(57)【要約】【課題】新規の肝疾患治療剤、及び肝疾患治療用医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明の肝疾患治療剤は、酵母の菌体又は培養物を有効成分として含有する。前記肝疾患治療剤において、酵母は、サッカロミセス属に属する酵母であることが好ましい。本発明の肝疾患治療用医薬組成物は、前記肝疾患治療剤と薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含有する。前記肝疾患治療用医薬組成物において、酵母は、サッカロミセス属に属する酵母であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の菌体又は培養物を有効成分として含有する肝疾患治療剤。
【請求項２】
前記酵母がサッカロミセス属に属する請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記酵母がサッカロミセス・ブラウディである請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
前記肝疾患が肝硬変である請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５】
前記治療剤は、経口又は静脈内に投与するものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療剤と薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含有する肝疾患治療用医薬組成物。
【請求項７】
前記肝疾患が肝硬変である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物は、経口又は静脈内に投与するものである請求項６又は７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患治療剤及びその使用に関する。具体的には、本発明は、酵母の菌体又は培養物を有効成分として含有する肝疾患治療剤、及び肝疾患治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患に対する根本的な治療方法として、細胞、組織又は器官が欠損した場合に幹細胞等を用いて修復することによりその機能を回復させる方法、すなわち再生医療が挙げられる。近年、再生医療では、幹細胞から目的とする組織や器官を形成させてから移植する方法だけでなく、幹細胞又は組織細胞の前駆細胞を疾患部位に注入し、疾患部位にて再生及び修復を行う方法、すなわち細胞医薬の活用が検討されている。
【０００３】
しかしながら、幹細胞又は組織細胞の前駆細胞を疾患患部に注入するためには、大量の細胞を要する。
細胞医療に使用される幹細胞の生産方法として、例えば、末梢血由来単球をマクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｍ−ＣＳＦ）等の特定のサイトカイン存在下で培養することで幹細胞に脱分化させる方法等が挙げられる（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００４】
さらに効率的な幹細胞の生産方法としては、例えば、末梢血由来単球をＭ−ＣＳＦ、並びにガングリオシド（糖脂質）及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種の存在下で培養し、脱分化させる方法等が挙げられる（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、Ｌｉｎ２８ａは、胎児期に一過的に発現するＲＮＡ結合タンパク質であり、ＥＳ細胞にも発現が認められるが、その分化の進展に伴い発現は低下することが知られている。２００７年に山中らによってヒトの細胞に４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，ＳＯＸ２，Ｃ−ｍｙｃ，Ｋｌｆ４）を導入することでｉＰＳ細胞が樹立できることが発表された（例えば、非特許文献３参照）。また、同日にジャームズ・トムソンらによってもヒト細胞に４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，ＳＯＸ２，Ｎａｎｏｇ，Ｌｉｎ２８ａ）を導入することでＥＳ細胞様の多分化能を有する細胞が樹立できることが示された（例えば、非特許文献４参照）。このことから、Ｌｉｎ２８ａが未分化状態の維持又は誘導に必要であることが判る。
【０００６】
山中４因子によるｉＰＳ細胞の樹立は、高齢者由来の体細胞では困難であるとされてきた。しかしながら、山中４因子に加え、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８ａを導入することで１０１歳という高齢者由来の体細胞からでもｉＰＳ細胞が誘導されることが発表された（例えば、非特許文献５参照。）。これにより、老化した細胞の初期化に寄与するＬｉｎ２８ａの持つ潜在的なポテンシャルに強い関心が注がれた。さらに２０１３年には、Ｌｉｎ２８ａの発現を、胎児期に止まらず、成体になってからも維持した場合における影響について興味深い論文が発表された（例えば、非特許文献６参照。）。これにより、Ｌｉｎ２８ａは組織修復因子として決定的に認知されるに至った。すなわち、Ｌｉｎ２８ａの発現を成体になっても維持することで、発毛が促進され、耳組織では、個体識別のために開けられた穴を開けても修復されて塞がり、仔マウスのときに個体識別のために切断した指先は再生されることが報告された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再公表ＷＯ２０１０／０６１７８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ruhnke M, et al., “Differentiation of in vitro-modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells”, Gastroenterology, vol.128, no.7, p1774-1786, 2005.
【非特許文献２】Zhao Y, et al., “A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells”, PNAS, vol.100, no.5, p2426-2431, 2003.
【非特許文献３】Yamanaka S, et al., “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors”, Cell, vol.131, issue 5, p861-872, 2007.
【非特許文献４】Thomson J A, et al., “Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells”, Science, vol.318, issue 5858, p1917-1920, 2007.
【非特許文献５】Lapasset L, et al., “Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state”, Genes Dev., vol.25, p2248-2253, 2011.
【非特許文献６】Ng Shyh-Chang, et al., “Lin28 Enhances Tissue Repair by Reprogramming Cellular Metabolism”, Cell, vol.155, issue 4, p778-792, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に記載の幹細胞の生産方法では、Ｍ−ＣＳＦとともに、ガングリオシド及び水溶性植物抽出物からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことにより、効率的に単球を幹細胞に脱分化させることができる。しかしながら、より効率的に脱分化を誘導できる物質が求められていた。
【００１０】
また、ＲＮＡ結合タンパク質であるＬｉｎ２８ａが、成長因子のように振る舞う理由については、その機能の全容解明も含めて判明しておらず、現在までに、細胞の代謝を早めることが解明されているに過ぎなかった。また、Ｌｉｎ２８ａの発現を誘導し、Ｌｉｎ２８ａを活性化する物質は知られていなかった。
【００１１】
従って、本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、新規のＬｉｎ２８ａ活性化剤を有効成分として含有する肝疾患治療剤及び肝疾患治療用医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵母の菌体又は培養物に含まれる多糖類がＬｉｎ２８ａを活性化し、さらに肝疾患を治療できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る肝疾患治療剤は、酵母の菌体又は培養物を有効成分として含有する。
【００１４】
上記第１態様に係る肝疾患治療剤において、前記酵母が、サッカロミセス属に属していてもよい。
【００１５】
上記第１態様に係る肝疾患治療剤において、前記酵母がサッカロミセス・ブラウディであってもよい。
【００１６】
上記第１態様に係る肝疾患治療剤において、前記疾患が肝硬変であってもよい。
【００１７】
上記第１態様に係る肝疾患治療剤において、前記治療剤は、経口又は静脈内に投与するものであってもよい。
【００１８】
本発明の第２態様に係る肝疾患治療用医薬組成物は、前記肝疾患治療剤と薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含有する。
【００１９】
上記第２態様に係る医薬組成物において、前記疾患が肝硬変であってもよい。
【００２０】
上記第２態様に係る医薬組成物において、前記医薬組成物は、経口又は静脈内に投与するものであってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
上記態様の肝疾患治療剤及び肝疾患治療用医薬組成物によれば、効果的に肝疾患を治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１における各種物質を培地に添加したマウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞でのＬｉｎ２８ａの発現誘導能を比較した結果を示す画像である。
【図２】実施例２におけるサッカロミセス・ブラウディの培養方法が異なる培養物を培地に添加したマウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞でのＬｉｎ２８ａの発現誘導能を比較した結果を示す画像である。
【図３】実施例３における透析外液中の物質及びサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（透析内液中の物質）を培地に添加したヒト線維芽細胞でのＬｉｎ２８ａの発現誘導能を比較した結果を示す画像である。
【図４】実施例４における各溶出物質を培地に添加したヒト線維芽細胞でのＬｉｎ２８ａの発現誘導能を比較した結果を示す画像である。
【図５Ａ】実施例４におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製前）の単糖組成分析結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】実施例４におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーで３００ｍＭのＮａＣｌで溶出された物質（陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製後）の単糖組成分析結果を示すグラフである。
【図６】実施例５におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を培地に添加したヒト線維芽細胞でのＬｉｎ２８ａ、Ｓｉｒｔ１及びＴＥＲＴの発現誘導能を比較した結果を示す画像である。
【図７】実施例６における異なる濃度のサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を培地に添加して培養したラット骨髄細胞の細胞数を比較したグラフである。
【図８】実施例７におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物又はサッカロミセス・ブラウディの菌体を肝硬変モデルマウスに投与した結果を示したグラフである。
【図９】実施例７におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物又はサッカロミセス・ブラウディの菌体を投与した肝硬変モデルマウスの肝臓切片の免疫染色の結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
≪肝疾患治療剤≫
一実施形態において、本発明は、酵母の菌体又は培養物を含む多糖類を有効成分として含有する肝疾患治療剤を提供する。
【００２４】
本実施形態の肝疾患治療剤によれば、効果的に肝疾患を治療することができる。
【００２５】
＜Ｌｉｎ２８ａ＞
本発明の肝疾患治療剤に含まれる酵母の菌体又は培養物は、Ｌｉｎ２８ａを活性化する。一般に、Ｌｉｎ２８ａとは、胎児期に一過的に発現するＲＮＡ結合タンパク質であり、ＥＳ細胞においても発現が認められるが、その分化の進展に伴い発現が低下するものである。また、Ｌｉｎ２８ａの発現を成体になっても維持することで、発毛が促進され、耳組織では、個体識別のために開けられた穴を開けても修復されて塞がり、仔マウスのときに個体識別のために切断した指先は再生されることが報告されている。そのため、Ｌｉｎ２８ａは組織修復因子として認知されている。よって、Ｌｉｎ２８ａの発現を誘導し、Ｌｉｎ２８ａを活性化させることにより、細胞、組織又は器官の損傷を修復することができる。
【００２６】
本発明者らは、Ｌｉｎ２８ａの発現を誘導し、Ｌｉｎ２８ａを活性化させる物質として、後述の実施例に示すように、酵母の菌体又は培養物に含まれる多糖類を見出し、これが肝疾患を有効に治療できることを見出した。
【００２７】
＜多糖類＞
本実施形態の肝疾患治療剤に含まれる酵母の菌体又は培養物は、リボース、キシロース及びそれらの誘導体からなる群から選択される１種以上の多糖類を含む。これらの多糖類が、Ｌｉｎ２８ａを活性化する。
【００２８】
また、前記リボース及びキシロースの誘導体としては、これら単糖が有するヒドロキシ基（−ＯＨ）がアミノ基（−ＮＨ２）に置換されたアミノ糖や、主鎖の末端のヒドロキシメチル基 （−ＣＨ２ＯＨ） がカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）に置換されたウロン酸等が挙げられる。
【００２９】
中でも、前記多糖類は、リボース及びキシロースを含むことが好ましい。後述の実施例に示すように、リボース及びキシロースを含む多糖類は、顕著なＬｉｎ２８ａの活性化効果を有する。
【００３０】
前記多糖類に含まれるキシロースのモル量に対するリボースのモル量の比率（Ｒ／Ｘ）は、１／１以上１０／１以下であることが好ましく、３／１以上９／１以下であることより好ましく、５／１以上８／１以下であることがさらに好ましい。
【００３１】
また、前記多糖類は、更に、ガラクトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びそれらの誘導体からなる群から選択される１種以上を含んでもよい。
【００３２】
また、上述の６種の単糖の誘導体としては、上述のリボース及びキシロースの誘導体として例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３３】
前記多糖類が、更に、ガラクトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びそれらの誘導体からなる群から選択される１種以上を含む場合、前記多糖類に含まれるこれら６種の単糖及びそれらの誘導体の合計モル量（Ｂ）に対するリボース、キシロース及びそれらの誘導体の合計モル量（Ａ）の比率（Ａ／Ｂ）は、例えば１／２以上１００／１以下とすることができ、例えば１／１以上５０／１以下とすることができる。前記多糖類に含まれる、上述の６種の単糖及びそれらの誘導体の合計モル量（Ｂ）に対するリボース、キシロース及びそれらの誘導体の合計モル量（Ａ）の比率が高いほど、より効果的に肝疾患を治療することができる。
【００３４】
前記多糖類の分子量は、後述の実施例に示すように、３５００以上であることが好ましく、３５００以上１５０００以下であることがより好ましい。前記多糖類の分子量が上記下限値以上であることにより、より効果的に肝疾患を治療することができる。
【００３５】
＜酵母＞
本実施形態の肝疾患治療剤に含まれる酵母としては、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属等に属する酵母が挙げられ、これらに限定されない。中でも、サッカロミセス属に属する酵母が好ましい。
【００３６】
前記サッカロミセス属に属する酵母としては、例えば、サッカロミセス・ブラウディ等が挙げられる。
【００３７】
一般に、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）とは、フランス人微生物学者であるＢｏｕｌａｒｄ博士がベトナムにて現地の人々がライチから作られた飲み物を飲むことでコレラの下痢が緩和されることを発見し、この飲み物から単離されたフルーツ酵母である。
【００３８】
前記サッカロミセス・ブラウディとしては、特別な限定はなく、具体的には、例えば、ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−７９６株又はＡＴＣＣ  ＭＹＡ−７９７株等が挙げられる。
【００３９】
本実施形態の肝疾患治療剤において、前記酵母の菌体としては、菌体の懸濁液、菌体の乾燥物（例えば、乾燥菌体）、菌体破砕液（例えば、酵母エキス等）が含まれる。前記酵母の培養物には、酵母の懸濁液及び培養上清が含まれる。また、酵母の培養物は液体であってもよく、乾燥体（例えば、培養上清を乾燥させたもの等）であってもよい。また、酵母の培養物としては、酵母の菌体を含んだ状態のものを用いてもよい。前記酵母の菌体又は培養物としては、酵母の菌体又は培養物から前記多糖類のみを分離及び精製して用いてもよい。
【００４０】
本実施形態の肝疾患治療剤及び医薬組成物においては、被検体の体内に直接投与又は注入（例えば、経口的、経皮的、静脈内、腹腔内等）するため少量で高い効果が得られ、高純度で安全性が高いことが求められる。このことから、本実施形態の肝疾患治療剤及び医薬組成物においては、微生物の培養物に含まれる多糖類のみを分離及び精製したものを用いることが好ましい。
【００４１】
本実施形態において、酵母の菌体又は培養物に含まれる多糖類の構造は同定されていないが、分子量が約３５００以上約１５０００以下であることが好ましい。また、培養物の液体状態におけるｐＨは例えば、４以上９以下であればよい。
【００４２】
本実施形態における酵母の菌体又は培養物は、酵母の培養に用いられる一般的な培地を用いて、当該酵母を培養することで得ることができる。
【００４３】
前記培地としては、例えば、ＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース含有）、グルコースの一部をラムノースに代替したＹＰＤ培地、グルコースの一部をリボースに代替したＹＰＤ培地等が挙げられ、これに限定されない。中でも、培地としては、グルコースの一部をラムノースに代替したＹＰＤ培地、又は、グルコースの一部をリボースに代替したＹＰＤ培地であることが好ましく、グルコースの一部をリボースに代替したＹＰＤ培地であることがより好ましい。
【００４４】
培養して増殖した酵母の菌体又はその培養物をそのまま用いてもよい。
【００４５】
又は、酵母の菌体又は培養物からそのエキスを調製してもよい。エキスの調製方法としては、例えば、菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して菌体を可溶化する酵素分解法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸あるいはアルカリを添加して菌体を可溶化する酸又はアルカリ分解法、凍結及び融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法等が挙げられる。前記物理的破砕法において用いられる物理的刺激としては、例えば、超音波処理、高圧下におけるホモジェナイズ、グラスビーズ等の固形物との混合による磨砕等が挙げられる。
【００４６】
又は、酵母の菌体又は培養物を乾燥処理して、乾燥菌体を調製してもよい。乾燥処理方法としては、例えば、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法等が挙げられる。さらに、得られた乾燥菌体を粉末状に加工することにより、取り扱い性に優れた乾燥菌末を得ることができる。
【００４７】
又は、酵母の菌体又は培養物から多糖類を含有する分画物を調製してもよい。培養物から多糖類を含有する分画物を分画する方法としては、例えば、熱水抽出、菌体破砕（例えば、上述のエキスの調整方法と同様の方法等）による抽出等により得られた抽出物を、遠心分離、透析、多糖類と親和性の高い物質を担持したアフィニティカラム等を用いて分画することにより、多糖類を高濃度に含む画分に濃縮精製することが可能となる。
【００４８】
本実施形態の肝疾患治療剤を用いて治療することができる肝疾患としては、例えば、肝硬変、慢性肝炎等が挙げられる。
【００４９】
本実施形態の肝疾患治療剤によれば、移植又は細胞医療を含む外科手術よりも低侵襲で効果的に肝疾患を治療することができる。
【００５０】
本実施形態の治療剤を生体内に投与することにより、治療剤に含まれる酵母の菌体又は培養物中の多糖類が疾患部に到達することで、疾患部でのＬｉｎ２８ａの発現を誘導し、Ｌｉｎ２８ａを活性化させる。これにより、肝臓の損傷を修復することができる。また、前記多糖類は、生体内に既存するＭ−ＣＳＦと協同して単球を幹細胞に脱分化させて、この幹細胞が疾患部に到達することで、各種の疾患を治療することができる。
【００５１】
また、本実施形態の肝疾患治療剤をインビトロ系において損傷を受けた肝細胞又は肝臓に投与することにより、治療剤に含まれる酵母の菌体又は培養物中の多糖類が損傷を受けた肝細胞でのＬｉｎ２８ａの発現を誘導し、Ｌｉｎ２８ａを活性化させる。これにより、インビトロ系において肝臓又は肝細胞の損傷を修復することができる。
【００５２】
本明細書において、「細胞」としては、例えば、肝臓を構成する肝細胞、肝幹細胞、肝前駆細胞、肝臓から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される肝細胞（肝細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された肝細胞、生体から分離され人為的に核が交換された肝細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５３】
肝前駆細胞とは、前記肝幹細胞から肝細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【００５４】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５５】
＜投与量及び投与経路＞
本実施形態の肝疾患治療剤の投与量は、被験動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、特に好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の肝疾患治療剤に含まれる多糖類の有効量は、ヒト成人の体重１ｋｇあたり１００ｎｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは１μｇ以上１０ｍｇ以下、より好ましくは１０μｇ以上５ｍｇ以下であると考えられる。
【００５６】
本実施形態の肝疾患治療剤は１日に１〜４回に分けて投与することができる。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
【００５７】
≪医薬組成物≫
一実施形態において、本発明は、前記肝疾患治療剤と薬学的に許容される担体とを含有する肝疾患治療用医薬組成物を提供する。
本実施形態の医薬組成物は、前記肝疾患治療剤の他に、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、軟膏剤等の形態の治療剤を調製することができる。
【００５８】
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、上述の多糖類の生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、上述の多糖類の移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えば、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の臓器、組織、又は細胞へ、上述の多糖類を効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００５９】
本実施形態の医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
【００６０】
又は、本実施形態の医薬組成物における製剤化の例としては、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００６１】
調剤単位形態が錠剤、カプセル剤である場合に、混和することができる添加剤としては、例えば、結合剤、賦形剤、膨化剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤等が挙げられる。
【００６２】
前記結合剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等が挙げられる。
【００６３】
前記賦形剤としては、例えば、結晶性セルロース等が挙げられる。
【００６４】
前記膨化剤としては、例えば、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等が挙げられる。
【００６５】
前記湿潤剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【００６６】
前記甘味剤としては、例えば、ショ糖、乳糖、サッカリン等が挙げられる。
【００６７】
前記香味剤としては、例えば、ペパーミント油、アカモノ等が挙げられる。
【００６８】
また、調剤単位形態がカプセル剤である場合に、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００６９】
調剤単位形態が注射剤である場合に、例えば、注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。また、注射用の水溶液としては、例えば、等張液と、適当な溶解補助剤又は非イオン性界面活性剤とを併用してもよい。
【００７０】
前記等張液は、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含むことができる。前記補助薬としては、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００７１】
前記溶解補助剤としては、例えば、アルコール、ポリアルコール等が挙げられる。前記アルコールとして具体的には、例えば、エタノール等が挙げられる。前記ポリアルコールとして具体的には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００７２】
前記非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等が挙げられる。
【００７３】
また、調剤単位形態が注射剤である場合に、上記の材料にさらに油性液を含有することができる。
【００７４】
前記油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油、オリーブ油等の植物油が挙げられる。
【００７５】
また、さらに、溶解補助剤を併用してもよい。前記溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００７６】
また、さらに、緩衝剤、無痛化剤、安定剤、又は、酸化防止剤を配合してもよい。
【００７７】
前記緩衝剤としては、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００７８】
前記無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン等が挙げられる。
【００７９】
前記安定剤としては、例えば、ベンジルアルコール、フェノール等が挙げられる。
【００８０】
また、調剤単位形態が注射剤である場合に、懸濁剤、又は、乳濁剤として調製することもできる。
【００８１】
このように調製された注射剤は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００８２】
また、このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。又は、注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、多糖類を凍結乾燥法等によって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００８３】
本実施形態の医薬組成物を用いて治療することができる肝疾患としては、例えば、肝硬変、慢性肝炎等が挙げられる。
【００８４】
本実施形態の医薬組成物の投与量は、被験動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、特に好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の医薬組成物に含まれる肝疾患治療剤の有効量は、多糖類として、ヒト成人の体重１ｋｇあたり１００ｎｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは１μｇ以上１０ｍｇ以下、より好ましくは１０μｇ以上５ｍｇ以下であると考えられる。
【００８５】
本実施形態の医薬組成物は１日に１〜４回に分けて投与することができる。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法が挙げられる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８７】
［実施例１］
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
まず、サッカロミセス・ブラウディを、１００ｍＬのＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース含有）を用いて、一晩、室温で振盪培養した。次いで、対数増殖期に、遠心分離（室温で１０００ｇ、１５分）を行い、培養上清を回収した。次いで、培養上清に、７５％飽和硫安（試料１Ｌ対して５１６ｇ）になるように粉末の硫酸アンモニウムを添加し、氷水中にて一時間以上冷却し、沈殿物を遠心分離（４℃で１０００ｇ、１５分）にて回収した。次いで、回収した沈殿物を少量の蒸留水に溶解し、限界分子量３５００の透析膜を用い、十分量の水に対して透析を行い、残存する硫酸アンモニウムを除去した。透析後、凍結乾燥によりサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を回収し、重量測定を行った。これにより、約２０ｍｇの外分泌物が得られた。
【００８８】
（２）マウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞の準備
予め、マウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所、ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲、細胞番号：ＩＦＯ５０３７４）を６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、３３℃、５％ＣＯ２環境下で一晩培養しておいた。
【００８９】
（３）Ｌｉｎ２８ａの発現誘導
次いで、マウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞の播種した翌日に、（１）で調製したサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、添加から５日間培養した。添加後、一度も培地は交換しなかった。また、コントロールとして、外分泌物を添加していないもの、ポジティブコントロールとして外分泌物の代わりに、ｉＰＳ細胞誘導可能な低分子６化合物の混合物である６ＣｉＰＳｓ（参考文献：Hou P., et al, “Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds”, Science, vol.341, Issue 6146, p651-654, 2013.）を添加したものを準備した。また、対照群として、外分泌物の代わりに、ガングリオシド（テクノケミカル株式会社製、１０６０）、又はサツマイモ由来の多糖類を最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加したものも準備した。
【００９０】
培養後、細胞は、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製、２５２０００５６）を用いて剥離し回収した。次いで、回収した細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ７４００４）を用い、トータルＲＮＡを回収した。トータルＲＮＡから、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（登録商標）  ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａ３８０１）を用いてｃＤＮＡを作製し、下記表１に示すプライマーを用いてＬｉｎ２８ａの発現をＰＣＲにてモニターした。
【００９１】
【表１】
2019131501.tif 000002
【００９２】
また、ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、結果を図１に示した。
【００９３】
図１から、レーン２であるポジティブコントロールの６ＣｉＰＳｓを添加したＴＫＤ２細胞、及びレーン５であるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を添加したＴＫＤ２細胞において、Ｌｉｎ２８ａの発現が誘導されたことが確かめられた。
一方、ガングリオシド及びサツマイモ由来の多糖類を添加したＴＫＤ２細胞では、Ｌｉｎ２８ａの発現は誘導されなかった。
【００９４】
［実施例２］
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
まず、サッカロミセス・ブラウディを、ＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、２％グルコース含有）（以下、「通常培養」と称する場合がある。）、グルコースの一部をラムノースに代替したＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．２％グルコース、１．８％ラムノース含有）（以下、「培養方法−Ｉ」と称する場合がある。）、又はグルコースの一部をリボースに代替したＹＰＤ培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．２％グルコース、１．８％リボース含有）（以下、「培養方法−ＩＩ」と称する場合がある。）を用いて、一晩、室温で振盪培養した。次いで、実施例１の（１）と同様の方法を用いて、それぞれの培養方法におけるサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を回収した。
【００９５】
（２）マウス血管内皮細胞株ＴＫＤ２細胞の準備
次いで、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、ＴＫＤ２細胞を播種し、一晩培養した。
【００９６】
（３）Ｌｉｎ２８ａの発現誘導
次いで、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物（通常培養）、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物（培養方法−Ｉ）、又は、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物（培養方法−ＩＩ）をそれぞれ最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加したこと以外は実施例１の（３）と同様の方法を用いて、ＴＫＤ２細胞を培養した。次いで、各ＴＫＤ２細胞を回収し、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、Ｌｉｎ２８ａの発現を比較した。結果を図２に示す。
【００９７】
図２から、通常培養から、培養方法−Ｉ、培養方法−ＩＩになるにつれて、Ｌｉｎ２８ａの発現が上昇することが明らかになった。これにより、グルコースの一部をラムノース、又は、リボースに代替することで、Ｌｉｎ２８ａの発現誘導効果が著しく上昇することがわかった。
【００９８】
［実施例３］
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物（透析内液中の物質）を得た。また、透析外液も回収し、凍結乾燥して、透析外液中の物質を得た。
【００９９】
（２）ヒト線維芽細胞の準備
予め、ヒト歯肉由来線維芽細胞を６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルとなるように播種し、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で一晩培養しておいた。
【０１００】
（３）Ｌｉｎ２８ａの発現誘導
次いで、ヒト線維芽細胞の播種した翌日に、（１）で調製した外分泌物（透析内液中の物質）及び透析外液中の物質を最終濃度３０μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、添加から１〜２週間培養した。添加後、一度も培地は交換しなかった。
【０１０１】
培養後、細胞は、０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製、２５２０００５６）を用いて剥離し回収した。次いで、回収した細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ７４００４）を用い、トータルＲＮＡを回収した。トータルＲＮＡから、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（登録商標）  ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａ３８０１）を用いてｃＤＮＡを作製し、下記表２に示すプライマーを用いてＬｉｎ２８ａの発現をＰＣＲにてモニターした。また、ＰＣＲの条件は、以下に示すとおりである。
１）  ９５℃  ３分間
２）  ９５℃  ３０秒間
３）  ５５℃  ３０秒間
４）  ７２℃  ４５秒間
５）  ７２℃  ５分間
※  ２）〜４）を３０サイクル
【０１０２】
【表２】
2019131501.tif 000003
【０１０３】
その結果を図３に示す。図３から、透析外液中の物質には、Ｌｉｎ２８ａ発現誘導活性は見られなかった。一方、（１）において、分子量３５００が排除限界である透析膜を用いて精製していることから、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物に含まれる分子量が３５００よりも大きな分子が活性本体であることが示唆された。
【０１０４】
［実施例４］
酵母の培養物からＬｉｎ２８ａ誘導活性を有する分子を精製し、その組成を解析した。
【０１０５】
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物を得た。
【０１０６】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製
次いで、得られたサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を、ＤＥＡＥ−６５０M（ＴＯＳＯＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社製、０００７４７３）を用いた陰イオン交換クロマグラフィーによって、分画した。溶出は、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、及び、２０００ｍＭのＮａＣｌによってステップワイズ法により行った。得られた各溶出画分は、限界分子量３５００の透析膜を用い、十分量の水に対して透析を行った。透析後、凍結乾燥により、各溶出物質を得た。また、得られた各溶出物質の重量を測定した。
【０１０７】
（３）ヒト線維芽細胞の準備
実施例３の（２）と同様の方法を用いて、ヒト線維芽細胞を予め培養した。
【０１０８】
（４）Ｌｉｎ２８ａの発現誘導
（１）で得られた各溶出物質を３０μｇ／ｍＬずつヒト線維芽細胞に添加した以外は、実施例３の（３）と同様の方法を用いて、各溶出物質によるＬｉｎ２８ａの発現誘導活性を評価した。結果を図４に示す。なお、図４において、レーン１〜６はそれぞれ５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、及び、２０００ｍＭのＮａＣｌによる溶出物質を添加した線維芽細胞をロードしている。
【０１０９】
図４から、３００ｍＭのＮａＣｌによる溶出物質が線維芽細胞でのＬｉｎ２８ａの発現誘導活性が最も高いことが明らかとなった。
【０１１０】
また、これらの溶出物質は、アルシャンブルー、トルイジンブルーで染色され、さららにフェノール硫酸によって赤褐色を呈した。このことから、溶出物質が多糖類であることが示唆された。
【０１１１】
（５）単糖組成分析
次いで、（１）で得られたサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（サンプルＮｏ．１）の透析後、凍結乾燥前の溶液２０μＬ（糖含有量として、１ｍｇ／ｍＬ）に超純水３０μＬを加えて、５０μＬの試料を調製した。また、（２）で得られた３００ｍＭのＮａＣｌによる溶出物質（サンプルＮｏ．２）の透析後、凍結乾燥前の溶液５μＬ（糖含有量として、４ｍｇ／ｍＬ）に超純水４５μＬを加えて、５０μＬの試料を調製した。各５０μＬの試料に８Ｍ  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを添加し、１００℃で３時間加熱して加水分解した。次いで、得られた各加水分解物を乾固させて、超純水１００μＬに溶解した。溶液を遠心分離（４℃で１０，０００×ｇ、１０分間）し、上清を回収した。得られた上清のうち５０μＬを、無水酢酸を用いて、Ｎ−アセチル化した。次いで、ＡＢＥＥ化試薬を用いて蛍光標識した。次いで、蛍光標識後の溶液について、水／クロロホルム抽出を行い、水相から蛍光標識化単糖を回収し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣの条件は以下に示すとおりである。
装置：ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ  ｅＺ（Ｔｏｓｏｈ社製）
カラム：ＰＮ−ＰＡＫ  Ｃ１８（３．０×７５ｍｍ）
溶媒：ホウ酸バッファー／アセトニトリル
流速：０．５ｍＬ／分
検出：蛍光（Ｅｘ：３０５ｎｍ、Ｅｍ：３６０ｎｍ）
【０１１２】
（１）で得られたサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（サンプルＮｏ．１）の分析結果を表３及び図５Ａに示す。また、（２）で得られた３００ｍＭのＮａＣｌによる溶出物質（サンプルＮｏ．２）の分析結果を表４及び図５Ｂに示す。
【０１１３】
【表３】
2019131501.tif 000004
【０１１４】
【表４】
2019131501.tif 000005
【０１１５】
表３、表４、図５Ａ及び図５Ｂから、Ｌｉｎ２８ａ発現誘導活性の高い３００ｍＭのＮａＣｌによる溶出物質に含まれる多糖類は、リボース及びキシロースを含むことが明らかとなった。また、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物に含まれる多糖類は、リボース及びキシロースに加えて、ガラクトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラムノース及びＮ−アセチルガラクトサミンを含むことが明らかとなった。
【０１１６】
これらのことから、Ｌｉｎ２８ａ発現誘導活性を有する多糖類は、少なくともリボース及びキシロースを含むことが明らかとなった。
【０１１７】
以上のことから、本実施形態に係るＬｉｎ２８ａ活性化剤に含まれる多糖類は、細胞におけるＬｉｎ２８ａの発現誘導活性を有することが確かめられた。
【０１１８】
［実施例５］
サッカロミセス・ブラウディの外分泌物を添加して培養したヒト線維芽細胞において、Ｌｉｎ２８ａ以外の遺伝子の発現を解析した。
【０１１９】
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物を得た。
【０１２０】
（２）ヒト線維芽細胞の準備
実施例３の（２）と同様の方法を用いて、ヒト線維芽細胞を予め培養した。
【０１２１】
（３）Ｓｉｒｔ１遺伝子及びＴＥＲＴ遺伝子の発現解析
次いで、ヒト線維芽細胞の播種した翌日に、（１）で調製したサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を最終濃度１０μｇ／ｍＬ又は３０μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、添加から１週間培養した。添加後、一度も培地は交換しなかった。
【０１２２】
次いで、実施例３の（３）に記載の方法と同様の方法を用いて、各条件で培養した細胞からトータルＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを作製した。次いで、上記表２に示すプライマー及び下記表５に示すプライマーを用いた以外は、実施例３の（３）に記載の方法と同様の方法を用いて、Ｓｉｒｔ１遺伝子及びＴＥＲＴ遺伝子の発現をＰＣＲにてモニターした。なお、Ｓｉｒｔ１遺伝子は、若返り遺伝子として知られているサーチュイン１の遺伝子である。また、ＴＥＲＴ遺伝子は、テロメレースのサブユニットの遺伝子である。
【０１２３】
【表５】
2019131501.tif 000006
【０１２４】
また、ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、結果を図６に示した。図６において、レーン１はサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を添加していない線維芽細胞をロードしている。レーン２はサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（１０μｇ／ｍＬ）を添加した線維芽細胞をロードしている。レーン３はサッカロミセス・ブラウディの外分泌物（３０μｇ／ｍＬ）を添加した繊維芽細胞をロードしている。
【０１２５】
図６から、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の添加量に依存して、若返り遺伝子として知られるＳｉｒｔ１遺伝子の発現誘導が増加することが明らかとなった。このことから、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物に含まれる多糖類に若返りの効果が期待できることが示唆された。
【０１２６】
一方、テロメレースのサブユニットであるＴＥＲＴ遺伝子の発現には影響が見られなかった。このことから、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の添加による発癌の懸念は大きく減少したと推察された。
【０１２７】
［実施例６］
データは示さないが、微生物由来の多糖類を培養液中に添加してもヒトファイブロブラストの増殖には全く影響がなかった。これに対し、微生物由来の多糖類の未分化細胞の増殖への影響について検証した。
【０１２８】
（１）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物を得た。
【０１２９】
（２）ラット骨髄細胞の準備
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅが全身に発現するように作られたトランスジェニックラットから骨髄細胞を得て、培養した。次いで、接着してきた細胞をトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ、２５２０００５６）ではがして回収し、さらに培養を続けた。培養は、終濃度２０％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、２１０６３）を用いた。
【０１３０】
（３）サッカロミセス・ブラウディの培養物（外分泌物）を用いた培養
次いで、（２）で予め培養した骨髄細胞に、（１）で得られたサッカロミセス・ブラウディの外分泌物を最終濃度０、３、１０、３０及び１００μｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、添加から４日間培養した。添加後、一度も培地は交換しなかった。次いで、培養後の細胞数を定量した。なお、細胞数の定量は、ルシフェリンの発光を指標にした。結果を図７に示す。図７において、縦軸は、ルシフェリンの発光のｃｐｓ（ｃｏｕｎｔ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ）である。横軸は、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の添加濃度である。
【０１３１】
図７から、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の添加濃度依存的に、骨髄細胞の細胞数が増加することが明らかとなった。このことから、上述の微生物由来の多糖類を用いることで、細胞治療のソースとして注目される骨髄等の未分化な細胞をヒト体内から採取する際に最低限の侵襲にとどめられることが示唆された。また、上述の微生物由来の多糖類を用いることで、治療に有効な未分化な細胞を体内で増殖させる、言わば、体外での細胞培養を必要としない再生医療の実現にも有効であることが示唆された。
【０１３２】
［実施例７］
（１）サッカロミセス・ブラウディの菌体及び培養物（外分泌物）の調製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、サッカロミセス・ブラウディの菌体及び外分泌物を得た。
【０１３３】
（２）肝硬変モデルマウスを用いた肝硬変治療効果の検証
四塩化炭素誘導マウス肝硬変モデルを以下のように作成した。
四塩化炭素（和光純薬工業株式会社、０３５−０１２７３）は、オリーブオイル（和光純薬工業社製、１５０−００２７６）にて１０倍希釈（体積にて、ｖ／ｖ）を行った。作製した１０％四塩化炭素／オリーブオイル溶液を要事調製し、１ｍｌ（四塩化炭素として）／Ｋｇで、ＢＡＬＢ／ｃの６週齢マウスに経口投与した。すなわち、マウスの体重を２５ｇとして１０％四塩化炭素／オリーブオイル溶液を２５０μｌを投与した。投与は、週に２回行い、１２週間投与を続けた。
【０１３４】
最終投与から一週間後に、（１）で得られたサッカロミセス・ブラウディの外分泌物の静脈内投与と、サッカロミセス・ブラウディの菌体の経口投与とを行った。サッカロミセス・ブラウディの外分泌物は、蒸留水にて１ｍｇ／ｍｌに調製し、１０ｍｇ／Ｋｇで週に一回で２週間にわたり計２回静脈内投与を行った。
サッカロミセス・ブラウディの菌体の投与は、１ｇ／Ｋｇにて週に三回で２週間にわたり計６回経口投与を行った。
いずれも最終投与から一週間後にマウスを安楽死させて、血清、肝臓を採取し、肝臓は、１０％ホルマリン液（和光純薬工業社製、０６０−０３８４５）に浸し、固定した。
【０１３５】
固定したマウス肝臓の切片を作成し、Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎに対する抗体（Ａｂｃａｍ社製、Ａｂ３４７１０）を用いた免疫染色を行った。血清は、ＡＬＴなど生化学的マーカーの測定を行った。図８にＡＬＴの測定結果を示す。図８において、群１は、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の静脈内投与群、群２は、サッカロミセス・ブラウディの菌体の経口投与群、群３は未投与群をそれぞれ示す。図８に示したように、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の静脈内投与及びサッカロミセス・ブラウディの菌体の経口投与により有意にＡＬＴ値が低下していた。
図９に、免疫染色の結果を示す。図９に示したように、サッカロミセス・ブラウディの外分泌物の静脈内投与及びサッカロミセス・ブラウディの菌体の経口投与によって有意にコラーゲン線維が減少していた。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本実施形態によれば、効果的な肝疾患治療剤及び肝疾患治療用医薬組成物を提供することができる。これにより、移植又は細胞医療を含む外科手術よりも低侵襲で効果的に肝疾患を治療することができる。
【図１】
2019131501.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019131501.tif 000015
【図９】
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【配列表】
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