(57)【要約】【課題】本発明は、オリゴヌクレオチドの全身性イン−ビボ送達のための方法を提供する。【解決手段】本発明は、生物の細胞の細胞質及び組織に注目の核酸配列を送達するために、オリゴヌクレオチドに連結された１又は複数のHESの存在を利用する。送達ベヒクルは細胞及び生物にとって非毒性である。送達は配列非依存性であり、そして受容体非依存的態様で膜を通過するので、送達されるオリゴヌクレオチドは、生きた細胞の細胞質及び核における相補的配列を標的とすることができる。細菌又はウイルス由来配列もまた標的化され得る。この方法は、生きた生物中の、特定の蛋白質の発現をコードする遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ディサー（Dicer）基質、miRNA、anti-miRNA、又は任意の核酸配列の送達のために使用され得る。生きた生物には、哺乳類、植物、並びに細菌、原生動物及びウイルスの如き微生物が含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に療法的オリゴヌクレオチドを送達するための組成物において、当該組成物は、療法的オリゴヌクレオチドを含む療法的有効量のＨ−タイプ励起構造（H-type excitonic structure；HES）−オリゴヌクレオチドを含んで成り、当該療法的オリゴヌクレオチドは、イン−ビボで核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを変更する、ことを特徴とする前記組成物。
【請求項２】
前記療法的オリゴヌクレオチドが、約８ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記療法的オリゴヌクレオチドが１本鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記療法的オリゴヌクレオチドが２本鎖である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記HES−オリゴヌクレオチドが、１又は複数のHESを形成することができる３又はそれより多くのフルオロフォアを含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記療法的オリゴヌクレオチドが、siRNA、shRNA、miRNA、ダイサー（Dicer）基質、アプタマー（aptamer）、デコイ（decoy）及びアンチセンスから選択されるメンバーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記療法的オリゴヌクレオチドが、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNAにハイブリダイズしたとき、RNAse Hのための基質である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマー（gapmer）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNAにハイブリダイズしたとき、RNAse Hのための基質でない、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、DNA又はDNA模倣物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドが、２'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ（morpholino motif）を含んで成る、請求項10に記載の組成物。
【請求項１３】
前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、
（ａ）mRNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内にある配列；
（ｂ）miRNAのヌクレオチド１−10；
（ｃ）mRNAの５'−非翻訳領域における配列；
（ｄ）mRNAの３'−非翻訳領域における配列；
（ｅ）mRNAのイントロン／エキソン連結部；
（ｆ）オリゴヌクレオチドにより結合されたとき、miRNAのプロセシングを遮断するプレカーサー−miRNA（pre-miRNA）又は一次（プライマー）−miRNA（pri-miRNA）における配列；及び
（ｇ）RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオ塩基の領域；
から成る群から選択されるRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記療法的オリゴヌクレオチドが、RNAインターフェアレンス（RNAi）を誘導することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記療法的オリゴヌクレオチドが、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記療法的オリゴヌクレオチドがshRNAである、請求項14に記載の組成物。
【請求項１７】
18〜35ヌクレオチド長である、請求項16に記載の療法的オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
18〜35ヌクレオチドの長さを有する、請求項15に記載の療法的オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記療法的オリゴヌクレオチドがダイサー（dicer）基質であり、そして組成物が、それぞれが18〜25ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチド３'オーバーハングを有する２つの相補的核酸鎖を含む、請求項15に記載の組成物。
【請求項２０】
2'OME、ロックされた核酸（LNA）、αLNA、２'−フルオロ（2'F）、2'-O(CH2)2OCH3、2'-OCH3(2'-O-メチル）、PNA及びモルホリノから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシドモチーフを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
修飾されたヌクレオシドモチーフが、LNA又はαLNA（ここで、メチレン（−CH2−)n基が２'酸素原子及び４'炭素原子を架橋し、ｎは１又は２である）である、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
前記LNA又はαLNAが、５'位にメチル基を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、３'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
C-5プロピン及び5-メチルCから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
対象における標的核酸又は蛋白質対象の調節、対象における核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、対象における蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、対象における異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における請求項１〜24のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
エクス−ビボでの、細胞中の標的核酸又は蛋白質の調節、エクス−ビボでの、核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、エクス−ビボでの、蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、エクス−ビボでの、異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における請求項１〜24のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドを含む、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを含んで成る組成物において、当該療法的オリゴヌクレオチドは、イン−ビボで標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを変更し、全身的送達の後、イン−ビボでの、細胞中の標的核酸又は蛋白質対象の調節、全身的送達の後、イン−ビボでの、対象における核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、全身投与された場合、イン−ビボでの、対象における蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、イン−ビボでの、対象における異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における使用のための組成物、ここで前記HES−オリゴヌクレオチドは10分より長い持続する血漿半減期を有する。
【請求項２８】
感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害から選択される疾患又は障害、の治療のための、請求項27に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害から選択される疾患又は障害の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。
【請求項３０】
白血病の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。
【請求項３１】
ウイルス感染の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
転移性癌の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
寄生体感染の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド療法の分野に関する。特に、本発明は、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド模倣物を含めてのオリゴヌクレオチドのための改良されたイン−ビボ送達を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年にわたり、療法剤としてのオリゴヌクレオチドの使用は、多くの興味の焦点であった。特定の遺伝子の転写の遮断及び特定のタンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列の付加の両方が、癌、感染性疾患、及び神経変性状態を含む多くの病的状態の療法として試みられてきた。更に、潜在的なオリゴヌクレオチドを基礎とする薬物及び薬物剤形の合成的、免疫的、及び生物物理的性質に取り組むために、多くの化学的アプローチが開発されてきた。しかしながら、溶液での及びエクス−ビボ系での幾つかの成功にも拘わらず、生物の存在する細胞膜及び細胞外マトリクスの如き生物的障壁、並びに細胞壁の如き感染性因子の構造成分を通ってのオリゴヌクレオチドの送達は最適には至っていない。したがって、イン−ビボでの細胞及び組織内の分子標的への接近性が、オリゴヌクレオチド療法分野の発達を限定している。
【０００３】
不運にも、印象的なデータを生成するためにインフルエンザウイルスの如き感染体の遺伝子を標的とするインビトロ既知研究が続けれれている間に、インビボの結果は遅れをとった。療法の舞台（すなわち、インビボ効果）への基礎的化学の発見からの過渡的ギャップにおいて遭遇する主要な問題は、生物流体におけるオリゴヌクレヲチド組成物の貧弱な細胞内取込み、低い生物学的利用能、及び速い分解であることが広く認識されている。インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの理由には、（１）オリゴヌクレオチドの通過に抵抗する原形質膜及び細胞外マトリクスの如き物理的障壁、（２）オリゴヌクレオチドの安定性を減少させる血漿の如き生物流体中のヌクレアーゼ、及び（３）細胞外自己凝集、細胞内エンドリソゾーム捕捉及び／又はしばしば細胞への低い特異性による、有効性のために必要な注目の細胞の細胞質に、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが入ることができないという事実、が含まれる。
【０００４】
インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの追加の理由には、許容できない毒性（しばしば、インビトロテッティングにおいて検出できない）に導く多くのオリゴヌクレオチドによる生来のインビボ免疫応答の開始及びオリゴヌクレオチドの生物利用性を低下させる血漿蛋白質とオリゴヌクレオチドとの複合体形成が含まれる。したがって、インビトロのみでのオリゴヌクレオチドの生物活性が、インビボで投与された場合の類似の、又はそれについていずれかの生物活性を誘発するか否かを合理的に予測するものではないことが広く知られている。したがって、組織への浸透を増強し、細胞標的化及び細胞に入ることを改良し、そして所望の生物標的において細胞内生物利用性を増強する新規な送達系を研究するための多くの努力が行なわれてきた。
【０００５】
DNA及びRNA配列の送達の限界の幾つかを克服するための最近の努力において、注目のオリゴヌクレオチド配列に結合した又はそれを包埋する、脂質、糖及び蛋白質から構成される送達ベヒクル（vehicle）、例えばリポソーム、及び脂質ナノ粒子、コレステロール接合体、及び抗体接合体が開発されている。しかしながら、これらの剤形の何れも、疾患治療におけるその期待される役割を達成するための、オリゴヌクレオチド療法の分野のためのオリゴヌクレオチド積荷の送達を可能にしていない。したがって、オリゴヌクレオチドに基礎を置く療法剤の改良されたイン−ビボ送達系の需要が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｈ−型励起構造（HES）を含むオリゴヌクレオチド複合体、並びにこれらの複合体の製造及び使用の方法に関する。本発明は、１本鎖、２本鎖及び多本鎖オリゴヌクレオチド配列への１又は複数のHESの結合が、イン−ビボ系において見出されるHES−オリゴヌクレオチド配列の生理的境界を通しての増加した送達をもたらすという、本発明者らの重要な発見に部分的に基づいている。
【０００７】
遺伝子発現変更療法におけるRNAi及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、PNA（PNAs）及びPMOsの使用を制限する最も堅固な障害の一つは、真核細胞によるこれらの化合物の低い取込みであった。このことは、現在利用可能な送達方法と共に、実際の細胞に入る化合物の隔離（sequestration）及び／又は変質（degradation）により増加され；細胞に入るのは主としてエンドサイトーシスによる。当業者に直ぐに明らかなように、本発明の非−毒性HES−オリゴヌクレオチド複合体が配列非依存的受動核酸を介して細胞に送達される際の驚くべき高い効率、及びこれらのオリゴヌクレオチドが細胞内リソゾームと共に同時局在化しないという本発明者らによる発見は、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルが、すべての細胞内空間／区画（compartment）に入る可能性を有することを示す。したがって、例えば、研究、診断及び療法の分野において本質的に無限定の用途が存在する。特定の態様において、本発明は、疾患、障害又は状態の治療又は予防のための、HES及び少なくとも１つの療法的オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体の全身性（syst3emic）イン−ビボ送達に関する。
【０００８】
更に、現在利用可能な送達方法をもって、外因性核酸配列に対する哺乳類細胞における生来の抗ウイルス防御の誘導が、同様に、療法的オリゴヌクレオチドの開発及び使用を有意に制限している。本発明者らは、HES−オリゴヌクレオチドが低い毒性（10倍より高い濃度における決定されたオリゴヌクレオチドのイン−ビボ細胞負荷レベル）を有することを発見し、そして実際に、驚くべきことに、HES−オリゴヌクレオチドの化学的連結が、他の送達ベヒクルをもって観察されるインターフェロン応答に比べて、宿主対象（すなわち、マウス）におけるインターフェロン応答を誘導しないことを見出した。したがって、追加の態様において、本発明は、投与された外因性核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）に対する宿主におけるインターフェロン応答を限定する方法を包含し、この方法は、１、２、３又はそれより多くのオリゴヌクレオチドをHESに連結してHES−オリゴヌクレオチド複合体を形成し、そして当該HES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成る。
【０００９】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体送達ベヒクルは、注目の核酸の存在をイン−ビボで同定及び／又は定量するための診断剤として使用される。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体送達ベヒクルは、宿主生物における感染物、例えば哺乳類組織におけるウイルス又は細菌、の存在を同定するために使用される。これらの態様において、当該複合体のHESの崩壊の際に生ずる蛍光の変化が、細胞中の核酸標的配列への、当該複合体中の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチド配列の結合についてのイン−ビボマーカーとして役立ちうる。したがって、幾つかの態様において、本発明の複合体は、診断的用途及び療法的用途の両方を有する。このアプローチはまた、宿主中の異常遺伝子のコピー数をイン−ビボで定量するために使用され得る。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、疾患又は障害についての核酸バイオマーカーのレベルの変化をイン−ビボで検出するための方法を提供し、当該方法は、前記核酸バイオマーカーと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、当該対象における蛍光のレベルを決定し、そしてこの蛍光レベルを、HES−オリゴヌクレオチドが投与された対照としての対象について得られたそれとを比較することを含んで成り、ここで、対照と比べて変化した蛍光が、前記対象が核酸バイオマーカーの変化したレベルを有することを示す。このアプローチはまた、宿主由来の異常遺伝子のコピー数をイン−ビボで定量するためにも使用され得る。
【００１１】
幾つかの態様において、疾患又は障害は、癌、線維症、増殖性疾患又は障害、神経疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、或いは皮膚又は眼の疾患又は障害である。
【００１２】
追加の態様において、本発明の方法は、異なる疾患又は障害の間を同定及び／又は区別するために使用される。本発明の方法は同様に、特に、正常な及び疾患性の（例えば癌性の）組織又は細胞の間を区別する変化した核酸（例えば、DNA及びRNA）プロファイルを決定するため、疾患性の細胞の異なるサブタイプの間（例えば、異なる癌及び特定の癌のサブタイプの間）を区別するため、異なる疾患状態を生じさせるか又は当該疾患状態と関連する変異（例えば発癌性変異）の間を区別するため、及び組織の由来（特に、転移した腫瘍）を同定するために使用され得る。
【００１３】
本発明は、核酸、及び当該調節された核酸によりコードされる又は制御される蛋白質を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、mRNA、小さい非コードRNA（例えば、miRNA）、遺伝子又は蛋白質のレベル、発現、プロセッシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することにより、オリゴヌクレオチドを細胞にイン−ビボで送達する方法を提供する。特定の態様において、前記オリゴヌクレオチドは療法的オリゴヌクレオチドである。
【００１４】
更に、幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドは、療法的オリゴヌクレオチドであり、そして当該療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に特異的にハイブリダイズする場合に増加した蛍光において生ずるHESの破壊又は有意な喪失が、当該療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に送達されそして当該標的核酸にハイブリダイズしたことを示す。したがって、幾つかの態様において、本発明は、標的核酸への療法的オリゴヌクレオチドのイン−ビボでの送達のモニタリング及び／又は定量のための方法を提供し、当該方法は、前記標的核酸に特異的にハイブリダイズする療法的オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、そして当該対象の細胞又は組織における蛍光のレベルを決定することを含んで成り、ここで、対照細胞又は組織と比べての、前記細胞又は組織における増加した蛍光が、前記療法的オリゴヌクレオチドが前記標的核酸に送達されそして当該標的核酸とハイブリダイズしたことを示す。
【００１５】
追加の態様において、本発明は療法的オリゴヌクレオチドを対象に送達するための組成物に向けられ、ここで、当該組成物は、療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドと作用可能に関連する１又は複数のＨ−型励起構造（HES）を含んで成り、当該療法的オリゴヌクレオチドは、核酸配列にイン−ビボで特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされるか又は制御される蛋白質のレベルを調節するものである。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドの長さを有する。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは、約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さを有する。
【００１６】
幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは１本鎖である。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは２本鎖である。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、１又は複数のHESを形成することができる３又はそれより多くのフルオロフォアを含んで成る。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、ダイサー（Dicer）基質、アプタマー（aptamer）、デコイ（decoy）及びアンチセンスから選択されるメンバーである。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はDNA模倣物である。
【００１７】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズしたときRNAse Hの基質である。特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはキャップマー（gapmer）である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、３'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。
【００１８】
幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、２'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ（morpholino motif）を含む。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ（2'F）、2'-O(CH2)2OCH3及び2'-OCH3(2'-O-メチル）から選択される修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA（ここで、メチレン（−CH2−)n基が２'酸素原子及び４'炭素原子を架橋し、ｎは１又は２である）である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、５'位にメチル基を含む。
【００１９】
追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、しかしながら当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズしたときRNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はDNA模倣物である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、３'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。
【００２０】
追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、２'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ（morpholino motif）を含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ（morpholino motif）を含んで成る。
【００２１】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ（2'F）、2'-O(CH2)2OCH3及び2'-OCH3(2'-O-メチル）から選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA（ここで、メチレン（−CH2−)n基が２'酸素原子及び４'炭素原子を架橋し、ｎは１又は２である）である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、５'位にメチル基を含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレシドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ（2'F）、2'-O(CH2)2OCH3及（2'OME）び2'-OCH3(2'-O-メチル）から選択される修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。
【００２２】
更なる態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、
（ａ）mRNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内にある配列；
（ｂ）miRNAのヌクレオチド１−10；
（ｃ）mRNAの５'−非翻訳領域における配列；
（ｄ）mRNAの３'−非翻訳領域における配列；
（ｅ）mRNAのイントロン／エキソン連結部；
（ｆ）オリゴヌクレオチドにより結合されたとき、miRNAのプロセシングを遮断するプレカーサー−miRNA（pre-miRNA）又は一次（プライマリー）−miRNA（pri-miRNA）における配列；及び
（ｇ）RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオ塩基の領域；
に特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
他の態様において、本発明は、医療的オリゴヌクレオチドを対象に送達するための組成物に向けられ、ここで当該組成物は、療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドと作用可能に関連する１又は複数のＨ−型励起構造（HES）を含んで成り、当該医療的オリゴヌクレオチドは、核酸配列とイン−ビボで特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを、RNAインターフェアランス（RNAi）の誘導を介して調節するものである。幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さを有する。
【００２４】
幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、ダイサー（dicer）基質であり、それぞれ18〜25ヌクレオチドの長さを有する２本の相補的核酸鎖を含み、そして２個のヌクレオチドの３'オーバーハングを有する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ダイサー（Dicer）酵素活性によりプロセシングされるdsRNA又はdsRNA模倣物である。追加の態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、RNAインターフェアレンスを誘導することができるRNA又はRNA模倣物である。幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、３'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。追加の態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される１又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。
【００２５】
幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、２'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ（morpholino motif）を含む。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ（2'F）、2'-O(CH2)2OCH3(2'-OME)及び2'-OCH3(2'-O-メチル）から選択される修飾された糖モチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA（ここで、メチレン（−CH2−)n基が２'酸素原子及び４'炭素原子を架橋し、ｎは１又は２である）である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、５'位にメチル基を含む。
【００２６】
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、細胞へのオリゴヌクレオチドの高度に効果的なイン−ビボ送達を提供し、そして標的核酸及び蛋白質のレベル及び活性を調節することにおける、限定の無い適用を本質的に有する。HES−オリゴヌクレオチドは、医療用途において特に有用である。
【００２７】
幾つかの態様において、本発明は、対象において標的核酸を調節する方法を提供し、当該方法は、当該対象にHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、ここで当該複合体のオリゴヌクレオチドは、当該標的核酸に対して実質的に相補的な配列を含み、核酸に特異的にハイブリダイズしそして核酸のレベルを調節し、またはそのプロセシング若しくは機能を干渉する。幾つかの態様において、標的核酸はRNAであり、更なる態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、対象の１又は複数の細胞又は組織において、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％又は少なくとも50％、標的RNAのレベルを低下させる。幾つかの態様において、標的核酸はDNAである。
【００２８】
本発明はまた、核酸を調節する、及び調節された核酸によりコードされ又は制御される蛋白質を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、mRNA、小さい非−コードRNA（例えば、miRNA）、遺伝子及び蛋白質のレベル、発現、プロセシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。
【００２９】
１つの態様において、対象において標的核酸の活性を阻害し、そして／又はその発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、核酸を含んで成る又はコードする核酸に標的化され、そして細胞における当該核酸のレベルを低下させ、そして／又はその機構を干渉するものである。特定の態様において、標的核酸は、小さい非−コードRNA、例えばmiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【００３０】
追加の態様において、本発明は、標的RNAの発現の低下が必要な対象において標的RNAの発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、当該対象にアンチセンスHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成る。特定の態様において、当該複合体中のオリゴヌクレオチドは、当該標的mRNAに結合したとき、RNAse Hの基質である。更なる態様において、オリゴヌクレオチドはギャップマー（gapmer）である。
【００３１】
追加の態様において、本発明は、対象における核酸の発現又は活性を増加させる方法を提供し、当該方法は、当該対象に、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んで成るか若しくはコードする又は当該核酸の内因性発現、プロセッシング又は機能を増加させ（例えば、当該核酸をコードする遺伝子中の制御配列に結合することによる）、そして細胞中での核酸のレベルを増加させ、及び／又はその機能を増加させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んで成るか又はコードする核酸と実質的に同じ配列を含んで成る。
【００３２】
本発明はまた、対象における核酸の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法を含み、当該方法は、前記対象に、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、核酸を含んで成るか又はコードする核酸に対して標的化されており、そして前記対象において前記核酸のレベルを低下させ、そして／またはその機能に干渉するものである。
【００３３】
更なる態様において、本発明は、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法を含み、当該方法は、前記対象に、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質をコードする核酸に対して標的化されており、又は前記対象において、前記蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を低下させるものである。幾つかの態様において、前記核酸はDNA、mRNA又はmiRNAである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗−miRNA、ダイサー（dicer）基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはsiRNA、miRNA、リボザイム（ribozyme）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。
【００３４】
追加の態様において、本発明はまた、対象における蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害を全身的に治療する（例えば、軽減する）方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質をコードするmRNAに特異的にハイブリダイズし、そして標的RNAのスプライシングを変更する（例えば、特定のスプライス生成物の生産又は過剰生産が疾患において関連する場合にエキソンスキッピングを促進する）ものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位における修飾を含む少なくとも１つの修飾された糖成分を含んで成る。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、2'OME又は2’アリルである。
【００３５】
追加の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、LNA、αLNA（例えば、５'位に立体的に嵩高な成分（例えば、メチル基）を含むLNA又はαLNA）である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、PNA又はホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、AUG開始コドンの30ヌクレオチド以内の配列、標的RNAの５'若しくは３'非翻訳領域における配列、又は標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、デュセンヌ型筋ジストロフィー（DMD）における標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。更なる態様において、変更されたスプライシングは、生ずるmRNAのエキソン51のスピッキングをもたらす。
【００３６】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、異常に発現されるRecQヘリカーゼファミリーメンバーにおける標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。更なる態様において、変更されたスプライシングは、スプライス変更された標的mRNAによりコードされるヘリカーゼのヘリカーゼ活性及び／又は少なくとも部分的なDNA結合を回復させる。特定の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーは、ワーナー（Werner）蛋白質（WRN）である。他の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーは、RecQL1である。
【００３７】
種々の態様において、本発明は、対象におけるイン−ビボで、又はエクス−ビボで、細胞中の標的核酸又は蛋白質を調節するために使用する組成物を提供する。本発明のHES−オリゴヌクレオチド組成物は、例えば、イン−ビボ又はエクス−ビボでの、対象における核酸又は蛋白質の過剰発現、過小発現及び／又は異常発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療において用途を有する。感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患または障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害、から選択される例示的疾患又は障害の治療における発明の組成物の使用もまた、本発明に含まれる。
【００３８】
追加の態様において、本発明は、細胞核再プログラミングの方法を提供する。幾つかの態様において、１又は複数のmiRNA、又は１又は複数のmiRNA模倣物及び／又は阻害剤を含むHES−オリゴヌクレオチドが細胞、例えばヒト及びマウスの体細胞にエクス−ビボで投与され、当該細胞が、誘導された多能性幹細胞（iPSC）又は胚幹（ES）−様多能性細胞の１又は複数の性質を有するように再プログラミングされる。本発明の、非−毒性の高度に効果的なHES−オリゴヌクレオチド送達系は、常用のオリゴヌクレオチド送達系（例えば、米国特許公開US2010/0075421、US 2009/0246875、US 2009/0203141、及びUS 2008/0293143を参照のこと）に比べて、細胞の再プログラミングのための送達方法に非常に増加した効率を提供する。
【００３９】
定義
本明細書において、下記の略号を使用される。
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」なる用語は、共有結合した少なくとも２個のヌクレオチドに関する。本発明の核酸／オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１本鎖または２本鎖であり、そして一般にホスホジエステル結合を含む。但し、下に概略記載するように、幾つかの場合には、例えば下記のものを含んで成る他の主鎖を有する核酸／オリゴヌクレオチド類似体が含まれる：
【００４０】
ホスホラミド（phosphoramide）：例えば、Beaucage et al. Tetrahedron 49(10):1925 (1993)）及びその中に引用されている文献：Letsinger J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al. Eur. J. Biochem. 81 :579 (1977)；Letsinger et al. Nucl. Acids Res. 14:3587 (1986); Sawai et al. Chem. Lett. 805 (1984)；Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；及びPauwels et al. Chemica Scripta 26: 1419 (1986), Chemica Scripta 26; 1419 (1986)を参照のこと：これらの文献のそれぞれの全内容を引用により本明細書に組み入れる。
ホスホラチオエート（phosphorathioate）（Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437；及び米国特許第5,644,048号：当該文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。
【００４１】
ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）：Briu et al. J. Am. Chem. Soc. 111 :2321 (1989))。
O-メチルホスホロアミジエート結合：例えば、Eckstein, Oligonucleoetides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)を参照のこと。
ペプチド核酸主鎖及び結合：例えば、Egholm J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)；Meier et al. Chem. Int. Ed. Engl. 31 : 1008 (1992)；Nielsen Nature 365:566 (1993); Carlsson et al. Nature 380:207 (1996)を参照のこと：これらの文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。
【００４２】
他の類似体核酸／オリゴヌクレオチドには、陽性主鎖を有するもの（例えば、Dempcy et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:6097 (1995)を参照のこと：当該文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる）、非−イオン性主鎖を有するもの（例えば、米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号及び第4,469,863号；Angew. Chem. Intl, Ed. English 30:423 (1991)；Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)；Letsinger et al. Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994)；Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)；Jeffs et al. J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Chaturvedi et al., Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)を参照のこと：これらの文献のそれぞれの全内容を引用により本明細書に組み入れる）、及び米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、及びChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されている非−リボース主鎖が含まれる。
【００４３】
１又は複数のカルボキシル糖を含む核酸／オリゴヌクレオチドもまた、核酸／オリゴヌクレオチドの定義に含まれる（例えば、Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp 169-176 (1995)を参照のこと）。この文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。幾つかの核酸／オリゴヌクレオチド類似体が、Rawls, C & E News Jun. 2 1997 page 35に記載されており、この文献の記載の全体を引用により本明細書に組み入れる。リボース−リン酸主鎖のこれらの修飾は、例えば、標識のごとき追加の成分の付加を促進するため、又は生理的環境でのそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われる。
【００４４】
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドの核酸／オリゴヌクレオチド主鎖は、約５ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドに亘る。本発明において使用される好ましいオリゴヌクレオチドの核酸／オリゴヌクレオチド主鎖は、約５ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドに亘り、そして好ましくは約10ヌクレオチド〜100ヌクレオチドの長さである。本明細書で使用される場合、数に関連して使用される「約」または「およそ」なる用語は、参照される数の0.25％、0.5％、１％、５％又は10％以内の任意の数を意味する。
【００４５】
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の少なくとも領域に特異的にハイブルダイズすることができるヌクレオシド及び／又はヌクレオチドモノマーのポリマー構造を有する。上に示したように、HES−オリゴヌクレオチドは、天然の対応物、及び天然の及び非天然のモノマーの組み合わせと同様に機能する、天然の塩基、糖及び糖間（主鎖）連結、非天然修飾モノマー又はその部分を含んで成る化合物（例えば、オリゴヌクレオチド類似体又は模倣物）を包含するが、それらに限定されない。本明細書で使用される場合、「修飾された」又は「修飾」なる用語は、出発の又は天然のオリゴマー化合物、例えばオリゴヌクレオチド、からの任意の置換及び／又は任意の変化を包含する。オリゴヌクレオチドへの修飾は、ヌクレオシド間連結、糖成分、又は塩基成分に対する置換又は変化、例えば本明細書に記載されているもの及び当業界で知られているものを包含する。
【００４６】
「アンチセンス」は、本明細書で使用される場合、５'から３'の方向に記載して、標的核酸の対応する領域の逆相補体を含み、そして／又は生理的条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド配列を意味する。したがって、幾つかの態様において、用語「アンチセンス」は、小さい非コードRNA、非翻訳mRNA、及び／又はゲノムDNA配列の対応する領域に逆相補体を含んで成るオリゴヌクレオチドを意味する。特定の態様において、本発明の複合体中のアンチセンスHES−オリゴヌクレオチドは、一旦標的核酸にハイブリダイズした後、標的遺伝子の発現、標的遺伝子のレベル、又は標的核酸によりコードされる蛋白質のレベルの低下を誘導し、又は開始することができる。
【００４７】
「相補的」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドのモノマー成分と、標的にされる核酸（例えば、DNA、mRNA、及び非−コードRNA、例えばmiRNA）中のヌクレオチドとの間の、対合（pairing）のための容量を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの或る位置のヌクレオチドが、DNA／RNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、当該オリゴヌクレオチド及びDNA／RNAはその位置において相補的であると考えられる。
【００４８】
この発明の文脈において、「ハイブリダイゼ―ション」は、オリゴヌクレオチドと相補的核酸配列との対合を意味する。このような対合は典型的には水素結合を含み、当該水素結合は、オリゴヌクレオチドの相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（ヌクレオ塩基）と、標的核酸配列との間のWatson-Crick, Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合であることができる（例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の対応する領域の逆相補的ヌクレオチド配列を含む）。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは標的核酸に特異的にハイブリダイズする。用語「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的にハイブリダイズし得る」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸（すなわち、DNA又はRNA）との間に安定な且つ特異的な結合が生ずる程度に十分な相補性を示すために、交換可能に使用される。特異的にハイブリダイズし得るためには、オリゴヌクレオチドは、その標的核酸配列に対して100％相補的である必要はないと理解される。
【００４９】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列への当該オリゴヌクレオチドの結合が、当該標的核酸の正常な機能を妨害し、そしてそれからの発現の喪失又は変更された有用性をもたらす場合に、特異的にハイブリダイズし得ると考えられる。好ましい態様において、特異的結合が望まれる条件下（例えば、イン−ビボ測定又は治療の場合の生理的条件下、及びイン−ビトロ測定の場合の測定が行われる条件下）で、不所望の非−標的配列へのオリゴヌクレオチドの非−特異的結合を回避又は最小にするのに十分な程度の相補性が存在する。最小の非−特異的ハイブリダイゼ―ション事象を伴って標的核酸への特異的ハイブリダイゼ―ションのために条件が最適である時を日常的に決定することは、十分に当業者のレベルの範囲内にある。
【００５０】
したがって、幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、それが特異的にハイブリダイズする標的DNA又はRNA配列の領域の対応する相補性配列に比べて、１、２又は３つの塩基置換を含む。幾つかの態様において、非−相補的ヌクレオ塩基の位置は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５'又は３'末端である。追加の態様において、非−相補的ヌクレオ塩基は、オリゴヌクレオチド中の内部位置に存在する。オリゴヌクレオチド中に２個又はそれより多くの非−相補的ヌクレオ塩基が存在する場合、それらは連続的（すなわち連結されている）、非−連続的、又は両方である。幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域に対して、少なくとも85％、少なくとも90％、又は少なくとも95％の配列同一性を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸内のポリヌクレオチド配列に対して100％の配列同一性を有する。
【００５１】
パーセント同一性は、それに対してオリゴヌクレオチドは比較される対応する核酸配列に対して同一である塩基の数にしたがって計算される。この同一性は、オリゴマー化合物（すなわち、オリゴヌクレオチド）の全長にわたるか、又はオリゴヌクレオチドの部分内であろう（例えば、オリゴヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドのパーセント同一性を決定するために、27−マーのヌクレオ塩基１−20が20−マーと比較されるであろう）。オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のパーセント同一性は、当業界で知られているアラインメントプログラム及びBLASTプログラム（基本的地域的アラインメント検索ツール）を用いて決定され得る（例えば、Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990); Zhang and Madden, Genome Res., 7, 649-656 (1997)を参照のこと）。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」及び「標的をコードする核酸」は、標的化され得る任意の核酸を包含するように使用され、限定的ではなく、所与の分子標的（すなわち、蛋白質又はポリペプチド）をコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA（miRNA、pre-mRNA及びmRNAを含む）、及び更にこのようなRNAに由来するcDNAが含まれる。妨害されるべき例示的なDNAの機能には、複製、転写及び翻訳が含まれる。標的核酸の機能に対するこのような妨害の全体的効果は、標的分子の発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」は、例えば遺伝子の発現における、量的変化、増加（刺激）又は減少（阻害）の何れか、を意味する。RNAレベルの低下を介しての遺伝子発現の阻害が、本発明に従う調節の好ましい形態である。
【００５３】
「クロモフォア」は、光りの吸収を担当する基、構造、又は分枝である。典型的なクロモフォアは、それぞれ特徴的な吸収スペクトルを有する。
「フルオロフォア」は、特徴的な波長において光を吸収し、そして次に、最も典型的には特徴的に異なる波長において光を再放出するクロモフォアである。フルオロフォアは当業界においてよく知られており、そしてキサンテン（xanthene）、キサンテン誘導体、ロダミン（rhodamine）及びロダミン誘導体、シアニン（cyanine）及びシアニン誘導体、クマリン（coumarin）及びクマリン誘導体、並びにランタニドイオン系列のキレーターを含むが、これ等に限定されない。フルオロフォアは、光りを吸収するが特徴的に再放出しないクロモフォアから区別される。
【００５４】
「Ｈ−型励起構造」（HES）は、２又はそれ以上のフルオロフォアであって、それらの遷移双極子が平行配置で配置されており、励起された一重項状態の分裂をもたらすものを意味し、基底状態と高い励起状態との間の遷移が認められると考えられ、そして基底状態と低い励起状態との間の遷移は禁じられると考えられる。或る種のフルオロフォアに関連するHESの形成は当業界で知られており、そして本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、診断的及び治療的オリゴヌクレオチド）へのこれ等のフルオロフォアの取付け、及び得られるHES−オリゴヌクレオチドの、本明細書に記載の方法に従っての使用を含む。本発明の方法に従って使用され得るHES形成フルオロフォアの例は、本明細書に開示され、又は当業界で知られており、そしてキサンテン（xanthene）、キサンテン誘導体、シアニン（cyanine）及びシアニン誘導体、クマリン（coumarin）及びランタニドイオン系列のキレーターを含むが、これ等に限定されない。
【００５５】
用語「HES−オリゴヌクレオチド」は、HESを形成する２又はそれより多くのフルオロフォアを含む１又は複数のオリゴヌクレオチド鎖（例えば、同じ、相補的又は異なるオリゴヌクレオチド配列を含む、線状又は環状のオリゴヌクレオチドの１本鎖、２本鎖、３本鎖又はそれより多くの鎖）の複合体を意味する。HES−オリゴヌクレオチドのフルオロフォアは、集合HES−オリゴヌクレオチドが１又は複数のHESを含む限り、１つのオリゴヌクレオチド又は異なる複数のオリゴヌクレオチド内で、５'及び／又は３'主鎖ホスフェート及び／又は他の塩基に取付けることができる。フルオロフォアは、任意には、リンカー、例えば柔軟性脂肪族鎖を介してオリゴヌクレオチドに取付けられる。
【００５６】
HES-オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、又はそれより多くのHESを含むことができる。更に、HES−オリゴヌクレオチド中のHESは、２、３、４又はそれより多くの同じ又は異なるフルオロフォアを含むことができる。例えば、Toptygin et al, Chem. Phys. Lett 277:430-435 (1997)を参照のこと。幾つかの態様において、HESは、本発明のHES−オリゴヌクレオチド間のフルオロフォア凝集の結果として形成される。幾つかの態様において、HESは、HESを形成することができるフルオロフォアにより単一標識された本発明のオリゴヌクレオチド間のフルオロフォア凝集の結果として形成される。
【００５７】
本明細書において使用する場合、用語「医薬として許容される」又は「生理的に許容できる」及びこれ等の文法的変形は、それらが組成物、キャリアー、希釈剤及び試薬に関する場合、交換可能に使用され、そして療法的に禁止される不所望の生理的効果、例えば吐気、めまい、急性胃蠕動などを伴わないで、対象（例えば、哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、又は霊長類、例えばヒト）に又は対象上に投与することができることを示す。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成る医薬組成物」は、HES−オリゴヌクレオチド複合体及び医薬として許容される希釈剤を含んで成る組成物を意味する。例えば、適当な医薬として許容される希釈剤はリン酸緩衝塩溶液である。
【００５９】
「修飾の安定化」又は「モチーフの安定化」とは、ヌクレアーゼの存在下で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結により連結された２'−デオキシヌクレオシドにより提供される安定化に較べて増強された安定性を提供することを意味する。したがって、このような修飾は、オリゴヌクレオチドに、「増強されたヌクレアーゼ安定性」を提供する。修飾の安定化は、少なくともヌクレオシドの安定化及びヌクレオシド間連結基の安定化を含む。
【００６０】
用語「イン−ビボ生物」は、再生、成長及び発達のごとき刺激並びに安定な全体としての恒常性の維持が可能な連続生物系を意味する。例には哺乳類、植物、及び微生物、例えば細菌、原生動物及びウイルスが含まれる。
用語「対象」は、任意の動物（例えば、哺乳類）を意味し、特定の処理の受容者であるヒト、非−ヒト霊長類、齧歯類などを含むがこれらに限定されない。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、ヒト対象に関しては交換可能に使用される。
【００６１】
用語「投与する」及び「投与」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドのごとき化学物質を、イン−ビボ又はエクス−ビボで対象に加えることを意味する。したがって、「投与する」は、対象へのHES−オリゴヌクレオチドの直接的付加、並びに細胞とHES−オリゴヌクレオチド複合体の接触及びこれに続く当該接触された細胞の対象への導入、の両方を含む。１つの態様においては、対象から取り出された細胞がHES−オリゴヌクレオチドと接触され、そして次に当該接触された細胞が対象に再導入される。
【００６２】
用語「接触させる」は、化学物質、例えばオリゴヌクレオチドを、イン−ビボ生物、例えば哺乳類、植物、細菌、又はウイルスに加えることを意味する。哺乳類については、接触の一般的経路は、経口（口を通して）、局所（皮膚）、経粘膜（経鼻、頬側／舌下、膣、眼、直腸）、吸入（肺）、経筋（筋肉）及び静脈内（静脈）を含む。細菌及びウイルスについては、接触が宿主生物の細胞又は組織内への送達であろう。
【００６３】
「処理する」又は「処理」は、症状、併合症、又は疾患の生化学的事象、状態又は障害の開始を回避又は遅延させるため、症状を軽減するため、あるいは疾患、状態又は障害の更なる進行を阻止又は阻害するために、HES−オリゴヌクレオチドを投与することを含む。処理は、予防的（疾患の開始の回避又は遅延、或いはその臨床的又は潜在的症状の顕在化の回避）、或いは疾患、状態又は障害の顕在化後の症状の療法的抑制又は軽減であることができる。処理は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含む組成物のみを用いてもよく、或いは１、２、３、又はそれより多くの追加の療法剤との組合せであってもよい。
【００６４】
用語「療法的有効量」は、所望の療法的結果を達成するため、及び／又は対象における疾患又は障害を「処理する」ために効果的なHES−オリゴヌクレオチド複合体（療法剤）又は他の薬剤の量を意味する。用語「療法的有効量」はまた、疾患の進行の遅延、生存期間の延長、及び／又は疾患の１若しくは複数の症状、もしくは疾患を有する対象における疾患の進行の改善を達成するために要求される量を意味することができる。
【００６５】
例えば、癌の場合、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、血管新生及び新生血管形成を減少させ、癌細胞の数を減少させ、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、腫瘍のサイズを減少させ、癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し（すなわち、遅くし又は停止し）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、遅くし又は停止し）、腫瘍の増殖又は腫瘍の発生率を阻害又は遅延し、癌細胞に対する免疫応答を刺激し、そして／又は癌に関連する１又は複数の症状を救済するであろう。
【００６６】
感染性疾患の場合、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、感染物（例えば、ウイルス負荷）の減少した数に関連し、そして／又は感染物により惹起される感染に関連する１又は複数の症状又は状態の改善に関連するであろう。「療法的有効量」はまた、投与量及び必要な時間において、所望の療法結果を達成するために効果的な量を意味するであろう。本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに対象において所望の応答を惹起するHES−オリゴヌクレオチド複合体の能力、のごとき因子にしたがって変わるであろう。療法的有効量はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体の毒性又は有害効果に比べて、療法的に有利な効果が勝るような量である。
【００６７】
治療指数（therapeutic index）は、HES−オリゴヌクレオチド複合体の、所望の効果を惹起する投与量に対する不所望の効果を生成する投与量の比率である。本発明の開示の文脈において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、活性が維持されており、しかし不所望の効果が減少しまたは存在しない場合、「改良された治療指数」を示す。例えば、改良された治療指数を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体は、不所望の効果、例えば免疫刺激活性をもたらすことなく、又は少なくとも複合体の投与を禁止する程度に不所望の効果をもたらすことなく、miRNA活性を阻害する能力を維持する。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「療法的オリゴヌクレオチド」は、所望の療法結果を達成し、そして／又は十分な量で投与される場合に、又はエクス−ビボで対象における疾患又は障害を「処理する」ことができるオリゴヌクレオチドを意味する。このような好ましい結果には、例えば、疾患の進行を遅らせること、生存時間の延長、及び／又は疾患を有する対象における疾患、疾患の進行、又は疾患関連状態の指標の１又は複数における改善が含まれる。療法的オリゴヌクレオチドの例には、siRNA、shRNA、ダイサー（Dicer）基質（例えば、dsRNA）、miRNA、抗−miRNA、アンチセンス、デコイ（decoy）、アプタマー（aptamer）、及びsiRNA、miRNA、リボザイム（ribozyme）、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は蛋白質コード配列を発現することができるプラスミドが含まれる。所望の療法的結果を達成することができないプローブ及びプライマーのごときオリゴヌクレオチドは、この開示の目的のために療法的オリゴヌクレオチドとは考えられない。
【００６９】
平均して、mRNAの１％未満がアンチセンスオリゴヌクレオチドのための適当な標的である。本発明のHES−オリゴヌクレオチドへの導入のために適当な多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載され、又は当業界において知られている。同様に、適当な療法的オリゴヌクレオチドが、当業界で知られているガイドライン、アルゴリズム及びプログラムを用いて日常的に設計することができる（例えば、Aartsma-Rus et al., Mol Ther 17(3) 548-553 (2009)及びReynolds et al., Nat. Biotech. 22(3):326-330 (2004)、並びにZhang et al., Nucleic Acids Res. 31e72 (2003)を参照のこと、これらの文献のそれぞれの内容が、引用により本明細書に繰り入れられる）。
【００７０】
適当な療法的オリゴヌクレオチドは同様に、商業的に入手可能なプログラムを用いて日常的に設計することができる（例えば、MysiRNA-Designer, AsiDesigner (Bioinformatics Research Center, KRIBB)、siRNA Target Finder (Ambion)、Block-iT RNAi Designer (Invitrogen)、Gene specific siRNA selector (The Wistar Institute)、siRNA Target Finder (GeneScript)、siDESIGN Center (Dharmacon)、SiRNA at Whitehead、siRNA Design (IDT), D: T7 RNAi Oligo Designer (Dudek P and Picard D.)、sfold-software、及びRNAstructure 4.5)；インターネットで入手可能なプログラム、例えばヒトスプライシングファインダーソフトウエアー（例えば".umd.be/HSF/"）及びTargetfinder（"bioit.org.cn/ao/targetfinder"から入手可能）；及び商業的提供者（例えば、Gene Tools, LLC）を参照のこと）。場合によっては、文脈が特に断らない限り、本明細書において、HES−オリゴヌクレオチド及び療法的オリゴヌクレオチドは相互交換的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】図１ａは、200μLの緩衝液（PBS）又はダイサー（Dicer）基質の注射の３時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞のフィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、1.5 mg/kgの濃度でのPBS又はダイサー（Dicer）基質の１回のip注射の後で単離された。
【図１ｂ】図１ｂは、200μLの緩衝液（PBS）又はダイサー（Dicer）基質の注射の３時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞のフィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、PBS、1.5 mg/kgの濃度でのダイサー（Dicer）基質、又は0.75 mg/kgの濃度でのダイサー（Dicer）基質、の１回のip注射の後で単離された。
【図１ｃ】図１ｃは、種々の時間、すなわちダイサー（Dicer）基質の１回のip投与（1.0mg／kg）の後１、３、５及び24時間後に単離された細胞からの蛍光をヒストグラム形式で示す。これらのデータは、対照動物からのヒストグラム（ｔ＝０と表示される）上に重ねられている。１、３及び５時間におけるダイサー（Dicer）基質に曝露された細胞における約２logの蛍光強度は、対照動物からのそれらとの比較において、３時間における最大取り込み、及び24時間までの細胞内オリゴヌクレオチドの喪失を示した。すべての群の光散乱特性は、高度に生存性の細胞及びHES−担持オリゴヌクレオチドの不存在を示した。更に、24時間動物からのシグナルの喪失は、HES−オリゴヌクレオチドの非毒性代謝と一致する。
【００７２】
【図２】図２は、（左欄）放射スペクトル、及び（右欄）相互添加の前（上方の２列）及び後（下列）のRNAのフルオロフォアで標識された各相補的単鎖のhplcクロマトグラムを示す。図の中央欄は、センス鎖のみ（０秒と約80秒の間）及びそれに続くアンチセンス鎖の添加後（約80秒）での蛍光強度を示す。
【図３】図３は、組換えダイサー（Dicer）酵素の添加後の時間の関数としての、RNAの標識されたセンス鎖と標識されたアンチセンス鎖との間で形成された２本鎖の蛍光強度を示す。
【００７３】
【図４】図４は、eGFPについてトランスジェニックであるマウスからの単一血液細胞の蛍光強度を示す。対照細胞からのヒストグラムと、eGFPを標的化する２本鎖RNAの曝露された細胞のヒストグラムとが重ねられている。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
病的状態、例えば癌、感染性疾患、及び神経変性疾患、の検出及び処理のための分子標的は、ユニークなDNA及びRNA配列であることができる。このような標的と相補的配列を含むプローブとの結合、すなわちハイブリダイゼ―ションとして知られる工程、についての研究は、高い精度及び特異性をもって行われてきており、これ等のデータは現在利用できない処理の開発についての楽観性の基礎を提供した。しかしながら、このような研究の多くは、非生理的条件下で、例えば溶液中で、又は透過性にされた若しくは固定された細胞及び組織において行われてきた。あいにく、生理的条件下で同じプローブが試された場合、透過性障壁、例えば宿主の細胞膜、細胞外マトリクス又は細胞壁の存在と相俟って相補配列のサイズ及び電荷のため、それらの標的接近性がかなり限定され、効率の低下が生じた。したがって、過去10年の間、多くの資源が、イン-ビボで遺伝子の転写及び翻訳を遮断することができるオリゴヌクレオチド配列を送達する方法の開発に向けられた。
【００７５】
送達方法を開発するために、生物的アプローチ及び化学的アプローチの両方が用いられてきた。例えば、生物的アプローチは、プロモーターにより発現される配列の幾つかのウイルスベクターの作成であり、他方化学に基礎を置く送達ベヒクルは、コレステロール、糖、アプタマー（aptamer）及び抗体を含めての種々の分子と核酸との接合により作製された。しかしながら、最も研究されたイン−ビボ化学的送達系は、脂質二重層から構成される小胞であるリポソーム中に核酸が封入されるナノ粒子を使用した。後者は、増強された安定性を有するポリエチレングリコール（PEG）ポリマーにより修飾される場合、SNALPを称され、そしてときには更に、特定の細胞型上の受容体への標的化のために、ナノ粒子表面上のペプチドリガンドにより更に修飾される。
【００７６】
上記のアプローチにより若干の成功が達成されたが、次の問題点に遭遇した：ウイルス性送達を用いて、宿主において免疫原性を開始する高い可能性が存在する。更に、ウイルス配列における変異による宿主での変異及び異常な遺伝子発現の危険性をモニターしなければならない。イン-ビボ化学的送達ベヒクルに関しては、あいにく、特異性についての増強された修飾をもってしても、送達が次の点に欠けることが示されている：（１）標的細胞による特異的取込み。むしろ、細綱内皮系の細胞は、食細胞−様過程により、核酸構成物、特にナノ粒子を非特異的に取り込む。（２）所望の細胞の標的化が好結果である場合でさえ、送達ベヒクルを伴う又は伴わないプローブの内在化はしばしば、オリゴヌクレオチドがリソソーム内で止まる細胞のエンドサイトシス系に向けてであり、この場合、化学環境、例えば低pHが、（ａ）核酸の破壊、又は（ｂ）細胞質中の標的化されるmRNA又は核内のDNAからの隔離をもたらし得る。
【００７７】
上記の送達ヘヒクルに対して、本発明は、従来の送達技法を用いて要求される投与に比べて、療法効果を達成するのに桁違いに少ない投与量を要求する高度に効果的なイン−ビトロ及びイン−ビボオリゴヌクレオチド送達系を提供する。本発明のHES−オリゴヌクレオチ送達ドベヒクルは、配列非依存性であり（例えば、核酸、修飾された核酸、PNA、モルホリノの送達）、そして細胞エンドサイトシス系をバイパスするために受動拡散を利用し、それによりすべての細胞内環境へのアクセスを提供し、そしてオリゴヌクレオチド（例えば、医療的オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA、shRNA、ダイサー（Dicer）基質（例えばdsRNA）、miRNA、抗−miRNA、デコイ（decoy）、アプタマー（aptamer）及び例えば細胞質中の標的化RNA又は核中のDNAに対するアンチセンス）の送達を増加させる。
【００７８】
特に、好ましい態様において、本発明は、細胞の細胞質及び／又は核及び生物の組織にイン−ビボで注目の核酸配列を送達するために、オリゴヌクレオチド及び２又は複数のHESを形成することができるフルオロフォアを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いる。HES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルは、細胞及び生物に対して無毒である。本発明の送達ベヒクルの優れた配列非依存性の細胞膜透過性は、受容体非−依存性態様で膜を通過し、そして生きた細胞の細胞質及び核内の相補的核酸配列へのオリゴヌクレオチドの増加した送達及び標的化を導く、HES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの能力を促進する。
【００７９】
本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達系はまた、細菌又はウイルス由来の核酸配列を標的化するためにも用いることができる。更に、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルは、広範囲の診断的及び機能的オリゴヌクレオチドをイン−ビボで細胞に送達する用途を有し、当該オリゴヌクレオチドには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ダイサー（Dicer）基質、リボザイム、miRNA、抗−miRNA、アプタマー（aptamer）、デコイ（decoy）、蛋白質コード配列、又は生きた生物中の任意の核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。このような生きた生物には、例えば、哺乳類、植物、及び微生物、例えば細菌、原生動物、及びウイルスが含まれる。
【００８０】
本発明の観点又は態様がマーカッシュ群又は他の代替物の群分けにより記載される場合、本発明は、全体としてリストされる全群のみならず、群の個々の各メンバー及び主群の全ての可能性ある亜群、及びまた、１又は複数のメンバーを欠く主群も含む。本発明はまた、特許請求される群メンバーの任意の１又は複数の明示的排除も予想する。
【００８１】
「Ａ及び／又はＢ」の如き句において使用される「及び／又は」なる語は、Ａ及びＢの両方；Ａ又はＢ；Ａのみ；Ｂのみ、を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」の如き句において使用される「及び／又は」なる語は、次の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣＦ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａのみ；Ｂのみ；並びにＣのみ、を含むことが意図される。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチド複合体中のフルオロフォアは、複合体中でホモ型の又はヘテロ型の同種のフルオロフォアを有するHESを形成することができる、複合体中の任意のフルオロフォアであることができる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、Ｈ−型励起構造を形成することができる２つのフルオロフォアを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、Ｈ−型励起構造を形成することができる３、４、５又はそれより多くのフルオロフォアを含む。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、Ｈ−型励起構造を形成することができる約２〜20、約２〜10、約２〜６、又は約２〜４のフルオロフォアを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、Ｈ−型励起構造を形成することができる３，４、５又はそれより多くのフルオロフォアを含んでなる。
【００８３】
２又はそれより多くのフルオロフォアは、それらの集合蛍光が、例えば溶液中約１μM又はそれ以下においてそれらが分離される場合のフルオロフォアの集合蛍光に比べて検出可能に低い場合、HES中で相互に消光（quench）されると言われる。個々のフルオロフォアのスペクトルと比べてのHES吸収スペクトルの最大は、より短い波長にシフト（すなわち、ブルーシフト）されるべき最大の吸収波長を示す。Ｈ−型励起構造（以下、「HES」と記す）又は集合体の蛍光強度は、その成分の蛍光強度より低い強度を示す。Ｈ−型励起構造又は集合体の、吸収スペクトルのブルーシフト又は蛍光強度挙動の低下の何れかは、シグナルレポーター成分の指標として使用することができる。好ましい態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中の２又はそれより多くのフルオロフォアは、少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％。より好ましくは少なくとも80％、そして最も好ましくは少なくとも90％、95％、又は更に少なくとも99％で、増強又は消光する。Ｈ−型励起構造を形成することができるフルオロフォアの例には、キサンタン類、シアニン類及びクンマリン類が含まれる。
【００８４】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、カルボキシロダイン110、カルボキシテトラメチルロダミン、カルボキシロダミン−X、ジエチルアミノクマリン及びカルボシアニン色素から選択されるフルオロフォアを含む。
【００８５】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ロダミングリーン（Rhodamine Green）（商標）カルボン酸、サクシンイミジルエステル又は塩酸塩；ロダミングリーン（商標）カルボン酸トリフルオロアセタミド又はサクシンイミジルエステル；ロダミングリーン（商標）−Ｘサクシンイミジルエステル又は塩酸塩；ロドルグリーン（Rhodol Green）（商標）カルボン酸、N,0-ビス-(トリフルオロアセチル）又はサクシンイミドエステル；ビス-(4-カルボキシピぺリジニル)スルホンロダミン又はジ(サクシンイミジルエステル)；5-(及び-6)-カルボキシナフトフルオレセイン；５−（及び−６）−カルボキシナフトフルオレセイン；サクシンイミジルエステル；5-カルボキシロダミン6G塩酸塩；6-カルボキシロダミン6G塩酸塩；5-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル；6-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル；5-(及び-6)-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル；5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセインサクシンイミジルエステル又はビス-(ジイソプロピルエチルアンモニウム)塩；5-カルボキシテトラメチルロダミン；6-カルボキシテトラメチルロダミン；5-(及び-6)-カルボキシテトラメチルロダミン；5-カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル；6-カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル；5-(及び-6)- カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル；6-カルボキシ-X-ロダミン；5-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル；6-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル；5-(及び-6)-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル；5-カルボキシ-X-ロダミントリエチルアンモニウム塩；リッサミン（Lissamine）（商標）ロダミンBスルホニルクロリド；マラカイトグリーンイソチオシアネート；ロダミンレッド（Rhodamine Red）（商標）-Xサクシンイミジルエステル；6-(テトラメチルロダミン-5-(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸サクシンイミジルエステル；テトラメチルロダミン-5-イソチオシアネート；テトラメチルロダミン-6-イソチオシアネート；テトラメチルロダミン-5-(及び-6）イソチオシアネート；テキサスレッド（Texas Red）（登録商標）スルホニル；テキサスレッド（登録商標）スルホニルクロリド；テキサスレッド（登録商標）-X STPエステル又はナトリウム塩；テキサスレッド（登録商標）-Xサクシンイミジルエステル；テキサスレッド（登録商標）-Xサクシンイミジルエステル；X-ロダミン-5-(及び-6)-イソチオシアネート；及びカルボシアニン類から成る群から選択されるフルオロフォアを含む。
【００８６】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、異なるフルオロフォアから形成されるヘテロHESを含む。特定の態様において、ヘテロ−HESは、ロダミン又はロダミン誘導体、及びフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体、又は２つのカルボシアニンを含む。更なる態様において、ヘテロ−HESは、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセインサクシンイミジルエステル；5-(及び-6)-カルボキシエオシン；5-カルボキシフルオレセイン；6-カルボキシフルオレセイン；5-(及び-6)-カルボキシフルオレセイン；5-カルボキシフルオレセイン-ビス-(5-カルボキシメトキシ-2-ニトロベンジル)エステル、-アラニン-カルボキサミド、又はサクシンイミジルエステル；5-カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル；6-カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル；；5-(及び-6)- カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル；5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン；2',7'-ジフルオロフルオレセイン；エオシン-5-イソチオシアネート；エリスロシン-5-イソチオシアネート；6-(フルオレセイン-5-カルボキサミド)ヘキサン酸又はサクシンイミジルエステル；6-(フルオレセイン-5(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸又はサクシンイミジルエステル；フルオレセイン-5-EXサクシンイミジルエステル；フルオレセイン-5-イソチオシアネート；及びフルオレセイン-6-イソチオシアネート、から選択されるフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体を含む。
【００８７】
オリゴヌクレオチド
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（RNA）、デオキシリボ核酸（DNA）又はこれらの模倣物のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然ヌクレオ塩基、糖、及びヌクレオシド間共有結合（主鎖）から構成されるオリゴヌクレオチド（すなわち、非−修飾オリゴヌクレオチド）、並びに非−天然ヌクレオ塩基、糖、及び／又はヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物、及び／又は同様に機能するDNA及び／又はRNAの類似体（すなわち、核酸「模倣物」（mimetics又はmimics）を含む。このような模倣オリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの好ましい性質のため、天然型を超えて好ましい。
【００８８】
例えば、本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド主鎖の１又は複数のリボース環がモルホリン環により置き換えられているモルホリノ（MNO）、及びヌクレオチド主鎖の１又は複数のリボース環がモルホリン環により置き換えられておりそして負に荷電したサブユニット間結合が荷電を有しないホスホロジアミデート結合により置き換えられているホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMO）を含む。同様に、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの１又は複数の糖リン酸主鎖がアミド含有主鎖に置きかえられているPNAを包含する。この明細書の目的のため、及び時には当業界において言及されるように、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオチドであると考えられる。更に、オリゴヌクレオチドはオリゴマーとも称される。
【００８９】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドベヒクルの送達は、配列非−依存性であり、そしてそれ故のHES−オリゴヌクレオチドベヒクルに含まれるオリゴヌクレオチドは、細胞に導入されることが好ましいことが知られている核酸又は模倣物の任意の形態であってよい。
【００９０】
HES−オリゴヌクレオチドベヒクル中のオリゴヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、環状又はヘアピン形オリゴヌクレオチドの形態であることができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、１本鎖DNA、RNA、又は核酸模倣物（例えば、PMO、MNO、PNA、又は１若しくは複数の修飾されたヌクレオチド、例えば２'OME及びLNAを含むオリゴヌクレオチド）である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２本鎖DNA、RNA、核酸模倣物、DNA／核酸模倣物、２本鎖DNA、DNA／RNA、RNA核酸模倣物である。
【００９１】
本発明者らが、驚くべきことに発見したところによれば、HES−オリゴヌクレオチド例えばssDNA及びdsRNAを含む複合体は、従来のオリゴヌクレオチド送達ベヒクルにより要求される投与に比べて数桁少ないオリゴヌクレオチドを必要とする卓越した配列非−依存性細胞内送達を示す。本発明の複合体に含まれる１本鎖核酸の例には、アンチセンス、siRNA、shRNA、リボザイム、miRNA、抗miRNA、トリプレックス形成性オリゴヌクレオチド及びアプタマー（aptamer）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、１本鎖DNA（ssDNA）である。好ましい態様において、ssDNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分は、標的RNAと特異的にハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNAの２本鎖を形成する。更なる好ましい態様において、オリゴヌクレオチド−RNAの２本鎖は、RNase開裂メカニズム（例えば、RNase H）に対して感受性である。幾つかの態様において、複合体中の１本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された主鎖連結、少なくとも１つの修飾された糖、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基（例えば、本明細書に記載のもの）を含んで成る。
【００９３】
幾つかの態様において、複合体中の１本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された主鎖連結、少なくとも１つの修飾された糖、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基（例えば、本明細書に記載のもの）を含んで成り、そしてRNAase開裂メカニズムに対して感受性のオリゴヌクレオチド−RNAの２本鎖を形成することができる。特定の態様において、１本鎖オリゴヌクレオチドは、ギャップマー（gapmer）（すなわち、本明細書に記載されているもの、又は当業界で知られているもの）である。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された主鎖連結、少なくとも１つの修飾された糖、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基を含んで成り、それは、RNase開裂メカニズム（本明細書に記載されているように）に対するオリゴヌクレオチドの感受性を低下させる。特定の態様において、１本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２'OME、LNA、MNO又はPNAモチーフを含んで成る。
【００９４】
本発明者らが驚くべきことに発見したところによれば、２本鎖オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体は、従来のオリゴヌクレオチド送達ベヒクルに比べて、卓越した２本鎖オリゴヌクレオチドの配列非−依存性細胞内送達を示す（やはり、ナノモル及び中程度マイクロモルの範囲で）。本発明の複合体に含まれる２本鎖DNAオリゴヌクレオチドの例には、dsRNAi及びダイサー（dicer）基質及び他のRNAインターフェアランス試薬、及び構造遺伝子及び／又は制御領域及び停止領域に対応する配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、線状２本鎖RNA（dsRNA）である。好ましい態様において、ds-RNAは、RNase開裂メカニズム（例えば、ダイサー（Dicer）及びドロシャ（Drosha）（RNase III酵素））に対して感受性である。追加の態様において、dsRNAは、細胞のRNA誘導サイレンシング複合体（RNA Induced Silencing Complex）（RISC）)に挿入されうる。更なる態様において、dsRNAのRNA鎖は、RNA標的の開裂を行なうためにRISC複合体を使用することができる。
【００９６】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、２本鎖オリゴヌクレオチドを含み、当該２本鎖オリゴヌクレオチドでは、一方又は両方のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された主鎖連結、少なくとも１つの修飾された糖、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基を含む。好ましい態様において、２本鎖オリゴヌクレオチドは、RNase開裂メカニズム（例えば、ダイサー（Dicer）及びドロシャ（Drosha）（RNase III酵素）に対して感受性である。追加の態様において、２本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞のRNA誘導サイレンシング複合体（RNA Induced Silencing Complex）（RISC）)に挿入されうる。更なる態様において、２本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖は、RNA標的の開裂を行なうためにRISC複合体を使用することができる。
【００９７】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は３本鎖オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは３本鎖DNA／RNAキメラを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された主鎖連結、少なくとも１つの修飾された糖、及び／又は少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基を含んで成る。特定の態様において、複合体中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２'OME、LNA、MNO及びPNAモチーフを含んで成る。
【００９８】
HES−オリゴヌクレオチドベヒクル中のオリゴヌクレオチドは、日常的に、線状に調製されるが、連結されることができ、あるいは環状に調製され、そしてまた分枝形成も含まれる。別々のオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズして２本鎖を形成することができ、当該２本鎖は平滑末端を有することができ、又は１端又は両端にオーバーハングを含むことができる。特定の態様において、本発明の複合体に含まれる２本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、dsRNA、及びオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１つが核酸模倣物である２本鎖オリゴヌクレオチド）は、21〜25ヌクレオチドの長さであり、そして１端又は両端に１、２、又は３ヌクレオチドのオーバーハングを有する。
【００９９】
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、一般に、核酸又は模倣体の特定の形態、及び意図される用途に依存して種々の長さを有することができる。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中の核酸／オリゴヌクレオチドは、約５ヌクレオチド〜約500ヌクレオチド、そして好ましくは約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さに亘る。
【０１００】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に対して相補的である少なくとも８個の連続するヌクレオ塩基を含んで成る。種々の関連する態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、約８〜約100モノマーサブユニット（ここで、用語「ヌクレオチド」と交換可能に使用される）、又は約８〜約50ヌクレオチドの長さを有する。
【０１０１】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、約８〜約30ヌクレオチド、約15〜約30ヌクレオチド、約20〜約30ヌクレオチド、約18〜26ヌクレオチド、約19〜25ヌクレオチド、約20〜25ヌクレオチド、又は約21〜25ヌクレオチドの長さを有する。
【０１０２】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50サブユニット（ヌクレオチド）の長さを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、19、20、21、22、23、24又は25ヌクレオチドの長さを有する。
【０１０３】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、21〜25ヌクレオチドの長さを有するRNAオリゴヌクレオチドの２本鎖を含み、そしていずれか又は両方の末端に１、２又は３ヌクレオチドのオーバーハングを有する。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、オリゴヌクレオチドの２本鎖を含み、当該オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも一方は21〜25ヌクレオチドの長さの核酸模倣物であり、そして２本鎖オリゴヌクレオチドは何れか又は両方の末端に１、２又は３ヌクレオチドのオーバーハングを有する。
【０１０４】
修飾を含むオリゴヌクレオチド
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、好ましくは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結、修飾された糖成分及び／又は修飾されたヌクレオ塩基を含む。このような修飾されたオリゴヌクレオチド（すなわち、模倣物）は、例えば、増強された細胞取込み、核酸標識に対する増強された親和性、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、及び／又は増加した阻害活性を含む好ましい性質のため、典型的には天然型を超えて好ましい。
【０１０５】
修飾されたヌクレオシド間連結
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を維持するオリゴヌクレオチド、及びヌクレオシド主鎖にリン原子を有しないおオリゴヌクレオチドを意味する。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含んで成る。本発明のオリゴヌクレオチド中の修飾されたヌクレオシド間連結は、例えば、ホスホジエステルヌクレオサイド間連結により提供されるヌクレアーゼ安定性に比べて、オリゴヌクレオチドに対する増強されたヌクレアーゼ安定性を提供することが知られている任意の態様のヌクレオシド間連結を含む。
【０１０６】
修飾されたヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を維持するヌクレオシド間連結、及びリンを含有しないヌクレオシド間連結が含まれる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間連結及び非−修飾のヌクレオシド間連結の間で交代する修飾されたヌクレオシド間連結を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結の殆どが修飾される。更なる態様において、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオシド間連結が修飾されている。
【０１０７】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば３'−アルキレンホスホネート、５'−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデート、例えば３−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノ−アルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３'−５'連結、これ等の２'−５連結類似体を有するセレノ−ホスフェート及びボロノホスフェート、及び１又は複数のヌクレオシド間連結が３'−３'、５'−５'、又は２'−２'連結である逆転した極性を有するものが含まれる。逆転した極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間連結の最３側に単一３'−３'連結、すなわち塩基脱落でもよい単一の逆転したヌクレオシド残基（ヌクレオシド塩基が欠けているか又はそれに代えてヒドロキシル基を有する）を含んで成る。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
【０１０８】
好ましい態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも１個のホスホロチオエート（PS）ヌクレオシド間連結を含み、当該ホスホロチオエート（PS）ヌクレオシド間連結においては、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子の１つが硫黄により置き換えられている。PSヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、通常のワトソン−クリック塩基対を形成し、RNase Hを活性化し、細胞送達のために負の電荷を担持し、そして他の追加の好ましい薬理動態特性を示す。幾つかの態様において、前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間連結はホスホロチオエートである。
【０１０９】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド間連結の少なくとも２、３、４、５、10又は15は、ホスホロチオエート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも１〜10、１〜20、１〜30は、ホスホロチオエート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも２、３、４、５、10又は15は、ホスホロチオエート連結である。追加の態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０１１０】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、２〜５のMOEヌクレオチドのいずれかの末端に接する８〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、MOEギャックマー）を有する。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、２〜５のLNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する８〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、LNAギャックマー）を有する。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、２〜５のトリシクロ−DNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する８〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、tcDNAギャックマー）を有する。
【０１１１】
他の適当な、リンを含有する修飾されたヌクレオシド間連結はN3'−P5'ホスホロアミデート（NP）であり、当該N3'−P5'ホスホロアミデート（NP）では、２'−デオキシリボースの３'−ヒドロキシ基が３'−アミノ基により置き換えられている。NPヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、相補的RNAに対する高い親和性及びヌクレアーゼに対する耐性を示す。ホスホロアミデートは標的RNAのRNase H開裂を含まないので、これ等のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、RNA一体化が維持される必要がある場合、例えばオリゴヌクレオチド調節、mRNAスプライシングの場合に用途を有する。
【０１１２】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド間連結の少なくとも２、３、４、５、10又は15は、ホスホロアミデート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも１〜10、１〜20、１〜30は、ホスホロアミデート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも２、３、４、５、10又は15は、ホスホロアミデート連結である。追加の態様において、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結はホスホロアミデートヌクレオシド間連結である。
【０１１３】
多くの修飾されたヌクレオシド間連結及びそれらの合成方法が当業界において知られており、そして本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる修飾に包含される。リン含有ヌクレオシド間連結の調製を教示する米国特許の例には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,194,599号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,489,677号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,527,899号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,565,555号、第5,602,240号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第5,646,269号、第5,663,312号、第5,672,697号、第5,677,439号、及び第5,721,218号が含まれるが、これらに限定されない。これらの開示のそれぞれを、引用により本明細書に繰り入れる。
【０１１４】
リン原子を含まないオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体もまた本発明に含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの例には、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキルとの混合ヌクレオシド間連結、あるいは１又は複数の短鎖ヘテロ原子又はヘテロサイクルヌクレオシド間連結により形成される主鎖を含むものが含まれる。これらの修飾された主鎖には、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖成分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びCH2成分部分を有するもの、を含むオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
リン原子を含まない主鎖を含むオリゴヌクレオチドの製造方法は当業界で知られており、そして米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,646,269号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、第5,677,439号、第5,792,608号に記載されている方法及び組成物を含むが、これらに限定されない。これらの開示のそれぞれを、引用により本明細書に組み入れる。
【０１１６】
幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３'−メチレンスルホネート、メチレン（メチルイミノ）（MMIとしても知られる）、モルホリノ、ロックされた核酸、及びペプチド核酸連結から選択される１又は複数の修飾された主鎖連結を含む。修飾された主鎖連結は、均一でもよく、又はRNAse H開裂が支持されない限り、他の連結、特にホスホジエステル又はホスホロチオエート連結と交互であってもよい。
【０１１７】
幾つかの態様において、HES複合体は核酸模倣物であるオリゴヌクレオチドを含む。用語「模倣物」は、オリゴヌクレオチドに適用される場合、糖、又は糖及びヌクレオチド間連結の両者がそれに代わる基により置き換えられているオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。
【０１１８】
幾つかの態様において、本発明の複合体は、１又は複数のモルホリノ連結を有するオリゴヌクレオチドを含む。モルホリノのRNAse及びヌクレアーゼ耐性特性により、それらが特に細胞での転写を制御するのに有用なものとなる。したがって、幾つかの態様において、モルホリノ単位を含む複合体は遺伝子発現を調節するために使用される。幾つかの態様において、モルホリノ単位はホスホロジアミテートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノに対応する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドの各モノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。追加の態様において、モルホリノオリゴヌクレオチド（例えば、PMO）を含有する複合体は、対象におけるmRNAスプライシングを変更するために使用される。追加の態様において、１又は複数のモルホリノヌクレオ塩基、例えばPMOを含む複合体は、アンチセンス剤として使用される。
【０１１９】
追加の態様において、本発明のオリゴヌクレオチド複合体は、ペプチド核酸（PNA）である。PNAは、オリゴヌクレオチドの糖ホスフェート主鎖がアミド含有主鎖により置き換えられている核酸模倣物である。特定の態様において、オリゴヌクレオチドのホスフェート主鎖は、アミノエチルグリシン主鎖により置き換えられており、そすてヌクレオ塩基は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。多くのPNA及びPNAの製造方法が当業界で知られている（例えば、Nielsen et al, Science, 254, 1497-150 (1991)、並びに米国特許第5,539,082号、第5,714,331号及び第5,719,262号を参照のこと）これらのそれぞれを、引用によりこの明細書に繰り入れる。PNA含有オリゴヌクレオチドは、増加した安定性及び好ましいハイブリダイゼ―ション動態を提供し、そして非置換対応核酸に比べてDNAより高いRNAに対する親和性を有し、そしてRNAse H介在分解を活性化しない。本発明の含まれるPNAは、PNA類似体、例えばオリゴヌクレオチドの１又は複数のモノマー単位のC2（α）、例えばＤ−アミノ酸、又はC5（γ）例えばL-アミノ酸（例えば、L-リジン）に正に荷電した基及び／又は１又は複数のキラル拘束立体中心を有する修飾された主鎖を有するPNAを含む。
【０１２０】
PNAオリゴヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらは、立体ブロックメカニズムを介しての細胞内でのRNA（例えば、mRNA及びmiRNA）の制御において特に有用なものとなる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAオリゴヌクレオチドを含んで成る。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAオリゴヌクレオチドを含んで成り、そして染色体２本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAオリゴヌクレオチドを含み、そして対象においてmRNAスプライシングを変更する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAオリゴヌクレオチド、例えばPMOを含み、そしてアンチセンスとして働く。
【０１２１】
同様に、モルホリノ含有オリゴヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらのオリゴヌクレオチドは、立体ブロックメカニズムを介して細胞でのRNA（例えば、mRNA及びimRNA）を制御するのに有用となる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そして染色体２本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そして対象においてmRNAスプライシングを変更する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そしてアンチセンスとして働く。
【０１２２】
更に、二環糖含有ヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらのオリゴヌクレオチドは、立体ブロックメカニズムを介して細胞でのRNA（例えば、mRNA及びmiRNA）を制御するのに有用となる。幾つかの態様において、本発明の複合体は少なくとも１つの二環糖含有ヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、二環糖含有ヌクレオチドはロックされた核酸（LNA）である。更なる態様において、LNAは糖リングの３'又は４'炭素原子に結合した２'ヒドロキシル基を有する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックされた核酸（LNA）を含んで成り、当該ロックされた核酸においては、メチレン（−CH2−)n基が２'酸素原子及び４'炭素原子を架橋し、ここでｎは１又は２である。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、二環糖含有ヌクレオチド例えばLNAを含んで成り、そして染色体２本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの二環糖オリゴヌクレオチド例えばLNAを含み、そして対象におけるmRNAスプライシングを調節する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの二環糖オリゴヌクレオチド、例えばLNA、を含んで成り、そしてアンチセンスとそて働く。
【０１２３】
修飾された糖成分
幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、１又は複数の修飾された糖成分を有する１又は複数のヌクレオシドを含んで成り、当該修飾された糖成分は、天然の又は合成非修飾ヌクレオ塩基に対して、機能的に相互交換可能だとしても、構造的に区別できる。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシド（ユニット）において修飾された糖を含んで成る。
【０１２４】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用な糖修飾の例には、OH；Ｆ；０−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル；又はO-アルキル-O-アルキル（式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換されているか又は置換されていないC1−C10アルキル又はC2−C10アルケニル又はアルキニルである）から選択される糖置換基を含んで成る化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
代表的な修飾された糖には、炭素環式又は非環式糖、２'、３'又は４'位の１又は複数に置換基を有する糖、糖の１又は複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖、及び糖内の他の２つの原子間に結合を有する糖が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用な２'−糖置換基の例には、OH；F；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；アリル、アミノ；アジド；チオ；Ｏ−アリル；0(CH2)2SCH3；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；或いはO-アルキル-O-アルキル（アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された又は非置換のC1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルである）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２６】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2、及び0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2（ここで、ｎ及びｍは１〜約10である）から選択される少なくとも１つの２'−糖置換基を含む。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、C1〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、SH、SCH3、OCN、CI、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター（intercalator）、薬理動態特性を改良するための基、又はオリゴヌクレオチド化合物の薬力学特性を改良するための基、及び類似の性質を有する他の置換基から選択される少なくとも１つの２'−糖置換基を含む。
【０１２７】
特定の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、２'−メトキシエトキシ(2-0--CH2CH2OCH3, aka 2'-MOE)置換基を有する少なくとも１つの２'−置換糖を含んで成る。
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-アリル(2-CH2--CH-CH2)、2'-0-アリル(2'-0--CH2--CH--CH2)、2'-アミノプロポキシ(2'-0CH2CH2CH2NH2)、及び2'-アセトアミド(2'-0--CH2C(--0)NRlRl（ここで、各Rlは独立にＨ又はCl-Clアルキルである）から選択される少なくとも１つの２'−修飾ヌクレオシドを含んで成る。
【０１２８】
更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-ジメチルアミノオキシエトキシ(2'-0(CH2)2ON(CH3)2基（2'-DMAOE)置換基としても知られる）；2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-0--CH2--0--CH2--N(CH2)2（2'-0-ジメチルアミノエトキシエチル又は2-DMAEOEとしても知られる）置換基；又は2'-O-メチル(2-0--CH3)置換基を有する少なくとも１つの２'−置換糖を含んで成る。更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-フルオロ(2-F)置換基を有する少なくとも１つの２'−置換糖を含んで成る。
【０１２９】
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの二環糖を含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックされた核酸（LNA）を有し、当該ロックされた核酸（LNA）においては、２'−ヒドロキシル基が糖環の３'又は４'炭素原子に結合している。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックされた核酸（LNA）を有し、当該ロックされた核酸（LNA）においては、メチレン(--CH2--)n基（ｎは１又は２）が２'酸素原子と４'炭素原子を架橋している。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、４'及び２'リボシル環原子間に架橋を有する少なくとも１つの二環の修飾されたヌクレオシドを含み、ここで、当該架橋は、4'-(CH2)-0-2'（LNA）；4'-(CH2)-S-2；4'-(CH2)2-0-2'（ENA）；4'-C(CH3)2-0-2'；4'-CH(CH3)-0-2'；4'-CH(CH2OCH3)-0-2'；4'-CH2-N(OCH3)-2'；4'-CH2-0-N(CH3)-2'；4'-CH2-N(R)--0-2'；4'-CH2-CH(CH3)-2'及び4'-CH2-C(-CH2)-2'から選択され、ここで、Ｒは独立に、Ｈ、C1-C12アルキル、又は保護基である。
【０１３０】
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの前記の糖構成及び追加のモチーフ、例えばα-L-リボフラノース、β-D-リボフラノース又はα-L-メチレンオキシ(4'-CH2--0-2')を有することができる。更に、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用なLNA及びその調製は当業界において知られている。例えば、米国特許第6,268,490号、第6,670,461号、第7,217,805号、第7,314,923号及び第7,399,845号；WO 98/39352及びWO 99/14226；並びにSingh et al, Chem. Commun., 4:455-456(1998)を参照のこと。これらの文献のそれぞれに内容を引用により本明細書に組み入れる。
【０１３１】
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたフラノシル（例えば、リボフラノース）環成分を含んで成る。化学的に修飾されたリボフラノース環の例には、置換基（５'及び２'置換基、そして特に二環核酸（BNA）を形成するための非−ゼミナル還原子を架橋する２'位置を含めて）の付加、Ｓ、N(R)、又はC(R1)(R)2（R--H、C1-C12アルキル又は保護基によるリボシル環原子の置き換え、及びこれ等の組み合わせを含むが、これらに限定されない。化学的に修飾された糖の例には、2'-F-5'-メチル置換ヌクレオシド（例えば、WO 2008/101157は特に5',2-ビス置換ヌクレオシドを開示した）又はＳによるリボシル環酸素原子の置換及び２'−位における更なる置換（例えば、US20050130923を参照のこと）、或いはBNAの5'-置換（WO 2007/134181、ここでLNAは例えば5-メチル又は5-ビニル基により置換される)が含まれる。
【０１３２】
３'末端ヌクレオシド上の糖の３'位又は２'−５'結合オリゴヌクレオチド及び５'−末端ヌクレオチドの５'位における上記の修飾に類似する修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチドを含む複合体も本発明に含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる２'−修飾ヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,700,920号、及び第5,792,747号が含まれるが、これ等に限定されない。これらのそれぞれを、引用により本明細書に組み入れる。
【０１３３】
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの複素環二環核酸を有する。例えば、幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのENAモチーフを有する（例えば、WO 01/49687を参照のこと、この内容を引用により、本明細書に組み入れる）。
【０１３４】
追加の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、６員環による５員フラノースの少なくとも１つの置換を有する。少なくとも１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのシクロへキセン核酸（CeNA）を有する。これらは、相補的DNA又はRNAと安定な２本鎖を形成し、そしてオリゴヌクレオチドを核酸分解から保護する。
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの三環DNA（tcDNA）を有する。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、２〜５のトリシクロ−DNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する８〜14塩基PS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、tcDNAギャップマー）を有する。
【０１３５】
特定の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖、及びヘテロ原子主鎖、例えば--CH2--NH--0--CH2--、--CH2--N(CH3)--0--CH2-（メチレン（メチルイミノ）又はMMI主鎖としても知られる）、--CH2--0--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及び--0--N(CH3)--CH2--CH2--並びにアミド主鎖を含む（例えば、米国特許第5,602,240号を参照のこと）。追加の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデート主鎖構造を有する。更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノ（すなわち、PMO）主鎖構造を有する（例えば、米国特許第5,034,506号を参照のこと、その内容を引用により本明細書に繰り入れる）。
【０１３６】
修飾されたヌクレオ塩基
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドはまた、天然の又は合成された非修飾のヌクレオ塩基と比べて機能的に相互交換可能であるが、構造的に区別できる１又は複数のヌクレオ塩基修飾を含むことができる。
【０１３７】
用語「非修飾」又は「天然」ヌクレオチド塩基は、本明細書で使用される場合、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾されたヌクレオ塩基には、合成の及び天然のヌクレオ塩基、例えば５−メチルシトシン（５−me−Ｃ）が含まれる。幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの５'メチルシトシン又はC-5プロピンを含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド中の各シトシンはメチルシトシンである。
【０１３８】
修飾されたヌクレオ塩基はまた、複素環塩基成分と称され、そして他の合成の又は天然のヌクレオ塩基、例えばキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル(--CC--CH3)ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾ−ウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが含まれる。
【０１３９】
本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる複素環塩基成分はまた、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環により置き換えられているもの、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増強するために特に有用なヌクレオ塩基には、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにN-2, N-6及び0-6置換プリン、例えば２アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが含まれる。
【０１４０】
本発明のオリゴヌクレオチドに任意に含まれる追加の修飾されたヌクレオ塩基には、三環ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（phenoxazine cytidine）（lH-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（phenothiazine cytidine）（lH-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、Ｇ−クランプス（G-clamps）、例えば置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4- b][l,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン）、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド[3 ',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン）、又はグアニジウムＧ−クランプス及び類似体が含まれるが、これらに限定されない。代表的なグアニジノ置換基は米国特許第6,593,466号に開示されており、その記載を引用により本明細書に組み入れる。代表的なアセタミド置換基は米国特許第6,147,200号に開示されており、その記載を引用により本明細書に組み入れる。
【０１４１】
本発明の複合体に含まれるオリゴヌクレオチドに包含される多くの修飾されたヌクレオ塩基及びそれらの合成方法は当業界において知られており、例えば、The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, 858-859頁, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990；Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 30:613； 81993);Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 289-302頁；Crooke, S. Ted., CRC Press, 1993；並びに米国特許第3,687,808号、第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,434,257号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,645,985号、第5,646,269号、第5,681,941号、第5,750,692号、第5,830,653号、第5,763,588号、第6,005,096号、第6,028,183号、第6,007,992号、米国特許公開第20030158403号に開示されている修飾されたヌクレオ塩基が含まれ、これらの開示のそれぞれを引用により本明細書に繰り入れる。
【０１４２】
キメラオリゴヌクレオチド
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖成分、及び／又は修飾されたヌクレオ塩基を含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチド（例えば、キメラオリゴマー化合物）である。用語「キメラオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」は、少なくとも２つの化学的に区別される領域（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿って配置された化学的に修飾されたサブユニットのモチーフのパターン及び方向）を含むオリゴヌクレオチドであり、当該領域のそれぞれは少なくとも１つのモノマーユニット、すなわち核酸をベースとするオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド又はヌクレオシドから作られている。キメラオリゴヌクレオチドはまた、例えばハイブリド（例えば、融合）及びギャップマー（gapmer）とも称されている。このようなキメラオリゴヌクレオチド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号、及び第5,700,922号が含まれるが、これらに限定されない。これらのそれぞれを引用により本明細書に組み入れる。
【０１４３】
キメラアンチセンス化合物は典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取込み、標的核酸に対する増加した結合親和性、及び／又は増加した阻害活性を付与するために修飾された少なくとも１つの領域を含む。例えば、ギャップマー（gapmer）は、３つの領域、すなわち２つの外部領域（ウイング）に挟まれた中央領域（ギャップ）、に分けられるヌクレオシドの連続配列を含んで成るキメラオリゴマーである。ギャップマーデザインは、典型的には、RNase Hのための基質として機能する約５〜10の連続する２'−デオキシヌクレオチドの中央領域を含み、典型的には、２'修飾オリゴヌクレオチドの１又は２つの領域と接して（挟まれて）おり、当該２'修飾オリゴヌクレオチドの領域は、増強された標的RNA結合親和性を提供するが、標的RNA分子のRNAse H開裂を支持しない。
【０１４４】
したがって、キメラが使用される場合、例えば、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドに比べて、基質領域を有するより短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果を得ることがしばしば可能である。他のキメラオリゴヌクレオチドは、他の領域に比べて増加した又は低下した親和性の何れかを示す修飾されたヌクレオシドの領域を含む標的についてのオリゴヌクレオチドの長さにわたる変更された結合親和性を提供する領域に頼る。いわゆる、MOE−ギャップマーは、ウイング中に２'−MOE修飾を有し、しばしば完全なPS主鎖を含み、そしてしばしばすべてのシトシン上に５'MeC修飾を含む。
【０１４５】
或いは、RNAプロセシングの調節におけるように、RNAse H活性が好ましくない状況について、均一に修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば各ヌクレオチド又はヌクレオシド位置におけるRNAse H活性を支持しない修飾されたオリゴヌクレオチドを用いるデザイン、を用いるのが好ましいであろう。本発明において用いる場合、「十分に修飾されたモチーフ」は、本質的に各ヌクレオシドが同じ修飾された糖成分を有するように修飾されている糖修飾ヌクレオシドの連続する配列を含むことを意味する。本発明の十分に修飾されたオリゴヌクレオチドについて好ましい糖修飾ヌクレオシドには、2'-フルオロ(2F)、2'-0(CH2)2OCH3（2'-MOE）、2'-OCH3（2'-0-メチル）、及び二環糖修飾ヌクレオシドが含まれるがこれらに限定されない。１つの観点において、３'及び５'−末端ヌクレオシドは修飾されないで残される。好ましい態様において、修飾されたヌクレオシドは、2-MOE、2'-F、2 -O-Me又は二環糖修飾ヌクレオシドである。
【０１４６】
本発明の組成物において使用されるオリゴヌクレオチドは、１又は複数の安定化基を有するように修飾され得る。幾つかの態様において、安定化基は、ヌクレアーゼ安定性のような性質を増強するためにオリゴヌクレオチドの１端又は両端に取付けられる。幾つかの態様において、安定化基はキャップ構造である。「キャップ構造又は末端キャップ成分」は、オリゴヌクレオチドの何れかの末端に導入されている化学的修飾を意味する（例えば、WO 97/26270を参照のこと、この記載を引用により、本明細書に組み入れる）。これらの末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、そして／又は細胞におけるオリゴヌクレオチドの送達及び／又は局在化を助けるであろう。オリゴヌクレオチドは、５'−末端（５'−キャップ）、３'−末端（３'−キャップ）、又は５'−末端及び３'−末端の両方にキャップを含むことができる。２本鎖オリゴヌクレオチドの場合、キャップは、いずれかの鎖のいずれかの末端又は両端に存在することができる。キャップ構造は当業界において知られており、そして例えば、反転デオキシ塩基脱落キャップ（inverted deoxy abasic cap）を含む。更に、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス）化合物の一端又は両端をキャップするために使用することができる３'及び５'−安定化基には、WO 03/004602に開示されているものが含まれ、その記載を、引用により本明細書に組み入れる。
【０１４７】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの５'−キャップには、反転塩基脱落残基（inverted abasic residue）（成分）である構造、4',5'-メチレンヌクレオチド；l-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4-チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；L-ヌクレオチド；α-ヌクレオチド；修飾された塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド；非環式3',4'-セコヌクレオチド；非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；3-3'-反転ヌクレオチド成分；3'-3'-反転塩基脱落成分；3'-2'-反転ヌクレオチド成分；3-2'-反転塩基脱落成分；1,4-ブタンジオールホスフェート；3'-ホスホラミデート；へキシルホスフェート；アミノへキシルホスフェート；3'-ホスフェート；3'-ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート成分（例えば、WO 97/26270を参照のこと、その記載を引用により本明細書に組み入れる）が含まれる。
【０１４８】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの５'−キャップには、例えば、4',5'-メチレンヌクレオチド；l-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド；4'-チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；5'-アミノ-アルキルホスフェート；l,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート；6-アミノへキシルホスフェート；1,2-アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；1,5-アンヒドロへキシトールヌクレオチド；L-ヌクレオチド；α-ヌクレオチド；修飾された塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ-ぺントフラノシルヌクレオチド；非環式3',4'-セコヌクレオチド；3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド；3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-5'-反転ヌクレオチド成分；5'-5'-反転塩基脱落成分；5'-ホスホロアミデート；5'-ホスホロチオエート；1,4-ブタンジオールホスフェート；5'-アミノ；架橋及び／又は非架橋5'-ホスホラミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び5'-メルカプト成分（更に、Beaucage et al, Tetrahedron 49: 1925 (1993)により開示されている安定化基を参照のこと、この記載を引用により、本明細書にくみ入れる）が含まれる。
【０１４９】
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、１又は複数のカチオンテイル（cationic tail）を含んで成る。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４又はそれより多くの正に荷電したアミノ酸、例えばリジン又はアルギニンと接合している。特定の態様において、オリゴヌクレオチドはPNAであり、そして１又は複数のリジン又はアルギニンが当該分子のC−末端に接合している。更なる態様において、オリゴヌクレオチドはPNAであり、そして１〜４のリジン及び／又はアルギニンがPNA連結に接合している。
【０１５０】
１つの態様において、そのような修飾されたオリゴヌクレオチドは、従来的に、接合基を官能基、例えばヒドロキシル又はアミノ基に取付けることにより調製される。通常の接合基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、及びオリゴヌクレオチドの薬理動態特性又は薬力学特性を増強する基が含まれるが、これらに限定されない。典型的な接合基には、コレステロール、炭水化物、ビオイン、フェナジン、フォレート、フェナンスリジン及びアンスラキノンが含まれる。代表的な接合基は、WO/1993/007883及び米国特許第6,287,860号に開示されており、これらを引用により本明細書に組み入れる。
【０１５１】
接合基は、オリゴヌクレオチドの種々の位置に、直接に又は任意の連結基を介して結合させることができる。用語「連結基」は、オリゴマー化合物への接合基の取付けを許容するすべての基を含むことが意図される。連結基は、化学的官能基、接合基、レポーター基及びその他のを、親化合物、例えばオリゴマー化合物の選択的部位に取付けるために有用な２価基である。一般に、２官能連結成分は、２個の官能基を有するヒドロカルビル成分を含んで成る。官能基の一方は、親分子又は注目の化合物に結合するために選択され、そして他方は本質的に任意に選択された基、例えば化学的官能基又は接合基に結合するために選択される。幾つかの態様において、リンカーは、鎖構造、又は反復基、例えばエチレングリコール又はアミノ酸ユニットのオリゴマーを含んで成る。２官能連結成分において日常的に使用される官能基の例には、求核性基と反応するための求電子剤、及び求電子性基と反応するための求核剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
幾つかの態様において、２官能連結成分は、アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸、チオール、不飽和（例えば、二重結合又は三重結合）、などを含む。２官能連結成分の若干の非限定的な例には、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（ADO）、サクシンイミジル4-(N-稀イミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート（SMCC）及び6-アミノヘキサン酸（AHEX又はAHA）が含まれる。他の連結基には、置換されたC1-C10アルキル、置換された又は非置換のC2-C10アルケニル、又は置換された又は非置換のC2-C10アルキニルが含まれるがこれらに限定されず、ここで、好ましい置換基の非限定的なリストには、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれるが、これらに限定されない。更なる代表的な連結基は、例えば、WO 94/01550及びWO 94/01550に開示されている。
【０１５３】
上記のようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,218,105号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,512,439号、第5,578,718号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、第5,688,941号及び第6,1 14,513号、並びに米国出願公開第2012/0095075号、第2012/0101 148号及び第2012/0128760号が含まれるがこれらに限定されない。これらのそれぞれの全内容を、引用により、本明細書に組み入れる。
【０１５４】
追加の関連する態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチド複合体及び／又はHES−オリゴヌクレオチド複合体を含みそして更に１又は複数の活性剤又は療法剤を含む医薬組成物を含む。１つの態様において、活性剤又は療法剤は核酸である。種々の態様において、核酸は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、miRNA、抗−miRNA、ダイサー（dicer）基質、デコイ（decoy）、アプタマー（aptamer）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイム（ribozyme）である。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド及びホスホラミデートは、当業界においてよく確立されている方法により、合成及び／又は修飾することができる。修飾された及び非修飾のヌクレオシドのオリゴマー化は、適当であれば合成について、DNA−様化合物（(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）及び／又はRNA−様化合物（例えば、Scaringe, Methods 23:206-217(2001), 及びGait et al, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al, Tetrahedron 57:5707-5713 (2001)について、文献の方法により行うことができる。（更に、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S. L. et al (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA,を参照のこと、それらの記載を引用により本明細書に組み入れる。）
【０１５６】
オリゴヌクレオチドは好ましくは、適切に保護された試薬及び商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機を用いて化学的に合成される。本発明のオリゴヌクレオチドの製造において有用なオリゴヌクレオチド合成試薬の提供者には、Proligo（ハンブルグ、ドイツ）、Dharmacon Research（Lafayette, CO, 米国）、Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL ,米国）、Glen Research（Sterling, VA, 米国）、ChemGenes（Ashland, MA, 米国）、及びCruachem（Glasgow, 英国）が含まれるが、これらに限定されない。或いは、オリゴマーは種々のオリゴマーヌクレオチド合成会社、例えばDharmacon Research Inc.,（Lafayette, Colo.）、Qiagen（Germantown, MD）、Proligo 及びAmbionから購入することができる。
【０１５７】
或る態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの調製は、DNAについて文献：Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Agrawal, Ed., Humana Press, 1993, RNA: Scaringe, Methods, 2001, 23, 206-217；Gait et al, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Smith, Ed., 1998, 1-36；Gallo et al, Tetrahedron, 57:5707-5713 (2001)、の方法に従って行われる。固相合成のための追加の方法は、米国特許第4,415,732号、第4,458,066号、第4,500,707号、第4,668,777号、第4,725,677号、第4,973,679号、及び第5,132,418号、並びに再発行特許第34,069号に見出されよう。
【０１５８】
使用される特定のプロトコールに拘わらず、本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技法をとおして従来通りにそして日常的に作ることができる。このような合成の装置は、例えば, Gene Forge（Redwood City, Calif.）を含めて、幾つかの売り手により販売されている。自動合成技法を含めて、適当な固相技法が、Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, New York, 1991に記載されている。上記に方法に加えて又はそれに代えて（液相合成を含めて）上記のような合成のための他の手段が当業界において知られている。
【０１５９】
二環糖修飾モノマー、アデニン、シトシン、グアニン、5−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製、並びにそれらのオリゴマー化、及び核酸認識特性は記載されている（Koshkin et al , Tetrahedron, 54:3607-3630 (1998)；WO 98/39352 及びWO 99/14226)、これのそれぞれの内容を引用により本明細書に繰り入れる）。他の二環糖修飾ヌクレオシド類似体、例えば4'-CH2--S-2'類似体もまた調製されている（Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2219-2222(1998)）。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド２本鎖を含む他の二環糖類似体の調製も記載されており（WO 98-DK393 19980914）これらのそれぞれの内容を引用により本明細書に組み入れる。
【０１６０】
フルオロフォアをオリゴヌクレオチドに連結する技法、例えば本発明の方法に従って使用される技法は当業界においてよく知られており、そして本発明のHES−オリゴヌクレオチドを調製するために使用することができ、又は日常的に改変することができる。例えば、Connolly et al, Nucleic Acids Res. 13:4485-4502 (1985)；Dreyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9752-9756 (1989)；Nelson et al, Nucleic Acids Res. 17:7187-7194 (1989)；Sproat et al, Nucleic Acids Res. 15, 6181-6196 (1987)及びZuckerman et al, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321 (1987)を参照のこと。これらのそれぞれの内容を引用により、本明細書に組み入れる。多くのフルオロフォアは通常、適当な反応性部位を有する。或いは、フルオロフォアを誘導体化して他の分子への連結のための反応性部位を提供することができる。第２の分子にカップリングするための官能基により誘導体化されたフルオロフォアは、種々の製造者から商業的に入手することができる。誘導体化は、フルオロフォア自体上の基の単純な置換によってもよく、又はリンカーとの接合によってもよい。
【０１６１】
フルオロフォアは、所望により、リンカーを介して、オリゴヌクレオチドの5'及び／又は3'末端主鎖ホスフェート及び／又は他の塩基に結合される。種々の適当なリンカーが当業界において知られており、そして／又は下に検討する。幾つかの態様において、リンカーは、柔軟な脂肪族リンカーである。追加の態様において、リンカーは、C1〜C30の線状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素鎖である。幾つかの態様において、リンカーは、C1〜C6の線状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素鎖である。追加の態様において、炭化水素鎖リンカーは、１又は複数のヘテロ原子、アリール、又は低級アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルコキシにより置換される。
【０１６２】
幾つかの態様において、１又は複数の、フルオロフォアで修飾されたヌクレオシド、フルオロフォア及び糖／塩基／及び／又は連結で修飾されたヌクレオシド及び／又はデオキシヌクレオシドホスホラミデートを用いて、自動合成の間に、１又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入される。
【０１６３】
幾つかの態様においては、合成後標識化反応において、１又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入される。適切な合成後標識化反応は当業界において知られており、そして本発明のHES−オリゴヌクレオチドを合成するために日常的に使用し、又は改変することができる。幾つかの態様においては、合成後標識化反応において、１又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入され、この場合、合成されたオリゴヌクレオチド中のアミノ−又はチオール修飾されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドが、アミン−又はチオール−反応性フルオロフォア、例えばサクシンイミジルエステルフルオロフォアと反応する。
【０１６４】
更なる態様においては、１又は複数の同一のフルオロフォアが単一反応においてオリゴヌクレオチドに一体化され、当該単一反応は、色素の反応性形を、フルオロフォアと反応することができる所望の数の反応性基を含むオリゴヌクレオチドと、適当な緩衝液中で、オリゴヌクレオチドへのフルオロフォアの一体化を完成するのに十分な条件下で且つ時間にわたって、接触させることを含む。反応性基は、当業界で知られている標準的技法及び試薬を用いる合成の間に、日常的に、オリゴヌクレオチドに導入することができる。
【０１６５】
製剤
HES−オリゴヌクレオチドは、所望により、医薬組成物の調製のために適当な、医薬として許容される希釈剤又は担体、医薬として許容される活性な又は不活性な物質と混合される。したがって、本発明はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含む医薬組成物を包含する。医薬組成物の製剤化のための組成物及び方法は、投与の経路、疾患の程度、又は投与量を含むがこれらに限定されない基準の数に依存する。このような考慮は、当業界においてよく理解される。
【０１６６】
粘膜又は局所送達のためのHES−オリゴヌクレオチドの投与量は、典型的には、投与当たり約0.1μg〜50mgの範囲にわたり(例えば、AVI-4658（モルホリノ）の如きエキソキッピング薬の場合、試験投与量は30 mg/kg及び50 mg/kg wk IVの薬物の投与を含む）、用途に依存して、毎日、毎週、又は毎月、及び任意の他の時間間隔である。しかしながら、投与は実質的により高い又はより低い範囲であることができる。適切な投与ハ範囲及び頻度の決定は、当業者の能力の範囲内である。所与の量の投与は、個々の投与量の形態で又は数回のより少ない投与単位の両方で行なうことができる。
【０１６７】
HES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る医薬組成物は、任意の医薬として許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、あるいは任意の他のオリゴヌクレオチドであって、対象、例えばマウス、ラット、ラビット又はヒトに投与後に生物学的に活性な代謝物又はその残物を（直接的に又は間接的に）提供することができるものを含む。したがって、例えば、開示はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体の生理的に及び医薬として許容される塩（すなわち、親化合物の所望の生物活性を維持し、そしてそれに対して不所望の毒性効果を付与しない塩）、プロドラッグ、当該プロドラッグの生理的に及び医薬として許容される塩、及び他の生物同等物にも向けられる。
【０１６８】
適切な医薬として許容される塩には、
（ａ）カチオン類、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン類、例えばスペルミン及びスペルミジン、等と共に形成される塩類；
（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭素水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、等と共に形成される酸付加塩類；
（ｃ）有機酸、例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸、グル混酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクチュロン酸、等と共に形成される塩類；並びに
（ｄ）元素性アニオン、例えば塩素、臭素及び沃素から形成される塩類；
が含まれるが、それらに限定されない。
プロドラッグには、例えば、オリゴヌクレオチドの一端又は両端に追加のヌクレオシドを導入したものであって、体内の内因性ヌクレアーゼにより開裂されて活性なオリゴヌクレオチドを形成するもの、が含まれる。
【０１６９】
幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、WO 93/24510及びWO 94/26764に開示されている方法にしたがって、SATE [(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
本発明の文脈において、医薬として許容される希釈剤には、リン酸緩衝塩溶液（PBS）が含まれる。PBSは、乾燥した凍結乾燥型から製剤化される組成物中での使用に適する希釈剤である。幾つかの態様において、医薬として許容される希釈剤には注射用水（WFI）が含まれる。最初に食塩溶液中に調製された医薬組成物に由来する乾燥した粉末形（例えば、凍結乾燥されたもの）である場合、投与されるべきWFIの量は、最適には、前記当欠乾燥形が由来する溶液と同じ体積である。
【０１７０】
凍結乾燥形の医薬組成物が特に好ましい。何故なら、これ等の組成物は、例えば注射のために意図される水溶液中に製剤化された組成物に較べて、周囲温度においてより長い安定性を有し、そしてそれ故に、しばしば好ましい従来の医薬オリゴヌクレオチド組成物を基礎とする医薬に較べて、周囲温度より低いそして更にゼロより低い貯蔵温度を必要としないからである。
本発明の医薬組成物には、溶液及び製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、前形成された液体を含むがそれに限定されない種々の化合物から生成され得る。幾つかの態様において、組成物は乾燥粉末形（例えば凍結乾燥したもの）である。
【０１７１】
医薬組成物は、従来どおり単位投与形として提供することができ、そして医薬工業においてよく知られている従来法に従って調製することができる。このような技法は、活性成分を医薬希釈剤又は担体と一緒にすることを含む。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体若しくは最終的に分けられた固体担体又はその両方に均一に且つ直接に一緒にし、そして次に必要であれば製品を成型することにより調製される。
【０１７２】
医薬組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、及び浣腸剤を含むがこれ等に限定されない多くの可能な剤形の何れかに製剤化することができる。医薬組成物は経口投与される形態で製剤化される。幾つかの態様において、医薬組成物は凍結乾燥形又はソフトゲル形で製剤化される。追加の態様において、組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドを胃の酸性環境においてではなく腸管において放出するように設計された、経口投与される腸放出カプセルに詰められる。幾つかの態様において、カプセルは、酸性の胃環境に対して耐性であるが、しかし中性又は僅かにアルカリ性の腸環境において崩壊する腸内ポリマーを含む。
【０１７３】
特定の態様において、腸内ポリマーは、セルロース誘導体、ポリアクリレート及びシェラック（shellac）から選択されるメンバーである。追加の態様において、カプセルはソフトカプセイルである。幾つかの態様において、ソフトカプセイルは澱粉を含む。特定の態様において、医薬組成物は、Swiss Caps A/Gにより製造されるタイプのカプセルに製剤化される。これらの経口投与される医薬組成物は、オリゴヌクレオチド医薬組成物の投与において従来から使用されているiv注射製剤に較べて有意な改良を示す。組成物はまた、液体又は混合媒体中懸濁液として製剤化することができる。水性懸濁液は更に、懸濁液の粘度を増強する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含有することができる。懸濁液は更に１叉は複数の安定剤を含むことができる。
【０１７４】
本明細書において使用される場合、用語「投与量」は、単一投与において提供される薬物剤の特定の量を意味する。或る態様において、投与量は、１又は複数のボーラス、錠剤又は注射として投与される。例えば、皮下投与が好ましくそして所望の投与量が単一注射によっては容易に得られない体積を必要とする或る態様において所望の投与量を達成するために、２回又はそれより多くの注射が使用される。或る態様においては、或る態様において、個体の注射部位の反応を最小にするために、投与量は、１又は複数の注射において投与される。
【０１７５】
投与
本発明はまた、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を含む医薬組成物又は製剤を包含する。本発明の方法は、医学的に許容される投与の任意の態様を用いて実施することができ、この任意の態様とは、臨床的に許容できない不都合の効果（すなわち、HES−オリゴヌクレオチド複合体の投与を禁ずる程度の不所望の効果）を惹起することなく療法的効果をもたらす態様である。本発明の医薬組成物は、局所処理又は全身処理の何れが望ましいか、及び処理されるべき面積に依存して、多くの方法で投与される。したがって、療法における使用のため、有効量のHES−オリゴヌクレオチドは、当該核酸を所望の表面、例えば粘膜又は全身に送達する任意の態様により、対象に投与されうる。適切な投与経路には、局所、経口、肺、非経口、鼻内、気管、吸入、眼、膣及び直腸が含まれるが、これらに限定されない。このような剤形及び調製は当業界においてよく知られており、任意的投与経路についての考慮のとおりである。
【０１７６】
投与は、局所投与（膣内及び直腸送達を含めての眼及び粘膜投与を含む）、例えば、ネブライザーによる場合を含めて粉末又はエアロゾルの吸入又は通気（insufflation）により肺投与、気管支内投与、鼻内投与、表皮投与及び経皮投与、経口投与、又は非経腸投与であろう。非経口投与には、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内注射又は吸入；或いは頭蓋内投与又は髄腔内投与であろう。少なくとも１つの2'-0-メトキシエチル修飾を有するHES−オリゴヌクレオチド、例えばキメラ分子、又はいずれかのヌクレオチド糖の2'-0-メトキシエチル修飾を有する分子は、経口投与のために特に有用であると信じられる。局所投与のための医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末が含まれよう。従来の医薬担体、液体、粉末などが必要か又は望ましいであろう。
【０１７７】
経口投与のための組成物及び製剤には、粉末又は顆粒、水中懸濁液又は溶液、カプセル、サケット（sachet）又は錠剤が含まれよう。幾つかの態様において、医薬組成物は、腸管において放出されるように設計された経口投与用カプセルにパッケジされる。特定の態様において、医薬組成物は、Swiss Caps A/Gにより製造されるタイプのカプセイルにパッケジされる。
非経口、髄腔内又は脳室内投与のための組成物及び製剤には、無菌水溶液が含まれてもよく、当該水溶液は更に、当業界で知られている緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤及び医薬として許容される担体又は賦形剤を含むであろう。
【０１７８】
或る態様において、非経口投与は、注入（infusion）による。注入は慢性的若しくは連続的又は短時間若しくは断続的である。或る態様において、注入される医薬剤はカヌーレ又はカテーテルにより送達される。或る態様において、注入される医薬剤はポンプにより送達される。或る態様において、本明細書に記載される化合物及び組成物は非経口的に投与される。追加の態様において、非経口投与は注射による。注射はシリンジ又はポンプにより送達され得る。或る態様において、注射はボーラス注射である。或る態様において、注射は組織又は器官に直接投与される。追加の態様において、非経口投与は皮下又は静脈内投与を含む。
【０１７９】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、経口経路の投与を介して対象に投与され得る。対象は、哺乳類、例えばマウス、ラット、イヌ、モルモット、又は非ヒト霊長類であろう。幾つかの態様において、対象はヒト対象である。或る態様において、本明細書において更に詳細に検討するように、対象は、１又は複数のpri-miRNAのレベル又は発現の調節を必要とするものである。幾つかの態様において、対象への投与のための組成物。
【０１８０】
本発明の文脈において、HES−オリゴヌクレオチドの送達のために好ましい手段は注入ポンプ、例えばMedtronic SyncroMed(R) IIポンプを採用する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、診断、療法、予防のため、及び研究用試薬及びキットとして使用され得る。療法のため、細胞の挙動を調節することにより治療され得る疾患又は障害を有することが疑われる対象、例えばマウス、ラット又は霊長類、好ましくはヒトが、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することにより処理され得る。
【０１８１】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達系は、細胞へのHES−オリゴヌクレオチド複合体の送達及び／又はオリゴヌクレオチドの標的化された送達を促進するため、１又は複数の追加のオリゴヌクレオチド送達系と組み合わされる。HES−オリゴヌクレオチド送達系と組み合わせることができる巨大分子送達系には、デンドリマー（dendrimer）、生物分解性ポリマーの使用が含まれるが、これに限定されない。更に、HES−オリゴヌクレオチド送達系と組み合わせることができる追加の送達系には、アミノ酸、ペプチド、糖、又は標的核酸モチーフとの接合体が含まれるが、それに限定されない。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、複合体の半減期を調節し又は複合体の取込みを促進する或る種の受容体又は血清蛋白質と特異的にハイブリダイズするアプタマー（aptamer）、ペプチド、又は抗体（若しくは抗体断片）と接合される。
【０１８２】
HES−オリゴヌクレオチド送達系はまた、コレステロール分子に共有結合させることができる。
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例えば受容体標的化分子、経口、直腸、局所又は他の製剤と、混合し、接合し又は関連づけることができる。
【０１８３】
例示的な作用様式
アンチセンス
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は単に「アンチセンス」は、標的とされる対象の細胞中の同起源のmRNAに結合し、そして例えば標的RNAの蛋白質翻訳の位置への移行、標的RNAから蛋白質の翻訳を変更し、標的RNAのスプライシングを変更し（例えば、エキソンスキッピングを促進し）、そして標的RNAに関連する又はそれにより促進される触媒活性を変更し、そして内因性RNase Hによる分解についてmRNAを標的化することにより、RNAの機能を調節する核酸（例えば、DNA、RNA、及び核酸模倣物、例えばPNAモルホリノ（例えば、PMO）の１本鎖に対応するオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。
【０１８４】
幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、染色体DNAと特異的にハイブリダイズすることにより細胞活性を変更する。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」はまた、所望の標的遺伝子に対して正確に相補的ではないアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、本発明は、非−標的特異的活性がアンチセンスに関して見出される場合、あるいは標的配列との間の１又は複数のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途のために好ましい場合に、使用され得る。標的核酸の機能に対するこのような妨害の全体的効果は、注目の標的蛋白質の調節である。
【０１８５】
本発明の文脈において、「調節」は、遺伝子又は蛋白質の発現の量、又は小さい非−コードRNA、核酸標的、小さい非−コードRNAに関連するRNA又は蛋白質、又は小さい非−コードRNA（例えば、小さい非−コードRNAにより制御される蛋白質コード核酸を代表するmRNA）の下流標的における増加（刺激）又は減少（阻害）の何れかを意味する。阻害は調節の適切な形体であり、そして小さい非−コードRNAは適切な核酸標的である。そのレベルが調節され得る小さい非−コードRNAには、miRNA及びmiRNA前駆体が含まれる。本発明の文脈において、「機能の調節」は、小さい非−コードRNAの機能又は活性の変更、或いは任意の細胞成分の機能の変更であってそれと共に小さい非−コードRNAが関連又は下流効果を有するものを意味する１つの態様において、機能の変更は小さい非−コードRNAの活性の阻害である。
【０１８６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さにして約８〜約80の連続して連結されたオリゴヌクレオシドである。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約50のヌクレオシド又は約13〜約30のヌクレオチドである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、リボザイム（ribozyme）、抗miRNA、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム；oligozymes）、及び他の短い触媒性RNA又は触媒性オリゴヌクレオチドであって、標的核酸に特異にハイブリダイズしそしてその発現を調節するものが含まれる。
【０１８７】
本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15〜約30のヌクレオシド長さ（すなわち、15〜30の連結されたヌクレオシド）、又は約17〜約25のヌクレオシド長さを含んで成る。特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30のヌクレオシド長さである。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約10〜約50ヌクレオチド、更に好ましくは約15〜約30ヌクレオチドである。更なる態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４、５、６又は７ヌクレオチド長を有する。
【０１８８】
追加の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、注目の標的RNAの転写を妨害する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、鎖置換（strand displacement）により、注目のmRNA又はmiRNAの転写を妨害する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、ストランド侵入（strand invasion）又はトリプレット形成（トリプレット形成オリゴヌクレオチド（THOs）、例えばLNAを含むもの、例えば、米国特許出願公開第2012/0122104号を参照のこと、引用により本明細書に組み入れる）により、標的遺伝子の部分と安定な複合体を形成することによって、mRNAの転写を妨害する。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドは、細胞の転写装置を妨害することにより、標的RNA（例えば、mRNA又はmiRNA）の転写を妨害する。
【０１８９】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、mRNAの５'末端中の領域又はAUG開始コドン（例えば、AUG開始コドンの30ヌクレオチド内）に特異的にハイブリダイズしそして翻訳を減少させるように設計される。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNAのイントロン／エキソン連結部に特異的にハイブリダイズするように設計される。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳標的配列に特異的にハイブリダイズするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAのヌクレオチド１−10に特異的にハイブリダイズするように設計される。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合されたときmiRNAのプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするように設計される。
【０１９０】
他の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、臨界的RNA二次構造の部位を標的にし又は翻訳されたポリペプチドのトランケーションを惹起する立体的ブロッカーとして作用する。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド（例えば、PNA及びPMO）は、例えば標的とされるmRNAのスプライス連結部又はその近傍に結合することにより、イントロンの切り取りを妨害するように設計される。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、イントロンの切り取りを妨害するように、又は他のスプライスバリアントの発現を増加させるように設計される。
【０１９１】
RNase Hは、RNA:DNA２本鎖のRNA成分を特異的に開裂させる内因性酵素である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合した場合、HNase活性を惹起する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNA又は核酸模倣物である。RNase H活性を引き出すHES−オリゴヌクレオチドは、例えば、標的とされるRNAを低下させるために内因性リボヌクレアーゼを利用することにおいて特別の利点を有する。
【０１９２】
RNase H活性を引き出すための１つのアンチセンス設計は、ギャップマー（gapmer）モチーフ設計であり、当該設計においては、ホスホロチオエート修飾を伴う又は伴わないDNAから構成される中央ブロック、及びヌクレアーゼ耐性５'及び３'フランキングブロックを有するキメラオリゴヌクレオチドであり、通常は2-O-メチルRNAであるが、広範囲な２'−修飾が使用されている（Crooke, Curr. Mol. Med. 4(5):465-487 (2004)を参照のこと）。他のギャップマー設計は本明細書に記載されるか又は当業界において知られている。
【０１９３】
追加の態様において、本発明の複合体中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞中のRNase Hの活性化を回避するように設計される。RNase H活性を引き出さないオリゴヌクレオチドは、例えば、転写機構のブロック（立体的ブロックメカニズムを介しての）及び標的RNAのスプライシングの変更において特別な利点を有する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、標的とされるmRNAのスプライス連結部又はその近傍に結合することによりイントロンの切り取りを妨害しそして／又はイントロンの切り取りを変更するように設計される。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、メッセージの他のスプライスバリアントを増加させるように設計される。本発明の好ましい態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノ（例えば、PMO）である。他の好ましい態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはPNAである。
【０１９４】
特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAのイントロン／エキソン連結部の上流50ヌクレオ塩基までの領域の少なくとも部分に標的化される。さらに好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNAのイントロン／エキソン連結部の上流の領域20−24又は30−50ヌクレオ塩基の少なくとも部分に標的化され、そして好ましくは結合の際にmRNA標的のRNAse H開裂を支持しない。好ましくは、アンチセンス化合物は、RNA標的（例えば、mRNA及びmiRNA）に対する結合親和性を増加させ、そしてアンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性を増加させる少なくとも１つの修飾を含む。
【０１９５】
１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖成分の２'修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含んで成る。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖成分の２'修飾を有する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、又は20ヌクレオシドを含んで成る。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖成分の２'修飾を有する少なくとも４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオシドを含んで成る。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの何れのヌクレオシドも、その糖成分の２'修飾を有する。好ましくは、２'修飾は、２'−フルオロ、２'−OME、2'-メトキシエチル(2'-MOE)又はロックされた核酸（LNA）である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、メチレン（--CH2-)n基が２'酸素原子と４'炭素原子とを架橋している（ｎは１又は２である）LNA又はαLNAである。
【０１９６】
更なる態様において、LNA又はαLNAは、５'位にメチル基を含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'修飾及び少なくとも１つのヌクレオシド間結合を含む。特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。１つの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエート主鎖結合間を交替にする。他の態様において、オリゴヌクレオチドの何れのヌクレオシド間結合もホスホロチオエート結合である。
【０１９７】
追加の好ましい態様において、本発明の複合体中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの3'-メチレンホスホネート連結、LNA、ペプチド核酸（PNA）連結、又はホスホロジアミデートモルホリノ連結を含んで成る。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基を含む。好ましくは、修飾されたヌクレオ塩基はC-5プロピン又は5-メチルＣである。
【０１９８】
更なる態様において、本発明のアンチセンスHES−オリゴヌクレオチド複合体は、標的mRNA又は標的遺伝子の異なる配列に対して相補的である１又は２より多くのアンチセンス鎖を含んでなる。幾つかの態様において、アンチセンス鎖は直鎖状に又は分枝鎖状に連結されている（例えば、デンドリマー（dendrimer））。更なる態様において、連結されたアンチセンス鎖は、標的mRNA及び／又は遺伝子についての新たな二次構造を含み、これにより標的とされるヌクレオチドの転写／翻訳を減少又は阻害する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、当業界において知られている技法を用いて、日常的に合成することができる。
【０１９９】
RNAi−転写後遺伝子サイレンシング
短い２本鎖RNA分子及び短いヘアピンRNA（shRNAs）、すなわちsiRNAをもたらす折り返しステム−ループ構造は、RNA妨害（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドはRNAiを誘導する。本発明の複合体中のRNAiオリゴヌクレオチドには、siRNA、hRNA及びdsRNA DROSHA及び／又はダイサー（Dicer）基質が含まれるが、これらに限定されない。siRNA、shRNA、及びdsRNAの一方の鎖又は両方の鎖は、好ましくは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖成分及び／又は修飾されたヌクレオ塩基であって、本明細書に記載されるもの又は当業界において知られているものを含む。これらのRNAiオリゴヌクレオチドは、対象における注目の遺伝子又はポリヌクレオチドの発現の中断を含むがこれに限定されない用途を有する。
【０２００】
したがって、幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の発現を特異的に阻害するために使用される。幾つかの態様において、遺伝子及び／又は核酸の発現の、２本鎖RNAで仲介される抑制は、dsRNA DROSHA基質、dsRNAダイソー（Dicer）基質、siRNA又はshRNAを含んで成る本発明の複合体を対象及び／又は細胞に投与することにより達成される。遺伝子及び核酸の発現の２本鎖RNAにより介在される抑制は、dsRNA、siRNA又はshRNAの対象への投与により本発明に従って達成されるであろう。siRNAは、２本鎖RNA、又はRNAとDNAの両方、例えば１つのRNA鎖及び１つのDNA鎖を含んで成るハイブリド分子により達成されるであろう。
【０２０１】
本発明のsiRNAは、RNA：RNAハイブリド、DNAセンス：RNAアンチセンスハイブリド、RNAセンス：DNAアンチセンスハイブリド、及びDNA：DNAハイブリド２本鎖であって、通常21〜30ヌクレオチドの長さを有し、RNAi−誘導サイレンシング複合体（RISC）として知られる細胞質−多タンパク質複合体と関連することができる。siRNAにより負荷されたRISCは、相同のmRNA転写物の分解を仲介する。本発明は、これらの異なるタイプの２本鎖分子の何れかを含むRNAi分子の使用を包含する。更に、RNAi分子は、種々の形態で使用されそして細胞に導入されると理解される。
【０２０２】
したがって、ここで使用される場合、RNAi分子には、細胞中でRNAi応答を誘導することができる任意の又はすべての分子が包含され、２本の別個の鎖、すなわちセンス鎖及びアンチセンス鎖を含んで成る２本鎖ポリヌクレオチド、例えば小型の妨害RNA（siRNA）；２本鎖領域を形成する相補的鎖のヘアピンループを含んで成るポリヌクレオチド、例えばshRNAi分子、並びに単独で又は他のポリヌクレオチドと組み合わされて２本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる１又は複数のポリヌクレオチドを発現するベクター、が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０３】
幾つかの態様において、本発明の複合体に含まれるオリゴヌクレオチドは２本鎖であり、そして16〜30又は18〜25ヌクレオチドの長さを有する。追加の態様において、本発明の複合体に含まれるdsRNAオリゴヌクレオチドは、２本鎖であり、そして17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、又は32ヌクレオチドの長さを有する。特定の態様において、dsRNAは21ヌクレオチドの長さを有する。或る態様において、dsRNAは０〜７ヌクレオチドの３'オーバーハング、又は０〜４ヌクレオチドの5'オーバーハングを有する。特定の態様において、dsRNAは、２ヌクレオチドの３'オーバーハングを有する。更なる態様において、dsRNAは、２ヌクレオチドの３'オーバーハングを伴う21ヌクレオチドの長さを有する２本の相補的RNA鎖を含む（すなわち、センス鎖及びアンチセンス鎖間に19ヌクレオチドの相補性領域を含む）。他の態様において、dsRNAは、２個の３'末端オーバーハングを有する25ヌクレオチドの長さ（すなわち、センス鎖とアンチセンス鎖との間に23ヌクレオチドの相補的領域を含む）の２本の相補的RNA鎖を含む。或る態様において、オーバーハングは、UU又はdTdT３'オーバーハングである。
【０２０４】
幾つかの態様において、本発明の複合体中のsiRNAオリゴヌクレオチドは、標的RNAの対応する逆相補鎖に対して完全に相補的である。他の態様において、siRNAは、標的RNAの対応する逆相補鎖に比べて、１又は２個の置換、欠失又は挿入を含む。
【０２０５】
追加の態様において、本発明の複合体は、短いヘアピンRNAであるRNAiオリゴヌクレオチドを含んで成る。shRNAは、siRNAをもたらす折り返しステム−ループ構造を含むヘアピンRNAの形態であり、そしてそれ故に、同様に標的遺伝子の発現を配列特異的に低下させることが可能である。短いヘアピンRNAは一般に、siRNAに比べて細胞環境において一層安定でありそして分解に対して感受性でない。shRNAのステム−ループ構造は、ステムの長さにおいて、典型的には19〜29ヌクレオチドの長さで異なることができる。或る態様において、本発明の複合体は、19〜21又は27〜29ヌクレオチドの長さのステムを有するshRNAを含んで成る。追加の態様において、shRNAは、４〜30ヌクレオチドの長さのループサイズを有する。標的mRNA（アンチセンス鎖）及びmRNAに特異的にハイブリダイズするステムの部分間の完全な相補性が好ましいが、shRNAは任意にはshRNAヘアピンステムの２本の鎖間にミスマッチを含むことができる。例えば、幾つかの態様において、shRNAは、へアピンを安定化させるためにヘアピンステム中に１個又は数個のG-U対合を含む。
【０２０６】
１つの態様において、本発明の複合体に含まれるRNAiヌクレオチドの核酸標的は、ＡＡジヌクレオチド配列の存在について標的RNA（例えば、mRNA又はmiRNA）をスキャニングすることにより選択される。各ＡＡジヌクレオチド配列は、３'に隣接する約19ヌクレオチドとの組合せにおいて、それに基づいてRNAiオリゴヌクレオチドを日常的に設計することができる潜在的siRNA標的部位である。幾つかの態様において、RNAiオリゴヌクレオチド標的部位は、５'及び３'非翻訳領域（UTR）内、或いは標的RNAの調節領域に結合する蛋白質によるsiRNPエンドヌクレアーゼ複合体の結合の潜在的妨害を回避するために、標的RNAの開始コドンの近傍の領域内（例えば、開始コドンの約75塩基内）に位置する。
【０２０７】
RNAiオリゴヌクレオチド標的化特異的ポリヌクレオチドは、当業界において知られている試薬及び手順を使用し又は日常的に改変することにより、容易に調製することができる。効果的なsiRNA分子の構造的特徴は同定されている。Elshabir et al. Nature 411 :494-498 (2001)、及びElshabir et al. EMBO 20:6877-6888 (2001)。したがって、当業者は、特定の遺伝子又は転写物を標的にするために種々の異なるsiRNA分子を使用することができると理解できよう。
【０２０８】
酵素的核酸
幾つかの態様において、本発明の複合体は、酵素的オリゴヌクレオチドを含んで成る。本発明に従って使用される酵素的オリゴヌクレオチドの２つの好ましい特徴は、それらが、標的遺伝子DNA又はRNAの領域の１又は複数に対して相補的である特異的基質結合部位を有すること、及び、それらが、オリゴヌクレオチドに対するRNA開裂活性を付与する基質結合部位内又はその周辺にヌクレオチド配列を有することである。幾つかの態様において、酵素的オリゴヌクレオチドはリボザイム（ribozyme）である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有するRNA−蛋白質複合体である。本発明の例示的リボザイムHES−オリゴヌクレオチドは、ハンマーヘッド（hammerhead）、ヘアピン、肝炎δウイルス、グループＩイントロン、又はRNaseP RNA（RNAガイド配列に関連して）又はニューロスポラ（Neurospora）VS RNAモチーフ中に形成される。
【０２０９】
本発明の複合体中の酵素的オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されているか又は当業界で知られている修飾されたヌクレオチドを含むが、重要なことは、そのような修飾が当該酵素的オリゴヌクレオチドの触媒活性を無くすコンホーメション変化を導かないことである。リボザイムの如き酵素的オリゴヌクレオチドを設計し、製造し、試験しそして最適化する方法は当業界で知られており、そして本発明の範囲内である。（例えば、WO 91/03162；WO 92/07065；WO 93/15187；WO 93/23569；WO 94/02595；WO 94/13688；EP 921 10298；及び米国特許第5,334,711号を参照のこと。これらのそれぞれを、引用により本明細書に組み入れる。）
【０２１０】
アプタマー（Aptamer)及びデコイ（Decoy）
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドはアプタマー（aptamer）及び／又はデコイ（decoy）を含む。本明細書で使用する場合、アプタマーは、特定の配列依存的形態を有しそして高い親和性及び特異性をもって標的蛋白質に特異的にハイブリダイズする１本鎖核酸分子（例えば、DNA又はRNA）を意味する。本発明の組成物におけるアプタマーは、その長さが、一般に100ヌクレオチドより短く、75ヌクレオチドより短く、又は50ヌクレオチドより短い。
【０２１１】
用語「アプタマー」は、本明細書で使用される場合、Ｄ−オリゴヌクレオチドに比べて酵素的分解に対する抵抗性を提供する鏡像アプタマー（高親和性Ｌ−エナンチオマー核酸、例えばＬ−リボース又はＬ−２'−デオキシリボースユニット）を含む。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、アプタマーMacugen（OSI Pharmaceuticals）又は ARC1779（Archemix, Cambridge, Mass.）を含む。特定の態様において、SES−オリゴヌクレオチドは、標的蛋白質結合についてアプタマーMacugen（OSI Pharmaceuticals）又は（ARC1779（Archemix, Cambridge, Mass.）競争するオリゴヌクレオチドを含む。追加の態様において、SES−オリゴヌクレオチドは、Tat又はRevと結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２１２】
更なる態様において、SES−オリゴヌクレオチドは、Tat、ヌクレオカプシド、逆転写酵素、インテグラーゼ（integrase）又はHIV−１のRevと結合するオリゴヌクレオチドを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、gp120、HCV NS3プロテアーゼ、肝炎C NS3m、イエルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）チロシンホスファターゼ、受容体チロシンキナーゼ（例えば、EGFRvIII）の細胞内ドメイン、ヌクレオリン（nucleolin）（AML）と結合するオリゴヌクレオチドを含む。アプタマーを製造しそして同定する方法は当業界において知られており、そして望ましい診断的及び／又は療法的性質を有するアプタマーを同定し、そしてそれらのアプタマーを本発明のHES−オリゴヌクレオチドに導入するために改変することができる。例えば、Wlotzka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 99(13):8898-8902 (2002）を参照のこと。その記載を引用により本明細書に組み入れる。
【０２１３】
本明細書において使用される場合、用語「デコイ」（decoy）は、蛋白質の如き因子が結合する核酸上の部位を模倣する短い２本鎖核酸（それ自体上で折り返すように設計された１本鎖核酸を含む）を意味する。このようなデコイは、因子の活性及び／又は機能を競争的に阻害し、そしてそれにより低下させる。デコイを製造しそして同定する方法は当業界において知られており、そして望ましい診断的及び／又は療法的性質を有するデコイを同定し、そしてそれらのデコイを本発明のHES−オリゴヌクレオチドに導入するために改変することができる。例えば、Edwardsらの米国特許第5,716,780号を参照にこと。そこ記載を引用により本明細書に組み入れる。
【０２１４】
小さい非−コードRNA及びアンタゴニスト（例えば、miRNA及び抗−miRNA）
小さい非−コードRNAにより介在されるメカニズムを介して遺伝子発現を制御する剤の必要性が存在する。本発明は、この必要性及び他の必要性に合致する。
本明細書において、用語「小さい非−コードRNA」は、限定的ではないが、17〜29ヌクレオチドの長さにわたるポリヌクレオチド分子を含めて使用される。１つの態様において、小さい非−コードRNAは、miRNA（miRNA、Mirs、miRs、mirs、及び成熟miRNAとしても知られる）である。
【０２１５】
”成熟”miRNAとしても知られるミクロRNA（miRNA）は、小さい（約21〜24ヌクレオチドの長さ）非−コードRNA分子であって、発生、細胞増殖、アポトーシス及び分化の鍵となる制御因子として同定されているものである。miRNAが関与する特定の発生過程の例には、幹細胞分化、神経発生、血管新生、造血及びエキソサイトーシスが含まれる（Alvarez-Garcia and Miska, Development, 132:4653-4662(2005)により総説されている）。miRNAは、疾患状態において異常に発現されることが見出されており、すなわち特定のmiRNAが、健康な細胞又は組織に較べて、疾患を有する細胞又は組織に高い又は低いレベルで存在する。
【０２１６】
miRNAは、しばしば数百ヌクレオチドの長さを有する長い内因性一次miRNA転写物（pri-miRNA、pri-mirs、pri-miR又はpri-pre-miRNAとしても知られる）から生ずると信じられる（Lee, et al, EMBO J., 21(17); 4663-4670 (2002)）。miRNAが遺伝子発現を制御する１つのメカニズムは、特定のmRNAの３'−非翻訳領域（３'−UTR）への結合を通してである。RNAにより誘導されるサイレンス複合体（RISC）に導入されることとなるmiRNAヌクレオチド（nt）RNA分子は、翻訳阻害、転写物の開裂、又はこれらの両方を通して遺伝子発現の下方制御（down-regulation）を仲介する。RISCはまた、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングに係わる。
【０２１７】
本発明は特に、疾患状態に関連するmiRNA活性を含めて小さい非−コードRNAの活性を調節するための組成物及び方法を提供する。本発明の或る種の組成物は、その改良された送達性、高い活性及び／又は改良された治療指数のためにイン−ビボ方法での使用に特に適する。
【０２１８】
本発明は、miRNAを含めて、小さい非−コードRNAを調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、１又は複数の小さい非−コードRNA、例えばmiRNAのレベル、発現、プロセシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。したがって、幾つかの態様において、本発明は、小さい非コードRNA、例えばmiRNAと特異的にハイブリダイズできる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有するHES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る医薬組成物のような組成物を包含する。
【０２１９】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、１又は複数の小さい非−コードRNA、例えばmiRNAを含んで成るか又はコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズするか又は立体的に妨害する。特定の特定の態様において、本発明は、アンチセンスメカニズムに頼るもの及びアンチセンスメカニズムに依存しないものを含めて、miRNAのレベル、活性又は機能を調節するために有用なEES−オリゴヌクレチド複合体及び方法を提供する。
【０２２０】
本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」、「標的RNA」、「標的RNA転写物」又は「核酸標的」は、限定的ではないがRNAを含めて標的化されうる任意の核酸を含めて使用される。１つの態様において、標的核酸は、miRNA及びmiRNA前駆体を含むがこれらに限定されない非−コード配列である。好ましい態様において、標的核酸は、miRNAとも称されるmiRNAである。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがmiRNAに対して100％を含めて実質的に相補的な配列を含んでなる場合、「miRNAに標的化される」。
【０２２１】
本明細書において使用される場合、オリゴヌクレオチドが生理的条件下で小さい非−コードRNAに対して特異的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドは、例えばRNA、例えば小さい非−コードRNAに対して「実質的に相補的」である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドがmiRNAの少なくとも８個の連続するヌクレオチドに対して100％を含めて実質的に相補的な配列を含んで成る場合、オリゴヌクレオチドは、「miRNAに標的化」される。幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、miRNAに特異的にハイブリダイズし、そして約８〜約21ヌクレオチド、約８〜約18ヌクレオチド、又は約８〜約14ヌクレオチドの長さにわたる。
【０２２２】
追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、miRNAに特異的にハイブリダイズし、そして約12〜約21ヌクレオチド、約12〜約18ヌクレオチド、又は約12〜約14ヌクレオチドの長さにわたる。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、８．９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21モノマーサブユニット（ヌクレオシド）の長さである。或る態様において、オリゴヌクレオチドは、14、15、16、17又は18モノマーサブユニット（ヌクレオチド）の長さである。
【０２２３】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、miRNAに対して全長相補性を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の長さ相補性及びオリゴヌクレオチドと標的miRNAとの間の３個までの「ミスマッチ」において、オリゴヌクレオチドはなお、標的miRNAとハイブリダイズすることができ、そしてオリゴヌクレオチドの機能は実質的に損なわれない。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的miRNAの長さに対して、オリゴヌクレオチドの３'又は５'末端、或いは３'及び５'の両末端における６個までのヌクレオチドの切除又は延長を含む。或る態様において、オリゴヌクレオチドは、標的miRNAの長さに比べて１又は２個のヌクレオチドが切除されている。非限定的な例として、標的miRNAが22ヌクレオチドの長さであれば、実質的に全長相補性を有するオリゴヌクレオチドは、20又は21ヌクレオチドの長さであろう。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、miRNAに比べて３'又は５'末端で１ヌクレオチド切除されている。
【０２２４】
幾つかの態様において、本発明は、細胞をHES−オリゴヌクレオチド複合体に接触させることを含んで成る、小さい非−コードRNAを調節する方法を提供し、ここでHES−オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNA、小さい非−コードRNA前駆体（例えば、miRNA前駆体）又は小さい非−コードRNAをコードする核酸に対して実質的に相補的である配列を含んで成る。本明細書において使用される場合、用語「小さい非−コードRNA前駆体、miRNA前駆体」は、小さい（成熟）非−コードRNAが由来する、より長い任意の核酸配列を含めて使用され、そして一次RNA転写物、pri-小さい非−コードRNA、及びプレ小さい−非−コードRNAを含むが、これに限定されない。例えば、miRNA前駆体は、miRNAが由来する、より長い核酸配列を包含し、そして一次RNA転写物、pri-miRNA、及びpre-miRNAを含むが、これらに限定されない。
【０２２５】
本発明は、特に、小さい非−コードRNAを含んで成る又はそれをコードする核酸に標的化されそして当該小さい非−コードRNAのレベルを調節するか又はその機能を調節するオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る組成物、例えば医薬組成物を提供する。更なる態様において、本発明は、miRNAに標的化され、そしてmiRNAのレベルを調節し又はそのプロセッシング若しくは機能を妨害するオリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【０２２６】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１−10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドに結合された場合にmiRNAのプロセシングをブロックする前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次-miRNA（pri-miRNA）中の配列に特異的にハイブリダイズする。
【０２２７】
幾つかの態様において、組成物は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含み、当該複合体は、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に標的化されそして当該Y小さい非−コードRNAのレベルを低下させるように働き、そして／又は細胞におけるその機能を妨害するオリゴヌクレオチドを含む。
【０２２８】
他の態様において、組成物は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含み、当該複合体は、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、或いは小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ（例えば、非−コードRNAをコードする遺伝子中の制御配列に結合することによる）、そして小さい非−コードRNAのレベルを増加させ、そして／又は細胞でのその核酸を増加させるように働くオリゴヌクレオチドを含む。
【０２２９】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドに含まれるオリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNA核酸標的を含んで成るか又はそれをコードする核酸にハイブリダイズして正常な機能の変更をもたらすことにより、小さい非−コードRNAのレベル、発現又は機能を調節することができる。例えば、小さい非−コードRNAの活性（レベル、発現又は機能を含む）を低下させるであろう非限定的なメカニズムには、開裂、隔離、立体的閉塞を通して、及び小さい非−コードRNAへのハイブリダイゼーション及び正常な細胞性標的へもハイブリダイゼションの回避とその活性の調節により、小さい非−コードRNAの破壊を促進することを含む。
【０２３０】
追加の態様において、本発明は、小さい非ーコードRNAの活性を阻害する方法を提供し、当該方法は、細胞をHES−オリゴヌクレオチド複合体と接触させることを含んで成り、当該複合体は、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、そして当該小さい非−コードRNAのレベルを低下させそして／又は細胞中でのその機能を妨害するオリゴヌクレオチドを含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に対して実質的に相補的である配列を含んで成る。特定の態様において、小さい非−コードRNAはmiRNAである。
【０２３１】
他の態様において、本発明は、小さい非−コードRNAの活性を阻害する方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はコードされる核酸に標的化され、そして当該小さい非−コードRNAのレベルを低下させそして／又は対象におけるその機能を妨害するものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に対して実質的に相補的な配列を含んで成る。特定の態様において、小さい非−コードRNAはmiRNAである。
【０２３２】
追加の態様において、本発明は、小さい非−コードRNAの活性を増加させる方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体に細胞を接触させることを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、当該小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、或いは当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ（例えば、当該非−コードRNAをコードする遺伝子中の制御配列に結合することによる）、そして細胞中で、当該小さい非−コードRNAのレベルを増加させ、そして／又はその機能を増加させるものである。
【０２３３】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸と実質的に同じ配列を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNA配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり100％の同一性を共有する。特定の態様において、小さい非−コードRNAはmiRNAである。
【０２３４】
他の態様において、本発明は、小さい非−コードRNAの活性を増加させる方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、当該小さい非−コードRNAを含んで成り又はそれをコードし、或いは当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ、そして対象において、当該小さい非−コードRNAのレベルを増加させ、そして／又はその機能を増加させるものである。
【０２３５】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸と実質的に同じ配列を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNA配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり100％の同一性を共有する。特定の態様において、小さい非−コードRNAはmiRNAである。
【０２３６】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸と実質的に同じ配列を含んで成る。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドはmiRNA模倣物である。幾つかの態様において、miRNA模倣物は２本鎖である。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、２本鎖であり、そして18〜23ユニットの長さのオリゴヌクレオチドを含み、そして平滑末端を有するか又は１、２若しくは３ヌクレオチドの１又は複数の３'オーバーハングを含んで成るmiRNA模倣物である。
【０２３７】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、18〜23ユニットの長さである１本鎖miRNA模倣物を含む。これらのmiRNA模倣物を発現する発現ベクターを含むHES−オリゴヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNA配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり100％の同一性を共有する。特定の態様において、小さい非−コードRNAはmiRNAである。
【０２３８】
本発明はまた、対象における小さい非−コードRNAの過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に（systemically）投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に標的化されており、そして対象において、当該小さい非−コードRNAのレベルを低下させ、そして／又はその機能を妨害するように働くものである。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは抗−miRNA（anti-miR）である。追加の態様において、抗−miRNAは２本鎖である。
【０２３９】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、２本鎖であり、そして18〜23ユニットの長さのオリゴヌクレオチドを含み、そして平滑末端を有するか又は１、２若しくは３ヌクレオチドの１又は複数の３'オーバーハングを含んで成る抗−miRNAである。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、８〜25ユニットの長さである１本鎖抗−miRNAを含む。これらの抗−miRNAを発現する発現ベクターを含むHES−オリゴヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、過剰発現される小さい非−コードRNAに対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２４０】
更なる態様において、本発明は、対象におけるmiRNAの過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理する方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、miRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に標的化され、そして対象において、miRNAのレベルを低下させ及び／又はその機能を妨害するように働くものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、過剰発現されるmiRNAに対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２４１】
miRNAのファミリーは、miRNAの位置２〜８、すなわちシード配列として知られる領域、におけるヌクレオチドの同一性により特徴づけられる。miRNAファミリーのメンバーを、ここで「関連miRNA」と称する。miRNAファミリーの各メンバーは、miRNA標的化及び機能において本質的な役割を演ずる同じシード配列を共有する。本明細書において使用される場合、用語「シード配列」又は「シード領域」は、成熟miRNA配列の５'−末端から２〜９のヌクレオチドを意味する。miRNAファミリーの例は当業界において知られており、そしてlet-7ファミリー（9 miRNAを有する）、miR-15ファミリー（miR-15a、miR-15b、miR15-16、miR-16-1及びmiR-195を含む)、及びmiR-181ファミリー（miR-181a、miR-181b、及びmiR-181cを含む）を含むが、これらに限定されない。
【０２４２】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAのシード領域に特異的にハイブリダイズし、そしてmiRNAのプロセシング又は機能を妨害する。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAのシード領域に特異的にハイブリダイズし、そして多miRNAのプロセシング又は機能を妨害する。更なる態様において、少なくとも２の複数miRNAが関連するシード配列を有し、又はmiRNAスーパーファミリーのメンバーである。
【０２４３】
疾患、例えば癌、線維症、代謝障害及び炎症性障害を伴うmiRNA機能障害と、一般の細胞過程に含まれる遺伝子の完全なネットワークに影響を及ぼすmiRNAの能力との関連付けが、特に魅力的な調節療法である抗−miRNA及びmiRNA模倣物の使用におけるmiRNAの選択的調節を行なう。本発明はまた、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質の増加した生産に影響を与える小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に標的化され、ここで、当該オリゴヌクレオチドは、対象において、前記小さい非−コードRNAのレベルを低下させそして／又はその機能を妨害するように働く。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記小さい非−コードRNAに対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２４４】
本発明はまた、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質の増加した生産に影響を与えるmiRNAを含んで成るか又はそれをコードする核酸に標的化され、ここで、当該オリゴヌクレオチドは、対象において、前記miRANのレベルを低下させそして／又はその機能を妨害するように働く。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記miRNAに対して実質的に相補的な（特異的にハイブリダイズすることができる）配列を含んで成る。
【０２４５】
本発明はまた、対象における小さい非−コードRNAの低い発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、又は当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ、そして対象において、前記小さい非−コードRNAのレベルを増加させそして／又はその機能を増加させるように働くものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記過剰発現される小さい非−コードRNAに対して実質的に相補的な（特異的にハイブリダイズできる）配列を含んで成る。
【０２４６】
更なる態様において、本発明はまた、対象におけるmiRNAの過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、又は当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ、そして対象において、前記小さい非−コードRANのレベルを低下させそして／又はその機能を増加するように働く。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、過剰発現されるmiRNAに対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２４７】
本発明はまた、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、又は当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ、そして、対象において、前記小さい非−コードRNAのレベルを低下させそして／又はその機能を増加するように働く。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記小さい非−コードRNAに対して実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２４８】
本発明はまた、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理するための方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、小さい非−コードRNAを含んで成るか又はそれをコードし、又は当該小さい非−コードRNAの内因性発現、プロセシング又は機能を増加させ、そして、対象において、前記小さい非−コードRNAのレベルを増加させそして／又はその機能を増加させるように働く。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、miRNAに対して実質的に相補的な（特異にハイブリダイズできる）配列を含んで成る。
【０２４９】
他の態様において、本発明は、miRNAの活性を阻害する方法を提供し、当該方法は、抗−miRNA活性を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体、例えば本明細書に記載されるもの、を対象に投与することを含んで成る。
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、siRNA、miRNA、ダイサー（dicer）基質（例えば、dsRNA）、リボザイム、デコイ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、miRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現させることができるプラスミドから選択されるオリゴヌクレオチドを含む。
【０２５０】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又はすべての2'-F修飾されたオリゴヌクレオチドを含む中央領域、及び少なくとも１つの安定性増強修飾を含んで成る外部領域を含んで成るキメラオリゴヌクレチドである。１つの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、第１の２'−修飾されたヌクレオチドを有する内部領域、及びそれぞれが第２の２'−修飾されたヌクレオチドを含んで成る外部領域を含んで成る。更なる態様において、ギャップ領域は１又は複数の２'−フルオロ修飾を含んで成り、そしてウイング領域は、１又は複数の２'−メトキシエチル修飾を含んで成る。１つの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、ISIS 393206又はISIS 327985である。
【０２５１】
療法剤
診断剤、薬物の発見及び療法剤
本発明のオリゴヌクレオチド、複合体及び他の組成物は、研究、薬物の発見、キット及診断剤並びに療法剤を含むが、これらに限定されない用途を有する。本発明の複合体は、従来の送達技法を超える改良されたオリゴヌクレオチド送達のため、イン−ビボ法での使用に特に適する。
【０２５２】
本発明は、イン−ビボ又はイン−ビトロで核酸配列を検出するための組成物及び方法を提供する。したがって、幾つかの態様において、本発明は、生理的条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る組成物を提供する。
【０２５３】
幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルは、宿主生物中の感染体、例えば哺乳類細胞中のウイルス、又は哺乳類組織中の細菌の同定のために使用される。この態様において、HESから構成されるHES−オリゴヌクレオチドは、相補的配列への結合のイン−ビボマーカーとして役立つ。この同定は、相補的外来（例えば、感染体）核酸配列へのHES−オリゴヌクレオチドの結合はHESの破壊又は有意な喪失をもたらし、そして蛍光消光の喪失をもたらす場合に、蛍光の変化の検出によって達成される。したがって、本発明は、宿主生物（対象）中の外来核酸の存在の決定、及び／又はレベルの定量のための方法を含む。幾つかの態様において、この方法はイン−ビトロで行なわれる。他の態様において、この方法はイン−ビボで行なわれる。
【０２５４】
幾つかの態様において、本発明は、対象中の感染物の存在をイン−ビトロ又はイン−ビボで検出する方法を提供し、当該方法は、感染物の核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドと細胞、組織又は対象とを接触させ、細胞、組織又は対象組織中の蛍光のレベルを決定し、そして当該蛍光のレベルを、HES−オリゴヌクレオチドと接触させた、感染物を含まない対照細胞、組織又は対象について得られた蛍光のレベルと比較することを含んで成り、ここで対照に比べて増加した蛍光により、細胞、組織又は対象が感染物を有することが示される。
【０２５５】
追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドは、疾患又は障害のバイオマーカーである核酸の変化したレベルを同定するために使用される。幾つかの態様において、本発明は、疾患又は障害についての核酸バイオマーカーの変化したレベルの存在をイン−ビトロで検出するための方法を提供し、当該方法は、核酸バイオマーカーと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドと細胞又は組織とを接触させ、細胞又は組織中の蛍光のレベルを決定し、そして当該蛍光のレベルと、HES−オリゴヌクレオチドと接触させた対照細胞又は組織について得られた蛍光のレベルとを比較することを含んで成り、ここで対照と比べて変化した蛍光により、細胞又は組織が核酸バイオマーカーの変化したレベルを有することが示される。
【０２５６】
更なる態様において、本発明は、疾患又は障害についての核酸バイオマーカーの変化したレベルをイン−ビボで検出するための方法を提供し、当該方法は、核酸バイオマーカーと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、対象における蛍光のレベルを決定し、そして当該蛍光のレベルと、HES−オリゴヌクレオチドが投与された対照対象について得られた蛍光のレベルとを比較することを含んで成り、ここで対照と比べて変化した蛍光により、対象が核酸バイオマーカーの変化したレベルを有することが示される。
【０２５７】
イン−ビトロ及びイン−ビボ蛍光は、当業界において知られている技法を用いてモニターすることができる。例えば、幾つかの態様において、蛍光は、蛍光内視鏡検査を通してモニターされる。蛍光内視鏡検査は、オリンパスEVIS ExERA-II CLV-80システム（オリンパス株敷く会社、東京、日本）の如き装置を用い、投与されたフルオロフォアのための適当な蛍光フィルター及び励起波長を用いて実施することができる。蛍光強度は、当業界において知られている技法及びソフトウエア、例えばImage-Jソフトウエア（NIH, Bethesda, MD）を用いて決定することができる。
【０２５８】
幾つかの態様において、疾患又は障害は、癌、線維症、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、或いは皮膚又は眼の疾患又は障害である。追加の態様において、疾患又は障害は、腎臓、肝臓、リンパ腺、脾臓又は脂肪組織の疾患又は障害である。特定の態様において、疾患又は障害は、腎臓、肝臓、リンパ腺、脾臓又は脂肪組織の疾患又は障害でない。
【０２５９】
更なる態様において、疾患又は障害は、増殖性障害、例えば癌である。例えば、種々のmiRNA、例えばmIR-lOb、mIR17-92、mIR-21、mIR125b、mIR-155、mIR193a、mIR-205a及びmIR-210の過剰発現が、種々の形態の癌と関連づけられている。幾つかの態様において、バイオマーカーは、mIR-lOb、mIR17-92、mIR-21、mIR125b、mIR-155、mIR193a、mIR-205a、及びmIR-210から選択されるmiRNAであり、そして対照に対する細胞、組織、又は対象の増加した蛍光により、対象が、癌を有するか、又は癌の素因を有することが示される。
【０２６０】
追加の態様において、本発明の方法は、異なる疾患又は障害を同定し及び／又は区別するために使用される。本発明の方法は同様に、特に、変化した核酸（例えば、DNA及びRNA）プロファイルであって、正常な及び疾患を有する（例えば、癌性の）組織又は細胞を区別するもの、疾患を有する細胞の異なるサブタイプの間（例えば、異なる癌の間及び特定の癌のサブタイプの間）を区別するもの、異なる疾患状態を生じさせる又は異なる疾患状態に関連する変異（例えば、発癌性変異）の間を区別するもの、及び組織の由来（例えば、転移した癌における）を同定するもの、を決定するために使用することができる。
【０２６１】
更に、幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、療法的オリゴヌクレオチドであり、そして療法的HES−オリゴヌクレオチドが標的核酸と特異的にハイブリダイズする場合に増加した蛍光をもたらすHESの破壊又は有意な喪失により、療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に送達されたこと、及びそれにハイブリダイズしたことが示される。したがって、幾つかの態様において、本発明は、標的核酸への療法的オリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達をモニターし、そして／又は定量するための方法を提供し、当該方法は、標的核酸に特異的にハイブリダイズする療法的オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、そして対象の細胞又は組織における蛍光のレベルを決定することを含んで成り、ここで対照細胞又は組織と比べての細胞又は組織中の増加した蛍光により、療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に送達され、そしてそれとハイブリダイズしたことが示される。
【０２６２】
本発明の送達ベヒクルは、部分的に、オリゴヌクレオチドの１又は複数の鎖への１又は複数のHESの結合が、生きた生物の細胞又は組織内でのHES−オリゴヌクレオチドの全身的（systemic）イン−ビボ送達を有意に増強するという驚くべき発見に基づいている。したがって、本発明のHES−オリゴヌクレオチドベヒクルは、広範囲の療法的用途のための療法的送達ベヒクルとして、並びに、例えば特定の遺伝子又はRNAのイン−ビボでの活性及び／又はコピー数を評価するための測定及び療法との組合せにおいて、用途を有する。
【０２６３】
研究及び薬物の発見のため、本発明のHES−オリゴヌクレオチドは、例えば、標的とされる核酸分子の正常な機能を妨害するために使用することができる。本発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドにより処理される細胞、組織又は対象内の発現パターンは、次に、当該化合物で処理されない対照細胞、組織又は対象と比較され、そして次の、精製したパターンが、核酸及び／又は蛋白質発現の異なるレベルについて分析され、そしてそれらは、例えば、試験される遺伝子の疾患関連、シグナル伝達経路、細胞配置、発現レベル、サイズ、構造又は機能に関連するようである。これ等の分析は、刺激された又は刺激されない細胞上で、及び発現パターンに影響する他の化合物の存在下又は非存在下で行なうことができる。
【０２６４】
本発明はまた、核酸、及び調節される核酸によりコードされる又は制御される蛋白質を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、mRNA、小さい非−コードRNA（例えば、miRNA）、遺伝子又は蛋白質のレベル、発現、プロセシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。
【０２６５】
幾つかの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することによりイン−ビボでオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法を提供する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは療法的オリゴヌクレオチドである。
【０２６６】
したがって、幾つかの態様において、本発明は、生理的条件下で標的核酸配列にハイブリダイズできる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有するHES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【０２６７】
幾つかの態様において、本発明は、対象にオリゴヌクレオチドを送達する方法を提供する。特定の態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成る、対象に療法的オリゴヌクレオチドを送達する方法を提供し、ここで、当該複合体は、標的RNA（例えば、mRNA及びmiRNA）及び標的遺伝子を調節するのに十分な、療法的有効量のオリゴヌクレオチドを含む。
【０２６８】
１つの態様に従えば、本発明は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成る、対象において標的核酸を調節する方法を提供し、ここで、当該複合体のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して実質的に相補的な、当該核酸に特異的にハイブリダイズしそしてそのレベルを調節し又はそのプロセシング若しくは機能を妨害する配列を含んで成る。幾つかの態様において、標的核酸はRNAであり、更なる態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、対象の１又は複数の細胞又は組織において、標的RNAのレベルを、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％又は少なくとも50％、低下させる。幾つかの態様において、標的核酸はDNAである。
【０２６９】
１つの態様に従えば、本発明は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成る、対象において蛋白質を調節する方法を提供し、ここで、当該複合体のオリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードしそして当該蛋白質の転写、翻訳、生産、プロセシング又は機能に影響を与える核酸に対して実質的に相補的な配列を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはRNAに特異的にハイブリダイズする。更なる態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、対象の１又は複数の細胞又は組織において、蛋白質又はRNAのレベルを、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％又は少なくとも50％、低下させる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNAに特異的にハイブリダイズする。
【０２７０】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗−miRNA、ダイサー基質（例えば、dsRNA）、アプタマー、デコイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、miRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RNA、又はRNAをコードする配列に特異的にハイブリダイズする。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、RNAをコードするDNA配列又はその制御配列に特異的にハイブリダイズする。
【０２７１】
追加の態様において、核酸又は蛋白質の発現は、対象において、当該対象を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体と接触させることにより調節される。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNAに結合する場合、RNAse Hの基質である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマー（gapmer）である。本明細書で使用される場合、「ギャップマー」は、２つ外部隣接領域（「ウイング」又は「ウイングセグメント」とも称される）の間に位置する中央領域（「ギャップ」叉は「ギャップセグメント」とも称される）を有するアンチセンス化合物である。
【０２７２】
これらの領域は、各異なる領域を構成する糖成分のタイプにより区別される。ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖成分のタイプには、幾つかの態様において、β-D-リボヌクレオシド、β-D-デオキシヌクレオシド、2'-修飾ヌクレオシド（例えば、特に、2'-修飾ヌクレオシドには2'-MOE、2'-フルオロ及び2-0--CH3が含まれよう）及び二環糖修飾ヌクレオシド（特に、このような二環糖修飾ヌクレオシドにはLNA(TM)又はENA(TM)が含まれよう）が含まれる。
【０２７３】
幾つかの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドの各ウイングは、同じ数のサブユニットを含んで成る。他の態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドの一方のウイングは、当該ギャップマーの他方のウイングとは異なる数のサブユニットを含んで成る。１つの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドのウイングは、独立に、１〜５ヌクレオシドを有し、その１，２、３、４又は５のウイングヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。１つの態様において、中央又はギャップ領域は、８〜25のβ-D-リボヌクレシド又はβ-D-デオキシリボヌクレオシドを含む（すなわち、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24又は25ヌクレオシドの長さである）。更なる態様において、中央又はギャップ領域は、17〜24のヌクレオチドを含む（すなわち、17、18、19、20、21、22、23又は24ヌクレオシドの長さである）。
【０２７４】
幾つかの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、又はホスホジエステルヌクレオチド間結合とホスホロチオエートヌクレオチド間結合との組合せを含んで成る。特定の態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドの中央領域は、少なくとも２，３、４、５又は10の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。特定の態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドの中央領域は、少なくとも10のβ-D-2'-デオキシ-2'-フルオロリボフラノシルヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの中央領域中の各ヌクレオシドは、β-D-2'-デオキシ-2'-フルオロリボフラノシルヌクレオシドである。
【０２７５】
１つの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、標的RNAに対して長さ相補性にわたって十分に相補的である。１つの態様において、ギャップマーの一方又は両方のウイングは、少なくとも１つの２'修飾ヌクレオシドを含む。１つの態様において、ギャップマーの一方又は両方のウイングは、１，２又は３個の２'−MOE修飾ヌクレオシドを含む。１つの態様において、ギャップマーの一方又は両方のウイングは、１，２又は３個の２'−OCH3修飾ヌクレオシドを含む。他の態様において、ギャップマーの一方又は両方のウイングは、１，２又は３個のLNA又はαLNAヌクレオシドを含む。
【０２７６】
幾つかの態様において、ギャップマーのウイング中のLNA又はαLNAは、LNAの６'（2',4'-拘束された-2'-O-エチルBNA,S-cEt）又は５'−位（-5'-Me-LNA又は-5'-Me-αLNA）に（Ｒ）又は（Ｓ）配置で１又は複数のメチル基を含むか、或いはLNA又はαLNA中の２'−酸素原子の代わりに置換された炭素原子を含む。更なる態様において、ギャップマー中のLNA又はαLNAは、５'位に立体的バルク成分（例えば、メチル基）を含む。更なる態様において、ギャップは、少なくとも１つの２'フルオロ修飾ヌクレオシドを含んで成る。追加の態様において、ウイングはそれぞれ、２又は３ヌクレオシドの長さであり、そしてギャップ領域は19ヌクレオシドの長さである。追加の態様において、ギャップマーは少なくとも１つの５−メチルシトシンを有する。
【０２７７】
他の態様において、中央領域（ギャップ）のヌクレオシドは、外部ウイング領域の一方又は両方の糖成分とは異なる均一な糖成分を含む。１つの非限定的な例において、ギャップは、第一の２'−修飾ヌクレオシドから均一に構成され、そしてウイングのそれぞれは、第二の２'−修飾オリゴヌクレオシドから均一に構成される。例えば、１つの態様において、中央領域は、２つの２'−MOE修飾ヌクレオチドをそれぞれが有する外部領域に、各末端において接する２'−Ｆ修飾ヌクレオチド（2'-MOE/2'-F/2'-MOE）を含む。特定の態様において、ギャップマーはISIS 393206である。他の態様において、中央領域は、２つの２'−MOE修飾ヌクレオチドをそれぞれが有する外部領域に、各末端において接する２'−Ｆ修飾ヌクレオチド（2'-MOE/2'-F/2'-MOE）を含む。
【０２７８】
特定の態様において、外部領域のそれぞれは、ギャップマーのウイングにおいて、２つのLNA又はαLNAを有する。更なる態様において、LNA又はαLNA修飾ヌクレオシドは、LNAの６'（2',4'-拘束された-2'-O-エチルBNA,S-cEt）又は５'−位（-5'-Me-LNA又は-5'-Me-αLNA）に（Ｒ）又は（Ｓ）配置で１又は複数のメチル基を含むか、或いはLNA又はαLNA中の２'−酸素原子の代わりに置換された炭素原子を含む。
【０２７９】
他の態様において、本発明は、miRNA又はmiRNAファミリーと関連する１又は複数の状態の処理のための組成物の製造における、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体の使用を提供する。
【０２８０】
１つの態様において、当該方法は、標的遺伝子又はRNA（例えば、mRNA及びmiRNA）の発現を調節しそして疾患又は障害に関連する１又は複数の状態又は症状を処理するのに十分な量に本発明のHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し又は接触させる段階を含んで成る。本発明の例示的化合物は、遺伝子、mRNA又は小さい非−コードRNA標的の発現、活性又は機能を効果的に調節する。好ましい態様において、小さい非−コードRNA標的は、miRNA、プレ−miRNA、又はポリシストロン性若しくはモノシストロン性pri-miRNAである。追加の態様において、小さい非−コードRNA標的は、miRNAファミリーの１メンバーである。更なる態様において、miRNAファミリーの２又はそれより多くのメンバーが調節のために選択される。
【０２８１】
追加の態様において、本発明は、対象において標的核酸の活性を阻害する方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んで成るか又はコードする核酸に標的化され、そして細胞において当該核酸のレベルを低下させそして／又はその機能を妨害するものである。特定の態様において、標的核酸は、小さい非−コードRNA、例えばmiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に実質的に相補的な配列を含んで成る。
【０２８２】
幾つかの態様において、本発明は、標的RNA発現を低下させる必要のある対象において標的RNAの発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、アンチセンスHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与することを含んで成る。特定の態様において、当該複合体中のオリゴヌクレオチドは、前記標的mRNAに結合する場合、RNAse Hの基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはギャックマーである。
【０２８３】
本明細書において開示されるように、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、増加した血清半減期を示す。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドの血清半減期は10分より長い。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドの血清半減期は、20、30、40、50、60、90、120、180又は200分より長い。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドの血清半減期は、30〜300分、30〜200分、又は30〜120分である。
【０２８４】
特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドの血清半減期は、血清のみの中の裸のオリゴヌクレオチド（すなわち、HESを含まないオリゴヌクレオチド成分）のそれの1.5〜４倍、２〜４倍位、又は３〜４倍である。他の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドの血清半減期は、血清のみの中の裸のオリゴヌクレオチドの血清半減期に較べて１、２、３、又は４時間長い。血清半減期を決定するための技法及び方法は当業界において知られている。
【０２８５】
追加の態様において、本発明は、標的RNA発現を低下させる必要のある対象において標的RNAの発現を低下させる方法であり、当該方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与することを含んでなり、ここで、当該アンチセンス配列は、標的RNAに特異的にハイブリダイズするものである。特定の態様において、当該HES−オリゴヌクレオチド複合体中のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記標的mRNAに結合する場合、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは18〜24ヌクレオチドの長さであり、11より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んで成り、当該第１及び第２ウイング領域のそれぞれは独立して１〜８個の2'-O-2-メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。
【０２８６】
他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA及びmiRNA）に結合する場合、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位での修飾を含んで成る少なくとも１つの修飾された糖成分を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位における修飾を含んで成る修飾された糖成分を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含んで成る。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含んで成る。幾つかの態様において、モルホリノは、ホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ（例えば、PMO）に対応する。
【０２８７】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド以内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブルダイズすることができる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'−非翻訳領域を標的にするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA（すなわち、mRNA中のmiRNA３'UTR標的部位）を標的にするように設計される。このような例の１つは、「miR-Mask」又は「標的プロテクター」であり、これらは、標的mRNA上のmiRNA結合部位へのmiRNAの接近を覆う、特異的標的mRNAの３'−UTR中の予想されるmiRNA結合部位に対して十分に相補的である１本鎖２'-O-メチル-修飾（又は他の化学修飾）されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである（例えば、Choi et al., Science 318:271 (2007)；Wang, Methods Mol. Biol. 676:43 (2011)、を参照のこと）。
【０２８８】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるmRNA中の３'非翻訳配列を模倣するように設計される。このような例の１つが、「miRNA sponge」、すなわち、対応するmiRNAと安定に相互作用し、そして内因性標的mRNAと標的miRNAとの会合を回避する、内因性miRNAのために、競争的miRNA阻害性トランスジーン発現多タンデム結合部位である。追加の態様において、核酸はmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、標的RNAのイントロン／エキソン連結部及び５'の１〜50ヌクレオ塩基領域、から成る群から選択されるRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズ可能である。
【０２８９】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１-10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズする、又は前駆体miRNA（pre-miRNA）又は一次miRNA（pri-miRNA）であって、オリゴヌクレオチドにより結合された場合にmiRNAのプロセシングをブロックするものを含む。
【０２９０】
他の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んでなる、蛋白質の生産を阻害する方法を提供し、当該オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードする核酸に標的化され、又は対象における当該蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を低下させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードする核酸に対して実質的に相補性の配列を含んでなる。
【０２９１】
幾つかの態様において、本発明は、オリゴヌクレオチド配列を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体に標的RNAを発現する細胞を接触させることにより、細胞における標的細胞性RNA又は対応する蛋白質の量を減少させる方法を提供し、前記オリゴヌクレオチド配列は標的RNAに特異的にハイブリダイズするものであり、標的RNA又は対応する蛋白質の量が減少する。幾つかの態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質（例えば、dsRNA）、デコイ、アプタマー、デコイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、miRNA、抗-miRNA、リボザイム又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。
【０２９２】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNAに結合する場合、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さであり、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２'−O-(2-メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30のリンクしたヌクレオシドを有する。
【０２９３】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA又はmiRNA）に結合する場合にRNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位に修飾を含んでなる少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'位に修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAモチーフを含んでなる。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノモチーフを含んでなる。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロジアミデートモルホリノを含んでなる。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０２９４】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内いの配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAに結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的のするように設計される。追加の態様において、標的RNAはmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択されるmRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０２９５】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０２９６】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０２９７】
追加の態様において、本発明は、標的RNAの低下した発現を必要とする対象において標的RNAの発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、標的RNAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んでなり、ここで、対象の細胞又は組織中で標的RNAの発現が低下する。幾つかの態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アプタマー、デコイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。
【０２９８】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA又はmiRNA）に結合する場合、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さであり、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２'−O-(2-メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30のリンクしたヌクレオシドを有する。
【０２９９】
他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA又はmiRNA）に結合する場合にRNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位に修飾を含んでなる少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位に修飾を含んでなる少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのPNAモチーフを含んでなる。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノモチーフを含んでなる。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３００】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド以内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブルダイズすることができる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'−非翻訳配列を標的にするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNAの３'非翻訳配列を標的にするように設計される。追加の態様において、標的RNAはmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオチドの領域、から成る群から選択される標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０３０１】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３０２】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３０３】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、標的核酸（例えば、遺伝子、mRNA又はmiRMAに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを送達するために対象に投与され、これは腫瘍細胞についての増殖の利点を提供し、又は微生物の複製を増強する。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、アンチセンス、siRNA、shRNA、ダイサー基質又はmiRNAであって疾患において関連した蛋白質（例えば蛋白質バリアント）をコードするものを送達するために投与される。したがって、幾つかの態様において、本発明は、例えば、異常な遺伝子発現のために疾患状態に悩む生物において遺伝子を沈黙させるために、特定の核酸配列を生きた細胞に輸送するシステムのイン−ビボ送達系を提供する。
【０３０４】
幾つかの態様において、本発明は、細胞中の注目のポリペプチドの量を減少させる方法を提供し、当該方法は、当該ポリペプチドをコードする核酸又はその相補体を発現する細胞を、オリゴヌクレオチド配列を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体と接触させることを含んでなり、当該オリゴヌクレオチド配列は、当該ポリペプチドをコードするDNA又はmRNAに特異的にハイブリダイズするものであり、こうして当該注目のポリペプチドの発現が低下する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、そしてこくで当該オリゴヌクレオチドは前記ポリペプチドをコードする核酸又はその相補体と特異的にハイブリダイズし、ポリペプチドの発現が低下する。
【０３０５】
特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30の連結されたヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、複合体は２本鎖RNA（dsRNA）を含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、２'修飾（例えば、２'−フルオロ、２-OME及び２−メトキシエチル（2-MOE））、ロックされた核酸（LNA及びαLNA）、PNAモチーフ及びモルホリノモチーフ、から選択される少なくとも１つの修飾されたオリゴヌクレオチドモチーフを含んでなる。
【０３０６】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス配列であり、そして標的RNAに結合するときRNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、ギャップマーは、キメラオリゴヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。幾つかの態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、５'及び３'ウイングセグメントの間に配置される２'−デオキシヌクレオチド中央ギャップ領域を含んでなる。ウイングセグメントは、少なくとも１つの２'−修飾された糖を含んでなるヌクレオシドを含む。ウイングセグメントは、２'−O−メトキシエチル糖成分又は二環核酸糖成分から選択される少なくとも１つの２'糖成分を含むヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、ギャップセグメントは、10個の２'−デオキシリボヌクレオチドの長さであり、そしてウイングセグメントのそれぞれは、５個の２'−O−メトキシエチルヌクレオチドの長さである。キメラオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合から均一に構成される。さらに、キメラオリゴヌクレオチドの各シトシンは５'−メチルシトシンであることができる。
【０３０７】
他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはRNAにハイブリダイズするとき、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位に修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３０８】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオチドの領域、から成る群から選択される標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０３０９】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３１０】
更なる態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３１１】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３１２】
追加の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んでなる、対象において核酸の活性を増加させる方法を提供し、当該オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んでなるか又はそれをコードし、或いは当該核酸の内因性発現、プロセシング又は機能を上昇させ（例えば、当該核酸をコードする遺伝子中の制御配列と結合することによる）、そして細胞における当該核酸のレベルを上昇させ、そして／又はその機能を上昇させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んでなるか又はそれをコードする核酸と実質的に同じ配列を含んでなる。
【０３１３】
他の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んでなる、蛋白質の生産を増加させる方法を提供し、当該オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードし又は対象において当該蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を増加させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードする核酸と実質的に同じ配列を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードする内因性核酸配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたるヌクレオチドと、100％の同一性を共有する。
【０３１４】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んでなる、対象における核酸の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理する方法を含み、当該オリゴヌクレオチドは、核酸を含んでなるか又はそれをコードする核酸に標的化され、そして対象において、核酸のレベルを低下させ、そして／又はその機能を妨害するものである。幾つかの態様において、前記核酸はDNA、mRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。
【０３１５】
特定の態様において、核酸はRNAであり、そしてHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズするときRNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さを有し、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２−O−（２−メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30の連結されたオリゴヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記核酸に実質的に相補的な配列を含んでなる。
【０３１６】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸に結合したとき、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位での修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３１７】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、核酸はmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０３１８】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３１９】
更なる態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３２０】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３２１】
更なる態様において、本発明は、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害の処理方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んでなり、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質をコードする核酸に標的化されており、又は対象における当該蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を低下させるものである。幾つかの態様において、核酸はDNA、mRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アプタマー、デコイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、蛋白質をコードする内因性核酸配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり、100％の同一性を共有する。
【０３２２】
特定の態様において、標的化される核酸はRNAであり、そしてHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズするとき、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さを有し、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２'−O−（２−メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30の連結されたヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記核酸に実質的に相補的な配列を含んでなる。
【０３２３】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA及びmiRNA）に結合したとき、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位での修飾を含んでなる少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは２'−位での修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３２４】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列（例えば、AUG開始コドンの30ヌクレオチド以内）に特異的にハイブリダイズし、そして翻訳を低下させる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、核酸はmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオチドの領域、から成る群から選択される、蛋白質をコードする標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０３２５】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３２６】
更なる態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３２７】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３２８】
本発明はまた、対象における蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理する（例えば、軽減する）方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に全身的に投与することを含んでなり、当該オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードするmRNAに特異的にハイブリダイズし、そして標的RNAのスプライシングを変更する（例えば、エキソンスキッピングを促進する）ものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２'−位における修飾を含んでなる少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでなる。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは２'OME又は２'アリルである。追加の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドはLNA、αLNA（例えば、５'位に立体的バルク成分（例えば、メチル基）を含むLNA又はαLNA）である。
【０３２９】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３３０】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。
【０３３１】
特定の態様において、疾患又は障害はジュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne Muscular Dystrophy；DMD）である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン（dystrophin）遺伝子のエキソン44、45、50、51、52、53又は55を「スッキプオーバー」するメッセージスプライシングを促進する、mRNA配列に特異的にハイブリダイズする。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、ジストロフィン（dystrophin）遺伝子のエキソン51を「スッキプオーバー」するメッセージスプライシングを促進する、mRNA配列に特異的にハイブリダイズする。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドはAVI-4658（AVI Biopharma）である。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、mRNAがジストロフィンAVI-4658と結合するのと競争する。
【０３３２】
特定の態様において、HES−おりごヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、エテプリルセン（eteplirsen）又はドリサペルセン（drisapersen）である。他の態様において、HES−おりごヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、ジストロフィン（dystrophin）mRNA結合についエテプリルセン（eteplirsen）又はドリサペルセン（drisapersen）と競争する。
【０３３３】
本発明の更なる態様は、疾患又は障害の診断を受けた対象を選択し、当該対象にオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量を投与することを含んでなる方法を提供し、当該オリゴヌクレオチドは、疾患若しくは障害又はそれに関連する状態と関連するか又はそれに関連する蛋白質をコードすると信じられる核酸配列に特異的にハイブリダイズするものである。
【０３３４】
幾つかの態様において、核酸はDNA、mRNA又はmiRNAである。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アプタマー、デコイ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸配列の少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり、100％の同一性を共有する。
【０３３５】
特定の態様において、核酸はRNAであり、そしてHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズするとき、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さを有し、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２−O−（２−メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30の連結されたオリゴヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記核酸に実質的に相補的な配列を含んでなる。
【０３３６】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA及びmiRNA）に結合したとき、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位での修飾を含んでなる修飾された少なくとも１つの糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオシドは２'−位での修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３３７】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオチドの領域、から成る群から選択されるmRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。
【０３３８】
幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、miRNAのヌクレオチド１〜10（すなわち、シード領域）に特異的にハイブリダイズするか、或いは前駆体−miRNA（pre-miRNA）又は一次−miRNA（pri-miRNA）であってオリゴヌクレオチドにより結合される場合にmiRNAプロセシングをブロックするもの中の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３３９】
更なる態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３４０】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３４１】
他の態様において、本発明は、蛋白質の過剰発現と関連する疾患又は障害に罹患している対象において疾患の進行を遅くする方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与することを含んでなり、当該オリゴヌクレオチドは、当該蛋白質をコードするDNA又はmRNAに特異的にハイブリダイズして、当該ポリペプチドの発現を低下せしめるものである。追加の態様において、追加の態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗-miRNA、ダイサー基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びにsiRNA、miRNA、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、蛋白質をコードするDNA又はmRNAの少なくとも15の連続するヌクレオチド、少なくとも20の連続するヌクレオチド、又は全長にわたり、100％の同一性を共有する。
【０３４２】
特定の態様において、核酸はmRNAであり、そしてHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。１つの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズするとき、RNAse Hの基質である。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜24ヌクレオチドの長さを有し、11個より多くの連続する２'−デオキシリボヌクレオチドを有するギャップ領域、並びに当該ギャップ領域を挟む第１ウイング領域及び第２ウイング領域を含んでなり、ここで、前記第１及び第２ウイング領域のそれぞれは、独立に、１〜８個の２'−O−（２−メトキシエチル）リボヌクレオチドを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、12〜30の連結されたオリゴヌクレオシドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、前記核酸に実質的に相補的な配列を含んでなる。
【０３４３】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的RNA（例えば、mRNA及びmiRNA）に結合したとき、RNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−位での修飾を含んでなる修飾された少なくとも１つの糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは２'−位での修飾を含んでなる修飾された糖成分を含んでなる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのPNAモチーフを含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがPNAに対応する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのモルホリノモチーフを含む。幾つかの態様において、モルホリノはホスホロジアミデートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットがホスホロジアミデートモルホリノ（PMO）に対応する。
【０３４４】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内の配列に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、オリゴヌクレオチド配列は、標的RNAの５'非翻訳領域中の配列に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RNA（例えば、mRNA）中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNAにより結合されるRNA中の３'非翻訳配列を標的とするように設計される。追加の態様において、核酸はmRNAであり、そしてオリゴヌクレオチド配列は、標的RNAのイントロン／エキソン連結部、並びに標的RNAのイントロン／エキソン連結部及びイントロン／エキソン連結部の５'の１〜50ヌクレオチドの領域、から成る群から選択される標的mRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、標的領域は、イントロン／エキソン連結部の５'の１〜15ヌクレオ塩基の領域、イントロン／エキソン連結部の５'の20〜24ヌクレオ塩基の領域、及びイントロン／エキソン連結部の５'の30〜50ヌクレオ塩基の領域、から成る群から選択される。
【０３４５】
更なる態様において、オリゴヌクレオチドはRNA妨害（interference）（RNAi）を誘導することができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー（Dicer）基質である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さのsiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、19〜29ヌクレオチドの長さのステム及び４〜30ヌクレオチド間のループサイズを有するshRNAである。更なる態様において、siRNA又はshRNAオリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３４６】
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはダイサー基質であり、そしてそれぞれが18〜25ヌクレオチドの長さの２本の核酸鎖を含み、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む。特定の態様において、ダイサー基質は、21ヌクレオチドの長さを有し、そして２ヌクレオチドの３'オーバーハングを含む２本鎖核酸である。更なる態様において、ダイサー基質の一方又は両方の鎖は１又は複数の修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド間結合、又はこれらの組み合わせを含む。
【０３４７】
miRNA−関連病状に対する療法的適用
miRNA又はmiRNAのファミリーにより制御されることが知られており、本願発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いて制御され得る病的状態の若干の個別のグループが、現在、存在する。
【０３４８】
１つの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、感染性疾患と関連する１又は複数のmiRNAの阻害剤又は模倣物である。１つの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドはmiR-122を阻害する。ミラビルセン（Miravirsen）（SPC3649）、Santaris Pharma A/Sにより開発されたmiR-122の阻害剤、Mir-122は、肝炎Ｃウイルスが必須の内因性宿主因子として複製のために必要とする肝臓特異的miRNAである。４週間のミラビルセン単一療法についての臨床試験データは、強力な投与量依存性抗ウイルス活性を示している。Regulus Therapeutics and GlaxoSmithKline（GSK）は同様に、前臨床試験において、miR-122がHCVの複製において必須であることを示しており、そしてHCV感染の治療のための臨床試験に進むことを計画している。
【０３４９】
他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、線維症と関連するmiRNAの阻害剤又は模倣物である。１つの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-21を阻害する。Regulus Pharmaceutical and Sanofi Aventisによる前臨床研究は、ヒトの線維組織において上方制御されるmiR-21の阻害が、心臓及び腎臓を含めての線維症の多くのモデルにおいて器官の機能を改良することができることを示している。他の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-29に対応し又はそれを模倣する。Mirna TherapeuticsによるMGN-4220、模倣物又はmiRNA置換療法は、心筋線維症に関連するmiR-29を標的とする。
【０３５０】
他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、発作、心臓疾患、アテローム性硬動脈化症、再狭窄、血栓症、貧血、白血球減少症、好中球減少症、血小板減少症、果粒球減少症、汎血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病を含むがこれらに限定されない心臓血管系疾患に関連するmiRNAの阻害剤又は模倣物である。１つの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-33を阻害する。Regulus Pharmaceutical and AstraZenecaは、前臨床研究において、miR-33の阻害が、動脈プラークサイズ（arterial plaque size）を減少させ、そしてHDLのレベルを上昇させることを示している。
【０３５１】
他の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-92、miR-378、miR-206及び／又はmiR-143/145ファミリーを阻害する。Miragen Therapeuticsにより開発されたMGN-6114、MGN-5804、MGN-2677、MGN-8107は、それぞれ、抹消動脈疾患に関連するmiR-92、心臓代謝性疾患に関連するmiR-378、心臓疾患に関連するmiR-143/145ファミリー、及び筋萎縮性側索硬化症に関連するmiR-206を標的とする。
【０３５２】
更なる態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-208/209ファミリー及び／又はmiR-15/195ファミリーを阻害する。Miragen TherapeuticsのMGN-9103及びMGN-1374は、miRNA阻害剤であって、それぞれ、慢性心不全についてのmiR-208/209ファミリー及び心筋梗塞後のリモデリングに関連するmiR-15/195を標的にする。他の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-126及び／又はmiR92aを阻害する。miR-126及びmiR-92aは、アテローム性斑の発達において中心的役割を演ずる。
【０３５３】
他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、神経性疾患又は障害に関連するmiRNAの阻害剤である。１つの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-206を阻害する。miR-206は、ALS及び神経筋シナップス再生（neuromuscular synapse regeneration）において必須の役割を演ずる。
【０３５４】
他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、癌状態に関連するmiRNAの阻害剤又は模倣物である。１つの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-21を阻害する。miR-21が、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、肺癌及び脳腫瘍を含めての癌の阻害及び進行において重要な役割を演ずることが、多くの科学刊行物により示唆されている。肝細胞癌（HCC）マウスモデルにおける抗−miR-21が、遅れた腫瘍の進行を示すことが、Regulus Pharmaceutical及びSanofi Aventisの前臨床研究において示されている。
【０３５５】
他の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-lObを阻害する。Regulus Pharmaceuticalによる抗−miR-lObの前臨床動物実験もまた、GBMモデルにおける療法効果を示した。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-34に対応し又はそれを模倣する。殆どの固体及び肝性悪性腫瘍において失われ又は低下したレベルで発現されるmiR-34の、Mirna Therapeuticsによる模倣又はmiRNA置換療法は、MRX34の前臨床研究において種々のタイプの癌について増殖の阻害を示した。
【０３５６】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7a、miR-9、miR-lOb、miR-15a、miR-16-l、miR-16、miR-21、miR-24、miR-26a、miR-34a、miR-103-107、miR-122、miR-133、miR-181、miR-192、miR-194、miR-200から選択されるmiRNAの阻害剤である。これらのミクロRNAは特に、癌と関連することが報告されているものである。
【０３５７】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7、let-7a、let-7f、miR-1、Mir-10b、miR-15a、miR-16-1、Mir-17-5p、Mir-17-92、miR-21、Mir-23-27、miR-25、miR-27b、miR-29、miR-30a、Mir-31、miR-34a、miR-92-1、miR-106a、miR-125、Mir-126、Mir-130a、Mir-132、miR-133b、Mir-155、miR-206、Mir-210、Mir-221/222、miR-223、Mir-296、miR-335、Mir-373、Mir-378、miR-380-5p、Mir-424、miR-451、miR-486-5p、及びMir-520cから選択されるmiRNAを阻害する。これらのミクロRNAは特に、癌の新生血管形成、転移及び／又は開始を促進することが報告されている。
【０３５８】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-15ファミリー、miR-21、miR-23、miR-24、miR-27、miR-29、miR-33、miR-92a、miR-145、miR-155、miR-199b、miR-208a/bファミリー、miR-320、miR-328、miR-499から選択されたmiRNAを阻害する。これらのミクロRNAは特に、心臓血管機能において種々の役割を有する。
【０３５９】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7b、miR-9、miR106b-25クラスター、miR-124、miR-132、miR-137、miR- 184から選択されるmiRNAを阻害する。これらのミクロRNAを特に、神経幹細胞（NSC）における成人神経発生の種々の役割を有することが報告されている。
【０３６０】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7a、miR-21、mir-26、miR-125b、mir-145、miR-155、miR-191、miR-193a、miR-200ファミリー、miR-205、miR-221、及びmiR- 222から選択されるmiRNAの阻害剤又は模倣物である。これらのミクロRNAは特に、癌の種々のタイプについての、診断的又は予後的バイオマーカーとして機能することが報告されている。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-21、mir-26、miR-125b、miR-155、miR-193a、miR-200ファンミリー、miR-221、及びmiR-222から選択されるmiRNAの阻害剤である。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7a、mir-145、miR-191、及びmiR-205から選択されるmiNAの配列を含み又はそれを模倣する。
【０３６１】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-138、mir-182、miR-21、mir-103/107、miR-29cから選択されるmiRNAの阻害剤である。これらのミクロRNAは特に、それぞれ、関節炎、狼瘡、アテローム性動脈硬化症、インスリン感受性、及び蛋白尿において役割を有することが報告されている。
【０３６２】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7、let-7-a3、lin-28、miR-1、miR-9-1、miR-15a、miR-16-1、miR-17-92クラスター、miR-21、miR-29ファミリー、miR-34ファミリー、miR-124、miR-127、及びmiR-290から選択されるmiRNAの阻害剤又は摸倣物である。これらのミクロRNAは特に、miRNAの発現を担当する遺伝的又は後成的制御における異常性による癌の種々のタイプにおいて調節されないことが報告されている。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7-a3、lin-28、miR-17-92クラスター、及びmiR-21から選択されるmiRNAの阻害剤である。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、let-7、miR-1、miR-9-1、miR-15a、miR-16-1、miR-21、miR-29ファミリー、miR-34ファミリー、miR-124、miR-127、及びmiR-290から選択されるmiRNAの配列を含むか又はそれを模倣する。
【０３６３】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、Mir-20a、Mir-34、Mir-92a、Mir-200c、Mir-217及びMir-503から選択されるmiRNAの配列を含むか又はそれを模倣する。これらのmiRNAは特に、血管新生阻害性であることが報告されている。
【０３６４】
追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-1、miR-2、miR-6、miR- 7又はlet-7の配列を含むか、又はそれを模倣する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、miR-Rx07、miR-Rx06、miR-Rxlet-7、miR-RxOl、miR-Rx02又はmiR-Rx03である。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、miR-451に対応するか、又はそれを模倣する。miR-451は、イン−ビボで赤血球新生を制御することが示されており（Patrick et al., Genes & Dev., 24:1614-1619(2010)）、そしてそれ故に、新生多血症、一般に赤血球障害（red cell dyscrasias）、又は他の造血性悪性腫瘍、の如き疾患に関連する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドはMGN-4893である。
【０３６５】
追加の態様において、注目の核酸を標的とするアンチセンス化合物を含んで成る医薬組成物は、当該核酸と関連する疾患又は障害に罹患しているか又は感受性の患者を処理するための組成物の製造のために使用される。
【０３６６】
核初期化及びiPSCの生成のためのmiRNAのエクス−ビボ送達
追加の態様において、本発明は、細胞核初期化（cell nuclear reprograming）のための方法を提供する。幾つかの態様において、１又は複数のmiRNAの模倣物及び／又は阻害剤を含むHES−オリゴヌクレオチドは、人工多能性幹細胞（iPSC）又は胚性幹（EB）−様多能性細胞の１又は複数の性質を持つように細胞をプログラムするために、細胞、例えばヒト及びマウスの体細胞にエクス−ビボで投与される（例えば、誘導されたiPSC及び胚様体（EB）のコロニー形態、中胚葉、内胚葉及び外胚葉を形成する多能性を示すiPSCに由来する奇形腫のqRT-PCR、ヘマトキシリン及びエオシン染色により示される初期化された幹細胞株における幹細胞マーカー遺伝子の発現、胚葉特異的分化マーカーの発現を示すiPSC由来奇形腫、SCIDマウスへの移植後の奇形腫形成の免疫組織化学的分析）。本発明の非−毒性で且つ高度に効果的なHES−オリゴヌクレオチド送達系は、従来のオリゴヌクレオチド送達方法に比べて細胞を初期化するための送達方法の非常に上昇した効率を提供する（例えば、米国特許公開第2010/0075421号、第2009/0246875号、第2009/0203141号、及び第2008/0293143号を参照のこと）。
【０３６７】
本発明の方法に従って体細胞に投与することができ、そしてそれによりiPSCの１又は複数の性質を示すように体細胞を初期化するmiRNA又はmiRNAの模倣物の例には、lin-28、miR-17-92クラスター、miR-93、miR-106b、miR-106b-25クラスター、miR-106a-363クラスター、miR-181a、miR-199b、miR-200c、miR-214、miR-302、miR-367、miR-302-367クラスター、miR-369、miR-371、miR-372、miR- 373、及びmiR-520、並びにこれらのmiRNAのファミリーメンバー及び変異体から選択されるmiRNA又はmiRNAの模倣物が含まれる（例えば、Anokye-Danso et al., Cell Stem Cell 8:376(2011)；Miyoshi et al., Cell Stem Cell 8: 1(2011)；Subramanyam et al., Nature Biotechnology, 29:5(2011)；Li et al. (2011) The EMBO Journal 30:5(2011); Lin et al., Nucleic Acids Research 39:3(2011)；Lakshniipathy et al., Regenerative Medicine 5:4(2010)；Xu et al., Cell 137:647(2009); Goff et al., PLoS One 4:9(2009)；Wilson et al., Stem Cells Dev. 18:5(2009)；Chin et al., Cell Stem Cell 5:1(2009)；Ren et al., Journal of Translational Medicine 7:20(2009)；Lin et al., RNA 14:2115(2008)、を参照のこと。これらのそれぞれの内容を引用により本明細書に組み入れる）。
【０３６８】
本発明の方法に従って体細胞に投与することができ、そしてそれによりiPSCの１又は複数の性質を示すように体細胞を初期化するmiRNA又はmiRNAの模倣物の例には、let-7、miR-145、並びにこれらのmiRNAのファミリーメンバー及び変異体から選択されるmiRNAの阻害剤が含まれる（例えば、Lakshmipathy et al., Regenerative Medicine 5:4(2010)；Xu et al., Cell 137:647(2009)、を参照のこと。これらのそれぞれの内容を引用により本明細書に組み入れる）。
【０３６９】
更なる態様において、本発明は、体細胞の初期化を誘導する方法を含み、当該方法は、当該細胞に、上記のmiRNAの１，２，３、４、５又はそれより多くのmiRNA、miRNA模倣物又はmiRNA阻害剤を含むHES−オリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる。上記のmiRNAの１，２，３、４、５又はそれより多くのmiRNA、miRNA模倣物又はmiRNA阻害剤をコードする発現構成物を含むHES−オリゴヌクレオチドの投与を含む、体細胞の初期化を誘導する方法も、本発明に含まれる。
【０３７０】
上記のmiRNAの１，２，３、４、５又はそれより多くのmiRNA、miRNA模倣物又はmiRNA阻害剤をコードする発現構成物を含むHES−オリゴヌクレオチドの投与を含む、体細胞の初期化を誘導する方法も、本発明に含まれる。「発現構成物」は、注目のRNAを転写するように設計された任意の２本鎖DNA又は２本鎖RNAを意味し、例えば、下流遺伝子、コード領域、又は注目のポリヌクレオチド配列に作用可能に連結されている又はされるであろう少なくとも１つのプロモーターを含む構成物（例えば、ポリペプチド又は蛋白質をコードするcDNA又はゲノムDNAフラグメント、又はRNAエフェクター分子、例えばアンチセンスRNA、３本鎖形成RNA、リボザイム、人工的に選択された高親和性RNAリガンド（アプタマー）、２本鎖RNA、例えば、ステム−ループ又はヘアピンdsRNAを含んでなるRNA分子、又は２フィンガー若しくは３フィンガーdsRNA又はミクロRNA、或いは注目の任意のRNA）である。
【０３７１】
「発現構成物」は、１又は複数のプロモーターを含んでなる２本鎖DNA又はRNAを包含し、ここで、当該１又は複数のプロモーターは、転写されるべきポリヌクレオチド配列に実際には作用可能に連結されておらず、むしろ、プロモーターにより転写されるべき作用可能に連結されるポリヌクレオチド配列の効果的な挿入のために設計される。受容細胞への発現構成物のトランスフェクション及びトランスフォーメーションは、細胞が、発現構成物によりコードされたRNAエフェクター分子、ポリペプチド又は蛋白質を発現することを可能にする。発現構成物は、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、組換えウイルス、又は例えば、バクテリオリオファージ、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス若しくはヘルペスウイルス等に由来する人造染色体、であることができる。発現構成物は生細胞において複製され、又はそれは合成されるであろう。
【０３７２】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、miRNA、miRNA模倣物及び／又はmiRNA阻害剤のタンデムコピーを含むか又はコードする。例えば、幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、１又は複数のmiRNAs、miRNA模倣物及び／又はmiRNA阻害剤の１又は複数のタンデムコピーをコードし、ここで、コードされた配列は、単一転写ユニットから又は多ポリシストロン性転写ユニットからシス又はトランスで発現され、多数の（例えば、２、３、４、又はそれより多くの）同一の又は異なるmiRNAs、miRNA模倣物及び／又はmiRNA阻害剤を細胞内で生成する（例えば、Chung et al., Nucleic Acids Research 34:7(2006)；米国特許第6,471,957号、及び米国特許公開第2006/0228800号及び第2011/0105593号を参照のこと、これらのそれぞれの内容を引用により本明細書に組み入れる）。
【０３７３】
本発明の方法に従って初期化され得る体細胞は、当業界において知られている技法を用いて、初期化された細胞が場合によっては戻し投与される対象を含めて、任意の由来から得ることができる。本発明の方法に従って使用され得る体細胞のヒト及びマウスの由来の例には、ヒト包皮繊維芽細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞（HDF）、ヒト脂肪間質細胞（hASC）、種々のヒト癌細胞系、マウス胚繊維芽細胞（MEF）、及びマウス脂肪間質細胞（mASC）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７４】
幾つかの態様において、本発明の方法は、例えば造血細胞、心筋細胞、肝細胞又はニューロンへの細胞系譜決定を駆動するmiRNA、miRNA模倣物又はmiRNA阻害剤を含むか又はコードする１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを細胞に投与することにより、初期化される体細胞が前駆細胞又は末端細胞系譜に分化するように誘導する段階を含む。
【０３７５】
細胞核初期化オリゴヌクレオチド、例えば或る種のmiRNAを体細胞集団に安全に且つ効果的に送達する本発明のHES−オリゴヌクレオチドの能力は更に、本発明に方法を、従来の核酸送達系により示された低い初期化効率及び細胞毒性の懸念により今日まで妨げられていた、療法的用途のための大きな患者集団からの患者特異的iPSC−様細胞の大規模な高い処理能力に対して、従順なものとする。
【０３７６】
HES−オリゴヌクレオチドの例示的療法用途
当業者にとって即座に明らかなように、少なくとも部分的に、細胞へのオリゴヌクレオチドの驚くべき高効率での全身的イン−ビボ送達のため、本発明にHES−オリゴヌクレオチド複合体は、標的核酸並びに蛋白質のレベル及び活性の調節において制限されない用途を有す、そして療法的適用において特に有用である。
【０３７７】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドにより処理され得る疾患及び障害の非限定的な例には、増殖性障害（例えば、癌、例えば血液癌（例えば、AML、CML、CLL及び多発性骨髄腫）及び固形腫瘍（例えば、黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、NSCLC）、免疫性疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、IBD、乾癬、喘息、自己免疫疾患、例えば関節リュウマチ、多発性硬化症、及びSLE）及び炎症性疾患、神経疾患（例えば、糖尿病性網膜症、デュセンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病及び脊髄性筋委縮病、及び他の神経性疾患）、代謝性疾患（例えば、II型糖尿病、肥満）、心臓血管系疾患（例えば、凝固障害、血栓症、冠動脈疾患、再狭窄、アミロイドーシス、壊血病、貧血、異常ヘモグロビン症、アテローム性動脈硬化、高コレステロール、高グリセリン症）、内分泌関連疾患及び障害（例えば、NASH、糖尿病、尿崩症、アジソン病、ターナー症候群、クッシング症候群、骨粗鬆症）、及び感染性疾患が含まれる。
【０３７８】
したがって、１つの態様において、本発明は、疾患若しくは障害またはその症状に関連する核酸に特異的にハイブリダイズする療法的オリゴヌクレオチドを含む療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを、疾患を有すると診断された対象に全身的に投与することを含んでなる、対象における疾患の処理方法を提供する。
追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドにより処理される疾患又は障害は、腎臓、肝臓、リンパ腺、脾臓、又は脂肪組織の疾患又は障害である。
【０３７９】
本発明はまた、対象における細胞又は組織への療法的オリゴヌクレオチドの送達をモニターする方法を提供し、当該方法は、療法的オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与し、そして当該対象における細胞又は組織の蛍光をモニターすることを含んでなり、ここで対象の細胞又は組織における増加した蛍光により、療法的オリゴヌクレオチドが対象の細胞又は組織に送達されたことが示される。
【０３８０】
特定の態様において、本発明は、対象における細胞又は組織への療法的オリゴヌクレオチドの送達をモニターする方法を提供し、当該方法は、療法的オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与し、そして当該対象における細胞又は組織の蛍光をモニターすることを含んでなり、ここで対象の細胞又は組織における所定の値に増加した蛍光により、療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドが対象の細胞又は組織に送達されたことが示される。特定の態様において、前記所定の値は、細胞への療法的有効量の療法的HES−オリゴヌクレオチドのイン−ビトロでの送達に関連する蛍光の対応する変化から、又は定量的蛍光モデル分析を通して決定される。
【０３８１】
本発明はまた、対象における核酸の低発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理する方法を包含し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与することを含んでなり、当該オリゴヌクレオチドは、前記核酸を含むか又はそれをコードし、又は当該核酸の内因性発現、プロセシング又は機能を上昇させ（例えば、当該核酸をコードする遺伝子における制御配列に結合することによる）、そして細胞における当該核酸のレベルを上昇させ、そして／又はその機能を上昇させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは前記核酸を含むか又はそれをコードする核酸と実質的に同じ配列を含んでなる。
【０３８２】
本願発明はまた、対象における蛋白質の低い発現により特徴付けられる疾患又は障害を処理する方法を包含し、当該方法は、当該蛋白質をコードするか、又は対象において当該蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を増加させるオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を前記対象に投与することを含んでなる。
【０３８３】
他の態様において、本発明は、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを、その投与を必要とする対象に全身的に投与することにより、癌又は癌に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。「癌」、「腫瘍」又は「悪性腫瘍」は、本明細書において同義語として使用され、そして、細胞の制御されない異常な増殖、局所的に又は血流及びリンパ系を通して体の他の部分に広がる（転移する）侵された細胞の能力、並びに多くの既知の特徴的な構造的及び／又は分子的特徴の何れかにより特徴付けられる多くの疾患の何れかを意味する。「癌性腫瘍」又は「悪性細胞」は、特徴的な構造的性質、分化の欠落、及び侵入及び転移の可能性を有する細胞として理解される。
【０３８４】
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いて処理できるであろう癌の例には、固体腫瘍及び血液癌が含まれる。本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いて処理できる癌の追加の例には、乳癌、肺癌、脳癌、骨癌、肝臓癌、腎臓癌、直腸癌、頭癌及び首癌、卵巣癌、造血性癌（例えば、白血病）、及び前立腺癌が含まれる。本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いて処理できる更なる癌の例には、癌腫、リンパ腫、骨髄腫、芽腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。このような癌の更に特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非−小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、及び種々のタイプの頭及び首癌、が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は白血病の治療に使用される。他の特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は前立腺癌の治療に使用される。
【０３８５】
追加の態様において、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドは血液癌を処理するために投与される。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、リンパ系腫瘍、膵臓の癌、リンパ腺の癌から選択される癌を処理するために投与される。追加の態様において、、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、バーキット（Burkitt）リンパ腫、びまんせい大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキン（Hodgkin）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫、非−ホジキン（non-Hodgkin）リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、及びＴ細胞リンパ腫から選択されるリンパ腫を処理するために投与される。
【０３８６】
追加の態様において、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞白血病（CD5+ Bリンパ球）、慢性骨髄性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、脊髄形成異常、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、及び二次性白血病から選択される白血病を処理するために投与される。追加の態様において、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドは、多発性骨髄腫を処理するために投与される。HES−オリゴヌクレオチドを用いて処理され得る他のタイプの癌及び腫瘍は、本明細書に記載されており、又は当業界において知られている。
【０３８７】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、AVI-4557（Cyp 3A4m; AVI Biopharma）、ISIS-2372（Survivin; ISIS）、Gem-640（XIAP; Hybridon）、Atu027（PKN3; Silence Therapeutics）、CEQ508（B catenin; Marina Biotech）、GEM 231（PKA Rlαsubunit; Idera）、Affinitak（Aprinocarsen, ISIS 3521/LY900003; PKC-α; ISIS/Lilly）、Aezea（OL(l)p53/EL-625; p53; Eleos Pharma）、ISIS 2503（H-ras; ISIS）、EZN-2968（Hif-１α; Enzon Pharmaceuticals）、G4460/LR 3001（c-Myb; Inex/Genta）、LErafAON（c-Raf; NeoPharm）、ISIS 5132（c-Raf; ISIS）、Genasense（Oblimersen/G3139; Bcl-2; Genta）、SPC2996（Bcl-2; Santaris Pharma）、OGX- 427（Hsp27; ISIS/ OncoGene X）、LY2181308（Surivin; Lilly）、LY2275796（EIF4E ; Lilly）、ISIS-STAT3 Rx（STAT3; ISIS）、OGX-011（Custirsen; clusterin; Teva）、Veglin（VEGF; VasGene Therapeutics）、AP12009（TGF-P2; Antisense Pharma）、GTI-2501（リボヌクレオチドレダクターゼ Rl; Lorus Therapeutics）、Gem-220（VEGF; Hybridon）、Gem-240（MEM2; Hybridon）、CALAA-19（M2サブユニットリボヌクレオチドレダクターゼ; Arrowhead Research Corporation）、Trabedersen（AP 12009; TGF-β2; アンチセンス）、GTI-2040 (リボヌクレオチドレダクターゼ R2, Lorus Therapeutics（5'-GGCTAAATCGCTCCACCAAG-3'）（配列番号：９））、AEG 35156 (XIAP; Aegera Pharma）、及びMG 98（DNAメチルトランスフェラーゼ; MethylGene/ MGI Pharma/ British Biotech）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０３８８】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、Atu027 (PKN3)、TKM-PLK1 (PLK1)、ALN-VSP02 (KSP及びVEGF)、CALAA-01 (RRM2)、siG12D LODER (KRAS)、ISIS-EIF4ERx (EIFR)、GTI-2040 (RRM2)、トラベデルセン（Trabedersen）(TGFB2)、アルケキシン（Archexin）（プロテインキナーゼＢα（Akt1））、及びセネルセン（Cenersen）（P53）から選択され；特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの一つと競争する。
【０３８９】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3'（配列番号：２）（PKC-α）；5'-CCCTGCTCCCCCCTGGCTCC-3'（配列番号：３）（p53）；5'-TCCGTCATC GCTCCTCAGGG-3'（配列番号：４）（H-ras）；5'-GGGACTCCTCGCTACTGCCT-3'（配列番号：５）（(H-ras）；5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3'（配列番号：６）（c-Raf）；5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'（配列番号：７）（Bcl2）；及び5'-TGGCTTGAAGATGTACTCGAT-3（配列番号：８）（TGF-β2）から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの一つと競争する。
【０３９０】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、5'-TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'（配列番号：10）（c-myb）；5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3'（配列番号：６）（c-RAF）；5'-CGC TGAAGGGCTTCTTCCTTATTGAT-3'（配列番号：11）（Bcr-abl）；5'-CGCTGAAGGGCTTTGAACTGTGCTT-3'（配列番号：12）（Bcr-abl）；5'-GGGACTCCTCGCTACTGCCT-3'（配列番号：５）（Ha-Ras）；5'-GCGUGCCTCCTCACUGGC-3'（配列番号：13）（Pka-rIA）；5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'（配列番号：14）（c-Myc）；5'-GCTCAGTGGACATGGATGAG-3'（配列番号：15）（JNK2）；5'-GGACCCTCCTCCGGAGCC-3'（配列番号：16）（IGF-1R）；5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3'（配列番号：18）（TLR-9）；及び5'-CTGCTAGCCTCTGGATTTGA-3'（配列番号：17）（PTEN）から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの一つと競争する。
【０３９１】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、アポトーシス、細胞の生存、血管新生、転移、異常な遺伝子制御、細胞サイクル、有糸分裂経路、及び／又は成長シグナル伝達を調節する核酸配列の特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、EGFR、HER-2/neu、ErbB3、cMet、p561ck、PDGFR、VEGF、VEGFR、FGF、FGFR、ANGl、ANG2、bFGF、TIE2、プロテインキナーゼＣ−α（PKC-α）、p561ck PKA、TGF-β、IGFIR、P12、MDM2、BRCA、IGF1、HGF、PDGF、IGFBP2、IGF1R、HIF1α、フェリチン、トランスフェリン受容体、TMPRSS2、IRE、HSP27、HSP70、HSP90、MITF、クルステリン（clusterin）、PARPlC-fos、C-myc、n-myc、C-raf、B-raf、Al、H-raf、Skp2、K-ras、N-ras、H-ras、ファレンシルトランスフェラーゼ（farensyltransferase）、c-Src、Jun、Fos、Bcr-Abl、c-Kit、EphA2、PDGFB、ARF、NOX1、NF1STAT3、E6/E7、APC、WNT、βカテキン、GSK3b、PI3k、mTOR、Akt、PDK-1、CDK、Mekl、ERK1、AP-1、p53、Rb、Syk、オステオポンチン（osteopontin）、CD44、MEK、MAPK、NFκβ、Ｅカドヘリン（cadherin）、サイクリンＤ、サイクリンＥ、Bcl-2、Bax、BXL-XL、BCL-W、MCL1、ER、MDR、テロメラーゼ、テロメラーゼ逆転写酵素、DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、HDAC1及びHDAC2）、インテグリン、IAP、アウロラキナーゼ（aurora kinase）、メタロプロテアーゼ（例えば、MMP2、MMP3及びMMP9）、プロテアゾーム、及びメタロチオネイン遺伝子から選択される蛋白質の発現を調節する核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３９２】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、するビビン（survivin）、HSPB1、EIF4E、PTPN1、RRM2、BCL2、PTEN、Bcr-abl、TLR9、HaRas、Pka-rIA、JNK2、IGF1R、XIAP、TGF-β2、c-myb、PLK、KRAS、KSP、PKN3、リボヌクレオチドレダクターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼR1、リボヌクレオチドレダクターゼR2、MEM2、及びTLR-9の群から選択される核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。
【０３９３】
更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、RecQヘリカーゼファミリーメンバーの核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、前記RecQヘリカーゼファミリーメンバーはワーナー（Werner）蛋白質（WRN）である。他の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーはRecQL1である。他の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーは、BLM、RecQL4、RecQ5、及びRTSから成る群から選択されるメンバーである。標的核酸配列についてのGenBankアクセス参照の例は、U39817、NM_000057及びBC034480におけるBLM；RecQ1 at NM_002907、NM_032941、BC001052、D37984及びL36140におけるRecQ1；NM_000553、AF091214、L76937及びAL833572におけるWRN；NM_004259、AK075084、AB006533、AB042825、AB042824、AB042823、AF135183及びBC016911におけるRecQ5；並びにNM_004260、AB006532、BC020496及びBC011602及びBC013277におけるRTSである。
【０３９４】
他の態様において、本発明は、癌又は癌に関連する状態の処理において、現在使用されており、使用されていた、又は有用であることが知られている１又は複数の療法との組合せにおいて、HES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することにより、癌又は癌に関連する１又は複数の状態を処理する方法を提供する。
【０３９５】
本明細書に示されるように、インビボIV及びIPで全身的に投与されたHES−オリゴヌクレオチド複合体は、骨髄及び脾臓に位置する細胞を含めて標的化造血細胞の98％を超える負荷を達成した。実施例２を参照のこと。幾つかの態様において、本発明は、白血病の如き血液の癌を治療する方法を提供し、この方法は本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体を患者に全身的に投与することを含み、ここで標的化造血細胞におけるHES−オリゴヌクレオチドの負荷は90％、95％又は98％より大であり、そして従来のオリゴヌクレオチド送達方法製剤は標的化造血細胞（例えば、骨髄及び脾臓に位置する細胞）のそれぞれ90％、95％又は98％より多くの負荷を達成しない。
【０３９６】
例えば、「Transfection of siRNAs into CML Primary Cells Using Nucleofectin」(2009).と題する論座白書及びArthanari et al., J. of Controlled Release, pages 1-9 (2010)に報告されている比較的に非常に低いインビトロ負荷効率を参照のこと。特定の態様において、標的化造血細胞は骨髄中の幹細胞である。追加の態様において、本発明は、本発明のHES−オリゴヌクレオチドを投与することにより、BCR-ABL陽性（フィラデルフィア染色体陽性）慢性骨髄性白血病あるいはこの白血病に関連する１又は複数の状態を治療する方法を提供する。
【０３９７】
幾つかの態様において、本発明は、免疫系の炎症性の又は他の疾患又は障害、或いは免疫系の炎症性の又は他の疾患又は障害に関連する１又は複数の状態の処理のための方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象（すなわち、炎症性の又は他の免疫系の疾患又は障害を有するか又はその危険を有する）に、本発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を全身的に投与することを含んでなる。当業者にとって即座に明らかなとおり、免疫系又は炎症性疾患から生ずる又はそれと関連する免疫性のまたは炎症性の疾患又は状態の任意のタイプが、本発明の方法に従って処理され得る。特定の態様において、本発明は、免疫系及び／又は炎症性疾患又は障害、或いはこのような免疫系疾患又は障害に関連する１又は複数の状態を処理することに向けられる。
【０３９８】
用語「炎症性障害」は、本明細書において使用される場合、１又は複数の痛み（毒性物質の発生及び神経の刺激からの苦痛）、熱（血管拡張からの熱）、発赤（血管拡張及び血流の増加からの発赤）、膨潤（体液の過剰な流入又は抑制された流出からの腫瘍）、及び機能の喪失（部分的又は完全な、一時的又は永続的でありうる機能喪失）の兆候により特徴付けられる疾患又は状態を意味する。炎症は多くの形態を採り、急性、癒着性、委縮性、カタル性、慢性、硬変性、びまん性、敗血症性、滲出性、線維素性、線維化、病巣性、肉芽性、増殖性（hyperplastic）、肥大性、間質性（interstitial）、転移性、壊死性、閉塞性、間質性（parenchymatous）、増殖性（plastic）、増殖性（productive）、増殖性（proliferous）、急性偽膜性、化膿性（purulent）、硬化性、セロプラスティック、漿液性、単純性、特異性、皮下性、化膿性（suppurative）、毒性、トラウマ性、及び／又は潰瘍性の１又は複数の炎症を含むが、これらに限定されない。
【０３９９】
炎症性障害は更に、血管（多発性動脈炎、側頭動脈炎）、関節（関節炎：クリスタル関節炎、変形性関節炎、リウマチ様動脈炎、反応性関節炎、関節リウマチ、ライター（Reiter）関節炎）、胃腸管(疾患）、皮膚（皮膚炎）、又は多器官及び組織（全身性エリテマトーデス）に影響を与えるものを含むが、これらに限定されない。用語「線維症」又は「線維化障害」は、本明細書で使用される場合、急性又は慢性炎症に続きそして細胞及び／又はコラーゲンの異常蓄積に関連する状態を意味し、そして個体の器官又は組織の線維症、例えば心臓、腎臓、関節、肺、又は皮膚の線維症を含み、そして障害、例えば特発性肺線維症（idiopathic pulmonary fibrosis）及び特発性間質性肺炎（cryptogenic fibrosing alveolitis）を含むが、これらに限定されない。特定の態様において、炎症性障害は、喘息、アレルギー障害、及び関節リウマチから成る群から選択される。
【０４００】
更なる態様において、障害又は免疫系の障害は、自己免疫疾患である。本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体により処理することができる自己免疫疾患、障害又は状態には、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、自己免疫血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、グルテン過敏性腸疾患、アレルギー性脳脊髄炎、心筋症、再発性多発性軟骨症、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎、（例えば、IgA腎炎）多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜眼炎、多腺性内分泌障害、紫斑病（例えば、ヘンロッホ・ショーンライン（Henloch Scoenlein）紫斑病）、ライター（Reiter）病、スチフ−マン（Stiff-Man）症候群、自己免疫肺炎症、心筋症、IgA糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、リウマチ性心疾患、ギャラン−バレー（Guillain-Barre）症候群、インスリン依存性糖尿病、及び自己免疫炎症眼（autoimmune inflammatory eye）、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能低下（例えば、ハシモト甲状腺炎、全身性エリテマトーサス、円板状紅斑性狼瘡、グードパスチャ―（Goodpasture）症候群、天疱瘡、受容体自己免疫性炎症、例えば（ａ）グレーブス（Graves）病、（ｂ）重症筋無力症及び（ｃ）インスリン耐性、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血球減少性紫斑病、関節リウマチ、抗−コラーゲン抗体による強皮症、混合結合組織症、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、特発性アジソン（Addison）病、不妊、糸球体腎炎、例えば、原発性糸球体腎炎及びIgA腎炎、水泡性類天疱瘡、シューグレン（Sjogren）症候群、糖尿病、及びアドレナリン作動性薬物耐性（喘息又は嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作動性薬物耐性を含む）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、尋常性白斑、脈管炎、ポスト-MI、心切開症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性筋障害、及び他の炎症性、肉芽腫性、退行性、及び委縮性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０４０１】
特定の態様において、自己免疫疾患又は障害は、クロン（Crohn）病、全身性エリテマトーシス（SLE）、炎症性腸疾患、乾蘇、糖尿病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、及び関節リウマチから選択される。
【０４０２】
追加の態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、免疫性又は心臓血管性疾患を治療する方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ICAM-1、p53、TNF-α、アデノシンA1受容体；PCSK9、SERPINC1、TFR2、TMPRSS6、CCR3、c-反応性蛋白質（CRP）、Apo-B100、ApoCIII、Apo(a)、Apo(b)、Factor VII及びファクターXIから選択される核酸標的に結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【０４０３】
幾つかの態様において、本発明は、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含んでなる、免疫性又は心臓血管系疾患を処理する方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、Alicaforsen（ICAM-1 ; ISIS 2302）、QPI-1002（p53; Silence Thera/Novartis/Quark）、XEN701（Isis/Xenon Pharmaceuticals）、ISIS 104838（TNF-a; ISIS/Orasense）、EPI-2010（RASON; Adenosine Al receptor; Epigenesis/ Genta）、Plazomicin（Isis/Achaogen）、ALN-PCS02（PCSK9; Alnylam）、ALN-AT3 (SERPINC1 ; Alnylam）、ALN-HPN（TFR2; Alnylam）、ALN-HPN（TMPRSS6; Alnylam）、ASM8-003（CCR3; Topigen Pharmaceuticals）、ISIS CRPRx（CRP; ISIS)、KynamroTM（ISIS 301012、Apo-B100; ISIS/Genzyme）、ISIS-APOCIII Rx（ApoCIII; ISIS）、ISIS-APO(a)（Apo(a); ISIS）、ISIS-FVII rx Factor VII; ISIS）、及びISIS-FXI（Factor XI; ISIS）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４０４】
追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ApoBに結合するオリゴヌクレオチドを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ミポメルセン（Mipomersen）（ApoB）を含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的ApoB核酸結合に関し、ミポメルセン（Mipomersen）と競争する。
【０４０５】
更なる態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、免疫性又は心臓血管系疾患を治療する方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3'（配列番号：19）（(ICAM-1）；5'-GCTGATTAGAGAGAGGTCCC-3'（配列番号：20）（TNF-α）；及び5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3'（配列番号：21）（アデノシンA1受容体）から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合に関し、上記のオリゴヌクレオチドの一つと競争する。
【０４０６】
幾つかの態様において、本発明は、感染、又はカテゴリーＡの感染物若しくは状態を処理する方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、感染性疾患を有するか又はその危険性を有する）に、療法的有効量の本願発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することを含んでなる。幾つかの態様において、感染性疾患は、ウイルス感染、細菌感染、菌類感染又は寄生感染である。
【０４０７】
幾つかの態様において、本発明は、感染性疾患、又は感染性疾患に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供し、当該方法は、必要とする対象（すなわち、感染性疾患を有するか又はその危険性を有する）に、療法的有効量の本願発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することを含んでなる。特定の態様において、感染物は、バシルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、クロストリジウム・ボツリヌム・トキシン（Clostridium botulinum toxin）、イエルシナ・ペスチ（yersina pestis）、バリオラ・マジョール（variola major）、フィロウイルス（例えば、Ebola及びMarburg）及びアレナウイルス（arenavirus）（例えば、Lassa及びMachupo）から選択される。特定の態様において、本発明の方法に従って処理される状態は、たんそ病、ボツリヌス症、疫病、天然痘、野兎病、及びウイルス性出血熱から選択される。
【０４０８】
幾つかの態様において、本発明は、感染物又はカテゴリーＢ感染物若しくは疾患に関連する状態を処理する方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、感染性疾患を有するか又はその危険性を有する）に、療法的有効量の本願発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することを含んでなる。特定の態様において、感染物は、バイルス・スペーシス（Bacilla species）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、サルモネラ・スペーシス（Salmonella species）、大腸菌（E. coli）0157:H7、シゲラ（Shigella）、ブルクホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、チヤミディア・プシタシ（Chyamydia psittaci）、コクシアラ・ブツネチー（Coxiella burnetii）、リケッチア・プロワゼッキー（Rickettsia prowazekii）、ウイルス性脳炎アルファウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎、東洋ウマ脳炎、西洋ウマ脳炎）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）及びクロストリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）から選択される。特定の態様において、本発明の方法に従って処理される状態は、ブルセラ病、クロストリジウム・パーフリンゲンスのエプシロン毒素、食品毒、馬疽、類鼻疽、オウム病、Ｑ熱、リシントキシン毒、チフス熱、ウイルス性脳炎及び赤痢から選択される。
【０４０９】
幾つかの態様において、本発明は、ウイルス感染、又はウイルス感染に関連する１又は複数の状態を処理する方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、ウイルス感染又はその危険性を有する）に、療法的有効量の本願発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる。当業者にとって即座に明らかなとおり、ウイルス感染、又はウイルス感染による若しくはそれに関連する状態（例えば、呼吸状態）の任意のタイプを本発明に従って処理することができる。特定の態様において、ウイルス性疾患又は障害は、エボラ、マールブルグ（Marburg）、ジュニン（Junin）、デングウエストナイル（Denge West Nile）、ラッサSARS Co-V、日本脳炎、ベネズエラウマ脳炎、セントルイス脳炎、 Manchupo, 黄熱病、及びインフルエンザから選択される感染又はそれらに関連する状態である。
【０４１０】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドにより処理することができるウイルス性感染又は状態を生じさせるウイルスの例には、レトロウイルス（例えば、ヒトＴ−細胞リンパ好性ウイルス（HTLV）タイプＩ及びII、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（HSV）タイプＩ及びII、エプスタイン−バール（Epstein-Barr）ウイルス、HHV6-HHV8、及びサイトメガロウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、モルビリウイルス（morbillivirus）ウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、流行性耳下腺炎、hMPV、及び肺炎ウイルス）、アデノウイルス、ブニアウイルス（bunyavirus）（例えば、ハンタウイルス（hantavirus））、コルナウイルス（cornavirus）、フィロウイルス（filovirus）（例えば、エボラウイルス）、フラビビウイルス（flavivirus）（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）、黄熱病ウイルス、及び日本脳炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（hepadnavirus）（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV））、オルトミオウイルス（orthomyovirus）（例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣ、及びPIV）、パポバウイルス（例えば、パピロマウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、リノウイルス（rhinovirus）、エンテロウイルス、及びＡ型肝炎ウイルス）、ポックスウイルス、レオウイルス（reovirus）（例えば、ロタウイルス）、トガウイルス（例えば、風疹ウイルス）、及びラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）の感染又は関連する状態が含まれるが、それらに限定されない。
【０４１１】
追加の態様において、本発明は、感冒、ウイルス性咽頭炎、ウイルス性喉頭炎、ウイルス性クループ、ウイルス性気管支炎、インフルエンザ、パラインフルエンザウイルス性疾患（PIV）（例えば、クループ、細気管支炎、気管支炎、肺炎）、呼吸系発疹ウイルス（RSV）疾患、メタニューモウイルス、及びアデノウイルス疾患（例えば、熱性呼吸器疾患、クループ、気管支炎及び肺炎）と関連するか又はこれらを生じさせるウイルス性呼吸系感染に関連する状態の処理又は軽減の方法を提供する。
【０４１２】
幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、AVI-4065（HCV; AVI Biopharma）、VRX496（HIV; VIRxSYS corporation）、Miravirsen（antimiR-122, Santaris）、GEM 91（Trecorvirsen)/92（(5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3')（配列番号：22）；Gag HIV; Hybridon）、Vitravene（Fomivirsen; CMV; ISIS/Novartis）（5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'）（配列番号：23）、ALN-RSV01（RSV; Alnylam）、AVI-6002（Ebola; AVI Biopharma）、AVI-6003（Ebola; AVI Biopharma）、MBI-1 121（human papillomavirus; Hybridon）、ARC-520（HPV hepatitis; Arrowhead Research Corporation）及びAVI-6001（Influenza/avian flu; AVI Biopharma）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、ISIS14803 (HCV; ISIS (5'-GTGCTCATGGTGCACGGTCT-3')（配列番号：24)）及び5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号：25）(CMV）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４１３】
１つの態様において、本発明は、RSV感染、又はRSV感染に関連する１若しくはそれより多くの状態を治療する方法を提供し、この方法は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも10のオリゴヌクレオチド配列に結合するHES−オリゴヌクレオチドを、必要とする患者に全身的に投与することによる。
【０４１４】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチチドは、RSV-Nオリゴヌクレオチド5'-GGCUCUUAGCAAAGUCAAGUUGAAUGAU-3'（配列番号：26）及び5'-AUCAUUCAACUUGACUUUGCUAAGAGCCAU-3'（配列番号：27）；RSV-Pオリゴヌクレオチド5'-CGAUAAUAUAACUGCAAGAdTdT-3'（配列番号：28）及び3'-dTdTGCUAUUAUAUUGACGUUCU-5'（配列番号：29）；並びにRSV-Fオリゴヌクレオチド5'-UGCUGUAACAGAAUUGCAGdTdT-3'（配列番号：30）及び5'-CUGCAAUUCUGUUACAGCadTdT-3'（配列番号：31）から成る群から選択されるSiRNA／代サー（Dicer）配列対を有する。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合に関し、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドの１又はそれより多くは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドの１又はそれより多くは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４１５】
追加の態様において、本発明は、本発明のHES−オリゴヌクレオチドの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の合わせを投与することによる、ウイルス感染、又はウイルス感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。幾つかの態様において、少なくとも２、少なくとも３、又は少なくとも４のHES−オリゴヌクレオチドが同一の標的核酸に特異的にハイブリダイズする。追加の態様において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４又は少なくとも５のHES−オリゴヌクレオチドが異なる標的核酸に結合する。
【０４１６】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも10のフィロウイルス（filovirus）のRNA配列に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、フィロウイルス（例えば、エボラ及びマーブル）感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、VP35、VP24及び／又はRNAポリメラーゼＬに結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４１７】
１つの態様において、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又は少なくとも10のエボラ（Ebola）RNA配列に結合するHES−オリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者の全身的に投与することによる、エボラウイル感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、VP24、VP35及び／又はRNAポリメラーゼＬに結合する。追加の態様において、HESオリゴヌクレオチドは、VP24、VP30、VP35、VP40、NP、GP、及び／又はRNAポリメラーゼＬに結合する。
【０４１８】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはVP35に結合し、そして5'-6CCTGCCCTT TGTTCTAGTTG 6-3'（配列番号：32；ここでC6は、ウリジンの塩基成分に結合したC6リンカーアームを意味し、そしてG6は、ウリジンの塩基成分に結合したG6リンカーアームを意味する）のアンチセンス配列を有する。追加の態様において、HESオリゴヌクレオチドはVP35に結合し、そして5'-GCGACAUCUUCUGUGAUAUUG-3'（配列番号：33）及び5'-AUAUCACAGAAGAUGUCGCUU-3'（配列番号：34）；5-CAUUACGAGUCU UGAGAAU-3'（配列番号：35）及び5'-UCUCAAGACUCGUAAUGCG-3'（配列番号：36）；5'-GCAACUCAUUGGACAUCAUUC-3'（配列番号：37）及び5'-AUGAUGUCCAAUGAGUUGCUA-3'（配列番号：38）；5'-UGAUGAAGAUUAAGAAAAA-3'（配列番号：39）及び5'-UUUCUUAAUCUUCAUCACU-3'（配列番号：40）；5'-GUGCUGAGAUGGUUGCAAA-3'（配列番号：41）及び5'-UGCAACCAUCUCAGCACAA-3'（配列番号：42）；5'-GCUAAUGACCGGAAGAAUU-3'（配列番号：43）及び5'-UUCUUCCGGUCAUUAGCUG-3'（配列番号：44）；並びに5'-CCAAUUAGUACAAGUGAU U-3'（配列番号：45）及び5'-UCACUUGUACUAAUUGGUG-3'（配列番号：46）から成る群から選択されるSiRNA/ダイサー（Dicer）配列対を有する。
【０４１９】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはNPに結合し、そして5'-6GAGAATCCATACTCGGAATT6-3'（配列番号：47）；5'-6GACGAGAATCCATACTCGGA6-3'（配列番号：48）；及び5'-6GCATGTACTTGAATTTGCC6-3'（配列番号：49）（ここで「６」は、ウリジンの塩基成分に結合したC6リンカーを意味する）から成る群から選択されるアンチセンス配列を有する。追加の態様にいて、HES−オリゴヌクレオチッドNPと結合し、そして5'-GGCAAAUUCAAGUACAUGCdTdT-3'（配列番号：50）及び5'-GCAUGUACUUGAAUUUGCCUU（配列番号：51）；5'-GCAUGGAGAGUAUGCUCCUUU-3'（配列番号：52）及び5'-AGGAGCAUACUCUCCAUGCUU（配列番号：63）；5'- ATGGTGATTTTCCGTTTGAT-3'（配列番号：54）及び5'-TCAAACGGAAAATCACCAT-3'（配列番号：55）；並びに5'-GAGAAGCAACTCCAACAAT-3'（配列番号：56）及び5'-UGUUGGAGUUGCUUCUC-3'（配列番号：47）から成る群から選択されるSiRNA/ダイサー（Dicer）配列対を有する。
【０４２０】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはRNAポリメラーゼＬに結合し、そして5'-6TGGGTATGTTGTGTAGCCAT6-3'（配列番号：58）のアンチセンス配列を有し；追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはRNAポリメラーゼＬと結合し、そして5'-GUACGAAGCUGUAUAUAAAUU-3'（配列番号：59）及び5'-UUUAUAUACAGCUUCGUACUU-3'（配列番号：60）から成る群から選択されるSiRNA/ダイサー（Dicer）配列対を有する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはVP24に結合し、そして5'-6GCCATGGTTTTTTCTCAGG6-3'（配列番号：61）のアンチセンス配列を有する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはVP24に結合し、そして5'-GCUGAUUGACCAGUCUUUGAU-3'（配列番号：62）及び5'-CAAAGACUGGUCAAUCAGCUG-3'（配列番号：63）；5'-ACGGAUUGUUGAGCAGUAUUG-3'（配列番号：64）及び5'-AUACUGCUCAACAAUCCGUUG-3'（配列番号：65）；並びに5'-UCCUCGACACGAAUGCAAAGU-3'（配列番号：66）及び5'-UUUGCAUUCGUGUCGAGGAUC-3'（配列番号：67）から成る群から選択されるSiRNA/ダイサー（Dicer）配列対を有する。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオロ後ヌクレオチドの１つと競争すする。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２１】
１つの態様において、本発明は、フラビビリダエ（Flaviviridae）科のメンバーの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５のRNA配列に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、フラビビリダエ（Flaviviridae）（例えば、ウエストナイル熱、黄熱病、日本脳炎、及びデングウイルス）ウイルス感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、ウイルスゲノムの５'又は３'領域中の高度に保存された非−コード領域、又はエンベロープコード遺伝子（Ｅ）に対応する配列に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２２】
１つの態様において、本発明は、アレノビリダエ（Arenavirideae）の科のメンバーの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の配列に特的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、アレノビリダエ（Arenavirideae）（例えば、ラッサ（Lassa）、ジュニン（Junin）、及びマチュポ（Machupo）ウイルス）科のウイルス感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、Ｚ蛋白質（亜鉛−結合蛋白質）、Ｌ蛋白質（ウイルスポリメラーゼ）又はGPC（糖蛋白質前駆体）蛋白質をコードする５'又は３'ウイルスmRNA転写物中の高度に保存された非−コード配列に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２３】
１つの態様において、本発明は、SARS Co-V科の核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それ必要とする患者に全身的に投与することによる、SARS−関連コロナウイルス（SARS Co-V）感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、レプリカse遺伝子（orf la/lb）、orf lbリボゾームフレームシフトポイント、転写制御配列（TRS）の５'−非翻訳領域（UTR）、TRS配列の３'UTR、スパイク蛋白質コード領域及び／又はNSP12領域に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２４】
１つの態様において、本発明は、レトロビリダエ（Retroviridae）科のメンバーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５のRNA配列に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、レトロビリダエ（Retroviridae）（例えば、HIVウイルス）科のウイルス感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、gag、pol、int、及びVpu領域の高度に保存された領域に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２５】
１つの態様において、本発明は、インフルエンザRNA配列の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、インフルエンザＡ（例えば、HlNl、H3N2及びH5N1）感染、又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、当該ウイルスのNP及びPA核酸配列に結合する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、当該ウイルスの、NP、M2、及び／又はPB2（例えば、PA、PB 1、PB2及びNPのAUG開始コドンを標的とする）、又はNP末端領域、NS1 及び／又はPA核酸配列に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２６】
１つの態様において、本発明は、インフルエンザウイルス感染又は当該感染に関連する１若しくは複数の状態を治療する方法を提供し、この方法は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９又はすくなうとも10のインフルエンザRNA配列に結合するHES−オリゴヌクレオチドを、必要とする患者に投与することによる。
【０４２７】
特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、NPオリゴヌクレオチド5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAG-3'（配列番号：68）及び5'-CUCCGAAGAAAUAAGAUCC-3'（配列番号：69）；PAオリゴヌクレオチド5'-GCAAUUGAGGAGUGCCUGA-3'（配列番号：70）及び5'-UCAGCGACUCCUCAAUUGC-3'（配列番号：71）；PB1オリゴヌクレオチド5'-GAUCUGUUCCACCAUUGAA-3'（配列番号：72）及び5'-UUCAAUGGUGGAACAGAUC-3'（配列番号：73）；並びにM2オリゴヌクレオチド5'-ACAGCAGAAUGCUGUGGAU-3'（配列番号：74）及び5'-AUCCACAGCAUUCUGCUGU-3'（配列番号：75）から成る群から選択されるSiRNA/ダイサー（Dicer）配列対を有する。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドの１又は複数はアンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２８】
追加の態様において、本発明は、アルファウイルスRNA配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５に特異的にハイブリダイズするHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、アルファウイルス（ウマ脳炎ウイルス（VEEV））の感染、又は当該アルファウイルス感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、当該ウイルスのNP及びPA核酸配列に結合する。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、当該ウイルスの、nspl、nsp4及び／又はEl RNA配列に結合する。更なる態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、PMO又はPPMOである。追加の態様において、１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、アンチセンス、siRNA又はshRNAである。
【０４２９】
幾つかの態様において、本発明は、細菌感染、又は細菌感染に関連する１若しくは複数の状態を処理する方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、細菌感染を有するか又はその危険性を有する）に、本発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を全身的に投与することを含んでなる。任意のタイプの細菌感染、或いはそれから生ずる、又は細菌感染に関連する状態を、本発明の組成物又は方法を用いて処理することができる。
【０４３０】
特定の態様において、本発明の方法に従って処理される細菌感染又は状態は、次の細菌属のメンバーと関連する：サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クラミジア（Chlamydia）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イエルシニア（Yersinia）、ボルダテラ（Bordatella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ナイセリア（Neisseria）、シゲラ（Shigella）、クラミジア（Clamydia）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イエシニア（Yesinia）、トレポネマ（Treponema）、コキシエラ（Coxiella）、エルリヒア（Ehrlichia）、ブルセラ（Brucella）、ストレプトバシルス（Streptobacillus）、フソスピロケタ（Fusospirocheta）、スピリルム（Spirillum）、ウレアプラズマ（Ureaplasma）、スピロカエタ（Spirochaeta）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、アクチノミセテス（Actinomycetes）、ボレリア（Borrelia）、バクテロイデス（Bacteroides）、トリコモラス（Trichomoras）、ブランハメラ（Branhamella）、パステウレラ（Pasteurella）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リステリア（Listeria）、バシルス（Bacillus）、エリシペロトリクス（Erysipelothrix）、ロドコッカス（Rhodococcus）、エシェリシア（Escherichia）、クレブシラ（Klebsiella）、シュードモナス（Pseudomanas）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、レジオネラ（Legionella）、マイコバクエリウム（Mycobacterium）、プロテウス（Proteus）、カンピロバクター（Campylobacter）、エンテロコッカス（Enterococcus）、アシノトバクター（Acinetobacier）、モルガネラ（Morganella）、モラキセラ（Moraxella）、シトロバクター（Citrobacter）、リケットシア（Rickettsia）及びラクリメアエ（Rochlimeae）。
【０４３１】
更なる態様において、本発明の方法に従って処理される細菌感染又は状態は、下記から選択される細菌属のメンバーと関連する：Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、大腸菌（E, coli）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）、Ｓ．エピデルミス（S. epidermis）、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）、Ｓ．ニューモニアス（S. pneumonias）、Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｎ．メニンギチディス（N. meningitidis）、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）、パステウレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、トレポネマ・パリズム（Treponema pallidum）、及びＰ．ミラビリス（P. mirabilis）。幾つかの態様において、細菌感染は細胞内細菌感染である。
【０４３２】
追加の態様において、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の細菌の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の核酸配列に特異的にハイブリダイズする療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、細菌感染、又は細菌感染と関連する１若しくは複数の状態の処理方法を提供する。追加の態様において、本発明は、菌類感染、又は菌類感染と関連する１若しくは複数の状態の処理方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、菌類感染を有するか又はその可能性を有する）に、療法的有効量の１又は複数の本発明のHES−オリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる。任意のタイプの菌類感染、又は菌類感染から生ずる又はそれに関連する状態が、本発明の組成物又は方法を用いて処理することができる。
【０４３３】
特定の態様において、本発明の方法に従って処理される菌類感染又は状態は、次のものから選択される菌類に関連する：クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）、ブラストミセス・デルマチチディス（Blastomyces dermatitidis）、アイエロミセス・デルマチチディス（Aiellomyces dermatitidis）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、カンジダ・スペーシス（Candida species）、例えば、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）、Ｃ．トロピカリス（C. tropicalis）、Ｃ．パラプシロシス（C. parapsilosis）、Ｃ．グイリエルモンディイ（C. guilliermondii）及びＣ．クルセイ（C. krusei）、アスペルギルス・スぺーシス（Aspergillus species）、例えば、Ａ．フミガツス（A. fumigatus）、Ａ．フラブス（A. flavus）及びＡ．ニガー（A. niger）、リゾプス・スペーシス（Rhizopus species）、リゾムコール・スペーシス（Rhizomucor species）、クニンガメラ・スペーシス（Cunninghammella species）、アポフィソミセス・スペーシス（Apophysomyces species）、例えばＡ．サクセナエア（A. saksenaea）、Ａ．ムコール（A. mucor）及びＡ．アブシディア（A. absidia）、スポロトリクス・シェンキー（Sporothrix schenckii）、パラコクシディオイデス・ブラシディオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）、シュードアレセへリア・ボイディー（Pseudalleseheria boydii）、トルロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）、トリコフィトム・スペーシス（Trichophyton species）、ミクロポルム・スペーシス（Microsporum species）及びデルマトフィレス・スペーシス（Dermatophyres species）、又は病原性であることが知られており又は同定されている他の任意の菌類（例えば、酵母）。
【０４３４】
追加の態様において、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の菌類の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の核酸配列に特異的にハイブリダイズする療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に全身的に投与することによる、菌類感染、又は菌類感染と関連する状態の処理方法を提供する。
【０４３５】
追加の態様において、本発明は、寄生体感染、又は寄生体感染と関連する１若しくは複数の状態の処理方法を提供し、当該方法は、それを必要とする対象（すなわち、寄生体感染を有するか又はその可能性を有する）に、療法的有効量の１又は複数の本発明のHES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することを含んでなる。任意のタイプの寄生体感染、又は寄生体感染から生ずる又はそれに関連する状態が、本発明の組成物又は方法を用いて処理することができる。
【０４３６】
特定の態様において、本発明の方法に従って処理される寄生体感染又は状態は、次のものから選択される寄生体に関連する：アピコムプレキサ・フィルム（Apicomplexa phylum）のメンバー、例えば、バベシア（Babesia）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、プラスモジウム（Plasmodium）、アイメリア（Eimeria）、イソスポラ（Isospora）、アトキソプラズマ（Atoxoplasma）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、ハンモンジア（Hammondia）、ベスニオチア（Besniotia）、サルコシスチス（Sarcocystis）、フレンケリア（Frenkelia）、ヘモプロテウス（Haemoproteus）、ロイコシトゾーン（Leucocytozoon）、テイレリア（Theileria）、ペルキンスス（Perkinsus）又はグレガリナ（Gregarina）のスペーシス；ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis carinii）；ミクロスポラ・フィルム（Microspora phylum）のメンバー、例えばノセマ（Nosema）、エンテロシトゾーン（Enterocytozoon）、エンケファリトゾーン（Encephalitozoon）、セプタタ（Septata）、ムラゼキア（Mrazekia）、アムブリオスポラ（Amblyospora）、アルネソン（Arneson）、グルゲア（Glugea）、プレイシトフォラ（Pleistophora）及びミクロスポリジウム（Microsporidium）のスペーシス；並びにアスセトスポラ・フィルム（Ascetospora phylum）、例えば、ハプロスポリジウム・スペーシス（Haplosporidium spp）。
【０４３７】
更なる態様において、本発明の方法に従って処理される寄生体感染又は状態は、次のものから選択される寄生体のスペーシスに関連する：プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、Ｐ．ビバクス（P. vivax）、Ｐ．オバレ（P. ovale）、Ｐ．マラリア（P. malaria）；トキソプラズマ・ゴンジー（Toxoplasma gondii）；レイシュマニア・メキシカナ（Leishmania mexicana）、Ｌ．トロピカ（L. tropica）、Ｌ．マジョル（L. major）、Ｌ．アエチオピカ（L. aethiopica）、Ｌ．ドノバニ（L. donovani）、トリパノソマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、Ｔ．ブルセイ（T brucei）、シストソマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）、Ｓ．ヘマトビウム（S. haematobium）、Ｓ．ジャポニウム（S. japonium）；トリチネラ・スピラリス（Trichinella spiralis）；ウチェレリア・バンクロフチ（Wuchereria bancrofti）；ブルギア・マライリ（Brugia malayli）；エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）；エンテロビウス・ベリミクロアルス（Enterobius vermiculoarus）；タエニア・ソリウム（Taenia solium）、Ｔ．サギナタ（T. saginata）、トリコモナス・バギナチス（Trichomonas vaginatis）、Ｔ．ホミニス（T. hominis）、Ｔ．テナクス（T. tenax）；ギアルジア・ラムブリア（Giardia lamblia）；クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）；ニューモシチス・カリニー（Pneumocytis carinii）、バベシア・ボビス（Babesia bovis）、Ｂ．ジベルゲンス（B. divergens）、Ｂ．ミクロチ（B. microti）、イソスポラ・ベリ（Isospora belli）、Ｌ．ホミニス（L. hominis）；ジアンタモエバ・フラギリス（Dientamoeba fragilis）；オンコセリカ・ボルブルス（Onchocerca volvulus）；アスカリス・ルムブリコイデス（Ascaris lumbricoides）；ネカトル・アメリカニス（Necator americanis）；アンシロストマ・ヅオレナレ（Ancylostoma duodenale）；ストロンギロイデス・ステルコラリス（Strongyloides stercoralis）；カピラリア・フィリピネンシス（Capillaria philippinensis）；アンギオストロンギルス・カントネンシス（Angiostrongylus cantonensis）；ヒメノレピス・ナナ（Hymenolepis nana）；ヂフィロボスリウム・ラツム（Diphyllobothrium latum）；エキノコッカス・グラヌロスス（Echinococcus granulosus）、Ｅ．マルチロクラリス（E. multilocularis）；パラゴニムス・ウエスターマニ（Paragonimus westermani）、Ｐ．カリエンシス（P. caliensis）；クロのルチス・シネンシス（Chlonorchis sinensis）；オピストルチス・フェリネアス（Opisthorchis felineas）、Ｇ．ビベリニ（G. Viverini）、ファッシオラ・ヘパチカ（Fasciola hepatica）、サルコプテス・スカビエイ（Sarcoptes scabiei）、ペジクルス・フマヌス（Pediculus humanus）；フシルルス・プビス（Phthirlus pubis）；及びデルマトビア・ホミニス（Dermatobia hominis）、並びに病原性であることが知られているか又は同定されている他の任意の寄生体。
【０４３８】
追加の態様において、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の寄生体の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも５の核酸配列に特異的にハイブリダイズする療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを、必要とする患者に全身的に投与することによる、寄生体感染、又は寄生体感染と関連する１若しくは複数の状態の処理方法を提供する。
【０４３９】
他の態様において、本発明は、現在使用されているか、使用されていたか、又はウイルス感染又はウイルス感染と関連する状態の処理のために有用であることが知られている１又は複数の療法、例えば限定的ではないが抗ウイルス剤、例えばアマンタジン（amantadine）、オセルタミビル（oseltamivir）、リバビラン（ribaviran）パリビツマブ（palivizumab）、及びアナミビル（anamivir）との組合せにおいて、本発明のHES−オリゴヌクレオチドを投与することによる、ウイルス感染、又はウイルス感染と関連する１又は複数の状態の処理の方法を提供する。或る態様において、療法的有効量の本発明の１又は複数のHES−オリゴヌクレオチドは、１又は複数の抗ウイルス剤、例えば限定的ではないが、アマンタジン（amantadine）、リマンタジン（rimantadine）、オセルタミビル（oseltamivir）、ツンアミビル（znamivir）、リバビラン（ribaviran）、RSV-IVIG（すなわち、静脈内免疫グロブリン注入）（RESPIGAM(TM)）、及びパリビツマブ（palivizumab）と組み合わせて投与される。
【０４４０】
幾つかの態様において、本発明は、呼吸系疾患、又は呼吸系疾患と関連する１若しくは複数の状態の処理方法を提供し、当該方法は、必要とする対象（すなわち、呼吸系疾患を有するか又はその可能性を有する）に、療法的有効量の１又は複数の本発明のHES−オリゴヌクレオチドを全身的に投与することを含んでなる。用語「呼吸系疾患」は、本明細書で使用される場合、呼吸に関する器官、例えば、鼻、喉、喉頭、気管、気管支、及び肺に影響を与える疾患を意味する。本発明の方法により処理することができる呼吸系疾患には、喘息、成人呼吸窮迫症候群及びアレルギー性（外因性）喘息、非−アレルギー性（内因性）喘息、急性重症喘息、慢性喘息、臨床喘息、夜間喘息、アレルゲン誘発喘息、アスピリン感受性喘息、運動誘発喘息、等炭酸ガス性呼吸過多、小児気管支喘息、成人気管支喘息、咳喘息、職業喘息、ステロイド耐性喘息、季節性喘息、季節性アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、例えば慢性気管支炎又は肺気腫、肺高血圧、間質性肺線維症及び／又は気道炎症、及び嚢胞性線維症、及び低酸素症が含まれるが、これ等に限定されない。
【０４４１】
幾つかの態様において、本発明は、療法的に有効な量のHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含んでなる、呼吸器疾患又は呼吸器疾患と関連する１若しくは複数の状態を処理する方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、STK、RSVヌクレオカプシド、Akt1、WT1、IGF-1R、NUPR、PKN3、PI3K、NFKb、MMP-12、VEGF、CCR1、CCR3、IL8R、IL4R、カスパーゼ３、IKK2、Syk、Lyn、STAT1、STAT6、GATA3、EZH2、let7、miR-34、miR-29、miR-223/1274a、miR1、miR-146a、miR-150、miR-21、miR-126、miR-155、miR-133a、let7d、miR-29、miR-200、miR-10a、miR-34、miR-123、miR-145、miR-150、miR-199b、miR-218及びmiR-222から選択される核酸に結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【０４４２】
幾つかの態様において、エキセラー（Exellair）（Sykキナーゼ）及びALN-RSV01（RSVヌクレオカプシド）から選択されるオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、代謝異常を処理する方法に向けられる。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４４３】
幾つかの態様において、本発明は、神経学的状態又は障害の処理方法を提供し、当該方法は、必要とする対象（すなわち、神経学的状態又は障害を有するか又はその可能性を有する）に、療法的有効量の１又は複数の本発明のHES−オリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる。用語「神経学的状態又は障害」は、本明細書において、神経変性状態、中枢又は末梢神経系の機能不全により、又は神経細胞又は組織の壊死及び／又はアポトシスにより特徴付けられる神経細胞又は組織の障害、及び栄養因子欠損に関連する神経細胞又は組織の損傷を含む状態を意味して使用される。
【０４４４】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドを用いて処理することができる神経変性性疾患の例には、家族性及び特発性筋萎縮性側索硬化症（それぞれ、FALS及びALS）家族性及び特発性パーキンソン病、ハンチントン病（ハンチントン舞踏病）、家族性及び特発性アルツハイマー病、脊髄性筋萎縮症（SMA）、視神経症、例えば、網膜変性を含む緑内障又は関連疾患、糖尿病性神経症、又は黄斑変性、内耳知覚細胞又はニューロンの変性による難聴、てんかん、ベル麻痺（Bell's palsy）、染色体17にリンクするパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症（FTDP-17）、多発性硬化症、びまん性皮質性小脳委縮症、レビー小体型認知症、ピック病、トリプレット病（trinucleotide repeat disease）、プリオン病、及びシャイ−ドレーガー（Shy-Drager）症候群が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４５】
本発明のHES−オリゴヌクレオチドを用いて処理することができる神経細胞又は組織の障害の例には、鈍的又は外科手術による外傷の後に見られる急性の又は非−急性の障害（術後認知機能障害及び脊髄及び脳幹の損傷を含む）及び血流を制限する（一過性又は永続性）虚血状態、例えば、全脳又は局所脳虚血（発作）に関連するもの；例えば脳組織又は脊髄への切開又は切断；神経組織における病変又はプラック（placque）；細胞の成長又は生存に必要な栄養因子の欠乏；及び神経毒、例えば化学療法剤への曝露；並びに偶発的ないし他の疾患状態、例えば慢性代謝性疾患、例えば糖尿病及び腎不全が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４６】
幾つかの態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、神経学的状態又は障害を処理する方法に向けられる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体はDMD核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、AVI-4658（Dystrophin (エキソンスキッピングAVI Biopharma）、ISIS-SMN Rx（SMN; ISIS/ Biogen Idee）、AVI-5126（CABG; AVI Biopharma）及びATL1102（VLA-4 (CD49d); ISIS/Antisense Therapeutics Ltd）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドはエテプリルセン（Eteplirsen）又はドリサペルセン（Drisapersen）を含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４４７】
幾つかの態様において、本発明は、療法的有効量のHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与することを含んでなる代謝障害の処理方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、FGFR4、GCC、PTP1VB、DME、TTR、PTPN1、DGAT及びAATから選択される核酸に結合するオリゴヌクレオチドを含む。
【０４４８】
追加の態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、代謝障害を処理する方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ISIS-FGFR4（FGFR4; ISIS）、ISIS-GCCR RX（GCC; ISIS）、ISIS-GCGR RX（GCG; ISIS）、ISIS- PTP1B（PTP1VB; ISIS（5'-GCTCCTTCCACTGATCCTGC-3')(配列番号：76)）、iCo-007（c-Raf; Isis/iCo Therapeutics Inc(5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3')(配列番号：6))、ISIS-DGATRX（DGAT; ISIS）、PF-04523655（DME, Silence Thera/Pfizer/Quark）、ISIS-TTR Rx（TTR: ISIS/GSK）、ISIS-AAT Rx（AAT: ISIS/GSK）、ALN-TTRsc（Transerythrin; Alnylam）、ALN-TTR01（Transerythrin; Alnylam）、及びALN-TTR02（Transerythrin; Alnylam）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４４９】
幾つかの態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチドの療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、疾患を処理する方法に向けられる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、GHr、CTGF及びPKN3から選択される標的核酸に結合するおりごヌクレオチドを含む。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ATL1103-GHr Rx（GHr; ISIS/Antisense Therapeutics Ltd）、EXC 001（CTGF; ISIS/Excaliard）、及びAtul11（PKN3; Silence Thera）から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４５０】
上記のことに加えて、本発明のHES−オリゴヌクレオチドは、限定的ではないが、代謝性疾患又は障害（例えば、糖尿病、肥満、高コレステロール、高トリグリセリド）の処理において、骨格系の疾患又は障害（例えば、骨粗鬆症及び骨関節炎）の処理において、心臓血管系の疾患及び障害（例えば、発作、心臓疾患、アテローム性動脈硬化、再狭窄、血栓、貧血、白血球減少症、好中球減少症、血小板減少症、顆粒球減少症、汎血球減少症、又は特発性血小板減少性紫斑病）の処理において、腎臓（例えば、腎障害）、膵臓（例えば、膵炎）、皮膚及び眼（例えば、結膜炎、網膜炎、強膜炎、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、春季結膜炎、乳頭性結膜炎、緑内障、網膜症、及び眼虚血状態、例えば前部乏血性視神経症、加齢黄斑変性（AMD）、虚血性視神経症（ION）、眼球乾燥症候群）の疾患及び障害の処理において、器官移植拒絶（例えば、肺、肝臓、心臓、膵臓、及び腎臓移植）の予防において用途を有し、そして再生医療（例えば、加齢の相殺において、創傷治癒の促進、及び骨、コラーゲン、組織及び器官の成長及び修復において）における用途を有する。
【０４５１】
幾つかの態様において、本発明は、p53、カスパーゼ２、ケラチン6a、アドレナリン受容体β２、VEGFR1、RTP801、ApoB及びVEGFから選択される標的核酸に結合するおりごヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量を対象に投与することを含んでなる、疾患の処置の方法に向けられる。特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、TKM-ApoB(ApoB)、I5NP(p53)、QPI-1007 (カスパーゼ２)、TD101 (ケラチン6a)、SYL040012 (アドレナリン受容体β２)、AGN-745 (VEGFR1)、PF-655 (RTP801)、及びべバシラニブ(VEGF)から選択されるオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的結合について、上記のオリゴヌクレオチドの１つと競争する。
【０４５２】
種々の態様において、本発明は、対象においてイン−ビボで、又はエクス−ビボで、細胞中の標的核酸又は蛋白質の調節において使用するための組成物を提供する。本発明のHES−オリゴヌクレオチド組成物は、例えば、イン−ビボ又はエクス−ビボで、対象における核酸又は蛋白質の過剰発現、過小発現、及び／又は異常発現により特徴付けられる疾患又は障害の処理において用途を有する。感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経学的疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害の処理における本発明の組成物の使用もまた本発明に含まれる。特定の観点において、本発明の組成物は転移を処理するために使用される。
【０４５３】
当業者に即座に明らかなとおり、本発明のHES−オリゴヌクレオチドの例示的療法的、及びコンパニオン診断的用途は、本質的に無制限である。本明細書において、本発明のHES−オリゴヌクレチドの組成物の例示的な診断的及び療法的用途が提供される。しかしながら、本明細書中の記載は限定的であることを意味せず、そしてHES−オリゴヌクレオチドは、細胞及び／又は生物において、核酸配列を検出し、或いは１又は複数の核酸又は関連する蛋白質のレベルを調節することが望まれるあらゆる状況において用途を有することは予想される。
【０４５４】
複数のHES−オリゴヌクレチド
幾つかの態様において、本発明の医薬組成物は、異なるオリゴヌクレオチド配列を有する、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも10の異なるHES−オリゴヌクレオチド複合体の組み合わせを含んでなる。幾つかの態様において、医薬組成物は、２〜15、２〜10、又は２〜５の間の異なるHES−オリゴヌクレオチド複合体を含む。幾つかの態様において、複合体中の少なくとも２又は少なくとも３の異なるオリゴヌクレヲチドは、同じポリペプチドに対応するDNA及び／又はmRNAに特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、複合体中の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも10の異なるオリゴヌクレオチドは、異なるポリペプチドに対応するDNA及び／又はmRNAに特異的にハイブリダイズする。幾つかの態様において、医薬組成物は、異なるポリペプチドに特異的にハイブリダイズする２〜15、２〜10、又は２〜５の間のオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、１又は複数の異なるHES−オリゴヌクレオチドが同時に対象に投与される。他の態様において、１又は複数の異なるHES−オリゴヌクレオチドが別々に対象に投与される。
【０４５５】
或る態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、１又は複数の追加の剤と同時投与される。或る態様において、このような追加の剤は、HES−オリゴヌクレオチド複合体とは異なる疾患、障害又は状態を処理するために設計される。幾つかの態様において、追加の剤は、複合体の不所望の効果を処理するために、HES−オリゴヌクレオチド複合体と同時投与される。追加の態様において、追加の剤は、組合せ効果を生成するために、HES−オリゴヌクレオチド複合体と同時投与される。更なる態様において、追加の剤は、相乗効果を生成するために、HES−オリゴヌクレオチド複合体と同時投与される。或る態様において、追加の剤は、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体の不所望の効果を処理するために投与される。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、追加の剤と同時に投与される。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド及び追加の剤は、単一の医薬製剤中に一緒に調製される。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド及び追加の剤は、別々に調製される。更なる態様において、追加の剤は、HES−オリゴヌクレオチド複合体とは異なる時間に投与される。
【０４５６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形の事項は、特に断らない限り、複数事項も含む。したがって、例えば、「方法」と称する場合、１又は複数の方法及び／又はそこに記載されているタイプの工程を含み、そして／又はこのことは、この開示を読んだ当業者にとって明かであろう。更に、用語「細胞」は、天然において不均一でも均一でもよい細胞集団として理解することができ、そしてまた細胞の集合体を意味することもできる。更に、本発明の限定のそれぞれは、発明の種々の態様を含むことができる。したがって、任意の１つの要素又は要素の組み合わせを含む本発明の限定のそれぞれは、本発明の各態様に含まれ得ると理解される。
【０４５７】
上記の詳細な記載、及びこの後の実施例は、単に例示的なものであり、そして発明の範囲の限定として取られるべきではないと理解される。当業者にとって明かであろう開示される態様の変更又は修飾は、本発明の本質及び範囲を逸脱することなく行われるであろう。
【０４５８】
米国特許出願第61/630,446号及び61/834,383並びに国際出願PCT/US2012/069294のそれぞれの開示を引用により、本明細書に組み入れる。更に、引用されるすべての公表、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセス番号／データベース配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の両方を含む）は、あたかも個々の公表、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセス番号／データベース配列が具体的に且つ個別に引用されるのと同様に、引用により本明細書に組み入れる。これらの公表は、本出願の出願日前の開示についてのみ提供される。先行発明により、又は他の理由のために、発明者がこのような開示を採用する権利を有しない旨の自認と解してはならない。日付についての全ての宣言又はこれらの文献の内容についての表現は、出願人が入手可能な情報に基づいており、そしてこれらの文献の日付及び内容の正しさについての何らの自認を構成するものではない。
【実施例】
【０４５９】
次の実施例は、例示を提供するものであって、特許請求された発明を限定するものではなく、次のことを明確にしめす：（１）HESの存在が、生きた生物において毒性を伴わないで、生きた細胞の内部でのオリゴヌクレオチドの送達を可能にすること、（２）２本鎖RNA中のHESの形成、（３）エンドヌクレアーセダイサー（Dicer）による２本鎖RNA（dsRNA）のプロセシングの、HESによる阻害の不存在、及び（４）Ｈ−型励起構造を含むdsRNAによる遺伝子のノックダウン。
【０４６０】
実施例１． Ｈ−型励起構造を含むオリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達
オリゴヌクレオチドが、生きた生物において毒性を伴わないで、生きた細胞内で送達されうることを示すため、β−アクチン（CCCGGCGATATCATCATCCATAAC (配列番号：１）（Sokol et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11538-43 (1998)）に相補的な24核酸の配列を含むDNAの鎖を合成し、そして当該鎖の両端を、フルオロフォア（N-エチル-N'-[5-(N"-サクシンイミジルオキシカルボニル)ペンチル]-3,3,3',3',-テトラメチル-2,2'-インドジカルボシアニンクロリド）により、共有結合で標識した。標識されたオリゴヌクレオチドを、逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製し、そして凍結乾燥した。オリゴヌクレオチド中の分子内HESの存在を、吸収スペクトル及び蛍光測定法により確認した。すべての測定は、標識されたオリゴヌクレオチドは容易に溶けるリン酸緩衝液（PBS）中で行なった。
【０４６１】
PBS中５μモルの濃度の標識されたオリゴヌクレオチド200μLの体積を、６週齢のC57BL/6マウス（464μg／kg）に尾静脈に注射した。18時間後、マウスを頸椎脱臼により殺し、即座に血液を心臓から採取し、そして脾臓を摘出した。血液をPBSにより希釈し、ハイパク−フィコル（Hypaque-Ficoll）上に付加し、そして1300rpmにて30分間遠心分離した。ハイパク−フィコルとPBSとの界面にある細胞を集め、PBSで洗浄し、＃０ホウケイ酸ガラス表面上Mattekガラス底マイクロウエル皿（P35G-0-10-C）中の置き、沈澱させ（約10分間）、そして次にライカDMIRE2共焦点顕微鏡により画像化した。平行して、注射器の末端を切除した器官に当てることにより、脾臓からのシングルセル懸濁液を作り、そして次に懸濁液をすり潰した。次に、PBS中の脾細胞を、同体積のACK細胞溶解緩衝液に３分間暴露し、更にPBSで希釈し、そして遠心分離した。次に、ペレット中の細胞をPBSに再懸濁し、Mattekガラス底マイクロウエル皿（P35G-0-10-C）中の置き、沈澱させ（約10分間）、そして最後に共焦点顕微鏡により画像化した。
【０４６２】
血液及び脾細胞の画像化は、蛍光及び明視野（微分干渉顕微鏡（DIC））チャンネルの両方における１ミクロンセクションの一連のスタックを入手することにより行った。各チャンネルのセクションを重ねることにより凝縮スタックを生成し、次に蛍光及びDICチャンネルからの凝縮画像を重ねることにより画像を再構成した。
【０４６３】
画像が示すところによれば、DIC画像に重ねられた蛍光チャンネルは、すべての脾細胞及び血液細胞がHES−含有オリゴヌクレオチドを取り上げたことを示した。生きた細胞内のオリゴヌクレオチドの存在は、各１ミクロンセクションの試験により確認された。特にDIC画像からも明らかなとおり、血液及び脾臓の両方からの細胞は健常であった。これらの同じサンプルにおいて、細胞によるトリパンブルー及びヨウ化プロピジオムの取込みが存在しないことにより更に確認された点である。
【０４６４】
更に、このオリゴヌクレオチドがその５'及び３'の両末端でフルオロポアと接合する場合、オリゴヌクレオチドバックボーンは拘束されループ形態を形成し、末端残基は非常に接近する。この誘導された形態はHESの存在による。このループ形態のはオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ感受性を有意に減少させる。この増強されたヌクレアーゼ耐性は、このHES担持オリゴヌクレオチドの37℃でのDNアーゼによる消化の速度をリアルタイムでモニターすることにより確認されている。すなわち、このヌクレアーゼ抵抗性が、尾部静脈注射後のインビボでのこのHES−βアクチンオリゴヌクレオチドの全身的送達を助けた。この結果は、リンパ性脾臓細胞の如き造血細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の困難性がよく知られているため、特に驚くべきものであった。
【０４６５】
オリゴヌクレオチドの効果的な全身性送達には、その生物的活性のために最大時間が得られるように、血漿に対して耐性でありその中で安定である送達カーゴ、すなわちオリゴヌクレオチドが必要である。追加の好ましい性質は、細胞取込みが、同じ環境、例えば血漿、生物流体、例えば脊椎液、又はサイトゾル、及び核環境において、その分解に較べて相対的に早いことである。最後に、HES−オリゴヌクレオチドは、細網内皮系（RES）の細胞内に捕捉されるのではなく組織浸透が細大になるように、ナノ粒子様サイズに凝集せず、溶液中に分子状に単分散される。
【０４６６】
実施例２． Ｈ−型励起構造を含むオリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達の定量
生きた生物内で毒性を伴わないで、生きた細胞内でのオリゴヌクレオチドのイン−ビボ送達を定量するため、実施例３に記載するようにしてダイサー（Dicer）基質を調製した。対象マウス（標準的、トランスフェクトされていないBALB/C系）において相補的対合が起こらないように、ダイサー（Dicer）基質の配列、すなわちeGFPについてのセンス鎖及びアンチセンス鎖（Kim et al. Nature Biotech. 22:321-5 (2004)）を選択した。２重標識され、凍結乾燥されたdsRNAをリン酸緩衝液（PBS）中に溶解した。オリゴヌクレオチド中分子間HESの存在は、吸収スペクトル及び蛍光測定により確認した。
【０４６７】
PBS中５μモル又は10μモルの濃度の標識されたオリゴヌクレオチドの200μL体積を、それぞれ10〜12週齢のBALB/Cマウス（0.75又は1.5μg／kg）の尾静脈に注射した。３時間後、各マウスの心臓から、ヘパリンの存在下で血液を採取した。血液をPBSにより希釈し、ハイパク−フィコル（Hypaque-Ficoll）上に付加し、そして1300rpmにて30分間遠心分離した。ハイパク−フィコルとPBSとの界面にある細胞を集め、各細胞の蛍光を、サイテック（Cytek）改変ベクトンデイッキンソンカリバー（Becton-Dickinson Caliber）フローサイトメーターにより測定した。
【０４６８】
図１パネルＣは、200μLの緩衝液（PBS）又はダイサー基質（27ヌクレオチド長の平滑eGFP２本鎖）を注射した後にマウスから分離した血液細胞にヒストグラムを示す。図１ａにおいて、PBS又はダイサー基質（1.5mg／kg）の１回のip注射の後に採取された細胞からの蛍光が、ヒストグラムの形で示される。PBSの注射を受けた動物の細胞からの蛍光に比べての、ダイサー基質に曝露された細胞における約２桁の蛍光強度の増加は、ダイサー基質の有意な取込みを示す。更に、両群の光散乱特性は高度に生存性の細胞を示す。
【０４６９】
図１ｂにおいて、ヒストグラムは、PBS、1.5mg／kgの濃度におけるダイサー基質、又は0.75mg／kgの濃度におけるダイサー基質のiv注射後３時間に採取された細胞の蛍光を示す。ip経路の場合と同様に、何れの投与量においてもダイサー基質を投与された、iv−注射された動物からの細胞はまた、PBS動物からの細胞に比べて、細胞当たり、蛍光強度の約２桁の増加を示し、高い方の濃度は、細胞当たり、僅かに高い平均強度をもたらした。そしてやはり、毒性の兆候は観察されなかった。
【０４７０】
パネルｃにおいて、ダイサー（Dicer）基質の１回ip投与の後種々の時点、すなわち１、３、５及び24時間後において分離された細胞からの蛍光をヒストグラム形式で示される。これらのデータは、対照動物からのヒストグラム（「ｔ＝０」と示される）の上に重ねられている。ダイサー基質に曝露された細胞における１，３及び５時間での約２logの蛍光強度の増加は、対照動物のそれに較べて、３時間における最大取り込み、及び24時間までの細胞内オリゴヌクレオチドの喪失を示した。すべての群の光散乱特性は、高度に生存性の細胞及びHES−担持オリゴヌクレオチドの毒性の欠如を示した。更に、24時間の動物からのシグナルの欠如はHES−オリゴヌクレオチドの非毒性代謝と一致する。
【０４７１】
図１Ｃは、iv注射後５時間においてさえ高度に維持された細胞内濃度を有するマウスにおけるiv注射後３時間でのHES−オリゴヌクレオチドを伴う血液細胞の最大細胞内濃度を示す。これらのデータは、（ａ）注射されたHES−オリゴヌクレオチドの血漿濃度の源が血液細胞であること、及び（ｂ）HES−オリゴヌクレオチドが種々の組織／器官の入る態様が受動拡散であることと一致する。HES−オリゴヌクレオチドが生存細胞に入ることができ又は生存細胞をそのままにしておくことができるメカニズムとしての受動拡散により、HES−オリゴヌクレオチドの位置を決定するのはHES−オリゴヌクレオチドの濃度勾配である。したがって、０〜３時間においてHES−オリゴヌクレオチドの細胞外濃度は細胞内に較べて高く、３時間より後には、インタクトな分子が細胞外に拡散し始めるであろう。すなわち、HES−オリゴヌクレオチドの腎臓を介してのクリアランスにより血漿濃度が低下する場合、インタクトなHES−オリゴヌクレオチドの細胞内環境から血漿への放出が存在する。
【０４７２】
すなわち、血液細胞は、裸のヌクレオチドについての10〜39分の血漿半減期の後に血漿濃度を維持する溜め（reservoir）として機能する。次に、予想外の血漿濃度PKプロファイルは、血漿安定性及び血漿蛋白質との結合を達成するための脂質ナノ粒子、コレステロール接合、ペプチド接合及び種々のヌクレオチドバックボーン修飾の如き常用の送達成分により修飾された常用のオリゴヌクレオチドに較べて、HES−オリゴヌクレオチドが如何に有意に異なるかを示す。（Jie Wang et al. AAPS Journal) 12:492-502 (2010)）。これは、しばしば使用されているものに較べて有意に単純な修飾である。（M. A. Colingwood et al., Oligonucleotides 18:187-200 (2008)を参照のこと）。
【０４７３】
インターロイキン−６（IL-6）及びインターフェロンα（IFα）の検出のため標準的ELISAアッセイが使用された別のインビトロ実験において、2-OMe及びHES成分により修飾された２個の末端残基を有する27/27残基長の平滑PBL２本鎖を含むダイサー（Dicer）基質により刺激されたヒトの新鮮なPBLは、バックグラウンドより高い検出可能なIL-6及びIFαを示さなかった。
【０４７４】
HESを形成する２個の異なるフルオロポアにより標識された、28ヌクレオチドのセンス鎖及び30ヌクレオチドのアンチセンス鎖から成るダイサー（Dicer）基質は、それが類似の全体集団変化（polulation shift）を伴う同じ送達時間枠においてマウスに注射された場合、血液細胞を負荷した（データは示されず）。
【０４７５】
実施例３． リアルタイムでの、分子内HESの形成
HESの形成は蛍光の消光と関連し、具体的には、蛍光は個々の成分フルオロポアのそれよりも低下する。したがって、HESの形成の過程を示すため、RNAの２つの相補的鎖、すなわちセンス鎖及びアンチセンス鎖（Kim et al. Nature Biotech. 22:321-5 (2004)）のそれぞれを、N-エチル-N'-[5-(N"-サクシンイミジルオキシカルボニル)ペンチル]-3,3,3',3',-テトラメチル-2,2'-インドジカルボシアニンクロリドにより標識し、そして次に一緒に加え、次に後者の溶液の蛍光強度を成分、すなわち単鎖のみ、のそれと比較した。
【０４７６】
２つの単一標識された鎖の蛍光スペクトルを、図２の左側に上方の２つのパネルに示す。各鎖の逆相HPLCにより測定された純度を、図２の右側の対応するパネルに示す。
【０４７７】
１データ／秒のデータ取得速度。中央セクションは先ず、時間（０〜約80秒）の関数としてのセンス溶液の蛍光強度、約7000カウント、を示す。アンチセンス溶液を添加するための80秒においてシャッターが閉じられた時、強度はゼロに落ちる。シャッターを再開した際、強度は約1100カウントで記録され、そしてセンス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される密接な複合体のため、このレベルに維持される。
【０４７８】
右側及び左側の最下パネルは、それぞれ、センス−アンチセンス複合体の放射スペクトル及びHPLCクロマトグラムを示す。
【０４７９】
実施例４． ダイサーによる、２本鎖センス−アンチセンスRNA複合体の認識
ダイサーは、２本鎖RNA（dsRNA）及びpreMiRNA（MiRNA）を、小さい障害RNA（siRNA）と称される２本鎖RNA断片に開裂させるエンドヌクレアーゼである。本発明の態様に１つはRNAのサイレンシングのためのオリゴヌクレオチドの送達であるので、HES−含有dsRNAがダイサーにより認識されそして開裂されることが必須である。したがって、２本鎖の末端にHESを含む実施例３に記載したdsRNAを、組換えダイサー（Recombinant Turbo Dicer Cat (# T520002) from Genlantis）に曝露した。試薬の提供者からの指示書における消化条件を使用して、dsRNA−含有溶液の蛍光を、前記のエンドヌクレアーゼを添加した後に測定した。
【０４８０】
HESにより、２つのダイサー基質を合成した。一方は未修飾のリボヌクレオチドの２つの鎖（25塩基及び27塩基）から構成され、第２は前記と同じ２本鎖で構成されたが、25ヌクレオチド鎖は末端で２つのＯ−メチル化さｓれたヌクレオチドにより延長された。末端Ｏ−メチル化は、血漿中の存在するエキソヌクレアーゼからオリゴヌクレオチドを保護することが示されている。図３に示されるように、両方のdsRNAの溶液の蛍光は、ダイサーの添加後、時間の関数として増加したので、このエンドヌクレアーゼによるプロセシングについての、HESの阻害の不存在が確認された。更に、Ｏ−メチル化を有するdsRNAは、僅かに低い消化速度を示し、この修飾の保護効果と一致した。
【０４８１】
実施例５． Ｈ−型励起構造を含むdsRNAによる遺伝子のノックダウン
Ｈ−型励起構造に連結されたオリゴヌクレオチドの機能性を示すため、eGFPの発現についてトランスジェニックであるマウスの血液細胞からの細胞当たりの蛍光を、図２に記載したように、Ｈ−型励起構造により誘導体化され、そしてeGHP（Kim et al, Nature Biotech. 22:321-5 (2004)）をコードするセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む２本鎖RNA（dsRNA）への曝露の後に、測定した。測定は、単核細胞の分離後マウスの血液からのフローサイトメトリーにより行った。
【０４８２】
図４は、対照及びダイサー処理された集団のの両方のヒストグラムを重ねたものである。対照細胞は、２つの集団を示す：第２の集団に比べて、細胞当たり＞10蛍光単位を有する67％の細胞。ダイサー基質による処理は、非蛍光対照細胞の平均蛍光に比べて僅かに高い平均蛍光を有する単一の集団をもたらす。
【０４８３】
３日早いIV又はIP投与を介して単一1.5 mg／kg ds-RNA-HES (2x28マー) eGFPダイサー基質に曝露されたeGFPダイサートランスジェニックから得られた血液細胞に基づいて定量的PCRもまた行われた。印象的なことには、プラシーボが投与された対照動物に較べて、IV及びIP投与された動物において、eGFP eGFP HES-siRNAダイサー基質が投与された動物の血液細胞において、eGFPメッセージが少なくとも75％ノックダウンされた。eGFPメッセージのノックダウンは特に顕著であり、そしてバックグラウンドに対して僅かに検出可能であった。
【０４８４】
実施例６． Ｈ−型励起構造（HES）を含むdsRNAによるインビボ標的遺伝子のノックダウン
HESに連結された場合のオリゴヌクレオチドの官能性が多くの器官において維持されていることを示すため、eGFPをコードする遺伝子の発現についてトランスゲニックであるマウス（Jackson Lab, stock #3291）における当該遺伝子のmRNAレベルが、図２に記載されるような、そしてeGFPをコードするセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むHESに連結された２本鎖RNA（dsRNA）のiv注射の後に測定された（Kim et al., Nature Biotech. 22:321-5 (2004）。測定は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により行なわれた。
【０４８５】
HES−オリゴヌクレオチドを含む溶液をPBS中に調製し、マウス当り200μl中２mg／kgの溶液を１日目にiv注射し、そしてマウス当り200μl中２mg／kgの溶液を２日目にiv注射した。平行して、マウス当り200μlのプラシーボ溶液を注射した。４日目にマウスを殺し、この時点で、脾臓、四頭筋（quadriceps muscle）、腹壁筋（abdominal wall muscle）及び肝臓からサンプルを集めた。脾細胞の単細胞懸濁液を調製し、そしてヒストパク−108（Histopaque-1083）（Sigma #10831）上で泳動させ、次にQiagenからの緩衝液FCSによりRNAを抽出した。RNAを筋及び肝臓サンプルからQiagenのRNeasyキットを用いて抽出した。cDNAは、抽出されたRNAのアリコットから、RocheのTranscriptor First Strand cDNA Synthesisキットを用いて調製した。次に、eGFP又はGAPDHの前方及び後方プライマーと共にRocheからのLightCycler 480 SYBR Green I Masterを用いて、LightCycler 480 II 装置を用いるRT−PCR分析を行った。すべての測定は少なくとも３連で行なった。
【０４８６】
表１は、各組織／器官についてノックダウンされたeGFP mRNAの阻害％を示す。印象的なことには、eGFPメッセージは、対照マウスに較べて、各動物において60％超ノックダウンされ、（ａ）５'末端ホスフェートを有しない比較的長い28−マー平滑末端RNA２本鎖のHES−オリゴヌクレチドの種々の器官への全身的送達、及び（ｂ）適切な配列から構成されるds−RNA（ダイサー基質RNA２本鎖）の内因性生物活性、すなわち器官組織内での発現されるsi−RNA活性）により確認されるような、HES−オリゴヌクレオチドの更に短いRNA２本鎖へのプロセシング、が示される。２'−Ｏメチル成分により修飾された２個のみの末端残基を有するHES成分を伴うRNA２本鎖による、標的mRNAの発現レベルの観察される阻害は、３'ヌクレアーゼ分解活性、そしてそれ故に血漿安定性の増加のために使用されるヌクレオチド修飾の最小レベルを考慮して、顕著である。M. A. Colingwood et al. Oligonucleotides 18:187-200 (2008)により報告されているように、３'血漿RNAse活性を低下低下させるために向けられたRNAヌクレオチド修飾の従来のレベルは、有意の大きな数の修飾を必要とするであろう。
【０４８７】
【表１】
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【０４８８】
HES−オリゴヌクレオチドがiv尾静脈注射をとおして注射された場合、組織当りGFP mRNA発現レベルに基づくこのRY-PCRの結果は、少なく修飾されたヌクレオチドを有する非常に長いオリゴヌクレオチドの全身的送達のための従来の送達方法に較べて、有意な改良を支持する。この結果が示すところによれば、このインビボ全身的送達は、肝臓（ナノ粒子ベヒクルが細網内皮系（RES）に蓄積し、そして単核貪食細胞系、例えばマクロファージ及び肝臓クッパー（Kuepffer）細胞により貪食される器官の１つ）への28−マー平滑末端RNA２本鎖の送達を許容するのみならず、1.5及び２mg／kg投与量（従来技術における典型的なオリゴヌクレオチド送達系の投与量、後のパラグラフを参照のこと）のiv注射に続く、他の遠位器官、例えば足骨格筋、腹壁筋、及び脾臓細胞への送達をも許容する。
【０４８９】
すなわち、この実施例において観察される、当該インビボ送達及び標的遺伝子mRNAノックダウンは、これ等の器官への送達のために典型的に用いられるのよりも低い投与量で、驚くべき効果的な送達を示す。この送達系は血液細胞に対して非毒性であることも見出された。何故なら、図１Ｃの時点サンプルが、フローサイトメトリー分析により示されるような前方散乱及び側方散乱（これらはそれぞれサイズ及び細胞粒状性の相違を示す）を誘導しなかったからである。HES−オリゴヌクレオチドが毒性を誘導する場合に示されるはずである。図１Ｃについてこのような変化は観察されなかった。更に、トリパンブルー又はヨウ化プロピジウム（propidium iodide）を用いる従来の細胞生存試験において有意に陽性に染色された細胞は見いだされなかった。
【０４９０】
当業界において有効なインビボオリゴヌクレオチド送達プロトコールを達成するために使用される典型的な投与量は次のとおりである：骨格ジストロフィンの発現を標的とするモルホリノオリゴヌクレオチドアンチセンスオリゴヌクレオチドについて報告されている有効な量は100mg／kg iv注射マウスである（Julia Alter et al., Nature Medicine (2006): doi:10.1038/nm1345）。ペプチド結合モルホリノオリゴヌクレオチドは、筋強直性ジストロフィー１型障害を標的として、１週間に１回６週間にわたり30 mg/kg、又は180mg／kgの累積投与量である（Andrew. J. Leger et al Nucleic Acid Therapeutics (2013) DOI: 10.1089/nat.2012.0404)。antimiRオリゴヌクレオチドのインビボ送達は、肝臓及び骨格筋並びに骨髄及び他の器官におけるmiR-16の鎮静をもたらすアンタゴミル−16（antagomir-16）の80mg／kgの３回の尾静脈注射、240mg／kgの累積投与量、として報告された（Jan Stenvang et al., Silence (2012), 3:1-17）。インビボ送達についての療法的siRNA送達及びそれらの障害についての総説は、Jie Wang et. al., The AAPS Journal (2010) 12:492-502及びYu-Cheng Tseng et. al. Advanced Drug Delivery review (2009) 61:721-731の如き総説に見られる。
【０４９１】
更なる重要なこととして、HES−オリゴヌクレオチド（この研究において使用されるeGPF mRNAを標的化する28−マー平滑末端RNA２本鎖）の血漿半減期が既に、蛍光検出器を用いるHPLCにより分析されている。血漿は、マウス当り２mg／kgの１回iv注射の後に種々の時点で採取された血液サンプルから調製された。HES−オリゴヌクレオチドの血漿半減期は4.5時間より長いことが見出され、これは、カニクイザル（cynomolgus monkey）においてSNALP−調剤されたssiApoB-2について見出された72分（Tracy S. Zimmermann et. al., Nature 441:111-114 (2006)）及び裸のsiRNAの血漿半減期（10分未満（van de Water et al. Drug Metab. Dispos. 34:1393-1397 (2006)))に較べて非常に長い。この延長された半減期は、注射されたHES−オリゴヌクレオチドのための溜め（reservoir）として血液細胞は機能することを一致し、これにより、注射後少なくとも３時間減少することなく高い血漿濃度が維持される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2019135259000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
【図１ａ】図１ａは、200μLの緩衝液（PBS）又はダイサー（Dicer）基質の注射の３時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞のフィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、1.5 mg/kgの濃度でのPBS又はダイサー（Dicer）基質の１回のip注射の後で単離された。
【図１ｂ】図１ｂは、200μLの緩衝液（PBS）又はダイサー（Dicer）基質の注射の３時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞のフィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、PBS、1.5 mg/kgの濃度でのダイサー（Dicer）基質、又は0.75 mg/kgの濃度でのダイサー（Dicer）基質、の１回のip注射の後で単離された。
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月12日(2019.6.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
適当な療法的オリゴヌクレオチドは同様に、商業的に入手可能なプログラムを用いて日常的に設計することができる（例えば、MysiRNA-Designer, AsiDesigner (Bioinformatics Research Center, KRIBB)、siRNA Target Finder (Ambion)、Block-iT RNAi Designer (Invitrogen)、Gene specific siRNA selector (The Wistar Institute)、siRNA Target Finder (GeneScript)、siDESIGN Center (Dharmacon)、SiRNA at Whitehead、siRNA Design (IDT), D: T7 RNAi Oligo Designer (Dudek P and Picard D.)、sfold-software、及びRNAstructure 4.5)；インターネットで入手可能なプログラム、例えばヒトスプライシングファインダーソフトウエアー（例えば".umd.be/HSF/"）及びTargetfinder（"bioit.org.cn/ao/targetfinder"から入手可能）；及び商業的提供者（例えば、Gene Tools, LLC）を参照のこと）。場合によっては、文脈が特に断らない限り、本明細書において、HES−オリゴヌクレオチド及び療法的オリゴヌクレオチドは相互交換的に使用される。
種々の時間、すなわちダイサー（Dicer）基質の１回のip投与（1.0mg／kg）の後１、３、５及び24時間後に単離された細胞からの蛍光をヒストグラム形式で示場合、これらのデータは、対照動物からのヒストグラム（ｔ＝０と表示される）上に重ねられている。１、３及び５時間におけるダイサー（Dicer）基質に曝露された細胞における約２logの蛍光強度は、対照動物からのそれらとの比較において、３時間における最大取り込み、及び24時間までの細胞内オリゴヌクレオチドの喪失を示した。すべての群の光散乱特性は、高度に生存性の細胞及びHES−担持オリゴヌクレオチドの不存在を示した。更に、24時間動物からのシグナルの喪失は、HES−オリゴヌクレオチドの非毒性代謝と一致する。
【外国語明細書】
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