(57)【要約】      （修正有）【課題】精製された治療用ナノ粒子、そのようなナノ粒子を含有している組成物、そのようなナノ粒子または組成物の調製方法、およびそのようなナノ粒子または組成物の使用方法の提供。【解決手段】活性成分とヒト血清アルブミンとを含有している精製された治療用ナノ粒子であって、ここでは、前記治療用ナノ粒子における活性成分に対するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の重量比が、０．０１：１〜８．５：１の２つの比の間の範囲より選択され、前記治療用ナノ粒子が、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、精製された治療用ナノ粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分とヒト血清アルブミンとを含有している精製された治療用ナノ粒子であって、ここでは、前記治療用ナノ粒子における活性成分に対するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の重量比が、０．０１：１、０．０２：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．５１：１、０．５２：１、０．５３：１、０．５４：１、０．５５：１、０．５６：１、０．５７：１、０．５８：１、０．５９：１、０．６：１、０．６５：１、０．７０：１、０．７５：１、０．８：１、０．８５：１、０．９：１、０．９５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、または上記任意の２つの比の間の範囲より選択され、前記治療用ナノ粒子が、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、精製された治療用ナノ粒子。
【請求項２】
活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比が、０．０３：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、または上記の任意の２つの比の間の範囲より選択される、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子が最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有している、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項４】
前記活性成分が、水に不溶であるかまたはわずかに可溶であるが、有機溶媒に可溶であるかまたは溶けやすい性質を有している、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項５】
前記活性成分が、タキサン、マクロライド、カンプトテシン、アントラサイクリン系抗生物質、コルヒチン、チオコルヒチン二量体、アミオダロン、リオチロニン、シクロスポリン、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ロミデプシン、セムスチン、およびイブプロフェンより選択される、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項６】
前記活性成分がタキサンである、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項７】
前記タキサンが、パクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項８】
前記有機溶媒が、低い水溶性と低い沸点を有している純粋な溶媒であるか、または低分子アルコールとのその混合物である、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項９】
前記活性成分が、ヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されている、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１０】
治療用ナノ粒子の平均粒径が、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００ｎｍ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１１】
活性成分とヒト血清アルブミンとを含有している精製された治療用ナノ粒子であって、ここでは、前記活性成分がヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されており、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比が０．０３：１から０．７：１までであり、治療用ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍから１９０ｎｍまでであり、そして前記ナノ粒子がナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、精製された治療用ナノ粒子。
【請求項１２】
ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、請求項１に記載の治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物。
【請求項１３】
ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、請求項１１に記載の治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が、液体または凍結乾燥粉末の形態である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記薬学的組成物が凍結乾燥粉末の形態である場合には、前記薬学的組成物が凍結乾燥賦形剤もまた含有している、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記凍結乾燥賦形剤が、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびデキストランの１種類以上より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記組成物が最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有する、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記活性成分がパクリタキセルである、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
癌を治療するための、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
癌を治療するための、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の治療用ナノ粒子を含有し、ＨＳＡを凍結乾燥賦形剤としてさらに含有している、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、薬学分野に、より具体的にはヒト血清アルブミンと疎水性薬物を含有しているナノ粒子、およびその調製方法に、そしてなおさらに具体的には、特定の物理的性質を含むアルブミンナノ粒子、およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パクリタキセルは、抗癌剤として、有糸分裂において微小管阻害剤として作用し、細胞内微小管の重合および安定化において重要な役割を担っている。有糸分裂の段階では、パクリタキセルは微小管の分離をできなくし、その結果、細胞は、Ｇ２期とＭ期の間でブロックされる。結果として、高速で分裂している腫瘍細胞はパクリタキセルにより有糸分裂期で停止させられ、複製が妨げられたことが原因で細胞死に至る。パクリタキセルは様々な癌（例えば、乳癌、卵巣癌、肺癌、および膀胱癌など）に対して重要な臨床的活性を有している。
【０００３】
しかし、不十分な水溶性が原因で、ヒトの体におけるパクリタキセルの用途は限定されている。パクリタキセルを静脈内注射に適するようにするために、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）は、界面活性物質であるポリオキシエチレンヒマシ油（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ）と無水アルコールがパクリタキセルの溶解性を高めるために共溶媒として一緒に添加されているＴＡＸＯＬ（登録商標）を開発した。Ｔａｘｏｌは、卵巣癌、乳癌、肺癌、食道癌、および頭頸部癌に対して有意な活性を有する。しかし、Ｔａｘｏｌが、治療に関連する毒性、およびかなりの急性かつ累積的な毒性（例えば、骨髄抑制、発熱性好中球減少症、および過敏症など）を誘導する可能性があることが明らかにされている。これらの副作用は、使用された界面活性物質であるポリオキシエチレンヒマシ油に関連する（Ａｎａｎｔｂｈｕｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｉａ  Ｐａｃ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１３；９：１７６−１８１）。治験の報告書および市販後の安全性に関するデータに基づくと、Ｔａｘｏｌにより誘導された過敏症の全体的な発症率は約３９％である。現在、Ｔａｘｏｌが使用される場合は、界面活性物質が原因である副作用を緩和するために、抗ヒスタミン剤およびステロイド剤が前もって患者に投与される。
【０００４】
パクリタキセルの水溶性を改善するために、より高い水溶性を提供する可能性がある官能基（例えば、スルホン酸エステル誘導体（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５０５９６９９号（１９９１））、およびアミノ酸エステル誘導体（Ｍａｔｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：１４５−１５１（１９９２）））を使用した研究による構造の変更もまた行われている。これらは、変更後に明らかな生物学的活性を示す。しかし、これらの変更は、望ましくない副作用を誘導するか、または薬効を低下させる可能性があり、さらに、医薬製剤のコストを増大させる可能性がある。
【０００５】
パクリタキセル製剤におけるＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬの有害な作用を回避するために、乳化剤または界面活性剤をいずれも含まない別の薬物送達システムが開発された。このようなシステムはミクロ粒子またはナノ粒子の形態であり、アルブミン（その一部がパクリタキセルと複合体を形成する）を含む。しかし、このシステムにはなおも多くの不都合がある。例えば、上記製剤には多量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が必要であり、これはアレルギーを引き起こす可能性がある。ＨＳＡは依然、ヒトの血液から取られており、採血および保存の際に起こり得るコンタミネーションが原因で、安全性リスクの可能性がある。加えて、ＨＳＡは比較的高価であり、特定の地域では不足し得る。
発明の概要
本開示は、精製された治療用ナノ粒子、そのようなナノ粒子を含有している組成物、そのようなナノ粒子または組成物の調製方法、およびそのようなナノ粒子または組成物の使用方法を提供する。
１つの態様では、本開示は、活性成分とヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子を提供する。ここでは、治療用ナノ粒子における活性成分に対するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の重量比は、０．０１：１、０．０２：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．５１：１、０．５２：１、０．５３：１、０．５４：１、０．５５：１、０．５６：１、０．５７：１、０．５８：１、０．５９：１、０．６：１、０．６５：１、０．７０：１、０．７５：１、０．８：１、０．８５：１、０．９：１、０．９５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、または上記の任意の２つの比の間の範囲より選択され、ここでは、治療用ナノ粒子は、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない。
特定の実施形態では、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比は、０．０３：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、または上記の任意の２つの比の間の範囲より選択される。
特定の実施形態では、ナノ粒子は最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有する。
特定の実施形態では、活性成分は、水に不溶であるかまたはわずかに可溶であるが、有機溶媒に可溶であるかまたは溶けやすい性質を有する。
特定の実施形態では、活性成分は、タキサン、マクロライド、カンプトテシン、アントラサイクリン系抗生物質、コルヒチン、チオコルヒチン二量体、アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｄｏｎｅ）、リオチロニン、シクロスポリン、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ロミデプシン、セムスチン、およびイブプロフェンより選択される。
特定の実施形態では、活性成分はタキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）である。
特定の実施形態では、有機溶媒は、低い水溶性と低い沸点を有している純粋な溶媒、または低分子アルコールとのその混合物である。
特定の実施形態では、活性成分は、ヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されている。
特定の実施形態では、治療用ナノ粒子の平均粒径は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００ｎｍ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される。
別の態様では、本開示は、活性成分とヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子を提供する。ここでは、活性成分は、ヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されており、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比は０．０３：１から０．７：１までであり、治療用ナノ粒子の平均粒径は５０ｎｍから１９０ｎｍまでであり、そしてナノ粒子は、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない。
別の態様では、本開示は、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物を提供する。ここでは、上記組成物は、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない。
特定の実施形態では、薬学的組成物は液体または凍結乾燥粉末の形態である。
薬学的組成物が凍結乾燥粉末の形態である特定の実施形態では、薬学的組成物は、１種類以上の凍結乾燥賦形剤（例えば、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン、またはそれらの混合物を含有する。
特定の実施形態では、薬学的組成物は最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有する。
別の態様では、本開示は、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子の調製方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させる工程、およびヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
２）上記油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；ならびに
４）上記懸濁液からナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去して、精製された治療用ナノ粒子を得る工程。
特定の実施形態では、有機溶媒はクロロホルムおよびエタノールの１種以上より選択される。
特定の実施形態では、上記方法は、工程３）と工程４）の間に、懸濁液から残留している有機溶媒を除去するために、工程３）の懸濁液を水溶液で透析する工程をさらに含む。
特定の実施形態では、上記水溶液は水である。
特定の実施形態では、上記工程４）における分離は、遠心分離、透析、および排除クロマトグラフィーより選択される方法を使用して行われる。
関連する態様では、本開示は、以下の工程を含む、本明細書中で提供される薬学的組成物の調製方法を提供する：
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させる工程、およびヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
２）上記油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；
４）ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去して、精製された治療用ナノ粒子を得る工程；
５）精製された治療用ナノ粒子を賦形剤を含有している溶液中に再懸濁させる工程；ならびに
６）随意に、精製された治療用ナノ粒子の再懸濁液を凍結乾燥させて、薬学的組成物を得る工程。
特定の実施形態では、上記方法は、工程３）と工程４）の間に、懸濁液から残留している有機溶媒を除去するために、工程３）の懸濁液を水溶液で透析する工程をさらに含む。
特定の実施形態では、上記水溶液は水である。
別の関連する態様では、本開示は、以下の工程を含む、本明細書中で提供される薬学的組成物の調製方法を提供する：
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させる工程、およびヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
２）上記油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；
４）賦形剤を含有している溶液により有機溶媒の除去後に得られた懸濁液を透析して、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去する工程；ならびに
５）随意に、透析した懸濁液を凍結乾燥させて薬学的組成物を得る工程。
特定の実施形態では、上記方法は、工程３）と工程４）の間に、懸濁液から残留している有機溶媒を除去するために、工程３）の懸濁液を水溶液で透析する工程をさらに含む。
特定の実施形態では、上記水溶液は水である。
別の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書中で提供される薬学的組成物をそれが必要な被験体に投与する工程を含む、癌の処置方法を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書中で提供される治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物を提供する。ここでは、上記組成物は、ＨＳＡを凍結乾燥賦形剤としてさらに含有する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、実施例５の試料の走査型電子顕微鏡画像を示す。
【０００７】
【図２】図２は、実施例５の試料を使用して調製したナノ粒子の走査型電子顕微鏡画像を示す。
【０００８】
【図３】図３は、パクリタキセルのＸ線回折パターンを示す。
【０００９】
【図４】図４は、アルブミンの凍結乾燥粉末のＸ線回折パターンを示す。
【００１０】
【図５】図５は、実施例２に対応しているパクリタキセル−アルブミンナノ粒子のＸ線回折パターンを示す。
【００１１】
【図６】図６は、実施例４に対応しているパクリタキセル−アルブミンナノ粒子のＸ線回折パターンを示す。
【００１２】
【図７】図７は、実施例６に対応しているパクリタキセル−アルブミンナノ粒子のＸ線回折パターンを示す。
【００１３】
【図８】図８は、実施例８に対応しているパクリタキセル−アルブミンナノ粒子のＸ線回折パターンを示す。
【００１４】
【図９】図９は、様々な製剤の精製されたナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロフィールを示す。
【００１５】
【図１０】図１０は、精製されたナノ粒子および従来の製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロフィールを示す。
【００１６】
【図１１】図１１は、イヌにおける精製されたナノ粒子および従来の製剤の薬物動態プロフィールを示す。
【００１７】
【図１２】図１２は、アルブミン濃度がＭＣＦ−７細胞に対する薬物の阻害作用に影響を及ぼすことを示す。
【００１８】
【図１３】図１３は、アルブミン濃度がＳＰＣ−Ａ−１細胞に対する薬物の阻害作用に影響を及ぼすことを示す。
【００１９】
【図１４】図１４は、アルブミン濃度がヒト血管内皮細胞ＥＡ．ｈｙ  ９２６による薬物の取り込みに影響を及ぼすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、精製された、ＨＳＡを含有している治療用ナノ粒子、そのようなナノ粒子を含有している組成物、ならびにそのようなナノ粒子および組成物の調製方法または使用方法を提供する。
【００２１】
精製された治療用ナノ粒子またはそのようなナノ粒子を含有している組成物は、以下の優れた性質のうちの１つ以上を有する：
【００２２】
（１）ＨＳＡを含有しているナノ粒子を含む以前から知られている組成物と比較して、精製された治療用ナノ粒子またはその組成物は、上記ナノ粒子または組成物が投与される被験体においてアレルギー反応を軽減する（例えば、実施例２５、２７、および６１を参照のこと）。いずれの仮説にも縛られることは望ましくないが、アレルギー反応の軽減は、精製されたナノ粒子またはその組成物中の減少した量のＨＳＡ多量体により生じている可能性があると提案される。ナノ粒子の調製の間に、ＨＳＡ単量体の一部がＨＳＡ多量体を形成し、より重症なアレルギー反応を引き起こすことが本発明者らにより発見された（例えば、実施例３２および６０を参照のこと）。最初の調製物からのナノ粒子の精製により、ナノ粒子に取り込まれていないほとんどの遊離のＨＳＡ（遊離のＨＳＡ多量体を含む）が排除される。
【００２３】
（２）ＨＳＡを含有しているナノ粒子を含む以前から知られている組成物と比較して、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子を含有している特定の組成物は、より安定である（例えば、実施例６２および６３を参照のこと）。これは、本開示の精製されたナノ粒子および組成物における活性成分に対するＨＳＡの比の有意な低下から見ると、そして多量のＨＳＡがナノ粒子を含有する組成物の安定化に重要または必要であるという当該分野での考え方から見ても、予想外である。
【００２４】
（３）動物での研究においてはｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出プロフィール、最大耐量、薬物動態特性、および有効性を維持したまま（例えば、実施例２２および２６〜３１を参照のこと）、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子またはその組成物は、ヒトの標的細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞およびヒト血管内皮細胞）へより容易に送達されるか、またはヒトの標的細胞によってより容易に取り込まれ、そのような細胞中でより優れた所望される作用を達成する（例えば、実施例５８および５９を参照のこと）。
【００２５】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。
【００２６】
数の範囲および適切なパラメーターの値が本開示の広い範囲で与えられるが、具体的な実施例の中の全ての数は可能な限り正確に記載される。しかし、それらの個々の測定について測定の際の標準偏差により生じる可能性がある一定の誤差が全ての数値について必然的に存在する。さらに、本明細書中で開示される全ての範囲が、その中に含まれる任意および全ての可能な部分範囲を含むことが理解されるものとする。例えば、本明細書中で記載される範囲「１から１０まで」は、最小である１と最大である１０との間の任意および全ての可能な部分範囲（端点を含む）を含むことが理解されるものとする。すなわち、全ての部分範囲は、最小である１またはそれ以上（例えば、１から６．１）から始まり、全ての部分範囲は、最大である１０またはそれ未満（例えば、５．５から１０）で終わる。さらに、「本明細書中に組み込まれる」と記載される任意の参考文献はその全体が組み込まれると理解されるものとする。
【００２７】
さらに、明らかかつ明白な別段の規定がない限りは、単数形は、本開示において使用される場合は複数の指示物を含むことに留意されるべきである。文脈において明白な別段の規定がない限りは、用語「または（ｏｒ）」と用語「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は互換的に使用される。
【００２８】
本明細書中で使用される用語「ナノ粒子」は、少なくとも１つの次元（例えば、一、二または三次元）でナノメートル単位である、例えば、約１ｎｍ、約１０ｎｍ、または約１００ｎｍのレベルの粒子を意味する。
【００２９】
用語「約」は、具体的な値を１０％上回る値または１０％下回る値を意味する。例えば、「約５０ｎｍ」は４５ｎｍ〜５５ｎｍを意味する。
【００３０】
本明細書中で使用される用語「治療用ナノ粒子」は、疾患の処置または予防に使用することができるナノ粒子を意味する。ここでは、疾患（例えば、癌）は、好ましくは、肝臓癌、前立腺癌、および肺癌より選択される。
【００３１】
本明細書中で使用される用語「ヒト血清アルブミン単量体」または「ＨＳＡ単量体」は、５８５アミノ酸からなる水溶性グロブリンを意味し、おおよその分子量は約６６，０００ダルトンである。これは、ヒトの血漿中に最も豊富に存在するタンパク質である。サイズ排除クロマトグラフィーにおいては、ヒト血清アルブミン単量体の保持時間が最も長く、正常なヒトのアルブミン生成物の大部分を占める。ＨＳＡは、薬物の様々なセット（特に、中性の電荷をもつ疎水性化合物および負電荷をもつ疎水性化合物）に結合することができる複数の疎水性結合部位を有している。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「ヒト血清アルブミン多量体」または「ＨＳＡ多量体」は、ヒト血清アルブミン単量体より重合した多量体の全体（二量体、三量体、および多量体を含む）を意味する。サイズ排除クロマトグラフィーにおけるヒト血清アルブミン多量体の保持時間は、ＨＳＡ単量体より短い。ＨＳＡ多量体は、ヒトのアルブミン生成物中に極少量（通常は、＜５％）しか存在しない。
【００３３】
ＨＳＡは、様々な増殖しつつある腫瘍の中に蓄積し、腫瘍細胞によるエネルギーおよびアミノ酸の取り込みの供給源として使用される。ｇｐ６０（アルボンディン）は、血管内皮中で過度に発現され、ＨＳＡに結合してＨＳＡをトランスサイトーシスにより下層組織に運搬する。ｇｐ６０は組織細胞中では発現されず、組織細胞中でのＨＳＡの輸送には関与していない。ＳＰＡＲＣ（分泌タンパク質であり、酸性であり、そしてシステインを多く含む）はｇｐ６０と相同なアミノ酸配列を有しており、ＨＳＡおよびｇｐ６０抗体に結合することができる。ＳＰＡＲＣは複数のタイプの腫瘍において過剰発現され、多くの研究により、ＳＰＡＲＣが組織細胞によるＨＳＡの取り込みと相関関係にあることが明らかにされている。ＨＳＡが結合した薬物もまた、内皮バリアを超えて腫瘍組織へと渡り、Ｇｐ６０−ＳＰＡＲＣ膜透過輸送経路により腫瘍細胞中に内在化することを示唆している研究が複数存在している。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「実質的に純粋なナノ粒子」または「精製されたナノ粒子」は、ヒト血清アルブミンと活性成分とから構成されているナノ粒子を意味し、ここでは、１０％未満（例えば、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％、または０．１％未満）のＨＳＡが遊離のＨＳＡである。
【００３５】
同様に、本明細書中で使用される用語「遊離のヒト血清アルブミンを実質的には含まない」または「遊離のＨＳＡを実質的には含まない」は、１０％未満（例えば、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％、または０．１％未満）の遊離のＨＳＡを有していることを意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「遊離のヒト血清アルブミン」または「遊離のＨＳＡ」は、ナノ粒子の中に取り込まれていないＨＳＡを意味する。ナノ粒子またはその組成物中の遊離のＨＳＡの量は、当該分野で公知である方法、または本開示（例えば、実施例１１および１７〜１９）で提供される方法により測定することができる。
【００３７】
本明細書中で使用される用語「活性成分」は薬学的活性成分を意味する。具体的には、活性成分は、治療的役割（例えば、任意の疾患および／または障害の処置、予防、緩和、または抑制）を果たすことができる任意の物質または実体を意味する。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「透析率（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｆｏｌｄ）」は、透析処理における試料溶液に対する消費された透析液の容積比を意味し、ここでは、試料溶液の容積は一定に保たれる。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「凍結乾燥賦形剤」は、凍結−乾燥処理の際にそのようなナノ粒子を維持するために、精製された治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物に対して添加される化合物を意味する。
【００４０】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、被験体（すなわち、患者）の疾患、障害、または状態の医学的管理を意味する（例えば、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙを参照のこと）。「癌の処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）」は、癌の症状の数を減らすこと、１つ以上の症状の重症度を下げること、または癌の進行を遅らせることを意味する。
【００４１】
特定の治療剤の「治療有効量」は、統計学的に有意な様式での癌の１つ以上の症状の重症度の低下、排除、または発症もしくは再発の遅延をもたらすために十分な薬剤の量を意味する。
【００４２】
１つの態様では、本開示は、活性成分とＨＳＡを含有している精製された治療用ナノ粒子を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子における活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比は、０．０１：１、０．０２：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．５１：１、０．５２：１、０．５３：１、０．５４：１、０．５５：１、０．５６：１、０．５７：１、０．５８：１、０．５９：１、０．６：１、０．６５：１、０．７０：１、０．７５：１、０．８：１、０．８５：１、０．９：１、０．９５：１、１：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、または上記任意の２つの比の間の範囲からなる群より選択される。
【００４４】
いくつかの特異的な実施形態では、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比は、０．０３：１、０．０４：１、０．０５：１、０．０６：１、０．０７：１、０．０８：１、０．０９：１、０．１０：１、０．１１：１、０．１２：１、０．１３：１、０．１４：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．１９：１、０．２：１、０．２１：１、０．２２：１、０．２３：１、０．２４：１、０．２５：１、０．２６：１、０．２７：１、０．２８：１、０．２９：１、０．３：１、０．３１：１、０．３２：１、０．３３：１、０．３４：１、０．３５：１、０．３６：１、０．３７：１、０．３８：１、０．３９：１、０．４：１、０．４１：１、０．４２：１、０．４３：１、０．４４：１、０．４５：１、０．４６：１、０．４７：１、０．４８：１、０．４９：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、または上記任意の２つの比の間の範囲、例えば、０．０３：１〜０．１９：１、または０．２１：１〜０．９：１からなる群より選択される。
【００４５】
より具体的には、特定の実施形態では、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比は、０．０４３：１、０．０７１：１、０．１３：１、０．１５：１、０．１６：１、０．１７：１、０．１８：１、０．２４：１、もしくは０．５７：１、または上記の任意の２つの比の間の範囲、例えば、０．０４３：１〜０．０７１：１、０．０４３：１〜０．１３：１、０．０４３：１〜、０．０４３：１〜０．１５：１、０．０４３：１〜０．１６：１、０．０４３：１〜０．１７：１、０．０４３：１〜０．１８：１、０．０４３：１〜０．２４：１、０．０４３：１〜０．５７：１、０．０７１：１〜０．１３：１、０．０７１：１〜０．１５：１、０．０７１：１〜０．１６：１、０．０７１：１〜０．１７：１、０．０７１：１〜０．１８：１、０．０７１：１〜０．２４：１、０．０７１：１〜０．５７：１、０．１３：１〜０．１５：１、０．１３：１〜０．１６：１、０．１３：１〜０．１７：１、０．１３：１〜０．１８：１、０．１３：１〜０．２４：１、０．１３：１〜０．５７：１、０．１５：１〜０．１６：１、０．１５：１〜０．１７：１、０．１５：１〜０．１８：１、０．１５：１〜０．２４：１、０．１５：１〜０．５７：１、０．１６：１〜０．１７：１、０．１６：１〜０．１８：１、０．１６：１〜０．２４：１、０．１６：１〜０．５７：１、０．１７：１〜０．１８：１、０．１７：１〜０．２４：１、０．１７：１〜０．５７：１、０．１８：１〜０．２４：１、０．１８：１〜０．５７：１、または０．２４：１〜０．５７：１である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンの内部へのカプセル化に適している活性成分は、水に不溶であるかまたはわずかに可溶であり、有機溶媒には可溶であるかまたは溶けやすい。有機溶媒は、低い水溶性（すなわち、６％未満の水溶性）および低い沸点（すなわち、８０℃未満の沸点）を持つ純粋な溶媒、または上記純粋な溶媒の低分子アルコール（エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソプロパノールなどを含む）とのその混合物であり得る。特異的な有機溶媒として、クロロホルム、ジクロロメタンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
本開示に適している活性成分は、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、ドセタキセルの疎水性誘導体（例えば、２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセル、および２’−ベンゾイルドセタキセル）を含むがこれらに限定されるわけではない）、またはマクロライド（ラパマイシンおよびその誘導体（例えば、テムシロリムスおよびエベロリムス）、エポチロンＢおよびその誘導体、タネスピマイシンおよびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない）、またはカンプトテシン（１０−ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８およびその誘導体を含むがこれらに限定されるわけではない）、またはアントラサイクリン系抗生物質（アクラシノマイシンおよびピラルビシンを含むがこれらに限定されるわけではない）、または他の活性成分（コルヒチンおよびその誘導体、チオコルヒチン二量体、アミオダロン、リオチロニン、シクロスポリン、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ロミデプシン、セムスチン、イブプロフェン、シクロスポリン、プロポフォール、ビンブラスチンなどを含む）である。いくつかの実施形態では、活性成分は、パクリタキセルおよびドセタキセルのうちの１種類以上より選択される。特定の実施形態では、活性成分はパクリタキセルである。いくつかの他の実施形態では、活性成分は、ドセタキセル、ラパマイシンおよびその誘導体、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラントなどより選択される。
【００４８】
特定の実施形態では、活性成分として、化学療法剤、放射線治療剤、免疫療法剤、および温熱療法剤など（例えば、アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、アミシン、パクリタキセル、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、塩酸プロカルバジン、チオグアニン、ビンブラスチン硫酸およびビンクリスチン硫酸）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４９】
いくつかの実施形態では、治療用ナノ粒子の平均粒径は、３０、５０、７０、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００ｎｍ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される。粒径を、現存するかまたは将来明らかになるであろう任意の適切な方法（重力沈降法、篩法、顕微鏡観察、またはレーザー粒径測定装置（ｌａｓｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ）を含むがこれらに限定されるわけではない）を使用して決定できることが当業者に理解されるものとする。本開示の中で開示される治療用ナノ粒子が複数の粒子を含む場合は、必ずしもすべての治療用ナノ粒子が同じ粒径を有していなければならないというわけではなく、それらの平均粒径（すなわち、平均粒子直径）が上記範囲内にある限りは、これらもまた本開示の範囲に含まれることもまた理解されるものとする。いくつかの特異的な実施形態では、粒径はレーザー粒径測定装置により決定される。治療用ナノ粒子の平均粒径は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０ｎｍ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される。
【００５０】
いくつかの態様では、ナノ粒子の粒径は特定の範囲内、例えば、３０ｎｍから２００ｎｍまで、好ましくは５０から１９０ｎｍまでである。好ましくは、粒径は実質的に均一である。
【００５１】
１つの特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．０４３：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１４０ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５２】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．０７１：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１３４ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５３】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１３：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１２５ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５４】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１５：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１３６ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５５】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１６：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１３３ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５６】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１７：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１３６ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５７】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１８：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１３８ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５８】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．２４：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１４１ｎｍである、パクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００５９】
別の特別な実施形態では、パクリタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてパクリタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．５７：１であり、治療用ナノ粒子の平均粒径が１４５ｎｍであるパクリタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００６０】
別の特別な実施形態では、ドセタキセルがヒト血清アルブミンの中にカプセル化されており、そしてドセタキセルに対するヒト血清アルブミンの重量比が０．１：１であり、治療用ナノ粒子の粒径が１１０ｎｍから１５０ｎｍまでの範囲にある、ドセタキセルとヒト血清アルブミンを含有している精製された治療用ナノ粒子が提供される。
【００６１】
本開示の精製された治療用ナノ粒子は、遊離のＨＳＡを実質的には含まない。特定の実施形態では、精製された治療用ナノ粒子は、最大で８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％、０．５重量％、または０．１重量％の遊離のＨＳＡを含有する。すなわち、精製された治療用ナノ粒子中の全ＨＳＡのうち最大で８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％が、活性成分に結合していない、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡである。
【００６２】
特定の実施形態では、精製された治療用ナノ粒子は、本質的には活性成分とＨＳＡからなり、ここでは、実質的に全てのＨＳＡ（すなわち、ＨＳＡの９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上）が活性成分に結合している。
【００６３】
特定の実施形態では、精製された治療用ナノ粒子は、そのようなナノ粒子の調製に使用された最少量（例えば、０．０５ｍｇ／ｍｌ未満、０．０４ｍｇ／ｍｌ未満、０．０３ｍｇ／ｍｌ未満、０．０２ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１ｍｇ／ｍｌ未満、あるいは５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満、または０．０１μｇ／ｍｌ未満）の１種類以上の有機溶媒を含有している。
【００６４】
特定の実施形態では、精製された治療用ナノ粒子はいずれの界面活性物質も含まない。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書中で提供される精製されたナノ粒子は、−２０から−４５まで、または−２５から−４０までのような比較的高いζ電位を有する。
【００６６】
別の態様では、本開示は、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子を含有しており、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、薬学的組成物は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、または０．１％未満の遊離のＨＳＡを含有している。
【００６７】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、被験体への注射に適している形態を含むがこれに限定されない液体の形態で提供される。１つの特別な実施形態では、薬学的組成物は注射液に調製される。
【００６８】
いくつかの他の実施形態では、薬学的組成物は、乾燥粉末または凍結乾燥粉末を含むがこれらに限定されない固体の形態で提供される。
【００６９】
特定の特別な実施形態では、本開示のナノ粒子または薬学的組成物は、デフェロキサミンまたはその塩（例えば、メシル酸デフェロキサミン）を含まない。
【００７０】
特定の特別な実施形態では、本開示の精製されたナノ粒子または薬学的組成物は、さらなる安定剤を含まない。
【００７１】
液体形態で提供される場合は、薬学的組成物は、本開示の治療用ナノ粒子と薬学的に許容され得る担体を含有する。治療用ナノ粒子は、薬学的に許容され得る担体の中に懸濁させられる。薬学的に許容され得る担体としては、緩衝液、防腐剤、注射用水、通常生理食塩溶液、および等張液が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの特異的な実施形態では、治療用ナノ粒子の活性成分の濃度は、液体形態の薬学的組成物中で１〜１０ｍｇ／ｍｌ（例えば、５ｍｇ／ｍｌ）である。
【００７２】
固体形態で提供される場合は、薬学的組成物は、本開示の治療用ナノ粒子と凍結乾燥賦形剤を含有する、本開示の治療用ナノ粒子と凍結乾燥賦形剤から本質的になる、または本開示の治療用ナノ粒子と凍結乾燥賦形剤からなる。いくつかの特異的な実施形態では、凍結乾燥賦形剤は、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびデキストランの１種以上より選択される。特定の特別な実施形態では、治療用ナノ粒子が、凍結乾燥賦形剤の溶液中に５％から１０％までの濃度で懸濁させられ、続いてこの溶液が凍結乾燥させられて薬学的組成物が凍結乾燥粉末の形態で得られる。特定の実施形態では、凍結乾燥賦形剤の溶液は、５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のトレハロース溶液、および１０％のマルトース溶液の１種類以上より選択される。いくつかの特異的な実施形態では、固体形態の薬学的組成物中の治療用ナノ粒子の含有量は、４．８重量％から１０重量％までである。
【００７３】
以下の工程を含む、本開示の精製された治療用ナノ粒子の調製方法もまた提供される：
（１）活性成分をヒト血清アルブミンと混合することにより治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を調製する工程、および（２）上記懸濁液からナノ粒子を精製して実質的に純粋な治療用ナノ粒子を得る工程。
【００７４】
別の態様では、本開示はまた、本明細書中で提供される方法により得られた治療用ナノ粒子を提供する。
【００７５】
別の態様では、精製された治療用ナノ粒子の調製方法が提供される。この方法は以下の工程を含む：
【００７６】
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させる工程、およびヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
【００７７】
２）油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
【００７８】
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；
【００７９】
４）上記懸濁液からナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去して、精製された治療用ナノ粒子を得る工程。
【００８０】
適切な有機溶媒（単数または複数）は、活性成分の性質に基づいて当業者により選択され得る。いくつかの特異的な実施形態では、活性成分がタキサンである場合は、適している有機溶媒は、クロロホルム、エタノール、またはクロロホルムとエタノールの混合物である。より具体的には、活性成分がパクリタキセルまたはドセタキセルである場合は、適切な有機溶媒はクロロホルムとエタノールの混合物である。いくつかの特異的な実施形態では、クロロホルムとエタノールとの間での容量比は１：１から２０：１までの範囲であり、例えば、１：１、４：１、９：１、および１１：１より選択される。いくつかの特異的な実施形態では、水相中のヒト血清アルブミンの濃度は、２％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）までの範囲である。例えば、２％、４％、５％、および１０％より選択される。いくつかの実施形態では、油相における活性成分と有機溶媒の間での比は、０．３〜７．５ｇ／１５〜２０ｍｌの範囲である。いくつかの特異的な実施形態では、油相における活性成分と有機溶媒の間での比は、０．３ｇ／１５ｍｌ、０．６ｇ／１５ｍｌ、１ｇ／２０ｍｌ、１．２５ｇ／１５ｍｌ、１．８ｇ／１５ｍｌ、２ｇ／１５ｍｌ、２．５ｇ／１５ｍｌ、３ｇ／２０ｍｌ、３ｇ／１５ｍｌ、５ｇ／１５ｍｌ、７．５ｇ／１５ｍｌ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される。
【００８１】
水中油型エマルジョンが油相と水相を用いて形成される場合は、これらの２つの相の間での容量比は１：１０から１：１００までより選択される。いくつかの実施形態では、油相と水相の混合比は３：１００または１：２５である。水中油型エマルジョンは、ホモジナイゼーションを含むがこれに限定されない当該分野で公知の方法を使用して形成される。特定の実施形態では、油相と水相の混合物が高剪断力分散機（ｈｉｇｈ  ｓｈｅａｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｅｒ）を使用して乳化され、続いて、水中油型エマルジョンが得られるように高圧式ホモジナイザー（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用してホモジナイズされる。特定の実施形態では、油相と水相の混合物が高剪断力分散機を使用して２〜１０分間乳化され、続いて、水中油型エマルジョンが得られるように、１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズされる。
【００８２】
有機溶媒を、任意の適切な方法を使用してエマルジョンから除去することができる。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、回転式減圧蒸発装置（ｒｏｔａｒｙ  ｖａｃｕｕｍ
ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してエマルジョンから除去される。特定の実施形態では、有機溶媒は、４０ｍｂａｒの圧力下で４０℃で回転式蒸発措置を使用してエマルジョンから除去される。有機溶媒の除去後、得られる懸濁液は、本開示の治療用ナノ粒子を含有している。しかし、ナノ粒子の形成に関与していない過剰量のアルブミンもまた、この懸濁液中に含まれる。
【００８３】
遊離のＨＳＡを実質的には含まない本開示の精製された治療用ナノ粒子を得るためには、過剰量の遊離のアルブミンが懸濁液からさらに除去される。いくつかの実施形態では、これは、遠心分離、透析、または排除クロマトグラフィーを使用して行われる。特定の実施形態では、懸濁液を、有機溶媒の除去後に遊離のＨＳＡを除去するために直接使用することができる。あるいは、これをさらなる使用のために保存することができる。
【００８４】
本開示の治療用ナノ粒子の望ましい投与経路が静脈内注射であるので、生成物は滅菌状態のものでなければならない。加熱滅菌は、ナノ粒子とヒト血清アルブミンの両方が温度に敏感であるために、本開示では適用できない。したがって、実行可能な滅菌方法として、無菌製造または滅菌濾過が挙げられる。このような場合は、有機溶媒の除去後に、懸濁液がフィルターを通して滅菌され、続いてこれが凍結乾燥させられて固体が得られる。得られた固体は塩化ナトリウム溶液中に再懸濁される。いくつかの実施形態では、固体が、約５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度に達するように０．９％の塩化ナトリウム溶液中に再懸濁される。
【００８５】
治療用ナノ粒子が遠心分離を使用して精製される場合は、遊離のＨＳＡの除去は２１０００×ｇで６０分間、または同等の条件で行われる。
【００８６】
治療用ナノ粒子が透析により精製される場合は、工程３）で得られたナノ粒子を含有している懸濁液は、遊離のＨＳＡを除去するために限外濾過膜を使用して透析される。特定の実施形態では、本開示の方法にしたがって得られたナノ粒子の液体は、３００Ｋのカットオフ分子量を持つ再生セルロース限外濾過膜を使用して等量の５％のマンニトール溶液中に透析され、透析率は５倍である。
【００８７】
治療用ナノ粒子が排除クロマトグラフィーを使用して精製される場合は、治療用ナノ粒子は、排除クロマトグラフィーカラムを使用して遊離のＨＳＡから分離される。特定の実施形態では、工程３）で得られたナノ粒子を含有している懸濁液がセファロースカラム上にアプライされ、治療用ナノ粒子に対応している溶離ピークが回収される。
【００８８】
特定の実施形態では、上記方法はさらに、工程３）と工程４）の間に、工程３）の懸濁液を水溶液（例えば、水または５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のトレハロース溶液、および１０％のマルトース溶液など）で透析して上記懸濁液から残留している有機溶媒を除去する工程が含まれる。例えば、懸濁液は、有機溶媒を通すがＨＳＡまたはナノ粒子は通さない限外濾過膜（例えば、３０Ｋのカットオフ分子量を持つセルロース限外濾過膜）を使用して、水または水溶液中に透析され得る。いずれの理論にも縛られることは望ましくないが、ナノ粒子を含有している懸濁液からの遊離のＨＳＡの除去前の残留している有機溶媒の除去または減少により、精製されたナノ粒子またはその組成物の安定性を改善できる場合がある。
【００８９】
別の態様では、治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物の調製方法もまた提供される。上記方法は以下の工程を含む：
【００９０】
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させる工程、およびヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
【００９１】
２）油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
【００９２】
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；
【００９３】
４）ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去して、精製された治療用ナノ粒子を得る工程；
【００９４】
５）精製された治療用ナノ粒子を薬学的に許容され得る担体を含有している溶液中に再懸濁させて、薬学的組成物を得る工程；ならびに
【００９５】
６）随意に、精製された治療用ナノ粒子の再懸濁液を凍結乾燥させる工程であって、ここでは、薬学的組成物が固体の形態である工程。
【００９６】
この方法の工程１）および工程４）は、精製された治療用ナノ粒子の調製方法に関して記載された工程と同じである。加えて、特定の実施形態では、上記方法は、これもまた精製された治療用ナノ粒子の調製方法に関して記載されたように、工程３）と工程４）の間に、工程３）の懸濁液を水溶液で透析して上記懸濁液から残留している有機溶媒を除去する工程を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る担体を含有している溶液は、凍結乾燥賦形剤を含有している溶液である。いくつかの特異的な実施形態では、凍結乾燥賦形剤は、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびデキストランの１種類以上より選択される。いくつかの他の特別な実施形態では、凍結乾燥賦形剤はＨＳＡである。特別な実施形態では、治療用ナノ粒子が、５％から１０％までの濃度で凍結乾燥賦形剤の溶液中に懸濁される。
【００９８】
随意に、薬学的組成物は凍結乾燥後に凍結乾燥粉末になるよう調製される。特定の実施形態では、凍結乾燥賦形剤の溶液は、５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のトレハロース溶液、１０％のマルトース溶液、および１０％のヒト血清アルブミン溶液の１種類以上より選択される。
【００９９】
いくつかの特異的な実施形態では、液体形態の薬学的組成物における治療用ナノ粒子の含有量は０．１％から３０％までであり、好ましくは０．２％から１０％まで、そしてより好ましくは、０．５％から５％まで、例えば１％である。いくつかの特異的な実施形態では、本開示の液体形態の薬学的組成物における活性成分（例えば、パクリタキセル）の含有量は、０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌまで、そしてより好ましくは１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌまで、例えば５ｍｇ／ｍｌである。
【０１００】
特定の実施形態では、固体形態の薬学的組成物における治療用ナノ粒子の含有量は０．１重量％から８０重量％までであり、好ましくは、０．５重量％から５０重量％、そしてより好ましくは、１重量％から３０重量％まで、例えば、２重量％から１０重量％までである。
【０１０１】
いくつかの特異的な実施形態では、液体形態の薬学的組成物における薬学的活性成分（例えば、パクリタキセル）の含有量は、０．１重量％から８０重量％まで、好ましくは０．５重量％から５０重量％まで、そしてより好ましくは１重量％から３０重量％まで、例えば、２重量％から１０％までである。
【０１０２】
あるいは、本開示の薬学的組成物は別の透析手順を使用して調製することができる。上記方法は以下の工程を含む：
【０１０３】
１）活性成分を有機溶媒中に溶解させて油相を形成させ、そしてヒト血清アルブミンを水中に溶解させて水相を形成させる工程；
【０１０４】
２）上記油相と水相を使用して水中油型エマルジョンを形成させる工程；
【０１０５】
３）上記エマルジョン中の有機溶媒を除去して、治療用ナノ粒子を含有している懸濁液を得る工程；
【０１０６】
４）薬学的に許容され得る担体を含有している溶液により有機溶媒の除去後に得られた懸濁液を透析して、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを除去する工程；ならびに
【０１０７】
５）薬学的組成物が固体の形態で調製される場合は、随意に、上記透析された懸濁液を凍結乾燥させる工程。
【０１０８】
この方法の工程１）および工程４）は、遊離のＨＳＡを除去するために透析が使用される場合は、精製された治療用ナノ粒子の調製方法に関して記載された工程と同じである。加えて、特定の実施形態では、上記方法は、これもまた精製された治療用ナノ粒子の調製方法に関して記載されたように、工程３）と工程４）の間に、工程３）の懸濁液を水溶液で透析して上記懸濁液から残留している有機溶媒を除去する工程を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る担体を含有している溶液は、透析液（これは、凍結乾燥賦形剤を含有している溶液である）として使用される。いくつかの特異的な実施形態では、凍結乾燥賦形剤は、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびデキストランの１種類以上より選択される。
【０１１０】
特別な実施形態では、治療用ナノ粒子が、５％から１０％までの濃度の凍結乾燥賦形剤の溶液中に懸濁される。随意に、薬学的組成物は凍結乾燥後に凍結乾燥粉末になるよう調製される。特定の実施形態では、凍結乾燥賦形剤の溶液は、５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のトレハロース溶液、１０％のマルトース溶液、および１０％のヒト血清アルブミン溶液の１種類以上より選択される。いくつかの実施形態では、透析は、３００Ｋのカットオフ分子量を持つ限外濾過膜を使用して行われる。
【０１１１】
別の態様では、本開示は、精製された治療用ナノ粒子またはその組成物の使用方法を提供する。本発明の精製されたナノ粒子または組成物が様々な活性成分を送達するための有効な手段であるので、これらを活性成分に反応する任意の疾患または障害を処置するために使用できる場合がある。例えば、精製された治療用ナノ粒子またはその組成物は、肝臓癌、前立腺癌、および肺癌のような癌の処置に使用することができる。処置され得るさらなる疾患または障害としては、乳癌、多発性骨髄腫、移植拒絶反応、結腸癌、リンパ腫、発熱などが挙げられる。
【０１１２】
特定の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書中で提供される薬学的組成物をそれが必要な被験体に投与する工程を含む、癌の処置方法を提供する。特別な実施形態では、被験体は、ヒト、イヌ、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない哺乳動物である。
【０１１３】
薬学的組成物の治療有効量は、特定の治療剤または薬学的組成物、投与経路、被験体の状態、すなわち、疾患の病期、疾患により起こった症状の重症度、全身の健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、ならびに医学の分野の当業者に明らかである他の要因を含む様々な要因に応じて決定または調整され得る。同様に、疾患または障害の処置についての治療剤の用量は、医学の分野の当業者に理解されているパラメーターにしたがって決定され得る。最適用量は一般的には、実験モデルおよび／または臨床試験を使用して決定され得る。
【０１１４】
薬学的組成物は任意の適切な経路（例えば、経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与）を通じて投与され得る。
【０１１５】
別の態様では、本明細書中で提供される精製された治療用ナノ粒子またはその薬学的組成物を含有している製剤キットもまた本開示の中で提供される。必要である場合は、製剤キットはまた、説明書、パッケージ、および治療用ナノ粒子または薬学的組成物を保持している容器を含有する。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、本明細書中で開示される治療用ナノ粒子および薬学的組成物をさらに説明するために意図されたものであり、本開示のいずれかの態様を限定するように意図されたものではない。
【０１１７】
【０１１８】
実施例１
【０１１９】
３ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を２０ｍｌのクロロホルム／エタノール（９：１、ｖ／ｖ）中に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｍｏｄｅｌ  Ｆ２２Ｅ，Ｆｌｕｋｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ）を使用して２分間乳状化して第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で使用してホモジナイズしてナノエマルジョンを得た。続いて、ナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１３６ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１２０】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１２１】
【０１２２】
実施例２
【０１２３】
０．３２ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機
（Ｍｏｄｅｌ  Ｆ２２Ｅ，Ｆｌｕｋｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１４５ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１２４】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１２５】
【０１２６】
実施例３
【０１２７】
０．６３ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、そして５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１４１ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１２８】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１２９】
【０１３０】
実施例４
【０１３１】
１．２５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機
（Ｍｏｄｅｌ  Ｆ２２Ｚ，Ｆｌｕｋｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１３８ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１３２】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１３３】
【０１３４】
実施例５
【０１３５】
１．８８ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機
（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１３３ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１３６】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１３７】
【０１３８】
実施例６
【０１３９】
２．５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１２５ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１４０】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１４１】
【０１４２】
実施例７
【０１４３】
５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１３４ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１４４】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１４５】
【０１４６】
実施例８
【０１４７】
７．５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１４０ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１４８】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１４９】
【０１５０】
実施例９
【０１５１】
１ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を２０ｍｌのクロロホルム／エタノール（４：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（２％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー
（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１３６ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０１５２】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ  ＬＤ−８５Ｓ，Ｍｉｌｌｒｏｃｋ，ＵＳＡ）の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０１５３】
【０１５４】
実施例１０：ヒト血清アルブミンおよびパクリタキセルの含有量の決定方法
【０１５５】
ヒト血清アルブミンの含有量をＨＰＬＣにより決定した。ヒト血清アルブミンは、Ｔｏｓｏｈａａｓ  ＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬゲルカラムとＵＶ検出器（１２６０ＶＷＤ
Ｇ１３１４Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＨＰＬＣにおいて、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二カリウム溶液の溶離相および１０μｌの注入量を用いて、２２８ｎｍの波長で決定した。アルブミンの含有量は外部標準法を使用して計算した。
【０１５６】
試験溶液の調製：試験溶液は、決定のための溶液を０．９％の塩化ナトリウム溶液を使用して３ｍｇ／ｍｌ未満のアルブミン濃度になるように希釈することにより調製した。
【０１５７】
パクリタキセルの含有量をＨＰＬＣにより決定した。パクリタキセルは、Ｃ１８逆相カラムとＵＶ検出器（１２６０ＶＷＤ  Ｇ１３１４Ｂ，Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続したＨＰＬＣにおいて、アセトニトリル−水（１：１、ｖ／ｖ）の溶離相および１０μｌの注入量を用いて、２２８ｎｍの波長で決定した。パクリタキセルの含有量は外部標準法を使用して計算した。
【０１５８】
試験溶液の調製：２０〜２００μｇ／ｍｌの濃度の試験溶液を、決定のための溶液をパクリタキセルが完全に溶解するまでアセトニトリルを使用して希釈することにより調製した。
【０１５９】
【０１６０】
実施例１１
【０１６１】
実施例１で得た生成物を０．９％の塩化ナトリウム溶液中で再構成して、５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル含有量を持つ試料１を得た。続いて、試料１をパクリタキセル含有量が２０μｇ／ｍｌに到達し得るように５％のアルブミンを含有している疑似血漿を使用して希釈し、試料２を得た（粒子はこのような条件下では完全に分解しており、パクリタキセル−ヒト血清アルブミンが結合した粒子は存在しなかった）。１ｍｌの試料１と１ｍｌの試料２を、それぞれ様々な時間、２１０００×ｇで遠心分離した。上清中のパクリタキセルおよびアルブミンの濃度を、実施例１０に記載した方法を使用して決定した。結果を表１に列挙する。
【表１】
2019131600.tif 000002
【０１６２】
完全に分解した試料（試料２）については、遠心分離後に沈澱は生じないことが示唆された。様々な遠心分離時間について、上清中のパクリタキセルおよびアルブミンの濃度に有意な変動は観察されなかった。すなわち、溶液中にパクリタキセルの結晶または重粒子は存在しなかった。
【０１６３】
分解していない試料（試料１）については、遠心分離後に底に沈澱が生じた。上清中のパクリタキセルの濃度は遠心分離時間に伴って低下し、最終的には平衡に達した。アルブミンの濃度は時間に伴ってわずかに上昇し、最終的には平衡に達した（上清の容量は全容量の約９０％であった）。結論として、試料中のナノ粒子を単離し、そして遠心分離により精製することができる。
【０１６４】
６０分間の遠心分離後、上清中のパクリタキセルの濃度は平衡に達した。このようにして、パクリタキセル−アルブミン粒子を２１０００×ｇで６０分間で単離することができる。
【０１６５】
【０１６６】
実施例１２  ナノ粒子の調製
【０１６７】
実施例１１に記載した遠心分離方法を使用して、実施例１〜９で得た試料から粒子を単離した。遠心分離後、上清を廃棄した。このようにして得た沈澱がパクリタキセル−アルブミンナノ粒子であった。これらを粒子１、２、３、４、５、６、７、８、および９と呼び、これらは実施例１〜９に対応している。
【０１６８】
【０１６９】
実施例１３  分離前および後の粒子の形態についての走査電子顕微鏡観察
【０１７０】
実施例５で得た試料の凍結乾燥粉末、および実施例１２で得た実施例５に由来する沈澱
（粒子５）を走査電子顕微鏡（Ｓ−４８００，Ｈｉｔａｃｈｉ）下で観察した。実施例５に由来する試料中の少量の粒子が、大量のアルブミンにより形成された支持剤（ｓｕｐｐｏｒｔ  ａｇｅｎｔ）の中に包埋されていることを、図１の結果から見ることができる。一方、粒子５については、これらの粒子は独立して存在していた（図２を参照のこと）。このように、実施例１１の分離方法を使用して得た沈澱が、純粋なまたは実質的に純粋なナノ粒子であったことを確認することができる。
【０１７１】
【０１７２】
実施例１４  粒子中のアルブミンとパクリタキセルの比
【０１７３】
実施例１２で得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子（実施例１〜９に対応している）をそれぞれ、１ｍｌの０．９％の塩化ナトリウム溶液中に再懸濁した。試料中のパクリタキセルおよびアルブミンの含有量を実施例１０の方法を使用してそれぞれ決定した。結果は以下のとおりである：
【０１７４】
【表２】
2019131600.tif 000003
【０１７５】
様々な製剤プロセスを使用して得た生成物由来の精製されたナノ粒子中でのアルブミンとパクリタキセルの比が様々であり、これらが一定の規則性を持つことが、上記の結果により示唆されている。油相中のパクリタキセルの濃度の増大が、アルブミン含有量に反比例することもまた見ることができる。
【０１７６】
【０１７７】
実施例１５  精製されたナノ粒子の透析を使用した調製
【０１７８】
透析を、注射用水で再構成した後の実施例２、実施例５、および実施例８で調製した試料に対して、５％のマンニトールの透析溶液に対して、３００Ｋのカットオフ分子量を持つ再生セルロース限外濾過膜（ＰＸＣ３００Ｃ５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して等容量で行った。透析率は５倍であった。試料中のパクリタキセルおよびアルブミンの含有量を、実施例１０の方法を使用して透析後に決定した。結果は以下のとおりである：
【表３】
2019131600.tif 000004
【０１７９】
上記結果は、遠心分離により得た粒子と比較して、限外濾過膜を使用した透析により得た粒子中のアルブミンとパクリタキセルの重量比が実質的に類似することを示していた。結果として、限外濾過膜を使用した透析もまた、懸濁液中の粒子を過剰量のアルブミンから単離するために、および粒子を取り囲んでいる溶液の置き換えのために使用することができる。
【０１８０】
実施例１６  クロマトグラフィーカラム上での精製されたナノ粒子の調製
【０１８１】
２０ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲルを１０ｍｍの直径のガラスカラム（Φ１０ｍｍ＊２３０ｍｍ，Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｍａｎｃａｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）に充填した。カラムをカラム容量の３倍までの０．９％の塩化ナトリウム溶液を用いて平衡化した。実施例２、実施例５、および実施例８で調製した１ｍｌの試料をゲルカラムの上にロードし、それぞれ、０．９％の塩化ナトリウム溶液を使用して溶離させた。溶出液を２８０ｎｍの波長でＵＶ検出器を使用してオンライン上でモニターした。クロマトグラム上の最初のピークに対応する溶出液はわずかに濁った懸濁液であり、これをパクリタキセルおよびアルブミンの決定のために回収した。第２のピークが終わるまで記録を継続した。いずれのピークも十分に分離され、これは、粒子と遊離のアルブミンをＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲルカラムを使用して効率的に分離できることを示していた。粒子中のパクリタキセルとアルブミンの含有量を実施例１０の方法を使用して決定した。結果は以下のとおりである：
【表４】
2019131600.tif 000005
【０１８２】
上記結果は、遠心分離により得た粒子および透析により得た粒子と比較して、ゲルカラム上での分離により得た粒子中のアルブミンとパクリタキセルの重量比が実質的に類似していることを示していた。結果として、ゲルカラムでの分離もまた、懸濁液中の粒子を過剰量のアルブミンから単離するために使用することができる。
【０１８３】
【０１８４】
実施例１７  透析により調製した精製されたナノ粒子中での遊離のアルブミン含有量の遠心分離を使用した決定
【０１８５】
実施例１５で透析により得た粒子懸濁液を、実施例１１の条件下での遠心分離により、さらに単離した。遠心分離管の底に全ての粒子を沈澱させた後、上清中のアルブミンの濃度を決定した。結果を表５に列挙する。
【表５】
2019131600.tif 000006
【０１８６】
透析により得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子懸濁液中では、遊離のアルブミンの割合は極めて低く、ほとんどのアルブミンがパクリタキセルに結合し、ナノ粒子を形成していることを上記結果からが見ることができる。
【０１８７】
【０１８８】
実施例１８  クロマトグラフィーカラムでの分離により調製した精製されたナノ粒子中での遊離のアルブミン含有量の遠心分離を使用した決定
【０１８９】
実施例１６のクロマトグラフィーカラムでの分離により得た粒子懸濁液を実施例１１の条件下でさらに遠心分離した。遠心分離管の底に全ての粒子を沈澱させた後、上清中のアルブミンの濃度を決定した。結果を表６に列挙する。
【表６】
2019131600.tif 000007
【０１９０】
クロマトグラフィーカラムでの分離により得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子懸濁液中には、遊離のアルブミンはほぼ存在せず、ほとんどのアルブミンがパクリタキセルに結合してナノ粒子を形成していることを上記結果から見ることができる。
【０１９１】
【０１９２】
実施例１９  遠心分離により調製した精製されたナノ粒子中の遊離のアルブミン含有量のクロマトグラフィーカラムでの分離による決定
【０１９３】
粒子懸濁液を、実施例１２で得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を０．９％の塩化ナトリウム溶液中に再懸濁させることにより得、精製されたナノ粒子と遊離のアルブミン（存在するならば）を、実施例１６に記載したようにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムを使用して互いに分離させた。溶離の間、ＵＶ吸収曲線をモニターした。粒子を完全に溶離させた後、次に続く溶離液を回収し、その中のアルブミンの濃度を決定した。結果を表７に列挙する。
【表７】
2019131600.tif 000008
【０１９４】
遠心分離により得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子懸濁液中には、遊離のアルブミンはほぼ存在せず、ほとんどのアルブミンがパクリタキセルに結合してナノ粒子を形成していることを上記結果から見ることができる。実施例１７、１８、および１９では、遊離のアルブミンをほぼ伴わない精製されたナノ粒子を３種類の測定法の全てにより得ることができることを、３種類の単離測定方法において観察した証拠から明らかに示すことができる。
【０１９５】
【０１９６】
実施例２０  粒径および電位の決定
【０１９７】
実施例１２で得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子（実施例１〜９に対応している）をそれぞれ精製水中に再懸濁した。精製されたナノ粒子の粒径とζ電位をＭａｌｖｅｎ  ＮＡＮＯ−ＺＳレーザー粒径測定装置を使用して検出した。結果を以下に列挙する。
【０１９８】
【表８】
2019131600.tif 000009
【０１９９】
遠心分離後に得た精製されたナノ粒子の平均粒径はその最初の平均粒径と実質的に同じであり、ζ電位はなおも比較的高く、その結果、電荷を粒子懸濁液を安定化させるために利用できることを結果から見ることができる。
【０２００】
【０２０１】
実施例２１  Ｘ線回折パターン
【０２０２】
結晶形態を、パクリタキセルおよび凍結乾燥させたアルブミン粉末の原薬について、Ｘ線回折装置で決定した。結果を図３および図４に示す。示すように、パクリタキセルの原薬は結晶粉であり、凍結乾燥させたアルブミン粉末は非晶質粉末であった。実施例１２で得た代表的な精製されたナノ粒子（実施例２、４、６、および８に対応している）を凍結乾燥器で凍結乾燥させて固体粉末を得、その結晶形態をＸ線回折装置で検出した。結果を図５、６、７、および８に示す。粒子におけるパクリタキセルに対するアルブミンの比が０．０４３：１から０．５７：１までの範囲であり、アルブミンおよびパクリタキセルがいずれも、非晶形である（これはパクリタキセルの原薬とはかなり異なり、凍結乾燥させたアルブミンの粉末とはわずかに異なる形態である）ことをＸ線回折パターンから見ることができる。
【０２０３】
【０２０４】
実施例２２  粒子からのパクリタキセルの放出
【０２０５】
実施例１１で確立した粒子の分離方法を使用して、遊離の成分をナノ粒子形態の成分から効率よく分離することができる。結果として、粒子からのパクリタキセルの放出は、そのような方法を使用して様々な濃度で検出することができる。具体的な手順を以下に示した。
【０２０６】
実施例１２で得たパクリタキセル−アルブミンナノ粒子（それぞれ、実施例１〜９に対応している）について、代表的な精製されたナノ粒子（実施例２、４、６、および８に対応しており、粒子２、４、６、および８と呼ぶ）を選択し、０．９％の塩化ナトリウム溶液をアルブミンとパクリタキセルの比に基づいて添加して、５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を持つストック溶液を作った。上記ストック溶液と疑似血漿溶液を３７℃で維持した。ストック溶液を疑似血漿溶液使用して希釈して、５０００、１０００、２００、１５０、１００、８０、５０、３０、および１０μｇ／ｍｌの濃度を持つパクリタキセル溶液の系列を得た。
【０２０７】
放出速度の決定：調製した試料溶液のパクリタキセル濃度を決定し、同時に、上清のパクリタキセル濃度もまた、１ｍｌのそれぞれの試料を使用して、２１０００×ｇで６０分間の遠心分離後に決定した。それぞれの濃度でのパクリタキセルの放出速度を、上清中のパクリタキセルの濃度を遠心分離前の濃度で割り算することにより計算し、放出曲線をプロットし、図９および図１０に示した。粒子におけるパクリタキセルに対するアルブミンの比が０．０４３：１から０．０５７：１までの範囲であり、粒子についてのパクリタキセルの放出特性が実質的に同じであり、その全てが濃度と相関関係にあることを、放出曲線から見ることができる。
【０２０８】
【０２０９】
実施例２３  治療用ナノ粒子を含有している組成物の調製
【０２１０】
方法１（遠心分離−再懸濁）：実施例１〜９に対応している実施例１２で得た治療用ナノ粒子（粒子１、２、３、４、５、６、７、８、および９と呼ぶ）をそれぞれ、５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のトレハロース溶液、１０％のマルトース溶液、１０％のヒト血清アルブミン溶液中に再懸濁させて、５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を確立した。再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液中の粒子について粒径の有意な変動は観察されなかった。上記懸濁液をそれぞれ凍結乾燥器で凍結乾燥させて、薬学的ナノ粒子を含有している組成物を得た。
【０２１１】
方法２（透析）：実施例１〜９で得た試料をそれぞれ再構成して、５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を持つ懸濁液を調製した。続いて、上記懸濁液をそれぞれ３００ｋＤａの限外濾過膜を使用して、５％のマンニトール溶液、１０％のスクロース溶液、５％のデキストラン溶液、１０％のラクトース溶液、１０％のマルトース溶液、１０％のトレハロース溶液、および１０％のヒト血清アルブミン溶液により透析した。最初の容量の５倍量までの透析の後、懸濁液中の遊離のヒト血清アルブミンを全て置き換えた。上記懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液中の粒子について粒径の有意な変動は観察されなかった。上記懸濁液をそれぞれ凍結乾燥器で凍結乾燥させて、治療用ナノ粒子を含有している組成物を得た。
【０２１２】
【０２１３】
実施例２４
【０２１４】
実施例２３の方法１（遠心分離−再懸濁）および方法２（透析）で得た治療用ナノ粒子を含有している組成物をそれぞれ注射用水で再構成して、５ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル濃度を確立した。それぞれの溶液の安定性を観察し、室温で１２時間の安定性を決定した。示すように、従来のリオプロテクタントは、精製されたパクリタキセル−アルブミンナノ粒子について保護的役割を担うことができる。結果を表９および表１０に示す。
【０２１５】
【表９】
2019131600.tif 000010
【表１０】
2019131600.tif 000011
【０２１６】
示すように、粒子の安定性は、遠心分離−再懸濁（方法１）および透析（方法２）を使用して粒子を取り囲んでいるアルブミンを置き換えることにより維持することができる。
【０２１７】
【０２１８】
実施例２５  モルモットでの感作性試験
【０２１９】
この実験では、実施例６由来の生成物と実施例２４由来の粒子６を含有している５％のマンニトール製剤を被験薬として選択した。この場合の製剤中のパクリタキセル濃度を以下の表に列挙する。感作用量を、３ｍｇ／モルモットおよび１．２５ｍｇ／モルモットとして選択した。感作は、１日おきに全部で３回の注射を、腹腔内注射により行った。同時に、陽性対照群（０．２％のオボアルブミン）および陰性対照群（０．９％の塩化ナトリウムの注射）もまた基準として用いた。詳細な投与レジュメを以下の表に列挙する。
【表１１】
2019131600.tif 000012
【０２２０】
感作のための投与方法：モルモットの背中を、杯型にした左手でしっかりと固定して、モルモットを固定した時に腹の皮膚が伸びるようにした。モルモットの腹部を持ち上げ、頭が低くなるようにした。アルコールワイプによる注射部位の消毒後、右手に持った２ｍｌの使い捨ての注射器の針をモルモットの皮膚に穿刺した。針を下腹部の中線に対して１ｍｍ左側の部位に挿入した。皮下部分に達したら、針をさらに５ｍｍから１０ｍｍ先に挿入し、続いて、４５°の角度で腹腔に穿刺した。針を固定した後、薬剤溶液をゆっくりと注射した。注射後、乾燥した綿のワイプを、薬剤の流出を防ぐために針を刺した部位に押さえつけた。３回の感作の後、実施例６由来の製剤の群のモルモット（３ｍｇ／モルモット）は異常なほどやせ衰え、死亡した。他の群では異常は観察されなかった。
【０２２１】
アレルギー励起：励起を静注により行い、励起は、６ｍｇ／動物および２．５ｍｇ／動物の静注の投薬量での最後の感作後１０日で行った。
【０２２２】
励起のための投与方法：注射を、助手が固定したモルモットの則脈中足静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｔａｔａｒｓａｌ  ｖｅｉｎ）に行った。動物の体を固定するために、操作者が後膝関節をしっかりと握った。その静脈を圧迫し、肢を伸びた状態にした。注射部位の毛を剃った（または注射部位の皮膚を切開した）。アルコールワイプによる消毒の後、太い則脈中足静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｔａｔａｒｓａｌ  ｖｅｉｎ）を見えるようにした。１ｍｌの使い捨ての注射器の針を、右手で心臓の方向に沿って血管に穿刺した。注射後、乾燥した綿のワイプを、出血を防ぐために注射部位に押さえつけた。
【０２２３】
各動物の反応と、アレルギー症状が現れたまたは消滅した時間を、励起の直後に３０分間観察した。最長観察時間は３時間であった。アレルギー反応の結果を表１４に列挙する。
【０２２４】
【表１２】
2019131600.tif 000013
【表１３】
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【表１４】
2019131600.tif 000015
【０２２５】
過剰量のアルブミンを含有しているナノ粒子製剤が強い感作性を有し、一方、精製されたナノ粒子を含有している製剤がアレルギー反応を有意に減少し得ることが、モルモットでの能動性アナフィラキシーの結果により示唆されている。
【０２２６】
【０２２７】
実施例２６  イヌでの薬物動態試験
【０２２８】
この試験では、実施例６由来の生成物と実施例２４由来の粒子６を含有している５％のマンニトール製剤を被験薬として選択し、ここでは、製剤中のパクリタキセルの濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。ビーグル犬を、両方の製剤についてのｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物動態試験に使用した。それぞれの群で、３匹のビーグル犬を、５ｍｇ／ｋｇの投与用量、および３０分の投与時間の長さで試験した。２ｍｌの血液を、投与の直後（０時間）、注入プロセスにおいて１５分（投与から０．２５時間）、針を抜き取った時点（投与から０．５時間）、および投与後０．５８時間、０．７５時間、１．０時間、１．５時間、２．５時間、３．５時間、４．５時間、６．５時間、８．５時間、２４．５時間でビーグル犬の前肢の橈側皮静脈から採血し、血液試料それぞれをヘパリンチューブに入れ、均質になるまで振盪し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿中のパクリタキセル濃度をＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより決定し、薬物濃度を時間に対してプロットした（図１１を参照のこと）。両方の製剤がほぼ同じｉｎ  ｖｉｖｏ特性を有しており、その結果、粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ特性に対する過剰量のアルブミンによる影響がないことを、薬物濃度−時間のプロットから見ることができる。
【０２２９】
【０２３０】
実施例２７  イヌでの薬物動態試験の際のアレルギー症状
【０２３１】
実施例２６で行ったイヌでの薬物動態試験では、いずれの製剤の投与の際にも副作用が観察された。実施例６の試料群では、様々な程度の明らかなアレルギー反応が３匹のイヌにおいて現れ、これには主に、激しいもがき反応、過剰な唾液分泌、口の周りの紅斑を含み、個々の実験動物においては、投与の際に嘔吐と尿失禁が起こった。一方、粒子６の試料群については、動物の一部にわずかなもがき反応、唾液分泌、および口の周りの紅斑が現れたにすぎず、症状は穏やかであった。結果として、精製されたナノ粒子の製剤が薬物のアレルギー反応を有意に緩和することができた。
【０２３２】
【０２３３】
実施例２８
【０２３４】
以下の試料の最大耐量を調べた。試料には、（実施例２、６、および８のナノ粒子に対応しており、以下で粒子２、粒子６、および粒子８と呼ぶ、実施例２４の方法１により得た）リオプロテクタントとしてマンニトールを使用した治療用ナノ粒子を含有している組成物、実施例６由来の生成物、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）を含めた。
【０２３５】
ＵＳＡのＮＣＩの推奨に基づいて、単回投与による急性毒性の最大耐量を決定するために実験方法を変更した。粒子２、粒子６、および粒子８、ならびに実施例６由来の凍結乾燥粉末については、４００ｍｇ／ｋｇを最大投与量として選択し、投与量を１．２の割合
（すなわち、４００ｍｇ／ｋｇ、３３３ｍｇ／ｋｇ、２７８ｍｇ／ｋｇ、２３１ｍｇ／ｋｇ、および１９３ｍｇ／ｋｇの用量の系列）で減少させた。ＴＡＸＯＬ（登録商標）については、４８ｍｇ／ｋｇを最大投与量として選択し、投与量はまた１．２の割合（すなわち、４８ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３３．３ｍｇ／ｋｇ、２７．８ｍｇ／ｋｇ、２３．１ｍｇ／ｋｇ、および１９．３ｍｇ／ｋｇの用量の系列）で減少させた。それぞれの用量群に、３匹のＫＭの雄のマウスを割り当てた。動物の全身状態と体重の変動を投与後１０日間観察した。動物が死なず、元に戻らない毒性反応が起こらなかったか、または実験前の体重と比較して１５％以下の体重の減少が観察の間に連続する３日間で見られた場合は、最大投与量を単回投与についての最大耐量と考えた。
【０２３６】
結果は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）の最大耐量が３３．３ｍｇ／ｋｇであることを示していた。全ての投与群において、ＴＡＸＯＬ（登録商標）の投与の際に、マウスは激しくもがき、投与後に昏睡および頻呼吸（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）が起こった。４０ｍｇ／ｋｇおよび４８ｍｇ／ｋｇの用量群では、死亡症例が生じた。残りの用量群では、マウスは投与後、徐々に回復した。毒性の症状の重症度と回復までに要した時間は投与量と相関関係にあった。実施例６、ならびに粒子２、粒子６、および粒子８についての最大耐量は全て１９３ｍｇ／ｋｇであった。１９３ｍｇ／ｋｇを上回る用量の群では、マウスの有害な症状に、主に、体重の減少、肛門の周囲の排泄物、後肢が弱くなる／麻痺、および死亡が含まれていた。有害な症状の重症度は投与量が増加するに伴って上がった。粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物によるマウスに対する毒性の間には明らかな差異は存在しなかった。しかし、上記毒性の全てが、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴＡＸＯＬ（登録商標）の毒性より低かった。
【０２３７】
【０２３８】
実施例２９  マウスの肝臓癌のＨ２２腫瘍に対する阻害作用
【０２３９】
粒子２、粒子６、粒子８、実施例６由来の生成物、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）を、マウスにおいて、肝臓癌Ｈ２２腫瘍の阻害作用について研究した。
【０２４０】
動物を体重に基づいて分けた。Ｈ２２肝臓癌の腹水細胞を、雄のＫＭマウスの前肢の腋窩部の皮下組織に、０．２ｍｌの接種量（約１．０×１０６細胞を含む）で皮下接種した。動物を接種時間にしたがって６つの群に均等に分けた。
【０２４１】
粒子２、粒子６、粒子８、実施例６由来の生成物、およびＴａｘｏｌ（登録商標）の単回静脈内投与を、接種後２４時間のマウスに最大耐量で行った。すなわち、粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物の投与量は１９３ｍｇ／ｋｇであり、Ｔａｘｏｌ（登録商標）の投与量は３３．３ｍｇ／ｋｇであった。ブランクの対照群では、０．９％の塩化ナトリウムの注射を単回静脈内投与に使用した。投与後１２日目に、マウスをＣＯ２での窒息により屠殺し、腫瘍塊を取り出し、重さを量った。腫瘍阻害率（％）は以下の式にしたがって計算することができる：腫瘍阻害率＝（１−試験群における平均腫瘍重量／対照群における平均腫瘍重量）×１００％。実験結果を、ＳＰＳＳ  １９．０の統計ソフトウェアを使用して一元配置分散分析により統計学的に分析した。
【０２４２】
実験結果を表１５に列挙する。マウスの最大耐量での単回静脈内投与については、Ｈ２２腫瘍の増殖は全ての群で有意に阻害された。粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物のＨ２２腫瘍に対する腫瘍阻害作用に群間で差異はなかった。粒子２、粒子８、および実施例６由来の生成物の腫瘍阻害率は、ＴＡＸＯＬ（登録商標）より有意に高かった。
【表１５】
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【０２４３】
【０２４４】
実施例３０  マウスの前立腺癌ＲＭ−１腫瘍に対する阻害作用
【０２４５】
粒子２、粒子６、粒子８、実施例６由来の生成物、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）を、マウスにおいて前立腺癌ＲＭ−１腫瘍の阻害作用について研究した。
【０２４６】
ＲＭ−１腫瘍細胞を対数増殖期で回収し、細胞数を２．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。腫瘍細胞の懸濁液を、７〜８週齢のＣ７５雄マウスの前肢の腋窩部の皮下組織に、０．２ｍｌの接種量（約５×１０５細胞を含む）で接種した。接種後、残った腫瘍細胞の懸濁液を光学顕微鏡下で計数し、生存している腫瘍細胞の数は＞９５％であった。マウスを接種時間に基づいて６つの群に分けた。
【０２４７】
粒子２、粒子６、粒子８、実施例６由来の生成物、およびＴａｘｏｌ（登録商標）の単回静脈内投与を、接種後７２時間でマウスの最大耐量で行った。すなわち、粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物の投与量は１９３ｍｇ／ｋｇであり、Ｔａｘｏｌ（登録商標）の投与量は３３．３ｍｇ／ｋｇであった。ブランクの対照群では、０．９％の塩化ナトリウムの注射を単回静脈内投与に使用した。腫瘍の増殖後、直径をノギスを使用して測定し、薬剤の抗腫瘍作用を機能的に観察した。腫瘍体積（ＴＶ）は以下の式として計算することができる：Ｖ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長さと幅を意味する）。腫瘍体積は結果に基づいて計算することができる。腫瘍体積阻害率（％）は以下の式にしたがって計算することができる：腫瘍阻害率＝（１−投与群における平均腫瘍体積／対照群における平均腫瘍体積）×１００％。実験結果を、統計ソフトウェアＳＰＳＳ  １９．０により分析した。時間に伴う測定間の腫瘍体積の変動を反復測定分散分析（Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）により分析し、それぞれの測定の間での群間の腫瘍体積の変動を多変量（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ）により分析した。
【０２４８】
実験結果を表１６に列挙する。単回静脈内投与を、前立腺癌ＲＭ−１腫瘍細胞の接種の３日後に最大耐量で行った。ブランクの対照群と比較して、マウスの前立腺癌ＲＭ−１腫瘍の増殖に対する有意な阻害作用が、粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物について観察され、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）については腫瘍に対する阻害作用は見られなかった。粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物では、マウスのＲＭ−１腫瘍に対する阻害作用に有意な差異は観察されなかった。しかし、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と比較すると、上記製剤の全てが腫瘍の増殖に対して有意な阻害作用を有していた。
【０２４９】
【０２５０】
【表１６】
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【０２５１】
実施例３１：
【０２５２】
Ｌｅｗｉｓ肺癌マウスの腫瘍に対する阻害作用
【０２５３】
粒子２、粒子６、粒子８、実施例６由来の生成物、およびＣｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）を、Ｌｅｗｉｓ肺癌マウス中の腫瘍に対する阻害作用について研究した。
【０２５４】
対数増殖期のＬｅｗｉｓ腫瘍細胞を回収し、細胞数を２．５×１０６細胞／ｍｌに調整した。腫瘍細胞の懸濁液を、７〜８週齢のＣ５７雄マウスの前肢の腋窩部の皮下組織に、０．２ｍｌの接種量（約５×１０５細胞を含む）で接種した。
【０２５５】
グループ分け、投与、指標の観察、および統計的方法は実施例１８のものと同じであった。
【０２５６】
実験結果を表１７に列挙する。単回静脈内投与は、Ｌｅｗｉｓ肺癌マウスの腫瘍細胞の接種の３日後に最大耐量で行った。ブランクの対照群と比較して、粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物については、Ｌｅｗｉｓ肺癌マウスの腫瘍の増殖に対する有意な阻害作用が観察され、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを用いて調製されたＴａｘｏｌ（登録商標）については腫瘍に対する阻害作用が見られなかった。粒子２、粒子６、粒子８、および実施例６由来の生成物のＬｅｗｉｓ肺癌マウスの腫瘍に対する阻害作用には有意な差異は観察されなかった。しかし、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と比較すると、上記製剤の全てが腫瘍の増殖に対して有意な阻害作用を有していた。
【表１７】
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【０２５７】
実施例３２
【０２５８】
市販されている製剤製品として、ヒト血清アルブミンは、アルブミン多量体がアレルギー反応を誘発する可能性があるので、その品質基準にしたがって５％を超える多量体は含まないはずである。実施例１０のアルブミンについての決定方法により、アルブミン単量体を多量体と区別することができる。アルブミン多量体およびパクリタキセルの含有量を、実施例１〜９由来の組成物（初期製剤（ｉｎｉｔｉａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と呼ぶ）およびそれぞれ、リオプロテクタントとしてマンニトールおよびヒト血清アルブミンを使用して（実施例１〜９に対応している）実施例２４の方法１により得た組成物において、実施例１０のアルブミンおよびパクリタキセルの決定方法に基づいて検出し、１ｍｇのパクリタキセルあたりのアルブミン多量体の含有量を計算した。結果を表１８に列挙する。
【０２５９】
【表１８】
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【０２６０】
【０２６１】
先行技術の方法（ホモジナイゼーション）を使用して直接調製した生成物中のアルブミン多量体の含有量が、本開示の調製方法による組成物の後で添加した（ｐｏｓｔ−ａｄｄｅｄ）アルブミン中での含有量よりも有意に高かったことが、結果から示唆されている。これは、先行技術のホモジナイゼーション処理または蒸発処理において新たに生じたアルブミン多量体により起こった。しかし、マンニトール保護剤を含有している製剤におけるアルブミン多量体の含有量は、極少量のアルブミンしか製剤中に含まれていないために低く、その結果、全量は初期製剤中の多量体の量よりも少なかった。
【０２６２】
【０２６３】
実施例３３  ナノ粒子の調製のためのアルブミンの取り出し
【０２６４】
実施例１５での透析により生じた透析液を回収し、１０Ｋのカットオフ分子量を持つ再生セルロース限外濾過膜を使用して約４％のアルブミン含有量に濃縮した。濃縮液を精製水により等量に透析した。５倍容量への透析後、４％のアルブミン溶液を取り出すことができる。
【０２６５】
実施例５の方法にしたがって、パクリタキセル−アルブミンナノ粒子を、取り出したアルブミン溶液を使用して調製した。結果として、調製したパクリタキセル−アルブミンナノ粒子の平均直径は１３４ｎｍであり、そして懸濁液は半透明であった。これは、実施例５で得た生成物と同様であった。
【０２６６】
この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルターを通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、室温で４８時間の保管後の懸濁液について有意な変化は観察されなかった。懸濁液をアリコートし、凍結乾燥器の中で２４時間凍結乾燥させて安定な灰白色のケーキを得た。
【０２６７】
【０２６８】
実施例３４  精製されたドセタキセル−アルブミン粒子の調製
【０２６９】
３ｇのドセタキセルを１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）中に溶解し、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１１０〜１５０ｎｍの平均直径を持つドセタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２７０】
ナノ粒子を、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法により、得られたドセタキセル−アルブミンナノ粒子懸濁液から単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のマンニトール溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のドセタキセルの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０２７１】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびドセタキセルの含有量の決定後、アルブミンとドセタキセルの比を０．１：１と計算することができる。
【０２７２】
実施例３５  精製された２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルアルブミン粒子の調製
【０２７３】
６９５ｍｇの２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルを６ｍｌのクロロホルム／エタノール（１０：１、ｖ／ｖ）中に溶解させ、１０２ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（１０％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、７５〜１００ｎｍの平均直径を持つ２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルアルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２７４】
得られた２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１５に記載した５％のマンニトール溶液に対する透析方法によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中の２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０２７５】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよび２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルの含有量の決定後、アルブミンと２’−Ｏ−ヘキサノイルドセタキセルの比を０．２７：１と計算することができる。
【０２７６】
実施例３６  精製された２’−ベンゾイルドセタキセルアルブミン粒子の調製
【０２７７】
２２６ｍｇの２’−ベンゾイルドセタキセルを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（９：１、ｖ／ｖ）中に溶解させ、３５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１８０００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、３０〜６０ｎｍの平均直径を持つ２’−ベンゾイルドセタキセルアルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２７８】
得られた２’−ベンゾイルドセタキセルアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。１０％のラクトース溶液を透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中の２’−ベンゾイルドセタキセルの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、６５時間凍結乾燥させた。
【０２７９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよび２’−ベンゾイルドセタキセルの含有量の決定後、アルブミンおよび２’−ベンゾイルドセタキセルの比を０．９５：１と計算することができる。
【０２８０】
【０２８１】
実施例３７  精製されたラパマイシンアルブミン粒子の調製
【０２８２】
１６６ｍｇのラパマイシンを１ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）中に溶解させ、３７ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、５０〜８５ｎｍの平均直径を持つラパマイシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２８３】
得られたラパマイシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。５％のデキストラン溶液を透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のラパマイシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０２８４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびラパマイシンの含有量の決定後、アルブミンとラパマイシンの比を０．６３：１と計算することができる。
【０２８５】
【０２８６】
実施例３８  精製されたテムシロリムスアルブミン粒子の調製
【０２８７】
１０１ｍｇのテムシロリムスを０．５ｍｌのクロロホルム／エタノール（７：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、１９．５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８０〜１１５ｎｍの平均直径を持つテムシロリムスナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２８８】
得られたテムシロリムスアルブミンナノ粒子から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のマンニトール溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のテムシロリムスの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０２８９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびテムシロリムスの含有量の決定後、アルブミンとテムシロリムスの比を０．１６：１と計算することができる。
【０２９０】
【０２９１】
実施例３９  精製されたエベロリムスアルブミン粒子の調製
【０２９２】
７８ｍｇのエベロリムスを１ｍｌのクロロホルム／エタノール（９：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、２２ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８０〜１１０ｎｍの平均直径を持つエベロリムスナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２９３】
得られたエベロリムスアルブミンナノ粒子懸濁液から、５％のデキストランに対する実施例１５に記載した透析方法によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のエベロリムスの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、６０時間凍結乾燥させた。
【０２９４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびエベロリムスの含有量の決定後、アルブミンとエベロリムスの比を０．３２：１と計算することができる。
【０２９５】
【０２９６】
実施例４０  精製されたロミデプシンアルブミン粒子の調製
【０２９７】
１１３ｍｇのロミデプシンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（８：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、３５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（１０％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１２０〜１５０ｎｍの平均直径を持つ２ロミデプシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０２９８】
得られたロミデプシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。１０％のスクロース溶液を透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のロミデプシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０２９９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびロミデプシンの含有量の決定後、アルブミンとロミデプシンの比を０．２５：１と計算することができる。
【０３００】
【０３０１】
実施例４１  精製されたピラルビシンアルブミン粒子の調製
【０３０２】
１４７ｍｇのピラルビシンを０．７５ｍｌのクロロホルム／エタノール（５：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、１９．５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１００〜１２０ｎｍの平均直径を持つ２ピラルビシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３０３】
得られたピラルビシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１５に記載した５％のマンニトール溶液に対する透析方法によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のピラルビシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０３０４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびピラルビシンの含有量の決定後、アルブミンとピラルビシンの比を０．４７：１と計算することができる。
【０３０５】
【０３０６】
実施例４２  精製されたアクラシノマイシンアルブミン粒子の調製
【０３０７】
１３５ｍｇのアクラシノマイシンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（８：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、２５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８０〜１５０ｎｍの平均直径を持つアクラシノマイシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３０８】
得られたアクラシノマイシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。５％のマンニトール溶液を透析液として使用した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のアクラシノマイシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、４８時間凍結乾燥させた。
【０３０９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびアクラシノマイシンの含有量の決定後、アルブミンとアクラシノマイシンの比を０．１３：１と計算することができる。
【０３１０】
【０３１１】
実施例４３  精製されたカバジタキセルアルブミン粒子の調製
【０３１２】
２８９ｍｇのカバジタキセルを３ｍｌのクロロホルム／エタノール（１０：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、６７ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、６５〜８５ｎｍの平均直径を持つカバジタキセルナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３１３】
得られたカバジタキセルアルブミンナノ粒子懸濁液から、５％のマンニトールに対する実施例１５に記載した等量透析によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のカバジタキセルの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、５５時間凍結乾燥させた。
【０３１４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびカバジタキセルの含有量の決定後、アルブミンとカバジタキセルの比を０．２７：１と計算することができる。
【０３１５】
【０３１６】
実施例４４  精製されたアミオダロンアルブミン粒子の調製
【０３１７】
９０ｍｇのアミオダロンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５８ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、７０〜１０５ｎｍの平均直径を持つ２アミオダロンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３１８】
得られたアミオダロンアルブミンナノ粒子懸濁液から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のデキストラン溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のアミオダロンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、５７時間凍結乾燥させた。
【０３１９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびアミオダロンの含有量の決定後、アルブミンとアミオダロンの比を０．４３：１と計算することができる。
【０３２０】
【０３２１】
実施例４５  精製されたリオチロニンアルブミン粒子の調製
【０３２２】
９３ｍｇのリオチロニンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（９：１、ｖ／ｖ）中に溶解させ、４６ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８５〜１２５ｎｍの平均直径を持つ２リオチロニンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３２３】
得られたリオチロニンアルブミンナノ粒子懸濁液から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のマンニトール溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のリオチロニンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、５０時間凍結乾燥させた。
【０３２４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびリオチロニンの含有量の決定後、アルブミンとリオチロニンの比を０．３９：１と計算することができる。
【０３２５】
【０３２６】
実施例４６  精製されたエポチロンＢアルブミン粒子の調製
【０３２７】
１２７ｍｇのエポチロンＢを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（１０：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５２ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８０〜１１５ｎｍの平均直径を持つエポチロンＢナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３２８】
得られたエポチロンＢアルブミンナノ粒子懸濁液から、５％のマンニトールに対する等量透析によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のエポチロンＢの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり１０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、６５時間凍結乾燥させた。
【０３２９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびエポチロンＢの含有量の決定後、アルブミンとエポチロンＢの比を０．１４：１と計算することができる。
【０３３０】
【０３３１】
実施例４７  精製された１０−ヒドロキシカンプトテシンアルブミン粒子の調製
【０３３２】
９３ｍｇの１０−ヒドロキシカンプトテシンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（１０：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、４８ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１００〜１３５ｎｍの平均直径を持つ１０−ヒドロキシカンプトテシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３３３】
得られた１０−ヒドロキシカンプトテシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のマンニトール溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中の１０−ヒドロキシカンプトテシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり２０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３３４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよび１０−ヒドロキシカンプトテシンの含有量の決定後、アルブミンと１０−ヒドロキシカンプトテシンの比を０．２６：１と計算することができる。
【０３３５】
【０３３６】
実施例４８  精製されたシクロスポリンアルブミン粒子の調製
【０３３７】
１４８ｍｇのシクロスポリンを１．５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、１８．５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１００〜１３５ｎｍの平均直径を持つシクロスポリンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３３８】
得られたシクロスポリンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。１０％のラクトースを透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のシクロスポリンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３３９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびシクロスポリンの含有量の決定後、アルブミンとシクロスポリンの比を０．２６：１と計算することができる。
【０３４０】
【０３４１】
実施例４９  精製されたタネスピマイシンアルブミン粒子の調製
【０３４２】
８８ｍｇのタネスピマイシンを２ｍｌのクロロホルム／エタノール（８：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、１８．５ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（１０％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８５〜１０５ｎｍの平均直径を持つタネスピマイシンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３４３】
得られたタネスピマイシンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。５％のマンニトールを透析液として使用した。精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のタネスピマイシンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３４４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびタネスピマイシンの含有量の決定後、アルブミンとタネスピマイシンの比を０．６２：１と計算することができる。
【０３４５】
【０３４６】
実施例５０  精製されたプロポフォールアルブミン粒子の調製
【０３４７】
６０３ｍｇのプロポフォールを６ｍｌのクロロホルムに溶解させ、７３ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（１０％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ
ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、７０〜１１５ｎｍの平均直径を持つプロポフォールナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３４８】
得られたプロポフォールアルブミンナノ粒子懸濁液から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を１０％のラクトース溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のプロポフォールの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３４９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびプロポフォールの含有量の決定後、アルブミンとプロポフォールの比を０．５８：１と計算することができる。
【０３５０】
【０３５１】
実施例５１  精製されたビンブラスチン硫酸アルブミン粒子の調製
【０３５２】
１．２５ｇのビンブラスチン硫酸を１０ｍｌのクロロホルム／イソプロパノール（１０：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、２０２ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、９０〜１３０ｎｍの平均直径を持つビンブラスチン硫酸ナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３５３】
得られたビンブラスチン硫酸アルブミンナノ粒子懸濁液から、５％のマンニトールに対する等量透析によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のビンブラスチン硫酸の含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３５４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびビンブラスチン硫酸の含有量の決定後、アルブミンとビンブラスチン硫酸の比を０．２３：１と計算することができる。
【０３５５】
【０３５６】
実施例５２  精製されたエキセメスタンアルブミン粒子の調製
【０３５７】
１５５ｍｇのエキセメスタンを３ｍｌのクロロホルム／エタノール（６：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、２７ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、７０〜１００ｎｍの平均直径を持つエキセメスタンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３５８】
得られたエキセメスタンアルブミンナノ粒子懸濁液から、５％のマンニトールに対する等量透析によりナノ粒子を単離した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のエキセメスタンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７２時間凍結乾燥させた。
【０３５９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびエキセメスタンの含有量の決定後、アルブミンとエキセメスタンの比を０．１９：１と計算することができる。
【０３６０】
【０３６１】
実施例５３  精製されたフルタミドアルブミン粒子の調製
【０３６２】
１８９ｍｇのフルタミドを２ｍｌのクロロホルム／ｔｅｒｔ−ブタノール（６：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、３８ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１００〜１２０ｎｍの平均直径を持つフルタミドナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３６３】
得られたフルタミドアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。５％のデキストラン溶液を透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のフルタミドの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり５０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、６０時間凍結乾燥させた。
【０３６４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびフルタミドの含有量の決定後、アルブミンとフルタミドの比を０．３５：１と計算することができる。
【０３６５】
【０３６６】
実施例５４  精製されたフルベストラントアルブミン粒子の調製
【０３６７】
３５０ｍｇのフルベストラントを３ｍｌのジクロロメタン／エタノール（６：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、６７ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１０５〜１５０ｎｍの平均直径を持つフルベストラントナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３６８】
得られたフルベストラントアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。１０％のラクトースを透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のフルベストラントの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり２０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、６０時間凍結乾燥させた。
【０３６９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびフルベストラントの含有量の決定後、アルブミンとフルベストラントの比を０．２９：１と計算することができる。
【０３７０】
【０３７１】
実施例５５  精製されたセムスチンアルブミン粒子の調製
【０３７２】
６５０ｍｇのセムスチンを５ｍｌのクロロホルム／エタノール（６：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、８９ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、８５〜１２０ｎｍの平均直径を持つセムスチンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３７３】
得られたセムスチンアルブミンナノ粒子懸濁液から、２１０００×ｇで６０分間の実施例１１に記載した遠心分離方法によりナノ粒子を単離した。上清を廃棄し、精製されたナノ粒子を回収した。精製されたナノ粒子を５％のマンニトール溶液中に再懸濁した。この再懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のセムスチンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり２０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７０時間凍結乾燥させた。
【０３７４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびセムスチンの含有量の決定後、アルブミンとセムスチンの比を０．５８：１と計算することができる。
【０３７５】
【０３７６】
実施例５６  精製されたチオコルヒチン二量体アルブミン粒子の調製
【０３７７】
４５６ｍｇのチオコルヒチン二量体を５ｍｌのクロロホルム／エタノール（９：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５８ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（８％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、６５〜９０ｎｍの平均直径を持つチオコルヒチン二量体ナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３７８】
得られたチオコルヒチン二量体アルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。１０％のラクトースを透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のチオコルヒチン二量体の含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり２０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、７０時間凍結乾燥させた。
【０３７９】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびチオコルヒチン二量体の含有量の決定後、アルブミンとチオコルヒチン二量体の比を０．３７：１と計算することができる。
【０３８０】
【０３８１】
実施例５７  精製されたイブプロフェン二量体アルブミン粒子の調製
【０３８２】
３４８ｍｇのイブプロフェンを３ｍｌのジクロロメタン／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、６２ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（５％ｗ／ｖ）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザーを使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、６５〜９５ｎｍの平均直径を持つイブプロフェンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。
【０３８３】
得られたイブプロフェンアルブミンナノ粒子懸濁液から、実施例１６に記載したクロマトグラフィーカラム分離方法によりナノ粒子を単離した。５％のデキストランを透析液として使用した。得られた精製されたナノ粒子懸濁液を０．２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過した。濾液においては、粒径に有意な変動は存在しなかった。溶液中のイブプロフェンの含有量をＨＰＬＣを使用して決定した。続いて、含有量に基づいて、溶液をバイアルあたり２０ｍｇの量でバイアルにアリコートした。これらのバイアルを凍結乾燥器に入れ、５０時間凍結乾燥させた。
【０３８４】
凍結乾燥させた生成物を注射用水中で再構成した場合は、得られたケーキは迅速に溶解し、懸濁液は半透明であり、粒径に有意な変動は観察されなかった。生成物中のヒト血清アルブミンおよびイブプロフェンの含有量の決定後、アルブミンとイブプロフェンの比を０．１９：１と計算することができる。
【０３８５】
実施例５８  アルブミン濃度がヒト腫瘍細胞に対する薬物の阻害作用に影響を及ぼす
ヒト肺癌細胞ＳＰＣ−Ａ−１および乳癌細胞ＭＣＦ−７を９６ウェルプレートに播種し、一晩培養し、これらをウェルに接着させた。その後、細胞を飢餓状態にするために培地を無血清培地に交換した。実施例６、粒子６、およびアブラキサンを、３７℃で２４時間かけて、１６０μｇ／ｍｌ、３２０μｇ／ｍｌ、および６４０μｇ／ｍｌ（パクリタキセル濃度）の最終濃度で細胞に添加した。様々な用量の群の細胞阻害率をＭＴＴ法を使用して比較し、結果を以下の表と図１２および１３に示した。さらに、阻害率−薬物濃度曲線も描いた。阻害率−薬物濃度曲線に示したように、粒子６の阻害率は他の２つの群より有意に高く、実施例６とアブラキサンの間には有意な差異はなかった。これは、余分なアルブミンが腫瘍細胞に対するパクリタキセルの阻害作用を低下させることを意味している。
【表１９】
2019131600.tif 000020
【０３８６】
実施例５９  アルブミン濃度がヒト血管内皮細胞による薬物の取り込みに影響を及ぼす
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＥＡ．ｈｙ  ９２６を６ウェルプレートに８×１０５で播種した。薬物の添加前に、培地を無血清培地に交換した。薬物を５つの群に分けた。Ａ群は粒子６であり、Ｂ群は実施例６であり、Ｃ群はアブラキサンであり、Ｄ群は粒子６＋０．５％のＨＳＡ単量体であり、Ｅ群は粒子６＋０．５％のＨＳＡ多量体であった。薬物の様々な群を、３７℃で２時間かけて、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ（パクリタキセル濃度）の最終濃度で細胞に添加した。２時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、その後、５００ｕｌの５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００をそれぞれのウェルに添加して細胞を溶解させた。細胞溶解液中のパクリタキセルの濃度を実施例１０に記載した方法により検出し、結果を以下の表と図１４に示した。結果は、Ａ群の細胞によるパクリタキセルの取り込みがＢ群およびＣ群より高かったこと、およびＢ群とＣ群の細胞によるパクリタキセルの取り込みには有意な差異がなかったことを示している。なおさらに、Ｄ群はＥ群より高かった。これは、より高いＨＳＡ濃度が血管内皮細胞への薬物の取り込みを妨げたこと、そして単量体と比較して、ＨＳＡ多量体が細胞による取り込みをより妨げるであろうことを意味する。
【表２０】
2019131600.tif 000021
実施例６０
使用したヒト血清アルブミン、実施例６で得た生成物、および対応しているナノ粒子６におけるアルブミンおよびパクリタキセル（ＰＴＸ）の含有量と、多量体の割合を、実施例１０の方法を使用して決定した。結果を以下の表に列挙する。
【表２１】
2019131600.tif 000022
ｐｏｌｙ−ＨＳＡの割合がパクリタキセルアルブミンナノ粒子の調製プロセスに間に有意に増大することが結果から明らかとなった。しかし、本開示の調製方法により調製した生成物中では、単位重量中のｐｏｌｙ−ＨＳＡの量は、全アルブミン含有量の減少が原因で有意に減少した。
アルブミン溶液中の多量体の量は、１００Ｋのカットオフ分子量を持つ再生セルロース限外濾過膜（ＰＸＣ１００Ｃ５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した透析により増加した。アルブミン多量体の割合は実施例１０の方法を使用して検出し、アルブミンの含有量は、可能性のある多量体に対する様々な応答により生じたＨＰＬＣ法の偏差を回避するために、Ｋｊｅｌｄａｈｌ方法により決定した。
【表２２】
2019131600.tif 000023
多量体の大部分の量を含むアルブミン溶液を透析処理により得ることができることを、結果から見ることができる。
実施例６１  モルモットにおけるＰｏｌｙ−ＨＳＡの感作性試験
この試験では、ＨＳＡと実施例６０により得たｐｏｌｙ−ＨＳＡを被験薬として選択した。モルモットあたり１ｍｇおよびモルモットあたり０．３ｍｇの投与量を選択した。感作は１日おきに１回の腹腔内注射により、全部で３回の注射を行った。同時に、陽性対照群（０．２％のオボアルブミン）と陰性対照群（０．９％の塩化ナトリウムの注射）もまた確立した。詳細な投薬計画を以下の表に列挙する。
【表２３】
2019131600.tif 000024
感作のための投与方法：モルモットの背中を杯型にした左手でしっかりと固定して、モルモットを固定した時に腹の皮膚が伸びるようにした。モルモットの腹部を持ち上げ、頭が低くなるようにした。モルモットの腹部を持ち上げ、頭が低くなるようにした。アルコールワイプによる注射部位の消毒後、右手に持った２ｍｌの使い捨ての注射器の針をモルモットの皮膚に穿刺した。針を下腹部の中線に対して１ｍｍ左側の部位に挿入した。皮下部分に達したら、針をさらに５ｍｍから１０ｍｍ先に挿入し、続いて、４５°の角度で腹腔に穿刺した。針を固定した後、薬剤溶液をゆっくりと注射した。注射後、乾燥した綿のワイプを、薬剤の流出を防ぐために針を刺した部位に押さえつけた。
アレルギー励起：励起を静注により行い、励起は、２ｍｇ／動物および０．６ｍｇ／動物の投与量で最後の感作後１０日で行った。
励起のための投与方法：注射を、助手が固定したモルモットの則脈中足静脈（ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｔａｔａｒｓａｌ  ｖｅｉｎ）に行った。動物の体を固定するために、操作者が後膝関節をしっかりと握った。その静脈を圧迫し、肢を伸びた状態にした。注射部位の毛を剃った（または注射部位の皮膚を切開した）。アルコールワイプによる消毒の後、太い則脈中足静脈を見えるようにした。１ｍｌの使い捨ての注射器の針を、右手で心臓の方向に沿って血管に穿刺した。注射後、乾燥した綿のワイプを、出血を防ぐために注射部位に押さえつけた。
各動物の反応と、アレルギー症状が現れたまたは消滅した時間を、励起の直後に３０分間観察した。最長観察時間は３時間であった。アレルギー反応の結果を以下の表に列挙する。
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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結果は、試料が含有しているｐｏｌｙ−ＨＳＡが多ければ多いほど、同じレベルの全ＨＳＡ含有量での感作が強いことを示している。
実施例６２
２．５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１２９ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、そして室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。
精製されたナノ粒子を、それぞれ、実施例１１の遠心分離により、実施例１５の透析により、および実施例１６のクロマトグラフィーカラムでの分離によって単離した。結果は、透析の間に懸濁液が混濁し、沈澱が生じたことを示していた。したがって、この方法では精製されたナノ粒子を得ることができなかった。遠心分離およびクロマトグラフィーカラムでの分離により得た精製されたナノ粒子は混濁しており、６０分以内に沈澱した。
実施例６３
２．５ｇのパクリタキセル（ＣＡＳ：３３０６９−６２−４，Ｙｕｎｎａｎ  Ｈａｎｄｅ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を１５ｍｌのクロロホルム／エタノール（１１：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、５００ｍｌのヒト血清アルブミン溶液（４％ｗ／ｖ）（ＣＡＳ：７００２４−９０−７，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇｌｉｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に添加した。この混合物を高剪断力分散機（Ｆｌｕｋｏ  ＦＺ−２０）を使用して２分間乳状化して、第一次エマルジョンを得た。次に、この第一次エマルジョンを１００００〜２００００ｐｓｉの圧力下で高圧式ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ  Ｍ１１０−ＥＨ３０Ｋ，ＭＦＩＣ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を使用してホモジナイズして、ナノエマルジョンを得た。続いて、このナノエマルジョンを回転式蒸発装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｒ−２１０，Ｂｕｃｈｉ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に移して、水浴中で４０ｍｂａｒおよび４０℃での減圧蒸発により溶液中の有機溶媒を除去した。このようにして、１２８ｎｍの平均直径を持つパクリタキセル−アルブミンナノ粒子を作製した。そして懸濁液は半透明であった。この懸濁液は、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、そして室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。
透析を、３０Ｋのカットオフ分子量を持つ再生セルロース限外濾過膜（ＰＸＣ３００Ｃ５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して精製水に対して、調製した試料と等量で行った。透析率は５倍であった。
精製されたナノ粒子を、それぞれ、実施例１１の遠心分離により、実施例１５の透析により、および実施例１６のクロマトグラフィーカラムでの分離によって単離した。３種類の方法の全てにより得られた半透明な懸濁液は安定であり、これらは、０．２２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してスムーズに濾過することができる。濾過後は粒径に有意な変動はなく、そして室温で４８時間の保管後に有意な変化は観察されなかった。
実施例６２と６３を比較すると、実施例６３では、残留溶媒を除去するために、精製水に対する等量透析のさらなるプロセスが行われた。残留溶媒の除去により精製されたナノ粒子の懸濁液の安定性が改善された。
【０３８７】
考察：
【０３８８】
先行技術の製剤は、活性成分に対するアルブミンの高い比（例えば、９：１）を有する。そのような製剤においては、ほとんどのアルブミンが凍結乾燥させた生成物中で保護剤または支持剤（ｓｕｐｐｏｒｔ  ａｇｅｎｔ）としてしか作用しないことが、本発明者らによって思いがけず発見された。ほとんどの薬物分子（例えば、パクリタキセル）はナノ粒子中にカプセル化されており、粒子を形成しないアルブミンには薬物分子は実質的に含まれていない。先行技術の製剤においては、ほとんどのヒト血清アルブミン分子は薬物分子に結合していない。
【０３８９】
投与後、先行技術の製剤中の粒子は迅速に分解し、薬物分子と内因性のヒト血清アルブミンとの間で複合体が形成される。結果として、先行技術の製剤中の過剰なヒト血清アルブミンは製剤の有効性には寄与しないが（実施例２６を参照のこと）、代わりにその凝集と免疫原性が原因で安全性リスクを引き起こす（実施例３２、２５、および２７を参照のこと）。なおさらに、余分なアルブミンはｇｐ６０受容体への結合について薬物−アルブミン複合体と競合する可能性があり、これにより、血管内皮細胞による薬物の取り込みを低下させる可能性がある（実施例５９を参照のこと）。さらに、調製プロセスにおいて形成されたｐｏｌｙ−ＨＳＡへの結合後、ｇｐ６０受容体は、効率的に経細胞質輸送されなくなる可能性があり、これにより、受容体の放出が妨げられる可能性がある。これは、内皮細胞による薬物の取り込みをさらに阻害する可能性があり、これにより薬物の有効濃度が低下する可能性がある。
【０３９０】
上記発見に基づくと、本開示の精製されたナノ粒子はより低いアルブミン：活性成分比を有する。薬物分子を含む安定なナノ粒子の形成には極少量のヒト血清アルブミンしか必要ないことが本発明者らにより確認された。本明細書中で提供される精製されたナノ粒子およびその組成物中のヒト血清アルブミンが少ないことにより、ヒト血清アルブミンの凝集および免疫原性に伴う副作用が軽減する。
【０３９１】
投与後、本明細書中で提供される精製されたナノ粒子は、迅速に分解し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの循環のために内因性のアルブミンに結合することができた。先行技術の製剤と比較して、動物実験では、安全性および有効性に関して有意な差異は観察されなかった。しかし、本明細書中で提供される精製されたナノ粒子およびその組成物は、ヒト血管内皮細胞による取り込みが改善されており、さらには、ヒトの標的細胞へまたはヒトの標的細胞中でのナノ粒子中の活性成分の送達および有効性も改善されていた。
【０３９２】
上記の様々な実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書中で言及した、および／または出願データシート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ）に列挙した全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために、様々な特許、出願、および刊行物の概念を利用するために必要に応じて変更することができる。
【０３９３】
これらおよび他の変更を、上記詳細な記載に照らして実施例に対して行うことができる。一般的には、以下の特許請求の範囲においては、使用される用語は明細書および特許請求の範囲に開示される特異的な実施形態に特許請求の範囲を限定さするように解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲に対して与えられる範囲と同等の全ての範囲に加えて、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は開示により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019131600.tif 000037
【図１１】
2019131600.tif 000038
【図１２】
2019131600.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月25日(2019.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分とヒト血清アルブミンとを含有している精製された治療用ナノ粒子であって、ここでは、前記治療用ナノ粒子における活性成分に対するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の重量比が、０．０３：１〜０．９５：１の間であり、前記治療用ナノ粒子が、ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、精製された治療用ナノ粒子。
【請求項２】
前記ナノ粒子が最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有している、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項３】
前記活性成分が、水に不溶であるかまたはわずかに可溶であるが、有機溶媒に可溶であるかまたは溶けやすい性質を有している、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項４】
前記活性成分が、タキサン、マクロライド、カンプトテシン、アントラサイクリン系抗生物質、コルヒチン、チオコルヒチン二量体、アミオダロン、リオチロニン、シクロスポリン、エキセメスタン、フルタミド、フルベストラント、ロミデプシン、セムスチン、およびイブプロフェンより選択される、請求項３に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項５】
前記活性成分がタキサンである、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項６】
前記タキサンが、パクリタキセルまたはドセタキセルである、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項７】
前記有機溶媒が、低い水溶性と低い沸点を有している純粋な溶媒であるか、または低分子アルコールとのその混合物である、請求項３に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項８】
前記活性成分が、ヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されている、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項９】
治療用ナノ粒子の平均粒径が、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００ｎｍ、または上記任意の２つの数値の間の範囲より選択される、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１０】
活性成分とヒト血清アルブミンとを含有している精製された治療用ナノ粒子であって、ここでは、前記活性成分がヒト血清アルブミンの内部にカプセル化されており、活性成分に対するヒト血清アルブミンの重量比が０．０３：１から０．９５：１までであり、治療用ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍから１９０ｎｍまでであり、そして前記ナノ粒子がナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、精製された治療用ナノ粒子。
【請求項１１】
ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、請求項１に記載の治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物。
【請求項１２】
ナノ粒子中に取り込まれていない遊離のＨＳＡを実質的には含まない、請求項１０に記載の治療用ナノ粒子を含有している薬学的組成物。
【請求項１３】
前記薬学的組成物が、液体または凍結乾燥粉末の形態である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が凍結乾燥粉末の形態である場合には、前記薬学的組成物が凍結乾燥賦形剤もまた含有している、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記凍結乾燥賦形剤が、マンニトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、およびデキストランの１種類以上より選択される、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記組成物が最大で５％（重量で）の遊離のＨＳＡを含有する、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記活性成分がパクリタキセルである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
癌を治療するための、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
癌を治療するための、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の治療用ナノ粒子を含有し、ＨＳＡを凍結乾燥賦形剤としてさらに含有している、薬学的組成物。