(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の変性抑制及び変性タンパク質のリフォールディングを可能にする新規人工シャペロン分子を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、高温溶解型温度応答性高分子、典型的には、下記式（Ｉ）：2019196416.tif 000017（Ｉ）により構成される人工シャペロン分子を提供し、該人工シャペロン分子を用いて、タンパク質を品質管理する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高温溶解型温度応答性高分子により構成される人工シャペロン分子。
【請求項２】
高温溶解型温度応答性高分子が疎水性及び／又はイオン性の官能基を側鎖に有する、請求項１に記載の人工シャペロン分子。
【請求項３】
高温溶解型温度応答性高分子がウレイド基を側鎖に有する、請求項１又は２に記載の人工シャペロン分子。
【請求項４】
高温溶解型温度応答性高分子が、
下記式（Ｉ）：
【化１】
2019196416.tif 000013
（Ｉ）
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｘは、１０以上の整数を意味し；
ａ及びｂは、０≦ａ≦１及び０≦ｂ≦１であって、かつ０≦ａ＋ｂ≦１を満たす数を意味し：
ｐ、ｑ、及びｒは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩；又は
下記式（ＩＩ）：
【化２】
2019196416.tif 000014
（ＩＩ）
（式中、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｙは、１０以上の整数を意味し；
ｃ及びｄは、０≦ｃ≦１及び０≦ｄ≦１であって、かつ０≦ｃ＋ｄ≦１を満たす数を意味し：
ｓ、ｔ、及びｕは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の人工シャペロン分子。
【請求項５】
高温溶解型温度応答性高分子が、
下記式（ＩＩＩ）：
【化３】
2019196416.tif 000015
（ＩＩＩ）
（式中、
Ｒ７及びＲ８は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｘ’は、１０以上の整数を意味し；
ｅは、０．１≦ｅ≦１を満たす数を意味し：
ｐ及びｑは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩；又は
下記式（ＩＶ）：
【化４】
2019196416.tif 000016
（ＩＶ）
（式中、
Ｒ９及びＲ１０は、独独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｙ’は、１０以上の整数を意味し；
ｆは、０．１≦ｆ≦１を満たす数を意味し：
ｖ及びｗは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の人工シャペロン分子。
【請求項６】
タンパク質のリフォールディング法であって、以下：
（ａ）変性タンパク質、及び請求項１〜５のいずれか１項に記載の人工シャペロン分子を共存させる工程；
（ｂ）変性タンパク質と人工シャペロン分子を複合化させる工程；
（ｃ）人工シャペロン分子の相転移温度以下に冷却する工程；及び
（ｄ）人工シャペロン分子を分離する工程
を含む上記方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）において、可溶化剤の存在下で人工シャペロン分子を共存させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
人工シャペロン分子を分離する工程が遠心分離である、請求項６又は７に記載のリフォールディング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温溶解型温度応答性高分子を基盤とする人工シャペロン分子、並びにこれを用いたタンパク質の品質を管理する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度応答性高分子は、低温溶解型又は下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature；ＬＣＳＴ型）と高温溶解型又は上限臨界溶液温度（Upper Critical Solution Temperature；ＵＣＳＴ型）の２種類に大別できる。生理的条件下でＬＣＳＴ型挙動を示すポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）は体温付近に相転移温度を持つことから、バイオマテリアルへの応用が盛んに研究されている。一方、有機溶液中で相転移を示すＵＳＣＴ型高分子の報告例はいくつか存在するが、水溶液中で、特に生理的条件下（例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の溶媒中で相転移を示す高分子は非常に少ない（非特許文献１〜６）。
【０００３】
これまでに、本発明者らは、ウレイド基を有するポリアリルアミン−ｃｏ−ポリアリルウレア（ＰＡＵ）が生理的条件下においてＵＣＳＴ型挙動を示す希少高分子であることを報告してきた（特許文献１、非特許文献７）。ウレイド基が分子内又は分子間で水素結合を形成することで相分離すると考えられる。また、ＰＡＵは主鎖の分子量やウレイド基導入率を変化させることにより、相分離温度（phase separation temperature；Ｔｐ）を８〜６５℃の広範囲で制御可能である。このように新しい物性を持つＰＡＵは、生体分子等と特殊な相互作用をする可能性がある。さらに、本発明者は、再生医療等の細胞培養においてＰＡＵを添加し、培養温度を変化させることによって、細胞を単層培養の状態から細胞塊に迅速かつ効率的に作製できる技術を開発した（特許文献２）。
【０００４】
一方で、これまで、タンパク質の凝集及び解離を制御するということも目指して、細胞レベルよりもさらにミクロな環境下において温度応答性高分子を利用したという報告例はない。タンパク質は熱やｐＨ変化に弱く、加熱や酸の添加によって天然状態の折り畳み構造（フォールディング）を維持できなくなる。このようにして生じた変性タンパク質は、疎水場が外に剥き出しになっており、水溶液中でタンパク質間による凝集を引き起こし易い。折り畳み構造が壊れただけの変性タンパク質は、再度、適切な温度やｐＨ条件下におくことで熱力学に安定な構造（リフォールディング）をとり、元の天然タンパク質へと戻ることが可能である。しかしながら、変性タンパク質同士が分子間で凝集体を形成してしまうと、適切な条件下であっても元の天然タンパク質に戻すことは不可能であり、凝集体を解くために高濃度の可溶剤の添加と、それに続く溶剤の除去が必要である。
【０００５】
従来、タンパク質の凝集抑制に効果的とされる添加剤によって、この問題は解決されてきた。凝集抑制剤としては、アルギニン塩酸塩が知られている。しかしながら、この凝集抑制には高濃度（０．５〜１．０Ｍ）のアルギニン塩酸塩が必要であり、工業的なスケールアップに適さない。この他の凝集抑制剤としては界面活性剤とシクロデキストリンを添加することによる人工シャペロン分子システムが挙げられる（非特許文献８）。最も基本的な人工シャペロンは分子ＳＤＳとシクロデキストリンからなる。これは、まずＳＤＳを変性タンパク質と結合させることで、変性タンパク質間の凝集反応を抑制し、次いで包接化合物であるシクロデキストリンを添加することでＳＤＳを徐々に変性タンパク質から取り除き、リフォールディングを促すシステムである。他にも多糖にコレステロールを導入することで形成されるナノゲルが変性タンパク質を吸着し、凝集を抑制する報告もある（非特許文献９）。さらにこのナノゲルは外部から加えられたシクロデキストリンを認知し、コレステロールとシクロデキストリン間で包接体を組むことでナノゲル構造を解除する。これによって徐々に変性タンパク質を放出し、リフォールディングを進行させることができる。
【０００６】
しかしながら、従来のシステムでは、最終的にリホームしたタンパク質を得るために、人工シャペロン分子からタンパク質を放出させるために解離剤としてシクロデキストリンが必要な上、タンパク質が放出された際、人工シャペロン分子自体も反応系中に残るという問題がある（非特許文献１０）。そのため、再生後、解離剤の除去及び回収するという煩雑な工程を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１１８５８７号
【特許文献２】特開２０１６−８６７８２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Costa, R. O. R. & Freitas, R. F. S., Polymer, 43, 5879-5885, 2002
【非特許文献２】Pagonis, K. & Bokias, G., Polymer, 45, 2149-2153, 2004
【非特許文献３】Hoogenboom, R., et al., U. S. Aust. J. Chem., 63, 1173-1178, 2010
【非特許文献４】Hoogenboom, R., et al., U. S. Soft Matter, 5, 3590-3592, 2009
【非特許文献５】Koyama, M., et al., J. Phys. Chem. B, 112, 10854-10860, 2008
【非特許文献６】Buscall, R., et al., Eur. Polym. J., 18, 967-974, 1982
【非特許文献７】Shimada, N., et al., Biomacromolecules, 12, 3418-3422, 2011
【非特許文献８】Rozema, D., et al., J. Biol. Chem., 271, 3478-3487, 1996
【非特許文献９】Takahashi, H., et al., ACS Nano, 5, 337-345, 2011
【非特許文献１０】Nomura, Y., et al., FEBS Letters, 553, 371-276, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、医薬品製造及び分子生物学研究の分野において望まれるタンパク質の変性抑制及び変性タンパク質のリフォールディングを可能にする新規人工シャペロン分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ＵＣＳＴ型高分子を用いることにより、高温時のタンパク質の凝集を抑制することができ、さらに冷却によりタンパク質をリフォールディングさせ、一方で、使用したＵＣＳＴ型高分子を容易に回収することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］高温溶解型温度応答性高分子により構成される人工シャペロン分子。
［２］高温溶解型温度応答性高分子が疎水性及び／又はイオン性の官能基を側鎖に有する、上記［１］に記載の人工シャペロン分子。
［３］高温溶解型温度応答性高分子がウレイド基を側鎖に有する、上記［１］又は［２］に記載の人工シャペロン分子。
［４］高温溶解型温度応答性高分子が、
下記式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
2019196416.tif 000002
（Ｉ）
【００１３】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｘは、１０以上の整数を意味し；
ａ及びｂは、０≦ａ≦１及び０≦ｂ≦１であって、かつ０≦ａ＋ｂ≦１を満たす数を意味し：
ｐ、ｑ、及びｒは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩；又は
下記式（ＩＩ）：
【００１４】
【化２】
2019196416.tif 000003
（ＩＩ）
【００１５】
（式中、
Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｙは、１０以上の整数を意味し；
ｃ及びｄは、０≦ｃ≦１及び０≦ｄ≦１であって、かつ０≦ｃ＋ｄ≦１を満たす数を意味し：
ｓ、ｔ、及びｕは、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の人工シャペロン分子。
［５］高温溶解型温度応答性高分子が、
下記式（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化３】
2019196416.tif 000004
（ＩＩＩ）
【００１７】
（式中、
Ｒ７及びＲ８は、独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｘ’は、１０以上の整数を意味し；
ｅは、０≦ｅ≦１を満たす数を意味し：
ｐ’及びｑ’は、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩；又は
下記式（ＩＶ）：
【００１８】
【化４】
2019196416.tif 000005
（ＩＶ）
【００１９】
（式中、
Ｒ９及びＲ１０は、独独立して、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３からなる群から選択され；
ｙ’は、１０以上の整数を意味し；
ｆは、０≦ｆ≦１を満たす数を意味し：
ｓ’及びｔ’は、独立して、０〜２０の整数である）
で表される化合物若しくはその付加塩である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の人工シャペロン分子。
［６］タンパク質のリフォールディング法であって、以下：
（ａ）変性タンパク質、及び上記［１］〜［５］のいずれかに記載の人工シャペロン分子を共存させる工程；
（ｂ）変性タンパク質と人工シャペロン分子を複合化させる工程；
（ｃ）人工シャペロン分子の相転移温度以下に冷却する工程；及び
（ｄ）人工シャペロン分子を分離する工程
を含む上記方法。
［７］前記工程（ａ）において、可溶化剤の存在下で人工シャペロン分子を共存させる、上記［６］に記載の方法。
［８］人工シャペロン分子を分離する工程が遠心分離である、上記［６］又は［７］に記載のリフォールディング法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＵＣＳＴ型（高温溶解型）高分子を用いた新規人工シャペロン分子を用いることにより、タンパク質の熱凝集を抑制し、またタンパク質のリフォールディングを可能にし、さらには、酵素の分離及び精製、又は活性測定を容易に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、合成した人工シャペロン分子（Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１）のスペクトルを示す。化学式中の各水素に対応するスペクトルのピーク位置を同一の記号を用いて示した。
【図２】図２は、Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１による炭酸脱水酵素（Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ；ＣＡ）の熱凝集抑制の結果を示す図である。左の写真は溶液を加熱する前の状態を示し、右の写真は溶液を７０℃に加熱した後の状態を示す。また、（Ａ）及び（Ｃ）はＬａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加していないサンプルであり、（Ｂ）及び（Ｄ）はＬａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加したサンプルである。
【図３】図３は、リフォールディング時間ごとの炭酸脱水酵素（ＣＡ）の比活性評価を示す図である。（＋）はＬａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加したサンプルであり、（−）はＬａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加していないサンプルである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．本発明の高温溶解型温度応答性高分子及びその製造方法
１−１．高温溶解型温度応答性高分子
本発明の温溶解型温度応答性高分子は、タンパク質の人工シャペロン分子として機能するものである。温度応答性高分子は、その温度応答挙動によって、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）型と上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）型の２種類に大別することができる。本発明の人工シャペロン分子として機能する温度応答性高分子は、下限臨界溶液温度型（ＬＣＳＴ型）高分子であり、本明細書においては、「高温溶解型」温度応答性高分子として記述する。
【００２３】
一般的に、ＬＣＳＴ型高分子は、ある温度を境に低温域では溶解しているが、高温域では不溶化する性質をもつ高分子である。この相転移機構は、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下で親水基が水分子との相互作用によって水和し、ＬＣＳＴ以上で高分子鎖の脱水和により疎水基が疎水性相互作用により凝集することに因る。従来、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子としては、ポリ（イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）が例として挙げられ、本発明の人工シャペロン分子として使用してもよい。また、ＰＮＩＰＡＭはＮ−イソプロピルアクリルアミドのホモポリマーであり、モノマーの状態では親水性を示すが、ポリマーはＬＣＳＴ型の温度応答性を示す。ＰＮＩＰＡＭは感温性高分子の中でも最も盛んに研究されている高分子であり、その転移温度（Ｔｐ）を３２℃に有し、細胞培養液中でも安定である。そのため細胞培養基材にこれらをグラフト化することで、温度変化のみで酵素を使わず細胞をシート状に回収する細胞シート工学において生医学的応用に成功を収めている。
【００２４】
本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、その相転移温度が、タンパク質を変性させる温度よりも低いものであれば、特に限定されない。本発明によれば、高温溶解型温度応答性高分子の相転移温度は、０〜３７℃、好ましくは５〜２５℃、より好ましくは１０〜２０℃である。なお、「相転移」とは、当該技術分野において一般的に使用される意味と同一であり、また、相転移温度の測定は、例えば、本発明の高温溶解型温度応答性高分子又はその付加塩を少なくとも１ｍＭの塩を含有する水溶液に溶解し、降温させながら石英セル中で５００ｎｍ又は７００ｎｍの可視光の透過率を測定し、当該化合物が完全に溶解しているときの清澄溶液の可視光の透過率を１００％とした場合に、これを降温したときに該透過率が減少し始める温度として求めることができる。
【００２５】
本発明の高温溶解型温度応答性高分子の分子構造としては、限定されないが、ポリビニル骨格、ポリエチレングリコール骨格、ポリアリル骨格、ポリメタクリル骨格，ポリウレタン骨格、ポリスチレン骨格、ポリアクリル骨格、又はポリアミド骨格を有することが好ましい。本発明によれば、高温溶解型温度応答性高分子は、ポリビニル骨格を有することがより好ましい。さらに、上記骨格を有する高分子の側鎖に、疎水性官能基及びイオン性官能基などの各種官能基を有することができる。疎水性官能基の例としては、限定されないが、脂肪族鎖（例えば、線状であるか分岐であるかを問わず、１〜２２個の炭素を含む炭化水素鎖）、芳香族構造（例えば、１つまたは複数の芳香族環を含有し、それらは縮合していてもよい）又はそれらの組合せが挙げられる。また、イオン性官能基は、カチン性官能基及びアニオン性官能基に大別できるが、カチオン性官能基としては、例えば、グアニジウムイオン、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２（ＣＨ３）＋、−ＮＨ（ＣＨ３）２＋、−Ｎ（ＣＨ３）３＋などのアンモニウムカチオンが挙げられる。このようなカチオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、塩素、臭素などのハロゲン陰イオン、硫酸陰イオン、スルホン酸陰イオン、燐酸陰イオン、カルボン酸陰イオンなどと結合して対塩を形成していてもよい。一方、アニオン性官能基としては、例えば、−ＣＯ２−、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＯＰＯ４−（リン酸基）、−Ｂ（ＯＨ）２（ボロン酸）などが挙げられる。このようなアニオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、金属陽イオン又は有機陽イオンと結合していてもよい。その金属陽イオンとしては、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋などのアルカリ金属が挙げられ、有機陽イオンとしては、Ｍｅ３Ｎ＋Ｈ、Ｅｔ３Ｎ＋Ｈ、Ｍｅ２Ｎ＋Ｈ２などが挙げられる。
【００２６】
一実施形態において、本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、下記式（Ｉ）で表される化合物又は付加塩であってもよい。
【００２７】
【化５】
2019196416.tif 000006
（Ｉ）
【００２８】
上記式（Ｉ）中、「ｘ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子の重合度を表す。具体的には、ｘは１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。
【００２９】
上記式（Ｉ）中、ｐ、ｑ、及びｒは、独立して、０〜２０の整数であり、具体的には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり得る。
【００３０】
上記式（Ｉ）中、「ａ」、「ｂ」、及び「１−ａ−ｂ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子における水素結合性官能基（Ｒ２、Ｒ３、及びＲ１）の導入度を表す。具体的には、ａ及びｂは、０≦ａ≦１及び０≦ｂ≦１であって、かつ０≦ａ＋ｂ≦１を満たす数を示す。ａ及びｂは各々、限定されないが、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９などであってもよい。
【００３１】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３で示される置換基は各々、それを含む側鎖全体がプロトンアクセプター又はプロトンドナーを有する基となり得る基であることが好ましい。よって、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３でとしては、独立して、例えば、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３であってもよい。
【００３２】
一実施形態において、本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、下記式（ＩＩ）で表される化合物又は付加塩であってもよい。
【００３３】
【化６】
2019196416.tif 000007
（ＩＩ）
【００３４】
上記式（ＩＩ）中、「ｙ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子の重合度を表す。具体的には、ｙは１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。
【００３５】
上記式（ＩＩ）中、ｓ、ｔ、及びｕは、独立して、０〜２０の整数であり、具体的には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり得る。
【００３６】
上記式（ＩＩ）中、「ｃ」、「ｄ」、及び「１−ｃ−ｄ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子における水素結合性官能基（Ｒ５、Ｒ６、及びＲ４）の導入度を表す。具体的には、ｃ及びｄは、０≦ｃ≦１及び０≦ｄ≦１であって、かつ０≦ｃ＋ｄ≦１を満たす数を示す。ｃ及びｄは各々、限定されないが、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９などであってもよい。
【００３７】
上記式（ＩＩ）中、Ｒ４、Ｒ４、及びＲ５で示される置換基は各々、それを含む側鎖全体がプロトンアクセプター又はプロトンドナーを有する基となり得る基であることが好ましい。よって、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６でとしては、独立して、例えば、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３であってもよい。
【００３８】
一実施形態において、本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物又は付加塩であってもよい。
【００３９】
【化７】
2019196416.tif 000008
（ＩＩＩ）
【００４０】
上記式（Ｉ）中、「ｘ’」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子の重合度を表す。具体的には、ｘは１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。
【００４１】
ｐ’及びｑ’は、独立して、０〜２０の整数であり、具体的には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり得る。
【００４２】
上記式（ＩＩＩ）中、「ｅ」及び「１−ｅ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子における水素結合性官能基（Ｒ８及びＲ７）の導入度を表す。具体的には、ｅは、０≦ｅ≦１を満たす数を示す。ｅは各々、限定されないが、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９などであってもよい。
【００４３】
上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ７及びＲ８で示される置換基は各々、それを含む側鎖全体がプロトンアクセプター又はプロトンドナーを有する基となり得る基であることが好ましい。よって、Ｒ７及びＲ８でとしては、独立して、例えば、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３であってもよい。
【００４４】
一実施形態において、本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、下記式（ＩＶ）で表される化合物又は付加塩であってもよい。
【００４５】
【化８】
2019196416.tif 000009
（ＩＶ）
【００４６】
上記式（ＩＶ）中、「ｙ’」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子の重合度を表す。具体的には、ｙ’は１０以上の整数を意味する。好ましくは１０〜５０００であり、より好ましくは２０〜２０００であり、特に好ましくは２０〜１０００である。
【００４７】
ｓ’及びｔ’は、独立して、０〜２０の整数であり、具体的には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり得る。
【００４８】
上記式（ＩＶ）中、「ｆ」及び「１−ｆ」は、本発明の高温溶解型温度応答性高分子における水素結合性官能基（Ｒ１０及びＲ９）の導入度を表す。具体的には、ｆは、０≦ｆ≦１を満たす数を示す。ｆは各々、限定されないが、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９などであってもよい。
【００４９】
上記式（ＩＶ）中、Ｒ９及びＲ１０で示される置換基は各々、それを含む側鎖全体がプロトンアクセプター又はプロトンドナーを有する基となり得る基であることが好ましい。よって、Ｒ７及びＲ８でとしては、独立して、例えば、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）１−２０−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＮＨ２、−ＣＯ−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３、及び−（ＣＨ２）１−２０−ＣＨ３であってもよい。
【００５０】
本発明の高温溶解型温度応答性高分子の付加塩とは、該高分子を構成するモノマー単位中の側鎖アミノ基及び／又はカルボキシル基への付加塩を挙げることができる。かかる付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、酢酸塩等のカルボン酸塩類、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩や酒石酸塩などオキシカルボン酸塩、安息香酸塩を例示することができる。
【００５１】
本明細書で使用するとき、「塩」とは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＫＢｒ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＳＯ４、及びＭｇＳＯ４等を挙げることができるが、高温溶解型温度応答性高分子（Ｉ）が、後述する式（ＶＩ）で示されるカルバモイル化ポリビニルアミンである場合、好適には塩化ナトリウムを挙げることができる。
【００５２】
１−２．高温溶解型温度応答性高分子の製造方法
本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、当業者であれば、従来技術を用いて製造することができる。例えば、ＵＣＳＴ型の温度応答性高分子化合物を製造する方法を記載した特許文献１（国際公開第２０１１／１１８５８７号及び特開２０１６−８６７８２号公報、上述）を参照して、本発明の高温溶解型温度応答性高分子を製造することができる。より具体的には、本発明の高温融解型高分子（前述の一般式（ＩＩＩ））のうち、Ｒ７及びＲ８が水素原子である化合物（ＶＩ）は、ポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩をシアン酸塩（ＭＣＮＯ）と反応させることによって製造することができる。ここで、ポリビニルアミン（Ｖ）の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩などの無機塩を挙げることができる。
【００５３】
【化９】
2019196416.tif 000010
（ｎ及びｍは、上記ｘ’及びｅと同意義である。ＭＣＮＯはシアン酸塩を意味する。）
【００５４】
なお、ポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩の製造方法は当業者に周知であるが、例えば、Ｎ−ビニルホルムアミドを２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）・二塩酸塩（ＡＡＰＨ）を重合開始剤として重合させ、得られたポリビニルホルムアミドを加水分解することによってポリビニルアミンを得ることができる（特開２０１２−０７７０９９号公報参照）。あるいは、市販のポリビニルアミン（塩フリー）を使用することもできる。
【００５５】
ポリビニルアミン（Ｖ）を溶液にするために使用する溶媒としては、水、有機溶媒又はこれらの混合液を挙げることができる。有機溶媒としては、ポリビニルアミンの溶解性から極性溶媒であることが好ましく、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等を挙げることができる。反応に使用するポリビニルアミン溶液におけるポリビニルアミン濃度としては、制限されないが、通常１〜５０重量％、好ましくは２〜３０重量％、より好ましくは５〜２０重量％を挙げることができる。
【００５６】
ポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩と反応させるシアン酸塩（ＭＣＮＯ）としては、シアン酸カリウムやシアン酸ナトリウム等のシアン酸のアルカリ金属塩を好適に例示することができる。好ましくはシアン酸カリウムである。かかるシアン酸塩の使用割合としては、上記ポリビニルアミン（Ｖ）にカルバモイル基を有する置換基が所望の割合（導入率）（一般式（ＩＩＩ）中、ｅが０≦ｎ≦１）で導入されるように、化学量論的に必要な計算量を挙げることができる。シアン酸塩の使用割合として、具体的には、ポリビニルアミン１モルに対して、０．４〜１０モルになるような割合を挙げることができる。上限は１０モル以下であればよいが、好ましくは５モル以下、より好ましくは３モル以下である。下限は該置換基の導入率（カルバモイル化度）に応じて対応するモル数に設定することができる。例えば、カルバモイル化度を０．４にする場合には０．４モル程度、０．８にする場合には０．８モル程度に設定調整することができる。
【００５７】
ポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを反応させて、Ｒ７及びＲ８が水素原子である本発明の高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）を製造する場合、最初に、原料のポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩の溶液にシアン酸塩（ＭＣＮＯ）をゆっくりと滴下することが好ましい。このとき、溶媒にシアン酸塩（ＭＣＮＯ）を溶解させて、原料のポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩の溶液に滴下することもできる。この場合、シアン酸塩（ＭＣＮＯ）を溶解させるための溶媒は、通常、原料のポリビニルアミンを溶解させるための溶媒と同じである。ポリビニルアミン（Ｖ）又はその塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）との反応は、撹拌しながら行うことが好ましい。反応温度は、特に制限されないが、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは３０〜６０℃に維持することが望ましい。反応時間も特に制限されないが、通常１２〜４８時間、好ましくは１２〜２５時間で、本発明の高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）の溶液を得ることができる。
【００５８】
反応終了後、副生したアルコールと反応溶媒を除去するために、反応溶液を、真空乾燥することにより、本発明の高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）を、固体として得ることができる。
【００５９】
また、本発明の高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）の付加塩は、原料として、ポリビニルアミンの部分塩を用い、これとシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを、フリーのポリビニルアミンを用いた場合と同様に、反応させることにより、製造することができる。通常、原料のポリビニルアミンの部分塩とシアン酸塩（ＭＣＮＯ）とを反応させた場合、そのポリビニルアミンのＮＨで、塩を形成していないＮＨが、優先的に水素結合性置換基で置換される。反応終了後、得られる高温融解型高分子（ＶＩ）の塩の溶液を、アセトン等の溶媒に加えて再沈することにより、本発明の高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）の付加塩を、固体として取り出すことが可能となる。
【００６０】
さらに、高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）の疎水性度を高めるために、例えば、炭素数８のオクチル基、２−エチルヘキシル基、炭素数１２のラウリル基、炭素数１８のステアリル基、イソステアリル基、オレイル基を側鎖に導入することができる。このような疎水性基の導入は、上記の例示した基に対応した酸無水物（例えば、ステアリン酸無水物、ラウリン酸無水物）を適切な有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯなど）に溶解させ、高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）と反応させることによって容易に製造することができる。
【００６１】
例えば、高温溶解型温度応答性高分子（ＶＩ）とラウリル酸無水物を反応させることによって、一般式（ＩＩＩ）において、Ｒ７が水素原子であり、Ｒ８が−ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３である、疎水性度を高めた高温溶解型温度応答性高分子を得ることができる。また、疎水性基の導入率は、反応させる酸無水物の添加量（モル比）により適宜変更可能であるため、高分子中に未反応のポリビニルアミンが残存するような構造を有してもよい。
【００６２】
２．本発明の高温融解型高分子を用いたタンパク質の品質管理
本発明は、上記高温溶解型温度応答性高分子を用いた、タンパク質の品質管理を行う方法を提供する。本明細書で使用するとき、「品質管理」とは、溶液中のタンパク質を安定に保存及び利用することを目的とした手段を指し、本発明によれば、例えば、タンパク質のフォールディング支援、複合体形成、脱凝集、及びリフォールディングのための方法が提供される。一般的に、タンパク質は、温度変化やｐＨ変化、圧力などの環境変化によってタンパク質の立体構造が大きく変化し、本来の物性や機能を失う。さらに、このような変性したタンパク質は、分子間で会合し凝集体を形成することがある。こうしたタンパク質の変性を防止し、又は変性したタンパク質をリフォールディングすることができれば、医薬品製造及び分子生物学研究の分野に非常に貢献することができる。後述するように、本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、タンパク質の熱凝集抑制、リフォールディング等を可能にする機能を有することから、本明細書において、該高分子を「人工シャペロン分子」と称する。
【００６３】
（１）熱凝集抑制
本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、タンパク質の熱凝集を抑制することができる人工シャペロン分子である。「熱凝集」とは、溶液中のタンパク質が該タンパク質に固有の変性温度を超えて加熱されると、タンパク質の立体構造が変化し、タンパク質同士が凝集することをいう。そのため、タンパク質の触媒機能などのタンパク質の本来の機能が喪失する。本発明によれば、タンパク質の溶液に予め本発明の高温溶解型温度応答性高分子により構成される人工シャペロン分子を添加しておくことにより、タンパク質の変性温度以上に溶液が加熱された場合であっても、タンパク質の熱凝集を抑制することができる。このような熱凝集を抑制され得るタンパク質の種類は特に限定されないが、本発明の高温溶解型温度応答性高分子の相転移温度を以上の変性温度を有するものであればよい。タンパク質の変性温度は、炭酸脱水酵素（ＣＡ）の場合は約６４℃であり、リゾチームの場合は約８０℃である。
【００６４】
タンパク質の水溶液中に共存させる高温溶解型温度応答性高分子の量は適宜変更することができ、タンパク質が１分子に対して高温溶解型温度応答性高分子が１分子以上の割合で水溶液に添加すればよい。例えば、タンパク質と高温溶解型温度応答性高分子の比は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：２０などが例示される。
【００６５】
本発明の人工シャペロン分子によるタンパク質熱凝集の抑制率は５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらになお好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。タンパク質が熱変性から抑制されたかどうかの検証には、シャペロン分子を共存させていないタンパク質の水溶液では溶液が不透明になり又は沈殿を形成することから視認による方法でもよく、又は溶液の一部を採取し、濁度を測定することによる方法であってもよい。
【００６６】
（２）リフォールディング
医薬品としてのタンパク質は非常に市場価値が高い。一般に、これらのタンパク質は大腸菌等で組み換えタンパク質として発現させる。しかし、目的のタンパク質の発現の際のフォールディング途中でタンパク質が凝集・沈殿し、正常なフォールディングをとれないため本来の機能を果たせないことが問題となっている。本発明の高温溶解型温度応答性高分子は、タンパク質の構造形成を介助し、天然状態にリフォールディングさせることができる人工シャペロン分子である。「リフォールディング」とは、タンパク質が不適切にもしくは異常に折り畳まれた状態、又は正常に若しくは適切に折り畳まれていない状態から、元の立体構造及び機能を回復させることをいう。本発明によれば、異常な立体構造であるタンパク質や機能喪失したタンパク質の水溶液中に本発明の高温溶解型温度応答性高分子を添加することによって、変性タンパク質をリフォールディングさせる方法が提供される。より具体的には、本方法は、
（ａ）変性タンパク質、及び上記高温溶解型温度応答性高分子により構成される人工シャペロン分子を共存させる工程；
（ｂ）変性タンパク質と人工シャペロン分子を複合化させる工程；
（ｃ）人工シャペロン分子の相転移温度以下に冷却する工程；及び
（ｄ）人工シャペロン分子を分離する工程
を含む。
【００６７】
工程（ａ）において、共存させる変性タンパク質と高温溶解型温度応答性高分子の比は、上記した熱凝集抑制の場合と同様であってよい。また、工程（ｅ）は、限定されないが、人工シャペロン分子を遠心分離によって分離及び除去することができる。遠心分離には、実験施設等でタンパク質の分離に一般的に使用されている各種機器を使用することが可能である。従来の人工シャペロン分子（例えば、グルカンデンドリマーなど）を用いたリフォールディング法では、変性から回復したタンパク質と人工シャペロン分子を分離するために、シクロデキストリンなどの解離剤の添加を必要とする。本発明によれば、このような解離剤を使用することなく、単に遠心分離を行うことによってタンパク質の水溶液から人工シャペロン分子を分離及び回収することができる。
【００６８】
また、変性タンパク質と人工シャペロン分子を複合化させるために、工程（ａ）において人工シャペロン分子を共存させる場合に、可溶化剤を添加させてもよい。可溶化剤としては、限定されないが、例えば、塩酸グアニジン、尿素、ＳＤＳなどが挙げられる。可溶化剤の使用濃度は、通常、タンパク質を変性させる際に使用され、当業者に周知である濃度であってもよい。
【００６９】
本発明の人工シャペロン分子によるリフォールディング率は５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらになお好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。タンパク質がリフォールディングしたかどうかの検証には、タンパク質の機能（例えば、触媒作用など）を測定することによって行うことができる。例えば、後述実施例３では、モデルタンパク質として炭酸脱水酵素（ＣＡ）を用いて、本発明の人工シャペロン分子の有用性を検討しているが、該酵素の基質であるパラニトロフェニルアセテートと混合し、パラニトロフェニルアセテートの加水分解に伴い生成するニトロフェノールイオンにおける吸光度を測定することによって酵素活性の復元、すなわち、リフォールディングされたかどうを検討している。
【００７０】
３．キット
本発明によれば、タンパク質の品質管理のために、本発明の人工シャペロン分子及び緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）を含むキットを提供することができる。人工シャペロン分子は、例えば、固体として、水若しくは緩衝液などの溶媒に溶解させた状態で、又は固相基材に担持させた状態でキットに含めることができる。
【００７１】
本発明の人工シャペロン分子を、例えば共有結合により担持させることが可能な固相基材は、限定されないが、粒子形状や基盤形状であってもよく、例えば、シリカ、シリコーン、ポリオレフィン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンタン、ポリメチルペンテン、多糖類、ポリペプチド、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリスルホネート、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリピロール、ポリビニルピロリドン、ポリスルホン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ芳香族ポリアミド、酸化アルミニウム、ガラス、セファロース、炭水化物、アクリレート又はメタクリレートとポリアミドの共重合体；ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリエーテルイミド、ポリアクリロニトリル、エチレングリコールジアクリレート又はエチレングリコールジメタクリレートとグリシジルアクリレート又はグリシジルメタクリレート及び／又はアリルグリシジルエーテルの共重合体、再生セルロース、セルロースアセテート、親水性ポリマーを加えた疎水性ポリマー、上記ポリマーの誘導体及び共重合体であり得る。なお、担体への人工シャペロン分子の担持は、当業者に周知の一般的な方法を用いて行うことできる。
【００７２】
４．医薬組成物
本発明の人工シャペロン分子は、タンパク質の変性や凝集に伴って発症するタンパク質凝集性疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物として使用することができる。該医薬組成物には、医薬として許容される賦形剤、医薬用担体を含むことができる。適応疾患としては、タウ・タンパク質が関連したアルツハイマー病、ピック病などが挙げられる。また、本発明の人工シャペロン分子と有害には反応しない滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤および／または芳香性の物質などのような補助剤と混合されてもよい。本発明の人工シャペロン分子は、患者に単独で投与されてもよく、又は上記適用症例を治療するための薬剤と同時投与されてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、製造例及び実験例を挙げて本発明の構成及び効果をより明確に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００７４】
実施例１：人工シャペロン分子の製造
本発明の人工シャペロン分子のうち、下記の構造：
【００７５】
【化１０】
2019196416.tif 000011
【００７６】
を有する化合物（Ｖ）（「Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１」）を典型例として合成した。また、この化合物を実施例２及び３において、タンパク質の熱凝集抑制効果及びリフォールディングに使用した。なお、Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１の合成は、その前駆化合物であるＰＶＵ２５０Ｋ９１を予め合成し、その後、ラウリル基（炭素数１２）を側鎖に導入することによって行った。
【００７７】
（１）試薬
Ｎ−ビニルホルムアミド、ラウリン酸無水物は東京化成工業から購入した。アゾビスアミジノプロパン二塩酸塩、アセトン、水酸化ナトリウム、塩酸は和光純薬から購入した。
【００７８】
（２）合成
（ａ）ＰＶＵ２５０Ｋ９１の合成
Ｎ−ビニルホルムアミド５．０ｇをＭｉｌｌｉＱ  １０ｍＬに溶解し、窒素置換を行った。アゾビスアミジノプロパン二塩酸塩９０ｍｇをモノマー溶液に加え、６０℃で９時間反応させた。反応後は反応後溶液をアセトン２００ｍＬで再沈殿し、ポリビニルホルムアミドを回収し、２Ｍ  ＮａＯＨを３３ｍＬ加え、８０℃で３時間加水分解した。その後、濃塩酸でｐＨ１に合わせ、エタノール４００ｍＬで再沈殿し、ポリビニルアミンを回収した。これをＭｉｌｌｉＱに溶解し、透析で精製し、凍結乾燥することで黄色い砂状のポリビニルアミンを得た。
【００７９】
次に、得られたポリビニルアミン（主鎖分子量２５０，０００＝２５０Ｋ）１．８７ｇをＭｉｌｌｉＱ  ２５ｍＬに溶解した。シアン酸カリウム１．７５ｇ（０．９２ｍｏｌ％）をＭｉｌｌｉＱ  ２５ｍＬに溶解し、ポリアリルアミンの溶液に加え、６０℃で２４時間反応させた。反応後は反応後溶液を透析膜に移し、３日程度透析した後、凍結乾燥することで白色綿状のＰＶＵを得た。合成の確認は、核磁気共鳴分光計（ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ４００Ａ：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）による１Ｈ  ＮＭＲ測定によって行った。ポリマーを１０ｍｇ／ｍＬになるようにＤ２Ｏ  １％ＮａＯＤで溶解し、温度６０℃、積算回数６４回で測定を行った。
【００８０】
スペクトルは以下のように同定された。δ＝１．５−２．０ｐｐｍ（ＰＶＵ主鎖−ＣＨ２−ＣＨ−）、δ＝２．９−３．１ｐｐｍ（アミノ基に隣接した主鎖−ＣＨ−ＮＨ２）、δ＝３．７−４．０ｐｐｍ（ウレイド基に隣接した主鎖−ＣＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２）。なお、ウレイド基の導入率はアミノ基に隣接した主鎖の水素とウレイド基に隣接した主鎖の水素の積分比から算出した。ウレイド基導入率は、シアン酸カリウムの仕込み率９２％に対して９１％となった。合成したＰＶＵは、主鎖分子量２．５×１０５、ウレイド基導入率９１ｍｏｌ％であることから、「ＰＶＵ２５０Ｋ９１」と表記した。
【００８１】
（ｂ）Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１の合成
ＰＶＵ２５０Ｋ９１  ２２４ｍｇをＭｉｌｌｉＱ  ６ｍＬに溶解した。ラウリン酸無水物３６ｍｇ（３．６ｍｏｌ％）をＤＭＳＯ  １８ｍＬに溶解し、ＰＶＵの溶液に加え、４０℃で２４時間反応させた。反応後は反応後溶液を透析膜に移し、２日間ＤＭＳＯ透析し、さらに２日程度ＭｉｌｌｉＱ透析をした後、凍結乾燥することで白色綿状のＬａｕ−ＰＶＵを得た。合成の確認は核磁気共鳴分光計（ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ４００Ａ：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）による１Ｈ  ＮＭＲ測定によって行った。ポリマーを１０ｍｇ／ｍＬになるようにＤ２Ｏで溶解し、温度６０℃、積算回数６４回で測定を行った。
【００８２】
スペクトルを図１に示し、以下のように同定された。δ＝１．１−１．２ｐｐｍ（ラウリル基末端メチル−ＣＨ２−ＣＨ３）、δ＝１．５−１．７ｐｐｍ（ラウリル基メチレン−ＣＨ２−）、δ＝１．７−２．２ｐｐｍ（ＰＶＵ主鎖−ＣＨ２−ＣＨ−）、δ＝２．４−２．６ｐｐｍ（カルボニル基に隣接したメチレン−ＣＨ２−ＣＨ−）、δ＝３．３−３．５ｐｐｍ（アミノ基に隣接した主鎖−ＣＨ−ＮＨ２）、δ＝３．８−４．３ｐｐｍ（ウレイド基とアミド基に隣接した主鎖−ＣＨ−ＮＨ−ＣＯ−）。ラウリル基の導入率は、ラウリル基末端メチルの水素εとアミド基・ウレイド基に隣接したメチレン基の水素βの積分比より算出した。合成したラウリルＰＶＵは、ラウリル修飾率５ｍｏｌ％、主鎖分子量２．５×１０５、ウレイド基導入率９１ｍｏｌ％であることから、「Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１」と表記した。Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１の相転移温度（Ｔｐ）は、透過率測定から１２℃であった。
【００８３】
実施例２：Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１のタンパク質熱凝集抑制
モデルタンパク質として炭酸脱水酵素（Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ；ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を選択した。ＣＡ（約３０ｋＤａ）は変性温度を６４℃にもち、自然なリフォールディングが起こりにくいこと、また酵素活性を評価しやすいことから採用した。Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１によるＣＡの熱凝集抑制は、以下のように行った。Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を１２ｍｇ／ｍＬ  ５００μＬを調製した。次に、ＣＡ  １．０ｍｇ／ｍＬ  ２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ  ＮａＣｌを５００μＬ添加した。溶液を７０℃で５分加熱し、各温度で加熱した後に凝集の有無を確認した。
【００８４】
結果を図２に示す。Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加していないサンプルでは、７０℃で加熱後にＣＡが凝集した（図３右（Ｃ））。一方で、Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１を添加したサンプルでは、加熱後もＣＡが凝集することなく溶液状態を保っていた（図３右（Ｄ））。これらの結果から、Ｌａｕ−ＰＶＵはタンパク質の熱凝集抑制剤として機能しているといえる。これは、変性温度以上で変性タンパク質の溶媒に露出した疎水基とＬａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１が相互作用することにより、タンパク質間の相互作用を抑制したためと考えられる。
【００８５】
次に、本発明のＬａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１と、従来の人工シャペロン分子（ＳＤＳ及びナノゲル型シャペロン）とを比較検討した。各人工シャペロン分子の濃度及びＣＡ濃度は、下記の表１の通りである。なお、当業者に周知であるように、ＳＤＳ及びナノゲル型シャペロンは、タンパク質とシャペロンを分離するために、シクロデキストリン（ＣＤ）を必要とする。
【００８６】
【表１】
2019196416.tif 000012
【００８７】
この結果は、従来報告されてきた人工分子シャペロンと比較して、保護することができるタンパク質濃度、リフォールディング時間と収率の両面で優れていることを示す。また、過剰に添加されたシクロデキストリンは、タンパク質中のトリプトファン残基やフェニルアラニン残基と包接複合体を組み、正しいリフォールディングが阻害されるという報告もあり、濃度に留意する必要があるため、本発明は、シクロデキストリンが不要であるという点についても有意な効果を有する。
【００８８】
実施例３：Ｌａｕ５−ＰＡＵ２５０Ｋ９１のタンパク質リフォールディング
１２ｍｇ／ｍＬ  Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１  ５００μＬを１．０ｍｇ／ｍＬ  ＣＡ  ５００μＬ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ）に添加し、混合溶液を７０℃で５分間加熱した。加熱後は４０℃で９０分静置し、各静置時間で溶液１００μＬを回収した。回収した溶液を１分間氷冷させた後、７，０００Ｇ、４℃で２分間遠心・冷却することでポリマーを除去した。ポリマー除去後の上清をサンプルとして１０μＬ取り出し、８連セル内で０．０７ｍｇ／ｍＬパラニトロフェニルアセテート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１４０μＬと混合し、パラニトロフェニルアセテートの加水分解に伴い生成するニトロフェノールイオンの４００ｎｍにおける吸光度を３７℃で測定することで定量した。吸光度測定には、紫外−可視分光光度計（ＵＶ−１６５０：島津製作所、Ｖ−６３０：日本分光）を使用した。
【００８９】
結果を図３に示す。Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１を添加していないサンプルでは、加熱後にその酵素活性は著しく失われていた。一方で、Ｌａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１を添加したサンプルでは、加熱後にその酵素活性は半分以上失われたが、その後４０℃で９０分間静置したものでは、酵素活性が大きく回復した。さらに回復後に冷却によってＬａｕ−ＰＶＵ２５０Ｋ９１を除去した後もその酵素活性が下がることはなく、９０％以上の酵素活性を復活させることができた。
【００９０】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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