(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘニパウイルス病因の機構の研究において、比較病原研究に用いることができる、関連する非病原性または低病原性のウイルスを提供する。【解決手段】ヘニパウイルス属に属するであろうシダーウイルス（ＣｅｄＰＶ）と呼ばれる新規のウイルス、およびその使用方法を開示する。また、個々のタンパク質およびその断片、ならびにＣｅｄＰＶを構成する個々のタンパク質のコード配列を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，２００、１，２５０、１，３００、１，３５０、１，４００、１，４５０、１，５００、１，５５０、１，６００、１，６５０、１，７００、１，７５０、１，８００、１，８５０、１，９００、１，９５０、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、または１８，０００個の連続したヌクレオチドまたはその相補体のヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
分子がＤＮＡである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
宿主細胞が原核細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ポリペプチドを産生するための方法であって、タンパク質産生を促進する条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から前記ポリペプチドを単離することと、を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の核酸分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項１２】
単離されたポリペプチドであって、
ａ．配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＮタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｄ．配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＰタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｅ．配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｆ．配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｇ．配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＣタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｈ．配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉ．配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｊ．配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＭタンパクの質抗原性を有するポリペプチド、
ｋ．配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｌ．配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｍ．配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＦタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｎ．配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｏ．配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｐ．配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＧタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｑ．配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｒ．配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｓ．配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＬタンパク質の抗原性を有するポリペプチド、
ｔ．配列番号８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および、
ｕ．配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリペプチドまたはその相補体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記分子がＤＮＡである、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、タンパク質産生を促進する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと、培養物から前記ポリペプチドを単離することと、を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片であって前記ペプチドに特異的に結合する断片。
【請求項２３】
前記抗体が、モノクローナル抗体もしくはその断片、ポリクローナル抗体もしくはその断片、ヒト化抗体もしくはその断片、組換えにより産生された抗体もしくはその断片、またはキメラ抗体もしくはその断片である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＮタンパク質の抗原性を有するポリペプチドに特異的に結合する請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含むワクチン。
【請求項２５】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、パラミクソウイルスのＮタンパク質の抗原性を有するポリペプチドに特異的に結合する請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、シダーウイルス、または他のパラミクソウイルスの感染の治療用または予防用組成物。
【請求項２６】
試料中のパラミクソウイルスを検出する方法であって、配列番号１で示されるヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドからなる断片を含むプローブ又はプライマーを用いて検出する方法。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
【請求項２８】
前記ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項２７に記載の組換えウイルス。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、シダーウイルスと呼ばれる新規のウイルス、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘニパウイルスは、オーストラリアおよびマレーシアでの家畜およびヒトにおける病気の発生で１９９０年代に最初に発見された（１、２）。これらのウイルスは、パラミクソウイルス科の唯一の既知のバイオセーフティレベル４（ＢＳＬ４）剤を含み（３）、死亡率は、ウイルス、動物種、および発生の地理的位置に応じて、ヒトおよび動物の両方ともに４０％〜１００％である（４、５）。パラミクソウイルス亜科のヘニパウイルス属は、現在、これら両ウイルスの主な天然リザーバーと特定されている、一般にフオオコウモリとして知られているフルーツコウモリのヘンドラウイルス（ＨｅＶ）およびニパウイルス（ＮｉＶ）の２員のメンバーを含む。しかしながら、血清学的証拠は、ヘニパウイルスが他のタイプのコウモリ（７〜１０）においても循環し得ることを示唆する。
【０００３】
ヘニパウイルスの発見は、我々のパラミクソウイルスの総合的な理解に大きな影響を及ぼしている。実際、麻疹ウイルスおよびイヌジステンパーウイルスなどのパラミクソウイルスは、狭い宿主範囲を有し、パラミクソウイルスの全てのメンバーによって共有される均一なゲノムサイズに近く、遺伝的に安定していることで知られている（３）。しかしながら、ヘニパウイルスは、これらのウイルスがはるかに広い宿主範囲および著しく大きいゲノムを有するため、これらのパラダイムをシフトさせた（６）。
【０００４】
近年、ヘニパウイルスの研究で、機能細胞受容体を識別することに成功し、新しい診断、ワクチン、および治療法の開発を推進してきた（１５〜２５）。しかしながら、一つには生の感染症研究を行うために必要な高いセキュリティ（ＢＳＬ４）の施設の必要性により、また一つには現在の動物モデルで使用される利用可能な研究手段の限られた数により、これらの非常に致死的なウイルスの病因についてはほとんど理解されていない。ヘニパウイルス病因の機構の研究はまた、比較病原研究に用いることができる、関連する非病原性または低病原性のウイルスの欠如によって妨げられている。
【０００５】
中国や他の地域における最近の血清学的調査は、異種のコウモリにおけるヘニパウイルスへの、交差反応性だが必ずしも相互中和性でない抗体の存在を示した（８）。アフリカのコウモリにおけるヘニパウイルスのようなゲノム配列の検出は、血清学的調査から取得された結果を更に裏付ける（２６）。
【０００６】
本明細書に開示された本発明は、新たに発見されたヘニパウイルスの単離および特徴付けを対象とする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、シダーウイルスと呼ばれる新規のウイルス（「ＣｅｄＰＶ」）、およびその使用方法を対象とする。
【０００８】
本発明はまた、個々のタンパク質およびその断片、ならびにＣｅｄＰＶを構成する個々のタンパク質のコード配列を対象とする。
【０００９】
本発明はまた、ＣｅｄＰＶに特異的に結合する抗体または断片を対象とする。
【００１０】
本発明はまた、ＣｅｄＰＶの少なくとも一部を含むワクチンおよび／または他の治療用組成物を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】パラミクソウイルス亜科において既存の５種類の模範ウイルスのものと比較した、ＣｅｄＰＶのゲノムサイズおよび組織を示している。コーディングおよび非コーディング領域の各々は、一定の縮尺で描かれている。全てのパラミクソウイルスのゲノムに存在する６個の主要な遺伝子が、以下のように示される：影付き＝ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオカプシド遺伝子（Ｎ、Ｐ、およびＬ）、斜線＝包絡膜タンパク質遺伝子（Ｆおよび付着タンパク質）、点線＝マトリックスタンパク質（Ｍ）。ムンプスウイルスのゲノムにおける小さなものは、遺伝子（ＳＨ）が通常、亜科のメンバー間で共有されていないことを表す。
【図２】異なるヘニパウイルス間のゲノムの特徴の比較を示している。（Ａ）リーダおよびトレーラ配列の整列（アンチゲノム配列を示す）。（Ｂ）遺伝子間領域（ＩＧＲ）の配列、ならびにＨｅＶおよびｎｉＶのものと比較した、ＣｅｄＰＶの転写開始および停止部位。
【図３】選択したパラミクソウイルスの系統樹を示している。２Ａ：樹は、Ｎタンパク質配列のウイルス名（略称）に基づき、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は以下の通りである：トリパラミクソウイルス６（ＡＰＭＶ６）ＡＹ０２９２９９、大西洋サーモンパラミクソウイルス（ＡｓａＰＶ）ＥＵ１５６１７１、Ｂｅｉｌｏｎｇウイルス（ＢｅｉＰＶ）ＤＱ１００４６１、ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂＰＩＶ３）ＡＦ１７８６５４、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）ＡＦ０１４９５３、シダーウイルス（ＣｅｄＰＶ）ＪＱ００１７７６、Ｆｅｒドランスウイルス（ＦｄｌＰＶ）ＡＹ１４１７６０、ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）ＡＦ０１７１４９、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ｈＰＩＶ２）ＡＦ５３３０１０、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ｈＰＩＶ３）Ｚ１１５７５、ヒトパラインフルエンザウイルス４ａ（ｈＰＩＶ４ａ）ＡＢ５４３３３６、ヒトパラインフルエンザウイルス４ｂ（ｈＰＩＶ４ｂ）ＥＵ６２７５９１、Ｊウイルス（ＪＰＶ）ＡＹ９００００１、メナングルウイルス（ＭｅｎＰＶ）ＡＦ３２６１１４、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）ＡＢ０１６１６２、モスマンウイルス（ＭｏｓＰＶ）ＡＹ２８６４０９、Ｍａｐｅｕｒａウイルス（ＭｐｒＰＶ）ＥＦ０９５４９０、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）ＡＢ０００３８８、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ＡＦ０７７７６１、ニパウイルス、バングラデシュ菌株（ＮｉＶ−Ｂ）ＡＹ９８８６０１、ニパウイルス、マレーシア菌株（ＮｉＶ−Ｍ）ＡＪ６２７１９６、パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）ＡＦ０５２７５５、小反芻獣疫（ＰＰＲＶ）Ｘ７４４４３、ブタルブラウイルス（ＰｏｒＰＶ）ＢＫ００５９１８、牛疫ウイルス（ＲＰＶ）Ｚ３０６９７、セーラムウイルス（ＳａｌＰＶ）ＡＦ２３７８８１、センダイウイルス（ＳｅＶ）Ｍ１９６６１、シミアンウイルス４１（ＳＶ４１）Ｘ６４２７５、ティオマンウイルス（ＴｉｏＰＶ）ＡＦ２９８８９５、Ｔｕｐａｉａパラミクソウイルス（ＴｕｐＰＶ）ＡＦ０７９７８０。（Ｂ）樹は、全ゲノム配列に基づく。（Ｃ）樹は、Ｌ遺伝子の５５０ヌクレオチドの領域に基づく。
【図４】ＣｅｄＰＶ  Ｐ遺伝子の編集部位と比較した、ＨｅＶおよびＮｉＶ用のＰ遺伝子の編集部位のための配列決定トレースファイルを示している。トレースファイルは、感染細胞中のＨｅＶおよびＮｉＶ  Ｐ遺伝子（＊印で示される）の編集とＣｅｄＰＶ  Ｐ遺伝子のｍＲＮＡにおける編集の欠如とを示している。ＣｅｄＰＶのＰ遺伝子の全部の潜在的な編集部位に及ぶＰＣＲ産物の配列決定は、いかなるＲＮＡ編集活性も明らかにしなかった。ＣｅｄＰＶ  Ｐ遺伝子の代表的な潜在的編集部位が示されている。
【図５】ＣｅｄＰＶおよびＨｅＶの間の抗原交差反応性を示している。ＣｅｄＰＶおよびＨｅＶに感染したベロ細胞はそれぞれ、各ウイルスの組換えＮタンパク質に対して惹起されたウサギ血清で染色された。
【図６】他のパラミクソウイルスとのＣｅｄＰＶの抗原交差反応性を示している。それぞれのＪパラミクソウイルス（ＪＰＶ）、牛疫ウイルス（ＲＰＶ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、メナングルウイルス（ＭｅｎＰＶ）およびＣｅｄＰＶに感染ベロ細胞上の抗ＣｅｄＰＶ血清で実行される間接蛍光抗体（ＩＦＡＴ）アッセイ。偽感染細胞単層は、陰性制御として含められた。反応性を示す唯一のパネルは、ＣｅｄＰＶパネルである。
【図７】ＣｅｄＰＶのエントリ受容体としてエフリンＢ２およびＢ３の機能テストを示している。エフリン遺伝子産物の存在下および非存在下でのＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞中へのＣｅｄＰＶの感染が示されている。受容体機能の間接的測定としての感染の感受性は、合胞体細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成によって証明される。
【図８】ＣｅｄＰＶ感染フェレットの気管支リンパ節の免疫組織化学的分析を示している。６日目に安楽死させられたフェレット＃２の気管支リンパ節はそれぞれ、ＣｅｄＰＶ（Ｂ）およびＮｉＶ（Ｄ）の組換えＮタンパク質に対するウサギ抗血清で染色された。（別の実験からのインフルエンザＨ５Ｎ１に感染した）無関係なフェレットの気管支リンパ節は、陰性制御として使用され、同一の条件下で同じ抗ＣｅｄＰＶ（Ａ）および抗ＮｉＶ（Ｃ）抗血清で染色された。
【図９】ＨｅＶおよびＮｉＶ糖タンパク質とのＣｅｄＰＶ糖タンパク質媒介性細胞−細胞融合およびヘテロ型混合の結果を示している。種々の標的細胞集団が凡例に示されている。
【図１０】沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーによって分析した、単独でまたはＣｅｄＰＶ−ｓＧと予備混合された精製された可溶性エフリン−ＦＣタンパク質を示している。分離ｓＧがマークされ、異なるエフリンタンパク質パターンが言及される。ＣｅｄＰＶ−ｓＧおよびエフリンＢ２は、レーン３で共に近接で実行される。
【図１１】エフリン受容体構築物にトランスフェクトすることにより調製され、次いで、ＣｅｄＰＶ、Ｈｅｖ、ＮｉＶ  ＦおよびＧ糖タンパク質のいずれかを発現するエフェクタ細胞を用いた細胞−細胞融合アッセイで使用されるＨｅｌａ−ＵＳＵ標的細胞集団の結果、および標準的な融合レポータ遺伝子アッセイが行われたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、シダーウイルスと呼ばれる新規のウイルス（「ＣｅｄＰＶ」）、およびその使用方法を対象とする。本発明はまた、個々のタンパク質およびその断片、ならびにＣｅｄＰＶを構成する個々のタンパク質のコード配列を対象とする。
【００１３】
本発明者らは、特定のヘニパウイルス中で新規のパラミクソウイルスを単離した。十分に確立されているように、ヘニパウイルス属は、パラミクソウイルス科のウイルスに属し、ヘンドラウイルス（ＨｅＶ）およびニパウイルス（ＮｉＶ）の両方を含む。十中八九、新たに単離されたＣｅｄＰＶは、系統発生の研究に基づいたヘニパウイルス属に属するであろう（図３を参照されたい）。その分類に関わらず、本発明者らは、数ある特性の中でも、ＣｅｄＰＶがヘンドラウイルスと抗原特性を共有する新型ウイルスであることを本明細書で確立する。新たに発見されたＣｅｄＰＶは、ＲＮＡの一本鎖を含有するＲＮＡウイルスである。
【００１４】
ウイルスのゲノムは、配列番号１として本明細書に示される。
【００１５】
【表１】
2019205475.tif 000002
【００１６】
2019205475.tif 000003
【００１７】
2019205475.tif 000004
【００１８】
2019205475.tif 000005
【００１９】
2019205475.tif 000006
【００２０】
2019205475.tif 000007
【００２１】
本発明は、ＣｅｄＰＶゲノムに関連する核酸を提供する。具体的には、本発明は、配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１のポリヌクレオチドの断片（例えば、プライマーおよびプローブ）を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本明細書に開示された核酸のいずれかを含有するベクターを含む。本明細書で使用する「ベクター」は、多数の核酸のいずれかであり得、該核酸中で、所望の配列が、異なる遺伝子環境間の輸送のためのまたは宿主細胞における発現のための制限および連結により挿入され得る。ＲＮＡベクターもまた利用可能であるが、ベクターは、典型的には、ＤＮＡで構成される。ベクターとしては、プラスミドおよびファージミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができ、１個以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって更に特徴づけられ、該部位でベクターを判定可能な方法で切ることができ、該部位中に、新しい組換えベクターが宿主細胞中で複製する能力を保持するように所望のＤＮＡ配列を連結することができる。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内でプラスミドの複製数が増加するにつれ何
度も発生し得る、または宿主が有糸分裂によって繁殖する前に宿主毎に１回のみ発生し得る。ファージの場合、複製は溶菌相の間に能動的に、または溶原性相の間に受動的に発生し得る。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が、それが調節配列に作動可能に結合されてＲＮＡ転写物として発現され得るように、制限および連結により挿入され得るものである。ベクターは、ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞の識別および選択での使用に好適な１個以上のマーカー配列を更に含み得る。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対して耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当該技術分野で公知の標準的なアッセイにより検出される酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、ならびに形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に可視的に影響を与える遺伝子が挙げられる。ベクターの例としては、動作可能に結合されているＤＮＡセグメント中に存在する構造的遺伝子産物の自律複製および発現が可能なものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
上記の配列番号１のゲノム配列は、ＣｅｄＰＶのヌクレプラスミド（ｎｕｃｌｅｐｌａｓｍｉｄ）タンパク質（「Ｎタンパク質」）、リンタンパク質（「Ｐタンパク質」）、マトリックスタンパク質（「Ｍタンパク質」）、融合タンパク質（「Ｆタンパク質」）、糖タンパク質または付着タンパク質（「Ｇタンパク質」）、および大型タンパク質（「Ｌタンパク質」）をコードする。加えて、Ｐ遺伝子もまた、ＣｅｄＰＶのＣタンパク質をコードする。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において同義的にアミノ酸のポリマーを指す。
【００２５】
ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋な」という用語は、ポリペプチドが、それの意図された使用のために実用的かつ適切な程度に自然またはインビボ系において見出され得る他の物質を本質的に含まないことを意味する。具体的には、ポリペプチドは十分に純粋であり、その宿主細胞の他の生体成分を十分な程度に含まず、例えば、抗体を産生する、配列決定する、または医薬調製物を産生するのに有用である。当該技術分野で周知の技術によって、実質的に純粋なポリペプチドは、本明細書に開示された核酸およびアミノ酸配列に照らして産生され得る。本発明の実質的に精製されたポリペプチドが、医薬調製物中の薬学的に許容される担体と混合され得るので、ポリペプチドは、調製物の重量の一定割合のみを含み得る。それでもなお、ポリペプチドは、それが生物系において関連し得る物質から実質的に分離されているという点で実質的に純粋である。
【００２６】
核酸およびタンパク質に関して本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、その天然環境で見出されないことを意味し、これらの状況を含むが、これらに限定されない：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅される（ｉｉ）クローニングするおよび／または培養することによって組換え的に産生される（ｉｉｉ）開裂およびゲル分離によって精製される（ｉｖ）調製されたプラスミドまたは発現ベクターの一部である、または（ｖ）例えば、化学合成などによって合成される。単離された核酸は、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能なものである。したがって、ベクターに含まれるヌクレオチド配列であって、５’および３’制限部位がそれで知られているか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列がそれに関して開示されている、ベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されていると考えられるが、その自然宿主中にその天然状態で存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製されてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離された核酸は、それが常駐する細胞内物質の微小な割合のみを含み得るという点で純粋ではない。しかしながら、それは当業者に公知の標準的な技術により容易に操作されるため、この用語が本明細書で使用されるとき、このような核酸は単離されている。
【００２７】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｎタンパク質のコード配列は、位置１４４で始まり、１６７６で終了し、配列番号２に開示されているように５１０アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置１４４〜１６７３にあるヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００２８】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｎ−タンパク質の誘導体および断片を提供する。特に、本発明は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本明細書で使用されるとき、参照ポリペプチドの「誘導体」は、参照ポリペプチドと１００％未満のアミノ酸同一性を有するポリペプチドである。例えば、本発明は、本明細書に記載のＣｅｄＰＶ  Ｎタンパク質の誘導体を提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチドの断片を提供する。本明細書で使用されるとき、参照ポリペプチドの断片は、参照ポリペプチドの長さ未満の長さを有するポリペプチドである。この断片は、断片を含有する分子の全長が参照タンパク質を超えるように、キメラタンパク質などのより大きな分子内にあってもよい。配列番号２のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５０６、５０７、５０８、または５０９アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号２のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号２のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも約．．．４４０、４４５．．．アミノ酸長」）として、４４０〜４４５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００３０】
【表２】
2019205475.tif 000008
【００３１】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｐタンパク質のコード配列は、位置２１１２で始まり、４３２５で終了し、配列番号３に開示されているように７３７アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置２１１２〜４３２５にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｐ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号３のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３３】
配列番号３のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、または７３６アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号３のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号３のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約
７２０、７２５．．．アミノ酸長」）として、７２０〜７２５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００３４】
【表３】
2019205475.tif 000009
【００３５】
Ｃタンパク質のコード配列は、Ｐタンパク質をコードする配列内にあり、（配列番号１の）位置２１３７から始まり、位置２６７０で終了し、配列番号４に開示されているように１７７アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置２１３７〜２６７０にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００３６】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｃ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号４のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３７】
配列番号４のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１６６、１６７ｍ  １６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、または１７６アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号４のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号４のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約１４０、１４５．．．アミノ酸長」）として、１４０〜１４５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００３８】
【表４】
2019205475.tif 000010
【００３９】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｍタンパク質のコード配列は、位置４６３５で始まり、５７１７で終了し、配列番号５に開示されているように３６０アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置４６３５〜５７１７にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００４０】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｍ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号５のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００４１】
配列番号５のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、または３５９アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号５のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号５のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約２８０、２８５．．．アミノ酸長」）として、２８０〜２８５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００４２】
【表５】
2019205475.tif 000011
【００４３】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｆタンパク質のコード配列は、位置６４０５で始まり、８０７８で終了し、配列番号６に開示されているように５５７アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置６４０５〜８０７８にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００４４】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｆ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号６のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００４５】
配列番号６のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、または５５６アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号６のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号６のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約５１５、５２０．．．アミノ酸長」）として、５１５〜５２０アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００４６】
【表６】
2019205475.tif 000012
【００４７】
Ｆタンパク質の断片の一例は、ＣｅｄＰＶのＦ糖タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｆ糖タンパク質である。Ｆ糖タンパク質の可溶性形態は、Ｆ糖タンパク質の膜貫通および／または細胞質尾部ドメインの全部または一部を欠失することによって産生され得る。例を挙げると、可溶性Ｆ糖タンパク質は、ＣｅＰＶ  Ｆ糖タンパク質の完全な細胞外領域を含み得る。いくつかの実施形態において、可溶性Ｆ糖タンパク質は、配列番号６においてＫ４９０の後で切り捨てられ得る。また、例を挙げると、可溶性Ｆ糖タンパク質は、細胞外領域の全部または一部とＣｅｄＰＶ  Ｆ糖タンパク質の膜貫通ドメインの一部とを含み得る。更に例を挙げると、可溶性Ｆ（ｓＦ）糖タンパク質のいくつかのバージョンは、主にタンパク質を固定する細胞質尾部および／または膜貫通ドメインを除去することを介して、構築され得る。本明細書で使用されるとき、「可溶性Ｆ糖タンパク質」または「Ｆ糖タンパク質の可溶性形態」または「ｓＦ糖タンパク質」は、細胞外ドメインまたはその一部分を含有する天然Ｆ糖タンパク質の断片または一部のためのアミノ酸配列を指す。ｓＦ糖タンパク質は、天然ウイルスＦ糖タンパク質と構造的に類似している。
【００４８】
本発明のｓＦ糖タンパク質は、天然ウイルスＦ糖タンパク質と構造的に類似している。例を挙げると、本発明のｓＦ糖タンパク質は、ＣｅｄＰＶを対象とするポリクローナル抗体によって認識され得る。例を挙げると、本発明のｓＦ糖タンパク質は、天然ＣｅｄＰＶ
Ｆ糖タンパク質に匹敵する（三量体などの）オリゴマー形態（複数可）で組み立て得る。
【００４９】
本発明のｓＦまたはｓＧ糖タンパク質は、例えば、ワクチン開発と、ワクチンとしてまたは組換えモノクローナル抗体の単離に使用されるときに抗ウイルス抗体を生成するために抗原として作用することとに好適である。ｓＦまたはｓＧ糖タンパク質は、天然のＦまたはＧ糖タンパク質を認識し得る抗体を生成するのに好適である。モノマーまたは三量体などのオリゴマー形態で組み立てられる本発明のｓＦまたはｓＧ糖タンパク質は、例えば、構造に基づく抗ウイルス調査を支援するように更なる情報を提供するために結晶化および構造決定のためなどに更に有用であり得る。本発明のｓＦまたはｓＧ糖タンパク質のオリゴマー形態はまた、天然のＦまたはＧ糖タンパク質およびその天然オリゴマー形態を認識し得る抗体を更に生成し得る。「可溶性」という用語は、水性または非水性溶媒中で溶解するタンパク質の能力に関係がない。
【００５０】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｇタンパク質のコード配列は、位置８２６８で始まり、１０１３６で終了し、配列番号７に開示されているように６２２アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置８２６８〜１０１３６にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００５１】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｇ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号７のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、
または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００５２】
配列番号７のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、または６２１アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号７のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号７のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約３００、３０５．．．アミノ酸長」）として、３００〜３０５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであろう。
【００５３】
【表７】
2019205475.tif 000013
【００５４】
Ｇタンパク質ＣｅｄＰＶの断片の例としては、ワクチン、診断、およびスクリーニングの迅速な高処理量産生を可能にする天然ウイルスＧ糖タンパク質の特徴を保持するＣｅｄＰＶ  Ｇタンパク質の可溶性形態が挙げられる。
【００５５】
ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質の可溶性形態は、Ｇ糖タンパク質の外部ドメイン（例えば、細胞外）の少なくとも一部を含む。選択された実施形態において、ＣｅｄＰＶは一般に、Ｇ糖タンパク質の膜貫通ドメインの全部または一部と、Ｇ糖タンパク質の細胞質尾部の全部または一部とを欠失することによって産生される。一実施形態において、ＣｅｄＰＶの可溶性Ｇタンパク質は、完全長のＧタンパク質の細胞質領域の任意の部分を含まない。別の実施形態において、ＣｅｄＰＶの可溶性Ｇタンパク質は、膜貫通ドメインの任意の部分を含まない。更に別の実施形態において、ＣｅｄＰＶの可溶性Ｇタンパク質は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの一部分を含まない。本明細書で使用されるとき、「可溶性」という用語は単に、Ｇタンパク質が、その細胞質尾部の一部または全部を欠落していること、またはＧタンパク質が、膜貫通ドメインの全部または一部を欠落していること、
またはその両方を意味する。いくつかの実施形態において、可溶性Ｇ糖タンパク質は、配列番号７においてＫ８７の後で切り捨てられる。「可溶性」という用語は、水性または非水性溶媒中で溶解するタンパク質の能力に関係がない。
【００５６】
本発明の可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質は、一般に、対応している天然ウイルス糖タンパク質の１個以上の特徴（ウイルス宿主細胞受容体と相互作用するまたはそれに結合する能力など）を保持し、モノマーおよび／またはオリゴマー形態（複数可）で産生され得るか、または抗体（ウイルス中和抗体を含むが、これに限定されない）を誘発する能力により、天然Ｇ糖タンパク質を認識することができる。付加的な特徴の例としては、宿主細胞の感染を阻止または防止する能力が挙げられるが、これに限定されない。従来の方法を用いて、１個以上の特徴について可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質を評価し得る。使用され得る方法の例としては、本明細書の実施例に記載のアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
【００５７】
上記の配列番号１のヌクレオチド配列を参照すると、Ｌタンパク質のコード配列は、位置１０５７２で始まり、１８０７７で終了し、配列番号８に開示されているように２５０１アミノ酸長のポリペプチドをもたらす。したがって、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。加えて、本発明はまた、配列番号１の位置１０５７２〜１８０７７にあるポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。
【００５８】
本発明はまた、ポリペプチド、ＣｅｄＰＶ  Ｌ−タンパク質の誘導体および断片をコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、配列番号８のポリペプチドと少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００５９】
配列番号８のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０
５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、１０００、１００５、１０１０、１０１５、１０２０、１０２５、１０３０、１０３５、１０４０、１０４５、１０５０、１０５５、１０６０、１０６５、１０７０、１０７５、１０８０、１０８５、１０９０、１０９５、１１００、１１０５、１１１０、１１１５、１１２０、１１２５、１１３０、１１３５、１１４０、１１４５、１１５０、１１５５、１１６０、１１６５、１１７０、１１７５、１１８０、１１８５、１１９０、１１９５、１２００、１２０５、１２１０、１２１５、１２２０、１２２５、１２３０、１２３５、１２４０、１２４５、１２５０、１２５５、１２６０、１２６５、１２７０、１２７５、１２８０、１２８５、１２９０、１２９５、１３００、１３０５、１３１０、１３１５、１３２０、１３２５、１３３０、１３３５、１３４０、１３４５、１３５０、１３５５、１３６０、１３６５、１３７０、１３７５、１３８０、１３８５、１３９０、１３９５、１４００、１４０５、１４１０、１４１５、１４２０、１４２５、１４３０、１４３５、１４４０、１４４５、１４５０、１４５５、１４６０、１４６５、１４７０、１４７５、１４８０、１４８５、１４９０、１４９５、１５００、１５０５、１５１０、１５１５、１５２０、１５２５、１５３０、１５３５、１５４０、１５４５、１５５０、１５５５、１５６０、１５６５、１５７０、１５７５、１５８０、１５８５、１５９０、１５９５、１６００、１６０５、１６１０、１６１５、１６２０、１６２５、１６３０、１６３５、１６４０、１６４５、１６５０、１６５５、１６６０、１６６５、１６７０、１６７５、１６８０、１６８５、１６９０、１６９５、１７００、１７０５、１７１０、１７１５、１７２０、１７２５、１７３０、１７３５、１７４０、１７４５、１７５０、１７５５、１７６０、１７６５、１７７０、１７７５、１７８０、１７８５、１７９０、１７９５、１８００、１８０５、１８１０、１８１５、１８２０、１８２５、１８３０、１８３５、１８４０、１８４５、１８５０、１８５５、１８６０、１８６５、１８７０、１８７５、１８８０、１８８５、１８９０、１８９５、１９００、１９０５、１９１０、１９１５、１９２０、１９２５、１９３０、１９３５、１９４０、１９４５、１９５０、１９５５、１９６０、１９６５、１９７０、１９７５、１９８０、１９８５、１９９０、１９９５、２０００、２００５、２０１０、２０１５、２０２０、２０２５、２０３０、２０３５、２０４０、２０４５、２０５０、２０５５、２０６０、２０６５、２０７０、２０７５、２０８０、２０８５、２０９０、２０９５、２１００、２１０５、２１１０、２１１５、２１２０、２１２５、２１３０、２１３５、２１４０、２１４５、２１５０、２１５５、２１６０、２１６５、２１７０、２１７５、２１８０、２１８５、２１９０、２１９５、２２００、２２０５、２２１０、２２１５、２２２０、２２２５、２２３０、２２３５、２２４０、２２４５、２２５０、２２５５、２２６０、２２６５、２２７０、２２７５、２２８０、２２８５、２２９０、２２９５、２３００、２３０５、２３１０、２３１５、２３２０、２３２５、２３３０、２３３５、２３４０、２３４５、２３５０、２３５５、２３６０、２３６５、２３７０、２３７５、２３８０、２３８５、２３９０、２３９５、２４００、２４０５、２４１０、２４１５、２４２０、２４２５、２４３０、２４３５、２４４０、２４４５、２４５０、２４５５、２４６０、２４６５、２４７０、２４７５、２４８０、２４８５、２４９０、２４９１、２４９２、２５９３、２４９４、２４９５、２４９６、２４９７、２４９８、２４９９、または２５００アミノ酸長の断片であり得る。本明細書で使用されるとき、上記で開示された断片の長さはまた、一定の範囲内のいくつかのアミノ酸を有するポリペプチドを示すために使用される。例えば、本明細書で使用されるとき、「配列番号８のポリペプチド断片は、少なくとも約１５、２０、２５、３０．．．アミノ酸長の断片であり得る」によって、断片が１５〜２０アミノ酸長であり得る、および断片が２０〜２５アミノ酸長であり得るなどを意味する。配列番号８のポリペプチド断片（例えば、「少なくとも．．．約２０５０、２０５５．．．アミノ酸長」）として、２０５０〜２０５５アミノ酸長であるポリペプチド断片が挙げられることを当業者は認識するであ
ろう。
【００６０】
【表８】
2019205475.tif 000014
【００６１】
参照アミノ酸配列（例えば、配列番号７）に対して少なくとも、例えば、約９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アミノ酸配列が参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大約５個の修飾を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意味すると理解される。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを得るために、参照配列のアミノ酸残基の最大約５％が欠失し得るもしくは別のアミノ酸で置換され得る、または参照配列中の全アミノ酸の最大約５％のいくらかのアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの修飾は、参照アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端の位置またはそれらの末端位置の間のどこかで発生し得、参照配列中のアミノ酸の間で個別に、または参照配列内の１個以上の連続した基中のいずれかにおいて散在する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「同一性」は、参照ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較して、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般的に、配列は、最上位の一致が取得されるように整列される。「同一性」それ自体は、当技術分野で認識された意味を有し、公表された技術を用いて計算することができる。（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ
Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，  ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ
Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたい）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するためのいくつかの方法があるが、「同一性」という用語は、当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。２個の配列間の同一性または類似性を判定するために一般的に使用される方法としては、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４）ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータプログラムはまた、同一性および類似性を計算する方法およびアルゴリズムを含み得る。２つの配列間の同一性および類似性を判定するコンピュータプログラム法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（ｉ）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０））、およびＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性および類似性を判定するための方法の例が、参照により組み込まれるＭｉｃｈａｅｌｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｇａｒｉａｎ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００）において議論されている。
【００６３】
本発明の一実施形態において、２個以上のポリペプチド間の同一性を判定するために使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。本発明の別の実施形態において、２個以上のポリペプチド間の同一性を判定するために使用されるアルゴリズムはＦＡＳＴＤＢであり、これはＢｒｕｔｌａｇらのアルゴリズムに基づいている（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）、参照により組み込まれる）。ＦＡＳＴＤＢ配列整列において、クエリ配列および参照配列は、アミノ酸配列である。配列整列の結果は、パーセント同一性による。一実施形態では、同一性パーセントを計算するためにアミノ酸配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用され得るパラメータとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マトリックス＝ＰＡＭ、Ｋ−タプル＝２、不一致ペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化グループ長＝０、カットオフ得点＝１、隙間ペナルティ＝５、隙間サイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ配列の長さのうちのいずれか短い方。
【００６４】
内部付加または欠失のためではなくＮ末端またはＣ末端の付加または欠失のために、参照配列がクエリ配列よりも短いまたは長い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを計算するときにＮ末端およびＣ末端の切断または参照配列の付加を考慮しないために、手動で補正を行うことができる。参照配列に対してＮ末端またはＣ末端で切断されたクエリ配列について、同一性パーセントは、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、一致／整列していない参照配列に対して、Ｎ末端およびＣ末端であるクエリ配列の残基数を計算することによって補正される。ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果により、一致／整列を判定する。整列パーセンテージは、次いで、同一性パーセントから減算され、最終同一性パーセントの得点に到達するために、指定されたパラメータを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される。この補正された得点は、整列が互いにどれだけ「対応す
る」か、ならびに同一性パーセンテージを判定する目的のために使用され得る。クエリ配列のＮ末端またはＣ末端を越えて延在する参照配列の残基は、同一性パーセントの得点を手動で調整する目的のためのものと考えられ得る。すなわち、比較配列のＮ末端またはＣ末端と一致／整列しない残基は、同一性パーセント得点または整列番号付けを手動で調整するとき、数えられる。
【００６５】
例えば、９０アミノ酸残基のクエリ配列は、同一性パーセントを判定するために１００残基の参照配列と整列される。欠失がクエリ配列のＮ末端で起こり、ゆえにＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対残基は、参照配列の１０％を表し（Ｎ末端およびＣ末端における残基の数は一致しない／参照配列中の残基の総数）、したがって、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセント得点から減算される。残りの９０個の残基が完全に一致した（１００％整列）場合には、最終的な同一性パーセントは、９０％（１００％整列、１０％不一致の突出）であろう。別の例では、欠失が内部欠失であることを除いて、９０残基のクエリ配列は、１００参照配列と比較される。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは、クエリと整合／整列されない対象配列のＮ末端またはＣ末端で残基が存在しないため、手動で補正されない。更に別の実施例において、１１０アミノ酸のクエリ配列は、同一性パーセントを判定するために１００残基の参照配列と整列される。クエリの付加がクエリ配列のＮ末端で起こり、ゆえにＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない場合もある。クエリ配列の残りの１００個のアミノ酸残基が、参照配列の全長に対して９５％の同一性を有する場合、クエリのＮ末端付加は無視され、参照配列に対するクエリの同一性パーセントは９５％となるであろう。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「に対応する（三人称含）」および「に対応している」という用語は、それらが整列配列に関連するとき、参照タンパク質内の列挙された位置を意味することが意図される（例えば、ＣｅｄＰＶ  Ｇタンパク質、および参照タンパク質上の位置と整列する修飾されるＣｅｄＰＶ  Ｇタンパク質におけるそれらの位置）。このように、対象ＣｅｄＰＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸配列が、参照ＣｅｄＰＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号７）と整列するとき、参照配列の一定の列挙された位置「に対応する」対象配列中のアミノ酸は、参照配列（例えば、配列番号７）のこれらの位置で整列するものであるが、参照配列のこれらの正確な数値位置にある必要は必ずしもない。配列間の対応しているアミノ酸を判定するために配列を整列するための方法が、本明細書に記載されている。したがって、本発明は、配列が配列番号７の配列に対応する新規のペプチドを提供する。
【００６７】
発現ベクター系中へ本明細書に開示されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入から生じる変異体もまた、企図される。例えば、変異体は（通常、挿入）、修飾されたタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、別のポリペプチドに融合されたときから生じ得る。
【００６８】
別の態様において、本発明は、修飾されたタンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基が、除去される欠失変異体を提供する。欠失は、修飾されたタンパク質の一方または両方の末端で、または修飾されたタンパク質の１つ以上の非末端アミノ酸残基の除去により、もたらされ得る。欠失変異体は、したがって、修飾されたタンパク質の全ての断片を含む。
【００６９】
開示された同一性パーセントの制限内で、本発明はまた、本発明の開示されたポリペプチドの置換変異体に関する。置換変異体は、修飾されたタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替の残基と置換されるそれらのポリペプチドを含む。一態様では、置換は本来保存的であるが、しかしながら、本発明はまた、非保存的である置換を包含する。以下の表に記載のように、この目的のための保存的置換が定義され得る。アミノ酸は、
物理的特性および二次および三次タンパク質構造に対する寄与に応じて分類され得る。保存的置換は、類似の特性を有する別のアミノ酸のための１個のアミノ酸の置換として、当該技術分野で認識されている。例示的な保存的置換は、以下の通りである。
【００７０】
【表９】
2019205475.tif 000015
【００７１】
代替的に、保存的アミノ酸は、以下の通り、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，［Ｂｉｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ、Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１  ７７］に説明されるようにグループ化され得る。
【００７２】
【表１０】
2019205475.tif 000016
【００７３】
更に他の代替的で例示的な保存的置換は、以下の通りである。
【００７４】
【表１１】
2019205475.tif 000017
【００７５】
本発明のペプチドまたはペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むことが意図されていることを理解すべきである。例を挙げると、修飾は本来共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機部分との化学結合を含み得る。このような誘導体は、ポリペプチドの循環半減期を増加させるように調製され得るか、または、所望の細胞、組織、または器官のためのポリペプチドの標的化能力を改善するように設計され得る。同様に、本発明は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールのような１つ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合的に修飾された修飾ペプチドを更に包含する。
【００７６】
本発明はまた、特に、ＣｅｄＰＶまたは本明細書で開示された任意のＣｅｄＰＶタンパク質の断片に結合する抗体またはその断片を対象とする。
【００７７】
具体的には、本発明は、シダーウイルスのＧ糖タンパク質の頭部の４個の疎水性ポケットに結合する抗体または抗体断片を提供する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。シダーウイルスは恐らく、とりわけ、少なくとも内皮細胞上に存在するエフリンＢ２の膜貫通タンパク質に結合することによって、感染過程を開始する。特に、エフリンＢ２タンパク質は、シダーウイルスのＧ糖タンパク質の頭部上の４個の疎水性結合ポケット中に挿入する「ＧＨ−ループ領域」を含み、したがって、ウイルスが、細胞表
面タンパク質に特異的に結合し、感染プロセスを開始することを可能にする。エフリンＢ２と結合するシダーウイルスの接触残基は、Ｖ５０７、Ｆ４５８、およびＩ４０１であり、文字は標準的なアミノ酸の標準一文字略号を指し、番号は本明細書に開示された配列に従って、配列番号７のアミノ酸番号を指す。このように、抗体または抗体断片であり、抗体が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４００５０号および同第ＰＣＴ／ＵＳ１２／３５８０６号に開示されている抗体のいずれでもないのであれば、本発明は、Ｖ５０７／Ｆ４５８／Ｉ４０１で定義されたシダーウイルスの非直線エピトープに結合する抗体または抗体断片を提供する。
【００７８】
例えば、本発明に包含される抗体としては、ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質に特異的な抗体、ヘンドラウイルスＧ糖タンパク質と交差反応する抗体、および／またはニパウイルスＧ糖タンパク質および中和抗体が挙げられるが、これらに限定されない。例を挙げると、中和抗体の特徴としては、宿主細胞の感染を阻止または防止する能力が挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体はまた、当該技術分野で公知の方法を使用して特徴付けされ得る。
【００７９】
本発明において有用な抗体は、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含め、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロ接合抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修正された構成を包含することができる。抗体の例は、マウス、ラット、ヒト、霊長類、または（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）他の任意の起源から派生する。
【００８０】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を調製する方法は、当該技術分野において周知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、必要に応じて、補助剤、の１回以上の注射により、哺乳類において高められ得る。補助剤の例としては、キーホールリンペット、ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、大豆トリプシン阻害剤、フロインド完全補助剤、およびＭＰＬ−ＴＤＭ補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。免疫化プロトコルは、当業者によって判定され得る。
【００８１】
抗体は、代替的に、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて産生され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１（１９８２）による修正として参照されたい）。
【００８２】
所望の場合、目的の抗体が配列決定され得、次いで、ポリヌクレオチド配列が、発現または増殖のためにベクター中にクローニングされ得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に維持され得、次いで、宿主細胞が拡大し、将来の使用のために凍結され得る。代替的な方法では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の「ヒト化」または親和性、抗体もしくは他の特徴を改善するように遺伝子操作のために使用され得る（例えば、Ｇ糖タンパク質に対してより大きな親和性、および／または宿主細胞受容体に対してシダーウイルス、ヘンドラ、またはニパウイルスの融合を阻害するより大きな効力を得るように抗体配列を遺伝的に操作する）。
【００８３】
抗体はまた、当該技術分野で既知の方法によってヒト化され得る。例えば、参照により組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，８０７，７１５号、同第５，８６６，６９２号、同第６，３３１，４１５号、同第５，５３０，１０１号、同第５，６９
３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５８５，０８９号、および同第６，１８０，３７０号を参照されたい。更に別の実施形態において、完全なヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することによって取得され得る。
【００８４】
別の実施形態において、抗体は、組換え的に生成され、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて発現させることができる。例を挙げると、抗体は、ファージディスプレイ技術により組換え的に生成され得る。例えば、参照により組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、および同第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい。代替的に、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を使用して、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。ファージディスプレイは多様な形式で実施され得る（審査には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい）。例を挙げると、本明細書中に記載の可溶性Ｇ糖タンパク質は、これらの技術によって組換え抗体を単離する目的のための抗原として使用することができる。
【００８５】
抗体は、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を最初に単離し、遺伝子配列を得て、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において組換え的に抗体を発現させる遺伝子配列を用いることによって、組換え的に生成され得る。使用され得る別の方法は、植物（例えば、タバコ）における抗体配列またはトランスジェニックミルクを発現させることである。植物または牛乳中で組換え的に抗体を発現させるための方法が開示されている。例えば、参照により組み込まれるＰｅｅｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６（２００１）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５（１９９５）、およびＰｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７（１９９９）を参照されたい。抗体の誘導体（例えば、ヒト化された単鎖など）を作るための方法は、当技術分野で既知である。
【００８６】
本発明の抗体は、例えば、生体試料もしくは検体中で、ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質を単離もしくは精製する、またはヘンドラもしくはニパＧ糖タンパク質を検出するために使用する従来の方法によって担体に結合され得る。代替的に、例を挙げると、本発明の中和抗体は、感染したか、またはヘンドラ、ニパ、および／またはシダーウイルスに感染している疑いのある対象に受動的免疫療法として投与され得る。「対象」および「患者」という用語は同義的に使用され、ヒト、サル、家畜、競技用動物、およびペットを含むが、これらに限定されない。獣医学的使用もまた、本発明によって包含される。
【００８７】
診断
【００８８】
本発明のタンパク質、タンパク質断片、および／または抗体は、シダーウイルスについて様々な免疫アッセイで使用され得る。本発明の発現された組換えタンパク質の断片は、高品質管理により産生され得、生体試料中の抗体を検出する目的のための抗原として好適である。例を挙げれば、限定ではなく、可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質は、対象の生体試料中で抗体を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原として使用することができる。
【００８９】
本発明のプライマーおよびプローブを含む核酸はまた、シダーウイルスのための様々なアッセイで使用される。本発明のプライマーおよびプローブを使用して、対象におけるシ
ダーウイルスをコードするリボ核酸の存在を検出する。本発明はまた、核酸増幅技術（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ法）を利用するシダーウイルスの存在を検出するための方法を含み、該方法は、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて行われる変性、プライマーアニーリング、および拡張の繰り返し周期を利用し、由来する核酸における指数関数的な増加につながり、ウイルスの存在の検出を容易にする。
【００９０】
ワクチン
【００９１】
本発明はまた、シダーウイルスのためのワクチンに関する。一態様において、ワクチンは、ワクチンに基づくＤＮＡである。当業者は、インビボでの外因性タンパク質の発現を得るために発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号、および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞内での発現のためのウイルスに基づくベクターは当該技術分野で周知であり、非限定的な実施例が本明細書に記載されている。別の態様において、ワクチンは、タンパク質に基づき、本発明のタンパク質の１つ以上の断片、またはタンパク質の断片を含む。タンパク質断片の例としては、外部ドメイン、トランス膜ドメイン、細胞質ドメイン、それらの機能部分、ならびに中和抗体に特異的に反応する部分が挙げられるが、それらに限定されない。ワクチンはまた、感染に対するより迅速な処置ならびに予防のための抗体に基づくワクチンであり得る。
【００９２】
発現ベクターの投与としては、注射、経口投与、粒子銃、またはカテーテル挿入投与、および局所投与を含む、局所投与または全身投与が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターまたはサブゲノムのポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的送達もまた、使用することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術については、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８に記載されている。
【００９３】
非ウイルス送達ビヒクルおよび方法はまた、死滅したアデノウイルスに単独で連結されているまたは連結されていないポリイーショニック（ｐｏｌｙｅａｔｉｏｎｉｃ）濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照されたい）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照されたい）、真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ９５／０７９９４号、同第ＷＯ９６／１７０７２号、同第ＷＯ９５／３０７６３号、および同第ＷＯ９７／４２３３８号を参照されたい）（これらの全てが参照により組み込まれる）、および細胞膜を有する核電荷中和または融合に対して採用され得るが、これらに限定されない。裸のＤＮＡもまた採用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、参照により組み込まれるＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、参照により組み込まれる米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ国際公開特許第ＷＯ９５／１３７９６号、同第ＷＯ９４／２３６９７号、同第ＷＯ９１／１４４４５号、および欧州公開特許第ＥＰ０５２４９６８号に記載されている。更なる手法が、参照により組み込まれるＰｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１に記載されている。
【００９４】
ヒトへの投与のために、タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むコドンが、ヒトへの使用のために最適化され得る。
【００９５】
本発明の別の態様において、可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質は、サブユニットのワクチンとして使用される。可溶性ＣｅｄＰＶ糖タンパク質またはそれらの組み合わせは、それら自体で、または補助剤と組み合わせて投与され得る。補助剤の例としては、アルミニウム塩、水中土壌乳剤、水中油型乳剤、サポニン、ＱｕｉｌＡおよびその誘導体、イスコム、リポソーム、ガンマインターフェロンまたはインターロイキン１２を含むサイトカイン、ＤＮＡ、固体または半固体粒子でのマイクロカプセル化、フロインド完全および不完全補助剤またはムラミルジペプチドおよび類似体を含むその活性成分、ＤＥＡＥデキストラン／鉱物油、アルヒドロゲル、アウスファーム（Ａｕｓｐｈａｒｍ）補助剤、およびアルガムリン（Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質またはそれらの組み合わせを含むサブユニットのワクチンは、経口投与、静脈内投与、皮下投与、動脈内投与、筋肉内投与、心臓内投与、脊髄内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、脳室内投与、舌下投与、および／または経皮的に投与することができる。
【００９７】
用量および投与のスケジュールは、当該分野で既知の方法によって決定することができる。可溶性ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質、またはシダー、ヘンドラ、ニパウイルス、または関連ヘニパウイルスウイルスのためのワクチンとしてのそれらの組み合わせの有効性はまた、当技術分野で既知の方法によって評価され得る。
【００９８】
実施例
実施例１
尿（約０．５〜１ｍｌ）を、オーストラリア南東クイーンズランドのシダーグローブでオオコウモリのコロニーの下に配置されたプラスチックシートから収集した（主に、混合された集団におけるいくらかのペトロパスポリオセファラス（Ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）を有するオオコウモリ属アレクト）０．５ｍｌのウイルス輸送培地（ＳＰＧＡ：スクロース、リン酸塩、グルタミン酸塩、およびアルブミン、ならびにペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾンの混合物）を含有する２ｍｌの管中にプールした。管を、収集後、一時的に氷上で保存し、クイーンズランドの実験室に輸送し、−８０℃で凍結した。試料を４℃で解凍し、破片をペレット化し、１分間１６，０００×ｇで遠心分離した。上清（約０．５〜１ｍｌ）中の尿を、細胞培養培地中で１：１０に希釈した。
【００９９】
希釈された尿を、５分間１，２００×ｇで遠心分離し、７５ｃｍ２の組織培養フラスコ中でベロ、パキ、ＰａＢｒ、ＰａＳｐ、およびＰａＰｌ細胞単層の上に均等に分割した。この研究で使用された細胞株は、ベロ（ＡＴＣＣ）、ＨｅＬａ−ＵＳＵ（２２）、および腎臓（パキ）、脳（ＰａＢｒ）、（脾臓）ＰａＳｐ、および胎盤（ＰａＰｌ）から派生したオオコウモリ属アレクトの一次細胞株であった。細胞は、３７℃で５％のＣＯ２の存在下で、二重強度の抗生物質−抗真菌剤（インビトロゲン）、１０μｇ／ｍｌのシプロフロキサシン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および１０％のウシ胎児血清で補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  Ｈａｍ中で増殖した。フラスコを３７℃で２時間揺動し、１４ｍｌの新鮮な細胞培養培地を添加し、次いで、３７℃で７日間インキュベートした。毒性、汚染、またはウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）について、フラスコを毎日観察した。
【０１００】
多核体ＣＰＥが、２個の異なる尿試料の接種の５日後（ｄｐｉ）、腎細胞（パキ）単層において観察された。ＣＰＥは、４個の他の細胞株のいずれにおいても観察されなかった。上清収穫６ｄｐｉを使用して、新鮮なパキ細胞単層に接種した。パキ細胞内の２回の通過後、ウイルスはベロ細胞中で感染し、ＣＰＥを引き起こすことが可能であった。しかしながら、ベロ細胞におけるウイルスのＣＰＥの形態は、ＨｅＶ感染のものとは異なっていた。ＨｅＶ特異的ＰＣＲプライマーを用いた更なる分析は、新規コウモリウイルスがＨｅＶの分離株ではないことが示された。
【０１０１】
実施例２
多核体ＣＰＥを示す実施例１の細胞を、全ての既知のパラミクソウイルスおよびパラミクソウイルスのサブセットのための広く公開されている反応性プライマー（３１）を使用してスクリーニングした。ＰＣＲ産物をゲル抽出し、Ｍ１３プライマーを使用して、配列決定を容易にするようにｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングされた。配列を取得し、初期分類を可能にする既知のパラミクソウイルス配列と整列させた。
【０１０２】
全体のゲノム配列を、４５４個の配列決定（４３）と、従来のサンガー配列決定の組み合わせを使用して分析した。組織培養上清からのビリオンを、３０，０００×ｇで６０分間の遠心分離により回収し、１４０μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ抽出のための５６０μｌの新たに作られたＡＶＬと混合した。ｃＤＮＡおよび無作為増幅の合成を、公開された手順（４４）の改変を用いて実行した。簡潔に述べると、ｃＤＮＡ合成を、１７マー定義プライマー配列に連結する無作為オクトマ（ｏｃｔｏｍｅｒ）を使用して実施した：（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＴＣＴＣＮＮＮ  ＮＮＮＮＮ−３’）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。８μｌのｄｓ−ｃＤＮＡを、２００μｌのＰＣＲ反応物中でホットスタートＴａｑポリメラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）および５’−Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ  ＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＴＣＴＣ−３’（＊はチオール修飾を意味する）を用いて、５分間９５℃での初期変性ステップの後、９５℃／１分間、４８℃／１分間、７２℃／１分間の４０周期、増幅プライマーとして増幅し、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ロシュ４５４配列決定のための試料調製（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂｒａｎｆｏｒｄ、コネチカット州、アメリカ）を、製造業者が示唆するプロトコル（Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｍＰＣＲ  Ｌｉｂ−Ｌ  ＳＶ）に従って実施した。
【０１０３】
正確なＣｅｄＰＶのゲノム配列を取得するため、（低品質で曖昧なアダプタ配列を除去した後の）４５４個の生成されたデータが、サンガー配列決定から派生したＣｅｄＰＶドラフトのゲノム配列上への未加工の読み取り値の新規アセンブリおよびマッピングの両方によって分析された。４５４個の読み取りマッピングのため、ＣＬＣソフトウェアで生成されたＳＮＰおよびＤＩＰが、マップされた未加工の読み取り値を視覚化することによって精度について手動で評価された（無作為のＰＣＲの誤りは、特に読み取り値範囲が深いときに実際のＳＮＰおよびＤＩＰと比較して明らかである）。４５４個の新規および読み取りマッピングアセンブリ方法の両方のためのコンセンサス配列が、次いで、低カバレッジ領域内での競合を解決するためにおよび４５４個のホモポリマーの誤りを解決するために、使用された後者を有するサンガー配列と比較された。
【０１０４】
ゲノム末端の配列を、以前に公開されたプロトコル（４５）を使用して、３’および５’−ＲＡＣＥによって判定した。簡潔に述べると、約１００ｎｇのＲＮＡを、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアダプタＤＴ８８（配列情報についての参考文献を参照されたい）と連結し、その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴキット（Ｌ
ｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびアダプタ特異的プライマー、ＤＴ８９を用いたｃＤＮＡ合成を行う。次いで、ＰＣＲ増幅を、ＤＴ８９および１つ以上のゲノム特異的プライマーを使用して行った。ＰＣＲ産物を、ＡＢＩシーケンサー３１００上で組織内のサービス基によってＤＴ８９またはゲノム特異的プライマーのいずれかを使用して直接配列決定した。
【０１０５】
ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｖ４．５．１（ＣＬＣ  Ｉｎｃ、オーフス、デンマーク）を使用して４５４個のアダプタおよびｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー
配列を整え、低品質の曖昧で小さな読み取り値（＜１５ｂｐ）を除去して、全て既定のパラメータで、新規および読み取りマッピングアセンブリを実施する。Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン９．１１（科学教育ソフトウェア、米国ノースカロライナ州ケアリー）を使用して、新規のアセンブリによって生成された重複するコンティグを結合した。系統樹を、ＭＥＧＡ４ソフトウェアパッケージ（４６）中での１０００回の反復によって判定されたブートストラップ値を有する近隣結合アルゴリズムを使用して構築した。
【０１０６】
この新しいウイルスによる多核体ＣＰＥの形成とコウモリの尿からパラミクソウイルスを単離することにおける以前の成功とを考慮しながら、パラミクソウイルス科特異的および属特異的プライマーが、この新しいウイルスがパラミクソウイルス科のメンバーであるかを判定するために使用された。予想されるサイズの陽性ＰＣＲ断片を、Ｔｏｎｇらによって開発されたパラミクソウイルス、レスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）／モルビリウイルス／ヘニパウイルスプライマーセットから取得した（３１）。
【０１０７】
ＰＣＲ産物の配列決定は、それが、ＨｅＶおよびＮｉＶと最も密接に関連する新しいパラミクソウイルスであることを示した。これらの予備的データに基づいて、ウイルスは、コウモリのコロニー採取された場所に因んで、シダーウイルス（ＣｅｄＰＶ）と命名された。
【０１０８】
図１に示されるように、ＣｅｄＰＶのゲノムは１８，１６２ヌクレオチド長であり、科におけるＨｅＶのものに最も類似している。完全なゲノム配列が、ＧｅｎＢａｎｋ（受託番号ＪＱ００１７７６）に堆積された。ゲノムサイズは６の倍数であり、これは、パラミクソウイルス亜科の既知の全メンバーについて観察された６の法則と完全に一致する（３）。ＣｅｄＰＶのゲノムは、７箇所の全ての位置で完全に保存されたＣＴＴの３ヌクレオチド遺伝子間配列、ならびにＨｅＶおよびＮｉＶ中に存在するものと類似する高度に保存された遺伝子の開始および停止信号を有する（図２）。
【０１０９】
また、ＨｅＶゲノムと同様に、ＣｅｄＰＶゲノムに比較的大きな非コード領域が存在する。（図１および第１表）。ＣｅｄＰＶゲノムの全体的なタンパク質コード容量は、ＨｅＶより８２．１２％高い８７．４１％である。ＣｅｄＰＶおよびＨｅＶのゲノムサイズが非常に類似しているとき、ＣｅｄＰＶの増大したコード能力は、６個の主要なタンパク質のうちの５個についてのタンパク質サイズの増大に起因し、Ｌタンパク質は、更に２５７アミノ酸大きい（第１表）。２，５０１アミノ酸では、ＣｅｄＰＶ  Ｌタンパク質は、パラミクソウイルス科の中でのみならず、モノネガウイルスの順番においても既知の全ウイルスについて最大である。
【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
完全長のゲノム配列に基づく系統分析および各構造的タンパク質の推定されるアミノ酸配列は、ＣｅｄＰＶが科の中でヘニパウイルスに最も密接に関連しているという初期考察を確認した。ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）の推定される配列に基づく系統樹が、図３Ａに示されている。全ゲノム配列に基づいた系統樹分析により同様の結果を得た（図３Ｂ）。実際に、ＣｅｄＰＶは、５５０ヌクレオチドのＬ遺伝子断片（図３Ｃ）の利用可能な唯一の配列に基づいた系統樹に示されるように、アフリカのコウモリ（２６、３２）に検出されたヘニパウイルス様配列よりもＨｅＶおよびＮｉＶにより密接に関連している。
【０１１２】
実施例３
パラインフルエンザウイルス５のために最初に発見され（シミアンウイルス５として以前から既知であるＰＩＶ５）、パラミクソウイルスのほぼ全てのメンバーがＰ遺伝子を有し、該Ｐ遺伝子は、編集部位（３、３３）から下向へ流れる異なる読み取り枠からＮ末端共直線タンパク質の産生へ導く非鋳型Ｇ残基の添加によって、ＲＮＡ編集機構を介して複数のタンパク質を産生する。これらの複数の遺伝子産物は、感受性宿主の生得的反応に拮抗する上で重要な役割を果たしていることが知られている（３）。
【０１１３】
ＣｅｄＰＶゲノムは、７３７アミノ酸のＰタンパク質および１７７アミノ酸のＣタンパク質をコードする。しかしながら、ＰＣＲ分析は、ほとんどの他のパラミクソウイルスに存在する高度に保存された、システインに富んだＶタンパク質ＯＲＦを見つけることに失敗した。Ｖタンパク質ＯＲＦの不在はＲＮＡ編集部位に起因し、現在までに発見された分
離株全ての他の既知のＨｅＶおよびＮｉＶの分離株中に保存されているＡＡＡＡＧＧＧの配列は、ＣｅｄＰＶ  Ｐ遺伝子配列から欠落している。
【０１１４】
ＣｅｄＰＶ  Ｐ遺伝子から産生される複数のｍＲＮＡｓが存在していないことを確認するために、Ｐ遺伝子転写の直接配列決定を、Ｐ遺伝子のコード領域全体をカバーする重複断片を生成するプライマーの複数のセットを使用して、ＣｅｄＰＶ感染ベロ細胞から実行した。簡潔に述べると、定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を、高スループット配列決定から取得されたＣｅｄＰＶ特異的配列に基づいて確立した。Ｐ遺伝子のＴａｑＭａｎアッセイが開発され、全てのその後の研究に使用された。プライマー／プローブの配列は、次の通りである：順方向プライマー、５’−ＴＧＣＡＴ  ＴＧＡＧＣ  ＧＡＡＣＣ  ＣＡＴＡＴ  ＡＣ；逆方向プライマー、５’−ＧＣＡＣＧ  ＣＴＴＣＴ  ＴＧＡＣＡ  ＧＡＧＴＴ  ＧＴ；プローブ、５’−ＴＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＡ  ＣＣＣＴＣ  ＴＧＴＧＴ  ＴＴＧＡ−ＭＧＢ。
【０１１５】
ＲＮＡ編集活性の欠如を示す各産生される均一なトレースファイル、これは、編集部位の直後にＨｅＶおよびＮｉＶによって生成された混合ピークから非常に異なる（図４）。ＣｅｄＰＶが、そのＰ遺伝子中のＲＮＡ編集および任意のＶ関連コード配列の両方が欠如しているパラミクソウイルスの最初に識別されたメンバーであると思われる。
【０１１６】
実施例４
ゲノムサイズと組織との顕著な類似性と、ＣｅｄＰＶとヘニパウイルスとの間のＮ、Ｍ、およびＬタンパク質の間の高度に保存されたタンパク質ドメインの存在とは、ＣｅｄＰＶが、ＨｅＶおよび／またはＮｉＶに抗原的に関連し得ることを示すであろう。ＣｅｄＰＶを対象とした抗体を調製するために、ＣｅｄＰＶ  Ｎタンパク質のためのコード領域を、前述したＧＳＴ融合発現ベクター中へのクローニングのために、ＡｓｃＩ（５’端部）およびＮｏｔＩ（３’端部）部位によって隣接する一対のプライマーでＰＣＲによって増幅した（４７）。前に説明されたように、ゲル溶出による発現および精製を実行した（４８）。抗体産生のために、精製タンパク質を、０および２７日目に２匹の大人の雌のニュージーランド白兎の４箇所の異なる部位に（動物１匹あたり１００マイクログラムの用量で）皮下注射した。以前に公開された三重補助剤（４９）を免疫化のために使用した。動物は、５および４２日後に特異的抗体を調べ、最終的な血液採取のために６９日で安楽死させた。
【０１１７】
免疫蛍光抗体試験のため、３００μｌの細胞培地中で３０，０００細胞／ウェルの濃度で播種して、３７℃で一晩インキュベートすることで、ベロ細胞単層を８ウェルのチャンバースライド中で調製した。細胞単層をＣｅｄＰＶ、ＨｅＶ、またはＮｉＶの０．０１のＭＯＩで感染させ、感染後２４時間１００％氷冷メタノールで固定した。チャンバースライドを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡの１００μｌ／ウェルを用いて３０分間３７℃で遮断した後、１：１０００で希釈されたＣｅｄＰＶ  ＮまたはＮｉＶ  Ｎに対して５０μｌ／ウェルのウサギ血清を添加した。３０分間３７℃でインキュベートした後、スライドを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１：１０００で希釈された５０μｌ／ウェルの抗ウサギ４８８アレクサフオレ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒｅ）接合体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、蛍光顕微鏡下での観察のために５０％グリセロール／ＰＢＳ中に装着した。
【０１１８】
ウイルス中和試験のために、血清の連続２倍希釈液を、５０μｌの細胞培地（アール塩を含有し、２ｍＭのグルタミン、抗生物質−抗真菌剤、および１０％のウシ胎児血清で補充された最小必須培地）中で９６ウェル組織培養プレートに二連で調製した。標的ウイルスの２００  ＴＣＩＤ５０を含有する等量を添加し、ウイルス血清混合物を加湿された５％のＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で３０分間インキュベートした。２×１０５細
胞／ｍｌを含有するベロ細胞懸濁液１００μｌを添加し、プレートを加湿された５％のＣＯ２インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。４日後、プレートをウイルスＣＰＥについて検査した。ＣＰＥの完全な阻害を生成する最高血清希釈を、最終的な中和力価として定義した。
【０１１９】
ウサギ抗ヘニパウイルス抗体を用いてベロ細胞に感染させたＣｅｄＰＶ−の染色は、交差反応性の存在を示した。この交差反応性は、組換えＣｅｄＰＶ  Ｎタンパク質に対して惹起されたウサギ血清を用いたＨｅＶ感染ベロ細胞を染色することによって逆に、更に確認された（図５）。しかしながら、ウイルス中和試験による分析は、ヘニパウイルス中和抗体がＣｅｄＰＶを中和することができなかったこと、その逆も同様であることを見出した。Ｊパラミクソウイルス（ＪＰＶ）、牛疫ウイルス（ＲＰＶ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、メナングルウイルス（ＭｅｎＰＶ）およびＣｅｄＰＶにそれぞれ感染したベロ細胞上の抗ＣｅｄＰＶ血清で実行されたＩＦＡＴを示す図６もまた参照されたい。偽感染細胞単層は、陰性制御として含められた。
【０１２０】
実施例  ５
ＣｅｄＰＶと認識されたヘニパウイルスとの間の関係を更に調べるために、エフリンＢ２およびＢ３宿主細胞タンパク質のＣｅｄＰＶの使用を検査した。典型的には、ＨｅＶおよびＮｉＶは、ＣｅｄＰＶ感染に対する感染についてのエントリのポイントとしてエフリンＢ２受容体を使用する（２２、３４）。ヒトのエフリンＢ２およびＢ３遺伝子をｐＱＣＸＩＨ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中にクローニングし、結果として得られたプラスミドを、ＧＰ２−２９３パッケージ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のレトロウイルス粒子中にパッケージし、製造業者の指示に従って水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）でシュードタイプした。ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞株（２２）を、１μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＶＳＶ−Ｇシュードタイプレトロウイルス粒子で感染させた。感染の８時間後、培地を交換して、細胞を２４時間置いて再生させた（これは、細胞ゲノムへのレトロウイルスの挿入の完了のための、かつハイグロマイシン耐性遺伝子の発現のための時間を与える）。
【０１２１】
感染から２４時間後、レトロウイルスによって形質転換された細胞を、培地中で２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加することによって選択した。ハイグロに耐性であった細胞の株を調製し、凍結した。ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞およびエフリン発現ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞を、６−ウェル組織培養プレート中で２５０，０００細胞／ウェルの密度で一晩播種した。ウイルス（ＨｅＶおよびＣｅｄＰＶ）を０．０１のＭＯＩを得るために希釈し、ウェルに接種した。細胞単層を多核体ＣＰＥについて毎日検査した。
【０１２２】
ＣｅｄＰＶについて、同様の観察をエフリンＢ２受容体に関して行った。図７に示されるように、ＣｅｄＰＶは、ＨｅＬａ−ＵＳＵを感染させることに失敗したが、ヒトエフリンＢ２遺伝子が発現したとき、感染させ、多核体ＣＰＥを引き起こすことが可能であった。対照的に、エフリンＢ３分子を導入したとき、感染の証拠はなかった。
【０１２３】
実施例  ６
フェレット、モルモット、およびマウスは、ＨｅＶおよびＮｉＶ感染に対する異なる応答を呈し、フェレットおよびモルモットは、全身性血管炎に特徴付けられる重度の疾患を発症したが、マウスは発症しなかった（２０，３５，３６，３７，３８）。コウモリのパキ細胞内を２回通過したＣｅｄＰＶ（２×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を２匹の雄のフェレット（１ｍｌ、口腔鼻に）、４匹の雌のモルモット（１ｍｌ、腹腔内に）、および５匹の雌のＢａｌｂ−Ｃマウス（５０μｌ、口腔鼻に）に投与した。モルモットおよびマウスに温度感知マイクロチップ（ＬｉｆｅＣｈｉｐ  Ｂｉｏ−ｔｈｅｒｍｏ（登録商標）、Ｄｅｓｔｒｏｎ  Ｆｅａｒｉｎｇ）を移植し、毎日計量した。フェレットの直腸温度およ
び体重を試料時間で記録した。動物は、病気の臨床徴候を毎日観察し、接種後２１日目に安楽死させた。ＣｅｄＰＶに対する中和抗体について試験するために１０、１５、および２１日目に血清を収集した。
【０１２４】
フェレットにおいて言及されたＣｅｄＰＶへの無症候性セロコンバージョンに基づいて、７匹の追加の雌フェレットを、３×１０３  ＴＣＩＤ５０の低用量で口腔鼻経路によって暴露した。２匹の動物を、接種後６、８、および１０日目の各日、１匹は２０日目に安楽死させた。鼻洗浄物、口腔スワブ、直腸スワブを２、４、６、８、および１０日目に収集し、尿を安楽死の日に採取した。各採取した検体をＣｅｄＰＶゲノムについて評価した。広い範囲の組織試料が、死後の検査で収集され、ルーチン組織学、免疫組織化学（それぞれ、組換えＣｅｄＰＶおよびはＮｉＶ  Ｎタンパク質に対して惹起されたウサギ抗体を用いた）、ｑＰＣＲ（上記参照）、ならびに試薬および以前に確立された手順を用いたウイルス分離によって評価された（１６）。
【０１２５】
ＮｉＶおよびＨｅＶへの暴露からの応答とは対照的に、ＣｅｄＰＶに曝露されたフェレットおよびモルモットは、中和抗体が１０〜２１日の間に血清中に検出されたが、臨床的に健康なままであった（第２表）。ＣｅｄＰＶに暴露されるＢａｌｂ−Ｃマウスもまた臨床的に健康なままであったが、２１日目までに血清中に中和抗体を発症しなかった。選択的にそれ以前の時点で安楽死させたフェレットにおいて、浮腫および赤血球増加を伴う、扁桃リンパ組織、咽頭後気管支リンパ節の反応性過形成が存在した。ＣｅｄＰＶ抗原が、６日目に安楽死させられた１匹の動物の気管支リンパ節で検出され、その組織におけるウイルス複製と一致した。抗ＮｉＶ  Ｎタンパク質抗体に対する交差反応免疫染色にも言及した（図８）。他の有意な組織学的病変は確認されなかった。
【０１２６】
【表１３】
2019205475.tif 000019
【０１２７】
ウイルスＲＮＡは、６〜８日目に試料として採取された３〜４匹の雌フェレットの、咽
頭、脾臓、および咽頭後気管支リンパ節を含めた選択されたリンパ組織内、ならびに２０日目に安楽死させたフェレットの顎下リンパ節に検出された。ＣｅｄＰＶゲノムは、影響を受けた動物の鼻洗浄物、口腔スワブ、咽頭、または肺組織から回収されなかったが、リンパ性関与のパターンは、上下気道に過渡的複製が存在し得ることを示唆している。
【０１２８】
実施例７
オーストラリアのクイーンズランド州から２００３〜２００５年の間に収集された１００匹のオオコウモリの血清を、ＣｅｄＰＶに対する中和抗体についてスクリーニングした。上で説明されるように（抗体試験）、ウイルス中和試験を実行した。全ての血清試料を１：２０の希釈で試験した。上で説明されたＨｅＶおよびＣｅｄＰＶの間で観察される抗原の交差反応性のために、ウイルス中和試験を、各ウイルスについてより正確な感染データを取得するために実行した。全体的に、血清の２３％がＣｅｄＰＶ陽性、３７％ＨｅＶ陽性であった。同時感染が試験された血清の８％に反映されていた。
【０１２９】
実施例８
ＣｅｄＰＶ−ＧおよびＦ糖タンパク質はまた、ヘニパウイルスＧおよびＦ機能ドメインのマッピングを探索する重要な体系を代表する。ＣｅｄＰＶ−Ｆは、ＨｅＶ−ＦおよびＮｉＶ−Ｆとそれぞれ４２％および４３％同一であり、ＣｅｄＰＶ−Ｇは、ＨｅＶ−ＧおよびＮｉＶ−Ｇと２９％および３０％同一である。ＣｅｄＰＶ機能エフリン受容体の使用量は、ＣｅｄＰＶ、ＨｅＶ、およびＮｉＶの組み合わせを使用して、ヘテロ型ＦおよびＧ共発現および融合アッセイと共に特徴付けられた。コドン最適化クローンをｐＣＤＮＡベクター中で調製し、Ｓ−ペプチドタグで検出のためにタグ付けした。両方の構築物を発現し、検出し、我々のレポータ遺伝子の細胞−細胞融合アッセイにおいて機能的であることが見出された。パイロットアッセイ（図９）は、この手法のこの実現可能性を示している。エフリンＢ２およびＢ３陰性ＨｅＬａ−ＵＳＵ細胞は、細胞株Ｈｅｌａ−Ｂ３を発現するエフリンＢ３を有する陰性ＣｅｄＰＶ細胞−細胞融合である。
【０１３０】
融合は、２９３Ｔ標的細胞およびＨｅＬａ−Ｂ２細胞株を発現するエフリンＢ２と共に観察される。重要なことには、ＣｅｄＰＶ−Ｆは、ＨｅＶ−ＧおよびＮｉＶ−Ｇの両方を伴うヘテロ型機能を有するが、更に、ＣｅｄＰＶ−Ｇは、ＨｅＶ−Ｆのみを伴うヘテロ型機能を有し、ＮｉＶ−Ｆ（図９）は伴わず、エフリン使用とも相関する。
【０１３１】
実施例  ９
有意な詳細は、ＨｅＶとＮｉＶ−Ｇとの間の結合について利用可能であり、ＧのエフリンＢ２またはＢ３変異のうちのいずれかは、茎または球状頭部内の位置でエフリン受容体結合能力を保持したまま、それを融合促進活性およびウイルス感染性において非機能的にすることができる。一連のエフリン受容体と共に３ｓＧタンパク質（ＨｅＶ、ＮｉＶ、およびＣｅｄＰＶ）を用いる共同ＩＰアッセイにおいて、ＣｅｄＰＶ−ｓＧが、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３−弱、Ａ１、Ａ２、Ａ４−弱、およびＡ５を含む複数のエフリン亜型に結合することが可能であることが観察された（図１０）。この著しく広い受容体結合プロファイルは、エフリンＢ２およびＢ３のみと結合するＮｉＶおよびＨｅＶ−Ｇに対して明らかに対照的である。
【０１３２】
実施例１０
ＨｅＬａ−ＵＳＵ標的細胞意志を使用したパイロット細胞−細胞融合実験、トランスフェクトされ、発現された様々なエフリン受容体構築物が、図１１に示されている。Ｈｅｌａ−ＵＳＵ標的細胞集団が、示されるエフリン受容体構築物にトランスフェクトすることにより調製され、次いで、ＣｅｄＰＶ、Ｈｅｖ、ＮｉＶ  ＦおよびＧ糖タンパク質のいずれかを発現するエフェクタ細胞を用いて細胞−細胞融合アッセイで使用され、標準的な融合レポータ遺伝子アッセイが行われた。ＨｅＶおよびＮｉＶがエフリンＢ２およびＢ３の
みを利用することを我々は知っているが、ＣｅｄＰＶ  ＧおよびＦ媒介性融合は、エフリンＡ１またはＡ２のいずれかであるとき（またはエフリンＢ１またはＢ２が利用された）、非常に寛容であった。
【０１３３】
更に、Ｈｅｌａ−ＵＳＵ細胞における（遺伝子配列データに基づく）エフリンＡ１の背景内因性レベルは、非トランスフェクト細胞中の融合シグナルの原因である。この実験の結果は、ＣｅｄＰＶ  Ｇ糖タンパク質（図１０）を有するエフリン受容体結合データが、インビトロで行われるＣｅｄＰＶ受容体結合および機能的細胞−細胞融合と良好に相関することを示している。これまでに得られたエフリン受容体結合および融合データの要約が以下の表３に示される。
【０１３４】
【表１４】
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【０１３５】
以下の参考文献は、本明細書で番号により参照され、その全体が参照により組み込まれる。
【０１３６】
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【０１４４】
９．  Ｈａｙｍａｎ  ＤＴ，Ｓｕｕ−Ｉｒｅ  Ｒ，Ｂｒｅｅｄ  ＡＣ，ＭｃＥａｃｈｅｒｎ  ＪＡ，Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｗｅｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｆｒｕｉｔ
ｂａｔｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２７３９．
【０１４５】
１０．  Ｈａｌｐｉｎ  Ｋ，Ｈｙａｔｔ  ＡＤ，Ｆｏｇａｒｔｙ  Ｒ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｄ，Ｂｉｎｇｈａｍ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｐｔｅｒｏｐｉｄ  Ｂａｔｓ
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Ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ８５：９４６−９５１．
【０１４６】
１１．  Ｌｅｒｏｙ  ＥＭ，Ｋｕｍｕｌｕｎｇｕｉ  Ｂ，Ｐｏｕｒｒｕｔ  Ｘ，Ｒｏｕｑｕｅｔ  Ｐ，Ｈａｓｓａｎｉｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｆｒｕｉｔ  ｂａｔｓ
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【０１４７】
１２．  Ｔｏｗｎｅｒ  ＪＳ，Ｐｏｕｒｒｕｔ  Ｘ，Ａｌｂａｒｉｎｏ  ＣＧ，Ｎｋｏｇｕｅ  ＣＮ，Ｂｉｒｄ  ＢＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ
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【０１４８】
１３．  Ｌｉ  Ｗ，Ｓｈｉ  Ｚ，Ｙｕ  Ｍ，Ｒｅｎ  Ｗ，Ｓｍｉｔｈ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂａｔｓ  ａｒｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ  ｏｆ  ＳＡＲＳ−ｌｉｋｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６７６−６７９．
【０１４９】
１４．  Ｃｈｕａ  ＫＢ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｈｙａｔｔ  Ａ，Ｙｕ  Ｍ，Ｔｏｍｐａｎｇ  Ｍ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｕｎｋｎｏｗｎ
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【０１５０】
１５．  Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ  Ｈ  Ｍ，  Ｂｅｒｈａｎｅ  Ｙ，Ｃａｓｗｅｌｌ  Ｊ  Ｌ，Ｌｏｏｓｍｏｒｅ  Ｓ，Ａｕｄｏｎｎｅｔ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｐｉｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：７９２９−７９３８．
【０１５１】
１６．  Ｍｕｎｇａｌｌ  ＢＡ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｄ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｂｉｎｇｈａｍ  Ｊ，Ｈａｌｐｉｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｆｅｌｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：１２２９３−１２３０２．
【０１５２】
１７．  ＭｃＥａｃｈｅｒｎ  ＪＡ，Ｂｉｎｇｈａｍ  Ｊ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｇｒｅｅｎ  ＤＪ，Ｈａｎｃｏｃｋ  ＴＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ
ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ
ｃａｔｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３８４２−３８５２．
【０１５３】
１８．  Ｐａｌｌｉｓｔｅｒ  Ｊ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｄ，Ｗａｎｇ  ＬＦ，Ｋｌｅｉｎ  Ｒ，Ｈａｉｎｉｎｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｅｒｒｅｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：５６２３−５６３０．
【０１５４】
１９．  Ｂｏｓｓａｒｔ  ＫＮ，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｈ，Ｚｈｕ  Ｚ，Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３：１０５ｒａ１０３．
【０１５５】
２０．  Ｂｏｓｓａｒｔ  ＫＮ，Ｚｈｕ  Ｚ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｄ，Ｋｌｉｐｐｅｌ  Ｊ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ
ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｆｅｒｒｅｔ  ｍｏｄｅｌ
ｏｆ  ａｃｕｔｅ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５：ｅ１０００６４２．
【０１５６】
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ｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １４２：２９−４０．
【０１５７】
２２．  Ｂｏｎａｐａｒｔｅ  ＭＩ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  ＡＳ，Ｂｏｓｓａｒｔ  ＫＮ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｍｕｎｇａｌｌ  ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ２  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２：１０６５２−１０６５７．
【０１５８】
２３．  Ｎｅｇｒｅｔｅ  ＯＡ，Ｌｅｖｒｏｎｅｙ  ＥＬ，Ａｇｕｉｌａｒ  ＨＣ，Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔ  Ａ，Ｎａｚａｒｉａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＥｐｈｒｉｎＢ２  ｉｓ  ｔｈｅ  ｅｎｔｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ，  ａｎ  ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｄｅａｄｌｙ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６：４０１−４０５．
【０１５９】
２４．  Ｎｅｇｒｅｔｅ  ＯＡ，Ｗｏｌｆ  ＭＣ，Ａｇｕｉｌａｒ  ＨＣ，Ｅｎｔｅｒｌｅｉｎ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｔｗｏ  ｋｅｙ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｅｐｈｒｉｎＢ３  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ａｓ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ２：ｅ７．
【０１６０】
２５．  Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｖ，Ｃｏｎｔａｍｉｎ  Ｈ，Ｌｏｔｈ  Ｐ，Ｇｅｏｒｇｅｓ−Ｃｏｕｒｂｏｔ  ＭＣ，Ｌｅｆｅｕｖｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ：ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：８３４−８４０．
【０１６１】
２６．  Ｄｒｅｘｌｅｒ  ＪＦ，Ｃｏｒｍａｎ  ＶＭ，Ｇｌｏｚａ−Ｒａｕｓｃｈ  Ｆ，Ｓｅｅｂｅｎｓ  Ａ，Ａｎｎａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｂａｔｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：ｅ６３６７．
【０１６２】
２７．  Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｔｏｄｄ  Ｓ，Ｇｒｉｍｌｅｙ  Ｓ，ＭｃＥａｃｈｅｒｎ  ＪＡ，Ｍａｒｓｈ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｔｅｒｏｐｉｄ  ｂａｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４：ｅ８２６６．
【０１６３】
２８．  Ｃｈｕａ  ＫＢ，Ｗａｎｇ  ＬＦ，Ｌａｍ  ＳＫ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｙｕ
Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｉｏｍａｎ  ｖｉｒｕｓ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｒｕｉｔ  ｂａｔｓ  ｉｎ  ｍａｌａｙｓｉａ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８３：２１５−２２９．
【０１６４】
２９．  Ｃｈｕａ  ＫＢ，Ｌｅｋ  Ｋｏｈ  Ｃ，Ｈｏｏｉ  ＰＳ，Ｗｅｅ  ＫＦ，Ｋｈｏｎｇ  Ｊ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  Ｍａｌａｙｓｉａｎ  Ｉｓｌａｎｄ  ｆｌｙｉｎｇ−ｆｏｘｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ  ４：１４５−１５１．
【０１６５】
３０．  Ｃｈｕａ  ＫＢ  （２００３）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ
ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｆｒｕｉｔ  ｂａｔｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  
Ｉｎｆｅｃｔ  ５：４８７−４９０．
【０１６６】
３１．  Ｔｏｎｇ  Ｓ，Ｃｈｅｒｎ  ＳＷ，Ｌｉ  Ｙ，Ｐａｌｌａｎｓｃｈ  ＭＡ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＬＩ（２００８）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４６：２６５２−２６５８．
【０１６７】
３２．  Ｂａｋｅｒ  ＫＳ，Ｔｏｄｄ  Ｓ，Ｍａｒｓｈ  Ｇ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｒａｓ  Ａ，Ｓｕｕ−ｌｒｅ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｏ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｕｒｂａｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｆｒｕｉｔ  ｂａｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９３：８５０−８５６．
【０１６８】
３３．  Ｔｈｏｍａｓ  ＳＭ，Ｌａｍｂ  ＲＡ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ＲＧ（１９８８）Ｔｗｏ  ｍＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｆｆｅｒ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｎｏｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｅ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐ  ａｎｄ  Ｖ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５．細胞  ５４：８９１−９０２．
【０１６９】
３４．  Ｂｏｓｓａｒｔ  ＫＮ，Ｔａｃｈｅｄｊｉａｎ  Ｍ，ＭｃＥａｃｈｅｒｎ  ＪＡ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｚｈｕ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｏｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｐｈｒｉｎ−Ｂ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｓ  Ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７２：３５７−３７１．
【０１７０】
３５．  Ｐａｌｌｉｓｔｅｒ  Ｊ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  Ｄ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ｇ，Ｙａｍａｄａ  Ｍ，Ｋｌｅｉｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｆｅｒｒｅｔｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１１９７９−１１９８２．
【０１７１】
３６．  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＭＭ，Ｈｏｏｐｅｒ  ＰＴ，Ｓｅｌｌｅｃｋ  ＰＷ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ  ＨＡ，Ｓｌｏｃｏｍｂｅ  ＲＦ（２０００）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｆｒｕｉｔ  Ｂａｔｓ  （Ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｐｏｌｉｏｃｅｐｈａｌｕｓ）．Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｐａｔｈｏｌ  １２２：２０１−２０７．
【０１７２】
３７．  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ  ＨＡ，Ｈｏｏｐｅｒ  ＰＴ，Ｓｅｌｌｅｃｋ  ＰＷ，Ｍｕｒｒａｙ  ＰＫ（１９９５）Ｅｑｕｉｎｅ  ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ
ｔｏ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ．Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  Ｊ  ７２：２７８−２７９．
【０１７３】
３８．  Ｗｏｎｇ  ＫＴ，  Ｇｒｏｓｊｅａｎ  Ｉ，Ｂｒｉｓｓｏｎ  Ｃ，Ｂｌａｎｑｕｉｅｒ  Ｂ，Ｆｅｖｒｅ−Ｍｏｎｔａｎｇｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａ  ｇｏｌｄｅｎ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  Ｎｉｐａｈ
ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３：２１２７−２１３７．
【０１７４】
３９．  Ｎｅｇｒｅｄｏ  Ａ（２０１１）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｂｏｌ
ａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ７：ｅ１００２３０４．
【０１７５】
４０．  Ｌａｍｂ  ＲＡ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＬ，Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ  Ｄ，Ｍｅｌｅｒｏ  ＪＡ，Ｎａｇａｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｆａｍｉｌｙ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ．．Ｉｎ：Ｆａｕｑｕｅｔ  ＣＭ，Ｍａｙｏ  Ｊ，Ｍａｎｉｌｏｆｆ
Ｊ，Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ  Ｕ，Ｂａｌｌ  ＬＡ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ：８ｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．６５５−６６８．
【０１７６】
４１．  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  Ｒ，Ｔａｋｉｍｏｔｏ  Ｔ（２００９）Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ  １：５７４−５９３．
【０１７７】
４２．  Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｙ，  Ｃｕｒｒａｎ  Ｊ，Ｐｅｌｅｔ  Ｔ，Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ  Ｄ，Ｒａｙ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅ  Ｐ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｅｎｃｏｄｅｓ
Ｐ  ａｎｄ  Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｖ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：３４０６−３４１０．
【０１７８】
４３．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｍ，Ｅｇｈｏｌｍ  Ｍ，Ａｌｔｍａｎ  ＷＥ，Ａｔｔｉｙａ  Ｓ，Ｂａｄｅｒ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：３７６−３８０．
【０１７９】
４４．  Ｐａｌａｃｉｏｓ  Ｇ，Ｑｕａｎ  ＰＬ，Ｊａｂａｄｏ  ＯＪ，Ｃｏｎｌａｎ
Ｓ，Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ  ＤＬ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐａｎｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３：７３−８１．
【０１８０】
４５．  Ｌｉ  Ｚ，Ｙｕ  Ｍ，Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｗａｎｇ  ＨＹ，Ｗａｎｇ  ＬＦ（２００５）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ
ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）ｆｏｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ５’ ａｎｄ ３’
ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３０：１５４−１５６．
【０１８１】
４６．  Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，Ｄｕｄｌｅｙ  Ｊ，Ｎｅｉ  Ｍ，Ｋｕｍａｒ  Ｓ（２００７）ＭＥＧＡ４：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＭＥＧＡ）ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２４：１５９６−１５９９．
【０１８２】
４７．  Ｗａｎｇ  ＬＦ，Ｙｕ  Ｍ，Ｗｈｉｔｅ  ＪＲ，Ｅａｔｏｎ  ＢＴ（１９９６）ＢＴａｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｘ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｔａｇ  ｆｏｒ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｅｎｅ  １６９：５３−５８．
【０１８３】
４８．  Ｗａｎｇ  ＬＦ，Ｇｏｕｌｄ  ＡＲ，Ｓｅｌｌｅｃｋ  ＰＷ（１９９７）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＥＭＶ）ｍａｔ
ｒｉｘ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４２：２２６９−２２７９．
【０１８４】
４９．  Ｐｒｏｗｓｅ  Ｓ（２０００）Ａ  ｎｅｗ  ａｄｊｕｖａｎｔ．ＡＮＺＣＣＡＲＴ  Ｎｅｗｓ  １３：７．
【０１８５】
連邦政府支援の研究または開発に関する記述
【０１８６】
本発明の開発中に実施された作業の一部は、国立衛生研究所の助成金番号ＡＩ０５４７１５のもとで米国政府の資金を利用した。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由での配列表の提出
【０１８７】
２０１３年７月２日またはその前後に作成された「０４４５０８−５０４５−ＷＯ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題される約７０キロバイトのコンピュータ可読テキストファイルは、本出願用の配列表を含み、その全体が参照より本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019205475.tif 000021
【図２】
2019205475.tif 000022
【図３Ａ】
2019205475.tif 000023
【図３Ｂ】
2019205475.tif 000024
【図３Ｃ】
2019205475.tif 000025
【図４】
2019205475.tif 000026
【図５】
2019205475.tif 000027
【図６】
2019205475.tif 000028
【図７】
2019205475.tif 000029
【図８Ａ】
2019205475.tif 000030
【図８Ｂ】
2019205475.tif 000031
【図８Ｃ】
2019205475.tif 000032
【図８Ｄ】
2019205475.tif 000033
【図９】
2019205475.tif 000034
【図１０】
2019205475.tif 000035
【図１１】
2019205475.tif 000036
【配列表】
2019205475000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月12日(2019.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2019205475000001.pdf
2019205475000002.pdf
2019205475000003.pdf
2019205475000004.pdf