(57)【要約】      （修正有）【課題】ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオン、及びその効率的な培養方法、分離方法の提供。【解決手段】植物または食品に溶媒を添加して振盪させながら発生する気化ガスを収集した後、濾過および遠心分離を介して前記気化ガスに含まれたルテリオンを分離する。前記ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含む、または糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。【選択図】図１
2019205467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記で選択された一つ以上の特性を有するルテリオン：
（ａ）５０〜８００ｎｍの原形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンド
リアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造
を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。
【請求項２】
ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃ
ｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、および
ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で構成される群から選択される一つ以
上の染色剤で染色する場合、陽性に染色される特性を有することを特徴とする請求項１に
記載のルテリオン。
【請求項３】
下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８
〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。
【請求項４】
前記植物は、表１〜４で選択される薬用植物であることを特徴とする請求項３に記載の
分離方法。
【請求項５】
前記植物は、当帰、漆皮およびキウィで構成された群から選択されることを特徴とする
請求項３に記載の分離方法。
【請求項６】
前記段階（ａ）の振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体
を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することを特徴とする請求
項３に記載の分離方法。
【請求項７】
前記振盪抽出は、８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間バブリングし
て植物または食品のルテリオンがかたまらないようにすることを特徴とする請求項６に記
載の分離方法。
【請求項８】
前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含むことを特徴
とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項９】
前記遠心分離は、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われることを特
徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項１０】
前記段階（ｃ）は、遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照
射して運動性を有して集まるルテリオン粒子を分離すること、またはルテリオン表面抗原
ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２を認知する結合体との結合の有無を確
認してルテリオン粒子を分離することを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項１１】
前記分離されたルテリオン粒子を５０ｎｍフィルターで濾過した後、フィルターにかか
った部位を収集する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項１２】
２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００ｎｍのフィルターを
順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、
６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオンに分類することを
さらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の分離方法。
【請求項１３】
ｐＨ７以下および０℃以下の条件で固定させる段階をさらに含むことを特徴とする請求
項３に記載の分離方法。
【請求項１４】
ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で固定させる段階をさらに含むことを特徴とする請求
項３に記載の分離方法。
【請求項１５】
２５，０００〜３５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｓｑｕａｒｅ  ｉｎｃｈ）
以上の圧力を加えて分裂を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の
分離方法。
【請求項１６】
ｐＨ１〜３および１０〜２０℃で分裂を誘導して増殖させる段階をさらに含むことを特
徴とする請求項３に記載の分離方法。
【請求項１７】
下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体または
アプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および
（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。
【請求項１８】
（ｃ）粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階をさらに含むこ
とを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項１９】
前記ルテリオンを含有する抽出物は、植物抽出物または食品抽出物であることを特徴と
する請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２０】
前記ルテリオンを含有する抽出物は、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（ｉｉ）植
物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒存在下に植物または食品の加熱によっ
て発生するガスの凝縮液であることを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方
法。
【請求項２１】
前記凝縮液は、下記段階を経て製造されたことを特徴とする請求項２０に記載の分離方
法：
（ａ）植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリ
ングしながら振盪する段階；および
（ｂ）前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて凝縮液を
取得する段階。
【請求項２２】
前記ルテリオン表面抗原は、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２である
ことを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２３】
前記粒子は、磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維
粒子および蛍光粒子で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の
ルテリオンの分離方法。
【請求項２４】
前記磁性粒子は、鉄、アルミニウム、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カド
ミウム、マグネシウム、銅、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成され
た群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２５】
前記磁性粒子は、炭素および抗体またはアプタマー結合のための官能基で二重コーティ
ングされたことを特徴とする請求項２３に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２６】
前記官能基は、アミド基（ａｍｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒ
ｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）およびカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙ
ｌ  ｇｒｏｕｐ）で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のル
テリオンの分離方法。
【請求項２７】
前記粒子の大きさは、１０〜１，０００ｎｍであることを特徴とする請求項１７に記載
のルテリオンの分離方法。
【請求項２８】
前記粒子は、磁性ナノ粒子であり、前記（ｂ）段階は、外部から磁力を加えてルテリオ
ンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収することを特徴とする請求項１７に記載の
ルテリオンの分離方法。
【請求項２９】
前記粒子は、蛍光粒子であり、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーターを利用してル
テリオンが結合された蛍光粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオ
ンの分離方法。
【請求項３０】
前記粒子は、静電気を帯びた粒子であり、前記（ｂ）段階は、不均一な電場を形成して
静電気的引力でルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記
載のルテリオンの分離方法。
【請求項３１】
前記粒子は、イオン性粒子であり、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリ
オンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１７に記載のルテリオンの分離
方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０
℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
【請求項３３】
請求項１に記載のルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増
殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
【請求項３４】
前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラク
トース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）またはキシロース（
ｘｙｌｏｓｅ）であることを特徴とする請求項３３に記載の培養方法。
【請求項３５】
前記培養前および後のルテリオンの大きさは、それぞれ５０〜２００ｎｍおよび３００
〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項３２または請求項３３に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオン、これの分離方法および培養
方法に関し、具体的には特定の大きさの空隙を有するフィルターを利用してルテリオンを
分離する方法、このような方法によって分離された特定特性を有するルテリオンおよびこ
れを増殖させる培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の発明者等は、患者または健常者で既排出された体液内に存在する微細物質であ
るルテリアルを効果的に分離できる方法を開発して、分離されたルテリアルの特性を解明
した内容を２０１４年５月９日付で特許出願した（ＷＯ２０１５／１０８２４６）。また
、患者で既排出された体液内に存在する微細物質の特性を観察することによって疾病を診
断および予測できることを発見してこれに対する内容を２０１４年１月１４日付で特許出
願した（ＷＯ２０１５／００５５５３）。
【０００３】
このようなルテリアルは、（１）原核細胞と真核細胞の中間段階融合特性を有する細胞
または細胞類似体であって；（２）血液、精液、腸液、唾液、細胞液などの体液に存在し
て；（３）免疫蛍光試験でヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）、アクリジ
ンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、およびローダミン１２３（Ｒｈｏｄａ
ｍｉｎｅ１２３）に陽性の発色反応を示して；（４）最適状態（ｐＨ７．２〜７．４）で
はベータ−プロテオバクテリアとガンマ−プロテオバクテリア由来遺伝子の発現特性を示
して、３０〜８００ｎｍの大きさを有し；（５）酸性化状態ではベータ−プロテオバクテ
リアとガンマ−プロテオバクテリア由来遺伝子だけでなく、真核細胞由来遺伝子の発現特
性を示すが、主にＳｔｅｒｐｔｏｐｈｙｔａ遺伝子とＨｏｍｏｌｏｇｕｅ特徴が現れて、
４００ｎｍ以上から２０００ｎｍ以上まで大きくなって；（６）正常条件でＡＴＰ生成に
関与し；および（７）ミトコンドリアとは異なり、エクソソームとは全く違う細胞または
細胞類似体である。
【０００４】
このようなルテリアルは主にヒトを含む動物の血液内に存在するのに対して、ルテリア
ルと類似の構造と機能を有する微細物質である主に植物または食品に存在するルテリオン
（Ｌｕｔｅｒｉｏｎ）の存在を確認した。
【０００５】
このような技術的背景下、本出願の発明者は、ルテリオンを臨床に適用することができ
るように効果的に分離および培養するために鋭意努力した結果、植物または食品に溶媒を
添加して振盪させながら発生する気化ガスを収集した後、濾過および遠心分離を介して前
記気化ガスに含まれたルテリオンを効果的に分離することができて、これから分離したル
テリオンを特定条件および培地の中から培養する可能性があることを確認して、本発明を
完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ルテリオンを提供するところにある。
本発明の他の目的は、特定の大きさの空隙を有するフィルターを利用してルテリオンを
臨床に適用することができるように効果的に分離する方法を提供するところにある。
本発明のさらに他の目的は、ルテリオンの効率的な培養方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は、下記で選択された一つ以上の特性を有するルテ
リオンを提供する：
（ａ）５０〜８００ｎｍの円形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンド
リアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造
を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。
【０００８】
本発明はまた、下記の段階を含むルテリオンの分離方法を提供する：
（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８
〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。
【０００９】
本発明はまた、下記の段階を含むルテリオンの分離方法を提供する：（ａ）ルテリオン
を含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定
された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および（ｂ）前記粒子に
結合されたルテリオンを回収する段階。
【００１０】
本発明はまた、前記ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３
０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、前記ルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で
増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ルテリオンを共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）で撮影した写真で、その大きさを共に示したものである。
【図２】ルテリオンをミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。
【図３】ルテリオンをローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）で染色した後、その発色有無を観察した写真を示したものである。
【図４】ルテリオンの蛍光／非蛍光写真を比較して示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂ）  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３）  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）  Ｒｅｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。
【図５】ルテリオンがローダミン１２３、ミトトラッカーレッド、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）によって共通して染色した後、その発色有無を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂ）  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３）  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）  Ｒｅｄ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；Ｄ：無染色）。
【図６】ルテリオンの蛍光染色部位の大きさを測定してルテリオンの大きさ（５０〜８００ｎｍ）を示したものである（Ａ：ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂ）反応大きさ測定；Ｂ：ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３）反応大きさ測定；Ｃ：ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）  Ｒｅｄ  反応大きさ測定；Ｄ：無染色反応大きさ測定）。
【図７】正常なルテリオンのｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａと突然変異されたルテリオンのｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｂを示したものである。
【図８】ルテリオンが二重膜構造を有することを確認したＴＥＭ電子顕微鏡写真である。
【図９】ルテリオンが内部に核酸を含有することを確認した原子顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】ルテリオンの内部にＲＮＡが含まれているか否かを分析したバイオアナライザー結果である（Ｌ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；１：５０ｎｍ以下、２：５０〜１００ｎｍ、３：１００〜２００ｎｍ、４：２００〜４００ｎｍ）。
【図１０Ｂ】２００〜４００ｎｍのルテリオンの全体ＲＮＡを示したものである。
【図１１】５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。
【図１２】１５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。
【図１３】３５，０００ｐｓｉおよび１０−２０℃条件でルテリオンの分裂誘導結果を示したものである。
【図１４】ルテリオンをＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で蛍光染色して核内にルテリオンが導入される結果を示したものである。
【図１５−１６】赤色蛍光で蛍光染色されたルテリオンが細胞内核に導入されることを拡大して確認した結果を示したものである。
【図１７】蛍光染色されたルテリオンを経口胃管投与した結果を示したものである。
【図１８−１９】蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注射した結果を示したものである。
【図２０】ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌）におけるテロメラーゼ活性を示したものである。
【図２１】ルテリオン処理濃度に応じた正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および様々な癌細胞（肺癌、乳癌、大腸癌、肝臓癌、白血病）の細胞生存能を示したものである。
【図２２】多様な由来のルテリオンを処理したすい臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１）における細胞増殖抑制を示したものである。
【図２３】多様な由来のルテリオンを処理したすい肺癌細胞株（Ａ５４９）における細胞増殖抑制を示したものである。
【図２４】多様な由来のルテリオンを処理したすい乳癌細胞株（ＢＴ−２０）における細胞増殖抑制を示したものである。
【図２５】ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）におけるテロメラーゼ活性を示したものである。
【図２６】ルテリオン処理によるＡＴＰ生成および抑制の有無を確認するためのＡＴＰアッセイデザインに対する模式図である。
【図２７】Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）でルテリオンを撮影した結果を示したものである。
【図２８】Ｂｒｕｋｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｃａｎ  ＡＦＭ原子顕微鏡でルテリオンを撮影した結果を示したものである。
【図２９】ルテリオンを抗−ＣＤ３９抗体結合およびミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、ＤＡＰＩによって共通的に染色した後、その発色有無をそれぞれまたは併合して示したものである。
【図３０】ルテリオンを抗−ＣＤ７３抗体結合およびミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、Ｈｏｅｃｈｓｔによって共通的に染色した後、その発色有無をそれぞれまたは併合して示したものである。
【図３１】ルテリオンが、抗−ＣＤ３３２抗体に陽性であるか否かを蛍光発光を介して確認した結果を示したものである。
【図３２】ルテリオンが、抗−ＣＤ１３３抗体に陽性であるか否かを蛍光発光を介して確認した結果を示したもので、上段はＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）蛍光染色した結果を示して、下段は抗−ＦＩＴＣで蛍光染色した結果を示したものである。
【図３３】ルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子に炭素、カルボキシル基コートをする段階を示したものである。
【図３４】ルテリオンと磁性粒子が固定されたルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が結合された複合体を磁石を使用して分離する段階を示したものである。
【図３５】ルテリオン分離後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示し、（ａ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｂ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を利用した分離方法を使用して分離した後、蛍光顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｃ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、電子顕微鏡で撮影した写真を示したもので、（ｄ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を使用した分離方法を使用して分離した後、電子顕微鏡で撮影した写真を示したものである。
【図３６】ルテリオンの抽出数水を示し、（ａ）はルテリオンをナノフィルターを使用して分離した後、ルテリオンの抽出数水を示したもので、（ｂ）はルテリオンをルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を利用した分離方法を使用して分離した後、ルテリオンの抽出数水を示したものである。
【図３７】ルテリオンの抽出段階を具体的に図示した模式図である。
【図３８】ルテリオン処理による癌細胞におけるＡＴＰ生成減少を示したものである。
【図３９】ルテリオン処理による正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）におけるＡＴＰ生成を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用
語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味
を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本
技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００１４】
本発明で使用する用語「ルテリアル（ｌｕｔｅｒｉａｌ）」および「ルテリオン（ｌｕ
ｔｅｒｉｏｎ）」とは、動物および植物を含むすべての生命体に存在する５０〜４００ｎ
ｍ大きさのナノ生命体で、ウイルスと類似する程度から融合時８００〜１２００ｎｍまで
の大きさを有する反面、１２００ｎｍ以上で遺伝子異常および病理現象を発現する変異体
に分類される微細物質を本発明者が命名したものである。
【００１５】
ルテリアルおよびルテリオンは、ＤＮＡとＲＮＡを含み、運動性と付着性を有する点で
エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）や微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とは区別さ
れる。ミトコンドリアは、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）および蛍光
染色であるローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ
ｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、およびＤ
ＡＰＩによって発色が確認されるが、前記ルテリオンおよびルテリアルもミトコンドリア
と同じ染色剤によって発色が確認されて（図１〜図６）、ミトコンドリアと類似して二重
膜を有する膜構造として内部クリステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を完成しなかった状態の構
造を有して（図７）、ミトコンドリアと同じレーザー波長範囲で観察される点で「類似ミ
トコンドリア」、「ミトコンドリア類似体」あるいは「ミトコンドリア前駆体（ｐｒｏｔ
ｏ−ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）」とも称してもよい。
【００１６】
ルテリアルは、生態系で宿主体内に存在するナノ生命体を意味して、ヒトを含む動物の
場合には、血液、唾液、リンパ管、精液、膣液、母乳（特に、初乳）、臍帯血、脳細胞、
脊髄、骨髄に存在することができる。一方、ルテリオンは宿主が食べ物などとして使用で
きるナノ生命体を意味して、植物や食品に主に存在することができる。
【００１７】
ルテリオンは、血液由来ルテリアルとは違って室温でも速く溶解したり消滅はせず、長
期間保管しても融合（ｆｕｓｉｏｎ）して突然変異化されない特性がある。
【００１８】
一観点において、本発明は、下記で選択された一つ以上の特性を有する分離されたルテ
リオンに関する：
（ａ）５０〜８００ｎｍの円形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンド
リアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造
を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。
【００１９】
本発明の一実施例によると、ルテリオンは生命因子（ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ
）として、ウイルスと類似する程度から約５００ｎｍまで（正常分裂段階５０〜５００ｎ
ｍ／異常融合段階８００ｎｍ以上）の大きさを有する微細物質を本発明者が命名したもの
である。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み、運動性を有する点で微小胞（ｍｉｃｒｏｖ
ｅｓｉｃｌｅ）とは区別される。また、自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）お
よび光合成の特性を有する。ミトコンドリアは蛍光染色剤であるローダミン１２３（Ｒｈ
ｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレ
ンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎ
ｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）により発色が確認されるが、ルテリオンもミトコンドリアと同じ
前記染色剤によって発色が確認されるので、前記染色剤によってルテリオンが正しく分離
されたか確認することができる（図１〜図６）。
【００２０】
また、ＤＡＰＩおよびアクリジンオレンジ（ＡＯ）染色法によってルテリオン内にＲＮ
ＡだけでなくＤＮＡも含まれていることを確認することができる。具体的に、ＲＮＡはア
クリジンオレンジ染色剤によって励起４６０ｎｍ、放出が６５０ｎｍであるｌｅｖｅｌで
オレンジに染色されて、ＤＮＡは、励起５０２ｎｍ、放出が５２５ｎｍであるｌｅｖｅｌ
で緑色に染色されて、ＤＡＰＩ染色法によると、ＤＮＡが含まれていることを確認するこ
とができる。本発明のルテリオンは、前記染色法を利用してルテリオン内にＲＮＡとＤＮ
Ａが含まれていることを確認することができる。
【００２１】
本発明の一実施例では、ルテリオンの構造を確認した結果、二重膜または多重膜を有す
ることを確認することができ（図８）、ルテリオンの内部に核酸、特にＲＮＡを含有する
ことを確認した（図９および図１０）。
【００２２】
従来、植物または食品内にルテリオンが存在する事実が知られていなかったため、ルテ
リオンの分離方法や培養する方法に対する技術は皆無であると言える。本発明によるとル
テリオンを効果的に分離・培養する方法を提供することができる。
【００２３】
他の観点において、本発明は、下記の段階を含むルテリオンの分離方法に関する：（ａ
）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１
．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；（ｂ）前記濾過された凝縮
液を遠心分離する段階；および（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離
する段階。
【００２４】
まず、前記段階（ａ）は、植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取
得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階で
ある。
【００２５】
一実施例で、前記振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体
を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することができる。本発明
で使用されるルテリオンはその密度が１以下で脂肪および地質よりは高い密度を有してタ
ンパク質よりは低い密度を示すので、水蒸気蒸留法によって植物または食品から分離する
ことができるが、これに限定されない。
【００２６】
５０〜９０℃の気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪すると、ルテリオン
が気体と共に水蒸気またはガス形態で遊離されるが、水蒸気またはガスと共に振盪すると
、ルテリオンを含む植物または食品の沸点が落ちるようになって、ルテリオンの分解、変
質または損傷を防ぐことができる。
【００２７】
場合により、前記（ａ）段階で８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間
バブリングして植物または食品のルテリオンがかたまらないようにする段階を追加で行う
ことによって、ルテリオンの分離効率を増加させることができる。
【００２８】
前記段階（ａ）における抽出−濾過に対する具体的内容は図３７に示した。植物または
食品に溶媒、例えば蒸溜水を添加して、振盪を介して抽出した後、約１００−２５０ｇ、
好ましくは１９０ｇで一次遠心分離してスピンダウンして不純物を除去して、約１０００
−５０００ｇ、好ましくは約３０００ｇで二次遠心分離して数分〜数十分（好ましくは二
時間内外）の間安定させた後、上澄み液を収集することができる。場合により、この時Ｃ
Ｄ３３２を染色して運動性を確認した後、ルテリオンの存在の有無を一次的に確認するこ
とができる。以後、純粋なルテリオンを得るために１００，０００−１５０，０００ｇ、
好ましくは１２０，０００ｇで三次遠心分離する段階を行うことができる。
【００２９】
以後、約８００ｎｍのフィルターで濾過された下層部を収集して、プラズマなど内部植
物またはエクソソームなど細胞死骸（Ｄｅｂｒｉｓ）ペレットを除去する。以後、再び１
４０，０００ｇ以上で遠心分離してペレットが含まれない上澄み液を収集することができ
る。上澄み液を４００ｎｍのフィルターで濾過して下層部を収集した後、再びＣＤ３３２
を染色して運動性を確認することができる。さらに、５００ｎｍのフィルターで濾過して
、フィルターの上にかかった上澄み液を集めてルテリオンを収集することができ、ｐＨ１
または−９０℃以下の温度で保存することができる。
【００３０】
一実施例で、前記植物は表１〜４で選択された薬用植物を使用することができる。ルテ
リオンはすべての植物に存在するので、表１〜４に記載された薬用植物に制限されない。
【００３１】
【表１】
2019205467.tif 000003
【００３２】
【表２】
2019205467.tif 000004
【００３３】
【表３】
2019205467.tif 000005
【００３４】
【表４】
2019205467.tif 000006
【００３５】
また、植物に含まれたルテリオンは植物の幹の方に多量分布すると予想され、幹の部分
を含んでルテリオンを分離することが好ましい。
【００３６】
前記凝縮液は、前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させ
て取得することができる。捕集された気化水蒸気またはガスと分離された状態のルテリオ
ンを取得したり、これと混合された状態のルテリオンを取得することができ、気化水蒸気
またはガスとルテリオンが混合された場合、別の分離手順を追加で経てルテリオンを取得
することができる。
【００３７】
場合により、前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含
んでもよい。例えば、ＩＲ光線を２０〜６０分、好ましくは３０〜４０分照射してルテリ
オンが変形されることを防止できて、段階（ｃ）を行う前にＩＲ光線照射によって運動性
を有するルテリオンが集まるようにすることによって高濃度のルテリオンが取得できるよ
うにする。
【００３８】
前記段階（ｂ）は、０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して前記取得
された凝縮液を濾過する段階である。０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターは、
ルテリオンの長径を考慮して本出願の発明者によって導き出された最適な大きさで、これ
により前記（ａ）段階で取得された凝縮液中目的とするルテリオン含有溶液を濾過するこ
とができる。
【００３９】
前記段階（ｃ）は、前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階である。これにより、さ
らに純度の高いルテリオンを取得することができる。前記遠心分離は、１２００〜５００
０ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われるが、純度向上のためのいかなる遠心分離条件で
も調整して適用できる。
【００４０】
前記段階（ｃ）は、遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階である。例
えば、前記遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照射して運動
性を有して集まるルテリオン粒子を分離したり、ルテリオン表面抗原ＣＤ３３２、ＣＤ１
３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を認知する結合体との結合の有無を確認してルテリオン粒
子を分離することができるが、これに制限されない。
【００４１】
このように段階（ｃ）を介してルテリオンを分離した以後にも、分離されたルテリオン
粒子を５０ｎｍ未満の空隙を有するフィルターで濾過した後、フィルターにかかった部位
を収集してフィルターにかかったルテリオンだけを分離することもできる。前記過程を介
してルテリオン以外の微細物質は除去することができ、５０ｎｍ以上の大きさを有するル
テリオンを取得することができる。
【００４２】
場合により、追加で２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００
ｎｍのフィルターを順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４
００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオ
ンに分類することができる。本発明に係るルテリオンは、暗視野顕微鏡または共焦点顕微
鏡を介して観察が可能で、それぞれ２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍおよび８００ｎ
ｍのフィルターを順次利用して大きさにより５０−２００ｎｍ（発生期）／２００−４０
０ｎｍ（成熟期）／４００−６００ｎｍ（分裂期）／６００−８００ｎｍ（過分裂期）に
区分することができる（図２７および図２８）。
【００４３】
以後、特定ｐＨ条件および温度条件でルテリオンを保存する段階を追加で含むことがで
きる。例えば、ｐＨ７以下および０℃以下の条件で保存することができる。好ましくは、
ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で保存することができる。本発明の一実施例で、特にｐ
Ｈ１〜３の条件で０℃以下の温度で保存する場合、運動性を有するルテリオンを保存する
ことができることを確認した。ルテリオンを保存すると分離効率を向上させることができ
る。
【００４４】
また、追加増殖段階、例えば分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）誘導段階を含むことができる。２
５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｓｑｕａｒｅ  ｉｎｃｈ）以上の圧力を加えて
分裂を誘導することができるが、本発明の一実施例で、特に２５，０００〜３５，０００
ｐｓｉの圧力を加えると、分裂が誘導されることを確認した。この時、温度は１０〜２０
℃に維持し、保存時使用したｐＨ１〜３条件を維持した。
【００４５】
他の観点において、本発明は、下記の段階を含むルテリオンの分離方法に関するもので
ある：（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体
またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；
および（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。
【００４６】
本発明ではルテリオン表面に特異抗原が発現することに基づいて大量のルテリオンを効
率的に分離しようと前記特異抗原に対する抗体またはアプタマーが固定された粒子を利用
してルテリオンの分離を試みた。その結果、本発明の一実施例では、従来の方法より短時
間で大量にルテリオンが分離できることを確認した。
【００４７】
前記ルテリオンを含有する抽出物は、例えば、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（
ｉｉ）植物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒の抗生剤存在下に植物または
食品の加熱によって発生するガスの凝縮液であってもよい。
【００４８】
前記熱水抽出物は、例えば４０℃以上の水を利用して植物から生理活性物質を抽出した
ものであれば、特に制限されず熱水抽出を使用すると有機溶媒の毒性に起因した問題が発
生しない。前記溶媒抽出物は、例えば、エーテル（ｅｔｈｅｒ）、メタノール（ｍｅｔｈ
ａｎｏｌ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、ヘキサン（ｈｅｘａｎｅ）のような溶媒を
使用して抽出されたものであってもよい。
【００４９】
前記凝縮液は、植物または食品に蒸溜水を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間
欠的にバブリングしながら振盪して、前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕
集した後、冷却させて取得した凝縮液であってもよい。
【００５０】
本発明に係る「ルテリオン表面抗原」とは、ルテリオン膜の脂質層に置かれている疏水
性アミノ酸を含有するカルボキシ末端ドメインを介して細胞表面膜に接着されていて、生
物学的な抗原効果を発揮できるもので、例えばＣＤ３９（Ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  １；ＥＮＴＰＤ
１）、ＣＤ７３（Ｅｃｔｏ−５’ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ；ＮＴ５Ｅ）、ＨＢｓＡｇ、
ＳＬＣ３Ａ２、ＣＤ１０９、ＬＹ９、ＣＤ３３２、ＣＤ１３３またはＣＤ５３であり、好
ましくはＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ３９またはＣＤ７３であってもよい。
【００５１】
「抗体」とは、抗原性部位に対して指示されて特異的に結合するタンパク質分子を意味
する。本発明は、ルテリオン表面抗原に特異的に結合できる物質に粒子を固定して使用し
たが、前記抗原と特異的に結合する抗体を使用することができる。本発明で利用可能な抗
体は、例えば、抗−ＣＤ３３２抗体、抗−ＣＤ１３３抗体、抗−ＣＤ３９抗体または抗−
ＣＤ７３抗体であってもよい。抗体は、市販中の製造されたものを使用することができる
。このような抗体の代わりに前記表面発現される抗原に結合するアプタマーを利用しても
よい。
【００５２】
「粒子」とは、特性により磁性特性、発光特性、静電気特性およびイオン性を帯びるこ
とができるものと、大きさによりマイクロまたはナノの大きさを有するものを意味して、
抗体との結合を介してルテリオンを分離することができるものであれば特に制限されない
が、例えば磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維粒子
および蛍光粒子で構成された群から選択される。また、前記粒子は磁性特性と蛍光特性を
同時に有する粒子、磁性粒子に量子ドットおよび金、銀粒子を結合させた粒子を含むこと
ができる。
【００５３】
前記粒子は、例えば、磁性粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）であり、前記
磁性粒子は、磁性を帯びて、磁場によって動く粒子を意味する。前記磁性とは、常磁性を
有するものであり得る。磁性粒子は、例えば、金属物質（ｍｅｔａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ
）、磁性物質（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）または磁性合金（ｍａｇｎｅｔｉ
ｃ  ａｌｌｏｙ）を含むことができる。磁性粒子は、磁性を帯びる粒子であるが、本発明
で磁性粒子はこれに限定されず、それ自体が磁性を帯びないが、磁性を有することができ
るまたは磁力で引っ張られて金属粒子であってもよい。また、前記金属粒子は、例えば、
鉄、アルミ、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カドミウム、マグネシウム、銅
、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成された群から選択されたいずれ
か一つで製造できる。この中好ましくは鉄が選択される。前記粒子は、マイクロメートル
の大きさである場合には強磁性を帯びるが、ナノメートルの大きさの小さい粒子は、超磁
性を帯びる。このような粒子は合成が容易で、大きさを容易に調節することができる。例
えば、１〜１，０００ｎｍの大きさを有して、好ましくは１０〜１，０００ｎｍ、より好
ましくは１０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１００ｎｍの大きさの粒子を使用す
ることができる。
【００５４】
場合により、前記磁性粒子に分散性と安全性を維持するために、磁性粒子を改質させる
ことができて、例えば炭素をコートして改質することができる。
【００５５】
追加で、抗体またはアプタマー結合に適した官能基をさらに含むことができる。前記官
能基は、例えば、アミド基（ａｍｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒ
ｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ  
ｇｒｏｕｐ）、チオール基（ＳＨ）、エポキシ基（ｅｐｏｘｙ  ｇｒｏｕｐ）、フェニル
基（ｐｈｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、スルフォン基（ｓｕｌｐｈｏｎｅ  ｇｒｏｕｐ）、ア
ルコキシ基（ａｌｋｏｘｙ  ｇｒｏｕｐ）、アルデヒド基（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｇｒｏｕ
ｐ）、ケトン基（ｋｅｔｏｎｅ  ｇｒｏｕｐ）から選択されたものであってもよい。前記
アミン基（ＮＨ２）は、モノアミン（ｍｏｎｏａｍｉｎｅ）、ジアミン（ｄｉａｍｉｎｅ
）、トリアミン（ｔｒｉａｍｉｎｅ）、エチレンジアミン（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍ
ｉｎｅ）またはジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）であっ
てもよい。
【００５６】
前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階で、粒子が磁性粒子である場合、前記
（ｂ）段階は、外部で磁性を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を回収すること
を特徴とする。
【００５７】
前記磁性を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収する方法は、
前記ルテリオンとルテリオン表面抗原に結合する抗体またはアプタマーが固定された磁性
粒子が含まれた試料を混合して反応した後、常温で磁石または磁気活性細胞分離器（Ｍａ
ｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）を利用して
収集後、上澄み液を除去して、緩衝溶液に再懸濁させた後、凝集用フィルムおよび捕獲用
ろ過膜に順次通過させて結果的にルテリオン−抗体−磁性粒子複合体を確認することがで
きる。
【００５８】
本発明で、前記粒子が蛍光粒子である場合、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーター
を利用してルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする。
【００５９】
前記蛍光利用セルソーターを利用した回収方法は、蛍光の種類と程度により細胞のよう
な形態の微細物質を分類する方法で、定量的分析と分類のために蛍光を帯びる細胞が所定
の管を介して流れるようにする「流れ制御系（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）」と、流
れ制御システムに制御により流れる微細物質を観察するための「光学系（ｏｐｔｉｃａｌ
ｓｙｓｔｅｍ）」と光学系の光信号を電気信号に変えて処理する「電子系（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）」からなる。蛍光活性細胞分類装置は、種々の細胞を特性に
より効率的に分類収集する装置であり、生命科学（動物学、植物学、微生物学、農学、水
産学、林学など）と医学研究において多く活用される装置である。本発明の蛍光粒子に含
まれる蛍光物質は、生体イメージングに使用できる蛍光物質ならいずれも使用可能である
。前記蛍光物質は、これに制限されないが、ローダミンとその誘導体、フルオレセインと
その誘導体、クマリンとその誘導体、アクリジンとその誘導体、ピレンとその誘導体、エ
リトロシンとその誘導体、エオシンとその誘導体、および４−アセトアミド−４’−イソ
シオチアナトスチルベン−２、２’ジスルホン酸で構成された群から選択されるものであ
ってもよい。蛍光物質をより具体的に例示すると、下記のとおりである：
ローダミンおよびその誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボ
キシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒ
ｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホ
ローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド
誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシロ
ーダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ａｌ
ｅｘａ誘導体、Ａｌｅｘａ−３５０、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５４７、Ａｌｅ
ｘａ−６４７；フルオレセインおよびその誘導体：５−カルボキシ−フルオレセイン（Ｆ
ＡＭ）、５−（４、６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡ
Ｆ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオセイン（ＪＯ
Ｅ）、フルオセイン、フルオセインイソチオシアナート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フ
ルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシアナート、４
−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローザ
ニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルアルデヒド；クマリンお
よびその誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０
）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、シアノサイン、
４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’、５’’−ジブロモ
ピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏ−ｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）、７
−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリンジエ
チレントリアミンペンタアセテート、４−（４’−ジイソチオシアナトデヒドロ−スチル
ベン−２、２’−ジスルホン酸、４、４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２、２’−
ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、ｄａ
ｎｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（
ＤＡＢＣＹＬ）４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（
ＤＡＢＩＴＣ）；アクリジンおよびその誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアナ
ート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３、５ジスルホ
ネート（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗ  ＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マ
レイミド、アントラニルアミド、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ；ピレンおよびその
誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート、Ｒｅａｃ
ｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）；
エリスロシンおよびその誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアナート、エ
チジウム；エオシンおよびその誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアナート；４−ア
セトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２、２’ジスルホン酸。
【００６０】
本発明で、前記粒子が静電気を帯びた粒子である場合、前記（ｂ）段階は、不均一な電
場を形成して粒子に双極子モーメントを形成させて、静電気的引力でルテリオンが結合さ
れたイオン性粒子を回収することを特徴とする。
【００６１】
前記不均一な電場を形成して粒子に双極子モーメントを形成させて、静電気的引力でル
テリオンが結合されたイオン性粒子を回収する方法は、粒子分離装置の一種である電気的
粒子分級装置（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ；ＤＭＡ）を
介して可能となる。電気的粒子分級装置は、静電気力による粒子の移動度差を利用して粒
子を分類する装置で、微分型電気移動度分析機または微分型静電分級機とも呼ばれる。具
体的に電気的粒子分級装置は、荷電された粒子の移動速度が粒子径の関数であることを利
用して、多分散（ｐｏｌｙ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）粒子から所望の径を有する単分散（ｍｏ
ｎｏ−ｄｉｓｐｅｒｓｅ）粒子を選別する装備である。
【００６２】
本発明で、前記粒子がイオン性粒子、例えば、陰イオン性または、陽イオン性粒子であ
る場合、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリオンが結合されたイオン性粒
子を回収することができる。
【００６３】
前記静電気的引力でルテリオンが結合された繊維粒子を回収する方法は、前記電気的粒
子分級装置（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ；ＤＭＡ）を介
して可能となる。
本発明は、粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階を追加で含
むことができる。
【００６４】
前記粒子に結合されたルテリオンにＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝溶液を加えて２５℃でインキュ
ベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）させた後、磁性またはイオン性を利用してＢＳＡ
が吸着された粒子だけを分離して、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ
）が吸着された粒子に再びＰＢＳを加えてインキュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ
）をして粒子を脱着させてルテリオンのみを分離することができる。
【００６５】
さらに他の観点において、本発明は、ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または
加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法に関する。
【００６６】
一実施例で、前記培養時添加される水分は、食塩水またはＰＢＳ溶液であってもよいが
、これに限定されない。
【００６７】
さらに他の観点において、本発明は、ルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９（保存時は
ｐＨ１〜３）および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法に
関する。
【００６８】
一実施例で、前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓ
ｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）または
キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であってもよく、好ましくはグルコースであってもよい。本
発明の一実施例で、グルコースを含む培地、例えばＤＭＥＭ培地または血液培地にグルコ
ースを約１〜１０％、好ましくは２〜８％の濃度で添加して、ｐＨ７および約２０℃の条
件を維持する最適にルテリオンを培養することができることを確認した。培養されたルテ
リオンの数は、ルテリオン特異的表面抗原であるＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３また
はＣＤ３９を含むルテリオンとミトトラッカーレッドに染色されたルテリオン数をカウン
トして確認した。
【００６９】
培養前のルテリオンは、その大きさが５０〜２００ｎｍであってもよいが、本発明の培
養方法により培養されたルテリオンの培養後大きさは、３００〜５００ｎｍであってもよ
い。この時、顕微鏡で観察しながらルテリオンの大きさが５００ｎｍを越えないようにす
ることができ、培養が終了すると、大きさ別に分類して−８０℃に冷却して保管するか、
窒素で充填して保管または０℃以上で保管でき、保管時保存剤を添加することができる。
【００７０】
前記の通り培養されたルテリオンは、一定期間特性への変化なしに所望の大きさ（５０
０ｎｍ以下）で保管が可能でルテリオンを利用した疾病の治療に効果的に活用することが
できる。
【００７１】
具体的に、本発明に係るルテリオンは、細胞内核に導入されることができる。ルテリオ
ンを赤色蛍光で蛍光染色してルテリオンが細胞内核に導入されるか否かを確認した結果、
ルテリオンがＤＡＰＩで染色された細胞内核に導入されることを確認した。
【００７２】
また、本発明に係るルテリオンを蛍光染色して、蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注
射（ＩＰ）および経口胃管投与法で投与した結果、経口投与時には少なくとも３時間以後
、腹腔内注射時５分以内にＢＢＢを通過することを確認することができる。このような特
性を活用して本発明に係るルテリオンは、退行性脳疾患などの治療に当たり血液脳関門を
通過できなくて治療剤として使用できなかった薬物の限界を克服することができて、これ
を利用して血液脳関門通過可能な退行性脳疾患治療剤として使用したり、従来既知の薬物
が血液脳関門に通過できるようにする薬物伝達体としても使用できる。
【００７３】
また、本発明によるルテリオンは、癌細胞でテロメラーゼ活性を阻害して、正常細胞で
は影響がないかまたはテロメラーゼ活性を増進させて、効果的に癌細胞の増殖だけを抑制
させる抗癌効果がある。
【００７４】
一方、正常細胞ではルテリオン処理によってテロメラーゼ発現が増加してテロメアの長
さが増加して、ルテリオンは正常細胞ではテロメラーゼ活性を増進させる抗老化活性を示
すことを確認することができた。
【００７５】
本発明で「正常細胞」とは、癌細胞と共に増加したテロメラーゼ活性を有して、無限増
殖をする表現型を有する細胞でなく正常な老化プロセスを有する細胞を意味する。
【００７６】
本発明の用語「テロメラーゼ」とは、テロメアの末端に対するテロメア（ｔｅｌｏｍｅ
ｒｉｃ）反復の添加を触媒するリボ核酸タンパク質を意味する。テロメアは、染色体の末
端を覆う反復配列の長い拡張であり、染色体を安定させるものであると考えられる。人に
おいて、テロメアは、典型的に長さが７−１０ｋｂで、配列−ＴＴＡＧＧＧ−の多重反復
を含む。テロメラーゼは多くの成人細胞で発現されず、テロメアの長さは、連続的な原形
の複製を減少させる。細胞複製が特定回数以上になると、テロメアは次第に縮小されて、
細胞が末端崩壊段階に入ることになり、これによって細胞は老化することになる。テロメ
ラーゼは、体細胞で不活性であるが、癌細胞の９０％では活性であり、テロメラーゼ抑制
剤は癌と戦うのに有用であり得る。
【００７７】
さらに、健常者線維芽細胞にルテリオンを処理した結果、前記ヒト正常細胞のテロメラ
ーゼ発現が増加して、ＡＴＰ生成が増加することを確認することができた。すなわち、ル
テリオンが正常細胞のテロメラーゼ活性増加を介して老化を抑制できることを確認するこ
とができた。従って、本発明に係るルテリオンは、増大されたテロメラーゼ発現および／
またはテロメラーゼ活性によって影響されやすい疾患または症状の治療に使用でき、治療
が必要な患者に投与することを含む患者の細胞または組織内テロメラーゼ活性を増加させ
ることができる。
【００７８】
「老化に伴う疾病または疾患」とは、腫瘍形成及び癌の悪性発展、心筋梗塞（臓内麻痺
）、小脳梗塞、脳卒中、パーキンソン病、心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧、白
内障、老化に伴う視力減退、筋減少症、骨関節炎、骨粗鬆症、骨髄損失、多発性硬化症、
シェーグレン症候群、リュウマチ性関節炎、免疫機能低下、糖尿病、特発性肺線維症、及
び神経退行性疾病、アルツハイマー病、ハンチントン病、及びテストステロン、エストロ
ゲン、成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉ、またはエネルギー生成の減少によりもたらされた障害
を意味する。
【００７９】
「老化防止効果」とは、増加されたミトコンドリア生物発生および機能、減少されたＲ
ＯＳレベル、老化細胞およびニューロン細胞のような体細胞分裂後細胞の延びた寿命、腫
瘍形成、癌の悪性発展、小脳梗塞および心筋梗塞といった老化に伴う現象の防止を含む表
現型を意味する。
【００８０】
細胞の発電所であるミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）は、呼吸作用が最も
活発な酸素消耗処としてすべての細胞が新陳代謝活動を行う場所であり、この活動は細胞
外他のすべての活動に必要なエネルギーを供給する（Ｂｏｖｅｒｉｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．
、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３４：７０７−７１６、２９７３）。ミトコンドリアの酸素で
運搬される電子伝達過程で生成されるＯ２・−またはＯＨ・のようなｒｅａｃｔｉｖｅ  
ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）は、ミトコンドリアの構造と成分を破壊して、
これは呼吸率と酸化的リン酸化反応に変化を誘発して結果的に細胞代謝を決定するＡＴＰ
生成やＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比に影響を与えるようになる。高等動物の多くのエネルギーは
、ミトコンドリアで合成されるＡＴＰに充てて、ミトコンドリアで起きるエネルギー代謝
作用は、老化と密接な関係にあるとされている（Ｌｅｅ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｋｏ
ｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．５２（１０）：１００７−１９、２００９）。
【００８１】
ルテリオン処理による正常細胞におけるＡＴＰ生成増加を確認した。本明細書で使用さ
れた、用語「老化に伴う疾病または症状を予防すること」とは、それが発生する場合を減
らし、老化に関連した疾病を遅延させたりひっくり返すことを指し示す。
【００８２】
本明細書で使用された、用語「老化」または「老化細胞」とは、テロメア機能障害、Ｄ
ＮＡ損傷、または腫瘍遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）活性化によって誘発され得る、有糸分
裂細胞における細胞サイクル停止状態を示す。出芽酵母で、テロメア機能障害によっても
たらされた老化細胞が細胞サイクルのＧ２／Ｍ期に停止している。哺乳類細胞では、老化
細胞が細胞サイクルの外部の非−分裂期であるＧ０期に停止している。ＷＩ−３８線維芽
細胞における老化は、顕微鏡で観察時パッセージ以後１０日間その数が増加せずβ−ガラ
クトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）陽性着色を示す細胞を意味する。
【００８３】
本明細書で使用された、用語「細胞分裂以後細胞」とは、細胞サイクル外部の非−分裂
期であるＧ０期に停止しているが、残りの生物の生命のためにその主な機能は行う細胞の
グループを指し示す。体細胞分裂以後細胞はニューロン細胞、心臓筋肉細胞、および筋肉
細胞を含む。肝および腎臓の組織実質（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）細胞のように、成熟し
た生物の一部細胞の種類は半−永久的にＧ０期に入って、非常に特別な環境でだけ再び分
裂を始めるように誘発されることができる。このような種類の細胞は、それらがＧ０期に
ある時体細胞分裂以後細胞と考慮される。
【００８４】
前記老化に伴う疾病または症状は、ミトコンドリア機能損失、テロメア機能障害、老化
細胞退化および寿命−依存的（ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞損失、またはミトコン
ドリア退化または体細胞分裂後細胞の細胞サイクル停止状態と関連する。
【００８５】
一実施様態で、ルテリオンは、テロメラーゼ酵素と相互作用して、個体の組織または細
胞でテロメラーゼ発現および／または活性を刺激および／または増加させる。一部実施様
態で、このような活性は減少されるかないことがあり、これによって個体の疾患、または
症状と関連した病因または症候群の増大または発達を招く。このような疾患または症状は
、特に、健康な組織におけるテロメラーゼ発現および／または活性を増加させることによ
って、個体の寿命を延ばすと共に個体の健康を維持するか／して、本願に記載されたよう
な「治療」とは、用語に含まれる任意の実施様態をはじめとする臨床治療および／または
診断分野を含むことができる。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に
説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者
において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００８７】
実施例１：ルテリオンの分離
（１）ルテリオン抽出
薬用植物である漆（Ｒｈｕｓ  ｖｅｒｎｉｃｉｆｌｕａ  ｓｔｏｋｅｓ）１００ｇを２
０−３０倍の大きさ、すなわち２−３リットル容器の大きさに合わせて切断して容器に入
れて、植物の５〜８倍である５００〜８００ｇ（好ましくは植物の６倍、すなわち６００
ｇ）の蒸溜水を容器に投入した後、８０℃以下で全湯を行った。約８時間程度全湯をする
が、約３時間毎に２０〜３０分間酸素でバブルリングを加えて植物のルテリオンがかたま
らないようにした。前記バブリング後抽出時スチームされる気化した水蒸気をフラスコに
収集した。前記収集した水蒸気を冷却して凝縮させて取得した凝縮液にＩＲ光線（波長：
３〜１０００ｕｍ内外、好ましくは２００〜６００ｕｍ）を１−２時間照射してルテリオ
ンが変異されず分裂が誘導されるようにした。このような過程を図３７に模式的に示した
。
【００８８】
（２）遠心分離および濾過による分離
（１）で収集した凝縮液を１９０ｇで一次遠心分離してスピンダウンして不純物を除去
して、３０００ｇで二次遠心分離して数分〜数十分（好ましくは二時間内外）の間安定さ
せた後、上澄み液を収集した。この時ＣＤ３３２を染色して運動性を確認した後、ルテリ
オンの存在の有無を一次的に確認した。以後、純粋なルテリオンを得るために、１２０，
０００ｇで三次遠心分離した。
【００８９】
約８００ｎｍのフィルターで濾過された下層部を収集して、プラズマなど内部植物また
はエクソソームなど細胞死骸（Ｄｅｂｒｉｓ）ペレットを除去した後、再び１４０，００
０ｇ以上で遠心分離してペレットが含まれない上澄み液を収集した。上澄み液を４００ｎ
ｍのフィルターで濾過して下層部を収集した後、再びＣＤ３３２を染色して運動性を確認
した。５００ｎｍのフィルターで濾過して、フィルターの上にかかった上澄み液を集めて
ルテリオンを収集して、ｐＨ１または−９０℃以下の温度で保存した。
【００９０】
前記過程によって長径５０〜８００ｎｍのルテリオンを取得することができ、これは暗
視野顕微鏡または共焦点顕微鏡を介して観察確認が可能であった。前記取得したルテリオ
ンは大きさにより５０〜２００ｎｍ（発生期）／２００〜４００ｎｍ（成熟期）／４００
〜６００ｎｍ（分裂期）／６００〜８００ｎｍ（過分列期）に区分した。
同様の方法で表１〜４に記載された薬用植物、当帰、漆皮およびキウィからルテリオン
を取得した。
【００９１】
（３）表面抗原特異的抗体による分離
３−１）ルテリオン表面抗原確認
植物から分離したルテリオンに抗−ＣＤ３９抗体（ｓｃ−１８７６６、Ｓａｎｔａ  Ｃ
ｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＣＤ７３抗体（ｓｃ−２５６０３、Ｓａｎ
ｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗−ＣＤ３３２抗体（ＢＳ−０６
７５Ｒ、Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ）を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色有無を観察
（青色蛍光：ＣＤ１３３／１−ＶＩＯＢＲＩＧＨＴ−ＦＩＴＣ製造）した。赤色蛍光は、
ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ製造）
で染色した。また、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）とＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃ
ｈｓｔで染色した後、その発色有無を蛍光顕微鏡を介して観察した。
【００９２】
その結果、ミトトラッカーとＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔによって染色されたルテリ
オンに抗−ＣＤ３９抗体、抗−ＣＤ７３抗体、抗−ＣＤ１３３抗体または抗−ＣＤ３３２
抗体が結合することを確認することによって、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣ
Ｄ３３２がルテリオンの表面抗原であることを確認することができた（図２９乃至図３２
）。
【００９３】
３−２）抗体が固定された粒子製造
段階１．炭素がコートされた鉄（Ｆｅ）磁性ナノ粒子の製造
鉄アセチルアセトネートヒドレート（０．５）ｍｍｏｌをオクチルエーテル１０ｍＬが
入っている三角フラスコに入れて撹はんしながら金属前駆体溶液を製造した後、超音波照
射機を利用して１０分間２０ｋＨｚ（５０％）強度で超音波を照射した。金属前駆体溶液
に超音波を照射するにつれ初期に橙色であった溶液が時間が過ぎると黒褐色に変わること
を観察することができたが、前記のような変化は酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）磁性ナノ粒子が成
功的に製造されたことを意味する。前記酸化鉄磁性ナノ粒子が製造された混合溶液に過量
のエタノールを添加して生成された磁性ナノ粒子を析出した後、遠心分離を行って磁性ナ
ノ粒子と上澄み液を分離して、上澄み液は除去した。前記の洗浄過程を３回以上繰り返し
た後、磁性ナノ粒子を５０℃の温度で１２時間乾燥して３００ｎｍの大きさを有する酸化
鉄磁性ナノ粒子を製造した。前記製造された酸化鉄磁性ナノ粒子を６００℃で３時間アル
ゴン（Ａｒ）雰囲気下で熱処理して炭素がコートされた鉄−磁性ナノ粒子を得た。
【００９４】
段階２．カルボキシル基がコートされた磁性ナノ粒子製造
段階１で得た炭素がコートされた鉄−磁性ナノ粒子（０．５ｇ）とｓｕｃｃｉｎｉｃ  
ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  １ｇをシランポリエチレングリコールカルボキシル酸５ｍｌと共に
エタノール２５ｍｌに分散させた後、２４時間反応した。反応が終了した後、遠心分離し
て得られた沈殿物はエタノールを利用して洗浄した後、真空オーブンで乾燥して炭素とカ
ルボキシル基が二重コートされた鉄−磁性ナノ粒子を得た。前記二重コートされた粒子製
造段階を模式図で示した（図３３の前方）。
【００９５】
段階３：抗体が固定された粒子製造
抗−ＣＤ３９抗体、抗−ＣＤ７３抗体、抗−ＣＤ１３３抗体または抗−ＣＤ３３２抗体
をチオール反応性試薬と反応させてチオール化させた。段階２で製造されたカルボキシル
基官能基が導入された鉄磁性ナノ粒子と前記チオール基を有する抗体を反応させて前記鉄
磁性ナノ粒子に前記抗体を付着させた。前記抗体が固定された粒子を模式図で示した（図
３３の後方）。
【００９６】
３−３）植物または食品由来ルテリオンの分離
１００〜２００ｕｌ植物抽出物と５ｕｌ  ＣＤ３９抗体−鉄磁性ナノ粒子またはＣＤ７
３抗体−鉄磁性ナノ粒子をビーカーに入れて、３０分間結合させた後、磁石分離器に１〜
２分置いてルテリオン−磁性ナノ粒子を集めて上澄み液を捨てて洗浄した。前記ルテリオ
ンと結合された鉄磁性ナノ粒子に０．０３３ｗｔ％  ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ
Ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ緩衝溶液を加えて、２５℃で１時間インキュベーティング（
ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）させた後、磁石を利用してＢＳＡが吸着された鉄磁性ナノ粒子の
みを分離して、ＢＳＡが吸着された鉄磁性ナノ粒子に再び一定量のＰＢＳを加えてインキ
ュベーティング（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）を介して脱着させた。吸着されたＢＳＡは、Ｆ
Ｐ−６４０分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（ＪＡＳＣＯ）に
より２８０ｎｍで標準検量線法を利用して定量分析を行った（放出スリット：０．５ｎｍ
、吸収スリット：０．５ｎｍ）。前記鉄磁性ナノ粒子を使用した植物または植物のルテリ
オン分離段階を模式図で示した（図３４）。
【００９７】
３−４）分離されたルテリオンの確認
前記３−３）で分離したルテリオンと（２）濾過による分離方法で分離したルテリオン
の中でＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２に結合する抗体に抗−ＦＩＴＣ
を結合させて発色有無を観察した（図３５の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ））。蛍光活
性化セルソーターを介して前記二つの分離方法の抽出収を比較した。
【００９８】
その結果、ナノフィルタリング方法を利用して分離した場合、ルテリオン数は１．５×
１０８個／ｍｌである反面、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２表面抗原
に結合する粒子を利用して分離した場合ルテリオンの数は７．１８×１０８個／ｍｌでナ
ノフィルタリング方法に比べてルテリオンの数が４倍以上増加したことを確認した（図３
６の（ａ）および（ｂ））。
【００９９】
【表５】
2019205467.tif 000007
【０１００】
表５に示された通り、ナノフィルタリング方法を利用する場合、５０〜４００ｎｍの大
きさのルテリオン最終抽出率は４０〜４５％、紛失率は５０〜６０％である反面、本発明
のＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２表面抗原に結合する抗体−鉄ナノ粒
子分離方法を利用する場合、５０〜４００ｎｍの大きさのルテリオン最終抽出率は９０〜
９５％以上であり、紛失率は１０％以下で、抽出率および効率が非常に高まることを確認
することができた。
【０１０１】
このような結果から、ナノフィルターを使用した従来のルテリオン分離方法より本発明
のルテリオン表面抗原に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を利用した分離
方法が最終抽出率は増加し分離過程中生じる紛失率は低下することを確認することができ
た。
【０１０２】
（４）植物ミトコンドリアとルテリオンの差確認
表６でのように植物ミトコンドリアは、ＣＤ３３２、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３
およびＣＤ３２６中いずれか一つの表面抗原も発現できないだけでなく、１４０，０００
ｇ以上で遠心分離時ミトコンドリアは裂けるが、ルテリオンは形状を維持したまま存在す
ることを確認した。また、分裂を誘導するための加圧、例えば、３５，０００ｐｓｉ以上
を適用すると、ミトコンドリアは裂けるが、ルテリオンは形状を維持したまま存在するこ
とを確認した。
【０１０３】
【表６】
2019205467.tif 000008
【０１０４】
実施例２：ルテリオンの保存
運動性があるルテリオンおよびＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２を表
面抗原として含むルテリオンを保存して数を確認した。ＩＲを照射して集まるルテリオン
を確認して、ルテリオンに抗−ＣＤ３３２、抗−ＣＤ３９、抗−ＣＤ１３３または抗−Ｃ
Ｄ７３抗体を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色が確認されたルテリオン、ミト
トラッカーで染色して染色されたルテリオンの数をカウトした。この時、ｐＨ１〜３、０
℃以下、−９０〜０℃条件でルテリオンを保存してルテリオン数をカウントした結果をｐ
Ｈおよび温度条件により下記の表７および８に示した（＋はカウントされたルテリオンの
数を示す）。
【０１０５】
【表７】
2019205467.tif 000009
【０１０６】
【表８】
2019205467.tif 000010
【０１０７】
表７および８によると、ｐＨ１〜３および−９０〜０℃条件で１〜３ヶ月維持する場合
、ルテリオン数に影響せずに保存を維持できることを確認することができる。
【０１０８】
実施例３：圧力を利用したルテリオンの分裂誘導
実施例１で分離されたルテリオンに表９のようにフレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒ
ｅｓｓ）を介して圧力を加えた。また、温度によりルテリオンの分裂誘導への影響を確認
した（＋は分裂程度を示す）。
【０１０９】
【表９】
2019205467.tif 000011
【０１１０】
表９および図１１乃至１３によると、ｐＨ１〜３、２５０００〜３５，０００ｐｓｉ、
１０〜２０℃の温度条件で分裂が誘導されて、ルテリオンの増殖が行われることを確認す
ることができる。
【０１１１】
実施例４：ルテリオンの特性
（１）構造
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜４００ｎｍの大きさを有するルテリオンを
共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃ
ｒｏｓｃｏｐｅ、Ｚｅｉｓｓ）、透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、原子力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ
ｓｃｏｐｅ）および共焦点スキャナ（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ８）で撮影して、ルテリ
オンもミトコンドリアと類似するように二重膜または多重膜を有する膜構造として内部ク
リステ（ｃｒｉｓｔａｅ）構造を完成しなかった状態の構造を有して、ミトコンドリアと
同じレーザー波長範囲で観察されることを確認した。また、その形態は円形ないし楕円形
であることを観察することができた（図６）。
【０１１２】
さらに、実施例１で分離されたルテリオンをＴＥＭ電子顕微鏡で撮影した結果、図８に
示された通り、二重膜または多重膜構造を有することを確認することができた。
【０１１３】
（２）染色特性
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜８００ｎｍの大きさを有するルテリオンを
ミトトラッカー（Ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ）、ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
１２３）、ヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で染色した後、その発色有
無を観察した。その結果、ルテリオンもミトトラッカー、ローダミン１２３、ヤヌスグリ
ーンＢによって発色が確認されることを確認した（図２、図３および図５参照）。
【０１１４】
（３）自家蛍光
実施例１で取得されたルテリオン中約５０〜８００ｎｍの大きさを有するルテリオンは
、光反応を示すことを蛍光写真で確認した（図４参照）。
【０１１５】
（４）ルテリオンにＲＮＡ含有の有無分析
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリオンの原子顕微鏡撮影結果、図９に
示された通り、ルテリオンにＲＮＡやＤＮＡのような核酸が含まれていると推定すること
ができる。
【０１１６】
実施例１で分離された２００〜４００ｎｍのルテリオンから総ＲＮＡとＤＮＡを分離す
るために、ＱＩＡＧＥＮキット（ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｉｃｒｏ  ｋｉｔ：
Ｃａｔ  ８０２８４）を使用して分離した後、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  ＲＮＡ（ＤＮＡ）  Ｓ
ｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）チップを利用して定量した。
【０１１７】
ルテリオンを遠心分離（８０００ｇ、１時間３０分）して回収した後、キット内分解緩
衝液ＲＬＴ  ｐｌｕｓ（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃａｎａｔｅ、ｄｅｔ
ｅｒｇｅｎｔｓ）５０ｕｌにベーターメルカプトエタノール３．５ｕｌを添加して２０ゲ
ージ針付き注射器を利用して５〜１０回通過させてルテリオンを溶解させた。サンプル分
解緩衝液をＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ  ｓｐｉｎカラムに移した後、遠心分離（≧８０００
ｇ、１５秒）してカラムにかかっているＤＮＡとカラムを通過したＲＮＡが含まれたバッ
ファーでそれぞれ分離した。
【０１１８】
まずカラムを通過したバッファーに同じ体積の３５０ｕｌ  ７０％エタノールを入れて
よく混ぜた後、７００ｕｌの混合液をＲＮｅａｓｅ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｓｐｉｎカラム
に移して遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）してカラムを通過したバッファーは除去した
。それぞれの７００ｕｌ  ＲＷ１、５００ｕｌのＲＰＥバッファーと８０％エタノールを
利用して段階的にカラム洗浄を進行した。前記で使用されたすべての遠心分離（≧８００
０ｇ、１５秒）は、同じ条件で進行した。ＲＮＡを得るために、１４ｕｌ  ＲＮｅａｓｙ
−ｆｒｅｅ溶液をカラムに入れた後、遠心分離（≧８０００ｇ、６０秒）してルテリオン
ＲＮＡを分離した。
【０１１９】
ゲノムＤＮＡは前記最初の過程でＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ  ｓｐｉｎカラムに付着され
たＤＮＡをそれぞれの５００ｕｌ  ＡＷ１と５００ｕｌ  ＡＷ２バッファーを利用して洗
浄した。前記使用されたすべての遠心分離（≧８０００ｇ、１５秒）速度と時間は、ＲＮ
Ａ分離過程と同じ条件下で進行した。５０ｕｌ  ＥＢバッファーをカラムに入れた後、室
温に２〜５分間放置後、遠心分離（≧８０００ｇ、６０秒）してルテリオンＤＮＡを分離
した。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  ＲＮＡ（ＤＮＡ）ＳｔｄＳｅｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）チップ
を利用して定量した結果、図１０Ａおよび図１０Ｂに示された通り、ルテリオンにＲＮＡ
が含まれているだけでなく、図１０Ｃに示された通り、ＤＮＡも含まれていることを確認
することができた。特に、２００〜４００ｎｍのルテリオンにＲＮＡとＤＮＡが含まれて
いることを確認することができた。
【０１２０】
実施例５：ルテリオンの培養
（１）実施例１で取得されたルテリオン中大きさが約５０〜２００ｎｍのルテリオンに
ＰＢＳを添加してＩＲ光線を照射した後、約３時間１８〜３０℃で培養した。ＩＲ光線を
照射した直後から約１時間間隔でルテリオンの大きさを顕微鏡で確認した。約１〜６時間
後、培養前のその大きさが約２００ｎｍであるルテリオンが約５００ｎｍに成長している
ことを確認することができた。これにより、ルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射下
に１８〜３０℃で培養する場合、その大きさを５００ｎｍ程度まで成長させることができ
ることが分かった。
【０１２１】
（２）実施例１で取得されたルテリオン中大きさが約４００〜８００ｎｍのルテリオン
にＰＢＳを添加してＩＲ光線を照射した後、約３時間１８〜３０℃で培養した。ＩＲ光線
を照射した直後から約１時間間隔でルテリオンの大きさと状態を顕微鏡で確認した。約１
〜６時間後、培養前のその大きさが約４００〜８００ｎｍのルテリオンが成長はせず分裂
（ｆｉｓｓｉｏｎ）されることを確認した。
【０１２２】
（３）グルコースを５％濃度で添加した培地（ＤＭＥＭまたは血液培地）を使用して、
ｐＨ７および２０℃条件でルテリオンを培養した。ＩＲを照射して集まるルテリオンを確
認して、ルテリオンに抗−ＣＤ３３２、抗−ＣＤ７３、抗−ＣＤ１３３、抗−ＣＤ３９抗
体を結合させて、抗−ＦＩＴＣを結合させて発色が確認されたルテリオン、ミトトラッカ
ーで染色して染色されたルテリオンの数をカウントした。その結果を下記の表１０に示し
た（＋はルテリオン数の相対的比を示す）。
【０１２３】
【表１０】
2019205467.tif 000012
【０１２４】
実施例６：細胞内導入の有無確認
ルテリオンをＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で蛍光染色し
て、Ａ５４９ヒ素細胞性肺癌細胞（ＡＴＣＣ♯：ＣＣＬ−１８５）と２４時間インキュベ
ーションした。細胞を固定して形態を顕微鏡で観察した。その結果を図１４乃至図１６に
示した。
【０１２５】
図１４を参照すると、ＰＫＨ２６−１、ＰＫＨ２６−２、ＰＫＨ２６−３赤色蛍光で染
色されたルテリオンがＤＡＰＩで染色された細胞内核に導入されることを確認することが
でき、図１５および１６の拡大イメージを確認した結果、細胞内核にルテリオンが導入さ
れることをより具体的に確認することができる。
【０１２６】
実施例７：ＢＢＢ（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）透過の有無確認
マウスにＰＫＨ２６で蛍光染色されたルテリオンを腹腔内注射（ＩＰ）および経口胃管
投与法で投与して、投与されたルテリオンがＢＢＢを通過するか否かを確認した。図１７
によると、経口胃管投与時少なくとも３時間以後ＢＢＢを通過することを確認することが
できる。
【０１２７】
また、図１８によると、腹腔内注射時５分以内にＢＢＢを通過することを確認すること
ができ、図１９によると、腹腔内注射後２４時間経過後にも心臓、肺、脾臓、肝、すい臓
、腎臓、睾丸、腹部および臓前身に分布することを確認することができる。
【０１２８】
実施例８：ルテリオンの坑癌（テロメア／テロメラーゼ活性）効果確認
（１）癌細胞のテロメラーゼ活性阻害
正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）および癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ
−４６８、ＷｉＤｒ）１×１０６細胞／ｍｌをそれぞれ６０ｍｍプレートに接種した後、
約１２時間後に実施例１で分離されたルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理して培養
した。細胞培養は、抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）が
ない条件で、１％ＦＢＳ条件で３７℃、５％ＣＯ２培養器で行って、１％  ＦＢＳ  ＤＭ
ＥＭ培地を使用して細胞接種４８ｈｒ後にそれぞれ収穫してテロメラーゼ活性を測定した
。
【０１２９】
ＴＲＡＰ分析で（ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））テロメラーゼ活性を分析した結果、ルテリオン
処理によって癌細胞（ＮＣｌ−Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＡ−４６８、ＷｉＤｒ）のテロメ
ラーゼ発現および活性が減少することを確認することができた（図２０のＢ）。
【０１３０】
また、正常細胞であるＦｉｂｒｏｂｌａｓｔを対象に、同じ実験と分析を行った結果、
ヒト正常細胞では対照群（ルテリオン未処理群）に比べてテロメラーゼ発現および活性が
増加することを確認することができた（図２０のＡ）。
【０１３１】
（２）ルテリオン処理による癌細胞増殖抑制
種々のヒト癌細胞株（肺癌（ＮＣＩ−Ｈ１９７５）、大腸癌（ＷｉＤｒ）、乳癌（ＭＤ
Ａ−ＭＢ−４８６）、肝臓癌（ＨＣＣ３８）、白血病（ＡＧＨ−７７））および正常細胞
株（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）でルテリオンの癌細胞に対する細胞毒性を測定するためにＭ
ＴＴ分析を実施した。
【０１３２】
５×１０４細胞／ｍｌ（８×１０３／ｗｅｌｌ）の細胞浮遊物を９６−ウェル（ｗｅｌ
ｌ）底が平らなマイクロタイター板の各ウェル（ｗｅｌｌ）に１００ｕｌずつ接種して２
４時間培養させた後、様々な濃度のルテリオンを含んでいる培地に取り替えた後、さらに
４８時間培養させた。その後、各ウェルに培地で１０倍希釈された非水溶性の黄色ＭＴＴ
（３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙｌ）−２、５−ｄｉｐｈｅ
ｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液１００ｕｌを添加する。細胞内の
ホルマザン結晶が生成されるように、３７℃温度および５％二酸化炭素濃度のインキュベ
ーターに保管した。約４時間後、余分の培地を除去した後、細胞内形成された非水溶性の
ホルマザンを溶解させるために各ウェルにＤＭＳＯを２００ｕｌずつ添加した後、マイク
ロプレートリーダーを利用して５９５ｎｍで吸光度を分析した。
【０１３３】
ルテリオンを処理しなかった対照群の吸光度を１００％にして、各濃度に対する癌細胞
の生存率を測定した結果、濃度依存的に癌細胞の生存率を減少させた。一方、正常細胞で
は細胞毒性がなかった（図２１）。
【０１３４】
さらに、前記癌細胞株の他にＡｓＰＣ−１すい臓癌細胞株、Ａ５４９肺癌細胞株、ＢＴ
−２０乳癌細胞株で多様な由来のルテリオンの癌細胞増殖抑制効果を確認した。細胞生存
率測定は、前記ＭＴＴ分析法と同様に行って、実施例１の方法で分離した多様な由来のル
テリオンは、癌細胞に対して細胞増殖抑制効果を示した（図２２乃至図２４）。
【０１３５】
従って、本発明のルテリオンは、癌細胞の増殖を抑制して癌を予防または治療すること
ができることが分かった。
【０１３６】
実施例９：ルテリオンの正常細胞でテロメラーゼ活性増加
正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）１×１０６細胞／ｍｌをそれぞれ６０ｍｍプレート
に接種した後、約１２時間後に実施例１で分離されたルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度
で処理して培養した。細胞培養は抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃ
ｏｔｉｃ）がない条件で、１％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地を使用して３７℃、５％ＣＯ２培
養器で行った。細胞接種４８時間後に収穫してテロメラーゼ活性を測定した。
【０１３７】
ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用したＴＲＡＰ分析でテロメラーゼ活性を分析した結果、ルテ
リオン処理によって正常細胞であるＦｉｂｒｏｂｌａｓｔのテロメラーゼ発現および活性
が増加することを確認することができた（図２５）。
【０１３８】
実施例１０：ルテリオンのＡＴＰ生成への影響
ルテリオン処理による癌細胞およびＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ正常細胞におけるＡＴＰ生成
増加を確認するために、癌細胞３種Ａ５４９、ＷＴＭ２６６−４およびＡｓＰＣ−１およ
び正常細胞（ＭＲＣ−５）１×１０６細胞／ｍｌを一般ＤＭＥＭ培地の６０ｍｍプレート
に接種して１日間培養した後、抗生剤ＰＳＦ（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏ
ｔｉｃ）がない条件で、０．１％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地を使用して栄養飢餓（ｓｅｒｕ
ｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）状態で再び１日間培養した。次に３日目、実施例１で分離し
たルテリオンを５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した後、０、１０、３０、１２０分にＡＴＰ
生成を測定した（図２６）。ＡＴＰ測定ｋｉｔは、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍ
Ａ、ＵＳＡ）社から購入して使用した。
【０１３９】
その結果、ルテリオンを処理した正常細胞でＡＴＰの生成が顕著に増加したことを確認
した（図３９）。また、ルテリオンを処理した癌細胞でＡＴＰ生成が低下することを確認
した（図３８）。
【０１４０】
従って、本発明のルテリオンは、正常細胞のエネルギー生成を増加させて老化を抑制す
ることができることが分かった。また、癌細胞のエネルギー生成を低下させて癌治療に適
用することができる。これにより、正常細胞には影響を及ぼすことなく癌細胞特異的坑癌
治療を考慮することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明によると、植物または食品内に存在する微細物質であるルテリオンを効果的に分
離することができ、前記分離されたルテリオンを一定の大きさに成長するように培養する
ことができて、疾病の予防および治療のための様々な用途開発に利用することができる。
【０１４２】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者
にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明
の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲
は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2019205467.tif 000013
【図２】
2019205467.tif 000014
【図３】
2019205467.tif 000015
【図４】
2019205467.tif 000016
【図５】
2019205467.tif 000017
【図６】
2019205467.tif 000018
【図７】
2019205467.tif 000019
【図８】
2019205467.tif 000020
【図９】
2019205467.tif 000021
【図１０Ａ】
2019205467.tif 000022
【図１０Ｂ】
2019205467.tif 000023
【図１１】
2019205467.tif 000024
【図１２】
2019205467.tif 000025
【図１３】
2019205467.tif 000026
【図１４】
2019205467.tif 000027
【図１５】
2019205467.tif 000028
【図１６】
2019205467.tif 000029
【図１７】
2019205467.tif 000030
【図１８】
2019205467.tif 000031
【図１９】
2019205467.tif 000032
【図２０】
2019205467.tif 000033
【図２１】
2019205467.tif 000034
【図２２】
2019205467.tif 000035
【図２３】
2019205467.tif 000036
【図２４】
2019205467.tif 000037
【図２５】
2019205467.tif 000038
【図２６】
2019205467.tif 000039
【図２７】
2019205467.tif 000040
【図２８】
2019205467.tif 000041
【図２９】
2019205467.tif 000042
【図３０】
2019205467.tif 000043
【図３１】
2019205467.tif 000044
【図３２】
2019205467.tif 000045
【図３３】
2019205467.tif 000046
【図３４】
2019205467.tif 000047
【図３５】
2019205467.tif 000048
【図３６】
2019205467.tif 000049
【図３７】
2019205467.tif 000050
【図３８】
2019205467.tif 000051
【図３９】
2019205467.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月6日(2019.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性を有する、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオン：
（ａ）５０〜８００ｎｍの円形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有；および
（ｑ）ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で構成される群から選択される一つ以上の染色剤で染色する場合、陽性に染色される。
【請求項２】
下記の段階を含む、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオンの分離方法：
（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｃ）前記遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照射して運動性を有して集まるルテリオン粒子を分離すること、またはＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２といったルテリオン表面抗原を認知する結合体との結合の有無を確認してルテリオンを分離する段階。
【請求項３】
前記植物は、表１〜４で選択される薬用植物であることを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記植物は、当帰、漆皮およびキウィで構成された群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項５】
前記段階（ａ）の振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項６】
前記振盪抽出は、８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間バブリングして植物または食品のルテリオンがかたまらないようにすることを特徴とする請求項５に記載の分離方法。
【請求項７】
前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項８】
前記遠心分離は、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われることを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項９】
２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００ｎｍのフィルターを順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオンに分類することをさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項１０】
ｐＨ７以下および０℃以下の条件で保存する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項１１】
ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で保存する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項１２】
２５，０００〜３５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｓｑｕａｒｅ  ｉｎｃｈ）以上の圧力を加えて分裂を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項１３】
ｐＨ１〜３および１０〜２０℃で分裂を誘導して増殖させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の分離方法。
【請求項１４】
下記の段階を含む、ミトコンドリア類似微細物質であるルテリオンの分離方法：
（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原ＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。
【請求項１５】
（ｃ）粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項１６】
前記ルテリオンを含有する抽出物は、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（ｉｉ）植物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒存在下に植物または食品の加熱によって発生するガスの凝縮液であることを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項１７】
前記凝縮液は、下記段階を経て製造されたことを特徴とする請求項１６に記載の分離方法：
（ａ）植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングしながら振盪する段階；および
（ｂ）前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて凝縮液を取得する段階。
【請求項１８】
前記粒子は、磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維粒子および蛍光粒子で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項１９】
前記磁性粒子は、鉄、アルミニウム、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カドミウム、マグネシウム、銅、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２０】
前記磁性粒子は、炭素および抗体またはアプタマー結合のための官能基で二重コーティングされたことを特徴とする請求項１８に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２１】
前記官能基は、アミド基（ａｍｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）およびカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）で構成された群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２２】
前記粒子の大きさは、１０〜１，０００ｎｍであることを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２３】
前記粒子は、磁性ナノ粒子であり、前記（ｂ）段階は、外部から磁力を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収することを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２４】
前記粒子は、蛍光粒子であり、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーターを利用してルテリオンが結合された蛍光粒子を回収することを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２５】
前記粒子は、静電気を帯びた粒子であり、前記（ｂ）段階は、不均一な電場を形成して静電気的引力でルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２６】
前記粒子は、イオン性粒子であり、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする請求項１４に記載のルテリオンの分離方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
【請求項２９】
前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）またはキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であることを特徴とする請求項２８に記載の培養方法。
【請求項３０】
前記培養前および後のルテリオンの大きさは、それぞれ５０〜２００ｎｍおよび３００〜５００ｎｍであることを特徴とする請求項２７または請求項２８に記載の培養方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
下記で選択された一つ以上の特性を有するルテリオン：
（ａ）５０〜８００ｎｍの円形ないし楕円形で、運動性がある；
（ｂ）核酸含有；
（ｃ）免疫化学蛍光染色時ミトコンドリアと類似の反応を示す；
（ｄ）融合（ｆｕｓｉｏｎ）および／または分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）生態様式を示す；
（ｅ）融合がない場合には大きさが５００ｎｍまで成熟して、ＤＮＡ含有類似ミトコンドリアに成熟して、ＳＥＭまたはＴＥＭ電子顕微鏡写真上でミトコンドリアと類似する構造を示す；
（ｆ）エキソソームとは異なる光反応を示す；
（ｇ）ＩＲ照射時または加圧時分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）が発生する；
（ｈ）表面抗原としてＣＤ３３２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３またはＣＤ３９を発現する；
（ｉ）自家蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示す；
（ｊ）２００〜４００ｎｍ大きさでＡＴＰを産生する；
（ｋ）二重膜または多重膜構造；
（ｌ）付着性がある；
（ｍ）癌細胞のテロメラーゼ活性抑制；
（ｎ）正常細胞のテロメラーゼ活性化促進；
（ｏ）細胞透過能保有；及び
（ｐ）血液脳関門（ＢＢＢ）透過能保有。
[項目２]
ローダミン１２３（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３）、ミトトラッカー（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＤＡＰＩ、およびヤヌスグリーンＢ（Ｊａｎｕｓ  ｇｒｅｅｎ  Ｂ）で構成される群から選択される一つ以上の染色剤で染色する場合、陽性に染色される特性を有することを特徴とする項目１に記載のルテリオン。
[項目３]
下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
（ａ）植物または食品の水蒸気またはガス振盪抽出物を冷却して取得した凝縮液を０．８〜１．２μｍの空隙を有するフィルターを利用して濾過する段階；
（ｂ）前記濾過された凝縮液を遠心分離する段階；および
（ｃ）前記遠心分離された上澄み液からルテリオンを分離する段階。
[項目４]
前記植物は、表１〜４で選択される薬用植物であることを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目５]
前記植物は、当帰、漆皮およびキウィで構成された群から選択されることを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目６]
前記段階（ａ）の振盪抽出は、植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングさせながら振盪するように進行することを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目７]
前記振盪抽出は、８〜１０時間振盪して、２〜３時間毎に２０〜３０分間バブリングして植物または食品のルテリオンがかたまらないようにすることを特徴とする項目６に記載の分離方法。
[項目８]
前記（ａ）段階で取得された凝縮液にＩＲ光線を照射する段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目９]
前記遠心分離は、１２００〜５０００ｒｐｍで５〜１０分間繰り返し行われることを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１０]
前記段階（ｃ）は、遠心分離された上澄み液に２００〜６００ｕｍ波長のＩＲ光線を照射して運動性を有して集まるルテリオン粒子を分離すること、またはルテリオン表面抗原ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２を認知する結合体との結合の有無を確認してルテリオン粒子を分離することを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１１]
前記分離されたルテリオン粒子を５０ｎｍフィルターで濾過した後、フィルターにかかった部位を収集する段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１２]
２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍ、８００ｎｍおよび１０００ｎｍのフィルターを順次利用して、それぞれ５０〜２００ｎｍ、２００〜４００ｎｍ、４００〜６００ｎｍ、６００〜８００ｎｍおよび８００〜１０００ｎｍの大きさのルテリオンに分類することをさらに含むことを特徴とする項目１１に記載の分離方法。
[項目１３]
ｐＨ７以下および０℃以下の条件で保存する段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１４]
ｐＨ１〜５および−９０℃〜０℃で保存する段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１５]
２５，０００〜３５，０００ｐｓｉ（ｐｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｓｑｕａｒｅ  ｉｎｃｈ）以上の圧力を加えて分裂を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１６]
ｐＨ１〜３および１０〜２０℃で分裂を誘導して増殖させる段階をさらに含むことを特徴とする項目３に記載の分離方法。
[項目１７]
下記の段階を含むルテリオンの分離方法：
（ａ）ルテリオンを含有する抽出物にルテリオン表面抗原に特異的に結合する抗体またはアプタマーが固定された粒子を添加してルテリオンと粒子の結合を誘導する段階；および
（ｂ）前記粒子に結合されたルテリオンを回収する段階。
[項目１８]
（ｃ）粒子に結合されたルテリオンからルテリオンのみを分離する段階をさらに含むことを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目１９]
前記ルテリオンを含有する抽出物は、植物抽出物または食品抽出物であることを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２０]
前記ルテリオンを含有する抽出物は、（ｉ）植物または食品の熱水抽出物、（ｉｉ）植物または食品の溶媒抽出物、または（ｉｉｉ）溶媒存在下に植物または食品の加熱によって発生するガスの凝縮液であることを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２１]
前記凝縮液は、下記段階を経て製造されたことを特徴とする項目２０に記載の分離方法：
（ａ）植物または食品に溶媒を添加して、５０〜９０℃で気体を利用して間欠的にバブリングしながら振盪する段階；および
（ｂ）前記振盪によって気化される水蒸気またはガスを捕集した後、冷却させて凝縮液を取得する段階。
[項目２２]
前記ルテリオン表面抗原は、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１３３またはＣＤ３３２であることを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２３]
前記粒子は、磁性粒子、シリカ粒子、量子ドット粒子、ガラス粒子、高分子粒子、繊維粒子および蛍光粒子で構成された群から選択されることを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２４]
前記磁性粒子は、鉄、アルミニウム、コバルト、ニッケル、マンガン、錫、亜鉛、カドミウム、マグネシウム、銅、バリウム、リチウムまたはイットリウムの酸化物で構成された群から選択されることを特徴とする項目２３に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２５]
前記磁性粒子は、炭素および抗体またはアプタマー結合のための官能基で二重コーティングされたことを特徴とする項目２３に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２６]
前記官能基は、アミド基（ａｍｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）、エステル基（ｅｓｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）、アミン基（ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）およびカルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）で構成された群から選択されることを特徴とする項目２５に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２７]
前記粒子の大きさは、１０〜１，０００ｎｍであることを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２８]
前記粒子は、磁性ナノ粒子であり、前記（ｂ）段階は、外部から磁力を加えてルテリオンが結合された磁性ナノ粒子を集めた後、回収することを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目２９]
前記粒子は、蛍光粒子であり、前記（ｂ）段階は、蛍光利用セルソーターを利用してルテリオンが結合された蛍光粒子を回収することを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目３０]
前記粒子は、静電気を帯びた粒子であり、前記（ｂ）段階は、不均一な電場を形成して静電気的引力でルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目３１]
前記粒子は、イオン性粒子であり、前記（ｂ）段階は、静電気的引力を利用してルテリオンが結合された粒子を回収することを特徴とする項目１７に記載のルテリオンの分離方法。
[項目３２]
項目１に記載のルテリオンに水分を添加してＩＲ光線照射または加圧下に１８〜３０℃で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
[項目３３]
項目１に記載のルテリオンを糖含有培地でｐＨ５〜９および１８〜３０℃の条件で増殖させる段階を含むルテリオンの培養方法。
[項目３４]
前記糖は、ラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、ガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）またはキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）であることを特徴とする項目３３に記載の培養方法。
[項目３５]
前記培養前および後のルテリオンの大きさは、それぞれ５０〜２００ｎｍおよび３００〜５００ｎｍであることを特徴とする項目３２または項目３３に記載の培養方法。
【外国語明細書】
2019205467000001.pdf