(57)【要約】【課題】核酸分子ワクチン組成物およびその使用の提供。【解決手段】本開示は、がんまたは感染性疾患などの病態を予防または処置するための核酸ワクチン組成物および方法に関する。さらに、本開示は、真核細胞における翻訳の多重開始を促進するための、１つまたは複数の非従来型スタートコドンを含有するｍＲＮＡを介した、抗原のより効率的な産生のための方法を提供する。多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、該ＭＴＩは、該抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は、紙原稿の代わりにテキスト形式で提供され、本明細書中に参照により組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、８９００７９＿４０１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは、２１０ＫＢであり、２０１５年３月１７日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、全ての外来チャレンジに応答する多数の細胞性および可溶性因子が関与する自然免疫、ならびに外来または異常な薬剤由来の正確なエピトープに特異的に応答する獲得免疫に、カテゴリー分けされ得る。獲得免疫応答には、Ｂリンパ球による抗体の産生が関与する体液性アーム、および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のキラー活性が関与する細胞性アームが含まれる。獲得免疫応答によって異常な細胞を検出および排除するための重要なメカニズムは、ＣＴＬによる監視である。異常な細胞は、ウイルス、寄生生物もしくは細菌が感染した細胞、または腫瘍原性形質転換を受けた細胞であり得る。
【０００３】
細胞は、排除のためにマーク（例えば、ユビキチン化）された本質的に任意の細胞性翻訳産物からペプチドのレパートリーを天然に産生して、それらの表面上でのペプチド／主要組織適合複合体（ＭＨＣ；ヒトでは、ヒト白血球抗原またはＨＬＡとして公知）クラスＩ複合体の提示を生じる。ユビキチン化されたタンパク質は、タンパク質分解のためにプロテアソームに標的化され、小胞体中に局在化する抗原提示（ＴＡＰ）タンパク質と関連するトランスポーターによって認識され得るより小さいペプチドを産生する。ＴＡＰは、サイトゾルから小胞体に小さいペプチドを移動させるヘテロ二量体であり、小胞体において、これらのペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子に結合してペプチド／ＨＬＡ複合体を形成する。次いで、ペプチド／ＨＬＡ複合体は、細胞表面に輸送される。
【０００４】
循環ＣＴＬの表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞指向性の免疫応答を誘発する、ウイルスタンパク質または腫瘍特異的タンパク質などの外来ペプチドの存在について、ペプチド／ＭＨＣ複合体を探索する。細胞は、ＴＣＲに対する潜在的なリガンドとして、ＭＨＣ分子との関連で数万の別個のペプチドを提示し得るが、各ペプチドの分量は、非常に低い。それにもかかわらず、ＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩによってディスプレイされるペプチドに対する非常に敏感なプローブである。一部の推定によれば、たった３コピーの抗原性ペプチドが、溶解のために細胞を標的化するのに十分である（Purbhooら、Nat.  Immunol.  ５巻：５２４頁、２００４年）。
【０００５】
ワクチンは、世界の健康に対して著明かつ持続的な効果を有してきた。天然痘は、根絶されており、ポリオはほぼ排除状態であり、ジフテリア、麻疹、ムンプス、百日咳および破傷風などの疾患は、封じ込められている。遺伝子療法および核酸免疫化は、後天性疾患および遺伝性疾患の両方の処置および予防のための有望なアプローチである（Liら、J.  Biotechnol.  １６２巻：１７１頁、２０１２年）。これらの技術には、被験体中へのｉ
ｎ  ｖｉｖｏでの所望の核酸ワクチンの直接投与、または被験体の細胞もしくは組織をｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトし、形質転換された材料を被験体に再導入することによるものがある。これらの技術のそれぞれは、十分な量の治療的または抗原性遺伝子産物を提供するために、いくつかの因子によって影響され得る、トランスフェクトされた細胞における核酸分子の効率的な発現を必要とする。あるいは、規定されたＴ細胞エピトープである抗原性ペプチドが、生産的なペプチド／ＭＨＣ複合体を形成し、Ｔ細胞応答を刺激するために、直接投与され得る。
【０００６】
しかし、現在のワクチンは、人および飼育動物が罹患する一握りの感染症またはがんにのみ対処している。ワクチンが存在しない一般的な感染性疾患により、米国単独で１年に約１２００億ドルが失われる（Robinsonら、American  Acad.  Microbiol.、１９９６年
）。先進工業国では、免疫不全ウイルスなどの新興感染症、ならびに薬物耐性形態の結核のような再興疾患が、新たな脅威を及ぼし、ワクチン開発にとっての課題をもたらしている。新たなワクチンおよび改善されたワクチンの両方の必要性は、有効なワクチンが入手不能であるか桁違いの費用がかかる場合が多い第三世界諸国において、さらにいっそう明白である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Purbhooら、Nat.  Immunol.  ５巻：５２４頁、２００４年
【非特許文献２】Liら、J.  Biotechnol.  １６２巻：１７１頁、２０１２年
【非特許文献３】Robinsonら、American  Acad.  Microbiol.、１９９６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在のワクチンに関連する制限を考慮すると、より効率的かつ管理可能なワクチンおよびワクチン接種のために有用な代替的な組成物および方法が、当技術分野で必要とされている。本開示は、かかる必要性を満たし、他の関連する利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むベクターであって、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、ベクターを提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子を含む細胞であって、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、細胞を提供する。
【００１２】
さらなる実施形態では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子を含むベクターを含む細胞であって、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、細胞を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、本明細書の実施形態の記載に従う核酸分子、本明細書の実施形態に記載される核酸分子によってコードされる抗原、またはその両方を含む免疫化組成物の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、本明細書の実施形態に記載される核酸分子または本明細書の実施形態に記載されるベクターを含む細胞の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）本明細書の実施形態に記載される核酸分子のうちいずれか１つによってコードされる１つまたは複数の抗原を含む抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、および（ｂ）本明細書の実施形態に記載される核酸分子または本明細書の実施形態に記載されるベクターを含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
なおさらなる実施形態では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）本明細書の実施形態に記載される核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、（ｂ）初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えるステップ、および（ｃ）本明細書の実施形態に記載される核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の第２の有効量、または抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、乳がんを処置する方法であって、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含み、抗原性エピトープが、葉酸受容体アルファ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ由来のペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む、方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、がんを処置する方法であって、本明細書の実施形態に記載される核酸分子を含む核酸免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の抗原が、被験体において同定された発癌性変異を有する抗原を含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、該ＭＴＩは、該抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子。
（項目２）
前記ＭＴＩ配列が、配列番号１〜６のうちいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列である、項目１に記載のキメラ核酸分子。
（項目３）
前記核酸分子が、約２から約１０の範囲の複数の抗原をコードする、項目１または２に記載のキメラ核酸分子。
（項目４）
前記複数の抗原のうち２つまたはそれ超が、スペーサーによって分離されている、項目３に記載のキメラ核酸分子。
（項目５）
前記スペーサーが（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎが、１から５の整数である、項目４に記載のキメラ核酸分子。
（項目６）
前記複数の抗原のうち２つまたはそれ超が、切断部位によって分離されている、項目３〜５のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目７）
前記切断部位が、参照タンパク質中に見出される抗原性ペプチドに対してアミノ末端側の約２から約１０アミノ酸、該参照タンパク質中に見出される該抗原性ペプチドに対してカルボキシ末端側の約２から約１０アミノ酸、自己切断性アミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、項目６に記載のキメラ核酸分子。
（項目８）
前記自己切断性アミノ酸配列が、ブタテッショウウイルス−１由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）またはそれらの任意の組合せである、項目６に記載のキメラ核酸分子。
（項目９）
前記抗原または抗原性エピトープが、ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、またはそれらの任意の組合せである、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目１０）
前記抗原または抗原性エピトープが、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを含むＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチドである、項目９に記載のキメラ核酸分子。
（項目１１）
前記抗原または抗原性エピトープが、病原体由来である、または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目１２）
前記病原体が、ウイルス、寄生生物または細菌である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目１３）
前記ウイルスが、天然痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスまたはエボラウイルスである、項目１２に記載のキメラ核酸分子。
（項目１４）
前記インフルエンザが、インフルエンザ株Ｈ７Ｎ９（鳥インフルエンザ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ８、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７またはＨ１Ｎ１である、項目１３に記載のキメラ核酸分子。
（項目１５）
前記細菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである、項目１２に記載のキメラ核酸分子。
（項目１６）
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、Ｅ．ｃｏｌｉ株０１５７：Ｈ７、ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＨＥＣまたはＥＡＥＣである、項目１５に記載のキメラ核酸分子。
（項目１７）
配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目１３に記載のキメラ核酸分子。
（項目１８）
前記ＴＡＡが、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、炎症性乳がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、結腸がん、原発性腹膜がん、精巣がん、腎がん、黒色腫、神経膠芽腫、肺がんまたは前立腺がんと関連する抗原である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目１９）
前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質、葉酸受容体−αタンパク質、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＩ３Ｋ、ＢＲＡＦ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ゴナドトロピン放出ホルモン１（ＧＮＲＨ１）、がん／精巣抗原１Ａ（ＣＴＡＧ１Ａ）、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２、ＰＤ−１アンタゴニスト、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３またはマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）由来である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目２０）
前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、葉酸受容体−α抗原またはそれらの組合せを含む、項目１９に記載のキメラ核酸分子。
（項目２１）
前記ＴＡＡが、配列番号６９〜９３もしくは１１７〜１３５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する、項目１９に記載のキメラ核酸分子。
（項目２２）
前記核酸分子が、配列番号９７、９８、１３６のうちいずれか１つ、またはそれらの任意の組合せに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２３）
前記核酸分子が、配列番号６７、６８、１１５、１１６のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する抗原をコードする、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２４）
配列番号５２、５７、５８、１００、１３７、１３９、１４１、１４５または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２５）
ＴＡＰタンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目２６）
前記ＴＡＰタンパク質が、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＬまたはそれらの任意の組合せである、項目２５に記載のキメラ核酸分子。
（項目２７）
前記ＴＡＰタンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号２０６〜２１０のうちいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組合せを有する、項目２５または２６に記載のキメラ核酸分子。
（項目２８）
前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子を含むベクター。
（項目２９）
発現ベクターである、項目２８に記載のベクター。
（項目３０）
前記発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含む、項目２９に記載のベクター。
（項目３１）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群ウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルスから選択される、項目３０に記載のベクター。
（項目３２）
項目１〜２７のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子を含む細胞。
（項目３３）
項目２８〜３１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
（項目３４）
第１の被験体から取得された自家細胞または該第１の被験体とは異なる被験体由来の同種細胞である、項目３２または３３に記載の細胞。
（項目３５）
抗原提示細胞である、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３６）
樹状細胞である、項目３２〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３７）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる抗原、またはその両方を含む免疫化組成物の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法。
（項目３８）
前記免疫化組成物が、核酸免疫化組成物を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記免疫化組成物が、抗原またはポリ抗原免疫化組成物を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記核酸免疫化組成物および前記抗原免疫化組成物が両方とも投与される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記抗原免疫化組成物が最初に投与され、前記核酸免疫化組成物が２番目に投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記核酸免疫化組成物が最初に投与され、前記抗原免疫化組成物が２番目に投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記核酸免疫化組成物および前記抗原免疫化組成物が、並行して投与される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記免疫化組成物が、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の細胞を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞性免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞応答である、項目３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記被験体がヒトである、項目３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子または項目２８〜３１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法。
（項目４８）
前記細胞が、自家または同種である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記細胞が抗原提示細胞である、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記被験体がヒトである、項目４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子のうちいずれか１つによってコードされる１つまたは複数の抗原を含む抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、および（ｂ）項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子または項目２８〜３１のいずれか一項に記載のベクターを含む核酸分子免疫化組成物の有効量を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目５３）
ステップ（ｂ）の前記核酸分子免疫化組成物が、複数の抗原をコードする、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
ステップ（ａ）の前記抗原免疫化組成物が、複数の抗原を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記核酸分子が、ステップ（ａ）において使用される前記１つまたは複数の抗原と同じタンパク質由来の１つまたは複数の抗原をコードする、項目５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記核酸分子免疫化組成物の前記核酸分子が、ステップ（ａ）において使用される前記１つまたは複数の抗原と同じ抗原のうち１つまたは複数をコードする、項目５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）と同時に実施される、項目５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）と逐次的に実施される、項目５２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１時間から８週間後に実施される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）の１時間から８週間後に実施される、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
（ｃ）抗原免疫化組成物の第２の有効量を前記被験体に投与するステップをさらに含み、該抗原性ペプチド免疫化組成物が、（ａ）において使用される前記抗原性ペプチドと同じタンパク質に由来するペプチドを含む、項目５２〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
ステップ（ｃ）の前記抗原免疫化組成物が、（ａ）において使用される前記抗原免疫化組成物と同じである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、（ｂ）初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えるステップ、および（ｃ）項目１〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の第２の有効量、または抗原免疫化組成物の有効量を該被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目６４）
前記抗原免疫化組成物が、ステップ（ａ）の前記核酸分子によってコードされる前記抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記核酸分子免疫化組成物の前記核酸分子が、（ｃ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチドのうち１つまたは複数をコードする、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
初期免疫応答を生じるのに十分な前記時間が、ステップ（ａ）の後１時間から８週間である、項目６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
（ｄ）抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップをさらに含み、該抗原免疫化組成物が、（ｃ）において使用される前記抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む、項目６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記抗原免疫化組成物が、（ｃ）において使用される前記抗原を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記被験体がヒトである、項目５２〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
補助的療法を施すステップをさらに含む、項目３７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記補助的療法が、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの組合せである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記補助的療法がシクロホスファミドである、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
乳がんを処置する方法であって、項目２１に記載のキメラ核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目７４）
補助的療法を施すステップをさらに含む、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記補助的療法が、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの任意の組合せである、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記抗体療法が、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはその両方を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
がんを処置する方法であって、項目１〜１１および１８〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、該核酸分子によってコードされる前記１つまたは複数の抗原が、該被験体において同定された発癌性変異を有する抗原を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、例示的なＤＮＡワクチン発現ベクターを示す。Ａ）ワクチンベクターは、ＳＶ４０プロモーターによって駆動される全長のコドン最適化されたＴＡＰ１およびＴＡＰ２、ならびにＣＭＶプロモーターの制御下にあるＭＴＩ−ペプチド抗原アレイ（ＰＡＡ）を含有する。Ｂ）ＰＡＡの過剰発現は、ＭＴＩ中に見出され得る３つの非古典的翻訳開始部位（ＣＵＧ）の適用を介して達成される。これらのＣＵＧおよびＡＵＧ部位は、それぞれ核およびサイトゾル性発現を媒介し、必要に応じて変更され得る。ＰＡＡには、Ｘｂａ１部位が隣接し、種々のＰＡＡの挿入および切り出しを促進する。Ｃ）Ａ＊０２０１  ＰＡＡ中のペプチド配列が示される（配列番号２０４）。Ａ２結合ペプチドは、太字のフォントで示される。各ペプチドには、各ペプチドに対する天然のプロテアソームプロセシング部位を保持するために、ＮＨ２末端およびＣＯＯＨ末端において３〜４アミノ酸残基が隣接する。各ペプチドは、（Ｇ４Ｓ）２スペーサーによっても分離される。この特異的ＰＡＡは、対照としてのインフルエンザＭ１タンパク質、およびエピトープ発現を評価するためのＣ末端ＶＳＶＧタンパク質エピトープタグ（配列番号１４）も含む。
【００２０】
【図２】図２は、ＴＡＰ１およびＭＴＩ−ＰＡＡの免疫沈降検出を示す。Ａ）ＴＡＰ１トランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来の細胞抽出物を、ヤギ抗Ｖ５抗体（組換えＴＡＰ１上のＮＨ２末端タグ）およびプロテインＧアガロースによって免疫沈降し、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦに移し、ウサギ抗Ｖ５抗体でイムノブロットした。Ｂ）ＭＴＩ−ＰＡＡトランスフェクトされたＣＯＳ細胞由来の細胞抽出物を、ヘパリンセファロース（ＨＳ）精製し、１２％  ＰＡＧＥによって分離し、移し、ヤギ抗ＦＧＦ２抗体でイムノブロットした。
【００２１】
【図３】図３は、抗Ｖ５抗体および抗ＴＡＰ１抗体を使用した、ＣＯＳ細胞におけるＴＡＰ１の発現の免疫蛍光顕微鏡写真を示す。
【００２２】
【図４】図４は、ＭＴＩ−ＰＡＡの発現の免疫蛍光顕微鏡写真を示す。染色を、ＭＴＩ−ＰＡＡのＣ末端部分に対する抗ＶＳＶ抗体を使用して実施した。
【００２３】
【図５】図５は、プロテアソーム活性の存在下または非存在下でのＰＡＡ産物の免疫沈降検出を示す。ＨＥＫ細胞を、ｐｃＤＮＡ３ＰＡＡまたは対照でトランスフェクトした。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下での発現産物の免疫沈降は、ＭＴＩ−ＰＡＡの予測された翻訳産物の発現を示した。
【００２４】
【図６】図６は、ＰＡＡ発現標的のＴ細胞認識を示す。ペプチドワクチン接種した（＃２２、＃２５、＃２８、＃３０、ＨＢＶコアＡｇ：フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化させた）マウス由来の脾細胞を、ＴＨＰ−１細胞（柱１）、１ｕｇ／ｍ１の各ペプチド（ｐ２２、ｐ２５、ｐ２８、ｐ３０）をパルスしたＴＨＰ−１細胞（柱２）と共にインキュベートしたか、またはＭＴＩ−ＰＡＡ発現ベクターで１８時間トランスフェクトした（柱３）。
【００２５】
【図７】図７は、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定された、一連の安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞系に対するＴ細胞反応性を示す。細胞系を、記載されるようにスーパートランスフェクトした。棒の最初の対は、Ｔａｐ１を発現するクローンで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞に対応する（白色／透明棒）。これらの細胞を、天然痘ＰＡＡをコードする発現ベクターでスーパートランスフェクトした（斜線棒）。左から右に移動して、次の４対の棒は、４つの独立した、Ｔａｐ１を発現する安定にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞系を表す。各Ｔａｐ１トランスフェクトされた細胞系を、天然痘抗原性ペプチドをコードするＰｏｌｙＳｔａｒｔ（商標）−ＰＡＡでスーパートランスフェクトした。斜線付き棒は、天然痘ＰＡＡのプロテアソームプロセシングを示す、上昇したＴ細胞反応性を示す。一番右の２つの棒は、陰性対照である（透明／白色は、トランスフェクトされていない正常ＨＥＫ細胞および天然痘ペプチドのみでパルスしたＨＥＫ細胞である）。
【００２６】
【図８】図８は、２用量ワクチン接種レジメン後のＨＬＡ−Ａ２マウスにおける免疫応答を測定するＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイからの結果を示す。ペプチド応答は、無関係のペプチドを発現する標的細胞に対する応答を上回る、ペプチド免疫原を発現する標的細胞に対する応答における増加倍数（ＩＦＮγスポット形成単位で）として報告される。示された全ての応答は、ｐ１９およびｐ２５以外有意である（ｐ＜０．０５）。
【００２７】
【図９】図９は、ペプチドワクチン接種後の免疫応答を示す。ＨＬＡ−Ａ２マウスに、ＩＦＡ中に乳化させたペプチド＃２２、＃２５、＃２８で２回ワクチン接種した。免疫応答を、プールされたペプチドカクテル（ペプチド＃２２、＃２５、＃２８：各々１ｕＭ）でパルスされた（網掛け棒）またはパルスされていない（白色棒）同系脾細胞に対して測定した。
【００２８】
【図１０】図１０は、ＶＡＣＶ−ＷＲによる致死鼻腔内チャレンジ後の生存に対するペプチド−ワクチンの効果を示す。ＶＡＣＶ−ＷＲ（１×１０６ｐｆｕ）による致死鼻腔内チャレンジ後の、ワクチン接種していないマウス（破線）およびペプチドワクチン接種した（＃２２、＃２５、＃２８、＃３０）マウス（実線）についてのカプラン・マイヤー生存曲線。有意性は、ログランク検定を使用して査定した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
一部の態様では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、１つもしくは複数の抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せ（例えば、ポリ抗原アレイまたはＰＡＡ）をコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、多重翻訳配列が、１つもしくは複数の抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子を提供する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本開示は、メモリーＴ細胞の産生を生じる堅固な免疫応答を惹起するための、プライムおよびブーストまたは複数回の抗原性チャレンジのための方法を提供する。例えば、免疫応答は、（ａ）被験体を抗原性ペプチド免疫化組成物と接触させること、（ｂ）任意選択で、初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えること、（ｃ）被験体を、本明細書に記載される核酸分子免疫化組成物と接触させることによってがんまたは感染性疾患に対して惹起され、核酸分子免疫化組成物の核酸分子は、ステップ（ａ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチドのうち１つまたは複数をコードする。
【００３１】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することが、その理解のために役立ち得る。さらなる定義は、本開示を通じて示される。
【００３２】
本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合にはその一部（例えば、整数の１０分の１または１００分の１）を含む。また、任意の物理的特徴（例えば、多量体サブユニット、サイズまたは厚さ）に関して本明細書で列挙された任意の数値範囲は、特記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、特記しない限り、（１）示された範囲、値もしくは構造の±２０％；（２）値を決定するために用いられている方法についての固有の誤差の変動を含む値；または（３）反復実験間に存在する変動を含む値、を意味する。本明細書で使用する場合、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」とは、列挙された構成要素のうち「１つまたは複数」を指す。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢または列挙された構成要素のうちいずれか１つ、その両方、またはそれらの任意の組合せを意味する。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用され、これらの用語またはそれらの異形は、非限定的と解釈される意図である。
【００３３】
用語「多重翻訳リーダー配列」、「多重翻訳開始配列」または「ＭＴＩ」とは、１つの標準的ＡＴＧスタートコドンに加えて少なくとも１つの非従来型ＣＵＧスタートコドンを含む核酸分子を指す。一部の実施形態では、ＭＴＩは、１モルのｍＲＮＡ当たり１モルよりも多いタンパク質の産生を可能にする。ある特定の実施形態では、ＭＴＩ核酸分子は、（ａ）ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンと、（ｂ）ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンの上流（５’）約１２３ヌクレオチドから約３８５ヌクレオチドを含む配列とを含有するＦＧＦ２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００６．４に示されるヒトＦＧＦ２遺伝子）の５’部分に対応し、ＡＴＧスタートコドンの上流のこの部分は、１から３つの翻訳的に活性な非従来型（例えば、ＣＵＧ）スタートコドンを含む。ある特定の実施形態では、ＭＴＩは、（ｃ）ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンの下流（３’）約１５ヌクレオチド（約５アミノ酸をコードする）から約４５ヌクレオチド（約１５アミノ酸をコードする）をさらに含む。一部の実施形態では、ＭＴＩは、（ｄ）ＡＵＧスタートコドンの上流かつ少なくとも１つの非従来型ＣＵＧスタートコドンの下流に位置する少なくとも１から２つの核局在化ドメインを含む。
【００３４】
例えば、融合タンパク質（例えば、線状アレイで連結された複数の抗原ペプチド）をコードする核酸分子の上流に連結された４つのＦＧＦ２翻訳開始部位（３つの非従来型ＣＵＧスタートコドンおよび１つの標準的ＡＴＧスタートコドン）を含む多重翻訳開始配列は、１モルの転写されたｍＲＮＡ毎に４モルのマルチペプチド融合タンパク質翻訳産物を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、宿主細胞中に導入され、発現され、核酸分子は、非ＡＵＧ（例えば、ＣＵＧ）翻訳開始部位における翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ（例えば、ＣＵＧ）翻訳開始部位を含む多重翻訳リーダー配列を含有する。一部の実施形態では、ＭＴＩは、少なくとも５つの翻訳開始部位（４つの非従来型ＣＵＧスタートコドンおよび１つの標準的ＡＴＧスタートコドン）を含む。
【００３５】
非規範的翻訳開始スタート部位は、Florkiewiczら、BBRC  ４０９巻（３号）：４９４
〜４９９頁、２０１１年；Ivanovら、Nucleic  Acids  Res  ３９巻（１０号）、２０１
１年；Peabody  DS、J  Biological  Chem  ２６４巻（９号）：５０３１〜５０３５頁；Starckら、Science  ３３６巻（６０８９号）：１７１９〜２３頁、２０１２年；Hannら
、Genes  and  Dev  ６巻：１２２９〜１２４０頁、１９９２年；Touriolら、Biol  Cell
９５巻（３〜４号）：１６９〜７８頁、２００３年；Schwabら、Science  ３０１巻（
５６３８号）：１３６７〜７１頁、２００３年；Malarkannanら、Immunity  １０巻（６
号）：６８１〜９０頁によって記載されており、これらは全て、その全体が参照によって組み込まれる。ある特定の状況では、古典的ＡＵＧ媒介性の翻訳は阻害され得るが、非ＡＵＧ開始コドンからの翻訳開始は、継続し得る、またはさらには増強され得る。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」とは、調節解除された成長を示すがん細胞または前がん細胞上で優先的に発現されるタンパク質、ペプチドまたはそれらのバリアントを指す。「優先的に発現される」とは、細胞中または細胞の表面上での検出可能なレベルのタンパク質またはペプチドの発現を指し、タンパク質またはペプチドは、同じ型の正常細胞上では発現されない。好ましくは、ＴＡＡは、非がん細胞上では発現されない。例示的なＴＡＡには、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１／２、葉酸受容体−α、ＷＴ１、ＰＩ３Ｋ、ＮＹ−ＥＳ０１、ＧＮＲＨ１、ＣＴＡＧ１Ａ、ＣＥＡ、ＩＧＦＢＰ２、サイクリンＤ１およびＭＩＦが含まれる。用語「腫瘍関連抗原」、「ＴＡＡ」、「バイオマーカー」、「がんマーカー」および「マーカー」は、至る所で相互交換可能に使用される。
【００３７】
「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の親タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの断片（例えば、抗原性ペプチド）に基づくポリペプチド構成要素を含み、宿主細胞中に天然には存在しない、線状単鎖タンパク質を指す。融合タンパク質は、天然に存在しない方法で一緒に連結された２つまたはそれ超の天然に生じるアミノ酸配列を含有し得る。例えば、融合タンパク質は、細胞もしくはタンパク質において通常は見出されない方法で連結された同じタンパク質もしくはその断片（例えば、抗原性断片）由来の２つまたはそれ超の部分を有し得、または融合タンパク質は、細胞において通常は見出されない方法で連結された２、３、４、５つまたはそれ超の異なるタンパク質由来の部分（例えば、抗原性部分）を有し得る。また、融合タンパク質は、タンパク質またはその断片（例えば、抗原性断片）の同じ部分を２コピーまたはそれ超有し得る。融合タンパク質は、核酸分子によってコードされ得、ここで、１つのタンパク質またはその一部分（例えば、抗原）をコードするポリヌクレオチド配列は、１つもしくは複数のタンパク質またはその一部分（例えば、同じまたは異なる抗原）をコードする核酸分子とインフレームで追加され、この２つまたはそれ超のタンパク質またはそれらの一部分は、任意選択で、リンカー、スペーサー、切断部位、接合部アミノ酸またはそれらの組合せをコードするヌクレオチドによって分離される。本明細書の組成物の任意の１つまたは複数の抗原性ペプチドエピトープの、例えば、抗原性ペプチドを含む融合タンパク質の結合価は、その中に含有される個々の抗原性ペプチドエピトープの数を２倍化、３倍化、４倍化またはさらに拡大することによって増加され得る。
【００３８】
「スペーサー」とは、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはドメインを接続するアミノ酸配列を指し、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子と関連することが可能な個々の抗原性ペプチドへの線状抗原アレイの切断と適合性のスペーサー機能を提供し得る。スペーサーは、一次翻訳産物の混乱したコンフォメーションを増強または促進し、それによって、そのユビキチン修飾を促進することによって、抗原性ペプチドへのタンパク質分解性プロセシングを促進できる。
【００３９】
「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの２つの隣接するモチーフ、領域またはドメイン間、例えば、抗原性ペプチド間、または多重翻訳リーダー配列によってコードされる抗原性ペプチドと隣接ペプチドとの間、または抗原性ペプチドとスペーサーもしくは切断部位との間の、１つまたは複数（例えば、約２〜１０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物設計から生じ得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築の間の制限酵素部位の使用から生じるアミノ酸残基）。接合部アミノ酸は、コンピューターアルゴリズムによって、またはＨＬＡクラスＩもしくはＨＬＡクラスＩＩ拘束されたタンパク質複合体から溶出されたペプチドの質量分析解析などの他の手段によって同定されたＨＬＡクラス１またはＨＬＡクラスＩＩペプチドのＮＨ２および／またはＣＯＯＨ末端を伸長させることによって、Ｔ細胞抗原性エピトープ配列に対して真正またはネイティブの配列から誘導され得る。
【００４０】
本明細書で使用する場合、分子または化合物は、１つまたは複数のドメイン（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端における、またはドメイン間のアミノ酸）の外側の部分が、組み合わさって、分子または化合物の長さの２０％以下（例えば、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％以下）に寄与し、種々のドメインのうち１つまたは複数の活性（例えば、抗原または抗原性エピトープの免疫原性、核に局在化する能力、ポリペプチド複合体（例えば、ＨＬＡ−ペプチド複合体）を形成する能力、非ＡＵＧコドンからの翻訳開始を促進する能力）に実質的に影響を与えない（即ち、５０％超活性を変更することがない（例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下）場合、１つもしくは複数のドメイン「から本質的になる」、または（例えば、抗原、リンカーまたはスペーサー、タンパク質分解性切断部位、核局在化シグナル、多重翻訳開始配列）「から本質的になる」１つもしくは複数のドメインをコードする。ある特定の実施形態では、核酸分子は、多重翻訳リーダー配列と、１つもしくは複数の抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする配列とから本質的になり、コードされた抗原は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端において、または抗原間に、接合部アミノ酸を含み得る。ある特定の実施形態では、抗原または抗原性エピトープ間のかかる接合部アミノ酸は、抗原または抗原性エピトープがｉｎ
ｖｉｖｏで分離され、例えば、対応する哺乳動物のクラスＩもしくはクラスＩＩのＨＬＡまたはＭＨＣ分子と関連できるように、タンパク質分解性切断部位を形成する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「核酸」または「核酸分子」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって生成された断片、およびライゲーション、開裂、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用のうちいずれか１つまたは複数によって生成された断片のうちいずれかを指す。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲによって産生される。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）である単量体、またはそれらの組合せから構成され得る。改変されたヌクレオチドは、糖部分、またはピリミジンもしくはプリン塩基部分中に、あるいはそれらの代わりに、改変を有し得る。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはかかる連結の類似体によって連結され得る。ホスホジエステル連結の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）、ホスホルアミデート、モルホリノなどが含まれる。用語「核酸分子」には、ポリアミド骨格に付着した天然に存在するまたは改変された核酸塩基を含む「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）もまた含まれる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００４２】
用語「構築物」とは、組換え核酸を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在し得る、またはゲノム中に組み込まれ得る。「ベクター」は、別の核酸をトランスポートすることが可能な核酸分子である。ベクターは、例えば、染色体、非染色体、半合成または合成の核酸を含み得る、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であり得る。例示的なベクターは、自律的複製が可能なベクター（エピソームベクター）および／またはそれらが連結される核酸の発現が可能なベクター（発現ベクター）である。
【００４３】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,  J.  M.、Retroviridae:  The  viruses  and  their  replication,  In  Fundamental  Virology、第
３版、B.  N.  Fieldsら編、Lippincott-Raven  Publishers、Philadelphia、１９９６年）。
【００４４】
「レンチウイルスベクター」とは、本明細書で使用する場合、それらの比較的大きいパッケージング能、低減された免疫原性、および大きい範囲の異なる細胞型を高い効率で安定に形質導入するそれらの能力に起因して遺伝子送達に有用な、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、通常、産生株細胞中への３つまたはそれ超のプラスミド（例えば、パッケージング、エンベロープおよび移入）の一過的トランスフェクション後に生成される。ＨＩＶと同様、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に進入する。進入の際に、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のＤＮＡにおけるウイルス組込みのための基質である、二本鎖線状ウイルスＤＮＡである。
【００４５】
用語「作動可能に連結した」とは、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一核酸断片上での核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることが可能である場合、コード配列と作動可能に連結している（即ち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。「連結されていない」とは、関連した遺伝エレメントが、互いに密接には関連せず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」とは、適切な宿主における核酸分子の発現をもたらすことが可能な適切な制御配列に作動可能に連結した核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。かかる制御配列には、転写をもたらすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単純に潜在的ゲノム挿入物であり得る。ウイルスベクターは、ＤＮＡベース（例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス）、または複製コンピテントもしくはインコンピテントな腫瘍溶解性ウイルスベクター（例えば、ＶＳＶ）を含む、ＲＮＡベースであり得る。適切な宿主中に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製および機能し得、または一部の場合には、ゲノム自体の中に組み込まれ得る。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」および「ベクター」は、しばしば相互交換可能に使用される。
【００４７】
用語「発現」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。プロセスは、転写および翻訳の両方を含む。翻訳は、ＣＵＧコドンなどの非従来型スタートコドンから開始し得、または翻訳は、産生されたｍＲＮＡよりも多いタンパク質（１モル量当たりに基づく）を産生するために、いくつかのスタートコドン（標準的ＡＵＧおよび非従来型）から開始し得る。
【００４８】
用語「導入された」は、核酸配列を細胞中に挿入することに関して、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核または原核細胞中への核酸配列の取込みへの言及を含み、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアＤＮＡ）中に取り込まれ、自律的レプリコンに変換され、または一過的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「接触させる」、「細胞を接触させる」、「被験体を接触させる」またはそれらの異形とは、核酸分子または組成物と接触させることに関して、核酸分子のコードされた内容物の少なくとも一部が細胞において発現されるように、細胞中に核酸を導入することを指す。「導入された」とは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、または遺伝子銃もしくはナノ粒子などによる、核酸分子の導入のための当該分野で公知の他の方法を意味する。
【００５０】
コドン使用バイアスが異なる種の細菌にわたって観察されているので、組換えタンパク質の発現は、その元の宿主以外では非効率的であり得る（Sharpら、Nucl.  Acids.  Res.
３３巻：１１４１頁、２００５年）。それらのネイティブ宿主内での組換えタンパク質の過剰発現さえも、困難であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される宿主中に導入される核酸分子（例えば、抗原性ペプチドをコードする核酸）は、タンパク質発現が増強されることを確実にするために、宿主中への導入の前にコドン最適化に供され得る。「コドン最適化」とは、ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドを変更することなしに宿主の典型的なコドン使用を反映するための、形質転換前の、遺伝子中または核酸のコード領域中のコドンの変更を指す。異種宿主における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、以前に記載されている（例えば、Welchら、PLoS  One  ４巻：ｅ７００２頁、２００９年；Gustafssonら、Trends  Biotechnol.  ２２巻：３４６頁、２０
０４年；Wuら、Nucl.  Acids  Res.  ３５巻：Ｄ７６頁、２００７年；Villalobosら、BMC  Bioinformatics  ７巻：２８５頁、２００６年；米国特許出願公開第２０１１／０１
１１４１３号および同第２００８／０２９２９１８号を参照のこと；これらの開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、本開示の多重翻訳リーダー配列は、ヒトであり、コドン最適化されていない。コドン最適化された組換え核酸は、核酸のコドン最適化されていない部分とは結果的に別個であるコドン最適化された部分を認識するように設計されたＰＣＲプライマーの使用に基づいて、対応する内因性遺伝子から区別され得る。
【００５１】
用語「同一な」または「パーセント同一性」とは、２つもしくはそれ超のポリペプチドまたは核酸分子配列に関して、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大の対応について比較およびアラインされる場合に、配列比較アルゴリズムなどの当該分野で公知の方法を使用して、手動アラインメントによって、または視覚的検査によって測定されるように、特定された領域にわたって、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定された百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性）を有する、２つもしくはそれ超の配列または部分配列を意味する。例えば、パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切な好ましいアルゴリズムは、デフォルト値に設定されたパラメーターを用いる、Altschulら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３頁、１９９０年に記載されるＢＬＡＳＴ２．０
アルゴリズムである。
【００５２】
本明細書で使用する場合、ＴＡＰ（抗原プロセシング関連トランスポーター）とは、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２タンパク質を含むヘテロ二量体を指す。ＴＡＰのヘテロ二量体は、小胞体（ＥＲ）中に位置し、この場所で、選択されたペプチドをサイトゾルからＥＲの内腔中に移動させるように機能し、ＥＲの内腔で、ペプチドは、ＨＬＡクラスＩタンパク質に結合する。別の細胞内ＴＡＰタンパク質は、エンドソームおよびリソソームなどの細胞内小胞性区画に局在化したＴＡＰＬ（抗原プロセシング関連トランスポーター様タンパク質）である。ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＴＡＰＬは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーのメンバーである。しかし、ＥＲ局在化ＴＡＰ１／２ヘテロ二量体とは異なり、ＴＡＰＬは、ホモ二量体として機能する。ＴＡＰの例には、ＴＡＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０００５９３．５）、ＴＡＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０００５４４．３）およびＴＡＰＬ（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ＿０１９６２４．３）が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「変異」とは、それぞれ、参照または野生型の核酸分子またはポリペプチド分子と比較した、核酸分子またはポリペプチド分子の配列における変化を指す。変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入または欠失を含む、配列におけるいくつかの異なる型の変化を生じ得る。他の実施形態では、変異は、１つまたは複数のヌクレオチドまたは残基の置換である。ある特定の実施形態では、変更または変異されたタンパク質またはポリペプチドは、参照分子と比較して、保存的アミノ酸置換だけを含有する。ある特定の他の実施形態では、変更または変異されたタンパク質またはポリペプチドは、参照分子と比較して、非保存的アミノ酸置換だけを含有する。さらに他の実施形態では、変更または変異されたタンパク質またはポリペプチドは、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方を含有する。これらの実施形態のいずれかでは、変更または変異は、タンパク質またはペプチドの抗原性エピトープを変更も排除もせず、変更または変異されたペプチドは、その同族ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子によってなおも認識される。
【００５４】
「保存的置換」は、当該分野で、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換として認識される。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３、１０頁、１９９７年３月１３日公開；Lehninger、Biochemistry、
第２版；Worth  Publishers,  Inc.  NY:NY（１９７５年）、７１〜７７頁；Lewin、Genes  IV、Oxford  University  Press、NYおよびCell  Press、  Cambridge、MA（１９９０年）、８頁を参照のこと）。ある特定の実施形態では、保存的置換には、例えば、ロイシンからセリンへの置換が含まれる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「組換え」または「非天然の」とは、少なくとも１つの操作された遺伝子変更を有するか、もしくは異種核酸分子の導入によって改変された、生物、微生物、細胞、核酸分子もしくはベクターを指し、または内因性の核酸分子もしくは遺伝子の発現を制御できるように変更された細胞を指す。組換えとは、非天然の細胞に由来する細胞、または１つもしくは複数のかかる改変を有する非天然の細胞の子孫である細胞もまた指す。遺伝子変更には、例えば、タンパク質をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、もしくは細胞の遺伝子材料の他の機能的変更が含まれる。例えば、組換え細胞は、ネイティブ（野生型）細胞内で同一もしくは相同な形態では見出されない遺伝子もしくは他の核酸分子を発現し得る（例えば、融合またはキメラタンパク質）、または過剰発現された、過小発現された、最小に発現された、もしくは全く発現されていないなどの、変更された発現パターンの内因性遺伝子を提供し得る。
【００５６】
細胞における外因性または異種核酸の発現のための組換え方法は、当該分野で周知である。かかる方法は、例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York（２００１年）；およびAusubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons、Baltimore、MD（１９９９年）中に記載されて見出され得る。発現される例示的な外因性タンパ
ク質または酵素には、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、抗原、サイトカインまたはそれらの任意の組合せが含まれる。融合タンパク質をコードする核酸分子への遺伝子改変は、その天然に存在する状態から変更されている組換えまたは非天然の細胞に、生化学的または代謝的能力を付与し得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「内因性」または「ネイティブ」とは、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物または活性を指す。用語「相同な」または「ホモログ」とは、宿主もしくは宿主細胞中に見出されるまたはそれらに由来するものと同じまたは類似の分子または活性である、外因性（非ネイティブ）供給源由来の分子または活性を指す。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「異種」核酸分子、構築物または配列とは、それが発現される細胞にとってネイティブではない核酸分子もしくは核酸分子配列の部分、変更もしくは変異されている宿主細胞にとってネイティブの核酸分子もしくは核酸分子の部分、または類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して変更された発現を有する核酸分子を指す。例えば、異種制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）は、天然または培養物中で通常発現される遺伝子または核酸分子とは異なる方法で、遺伝子または核酸分子の発現を調節するために使用され得る。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、ネイティブ宿主細胞遺伝子と相同であり得るが、変更された発現レベルを有し得る、もしくは異なる配列を有し得る、またはその両方であり得る。他の実施形態では、異種または外因性の核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムにとって内因性でなくてもよいが（例えば、融合タンパク質）、その代り、形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）によって宿主細胞中に導入されていてもよく、ここで、追加された分子は、宿主ゲノム中に組み込まれ得、または一過的に（例えば、ｍＲＮＡ）もしくは１つよりも多い世代にわたって半安定的に（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミドまたは他の自己複製性ベクター）のいずれかで、染色体外遺伝子材料として存在し得る。
【００５９】
ある特定の実施形態では、１つよりも多い異種または外因性核酸分子は、別々の核酸分子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一核酸分子として、またはそれらの任意の組合せとして、宿主細胞中に導入され得、なおも、１つよりも多い異種または外因性核酸とみなされる。２つまたはそれ超の外因性核酸分子が宿主細胞中に導入される場合、２つまたはそれ超の外因性核酸分子は、単一核酸分子として（例えば、単一ベクター上で）、別々のベクター上で、単一または複数のｍＲＮＡ分子として導入され得、単一の部位または複数の部位において宿主染色体中に組み込まれ得、これらの実施形態のそれぞれは、２つまたはそれ超の外因性核酸分子となおもみなされることが理解される。従って、言及された異種核酸分子またはタンパク質活性の数とは、宿主細胞中に導入された別々の核酸分子の数ではなく、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。
【００６０】
例えば、細胞は、本明細書に開示されるように、１つまたは複数の融合タンパク質をコードする、同じまたは異なり得る２つまたはそれ超の異種または外因性核酸分子を発現するように改変され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子および第２の融合タンパク質をコードする別の第２の核酸分子を含有するか、または宿主細胞は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質をコードする単一のポリシストロニック核酸分子、または第１の融合タンパク質、切断可能なアミノ酸配列（例えば、トリプシン、ペプシン、プロテアソーム部位）もしくは自己切断性アミノ酸配列（例えば、２Ａタンパク質）および第２の融合タンパク質をコードする単一の核酸分子を含有する。
【００６１】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と一緒に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することを一般に担う、Ｔ細胞の表面上で見出される分子である。ＴＣＲは、ほとんどのＴ細胞において、高度に可変性のα鎖およびβ鎖のジスルフィド連結されたヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞では、可変性のγ鎖およびδ鎖で構成された代替的受容体が発現される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのアミノ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質尾部を保有する（AbbasおよびLichtman、Cellular  and  Molecular  Immunology（第５版）、Saunders編、Philadelphia、２００３年；Janewayら、Immunobiology:  The  Immune  System  in  Health  and  Disease、第４版、Current  Biology  Publications、１４８頁、１４９頁および１７２
頁、１９９９年を参照のこと）。
【００６２】
ＨＬＡクラスＩ結合性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原性ペプチドが結合した細胞表面局在化ＨＬＡ（ＭＨＣとしても公知）間の相互作用を介して、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を死滅させるＴ細胞である。ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドエピトープを提示する細胞は、抗原提示細胞と呼ばれる。
【００６３】
ＨＬＡクラスＩＩ提示は、ペプチド抗原が、細胞表面上に既に存在する、またはエンドソームもしくはリソソームなどのある特定の細胞内小胞中に存在するＨＬＡクラスＩＩ複合体に結合しているという点で、ＨＬＡクラスＩとは異なる。従って、クラスＩＩ抗原提示は、ＴＡＰの活性を先験的に必要としない。しかし、エンドソームまたはリソソームなどのある特定の細胞内小胞に局在化して見出される、ＴＡＰＬと呼ばれるタンパク質は、サイトゾル局在化クラスＩＩペプチドを認識するように機能し、結果的に、次いで細胞表面上に戻し輸送するクラスＩＩ  ＨＬＡを含有する細胞内小胞中に、サイトゾルから１２〜１８アミノ酸のペプチドを移入させ得、細胞表面で、クラスＩＩ  ＨＬＡは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団と相互作用し、結果的に集団を拡大させ得る。細胞表面局在化ＨＬＡクラスＩＩペプチド複合体を認識した宿主のＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と呼ばれ、これらは、一そろいのＣＤ８＋サイトカインの放出によって媒介されるＣＤ８＋キラーＴ細胞の機能を保存することを主に担う。
【００６４】
用語「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、特異的抗原を発現する細胞に対する、Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を指す。一部の実施形態では、Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはそれらの組合せである。
【００６５】
用語「抗原」、「抗原性ペプチド」またはそれらのバリアントとは、細胞性免疫応答を刺激できるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、抗原は、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩペプチド、またははめ込まれたＨＬＡクラスＩペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩペプチドである。
【００６６】
用語「免疫化組成物」とは、免疫応答を刺激または惹起できる組成物を指す。好ましくは、免疫応答は、細胞性免疫応答、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）によって媒介される獲得免疫応答である。一部の実施形態では、免疫化組成物は、医薬品製剤である。さらなる実施形態では、免疫化組成物は、抗原性ペプチド免疫化組成物、核酸免疫化組成物、細胞免疫化組成物またはそれらの組合せである。
【００６７】
用語「抗原免疫化組成物」または「ペプチド免疫化組成物」とは、細胞性免疫応答を促進または刺激することが可能な１つまたは複数の抗原を含む免疫化組成物を指す。一部の実施形態では、抗原免疫化組成物は、ＨＬＡクラスＩペプチド、ＨＬＡクラスＩＩペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩペプチド、またはそれらの組合せを含む。
【００６８】
用語「核酸免疫化組成物」とは、１つまたは複数の抗原または抗原性エピトープをコードし、ベクター（例えば、プラスミド、ウイルス）中に含有され得る核酸分子を含む、免疫化組成物を指す。核酸免疫化組成物は、被験体における１つまたは複数の抗原性ペプチドの発現のために、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞中に導入され得る。ある特定の実施形態では、核酸免疫化組成物は、ＨＬＡクラスＩペプチド、ＨＬＡクラスＩＩペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩペプチド、またはそれらの組合せをコードする。
【００６９】
用語「核酸分子免疫化」または「ＤＮＡ免疫化」とは、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の抗原をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させるために宿主または宿主細胞中に導入される、１つまたは複数の抗原をコードする核酸分子を指す。核酸分子免疫化は、例えば、標準的注射（例えば、筋内、皮内）、経皮粒子送達、吸入、局所、経口、鼻腔内または粘膜による、宿主中への直接投与によるものであり得る。あるいは、核酸分子は、宿主細胞（例えば、宿主細胞、または宿主とＨＬＡが合致したドナー由来の細胞）中にｅｘ  ｖｉｖｏで導入され得、トランスフェクトされた宿主細胞は宿主中に投与され得、その結果、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の抗原に対して、免疫応答が開始され得る。
【００７０】
用語「核酸分子ワクチン」または「ＤＮＡワクチン」とは、本明細書で使用する場合、本明細書に定義される核酸分子免疫化において使用される１つまたは複数の抗原または抗原性エピトープをコードする核酸分子を指す。
【００７１】
「処置」、「処置する」または「寛解させる」とは、治療的、予防的／防止的またはそれらの組合せ処置であり得る、被験体（例えば、患者）の疾患、障害または状態の医療的管理を指す。処置は、疾患の少なくとも１つの症状の重症度を改善もしくは減少させ、疾患の悪化もしくは進行を遅延させ、またはさらなる関連疾患の発病を遅延もしくは予防し得る。「疾患を発症するリスクを低減させる」とは、疾患（例えば、がん）の発病または疾患の１つもしくは複数の症状の再発を予防または遅延させることを指す。
【００７２】
化合物または組成物の「治療有効量（または用量）」または「有効量（または用量）」とは、統計的に有意な様式で、処置されている疾患の１つまたは複数の症状の寛解を生じるのに十分な化合物の量を指す。正確な量は、多数の因子、例えば、組成物の活性、用いられる送達の方法、組成物の免疫刺激能、意図した患者および患者考慮事項などに依存し、当業者によって容易に決定され得る。
【００７３】
治療効果は、疾患の１つまたは複数の症状の直接的または間接的な低減（例えば、腫瘍量における低減または病原体負荷における低減）を含み得る。治療効果は、細胞性免疫応答の直接的または間接的な刺激もまた含み得る。
【００７４】
「合致した」ワクチン接種戦略は、ペプチドワクチンおよびＤＮＡワクチンが被験体に投与される戦略であり、このとき、ペプチドワクチンのペプチドおよびＤＮＡワクチンによってコードされるペプチドは、同じタンパク質（例えば、同じがん関連ＴＡＡまたは病原体由来抗原）に由来する。一部の実施形態では、ペプチドワクチンのペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原である。一部の実施形態では、ＤＮＡワクチンによってコードされるペプチドは、ＨＬＡクラスＩペプチドである。合致したワクチン接種戦略は、プライムおよびブーストとして、それぞれの組成物を投与するステップを含み得る。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「プライムおよびブースト」または「免疫原性チャレンジ」とは、逐次的にもしくは同時に、一連のペプチドワクチンのうち１つもしくは複数を送達し、その後、一連のＤＮＡワクチン中の１つもしくは複数を送達すること、または代替法では、逐次的にもしくは同時に、一連のＤＮＡワクチンのうち１つもしくは複数を送達し、その後、一連のペプチドワクチン中の１つもしくは複数を送達することを指す。
【００７６】
がん細胞は、不適切な発現または過剰発現のいずれかによって、ある特定のポリペプチドを異常に発現し得る。このように、不適切に発現されたポリペプチドは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として同定されている。しかし、腫瘍関連抗原は、機能的に非免疫原性であり得るか、または非有効的にもしくは弱く免疫原性である。これは、免疫寛容と呼ばれ得る。本開示の組成物および方法は、がん細胞を死滅させるまたは病原体感染細胞を死滅させるのにより有効に機能することが可能であるように、患者の免疫系を増強またはさらに刺激するように設計される。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「被験体」は、細胞性免疫応答を発達させることが可能な任意の生物、例えば、ヒト、ペット、家畜、見世物動物、動物園標本または他の動物であり得る。例えば、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどであり得る。本明細書に記載される治療剤の投与を必要とする被験体には、がんまたは感染性疾患を発症する高いリスクにある被験体、ならびに既存のがんまたは感染性疾患を示している被験体が含まれる。被験体が、発癌物質もしくは放射線への曝露などの傷害を経験している、またはＢＲＣＡ１／２、葉酸受容体−αもしくはｐ５３遺伝子における変異などの遺伝的素因を有する場合、被験体は、がんを発症する高いリスクにあり得る。感染性疾患もしくはがんに罹患しているまたはそれらを有すると疑われる被験体は、本明細書に記載される、当該分野で公知の方法を使用して同定され得る。
【００７８】
「必要とする被験体」とは、本明細書に提供される化合物またはその組成物による処置または寛解に従順な疾患、障害もしくは状態の高いリスクにある被験体またはそれらに罹患している被験体を指す。ある特定の実施形態では、必要とする被験体は、ヒトである。
【００７９】
従って、一部の実施形態では、本開示の組成物は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含む、キメラ核酸分子であって、ＭＴＩが、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子を提供する。
【００８０】
本明細書に記載される核酸ベースのプラスミドまたはウイルス送達系は、真核細胞翻訳構成要素によって認識される転写されたｍＲＮＡを提供し、これは、第１のまたは適切な翻訳開始コドンにおいて生じる翻訳の開始の後に、タンパク質へと翻訳される。翻訳開始の規範的メカニズムは、ＡＵＧコドンにおいて始まる。しかし、本明細書で使用する場合、翻訳開始は、非ＡＵＧコドン、例えばＣＵＧコドンにおいても始まり得る。ＦＧＦ２をコードするヒト遺伝子は、１つのＡＵＧコドンに加えて３つのＣＵＧスタートコドンを介して媒介される翻訳を有する遺伝子の一例である。一部の実施形態では、本明細書に示されるＭＴＩ核酸分子は、遺伝子／ｍＲＮＡのＦＧＦ２の複数の翻訳開始ドメインの一部分を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、キメラ核酸分子のＭＴＩは、ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンと、ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンの上流（５’）約１２３ヌクレオチドから約３８５ヌクレオチドを含む配列とを含有するＦＧＦ２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００６．４に示されるヒトＦＧＦ２遺伝子）の５’部分に対応し、ＡＴＧスタートコドンの上流のこの部分は、１から３つの翻訳的に活性な非従来型（例えば、ＣＵＧ）スタートコドンを含む。ある特定の実施形態では、ＭＴＩは、ＦＧＦ２のＡＴＧスタートコドンの下流（３’）約１５ヌクレオチド（約５アミノ酸をコードする）から約４５ヌクレオチド（約１５アミノ酸をコードする）をさらに含む。一部の実施形態では、ＭＴＩは、ＡＵＧスタートコドンの上流かつ少なくとも１つの非従来型ＣＵＧスタートコドンの下流に位置する少なくとも１から２つの核局在化ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質（例えば、線状アレイで連結された複数の抗原ペプチド）をコードする核酸分子の上流に連結された４つのＦＧＦ２翻訳開始部位（３つの非従来型ＣＵＧスタートコドンおよび１つの標準的ＡＴＧスタートコドン）を含むＭＴＩ配列は、１モルの転写されたｍＲＮＡ毎に４モルのマルチペプチド融合タンパク質翻訳産物を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、宿主細胞中に導入され、発現され、核酸分子は、非ＡＵＧ（例えば、ＣＵＧ）翻訳開始部位における翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ（例えば、ＣＵＧ）翻訳開始部位を含む多重翻訳リーダー配列を含有する。一部の実施形態では、ＭＴＩ配列は、配列番号１〜６、９５または９６のうちいずれか１つに示される配列を有する核酸分子である。ある特定の実施形態では、ＭＴＩ配列は、配列番号１〜６のうちいずれか１つに示される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸分子である。
【００８２】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、複数のクラスＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡ）抗原性ペプチド、複数のクラスＩＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡ）抗原性ペプチドまたはそれらの組合せを含む。さらなる実施形態では、複数のＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ抗原性ペプチド、クラスＩＩ抗原性ペプチドまたはそれらの組合せは、線状単鎖ポリペプチド抗原アレイとして発現され、各抗原は、スペーサー、切断可能な部位（例えば、酵素認識部位または自己切断性）またはその両方によって隣接抗原から分離されており、ポリペプチド抗原アレイは、細胞性機構（例えば、プロテアソームまたは核プロテアソーム）によって、それらの同族ＭＨＣ分子と複合体を形成することが可能な個々の抗原ペプチドへとプロセシングされる。
【００８３】
本明細書に示される開示によれば、翻訳されたポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、ユビキチン部分の付加によって細胞内で修飾されている、または次いで修飾され得る、線状ペプチド抗原アレイ（ＰＡＡ）を含む。ユビキチン修飾されたＰＡＡは、プロテアソームによって認識され、その作用を介してタンパク質分解によりプロセシングされる。タンパク質分解性プロセシングの結果は、ＴＡＰと呼ばれる細胞内ＥＲ局在化タンパク質によって次いで認識される、およそ８〜１２アミノ酸長の小さいペプチドである。
【００８４】
従って、一部の実施形態では、キメラ核酸分子には、本明細書でポリ抗原アレイ（ＰＡＡ）と呼ばれる、１つもしくは複数の抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せ（集合的に抗原と呼ばれる）をコードする核酸分子が含まれる。一部の実施形態では、ＰＡＡは、同じタンパク質由来の１つまたは複数の抗原をコードする。他の実施形態では、ＰＡＡは、１つよりも多いタンパク質由来の１つまたは複数の抗原をコードする（即ち、キメラポリペプチドを含む）。例えば、ＰＡＡは、葉酸受容体−α由来の１つまたは複数の抗原およびＨｅｒ２／ｎｅｕ由来の１つまたは複数の抗原をコードし得る。一部の実施形態では、核酸分子は、約２から約２０、約２から約１５、約２から約１０、約２から約９、約２から約８の範囲の複数の抗原をコードし、または核酸分子は、２、４、５、６、７または８つの抗原をコードする。
【００８５】
一部の実施形態では、ＰＡＡは、複数の抗原のうち２つまたはそれ超がスペーサーによって分離されている、複数の抗原をコードする。ある特定の実施形態では、スペーサーは、約２から約３５アミノ酸または約５から約２５アミノ酸または約８から約２０アミノ酸または約１０から約１５アミノ酸から構成される。一部の実施形態では、スペーサーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリピートなどの特定の配列を有し得、ｎは、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３などの整数である。特定の実施形態では、スペーサーは、（Ｇ４Ｓ）２ペプチドである。
【００８６】
一部の実施形態では、キメラ核酸は、複数の抗原のうち２つまたはそれ超が切断部位によって分離されている、ＰＡＡをコードする。ある特定の実施形態では、切断部位は、参照タンパク質中に見出される抗原性ペプチドに対してアミノ末端側の約２から約２０アミノ酸、参照タンパク質中に見出される抗原性ペプチドに対してカルボキシ末端側の約２から約２０アミノ酸、自己切断性アミノ酸配列、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、切断部位は、抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端において、約２から約１５、約２から約１０または約２から約５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、切断部位は、ブタテッショウウイルス−１由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）またはそれらの任意の組合せを含む自己切断性アミノ酸配列である（例えば、Kimら、PLOS  One  ６巻：ｅ１８５５６頁、２０１１年を参照のこと、その２Ａの核酸およびアミノ酸配列は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
一部の実施形態では、抗原または抗原性エピトープは、ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、抗原または抗原性エピトープは、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを含むＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチドである。「はめ込まれた抗原」は、より大きい抗原性配列またはエピトープ内に含有された抗原性配列またはエピトープである。例えば、抗原性ＨＬＡクラスＩＩペプチド抗原に対応する配列は、その中に、ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを代表する配列を含有し得る。一部の実施形態では、伸長された抗原性ペプチド配列は、複数の重複する（即ち、はめ込まれた）抗原を含有し得る。
【００８８】
がん細胞は、１つまたは複数のマーカータンパク質または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のｄｅ  ｎｏｖｏ発現によって、正常細胞から区別され得る。マーカータンパク質またはＴＡＡは、１つまたは複数の抗原性ペプチドを含み得る。例えば、抗原性ペプチドは、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ拘束された抗原性ペプチドエピトープのいずれかを表し得る。ＴＡＡもしくはがんマーカータンパク質またはそれらの抗原性ペプチドは、患者の免疫系による破壊のために、望ましくないがん細胞を標的化する免疫応答（例えば、細胞性免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を惹起することが可能なワクチン組成物において使用され得る。
【００８９】
一部の実施形態では、抗原または抗原性エピトープは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。本明細書に開示されるＰＡＡの抗原性ペプチドは、１つまたは複数のＴＡＡに由来し得る。ＴＡＡは、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、炎症性乳がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、結腸がん、原発性腹膜がん、精巣がん、腎がん、黒色腫、神経膠芽腫、肺がんまたは前立腺がんと関連する抗原であり得る。ある特定の実施形態では、ＴＡＡ由来の抗原性Ｔ細胞エピトープ（クラスＩまたはクラスＩＩのいずれか）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、葉酸受容体アルファ、サイクリンＤ１、ＩＧＦＢＰ２、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、黒色腫関連ｇｐ１００ならびにＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３、精巣がん抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１）、がん／精巣抗原１Ａ（ＣＴＡＧ１Ａ）、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＩ３Ｋ、ＢＲＡＦ、インスリン様増殖因子結合タンパク質２またはＰＤ−１アンタゴニスト由来である。一部の実施形態では、ＰＡＡは、本明細書で使用する場合、１つよりも多いＴＡＡ由来のＴ細胞抗原性エピトープの組合せ（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよび葉酸受容体アルファの抗原性Ｔ細胞エピトープの組合せ）である。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、葉酸受容体−α抗原またはそれらの組合せを含む。例示的な葉酸受容体−α抗原性ペプチドは、米国特許第８，４８６，４１２号に示されており、そのペプチドは、参照によって本明細書に組み込まれる。例示的なＨＥＲ２／ｎｅｕ、サイクリンＤ１、ＩＧＦＢＰ２およびＣＥＡの抗原性ペプチドは、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６４０号の表ＩおよびＩＩに記載されており、その抗原性ペプチドは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９０】
ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号１１７〜１３５に示される、ＨＥＲ２に由来するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号６９〜９３に示される、葉酸受容体−αに由来するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。従って、一部の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号６９〜９３もしくは１１７〜１３５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号９７、９８、１３６のうちいずれか１つ、またはそれらの任意の組合せに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、この核酸分子は、配列番号６７、６８、１１５、１１６のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する抗原をコードする。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５２、５７、５８、１００、１３７、１３９、１４１、１４５または１４９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号１０３〜１１２に示されるＩＧＦＢ２に由来するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号１８６〜２０２に示されるＣＥＡに由来するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号１５２〜１８３に示されるサイクリンＤ１に由来するアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する。ある特定の実施形態では、ＴＡＡは、配列番号６９〜９３、１０３〜１１２、１１７〜１３５、１５２〜１８３、１８６〜２０２のうちいずれか１つに示される配列、またはそれらの任意の組合せに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。本明細書で指摘されるように、抗原性Ｔ細胞エピトープは、患者の試料を使用して同定され得る。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本開示は、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、２から約１０のヒト葉酸受容体−アルファ（ＦＲα）抗原性ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、ＭＴＩが、融合タンパク質の翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含み、１モルのｍＲＮＡ当たり１モルよりも多い融合タンパク質の産生を可能にする、キメラ核酸分子を提供する。一部の実施形態では、ＭＴＩ配列は、配列番号１〜６、９５または９６のうちいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、２から約５つの抗原性ペプチドを含む、または５つの抗原性ペプチドを含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質のＦＲα抗原性ペプチドのうち２つまたはそれ超は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含むスペーサーによって分離されており、ｎは、１から５の整数である。さらなる実施形態では、融合タンパク質のＦＲα抗原性ペプチドのうち２つまたはそれ超は、約２から約１０アミノ酸を含む天然の切断部位、自己切断性アミノ酸配列またはそれらの組合せによって分離されている。さらなる実施形態では、融合タンパク質の各ＦＲα抗原性ペプチドは、配列番号６９〜９３のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、コードされた融合タンパク質は、配列番号４９、６７または６８に示されるポリペプチドのうちいずれか１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、コードされた融合タンパク質は、配列番号５３〜５５または５９〜６１に示されるポリペプチドのうちいずれか１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、ＦＲα抗原性ペプチドのうち１つまたは複数は、ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを含むＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、またはそれらの任意の組合せである。
【００９２】
ある特定の態様では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、キメラ核酸分子の治療有効量をヒト被験体に投与するステップを含み、キメラ核酸分子が、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、２から約１０のヒト葉酸受容体−アルファ（ＦＲα）抗原性ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子とを含み、ＭＴＩが、融合タンパク質の翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含み、１モルのｍＲＮＡ当たり１モルよりも多い融合タンパク質の産生を可能にし、それによって、細胞性免疫応答を惹起する、方法を提供する。さらなる実施形態では、ＭＴＩ配列は、配列番号１〜６、９５または９６のうちいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、融合タンパク質の各ＦＲα抗原性ペプチドは、配列番号６９〜９３のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、コードされた融合タンパク質は、配列番号４９、６７または６８に示されるポリペプチドのうちいずれか１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、コードされた融合タンパク質は、配列番号５３〜５５または５９〜６１に示されるポリペプチドのうちいずれか１つと、少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、キメラ核酸分子は、治療的に許容される担体または賦形剤を含む組成物として製剤化される。さらなる実施形態では、方法は、投与前にｅｘ  ｖｉｖｏでキメラ核酸分子を免疫細胞と接触させるステップ、およびキメラ核酸分子を含有する免疫細胞の集団をヒト被験体に投与するステップを含む。さらなる実施形態では、惹起された免疫応答は、ＦＲα関連がんを処置する。
【００９３】
他の態様では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＦＲα抗原性ペプチドを含む抗原性ペプチド免疫化組成物の有効量をヒト被験体に投与するステップ、および（ｂ）キメラ核酸分子の有効量をヒト被験体に投与するステップを含み、キメラ核酸分子が、多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、２から約１０のヒト葉酸受容体−アルファ（ＦＲα）抗原性ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子とを含み、ＭＴＩが、融合タンパク質の翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含み、１モルのｍＲＮＡ当たり１モルよりも多い融合タンパク質の産生を可能にし、それによって、細胞性免疫応答を惹起する、方法を提供する。さらなる実施形態では、キメラ核酸分子は、ステップ（ａ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチドのうち１つまたは複数をコードする。さらなる実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）と同時に実施され、またはステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の１時間から８週間後に実施され、またはステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の１時間から８週間後に実施される。さらなる実施形態では、方法は、（ｃ）第２の抗原性ペプチド免疫化組成物の有効量をヒト被験体に投与するステップをさらに含み、第２の抗原性ペプチド免疫化組成物は、ステップ（ａ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチド免疫化組成物を含む。さらなる実施形態では、方法は、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法、免疫抑制療法またはそれらの任意の組合せ、例えば、シクロホスファミド、トラスツズマブ、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４またはそれらの任意の組合せから選択される補助的療法を施すステップをさらに含む。さらなる実施形態では、惹起された免疫応答は、ＦＲα関連がんを処置する。
【００９４】
従って、本明細書に開示される組成物および方法を使用して処置され得るがんには、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、炎症性乳がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、結腸がん、原発性腹膜がん、精巣がん、腎がん、黒色腫、神経膠芽腫、肺がんまたは前立腺がんが含まれる。
【００９５】
生物学的病原体に対する有効な対策は、生物テロ防御および国家安全保障の重要な構成要素であり（Altmann、Expert  Rev  Vaccines  ４巻、２７５〜２７９頁、２００５年）、さらななる製品は、生物テロ防御上の要求を満たす必要がある（Matheny,J.、Mair,  M.およびSmith,  B..Nat  Biotechnol  ２６巻、９８１〜９８３頁、２００８年；Cohen,
J..  Science  ３３３巻、１２１６〜１２１８頁、２０１１年；Artenstein,  A.  W.
およびGrabenstein,  J.  D.  Expert  Rev  Vaccines  ７巻、１２２５〜１２３７頁、
２００８年）。ワクチンは、予防的または治療的対策を提供するだけでなく、生物テロリズムの主要な成果を打ち消すために迅速に配備され得、それによって、生物兵器を使用する動機付けを取り除くことができるという点で、実際の抑止力としても機能し得る（Polandら、Vaccine  ２７巻、Ｄ２３〜Ｄ２７頁、２００９年）。
【００９６】
本明細書に記載される核酸分子を取り込むワクチン組成物について、所望の最終結果は、最小の副作用で持続的な防御免疫を誘導することが可能な安全な製品であり、他の戦略（例えば、全体生病原体または弱毒化病原体）と比較して、製造に費用がかからず、全体または弱毒化ウイルスワクチン組成物の使用と別の方法で（典型的には）関連付けられてきた禁忌を最小化または排除し、核酸および／または合成ペプチドベースであるために、延長された保存期間を有する。感染性疾患緊急事態（天然の大流行、パンデミックまたはバイオテロ）に迅速に応答する能力は、生物テロ防御またはがん免疫療法またはテクノロジーのいずれに関してであれ、本明細書に開示される実施形態の有効な使用の利益である。本開示は、ペプチドベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンのための適切な病原体関連またはがん関連の抗原性エピトープの迅速な同定および選択を示し、複数のカテゴリーＡ〜Ｃの薬剤、ならびに新たなおよび新興の病原体に、容易に適応可能である。
【００９７】
他の実施形態では、キメラ核酸分子は、病原体由来の抗原または抗原性エピトープをコードする。ある特定の実施形態では、病原体は、ウイルス、寄生生物または細菌である。さらなる実施形態では、キメラ核酸分子は、１つまたは複数の病原体由来のＰＡＡをコードする。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ＰＡＡは、ウイルス由来の抗原を含み、ウイルスは、天然痘ウイルスおよび他の関連のポックスウイルス、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、アレナウイルス、例えば、フニン、マチュポ、グアナリト、チャパレ、ラッサおよびルジョ、ブニヤウイルス、例えば、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルスおよびクリミア・コンゴ出血熱ウイルス、フラビウイルス（Flavirus）、例えば、デング熱ウイルス；フィロウイルス、例えば、エボラおよびマールブルグウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、レオウイルス、パポバウイルス（papovarius）、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群ウイルスまたはスプーマウイルスである。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザ株Ｈ７Ｎ９（鳥インフルエンザ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ８、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ１またはそれらの組合せである。
【００９９】
他の実施形態では、ＰＡＡは、細菌由来の抗原を含む。ある特定の実施形態では、細菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである。病原性Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｅ．ｃｏｌｉ株０１５７：Ｈ７、ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＡＥＣまたはそれらの組合せであり得る。
【０１００】
ある特定の実施形態では、ＰＡＡは、寄生生物由来の抗原を含む。一部の実施形態では、寄生生物は、原生動物、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｇｉａｒｄｉａ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｂａｂｅｓｉａ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ  ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、ＣｙｃｌｏｓｐｏｒａもしくはＮａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ、寄生虫、例えば、ギニア虫（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ）、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、蟯虫、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ、ギニア虫、鉤虫、サナダムシもしくは鞭虫、または寄生性吸虫、例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａもしくはＴｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ  ｒｅｇｅｎｔである。
【０１０１】
本明細書に開示される実施形態のいずれかでは、抗原をコードする核酸配列は、適切な被験体（例えば、ヒト）における発現のために、コドン最適化され得る。ある特定の実施形態では、天然痘核酸配列は、配列番号２４〜３０に示される抗原またはそれらの任意の組合せをコードする天然痘ＭＴＩ−ＰＡＡを含む。一部の実施形態では、天然痘ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする核酸配列は、配列番号７に示される配列に対応する。さらなる実施形態では、天然痘ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする核酸配列は、配列番号７に示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列に対応する。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、多重翻訳リーダー配列部分（またはＰｏｌｙＳｔａｒｔ（商標））を含有する核酸ベクターは、ＴＡＰタンパク質をコードする核酸配列もまた含有し得る。コードされたＴＡＰは、ヘテロ二量体（ＴＡＰ１＋ＴＡＰ２）またはＴＡＰ１のみまたはＴＡＰ２のみとしてであり得る。ＴＡＰは、内因性ＴＡＰから区別できるように、コドン最適化され得る。さらに、ＴＡＰ翻訳産物は、ペプチドタグ検出部分／部分、例えば、ＶＳＶ  Ｇタンパク質エピトープタグ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタグまたは任意の他の検出部分を取り込み得る。
【０１０３】
従って、ＭＴＩ−ＰＡＡに加えて、本明細書に開示されるキメラ核酸分子は、ＴＡＰタンパク質をコードする核酸分子をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＴＡＰタンパク質は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＬまたはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、ＴＡＰタンパク質は、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２のヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ＴＡＰタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２０６〜２１０のうちいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組合せを有する。
【０１０４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるキメラ核酸は、核酸ベクター中に含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターの例には、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドであり、ｐｃＤＮＡ３、ｐＳＧ５、ｐＪ６０３またはｐＣＭＶを含む。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群ウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルスから選択されるウイルスベクターである。本開示の核酸分子を取り込むウイルスベクターの場合、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ワクシニア、アデノウイルス）またはＲＮＡウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）であり得る。ある特定の実施形態では、ウイルスは、腫瘍溶解性である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本開示の多重ベクターは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結した、ＭＴＩ−ＰＡＡ融合物をコードする核酸分子を有し、融合タンパク質は、カルボキシ末端ＶＳＶ−ｇエピトープタグ（配列番号１３）を含有する。さらなる実施形態では、本開示の多重ベクターは、ＳＶ４０プロモーターによって発現されるＴａｐ１遺伝子を含み、ＴＡＰ１は、アミノ末端Ｖ５エピトープタグ（配列番号１４）を含むが、ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする核酸は、ＣＭＶプロモーターおよびカルボキシ末端ＶＳＶ−ｇエピトープタグ（配列番号１３）に作動可能に連結する。なおさらなる実施形態では、本開示の多重ベクターは、ＳＶ４０プロモーターによって発現されるＴａｐ２遺伝子を含み、ＴＡＰ２は、アミノ末端ＡＵ５エピトープタグ（配列番号１５）を含むが、ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする核酸分子は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結し、ＰＡＡは、カルボキシ末端ＶＳＶ−ｇエピトープタグ（配列番号１３）を含んだ。なおさらなる実施形態では、本開示の多重ベクターは、ＩＲＥＳによって分離された、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結したＴａｐ１およびＴａｐ２遺伝子を含み、ＴＡＰ１は、アミノ末端Ｖ５エピトープタグ（配列番号１４）を含み、ＴＡＰ２は、アミノ末端ＡＵ５エピトープタグ（配列番号１５）を含むが、ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする核酸分子は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結し、ＰＡＡは、カルボキシ末端ＶＳＶ−ｇエピトープタグ（配列番号１３）を含んだ。
【０１０６】
核酸ベースの免疫化組成物中に取り込まれたクラスＩペプチドワクチンは、防御免疫を惹起でき、ＨＬＡクラスＩＩペプチドを含めることおよびＴヘルパー応答の生成は、最適な細胞性免疫を刺激し、ＣＴＬ単独によって提供される防御を増進すると予測される。一部の実施形態では、１つまたは複数のクラスＩＩ「レポーターエピトープ」ＰＡＡおよびクラスＩＩエピトープ含有ＰＡＡをコードする本開示の核酸は、ＭＴＩ−ＶＳＶＧ−ＰＡＡとして表され得、ＭＴＩ部分は、サイトゾル性のままであるように変異される。設計どおりに、ＭＴＩ−ＶＳＶＧ−ＰＡＡは、内在化されたＶＳＶＧシグナル配列（例えば、配列番号４２）と本明細書で呼ばれるものを含有する一次翻訳産物を生じる。内在化されたシグナル配列は、プロセシングされ、キメラタンパク質は、分泌または膜局在化し、それによって、エンドサイトーシス区画およびクラスＩＩプロセシング経路中へのＰＡＡの進入を促進する。ＶＳＶＧプロセシングおよびシグナル伝達配列は、Roseら、Journal  of
Virology  ３９巻：５１９〜５２８頁、１９８１年；Gallioneら、Journal  of  Virology  ５４巻（２号）：３７４〜３８２頁、１９８５年；Machamerら、Molecular  and  Cellular  Biology  ５巻：３０７４〜３０８３頁、１９８５年；Rottierら、Journal  of
Biological  Chemistry  ２６２巻：８８８９〜８８９５頁、１９８７年においてさら
に詳細に議論されており、これらは全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
従って、一部の実施形態では、本明細書の実施形態のいずれかに開示されるキメラ核酸は、内在化ＶＳＶＧシグナル配列、ＶＳＶＧ分泌シグナル配列、輸送配列  樹状細胞標的化配列、膜局在化配列またはそれらの任意の組合せをさらに含む。一部の実施形態では、キメラ核酸は、配列番号４３に示される内在化ＶＳＶＧシグナル配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４７または４８に示されるＶＳＶＧ分泌シグナル配列を含む。ＶＳＶＧ分泌シグナル配列は、ＥＲ／ゴルジを介した細胞表面（即ち、形質膜）への輸送を促進する。一部の実施形態では、核酸は、配列番号４５に示される樹状細胞標的化配列を含む。ＤＣ標的化配列は、任意選択であり、ＣＯＯＨ末端に配置され得る。一部の実施形態では、核酸は、配列番号５７に示されるＶＳＶＧ膜局在化配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、葉酸受容体−αクラスＩＩ抗原をコードする配列を含むＰＡＡを含み、分泌型キメラである。一部の実施形態では、核酸は、配列番号５２に示される配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、葉酸受容体−αクラスＩＩ抗原をコードする配列を含むＰＡＡを含み、膜局在化ポリペプチドである。一部の実施形態では、核酸は、葉酸受容体−αクラスＩＩ抗原をコードする配列を含むＰＡＡを含み、膜局在化ポリペプチド、例えば、配列番号５８に示される核酸配列によってコードされる融合タンパク質である。
【０１０８】
本明細書に記載されるキメラ核酸およびベクターは、細胞中に導入され得る。核酸分子を導入する方法は、当該分野で周知であり、これには、形質転換および形質導入が含まれる。従って、一部の実施形態は、本明細書に記載される核酸分子を含む細胞を含む。さらに、ある特定の実施形態は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに従うベクターを含む細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は、第１の被験体から取得された自家細胞または第１の被験体とは異なる被験体由来の同種細胞である。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏに位置し得る。一部の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、例えば、専門または非専門の抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、専門抗原提示細胞、例えば、樹状細胞またはマクロファージであり得る。好ましい一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【０１０９】
用語、樹状細胞（ＤＣ）は、Ｓｔｅｉｎｍａｎらによって１９７３年に記載された（Steinman  RMおよびCohn  ZA  J  Exp  Med  １３７巻：１１４２〜６２頁、１９７３年）
。樹状細胞は、骨髄系骨髄前駆体細胞に由来し、生存細胞ベースの抗がん療法として使用される潜在性を有する（Vacchelliら、OncoImmunology  ２巻：１０頁、２０１３年；Slingluffら、Clin  Cancer  Res  １２巻（補遺７）：２３４２ｓ〜２３４５ｓ頁、２００
６年；Steinman  RM  Immunity  ２９巻：３１９〜３２４頁、２００８年）。ＤＣは、リンパ系組織、皮膚（例えば、表皮ランゲルハンス細胞）および種々の粘膜に局在化する。成熟すると、ＤＣは、ＨＬＡクラスＩＩならびにＨＬＡクラスＩ拘束された系の両方のための強力な専門抗原提示細胞である（Santambrogioら、PNAS  ９６巻（２６号）：１５０５０〜５５頁、１９９９年）。成熟ＤＣは、細胞表面上に上昇したレベルのＨＬＡクラスＩＩタンパク質を発現し、リンパ節に遊走し、高レベルのサイトカイン／ケモカインを分泌する。活性化されたＤＣの細胞表面上に提示されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合したＴ細胞活性化抗原性ペプチドは、同族ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の両方を刺激（活性化）し、同時に、いくつかのサイトカインおよび他の成長促進因子を分泌する。本明細書に示されるペプチドまたは核酸ベースの組成物の真皮下投与（ＤＣが豊富な部位）は、ＤＣが発現したＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩタンパク質との関連で、抗原性Ｔ細胞ペプチド（天然にプロセシングされた抗原性ペプチドを含む）の取込みおよび免疫系提示を生じる。
【０１１０】
ＤＣに対する、本明細書に開示されるＴＡＡ由来ペプチドまたは核酸ベースの抗原性Ｔ細胞ペプチド組成物の親和性は、例えば、Dieboldら、Gene  Therapy  ８巻：４８７〜４９３頁、２００１年；Bonifazら、J  Exp  Med  １９６巻（１２号）：１６２７〜１６３８頁、２００２年；Birkholzら、Blood  １１６巻（１３号）：２２７７〜２２８４頁、
２０１０年；Apostolopoulosら、J  Drug  Delivery、１〜２２頁、２０１３年；Lewisら、Biomaterials  ３３巻（２９号）：７２２１〜７２３２頁、２０１２年；Gieselerら、Scandinavian  J  Immunology  ５９巻：４１５〜４２４頁、２００４年に教示されるよ
うな、ポリペプチド、小分子または抗体ベースのテクノロジーなど、１つまたは複数のＤＣ標的化モチーフを含めることによって増強され得、これらは全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、ＤＣ親和性は、１つまたは複数の抗体、またはＤＣ表面マーカー、例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＬＥＣ４Ａに対する親和性を有する他の分子を含めることによって増強され得、成熟化シグナル、例えば、ＩＬ−１５もまた含み得る。
【０１１１】
従来のポリペプチドベースのワクチンとは対照的に、ＤＮＡワクチンは、プラスミドの形態で核酸を含み得るが（Liら、J.  Biotechnol.  １６２巻：１７１頁、２０１２年）
、ＲＮＡの形態でも取り込まれ、または送達のためのウイルスベクターの核酸中にも取り込まれ得る。プラスミドＤＮＡは、当業者によって理解されるように、本明細書に示される１つまたは複数の転写単位の発現を駆動するプロモーターを含む。核酸ベースのワクチンは、例えば、筋内注射によって、皮下で、鼻腔内で、粘膜提示を介して、静脈内で、または皮内もしくは皮下投与によって、投与され得る。
【０１１２】
核酸ベースのワクチンは、（ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡまたはウイルスベクターのいずれかを使用して）患者に投与され、それによって、核酸は、細胞の細胞質および／または核中に取り込まれ、ここで、核酸は、ｍＲＮＡへと転写され、次いで、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳される。本明細書に示されるワクチンモダリティーは、プライムおよびブーストプラットホームとして、個々にまたは逐次的に投与され得る。プライミングワクチン組成物は、ペプチドベースであり得、その後、例えばプラスミドＤＮＡとしてまたはウイルス送達系として送達される核酸を含むワクチンブーストが続く。あるいは、プライミングワクチン組成物は、送達される核酸であり得、その後、ペプチドベースのワクチンが続く。プライムもしくはブーストのいずれかのワクチン、またはプライムおよびブーストの両方は、それを必要とする患者に、１回または複数回投与され得る。
【０１１３】
従って、一部の実施形態では、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるＭＴＩ−ＰＡＡを含む核酸分子、本明細書の実施形態のいずれかに従う核酸分子によってコードされる抗原、またはその両方を含む免疫化組成物の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む方法である。一部の実施形態では、免疫化組成物は、核酸免疫化組成物を含む。一部の実施形態では、免疫化組成物は、抗原またはポリ抗原免疫化組成物を含む。一部の実施形態では、核酸免疫化組成物および抗原免疫化組成物は、両方とも投与される。ある特定の実施形態では、抗原免疫化組成物が最初に投与され、核酸免疫化組成物が２番目に投与される。他の実施形態では、核酸免疫化組成物が最初に投与され、抗原免疫化組成物が２番目に投与される。なおさらなる実施形態では、核酸免疫化組成物および抗原免疫化組成物は、並行して投与される。一部の実施形態では、免疫化組成物は、本明細書に開示される実施形態に従う核酸を含む細胞を含む。一部の実施形態では、細胞性免疫応答は、抗原特異的Ｔ細胞応答である。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。ある特定の実施形態では、核酸免疫化組成物は、抗原提示細胞によって取り込まれる。抗原提示細胞は、専門または非専門の抗原提示細胞であり得る。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。ある特定の実施形態では、方法は、核酸免疫化組成物を被験体に投与するステップを含み、核酸免疫化組成物は、本明細書に記載されるＭＴＩ（例えば、配列番号１〜６、９５または９６のうちいずれか）を含みＰＡＡを含むキメラ核酸分子を含み、ＰＡＡは、葉酸受容体−α（例えば、配列番号６９〜９３のうちいずれか）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（例えば、配列番号１１７〜１３５のうちいずれか）由来の抗原、またはそれらの任意の組合せを含む。例示的な葉酸受容体−αＰＡＡおよびＭＴＩ−ＰＡＡ配列は、配列番号４９、５０、５２、５３〜５５、５８〜６４、６６〜６８および９７〜１００に提供される。例示的なＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＰＡＡおよびＭＴＩ−ＰＡＡ配列は、１１５、１１６、１３６〜１５０に提供される。
【０１１４】
本明細書に記載されるＭＴＩテクノロジーは、患者の細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで改変するためにも使用され得る。例えば、患者のＴ細胞、樹状細胞または他の抗原提示細胞集団の、単離または富化された調製物は、本明細書に開示された核酸分子でトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた細胞は、拡大され、次いで、エフェクターＴ細胞として患者中に再導入され得る。
【０１１５】
従って、ある特定の実施形態では、細胞性免疫応答を惹起する方法は、細胞を、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるキメラ核酸分子を含む核酸免疫化組成物と接触させるステップを含み、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触され、次いで被験体に投与される。被験体から細胞を単離し、核酸分子を導入する方法は、当該分野で公知である。一部の実施形態では、細胞は、自家または同種である。ある特定の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞である。一部の実施形態では、細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの核酸分子またはベクターを含む細胞の有効量を被験体に投与し、それによって、細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、自家または同種である。一部の実施形態では、細胞は、抗原提示細胞である。ある特定の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。
【０１１７】
一部の実施形態では、本開示は、メモリーＴ細胞の産生を生じる堅固な免疫応答を惹起するための、プライムおよびブーストのための方法を提供する。例えば、免疫応答は、（ａ）被験体を、その核酸分子が１つまたは複数の抗原性ペプチドをコードする、本明細書に記載される核酸分子免疫化組成物と接触させること、（ｂ）任意選択で、初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えること、（ｃ）被験体を、抗原性ペプチド免疫化組成物と接触させることによって、がんまたは感染性疾患に対して惹起される。ペプチド免疫化組成物および核酸免疫化組成物は、同じ１つまたは複数のＨＬＡクラスＩペプチド抗原（複数可）に対応し得る。あるいは、ペプチド免疫化組成物および核酸免疫化組成物は、同じがんマーカータンパク質またはＴＡＡに対応し得る。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）本明細書に開示される核酸分子のうちいずれか１つによってコードされる１つまたは複数の抗原を含む抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、および（ｂ）本明細書に記載される実施形態のうちいずれか１つの核酸分子またはベクターを含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）の核酸分子免疫化組成物は、複数の抗原をコードする。一部の実施形態では、ステップ（ａ）の抗原免疫化組成物は、複数の抗原を含む。ある特定の実施形態では、核酸分子は、ステップ（ａ）において使用される１つまたは複数の抗原と同じタンパク質由来の１つまたは複数の抗原をコードする。一部の実施形態では、核酸分子免疫化組成物の核酸分子は、ステップ（ａ）において使用される１つまたは複数の抗原と同じ抗原のうち１つまたは複数をコードする。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）と同時に実施される。他の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）と逐次的に実施される。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の１時間から５ヶ月、１時間から４ヶ月、１時間から３ヶ月、１時間から８週間、１時間から６週間、１時間から４週間、１時間から３週間、１時間から２週間、１時間から１週間、１時間から７２時間、１時間から４８時間または１時間から２４時間後に実施される。他の実施形態では、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ）の１時間から５ヶ月、１時間から４ヶ月、１時間から３ヶ月、１時間から８週間、１時間から６週間、１時間から４週間、１時間から３週間、１時間から２週間、１時間から１週間、１時間から７２時間、１時間から４８時間または１時間から２４時間後に実施される。一部の実施形態では、方法は、（ｃ）抗原免疫化組成物の第２の有効量を被験体に投与するステップをさらに含み、抗原免疫化組成物は、（ａ）において使用される抗原性ペプチドと同じタンパク質に由来するペプチドを含む。例えば、一部の実施形態では、ステップ（ｃ）の抗原免疫化組成物は、（ａ）において使用される抗原免疫化組成物と同じである。
【０１１９】
他の実施形態では、細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）本明細書に記載される実施形態のいずれかの核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、（ｂ）初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えるステップ、および（ｃ）本明細書に記載される実施形態のいずれかに従う核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の第２の有効量、または抗原性ペプチド免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、抗原免疫化組成物は、ステップ（ａ）の核酸分子によってコードされる抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む。一部の実施形態では、核酸分子免疫化組成物の核酸分子は、（ｃ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチドのうち１つまたは複数をコードする。ある特定の実施形態では、初期免疫応答を生じるのに十分な時間は、ステップ（ａ）の後１時間から５ヶ月、１時間から４ヶ月、１時間から３ヶ月、１時間から８週間、１時間から６週間、１時間から４週間、１時間から３週間、１時間から２週間、１時間から１週間、１時間から７２時間、１時間から４８時間または１時間から２４時間である。ある特定の実施形態では、方法は、（ｄ）抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップをさらに含み、抗原免疫化組成物は、（ｃ）において使用される抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｄ）の抗原免疫化組成物は、（ｃ）において使用される同じ抗原を含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、核酸分子免疫化組成物および抗原免疫化組成物は、異なるペプチド抗原クラスをコードし、例えば、ペプチド免疫化複合体のペプチド（複数可）は、がんマーカータンパク質に由来する１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチドエピトープを含み得るが、核酸分子は、同じがんマーカータンパク質（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕまたは葉酸受容体アルファ）に由来する１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドをコードし得る。
【０１２１】
核酸免疫化組成物内に含有される抗原性ペプチドエピトープおよびペプチド免疫化組成物内に含有される抗原性ペプチドエピトープは、１つよりも多いがんマーカータンパク質（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよび葉酸受容体アルファ）に由来し得る。
【０１２２】
典型的には、がんを有する患者は、腫瘍を完全に排除するのに、または腫瘍量を管理可能なレベルに低減させるのに十分なように、十分な数のがん細胞を破壊し、それによって、再発までの長い時間を有する、改善された生活水準を提供できる、強い十分な免疫応答を惹起することが不可能である。がんを有する患者にとっての医療上の選択肢は、歴史的に、腫瘍塊の外科的切除、化学療法または放射線療法に焦点を当ててきた。これらの歴史的選択肢のそれぞれにおいて、処置は、化学療法が、患者の良好な細胞ならびに望ましくないがん細胞もまた死滅させるという点で、特に侵襲性または特に無分別である。
【０１２３】
患者自身の免疫系を刺激してがん細胞を破壊させることの利点は、本明細書に示される実施形態に一般によれば、かかる免疫刺激が、長寿命であり、結果的に再発を防止する、または再発までの時間を延長するはずであるということである。対照的に、放射線療法または化学療法は、望ましくないがん細胞を死滅させ続けるために、反復処置の継続を必要とする。患者自身の免疫系細胞を刺激することは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで媒介され得る。ｅｘ  ｖｉｖｏ投与のために、患者の細胞（例えば、樹状細胞および／またはＴ細胞）は、患者から取り出され、次いで本発明のペプチド、核酸またはウイルス組成物と接触させる。接触させた後で、患者の細胞は、患者に戻し投与される。
【０１２４】
本明細書に記載されるワクチンアプローチは、患者の免疫細胞を刺激して長期にわたって機能させるように設計され、従って、新たながん細胞が存在するようになると、そのがん細胞は破壊される。一実施形態では、長期免疫機能は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＨＬＡクラスＩ拘束された）およびヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞（ＨＬＡクラスＩＩ拘束された）の両方を刺激することが可能なマルチ抗原性ペプチド組成物を使用して達成される。それによって、患者は、別のラウンドの化学療法または放射線療法のために、自身の医療提供者（医師、病院）に繰り返し行く必要はない。化学療法、放射線療法または手術による処置の多くの状況では、処置は、成功の障害であり得、実際、患者は、疾患（がん）自体ではなく、処置の結果として悪化を感じる場合が多い。
【０１２５】
一部の実施形態では、上記細胞性免疫応答を惹起する方法は、本明細書に記載されるＴＡＡに対する免疫応答を惹起するためのものである。他の実施形態では、上記細胞性免疫応答を惹起する方法は、本明細書に記載される病原体に対する免疫応答を惹起するためのものである。上記細胞性免疫応答を惹起する方法のいずれかでは、被験体は、ヒトであり得る。
【０１２６】
上記細胞性免疫応答を惹起する方法のいずれかでは、方法は、補助的療法を施すステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、補助的療法は、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、補助的療法は、シクロホスファミドである。
【０１２７】
がん、例えば乳がんは、毎年およそ２１０，０００人の女性において診断されている。手術、化学療法および放射線療法などの従来の標準的治療は、少なくとも初期には首尾よい処置であるが、再発が共通の問題であり、しばしば、罹患率および死亡率の主要な供給源である。ＨＥＲ２／ｎｅｕ＋乳がんに対するトラスツズマブなどのモノクローナル抗体が、一部のがんの処置において進歩している。トラスツズマブの組合せは、進行型ＨＥＲ２／ｎｅｕ＋がんを有する女性にとって生存時間を延長させるが、女性の大部分は、処置の開始の１年以内に耐性を発達させる。さらなるまたは代替的戦略の開発は、患者に新たな処置選択肢を提供し、現在の標準的治療を改善し得る。疾患再発までの時間を遅延させるまたは疾患再発を予防するワクチンは、顕著な臨床的および経済的可能性を有する。さらに、本明細書に記載されるがんワクチンは、がん患者において検出されるＴＡＡに対する先在の免疫を生成することが公知であるまたは生成すると予測される腫瘍抗原性Ｔ細胞エピトープに対する免疫をブーストするために使用され得る。
【０１２８】
他の実施形態では、乳がんを処置する方法であって、乳がんＴＡＡを含む核酸分子免疫化組成物を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、乳がんＴＡＡは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、葉酸受容体−αまたはそれらの組合せである。一部の実施形態では、核酸免疫化組成物は、配列番号４９、５０、５２〜５５、５８〜６４、６６〜９３、９７〜１００、１１５〜１５０に対応する核酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、乳がんを処置する方法は、補助的療法を施すステップをさらに含む。補助的療法は、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、抗体療法は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、抗葉酸受容体アルファ（例えば、ファーレツズマブ）；ならびにキナーゼドメイン機能の小分子阻害剤（例えば、ラパチニブ（laptinib）、ゲフィチニブ、エルロチニブなど）を含む。一部の実施形態では、補助的療法は、シクロホスファミドである。一部の実施形態では、補助的療法は、免疫抑制を阻害する療法である。ある特定の実施形態では、免疫抑制シグナルの阻害剤である、免疫抑制を阻害する療法は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＧＡＬ９、ＴＩＭ３、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、ＩＬ−３５またはそれらの任意の組合せに特異的な、抗体、融合タンパク質またはｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、抗ＣＴＬ４抗体は、ＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合性断片、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１特異的抗体またはその結合性断片、例えば、ピディリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１特異的抗体またはその結合性断片、例えば、ＭＤＸ−１１０５、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃまたはそれらの任意の組合せである。
【０１２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞性免疫応答を惹起する方法は、患者特異的ＴＡＡ抗原を同定するステップをさらに含む。従って、患者のＴ細胞の集団は、患者が検出可能なＴ細胞免疫応答を既に有している抗原性エピトープを同定するために、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ  Ｔ細胞ペプチドの収集に対してスクリーニングされ得る。患者の細胞は、単離され、マルチウェルプレートを使用して、ディスプレイされたペプチドと共にインキュベートされ、ガンマインターフェロンなどのサイトカイン応答が測定される。次いで、そうして同定された抗原性ペプチドのうち１つまたは複数は、ペプチドベースのワクチン組成物へと製剤化され得る。検出された抗原性ペプチドは、クラスＩまたはクラスＩＩ拘束され得る。さらに、同じクラスＩおよび／またはクラスＩＩペプチドは、本明細書に開示される核酸ベースの送達系中に取り込まれ得る。次いで、患者には、独立型の薬として、または上記実施形態に記載されるプライムおよびブーストモダリティーとして逐次的な組合せで、オーダーメードのペプチドまたは対応する核酸ベースの組成物が投与され得る。これに関して、プライムは核酸ベースであり得、ブーストはペプチドベースであり得るか、またはその逆であり得る。従って、一部の実施形態では、がんを処置する方法であって、本明細書に記載の実施形態のうちいずれかの核酸分子を含む核酸免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の抗原が、被験体において同定された発癌性変異を有する抗原を含む、方法である。
【０１３０】
本開示を支持して、本明細書に記載される組成物および方法は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子によって提示される新規ペプチドエピトープの同定を助けるために、質量分析を組み合わせる。投与後、当業者は、細胞培養物および小動物または非ヒト霊長類モデル系を使用して、免疫応答を追跡および特徴付けできる。ペプチド配列は、核酸配列（完全にまたは部分的にコドン最適化され得る）に変換され、核酸ベースの発現／送達ワクチン系中に含めるために設計される。例示的なペプチドは、がん（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６４０号に開示されるようなＨＥＲ２ｎｅｕペプチド、そのペプチドは、参照によって本明細書に組み込まれる；葉酸受容体−αペプチド；ＮＹ−ＥＳ０１精巣特異的抗原；ＷＴ１ペプチドなど）または他の感染性疾患（例えば、他のウイルス、寄生生物、細菌）由来であり得る。
【０１３１】
本開示の組成物および方法は、ＨＬＡクラスＩペプチドの提示および引き続くＣＤ８  Ｔ細胞応答を増強するのに適しており、翻訳効率を増強する特徴を取り込む、抗原発現を最大化するように設計されたワクチンベクター（図１）とそれを組み合わせる；抗原性ペプチドのアレイの産生を誘導する；ならびにプロテアソーム標的化／輸送およびタンパク質分解性プロセシングのためにペプチドをマークする、分子アジュバントメカニズム（ＴＡＰ１／ＴＡＰ２）を含み得る。本開示の組成物および方法は、増加した発現のために複数の翻訳開始部位を取り込み（例えば、１つのｍＲＮＡは、４つの翻訳産物を開始および合成する）；サイトゾル性および／または核標的化ならびに引き続くプロセシングを取り込み；内因性タンパク質と組換えタンパク質とを区別し；ＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２をコードする内因性核酸と組換え核酸とを区別し；核およびサイトゾル性抗原標的化を可能にし得る。ベクターは、各特徴が特徴付けおよび試験のために独立して操作できるようにも、構築され得る。
【０１３２】
陰性免疫モジュレーター、例えば、調節性Ｔ細胞および関連のチェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１、Ｙｅｒｖｏｙ、シクロホスファミド）を含む、さらなる免疫刺激剤またはモジュレート剤は、本明細書に記載される任意の組成物または方法中に含まれ得る。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、以前に記載されたように、ワクチンアジュバントとして機能し得る（Mohebtashら、Clin  Cancer  Res  １７巻：７１６４〜７３頁、２０１１年を参照のこと）。他のアジュバント、例えば、ミョウバン、ＭＦ５９、ＣｐＧ、Ｒ８４８などが、本明細書に記載される組成物または方法中に含まれ得る。
【０１３３】
一例として、本発明を投与することによって処置可能な１つの感染性疾患は、天然痘であるが、それは、この疾患が、過去２世紀だけでも何億人もの命を奪っているからであり（Dixon,  C.  W.  Smallpox.  （J.  &  A.  Churchill、１９６２年；F.  Fennerら、Smallpox  and  its  Eradication.  ６巻  W.H.O.、１９８８年）、１９８０年以降根絶
されたとみなされているものの（Fenner,  F.  Smallpox  and  its  eradication.  （World  Health  Organization、１９８８年）、ポックスウイルスに関する生物テロ防御研究は、以下の理由で、依然として極めて重要である：（１）生物兵器としての天然痘の使用に関する懸念（Henderson,  D.  A.ら、Working  Group  on  Civilian  Biodefense.
Jama  ２８１巻、２１２７〜２１３７頁、１９９９年；Kennedy,  R.  B.ら、Vaccine
２７巻、補遺４、Ｄ７３〜７９頁、２００９年；Whitley,  R.  J.  Antiviral  Res  ５７巻、７〜１２頁、２００３年；Bossi,  P.ら、Cell  Mol  Life  Sci  ６３巻、２１９６〜２２１２頁、２００６年；Mayr,  A.  Comp  Immunol  Microbiol  Infect  Dis  ２６巻、４２３〜４３０頁、２００３年；Wiser,  I.ら、Vaccine  ２５巻、９７６〜９
８４頁、２００７年）；（２）新興の人畜共通ポックスウイルス、例えば、米国およびアフリカにおけるサル痘（Hutson,  C.  L.ら、Am  J  Trop  Med  Hyg  ７６巻、７５７〜７６８頁、２００７年；Kile,  J.  C.ら、Archives  of  pediatrics  &  adolescent  medicine  １５９巻、１０２２〜１０２５頁、２００５年；Di  Giulio,  D.  B.およびEckburg,  P.  B..  The  Lancet  infectious  diseases  ４巻、１５〜２５頁、２００
４年；Edghill-Smith,  Y.ら、J  Infect  Dis  １９１巻、３７２〜３８１頁、２００５年；Larkin,  M.  The  Lancet  infectious  diseases  ３巻、４６１頁、２００３年；Jezek,  Z.ら、American  journal  of  epidemiology  １２３巻、１００４〜１０１２
頁、１９８６年）、南アメリカにおけるワクシニア様ウイルス（Leite,  J.  A.ら、Emerging  infectious  diseases  １１巻、１９３５〜１９３８頁、２００５年；Silva-Fernandes,  A.  T.ら、J  Clin  Virol  ４４巻、３０８〜３１３頁、２００９年；Trindade,  G.  S.ら、Clin  Infect  Dis  ４８巻、ｅ３７〜４０頁、２００９年）、およびインドにおける水牛痘（Singh,  R.  K.ら、Animal  health  research  reviews  /  Conference  of  Research  Workers  in  Animal  Diseases  ８巻、１０５〜１１４頁、２０
０７年）；（３）多数のワクチン禁忌（Neff,  J.ら、Clin  Infect  Dis  ４６巻、補遺３、Ｓ２５８〜２７０頁、２００８年；Poland,  G.  A.ら、Vaccine  ２３巻、２０７８〜２０８１頁、２００５年；Bonilla-Guerrero,  R.およびPoland,  G.  A..  J  Lab  Clin  Med  １４２巻、２５２〜２５７頁、２００３年）；（４）ＶＡＣＶ伝播に伴う懸念（Fulginiti,  V.  A.ら、Clin  Infect  Dis  ３７巻、２４１〜２５０頁、２００３年
；Wharton,  M.ら、MMWR  Recomm  Rep  ５２巻、１〜１６頁、２００３年；Redfield,  R.  R.ら、N  Engl  J  Med  ３１６巻、６７３〜６７６頁、１９８７年）；ならびに（
５）稀ではあるが重大な有害事象を生じる生ウイルス天然痘ワクチンに固有の安全性問題（Fulginiti,  V.  A.ら、Clin  Infect  Dis  ３７巻、２５１〜２７１頁、２００３年
；Fulginiti,  V.  A.  Jama  ２９０巻、１４５２頁；著者の回答１４５２頁、２００３年；Lane,  J.  M.ら、Jama  ２１２巻、４４１〜４４４頁、１９７０年；Lane,  J.  M.ら、N  Engl  J  Med  ２８１巻、１２０１〜１２０８頁、１９６９年；Morgan,  J.ら、Clin  Infect  Dis  ４６巻、補遺３、Ｓ２４２〜２５０頁、２００８年；Vellozzi,  C.ら、Clin  Infect  Dis  ３９巻、１６６０〜１６６６頁、２００４年；Halsell,  J.  S.ら、Jama  ２８９巻、３２８３〜３２８９頁、２００３年；Poland,  G.  A.およびNeff,  J.  M.  Immunol  Allergy  Clin  North  Am  ２３巻、７３１〜７４３頁、２００３年；Chapman,  L.  E.ら、Clin  Infect  Dis  ４６巻、補遺３、Ｓ２７１〜２９３頁、
２００８年）。最近導入された第２世代（生）組織培養物ベースのワクチン（ＡＣＡＭ２０００）は、Ｄｒｙｖａｘ（登録商標）にとって代わっているが、第１世代ワクチンの欠点のほぼ全てを保持している（Kennedy,  R.  B.ら、Curr  Opin  Immunol  ２１巻、３
１４〜３２０頁、２００９年；Artenstein,  A.  W.ら、Vaccine  ２３巻、３３０１〜３３０９頁、２００５年；Greenberg,  R.  N.およびKennedy,  J.  S.  Expert  Opin  Investig  Drugs  １７巻、５５５〜５６４頁、２００８年；Poland,  G.  A..  Lancet  
３６５巻、３６２〜３６３頁、２００５年；Greenberg,  R.  N.ら、Lancet  ３６５巻、３９８〜４０９頁、２００５年）。ＭＶＡに基づく弱毒化ワクチン（ＩＭＶＡＭＵＮＥ）は、改善された安全性プロファイルを有し得るが（Kennedy,  J.  S.およびGreenberg,  R.  N.  Expert  Rev  Vaccines  ８巻、１３〜２４頁、２００９年；Frey,  S.  E.ら、Vaccine  ２５巻、８５６２〜８５７３頁、２００７年；Vollmar,  J.ら、Vaccine  ２４巻、２０６５〜２０７０頁、２００６年；Edghill-Smith,  Y.ら、J  Infect  Dis  １８８巻、１１８１〜１１９１頁、２００３年）、依然として生ウイルスワクチンのままであり、安全性および免疫原性の両方に関していくつかの懸念が存在する。
【０１３４】
ＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２と一緒に、複数のＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ由来ペプチドからなるペプチド抗原アレイ（ＰＡＡ）をコードする発現ベクター（プラスミドおよびワクシニアウイルスベース）の調製および特徴付けが、本明細書に示される。本開示の一例として、図１に概説される特徴の種々の組合せをコードするプラスミド発現ベクター：（１）ワクシニア−ペプチド抗原アレイならびに（２）ＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２を含有する発現カセット。これらの発現ベクターは、ＦＧＦ２のアミノ末端部分（ＭＴＩ）と、その後の感染性疾患またはがんと関連するペプチドの選択を含有する相互交換可能なペプチド抗原アレイとを含有する、キメラタンパク質の合成を指向する。
【０１３５】
コードされたペプチド配列の効率的なプロテアソームプロセシングを促進し、それによって、完全なプロテアーゼプロセシング部位を保存するために、ＮＨ２末端およびＣＯＯＨ末端は、３つまたは４つまたはそれ超のネイティブ／天然に存在するアミノ酸分、伸長され得る（図１、小文字）。各抗原性ペプチド部分は、スペーサー（例えば、Ｇ４Ｓ）によって、次の抗原性ペプチドからさらに分離され得る。４つのＭＴＩ翻訳開始部位は、１モルの転写されたｍＲＮＡ毎に４モルのマルチペプチドＰＡＡ翻訳産物を生じる（図１）（Florkiewicz,  R.  Z.およびSommer,  A.  PNAS  ８６巻、３９７８〜３９８１頁、１
９８９年；Florkiewicz,  R.  Z.ら、Growth  Factors  ４巻、２６５〜２７５頁、１９
９１年）。
【０１３６】
本開示によれば、核酸分子ベースの発現ベクターは、ＭＴＩ−ＰＡＡのＰＡＡ部分が、容易に切り出しおよび置き換えられるカセットであるように、設計されている。これにより、当業者が、モジュラー組換え戦略と一致して、さらなるＶＡＣＶ／ＶＡＲＶエピトープを迅速に取り込み、「レポーターエピトープ」ＰＡＡを創出し、または他の病原体もしくはがん標的に特異的なＰＡＡを設計することが可能になる。
【０１３７】
ＣＯＯＨ末端ＶＳＶＧエピトープタグは、免疫沈降、イムノブロッティングおよび間接的免疫蛍光による検出のために使用され得る（および転写されたｍＲＮＡの検出のためのＰＣＲプライマー対を設計するためにも使用され得る）。ＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２と一緒に、抗原性ペプチド／タンパク質の発現を増強するために、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＰＡＡ（ＭＴＩではない）をコードする核酸分子が、好ましいコドン利用アルゴリズムの背景で、合成により調製され、それによって、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの好ましいコドンバイアスと一致する増強された翻訳効率を提供するが、同時に、翻訳効率に負の影響を与え得る潜在的なシス作用性ｍＲＮＡ配列を最小化する。
【０１３８】
さらに、本開示の核酸は、内因性Ｔａｐ１および／またはＴａｐ２とは対照的に、ベクターにコードされたタンパク質の示差的免疫検出のために、共通のエピトープタグを取り込み得る。ＮＨ２末端Ｔａｐ１タグはＶ５であり、Ｔａｐ２についてのＮＨ２末端タグはＡＵ５である。
【０１３９】
プロテアソームは、組成およびプロセシング能力において異なることが理解される（Bedford,  L.ら、Trends  in  cell  biology  ２０巻、３９１〜４０１頁、２０１０年；de  Graaf,  N.ら、Eur  J  Immunol  ４１巻、９２６〜９３５頁、２０１１年；Khan,  S.ら、J  Immunol  １６７巻、６８５９〜６８６８頁、２００１年；Sijts,  E.  J.およ
びKloetzel,  P.  M.、Cellular  and  molecular  life  sciences  :  CMLS  ６８巻、１４９１〜１５０２頁、２０１１年；Wilk,  S.ら、Arch  Biochem  Biophys  ３８３巻
、２６５〜２７１頁、２０００年；Xie,  Y.  J  Mol  Cell  Biol  ２巻、３０８〜３１７頁、２０１０年）。さらに、十分に特徴付けられてはいないものの、核プロテアソームは、サイトゾル性プロテアソームとは異なるようであると認識されている。本発明によれば、ＣＵＧコドンで開始されたＭＴＩ翻訳産物は、核に標的化されるが、ＡＵＧコドンで開始された翻訳産物は、サイトゾル性のままである。ＭＴＩ配列を調整することによって（部位特異的または欠失変異誘発は、複数のＧＲリピートを除去する）、開示される発明は、サイトゾル性または核のいずれかに局在化したＭＴＩ−ＰＡＡを排他的に発現させ得る。
【０１４０】
本明細書に開示される発明は、Ｔａｐ１および／またはＴａｐ２と称されるタンパク質などの分子アジュバントを含み得、ＴＡＰ１を含めることでＰＡＡ由来ペプチドの提示をさらに増強できることを実証するために使用され得る。
【０１４１】
一部の実施形態では、ペプチド／ＭＨＣ複合体特異的抗体が存在するエピトープからなる「レポーターエピトープ」ＰＡＡが、ＰＡＡ中に取り込まれ得る。かかるレポーターエピトープは、それらの拘束性のＭＨＣ／ＨＬＡ対立遺伝子の背景で提示されたペプチドの表面発現を直接測定するために、当業者がこれらの抗体を使用することを可能にし得る。
【０１４２】
免疫原性試験は、ワクチン誘導性免疫応答を特徴付けるために設計された一連の用量範囲およびワクチン接種スケジュール試験実験を含む。抗原性エピトープへの合致するＨＬＡ拘束を有する異なるＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩトランスジェニック動物系統が、開示された発明の文脈内で使用され得る。
【０１４３】
ワクチン効力試験は、ＰＡＡ／ＴＡＰベクターワクチン接種の用量／スケジュールの評価と、その後の、例えば鼻腔内感染モデルを使用する生存研究とを含む。マウス中へのワクシニアウエスタンリザーブ（ＷＲ）の鼻腔内接種は、体重減少、逆立った毛皮、嗜眠、および感染後６日目または７日目までの死によって特徴付けられる、致死感染を生じる（Turner,  G.  S.、J  Gen  Virol  １巻、３９９〜４０２頁、（１９６７年）；Reading,
P.  C.およびSmith,  G.  L.  The  Journal  of  general  virology  ８４巻、１９
７３〜１９８３頁、（２００３年）；Williamson,  J.  D.ら、The  Journal  of  general  virology  ７１巻（１１部）、２７６１〜２７６７頁、（１９９０年））。
【０１４４】
ワクチン効力実験の前に、各トランスジェニック系統についてのＶＡＣＶ−ＷＲ  ＬＤ５０は、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法に従って実験的に決定され得、５〜１０のＬＤ５０が、生存実験のため、およびヒトワクチン接種集団における防御のレベルを引き出すために、防御／免疫の相関を発達させるために、使用される（Reed,  L.  J.およびMuench,  H.
A.  American  journal  of  epidemiology  ２７巻、４９３〜４９７頁、１９３８年
）。
【０１４５】
ＣＴＬ機能：当業者に理解されるように、パーセント特異的溶解は、確立されたプロトコール（Latchman,  Y.  E.ら、PNAS  １０１巻、１０６９１〜１０６９６頁、２００４
年）に従って、各エフェクター：標的比について計算され、ＡＮＯＶＡを使用して群間で比較される。
【０１４６】
Ｔヘルパー機能：抗原特異的Ｔ細胞活性は、刺激されたウェルの中央値ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答値から、刺激されていないウェルの中央値ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答値を差し引くことによって計算される。値は、個々のマウスについて計算され得、免疫化群と対照群との間の差異は、スチューデントｔ検定を使用して比較される。フローサイトメトリーにおいて使用される追跡試薬ＣＦＳＥが、群間の増殖速度の差異を決定するために使用され、確立されたモデルを使用して比較される（Banks,  H.  T.ら、J  Immunol  Methods  ３７３巻、１４３〜１６０頁、２０１１年；Banks,  H.  T.ら、Bull  Math  Biol  ７３巻、１１６〜１５０頁、２０１１年）。
【０１４７】
生存研究：検出力計算（０．０５の第Ｉ種過誤率を仮定、および仮説の両側検定）は、２０匹のマウス／群を用いたとき、７日目における真の生存率が、免疫化群について５０％、非免疫化群について１０％である場合、生存における差異について約８０％検出力が測定可能であることを示している。全ての生存実験のために、カプラン・マイヤー生存曲線がプロットされ、ログランク検定などの生存についての標準的な統計的試験を使用して比較される。
【０１４８】
コンセンサスタンパク質ユビキチン化モチーフ（例えば、ＫＥＥＥ（配列番号２０３）またはＥＫＥ）（Catic,  A.ら、Bioinformatics  ２０巻、３３０２〜３３０７頁、２００４年；Chen,  Z.ら、PLoS  One  ６巻、ｅ２２９３０頁、２０１１年；Jadhav,  T.お
よびWooten,  M.  W.  J  Proteomics  Bioinform  ２巻、３１６頁、２００９年；Sadowski,  M.およびSarcevic,  B.  Cell  Div  ５巻、１９頁、２０１０年）を含むように改変されたＰＡＡのプロテアソームプロセシングは、エピトープ提示を直接測定するために、ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的な蛍光標識された抗体と共に、本明細書に列挙した実施形態中に含まれ得る。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＴＡＰは、クラスＩ抗原提示を増強するための分子アジュバントとして選択される。背景として、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩプロセシングと提示経路との間には、かなりのクロストークが存在する（Chicz,  R.  M.ら、The  Journal
of  experimental  medicine  １７８巻、２７〜４７頁、１９９３年；Lechler,  R.、Aichinger,  G.およびLightstone,  L.  Immunological  reviews  １５１巻、５１〜７
９頁、１９９６年；Rudensky,  A.ら、Nature  ３５３巻、６２２〜６２７頁、１９９１
年）。さらに、細胞内ペプチドは、複数のメカニズムを介して、ＨＬＡクラスＩＩペプチド上に積載され得る（Dengjel,  J.ら、PNAS  １０２巻、７９２２〜７９２７頁、２００５年；Dongre,  A.  R.ら、Eur  J  Immunol  ３１巻、１４８５〜１４９４頁、２００１年；Nedjic,  J.ら、Curr  Opin  Immunol  ２１巻、９２〜９７頁、２００９年）。クラスＩ抗原プロセシング機構が、クラスＩＩプロセシングおよび提示のためのこの内因性経路に影響を与えるという証拠もまた増加している（Jaraquemada,  D.ら、１７２巻、９４７〜９５４頁、（１９９０年；Loss,  G.  E.,  Jr.ら、The  Journal  of  experimental  medicine  １７８巻、７３〜８５頁、１９９３年；Oxenius,  A.ら、European  journal  of  immunology  ２５巻、３４０２〜３４１１頁、１９９５年）。Ｔｅｗａｒｉらは、ＴＡＰおよびプロテアソーム機構によってプロセシングされ、再循環するＭＨＣクラスＩＩ分子上に積載される、インフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質由来の２つのＩ−Ｅｄ拘束されたエピトープを同定している（Tewari,  M.  K.ら、Nature  immunology  ６
巻、２８７〜２９４頁、２００５年）。
【０１５０】
プラスミド発現ベクター：過剰発現されたＴＡＰまたはＭＴＩ−ＰＡＡの検出は、ＰＣＲ、免疫沈降、ウエスタンブロット、免疫蛍光および／またはＩＨＣによって決定される。免疫検出は、市販の抗体を使用する（実施例を参照のこと）。細胞内局在化は、市販の方法論（例えば、ＮＥ−ＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｃ．）を使用して、間接的免疫蛍光および細胞下分画によって評価される。ＶＡＣＶベクターの調製は、標準的方法論に従って、当業者によって達成され得る。
【０１５１】
抗原提示のレベルは、いくつかの方法によって査定される：ハイブリドーマから単離され、ＰＥまたはＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ）にコンジュゲートされた、精製されたｐ／ＭＨＣ特異的抗体を使用するフローサイトメトリー；トランスフェクトされたＡＰＣとペプチド特異的Ｔ細胞との共インキュベーション、およびＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイまたは細胞内サイトカイン染色による免疫認識の査定。
【０１５２】
１つまたは複数のエピトープタグが、プラスミドまたはウイルスベクター中に含有される場合に本開示の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチドの検出を補助するために使用され得、ここで、核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結している。
【０１５３】
抗原性ペプチド（クラスＩまたはＩＩ拘束された）は、タンパク質またはその断片がプロテアソームプロセシングを受けるときに生じる。次いで、生成されたペプチドは、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子に結合でき、種々のさらなるパラメーター、例えば、（１）ＨＬＡ結合親和性；（２）ペプチド／ＨＬＡ安定性；（３）分子シャペロンとの相互作用（ＴＡＰ／ＨＬＡ−ＤＭ）（Yin,  L.ら、J  Immunol  １８９巻、３９８３〜３９９４頁、２０１２年）；（４）ＴＣＲ：ペプチド：ＭＨＣ複合体相互作用の強度；（５）抗原発現レベルおよび速度論；（６）細胞局在化；ならびに（７）Ｔ細胞認識／ペプチド免疫原性が満たされた場合、防御免疫を惹起できる（Gilchuk,  P.ら、Journal  of  clinical  investigation  １２３巻、１９７６〜１９８７頁、２０１３年）。ある特定の実施形態では、ペプチドは、多機能性のＴ細胞応答を惹起し、宿主を感染性疾患から、または宿主ががんを発症することから防御する、長寿命のメモリー細胞を生じる。
【実施例】
【０１５４】
（実施例１）
多重翻訳開始配列を含む核酸分子
【０１５５】
図１は、本明細書に開示されるＭＴＩ（ＣＵＧスタートコドンからＦＧＦ２の上流多重翻訳開始に基づく）テクノロジーを取り込む核酸ベースの発現ベクターの例示的な構築を示す。発現ベクターは、プラスミドベクターを含み得る、または１つもしくは複数のウイルス送達系中に取り込まれたペプチド抗原性エピトープをコードする核酸分子を含み得る。（ａ）ＭＴＩ−ＰＡＡ（ＰＡＡ＝ペプチド抗原アレイ：図１Ｃを参照のこと）、（ｂ）コドン最適化されエピトープタグ化されたＴＡＰ１、および（ｃ）コドン最適化されたＴＡＰ２、をコードする第１の一連のプラスミド発現ベクター。これらのＭＴＩ−ＰＡＡ核酸分子ベースの系は、ＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２の組合せをさらに含み得る。ベクター設計は、ＰＡＡ部分が、カセットとして容易に切り出され、任意の一連のＴ細胞エピトープに対応する配列で置き換えられるのを可能にし、発現ベクター中への、他の病原体、がん遺伝子またはＨＬＡスーパータイプ由来のさらなるエピトープの取込みを可能にする−「プラグ・アンド・プレイ」プラットホームとしてのその有用性を増強する。
【０１５６】
ＭＨＣクラスＩペプチドに関して、発現ベクターは、ｈＦＧＦ２のＮＨ２部分（ＭＴＩ）と、その後の上述の抗原性ペプチドを代表する特異的ペプチド抗原アレイ（ＰＡＡ）とを含有するキメラタンパク質の合成を指向する。本発明者らは、ペプチドの選択を線状ペプチド抗原アレイ（ＰＡＡ）へとアセンブルし、それを核酸発現ベクターへと変換した。しかし、本発明者らは、プロテアーゼプロセシングが、完全なプロテアーゼプロセシング部位の提示を必要とすると仮説を立てた。従って、ペプチド配列の効率的なプロテアソームプロセシングを奨励または他の方法で再現するために、本発明者らは、ＮＨ２末端およびＣＯＯＨ末端において、３つまたは４つまたはそれ超のネイティブ／天然に存在するアミノ酸分、アミノ酸配列を伸長させた。
【０１５７】
発現ベクターは、合成される選択されたＰＡＡ／ペプチド（Ｔ細胞エピトープ）の量を増強する特徴を取り込む。特定の特徴には、（１）コドン最適化されたＤＮＡ、および（２）１モルの転写されたｍＲＮＡ毎に４モルのＭＴＩ−ＰＡＡを合成する能力が含まれる。本明細書で使用される発現ベクターのＰＡＡ部分のコドン最適化は、転写されたｍＲＮＡの翻訳効率を増加させる。一部の場合には、コドン最適化は、前臨床ならびに臨床的評価において、対応する内因性遺伝子から、ベクターがコードする遺伝子（例えば、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２）を（例えば、ＰＣＲによって）分子的に区別する手段もまた提供する。
【０１５８】
１モルの転写されたｍＲＮＡ毎に４モルのＭＴＩ−ＰＡＡを合成する上述の能力に関して、発現系は、ヒトＦＧＦ２遺伝子が、３つの非従来型ＣＵＧ翻訳開始コドンおよび１つの古典的ＡＵＧコドンの認識を介して、１つのｍＲＮＡからの４つのポリペプチドの合成を指向することが可能であるという事実を利用する。３つのＣＵＧコドンは、下流のＡＵＧコドンにおいて翻訳を開始する１８ｋＤａ  ＦＧＦ２の３つの共線的アミノ末端伸長バージョンの翻訳を開始する。上記ベクター中に含まれるＦＧＦ２部分は、３つのＣＵＧコドンならびに１つのＡＵＧコドンを保持する。従って、ベクターは、１モルのｍＲＮＡ毎に４モルの特定のＰＡＡを提供する。
【０１５９】
発現ベクターのＦＧＦ２部分のさらなる特徴は、サイトゾル性対核プロテアソームプロセシングの効率を評価する能力である。プロテアソームプロセシングがＭＨＣクラスＩ媒介性の細胞表面提示のためのペプチド基質を提供することは、十分に確立されている。プロテアソームは組成において異なり、例えば、免疫プロテアソームは、非免疫（正常）プロテアソームとは別であることもまた理解される。さらに、十分に特徴付けられてはいないものの、核プロテアソームは、サイトゾル性プロテアソームとは異なるようであると認識されている。
【０１６０】
ＣＵＧコドンで開始されたＦＧＦ２翻訳産物は、核に標的化されるが、ＡＵＧコドンで開始された翻訳産物は、サイトゾル性である（データ示さず）。従って、ＦＧＦ２配列は、サイトゾル性または核のいずれかに局在化されるＭＴＩ−ＰＡＡキメラを排他的に発現するために、改変される（部位特異的または欠失変異誘発）。
【０１６１】
（実施例２）
ポリ抗原アレイエピトープの発現
【０１６２】
トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞におけるＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＰｏｌｙＳｔａｒｔ（商標）ＭＴＩ−ＰＡＡ遺伝子発現は、ＰＣＲによって観察されている（データ示さず）。ｐＪ６０３発現プラスミドを、これらの実験のために選択した。プラスミド中に含有されるＣＭＶおよび／またはＳＶ４０後期プロモーターは、下流コード配列ならびに（一部の場合には）ＣＵＧ／ＡＵＧ翻訳開始コドンのｍＲＮＡ構造および適切な認識を維持するために重要であると思われる配列の転写を駆動する。従って、本発明者らは、（ａ）ＭＴＩ−ＰＡＡ（天然痘ペプチド）、（ｂ）Ｔａｐ１のみ、（ｃ）Ｔａｐ２のみ、（ｄ）Ｔａｐ１−ＩＲＥＳ−Ｔａｐ２、（ｅ）Ｔａｐ１＋ＭＴＩ−ＰＡＡ、および（ｆ）Ｔａｐ２＋ＭＴＩ−ＰＡＡをコードする第１の一連のプラスミド発現ベクターを設計／調製した。ＶＳＶＧペプチドタグエピトープタグを、ＭＴＩ−ＰＡＡのＣＯＯＨ末端に含めた。
【０１６３】
発現ベクターは、ＭＴＩ−ＰＡＡのＰＡＡ部分が、容易に切り出され、任意の一連のＴ細胞ペプチドエピトープ（または全長／トランケート型タンパク質）に対応する任意のＰＡＡをコードする任意のコドン最適化されたＤＮＡ配列で置き換えられ得るように設計されており、本発明者らが、さらなるペプチドエピトープ、例えば、ＶＥＥＶ  Ｅ３もしくはＥ２、がんエピトープ、例えば、乳がん関連エピトープ（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、葉酸受容体アルファ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＩＦ、ＧｎＲｈまたはＧｎＲＨＲ）、または任意の病原体（複数可）もしくは標的化されたがん細胞タンパク質に特異的なペプチドエピトープを、本発明者らの発現ベクター中に迅速に取り込むことを可能にしている。
【０１６４】
さらに、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびＰＡＡをコードする核酸配列を、好ましいコドン利用アルゴリズムの背景で、合成により調製した。コドン最適化は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの好ましいコドンバイアスと一致する増強された翻訳効率を提供し、同時に、翻訳効率に負の影響もまた与え得る潜在的なシス作用性ｍＲＮＡ配列を最小化する。この実施例では、ＦＧＦ２（ＭＴＩ）部分は、内部リボソーム進入と機構的に一致する様式で非従来型（即ち、ＣＵＧ）翻訳開始コドンからの翻訳を媒介するために必要とされ得る配列依存的なｍＲＮＡ構造を保存するために、コドン最適化しなかった。この戦略は、より高いレベルの発現を支持し、それによって、より高いレベルの対応する抗原性ポリペプチドを提供する。これは次に、より高いプロテアソーム媒介性のペプチドプロセシング、ならびに結果的に、ＭＨＣに対するより高いＴＡＰ媒介性のペプチド提示および引き続く細胞表面提示を生じると予測される。
【０１６５】
ＴＡＰ１およびＴＡＰ２をコードするコドン精緻化された合成ＤＮＡの独自の態様が、ベクターにより転写されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡから、内因性ｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡを区別するＰＣＲプライマー対を設計するために利用されてきた。次いで、プライマー対を、３つの供給源から取得された鋳型ＤＮＡを使用するＰＣＲ反応において使用した：ＴＡＰ１およびＴＡＰ２についてのコドン精緻化されたプラスミドＤＮＡ；トランスフェクトされていないＣＯＳ−７およびＰＡＮＣ−１細胞由来のｃＤＮＡ鋳型；ならびにＴＡＰ１およびＴＡＰ２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞由来のｃＤＮＡ鋳型。
【０１６６】
ＣＯＳ−１細胞（７０％コンフルエント）を、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）を使用して６０ｍｍプレート中でトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ４０時間後、総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡを、ＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅで処理し、ｃＤＮＡを、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用して生成した。ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を、以下のように、ＰＣＲ反応において使用した：９５°維持、９５°１５’、［９５°３０’’、５４／５７°３０’’、７２°１’３０’’］４０×７２°５’、１２°維持；＋／−Ｑ溶液。
【０１６７】
結果により、内因性ＴＡＰ１およびＴＡＰ２を検出するために設計されたＰＣＲプライマーが、コドン精緻化されたＴＡＰ１またはＴＡＰ２を含有するプラスミドＤＮＡを認識しないことが実証された（データ示さず）。比較すると、合成のコドン精緻化されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマー対は、プライムしない。さらに、ＴＡＰ１プライマーは、ＴＡＰ２鋳型とクロスプライムしない。同様に、トランスフェクトされていないＣＯＳ−７およびＰＡＮＣ−１細胞から調製された総ＲＮＡを使用すると、内因性ＴＡＰ１およびＴＡＰ２を認識するＰＣＲプライマー対は、ベクターにコードされたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを認識しないが、内因性ＴＡＰ１およびＴＡＰ２  ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ鋳型は認識する（データ示さず）。最後に、コドン優先的なＴＡＰ１およびＴＡＰ２配列を含有するプラスミド発現ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞に由来するｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡは、トランスフェクトされたｍＲＮＡから内因性ｍＲＮＡを区別した（データ示さず）。これらのＰＣＲ条件を、治療的プラスミドＤＮＡの提示後に、または組換えワクシニアウイルスによる感染後に、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２発現を追跡／確認するために使用した。
【０１６８】
さらに、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２の両方が、ＴＡＰ１の曝露されたサイトゾル性ＮＨ２部分およびＴＡＰ２の曝露されたＥＲ−内腔局在化ＮＨ２部分を残して、内在化された非切断シグナル配列を含有するので、本発明者らの合成構築物は、内因性のＴＡＰ１および／またはＴＡＰ２とは対照的に、コードされたベクターの示差的検出のために、一般に使用されるＮＨ２末端エピトープタグを取り込む。ＮＨ２末端ＴＡＰ１タグはＶ５であり、ＴＡＰ２についてのＮＨ２末端タグはＡＵ５である。市販の抗体を使用して、免疫沈降、イムノブロッティングおよび免疫蛍光によって、発現および細胞内局在化を検出した。
【０１６９】
ＴＡＰ１およびＭＴＩ−ＰＡＡの両方のタンパク質発現を、免疫沈降によって確認した（図２）。コドン最適化されたＴＡＰ２タンパク質発現には問題があり、本発明者らは、ネイティブヒトＴＡＰ２配列を使用してベクターを再創出している。免疫蛍光データは、抗Ｖ５抗体および抗ＴＡＰ１抗体の両方を使用して、ＴＡＰ１のサイトゾル性発現を実証している（図３）。ＭＴＩ−ＰＡＡの全長発現を特徴付ける対照実験もまた、アミノ末端を標的化する抗ＦＧＦ２  Ａｂ（データ示さず）およびＭＴＩ−ＰＡＡのＣ末端部分に対する抗ＶＳＶ  Ａｂ（図４）を使用する、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の免疫蛍光染色によって確認した。これらのデータは、ＭＴＩ−ＰＡＡが核に優勢に局在化することもまた実証している。図２は、ＭＴＩ−ＰＡＡ発現が、プロテアソーム（proteosomal）
阻害剤ＭＧ１３２（１０ｎＭ）の存在下で増強されることも示している。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からのＩＰデータもまた、ＭＧ１３２の存在下でのＭＴＩ−ＰＡＡの増加したレベル（図５）、ならびにＭＴＩ−ＰＡＡの４つ全ての予測された翻訳産物の検出（図５）を示している。
【０１７０】
（実施例３）
ポリ抗原アレイエピトープの発現および免疫認識
【０１７１】
図６は、ペプチド特異的Ｔ細胞（ペプチドワクチン接種されたマウス由来）が、ＰｏｌｙＳｔａｒｔ（商標）ＭＴＩ−ＰＡＡでトランスフェクトされた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＨＰ−１細胞を認識することを実証しており、免疫原性ペプチドの、ＰＡＡ駆動性の発現、プロセシングおよび提示を確認している。さらに、図７に示されるように、ＨＥＫのＰＡＡトランスフェクトされた細胞におけるＴＡＰ１の共発現は、Ｔ細胞による抗原認識に影響を与える。
【０１７２】
（実施例４）
マウスペプチド反応性
【０１７３】
Ｄｒｙｖａｘ（登録商標）を皮内ワクチン接種したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからのペプチド特異的Ｔ細胞応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴを使用して検出した。陽性応答は、ｐ＜０．０５で背景を上回るスポット計数における≧２倍の増加として定義され、複数のマウスにおいて一貫した反応性を示すペプチドは表１に示される。これら同じ７つのペプチドは、２つの異なる系統のＨＬＡ−Ａ２マウス（ＢＬ／６×Ｂａｌｂ／ｃ  Ｆ１背景でのキメラＡ２／Ｋｂ、およびＢＬ／６×ＣＢＡ  Ｆ１背景でのキメラＡ２／Ｄｄ）由来のＴ細胞によって認識され、天然痘免疫化後のこれらのペプチドの免疫学的妥当性における信頼を増加させた。
【表１】
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【０１７４】
（実施例５）
ペプチド免疫原性試験
【０１７５】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（ｎ＝３／群）を、表１に列挙した個々のペプチド１０ｕｇで２回免疫化した。Ａ２ペプチドを、１００ｕｇのＣｐＧ１８２６および１４０ｕｇのＨＢＶコア抗原（配列番号３１；ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）と共に、ＩＦＡ中に乳化させた。ペプチドパルスした標的細胞に対する免疫応答は、２回目のワクチン接種の４週間後に容易に検出可能であった（図８）。ペプチドの組合せで免疫化したマウスは、２回目の免疫化の４〜５ヶ月後に検出可能な応答を有した（図９）。個々のペプチドに対するＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答は、背景を上回る２から１９倍の範囲の増加であり、各ペプチドは、一貫した大きさの応答を示す（データ示さず）。これらの結果は、感染ヒト細胞系から同定されたエピトープに対する、首尾よく惹起されたＡ２拘束されたマウスＴ細胞応答を実証しており、従って、モデル系は、抗原プロセシングおよび天然のヒト感染症の提示を再現する。
【０１７６】
（実施例６）
ヒトワクチンにおけるマウスモデルエピトープの検証
【０１７７】
ペプチドプール（表１の７つ全てのペプチド）に対する免疫応答を、以前に１〜４年間天然痘ワクチンを受けていた８３人のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ陽性のヒト被験体において試験した。被験体の４２．２％（３５／８３）は、ペプチドプールに対して陽性のＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を有した（ｔ検定でｐ＜０．０５で、スポット計数≧背景ウェルの１．５倍）。応答は、背景を上回る１．５から６．２倍の範囲の増加であった。さらに、さらなる５４人のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ陽性被験体の２０．４％が、個体のうち１つまたは複数に対する検出可能な免疫応答を有した。一部のペプチドは、被験体のいずれによっても認識されなかったが、他のペプチドは、複数の被験体によって認識された（データ示さず）。これらの結果は、ヒトワクチンレシピエントによって認識される適切なペプチドを同定するためのＨＬＡトランスジェニックマウスの使用を支持している。
【０１７８】
（実施例７）
同定されたペプチドの効力
【０１７９】
マウス（ｎ＝５）に、ＩＦＡに乳化させた、４つのＣＴＬペプチド（表１の＃２２、＃２５、＃２８、＃３０）１４０μｇのＨＢＶ  Ｔヘルパーエピトープ、および１００μｇのＣｐＧ１８２６を、右側腹部に皮下でワクチン接種した。ワクチン接種していないマウス（ｎ＝５）は対照として機能した。免疫化の３週間後、マウスを、１×１０６ｐｆｕのワクシニアウエスタンリザーブで鼻腔内チャレンジした。生存、体重減少および病気の臨床症状を、毎日モニタリングした。その体重の２５％を喪失するマウスは安楽死させた。
【０１８０】
生存データを図１０に示す。ペプチドワクチン接種したマウスは、致死チャレンジから完全に防御された。対照的に、ワクチン接種していないマウスの全てが、重度の臨床症状（逆立った毛皮、猫背の姿勢、可動性の喪失）を発症し、そのうち８０％が、感染性チャレンジで死亡した。
【０１８１】
（実施例８）
さらなる病原体におけるエピトープ同定
【０１８２】
本開示の方法は、７つのＨＬＡクラスＩスーパータイプ（Ａ１、Ａ２、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４）および３つのＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子（Ｃｗ＊０４０１、Ｃｗ＊０６０２、Ｃｗ＊０７０２）由来の抗原性ペプチドエピトープをコードする核酸分子ワクチンを創出するために使用され得、このワクチンは、＞９６％の平均で世界中の集団にわたって防御し、ペプチド結合の混乱を考慮しなくても取得可能である。ＨＬＡクラスハプロタイプを決定するための頻度および資源は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるRobinsonら、Nucleic  Acids  Research  ４１巻：Ｄ１２２２〜Ｄ１２２７頁、２０１２年に記載されている。
【０１８３】
（実施例９）
ＨＥＲ２／ＮＥＵ＋がんワクチン組成物
【０１８４】
以下の実施例は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現乳がんなどの、ＨＥＲ２／ｎｅｕマーカータンパク質を過剰発現するがんを処置するための、ペプチドベースおよび核酸ベースの免疫化組成物を示す。
【０１８５】
コンピューターアルゴリズムによって生成されたまたはヒト患者試料を試験することによって同定された１つまたは複数のＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原性Ｔ細胞ペプチド配列を含有する組成物が調製される。例えば、コンピューターベースの予測は、８４のクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープのパネルを同定した（Kalliら、Cancer  Res  ６８巻：４８９３〜９０１頁、２００８年；Karyampudiら、Cancer  Immunol  Immunother  ５９巻：１６１〜７１頁、２０１０年）。４つのＨＬＡ−ＤＲエピトープを
含有するプールは免疫原性であり、天然にプロセシングされ、コーカサス人、アフリカ系アメリカ人およびアジア人の約８４％をカバーする（ハーディー・ワインベルグ平衡解析）。４つの個々のペプチドエピトープのアミノ酸配列は、ＮＬＥＬＴＹＬＰＴＮＡＳＬＳＦ（配列番号３２）、ＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱＲＬＲＩＶ（配列番号３３）、ＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬ（配列番号３４）およびＰＩＫＷＭＡＬＥＳＩＬＲＲＲＦ（配列番号３５）を含む。これら４つのＨＬＡ−ＤＲペプチドを含む組成物は、表題「A  Phase  I
Trial  of  a  Multi-Epitope  HER2/neu  Peptide  Vaccine  for  Previously  Treated  HER-2  Positive  Breast  Cancer」の第Ｉ相臨床試験においてさらに記載されている。試験では、５００ｕｇの各ペプチドが、乳がんおよび卵巣がん患者の最大約９０％において免疫応答を生じるのに十分である（Knutsonら、J.  Clinical  Invest  １０７巻
（４号）：４７７〜８４頁、２００１年；Disis  MLら、J  Clin  Oncol  ２０巻（１１
号）：２６２４〜３２頁）。
【０１８６】
ペプチドまたは核酸ワクチン組成物は、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩエピトープと組み合わせて、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ抗原性ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原性エピトープもまた含有し得る。例えば、組成物は、表題「Methods  and  materials  for  generating  CD8+  T-cells  having  the  ability  to  recognize  cancer  cells  expressing  a  Her2/neu  polypeptide」の米国仮特許出願第６１／６００，４８０号に記載さ
れるようなエピトープを含み得る。例示的なアミノ酸配列は、ＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤ（配列番号３６）（アミノ酸３７３〜３８２）である。
【０１８７】
ＨＬＡクラスＩ抗原性エピトープは、そのＮＨ２末端および／またはＣＯＯＨ末端において、１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸分伸長させることによって改変され得る。かかる伸長は、ユビキチン化を促進する配列を含み得る、細胞のプロテアソーム媒介性の分解経路を介したタンパク質分解性プロセシングに関与する、内因性に認識された天然にプロセシングされたポリペプチド配列を再現し得る。従って、プラスミドベースの核酸免疫化組成物は、対応するＤＮＡコード配列を取り込み得、この配列は、天然のＮＨ２末端および／またはＣＯＯＨ末端の伸長を反映する核酸配列を含み得、各ペプチドのコード配列間に位置付けられたリンカー領域を取り込み得る。
【０１８８】
例示的なワクチン接種戦略は、プライムおよびブーストとして投与すること、即ち、逐次的に、１つまたは複数を一連のペプチドワクチン組成物（複数可）で、その後、１つまたは複数を一連の核酸（例えば、プラスミドまたはウイルス）ワクチン組成物で送達すること、またはその逆である。一態様では、ペプチド免疫化組成物は、核酸免疫化組成物の投与の前に投与される。別の態様では、核酸免疫化組成物は、ペプチド免疫化組成物の投与の前に投与される。
【０１８９】
さらに、一部の患者は、ワクチン組成物を投与する前に、患者がシクロホスファミドまたは類似の組成物を、１週間経口で受け、その後１週間休薬し、次いで、もう１週間のシクロホスファミド処置を受ける場合、より良い転帰を有し得る。シクロホスファミド処置の約７〜１０日後、患者に、皮内、筋内または単離された細胞を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで、ワクチン接種する。ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ関連であり得、核酸は、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ抗原性細胞傷害性Ｔ細胞エピトープをコードし得る。
【０１９０】
コンピューターアルゴリズムまたはヒト患者試料を試験することから、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原性Ｔ細胞ペプチド配列を含有する組成物が調製される。ワクチン組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、１２５ｕｇ／注射）などのアジュバントを含み得る。
【０１９１】
（実施例１０）
葉酸受容体アルファおよびがんワクチン組成物
【０１９２】
この実施例は、葉酸受容体アルファ発現がんを処置するための、組み合わされたまたは逐次的に投与される核酸ベースの組成物およびペプチドベースの組成物を示す。
【０１９３】
葉酸受容体アルファは、いくつかのがん、例えば、卵巣がん、原発性腹膜がん、肺がん、子宮がん、精巣がん、結腸がん、腎がん、ＨＥＲ２／ｎｅｕ＋乳がんおよびトリプルネガティブ乳がんにおいて過剰発現される（Zhangら、Arch  Pathol  Lab  Med  １〜６頁
、２０１３年；Weitmanら、Cancer  Res  ５２巻：３３９６〜３４０１頁、１９９２年；O’Shannesstら、SpringerPlus  １巻（２２号）：１〜９頁、２０１２年；Kelemen,  Linda  E.  Int  J  Cancer  １１９巻：２４３〜２５０頁、２００６年；２０１３年７月
１６日発行の米国特許第８，４８６，４１２Ｂ２号）。
【０１９４】
一態様では、ワクチン組成物は、表題「A  Phase  I  Trial  of  the  Safety  and  Immunogenicity  of  a  Multi-epitope  Folate  Receptor  Alpha  Peptide  Vaccine
in  Combination  with  Cyclophosphamide  in  Subjects  Previously  Treated  for  Breast  or  Ovarian  Cancer」の第Ｉ相臨床試験において記載されるように、１つまたは複数の抗原性葉酸受容体アルファＨＬＡクラスＩＩおよび／またはＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドエピトープを含有する。１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ葉酸受容体アルファ抗原性Ｔ細胞ペプチドを含むワクチン組成物は、例えば、ペプチドＦＲ３０（アミノ酸配列ＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫ（配列番号３７））、ペプチドＦＲ５６（アミノ酸配列ＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴ（配列番号３８））、ペプチドＦＲ７６（アミノ酸配列ＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡ（配列番号３９））；ペプチドＦＲ１１３（アミノ酸配列ＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶ（配列番号４０））およびペプチドＦＲ２３８（アミノ酸配列ＰＷＡＡＷＰＰＬＬＳＬＡＬＭＬＬＷＬ（配列番号４１））を含み、任意選択で、１つまたは複数の同様に同定されたＨＬＡクラスＩ葉酸受容体アルファ抗原性Ｔ細胞ペプチドと共に製剤化され得る。１つまたは複数のクラスＩ抗原性Ｔ細胞エピトープが、ＨＬＡクラスＩＩエピトープの配列内に含有され得ることに留意されたい。例えば、クラスＩＩペプチドＦＲ５６、および葉酸受容体アルファペプチド２４５〜２５３のＨＬＡクラスＩエピトープを含有するＦＲ２３８のペプチド配列。組成物はまた、ＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントと共に製剤化され、および／またはシクロホスファミドもしくはデニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ）などの免疫調節性物質による事前の処置と組み合わされ得る。
【０１９５】
プラスミドベースの核酸免疫化組成物は、葉酸受容体アルファＨＬＡクラスＩＩおよび／またはＨＬＡクラスＩ抗原性Ｔ細胞ペプチドについての対応するＤＮＡコード配列を取り込む。ＤＮＡは、プロテアソーム媒介性分解のための天然に存在するプロテアーゼプロセシング部位を再現すると考えられる天然のＮＨ２末端および／またはＣＯＯＨ末端の伸長を反映する核酸配列を含み得る。さらに、ＤＮＡは、各ペプチドのコード配列間に位置付けられたリンカー領域を取り込み得る。
【０１９６】
合致したワクチン接種戦略は、ペプチドおよび核酸にコードされた配列が、同じがん関連ＴＡＡに由来する戦略である。合致したワクチン接種戦略は、それぞれの組成物をプライムおよびブーストとして投与すること、即ち、逐次的に、一連の葉酸受容体アルファ抗原性Ｔ細胞ペプチドワクチン組成物（複数可）のうち１つまたは複数を、その後、１つまたは複数を一連の葉酸受容体アルファペプチド由来の核酸ワクチン組成物（例えば、プラスミドまたはウイルス）で送達することを含む。一態様では、ペプチド免疫化組成物は、核酸免疫化組成物の投与の前に投与される。別の態様では、核酸免疫化組成物は、ペプチド免疫化組成物の投与の前に投与される。ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ関連であり得、核酸は、１つまたは複数のＨＬＡ−クラスＩ抗原性細胞傷害性Ｔ細胞エピトープをコードし得る。
【０１９７】
さらなるがんＴＡＡが、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（Kalliら、Cancer  Res  ６８巻（１２号）：４８９３〜４９０１頁、２００８年；）、癌胎児性抗原（Karyampudiら、Cancer  Immunol  Immunother  ５９巻（１号）：１６１〜１７１頁、２０１０
年）ならびにＰＤ−１アンタゴニスト（Krempskiら、J  Immunol  １８６巻（１２号）：６９０５〜６９１３頁、２０１１年）から誘導された抗原性Ｔ細胞ペプチドを含むワクチン組成物中に含まれ得る。
【０１９８】
コンピューターアルゴリズムまたはヒト患者試料を試験することから、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原性Ｔ細胞ペプチド配列を含有する組成物が調製される。ワクチン組成物は、ＧＭ−ＣＳＦ（例えば、１２５ｕｇ／注射）などのアジュバントを含有し得る。さらに、一部の患者は、ワクチン組成物を投与する前に、患者がシクロホスファミドまたは類似の組成物を、１週間経口で受け、その後１週間休薬し、次いで、もう１週間のシクロホスファミド処置を受ける場合、より良い転帰を有し得る。シクロホスファミド処置の約７〜１０日後、患者に、皮内、筋内または単離された細胞を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで、ワクチン接種する。
【０１９９】
上記種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。２０１４年３月１７日出願の米国特許出願第６１／９５４，５８８号が含まれるがこれに限定されない、本明細書で言及されるおよび／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、なおさらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるために、改変され得る。
【０２００】
これらおよび他の変化が、上に詳述した説明に照らして、実施形態に対してなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に特許請求の範囲を限定すると解釈すべきでなく、かかる特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に、全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。従って、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
（項目１）
多重翻訳開始（ＭＴＩ）配列と、抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せをコードする核酸分子とを含むキメラ核酸分子であって、該ＭＴＩは、該抗原、抗原性エピトープまたはそれらの組合せの翻訳開始を媒介する少なくとも１つの非ＡＵＧ翻訳開始部位を含む、キメラ核酸分子。
（項目２）
前記ＭＴＩ配列が、配列番号１〜６のうちいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列である、項目１に記載のキメラ核酸分子。
（項目３）
前記核酸分子が、約２から約１０の範囲の複数の抗原をコードする、項目１または２に記載のキメラ核酸分子。
（項目４）
前記複数の抗原のうち２つまたはそれ超が、スペーサーによって分離されている、項目３に記載のキメラ核酸分子。
（項目５）
前記スペーサーが（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎが、１から５の整数である、項目４に記載のキメラ核酸分子。
（項目６）
前記複数の抗原のうち２つまたはそれ超が、切断部位によって分離されている、項目３〜５のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目７）
前記切断部位が、参照タンパク質中に見出される抗原性ペプチドに対してアミノ末端側の約２から約１０アミノ酸、該参照タンパク質中に見出される該抗原性ペプチドに対してカルボキシ末端側の約２から約１０アミノ酸、自己切断性アミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを含む、項目６に記載のキメラ核酸分子。
（項目８）
前記自己切断性アミノ酸配列が、ブタテッショウウイルス−１由来の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、口蹄疫ウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）またはそれらの任意の組合せである、項目６に記載のキメラ核酸分子。
（項目９）
前記抗原または抗原性エピトープが、ＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチド、ＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを有するＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチド、またはそれらの任意の組合せである、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目１０）
前記抗原または抗原性エピトープが、はめ込まれたＨＬＡクラスＩ抗原性ペプチドを含むＨＬＡクラスＩＩ抗原性ペプチドである、項目９に記載のキメラ核酸分子。
（項目１１）
前記抗原または抗原性エピトープが、病原体由来である、または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目１２）
前記病原体が、ウイルス、寄生生物または細菌である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目１３）
前記ウイルスが、天然痘ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルスまたはエボラウイルスである、項目１２に記載のキメラ核酸分子。
（項目１４）
前記インフルエンザが、インフルエンザ株Ｈ７Ｎ９（鳥インフルエンザ）、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ８、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７またはＨ１Ｎ１である、項目１３に記載のキメラ核酸分子。
（項目１５）
前記細菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａである、項目１２に記載のキメラ核酸分子。
（項目１６）
前記Ｅ．ｃｏｌｉが、Ｅ．ｃｏｌｉ株０１５７：Ｈ７、ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＨＥＣまたはＥＡＥＣである、項目１５に記載のキメラ核酸分子。
（項目１７）
配列番号７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、項目１３に記載のキメラ核酸分子。
（項目１８）
前記ＴＡＡが、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、炎症性乳がん、卵巣がん、子宮がん、結腸直腸がん、結腸がん、原発性腹膜がん、精巣がん、腎がん、黒色腫、神経膠芽腫、肺がんまたは前立腺がんと関連する抗原である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目１９）
前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質、葉酸受容体−αタンパク質、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＩ３Ｋ、ＢＲＡＦ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ゴナドトロピン放出ホルモン１（ＧＮＲＨ１）、がん／精巣抗原１Ａ（ＣＴＡＧ１Ａ）、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２、ＰＤ−１アンタゴニスト、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３またはマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）由来である、項目１１に記載のキメラ核酸分子。
（項目２０）
前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、葉酸受容体−α抗原またはそれらの組合せを含む、項目１９に記載のキメラ核酸分子。
（項目２１）
前記ＴＡＡが、配列番号６９〜９３もしくは１１７〜１３５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはそれらの任意の組合せを有する、項目１９に記載のキメラ核酸分子。
（項目２２）
前記核酸分子が、配列番号９７、９８、１３６のうちいずれか１つ、またはそれらの任意の組合せに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２３）
前記核酸分子が、配列番号６７、６８、１１５、１１６のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する抗原をコードする、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２４）
配列番号５２、５７、５８、１００、１３７、１３９、１４１、１４５または１４９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、項目１９または２０に記載のキメラ核酸分子。
（項目２５）
ＴＡＰタンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目２６）
前記ＴＡＰタンパク質が、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＴＡＰＬまたはそれらの任意の組合せである、項目２５に記載のキメラ核酸分子。
（項目２８）
前記ＴＡＰタンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号２０６〜２１０のうちいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組合せを有する、項目２６〜２８のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子。
（項目３０）
前記項目のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子を含むベクター。
（項目３１）
発現ベクターである、項目３０に記載のベクター。
（項目３２）
前記発現ベクターが、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含む、項目３１に記載のベクター。（項目３３）
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、肝炎ウイルス、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群ウイルス、レンチウイルスまたはスプーマウイルスから選択される、項目３２に記載のベクター。
（項目３４）
項目１〜２９のいずれか一項に記載のキメラ核酸分子を含む細胞。
（項目３５）
項目３０〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
（項目３６）
第１の被験体から取得された自家細胞または該第１の被験体とは異なる被験体由来の同種細胞である、項目３４または３５に記載の細胞。
（項目３５）
抗原提示細胞である、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３６）
樹状細胞である、項目３４〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目３７）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子、項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされる抗原、またはその両方を含む免疫化組成物の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法。
（項目３８）
前記免疫化組成物が、核酸免疫化組成物を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記免疫化組成物が、抗原またはポリ抗原免疫化組成物を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記核酸免疫化組成物および前記抗原免疫化組成物が両方とも投与される、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記抗原免疫化組成物が最初に投与され、前記核酸免疫化組成物が２番目に投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記核酸免疫化組成物が最初に投与され、前記抗原免疫化組成物が２番目に投与される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記核酸免疫化組成物および前記抗原免疫化組成物が、並行して投与される、項目４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記免疫化組成物が、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の細胞を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
前記細胞性免疫応答が、抗原特異的Ｔ細胞応答である、項目３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体がヒトである、項目３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子または項目３０〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞の有効量を被験体に投与し、それによって細胞性免疫応答を惹起し、それによって細胞性免疫応答を惹起するステップを含む、方法。
（項目４２）
前記細胞が、自家または同種である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記細胞が抗原提示細胞である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記被験体がヒトである、項目４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子のうちいずれか１つによってコードされる１つまたは複数の抗原を含む抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、および（ｂ）項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子または項目３０〜３３のいずれか一項に記載のベクターを含む核酸分子免疫化組成物の有効量を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目４７）
ステップ（ｂ）の前記核酸分子免疫化組成物が、複数の抗原をコードする、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ａ）の前記抗原免疫化組成物が、複数の抗原を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記核酸分子が、ステップ（ａ）において使用される前記１つまたは複数の抗原と同じタンパク質由来の１つまたは複数の抗原をコードする、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４７）
前記核酸分子免疫化組成物の前記核酸分子が、ステップ（ａ）において使用される前記１つまたは複数の抗原と同じ抗原のうち１つまたは複数をコードする、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）と同時に実施される、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）と逐次的に実施される、項目４６または４７に記載の方法。
（項目５０）
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の１時間から８週間後に実施される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
ステップ（ａ）が、ステップ（ｂ）の１時間から８週間後に実施される、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
（ｃ）抗原免疫化組成物の第２の有効量を前記被験体に投与するステップをさらに含み、該抗原性ペプチド免疫化組成物が、（ａ）において使用される前記抗原性ペプチドと同じタンパク質に由来するペプチドを含む、項目４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
ステップ（ｃ）の前記抗原免疫化組成物が、（ａ）において使用される前記抗原免疫化組成物と同じである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
細胞性免疫応答を惹起する方法であって、（ａ）項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップ、（ｂ）初期免疫応答を生じるのに十分な時間を与えるステップ、および（ｃ）項目１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の第２の有効量、または抗原免疫化組成物の有効量を該被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目５５）
前記抗原免疫化組成物が、ステップ（ａ）の前記核酸分子によってコードされる前記抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５５）
前記核酸分子免疫化組成物の前記核酸分子が、（ｃ）において使用されるのと同じ抗原性ペプチドのうち１つまたは複数をコードする、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
初期免疫応答を生じるのに十分な前記時間が、ステップ（ａ）の後１時間から８週間である、項目５４または５５に記載の方法。
（項目５７）
（ｄ）抗原免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップをさらに含み、該抗原免疫化組成物が、（ｃ）において使用される前記抗原と同じタンパク質由来である１つまたは複数の抗原を含む、項目５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記抗原免疫化組成物が、（ｃ）において使用される前記抗原を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記被験体がヒトである、項目４６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
補助的療法を施すステップをさらに含む、項目３７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記補助的療法が、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの組合せである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記補助的療法がシクロホスファミドである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
乳がんを処置する方法であって、項目２１に記載のキメラ核酸分子を含む核酸分子免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目６４）
補助的療法を施すステップをさらに含む、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記補助的療法が、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法またはそれらの任意の組合せである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記抗体療法が、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはその両方を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
がんを処置する方法であって、項目１〜１１および１９〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む核酸免疫化組成物の有効量を被験体に投与するステップを含み、該核酸分子によってコードされる前記１つまたは複数の抗原が、該被験体において同定された発癌性変異を有する抗原を含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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