(57)【要約】【課題】顕微鏡観察用サンプルのゲル化または固体化およびその液化を容易かつ安定して行う。【解決手段】媒質溶液Ａを流動させる流路５を備え、該流路の一端に開口し媒質溶液Ａを注入する注入部７と、流路５の他端に開口し注入部７から注入される媒質溶液Ａの液滴Ａ´をその表面を部分的に露出させて吊り下げた状態に支持する懸滴形成部９とを備える基材本体３と、基材本体３の流路５における注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止する流動性部材１１とを備える顕微鏡観察用サンプルの作製基材１を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
媒質溶液を流動させる流路を備え、該流路の一端に開口し前記媒質溶液を注入する溶液注入部と、前記流路の他端に開口し前記溶液注入部から注入された前記媒質溶液の液滴をその表面を部分的に露出させて吊り下げた状態に支持する液滴支持部とを備える基材本体と、
該基材本体の前記流路における前記溶液注入部から前記液滴支持部への外気の流入を阻止する外気流入阻止部材とを備える顕微鏡観察用サンプルの作製基材。
【請求項２】
前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部から注入され該溶液注入部または前記流路内を閉塞する流動性を有する物質からなる請求項１に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製基材。
【請求項３】
前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部に挿脱可能に挿入されまたは前記溶液注入部の開口を開放可能に覆い、前記溶液注入部を閉塞する蓋部材である請求項１に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製基材。
【請求項４】
前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部の開口を覆う光学的に透明な板状部材である請求項１に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製基材。
【請求項５】
前記外気流入阻止部材が、前記流路の途中位置を開閉可能な弁つき栓である請求項１に記載の顕微鏡観察用サンプルの作製基材。
【請求項６】
基材本体の流路の一端に開口する溶液注入部からゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液を注入する工程と、
前記基材本体における前記流路の他端に開口する液滴支持部により、前記溶液注入部から注入された前記媒質溶液の液滴をその表面を部分的に露出させつつ観察対象物を内包させて吊り下げた状態に支持する工程と、
前記液滴が支持された前記基材本体の前記流路における前記溶液注入部から前記液滴支持部への外気の流入を阻止する工程と、
前記液滴支持部への外気の流入が阻止された状態で、前記液滴支持部により支持されている前記液滴をゲル化または固体化させる工程とを含む顕微鏡観察用サンプルの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察用サンプルの作製基材および顕微鏡観察用サンプルの作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、スフェロイドやオルガノイドなど３次元的に培養した細胞凝集塊の顕微鏡観察が注目されている。細胞凝集塊の作製としては、例えばシャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。
【０００３】
特許文献１の技術を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、特許文献１に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献２は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献１と同様になんら言及していない。
【０００４】
特許文献２の技術を更に発展させ、顕微鏡による精細な観察や撮像を行えるようにした技術が知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面で透明なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、細胞凝集塊が発する光をウエルの底面を介して倒立型顕微鏡の対物レンズで集光して観察や撮像を行っている。しかしながら、特許文献３の技術では、細胞凝集塊がウエルの側面に接するように位置する場合は、ウエルの底面と側面との境界である稜線部分が対物レンズで受光されるべき光束に干渉し、顕微鏡が本来有する光学性能を発揮できない。特にライトシート顕微鏡による観察では、細胞凝集塊に対して側面から励起光を照射するため、細胞凝集塊がウエルの側面に接している部分の観察が非常に困難である。
【０００５】
特許文献３の技術を更に発展させ、ウエルの底面と細胞凝集塊とが接しないように固定可能な技術が知られている（例えば、特許文献４参照。）。特許文献４に記載の技術は、細胞／アルギン酸混和液に塩化カルシウム溶液を作用させてアルギン酸をゲル化し、アルギン酸ビーズ状ゲル中に培養細胞が内包されたサンプルを作製している。また、特許文献４に記載の技術では、アルギン酸ビーズ状ゲルをキレート剤の水溶液に浸すことで溶解し、培養細胞を回収して再培養を行なっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】独国特許発明第１０３６２００２号明細書
【特許文献２】特許第５４９０８０３号公報
【特許文献３】国際公開第２０１７／００１６８０号
【特許文献４】特開平１０−２４８５５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、細胞を内包する溶液の液滴を基材により支持した状態で、溶液をゲル化させる液体をその液滴に作用させたり、ゲル化させた液滴に再び液化させる液体を作用させたりすると、液体の付着に伴う液滴の重量の増加や表面張力を低下させる液体の影響等により、基材により支持されている溶液の液滴が基材から脱落する可能性があるという問題がある。
【０００８】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、顕微鏡観察用サンプルのゲル化または固体化およびその液化を容易かつ安定して行うことができる顕微鏡観察用サンプルの作製基材、および、そのような顕微鏡観察用サンプルを簡易に作製することができる顕微鏡観察用サンプルの作製方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、媒質溶液を流動させる流路を備え、該流路の一端に開口し前記媒質溶液を注入する溶液注入部と、前記流路の他端に開口し前記溶液注入部から注入された前記媒質溶液の液滴をその表面を部分的に露出させて吊り下げた状態に支持する液滴支持部とを備える基材本体と、該基材本体の前記流路における前記溶液注入部から前記液滴支持部への外気の流入を阻止する外気流入阻止部材とを備える顕微鏡観察用サンプルの作製基材である。
【００１０】
本態様によれば、基材本体において、流路の一端に開口する溶液注入部から媒質溶液が注入され、その液滴が流路の他端に開口する液滴支持部により表面を部分的に露出させて吊り下げた状態に支持される。
【００１１】
この状態で、外気流入阻止部材により、基材本体の流路における溶液注入部から液滴支持部への外気の流入を阻止しておくことで、液滴支持部により吊り下げられている液滴にこれをゲル化または固体化させる液体を付着させることによって液滴の重量が増加したり液滴がゲル化または固体化して表面張力の働きが低減したりしても、ゲル化または固体化した液滴が基材本体から落下するのを防ぐことができる。さらに、ゲル化または固体化した液滴を再び液化する液体を液滴支持部により吊り下げられている液滴に付着させることによって液滴の重量が増加した場合も、外気流入阻止部材により溶液注入部から液滴支持部への外気の流入を阻止しておくことで、液化した液滴が基材本体から落下するのを防ぐことができる。したがって、顕微鏡観察用サンプルのゲル化または固体化およびその液化を容易かつ安定して行うことができる。
【００１２】
上記態様においては、前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部から注入され該溶液注入部または前記流路内を閉塞する流動性を有する物質からなることとしてもよい。
このように構成することで、外気流入阻止部材としての流動性を有する物質を溶液注入部から流し込みながら、流路内の空気を溶液注入部から外部に逃がすことができる。これにより、溶液注入部から流路内に外気を押し込むことなく溶液注入部または流路内を閉塞することができる。
【００１３】
上記態様においては、前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部に挿脱可能に挿入されまたは前記溶液注入部の開口を開放可能に覆い、前記溶液注入部を閉塞する蓋部材であってもよい。
このように構成することで、外気流入阻止部材としての蓋部材を溶液注入部に挿入または蓋部材により溶液注入部の開口を覆うだけで、溶液注入部を閉塞することができる。また、蓋部材により溶液注入部を一旦閉塞した後も、蓋部材を外すことで溶液注入部を容易に開放することができる。
【００１４】
上記態様においては、前記外気流入阻止部材が、前記溶液注入部の開口を覆う光学的に透明な板状部材であってもよい。
このように構成することで、基材本体によって支持される媒質溶液の液滴に観察対象物を内包させておくことにより、外気流入阻止部材としての光学的に透明な板状部材により溶液注入部を閉塞した状態で、顕微鏡により板状部材を介して液滴内の観察対象物を観察することができる。
【００１５】
上記態様においては、前記外気流入阻止部材が、前記流路の途中位置を開閉可能な弁つき栓であってもよい。
このように構成することで、外気流入阻止部材としての弁つき栓により流路の途中位置を開閉するだけの簡易な作業で、溶液注入部から液滴支持部への外気の流入を阻止したり、溶液注入部から液滴支持部への外気の流入を可能にしたりすることができる。
【００１６】
本発明の第２態様は、基材本体の流路の一端に開口する溶液注入部からゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液を注入する工程と、前記基材本体における前記流路の他端に開口する液滴支持部により、前記溶液注入部から注入された前記媒質溶液の液滴をその表面を部分的に露出させつつ観察対象物を内包させて吊り下げた状態に支持する工程と、前記液滴が支持された前記基材本体の前記流路における前記溶液注入部から前記液滴支持部への外気の流入を阻止する工程と、前記液滴支持部への外気の流入が阻止された状態で、前記液滴支持部により支持されている前記液滴をゲル化または固体化させる工程とを含む顕微鏡観察用サンプルの作製方法である。
【００１７】
本態様によれば、基材本体において、流路の一端に開口する溶液注入部から注入された媒質溶液の液滴が、流路の他端に開口する液滴支持部によりその表面を部分的に露出させつつ観察対象物を内包して吊り下げた状態に支持される。そして、基材本体の流路における溶液注入部から液滴支持部への外気の流入が阻止された状態で、液滴支持部により支持されている媒質溶液の液滴がゲル化または固体化される。
【００１８】
これにより、基材本体により支持されている媒質溶液の液滴に内包されている観察対象物から発せられる光をゲル状または固体状の略透明な媒質溶液の液滴の外部で検出し、観察対象物を高精細に観察することができる。
【００１９】
この場合において、媒質溶液をゲル化または固体化させる液体を液滴に付着させることによって、液滴の重量が増加したり液滴がゲル化または固体化して表面張力の働きが低減したりしても、液滴支持部に溶液注入部から外気が流入しないので、ゲル化または固体化した液滴が基材本体から落下するのを防ぐことができる。さらに、溶液注入部から液滴支持部への外気の流入を阻止しておけば、ゲル化または固体化した液滴を再び液化する液体を液滴に付着させることによって液滴の重量が増加した場合も、液化した液滴が基材本体から落下するのを防ぐことができる。したがって、ゲル化または固体化およびその液化を容易かつ安定して行うことができる顕微鏡観察用サンプルを簡易に作製することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材によれば、顕微鏡観察用サンプルのゲル化または固体化およびその液化を容易かつ安定して行うことができるという効果を奏し、本発明に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法によれば、そのような顕微鏡観察用サンプルを簡易に作製することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材の一例を示す断面図である。
【図２】図１の顕微鏡観察用サンプルの作製基材により形成されるハンギングドロップを明視野観察して得られた画像の一例を示す図である。
【図３】図１の微鏡観察用サンプルの作製基材においてハンギングドロップに働く表面張力による鉛直上方への力を説明する図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法を説明するフローチャートである。
【図５】図１の液状のハンギングドロップにこれをゲル化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図である。
【図６】本発明の一実施形態の第１変形例に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材の一例を示す断面図である。
【図７】図６の顕微鏡観察用サンプルの作製基材の蓋部材の先端部を拡大した縦断面図である。
【図８】本発明の一実施形態の第２変形例に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材で用いられる板状部材の一例を示す断面図である。
【図９】図８の顕微鏡観察用サンプルの作製基材で採用する基材本体の一例を示す斜視図である。
【図１０】本発明の一実施形態の第３変形例に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材の一例を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材および顕微鏡観察用サンプルの作製方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材１は、図１に示すように、媒質溶液Ａを流動させる流路５を備え、媒質溶液Ａの液滴Ａ´が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤを形成する基材本体３と、基材本体３の流路５を閉塞する流動性部材（外気流入阻止部材）１１とを備えている。
【００２３】
基材本体３は、流路５の一端に開口し、媒質溶液Ａが注入される注入部（溶液注入部）７と、流路５の他端に開口し、注入部７から注入された媒質溶液Ａの液滴Ａ´を支持する懸滴形成部（液滴支持部）９とを備えている。
【００２４】
この基材本体３は、注入部７が鉛直上方で懸滴形成部９が鉛直下方となる向きで使用するようになっている。以下、鉛直方向をＺ方向とし、Ｚ方向に直交しかつ互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。
【００２５】
注入部７は、流路５の一端に開口する開口部７ａを有し、開口部７ａからテーパ状に細くなって懸滴形成部９に繋がる略円錐形状を有している。
懸滴形成部９は、流路５の他端に開口する開口部９ａを有し、注入部７の細径部分から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。この懸滴形成部９は、媒質溶液Ａの液滴Ａ´をその下部の表面を部分的に露出させて吊り下げた状態に支持するようになっている。
【００２６】
具体的には、懸滴形成部９は、図３に示すように、開口部９ａの外径での表面張力による鉛直上方への力ＦがＦ≧ｍｇの関係を満たすことにより、媒質溶液Ａの液滴Ａ´を落下させることなくハンギングドロップＤを形成することができるようになっている。
ここで、Ｆ＝２πｒ×λ×ｃｏｓθ、ｒ：懸滴形成部９の開口部９ａの外半径、λ：表面張力、ｍ：液滴Ａ´における懸滴形成部９から露出する部分の質量、ｇ：重力加速度である。
【００２７】
流動性部材１１は、基材本体３の注入部７の開口部７ａから注入されて注入部７または流路５内を閉塞する流動性を有する物質、例えば、樹脂、油脂およびゲルの少なくとも１つからなり、流路５における注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止するようになっている。本実施形態においては、流動性部材１１として光硬化性樹脂を例示して説明する。
【００２８】
次に、本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材１は、図４のフローチャートに示すように、基材本体３の注入部７から媒質溶液Ａを注入する注入工程Ｓ１と、注入部７から注入された媒質溶液Ａの液滴Ａ´を懸滴形成部９によりその表面を部分的に露出させつつスフェロイド（観察対象物）Ｓを内包させて吊り下げた状態に支持してハンギングドロップＤを形成する支持工程Ｓ２と、ハンギングドロップＤを支持する基材本体３の流路５における注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止する阻止工程Ｓ３と、懸滴形成部９への外気の流入が阻止された状態で、懸滴形成部９より支持されている液状のハンギングドロップＤをゲル化させるゲル化工程Ｓ４とを含んでいる。
【００２９】
媒質溶液Ａとしては、例えば、アルギン酸ナトリウムを含む生物由来材料を育成可能な培地が用いられる。媒質溶液Ａはゲル化時に透明である。アルギン酸塩であればナトリウム塩に限られない。また、アルギン酸ナトリウムは重量％で０．５％以上が好ましいが、これに限定されるものではない。この媒質溶液Ａは比重が１であり、スフェロイドＳの比重よりも小さい。
【００３０】
支持工程Ｓ２においては、ハンギングドロップＤを形成した後、懸滴形成部９により吊り下げられた状態に支持されている媒質溶液Ａの液滴Ａ´の下部からその液滴Ａ´内にスフェロイドＳを挿入するようになっている。
【００３１】
阻止工程Ｓ３は、基材本体３の注入部７に流動性部材１１としての液状の光硬化性樹脂を注入し、注入した光硬化性樹脂に特定の波長の光を照射して硬化させるようになっている。注入部７に注入した光硬化性樹脂を硬化させることで、注入部７を安定して閉塞することができる。
【００３２】
ゲル化工程Ｓ４は、例えば、図５に示すように、ハンギングドロップＤの露出する表面に媒質溶液Ａをゲル化させる液体Ｂを霧状で接触させて、化学反応によりハンギングドロップＤをゲル化させるようになっている。液体Ｂを霧化させる装置としては、超音波を発生して液体Ｂを微細な霧状にする超音波霧化装置（図示略）が用いられる。例えば、作製基材１により支持したハンギングドロップＤを図示しない容器に収容し、超音波霧化装置により液体Ｂを微細な霧状にしてその容器内に充満させることにより、ハンギングドロップＤの露出する表面に液体Ｂを霧状で接触させるようになっている。
【００３３】
液体Ｂとしては、例えば、２価の金属イオン（カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム等）を含む水溶液である塩化カルシウム水溶液等が用いられる。塩化カルシウムはモル濃度で１００ｍＭ以上が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
このように構成された顕微鏡観察用サンプルの作製基材１および顕微鏡観察用サンプルの作製方法の作用について、図４のフローチャートを参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材１および顕微鏡観察用サンプルの作製方法により顕微鏡観察用サンプルを作製するには、まず、基材本体３の注入部７に上方から媒質溶液Ａを分注する（注入工程Ｓ１）。
【００３５】
注入部７に分注された媒質溶液Ａは、重力によって注入部７から下方に移動し、懸滴形成部９により液滴Ａ´が吊り下げられた状態に支持される。この状態で、媒質溶液Ａの液滴Ａ´の下部から液滴Ａ´内にスフェロイドＳを挿入する。これにより、図１および図２に示すように、スフェロイドＳを内包して、媒質溶液Ａの液滴Ａ´が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤが形成される（支持工程Ｓ２）。
【００３６】
ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液ＡはスフェロイドＳよりも比重が小さいので、スフェロイドＳは、重力によりハンギングドロップＤの界面に沿って移動してハンギングドロップＤの最下点近傍に落ち着く。したがって、注入部７に分注する媒質溶液Ａの量を決めておくことにより、液滴Ａ´内でのスフェロイドＳのＸ，Ｙ方向の位置だけでなくＺ方向の位置も一定にすることができる。また、基材本体３を用いることで、ハンギングドロップＤを形成するために媒質溶液Ａの液滴Ａ´を反転させる必要もない。
【００３７】
次に、基材本体３の注入部７の上方から流動性部材１１としての液状の光硬化性樹脂を注入し、流動性部材１１に特定の波長の光を照射して、注入部７内で流動性部材１１を硬化させる（阻止工程Ｓ３）。これにより、注入部７または流路５内が閉塞され、流路５における注入部７から懸滴形成部９への外気の流入が流動性部材１１によって阻止される。
【００３８】
次に、作製基材１により支持されているハンギングドロップＤを図示しない容器に収容し、超音波霧化装置により液体Ｂを霧化させて容器内に充満させる。そして、流動性部材１１により懸滴形成部９への外気の流入が阻止された状態で、懸滴形成部９から露出しているハンギングドロップＤの表面に液体Ｂを霧状で接触させる。
【００３９】
そのまま霧状の液体Ｂ内にハンギングドロップＤを静置させ、ハンギングドロップＤの露出する下部の表面から内部に液体Ｂを浸透させて、スフェロイドＳの周辺近傍までハンギングドロップＤをゲル化させる（ゲル化工程Ｓ４）。これにより、略透明なハンギングドロップＤ内でスフェロイドＳが最下部の位置に固定されたサンプルが作製される。
【００４０】
これにより、例えば、ライトシート顕微鏡等によって、作製基材１により支持されているゲル状の略透明なハンギングドロップＤ内のスフェロイドＳに励起光を照射し、スフェロイドＳから発せられる光をハンギングドロップＤの外部で検出して、スフェロイドＳを観察することができる。
【００４１】
ハンギングドロップＤに内包されているスフェロイドＳの観察後は、ゲル状のハンギングドロップＤにこれを溶解させるキレート剤等を作用させて、スフェロイドＳを内包しつつ基材本体３により支持されている状態を維持させたままハンギングドロップＤを液化することとしてもよい。
【００４２】
この場合も、流動性部材１１により懸滴形成部９への外気の流入が阻止された状態で、懸滴形成部９により支持されているゲル状のハンギングドロップＤの表面にキレート剤等を噴霧や塗布したり、ハンギングドロップＤをキレート剤等に浸漬させたりすることとすればよい。ハンギングドロップＤを基材本体３により支持されている状態を維持させたまま液化することで、同じ基材本体３上で培地交換や継続的な培養を行ったり、液化したハンギングドロップＤからスフェロイドＳを容易に回収したりすることができる。
【００４３】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製基材１によれば、流動性部材１１により、基材本体３の流路５における注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止しておくことで、懸滴形成部９により吊り下げられているハンギングドロップＤの表面にこれをゲル化させる液体Ｂを付着させることによってハンギングドロップＤの重量が増加したりハンギングドロップＤがゲル化して表面張力の働きが低減したりしても、ゲル化したハンギングドロップＤが基材本体３から落下するのを防ぐことができる。
【００４４】
さらに、懸滴形成部９により吊り下げられているゲル状のハンギングドロップＤにキレート剤等を付着させることによってハンギングドロップＤの重量が増加した場合も、流動性部材１１により注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止しておくことで、液化したハンギングドロップＤが基材本体３から落下するのを防ぐことができる。したがって、顕微鏡観察用サンプルのゲル化およびその液化を容易かつ安定して行うことができる。
【００４５】
また、外気流入阻止部材として、熱硬化性樹脂等の流動性を有する物質からなる流動性部材１１を採用することで、液状の流動性部材１１を注入部７から流し込みながら、流路５内の空気を注入部７から外部に逃がすことができる。これにより、注入部７から流路５内に外気を押し込むことなく注入部７を閉塞することができ、注入部７を閉塞する際に懸滴形成部９からハンギングドロップＤが落下するのを防ぐことができる。
また、本実施形態に係る顕微鏡観察用サンプルの作製方法によれば、このような顕微鏡観察用サンプルを簡易に作製することができる。
【００４６】
本実施形態においては、支持工程Ｓ２において、媒質溶液Ａの液滴Ａ´の下部から液滴Ａ´内にスフェロイドＳを挿入することとしたが、これに代えて、例えば、媒質溶液Ａの液滴Ａ´に生物由来材料である細胞（図示略）を内包させて、ハンギングドロップＤ内でその細胞が観察のための形態になるまで培養することとしてもよい。
【００４７】
この場合、注入工程Ｓ１において、注入部７の開口部７ａに上方から複数の細胞と共に培地を分注し、支持工程Ｓ２において、培地の液滴によりハンギングドロップＤを形成させてその内部で細胞を培養してスフェロイドＳを形成させることとすればよい。
【００４８】
このようにすることで、観察に適した形態になったスフェロイドＳを観察することができる。また、ハンギングドロップＤ内で細胞を培養してスフェロイドＳを形成することで、スフェロイドＳを移し替える必要がなく、スループットを向上して安価にスクリーニングを行うことができる。
【００４９】
また、本実施形態においては、基材本体として、注入部７および懸滴形成部９の組が１つからなる単体の基材本体３を例示して説明したが、これら注入部７および懸滴形成部９の組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートを採用することとしてもよい。このようなマルチウエルプレートを採用することにより、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量のスフェロイドＳの撮像を高スループットで行うことができる。
【００５０】
また、本実施形態においては、超音波霧化装置を採用することとしたが、液体Ｂを霧化できるものであればよく、例えば、超音波や加圧により液体Ｂを霧化させるネブライザー装置等、これに限定されるものではない。また、液体Ｂを霧化させることに代えて、例えば、液体Ｂを泡状やスプレーのように媒質溶液Ａの液滴よりも小さな体積の液滴状にして媒質溶液Ａの液滴Ａ´の表面に接触させることとしてもよい。この場合、例えば、スプレー装置、スパッタリング装置またはポンプ等を採用することとしてもよい。
【００５１】
また、本実施形態においては、観察対象物として、スフェロイドＳを例示して説明したが、これに代えて、例えば、細胞、細胞凝集塊、細胞組織またはオルガノイド等からなる生物由来材料を採用してもよい。細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコなど脊椎動物由来の細胞、ショウジョウバエ、カイコなど無脊椎動物由来の細胞、酵母、大腸菌など菌類、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞等の幹細胞などが挙げられる。また、観察対象物として、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料を採用してもよい。
【００５２】
また、基材は、例えば、ガラス等を含む無機物質、または、合成ゴム、ジメチルシロキサン、シリコーン樹脂、天然ゴム、フッ素化ポリマー、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリシロキサン系ポリマー、ポリメチルアクリレート、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ポリメチルメタクリレート、メチルハイドロジェンシロキサンなど類似物質、誘導体、フレンドなどを含む有機物質によって製作されるものとすればよい。これらの原料を単一もしくは複数使用して作製されるものでもよい。
【００５３】
本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例は、例えば、図６に示すように、外気流入阻止部材として、基材本体３の注入部７に挿脱可能に挿入されて注入部７を閉塞する蓋部材１３を採用することとしてもよい。
【００５４】
蓋部材１３としては、例えば、樹脂、金属、陶器などを採用することができ、注入部７の開口部７ａに挿入されて開口部７ａを閉塞したり開口部７ａから取り出して開口部７ａを開放したりすることができる形状を有するものであればよい。
このようにすることで、蓋部材１３により、注入部７の閉塞および開放を容易にすることができる。
【００５５】
この場合において、蓋部材１３は、図７に示すように、注入部７に挿入される先端部分が、その先端に向かって先細になるように流路５に沿う方向に対して傾斜した傾斜面１３ａを有することとしてもよい。このようにすることで、蓋部材１３を注入部７に挿入する際に、蓋部材１３の先端部分の傾斜面１３ａに沿って流路５内の空気を注入部７から外部に逃がし易くすることができる。これにより、注入部７に蓋部材１３を挿入する際に、注入部７から流路５内に外気が押し込まれて懸滴形成部９からハンギングドロップＤが落下するのを防ぐことができる。
【００５６】
また、蓋部材１３の注入部７に挿入される先端部分が、基材本体３の流路５に沿う方向に延びるスリット（図示略）を有することとしてもよい。このようにすることで、蓋部材１３を注入部７に挿入する際に、蓋部材１３の先端部分のスリットに沿って流路５内の空気を注入部７から外部に逃がし易くすることができる。
【００５７】
第２変形例は、外気流入阻止部材として、図８に示すように、注入部７の開口を覆う光学的に透明なガラスや樹脂等からなる板状部材１５を採用することとしてもよい。この場合、基材本体３に代えて、図８に示すように、厚さ方向に貫通する流路５を有する薄い板状の基材本体１７を採用することとしてもよい。基材本体１７が薄い板状の形態を有することで、流路５の一端に開口する注入部７と流路５の他端に開口する懸滴形成部９とを近接した形状とすることができる。
【００５８】
本変形例によれば、光学的に透明な板状部材１５を採用することで、板状部材１５により注入部７を閉塞した状態で、板状部材１５を介して液滴Ａ´内のスフェロイドＳを観察することができる。例えば、基材本体１７の上方から板状部材１５を介してハンギングドロップＤ内のスフェロイドＳに励起光を照射し、スフェロイドＳから発せられる光を基材本体１７の下方で鉛直方向に交差する方向から検出して観察することとしてもよい。
【００５９】
本変形例においては、図９に示すように、基材本体１７が、複数の流路５がアレイ状に配列された板状の形態を有することとしてもよい。このようにすることで、各流路５における注入部７の開口部７ａを一枚の板状部材１５で閉塞することができ、多検体を自動化して観察することが容易となる。
【００６０】
第３変形例は、図１０に示すように、基材本体として、注入部７と懸滴形成部９との間に流路５が細径化された細長い導管２１を有する基材本体１９を採用することとしてもよい。
【００６１】
この場合、外気流入阻止部材として、導管２１の流路５の途中位置を開閉可能な弁つき栓２３を採用することとしてもよい。このようにすることで、流路５の途中位置において弁つき栓２３を開閉するだけの簡易な作業で、注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を阻止したり、注入部７から懸滴形成部９への外気の流入を可能にしたりすることができる。
【００６２】
本変形例においては、弁つき栓２３に代えて、注入部７の開口を開放可能に覆う図１０に示すような蓋部材２５や、注入部７に挿脱可能に挿入される蓋部材１３を採用することとしてもよいし、弁つき栓２３とこれら蓋部材２５や蓋部材１３とを併用することとしてもよい。
【００６３】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００６４】
また、例えば、上記実施形態およびその変形例においては、媒質溶液Ａとしてアルギン酸ナトリウムを含む水溶液を採用し、液体Ｂとして２価の金属イオンを含む水溶液を例示して説明したが、媒質溶液Ａ，液体Ｂとしてそれぞれ他の水溶液を採用し、その媒質溶液Ａの表面に液体Ｂを接触させることで観察および測定に適した粘弾性を与えることができればよく、これに限定されるものではない。また、媒質溶液Ａの表面に媒質溶液Ａを固体化する液体を作用させて、媒質溶液Ａを固体化させることとしてもよい。
【符号の説明】
【００６５】
１                作製基材
３，１７，１９    基材本体
５                流路
７                注入部（溶液注入部）
９                懸滴形成部（液滴支持部）
１１              流動性部材（外気流入阻止部材）
１３              蓋部材（外気流入阻止部材）
１５              板状部材（外気流入阻止部材）
Ｓ                スフェロイド（観察対象物）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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