフィが、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
本発明1024の方法により単離されたCRMタンパク質。
[本発明1027]
単離されたCRMタンパク質を結合する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1028]
結合されたCRMタンパク質がワクチンである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
本発明1028の方法により作製されたCRMタンパク質ワクチン。
[本発明1030]
以下を含む、CRMタンパク質の全体または一部を産生する方法：
CRMコード配列に機能的に連結したプロモーターを含む発現ベクターを含有する組み換え細胞を提供する段階、
該CRMコード配列からCRMタンパク質を発現する段階、および
発現された該CRMタンパク質を単離する段階。
[本発明1031]
組み換え細胞が、原核または真核細胞である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
原核細胞が、大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プロモーターが構成的または誘導性である、本発明1030の方法。
[本発明1034]
CRMコード配列が、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする、本発明1030の方法。
[本発明1035]
CRMコード配列が、CRM197をコードする、本発明1030の方法。
[本発明1036]
組み換え細胞が、未改変の組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態を、より酸化の状態にシフトさせるように改変されている、本発明1030の方法。
[本発明1037]
改変された組み換え細胞の、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性が低下している、本発明1036の方法。
[本発明1038]
一つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
発現ベクターが、リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサー配列を含む、本発明1030の方法。
[本発明1040]
スペーサーが、9個を上回るまたは9個未満のヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
スペーサーが、5から20ヌクレオチドを含む、本発明1039の方法。
[本発明1042]
発現ベクターが、発現エンハンサーを含む、本発明1030の方法。
[本発明1043]
発現エンハンサーが、CRMコード配列の上流のリボソーム結合部位と開始コドンとを含む、本発明1030の方法。
[本発明1044]
単離する段階が以下を含む、本発明1030の方法：
ローディングバッファーと共に樹脂を含有するクロマトグラフィカラムに、CRMタンパク質を負荷する段階、
一種または複数種の洗浄バッファーで該樹脂を洗浄する段階、
溶出バッファーで樹脂からCRMタンパク質を溶出させる段階。
[本発明1045]
ローディングバッファーおよび洗浄バッファーが同じであってもよい、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ローディングバッファーおよび一種または複数種の洗浄バッファーが、約10 mS/cm以下の伝導率を有する低伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1047]
溶出バッファーが、約10 mS/cm以上の伝導率を有する高伝導率バッファーである、本発明1044の方法。
[本発明1048]
樹脂が、デキストラン硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂からなる群より選択される、本発明1044の方法。
[本発明1049]
以下を含む、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法：
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質をHB-EGFに接触させる段階、
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量を測定する段階、および
測定された結合の量によって、ジフテリア毒素またはCRMタンパク質の折りたたみを判定する段階であって、該結合が正しい折りたたみを示す、前記段階。
[本発明1050]
ジフテリア毒素またはCRMが受容体結合ドメインを含有する、本発明1049の方法。
[本発明1051]
CRMタンパク質がCRM197を含む、本発明1049のCRMタンパク質の折りたたみを特徴づける方法。
[本発明1052]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質およびHB-EGFのうちの少なくとも一つが、固相支持体に結合されている、本発明1049の方法。
[本発明1053]
ジフテリア毒素またはCRMタンパク質のHB-EGFへの結合の量が、ELISAにより決定される、本発明1049の方法。
[本発明1054]
HB-EGFに結合するCRMタンパク質がPBSにおいて可溶性であり、かつ約pH7.5のバッファー中5 mg/ml以上に濃縮される、本発明1049の方法。
[本発明1055]
プロモーターと、それぞれがタンパク質をコードする2つ以上のシストロンとを含む発現ベクターであって、少なくとも一つのシストロンがCRMタンパク質をコードし、各シストロンがリボソーム結合部位および開始コドンを有している、前記発現ベクター。
[本発明1056]
リボソーム結合部位と開始コドンの間にスペーサーをさらに含む、本発明1055の発現ベクター。
[本発明1057]
スペーサーが、5〜20ヌクレオチドを含む、本発明1056の発現ベクター。
[本発明1058]
スペーサーが9ヌクレオチドを含まない、本発明1056の発現ベクター。
本発明の別の態様および利点は、一部は以下の説明に記述されており、および一部はこの説明から自明であるか、または本発明の実施から認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】いずれも太字で示されたリボソーム結合部位(RBS)およびスタートコドン(ATG)を有し、下線を付されたスペーサー配列を有する、ベクター構成crm7 (SEQ ID NO 10)、crm7_2 (SEQ ID NO 11)、crm 8 (SEQ ID NO 12)、crm 9 (SEQ ID NO 13)、およびcrm 12 (SEQ ID NO 14)の概略図。
【図２】2 μg/mlのpn6Bでコーティングされたimmunotechプレート上でのマウス抗pn6B血清の力価測定の結果。
【図３】pn14がコーティングされたプレート上での抗pn14血清の力価測定の結果。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
可溶性で無傷の組み換えCRMは、最初はプロテアーゼ欠損大腸菌で産生された(Bishai et.al 1987)。しかしながら、タンパク質産生の量は極めて少なかった。次に、CRM197が、封入体として(Stefan A, et al. J Biotechnol. Dec 20;156(4):245-52, 2010;国際公開公報第2011/126811号, 中国特許出願第200610042194号)、またはシグナルペプチドによりペリプラズムに移動する可溶性タンパク質として(国際公開公報第2011/042516号)、大腸菌細胞内で産生された。大腸菌のペリプラズムは、ジスルフィド結合の形成を可能にする酸化環境である。CRM197は、正しい折りたたみおよび機能のために、ならびにタンパク質可溶性のためにおそらく重要である2つのジスルフィド結合を有する。
【００２２】
驚くべきことに、可溶性の組み換えCRMタンパク質の切断されていない一本鎖が、細胞内でかつ商業量で微生物から迅速に産生され、そしてその後、大量に単離および／または精製され得、かつ可溶性のままであるということが発見された。CRMはリン酸緩衝食塩水(PBS, pH 7.5)および他の類似のバッファー中で可溶性であり、かつこのおよび他のバッファー中で可溶性を維持しながら5 mg/mlを上回るまで濃縮され得る。コリネバクテリア(Cornybacter)中で発現されたCRMはこれらのバッファー中で濃縮されることができるが、シュードモナス(Pseudomonas)中で作られ、かつペリプラズム中に発現されたCRMは、これらの同じバッファー(Pfenex Inc., San Diego, CA)中で容易に濃縮されることができない。ペリプラズムでの発現と比較した細胞内発現のさらなる利点は、ペリプラズム空間が細胞空間と比較して制限されているので、より高い発現レベルが達成されるということである。
【００２３】
産生された好ましいCRMタンパク質は、完全長であるか、または例えばペプチド、単一もしくは多重ドメインもしくはエピトープ、ならびに一つまたは複数の欠失、置換および／もしくは付加(例えば、保存的または非保存的)で改変されたCRM配列、および宿主生物における発現を促進する付加配列(例えば、一つまたは複数のプロモーター、スタートコドン、および翻訳因子、リボソームまたはポリメラーゼ結合部位)で改変されたCRM配列を含む、天然のCRMコード配列から発現された任意の特定領域などの部分領域である。好ましいCRMタンパク質は、CRM197である。可溶性であるCRMタンパク質の発現が好ましく、そうではなく、細胞の不溶性封入体として結合したCRMタンパク質の発現は、好ましくない。CRMタンパク質の発現および産生のための好ましい発現系は、細胞内の酸化の状態を有する微生物を含む。好ましい発現系は、組み換えまたは天然の真核または原核細胞であり得、ここで組み換え細胞は、非天然のCRMコード配列を含有する細胞を含む。好ましい原核細胞は、一つまたは複数の遺伝子変化(例えば、一つまたは複数の欠失または変異)を含む大腸菌株または別の細菌株である。好ましくは、一つまたは複数の遺伝子変化は、例えば、米国特許第7,410,788号(参照により組み入れられる)に開示されているように、細胞の細胞質の酸化還元状態を、野生型と比較して、より酸化の状態にシフトする。変化は、好ましくは、細胞質の酸化の状態を還元させる一つまたは複数のジスルフィド還元酵素遺伝子および／または他の遺伝子の活性を低下させる。好ましくは、活性の低下は、1つ、2つ、もしくは複数のジスルフィド還元酵素もしくは他の遺伝子の非発現もしくは発現の低下、または一つもしくは複数の発現されたジスルフィド還元酵素タンパク質もしくは他のタンパク質の活性を低下させる一つもしくは複数の変異に起因する。微生物細胞の好ましい株(例えば、組み換えの、遺伝子工学により操作された、または天然の真核または原核細胞)は、ジスルフィド結合を含みながら機能的なタンパク質のままである自然に折りたたまれたタンパク質を産生する能力が向上した。本発明の方法は、完全な、短縮型の、または改変されたCRMアミノ酸配列を含むCRMタンパク質の量を産生する。本発明にしたがって産生されたCRMタンパク質の量は、例えば、細菌細胞培養液のリッターあたりCRMタンパク質が600 mg以上などの驚くべきものである。
【００２４】
本発明の一つの態様は、大量のCRMタンパク質、および好ましくはCRM197の産生のための方法に指向する。産生量は、細菌細胞培養物1L当たりのmg（mg/L）として通常は定量化される。本発明の方法による、CRMタンパク質産生は、200mg/L以上、300mg/L以上、400mg/L以上、500mg/L以上、600 mg/L以上、700 mg/L以上、800 mg/L以上、900 mg/L以上、1,000 mg/L以上、1,500mg/L以上、または2,000mg/L以上である。本発明の好ましい量のCRM197は、完全長および短縮型CRMタンパク質を含む関連タンパク質、ならびにCRMタンパク質の改変されたアミノ酸配列を含む。改変は、一つまたは複数の保存的アミノ酸欠失、置換、および／または付加を含む。分子の機能的活性および／または免疫原性は、増大または低下するかもしれないが、保存的改変は、分子の機能的活性および／または免疫原性を維持するものである。CRMの保存的改変の例は、限定するものではないが、アミノ酸改変(例えば、1つの、2つの、およびそうでなければ短いアミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換)、ワクチンを形成する際の結合に利用できるリジン残基の39αアミノ基(リジンの第一級アミノ基)の外側の改変、DTの血清型変化に起因する改変、免疫原性を増大させるもしくは結合効率を増大させる改変、ヘパリンへの結合を実質的に変えない改変、適切な折りたたみもしくは3次元構造を維持する改変、ならびに／またはDTに対する防御免疫を提供するタンパク質もしくは該タンパク質の部分の免疫原性を有意に変えない改変を含む。
【００２５】
本発明の方法で使用される組み換え細胞は、好ましくは大腸菌細菌であり、好ましくは、例えば、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、グルタミン酸システインリアーゼ、ジスルフィド還元酵素、タンパク質還元酵素、および／またはグルタチオン還元酵素などの、例えば一つまたは複数のジスルフィド還元酵素遺伝子の変異などにより、細胞質の酸化還元状態をより酸化の状態にシフトするように遺伝子操作されている大腸菌である。好ましくは、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素遺伝子が変異し、その結果、細胞の細胞質の酸化還元状態が野生型と比較してより酸化の状態にシフトされるよう非機能的にまたはわずかに機能的にされている。酸化的タンパク質折りたたみは、ジスルフィド架橋の形成および異性化を伴い、かつCRM197を含む多くのタンパク質の安定性および可溶性において重要な役割を果たす。ジスルフィド架橋の形成および破壊は、一般に、チオール-ジスルフィド酸化還元酵素により触媒される。これらの酵素は、CXXC酸化還元活性化部位モチーフを伴う、3つのαへリックスにより囲まれた4ストランドβシートからなる一つまたは複数のTrxによる折りたたみを特徴とする。さまざまなTrxモジュールの集合体が、原核生物においておよび真核生物において見られる異なるチオール酸化還元酵素を作り上げるために利用されている。細菌のペリプラズムにおいて、DsbB-DsbAおよびDsbD- DsbC/DsbE/DsbGの対の複合作用により、タンパク質が適切な酸化状態で保たれる(Inaba 2009, Gruber et al, 2006)。多くのタンパク質発現系は当技術分野において周知であり、かつ市販されている。
【００２６】
特に好ましい微生物は、大腸菌発現株、例えば、細胞質においてジスルフィド結合したタンパク質を形成するように遺伝子工学により操作された、化学的コンピテント大腸菌K12細胞(例えばORIGAMI(商標) (EMD Millipore)およびSHUFFLE(商標) (New England Biolabs))を含む。酸化還元状態が高度に酸化的である、細胞および他の大腸菌株の他の株および種類も使用してもよい。例えば、ORIGAMI(商標)2宿主株は、チオレドキシン還元酵素(trxB)およびグルタチオン還元酵素(gor)遺伝子の両方に変異を有するK-12派生体であり、大腸菌細胞質においてジスルフィド結合形成を大いに向上させる。これらの株はカナマイシン感受性である; オリジナルのOrigami株と同様に、gor変異がテトラサイクリンによって依然として選択される。分子間のジスルフィド結合形成の可能性を低下させるために、trxBおよびgorに変異を含む株が、適切な折りたたみのためにジスルフィド結合形成を必要とするタンパク質の発現のためのみに推奨される。SHUFFLE(商標)細胞は、細胞質においてジスルフィド結合を含むタンパク質を形成するために遺伝子工学により操作された、化学的コンピテント大腸菌K12細胞である。好ましくは、これらの細胞は、trxB およびgorにおける変異および細胞質シャペロンジスルフィド結合イソメラーゼDsbCを含む。
2019205446.tif 000003
また好ましくは、細胞は、T7プロモーター駆動型タンパク質発現に適しており、かつ遺伝子型が
2019205446.tif 000004
であるものである。SHUFFLE(商標)株は、ジスルフィド結合イソメラーゼDsbCの染色体コピーを構成的に発現する。DsbCは、誤って酸化したタンパク質のその正しい形への修正を促進する。細胞質のDsbCはまた、ジスルフィド結合を必要としないタンパク質の折りたたみに役立ち得るシャペロンでもある。
【００２７】
細菌の培養物は、より高い温度(例えば、37℃)での溶解度と比較して、発現されたタンパク質(例えば、CRMまたはCRM197)の溶解度が増大するような温度で好ましくは培養される。好ましい培養温度は、30℃以下、好ましくは25℃以下、好ましくは20℃以下、好ましくは18℃以下、および好ましくは15℃から32℃である。
【００２８】
本発明の別の態様は、CRMを産生するためのベクター、ならびに、細胞および好ましくは原核細胞の細胞質において可溶性である、好ましくはCRM197などのCRMタンパク質の全体または一部を産生する方法に指向する。大腸菌において細胞内でCRMを発現する以前の試みは、CRM配列のみをコードするモノシストロン性mRNAに基づいており、封入体形成をもたらした。細胞の細胞質において可溶性CRMを産生する方法は、ポリシストロン性mRNAにおけるCRMの転写を提供する発現ベクターを用いて開発された。ポリシストロン性mRNAは、2以上のポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを意味している。原核細胞において、同じ生化学的または生理学的経路に関与する遺伝子は、多くの場合、遺伝子の単一ポリシストロン性mRNAへの転写を制御する1つのオペロンにグループ化される。オペロン中の遺伝子(シストロン)は、リボソーム結合部位配列に制御され、かつ複数のヌクレオチドによって分離され得るか、さらには重複配列であり得る。例えば、ガラクトースオペロン中にある時、第一遺伝子のストップコドンは、第二遺伝子スタートコドンの下流にある。オペロン中の遺伝子位置が、翻訳のおよびmRNA安定性の効果を介して、遺伝子発現レベルに強力に作用することも示された(Smolke, C. D., and Keasling, J. D. (2002) Effect of gene location, mRNA secondary structures, and RNase sites on expression of two genes in an engineered operon. Biotechnol. Bioeng. 80, 762-76)。下流遺伝子の発現レベルが、翻訳共役を介して上流遺伝子の発現によって増大されることが知られている(Schumperli, D., McKenney, K., Sobieski, D. a, and Rosenberg, M. (1982) Translational coupling at an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. Cell 30, 865-71)。本発明の一つの好ましい態様は、原核生物のプロモーターと、そのうち一つがCRMであるポリペプチドをコードする2つのシストロンとを含むベクターである。各シストロンは、リボソーム結合部位および例えばATGなどの開始コドンを含む。本発明は、CRMタンパク質を産生するために発現ベクターを誘導する段階、および発現されたCRMタンパク質を単離する段階をさらに含む。一つの好ましい態様において、第一のシストロンのためのストップコドンが、CRMの開始コドンの下流にあるように、CRM配列に先行する第一のシストロンはT7tag配列を含み、CRMのシストロンと部分的に重複する(例えば、SEQ ID NO 15)。発現エンハンサーは、SEQ ID NO 16またはSEQ ID NO 17のようにさらに改変される。CRMコード配列に先行する第一のシストロンは、「発現エンハンサー配列」(EES)と呼ばれる。発現ベクターは、(1)リボソーム結合部位および発現エンハンサー配列が続くプロモーター、ならびに(2)リボソーム結合部位およびATGコドンおよびCRMコード配列を含む。組み換え細胞は、原核または真核細胞でもよい。好ましくは、組み換え細胞は、例えば大腸菌細胞、または大腸菌の派生体もしくは株などの原核細胞である。好ましくは、組み換え細胞の改変は、例えば、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシンおよびチオレドキシン還元酵素、タンパク質還元酵素またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数などの、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を含む。好ましくは、一つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下は、組み換え細胞の細胞質の酸化還元状態を、非組み換え細胞と比較して酸化の状態にシフトする。好ましくは、CRMコード配列は、一つまたは複数のCRMエピトープ、CRMペプチド配列、CRMドメイン、またはこれらの組み合わせをコードする。好ましくは、細胞によって発現されたCRMタンパク質は可溶性であり、かつ細胞内にある、ペリプラズムにある、または分泌されたものである。好ましくは、組み換え細胞は、約15℃〜約32℃の温度で増殖する。
【００２９】
本発明の別の態様は、例えば、発現可能なCRM配列および好ましくはCRM197の配列を含む細菌細胞、哺乳類細胞または昆虫細胞などの組み換え細胞を含む。好ましい宿主細胞は、限定するものではないが、細胞質の酸化還元状態をより酸化の状態にシフトさせるように遺伝子操作されている細胞を含む。好ましい細胞は、例えば、大腸菌細胞発現系、バキュロウイルス(Baculovirus)発現系、ならびに他の細菌および／または真核細胞の発現系などの、原核または真核細胞を含む。好ましくは、細胞はCRMペプチドなどの外来のまたは非天然の配列を発現するためのタンパク質発現系を含む。発現される配列が、誘導プロモーター(例えば、好ましくは特定の培地を用いる自己誘導性のもの)、スタートコドン(例えば、ATG)、リボソーム結合部位、不特定のポリペプチド配列、およびポリシストロン性mRNAに転写されたCRMコード配列のうちの一つまたは複数を含む発現ベクターから構成されることもまた好ましい。発現ベクターが、リボソーム結合部位とATGスタートコドンの間に、またはスタートコドンと発現される配列の間に、改変された配列を含むこともまた好ましい。好ましい改変された配列またはスペーサー配列は、例えば、9を上回るまたは9未満(例えば、7から12ヌクレオチド)であり、かつ好ましくは9ヌクレオチドではない、複数のヌクレオチドを含む。発現系で利用できるスペーサーヌクレオチドの具体的な例は、限定するものではないが、
2019205446.tif 000005
を含む。したがって、本発明の別の態様は、規定のスペーサー配列の有無にかかわらず、および宿主細胞の有無にかかわらず、CRM、ヌクレオチド、およびアミノ酸配列の発現構築物を含む。
【００３０】
本発明の別の態様は、組み換えCRM197タンパク質、ならびに誘導プロモーターおよび／またはリボソーム結合部位とATGスタートコドンの間の改変された配列を有する発現ベクターを用いた大腸菌または別の宿主細胞における組み換えCRMの発現に指向する。好ましくは、発現ベクターは、ラクトース/IPTG誘導プロモーター、好ましくはtacプロモーター、およびリボソーム結合部位とATGスタートコドンの間の配列を含む。好ましくは、発現系は、9を上回るまたは9未満(例えば、7から12ヌクレオチド)であり、かつ好ましくは9ヌクレオチドではない、複数のヌクレオチドから構成される、スタートコドンと発現配列の間のスペーサーを含む。発現系において利用され得るスペーサーヌクレオチドの具体的な例は、限定するものではないが、本明細書に規定されているものを含む。驚くべきことに、9ヌクレオチドのスペーサーと比較したとき、長さが7または12のスペーサーの使用により、CRM197発現のレベルの顕著な増加がもたらされることが発見された。
【００３１】
本発明の別の態様は、本明細書に開示されている規定のスペーサー配列の有無にかかわらず、およびエンハンサー領域の有無にかかわらず、CRM、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の発現構築物を含む。エンハンサー領域は、タンパク質可溶性をもたらすCRMの正しい折りたたみを増強する翻訳共役により、下流のCRM配列の発現を促進する。エンハンサー領域はまた、発現増加のための核酸認識を促進する一つまたは複数の配列(例えば、スタートコドン、酵素結合部位、翻訳または転写因子結合部位)を追加することにより、タンパク質発現を促進する。好ましくは、本発明のエンハンサーは、CRMタンパク質のコード配列とは異なるコード配列の上流にありかつそれを伴うスタートコドンと共にリボソーム結合部位を含む。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明の方法にしたがって精製された、組み換えCRM、および特にCRM197に指向する。精製は、好ましくは、ヘパリンまたはヘパリン様アフィニティクロマトグラフィを含む。驚くべきことに、Bがリジンまたはアルギニンであり、かつXがハイドロパシー残基である典型的なヘパリン結合部位XBBXBX (SEQ ID NO 6)の配列ベースモチーフをCRM197が含有することが発見された(Cardin AD, Weintraub HJ.,1989: Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions. Arteriosclerosis 9: 21-32)。このモチーフは、CRM197受容体結合ドメイン内に位置し、かつ次のアミノ酸を含む: GRKIRMRCR (SEQ ID NO 7)、ここでG (グリシン)、I (イソロイシン)、M (メチオニン)およびC (システイン)はハイドロパシー残基である。ヘパリン結合部位の存在は、精製におけるヘパリンまたはヘパリン様樹脂の使用を可能にする。ヘパリン様樹脂は、硫酸デキストランなどの官能性硫酸基を含有する樹脂、例えば、Dextran sulfate (Sterogene)、Capto Devirs (GE)、または硫酸エステルを含有する樹脂、例えばCellufine Sulfate (Asahi Kasei Bioprocess)を含む。
【００３３】
第一段階において、大腸菌粗抽出物は、例えば、好ましくは遠心分離または深層濾過により不純物が除去され得る。任意で、不要物が取り除かれた溶解物は、好ましくはタンパク質の可溶性に影響を与える塩を加え、そしてCRM197を塩析させることにより、さらに分画してもよい。第二段階において、CRM197を含有する不純物が除去された溶解物または再び可溶化された塩析画分を、例えば、CRM197が流れる状態下でアニオン交換樹脂に加えてもよい。第三段階において、CRM197を含有する通過画分を、カラムに加えてもよい。好ましいカラム樹脂は、限定するものではないが、デキストラン硫酸塩樹脂、CELLUFINE(商標)樹脂(Chisso Corporation; クロマトグラフィゲル)、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、またはヘパリンもしくはヘパリン様樹脂を含む。好ましくは、CRMの樹脂への結合は、低塩濃度バッファーにおいて実行され、そしてより高い塩濃度バッファー中に溶出されて、高度に精製されたCRM197が得られる。好ましい結合バッファーは、例えば、一つまたは複数のカオトロピック剤、NaCl、KCl、グリセロール、イソプロピルアルコール、エタノール、アルギニン、酢酸塩、グアニジン、尿素、ATP、一つまたは複数のモノ-、ジ-、トリ-、および／またはポリ-リン酸塩、硫酸塩もしくはピロリン酸塩、ならびにそれらの組み合わせを含有する。好ましい溶出バッファーは、例えば、結合バッファーの、より高い濃度の一つまたは複数の成分を含有する。
【００３４】
他の好ましい精製方法は、アニオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、および／またはCibacron-Blue樹脂の任意の一つもしくは組み合わせを含む(CN 101265288A、米国特許第8,383,783号)。本発明の精製方法は、組み換えCRMタンパク質(例えば、CRM197)を、本明細書に論じられているように高収率で、かつ、80％より高い、好ましくは85%より高い、好ましくは90%より高い、好ましくは95%より高い、好ましくは99%より高い純度レベルで、および好ましくはより高い純度で、産生する。
【００３５】
本発明の別の態様は、受容体結合ドメイン(SEQ ID NO 2を参照されたい)を含有する、組み換えDTおよびCRMタンパク質、および特にCRM197を特徴づける方法(例えば、結合活性)に指向する。これらの方法は、DTの受容体結合ドメインの天然のまたは改変された配列を含有するタンパク質の結合活性の決定を含む。このような改変は、好ましくは、HB-EGF(ヘパリン結合性上皮成長因子)に結合するCRMの能力を保存する。該方法は、粗CRM197および精製CRM197のいずれに対しても適用できる。結合活性は、可溶型のジフテリア毒素受容体HB-EGF(DTR)への結合を表す。これらの方法は、好ましくは、CRM197のDTRへの結合の判定、ならびに適切に折りたたまれた構造、複合体、結合、および／または結合部位に特異的な分子(例えば、抗体、抗体フラグメント、抗原)を用いた、および好ましくは、ELISAフォーマットにおける検出を含む。適切に折りたたまれたCRM197だけが受容体に結合するので、結合を判定および定量化するアッセイは、CRM197が正しく折りたたまれている事の迅速な判定を可能にする。したがって、該方法は、開発、産生、および精製過程で生産されたCRM197および関連タンパク質の正しい折りたたみをモニタリングする。加えて、この特徴づけ方法は、例えばワクチン産生における別の分子との結合の後にCRMタンパク質を識別し、かつ追跡するために使用する事ができる。本発明の検出方法を使用することにより、適切に折りたたまれ形成された結合CRMタンパク質を、患者における疾患および障害の処置および／または予防のためのワクチンの開発中にモニタリングする事ができる。
【００３６】
本発明の別の態様は、例えば、多糖体との結合によるなどの、ワクチン産生のためにCRMタンパク質を結合するための方法を含む。また、タンパク質、ペプチド、オリゴ多糖類、およびハプテンの結合も含まれる。本発明の別の態様は、本発明のCRMタンパク質を含有するワクチンを含む。本発明の別の態様は、別のタンパク質または多糖体などの別の分子と遺伝子学的にまたは化学的に融合した本発明のCRMタンパク質に指向する。融合は、好ましくは、分子間の一つまたは複数の共有結合による。
【００３７】
以下の実施例は、本発明の態様を説明しているが、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【実施例】
【００３８】
実施例1  RBSと開始ATGコドンの間に7、8、9または12ヌクレオチド配列を含む発現ベクターからの検出されたCRM197発現
成熟CRM197をコードしたDNAが、DNA調節フラグメントおよびコードフラグメントの次の配列をもたらすポリシストロン形式で発現ベクターにクローン化された：tacプロモーター-リボソーム結合部位-ATGコドン-T7 tag-リボソーム結合部位-ATGコドン-CRMコード配列-ストップコドン。ORIGAMI 2、C41を含む異なる大腸菌株が、発現株として試験された(図1)。
【００３９】
実施例2  細胞質中でのジスルフィド結合の形成を可能にする大腸菌発現株Origami 2において溶解可能にCRM197は発現する
CRM197は、37℃で不溶性に発現された。発現温度が、37℃を下回ったとき、ORIGAMI(商標)2細胞およびSHUFFLE(商標)細胞において発現されたタンパク質の溶解度は増大するが、他の試験された大腸菌株では増大しない。CRM197は、ORIGAMI(商標)2細胞において18℃で発現されるとき、最も溶解する。
【００４０】
実施例3  CRM197発現における発現エンハンサー配列(EES)
EESはCRM含有ベクター中のCRM配列の転写を促進し、2つのタンパク質；短いEESペプチドおよびCRMペプチドに翻訳されるポリシストロン性mRNAをもたらす。天然のCRM遺伝子のコード配列が可能性のある3D構造形成について分析されて、翻訳を阻害し得る潜在的な複数のヘアピンを含有することが判明した。ヘアピン構造を持たないmRNAをもたらすが同じCRMアミノ酸配列を翻訳する可能性があるCRM配列が作られた。この遺伝子配列は、最適化されたCRM配列を意味し、SEQ ID NO 8を含む。
【００４１】
この最適化されたCRM配列は、大腸菌(例えば、BL21)と酸化した細胞質を含有するように遺伝子工学により操作された大腸菌(例えば、Shuffle)のいずれにおいても良好に発現する。ポリシストロン性mRNAから翻訳されたCRMペプチドは、完全長タンパク質を産生し、かつこれは天然のCRMコード配列よりも安定していると考えられる。天然のCRM配列とは異なり、最適化されたCRM配列は、Shuffle細胞において完全長としてかつ可溶性タンパク質として発現された。加えて、天然のCRMと比較すると、最適化されたCRM配列のより高い発現が、より低い細胞密度で、かつCRMタンパク質のより高い産生レベルをもたらすクロマトグラフィ樹脂への結合の増大を伴って観察された。
【００４２】
実施例4  細胞溶解物からのCRM197の硫酸アンモニウム沈殿物
CRM197を発現するSHUFFLE(商標)細胞を、マイクロフルダイザーを用いて破壊（open）し、1Mの塩化ナトリウムを細胞溶解物に加えた。同じ1Mまで十分な硫酸アンモニウムをこれに加え、次に30分間、20,000x gで遠心分離し、誤って折りたたまれたCRM197と細菌のタンパク質の大半を取り除いた。遠心分離の後に、硫酸アンモニウム濃度を2.2Mにさらに増加させた。主にCRM197である沈殿物が回収されて、そして低伝導率バッファー中で再度可溶化された。
【００４３】
実施例5  ヘパリンカラム上でのCRM197の精製
硫酸アンモニウムで沈殿されたCRM197を、20mM Tris-HCl pH 8.0中で再度可溶化して伝導率5 mS/cmを達成し、そしてヘパリンセファロースCL-6B樹脂(GE)を含有するカラムに負荷した。精製を次の条件下で実行した：流速が5ml/分、洗浄バッファーA: 20mM Tris-HCl pH8。溶出を、バッファーB 0〜100%勾配で実施した。バッファーB: バッファーA + 20 CV中1M NaCl。溶出されたCRM197は、還元および非還元条件でSDS-PAGEにより分析した。溶出されたCRM197の純度は、95%より高かった。DDTで還元されたタンパク質は、無傷な形のCRM197が大腸菌において発現されることを裏づける一本のポリペプチドとして現れる。
【００４４】
実施例6  Capto Devirsカラム上でのCRM197の精製
CRM197を発現するSHUFFLE(商標)細胞を、1xPBS、pH 7.4、1%ピロリン酸ナトリウム中で、マイクロフルダイザーを用いて破壊した。溶解物は、深層濾過により不純物を除去した。不純物を除去した溶解物を、Q Sepharose XL (GE)を含有するカラムに負荷し、そして通過画分を回収した。量と伝導度を低減させるために、通過画分は、10Kカセット(Sartorius)を用いて、タンジェンタルフロー濾過に供した。Capto Devirs樹脂を、25mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.0で平衡化した。CRM197を、次の条件の下でカラムに結合させた：カオトロピック剤(例えば、この場合は尿素)を含有する結合バッファー中、伝導率は10mS/cm未満、洗浄バッファーは25mMリン酸ナトリウム、pH8.0だった。溶出はNaClを用いて行った。溶出されたCRM197は、還元および非還元条件下でSDS-PAGEにより分析した。溶出されたCRM197の純度は、95%より高かった。DDTで還元されたタンパク質は、CRM197が精製過程で無傷のままであったことを裏づける一本のポリペプチドとして現れる。
【００４５】
実施例7  CRM197特徴づけのための結合アッセイ
組み換え可溶性ジフテリア毒素受容体HB-EGF (DTR) (Sigma)をELISAプレートに結合させた。5%スキムミルクのブロック溶液を、高いバックグラウンドを予防するために使用した。1xPBS、pH7.4、0.1% Twin 20中に希釈された組み換えCRM197を、37℃で1時間プレート上でインキュベートした。HB-EGFに結合したCRM197を、ウサギポリクローナル抗CRM197抗体および大豆ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体(Fina BioSolutions; Rockville, MD)により検出した。変性した組み換えCRM197は、受容体に結合しなかった。
【００４６】
実施例8  大腸菌内で産生されたCRM197は、コリネバクテリウムおよびシュードモナス由来のCRMと同じようにDTRに結合する
ELISAプレートを可溶性HB-EGF(ヘパリン結合性EGF様成長因子)でコーティングし、そして5%スキムミルクでブロックした。CRM197は、受容体に結合し、そしてウサギ抗CRM197ポリクローナル抗体およびSBPと結合したヤギ抗ウサギポリクローナルで検出された。大腸菌内で発現されたCRM197は、HB-EGFに対し、コリネバクテリウムおよびシュードモナスで産生されたCRMと同じ親和性を示した。
【００４７】
実施例9  CRM197は担体タンパク質である
CRM197を本発明の方法にしたがって発現させかつ精製し(実施例1)、そしてCDAPの化学的性質を用いて肺炎球菌莢膜多糖体血清型14および6Bに化学的に連結した(結合した)(Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents。米国特許第5,651,971号; 第5,693,326号および第5,849,301号を参照されたい)。結合体を、結合していないタンパク質および多糖体から精製した。メスのBALB/cマウスを、表1にあるスケジュールにしたがって、結合体を用いて皮下的に免疫化した。マウスを、完全フロイントアジュバンドにおいて免疫化し、そして不完全フロイントアジュバンドにおいて2回ブーストし、そして57日目に採血した。
【００４８】
【表１】
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*60%完全フロイントアジュバント;  **60%不完全フロイントアジュバント
【００４９】
血清を、ガンマ特異的検出を用いて、2 μg/mlの(ATCC由来の)Pn6BまたはPn14でコーティングされたBrandtech Immunogradeプレート上で、ELISAにより反応性について試験した。図2にある結果は、Pn6Bとの強い反応性を示す。マウス5086をハイブリドーマ産生のために使用し、そして得られたハイブリドーマのうち3つを用いて、高度に特異的なマウス抗6Bモノクローナル抗体が調製した。Pn14コーティングプレートに対する血清力価測定の結果が、図3に示されている。マウス1397を、次に、P14多糖体と反応する4つの高度に特異的なマウスモノクローナル抗体の産生のために使用した。結合されていない多糖体は、有意なELISA吸光度を与えない。
【００５０】
本発明の他の態様および使用は、本明細書の考察および本明細書に開示された本発明の実施から当業者に明らかであろう。すべての出版物、米国および外国の特許および特許出願を含む本明細書に引用されたすべての文献は、具体的にかつ全体が参照により組み入れられる。これまで使用されていた箇所での「含む(comprising)」という用語は、「からなる(consisting)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語を含むことが意図される。さらに、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含む/含有する(containing)」等の用語は、限定することを意図しない。明細書および実施例は、添付の特許請求の範囲に示された本発明の真の範囲および精神を伴う単なる例示であるとみなされることが意図される。
【００５１】
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月5日(2019.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CRMタンパク質の1つまたは複数のドメインを含むペプチドを産生する方法であって、
該ペプチドをコードする発現ベクターを含む組み換え細胞から、該ペプチドを発現させる段階であって、該組み換え細胞が、1つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を有し、該発現ベクターが、該ペプチドのコード領域に機能的に連結したプロモーターを含み、該組み換え細胞が、大腸菌(E. coli)細胞または大腸菌の派生体もしくは株であり、該1つまたは複数のジスルフィド還元酵素が、酸化還元酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素、チオレドキシン還元酵素、またはグルタチオン還元酵素のうちの一つまたは複数を含み、該1つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下が、1つまたは複数のジスルフィド還元酵素の活性の低下を有さない組み換え細胞と比較して、細胞質の酸化還元状態をより酸化状態にシフトさせるものであり、該ペプチドが、細胞質において発現される、段階；ならびに
可溶性である発現されたペプチドを単離する段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記1つまたは複数のドメインが、CRM受容体結合ドメイン、CRM触媒毒性ドメイン、および／またはCRM細胞質移行ドメインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記CRM受容体結合ドメインがSEQ ID NO:2の配列を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターが、リボソーム結合部位、開始コドン、および発現エンハンサー領域を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記組み換え細胞が、1つのみのジスルフィド還元酵素の活性の低下を有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記発現された可溶性ペプチドが、自然に折りたたまれたCRMのドメインを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーターが誘導プロモーターであり、かつ発現段階が、誘導プロモーターを第1の誘導剤を用いて誘導することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え細胞が第2の発現ベクターを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記単離段階がクロマトグラフィを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィが、硫酸塩樹脂、ゲル樹脂、活性硫酸化樹脂、リン酸塩樹脂、ヘパリン樹脂、またはヘパリン様樹脂を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記発現されたペプチドをポリエチレングリコールおよび／もしくはポリエチレングリコールの誘導体と結合する段階、または前記発現されたペプチドをポリマーとカップリングする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーが、多糖体、ペプチド、抗体もしくは抗体の一部、脂質、脂肪酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。