(57)【要約】      （修正有）【課題】C1エラスターゼインヒビター欠損に付随する血管浮腫を治療するための新規な長期持続的な治療アプローチを提供する。【解決手段】ヒトC1エステラーゼインヒビター又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを開示する。また、該ベクターを含む組成物及び該ベクターを用いて遺伝性血管浮腫を治療又は予防する方法を開示する。【選択図】図１
2019205473.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトC1エステラーゼインヒビター(C1EI)をコードする核酸配列又はヒト第XII因子をコードする核酸配列、又はその両方に作動可能に連結したプロモーターを含むベクター。
【請求項２】
ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス又はプラスミドである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ベクターがAAVベクターである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
AAVベクターが非ヒトアデノ随伴ウイルスである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
非ヒトアデノ随伴ウイルスが、アカゲザルアデノ随伴ウイルスである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
アカゲザルアデノ随伴ウイルスがアデノ随伴ウイルス血清型rh.10である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
プロモーターが構成的に活性なプロモーターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
プロモーターが細胞種特異的プロモーターである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
プロモーターがニワトリβ-アクチンプロモーターである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】
ベクターが配列番号１を含むポリペプチドをコードするC1EIをコードする核酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
ベクターが配列番号３を含むポリペプチドをコードする第XII因子をコードする核酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のベクター及び医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
哺乳動物における機能的な血漿C1エステラーゼインヒビターの欠損の治療、又はその任意の症状の治療もしくは予防方法であって、請求項１〜１２のいずれかに記載のベクターを該哺乳動物に投与し、それによって核酸が発現しタンパク質を産生する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物が遺伝性血管浮腫を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該方法が哺乳動物における粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は軽減する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
組成物を、浮腫の発症前及び／又は発症後に１回哺乳動物に投与する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
組成物を、浮腫の発症前及び／又は発症後に２回以上哺乳動物に投与する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
組成物を予防的に哺乳動物に投与する、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物がヒトである、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
組成物を、口内、筋肉内、経皮、静脈内、動脈内、皮下、皮内及び腹腔内からなる群より選択される投与経路により哺乳動物に投与する、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト遺伝性血管浮腫のモデルとなる組換えマウスであって、該マウスにおけるC1EI活性を、SERPING1変異を有しない同型のマウスと比較して低下させるSERPING1の変異を含む、組換えマウス。
【請求項２３】
組換えマウスがSERPING1の第3エキソンに変異を含む、請求項２２に記載の組換えマウス。
【請求項２４】
哺乳動物における機能的な血漿C1エステラーゼインヒビターの欠損の治療、又はその任意の症状の治療もしくは予防のための組成物であって、該哺乳動物に対する請求項１〜１２のいずれかに記載のベクターを含む、組成物。
【請求項２５】
哺乳動物が遺伝性血管浮腫を有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
方法が哺乳動物における粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は軽減する、請求項２４又は２５に記載の組成物。
【請求項２７】
組成物が、浮腫の発症前及び／又は発症後に１回哺乳動物に投与するためのものである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
組成物が、浮腫の発症前及び／又は発症後に２回以上哺乳動物に投与するためのものである、請求項２６又は２７に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が予防的に哺乳動物に投与するためのものである、請求項２４〜２８のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
組成物が、口内、筋肉内、経皮、静脈内、動脈内、皮下、皮内又は腹腔内投与により投与されるためのものである、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、2015年5月28日に出願された合衆国仮特許出願第62/167,603号、2016年4月18日に出願された合衆国仮特許出願第62/324,183号及び2016年5月27日に出願された合衆国特許出願第15/167,729号の利益を主張し、ここで参照することにより、それらは本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された材料の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下のとおり：2016年5月27日に作成された「724068_ST25.TXT」と名付けられた1つの41,866バイトの ASCII (Text) ファイル、と特定されたコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
遺伝性血管浮腫（HAE）は、皮膚や上気道もしくは消化管の粘膜組織で最も頻繁に起こる腫れを繰り返すことにより特徴づけられる、稀少かつ生命を脅かす可能性のある遺伝的状態である(例えば、Banerji, Ann Allergy Asthma Immunol, 111: 329-336 (2013) 及びAygoren-Pursun et al., Orphanet J Rare Dis.,9: 99 (2014)を参照)。この疾患は常染色体優性形式で遺伝し、10,000人に1人から15,000人に1人が罹患する。HAE(I型及びII型)の根本原因は、第11番染色体に位置するC1エステラーゼインヒビター遺伝子(C1EI遺伝子又はSERPING1遺伝子)における変異の常染色体優性遺伝に帰する。HAE症例の85%は、C1エステラーゼインヒビターの産生量が不足するI型である(例えば、Gower et al., World Allergy Organ J., 4: S9-S21 (2011); Cungo et al., Trends Mol Med, 15: 69-78 (2009); Gooptu et al., Annu Rev Biochem, 78: 147-176 (2009); 及びZuraw et al., J Allergy Clin Immunol Pract, 1: 458-467 (2013)を参照)。残りの症例は機能不全のC1エステラーゼインヒビターの発現により特徴づけられる。
【０００４】
HAEに付随する発作の頻度、持続及び重篤度は多様であり、患者の30%は月1回超の発作頻度を訴え、40%は年6〜11回の発作を訴え、残りの30%はあまり症状を示さない。通常、症状は一過性であり、12〜36時間にわたって進行し2〜5日内で収まるが、1週間まで続く発作もあり得る。HAE発作は自己制御されるが、予期せぬ発作の発生は患者に相当の負担を課し、しばしば生活の質に多大な影響を及ぼし、命にかかわる場合もある。
【０００５】
今のところ、治療剤は、長期予防、急性発作の治療及び短期予防（即ち、歯科手術前）に適応されており、高い副作用プロファイルを有するダナゾール、C1インヒビター代替タンパク質、ブラジキニン受容体アンタゴニスト、カリクレインインヒビター、新鮮凍結血漿及び精製C1インヒビター等の薬剤が挙げられる。これらの治療薬は症状を緩和し、生活の質を最大化することはできるが、病気の再発と長期継続投与が必要なことは、依然として治療への大きな障害である(例えば、Aberer, Ann Med, 44: 523-529 (2012); Charignon et al., Expert Opin Pharmacother, 13: 2233-2247 (2012); Papadopoulou-Alataki, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 10: 20-25 (2010); Parikh et al., Curr Allergy Asthma Rep, 11: 300-308 (2011); Tourangeau et al., Curr Allergy Asthma Rep, 11: 345-351 (2011); Bowen et al., Ann Allergy Asthma Immunol, 100: S30-S40 (2008); Frank, Immunol Allergy Clin North Am, 26: 653-668 (2006); Cicardi et al., J Allergy Clin Immunol, 99: 194-196 (1997); Kreuz et al., Transfusion 49: 1987-1995 (2009); Bork et al., Ann Allergy Asthma Immunol, 100: 153-161 (2008); and Cicardi et al., J Allergy Clin Immunol, 87: 768-773 (1991)を参照)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、C1エラスターゼインヒビター欠損に付随する血管浮腫を治療するための新規な長期持続的な治療アプローチが必要である。本発明は血管浮腫を治療するためのそのような治療アプローチを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の簡単な要約
本発明は、ヒトC1エラスターゼインヒビター（C1EI）をコードする核酸配列又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含むベクターを提供する。本発明はまた、該ベクターを含有する組成物及び該ベクターを用いて哺乳動物における血漿C1エステラーゼインヒビターの欠損を治療する方法、あるいはその任意の症状を治療もしくは予防する方法を提供する。さらに、本発明は、ヒト遺伝性血管浮腫のモデルとなる組換えマウスを提供する。該組換えマウスは、SERPING1変異を有しない同型のマウスと比較して、該マウスにおけるC1EI活性が低下するSERPING1変異を含む。
【０００８】
図面のいくつかの表示の簡単な説明
本特許又は出願ファイルは少なくとも1つのカラーで作製した図面を含む。カラー図面付きの本特許又は特許出願の公開の写しは、請求及び必要な手数料の支払いにより、庁より提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、SERPING1 E3を標的化した変異により作製されたC1EI欠損のS63マウスモデルの作製に用いた方法の模式図である。野生型及び変異S63のDNA配列は、それぞれ配列番号５及び６に対応する。
【図２Ａ】図２Ａは、野生型及びS63 SERPING1+/-ヘテロ接合型マウスにおけるC1EIのレベルを示すグラフである。変異S63及び野生型C1EIレベルをELISAにより測定した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、野生型及びS63 SERPING1+/-ヘテロ接合型マウスにおけるブラジキニンレベルを示すグラフである。変異S63及び野生型ブラジキニンレベルをELISAにより測定した。
【図３Ａ】図３Ａは、AAV2逆位末端反復(ITR)、カプシド形成シグナル(ψ)、CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、最適化したヒトC1EI (hC1EI) cDNA及びウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルを描写した、AAVrh.10hC1EI、AAV8hC1EI又はAAV9hC1EIベクターの模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、HEK293T細胞におけるAAV-hC1EIプラスミドにコードされたhC1EIの発現を示すウェスタンブロット像である。
【図４Ａ】図４Ａは、野生型C57Bl/6アルビノマウス(n=5/群)へのAAVrh.10hC1EIベクターの単回静脈内投与後のヒトC1EIの長期発現を示す実験データのグラフである。
【図４Ｂ−Ｄ】図４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、C57Bl/6アルビノ(図４Ｂ)、C57Bl/6(図４Ｃ)マウス(n=4-5マウス/群)はS63(図４Ｄ)マウスへの、1010 gc AAVrh.10hC1EI、1011 gc AAVrh.10hC1EI、1011AAVrh.10hα1AT(コントロール)又はPBSの単回静脈内投与後のヒトC1EIの用量依存的な長期発現を示す実験データのグラフである。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、C57/Bl/6マウス(n=5 雄/群、n=5 雌/群、PBS投与をコントロールとした)への、1011 gc AAV8hC1EI(図５Ａ)、AAV9hC1EI(図５Ｂ)又はAAVrh.10hC1EI(図５Ｃ)の単回静脈内投与後のヒトC1EIの長期発現を示す実験データのグラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ａ−５Ｃからのデータを組み合わせたグラフである。
【図６】図６は、S63及びコントロール野生型B6(Cg)-Tyrc-2J/Jマウス(S63マウス: n=4 雄/群、n=4 雌/群; B6(Cg)-Tyrc-2J/Jマウス: n=4 雄/群、n=4 雌/群)における、AAVrh.10hC1EIの単回投与後2週間のヒトC1EI活性の変化を示す実験データのグラフである。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、S63 SERPING1+/-マウスのAAVrh.10hC1EIによる治療効果を示す。S63 SERPING1+/-マウスにAAVrh.10hC1EIを投与してから2週間後に、エバンスブルー染料を尾静脈注射により投与し、30分後にマウスを撮影した。図７Ａは、S63ヘテロ接合型非処置マウス及びS63ヘテロ接合型AAVrh.10hC1EI処置マウス(n=4 雄、n=4 雌)の後足における該青色染料を示す。図７Ｂは、S63ヘテロ接合型非処置マウス及びS63ヘテロ接合型AAVrh.10hC1EI処置マウス(n=4 雄、n=4 雌)の鼻における該青色染料を示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、S63 SERPING1+/-マウスのAAVrh.10hC1EIによる治療効果を示す。S63 SERPING1+/-マウスにAAVrh.10hC1EIを投与してから6週間後に、エバンスブルー染料を尾静脈注射により投与し、30分後にマウスを撮影した。図８Ａは、S63ヘテロ接合型非処置マウス及びS63ヘテロ接合型AAVrh.10hC1EI処置マウス(n=4 雄、n=4 雌)の後足における該青色染料を示す。図８Ｂは、S63ヘテロ接合型非処置マウス及びS63ヘテロ接合型AAVrh.10hC1EI処置マウス(n=4 雄、n=4 雌)の鼻における該青色染料を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｆは、SERPING1+/-S63 AAVrh.10hC1EI処置マウス及びAAVrh.10hC1EI非処置マウス(n=5/群)の、後足(図９Ａ)、腎臓(図９Ｂ)、腸(図９Ｃ)、肺(図９Ｄ)、脾臓(図９Ｅ)及び心臓(図９Ｆ)における血管透過性応答の定量的な染料重量の実験結果のグラフである。
【図１０】図１０は、SERPING1+/-S63非処置マウス(n=4 雌、n=4 雄)及びS63 SERPING1+/- AAVrh.10hC1EI処置マウス(n=4 雄、n=4 雌)の血管透過性応答の分光光度分析を示す実験結果のグラフである。B6(Cg)-Tyrc-2J/J野生型の処置及び非処置マウスをコントロールとした(n=2 雌、n=2 雄)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも幾分は、安全にヒトに投与され、治療導入遺伝子の持続的発現を提供するというベクターの能力に基づいている。本発明は、ヒトC1エステラーゼインヒビター(C1EI)をコードする核酸配列又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む、から実質的になる、あるいは、からなるベクターを提供する。本発明のベクターが、C1EIをコードする核酸配列又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターから実質的になる場合、該ベクターに実質的に影響を与えない付加的構成要素（例えば、ポリ(A)配列又はインビトロでのベクターの操作を容易にする制限酵素部位等の遺伝的構成要素）を含み得る。該ベクターが、C1EIをコードする核酸配列又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターから実質的になる場合、該ベクターはいかなる付加的構成要素（即ち、該ベクターに内在せず、それによって該タンパク質を提供する該核酸配列の発現をもたらすのに必要でない構成要素）も含まない。
【００１１】
本発明のベクターは、当該技術分野で公知の任意の遺伝子導入ベクターを含む、から実質的になる、あるいは、からなることができる。そのようなベクターの例として、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びプラスミドが挙げられる。好ましい実施態様において、該ベクターはAAVベクターである。
【００１２】
アデノ随伴ウイルスはパルボウイルス科のメンバーであり、約5,000ヌクレオチド未満の線状の一本鎖DNAゲノムを含む。AAVは、効率的な複製のために、ヘルパーウイルス(即ち、アデノウイルス又はヘルペスウイルス)の共感染又はヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療核酸の投与に用いられるAAVベクターは、通常、親ゲノムのおよそ96%を欠失しており、DNA複製及びパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復(ITR)しか残っていない。これにより、ウイルス遺伝子の発現による免疫学的又は毒性の副作用が取り除かれる。さらに、所望により、産生細胞に特定のAAVタンパク質を送達することにより、細胞ゲノムの特定の領域へのAAV ITRを含むAAVベクターの組込みが可能となる(例えば、合衆国特許第6,342,390号及び第6,821,511号を参照)。組み込まれたAAVゲノムを含む宿主細胞は、細胞増殖や形態における変化はない(例えば、合衆国特許第4,797,368号を参照)。
【００１３】
AAV ITRは、非構造的な複製(Rep)タンパク質及び構造的なカプシド(Cap)タンパク質(ビリオンタンパク質(VP)としても知られる)のユニークなコーディングヌクレオチド配列の側に位置する。末端の145ヌクレオチドは自己相補的で、T字形のヘアピンを形成するエネルギー的に安定は分子内二重鎖を形成し得るように構成されている。これらのヘアピン構造は、細胞のDNAポリメラーゼ複合体のプライマーとして働くことにより、ウイルスDNAの複製起点として機能する。Rep遺伝子は、Repタンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40をコードする。Rep78とRep68はp5プロモーターから転写され、Rep52とRep40はp19プロモーターから転写される。Rep78とRep68は、生産的複製の間ヘリカーゼ及びニッカーゼ機能を発揮し、AAV末端の解離を可能にする多機能のDNA結合タンパク質である(例えば、Im et al., Cell, 61: 447-57 (1990)を参照)。これらのタンパク質はまた、内在性AAVプロモーター及びヘルパーウイルス内のプロモーターからの転写を制御する(例えば、Pereira et al., J. Virol., 71: 1079-1088 (1997)を参照)。その他のRepタンパク質はRep78及びRep68の機能を修飾する。cap遺伝子はカプシドタンパク質VP1、VP2及びVP3をコードする。該cap遺伝子はp40プロモーターから転写される。
【００１４】
本発明のAAVベクターは、当該技術分野で公知の任意のAAV血清型を用いて作製することができる。いくつかのAAV血清型及び100を超えるAAVバリアントがアデノウイルスストック又はヒトもしくは非ヒト霊長類の組織から分離されている(例えば、Wu et al., Molecular Therapy, 14(3): 316-327 (2006)において総説されている)。一般的に、AAV血清型は、核酸配列及びアミノ酸配列レベルで顕著なホモロジーのあるゲノム配列を有しており、異なる血清型は同一の一連の遺伝的機能を有し、本質的に物理的かつ機能的に同等のビリオンを産生し、実質的に同一のメカニズムで複製し会合する。AAV血清型1-6及び7-9は、それらが他のすべての既存の特徴づけられた血清型に特異的な中和血清とも効率よく交差反応しない点において、「真の」血清型として定義されている。対照的に、AAV血清型6、10(Rh10ともいう)及び11は、それらが「真の」血清型の定義に忠実ではないので、「バリアント」血清型であるとみなされている。AAV血清型2(AAV2)は、病原性がないこと、感染域が広いこと及び長期間導入遺伝子の発現を確立できることから、遺伝子治療応用に広く用いられている(例えば、Carter, B.J., Hum. Gene Ther., 16: 541-550 (2005); 及びWu et al., 上述を参照)。種々のAAV血清型のゲノム配列及びそれらの比較が、例えば、GenBankアクセッション番号U89790、J01901、AF043303及びAF085716; Chiorini et al., J. Virol., 71: 6823-33 (1997); Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-64 (1983); Chiorini et al., J. Virol., 73: 1309-1319 (1999); Rutledge et al., J. Virol., 72: 309-319 (1998); 及びWu et al., J. Virol., 74: 8635-47 (2000)に開示されている。
【００１５】
AAVのrep及びITR配列は、ほとんどのAAV血清型にわたって特に保存されている。例えば、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4及びAAV6のRep78タンパク質は、報告によると約89-93%同一である(Bantel-Schaal et al., J. Virol., 73(2): 939-947 (1999)を参照)。AAV血清型2、3A、3B及び6は、ゲノムレベルで約82%の全ヌクレオチド配列同一性を共有すると報告されている(Bantel-Schaal et al., 上述)。さらに、多くのAAV血清型のrep配列及びITRは、哺乳動物細胞内でのAAV粒子の産生の間、他の血清型由来の対応する配列を効率よく交差相補する（即ち、機能的に代替する）ことが知られている。
【００１６】
一般的に、AAV粒子の細胞指向性を決定するcapタンパク質及び関連するcapタンパク質コード配列は、異なるAAV血清型間でRep遺伝子よりも有意に保存されていない。Rep及びITR配列が他の血清型の対応する配列を交差相補し得ることを考慮すれば、AAVベクターは複数の血清型の混合物を含むことができ、それにより「キメラ」又は「偽型」AAVベクターであり得る。キメラAAVベクターは、通常、2以上(例えば、2、3、4、その他)の異なるAAV血清型由来のAAVカプシドタンパク質を含む。対照的に、偽型AAVベクターは、別のAAV血清型のカプシド中にパッケージングされた1つのAAV血清型の1以上のITRを含む。キメラ及び偽型AAVベクターは、例えば、合衆国特許第6,723,551号; Flotte, Mol. Ther., 13(1): 1-2 (2006); Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11854-11859 (2002); De et al., Mol. Ther., 13: 67-76 (2006); 及びGao et al., Mol. Ther., 13: 77-87 (2006)に、さらに記載されている。
【００１７】
一実施態様において、AAVベクターは、ヒトに感染するAAV(例えば、AAV2)を用いて作製される。好ましい実施態様において、ヒトに感染するAAVを用いて作製されたAAVベクターは、AAV8又はAAV9である。あるいは、AAVベクターは、例えば、大型ザル(例えば、チンパンジー)、旧世界ザル(例えば、マカク)及び新世界ザル(例えば、マーモセット)等の非ヒト霊長類に完全するAAVを用いて作製される。好ましくは、該AAVベクターは、ヒトに感染するAAVで偽型化した非ヒト哺乳動物に感染するAAVを用いて作製される。そのような偽型AAVベクターの例は、例えば、Cearley et al., Molecular Therapy, 13: 528-537 (2006)に記載されている。一実施態様において、AAV2逆位末端反復(ITR)で偽型化した、アカゲザルに感染するAAV由来のカプシドタンパク質を含むAAVベクターを作製することができる。特に好ましい実施態様において、本発明のAAVベクターは、AAV10由来のカプシドタンパク質(「AAVrh.10」ともいう)を含み、これはAAV2 ITRで偽型化されたアカゲザルに感染するものである(例えば、Watanabe et al., Gene Ther., 17(8): 1042-1051 (2010); 及びMao et al., Hum. Gene Therapy, 22: 1525-1535 (2011)を参照)。
【００１８】
本発明のベクターは、ヒトC1EIをコードする核酸配列又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む。DNA領域は、それらが互いに機能的に関連する場合に「作動可能に連結」している。プロモーターは、それがコード配列の転写を制御すれば、該配列に「作動可能に連結」している。
【００１９】
「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域である。様々な異なるソース由来の数多くのプロモーターが、当該技術分野において周知である。プロモーターの代表的なソースとしては、例えば、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母及び細菌が挙げられ、これらのソースから適切なプロモーターが容易に入手可能であり、あるいは、例えばATCC等の寄託機関及び他の商業的もしくは個人的な供給先から、公共に入手可能な配列に基づいて、合成的に製造することができる。プロモーターは、一方向性(即ち、一方法に転写を開始する)であっても、双方向性(即ち、3’もしくは5’方向のいずれにも転写を開始する)であってもよい。
【００２０】
本発明のベクターのプロモーターは、当該技術分野で公知の任意のプロモーターを含む、から実質的になる、あるいは、からなることができる。そのようなプロモーターのクラスの例としては、構成的に活性なプロモーター(例えば、ヒトβ-アクチン、ニワトリβ-アクチン、サイトメガロウイルス(CMV)及びSV40)、細胞種特異的プロモーター(例えば、CD19遺伝子プロモーター、CaMKIIa及びUAS)又は誘導プロモーター(例えば、Tetシステム(合衆国特許第5,464,758号及び第5,814,618号)、エクジソン誘導システム(No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996))、T-REXTMシステム(Invitrogen, Carlsbad, CA)、Cre-ERTタモキシフェン誘導リコンビナーゼシステム(Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); 合衆国特許第7,112,715号; 及びKramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)及びLACSWITCHTMシステム(Stratagene, San Diego, CA))が挙げられる。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様において、プロモーターは構成的に活性なプロモーター、誘導プロモーター又は細胞種特異的プロモーターである。本発明のより好ましい実施態様において、プロモーターは構成的に活性なプロモーターであり、好ましくは、構成的に活性なプロモーターは、ニワトリβ-アクチンプロモーターである。
【００２２】
「核酸配列」は、DNA又はRNAのポリマー、即ち、ポリヌクレオチド包含することを意図しており、それは一本鎖又は二本鎖であっても、非天然の又は改変されたヌクレオチドを含んでもよい。本明細書において用いられる用語「核酸」及び「ヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド(RNA)又はデオキシリボヌクレオチド(DNA)のいずれかの多量体をいう。これらの用語は当該分子の一次構造をいい、従って、二本鎖及び一本鎖DNA、並びに二本鎖及び一本鎖RNAを含む。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類縁体から製造されるRNA又はDNAのいずれかの類縁体、並びに、メチル化及び／又はキャッピングされたポリヌクレオチド等の、しかしそれらに限定されない修飾ポリヌクレオチドを含む。
【００２３】
本発明のベクターのプロモーターに作動可能に連結する核酸配列は、遺伝子血管浮腫を有する哺乳動物における粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は低減する治療遺伝子をコードする任意の核酸配列を含み得る。該核酸配列は、好ましくは、ヒトC1EI又は第XII因子をコードする。好ましくは、該核酸配列は全長ヒトC1EIタンパク質をコードするが、該核酸配列は、産生するタンパク質が全長タンパク質の機能的特性(例えば、補体系の阻害)を維持する限り、バリアントや切断物コードしていてもよい。該核酸配列はまた、活性なタンパク質、例えばヒトC1EI、第XII因子、又は遺伝子血管浮腫を有する哺乳動物における粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は低減する任意の治療遺伝子と、該活性なタンパク質の特性(例えば、効力、溶解度又は半減期)を向上させる第二の部分、通常はタンパク質とで構成される融合タンパク質をコードしてもよい。該第二の部分の例は当該技術分野で公知であり、例えば、イムノグロブリンのFcドメインやポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。
【００２４】
C1EIは、血漿中を21-40mg/kg程度のレベルで循環するプロテアーゼインヒビターである。C1EIの主要な機能の1つは、古典的補体経路のC1r及びC1sプロテアーゼに結合してそれらを不活性化することにより、補体系を阻害して自発的活性化を防止することである。ヒトC1EIは、高度に糖鎖付加された500アミノ酸残基を有する一本鎖ポリペプチドを含み、通常は肝細胞、線維芽細胞、単球及び内皮細胞により製造される。ヒトC1EIは、第11番染色体上の11q11-q13.1に位置するSERPING1遺伝子によってコードされている。染色体11q11-q13.1はおおよそ1.5kbの長さであり、8つのコーディングエキソンを含む。ヒトC1EIのアミノ酸配列及び核酸配列、並びにヒトC1EIの機能バリアントは当該技術分野で周知である。C1EIタンパク質のアミノ酸配列及びC1EIタンパク質をコードする核酸配列の一例は、例えば、GenBankアクセッション番号: AAM21515.1(アミノ酸配列)(配列番号1)及びAF435921.1(核酸)(配列番号2)に見出すことができる。
【００２５】
第XII因子は血漿中を循環する凝固因子であり、III型遺伝性血管浮腫と関連する。第XII因子は、第XI凝固因子と相互作用することにより血液凝固カスケードの中で機能し、また炎症刺激においても役割を果たしている。第XII因子はF12遺伝子にコードされている。第XII因子のアミノ酸配列及び核酸配列、並びに第XII因子の機能バリアントは当該技術分野で周知であり、例えば、GenBankアクセッション番号: AAB59490.1(アミノ酸)(配列番号3)及びM11723.1(核酸)(配列番号4)に見出すことができる。
【００２６】
ヒトC1EI又は第XII因子をコードする核酸配列は、当該技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。例えば、核酸配列、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換えDNA技術を用いて、組換え生産することができる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rded., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照)。さらに、合成的に製造したヒトC1EI又は第XII因子をコードする核酸配列は、細菌、昆虫、又は、例えばラット、ヒト等の哺乳動物などのソースから単離及び／又は精製することができる。単離及び精製の方法は当該技術分野で周知である。あるいは、本明細書に記載される核酸配列は、商業的に合成され得る。この点において、核酸配列は、合成されても、組換え体であっても、単離及び／又は精製されてもよい。当該配列(例えば、配列番号1-4)は、mRNAの安定性を増大させるためや、変異mRNAによりトランスに阻害される可能性を低減させるために、さらに最適化することができる。
【００２７】
ヒトC1EI又は第XII因子をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターに加えて、ベクターは、好ましくは、宿主細胞内での該核酸配列の発現のために供される、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位(IRES)等の付加的な発現調節配列を含むことができる。発現調節配列の例は当該技術分野で公知であり、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990)に記載されている。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「エンハンサー」とは、例えば、それに作動可能に連結した核酸配列の転写を増大させるDNA配列をいう。エンハンサーは該核酸配列のコード領域から何キロベースも離れて位置することができ、調節因子の結合、DNAメチル化のパターン又はDNA構造の変化を媒介することができる。様々な異なるソース由来の数多くのエンハンサーが当該技術分野において周知であり、(例えば、ATCC等の寄託機関や他の商業的又は個人の供給先から)クローン化されたポリヌクレオチドとして、又はその中で入手可能である。(よく使用されるCMVプロモーターのように)プロモーターを含む多くのポリヌクレオチドは、エンハンサー配列も含んでいる。エンハンサーは、コード配列の上流、内部又は下流に位置することができる。ヒトC1EI又は第XII因子をコードする核酸配列は、CMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチンプロモーター(「CAGプロモーター」ともいう)に作動可能に連結され得る(例えば、Niwa et al., Gene, 108: 193-199 (1991); Daly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96: 2296-2300 (1999); 及びSondhi et al., Mol. Ther., 15: 481-491 (2007)を参照)。
【００２９】
本発明は、上記のベクター及び医薬上許容される(例えば、生理学上許容される)担体を含む、から実質的になる、あるいは、からなる組成物を提供する。該組成物が本発明のベクター及び医薬上許容される担体から実質的になる場合、該組成物に実質的な影響を与えない付加的構成要素(例えば、アジュバント、緩衝液、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、保存剤等)を含み得る。該組成物が本発明のベクター及び医薬上許容される担体からなる場合、該組成物はいかなる付加的構成要素も含まない。本発明に照らして任意の適切な担体を使用することができ、そのような担体は当該技術分野で周知である。担体の選択は、部分的には、該組成物が投与され得る特定の部位、並びに、該組成物を投与するのに用いる特定の方法により決定されるであろう。該組成物は、本明細書に記載されるベクターを例外として、任意で無菌であり得る。該組成物は、保存のために凍結又は凍結乾燥し、使用前に適切な無菌の担体内で再構成させることができる。該組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)に記載される慣用の技術に従って作製することができる。
【００３０】
該組成物の適切な剤形として、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤を含み得る水性又は非水性の溶液、等張の無菌溶液、並びに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存剤を含み得る水性又は非水性の無菌懸濁液が挙げられる。製剤は一回用量もしくは複数回用量をアンプルやバイアル等の密封した容器内に存在させることができ、使用直前に無菌の液状担体、例えば水、を添加することのみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)の状態で保存することができる。以前に記載した種類の無菌の粉剤、顆粒剤及び錠剤から溶液又は懸濁液を即時調製することができる。好ましくは、担体は緩衝生理食塩水溶液である。より好ましくは、本発明のベクターは、本発明のベクターを投与前の損傷から防ぐように処方された組成物中で投与される。例えば、該組成物は、ベクターを調製、保存又は投与するのに用いられる、ガラス製品、シリンジ又はニードル等のデバイス上でのベクターの損失を低減するように製剤化することができる。該組成物は、ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を低下させるように製剤化することができる。この目的のために、該組成物は、好ましくは、例えば、上記したような医薬上許容される液状担体、並びに、ポリソルベート80、L-アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース及びそれらの組み合わせからなる群より選択される安定化剤を含有する。そのような組成物を使用することにより、ベクターの保存可能期間が延長され、投与が容易になり、本発明の方法の効率が増大するであろう。ベクター含有組成物の処方は、例えば、Wright et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 6(2): 174-178 (2003)及びWright et al., Molecular Therapy, 12: 171-178 (2005)に、さらに記載されている。
【００３１】
該組成物はまた、導入効率を増強すべく製剤化することができる。さらに、本発明のベクターを他の治療的又は生物学的に活性な薬剤を含む組成物中に存在させることができると、当業者は理解するであろう。例えば、ベクターのインビボ投与に伴う腫れや炎症を低減させるために、イブプロフェンやステロイド等の炎症を制御する因子を該組成物の一部とすることができる。抗生物質、即ち殺菌剤及び防カビ剤を既存の感染の治療及び／又は遺伝子導入手順に伴う感染のような将来の感染リスクの低減のために存在させることができる。
【００３２】
本発明は、哺乳動物に本発明のベクターを投与することにより、核酸が発現して、粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は軽減し、あるいは遺伝性血管浮腫を予防又は治療するタンパク質を産生することを含む、遺伝性血管浮腫を有する哺乳動物における粘膜下又は皮下浮腫を阻害又は軽減する方法、あるいは哺乳動物における遺伝性血管浮腫の予防又は治療方法を提供する。好ましい実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００３３】
遺伝性血管浮腫の予防又は治療には、遺伝性血管浮腫によりもたらされるいかなる生理学的反応又は症状のいかなる程度の緩和も包含される。粘膜下又は皮下浮腫の阻害又は軽減には、粘膜下又は皮下浮腫のいかなる程度の緩和も包含される。
【００３４】
哺乳動物に該組成物を送達させるために、任意の投与経路を用いることができる。実際、該組成物を投与するために2以上の経路を用いることができるが、ある特定の経路は、他の経路よりも、より即時かつ有効な反応を提供することができる。好ましくは、該組成物は筋肉内注射により投与される。組成物はまた、体腔に塗布もしくは注入したり、経皮吸収させたり(例えば、経皮パッチ)、吸入したり、摂取したり、組織に局所適用したり、あるいは、例えば、静脈内、腹腔内、口内、皮内、皮下又は動脈内投与を通じて、非経口的に投与したりすることもできる。
【００３５】
該組成物は、スポンジ、生体適合性メッシュ、機械的貯留物又は機械的インプラント等の、放出制御又は持続放出を可能にするデバイス中又はデバイス上で投与することができる。埋め込み可能なデバイス(例えば、ポリマー組成物で構成される機械的貯留物もしくはインプラントもしくはデバイス)等のインプラント(例えば、合衆国特許第5,443,505号を参照)、デバイス(例えば、合衆国特許第4,863,457号を参照)は、AAVベクターの投与に特に有用である。該組成物はまた、例えば、発泡ゲル、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリリン酸エステル、ビス-2-ヒドロキシエチルテレフタレート(BHET)及び／又はポリ乳酸-グリコール酸等を含む、持続放出製剤(例えば、合衆国特許第5,378,475号を参照)の形態で投与することができる。
【００３６】
哺乳動物に投与される組成物中のベクターの用量は、哺乳動物のサイズ(重量)、任意の副作用の程度、特定の投与経路等を含む多くの要因に依存するだろう。好ましくは、本発明の方法は、本明細書に記載される本発明のベクターを含む諸生物を「治療上有効な量」投与することを含む。「治療上有効な量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を実現するのに有効な量をいう。治療上有効な量は、個体のアレルゲン感受性の程度、齢、性別及び体重、並びに個体において所望の応答を引き起こすベクターの能力等の要因に応じて変動し得る。
【００３７】
別の実施態様において、本発明の方法は、本発明のベクターを含む組成物を「予防上有効な量」投与することを含み得る。「予防上有効な量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果(例えば、免疫応答又はアレルギー反応の阻止)を実現するのに有効な量をいう。予防的投与を必要とする対象は、当該技術分野で公知の常套的な試験により容易に決定することができる。さらに、以前に遺伝性血管浮腫の発作を起こした対象を、将来の発作に対して予防的に処置することができる。
【００３８】
好ましい実施態様において、組成物は哺乳動物に一回投与される。該組成物の単回投与の結果、最少の副作用で、該哺乳動物におけるヒトC1EIの持続的発現を生じると信じられている。しかしながら、ある症例においては、該組成物に細胞を十分に曝露するのを確実にするために、治療的又は予防的処置期間の間に該組成物を複数回投与すること、及び／又は、複数の投与経路、例えば筋肉内と皮下とを用いることが適切であり得る。例えば、治療的又は予防的処置期間の間に、該組成物を2回以上(例えば、2、3、4、5、6、6、8、9又は10回以上)投与することができる。
【００３９】
特定の治療又は予防効果(即ち、アレルギー反応の軽減又は阻害)を達成するのに必要な組成物中のベクターの用量が、通常、細胞あたりのベクターゲノムコピー(gc/細胞)又はkg体重あたりのベクターゲノムコピー(gc/kg)の単位で投与される。当業者は、これらの、及び当該技術分野で周知の他の要素に基づいて、特定の免疫応答を有する患者を治療するのに適切な用量範囲を容易に決定することができる。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、もちろん、それらは本発明の範囲を何ら制限するものと解されるべきではない。
【実施例１】
【００４１】
本実施例は、C1EI欠損遺伝性血管浮腫マウスモデルの開発及び特性解析を示す。
【００４２】
clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)及びCRISPR-associated endonuclease 9 (Cas9)技術を用い、SEPING1の第3エキソン(E3)をターゲッティングしてC1EI欠損マウスモデルを開発した。所望の配列を標的化する合成の一本鎖ガイドRNA(sgRNA)が提供されると、Cas9エンドヌクレアーゼは、部位特異的DNA二重鎖切断(DSB)を生じるよう指示する。哺乳動物細胞において、Cas9切断により生じたDSBは、遺伝子内に挿入/欠失変異(InDel)を導入する、細胞の非相同末端結合(NHEJ)修復経路により修復され、そのことがフレームシフトを引き起こし、その結果nullアレルが生じる。我々は、この技術を利用して、マウスSERPING1遺伝子に標的化したnull変異を導入した。
【００４３】
CBA/J x B6/Jマウス由来のF1接合子に、SERPING1の第3エキソンを標的化する機能的な一本鎖ガイドRNAとCas9 mRNAとを同時注入した。2細胞期に胚を仮親に移植し、すべての仔について、SERPING1第3エキソンの挿入/欠失の存在を、T7エンドヌクレアーゼIに基づくPCR解析によりスクリーニングした。第3エキソンにInDelを有するマウスを繁殖及びさらなるDNAシーケンシングのために選択した。マウスを対(雌1匹と雄1匹)又は3匹(雌2匹と雄1匹)で、B6(Cg)-Tyrc-2J/Jマウス(B6アルビノマウス、Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)と繁殖させた。すべてのマウスは、マイクロアイソレーターケージ内で飼育し、標準的なガイドラインに従って維持した。
【００４４】
すべての第1子孫を、T7エンドヌクレアーゼI消化により第3エキソンの変異についてスクリーニングした。簡単にいうと、マウスのゲノムDNAを尾組織(尾端0.5cm)から抽出し、変異標的化領域をフランキングするプライマー(フォーワードプライマー, 5’-TTGCACGGCGGTCACTGGACACAGATAACT-3’(配列番号７); リバースプライマー, 5’-CAAGCGGCTCCGGGCAGAAAGGGTTCA-3’(配列番号８))を用いて、PCRにより増幅した。次いで、PCR産物を高温で変性させ、DNA二重鎖形成のために再アニーリングし、ミスマッチを有するDNA二重鎖(ヘテロ二重鎖)を切断するT7エンドヌクレアーゼI(T7E-I)を用いて消化した。変異を有するヘテロ二重鎖のT7EIによる消化の結果、アガロースゲル電気泳動により分離し得る2以上のより小さなDNA断片を生じる。
【００４５】
第3エキソンに変異を有するファウンダーヘテロ接合型マウスをゲノムDNAシーケンシングのために選択した。イソフルランガス下で麻酔したSERPING1ノックアウトマウスから尾端組織(0.5cm)を採取し、KAPA Express Extract DNA Extraction Kit (KAPA Biosytems; Wilmington, MA)を用いて、ゲノムDNA(gDNA)を抽出した。SERPING1遺伝子の標的化した第3エキソン領域をフランキングする特異的プライマー(フォーワードプライマー, 5’-TTGCACGGCGGTCACTGGACACAGATAACT-3’(配列番号７); reverse primer, 5’-CAAGCGGCTCCGGGCAGAAAGGGTTCA-3’(配列番号８))を用いてゲノムDNAを増幅した。PCR増幅は、Taqポリメラーゼと、KAPA2G Fast (HotStart) Genotyping Mix (KAPA Biosytems; Wilmington, MA)により供給される試薬とを用いて実施した。変性(95℃、30秒)、アニーリング(60℃、30秒)及び伸長(72℃、30秒)の各サイクルを35回繰り返した。得られたPCR産物をQIAGEN PCR Purification Kit (QIAGEN; Valencia, CA)を用いて精製し、DNAを50μlのEB緩衝液中に溶出し、DNAシーケンシング用のTOPOベクター中(Life Technologies, Norwalk, CT)にクローン化した。各変異体について複数のTOPOクローンをSanger技術によりシーケンシングし、CRISPR/Cas9に指示されたNHEJ DNA修復システムにより導入された変異を同定した。
【００４６】
この技術を用いて、我々は、SERPING1遺伝子の第3エキソンに異なる遺伝的バリアントを有する多くのマウスを作製した(図１)。これらのマウスの1つ(「S63」という)の特性を詳細に解析し、AAVrh.10hC1EI治療の有効性を実証するための、遺伝性血管浮腫のモデルとして使用した。S63マウスは出生時、外見上正常であり、その後正常に発生し繁殖した。
【００４７】
S63マウス血清中のマウスC1EI(mC1EI)レベルを、ELISA (Biomatik, Wilmington, DE)により、製造者の指示に従って評価した。S63マウス血清中のマウスブラジキニンレベルを、ELISA (MyBioSource, San Diego, CA)により、製造者の指示に従って評価した。ヒトC1EI(hC1EI)活性レベルを、該タンパク質がその天然の基質であるC1エステラーゼを阻害する能力を測定する発色活性アッセイ(TECHNOCHROM(登録商標) C1-INH [CE], DiaPharma Group, West Chester, OH)により評価した。簡単に言うと、該アッセイはC1エステラーゼ活性の阻害に基づいている。基質C1-1(C2H5CO-lys (ε-Cbo)-Gly-Arg-pNA)のC1エステラーゼ切断により、発色団para-ニトロアニリン(pNA)が遊離する。遊離したpNAのOD405nmにおける吸光度を測定すると、該吸光度は、血清又は血漿中に存在するC1エステラーゼインヒビターの濃度(活性)に反比例する。該活性アッセイを、製造者のプロトコルに従って行い、結果を機能単位(U/mL)として表した。すべての分析を二連で実施した。エバンスブルー染料(100μlリン酸緩衝生理食塩水中30 mg/kg; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を6-8週齢のマウスの尾静脈に注射した。エバンスブルー染料の注射から30分後に、後足及び鼻の写真を撮影した。マウスをCO2吸入により安楽死させた後、脚を除去し、拭き取り乾燥し、秤量した。1mlのホルムアルデヒドを用いて、エバンスブルー染料を55℃で一晩抽出し(等量)、600nmで分光光学的に測定した。
【００４８】
これらの研究の結果は、S63マウスにおけるC1EIレベルは野生型コントロールにおけるC1EIレベルよりも顕著に低下していること(図２Ａ)、及びブラジキニンレベルは、野生型コントロールに比べてS63マウスにおいて上昇していること(図２Ｂ)を示す。S63マウスモデルは遺伝性血管浮腫のインビボ動物モデルを提供することを示している。
【実施例２】
【００４９】
本実施例は、ヒトC1EIをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含むAAV-ベクターの設計及びインビトロ特性解析を示す。
【００５０】
発現カセットは、AAV2逆位末端反復(ITR)、カプシド形成シグナル(ψ)、ヒトC1EI cDNA配列に作動可能に連結したサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー ニワトリ-β-アクチンプロモーター(CAGプロモーター)及びウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルからなる(図３Ａ)。hC1EI cDNA配列は、mRNAの安定性を増大させ、変異mRNAによるトランスの阻害の可能性を低減させるために最適化した。hC1EI cDNAを、ヒトで偏ったコドンと、mRNA不安定エレメント; 低(<30%)もしくはリッチ(>80%)GC領域; コード領域内の翻訳開始配列; 及び潜在的なスプライシングシグナルの除去とを用いて、配列を最適化した。最適化されたhC1EI cDNAを最適なコザックコンセンサスとともに合成した。
【００５１】
最適化した全長ヒトC1EI cDNA配列を合成し、CAGプロモーターの制御下のpAAVプラスミドにクローン化した。ベクターの複製に必要なAAV2由来のAAV Repタンパク質、作製されるAAVベクターの血清型を規定するAAVrh.10ウイルス構造(Cap)タンパク質VP1、2及び3、及びアデノウイルスのヘルパー機能であるE2、E4及びVA RNAを担持するプラスミドとともに、pAAVプラスミドをヒト胚性腎293T細胞(HEK293T; アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)に同時トランスフェクションすることにより、AAV-hC1EIプラスミドを製造した。該AAV-hC1EIベクター(「AAVrh.10hC1EI」という)をイオジキサノール密度勾配及びQHP陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ベクターゲノム力価を定量的TaqManリアルタイムPCR解析により測定した。無関係のタンパク質をコードするベクターAAV-GFPを発現研究のためのコントロールとして使用した。
【００５２】
AAVrh.10hC1EIにより指示されるヒトC1EIタンパク質のインビトロでの発現を調べるために、HEK293T細胞をAAVrh.10hC1EIプラスミド又はコントロールプラスミドでトランスフェクトし、上清を72時間後に集めた。上清中のヒトC1EIの発現をクーマシーブルー染色SDS-PAGE及びペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体とペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ヒトC1EI抗体とを用いたウェスタン分析により評価した。図３Ｂに示すとおり、細胞培養上清においてヒトC1EIが検出された。本実施例の結果は、AAVベクターからのC1EIの発現を示している。
【実施例３】
【００５３】
本実施例は、野生型マウスにおけるAAVrh.10hC1EIの長期インビボ発現を実証する。
【００５４】
AAVrh.10hC1EIベクター処理後のヒトC1EIのインビボ血清での長期発現を評価するために、6-8週齢のC57Bl/6アルビノ、C57Bl/6又はSERPING+/- S63の雄性及び雌性マウスに、AAVrh.10hC1EIベクター、コントロールのAAVrh.10hα1ATベクター又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、1010又は1011ゲノムコピー(gc)、100μl容の静脈内注射により単回投与した。時刻0及び第20週までのマウスの様々な時点で尾静脈血を調べた。血液サンプルを23℃で1時間凝固させた後、13,000RPMで10分間遠心分離して血清を集めた。各サンプルにおけるヒトC1EIの活性を分析した。
【００５５】
AAV8hC1EIベクター、AAV9hC1EIベクター又はAAVrh.10hC1EIベクターで処理後のヒトC1EIのインビボ血清での長期発現を評価するために、6-8週齢のC57Bl/6雄性及び雌性マウスに、AAV8hC1EIベクター、AAV9hC1EIベクター、AAVrh.10hC1EIベクター又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のいずれかを、1010又は1011ゲノムコピー(gc)、100μl容の静脈内注射により単回投与した。時刻0及び第6週までのマウスの様々な時点で尾静脈血を調べた。血液サンプルを23℃で1時間凝固させた後、13,000RPMで10分間遠心分離して血清を集めた。各サンプルにおけるヒトC1EIの活性を分析した。
【００５６】
図４Ａに示すとおり、ヒトC1EIは実験の期間中（20週間）発現が示され、ベクター投与20週間後において、hC1EIの活性レベルは臨床的な閾値より大きかった(n=5 雄/群; n=5 雌/群)。さらに、図４Ｂおよび４Ｃに示すとおり、ヒトC1EIは実験の期間中(図４Ｂについては12週間及び図４Ｃについては24週間)用量依存的な発現が示され、hC1EIの活性レベルは、1011又は1010 gc AAVrh.10hC1EIで処理した雄性マウス及び1011 gc AAVrh.10hC1EIで処理した雌性マウスにおいて、各実験の期間中、臨床的な閾値よりも大きかった(n=5 雄/群; n=5 雌/群)。図４Ｄに示すとおり、ヒトC1EIは実験の期間中(6週間)発現が示され、ベクター投与6週間後において、hC1EIの活性レベルは臨床的な閾値よりも大きかった(AAVrh.10hC1EI処理 n=3 マウス/群; 治療なし(PBSコントロール) n=3 雄及び1 雌)。
【００５７】
図５Ａ-５Ｃに示すとおり、ヒトC1EIは実験の期間中(6週間)発現が示され、AAV8hC1EI、AAV9hC1EI又はAAVrh.10hC1EIのいずれかのベクター投与6週間後において、hC1EIの活性レベルは臨床的な閾値よりも大きかった(n=5 雄/群; n=5 雌/群)。さらに、図５Ｄに示すとおり、ヒトC1EIの活性は試験したベクターの各々について類似していた。
【００５８】
これらのデータは、AAV8hC1EI、AAV9hC1EI及びAAVrh.10hC1EIのそれぞれが、単回投与からヒトC1EIの長期発現を提供し得ることを実証するものである。
【実施例４】
【００５９】
本実施例は、遺伝性血管浮腫のマウスモデルにおけるAAVrh.10hC1EIの投与による遺伝性血管浮腫の治療を示す。
【００６０】
AAVrh.10hC1EIにより指示されるヒトC1EIタンパク質のインビボでの発現を調べるために、6-8週齢のS63 (SERPING1+/-)マウスに、AAVrh.10hC1EIを一回用量1011ゲノムコピー(gc)で投与した。100μl容の静脈内注射により行った。ベクター投与2週間後に尾静脈血(100μl)を調べた。血液サンプルを23℃で1時間凝固させた後、13,000RPMで10分間遠心分離して血清を集めた。n=4 雄及びn= 4雌において、2週間後にヒトC1EIの活性を測定した。ベクターで処理した(AAVrh.10hC1EIを1011 gcで)及び処理していない野生型B6(Cg)-Tyrc-2J/J (Jackson Labs)マウス(n=4 雄及びn= 4 雌)をコントロールとした。ベクター投与2及び6週間後に、エバンスブルー染料(リン酸緩衝生理食塩水100μl中30 mg/kg)を、マウスに尾静脈注射により投与した。エバンスブルー染料の注射から30分後に、鼻及び後足の写真を撮影した。マウスをCO2吸入により安楽死させた後、後足を除去し、拭き取り乾燥し、秤量した。等量の後足、腎臓、腸、肺、脾臓及び心臓から、1mlのホルムアルデヒドを用いて、エバンスブルー染料を55℃で一晩抽出し、600nmで分光光学的に測定した。ベクターで処理した(AAVrh.10hC1EIを1011 gcで)及び処理していない野生型B6(Cg)-Tyrc-2J/J (Jackson Labs)マウスをコントロールとした。
【００６１】
これらの研究の結果は、AAVrh.10hC1EI遺伝子導入から2週間後のhC1EI活性が、臨床的な正常閾値より大きいことを示した。B6(Cg)-Tyrc-2J/Jコントロールマウスにおいて同レベルhC1EI活性が観察された。非処理のマウス由来の血清においては、ヒトC1EIの活性は検出されなかった(図６)。非処理のS63雄性及び雌性マウスは、野生型マウスと比較して、血管透過性が顕著に増大していた。エバンスブルー染料注射後数分以内に鼻及び後足の青色着色を観察したところ、ベクター投与後2週間において、野生型マウスよりもS63マウスにおいて青色着色が非常に強かった(図７Ａ及び７Ｂ)。同様に、エバンスブルー染料注射後数分以内に鼻及び後足の青色着色を観察したところ、ベクター投与後6週間において、野生型マウスよりもS63マウスにおいて青色着色が非常に強かった(図８Ａ及び８Ｂ)。非処理のS63マウスは、AAVrh.10hC1EIで処理した群と比較すると、それらの後足及び鼻における染料の溢出が目視上より大きかった。染料の溢出は、B6(Cg)-Tyrc-2J/J野生型の処理及び非処理マウスにおいては同等であった。処理及び非処理のS63 SERPING1ヘテロ接合型マウスの定量的な漏出表現型を、主要臓器における染料の溢出を測定することにより決定した(図９Ａ-９Ｆ)。観察された表現型は、後足から抽出した染料の分光光度分析により認証した(図１０)。処理したマウスは、非処理のそれらの同腹子よりも、有意に(p<0.001 雄、p<0.008 雌)染料の溢出レベルが低かった。これらの結果は、AAVrh.10hC1EIベクターによる遺伝性血管浮腫の治療により、遺伝性血管浮腫の症状が顕著に軽減されることを示している。
【００６２】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が記載されているのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【００６３】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」及び同様の指示語の使用は、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。１以上の項目の一覧が後に続く用語「少なくとも１つ」の使用(例えば、「A及びBの少なくとも１つ」)は、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、列挙された項目から選択される１つ(A又はB)又は列挙された項目の2つ以上の任意の組み合わせ(A及びB)を意味すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、他に特に明記がない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書中で他に特に明記がない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に特に明記がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に特に主張されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に不可欠なものとして主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００６４】
本発明の実施に関して、本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書中に記載する。もちろん、それらの好適な実施態様のバリエーションは、上記の説明を読むと、当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予想し、そして本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたものとは別の状態で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組合わせは、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月12日(2019.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。