(57)【要約】【課題】長期保存のために安定化された、フィブリノゲン製剤を提供する。【解決手段】フィブリノゲン製剤において、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源としてのクリオプア血漿とを約３：１〜約１：３の比率で含有せしめ、血小板に富んだ血漿を含有せしめない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿源を補充してなる、長期保存のために安定化された、フィブリノゲン製剤であって、
前記フィブリノゲン製剤が、血漿クリオプレシピテート、血漿酸沈殿物、血漿冷却沈殿物、血漿水酸化アルミニウム沈殿物、血漿グリシン沈殿物、血漿エタノール沈殿物、血漿ヘパリン沈殿物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される濃縮フィブリノゲン調製物を含有し、
前記血漿源が、動物血漿、クリオプア血漿、回収された血漿、トロンビン枯渇血漿、因子枯渇血漿、血漿交換により収集された血漿、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるプールした血漿源であり、
前記濃縮フィブリノゲン調製物と前記血漿源との比が、約３：１〜約１：３であり、
前記フィブリノゲン製剤は、血小板に富んだ血漿を含有せず、
前記血漿源が前記クリオプア血漿である、
フィブリンシーラントの成分として使用するための、フィブリノゲン製剤。
【請求項２】
請求項１に記載のフィブリノゲン製剤を含む、シーラント製剤。
【請求項３】
請求項１に記載のフィブリノゲン製剤を含む、容器。
【請求項４】
請求項２に記載のシーラント製剤を含む、容器。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の容器、及び任意に使用説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
血漿補充フィブリノゲン及び／又はフィブリン製剤の調製方法、血漿補充フィブリノゲン及び／又はフィブリン製剤、並びにそれを用いた使用方法を本明細書に提供する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリン糊としても既知のフィブリンシーラントは、数十年間、臨床で使用されている（例えば、Ｔａｂｅｌｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ  ２０１２，１５：１２４〜１４０、Ｄｉｃｋｎｅｉｔｅ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ  ２００３，１１２：７３〜８２を参照されたい）。多くの場合、フィブリンシーラントは、２つの液体成分、即ちフィブリノゲン含有成分とトロンビン含有成分とからなり、これらは固有の不安定性により凍結して保存される。フィブリンシーラント製品は、２つの凍結乾燥成分からなる場合があり、これらは使用直前に再構成する必要があり、また、結合した注射器又は他の二連式送達デバイスによる送達が必要である。凍結乾燥製剤は、典型的に安定であるが、フィブリノゲン成分は再構成が困難である。
【０００３】
フィブリンシーラント凝塊が、フィブリノゲン、トロンビン及び第ＸＩＩＩ因子が関与する酵素反応により形成される。トロンビンは、トロンビンの濃度によって決まる速度での酵素作用により、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。血液凝固系の酵素である第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン凝塊を架橋及び安定化させる。このプロセスは、通常の血液凝固の工程のほとんどを迂回し、その最終段階を模倣するものである。一部の製造者は、フィブリンシーラント製剤に抗タンパク質分解剤を添加する（国際公開第９３／０５８２２号に記載される）か、あるいは、フィブリン溶解を停止又は遅らせるために特定してプラスミノゲンを除去することを行っている（例えば、米国特許第５，７９２，８３５号及び同第７，１２５，５６９号に記載される）。フィブリノゲン及びトロンビン成分は、ヒト若しくは動物（例えば、ウシ若しくはブタ）起源であってもよく、又は組換えにより生成されてもよい。二成分溶液を混合した後、トロンビンはフィブリノゲンを切断することにより後者を重合させてフィブリンとし、シーラントを生成する。トロンビン成分は、セリンプロテアーゼである酵素トロンビンを含有する。
【０００４】
特定の産業的フィブリノゲン画分の生産プロセスでは、フィブリノゲン組成物から血漿タンパク質の幾つかの部分的又は完全な除去がもたらされる。目下の論点は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の製造プロセス中の副産物として得られるフィブリノゲン含有画分の生産である。このフィブリノゲンが豊富な画分を使用して、フィブリンシーラントの成分として有用なフィブリノゲン組成物を得ることができるが、この画分は、プロセス工程中、血漿タンパク質の幾つかが部分的又は完全に枯渇する可能性がある。結果として、そのようなフィブリノゲンが豊富な画分から得られるフィブリノゲン組成物は、重要な血漿タンパク質のレベルが低いか、又は重要な血漿タンパク質を完全に欠いている。
【０００５】
従来技術としては、米国特許第４，３４１，７６４号、同第４，４５５，３００号、同第５，８３４，４２０号及び同第６，２７７，９６１が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
血漿補充フィブリノゲンの調製方法、血漿補充フィブリノゲン、及び、シーラント製剤の成分の製造のための血漿補充フィブリノゲンの使用を本明細書に提供する。
【０００７】
また、フィブリノゲン製剤の製造方法、フィブリノゲン製剤それ自体、及びそれを用いた使用、特に、組織シーラント製剤におけるフィブリノゲン成分としての使用を本明細書に提供する。
【０００８】
一態様において、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とを混合する工程を含む、フィブリノゲン製剤の調製方法を本明細書に提供する。濃縮フィブリノゲン調製物は、血液又は血漿中のフィブリノゲン濃度よりも高いフィブリノゲン濃度を含む調製物に関する（約２〜４ｍｇ／ｍｌを超え、例えば最大２００ｍｇ／ｍｌ）。濃縮フィブリノゲン調製物は、例えば、哺乳類起源（例えばヒト又は豚）から得ることができ、又は組換え体であってもよい。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、血液又は血液画分に由来する。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、ヒト血液又はヒト血液画分に由来する。
【０００９】
本方法の様々な実施形態において、濃縮フィブリノゲン調製物中のフィブリノゲンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、クリオプレシピテートである。様々な実施形態において、クリオプレシピテートは、第ＶＩＩＩ因子枯渇クリオプレシピテート（ＦＤＣ）である。血漿源を含む溶液との混合後、フィブリノゲン濃度は、７ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌの範囲内、又は約３０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００１０】
本方法の幾つかの実施形態では、血漿源は、例えば、動物血漿、例えば哺乳類血漿、好ましくはヒト血漿である。幾つかの実施形態では、血漿源は、プールした動物血漿、例えば、プールしたヒト血漿である。一実施形態において、血漿源は、クリオプア（cryo-poor）血漿である。クリオプア血漿は、クリオプレシピテートが除去された、プールした血漿である。典型的には、血漿は、増殖因子を含む。一実施形態において、血漿源及び／又はフィブリノゲンは、非自己である。特定の実施形態では、血漿は、血小板に富んだ（reach）血漿ではない。
【００１１】
用語「血小板に富んだ血漿」（ＰＲＰ）は典型的に、限られた体積の血漿中で濃縮された血小板を含むエクスビボ調製物に関する（Ｌａｃｃｉ  ＫＭ，Ｄａｒｄｉｋ  Ａ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２０１０．Ｍａｒ；８３（１）：１〜９）。
【００１２】
用語「自己」は、同一の個体に由来するか、又は一個体がドナー及びレシピエントの両方として関与することを意味する。
【００１３】
一実施形態において、血漿は、トロンビンを含まない、かつ／又は因子枯渇血漿である。
【００１４】
「因子枯渇血漿」は、本明細書では、第ＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子などの１つ又は２つ以上の凝固因子が枯渇した血漿に関する。
【００１５】
「第ＩＩ因子枯渇血漿」若しくは「第ＩＩ因子欠乏血漿」又は「プロトロンビン欠乏血漿」は、第ＩＩ因子又はプロトロンビンが枯渇した、プールした正常なヒト血漿から製造される。残留するプロトロンビンの活性は、例えば１０％以下、又は１％以下であり得る。
【００１６】
用語「トロンビンを含まない血漿」は、凝固時間アッセイ又は発色性アッセイによって、例えば２ＩＵ／ｍｌ以下の、又は検出できないトロンビン活性を有する血漿に関する。
【００１７】
様々な実施形態において、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とは、約３：１〜約１：３（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、約２：１〜約１：２（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、又は約１：１（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）の比で混合される。
【００１８】
別の態様では、血漿で補充されたフィブリノゲン調製物を含むフィブリノゲン製剤を提供する。幾つかの実施形態では、フィブリノゲン製剤は、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とを混合することにより調製される。濃縮フィブリノゲン調製物は、血液又は血漿中のフィブリノゲン濃度よりも高い、例えば約２〜４ｍｇ／ｍｌを超え、例えば最大２００ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン濃度を含む調製物に関する。濃縮フィブリノゲン調製物は、例えば、哺乳類起源（例えばヒト又は豚）から得ることができ、又は組換え体であってもよい。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、血液又は血液画分に由来する。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、ヒト血液又はヒト血液画分に由来する。
【００１９】
様々な実施形態において、濃縮フィブリノゲン調製物中のフィブリノゲンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌである。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、クリオプレシピテートである。様々な実施形態において、クリオプレシピテートは、第ＶＩＩＩ因子枯渇クリオプレシピテート（ＦＤＣ）である。血漿源を含む溶液との混合後、フィブリノゲン濃度は、７ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌの範囲内、又は約３０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００２０】
幾つかの実施形態では、血漿源は、動物血漿、好ましくは哺乳類血漿、例えばヒト血漿である。幾つかの実施形態では、血漿源は、プールした動物血漿、例えばプールしたヒト血漿（例えばクリオプア血漿）である。様々な実施形態において、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とは、約３：１〜約１：３（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、又は約２：１〜約１：２（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、又は約１：１（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）の比で混合される。
【００２１】
幾つかの実施形態では、フィブリノゲン製剤は、液体形態である。幾つかの実施形態では、フィブリノゲン製剤は、薬学的に許容される担体を含む。一実施形態において、製剤中のフィブリノゲン濃度は、５０〜１２０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。別の態様では、製剤中のフィブリノゲン濃度は、５０〜９０ｍｇ／ｍｌ又は５５〜８５ｍｇ／ｍｌの範囲内、約７０ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌの範囲内、又は約３０ｍｇ／ｍｌである。
【００２２】
フィブリノゲン製剤は、例えばＳ／Ｄ処理、低温殺菌及び／又は濾過によって、無菌でありかつ病原体を含まないことが好ましい。様々な実施形態において、フィブリノゲン製剤は、凍結乾燥される。
【００２３】
別の態様では、血漿補充フィブリノゲン製剤を保持する容器を提供する。この容器は、例えば、アンプル、バイアル瓶又は注射器であってもよい。容器は、例えば、ガラス、金属又はプラスチック製であってもよい。
【００２４】
別の態様では、本明細書で上記に開示した血漿補充フィブリノゲン製剤を含むアンプル、バイアル瓶又は注射器などの容器を含むキットを提供する。任意にキットは、トロンビン成分及び／又は使用説明書を含む。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物を有する容器と、血漿を有する容器とを含むキットを提供する。キットは、トロンビン成分及び／又は使用説明書を更に含んでもよい。キットは、少なくとも１つの容器及び少なくとも１つのラベルを含んでもよい。好適な容器の例としては、アンプル、バイアル瓶、注射器及び試験管が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で上記に開示した血漿補充フィブリノゲン製剤は、移植片固定、創傷治癒、修復、再建、及び吻合部位の封止を含むがこれらに限定されない、例えば止血、治癒、及び／又は手術用のシーラントの形成において有用である。フィブリノゲン製剤はまた、形成手術、例えば腹壁形成術、皮膚及び内部器官移植片固定、組織治癒、やけど処置、及び／又は創傷出血の軽減のためのシーラント中に使用されてもよい。そのようなシーラントは、更に、例えば頭蓋又は脊髄手術におけるデュラシーリング（dura sealing）に有用である。
【００２６】
したがって、一態様において、必要のある対象における表面に対する止血処理、移植片固定、創傷治癒及び／又は吻合の提供方法であって、治療的有効量の血漿補充フィブリノゲン製剤を表面に適用することを含む、方法を提供する。本方法は、腹壁形成術、組織治癒、やけど処置、及びデュラシーリングを含むが、これらに限定されない。対象は、動物、例えばヒト対象を含む哺乳類対象であってもよい。
【００２７】
別の態様では、治癒、止血及び／又は手術における使用のための血漿補充フィブリノゲン製剤を提供する。この使用には、移植片固定、創傷治癒、吻合、腹壁形成術、組織治癒、やけど処置、及びデュラシーリングが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
別の態様では、血漿補充フィブリノゲン成分及びトロンビン成分を表面に適用することを含む、表面におけるシーラントの形成方法を本明細書に提供する。
【００２９】
別の態様では、シーラントの形成方法を本明細書に提供する。本方法は、血漿補充フィブリノゲンを使用することを含む。
【００３０】
更なる別の態様では、濃縮フィブリノゲン調製物を血漿源と混合する工程を含む、シーラント製剤用の成分の製造方法を本明細書に提供する。
【００３１】
シーラント製剤は、一成分シーラント製剤、又は二成分若しくはそれよりも多くの成分のシーラント製剤などの多成分シーラント製剤であってもよい。一成分シーラント製剤の例としては、米国特許第５３１８５２４号、同第８３６７８０２号、同第６２６２２３６  Ｂ１号、同第６２６８４８３  Ｂ１号、同第６２６８４８３Ａ号、同第６５００４２７  Ｂ１号が挙げられる。一実施形態において、一成分シーラントは、フィブリンモノマー及び可逆的フィブリン重合遮断剤を含む安定液体シーラント製剤である。一実施形態において、単一成分シーラント製剤は、フィブリノゲン、並びに第ＩＩ因子（ＦＩＩ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）などのビタミンＫ依存性凝固チモーゲンを含む。
【００３２】
表面は、対象における出血又は非出血表面であってもよい。表面はまた、例えば、身体表面、外部若しくは内部身体器官、血管、又は移植組織若しくは器官であってもよい。対象は、動物、例えばヒト対象を含む哺乳類対象であってもよい。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明の様々な態様における血漿源は、クリオプレシピテートではない。
【００３４】
本発明のこれら及び他の態様並びに実施形態は、以下の本発明の詳細な説明及び図面を参照して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイして、３７℃で（レーン１及び２）又は−８０℃（レーン３及び４）で５日間保持した、血漿で補充されていない（レーン２及び４）、又は血漿で補充された（レーン１及び３）フィブリノゲン製剤の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、濃縮フィブリノゲン調製物を血漿で補充することにより、特に生物学的シーラントの成分として有用な、安定なフィブリノゲン製剤が得られるという予想外の発見に部分的に基づいている。今まで、フィブリノゲン又はフィブリノゲン含有画分を血漿から単離して、組織シーラント中で使用するためのフィブリノゲン製剤を生成していたため、血漿源を濃縮フィブリノゲン調製物に添加することを含む、フィブリノゲン製剤の製造は直感に反しており、例えばプロテアーゼによる、製剤の汚染が考えられていた。更に、血漿補充フィブリノゲン製剤は、非補充フィブリノゲン製剤と比較して、驚くべき安定性を呈する。
【００３７】
フィブリノゲン製剤の安定性は、例えば、製剤のゲル分離パターンの観察、Ｃｌａｕｓｓによる経時的なフィブリノゲン濃度の比較、又は製剤が凝塊を形成する能力、によって決定することができる。
【００３８】
本明細書には、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とを混合する工程を含むフィブリノゲン製剤の製造方法、血漿補充フィブリノゲン製剤それ自体、及び血漿補充フィブリノゲン製剤の使用方法を開示する。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ又は２つ以上の」を意味する。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、工程、又は成分を特定するものとして理解されるが、１つ又は２つ以上の更なる特徴、工程、成分、又はこれらの群の追加を排除するものではない。
【００４１】
数値の前に用語「約」が記載されている場合、用語「約」は、＋／−１０％を示すことを意図する。用語「ｇ」はグラムを指し、「ｍｇ」はミリグラムを指し、「ｍｌ」はミリリットルを指す。
【００４２】
本明細書で使用されるシーラントという用語は、糊という用語と交換可能である。
【００４３】
「濃縮フィブリノゲン調製物」は、血液又は血漿中のフィブリノゲン濃度よりも高い、例えば約２〜４ｍｇフィブリノゲン／ｍｌを超え、最大約２００ｍｇフィブリノゲン／ｍｌのフィブリノゲン濃度を含む、調製物に関する。濃縮フィブリノゲン調製物は、例えば、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜２００ｍｇ／ｍｌ、１０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、２０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌを含む。濃縮フィブリノゲン調製物は、任意の起源、例えば、哺乳類起源から（例えば、ヒト血漿又は豚血漿から）調製されてもよく、又は組換え体であってもよい。幾つかの実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、クリオプレシピテートである。血漿源を含む溶液との混合後、フィブリノゲン濃度は、７ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、約２０〜４０ｍｇ／ｍｌ、約１５〜４０ｍｇ／ｍｌ、約２５〜１２０ｍｇ／ｍｌの範囲内、又は約３０ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００４４】
本発明の一実施形態では、「濃縮フィブリノゲン調製物」は、精製フィブリノゲン調製物である。精製フィブリノゲン調製物は、フィブリノゲンを含む出発組成物から得られ、出発組成物を１つ又は２つ以上の精製工程（クロマトグラフィー工程、又は沈殿工程など）に供して、出発組成物と比較してフィブリノゲンが豊富にされた調製物をもたらす。
【００４５】
用語「クリオプア血漿」は、クリオプレシピテートが除去された、プールした血漿を指す。
【００４６】
機能性フィブリノゲンの濃度は、欧州薬局方、フィブリンシーラントキット１９９７；０９０３：８５８、及びＣｌａｕｓｓ  Ａ．Ｇｅｒｉｎｎｕｎｇｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ  Ｓｃｈｎｅｌｌｍｅｔｈｏｄｅ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｄｅｓ  Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ．Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９５７；１７：２３７〜２４６に詳論されている欧州薬局方アッセイ（０９０３／１９９７）手順の修正により、凝塊を形成する能力により、又は当該技術分野において既知の他の方法により、測定されてもよい。
【００４７】
用語「クリオプレシピテート」は、全血、回収された血漿、又は血漿交換により収集された血漿から調製された凍結血漿から得られる、血液成分を指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、典型的には０〜４℃の温度でゆっくり解凍すると、フィブリノゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含有する沈殿物が形成されることで得ることができる。この沈殿物は、例えば遠心分離によって、収集することができる。
【００４８】
沈殿物は、ＦＶＩＩＩの製造プロセスからの副産物であってもよく、本明細書では「ＦＤＣ」、例えば酸沈殿物、冷却沈殿物、水酸化アルミニウム沈殿物（例えば、米国特許第４，４５５，３００参照）、グリシン沈殿物（例えば、米国特許第４，２９７，３４４号参照）、エタノール沈殿物及びヘパリン沈殿ペーストと称される。
【００４９】
用語「副産物」は、通常、産業的又は生物学的プロセスの過程において、所望の物質／生成物に加えて生成又は形成される、所望でない及び／又は意図されない及び／又は不使用の物質及び／又は残留物質を指す。
【００５０】
用語「沈殿物」及び「沈殿画分」は、交換可能である。
【００５１】
一実施形態において、沈殿物は、水酸化アルミニウム沈殿物である。有利には、沈殿物が水酸化アルミニウムを含む場合、この水酸化アルミニウムは、例えば遠心分離及び／又は濾過により、特定のプロテアーゼと共に、浮遊沈殿物から容易に除去することができる。
【００５２】
本発明の一実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、血漿源を用いた補充の間、少なくとも部分的に可溶性、完全に可溶性、又は完全に不溶性である。
【００５３】
「完全に可溶性」は、例えばいかなる固体粒子も有することなく、１００％溶解していることを意味する。「部分的に可溶性」は、１００％未満溶解していることを意味し、例えば濃縮フィブリノゲン調製物は、約５％〜１００％未満溶解していてもよい。
【００５４】
本発明の一実施形態では、濃縮フィブリノゲン調製物は、約５０％〜約９５％溶解している。
【００５５】
「完全に不溶性」は、１００％固体形態であることを意味する。
【００５６】
本明細書に記載されるとき、濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とは、約３：１〜約１：３（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、又は約２：１〜約１：２（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）、又は約１：１（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ）の比で混合される。用語「ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、又はｗ／ｗ」は、濃縮フィブリノゲン調製物及び血漿源が、独立して、液体又は固体のいずれかであり得ることを意味する。
【００５７】
シーラント製剤の製造方法を提供する。本方法は、濃縮フィブリノゲン調製物を血漿源と混合する工程を含む。
【００５８】
シーラント製剤は、１つ又は２つ以上の成分を含んでもよい。
【００５９】
シーラントは、血漿補充フィブリノゲンを含む１つの成分と、トロンビンを含む他の成分とを含んでもよい。
【００６０】
あるいは、シーラントは、血漿補充フィブリノゲン及びプロトロンビンを含む成分を含んでもよい。
【００６１】
また、シーラントは、例えば低ｐＨ、又はＧＰＲＰなどの重合阻害剤を組成物に含めることによる、重合を阻害する条件下で、フィブリンモノマーを含む成分を含んでもよい。フィブリンモノマーは、例えば血漿補充フィブリノゲンを、ビーズに結合したトロンビンと接触させ、未結合画分を収集することにより、血漿補充フィブリノゲンから調製されてもよい。
【００６２】
フィブリノゲン、トロンビン及び血漿は、フィブリン重合を阻害する条件下で接触させてもよい。
【００６３】
血漿は、フィブリンモノマーを含む液体シーラント製剤を安定化させ、かつ／又は、重要な血漿タンパク質を該液体シーラント製剤に添加するために、使用され得る。
【００６４】
フィブリンモノマーを含む血漿補充液体シーラント製剤を本明細書に提供する。更に、ａ）フィブリンモノマーと、ｂ）可逆的フィブリン重合遮断剤とを含む、血漿補充液体シーラント製剤を本明細書に提供する。
【００６５】
一実施形態において、可逆的阻害剤は、フィブリンモノマーに対して低親和性の阻害剤（例えばＧＰＲＰペプチド）、及びフィブリン重合又はフィブリン凝塊に対する永久的効果を有しない阻害剤に関する。したがって、典型的に、希釈及び／又は除去は、阻害効果を除去するであろう。
【００６６】
可逆的フィブリン重合阻害剤の例としては、ＧＰＲＰペプチド、ｐＨ、及びアプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で使用される用語「フィブリンモノマー」は、約２０、２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周囲温度で、フィブリンが水性液体溶液中に可溶形態で維持されるような数のフィブリン単位を有する、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーを含む。一実施形態において、オリゴマーは、最大１０個のフィブリン単位を含む。
【００６８】
本明細書で使用される用語「フィブリンポリマー」は、約２０、２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周囲温度で、水性液体溶液中のフィブリンの溶解度を制限する数のフィブリン単位を有する、複数のフィブリン単位を含む。
【００６９】
また、必要のある対象に独立型製剤として投与することができる、血漿補充フィブリノゲン、及び／又はフィブリンモノマーを含む血漿補充液体シーラント製剤を本明細書に提供する。
【００７０】
必要のある対象に投与することができる、フィブリンシーラント製剤を提供する。
【００７１】
「血漿（plasma）」及び「血漿（blood plasma）」は、交換可能に使用されてもよく、特に、塩、酵素、免疫グロブリン（抗体）、凝固因子、並びにアルブミン、第ＶＩＩＩ因子及びフィブリノゲンを含むタンパク質を含有する、血液の血漿画分を指し得る。「血漿源」は、分画からの血漿、プールした血漿、クリオプア血漿、回収された血漿、及び、血漿交換により収集されたヒト血液の流体部分である血漿であってもよい。一実施形態において、血漿は、トロンビン枯渇及び／又は因子枯渇血漿である。
【００７２】
血漿は、血液の画分である。未分画の血液は、本願に定義される「血漿源」とは見なされない。
【００７３】
「トロンビン」又は「トロンビンペプチド」は、別のセリンプロテアーゼ（第Ｘａ因子）により、チモーゲン前駆体であるプロトロンビン（第ＩＩ因子）を切断することによってもたらされる、セリンプロテアーゼである。「トロンビン」は、血液凝固カスケードの一部であり、フィブリノゲンをフィブリンの不溶性鎖に変換するとともに、他の凝固関連反応を触媒する。ヒトでは、プロトロンビンは、Ｆ２遺伝子によってコードされており、得られるポリペプチドは、凝固カスケードにおいてタンパク質分解的に切断されてトロンビンを形成する。トロンビンは、幾つかの止血製品において、特に、活性成分として機能する。例えば、フィブリンシーラントは、典型的に、フィブリノゲン成分及びトロンビン成分を含む。両成分を混合したとき（例えば、出血している創傷に塗布したとき）、トロンビンは、フィブリノゲンを切断し、フィブリンポリマーが形成される。
【００７４】
長期間の保存のためには、フィブリノゲン製剤を滅菌バイアル瓶、アンプル、又は他の容器、例えば注射器若しくは他のアプリケータ内に等分し、これを次いで封止する。一実施形態では、シールを貫通する注射器を用いて製剤を取り出すことができる容器を用いる。容器は、薬学分野又は医療機器分野における標準的慣行に従ってラベルが付けられる。
【００７５】
別の態様では、本明細書で上記に開示したフィブリノゲン製剤を含むアンプル、バイアル瓶又は注射器などの容器を含む、キットを提供し、任意に、キットは、トロンビン成分及び／又は使用説明書を含む。キットは、少なくとも１つの容器及び少なくとも１つのラベルを含んでもよい。好適な容器としては、例えば、アンプル、バイアル瓶、注射器及び試験管が挙げられる。容器は、例えば、ガラス、金属又はプラスチック製であってもよい。代替的な態様では、濃縮フィブリノゲン調製物を有する容器と、血漿を有する容器とを含むキットを提供し、任意に、キットは、トロンビン成分及び／又は使用説明書を含む。
【００７６】
「周囲温度」は、フィブリノゲン製剤が維持されている環境内の温度である。
【００７７】
フィブリノゲン製剤は、生物学的シーラントを形成するためのフィブリノゲン成分として使用されてもよい。使用に関しては、フィブリノゲン製剤は、個々の患者の必要性及出血の重症度に従って、容器から直接使用されてもよい。例えば、フィブリノゲン製剤は、トロンビン製剤と併用して出血組織に適用されて、止血を達成してもよい。あるいは、フィブリノゲン製剤は、単一成分シーラント製剤中で使用されてもよい。一実施形態において、単一成分シーラント製剤は、フィブリノゲン、並びに第ＩＩ因子（ＦＩＩ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）などのビタミンＫ依存性凝固チモーゲンを含む。
【００７８】
本発明による製剤は、液体であっても、凍結又は凍結乾燥されていてもよい。
【００７９】
本製剤の利点は多種多様であり、以下のうちの少なくとも１つであり得る。向上された安定性、向上された抗ウイルス活性、例えば抗Ｂ１９特異的抗体の豊富化、改善された治癒特性、及び／又はフィブリンシーラントのための代替的な出発物質としての濃縮フィブリノゲン副産物調製物の効率的な使用。
【００８０】
フィブリンシーラントは、一成分製剤、二成分又はそれよりも多くの成分の製剤から形成することができる。
【００８１】
「薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、製剤中の構成成分と適合し、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の合併症を伴うことなく、妥当な利益／危険性の比に見合って、人間及び動物の組織との接触における使用に好適な試薬、化合物、材料、組成物、希釈剤を指す。
【００８２】
「表面」は、シーラント又は糊の形成が所望される位置又は場所である。表面は、シーラントの用途に依存する。シーラントは、例えば、止血、組織固定、移植片固定、創傷治癒及び吻合において使用され得る。本明細書に開示する製剤、方法、及びキットは、組織及び器官移植片固定のために、手術創の封止のために、止血の提供を含む脈管手術において、並びに動脈、胃腸管及び気管吻合などの吻合のために、内部的及び外部的に使用することができる。
【００８３】
本明細書で使用される用語「動物」は、哺乳類及びヒト対象を含む。
【００８４】
本明細書で使用される「対象」は、ヒトを含む、哺乳類起源の動物を含む。一実施形態において、対象は、手術患者、又は創傷患者である。
【００８５】
「治療的有効量」は、対象におけるフィブリン封止効果、例えば封止、治癒、及び／又は失血の低減を提供する量を意味する。
【００８６】
血液成分由来の生物学的物質は、典型的に、血液媒介病原体によりもたらされる潜在的な危険性を最小限にするために、感染性粒子から精製される。精製手順は、ナノ濾過、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理、熱処理、ガンマ線若しくはＵＶＣ（＜２８０ｎｍ）照射などにより、又は当該技術分野において既知の任意の他の方法により実行することができる。
【００８７】
用語「感染性粒子」は、微生物又はプリオンなどであるが、これらに限定されない、微細粒子を指し、これらは生物有機体に感染又は伝播し得る。感染性粒子はウイルス粒子であってもよい。感染性粒子の不活化手順は、手順前及び／又は手順中に、不活化分子を溶液に添加することによって行われ得る。添加した分子及びそれらの生成物は、重力、カラムクロマトグラフィー相分離により、又は当該技術分野において既知の任意の他の方法により除去できる。感染性粒子の除去は、濾過により、又はアフィニティ、イオン交換、若しくは疎水性クロマトグラフィーなどの選択的吸収法によって行われ得る。
【００８８】
多工程のウイルス不活化手順を行ってもよい。例えば、以下のうちの２つ又は３つ以上、即ち、溶媒／洗剤処理、低温殺菌、選択的クロマトグラフィー及びナノ濾過、を組み合わせることによる。
【００８９】
用語「ウイルス不活化」は、ウイルスが溶液中に維持されるが、（例えば、それらの脂質被覆を溶解することによって）生育不能にされる状況、及び／又は、（例えば、サイズ排除技法によって）ウイルスが溶液から物理的に除去される状況の両方を指す。
【００９０】
「溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）処理」は典型的に、それらの脂質エンベロープを破壊することによって、エンベロープを持つ又は脂質被覆されたウイルスを不活化するプロセスを指す。処理は、洗剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００又はＴｗｅｅｎ  ８０など）及び溶媒［トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴｎＢＰ）、ジ−又はトリアルキルホスフェートなど］を添加することにより行ってもよい。脂質被覆ウイルスの不活化に使用される溶媒−洗剤の組み合わせは、ＴｎＢＰ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びコール酸ナトリウム、並びに他の組み合わせなどの、当該技術分野において既知の任意の溶媒−洗剤の組み合わせであってもよい。溶媒（複数可）及び洗剤（複数可）の濃度は、例えば、０．１％超のＴｎＢＰ及び０．１％超のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような、当該技術分野において一般的に使用されるものであり得る。時には、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％  ＴｎＢＰの組み合わせが使用される。典型的には、溶媒−洗剤がウイルスを不活化する条件は、５〜８の範囲のｐＨ値で１０〜１００ｍｇ／ｍＬの溶媒−洗剤、及び２〜３７℃の範囲の温度にて３０分間〜２４時間からなる。しかしながら、他の溶媒−洗剤の他の組み合わせ、及び好適な条件が、当業者には明らかとなろう。Ｓ／Ｄ処理において使用される溶媒−洗剤のバルクは、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＨＩＣ）、例えば、Ｃ−１８シリカ充填材料及びＳＤＲ（溶媒−洗剤除去）ＨｙｐｅｒＤ、イオン交換マトリックスなどのタンパク質吸着マトリックス、アフィニティマトリックス、油抽出及び／又はサイズ排除マトリックスなどの、クロマトグラフィーカラムを使用することによって除去することができる。ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤは有利に、疎水性相互作用の混合モード吸着を伴い、分子排除効果に関連している［Ｇｕｅｒｒｉｅｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ｔｏ  ｒｅｍｏｖｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ」。Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ｆｅｂ  ３；６６４（１）：１１９〜１２５］。
【００９１】
「低温殺菌」は典型的に、熱が脂質エンベロープを持つ及びエンベロープを持たないウイルスの両方を破壊するプロセスを指す。「低温殺菌」は、用語「熱不活化」又は「熱処理」と交換可能である。熱不活化は、約６０℃で約１０時間行われてもよい。低温殺菌工程中、スクロース及びグリシンなどの安定剤を溶液中に添加してもよい。
【００９２】
「ナノ濾過」は典型的に、例えばＰｌａｎｏｖａ（商標）１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ及び７５Ｎ；Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／７０（商標）、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ／１８０（商標）などのナノメートルスケールのフィルタを使用することによって、脂質エンベロープを持つ及びエンベロープを持たないウイルスを溶液から排除するプロセスを指す。フィルタは、７０ｎｍ未満、好ましくは１５〜５０ｎｍの孔径を有し得る。しかしながら、試料からウイルスを低減又は排除するのに十分な孔径を有する任意の膜を、ナノ濾過で採用することができる。ナノ濾過によって除去されるウイルスは、エンベロープを持つ（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ウエストナイルウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））、及びエンベロープを持たない（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス）可能性がある。溶液は、限外濾過プロセスによって濃縮され得る。限外濾過に続いて、又は限外濾過の前に、緩衝液を交換するために透析濾過が行われ得る。限外濾過及び透析濾過による濃縮及び透析はそれぞれ、１つの工程において又は２つの別々の工程として行われ得る。透析濾過は、ヒト投与に好適である任意の溶媒又は緩衝液に対して行われ得る。
【００９３】
以上又は以下に引用する出願、特許、及び刊行物の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示すが、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を十分に説明するのに寄与するものとして解釈すべきである。
【実施例】
【００９５】
材料及び方法
第ＶＩＩＩ因子枯渇クリオプレシピテート（ＦＤＣ）の調製：
ＦＶＩＩＩ枯渇クリオプレシピテート（ＦＤＣ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の製造プロセスの副産物である。製造プロセス中、低い塩濃度の条件下、１４〜１８℃の範囲内の温度でエタノールを添加した後、遠心分離することにより、フィブリノゲン、フィブロネクチン、第ＸＩＩＩ因子、並びにプラスミン及び／又はプラスミノゲンなどのプロテアーゼが、再懸濁クリオプレシピテートから沈殿する。遠心分離工程に先立って、上記の再懸濁中に水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３］を添加することにより）、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子及び第Ｘ因子などのビタミンＫ依存性凝固因子が水酸化アルミニウムと共に沈殿する。水酸化アルミニウム沈殿物（即ち、ＦＤＣ）を、第ＶＩＩＩ因子含有上清から分離し、下記に記載する実験にて使用した。
【００９６】
ＦＤＣは、以下のように得られた。血漿クリオプレシピテートを基本的に国際特許出願公開第９３／０５８２２号及び同第９４／２２５０３号に記載されているように調製した。
【００９７】
手短には、凍結（−３０℃）したヒト血漿を４℃で解凍することによりクリオプレシピテートを調製し、上清を除去した。このクリオプレシピテートを、使用まで−３０℃に維持した。このクリオプレシピテートを０〜４℃で解凍し、３ＩＵ／ｍｌヘパリンナトリウム（プロテアーゼ阻害剤）を含む２倍容積の水中に１０〜２０℃で再懸濁した。希釈酢酸を使用して、ｐＨを７〜８に調整した。エタノールを添加して、最終濃度１％とした。希釈酢酸を使用してｐＨを６．８〜７．２に調整した。混合物を撹拌しながら１０〜１５℃の温度に冷却し、水酸化アルミニウムを添加した（１Ｋｇクリオプレシピテート当たり１０８ｇの２％アルハイドロゲル溶液）後、１４〜１８℃にて１７，０００ｇで２５分間遠心分離した。上清（第ＶＩＩＩ因子を含む）を除去し、ペレットを収集した。この沈殿物（ペレット）、別名ＦＤＣは、特に、フィブリノゲン、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、プラスミン及び／又はプラスミノゲン、水酸化アルミニウム並びにビタミンＫ依存性凝固因子を含有した。ペレットはエタノールを含み（約１％エタノール）、７．２未満のｐＨを有した。ペレットを更なる処理まで−８０℃に維持した。
【００９８】
この沈殿物（ＦＤＣ）を濃縮フィブリノゲン調製物の一実施例として使用した。
【００９９】
フィブリノゲンレベルの決定：
凝固時間の試験によるフィブリノゲンレベルの決定（Ｃｌａｕｓｓ法）
【０１００】
Ｃｌａｕｓｓ法は、欧州薬局方アッセイ０９０３／１９９７の修正であり、試験試料の凝固時間を評価する運動学的方法であるＣｌａｕｓｓ法に基づいている。過剰のトロンビンの存在下、１％フィブリノゲン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて較正曲線を準備し、試料のフィブリノゲン濃度を較正曲線から計算する。較正曲線を８ｍｇ／１００ｍｌ〜３２ｍｇ／１００ｍｌの範囲内でフィブリノゲンに関して生成した。試験試料の結果を試料の希釈倍数で乗算することにより、ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン単位で報告する。
試料のフィブリノゲン（ｍｇ／ｍｌ）＝（較正曲線からのｍｇ／１００ｍｌ×希釈倍数）／１００。
【０１０１】
実施例１：ＦＤＣから得られた濃縮フィブリノゲン調製物の血漿補充
非補充及び血漿補充フィブリノゲン試料を、以下のように調製した。１２０ｍｌ及び９０ｍｌの再懸濁緩衝液（０．７％  ＮａＣｌ、０．２９５％クエン酸三ナトリウムｐＨ７．４）を、それぞれ２つの異なるビーカーＡ及びＢ内で３４℃に予熱した。次いで、７．５ｍｌの２％アルハイドロゲル［Ａｌ（ＯＨ）３］及び２．２５ｍｌの、ビーズに結合したトラネキサム酸（ＴＥＡ）（これは、概して国際特許出願公開第２０１３／００１５２４号に開示されているように、特にＦＤＣ調製物からプラスミン及び／又はプラスミノゲンを除去する）を連続的に撹拌しながら各ビーカーに添加した。３０ｍｌのプールしたヒト血漿（クリオプア血漿）をビーカーＢ内の混合物に添加した。
【０１０２】
ＦＤＣを以下のように調製した。８０ｇの凍結ＦＤＣを、ブレンダーを使用して２０秒間の２サイクルで機械的に粉砕して小片（＜１ｃｍ）とし、このサイクル間に２０秒間の中断を有した。３０ｇの粉砕ＦＤＣを、３０〜３２℃の温度で連続的に撹拌しながら各ビーカー（Ａ及びＢ）に添加した。試料Ｂ中のＦＤＣと血漿との比は、１：１（ｗ／ｖ）であった。１０分後、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用して混合物のｐＨを７．２〜７．３に調整し、この混合物を９０分間撹拌しながら可溶化するに任せた。ＦＤＣが両方のビーカー内で可溶化すると、非再懸濁／非可溶化粒子を、１７，０００ｇ／２５分間の遠心分離により沈殿させた。上清を１．２μｍフィルタを通した濾過により清澄化した。清澄化した上清を、最終濃度１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１２０ｍＭグリシンを有するように補充し、安定性（実施例２）及び抗Ｂ１９抗体含有率（実施例４）に関してアッセイするまで、試料Ａ及びＢ（上清）を−３０℃以下で保存した。試料Ａ及びＢ中のフィブリノゲン濃度は、１５〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲内であった。
【０１０３】
実施例２：ＦＤＣから得られた血漿補充濃縮フィブリノゲン調製物の安定性
上記の実施例１の非補充（Ａ）及び血漿補充（Ｂ）フィブリノゲン試料を、以下のように、フィブリノゲン安定性に関して試験した。
【０１０４】
試料を室温２０〜２５℃で最大５日間維持した。Ｃｌａｕｓｓ法（以前に記載した）を用いて、フィブリノゲンの安定性を評価した。結果を表１にまとめる。
【０１０５】
【表１】
2019196388.tif 000002
【０１０６】
表１は、血漿補充試料（試料Ｂ）が、試験の５日間、安定な状態を保ったが、対応する非補充試料（試料Ａ）は乏しい安定性を示したことを示す。
【０１０７】
ＦＤＣの異なるバッチ及び血漿の異なるバッチを使用した数回の実験において、結果を確認した。
【０１０８】
実施例３：クリオプレシピテートから得られた血漿補充濃縮フィブリノゲンの安定性
クリオプレシピテートから得られた濃縮フィブリノゲン調製物に血漿を添加して、タンパク質安定性に対する血漿の効果（例えば、タンパク質分解の低下）を評価した。クリオプレシピテートを溶解し、水酸化アルミニウムを添加し、Ｓ／Ｄ処理に供し、油抽出及び逆相カラムによりＳ／Ｄ物質を除去する（概して、国際公開第９３／０５８２２号及び同第９４／２２５０３号に記載されているように）ことによって、クリオプレシピテート由来の濃縮フィブリノゲン調製物を調製した。この実施例では、濃縮フィブリノゲン調製物は、プラスミン／プラスミノゲンを除去するためのＴＥＡに供されず、またプロテアーゼ阻害剤にも供されなかった。濃縮フィブリノゲン調製物（約３０ｍｇ／ｍｌ）の２つのバッチからの試料を収集し、添加された血漿と共に又は添加された血漿なしに、３７℃（又は凍結状態に維持）でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してタンパク質の完全性に関して試験した。使用した血漿は、ドナーから血漿交換により収集した血漿単位であった。希釈緩衝液の組成は、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭグリシン、９５ｍＭアルギニン塩酸塩、１ｍＭ塩化カルシウムであった。
【０１０９】
濃縮フィブリノゲン調製物及び血漿を解凍し、以下の４グループのそれぞれに関して以下のアリコート（４×２００μｌ）を調製した。
Ｉ．３７℃保存−１００μｌフィブリノゲン調製物＋１００μｌ血漿。
ＩＩ．３７℃保存−１００μｌフィブリノゲン調製物＋１００μｌ希釈緩衝液。
ＩＩＩ−８０℃保存−１００μｌフィブリノゲン調製物＋１００μｌ血漿。
ＩＶ．−８０℃保存−１００μｌフィブリノゲン調製物＋１００μｌ希釈緩衝液。
【０１１０】
上記のスキームに従って、試料を−８０℃又は３７℃で５日間保存した。５日間のインキュベーション後、４グループからの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ手順は、以下のように行った。
９５０ｍｌ  ＤＤＷを５０ｍｌ  ＭＯＰＳ泳動緩衝液Ｘ２０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＮＰ０００１）で希釈することにより１リットルの泳動緩衝液を調製した。試料ローディング混合物の組成を、表２に示す。
【０１１２】
【表２】
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１  Ｎｕｐａｇｅ試料緩衝液ｘ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００７）。
２  Ｎｕｐａｇｅ還元剤ｘ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００９）。
【０１１３】
全試料を９５℃で５分間加熱し、遠心分離した。ゲル（ＮｕＰＡＧＥ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０３１４ＢＯＸ）に１レーン当たり１０μｌの希釈試料をロードした。ゲルを２００Ｖで４０分間泳動させた。ゲルをＤＤＷで３回洗浄し、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ，２６１４５）で少なくとも１時間染色した。ＤＤＷ洗浄により脱染を行い、ゲルを一晩乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。
【０１１４】
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイして、３７℃（レーン１及び２）又は−８０℃（レーン３及び４）で５日間保持した、非補充（レーン２及び４）又は血漿補充（レーン１及び３）であった濃縮フィブリノゲン試料の比較を示す。
【０１１５】
驚くべきことに、この結果は、血漿の添加が低分子量のバンドの出現を顕著に低下させ、無処理フィブリノゲンのバンドを増大させたことを示す（図１、レーン１対レーン２参照）。
【０１１６】
実施例４：実施例１に開示する血漿補充フィブリノゲンにおける抗Ｂ１９抗体の定量
ヒト血清血漿中のＩｇＧクラスパルボウイルスＢ１９抗体を検出するためにパルボウイルスＢ１９−ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（ＢＩＯＴＲＩＮ）、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、Ｂ１９特異的抗体の定量を行った。アッセイは製造者の指示書に従って行った。試料Ａ及びＢに関して得られた結果を、表３に要約する。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
表３は、両方の試料に抗Ｂ１９  Ａｂｓが存在するが、血漿で補充されたフィブリノゲン試料（試料Ｂ）中の抗Ｂ１９  Ａｂｓの量が、非補充試料（試料Ａ）における量よりも有意に高い（４．８ＩＵ／ｍｌ対２．０ＩＵ／ｍｌ）ことを示す。
【０１１９】
実施例５：血漿補充フィブリノゲンの処理
実施例１の血漿補充フィブリノゲンを、２つの直交性ウイルス不活化工程と、プラスミン及びプラスミノゲンの除去と、濃縮と、調製と、滅菌濾過とを含むように、処理した（基本的に、国際特許出願公開第２０１３／００１５２４号におけるように）。最終的な製剤は、５０〜９０ｍｇ／ｍｌの範囲内のフィブリノゲン濃度を含んでいた。
【０１２０】
実施例６：フィブリンシーラントの成分としての血漿補充フィブリノゲン製剤のインビボでの評価
ラット腎臓止血モデルは、止血試験のための一般的なモデルである（Ｒａｃｃｕｉａ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．１９９２．１６３（２）：２３４〜８）。手短には、腎臓を腹膜側から解剖して出し、その周囲にパッドを置いて血液を吸い上げた。腎臓に供給する血管上にクランプを置き、腎臓を通して横方向の切断部を作製した。血漿補充フィブリノゲン成分（実施例５のように調製）及びトロンビン成分（ＶＩＣＥＬフィブリンシーラントにおけるトロンビン成分のような）を含むシーラント製剤を、１：１の比で使用した。シーラントを適用し、クランプを除去した。出血を１時間の間評価した後、出血の総量を秤量した。続いて、シーラントを擦り落とし、出血を再開させ、低、中又は高として定量した（出血の可能性が尚存在するか否かを評価するために）。全てのラットに３００ＩＵヘパリン／ｋｇ動物体重を注入して、自発的な止血を防止した。
【０１２１】
結果は、血漿補充フィブリノゲン成分を含むフィブリンシーラントが効果的な止血を達成したことを示す。
【０１２２】
本明細書では様々な実施形態について説明してきたが、その実施形態に対して多くの改変及び変更を行ってもよい。また、特定の成分に関して材料を開示したが、他の材料を使用してもよい。以上の明細書及び以下の「特許請求の範囲」は、このような改変及び変更を全て網羅することを意図する。
【０１２３】
全体的に又は一部において、本明細書に参照により援用すると言われるいずれの特許、刊行物、又は他の開示資料も、援用される資料が既存の定義、記載、又は本開示に記載されている他の開示資料と矛盾しない程度にのみ本明細書に援用するものとする。このように、また必要な範囲で、本明細書に明瞭に記載されている開示は、参照により本明細書に組み込まれる任意の矛盾する事物に取って代わるものとする。本出願のいずれの参照文献の引用又は指定も、このような参照文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１２４】
節の見出しは、本明細書では、明細書の理解を容易にするために用いられており、必ずしも限定するものとして解釈すべきではない。
【０１２５】
〔実施の態様〕
（１）  フィブリノゲン製剤の調製方法であって、
濃縮フィブリノゲン調製物と血漿源とを混合する工程を含む、方法。
（２）  前記濃縮フィブリノゲン調製物が、血液又は血液画分に由来する、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記濃縮フィブリノゲン調製物中のフィブリノゲン濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの範囲内である、実施態様１又は２に記載の方法。
（４）  前記濃縮フィブリノゲン調製物中のフィブリノゲン濃度が、約１０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの範囲内である、実施態様１又は２に記載の方法。
（５）  前記濃縮フィブリノゲン調製物がクリオプレシピテートである、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１２６】
（６）  前記クリオプレシピテートが、第ＶＩＩＩ因子枯渇クリオプレシピテートである、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記濃縮フィブリノゲン調製物と前記血漿とが、約１：１の比で混合される、実施態様１〜６のいずれかに記載の方法。
（８）  血漿補充フィブリノゲン製剤。
（９）  実施態様１〜７のいずれかに記載の方法に従って得ることが可能なフィブリノゲン製剤。
（１０）  フィブリンシーラントの成分として使用するための、実施態様８又は９に記載のフィブリノゲン製剤。
【０１２７】
（１１）  血漿補充フィブリノゲンを含むシーラント製剤。
（１２）  血漿補充フィブリノゲン成分及びトロンビン成分を表面に適用することを含む、前記表面におけるシーラントの調製方法。
（１３）  血漿補充フィブリノゲンから調製されたフィブリンモノマーを含む、シーラント製剤。
（１４）  実施態様８、９、１１又は１３のいずれかに記載の製剤を含む容器。
（１５）  実施態様１４に記載の容器及び任意に使用説明書を含む、キット。
【０１２８】
（１６）  必要のある対象における失血を封止、治癒及び／又は低減する方法であって、有効量の実施態様８、９、１１又は１３のいずれかに記載の製剤を前記対象に適用することを含む、方法。
（１７）  有効量の実施態様８、９又は１１のいずれかに記載の製剤を、トロンビン製剤と共に前記対象に適用することを含む、実施態様１６に記載の方法。
（１８）  フィブリンモノマーを含む血漿補充製剤。
【図１】
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