(57)【要約】      （修正有）【課題】非天然のヌクレオチドのアナログの提供。【解決手段】以下の式の核酸塩基を含む化合物。2019196355.tif 000043式中、ＸはＣ；Ｒ２は独立してＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ等；Ｙは硫黄、セレン、または二級アミン；Ｅは硫黄；波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログとの結合点を示す。【選択図】図１
2019196355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式のいずれかの核酸塩基アナログを含む化合物であって、
【化１】
2019196355.tif 000037
式中、
それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、
Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、
Ｅはそれぞれ独立して硫黄またはセレンであり、
波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログは遊離形態であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩に接続され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の基を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる、化合物。
【請求項２】
以下の式のいずれかの核酸塩基アナログを含む化合物であって、
【化２】
2019196355.tif 000038
式中、
それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、
Ｅはそれぞれ独立して硫黄またはセレンであり、
波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログは遊離形態であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩に結合され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の基を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる、化合物。
【請求項３】
反応性の中心はアミノ基、アセチレン基、チオール基、アルデヒド基、またはアジド基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
反応性の中心はアミノ基、アセチレン基、チオール基、アルデヒド基、またはアジド基を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、その５’−ヒドロキシルに結合した三リン酸塩またはα−チオ三リン酸基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、その５’−ヒドロキシルに結合した三リン酸塩またはα−チオ三リン酸基を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド鎖にそれぞれ取り込まれるか、あるいは、リボシルまたはデオキシリボシル部分あるいはそのアナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡのアナログに取り込まれる、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド鎖にそれぞれ取り込まれるか、あるいは、リボシルまたはデオキシリボシル部分あるいはそのアナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡのアナログに取り込まれる、請求項２に記載の化合物。
【請求項９】
少なくとも１つのＲ２は独立して、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基であって、式中、Ｒ３が水素であるか、あるいはアミノ保護基；カーゴとアセチレン反応基を含むカーゴ試薬を用いたクリック反応での使用に適したアセチレン基；カーゴとチオール−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したチオール基；カーゴとアルデヒド−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアルデヒド基；カーゴとアジド反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアジド基；および、ｎが１、２、３、４、５、または６である−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨである、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基、ならびに、ｎ１とｎ２がそれぞれ独立して１、２、または３である−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ≡ＣＨからなる群から選択された基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
少なくとも１つのＲ２は独立して、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基であって、式中、Ｒ３が水素であるか、あるいはアミノ保護基；カーゴとアセチレン反応基を含むカーゴ試薬を用いたクリック反応での使用に適したアセチレン基；カーゴとチオール−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したチオール基；カーゴとアルデヒド−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアルデヒド基；カーゴとアジド反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアジド基；および、ｎが１、２、３、４、５、または６である−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨである、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基、ならびに、ｎ１とｎ２がそれぞれ独立して、１、２、または３である−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ≡ＣＨからなる群から選択された基を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
式β９ｂを有する第１の核酸塩基アナログと、式α１５ａまたはα１５ｂのいずれかを有する第２の核酸塩基アナログを含む核酸塩基対であって、
【化３】
2019196355.tif 000039
式中、
それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、
Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンであり、
波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログは遊離形態であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩に結合され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の基を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる、核酸塩基対。
【請求項１２】
式β９ａまたはβ９ｂのいずれかを有する第１の核酸塩基アナログと、式α１６ａまたはα１６ｂのいずれかを有する第２の核酸塩基アナログとを含む核酸塩基対であって、
【化４】
2019196355.tif 000040
式中、
それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、
Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、
Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、
Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンであり、
Ｅ２はそれぞれ独立して硫黄またはセレンであり、
波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログとの結合点を示し、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分またはそのアナログは遊離形態であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩に結合され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の基を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる、核酸塩基対。
【請求項１３】
二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスであって、
第１のオリゴヌクレオチド鎖は請求項１の化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的な塩基対合部位で相補的な塩基対合核酸塩基を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス。
【請求項１４】
二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスであって、
第１のオリゴヌクレオチド鎖は請求項２の化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的な塩基対合部位で相補的な塩基対合核酸塩基を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス。
【請求項１５】
第１の鎖はｄＴＰＴ３を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は相補的な塩基対合部位にｄＮａＭ、ｄＤＭＯ、またはｄＭＭＯ２を含む、請求項１３に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス。
【請求項１６】
二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスの部位特異的な機能化を実行する方法であって、
反応性の中心を含む反応的なリンカーを含んでいる請求項１の化合物から選択される非天然の核酸塩基を、第１のオリゴヌクレオチド鎖に取り込む工程、その後、第１の鎖に相補的な第２の鎖を、第１の鎖と第２の鎖が二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを形成するような条件下で合成する工程であって、第２の鎖がその部位特異的な相補的位置で非天然の核酸塩基に相補的な核酸塩基を含む、工程、その後、反応的なリンカーと相補的な反応性の基との反応により結合リンカーを得るのに適した条件下で、カーゴと相補的な反応性の基を含むカーゴ試薬に、反応的なリンカー部分を含む非天然の核酸塩基を取り込む二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを接触させる工程であって、それによって、結合リンカーによって結合したカーゴで機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを得る、工程、を含む、方法。
【請求項１７】
二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスの部位特異的な機能化を実行する方法であって、
反応性の中心を含む反応的なリンカーを含んでいる請求項２の化合物から選択される非天然の核酸塩基を、第１のオリゴヌクレオチド鎖に取り込む工程、その後、第１の鎖に相補的な第２の鎖を、第１の鎖と第２の鎖が二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを形成するような条件下で合成する工程であって、第２の鎖がその部位特異的な相補的位置で非天然の核酸塩基に相補的な核酸塩基を含む、工程、その後、反応的なリンカーと相補的な反応性の基との反応により結合リンカーを得るのに適した条件下で、カーゴと相補的な反応性の基を含むカーゴ試薬に、反応的なリンカー部分を含む非天然の核酸塩基と取り込む二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを接触させる工程であって、それによって、結合リンカーによって結合したカーゴで機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを得る、工程、を含む、方法。
【請求項１８】
式：Ｎ１−Ｚｘ−Ｎ２を含む構造であって、
式中、Ｎ１はヌクレオチドまたはそのアナログ、あるいは末端のリン酸基であり、Ｎ２はヌクレオチドまたはそのアナログ、あるいは末端のヒドロキシル基であり、Ｚは請求項１または２の化合物であり、および、ｘは１から２０までの整数である、構造。
【請求項１９】
【化５】
2019196355.tif 000041
および、その誘導体またはアナログからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
【化６】
2019196355.tif 000042
および、その誘導体またはアナログからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援についての声明
本発明は国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＧＭ０６０００５下で政府の支援をうけて作られた。米国政府は本発明に一定の権利を有している。
【０００２】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は２０１３年８月８日に出願された米国仮出願第６１／８６３，６４９号の利益を主張し、該文献は参照によって全体として組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドとその使用法は生物工学に革命を起こした。しかしながら、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含むオリゴヌクレオチドは各々、ＤＮＡのアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４つの天然ヌクレオチドと、ＲＮＡのアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）の４つの天然ヌクレオチドのみを含み、このことはオリゴヌクレオチドの潜在的な機能と用途を大きく制限する。
【０００４】
例えば、ＰＣＲまたは等温の増幅系（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写）によってポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を配列特異的に合成する／増幅する能力は、生物工学に革命を起こした。ナノテクノロジーにおける潜在的な用途のすべてに加えて、これにより、ＲＮＡとＤＮＡのアプタマーと酵素のＳＥＬＥＸ（試験管内進化法：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によってインビトロの進化のような多種多様な範囲の新しい技術が使用可能となった。例えば、Ｏｌｉｐｈａｎｔ  ＡＲ，  Ｂｒａｎｄｌ  ＣＪ  ＆  Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ  （１９８９），  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｎｄｏｍ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ＧＣＮ４  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９：２９４４−２９４９；Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  ＆  Ｇｏｌｄ  Ｌ  （１９９０），  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：５０５−５１０；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ  （１９９０），Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４６：８１８−８２２を参照。
【０００５】
不運にもこうした適用は天然の遺伝アルファベット（ＤＮＡ中の４つの天然のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ、ならびに、ＲＮＡ中の４つの天然のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）中に存在する制限された化学的／物理的な多様性によって制限される。これに応じて、天然の遺伝アルファベットのヌクレオチド中に存在しない官能基で部位特異的に標識されるオリゴヌクレオチドの酵素的合成／増幅を可能にする技術に多くの関心が集まっている。現在、部位特異的な核酸誘導体化に利用可能なオプションは、固形担体（ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔ）ベースの化学合成、組み合わされた化学的／酵素的な合成、および、末端標識の手順を含む。末端標識の手順はオリゴヌクレオチド終端に制限され、化学合成は短いオリゴヌクレオチド（ＤＮＡについて＜２００ヌクレオチド、およびＲＮＡについて＜７０ヌクレオチド）に制限されている。酵素の機能化は対象の修飾の酵素認識に依存しており、それが部位特異的ではないことは問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書に記載された組成物と方法は、インビトロの遺伝アルファベットの伸長に基づいており、例えば、標準ＰＣＲまたは等温の転写方法を用いて、相補反応性の基を含むカーゴの試薬と反応するのに適した反応性リンカー、あるいは、それと結合したカーゴを持つリンカーを有する本明細書に記載されているような非天然のヌクレオチドを、任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の任意の位置に部位特異的に取り込む。
【０００７】
様々な実施形態では、リンカーはヌクレオチド三リン酸塩段階でカーゴに付いており、それにより、例えば、ホスホロアミダイトポリヌクレオチド合成機械のような自動式のポリヌクレオチド合成機械による、所望の部位特異的に標識されたオリゴヌクレオチドの直接製造が可能となる。
【０００８】
リンカーは、他の実施形態では、反応性の中心（例えば、一級アミン、アルキン、チオール、アルデヒド、またはアジ化物）を含み、反応性のリンカーをもたらし、その合成後のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの部位特異的な修飾を可能にする。これは、カーゴ（例えば、分子、リポソーム、ナノ粒子など）と、反応的なリンカー部分の反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬を使用して遂行することができる。いくつかの実施形態では、リンカー部分の反応性の中心は標準的な保護基で保護されている。反応的なリンカー（必要に応じて、脱保護の後に）、および、カーゴと相補的な反応性の基とを反応的なリンカーに組み込むカーゴ試薬を有する本明細書で開示される核酸塩基の反応は、連結されたリンカー部分によってカーゴに結合された核酸塩基をもたらす役割を果たす。
【０００９】
様々な実施形態における本開示の組成物は、４つの天然のＤＮＡヌクレオチドと４つの天然のＲＮＡヌクレオチドの機能性の制限されたレパートリーの拡張を可能にすることにより、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドに、あるいはＰＮＡまたはＬＮＡなどのＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログへの所望の部位特異的な組み込みの任意の機能性を事実上含む。カーゴは、分子認識の変更（つまりアプタマーの発生のため）、反応性の変更（触媒作用のために含まれる）、ならびに／あるいは、視覚化および／または特徴づけのための調査（つまり、診断法の開発のため）を可能にするための機能性を随意に含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、様々な実施形態において、以下の式β８ａまたはβ８ｂのいずれかの核酸塩基アナログを含む化合物が提供され、
【００１１】
【化１】
2019196355.tif 000003
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり；Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素であり、核酸塩基アナログは４ＴＦＰまたは７ＴＦＰまたはそのリンカー誘導体化ではない。
【００１２】
本明細書では、様々な実施形態において、以下の式のいずれかの核酸塩基アナログを含む化合物が提供され、
【００１３】
【化２】
2019196355.tif 000004
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素であり、核酸塩基アナログは、ＦＩＭＯ、ＭＩＭＯ、ＦＥＭＯ、ＰｒＭＯ、ＥＭＯ、ＭＥＭＯ、ＩＭＯ、ＭＭＯ２、ＤＭＯ、ＮＭＯ、５ＦＭ、２ＯＭｅ、ＴＭＯ、ＦＤＭＯ、ＶＭＯ、ＺＭＯ、ＣＩＭＯ、ＴｆＭＯ、ＣＮＭＯ、ＮａＭ、またはＱＭＯではない。
【００１４】
全体を通して、波線は、リボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシル部分への、あるいは、ロックドリボースアナログ、ペプチド基などのようなリボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシル部分のアナログへの付着点を示す。いくつかの実施形態では、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分、またはそのアナログは遊離形態であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩の群に接続され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の群を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非天然の核酸塩基Ｘ、ｄＸ、または（ｄ）Ｘのリボシル部分またはデオキシリボシル部分のいずれかについて言及する際、例えば、ｄＴＰＴ３または（ｄ）ＴＰＴ３とは、波線によって指示される位置における選択肢のいずれかと結合したＴＰＴ３核酸塩基を指す。したがって、ｄＸの一般的な名称は、波線によって指示されるようにそれと結合したリボースまたはデオキシリボースのアナログを有する化合物を指す。具体的にリボシルヌクレオシドについて言及する際、接頭辞「ｄ」は落とされ、つまり、ＴＰＴ３はリボシル形態を指す。三リン酸塩ポリメラーゼ基質に取り込まれる際（つまり、ＴＰＴ３ＴＰ、ｄＴＰＴ３ＴＰ）、ヌクレオチドまたはリンカー誘導体化された変異体は、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いて、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチドに取り込まれると考えられる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、提供されるヌクレオシドアナログ（例えば、β８ａ、β８ｂ、α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ）のリボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシルのアナログは、２’官能基を含む。官能基の例は、メトキシ、ハロゲン、−Ｏ−アリル、−Ｏ−メトキシエチル、一級アミン、−Ｏ−ジニトロフェノール、−Ｏ−ジニトロフェニルエーテル、アルキル、−Ｏ−アルキル、チオール、アミノエトキシメチル、アミノプロポキシメチル、アミノエチル、シアノエチル、およびグアニジノエチル群を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシルのアナログは、４’−チオ置換（例えば、糖部分の酸素が硫黄と取り替えられる）を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログのアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、およびイソプロピルの基を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログのハロゲン基は、限定されないが、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含んでいる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの反応的なリンカーは、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル（ｈａｌｏｆｏｒｍｙｌ）、炭酸エステル、カルボキシラート、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、メチレンジオキシ、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、一級アミン、二級アミン、イミド、アジド、アゾ、シアナート、イソシアネート、硝酸塩、ニトリル、イソニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、スルフヒドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スルフォ、チオシアナート、イソチオシアン酸塩、カルボノチオイル、ホスフィノ、ホスホノ、リン酸塩、ボロノ、ボロン酸塩、ボリノ（ｂｏｒｉｎｏ）、ボリン酸塩（ｂｏｒｉｎａｔｅ）、および、これらの組み合わせを含む官能基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの反応的なリンカーは、アミノ基、アセチレン基、チオール基、アルデヒド基、またはアジド基を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、その５’−ヒドロキシルに結合した三リン酸塩またはα−チオ三リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、リボシルまたはデオキシリボシルの部分は、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド鎖にそれぞれ取り込まれるか、あるいは、リボシルまたはデオキシリボシル部分、あるいはそのアナログはＲＮＡまたはＤＮＡのアナログに取り込まれる。ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは特定の実施形態では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）である。ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは特定の実施形態では二環式の誘導体である。二環式の誘導体は、限定されないが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）、炭素環式のロックド核酸（ＣＬＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣＥＮＡ）、および２’−デオキシ−２’−Ｎ，４’−Ｃ−エチレン−ロックド核酸（ＡＥＮＡ）を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは非環式の誘導体である。特定の実施形態では、ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは非ロックド核酸（ＵＮＡ）である。特定の実施形態では、ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは、リボースの代わりにピラノース環を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログは、アラビノ核酸（ＡＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、リボシルまたはデオキシリボシルの部分、あるいはそのアナログは、自動式の化学的なオリゴヌクレオチド合成機械での使用に適した保護基と活性基で置換される。自動式の化学的なオリゴヌクレオチド合成機械の一例は、ホスホロアミダイト合成機械である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は独立して、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基を含み、Ｒ３は水素であるか、あるいはアミノ保護基である。アミノ保護基の一例はジクロロアセチル基である。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は、独立して、カーゴとアセチレン反応基を含むカーゴ試薬を用いたクリック反応での使用に適したアセチレン基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は、独立して、カーゴとチオール−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したチオール基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は、独立して、カーゴとアルデヒド−反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアルデヒド基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は、独立して、カーゴとアジド反応基を含むカーゴ試薬を用いた反応での使用に適したアジド基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログの少なくとも１つのＲ２は、独立して、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨを含み、ｎは１、２、３、４、５、または６であり、あるいは、Ｒ２は−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ≡ＣＨであり、ｎ１とｎ２はそれぞれ独立して、１、２、または３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して、アミノ基とアミノ反応基の反応によってカーゴに結合した１つの結合リンカーである。アミノ反応基の一例は、アシル化基またはアルキル化基であるか、あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して、アセチレン基とアセチレン反応基の反応によってカーゴに結合した結合リンカーである。アセチレン反応基の一例はアジド基である。特定の実施形態では、アセチレン基とアジド基は銅で触媒されたクリック反応により連結される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して、チオールとチオール反応基の反応によってカーゴに結合した結合リンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して、アルデヒドとアルデヒド反応基の反応によってカーゴに結合した結合リンカーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して、アジドとアジド反応基の反応によってカーゴに結合した結合リンカーである。アジド反応基の一例は末端アルキンまたは歪んだシクロオクチンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ２は、独立して水素であり、該化合物はα−チオ三リン酸基を含み、γ−ブロモ−α，β−不飽和カルボニル、ヨード、ブロモアセチル、またはアジリジニルスルホンアミド基を含むカーゴ試薬はそれに連結される）。
【００２２】
いくつかの実施形態では、核酸塩基アナログのカーゴは、限定されないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、小分子医薬品、脂肪族基、光反応性基を含む化合物、化学的に反応基を含む化合物、触媒基を含む化合物、クロロメチルケトンを含む化合物、脂質、ビオチン、蛍光性の化合物、螢光消光化合物、リポソーム、およびナノ粒子を含む。
【００２３】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＴＰＴ３
【００２４】
【化３】
2019196355.tif 000005
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００２５】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＦＴＰＴ３
【００２６】
【化４】
2019196355.tif 000006
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００２７】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＭＭＳ
【００２８】
【化５】
2019196355.tif 000007
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００２９】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＤＭＳ
【００３０】
【化６】
2019196355.tif 000008
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００３１】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＦＥＭＳ
【００３２】
【化７】
2019196355.tif 000009
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００３３】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＢｒＭＳ
【００３４】
【化８】
2019196355.tif 000010
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００３５】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、核酸塩基アナログＩＭＳ
【００３６】
【化９】
2019196355.tif 000011
と、その誘導体およびアナログが提供される。
【００３７】
本明細書では、いくつかの実施形態において、式β９ａまたはβ９ｂのいずれかを有する第１の核酸塩基アナログと、式α１５ａまたはα１５ｂのいずれかを有する第２の核酸塩基アナログと含む核酸塩基対が提供され、
【００３８】
【化１０】
2019196355.tif 000012
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンであり、核酸塩基対は、ｄＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄＩＣＳ−２ＯＭｅ，ｄＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄＳＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄＳＮＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，および、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＣＮＭＯではない。
【００３９】
本明細書では、いくつかの実施形態において、式β９ｂを有する第１の核酸塩基アナログと、式α１５ａまたはα１５ｂのいずれかを有する第２の核酸塩基アナログを含む核酸塩基対が提供され、
【００４０】
【化１１】
2019196355.tif 000013
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、および、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンである。
【００４１】
本明細書では、いくつかの実施形態において、式β９ａまたはβ９ｂのいずれかを有する第１の核酸塩基アナログと、式α１６ａまたはα１６ｂのいずれかを有する第２の核酸塩基アナログとを含む核酸塩基対が提供され、
【００４２】
【化１２】
2019196355.tif 000014
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンであり、および、Ｅ２はそれぞれ独立して硫黄またはセレンである。
【００４３】
波線は、リボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシル部分への、あるいは、ロックドリボースアナログ、ペプチド基などのリボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシル部分のアナログへの付着点を示す。いくつかの実施形態では、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分、またはそのアナログは遊離型であり、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩の群に接続され、随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の群を含むか、あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ中に、あるいはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログ中に含まれる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、アルキニル基はエチニルまたはプロピニル基である。いくつかの実施形態では、アルキル基はメチル、エチル、プロピル、またはイソプロピルの基である。いくつかの実施形態では、ハロゲンはフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、核酸塩基対のリボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシルアナログは、２’官能基を含む。典型的な官能基は、限定されないが、メトキシ、ハロゲン、−Ｏ−アリル、−Ｏ−メトキシエチル、一級アミン、アルキル、−Ｏ−アルキル、チオール、−Ｏ−ジニトロフェノール、−Ｏ−ジニトロフェニルエーテル、アミノエトキシメチル、アミノプロポキシメチル、アミノエチル、シアノエチル、およびグアニジノエチル基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対のリボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシルアナログは、４’−チオ置換を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式α１５ｂを有する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式α１５ａを有する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ｂを有する核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ｂを有する核酸塩基を含み、Ｘはそれぞれ炭素であり、Ｙは硫黄であり、Ｒ２はそれぞれ水素であり、Ｅは硫黄である。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式α１５ｂを有する核酸塩基を含み、Ｘはそれぞれ炭素であり、Ｒ２はそれぞれ水素であり、Ｒ１はメチル基であり、Ｅは酸素である。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ａを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ａを有する第２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ａを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ｂを有する第２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ｂを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ａを有する第２の核酸塩基アナログを含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基対は式β９ｂを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ｂを有する第２の核酸塩基アナログを含む。
【００４７】
本明細書では、特定の実施形態において、式β９ｂを有する第１の核酸塩基アナログと式β９ｂを有する第２の核酸塩基アナログを含む核酸塩基対が提供され、
【００４８】
【化１３】
2019196355.tif 000015
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、および、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンである。いくつかの実施形態では、核酸塩基対はホモ−核酸塩基対である。
【００４９】
本明細書では、特定の実施形態において、式α１６ａを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ａを有する第２の核酸塩基アナログとを含む核酸塩基対が提供され、
【００５０】
【化１４】
2019196355.tif 000016
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、および、Ｅ２はそれぞれ独立して硫黄またはセレンである。いくつかの実施形態では、核酸塩基対はホモ−核酸塩基対である。
【００５１】
本明細書では、特定の実施形態において、式α１６ｂを有する第１の核酸塩基アナログと式α１６ｂを有する第２の核酸塩基アナログとを含む核酸塩基対が提供され、
【００５２】
【化１５】
2019196355.tif 000017
式中、それぞれのＸは独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、および、Ｅ２はそれぞれ独立して硫黄またはセレンである。いくつかの実施形態では、核酸塩基対はホモ−核酸塩基対である。
【００５３】
本明細書では、特定の実施形態において、式β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、またはα１６ｂのいずれかを有する第１の核酸塩基アナログと、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、２−プロピル、およびアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、３−デアザアデニン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、ならびに、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換された、５−ハロ、５−置換されたピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシルで置換されたアデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換されたプリン、Ｎ−６置換されたプリン、Ｏ−６置換されたプリン、二重の形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性の核酸、プロミスカスな（ｐｒｏｍｉｓｕｃｕｏｕｓ）核酸、サイズを拡張した核酸、フッ素で処理された核酸、三環系のピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎ）−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｄｏ）［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｊｅ）、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジンの塩基が複素環と取り替えられたものからなる群から選択される第２の核酸塩基とを含む核酸塩基対が提供される。
【００５４】
１以上の非天然の核酸塩基を含む塩基対は、ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭの非天然塩基対（つまり、ｄＴＰＴ３ＰＡとｄＮａＭの間で形成される対；図１Ａと１Ｂ）によって例証される。加えて、開発された様々な反応的な中心／リンカー（つまり、ホスホロチオエート、アミン、およびアルキン）の直交反応性により、同じオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に様々な部分を選択的に配置することが可能となる。別の組成物はｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＭＭＯ２ｐＣＯの非天然の塩基対によってさらに例証され、様々な実施形態では、ｄＭＭＯ２ｐＣＯのアルキニル基を用いて、銅（Ｉ）で触媒された触媒されたアジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）によって１つの官能基を付け、ｄＴＰＴ３ＰＡの脱保護後に遊離アミンを用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）カップリングによって異なる官能基を付ける。
【００５５】
他のいくつかの非天然の塩基対が報告され、リンカーで誘導体化されてきたが、その一方で、本明細書に記載されるリンカーに誘導体化された対、ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭ、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ−ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＭＭＯ２ｐＣＯ（図２）は、より有効であるだけでなく、ＤＮＡ内での複製とＲＮＡへの転写にも優れている。とりわけ、ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭは良く複製され、したがって、本明細書で開示および主張される方法の実行の際の使用に適している。
【００５６】
本明細書では、ｄＴＰＴ３を含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＴＰＴ３はリンカー誘導体化される。ｄＴＰＴ３またはリンカー誘導体化されたｄＴＰＴ３（例えば、ｄＴＰＴ３ＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＴＰＴ３−ＭＭＳ，ｄＴＰＴ３−ＤＭＳ，ｄＴＰＴ３−ＦＥＭＳ，ｄＴＰＴ３−ＢｒＭＳ，ｄＴＰＴ３−ＩＭＳ，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＮ，ｄＴＰＴ３−ｄ４ＯＭｅ，ｄＴＰＴ３−ｄＩＱ，ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮ，ｄＴＰＴ３−ｄ３ＯＭｅ，ｄＴＰＴ３−ｄＱＬ，  ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｎｐ，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ４，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ，ｄＴＰＴ３−ｄＢＥＮ，ｄＴＰＴ３−ｄ３ＦＢ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＭ１，ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ２，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ５，ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｐｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ５ＭＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄＥＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ３ＭＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ３４ＤＭＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ４５ＤＭＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ４ＭＰｙ，  ｄＴＰＴ３−ｄ３５ＤＭＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄＢＰ，ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｐ，ｄＴＰＴ３−ｄＢＦ，ｄＴＰＴ３−ｄＩＮ，ｄＴＰＴ３−ｄＴｐ，ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｚ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＴｐ，ｄＴＰＴ３−ｄＡＭ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＮ，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＭＡＮ，ｄＴＰＴ３−ｄＡＤＭ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＡＮ，ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８８，ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５７６，ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８７，ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８６，ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８０，ｄＴＰＴ３−ｄＰｈＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＰｙＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ＰｙＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ３，ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ＴｐＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ｄＴｐＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＩＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＥＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＰｒＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ｄ２ＯＭｅ，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＴＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＮＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＮＯＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄ５ＦＭ，ｄＴＰＴ３−ｄＮＡＭ，ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ１，ｄＴＰＴ３−ｄＡＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ２，ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ３，ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＡＰｙ，ｄＴＰＴ３−ｄＦＤＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＶＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＱＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＺＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＣＩＭＯ，ｄＴＰＴ３−ｄＴｆＭＯ，および、ｄＴＰＴ３−ＣＮＭＯを含み、ｄＴＰＴ３相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｄＭＭＯ２ｐＣＯ）。ｄＴＰＴ３はβ６アナログとして図９に例証される。リンカー誘導体化されたｄＴＰＴ３の一例は図２に例証され、いくつかの例では、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＴＰＴ３に相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１および１５に例証されるαアナログ、またはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＴＰＴ３またはリンカー誘導体化されたｄ��ＰＴ３は、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＴＰＴ３またはリンカー誘導体化されたｄＴＰＴ３と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＴＰＴ３またはリンカー誘導体化されたｄＴＰＴ３は、限定されないが、図９、１２、および１３で例証される任意の核酸塩基を含むβ核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基をと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基（例えばｄＴＰＴ３ＰＡ）で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基（例えばｄＴＰＴ３Ａ）で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００５７】
本明細書では、ｄＭＭＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＭＭＳはリンカー誘導体化される。ｄＭＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＭＳ（例えばｄＭＭＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＡＩ−ｄＭＭＳ，ｄＭ７ＡＩ−ｄＭＭＳ，ｄＩｍＰｙ−ｄＭＭＳ，  ｄＰ７ＡＩ−ｄＭＭＳ，ｄＰＰＰ−ｄＭＭＳ，ｄ８Ｑ−ｄＭＭＳ，ｄＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＰＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＭＳ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＭＳ，ｄ４ＯＴＰ−ｄＭＭＳ，ｄＰＹＲ−ｄＭＭＳ，ｄ４ＭＰ−ｄＭＭＳ，ｄ３ＭＰ−ｄＭＭＳ，ｄＰＰＹＲ−ｄＭＭＳ，ｄＭＯＰ−ｄＭＭＳ，ｄ４ＭＯＰ−ｄＭＭＳ，ｄＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ，ｄＴＰＴ１−ｄＭＭＳ，ｄＴＰＴ２−ｄＭＭＳ，ｄＦＰＴ１−ｄＭＭＳ，および、ｄＦＴＰＴ３−ｄＭＭＳを含み、ｄＭＭＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｐＦＴＰＴ３ｐＡ）。ｄＭＭＳはα１４ａアナログとして図１１に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＭＭＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＭＭＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証されるβアナログまたはリンカー誘導体化されたβアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＭＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＭＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＭＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＭＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＭＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＭＳは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導体化された核酸塩基を含むα核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００５８】
本明細書では、ｄＤＭＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＤＭＳはリンカー誘導体化される。ｄＤＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＤＭＳ（例えばｄＤＭＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＡＩ−ｄＤＭＳ，ｄＭ７ＡＩ−ｄＤＭＳ，ｄＩｍＰｙ−ｄＤＭＳ，  ｄＰ７ＡＩ−ｄＤＭＳ，ｄＰＰＰ−ｄＤＭＳ，ｄ８Ｑ−ｄＤＭＳ，ｄＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＰＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＤＭＳ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＤＭＳ，ｄ４ＯＴＰ−ｄＤＭＳ，ｄＰＹＲ−ｄＤＭＳ，ｄ４ＭＰ−ｄＤＭＳ，ｄ３ＭＰ−ｄＤＭＳ，ｄＰＰＹＲ−ｄＤＭＳ，ｄＭＯＰ−ｄＤＭＳ，ｄ４ＭＯＰ−ｄＤＭＳ，ｄＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ，ｄＴＰＴ１−ｄＤＭＳ，ｄＴＰＴ２−ｄＤＭＳ，ｄＦＰＴ１−ｄＤＭＳ，ｄＦＴＰＴ３−ｄＤＭＳを含み、ｄＤＭＳ相補的な塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｐＦＴＰＴ３ｐＡ）。ｄＤＭＳはα１４ａアナログとして図１１に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＤＭＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＤＭＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証されるβアナログまたはリンカー誘導体化されたβアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＤＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＤＭＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＤＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＤＭＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＭＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＭＳは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含むα核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００５９】
本明細書では、ｄＦＥＭＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例ではｄＦＥＭＳはリンカー誘導体化される。ｄＦＥＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＦＥＭＳ（例えば、ｄＦＥＭＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ，ｄＭ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ，ｄＩｍＰｙ−ｄＦＥＭＳ，ｄＰ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ，ｄＰＰＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄ８Ｑ−ｄＦＥＭＳ，ｄＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＰＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄ４ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ，ｄ４ＭＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄ３ＭＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄＰＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ，ｄＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄ４ＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ，ｄＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ，ｄＴＰＴ１−ｄＦＥＭＳ，ｄＴＰＴ２−ｄＦＥＭＳ，ｄＦＰＴ１−ｄＦＥＭＳ，ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＳを含んでおり、ｄＦＥＭＳ相補的な塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｐＦＴＰＴ３ｐＡ）。ｄＦＥＭＳはα１４ａアナログとして図１１に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＦＥＭＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＦＥＭＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証されるβアナログまたはリンカー誘導体化されたβアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＦＥＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＦＥＭＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するためにｄＦＥＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＦＥＭＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＦＥＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＦＥＭＳは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、α核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６０】
本明細書では、ｄＢｒＭＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＢｒＭＳはリンカー誘導体化される。ｄＢｒＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＢｒＭＳ（例えばｄＢｒＭＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ，ｄＭ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ，ｄＩｍＰｙ−ｄＢｒＭＳ，ｄＰ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ，ｄＰＰＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄ８Ｑ−ｄＢｒＭＳ，ｄＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＰＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄ４ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ，ｄ４ＭＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄ３ＭＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄＰＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ，ｄＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄ４ＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ，ｄＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ，ｄＴＰＴ１−ｄＢｒＭＳ，ｄＴＰＴ２−ｄＢｒＭＳ，ｄＦＰＴ１−ｄＢｒＭＳ，ｄＦＴＰＴ３−ｄＢｒＭＳを含み、ｄＢｒＭＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｐＦＴＰＴ３ｐＡ）。ｄＢｒＭＳはα１４ａアナログとして図１１に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＢｒＭＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＢｒＭＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証されるβアナログまたはリンカー誘導体化されたβアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＢｒＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＢｒＭＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＢｒＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＢｒＭＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＢｒＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＢｒＭＳは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、α核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６１】
本明細書では、ｄＩＭＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例ではｄＩＭＳはリンカー誘導体化される。ｄＩＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＭＳ（例えばｄＩＭＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＡＩ−ｄＩＭＳ，ｄＭ７ＡＩ−ｄＩＭＳ，ｄＩｍＰｙ−ｄＩＭＳ，ｄＰ７ＡＩ−ｄＩＭＳ，ｄＰＰＰ−ｄＩＭＳ，ｄ８Ｑ−ｄＩＭＳ，ｄＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＰＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＩＭＳ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＩＭＳ，ｄ４ＯＴＰ−ｄＩＭＳ，ｄＰＹＲ−ｄＩＭＳ，ｄ４ＭＰ−ｄＩＭＳ，ｄ３ＭＰ−ｄＩＭＳ，ｄＰＰＹＲ−ｄＩＭＳ，ｄＭＯＰ−ｄＩＭＳ，ｄ４ＭＯＰ−ｄＩＭＳ，ｄＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ，ｄＴＰＴ１−ｄＩＭＳ，ｄＴＰＴ２−ｄＩＭＳ，ｄＦＰＴ１−ｄＩＭＳ，ｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＳ、ｄＩＭＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｐＦＴＰＴ３ｐＡ）。ｄＩＭＳはα１４ａアナログとして図１１に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＩＭＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＩＭＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証されるβアナログまたはリンカー誘導体化されたβアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＩＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＭＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＩＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＭＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＩＭＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＭＳは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、α核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６２】
本明細書では、ｄＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＣＳ（例えばｄＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｄＤＭＯｐＣＯ、ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＩＣＳはβ２アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６３】
本明細書では、ｄＰＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＰＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＰＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＰＩＣＳ（例えばｄＰＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＰＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄＰＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＰＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄＰＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＰＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＰＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＰＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＰＩＣＳはβ２アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＰＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＰＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＰＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＰＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＰＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＰＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＰＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＰＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６４】
本明細書では、ｄＭＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＭＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＩＣＳ（例えばｄＭＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は限定されないが、ｄＭＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄＭＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＭＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄＭＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＭＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＭＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＭＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＭＩＣＳはβ２アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＭＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＭＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＭＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６５】
本明細書では、ｄ４ＭＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄ４ＭＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄ４ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＭＩＣＳ（例えばｄ４ＭＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄ４ＭＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，  ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄ４ＭＩＣＳはβ２アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄ４ＭＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄ４ＭＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄ４ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＭＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄ４ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＭＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄ４ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＭＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６６】
本明細書では、ｄ５ＭＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄ５ＭＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄ５ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ５ＭＩＣＳ（例えばｄ５ＭＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＭＯ２，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄ５ＭＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，  ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄ５ＭＩＣＳはβ２アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄ５ＭＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄ５ＭＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄ５ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ５ＭＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄ５ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ５ＭＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄ５ＭＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ５ＭＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６７】
本明細書では、ｄＮＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＮＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＮＩＣＳ（例えばｄＮＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＮＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＮＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ＭＭＯ２，ｄＮＩＣＳ−２ＯＭｅ，ｄＮＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＮＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＮＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＮＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＮＩＣＳはβ３アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＮＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＮＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＮＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＮＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＮＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６８】
本明細書では、ｄＯＮＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＯＮＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＯＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＯＮＩＣＳ（例えばｄＯＮＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ＭＭＯ２，ｄＯＮＩＣＳ−２ＯＭｅ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＯＮＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＯＮＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＯＮＩＣＳはβ３アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＯＮＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＯＮＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＯＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＯＮＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＯＮＩＣＳあるいはリンカー誘導体化されたｄＯＮＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＯＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＯＮＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００６９】
本明細書では、ｄＳＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＳＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＩＣＳ（例えばｄＳＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＳＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＳＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＳＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＳＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＳＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ、ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＳＩＣＳはβ５アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＳＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＳＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００７０】
本明細書では、ｄＳＮＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄＳＮＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄＳＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＮＩＣＳ（例えばｄＳＮＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄＳＮＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄＳＮＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｄＤＭＯｐＣＯ、ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄＳＮＩＣＳはβ５アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄＳＮＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄＳＮＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄＳＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＮＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄＳＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＮＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄＳＮＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄＳＮＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００７１】
本明細書では、ｄ４ＳＩＣＳを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄ４ＳＩＣＳはリンカー誘導体化される。ｄ４ＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＳＩＣＳ（例えばｄ４ＳＩＣＳＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＩＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＩＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＰｒＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＥＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＥＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＩＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＤＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＮＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄ５ＦＭ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＴＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＤＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＶＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＺＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＣＩＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＴｆＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＣＮＭＯ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＮＡＭ，ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＱＭＯを含み、ｄ４ＳＩＣＳ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えばｄＤＭＯｐＣＯ、ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄ４ＳＩＣＳはβ５アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄ４ＳＩＣＳは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄ４ＳＩＣＳに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄ４ＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＳＩＣＳは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄ４ＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＳＩＣＳと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄ４ＳＩＣＳまたはリンカー誘導体化されたｄ４ＳＩＣＳは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００７２】
本明細書では、ｄ７ＯＦＰを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄ７ＯＦＰはリンカー誘導体化される。ｄ７ＯＦＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＦＰ（例えばｄ７ＯＦＰＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＩＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＩＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＥＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＰｒＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＥＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＥＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＩＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＭＯ２，ｄ７ＯＦＰ−ｄＤＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＮＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄ５ＦＭ，ｄ７ＯＦＰ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＴＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＤＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＶＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＺＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＣＩＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＴｆＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＣＮＭＯ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＮＡＭ，ｄ７ＯＦＰ−ｄＱＭＯを含み、ｄ７ＯＦＰ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，  ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄ７ＯＦＰはβ５アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄ７ＯＦＰは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄ７ＯＦＰに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄ７ＯＦＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＦＰは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄ７ＯＦＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＦＰと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄ７ＯＦＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＦＰは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００７３】
本明細書では、ｄ７ＯＴＰを含む非天然の塩基対が提供され、いくつかの例では、ｄ７ＯＴＰはリンカー誘導体化される。ｄ７ＯＴＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＴＰ（例えばｄ７ＯＴＰＰＡ）を含む非天然の塩基対は、限定されないが、ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＩＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＩＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＥＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＰｒＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＥＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＥＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＩＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＭＯ２，ｄ７ＯＴＰ−ｄＤＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＮＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄ５ＦＭ，ｄ７ＯＴＰ−ｄ２ＯＭｅ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＴＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＤＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＶＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＺＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＣＩＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＴｆＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＣＮＭＯ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＮＡＭ，ｄ７ＯＴＰ−ｄＱＭＯを含み、ｄ７ＯＴＰ相補的塩基はリンカー誘導体化されるか、あるいはリンカー誘導体化されない（例えば、ｄＤＭＯｐＣＯ，ｄＤＭＯｐＣＣ）。ｄ７ＯＴＰはβ５アナログとして図９に例証される。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化されたｄ７ＯＴＰは官能基Ｒを含み、Ｒはカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカーであるか、あるいは、Ｒはカーゴが結合した結合リンカーである。ｄ７ＯＴＰに相補的な核酸塩基アナログは、限定されないが、図８、１０、１１、および１５に例証されるαアナログまたはリンカー誘導体化されたαアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｄ７ＯＴＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＴＰは、ホモ−核酸塩基対を形成するために、ｄ７ＯＴＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＴＰと対になった塩基である。いくつかの実施形態では、ｄ７ＯＴＰまたはリンカー誘導体化されたｄ７ＯＴＰは、限定されないが、図９、１２、および１３に例証される任意の核酸塩基、あるいはその誘導された核酸塩基を含む、β核酸塩基と対になった塩基である。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護される。いくつかの実施形態では、リンカー部分は保護基で保護されず、いくつかの例では保護基が取り除かれた。
【００７４】
本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＭＭＳを含む核酸塩基対がさらに提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＤＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＦＥＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＢｒＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＩＭＳを含む核酸塩基対が提供される。
【００７５】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＦＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＭＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＦＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＤＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＦＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＦＥＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＦＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＢｒＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＦＴＰＴ３と第２の核酸塩基ＩＭＳを含む核酸塩基対が提供される。
【００７６】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基５ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＭＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基５ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＤＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基５ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＦＥＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基５ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＢｒＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基５ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＩＭＳを含む核酸塩基対が提供される。
【００７７】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＭＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＤＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＦＥＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＢｒＭＳを含む核酸塩基対が提供される。さらに、本明細書では、様々な実施形態において、第１の核酸塩基ＳＩＣＳと第２の核酸塩基ＩＭＳを含む核酸塩基対が提供される。
【００７８】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において二本鎖のオリゴヌクレオチドのデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）が提供され、第１のオリゴヌクレオチド鎖は本明細書で開示される非天然の核酸塩基（例えば、核酸塩基アナログ）を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的塩基対合部位に相補的な塩基対合を含む。例えば、ｄＴＰＴ３については、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対合部位に、ｄＮａＭ、ｄＤＭＯまたはｄＭＭＯ２、あるいはリンカー誘導体化されたアナログを含む。このように、第１のオリゴヌクレオチド鎖と第２のオリゴヌクレオチド鎖の間の対合の相互作用は、本明細書で提供される非天然の核酸塩基部分と、天然または非天然の核酸塩基であり得る相補的な核酸塩基との間の特定の核酸塩基対合による相互作用を含んでいる。
【００７９】
本明細書では、いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスが提供され、第１のオリゴヌクレオチド鎖は式β８ａまたはβ８ｂを有する化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的な塩基対合部位で相補的な塩基対合核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、相補的な塩基対合核酸塩基は、式α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、またはα１４ｆを有する化合物である。いくつかの実施形態では、相補的な塩基対合核酸塩基は、限定されないが、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、２−プロピル、およびアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、３−デアザアデニン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、ならびに、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換された、５−ハロ、５−置換されたピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシルで置換されたアデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換されたプリン、Ｎ−６置換されたプリン、Ｏ−６置換されたプリン、二重の形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性の核酸、プロミスカスな核酸、サイズを拡張した核酸、フッ素で処理された核酸、三環系のピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎ）−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｄｏ）［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミ��［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｊｅ）、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジンの塩基が複素環と取り替えられたものを含む。
【００８０】
本明細書では、いくつかの実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスが提供され、第１のオリゴヌクレオチド鎖は式α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、またはα１４ｆを有する化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的な塩基対合部位に相補的な塩基対合核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、相補的な塩基対合核酸塩基は、式β８ａまたはβ８ｂを有する化合物である。いくつかの実施形態では、相補的な塩基対合核酸塩基は、限定されないが、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、２−プロピル、およびアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、３−デアザアデニン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、ならびに、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換された、５−ハロ、５−置換されたピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシルで置換されたアデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換されたプリン、Ｎ−６置換されたプリン、Ｏ−６置換されたプリン、二重の形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性の核酸、プロミスカスな核酸、サイズを拡張した核酸、フッ素で処理された核酸、三環系のピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎ）−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｄｏ）［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミ��［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｊｅ）、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジンの塩基が複素環と取り替えられたものを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス中の核酸塩基の少なくとも１つのＲ２は、カーゴと結合した結合リンカーである。いくつかの実施形態では、カーゴは触媒機能性を含むレポーターの基、タンパク質、または化合物である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸塩基アナログを含む第１のオリゴヌクレオチド鎖は、反応的なリンカーを含む核酸塩基を用いた合成と、その後の、第１のオリゴヌクレオチド鎖とのカーゴ試薬の結合によって調製されるか、あるいは、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、カーゴに結合した結合リンカーを含む核酸塩基を用いた合成によって調製される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスは、ｄＴＰＴ３またはその誘導体を含む第１の鎖と、相補的な塩基対合部位にｄＮａＭ、ｄＤＭＯまたはｄＭＭＯ２、あるいはその誘導体を含む第２の鎖とを有する。
【００８４】
さらに、本明細書では、様々な実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスの部位特異的な機能化を実行する方法が提供され、該方法は、反応性の中心を含む反応的なリンカーを含む非天然の核酸塩基を第１のオリゴヌクレオチド鎖に取り込む工程であって、核酸塩基が以下の式α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ、β８ａ、β８ｂ、β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、またはα１６ｂのいずれかを有する工程、その後、第１の鎖に相補的な第２の鎖を、第１の鎖と第２の鎖が二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを形成するような条件下で合成する工程であって、第２の鎖が本明細書に記載の部位特異的な相補的な位置で非天然の核酸塩基に相補的な核酸塩基を含む、工程、その後、反応的なリンカーと相補的な反応性の基との反応により結合リンカーを得るのに適した条件下で、カーゴと相補的な反応性の基を含むカーゴ試薬に、反応的なリンカー部分を含む非天然の核酸塩基を取り込む二本鎖オリゴヌクレオチドを接触させる工程であって、それによって、結合リンカーによって結合したカーゴで機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドを得る、工程、を含む。
【００８５】
本明細書では、さらに、様々な実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスの部位特異的な機能化を実行する方法が提供され、該方法は、反応性の中心を含む反応的なリンカーを含む非天然の核酸塩基を第１のオリゴヌクレオチド鎖へ取り込む工程であって、核酸塩基がｄ５ＳＩＣＳＣＯ，ｄ５ＳＩＣＳＣＣ，ｄＤＭＯＣＯ，ｄＤＭＯＣＣ，ｄＭＭＯ２ｐＣＯ，ｄＭＭＯ２ｐＣＣ，ｄＴＰＴ３，ｄＴＰＴ３Ａ，ｄＴＰＴ３ＰＡ，ｄＴＰＴ３ＣＯ，および、ｄＴＰＴ３ＣＣからなる群から選択される、工程、その後、第１の鎖に相補的な第２の鎖を合成する工程であって、第２の鎖は、第１の鎖と第２の鎖が二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスを形成するような条件下で、本明細書に記載の部位特異的な相補的な位置で非天然の核酸塩基に相補的な核酸塩基を含む、工程、その後、反応的なリンカーと相補的な反応性の基との反応により結合リンカーを得て、結合リンカーによって結合したカーゴで機能化された二本鎖オリゴヌクレオチドを得るのに適した条件下で、カーゴと相補的な反応性の基を含むカーゴ試薬に、反応的なリンカー部分を含む非天然の核酸塩基を取り込む二本鎖オリゴヌクレオチドを接触させる工程、を含む。
【００８６】
一実施形態では、対応する５’三リン酸塩がＤＮＡまたはＲＮＡのポリメラーゼ（必要に応じて脱保護後に）を使用してＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドに取り込まれた後に、リンカーはカーゴと結合している。別の実施形態では、第１の鎖と相補的な第２のオリゴヌクレオチドが合成され、第２の鎖は第１の鎖の非天然のヌクレオチドに相補的な位置で非天然のヌクレオチドを含み、その後、反応的なリンカーの反応性の中心と選択的に反応するカーゴを有する試薬に、結果として生じた二本鎖オリゴヌクレオチドを反応させることにより、カーゴを有する機能化された二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡ）が得られる。
【００８７】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、式：Ｎ１−Ｚｘ−Ｎ２を含む構造が提供され、式中、Ｎ１はヌクレオチドまたはそのアナログ、あるいは末端のリン酸基であり、Ｎ２はヌクレオチドまたはそのアナログ、あるいは末端のヒドロキシル基であり、Ｚは、式α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ、β８ａ、β８ｂ、β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、またはα１６ｂのいずれかを有する化合物であり、および、ｘは１から２０までの整数である。いくつかの実施形態では、構造はオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはリボ核酸またはデオキシリボ核酸である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアプタマーまたは核酸ベースのセンサーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは分子ビーコンである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡアナログまたはＤＮＡアナログである。
【００８８】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、標的分子に対して増強された所望の特性を有するような、本明細書に記載される少なくとも１つの化合物（例えば、α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ、β８ａ、β８ｂ、β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、α１６ｂ）を含む核酸アプタマーを同定する方法が提供され、該方法は、ａ）一本鎖核酸アプタマーの候補混合物を調製する工程であって、アプタマーの候補混合物の各々の核酸アプタマーは、本明細書に記載される少なくとも１つの化合物を含み（例えば、α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ、β８ａ、β８ｂ、β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、α１６ｂ）、その後、ｂ）標的分子との結合が生じやすいような条件下で標的分子に候補混合物を接触させる工程、その後、ｃ）候補混合物のアプタマーの中から標的分子に対して所望の特性を有する１つ以上の核酸アプタマーを分割する工程、および、その後、ｄ）標的分子に対して増強された所望の特性を有する１つ以上の核酸アプタマーを得るために、所望の特性を備えた１つ以上の核酸アプタマーをインビトロで増幅する工程、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程ｃ）と工程ｄ）を繰り返す工程ｅ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、一本鎖核酸アプタマーは一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＲＮＡからなる群から選ばれる。いくつかの実施形態では、所望の特性は標的に対する結合親和性である。いくつかの実施形態では、所望の特性は標的結合誘導活性である。いくつかの実施形態では、所望の特性は触媒活性である。いくつかの実施形態では、所望の特性は阻害活性、活性化活性、あるいは、阻害活性または活性化活性の修飾である。いくつかの実施形態では、所望の特性は構造スイッチング活性（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）あるいは構造スイッチング活性の修飾である。いくつかの実施形態では、所望の特性は協同活性である。いくつかの実施形態では、所望の活性は増強された細胞の最新の有効性である。
【００８９】
さらに、本明細書では、特定の実施形態において、以下の式：α１４ａ、α１４ｂ、α１４ｃ、α１４ｄ、α１４ｅ、α１４ｆ、β８ａ、β８ｂ、β９ａ、β９ｂ、α１５ａ、α１５ｂ、α１６ａ、α１６ｂのいずれかを有する化合物を含むアプタマーである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＤＮＡまたはＲＮＡ中のｄＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＤＭＯの対合を示す。
【図２】リンカー誘導体化されたヌクレオチドｄＴＰＴ３Ｒ、ｄ５ＳＩＣＳＲ、ｄＭＭＯ２Ｒ、ｄＭＭＯ２ｐＲ、ｄＤＭＯＲ、ｄＮａＭｐＲ、ｄＮａＭｐＲ、ｄＦＥＭＯ、およびｄＥＭＯを示し、Ｒ＝３−アミノプロピン−１−イル（Ａ、例えばｄＴＰＴ３Ａとして表示される）；Ｒ＝ジクロロアセチル−３−アミノプロピン−１−イル（ＰＡとして表示される）；Ｒ＝４−オキサヘプタ−１，６−ジイン−１−イル（ＣＯとして表示される）；Ｒ＝ヘプタ−１，６−ジイン−１−イル（ＣＣとして表示される）
【図３】ホスホロチオエートベースの合成後の部位特異的な標識戦略の概観を示す。
【図４】アミノベースの合成後の部位特異的な標識戦略の概観を示す。オリゴヌクレオチドと対応するホスホロアミダイトの標準的な固相合成を駆使して、リンカー修飾されたヌクレオチドを鋳型ＤＮＡに直接取り込むこともできる。
【図５】クリックケミストリーベースの合成後の部位特異的な標識戦略の概観を示す。オリゴヌクレオチドと対応するホスホロアミダイトの標準的な固相合成を駆使して、リンカー修飾されたヌクレオチドを鋳型ＤＮＡに直接取り込むこともできる。
【図６】ストレプトアビジン（ＳＡ）ゲルシフトによって分析されたＤＮＡの増幅後標識を例証する代表的なデータを示す。高速移動するバンドはｄｓＤＮＡに対応する一方で、低速移動するバンドはｄｓＤＮＡとストレプトアビジンの間の１：１の複合体に対応する。（Ａ）標識効率はｄ５ＳＩＣＳＰＡ−ｄＮａＭで７２％であり、ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭで８０％である。（Ｂ）標識効率は、１番目（プライマー１：位置１での非天然の塩基対）、９番目（プライマー２：位置１１の非天然の塩基対）、および、１１番目（プライマー３：位置９での非天然の塩基対）位置で、ｄ５ＳＩＣＳＰＡ−ｄＮａＭによって６％、８４％、および５６％である。ｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭを備えた対応する標識効率は７２％、９４％、および８１％である。
【図７】５ＳＩＣＳまたはＭＭＯ２のリンカー誘導体化されたアナログを含むＲＮＡの完全長の転写を確認するゲル電気泳動データを示す。
【図８】α核酸塩基アナログ、α１−α１２の１２のグループ分けを示す。
【図９】β核酸塩基アナログ、β１−β６の６つのグループ分けを示す。
【図１０】α核酸塩基アナログ、α１３およびα１４の２つのグループ分けを示し、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒはそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素である。
【図１１】リンカー誘導体化された核酸塩基アナログ、ＭＭＳｐＣＯ、およびＭＭＳＰＡを含むα１４ａ核酸塩基アナログの例を示す。
【図１２】β核酸塩基アナログβ７およびβ８の２つのグループ分けを示し、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素であり、Ｒは随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーである。
【図１３】β８のリンカー誘導体化された核酸塩基アナログの例を示す。
【図１４−１】６ラウンドのスクリーニングの間に増幅後、ＤＮＡ中で保持される非天然の塩基対のパーセンテージを示す。
【図１４−２】６ラウンドのスクリーニングの間に増幅後、ＤＮＡ中で保持される非天然の塩基対のパーセンテージを示す。
【図１４−３】６ラウンドのスクリーニングの間に増幅後、ＤＮＡ中で保持される非天然の塩基対のパーセンテージを示す。
【図１５】α核酸塩基アナログα１５ａ、α１５ｂ、α１６ａおよびα１６ｂを示し、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンであり、および、Ｅ２はそれぞれ独立して硫黄またはセレンである。
【図１６】β核酸塩基アナログ、β９ａおよびβ９ｂを示し、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド、ニトロ基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して酸素、硫黄、またはセレンである。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
本明細書で使用されるような合成の方法の文脈における「・・を提供するのに適した条件下で」または「・・を得るのに適した条件下で」といった成句は、有用な量または収率の反応生成物をもたらす、実験者が変更する通常の技術の範囲内の時間、温度、溶媒、反応物濃縮といった反応条件のことを指す。所望の反応生成物が唯一の反応生成物である必要はなく、あるいは、所望の反応生成物を単離させるか、あるいはそれ以外の方法でさらに使用することができるという条件で、出発物質を完全に消費する必要はない。
【００９２】
「化学的に実行可能な」により、有機構造の一般に理解されている規則が破られない化合物または結合配置を意味し、例えば、自然界に存在しない五価の炭素原子を特定の状況下で含む請求項の定義内の構造は、請求項内にはないことが理解されよう。こうした実施形態のすべてにおいて、本明細書で開示された構造は、「化学上実現可能な」構造のみを含むよう意図されており、例えば、可変の原子または基を用いて示された構造で、化学的に実現可能ではないいかなる列挙された構造も本明細書で開示または主張することを意図していない。
【００９３】
化学構造の「アナログ」は、本明細書で使用されるように親構造との実質的な類似点を保存する化学構造を指すが、親構造に容易に合成的に由来しないこともあり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは非天然のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドアナログは非天然のヌクレオシドである。親の化学構造に容易に合成的に由来する関連する化学構造は「誘導体」と呼ばれる。
【００９４】
これに応じて、「ＤＮＡアナログ」または「ＲＮＡアナログ」は、本明細書で使用されるように、当該技術分野で周知のペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートなどのＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリマーを指す。ＤＮＡとＲＮＡのアナログは、ＤＮＡおよびＲＮＡと同様に、例えば、シンセサイザーの使用に適したホスホロアミダイト化学または他の化学的なアプローチを駆使して、自動式シンセサイザーで合成可能である。
【００９５】
ＤＮＡは限定されないがｃＤＮＡとゲノムＤＮＡを含む。ＤＮＡは、限定されないがＲＮＡとペプチドを含む別の生体分子に共有結合または非共有結合の手段によって付けられることもある。ＲＮＡはコード化ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、長ｎｃＲＮＡ、あるいはその任意の組み合わせまたはハイブリッドである。いくつかの例では、ＲＮＡはリボザイムの成分である。ＤＮＡとＲＮＡは、限定されないが、直鎖、環状鎖、スーパーコイル状の、一本鎖、および二本鎖を含む任意の形態であり得る。
【００９６】
用語「アミノ保護基」または「アミノ保護される」とは、本明細書で使用されるように、合成手順の間に望ましくない反応からアミノ基を保護するように意図された基であって、アミンを暴露するために後に取り除くことが可能な基を指す。一般に使用されるアミノ保護基はＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．Ｗ．；  Ｗｕｔｓ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  （３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９９）で開示される。アミノ保護基は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなどのようなアシル基；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、および同種のものなどのスルホニル基；アルコキシ−またはアリールオキシ−カルボニル基（保護アミンを含むウレタンを形成する）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエチルオキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチロキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（ａｄａｍａｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなどの（保護されたアミンを含むウレタンを形成する）アルコキシルカルボニル基またはアリールオキシカルボニル基；ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなどのアラルキル基；ならびに、トリメチルシリルや同種のものなどのシリル基、を含んでいる。アミン保護基は、複素環にアミノ窒素を取り込む、フタロイルおよびジチオスクシンイミジル（ｄｉｔｈｉｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）などの環状のアミノ保護基も含む。一般に、アミノ保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、フェニルスルホニル、Ａｌｌｏｃ、Ｔｅｏｃ、ベンジル、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、およびＣｂｚを含む��保護基はさらに、カルバミン酸メチル、カルバミン酸９−フルオレニルメチル、２，２，２−トリクロロエチルカルバマート、ｔ−ブチルカルバマート、２−（トリメチルシリル）エチルカルバマート、アリルカルバマート、ベンジルカルバマート、ｍ−ニトロフェニルカルバマート、トリフルオロアセトアミド、ベンジルアミン、アリルアミン、およびトリチルアミンを含む。保護基は、ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、ｐ−トルエンスルホニル、トリフルオロメタンスルホニル、トリメチルシリルエタンスルホンアミド、およびｔｅｒｔ−ブチルフルホニルも含む。現在の合成タスクに適切なアミノ保護基を選んで使用することは当業者の十分範囲内である。
【００９７】
ＤＮＡとＲＮＡのアナログはＰＮＡ（ペプチド核酸）とＬＮＡ（ロックド核酸）アナログを含んでいる。
【００９８】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は合成ＤＮＡ／ＲＮＡアナログであり、ペプチドのような骨格はＤＮＡまたはＲＮＡの糖リン酸骨格を取り替える。ＰＮＡオリゴマーは相補的なＤＮＡとの結合の際に高い結合強度と大きな特異性を示し、ＰＮＡ／ＤＮＡ塩基のミスマッチはＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の中の同様のミスマッチよりも不安定化している。この結合の強度と特異性はＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖にも当てはまる。ＰＮＡは、酵素分解に対して耐性を有するようになり、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼのいずれによっても容易に認識されない。ＰＮＡはさらに広いｐＨ領域にわたって安定している。さらにＮｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ，  Ｅｇｈｏｌｍ  Ｍ，  Ｂｅｒｇ  ＲＨ，  Ｂｕｃｈａｒｄｔ  Ｏ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９１）．  “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４  （５０３７）：  １４９７−５００．  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１９６２２１０．  ＰＭＩＤ  １９６２２１０；  ａｎｄ，  Ｅｇｈｏｌｍ  Ｍ，  Ｂｕｃｈａｒｄｔ  Ｏ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  Ｌ，  Ｂｅｈｒｅｎｓ  Ｃ，  Ｆｒｅｉｅｒ  ＳＭ，  Ｄｒｉｖｅｒ  ＤＡ，  Ｂｅｒｇ  ＲＨ，  Ｋｉｍ  ＳＫ，  Ｎｏｒｄｅｎ  Ｂ，  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ  （１９９３），  “ＰＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｏｂｅｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｂｏｎｄｉｎｇ  Ｒｕｌｅｓ”．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５  （６４４６）：  ５６６−８．  ｄｏｉ：１０．１０３８／３６５５６６ａ０．  ＰＭＩＤ  ７６９２３０４を参照する。
【００９９】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は修飾されたＲＮＡヌクレオチドであり、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は２’酸素と４’炭素を接続する余分なブリッジで修飾される。ブリッジはしばしばＡ型二本鎖で見られる３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ）立体構造中のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、必要な時はいつでも、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡの残基と混合可能である。こうしたオリゴマーは化学的に合成することができ、市販で入手可能である。ロックドリボース立体構造は塩基の積み重ねと骨格の事前の組織化を増強する。例えば、Ｋａｕｒ，  Ｈ；  Ａｒｏｒａ，  Ａ；  Ｗｅｎｇｅｌ，  Ｊ；  Ｍａｉｔｉ，  Ｓ  （２００６），  “Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ，  Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５  （２３）：  ７３４７−５５．  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０６０３０７ｗ．  ＰＭＩＤ  １６７５２９２４；  Ｏｗｃｚａｒｚｙ  Ｒ．；  Ｙｏｕ  Ｙ．，  Ｇｒｏｔｈ  Ｃ．Ｌ．，  Ｔａｔａｕｒｏｖ  Ａ．Ｖ．  （２０１１），  “Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ．”，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５０  （４３）：  ９３５２−９３６７．  ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ２００９０４ｅ．  ＰＭＣ  ３２０１６７６．  ＰＭＩＤ  ２１９２８７９５；  Ａｌｅｘｅｉ  Ａ．  Ｋｏｓｈｋｉｎ；  Ｓａｎｊａｙ  Ｋ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｐｏｕｌ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｖｉｖｅｋ  Ｋ．  Ｒａｊｗａｎｓｈｉ，  Ｒａｖｉｎｄｒａ  Ｋｕｍａｒ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｍｅｌｄｇａａｒｄ，  Ｃａｒｌ  Ｅｒｉｋ  Ｏｌｓｅｎ，  Ｊｅｓｐｅｒ  Ｗｅｎｇｅｌ  （１９９８），  “ＬＮＡ  （Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｉｎｅ，  ｃｙｔｏｓｉｎｅ，  ｇｕａｎｉｎｅ，  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ，  ｔｈｙｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｕｒａｃｉｌ  ｂｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ，  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｕｎｐｒｅｃｅｄｅｎｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４  （１４）：  ３６０７−３０．  ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０−４０２０（９８）０００９４−５；  ａｎｄ，  Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｏｂｉｋａ；  Ｄａｉｓｈｕ  Ｎａｎｂｕ，  Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｈａｒｉ，  Ｋｅｎ−ｉｃｈｉｒｏ  Ｍｏｒｉｏ，  Ｙａｓｕｋｏ  Ｉｎ，  Ｔｏｓｈｉｍａｓａ  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｉｍａｎｉｓｈｉ  （１９９７），  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  −ｃｙｔｉｄｉｎｅ．  Ｎｏｖｅｌ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｆｉｘｅｄ  Ｃ３’−ｅｎｄｏ  ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３８  （５０）：  ８７３５−８．  ｄｏｉ：１０．１０１���／Ｓ００４０−４０３９（９７）１０３２２−７を参照。
【０１００】
分子ビーコンまたは分子ビーコンプローブは、均質の溶液中の特定の核酸配列の存在を検出することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。分子ビーコンは、標的核酸配列に結合する際にその螢光が回復される内部でクエンチされたフルオロフォアを含むヘアピン形状の分子である。例えば、Ｔｙａｇｉ  Ｓ，  Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ  （１９９６），  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ：  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４  （３）：  ３０３−８．  ＰＭＩＤ  ９６３０８９０；  Ｔａｐｐ  Ｉ，  Ｍａｌｍｂｅｒｇ  Ｌ，  Ｒｅｎｎｅｌ  Ｅ，  Ｗｉｋ  Ｍ，  Ｓｙｖａｎｅｎ  ＡＣ  （２０００  Ａｐｒ），  “Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５’−ｎｕｃｌｅａｓｅ  ＴａｑＭａｎ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ”，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２８  （４）：  ７３２−８．  ＰＭＩＤ  １０７６９７５２；  ａｎｄ，  Ａｋｉｍｉｔｓｕ  Ｏｋａｍｏｔｏ  （２０１１），  “ＥＣＨＯ  ｐｒｏｂｅｓ：  ａ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｎｓｉｎｇ”，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．  ４０：  ５８１５−５８２８を参照。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は一般にヌクレオシドのヘテロ環式塩基部分である。核酸塩基は自然に発生することもあれば、修飾されることもあり、天然の塩基との類似点を持たないこともあれば、例えば、有機合成によって合成されることもある。特定の実施形態では、核酸塩基は水素結合を用いて、または用いずに、別の核酸の塩基と相互に作用することができる任意の原子または原子団も含む。特定の実施形態では、非天然の核酸塩基は天然の核酸塩基に由来しない。非天然の核酸塩基は基本的特性を必ずしも有しているわけではないが、簡略化のために核酸塩基と呼んでいることに留意されたい。いくつかの実施形態において、核酸塩基を参照する際、“（ｄ）”は核酸塩基をデオキシリボースまたはリボースに付けることができることを示している。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは核酸塩基部分と糖部分を含む化合物である。ヌクレオシドは限定されないが、自然発生のヌクレオシド（ＤＮＡとＲＮＡで見られるような）、脱塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、および模倣性の塩基および／または糖類を有するヌクレオシドを含む。ヌクレオシドはあらゆる種類の置換基も含むヌクレオシドを含んでいる。ヌクレオシドは、核酸塩基と糖の還元基との間のグリコシド結合によって形成されたグリコシド化合物であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分がリン酸を含むエステル、より好ましくはモノリン酸エステル、ジリン酸エステル、またはトリリン酸エステルを形成する化合物である。こうしたヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分は、リボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、または２’−位置で置換基を有する２’置換されたリボフラノシルであり得る。同様に、リン酸部分はチオリン酸であり得る。すなわち、糖とリン酸の部分は既知のヌクレオシド、ヌクレオチド、またはその誘導体で見られるような同じ形態であってもよい。その糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドは、ＲＮＡを構成するメンバーとして使用可能である。その糖部分がデオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドは、ＤＮＡを構成するメンバーとして使用可能である。ヌクレオチドはリン酸結合基をさらに含むヌクレオシドであり得る。ヌクレオチドはリン酸塩部分を含むヌクレオシドを含むことがある。
【０１０４】
ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭとｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２（図１）によって例証される天然の塩基対のクラスが我々によって複製するように（ＰＣＲの使用を含む）開発され、示されており、天然の塩基対の場合に近い効率と忠実度で様々な天然のポリメラーゼによって複製され転写されてきた（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．  Ａ．  ；  Ｓｅｏ，  Ｙ．  Ｊ．；  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．；  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．  Ｅ．，  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００９．  １３１  （４１），  １４６２０−１４６２１；  Ｓｅｏ，  Ｙ．  Ｊ．；  Ｍａｔｓｕｄａ，  Ｓ．；  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．  Ｅ．，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００９，  １３１  （１４），  ５０４６−５０４７；  Ｌａｖｅｒｇｎｅ  Ｔ．；  Ｄｅｇａｒｄｉｎ  Ｍ．；  Ｍａｌｙｓｈｅｖ  Ｄ．Ａ．；  Ｑｕａｃｈ  Ｈ．Ｔ．；  Ｄｈａｍｉ  Ｋ．；  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ  Ｐ．；  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．；  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ＤＮＡ：  Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１３，  １３５，  ５４０８−５４１９；  Ｓｅｏ，  Ｙ．Ｊ．，  Ｍａｌｙｓｈｅｖ  Ｄ．Ａ．，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ  Ｔ．，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１１，  １３３，  １９８７８．を参照）。こうした非天然の塩基対は不自然で優勢的に疎水性の核酸塩基を有するヌクレオチドアナログ間で形成される。塩基対は図１に示されており、各々の非天然のヌクレオチドは相補的な（つまり、対合の）位置でオリゴヌクレオチドに取り込まれ、核酸塩基は波線で示される位置でリボシルの１’−位置、または２’−デオキシリボシル部分に結合することが分かる。核酸塩基自体は、完全に天然の核酸の場合によくあることであるが、リボシルまたはデオキシリボシルの基の３’と５’ヒドロキシル基それぞれと結合するリン酸基またはホスホロチオエート基によってＲＮＡまたはＤＮＡに取り込まれる。したがって対合は、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス構造の形成において周知のように、相補的な塩基の一部として行われる。本明細書では、様々な実施形態において、非天然の核酸塩基ｄＴＰＴ３とそのリンカー誘導体化された変異体が提供され、これらは同様の方法で非天然の核酸塩基ｄＮａＭ、ｄＭＭＯ２、およびｄＤＭＯ（あるいはそのリンカー誘導体化された変異体）と対になると考えられる。
【０１０５】
我々は、非天然のヌクレオチドｄＴＰＴ３とｄＴＰＴ３ＰＡがｄＮａＭの反対側でＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡに効率的に取り込まれることを実証した（図２）。ｄＴＰＴ３とｄＴＰＴ３ＰＡ（ＰＡ＝ジクロロアセチル−３−アミノプロピン−１−イル）の両方は、Ｒ＝３−アミノプロピン−１−イル（ｄＴＰＴ３Ａ）、Ｒ＝４−オキサヘパト（ｏｘａｈｅｐａｔ）−１，６−ジイン−１−イル（ｄＴＰＴＣＯ）、あるいはＲ＝ヘプタ−１，６−ジイン−１−イル（ｄＴＰＴＣＣ））である場合を含むｄＴＰＴ３の他のリンカー誘導体化された変異体と同様に（図３）、ｄＮａＭ、ｄＤＭＯまたはｄＭＭＯ２、あるいはそのリンカー誘導体化されたアナログと対になることが予想される。ｄＮＡＭとは反対側でのｄＴＰＴ３とそのリンカー誘導体化された変異体の取り込み速度は、天然の塩基対の速度に近くなる。効率的な取り込み速度で同定されたさらなる非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、およびｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＯを含んでいる。
【０１０６】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、αアナログ（例えば、図８、１０、１１、１５のいずれか１つ、およびその誘導体）；βアナログ（例えば図９、１２、１３、１６のいずれか１つ、およびその誘導体）；ｄ５ＳＩＣＳＣＯ、ｄ５ＳＩＣＳＣＣ、ｄＤＭＯＣＯ、ｄＤＭＯＣＣ、ｄＭＭＯ２ｐＣＯ、ｄＭＭＯ２ｐＣＣ、ｄＴＰＴ３、ｄＴＰＴ３ＰＡ、ｄＴＰＴ３Ａ、ｄＴＰＴ３ＣＯ、ｄＴＰＴ３ＣＣ、および、そのリボシル形態、ならびにそのアナログ（図２を参照）；ヌクレオシドの形態で、ヌクレオシド’５、三リン酸塩およびそのアナログ（例えば、リボシルと２’−デオキシリボシル）、ヌクレオチドとそのアナログ（例えば、リボシルと２’−デオキシリボシル、リン酸塩とホスホロチオエート）（ＲＮＡ／ＤＮＡ合成（ＤＭＴ保護されたホスホラミダイト）で使用される、および、ＰＣＲまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ媒介性の転写によるようなオリゴヌクレオチドへの酵素的な取り込みや、ＤＮＡとＲＮＡなどの核酸（オリゴヌクレオチド）への取り込みで使用される、ヌクレオチド試薬を含む）、を含む核酸塩基アナログを備える非天然のヌクレオチドが提供される。非天然の核酸塩基アナログを含む化合物も、ＰＮＡ、ＬＮＡおよび他の類似するポリヌクレオチドアナログポリマーなどのＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログに取り込むことができる。本明細書で提供される典型的な核酸塩基アナログは、図１２に示されるような式β８ａとβ８ｂを含むβ８アナログを含み、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素であり、および、Ｒは随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーである。β８アナログの例はｄＴＰＴ３とそのリンカー誘導体化されたアナログを含んでいる。本明細書で提供される典型的な核酸塩基アナログは、図１０で示されるように、式α１４ａ−α１４ｆを含むα１４アナログを含んでおり、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒはそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素である。α１４アナログの例は、ｄＭＭＳ、ｄＤＭＳ、ｄＦＥＭＳ、ｄＢｒＭＳ、ｄＩＭＳ、およびそのリンカー誘導体化されたアナログを含んでいる。
【０１０７】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、本明細書で開示される任意の１つのαアナログまたはその誘導体、および、本明細書で開示される任意の１つのβアナログまたはその誘導体を含む非天然の塩基対が本明細書で提供される。誘導体は、限定されないが、リンカー部分の置換物と付加物を含む。リンカー部分は合成の間に、または核酸への核酸塩基の取り込み後に、アナログに付けられることもある。典型的な非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＯを含む。非天然の塩基対は、限定されないが、ｄＴＰＴ３−ＭＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＤＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＩＭＳ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ４ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＱ、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＱＬ、ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｎｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ４、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＥＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＦＢ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭ１、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ２、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ５、ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｐｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ５ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＥＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３４ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ４５ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ４ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３５ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＰ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＦ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｚ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＤＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８８、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５７６、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８７、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８６、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８０、ｄＴＰＴ３−ｄＰｈＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＰｙＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ＰｙＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ３、ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ＴｐＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＴｐＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＰｒＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＴＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＯＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ５ＦＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＡＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ３、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＤＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＶＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＱＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＺＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＣＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＴｆＭＯ、ｄＴＰＴ３−ＣＮＭＯ、ｄ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＭＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＭＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＭＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＭＩＣ��−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＭＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＭＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＭＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＭＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＭＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＭＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＭＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＭＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＭＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＤＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＤＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＤＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＤＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＤＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＤＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＤＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＤＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＤＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＤＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＤＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＤＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＤＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＦＥＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＦＥＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＦＥＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＢｒＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＢｒＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＢｒＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＩＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＩＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＩＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＩ��Ｓ、ｄＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＩＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＩＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＩＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＩＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＩＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＩＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＩＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＩＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＩＭＳ、およびｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＳを含み、非天然の塩基対の１または２の非天然の核酸塩基はリンカーで誘導体化されることもある。この開示の典型的な非天然の塩基対は実施例１に記載される任意の対もさらに含む。典型的なβアナログは図９、１２、および１３で提示されるものを含む。典型的なβ核酸塩基アナログは、図１２に示されるように、式β８ａとβ８ｂを含むβ８アナログを含んでおり、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素であり、および、Ｒは随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーである。βアナログの例は、ｄＴＰＴ３、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＦＴＰＴ３、およびその誘導体またはアナログを含んでいる。典型的なαアナログは図８、１０、および１１に提示されるものを含む。典型的なαアナログは、図１０に示されるように式α１４ａ−α１４ｆを含むα１４アナログを含み、Ｘはそれぞれ独立して炭素または窒素であり、Ｒ１はそれぞれ独立して、水素、アルキル基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、あるいはカーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒ２はそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであり、Ｒはそれぞれ随意であり、存在する場合、独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、カーゴと反応性の中心に相補的な反応性の基とを含むカーゴ試薬に結合するのに適した反応性の中心を含む反応的なリンカー、カーゴが結合している結合リンカーであ���、Ｙはそれぞれ独立して硫黄、酸素、セレン、または二級アミンであり、Ｅはそれぞれ独立して硫黄、セレン、または酸素である。αアナログの例は、ｄＭＭＳ、ｄＤＭＳ、ｄＢｒＭＳ、ｄＩＭＳ、ｄＦＥＭＳ、ｄＮＡＭ、ｄＭＭＯ２、ｄＤＭＯ、ｄＥＭＯ、ｄＦＥＭＯ、およびその誘導体またはアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対はαアナログと天然の塩基を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対はβアナログと天然の塩基を含んでいる。さらに本明細書では、いくつかの態様において、同じ２つの非天然のヌクレオシドアナログあるいはその誘導体を含む非天然の塩基対が提供される。
【０１０８】
非天然の塩基対は様々な態様において、本明細書で開示される１つの非天然の核酸塩基（例えば、αアナログあるいはその誘導体、βアナログあるいはその誘導体）と、限定されないが以下を含む別の非天然の核酸塩基、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、２−プロピル、および、アデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、３−デアザアデニン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、ならびに、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換された、５−ハロ、５−置換されたピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシルで置換されたアデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換されたプリン、Ｎ−６置換されたプリン、Ｏ−６置換されたプリン、二重の形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性の核酸、プロミスカスな核酸、サイズを拡張した核酸、フッ素で処理された核酸、三環系のピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎ）−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｄｏ）［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラ��ル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｊｅ）、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジンの塩基が複素環と取り替えられたものを含む。非天然の塩基対のαアナログは、限定されないが、ｄＭＭＳ、ｄＤＭＳ、ｄＢｒＭＳ、ｄＩＭＳ、ｄＦＥＭＳ、ｄＮＡＭ、ｄＭＭＯ２、ｄＤＭＯ、ｄＥＭＯ、ｄＦＥＭＯ、およびその誘導体またはアナログを含んでいる。非天然の塩基対のβアナログは、限定されないが、ｄＴＰＴ３、ｄ５ＳＩＣＳおよびｄＦＴＰＴ３を含んでいる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された非天然の核酸塩基と非天然の塩基対は、天然のポリメラーゼで効率的な取り込みと伸長を行う。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された非天然の核酸塩基と非天然の塩基対は、修飾ポリメラーゼで効率的な取り込みと伸長を行う。ポリメラーゼ認識に対する非天然の核酸塩基または非天然の核酸塩基誘導体の影響は、典型的な実施形態において、鋳型中でのその相補的な塩基とは反対側での非天然のヌクレオチドの挿入によりポリメラーゼが非天然の塩基対を合成し、次の正確な天然のヌクレオチドの挿入により結果として生じる非天然のプライマー終端を延長する際の定常的な効率（例えば、二次速度定数ｋｃａｔ／ＫＭ）を決定することによって評価される。忠実度を決定するために、天然のヌクレオチドを含む誤対合に関する合成と伸長の対応する速度も測定されることがある。いくつかの実施形態では、取り込みまたは伸長の速度を改善するためにポリメラーゼを修飾する必要はない。本明細書で開示される実施形態と実施例は任意の既知のポリメラーゼで行われることもある。ポリメラーゼは自然発生のポリメラーゼと、限定されないが、突然変異体、組換え体、融合物、遺伝子組み換え物、化学修飾物、化学合成品およびアナログを含む任意の変化物とを含む。自然発生のポリメラーゼとその修飾変化物は、重合反応を触媒する能力を保持するポリメラーゼに限定されない。いくつかの例では、自然発生するおよび／または修飾された変化物は、重合反応を触媒する能力を保持する。突然変異体ポリメラーゼは、１つ以上のアミノ酸が（自然発生または非自然発生の）他のアミノ酸と取り替えられたポリメラーゼと、１つ以上のアミノ酸挿入または欠失を有するポリメラーゼとを含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは互いに連結した少なくとも２つの部分を含む融合タンパク質を指し、例えば、核酸へのヌクレオチドの重合を触媒することができるペプチドを含む１つの部分は、レポーター酵素または処理能力を修正するドメインなどの第２の部分を含む別の部分に連結される。こうしたポリメラーゼの典型的な１つの実施形態はＴ７  ＤＮＡポリメラーゼであり、これは核酸の重合化ドメインとチオレドキシン結合ドメインを含み、チオレドキシン結合はポリメラーゼの処理能力を増強する。チオレドキシン結合がないときは、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼは、１乃至数個の塩基の処理能力を備えた離散型のポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼは、限定されないが、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ウィルスＤＮＡポリメラーゼ、およびファージＤＮＡポリメラーゼを含む。細菌ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ、ＩＶおよびＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ（Ｃｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  （Ｃｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。真核生物のＤＮＡポリメラーゼは、Ｒｅｖ１ポリメラーゼ（末端デオキシシチジルトランスフェラーゼ）と末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）と同様に、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、∈、η、ζ、σ、λ、μ、ι、およびκを含んでいる。ウィルスＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＡ−１、ｐｈｉ−２９−様ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＺＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−１５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４ポリメラーゼを含んでいる。古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓｕ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｕｒｂｏ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＪＤＦ−３（ＪＤＦ−３）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＯＫ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ．Ｔｏｋ  Ｐｏｌ）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡポリメラーゼ；および、ヘテロ二量体ＤＮＡポリメラーゼＤＰ１／ＤＰ２から分離されたＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性および／または好熱性のＤＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、限定されないが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、およびＫ１１ポリメラーゼのようなウィルスＲＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼＶのような真核生物ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに、古細菌ＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、天然のヌクレオチドに対してポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、αまたはβの核酸塩基アナログを含む非天然のヌクレオチドへの特異性を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、天然のヌクレオチドおよび／または修飾された糖を含まない非天然のヌクレオチドに対してポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％  ３０％  ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％  ９９％  ９９．５％、９９．９９％である、αまたはβの核酸塩基アナログと修飾された糖を含む非天然のヌクレオチドへの特異性を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、天然のヌクレオチドおよび／またはリンカーを含まない非天然のヌクレオチドに対してポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％  ３０％  ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％  ９９％  ９９．５％、９９．９９％である、リンカー誘導体化されたαまたはβの核酸塩基アナログを含む非天然のヌクレオチドへの特異性を有する。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＴＰＴ３である。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＭＭＳである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＤＭＳである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＢｒＭＳである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はＩＭＳである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＦＥＭＳである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はＭＭＳｐＣＯである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＭＭＳＰＡである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＦＴＰＴ３である。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＴＰＴＰＡである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基はｄＴＰＴ３ＣＯである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ｃあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ｄあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ｅあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式α１４ｆあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式β８ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基は式β８ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。
【０１１１】
特定の天然および／または非天然のヌクレオチド、あるいは天然および／または非天然のヌクレオチドの集合体と共に使用される際、ポリメラーゼはその忠実度に従って特徴づけることが可能であり、非天然のヌクレオチドは本明細書に記載されるαまたはβの核酸塩基アナログを含む。様々な実施形態において、忠実度とは一般にオリゴヌクレオチド鋳型のコピーを作る際に、ポリメラーゼが成長しているオリゴヌクレオチドに適切なヌクレオチドを取り込む正確性のことを指す。ポリメラーゼ鎖鋳型核酸二元複合体中の同じ部位で鎖合成をめぐって競い合うために、天然および非天然のヌクレオチドが例えば等しい濃度で存在する場合、正確な天然および非天然のヌクレオチドの取り込み対不正確な天然および非天然のヌクレオチドの取り込みの比率として、ポリメラーゼの忠実度を測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ忠実度は、天然および非天然のヌクレオチドの（ｋｃａｔ／ＫＭ）と不正確な天然および非天然のヌクレオチドの（ｋｃａｔ／ＫＭ）の比率として計算可能であり、ｋｃａｔとＫＭは定常状態酵素動力学のミカハエリス・メンデンのパラメータである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性を含むまたは含まずに、少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１ｘ１０６の忠実度値を有する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、非天然のヌクレオチド取り込みについて少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１ｘ１０６の忠実度値を有する。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはｄＴＰＴ３ＴＰまたはその誘導体であり、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はｄＮＡＭまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはｄＮａＭＴＰまたはその誘導体であり、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はｄＴＰＴ３またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ａまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｂまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｃまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｄまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｅまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ａまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｆまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｂまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４���またはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｂまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｂまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｂまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｃまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｂまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｄまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｅまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｅまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、非天然のヌクレオチドはβ８ｆまたはその誘導体を含み、鋳型のオリゴヌクレオチド上のその対応する核酸塩基はα１４ｆまたはその誘導体を含む。
【０１１２】
非天然の塩基対は、いくつかの実施形態において、天然の塩基対のような効率と忠実度で合成／増幅される。非天然の塩基対は様々な実施形態において、任意のα核酸塩基アナログまたはその誘導体に、および／または、任意のβ核酸塩基アナログまたはその誘導体を含む。βアナログの例はｄＴＰＴ３、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＦＴＰＴ３、およびその誘導体またはアナログを含んでいる。αアナログの例はｄＭＭＳ、ｄＤＭＳ、ｄＢｒＭＳ、ｄＩＭＳ、ｄＦＥＭＳ、ｄＮＡＭ、ｄＭＭＯ２、ｄＤＭＯ、ｄＥＭＯ、ｄＦＥＭＯ、およびその誘導体またはアナログを含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、倍加当たり９０％、９１％  ９２％、９３％）、９４％、９５％、９６％、９７％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８５、９９．９、またはそれよりも高い忠実度で、ＧＣとＡＴに富んだ配列、無作為化した配列、および複数の非天然の核酸塩基対を含む配列を含んでいる多種多様な配列構成で効率的に増幅される。例えば、１以上の非天然の核酸塩基を含む非天然の核酸塩基対は、天然の塩基対の増幅効率および／または忠実度に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％  ８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％類似している合成効率および／または忠実度を有する。別の例として、１つ以上の非天然の核酸塩基を含む非天然の核酸塩基対は、天然の塩基対のせいぜい１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％以下しか効率的および／または正確でない合成効率および／または忠実度を有する。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対は、両方の鎖の構成（例えば、ｄＸはＹＴＰ挿入を鋳型にしなければならず、ｄＹはＸＴＰ挿入を鋳型にしなければならない）中で優れた効率と選択性で転写される。いくつかの実施形態では、完全に天然の配列が転写される速度に比べて、非天然のヌクレオチドの取り込みは完全長の転写の速度を低下させない。いくつかの実施形態では、完全に天然の配列が転写される速度に比べて、非天然のヌクレオチドの取り込みは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０未満の倍数、完全長の転写の速度を低下させる。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、ｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｃあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｄあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｅあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ａあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｆあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｃあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｄあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｅあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対は、β８ｂあるいはその誘導体またはアナログ、およびα１４ｆあるいはその誘導体またはアナログを含む。
【０１１３】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、１以上の非天然の核酸塩基（例えば、α核酸塩基、β核酸塩基、またはα核酸塩基とβ核酸塩基）を含む非天然の塩基対が提供され、１または２の核酸塩基がリンカーを含む。リンカーは反応性の中心を含む。典型的な反応性の中心は、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、炭酸エステル、カルボキシラート、カルボキシル、エステル、メトキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、メチレンジオキシ、オルト炭酸エステル、カルボキサミド、一級アミン、二級アミン、イミド、アジド、アゾ、シアナート、イソシアネート、硝酸塩、ニトリル、イソニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、スルフヒドリル、スルフィド、ジスルフィド、スルフィニル、スルフォ、チオシアナート、イソチオシアン酸塩、カルボノチオイル、ホスフィノ、ホスホノ、リン酸塩、ボロノ、ボロン酸塩、ボリノ、ボリン酸塩、および、これらの組み合わせを含む。リンカー誘導体化された核酸塩基の一例は図２に示されるＴＰＴ３Ｒであり、上付きのＲはリンカーを示す。いくつかの実施形態では、リンカーは保護基、例えば、ＴＰＴ３ＰＡで修飾され、リンカーは保護されたプロパルギルリンカーである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸塩基アナログは、アミノ機能的なリンカーまたは保護されたアミノ機能的なリンカー（例えばｄＸＰＡ）を含む。特定の実施形態において、アミノ機能的なリンカーは３−アミノプロピン−１−イルである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸塩基アナログは、クリックケミストリーによる誘導体化のためのアルキンアジドエーテルリンカー、あるいはクリックケミストリーによる誘導体化のための保護されたアルキンアジドエーテルリンカーを含む。特定の実施形態では、アルキンアジドエーテルリンカーは４−オキサへパト（ｏｘａｈｅｐａｔ）−１，６−ジイン−１−イルである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸塩基アナログは、クリックケミストリーによる誘導体化のためのアルキンアジドトリメチレンリンカー、あるいはクリックケミストリーによる誘導体化のための保護されたアルキンアジドトリメチレンリンカーを含む。特定の実施形態では、アルキンアジドトリメチレンリンカーはヘプタ−１，６−ジイン−１−イルである。いくつかの実施形態では、Ｘは、図９、１２、１３、および１６の式のいずれかを有するβヌクレオシドアナログである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＩＣＳ、ＰＩＣＳ、ＭＩＣＳ、４ＭＩＣＳ、５ＭＩＣＳ、ＮＩＣＳ、ＯＮＩＣＳ、ＳＩＣＳ、ＳＮＩＣＳ、５ＳＩＣＳ、４ＳＩＣＳ、７ＯＦＰ、７ＯＴＰ、ＴＰＴ２、ＴＰＴ３、またはＦＴＰＴ３である。いくつかの実施形態では、Ｘは、図８、１０、１１、および１５の式のいずれかを有するαヌクレオシドアナログである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＦＩＭＯ、ＭＩＭＯ、ＦＥＭＯ、ＰｒＭＯ、ＥＭＯ、ＭＥＭＯ、ＩＭＯ、ＭＭＯ２、ＤＭＯ、ＮＭＯ、５ＦＭ、２ＯＭｅ、ＴＭＯ、ＦＤＭＯ、ＶＭＯ、ＺＭＯ、ＣＩＭＯ、ＴｆＭＯ、ＣＮＭＯ、ＭＭＳ、ＤＭＳ、ＢｒＭＳ、ＩＭＳ、ＦＥＭＳ、ＮＡＭ、またはＱＭＯである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、リンカーは天然のヌクレオチドと共に使用されるようなプロピニルリンカーである。これらのリンカーは、他の機能性を付けるための反応部位として機能するアミンと共に、プロパルギルアミンを含む。
【０１１６】
様々な実施形態では、リンカー誘導体化された核酸塩基はスペーサーを含む。典型的なスペーサーはアセトアミドヘキサンアミドである。スペーサーは親水性であってもよい。スペーサーは官能基にリンカーを接続することがある。スペーサーは、限定されないが、スペーサーＣ３（３−炭素スペーサー）、スペーサーＣ６（６−炭素スペーサー）、光開裂可能な（ｐｈｏｔｏ−ｃｌｅａｖａｂｌｅ）スペーサー、ヘキサンジオールスペーサー、スペーサー９（トリエチレングリコールスペーサー）、スペーサーＣ１２（１２−炭素スペーサー）、スペーサー１８（１８−原子ヘキサ−エチレングリコールスペーサー）、および、１’，２’−ジデオキシリボース（Ｄｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）スペーサーを含む。
【０１１７】
１または２のリンカー誘導体化された核酸塩基を含む非天然の核酸塩基対は、いくつかの例では、天然の塩基対、または非リンカー誘導体化された非天然の塩基対の効率と忠実度に類似した効率と忠実度で増幅される。例えば、１または２のリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基を含む非天然の核酸塩基対は、天然の塩基対、または非リンカー誘導体化された非天然の塩基対の合成効率および／または忠実度に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％類似している合成効率および／または忠実度を有する。別の例として、１または２のリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基を含む非天然の核酸塩基対は、天然の塩基対、または非リンカー誘導体化された非天然の塩基対の合成効率および／または忠実度のせいぜい１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％以下しか効率および／または正確ではない合成効率および／または忠実度を有する。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＴＰＴ３ＰＡを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＴＰＴ３ＣＯを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＭＭＳｐＣＯを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＭＭＳＰＡを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＮａＭＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＭＭＯ２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＤＭＯＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄ５ＳＩＣＳＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＭＭＳＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＤＭＳＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＦＥＭＳＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＢｒＭＳＲを含む。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基対はｄＩＭＳＲを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、リンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間の挿入効率を上げる。いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、リンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間の挿入効率を下げる。いくつかの例では、リンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、リンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間ほぼ同じ挿入効率である。いくつかの実施形態では、保護されたリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、保護されたリンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間の挿入効率を上げる。いくつかの実施形態では、保護されたリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、保護されたリンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間に挿入効率を下げる。いくつかの例では、保護されたリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基は、保護されたリンカーを含まない同じ非天然の核酸塩基と比較して、オリゴヌクレオチド合成の間ほぼ同じ効率である。
【０１１９】
非天然の塩基対合成効率（鋳型中のそのパートナーの反対側での非天然の核酸塩基の挿入）と伸長（継続的なプライマー伸長）を分析する典型的な方法が提供される。様々な実施形態において、非天然の塩基対中の核酸塩基の１つまたは両方は、リンカー誘導体化された非天然の核酸塩基であってもよい。１つの方法は前定常状態分析を用いる。分析は、固定された一連の条件下で、ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片）による鋳型（例えば、４５量体）中のその相補的なヌクレオチドの反対側での非天然のヌクレオチドの付加によって伸長するプライマー（例えば２３量体）の量を決定することに基づく。この分析では、非天然の塩基対合成の効率は、例えば、［２４量体＋２５量体］／［２３量体＋２４量体＋２５量体］などの比率を用いて、非天然の次の正確な三リン酸塩の所定の濃度で取り込みパーセント（％ｉｎｃ）を測定することにより特徴づけられる。この分析では、伸長の効率は、例えば、［２５量体］／［２４量体＋２５量体］の比率を用いて、次の正確なヌクレオチドの所定の濃度と非天然のヌクレオチドの飽和濃度で伸長パーセント（％ｅｘｔ）を測定することにより特徴づけられる。典型的な前定常状態分析の結果が表１に示され、非天然の三リン酸塩は５ＳＩＣＳ、ＦＰＴ１、ＴＰＴ１、ＴＰＴ２、ＴＰＴ３、ＦＴＰＴ３、ＴＰＴ３ＰＡ、または５ＳＩＣＳＰＡである。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基の取り込みパーセントは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、非天然の核酸塩基の挿入後の次の正確なヌクレオチドの伸長パーセントは、少なくとも３０％、３１％  ３２％  ３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％以上である。いくつかの実施形態では、合成効率は非天然の核酸塩基の誘導体化により上昇する。例えば、リンカー、保護リンカー、および／またはカーゴ分子に共役したリンカーの付加による。別の例として、誘導体化は原子の置換、追加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、伸長パーセントは非天然の核酸塩基の誘導体化により上昇する。非天然の核酸塩基の誘導体化は、いくつかの例において、鋳型中の塩基対に相補的なヌクレオチドの挿入の効率を少なくとも１−２桁増加させる。この効率の増加はｋｃａｔの増加とＫＭの減少によることもあり得る。
【０１２０】
【表１】
2019196355.tif 000018
【０１２１】
さらに本明細書では、複製評価手段が提供される。１つの方法において、非天然の塩基対（例えば、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭまたはそのアナログ）を含む鋳型核酸二本鎖はＰＣＲによって増幅される。一例において、１セットのＰＣＲ反応はＯｎｅＴａｑポリメラーゼを含む４８のサイクルを使用する。別の例において、１セットのＰＣＲ反応はエキソヌクレアーゼ陰性（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｔａｑを含む２０の増幅サイクルを使用する。効率は増幅レベルをモニタリングすることにより決定される。一般に倍加あたりの非天然の塩基対の伸長として定義される忠実度は、非天然の塩基対を保持する増幅されたＤＮＡのパーセンテージから決定される。非天然の塩基対を保持する増幅されたＤＮＡのパーセンテージは、配列決定クロマトグラムの相対的なピーク強度から決定されることがある。いくつかの実施形態では、非天然の塩基対複製の忠実度は、少なくとも９８％、９８．１％  ９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、または９９．９９％である。非天然の塩基対の複製は、配列の偏りがほとんどない、またはまったくない状態で進められることもあり、配列の偏りがほとんどなければ、好ましくない配列は忠実度を１％未満減少させる。典型的な忠実度は実施例１に述べられ、表４、５、および６に示されている。
【０１２２】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、本明細書に記載される１以上の非天然の核酸塩基（例えば、任意のα核酸塩基あるいはそのアナログまたは誘導体、および／または、任意のβ核酸塩基あるいはそのアナログまたは誘導体）を含む、一本鎖および二本鎖（例えば、デュプレックス）ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドが提供される。核酸塩基は図２、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、および１６のものを含む任意のα核酸塩基またはβ核酸塩基であってもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドはＤＮＡ−ＤＮＡデュプレックス、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドデュプレックス、およびＲＮＡ−ＲＮＡデュプレックスを含んでいる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはリンカー誘導体化された核酸塩基を含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上の非天然の核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド中の非天然の核酸塩基のパーセントは、約０％乃至約１％、約０％乃至約２％、約０％乃至約３％、約０％乃至約４％、約０％乃至約５％、約０％乃至約１０％、約１％乃至約１０％、約１％乃至約１５％、約１％乃至約２０％、約５％乃至約１０％、約５％乃至約２０％、約１０％乃至約３０％、約１％乃至約５０％、あるいは約１％乃至約１００％である。
【０１２４】
１以上の非天然の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、ＤＮＡアプタマーとＲＮＡアプタマーが挙げられる。ＤＮＡとＲＮＡのアプタマーは、限定されないが、プライマーと分子ビーコンを含む。ＤＮＡアプタマーはバーコードを含むことがある。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄ５ＳＩＣＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＭＭＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＤＭＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＦＥＭＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＢｒＭＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＩＭＳあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはβ８ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはβ８ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ａあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ｂあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ｃあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ｄあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ｅあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα１４ｆあるいはその誘導体またはアナログを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログ、およびｄＮａＭあるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはｄＴＰＴ３−ｄＮａＭ塩基対を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、およびｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＯから選ばれた１つ以上の塩基対を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｄＴＰＴ３−ＭＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＤＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ３−ＩＭＳ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ４ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＱ、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＱＬ、ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｎｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ４、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＥＮ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＦＢ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭ１、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ２、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ５、ｄＴＰＴ３−ｄ２Ｐｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ５ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＥＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３４ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ４５ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ４ＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ３５ＤＭＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＰ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＦ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＢＴｚ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＴｐ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＤＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＡＮ、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８８、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５７６、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８７、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８６、ｄＴＰＴ３−ｄＴＯＫ５８０、ｄＴＰＴ３−ｄＰｈＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＰｙＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ＰｙＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＰＭＯ３、ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＦｕＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ＴｐＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＴｐＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＥＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＰｒＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＯＭｅ、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＴＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＯＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄ５ＦＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＮＡＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ１、ｄＴＰＴ３−ｄＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ２、ｄＴＰＴ３−ｄＭＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＡＭＯ３、ｄＴＰＴ３−ｄＤＭＡＰｙ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＤＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＶＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＱＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＺＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＣＩＭＯ、ｄＴＰＴ３−ｄＴｆＭＯ、ｄＴＰＴ３−ＣＮＭＯ、ｄ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＭＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＭＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＭＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＭＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＭＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＭＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＭＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＭＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＭＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＭＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＭＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＭＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＭＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＭＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＭＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＤＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＤＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＤＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＤＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＤＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＤＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＤＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＤＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＤＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＤＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＤＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＤＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＤＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＤＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＤＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＦＥＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＦＥＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＦＥＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＦＥＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＦＥＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＦＥＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＦＥＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＢｒＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＢｒＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＢｒＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＢｒＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＢｒＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＢｒＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＢｒＭＳ、ｄ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＭ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＩｍＰｙ−ｄＩＭＳ、ｄＰ７ＡＩ−ｄＩＭＳ、ｄＰＰＰ−ｄＩＭＳ、ｄ８Ｑ−ｄＩＭＳ、ｄＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＰＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ５ＭＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＯＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ７ＯＦＰ−ｄＩＭＳ、ｄ７ＯＴＰ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＯＴＰ−ｄＩＭＳ、ｄＰＹＲ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＰ−ｄＩＭＳ、ｄ３ＭＰ−ｄＩＭＳ、ｄＰＰＹＲ−ｄＩＭＳ、ｄＭＯＰ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＭＯＰ−ｄＩＭＳ、ｄＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄ４ＳＩＣＳ−ｄＩＭＳ、ｄＴＰＴ１−ｄＩＭＳ、ｄＴＰＴ２−ｄＩＭＳ、ｄＦＰＴ１−ｄＩＭＳ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＩＭＳから選ばれた１つ以上の塩基対を含み、非天然の塩基対の１または２の非天然の核酸塩基はリンカーで誘導体化されることがある。
【０１２７】
本明細書に開示される非天然の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、限定されないが、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、２−プロピル、およびアデニンとグアニンのアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン（ｄｅａｚａｇｕａｎｉｎｅ）、３−デアザアデニン（ｄｅａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、ならびに、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換された、５−ハロ、５−置換されたピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素付加されたシトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンとグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾ−シトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシルで置換されたアデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換されたプリン、Ｎ−６置換されたプリン、Ｏ−６置換されたプリン、二重の形成の安定性を増加させるもの、ユニバーサル核酸、疎水性の核酸、プロミスカスな核酸、サイズを拡張した核酸、フッ素で処理された核酸、三環系のピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン（ｂｅｎｚｏｘａｚｉｎ）−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｄｏ）［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドル−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｊｅ）、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジンの塩基が複素環と取り替えられたものを含む１つ以上の追加の非天然の塩基をさらに含むこともある。
【０１２８】
本明細書に開示される非天然の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、限定されないが、２’位置での修飾：ＯＨ；置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２  ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏアルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３、式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは置換されるか、または置換されたＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であってもよく、ｎとｍは１〜約１０までであり；および／または、５’位置での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）；４’位置での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、あるいはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および、これらの任意の組み合わせ；を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非天然の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、非天然の骨格をさらに含む。非天然の骨格は、限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステラーゼ、アミノアルキルホスホトリエステラーゼ、Ｃ１−Ｃ１０フォスフォン酸塩、３’−アルキレンフォスフォン酸塩、キラルフォスフォン酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸、３’−アミノホスホロアミド酸、アミノアルキルホスホロアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステラーゼ、およびボラノリン酸を含む。
【０１３０】
非天然の塩基対（リンカーを含む、または含まない）を含むオリゴヌクレオチドのデュプレックスの安定性を決める方法は、円二色性（ＣＤ）測定やＵＶ溶融実験の熱力学的分析を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡデュプレックス安定度研究を用いて、適切な非天然のヌクレオチド塩基対、非天然の核酸塩基、あるいは非天然の核酸塩基誘導体または置換の選択を容易にする。適切に選択された非天然の塩基対は、デュプレックス内の他の位置でオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション忠実度を増加させるものを含む。適切に選択された非天然の塩基対は、オリゴヌクレオチドのデュプレックスの安定性を増加させるものを含んでいる。適切に選択された核酸塩基を用いることで、高忠実度のハイブリダイゼーションと判別が非常に重要な生物工学的用途または治療用途についてオリゴヌクレオチドを最適化することもある。いくつかの例において、非天然の塩基対はオリゴヌクレオチドのデュプレックス中の天然の塩基対と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、同じくらい安定している。いくつかの例において、１つ以上の非天然の塩基対を含むデュプレックスのＴｍは、同じデュプレックスのＴｍよりも１０°Ｃ、９°Ｃ、８°Ｃ、７°Ｃ、６°Ｃ、５°Ｃ、４．５°Ｃ、４°Ｃ、３．５°Ｃ、３°Ｃ、２．９°Ｃ、２．８°Ｃ、２．７°Ｃ、２．６°Ｃ、２．５°Ｃ、２．４°Ｃ、２．３°Ｃ、２．２°Ｃ、２．１°Ｃ、２°Ｃ、１．９°Ｃ、１．８°Ｃ、１．７°Ｃ、１．６°Ｃ、１．５°Ｃ、１．４°Ｃ、１．３°Ｃ、１．２°Ｃ、１．１°Ｃ、１°Ｃ、０．９°Ｃ、０．８°Ｃ、０．７°Ｃ、０．６°Ｃ、０．５°Ｃ、０．４°Ｃ、０．３°Ｃ、０．２°Ｃ、０．１°Ｃ未満であり、１以上の非天然の核酸塩基は１以上の天然の核酸塩基と取り替えられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのデュプレックス中に非天然の塩基対が存在しても、デュプレックスの構造は著しく乱されることはない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、リンカー誘導体化された核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、酵素的合成中または酵素合成後に、そのＤＮＡまたはＲＮＡの部位特異的な修飾を可能にする。本明細書に開示される非天然のヌクレオチド（例えば、非天然のαまたはβの核酸塩基アナログを含むヌクレオチド）は、いくつかの例では、ポリメラーゼ認識を除去することなく様々な官能基（例えばカーゴ）の付着を可能にするリンカーで修飾される。部位特異的な機能性は、限定されないが、フルオロフォア、特性付け（例えばＦ１９）のためのＮＭＲの手がかり（ｈａｎｄｌｅ）、ＩＲプローブ（例えば、アジド基とシアノ基）、ビオチン（例えば、同定および／または精製を容易にするため）、アフィニティータグ、リポソーム、およびナノ粒子を含む。一実施形態では、リンカーはクロスカップリング（例えばヨード基）によって生体共役を提供する。一実施形態では、リンカーはクリックケミストリー（例えばアジドとアルキンの置換基）によって生体共役の手がかりを与える。一実施形態では、リンカー誘導体化された核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、プライマーおよび／または分子ビーコンとして有用である。
【０１３２】
さらに本明細書では、様々な実施形態において、オリゴヌクレオチドの部位特異的な開裂または機能化における、本明細書に開示される任意のヌクレオシドアナログ（αまたはβ）、あるいはそのアナログまたは誘導体の使用が提供される。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドアナログは、部位特異的な修飾のために形成された１つ以上のリンカーを含む。リンカー部分を含むヌクレオチドアナログの例としては、限定されないが、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ、ｄ５ＳＩＣＳＣＣ、ｄＤＭＯＣＯ、ｄＤＭＯＣＣ、ｄＭＭＯ２ｐＣＯ、ｄＭＭＯ２ｐＣＣ、ｄＴＰＴ３、ｄＴＰＴ３Ａ、ｄＴＰＴ３ＰＡ、ｄＴＰＴ３ＣＯ、ｄＭＭＳｐＣＯ、ｄＭＭＳＰＡ、およびｄＴＰＴ３ＣＣ、あるいはそのリボシル形態またはアナログが挙げられる。本明細書では、様々な実施形態において、機能化されたオリゴヌクレオチドの物質そのものの組成物、機能化されたオリゴヌクレオチドの調製法、および機能化されたオリゴヌクレオチドの使用方法が提供される。様々な実施形態は、オリゴヌクレオチドに取り込まれるｄＴＰＴ３、ｄＴＰＴ３ＰＡ、ｄＴＰＴ３Ａ、ｄＴＰＴ３ＣＯおよびｄＴＰＴ３ＣＣ、またはｄＴＰＴ３の他のリンカー誘導体化されたアナログと、オリゴヌクレオチド中の非天然の核酸塩基アナログを用いる選択的な反応のための様々な試薬を用いるオリゴヌクレオチドに取り込まれるこうした非天然の核酸塩基アナログのさらなる反応と誘導体化を与え、自然発生の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）は、任意の適切な程度までこうした試薬には反応しない。リンカーを有する非天然のヌクレオチドのｄＴＰＴ３ベースのファミリーは、ｄ５ＳＩＣＳまたはそのリンカー誘導体化された変異体を含む塩基対よりもＤＮＡポリメラーゼによって効率的に複製されることが分かっているようにとりわけ中心にある。これにより、潜在的な使用の多くが大幅に容易になる。いくつかの実施形態では、リンカーを含む非天然のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの取り込みパーセントは、少なくとも６０％、６５％  ７０％  ７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、次の正確なヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの伸長パーセント（次の正確なヌクレオチドはリンカーを含む非天然のヌクレオチドの取り込みの結果として生じる）は、少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％以上である。いくつかの実施形態では、部位特異的な機能性の付加は、オリゴヌクレオチドへの非天然のヌクレオチドの取り込みパーセントをせいぜい約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％しか低下させない。いくつかの実施形態では、リン���ー誘導体化された非天然のヌクレオチドの忠実度は、少なくとも９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、または９９．９９％である。これに応じて、様々な実施形態において、別の対象の分子で部位特異的は修飾されるＤＮＡまたはＲＮＡを生成するためにリンカー誘導体化された非天然のヌクレオチドを使用する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、様々な機能性の部位特異的な含有物が増幅前または増幅後に生じる。いくつかの実施形態では、部位特異的な機能化がＳＥＬＥＸ用途に使用される。
【０１３３】
別の対象となる分子で部位特異的に修飾されるＤＮＡまたはＲＮＡを生成するための典型的な戦略はホスホロチオエート戦略（図３）と呼ばれ、これは図１または２の非天然ヌクレオシドの１つのリボまたはデオキシリボα−チオ三リン酸塩によるＤＮＡまたはＲＮＡへホスホロチオエート基の部位特異的な取り込みに依存している。ＤＮＡまたはＲＮＡへの取り込みの後、ホスホロチオエートを用いることで、部位特異的に機能化したＤＮＡまたはＲＮＡを生成するためにγ−ブロモ−α，β−不飽和カルボニル部分、ヨード（またはブロモ）アセチル部分、またはアジリジニルスルホンアミド部分を有する試薬を連結することもある。代替的に、ＤＮＡまたはＲＮＡへの取り込み後、ホスホロチオエートは、アルカリ溶液またはヨードエタノール中のヨウ素を使用して部位特異的にＤＮＡまたはＲＮＡを切断するように使用されることもある。したがって、ホスホロチオエート戦略は、核酸骨格の部位特異的な修飾をもたらし、オリゴヌクレオチド鎖の部位特異的な切断方法を与える。
【０１３４】
リンカー戦略（図４と５）と呼ばれる、別の分子または対象で部位特異的に修飾されるＤＮＡまたはＲＮＡを生成する別の戦略は、重合（合成されているＤＮＡまたはＲＮＡの鎖に取り込まれる適切な機能化された核酸塩基三リン酸試薬を用いるＰＣＲまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ媒介性によって）、あるいは適切な機能化試薬、例えば、所望の官能基をさらに含むＮＨＳ含有試薬を用いるオリゴヌクレオチド鎖への取り込み後の非天然の核酸塩基のリンカーの反応によって、対象の官能基を付けるために使用され得るリンカー（図２）を用いる非天然の核酸塩基の誘導体化を利用し、ＮＨＳは、ｄ５ＳＩＣＳＡ、ｄＭＭＯ２Ａ、またはｄＴＰＴ３Ａなどのアミノ機能化された非天然の核酸塩基の遊離アミノ基と反応する。図４はさらに、デュプレックスＤＮＡの部位特異的な二重標識を可能にするｄ５ＳＩＣＳＡとｄＭＭＯ２ＰＡを使用するアミノ機能化リンカー戦略を示す。
【０１３５】
例えば、機能化は、一次アミノ基（例えばｄＴＰＴ３Ａ）を有するリンカーを用いる非天然の核酸塩基のオリゴヌクレオチドへの取り込み後に実現可能である。より具体的には、機能化は、一次アミノ（例えば、プロパルギルアミノ基）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（図４）を含むカーゴを有する試薬の反応によって実行可能である。この用途のために開発されたアナログは、ｄ５ＳＩＣＳＡ、ｄ５ＳＩＣＳＰＡ、ｄＭＭＯ２Ａ、ｄＭＭＯ２ＰＡ、ｄＴＰＴ３ＰＡ、およびｄＴＰＴ３Ａ（「Ａ」がプロパルギルアミンを含むヌクレオチドを指し、「ＰＡ」が保護基と同じリンカーを指すことを思い出す。図２とそのキャプションを参照）を含む。オリゴヌクレオチドの配列に特異的な機能化のために、保護された一次プロパルギルアミノ基を有するｄＴＰＴ３ＰＡと、一次プロパルギルアミノ基を有するｄＴＰＴ３Ａの使用が本明細書に開示され、主張されている。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドの部位特異的な機能化は、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）（つまり、「クリックケミストリー」リンカー戦略；図５）を用いても実現可能であり、および、これらの使用のために、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ、ｄ５ＳＩＣＳＣＣ、ｄＤＭＯＣＯ、ｄＤＭＯＣＣ、ｄＭＭＯ２ｐＣＯ、ｄＭＭＯ２ｐＣＣ、ｄＴＰＴ３ＣＯおよびｄＴＰＴ３ＣＣ（図２）が使用されることもある。各々の場合、非天然の核酸塩基のリボシル三リン酸塩は部位特異的に標識されたＲＮＡを生成するための転写に利用可能であり、非天然の核酸塩基のデオキシリボシル三リン酸塩は、例えば、部位特異的に標識されたＤＮＡを生成するために使用可能である。ＣｕＡＡＣ共役、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ、ｄ５ＳＩＣＳＣＣ、ｄＤＭＯＣＯ、ｄＤＭＯＣＣ、ｄＭＭＯ２ｐＣＯ、ｄＭＭＯ２ｐＣＣ、ｄＴＰＴ３ＣＯ、およびｄＴＰＴ３ＣＣでの使用に適したアセチレン（アルキニル）リンカー基を含む非天然の核酸塩基、その調製方法、および部位特異的に標識されるオリゴヌクレオチドを調製する際に使用されるその使用方法が本明細書で開示され、主張される。
【０１３７】
一般的なホスホロチオエート戦略（図３）の実証。我々の系の実現可能性を実証するために、非天然のヌクレオチド、ｄ５ＳＩＣＳ（ｄ５ＳＩＣＳ−αＳ）のα−チオ三リン酸塩を調製し、標準的なＰＣＲを使用してその同族の非天然のヌクレオチドｄＮａＭの反対側でＤＮＡにそれを取り込んだ。ｄ（５ＳＩＣＳ−αＳ）ＴＰの取り込みの増幅の効率と忠実度は９９％以上であり、ｄ５ＳＩＣＳで得られた結果と事実上同一である。この非天然の塩基対を機能化するために、我々は部位特異的に取り込まれたホスホロチオエート結合をヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチンと反応させて、ビオチン機能性８でＤＮＡデュプレックスを標識した。この部位特異的な付加物を特徴づけるために、我々はストレプトアビジンの存在下でそれをインキュベートし、その後、ゲルシフトアッセイによって機能化を定量化した。我々は、ホスホロチオエート結合の６０−７０％を機能化された誘導体に変換することができた。これは文献に以前に報告された標識化のプロトコルでは標準的な効率（７０％）である（Ｆｉｄａｎｚａ，  Ｊ．  Ａ．；  Ｏｚａｋｉ，  Ｈ．；  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｄｉｅｓｔｅｒｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００２，  １１４  （１４），  ５５０９−５５１７．）。こうした共役誘導体は、ＤＮＡデュプレックスの熱変性に典型的な条件下、つまり、ｐＨ６．０−８．３（＜１０％の分解）の範囲内で一晩中５０°Ｃと、同様に、ｐＨ８．３（＜５％の分解）で３分間９５°Ｃで、高い安定性を示した。我々は、ｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２とｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭを含む、他の非天然の塩基対でもホスホロチオエート戦略を等しく十分に使用することができると考えている。
【０１３８】
本明細書では、様々な実施形態において、非天然の塩基対ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＭＭＯ２あるいはｄＴＰＴ３−ｄＤＭＯ、またはそのリンカー誘導体化された変異体を用いるホスホロチオエート戦略が提供される。
【０１３９】
ホスホロチオエートとリンカーベースの戦略は相互に排他的ではなく、組み合わせる場合には、最大で３つの官能基、核酸塩基対の第１の核酸塩基に付けられる１つ、核酸塩基対の第２の核酸塩基に付けられる２つ目、非天然のヌクレオチドに対して５’に近接して骨格に付けられる３つ目により、所定の部位を同時に修飾することが可能となる。
【０１４０】
一級アミンを備えたリンカー戦略の実証（図４）。さらに我々の系の実現可能性を実証するために、我々はｄ５ＳＩＣＳとｄＭＭＯ２のアミノ−および保護アミノ−リンカー誘導体化された変異体を合成し、特徴づけた（図２）。同族の非天然のパートナーの反対側でＤＮＡにおいて対にする際、我々はそれぞれがＰＣＲによって十分に増幅され、ＲＮＡへ転写されたことを示した。ＮＨＳ−エステルビオチンを用いるＰＣＲ増幅によって調製されたｄＭＭＯ２Ａまたはｄ５ＳＩＣＳＡを含むＤＮＡのカップリングは、それぞれ５５％と７０％の効率で続けられる。
【０１４１】
我々は、５ＳＩＣＳＰＡ、５ＳＩＣＳＡ、ＭＭＯ２ＰＡ、またはＭＭＯ２Ａのリボヌクレオチド三リン酸塩が高効率と忠実度でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡへ転写されることを示した（図７）。
【０１４２】
本明細書では、様々な実施形態において、ｄＴＰＴ３Ｌ−ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３Ｌ−ｄＭＭＯ２、またはｄＴＰＴ３Ｌ（ｄ）−ＤＭＯを使用するＤＮＡまたはＲＮＡの部位特異的な修飾が提供される（Ｒはリンカーであり、例えば、Ｒ＝ｄＴＰＴ３のためのＨであり、Ｒ＝ｄＴＰＴ３Ａのための３−アミノプロピン−１−イルであり、Ｒ＝ｄＴＰＴ３ＰＡのためのジクロロアセチル−３−アミノプロピン−１−イルであり、Ｒ＝ｄＴＰＴ３ＣＯのための４−オキサへパト−１，６−ジイン−１−イルであり、Ｒ＝ｄＴＰＴ３ＣＣのためのヘプタ−１，６−ジイン−１−イルである）。
【０１４３】
アルキンを用いる一般的なリンカー戦略の実証（図５）。さらに我々の系の実現可能性を実証するために、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ、ｄ５ＳＩＣＳＣＣ、ｄＤＭＯＣＯ、ｄＤＭＯＣＣ、ｄＭＭＯ２ｐＣＯ、ｄＭＭＯ２ｐＣＣ（図２）を含む、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＤＭＯ、およびｄＭＭＯ２のアルキニル機能化された変異体を合成して特徴づけた。これらのアルキン機能化された非天然のヌクレオチドはそれぞれ、ＤＮＡ中に存在する際には効率的に増幅されたＰＣＲでなければならない。いったん増幅されると、例えば、ｄ５ＳＩＣＳＣＯ−ｄＮａＭ塩基対を含むＤＮＡは、クリックケミストリー、例えば、銅触媒されたクリック反応を用いて、小分子、または１つ以上のタンパク質を有するアジド基で効率的に部位特異的に修飾されることもある。さらに、我々は、オリゴヌクレオチドへの取り込みのためのｄＥＭＯとｄＦＥＭＯ（図２）の有用性と、部位特異的にオリゴヌクレオチドを機能的にするためにアジドを用いるクリックケミストリー反応におけるこれらの機能化されたオリゴヌクレオチドの使用を実証した。
【０１４４】
ｄＴＰＴ３ＰＡを用いるリンカー戦略の実証（図６）。ｄ５ＳＩＣＳとｄＭＭＯ２の足場に対するリンカーの付着は、非天然のヌクレオチドがＤＮＡに酵素的に取り込まれる効率を著しく低下させ、これはその実用化を制限すると予想される。しかしながら、我々はｄＴＰＴ３足場がリンカー付加に対してはるかに寛容であることを発見した（図６）。例えば、ｄＴＰＴ３ＰＡＴＰは、天然の塩基対と事実上同じ効率と忠実度でＤＮＡポリメラーゼによって鋳型中のｄＮａＭの反対側でプライマーに取り込まれる。これに応じて、様々な実施形態では、部位特異的に機能的にされたオリゴヌクレオチドの合成におけるｄＴＰＴ３ＰＡ（保護されたアミノ機能的なリンカー）、ｄＴＰＴ３Ａ（アミノ機能的なリンカー）、およびｄＴＰＴ３ＣＯ（クリックケミストリーによる誘導体化のためのアルキン−アジドエーテルリンカー）、および、ｄＴＰＴ３ＣＣ（クリックケミストリーによる誘導体化のためのアルキン−アジドトリメチレンリンカー）を含むｄＴＰＴ３足場に基づいた非天然の核酸塩基の使用が提供される。
【０１４５】
模式図１は、部位特異的にＤＮＡまたはＲＮＡを修飾するために使用することができる様々なリンカーを含むｄＴＰＴ３の例を例証する。
【０１４６】
【化１６】
2019196355.tif 000019
【０１４７】
明瞭化のために、ｄＴＰＴ３足場の核酸塩基部分だけが示されているが、これらはヌクレオチドとして使用されることが理解される。機能化反応はオリゴヌクレオチドへの非天然の核酸塩基の取り込みの前または後に実行可能である。模式図１（上の反応）は、アミドを形成するために活性化されたエステルを使用してアシル化される、一級アミンを有するリンカーを含むｄＴＰＴ３Ａの使用を例証しており、Ｒ基はカーゴを含む。模式図１の中央の反応は、クリックケミストリーによってトリアゾールを生成するためにアジドと反応したアルキニルを有するリンカーを含むｄＴＰＴ３ＣＯの使用（ｄＴＰＴ３ＣＣも使用可能である）を例証しており、形成されるトリアゾールのＲ基はカーゴを含む。下の反応は、リンカー、例えば、チオール−マレイミド、ヒドラジン−アルデヒドなどの反応部分に相補的な反応部分を含むＲ２基と共有結合を選択的に形成することができる反応的な部分を含むリンカー基Ｒ１を有するｄＴＰＴ３足場誘導体の最も一般的なケースを例証している。
【０１４８】
一実施形態では、アジド反応基を含むリンカーは、クリック反応を介してカーゴを含むアルキン（ａｋｌｙｎｅ）に付着するのに役立つ。一実施形態では、チオール基を含むリンカーは、限定されないが、マレイミド、臭化物、ヨウ化物、スルホニル誘導体、活性のあるエステル、およびイソチオシアナート誘導体を含む様々なカーゴ受容基と可逆的なジスルフィド結合または不可逆的な結合を形成することができる。一実施形態では、アジド基を含むリンカーはホスフィン基を含むカーゴ分子に反応的である。
【０１４９】
一実施形態では、１以上のリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドは、分子ビーコンとして使用されるように構成される。分子ビーコンのフルオロフォアはリンカー誘導体化された非天然の核酸塩基の反応性の中心に付けられたカーゴ分子である。典型的なフルオロフォアカーゴ分子は、限定されないが、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、Ｃｙ３（商標）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、Ｃｙ５（商標）、ＴＡＭＲＡ、ＭＡＸ、ＴＥＴ（商標）、ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＴＹＥ（商標）５６３、ヘキサクロロフルオレセイン（Ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＥＸ６１５、ＴＹＥ（商標）６６５、ＴＹＥ７０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０，  ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ，  ＡＴＴＯ（商標）４８８，  ＡＴＴＯ（商標）５３２，  ＡＴＴＯ（商標）５５０，  ＡＴＴＯ（商標）５６５，  ＡＴＴＯ（商標）Ｒｈｏ１０１，  ＡＴＴＯ（商標）５９０，  ＡＴＴＯ（商標）６３３，  ＡＴＴＯ（商標）６４７Ｎ，  ローダミン  Ｇｒｅｅｎ（商標）−Ｘ，  ローダミン  Ｒｅｄ（商標）−Ｘ，  ５−ＴＡＭＲＡ（商標），Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ，  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０，  および、Ｄｙ  ７５０を含む。
【０１５０】
非天然の塩基対は、いくつかの実施形態において、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのアプタマーの生成を含む試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）用途のためにＤＮＡへ様々な機能性を部位特異的に包含させることを可能にする。ＤＮＡとＲＮＡのアプタマーは核酸、小分子、ペプチド、炭水化物、および細胞を含む様々な標的を有する。ＳＥＬＥＸは、核酸分子のライブラリの形成と、標的分子と結合する核酸分子を選択するために標的分子にライブラリを接触させること、および標的分子と結合したライブラリメンバーを増幅することを含む。十分なアプタマーが回復するまで選択と増幅を何度も継続する。アプタマーは、一態様において、本明細書に開示されるあらゆる非天然の塩基を含んでいる。いくつかの実施形態では、ライブラリ成分が非天然の核酸塩基を含むＳＥＬＥＸ実験は、非天然の核酸塩基を含まないライブラリよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以下の選択で標的分子に対するアプタマーの親和性を生成する。いくつかの実施形態では、１以上の非天然の核酸塩基を含むアプタマーは、天然の核酸塩基だけを含んでいるアプタマーよりも標的分子への親和性が大きい。ＳＥＬＥＸライブラリの１以上の非天然の核酸塩基の追加は、結果として生じるＤＮＡまたはＲＮＡのアプタマーの化学的および構造的な多様性を増加させる。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは少なくともその標的分子に対してナノモルの親和性を有する。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは少なくともその標的分子に対してピコモルの親和性を有する。例えば、非天然のアプタマーは１〜１，０００ｐＭのその標的分子に対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは少なくともその標的分子に対するフェムトモルの親和性を有する。例えば、非天然のアプタマーは１〜１，０００ｆＭのその標的分子に対する親和性を有する。ＳＥＬＥＸを用いて選択された非天然のアプタマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０以上の非天然の核酸塩基を含むことがある。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーはｄＴＰＴ３あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ａを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ｂを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ｃを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ｄを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ｅを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式α１４ｆを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式β８ａを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。いくつかの実施形態では、非天然のアプタマーは、式β８ｂを有する核酸塩基あるいはその誘導体またはアナログを含む。
【０１５１】
典型的な反応混合物と反応方法に関して上で説明された成分の様々な組み合わせは、キット形態で提供可能である。こうしたキットは、互いから分離された、例えば、別々の容器または包装に入れて運ばれる個々の成分を含み得る。キットは、本明細書で説明された成分の１つ以上の下位の組み合わせを含み得るが、１つ以上の下位の組み合わせはキットの他の成分から分けられる。下位の組み合わせは本明細書で述べられる反応混合物を形成するために結合可能である（あるいは、本明細書で述べられる反応を行うために組み合わされる）。特定の実施形態では、個々の容器または包装に入れられた成分の下位の組み合わせは、本明細書で述べられる反応を行うのには不十分である。
【０１５２】
しかしながら、キットは全体として様々な容器や包装を含み得るが、その内容物は本明細書で述べられる反応を行うために組み合わせることが可能である。
【０１５３】
キットは、キットの内容物を収容するために適切な包装材料を含み得る。包装材料は好ましくは無菌の汚染物質のない環境を与えるために周知の方法によって構築可能である。本明細書で使用される包装材料は、例えば、核酸シーケンシング系との使用のために販売されている市販のキットで通例利用されるものを含み得る。典型的な包装材料は、限定されないが、本明細書で述べられる成分を一定の制限範囲内で保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどを含んでいる。
【０１５４】
包装材料は成分の特別の使用を指示するラベルを含み得る。ラベルによって指示されるキットの使用は、キット中にある成分の特定の組み合わせに適切なものとして本明細書で述べられる方法の１つ以上であり得る。例えば、ラベルは、キットがオリゴヌクレオチド中の非天然の核酸塩基のリンカー部分へカーゴ分子を共役させる方法に役立つことを示すことがある。
【０１５５】
包装された試薬または成分の使用に関する説明書もキットに含められることがある。説明書は典型的には、混合されるキット成分とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合剤用の保守期間、温度、緩衝条件などの反応パラメータ明確な表現を含んでいる。
【０１５６】
特定の反応に必要なすべての成分が特定のキット中にある必要はないということが理解されよう。むしろ、１つ以上の追加の成分を他のソースから得ることも可能である。キットと共に提供される説明書は、提供される追加の成分と、その入手場所を特定することができる。
【０１５７】
一実施形態では、キットは、１以上の非天然の核酸塩基あるいはその誘導体と、１以上の非天然の核酸塩基あるいはその誘導体を使用して部位特異的な機能化を行うために構成される試薬を提供する。
【実施例】
【０１５８】
現在、ｄ５ＳＩＣＳとｄＮａＭの遊離ヌクレオシドおよびホスホラミダイトはＢｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  （Ｄｅｘｔｅｒ，  ＭＩ）から市販で入手可能である。
【０１５９】
実施例１．非天然の塩基対を同定するためのＰＣＲベースのスクリーニング
α６基の三リン酸塩を、Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｊ．  および  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  Ｒａｐｉｄと、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスホリン−４−オンを用いるヌクレオシド５’−０−（１−チオ三リン酸塩），５’−三リン酸塩、および２’，３’−シクロホスホロトエートの効率的な合成に従って、以前に報告されたヌクレオシド（Ｋｕｂｅｌｋａ，  Ｔ．  ，  Ｓｌａｖｅｔｉｎｓｋａ，  Ｌ．，  Ｅｉｇｎｅｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｈｏｃｅｋ，  Ｍ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２，６−ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ  Ｃ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｒｏｍｏ−ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．  Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １１，  ４７０２−４７１８）から調製した。他のすべての三リン酸塩の純度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦとＵＶ−ＶＩＳによって確認された。ＴａｑとＯｎｅＴａｑのＤＮＡポリメラーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。デオキシリボヌクレオチド三リン酸の混合物をＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，  ＭＤ）から購入した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（１０，０００×）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。１−５回のスクリーニングに用いられるＤＮＡ鋳型、Ｄ８（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｄｈａｍｉ，  Ｋ．，  Ｑｕａｃｈ，  Ｈ．Ｔ．，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ，  Ｔ．  ，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．，  Ｔｏｒｋａｍａｎｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｘ−ｌｅｔｔｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０９，  １２００５−１２０１０）と、他のすべての増幅に使用されるＤ６（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｓｅｏ，  Ｙ．Ｊ．，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３１，  １４６２０−１４６２１）の合成は先に記載された。サンガー法シーケンシングは以前に記載された通りに実行された（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｄｈａｍｉ，  Ｋ．，  Ｑｕａｃｈ，  Ｈ．Ｔ．，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ，  Ｔ．，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．，  Ｔｏｒｋａｍａｎｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｘ−ｌｅｔｔｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳ��，  １０９，  １２００５−１２０１０）。生のサンガー法シーケンシングの痕跡を用いて非天然の塩基対の保持パーセントを決定し、これを記載された通りに倍加当たりの忠実度に変換した（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｄｈａｍｉ，  Ｋ．，  Ｑｕａｃｈ，  Ｈ．Ｔ．，  Ｌａｖｅｒｇｎｅ，  Ｔ．  ，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．，  Ｔｏｒｋａｍａｎｉ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｔｈｉｒｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｘ−ｌｅｔｔｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０９，  １２００５−１２０１０；  Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｓｅｏ，  Ｙ．Ｊ．，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３１，  １４６２０−１４６２１）。
【０１６０】
すべてのＰＣＲ増幅は、以下の条件を用いて２５μＬの全容積でＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ検出（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で行われた：１×ＯｎｅＴａｑ反応緩衝液、０．５×Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、４．０ｍＭに調節されたＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５０μＭのそれぞれの非天然の三リン酸塩、１ｍＭのＰｒｉｍｅｒ１とＰｒｉｍｅｒ２（表２を参照）、および０．０２Ｕ／μｌのＤＮＡポリメラーゼ。各回のスクリーニングに特有の他の条件が表３に記載されている。Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）のＤＮＡ  ＣｌｅａｎとＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓを使用して、増幅した生成物を精製した。精製後に、以下に記載されるような非天然の塩基対の保持を決定するために、ＰＣＲ生成物を３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で配列決定した。３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＰｒｉｍｅｒ１を用いて配列決定することにより決定されるような非天然の塩基対（ＵＢＰ）保持から忠実度を特徴づけた。
【０１６１】
【表２】
2019196355.tif 000020
【０１６２】
【表３】
2019196355.tif 000021
【０１６３】
特定のＰＣＲ分析条件。最も有望なＵＢＰを用いるＰＣＲは表３に記載されるような条件で行われた。ＰＣＲ生成物は、２％のアガロースゲル上でさらに精製され、その後単一のバンド切除を行い、その後Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔを用いてクリーンアップを行った。２０μｌの水を用いた溶出の後、蛍光色素結合（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＤＮＡ濃縮物を測定し、Ｐｒｉｍｅｒ１とＰｒｉｍｅｒ２の両方で３回繰り返して生成された増幅産物を配列決定することで、ＵＢＰ保持としたがって増幅の忠実度を決定した。基α６のアナログを含む対を含んでいるＤＮＡの増幅は、以下の熱サイクル条件下においてＯｎｅＴａｑポリメラーゼで行われた：１分間９６°Ｃでの最初の変性；１０秒間９６°Ｃ、１５秒間６０°Ｃ、１分間６８°Ｃの１６サイクル。忠実度は三回繰り返してＰｒｉｍｅｒ１中の増幅産物を配列決定することにより決定された。ｄＴＰＴ３およびｄ２ＭＮまたはｄＤＭ２の間で形成されたＵＢＰを含むＤＮＡの増幅は、以下の熱サイクル条件下で１６サイクルにわたってＯｎｅＴａｑまたはＴａｑポリメラーゼを用いて行われた：１）ＯｎｅＴａｑ：１分間９６°Ｃの最初の変性、１０秒間９６°Ｃ、１５秒間６０°Ｃ、１分間６８°Ｃ；あるいは２）Ｔａｑ：１分間９６°Ｃの最初の変性、５秒間９６°Ｃ、５秒間６０°Ｃ、１０秒間６８°Ｃ。忠実度は三回繰り返してＰｒｉｍｅｒ１中の増幅産物を配列決定することにより決定された。
【０１６４】
結果。よく複製されたＵＢＰをスクリーニングするために、非天然のデオキシヌクレオシド３リン酸をｄＭＭＯ２／ｄＮａＭ−、またはｄ５ＳＩＣＳ／ｄＴＰＴ３−のようなアナログに分析のためにグループ化したが、すべての場合においてその区別は完全には明らかではなかった。合計して８０のｄＭＭＯ２／ｄＮａＭアナログを１２の「α基」（α１−α１２；図８）にグループ分けし、３１のｄ５ＳＩＣＳ／ｄＴＰＴ３アナログを６つの「β基」（β１−β６；図９）にグループ分けした。本明細書で使用されるグループ指定はアノマー指定と混合されてはならないことに留意する（検査されたアナログはすべてβグリコシドである）。加えて、スクリーニングの構造活性相関（ＳＡＲ）内容物を増加させるために、置換されたピリジル核酸塩基（Ｋｕｂｅｌｋａ，  Ｔ．，  Ｓｌａｖｅｔｉｎｓｋａ，  Ｌ．，  Ｅｉｇｎｅｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｈｏｃｅｋｍ  Ｍ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２，６−ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｙｒｉｄｉｎ−３−ｙｌ  Ｃ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｒｏｍｏ−ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．  Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １１，  ４７０２−４７１８．）をリン酸化して、基α６として含めた。スクリーニングについては、中心に位置するｄＮａＭ（Ｄ８と呼ばれる）を含む１３４量体の一本鎖ＤＮＡ鋳型は、天然の三リン酸塩（それぞれ２００μＭ）、図８と９で示されるαとβの三リン酸塩基のすべての対の組み合わせ（それぞれ５０μＭ）、および０．０２Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼの存在下で、ＰＣＲ増幅された。ＰＣＲの第一回の間に、ｄＮａＭはαアナログの取り込みを鋳型にし、その後オリジナルの鎖が第２回でコピーされる際にβアナログと取り替えられ、結果として生じるＵＢＰはその後の回で増幅される。各反応の増幅生成物はサンガー法シーケンシングによって分析された。非天然のヌクレオチドの存在は配列決定クロマトグラムの急な停止反応をもたらし、ＵＢＰ保持のレベルはリードスルーの量によって定量化可能となる。各回のスクリーニングの間の増幅後にＤＮＡ中で保持されるＵＢＰの割合が図１４に示されている。
【０１６５】
第１回のスクリーニングは、ＯｎｅＴａｑポリメラーゼと１分間の伸長時間を含む比較的許容条件下で０．１ナノグラムの鋳型と１６サイクルの増幅を使用した。この例については、ＯｎｅＴａｑは許容的であると考えられる。なぜならこれはＴａｑ（ファミリーＡポリメラーゼ）とＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ファミリーＢポリメラーゼ）の混合物であり、後者は不正確に取り込まれた三リン酸塩の切除を可能にするエキソヌクレアーゼ  プルーフリーディングを有するからである、こうした条件下では、基β５またはβ６を含む対だけが高い保持を示した。
【０１６６】
最も高い保持率を示したβ５またはβ６およびαの基の組み合わせが第２回のスクリーニングに進められ、これらをより小さな基（ａ、ｂ、またはｃによって表示される；図８と９）に分割された。高い保持率（≧９７％）がβ５ａとα２ｃ、α９ａ、α９ｃ、α１０ａ、α１０ｃ、α１２ｂ、またはα１２ｃ；β５ｂとα９ａ、α９ｂ、α１０ｃｍ、またはα１２ｂ；および、β６ｂとα１０ｃで、で観察された。中程度の保持率（８４−９６％）は、β５ａとα１ａ、α１ｂ、α６ａ、α９ｂ、α１０ｂ、またはα１２ａ；β５ｂとα１ａ、α１ｂ、α２ｃ、α６ａ、α９ｃ、α１０ａ、α１２ａ、またはα１２ｃ；β６ａとα１ｂまたはα１０ｃ；ならびに、β６ｂとα１ａ、α６ａ、α９ａ−ｃ、α１０ａ、α１０ｂ、またはα１２ａ−ｃで観察された。
【０１６７】
第３回のスクリーニングについては、αアナログは１〜３つの化合物だけの群で分析され、群β６ａはその２つの三リン酸塩構成物ｄＴＰＴ１ＴＰおよびｄＦＰＴ１ＴＰに細分された。最も高い保持率（≧９０％）は、β５ａとα１ａ、α２ｃＩＩ、α９ａ−ｃ、α１０ａＩ、α１０ａＩＩ、α１０ｃ、α１２ｂ、またはｄＴｆＭＯＴＰ；β５ｂとα９ａ、α９ｃ、またはα１０ｃ；ｄＦＰＴ１ＴＰとα１０ａＩ；ならびに、β６ｂとα１ａ、α９ａ−ｃ、α１０ａＩ、α１０ａＩＩ、α１０ｃ、α１２ｂ、ｄＮＭＯＴＰ、ｄＴｆＭＯＴＰ、またはｄＣＮＭＯＴＰ、で観察された。ほんのわずかに少ない保持率（８０−８９％）は、β５ａとα２ｃＩ、α１２ａ、ｄＮＭＯＴＰ、ｄＱＭＯＴＰ、またはｄＴＯＫ５８７ＴＰ；β５ｂとα１ａ、α２ｃＩＩ、α１０ａＩ、α１０ａＩＩ、α１２ｂ、またはｄＴＯＫ５８７ＴＰ；ｄＦＰＴ１ＴＰとα１０ｃ；ならびに、β６ｂとα１２ａ、ｄＱＭＯＴＰ、ｄＦｕＭＯ１ＴＰ、またはｄＴＯＫ５８７ＴＰ、で観察された。
【０１６８】
第４回のスクリーニングについては、図９のα誘導体はすべて、グループ化されたままのα９ｂとα９ｃを例外として、個々の三リン酸塩として分析された。最も高い保持（≧９１％）は、β５ａとα９ｂ、α９ｃ、ｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＭＭＯ２ＴＰ、ｄ２ＯＭｅＴＰ、ｄＤＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＶＭＯＴＰ、ｄＺＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＴｆＭＯＴＰ、ｄＱＭＯＴＰ、ｄ２ＭＮＴＰ、ｄＤＭ２ＴＰ、またはｄＴＯＫ５８７ＴＰ；β５ｂとα９ｂ、α９ｃ、ｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＺＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＱＭＯＴＰ、ｄＭＭ１ＴＰ、ｄＤＭ２ＴＰ、またはｄＴＯＫ５８７ＴＰ；β６アナログｄＦＰＴ１ＴＰとαアナログｄ２ＯＭｅＴＰまたはｄＮａＭＴＰ；ならびに、β６ｂとα９ｂ、α９ｃ、ｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＭＭＯ２ＴＰ、ｄＤＭＯＴＰ、ｄＴＭＯＴＰ、ｄＮＭＯＴＰ、ｄ５ＦＭＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＶＭＯＴＰ、ｄＺＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＴｆＭＯＴＰ、ｄＱＭＯＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、ｄ２ＭＮＴＰ、ｄＴＯＫ５８７ＴＰ、またはｄＦｕＭＯ２ＴＰで観察された。
【０１６９】
スクリーニングのストリンジェンシーを増加させるために、第５回はＯｎｅＴａｑの代わりにＴａｑポリメラーゼで行われた、というのも、それはエキソヌクレアーゼプルーフリーディングを欠き、したがって合成を誤対合にする感度を増加させるからである。この回はさらに残りのαとβの基をすべて個々の三リン酸塩に分けた。最も高い保持（≧９０％）はｄＳＩＣＳＴＰとｄＮａＭＴＰ；ｄＳＮＩＣＳＴＰとｄＮａＭＴＰ；ｄＴＰＴ２ＴＰとｄＦＤＭＯＴＰ；ｄＴＰＴ３ＴＰとｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰあるいはｄＮａＭＴＰ；ならびに、ｄＦＴＰＴ３ＴＰとｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＮＭＯＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＴｆＭＯＴＰ、またはｄＣＮＭＯＴＰで観察された。
【０１７０】
ＵＢＰをより良く区別するために、我々は６２の最も有望な候補ＵＢＰを第６回のスクリーニングに進行させ、ここで鋳型の濃度は１０倍（１０ｐｇに）低下したことでより大きな増幅が可能となり、それによってより優れた識別が与えられる。そして、鋳型はＤ６に変えられ（Ｍａｌｙｓｈｅｖ，  Ｄ．Ａ．，  Ｓｅｏ，  Ｙ．Ｊ．，  Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．  ＰＣＲ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １３１，  １４６２０−１４６２１）、非天然のヌクレオチドの一方の側に隣接している３つのヌクレオチドは天然のヌクレオチド中で無作為化される。さらに、変性とアニーリングの工程はそれぞれ５ｓに減らされ、伸長時間は１０ｓに減らされた。こうした条件下で、我々はＯｎｅＴａｑまたはＴａｑのみを用いる増幅を探った。ＯｎｅＴａｑを用いる結果はｄＳＩＣＳＴＰとｄＮａＭＴＰ；ｄＳＮＩＣＳＴＰとｄＦＥＭＯＴＰ；ｄＴＰＴ３ＴＰとｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＺＭＯＴＰ、またはｄＮａＭＴＰ；ならびに、ｄＦＴＰＴ３ＴＰとｄＩＭＯＴＰまたはｄＦＥＭＯＴＰで、最も高い保持（＞９５％）を示した。中程度の保持（８６％−９４％）は、ｄＳＩＣＳＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、またはｄＤＭ２ＴＰ；ｄ５ＳＩＣＳＴＰとｄＮａＭＴＰ；ｄＳＮＩＣＳＴＰまたはｄＩＭＯＴＰ；ｄＴＰＴ２ＴＰとｄＮａＭＴＰ；ｄＴＰＴ３ＴＰとｄＮＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＱＭＯＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、またはｄ２ＭＮＴＰ；ならびに、ｄＦＴＰＴ３ＴＰとｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＺＭＯＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＴｆＭＯＴＰ、またはｄＣＮＭＯＴＰで観察された。Ｔａｑを媒介とした増幅中の保持はＯｎｅＴａｑを用いる保持と比較して一般に減少したが、一般的な傾向も同様であった。最も高い保持（＞９６％）は、ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＦＩＭＯＴＰ、あるいはｄＩＭＯＴＰで、およびｄＦＴＰＴ３ＴＰとｄＦＩＭＯＴＰで観察された。ほんのわずかに低い保持（８９％−９４％）は、ｄＴＰＴ３ＴＰとｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＮａＭＴＰあるいはｄＣＮＭＯＴＰ；ならびに、ｄＦＴＰＴ３ＴＰとｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、ｄＣｌＭＯＴＰ、ｄＣＮＭＯＴＰ、またはｄ２ＭＮＴＰで観察された。
【０１７１】
その後、三リン酸塩、ｄＴＰＴ３ＴＰあるいはｄＦＴＰＴ３ＴＰ、およびｄＦＩＭＯＴＰ、ｄＩＭＯＴＰ、ｄＦＥＭＯＴＰあるいはｄＮａＭＴＰの最も有望な組み合わせによる増幅を、Ｔａｑと１０ｓの伸長時間を用いてとりわけストリンジェントな条件を探り、あるいはＯｎｅＴａｑと３０ｓの伸長時間を用いてより実務的な条件を探るために、５２のサイクルで行った（表４）。両方の増幅された鎖を３回繰り返して配列決定して高精度でＵＢＰ保持を決定した。Ｔａｑを用いて、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯ、ｄＦＴＰＴ３−ｄＮａＭ、およびｄＦＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯは最も高い保持を示し、その一方でｄＩＭＯとｄＦＥＭＯを含む対は多少少ない保持を示した。ＯｎｅＴａｑを用いて、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭとｄＦＴＰＴ３−ｄＮａＭは最も高い保持を示し、そのすぐ後に僅差でｄＦＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯとｄＴＰＴ３−ｄＦＩＭＯが続いた。
【０１７２】
【表４】
2019196355.tif 000022
【０１７３】
スクリーニングデータは、ｄＴＰＴ３とα６のあらかじめ試験されなかったピリジンベースの誘導体との間で形成されたいくつかの対は合理的によく複製されたことを示唆している。したがって、我々は、１分間の伸長時間を含む１６の増幅サイクルとＯｎｅＴａｑを使用して、こうしたＵＢＰを含むＤＮＡの増幅を３回繰り返して試験した（表５）。ｄＴＰＴ３とｄＴＯＫ５８０、ｄＴＯＫ５８２、またはｄＴＯＫ５８６の間で形成された対は不十分にしか複製されなかった。しかしながら、ｄＴＰＴ３とｄＴＯＫ５８８、ｄＴＯＫ５８１、ｄＴＯＫ５７６、およびｄＴＯＫ５８７の間で形成された対はそれぞれ６２％、６５％、８５％、および９４％の保持率で増幅された。
【０１７４】
【表５】
2019196355.tif 000023
【０１７５】
最後に、スクリーニングデータは、ｄ２ＭＮもｄＤＭ２も推定上本質的なオルトＨ−結合受容体を所有するもにもかかわらず、ｄＴＰＴ３とｄ２ＭＮあるいはｄＤＭ２の間で形成された対は合理的に十分には複製されないことを示唆した。したがって、こうした対は、ＯｎｅＴａｑまたはＴａｑのみを用いる、１分または１０秒のいずれかの伸長時間を含む１６サイクルの増幅によってさらに試験された（表６）。Ｔａｑでのみを用いる場合、弱い保持だけしか観察されなかった。しかしながら、ＯｎｅＴａｑを用いると、両方の対で保持率はより優れていた。ｄＴＰＴ３−ｄＤＭ２対の保持率は、１分と１０秒の伸長時間でそれぞれ５８％と６９％である。注目すべきことに、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮは、それぞれ１分と１０ｓの伸長時間を含む９６％と９４％の保持率で増幅される。
【０１７６】
【表６】
2019196355.tif 000024
【０１７７】
議論。最も有望なＵＢＰを同定するためのＰＣＲに基づくスクリーニングが行われた。スクリーニングのＳＡＲ内容物を増加させるために、グリコシド結合に対するオルトとパラの位置での様々な置換基を含むピリジル足場に基づく７つの新規なα誘導体が含まれていた。
【０１７８】
構造活性相関データ。エキソヌクレアーゼ  プルーフリーディングが存在するとともに伸長時間が１分であった許容条件下でも、βアナログを含むαアナログの混合グループ分けだけが有意なレベルの保持率を示し、効率的な複製はβ足場を含むα足場の対合を必要とすることを実証している。しかしながら、高い保持率を示したｄβ群だけはβ５とβ６であった。このことは、試験された他のもののすべてに対するｄ５ＳＩＣＳ／ｄＴＰＴ３様の足場の特権状態を明らかにしている。基β５による高い保持率への優先的な貢献度は、ｄ５ＳＩＣＳを含む対ではなく、ｄＳＩＣＳと、それよりも程度は少ないがｄＳＮＩＣＳを含む対に起因することがわかった。例えば、すべての条件下で、ｄＳＩＣＳ−ｄＮａＭはｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭよりも良く複製された。ｄ５ＳＩＣＳはｄＭＭＯ２との対合に関してはｄＳＩＣＳの最適化に由来し、明らかに、ｄＮａＭの容積の増加により、追加されたメチル基は有害なものとなる。さらに、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＮａＭはｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭと同じくらい（ＯｎｅＴａｑで）、あるいはそれよりも良く（Ｔａｑで）複製され、このことは、６−アザ置換基は、ｄＮａＭの反対側での非天然の三リン酸塩の挿入を容易にすることにより、あるいは、非天然のヌクレオチドがｄＮａＭＴＰの挿入を鋳型にする効率を増加させることにより、ＵＢＰ合成を最適化することを示唆している。最後に、ｄＳＮＩＣＳ−ｄＦＥＭＯも同様にｄ５ＳＩＣＳ−ｄＮａＭよりも良く複製されるが、プルーフリーディングの存在下に限られ、このことは三リン酸塩の挿入がそれほど効率的ではないこともあるが、伸長の効率増加は忠実度の全体的は増大につながることを示唆している。基β６による高忠実度に対する優先的な貢献は、ｄＴＰＴ３とｄＦＴＰＴ３によってもたらされた。一般に、両方ともｄＮａＭ、ｄＦＥＭＯ、ｄＦＩＭＯ、またはｄＩＭＯと十分に対にされる。ｄＴＰＴ３はとりわけｄＦＩＭＯおよびｄＩＭＯと十分に対にされ、このことはパラヨード置換基が好意的な相互作用を媒介としており、エキソヌクレアーゼ活性が存在するときにｄＦＥＭＯ、特にｄＮａＭとも十分に対にされることを示唆している。ｄＦＴＰＴ３は、エキソヌクレアーゼ活性の存在下でｄＩＭＯまたはｄＦＥＭＯのいずれかと、同様にその不在下でｄＦＩＭＯとｄＮａＭと十分に対にされた。
【０１７９】
ピリジンベースのαアナログ（基α６）の窒素置換基が一般に複製には不向きであったが、ｄＴＰＴ３で形成されたＵＢＰのより詳細な分析によりいくつかの傾向が明らかとなった。Ｃ−グリコシド結合に対するオルト位置でのメチル、クロロ、またはアミノ置換基は、おそらくは非天然の三リン酸塩の取り込み後の伸長が十分でなかったことから十分な複製対を生成しなかった。ｄＴＯＫ５８１のオルトメトキシ置換基は、ＵＢＰ合成の間に鋳型を疎水的に詰め、おそらくおよび伸長の間にポリメラーゼベースのＨ−結合ドナーを含むＨ−結合を受け入れるその両方の能力によって、優れた複製をもたらす。データはさらに、ｄＴＯＫ５８８およびｄＴＯＫ５７６、特にｄＴＯＫ５８７のメチルスルファニルオルト置換基がより優れた複製をもたらすことを明らかにした。この改善は、疎水的に詰める能力とプライマー末端でポリメラーゼからＨ−結合を受け入れる能力との間の最適な妥協による可能性が高い。加えて、この一連の誘導体におけるパラ置換基は効率的な複製に貢献することができ、ブロモ置換基が最も優れており、その後は二次メチルスルファニル基が続き、最後は単純なメチル基である。ｄＴＯＫ５８７は、オルトメチルスルファニルとパラブロモ置換基のその組み合わせでｄＴＰＴ３と対にされ、結果として生じるＵＢＰは９９．３％の忠実度で（保持レベルから計算）、ＯｎｅＴａｑと１分の伸長時間により複製され、これは同様の条件下のｄ５ＳＩＣＳ−ｄＭＭＯ２よりもわずかに優れている。明らかに、同様のオルトメチルスルファニルとパラブロモ置換基は、ｄＦＩＭＯとｄＮａＭのようなより効率的に複製されたα様の足場で試験されなければならない。
【０１８０】
ｄＴＰＴ３とｄ２ＭＮあるいはｄＤＭ２の間で形成される対の複製は議論するに値する。こうした対を含むＤＮＡはＴａｑ単独では増幅されないが、ＯｎｅＴａｑによって十分に増幅される。ｄ２ＭＮもｄＤＭ２も発生期の（天然または非天然の）プライマー末端の伸長に必要不可欠であると仮定されたオルトＨ−結合受容体を所有しないため、こうした結果は予想外であった。具体的には、ヌクレオチドが成長プライマー末端に位置している場合、Ｈ−結合受容体はポリメラーゼからＨ−結合を受け取る開発途上の副溝へ配置され、このＨ−結合が適切な末端配列には必要であると思われている。ＯｎｅＴａｑを用いて１分間の伸長時間で増幅されるとき、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮは９９．５％の忠実度で複製され、これは伸長時間が１０ｓに減らされる場合でも、９９．１％までしか低下しない。プルーフリーディングの不在下での増幅のない状態は、伸長時間が減少した際のプルーフリーディングの存在下で観察されたわずかな減少と結び付けられて、ｄＴＰＴ３−ｄ２ＭＮを含むＤＮＡの驚くほど高い忠実度または増幅が誤対に対するＵＢＰの選択的な伸長に起因することを示唆している。これは、オルトＨ−結合受容体の不在がＵＢＰの伸長に対するよりも、誤対の伸長には対してより有害であることを示唆している。
【０１８１】
遺伝アルファベットの伸長への努力。全体的に見て、データは、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭが試験されたものの中で最も有望なＵＢＰであることを確認する。しかしながら、ｄＴＰＴ３とｄＦＥＭＯ、ｄＦＩＭＯ、またはｄＩＭＯ、あるいはｄＦＴＰＴ３とｄＮａＭ、ｄＦＥＭＯ、ｄＦＩＭＯ、あるいはｄＩＭＯとの間で形成される対も同様に有望である。上記の最も有望なＵＢＰに加えて、注目すべき数の追加の新規な対がやや低下しただけの忠実度で複製されるか、あるいは増幅がさほどストリンジェントではない条件下で行われる際に高い忠実度で複製されることは注目に値する（表７）。最も効率的に複製されたＵＢＰに加えて、様々な物理化学的性質が様々な薬物動態学的に類似する特性を含むヌクレオチド構成物を授けることが予想される場合、こうした対はさらなる最適化の努力のために多様な物理化学的性質を様々な足場に与える。
【０１８２】
【表７】
2019196355.tif 000025
【０１８３】
実施例２．三リン酸塩合成のための一般的な手順
プロトンスポンジ（１．３等量）と遊離ヌクレオシド誘導体（１．０等量）を、乾燥したトリメチルホスフェート（４０等量）に溶かし、窒素雰囲気下で−１５°Ｃに冷やした。新鮮に蒸留したＰＯＣｌ３（１．３等量）を液滴で加え、結果として生じた混合物を２時間−１０°Ｃで撹拌した。トリブチルアミン（６．０等量）と、ジメチルホルムアミド（０．５Ｍ）中のトリブチルアンモニウムピロリン酸塩（５．０等量）の溶液を加えた。３０分にわたって反応を０°Ｃまでゆっくりと温め、その後、０．５Ｍの水性のＥｔ３ＮＨ２ＣＯ３（ＴＥＡＢ）ｐＨ７．５（２容積等量）を加えてクエンチした。その混合物をＨ２Ｏで２倍に希釈し、生成物を０〜１．２ＭのＴＥＡＢの溶出勾配でＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で分離し、蒸発させ、Ｈ２Ｏ（３×）で共蒸留した。逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣ（０．１ＭのＴＥＡＢ中０−３５％のＣＨ３ＣＮ、ｐＨ７．５）によるさらなる精製を行った（１０％−３１％の収率）。
【０１８４】
【化１７】
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模式図Ｓ１。（ａ）ピペリジン、Ｐｙ、１００°Ｃ、１２時間、その後１時間還流；（ｂ）ＳＯＣｌ２、ＤＭＦ、ＣＨＣｌ３、還流、３時間、（ｃ）ＮａＮ３、１，４−ジオキサン、Ｈ２Ｏ、５°Ｃ、０．５時間；（ｄ）ジフェニルエーテル、２３０°Ｃ、１時間
【０１８５】
核酸塩基アナログ４ａ、４ｂ、４ｃ、および４ｄは、模式図Ｓ１で示されるように、文献の方法１、２に基づいて合成された。簡潔に言えば、溶媒としてピペリジン中で、および触媒としてピリジン中で、１２時間、１００°Ｃでマロン酸を用いてアルデヒド（１ａ−ｄ）を縮合し、その後１時間還流することにより、対応するアクリル酸中間物（２ａ−ｄ）を得た。ＤＭＦの存在下でのクロロホルム中の塩化チオニルを用いたこうした酸の塩素化により塩化アシルが得られ、これは精製されなかったが、アジド（３ａ−ｄ）の調製で直接使用することができる。アジドナトリウムを用いて５°Ｃで１，４−ジオキサンと水の２相混合物中で化合物３ａ−ｄを調製した。ＣＨＣｌ３溶液中の３ａ−ｄの粗製混合物をジフェニルエーテルに少量ずつ加え、２３０°Ｃに加熱することでイソシアネートが得られ、これは縮合した６−５の二環系４ａ−ｄに対する分子内の環化を経験した。
【０１８６】
【化１８】
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模式図Ｓ２。（ａ）Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ＴＭＳ）アセトアミド、ＳｎＣｌ４（ＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２、３時間、４５％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、５８％；（ｃ）３０％ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、８５％；（ｄ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、３１％。
【０１８７】
化合物５ａ。窒素雰囲気下で室温のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中の４ａ（５４ｍｇ、０．３３ミリモル）の溶液に、ｂｉｓ（トリメチルシリル）アセトアミド（８３ｍｇ、０．３９ミリモル）を加えた。４０分間撹拌した後、３，５−ｂｉｓ（トルオイル）−２−デオキシリボシル塩化物（１９６ｍｇ、０．３９ミリモル）を加えた。反応混合物を０°Ｃに冷却し、ＳｎＣｌ４を液滴で加えた（ＣＨ２Ｃｌ２中の１．０Ｍ、１６０μＬ、０．１６ミリモル）。その溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和した水性のＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）に晒して、白い泡（７７ｍｇ、０．１５ミリモル、４５％）として化合物５ａを得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．９７−６．８２（ｍ、１１Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、６．４４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−１’）、５．６３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−３’）、４．７６−４．６８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ、５’ｂ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、Ｈ−４’）、２．８９（ｄｄ、Ｊ＝１．５、０．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−２’ａ）、２．５９（ｓ、３Ｈ、Ａｒ−ＣＨ３）、２．４３（ｓ、３Ｈ、Ａｒ−ＣＨ３）、２．４３（ｓ、３Ｈ、Ａｒ−ＣＨ３）、２．３６−２．３０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１６６．６、１６６．５、１５８．５、１４７．２、１４４．８、１４４．６、１４０．０、１３１．１、１３０．３、１３０．０、１２９．９、１２９．７、１２７．１、１２６．９、１２５．６、１２２．８、１０２．７、８５．９、８３．３、７５．６、６４．８、３９．６、２２．１、１６．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５１８．１６３２，  ｆｏｕｎｄ  ５１８．１６２１
【０１８８】
化合物６ａ。化合物５ａ（２７ｍｇ、０．０５２ミリモル）を無水のトルエンを含む３つの共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１ｍＬ）中に溶解させた。ローソン試薬（４１．５ｍｇ、０．１０ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿上で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、黄色の泡として化合物６ａを得た（１６ｍｇ、０．０３ミリモル、５８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．００−７．８９  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．７１  （ｍ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４９−７．４８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２９−７．２１  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．６５−７．６２  （ｍ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．９０  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ５．６４−５．６２  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８５−４．７４  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ），  ４．６８−４．６７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−５’ｂ），  ３．３８−３．３４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ２．２６  （ｓ，３Ｈ），  ２．４４  （ｓ，３Ｈ），  ２．４１  （ｓ，３Ｈ），  ２．２８−２．２２  （ｍ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １７４．６，  １６６．６，  １４４．９，  １４４．８，  １４２．９，  １４２．７，  １４２．３，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．７，  １２７．９，  １２７．０，  １２６．９，  １２６．８，  １０８．３，  １００．０，  ９１．４，  ８４．０，  ７４．９，  ６４．５，  ３９．３，  ２２．２，  ２２．１，  １６．３．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５３４．１４０３，  ｆｏｕｎｄ  ５３４．１４０４．
【０１８９】
化合物７ａ。メタノール（１．０  ｍＬ）中の６ａ（２０ｍｇ、０．０３７ミリモル）の溶液に、３０％のＮａＯＭｅ（８．６６ｍｇ、０．１６ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。その後、反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡として化合物７ａを得た（９．２ｍｇ、０．０３１ミリモル、８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．３６  （ｄ，Ｊ＝  ４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５８  （ｄ，Ｊ＝  １Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．３５  （ｔ，Ｊ＝  ４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２２  （ｄ，Ｊ＝  ８  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ４．０７−４．０６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．０７  （ｄ，Ｊ＝  ４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．８０  （ｄｄ，Ｊ＝  ２４，  ４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ２．７９−２．７６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．１３−２．０８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  １７３．６０，  １４３．２９，  １４２．２６，  １４２．２３，  １２９．３５，  １２６．１１，  １０８．０１，  ９１．１４，  ８８．４４，  ７０．３７，  ６１．３５，  ４１．５９，  １４．８１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１６ＮＯ３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ２９８．０５６６，  ｆｏｕｎｄ  ２９８．０５６９．
【０１９０】
化合物８ａ（ｄＴＰＴ１ＴＰ）。７ａ（２０ｍｇ、６７．３μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物８ａ（１１．２ｍｇ、２０．８μｍｏｌ、３１％）を合成した。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１０．３  （ｄ，Ｊ＝  １９．８  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１０．９  （ｄ，Ｊ＝  ２０．１  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２２．８  （ｔ，Ｊ＝  １９．４  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  マトリックス：  ９−アミノアクリジン）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１７ＮＯ１２Ｐ３Ｓ２，  ５３６．３，  ｆｏｕｎｄ，  ５３６．７．
【０１９１】
【化１９】
2019196355.tif 000028
模式図Ｓ３。（ａ）Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ＴＭＳ）アセトアミド、ＳｎＣｌ４（ＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２、３時間、４１％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、５２％；（ｃ）３０％のＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、８５％；（ｄ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、２１％。
【０１９２】
化合物５ｂ。窒素雰囲気下で室温のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中の４ｂ（１００ｍｇ、０．６７ミリモル）の溶液に、ｂｉｓ（トリメチルシリル）アセトアミド（１６５ｍｇ、０．８１ミリモル）を加えた。４０分間撹拌した後、３，５−ビス（トルオイル）−２−デオキシリボシル塩化物（２９２ｍｇ、０．８１ミリモル）は加えた。反応混合物を０°Ｃに冷やして、ＳｎＣｌ４を液滴で加え（ＣＨ２Ｃｌ２中の１．０Ｍ、２００μＬ、０．２ミリモル）だった。その溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和した水性のＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、白い泡として化合物５ｂを得た（１３７ｍｇ、０．２７ミリモル、４１％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ７．９９  （ｄ，Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．９３  （ｄ，Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５５  （ｄ，Ｊ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．３３  −  ７．２８  （ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２７  −  ７．２０  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），  ６．８２  （ｄｄ，Ｊ＝  ８．３，  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．５７  （ｄ，Ｊ＝  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．４１  （ｄ，Ｊ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ５．６８  −  ５．６１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．７５  （ｄｄ，Ｊ＝  １２．１，  ３．４  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６２  （ｑ，  Ｊ  ＝  ３．１  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ¬３’），  ２．９４  （ｄｄｄ，Ｊ＝  １４．３，  ５．６，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４８  −  ２．３９  （ｓ，  ３ｘ３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３６  −  ２．２６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １６６．６，  １６６．５，  １５９．２，  １５９．１，  １５４．５，  １４４．８，  １４４．６，  １３０．２，  １３０．０，  １２９．７，  １２７．５，  １２７．１，  １２６．９，  １１７．５，  １０３．３，  ９６．６，  ８６．０，  ８３．２，  ７５．５，  ６４．７，  ３９．８，  ２２．１，  １４．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ７  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５０２．１８６０，  ｆｏｕｎｄ  ５０２．１８８５．
【０１９３】
化合物６ｂ。化合物５ｂ（２９ｍｇ、０．０５６ミリモル）を無水のトルエンを含む３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１ｍＬ）に溶解させた。ローソン試薬（４１．５ｍｇ、０．１０ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすることで、黄色の泡（１５ｍｇ、０．０２９ミリモル、５２％）として化合物６ｂを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ８．１０−７．８９  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５２−７．４８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ¬１’），７．２９−７．２２  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．８  （ｄ，Ｊ＝  １Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．７３  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，Ａｒ−Ｈ），  ５．６５−５．６２  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８４−４．７４  （ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６７−４．６５  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．３６−３．３２  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４３  （ｓ，３Ｈ，  ｓ，  ３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４１  （ｓ，３Ｈ，  ｓ，  ３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．２７−２．２１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １６６．６，  １５６．９，  １５３．９，  １４４．８，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．８，  １２９．７，  １２７．９，  １０６．４，  ９６．０，８３．９，  ５６．６，  ３９．５，  ２２．１，  １２．６．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５１８．１６３２，  ｆｏｕｎｄ  ５１８．１６３８．
【０１９４】
化合物７ｂ。メタノール（１．０  ｍＬ）中の６ｂ（２０ｍｇ、０．０３９ミリモル）の溶液に３０％のＮａＯＭｅ（８．６６ｍｇ、０．１６ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。その後、反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡（９．３ｍｇ、０．０３３ミリモル、８５％）として化合物７ｂを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．５７  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４２  （ｔ，Ｊ＝  ４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．１３  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．８０  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ４．５０−４．４７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．１２  （ｄ，Ｊ＝  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．９５  （ｄｄ，Ｊ＝  ３０，  ３  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ２．８１−２．７７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．５０  （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．１８−２．１４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  ｏｅ  １７２．９，  １５７．２，  １５４．５，  １３２．７，  １３１．３，  １０５．４，  １００．８，  ９０．９，  ８８．５，  ７０．３，  ６１．３，  ４１．８，  １２．７．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１６ＮＯ４Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ２８２．０７９５，  ｆｏｕｎｄ  ２８２．０７９０．
【０１９５】
化合物８ｂ（ｄＦＰＴ１ＴＰ）。７ｂ（２０ｍｇ、７１．２μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物８ｂ（３．７ｍｇ、７．１μｍｏｌ、１０％）を合成した。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１０．４  （ｄ，Ｊ＝  ２０．０  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１０．９  （ｄ，Ｊ＝  １９．４  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２２．８  （ｔ，Ｊ＝  ２０．０  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  マトリックス：  ９−アミノアクリジン）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１７ＮＯ１３Ｐ３Ｓ，  ５２０．３，  ｆｏｕｎｄ，  ５２０．１．
【０１９６】
【化２０】
2019196355.tif 000029
模式図Ｓ４。（ａ）  Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ＴＭＳ）アセトアミド、ＳｎＣｌ４（ＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２、３時間、４０％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、３１％；（ｃ）３０％のＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、８１％；（ｄ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、１５％。
【０１９７】
化合物５ｃ。窒素雰囲気下で室温のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中の４ｃ（４６ｍｇ、０．２８ミリモル）の溶液に、ｂｉｓ（トリメチルシリル）アセトアミド（６６ｍｇ、０．３３ミリモル）を加えた。４０分間撹拌した後、３，５−ｂｉｓ（トルオイル）−２−デオキシリボシル塩化物（１２０ｍｇ、０．３３ミリモル）を加えた。反応混合物を０°Ｃに冷やし、ＳｎＣｌ４を液滴で加えた（ＣＨ２Ｃｌ２中の１．０Ｍ、１４０μＬ、０．１４ミリモル）。その溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和した水性のＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、白い泡（５８ｍｇ、０．１１ミリモル、４０％）として化合物５ｃを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ７．９８−７．９０  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５３  （ｄ，Ｊ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２７−  ７．２１  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．８３−６．８２  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），  ６．４４  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ¬１’），  ５．６３（ｄ，Ｊ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．７６  −  ４．６０  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．５９  （ｄ，Ｊ＝  ２．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−３’），  ２．８９  （ｄｄ，Ｊ＝  １３，  ５．５  Ｈｚ，  Ｈ−２’ａ），  ２．５９  （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４３    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４０    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３７−２．３０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １６６．５，  １５８．０，  １４９．９，  １４６．３，  １４４．８，  １４４．６，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．７，  １２８．８，  １２７．３，  １２２．８，  １０３．７，  １００．０，  ８５．８，  ８３．２，  ７５．５，  ６４．８，  ３９．５，  ２２．１，  １６．７．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５１８．１６３２，  ｆｏｕｎｄ  ５１８．１６３１．
【０１９８】
化合物６ｃ。化合物５ｃ（５０ｍｇ、０．０９７ミリモル）を、無水トルエンを用いる３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１．５ｍＬ）に溶解させた。ローソン試薬（８３ｍｇ、０．２０ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、黄色の泡（１６ｍｇ、０．０３ミリモル、３１％）として化合物６ｃを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ８．１３−７．９７  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５２−７．４９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．３７−７．２９  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．９９  （ｄ，Ｊ＝  １Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．９１  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ５．７３−５．７１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．９１−４．８２  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．７６−４．７４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．４１−３．３７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．６８    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．５２    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４９    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３９−２．３４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １７２．１，  １６６．６，  １５４．０，  １４４．９，  １４４．７，  １４０．４，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．７，  １２９．６，  １２７．０，  １２６．８，  １２２．７，  １０９．０，  ９１．２，  ８３．９，  ７５．０，  ６４．５，  ３９．４，  ２２．２，  ２２．１，  １７．０．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ２８ＮＯ５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５３４．１４０３，  ｆｏｕｎｄ  ５３４．１４０６．
【０１９９】
化合物７ｃ。メタノール（１．０ｍＬ）中の６ｃ（２０ｍｇ、０．０３７ミリモル）の溶液に、３０％のＮａＯＭｅ（８．６６ｍｇ、０．１６ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。その後、反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡（８．９ｍｇ、０．０３ミリモル、８１％）として化合物７ｃを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．４８，  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４２  （ｔ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２０  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １  Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．１２  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ４．５１−４．４８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．１３  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．９５  （ｄｄ，Ｊ＝  ３０，  ５  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ２．８１−２．７８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．６７    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．２１−２．１６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  １７１．１，  １５４．０，  １４４．１．１４１．１，  １３１．１，  １２２．７，  １０８．８，  ９０．９，  ８８．５，  ７０．５，  ６１．４，  ４１．７，  １５．４．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１６ＮＯ３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ２９８．０５６６，  ｆｏｕｎｄ  ２９８．０５６６．
【０２００】
化合物８ｃ。７ｃ（２０ｍｇ、６７．３μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物８ｃ（１０．８ｍｇ、２０．２μｍｏｌ、３０％）を合成した。
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１０．８  （ｄ，Ｊ＝  １９．８  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１１．５  （ｄ，Ｊ＝  ２０．１  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２３．３  （ｔ，Ｊ＝  ２０．１  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  マトリックス：  ９−アミノアクリジン）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１７ＮＯ１２Ｐ３Ｓ２，  ５３６．３，  ｆｏｕｎｄ，  ５３６．１
【０２０１】
【化２１】
2019196355.tif 000030
模式図Ｓ５。（ａ）Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ＴＭＳ）アセトアミド、ＳｎＣｌ４（ＣＨ２Ｃｌ２中の１Ｍ）、ＣＨ２Ｃｌ２、３時間、３９％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、３３％；（ｃ）３０％ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、８２％；（ｄ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、３０％。
【０２０２】
化合物５ｄ。窒素雰囲気下で室温のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）中の４ｄ（２００ｍｇ、１．３２ミリモル）の溶液に、ｂｉｓ（トリメチルシリル）アセトアミド（２９８ｍｇ、１．４６ミリモル）を加えた。４０分間撹拌した後に、３，５−ビス（トルオイル）−２−デオキシリボシル塩化物（５６３ｍｇ、１．４６ミリモル）を加えた。反応混合物を０°Ｃに冷やして、ＳｎＣｌ４を液滴で加え（ＣＨ２Ｃｌ２中の１．０Ｍ、６６０μＬ、０．６６ミリモル）た。その溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和した水性のＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、白い泡として化合物５ｄ（２６０ｍｇ、０．５２ミリモル、３９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ７．９８−７．９０  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．７０  （ｄ，Ｊ＝  ６  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５５  （ｄ，Ｊ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２８−７．１６  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．８４−６．８５  （ｍ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．５７  （ｄ，Ｊ＝  ９．５  Ｈｚ，  Ｈ−１’），  ５．６６−５．６４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．７５−４．７２  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ２．９５−２．９０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４３    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４０    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３９−２．３１（ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １６６．２，  １６６．１，  １５８．１，  １４５．１，  １４４．４，  １４４．２，  １３３．８，  １２９．９，  １２９．６，  １２９．３，  １２９．１，  １２６．９，  １２６．５，  １２４．２，  １０３．５，  ８５．５，  ８２．９，  ７５．１，  ６４．４，  ３９．２，  ２１．７．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２０Ｈ２０Ｃｌ２Ｎ２Ｏ５Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５０４．１４７５，  ｆｏｕｎｄ  ５０４．１４８０．
【０２０３】
化合物６ｄ。化合物５ｄ（５０ｍｇ、０．１ミリモル）を、無水トルエンを用いる３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１ｍＬ）に溶解させた。ローソン試薬（４８ｍｇ、０．１２ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、黄色の泡として化合物６ｄ（１７ｍｇ、０．０３３ミリモル、３３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ８．１４−７．８２  （ｍ，  ７Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５１  （ｄｄ，Ｊ＝  ７．５，  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．３２−７．２３  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．９９  （ｄ，Ｊ＝  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７４−５．７３  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．９２−４．８３  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．７８−４．７７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．４３−３．４０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．５１    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４８    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３９−２．３６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １７３．５，  １６６．６，  １４４．９，  １４４．８，  １３９．５，  １３８．０，  １３４．５，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．７，  １２９．５，  １２６．８，  １２４．７，  １０９．５，  ９１．４，  ８４．０，  ７５．０，  ６４．５，  ３９．４，  ２２．２，  ２２．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ２６ＮＯ５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５２０．１２４７，  ｆｏｕｎｄ  ５２０．１２４１．
【０２０４】
化合物７ｄ。メタノール（１．０ｍＬ）中の６ｄ（２０ｍｇ、０．０３９ミリモル）の溶液に、３０％のＮａＯＭｅ（８．６６ｍｇ、０．１６ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。その後、反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡として化合物７ｄ（９．０ｍｇ、０．０３２ミリモル、８２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．４８  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ８．０１  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４０−７．３８  （ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２９  （ｄ，Ｊ＝  １０  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ¬１’），  ４．４７−４．４６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．１０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．９４−３．８８  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ  ，ｂ），  ２．７７−２．７６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．１９−２．１４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  １７１．２，  １４４．７，  １３９．６，  １３７．６，  １３０．５，  １２４．２，  １０８．８，  ９０．７，  ８８．２，  ７０．１，  ６１．０，  ４１．３．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ２８４．０４１，  ｆｏｕｎｄ  ２８４．０４１０．
【０２０５】
化合物８ｄ（ｄＴＰＴ３ＴＰ）。７ｄ（１０ｍｇ、３５．３μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物８ｄ（５．７ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、３１％）を合成した。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−９．３  （ｄ，Ｊ＝  １９．５  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１０．８  （ｄ，Ｊ＝  １９．８  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２２．４  （ｔ，Ｊ＝  ２０．０  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  マトリックス：  ９−アミノアクリジン）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ１５ＮＯ１２Ｐ３Ｓ２−，  ５２１．９，  ｆｏｕｎｄ，  ５２１．９．
【０２０６】
【化２２】
2019196355.tif 000031
模式図Ｓ６。（ａ）ｉ．Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ、ＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＮ、還流、３時間；ｉｉ．ＴｆＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１ｖ／ｖ）、１時間、８５％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、３２％；（ｃ）３０％ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、８５％；（ｄ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、１０％。
【０２０７】
化合物９。化合物５ｄ（５５ｍｇ、０．１１ミリモル）を１．０ｍＬのＭｅＯＨ−ＣＨ３ＣＮ（１：１ｖ／ｖ）に溶かし、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（４２ｍｇ、０．１２ミリモル）を加え、混合物を３時間還流で加熱し、その後溶媒を蒸発させ、残基をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）中に溶かし、有機相を水で３回洗浄した。その後、有機溶媒を蒸発させ、固形残留物は無水トルエンを用いた３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を１ｍＬのＴｆＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１ｖ／ｖ）に溶かし、その後混合物を１時間室温で撹拌し、混合物をその後濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、白色固形物として化合物９（４９ｍｇ、０．０９３ミリモル、８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ７．９８−７．９２  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．７５  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５２  （ｄ，Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．３２−７．２１  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．８２−６．７８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−１’），  ５．６４−５．６１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８０−４．５９  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６２−４．５９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ２．９３−  ２．８７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４３    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３９    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３４−２．２７  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １６６．２，  １６６．１，  １５６．４，  １４４．５，  １４４．３，  １３７．７，  １３７．５，  １３４．６，  １２９．９，  １２９．６，  １２９．３，  １２６．６，  １２６．４，  １２０．２，  １１２．１，  １１１．７，  ８５．５，  ８３．１，  ７５．０，  ６４．２，  ３９．１，  ２１．８，  ２１．７．１９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ−１５１．５．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ２５ＦＮＯ６Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５２２．１３８１，  ｆｏｕｎｄ  ５２２．１３８０．
【０２０８】
化合物１０。化合物９（２０ｍｇ、０．０３８ミリモル）を、無水トルエンを用いる３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１ｍＬ）に溶解させた。ローソン試薬（１８．５ｍｇ、０．０４６ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、黄色の泡として化合物１０（６．５ｍｇ、０．０１２ミリモル、３２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  ８．１１−７．８５  （ｍ，  ６Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４０−７．３９（ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２８−７．２１  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ５．６４−５．６３  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８３  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．３４−３．２９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４４  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４０    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３０−２．２６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １７０．９，  １６６．６，  １６６．５，  １４４．９，  １４４．８，  １３８．６，  １３０．３，  １３０．０，  １２９．９，  １２９．７，  １２９．７，  １２６．９，  １２６．７，  １２０．５，  １１６．３，  １１６．０，  １００．０，  ９１．６，  ８４．３，  ７４．７，  ６４．３，  ３９．２，  ２２．２，  ２２．１．１９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ−１４２．９．
ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ２５ＦＮＯ５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ５３８．１１５３，  ｆｏｕｎｄ  ５３８．１１５５．
【０２０９】
化合物１１。メタノール（１．５ｍＬ）中の１０（１０ｍｇ、０．０１９ミリモル）の溶液に、３０％のＮａＯＭｅ（４．３３ｍｇ、０．０８ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。その後、反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡として化合物１１（４．９ｍｇ、０．０１６ミリモル、８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．６８  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ８．１２  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５２  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２８  （ｔ，Ｊ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．４８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．１０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．９４  （ｄｄ，Ｊ＝  ３５，  ３  Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ２．７８−２．７５  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．２４−２．１９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  １７０．２，  １５０．２，  １４８．３，  １３９．０，  １３１．７，  １３１．６，  １１９．８，  １１７．８，  １１７．４，  ９１．５，  ８８．７，  ７０．１，  ６１．０，  ４１．５．１９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ−１４５．３．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ１３ＦＮＯ３Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ３０２．０３１５，  ｆｏｕｎｄ  ３０２．０３１４．
【０２１０】
化合物１２（ｄＦＴＰＴ３ＴＰ）。１１（５ｍｇ、１６．６μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物１２（２．０ｍｇ、３．７μｍｏｌ、２２％）を合成した。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１０．９  （ｄ，Ｊ＝  ２０．０  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１１．６  （ｄ，Ｊ＝  ２１．１  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２３．３  （ｔ，Ｊ＝  ２３．１  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．１９Ｆ  ＮＭＲ  （３７６  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１３８．５  （ｓ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  マトリックス：  ９−アミノアクリジン）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ１４ＦＮＯ１２Ｐ３Ｓ２−，  ５３９．９，  ｆｏｕｎｄ，  ５４０．１．
【０２１１】
【化２３】
2019196355.tif 000032
模式図Ｓ７。（ａ）ＩＣｌ、ＣＨ２Ｃｌ２、０°Ｃ乃至室温、夜通し、６３％；（ｂ）ローソン試薬、トルエン、還流、夜通し、２７％；（ｃ）２，２−ジクロロ−Ｎ−ｐｒｏｐ−２−イン−１−イルアセトアミド、（ＰＰｈ３）４Ｐｄ、ＣｕＩ、Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＦ、室温、夜通し、９１％；（ｄ）３０％のＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、室温、１時間、７４％；（ｅ）プロトンスポンジ、ＰＯＣｌ３、Ｂｕ３Ｎ、Ｂｕ３ＮＰＰｉ、（ＭｅＯ）３Ｐ、ＤＭＦ、−２０°Ｃ、２５％。
【０２１２】
化合物１３。窒素雰囲気下で０°ＣのＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中の５ｄ（７３ｍｇ、０．１４５ミリモル）の溶液に、一塩化ヨウ素（ＣＨ２Ｃｌ２中の１．０Ｍ、０．１５ｍｌ、０．１５ミリモル）を液滴で加えた。結果として生じる混合物を室温で夜通し撹拌した。反応混合物を飽和した水性のＮａＨＣＯ３と飽和した水性のＮａ２Ｓ２Ｏ３でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、白い泡として化合物１３（５７ｍｇ、０．０９１ミリモル、６３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ７．９８−７．９３  （ｍ，４Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．８３  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．７２  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．２８−７．１７  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．７８−６．７５  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−１’），  ５．６５−５．６３  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．７６  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．６３−４．６２  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ２．９５−２．９１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４３  （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３５    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３４−２．２９  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １６６．６，  １６６．５，  １５７．６，  １４７．４，  １４４．９，  １４４．６，  １３３．７，  １３２．７，  １３０．３，  １３０．１，  １２９．８，  １２９．７，  １２９．４，  １２８．５，  １２７．０，  １２６．８，  ８６．１，  ８３．８，  ７５．７，  ６４．７，  ３９．９，  ２２．２，  ２２．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ２５ＩＮＯ５Ｓ  （Ｍ＋Ｈ＋）  ６３０．０４４２，  ｆｏｕｎｄ  ６３０．０４４０．
【０２１３】
化合物１４。化合物１３（３０ｍｇ、０．０４８ミリモル）を、無水トルエンを用いる３回の共蒸着によって乾燥させた。残基を無水トルエン（１ｍＬ）に溶かし、ローソンの試薬（２３ｍｇ、０．０５７ミリモル）を加え、混合物を還流で夜通し加熱した。綿で濾過した後、濾液を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）にさらすことで、黄色の泡として化合物１４（８．４ｍｇ、０．０１３ミリモル、２７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．３１  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．９９−７．８２  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．３９−７．３６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２９−７．２０  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ５．６５−５．６４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８３−４．８１  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．７１−４．７０  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．３５  （ｄｄ，Ｊ＝  １５，  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４４    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３９    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．２７−２．２１  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  １７２．９，  １６６．６，  １４４．９，  １４４．７，  １４４．６，  １４１．８，  １３７．８，  １３５．０，  １３０．３，  １３０．２，  １２９．８，  １２９．７，  １２８．６，  １２６．９，  １２６．７，  ９１．７，  ８４．５，  ７５．３，  ６４．６，  ３９．５，  ２２．２，  ２２．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ２５ＩＮＯ５Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ６４６．０２１３，  ｆｏｕｎｄ  ６４６．０２１９．
【０２１４】
化合物１５。窒素雰囲気下でＤＭＦ（２ｍＬ）中の１４（１０ｍｇ、０．０１５ミリモル）の溶液に、（ＰＰｈ３）４Ｐｄ（１．７ｍｇ、０．００１５ミリモル）、ＣｕＩ（０．５７ｍｇ、０．０１１ミリモル）、およびＥｔ３Ｎ（５μＬ、０．０３０ミリモル）を加えた。反応混合物をガス抜きし、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＣｌ２ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＣＨ（３．８ｍｇ、０．０２２５ミリモル）の溶液を加えた。反応混合物を室温で夜通し撹拌して、ＴＬＣによってモニタリングした。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和した水性のＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡として化合物１５（９．２ｍｇ、０．０１３５ミリモル、９１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．２６  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．９９−７．８２  （ｍ，５Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．４０−７．３７  （ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ，  Ｈ−１’），  ７．２９−７．２１  （ｍ，  ４  Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ６．７１  （ｂｒ，  １Ｈ，  ＮＨ），６．９５  （ｓ，１Ｈ，  ＣＨＣｌ２），  ５．６５−５．６４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．８５−４．７９  （ｍ，２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ４．７３  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ４．２６−４．１１  （ｍ，２Ｈ，  ＮＨＣＨ２），  ３．３８−３．３４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．４４    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．４０    （ｓ，３Ｈ，  Ａｒ−ＣＨ３），  ２．３１−２．２５  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）ｏｅ  １７３．３，  １６６．６，  １６４．１，  １４４．８，  １３９．０，  １３８．３，  １３３．４，  １３０．３，  １３０．１，  １２９．８，  １２９．７，  １２６．９，  １２４．３，  １０４．８，  ９１．８，  ８８．３，  ８４．５，  ７８．８，  ７５．２，  ６６．４，  ６４．７，  ３９．６，  ３１．３，  ２２．２．  ２２．１．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３３Ｈ２９Ｃｌ２Ｎ２Ｏ６Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ６８３．０８３９，  ｆｏｕｎｄ  ６８３．０８５４．
【０２１５】
化合物１６。メタノール（１．０ｍｌ）中の１５（９．２ｍｇ、０．０１３５ミリモル）の溶液に、３０％のＮａＯＭｅ（２．９２ｍｇ、０．３２ミリモル）を液滴で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、ＴＬＣによってモニタリングした。反応混合物を濃縮し、粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）にさらすことで、黄色の泡として化合物１６（４．５ｍｇ、０．０１ミリモル、７４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  ８．６９  （ｓ，１Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ８．０６  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．５３  （ｄ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ａｒ−Ｈ），  ７．３０  （ｔ，Ｊ＝  ５  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ−１’），  ６．３３  （ｓ，１Ｈ，  ＣＨＣｌ２  ），  ４．４７−４．４６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−４’），  ４．３６  （ｓ，  ２Ｈ，  ＮＨＣＨ２），  ４．１１−４．０８  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−３’），  ３．９７  （ｄｄ，Ｊ＝  １２，  ３Ｈｚ，  ２Ｈ，  Ｈ−５’ａ，  ｂ），  ２．７９−２．７４  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ａ），  ２．２１−２．１６  （ｍ，１Ｈ，  Ｈ−２’ｂ）．１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）ｏｅ  １７２．９，  １３８．４，  １３４．３，  １２３．９，  ，１２２．８，  １０４．７，  １００．０，  ９１．２，  ８８．６，  ７７．１，  ７０．３，  ６６．４，  ６１．１，  ４１．７，  ３０．２．ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ１７Ｃｌ２Ｎ２Ｏ４Ｓ２  （Ｍ＋Ｈ＋）  ４４７．０００１，  ｆｏｕｎｄ  ４４７．００２０．
【０２１６】
化合物１７（ｄＴＰＴ３ＰＡＴＰ）。１６（５ｍｇ、１１．２μｍｏｌ）から始まる上記の三リン酸塩の合成のための一般的な手順を用いて化合物１７（２．２ｍｇ、３．１μｍｏｌ、２８％）を合成した。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）ｏｅ−１０．８５  （ｄ，Ｊ＝  １９．９  Ｈｚ，  ｙ−Ｐ），  −１１．６３  （ｄ，Ｊ＝  ２０．０  Ｈｚ，  ａ−Ｐ），  −２３．０７  （ｓ），  −２３．２６  （ｔ，Ｊ＝  １９．７  Ｈｚ，  ｆ３−Ｐ）．ＭＳ  （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−，  ｍａｔｒｉｘ：  ９−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ）  （ｍ／ｚ）：［Ｍ−Ｈ］−  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ１８Ｃｌ２Ｎ２Ｏ１３Ｐ３Ｓ２−，  ６８４．９，  ｆｏｕｎｄ，  ６８５．０．
【０２１７】
実施例３．忠実度を決定するためのＰＣＲ増幅の一般的な手順。
材料。ＴａｑとＯｎｅＴａｑのＤＮＡポリメラーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。ｄＮＴＰの混合物をＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，  ＭＤ）から購入した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ核酸ゲル染色（１０，０００×）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。
【０２１８】
ＤＮＡオリゴヌクレオチド。完全なオリゴヌクレオチド配列は表８に提供する。完全な天然のプライマーをＩｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）から購入した。非天然のプライマー１−３の合成のための試薬と溶媒をＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）および／またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から入手した。オリゴヌクレオチドは、制御された多孔性ガラス支持物（０．２０μｍｏｌ、１０００Ａ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０５  シンセサイザー上で、超軽度天然ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とｄＮａＭホスホラミダイト（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いる標準的な自動化ＤＮＡ合成を用いて調製された。自動合成の後、オリゴヌクレオチドを支持物から切断し、濃縮したアンモニア水中でのインキュベーションによって室温で夜通し脱保護し、ＤＭＴ精製（ｇｌｅｎ−ｐａｋ（ｔｍ）カートリッジ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって精製し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−２５カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。一本鎖オリゴヌクレオチドの濃度は２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定された。
【０２１９】
ＰＣＲ分析。ＰＣＲ増幅は、２５μＬの全容積で、および表９に記載されるような各分析に特有の条件で行われた。増幅の後に、５μＬのアリコートを、５０ｂｐラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に実行された６％の非変性ＰＡＧＥゲル上で分析することで、増幅産物のサイズを確認した。残りの溶液を回転カラム（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５；Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）によって、その後、４％のアガロースゲルによって精製し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で回復させ、蛍光染料結合（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量化し、３７３０のＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で配列決定した。以下に記載されるように、倍加当たりの非天然の塩基対の平均保持％として忠実度を決定した。
【０２２０】
忠実度の決定。非天然の塩基対（Ｆ）の保持パーセントは生の配列決定データを用いて測定され、倍加当たりの忠実度に標準化される。簡潔に言えば、非天然のヌクレオチドの存在は配列決定プロファイルの急な終了の原因となり、天然のヌクレオチドへの突然変異は「リードスルー」をもたらす。「リードスルー」の程度はこのように非天然の塩基対の保持とは逆の相関関係にある。ＰＣＲ忠実度の定量的測度として配列決定データを使用するために、我々は、非天然の塩基対の５０−１００％の保持率の範囲のキャリブレーション実験を行った。したがって、低い保持率（＜５０％）と高い「リードスルー」により定量化は不正確になる。
【０２２１】
高い保持率（＞５０％）の定量化は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の開始点と終了点を調節すること、および、非天然のヌクレオチドの前（区画Ｌ）およびＳ３６後（区画Ｒ）にこうした定義された点（長さで３５−４５のヌクレオチド）内のピークについて各々の経路の（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）の個々の平均信号強度を決定することによって行われた。Ｒ／Ｌ比率は、配列決定クロマトグラム中のノイズと対照サンプル中のリードスルーの両方を説明するために配列決定キャリブレーションプロットを使用して標準化された。標準化後のＲ／Ｌ比率（Ｒ／Ｌｎｏｒｍ）はプール中の天然の配列の割合に対応する。最後に、Ｆは１−（Ｒ／Ｌ）ｎｏｒｍとして計算され、倍加当たりの非天然の塩基対の保率（忠実度、ｆ）は、１／（Ｆｌｏｇ２Ａ）として計算され、Ａは増幅であり、ｌｏｇ２Ａは倍加の数である。ＰＣＲ増幅前後の各サンプルをそれぞれの方向に三回繰り返して配列決定することで、配列決定の誤差を最小限に抑えた。対応するデータを表１０に提供する。標準ＰＣＲ条件下では、ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭを含むＤＮＡを、天然の塩基対のみを含むＤＮＡよりも４倍低いだけの効率と、９９．９８％を越える忠実度でＯｎｅＴａｑによって増幅した。この忠実度は１つのヌクレオチド当たり１０−４の誤差率に相当し、これは一般に用いられるＰＣＲ系を用いて完全に天然のＤＮＡの１０−４〜１０−７の誤差率で重複する。Ｔａｑポリメラーゼを用いて、効率は天然の塩基対よりも２．５倍低いだけであり、忠実度は９９．７％である。この忠実度は１０−３の誤差率に相当し、これは天然のＤＮＡのＴａｑ媒介性の増幅で観察される誤差率に類似する。
【０２２２】
【表８】
2019196355.tif 000033
【０２２３】
【表９】
2019196355.tif 000034
【０２２４】
【表１０】
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【０２２５】
実施例４：ＴＰＴ３の部位特異的な標識化：ストレプトアビジンゲルシフトアッセイによる分析。
中心に位置したｄＴＰＴ３ＰＡ−ｄＮａＭあるいはｄ５ＳＩＣＳＰＡ−ｄＮａＭを含む１３４量体のＤＮＡが合成された。ＤＮＡ鋳型は表９に記載される条件下でＰＣＲにより増幅された。完了後、ＮａＯＨ（１Ｍ、１２．５μＬ）を、０．２Ｍの最終濃度になるまでＰＣＲサンプルに直接加えて、室温で５時間培養した。ＮａＯＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５．５、７．５μＬ）と２００μＬの冷たいエタノールの追加後、サンプルを混合し、氷の上で夜通しインキュベートし、ＤＮＡを４°Ｃで３０分間１０，０００ｒｆｕで遠心分離によって沈殿させた。上清を取り除き、ペレット剤は８０％のエタノールで注意深く洗浄した。サンプルを、５０μＬのアニーリング緩衝液（５０ｍＭのＮａリン酸塩、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で再懸濁し、９５°Ｃに加熱し、３０分かけて室温まで冷やした。アニーリング緩衝液（４０ｍＭ、５０μＬ）中のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液をＤＮＡサンプルと混ぜ、室温で夜通しインキュベートした。サンプルを回転カラム（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））によって精製し、１０μＬの溶出緩衝液中で溶出させた。サンプル（５μＬ）の半分をアニーリング緩衝液中の１μｇのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混ぜ、３７°Ｃで３０分間インキュベートし、５ｘ非変性添加液（Ｑｉａｇｅｎ）と混ぜ、６％の非変性ＰＡＧＥ上に負荷した。残りの半分を５ｘの非変性添加液と混ぜ、対照としてゲルに直接負荷した。３０分間１１０Ｖでゲルを泳動させた後に、ゲルを３０分間１ｘ  Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に浸漬させ、５２０ＤＦ３０フィルタ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を装備したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋を使用して視覚化した。記載される標識化戦略の図が以下に記載される。
【０２２６】
【化２４】
2019196355.tif 000036
【０２２７】
実施例５．非天然の塩基対の転写の一般的な手順。
ｄＴＰＴ３およびｄＮａＭ、あるいはそのアナログまたは誘導体によって形成された非天然の塩基対の転写を特徴づけるために（誘導体はリンカー部分を含む）、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを合成し、対応する三リン酸塩またはデオキシホスホラミダイトに変換され、自動式ＤＮＡ合成を使用してデオキシホスホラミダイトをＤＮＡ鋳型に取り込む。転写実験は１００ｎＭのＤＮＡ基質、１ｘＴａｋａｒａ緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン）、ＤＥＰＣで処理された、かつヌクレアーゼを含まない滅菌水（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｔ７ポリメラーゼ（５０単位）、２０μＭのそれぞれの天然のＮＴＰ、α−３２Ｐ−ＡＴＰ（２．５μＣｉ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および、５μＭのＴＰＴ３ＴＰ、あるいは５μＭのＮａｍＴＰで行われる。３７°Ｃで２時間のインキュベーション後、１０μＬのゲル負荷溶液を加えて反応をクエンチし（１０Ｍの尿素、０．０５％のブロモフェノールブルー）、反応混合物を２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルに載せ、電気泳動にかけて、ホスフォイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によって分析する。時間関数として形成された完全長の生成物の量を測定すること（低い変換割合で）によって転写効率を調べる。
【０２２８】
実施例６．非天然の塩基対を含むＤＮＡデュプレックスの熱力学的分析の一般的な手順。
ＵＶ溶解実験はＣａｒｙ３００Ｂｉｏ  ＵＶ可視の分光光度計を使用して実行される。サンプル（非天然の塩基対、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む３μＬのオリゴヌクレオチド）の吸光度は、１分当たり０．５°Ｃの加熱速度で２１°Ｃから８０°Ｃまで２６０ｎｍでモニタリングされる。融解温度はＣａｒｙ  Ｗｉｎ  ＵＶ熱アプリケーションソフトウェアを使用して、誘導法によって決定される。
【０２２９】
熱力学的パラメータは、ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆ分析Ｔｍ−１＝Ｒ［ｌｎ（［ＣＴ］／４）］ΔＨ＋ΔＳ°／ΔＨ°によって決定され、式中、ΔＨ°とΔＳ°はそれぞれＵＶ実験から決定された標準的なエンタルピーとエントロピーの変化であり、Ｒは一般気体定数であり、［ＣＴ］は総オリゴヌクレオチド鎖濃度である。融解過程に関連した水分子の数の変化（Δｎｗ）は、方程式Δｎｗ＝（−ΔＨ／Ｒ）［δ（Ｔｍ−１）／δ（ｌｎａｗ）］に従って水分活性（ａｗ）へのＴｍの依存度から得られる。エチレングリコールの様々な濃度（重量％で０、２、５、７、１０、１５％）の水分活性の対数に対する溶解の相互の温度（Ｋ−１）のプロットの勾配は、δ（Ｔｍ−１）／δ（ｌｎａｗ）の値として得られる。
【０２３０】
ＣＤ実験は、Ｐｅｌｔｉｅｒの熱電気温度調整ユニット（３μＭのオリゴヌクレオチド濃度、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのｐＭｇＣｌ２）を装備したＡｖｉｖモデル６１ＤＳ分光偏光計を用いて行われる。データは、３６０〜２２０ｎｍのスキャン、３ｓの時定数、および２５°Ｃでの０．５ｎｍの波長ステップサイズで１ｃｍの経路長の石英キュベットを用いて収集される。
【０２３１】
実施例７．非天然の核酸塩基を用いるインビトロの選択
非天然の核酸を含むオリゴヌクレオチドライブラリーが生成される。ライブラリのサンプルは、標的分子（例えばタンパク質）との連続的な結合およびそれからの溶出にさらされる。結合核酸のプールはＰＣＲによって増幅され、標的分子と結合するために再度の選択にさらされる。この選別プロセスは数回繰り返される。最後の数回の選択時に選択圧を増加させるために、標的分子の濃縮および／またはインキュベーション時間を減らす。生き残った核酸を潜在的なアプタマーとして配列決定される。潜在的なアプタマーの結合親和性はフローサイトメトリーを使用して決定される。
【０２３２】
実施例８．ＤＮＡクリック反応の一般的な手順。
１４μＬのＤＭＳＯ中のＤＮＡ溶液（０．２ｐｍｏｌ）に、１μＬのアジド−ＰＥＧ（３＋３）−Ｓ−Ｓ−ビオチン（Ｈ２Ｏ中の２０ｍＭ）を加え、その後、２μＬのリガンド（ＢｉｍＣ４Ａ）３（Ｈ２Ｏ中の４ｍＭ）、１μＬのアスコルビン酸ナトリウム（Ｈ２Ｏ中の１００ｍＭ）、および１μＬのＰＢＳ緩衝液（５×）を加え、その後、その混合物をボルテックスし、最後の成分として、１μＬの新鮮に調製したＣｕＳＯ４溶液（Ｈ２Ｏ中の４ｍＭ）を加えた。その溶液を３７°Ｃで２時間振り、その後、結果として生じる生成物ＤＮＡを精製した（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  ｋｉｔ，  Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）。精製されたサンプルを用いてゲル移動度アッセイに直接使用された（以下を参照）。
【０２３３】
実施例９．増幅後ＤＮＡ標識の一般的な手順（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＣＳ  ２０１１，  １３３，  １９８７８から）。
酵素合成後の標識について、遊離アミノ基を含むｄｓＤＮＡを、リン酸標識緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、室温で１時間１０ｍＭのＥＺーＬｉｎｋスルフォ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、またはＥＺ−ＬｉｎｋＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてインキュベートし、その後、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ｄＴＰＴ３ＰＡまたはｄ５ＳＩＣＳＰＡのようなジクロロアセチル保護されたアミン誘導体を用いて、アミンはまず脱保護を必要とし、これは室温の濃縮アンモニア水溶液中で夜通し培養することにより達成された。アンモニアはＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置を介して除去された（水吸引器、その後、油真空ポンプが続く）。リンカー（つまり、ＳＳ−ビオチンまたはＳＳ−ＰＥＧ４−ビオチン）を含むジスルフィドを切断するために、ｄｓＤＮＡを３７°Ｃで１時間ＤＴＴ（３０ｍＭの最終濃度）を用いて処理した。骨格標識化については、骨格ホスホロチオエートを含むｄｓＤＮＡを５０°Ｃのリン酸標識緩衝液中で２５ｍＭのＥＺ−Ｌｉｎｋヨードアセチル−ＰＥＧ２−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で夜通しインキュベートし、生成物をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットで精製した。付着したビオチン部分を操作するすべての反応をストレプトアビジンゲルシフトアッセイによって定量化した。
【０２３４】
ゲル移動度アッセイ。ＤＮＡサンプル（１０−５０ナノグラム）をリン酸標識緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の１μｇのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合して３７°Ｃで３０分間インキュベートし、５×非変性添加液（Ｑｉａｇｅｎ）と混ぜ、６％非変性ＰＡＧＥ上に負荷した。ゲルを２５−４０分１５０Ｖ泳動させ、３０分間ＴＢＥ中の１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ核酸染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、５２０ＤＦ３０フィルタ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を装備したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  ＤｏｃＸＲ＋を使用して視覚化した。ｄｓＤＮＡ（〜１５０ｂｐ）と、ｄｓＤＮＡとストレプトアビジン（〜４００ｂｐ）との間の１：１の複合体に対応する強いバンドは明らかであった。ＤＮＡとストレプトアビジンの、あるいはいくつかの例におけるＰＣＲ後の不完全なアニーリングに由来する非ビオチン化一本鎖ＤＮＡからの、高次（移動性の低い）複合体に対応する弱いバンドも明らかであった。
【０２３５】
本明細書で参照されるすべての特許と出版物は、あたかも個々の出版物が参照によってその全体として具体的かつ個々に組み込まれるのと同じ程度で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３６】
使用されてきた用語と表現は限定するものではなく記載上の用語として使用され、示され記載された特徴のあらゆる同等物またはその一部を除くこうした用語や表現を使用することを意図していないが、主張される実施形態の範囲内で様々な修正が可能であることが理解される。したがって、本実施形態は特に好ましい実施形態と随意の機能によって開示されてきたが、本明細書で開示される概念の修正および変化が当業者により用いられてもよく、こうした修正と変化は添付の請求項によって定義されるように本開示の範囲内であるとみなされる。
【図１】
2019196355.tif 000044
【図２】
2019196355.tif 000045
【図３】
2019196355.tif 000046
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019196355.tif 000050
【図８−１】
2019196355.tif 000051
【図８−２】
2019196355.tif 000052
【図９】
2019196355.tif 000053
【図１０】
2019196355.tif 000054
【図１１】
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【図１２】
2019196355.tif 000056
【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月25日(2019.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の核酸塩基を含む化合物であって、
【化１】
2019196355.tif 000063
式中、
それぞれのＸは炭素であり、
それぞれのＲ２は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、メトキシ、メタンチオール、メタンセレノ、ハロゲン、シアノ、アジド基、反応的なリンカーであり、反応的なリンカーは、
（ｉ）    −Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＮＨＲ３基であって、Ｒ３が水素であるか、あるいはアミノ保護基である；
（ｉｉ）  アセチレン基；
（ｉｉｉ）チオール基；
（ｉｖ）  アルデヒド基；
（ｖ）    アジド基；
（ｖｉ）  −Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＨ基であって、ｎが１、２、３、４、５、または６である；および
（ｖｉｉ）−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎ１−Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−Ｃ≡ＣＨ基であって、ｎ１とｎ２がそれぞれ独立して１、２、または３である
からなる群から独立して選択され、
Ｙは独立して硫黄、セレンまたは二級アミンであり、
Ｅは硫黄であり、および
波線は、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分との結合点を示し、リボシル、デオキシリボシル、あるいはジデオキシリボシル部分は遊離形態である、または一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩の少なくとも１つに接続されており、三リン酸塩は随意にα−チオリン酸塩、β−チオリン酸塩、またはγ−チオリン酸塩の基を含む、化合物。
【請求項２】
Ｙは硫黄である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
それぞれのＲ２は水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
反応的なリンカーは、アミノ基、アセチレン基、チオール基、アルデヒド基、またはアジド基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
リボシル、デオキシリボシル、またはジデオキシリボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
リボシル部分またはデオキシリボシル部分の５’−ヒドロキシルは、三リン酸塩またはα−チオリン酸塩の基に接続されている、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
リボシル部分またはデオキシリボシル部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴヌクレオチド分子に取り込まれる、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックスであって、
第１のオリゴヌクレオチド鎖は請求項１の化合物を含み、第２の相補的なオリゴヌクレオチド鎖はその相補的な塩基対合部位に相補的な塩基対合核酸塩基を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス。
【請求項９】
第１の鎖はｄＴＰＴ３を含み、第２の鎖はその相補的な塩基対合部位にｄＮａＭ、ｄＤＭＯ、またはｄＭＭＯ２を含む、請求項８に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのデュプレックス。
【請求項１０】
核酸塩基は以下である、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2019196355.tif 000064
【請求項１１】
核酸塩基は以下である、請求項５に記載の化合物。
【化３】
2019196355.tif 000065
【請求項１２】
リボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
デオキシリボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
ジデオキシリボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
核酸塩基は、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド分子に取り込まれる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
核酸塩基は以下である、請求項５に記載の化合物。
【化４】
2019196355.tif 000066
【請求項１７】
リボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
波線は、デオキシリボシル部分が結合点に付けられることを示す、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
ジデオキシリボシル部分は、結合点に付けられる、請求項１６に記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載の核酸塩基が、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチド分子に取り込まれる工程を含む方法。
【外国語明細書】
2019196355000001.pdf