(57)【要約】      （修正有）【課題】熱安定性が高く、コルチゾールに対する結合能に優れたコルチゾール結合タンパク質、及びそれを用いたコルチゾールの検出方法を提供する。【解決手段】特定の配列からなるアミノ酸配列を含み、コルチゾールに結合可能であるタンパク質。前記タンパク質と固相担体が結合した複合体と、被分析物とを接触させ、被分析物中のコルチゾールと複合体との結合に基づく物理量の変化を検出する、コルチゾールの検出方法。【選択図】図７
2019196325.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、コルチゾールに結合可能であるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質を含み、前記タンパク質は固相担体と結合している、複合体。
【請求項３】
請求項２に記載の複合体と、検出部とを含み、
前記検出部は、被分析物中のコルチゾールと前記複合体との結合に基づく物理量の変化を検出する、
コルチゾールの検出装置。
【請求項４】
請求項２に記載の複合体と、被分析物とを接触させるステップと、
前記被分析物中のコルチゾールと前記複合体との結合に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む、
コルチゾールの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コルチゾール結合タンパク質、それを含む複合体、並びに、それを用いたコルチゾール検出装置および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾールは、過度なストレスを受けると分泌量が増加するホルモンである。このため、コルチゾールの濃度を検査することで、検査時点におけるストレス量を把握することができる。コルチゾールの濃度が高値の場合、クッション症候群、ストレス、鬱病、神経性食欲不振症などが疑われる。一方、コルチゾールの濃度が低値の場合、アジソン病、先天性副腎皮質過形成、ＡＣＴＨ不心症、下垂体性副腎皮質機能低下症などが疑われる。
【０００３】
コルチゾールは、唾液中にも微量ではあるが含まれていることが知られているため、コルチゾールの検出には、唾液中に含まれるコルチゾールを測定してストレスの判定の指標とすることが検討されている。一般に、生体試料中に含まれる微量タンパクを分析する技術としては、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓｓａｙ）法が多く用いられている。この酵素免疫測定法には、大きく分けて競合法とサンドイッチ法とがある。
【０００４】
例えば、コルチゾールを、競合法を用いた分析チップで検出する方法が報告されている（特許文献１）。特許文献１では、コルチゾールと特異的に結合することができる特異的結合物質（捕捉剤）としてコルチゾール抗体を用いて、競合法によってコルチゾールを検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１９４０３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１のような抗体を用いた検出法では、抗体作成に要するコストや、抗体では熱安定性を得にくいといった難点があった。
【０００７】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、熱安定性が高く、コルチゾールに対する結合能に優れたコルチゾール結合タンパク質及びそれを用いたコルチゾールの検出方法等を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一局面に係る新規なタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、コルチゾールに結合可能であることを特徴とする。
【０００９】
さらに、本発明の他の局面に係る複合体は、上記タンパク質を含み、当該タンパク質は固相担体と結合していることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明のさらの他の局面に係るコルチゾールの検出装置は、上記複合体と、検出部とを含み、前記検出部は、被分析物中のコルチゾールと前記複合体との結合に基づく物理量の変化を検出することを特徴とする。
【００１１】
さらに、本発明のまた別の局面に係るコルチゾールの検出方法は、上記複合体と、被分析物とを接触させるステップと、前記被分析物中のコルチゾールと前記複合体との結合に基づく物理量の変化を検出するステップとを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、熱安定性が高く、コルチゾールに対する結合能に優れたコルチゾール結合タンパク質及びそれを用いたコルチゾールの検出方法等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＡＳＰ２ライブラリ断片の制限酵素処理を示す模式図である。
【図２】図２は、酵母表層提示用プラスミドｙｆｌｏＤ＿ｐＹ２の制限酵素処理を示す模式図である。
【図３】図３は、ＰＣＲによるＡＳＰ２ライブラリ遺伝子断片の作製手順を示す模式図である。
【図４】図４は、ライブラリ遺伝子を作製する際の、プルミドベクター１のベクターマップを示す。
【図５】図５は、ＦＡＣＳを用いたコルチゾール結合性タンパク質ＡＳＰ２のスクリーニングマップである。
【図６】図６は、実施例における蛍光法によるコルチゾール結合性タンパク質ＡＳＰ２  Ｐ５−２１の結合活性を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例におけるコルチゾール結合性を示す解離定数評価の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係る実施形態について具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態のタンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、コルチゾールに結合可能であることを特徴とする。
【００１６】
本実施形態のタンパク質は、後述する実施例に示す方法によって合成およびスクリーニングされた、ミツバチ由来のコルチゾール結合性タンパク質である。
【００１７】
本実施形態のタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００１８】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。
【００１９】
また、本実施形態のタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００２０】
本実施形態のタンパク質は、ストレスの指標となる物質、コルチゾールを検出するための検出装置または検出方法において用いられる。この場合、本実施形態のタンパク質は、固相担体に結合した複合体の状態で用いられ、当該タンパク質に対するコルチゾールと競合物質との競合反応を利用して、コルチゾールを検出することができる。
【００２１】
本実施形態において、固相担体とは、本実施形態の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。固相担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、薄膜などが挙げられる。固相担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、ガラスなどが挙げられる。本実施形態のタンパク質を固相担体へ結合させる方法としては、特に限定はなく、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
【００２２】
また、本実施形態で使用可能な競合物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、放射性物質などが挙げられる。なかでも、蛍光物質である、Ｎ−フェニル−１−ナフチルアミン（１−ＮＰＮ）が好適に用いられる。
【００２３】
本実施形態のタンパク質を用いた検出方法では、当該タンパク質を含む複合体と被分析物とが接触させられ、被分析物中のコルチゾールと、複合体中のタンパク質との結合に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、蛍光強度、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。
【００２４】
さらに、本実施形態のタンパク質を用いた、コルチゾールの検出装置は、前記複合体と、検出部を含み、当該検出部は、被分析物中のコルチゾールと、複合体中のタンパク質との結合に基づく物理量の変化を検出する。前記検出部は、例えば、各種光度計、分光器、線量計など公知の装置で構成される。
【００２５】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
（実施例）
コルチゾールに結合するミツバチ由来におい結合性タンパク質ＡＳＰ２が、以下の手順に従って調製された。以下、ミツバチ由来におい結合性タンパク質は「ＡＳＰ２」と称す。
【００２７】
（ＡＳＰ２ライブラリの作製）
ＡＳＰ２のアミノ酸配列を有するタンパク質から以下のアミノ酸配列を示すＡＳＰ２ライブラリ（ＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリ）を作製した。
ＩＤＱＤＴＶＸＡＫＹＸＥＹＬＭＰＤＸＭＰＣＡＤＥＬＨＩＳＥＤＩＡＴＮＩＱＡＡＫＮＧＡＤＭＳＱＬＧＣＬＫＡＣＸＸＫＲＫＥＭＬＫＧＸＥＬＹＶＥＰＶＹＫＭＩＥＶＶＨＡＧＮＡＤＤＩＱＬＶＫＧＩＡＮＥＣＩＥＮＡＫＧＥＴＤＥＣＮＩＧＮＫＹＴＤＣＹＩＥＫＬＦＸ（配列番号：２）
【００２８】
タンパク質ライブラリの作製には、コルチゾール結合性ＡＳＰ２の高効率な合成とスクリーニングが可能である酵母表層提示法を用いた。
【００２９】
ＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリは、上記アミノ酸配列に示すようにＡＳＰ２のにおい分子結合領域の６残基（Ｘで表記）をランダム化して１３種類の天然アミノ酸がコードされるようにｄｎｋの混合塩基を設計した。
【００３０】
ＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリを提示させるために、酵母の表層タンパク質であるＦｌｏ１ｐのＣ末端ドメインであるＦｌｏ４２を用いた。Ｆｌｏ４２をコードした酵母表層提示用プラスミド（ｙｆｌｏＤ＿ｐＹ２）に対し、ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１で制限酵素処理を行い、同様に制限酵素処理したライブラリ断片とライゲーションを行った（図１、図２）。
【００３１】
ライブラリ断片はランダム化したオリゴヌクレオチドを利用し、図３に示す２度のＰＣＲによって作製した。ライゲーションしたＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリをコードしたプラスミド（ＡＰＳ２＿ｄｎｋ＿ｙｆｌｏＤ＿ｐＹ２）を用いて大腸菌を形質転換した後、一晩培養し、アルカリ抽出法によってＡＳＰ２＿ｄｎｋ＿ｙｆｌｏＤ＿ｐＹ２を抽出し、それを用いて酵母ＢＹ４７４１を形質転換した。本実施例のＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリのサイズは５．５×１０６であった。
【００３２】
（１ｓｔＰＣＲによるライブラリ断片の作製）
ＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリの部分遺伝子を人工合成されたプライマーからＰＣＲ法により獲得した。ＰＣＲのための酵素はＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）を使用した。
【００３３】
以下の試薬を混合して、混合液を得た。
１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ      ４０  マイクロリットル
ｄＮＴＰｓ            ４０  マイクロリットル
ＭｇＳＯ４                      ２４  マイクロリットル
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ            １２  マイクロリットル
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ          １２  マイクロリットル
Ｈ２Ｏ                          ２６４  マイクロリットル
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ      ８  マイクロリットル
【００３４】
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。
摂氏９６度で３０秒間
摂氏６０度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。
このサイクルが３０回繰り返された。
【００３５】
最後に、混合液は、摂氏６８度で１０分間加熱した後、摂氏４度で保存された。
【００３６】
このＰＣＲ法においては、以下のプライマーセットが使用され、それぞれの遺伝子断片を得た。
セット１
ｐｒｉｍｅｒ  １：５’−  ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＡＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴｄｎｋＧＣＴＡＡＧＴＡＣｄｎｋＧＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴ  −３’（配列番号：３）
ｐｒｉｍｅｒ  ２：  ５’−  ＧＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＣＡＴｍｎｈＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣ  −３’  （配列番号：４）
【００３７】
セット２
ｐｒｉｍｅｒ  ３：  ５’−  ＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧ  −３’  （配列番号：５）
ｐｒｉｍｅｒ  ４：  ５’−  ＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＴＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＧ  −３’  （配列番号：６）
【００３８】
セット３
ｐｒｉｍｅｒ  ５：  ５’−  ＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＧＴｄｎｋｄｎｋＡＡＧＡＧＡａａｇｄｎｋＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＴＴＧＴＡＴＧ  −３’  （配列番号：７）
ｐｒｉｍｅｒ  ６：  ５’−  ＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＡＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣ  −３’  （配列番号：８）
【００３９】
セット４  
ｐｒｉｍｅｒ  ７：  ５’−  ＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＧＡＡ  −３’  （配列番号：９）
ｐｒｉｍｅｒ  ８：  ５’−  ＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＧＡＴＡＣＡＴＴＣＧＴＴＡＧＣＧＡＴＡＣＣＣＴＴＡＡＣ  −３’  （配列番号：１０）
【００４０】
セット５
ｐｒｉｍｅｒ  ９：  ５’−  ＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＴ  −３’  （配列番号：１１）
Ｐｒｉｍｅｒ  １０：  ５’−  ＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣｍｎｈＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡ  −３’  （配列番号：１２）
【００４１】
（２ｎｄＰＣＲによるライブラリ断片の作製）
前記オーバーラップエクステンションＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片（セット１、セット２、セット３、セット４、セット５）を鋳型としてＰＣＲ法により、ＡＳＰ２ライブラリ全長遺伝子が獲得された。ＰＣＲのための酵素はＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）を利用した。
【００４２】
以下の試薬が混合され、混合液を得た。
１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ      ４０  マイクロリットル
ｄＮＴＰｓ            ４０  マイクロリットル
ＭｇＳＯ４                      ２４  マイクロリットル
セット１                ８００  ナノグラム
セット２        ８００  ナノグラム
セット３                ８００  ナノグラム
セット４                ８００  ナノグラム
セット５                ８００  ナノグラム
Ｐｒｉｍｅｒ  １１          １２  マイクロリットル
Ｐｒｉｍｅｒ  １２                １２  マイクロリットル
Ｈ２Ｏ                          ２６４  マイクロリットル
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ      ８  マイクロリットル
【００４３】
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液を、摂氏９５度で２分間加熱した。
次いで、混合液の温度を、以下のサイクルに従って変化させた。
摂氏９６度で３０秒間
摂氏６０度で３０秒間、そして
摂氏６８度で６０秒間。
このサイクルが３０回繰り返された。
【００４４】
最後に、混合液を、摂氏６８度で１０分間加熱した後、摂氏４度で保存した。
【００４５】
このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
ｐｒｉｍｅｒ  １１：  ５’−  ＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＡＣＣＧＴＡ  −３’  （配列番号：１３）
ｐｒｉｍｅｒ  １２：  ５’−  ＣＴＧＣＴＴＧＣｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＴＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣ  −３’  （配列番号：１４）
【００４６】
（ライブラリ遺伝子の作製）
次に、作製した遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってライブラリ遺伝子が作製された。
【００４７】
市販されているプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）由来のプラスミドベクター１（５８５７塩基対、図４）が、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより処理された。図４における制限酵素サイトＢａｍＨＩは、ＧＧＡＴＣＣ（配列番号：１５）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＥｃｏＲＩは、ＧＡＡＴＴＣ（配列番号：１６）により表される遺伝子配列からなる。なお、プラスミドベクター１の詳細なベクターマップを図４に示す。
【００４８】
プラスミドベクター１は、以下の遺伝子配列（配列番号：１７）からなる。
ＡＣＧＧＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＣＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＴＡＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＣＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＧＧＡＣＴＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴｔａｔａａａａａａｃａＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＡＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＴＡＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＧＴＣＣＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡｃｔｃｇａｇＣＡＴＧＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＣＧＣＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＴＣＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＴＣＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＡＴＴＡＡＧＡＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＧＡＣＧＣＧＴＧＴＡＣＧＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＣＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＣＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＡＴＴＴＧＴＧＡＧＴＴＴＡＧＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＴＴＡＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＴＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＡＡＴＧＣＧＴＣＴＣＣＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＡＧＣＣＧＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＣＧＣＴＣＴＴＣＧＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＣＡＡＡＡＧＧＣＣＴＣＴＡＧＧＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＧＴＧＴＧＣＡＴＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＣＴＡＡＣＴＣＣＡＧＴＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＧＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＧＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＧＴＡＧＣＴＴＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＧＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＣＧＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＴＡＴＡＣＴＡＧＡＴＡＣＴＣＣＧＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＧＡＴＡＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＣＴＡＡＧＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＡＡＴＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＡＴＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＧＡＴＣＧＴＡＣＴＴＧＴＴＡＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＴＡＴＴＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＣＴＴＴＡＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＡＴＡＧＧＴＡＡＴＣＴＴＧＣＡＣＧＴＣＧＣＡＴＣＣＣＣＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＴＡＧＣＡＴＡＴＣＴＴＴＧＴＴＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣ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【００４９】
同様に、ＡＰＳ２＿ｄｎｋライブラリの遺伝子も制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより処理された。このようにして、ＡＰＳ２＿ｄｎｋ遺伝子断片が得られた。
【００５０】
このように処理されたプラスミドベクター１が、ＡＰＳ２＿ｄｎｋライブラリ遺伝子断片と、１：５の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社製、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で一晩静置された。このようにして、ＡＰＳ２＿ｄｎｋライブラリ遺伝子断片がプラスミドベクター１にライゲーションされた。
【００５１】
このようにして作製されたライゲーション産物を用いて、大腸菌（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品名：ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）が形質転換された。
【００５２】
次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢ培地で一晩培養された。このようにして培養された菌体を回収し、プラスミドを抽出して、ＡＰＳ２＿ｄｎｋ遺伝子ライブラリが得られた。
【００５３】
培養後、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、４．８ｘ１０７ＣＦＵの個数を有していた。
【００５４】
次に、作製されたＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリ遺伝子）を用いて酵母（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、商品名：ＢＹ４７４１）が形質転換された。
【００５５】
次いで、酵母は、ウラシル要求性ＳＤ培地上で２日間培養された。このようにしてＡＰＳ２＿ｄｎｋライブラリ遺伝子（ＡＳＰ２＿ｄｎｋ＿ｙｆｌｏＤ＿ｐＹ２）から得られるタンパク質を提示する酵母のライブラリが得られた。
【００５６】
培養後、ウラシル要求性ＳＤプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５ｘ１０５ｃｆｕ／ミリリットルの濃度を有していた。
【００５７】
コルチゾールに特異的に結合するＡＳＰ２が、上記酵母ライブラリから以下の手順に従って得られた。
【００５８】
（ＭＡＣＳによるコルチゾールに特異的に結合するＡＳＰ２のスクリーニング）
ＡＳＰ２＿ｄｎｋライブラリを発現した酵母の中から、コルチゾールに結合するクローンを抽出するため、３回のＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）を実施した。
【００５９】
ＡＳＰ２の遺伝子ライブラリに含まれるＡＳＰ２遺伝子断片が導入された酵母（ＢＹ４７４１）を、吸光度を示す値（ＯＤ６００）が０．０５から０．４になるまで摂氏３０度にて１０００ｍＬの発現用培地（２％ガラクトース、２％ラフィノース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、ペニシリンストレプトマイシンを含有したウラシル要求性ＳＵ−Ｃ培地）の培地中で培養し、酵母を増殖させた。
【００６０】
その後、培地を３，５００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、酵母を回収した。２５ｍＬの氷冷したＰＢＳＭ（５％  牛血清アルブミンを含有したＰＢＳ）にけん濁した後、再度遠心して上清を捨てた。この作業を２回繰り返した。
【００６１】
ＡＳＰ２を提示する酵母のライブラリ（およそ５Ｅ＋０９ＣＦＵ）が、１ミリリットルのＰＢＳＭと混合され、混合液を調製した。混合液に、ビオチン化コルチゾールが最終濃度１ｕＭとなるように注入された。振とう培養装置で室温にて一時間、穏やかに攪拌された。
【００６２】
その後、３，５００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、酵母を回収しＰＢＳＭで３回、洗浄された。
【００６３】
回収した酵母ライブラリは５ｍＬのＰＢＳＭにより再けん濁された。その後、１００  ｕＬのｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（ミルテニーバイオテク社製）が添加され、氷上で３０分間静置された。その後、得られた酵母ライブラリとｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓの混合液は１０ｕｍのフィルターでろ過された。
【００６４】
ＬＳカラム（ミルテニーバイオテク社製）がＭｉｄｉＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社製）に設置された。
【００６５】
ろ過した酵母ライブラリとｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓの混合液をＬＳカラムに添加した。全量がＬＳカラムを素通りした後、７ｍＬのＰＢＳＭをＬＳカラムに２回添加した。
【００６６】
その後、ＬＳカラムをＭｉｄｉＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒから外し、７ｍＬのウラシル要求性ＳＵ−Ｃ培地を添加してＬＳカラム中の酵母を溶出した。溶出した酵母を含んだ培地は３０℃で一晩振とう培養された。
【００６７】
１回目のＭＡＣＳ手順と全く同様に、２回目のＭＡＣＳおよび３回目のＭＡＣＳが行われた。言い換えれば、ＭＡＣＳが繰り返された。このようにして、ＡＳＰ２を提示する酵母が精製された。
【００６８】
（ＦＡＣＳによるコルチゾールに特異的に結合するＡＳＰ２のスクリーニング）
３回目のＭＡＣＳの後、溶出した酵母を含んだ培地は、３０℃で一晩振とう培養された。その後、吸光度を示す値（ＯＤ６００）が０．０５から０．４になるまで摂氏３０度にて１０ｍＬの発現用培地（２％ガラクトース、２％ラフィノース、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、ペニシリンストレプトマイシンを含有したウラシル要求性ＳＵ−Ｃ培地）の培地中で培養し、酵母を増殖させた。
【００６９】
培養した酵母は３，５００ｒｐｍで１０分間遠心して回収された。１０ｍＬの氷冷したＰＢＳＭにけん濁した後、再度遠心して上清を捨てた。この作業を３回繰り返した。
【００７０】
ＡＳＰ２を提示する酵母はが、１ミリリットルのＰＢＳＭと混合され、混合液を調製した。混合液に、ビオチン化コルチゾールが最終濃度１００ｎＭとなるように注入された。振とう培養装置で室温にて一時間、穏やかに攪拌された。
【００７１】
その後、３５００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心し、酵母を回収しＰＢＳＭで３回、洗浄された。
【００７２】
回収した酵母は１ｍＬのＰＢＳＭに再けん濁され、フィコエリスリン修飾ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｉｅｒ社製）とＦＩＴＣ修飾ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ（ＳＩＧＭＡ−ＡＲＤＬＩＣＨ社製）が添加され、氷上で３０分間静置された。
【００７３】
その後、３５００ｒｐｍの回転数で４℃にて１０分間遠心し、酵母を回収し、ＰＢＳＭで３回洗浄された。１ｍＬのＰＢＳＭで再けん濁された後、１００ｕＬが３ｍＬのＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ（登録商標）（ベクトン・ディッキットソン社製）に添加され、混合液とした。
【００７４】
混合液がＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（登録商標）ＩＩＣｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ベクトン・ディッキットソン社製）に添加されて、流速１３００  ｃｅｌｌ／分で分取が行われた。
【００７５】
蛍光波長５３０ｎｍ、５８５ｎｍで各酵母のＦＩＴＣおよびフィコエスリンの蛍光強度が測定された。図５に、ＦＡＣＳを用いたコルチゾール結合性ＡＳＰ２のスクリーニングマップを示す。図５に示すＰ５の枠内の酵母が回収すべき酵母として選別された。
【００７６】
回収された酵母はウラシル要求性ＳＤ寒天培地に塗布され、３０℃で二晩培養された。
【００７７】
（コルチゾール結合性ＡＳＰ２の遺伝子配列解析）
ＦＡＣＳで回収した酵母に含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。以下の１つＤＮＡ配列が見いだされた（配列番号：１８）。Ｐ５−２１と名づけた。
【００７８】
ＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＴＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＧＡＡＴＧＴＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣ（配列番号：１８）
【００７９】
上記により表されるＤＮＡ配列から合成されるタンパク質は、以下のアミノ酸配列からなる（配列番号：１）。
ＩＤＱＤＴＶＩＡＫＹＶＥＹＬＭＰＤＩＭＰＣＡＤＥＬＨＩＳＥＤＩＡＴＮＩＱＡＡＫＮＧＡＤＭＳＱＬＧＣＬＫＡＣＦＭＫＲＫＥＭＬＫＧＴＥＬＹＶＥＰＶＹＫＭＩＥＶＶＨＡＧＮＡＤＤＩＱＬＶＫＧＩＡＮＥＣＩＥＮＡＫＧＥＴＤＥＣＮＩＧＮＫＹＴＤＣＹＩＥＫＬＦＦ（配列番号：１）
【００８０】
（コルチゾール結合性ＡＳＰ２の発現）
市販のｐＰＩＣＺａｌｐｈａ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を発現ベクターとして用いた。ＰＣＲ法にて制限酵素サイトＸｈｏＩおよびＮｏｔＩが含まれたＰ５−２１が獲得され、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで制限酵素処理を行い、同様に制限酵素処理したｐＰＩＣＺａｌｐｈａ断片とライゲーションを行った。以下、付加された手順を詳細に説明する。
【００８１】
まず、以下２つのプライマー（配列番号：１９および２０）を用いて、ＰＣＲ法により、Ｐ５−２１遺伝子断片がコードされたプラスミドベクター１（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）から、Ｐ５−２１遺伝子断片が複製された。
【００８２】
Ｐｒｉｍｅｒ  １３：  ５’−  ＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧ  −３’（配列番号：１９）
Ｐｒｉｍｅｒ  １４：  ５’−  ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣＡＡ  ＴＧＴＡＧＣＡＡＴＣＴＧ  −３’（配列番号：２０）
【００８３】
このようにして、以下に表されるアミノ酸配列（配列番号：２１）をコードする遺伝子配列を含む以下の１つのＤＮＡが得られた。
５’−ＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＴＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＴＡＣＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＣＴＡＡＣＧＡＡＴＧＴＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣ  −３’ （配列番号：２１）
【００８４】
ＰＣＲのための酵素はＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）が使用された。
以下の試薬が混合され、混合液を得た。
Ｔｅｍｐｌａｔｅ        ０．５  マイクロリットル
１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ      ５  マイクロリットル
ｄＮＴＰｓ            ５  マイクロリットル
ＭｇＳＯ４                      ３  マイクロリットル
Ｐｒｉｍｅｒ  １          １．５  マイクロリットル
Ｐｒｉｍｅｒ  ２        １．５  マイクロリットル
Ｈ２Ｏ                            マイクロリットル
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｎｅｏ      １  マイクロリットル
【００８５】
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。
摂氏９６度で３０秒間
摂氏６０度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。
このサイクルが３０回繰り返された。
【００８６】
最後に、混合液は、摂氏６８度で１０分間加熱した後、摂氏４度で保存された。
【００８７】
Ｐ５−２１遺伝子断片およびベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａは制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩにより処理された。本実施例における制限酵素サイトＸｈｏＩは、ＣＴＣＧＡＧ（配列番号：２２）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＮｏｔＩは、ＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号：２３）により表される遺伝子配列からなる。
【００８８】
このように処理されたＰ５−２１遺伝子断片およびベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａが、１：１の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社製、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で３０分間静置された。このようにして、Ｐ５−２１遺伝子断片がベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａにライゲーションされた。
【００８９】
ライゲーション溶液が大腸菌ＤＨ５ａｐｌｈａ（ニッポンジーン製、５０マイクロリットル）と氷上にて混合された。混合液は、１０分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、２分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。
【００９０】
摂氏３７度で１時間振とう培養後、全量の混合液が、２５マイクログラム／ミリリットルの濃度でｚｅｏｃｉｎを含有するＬＢ培地（ＬＢ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地）上に散布された。ＬＢ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。
【００９１】
ＬＢ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地（４ミリリットル）で一晩培養された。
【００９２】
培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ製、商品名：ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて、ＬＢ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地から抽出された。目的のＰ５−２１の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、以下の配列を有する５’ＡＯＸ１  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒが用いられた。
５’ＡＯＸ１  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ  ：  ５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ  −３’ （配列番号：２４）
【００９３】
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。
【００９４】
選択されたプラスミドを用いて、酵母（ＧＳ１１５Ｓ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）が形質転換された。
【００９５】
形質転換された酵母を含有する溶液は、回転数１３０００ｒｐｍ、４度にて１分間遠心し、上清を除去した後、滅菌水（１ミリリットル）が添加された。
【００９６】
得られた酵母溶液（１ミリリットル）は、２５マイクログラム／ミリリットルの濃度のＺｅｏｃｉｎを含有したＳＤ培地（ＳＤ＋Ｚｅｏｃｉｎ）に散布された。ＳＤ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地は、摂氏３０度の温度で二晩、静置された。
【００９７】
ＳＤ＋Ｚｅｏｃｉｎ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＢＭＧＹ培地（５０ミリリットル）中で、２００ｒｐｍで振とうされながら摂氏３０度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。
【００９８】
さらに、培養液（５０ミリリットル）は回転数３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、培地を除去し、ＢＭＭＹ培地（１０００ミリリットル）に再けん濁された。混合液は摂氏３０度の温度で１２０ｒｐｍで４日間振とうされた。
【００９９】
培養されたＢＭＭＹ培地を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。
【０１００】
回収されたＢＭＭＭ培地はＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（メルク株式会社製）で濃縮された。濃縮液は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。
【０１０１】
濾液は、Ｈｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルのＮｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅに対して５ミリリットルを有する溶出バッファが用いられた。
【０１０２】
このようにして得られた溶液に含有されるコルチゾール結合性ＡＳＰ２  Ｐ５−２１は、吸光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製、商品名：ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、Ｐ５−２１の濃度は０．９ミリグラム／ミリリットルであった。
【０１０３】
（蛍光法によるコルチゾール結合性ＡＳＰ２  Ｐ５−２１の結合活性評価）
ヒドロコルチゾンおよびＮ−フェニル−１−ナフチルアミン（１−ＮＰＮ）を用いて、Ｐ５−２１が以下のように評価された。蛍光法の詳細は以下の通りである。
蛍光プレートリーダー：  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社製）
バッファ：  ＰＢＳ（ニッポンジーン製）
コルチゾール：  ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）
蛍光色素：  １−ＮＰＮ（東京化成工業製）
【０１０４】
被分析物として、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰ５−２１が用いられた。１点目〜８点目の分析において、反応液に含有されるコルチゾールの最終濃度は、それぞれ、０μＭ、０．３９μＭ、０．７８μＭ、１．５６μＭ、３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭに調整された。
【０１０５】
８点全ての反応液に対して、最終濃度２μＭの１−ＮＰＮ、最終濃度２μＭのＰ５−２１が調整された。
【０１０６】
図６は蛍光法により得られた評価結果を示すグラフである。各コルチゾール濃度における最大蛍光波長４００  ｎｍの蛍光強度がプロットされ（図７）、解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェアＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（ＨＵＬＩＮＫＳ社製）を用いて算出された。その結果、コルチゾール結合性ＡＳＰ２  Ｐ５−２１（実施例）の解離定数Ｋｄは、２．７μＭであった。
【０１０７】
なお、比較例として、図７には、天然のにおい結合性タンパク質ｗｔ＿ＡＳＰ２（配列番号２５）の各コルチゾール濃度における最大蛍光波長４００  ｎｍの蛍光強度をもプロットした。その結果、本発明のタンパク質の方が優れた結合性を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本開示のコルチゾール結合タンパク質は、熱安定性が高く、コルチゾールに対する結合能に優れる。このため、本開示のコルチゾール結合タンパク質は、コルチゾールの検出装置及び検出方法において利用可能である。
【図１】
2019196325.tif 000003
【図２】
2019196325.tif 000004
【図３】
2019196325.tif 000005
【図４】
2019196325.tif 000006
【図５】
2019196325.tif 000007
【図６】
2019196325.tif 000008
【図７】
2019196325.tif 000009
【配列表】
2019196325000001.app