(57)【要約】      （修正有）【課題】移植前のＴＮＦスーパーファミリーのリガンドへの細胞の曝露によって、造血幹細胞および前駆細胞の生着を促進し、移植結果を改善するための方法、及び移植での使用のための、活性化された造血幹細胞及び前駆細胞の集団の提供。【解決手段】ＴＮＦファミリー受容体の活性化により生着特性が向上している幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）の集団を得るためのエクスビボの方法であって、ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料を、ＴＮＦスーパーファミリーのうち少なくとも１つのメンバーまたは完全なタンパク質の活性を保持するそれらの何れかの断片もしくは誘導体とエクスビボで接触させることを含み、ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦファミリー受容体の活性化により生着特性が向上している幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）の集団を得るためのエクスビボの方法であって、
前記細胞は、ＳＰＣ移植を必要とするレシピエントへ移植されることに適しており、
前記方法は、ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料を、ＴＮＦスーパーファミリーのうち少なくとも１つのメンバーまたは完全なタンパク質の活性を保持するそれらの何れかの断片もしくは誘導体とエクスビボで接触させることを含み、
前記生着特性の向上は、骨髄系、リンパ系、血小板または赤血球系再構成または活性の向上を含み、前記ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択され、かつ
前記生体試料が臍帯血（ＵＣＢ）であり、前記接触の工程（ａ）が１８時間から４８時間にわたる、または
前記生体試料が動員末梢血（ｍＰＢ）であり、前記接触の工程（ａ）が３時間から１８時間にわたる、方法。
【請求項２】
前記ＳＰＣが、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＮＦ−αが１０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度であるか、または前記ＦａｓＬが１０ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーが表面に結合され、任意に前記表面がビーズであり、任意に前記結合がリンカーを介する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）移植を必要とするレシピエントにおけるＳＰＣの生着を向上させる方法において使用するための細胞集団であって、
前記細胞は、生着特性が向上している幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）であり、
前記生着特性が向上しているＳＰＣ集団は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体の活性化、およびＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料を、ＴＮＦスーパーファミリーのうち少なくとも１つのメンバーまたは完全なタンパク質の活性を保持するそれらの何れかの断片もしくは誘導体とエクスビボで接触させることにより得られ、
前記生着特性の向上は、骨髄系、リンパ系、血小板または赤血球系再構成または活性の向上を含み、前記ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択され、かつ
前記生体試料が臍帯血（ＵＣＢ）であり、前記接触が１８時間から４８時間にわたる、または
前記生体試料が動員末梢血（ｍＰＢ）であり、前記接触が３時間から１８時間にわたる、細胞集団。
【請求項６】
前記ＳＰＣが、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）である、請求項５に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記ＴＮＦ−αが１０ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度であるか、または前記ＦａｓＬが１０ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、請求項５に記載の細胞集団。
【請求項８】
前記ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーが表面に結合され、任意に前記表面がビーズであり、任意に前記結合がリンカーを介する、請求項５〜７の何れか１項に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
造血幹細胞および前駆細胞移植は、様々な放射線療法耐性の悪性腫瘍において根治性がある、腫瘍学における従来からの治療用式である。移植手順における改善および漸進的な進歩によって、先天性欠乏、先天的および後天的な免疫不全症候群、免疫異常、自己免疫疾患ならびに臓器移植片および組織移植片に対する寛容性の誘導を含む非腫瘍性障害における造血移植の幅広い実現への道が開かれる。
【０００２】
ＴＮＦファミリーには、１９種類の既知の受容体／リガンド相互作用が含まれ、これらは、体細胞において共通するアポトーシス誘導活性を共有する。
【０００３】
マウスおよびヒト細胞を用いてストレス造血および移植のモデルにおいて行われた研究から得られたアポトーシスおよび刺激の二重介在物質としての腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー受容体の役割は論争の的となっている［１−４］。一方、従来の概念は、アポトーシスの介在物質としてのこれらの受容体の役割が支配的であり、これらのいくつかのうちあるものは細胞発生における不可逆的事象である。したがって、Ｆａｓ／ＦａｓＬ相互作用は、分化の末端段階におけるクローン性増殖の抑制と同じく、造血前駆細胞発生の負の制御因子であると考えられる［５−７］。この概念は、Ｆａｓ受容体がインビトロで造血前駆細胞機能を抑制し［８、９］、クローン形成活性を阻止し［１０、１１］、免疫障害マウス［１２、１３］およびヒト［１１］においてヒト細胞生着を害することを示すデータに基づく。
【０００４】
アポトーシスおよび抑制シグナルを伝達するＴＮＦファミリーの受容体の発現レベルが低いために、前駆細胞がアポトーシスから保護されるということが示唆されている［８−１０］。
【０００５】
一方で、レシピエント骨髄へのホーミングおよびそこでのシーディング後すぐにドナー細胞においていくつかのＴＮＦファミリー受容体の急激な上方制御が観察される。
【０００６】
アポトーシスに対する造血前駆細胞の耐性は、ＷＯ２００７／１３８５９７に記載のように、移植設定においていくつかの重要な意味がある。その態様の１つにおいて、ＷＯ２００７／１３８５９７は、表現型に基づく選択に対する代替法として、機能的特徴に基づき、移植用前駆細胞の濃縮のためにアポトーシス負荷を使用することを提案する。この効果的で信頼できる選択手順は、単純かつ安価であり、これには、ドナー移植片中の、ＣＤ３４およびＣＤ１３３などのマーカーの発現レベルが低いかまたはこれらを発現しない前駆細胞が含まれる。さらに、アポトーシスに基づく細胞調製は、移植片対宿主（ＧｖＨＤ）エフェクターおよび自己反応性Ｔ細胞および悪性細胞をドナー移植片から除去するという注目すべき長所がある［３３、３４］。
【０００７】
発明者らは、インビトロでの造血細胞機能におけるＴＮＦファミリー受容体の負の影響が、サイトカインで刺激を受けた骨髄およびＵＣＢ細胞に限定されることを以前示しており［８−２０、２３、２７］、これは、サイトカイン消退によってさらに強調される［３５］。Ｆａｓを発現するＣＤ３４＋前駆細胞の分画は、生着能が漸進的に失われる長期のエクスビボ培養中、自発性のアポトーシスに対して過剰な感受性を呈するが［１２、１３］、この現象はＦａｓ受容体クロスリンクとは独立したものである［２８、３１］。アポトーシスに対する固有の前駆細胞耐性が移植後にインビボで持続し、移植前の前処置により与えられる損傷により引き起こされる厳しい骨髄環境内での生着に対してアポトーシス非感受性前駆細胞が優先されることが示された［２８］。前駆細胞のこの特徴によって、前駆細胞は、膜性ＦａｓＬタンパク質の異所性発現により獲得されるインビボでの拒絶に介在する宿主対移植片（ＨｖＧ）同種免疫反応を軽減するための免疫調節に対する免疫細胞の効果的な代替物となる［３６、３７］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＴＮＦファミリー受容体の活性化による造血細胞生着の改善に関する。デス受容体の活性化が造血前駆細胞生着および機能に有害であるとする従来の概念とは異なり、発明者らは、本質的に受容体介在性アポトーシスに対して耐性である前駆細胞においてこれらの受容体の誘導性活性を明らかにする。エクスビボでのＦａｓ−リガンド、ＴＮＦ−αおよびＴＲＡＩＬおよびそれらの組み合わせへの曝露は、ＳＣＩＤマウスにおいて量的異種キメラ現象を促進し、インビボで骨髄系再構成を改善する。骨髄系前駆細胞活性の誘導もまた培養において明らかにされる。造血前駆細胞の活性化がドナー細胞移植片の一般的な供給源をもたらし、保存に依存しないことを明らかにするために、詳細な例を新鮮な臍帯血および凍結保存された動員末梢血に対して示す。様々な供給源からの前駆細胞の活性化に必要とされる時間およびリガンドの濃度は変動し、したがって最適化されている。本発明によれば、優れた量的および質的生着および再構成を達成するための前駆細胞活性化のためにドナー造血移植片をＴＮＦスーパーファミリーのリガンドに曝露する。
【０００９】
したがって、その態様の第一において、本発明は、前駆細胞（ＳＰＣ）移植を必要とするレシピエントにおいて幹細胞およびＳＰＣの生着を促進するための方法であって、
ａ．ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料をＴＮＦスーパーファミリーまたはそれらの何れかの断片もしくは誘導体のうち少なくとも１つのメンバーとエクスビボで接触させ；
ｂ．前記接触段階（ａ）の後、前記ＳＰＣを前記レシピエントに移植する、
ことを含み、この移植されたＳＰＣが生着向上を示す、
方法を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、移植の方法での使用のための細胞の集団であって、前記細胞が、生着特性が向上している幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）であり、前記生着特性が向上しているＳＰＣの集団が、ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料をＴＮＦスーパーファミリーまたはそれらの何れかの断片もしくは誘導体のうち少なくとも１つのメンバーとエクスビボで接触させることにより得られる、細胞の集団を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａは、培地中で温置し、５００ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬに予め曝露した細胞を移植したマウスの生存を示すグラフである（ｎ＝２０）。ここで与えられる４週間より長い時間でさらなる死亡例はなかった。図１Ｂは、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬキメラタンパク質、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよびそれらの組み合わせとともに予備温置した細胞のレシピエントの生存を示すグラフである（ｎ＝２０）。図１Ｃは、対応する実験群での移植３週間後のドナーキメラ現象のレベルを示すグラフである（各群ｎ＝６）。図１Ｄは、デスリガンド提示ＧＲ−１＋骨髄系細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋Ｂリンパ球に予め曝露した細胞を移植したマウスにおける細胞系列キメラ現象を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、実験の着手を明らかにする模式図である。図２Ｂは、２４、４８および７２時間の、培地中での（それぞれｎ＝１２、１０、５）、およびＦａｓＬ（それぞれｎ＝８、８、８）、ＴＮＦ−α（それぞれｎ＝７、７、５）、ＴＲＡＩＬ（それぞれｎ＝７、８、９）とともに行う移植前温置とともに、新鮮なＵＣＢ（ｎ＝２７）に対してヒト抗ＣＤ４５モノクローナル抗体で染色することにより決定されるヒトキメラ現象のパーセンテージを示すグラフである。図２Ｃは、種特異的なＣＤ４５を用いたマウス骨髄におけるヒト細胞キメラ現象の代表的測定を示す略図である。
【図３】図３Ａは、移植１２週間後にマウス骨髄においてヒトＵＣＢ細胞から発生した細胞系列の略図である。移植した細胞は、移植前に２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αとともに予備温置した：ＣＤ３４＋および細胞系列陰性（ｌｉｎ−）前駆細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球、ＣＤ３３＋骨髄系細胞。図３Ｂは、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬとともに４８時間、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦおよび１．５μｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬとともに４８時間予備温置した細胞の移植１２週間後の骨髄におけるヒト細胞生着のパーセンテージを示すグラフである（各群ｎ＝７から１２）。図３Ｃは、ＣＤ１４＋単球を含む、デスリガンドとともに２４から４８時間にわたり予備曝露した後の質的生着を示す略図である（各群ｎ＝４から７）。骨髄性単球分画の増加が示される。
【図４】図４Ａは、対照およびＴＮＦα処理ＵＣＢ細胞と比較した、一次および二次レシピエントにおけるパーセント生着を示すグラフである。図４Ｂは、２４時間または４８時間にわたりＴＮＦまたは対照（培地）で処理したＵＣＢ細胞のレシピエントにおける骨髄系コロニー数を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、培地中でのおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬまたは１．５μｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬとの温置後の、ＵＣＢ細胞における、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体およびＴＲＡＩＬ受容体の分画発現の略図である（各群ｎ＝５から９）。図５Ｂは、ＦａｓＬ、ＴＮＦ−αおよびＴＲＡＩＬとの温置４８時間後の、単核（ＭＮＣ）ＵＣＢ細胞、ＣＤ３４＋および細胞系列陰性前駆細胞（ｌｉｎ−）の増殖指数を示すグラフである（各群ｎ＝４から７）。右パネルは、ＭｏｄＦｉｔシミュレーション・ソフトウェアを用いたＣＦＳＥ希釈物からの増殖の例証となる測定を示す。図５Ｃは、リガンドとの温置４８時間後のＣＤ３４＋およびｌｉｎ−前駆細胞における細胞周期相を示すグラフである。右パネルは、ヨウ化プロピジウムを用いたＤＮＡ含量の測定に対する例証となる（各群ｎ＝４から７）。
【図６】図６Ａは、実験の着手を示す模式図である。図６Ｂは、新鮮なＵＣＢ（対照）に対する、および２４から７２時間にわたる培地中でのおよびデスリガンドとの温置後の、１０３個の播種細胞あたり発現される骨髄系コロニー形成を示すグラフである（各時間点でｎ＝６から１４）。図６Ｃは、ＣＤ３４＋前駆細胞におけるパーセントＦａｓ発現を示すグラフである（ｎ＝９）。図６Ｄは、メチルセルロース培養における骨髄系前駆細胞活性を示すグラフである（ｎ＝７から１５）。
【図７】図７Ａは、新鮮な試料における、および各リガンドとの温置後の、％Ｆａｓ発現を示すグラフである（ｎ＝２９新鮮、ｎ＝１１温置）。図７Ｂは、新鮮な試料における、およびリガンドＴＮＦ−Ｒ１（ｎ＝７新鮮、ｎ＝５温置）およびＴＮＦ−Ｒ２（ｎ＝１２新鮮およびｎ＝１０温置）のそれぞれとの温置後の、％Ｆａｓ発現を示すグラフである。図７Ｃは、新鮮な試料における、ならびにリガンドＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４、ｎ＝９）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５、ｎ＝８）のそれぞれとの温置後の、％Ｆａｓ発現を示すグラフである。図７ＤからＦは、同族のリガンドによる受容体クロストークおよび誘導の結果の略図であり、図７Ｄは受容体の発現誘導、図７Ｅは細胞増殖の減弱、図７Ｆは、膜下（ｓｕｂｍｅｍｂｒａｎａｌ）シグナル伝達経路の略図に基づくアポトーシスである。
【図８】図８Ａは、培地中での、およびリガンドとの温置後の１１個のｍＰＢ試料を移植した後のヒト抗ＣＤ４５染色から決定した場合の、ヒトドナーキメラ現象の累積的レベルを示すグラフである（各実験群でｎ＝９から１７匹マウス）。図８Ｂは、ＣＤ３４＋および細胞系列陰性（ｌｉｎ−）前駆細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球およびＣＤ３３＋骨髄系細胞を含む移植１２週間後の宿主骨髄における細胞系列の分画分布の略図である（各群ｎ＝４から７）。
【図９】図９Ａは、１０３個のｍＰＢ細胞あたりのＣＦＵ数を示すグラフである。図９Ｂは、リガンドとの４および１６時間にわたる温置後の大型（＞細胞５０個）および小型（細胞３０から５０個）骨髄系コロニーの分配を示すグラフである（ｎ＝５から１１）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、幹細胞および前駆細胞活性化を誘導するためのＴＮＦファミリー受容体シグナル伝達の利用に関する。アポトーシス機構は、殆どの原始幹細胞および前駆細胞を含め、全ての細胞でよく保存されているので、この経路は、栄養性シグナル伝達のために使用される。本発明によれば、造血細胞移植片の後続活性をインビボで誘導するために、造血細胞移植片を移植前にＴＮＦファミリー受容体のリガンドの様々な組み合わせに曝露する。
【００１３】
本発明は、幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）における、特に造血幹細胞および前駆細胞（ｈＳＰＣ）におけるＴＮＦファミリー受容体の移植前の活性化が、造血前駆細胞生着および再構成を促進することによって移植の結果を改善するという新規の知見に基づく。各個々の受容体は造血幹細胞および前駆細胞の比較的小さな分画で発現されるものの、これらは、新鮮な臍帯血（ＵＣＢ）前駆細胞のおよそ５０％で見出される。したがって、同時活性化は、前駆細胞のうちかなりの割合のものの活性に影響を与えることができる。その結果から、ＴＮＦファミリー受容体活性化がインビボでの造血前駆細胞活性の誘導に十分であることが明らかとなる。
【００１４】
さらに、ＴＮＦファミリー受容体活性化は、比較的短時間に、ＴＮＦファミリーリガンドを用いて、さらなるサイトカインおよび増殖因子の非存在下で行われる。このアプローチは、移植片の移植前調製の状態に対して実行可能であり、通常、これは支持および刺激因子を含まない。
【００１５】
さらに、本発明は、ＧｖＨＤに関与するアポトーシス感受性サブセットの除去および残留する悪性細胞の自己移植片からの排除のためにアポトーシスに対する前駆細胞耐性を使用する、移植片調製のアポトーシス介在性機序とは異なる。前駆細胞の移植前の栄養性活性化を達成するための、曝露の時間、リガンドの濃度および活性化受容体の性質は、アポトーシスに対するそれらの非感受性に基づく前駆細胞の機能的な負の選択とは異なる（ＷＯ２００７／１３８５９７）。
【００１６】
臍帯血は、造血幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源であり、これを使用することは、移植による悪性および非悪性障害の処置において飛躍的に増加する。ドナー細胞供給源としてのＵＣＢの主要な制約は、前駆細胞数が少なく、成人レシピエントの移植で必要とされる閾値を下回り、生着が遅く、無形成および感染に対する宿主曝露の危険な期間が長くなることである。これらの制約の解決策には、数単位の臍帯の同時移植および前駆細胞のエクスビボ増殖が含まれる。発明者らは、アポトーシスに耐性のあるＵＣＢ前駆細胞の機能的選択により、表現型マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１３３）に基づく単離と比較した場合、それらの有効数が増加するということを既に明らかにしている。さらに、アポトーシスに対して感受性となる分化細胞の排除によって、決定を受けていないアポトーシス非感受性前駆体に対して優位性を与えることによりエクスビボでのＵＣＢ前駆細胞増殖の収量が改善する。
【００１７】
本発明は、前駆細胞の移植前活性化によって生着時間を短縮するためのさらなるアプローチを提供するが、この活性化は持続し、量的および質的造血再構成の加速につながる。
【００１８】
造血前駆細胞の別の一般的供給源は、動員末梢血（ｍＰＢ）であり、動員剤を用いた骨髄刺激後のアフェレーシスによる単核細胞の回収に基づく。発明者らは、ｍＰＢ移植片からのＴおよびＢリンパ球の機能的な負の選択によって、ＧｖＴ活性を保持しながら、ＧｖＨＤの重症度が顕著に低下することを以前明らかにした［３８］。この手順によって、ＧｖＨＤの潜在的可能性を低下させながらＴ細胞の移植促進効果を保持することにより、生着効率が顕著に改善する。
【００１９】
本発明は、前駆細胞の移植前活性化によって量的および質的ｍＰＢ細胞生着を促進するためのさらなるアプローチを提供する。
【００２０】
アポトーシスおよび抑制シグナルを伝達するＴＮＦファミリーの受容体の発現レベルが低いために前駆細胞がアポトーシスから保護されるということが以前から示唆されている［８−１０］。裏付けとなる証拠は、抗体および可溶性ＦａｓＬをブロックすることにより造血細胞が明らかに保護されることであり［１４−１６］、これは、Ｆａｓ三量体化を防ぐことによって抗アポトーシス効果を発揮する［２］。インビトロ実験から、アポトーシスの誘導［１９、２０］を通じたサイトカイン活性化造血細胞の機能におけるＴＮＦ−αの有害効果が明らかになったが［１７、１８］、これには、その同族受容体との直接的な相互作用［１８、２１、２２］およびＦａｓ受容体の間接的な上方制御［８−１０］の両方が介在する。全てのこれらの研究において、エクスビボで様々なサイトカインおよびケモカインとともに、ＴＮＦ−α受容体とのクロストークによる誘導性Ｆａｓ発現［１２、１６、１８］を含む劇的な表現型および機能変化が付随する条件［２３］で、様々な時間にわたり細胞を培養した。細胞機能の変化は、ホーミング障害、細胞周期の誘導および生着潜在力の喪失を引き起こす、ＴＮＦファミリー受容体の有害効果に原因があるとされている［２４−２７］。これらのデータから、ＦａｓおよびＴＮＦ受容体の中和が、移植片対宿主病においてこの経路が関与するため、特に移植の設定において造血細胞機能にとって有益であり得ることが示唆される。
【００２１】
一方で、レシピエント骨髄へのホーミングおよびそこでのシーディング後すぐにドナー細胞においていくつかのＴＮＦファミリー受容体の急激な上方制御が観察される。殆どの原始造血幹細胞および前駆細胞は、ストレス条件下でＦａｓ［２８］、ＴＮＦ［２９］および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体［３０］をユビキタスに上方制御する。これらの受容体の生理学的意義は、Ｆａｓ［３１］およびＴＮＦ受容体［２９］を欠く前駆細胞の生着および長期再構成能の欠損により強調されている。
【００２２】
細胞活性は、不可逆的な負の制御の主要機序である、活性化および死の機序によって厳密に制御される。細胞生存能を調節するアポトーシス機構は、全ての細胞で発現される、よく保存されている経路であるが、幹細胞および前駆細胞は、受容体介在性アポトーシスに対して殆ど耐性である。移植後にＴＮＦファミリー受容体の発現を上方制御するマウス造血前駆細胞は、アポトーシスシグナル伝達に対して殆ど非感受性であることが明らかになっている［２８、２９］。これらのデータは、Ｆａｓ（検討中）、ＴＮＦ−Ｒ１［３２］およびＴＲＡＩＬ−Ｒ１［３０］が介在するアポトーシスに耐性がある、臍帯血（ＵＣＢ）および動員末梢血（ｍＰＢ）由来のヒト前駆細胞にまで拡大されている。
【００２３】
当技術分野と対照的に、本発明は、移植細胞の少なくとも一部を活性化することによる、移植の結果を改善するための移植前のＴＮＦスーパーファミリーのリガンドへの造血幹細胞および前駆細胞の曝露に関する。理論により縛られることを望むものではないが、この効果は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体が介在する栄養刺激を含む。Ｆａｓ−リガンド、ＴＮＦ−aおよびＴＲＡＩＬに対する受容体のそれぞれ１つまたはそれらの組み合わせの活性化により、量的および質的造血再構成が促進される。エクスビボでのＴＮＦスーパーファミリー受容体の移植前活性化は、インビボでの前駆細胞のその後の挙動の調整能を有しており、早期造血再構成を促進し、移植前の期間および活性化される受容体のタイプに従い特定の細胞系列を育成する。性質、リガンド濃度、組み合わせ、曝露時間は、移植片の供給源、抗原不同性、ドナー接種材料のサイズ（前駆細胞数）、レシピエントの状態および特定の設定における見込まれる病的状態に従い、様々に設定される。リガンドの適用によって、受容体をそれらの活性化前に、またはそれと同時に上方制御し得る。
【００２４】
したがって、その態様の第一において、本発明は、幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）移植を必要とするレシピエントにおいて幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）の生着を促進する方法であって、
ａ．ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料をＴＮＦスーパーファミリーまたはそれらの何れかの断片もしくは誘導体のうち少なくとも１つのメンバーとエクスビボで接触させ；
ｂ．前記接触段階（ａ）の後、前記ＳＰＣを前記レシピエントに移植することを含み、
移植されたＳＰＣが、生着向上を示す、
方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、移植の方法における使用のための細胞の集団であって、前記細胞が、生着特性が向上している幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）であり、前記生着特性が向上しているＳＰＣの集団が、ＳＰＣの集団を含む、ドナーから得られた生体試料をＴＮＦスーパーファミリーまたはそれらの何れかの断片もしくは誘導体のうち少なくとも１つのメンバーとエクスビボで接触させることによって得られる、細胞の集団を提供する。
特定の実施形態において、このＳＰＣは造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「幹細胞および前駆細胞（ＳＰＣ）の生着を促進する」という句は、細胞移植の効率、品質もしくは迅速性の改善または、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーによるインビトロ曝露および細胞の活性化の結果であり得る量的および質的造血再構成の加速に関する。例えば、生着促進は、骨髄系、リンパ系、血小板または赤血球系再構成または活性を向上させることを含む。細胞生着を評価するための方法には、例えば、下記で詳述するような、細胞遊走および他のインビトロ技術ならびに生体試料の組織学的、免疫学的および／または放射線学的評価（例えば血液試料）が含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「エクスビボ」という用語は、生体試料の形態の、生きている生命体（好ましくはヒト）から取り出された細胞が維持され、場合によっては生命体の外部（例えば試験フラスコ中）で増殖させられる過程を指す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「細胞の集団」という句は、細胞の、単離された均一または不均一集団を指す。「ＳＰＣまたはＨＳＰＣの集団」は、それぞれ幹細胞および前駆細胞または造血幹細胞および前駆細胞の、単離された均一または不均一集団を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「幹細胞および前駆細胞」という用語は、組織または身体において細胞塊を生成させるのに寄与する最も早期の再生可能細胞集団および幾分分化が進んでおり、まだ決定が起こっておらず、最も早期の再生可能細胞集団超初期の一部になるように容易に戻すことができる、非常に早期の前駆細胞を指す。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「造血幹細胞および前駆細胞」という用語は、全ての血液細胞系列を生成させるのに関与する幹細胞および前駆細胞血液細胞を指す。
【００３１】
ある一定の実施形態において、幹細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−または当技術分野で公知の他の幹細胞マーカーなどの幹細胞マーカーによって同定することができる。
【００３２】
ＳＰＣの供給源は、臍帯血（ＵＣＢ）、動員末梢血（ｍＰＢ），または骨髄であり得る。すなわち、特定の実施形態において、ＳＰＣまたはＨＳＰＣの集団を含む生体試料は、臍帯血（ＵＣＢ）、動員末梢血（ｍＰＢ）または骨髄からなる群から選択される。
【００３３】
移植のための細胞の調製の方法は、当技術分野で周知である。滅菌手順を用いて組織（例えば臍帯血および骨髄穿刺）を採取する。移植のために調製した細胞を生理溶液中で維持するか、または懸濁液中もしくは固定基質上で培養することができる。細胞を支持することが可能な適切な培養液としては、ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などが挙げられる。必要に応じて、培地は、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル、トランスフェリンなどの、細胞代謝に必要とされる補助剤を含有し得る。培地は、酵母、細菌および真菌による混入を防ぐために、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質も含有し得る。培養において、条件は生理学的条件に近いものであるべきである（好ましくは約６から約８のｐＨおよび約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃の温度）。
【００３４】
当技術分野で公知の何らかの方法に従い、臍帯血（ＵＣＢ）から細胞を入手し得、例えば正常な満期産（インフォームドコンセント受領後）後にＵＣＢから細胞を得る。例えばＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １９９５；９２（２２）：１０１１９−１０１２２）に従い、分娩後２４時間以内に、試料を回収し、凍結し得る。使用前に、２．５％ヒト血清アルブミンを含有するデキストラン緩衝液中で細胞を凍結融解し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上に重ね、８００ｘｇで３０分間遠心し得る。界面層中の単核細胞を回収し、０．５％ＨＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し得る。
【００３５】
生体試料を新たに回収、保存または凍結保存し得る。新鮮なまたは培養した細胞調製物は、それらが必要とされるまで、当技術分野で公知の何らかの方法によって凍結保存し得る。特定の凍結保存剤を含有する当張液、好ましくは細胞培養液中で細胞を懸濁し得る。このような凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが挙げられる。移植のための細胞の調製および保存のためのさらなる方法が当技術分野で公知であり、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＫｉｐｓｈｉｄｚｅおよびＳｅｒｒｕｙｓ，ｅｄｓ．Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００４）で詳細に開示されている。
【００３６】
特定の実施形態において、前記の生着促進は、骨髄系、リンパ系、血小板または赤血球系再構成または活性を上昇させることを含む。
【００３７】
「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー」は現在、ヒトでは１９個のリガンドおよび２９個の受容体からなり、３個のさらなるＴＮＦスーパーファミリー受容体がマウスで同定されている。殆どのＴＮＦリガンドは、可溶性サイトカインを生成させるために特異的なメタロプロテイナーゼによって細胞外ドメインが切断され得るＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦスーパーファミリーリガンドに対する受容体は、オリゴマー、Ｉ型またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーとしては、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＥＤＡ／エクトジスプラシン、ＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１、ＥＤＡ−Ａ２／エクトジスプラシンＡ２、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン、リンホトキシンｂｅｔａ／ＴＮＦＳＦ３、リンホトキシン−ａｌｐｈａ／ＴＮＦ−ｂｅｔａ、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２が挙げられる。
【００３８】
このファミリーにおける全ての受容体およびリガンドは、顕著な構造相同性（〜８５％）を示す。しかし、別個の活性末端は、ファミリー内での交差活性化なく、同族受容体へのリガンドの選択的な結合を媒介する。ＴＮＦは２個の同族受容体を有し、ＴＲＡＩＬは４個の膜結合型受容体および１個の可溶性受容体を有し、これらの３個（可溶性のものを含む。）は、シグナル伝達なくリガンドに結合するデコイ受容体であると考えられる。ＴＮＦファミリー内で、Ｆａｓはアポトーシスの共通の実行体であると考えられ、Ｆａｓは、ファミリーの他のメンバーと比較して、いくつかの別個の特徴を呈する［１、２］。Ｆａｓの活性化は、受容体三量体化を必要とし、したがってＦａｓＬの活性アイソフォームは、生理的条件下で膜結合性であり、薬理学的使用のためには、オリゴマーを生成させるために結合を必要とする。ＦａｓＬの可溶性アイソフォームは、三量体化のないＦａｓのライゲーションがアポトーシスシグナル伝達を阻止するので、抗アポトーシス活性を有する。
【００３９】
特定の実施形態において、ＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）からなる群から選択される。
【００４０】
特定の実施形態において、前記の生体試料はＵＣＢであり、前記の段階（ａ）の接触は約１８時間から約４８時間にわたる。
【００４１】
別の特定の実施形態において、前記の生体試料は骨髄であり、前記の段階（ａ）の接触は約１２時間から約３２時間にわたる。
【００４２】
別の特定の実施形態において、前記の生体試料はｍＰＢであり、前記の段階（ａ）の接触は約３時間から約１８時間にわたる。
【００４３】
特定の実施形態において、約１０ｎｇ／ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＴＮＦ−α、および／または約１０ｎｇ／ｍｌから約５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＦａｓＬおよび／または約５００ｎｇ／ｍｌから約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＴＲＡＩＬとともにＳＰＣを温置する。
【００４４】
特定の実施形態において、何らかのさらなるサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子なく、ＴＮＦスーパーファミリーまたはそれらの何れかの断片もしくは誘導体のうち少なくとも１つのメンバーとともにＳＰＣを温置する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーの「断片または誘導体」という用語は、上記で定められるとおりの生着向上に関して完全なタンパク質の活性を保持する、タンパク質の何らかの部分に関する。
【００４６】
特定の実施形態において、前記のＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは表面、例えばビーズに結合されている。結合はリンカーを介するものであり得る。
【００４７】
特定の実施形態において、前記のＴＮＦスーパーファミリーの少なくとも１つのメンバーは、ＴＮＦαおよびＦａｓＬの組み合わせである。
【００４８】
下記の実施例で明らかにされるように、ＴＮＦファミリーのリガンドへのマウス骨髄由来前駆細胞の移植前曝露によって、限界希釈条件下でレシピエント生存が改善した。さらに、リガンドのそれぞれ１つでの前駆細胞の活性化によって、実質的に量的および質的造血再構成が改善された。これらのデータから、（ＴＮＦファミリーのリガンドへの曝露を介した）ＴＮＦファミリー受容体のマウス前駆細胞活性化能および照射を受けたマウスをレスキューするための早期生着促進能が明らかになる。
【００４９】
移植前のＴＮＦファミリーリガンドへの移植前曝露によって、ヒトＵＣＢおよびｍＰＢ細胞の量的生着が改善される。ＳＣＩＤ再構成細胞（ＳＲＣ）は、ヒト再構成細胞（ＨＲＣ）に関連する、ヒト細胞に対する最も信頼できる代替アッセイと考えられる。しかしヒト細胞試料間での幅広い変動性および個々のマウスにおける生着の生物学的変動性は、このアッセイの大きな欠点である。さらに、サイトカインおよび増殖因子の部分的マウス−ヒト適合性の条件下でヒト細胞が発生する。したがって、比較的多数のヒト試料（６５ＵＣＢ単位）を用いて、それぞれ１つを３から７レシピエントに移植して、生着におけるデスリガンドの影響の比較分析を行った。下記の実施例で示されるように、ＴＮＦファミリー受容体の移植前活性化の結果、新鮮なＵＣＢ細胞および凍結保存されたｍＰＢ試料の優れた量的生着が得られた。全体的に、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドへのヒト細胞の移植前曝露によって、ＳＣＩＤ異種キメラにおいて量的ヒト細胞生着が改善される。
【００５０】
ＴＮＦファミリーリガンドへの移植前曝露によって、ヒトＵＣＢおよびｍＰＢ細胞の質的生着が調整される。Ｂリンパ球および骨髄系細胞は、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト前駆細胞から発生する第一のヒト細胞系列である。実施例で示されるように、Ｂリンパ球の分画が増強され、ＴＮＦファミリーリガンドとともに温置されたＵＣＢ細胞のレシピエントにおいて優れた骨髄系生着が明らかになった。したがって、量的生着改善は、早期生着および前駆細胞の機能促進の結果である。さらに、ＴＮＦファミリー受容体の移植前活性化の時間によって、造血前駆細胞機能の質が調整される。
【００５１】
ＴＮＦ受容体のライゲーションを通じた造血前駆細胞の活性化は、マウスおよびヒト細胞において共通の経路として進展する。実施例で明らかにされるように、優れた量的および質的生着により強調されるように、活性化はインビボで持続する。この証拠から、ＴＮＦスーパーファミリー受容体の活性化が介在する、生着促進および早期前駆細胞活性が指摘される。
【００５２】
臍帯血は、骨髄および動員末梢血と比較して、造血前駆細胞の豊富な供給源である。１０７個のｍＰＢ細胞と比較して、ＵＣＢ細胞を移植したマウスにおいてヒトキメラ現象が優れたレベルであることにおいて、ＳＲＣが高頻度であることがはっきりと表れている。臍帯血移植の主要な制約は、前駆細胞数が少なく、生着速度が遅いことである。ＵＣＢ前駆細胞は、それらのナイーブで原始的な性質のため、かつ骨髄間質との相互作用における先行経験がないために、活性の惹起が遅い。耐久性のある多細胞系列ヒト造血再構成に介在するのは、骨髄で生着した前駆細胞のみである。本発明は、両制約に影響を及ぼす能力：より早期の生着および量的再構成改善能を有する。
【００５３】
本発明は、あらゆるタイプ、すなわちドナー細胞の異なる供給源および様々なレシピエント条件からの移植における使用に適切である。潜在的な合併症が移植前に推定され得ることが多く、これにより、移植片の移植前調整は臨床的に意義がある。生着までの時間は移植の重要なパラメーターの１つであり、感染症への感受性に著しい影響を及ぼし得、無形成、出血および血小板回復前に処置することができない静脈閉塞性事象の期間中に輸血を行う必要がある。
【００５４】
ＴＮＦファミリー受容体ライゲーションを通じた前駆細胞の移植前活性化後、Ｇ−ＣＳＦの移植後投与がドナー細胞生着を促進することにおいてより有効であることが企図される。
【００５５】
動員末梢血は、腫瘍学的な移植において幅広い用途がある細胞の到達可能な供給源であり、これは成熟ドナーＴ細胞が介在する致死の可能性があるＧｖＨＤにより制限される。アポトーシス感受性Ｔ細胞の機能阻害によるＧｖＨＤ重症度の軽症化［３６、３８］に加えて、提案されるアプローチは、生着を向上させることによって移植片対腫瘍反応性に影響を与えると思われる。移植中の免疫抑制期間は、腫瘍細胞の増殖が制限されなくなるので危険である。
【００５６】
前駆細胞活性化の真の性質は、二次移植実験により強調される。前駆細胞活性化により課せられる疑問の１つは、それが、短期および長期造血再構成能が与えられる前駆細胞の分化により消退を引き起こすか否かである。Ｂリンパ球および骨髄系子孫細胞の増加には、一次ＳＣＩＤレシピエントの骨髄における細胞系列陰性細胞の相反的な減少が付随した。しかし、一次レシピエントにおける優れた量的再構成とともに、連続的な二次レシピエントの再構成も改善された。理論により縛られることを望むものではないが、これらの結果から、消退ではなくむしろ前駆細胞活性化によってＴＮＦファミリー受容体が生着を改善することが示される。
【００５７】
前に示されるように、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）などの刺激因子との相乗作用を通じて、クローン形成活性に関与するよう前駆細胞を誘導する［２９、３０］。これらのシグナルにはマウス細胞においてＦａｓ、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（唯一のマウスＴＲＡＩＬ受容体）が介在する［２９−３１］。一貫して、培養中に構成的に存在するリガンドの栄養シグナルは、ヒトＵＣＢおよびｍＰＢ試料の活性化を刺激するために増殖因子と協同する［３６、３８］。これらのシグナルには、最初に、Ｆａｓの正の影響がより小さいＴＮＦ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ１が介在する。同時に、ＴＮＦファミリーリガンドは、最終的に分化した子孫細胞において負の制御因子として作用し、コロニーサイズを縮小させるが、個々の受容体間で顕著な変動がある［２９−３１］。ヒト細胞のこれらの代理アッセイのある重要な制約は、コロニー発生におけるアポトーシス細胞の負の影響であり、これは、デスリガンドによる感受性細胞でのアポトーシスの誘導により悪化する［２９、３２］。したがって、精製した前駆細胞を用いて培養が開始される場合でさえも、分化した子孫細胞がアポトーシスに感受性になるので、培養におけるリガンドの真の栄養効果は、内因子により過小評価となる。
【００５８】
本発明による幹細胞および前駆細胞活性化の機序は、一次レシピエントの骨髄から回収された細胞の骨髄系コロニー数の増加によって実証される。移植１２週間後でさえも、ＴＮＦ−αで前処理した細胞のレシピエントにおいてクローン形成活性が上昇した。このインビトロアッセイは、インビボでの骨髄系活性促進と一致し、これによってインビボでの骨髄系活性促進が正しいことが確認される。したがって、ＴＮＦスーパーファミリー受容体を通じた移植前の前駆細胞活性化は、移植後の結果を維持している。
【００５９】
インビボで観察されるＴＮＦファミリー受容体ライゲーションの結果を検証するために、インビトロクローン形成アッセイを行った。半固形メチルセルロース培養におけるクローン形成活性は、ＳＣＩＤ再構成細胞と比較した場合、より決定が進んだ前駆細胞サブセットの活性を反映し、これはＳＣＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦなどの増殖因子によって刺激される。クローン形成アッセイによって、主に、ＵＣＢおよびｍＰＢ細胞のＴＮＦファミリーリガンドとの短期温置後の活性促進が確認される。これらのデータから、ＴＮＦファミリー受容体による、決定が起こった造血前駆細胞の刺激が明らかになる。重要なことは、ここで行ったクローン形成アッセイでは、相当な数の死細胞が培養中に含まれたので、ＴＮＦファミリー受容体の真の誘導性効果が過小評価される、ということである。死細胞の存在は、セモイソリッド（ｓｅｍｏｉｓｏｌｉｄ）培養においてクローン形成活性を実質的に阻害する［３２］。これらのアッセイは、直接的な栄養効果を明らかにしており、死細胞の除去により達成される生存可能な集団内での前駆細胞頻度の増加とは異なる［３３、３４］。
【００６０】
分化した造血細胞は、成熟の過程に沿ってアポトーシスシグナル伝達に対する感受性を獲得し、ＴＮＦファミリー受容体が負の制御の主要なホメオスタシス機序になる。これは、培養中でのデスリガンドの存在下でのコロニーサイズ縮小から明らかであった［２９−３２］。しかし、下記の実施例で示されるように、ＴＮＦ−αの誘導性活性は、ｍＰＢ前駆細胞の予備活性化後の大きなコロニーサイズにおいて明らかであった。リガンドは培養中に存在せず、したがって分化した子孫細胞において負の制御を課さなかった。
【００６１】
下記の実施例で示されるように、ＴＮＦファミリーリガンドとの短期温置期間の終了時の分析によって前駆細胞の特徴の一部が明らかになった。受容体の活性化は、有糸分裂的に静止状態の細胞の分画に影響しなかった。これらの細胞はＳＲＣサブセットを含有する［２４−２６］。さらに、受容体の活性化は、ＣＤ３４＋および細胞系列陰性ＵＣＢ前駆細胞の増殖を誘導しなかった。これらのデータから、ＴＮＦファミリー受容体が、それらの数の増幅または増殖の誘導なしで前駆細胞活性を活性化することが明らかになる。
【００６２】
従来の定説［８−１０、１７−２２、２７］とは対照的に、造血前駆細胞生存能および機能においてＴＮＦファミリー受容体の活性化が有害な結果を有しないことが強調される。造血細胞機能におけるＴＮＦファミリー受容体の有害効果を報告する先行試験は、増殖因子および補助ケモカインの補給ならびにそれらの消退によってインビトロで前駆細胞を刺激した［１２、１３、１６−２１、２７、３５］。本発明で示されるように、臨床背景を模倣するために実験を設計し、移植前に前駆細胞を刺激せず、補助ケモカインを補給しなかった。先行技術とは対照的に、本発明の発明者らは、前駆細胞におけるＴＮＦ受容体活性化の顕著な栄養活性を見出した。このデータから、受容体介在性シグナル伝達が、栄養経路を誘導し、これが、持続性の活性化を伝達し、続く前駆細胞機能を支配することが示される。
【００６３】
下記で示されるように、各受容体が新鮮なＵＣＢ細胞のごく一部で発現されるにもかかわらず、前駆細胞のおよそ５０％が受容体のうち１つを通じたシグナル伝達に反応する。ヒト細胞における栄養受容体は、ＴＮＦ−Ｒ２の未知の活性があるＴＮＦ−Ｒ１［３２］およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の拮抗性活性があるＴＲＡＩＬ−Ｒ１である［３０］。
【００６４】
本発明は、次の要素を考慮する：ａ）活性化の標的受容体、ｂ）リガンドの濃度、ｃ）前駆細胞活性化を達成するための受容体ライゲーションの持続時間、ｄ）受容体発現の調整およびｅ）適用されるリガンドの組み合わせ。
【００６５】
下記の非限定例から、Ｆａｓ、ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬ受容体の活性化が示される。これらの受容体のそれぞれ１つは、造血前駆細胞において栄養活性を示す。マウス細胞において、リガンドの最適濃度で３個の受容体の活性化の同様の結果がある。相違において、ＵＣＢおよびｍＰＢ起源の両方のヒト細胞において、ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ１は、活性誘導においてＦａｓよりも強力である。ヒト前駆細胞活性化に対するリガンドの有効濃度は、ＦａｓＬが１０から５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αが１０から２０ｎｇ／ｍｌおよびＴＲＡＩＬが５００から１５００ｎｇ／ｍｌ（１から５ｘ１０７個細胞／ｍｌの懸濁液濃度）の範囲である。
【００６６】
リガンドに対する曝露の持続時間は異なる。ＵＣＢ細胞は、１８から４８時間にわたり温置し、骨髄細胞は１２から３２時間、ｍＰＢは３から１８時間にわたり温置する。栄養シグナル伝達に対する温置時間は様々であり、一般には前駆細胞の機能的な負の選択に対する曝露時間よりも長い。ヒト細胞の移植前温置時間は、これらの細胞が培養中に受ける劇的な表現型変化およびエクスビボ培養３日後の生着能の喪失により制限される。下記の実施例で示されるように、エクスビボ培養７２時間後のＵＣＢ前駆細胞の生着能の喪失は、ＴＮＦファミリー受容体が介在するアポトーシスシグナル伝達と独立している。したがって、一般的な目的は、最小限まで培養時間を短縮することである。上記で詳述されるように、温置の時間も、リンパ系および骨髄系分化の選択的誘導を決定する。
【００６７】
ＴＮＦファミリーリガンドの組み合わせの使用により、移植前温置条件の構成を目的に合わせて個別化することができるようになる。あるこのような組み合わせがＦａｓＬおよびＴＮＦ−αに対して与えられ、これは各リガンド単独と同様の栄養活性を示す。
【００６８】
アポトーシスに対する前駆細胞の耐性によって、受容体発現の調整によりＴＮＦファミリーリガンドの様々なメンバーに対する反応性のパターンを調整することができるようになる。例えば、ＦａｓおよびＴＮＦ受容体を同族リガンドの適用前または適用と同時にインターフェロン−γにより上方制御し得る。受容体発現パターンの調整によって前駆細胞の反応を減弱させることが可能である。いくつかのリガンドを使用することによって、生着を促すためのアプローチとして、様々な移植設定下の様々な供給源からの細胞の前処理においてある程度の柔軟性がもたらされる。特に、ＴＮＦファミリー受容体とリガンドとの間に交差反応性はなく、各分子はその同族受容体に限定される。
【００６９】
同族リガンドによる直接的活性化以外に、誘導性クロストークは、様々な受容体の性質を向上させる。下記の実施例で示されるように、Ｆａｓ発現におけるＴＮＦ−αの特徴がよく分かっている誘導性効果［８、１２］には、両ＴＮＦ受容体が介在する。さらに、さらなる誘導性相互作用が明らかになった：ＦａｓはＴＲＡＩＬ−Ｒ１の発現を誘導し、ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方の発現を誘導する。受容体クロストークの機能の結果には、Ｆａｓクロスリンクに反応してＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現する前駆細胞の増殖の誘導ならびにＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒ２を同時発現する細胞のさらなるアポトーシスが含まれる。しかし、ＦａｓおよびＴＮＦ−Ｒ１またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１の同時発現は、アポトーシスに対する感受性を向上させない。実際に、ＣＤ３４＋ＵＣＢ前駆細胞の〜４０％におけるＦａｓのＴＮＦα−誘導性発現およびＦａｓＬによるクロスリンクは、半固形培養において骨髄系前駆細胞の刺激を弱めない。要するに、下記で与えられるデータは、造血前駆細胞におけるアポトーシスシグナル伝達とは関係がない、ＴＮＦファミリー受容体間での顕著なクロストークを強調する。
【００７０】
異なるリガンドでは影響が異なるため、様々な供給源からの造血細胞の特定のサブセットに対して様々な結果を得るために混合物を使用する可能性が出てくる。しかし、移植関連の検討事項の一部の例としての、ドナー−レシピエントＨＬＡミスマッチの程度、ＡＢＯ不適合性、移植に利用可能な細胞および前駆細胞の絶対数（５ｘ１０６個ＣＤ３４＋細胞／ｋｇのおよその閾値で）、活動性悪性疾患（急性転化）対微小残存病変（１：１０，０００悪性細胞）および完全寛解、好中球減少症およびリンパ球減少症の移植後の期間中に再活性化され得る既存の感染症（例えばＣＭＶ、ＥＢＶ、水痘、ヘルペス）、進行中の慢性ＧｖＨＤ（例えば以前の移植失敗後）、急性ＧｖＨＤ（例えばハプロタイプ一致移植）の脅威、生着に対する宿主耐性（例えばファンコニー貧血）など、他の検討事項が、決定されたリガンドの最適の組み合わせに影響を与え得る。主に骨髄系（例えば関節リウマチ）またはリンパ系細胞（例えば１型糖尿病、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、炎症性腸疾患）の異常が原因であるものであり得る自己免疫障害に同様の基準が適用される。
実施例
実施例１：デスリガンドに対するマウス骨髄のエクスビボ曝露によって前駆細胞機能が促進される。
【００７１】
この実施例は、マウス骨髄由来前駆細胞生着に対する移植前のＴＮＦファミリー受容体活性化の影響を明らかにする。培地中およびデスリガンドの存在下での１８時間の温置後、８５０ｒａｄ  ＴＢＩで前処置したレシピエントマウスに１．５ｘ１０５個の細胞系列陰性同系（ＣＤ４５．１→ＣＤ４５．２）前駆細胞を移植した。バルク細胞温置には前駆細胞のクローン形成活性を減少させる死細胞の内容物が混入しているので［２９、３１］、限界希釈移植前に単離した細胞系列陰性前駆細胞をデスリガンドに曝露した。細胞の境界数、すなわち１．５ｘ１０５個の同系骨髄由来ｌｉｎ−前駆細胞の移植により、マウスの〜５０％の生存率が与えられる。１８時間にわたりＴＲＡＩＬ（図１Ａ）、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−α（図ＩＢ）で予め刺激した１．５ｘ１０５個のｌｉｎ−前駆細胞の移植の結果、実質的に改善され優れた生存率が得られた。さらに、Ｆａｓ受容体発現を誘導するためのＴＮＦ−αへの同時曝露およびＦａｓＬとの受容体クロスリンクの結果、限界希釈移植において同等の優れた生存率が得られた（図１Ｂ）。これらのデータは、デスリガンドでのマウス骨髄細胞の短時間の移植前刺激が、限界希釈条件下での生存率改善度に対して生理学的に意義があることを強調する。
【００７２】
いくつかの可能性のある機序の中でも生着における受容体活性化の誘導性効果を検証するために、混合キメラにおいてドナー細胞発生をモニタリングした。デスリガンドのうち１つおよびＴＮＦ−αおよびＦａｓＬの組み合わせの何れかに予め曝露した細胞のレシピエントは、移植３週間後でドナーキメラ現象のレベル上昇を示した（図１Ｃ）。混合キメラにおける子孫細胞におけるデス受容体活性化の誘導性効果を改良するために、骨髄前駆体の子孫細胞を免疫表現型で分けた。骨髄系生着は移植３週間後に安定であり、これはほぼ確実にこれらの移植条件下での飽和値により引き起こされる（図１Ｄ）。相違において、リンパ球区画は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方の中程度の減少およびＢリンパ球の顕著な増加を示した。Ｂ細胞は移植後に発生する最初のリンパ系細胞系列であるので、これらのデータは前駆細胞機能における受容体活性化の誘導性効果を明らかに示す。
実施例２
デスリガンドへのＵＣＢ細胞の移植前のエクスビボ曝露は生着を促進する。
【００７３】
ＵＣＢ細胞の著しい制約は、前駆細胞数が少ないことおよびこれらの骨髄経験がない細胞の生着速度が遅いことである。新鮮な臍帯血単位を培地（ケモカイン補給なし）中で、および５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１，５００ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬとともに様々な時間（１から３日間）にわたり温置した。２５μｇ／ｇブスルファンを２回投与して前処置した免疫不全ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに同数の最初の細胞を移植した。比較のために、新鮮なものまたは培地温置したものとしての両方で、デスリガンドへの曝露後に、同じＵＣＢ単位からの細胞を移植した。マウス骨髄において移植１２週間後に読み取りを行った（図２Ａ）。９個の臍帯単位からの移植実験のまとめ（各臍帯単位は、３実験群中の３から６匹のマウスの移植用となる。）から、培地単独と比較して、２４から４８時間にわたるＦａｓＬ、ＴＮＦ−αおよびＴＲＡＩＬでの移植前曝露後にキメラ現象の上昇傾向が示された（図２Ｂ）。マウス骨髄におけるヒトキメラ現象の例証的な測定をＴＮＦ−αとの予備温置に対して示す。ストレプトアビジンが結合したメタロプロテイナーゼ切断部位欠失ＦａｓＬの短縮アイソフォームにＵＣＢ細胞を予め曝露した場合に同様の結果が得られた［２８、３１、３７］。しかし重要なこととして、ＴＮＦαは、Ｆａｓ受容体発現を誘導する（下記参照）が、ＦａｓＬとの同時温置は、ヒト異種キメラ現象の促進を弱めない。２日間を超えてＵＢ細胞を温置すると、リガンドの存在に関係なく、生着効率が顕著に低下する。これらのデータから、ＴＮＦスーパーファミリーのデスリガンドへの移植前曝露により誘導される量的ＵＣＢ細胞生着促進が明らかになる。
実施例３
デスリガンドへのＵＣＢ細胞の移植前曝露は質的骨髄系再構成を促進する。
【００７４】
臨床背景における生着までの時間は、感染に対する感受性低下に関連する、末梢循環における顆粒球の安定した存在から決定される（＞５００個細胞／ｄｌ）。インビボでのＵＣＢ前駆細胞に対するデスリガンドの影響を評価するために、マウス骨髄におけるヒト造血細胞系列を評価した。ＴＮＦαで予め処理した細胞に対して、ヒト細胞ではゲートにおいてＢリンパ球子孫が主であり、Ｔ細胞発生が少し存在することを示す例が示される（図３Ａ）。図２Ａで示される条件に従い、マウスに移植した。移植前のデスリガンドへのＵＣＢ細胞の予備曝露によって生着パターンが調整され、骨髄性単球子孫が増加し（ｐ＜０．０５）、Ｂリンパ球キメラ現象が増加するが、これは、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて発生する、最初のヒト造血細胞系列である（ｐ＜０．０１、図３Ｂ）。ヒト前駆細胞活性の誘導は、マウス骨髄における細胞系列陰性ヒト細胞数の相反する減少と一致していた（ｐ＜０．００５）。特に、ＵＣＢ細胞の温置４８時間後に最も顕著な誘導性効果が観察され、インビボで１２週間の長期生着中、持続した（図３Ｃ）。これらのデータから、デスリガンドによる移植前誘導後のインビボでの早期ヒト骨髄系およびＢリンパ球前駆細胞活性の促進が明らかになる。ＳＣＩＤ再構成細胞（ＳＲＣ）は、短期ヒト再構成細胞の活性と最良に相関すると考えられる。
実施例４
前駆細胞活性促進は二次的再構成を改善する。
【００７５】
ＳＣＩＤ再構成細胞の活性化は、ヒト前駆細胞の消退を引き起こし、生着の耐久性を減じ得る。しかし、２４および４８時間にわたるＴＮＦ−αへの予備曝露によって移植１２週間後でのマウス骨髄中のヒトＣＤ３４＋細胞の絶対含量が、対照培地と比較して、それぞれ３４±３０％（有意でない。）および２１％±２４％（有意でない。）増加した。したがって、二次レシピエントでの生着の機能アッセイにおいて、一次レシピエントにおいて生着したヒト細胞をさらに評価した。図１Ａで示される条件に従い、一次レシピエントを移植した。第一段階において、一次レシピエントの骨髄内容物の二次レシピエントへの移植によって、耐久性のある再構成に関与する前駆細胞におけるＴＮＦ−αの影響を調べた。移植１２週間後に、培地中でおよびＴＮＦαとともに２４時間にわたり予備温置したＵＣＢ細胞の一次レシピエントの大腿骨の細胞内容物の半分を二次ブスルファン前処理ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに移植した。ＴＮＦαとともに予備温置した細胞の一次レシピエントの大腿骨内容物の半分には３．２±１．４ｘ１０５個のヒトＣＤ３４＋細胞が含有され、一方で２４時間にわたり培地中で予備温置したものは、５．３±３．１ｘ１０５個のヒトＣＤ３４＋細胞を含有した（有意でない。）。１２週間後に骨髄においてヒト異種キメラ現象を測定した（各群６匹マウスにおいて３ＵＣＢ単位）。二次ＮＯＤ．ＳＣＩＤレシピエントへの大腿骨内容物の半分の移植によって、ＴＮＦ−αへの予備曝露後のヒトキメラ現象のレベル上昇が示され（ｐ＜０．０５、図４Ａ）、ヒト前駆細胞に対するサイトカインの有害効果がないことが検証された。第二段階において、インビボでの骨髄における骨髄系表現型の明らかな増加をインビトロでヒトサイトカインにより刺激したメチルセルロース培養においてさらに評価した。ヒトＳＣＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦで刺激した半固形メチルセルロースアッセイにおいて、実験終了時に一次レシピエントの骨髄由来の同数のＣＤ３４＋ヒト前駆細胞を評価した。２４時間（ｎ＝６から３ＵＣＢ単位）および４８時間（ｎ＝７から３ＵＣＢ単位）にわたり予備温置したＵＣＢ細胞のレシピエントのコロニーを、培地中で予備温置した細胞のレシピエントで測定したクローン形成活性に対して正規化した（正規化）。２４および４８時間にわたるＴＮＦ−αへの曝露後の骨髄系クローン形成活性の上昇が明らかになった（図４Ｂ）。前駆細胞数の増加および骨髄系再増殖促進により、ＴＮＦ−α（例証的なリガンドとして）へのエクスビボ曝露により増大させられるＵＣＢ前駆細胞の効果的な自己再生が指摘される。
実施例５
ＵＣＢ細胞予備温置の影響の特徴
【００７６】
次の段階において、発明者らは、移植前温置およびＴＮＦファミリーリガンドへの曝露中にＵＣＢ細胞の特徴の一部の評価を行った。ＵＣＢ細胞におけるリガンドの影響は、同族受容体の発現に依存する。培地中で４８時間にわたり温置されたＵＣＢ細胞において、全ての受容体が比較的低レベルで発現され、ＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬの影響は変動する（図５Ａ）。ＴＮＦ−αの影響を下記で詳述する。リガンドのうち何れか１つへの曝露では増殖が誘導されず、液体培養中のバルク細胞系列陽性ＵＣＢ細胞と比較して、ＣＤ３４＋および細胞系列陰性前駆細胞の周期は遅い（図５Ｂ）。同様に、リガンドは周期相に影響を与えず、細胞系列陰性前駆細胞のうちおよそ５０％がＧ０／Ｇ１期であることが分かり、一方で、ＣＤ３４＋前駆細胞のうち有糸分裂的に静止状態であるものはごく僅かである（図５Ｂ）。ＳＲＣ（およびヒト再構成細胞）活性が有糸分裂的に静止状態の前駆細胞のサブセットに限定されるので、このパターンは生着保持および促進と一致する［２４−２６］。
実施例６
デスリガンドへのＵＣＢ細胞の曝露は半固形培養中で骨髄系前駆細胞活性を促進する。
【００７７】
ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦで刺激した半固形メチルセルロース培養において、骨髄系前駆細胞活性に対する、ＴＮＦファミリーリガンドとのＵＣＢ細胞予備温置の影響をさらに調べた（図６Ａ）。ＵＣＢ細胞を１から３日間にわたり５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１，５００ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬに曝露した。前駆細胞刺激を調べるために、生存能に関わりなく（すなわち死細胞を排除しない。）、同数の総予備温置細胞を半固形メチルセルロース培養に入れた。顆粒球−マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）および幹細胞因子（ＳＣＦ）で培養物を刺激した。４８時間にわたる全リガンドへのＵＣＢ細胞の曝露は、新鮮な細胞および対照培地中での温置と比較して、半固形培養において骨髄系前駆細胞活性を刺激した（図６Ｂ）。比較分析のために、新鮮試料または対照として、およびリガンドへの曝露後に、同じＵＣＢ試料を入れた。ある例外は、ＳＲＣ活性の顕著な低下にもかかわらず、ＴＲＡＩＬでの温置７２時間後にクローン形成活性が促進されたことであった（図２Ｂ）。４８時間にわたるＴＮＦ−αへのＵＣＢ細胞の曝露によって、ＣＤ３４＋ＵＣＢ前駆細胞の〜５０％でＦａｓ発現が上方制御される（図６Ｃ）。ＴＮＦ−αがＦａｓ発現の強力な誘導因子であるので、発明者らは、インビトロで前駆細胞活性におけるこの誘導の影響を評価した。５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αへのＵＣＢ細胞の同時曝露も骨髄系前駆細胞活性化において有効であり、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−α単独それぞれの影響に匹敵する（図６Ｄ）。これらのデータから、ＴＮＦ誘導性Ｆａｓ発現によって、アポトーシスに対して前駆細胞が増感されないが、それらの効果が相加的または相乗的ではなくむしろ重複していることが明らかになる。これらのインビトロデータは、インビボでの骨髄系前駆細胞活性に対するＴＮＦファミリーリガンドの刺激効果と一致し、これを説明する。
実施例７
ＴＮＦファミリー受容体のクロストーク
【００７８】
ＴＮＦファミリー受容体がクローン形成アッセイにおいて重複した活性を示すにもかかわらず、それらの差次的な影響は、様々な動作を得るために、活性化リガンドの組み合わせの適用を必要とし得る。この実施例において、アポトーシスおよび栄養的影響に対して増感させ得る受容体間の誘導性クロストークの存在を評価した。液体培養中でのデス受容体発現のダイナミクスを調べた。単核ＵＣＢ細胞を５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１．５μｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬとともに７２時間温置し、新鮮な試料中で、および各リガンドとの温置後、ＣＤ３４＋前駆細胞でのゲーティングにより受容体の発現を調べた。先行研究で強調されるように［８、１２］、ＴＮＦ−αは、ＣＤ３４＋ＵＣＢ前駆細胞においてＦａｓの発現を誘導する唯一のリガンドである（図７Ａ）。ＴＮＦ受容体の発現に対するリガンドの影響消失とは異なって（図７Ｂ）、ＦａｓＬは、前駆細胞においてＴＲＡＩＬ−Ｒ１の顕著な発現を誘導する（図７Ｃ）。さらに、ＴＲＡＩＬはそれ自身の受容体を誘導し、これは７２時間の長時間温置後の正の効果の持続に関与し得る（図６Ｂ）。まとめると、両ＴＮＦ受容体とＦａｓとの間の注目すべきクロストークが観察され（図７Ｄ）、一方でＴＮＦＲ２誘導性Ｆａｓのみによって、ＦａｓＬ介在性アポトーシスが起こり易くなり、ＴＮＦＲ１誘導性Ｆａｓ発現は殆ど、プロアポトーシス活性がない（図７Ｆ）。別の相互作用は、Ｆａｓ誘導性ＴＲＡＩＬ−Ｒ１発現であり（図７Ｄ）、これはプロアポトーシスの帰結および両受容体を発現する細胞における増殖の誘導がない（図７Ｅ）。これらの相互作用は、誘導性クロストークを通じた受容体の活性化が介在する影響の性質を定める。
実施例８
デスリガンドへのｍＰＢ細胞の曝露により生着が増強する
【００７９】
デスリガンドの影響がＵＣＢ細胞の選択的特性ではないことを検証するために、凍結保存動員末梢血（ｍＰＢ）細胞を用いて実験を行った。凍結保存ｍＰＢ試料を凍結融解し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦおよび１，５００ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬとともに４時間温置した。比較分析のために、同じｍＰＢ単位からの細胞を未操作（凍結融解）物として、または培地中での温置後に移植し、リガンドに曝露した。全部で１０７個の細胞（死細胞を排除しない。）をブスルファン前処理ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに移植し（図２Ａで示されるとおり）、１２週間後に骨髄を分析した。Ｇ−ＣＳＦによる５日間の動員およびフェレーシスによる単核細胞の回収によってこれらの試料を得た。ＤＭＳＯを用いてこれらの試料を凍結し、凍結融解後に〜１５％死細胞が含有されていた。ブスルファン前処理ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスへの移植（図２Ａ）から、ＵＣＢ細胞移植よりも顕著に低いレベルのドナーキメラ現象が示された（図８Ａ）。しかし、対照培地単独ではなく、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αとの細胞の移植前温置によって、ヒト異種キメラ現象の実質的レベルが向上した。移植１２週間後でのマウス骨髄の分析から、ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αで前処理した細胞（細胞をリガンドとともに４または１６時間予備温置）のレシピエントにおいて、異種キメラにおけるヒト細胞分化の主要な早期細胞系列であるヒトＢリンパ球が顕著に増加することが明らかになった（図８Ｂ）。これらのデータから、ＴＮＦファミリー受容体のエクスビボ活性化によって、末梢血に動員され、凍結保存されたヒト造血細胞の量的および質的生着が調整されることが明らかとなる。
実施例９
デスリガンドへのｍＰＢ細胞の曝露は骨髄系前駆細胞機能を促進する。
【００８０】
半固形培養での骨髄系前駆細胞アッセイにおいてデスリガンドの影響のさらなる分析を行った。凍結保存ｍＰＢ細胞を凍結融解し、デスリガンド（５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬおよび２０ｎｇ／ｍｌ）とともに４および１６時間温置した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＳＣＦ（ｎ＝５−１１）で刺激したメチルセルロース培養において同じ総細胞数（死細胞を排除しない。）で細胞を入れた（図６Ａ）。ＦａｓＬおよびＴＮＦ−αとの４時間の短時間の温置によってコロニー数の小さな増加が誘導され、これは１６時間にわたる温置後に顕著に促進された（図９Ａ）。骨髄系前駆細胞活性化のさらなる証拠は、ＴＮＦ−αにより誘導されるコロニーサイズ拡大から明らかであった（図９Ｂ）。前駆体の発生はインビボおよびインビトロの様々な環境による影響であったので、デスリガンドによる前駆細胞活性化の帰結が前駆細胞機能に対して異なる帰結を有したことは驚くことではない。これらのデータから、末梢血へ動員された骨髄系前駆細胞の活性化に対するデスリガンドの栄養効果が明らかとなる。
【００８１】
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１９．Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＦＷ，Ｒｏｔｈｅ  Ｍ，Ｒｕｓｔｅｎ  Ｌ，Ｇｏｅｄｄｅｌ  ＤＶ，Ｓｍｅｌａｎｄ  ＥＢ，Ｖｅｉｂｙ  ＯＰ，Ｓｌｏｒｄａｌ  Ｌ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＳＥ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７５−ｋＤａ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４；９１：１０６９５−１０６９９．
２０．Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｈａｒａｄａ  Ａ，Ｂｌｕｅｔｈｍａｎｎ  Ｈ，Ｗａｎｇ  ＪＢ，Ｎａｋａｏ  Ｓ，Ｍｕｋａｉｄａ  Ｎ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  Ｋ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）  ｉｓ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐ５５  −ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：２９３０−２９３７
２１．Ｃａｕｘ  Ｃ，Ｆａｖｒｅ  Ｃ，Ｓａｅｌａｎｄ  Ｓ，Ｄｕｖｅｒｔ  Ｖ，Ｄｕｒａｎｄ  Ｉ，Ｍａｎｎｏｎｉ  Ｐ，Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．１９９１；７８：６３５−６４４．
２２．Ｔｈｅｕｓ  ＪＷ，Ｊｕｓｔｕｓ  ＲＳ，Ｔｈｅｕｓ  ＳＡ．Ａ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００９；４９：１７２０−１７２７．
２３．Ｄａｎｅｔ  ＧＨ，Ｌｅｅ  ＨＷ，Ｌｕｏｎｇｏ  ＪＬ，Ｓｉｍｏｎ  ＭＣ，Ｂｏｎｎｅｔ  ＤＡ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４（＋）ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２００１；２９：１４６５−１４７３．
２４．Ｇｏｔｈｏｔ  Ａ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｏｏ  ＪＣＭ，Ｃｌａｐｐ  ＤＷ，Ｓｒｏｕｒ  ＥＦ．Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ／ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９２：２６４１−２６４９．
２５．Ｇｌｉｍｍ  Ｈ，Ｏｈ  ＩＨ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ．Ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｏｓｅ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  Ｓ／Ｇ（２）／Ｍ  ｔｒａｎｓｉｔ  ａｎｄ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｒｅｅｎｔｅｒ  Ｇ（０）．Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：４１８５−４１９３．
２６．Ｊｅｔｍｏｒｅ  Ａ，Ｐｌｅｔｔ  ＰＡ，Ｔｏｎｇ  Ｘ，Ｗｏｌｂｅｒ  ＦＭ，Ｂｒｅｅｓｅ  Ｒ，Ａｂｏｎｏｕｒ  Ｒ，Ｏｒｓｃｈｅｌｌ−Ｔｒａｙｃｏｆｆ  ＣＭ，Ｓｒｏｕｒ  ＥＦ．Ｈｏｍｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９：１５８５−１５９３．
２７．Ｌｉｕ  Ｂ，Ｂｕｃｋｌｅｙ  ＳＭ，Ｌｅｗｉｓ  ＩＤ，Ｇｏｌｄｍａｎ  ＡＩ，Ｗａｇｎｅｒ  ＪＥ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｏｏ  ＪＣ．Ｈｏｍｉｎｇ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｍｏｕｓｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｆａｓ／ＣＤ９５．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００３；３１：８２４−８３２．
２８．Ｐｅａｒｌ−Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ、Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ  ａｎｄ  Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｄｏｎｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２００７ａ；３５：１６０１−１６１２．
２９．Ｐｅａｒｌ−  Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｍｉｚｒａｈｉ  Ｋ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１０；２８：１２７０−１２８０．
３０．Ｍｉｚｒａｈｉ  Ｋ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｐｅａｒｌ−  Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１０；２４：１３２５−１３３４
３１．Ｐｅａｒｌ−  Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｆａｒｋａｓ  ＤＬ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｆａｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ  ｄｕａｌ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７ｂ；２５：３１９４−２０３
３２．Ｍｉｚｒａｈｉ  Ｋ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．ＴＮＦ−α  ｈａｓ  ｔｒｏｐｉｃ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−８．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１３  Ｊａｎ；３１（ｌ）：１５６−６６．
３３．Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ，Ｍｉｚｒａｈｉ  Ｋ，Ａｓｈ  Ｓ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  ＥＭ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｍｐａｉｒｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｒ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３  Ｆｅｂ；１９（２）：１８５−９５．
３４．Ｍｉｚｒａｈｉ  Ｋ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｆａｓ  ａｎｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ＧｖＨＤ  ｉｎ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒａｆｔｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１３；ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
３５．Ｗａｎｇ  ＬＳ，Ｌｉｕ  ＨＪ，Ｘｉａ  ＺＢ，Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ＨＥ，Ｌｕ  Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３／ＣＰＰ３２  ｉｎ  ＣＤ３４（＋）ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００；２８：９０７−９１５．
３６．Ｗｈａｒｔｅｎｂｙ  ＫＡ，Ｓｔｒａｌｅｙ  ＥＥ，Ｋｉｍ  Ｈ，Ｒａｃｋｅ  Ｆ，Ｔａｎａｖｄｅ  Ｖ，Ｇｏｒｓｋｉ  ＫＳ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｃｉｖｉｎ  ＣＩ．Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：３１４７−３１５４．
３７．Ｐｅａｒｌ−Ｙａｆｅ  Ｍ，Ｙｏｌｃｕ  ＥＳ，Ｓｔｅｉｎ  Ｊ，Ｋａｐｌａｎ  Ｏ，Ｙａｎｉｖ  Ｉ，Ｓｈｉｒｗａｎ  Ｈ，Ａｓｋｅｎａｓｙ  Ｎ．Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７ｃ；２５：１４４８−１４５５．
【図１】
2019205462.tif 000002
【図２】
2019205462.tif 000003
【図３】
2019205462.tif 000004
【図４】
2019205462.tif 000005
【図５】
2019205462.tif 000006
【図６】
2019205462.tif 000007
【図７−１】
2019205462.tif 000008
【図７−２】
2019205462.tif 000009
【図８】
2019205462.tif 000010
【図９】
2019205462.tif 000011