(57)【要約】【課題】カルボキシメチルキチン（CM-キチン）の新たな用途の発見、及び特に再生医療の足場材料としてのCM-キチンの更なる高機能化を提供する。【解決手段】γ線照射カルボキシメチルキチンを含有し、特に非経口投与によって被験体に投与することができるマクロファージ活性化剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ線照射カルボキシメチルキチン（CM-キチン）を含有することを特徴とする、マクロファージ活性化剤。
【請求項２】
CM-キチンが可溶性CM-キチン又は不溶性CM-キチンである、請求項１記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項３】
γ線照射量が10〜50kGyの範囲である、請求項１又は２記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項４】
一酸化窒素産生量を指標とした場合に、γ線非照射CM-キチンと比較してマクロファージ活性化能が3倍以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項５】
非経口投与によって被験体に投与される、請求項１〜４のいずれか１項記載のマクロファージ活性化剤。
【請求項６】
再生医療のための足場材料として使用される、請求項１〜４のいずれか１項記載のマクロファージ活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマクロファージ活性化剤に関する。より具体的には、本発明のマクロファージ活性化剤は、γ線照射カルボキシメチルキチンを含有することを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
キチンはカニやエビなどの甲殻類の外骨格を主原料とする生体材料であり、主としてβ-1,4-N-アセチルグルコサミンの化学構造を有する直鎖状の天然高分子である。また、キチンに脱アセチル化処理を施すことで得られるβ-1,4-グルコサミンはキトサンと呼ばれている。キチン及びキトサンの分子はいずれも完全なホモポリマーではなく、グルコサミン及びN-アセチルグルコサミンをそれぞれ一部に含むことが知られている。キチン及びキトサンは生体材料由来であるために入手が容易であり、様々な用途に用いられている。
【０００３】
近年、損傷した組織の修復のための再生医療の研究が急速に進歩しつつあるが、組織の効果的な再生のためには、多能性幹細胞、及び幹細胞の増殖を促す増殖因子に加えて、再生の場を提供する足場材料が必要とされる。キチン及びキトサンは足場材料の素材としての応用も進められているが、いずれも水に不溶であること等から、これらを高機能化させるための誘導体化の試みが行われている。
【０００４】
カルボキシメチルキチン（以下CM-キチンともいう）は、キチンにカルボキシメチル基を導入することで高い水溶性と生体内分解性を付与した人工ポリマーである。CM-キチン自体は可溶性ポリマーであるが、CM-キチンを脱水縮合することにより、ゲル状の形態とすることができる。
【０００５】
ゲル状CM-キチンを、例えばβ-リン酸三カルシウムと共にウサギの骨・軟骨欠損部分に埋植することで骨・軟骨が再生されることが報告されており（非特許文献１）、生体組織修復材としての利用が開示されている（特許文献１）。
【０００６】
また、特定の粒径を有するキチン微粒子がマクロファージにファゴサイトーシスによって取り込まれた場合にサイトカインの産生や活性酸素の放出が増大するが、可溶性キチンではこの活性はないことが開示されている（非特許文献２）。本発明者等のグループは、ゲル状CM-キチンがマウスの免疫細胞を刺激してTNF-α等の炎症性因子とTGF-β等の組織再生因子の産生を誘導すること（非特許文献３）、ゲル状CM-キチンによって誘導されたこれらの因子が間葉系幹細胞を刺激して軟骨に分化させること（非特許文献４）等を報告している。
【０００７】
一方、グルコサミンは、軟骨に必要な成分であり、年齢と共に減少することが近年知られるようになり、これを補うことを目的として、サプリメントとして販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2004-229840号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Key Eng Mater 2005, 284-286, 791-794
【非特許文献２】Infect. Immun. 1997, May; 65(5): 1734-1741
【非特許文献３】J. Biomed. Mater. Res., Part A, 2007, 83, 58-63
【非特許文献４】J. Biomed. Mater. Res., 2010, 94, 1034-1041
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記の通り、再生医療のための足場材料素材として使用されるCM-キチンは、必要に応じてゲル化させる固形状のものであり、骨・軟骨の再生に有用であること、免疫細胞の刺激能を有することについて報告されているが、脱水縮合していないCM-キチン（可溶性CM-キチン）にはこれらの活性は存在していないことも報告されている。CM-キチンの新たな用途の発見、また、特に再生医療の足場材料としての更なる高機能化が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、CM-キチンの高機能化を検討する中で、ゲル状CM-キチンにγ線を照射するとマクロファージの活性化能が現れること、そして照射量を変更すると吸収線量に応じてマクロファージの活性化能が上昇することを見出した。更に、この活性化能は、ゲル状CM-キチンのみならず、可溶性CM-キチンも有していることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに到った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  γ線照射カルボキシメチルキチン（CM-キチン）を含有することを特徴とする、マクロファージ活性化剤。
２．  CM-キチンが可溶性CM-キチン又は不溶性CM-キチンである、上記１記載のマクロファージ活性化剤。
３．  γ線照射量が10〜50kGyの範囲である、上記１又は２記載のマクロファージ活性化剤。
４．  一酸化窒素産生量を指標とした場合に、γ線非照射CM-キチンと比較してマクロファージ活性化能が3倍以上である、上記１〜３のいずれか記載のマクロファージ活性化剤。
５．  非経口投与によって被験体に投与される、上記１〜４のいずれか記載のマクロファージ活性化剤。
６．  再生医療のための足場材料として使用される、上記１〜４のいずれか記載のマクロファージ活性化剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、CM-キチンの新たな用途を見出すと共に、従来の用途においても更に高機能のものを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】γ線照射したゲル状CM-キチンの添加によってJ774A.1細胞からのNO産生が顕著に増大することを示す。縦軸は540nnの吸光度（NO由来）から620nmの吸光度（ベースライン）を減算したものを示す。NC：陰性対照；Gel1-γ：ガンマ線非照射ゲル状キチン；Gel+γ：ガンマ線照射ゲル状キチン。
【図２】J774A.1細胞からのNO産生誘導能がゲル状CM-キチンに対するγ線の照射量に依存することを示す。縦軸は540nnの吸光度（NO由来）から620nmの吸光度（ベースライン）を減算したものを示す。NC：陰性対照；-γ：ガンマ線非照射ゲル状キチン。
【図３】ゲル状CM-キチン、可溶性CM-キチン、及び未処理のCM-キチンのいずれもがγ線照射によってJ774A.1細胞からのNO産生を誘導することを示す。縦軸は540nnの吸光度（NO由来）から620nmの吸光度（ベースライン）を減算したものを示す。NC：陰性対照。
【図４】ゲル状CM-セルロースに対するガンマ線照射がJ774A.1細胞からのNO産生に及ぼす誘導効果を示す。縦軸は540nnの吸光度（NO由来）から620nmの吸光度（ベースライン）を減算したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
マクロファージは、血液中の白血球の5％を占める単核白血球から分化し、細菌やウイルスなどの異物の取り込み及び分解、細胞表面への抗原提示等、免疫系における様々な重要な機能を果たしていることが知られている。マクロファージは天然ではＴ細胞から分泌されるインターフェロン等のサイトカインやリポ多糖（LPS）等によって活性化され、一酸化窒素の放出等によって感染防御作用を発揮する。近年、個体における自然治癒力を高めるために、マクロファージを活性化させることが効果的であると考えられるようになってきている。
本発明は、γ線照射カルボキシメチルキチン（CM-キチン）を含有することを特徴とする、マクロファージ活性化剤を提供する。
【００１６】
γ線（ガンマ線）は、およそ10pmより短い波長を有する電磁波・放射線であり、60Coや137Cs等がγ崩壊する際に放出されることが知られている。γ線は滅菌のための使用が知られている。γ線の線量の単位としては、照射によって単位質量あたりの物質が吸収するエネルギー量である吸収線量（グレイ、Gy）で表すことができる。
【００１７】
γ線照射は、例えばコバルト60などを線源とした装置等のγ線照射装置を使用して、目的の線量で照射することができる。また、例えば(株)コーガアイソトープ等にγ線照射を依頼することもできる。
【００１８】
CM-キチンは、キチンのモノマーであるN-アセチルグルコサミンの6位をカルボキシルメチル化した誘導体であり、水性溶媒に対して可溶性であると共に生分解性が高く、炎症性が低い、創傷治癒効果を有する等の効果が知られている。CM-キチンとしては、例えばキチン、好適には脱アセチル化度：24-30%、カルボキシメチル化度：70-80%、粘度：10-20mPa・sの範囲のものを水酸化ナトリウム存在下でモノクロロ酢酸で処理したもの（甲陽ケミカル株式会社より入手可能）等を好適に使用することができる。
本発明において好適に使用可能なCM-キチンは、可溶性CM-キチン又は不溶性CM-キチンのいずれであっても良い。
【００１９】
可溶性CM-キチンとしては、上記の市販のCM-キチンをそのまま使用することもでき、あるいは特定の分子量画分を選択することもできる。例えば、透析膜（分画分子量3500）で透析したものや、エタノール沈殿によって沈殿する高分子量画分を可溶性CM-キチンとして用いることもできる。
【００２０】
不溶性CM-キチンとしては、例えば可溶性CM-キチンを当分野で通常用いられる手法によって不溶化させたものを使用することができる。例えば、特に限定するものではないが、可溶性CM-キチンを凍結乾燥した後、更に減圧脱水縮合をさせることで、不溶化させることができる。得られた不溶性CM-キチンは、乾燥状態ではスポンジ状の多孔質の固形状の形態をとり、緩衝液又は体液等の水性溶液と接触した場合に溶解せずにゲル化し得ることから、本明細書において「ゲル状CM-キチン」と記載することとする。ゲル状CM-キチンは不溶性CM-キチンとして使用することができる。
【００２１】
上記のようにして得られたゲル状CM-キチンは、再生医療のための足場材料として、必要に応じてゲル化させて使用することができる。この時、一般的な滅菌方法として、γ線照射を行うこともできる。足場材料としての利用のためには、可溶性CM-キチンは好適なものとは考えられていない。
【００２２】
しかしながら、本発明においては、実施例にも示す通り、CM-キチンは可溶性CM-キチンであっても同様のマクロファージ活性化効果を示すことが明らかとなった。
本発明のマクロファージ活性化剤を取得するためのγ線照射量は、特に限定するものではないが、10〜50kGyの範囲とすることが好ましい。
【００２３】
マクロファージの活性化は、当分野における様々なアッセイ方法によって検出することができる。例えば、マクロファージの活性化は、TNF-α等のサイトカイン産生量の増大、一酸化窒素産生量の増大等を指標として確認することができる。
【００２４】
マクロファージの活性化を一酸化窒素産生量を指標として測定した場合、本発明のマクロファージ活性化剤は、γ線非照射CM-キチンと比較してマクロファージ活性化能が3倍以上であり得る。
【００２５】
本発明のマクロファージ活性化剤は、限定するものではないが、非経口投与によって被験体に投与することが好適である。「被験体」とは、特に限定するものではないが、哺乳動物、特にヒトであり、マクロファージの活性化による免疫反応の増大、炎症の抑制を必要とし得る患者、あるいは健常者であり得る。
【００２６】
本発明のマクロファージ活性化剤は、単独で、又は他の免疫増強剤等の薬剤と組み合わせて投与することができる。また、好適な製剤中に配合して、免疫増強のための医薬組成物として使用することもできる。医薬組成物にはまた、本発明のマクロファージ活性化剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。
【００２７】
非経口投与としては、特に限定するものではないが、例えば腹腔内、病巣内、皮下経路等を介した投与が挙げられる。非経口投与の場合には、可溶性CM-キチンを用い、生理的pHに緩衝された等張の水溶液として用いることが好ましい。不溶性の場合は、例えばJ. Immunol. 1997, 159(5), 2462-2467に記載されているように、予め粒径を調整して用いることができる。
【００２８】
本発明のマクロファージ活性化剤の投与量は、投与対象者の体重、年齢、健康状態等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.1〜100mg/kg体重の範囲で１回又は複数回投与することができ、複数回投与の場合、例えば毎日、毎週、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎に投与することが可能である。
本発明のマクロファージ活性化剤はまた、マクロファージ活性化効果という付加価値を有する足場材料として使用することができる。
【００２９】
再生医療のために使用する場合、本発明のマクロファージ活性化剤は、ES細胞、iPS細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞、及びトランスフォーミング増殖因子（transforming growth factor、TGF）、上皮成長因子（epidermal growth factor、EGF）、骨形成因子（bone morphogenic protein、BMP）等の増殖因子と組み合わせて、足場材料として使用することができる。足場材料として利用する場合、ゲル状CM-キチン等の不溶性CM-キチンを用いることが好ましい。不溶性CM-キチンは、足場材料として通常使用されるポリL-乳酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、ゼラチン、ハイドロキシアパタイト等と併用することもできる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
［実施例１］
ズワイガニの殻から抽出したキチンから、Tokura S.等、Polym J. 1983, 15: 485-489に記載された方法を用いてCM-キチン（カルボキシメチル化度：79モル％、脱アセチル化度：27モル％）を調製した。
【００３２】
具体的には、CM-キチン（800 mg、甲陽ケミカル株式会社製）を蒸留水40 mlに溶解し、透析膜（Spectra/Por 7 (Spectrum Laboratories Inc.)、分画分子量3500）を用いて精製水に対して透析し、凍結乾燥することによって高分子量画分を得た（可溶性CM-キチン）。
【００３３】
次いで、可溶性CM-キチン水溶液（5mg/ml）を凍結乾燥後、減圧下で脱水縮合して（140℃、12時間、10 Pa以下）不溶化したゲル状CM-キチンを得た。
γ線照射ゲル状CM-キチンは、上記のゲル状CM-キチンに25kGyのガンマ線を照射して（(株)コーガアイソトープ）得た。
【００３４】
J774A.1細胞（国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  JCRB細胞バンクから入手可能）を、96ウェルプレートに3×105個/ウェルの濃度でまき、これにゲル状CM-キチンを4重量％の分散液として添加して、37℃で24時間、5％CO2下でインキュベートした。
【００３５】
反応液を100×gで5分間遠心分離した上清にグリース試薬（株式会社  同仁化学研究所）を加え、540nmと620nmの吸光度を測定してNO産生誘導活性を測定した。
その結果、図１に示すように、ゲル状CM-キチンの添加によって、NO産生が2倍程度に上昇したが、γ線照射によって、更に約3倍の上昇が確認された。
【００３６】
［実施例２］
実施例１と同様にして、γ線吸収線量の違いによって活性化が異なるかどうかを検討した。その結果、図２に示すように、γ線照射していないゲル状CM-キチンの添加によって、NO産生が2倍程度に上昇したが、5〜50kGyのγ線を照射したゲル状CM-キチンを添加した場合には、吸収線量が増大するにつれて、NO産生量も上昇することが確認された。
【００３７】
［実施例３］
ゲル状CM-キチンに加えて、実施例１で得られた可溶性CM-キチン、及びEtOH沈殿処理を行わずに凍結乾燥した未処理のキチンを用いて実施例１と同様の検討を行った。
【００３８】
3種のCM-キチンに対して25kGyのγ線照射を行った後、実施例１と同様にして、3×105個のJ774A.1細胞に対してそれぞれ4重量％のCM-キチンを溶液又は分散液として添加して、37℃で24時間、5％CO2下でインキュベートした。
【００３９】
その結果、図３に示すように、ゲル状CM-キチンだけでなく、可溶性のCM-キチン、またEtOH処理を行っていないCM-キチンでも同様のマクロファージ活性化能を示すことが実証された。
【００４０】
［比較例１］
カルボキシメチルセルロース（ナカライテスク株式会社製、11676-85）を実施例１と同様の処理で不溶化させたゲル状CM-セルロースをゲル状CM-キチンの代わりに用い、実施例１と同様の検討を行った。その結果、図４に示すように、ゲル状CM-セルロースにおいてもγ線照射によってマクロファージの活性化能が上昇することが示されたが、活性化誘導の程度はCM-キチンと比較して小さいと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
宿主の免疫系が低下している場合、通常よりも感染症等の疾患に罹患する可能性が高く、また症状も重症化し得る。医薬としての利用のみならず、安価で利用できる本発明のマクロファージ活性化剤は、様々な疾患の予防薬や、健康食品・サプリメントとして、大きな需要があると考えられる。
【００４２】
更に、近年、再生医療の進歩はめざましく、そのための細胞の足場材料に対する国内市場も拡大している。本発明の知見に基づけば、移植部位での炎症等を抑制し、より早期に損傷した組織の再生を図ることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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