(57)【要約】      （修正有）【課題】ロスバスタチンカルシウム及びその中間体を、効率よく、安価に且つ高純度に製造することができる、新規な方法を提供する。【解決手段】極低温反応や特殊な不斉触媒を使用することなく、高純度のロスバスタチンカルシウム及びその中間体を、工業的規模において効率的に生産する方法であって、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素を使用することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）下記一般式（１ａ）：
【化１】
2019205429.tif 000085
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元する工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（２）：
【化２】
2019205429.tif 000086
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
ここで、前記酵素は、
（Ａ）Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
のいずれかを含む酵素である。
【請求項２】
前記酵素をコードする遺伝子が、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列を含むＤＮＡである、請求項１に記載の製造方法。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項３】
前記一般式（１ａ）におけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
（iiａ）下記式（３）：
【化３】
2019205429.tif 000087
で表される化合物と下記一般式（４ａ）：
【化４】
2019205429.tif 000088
（式中、Ｒ２は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、下記Ｒとは異なる基である。）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程；及び
（iiｂ）前記工程（iiａ）で得られた下記一般式（５）：
【化５】
2019205429.tif 000089
（式中、Ｒ２は前記一般式（４ａ）のＲ２と同義である。）
で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）で表されるアルコールを反応させる工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（１ａ）：
【化６】
2019205429.tif 000090
（式中、Ｒは前記Ｒ−ＯＨのＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
【請求項５】
（iiａ）下記式（３）：
【化７】
2019205429.tif 000091
で表される化合物と下記一般式（４ａ）：
【化８】
2019205429.tif 000092
（式中、Ｒ２は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、前記Ｒとは異なる基である。）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程；
（iiｂ）前記工程（iiａ）で得られた下記一般式（５）：
【化９】
2019205429.tif 000093
（式中、Ｒ２は前記一般式（４ａ）のＲ２と同義である。）
で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）で表されるアルコールを反応させる工程；及び
（i）前記工程（iiｂ）で得られた下記一般式（１ａ）で表される化合物：
【化１０】
2019205429.tif 000094
（式中、Ｒは前記Ｒ−ＯＨのＲと同義である。）
に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元する工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（２）：
【化１１】
2019205429.tif 000095
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
ここで、前記酵素は、
（Ａ）Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
のいずれかを含む酵素である。
【請求項６】
前記Ｒ−ＯＨにおけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記酵素をコードする遺伝子が、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列を含むＤＮＡである、請求項５に記載の製造方法。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項８】
前記工程（i）が、
（iａ）下記一般式（１ａ）で表される化合物：
【化１２】
2019205429.tif 000096
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（１ｂ）及び／又は（１ｃ）：
【化１３】
2019205429.tif 000097
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
【化１４】
2019205429.tif 000098
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物を得る工程
を有する請求項５に記載の製造方法。
【請求項９】
前記一般式（１ａ）におけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
下記一般式（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）で表される化合物。
【化１５】
2019205429.tif 000099
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はイソプロピル基を表す。）
【化１６】
2019205429.tif 000100
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はイソプロピル基を表す。）
【化１７】
2019205429.tif 000101
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はｎ−プロピル基を表す。）
【請求項１１】
下記式：
【化１８】
2019205429.tif 000102
で表される化合物の結晶であって、２θ＝８．４°、１６．１°、２１．１°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶。
【請求項１２】
（iiiａ）前記一般式（２）：
【化１９】
2019205429.tif 000103
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【化２０】
2019205429.tif 000104
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１３】
（iiiｂ）前記一般式（２）：
【化２１】
2019205429.tif 000105
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた下記式（８）：
【化２２】
2019205429.tif 000106
で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた下記一般式（９）：
【化２３】
2019205429.tif 000107
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜８のアルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により塩交換した後、カルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【化２４】
2019205429.tif 000108
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１４】
（iiiｃ）前記一般式（２）：
【化２５】
2019205429.tif 000109
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた下記式（１０）：
【化２６】
2019205429.tif 000110
で表される化合物をカルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【化２７】
2019205429.tif 000111
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む請求項１に記載の製造方法。
【請求項１５】
２θ＝６．６°、１７．０°（±０．２°）において特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸  ジメチルアミン塩の結晶。
【請求項１６】
下記式（１１）：
【化２８】
2019205429.tif 000112
で示される化合物を１ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム。
【請求項１７】
下記一般式（２）：
【化２９】
2019205429.tif 000113
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後、１５℃／時間以下の冷却速度で冷却することにより、前記一般式（２）で表される化合物の結晶を析出させることを特徴とする、前記一般式（２）で表される化合物の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロスバスタチンカルシウム及びその中間体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロスバスタチンは、酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼ（HMG-CoAレダクターゼ）の阻害剤であり、例えば高コレステロール血症及び混合型異常脂質血症の治療に有用である。ロスバスタチンは、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸の一般名である。ロスバスタチンは、治療においては、そのカルシウム塩として投与される。ロスバスタチンカルシウムは、ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）の商標名で、HMG-CoAレダク
ターゼ阻害剤として販売されている。ロスバスタチンカルシウムは以下の化学式を有する。
【０００３】
【化１】
2019205429.tif 000002
【０００４】
特許文献１には、ロスバスタチン、そのナトリウム塩とカルシウム塩、及びこれらの製造方法が開示されている。特許文献１によれば、ロスバスタチン及びその塩は、（３Ｒ）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］−５−オキソ−６−トリフェニルホスホラニリデンヘキサン酸メチルと４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メタンスルホニルアミノ）−５−ピリミジンカルボキシアルデヒドを縮合させて不斉中心を１つ有する側鎖を導入し、次いで３−ヒドロキシ基の脱保護、５−オキソ基の不斉還元、及び加水分解を行うことによって得られる。この方法では、不斉還元の際に極低温条件（好ましくは−８５℃〜−７０℃）が必要とされるため、必ずしも工業的に好ましい製法とはいえない。
【０００５】
同様の方法で、不斉中心を２つ有する側鎖を導入する方法も知られている（特許文献２、３など）。これらの方法においても、Wittig反応を実施する際に極低温条件（例えば約−７５℃）が必要とされるため、必ずしも工業的に好ましい製法とはいえない。
【０００６】
また、光学活性なチタン触媒を用いて不斉中心を導入する方法も知られている（特許文献４など）。これらの方法では、高価な光学活性触媒を使用すること、また不斉還元の際に極低温条件（約−８０℃〜−５０℃）が必要とされるため、必ずしも工業的に好ましい製法とはいえない。
【０００７】
非特許文献１及び２には、ジケトエステル誘導体を還元してジヒドロキシエステル誘導体を製造する方法が記載されている。しかしながら、非特許文献１及び２で具体的に示されているのは、有機合成反応による還元のみであり、また、ジケトエステル誘導体又はジヒドロキシエステル誘導体がｔｅｒｔ−ブチルエステルである化合物のみである。
【０００８】
特許文献５及び６には、ピタバスタチンの製造方法として、カルボニル還元酵素を用いた製造方法が記載されている。しかしながら、特許文献５及び６には、ロスバスタチンに関する記載はなく、また、ロスバスタチンはスルホニルアミノ基で置換されたピリミジン環を有するのに対し、ピタバスタチンはキノリン環を有し、それらの化学構造は大きく異なっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第２６４８８９７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４７２９６号
【特許文献３】国際公開第２００５／０４２５２２号
【特許文献４】国際公開第２００８／０６５４１０号
【特許文献５】国際公開第２００２／０６３０２８号
【特許文献６】国際公開第２００３／０７８６３４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＩＰ．ｃｏｍ  ｎｕｍｂｅｒ：ＩＰＣＯＭ０００１４４０２６Ｄ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １４，２００６
【非特許文献２】ＩＰ．ｃｏｍ  ｎｕｍｂｅｒ：ＩＰＣＯＭ０００１４５６２３Ｄ、Ｊａｎｕａｒｙ  １９，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のロスバスタチンの製造方法は、極低温反応や高価な不斉触媒を使用するため、より経済的な製造方法の開発が望まれている。本発明は、ロスバスタチンカルシウム及びその中間体を、効率良く、安価に且つ高純度に製造することができる、新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記の製造方法及び／又は中間体により、経済的な反応条件でロスバスタチンカルシウムを効率よく、且つ高純度に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］（ｉ）下記一般式（１ａ）：
【００１３】
【化２】
2019205429.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元する工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（２）：
【００１５】
【化３】
2019205429.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
ここで、前記酵素は、
（Ａ）Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
のいずれかを含む酵素である。
［２］前記酵素をコードする遺伝子が、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列を含むＤＮＡである、上記［１］に記載の製造方法。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
［３］前記一般式（１ａ）におけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、上記［１］に記載の製造方法。
［４］（ｉｉａ）下記式（３）：
【００１７】
【化４】
2019205429.tif 000005
【００１８】
で表される化合物と下記一般式（４ａ）：
【００１９】
【化５】
2019205429.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ２は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、下記Ｒとは異なる基である。）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程；及び
（ｉｉｂ）前記工程（ｉｉａ）で得られた下記一般式（５）：
【００２１】
【化６】
2019205429.tif 000007
【００２２】
（式中、Ｒ２は前記一般式（４ａ）のＲ２と同義である。）
で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）で表されるアルコールを反応させる工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（１ａ）：
【００２３】
【化７】
2019205429.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒは前記Ｒ−ＯＨのＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
［５］（ｉｉａ）下記式（３）：
【００２５】
【化８】
2019205429.tif 000009
【００２６】
で表される化合物と下記一般式（４ａ）：
【００２７】
【化９】
2019205429.tif 000010
【００２８】
（式中、Ｒ２は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、前記Ｒとは異なる基である。）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程；
（ｉｉｂ）前記工程（ｉｉａ）で得られた下記一般式（５）：
【００２９】
【化１０】
2019205429.tif 000011
【００３０】
（式中、Ｒ２は前記一般式（４ａ）のＲ２と同義である。）
で表される化合物と、Ｒ−ＯＨ（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）で表されるアルコールを反応させる工程；及び
（ｉ）前記工程（ｉｉｂ）で得られた下記一般式（１ａ）で表される化合物：
【００３１】
【化１１】
2019205429.tif 000012
【００３２】
（式中、Ｒは前記Ｒ−ＯＨのＲと同義である。）
に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元する工程；
を有することを特徴とする、下記一般式（２）：
【００３３】
【化１２】
2019205429.tif 000013
【００３４】
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物の製造方法。
ここで、前記酵素は、
（Ａ）Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド、
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物を、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
のいずれかを含む酵素である。
［６］前記Ｒ−ＯＨにおけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、上記［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］前記酵素をコードする遺伝子が、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列を含むＤＮＡである、上記［５］に記載の製造方法。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列、
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ前記一般式（１ａ）で表される化合物に作用して、前記一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
［８］前記工程（ｉ）が、
（ｉａ）下記一般式（１ａ）で表される化合物：
【００３５】
【化１３】
2019205429.tif 000014
【００３６】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、下記一般式（１ｂ）及び／又は（１ｃ）：
【００３７】
【化１４】
2019205429.tif 000015
【００３８】
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
【００３９】
【化１５】
2019205429.tif 000016
【００４０】
（式中、Ｒは前記一般式（１ａ）のＲと同義である。）
で表される化合物を得る工程
を有する上記［５］に記載の製造方法。
［９］前記一般式（１ａ）におけるＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である、上記［８］に記載の製造方法。
［１０］下記一般式（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）で表される化合物。
【００４１】
【化１６】
2019205429.tif 000017
【００４２】
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はイソプロピル基を表す。）
【００４３】
【化１７】
2019205429.tif 000018
【００４４】
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はイソプロピル基を表す。）
【００４５】
【化１８】
2019205429.tif 000019
【００４６】
（式中、Ｒはｎ−プロピル基又はｎ−プロピル基を表す。）
［１１］下記式：
【００４７】
【化１９】
2019205429.tif 000020
【００４８】
で表される化合物の結晶であって、２θ＝８．４°、１６．１°、２１．１°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶。
［１２］（ｉｉｉａ）前記一般式（２）：
【００４９】
【化２０】
2019205429.tif 000021
【００５０】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【００５１】
【化２１】
2019205429.tif 000022
【００５２】
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む上記［１］に記載の製造方法。
［１３］（ｉｉｉｂ）前記一般式（２）：
【００５３】
【化２２】
2019205429.tif 000023
【００５４】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた下記式（８）：
【００５５】
【化２３】
2019205429.tif 000024
【００５６】
で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた下記一般式（９）：
【００５７】
【化２４】
2019205429.tif 000025
【００５８】
（式中、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜８のアルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により塩交換した後、カルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【００５９】
【化２５】
2019205429.tif 000026
【００６０】
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む上記［１］に記載の製造方法。
［１４］（ｉｉｉｃ）前記一般式（２）：
【００６１】
【化２６】
2019205429.tif 000027
【００６２】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を塩基により加水分解した後、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた下記式（１０）：
【００６３】
【化２７】
2019205429.tif 000028
【００６４】
で表される化合物をカルシウム化合物と反応させて、下記式（６）：
【００６５】
【化２８】
2019205429.tif 000029
【００６６】
で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程を更に含む上記［１］に記載の製造方法。
［１５］２θ＝６．６°、１７．０°（±０．２°）において特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することを特徴とする、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸  ジメチルアミン塩の結晶。
［１６］下記式（１１）：
【００６７】
【化２９】
2019205429.tif 000030
【００６８】
で示される化合物を１ｐｐｍ以上１５００ｐｐｍ以下含有することを特徴とする、ロスバスタチンカルシウム。
［１７］下記一般式（２）：
【００６９】
【化３０】
2019205429.tif 000031
【００７０】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）
で表される化合物を有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後、１５℃／時間以下の冷却速度で冷却することにより、前記一般式（２）で表される化合物の結晶を析出させることを特徴とする、前記一般式（２）で表される化合物の精製方法。
【発明の効果】
【００７１】
本発明の製造方法によれば、極低温反応や高価な不斉触媒を使用することなく、経済的な条件で高純度のロスバスタチンカルシウム及びその中間体を、工業的規模において効率的に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例２で得られた化合物（ＤＯＸＰ（（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル））の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【図２】実施例２’で得られた化合物（ＤＯＸＰ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【図３】実施例５で得られた化合物（ＤＯＬＰ（（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ））−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル））の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【図４】実施例１１で得られた化合物（ＤＯＬＰ）の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【図５】実施例７で得られたプロピルアミン塩の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【図６】実施例９で得られたジメチルアミン塩の粉末Ｘ線回折パターンを示す図である。縦軸は強度を、横軸は２θ（°）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下、本明細書において用いられる用語について詳しく説明する。
本明細書において、「炭素数１〜８の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ-オクチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数１〜４の１級アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜６の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、１−エチルプロピル基、１−エチルブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜４の２級アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基を意味する。
本明細書において、「炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基」とは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ-オクチル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基を意味する。
本明細書において、「炭素数３〜８の分岐状アルキル基」とは、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルブチル基、１−メチルヘプチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基を意味する。
本明細書において、「カルシウム化合物」とは、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等の、カルボン酸をカルボン酸のカルシウム塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、カルシウム化合物は塩化カルシウムである。
本明細書において、「アミン化合物」とは、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等の、カルボン酸をカルボン酸のアミン塩に変換することのできる化合物を意味する。好ましくは、アミン化合物はｎ−プロピルアミン又はジメチルアミンである。
なお、本発明に係る化合物には、化合物の塩、無水物、水和物、溶媒和物等も包含される。
【００７４】
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素」とは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を有する酵素を意味する。
「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有するか否かは、カルボニル基含有化合物中のカルボニル基を不斉還元して光学活性なアルコール類に変換する活性を、通常のアッセイ法で測定することにより判定可能である。例えば、一般式（１）で表される化合物に、測定の対象とする酵素を作用させ、一般式（１）で表される化合物から変換された一般式（２）で表される化合物の量を直接的に測定することで、その酵素活性を確認することができる。
また、本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、通常の固定化技術を用いて固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
本明細書において、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」（以下、「本発明の微生物若しくは細胞」と称することがある。）とは、「カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性」を有していれば特に制限はなく、内在的に前記活性を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記活性を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。育種により前記活性を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理など、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とする遺伝子を導入する、有機化合物の生合成経路における酵素遺伝子の発現を強化する、副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現を低減するなどの方法を用いることができる。
なお、「微生物若しくは細胞」の種類としては、後述の宿主生物若しくは宿主細胞に記載のものが挙げられる。「微生物若しくは細胞」は、凍結された状態でも用いることができる。また、本明細書において、「前記活性を有する酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞」としては、生きている微生物若しくは細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素活性を有するものも含まれる。
また、本発明の微生物若しくは細胞は、国際公開第２００３／０７８６３４号に記載の方法で作製することができる。
本明細書において、「宿主生物」とする生物の種類は特に限定されず、大腸菌、枯草菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは、大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
本明細書において、「宿主細胞」とする細胞の種類は特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、発現ベクターはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクターが導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する所望の形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞の処理物」とは、微生物若しくは細胞を培養し、該微生物若しくは細胞を、１）有機溶媒等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体などに固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したものであり、かつ、所望の機能を有するタンパク質を含有するもの等を意味する。
本明細書において、「微生物若しくは細胞を培養して得られた酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒等により処理をした培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的又は酵素的に破壊してある培養液を意味する。
【００７５】
［本発明の製造方法］
次に、本発明の製造方法について詳しく説明する。なお、以下において、ｗ／ｖは重量／容量を意味する。
本発明の製造方法には、以下に示すように、一般式（１）で表される化合物を一般式（２）で表される化合物に変換する工程（ｉ）、及び一般式（２）で表される化合物を式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムに変換する工程（iiiａ）、（iiiｂ）（（iiiｂ−１）〜（iiiｂ−３））又は（iiiｃ）（（iiiｃ−１）〜（iiiｃ−２））が含まれる。
【００７６】
【化４０】
2019205429.tif 000032
【００７７】
式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４の１級アルキル基又は炭素数３〜４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基又はｎ−ブチルが好ましい。中でも、効率よく工程（ｉ）を行うことができる観点から、Ｒとしては、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ−プロピル基が特に好ましい。
−Ｘ１及び−Ｘ２はそれぞれ独立して、−ＯＨ又は＝Ｏを表し、−Ｘ１及び／又は−Ｘ２は＝Ｏである。
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜８のアルキル基を表し、好ましくは、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基である。
【００７８】
本発明の製造方法には、以下に示すように、工程（ｉ）で使用する一般式（１）で表される化合物の製造方法として、式（３）で表される化合物及び一般式（４）で表される化合物から一般式（１）で表される化合物に変換する工程（ii）が含まれる。
さらに、工程（ii）の好ましい態様として、式（３）で表される化合物及び一般式（４ａ）で表される化合物から一般式（５）で表される化合物に変換する工程（iiａ）、及び一般式（５）で表される化合物を一般式（１）で表される化合物に変換する工程（iiｂ）が含まれる。
【００７９】
さらに、工程（ｉ）の別の態様として、一般式（１ａ）で表される化合物を一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に変換する工程（ｉａ）、及び一般式（１ｂ）で表される化合物及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物を一般式（２）で表される化合物に変換する工程（ｉｂ）も本発明の製造方法に含まれる。
【００８０】
【化４１】
2019205429.tif 000033
【００８１】
式中、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
Ｒ１は炭素数１〜８の直鎖状又は分岐状アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表し、より好ましくは炭素数１〜４の１級アルキル基又は炭素数３若しくは４の２級アルキル基を表す。Ｒ１としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基又はｎ−ブチルが好ましい。中でも、効率よく工程（ｉ）を行うことができる観点から、Ｒ１としては、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ−プロピル基が特に好ましい。
Ｒ２は炭素数３〜８の分岐状アルキル基を表し、上記Ｒとは異なる基である。Ｒ２は好ましくは、イソプロピル基、ｓ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｔｅｒｔ−アミル基であり、特に好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
【００８２】
以下に、本発明の製造方法の各工程について詳述する。
【００８３】
工程（ｉ）：
工程（ｉ）は、一般式（１）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞（本発明の微生物若しくは細胞）、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液（以下、これらをまとめて「本発明の酵素等」と称することがある。）を作用させて還元して、一般式（２）で表される化合物を得る工程である。
【００８４】
【化４２】
2019205429.tif 000034
【００８５】
式中、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
【００８６】
工程（ｉ）で用いる酵素としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するもの（以下「ＯＣＲ１」と称する場合がある）又は該アミノ酸配列のホモログを用いることができる。具体的には、下記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すポリペプチドのいずれかを含む酵素、又はこれらのホモログが挙げられる。
（Ａ）特許第４２７０９１８号に記載のＯｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＮＢＲＣ１４７３由来のカルボニル還元酵素（ＯＣＲ１）（配列番号２）を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、一般式（１）で表される化合物を、一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ一般式（１）で表される化合物を、一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチド
【００８７】
上記（Ｂ）のホモログは、配列番号２に示されるアミノ酸配列全長と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
また、上記（Ｃ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するものである。ここで、「１又は数個のアミノ酸」とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸である。
上記酵素をコードする遺伝子は、下記（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示す塩基配列、又はこれらのホモログを含むＤＮＡである。
（Ｄ）配列番号１に記載の塩基配列
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列の相補配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、一般式（１）で表される化合物に作用して、一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（Ｆ）配列番号１に記載の塩基配列において１又は数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列を含み、かつ一般式（１）で表される化合物に作用して、一般式（２）で表される化合物に変換する活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
ここで、上記（Ｅ）の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法及びプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
各ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９．等に記載されている方法に準じて行うことができる。
また、上記（Ｆ）のホモログは、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を害さない範囲において、配列番号１に記載の塩基配列に１又は数個の塩基が欠失、付加又は置換された塩基配列を有するものである。「１又は数個の塩基」とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下の塩基である。
工程（ｉ）において、本発明の酵素等は、取り扱い性に優れ、また、反応系への添加が容易であることから、凍結した状態で用いることもできる。凍結した本発明の酵素等を用いるときは、その形状は、特に制限はないが、例えば、角柱状、円柱状、塊状、球状等にすることができる。
【００８８】
工程（ｉ）において、反応基質となる一般式（１）で表される化合物は、通常、基質濃度が０．０１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの範囲で用いられる。反応基質は反応開始時に一括して添加してもよい。また、酵素の基質阻害があった場合にはその影響を減らし、また生成物の蓄積濃度を向上させるという観点からすると、連続的もしくは間欠的に添加することもできる。
工程（ｉ）においては、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋もしくはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で行なうことが好ましく、この場合、上記補酵素を、通常、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度になるように添加するのが好ましい。
上記補酵素を添加する場合には、反応系内で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成するＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈへ再生させることが生産効率向上のため好ましい。再生方法としては、
１）本発明の微生物若しくは細胞自体のＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力、即ち、ＮＡＤ（Ｐ）＋還元能を利用する方法、
２）ＮＡＤ（Ｐ）＋からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその処理物、あるいは、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（以下、「再生酵素」という）を一種類以上反応系内に添加する方法、
３）本発明の微生物若しくは細胞を作製するに当たり、上記再生酵素の遺伝子を一種類以上、合わせて宿主生物若しくは宿主細胞に導入する方法等が挙げられる。
上記１）の方法においては、反応系にグルコース、エタノール、２−プロパノール又はギ酸などを添加することが好ましい。
また、上記２）の方法においては、上記再生酵素を生産する能力を有する微生物、該微生物をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、物理的又は酵素的に破砕したもの等の微生物の処理物、該酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出したもの、さらには、これらをポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよく、また市販の酵素を用いてもよい。
この場合、上記再生酵素の使用量としては、本発明のカルボニル基を立体選択的に還元しうる能力を有する酵素のカルボニル還元活性と比較して、酵素活性で通常０．０１倍〜１００倍、好ましくは０．５倍〜２０倍程度となるよう添加する。
また、上記再生酵素の基質となる化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどの添加も必要となるが、その添加量としては、反応原料である一般式（１）で表される化合物に対して、通常０．１当量〜２０当量、好ましくは１当量〜１０当量添加する。
また、上記３）の方法においては、工程（ｉ）に用いられる酵素をコードするＤＮＡと共に上記再生酵素のＤＮＡを染色体に組み込む方法、単一の発現ベクター中に両ＤＮＡを導入し、宿主生物若しくは細胞を形質転換する方法、又は両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に、宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法を用いることができる。両ＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに導入した後に宿主生物若しくは宿主細胞を形質転換する方法の場合は、両発現ベクター同士の不和合性を考慮して発現ベクターを選択する必要がある。
単一の発現ベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター及びターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００８９】
工程（ｉ）は、一般式（１）で表される化合物及び上記酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液、並びに、必要に応じて各種補酵素（その再生システム、即ち、補酵素を再生できるようになっていることがより好ましい。）を含有する、水性媒体中もしくは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行われる。なお、一般式（１）で表される化合物は、後述する方法により製造することができる。
水性媒体としては、水又はリン酸カリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液が挙げられる。
有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール等、一般式（１）で表される化合物の溶解度が高いものを使用することができる。これらの中でも、有機溶媒としては、一般式（１）で表される化合物の溶解度が高いことから、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノールが好ましい。さらに転化率が高いことからジメチルスルホキシドがより好ましい。
また、工程（ｉ）は、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトール、イノシトール、ソルビトール、キシリトール等の多価アルコール類の存在下で行なうことができる。上述の多価アルコール類は、重合体や誘導体であってもよく、また、一種で用いることも二種以上を混合して用いることもできる。工程（ｉ）を多価アルコール類の存在下で行なうと、転化率が向上する傾向にある。中でも、グリセリンは、酵素の高次構造を保持することで酵素活性を維持することができると考えられ、さらに、入手が容易であるため好ましい。グリセリンの使用量としては、４０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１７０ｇ／Ｌ以上がより好ましく、また、６００ｇ／Ｌ以下が好ましく、４００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
なお、後述の工程（ｉａ）及び／又は工程（ｉｂ）も、上述の多価アルコール類の存在下で行なうことができる。
工程（ｉ）は、通常４℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜６０℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ４〜８で行われる。反応時間は、通常０．５時間〜４８時間、好ましくは０．５時間〜２４時間である。また、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
工程（ｉ）で得られる一般式（２）で表される化合物は、遠心分離やフィルトレーションなどにより菌体やポリペプチド等を分離した後に、適当なｐＨに調整し、ヘキサン、酢酸エチル、トルエンなどの有機溶媒による抽出、カラムクロマトグラフィーによる精製、結晶化などを適宜組み合わせることにより精製することができる。
【００９０】
一般式（２）で表される化合物を結晶化により精製する場合、用いることのできる有機溶媒としては、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエンなどの炭化水素溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）などのエーテル溶媒、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール等のアルコール溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等、一般式（２）で表される化合物の溶解度が高い溶媒を使用することができる。これらの有機溶媒は単独で用いることができるが、これらの有機溶媒と水との混合溶媒も用いることができる。
一般式（２）で表される化合物を結晶化により精製する場合、前記一般式（２）で表される化合物を有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後、１５℃／時間以下の冷却速度で冷却することにより、前記一般式（２）で表される化合物の結晶を析出させることが好ましい（この冷却して結晶を析出させる工程のことを、以下、「冷却工程」という）。
冷却工程において、冷却を開始する温度は、好ましくは１５℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜５５℃である。
冷却工程における冷却速度は、１５℃／時間以下が好ましく、９℃／時間以下がより好ましく、６℃／時間以下がさらに好ましく、５℃／時間以下が特に好ましい。これは、得られる一般式（２）で表される化合物の純度を上げるためである。
なお、冷却工程においては、冷却速度を途中で変更することもできる。特に、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下の温度範囲においては、ゆっくり冷却することが好ましい。具体的には、冷却速度を９℃／時間とすることがより好ましく、６℃／時間以下とすることがさらに好ましく、５℃／時間以下とすることが特に好ましい。
【００９１】
また、前記一般式（２）で表される化合物を上述の溶媒に溶解させた後であって、前記冷却工程の前に、熟成する工程（以下、「熟成工程」という）を設けることが好ましい。該熟成工程は、高温熟成工程と、該高温熟成工程よりも低い温度で熟成を行なう低温熟成工程を有することが好ましい。熟成工程において、高温熟成工程と低温熟成工程の順序には、特に制限はないが、低温熟成工程の後に高温熟成工程を設けることが好ましい。また、低温熟成工程と高温熟成工程は、必要に応じて、複数回、繰り返して行なうこともできる。
【００９２】
熟成工程における低温熟成工程とは、前記一般式（２）で表される化合物を前記の有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後に、前記の有機溶媒等に溶解させたときの温度よりも低く、かつ、後述の高温熟成工程の熟成温度よりも低い温度で熟成を行なう工程である。
低温熟成工程における熟成温度は、前記の有機溶媒等に溶解させたときの温度よりも１℃以上低いことが好ましく、５℃以上低いことがより好ましく、１０℃以上低いことが特に好ましい。具体的な熟成温度としては、好ましくは０℃〜５９℃、より好ましくは５℃〜５０℃である。
また、低温熟成工程では、途中で温度を変化させてもよい。温度を変化させる場合、例えば、最初に比較的高温（例えば、３５℃〜４５℃）で５分間〜１２時間熟成させ、その後で、比較的低温（例えば、３０℃〜４０℃）で１０分間〜５時間熟成させることができる。
また、この低温熟成工程は、好ましくは１０分間〜２４時間、より好ましくは２０分間〜１０時間、行なう。
低温熟成工程においては、温度を保持するだけではなく、必要に応じて、撹拌したり、種晶を添加したりしてもよい。
【００９３】
熟成工程における高温熟成工程とは、上述の低温熟成工程の熟成温度よりも高い温度で熟成を行なう工程である。
高温熟成工程における熟成温度は、前記低温熟成工程の熟成温度よりも１℃以上高いことが好ましく、３℃以上高いことがより好ましく、５℃以上高いことが特に好ましい。具体的な熟成温度としては、好ましくは２０℃〜６０℃、より好ましくは２５℃〜５５℃である。通常、高温熟成工程の熟成温度（高温熟成工程を複数回行なう場合は、最後の高温熟成工程の温度）の熟成温度から前記冷却工程を開始することになる。また、高温熟成工程においても、途中で温度を変化させてもよい。
また、この高温熟成工程は、好ましくは１０分間〜２４時間、より好ましくは２０分間〜１０時間、行なう。
高温熟成工程においては、温度を保持するだけではなく、必要に応じて、撹拌してもよい。
このような熟成工程を設けることにより、ろ過性が改善し目的物の純度が向上するという効果が得られる。
一般式（２）で表される化合物を結晶化により精製する場合、一般式（２）で表される化合物を有機溶媒、又は有機溶媒と水との混合溶媒に溶解させた後に、前記熟成工程（前記高温熟成工程、及び前記低温熟成工程）、前記冷却工程を行なうことにより、精製することが好ましい。
このような方法で結晶化することで、得られる結晶の純度をさらに向上させることができる。
【００９４】
また、工程（ｉ）は、以下のように、工程（ｉａ）及び工程（ｉｂ）の２段階に分けて行うこともできる。
【００９５】
工程（ｉａ）：
工程（ｉａ）は、一般式（１）において、−Ｘ１及び−Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ａ）で表される化合物に、カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（１）において、−Ｘ１が−ＯＨで−Ｘ２が＝Ｏである一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は−Ｘ１が＝Ｏで−Ｘ２が−ＯＨである一般式（１ｃ）で表される化合物を得る工程である。
一般式（１ａ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
【００９６】
【化４３】
2019205429.tif 000035
【００９７】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
【００９８】
工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）及び／又は（１ｃ）で表される化合物は、次の工程（ｉｂ）に供する前に、例えば結晶化により精製されてもよい。
【００９９】
工程（ｉｂ）：
工程（ｉｂ）は、工程（ｉａ）で得られた一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物に、上記カルボニル基を立体選択的に還元しうる活性を有する酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて還元し、一般式（２）で表される化合物を得る工程である。
一般式（１ｂ）で表される化合物、及び／又は一般式（１ｃ）で表される化合物の還元は、工程（ｉ）と同様の方法を採用することができる。
【０１００】
【化４４】
2019205429.tif 000036
【０１０１】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
【０１０２】
また、工程（ｉ）、又は、工程（ｉａ）及び（ｉｂ）で得られる、一般式（２）で表される化合物、中でも一般式（２）においてＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
一般式（２）においてＲがｎ−プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する（以下に示す粉末Ｘ線回折パターンは、後述の実施例５で得られたものである）。
【０１０３】
【表１】
2019205429.tif 000037
【０１０４】
すなわち、一般式（２）においてＲがｎ−プロピル基である化合物の結晶は、２θ＝８．４°、１６．１°、２１．１°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝７．７°、８．４°、１６．１°、１９．５°、２１．１°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましく、２θ＝７．７°、８．４°、１５．０°、１６．１°、１９．５°、２１．１°、２２．５°、（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することがより好ましい。また、２θ＝１６．３°、１９．７°、２１．３°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することも好ましく、さらには、２θ＝７．９°、１６．３°、１９．７°、２１．３°、２２．７°、２４．９°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することもより好ましい。
【０１０５】
工程（ii）：
工程（ii）は、工程（ｉ）で使用する一般式（１）で表される化合物を製造する工程である。具体的には、式（３）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させる工程である。
【０１０６】
【化４５】
2019205429.tif 000038
【０１０７】
式中、Ｒ１、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ-ブトキシド等のアルコキシド等を用いることができ、特に、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシドが好ましい。塩基の使用量は、式（３）で表される化合物に対して、通常１当量〜６当量、好ましくは、１．５当量〜６当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り、特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。
溶媒の使用量は、式（３）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜２００℃、好ましくは、−５℃〜４０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜２００時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【０１０８】
式（３）で表される化合物は、例えば、特許第２６４８８９７号公報に記載の方法により製造することができ、また、市販のものを用いることもできる。
一般式（４）で表される化合物は、公知の方法に準じて、例えば、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，１８（７），７３５‐７３９（１９８８）に記載の方法や、本明細書の参考例１に記載の方法により製造することができ、市販のものを用いることもできる。
一般式（４）で表される化合物のｐＨは、好ましくはｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ３以下である。なお、一般式（４）で表される化合物のｐＨは、一般式（４）で表される化合物と水とを１：１（体積比）で混合した後、水層のｐＨを測定した値である。このｐＨの値が高過ぎるとき（例えば、ｐＨが４より大きいとき）は、必要に応じて、酢酸、塩酸、硫酸等の酸でｐＨを下げることができる。これにより、一般式（４）で表される化合物の保存安定性が向上し、反応時の不純物の生成を低減させることができる。
【０１０９】
なお、一般式（４ａ）におけるＲ１が、一般式（１）におけるＲとは異なる基である場合は、上記縮合で得られた化合物と、Ｒ−ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１）で表される化合物を得る。本工程は、後述の工程（iiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１１０】
工程（ii）においては、特に以下の（iiａ）及び（iiｂ）の工程を有することが好ましい。
【０１１１】
工程（iiａ）：
工程（iiａ）は、式（３）で表される化合物と一般式（４）においてＲ１がＲ２である一般式（４ａ）で表される化合物を、塩基の存在下、縮合させて、一般式（５）で表される化合物を得る工程である。
【０１１２】
【化４６】
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【０１１３】
式中、Ｒ２は前記定義と同義である。
塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物、ナトリウムアミド等の金属アミド、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等の有機リチウム、ｔｅｒｔ−ブチルマグネシウムクロライド等のグリニャール試薬、ナトリウムエトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ-ブトキシド等のアルコキシド等を用いることができ、特に、ナトリウムアミド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、水素化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、式（３）で表される化合物に対して、通常１当量〜６当量、好ましくは、１．５当量〜６当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン溶媒、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。
溶媒の使用量は、式（３）で表される化合物１ｇに対して、通常５ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常０．１時間〜２００時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【０１１４】
一般式（５）で表される化合物は、結晶性が高いため、クロマトグラフィー等の煩雑な精製を行うことなく高純度で得ることができる。
【０１１５】
工程（iiｂ）：
一般式（５）で表される化合物と、Ｒ−ＯＨで表されるアルコールを反応させて一般式（１ａ）で表される化合物を得る。
ここで、Ｒは、炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表し、好ましくは炭素数１〜４の１級アルキル基又は炭素数３〜４の２級アルキル基を表す。Ｒとしては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基又はｎ−ブチル基が好ましく、ｎ−プロピル基又はイソプロピル基がより好ましく、ｎ−プロピル基が特に好ましい。
Ｒ−ＯＨで表されるアルコールの使用量は、式（５）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、１ｍＬ〜１０ｍＬである。
【０１１６】
【化４７】
2019205429.tif 000040
【０１１７】
式中、Ｒ２、Ｒ、−Ｘ１及び−Ｘ２は前記定義と同義である。
【０１１８】
一般式（１）で表される化合物の中でも、特に、下記式（１ａ）で表される化合物が好ましい。
【０１１９】
【化４８】
2019205429.tif 000041
【０１２０】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
反応は、溶媒を用いて行うこともできる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル(ＭＴＢＥ)、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。また、Ｒ−ＯＨで表されるアルコール自体を溶媒として用いてもよい。
溶媒の使用量は、式（５）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、１ｍＬ〜１０ｍＬである。
反応温度は、通常３０℃〜１５０℃、好ましくは、４０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
【０１２１】
上記のようにして得られる一般式（１）で表される化合物、特に一般式（１ａ）で表される化合物、中でも一般式（１ａ）においてＲがｎ−プロピル基又はイソプロピル基である化合物は、結晶性が高いため高純度で得ることができる。
一般式（１ａ）においてＲがｎ-プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい（以下に示す粉末Ｘ線回折パターンは、後述の実施例２で得られたものである）。
【０１２２】
【表２】
2019205429.tif 000042
【０１２３】
すなわち、２θ＝８．３°、１６．５°、２１．０°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝８．３°、１６．５°、２１．０°、２２．０°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましく、２θ＝８．３°、１３．０°、１３．９°、１６．５°、１７．７°、２１．０°、２２．０°、２４．９°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することがより好ましい。また、２θ＝１６．７°、１７．６°、２０．８°、２２．１°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することも好ましい。
また、一般式（１ａ）においてＲがｎ-プロピル基である化合物の結晶は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有することも好ましい（以下に示す粉末Ｘ線回折パターンは、後述の実施例２’で得られたものである）。
【０１２４】
【表３】
2019205429.tif 000043
【０１２５】
すなわち、２θ＝１０．３°、１１．８°、２１．５°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１０．３°、１１．８°、１４．１°、１８．４°、２１．５°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましく、２θ＝１０．３°、１１．８°、１４．１°、１６．５°、１８．４°、１９．０°、１９．５°、２０．６°、２１．５°、２３．７°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することがより好ましい。また、２θ＝１６．７°、１９．２°、２０．８°、２１．３°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することも好ましい。
【０１２６】
工程（iiiａ）：
工程（iiiａ）は、一般式（２）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させ、得られた生成物を単離することにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
【０１２７】
【化４９】
2019205429.tif 000044
【０１２８】
式中、Ｒは前記定義と同義である。
工程（iiiａ）においては、まず、一般式（２）で表される化合物を、塩基により加水分解する。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（２）で表される化合物に対して、通常０．９当量〜２当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の炭化水素溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒を用いることができる。さらにはこれら極性溶媒と、エーテル溶媒、炭化水素溶媒、及びハロゲン溶媒からなる群から選ばれる少なくとも一種との混合溶媒が好ましく、中でも、極性溶媒とエーテル溶媒との混合溶媒が好ましい。このような混合溶媒を用いると、加水分解により得られる生成物（例えば、ナトリウム塩）は水層に移行し、不純物は有機溶媒層に移行するので、生成物と不純物の分離が容易にできるため、好ましい。
溶媒として、極性溶媒と、エーテル溶媒、炭化水素溶媒、及びハロゲン溶媒からなる群から選ばれる少なくとも一種との混合溶媒を用いる場合、上述した中でも、極性溶媒としては、水、もしくは、水とその他の極性溶媒（例えば、ＴＨＦ、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド等）との混合溶媒が好ましく、エーテル溶媒としては、ＭＴＢＥ、ＣＰＭＥが好ましく、炭化水素溶媒としては、シクロヘキサン、トルエンが好ましく、ハロゲン溶媒としては、塩化メチレンが好ましい。これらの中でも、溶媒の毒性が低いことから、水とＭＴＢＥとの混合溶媒、又は、水とＣＰＭＥとの混合溶媒を用いることが特に好ましい。
溶媒の使用量は、一般式（２）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、２ｍＬ〜５０ｍＬ、より好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
反応時のｐＨは、ｐＨ８以上が好ましく、ｐＨ９以上がより好ましい。このような範囲とすることで、反応効率を向上させることができる。また、上限としては、ｐＨ１３以下が好ましい。
【０１２９】
一般式（２）で表される化合物の加水分解を行なった後は、そのまま、後述するカルシウム化合物との反応に供することもできるが、必要に応じて洗浄、抽出、濃縮、乾燥等を行なったり、例えば、ナトリウム塩として単離したりすることもできる。次いで、上述の加水分解により得られる生成物を、カルシウム化合物と反応させ、一般式（６）で表されるロスバスタチンカルシウムを得ることができる。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、水への溶解度が高いため、酢酸カルシウムが好ましい。
カルシウム化合物の使用量は、一般式（２）で表される化合物に対して、通常０．４当量〜３当量、好ましくは、０．５当量〜２当量、より好ましくは、０．５当量〜１．５当量である。
カルシウム化合物との反応において、溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒を用いることができる。これらの中でも、水、又は、水と、水以外の極性溶媒との混合溶媒が好ましく、水がより好ましい。ここで、水以外の極性溶媒としては、ＴＨＦ、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
溶媒の使用量は、一般式（２）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、２ｍＬ〜５０ｍＬ、より好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃、より好ましくは、５℃〜２５℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜４８時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
反応時のｐＨは、通常ｐＨ５〜ｐＨ１３、好ましくは、ｐＨ６〜ｐＨ１２である。また、反応を開始するときのｐＨをｐＨ５〜ｐＨ１０とすることが好ましく、ｐＨ６〜ｐＨ９とすることがより好ましい。このような範囲に調整することで、反応後に得られる化合物の洗浄が容易となり、また、得られる化合物に含まれる不純物の量を減らすことができる。
工程（iiiａ）により得られたロスバスタチンカルシウムは、必要に応じて、熟成、冷却、乾燥、粉砕、解砕などを行なうことができる。
【０１３０】
工程（iiiｂ）：
工程（iiiｂ）は、一般式（２）で表される化合物を、塩基により加水分解した後、酸で処理し、得られた式（８）で表される化合物をアミン化合物と反応させ、得られた一般式（９）で表される化合物を塩基により加水分解した後、カルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
具体的には、一般式（２）で表される化合物を、塩基により加水分解して、一般式（７）で表される化合物とする。
【０１３１】
【化５０】
2019205429.tif 000045
【０１３２】
式中、Ｒは前記定義と同義である。Ｘはナトリウム又はカリウム等を表す。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、式（２）で表される化合物に対して、通常０．９当量〜２当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、式（２）で表される化合物に対して、通常０．４当量〜１．５当量、好ましくは、０．５当量〜１．２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒の混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（２）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜３０ｍＬである。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜４０℃である。
反応時間は、通常１時間〜４８時間、好ましくは、２時間〜２４時間である。
【０１３３】
次いで、一般式（７）で表される化合物を酸で処理して式（８）で表される化合物とする。
【０１３４】
【化５１】
2019205429.tif 000046
【０１３５】
式中、Ｘは前記定義と同義である。
酸としては、塩酸、硫酸等を用いることができ、特に、塩酸が好ましい。酸の使用量は、酸性化できる量であれば特に限定されないが、加水分解時に使用した塩基に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜１．５当量である。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、通常０．５時間〜５時間である。
【０１３６】
さらに、式（８）で表される化合物にアミン化合物を添加して、式（９）で表されるアミン塩とする。結晶性が高いアミン塩とすることにより、目的物であるロスバスタチンカルシウムの純度を向上させることが可能である。
【０１３７】
【化５２】
2019205429.tif 000047
【０１３８】
式中、Ｒ３及びＲ４は前記定義と同義である。
アミン化合物としては、ｎ−プロピルアミン、イソプロピルアミン、ジメチルアミン等を用いることができ、特に、ｎ−プロピルアミン、ジメチルアミンが好ましい。アミン化合物の使用量は、式（８）で表される化合物に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル等のエステル溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、０．５時間〜５時間である。
【０１３９】
特に、一般式（９）で表される化合物がｎ−プロピルアミン塩やジメチルアミン塩である場合は、結晶性が高いため、高純度で得ることができるので好ましい。
【０１４０】
（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸のｎ−プロピルアミン塩は、例えば、以下に示すＸ線回折パターンを有する（以下に示す粉末Ｘ線回折パターンは、後述の実施例７で得られたものである）。
【０１４１】
【表４】
2019205429.tif 000048
【０１４２】
すなわち、２θ＝１９．８°、２２．９°（±０．２°）に特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝１０．８°、１５．３°、１９．８°、２０．９°、２２．９°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましく、２θ＝１０．０°、１０．８°、１５．３°、１６．８°、１８．５°、１９．８°、２０．９°、２２．９°、２６．８°、３０．３°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することがより好ましい。また、２θ＝２６．８°、２９．１°、３０．３°、３８．９°、４５．７°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有していてもよく、さらには、２θ＝１９．８°、２２．９°、２６．８°、２９．１°、３０．３°、３４．２°、３６．５°、３８．９°、４５．７°、４６．８°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有していてもよい。
【０１４３】
また、（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ヒドロキシ−６−ヘプテン酸のジメチルアミン塩は、例えば、以下に示す粉末Ｘ線回折パターンを有する（以下に示す粉末Ｘ線回折パターンは、後述の実施例９で得られたものである）。
【０１４４】
【表５】
2019205429.tif 000049
【０１４５】
すなわち、２θ＝６．６°、１７．０°（±０．２°）において特徴的なピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有する。さらには、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することが好ましい。特に、２θ＝６．６°、１０．１°、１３．５°、１７．０°、１８．３°、１８．９°、１９．４°、１９．６°、２０．５°、２１．２°（±０．２°）にピークを示す粉末Ｘ線回折パターンを有することがより好ましい。
【０１４６】
次いで、一般式（９）で表されるアミン塩を塩基により塩交換して、一般式（７）で表される化合物とする。
【０１４７】
【化５３】
2019205429.tif 000050
【０１４８】
式中、Ｒ３、Ｒ４及びＸは前記定義と同義である。
【０１４９】
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることができ、特に、水酸化ナトリウムが好ましい。塩基の使用量は、一般式（９）で表される化合物に対して、通常１当量〜３当量、好ましくは、１当量〜２当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。
反応温度は、通常−１０℃〜５０℃、好ましくは、０℃〜３０℃である。
反応時間は、通常０．５時間〜１０時間である。
【０１５０】
さらに、一般式（７）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る。
【０１５１】
【化５４】
2019205429.tif 000051
【０１５２】
式中、Ｘは前記定義と同義である。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、一般式（７）で表される化合物に対して、通常０．５当量〜３当量、好ましくは、０．６当量〜２．８当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒等を用いることができる。これらの一種または二種以上を混合して用いることもでき、極性溶媒と非極性溶媒の混合物も用いることができる。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜２００時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
【０１５３】
工程（iiiｃ）：
工程（iiiｃ）は、一般式（２）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物とし、次いで一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、得られた式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程である。
【０１５４】
【化５５】
2019205429.tif 000052
【０１５５】
式中、Ｒ及びＸは前記定義と同義である。
一般式（２）で表される化合物を塩基により加水分解して一般式（７）で表される化合物を得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１５６】
一般式（７）で表される化合物を、酸触媒の存在下又は非存在下で分子内脱水縮合させ、式（１０）で表される化合物を得る工程において、酸触媒としては、ｐ−トルエンスルホン酸、ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート、硫酸、塩酸等を用いることができ、特に、塩酸、ｐ−トルエンスルホン酸が好ましい。酸触媒の使用量は、式（７）で表される化合物に対して、通常０．００１当量〜０．５当量、好ましくは、０．０１当量〜０．１当量である。
前記分子内脱水縮合は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル溶媒、シクロヘキサン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、トルエン等の非極性溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン溶媒、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒の混合物が好ましい。溶媒の使用量は、式（７）で表される化合物１ｇに対して、通常１ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬ〜５０ｍＬである。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常１時間〜７２時間、好ましくは、１時間〜２４時間である。
【０１５７】
式（１０）で表される化合物をカルシウム化合物と反応させることにより、式（６）で示されるロスバスタチンカルシウムを得る工程は、工程（iiiｂ）と同様の方法を採用することができる。
【０１５８】
本発明のロスバスタチンカルシウムの製造方法は、必要に応じて、さらに、以下の（Ｂ）工程を設けることが好ましい。（Ｂ）工程は、
（Ｂ）下記一般式（１２）：
【０１５９】
【化５６】
2019205429.tif 000053
【０１６０】
（式中、Ｍは、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、又は水素である。）
で表される化合物を、下記式（１３）：
【０１６１】
【化５７】
2019205429.tif 000054
【０１６２】
で表される化合物に変換する工程である。（Ｂ）工程を設けると、特に、前記一般式（１２）で表される不純物を効率よく除去することができ、ロスバスタチンカルシウムの純度をさらに向上させることができる。上述の工程（iiiａ）を実施するときに、（Ｂ）工程を設けることが特に好ましい。
【０１６３】
後述の一般式（１６）及び前記一般式（１２）において、Ｍは、アルカリ金属元素であることが好ましい。ここで、アルカリ金属元素としてはリチウム、ナトリウム、カリウムが好ましく、ナトリウムであることが特に好ましい。
ここで、本発明の製造方法は、前記一般式（１２）で表される化合物を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ）で測定して０．０１面積％以上含有する後記一般式（１６）で表される化合物を対象とすることが好ましく、０．０５面積％以上含有する後記一般式（１６）で表される化合物を対象とすることがより好ましい。また、上限値としては、本発明の効果が得られる限り、特に制限はないが、通常９９面積％以下、好ましくは、５０面積％以下、より好ましくは、２５面積％以下、特に好ましくは、５面積％以下、もっとも好ましくは、１面積％以下である。本発明の特に好ましい実施態様では、後記一般式（１６）で表される化合物は、前記一般式（１２）で表される化合物を０．０１面積％以上５面積％以下含有する。
【０１６４】
本発明の製造方法は、前記（Ｂ）工程に先立ち、（Ａａ）下記一般式（１４）：
【０１６５】
【化５８】
2019205429.tif 000055
【０１６６】
（式中、Ｒは炭素数１〜８の１級アルキル基又は炭素数３〜６の２級アルキル基を表す。）で表される化合物と、下記一般式（１５）：
【０１６７】
【化５９】
2019205429.tif 000056
【０１６８】
（式中、Ｒは上記で定義した通りである。）
で表される化合物とを含む混合物を、塩基の存在下、加水分解して、下記一般式（１６）：
【０１６９】
【化６０】
2019205429.tif 000057
【０１７０】
（式中、Ｍは、アルカリ金属元素、アルカリ土類金属元素、又は水素である。）
で表される化合物と、前記一般式（１２）で表される化合物とを含む混合物に変換する工程を有することが好ましい。
【０１７１】
前記一般式（１４）及び（１５）において、Ｒは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｔ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｎ−ブチル基であることが好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基であることがより好ましく、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基であることが特に好ましい。
また、前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記式（１３）で表される化合物を除去する工程を有することが好ましい。
さらに、前記工程（Ｃ）の後、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することが好ましい。
【０１７２】
以下、本発明の製造方法が有する工程（Ａａ）及び（Ｂ）〜（Ｄ）について、工程ごとに説明する。
【０１７３】
工程（Ａａ）：
工程（Ａａ）は、前記一般式（１４）で表される化合物と前記一般式（１５）で表される化合物とを含む混合物を、塩基の存在下、加水分解して、前記一般式（１６）で表される化合物と前記一般式（１２）で表される化合物とを含む混合物に変換する工程である。このとき、前記一般式（１４）で表される化合物は前記式（１２）で表される化合物に変換され、前記一般式（１５）で表される化合物は前記一般式（１６）で表される化合物に変換される。
本工程（Ａａ）の詳細については、上述の工程（iiiａ）の説明を参照されたい。
【０１７４】
工程（Ｂ）：
工程（Ｂ）は、前記一般式（１２）で表される化合物を、前記式（１３）で表される化合物に変換する工程である。
前記一般式（１２）で表される化合物を、前記式（１３）で表される化合物に変換することができれば、反応条件等に特に制限はないが、工程（Ｂ）における反応条件の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ｂ）は、溶媒の存在下で行なうことが好ましい。ここで、溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、シクロペンチルメチルエーテルなど）、酢酸エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピルなど）、アミド類（例、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなど）、炭化水素類（例、トルエン、シクロヘキサンなど）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、水等が挙げられ、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、トルエン、水が好ましい。
反応温度としては、通常３０℃以上、好ましくは、４０℃以上であり、また、通常１３０℃以下、好ましくは、１００℃以下である。反応を効率的に進めるため、必要に応じて加熱することが好ましい。本発明の特に好ましい実施態様では、工程（Ｂ）は、３０℃以上１３０℃以下の条件下で行われる。
工程（Ｂ）は、そのｐＨの条件に特に制限はないが、反応を促進させるためには、酸性条件下、或いは塩基性条件下とすることが好ましい。
酸性条件下で行なう場合、ｐＨ０以上ｐＨ３以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、塩酸、又は硫酸が好ましい。
塩基性条件下で行なう場合、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウムなど）や、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
また、反応時間は、その他の条件にもよるが、通常１時間以上、好ましくは、２時間以上であり、また、通常４８時間以下、好ましくは、２４時間以下である。
上記の反応時間を短縮するためにも、必要に応じて、工程（Ｂ）においては、反応溶液を必要に応じて撹拌することが好ましい。
なお、本工程においては、前記一般式（１６）で表される化合物は、通常、特に変換はされない。
【０１７５】
工程（Ｃ）：
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた混合物から、前記式（１３）で表される化合物を除去する工程である。なお、ここで、除去するとは、必ずしも完全に除去されている必要はなく、その大部分が除去されることで、得られる化合物の純度が向上すればよい。また、本工程で、前記式（１３）で表される化合物が除去されると、前記一般式（１６）で表される化合物が残る。
前記式（１３）で表される化合物を除去することができれば、その手段や反応条件に特に制限はないが、工程（Ｃ）の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ｃ）は、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記式（１３）で表される化合物を除去することが好ましい。
ここで、用いることのできる有機溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）など）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類等が挙げられ、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチルが好ましい。
また、塩基性の条件下とは、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましく、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことがより好ましい。
ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
【０１７６】
工程（Ｄ）：
工程（Ｄ）は、前記工程（Ｃ）で得られた化合物、即ち、前記一般式（１６）で表される化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程である。
前記工程（Ｃ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させ、カルシウム塩を得ることができれば、反応条件等に特に制限はないが、工程（Ｄ）における反応条件等の好ましい例を以下に記載する。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、前記工程（Ｃ）で得られた化合物に対して、通常０．５当量〜３当量、好ましくは、０．６当量〜２．８当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（例、トルエン、シクロヘキサン、メシチレンなど）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜２００時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
【０１７７】
［本発明の精製方法］
本発明のロスバスタチンカルシウムの精製方法では、前記一般式（１２）で表される化合物を含むロスバスタチンカルシウムの精製を行なうことができる。本発明の精製方法は、上述の本発明の製法により製造されたロスバスタチンカルシウムに対して行なうこともできるし、その他の製法により製造されたロスバスタチンカルシウムに対して行なうこともできる。
ここで、ロスバスタチンカルシウムとしては、前記一般式（１２）で表される化合物を、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ）で測定して０．０１面積％以上含有するものを対象とすることが好ましく、０．０５面積％以上含有するものを対象とすることがより好ましい。また、上限値としては、本発明の効果が得られる限り、特に制限はないが、通常９９面積％以下、好ましくは、５０面積％以下、より好ましくは、２５面積％以下、特に好ましくは、５面積％以下、もっとも好ましくは、１面積％以下である。本発明の特に好ましい実施態様では、ロスバスタチンカルシウムは、前記一般式（１２）で表される化合物を０．０１面積％以上５面積％以下含有する。
【０１７８】
本発明の精製方法は、（Ｂ）前記一般式（１２）で表される化合物を前記式（１３）で表される化合物に変換する工程を有することを特徴とする。
前記工程（Ｂ）に先立ち、（Ａｂ）前記一般式（１２）で表される化合物を含むロスバスタチンカルシウムを溶媒に溶解する工程を有することが好ましい。
また、前記工程（Ｂ）の後、（Ｃ）前記式（１３）で表される化合物を除去する工程を有することが好ましい。
さらに、前記工程（Ｃ）の後、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程を有することが好ましい。
以下、本発明の精製方法が有する工程（Ａｂ）及び（Ｂ）〜（Ｄ）について、工程ごとに説明する。
【０１７９】
工程（Ａｂ）：
工程（Ａｂ）は、前記一般式（１２）で表される化合物を含むロスバスタチンカルシウムを溶媒に溶解する工程である。ここで、溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）など）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類、水等が挙げられ、中でも、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）など）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類、トルエン、メチルエチルケトン等のケトン類、水が好ましい。
工程（Ａｂ）では、通常、ロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）が、下記式（１７）：
【０１８０】
【化６１】
2019205429.tif 000058
【０１８１】
で表される化合物（（３Ｒ、５Ｓ、６Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］−３，５−ヒドロキシ−ヘプト−６−エン酸）に変換される。
なお、本工程においては、前記一般式（１２）で表される化合物は、通常、特に変換はされない。
【０１８２】
工程（Ｂ）：
工程（Ｂ）は、前記一般式（１２）で表される化合物を、前記式（１３）で表される化合物に変換する工程である。
工程（Ｂ）では、上記反応に伴い、用いる酸や塩基の種類により、通常、前記式（１７）で表される化合物が、前記一般式（１６）で表される化合物に変換される。
【０１８３】
前記一般式（１２）で表される化合物を、前記式（１３）で表される化合物に変換することができれば、反応条件等に特に制限はないが、工程（Ｂ）における反応条件の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ｂ）は、溶媒の存在下で行なうことが好ましい。ここで、溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、シクロペンチルメチルエーテルなど）、酢酸エステル類（例、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピルなど）、アミド類（例、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなど）、炭化水素（例、トルエン、シクロヘキサンなど）、アルコール類（例、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、水等が挙げられ、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、ＴＨＦ、酢酸エチル、トルエン、水が好ましい。
反応温度としては、通常５０℃以上、好ましくは、６０℃以上であり、また、通常１２０℃以下、好ましくは、１１０℃以下である。反応を効率的に進めるため、必要に応じて加熱することが好ましい。本発明の特に好ましい実施態様では、工程（Ｂ）は、６０℃以上１００℃以下の条件下で行われる。
工程（Ｂ）のｐＨの条件としては、特に制限はないが、反応を促進させるためには、酸性条件下、或いは塩基性条件下で行なうことが好ましい。
酸性条件下で行なう場合、ｐＨ０以上ｐＨ３以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる酸としては、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、中でも、塩酸、硫酸が好ましい。
塩基性条件下で行なう場合、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましい。ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
また、反応時間は、その他の条件にもよるが、通常１時間以上、好ましくは、２時間以上であり、また、通常７２時間以下、好ましくは、４８時間以下である。
上記の反応時間を短縮するためにも、必要に応じて、工程（Ｂ）においては、反応溶液を必要に応じて撹拌することが好ましい。
【０１８４】
工程（Ｃ）：
工程（Ｃ）は、工程（Ｂ）で得られた混合物（工程（Ａｂ）を有する場合、溶液）から、前記式（３）で表される化合物を除去する工程である。なお、ここで、除去するとは、必ずしも完全に除去されている必要はなく、その大部分が除去されることで、得られる化合物の純度が向上すればよい。また、本工程で、前記式（１３）で表される化合物が除去されると、前記一般式（１６）で表される化合物が残る。
前記式（１３）で表される化合物を除去することができれば、その手段や反応条件に特に制限はないが、工程（Ｃ）の好ましい例を以下に記載する。
工程（Ｃ）は、塩基性の条件下、有機溶媒により抽出することにより、前記式（１３）で表される化合物を除去することが好ましい。
ここで、用いることのできる有機溶媒としては、エーテル類（例、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）等）、エステル類（例、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸メチル等）、ケトン類（例、トルエン、メチルエチルケトン等）等が挙げられ、中でも、上述のエーテル類、エステル類が好ましく、中でも、メチルｔ−ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、メチルエチルケトン、酢酸エチルが好ましい。
また、塩基性の条件下とは、ｐＨ８以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことが好ましく、ｐＨ１０以上ｐＨ１４以下の範囲で行なうことがより好ましい。
ここで用いることのできる塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）や、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等が挙げられ、中でも、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
【０１８５】
工程（Ｄ）：
工程（Ｄ）は、前記工程（Ｃ）で得られた化合物、即ち、前記一般式（１６）で表される化合物とカルシウム化合物とを反応させる工程である。
工程（Ｄ）では、前記一般式（１６）で表される化合物が、そのカルシウム塩であるロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）に変換される。
【０１８６】
前記工程（Ｃ）で得られた化合物とカルシウム化合物とを反応させ、カルシウム塩を得ることができれば、反応条件等に特に制限はないが、工程（Ｄ）における反応条件等の好ましい例を以下に記載する。
カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム等を用いることができ、特に、塩化カルシウムが好ましい。カルシウム化合物の使用量は、前記工程（Ｃ）で得られた化合物に対して、通常０．５当量〜３当量、好ましくは、０．６当量〜２．８当量である。
反応は、溶媒を用いて行うことができる。溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ＭＴＢＥ、ＴＨＦ、ＣＰＭＥ等のエーテル溶媒、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、水等の極性溶媒、さらにはこれら極性溶媒と非極性溶媒（例、トルエン、シクロヘキサン、メシチレンなど）との混合物が好ましい。
反応温度は、通常０℃〜２００℃、好ましくは、２０℃〜１１０℃である。
反応時間は、通常０．０１時間〜２００時間、好ましくは、０．５時間〜２４時間である。
【０１８７】
［本発明のロスバスタチンカルシウム］
本発明の製造方法で得られるロスバスタチンカルシウムは高純度であり、下記式（１１）：
【０１８８】
【化６２】
2019205429.tif 000059
【０１８９】
で表される化合物、即ち、５−［ｔｒａｎｓ−（３Ｓ，５Ｒ）−ジヒドロキシヘキセン−１−イル］−４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジンの含有量は、好ましくは１５００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下、特に好ましくは５０ｐｐｍ以下である。また、好ましくは１ｐｐｍ以上である。このようなロスバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
【０１９０】
本発明のロスバスタチンカルシウムは、上記式（１３）で表される化合物を好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下含有する。また、上記式（１３）で表される化合物の含有量は、好ましくは１ｐｐｍ以上である。
上記式（１３）で表される化合物を１ｐｐｍ以上１０００ｐｐｍ以下含有するロスバスタチンカルシウムは、安定して保存することができる。
【０１９１】
なお、本発明において、粉末Ｘ線回折スペクトルは、公知の方法にしたがって測定することができる。例えば、サンプルをガラス試料板上に充填し、４５ｋＶ及び４０ｍＡにて操作されるセラミックスＸ線管球Ｃｕから発生する１．５４０６オングストロームの波長のＸ線をサンプルに照射して測定することができる。粉末Ｘ線回折スペクトルの２θの値は、測定機器やサンプルによって、例えば±０．２°の誤差範囲内で変わることがあるため、本発明における２θの値は絶対的な値と解釈すべきではない。
【実施例】
【０１９２】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１９３】
本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｓ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
【０１９４】
＜ＤＨＡＢの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌ  酢酸アンモニウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  エチレンジアミンテトラ酢酸２ナトリウム塩  Ｂ：１０％移動相Ａ、９０％メタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４０％（０分）→１００％（１２分）→１００％（１４分）
流速：１ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１９５】
＜ＤＯＸＰの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（ｍＬ／ｍＬ／ｇ）Ｂ：ＴＨＦ
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：３８％（０分）→３８％（１７分）→８０％（２７分）
流速：１ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１９６】
＜ＤＯＸＥの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧ（４．６ｍｍ×７５ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：水／酢酸／酢酸アンモニウム＝１０００／１００／７．７（ｍＬ／ｍＬ／ｇ）Ｂ：ＴＨＦ
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４１％（０分）→４１％（１７分）→９０％（２７分）
流速：１ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
【０１９７】
＜ＤＯＬＰの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧＩＩＩ−Ｈ（２．０ｍｍ×１００ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム／エタノール＝３／２（ｍＬ／ｍＬ）Ｂ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム／エタノール＝１／４（ｍＬ／ｍＬ）
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：０％（０分）→０％（１０分）→１００％（２５分）→１００％（３０分）
流速：０．３ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
但し、実施例４および５においては、以下の条件で測定した。
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：エタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：４０％（０分）→６０％（２０分）→８０％（２５分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
【０１９８】
＜ＲＳＶ-Ｃａの化学純度＞
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
【０１９９】
＜ＲＳＶ-Ｃａの光学純度＞
カラム：ダイセル社製  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＩＢ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：トリフルオロ酢酸／ヘキサン／エタノール＝０．１／９０／１０（ｍＬ／ｍＬ／ｍＬ）
流速：１ｍＬ／分    カラム温度：２５℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＲＳＶ−Ｃａ中のＤＯＬＨ分析＞
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出器：ＭＳ  （極性：ポジティブ  モード：ＳＩＭ  フラグメンター：２００  ドライガス流量：５Ｌ／ｍｉｎ  ネブライザー：４０ｐｓｉ  ドライガス温度：２５０℃  ベポライザー温度：１５０℃）
【０２００】
＜ＤＯＸＰおよびＤＯＬＰの粉末Ｘ線回折スペクトル＞
ＤＯＸＰおよびＤＯＬＰの粉末Ｘ線回折スペクトル（実施例２、２’、５、および１１）は、Ｘ線回折装置ＸＲＤ−６０００（株式会社島津製作所製）を用いて測定した。セラミックスＸ線管球Ｃｕから発生する１．５４０６オングストロームの波長のＸ線をサンプルに照射した。平行にしたＸ線源を、自動発散スリットに通し、反射したＸ線を高速半導体検出器で測定した。機器には高速半導体検出器を取り付けた。測定条件は、以下の通りとした。
モノクロメータ：  使用
管電圧：  ４０．０Ｋｖ
管電流：  ４０．０ｍＡ
ダイバージェンス：  １．００ｄｅｇ
スキャッタリング：  １．００ｄｅｇ
レシービング：  ０．１５ｍｍ
モード：  連続スキャン
駆動軸：  ２θ／θ
データ範囲：  ５〜４０ｄｅｇ
ステップ：  ０．０２ｄｅｇ
スキャン速度：  ３．５０００ｄｅｇ／分（実施時間：  １０分間）
回転速度：  ６０ｒｐｍ
【０２０１】
＜プロピルアミン塩の粉末Ｘ線回折スペクトル＞
プロピルアミン塩の粉末Ｘ線回折スペクトル（実施例７）は、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ−ＰＲＯ  ＭＰＤ（スペクトリス株式会社製）を用いたこと、および測定条件を以下の通りとしたこと以外は、＜ＤＯＸＰおよびＤＯＬＰの粉末Ｘ線回折スペクトル＞と同様の条件で測定した。
モノクロメータ：  使用
管電圧：  ４５．０Ｋｖ
管電流：  ４０．０ｍＡ
ダイバージェンス：  自動
照射幅 ：  １０．００ｍｍ
試料幅 ：  １０．００ｍｍ
モード：  連続スキャン
駆動軸：  ２θ／θ、
データ範囲：  ５〜４０ｄｅｇ
ステップ：  ０．０１７ｄｅｇ
スキャンステップ時間 [s]：  １０．９８３４
実施時間：  １０分４０秒間
【０２０２】
＜ジメチルアミン塩の粉末Ｘ線回折スペクトル＞
ジメチルアミン塩の粉末Ｘ線回折スペクトル（実施例９）は、Ｘ線回折装置ＲＡＤ−ＲＢ（株式会社理学製）を用いたこと、および測定条件を以下の通りとしたこと以外は、上記の＜ＤＯＸＰおよびＤＯＬＰの粉末Ｘ線回折スペクトル＞と同様の条件で測定した。
モノクロメータ：  使用
管電圧：  ４０．０Ｋｖ
管電流：  １００ｍＡ
発散スリット：  １．００ｄｅｇ
散乱スリット：  １．００ｄｅｇ
受光スリット：  ０．１５ｍｍ
モード：  連続スキャン
駆動軸：  ２θ／θ
データ範囲：  ２〜４０ｄｅｇ
ステップ：  ０．０２ｄｅｇ
スキャン速度：  ２ｄｅｇ／分（実施時間：  １９分間）
【０２０３】
参考例１
（ＤＨＡＢ（３，５―ジオキソヘキサン酸ｔ−ブチルエステル）の合成）
［工程１］
【０２０４】
【化６３】
2019205429.tif 000060
【０２０５】
窒素雰囲気下、１０Ｌのフラスコにメルドラム酸（ＭＡ）９００．１ｇ（６．２４ｍｏｌ）とクロロベンゼン４５３２．１ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２０℃に調整した。混合液にトリエチルアミン６３１．９ｇ（６．２４ｍｏｌ）を２５分かけて滴下した。３０分間撹拌した後、混合液にジケテン（ＤＫ）５５７．８ｇ（６．８６ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。内温２２℃で１．５時間撹拌した後、反応混合物に、３５％塩酸６５１．４ｇと水１７９９．９ｇとの混合液を１時間２０分かけて滴下した。有機層を分離後、有機層を水で洗浄した。得られた有機層を乾燥したＳＫ１Ｂ（Ｈ型イオン交換樹脂、三菱化学社製）で乾燥させた。
乾燥終了後、有機層をろ過して次の工程にて使用した。
［工程２］
【０２０６】
【化６４】
2019205429.tif 000061
【０２０７】
窒素雰囲気下、前工程で得られた有機層を１０Ｌのフラスコに仕込んだ後、ｔｅｒｔ−ブタノール５５５．４ｇ（７．４８ｍｏｌ）を添加した。混合物を内温６０℃まで昇温した。７時間撹拌した後、反応液を室温まで冷却した。反応液に７％炭酸水素ナトリウム水溶液１３２５．８ｇを添加した後、反応混合物をろ過した。その後、有機層を分離し、得られた有機層を水で洗浄した。有機層は６０℃において有機溶媒が留出しなくなるまで濃縮を行った。
残渣を薄膜蒸留装置（圧力：５０Ｐａ〜８０Ｐａ、熱媒温度：１１０℃）で精製した。得られた３，５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＤＨＡＢ）は８９３ｇ（収率：６９％）でＨＰＬＣでの純度は９２．１面積％であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，互変異性体の混合物）δ１．４３−１．４９（９Ｈ，ｍ），２．０７（２．５Ｈ，ｓ），２．２５（０．５Ｈ，ｓ），３．２４（１．７Ｈ，ｓ），３．４６（０．３Ｈ，ｓ），３．７３（０．３Ｈ，ｓ），５．６１（０．７Ｈ，ｓ）
【０２０８】
参考例２
（ＤＨＡＥ（３，５―ジオキソヘキサン酸エチルエステル）の合成法）
［工程１］
【０２０９】
【化６５】
2019205429.tif 000062
【０２１０】
窒素雰囲気下、２Ｌのフラスコにメルドラム酸（ＭＡ）１００．２ｇ（０．６９ｍｏｌ）とクロロベンゼン５５４ｇを仕込み、撹拌開始後、内温を２０℃に調整した。混合液にトリエチルアミン７０．３ｇ（０．６９ｍｏｌ）を１７分かけて滴下した。１時間撹拌後、混合液にジケテン６４．６ｇ（０．７６ｍｏｌ）を１時間２０分かけて滴下した。内温２５℃で５．５時間撹拌した後、反応混合物に、３５％塩酸７２．３ｇと水２７７．５ｇを予め混合して調製しておいた液を３０分かけて滴下した。有機層を分離後、有機層を水で洗浄した。得られた有機層を乾燥したＳＫ１Ｂ（Ｈ型イオン交換樹脂、三菱化学社製）で乾燥させた。
乾燥終了後、有機層をろ過して次の工程にて使用した。
［工程２］
【０２１１】
【化６６】
2019205429.tif 000063
【０２１２】
窒素雰囲気下、前工程で得られた有機層を２Ｌのフラスコに仕込んだ後、エタノール３８．５ｇ（０．８３ｍｏｌ）を添加した。混合物を内温６０℃まで昇温した。９時間撹拌した後、反応液を室温まで冷却した。反応液に７％炭酸水素ナトリウム水溶液８７．２ｇを添加した後、反応混合物をろ過した。その後、有機層を分離し、得られた有機層を水で洗浄した。有機層は６０℃において有機溶媒が留出しなくなるまで濃縮を行った。
残渣を単蒸留装置（圧力：５０Ｐａ〜８０Ｐａ、熱媒温度：１１０℃）で精製した。得られた３，５−ジオキソ−ヘキサン酸エチルエステル（ＤＨＡＥ）は８３．５ｇ（収率：７０％）でＨＰＬＣでの純度は９７．９面積％であった。
【０２１３】
実施例１
（ＤＯＸＰ（（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル）の製造）
【０２１４】
【化６７】
2019205429.tif 000064
【０２１５】
窒素雰囲気下、フラスコに水素化ナトリウム５．５０ｇ（純度６２．１％，１４２ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン５０ｍＬを仕込み、０℃〜５℃まで冷却した。混合液に参考例１で得られたＤＨＡＢ６８．３ｍｍｏｌのテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）溶液を１時間かけて滴下した。滴下終了後、０℃〜５℃で１時間撹拌した。（反応液Ａ）
窒素雰囲気下、フラスコに４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ（市販品））１０．０ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１００ｍＬを仕込み、０℃〜５℃に冷却した。その後、同温度にて反応液Ａを滴下した。滴下終了後、２時間かけて内温２０℃まで昇温し、２０℃で４時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＤＯＸＢ（（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル）への転化率は９７．０％であった。その後、内温を１０℃に冷却し、水１００ｍＬを滴下した。滴下後、室温まで昇温し、分液により水層を抜き出した。続いて２％水酸化ナトリウム水溶液５０．０ｇ（ＮａＯＨ１．０ｇ，水４９．０ｇ）、１０％クエン酸水溶液５０．０ｇ（クエン酸５．０ｇ，水４５．０ｇ）、２％ＮａＣｌ水溶液６０．０ｇ（ＮａＣｌ２．０ｇ，水５８．０ｇ）の順で有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、ＡＬＤからの収率は８７．０％であった。
得られた有機層を外温３５℃で減圧濃縮した。得られた残渣にｎ−プロパノールを添加して外温４０℃で減圧濃縮した。濃縮後、再度残渣にｎ−プロパノールを添加して外温４０℃で減圧濃縮した。
その後、得られた残渣にｎ−プロパノールを加えて液量を５０ｍＬに調整し、内温１００℃まで昇温した。７．５時間後、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＰへの転化率は９９．０％であった。その後、冷却し内温が６０℃となったところで減圧濃縮を開始し、溶液量が３０ｍＬになるまで濃縮した。内温を４５℃に調整した時点でＤＯＸＰの種晶を投入し、０℃〜５℃までゆっくり冷却した。冷却後、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶のＨＰＬＣでの純度は、９５．５面積％であった。
１００ｍＬのセパラブルフラスコに、得られた結晶及びメタノール３１ｍＬを仕込み、溶媒が還流する温度まで昇温して均一な溶液とした。結晶が全て溶解したことを確認後、内温４５℃まで冷却した。内温４５℃でＤＯＸＰの種晶を投入し、その後２時間かけて０℃まで冷却した。冷却後、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥した。得られたＤＯＸＰのＨＰＬＣでの純度は９７．４面積％であり、回収量は９．５９ｇ（収率６４．７％）であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．９２−０．９６（３Ｈ，ｔ，Ｊ=７．５Ｈｚ），１．２９（３Ｈ，ｓ），１．３１（３Ｈ，ｓ），１．６４−１．７０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．３６−３．４２（２Ｈ，ｍ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ）４．０９−４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ=６．５Ｈｚ），５．５３（１Ｈ，ｓ），５．７９−５．８３（１Ｈ，ｄ，J=１５．９Hz），７．１０−７．１５（２Ｈ，ｍ），７．６１−７．６８（３Ｈ，ｍ）
【０２１６】
（ＤＯＸＰの種晶の製造）
窒素雰囲気下、反応釜に水素化ナトリウム５２．５ｇ（純度６５％，１．４２ｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン０．５Ｌを仕込み、内温が０℃〜５℃になるまで冷却した。別の反応釜に、窒素雰囲気下、参考例１と同様にして合成したＤＨＡＢ１３７．０ｋｇ（０．６８３ｍｏｌ）にテトラヒドロフラン０．５Ｌを加えた溶液を調製した。そのＤＨＡＢのテトラヒドロフラン溶液を１時間かけて水素化ナトリウムのテトラヒドロフラン溶液に滴下し、０℃〜５℃で１時間撹拌した。（反応液Ｂ）
窒素雰囲気下、反応釜に４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ）を１００ｇ（０．２８１ｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン１Ｌを仕込み、０℃〜５℃まで冷却した。その後、反応液Ｂを内温０℃〜５℃に制御しながら滴下した。滴下終了後、同温度で５時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＡＬＤからの転化率は９９．２％であった。
反応終了後、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１Ｌを加え、内温０〜５℃に制御しながら水１Ｌを滴下した。滴下後、分液により水層を抜き出した。続いて２％ＮａＣｌ水溶液５００ｇ（ＮａＣｌ１０ｇ，水４９０ｇ）、１０％クエン酸水溶液１０００ｇ（クエン酸１００ｇ，水９００ｇ）、水５００ｇの順で有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、ＡＬＤからの収率８３．２％でＤＯＸＢを得た。
得られた有機層を、外温３５℃で全量が５００ｇとなるまで減圧濃縮した。得られた残渣にｉ−プロパノール２００ｍＬを添加して外温４０℃で全量が５００ｇとなるまで減圧濃縮した。この操作を３回繰り返した。
その後、１時間かけて内温を０〜５℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥してＤＯＸＢを得た。得られたＤＯＸＢのＨＰＬＣでの純度は９８．７面積％であり、回収量は９８．７ｇ（収率６５％）であった。
上記の方法で得られたＤＯＸＢ１ｇにｎ−プロパノール１０ｍＬを加え、内温が９８℃になるまで昇温した。１０時間後、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＰへの転化率は９９．５％であった。
反応液を濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘプタン／酢酸エチル＝９４／６から５０／５０（体積比）に直線的にグラジエント）にて精製を行い、目的物を多く含む分画を回収し、外温５０℃にて濃縮を行った。得られた残渣を減圧乾燥するとＤＯＸＰは結晶化した。得られたＤＯＸＰのＨＰＬＣでの純度は９７．２面積％で回収量は１．０１ｇ（収率１０３％）であった。
【０２１７】
実施例２
（ＤＯＸＰの製造）
窒素雰囲気下、反応釜に水素化ナトリウム８．２８ｋｇ（純度６１．９％，２１４ｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン７５Ｌを仕込み、内温が０℃〜５℃になるまで冷却した。別の反応釜に、窒素雰囲気下、参考例１と同様にして合成したＤＨＡＢ２０．５ｋｇ（１０３ｍｏｌ）にテトラヒドロフラン７５Ｌを加えた溶液を調製した。そのＤＨＡＢのテトラヒドロフラン溶液を５時間かけて水素化ナトリウムのテトラヒドロフラン溶液に滴下し、０℃〜５℃で１時間撹拌した。（反応液Ｃ）
窒素雰囲気下、反応釜に４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ）を１４．９ｋｇ（４２．４ｍｏｌ）及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１５０Ｌを仕込み、０℃〜５℃まで冷却した。その後、反応液Ｃを内温０℃〜５℃に制御しながら滴下した。滴下終了後、２時間かけて内温２０℃〜２５℃まで昇温し、２０℃〜２５℃で２時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＡＬＤからの転化率は９９．３％であった。
反応終了後、内温が２０℃以下になるまで冷却し、２０℃以下を維持したまま水１５０Ｌを滴下した。滴下後、分液により水層を抜き出した。続いて２％水酸化ナトリウム水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＯＨ１．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）、１０％クエン酸水溶液７５．０ｋｇ（クエン酸７．５ｋｇ，水６７．５ｋｇ）、２％ＮａＣｌ水溶液７５．０ｋｇ（ＮａＣｌ１．５ｋｇ，水７３．５ｋｇ）の順で有機層を洗浄した。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、ＡＬＤからの収率８２．８％でＤＯＸＢを得た。
得られた有機層を、外温３５℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた残渣にｎ−プロパノール７５Ｌを添加して外温４０℃で全量が３０Ｌとなるまで減圧濃縮した。
その後、得られた残渣にｎ−プロパノール３８Ｌを加え、内温が９７℃になるまで昇温した。反応８時間後、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＰへの転化率は９９．３％であった。
内温６０℃にて減圧濃縮を実施し、溶液量を４５Ｌまで濃縮した。その後、内温４５℃まで冷却し、同温度でＤＯＸＰの種晶を投入した。４時間かけて０℃〜５℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶のＨＰＬＣでの純度は９８．１面積％であった。
１２０Ｌ反応器に、得られた結晶及びメタノール５０Ｌを仕込み、昇温し均一な溶液とした。結晶が全て溶解したことを確認後、４５℃に内温を調整しＤＯＸＰの種晶を投入した。その後４時間かけて０℃〜５℃まで冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥してＤＯＸＰを得た。得られたＤＯＸＰのＨＰＬＣでの純度は９９．０面積％であり、回収量は１４．０ｋｇ（収率６３．４％）であった。
得られたＤＯＸＰの結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを図１に示す。
【０２１８】
実施例２’
（ＤＯＸＰの製造）
窒素雰囲気下、反応釜で、水素化ナトリウム１７．１ｋｇ（純度６０％，４２７ｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５０Ｌに溶解させた後、内温が０℃〜５℃になるまで冷却した（溶液Ｄ）。
別の反応釜で、窒素雰囲気下、参考例１と同様にして合成したＤＨＡＢ４１ｋｇ（２０４ｍｏｌ）にメチルｔ−ブチルエーテル１５０Ｌを加え、溶解させた。内温を１０℃以下に制御しながら、得られた溶液を溶液Ｄ（水素化ナトリウムのＴＨＦ溶液）に滴下した（溶液Ｅ）。
別の反応釜に、４−（４−フルオロフェニル）−５−ホルミル−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン（ＡＬＤ）３０ｋｇ（８５．３ｍｏｌ）を、ＴＨＦ３００Ｌに溶解させた。その溶液を、内温０℃〜５℃に制御しながら、溶液Ｅの中へ滴下した。滴下終了後、内温２０℃〜２５℃まで昇温し、同温度で７時間撹拌した。ＨＰＬＣで分析した結果、ＡＬＤの残量は０．７％であった。
その後、水３００Ｌを滴下した。分液後、得られた有機層を３回洗浄した。溶媒は、２％食塩水、１０％クエン酸水溶液、２％食塩水の順で用いた。洗浄した有機層を外温４５℃付近で減圧濃縮した後、得られた残渣にｎ−プロパノールを添加して外温４５℃付近で再度、減圧濃縮した。
得られた残渣にｎ−プロパノールを加え、ｎ−プロパノールが還流するまで昇温し、その状態で１０時間、保持した。得られた溶液を、ＨＰＬＣにより分析した結果、ＤＯＸＢの残存量は１．６％であった。
得られた溶液を、外温６０℃〜７０℃にて減圧濃縮を行なった。その後、内温４２℃〜４５℃まで冷却し、同温度でＤＯＸＰの種晶を投入した。４時間かけて−５℃〜０℃まで冷却し、固液分離により湿結晶を回収した。
反応釜に、得られた湿結晶及びｎ−プロパノール６０ｋｇを仕込み、昇温して１時間加熱還流した。その後、内温を４２℃〜４５℃に調整し、ＤＯＸＰの種晶を投入した。その後、４時間かけて−５℃〜０℃まで冷却し、固液分離により湿結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥してＤＯＸＰの結晶を得た。得られたＤＯＸＰの結晶のＨＰＬＣでの純度は９９．０面積％であり、回収量は２３．２ｋｇ（収率５２％）であった。
得られたＤＯＸＰの結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを図２に示す。
【０２１９】
実施例３
（ナトリウムアミドを用いた縮合によるＤＯＸＰの製造）
２５０ｍＬセパラブルフラスコに、窒素雰囲気下、ナトリウムアミド５．５ｇ（１４２ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍＬを仕込んだ。内温２℃まで冷却後、参考例１と同様にして合成したＤＨＡＢ１４．８ｇのＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液を２℃〜５℃の間に温度を制御しながら滴下した。滴下終了後、内温３℃で１時間撹拌した。この混合物に、ＡＬＤ１０ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）のＭＴＢＥ（１００ｍＬ）溶液を、０℃〜１℃に温度を制御しながら添加した。滴下終了後、内温０℃で３時間撹拌した後、温度を１０℃まで上昇させて更に３．５時間撹拌した。その後、反応液に水１００ｇを添加した。分液後、得られた有機層を２重量％水酸化ナトリウム水溶液５０ｇ、１０重量％クエン酸水溶液５０ｇ、２重量％水酸化ナトリウム水溶液５０ｇの順で洗浄を行った。得られた有機層をＨＰＬＣで定量分析した結果、ＡＬＤからの収率７０％でＤＯＸＢを得た。
その後、有機層を、外温４０℃、減圧下で濃縮した後、残渣にｎ−プロパノール（５０ｍＬ）を添加し、再び外温４０℃、減圧下で濃縮した。得られた残渣の体積が４０ｍＬになるようにｎ−プロパノールを添加した後、内温を９７℃まで上昇させた。同温度で５時間反応した後、反応混合物を４５℃まで冷却し、ＤＯＸＰの種晶を添加した。反応液を０℃まで冷却後、得られた結晶をろ取した。回収した結晶にメタノール（３０ｍＬ）を添加して、内温を５２℃まで上昇させて溶解させた。溶液を４０℃まで冷却し、ＤＯＸＰの種晶を添加した。溶液を０℃まで冷却後、得られた結晶をろ取した。結晶を４０℃、減圧下で乾燥させた。得られた結晶の重量は７．７ｇであり、ＨＰＬＣで定量分析した結果、ＡＬＤからの収率は５４％、純度は９７．８面積％であった。
【０２２０】
実施例１’
（ＤＯＸＥ（（Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジオキソ−６−ヘプテン酸エチルエステル）の合成）
［工程１］
【０２２１】
【化６８】
2019205429.tif 000065
【０２２２】
窒素雰囲気下、２００ｍＬ３つ口フラスコに、６０％水素化ナトリウム１．２ｇ（２９．９ｍｍｏｌ）を仕込み、乾燥したｎ−ペンタン（１０ｍＬ）を添加した。５分間撹拌した後、静置して上澄みを除去した。その後、ＴＨＦ（５０ｍＬ）を添加し、内温を−１０℃まで冷却した。その中に、参考例２で合成したＤＨＡＥ（４．９ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液を、内温−１０℃付近に維持しながら滴下した。−１０℃付近で５０分間撹拌した後、内温を−３０℃まで冷却した。その後、１．３ｍｏｌ／Ｌのｎ−ブチルリチウムのＴＨＦ溶液（４０．６ｍＬ、５６、９ｍｍｏｌ）を内温−２７℃〜−２５℃の間に維持するように滴下した。滴下終了後、混合物を内温−１５℃で４０分間撹拌した。内温を−３０℃まで冷却した後、ＡＬＤ（５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（９０ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物を内温０℃まで昇温し、２時間撹拌した。その後、酢酸（６．８ｍＬ）を内温０℃付近で滴下し、トルエン（５０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）を添加した。分液後、得られた有機層を水（２５ｍＬ）、続いて２５重量％水酸化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。その後、有機溶媒を減圧下で留去し粗体のＨＤＯＸＥ（７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチル
スルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−７−ヒドロキシ−３，５−ジオキソ−６
−ヘプテン酸エチルエステル）を９．２ｇ得た。
［工程２］
【０２２３】
【化６９】
2019205429.tif 000066
【０２２４】
窒素雰囲気下、１００ｍＬ３つ口フラスコに、前工程で得られたＨＤＯＸＥ粗体３．７ｇ（純量換算２．９ｇ、５．６７ｍｍｏｌ）にｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）０．１１ｇ（０．５７ｍｍｏｌ）及びトルエン６０ｍＬを仕込んだ。その後、内温を１１０℃まで上昇させ４時間還流した。その後、反応液を２５℃まで冷却し、混合物中に飽和重曹水２０ｍＬを添加した。分液後、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥した有機層をろ過後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０〜９０／１０）で精製した。主分画を濃縮し、目的とするＤＯＸＥ０．９２ｇ（３２％、純度８９面積％）を油状物質として得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3，互変異性体の混合物）δ１．２２−１．３１（９Ｈ，ｍ），３．２５−３．４１（３Ｈ，ｍ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），４．１８−４．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ），５．３０（０．７Ｈ，ｓ），５．５２（１．３Ｈ，ｓ），５．７９−５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），７．１１−７．１６（２Ｈ，ｍ），７．６０−７．６９（３Ｈ，ｍ）
【０２２５】
参考例３
（菌体の調製）
［カルボニル還元酵素（以下、ＯＣＲ１）、グルコース−１−デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨ）を共発現した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの調製例］
【０２２６】
（１）遺伝子のクローニング
オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＮＢＲＣ（旧ＩＦＯ）１４７３由来のＯＣＲ１（特許第４２７０９１８号、配列番号２）をコードする遺伝子配列（ｏｃｒ１）を元に、ｏｃｒ１遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｏｃｒ１＿Ｆ（配列番号３）とｏｃｒ１＿Ｒ（配列番号４）を設計、合成した。続いて、オガタエア・ミヌタ  変種ノンファーメンタス（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ  ｖａｒ．  ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、常法に従ってＰＣＲを行い、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
次に、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＬ００９１２６．３）がコードするグルコース−１−デヒドロゲナーゼにおいて９６番目のアミノ酸残基のグルタミン酸をアラニンに置換したＧＤＨ（配列番号６）をコードする遺伝子配列（以下、ｇｄｈ（配列番号５））に対し、ｇｄｈの遺伝子の全長を増幅させるためのプライマーｇｄｈ＿Ｆ１（配列番号７）とｇｄｈ＿Ｒ１（配列番号８）を設計、合成した。続いて、常法に従ってＰＣＲを行い約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【０２２７】
（２）発現用プラスミドの調製
上記（１）で得られたｏｃｒ１のＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化した特開２００５−３４０２５号公報に記載のプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１を得た。
次に、上記（１）で得られたｇｄｈのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、及びＸｂａＩにより消化し、ＭｕｎＩ及びＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＫＶ３２にＬｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いてｔｒｃプロモーターの下流に導入し、ｐＫＶ３２ＧＤＨを得た。
さらに、ｐＫＶ３２ＧＤＨを鋳型として、制限酵素サイトＨｉｎｄＩＩＩを付加したプライマーｇｄｈ＿Ｆ２（配列番号９）とｇｄｈ＿Ｒ２（配列番号１０）でＰＣＲを行い得られたフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１の下流に挿入し、ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。得られたプラスミドにおけるｇｄｈ遺伝子の向きはＰＣＲにより確認した。
【０２２８】
（３）発現株の調製
上記（２）で得られたプラスミドｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。
【０２２９】
実施例４
（ＤＯＬＰ（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル）の製造）
【０２３０】
【化７０】
2019205429.tif 000067
【０２３１】
１Ｌのジャーファーメンター（エイブル社製、型式ＢＭＪ−０１）に、イオン交換水３８５．９ｍＬ、グルコース１９．５ｇ（１０８．２ｍｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）７５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）、リン酸水素二カリウム０．５ｇ（２．９ｍｍｏｌ）、及びリン酸二水素カリウム３．８ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を仕込み溶解させた。そこに、参考例３の方法で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体５５．６ｇ、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）８６．３ｇ（１１１１．４ｍｍｏｌ）にＤＯＸＰ７．０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）を溶かして調製した基質溶液全量を添加し、内温５０℃で３時間撹拌した。反応中は２５重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを６．５に保持した。得られた反応液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。この沈殿物を５重量％硫酸ナトリウム水溶液に懸濁した後、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチルによる抽出を３回繰り返して得た抽出液を混合し、ＨＰＬＣで混合した抽出液を分析した結果、ＤＯＬＰの収量は６．０５ｇ（収率８５．８％）であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．２６（６Ｈ，ｄ, Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．４４−１．７０（４Ｈ，ｍ），２．４８（２Ｈ，ｄ, Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．３６（１Ｈ, ｍ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５７（３Ｈ，ｓ）３．６２（１Ｈ，ｓ），３．７６（１Ｈ，ｓ），４．０９（２Ｈ，ｔ, Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２１（１Ｈ，ｍ），４．４６（１Ｈ，ｍ），５．４５（１Ｈ，ｄｄ, Ｊ＝５．６Ｈｚ，１６．０Ｈｚ），６．６４（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．０Ｈｚ）７．０９（２Ｈ，ｍ），７．６４（２Ｈ，ｍ）
【０２３２】
実施例４−１〜４−４
（ＤＯＬＰの製造）
表６に記載のグリセリン濃度となるようにイオン交換水、グリセリン、グルコース４８．３ｇ（２６８．１ｍｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）１３８ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、リン酸水素二カリウム８．２９ｇ（４７．６ｍｍｏｌ）、及びリン酸二水素カリウム３．９７ｇ（２９．２ｍｍｏｌ）を仕込んだこと、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体の使用量を５０．６０ｇとしたこと、基質溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１２４．２０ｇ（１５８９．７ｍｍｏｌ）にＤＯＸＰ１４．４ｇ（２７．７ｍｍｏｌ）を溶かして調製した溶液としたこと、反応時間を５時間としたこと、及び、反応時のｐＨをｐＨ６に保持したこと以外は、実施例４と同様の条件でＤＯＬＰを製造した。ＤＯＬＰへの転化率を表６に示す。グリセリンの存在下で反応を行なうと転化率が向上することがわかる。なお、ＤＯＬＰが得られていることは、ＨＰＬＣの保持時間（retention time）で確認した。
【０２３３】
【表６】
2019205429.tif 000068
【０２３４】
実施例５
（ＤＯＬＰの製造）
５Ｌのジャーファーメンター（エイブル社製、型式ＢＭＳ）に、イオン交換水１９２９．６ｍＬ、グルコース９７．７ｇ（５４２．２ｍｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（オリエンタル酵母社製）３７４ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）、リン酸水素二カリウム２．６ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）及びリン酸二水素カリウム１９．１ｇ（１４０．３ｍｍｏｌ）を仕込み溶解させた。そこに、参考例３の方法で調製した組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体２７８ｇ、及びＤＭＳＯ４３４．１ｇ（５５５６．１ｍｍｏｌ）にＤＯＸＰ３５ｇ（６７．４ｍｍｏｌ）を溶かして調製した基質溶液全量を添加し、内温５０℃で３時間撹拌した。反応中は２５重量％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを６．５に保持した。得られた反応液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。この沈殿物を５重量％硫酸ナトリウム水溶液に懸濁した後、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチルによる抽出を３回繰り返して得た抽出液を混合し、ＨＰＬＣで混合した抽出液を分析した結果、ＤＯＬＰの収量は２９．５ｇ（収率８３．７％）であった。
【０２３５】
（ＤＯＬＰ取出し）
ＤＯＬＰのバイオ還元反応液の酢酸エチル抽出液（ＤＯＬＰ２４．１ｇ含有）を外温４０℃で減圧濃縮した。濃縮後、メタノールを添加し、再度、外温４０℃、減圧下で濃縮してＤＯＬＰのメタノール溶液７２．４ｇとした（ＤＯＬＰ２４．１ｇ，メタノール４８．３ｇ）。この溶液に水３６．２ｇ及びメタノール１８．６ｇを添加してＤＯＬＰに対して５倍体積量の７０％メタノール水溶液とした。この溶液を５０℃〜６０℃に昇温して均一な溶液とした後、内温４８℃でＤＯＬＰの種晶を投入した。２時間かけて内温４０℃まで冷却し、その温度で３０分間撹拌した。その後、２時間かけて内温３℃まで冷却し３０分間撹拌後、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶の重量は３５．４ｇであった。湿結晶を４０℃で減圧乾燥し乾体のＤＯＬＰを得た。乾体のＤＯＬＰの回収量は２２．１ｇ、純度は９７．３面積％であった。
フラスコに、ＤＯＬＰ４０．７ｇ（ＨＰＬＣ純度９８．９面積％）及びトルエン２０４ｍＬを仕込み、内温６５℃まで昇温して均一な溶液とした。ＤＯＬＰが全て溶解したことを確認後、内温４５℃まで冷却した。内温４５℃でＤＯＬＰの種晶を投入し１時間撹拌した。撹拌終了後、内温を５０℃に調節し1時間撹拌した。撹拌終了後、１０℃／ｈｒの冷却速度で０℃〜５℃に冷却し、その温度で１時間撹拌した。撹拌終了後、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥し精製ＤＯＬＰを得た。得られた精製ＤＯＬＰのＨＰＬＣでの純度は９９．４面積％であり、回収量は３８．１ｇ、回収率は９３．６％であった。
得られた精製ＤＯＬＰ結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを図３に示す。
【０２３６】
（ＤＯＬＰの種晶の製造）
実施例４に記載の方法に準じて製造したＤＯＬＰを０．７ｇ含む酢酸エチル溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／ヘプタン＝１０／９０から８０／２０（体積比）に直線的にグラジエント）を用いて精製を行った。目的物を多く含む分画を回収し、減圧濃縮を行なったところ、ＤＯＬＰは結晶化した。得られた結晶の純度は９８．７面積％であり、回収量は０．４ｇであった。
【０２３７】
実施例５−１
実施例５に記載の方法に準じて製造したＤＯＬＰ６６．２ｇ（ＨＰＬＣ純度９８．１面積％）とトルエン４００ｇを窒素雰囲気下で仕込み、ＤＯＬＰが溶解するまで加熱した。ＤＯＬＰが完全に溶解したことを確認後、２９℃〜３１℃まで冷却して、同温度でＤＯＬＰの種晶（この種晶は、実施例５に記載の方法に準じて製造したものである。）を加えて、１０分間撹拌した。その後、５０〜５２℃まで昇温し、１．５時間撹拌した。得られたスラリーを１℃付近まで５時間かけて冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥した。
精製したＤＯＬＰの回収量は６４．７ｇであった。精製したＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９９．０面積％であり、仕込み時の純度よりも０．９面積％向上した。
【０２３８】
実施例５−２
実施例５に記載の方法に準じて製造したＤＯＬＰ６５．３ｇ（ＨＰＬＣ純度９７．９面積％）とトルエン３９５ｇを窒素雰囲気下で仕込み、ＤＯＬＰが溶解するまで加熱した。ＤＯＬＰが完全に溶解したことを確認後、３４℃〜３６℃まで冷却して、同温度でＤＯＬＰの種晶（この種晶は、実施例５に記載の方法に準じて製造したものである。）を加えて、３０分間撹拌した。その後、５０〜５２℃まで昇温し、１．５時間撹拌した。得られたスラリーを１℃付近まで１１時間かけて冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥した。
精製したＤＯＬＰの回収量は６３．１ｇであった。精製したＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９９．３面積％であり、仕込み時の純度よりも１．４面積％向上した。
【０２３９】
実施例５−３
実施例５に記載の方法に準じて製造したＤＯＬＰ４８．７ｇ（ＨＰＬＣ純度９６．９面積％）とトルエン２１０ｇを窒素雰囲気下で仕込み、ＤＯＬＰが溶解するまで加熱した。ＤＯＬＰが完全に溶解したことを確認後、３８℃〜４１℃まで冷却して、同温度でＤＯＬＰの種晶（この種晶は、実施例５に記載の方法に準じて製造したものである。）を加えて、１時間撹拌した。その後、３３〜３５℃まで冷却し、１時間撹拌した。更に、５０〜５３℃まで昇温し、１０分間撹拌の後、得られたスラリーを３℃付近まで１４．５時間かけて冷却し、固液分離により結晶を回収した。得られた湿結晶を減圧乾燥した。
精製したＤＯＬＰの回収量は４６．２ｇであった。精製したＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９９．５面積％であり、仕込み時の純度よりも２．６面積％向上した。
【０２４０】
【表７】
2019205429.tif 000069
【０２４１】
実施例６
（ＲＳＶ−Ｃａの製造）
【０２４２】
【化７１】
2019205429.tif 000070
【０２４３】
窒素雰囲気下、ＤＯＬＰ３６ｇ（６８．８ｍｍｏｌ）とエタノール６６６ｇをフラスコに仕込んで溶解させた。その後、水７６６．８ｇを添加した。その混合物に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液３８．５ｍＬ（７７．０ｍｍｏｌ）を内温２３℃で７分間かけて滴下した。２時間撹拌した後、反応液を濃縮してエタノールを留去した。得られた液に酢酸エチル１４４ｇを添加した。２０分間撹拌した後、分液した。この操作を２回繰り返した。得られた水層中に含まれる酢酸エチルを減圧濃縮して留去した。得られた溶液のｐＨが１２付近になるように２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液で調製した後、内温９℃まで冷却した。その後、０．１７ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液４５１ｇを２４分間かけて滴下した。同温で２時間撹拌した後、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度４０℃、減圧下で乾燥させた。得られた結晶は２８．５ｇ（８３％）で水分を３．４％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の結晶の化学純度は９９．７面積％、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），１．２３（１Ｈ，ｍ），１．４５（１Ｈ，ｍ），１．９３（１Ｈ，ｍ），２．０７（１Ｈ，ｍ），３．３７−３．３０（４Ｈ, ｍ），３．４２（３Ｈ，ｓ），３．７０（１Ｈ，ｂｒｓ）４．１３（１Ｈ，ｂｒ ｓ），４．９９（１Ｈ，ｂｒ ｓ），５．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１６．０Ｈｚ），５．７５（１Ｈ，ｂｒ ｓ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ），７．２０（２Ｈ，ｍ），７．６３（２Ｈ，ｍ）
【０２４４】
実施例７
（ｎ−プロピルアミン塩の製造）
【０２４５】
【化７２】
2019205429.tif 000071
【０２４６】
試験管に、ＤＯＬＰ１ｇ（１．９１ｍｍｏｌ、純度：９９．１面積％）、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル４．４１ｇ及び水１０．０ｇを仕込んだ。その混合物に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液１．１７ｇ（２．１３ｍｍｏｌ）を室温で滴下した。４時間撹拌した後、静置して分液操作を行った。得られた有機層に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２．５ｇを添加し、反応系内を酸性化した。その混合物に酢酸エチル（９．０ｇ）を添加し、分液操作を行った。得られた有機層を２重量％水酸化ナトリウム水溶液１０ｇで２回洗浄した。一部の有機溶媒を減圧下で留去した後、全体の体積が１０ｍＬになるように液量を調整した。
前記溶液にｎ−プロピルアミン１３６ｍｇ（２．３ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液（５ｍＬ）を滴下した。得られた混合溶液にｎ−プロピルアミン塩の種晶を添加し、内温を５℃まで冷却して、析出したｎ−プロピルアミン塩の結晶をろ取した。得られた結晶を外温４０℃、真空下で乾燥を行った。ＨＰＬＣ分析の結果、得られたｎ−プロピルアミン塩の重量は０．９０ｇであり、純度は９９．９面積％であった。
得られたｎ−プロピルアミン塩の結晶の粉末Ｘ線回折スペクトルを図５に示す。
【０２４７】
（ｎ−プロピルアミン塩の種晶の製造）
窒素雰囲気下、試験管にＤＯＬＥ（（３Ｒ），（５Ｓ），（６Ｅ）−７−[４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル]−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸エチルエステル）１００ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）、エタノール２．０７ｇ及び水２ｇを仕込んだ。室温で撹拌した後、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１６ｍＬを添加した。室温で２時間撹拌した後、エタノールを減圧下で留去した。回収した水層を酢酸エチルで２回抽出した後、再度酢酸エチルを添加し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ５に調整した。分液操作により水層を除去した後、溶媒を留去した。得られた残渣にアセトニトリル１ｍＬを添加し、１０重量％ｎ−プロピルアミン水溶液１３９ｍｇを滴下した。外温５℃にて二晩静置し、析出した結晶をろ取して、減圧乾燥し、ｎ−プロピルアミン塩０．０４ｇを得た。
【０２４８】
実施例８
（ＲＳＶ−Ｃａの製造）
【０２４９】
【化７３】
2019205429.tif 000072
【０２５０】
ｎ−プロピルアミン塩８００ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度：９９．９面積％）に水６ｍＬ及び２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．８１ｍＬ（１．６３ｍｍｏｌ）を添加した。１時間撹拌した後、反応混合物に、塩化カルシウム（２３９ｍｇ）の水（２ｍＬ）溶液を滴下した。滴下後、内温を５℃まで冷却して、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を外温４０℃、真空下で乾燥を行った。ＨＰＬＣ分析の結果、得られたＲＳＶ−Ｃａの結晶の重量は０．６９ｇであり、純度は９９．９面積％であった。
【０２５１】
実施例９
（ジメチルアミン塩の製造）
【０２５２】
【化７４】
2019205429.tif 000073
【０２５３】
窒素雰囲気下、試験管にＤＯＬＥ１００ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ）、エタノール２．０７ｇ及び水２ｇを仕込んだ。室温で撹拌した、２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．１６ｍＬを添加した。２時間撹拌した後、エタノールを減圧下で留去した。回収した水層を酢酸エチルで２回抽出した後、再度酢酸エチルを添加し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸でｐＨ５に調整した。分液操作により水層を除去した後、溶媒を留去した。得られた残渣にアセトニトリル１ｍＬを添加し、１０重量％ジメチルアミン水溶液２１２ｍｇを滴下した。析出した結晶をろ取して、減圧乾燥し、ジメチルアミン塩０．０３ｇを得た。
得られたジメチルアミン塩の結晶のＸ線粉末回折スペクトルを図６に示す。
【０２５４】
実施例１０
（ＲＳＶ−Ｃａの製造）
【０２５５】
【化７５】
2019205429.tif 000074
【０２５６】
試験管にＤＯＬＥ（純量０．５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ、純度９２．８面積％）にエタノール９．２４ｇ及び水１０ｇを添加した。２５℃で１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．１ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。３時間撹拌した後、反応液を４０℃で減圧濃縮した。その後、水１０ｇ及び酢酸エチル２．２８ｇを添加して分液した。この操作を２回繰り返した。得られた水層に酢酸エチル１０ｇ及び１ｍｏｌ／Ｌ塩酸１Ｌを添加した。分液後、得られた水層に酢酸エチルを添加し、再び分液した。得られた有機層を濃縮し、トルエン１７．２ｇを添加した。トルエン８．６ｇを外温４０℃、減圧下で濃縮した後、濃縮物を内温１１０℃まで昇温した。この温度を６時間維持した後、内温５℃まで冷却した。析出した結晶をろ取してラクトン体０．３５ｇを得た。ＨＰＬＣ分析の結果、得られたラクトン体の純度は９６．４面積％であった。
【０２５７】
【化７６】
2019205429.tif 000075
【０２５８】
試験管に、得られたラクトン体０．２ｇ、エタノール９．３ｇ及び水１０．６ｇを仕込み、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液０．３ｇを添加した。反応終了後、反応液を外温４０℃、減圧下で濃縮し、得られた液に酢酸エチル（２．３ｇ）を添加し、分液した。この操作を２回繰り返した。得られた水層を外温４０℃、減圧で濃縮した。回収した液に、水（１ｇ）を添加し、０．１７ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液（３．２ｇ）を添加した。反応混合物を内温１０℃で撹拌したのち、析出した結晶をろ取した。得られた結晶を外温４０℃、減圧下で乾燥した。ＨＰＬＣ分析の結果、ＲＳＶ−Ｃａの結晶の重量は０．８ｇであり、純度は９８．２面積％であった。
【０２５９】
実施例１１
（ＤＯＬＰの製造）
１ｍ３の反応槽に、イオン交換水２００Ｌ、含水グルコース１１０.９４ｋｇ、リン酸水素二カリウム２．１３ｋｇ及びリン酸二水素カリウム４．２５ｋｇを仕込み溶解させた。次に、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体５２．７ｋｇ及びイオン交換水３Ｌに溶解させたＮＡＤＰ+０．１４４ｋｇを仕込み懸濁させた。そこに、ＤＭＳＯ９６．０ｋｇに溶解させた、実施例２で得られたＤＯＸＰ１０．０ｋｇ（１９．２ｍｏｌ）を添加し、内温４５℃〜５２℃で６時間撹拌した。反応中は１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨを６．０に保持した。反応終了後、９８重量％硫酸を用いてｐＨ５．０に調整し、内温６５℃で１時間撹拌した。撹拌後のＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９２．６０面積％であった。
反応液を遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。得られた沈殿物を２０％メタノール水溶液５０２Ｌに懸濁させ、遠心分離した。
【０２６０】
（ＤＯＬＰの抽出）
上記手法で得られた沈殿物を５重量％硫酸ナトリウム水溶液１０５．３ｋｇに懸濁した後、酢酸エチルによる抽出を３回繰り返した。得られた抽出液を混合し、減圧濃縮した。得られた濃縮液を４重量％硫酸ナトリウム水溶液１０４ｋｇで洗浄し、得られた有機層を濾過後、再度減圧濃縮した。得られたＤＯＬＰの酢酸エチル溶液は１３２．８ｋｇであり、ＤＯＬＰの含有量は７．０ｋｇ（回収率７０．０％、ＨＰＬＣ純度は９４．１３面積％）であった。
【０２６１】
（ＤＯＬＰの晶析）
上記の方法で得られたＤＯＬＰの酢酸エチル溶液（ＤＯＬＰ６．７ｋｇ含有）を減圧濃縮した。得られた残渣に１−プロパノール５１．５ｋｇを添加後、再度減圧濃縮した。濃縮後、水２５．６ｋｇを添加し、温度を１０℃まで冷却した。ＤＯＬＰの種晶を添加し結晶を析出させた後、水１２．８ｋｇを追加した。析出した結晶を固液分離により回収した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８０面積％で、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
窒素雰囲気下、ＤＯＬＰの湿結晶にトルエン４８．１ｋｇを添加した。混合物を４５℃まで昇温した後、分液して水層を除去した。分液後、減圧濃縮を実施した。温度を４０℃に調整した後、ＤＯＬＰの種晶を添加するとＤＯＬＰが析出した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．４ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９８．８７面積％で、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
窒素雰囲気下、ＤＯＬＰの湿結晶にトルエン３１．７ｋｇを添加した。混合物を６２℃まで昇温し、ＤＯＬＰを溶解させた。溶液を４０℃まで冷却した後、ＤＯＬＰの種晶５．２ｇを添加し結晶化させた。その後、トルエン９ｋｇを追加した。温度を０℃まで冷却後、固液分離により結晶を回収した。結晶は予め５℃まで冷却したトルエン２．２ｋｇにて洗浄した。得られたＤＯＬＰの純度は９９．５８面積％で、乾燥することなく次の結晶化を実施した。
上記の方法を２回繰り返し、得られた結晶を減圧乾燥して回収した。乾燥後のＤＯＬＰ重量は３．４１ｋｇ（通算回収率４８％）で純度は９９．８６面積％であった。得られた結晶の粉末Ｘ線回折の結果を図４及び表８に示す。
【０２６２】
【表８】
2019205429.tif 000076
【０２６３】
実施例１２
窒素雰囲気下、実施例１１で得られたＤＯＬＰ２．９９ｋｇ（５．７１ｍｏｌ）とメチルｔ−ブチルエーテル１１．１ｋｇを反応容器に仕込み、脱塩水２９．０ｋｇを添加した。得られたスラリーに２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液３．４７ｋｇ（６．４２ｍｏｌ）を内温２５〜２８℃で１０分間かけて滴下した。３．５時間撹拌した後、分液して得られた水層にメチルｔ−ブチルエーテル１１．１ｋｇを添加した。得られた溶液を３０分間撹拌した後、再度、有機層を分離して除去し、水層を液量２４Ｌとなるまで減圧濃縮した。得られた溶液を内温２５〜２８℃に調整し、１０％塩化カルシウム水溶液６．９２ｋｇ（６．２２ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。得られたスラリーを、内温２５〜２８℃で１時間撹拌した後、０〜５℃まで冷却し、同温で１４０分間熟成させ、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度４０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は２．１４ｋｇ（収率７５％）であり、水分を２．９％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の結晶の化学純度は９９．９３面積％、光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。また、結晶中には、下記式（１１）：
【０２６４】
【化７７】
2019205429.tif 000077
【０２６５】
で示される化合物が２０ｐｐｍ含まれていた。
【０２６６】
実施例１３
（ＲＳＶ−Ｃａの製造）
窒素雰囲気下で、実施例１１に記載の方法に準じて製造したＤＯＬＰ１０ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）、メチルｔ−ブチルエーテル５０ｍＬ及び水１００ｇを混合した。得られた混合物に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、ｐＨ１２〜１３に調整し、撹拌した後、分液した。得られた水層にメチルｔ−ブチルエーテルを添加し、撹拌した後、分液し、得られた水層中に含まれるメチルｔ−ブチルエーテルを減圧濃縮して留去した。得られた溶液に、０．２Ｎ酢酸水溶液を添加し、ｐＨ６〜７となるように調整した。その後、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸カルシウム溶液を滴下し、冷却した。析出した結晶をろ取し、乾燥させた。
得られた結晶は８．８５ｇ（９２％）で水分を１．９％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の結晶の化学純度は９９．９２面積％であった。
【０２６７】
また、本発明の製造方法及び精製方法に関する実施例を以下に示す。
【０２６８】
本実施例における定量分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用い、以下の条件で測定を行った。
【０２６９】
＜ＭｏＳｉ及びＤｉＳｉの化学純度＞
カラム：アジレント製  ＨＰ−５（０．３２ｍｍ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）
温度：４５℃（０分）→（２０℃／分）→２４０℃（５分）
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２５０℃
カラム内流量：１．５ｍＬ／分（ヘリウム）    スピリット比：２０：１
検出器：ＦＩＤ
＜ＤＯＸＰの化学純度＞
上述に記載の条件と同一の条件で測定を行なった。
＜５−ＭＯＬＰ及びＤＯＬＰの化学純度＞
カラム：資生堂製  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧＩＩＩ−Ｈ（２．０ｍｍ×１００ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム／エタノール＝３／２（ｍＬ／ｍＬ）Ｂ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム／エタノール＝１／４（ｍＬ／ｍＬ）
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：０％（０分）→０％（１０分）→１００％（２５分）→１００％（３０分）
流速：０．３ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出波長：ＵＶ２４５ｎｍ
＜ＲＳＶ−Ｃａ中のＤＥＮＫ分析＞
カラム：インタクト社製  Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、３μｍ）
移動相：Ａ：０．１％ギ酸水溶液  Ｂ：０．１％ギ酸を含むメタノール
グラジエントプログラム（Ｂ濃度）：６０％（０分）→７５％（１２分）→１００％（２０分）
流速：０．８ｍＬ／分    カラム温度：４０℃
検出器：ＭＳ  （極性：ポジティブ  モード：ＳＩＭ  フラグメンター：２００  ドライガス流量：５Ｌ／ｍｉｎ  ネブライザー：４０ｐｓｉ  ドライガス温度：２５０℃  ベポライザー温度：１５０℃）
【０２７０】
［参考例４］
【０２７１】
【化７８】
2019205429.tif 000078
【０２７２】
窒素雰囲気下、１Ｌのフラスコにアセト酢酸プロピル（ＥＡＡ）７５．４ｇ（５２３ｍｍｏｌ）とｎ−ヘプタン５１８．１ｇを仕込んだ。内温を２０℃に調節後、トリエチルアミン５８．２ｇ（５７５ｍｍｏｌ）を添加した。その後、内温を１０℃まで冷却後、トリメチルシリルクロライド６１．４ｇ（５６４ｍｍｏｌ）を４０分かけて滴下した。その後、内温を２０℃に調節し、１．５時間撹拌した。生成した結晶をろ過し、結晶を２５７ｇのｎ−ヘプタンで洗浄した。得られた母液を外温４０℃にて減圧濃縮を行った。得られたＭｏＳｉの重量は１１０．５ｇで、ＧＣによる純度は９９．１面積％で、２．８％のｎ−ヘプタンが含まれていた。
【０２７３】
［参考例５］
【０２７４】
【化７９】
2019205429.tif 000079
【０２７５】
窒素雰囲気下、２Ｌのフラスコにジイソプロピルアミン５２．９ｇ（５２２ｍｍｏｌ）とＴＨＦ  ２４４ｇを仕込んだ。内温を−２５℃まで冷却後、２．５Ｍ  ｎ−ブチルリチウムのｎ−ヘキサン溶液２００ｍｌを３０分かけて滴下した。滴下終了後、内温を−７３℃まで冷却した。その後、参考例４で得られたＭｏＳｉ  １０６．４ｇをＴＨＦ  １０４ｇに溶解した溶液を１時間かけて滴下した。滴下終了後、トリメチルシリルクロライド６１．９ｇ（５７０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ  ６９．８ｇに溶解した溶液を４０分かけて滴下した。反応液を室温まで昇温後、外温２０℃にて減圧濃縮を行った。生成した結晶をろ過し、結晶をｎ−ヘプタン１３２ｇにて洗浄し、再び外温２０℃にて減圧濃縮を行った。得られたＤｉＳｉの重量は１４４．１ｇで、ＧＣによる純度は７８．３面積％で、２％のｎ−ヘキサン、０．１％のＴＨＦ、０．１６％のｎ−ヘプタンが含まれていた。
【０２７６】
［参考例６］
【０２７７】
【化８０】
2019205429.tif 000080
【０２７８】
窒素雰囲気下、１００ｍＬフラスコに塩化メチレン４５ｍｌとモレキュラーシーブス４Ａ  １ｇ及び（Ｓ）−１，１’−ビ−２−ナフトール（（Ｓ）−ＢＩＮＯＬ）１ｇを仕込んだ。常温にてチタンテトライソプロポキシド１ｇを滴下した。混合物を２．５時間撹拌の後、ろ過して常温にて減圧濃縮した。得られた残渣の重量は１．５９ｇで、精製せずそのまま次の反応に使用した。
【０２７９】
［参考例７］
【０２８０】
【化８１】
2019205429.tif 000081
【０２８１】
窒素雰囲気下、３００ｍＬフラスコにＥＮＡＬ  ５ｇ（１３．２５ｍｍｏｌ）、参考例６で調製した触媒０．２１ｇ、塩化リチウム０．２ｇ（４．７ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ  ７５ｍｌを仕込んだ。内温２７℃にて、テトラメチルエチレンジアミン１．４６ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）を添加した。同温度にて１．５時間撹拌の後、参考例５で調製したＤｉＳｉ  １０．３ｇをＴＨＦ  ５ｍｌで希釈した溶液を３０分間かけて滴下した。同温度にて１７時間撹拌の後、内温を１２℃まで冷却して９８％硫酸２．６５ｇと水２２．１ｇを混合した液を添加した。１０分間撹拌の後、静置して分液した。得られた有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液９．３ｇ、次いで飽和食塩水１０．４ｇにて洗浄した後、硫酸マグネシウム４．３ｇにて乾燥した。ろ過を行った後、得られた母液を外温４３℃にて減圧濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ｎ−ヘプタンと酢酸エチル）にて精製を実施した。目的物を含む分画を濃縮して５−ＭＯＬＰ  ５．８ｇを得た。得られた５−ＭＯＬＰのＨＰＬＣによる純度は８６．８面積％であった。
【０２８２】
［参考例８］
【０２８３】
【化８２】
2019205429.tif 000082
【０２８４】
窒素雰囲気下、参考例７の方法で合成した５−ＭＯＬＰ  ０．１ｇにメチルｔ−ブチルエーテル１ｍＬ及び水１ｍＬを仕込んだ。常温にて２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．１１ｇを添加した。常温にて１晩撹拌後、静置して水層と有機層を分離した。得られた水層を外温８０℃まで昇温し、１３時間撹拌した。反応終了後、室温まで冷却し、メチルｔ−ブチルエーテル２ｍｌを添加し、分液した。得られた有機層を常温にて減圧濃縮した。残渣を分析すると、ＤＥＮＫがＨＰＬＣの分析で９３．５面積％の純度で含まれていた。
得られたＤＥＮＫの1Ｈ−ＮＭＲを以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．８０（１Ｈ，ｍ），２．３０（３Ｈ，ｓ），３．５２（３Ｈ，ｓ），３．５９（３Ｈ，ｓ），６．０８（１Ｈ，ｄ, Ｊ＝１６．４Ｈｚ），６．２２（１Ｈ，ｍ），７．１５（４Ｈ、ｍ），７．６５（２Ｈ，ｍ）
【０２８５】
［実施例１４］
（ＤＯＸＰの製造）
上述の参考例１と同一の方法で製造したＤＨＡＢを用いて、上述の実施例２と同一の方法で、ＤＯＸＰを製造した。
【０２８６】
（菌体の調製）
上述の参考例３と同一の方法で、菌体の調製を行ない、組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨを得た。
【０２８７】
（ＤＯＬＰの合成）
【０２８８】
【化８３】
2019205429.tif 000083
【０２８９】
（１）バイオ反応
５Ｌの反応槽に、イオン交換水９００ｍＬ、含水グルコース２１２．５ｇ、リン酸水素二カリウム１８．５ｇ及びリン酸二水素カリウム３１．０ｇ及びグリセロール４８０．０ｇを仕込み溶解させた。次に、上記で得られた組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＫＶ３２ＯＣＲ１−ＧＤＨの凍結菌体２０２．４ｇと、ＮＡＤＰ+  ５５２ｍｇを仕込み、懸濁させた
。上記で得られたＤＯＸＰ  ５７．６ｇ（１１０．８１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ４９６．８ｇに溶解させ、その溶液を、上記の菌体を懸濁させた溶液に添加した。内温４５℃〜５２℃にて、２４％水酸化ナトリウム水溶液を滴下することでｐＨを６．０に保持しながら、６時間撹拌した。反応終了後、９８％硫酸を用いてｐＨ５．０に調整し、内温６５℃で１時間撹拌した。得られたＤＯＬＰのＨＰＬＣ純度は９２．０面積％で、５−ＭＯＬＰは５．１面積％含まれていた。
得られた反応液を遠心分離し、菌体と反応生成物からなる沈殿物を得た。更に得られた沈殿物を２０％メタノール水溶液１１．５ｋｇに懸濁させ、遠心分離した。
【０２９０】
（２）ＤＯＬＰ抽出
上記で得られた沈殿物および食塩２３０ｇをアセトン１．７２ｋｇに懸濁した後、固液分離を行った。
【０２９１】
（３）ＤＯＬＰ晶析
得られたＤＯＬＰのアセトン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣に１−プロパノール９７３ｇを添加後、再度、減圧濃縮し、そこに、水１９２ｇを添加し、温度を５℃まで冷却し結晶を析出させた。その後、水９６．９ｇを追加し固液分離を行った。得られた結晶を減圧乾燥した。乾燥後の結晶の重量は４５．９ｇ（収率８０％）で、純度は９８．８０面積％で、５−ＭＯＬＰは１．５面積％含まれていた。
上記の方法で得られた結晶（ＤＯＬＰ）３５．０ｇに、窒素雰囲気下で、トルエン２４２．２ｇを添加した。その後、６２℃まで昇温して溶解させたのち、温度を４２℃付近に調整し、ＤＯＬＰ種晶を添加した。３．５時間撹拌の後、トルエン６０．５ｇを追加した。その後温度を０℃まで冷却した後、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥した。乾燥後のＤＯＬＰの量は３２．５ｇ（回収率９３％）で、純度は９９．３面積％で、５−ＭＯＬＰは０．４面積％含まれていた。
得られた結晶（ＤＯＬＰ）３０ｇに、窒素雰囲気下で、トルエン２０７．６ｇを添加し、６１℃まで昇温して結晶を溶解させた。得られた溶液を４０℃まで冷却すると結晶化した。１時間熟成した後、トルエン５１．７ｇを追加して、温度を０℃まで冷却した後、固液分離により結晶を回収した。得られた結晶を減圧乾燥した。乾燥後のＤＯＬＰの量は２８．３ｇ（回収率９４％）で、純度は９９．６面積％で、５−ＭＯＬＰが０．１６面積％含まれていた。
【０２９２】
（ＲＳＶ−Ｃａの合成）
【０２９３】
【化８４】
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【０２９４】
窒素雰囲気下、上記の方法で得られたＤＯＬＰ  １０ｇ（１９．１ｍｍｏｌ）とメチルｔ−ブチルエーテル４４．０ｇを反応容器に仕込み、脱塩水１００ｇを添加した。その中に２ｍｏｌ／Ｌ  水酸化ナトリウム水溶液１０．４ｇ（１９．３ｍｍｏｌ）を内温２５℃付近で５分間かけて滴下した。６時間撹拌した後、分液して得られた水層を外温８０℃で加熱した。８時間加熱した後、溶液にメチルｔ−ブチルエーテル２２．０ｇを添加した。得られた溶液を１０分間撹拌した後、有機層を分離して除去し、水層を液量８０ｍｌとなるまで減圧濃縮した。得られた溶液を内温２５℃付近に調整し、予め酢酸カルシウム１水和物３．５ｇと脱塩水２０ｇを混合した溶液を２５分かけて滴下した。得られたスラリーを、内温２５℃付近で１時間撹拌し、０〜５℃まで冷却した後、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を温度４０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は８．８ｇ（収率９１％）で、水分を０．９％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の結晶の化学純度は９９．９５面積％で、前記一般式（１２）で表される化合物である、７−（４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（メタンスルホニルメチルアミノ）ピリミジン−５−イル）−５−ヒドロキシ−３−オキソ−６−ヘプテン酸ｎ−プロピルエステル（以下、「５−ＭＯＬＡ」）は０．０２面積％、ＤＥＮＫは９１ｐｐｍ含まれていた。乾燥後のＤＯＬＰの分析結果と比較すると、５−ＭＯＬＡの含有量が減少し、１／２０になっていることがわかる。
【０２９５】
［実施例１５］
（ＲＳＶ−Ｃａの精製）
窒素雰囲気下、５００ｍｌフラスコに、５−ＭＯＬＡを０．０９面積％含むロスバスタチンカルシウム７．５ｇ、メチルｔ−ブチルエーテル３２．６ｇ及び水２２．２ｇを仕込み、そこに、１Ｎ塩酸１５．８ｇを添加して溶解させた。得られた溶液を２．５時間撹拌した後、静置して分液した。得られた有機層に水２９．４ｇと２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液８．４ｇを添加した。１０分間撹拌した後、静置して分液した。得られた水層を外温８０℃にて加熱しながら、３４時間撹拌した。その後、室温まで冷却しメチルｔ−ブチルエーテル３８ｍｌにて抽出を２回実施した。得られた水層を外温５０℃にて減圧濃縮を行った。その後、濃縮液に酢酸を添加し、系内のｐＨを７．５に調整した。外温を２０℃に設定後、酢酸カルシウム１水和物２．７ｇと水１４．８ｇを混合した溶液を３０分かけて滴下した。その後、外温を０℃まで冷却後、析出した結晶をろ取した。回収した結晶を外温４０℃、減圧下で乾燥させた。
得られた結晶は６．７ｇ（収率８９％）で、水分を０．３％含んでいた。ＨＰＬＣで分析した結果、得られたロスバスタチンカルシウム（ＲＳＶ−Ｃａ）の結晶の化学純度は９９．９４面積％で、５−ＭＯＬＡは０．０２面積％含まれていた。仕込み時のロスバスタチンカルシウムの分析結果と比較すると、５−ＭＯＬＡの含有量が減少し、１／５になっていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０２９６】
本発明は、極低温反応や高価な不斉触媒を使用することなく、経済的な条件で高純度のロスバスタチンカルシウム及びその中間体を、工業的規模において効率的に生産する方法を提供できる。
【０２９７】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−２１７６９、特願２０１４−２０９１４２及び特願２０１４−２０９４８０を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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