(57)【要約】【課題】吸収性物品の着用時若しくは使用中に吸収性物品に移行した微生物に対して、分子生物学的手法による解析を実施するために必要な量の核酸又はタンパク質を抽出する方法を提供する。【解決手段】吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法であって、  吸収性物品に付着する微生物を洗浄し、洗浄液に微生物を洗い出し、  洗浄液を濾材で濾過し、濾材上に担持させた微生物を捕集し、  捕集した微生物由来の核酸又はタンパク質を抽出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法であって、
吸収性物品に付着する微生物を洗浄し、洗浄液に微生物を洗い出し、
洗浄液を濾材で濾過し、濾材上に担持させた微生物を捕集し、
捕集した微生物由来の核酸又はタンパク質を抽出する方法。
【請求項２】
吸収性物品を裁断し、排泄点及びその近傍領域を洗浄する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄液が、生理食塩水を主成分とする洗浄液である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記吸収性物品に使用されている高吸収性高分子の吸水量を超える過剰量の洗浄液を用いて、微生物の洗浄を行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
吸収性物品を粉砕及び均質化できる洗浄機器を用いて、又は手振りにより、微生物の洗浄を行う、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
吸引濾過により、微生物を洗い出した洗浄液を濾材で濾過する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
濾材上に担持させ、捕集した微生物に対して機械的若しくは化学的に菌体破砕を行い、核酸若しくはタンパク質を抽出する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
吸収性物品に移行した微生物の分子生物的手法による解析に必要な量の核酸又はタンパク質を抽出する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の方法により抽出した核酸又はタンパク質を用いて、分子生物学的手法により、吸収性物品に移行した微生物を解析する方法。
【請求項１０】
吸収性物品に移行した微生物について、菌種の特定、菌叢解析、菌数の定量、遺伝子発現解析、及びタンパク質解析のいずれかを行う、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理用ナプキンやパンティライナー、タンポン、失禁パッド、おむつ、尿とりパッドなどの吸収性物品の使用中や、吸収性物品の着用時に、皮膚常在菌や膣内に存在する微生物、環境由来の微生物が吸収性物品に移行し、経血や便などの排泄物と接触すると、このような微生物が増殖し、湿疹、腫れ、かぶれ、痒みなどの肌トラブルを引き起こすことが知られている。また、排泄物自体に含まれる微生物が吸収性物品上で増殖すると、肌トラブルの原因となる。
そのため、吸収性物品の着用によるデリケートゾーンでの肌トラブル発生のメカニズムの解明や、肌トラブルの予防若しくは改善方法による予防若しくは改善効果の確認、肌トラブルの予防若しくは改善剤の開発には、使用中若しくは使用後の吸収性物品に移行若しくは存在する微生物を解析することが求められている。
【０００３】
環境菌や動物由来のサンプルに含まれる微生物の解析方法に関して、例えば、特許文献１には、ヒトの個人識別のために、ヒトの皮膚常在菌の菌株遺伝子型の構成比率を解析する方法が記載されている。また、特許文献２には、唾液や歯垢中の微生物による酸産生量を測定し、齲蝕活動性を検査する方法が記載されている。特許文献３には、食品、糞便、環境サンプルなどから、腸管出血大腸菌を検出する方法が記載されている。さらに、特許文献４には、便などの腸管由来試料から、家畜の健康状態を評価するための微生物学的叢の構成を分析する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−８６０７２号公報
【特許文献２】特開２００７−２４８２４３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／０１８７６２号
【特許文献４】国際公開第００／５２２０６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、ヒト若しくは非ヒト動物由来のサンプル、土壌や環境由来のサンプルから微生物を採取し、分子生物学的手法により解析する方法は各種知られている。
しかし、吸収性物品には、高い液吸収性を有する高吸収性高分子などから構成され、排泄物を吸収、保持する吸収部が設けられている。よって、吸収性物品に移行した微生物を分子生物学的手法により解析しようとする場合、移行した微生物が吸収部の高吸収性高分子に吸収、保持される。そのために、分子生物学的手法で解析できるだけの微生物を高吸収性高分子から容易に捕集することができない。
したがって、吸収性物品に移行した微生物について、十分量のDNAやRNAなどの核酸、並びにタンパク質を抽出し、各種分子生物学的手法による解析を実施することは困難である。
【０００６】
そこで本発明は、吸収性物品の着用時若しくは使用中に吸収性物品に移行した微生物に対して、分子生物学的手法による解析を実施するために必要な量の核酸又はタンパク質を抽出する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。
その結果、微生物が移行した吸収性物品を過剰量の洗浄液を用いて洗浄し、吸収性物品を粉砕及び均質化、並びに洗浄して微生物を洗い出し、洗浄液を濾過して濾材に微生物を担持させることで、吸収性物品に移行した微生物を効率的に捕集できることを見出した。さらに、捕集した微生物から、分子生物学的手法による解析を実施できる量の核酸又はタンパク質を菌から抽出できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００８】
本発明は、吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法であって、
吸収性物品に付着する微生物を洗浄し、洗浄液に微生物を洗い出し、
洗浄液を濾材で濾過し、濾材上に担持させた微生物を捕集し、
捕集した微生物由来の核酸又はタンパク質を抽出する方法に関する。
【０００９】
また本発明は、前記方法により抽出した核酸又はタンパク質を用いて、分子生物学的に、吸収性物品に移行した微生物を解析する方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、吸収性物品を過剰量の洗浄液で洗浄し、洗浄液を濾過し、濾材から集菌することで、吸収性物品の着用時若しくは使用中に移行した微生物を効率的に回収することができる。そして、捕集した微生物から核酸若しくはタンパク質の抽出操作を行うことで、各種分子生物学的手法による解析に必要な量の核酸若しくはタンパク質を抽出することができる。
さらに、本発明の方法により抽出した核酸若しくはタンパク質を各種分子生物学的手法により解析することで、捕集した微生物が少量であっても、短時間でかつ正確に、吸収性物品に移行した微生物の解析が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
まず、本発明における、吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法について説明する。
本発明で使用する吸収性物品は、排泄液の吸収及び保持が可能な種々のものとすることができる。例えば、生理用ナプキン、パンティライナー、タンポン、失禁パッド、おむつ、尿とりパッドが挙げられる。なお本発明で使用する吸収性物品は、使用前の吸収性物品であってもよいが、使用済の吸収性物品であることが好ましい。ここで使用済の吸収性物品には、実際にヒトが装着した後の吸収性物品の他、パッケージから取り出した使用前のものを環境中に一定時間放置した吸収性物品や、人為的に菌を播種した吸収性物品も含まれる。
【００１２】
本明細書において「微生物」とは、肉眼でその存在が判別できず、顕微鏡などで観察できる程度の大きさの生物全般を指し、好ましくは真菌類、細菌類、及びウイルス類からなる群より選ばれる少なくとも１種が含まれる。
【００１３】
本発明の抽出方法において、まずは、洗浄液を用いて吸収性物品に付着する微生物を洗浄し、洗浄液に微生物を洗い出す。本発明においては、吸収性物品をそのまま洗浄してもよい。あるいは、核酸やタンパク質の抽出効率、吸収性物品の装着による肌トラブルの原因微生物を特定する観点から、吸収性物品を裁断し、排泄点及びその近傍領域を洗浄することが好ましい。
【００１４】
微生物の洗浄に用いる洗浄液の種類に特に制限はないが、微生物由来の核酸又はタンパク質を抽出するためには、使用済の吸収性物品に付着する微生物に対して殺菌性を示さない洗浄液を用いることが好ましい。
具体例としては、滅菌水、生理食塩水、培養液（各種液体培地）、及び抗菌性試験不活化剤（SCDLP液等）からなる群より選ばれる少なくとも１種を主成分とする洗浄液が挙げられる。このうち、生理食塩水を主成分とする洗浄液が好ましい。また、本発明で用いる洗浄液は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤として、ノニオン界面活性剤が好ましく、Tween20、Tween40、Tween60及びTween80（いずれも商品名、東京化成工業社製）、並びにTriron X-100及びTriton X-114（いずれも商品名、Sigma-Aldrich社製）からなる群より選ばれる少なくとも１種が特に好ましい。洗浄液中の界面活性剤の濃度は適宜選択することができ、0.025%(w/v)〜0.2%(w/v)が好ましく、0.05%(w/v)〜0.1%(w/v)が特に好ましい。
【００１５】
微生物の洗浄に用いる洗浄液の使用量も特に制限はなく、吸収性物品に使用されている吸収体（高吸水性高分子：SAP）や、後述の洗浄機器の種類、洗浄方法に応じて、菌由来の核酸又はタンパク質の抽出に必要な、洗浄液の使用量を適宜設定することができる。
洗浄液の使用量の一般的な目安が、「吸水性樹脂抗菌性能試験方法（吸収性樹脂工業会編）」に記載されている。例えば、SAP0.2gの吸水量を測定し、SAPに摂取する試験菌懸濁人工尿量及び洗浄液であるSCDLP液の使用量を決定することができる。なお、SAP1gあたりの吸水量は、概ね50mLである。
後述の実施例で用いた、3×3cm2に裁断した吸収性物品の試験片の重量は、ナプキン表面材が0.08g、ナプキン吸収体が0.55g、パンティライナー吸収紙が0.12gである。ここで、SAPの吸水量を50mL/gとして、各試験片の吸水量を算出すると、ナプキン表面材では4mL、ナプキン吸収体では27.5mL、パンティライナー吸収紙では6mLとなる。この吸水量を超える過剰量の範囲で、核酸又はタンパク質の抽出に必要な洗浄液の使用量を適宜設定できる。その洗浄液の使用量として、SAPの吸水量の2倍以上50倍以下が好ましく、3倍以上30倍以下がさらに好ましい。
【００１６】
微生物の洗浄方法に特に制限はないが、微生物の捕集効率、並びに核酸若しくはタンパク質の抽出効率を向上させるため、吸収性物品、好ましくは高吸収性高分子、を粉砕及び均質化できる洗浄機器を用いて菌を洗浄することが好ましい。このような洗浄機器の具体例としては、ストマッカー、ボルテックスミキサー、撹拌振とう機、超音波発生機などが挙げられる。本発明のうち、これらの洗浄機器のうち１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて使用してもよい。本発明で使用できる洗浄機器としては、ストマッカー及びボルテックスミキサーが好ましい。
あるいは、手振りにより、吸収性物品から微生物を洗浄液に洗いだしてもよい。手振りによる菌の洗浄方法については、JIS L 1902:2015等に記載されている常法に従い、行うことができる。
【００１７】
本発明において、前記洗浄工程を経て回収した洗浄液に対して、濾過フィルターを用いることで、混入した吸収性物品由来の夾雑物(不織布片、パルプ、SAPなど)を除去することが好ましい。濾過フィルターの孔径は吸収性物品に応じて適宜選択することができ、20μm〜100μmが好ましく、40μm〜60μmが特に好ましい。
【００１８】
前記洗浄工程、及び必要により夾雑物除去工程を経て回収した洗浄液に対して、常法に従い濾過を行い、洗浄液に含まれる微生物を濾材上に担持させる。
本発明で用いる濾材の材質や孔径は、微生物を濾材上に担持できるよう、洗浄液の成分の種類に応じて適宜設定できるが、材質は、セルロースエステル、ポリエーテルサルフォンが好ましく、孔径は、0.2μm〜0.5μmが好ましい。
また、濾過方法についても、吸引濾過などの常法に従い行うことができる。本発明において、回収した洗浄液を吸引濾過により濾過することが好ましい。吸引濾過を行った場合、分子生物学的な微生物の解析の実施に必要な量の微生物を効率的、かつ容易に得ることができる。
【００１９】
濾材上に担持させ、捕集した微生物から核酸やタンパク質を抽出する方法は、常法より適宜選択することができる。
抽出方法としては、グラインダーによる破砕、浸透圧破砕、ビーズ破砕などの機械的菌体破砕、界面活性化剤、カオトロピック剤、フェノール・クロロホルム、エタノールなどを用いた化学的菌体破砕、プロテアーゼなどを用いた酵素反応、細胞膜の破壊と細胞内ヌクレアーゼの不活性化とを組み合わせる方法、などが挙げられる。このうち、機械的若しくは化学的に菌体破砕を行い、核酸若しくはタンパク質を抽出することが好ましい。あるいは、市販されているキットを用いて、核酸若しくはタンパク質を抽出することもできる。
また、抽出処理を行った後、濾過又は沈澱により、不要な細胞画分や抽出試薬成分などを除去してもよい。
【００２０】
前記工程を経ることで、各種分子生物学的手法による解析に必要な量の核酸若しくはタンパク質を抽出することができる。そして、抽出した核酸やタンパク質から、吸収性物品へ移行した微生物について、分子生物学的手法により、短時間で、かつ正確に、菌種の特定、菌叢解析、菌数の定量、遺伝子発現解析、タンパク質解析などのいずれかの解析を行うことができる。
【００２１】
本発明で行うことができる分子生物学的手法は特に制限はなく、常法より適宜選択できる。
本明細書において「分子生物学的手法」とは、核酸やタンパク質などの遺伝情報を有する生体高分子の構造、特性、機能などに基づき、細胞レベル以下の分子レベルで、基本的な生命現象を解明するための手法をいう。分子生物学的手法の具体例としては、PCRによる核酸処理方法（増幅、逆転写など含む）、リアルタイムPCRによる各種遺伝子の発現評価方法（菌数定量方法、菌検出方法などを含む）、シーケンサー若しくは次世代シーケンサーを用いた各種遺伝子の発現解析方法（菌種解析方法、菌叢解析方法、網羅的遺伝子発現解析方法など）、各種電気泳動法による核酸若しくはタンパク質の検出方法、同定方法若しくは定量方法、DNAチップを用いた遺伝子発現解析方法（マイクロアレイ法）、酵素による反応を伴う生化学的解析方法、タンパク質相互作用を伴う生化学的解析方法、などが挙げられる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２３】
試験例１
（吸収性物品の試験片の作製）
試験片の作製に、下記の吸収性物品を使用した。
＜ナプキン＞
ロリエエフしあわせ素肌 ふわふわスリム 多い昼用 羽根つき（22.5cm）（花王社製）
＜パンティライナー＞
ロリエきれいスタイル Airy 無香料（花王社製）
前記ナプキンの排泄点を中心として、3×3cm2の正方形に裁ちばさみで切断し、表面材（以下、「ナプキン表面材」ともいう）と吸収体（以下、「ナプキン吸収体」ともいう）に分離した。
また、前記パンティライナーについても、排泄点を中心として、3×3cm2の正方形に裁ちばさみで切断し、吸収紙（以下、「パンティライナー吸収紙」ともいう）を分離した。
下記に示す試験では、ナプキン表面材、ナプキン吸収体、及びパンティライナー吸収紙はいずれも、試験直前に安全キャビネット内で10分以上のＵＶ殺菌後に使用した。
【００２４】
（菌液の調製）
供試菌として、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）NBRC12993を用いた。
本菌株のグリセロールストックの氷塊の一部を白金耳で回収し、卵黄加マンニット食塩寒天培地（関東化学社製）に画線し、37℃で一晩（約24時間）培養したものをマスタープレートとした。
マスタープレートのシングルコロニーを白金耳ですくい、生理食塩水（商品名：大塚生食注、大塚製薬社製）100〜300μLに菌体を懸濁し、卵黄加マンニット食塩寒天培地に懸濁液を100μLずつ塗抹し、37℃で20時間培養し、前培養を行った。
【００２５】
前培養を行ったシャーレに生理食塩水1mLを滴下し、コンラージ棒を用いて全菌を回収した。回収した菌体を生理食塩水で5mLにメスアップし、遠心した（7,000g×3min, 4℃）。上清を除去し、生理食塩水5mLにペレットを再懸濁し、再度遠心し（7,000g×3min, 4℃）、菌を洗浄した。
この菌体の洗浄操作を再度繰り返し、分光光度計を用いてOD600が1.0となるよう、生理食塩水でペレットを希釈し、供試菌液を調製した。
【００２６】
OD600を1.0となるよう調製した供試菌液を生理食塩水で100倍希釈し、播種用菌液（生理食塩水）（菌数約105CFU/100μL）を調製した。
【００２７】
（吸収性物品からの菌体の洗浄）
ナプキン表面材及びパンティライナー吸収紙に、本播種菌液100μLをそれぞれ滅菌シャーレ上で播種し、30分静置した。ナプキン吸収体には、本播種菌液100μLに対して生理食塩水900μLで1mLにメスアップしたものを滅菌シャーレ上で播種し、30分静置した。
播種した菌液100μLを、生理食塩水900μLで段階的に希釈（1×101〜1×105倍）した後、卵黄加マンニット食塩寒天培地に100μLずつ塗抹し、37℃のインキュベーターで2日間培養した。
培養後、プレート上の生育コロニーを計数し、播種菌数を評価した。
【００２８】
吸収性物品に播種した菌体の洗浄は、ボルテックスミキサー及びストマッカーを用いた。
ボルテックスミキサーを用いた洗浄では、70mL滅菌コンテナ（ザルスタット社製）に、菌体を播種した試験片と菌洗浄液（0.9%(w/v)NaCl（和光純薬社製）、0.05%(w/v)Tween80（東京化成工業社製）、オートクレーブ滅菌処理済）を入れた後、ボルテックスミキサーとしてボルテックス ジェニー2（商品名、Scientific Industries社製）(以下、「ボルテックスミキサー」ともいう)を用いて速やかに最大速度で1分間渦流撹拌した。ここで、ナプキン表面材とパンティライナー吸収紙の場合、洗浄液は20mL使用し、ナプキン吸収体の場合、洗浄液は40mL使用した。
ストマッカーを用いた洗浄では、ストマフィルターNEO（GSIクレオス社製）に、菌体を播種した試験片と洗浄液100mLを入れ、ポリシーラーP-200（富士インパルス社製）を用いて加熱時間設定8で、内側底辺より11cmの位置をヒートシールした。その後速やかに、ストマッカーとしてバッグミキサー400SW（InterScience社製）を用いて1分間ホモジナイズ（10ストローク/秒）した。
【００２９】
1分間洗浄後の洗浄液について、70mL滅菌コンテナは直接、40μmセルストレーナー（Falcon社製）に2回通すことで膨潤した吸収ポリマーなどの夾雑物を濾過し、菌洗浄液を取得した。ストマフィルターNEOは200mLスクリューカップ（栄研社製）を介して、40μmセルストレーナーに2回通すことで膨潤した吸収ポリマーなどの夾雑物を濾過し、菌洗浄液を取得した。
【００３０】
菌洗浄液100μLを生理食塩水900μLで段階希釈（ボルテックスミキサー：101〜103倍、ストマッカー：100〜102倍）した後、卵黄加マンニット食塩寒天培地に100μLずつ塗抹し、37℃のインキュベーターで2日間培養した。プレート上の生育コロニーを計数し、洗浄液全量（20mL、40 mL、100mL）中の菌数として補正、評価した。
その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2019075997.tif 000002
【００３２】
今回試験片に播種した菌数は5.44(Log10CFU)であった。そして、表１で示すように、吸収性物品から菌体を効率的に回収できる。さらに、回収した菌数の誤差も小さく、菌体の回収精度も高かった。
なお、菌体の洗い出しに使用した洗浄液量が20mL若しくは40mLであるボルテックスミキサーを用いた場合より、洗浄液量が100mLであるストマッカーを用いた場合の方が、菌体の回収量が多く、洗浄に用いた機器は異なるものの洗浄液量の多い方がより効率的に菌を回収することができた。
【００３３】
試験例２
（菌ゲノムの抽出）
OD600を1.0となるよう調製した前記供試菌液（菌数：約108CFU/mL）を、菌数が約102〜106CFU/mLとなるよう生理食塩水で段階的に希釈し、各菌液1mLをそれぞれ生理食塩水で20mLにメスアップした。
20mLにメスアップした前記菌液（菌数約102〜106CFU/20mL）を、吸引濾過フラスコ、マイクロファンネル フィルターファンネル（#4800, 0.45μm径 GN-6）（PALL社製）を用いて、吸引濾過により、菌体をフィルターメンブレンに担持させた。菌体を担持させた面が内側となるようピンセットでフィルターメンブレンを丸めて、15mL遠沈管又は5mL PowerWater Bead Tube（DNeasy PowerWater Kit（Qiagen社製）付属）に入れ、-20℃で保存した。
【００３４】
フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（PCI）抽出
メンブレンの入った遠沈管にジルコニアビーズ1,200mg（ジルコプレップ ミニ  2本分）（日本ジェネティクス社製）を入れ、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合液（25:24:1）（PCI）（ニッポンジーン社製）950μLを追加し、氷上で冷却した。次いで、DNA Isolation Buffer［Tris-HCl(pH 8.0)（ニッポンジーン社製）（終濃度10mM）、EDTA（PanReac AppliChem）（終濃度1mM）、NaCl（Ambion）（終濃度100mM）、Triton X-100（Sigma-Aldrich社製）（終濃度1%(v/v)）、SDS（ニッポンジーン社製）（終濃度1 %(w/v)）］950μLを添加した。
菌体破砕のため、キュートミキサー（バイオメディカルサイエンス社製）又はボルテックスアダプター（Holds 6 Tubes）（Qiagen社製）を装着したボルテックスミキサー（以下、「Vortex Ad」ともいう）を用いて、いずれも最大速度で10分間渦流撹拌した後、遠心した（9,000rpm×10 min, 4℃）。
水相700μLを、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合液（25:24:1）1mLを入れたPhase Lock Gelチューブ（MaXtract High Density(2mL)）（Qiagen社製）に混合した。キュートミキサーを用いて、最大速度で5分間渦流撹拌した後、遠心した（12,000rpm×5min, 20℃）。
水相600μLを、1.5mLマイクロチューブに回収し、共沈剤（エタ沈メイト（ニッポンジーン社製））4μL及び3M 酢酸ナトリウムバッファー(pH5.2)（和光純薬社製）60μLを混合し、ボルテックスミキサーを用いて渦流撹拌した。さらに、イソプロパノール インフィニティピュア（和光純薬社製）600 μLを混合し、転倒混和後、4℃で10分間インキュベーションした。遠心した（14,000rpm×10 min, 20℃）後、上清を除去し、70%エタノール（インフィニティピュア（和光純薬社製））600μLを添加し、洗浄した。再度遠心した（14,000rpm×10min, 20℃）後、上清を除去、減圧乾燥にてペレットを乾燥させた。最後に200μLのTE Buffer(pH8.0)（ニッポンジーン社製）を用いて溶解し、DNA溶液とした。
【００３５】
DNeasy PowerWater Kit
DNeasy PowerWater Kit（PW Kit）（Qiagen社製）を用いて、菌体破砕、ゲノム抽出を行った。基本的にキット添付のプロトコールに従ったが、一部変更した。変更点のみ以下に記す。
菌体溶解効率向上のため、PowerWater Bead TubeにSolution PW1を1mL添加後、65℃で10分間インキュベーションした。菌体破砕として、キュートミキサー又はVortex Adを用いて、いずれも最大速度で10分間渦流撹拌した。DNA溶液溶出の際、TE Buffer (pH 8.0) 200μLを用いて行った。
【００３６】
取得したゲノムDNA溶液について、リアルタイムPCRにより、その濃度を測定した。その結果を表２に示す。
【００３７】
リアルタイムPCR
リアルタイムPCRはMx3005Pシステム（Agilent社製）を使用し、Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix（Agilent社製）を用いて行った。検量線用プラスミドとして、pUC118-S.epi 27F/338R（pUC118のマルチクローニングサイト(HincII)に、表皮ブドウ球菌NBRC12993の16S rRNA遺伝子 27番目から338番目の塩基配列を挿入して作成）を、forward primerとして、27Fmod（5'-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3'、配列番号１）を、reverse primerとして、338R（5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'、配列番号２）を用いた。
PCR反応は25μLの反応溶液（1 x SYBR Green master mix, 0.4μM forward primer and reverse primer, 3.2μM reference dye, 5μL sample solution（テンプレート））にて行い、95℃で3分間反応した後、95℃で5秒、60℃で30秒を40回繰り返すことで行った。反応終了後のサンプルは95℃で1分、55℃で30秒間処理した後、0.2℃/秒で95℃まで温度を上げ、連続的に蛍光強度を測定することで解離曲線を作成し、単一のピークであることを確認した。検量線用プラスミドのコピー数は1bpあたりの平均分子量を660とし、アボガドロ数を6.022×1023として、ゲノム濃度[16S rRNA遺伝子コピー数/μL]を算出した。
上記により測定した値は、16SrRNA遺伝子のコピー数を示している。菌種により保有する16S rRNA遺伝子のコピー数は異なるが、リアルタイムPCRで測定した16S rRNA遺伝子コピー数とコロニーカウントにより測定した菌数に相関が認められているため、本解析においては、16S rRNA遺伝子コピー数の値をリアルタイムPCRにより測定した菌数として考察する。
【００３８】
【表２】
2019075997.tif 000003
【００３９】
菌数が102〜106CFUの範囲では、CFU数と16S rRNA遺伝子コピー数に約10倍ずつの正の相関がある。
本発明によれば、表２に示すように、一般的なヒト皮膚常在菌数である102〜106(/cm2)CFUの範囲で、リアルタイムPCRによる16S rRNA遺伝子コピー数の測定により、菌数を精度よく評価できた。
【００４０】
試験例３
（吸収性物品からの菌体の洗浄及び菌ゲノムの抽出）
試験例１と同様に前記供試菌液、播種用菌液（生理食塩水）を調製した。また、供試菌液を生理食塩水で10倍に希釈し、馬脱繊維血液（以下、「馬血」ともいう。日本バイオテスト研究所社製。無菌的に採血後、脱繊維処理済み）で更に10倍希釈した播種用菌液（馬血）（菌数約105CFU/100μL）も調製した。
試験例１と同様に、ナプキン表面材及びパンティライナー吸収紙にそれぞれ播種用菌液（生理食塩水、馬血）100μLを播種し、30分静置した。なお、ナプキン吸収体には、播種用菌液（生理食塩水、馬血）100μLに対して生理食塩水若しくは馬血900μLで1mLにメスアップしたものを播種した。播種した菌液は試験例１と同様に、生理食塩水若しくは馬血900μLで段階的に希釈（1×101〜1×105倍）した後、卵黄加マンニット食塩寒天培地に塗抹培養し、培養後の生育コロニーを計数して播種菌数を評価した。
【００４１】
試験例１と同様に、菌液を播種した吸収性物品試験片を、ストマッカーを用いて洗浄し、菌洗浄液を取得した。また、菌洗浄液について、同様に卵黄加マンニット食塩寒天培地に塗抹培養し、培養後の生育コロニーを計数、洗浄液全量中の菌数を評価した。その結果を表３に示す。
取得した菌洗浄液について、試験例２と同様に、吸引濾過により、フィルターメンブレン上に菌体を担持させた。そして、Vortex Adを用いてフィルターメンブレン上の菌体破砕し、PCI抽出によりゲノム抽出し、DNA溶液を取得した。取得したDNA溶液について、前述のようにリアルタイムPCRにより、ゲノム濃度を測定した。その結果を表４に示す。
【００４２】
【表３】
2019075997.tif 000004
【００４３】
【表４】
2019075997.tif 000005
【００４４】
表３及び４で示すように、本発明によれば、血液を含む吸収性物品からも精度よく菌体を回収でき、かつ、菌体のゲノム抽出やリアルタイムPCRによる菌数の評価も可能であった。
【００４５】
試験例４
（菌体破砕方法と、ゲノム抽出方法についての検討）
試験例１で調製した供試菌液（菌数：約108CFU/mL）1mLを生理食塩水で20mLにメスアップした。また、試験例１と同様にして、供試菌液を生理食塩水で希釈し、卵黄加マンニット食塩寒天培地に塗抹培養し、培養後の生育コロニーを計数して菌数を評価した。
試験例２と同様に、吸引濾過により、フィルターメンブレン上に菌体を担持させ、PCI抽出若しくはPW Kit抽出を行い、キュートミキサー若しくはVortex Adを用いてフィルターメンブレン上の菌体を破砕してゲノムを抽出し、DNA溶液を取得した。
取得したDNA溶液について、Qubitを用いてゲノム濃度を測定した。その結果を表５に示す。
【００４６】
Qubit
Qubit 2.0（Thermo Fisher Scientific社製）、Qubit ds DNA HS Assay Kits（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、キット添付のプロトコールに従ってゲノム濃度[ng/μL]を測定した。
【００４７】
【表５】
2019075997.tif 000006
【００４８】
2.38×108CFUの菌より、 PCI若しくはPW Kitによりゲノムを抽出したところ、表５に示すように、PCIの方が、ゲノム抽出効率が優れていた。また、菌体破砕法について、キュートミキサーとVortex AdのどちらもビーズおよびDNA抽出液を用いた渦流撹拌により、菌体破砕およびゲノム抽出しているが、渦流の方向がそれぞれ異なる。キュートミキサーは垂直方向軸を回転軸とした渦流、Vortex Adは水平方向軸を回転軸とした渦流であるが、キュートミキサーと、Vortex Adとでは、ゲノム抽出効率の違いはみられなかった。
以上のように、菌体破砕方法として、キュートミキサー若しくはVortex Ad、ゲノム抽出法として、好ましくは市販のキットの使用若しくはPCIにより（好ましくはPCIにより）、フィルターメンブレン上に担持した微生物より、ゲノムを抽出できた。
【００４９】
以上のように、本発明によれば、吸収性物品に移行した微生物を効率的に回収することができる。そして、回収した微生物から核酸若しくはタンパク質の抽出操作を行うことで、各種分子生物学的手法による解析に必要な量の核酸若しくはタンパク質を抽出することができ、吸収性物品に移行した微生物について、分子生物学的手法での解析が可能となる。
【配列表】
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