(57)【要約】      （修正有）【課題】自己抗原を封入するリポソームの提供。【解決手段】（ｉ）リポソームが５００〜１５０００ｎｍの大きさを有し；且つ、（ｉｉ）リポソーム膜がホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含み、ＰＳの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１０重量％であり、ＰＣの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１０重量％であり、ＣＨＯＬの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１３重量％である、リポソーム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗原を封入するリポソームであって、
（ｉ）リポソームが５００〜１５０００ｎｍの大きさを有し；且つ
（ｉｉ）リポソーム膜が膜リポソームの組成全体に対して１０〜４０重量％の量でホスファチジルセリン（ＰＳ）を含む、
リポソーム。
【請求項２】
多胞体ベシクル（ＭＶＶ）である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
ＰＳの重量％が膜リポソームの組成全体に対して２２〜３３％である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
リポソーム膜が更にホスファチジルコリン（ＰＣ）とコレステロール（ＣＨＯＬ）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項５】
リポソーム膜が、ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬを、０．６：０．６：０．７〜１．５：１．５：１．８からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬで含む、請求項４に記載のリポソーム。
【請求項６】
リポソーム膜を形成する脂質の総量と自己抗原の総量との重量比が２０：１〜３：１である、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項７】
自己抗原が５〜５０のアミノ酸からなる大きさを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項８】
自己抗原が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される自己免疫疾患に関連付けられるペプチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項９】
自己抗原が、Ｔ１Ｄに関連付けられるものであり、配列番号１及び配列番号２のペプチドからなる群より選択される、請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１０】
自己抗原がＭＳに関連付けられるものであり、配列番号３を含む、請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１１】
更に自己抗原を封入し、封入された自己抗原のすべてが同じ自己免疫疾患に関連付けられる、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソームの治療的有効量を、他の適切な薬学的又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む、薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１２に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患の予防又は治療における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１２に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１５】
自己免疫疾患に罹患した患者の、自己に対する寛容性の回復における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１２に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１６】
自己免疫疾患が、Ｔ１Ｄ、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される、請求項１４又は１５に記載の使用のための、リポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１７】
自己免疫疾患が１型糖尿病又はＭＳである、請求項１６に記載の使用のための、リポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に関する。特に、本発明は、自己免疫疾患の予防又は治療のための自己抗原封入リポソームを提供する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫は、自身の構成部分を自身として認識するうえでの生物体の失敗であり、したがって自身の細胞及び組織に対する免疫応答を招く。異常な免疫応答に起因するあらゆる疾患を自己免疫疾患という。顕著な例には、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、シェーグレン症候群が含まれる。
【０００３】
先進国の人口のうち７〜１０％の人口がこれらの疾患に罹患していると計算されており、疾患は時に慢性、消耗性で、生命に関わる。自己免疫関連の医療費は、自己免疫疾患が世界的に増加している中、有効な治療法がないために、膨張を続けている。
【０００４】
自己免疫疾患の治療は、常套的に、免疫抑制薬、抗炎症剤（ステロイド）、又は苦痛緩和剤であった。橋本甲状腺炎又は１型糖尿病におけるホルモン補充のような非免疫学的療法は、自己攻撃的応答の結果を処置するものであり、したがってこれらは対症療法である。食餌操作はセリアック病の重症度を制限する。ステロイド又はＮＳＡＩＤによる治療は多くの疾患の炎症症候を制限する。
【０００５】
望ましくない免疫応答を低減又は回避する免疫調節性療法の開発に大規模な研究の投資が行われた。しかしながら、複数の異なる自己免疫疾患の複雑な詳細の理解が不足しているために、この分野の進歩は実質的に減速している。現在の戦略は、一般に、免疫抑制を維持するために通常生涯にわたる治療となる、広範な作用を有する免疫抑制薬である。加えて、広範に作用する免疫抑制薬の使用は、腫瘍、感染、腎毒性、及び代謝異常といった重度の副作用の危険に関連付けられる。
【０００６】
これまでの努力にも関わらず、効果的且つ望ましくない副作用を回避する、自己免疫疾患を治療するための更なる治療的手法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、自己免疫疾患の治療において高度に効果的な新規の自己抗原特異的治療法を開発した。特に、本発明者らは、脂質ホスファチジルセリンを含む特定の大きさのリポソーム内に、治療対象の自己免疫疾患に関連付けられる自己抗原を封入することにより、自己免疫疾患が効果的に治療されうることを発見した。
【０００８】
したがって、第一の態様において、本発明は、自己抗原を封入するリポソームに関し、ここで（ｉ）リポソームは５００〜１５０００ｎｍの大きさを有し；且つ（ｉｉ）リポソーム膜は、膜リポソームの全組成に対してホスファチジルセリン（ＰＳ）を１０〜４０重量％の量で含む。
【０００９】
本発明は、本発明のリポソームの特徴、即ち、５００〜１５０００ｎｍからなる大きさ、及び１０〜４０％のＰＳの存在が、抗原提示細胞による封入自己抗原の寛容原性提示を可能にし、それにより自己抗原に対する寛容性を回復することを発見した。
【００１０】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、本リポソームの特徴が、それらが樹状細胞によって効果的に取り込まれ、封入された自己抗原が処理されて、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介してＣＤ４＋Ｔリンパ球に（外因性提示）、寛容原性形態でＣＤ８＋Ｔリンパ球に（交差提示）それぞれ提示されることを保証し、したがって抗原に対する寛容性を誘導し、自己免疫カスケードを停止させると仮定する。換言すれば、本発明の自己抗原封入リポソームは、自己免疫性ではなく自己抗原に対する寛容性を誘導し、自己免疫疾患の効果的な治療を導くものである。
【００１１】
本発明の自己抗原封入リポソームの寛容原性効果、並びに自己免疫疾患の治療、特にＴ１Ｄ及びＭＳの治療におけるその驚くべき効果を、後述の実施例に示す。
【００１２】
図２、３及び４に示すように、インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームは樹状細胞によって取り込まれ、それによりこれら樹状細胞は寛容原性を取得する：共刺激性分子の発現低下は、ＰＧＥ２の生成を誘導し、糖尿病の観点からはＴ細胞の増殖を低減させた。このような結果は、リポソームが、ある程度は、アポトーシス小体と同様に樹状細胞（ＤＣ）の免疫寛容原性を促進することを示している。加えて、この効果は、炎症誘発性の刺激後も減じることはなく、これはこの治療法が、自己免疫カスケードが進行していて刺激促進刺激が存在するときに有効であることを実証するものであるため、考慮すべき重要な特徴である。
【００１３】
上記はすべて、後述の実施例に示すように、自己免疫疾患の効率的な治療に繋がる。図５及び６は、ＮＯＤ前糖尿病マウスの治療が、本発明のリポソームの単独投与内で達成されることを示し、図８Ａは、疾患の発症後に投与されたとき、インスリンペプチドが充填されたＰＳ−リポソームはＮＯＤマウスの糖尿病を元に戻すことができることを示している。更に、図９は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドを含有するＰＳ−リポソームが、Ｃ５７ＢＬ／６免疫化マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）疾患の発生を防ぎうることを示している。したがって、自己免疫疾患のための既知の免疫調節又は抗炎症治療とは異なり、本発明者らの開発したリポソームに基づく治療法は、恒久的に必要とされるものではない。代わりに、長期持続性の耐性の回復が達成され、それにより自己免疫疾患の効果的な予防又は治療がもたらされる。この効果は、有効量の自己抗原封入リポソームを含む薬学的組成物の単回投与、又は２〜４回以内の投与後に達成されうる。
【００１４】
また、図５、６及び８Ｂでは、マウスが空のリポソームを投与されたとき、Ｔ１Ｄの発生に何の効果も得られなかったことを見ることができる。したがって、治療はリポソームが適切な自己抗原を封入しているときのみ効果的であり、これはナノ治療の抗原特異性を示している。
【００１５】
抗原特異性に基づく治療法であるが、本発明の自己抗原封入リポソームは、望ましくない副作用を呈しないという利点を有する。上述のように、自己免疫疾患の治療のための他の免疫調節法は免疫抑制性剤を使用しており、これは往々にして感染に対する高い感受性を招き、時に腫瘍の発生、腎毒性又は代謝異常を助長する。
【００１６】
寛容原性の提示が得られることに加え、特別に設計した本発明のリポソーム内に自己抗原を封入することは、カーゴの劣化を防ぎ、毒性が低下／排除されることから極めて望ましい目標である。これは、自己抗原が、抗原提示細胞によって取り込まれるまでリポソーム内に閉じ込められていることにより、有害な免疫応答を誘導しえないという事実に依るものである。
【００１７】
本発明の第２の態様は、治療的有効量の上述の自己抗原封入リポソームを、他の適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体と共に含有する薬学的又は獣医学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明によるリポソームに基づく薬学的組成物は、安定性、均一性、及び大規模生産の容易性といった観点から複数の利点を有する。
【００１９】
第１に、本発明の自己抗原封入リポソームの生産は、製薬業界において一般的な試薬及び設備を用いて低コストで達成されうる。
【００２０】
本発明のリポソームは、その大きさにより、溶液中で極めて安定であり、凝集しがちでその生産に小さな孔径を有する高価な膜を用いた押出成型プロセスの反復が必要とされるそれらより小さなリポソームとは異なり、容易に得ることができる。
【００２１】
更に、製品の均一性が保障されると同時に、大規模な工業的生産のためのスケールアップが可能である。
【００２２】
別の大きな利点は、本発明のリポソームに基づく薬学的組成物が規定組成物であり、望ましくない夾雑物又は副産物を含まないという事実に起因する。自己抗原封入リポソームは、ネクローシス小体といった毒性の副産物へと変性することはなく、自家性又は異種性の細胞ベースの治療法の場合のような拒絶を起こすことがない。
【００２３】
その寛容原性効果のために、本発明の自己抗原封入リポソームは、自己免疫疾患の効果的な予防（即ち、自己免疫の発動の回避）、並びに、前臨床病期（即ち、自己免疫性は既に発動しているが、組織損傷及び臨床症状は小さい段階）及び臨床病期（即ち、組織損傷が大きく臨床症状が明白である段階）の両方における自己免疫疾患の効果的な治療を可能にする。
【００２４】
したがって、本発明の第３の態様は、医薬としての使用のための、本発明の第１の態様による自己抗原封入リポソームを提供する。この態様は、治療を必要とするヒトを含む哺乳動物に対し、治療的有効量の本発明の自己抗原封入リポソームを、一又は複数の適切な薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に投与することを含む、疾患の予防又は治療のための方法として説明することもできる。
【００２５】
第４の態様では、本発明は、自己免疫疾患の予防又は治療における使用のための、上記に定義された自己抗原封入リポソームを提供する。この態様は、自己免疫疾患の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記に定義された自己抗原封入リポソームの使用として説明することもできる。この態様は、治療を必要とするヒトを含む対象において、治療的有効量の上記に定義された自己抗原封入リポソームを、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に投与することを含む、自己免疫疾患の予防又は治療のための方法として説明することもできる。
【００２６】
第５の態様では、本発明は、自己免疫疾患に罹患した患者の自己に対する寛容性の回復における使用のための、上記に定義された自己抗原封入リポソームを提供する。この態様は、自己免疫疾患に罹患した患者の自己に対する寛容性の回復のための医薬の製造のための、上記に定義された自己抗原封入リポソームの使用として説明することもできる。この態様は、治療を必要とするヒトを含む対象において、治療的有効量の上記に定義された自己抗原封入リポソームを、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に投与することを含む、自己免疫疾患に罹患した患者の自己に対する寛容性の回復のための方法として説明することもできる。
【００２７】
最後に、本発明の他の態様は、自己免疫応答を抑制するための、上記に定義されたリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物；並びに自己免疫疾患の予防又は治療における使用のための、上記に定義されたリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物を提供し、前記リポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は封入された自己抗原に対する寛容性を回復する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】インスリン由来の自己抗原を充填したＰＳ−リポソームの極低温透過型電子顕微鏡（クライオＴＥＭ、ＪＥＯＬ−ＪＥＭ１４００顕微鏡）画像である。Ｂａｒ＝０．２μｍ。
【図２】コントロールＤＣ（Ａ）、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＤＨＰＥ標識したＰＳ−リポソーム（ＯＧ４８８  ＰＳ−ｌｉｐｏ）と共に３０分間４oＣで共培養したＤＣ（Ｂ）及び３７oＣで同様に共培養したＤＣ（Ｃ）の、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析である。ｘ座標はＯＧ４８８  ＰＳ−ｌｉｐｏを；ｙ座標はＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７染色したＤＣを表す。
【図３】ＤＣ中へのＰＳ−リポソームの捕捉の効果を示す。ｙ座標は、（Ａ）アネキシンＶ及び７ａａｄ染色により評価したＤＣ生存率（％）、（Ｂ）ＣＤ４０及びＣＤ８６膜発現の蛍光強度の中央値、及び（Ｃ）未成熟及び成熟ＤＣの培養上清における、ＥＬＩＳＡによるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）生成の定量化を表している。白の記号は、ＰＳ−リポソームの捕捉前（三角）及び後（四角）の未成熟ＤＣ、又は培養の２４時間後の、インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソーム（丸）を表す。黒の記号は、ＰＳ−リポソームの捕捉前（三角）及び後（四角）の成熟ＤＣの生存率、又は炎症促進性刺激（リポ多糖、ＬＰＳ）の２４時間後のインスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソーム（丸）を表す。ＥＬＩＳＡのデータは細胞１０６個当たりのｐｇとして表す。
【図４】炎症促進性刺激後であっても、ＰＳ−リポソームの捕捉後は、ＤＣはＴ細胞の自己増殖を刺激しない。ｙ座標は、ＰＳ−リポソームの捕捉前（白三角）及び後（白四角）における、未成熟ＤＣにより誘導される刺激後のＴ細胞の自己増殖（３Ｈチミジンアッセイの場合ｃ．ｐ．ｍ．）、或いは７日間インスリンペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を１：１０の比で充填したＰＳ−リポソーム（白丸）の場合の自己増殖を表す。黒の記号は、ＰＳ−リポソームの捕捉前（黒三角）及び後（黒四角）の、成熟ＤＣにより誘導される増殖、又は炎症促進性刺激ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で予め活性化した、インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソーム（黒丸）の場合の増殖を表す。
【図５】ＰＳ−リポソームに封入されたインスリンペプチドを用いる免疫療法は、Ｔ１Ｄの発生を減少させる。（Ａ）ｙ座標は、インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソームで処置したＮＯＤマウス（丸、ｎ＝１２）、空のＰＳ−リポソームで処置したＮＯＤマウス（四角、ｎ＝１８）、及び食塩水を与えたコントロール群（三角、ｎ＝１６）における糖尿病の累積発生率（パーセンテージ）を表す。（Ｂ）ｙ座標は、インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソームで処置したマウス（丸、ｎ＝１２−６）、空のＰＳ−リポソームで処置したマウス（四角、ｎ＝１８−３）、及び食塩水で処置したコントロール群（三角、ｎ＝１６−３）における体重（ｇ）の径観察を表す。ｘ座標はマウスの週齢を示す。
【図６】膵島炎スコアは免疫化マウスにおいて重度が低かった。ＮＯＤマウスの膵島炎に対するＰＳ−リポソームの効果。ｙ座標は、（Ａ）異なる群のＮＯＤマウスの膵島炎スコア、及び（Ｂ）異なるＮＯＤマウス群において五つの浸潤カテゴリーの各々に分類された膵島のパーセンテージを表す。浸潤カテゴリー：０、膵島炎なし；１、膵島周囲の炎症；２、軽度の膵島炎（＜２５％の膵島に浸潤）；３、２５〜７５％の膵島に浸潤；４、膵島全体に浸潤。ＮＯＤマウスの群は：食塩水で処置したコントロールマウス（Ｓ）、空のＰＳ−リポソームで処置したマウス（ＰＳ）、及び自己抗原を含有するＰＳ−リポソームで処置したマウス（ＰＳＡＢ）であった。一の群につき４〜６の非糖尿病マウス由来の膵臓を、試験期間（３０週）の最後に分析した。結果は平均±ＳＥＭである。＊コントロール群との有意な差（ｐ＜０．０５）（独立ｔ検定）。
【図７】ＰＳ−リポソームの経過観察。２４時間目の、蛍光標識されたＰＳ−リポソーム（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射されたＮＯＤマウス由来の複数の器官における蛍光性シグナル（組織１ｇ当たりのＲＦＵ、即ち相対蛍光単位）の柱状図である。ＰＡＴ（生殖腺周囲脂肪組織）；Ｋ（腎臓）；Ｓ（脾臓）；Ｐ（膵臓）；ＰＬＮ（膵臓リンパ節）；ＭＬＮ（腸間膜リンパ節）；Ｌ（肝臓）；ＭＤＬＮ（縦隔リンパ節）；Ｔ（胸腺）。三つの個別の実験のうち一つの代表的な実験の結果を示す。Ｙ座標は組織１ｇ当たりのＲＦＵを示す。
【図８】インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソームで処置した糖尿病マウス（Ａ）又は空のリポソームで処置した同マウス（Ｂ）における、疾患の発症（０日目）後１、５及び８日目の糖血症のレベルである。Ｙ座標は糖血（ｍｇ／ｄｌ）を示す。グレーのゾーンは血糖症の診断値の範囲を示す。Ｘ座標は、疾患の発症からの時間を日数で示す。丸はインスリン投与のなかった日を示す。
【図９】ＭＯＧペプチドを含有するリポソームで処置したＣ５７ＢＬ／６免疫化マウス（白丸）又は空のリポソーム（白三角）で処置した同マウスについて毎日実施したＥＡＥの臨床スコアである。Ｙ座標は平均臨床スコアを示す。Ｘ座標は免疫化後の時間（日）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の第１の態様は、自己抗原封入リポソームを提供する。
【００３０】
「リポソーム」という用語は、脂質の二重層からなる一又は二の膜を含む自己凝集構造と理解され、前記二重層の各々は、両親媒性の脂質分子を含有し反対方向を向く二つの単一層を含む。両親媒性の脂質は、一又は複数の非極性（疎水性）アシル鎖に共有結合した極性（親水性）のヘッドグループ領域を含む。疎水性アシル鎖と周囲の水性媒体とのエネルギー的に好ましくない接触は、両親媒性脂質分子を誘導して、それらの極性ヘッドグループが二重層表面の方向を向き、アシル鎖が二重層の内部に再び向くように自身を構成せる。したがって、エネルギー的に安定な構造が形成され、アシル鎖が水性の環境と接触しないように効果的に遮蔽される。
【００３１】
リポソームは、単一の二重層膜（小さな単層ベシクル「ＳＵＶ」及び大きな単層ベシクル「ＬＵＶ」）、又は複数の二重層膜（多層の大ベシクル「ＭＬＶ」）を有することができる。リポソームは、複数の非同心円状の水性チャンバーを閉じ込める又は封入するリポソームである、多胞体ベシクル「ＭＶＶ」として調製されてもよい。対照的に、ＭＬＶは複数の同心円状の「玉ねぎの皮」様の膜を有し、それら膜の各々は水性の区画を封入する。脂質分子の保護障壁内部におけるこのような水性の容積の封入により、リポソームは、封入された分子、例えばペプチドを、外部環境内に存在する要因、例えばペプチダーゼ酵素の劣化効果から隔離することができる。
【００３２】
本発明のリポソームの大きさは、抗原提示細胞によるそれらの取り込みを増大させる５００〜１５０００ｎｍである。加えて、本発明のリポソームは、好ましくは図１に示すようなＭＶＶ形態を有する。これら大きなＭＶＶリポソームは、従来のＭＬＶ又はＳＵＶと比較して有意に高い充填効率を有し、且つ、封入された活性薬剤（この場合、自己抗原）が好ましくは水性の区画において溶解する（沈殿したり膜に結合したりしない）ために有利に働く。これらすべては、抗原提示細胞内部の自己抗原のバイオアベイラビリティーとそれによりもたらされる免疫調節活性の向上という観点から利点を有する。
【００３３】
一実施態様では、本発明のリポソームは５００〜１２０００ｎｍの大きさを有する。別の実施態様では、リポソームの大きさは５００〜１００００ｎｍである。別の実施態様では、リポソームの大きさは６００〜８０００ｎｍであり、具体的には７００〜７０００ｎｍ、又は８００〜５０００ｎｍ、又は９００〜３０００ｎｍ、又は９００〜２０００ｎｍ、又は９００〜１５００ｎｍ、又は１０００又は１４００ｎｍである。特定の実施態様では、リポソームは、１０００〜１３００ｎｍ、例えば１０００ｎｍ、１０５０ｎｍ、１１００ｎｍ、１１５０ｎｍ又は１２００ｎｍの大きさを有する。
【００３４】
一実施態様では、本発明のリポソームは、ＭＶＶ形態及び５００〜１２０００ｎｍの大きさを有する。別の実施態様では、本発明のリポソームは、ＭＶＶ形態を有し、５００〜１０，０００ｎｍの大きさを有する。別の実施態様では、本発明のリポソームは、ＭＶＶ形態を有し、６００〜８０００ｎｍ、具体的には７００〜７０００ｎｍ、又は８００〜５０００ｎｍ、又は９００〜３０００ｎｍ、又は９００〜２０００ｎｍ、又は９００〜１５００ｎｍ、又は１０００又は１４００ｎｍの大きさを有する。特定の実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態を有し、１０００〜１３００ｎｍ、例えば１０００ｎｍ、１０５０ｎｍ、１１００ｎｍ、１１５０ｎｍ又は１２００ｎｍの大きさを有する。
【００３５】
リポソーム膜は、限定しないが、リン脂質、例えばホスファチジルコリン（「ＰＣ」）、ホスファチジルセリン（「ＰＳ」）、ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＥ」）、ホスファチジルグリセロール（「ＰＧ」）、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ」）及びホスファチジン酸（「ＰＡ」）を含みうる。ナノ粒子の膜を構成することができる他の脂質には、限定されないが、コレステロール（「ＣＨＯＬ」）及びコレステロール−ＰＥＧ、及び蛍光標識されたホスファチジルコリンが含まれる。リポソーム膜は、タンパク質、糖（炭水化物）、抗体又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖といった、自然界では脂質でない他の分子を含有しうる。リポソームは、リポソームを特定の部位又は標的細胞に向かわせるように、又はリポソームを有害環境（例えば、胃腸管）から保護するように設計された特定の部分を含むことができる。リポソームの組成は、自己抗原の寛容原性の送達に関連する。したがって、上述のように、リポソーム膜はＰＳを、膜リポソームの組成全体に対して１０〜４０重量％の量で含む。リポソーム膜に含有されるＰＳは「私を食べて」というシグナルを構成し、このシグナルは抗原提示細胞によるＰＳ認識を寛容誘導の結果につなげる。ＤＣによって効果的に取り込まれ、自己抗原の寛容原性の送達が達成されるために、本発明のリポソームが更なる受容体又はリガンドを必要としないことは注目に値する。しかしながら、他の受容体及び／又はリガンドが、取り込み及び／又は寛容原性処理を向上させるためにリポソーム中に集められてもよい。
【００３６】
「重量パーセント（％）」は、膜リポソーム組成物の総重量に対するリポソーム膜の各成分のパーセンテージを指す。
【００３７】
「膜リポソーム組成物」は、例えば、複数の膜二重層を含むＭＶＶリポソームであるとき（図１に示すように）、リポソームに含有される膜二重層の全体を指す。共に本発明のリポソームに含有される膜二重層全体を指す用語「リポソーム膜（ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」又は「リポソーム膜（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）」が使用される場合も同義である。
【００３８】
一実施態様では、リポソーム膜は、膜リポソームの組成全体に対して１５〜３７重量％の量でＰＳを含む。更なる実施態様では、膜のＰＳは、膜リポソームの組成全体に対して２０〜３５重量％、又は２２〜３５重量％、又は２２〜３３重量％、又は２５〜３２重量％、又は２６〜３１重量％、又は２７〜３０重量％、例えば２７重量％、２８重量％、２９重量％又は３０重量％で含まれる。好ましくは、膜のＰＳは、膜リポソームの組成全体に対して３０重量％である。
【００３９】
本発明によるリポソームは、ＰＳに加えて、可変濃度の他の脂質を含みうる。いくつかの実施態様では、リポソーム膜はＰＣも含む。いくつかの実施態様では、リポソーム膜はＣＨＯＬも含む。特定の実施態様では、リポソーム膜はＰＣ及びＣＨＯＬも含む。
【００４０】
一実施態様では、リポソーム膜は、膜リポソームの組成全体に対して１０〜４０重量％の量でＰＣを含む。別の実施態様では、リポソーム膜は、膜リポソームの組成全体に対して１２〜４０重量％の量でＰＣを含む。更なる実施態様では、膜のＰＳは、膜リポソームの組成全体に対して１５〜３７重量％、又は２０〜３５重量％、又は２２〜３３重量％、又は２５〜３２重量％、又は２６〜３１重量％、又は２７〜３０重量％、例えば２７重量％、２８重量％、２９重量％又は３０重量％で含まれる。
【００４１】
ＣＨＯＬの量は、膜リポソームの組成全体に対して１３〜５３重量％で含まれる。一実施態様では、リポソーム膜は、膜リポソームの組成全体に対して２０〜５０重量％の量でＣＨＯＬを含む。更なる実施態様では、膜のＣＨＯＬは、好ましくは、膜リポソームの組成全体に対して２７〜４６重量％、又は３０〜４４重量％、又は３３〜４２重量％、又は３６〜４０重量％、例えば３６重量％、３７重量％、３８重量％、３９重量％、又は４０重量％で含まれる。
【００４２】
リポソーム膜に含有される複数の異なる脂質の割合は、安定性、透過性、及び形態の観点から適切な物理的及び化学的特性を有するリポソームを得るために釣り合っていなければならない。一般に、リポソーム膜は、ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬを、０．６：０．６：０．７〜１．５：１．５：１．８のモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬで含む。用語「比」は、互いに対する量の大きさとして通常の意味で理解されるものとする。厳密には、二つの量の比は、第１の量（Ｘ）が第２の量（Ｙ）に何回含まれるかをＸ：Ｙとして表したものである。用語「モル比」は、言及される大きさがモルであるときに使用される。或いは、比は、言及される大きさが重量であるときは「重量比」と表現されうる。ここで、三つの特定の脂質（ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬ）についてモル比の範囲を示す。一実施態様では、膜は、０．７：０．７：０．８〜１．４：１．４：１．６からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含む。別の実施態様では、膜は、０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含む。別の実施態様では、膜は、０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含む。好ましい実施態様では、膜は、約１：１：１．３３のモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含む。
【００４３】
上述のように、本発明のリポソームは自己抗原を封入する。用語「自己抗原」は、特定の自己免疫疾患に罹患した患者の免疫系によって認識される正常なタンパク質又はタンパク質の複合体を指す。これら抗原は正常条件下においては免疫系の標的になってはならないが、主に遺伝的及び環境的要因により、これら患者においてはそのような抗原の正常な免疫寛容が失われている。特定の実施態様では、リポソームは、同じ自己免疫疾患に関連付けられる更なる自己抗原を封入する。例えば、リポソームは、好ましくはＴ１Ｄに関連付けられる、二つ、三つ、四つ又は五つの自己抗原を封入する。
【００４４】
いくつかの実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は５０：１〜２：１である。別の実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は３０：１〜３：１である。また別の実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。また別の実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。また別の実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１２：１〜３：１である。別の実施態様では、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１及び４：１からなる群より選択される。
【００４５】
一実施態様では、リポソームは、５００〜１０，０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２０〜３５重量％のＰＳ及び０．７：０．７：０．８〜１．４：１．４：１．６からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は５０：１〜３：１である。
【００４６】
一実施態様では、リポソームは、７００〜７，０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３３重量％のＰＳ及び０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。
【００４７】
別の実施態様では、リポソームは、８００〜５０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２５〜３２重量％のＰＳ及び０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。
【００４８】
別の実施態様では、リポソームは９００〜３０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、３０重量％のＰＳ、３０重量％のＰＳ及び４０重量％のＣＨを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１２：１〜３：１であり、好ましくは重量比は、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１及び４：１からなる群より選択される。
【００４９】
別の実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態を有し、且つ８００〜５０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２５〜３２重量％のＰＳ及び０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。別の実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態を有し、且つ９００〜３０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、３０重量％のＰＳ、３０重量％のＰＳ及び４０重量％のＣＨを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１２：１〜３：１であり、好ましくは重量比は、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１及び４：１からなる群より選択される。好ましい実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態、１０００ｎｍを有し、リポソーム膜は、３０重量％のＰＳ、３０重量％のＰＳ及び４０重量％のＣＨを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１２：１〜３：１であり、好ましくは重量比は、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１及び４：１からなる群より選択される。
【００５０】
封入される自己抗原は、特定の自己免疫疾患に関連付けられる。特定の実施態様では、自己抗原は、Ｔ１Ｄ、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される自己免疫疾患に関連付けられる。特定の実施態様では、リポソームはＴ１Ｄに関連付けられる自己抗原を封入する。Ｔ１Ｄに関連付けられることが知られる非限定的な自己抗原は、インスリン、プロインスリン、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＩＡ２、膵島細胞抗原５１２としても知られる）、グルタメートデカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、クロモグラニン及び膵島−グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）（Ｒｏｅｐ  ＢＯ，Ｐｅａｋｍａｎ  Ｍ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ，２０１２，ｖｏｌ．２（４）：ａ００７７８１．ｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ００７７８１．）である。したがって、一実施態様では、本発明のリポソームは、インスリン、プロインスリン、ＩＡ２、ＧＡＤ、クロモグラニン及びＩＧＲＰからなる群より選択される自己抗原を封入する。
【００５１】
更に、本発明の意味において、リポソームに封入される自己抗原は、完全な抗原タンパク質である必要はない。実際、関連するタンパク質の特定の領域が単離されて、これは特に抗原性であると説明されている。したがって、特定の実施態様では、リポソームは、抗原性ペプチド、特にＴ１Ｄに関連付けられた抗原性ペプチド、例えばインスリン、プロインスリン、ＩＡ２、ＧＡＤ、クロモグラニン及びＩＧＲＰから誘導される抗原性ペプチドである自己抗原を封入する。例えば、インスリンＡ鎖から誘導される配列番号１（２１  ａａ、ＧＩＶＤＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ）及びインスリンＢ鎖から誘導される配列番号２（３０  ａａ、ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＭＳ）によって規定されるペプチドが、Ｔ１Ｄにおいて特に自己抗原性として開示された。したがって、一実施態様では、リポソームは、好ましくは配列番号１及び配列番号２を含むペプチドから選択されるインスリンから誘導された、Ｔ１Ｄに関連付けられる自己抗原を封入する。特定の実施態様では、リポソームは、配列番号１及び配列番号２を含むペプチドを封入する。
【００５２】
自己免疫疾患に関連付けられ、本発明のリポソームに封入されうる他の自己抗原性タンパク質又はペプチドは、例えば、多発性硬化症のミエリン由来のペプチド、例えばミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）由来のペプチド、重症筋無力症のアセチルコリン受容体由来のペプチド、セリアック病のトランスグルタミナーゼ、自己免疫甲状腺炎のサイログロブリンである（Ｌｅｒｎｍａｒｋ  Ａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００１、ｖｏｌ．１０８，ｐ．１０９１−１０９６）。特定の実施態様では、本発明のリポソームは、ＭＳに関連付けられる抗原性ペプチド、例えばＭＯＧに由来する抗原性ペプチド、例えば配列番号３によって規定されるペプチドである自己抗原を封入する。
【００５３】
本発明のリポソームに含有される自己抗原性ペプチドは、有利には、主要組織適合性遺伝子複合体の表面分子による前記抗原の直接提示を可能にする大きさである。「直接提示」は、抗原提示細胞によるこれらペプチドの主要な処理が、表面表示前に不要であることを意味する。いくつかの実施態様では、本発明のリポソーム中の自己抗原性ペプチドの大きさは、５〜１００アミノ酸、特に５〜７０アミノ酸、又は８〜５０アミノ酸、又は８〜３５アミノ酸、又は８〜３０アミノ酸である。このような自己抗原は、バイオアベイラビリティー、リポソームに基づく治療法の有効性及び処理の容易さ（このような小さなペプチドの封入は、全タンパク質又は大きなペプチドと比較して容易且つ安価である）といった観点で利点を提供する。
【００５４】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態を有し、且つ７００〜７０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３３重量％のＰＳ及び０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、リポソームは、Ｔ１Ｄに関連付けられる少なくとも一つの自己抗原、好ましくはインスリンから誘導されるペプチドである自己抗原を封入し、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。
【００５５】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態及び７００〜７０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３３重量％のＰＳ及び０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、少なくとも一つの自己抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチドであり、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。
【００５６】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態及び８００〜５０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３２重量％のＰＳ及び０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、少なくとも一つの自己抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチドであり、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。
【００５７】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態及び８００〜５０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３２重量％のＰＳ及び０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、少なくとも一つの自己抗原は、配列番号１を含むペプチドであり、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。
【００５８】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態及び８００〜５０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３２重量％のＰＳ及び０．９：０．９：１〜１．１：１．１：１．４からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、少なくとも一つの自己抗原は、配列番号２を含むペプチドであり、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は１５：１〜３：１である。
【００５９】
一実施態様では、リポソームは、ＭＶＶ形態及び７００〜７０００ｎｍの大きさを有し、リポソーム膜は、２２〜３３重量％のＰＳ及び０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、リポソームは、ＭＳに関連付けられる少なくとも一つの自己抗原、好ましくはＭＯＧから誘導されるペプチドである自己抗原、例えば配列番号３により規定されるペプチドである自己抗原を封入し、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。
【００６０】
当業者に周知の様々な方法を使用して、一又は複数のペプチドを封入するリポソームを調製することができる。例えば、本発明のリポソームは、リポソーム形成の間に自己抗原を脂質膜水和方法により直接的に捕捉することにより形成される。
【００６１】
一実施態様では、本発明のリポソームは：（ａ）適切な溶媒、例えばクロロホルム中において脂質ブレンド物を調製すること、（ｂ）溶媒を、例えば減圧下でのエバポレーションにより除去すること、（ｃ）脂質ブレンド物を適切なバッファー、例えば少なくとも一つの自己抗原を含むリン酸バッファー生理食塩水で水和させること、（ｄ）任意選択的に非封入ペプチドを、例えば遠心分離により除去すること、及び（ｅ）その結果得られた自己抗原含有リポソームを、大きさで精製又は均質化することを含む方法により調製される。好ましくは、リポソームの大きさを均一化する、即ちリポソームを圧力下で規定の選択された大きさのフィルター孔に通すことにより、所定の平均サイズを有するリポソームを生成するために、押出成形を使用することができる。リポソームを精製して大きさを規則化するため、即ち、含まれる不純物を減少させ、大きさの不均一性を低減し、分布の均一性及び統一性を向上させたリポソームの集団を生成するために、タンジェント流濾過を使用することもできる。リポソームが複数の自己抗原を封入するとき、水和工程（ｃ）は前記自己抗原の混合物を所望の割合で含有するバッファーの存在下で実施される。このような割合は、各自己抗原の特定の封入効率を考慮する。
【００６２】
別の実施態様では、本発明は、上記の方法により得られる自己抗原封入リポソームに関する。
【００６３】
当技術分野において既知の他の方法も、本発明の自己抗原封入リポソームを得るために使用されてよい。例えば、いくつかの実施態様は、まずリポソームを得、次いで自己抗原を封入することを考慮する。当技術分野には化合物をリポソーム内に封入するための周知の方法が存在する（Maurer N. et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, vol. 1(6), p. 923-47; Waterhouse D. N. et al., Methods Enzymol., 2005; vol. 391, p. 40-57; Urban P. et al., Nanosc. Res. Lett., 2011, vol. 6, p. 620参照)。
【００６４】
本発明の別の態様は、上記請求内容のいずれか一つに定義されるリポソームの治療的有効量を、他の適切な薬学的に又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む薬学的又は獣医学的組成物を提供する。
【００６５】
好ましくは、本発明の組成物は、狭い粒径分布の、即ちサイズ不均一性の低いリポソームを含む。特定の実施態様では、本発明の薬学的又は獣医学的組成物は、７００〜７０００ｎｍの大きさを有するリポソームを含み、この場合、リポソーム膜は、２２〜３３重量％のＰＳ及び０．８：０．８：０．９〜１．２：１．２：１．５，からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを含み、リポソーム膜を形成する脂質の総重量と自己抗原の総重量との重量比は２０：１〜３：１である。
【００６６】
好ましくは、本発明の組成物に含まれるリポソームは、少なくとも、Ｔ１Ｄに関連付けられる自己抗原を封入する。更に好ましくは、自己抗原は、インスリンから誘導されるペプチドである。更に好ましくは、自己抗原は、配列番号１及び配列番号２から選択されるペプチドである。
【００６７】
一実施態様では、本発明の組成物に含まれるリポソームは、少なくとも、ＭＳに関連付けられる自己抗原を封入する。好ましくは、自己抗原はＭＯＧから誘導されるペプチドである。更に好ましくは、自己抗原は配列番号３を有するペプチドである。
【００６８】
本発明は、リポソームが複数の自己抗原を封入する組成物、及び各々が異なる自己抗原を封入する複数の異なるリポソームを含む組成物も考慮する。好ましくは、本発明の組成物中のリポソームに封入されるすべての自己抗原は、同じ自己免疫疾患、好ましくはＴ１Ｄ又はＭＳに関連する。特定の実施態様では、組成物は、配列番号１及び配列番号２を有するペプチドの両方を封入するリポソームを含む。別の実施態様では、組成物は、配列番号１を有するペプチドを封入するリポソームと、配列番号２を有するペプチドを封入するリポソームとを含む。別の実施態様では、組成物は、配列番号１を有するペプチドを封入するリポソームと、配列番号２を有するペプチドを封入するリポソームとを、１０：１〜１：１０、好ましくは５：１〜１：５、具体的には２：１〜１：２、好ましくは１：１からなる配列番号１のリポソーム対配列番号２のリポソームの重量比で含む。
【００６９】
本発明において、用語「薬学的に許容される賦形剤又は担体」は、薬学的に許容される物質、組成物又はビヒクルを指す。各成分は、薬学的組成物の他の成分との適合性という意味で薬学的に許容されなければならない。また、各成分は、妥当な利益／危険の比に見合う過度な毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性又は他の問題又は合併症なしで、ヒト及び動物の組織又は器官との接触に使用されるための適性を有さなければならない。同様に、用語「獣医学的に許容される」とは、非ヒト動物との接触に使用するために適切であることを意味する。
【００７０】
本発明の組成物の製剤は、投与経路に大きく依存する。本発明の一実施態様では、自己抗原封入リポソームが患者に対して経口投与される。経口組成物には、錠剤、粉末、カプセル剤、サシェ剤、並びに液体シロップ剤、懸濁液及びエリキシル剤が含まれ、それらはすべて当技術分野で周知の方法により製剤化されうる。自己抗原封入リポソームは、患者に対し、静脈内、動脈内、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下、筋肉内又は皮内経路で投与することもできる。これら投与経路に適した組成物は、はやり当技術分野において周知であり、注射用溶液、潅流用溶液、液体注入の再構成のための粉末、及び事前充填シリンジを含む。本発明の意味において、鼻腔内又は吸入投与、直腸内投与のため、又は例えばクリーム、ジェル、軟膏又は皮膚パッチの形態での局所投与のために、自己抗原封入リポソームを製剤化することも適切であろう。これら製剤の調製のための方法は当技術分野で既知である。更に、自己抗原封入リポソームは、制御された放出投与の形態で製剤化することができる。制御放出投与形態は、当技術分野で既知であり、慢性疾患の治療のため、又は高用量で毒性となりうる若しくは患者に投与されると低半減期パターンを示す活性薬剤の投与のために特に望ましい。
【００７１】
本明細書において使用される「治療的有効な量」という表現は、投与されると、対処される疾患の一又は複数の症候の、発生を防止する、又はある程度緩和するために十分な化合物の量を指す。本発明により投与される化合物の特定の用量は、言うまでもなく、投与される化合物、封入効率、投与経路などの検討事項を含む、症例を取り巻く特定の事情によって決定されるであろう。
【００７２】
治療される特定の自己免疫状態は、投与される化合物の特定の用量に重要な役割を果たす。一実施態様では、予防又は治療される自己免疫疾患は、Ｔ１Ｄ、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される。好ましい実施態様では、自己免疫状態はＴ１Ｄである。
【００７３】
更に、投与される自己抗原封入リポソームの適切な用量を決定するために、治療される自己免疫状態の臨床病期も考慮する必要がある。前述のように、本発明のリポソームは、自己免疫疾患の予防及び治療の両方に有用である。「予防」とは、自己抗原に対する異常な免疫応答を防ぐことにより、異常な免疫応答の原因である病原性事象を発症させないことと理解される。「治療」とは、異常な免疫応答の原因である進行する病原性事象に対処し、続いて存在するあらゆる臨床症状を緩和することと理解される。これには、自己免疫応答及び何らかの組織損傷を有しているにも関わらず、自己免疫疾患の臨床症状を示さないか、又は殆ど示さない患者の自己免疫状態の治療が含まれる。この段階は、時に「前臨床」段階と呼ばれ、Ｔ１Ｄのような多くの自己免疫疾患に典型的であり、Ｔ１Ｄにおいては「前糖尿病」と呼ばれる。前糖尿病では、膵臓Ｂ細胞がある程度損傷しているが、糖尿病の診断基準の一部しか満たされていない。この段階の疾患は、後述の実験において得られた結果によって支持されるように、本発明のリポソームに基づく免疫療法によって効果的に治療される。加えて、組織損傷が大きく臨床症状が顕著である自己免疫疾患の進行段階も、本発明の自己抗原封入リポソームの有効量を投与することにより効果的に治療されうる。
【００７４】
本発明の一実施態様は、自己免疫疾患の予防を目的とし、別の実施態様は、疾患の治療を目的とする。別の特定の実施態様は、前臨床病期の間の自己免疫疾患の治療を目的とする。
【００７５】
好ましい実施態様では、本発明は、Ｔ１Ｄの予防における使用のための、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物を提供する。別の好ましい実施態様では、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は、Ｔ１Ｄの治療における使用を目的とする。また別の好ましい実施態様では、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は、前糖尿病の対象におけるＴ１Ｄの治療における使用を目的とする。
【００７６】
一実施態様では、本発明は、ＭＳの予防における使用のための、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物を提供する。別の実施態様では、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は、ＭＳの治療における使用を目的とする。
【００７７】
つまるところ、投与される自己抗原封入リポソームの用量は、複数の事情を鑑みて決定される。単に説明的実施例として、配列番号１を有するＴＤ１関連自己抗原を脂質対抗原の重量比１１，６：１（脂質の総量対自己抗原の総量）で封入する、ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬを脂質モル比１：１：１．３３（ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬ）で含有する本発明によるＭＶＶリポソームが使用されるとき、前糖尿病のステージにあるＴ１Ｄに罹患したヒト対象を治療するための治療的有効量は、体重１ｋｇ当たり、０．０５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜５ｍｇの自己抗原封入リポソームとすることができる。配列番号２が、上記に定義されるリポソーム内に、脂質対抗原の重量比３．８：１で封入されるとき、前糖尿病のステージにあるＴ１Ｄに罹患したヒト対象を治療するための治療的有効量は、体重１ｋｇ当たり、０．０５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜５ｍｇの自己抗原封入リポソームとすることができる。上記に定義される両種のリポソームを、好ましくは、配列番号１を有するリポソーム対配列番号２を有するリポソームの重量比１：１で含む組成物が使用される時、前糖尿病のステージにあるＴ１Ｄに罹患したヒト対象を治療するための治療的有効量は、体重１ｋｇ当たり、０．０５〜５０ｍｇ、好ましくは０．５〜５ｍｇの自己抗原封入リポソームとすることもができる。
【００７８】
更に、医療専門家は、自己免疫疾患を予防又は治療するために、医薬の何回分の用量を患者に投与するかを決定するであろう。これに関し、本発明者らは、本発明の自己抗原封入リポソームが一回分の用量だけで前糖尿病のマウスのＴ１Ｄを治療することを発見した。しかしながら、医療専門家は、疾患の進行段階を治療するためには投薬回数を増やす必要があると決定することがあるであろう。一実施態様では、上記に定義されたリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は、一から五回分の用量の前記リポソーム又は薬学的組成物を患者に対して投与することによる、自己免疫疾患、好ましくはＴ１Ｄの予防又は治療のための使用を目的とする。特定の実施態様では、予防又は治療は、一回、二回、三回、又は四回分の用量を投与することにより達成される。別の実施態様では、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物は、一回、二回、三回、四回又は五回分の用量の前記リポソーム又は薬学的組成物を患者に対して投与することによる、Ｔ１Ｄの治療のための使用を目的とする。好ましい実施態様では、患者は糖尿病患者である。
【００７９】
予防的又は治療的効果は、封入された自己抗原の寛容原性の提示と、その後の自己免疫応答の抑制により達成されるため、本発明の最後の態様は、自己に対する寛容性の回復と、自己免疫応答の抑制とのための、上記に定義されるリポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物に関する。本発明のこれら態様の特定の実施態様では、自己に対する寛容性の回復と自己免疫応答の抑制とは、Ｔ１Ｄに関し、具体的には前糖尿病に関する。
【００８０】
明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語とその変形は、他の技術的特徴、添加剤、成分、又は段階を排除することを意図していない。更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語は、「〜なる／〜構成される」という場合も包含する。本発明の更なる目的、利点及び特徴は、記載を吟味すること又は本発明の手順を学ぶことにより、当業者に明らかとなろう。後述の実施例及び添付図面は、説明のために提供されているのであり、本発明を限定することを意図するものではない。添付図面に関連する及び特許請求の範囲において括弧内に配置される参照記号は、特許請求の範囲の完全性を向上させることのみを目的としており、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。更に、本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様及び好ましい実施態様に可能なすべての組み合わせを網羅する。
【実施例】
【００８１】
材料及び方法：
リポソームの調製
ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）は、Ｌｉｐｏｉｄ、Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した。コレステロール（ＣＨＯＬ）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから購入した。脂質コンジュゲート蛍光色素Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＤＨＰＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからそのスクシンイミジルエステル形態で取得され、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＵＳＡ）により供給される脂質ＤＯＰＥとコンジュゲートされた。インスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖からそれぞれ誘導される配列番号１（ＧＩＶＤＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ）及び配列番号２（ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＭＳ）を有するペプチドは、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から取得され、＞９５％の純度を有し、トリフルオロ酢酸（ｔｆａ）を除去したものであった。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）から誘導される配列番号３（ＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）を有するペプチドは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｒｅｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｍeｄｉｃａ  ｄｅ  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ＩＲＢＢ、Ｂａｒｃｅｌｏｎｅ、Ｓｐａｉｎから取得した。
【００８２】
リポソームは、薄膜水和方法を用いて、１：１：１．３３のモル比のＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬの脂質混合物からそれぞれ調製された（Ｈａｒｅｌ−Ａｄａｒ  Ｔ、２０１１）。脂質の総量は３０ｍＭであった。脂質及び脂質コンジュゲート蛍光色素をクロロホルムに溶解し、減圧下及び窒素下におけるエバポレーションにより溶媒を除去した。脂質を適切なバッファー（ＰＢＳ、ＰＢＳ中、それぞれ配列番号１又は配列番号２又は配列番号３を有するペプチドの溶液０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて水和させ、このようにして得られたリポソームを押出成型により１μｍに均一化した（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）。非封入ペプチドを、遠心分離によりリポソーム製剤から除去した。粒子径分布及びリポソームのゼータ電位（ζ）として表される安定性を、希釈していない試料中において、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いる動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定した。リポソームの形態及びラメラ特性を、ＪＥＯＬ−ＪＥＭ１４００顕微鏡の極低温透過型電子顕微鏡（クリオＴＥＭ）を用いて調べた。
【００８３】
マウス
野生型ＮＯＤマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から取得し、特定の無病原体条件下に保った。週齢８のメスのみが使用された。
【００８４】
マウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｔａｌｙ）から購入し、一般的な条件下で収容した。週齢８〜１０のメスのみが使用された。ＥＡＥの誘導のために、週齢８のＣ５７ＢＬ／６メスマウス（Ｈａｒｌａｎ）の両側腹部に、ケタミン（体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ）及びキシラジン（体重１ｋｇ当たり５ｍｇ）下において、４ｍｇ／ｍｌのマイコバクテリウム結核Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）を含有する等容積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した、ＰＢＳ中５０μｇのＭＯＧペプチドを皮下注射した。加えて、２５０ｎｇの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、０及び２日目に静脈注射した。
【００８５】
この試験は、ジャナラリータ・デ・カタルーニャ（カタロニア自治政府）の実験動物のケアと使用に関する指針の勧告を遵守して実施された。プロトコールは、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎｓ  Ｔｒｉａｓ  ｉ  Ｐｕｊｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって承認された（許可番号：ＤＡＡＭ５１５７）。
【００８６】
樹状細胞（ＤＣ）の生成及び取り込み実験
ＤＣを、以前に報告されているようにして（Marin-Gallen, Clinical and Experimental Immunology 2010）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｓｐｅｃ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）を含有する培地においてＮＯＤマウスの骨髄前駆体から生成した。ＤＣの純度を、記載されているようにして（Pujol-Autinell I, et al. PLOS ONE 2013）ＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７染色（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）により評価した。生存率を、以前に報告されているようにして（Pujol-Autonell I et al. PLOS ONE, 2013）、アネキシン及び７ａａｄ染色により決定し、細胞をフローサイトメトリー（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｃｏｕｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｃｙｔｏｇｎｏｓ，Ｓａｌａｍａｎｃａ，Ｓｐａｉｎ）により数えた。リポソーム捕捉を、ＤＣをリポソームの微小粒子（空又はインスリンペプチドを充填）と共に２時間共培養することにより実施した。１００〜１０００  μＭに希釈したリポソーム微小粒子の原液（３０ｍＭ）をこれら実験に用いた。コントロールＤＣを、塩基性条件下で培養して未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を得るか、又はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で２４時間刺激して成熟ＤＣ（ｍＤＣ）を得た。ＤＣによるＰＳ−リポソームのインビトロでの取り込みを、蛍光標識されたＰＳ−リポソーム（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ４８８  ＤＨＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。細胞膜に付着したリポソームを除去するためにＰＢＳ中において徹底的に洗浄した後、リポソーム捕捉をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により決定した。
【００８７】
リポソーム捕捉後のＤＣ中における寛容原性特性
ＤＣの共刺激膜分子ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）により決定した。ＤＣを、マウスＣＤ１１ｃ／ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４０／ＡＰＣ、ＣＤ８６／ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するモノクローナル抗体で染色した。アイソタイプ  コントロール染色をコントロールとして使用した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを分析した。アポトーシス細胞（Ｐｕｊｏｌ−Ａｕｔｏｎｅｌｌ  ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ６３２９６、２０１３）による寛容性誘導におけるＰＧＥ２の役割の以前の結果に基づいて、複数の異なる培養物の上清中におけるＤＣによるＰＳ−リポソームの捕捉を、ＥＬＩＳＡ（ＰＧＥ２  ＥＩＡ  Ｋｉｔ−モノクローナル；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）により評価した。検出限界：８０％  Ｂ／Ｂ０：１５ｐｇ／ｍｌ。感受性：５０％  Ｂ／Ｂ０：５０ｐｇ／ｍｌ。結果は指標として表した（細胞１０６個当たりのＰＧＥ２のｐｇ）。
【００８８】
Ｔ細胞増殖アッセイ
ＤＣに、１ｍＭのリポソーム（空又はインスリンペプチドを充填したもの）を、２時間にわたり２０μｇ／ｍのインスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて充填し、次いでＴ細胞の増殖を決定するために使用した。記載されているように（Pujol-Autonell, PLOS ONE 2013）、Ｔ細胞を、ＮＯＤの脾臓の機械的破壊後に取得し、ＣＤ１９−ＰＥ、ＣＤ１６／３２−ＰＥ、ＣＤ１１ｃ−ＰＥＣｙ７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＬｙ−６Ｇ（Ｇｒ−１）−ｅＦｌｕｏｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する抗体を用いた負の選択により精製し、選別した（ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＤＣ（１００００個の細胞）のみ又は空のＰＳ−リポソーム若しくは自己抗原を封入するリポソームでパルスしたＤＣを、１０５のＴリンパ球（１：１０の比）を用いて培養した。６日後、細胞を、１μＣｉの（３Ｈ）−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で更に１６時間パルスした。細胞を採取し（Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６、Ｔｏｍｔｅｃ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）、シンチレーションカウンター（１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ，ＴｒｉｌｕｘＷａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて分析した。Ｔ細胞増殖をｃ．ｐ．ｍ×１０３個の細胞として表した。
【００８９】
１型糖尿病免疫療法（予防及び治療）
前糖尿病のＮＯＤマウス（週齢８）に、２００μｌの食塩水中３ｍｇの用量のＰＳ−リポソーム（空又は配列番号１及び配列番号２を１：１の比で有するペプチドを封入）を腹腔内に一回投与した。食塩水のみを与える疑似コントロール群も含めた。一群当たり合計１２〜１８の動物を使用した。マウスを、グルコストリップ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を用いて尿中グルコースについて毎日、及び体重について３０週の期間にわたり毎週、モニタリングした。血糖値が＞３００ｍｇ／ｄｌであったとき、糖尿を有するマウスを糖尿病と確定した。
【００９０】
糖尿病のＮＯＤマウス（週齢＞２５）は、疾患の発症後、２００μｌの食塩水中３．５ｍのＰＳ−リポソーム（空又は配列番号１及び配列番号２を１：１の比で有するペプチドを封入）の用量を、１、５及び８日目に計３回腹腔内投与することにより処置された。マウスを、尿中グルコースについて、Ｇｌｕｃｏｃａｒｄストリップ（Ｍｅｎａｒｉｎｉ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を用いて３０週の期間にわたり毎日モニタリングした。連続して血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを上回ったとき、又は測定値が３００ｍｇ／ｄＬより高かったとき、糖尿を有する動物を糖尿病と確定し、疾患の発症を決定した。血糖値を週に一度モニタリングした（ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。正常血糖値が達成されない限り、疾患の発症から毎日皮下（ｓ．ｃ．）注射によりインスリン（１Ｕ，Ｉｎｓｕｌａｔａｒｄ  Ｆｌｅｘ−Ｐｅｎ，Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を投与した。血糖症を、週に３回２時間の絶食後にモニタリングした（ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
【００９１】
膵島炎スコア
白血球による膵島の浸潤−膵島炎−の度合いを、試験の最後に決定した。簡潔には、各群のすべてのマウス由来の膵臓を、イソペンタンｌ／冷アセトン浴槽においてスナップ凍結した。５の非重複レベルにおいて５μｍの低温切片を得た。切片を、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、コード化し、実験条件を知らない２人の独立した観察者が分析した。各観察者は一の動物について最低４０個の膵島を評価した。膵島炎を別途記載（Ａｌｂａ  Ａ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；１７３：６６６７−７５）のようにスコア化した：０、膵島炎なし；１、膵島周囲の炎症；２、軽度の膵島炎（＜２５％の膵島に浸潤）；３、２５〜７５％の膵島に浸潤；４、膵島全体に浸潤。
【００９２】
ＥＡＥ免疫療法
Ｃ５７ＢＬ／６免疫化マウスは、ＭＳに密接に関連しているＥＡＥ疾患のモデルとして頻繁に使用され、ＭＳに対する治療法及び処置を試験するために役立つことが多い。ＥＡＥの発生を防ぐため、Ｃ５７ＢＬ／６免疫化マウスを、１００μｌの食塩水中１．７５ｍｇのＭＯＧ４０−５５を充填したＰＳ−リポソームの用量を、免疫化後５及び９日目に計２回腹腔内投与することにより処置した。コントロールとして、マウスを空のリポソーム（ＰＳ−リポソーム）又はＰＢＳ（疑似）で処置した。
【００９３】
すべての動物について毎日、体重を量り、処置したマウスの健康及び臨床状態、並びに神経徴候を調べた。以下の基準に従ってＥＡＥの臨床スコアを実施した（Espejo C, et al., Exp Neurol 2001）：０、無症候；０．５、尾部遠位側半分の色調喪失；１、尾部全体の色調喪失；１．５、後足の脱力；２、後足の麻痺；２．５、後足の対麻痺；３、前足の脱力；４、四肢不全麻痺；４．５、重度の四肢不全麻痺；５、四肢麻痺；及び６、死亡（別途記載による［Espejo 2001, supra］）。二名の異なる観察者により盲検下において臨床経過観察分析を実施した。
【００９４】
腹腔内投与後のリポソームの追跡
バイオイメージング実験のために、蛍光標識されたＰＳ−リポソーム（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）を、前糖尿病のＮＯＤマウスに腹腔内注射し、３日間観察した。マウスを、投与の時点、並びに注射後６、２４、４８及び７２時間後に麻酔（Ｐｅａｒｌ  Ｉｍａｇｅｒ，Ｌｉ−Ｃｏｒ）下において画像化した。蛍光シグナルを定量化した。実験の最後に、複数の器官を採取し、重量を測定し、画像化して蛍光分布を決定した。
【００９５】
統計分析
Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて統計を実施した。対のデータのために、ノンパラメトリックなウィルコクソン試験を実施した。それ以外の場合、マン・ホイットニー検定を使用した。＜０．０５のｐ値を有意と考えた。
【００９６】
結果
インスリンペプチドを封入するＰＳ提示リポソームはＤＣによって捕捉される。
ＰＳ−リポソームは、１：１：１．３３のモル比のＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬを用いて調製され、それらの表面上に「デスシグナル」ＰＳを提示した。空のリポソームは、多分散指数（ＰｄＩ）０．３２１と共に、樹状細胞による効率的な取り込みに最適な大きさである平均粒径１．０１４μｍを提示する（Ulrich AS, Bioscience Reports 22: 129-150, 2002）。加えて、ゼータ電位の測定値により、ＰＳ−リポソーム上の正味表面電荷が−３０．６６ｍＶであることが明らかとなった。一方、ＰＳ−リポソームがマウスインスリンＩｎｓｕｌｉｎ２由来の配列番号１又は配列番号２を有するペプチドを封入していたとき、リポソームは、配列番号１及び配列番号２を有するペプチドについてそれぞれ平均径１．０６２μｍ（ＰｄＩ＝０．３２４）及び０．９５４μｍ（ＰｄＩ＝０．３０９）を示す（図１）。ゼータ電位に関し、両方の封入リポソームは負の表面電荷−２９．５ｍＶを提示する。封入の％は、配列番号１を有するペプチドの場合４４．６３±２３．６８％であり、配列番号２のペプチドの場合８８．４８±３．９７％であった（平均±ＳＤ）。配列番号３を有するペプチドを封入するＰＳ−リポソームは、平均径９４２．２ｎｍとゼータ電位−３３．６６ｍＶを有していた。配列番号３の封入効率は８９．３４±４．６９％であった。クリオＴＥＭ分析により、大部分のリポソーム（空又は封入ペプチド）が多胞体ベシクル（ＭＶＶ）であることが観察された。共培養後、ＰＳ−リポソームはＤＣによって取り込まれた（図２）。
【００９７】
ＤＣは、共刺激分子の低減された発現を有し、且つインスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームの捕捉後にＰＧＥ２を生成する。
共培養後のＤＣの生存率は、用量（１００〜２０００ｍＭの範囲、データは示さない）に関係なく、炎症促進性刺激の後も常にコントロールＤＣと同様であった（図３Ａ）。
【００９８】
二つの共刺激分子ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現を、ＣＤの表面上において評価した（図３Ｂ）。細胞膜中のＣＤ４０及びＣＤ８６の発現が、リポソーム捕捉後に増大せず、低レベルのままであることが観察された。ＬＰＳ曝露後、ＤＣは、ＣＤ４０及びＣＤ８６発現を有意に増大させ、ＰＳ−リポソームを充填したＤＣはＣＤ８６を有意に増大させた（ｐ＜０．００１）がＣＤ４０は増大させなかった。対照的に、ＰＳＡＢ−リポソームはＣＤ４０の膜発現もＣＤ８６の膜発現も有意に増大させることはなかった。
【００９９】
過去の結果に基づいて（Pujol-Autonell, PLOS ONE 2013）、ＤＣ中のリポソームによって誘導されたＰＧＥ２の生成を試験した。ＰＧＥ２の濃度は、ｉＤＣと比較したときリポソーム（空又はインスリンペプチドを充填）を用いて共培養されたＤＣの上清において有意に上昇した（ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。
【０１００】
インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームの捕捉後、ＣＤは自己Ｔ細胞の増殖を刺激しない。
ＮＯＤマウスの骨髄前駆体から生成されたＤＣは、ＤＣマーカーＣＤ１１ｃの染色に基づけば＞８０％の純度を有しており、生存率は常に＞９０％であった。Ｔ細胞の純度及び生存率は、それぞれ常に９０％及び９５％を上回っていた（データは示さない）。ｉＤＣによるＰＳ−又はＰＳＡＢ−リポソームの捕捉は、ｉＤＣのみと比較したとき、自己Ｔ細胞の増殖を増加させない（図４）。ＬＰＳ刺激後、ｍＤＣによって誘導されるＴ細胞の増殖は、ｉＤＣによって誘導される増殖より大きかった（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＰＳ−又はＰＳＡＢ−リポソームを充填したＤＣによって誘導されるＴ細部増殖は、これら炎症促進性刺激の影響後であっても増大しない。この結果は、ＰＳ−リポソーム−ＤＣによって誘導されるＴ細胞の増殖が、これら炎症促進性刺激の効果の後も増大しないことを示している。
【０１０１】
インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームは、ＮＯＤ前糖尿病マウスを効果的に治療する。
Ｔ１Ｄを予防するためのリポソームの有効性を評価するために、本発明者らは、前糖尿病の期間の間に免疫療法の単回用量を用いてＮＯＤマウスを処置した（週齢８）。予想通りに、疑似コントロール群の動物は週齢１３から糖尿病を発症し、最終的な発生率は８１．３％（ｎ＝１６）であった（図５Ａ）。空のＰＳ−リポソームを用いた処置の結果は８３．３％（ｎ＝１８）の疾患発生率であり、疾患は週齢１５で発症した。自己抗原性インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームによる処置の結果、疾患が改善し、やはり週齢１５で発症した疾患発生率は５０％（ｎ＝１２）であった。疑似群又は空のリポソーム処置群と比較したとき、免疫療法を受けたマウスの体重に有意な差は見られなかった（図５Ｂ）。
【０１０２】
インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームにより処置したマウスにおいて膵島炎は減少する。
膵島炎を、経過観察期間（３０週）の最後に各群から３〜６の非糖尿動物についてスコア化し、膵島白血球の浸潤に対する治療の効果があったかを決定した（図６Ａ）。予想通り、疑似群の動物は高い膵島炎スコアを示した（２．３４±０．１８）。空のＰＳ−リポソームで処置したマウスは、類似の膵島炎の度合いを示した（２．１２±０．４６）。インスリンペプチドを封入するＰＳ−リポソームを用いた免疫療法は、疑似群と比較したとき、有意ではないものの、膵島炎スコアの生物学的減少を示した（１．６９±０．５８）。更に、五つの浸潤カテゴリーの各々に分類される膵島炎のパーセンテージの分析は、免疫療法により治療したマウスでは、膵島炎を有さない又は炎症が周囲のみの膵島が４７％残ったのに対し、疑似群及びＰＳ−リポソーム群では、破壊されなかった膵島はそれぞれ２６％及び３４％あった（図６Ｂ）。
【０１０３】
インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソームは、疾患の発症後に投与されたとき、ＮＯＤマウスの糖尿病を元に戻すことができる。
インスリンペプチドを充填したＰＳ−リポソームは、疾患の発症後に投与されたとき、ＮＯＤマウスの糖尿病を元に戻した（図８Ａ）。これらマウスは、外的なインスリン投与なしに生存し、インスリンが正常な血糖値に到達した。対照的に、空のＰＳ−リポソームで処置したマウスは、インスリンの継続投与にもかかわらず、正常血糖値に到達しない（図８Ｂ）。
【０１０４】
ＭＯＧペプチドを封入するＰＳ−リポソームはＥＡＥを改善する。
ＭＯＧペプチドを含有するＰＳ−リポソーム（ＭＳ中の特異的自己抗原）を調製した。これらリポソームは、Ｃ５７ＢＬ／６免疫化マウスに腹腔内投与されると、疾患の発生を予防した（図９）。ＭＯＧペプチドを充填したリポソームによる処置は、免疫化したマウスの脾臓における周囲寛容性の維持に関与する細胞集団である、従来の制御性Ｔ細胞の増加を誘導した（結果は示さない）。空のリポソームには効果がなく、ＰＳ−リポソームとペプチド封入の両方が、治療的効果にとって重要であった。したがって、ＭＯＧペプチド封入ＰＳ−リポソームは、ＥＡＥを改善し、最初の発作の重症度を低減し、増悪から迅速に回復させる。結果として、ＭＯＧペプチド封入ＰＳ−リポソームは、ＭＳの治療にとって有用でありうる。
【０１０５】
腹腔内投与後のリポソームの追跡
リポソームからの蛍光シグナルを、免疫系の複数の異なる器官において検出した。予想通り、リポソームは膵臓リンパ節、脾臓、膵臓及び縦隔又は副甲状腺リンパ節に見つかった。（図７）。
【０１０６】
本出願に引用される参照文献
Marin-Gallen S, Clemente-Casares X, Planas R, Pujol-Autonell I, Carrascal J, et al.“Dendritic cells pulsed with antigen-specific apoptotic bodies prevent experimental type 1 diabetes”.Clin Exp Immunol 2010, vol. 160, p. 207-214.
Alba A, Puertas MC, Carrillo J et al.“IFN beta accelerates autoimmune type 1 diabetes in nonobese diabetic mice and breaks the tolerance to beta cells in nondiabetes-prone mice”.J Immunol 2004, vol. 173, p. 6667-75.
Pujol-Autonell I, Planas R, Ampudia R, Marin-Gallen S, Sanchez A, Carrascal J, , Marin A, Puig-Domingo M, Pujol-Borrell R, Verdaguer J, Vives-Pi M. “Efferocytosis promotes suppresive effects in dendritic cells through prostaglandin E2 production in the context of autoimmunity”.PLOS ONE 8:e63296, 2013.
Ulrich AS.“Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles”.Bioscience Reports 2002, vol. 22, p. 129-150.
Maurer N. et al., “Developments in liposomal drug delivery Systems”, Expert Opin Biol Ther, 2001, vol. 1(6), p. 923-47.
Waterhouse D. N. et al., “Preparation, characterization, and biological analysis of liposomal formulations of vincristine”, Methods Enzymol., 2005; vol. 391, p. 40-57.
Urban P. et al., “Study of the efficacy of antimalarial drugs delivered inside targeted immunoliposomal nanovectors”, Nanoscale Research Letters, 2011, vol. 6, p. 620
Roep BO, Peakman M. “Antigen Targets of Type 1 Diabetes Autoimmunity”.Cold Spring Harb Perspect Med, 2012, vol. 2(4):a007781. oi: 10.1101/cshperspect.a007781.Review.PMID:22474615.
Lernmark A. “Series introduction: Autoimmune diseases: are markers ready for prediction?”.J. Clin Invest, 2001, vol. 108, p. 1091-1096.
Espejo C, et al.“Treatment with anti-interferon-gamma monoclonal antibodies modifies experimental autoimmune encephalomyelitis in interferon-gamma receptor knockout mice”.Exp Neurol 2001, vol. 172, p. 460-468
【図１】
2019196363.tif 000002
【図２】
2019196363.tif 000003
【図３】
2019196363.tif 000004
【図４】
2019196363.tif 000005
【図５】
2019196363.tif 000006
【図６】
2019196363.tif 000007
【図７】
2019196363.tif 000008
【図８】
2019196363.tif 000009
【図９】
2019196363.tif 000010
【配列表】
2019196363000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月19日(2019.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗原を封入するリポソームであって、
（ｉ）リポソームが５００〜１５０００ｎｍの大きさを有し；且つ
（ｉｉ）リポソーム膜がホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含み、ＰＳの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１０重量％であり、ＰＣの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１０重量％であり、ＣＨＯＬの量が膜リポソームの組成全体に対して少なくとも１３重量％である、リポソーム。
【請求項２】
多胞体ベシクル（ＭＶＶ）である、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
ＰＳの重量％が膜リポソームの組成全体に対して１０〜４０％である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
リポソーム膜が、ＰＳ、ＰＣ及びＣＨＯＬを、０．６：０．６：０．７〜１．５：１．５：１．８からなるモル比ＰＳ：ＰＣ：ＣＨＯＬで含む、請求項３に記載のリポソーム。
【請求項５】
リポソーム膜を形成する脂質の総量と自己抗原の総量との重量比が２０：１〜３：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項６】
自己抗原が５〜５０のアミノ酸からなる大きさを有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項７】
自己抗原が、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される自己免疫疾患に関連付けられるペプチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項８】
自己抗原が、Ｔ１Ｄに関連付けられるものであり、配列番号１及び配列番号２のペプチドからなる群より選択される、請求項７に記載のリポソーム。
【請求項９】
自己抗原がＭＳに関連付けられるものであり、配列番号３を含む、請求項７に記載のリポソーム。
【請求項１０】
更なる自己抗原を封入し、封入された自己抗原のすべてが同じ自己免疫疾患に関連付けられる、請求項１から９のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソームの治療的有効量を、他の適切な薬学的又は獣医学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む、薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１２】
医薬としての使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１１に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１３】
自己免疫疾患の予防又は治療における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１１に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１４】
自己免疫疾患に罹患した患者の、自己に対する寛容性の回復における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリポソーム又は請求項１１に記載の薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１５】
自己免疫疾患が、Ｔ１Ｄ、紅斑性狼瘡、関節リウマチ、多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、グレーブス病、乾癬、乾癬性関節炎及びシェーグレン症候群からなる群より選択される、請求項１３又は１４に記載の使用のための、リポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物。
【請求項１６】
自己免疫疾患が１型糖尿病又はＭＳである、請求項１５に記載の使用のための、リポソーム又は薬学的若しくは獣医学的組成物。
【外国語明細書】
2019196363000001.pdf