(57)【要約】【課題】標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物、並びに使用方法の提供。【解決手段】Ｙ染色体又は困難な標的遺伝子座上で標的化された遺伝子修飾を発生させるための方法及び組成物が提供される。組成物は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹ多能性及び／又は全能性動物細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を含むインビトロ培養物を含み、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地中でこれらの細胞を培養する。そのような組成物は、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための様々な方法での用途を見出す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年６月２６日出願の米国仮出願第６２／０１７，５８２号及び２０１４年６月２６日出願の米国仮出願第６２／０１７，６２７号の利益を主張し、それらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、多能性及び／又は全能性細胞を維持又は培養するための方法及び組成物、並びに細胞集団及びトランスジェニック動物を生成するための方法及び組成物に関する。
【０００３】
（ＥＦＳ  ＷＥＢ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照）
配列表の正式なコピーは、２０１５年６月２５日に作成され、かつ１４キロバイトのサイズを有する、ファイル名「４６３５４５ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、かつ本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
おそらくＹ染色体の独特な構造特徴によって、Ｙ連鎖遺伝子上で突然変異を発生させるためのマウス胚性幹細胞中の従来の遺伝子標的戦略は、限られた成功しか収めていない。したがって、多くの場合、マウスのＹ連鎖遺伝子の機能の理解は、自然欠失、ランダム遺伝子トラップ挿入、又は常染色体導入遺伝子を有するマウスの研究から得られた洞察に限られる。Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を標的化する能力を改善する方法が必要とされる。
【０００５】
Ｓｒｙタンパク質（性決定領域Ｙ）は、有胎盤哺乳動物における雄性決定の主要な制御因子である。精巣決定因子（ＴＤＦ）としても知られるＳｒｙ遺伝子がＹ染色体上にある。Ｓｒｙは、その高移動度群（ＨＭＧ）ドメインを介してＤＮＡに結合する転写因子であると考えられる。マウスＳｒｙ遺伝子の発現は、胚発達の１１日目あたりの狭い時間窓における生殖隆起に制限され、Ｓｒｙ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方が検出される。十分なＳｒｙは、卵巣発達の雌のプログラムを阻害すると同時に、両性能の生殖隆起を雄の精巣形成プログラムに向かって変換するために、この時間窓内で作製されなければならない。成体精巣において、円形のＳｒｙ転写物が検出されるが、Ｓｒｙタンパク質は検出されない。不活性Ｓｒｙタンパク質の産出を引き起こすか、又は遺伝子発現のタイミング及び強度を改変するＳｒｙ遺伝子中の突然変異は、雄雌性転換を引き起こし、Ｘ及びＹ染色体を有するが解剖学的に雌である動物をもたらし得る。いわゆるＸＹ雌は、多くの場合、生殖不能であるか、又は低い繁殖力を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｓｒｙの制御によって性決定を調節することが可能であることは、遺伝子修飾された動物の産出において大きな価値があろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法が提供される。本方法は、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を含むように非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を修飾することと、（ｂ）Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なＥＳ細胞株を作製することを可能にする条件下で、修飾されたＥＳ細胞株を培養することと、を含む。
【０００８】
Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を作製するための方法も提供される。本方法は、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有する、上記の方法によって作製された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を宿主胚内に導入することと、（ｂ）宿主胚を懐胎させることと、（ｃ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。一実施形態では、雌ＸＹ  Ｆ０非ヒト哺乳動物は、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ。特定の実施形態では、野生型マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６である。
【０００９】
一実施形態では、非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞は、げっ歯類由来である。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウスである。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９系統由来である。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９系統由来のＹ染色体を含む。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６系統由来である。別の実施形態では、げっ歯類は、ラット又はハムスターである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少は、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾に起因する。いくつかのそのような実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子における遺伝子修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、異種、若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む。
【００１１】
本明細書に提供される方法において、標的化された遺伝子修飾は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、常染色体上にある。
【００１２】
いくつかの実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子の修飾は、非ヒト哺乳類ＥＳ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー及び／又はレポーター遺伝子の挿入を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子の修飾は、内因性Ｓｒｙプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入を含む。特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、レポータータンパク質ＬａｃＺをコードする。
【００１３】
一実施形態では、培養工程は、非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を培養することを含み、培地は、低浸透圧培地である。一実施形態では、低浸透圧培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧を示す。他の実施形態では、低浸透圧培地は、以下の特徴、すなわち約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、宿主胚内への非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く宿主胚の懐胎後に、Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％がＸＹ雌であり、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。
【００１５】
一実施形態では、非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞は、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上に標的ゲノム遺伝子座を含み、ヌクレアーゼ剤は、認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する。そのような方法は、挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターの存在下で、ＥＳ細胞をヌクレアーゼ剤に曝露することを更に含むことができ、ヌクレアーゼ剤及び標的化ベクターへの曝露後、ＥＳ細胞は、挿入ポリヌクレオチドを含むように修飾される。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であるか、又は（ｃ）メガヌクレアーゼである。他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。そのような方法では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、（ａ）第１の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む。場合によっては、認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
【００１６】
本明細書に提供される方法のいずれかに従った非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞株を含むインビトロ培養物も提供される。
【００１７】
インビトロ培養物が提供され、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有する非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞と、（ｂ）非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地とを含む。一実施形態では、基本培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧を示す。他の実施形態では、基本培地は、以下の特徴、すなわち約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す。一実施形態では、非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞は、げっ歯類由来である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス又はラットである。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。一実施形態では、げっ歯類は、ラット又はハムスターである。一実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少は、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾による。一実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、非ヒト哺乳類ＥＳ細胞は、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、ＸＹ  ＥＳ細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、常染色体上にある。一実施形態では、基本培地は、５０±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２６１ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、１１０±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、８６±５ｍＭのグルコース、及び３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施���態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、宿主胚内への非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く宿主胚の懐胎後に、Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも８０％がＸＹ雌であり、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。
【００１８】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための方法が更に提供され、（ａ）非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するドナー非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を培養することと、（ｂ）ドナーＸＹ非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を宿主胚内に導入することと、（ｃ）宿主胚を懐胎させることと、（ｄ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。一実施形態では、培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧を示す。他の実施形態では、培地は、以下、すなわち約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を含む特徴を示す。一実施形態では、非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞は、げっ歯類由来である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス又はラットである。一実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。一実施形態では、げっ歯類は、ラット又はハムスターである。一実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少は、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾による。一実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、非ヒト哺乳類ＥＳ細胞は、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、ＸＹ  ＥＳ細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、常染色体上にある。一実施形態では、基本培地は、５０±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２６１ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、１１０±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを��す。一実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、８６±５ｍＭのグルコース、及び３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。一実施形態では、基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す。
【００１９】
Ｆ１世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法が更に提供され、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性が減少したＦ０  ＸＹの繁殖力のある雌を、同じＥＳ細胞クローン由来のコホートクローン兄弟であるＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交配させることであって、Ｆ０  ＸＹの繁殖力のある雌の非ヒト哺乳動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物のそれぞれは、遺伝子突然変異に関してヘテロ接合性である、交配させることと、（ｂ）遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫マウスを得ることと、を含む。
【００２０】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法も提供され、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。一実施形態では、第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、少なくとも４ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である。一実施形態では、第１のホモロジーアーム及び／又は第２のホモロジーアームの長さは、少なくとも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である。別の実施形態では、第１のホモロジーアーム及び／又は第２のホモロジーアームの長さは、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである。
【００２１】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が更に提供され、提供され、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。一実施形態では、第１のホモロジーアーム及び／又は第２のホモロジーアームの長さは、少なくとも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である。別の実施形態では、第１のホモロジーアーム及び／又は第２のホモロジーアームの長さは、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである。一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、非ヒト細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。一実施形態では、げっ歯類は、ラット、マウス、又はハムスターである。一実施形態では、細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。そのような方法では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、（ａ）第１の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むことができる。一実施形態では、第１又は第２の認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、修飾は、内因性核酸配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ。特定の実施形態では、欠失は、少なくとも５００ｋｂである。一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、非ヒト細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。一実施形態では、げっ歯類は、ラット、マウス、又はハムスターである。一実施形態では、細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む。そのような方法では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、（ａ）第１の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むことができる。一実施形態では、第１又は第２の認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。
【００２３】
少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡにＹ染色体を曝露することを含む、Ｙ染色体を修飾するための方法は、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣへの曝露に続いて、Ｙ染色体が少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように修飾されることを含む。ＬＴＶＥＣは、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、又は少なくとも９０ｋｂの核酸配列を含むことができる。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。
【００２４】
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が更に提供され、（ａ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞を提供することであって、標的ゲノム遺伝子座は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列を含む、提供することと、（ｂ）哺乳類細胞中に、（ｉ）標的ゲノム遺伝子座に相同の標的化アームが隣接した第１の核酸を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、少なくとも１０ｋｂである、ＬＴＶＥＣと、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に操作可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の発現構築物と、（ｉｉｉ）ｇＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸に操作可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の発現構築物と、を導入することであって、第１及び第２のプロモーターは、哺乳類細胞中で活性である、導入することと、（ｃ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において標的化された遺伝子修飾を含む、修飾された哺乳類細胞を特定することと、を含む。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、又は少なくとも９０ｋｂである。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣは、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂである。一実施形態では、哺乳類細胞は、非ヒト哺乳類細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、線維芽細胞である。一実施形態では、哺乳類細胞は、げっ歯類由来である。一実施形態では、げっ歯類は、ラット、マウス、又はハムスターである。一実施形態では、哺乳類細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、発達制限されたヒト前駆細胞である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。一実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。一実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。一実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、（ａ）内因性核酸配列の、相同若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、若しくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ���約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ、内因性核酸配列の欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、若しくは約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同若しくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）哺乳類細胞中で活性な第３のプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子の挿入、又は（ｊ）これらの組み合わせを含む。一実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、（ｉ）５’ホモロジーアームと相同である５’標的配列と、（ｉｉ）３’ホモロジーアームと相同である３’標的配列とを含む。一実施形態では、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満だけ隔てられる。一実施形態では、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、又は少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、又は少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満だけ隔てられる。一実施形態では、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。一実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、Ｓｒｙ遺伝子座を含む。
【００２５】
非ヒト動物のＹ染色体上の標的化された遺伝子修飾のための方法が更に提供され、（ａ）本明細書に記載される方法に従って、非ヒト多能性細胞のＹ染色体上の対象となるゲノム遺伝子座を修飾し、それにより、Ｙ染色体上の標的化された遺伝子修飾を含む、遺伝子修飾された非ヒト多能性細胞を生み出すことと、（ｂ）非ヒト宿主胚内に（ａ）の修飾された非ヒト多能性細胞を導入し、代理母において修飾された多能性細胞を含む非ヒト宿主胚を懐胎させることとを含み、代理母は、標的化された遺伝子修飾を含むＦ０子孫を生み出し、標的化された遺伝子修飾は、生殖系列を通じて伝達されることが可能である。一実施形態では、対象となるゲノム遺伝子座は、Ｓｒｙ遺伝子座を含む。
【００２６】
Ｙ染色体上の標的化された遺伝子修飾を発生させるための方法及び組成物が提供される。組成物は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹ多能性及び／又は全能性動物細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を含み、かつＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地中でこれらの細胞を培養する、インビトロ培養物を含む。そのような組成物は、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための様々な方法での用途を見出す。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非ヒト哺
乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法であって、
（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を含むように非ヒト
哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を修飾することと、
（ｂ）Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非
ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞株を作製することを可能にする条件下で、前記修飾された非ヒ
ト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を培養することと、を含む、方法。
（項目２）
（ｃ）前記修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を宿主胚内に導入することと、
（ｄ）前記宿主胚を懐胎させることと、
（ｅ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を更に含み、性成熟に達すると、前
記Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞がげっ歯類由来である、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞が１２９系統又はＣ５７ＢＬ／６系統由来のマウスＸ
Ｙ  ＥＳ細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、１２９系統に由来するＹ染色体を含む、項目５に記載の
方法。
（項目７）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞がＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の前記減少が、前記Ｓｒｙ遺伝子を含む
ゲノム遺伝子座における標的化された遺伝子修飾に起因する、項目１〜７のいずれか一項
に記載の方法。
（項目９）
前記Ｓｒｙ遺伝子中の前記遺伝子修飾が、
（ｉ）１つ以上のヌクレオチドの挿入と、
（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドの欠失と、
（ｉｉｉ）１つ以上のヌクレオチドの置換と、
（ｉｖ）ノックアウトと、
（ｖ）ノックインと、
（ｖｉ）内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、又は異種核酸配列との置き換えと、
（ｖｉｉ）点突然変異と、
（ｖｉｉｉ）前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連
結された選択可能なマーカー及び／又はレポーター遺伝子の挿入と、
（ｉｘ）内因性Ｓｒｙプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入と
、を含み、任意に、前記レポーター遺伝子がレポータータンパク質ＬａｃＺをコードする
、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞が、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Ｙ染
色体上に標的ゲノム遺伝子座を含み、
前記標的ゲノム遺伝子座が前記Ｓｒｙ遺伝子であり、
修飾工程（ａ）が、
（ｉ）前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞中に、（Ａ）前記ヌクレアーゼ剤であって、前
記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する前記ヌクレアーゼ剤、及び（Ｂ）前
記認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２の
ホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む、標的化ベクターを導入するこ
とと、
（ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記挿入ポリヌクレオチドを細
胞のゲノム中に含む、修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を特定することと、を含む
、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目１０に記載の
方法。
（項目１２）
前記ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（
Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタ
ンパク質がＣａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記第１の認識部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって
、前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、ＣＲ
ＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、項目１
２に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｓｒｙタンパク質の前記レベル及び／又は活性が、前記細胞中に、前記Ｓｒｙタン
パク質の前記レベル及び／又は活性を減少させるポリヌクレオチドを導入することによっ
て減少させられ、前記ポリヌクレオチドが、前記Ｓｒｙ  ｍＲＮＡの翻訳を防止するか、
前記Ｓｒｙ遺伝子の転写若しくは翻訳を阻止するポリペプチドをコードするか、又は前記
Ｓｒｙタンパク質の前記活性を阻止するポリペプチドをコードする、項目１〜７のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目１５）
前記修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞が、前記Ｓｒｙタンパク質の前記活性及び
／又はレベルを低減する条件付きＳｒｙ対立遺伝子を含む、項目１〜７のいずれか一項に
記載の方法。
（項目１６）
前記培養工程が、前記修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を培養物中で維持するの
に好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、前記修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細
胞を培養することを含み、前記培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋ
ｇ未満の浸透圧を示す低浸透圧培地である、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記低浸透圧培地が、以下の特徴、すなわち
（ｉ）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、
（ｉｉ）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、
（ｉｉｉ）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、並びに
（ｉｖ）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃
度のうちの１つ以上を示す、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
宿主胚内への前記修飾された非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く前記宿主胚の
懐胎後に、前記Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも８０％がＸＹ雌であり、前記ＸＹ雌が、
性成熟に達すると繁殖力を持つ、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物がマウスであり、野生型マウスに交配されたときに繁
殖力を持つ、項目２に記載の方法。
（項目２０）
前記野生型マウスがＣ５７ＢＬ／６マウスである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞株を含む、インビト
ロ培養物。
（項目２２）
Ｆ１世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニッ
ク非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、
（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性が減少したＦ０  ＸＹの繁殖力のある
雌非ヒト哺乳動物を、同じＥＳ細胞クローン由来のＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物コホート
クローン兄弟と交配させることであって、前記Ｆ０  ＸＹの繁殖力のある雌非ヒト哺乳動
物及び前記Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、前記遺伝子突然変異に関してヘテ
ロ接合性である、交配させることと、
（ｂ）前記遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫非ヒト哺乳動物を得ることと
、を含む、方法。
（項目２３）
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座を含む前記細胞を提供することであっ
て、前記標的ゲノム遺伝子座がヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む、提供することと
、
（ｂ）前記細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーア
ームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む、標的化ベクターを導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記挿入ポリヌクレオチドを細胞
のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
（項目２４）
工程（ｂ）が、前記細胞中に前記ヌクレアーゼ剤を導入することを更に含み、前記ヌク
レアーゼ剤が認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発し、前記第１及び第２の標的
部位が前記認識部位に十分に近接して位置する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも４
ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２６）
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも１
０ｋｂである、項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２７）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが、少なく
とも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である、項目２３又は２４に記載の方法。
（項目２８）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが約７００
ｂｐ〜約８００ｂｐである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記哺乳類細胞が非ヒト細胞である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記哺乳類細胞がげっ歯類由来である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞が多能性細胞である、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記多能性細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞又は非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞であ
る、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記多能性細胞がげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、マウスＥ
Ｓ細胞、又はラットＥＳ細胞である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目２３〜３５の
いずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｃ）メガヌクレアーゼ、又は
（ｄ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（
Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項目２３〜３５のいずれか一
項に記載の方法。
（項目３８）
前記ヌクレアーゼ剤が、前記Ｃａｓタンパク質及び前記ｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタ
ンパク質がＣａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記第１の認識部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって
、前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、ＣＲ
ＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、項目３
７に記載の方法。
（項目３９）
前記挿入ポリヌクレオチドが約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、
約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４０
０ｋｂの長さである、項目２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記挿入ポリヌクレオチドが、条件付き対立遺伝子、選択マーカーをコードするポリヌ
クレオチド、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸、又はプロモーターに操作可能
に連結されたレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ
、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅ
ｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ビーナス、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タ
ンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ
、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セルリアン、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータ
ンパク質をコードする、項目２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記修飾が、内因性核酸配列の欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、ドメイ
ンスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、制御配列スワップ、遺伝子スワッ
プ、又はこれらの組み合わせを含む、項目２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記修飾が内因性核酸配列の欠失を含み、
（ａ）前記欠失が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約
４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋ
ｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、若しくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ
〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００
ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．
５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶか、又は
（ｂ）前記欠失が、少なくとも５００ｋｂである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記修飾が、内因性核酸配列の外因性核酸配列との置き換えを含む、項目２３〜４２の
いずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記修飾が、内因性核酸配列の、相同又はオーソロガス核酸配列との置き換えを含む、
項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Ｓｒｙ遺伝子、Ｕｔｙ遺伝子、Ｅｉｆ２
ｓ３ｙ遺伝子、Ｄｄｘ３ｙ遺伝子、Ｕｂｅ１ｙ遺伝子、Ｔｓｐｙ遺伝子、Ｕｓｐ９ｙ遺伝
子、Ｚｆｙ１遺伝子、Ｚｆｙ２遺伝子、又は前記Ｋｄｍ５ｄ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｔｓｐｙ
、Ｕｔｙ、Ｄｄｘ３ｙ、及びＵｓｐ９ｙ遺伝子を包含する領域である、項目２３〜４４の
いずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座が、Ｓｒｙ遺伝子である、項目２３〜４４の
いずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】マウスＳｒｙ遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの概略図を提供する。ＶＧ−１（配列番号１０）、ＶＧ−２（配列番号１１）、ＶＧ−３（配列番号１２）。図１に示されるプライマー及びプローブは、配列番号１３〜２９で提供される。
【図２】ｌａｃＺレポーター遺伝子を使用して、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲを有するＳｒｙ遺伝子を標的化する概略図を提供する。Ｙ染色体上の困難な遺伝子座を回避するために、Ｓｒｙ遺伝子を、ＬＴＶＥＣ及びＬＴＶＥＣよりも小さいホモロジーアームを有する短腕ベクター（ｓｍａｌｌＴＶＥＣ）で標的化した。
【図３】胚内のＬａｃＺ発現を示す。
【図４】ＺＦＮによって、又はＣａｓ９  ＤＮＡエンドヌクレアーゼと組み合わせたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡによって媒介された、Ｙ染色体上の５００ｋｂを超える大きい欠失の概略図を提供する。
【図５Ａ】様々なクローン中の大きいＹ染色体欠失の配列決定確認を提供する。
【図５Ｂ】様々なクローン中の大きいＹ染色体欠失の配列決定確認を提供する。
【図５Ｃ】様々なクローン中の大きいＹ染色体欠失の配列決定確認を提供する。クローン１−Ｄ５に対する配列決定結果である。Ｋｄｍ５  Ｕｐ及びＵｓｐｙ９  ｄｏｗｎ配列が配列番号３０、１−Ｄ５  １５００Ｆ（配列番号３１）、１−Ｄ５  １０００Ｒ（配列番号３２）で提供され、クローン５−Ｃ４に対する配列決定結果である。Ｋｄｍ５  Ｕｐ及びＵｓｐｙ９  ｄｏｗｎ配列が配列番号３３、１５００Ｆ（配列番号３４）、１０００Ｒ（配列番号３５）、１０００Ｆ（配列番号３６）で提供され、クローン６−Ａ１２に対する配列決定結果である。Ｋｄｍ５  Ｕｐ及びＵｓｐｙ９  ｄｏｗｎ配列が配列番号３７、１５００Ｆ（配列番号３８）、１０００Ｒ（配列番号３９）、１０００Ｆ（配列番号４０）、１５００Ｒ（配列番号４１）で提供される。図５Ｂ及び図５Ｃ中の囲み領域は、マイクロホモロジー領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
本明細書で互換的に使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、コード及び非コードアミノ酸、並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。それらの用語はまた、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されているポリマーを含む。
【００２９】
本明細書で互換的に使用される用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの類似体若しくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。それらは、プリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、及びポリマーを含む。簡単にするために、核酸が二本鎖又は一本鎖の形態であるかどうかにかかわらず、核酸サイズはｂｐで言及され得、後者の場合、ｂｐは、一本鎖核酸がその厳密に相補的な鎖と二重鎖形成される場合に、かつ二重鎖形成されたときに形成されるものである。
【００３０】
「コドン最適化」は概して、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子中でより頻繁に、又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、特定の宿主細胞中の発現の強化のために核酸配列を修飾する工程を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、自然発生的核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は任意の他の宿主細胞を含む所与の原核又は真核細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表は、多くの方法で適用され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現に対する特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムもまた、入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００３１】
「操作可能な連結」又は「操作可能に連結」されていることは、両方の構成要素が正常に機能し、かつ構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性を可能にするような、２つ以上の構成要素（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並置を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写制御因子の存在又は非存在に応答して、コード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結され得る。
【００３２】
核酸の「相補性」は、そのヌクレオ塩基の基の配向によって、核酸の１つの鎖中のヌクレオチド配列が、対向する核酸鎖上の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡ中の相補的塩基は、典型的には、ＴとＡ及びＧとＣである。ＲＮＡ中では、それらは、典型的には、ＧとＣ及びＡとＵである。相補性は、完全又は実質的／十分であり得る。２つ核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が、二重鎖中の全ての塩基がワトソン−クリック対合によって相補的塩基に結合される二重鎖を形成することができることを意味する。「実質的な」又は「十分な」相補性は、１つの鎖中の配列が対向する鎖中の配列に全面的及び／又は完璧に相補的ではないが、２つの鎖上の塩基間で十分な結合が生じて、一組のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）下で、安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。そのような条件は、配列及びハイブリダイズ鎖のＴｍを予測するための標準的な数学的計算を使用することによって、又は常法を用いたＴｍの経験的決定によって予測され得る。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性した温度を含む。Ｔｍ未満の温度において、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利に働く一方で、Ｔｍを超える温度においては、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解又は分離に有利に働く。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）を使用することによって、１ＭのＮａＣｌ水溶液中で既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸に対して推定されてもよいが、他の既知のＴｍ計算は、核酸構造特徴を考慮に入れる。
【００３３】
「ハイブリダイゼーション条件」は、１つの核酸鎖が、ハイブリダイゼーション複合体を生み出すために、相補鎖相互作用及び水素結合によって第２の核酸鎖に結合する、累積的な環境を含む。そのような条件は、核酸を含有する水性又は有機溶液の化学構成成分及びそれらの濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、並びに混合物の温度を含む。インキュベーション時間の長さ又は反応チャンバの寸法などの他の要因が環境に寄与し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１．９０〜１．９１，９．４７〜９．５１，１  １．４７〜１１．５７（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照されたい。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、塩基間のミスマッチの可能性はあるものの、２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とする。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適した条件は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対する融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。短区間の相補性（例えば、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２２個以下、２０個以下、又は１８個以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションに関して、ミスマッチの位置は重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照、１１．７〜１１．８を参照されたい）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸に対する長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸に対する例示的な最小長は、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。更に、温度及び洗浄溶液塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調整されてもよい。
【００３５】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的化される標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、２０個中１８個のヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする、ｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非特異的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドが散在又は点在していてもよく、互いに、又は相補的ヌクレオチドに接触している必要はない。
【００３６】
核酸内の核酸配列の特定の区間の間の相補性の百分率は、当該技術分野において既知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカル配列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６）を使用して、又はＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）を使用する、デフォルト設定を使用したＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用して、慣例的に決定され得る。
【００３７】
本明細書に提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成成分を採用する。いくつかの構成成分が活性な変異体及びフラグメントを有することができることが、本明細書全体を通して認識される。そのような構成成分としては、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが挙げられる。これらの構成成分のそれぞれに対する生物活性は、本明細書の別の個所に記載される。
【００３８】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連での「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大限に一致するようにアラインメントされたときに同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一ではない残基部分は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なることが認識され、この保存的アミノ酸置換において、アミノ酸残基は、同様の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換の点で異なるとき、配列同一性の百分率は、置換の保存性を補正するように上方調節されてもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより、配列同一性の百分率を増加させることを伴う。したがって、例えば、同一アミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換は、ゼロ〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実装されるように計算される。
【００３９】
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定された値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、基準配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中で生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって計算される。
【００４０】
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータ、すなわち、５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ及び３のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列に対する同一性％及び類似性％、８のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ及び２のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用した同一性％及び類似性％、又はこれらの任意の同等のプログラムを使用して、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、当該の任意の２つの配列に関して、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成された対応するアラインメントと比較したとき、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基マッチ及び同一の配列同一性の百分率を有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを含む。
【００４１】
１つ以上の列挙された要素を「備える」又は「含む」組成物又は方法は、特に列挙されていない他の要素を含んでもよい。例えば、あるタンパク質を「備える」又は「含む」組成物は、そのタンパク質を単独で、又は他の成分と組み合わせて含有してもよい。
【００４２】
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を画定する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
【００４３】
文脈から明らかではない限り、用語「約」は、規定された値の測定の標準的な標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【００４４】
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「Ｃａｓタンパク質」又は「少なくとも１つのＣａｓタンパク質」は、これらの混合物を含む複数のＣａｓタンパク質を含むことができる。
【００４５】
Ｉ．Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ動物を作製するための方法及び組成物
ドナーＥＳ細胞及び宿主胚から非ヒト動物を作製するための方法が既知である。ドナーＥＳ細胞は、宿主胚に定着し、したがって、ドナーＥＳ細胞及び宿主胚によって形成される動物に部分的に、又は実質的に部分的に寄与する細胞の能力を強化する、ある特定の特徴のために選択される。形成された動物は、主にＥＳ細胞の遺伝子型（例えば、ＸＹ又はＸＸ）に基づき、雄又は雌であり得る。
【００４６】
トランスジェニック動物を作製するためのＥＳ細胞株の大部分は、雄のＸＹ遺伝子型を有する。哺乳類性決定におけるＹ染色体の優性のため、ＸＹ  ＥＳ細胞が胚盤胞宿主胚内に導入され、かつ懐胎されるとき、それらは、ほぼ必ず、第１世代（Ｆ０）において、すなわち、雄のドナーＥＳ細胞（ＸＹ）由来の細胞と、雄（ＸＹ）又は雌（ＸＸ）のいずれかであり得る宿主胚由来の細胞とを含有するキメラである、表現型的に雄の動物を生み出す。ＸＹ  ＥＳ細胞は、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ方法によって８細胞宿主胚内に導入され、かつ懐胎されたとき、完全にＸＹ  ＥＳ細胞由来である第１世代（Ｆ０）の表現型的に雄の動物において生じることができる。
【００４７】
国際公開第ＷＯ２０１１／１５６７２３号は、宿主胚へのＸＹドナー細胞の導入及び好適な宿主中での懐胎後に、繁殖力のあるＸＹ雌動物がＦ０集団において生み出されるように、ＸＹドナー細胞を培養物中で維持するための培地を採用する、方法及び組成物を提供する。そのような組成物は、所与の標的化された遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫を作製することにおいて用途を見出す。
【００４８】
本願は、解剖学的に正常で、繁殖力を持ち、かつ受胎可能なＸＹ  Ｆ０雌の産出を促進する培地と組み合わせた、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹドナー細胞の組み合わせを採用する、方法及び組成物を提供する。そのような方法及び組成物は、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物を作製することを可能にする。本明細書に記載される培地と組み合わせた、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹ  ＥＳ細胞の組み合わせは、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ子孫の百分率を有利に増加させる。効率的な雄雌性転換のための方法は、家畜産業にとって貴重である。例えば、雌の子牛は、雄よりも乳牛産業にとってはるかに貴重である。同じことが家禽にも当てはまる。繁殖目的で、それがウシ又はブタ又はヒツジであるかにかかわらず、多くの雌からほんのわずかな雄ウシ、雄ブタ、又は雄ヒツジを繁殖させることが好ましい。したがって、本明細書に提供される様々な方法は、様々な商業的に重要な繁殖産業において用途を見出す。
【００４９】
雌化培地中で培養することなく、Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法及び組成物もまた提供される。そのような方法では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹ  ＥＳ細胞株は、本明細書の別の個所で提供される雌化培地の非存在下で、（例えば、本明細書の別の個所で記載されるＤＭＥＭなどの基本培地中で培養することによって）Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なＥＳ細胞株を生み出すことができる。
【００５０】
Ａ．Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有する動物ＸＹ細胞
動物由来の様々なＸＹ多能性及び／又は全能性細胞を含む様々な組成物及び方法が、本明細書に提供される。本明細書で使用される場合、用語「多能性細胞」は、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性及び／又は全能性ＸＹ細胞は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」は、胚内への導入後に発達中の胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性又は多能性細胞を含む。
【００５１】
細胞、多能性及び／若しくは全能性細胞、ＸＹ細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ドナー細胞、並びに／又は宿主胚に関連した用語「動物」としては、哺乳動物、魚類、及び鳥類が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、ウシ種、例えば、乳牛、去勢雄牛など、ヒツジ種、例えば、ヒツジ、ヤギなど、及びブタ種、例えば、ブタ及びイノシシ）が挙げられる。鳥類としては、例えば、鶏、七面鳥、ダチョウ、ガン、アヒルなどが挙げられる。家畜及び農業用動物もまた含まれる。細胞、ＸＹ細胞、ＥＳ細胞、ドナー細胞、及び／又は宿主胚に関連した句「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。
【００５２】
特定の実施形態では、多能性細胞は、ヒトＸＹ  ＥＳ細胞、ヒトＸＹ  ｉＰＳ細胞、ヒト成体ＸＹ  ＥＳ細胞、発達制限されたヒト前駆ＥＳ細胞、非ヒトＸＹ  ＥＳ細胞、非ヒトＸＹ  ｉＰＳ細胞、げっ歯類ＸＹ  ＥＳ細胞、げっ歯類ＸＹ  ｉＰＳ細胞、マウスＸＹ
ＥＳ細胞、マウスＸＹ  ｉＰＳ細胞、ラットＸＹ  ＥＳ細胞、ラットＸＹ  ｉＰＳ細胞、ハムスターＸＹ  ＥＳ細胞、ハムスターＸＹ  ｉＰＳ細胞、サルＸＹ  ＥＳ細胞、サルＸＹ  ｉＰＳ細胞、農業用哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞、農業用ＸＹ  ｉＰＳ細胞、家畜哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞、又は家畜ＸＹ  ｉＰＳ細胞である。更に、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞は、近交系統、ハイブリッド系統、又は非近交系統由来であってもよい。多能性及び／又は全能性ＸＹ細胞がＸＹＹ核型又はＸＸＹ核型を含むことができることが、更に認識される。
【００５３】
マウス多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の混合、ＢＡＬＢ／ｃ系統、又はＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統由来であってもよい。特定の実施形態では、マウスは、５０％の１２９及び５０％のＣ５７ＢＬ／６である。一実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６）を参照されたい。一実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ系統であり、特定の実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、又はＣ５７ＢＬ／Ｏｌａ由来である。特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統及び上記のＣ５７ＢＬ／６系統の混合である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混合、又は上記のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。いくつかの実施形態では、マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９系統由来のＹ染色体を含む。
【００５４】
更に別の実施形態では、ＸＹマウスＥＳ細胞は、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である。ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４としても既知）マウスＥＳ細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚由来であった。したがって、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスからのＹ染色体を含有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９，１０２４〜１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい。
【００５５】
ラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４若しくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統が挙げられるがこれらに限定されない、任意のラット系統由来であってもよい。ラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）はまた、上記で列挙された２つ以上の系統の混合由来の系統から得ることができる。一実施形態では、ラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、ＤＡ系統及びＡＣＩ系統から選択された系統由来である。特定の実施形態では、ラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、ＡＣＩ系統由来である。ＡＣＩラット系統は、白色の腹及び足、並びにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する、黒いアグーチを有するものと特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。他の実施形態では、様々なラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、アグーチ毛及びＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有するものと特徴付けられる、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統由来である。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給元から入手可能である。更なる実施形態では、ラット多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、近交ラット系統由来である。特定の実施形態では、ラットＥＳ細胞株は、ＡＣＩラット由来であり、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞を含む。別の実施形態では、ラットＥＳ細胞株は、ＤＡラット由来であり、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株又はＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株を含む。例えば、２０１４年２月２０日出願の、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国実用出願１４／１８５，７０３号を参照されたい。
【００５６】
様々な実施形態では、多能性及び／若しくは全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞若しくはＸＹ  ｉＰＳ細胞）、ドナー細胞、並びに／又は宿主胚は、以下のうちの１つ以上、すなわちナンベイヤチネズミ属、モリレミング属、ハタネズミ属、ヨーロッパモグラ属に由来していない。様々な実施形態では、ドナー細胞及び／又は宿主胚は、正常な野生型特徴がＸＹ雌繁殖性である任意の種に由来していない。様々な実施形態では、遺伝子修飾が多能性及び／若しくは全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞若しくはＸＹ  ｉＰＳ細胞）、ドナー細胞、又は宿主胚中に存在する場合、遺伝子修飾は、ＸＹＹ若しくはＸＸＹ、Ｔｄｙ−陰性性転換、Ｔｄｙ−陽性性転換、Ｘ０修飾、異数体、ｆｇｆ９−／−遺伝子型、又はＳＯＸ９修飾ではない。
【００５７】
本方法及び組成物で採用される多能性及び／又は全能性ＸＹ細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少をもたらす遺伝子修飾を有する。「性決定領域Ｙ」タンパク質又は「Ｓｒｙ」タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質の高移動度群（ＨＭＧ）−ボックスファミリーのメンバーである転写因子である。Ｓｒｙは、雄性決定を開始する精巣決定因子である。様々な生物由来のＳｒｙタンパク質の配列が既知であり、これには、マウス（受託番号Ｑ０５７３８）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ６１８８２．１）、ヒト（受託番号Ｑ０５０６６）、ネコ（受託番号Ｑ６７Ｃ５０）、及びウマ（受託番号Ｐ３６３８９）が含まれ、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
概して、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性は、Ｓｒｙタンパク質のタンパク質レベル及び／又は活性レベルが、Ｓｒｙタンパク質の発現及び／又は活性を阻害するように遺伝子修飾又は突然変異されていない適切な対照細胞中のＳｒｙのタンパク質レベルよりも統計的に低い場合、減少している。特定の実施形態では、Ｓｒｙタンパク質の濃度及び／又は活性は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有するように修飾されていない対照細胞に対して、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少する。
【００５９】
「対象細胞」は、本明細書に開示される遺伝子修飾などの遺伝子改変がもたらされている細胞か、又はそのように改変した細胞の子孫であり、かつその改変を含む細胞である。「対照」又は「対照細胞」は、対象細胞の表現型の変化を測定するための基準点を提供する。一実施形態では、対照細胞は、それが活性の減少をもたらす遺伝子修飾又は突然変異を欠くことを除いて、Ｓｒｙ活性が減少した細胞と可能な限り厳密に一致している（例えば、個々の細胞は、同じ細胞株に由来し得る）。他の場合においては、対照細胞は、例えば、（ａ）野生型、すなわち、対象細胞をもたらす遺伝子改変に対して出発物質と同じ遺伝子型の細胞、（ｂ）出発物質と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、マーカー遺伝子を含む構築物など、対象となる形質に対する既知の効果を有しない構築物で）遺伝子修飾されている細胞、（ｃ）対象細胞の遺伝子修飾されていない子孫である細胞（すなわち、対照細胞及び対象細胞は、同じ細胞株に由来する）、（ｄ）対象細胞と遺伝学的に同一であるが、対象となる遺伝子の発現を低減する条件若しくは刺激に曝露されていない細胞、又は（ｅ）遺伝子修飾が対象となるポリヌクレオチドの発現の改変をもたらさない条件下での対象細胞自体を含んでもよい。
【００６０】
Ｓｒｙポリペプチドの発現レベルは、例えば、細胞若しくは生物中のＳｒｙポリペプチドのレベルについて分析することによって直接、又は例えば、Ｓｒｙポリペプチドの活性を測定することによって間接的に測定されてもよい。Ｓｒｙタンパク質の活性を判定するための様々な方法が既知である。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０〜９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１〜９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０〜５３２を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
他の場合において、Ｓｒｙポリペプチドの活性及び／又はレベルを低減する標的化された遺伝子修飾を有する細胞は、サザンブロット解析、ＤＮＡ配列決定法、ＰＣＲ解析、又は表現型解析が挙げられるがこれらに限定されない方法を使用して選択される。そのような細胞は、次いで、本明細書に記載される様々な方法、組成物、及びキットにおいて採用される。
【００６２】
標的化された遺伝子修飾は、例えば、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座への標的化された改変、Ｓｒｙ遺伝子への標的化された改変、又は他の所望のポリヌクレオチドへの標的化された改変を含む、対象となるポリヌクレオチドへの標的化された改変を含むことができる。そのような標的化された修飾としては、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックアウト、対象となるポリヌクレオチド若しくはその一部分のノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くのヌクレオチドが、標的化されたゲノム修飾を形成するように変化させられる。
【００６３】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少は、Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾（すなわち、制御領域、コード領域、及び／又はイントロンなどにおける遺伝子修飾）に起因し得る。そのような遺伝子修飾としては、ゲノム中へのヌクレオチドの付加、欠失、及び置換が挙げられるがこれらに限定されない。そのような遺伝子修飾としては、例えば、Ｓｒｙ遺伝子中への１つ以上のヌクレオチドの挿入、Ｓｒｙ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、Ｓｒｙ遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの置換、Ｓｒｙ遺伝子若しくはその一部分のノックアウト、Ｓｒｙ遺伝子若しくはその一部分のノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、Ｓｒｙ遺伝子の改変が挙げられ得る。したがって、特定の実施形態では、Ｓｒｙポリペプチドの活性は、Ｓｒｙポリペプチドをコードする遺伝子を破壊することによって低減又は排除されてもよい。特定の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くのヌクレオチドが、Ｓｒｙ遺伝子中で変化させられる。追加の標的化された遺伝子修飾を発生させるために、様々な方法が使用され得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０〜９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１〜９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０〜５３２を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。加えて、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を修飾するための本明細書に記載される様々な方法が、Ｓｒｙ遺伝子に標的化された遺伝子修飾を導入するために使用され得る。
【００６４】
他の実施形態では、Ｓｒｙポリペプチドの活性及び／又はレベルは、Ｓｒｙポリペプチドのレベル又は活性を阻害するポリヌクレオチドを細胞中に導入することによって、低減又は排除される。ポリヌクレオチドは、ＳｒｙメッセンジャーＲＮＡの翻訳を防止することによって直接、又はＳｒｙタンパク質をコードする遺伝子の転写若しくは翻訳を阻害するポリペプチドをコードすることによって間接的に、Ｓｒｙポリペプチドの発現を阻害してもよい。他の実施形態では、Ｓｒｙポリペプチドの活性は、Ｓｒｙポリペプチドの活性を阻害するポリペプチドをコードする配列を細胞中に導入することによって、低減又は排除される。
【００６５】
一実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、Ｓｒｙタンパク質の活性及び／又はレベルを低減する条件付きＳｒｙ対立遺伝子を含む。「条件付きＳｒｙ対立遺伝子」は、所望の発達時間において、かつ／又は所望の対象となる組織内で、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有するように設計された、修飾Ｓｒｙ遺伝子を含む。レベル及び／又は活性の低減は、条件付き対立遺伝子を生じさせる修飾を欠く対照細胞と、又は所望の発達時点における活性の低減の場合、先行する及び／若しくは後続する時点と、又は所望の組織の場合、全ての組織の平均活性量と比較され得る。一実施形態では、条件付きＳｒｙ対立遺伝子は、所望の発達時点において、かつ／又は特定の組織中でスイッチをオフにし得る、Ｓｒｙの条件付きヌル対立遺伝子を含む。そのような条件付き対立遺伝子は、任意の遺伝子標的化クローン由来の繁殖力のあるＸＹ雌を作り出すために使用され得る。本明細書の別の個所で記載されるように、そのような方法は、Ｆ１世代における所望のホモ接合性遺伝子修飾の作出を可能にする。そのような方法は、Ｆ２世代まで繁殖する必要なしで、表現型の迅速な検査を提供する。
【００６６】
非限定的な実施形態では、条件付きＳｒｙ対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号に記載されるように、多機能性対立遺伝子である。特定の実施形態では、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に対するセンス配向における作動配列、及びセンス又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｂ）アンチセンス配向における、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件付き（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及び反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する。例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい）、並びに（ｃ）（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠く、かつ（ｉｉ）センス配向におけるＮＳＩ及びアンチセンス配向におけるＣＯＩＮを含有する条件付き対立遺伝子を形成するために、第１のリコンビナーゼへの曝露後に組み換える、組み換え可能な単位を含む。
【００６７】
Ｓｒｙ遺伝子の条件付き対立遺伝子は、任意の細胞型において生成され得、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞に限定されない。そのような細胞型は、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を標的化するための非限定的な方法と共に、本明細書の別の箇所で更に詳細に考察される。
【００６８】
本明細書の別の個所で考察されるように、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる遺伝子修飾を有する多能性及び／又は全能性ＸＹ細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、対象となるポリヌクレオチドへの少なくとも１つの追加の標的化された遺伝子修飾を更に含むことができる。少なくとも１つの追加の標的化された遺伝子修飾は、１つ以上の核酸の置換、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、ノックアウト、及びノックインを含むことができる。追加の標的化された遺伝子修飾は、Ｙ染色体、Ｘ染色体、又は常染色体上にあってもよい。様々な方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、標的プラスミド及び大きな標的ベクターを採用することを含む、追加の標的化された遺伝子修飾を発生させるために使用され得る。核移植に関連した方法について、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国第Ｓ２００８００９２２４９号、国際公開第ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国第２００４０１７７３９０号、国際公開第ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号も参照されたい。加えて、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座（すなわち、Ｓｒｙ遺伝子）を修飾するための本明細書に記載される様々な方法はまた、Ｙ染色体上に位置していない対象となるポリヌクレオチドへの標的化された遺伝子修飾を導入するためにも使用され得る。
【００６９】
Ｂ．Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有する多能性及び／又は全能性ＸＹ細胞を培養するための培地
Ｆ０世代におけるＸＹの繁殖力のある雌を促進する様々な方法及び組成物において採用される培地は、それが多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を維持するようなものである。用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」は、本明細書に記載される多能性及び／又は全能性細胞（ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を含む）の特徴又は表現型のうちの少なくとも１つ以上の安定した保持を指す。そのような表現型は、細胞の多能性及び／又は全能性、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、並びに他の機能的特徴を維持することを含むことができる。用語「維持する」、「維持すること」、及び「維持」はまた、細胞の増殖、又は培養されている細胞の数の増加を包含することができる。その用語は、細胞が分裂し、数を増加させ続ける場合も、そうでない場合もある一方で、細胞が多能性のままであることを可能にする培養条件を更に企図する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減する遺伝子修飾を有するＸＹ細胞は、多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を培養物中で増殖させるか、又は維持することにおける使用（補充物を添加して）に好適である、当該技術分野において既知の任意の基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）中で培養することによって維持される。そのような場合、培養されたＸＹ  ＥＳ細胞は、細胞がレシピエント胚内へと組み込まれ、かつ繁殖力のある雌子孫を生じさせるように、繁殖力のある雌動物へと発達する可能性を有するが、多能性及び／又は全能性をなおも保持する。
【００７１】
他の実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減する遺伝子修飾を有するＸＹ細胞は、細胞がレシピエント胚内へと組み込まれ、かつ繁殖力のある雌子孫を生じさせ得るように、細胞のうちの一部が繁殖力のある雌動物に発達する可能性を有するＸＹ細胞に変換するが、多能性及び／又は全能性をなおも維持するくらい十分な時間にわたって、以下で更に定義されるような培地中で培養することによって維持される。
【００７２】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減する遺伝子修飾を有するＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を維持するために採用される培地は、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する。したがって、そのような培地中で培養することは、適切な対照培地中で培養すること（例えば、ＤＭＥＭに基づく培養）と比較して得られるＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の数を増加させる。したがって、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の数の増加は、Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％がＸＹ雌であることを含むことができ、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。
【００７３】
句「基本培地」又は「基本培地（複数）」は、例えば、多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＸＹ  ＥＳ細胞、ＸＹ  ｉＰＳ細胞など）を培養物中で増殖させるか、又は維持することにおける使用（補充物を添加して）に好適である、当該技術分野において既知の基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）を含む。繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適な基本培地（すなわち、「低塩ＤＭＥＭ」又は「低浸透圧培地」）は、ＥＳ細胞を培養物中で維持するために典型的に使用される基本培地とは異なる。基本培地を一般的に考察する目的で、繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適ではない基本培地は、「ＤＭＥＭ」としてのこの項及び表１に記載される（例えば、典型的なＤＭＥＭ培地）。繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適な基本培地を考察する目的で、句「低塩ＤＭＥＭ」又は「低浸透圧ＤＭＥＭ」が使用される。多能性及び／又は全能性細胞を培養物中で維持するために典型的に使用される基本培地（例えば、ＤＭＥＭ）と、繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適な基本培地（例えば、「低塩ＤＭＥＭ」）との間の違いは、本明細書において明確に述べられる。句「低塩ＤＭＥＭ」は、便宜上使用され、繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適なＤＭＥＭは、「低塩」に限定されない特徴を示し、本明細書に記載される特徴を含む。例えば、表１に示されるＤＭＥＭは、本明細書で提供されるような塩化ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム濃度を変化させることによって、繁殖力のあるＸＹ雌を作製するのに好適なものにされ得、それはまた、表１に示されるＤＭＥＭと比較して異なる浸透圧及び異なる導電率をもたらす。基本培地の一例は、様々な形態におけるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）である（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＭＥＭ、カタログ番号１  １９７１−０２５）（表１）。好適な低塩ＤＭＥＭは、ＫＯ−ＤＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０８２９−０１８）として市販されている。基本培地は、典型的には、ドナー細胞として使用するために細胞を培養物中で維持するために使用されるとき、当該技術分野において既知の多くの補充物が補充される。そのような補充物は、本開示において「補充物」又は「＋補充物」として示される。
【００７４】
【表１】
2019205481.tif 000002
【００７５】
用語「補充物」又は句「＋補充物」は、例えば、ドナー細胞の多能性又は全能性を培養中で維持するために、多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ
ｉＰＳ細胞）を培養中で増殖させるか、又は維持するための基本培地に添加される要素を含む。例えば、多能性及び／又は全能性細胞を培養物中で増殖させるか、又は維持するのに好適な培地補充物としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン、抗生物質（複数可）、ペニシリン及びストレプトマイシン（例えば、ｐｅｎｓｔｒｅｐ）、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、非必須アミノ酸（例えば、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、２−メルカプトエタノール、並びに白血病阻止因子（ＬＩＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７６】
一実施形態では、基本培地は、例えば、胚内への注射及び代理母マウスへの子宮内導入後に、雄性決定発達プログラムに寄与する能力が低減したＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む、多能性細胞を培養物中で維持するのに好適な１つ以上の補充物を含む。
【００７７】
特定の実施形態では、多能性細胞を培養物中で維持するのに好適な１つ以上の補充物は、ＦＢＳ（９０ｍＬのＦＢＳ／０．５Ｌの基本培地）、グルタミン（２．４ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、ピルビン酸ナトリウム（０．６ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、非必須アミノ酸（＜０．１ｍｍｏｌ／０．５Ｌの基本培地）、２−メルカプトエタノール、ＬＩＦ、及び１つ以上の抗生物質である。
【００７８】
他の実施形態では、例えば、胚内への注射及び代理母マウスへの子宮内導入後に、雄性決定発達プログラムに寄与する能力が低減したＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む、多能性細胞を培養物中で維持するための培地は、以下の補充物が添加される約５００ｍＬの基本培地を含む。約９０ｍＬのＦＢＳ（例えば、Ｈｙｌｃｏｎｅ  ＦＢＳカタログ番号ＳＨ３００７０．０３）、約２．４ミリモルのグルタミン（例えば、約１２ｍＬの２００ｍＭグルタミン溶液、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０−０８１、ペニシリン：ストレプトマイシン（例えば、約５１ｍｇのＮａＣｌを有する６０，０００単位のペニシリンＧナトリウム及び６０ｍｇの硫酸ストレプトマイシン、例えば、約６ｍＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐｅｎｎｓｔｒｅｐ、カタログ番号１５１４０−１２２）、約０．６ミリモルのピルビン酸ナトリウム（例えば、６ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１  １３６０−０７０）、約０．０６ミリモルの非必須アミノ酸（例えば、約６ｍＬのＭＥＭ  ＮＥＡＡ、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１  １  １４０−０５０からのＭＥＭ  ＮＥＡＡ）、約１．２ｍＬの２−メルカプトエタノール、及び約１．２マイクログラムのＬＩＦ（例えば、約１２０マイクロリットルの１０６単位／ｍＬのＬＩＦ調製物、例えば、約１２０マイクロリットルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＥＳＧＲＯ（商標）−ＬＩＦ、カタログ番号ＥＳＧ１  １０７）。繁殖力のあるＸＹ雌を作製するためにＸＹ  ＥＳ又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を維持するための基本培地を構成するとき、ほぼ同じ量の典型的に同じ補充物が採用されるが、基本培地の組成は（ＤＭＥＭ、例えば、上記の表に記載される培地とは）異なり、違い（複数可）は、本明細書に教示される違い（複数可）に対応する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、補充物は、Ｗｎｔ条件培地、例えば、Ｗｎｔ−３ａ条件培地を含む。
【００８０】
一実施形態では、例えば、胚内への注射及び代理母マウスへの子宮内導入後に、雄性決定発達プログラムに寄与する能力が低減したＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む、多能性細胞は、基本培地及び補充物を含む培地中で、インビトロ培養物中で維持され、基本培地は、以下の特徴、すなわち（ａ）約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧、（ｂ）約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、（ｃ）約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、（ｄ）約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、（ｅ）約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又は（ｆ）これらのうちの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す。他の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１／１５６７２３号に記載されるような培地中のインビトロ培養物中で維持される。
【００８１】
一実施形態では、基本培地は、低塩ＤＭＥＭである。特定の実施形態では、低塩ＤＭＥＭは、８５〜１３０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する。一実施形態では、基本培地は、低浸透圧ＤＭＥＭである。特定の実施形態では、低浸透圧ＤＭＥＭは、２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。一実施形態では、基本培地は、低導電率ＤＭＥＭである。特定の実施形態では、低導電率ＤＭＥＭは、１１〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
【００８２】
他の実施形態では、基本培地は、約３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７５、２７０、２６０、２５０、又は２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧を示す。一実施形態では、基本培地又は基本培地及び補充物を含む培地は、約２４０〜３２０、２５０〜３１０、２７５〜２９５、又は２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧を示す。特定の実施形態では、基本培地又は基本培地及び補充物を含む培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を示す。
【００８３】
他の実施形態では、基本培地は、約１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、又は１４．０ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を示す。一実施形態では、基本培地は、約１０〜１４ｍＳ／ｃｍ又は１１〜１３ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を示す。特定の実施形態では、基本培地は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率を示す。
【００８４】
特定の実施形態では、基本培地は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍの導電率及び約２６０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を示す。更なる特定の実施形態では、基本培地は、約９０ｍＭのＮａＣｌの濃度の塩化ナトリウムを含む。更なる特定の実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約７０〜９５ｍＭである。更なる特定の実施形態では、基本培地は、約３５ｍＭ未満の濃度の重炭酸ナトリウムを含む。更なる特定の実施形態では、重炭酸ナトリウムの濃度は、約２０〜３０ｍＭである。
【００８５】
一実施形態では、基本培地は、約１００ｍＭ以下のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度を示す。一実施形態では、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩は、ＮａＣｌである。一実施形態では、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度は、９０、８０、７０、６０、又は５０ｍＭ以下である。一実施形態では、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩の基本培地中の濃度は、約６０〜１０５、７０〜９５、又は８０〜９０ｍＭである。特定の実施形態では、濃度は、約８５ｍＭである。
【００８６】
一実施形態では、基本培地は、炭酸の塩の濃度を示す。一実施形態では、炭酸の塩は、ナトリウム塩である。一実施形態では、ナトリウム塩は、重炭酸ナトリウムである。一実施形態では、基本培地中の炭酸塩の濃度は、４０、３５、３０、２５、又は２０ｍＭ以下である。一実施形態では、基本培地中の炭酸塩の濃度は、約１０〜４０、別の実施形態では、約２０〜３０ｍＭである。特定の実施形態では、濃度は、約２５又は２６ｍＭである。更に他の実施形態では、重炭酸ナトリウム濃度は、約２６ｍＭ、約１８ｍＭ、約１８ｍＭ〜約２６ｍＭ、又は約１８ｍＭ〜約４４ｍＭである。
【００８７】
一実施形態では、基本培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩との濃度の合計は、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、又は８０ｍＭ以下である。一実施形態では、基本培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩との濃度の合計は、約８０〜１４０、８５〜１３０、９０〜１２０、９５〜１２０、又は１００〜１２０ｍＭである。特定の実施形態では、基本培地中のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩との濃度の合計は、約１１５ｍＭである。
【００８８】
一実施形態では、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩とのモル比は、２．５よりも高い。一実施形態では、比は、約２．６〜４．０、２．８〜３．８、３〜３．６、又は３．２〜３．４である。一実施形態では、比は、３．３〜３．５である。特定の実施形態では、比は、３．４である。
【００８９】
一実施形態では、基本培地は、約２５０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、並びに約６０〜１０５ｍＭのアルカリ金属及びハロゲン化物の塩の濃度を示す。更なる実施形態では、基本培地は、約２０〜３０ｍＭの炭酸の塩の濃度を有する。更なる実施形態では、アルカリ金属及びハロゲン化物の塩と炭酸の塩との濃度の合計は、約８０〜１４０ｍＭである。更なる実施形態では、基本培地の導電率は、約１２〜１３ｍＳ／ｃｍである。
【００９０】
一実施形態では、基本培地は、約２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩を含む。特定の実施形態では、基本培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む。
【００９１】
別の実施形態では、基本培地は、約２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約１８±５ｍＭを含む。特定の実施形態では、基本培地は、約２６１ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む。
【００９２】
別の実施形態では、基本培地は、約２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約１１０±５ｍＭのＮａＣｌ及び約１８±５ｍＭの炭酸塩を含む。特定の実施形態では、基本培地は、約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む。
【００９３】
別の実施形態では、基本培地は、約２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ及び約２６±５ｍＭの炭酸塩を示す。特定の実施形態では、基本培地は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを示す。
【００９４】
別の実施形態では、基本培地は、約３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約８７±５ｍＭのＮａＣｌ、約２６±５ｍＭの炭酸塩、及び約８６±５ｍＭのグルコースを含む。特定の実施形態では、基本培地は、約３２２ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び約１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコースを含む。
【００９５】
本明細書に開示される様々な方法及び組成物において採用され得る追加の基本培地は、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び２６±５ｍＭの炭酸塩を含む基本培地を含む。特定の実施形態では、基本培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む。
【００９６】
他の実施形態では、基本培地は、２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、５０±５ｍＭのＮａＣｌ及び２６±５ｍＭの炭酸塩を含む。特定の実施形態では、基本培地は、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有し、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ及び２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含む。
【００９７】
他の実施形態では、約４４ｍＭ、２６ｍＭ、又は１８ｍＭを含む、本明細書に開示されるようなＮａＨＣＯ３の濃度を有する高グルコースＤＭＥＭ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、それぞれ５０ｕｇ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、１５％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、及び２０００Ｕ／ｍＬのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した。
【００９８】
Ｃ．標的化された遺伝子修飾を行うための方法
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる標的化された遺伝子修飾を行うための様々な方法が使用され得る。例えば、１つの場合において、標的化された遺伝子修飾は、相同組み換え事象を介して標的化された遺伝子修飾を発生させる系を採用する。他の場合において、動物細胞は、標的化されたゲノム位置において一本鎖又は二本鎖切断を発生させるヌクレアーゼ剤を使用して修飾され得る。一本鎖又は二本鎖切断は、次いで、非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）によって修復される。そのような系は、例えば、標的化された機能喪失型遺伝子修飾を発生させることにおいて用途を見出す。例えば、標的プラスミド、小さな標的化ベクター（ｓｍａｌｌＴＶＥＣ）、又は大きな標的化ベクターの使用を含む、そのような標的化された遺伝子修飾を発生させるための非限定的な方法は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。また、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  １５３：９１０〜９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ
ＯＮＥ  ７：ｅ４５７６８：１〜９、及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０〜５３２も参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
特定の実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子の標的化された遺伝子修飾及び／又は任意の他の対象となるポリヌクレオチドの標的化された遺伝子修飾が生じ得る一方で、多能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞）が本明細書に記載される培地（例えば、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地）中で維持されていることが認識される。あるいは、Ｓｒｙ遺伝子及び／又は任意の他の対象となるポリヌクレオチドの標的化された遺伝子修飾が生じ得る一方で、多能性細胞（すなわち、ＥＳ細胞）は、異なる培地中で維持されており、続いて、本明細書に開示される培地（例えば、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地）に移される。
【０１００】
Ｄ．多能性及び／又は全能性細胞を培養物中で培養及び維持する方法
ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）をインビトロ培養物中で維持又は培養するための方法が提供され、細胞は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を含み、細胞は、本明細書に記載される条件下で、インビトロ培養物中で維持される。ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）をインビトロ培養物中で維持又は培養するそのような方法は、宿主胚内への非ヒト動物ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く宿主胚の懐胎後に、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌動物の数の増加を促進するような方法である。
【０１０１】
本明細書に開示される任意の培地がそのような維持又は培養方法のために採用され得るが、１つの非限定的な実施例としては、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を培養物中で維持又は培養するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で培養することが挙げられ、基本培地又は基本培地及び補充物を含む培地は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧を示す。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、基本培地又は基本培地及び補充物を含む培地は、以下の特徴、すなわち約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す。
【０１０３】
一実施形態では、本方法は、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を、基本培地及び補充物を含む好適な培養培地中で維持又は培養することを含み、基本培地又は基本培地及び補充物を含む培地は、約２４０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、約１０〜１４ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０〜１０５ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩濃度、１０〜４０ｍＭの炭酸塩濃度、及び／又は約８０〜１４０ｍＭのアルカリ金属塩及び炭酸塩の組み合わせた濃度を含む。一実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への導入前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３日間、又は２週間、３週間、若しくは４週間の期間にわたって、培地（ＥＳ細胞を維持するための補充物を有する）中で維持される。特定の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への導入前に約２〜４週間にわたって、培地（ＥＳ細胞を維持するための補充物を有する低塩基本培地）中で維持される。
【０１０４】
別の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内にドナー細胞を導入する前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２日間、２週間、３週間、又は４週間にわたって、低塩基本培地を有する培地中で維持される。特定の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への細胞の導入前に少なくとも２〜４週間、低塩基本培地を有する培地中で維持される。
【０１０５】
別の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持（例えば、凍結）され、ドナー細胞は、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で解凍され、かつ宿主胚内にＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を導入する前に少なくとも１、２、３、又は４日間以上にわたって維持される。特定の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で少なくとも１回継代され、細胞は、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で凍結され、細胞は、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で解凍され、宿主胚内への導入前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３日間、２週間、３週間、４週間以上にわたって増殖される。
【０１０６】
更に別の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への導入前に１、２、３、又は４日間の期間にわたって、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持される。一実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、３日間の期間にわたって、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持される。
【０１０７】
一実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への導入前に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２日間、２週間、３週間、若しくは４週間以上にわたって、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持される。特定の実施形態では、ドナー細胞は、宿主胚内への導入前に少なくとも１週間にわたって、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持される。特定の実施形態では、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内への導入前に２〜４週間にわたって、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌を促進する培地中で維持される。
【０１０８】
したがって、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を培養物中で維持又は培養するための方法が提供され、細胞は、宿主胚内へのＸＹ細胞の導入及び続く好適な雌宿主中での懐胎後に、雌ＸＹ動物の発達を促進するか、又はそれに有利に働く条件下で維持される。
【０１０９】
一態様では、本明細書に記載されるような条件下で、ドナーＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を培養物中で維持又は培養するための方法が提供され、Ｆ０胚を形成するための宿主胚内へのドナーＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び好適な動物におけるＦ０胚の懐胎後に、Ｆ０胚は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超えてＸＹであり、かつ性成熟に達すると繁殖力を持つ雌である、Ｆ０動物へと発達する。
【０１１０】
Ｅ．標的化された遺伝子修飾を有するＦ０胚及びＦ１子孫の生成
本明細書に提供されるＳｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有するＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を採用する様々な方法及び組成物が、遺伝子修飾された動物を生成するために使用され得る。遺伝子修飾を導入するための様々な方法は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
【０１１１】
ｉ．Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物を作製するための方法
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物を作製するための方法が提供される。そのような方法は、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するドナー非ヒト動物のＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を、ＸＹの繁殖力のある雌ＥＳ細胞の発達を促進する培地中で維持又は培養することと、（ｂ）宿主胚内に、ドナーＸＹ非ヒト動物のＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を導入することと、（ｃ）宿主胚を懐胎させることと、（ｄ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト動物を得ることとを含み、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト動物は、繁殖力を持つ。特定の実施形態では、ドナー非ヒト動物のＸＹドナー細胞は、対象となるポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つの追加の標的化された遺伝子修飾を含むことができる。そのような修飾は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
【０１１２】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するＸＹ  ＥＳ細胞は、低塩培地なしで維持され得、ＸＹの繁殖力のある雌へと発達することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＸＹの繁殖力のあるＦ０雌動物の発達を促進する培地は、非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持又は培養するのに好適な基本培地及び補充物を含む、低塩ベースの培地を含むことができ、低塩基本培地は、以下のうちの１つ以上を含む特徴、すなわち約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせを示す。
【０１１４】
他の実施形態では、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物を作製するためのそのような方法は、以下を含むがこれらに限定されない、本明細書に開示される培地を使用して実施され得る。（ａ）５０±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを含む基本培地、（ｂ）約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを含む基本培地、（ｃ）８７±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを含む基本培地、（ｄ）約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２６１ｍＯｓｍ／ｋを含む基本培地、（ｅ）基本培地は、１１０±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを含む、（ｆ）基本培地は、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを含む、（ｇ）基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを含む、（ｈ）基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを含む、（ｉ）基本培地は、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、８６±５ｍＭのグルコース、及び３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを含む、並びに／又は（ｊ）基本培地は、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを含む。
【０１１５】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有し、かつＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地中で培養されている、遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚内に移植され得る。宿主胚内に移植された細胞は、本明細書において「ドナー細胞」と称される。特定の実施形態では、遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、宿主胚と同じ系統由来であるか、又は宿主胚とは異なる系統由来である。同様に、代理母は、遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／若しくは全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞若しくはＸＹ  ｉＰＳ細胞）及び／又は宿主胚と同じ系統由来であってもよく、あるいは代理母は、遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／若しくは全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞若しくはＸＹ  ｉＰＳ細胞）及び／又は宿主胚とは異なる系統由来であってもよい。一実施形態では、ＸＹドナー細胞は、ＸＸ宿主胚内に移植される。
【０１１６】
様々な宿主胚が、本明細書に開示される方法及び組成物において採用され得る。いくつかの実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少をもたらす標的化された遺伝子修飾を有する、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、対応する生物からの桑実期前の胚、例えば、８細胞期胚内に導入される。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国第７，５７６，２５９号、米国第７，６５９，４４２号、米国第７，２９４，７５４号、及び米国第２００８−００７８０００  Ａ１号を参照されたい。他の実施形態では、ドナーＥＳ細胞は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、又は６４細胞期宿主胚において、宿主胚に移植されてもよい。別の実施形態では、宿主胚は、胚盤胞である。一実施形態では、宿主胚は、胚盤胞前の胚、桑実期前、桑実期、緊密化していない、及び緊密化した桑実期から選択される段階にある。一実施形態では、マウス胚を採用するとき、宿主胚の段階は、Ｔｈｅｉｌｅｒ  ｓｔａｇｅｓ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  Ｔｈｅｉｌｅｒ（１９８９）「Ｔｈｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｍｏｕｓｅ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照して、Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｓｔａｇｅ  １（ＴＳ１）、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５、及びＴＳ６から選択される。特定の実施形態では、Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｓｔａｇｅは、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、及びＴＳ４から選択される。一実施形態では、宿主胚は、透明帯を含み、ドナー細胞は、透明帯内の穴を通じて宿主胚内に導入されるＸＹ  ＥＳ細胞である一方で、他の実施形態では、宿主胚は、透明帯がない胚である。更に他の特定の実施形態では、桑実期宿主胚は、凝集される。
【０１１７】
核移植技術もまた、遺伝子修飾された動物を生成するために使用され得る。簡潔に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核する工程と、（２）除核卵母細胞と組み合わせるために、ドナー細胞又は核を単離する工程と、（３）細胞又は核を除核卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成する工程と、（４）再構成細胞を動物の子宮に移植して、胚を形成する工程と、（５）胚を発達させる工程とを含む。そのような方法において、卵母細胞は、概して、死亡動物から回収されるが、それらは、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかからも単離され得る。卵母細胞は、除核前に当業者に既知の様々な培地中で成熟させられ得る。卵母細胞の除核は、当業者に周知のいくつかの方法で実施され得る。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、通常、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射による。融合は、接触／融合面（電気融合）にわたるＤＣ電気パルスの印加によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、又はセンダイウイルスなどの不活性化ウイルスによって誘発されてもよい。再構成細胞は、典型的には、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、中、及び／又は後に、電気及び／又は非電気手段によって活性化される。活性化方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子による侵入、卵母細胞内の二価陽イオンのレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤などによる）細胞タンパク質のリン酸化の低減が挙げられる。活性化された再構成細胞又は胚は、典型的には、当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移される。例えば、米国第２００８００９２２４９号、国際公開第ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国第２００４０１７７３９０号、国際公開第ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有する遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を含む宿主胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植されて、Ｆ０動物を生み出す。遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座を有する動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を介して特定され得る。
【０１１９】
一実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有する遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を含む宿主胚は、好適な宿主への移植前に１、２、３、又は４日間以上にわたって、ＸＹの繁殖力のある雌ＥＳ細胞の発達を促進する培地（すなわち、低塩基本培地）中で維持される。そのような方法は、Ｆ０の繁殖力のある雌動物の生成への有利な働きを可能にする。
【０１２０】
一実施形態では、培養された宿主胚は、代理母に移植され、培養された宿主胚は、代理母内で懐胎する。
【０１２１】
特定の実施形態では、宿主胚内への非ヒト動物ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）の導入、及び続く宿主胚の懐胎後に、少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％  ８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のＦ０非ヒト動物が、ＸＹ雌であり、性成熟に達すると、Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物は、繁殖力を持つ。
【０１２２】
Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる標的化された遺伝子修飾を有するＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含む少なくとも１つの異種幹細胞を有する、内細胞塊を含む、Ｆ０胚が更に提供される。
【０１２３】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物を生成するための本明細書に記載される様々な方法は、（１）Ｓｒｙポリペプチドのレベル及び／又は活性を低減するための遺伝子修飾、並びに特定の実施形態では、（２）対象となるポリヌクレオチドにおける１つ以上の追加の標的化された遺伝子修飾を有する、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を採用することができる。本明細書の別の個所で概説されるように、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの追加の標的化された遺伝子修飾が、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）中で行われ得る。そのような場合、Ｆ０の繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物は、これらの追加の標的化された遺伝子修飾のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１２４】
他の実施形態では、Ｆ０の繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物は、その生存期間中に１、２、３、４、５、６、７、８、又は９匹の同腹子を生み出す。一実施形態では、Ｆ０の繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物は、一腹当たり少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０匹の子孫を生み出す。一実施形態では、Ｆ０の繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物は、一腹当たり約４〜６匹の子孫を生み出す。一実施形態では、Ｆ０の繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト動物は、２〜６匹の子孫を生み出し、各同腹子は、少なくとも２、３、４、５、又は６匹の子孫を有する。一実施形態では、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の子孫が、ＸＹの繁殖力のある雌の子孫である。
【０１２５】
げっ歯類の同腹子（すなわち、マウス又はラットの同腹子）を生成するための方法もまた提供され、宿主胚内に、本明細書に記載される方法に従って調製された、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を有するＸＹ多能性及び／又は全能性ドナー細胞（すなわち、ＸＹドナーＥＳ細胞又はＸＹドナーｉＰＳ細胞）を導入することと、好適な分離母内で胚を懐胎させることと、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌げっ歯類である、少なくとも１つのＸＹ雌げっ歯類を含む、Ｆ０子孫を得ることとを含む。一実施形態では、性成熟に達すると繁殖力を持つ、Ｆ０  ＸＹ雌げっ歯類の出生率は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、又は１００％である。
【０１２６】
他の実施形態では、そのような方法から生まれたＦ０子孫は、約３％、約１０％若しくはそれよりも多く、又は約６３％若しくはそれよりも多くが遺伝子修飾されたドナーＸＹ細胞由来である。
【０１２７】
本明細書に提供される方法及び組成物は、Ｆ０動物のうちの少なくとも１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又はそれよりも多くが、Ｆ１子孫に遺伝子修飾を伝達するための標的化された遺伝子修飾（すなわち、Ｓｒｙタンパク質レベル及び／若しくは活性の減少、並びに／又は対象となるポリヌクレオチドへの標的化された遺伝子修飾）を有することを可能にする。
【０１２８】
一実施形態では、Ｆ０世代の雌ＸＹ非ヒト動物及び／又は雄ＸＹ非ヒト動物は、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、又は９９．８％がドナー細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０雌ＸＹ非ヒト動物及び／又はＦ０雄ＸＹ非ヒト動物は、１００％がドナー細胞由来である毛色を有する。
【０１２９】
一実施形態では、Ｆ０世代における非ヒト雌ＸＹ動物は、げっ歯類（すなわち、マウス又はラット）であり、１００％がドナー細胞由来の毛色を有する。一実施形態では、Ｆ０世代において形成された非ヒト雌ＸＹ非ヒト動物は、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は９９．８％がＸＹドナー細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０世代における非ヒト雌ＸＹ動物は、約１００％がドナー細胞由来である。一実施形態では、Ｆ０世代における非ヒト雌ＸＹ動物に対する宿主胚細胞の寄与は、２，０００個中１個の細胞（０．０５％）を検出することが可能である定量的アッセイによって決定され、雌ＸＹ動物のどの組織も宿主胚細胞の寄与に対して陽性ではない。
【０１３０】
ｉｉ．雌の繁殖力のあるＸＹ  Ｆ０世代を繁殖させる様々な方法
特定の実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる遺伝子修飾を有するＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）由来の、得られる雌の繁殖力のあるＸＹ  Ｆ０世代は、Ｆ１世代の子孫を得るために動物と交配させられる。特定の実施形態では、雌の繁殖力のあるＸＹ  Ｆ０は、野生型動物と交配させられる。一実施形態では、雌ＸＹ  Ｆ０非ヒト哺乳動物は、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ。特定の実施形態では、野生型マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６である。Ｆ１子孫は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の減少を含む標的化された遺伝子修飾が存在するかを決定するための特異的なプライマー及び／又はプローブを使用して、遺伝子型決定され得る。更に、追加の標的化された遺伝子修飾がＦ０世代において存在した場合、Ｆ１子孫は、そのような修飾が存在するかを決定する特異的なプライマー及び／又はプローブを使用して、遺伝子型決定され得る。次いで、所望の使用のための適切なＦ１子孫が、特定され得る。特定の実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減した遺伝子修飾を欠くＦ１子孫が選択される。他の実施形態では、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減した遺伝子修飾を欠き、かつ少なくとも１つの追加の標的化された遺伝子修飾を含むＦ１子孫が選択される。
【０１３１】
１つの非限定的な実施例では、特異的なプライマー及び／又はプローブによる遺伝子型決定後に、対象となるポリヌクレオチドへの標的化された遺伝子修飾に関してヘテロ接合性であり、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を低減する標的化された修飾を欠くＦ１動物が、互いに交配させられる。そのような交配は、対象となる遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座に関してホモ接合性であり、かつＳｒｙタンパク質レベル及び／又は活性を低減するための遺伝子修飾を含まない、Ｆ２子孫を生み出す。
【０１３２】
Ｆ１世代における標的化された遺伝子修飾に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法が更に提供される。本方法は、（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる標的化された遺伝子修飾を有するＦ０  ＸＹの繁殖力のある雌非ヒト動物を、Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト動物と交配させることであって、Ｆ０  ＸＹの繁殖力のある雌非ヒト動物及びＦ０  ＸＹ雄非ヒト動物はそれぞれ、対象となるポリヌクレオチドの同じ遺伝子修飾に関してヘテロ接合性である、交配させることと、（ｂ）対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫を得ることと、を含む。特定の実施形態では、選択されたＦ１子孫は、対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された遺伝子修飾に関してホモ接合性であり、かつＳｒｙタンパク質の活性及び／又はレベルを減少させる標的化された遺伝子修飾を欠く。そのような方法は、同じＦ０世代において、それぞれが完全にドナーＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の、非ヒト動物の繁殖対を発達させるために採用され得る。
【０１３３】
様々な方法が、上記のＦ０動物を得るために採用され得る。１つの非限定的な実施形態では、任意の染色体上の対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾を有するＸＹ細胞クローンが単離される。様々な方法が、対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾を発生させるために使用され得ることが認識される。第２の工程において、標的化された修飾は、修飾がＳｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させるように、Ｓｒｙ遺伝子に導入される。そのような方法は、本明細書の別の個所で詳細に記載されるように、ＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地中でＸＹ  ＥＳ細胞を培養することを更に採用する。Ｓｒｙ遺伝子の標的化された修飾の方法は、本明細書の別の個所で詳細に開示され、例えば、単独での、又は本明細書の別の個所で記載されるヌクレアーゼと組み合わせた（すなわち、Ｔａｌｅｎ又はＣＲＩＳＰＲ−若しくはＺＦＮ−系）、標的化ベクター（ＬＴＶＥＣを含む）の使用を含むことができる。対象となるポリヌクレオチドにおける第１の標的化された修飾、並びにＳｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させるＳｒｙ遺伝子の第２の標的化された修飾の両方を含むサブクローンが、単離される。対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾を有する元のＸＹクローン、並びにＳｒｙ遺伝子及び対象となるポリヌクレオチドへの標的化された修飾の両方を含むＸＹサブクローンの両方が、本明細書の別の個所で考察されるように、別々の宿主胚内に導入される。特定の実施形態では、非ヒト宿主胚は、前桑実胚（すなわち、８細胞期胚）を含む。修飾された多能性細胞を含む非ヒト宿主胚のそれぞれは、懐胎のために代理母内に導入される。代理母のそれぞれは、標的ゲノム修飾を含むＦ０子孫（すなわち、対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾を有するＦ０  ＸＹ雄、並びに対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾を有し、かつＳｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる遺伝子修飾を有するＦ０  ＸＹの繁殖力のある雌）を生み出す。特定の実施形態では、標的化されたゲノム修飾のそれぞれは、生殖系列を通じて伝達されることが可能である。これらのＦ０動物のそれぞれは、互いと交配させられて、対象となるポリヌクレオチドにおけるホモ接合性の標的化された修飾を含むＦ１動物を生成する。Ｆ１世代の４分の１が、対象となるポリヌクレオチドにおける標的化された修飾に関してホモ接合性であることが予想される。Ｆ１子孫は、Ｓｒｙ遺伝子への標的化された修飾を保持するように選択され得るか、又はＦ１子孫は、Ｓｒｙ遺伝子への標的化された修飾を保持しないように選択され得る。
【０１３４】
別の実施形態では、標的化ベクター（及び特定の実施形態では、Ｔａｌｅｎ、Ｃｒｉｓｐｒ、又はＺｆｎなどのヌクレアーゼ）を採用するＳｒｙ遺伝子の標的化された修飾の導入は、対象となるポリヌクレオチドの遺伝子修飾のためのベクター標的化と同時に生じ得る。そのような方法は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させ、かつ対象となるポリヌクレオチドへの標的化された修飾を更に含む、遺伝子修飾の両方を有する、ＸＹ  ＥＳ細胞の生成を可能にする。
【０１３５】
一実施形態では、Ｆ１世代子孫は、完全にドナーＥＳ細胞由来のゲノムを含む。他の実施形態では、完全にＥＳ細胞由来のマウスを生じさせるＦ０世代雄及びＦ０世代雌マウスの交配の頻度は、１００％である。
【０１３６】
ＩＩ．困難な標的ゲノム遺伝子座又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法及び組成物
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする方法及び組成物が提供される。「困難な」ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする方法が更に提供される。用語「困難な遺伝子座」は、従来の遺伝子標的化戦略による標的化が難しい染色体領域を含む。そのような遺伝子座は、Ｙ染色体、Ｘ染色体、又は常染色体上に位置し得る。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、遺伝子に乏しい、反復に富む、かつ／又は主に異質染色質の染色体領域内、又はそれに近接して位置する。例えば、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１：７６００〜７６０５（２０１４）を参照されたい。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、染色体ＤＮＡへの接近可能性が染色質構造によって制限される染色体領域内、又はそれに近接して位置する。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、少なくとも約およそ２０％、少なくとも約およそ３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％の異質染色質などの高い割合の異質染色質を特徴とする染色体領域内にあるか、又はそれに近接している。ある特定の実施形態では、困難な遺伝子座は、複製及び再配列を受けているか、又は反復若しくは逆方向反復の存在を特徴とする染色体領域内にあるか、又はそれに近接している。例えば、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｂｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７９５３〜７９５７（１９９２）を参照されたい。
【０１３７】
用語「染色質」は、細胞遺伝物質を細胞内に格納するためにそれを緊密化及び組織化する、核タンパク質複合体を含む。用語「異質染色質」は、非常に凝縮された状態であり、かつ概して転写的にサイレントであるゲノム中の領域を含む。異質染色質は、概して、より密にコイル状であり、かつ概して、真性染色質よりも反復的なＤＮＡ配列を有する。用語「真性染色質」は、転写的に活性かつ接近可能であることの多い、より伸長され、かつあまり凝縮されていない染色質ドメインを特徴とするゲノム中の領域を含む。
【０１３８】
用語「曝露すること」は、所望の構成成分がごく近接させられるか、又は直接接触させられる任意の方法を使用することを含む。
【０１３９】
細胞中の困難な標的ゲノム遺伝子座又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする方法及び組成物が提供される。おそらくＹ染色体の独特な構造特徴によって、Ｙ連鎖遺伝子上で突然変異を発生させるためのマウス胚性幹細胞中の従来の遺伝子標的戦略は、限られた成功しか収めていない。したがって、多くの場合、マウスのＹ連鎖遺伝子の機能の理解は、自然欠失、ランダム遺伝子トラップ挿入、又は常染色体導入遺伝子を有するマウスの研究から得られた洞察に限られる。本明細書に提供される方法は、ヌクレアーゼ剤の非存在下で、又はそれと組み合わせて標的化ベクターを採用することによって、Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座の標的化を可能にする。
【０１４０】
いくつかのそのような方法は、小さな標的化ベクター又はｓｍａｌｌＴＶＥＣを利用する。「ｓｍａｌｌＴＶＥＣ」は、短いホモロジーアームを含む標的化ベクターを含む。ｓｍａｌｌＴＶＥＣ上のホモロジーアームの長さは、約４００〜１０００ｂｐであってもよい。ｓｍａｌｌＴＶＥＣのホモロジーアームは、例えば、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、又は約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐを含む、対応する標的部位を有する相同組み換え事象を促進するのに十分である任意の長さであってもよい。ｓｍａｌｌＴＶＥＣ上のホモロジーアームの好ましい長さは、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである。別の実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂである。そのような方法では、ホモロジーアームの短い長さは、より長いホモロジーアームを有する標的化ベクターと比較して、標的化の効率性を高める。高頻度反復配列を有するＹ染色体の性質により、ｓｍａｌｌＴＶＥＣの短いアームは、Ｙ染色体上の高度に特異的な標的化を可能にする。
【０１４１】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供され、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。特定の実施形態では、標的化ベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。いくつかの実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣが採用される。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。同様の方法が、困難な標的ゲノム遺伝子座を標的化するときに実施され得る。１つの非限定的な実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地を採用し、それによりＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌動物を生成して実施される。他の場合において、本明細書に記載される方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、Ｓｒｙ遺伝子における標的化された遺伝子修飾を生じさせるために採用される。
【０１４２】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が更に提供され、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、並びに（ｉｉ）第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。特定の実施形態では、標的化ベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。いくつかの実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣが採用される。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。同様の方法が、困難な標的ゲノム遺伝子座を標的化するときに実施され得る。１つの非限定的な実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地を採用し、それによりＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌動物を生成して実施される。他の場合において、本明細書に記載される方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、Ｓｒｙ遺伝子における標的化された遺伝子修飾を生じさせるために採用される。
【０１４３】
標的化ベクター、ｓｍａｌｌＴＶＥＣ、又はＬＴＶＥＣを採用するＹ染色体上のゲノム遺伝子座（又は任意の困難なゲノム遺伝子座）における標的化された修飾を発生させるための本明細書に開示される様々な方法が、任意の細胞型で実施され得、ＸＹ多能性及び／又は全能性細胞に限定されないことが認識される。そのような細胞型としては、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、又は任意の他の宿主細胞が挙げられるがこれらに限定されない。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚（ＥＳ）細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞が挙げられる。
【０１４４】
本明細書に提供される様々なヌクレアーゼ剤のいずれかを採用する、Ｙ染色体上の大きい欠失を発生させるための方法が更に開示される（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、又はＴＡＬＥＮと組み合わせたＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡ）。Ｙ染色体上のそのような欠失は、内因性核酸配列の欠失であってもよい。欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約９００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及び得る。一実施形態では、欠失は、５００ｋｂよりも大きい。別の実施形態では、欠失は、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂである。特定の実施形態では、欠失は、約５００ｋｂである。Ｙ染色体上のそのような欠失は、任意の核酸配列の欠失であってもよい。一実施形態では、欠失は、繁殖性／非繁殖性と関連する遺伝子を含む。Ｙ染色体上の欠失は、複数の遺伝子の欠失を含むことができる。そのような方法では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれよりも多くの遺伝子が、削除され得る。特定の実施形態では、Ｋｄｍ５ｄ遺伝子（リシン（Ｋ）特異的デメチラーゼ５ｄ、例えば、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２０５９２（ハツカネズミ））及び／又はＵｓｐ９ｙ遺伝子（ユビキチン特異的ペプチダーゼ９、Ｙ連鎖、例えば、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １０７８６８（ハツカネズミ））が欠失のために標的化される。他の実施形態では、Ｓｒｙ遺伝子が欠失のために標的化される。
【０１４５】
Ａ．ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤のための認識部位
用語「ヌクレアーゼ剤のための認識部位」は、ニック又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘発されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤のための認識部位は、細胞に対して内因性（若しくは天然）であってもよく、又は認識部位は、細胞に対して外因性であってもよい。特定の実施形態では、認識部位は、細胞に対して外因性であり、それにより、細胞のゲノム中で自然発生的ではない。なお更なる実施形態では、認識部位は、細胞に対して、かつ標的遺伝子座に位置付けられることが望まれる対象となるポリヌクレオチドに対して外因性である。更なる実施形態では、外因性又は内因性認識部位は、宿主細胞のゲノム中で一度のみ存在する。特定の実施形態では、ゲノム内で一度のみ生じる内因性又は天然部位が特定される。次いで、そのような部位は、内因性認識部位においてニック又は二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼ剤を設計するために使用され得る。
【０１４６】
認識部位の長さは異なり得、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対に対して約３０〜３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮに対して約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に対して約３６ｂｐ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに対して約２０ｂｐである認識部位を含む。
【０１４７】
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤の各単量体は、少なくとも９ヌクレオチドの認識部位を認識する。他の実施形態では、認識部位は、約９〜約１２ヌクレオチド長、約１２〜約１５ヌクレオチド長、約１５〜約１８ヌクレオチド長、又は約１８〜約２１ヌクレオチド長、及びそのような部分範囲の任意の組み合わせ（例えば、９〜１８ヌクレオチド）である。所与のヌクレアーゼ剤が認識部位と結合し、その結合部位を開裂することができるか、あるいはヌクレアーゼ剤が認識部位とは異なる配列と結合することができることが認識される。更に、認識部位という用語は、ニック／開裂部位がヌクレアーゼ剤結合部位の内側又は外側にあるかどうかにかかわらず、ヌクレアーゼ剤結合部位及びニック／開裂部位の両方を含む。別の変化形において、ヌクレアーゼ剤による開裂は、互いにすぐ反対側のヌクレオチド位置で生じて、平滑末端切断を生じさせ得るか、又は他の場合において、切断が段違いであり、５’突出若しくは３’突出のいずれかであってもよい、「付着末端」とも呼ばれる一本鎖突出を生じさせ得る。
【０１４８】
所望の認識部位へのニック又は二本鎖切断を誘発する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。自然発生的又は天然ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位でのニック又は二本鎖切断を誘発する限り採用され得る。あるいは、修飾又は操作されたヌクレアーゼ剤が採用され得る。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位でのニック又は二本鎖切断を特異的に認識及び誘発するようにその天然の形態から操作される（修飾される、又は誘導される）ヌクレアーゼを含む。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の自然発生的なヌクレアーゼ剤由来であってもよく、又はそれは、人工的に作られるか、若しくは合成され得る。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質開裂剤中の１つのアミノ酸、又は核酸開裂剤中の１つのヌクレオチドほどわずかであってもよい。いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、認識部位でのニック又は二本鎖切断を誘発し、この認識部位は、天然（操作又は修飾されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではなかった。認識部位又は他のＤＮＡでニック又は二本鎖切断を生じさせることは、認識部位又は他のＤＮＡを「切断」又は「開裂」することと本明細書で称され得る。
【０１４９】
例示的な認識部位の活性変異体及びフラグメントもまた提供される。そのような活性変異体は、所与の認識部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、生物活性を保持し、したがって、配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識及び開裂されることが可能である。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定するためのアッセイは、当該技術分野において既知である（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６：２９５〜３０７）。
【０１５０】
特定の実施形態では、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置付けられる。そのような位置は、選択マーカーのコード領域内、又は選択マーカーの発現に影響を及ぼす制御領域内に位置し得る。したがって、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカー、プロモーター、エンハンサー、制御領域、又は選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域のイントロン内に位置し得る。特定の実施形態では、認識部位におけるニック又は二本鎖切断は、選択マーカーの活性を妨害する。機能的な選択マーカーの存在又は非存在についてアッセイするための方法は、既知である。
【０１５１】
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核又は真核生物のゲノム中の特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用され得る、配列特異的ヌクレアーゼの種類である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然の、若しくは操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、又はその機能部を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインと融合させることによって作られる。独特のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特異的なＤＮＡ標的部位を認識するように操作され得、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用され得る。国際公開第ＷＯ  ２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ  ＆  Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  １：４２８〜４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７〜７６１、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１４３〜１４８を参照されたく、これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５  Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４  Ａ１号、２０１１／０１４５９４０  Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０
Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９  Ａ１号、同第２００５／００２６１５７  Ａ１号、同第２００５／００６４４７４  Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７  Ａ１号、及び同第２００６／００６３２３１  Ａ１号に開示される（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。様々な実施形態では、例えば、対象となる遺伝子座又は対象となるゲノム遺伝子座において、標的核酸配列中、又はその近くで切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、標的核酸配列は、標的化ベクターによって修飾される配列にあるか、又はその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物と共に使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載されるような標的化ベクターによって修飾される標的核酸配列において、又はその近くで結合するように特異的に設計されるＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。
【０１５３】
一実施形態では、ＴＡＬＥＮの各単量体は、２つの高度可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３〜３５個のＴＡＬ反復を含む。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態では、独立ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインとを含み、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに操作可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬ反復ベースのＤＮＡ結合ドメインは、異なる長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは、標的配列において二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作るように二量体になる。
【０１５４】
本明細書に開示される様々な方法及び組成物で採用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を更に含むことができる。一実施形態では、ＺＦＮの各単量体は、３個以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐサブサイトと結合する。他の実施形態では、ＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに操作可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態では、独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとを含み、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに操作可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーによって隔てられた標的ＤＮＡ配列の各鎖において２つの隣接標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行うための活性ヌクレアーゼを作り出す。例えば、米国第ＵＳ２００６０２４６５６７号、米国第ＵＳ２００８０１８２３３２号、米国第ＵＳ２００２００８１６１４号、米国第ＵＳ２００３００２１７７６号、国際公開第ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２号、米国第ＵＳ２０１３０１２３４８４号、米国第ＵＳ２０１００２９１０４８号、国際公開第ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２号、及びＧａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７〜４０５を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
更に別の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づく４つのファミリーに分類されており、このファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ、及びＨｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型性に対する耐性が注目すべき点である。メガヌクレアーゼドメイン、構造、及び機能は既知であり、例えば、Ｇｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８：１９９〜２４８、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：９６０〜９、Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４〜２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９〜９５、及びＭｏｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照されたい。いくつかの実施例では、自然発生的変異体、及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補助因子相互作用、発現、最適条件、及び／又は認識部位特異性を変更するための、かつ活性のスクリーニングのための方法は既知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２９５２〜６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：８９５〜９０５、Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３４：９９３〜１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
３０：３８７０〜９、Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３１〜４１、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：４７９１〜８００、Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１５４、国際公開第ＷＯ２００５１０５９８９号、同第ＷＯ２００３０７８６１９号、同第ＷＯ２００６０９７８５４号、同第ＷＯ２００６０９７８５３号、同第ＷＯ２００６０９７７８４号、及び同第ＷＯ２００４０３１３４６号を参照されたい。
【０１５６】
Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、又はこれらの任意の活性変異体若しくはフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない、任意のメガヌクレアーゼが本明細書で使用され得る。
【０１５７】
一実施形態では、メガヌクレアーゼは、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全にマッチした標的配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
【０１５８】
ヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型エンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼを更に含むことができる。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位からの可変位置において開裂し、それは、開裂部位（認識部位）から離れた数百もの塩基対であり得る。ＩＩ型系において、制限活性は、任意のメチラーゼ活性とは無関係であり、開裂は、典型的には、結合部位内、又はその近くの特定の部位において生じる。ほとんどのＩＩ型酵素が回文配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非回文認識部位を認識し、かつ認識部位の外側で開裂し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で２回配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称認識部位を認識し、片側で、かつ認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの画定された距離において開裂する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的化する。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ  ３１：４１８〜２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５〜１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１〜７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）で更に記載及び分類される。
【０１５９】
様々な方法及び組成物で採用されるヌクレアーゼ剤はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も含むことができる。そのような系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを採用することができ、それは、場合によっては、それが発現させられる所望の細胞型のためにコドン最適化される。その系は、コドン最適化Ｃａｓ９と機能する融合ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物を更に採用する。この単一ＲＮＡは多くの場合、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡ内で、ｃｒＲＮＡ部分は、所与の認識部位に対する「標的配列」として特定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは多くの場合、「足場」と称される。この系は、様々な真核及び原核細胞中で機能することが示されている。簡潔に述べると、標的配列を含有する短いＤＮＡフラグメントが、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの実施形態では、約２０ヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の形態（足場）、並びに細胞中で活性であり、かつ真核細胞中での適切な処理のために必要な要素である好適なプロモーターを含む。その系の多くは、二本鎖ＤＮＡを形成するためにアニールされ、次いで、ｇＲＮＡ発現プラスミドにクローン化される、カスタムの相補的オリゴに依存する。次いで、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットは、細胞に導入される。例えば、Ｍａｌｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３〜６、Ｊｉｎｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６〜２１、Ｈｗａｎｇ  ＷＹ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７〜９、Ｊｉａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１３
Ｍａｒ；３１（３）：２３３〜９、及びＣｏｎｇ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９〜２３を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
本明細書に開示される方法及び組成物は、細胞内のゲノムを修飾するために、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系、又はそのような系の構成成分を利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、又はその活性を誘導する、転写物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型系であってもよい。本明細書に開示される方法及び組成物は、核酸の部位特異的な開裂のためのＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する。
【０１６１】
本明細書に開示される方法で使用されるいくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非自然発生的である。「非自然発生的」な系は、系の１つ以上の構成成分がそれらの自然発生的な状態から改変若しくは突然変異されること、それらが本質的に自然に関連する少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないこと、又はそれらが自然に関連していない少なくとも１つの他の構成成分と関連していることなど、人の手の関与を示すいかなるものをも含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、一緒に自然発生しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む、非自然発生的ＣＲＩＳＰＲ複合体を採用する。
【０１６２】
（ｉ）Ａ．Ｃａｓ  ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ
Ｃａｓタンパク質は、概して、少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。そのようなドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、以下でより詳細に記載される）と相互作用することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質間相互作用ドメイン、二量化ドメイン、及び他のドメインを含むことができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸開裂のための触媒活性を有する。開裂は、核酸分子の共有結合の切断を含む。開裂は、平滑末端又は段違いの末端を生じさせることができ、それは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【０１６３】
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにこれらの相同体若しくは修飾バージョンが挙げられる。
【０１６４】
Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよく、又はＣａｓ９タンパク質由来であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、保存構造を有する４つの主要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス−サーモフィルス、ストレプトコッカス属、黄色ブドウ球菌、ノカルジオプシス−ダソンビレイ、ストレプトミセス−プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス−ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス−ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランギウム−ロセウム、ストレプトスポランギウム−ロセウム、アリサイクロバチルス−アシドカルダリウス（AlicyclobacHlus  acidocaldarius）、バチルス−シュードミコイデス、バチル
ス−セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム−シビリカム、ラクトバチラス−デルブリッキー、ラクトバチラス−サリバリウス、ミクロシラ−マリナ、バークホルデリア−バクテリウム、ポラロモナス−ナフタレニボランス、ポラロモナス属、クロコスファエラ−ワトソニイ、シアノセイス属、ミクロキスティス−エルギノーサ、シネココックス属、アセトハロビウム−アラビティカム、アンモニフェツクス−デゲンシイ、カルディセルロシルプター−ベシー、カンジデイタス−デサルホルディス、クロストリジウム−ボツリナム、クロストリジウム−ディフィシル、フィネゴルディア−マグナ、ナトロアナエロビウス−サーモフィルス、ペロトマクルム−サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス−カルダス、アシディチオバチルス−フェロオキシダンス、アロクロマチウム−ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス−ハロフィルス、ニトロソコッカス−ワトソニイ、シュードアルテロモナス−ハロプランクティス、クテドノバクター−ラセミファー、メタノハロビウム−エベスチガータム、アナベナ−バリアビリス、ノジュラリア−スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ−マキシマ、アルスロスピラ−プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレウス−クソノプラステス、オスキラトリア属、ペトロトガ−モビリス、サーモシフォ−アフリカヌス、又はＡアカリオクロリス−マリナ由来であってもよい。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、参照よりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ  ２０１４／１３１８３３号に記載される。化膿レンサ球菌からの、又はそれ由来のＣａｓ９タンパク質が、好ましい酵素である。化膿レンサ球菌からのＣａｓ９タンパク質には、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている。
【０１６５】
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の活性変異体又はフラグメントであってもよい。活性変異体又はフラグメントは、野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質又はこれらの一部分に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の開裂部位において切断する能力を保持し、したがって、ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性に対するアッセイは既知であり、概して、開裂部位を含有するＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１６６】
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び／又は酵素活性を増加又は減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の任意の他の活性又は特性を変化させるように修飾され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインは、修飾、欠失、若しくは不活性化され得るか、あるいはＣａｓタンパク質は、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するために、又はＣａｓタンパク質の活性を最適化（例えば、強化若しくは低減）するために切断され得る。
【０１６７】
いくつかのＣａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２個のヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、ＤＮＡ中で二本鎖切断を行うために、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２１を参照されたい。
【０１６８】
ヌクレアーゼドメインのうちの一方又は両方は、それらがもはや機能的ではないか、又はヌクレアーゼ活性が低減しているように、欠失又は突然変異され得る。ヌクレアーゼドメインのうちの一方が欠失又は突然変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、ニッカーゼと称され得、二本鎖切断ではなく、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列において一本鎖切断を発生させることができる（すなわち、それは、両方ではなく、相補鎖又は非相補鎖を開裂することができる）。ヌクレアーゼドメインの両方が欠失又は突然変異される場合、得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を開裂する能力の低減を有する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の一例は、化膿レンサ球菌からのＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０におけるアスパラギン酸塩からアラニン）突然変異である。同様に、化膿レンサ球菌からＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニン）又はＨ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例は、ストレプトコッカス−サーモフィルスからのＣａｓ９への対応する突然変異を含む。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第ＷＯ  ２０１３／１４１６８０号を参照されたい。そのような突然変異は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介性突然変異誘発、又は全遺伝子合成などの方法を使用して発生させられ得る。ニッカーゼを作る他の突然変異の例は、例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号及び同第ＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１号に見出すことができ、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、開裂ドメイン、後成的修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制因子ドメインと融合され得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ  ２０１４／０８９２９０号を参照されたい。Ｃａｓタンパク質はまた、増加又は減少した安定性を提供する異種ポリペプチドと融合され得る。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内に内部的に位置され得る。
【０１７０】
Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在性を提供する異種ポリペプチドと融合され得る。そのような異種ペプチドは、例えば、核を標的化するためのＳＶ４０  ＮＬＳなどの核局在シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含む。例えば、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置し得る。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸の区間を含むことができ、一分配列又は二分配列であってもよい。
【０１７１】
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインに結合され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列由来である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ  ２０１４／０８９２９０号を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置し得る。
【０１７２】
Ｃａｓタンパク質はまた、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなど、追跡又は精製を容易にするための異種ポリペプチドを含むことができる。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、ミドリイシ−シアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ−単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−単量体、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、クサビラーオレンジ、単量体クサビラーオレンジ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが挙げられる。
【０１７３】
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡなど、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物中のタンパク質への効率的な翻訳のために最適化されたコドンであってもよい。
【０１７４】
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結され得る。発現構築物としては、遺伝子又は他の対象となる核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を誘導することができ、かつそのような対象となる核酸配列を標的細胞に導入することができる、任意の核酸構築物が挙げられる。発現構築物中で使用され得るプロモーターとしては、例えば、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター細胞中で活性なプロモーターが挙げられる。他のプロモーターの例は、本明細書の別の個所で記載される。
【０１７５】
（ｉｉ）Ｂ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質と結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子を含む。ガイドＲＮＡは、２つの部分、すなわち「ＤＮＡ標的化セグメント」と「タンパク質結合セグメント」とを含むことができる。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの隣接区間など、分子のセグメント、セクション、又は領域を含む。いくつかのｇＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子、すなわち「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」とを含む。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、国際公開第ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１号、同第ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２号、同第ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２号、同第ＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１号、及び同第ＷＯ  ２０１４／１３１８３３Ａ１号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」は、二重分子ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
【０１７６】
例示的な二分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ反復」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「足場」）分子とを含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの区間の両方を含む。
【０１７７】
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他方の半分を形成するヌクレオチドの区間を含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間に相補的であり、かつそれとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。
【０１７８】
ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、加えて、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内の修飾のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３〜８２６、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２１、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７〜２２９、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３〜２３９、及びＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９〜８２３を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーションを介して、配列特異的な様式で標的ＤＮＡと相互作用する（すなわち、塩基対合）。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は異なってもよく、かつｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象となるｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡの任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。自然発生的ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９系及び生物によって異なるが、多くの場合、２１〜４６ヌクレオチド長の２つの直列反復（ＤＲ）が隣接した、２１〜７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含有する。化膿レンサ球菌の場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’位置のＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズし、このｔｒａｃｒＲＮＡが次いでＣａｓ９タンパク質と結合する。
【０１８０】
ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド長を有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有することができる。あるいは、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することができる。
【０１８１】
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列）に相補的であるＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化配列（すなわち、標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に相補的であるＤＮＡ標的化セグメント内の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。あるいは、ＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有することができる。場合によっては、ＤＮＡ標的化配列は、約２０ｎｔの長さを有することができる。
【０１８２】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長のｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び異なる長さであってもよい。それらは、一次転写産物又は処理された形態を含むことができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、又は二分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部又は一部分（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５以上、又はそれよりも多くのヌクレオチド）を含むか、又はそれからなってもよい。化膿レンサ球菌からの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１−ヌクレオチド、８９−ヌクレオチド、７５−ヌクレオチド、及び６５−ヌクレオチドバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６０２〜６０７、国際公開第ＷＯ  ２０１４／０９３６６１号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大で＋ｎ個のヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第８，６９７，３５９号を参照されたい。
【０１８３】
ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であってもよい。ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、約２０個の隣接ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってもよい。一例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の５’末端における１４個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％ほど低い。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチド長であると見なされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列との間の相補性の割合は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の５’末端における７個の隣接ヌクレオチドにわたって１００％であり、残りの部分にわたって０％ほど低い。そのような場合、ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチド長であると見なされ得る。
【０１８４】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つの区間を含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象となるｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントを介して、結合したＣａｓタンパク質を、標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。
【０１８５】
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特徴（例えば、修飾又は制御された安定性、細胞内標的化、蛍光標識を用いた追跡、タンパク質又はタンパク質複合体のための結合部位など）を提供する、修飾又は配列を含むことができる。そのような修飾の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による制御された安定性及び／又は制御された接近可能性を可能にするための）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン））を形成する配列、細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）にＲＮＡを標的化する修飾又は配列、追跡（例えば、蛍光分子との直接共役、蛍光検出を促進する部分との共役、蛍光検出を可能にする配列など）を提供する修飾又は配列、タンパク質（例えば、転写活性因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）のための結合部位を提供する修飾又は配列、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８６】
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）として、又は１つの分子（ｓｇＲＮＡ）としてのいずれかのＲＮＡの形態で、並びに任意に、Ｃａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別々のＲＮＡ分子（例えば、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別々のＤＮＡ分子として提供され得る。
【０１８７】
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに操作可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、例えば、多能性ラット、真核、哺乳類、非ヒト哺乳類、ヒト、げっ歯類、マウス、又はハムスター細胞中で活性であってもよい。場合によっては、プロモーターは、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。他のプロモーターの例は、本明細書の別の個所で記載される。
【０１８８】
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法によって調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写によって調製され得る（例えば、国際公開第ＷＯ  ２０１４／０８９２９０号及び同第ＷＯ  ２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製された、合成的に生み出された分子であってもよい。
【０１８９】
（ｉｉｉ）Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列
用語「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列」は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列を含むが、ただし、結合のための十分な条件が存在することを条件とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計される配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列とＤＮＡ標的化配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、ただしハイブリダイゼーションを引き起こし、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があることを条件とする。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、以下でより詳細に記載される、Ｃａｓタンパク質のための開裂部位も含む。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、それは、例えば、細胞の核若しくは細胞質内に、又はミトコンドリア若しくは葉緑体などの細胞のオルガネラ内に位置し得る。
【０１９０】
標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡによって標的化され得る（すなわち、それによって結合され得る、又はそれとハイブリダイズし得る、又はそれに相補的であり得る）。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件は、細胞中に通常存在する生理学的条件を含む。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）を参照されたい）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と呼ばれ得、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ばれ得る。
【０１９１】
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列の内側又は外側の部位で核酸を開裂することができる。「開裂部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生じさせる核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズされ、かつＣａｓタンパク質と複合体を形成されたｇＲＮＡを含む）は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列中、又はその近くで（例えば、そこから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対、又はそれを超える塩基対以内で）、一方又は両方の鎖の開裂をもたらし得る。開裂部位が、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合する核酸配列の外側にある場合、開裂部位はなおも「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列」内にあると見なされる。開裂部位は、核酸の一方のみの鎖又は両方の鎖上にあってもよい。開裂部位は、核酸の両方の鎖上の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生じさせる）、又は各鎖上の異なる部位にあってもよい（段違いの末端を生じさせる）。段違いの末端は、例えば、２つのＣａｓタンパク質によって生じ得、それらのそれぞれは、各鎖上の異なる開裂部位において一本鎖切断を生じさせ、したがって、二本鎖切断を生じさせる。例えば、突出配列が作られるように、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上で一本鎖切断を引き起こし得、第２のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第２の鎖上で一本鎖切断を引き起こし得る。場合によっては、第１の鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対、第２の鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列から隔てられる。
【０１９２】
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的開裂は、標的ＤＮＡ中の（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じ得る。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に隣接することができる。任意に、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列に、ＰＡＭが隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９の開裂部位は、ＰＡＭ配列の約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）上流又は下流であってもよい。場合によっては（例えば、化膿レンサ球菌からのＣａｓ９又は近縁のＣａｓ９が使用されるとき）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’であってもよく、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のすぐ３’である。したがって、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣ  Ｎ２−３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの相補鎖のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列のすぐ５’である。いくつかのそのような場合において、Ｎ１及びＮ２は相補的であり得、Ｎ１−Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ、Ｎ１＝Ｔ、及びＮ２＝Ａ）。
【０１９３】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の例は、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列に加えたそのようなＤＮＡ配列を含む。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓタンパク質によって認識されたＮＧＧモチーフのすぐ前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列であり得る（例えば、国際公開第ＷＯ  ２０１４／１６５８２５号を参照されたい）。５’末端におけるグアニンは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列の他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端において２つのグアニンヌクレオチドを含むことができる（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ、配列番号９）。例えば、国際公開第ＷＯ  ２０１４／０６５５９６号を参照されたい。
【０１９４】
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、細胞に内因性又は外因性の任意の核酸配列であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列若しくは非コード配列（例えば、制御配列）であってもよく、又は両方を含むことができる。
【０１９５】
一実施形態では、標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。一実施形態では、対象となる遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする、第３の核酸配列を含む。別の実施形態では、多能性ラット細胞のゲノムは、標的配列に相補的な標的ＤＮＡ領域を含む。いくつかのそのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む。いくつかのそのような方法では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載される配列を含む。いくつかのそのような実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号７又は配列番号８に記載される配列を含む。
【０１９６】
ヌクレアーゼ剤の活性変異体及びフラグメント（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）もまた提供される。そのような活性変異体は、天然ヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれを超える配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の認識部位において切断する能力を保持し、したがって、ニック又は二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から修飾され、かつ天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位におけるニック又は二本鎖切断を認識及び誘導するように設計され得る。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼは、対応する天然ヌクレアーゼ剤認識部位とは異なる認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニック又は二本鎖切断誘導活性に対するアッセイは既知であり、概して、認識部位を含有するＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
【０１９７】
ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野において既知の任意の手段によって細胞に導入されてもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入されてもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されるとき、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一次的に、条件付きで、又は構成的に発現され得る。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中に含有され、かつ条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターに操作可能に連結され得る。そのような対象となるプロモーターは、本明細書の別の個所で更に詳細に考察される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。
【０１９８】
特定の実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノム中に安定して組み込まれ、かつ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが挿入ポリヌクレオチドを含む同じ標的化ベクター内にある一方で、他の場合において、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターとは別であるベクター又はプラスミド内にある。
【０１９９】
ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通じて細胞に提供されるとき、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、対象となる細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、自然発生的ポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の対象となる宿主細胞を含む、所与の対象となる原核又は真核細胞中でより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。
【０２００】
Ｂ．困難なゲノム遺伝子座又はＹ染色体遺伝子座を修飾するための、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）又は小さな標的化ベクター（ＳｍａｌｌＴＶＥＣ）と組み合わせたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の採用
困難なゲノム遺伝子座又はＹ染色体の遺伝子座を修飾するための非限定的な方法は、少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡに染色体（すなわち、Ｙ染色体）を曝露することを含み、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及びＬＴＶＥＣへの曝露に続いて、染色体（すなわち、Ｙ染色体）は、少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように修飾される。
【０２０１】
本方法は、本明細書に記載されるＬＴＶＥＣ又はｓｍａｌｌＴＶＥＣのうちのいずれかを採用することができる。非限定的な実施形態では、ＬＴＶＥＣ又はｓｍａｌｌＴＶＥＣは、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。別の実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂである。
【０２０２】
困難な標的遺伝子座又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が更に提供され、（ａ）困難な標的遺伝子座又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞を提供することであって、標的ゲノム遺伝子座は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列を含む、提供することと、（ｂ）哺乳類細胞に、標的ゲノム遺伝子座に相同の標的化アームが隣接した第１の核酸を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、少なくとも１０ｋｂである、ＬＴＶＥＣと、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に操作可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の発現構築物と、（ｉｉｉ）ｇＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸に操作可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の発現構築物と、を導入することであって、第１及び第２のプロモーターは、哺乳類細胞中で活性である、導入することと、（ｃ）困難な標的ゲノム遺伝子座又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において標的化された遺伝子修飾を含む修飾された哺乳類細胞を特定することと、を含む。特定の実施形態では、第１及び第２の発現構築物は、単一の核酸分子上にある。他の実施形態では、Ｙ染色体の標的ゲノム遺伝子座は、Ｓｒｙ遺伝子座である。
【０２０３】
上記で概説されたように、一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質を含むことができる。別の実施形態では、ｇＲＮＡ標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する。
【０２０４】
本方法は、本明細書に記載されるＬＴＶＥＣ又はｓｍａｌｌＴＶＥＣのうちのいずれかを採用することができる。非限定的な実施形態では、ＬＴＶＥＣ又はｓｍａｌｌＴＶＥＣは、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂである。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。
【０２０５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を採用する様々な方法（又は本明細書に開示される任意の方法）は、例えば、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞、線維芽細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、又はハムスター細胞に実施され得る。細胞は、多能性細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞であってもよい。
【０２０６】
以下で詳細に考察されるように、上記で概説されたＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を採用、例えば使用した、非ヒト多能性細胞の困難なゲノム遺伝子座又はＹ染色体上の対象となるゲノム遺伝子座（すなわち、Ｓｒｙ遺伝子座）の修飾に続いて、生み出される遺伝子修飾された非ヒト多能性細胞は、非ヒト宿主胚内に導入され得、代理母内に修飾された多能性細胞を含む非ヒト宿主胚は、懐胎される。代理母は、標的化された遺伝子修飾を含むＦ０子孫を生み出す。特定の実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、生殖系列を通じて伝達されることが可能である。
【０２０７】
Ｃ．選択マーカー
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座を修飾することを可能にする、様々な選択マーカーが、本明細書に開示される方法及び組成物で使用され得る。そのようなマーカーは、本明細書の別の個所で開示され、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン、又はピューロマイシンなどの抗生物質への耐性を付与する選択マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。そのような発現カセット及びそれらの様々な制御成分は、本明細書の別の個所で更に詳細に考察される。
【０２０８】
Ｄ．標的ゲノム遺伝子座
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座における少なくとも１つの挿入ポリヌクレオチドの組み込みを可能にする、様々な方法及び組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座」は、挿入ポリヌクレオチドを組み込みたいＹ染色体上のＤＮＡの任意のセグメント又は領域を含む。
【０２０９】
標的化されているＹ染色体上のゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座は、細胞に対して天然であり得るか、あるいは、細胞の染色体に組み込まれたＤＮＡの異種又は外因性セグメントを含むことができる。ＤＮＡのそのような異種又は外因性セグメントは、導入遺伝子、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、又はゲノムＤＮＡの異種若しくは外因性領域を含むことができる。Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座は、例えば、認識部位、選択マーカー、すでに組み込まれた挿入ポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド、プロモーターなどを含む、標的化されたゲノム組み込み系のいずれかを含むことができる。あるいは、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は適切な宿主細胞中に含有された任意の他の操作されたゲノム領域内に位置し得る。したがって、特定の実施形態では、Ｙ染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座又は困難な標的ゲノム遺伝子座は、非ヒト哺乳動物、非ヒト細胞、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、若しくは任意の他の対象となる生物、又はこれらの組み合わせからの天然、異種、又は外因性ゲノム核酸配列を含むことができる。
【０２１０】
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座の非限定的な例としては、Ｓｒｙ遺伝子、Ｕｔｙ遺伝子、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ遺伝子、Ｄｄｘ３ｙ遺伝子、遺伝子、Ｕｂｅ１ｙ遺伝子、Ｔｓｐｙ遺伝子、Ｕｓｐ９ｙ遺伝子、Ｚｆｙ１遺伝子、及びＺｆｙ２遺伝子、並びにＫｄｍ５ｄ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｔｓｐｙ、Ｕｔｙ、Ｄｄｘ３ｙ、及びＵｓｐ９ｙ遺伝子を包含するＹ染色体上の領域が挙げられる。Ｙ染色体上のそのような遺伝子座は、非ヒト哺乳動物、哺乳動物、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、若しくは任意の他の対象となる生物、又はこれらの組み合わせ由来であり得る。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞が挙げられる。
【０２１１】
本明細書の別の個所で記載されるように、Ｓｒｙタンパク質の活性又はレベルの減少を有するＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（ＸＹ  ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞など）を含む、様々な方法及び組成物が提供される。Ｙ染色体上のゲノム遺伝子座を修飾するための本明細書に記載される様々な方法また、Ｙ染色体上に位置していない対象となるポリヌクレオチドへの標的化された遺伝子修飾を導入するためにも使用され得る。
【０２１２】
Ｅ．標的化ベクター及び挿入ポリヌクレオチド
上記で概説されたように、本明細書に提供される方法及び組成物は、単独で、又はヌクレアーゼ剤と組み合わせて標的化ベクターを採用する。「相同組み換え」は、従来、相同性の領域内の交差部位における２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡフラグメントの交換を指すために使用される。
【０２１３】
ｉ．挿入ポリヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「挿入ポリヌクレオチド」は、標的ゲノム遺伝子座において組み込むことが望まれるＤＮＡのセグメントを含む。特定の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、Ｙ染色体上にある。他の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、困難なゲノム遺伝子座である。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、１つ以上の発現カセットを含むことができる。所与の発現カセットは、発現に影響を及ぼす様々な制御成分と共に、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及び／又はレポーター遺伝子を含むことができる。挿入ポリヌクレオチド内に含まれ得る、対象となるポリヌクレオチド、選択マーカー、及びレポーター遺伝子の非限定的な例は、本明細書の別の個所で詳細に考察される。
【０２１４】
特定の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸を含むことができる。一実施形態では、ゲノム核酸は、動物、マウス、ヒト、非ヒト、げっ歯類、非ヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、鳥類、若しくは任意の他の対象となる生物、又はこれらの組み合わせ由来である。
【０２１５】
更なる実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、条件付き対立遺伝子を含む。一実施形態では、条件付き対立遺伝子は、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号に記載されるように、多機能性対立遺伝子である。特定の実施形態では、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に対するセンス配向における作動配列、及びセンス又はアンチセンス配向における薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、（ｂ）アンチセンス配向における、対象となるヌクレオチド配列（ＮＳＩ）及び反転モジュールによる条件付き（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロン及び反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する。例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい）、並びに（ｃ）（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠く、かつ（ｉｉ）センス配向におけるＮＳＩ及びアンチセンス配向におけるＣＯＩＮを含有する条件付き対立遺伝子を形成するために、第１のリコンビナーゼへの曝露後に組み換える、組み換え可能な単位を含む。
【０２１６】
挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂであってもよい。
【０２１７】
特定の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、部位特異的組み換え標的配列が隣接した核酸を含む。挿入ポリヌクレオチド全体に、そのような部位特異的組み換え標的配列が隣接し得る一方で、挿入ポリヌクレオチド内の任意の領域又は個々の対象となるポリヌクレオチドにもまた、そのような部位が隣接し得ることが認識される。本明細書で使用される場合、用語「組み換え部位」は、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、かつ組み換え事象のための基質としての役割を果たし得る、ヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「部位特異的リコンビナーゼ」は、２つの組み換え部位が単一核酸分子内、又は別々の核酸分子上で物理的に隔てられる、組み換え部位間の組み換えを促進することができる、酵素の群を含む。部位特異的リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられるがこれらに限定されない。部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリペプチドを細胞に導入することによって、又は部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することなどによって、任意の手段によって細胞に導入され得る。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチド内、又は別個のポリヌクレオチド内に位置し得る。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導性プロモーター、細胞に内因性であるプロモーター、細胞に異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は発達段階特異的プロモーターを含む、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。挿入ポリヌクレオチド又は挿入ポリヌクレオチド中の任意の対象となるポリヌクレオチドに隣接することができる部位特異的組み換え標的配列としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、及びこれらの組み合わせが挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０２１８】
他の実施形態では、部位特異的組み換え部位は、挿入ポリヌクレオチド内に含有される選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。そのような場合、標的化されたゲノム遺伝子座における挿入ポリヌクレオチドの組み込みに続いて、部位特異的組み換え部位間の配列は、除去され得る。
【０２１９】
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。そのような選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、若しくは単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結される。標的化されたゲノム遺伝子座に対象となるポリヌクレオチドを連続的にタイリングするとき、選択マーカーは、上記で概説されたように、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むことができる。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに、部位特異的組み換え標的配列が隣接する。
【０２２０】
挿入ポリヌクレオチドは、プロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を更に含むことができ、レポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ビーナス、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セルリアン、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータンパク質をコードする。そのようなレポーター遺伝子は、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内因性であるプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター様式、又は発達段階特異的プロモーターであってもよい。
【０２２１】
ｉｉ．標的化ベクター
標的化ベクターは、Ｙ染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座に、又は別の対象となる染色体上に挿入ポリヌクレオチドを導入するために採用される。標的化ベクターは、挿入ポリヌクレオチドを含み、挿入ポリヌクレオチドに隣接する上流及び下流ホモロジーアームを更に含む。挿入ポリヌクレオチドに隣接するホモロジーアームは、標的化されたゲノム遺伝子座内のゲノム領域に対応する。参照を容易にするために、標的化されたゲノム遺伝子座内の対応するゲノム領域は、本明細書において「標的部位」と称される。したがって、一実施例において、標的化ベクターは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した、第１の挿入ポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、それにより、標的化ベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと対応する標的部位との間で生じる相同組み換え事象を通じて、標的化されたゲノム遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの組み込みを補助する。
【０２２２】
標的化ベクターのホモロジーアームは、例えば、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、若しくは約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１００〜２００、若しくは２００〜３００キロベース以上の長さを含む、対応する標的部位を有する相同組み換え事象を促進するのに十分である任意の長さであってもよい。特定の実施形態では、標的化アームの合計は、少なくとも０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、又は少なくとも１０ｋｂである。他の実施形態では、ホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、又は約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである。以下で更に詳細に概説されるように、大きな標的化ベクターは、より大きい長さの標的化アームを採用することができる。
【０２２３】
標的化ベクターの上流及び下流ホモロジーアームに対応する標的化されたゲノム遺伝子座内の標的部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置する「認識部位に十分に近接」して位置する。本明細書で使用される場合、標的化ベクターの上流及び下流ホモロジーアームは、距離が認識部位におけるニック又は二本鎖切断後に標的部位とホモロジーアームとの間の相同組み換え事象の発生を促進するようなものであるとき、認識部位に「十分に近接して位置」する。したがって、特定の実施形態では、標的化ベクターの上流及び／又は下流ホモロジーアームに対応する標的部位は、所与の認識部位の少なくとも１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂ以内である。特定の実施形態では、認識部位は、標的部位のうちの少なくとも１つ又は両方に直接隣接する。
【０２２４】
選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の認識部位に対する、標的化ベクターのホモロジーアームに対応する標的部位の空間的関係は、異なり得る。例えば、両方の標的部位が認識部位に５’に位置し得る、両方の標的部位が認識部位に３’に位置し得る、又は標的部位は、認識部位に隣接し得る。
【０２２５】
特定の実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、（ｉ）５’ホモロジーアームに相同である５’標的配列と、（ｉｉ）３’ホモロジーアームに相同である３’標的配列とを含む。特定の実施形態では、５’標的配列及び３’標的配列は、少なくとも５ｋｂであるが３ｋｂ未満、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、又は少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、又は少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満、隔てられる。
【０２２６】
本明細書で使用される場合、ホモロジーアーム及び標的部位は、２つの領域が互いに対して十分な配列同一性のレベルを共有して、相同組み換え反応のための基質としての役割を果たすとき、互いに「対応する」又は「対応している」。「相同性」とは、対応する配列に対して同一であるか、又は配列同一性を共有するかのいずれかであるＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と標的化ベクター上で見出される対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組み換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、標的化ベクターのホモロジーアーム（又はそのフラグメント）及び標的部位（又はそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性であってもよい。更に、ホモロジーアームと対応する標的部位との間の相同性の対応領域は、開裂された認識部位における相同組み換えを促進するのに十分である任意の長さであってもよい。例えば、所与のホモロジーアーム及び／又は対応する標的部位は、ホモロジーアームが細胞のゲノム内の対応する標的部位との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約４００ｂｐ〜約５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約６００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約７００ｂｐ、約７００ｂｐ〜約８００ｂｐ、約８００ｂｐ〜約９００ｂｐ、若しくは約９００ｂｐ〜約１０００ｂｐ（本明細書の別の個所で記載されるｓｍａｌｌＴＶＥＣベクターに関して記載されるもの等）、又は少なくとも約５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１００〜２００、若しくは２００〜３００キロベース以上の長さ（本明細書の別の個所で記載されるＬＴＶＥＣベクターに関して記載されるものなど）である相同性の対応領域を含むことができる。
【０２２７】
参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書において上流及び下流ホモロジーアームと称される。この用語は、標的化ベクター内の挿入ポリヌクレオチドに対するホモロジーアームの相対位置に関する。
【０２２８】
したがって、標的化ベクターのホモロジーアームは、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を有する、又は困難な標的化された遺伝子座内の標的部位に対応するように設計される。したがって、ホモロジーアームは、細胞に天然であるゲノム遺伝子座に対応することができるか、あるいは、それらは、導入遺伝子、発現カセット、又はゲノムＤＮＡの異種若しくは外因性領域が挙げられるがこれらに限定されない、Ｙ染色体に組み込まれたＤＮＡの異種又は外因性セグメントの領域に対応することができる。あるいは、標的化ベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、又は適切な宿主細胞中に含有された任意の他の操作されたゲノム領域に対応することができる。なお更に、標的化ベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリーの領域に対応し得るか、又はそれ由来であってもよい。したがって、特定の実施形態では、標的化ベクターのホモロジーアームは、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、トリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、家畜哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、鳥類、又は任意の他の対象となる生物に天然、異種、又は外因性であるＹ染色体上のゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座に対応する。更なる実施形態では、ホモロジーアームは、従来の方法を使用しては標的化できない細胞のゲノム遺伝子座に対応するか、又はヌクレアーゼ剤によって誘導されたニック又は二本鎖切断の非存在下で、間違ってのみ、若しくは著しく低い効率性でのみ、標的化され得る。一実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡ由来である。
【０２２９】
更に他の実施形態では、上流及び下流ホモロジーアームは、標的化されたゲノムと同じゲノムに対応する。一実施形態では、ホモロジーアームは、関連したゲノム由来であり、例えば、標的化されたゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、標的化アームは、第２のマウスゲノム由来であり、第１の系統及び第２の系統は異なる。他の実施形態では、ホモロジーアームは、同じ動物のゲノム由来であるか、又は同じ系統のゲノム由来であり、例えば、標的化されたゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、標的化アームは、同じマウスから、又は同じ系統からのマウスゲノム由来である。
【０２３０】
標的化ベクター（大きな標的化ベクターなど）はまた、本明細書の別の個所で考察されるように、選択カセット又はレポーター遺伝子を含むことができる。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含むことができ、核酸配列は、プロモーターに操作可能に連結される。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内因性であるプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター様式、又は発達段階特異的プロモーターであってもよい。一実施形態では、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、及び単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、並びにこれらの組み合わせから選択される。標的化ベクターの選択マーカーは、上流及び下流ホモロジーアームが隣接し得るか、又はホモロジーアームに５’若しくは３’のいずれかで見出され得る。
【０２３１】
一実施形態では、標的化ベクター（大きな標的化ベクターなど）は、プロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ビーナス、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、エメラルド、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セルリアン、Ｔ−サファイア、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータンパク質をコードする。そのようなレポーター遺伝子は、細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内因性であるプロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター様式、又は発達段階特異的プロモーターであってもよい。
【０２３２】
１つの非限定的な実施形態では、クレアーゼ剤との標的化ベクター（例えば、大きな標的化ベクター）の組み合わせた使用は、標的化ベクター単独の使用と比較して標的化の効率性の増加をもたらす。一実施形態では、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と併用されるとき、標的化ベクターの標的化の効率性は、標的化ベクターが単独で使用されるときと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも１０倍増加する。
【０２３３】
ｉｉｉ．大きな標的化ベクター
本明細書で使用される場合、用語「大きな標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」は、細胞中で相同標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、かつそれら由来である、及び／又は細胞中で相同組み換え標的化を実施するよう意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、ホモロジーアームを含む、大きな標的化ベクターを含む。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム及び／又は挿入ポリヌクレオチドは、真核細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ、例えば、サザンブロッティング及びロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲによって、標的化事象のスクリーニングを可能にするには大きすぎる。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）由来のベクターが挙げられるがこれらに限定されない。ＬＴＶＥＣ及びそれらを作製するための方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第ＷＯ  ２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）号に記載され、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
ＬＴＶＥＣは、少なくとも約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ、約４０ｋｂ、約５０ｋｂ、約６０ｋｂ、約７０ｋｂ、約８０ｋｂ、約９０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂが挙げられるがこれらに限定されない、任意の長さであってもよい。
【０２３５】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂの範囲の挿入ポリヌクレオチドを含む。
【０２３６】
他の場合において、ＬＴＶＥＣ設計は、本明細書に記載されるように、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ又は約５ｋｂ〜約３．０Ｍｂである所与の配列の置き換えを可能にするようなものであってもよい。一実施形態では、置き換えは、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂである。
【０２３７】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、又はＰ１ファージライブラリー由来である。他の実施形態では、ホモロジーアームは、細胞の標的化されたゲノム遺伝子座由来であり、場合によっては、ＬＴＶＥＣが標的化するように設計される標的ゲノム遺伝子座は、従来の方法を使用しては標的化できない。更に他の実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡ由来である。
【０２３８】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣ中の上流ホモロジーアーム及び下流ホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂである。他の実施形態では、上流ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及ぶ。一実施形態では、下流ホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂに及ぶ。他の実施形態では、上流及び下流ホモロジーアームの合計は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである。一実施形態では、欠失のサイズは、ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計のサイズと同じ又は同様である。
【０２３９】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣは、本明細書の別の個所で考察されるように、選択カセット又はレポーター遺伝子を含む。
【０２４０】
ｉｖ．相同組み換えによってＹ染色体上の認識部位の近くに挿入ポリヌクレオチドを組み込む方法
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が提供され、（ａ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。同様の方法が、困難な染色体遺伝子座を標的化するために実施され得る。本明細書の別の個所で詳細に考察されるように、特定の実施形態では、標的化ベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。他の特定の実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣが採用される。１つの非限定的な実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地を採用し、それによりＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌動物を生成して実施される。他の場合において、本明細書に記載される方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、Ｓｒｙ遺伝子における標的化された遺伝子修飾を生じさせるために採用される。
【０２４１】
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法が更に提供され、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含むＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、（ｃ）Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む。同様の方法が、困難な標的遺伝子座を標的化するために実施され得る。本明細書の別の個所で詳細に考察されるように、特定の実施形態では、標的化ベクターの第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームの合計は、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、約０．５ｋｂ〜約１ｋｂ、約１ｋｂ〜約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ〜約２ｋｂ、約２ｋｂ〜約３ｋｂ、約３ｋｂ〜約４ｋｂ、約４ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂであるか、又は少なくとも１０ｋｂ若しくは少なくとも１０ｋｂかつ１５０ｋｂ未満である。特定の実施形態では、ＬＴＶＥＣが採用される。他の特定の実施形態では、ｓｍａｌｌＴＶＥＣが採用される。１つの非限定的な実施形態では、そのような方法は、本明細書に開示されるＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌の発達を促進する培地を採用し、それによりＸＹ  Ｆ０の繁殖力のある雌動物を生成して実施される。他の場合において、本明細書に記載される方法は、本明細書の別の個所で考察されるように、Ｓｒｙ遺伝子における標的化された遺伝子修飾を生じさせるために採用される。
【０２４２】
ゲノム標的遺伝子座において組み込まれた挿入ポリヌクレオチドを有する細胞を特定するために、様々な方法がまた採用され得る。ゲノム標的遺伝子座における挿入ポリヌクレオチドの挿入は、「対立遺伝子の修飾」をもたらす。用語「対立遺伝子の修飾」又は「ＭＯＡ」は、ゲノム中の遺伝子（複数可）又は染色体遺伝子座（複数又は単数）の１つの対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の修飾を含む。「対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）」の例としては、単一ヌクレオチドほどの小さい欠失、置換、若しくは挿入、又は対象となる遺伝子（複数可）又は染色体遺伝子座（複数又は単数）に及ぶ何キロベースもの欠失、並びにこれらの２つの最末端間のありとあらゆる可能な修飾が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４３】
様々な実施形態では、標的化された修飾の特定を促進するために、ハイスループット定量的アッセイ、すなわち、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイが採用される。本明細書に記載されるＭＯＡアッセイは、遺伝子修飾後に、親染色体中の修飾された対立遺伝子（複数可）の大規模スクリーニングを可能にする。ＭＯＡアッセイは、定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が挙げられるがこれに限定されない、様々な分析技術を介して実施され得る。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマープローブセットと、標的化されていない基準遺伝子座を認識する第２のプライマープローブセットとを含む。加えて、プライマープローブセットは、増幅配列を認識する蛍光プローブを含む。定量的アッセイはまた、蛍光媒介原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられるがこれらに限定されない、様々な分析技術を介して実施され得る。（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国第ＵＳ２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。
【０２４４】
様々な実施形態では、ニック又は二本鎖切断の存在下で、標的ゲノム遺伝子座における標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ又はｓｍａｌｌＴＶＥＣなど）の標的化の効率性は、ニック又は二本鎖切断の非存在下（例えば、対象となるゲノム遺伝子座において同じ標的化ベクター、並びに同じホモロジーアーム及び対応する標的部位を使用するが、ニック又は二本鎖切断を行う追加されたヌクレアーゼ剤の非存在下）よりも少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い。
【０２４５】
上記の様々な方法は、所与のＹ染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座への任意の数の挿入ポリヌクレオチドの標的化された組み込みを可能にするために連続的に反復され得る。したがって、これらの様々な方法は、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座への少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれよりも多くの挿入ポリヌクレオチドの挿入を可能にする。特定の実施形態では、そのような連続的なタイリング方法は、Ｙ染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座への、動物細胞又は哺乳類細胞（すなわち、ヒト、非ヒト、げっ歯類、マウス、サル、ラット、ハムスター、家畜哺乳動物、又は農業用動物）からの大きいゲノム領域の再構成を可能にする。そのような場合、コード及び非コード領域の両方を含むゲノム領域の導入及び再構成は、所与の領域の複雑性が、少なくとも部分的に、コード領域、非コード領域、及び天然ゲノム領域内に見出されるコピー数多型を保持することによって維持されることを可能にする。したがって、様々な方法が、例えば、任意の対象となる哺乳類細胞又は哺乳動物内で「異種」又は「外因性」ゲノム領域を生成するための方法を提供する。１つの非限定的な例において、非ヒト動物内の「ヒト化」ゲノム領域が生成される。
【０２４６】
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾することと共に、本明細書に開示される様々な方法及び組成物が、別の染色体上の標的化された遺伝子修飾も発生させるために採用され得ることが更に認識される。
【０２４７】
ｖ．対象となるポリヌクレオチド
任意の対象となるポリヌクレオチドが様々な挿入ポリヌクレオチドに含有され、それにより、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座において組み込まれてもよい。本明細書に開示される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６個、又はそれよりも多くの対象となるポリヌクレオチドが、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれることを可能にする。
【０２４８】
Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座又は困難な標的遺伝子座において組み込まれるときの挿入ポリヌクレオチド内の対象となるポリヌクレオチドは、細胞中に１つ以上の遺伝子修飾を導入することができる。遺伝子修飾は、内因性核酸配列の欠失、及び／又は標的ゲノム遺伝子座への外因性若しくは異種若しくはオーソロガスポリヌクレオチドの付加を含むことができる。一実施形態では、遺伝子修飾は、標的ゲノム遺伝子座における、内因性核酸配列の、対象となる外因性ポリヌクレオチドとの置き換えを含む。したがって、本明細書に提供される方法は、Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座中のノックアウト、欠失、挿入、置き換え（「ノックイン」）、点突然変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、制御配列スワップ、遺伝子スワップ、又はこれらの組み合わせを含む、遺伝子修飾の発生を可能にする。そのような修飾は、標的ゲノム遺伝子座への第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、又は任意の後続の挿入ポリヌクレオチドの組み込み後に生じてもよい。
【０２４９】
挿入ポリヌクレオチド内の、及び／若しくは標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に天然若しくは相同である配列を含むことができるか、対象となるポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に異種であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に外因性であってもよいか、対象となるポリヌクレオチドは、それが導入される細胞にオーソロガスであってもよいか、又は対象となるポリヌクレオチドは、それが導入される細胞とは異なる種由来であってもよい。本明細書で使用される場合、配列に関連した「相同」は、細胞に天然である配列である。本明細書で使用される場合、配列に関連した「異種」は、外来種に由来するか、又は同じ種由来である場合、意図的な人間の介入によって組成物及び／若しくはゲノム遺伝子座中でその天然の形態から実質的に修飾される配列である。本明細書で使用される場合、配列に関連した「外因性」は、外来種に由来する配列である。本明細書で使用される場合、「オーソロガス」は、別の種における既知の基準配列と機能的に同等である１つの種由来のポリヌクレオチドである（すなわち、種変異体）。対象となるポリヌクレオチドは、非ヒト、げっ歯類、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、鳥類、農業用哺乳動物、又は非農業用哺乳動物が挙げられるがこれらに限定されない、任意の対象となる生物由来であってもよい。対象となるポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、制御領域、又はゲノムＤＮＡを更に含むことができる。したがって、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び／又は後続の任意の挿入ポリヌクレオチドがそのような配列を含むことができる。
【０２５０】
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、マウス核酸配列、ヒト核酸、非ヒト核酸、げっ歯類核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、又は非農業用哺乳動物核酸に相同である。なお更なる実施形態では、標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、ゲノム核酸のフラグメントである。一実施形態では、ゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸、非ヒト核酸、げっ歯類核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳動物核酸、若しくは非農業用哺乳動物核酸、又はこれらの組み合わせである。
【０２５１】
一実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、上記のように、約５００ヌクレオチド〜約２００ｋｂに及ぶことができる。対象となるポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。
【０２５２】
挿入ポリヌクレオチド内の、及び／若しくはＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ｍｉＲＮＡをコードすることができ、長い非コードＲＮＡをコードすることができるか、あるいはそれは、例えば、制御配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写抑制因子結合配列を含む、任意の対象となる制御領域若しくは非コード領域、又は非タンパク質コード配列の欠失を含むことができるが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。加えて、挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において挿入された対象となるポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋肉系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、又はこれらの組み合わせにおいて発現されるタンパク質をコードすることができる。
【０２５３】
挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、コード配列中の遺伝子修飾を含むことができる。そのような遺伝子修飾としては、コード配列の欠失突然変異又は２つのコード配列の融合が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５４】
挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態では、変異タンパク質は、改変した結合特徴、改変した局所化、改変した発現、及び／又は改変した発現パターンを特徴とする。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上のゲノム標的遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、少なくとも１つの疾病対立遺伝子を含む。そのような場合、疾病対立遺伝子は、優性対立遺伝子であってもよく、又は疾病対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。更に、疾病対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含むことができる。変異タンパク質をコードする対象となるポリヌクレオチドは、変異タンパク質をコードする哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物ポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
【０２５５】
挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドはまた、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写抑制因子結合配列、又は転写終結因子配列を含む、制御配列を含むことができる。特定の実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内の、及び／又はＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座若しくは困難な標的遺伝子座において組み込まれた対象となるポリヌクレオチドは、非タンパク質コード配列の欠失を有するポリヌクレオチドを含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、制御配列の欠失を含む。別の実施形態では、制御要素の欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態では、制御要素の欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。そのような対象となるポリヌクレオチドは、変異タンパク質をコードする哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物ポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない、任意の生物由来であってもよい。
【０２５６】
本明細書に開示される様々な方法が、困難なゲノム遺伝子座又はＹ染色体遺伝子座（Ｓｒｙなど）における様々な修飾を発生させるために採用され得る。そのような修飾としては、例えば、内因性核酸配列の、相同若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、内因性核酸配列の欠失、又は内因性核酸配列（欠失は、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約６００ｋｂ、約６００ｋｂ〜約７００ｋｂ、約７００ｋｂ〜約８００ｋｂ、約８００ｋｂ〜約９００ｋｂ、約９００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ）、外因性核酸配列の挿入、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、若しくは約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶ外因性核酸配列の挿入、相同若しくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子の挿入、哺乳類細胞中で活性な第３のプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子の挿入、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２５７】
ＩＩＩ．配列の導入及びトランスジェニック動物の生成方法
上記で概説されたように、Ｙ染色体上に位置する、困難な標的遺伝子座における対象となる１つ以上のポリヌクレオチドの標的化された遺伝子修飾、又はＳｒｙタンパク質のレベル及び／若しくは活性の減少を可能にするための方法及び組成物が、本明細書に提供される。Ｙ染色体又は困難な標的染色体遺伝子座上の配列への標的化された遺伝子修飾に加えて、追加の標的化された遺伝子修飾が他の染色体に行われ得ることが更に認識される。これらの標的化された遺伝子修飾を可能にするそのような系は、様々な構成成分を採用することができ、参照を容易にするために、本明細書において、用語「標的化されたゲノム組み込み系」は、一般的に、組み込み事象のために必要とされる全ての構成成分を含む（すなわち、様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、標的化ベクター、標的ゲノム遺伝子座、及び対象となるポリヌクレオチド）。
【０２５８】
本明細書に提供される方法は、細胞中に、標的化されたゲノム組み込み系の様々な構成成分を含む１つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド構築物を導入することを含む。「導入すること」は、配列が細胞の内部に接近するような様式で、細胞に配列（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を提示することを意味する。本明細書に提供される方法は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞の内部に接近する限り、細胞中に標的化されたゲノム組み込み系の任意の構成成分を導入するための特定の方法に依存しない。様々な細胞型にポリヌクレオチドを導入するための方法は、当該技術分野において既知であり、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、及びウイルス媒介性方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、方法及び組成物で採用される細胞は、それらのゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を有する。「安定的に組み込まれた」又は「安定的に導入された」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込み、その子孫によって遺伝されるような、細胞中へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ＤＮＡ構築物又は標的化されたゲノム組み込み系の様々な構成成分の安定的な組み込みのために、任意のプロトコルが使用されてもよい。
【０２６０】
トランスフェクションプロトコル並びに細胞中にポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、異なり得る。非限定なトランスフェクション方法としては、化学系トランスフェクション方法が挙げられ、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２（２）：４５６〜６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４（４）：１５９０〜４、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６〜９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥデキストラン若しくはポリエチレンイミンなどの陽イオンポリマーの使用を含む。非化学的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学トランスフェクションが挙げられる。粒子系トランスフェクションとしては、遺伝子銃、磁性補助トランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，２７７〜２８）が挙げられる。ウイルス方法もまた、トランスフェクションのために使用され得る。
【０２６１】
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクター、ｓｍａｌｌＴＶＥＣ、又は大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と同時に細胞に導入される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ある期間にわたって、標的化ベクター、ｓｍａｌｌＴＶＥＣ、又はＬＴＶＥＣとは別に導入される。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤が標的化ベクター、ｓｍａｌｌＴＶＥＣ、又はＬＴＶＥＣの導入の前に導入される一方で、他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、標的化ベクター、ｓｍａｌｌＴＶＥＣ、又はＬＴＶＥＣの導入後に導入される。
【０２６２】
非ヒト動物は、本明細書に開示される様々な方法を採用して生成され得る。そのような方法は、（１）本明細書に開示される方法を採用して、非ヒト動物の多能性細胞のＹ染色体の標的化されたゲノム遺伝子座において１つ以上の対象となるポリヌクレオチドを組み込んで、Ｙ染色体の標的化されたゲノム遺伝子座中に挿入ポリヌクレオチドを含む遺伝学的に修飾された多能性細胞を生成することと、（２）Ｙ染色体の標的ゲノム遺伝子座において対象となる１つ以上のポリヌクレオチドを有する遺伝学的に修飾された多能性細胞を選択することと、（３）桑実期前において、非ヒト動物の宿主胚内に遺伝学的に修飾された多能性細胞を導入することと、（４）代理母内に、遺伝学的に修飾された多能性細胞を含む宿主胚を移植して、遺伝学的に修飾された多能性細胞由来のＦ０世代を生成することとを含む。同様の方法が、困難な標的染色体遺伝子座を標的化するために採用され得る。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物若しくは家畜哺乳動物、又は魚類又は鳥類であってもよい。
【０２６３】
多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物ＥＳ細胞、又は家畜哺乳動物ＥＳ細胞であってもよい。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる。そのような場合、多能性細胞は、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含むことができる。そのような細胞を培養して、Ｆ０の繁殖力のあるＸＹ雌動物の発達を促進する方法は、本明細書の別の個所で詳述される。
【０２６４】
核移植技術もまた、非ヒト哺乳動物を生成するために使用され得る。簡潔に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核する工程と、（２）除核卵母細胞と組み合わせるために、ドナー細胞又は核を単離する工程と、（３）細胞又は核を除核卵母細胞に挿入して、再構成細胞を形成する工程と、（４）再構成細胞を動物の子宮に移植して、胚を形成する工程と、（５）胚を発達させる工程とを含む。そのような方法において、卵母細胞は、概して、死亡動物から回収されるが、それらは、生存動物の卵管及び／又は卵巣のいずれかからも単離され得る。卵母細胞は、除核前に当業者に既知の様々な培地中で成熟させられ得る。卵母細胞の除核は、当業者に周知の多くの方法で実施され得る。再構成細胞を形成するための除核卵母細胞へのドナー細胞又は核の挿入は、通常、融合前の透明帯下でのドナー細胞の微量注射による。融合は、接触／融合面（電気融合）にわたるＤＣ電気パルスの印加によって、ポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質への細胞の曝露によって、又はセンダイウイルスなどの不活性化ウイルスによって誘発されてもよい。再構成細胞は、典型的には、核ドナー及びレシピエント卵母細胞の融合前、中、及び／又は後に、電気及び／又は非電気手段によって活性化される。活性化方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子による侵入、卵母細胞内の二価陽イオンのレベルの増加、及び卵母細胞内の（キナーゼ阻害剤などによる）細胞タンパク質のリン酸化の低減が挙げられる。活性化された再構成細胞又は胚は、典型的には、当業者に周知の培地中で培養され、次いで、動物の子宮に移される。例えば、米国第２００８００９２２４９号、国際公開第ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２号、米国第２００４０１７７３９０号、国際公開第ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１号、及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたく、これらのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
その生殖系列中に本明細書に記載されるような１つ以上の遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製するための他の方法が提供され、（ａ）本明細書に記載される様々な方法を採用して、原核細胞中の非ヒト動物のＹ染色体上の標的化されたゲノム遺伝子座を修飾することと、（ｂ）標的化されたゲノム遺伝子座における遺伝子修飾を含む修飾された原核細胞を選択することと、（ｃ）修飾された原核細胞のゲノムから遺伝子修飾された標的化ベクターを単離することと、（ｄ）非ヒト動物の多能性細胞中に、遺伝子修飾された標的化ベクターを導入して、Ｙ染色体の標的化されたゲノム遺伝子座において挿入核酸を含む遺伝学的に修飾された多能性細胞を生成することと、（ｅ）遺伝学的に修飾された多能性細胞を選択することと、（ｆ）桑実期前において、非ヒト動物の宿主胚内に遺伝学的に修飾された多能性細胞を導入することと、（ｇ）代理母内に、遺伝学的に修飾された多能性細胞を含む宿主胚を移植して、遺伝学的に修飾された多能性細胞由来のＦ０世代を生成することとを含む。そのような方法では、標的化ベクターは、大きな標的化ベクター又はｓｍａｌｌＴＶＥＣを含むことができる。同様の方法が、困難な標的遺伝子座を標的化するために採用され得る。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物、又は家畜哺乳動物であってもよい。多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、げっ歯類ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物ＥＳ細胞、又は家畜哺乳動物ＥＳ細胞であってもよい。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発達制限されたヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的化された遺伝子修飾は、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる。そのような場合、多能性細胞は、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞を含むことができる。そのような細胞を培養して、Ｆ０の繁殖力のあるＸＹ雌動物の発達を促進する方法は、本明細書の別の個所で詳述される。
【０２６６】
更なる方法では、単離工程（ｃ）は、（ｃ１）遺伝子修飾された標的化ベクター（すなわち、遺伝子修飾されたＬＴＶＥＣ）を線形化することを更に含む。なお更なる実施形態では、導入工程（ｄ）は、（ｄ１）多能性細胞中に、本明細書に記載されるようなヌクレアーゼ剤を導入することを更に含む。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｅ）は、原核細胞又は多能性細胞に、本明細書に記載されるような選択可能な薬剤を適用することによって実施される。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｅ）は、本明細書に記載されるような対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを介して実施される。
【０２６７】
原核細胞中の細菌相同組み換え（ＢＨＲ）を介して、動物細胞の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための更なる方法が提供され、（ａ）Ｙ染色体の標的ゲノム遺伝子座を含む原核細胞を提供することと、（ｂ）原核細胞中に、第１の上流ホモロジーアーム及び第１の下流ホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクター（上記のような）を導入することであって、挿入ポリヌクレオチドは、哺乳類ゲノム領域を含む、導入することと、原核細胞中に、第１の認識部位において、又はその近くでニック又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を導入することと、（ｃ）染色体の標的ゲノム遺伝子座において挿入ポリヌクレオチドを含む標的化された原核細胞を選択することであって、原核細胞は、ＢＨＲを仲介するリコンビナーゼを発現させることが可能である、選択することとを含む。同様の方法が、困難な標的遺伝子座を標的化するために採用され得る。工程（ａ）〜（ｃ）は、本明細書に開示されるように連続的に反復されて、原核細胞中の標的化されたゲノム遺伝子座における複数の挿入ポリヌクレオチドの導入を可能にすることができる。いったん標的化されたゲノム遺伝子座が原核細胞で「構築される」と、Ｙ染色体の修飾された標的ゲノム遺伝子座を含む標的化ベクターは、原核細胞から単離され、哺乳類細胞内のＹ染色体の標的ゲノム遺伝子座に導入され得る。Ｙ染色体の修飾されたゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞は、次いで、非ヒトトランスジェニック動物にされ得る。
【０２６８】
原核細胞中の細菌相同組み換え（ＢＨＲ）を介して、動物細胞の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための更なる方法が提供され、（ａ）Ｙ染色体の標的ゲノム遺伝子座を含む原核細胞を提供することと、（ｂ）原核細胞中に、第１の上流ホモロジーアーム及び第１の下流ホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクター（上記のような）を導入することであって、挿入ポリヌクレオチドは、哺乳類ゲノム領域を含む、導入することと、（ｃ）染色体の標的ゲノム遺伝子座において挿入ポリヌクレオチドを含む標的化された原核細胞を選択することであって、原核細胞は、ＢＨＲを仲介するリコンビナーゼを発現させることが可能である、選択することと、を含む。同様の方法が、困難な標的遺伝子座を標的化するために採用され得る。工程（ａ）〜（ｃ）は、本明細書に開示されるように連続的に反復されて、原核細胞中の標的化されたゲノム遺伝子座における複数の挿入ポリヌクレオチドの導入を可能にすることができる。いったん標的化されたゲノム遺伝子座が原核細胞で「構築される」と、Ｙ染色体の修飾された標的ゲノム遺伝子座を含む標的化ベクターは、原核細胞から単離され、哺乳類細胞内のＹ染色体の標的ゲノム遺伝子座に導入され得る。Ｙ染色体の修飾されたゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞は、次いで、非ヒトトランスジェニック動物にされ得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される標的ゲノム遺伝子座の様々な遺伝子修飾は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用した、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来のＬＴＶＥＣを使用した、細菌細胞中の一連の相同組み換え反応（ＢＨＲ）によって実施され得る（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（６）：６５２〜６５９を参照されたい）。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような様々な遺伝子修飾を含む、標的化されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、Ｘ  ＹＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）は、挿入ドナー細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介して、対応する生物からの桑実期前の胚、例えば、８細胞期マウス胚に導入される（例えば、それらの全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号、及び同第２００８−００７８０００  Ａ１を参照されたい）。遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、ＸＹ  ＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）を含む非ヒト動物胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母に移植されて、Ｆ０動物を生み出す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような様々な遺伝子修飾を含む標的化された哺乳類ＥＳ細胞は、胚盤胞期の胚内に導入される。Ｙ染色体の遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座を有する非ヒト動物は、本明細書に記載されるように、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）を介して特定され得る。遺伝子修飾されたＸＹ多能性及び／又は全能性細胞（すなわち、Ｘ  ＹＥＳ細胞又はＸＹ  ｉＰＳ細胞）由来の得られたＦ０世代の非ヒト動物は、野生型非ヒト動物と交配させられて、Ｆ１世代の子孫を得る。特異的なプライマー及び／又はプローブを用いた遺伝子型決定後に、遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座に関してヘテロ接合性であるＦ１の非ヒト動物は、互いと交配させられて、Ｙ染色体の遺伝子修飾されたゲノム遺伝子座に関して、又は遺伝子修飾された困難な標的遺伝子座に関してホモ接合性であるＦ２世代の非ヒト動物子孫を生み出す。
【０２７１】
ＩＶ．細胞及び発現カセット
本明細書に記載される様々な方法は、Ｙ染色体に対して、又は細胞中の困難な標的遺伝子座に対して、ゲノム遺伝子座標的化系を採用する。そのような細胞としては、大腸菌を含む細菌細胞などの原核細胞、又は酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、又はマウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、トリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）細胞などが挙げられるがこれらに限定されない哺乳類細胞、及び家畜哺乳動物からの細胞、若しくは農業用哺乳動物からの細胞が挙げられる。いくつかの細胞は、非ヒト、特に、非ヒト哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、好適な遺伝学的に修飾可能な多能性細胞が容易に入手可能ではない哺乳動物に対して、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、及びＧｌｉｓ１が挙げられるがこれらに限定されない、多能性誘導因子の組み合わせの体細胞への導入を介して、体細胞を多能性細胞に再プログラミングするために、他の方法が採用される。そのような方法では、細胞はまた、哺乳類細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳類細胞、非ヒト細胞、げっ歯類、ラット、マウス、ハムスターからの細胞、線維芽細胞、又は任意の他の宿主細胞であってもよい。他の実施形態では、細胞は、多能性細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。そのような細胞としては、例えば、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む多能性細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚（ＥＳ）細胞、又は発達制限されたヒト前駆細胞、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、若しくはラット胚性幹（ＥＳ）細胞が挙げられる。
【０２７２】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、及び「核酸フラグメント」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然、又は改変ヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖又は二本鎖である、ＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はこれらの混合物の１つ以上のセグメントからなってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、リボヌクレオチドは、自然発生的な分子及び合成類似体の両方、並びにこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に提供されるポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などが挙げられるがこれらに限定されない、全ての形態の配列を包含する。
【０２７３】
組み換えポリヌクレオチドが更に提供される。用語「組み換えポリヌクレオチド」及び「組み換えＤＮＡ構築物」は、本明細書において互換的に使用される。組み換え構築物は、核酸配列の人工又は異種の組み合わせ、例えば、自然界で一緒に見出されない制御配列及びコード配列を含む。他の実施形態では、組み換え構築物は、異なる源由来である制御配列及びコード配列、又は同じ源由来であるが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配列された制御配列及びコード配列を含んでもよい。そのような構築物は、それ自体で使用されてもよく、又はベクターと併用されてもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるような宿主細胞を変換するために使用される方法によって決まる。例えば、プラスミドベクターが使用され得る。スクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析、又は表現型解析によって達成されてもよい。
【０２７４】
特定の実施形態では、本明細書に記載される構成成分のうちの１つ以上は、多能性及び／又は全能性細胞中の発現のための発現カセット中に提供され得る。カセットは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドに操作可能に連結された５’及び３’制御配列を含むことができる。「操作可能に連結された」は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味する。例えば、対象となるポリヌクレオチドと制御配列（すなわち、プロモーター）との間の操作可能な連結は、対象となるポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。操作可能に連結された要素は、隣接していてもよく、又は隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の結合に言及するために使用されるとき、「操作可能に連結された」は、コード領域が同じリーディングフレームにあることを意味する。別の場合において、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写制御を保持するために、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に操作可能に連結されてもよい。カセットは、ＥＳ細胞中に共導入される少なくとも１つの追加の対象となるポリヌクレオチドを更に含有してもよい。あるいは、追加の対象となるポリヌクレオチドが、複数の発現カセット上に提供され得る。そのような発現カセットは、組み換えポリヌクレオチドの挿入が制御領域の転写制御下にあるための複数の制限部位及び／又は組み換え部位が提供される。発現カセットは、選択マーカー遺伝子を更に含有してもよい。
【０２７５】
発現カセットは、転写の５’−３’方向に、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチド、並びに対象となる哺乳類細胞又は宿主細胞中で機能的な転写及び翻訳終止領域（すなわち、終止領域）を含むことができる。制御領域（すなわち、プロモーター、転写制御領域、並びに転写及び翻訳終止領域）、並びに／又は本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞又は互いに天然／類似であってもよい。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞又は互いに異種であってもよい。例えば、異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来した種とは異なる種由来であるか、又は同じ／類似の種由来の場合、一方又は両方は、それらの元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に修飾されるか、又はプロモーターは、操作可能に連結されたポリヌクレオチドのための天然プロモーターではない。あるいは、制御領域及び／又は本明細書に提供される組み換えポリヌクレオチドは、完全に合成であってもよい。
【０２７６】
終止領域は、転写開始領域と共に天然であってもよく、操作可能に連結された組み換えポリヌクレオチドと共に天然であってもよく、宿主細胞と共に天然であってもよく、又はプロモーター、組み換えポリヌクレオチド、宿主細胞、若しくはこれらの組み合わせに対して別の源由来（すなわち、異質若しくは異種）であってもよい。
【０２７７】
発現カセットの調製において、適切な配向でＤＮＡ配列を提供するために、様々なＤＮＡフラグメントが操作されてもよい。この目的で、アダプター若しくはリンカーがＤＮＡフラグメントを結合するために採用されてもよく、又は好都合な制限部位、不必要なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを提供するために、他の操作が関与してもよい。この目的で、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、転位及び転換が関与してもよい。
【０２７８】
多くのプロモーターが、本明細書に提供される発現カセット中で使用され得る。プロモーターは、所望の結果に基づき選択され得る。対象となるポリヌクレオチドのタイミング、位置、及び／又は発現レベルを調節するために、発現カセット中の異なるプロモーターの使用によって、異なる適用が強化され得ることが認識される。そのような発現構築物はまた、必要に応じて、プロモーター制御領域（例えば、誘導性、構成的、環境若しくは発達制御、又は細胞若しくは組織特異的／選択的発現を与えるもの）、転写開始起始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡ処理シグナル、転写終止部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含有してもよい。
【０２７９】
非限定的な実施形態は以下を含む。
１．
（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有する非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞と、
（ｂ）該非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地であって、以下の特徴、すなわち約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す、培地と、を含む、ｘインビトロ培養物。
２．該非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞がげっ歯類由来である、請求項１に記載のインビトロ培養物。
３．該げっ歯類がマウスである、請求項２に記載のインビトロ培養物。
４．該マウスＸＹ  ＥＳ細胞がＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、実施形態３に記載のインビトロ培養物。
５．該げっ歯類がラット又はハムスターである、実施形態２に記載のインビトロ培養物。
６．該Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の該減少が、該Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾による、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
７．該Ｓｒｙ遺伝子中の該遺伝子修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態６に記載のインビトロ培養物。
８．該非ヒト哺乳類ＥＳ細胞が、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
９．該標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態８に記載のインビトロ培養物。
１０．該標的化された遺伝子修飾が、ＸＹ  ＥＳ細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む、実施形態８に記載のインビトロ培養物。
１１．該標的化された遺伝子修飾が、常染色体上にある、実施形態８〜１０のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１２．該基本培地が、５０±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１３．該基本培地が、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１４．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１５．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２６１ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１６．該基本培地が、１１０±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１７．該基本培地が、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１８．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
１９．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
２０．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、８６±５ｍＭのグルコース、及び３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
２１．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
２２．宿主胚内への該非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く該宿主胚の懐胎後に、該Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも８０％がＸＹ雌であり、性成熟に達すると、該Ｆ０
ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のインビトロ培養物。
２３．Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
（ａ）非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を有するドナー非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を培養することであって、該培地が、以下のうちの１つ以上を含む特徴、すなわち約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧、約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせを示す、培養することと、
（ｂ）該ドナーＸＹ非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を宿主胚内に導入することと、
（ｃ）該宿主胚を懐胎させることと、
（ｄ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、該Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、方法。
２４．該非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞がげっ歯類由来である、実施形態２３に記載の方法。
２５．該げっ歯類がマウスである、実施形態２４に記載の方法。
２６．該マウスＸＹ  ＥＳ細胞がＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、実施形態２５に記載の方法。
２７．該げっ歯類がラット又はハムスターである、実施形態２４に記載の方法。
２８．該Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の該減少が、該Ｓｒｙ遺伝子中の遺伝子修飾による、実施形態２３〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．該Ｓｒｙ遺伝子中の該遺伝子修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態２８の方法。
３０．該非ヒト哺乳類ＥＳ細胞が、１つ、２つ、３つ、又はそれよりも多くの標的化された遺伝子修飾を含む、実施形態２３〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．該標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態３０に記載の方法。
３２．該標的化された遺伝子修飾が、該ＸＹ  ＥＳ細胞のゲノム中への異種ポリヌクレオチドの少なくとも１つの挿入を含む、実施形態３０に記載の方法。
３３．該標的化された遺伝子修飾が常染色体上にある、実施形態３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．該基本培地が、５０±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２１８±２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．該基本培地が、約３ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２１８ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２６１±２６ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３７．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２６１ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３８．該基本培地が、１１０±５ｍＭのＮａＣｌ、１８±５ｍＭの炭酸塩、及び２９４±２９ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３９．該基本培地が、約６．４ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、１．５ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２９４ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
４０．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、及び２７０±２７ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
４１．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、及び２７０ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
４２．該基本培地が、８７±５ｍＭのＮａＣｌ、２６±５ｍＭの炭酸塩、８６±５ｍＭのグルコース、及び３２２±３２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
４３．該基本培地が、約５．１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１５．５ｍｇ／ｍＬのグルコース、及び３２２ｍＯｓｍ／ｋｇを示す、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
４４．Ｆ１世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、（ａ）該Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性が減少したＦ０  ＸＹの繁殖力のある雌を、同じＥＳ細胞クローン由来のコホートクローン兄弟であるＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交配させることであって、該Ｆ０  ＸＹの繁殖力のある雌の非ヒト哺乳動物及び該Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、該遺伝子突然変異に関してヘテロ接合性である、交配させることと、（ｂ）該遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫マウスを得ることと、を含む、方法。
４５．細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）該細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）該第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することであって、該第１のホモロジーアーム及び該第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも４ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、導入することと、（ｃ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
４６．細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
（ｂ）該細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することであって、該第１のホモロジーアーム及び該第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも４ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、導入することと、
（ｃ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
４７．該細胞が哺乳類細胞である、実施形態４５又は４６に記載の方法。
４８．該哺乳類細胞が非ヒト細胞である、実施形態４７に記載の方法。
４９．該哺乳類細胞がげっ歯類由来である、実施形態４７に記載の方法。
５０．該げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、実施形態４９に記載の方法。
５１．該細胞が多能性細胞である、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．該哺乳類細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．該多能性細胞が非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態５１の方法。
５４．該多能性細胞がげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態５１の方法。
５５．該ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、実施形態４５及び４７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．該ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、実施形態４５及び４７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５７．該ヌクレアーゼ剤が転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、実施形態４５及び４７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５８．該ヌクレアーゼ剤がメガヌクレアーゼである、実施形態４５及び４７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５９．該ヌクレアーゼ剤がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、実施形態４５及び４７〜５４のいずれか１つに記載の方法。
６０．少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含む大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の存在下で、Ｃａｓタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡにＹ染色体を曝露することを含む、該Ｙ染色体を修飾するための方法であって、該Ｃａｓタンパク質、該ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、及び該ＬＴＶＥＣへの曝露に続いて、該Ｙ染色体が少なくとも１０ｋｂの核酸配列を含むように修飾されることを含む、方法。
６１．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、又は少なくとも９０ｋｂの核酸配列を含む、実施形態６０に記載の方法。
６２．該ＬＴＶＥＣが、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂの核酸配列を含む、実施形態６０に記載の方法。
６３．Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、（ａ）該Ｙ染色体上の該標的ゲノム遺伝子座を含む哺乳類細胞を提供することであって、該標的ゲノム遺伝子座は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列を含む、提供することと、（ｂ）該哺乳類細胞中に、（ｉ）該標的ゲノム遺伝子座に相同の標的化アームが隣接した第１の核酸を含む、大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）であって、少なくとも１０ｋｂである、ＬＴＶＥＣと、（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸に操作可能に連結された第１のプロモーターを含む、第１の発現構築物と、（ｉｉｉ）該ｇＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸に操作可能に連結された第２のプロモーターを含む、第２の発現構築物と、を導入することであって、該第１及び第２のプロモーターは、該哺乳類細胞中で活性である、導入することと、（ｃ）該Ｙ染色体上の該標的ゲノム遺伝子座において標的化された遺伝子修飾を含む修飾された哺乳類細胞を特定することと、を含む、方法。
６４．該ＬＴＶＥＣが少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、又は少なくとも９０ｋｂである、実施形態６３に記載の方法。
６５．該ＬＴＶＥＣが少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、又は少なくとも２００ｋｂである、実施形態６３に記載の方法。
６６．該哺乳類細胞が非ヒト哺乳類細胞である、実施形態６３に記載の方法。
６７．哺乳類細胞が線維芽細胞である、実施形態６３に記載の方法。
６８．該哺乳類細胞がげっ歯類由来である、実施形態６３に記載の方法。
６９．該げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、実施形態６８に記載の方法。
７０．該哺乳類細胞が多能性細胞である、実施形態６３に記載の方法。
７１．該多能性細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態７０に記載の方法。
７２．該多能性細胞がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態７０に記載の方法。
７３．該多能性細胞が発達制限されたヒト前駆細胞である、実施形態７０に記載の方法。
７４．該Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、実施形態６３に記載の方法。
７５．該ｇＲＮＡ標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、実施形態７４に記載の方法。
７６．該ＬＴＶＥＣの５’及び３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂである、実施形態６３に記載の方法。
７７．該ＬＴＶＥＣの該５’及び３’ホモロジーアームの合計が約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである、実施形態７６に記載の方法。
７８．該標的化された遺伝子修飾が、（ａ）内因性核酸配列の、相同若しくはオーソロガス核酸配列との置き換え、（ｂ）内因性核酸配列の欠失、（ｃ）欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、若しくは約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、若しくは約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ、内因性核酸配列の該欠失、（ｄ）外因性核酸配列の挿入、（ｅ）約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、若しくは約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂに及ぶ、外因性核酸配列の挿入、（ｆ）相同若しくはオーソロガス核酸配列を含む外因性核酸配列の挿入、（ｇ）ヒト及び非ヒト核酸配列を含むキメラ核酸配列の挿入、（ｈ）部位特異的リコンビナーゼ標的配列が隣接した条件付き対立遺伝子の挿入、（ｉ）該哺乳類細胞中で活性な第３のプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー若しくはレポーター遺伝子の挿入、又は（ｊ）これらの組み合わせを含む、実施形態６３に記載の方法。
７９．該標的ゲノム遺伝子座が、（ｉ）５’ホモロジーアームに相同である５’標的配列と、（ｉｉ）３’ホモロジーアームに相同である３’標的配列とを含む、実施形態６３に記載の方法。
８０．該５’標的配列及び該３’標的配列が少なくとも５ｋｂであるが３Ｍｂ未満隔てられる、実施形態７９に記載の方法。
８１．該５’標的配列及び該３’標的配列が、少なくとも５ｋｂであるが１０ｋｂ未満、少なくとも１０ｋｂであるが２０ｋｂ未満、少なくとも２０ｋｂであるが４０ｋｂ未満、少なくとも４０ｋｂであるが６０ｋｂ未満、少なくとも６０ｋｂであるが８０ｋｂ未満、少なくとも約８０ｋｂであるが１００ｋｂ未満、少なくとも１００ｋｂであるが１５０ｋｂ未満、又は少なくとも１５０ｋｂであるが２００ｋｂ未満、少なくとも約２００ｋｂであるが約３００ｋｂ未満、少なくとも約３００ｋｂであるが約４００ｋｂ未満、少なくとも約４００ｋｂであるが約５００ｋｂ未満、少なくとも約５００ｋｂであるが約１Ｍｂ未満、少なくとも約１Ｍｂであるが約１．５Ｍｂ未満、少なくとも約１．５Ｍｂであるが約２Ｍｂ未満、少なくとも約２Ｍｂであるが約２．５Ｍｂ未満、又は少なくとも約２．５Ｍｂであるが約３Ｍｂ未満隔てられる、実施形態７９に記載の方法。
８２．該第１及び第２の発現構築物が単一核酸分子上にある、実施形態６３に記載の方法。
８３．該標的ゲノム遺伝子座がＳｒｙ遺伝子座を含む、実施形態６３に記載の方法。
８４．非ヒト動物のＹ染色体の標的化された遺伝子修飾のための方法であって、（ａ）実施形態４に記載の方法に従って、非ヒト多能性細胞の該Ｙ染色体上の対象となるゲノム遺伝子座を修飾し、それにより、該Ｙ染色体上の標的化された遺伝子修飾を含む、遺伝子修飾された非ヒト多能性細胞を生み出すことと、（ｂ）非ヒト宿主胚内に（ａ）の修飾された非ヒト多能性細胞を導入することと、（ｃ）代理母において修飾された多能性細胞を含む該非ヒト宿主胚を懐胎させることとを含み、該代理母が、該標的化された遺伝子修飾を含むＦ０子孫を生み出し、該標的化された遺伝子修飾が、生殖系列を通じて伝達されることが可能である、方法。
８５．該対象となるゲノム遺伝子座がＳｒｙ遺伝子座を含む、実施形態８４に記載の方法。
８６．細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む該Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、（ｂ）該細胞中に、（ｉ）ヌクレアーゼ剤であって、第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、及び（ｉｉ）該第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することであって、該第１のホモロジーアーム及び該第２のホモロジーアームの長さが、少なくとも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である、導入することと、（ｃ）該標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた該第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
８７．該第１のホモロジーアーム及び／又は該第２のホモロジーアームの該長さが約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである、実施形態８６に記載の方法。
８８．該修飾が内因性核酸配列の欠失を含む、実施形態８６に記載の方法。
８９．該欠失が約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ、実施形態８８に記載の方法。
９０．該欠失が少なくとも５００ｋｂである、実施形態８８に記載の方法。
【０２８０】
本方法及び組成物は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと見なされるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が該当し得る法的要件を満たすように提供される。同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。
【０２８１】
上記の説明及び関連する図面中に示される教示の利益を得れば、本方法及び組成物が関連する技術分野の当業者は、本明細書に記載される方法及び組成物の多くの修正形態及び他の実施形態に想到するであろう。したがって、本方法及び組成物が開示された特定の実施形態に限定されないものであること、並びに修正形態及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。特定の用語が本明細書で採用されるが、それらは、限定目的ではなく一般的かつ説明的な意味でのみ使用される。
【０２８２】
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提供される。
【実施例】
【０２８３】
実施例１．ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲによって補助されたＹ染色体遺伝子Ｓｒｙの標的化
順番に、約７００ｂｐの上流ホモロジーアーム、βガラクトシダーゼコード配列（ｌａｃＺ）、続いて、ポリアデニル化シグナル、第１のエクソン、第１のイントロン、及び第２のエクソンの一部を含む、ヒトユビキチンＣプロモーターを含むｌｏｘＰ部位が隣接したネオマイシン耐性カセット、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列、及びポリアデニル化シグナル、並びに約６５０ｂｐの下流ホモロジーアームを含む、標的化ベクターを用いて、ＳｒｙのためのｌａｃＺ置き換え対立遺伝子を含む標的化された欠失を引き起こした。標的化ベクターを用いたＳｒｙ遺伝子の正しい標的化によって作られた対立遺伝子は、βガラクトシダーゼコード配列がＳｒｙ開始コドンにおいてインフレームで融合されるように、約１ｋｂのＳｒｙオープンリーディングフレームの欠失、及びｌａｃＺ−ｎｅｏカセットでの置き換えを含む。標的化ベクターを使用して、ＶＧＢ６（別名、Ｂ６Ａ６）Ｃ５７ＢＬ／６及びＶＧＦ１（別名、Ｆ１Ｈ４）Ｃ５７ＢＬ６／１２９  Ｆ１ハイブリッドＥＳ細胞株の両方においてＳｒｙ遺伝子を標的化した。ＶＧＦ１（Ｆ１Ｈ４）マウスＥＳ細胞は、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚由来であった。したがって、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスからのＹ染色体を含有する。ＶＧＦ１細胞株から生み出された雌ＸＹマウスは、１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウス由来のＹ染色体を含有する。
【０２８４】
実施例２．Ｙ染色体遺伝子Ｓｒｙ中のＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ誘導性突然変異
Ｃａｓ９  ＤＮＡエンドヌクレアーゼと組み合わせた、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの作用によって、おそらく３ｂｐ〜１．２ｋｂ以上に及ぶ二本鎖ＤＮＡ切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復の結果である、欠失突然変異を、Ｓｒｙ遺伝子中で引き起こした（図１を参照されたい）。Ｓｒｙ遺伝子中でＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ誘導性突然変異を含むＥＳ細胞はまた、ＮＩＨ  ＫＯＭＰプロジェクトＶＧ１２７７８  ＬＴＶＥＣのランダムトランスジェニック挿入（ＵＲＬ「ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｋｏｍｐ／ｄｅｔａｉｌ／１２７７８」でワールド・ワイド・ウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介して入手可能）を有し、それは、Ｓｒｙコード配列の欠失、及びＳｒｙ開始コドンとインフレームで融合されたｌａｃＺを含む挿入カセットでの置き換え、並びに３８及び３７ｋｂのホモロジーアームが隣接し、かつｂＭＱライブラリー（１２９Ｓ７／ＳｖＥｖ  Ｂｒｄ−Ｈｐｒｔ  ｂ−ｍ２）からのＢＡＣに基づく、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。ＬＴＶＥＣは、そのホモロジーアーム中に、Ｓｒｙの発現のための全ての既知の制御要素を含む。そのｌａｃＺコードβガラクトシダーゼは、Ｓｒｙ遺伝子の組織特異的及び発達段階特異的発現のためのレポーターとしての役割を果たす。ＶＧＢ６（別名、Ｂ６Ａ６）及びＶＧＦ１（別名、Ｆ１Ｈ４）ＥＳ細胞株の両方において、ＬＴＶＥＣ挿入を伴うＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ誘導性突然変異を引き起こした。
【０２８５】
我々は、Ｓｒｙ遺伝子中のＨＭＧボックスＤＮＡ結合モチーフコード配列の一部（上流認識配列：５’−ＴＣＣＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号７２）、下流認識配列：５’−ＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴ−３’（配列番号７３））を標的化するように設計されたＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ−１）を得た。ＴＡＬＥＮ−１は、複数の実験において、Ｓｒｙ遺伝子座におけるＮＨＥＪ突然変異を引き起こす際に活性であった。
【０２８６】
ＶＧＢ６及びＶＧＦ１マウスＥＳ細胞の両方を、ＴＡＬＥＮ誘導性突然変異によって作った。表１は、全てのクローン及びそれらが有する欠失突然変異のサイズのリストを含む。（表１中のＮＤは、突然変異がｑＰＣＲアッセイによって検出されたが、突然変異の正確な分子的性状は判定されなかったことを示す。）全てのクローンはまた、ＮＩＨ  ＫＯＭＰプロジェクトＶＧ１２７７８  ＬＴＶＥＣの少なくとも１つのコピーを有する。
【０２８７】
【表２】
2019205481.tif 000003
＊５０ｂｐの挿入も含んだ
【０２８８】
Ｓｒｙ変異体クローンのマイクロインジェクションの結果が表２に記載され、性転換雌の繁殖結果が表３に記載される。
【０２８９】
【表３】
2019205481.tif 000004
【０２９０】
【表４】
2019205481.tif 000005
＊ＸＹ雌ＩＤ番号１４６０４０６は、出産近くに危機があり、出産できなかったため、安楽死させなければならなかった。その死亡した子（４匹の雄、５匹の雌）を解剖によって回収し、Ｓｒｙ突然変異を有したものはなかった。
【０２９１】
ＶＧＢ６  ＥＳ細胞由来のＳｒｙ突然変異を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅの全てが、Ｓｒｙの不活性化に関して予想されたように、雌であった（表２）。Ｓｒｙ突然変異はないが、ＮＩＨ  ＫＯＭＰ  ＶＧ１２７７８  ＬＴＶＥＣの少なくとも１つのコピーを有するものは、雄のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅのみを生み出した（表２、クローンＧＢ４及びＧＧ１）。１７匹のＳｒｙ変異体雌Ｂ６  ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを試験繁殖させたとき、１匹のみが約４カ月の繁殖設定後に妊娠し（表３）、その雌は、出産近くに危機があり、出産できなかったため、安楽死させなければならなかった。解剖によって回収したその死亡した子（４匹の雄、５匹の雌）は全てＷＴであり、Ｓｒｙ突然変異を有したものはなかった。ＶＧＢ６  ＥＳ細胞から作製されたほぼ全てのＳｒｙ変異体マウスが不妊であると結論付けられ、それは、Ｓｒｙ突然変異に関する文献と一致する。しかしながら、我々のデータは、ＶＧＦ１クローンによる非常に異なる結果を示した。
【０２９２】
第一に、雌化している我々のＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度増殖培地中で、通常通り、ＶＧＦ１  ＥＳ細胞を維持し、この培地中で増殖された、マイクロインジェクションされたＸＹクローンのいくつかは、それらが突然変異を有しないにもかかわらず、繁殖力のあるＸＹ雌、すなわち、ＸＹ雌現象を生み出す。一例は、クローンＴＨ４であり、それは、Ｓｒｙ突然変異を有しないが、ＮＩＨ  ＫＯＭＰ  ＶＧ１２７７８  ＬＴＶＥＣの少なくとも１つのコピーを有する。このクローンは、２匹の雌及び６匹の雄のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを生み出した（表２）。Ｓｒｙ突然変異を有しない２匹の他のＶＧＦ１クローン（ＴＡ３及びＴＡ４、表２）は、雄のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅのみを生み出した。我々は、Ｓｒｙ中の突然変異を有するＶＧＦ１  ＸＹ  ＥＳ細胞もまた培地によって雌化されるかどうかを決定したいと思った。換言すれば、それらは、ＶＧＢ６  Ｓｒｙ変異体ＥＳ細胞とは異なり、いくつかの繁殖力のあるＸＹ  Ｓｒｙ変異体雌を生み出であろうか。（ＶＧＢ６  ＥＳ細胞がＫＯ−ＤＭＥＭ様低浸透強度培地中で維持することができず、マウスを生み出す能力を保持することができないことに留意されたい。）答えは、表３に示されるように、「はい」である。
【０２９３】
５ｂｐ〜１ｋｂ超に及ぶＴＡＬＥＮ誘導性の小さい欠失を有する６個のＶＧＦ１  ＥＳ細胞クローンにマイクロインジェクションを行った。全てが雌のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを生み出し、そのうちの３２匹を繁殖させた。注目すべきことに、Ｓｒｙ変異体ＸＹ雌ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅの全てが繁殖力を持ち、それぞれが少なくとも１匹の同腹子を生み出した（表３）。Ｓｒｙ変異体ＸＹ雌のうちの多くが、正常な同腹子数で複数の同腹子を生み出した一方で、ＸＹ雌のうちの一部は、１匹又は２匹の少数の同腹子のみを生み出した。遺伝子型決定されているこれらの繁殖からの２９９匹のＦ１マウスのうち、約半分（１４６匹、４９％）が正常なＸＹ雄又は正常なＸＸ雌である。Ｆ１マウスのうち１７４匹（５８％）が表現型雌であった一方で、１２５匹（４２％）が表現型雄であった。雌のうち２６匹（雌の１５％、全Ｆ１世代の８．７％）は、変異体Ｓｒｙ対立遺伝子を受け継いだＸＹ雌であった。ＸＹ卵母細胞と関連した減数分裂の不分離事象のため、多くの異常な遺伝子型ＸＸＹ、ＸＹＹ、ＸＯ、ＸＸＹＹ（そのうちのいくつかは、変異体Ｓｒｙ対立遺伝子を含んだ）が、Ｓｒｙ変異体ＸＹ雌ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅのＦ１子孫において観察された。
【０２９４】
ＸＹ  ＥＳ細胞からの繁殖力のあるＸＹ雌ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅの効率的な作出のための方法が発見されている。雌化増殖培地中で維持されているＥＳ細胞中のＳｒｙ遺伝子中の不活性化突然変異が引き起こされる場合、雄と交配させられたときに、大部分は正常なＸ及びＹ染色体を有する雄及び雌マウスを生み出す、高い割合の繁殖力のあるＸＹ雌マウスが得られる。
【０２９５】
実施例３．Ｙ染色体遺伝子Ｓｒｙ中のＴＡＬＥＮ誘導性突然変異後のＫＯ−ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭにおける胚回収
ＸＹであり、かつＳｒｙ突然変異を有したＦ０雌由来のＦ１子孫の遺伝子型決定によって、ＬＴＶＥＣによるマウスＳｒｙの正しい標的化を確認又は否定した。Ｓｒｙ突然変異を有するＬａｃＺ／ＮｅｏカセットのＦ１マウスにおける共分離（Ｓｒｙ  ＬＯＡアッセイによって評価されるような）は、正しい標的化を強く示唆する。ＬａｃＺ／Ｎｅｏが突然変異と共分離できないことは、元のクローンが、ゲノム中の別の箇所のＬａｃＺ／Ｎｅｏトランスジェニック挿入に加えて、Ｓｒｙ欠失突然変異（ＴＡＬＥＮによって誘導された）を含んだことを示す。
【０２９６】
Ｓｒｙ突然変異を有するＸＹ雌からの子孫は、高頻度で様々な異常な核型を示した（ＸＸＹ、ＸＹＹ、及びＸＯを含む）。Ｘ及びＹ染色体上の遺伝子に対する無関係の対立遺伝子の欠損（ＬＯＡ）アッセイを使用して、性染色体数を評価した。次いで、ＬＯＡアッセイを使用してＳｒｙのコピー数を判定した。マウスにおける変異体Ｓｒｙ対立遺伝子の存在が推測され、Ｙ染色体コピー数は、Ｓｒｙコピー数を超えた（例えば、Ｙの１コピー及びＳｒｙの０コピー、又はＹの２コピー及びＳｒｙの１コピー）。最後に、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、ＬａｃＺ及びＮｅｏの存在を判定した。
【０２９７】
ＴＡＬＥＮヌクレアーゼと共にＳｒｙ  ＬＴＶＥＣによって作られ、ＫＯ−ＤＭＥＭ中で増殖されたクローンの元の組において、ＬａｃＺ／ＮｅｏカセットがＳｒｙ突然変異と共分離していなかったことが明らかであった。これらのクローンからのサンプル同腹子が表４に示される。
【０２９８】
【表５】
2019205481.tif 000006
【０２９９】
ＴＡＬＥＮヌクレアーゼと共にＳｒｙ  ＬＴＶＥＣによって作られ、ＤＭＥＭ中で増殖されたクローンの後続の組において、ＬａｃＺ／Ｎｅｏカセットは、Ｓｒｙ突然変異と完全に共分離しており、正しい標的化を示す。これらのクローンからの典型的な同腹子が表５に示される。
【０３００】
【表６】
2019205481.tif 000007
【０３０１】
実施例４：ＳｍａｌｌＴＶＥＣ又はＬＴＶＥＣによるＳｒｙのＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ補助による標的化
図２に示されるように、Ｃａｓ９  ＤＮＡエンドヌクレアーゼと組み合わせて、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのいずれかと共に、ＬＴＶＥＣ又は小さな標的化ベクター（ｓｍａｌｌＴＶＥＣ）のいずれかを用いて、ＳｒｙのためのｌａｃＺ置き換え対立遺伝子を含む標的化された欠失を引き起こした。ｓｍａｌｌＴＶＥＣは、順番に、約７００〜８００ｂｐの上流ホモロジーアーム、βガラクトシダーゼコード配列（ｌａｃＺ）、続いて、ポリアデニル化シグナル、第１のエクソン、第１のイントロン、及び第２のエクソンの一部を含む、ヒトユビキチンＣプロモーターを含むｌｏｘＰ部位が隣接したネオマイシン耐性カセット、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列、及びポリアデニル化シグナル、並びに約７００〜８００ｂｐの下流ホモロジーアームを含んだ。標的化ベクターを用いたＳｒｙ遺伝子の正しい標的化によって作られた対立遺伝子は、βガラクトシダーゼコード配列がＳｒｙ開始コドンにおいてインフレームで融合されるように、約１ｋｂのＳｒｙオープンリーディングフレームの欠失、及びｌａｃＺ−ｎｅｏカセットでの置き換えを含む。標的化ベクターを使用して、ＶＧＦ１（別名、Ｆ１Ｈ４）Ｃ５７ＢＬ６／１２９  Ｆ１ハイブリッドＥＳ細胞株及びＶＧＢ６  ＥＳ細胞株（別名、Ｂ６Ａ６）中のＳｒｙ遺伝子を標的化した。
【０３０２】
表６に示されるように、４つの異なるｇＲＮＡ及び１つのＴＡＬＥＮ対を使用して生み出されたクローンを生み出し、ＴａｑＭａｎアッセイによって対立遺伝子の開裂及び欠損に関してスクリーニングした。
【０３０３】
【表７】
2019205481.tif 000008
【０３０４】
ＬＴＶＥＣトランスジェニッククローンは、同じｌａｃＺパターンを有する胚を生み出した。図３は、胚内のＬａｃＺ発現を示す。
【０３０５】
表７は、ＴＡＬＥＮ補助ＬＴＶＥＣによるＳｒｙの標的化された欠失−置き換え突然変異を有した従来のＤＭＥＭベースの培地中で増殖された、ＥＳ細胞由来のＸＹ雌の繁殖性結果を報告する。予想外に、ＫＯ−ＤＥＭＥＭベースの培地中で増殖されたＥＳ細胞を用いた同様の実験に関する結果（表３）と比較して、ＤＭＥＭベースの培地中のＬＴＶＥＣによる標的化は、正しく標的化されたＳｒｙ欠失及びｌａｃＺ−ｎｅｏ挿入を有するクローンを生み出した。４つの標的化されたクローン由来の４１匹のＸＹＳｒｙ（ｌａｃＺ）雌のうちの４０匹が、交配後に生産児を生み出し、これは９８％の繁殖率であった。したがって、我々は、変異体ＥＳ細胞から繁殖力の高いＸＹ雌を生み出すための２つの新しい方法、（１）ＫＯ−ＤＭＥＭベースの培地中で増殖されたＥＳ細胞中のＳｒｙ中のＴＡＬＥＮ誘導性不活性化突然変異、及び（２）ＤＭＥＭベースの培地中で増殖されたＥＳ細胞中のＴＡＬＥＮ補助ＬＴＶＥＣにより標的化された精確な欠失−置き換え突然変異を考案した。
【０３０６】
【表８】
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【０３０７】
実施例５：ＺＦＮによって媒介されたＹ染色体上の大きい欠失
図４に示されるように、Ｋｄｍ５ｄ及びＵｓｐ９ｙ遺伝子を標的化するＺＦＮを使用して、Ｙ染色体上で５００ｋｂ以上の大きい欠失を行った。表８は、Ｙ染色体上のジンクフィンガー配列の例を提供する。
【０３０８】
【表９】
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【０３０９】
一実験において、ＶＧＢ６クローンＤ−Ｇ５及びＥ−Ｇ７（表３）からの３３０万個のＥＳ細胞を、ＺＦＮ  ｍＲＮＡ対、Ｋｄｍ５ｄ−ＺＦＮ５（ＮＭ０１１４１９−ｒ１７３４７ａ１）／ＺＦＮ６（ＮＭ０１１４１９−１７３５３ａ１）及びＵｓｐ９ｙ−ＺＦＮ３（ＮＭ１４８９４３−ｒ１１８３０ａ１）／ＺＦＮ４（ＮＭ１４８９４３−１１８３６ａ１）（各１０ｕｇ）で、かつＣｈ２５ｈ遺伝子を標的化するＬＴＶＥＣ（０．６７ｕｇ）で電気穿孔して、ピューロマイシン耐性に対する選択を提供した。ピューロマイシン耐性コロニーを採取し、欠失に関してスクリーニングした。結果が表９に示される。
【０３１０】
【表１０】
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【０３１１】
表１０は、Ｅ−Ｇ７親クローン（表３）由来の１つの欠失クローン（４３０６Ａ−Ｄ５）、及びＤ−Ｇ５親クローン（表３）由来の２つの欠失クローン（４３０６Ｅ−Ｃ４及び４３０６Ｆ−Ａ１２）に関して精確に判定された、５００ｋｂを超える欠失の正確なサイズを示す。
【０３１２】
【表１１】
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【０３１３】
図５に示されるように、対立遺伝子の欠失欠損アッセイ及びＤＮＡ配列において、Ｋｄｍ５ｄ、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、Ｄｄｘ３ｙ、及びＵｓｐ９ｙ遺伝子の欠失（図４）を確認した。クローン４３０６Ａ−Ｄ５は、８細胞期胚へのマイクロインジェクション及び代理母への導入後に、９匹のＸＹ雌の完全にＥＳ細胞由来のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを生み出した。クローン４３０６Ａ−Ｄ５からのＸＹ雌のどれも、繁殖力を持たなかった。
【０３１４】
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって媒介されたＹ染色体上の大きい欠失
Ｋｄｍ５ｄ遺伝子とＵｓｐ９ｙ遺伝子との間の領域を標的化するＹ染色体上の大きい欠失を、Ｃａｓ９  ＤＮＡエンドヌクレアーゼと組み合わせてＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを利用して行った。Ｋｄｍ５ｄ遺伝子及びＵｓｐ９ｙ遺伝子を標的化するように、ｇＲＮＡを設計した。Ｋｄｍ５ｄを標的化するように、以下のｇＲＮＡを設計した。Ｋｄｍ５ｄｇＡ（ガイド番号１）ＵＵＵＧＣＣＧＡＡＵＡＵＧＣＵＣＵＣＧＵ（配列番号６６）、Ｋｄｍ５ｄｇＢガイド番号２）ＵＵＧＣＣＧＡＡＵＡＵＧＣＵＣＵＣＧＵＧ（配列番号６７）、及びＫｄｍ５ｄｇＣ（ガイド番号５）ＣＧＧＧＣＡＵＣＵＣＣＡＵＡＣＵＣＣＣＵ（配列番号６８）。Ｕｓｐ９ｙを標的化するように、以下のｇＲＮＡを設計した。Ｕｓｐ９ｙｇＡ（ガイド番号１）ＵＡＧＣＵＣＧＵＵＧＵＧＵＡＧＣＡＣＣＵ（配列番号６９）、Ｕｓｐ９ｙｇＢ（ガイド番号１）ＵＡＵＡＧＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＧＵＡＡＣ（配列番号７０）、及びＵｓｐ９ｙｇＣ（ガイド番号２）ＧＧＡＵＡＣＣＣＵＵＣＵＡＵＡＧＧＣＣＣ（配列番号７１）。
【０３１５】
ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞を、Ｃａｓ９を発現させた５μｇのプラスミド、並びにＫｄｍ５ｄ  ｇＲＮＡ  Ｂ及びＵｓｐ９ｙ  ｇＲＮＡ  Ｃを発現させた、それぞれ１０μｇのプラスミドで、かつＣｈ２５ｈ遺伝子を標的化するＬＴＶＥＣ（０．６７ｕｇ）で電気穿孔して、ピューロマイシン耐性に対する選択を提供した。
【０３１６】
図４に示されるように、Ｋｄｍ５ｄｇＢ（ｇＲＮＡ  Ｂ）及びＵｓｐ９ｙｇＣ（ｇＲＮＡ  Ｃ）を使用して、Ｋｄｍ５ｄ及びＵｓｐ９ｙ遺伝子の欠失を標的化した。Ｋｄｍ５ｄ及びＵｓｐ９ｙ遺伝子並びに間にある遺伝子（Ｅｉｆ２ｓ３ｙ、Ｕｔｙ、及びＤｄｘ３ｙ）における配列に関する対立遺伝子の欠損アッセイによる欠失に関して、かつ標的化された欠失の外側の遺伝子（Ｚｆｙ２及びＳｒｙ）に関して、得られるクローンをスクリーニングした。表１１に示されるように、大きい欠失を含む４個のクローンが得られた。クローンＲ−Ａ８は、８細胞期胚へのマイクロインジェクション及び代理母への導入後に、７匹のＸＹ雌及び３匹の雌の完全にＥＳ細胞由来のＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅを生み出した。
【０３１７】
【表１２】
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【０３１８】
本明細書で言及された全ての刊行物及び特許は、本発明が関係する技術分野における当業者の水準を示す。全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物及び特許出願が参照により組み込まれているかのように具体的かつ個別的に示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。寄託番号などの引用と関連した情報が時と共に変化する場合、本出願の有効な出願日において有効な情報のバージョンが意図され、有効な出願日とは、実際の出願日又は最初にその引用を提供する優先出願の日を意味する。任意の実施形態の文脈から特に明らかではない限り、本発明の態様、工程、又は特徴は、互いと組み合わせて使用され得る。範囲への言及は、その範囲内の任意の整数、その範囲内の任意の部分範囲を含む。複数の範囲への言及は、そのような範囲の複合を含む。
【０３１９】
例えば、本発明の好ましい実施形態では以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能な非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法であって、
（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性を減少させる修飾を含むように非ヒト哺乳類ＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を修飾することと、
（ｂ）Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を生み出すことが可能なＥＳ細胞株を作製することを可能にする条件下で、前記修飾されたＥＳ細胞を培養することと、を含む、方法。
（項目２）
Ｆ０世代における繁殖力のあるＸＹ雌非ヒト哺乳動物を作製するための方法であって、
（ａ）項目１に記載の非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を宿主胚内に導入することと、
（ｂ）前記宿主胚を懐胎させることと、
（ｃ）Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物を得ることと、を含み、性成熟に達すると、前記Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、方法。
（項目３）
前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞がげっ歯類由来である、項目１又は２に記載の方法。（項目４）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が１２９系統由来である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、１２９系統に由来するＹ染色体を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞がＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞がＣ５７ＢＬ／６系統由来である、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性の前記減少が、Ｓｒｙ遺伝子を含むゲノム遺伝子座における標的化された遺伝子修飾に起因する、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｓｒｙ遺伝子における前記遺伝子修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、若しくは異種核酸配列との置き換え、又はこれらの組み合わせを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記標的化された遺伝子修飾が、挿入、欠失、ノックアウト、ノックイン、点突然変異、又はこれらの組み合わせを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｓｒｙ遺伝子の前記修飾が、前記非ヒト哺乳類ＥＳ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結された選択可能なマーカー及び／又はレポーター遺伝子の挿入を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｓｒｙ遺伝子の前記修飾が、内因性Ｓｒｙプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記レポーター遺伝子がレポータータンパク質ＬａｃＺをコードする、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記標的化された遺伝子修飾が常染色体上にある、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記培養工程が、前記非ヒト哺乳類ＥＳ細胞を培養物中で維持するのに好適な基本培地及び補充物を含む培地中で、前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞を培養することを含み、前記培地が低浸透圧培地である、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記低浸透圧培地が、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３２９ｍＯｓｍ／ｋｇ未満の浸透圧を示す、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記低浸透圧培地が、以下の特徴、すなわち約１１ｍＳ／ｃｍ〜約１３ｍＳ／ｃｍの導電率、約５０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のアルカリ金属及びハロゲン化物の塩、
約１７ｍＭ〜約３０ｍＭの炭酸塩濃度、約８５ｍＭ〜約１３０ｍＭのアルカリ金属ハロゲン化物塩及び炭酸塩の総計濃度、並びに／又はこれらの任意の２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上を示す、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
宿主胚内への前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞の導入及び続く前記宿主胚の懐胎後に、前記Ｆ０非ヒト哺乳動物の少なくとも８０％がＸＹ雌であり、前記ＸＹ雌が、性成熟に達すると、前記Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が繁殖力を持つ、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞が、ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Ｙ染色体上に標的ゲノム遺伝子座を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターの存在下で、前記ＥＳ細胞を前記ヌクレアーゼ剤に曝露することを更に含み、前記ヌクレアーゼ剤及び前記標的化ベクターへの曝露後、前記ＥＳ細胞が、前記挿入ポリヌクレオチドを含むように修飾される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であるか、又は
（ｃ）メガヌクレアーゼである、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、（ａ）前記第１の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳類ＸＹ  ＥＳ細胞株を含む、インビトロ培養物。
（項目２９）
Ｆ１世代における標的化された遺伝子突然変異に関してホモ接合性のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生み出す方法であって、
（ａ）Ｓｒｙタンパク質のレベル及び／又は活性が減少したＦ０  ＸＹの繁殖力のある雌を、同じＥＳ細胞クローン由来のコホートクローン兄弟であるＦ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物と交配させることであって、前記Ｆ０  ＸＹの繁殖力のある雌の非ヒト哺乳動物及び前記Ｆ０  ＸＹ雄非ヒト哺乳動物のそれぞれが、前記遺伝子突然変異に関してヘテロ接合性である、交配させることと、
（ｂ）前記遺伝子修飾に関してホモ接合性であるＦ１子孫マウスを得ることと、を含む、方法。
（項目３０）
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
（ｂ）前記細胞中に、
（ｉ）前記ヌクレアーゼ剤であって、前記第１の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発する前記ヌクレアーゼ剤、及び
（ｉｉ）前記第１の認識部位に十分に近接して位置する第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
（項目３１）
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも４ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが、少なくとも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
細胞中のＹ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法であって、
（ａ）ヌクレアーゼ剤のための認識部位を含む前記Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座を含む細胞を提供することと、
（ｂ）前記細胞中に、第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した第１の挿入ポリヌクレオチドを含む、第１の標的化ベクターを導入することと、
（ｃ）前記標的ゲノム遺伝子座において組み込まれた前記第１の挿入ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を特定することと、を含む、方法。
（項目３５）
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計が、少なくとも４ｋｂであるが１５０ｋｂ未満である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが、少なくとも４００ｂｐであるが１０００ｂｐ未満である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記第１のホモロジーアーム及び／又は前記第２のホモロジーアームの長さが約７００ｂｐ〜約８００ｂｐである、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目３９）
前記哺乳類細胞が非ヒト細胞である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記哺乳類細胞がげっ歯類由来である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記げっ歯類がラット、マウス、又はハムスターである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記細胞が多能性細胞である、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目４３）
前記哺乳類細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
前記多能性細胞が非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記多能性細胞がげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目４７）
前記ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は
（ｃ）メガヌクレアーゼである、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目４８）
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目４９）
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、（ａ）前記第１の認識部位を標的化する、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の認識部位に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記修飾が、内因性核酸配列の欠失を含む、項目３０又は３４に記載の方法。
（項目５３）
前記欠失が、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ、又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂに及ぶ、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記欠失が少なくとも５００ｋｂである、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記Ｆ０  ＸＹ雌非ヒト哺乳動物が、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持つ、項目２に記載の方法。
（項目５６）
前記野生型マウスがＣ５７ＢＬ／６である、項目５５に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹマウスを生み出すことが可能なマウスＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞株を作製するための方法であって、
（ａ）マウスＸＹ  ＥＳ細胞を、内因性Ｓｒｙ遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾を含むように改変することであって、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６系統由来のＹ染色体を含む、ことと、
（ｂ）改変された前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞を、Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹ非ヒト哺乳動物を生み出すことができるマウスＸＹ  ＥＳ細胞株を生み出す条件下で培養することとを含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝子修飾を、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞中に導入することによって生じさせ、ここで、前記ヌクレアーゼ剤は、前記Ｙ染色体上の認識部位において、ニック又は二本鎖切断を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、あるいは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡは、
（ａ）前記認識部位を標的化するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記認識部位にはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接する、ｃｒＲＮＡと、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含み、
必要に応じて、前記ｇＲＮＡは、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２を含む配列を標的化する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼ剤がＴＡＬＥＮであり、
必要に応じて、前記ＴＡＬＥＮが、配列番号７２を含む配列及び配列番号７３を含む配列を標的化する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子修飾が、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞に、前記Ｙ染色体上の標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターを導入することによって生じ、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞は、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のホモロジーアームは、約４００〜１０００塩基対であり、前記第２のホモロジーアームは、約４００〜１０００塩基対である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子修飾が、前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞に：
（ｉ）Ｙ染色体上の認識部位においてニック又は二本鎖切断を誘発するヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドと；
（ｉｉ）Ｙ染色体上の前記標的ゲノム遺伝子座における第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームが隣接した挿入ポリヌクレオチドを含む標的化ベクターと
を導入することによって生じ、
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、前記標的ゲノム遺伝子座において前記挿入ポリヌクレオチドを含むように改変される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、雌化培地中で培養されない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養する工程が、前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞を、（１）約３ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム及び約２．２ｍｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウムを含み、約２１８ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する基本培地と；（２）前記改変されたマウスＥＳ細胞を培養物中で維持する補充物とを含む培地中で培養することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主胚内への前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞の導入、及び続くＦ０マウスを生み出すための宿主胚の懐胎後に、前記Ｆ０マウスの少なくとも６０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｆ０世代における繁殖力のある雌ＸＹマウスを作製するための方法であって、
（ａ）マウスＸＹ胚性幹（ＥＳ）細胞を宿主胚に導入することであって、前記ＸＹ  ＥＳ細胞は、１２９Ｓ６系統由来のＹ染色体と、内因性マウスＳｒｙ遺伝子を不活性化する欠失を含む遺伝子修飾とを含み、必要に応じて、前記宿主胚は、前桑実胚である、導入することと；
（ｂ）前記宿主胚を懐胎させることと；
（ｃ）前記宿主胚の懐胎に続いてＦ０マウスを得ることであって、前記Ｆ０マウスの少なくとも６０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、得ることとを含む、方法。
【請求項１４】
前記Ｆ０  ＸＹ雌マウスが、野生型マウスに交配されたときに繁殖力を持ち、必要に応じて、前記野生型マウスはＣ５７ＢＬ／６マウスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、１２９Ｓ６系統及びＣ５７ＢＬ／６系統の間の交配であるマウスから単離される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを雄１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃマウスに交配することによって生み出されたハイブリッド胚から単離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞が、ＶＧＦ１マウスＥＳ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの置換、又はこれらの組み合わせをさらに含み、必要に応じて、
（Ｉ）前記遺伝子修飾が、ノックアウト、ノックイン、内因性核酸配列の、相同、オーソロガス、若しくは異種配列との置き換え、又はこれらの組み合わせをさらに含むか；
（ＩＩ）前記遺伝子修飾が、選択可能なマーカーをコードする核酸及び／又は前記マウスＸＹ  ＥＳ細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含むか；
（ＩＩＩ）前記遺伝子修飾が、内因性Ｓｒｙプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子をコードする核酸の挿入をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＸＹ  ＥＳ細胞を、少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドのさらなる標的化遺伝子修飾を含むように改変することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主胚内への前記改変されたマウスＸＹ  ＥＳ細胞の導入、及び続く前記宿主胚の懐胎後に、前記Ｆ０マウスの少なくとも８０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌であり、前記Ｆ０マウスの少なくとも９０％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌であり、必要に応じて、前記Ｆ０マウスの少なくとも９５％が、性成熟に達すると繁殖力を持つＸＹ雌である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
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