(57)【要約】【課題】トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さずに目的のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる新規のプラスチド移行シグナルペプチドを提供する。【解決手段】プラスチド移行シグナルペプチドは、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなる。（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上であるアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列；（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるプラスチド移行シグナルペプチド。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上であるアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【請求項２】
請求項１に記載のプラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
さらに、デンプン分解酵素をコードする核酸を含む請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記デンプン分解酵素がα−アミラーゼである請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項２に記載の核酸を含む第１のベクターと、
デンプン分解酵素コードする核酸を含む第２のベクターと、
を備えるベクターセット。
【請求項７】
さらに、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む第３のベクターを備える請求項６に記載のベクターセット。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２位及び７位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【請求項８】
請求項１に記載のプラスチド移行シグナルペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む遺伝子改変植物。
【請求項９】
染色体上において標的遺伝子の上流又は下流に請求項２に記載の核酸が挿入された遺伝子改変植物。
【請求項１０】
請求項１に記載のプラスチド移行シグナルペプチド、請求項３に記載のベクター又は請求項６若しくは７に記載のベクターセットを用いる遺伝子改変植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスチド移行シグナルペプチド及びその使用に関する。具体的には、本発明は、プラスチド移行シグナルペプチド、核酸、ベクター、ベクターセット、遺伝子改変植物及び遺伝子改変植物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチドとは、葉緑体、アミロプラスト、クロモプラスト、エチオプラストやプロプラスチド等の総称であり、植物細胞に存在する特有なオルガネラである。プラスチドは独自のＤＮＡを有するが遺伝子の数は限られており、このオルガネラの分化及び機能発現は細胞核ゲノム遺伝子にコードされた機能タンパク質がプラスチドに輸送及び局在化することによって導かれる。プラスチド外から移入される多くのプラスチドタンパク質はトランジットペプチドを持つ前駆体として合成され、この前駆体はプラスチド包膜に存在するＴｏｃ−Ｔｉｃ複合体という膜透過装置を介してプラスチド中へ輸送されることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、近年、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さないプラスチドへの輸送経路の存在が明らかになってきた（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Jarvis P, “Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.”, New Phytol, Vol. 179, p257-285, 2008.
【非特許文献２】Shiraya T et al., “Golgi/plastid-type manganese superoxide dismutase involved in heat-stress tolerance during grain filling of rice.”, Plant Biotechnol J., Vol. 13, Issue 9, p1251-1263, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
高等植物細胞におけるプラスチドの分化及び機能発現は、プラスチドゲノム遺伝子と細胞核ゲノム遺伝子とによって調節されるが、細胞核ゲノムにコードされたプラスチドタンパク質はプラスチドゲノム遺伝子産物に比べてはるかに多い。視点を変えれば、プラスチドは様々なタンパク質を多量に取り込む能力を有すると捉えることができる。しかしながら、これまで、タンパク質をプラスチドに高蓄積させるという発想及び取組はなかった。
また、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さないプラスチドへの輸送経路の具体的な仕組みについては未だ解明されていなかった。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さずに目的のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる新規のプラスチド移行シグナルペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るプラスチド移行シグナルペプチドは、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上であるアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【０００７】
本発明の第２態様に係る核酸は、上記第１態様に係るプラスチド移行シグナルペプチドをコードする。
【０００８】
本発明の第３態様に係るベクターは、上記第２態様に係る核酸を含む。
上記第３態様に係るベクターは、さらに、デンプン分解酵素をコードする核酸を含んでもよい。
前記デンプン分解酵素がα−アミラーゼであってもよい。
【０００９】
本発明の第４態様に係るベクターセットは、上記第２態様に係る核酸を含む第１のベクターと、デンプン分解酵素コードする核酸を含む第２のベクターと、を備える。
上記第４態様に係るベクターセットは、さらに、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む第３のベクターを備えてもよい。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２位及び７位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【００１０】
本発明の第５態様に係る遺伝子改変植物は、上記第１態様に係るプラスチド移行シグナルペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む。
【００１１】
本発明の第６態様に係る遺伝子改変植物は、染色体上において標的遺伝子の上流又は下流に上記第２態様に係る核酸が挿入されている。
【００１２】
本発明の第７態様に係る遺伝子改変植物の製造方法は、上記第１態様に係るプラスチド移行シグナルペプチド、上記第３態様に係るベクター又は上記第４態様に係るベクターセットを用いる方法である。
【発明の効果】
【００１３】
上記態様のプラスチド移行シグナルペプチドによれば、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さずに目的のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】実施例１におけるｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ、又は、ｐＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを導入したイネ細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図１Ｂ】実施例１におけるｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ、又は、ｐＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを導入したイネ細胞でのＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄによって標識されたプラスチド（色素体及びミトコンドリア）の数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチド（色素体及びミトコンドリア）の数の比を示すグラフである。
【図２Ａ】実施例２における各カルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１の構造を示す体系図である。
【図２Ｂ】実施例２における各カルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１とＧＦＰとの融合タンパク質及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ又はＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図２Ｃ】実施例２における各カルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１とＧＦＰとの融合タンパク質及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ又はＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞でのＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ又はＳＴ−ＲＦＰによって標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数に対するＧＦＰによって標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数の比を示すグラフである。
【図２Ｄ】実施例２における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質の第２の膜通過ドメイン（ＴＭＤ２）のアミノ酸配列、及び、ＴＭＮ７のＴＭＤ２の変異体（タイプ１〜３）のＴＭＤ２のアミノ酸配列を示す体系図である。
【図２Ｅ】実施例２における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質、又は、ＴＭＮ７の第２の膜通過ドメイン（ＴＭＤ２）の変異体（タイプ１〜３）とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図２Ｆ】実施例２における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質、又は、ＴＭＮ７の第２の膜通過ドメイン（ＴＭＤ２）の変異体（タイプ１〜３）とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞でのＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄによって標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例２におけるＴＭＮ１のＴＭＤ２のアミノ酸置換変異体（Ｙ３５１Ａ）の構造を示す体系図である。
【図３Ｂ】実施例２におけるＴＭＮ１（全長）とＧＦＰとの融合タンパク質又はＴＭＮ１のＴＭＤ２のアミノ酸置換変異体（Ｙ３５１Ａ）とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図３Ｃ】実施例２におけるＴＭＮ１（全長）とＧＦＰとの融合タンパク質又はＴＭＮ１のＴＭＤ２のアミノ酸置換変異体（Ｙ３５１Ａ）とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞でのＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄによって標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を示すグラフである。
【図４Ａ】実施例３におけるＴＭＮ１とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、ＳＴ−ｍＲＦＰを発現させ、ジメチルスルホキシド （Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）又はブレフェルジンＡ（Ｂｌｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ：ＢＦＡ）存在下で培養したタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図４Ｂ】実施例３におけるＴＭＮ１とＧＦＰとの融合タンパク質又はＴＭＮ１（１−６３９）とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、ＳＴ−ｍＲＦＰ又はＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させ、ＤＭＳＯ存在下、ＢＦＡ存在下又はＤＭＳＯ及びＢＦＡ非存在下で培養したタマネギ表皮細胞（野生型、ＡＲＦ１（Ｑ７１Ｌ）ドミナントネガティブ変異体及びＳＡＲ１（Ｈ７４Ｌ）ドミナントネガティブ変異体）の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図４Ｃ】実施例３における各条件のタマネギ表皮細胞でのＳＴ−ｍＲＦＰ又はＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数に対するＧＦＰによって標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数の比を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例４におけるＡｍｙｌ−１とＧＦＰとの融合タンパク質、及び、ＴＭＮ１とｍＣｈｅｒｒｙとの融合タンパク質を発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図５Ｂ】実施例４における各種融合タンパク質を発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。「ａ」は、Ａｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ、Ｈｉｓ−ｃＹＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。「ｂ」は、ＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ、Ｈｉｓ−ｎＹＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。「ｃ」は、Ａｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ、ＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。
【図５Ｃ】図５Ｂの画像から算出されたＡｍｙｌ−１−ＧＦＰ及びＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙの局在化している箇所の面積の割合を示すグラフである。「ａ」は、ＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙで標識された箇所の面積に対するＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所の面積の比である。「ｂ」は、Ａｍｙｌ−１−ＧＦＰで標識された箇所の面積に対するＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所の面積の比である。
【図５Ｄ】図５Ｂの画像から算出されたＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識された面積に対するＹＦＰで標識された面積の比を示すグラフである。「ａ〜ｃ」は図５Ｂと同じである。
【図５Ｅ】実施例４における各ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物及び野生型のイネ科植物でのＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対するＴＭＮ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比を示すグラフである。
【図５Ｆ】実施例４における各ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物及び野生型のイネ科植物のヨウ素染色像である。
【図５Ｇ】実施例４におけるＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統（２−２系統）及び野生型のイネ科植物のデンプンを定量した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例５における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質及びＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図６Ｂ】実施例５における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質及びＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞でのＳＴ−ＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を示すグラフである。
【図６Ｃ】実施例５における各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＣ末端尾部のアミノ酸配列、並びに、ＴＭＮ１のアミノ酸欠失及びアミノ酸置換変異体のＣ末端尾部のアミノ酸配列を示す体系図である。
【図６Ｄ】実施例５における各ＴＭＮ１変異体とＧＦＰとの融合タンパク質及びＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図６Ｅ】実施例５における各ＴＭＮ１変異体とＧＦＰとの融合タンパク質及びＳＴ−ＲＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞でのＳＴ−ＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例６におけるＴＭＮ１とＧＦＰとＣＴとの融合タンパク質であるＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴ及びＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴの構造を示す体系図である。
【図７Ｂ】実施例６におけるＴＭＮ１とＧＦＰとＣＴとの各融合タンパク質とＳＴ−ＲＦＰとを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。上の図が、ＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴを発現させたタマネギ表皮細胞であり、下の図がＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴを発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。スケールバーは、１０μｍを示す。
【図７Ｃ】実施例６におけるＴＭＮ１−ＧＦＰ、ＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴ又はＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴとＳＴ−ＲＦＰとを発現させたタマネギ表皮細胞でのＳＴ−ＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を示すグラフである。
【図８】実施例７におけるＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）とｍＲＦＰとの融合タンパク質及びＡｔＳｅｃ２２とＧＦＰとの融合タンパク質を発現させたタマネギ表皮細胞の蛍光像である。
【図９】分泌経路を介した複数の経路からのコメＴＭＮ１のプラスチド局在化の仮説モデルである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪プラスチド移行シグナルペプチド≫
本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドは、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなる。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上であるアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【００１６】
本発明者は、イネのトランスメンブレン９ファミリータンパク質１（ＴＭＮ１）が分泌経路からプラスチドに局在化することから、ＴＭＮ１中の特定の領域がプラスチド移行シグナルペプチドとして機能することを見出し、本発明を完成するに至った。
本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドによれば、後述する実施例に記載のとおり、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さずに目的のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる。また、本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドによれば、後述する実施例に記載のとおり、ゴルジ体を経由した輸送経路である小胞体（ＥＲ）−ゴルジ体−プラスチド間の輸送経路を介さずに、目的のタンパク質を直接プラスチドへ輸送することができる。
なお、一般に、「プラスチド」とは、植物や藻類等が有する細胞小器官（オルガネラ）であって、光合成等の同化作用、糖や脂肪等の貯蔵、様々な種類の化合物の合成等を担う、半自律的な細胞小器官の総称である。また、色素体と呼ばれる場合もある。プラスチドとして具体的には、例えば、アミロプラスト、葉緑体、エチオプラスト、エライオプラスト、有色体、白色体等が挙げられ、これらに限定されない。本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドによれば、任意のタンパク質を上記例示されたプラスチドに蓄積させることができる。
【００１７】
本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドは、下記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドである。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列
【００１８】
上記（１）における配列番号１に示されるアミノ酸配列は、下記のアミノ酸配列に示される配列である。
ＣＶＹＶＧＴＧＶＱＦＦＧＭＬＬＶＴＭＩＦＡＶＬ（配列番号１）
【００１９】
この配列番号１に示されるアミノ酸配列は、後述する実施例に記載されているとおり、ＴＭＮ１の第２の膜貫通ドメイン（ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ；ＴＭＤ２）として同定されたアミノ酸配列であり、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドは、プラスチド局在化能を有する。さらに、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、後述する実施例に記載のとおり、配列番号１に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号３位のチロシン残基は、プラスミド局在能に必須である。
なお、本明細書において、「プラスチド局在化能」とは、任意のタンパク質をプラスチドへ輸送し局在化させる能力を意味する。すなわち、本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドを任意のタンパク質のＮ末端側又はＣ末端側に結合させてなる融合タンパク質を植物細胞内に導入することで、任意のタンパク質をプラスチド内に蓄積させることができる。
【００２０】
本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドは、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記（２）又は（３）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上であるアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号３位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【００２１】
なお、上記（２）又は（３）のアミノ酸配列からなるペプチドは、全体の構造が上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと同等であることにより、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等である、すなわち、プラスチド局在化能を有することができる。
【００２２】
上記（２）のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるためには、８５％以上の同一性を有する。係る同一性としては、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００２３】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（Ａ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
「配列同一性（％）」  ＝  ［一致したアミノ酸の数］／［対象アミノ酸配列のアミノ酸の総数］×１００  （Ａ）
【００２４】
また、上記（３）のアミノ酸からなるペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００２５】
なお、本明細書中において、「置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本実施形態のペプチドの属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン及びヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン及びスレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン及びメチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン及びグルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン）等で分類することができる。
【００２６】
≪核酸≫
本実施形態の核酸は、上記実施形態に係るプラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸である。
【００２７】
本実施形態の核酸によれば、プラスチド局在化能を有するペプチドを得ることができる。
【００２８】
上記ペプチドをコードする核酸としては、例えば、以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの塩基配列からなる核酸等が挙げられる。
（Ｉ）配列番号３に示される塩基配列
（ＩＩ）配列番号３に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
（ＩＩＩ）配列番号３に示される塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
（ＩＶ）配列番号３に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストトリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
【００２９】
なお、上記（Ｉ）に示す配列番号３に示される塩基配列は、上記（１）に示す配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
【００３０】
また、上記（ＩＩ）に示す塩基配列からなる核酸がコードするペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上９個以下が好ましく、１個以上６個以下がより好ましく、１個以上３個以下がさらに好ましく、１個以上２個以下が特に好ましく、１個が最も好ましい。
【００３１】
上記（ＩＩＩ）に示す塩基配列からなる核酸がコードするペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるためには、８５％以上の同一性を有する。係る同一性としては、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００３２】
ここで、基準塩基配列に対する、対照塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（Ｂ）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
「配列同一性（％）」  ＝  ［一致した塩基数］／［対象塩基配列の総塩基数］×１００  （Ｂ）
【００３３】
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、ハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。前記ハイブリダイゼーションバッファーとしては、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム、０．３Ｍ クエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び、５０％フォルムアミドからなる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液が好ましく、０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液がより好ましい。
【００３４】
≪ベクター≫
本実施形態のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む。
【００３５】
本実施形態のベクターに含まれる上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸の上流又は下流に任意のタンパク質をコードする核酸を挿入することで、プラスチド局在化能を有するペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質を得ることができる。また、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸の上流又は下流に任意のタンパク質をコードする核酸が挿入された本実施形態のベクターを植物細胞に導入することで、プラスミドに任意のタンパク質を蓄積させることができる。
【００３６】
本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に限定されず、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系のベクター等が挙げられる。特に、植物細胞又植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウム属細菌を介する方法である場合には、ｐＢＩ系又はｐＰＺＰ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等が挙げられる。ｐＰＺＰ系のバイナリーベクターとして具体的には、例えば、ｐＰＺＰ１００、ｐＰＺＰ２００、ｐＰＺＰ５００、ｐＰＺＰ３４２５等が挙げられる。
【００３７】
植物内に、本実施形態のベクターを導入する場合、上記核酸は少なくとも核酸導入後に植物が再生可能な組織又は未分化細胞を含む組織において発現されることが好ましい。核酸導入後に植物が再生可能な組織として具体的には、例えば、葉等が挙げられる。未分化細胞を含む組織として具体的には、例えば、カルス、メリステム等が挙げられる。
上記核酸を葉又はカルス等において発現させる場合、葉又はカルス等において特異的に核酸を発現させる転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。或いは、葉又はカルス等から成長及び分化した植物体全体で核酸を発現させる恒常的プロモーター等の転写調節領域によって、核酸を発現させてもよい。
恒常的プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター等が挙げられる。
転写調節領域によって核酸を発現させる方法は公知であり、例えば、発現させるべき核酸をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに、転写調節領域を作動可能に連結されることが挙げられる。
【００３８】
なお、本明細書において、「作動可能に連結されている」とは、前記転写調節領域が核酸の発現を調節可能であることを意味する。
また、「転写調節領域」としては、転写開始や転写効率を制御可能な配列であり、例えば、プロモーター、エンハンサー、応答配列等が挙げられる。
また、「葉、カルス又は植物体全体において転写調節可能な転写調節領域」とは、植物体を構成する細胞において核酸の転写を調節可能であることを意味する。より詳しくは、植物体全体において転写調節可能な転写調節領域とは、前記核酸が、植物体の中でも特に、形質転換後に植物体の再生が可能な組織に作用可能なように転写調節可能な転写調節領域である。
葉、カルス又は植物体全体において転写調節可能な転写調節領域としては、形質転換後に植物体の再生が可能な葉、カルス又は植物体全体において遺伝子の発現をもたらし得る転写調節領域が好ましく、葉又はカルスにおいて特異的に核酸の発現をもたらし得る転写調節領域がより好ましい。
【００３９】
本実施形態のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸に加えて、さらに、デンプン分解酵素をコードする核酸を含んでもよい。
前記デンプン分解酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ等が挙げられ、中でも、α−アミラーゼが好ましい。α−アミラーゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号４に示される塩基配列（イネのα−アミラーゼｌ−１遺伝子（Ａｍｙｌ−１）の塩基配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１０１７４４））からなる核酸等が挙げられる。
【００４０】
本実施形態のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸に加えて、さらに、例えば、薬剤耐性配列、マーカー配列等の配列を有していてもよい。
【００４１】
本実施形態のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸等を、ベクターに組み込むことで製造可能である。該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【００４２】
≪ベクターセット≫
本実施形態のベクターセットは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む第１のベクターと、デンプン分解酵素コードする核酸を含む第２のベクターと、を備える。
【００４３】
本実施形態のベクターセットによれば、任意のタンパク質をプラスチドに輸送及び局在化でき、同時に、プラスミド（特に、アミロプラスト）に貯蔵されているデンプンを分解できるため、より効率的に任意のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる。
【００４４】
第１のベクター及び第２のベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては、上述の「＜ベクター＞」にて例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４５】
＜第１のベクター＞
第１のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む。
第１のベクターとしては具体的には、上述の「＜ベクター＞」にて例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４６】
＜第２のベクター＞
第２のベクターは、デンプン分解酵素コードする核酸を含む。
デンプン分解酵素としては、上述の「＜ベクター＞」にて例示されたものと同様のものが挙げられ、中でも、α−アミラーゼが好ましい。
また、第２のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸の代わりに、上記デンプン分解酵素コードする核酸を含む以外は、第１のベクターと同じ構成とすることができる。また、第２のベクターは、上記デンプン分解酵素コードする核酸に加えて、その上流又は下流に、さらに、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含んでもよい。
【００４７】
＜第３のベクター＞
本実施形態のベクターセットは、上記第１のベクター及び上記第２のベクターに加えて、さらに、以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなるゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む第３のベクターを備えてもよい。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２位及び７位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【００４８】
本実施形態のベクターセットにおいて、上記第１のベクター及び上記第２のベクターに加えて、上記第３のベクターを備えることで、任意のタンパク質をプラスチドへ直接輸送する経路に加えて、任意のタンパク質を、ゴルジ体を介してプラスチドへ輸送する経路（ゴルジ体−プラスチド間の輸送経路）からも輸送することができる。従って、複数の経路から任意のタンパク質をプラスチドに輸送することができるため、より効率的に任意のタンパク質をプラスミドに蓄積させることができる。
【００４９】
［ゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸］
ゴルジ体移行シグナルペプチドのアミノ酸配列として例示された、上記（１）における配列番号２に示されるアミノ酸配列は、下記のアミノ酸配列に示される配列である。
ＷＦＴＲＬＩＹＳＳＶＫＩＤ（配列番号２）
【００５０】
この配列番号２に示されるアミノ酸配列は、後述する実施例に記載されているとおり、ＴＭＮ１の細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ；ＣＴ）として同定されたアミノ酸配列であり、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドは、ゴルジ体局在化能を有する。さらに、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、後述する実施例に記載のとおり、配列番号２に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸番号２位のフェニルアラニン残基及び７位のチロシン残基は、ゴルジ体局在能に必須である。
なお、本明細書において、「ゴルジ体局在化能」とは、任意のタンパク質をゴルジ体へ輸送し局在化させる能力を意味する。すなわち、上記ゴルジ体移行シグナルペプチドを任意のタンパク質のＮ末端側又はＣ末端側に結合させてなる融合タンパク質を植物細胞内に導入することで、任意のタンパク質を、ゴルジ体を介してプラスチド内に蓄積させることができる。
【００５１】
ゴルジ体移行シグナルペプチドは、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記（２）又は（３）のアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２位及び７位以外の部位において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、ゴルジ体局在化能を有するペプチドのアミノ酸配列
【００５２】
なお、上記（２）又は（３）のアミノ酸配列からなるペプチドは、全体の構造が上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと同等であることにより、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等である、すなわち、ゴルジ体局在化能を有することができる。
【００５３】
上記（２）のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるためには、８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００５４】
ここで、基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、上記「＜プラスチド移行シグナルペプチド＞」において記載の方法と同様の方法を用いて、求めることができる。
【００５５】
また、上記（３）のアミノ酸からなるペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【００５６】
ゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸として具体的には、例えば、以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの塩基配列からなる核酸等が挙げられる。
（Ｉ）配列番号５に示される塩基配列
（ＩＩ）配列番号５に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
（ＩＩＩ）配列番号５に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
（ＩＶ）配列番号５に示される塩基配列からなる核酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストトリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、プラスチド局在化能を有するペプチドをコードする核酸の塩基配列
【００５７】
なお、上記（Ｉ）に示す配列番号５に示される塩基配列は、上記（１）に示す配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードする核酸の塩基配列である。
【００５８】
また、上記（ＩＩ）に示す塩基配列からなる核酸がコードするペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるために、欠失、置換又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上９個以下が好ましく、１個以上６個以下がより好ましく、１個以上３個以下がさらに好ましく、１個以上２個以下が特に好ましく、１個が最も好ましい。
【００５９】
上記（ＩＩＩ）に示す塩基配列からなる核酸がコードするペプチドにおいて、上記（１）のアミノ酸配列からなるペプチドと機能的に同等であるためには、８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００６０】
ここで、基準塩基配列に対する、対照塩基配列の配列同一性は、上記「＜プラスチド移行シグナルペプチド＞」において記載の方法と同様の方法を用いて、求めることができる。
【００６１】
［その他構成成分］
第３のベクターは、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸の代わりに、上記ゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸を含む以外は、第１のベクターと同じ構成とすることができる。
【００６２】
＜ベクターセットの製造方法＞
本実施形態のベクターセットにおいて、第１のベクター、第２のベクター及び第３のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸、上記デンプン分解酵素コードする核酸及び上記ゴルジ体移行シグナルペプチドをコードする核酸等を、それぞれベクターに組み込むことで製造可能である。該核酸を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【００６３】
≪遺伝子改変植物≫
＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態に係る遺伝子改変植物は、上記プラスチド移行シグナルペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む。
【００６４】
本実施形態の遺伝子改変植物では、プラスチド内に任意のタンパク質を効率的に蓄積させることができる。
【００６５】
本実施形態の遺伝子改変植物としては、被子植物が好ましい。被子植物としては、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよく、中でも、単子葉植物が好ましい。
単子葉植物として具体的には、例えば、ショウブ目（Ａｃｏｒａｌｅｓ）、オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、キジカクシ目（Ａｓｐａｒａｇａｌｅｓ）、ヤマノイモ目（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｉａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サクライソウ目（Ｐｅｔｒｏｓａｖｉａｌｅｓ）、ツユクサ類（ｃｏｍｍｅｌｉｎｉｄｓ）等が挙げられる。ツユクサ類としては、例えば、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）等が挙げられる。中でも、単子葉植物としては、イネ目の植物が好ましい。
【００６６】
また、本実施形態において、植物は、植物個体のみのならず細胞を包含する。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。中でも、本実施形態において、植物としては、植物体、植物細胞、植物培養細胞又はカルスであることが好ましい。
【００６７】
＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態に係る遺伝子改変植物は、染色体上において標的遺伝子の上流又は下流に上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸が挿入されている。
【００６８】
本実施形態の遺伝子改変植物では、プラスチド内に任意のタンパク質を効率的に蓄積させることができる。さらに、本実施形態の遺伝子改変植物は、染色体上に上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸が挿入されているため、該植物体同士を交配させることで、プラスチド内に任意のタンパク質を効率的に蓄積できる植物体を容易に作出することができる。
【００６９】
標的遺伝子としては、プラスチドに蓄積させたい任意のタンパク質をコードする遺伝子であればよく、特別な限定はない。
【００７０】
＜遺伝子改変植物の製造方法＞
本実施形態の遺伝子改変植物は、上記実施形態に係るプラスチド移行シグナルペプチド、上記実施形態に係るプラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含むベクター又は上記実施形態に係るベクターセットを用いることで製造することができる。
【００７１】
＜第１実施形態＞
上記第１実施形態に係る遺伝子改変植物を製造する場合には、例えば、上記プラスチド移行シグナルペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを植物へ導入することで製造することができる、
【００７２】
ベクターの植物への導入方法としては、例えば、アグロバクテリウム属細菌等のバクテリアを介する方法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法が挙げられる。中でも、導入方法としては、アグロバクテリウム属細菌等のバクテリアを介する方法であることが好ましく、アグロバクテリウム属細菌を介する方法であることがより好ましい。
また、アグロバクテリウム属細菌を介する方法により導入する場合には、まず、宿主であるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）へベクターを組み込む必要がある。組み込む方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウィスカー法等の公知の方法が挙げられる。
【００７３】
次いで、上記プラスチド移行シグナルペプチドと任意のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターが導入された植物を選抜することで、本実施形態の遺伝子改変植物を得ることができる。
【００７４】
＜第２実施形態＞
上記第２実施形態に係る遺伝子改変植物を製造する場合には、例えば、公知のゲノム編集技術を用いて、染色体上において、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を標的遺伝子の上流又は下流に挿入することで製造することができる。このとき、標的遺伝子は、植物が元々備えている内在遺伝子であってもよく、上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸の上流又は下流に連結された状態で外部から導入された外来遺伝子であってもよい。
【００７５】
公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて遺伝子改変植物を製造する方法として具体的には、植物に、Ｃａｓ９、染色体上の上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を挿入したい遺伝子領域に対するガイドＲＮＡ及び上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸を含むベクターを導入する。導入方法としては、上記「ベクターの植物への導入方法」として例示されたものと同様のものが挙げられる。
次いで、染色体上において標的遺伝子の上流又は下流に上記プラスチド移行シグナルペプチドをコードする核酸が挿入された植物を選抜することで、本実施形態の遺伝子改変植物を得ることができる。
【００７７】
＜用途＞
本実施形態の遺伝子改変植物において、例えば、プラスチドに蓄積させる任意のタンパク質が特定の感染症に対する組み換えタンパク質ワクチンである場合、本実施形態の遺伝子改変植物を用いることで、大量のワクチンを容易に製造することができる。
【００７８】
また、例えば、プラスチドに蓄積させる任意のタンパク質が、植物性タンパク質であって、対象となる植物が食用又は飼料用の穀物や野菜である場合、植物性タンパク質の含有量が通常の穀物や野菜よりも多い（植物性タンパク質の含有量が増強された）穀物や野菜を得ることができる。該穀物や野菜は、栄養機能食品として有用である。また、該穀物や野菜は家畜用の飼料としても有用である。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
［実施例１］ＴＭＮ１のイネ細胞における細胞内局在の確認試験
ゴルジ体膜に蓄積されることが知られているイネのトランスメンブレン９ファミリータンパク質１（ＴＭＮ１）の機能を評価するために、ＴＭＮ１−ＧＦＰ融合タンパク質をイネ細胞において発現させ、その細胞内局在を調べた。具体的には、以下に示す手順に従い、試験を行った。
【００８１】
（１）プラスミドの構築
ＴＭＮ１の全長ＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１２１３２０（ＢＡＦ２５８２０））を鋳型として、以下の表１に示すプライマーを用いて増幅し、ｐＺＨ２Ｂベクターにクローン化した。次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を使用して、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）ベクターを増幅した。
【００８２】
【表１】
2019135956.tif 000002
【００８３】
（２）形質転換
次いで、イネ科コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）（以下、「Ｏ．ｓａｔｉｖａ」と略記する場合がある）の品種「日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）」の細胞に、（１）で構築したｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ（参考文献１：「Kitajima A et al., “The Rice α-Amylase Glycoprotein Is Targeted from the Golgi Apparatus through the Secretory Pathway to the Plastids.”, The Plant Cell, Vol. 21, Issue 9, p2844-2858, 2009.」）、又は、ｐＧＦＰ（参考文献２：「Niwa Y et al., “Non-invasive quantitative detection and applications of non-toxic, S65T-type green fluorescent protein in living plants.”, The Plant Journal, Vol. 18, Issue 4, p455-463, 1999.」）及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【００８４】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、プラスチドマーカーであるＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄによって標識されたプラスチド（色素体及びミトコンドリア）の数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチド（色素体及びミトコンドリア）の数の比を計算した。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂにおいて、「ＧＦＰ」とは、ｐＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを導入した細胞での結果を示し、「ＴＭＮ１−ＧＦＰ」とは、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを導入した細胞での結果を示す。
【００８５】
図１Ａ及び図１Ｂから、ＴＭＮ１がプラスチドに優先的に局在することが確かめられた。
【００８６】
［実施例２］プラスチド移行シグナルとして機能するＴＭＮ１の第２の膜貫通ドメインの同定
１．カルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１−ＧＦＰ融合タンパク質を用いたＴＭＮ１の第２の膜貫通ドメインの同定
次いで、ＴＭＮ１のプラスチド移行シグナルを同定するために、カルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１−ＧＦＰ融合タンパク質をタマネギの表皮細胞において発現させ、その細胞内局在を調べた。具体的には、以下に示す手順に従い、試験を行った。
【００８７】
（１）プラスミドの構築
図２Ａに本実施例で用いたカルボキシ末端短縮型ＴＭＮ１の構造を示す体系図を示す。これらの全長又は部分ＴＭＮ１を鋳型として、以下の表２に示すプライマーを用いて増幅し、それぞれｐＵＣ１１９ベクターにクローン化した。
【００８８】
【表２】
2019135956.tif 000003
【００８９】
次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を使用して、以下に示す１１種類のベクターを増幅した。
ｐＯｓＴＭＮ１（１−６４６）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６４６）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−６３４）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６３４）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−６０９）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６０９）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−５７１）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−５７１）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−５３６）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−５７１）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−５０４）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−５０４）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−４５０）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−４５０）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−４１８）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−４１８）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−３８０）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−３８０）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−３４８）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−３４８）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−２８４）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−２８４）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【００９０】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、（１）で構築した各ベクターと、ゴルジ体マーカーであるｐＳＴ−ｍＲＦＰ（参考文献３：「Matsuura-Tokita K et al., “Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.”, nature, Vol. 441, p1007-1010, 2006.」）又はｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【００９１】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、各マーカーで標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数に対するＧＦＰによって標識された各オルガネラ（ゴルジ体又はプラスチド）の数の比を計算した。結果を図２Ｃに示す。図２Ｃにおいて、横軸は、各部分ＴＭＮ１のアミノ酸配列の長さを示す。
【００９２】
図２Ｂ及び図２Ｃから、ＴＭＮ１（１−６３４）において、ゴルジ体局在化能を失ったが、プラスチド局在化能は保持されることが明らかとなった。また、ＴＭＮ１（１−３８０）はプラスチド局在化能が保持されていたが、ＴＭＮ１（１−３４８）及びＴＭＮ１（１−２８４）では、ゴルジ体局在化能及びプラスチド局在化能のいずれも失うことが明らかとなった。
この相違から、ＴＭＮ１がＴＭＮ１のアミノ酸配列のうち、システイン３４９残基からグリシン３８０残基までの間に第２の膜貫通ドメイン（ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ；ＴＭＤ２）を有し、該ＴＭＤ２はプラスチド局在化能に重要であることが示唆された。
【００９３】
２．ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２を用いたプラスチド局在化能に寄与する部位の同定
次いで、ＴＭＮ１のプラスチド移行シグナルの性質を理解するためにＴＭＤ２領域をさらに分析した。
【００９４】
（１）ベクターの構築
まず、ＴＭＮ１、ＴＭＮ６、ＴＭＮ７、ＴＭＮ１１及びＴＭＮ１２のＴＭＤ２とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するベクターを構築した。
各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質（全長）を鋳型として、以下の表３に示すプライマーを用いて、ＴＭＮ１（全長）又は各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２をコードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、鋳型として用いた各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質の全長ＤＮＡとしては、ＴＭＮ１は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１２１３２０（ＢＡＦ２５８２０）であり、ＴＭＮ６は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１００７１１（ＢＡＳ９２４５６）であり、ＴＭＮ７は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ０６６５４５（ＢＡＳ９８８９８）であり、ＴＭＮ１１は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ２４３５０６（ＢＡＴ０６６３６）であり、ＴＭＮ１２は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ０９９７２７（ＢＡＴ０９６４１）である。
【００９５】
【表３】
2019135956.tif 000004
【００９６】
次いで、デスティネーションベクター及びＤＮＡ断片を含むエントリークローンを備えるＧｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
具体的には、Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１を作製するために、ａｔｔＢ１配列及びａｔｔＢ２配列を２段階ＰＣＲによって、各ＤＮＡ断片に付加した。まず、下記表４に示すａｔｔＢ１配列及びａｔｔＢ２配列の一部を５’及び３’末端に有する鋳型特異的プライマーを用いて第１のＰＣＲを行った。
【００９７】
【表４】
2019135956.tif 000005
【００９８】
次いで、上記表４に示す完全なａｔｔＢ１配列及びａｔｔＢ２配列を有するアダプタープライマーを用いて、第１のＰＣＲ産物を鋳型として、第２のＰＣＲを行い、以下に示すＴＭＮ１（全長）又は各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２をコードするＤＮＡ断片を含む６種類のプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ１−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ６ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ６ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１１ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１１ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１２ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１２ＴＭＤ２−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【００９９】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、（１）で構築した各ベクターとｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１００】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図２Ｅに示す。図２Ｅにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を計算した。結果を図２Ｆに示す。図２Ｆにおいて、横軸に記載の「（ＴＭＮｓ−ＴＭＤ２）１、６、７、１１、１２」が各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２とＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとを発現させたタマネギ表皮細胞での結果である。
【０１０１】
図２Ｅ及び図２Ｆから、ＴＭＮ１のＴＭＤ２領域はプラスチド局在化のために必要かつ十分であることが確かめられた。また、ＴＭＮ１１ＴＭＤ２−ＧＦＰは、ＴＭＮ１ＴＭＤ２−ＧＦＰと同様に、プラスチドに局在化されたが、ＴＭＮ６ＴＭＤ２−ＧＦＰ、ＴＭＮ７ＴＭＤ２−ＧＦＰ及びＴＭＮ１２ＴＭＤ２−ＧＦＰはプラスチドでの局在は見られなかった。
【０１０２】
図２Ｄは、各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２のアミノ酸配列、及び、ＴＭＮ７のＴＭＤ２変異体（タイプ１〜３）のＴＭＤ２のアミノ酸配列を示す体系図である。図２Ｄにおいて、各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２のアミノ酸配列、及び、ＴＭＮ７のＴＭＤ２変異体（タイプ１〜３）のＴＭＤ２のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、３６〜５０に示す。
【０１０３】
図２Ｄから、イネＴＭＮスーパーファミリータンパク質間のアミノ酸配列を比較したところ、ＴＭＮ１、ＴＭＮ１０及びＴＭＮ１１において相同性が高いことが明らかとなった。この各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質間のアミノ酸配列の相同性は、上記各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質のＴＭＤ２領域のプラスチド局在化能と相関があることが確かめられた。
【０１０４】
３．ＴＭＮ７の変異体を用いたプラスチド局在化能に寄与する部位の同定１
次いで、ＴＭＤ２領域中のプラスチド局在化能に寄与するアミノ酸残基を同定するために、ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域の３つのタイプのアミノ酸置換変異体を作製し、そのプラスチド局在化能を調べた。
【０１０５】
（１）プラスミドの構築
まず、ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体とＧＦＰとの融合タンパク質を発現する３種類のベクターを構築した。ＴＭＮ７（全長）を鋳型として、以下の表５に示すプライマーを用いて、ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１０６】
【表５】
2019135956.tif 000006
【０１０７】
次いで、「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示す３種類のＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ１）−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ１）−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ２）−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ２）−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ３）−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ７ＴＭＤ２（Ｔｙｐｅ３）−Ｇ３ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１０８】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、（１）で構築した各ベクターとｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１０９】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図２Ｅに示す。図２Ｅにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を計算した。結果を図２Ｆに示す。図２Ｆにおいて、横軸に記載の「Ｔｙｐｅ１、Ｔｙｐｅ２、Ｔｙｐｅ３」が各ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体とＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとを発現させたタマネギ表皮細胞での結果である。
【０１１０】
図２Ｅ及び図２Ｆから、いずれの変異体を発現させた細胞においても、プラスチドへの局在は見られなかった。
【０１１１】
４．ＴＭＮ７の変異体を用いたプラスチド局在化能に寄与する部位の同定２
「３．」での結果から、ＴＭＮ１及びＴＭＮ１１のＴＭＤ２領域のチロシン３５１残基がプラスチド局在化能に大きく寄与していると推測し、チロシン３５１残基をアラニンに置換した１アミノ酸置換変異体（図３Ａ参照）を作製して、そのプラスチド局在化能を調べた。なお、図３Ａに示すアミノ酸配列は、ＴＭＮ１のＴＭＤ２のアミノ酸配列であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列である。
【０１１２】
（１）プラスミドの構築
ｐＯｓＴＭＮ１−Ｇ３ＧＦＰを鋳型として、以下の表６に示すプライマーを用いて、ＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）変異体をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１１３】
【表６】
2019135956.tif 000007
【０１１４】
次いで、「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示すＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）変異体をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）−Ｇ３ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１１５】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−Ｇ３ＧＦＰ又は（１）で構築したｐＯｓＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）−Ｇ３ＧＦＰとｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１１６】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を計算した。結果を図３Ｃに示す。
【０１１７】
図３Ｂ及び図３Ｃから、ＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）変異体では、ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体（Ｔｙｐｅ  １）と同様に、ＴＭＤ２によるプラスチド局在化能を有意に低下させることが明らかとなった。また、これにより、Ｙ３５１がＴＭＤ２のプラスチド局在化能に必須であることが明らかとなった。
【０１１８】
また、「３．」に示したように、ＴＭＮ７のＴＭＤ２領域のアミノ酸置換変異体（Ｔｙｐｅ  ３）において、Ｙ３５１存在下であっても、プラスチド局在化能が失われていた。
これらの結果から、プラスチドへのタンパク質を移行するためには、ＴＭＤ２領域中の狭い範囲のアミノ酸残基ではなく、ＴＭＤ２領域全体の構造が重要であることが示唆された。
【０１１９】
また、ＰＳＯＲＴ、ｉＰＳＯＲＴ、ＴａｒｇｅｔＰアルゴリズムは、ＴＭＮ１のＴＭＤ２領域のアミノ酸配列がタンパク質を小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体及び細胞膜に局在化させることを予測した。
よって、ＴＭＮ１のＴＭＤ２領域が融合されたタンパク質は、分泌経路からプラスチドへ輸送されると推察できる。
【０１２０】
［実施例３］ＴＭＮ１のプラスチドへの輸送経路の同定
１．ＢＦＡを用いた小胞体（ＥＲ）−ゴルジ体間の輸送経路の遮断試験
分泌経路を介したＴＭＮ１のプラスチドへの輸送経路を同定するために、ＥＲ−ゴルジ体間の輸送経路に関与しているＡＲＦ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）の機能の強力な阻害剤であるブレフェルジンＡ（Ｂｌｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ：ＢＦＡ）を用いて、ＥＲ−ゴルジ体間の輸送経路の遮断試験を実施した。
【０１２１】
（１）プラスミドの構築
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）ベクターを作製した。
【０１２２】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰベクターとｐＳＴ−ｍＲＦＰ又はｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、ジメチルスルホキシド （Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）又はＢＦＡ存在下で培養した。
【０１２３】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図４Ａ（ＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＳＴ−ｍＲＦＰを共発現させたＤＭＳＯ又はＢＦＡ存在下で培養したタマネギ表皮細胞）及び図４Ｂ（ＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを共発現させたＤＭＳＯ又はＢＦＡ存在下で培養したタマネギ表皮細胞）に示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、各マーカーで標識された各オルガネラ（ゴルジ体及びプラスチド）の数に対するＧＦＰによって標識された各オルガネラ（ゴルジ体及びプラスチド）の数の比を計算した。結果を図４Ｃに示す。図４Ｃにおいて、「ＴＭＮ１−ＧＦＰ＋ＳＴ−ｍＲＦＰ（Ｇｏｌｇｉ）」の「ＤＭＳＯ」がＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＳＴ−ｍＲＦＰを共発現させて、ＤＭＳＯ存在下で培養したタマネギ表皮細胞の結果であり、「ＢＦＡ」がＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＳＴ−ｍＲＦＰを共発現させて、ＢＦＡ存在下で培養したタマネギ表皮細胞の結果である。また、「ＴＭＮ１−ＧＦＰ＋Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ（Ｐｌａｓｔｉｄｓ）」の「ＤＭＳＯ」がＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを共発現させて、ＤＭＳＯ存在下で培養したタマネギ表皮細胞の結果であり、「ＢＦＡ」がＴＭＮ１−ＧＦＰ及びＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄを共発現させて、ＢＦＡ存在下で培養したタマネギ表皮細胞の結果である。
【０１２４】
図４Ａから、ＢＦＡ存在下のタマネギ表皮細胞では、ゴルジ体の小胞様点状構造の代わりに、ＳＴ−ｍＲＦＰ及びＴＭＮ１−ＧＦＰの両方を含む未定義の構造が形成された。しかしながら、図４Ｂ及び図４Ｃから、ＢＦＡ存在下においても、ＴＭＮ１−ＧＦＰのプラスチド局在化能が保持されていた。
【０１２５】
２．ＡＲＦ１及びＳＡＲ１のドミナントネガティブ変異体を用いたＥＲ−ゴルジ体間の輸送経路の遮断試験
また、ＥＲ−ゴルジ体間の輸送経路に関与しているＡＲＦ１又はＳＡＲ１のドミナントネガティブ変異体（ＡＲＦ１（Ｑ７１Ｌ）変異体及びＳＡＲ１（Ｈ７４Ｌ）変異体）を発現するタマネギ表皮細胞を用いて、ＥＲ−ゴルジ体間の輸送経路の遮断試験を実施した。
【０１２６】
（１）プラスミドの構築
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）ベクターを作製した。
また、後述する実施例６に記載の方法を用いて、ｐＯｓＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）ベクターを作製した。
【０１２７】
（２）形質転換
次いで、タマネギ表皮細胞の野生型（ＷＴ）にｐＯｓＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰベクターとｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。また、ＡＲＦ１（Ｑ７１Ｌ）変異体を発現するタマネギ表皮細胞又はＳＡＲ１（Ｈ７４Ｌ）変異体を発現するタマネギ表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰベクターとｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとをアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１２８】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図４Ｂに示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識されたプラスチドの数に対するＧＦＰによって標識されたプラスチドの数の比を計算した。結果を図４Ｃに示す。図４Ｃにおいて、「ＴＭＮ１（ΔＣＴ）」は、ＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰを発現させたタマネギ表皮細胞の結果である。
【０１２９】
図４Ｂ及び図４Ｃから、ＴＭＮ１−ＧＦＰのプラスチドでの局在はＡＲＦ１又はＳＡＲ１のドミナントネガティブ変異体の存在有無で変化しなかった。
また、「１．」のＢＦＡ存在下で培養したタマネギ表皮細胞におけるＴＭＮ１のプラスチド局在化能は、ゴルジ体局在化シグナルを有さないＴＭＮ１（１−６９３）と同程度であった。
これらの結果から、分泌経路を介したゴルジ体からプラスチドへのタンパク質の輸送経路に加えて、ＴＭＮ１のプラスチド局在化能によるＥＲ−プラスチド間の輸送経路の存在が推察された。また、プラスチドへのタンパク質の輸送は、複数の経路により制御及び改善されていることが示唆された。
【０１３０】
［実施例４］ＴＭＮ１とα−アミラーゼ（Ａｍｙｌ−１）との相互作用の確認試験
１．タマネギ表皮細胞でのＴＭＮ１及びα−アミラーゼ（Ａｍｙｌ−１）の細胞内局在の確認試験
次いで、ＴＭＮ１とα−アミラーゼ（Ａｍｙｌ−１）との相互作用を確認するために、タマネギ表皮細胞にＴＭＮ１とα−アミラーゼ（Ａｍｙｌ−１）とを共発現させた。
【０１３１】
（１）ベクターの構築
まず、ＴＭＮ１（全長）又はＡｍｙｌ−１（全長）を鋳型として、以下の表７に示すプライマーを用いて増幅し、ＴＭＮ１（全長）又はＡｍｙｌ−１（全長）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１３２】
【表７】
2019135956.tif 000008
【０１３３】
次いで、「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示すＴＭＮ１（全長）又はＡｍｙｌ−１（全長）をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙ（ｐＧＷｍＣ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＡｍｙｌ−１−ＧＦＰ（ｐＧＷｍＣ：３５Ｓ−ＯｓＡｍｙｌ−１−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１３４】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、（１）で構築した２種類のベクターを一緒にアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１３５】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図５Ａに示す。図５Ａにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。また、図５Ａにおいて、「Ｍｅｒｇｅｄ」において白色で示されている箇所は、ＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所を示している。
また、定量的分析のために、図５Ｂの画像から、ＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所の割合を計算した。結果を図５Ｃに示す。図５Ｃの「ａ」は、ＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙで標識された箇所の面積に対するＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所の面積の比であり、「ｂ」はＡｍｙｌ−１−ＧＦＰで標識された箇所の面積に対するＴＭＮ１−ｍＣｈｅｒｒｙとＡｍｙｌ−１−ＧＦＰとが共局在している箇所の面積の比である。
【０１３６】
図５Ａ及び図５Ｃから、ＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１とがオルガネラ様点状構造内に共局在していることが確かめられた。
【０１３７】
２．二分子蛍光補完法によるＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１との相互作用の確認試験
次いで、ＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１と相互作用を調べるために、Ａｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ及びＴＭＮ１−ｃＹＦＰ、並びに、プラスチドマーカー（Ｗ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ）をタマネギ表皮細胞で発現させる二分子蛍光補完法を実施した。具体的には、以下に示す手順に従い、試験を行った。
【０１３８】
（１）プラスミドの構築
まず、ＴＭＮ１（全長）又はＡｍｙｌ−１（全長）を鋳型として、上記表７に示すプライマーを用いて増幅し、ＴＭＮ１（全長）又はＡｍｙｌ−１（全長）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。また、ｐＥＴ−２８ａを鋳型として、下記表８に示すプライマーを用いて増幅し、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１３９】
【表８】
2019135956.tif 000009
【０１４０】
次いで、実施例２の「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示す４種類のプラスミドを構築した。
ｐＡｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ（ｐＧＷｎＹ（ｎＹＦＰ／ｐＵＧＷ２）：３５Ｓ−Ａｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ（ｐＧＷｃＹ（ｃＹＦＰ／ｐＵＧＷ２）：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＨｉｓ−ｎＹＦＰ（ｐＧＷｎＹ（ｎＹＦＰ／ｐＵＧＷ２）：３５Ｓ−Ｈｉｓ−ｎＹＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＨｉｓ−ｃＹＦＰ（ｐＧＷｃＹ（ｃＹＦＰ／ｐＵＧＷ２）：３５Ｓ−Ｈｉｓ−ｃＹＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１４１】
（２）形質転換
次いで、タマネギ表皮細胞に、以下のａ〜ｃの組み合わせで、各プラスチドをアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
ａ：ｐＡｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ、ｐＨｉｓ−ｃＹＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ
ｂ：ｐＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ、ｐＨｉｓ−ｎＹＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ
ｃ：ｐＡｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ、ｐＯｓＴＭＮ１−ｃＹＦＰ及びｐＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄ
【０１４２】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図５Ｂに示す。図５Ｂにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。また、図５Ｂにおいて、「Ｍｅｒｇｅｄ」で白色で示されている箇所は、ｎＹＦＰ／ｃＹＦＰ複合体とＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄとが共局在している箇所を示している。
また、定量的分析のために、図５ＢにおいてＷ×ＴＰ−ＤｓＲｅｄで標識された面積に対するＹＦＰで標識された面積の比を計算した。その結果を図５Ｄに示す。
なお、図５Ｂ及び図５Ｄにおいて、ａ〜ｃは上記（２）で示した組み合わせのプラスミドを導入した細胞を意味する。
【０１４３】
図５Ｂ及び図５Ｄから、Ａｍｙｌ−１−ｎＹＦＰ−ＴＭＮ１−ｃＹＦＰ複合体の蛍光は、ＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄによって標識されたプラスチドで検出され、ＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１とが相互作用していることが明確に示された。
【０１４４】
３．ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）イネ植物を用いたＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１との相互作用の確認試験
ＴＭＮ１遺伝子の発現が抑制された（ノックダウン（ＫＤ））遺伝子改変植物を以下に示す手順に従い、作製し、ＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１との相互作用の確認試験を行った。
【０１４５】
（１）ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）植物の作製
（１−１）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベクターの構築
ｐＯｓＴＭＮ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１２１３２０）を鋳型として、以下の表９に示すプライマーを用いて、ＴＭＮ１  ｃＤＮＡ（ｂｐ８４５−２０３２）を増幅した。
【０１４６】
【表９】
2019135956.tif 000010
【０１４７】
次いで、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に含まれるＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、ユビキチンプロモーターの制御化でｐＡＮＤＡべクターにクローニングして、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ベクターであるｐＡＮＤＡ−Ｕｂｑ−ＴＭＮｓ−ＲＮＡｉを構築した。
【０１４８】
（１−２）形質転換及びＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物の樹立
次いで、（１−１）で作製したＲＮＡｉベクターをＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ株ＥＨＡ１０１に形質転換し、さらに、公知の方法（参考文献４：「Hiei Y et al., “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.”, Plant J, Vol. 6, p271-282, 1994.」）を用いて、イネ科コメ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）の品種「日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）」の細胞に形質転換して、遺伝子改変植物を選抜し、ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物（品種：日本晴）を得た。
【０１４９】
（１−３）ＴＭＮ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量の確認
次いで、（１−２）で得られたＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物（１−１、２−１、２−２、２−３、３−１、４−１、４−２、４−３及び５−１の９系統）及び野生型のイネ科植物（品種：日本晴）の成熟葉からそれぞれＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法により全ＲＮＡを単離し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製した。次いで、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いて、第１ｃＤＮＡ鎖を合成した。次いで、以下の表１０に示すプライマーを用いたＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によりリアルタイムＰＣＲ分析を行った。なお、プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｕｔ．ｅｅ／ｐｒｉｍｅｒ３−０．４．０／）を用いて構築した。
【０１５０】
【表１０】
2019135956.tif 000011
【０１５１】
次いで、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対するＴＭＮ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比を算出した。結果を図５Ｅに示す。なお、図５Ｅにおいて、野生型のイネ科植物でのＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの発現量に対するＴＭＮ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比を１としたときの、各ＴＭＮ１遺伝子ノックダウン（ＫＤ）系統のイネ科植物の当該比を示している。
【０１５２】
図５Ｅから、成熟葉におけるＴＭＮ１遺伝子のｍＲＮＡの発現は、ＴＭＮ１遺伝子ＫＤ系統のイネ科植物（品種：日本晴）において、野生型のイネ科植物（品種：日本晴）の約２０％以上５０％以下程度にまで減少していた。
【０１５３】
（１−４）ヨウ素染色及びデンプン定量
次いで、ＴＭＮ１遺伝子ＫＤ系統のイネ科植物（２−２、３−１、４−３及び５−１の４系統）、並びに、野生型のイネ科植物のヨウ素染色と、ＴＭＮ１遺伝子ＫＤ系統のイネ科植物（２−２の１系統）及び野生型のイネ科植物のデンプン定量とを、公知の方法（参考文献５：「Asatsuma S et al., “Involvement of α- amylase I-1 in starch degradation in rice chloroplasts.”, Plant Cell Physiol, Vol. 46, Issue 6, p858-869, 2005.」）を用いて行った。結果を図５Ｆ（ヨウ素染色像）及び図５Ｇ（デンプン定量のグラフ）に示す。
【０１５４】
図５Ｆ及び図５Ｇから、ＴＭＮ１遺伝子ＫＤ系統のイネ科植物（品種：日本晴）において、野生型のイネ科植物（品種：日本晴）よりも、有意に多くのデンプンが蓄積されたことが明らかとなった。
【０１５５】
以上のことから、ＴＭＮ１とＡｍｙｌ−１との相互作用、及び、ＴＭＮ１のデンプン代謝への関与が明らかとなった。これにより、ＴＭＮ１がゴルジ体からプラスチドへのＡｍｙｌ−１の輸送に関与していることが強く示唆された。
【０１５６】
［実施例５］ＴＭＮスーパーファミリータンパク質中のゴルジ体局在化能に寄与する領域の同定
１．ＴＭＮスーパーファミリータンパク質におけるゴルジ体局在化能の比較試験
次いで、ＴＭＮスーパーファミリータンパク質におけるゴルジ体移行シグナルを同定するために、各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質−ＧＦＰ融合タンパク質をタマネギの表皮細胞において発現させ、その細胞内局在を調べた。具体的には、以下に示す手順に従い、試験を行った。
【０１５７】
（１）プラスミドの構築
各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質（全長）を鋳型として、以下の表１１に示すプライマーを用いて増幅し、それぞれｐＺＨ２Ｂベクターにクローン化した。なお、鋳型として用いた各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質の全長ＤＮＡとしては、ＴＭＮ２は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ０６９０５３（ＢＡＳ８１３８０）であり、ＴＭＮ６は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ１００７１１（ＢＡＳ９２４５６）であり、ＴＭＮ７は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ０６６５４５（ＢＡＳ９８８９８）であり、ＴＭＮ１１は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ２４３５０６（ＢＡＴ０６６３６）であり、ＴＭＮ１２は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＫ０９９７２７（ＢＡＴ０９６４１）である。
【０１５８】
【表１１】
2019135956.tif 000012
【０１５９】
次いで、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を使用して、以下に示す５種類のベクターを増幅した。また、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰは、実施例１の（１）で構築されたものを用いた。
ｐＯｓＴＭＮ２−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ２−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ６−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ６−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ７−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ７−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１１−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１１−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１２−ＧＦＰ（ｐＺＨ２Ｂ：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１２−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１６０】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ又は（１）で構築した各ベクターとｐＳＴ−ｍＲＦＰとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１６１】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図６Ａに示す。図６Ａにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、ＳＴ−ｍＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を計算した。結果を図６Ｂに示す。
【０１６２】
図６Ａ及び図６Ｂから、ＴＭＮ１、ＴＭＮ２、ＴＭＮ６、ＴＭＮ７、ＴＭＮ１１及びＴＭＮ１２のゴルジ体局在化能は類似していた。
【０１６３】
２．ＴＭＮ１のアミノ酸欠失及びアミノ酸置換変異体を用いたゴルジ体局在化能に寄与する部位の同定
次いで、ＴＭＮ１のアミノ酸欠失及びアミノ酸置換変異体を用いてＴＭＮ１のＣ末端尾部のうち、ゴルジ体局在化能に寄与する部位の同定を試みた。図６Ｃは、ＴＭＮスーパーファミリータンパク質並びにＴＭＮ１のアミノ酸欠失及びアミノ酸置換変異体のＣ末端尾部のアミノ酸配列を示す体系図である。なお、図６Ｃにおいて、各ＴＭＮスーパーファミリータンパク質、及び、ＴＭＮ１のアミノ酸欠失及びアミノ酸置換変異体のＣ末端尾部のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２、７９〜９３に示す。イネＴＭＮ１のＣ末端尾部のアミノ酸配列のうち、フェニルアラニン６３５残基及びチロシン６４０残基がゴルジ体局在化能へ大きく寄与していると推測し、ＴＭＮ１（Ｆ６３５Ａ及びＹ６４０Ａ）変異体を作製した。具体的には、以下に示す手順に従い、試験を行った。
【０１６４】
（１）プラスミドの構築
まず、全長ＴＭＮ１を鋳型として、以下の表１２に示すプライマーを用いて、各ＴＭＮ１変異体をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１６５】
【表１２】
2019135956.tif 000013
【０１６６】
次いで、実施例２の「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示す３種類のＴＭＮ１変異体をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ１（１−６４０）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６４０）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−６３９）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
ｐＯｓＴＭＮ１（Ｆ６３５Ａ，Ｙ６４０Ａ）−ＧＦＰ（ｐＵＣ１１９：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（Ｆ６３５Ａ，Ｙ６４０Ａ）−ＧＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１６７】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ又は（１）で構築した各ベクターとｐＳＴ−ｍＲＦＰとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１６８】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図６Ｄに示す。図６Ｄにおいて、スケールバーは、１０μｍを示す。
また、定量的分析のために、各細胞において、ＳＴ−ｍＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を計算した。結果を図６Ｅに示す。
【０１６９】
図６Ｄ及び図６Ｅから、ＴＭＮ１（１−６４０）変異体はゴルジ体局在化能を部分的に失い、ＴＭＮ１（１−６３９）変異体はゴルジ体局在化能を完全に失った。また、ＴＭＮ１（Ｆ６３５Ａ及びＹ６４０Ａ）変異体も同様にゴルジ体局在化能を完全に失った。
これらのことから、ＴＭＮ１のＣ末端の尾部がゴルジ体移行シグナルとして機能することが示唆された。
【０１７０】
［実施例６］ＴＭＮ１の細胞内局在に対するＫＸＤ／Ｅモチーフを含むＣ末端の細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ；ＣＴ）の効果の確認試験
シロイヌナズナのＥＭＰ１２（ＴＭＮ１２）は、小胞体及びゴルジ体に局在化しており、ゴルジ体局在化能に関与するＫＸＤ／ＥモチーフをＣ末端の細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ；ＣＴ）に有することが知られている。そのため、Ｏ．ｓａｔｉｖａのＴＭＮ１においてもＣ末端にＫＸＤ／Ｅモチーフが存在することを確認し、ＴＭＮ１の細胞内局在に対するＫＸＤ／Ｅモチーフを含むＣ末端のＣＴの効果を調べた。
【０１７１】
（１）ベクターの構築
図７Ａは、ＴＭＮ１とＧＦＰとＣＴとの融合タンパク質であるＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴ及びＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴの構造を示す体系図である。なお、図７Ａにおいて、「ＳＰ」はシグナルペプチドを意味し、「ＣＴ」は細胞質側末端（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）を意味する。これらの融合タンパク質を発現するためのベクターを構築するために、全長ＴＭＮ１を鋳型として、上記表１及び下記表１３に示すプライマーを用いて増幅し、それぞれＧＦＰ−ＣＴ融合タンパク質をコードする核酸を含むｐＵＣ１１９ベクターにクローン化した。
【０１７２】
【表１３】
2019135956.tif 000014
【０１７３】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、ｐＯｓＴＭＮ１−ＧＦＰ又は（１）で構築した各ベクターとｐＳＴ−ｍＲＦＰとをそれぞれアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。
【０１７４】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図７Ｂに示す。図７Ｂにおいて、「Ｍｅｒｇｅｄ」において白色で示されている箇所は、ＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴ又はＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴとＳＴ−ｍＲＦＰとが共局在している箇所を示している。
また、定量的分析のために、各細胞において、ＳＴ−ｍＲＦＰによって標識されたゴルジ体の数に対するＧＦＰによって標識されたゴルジ体の数の比を計算した。結果を図７Ｃに示す。
【０１７５】
図７Ｂ及び図７Ｃから、ゴルジ体へのＴＭＮ１−ＧＦＰ−ＣＴの局在はＴＭＮ１−ＧＦＰの局在と同様であったが、ＴＭＮ１（１−３４７）−ＧＦＰ−ＣＴはゴルジ体局在化能が失われていた。 したがって、ＴＭＮ１−ＧＦＰのプラスチドへの局在化は、キャップされたＫＸＤ／Ｅモチーフによって引き起こされる誤った局在化ではないことが確かめられた。また、ＴＭＮ１のＣＴは、ＴＭＮ１のゴルジ体局在化能のために必要であるが、十分ではないことが明らかとなった。
【０１７６】
［実施例７］タマネギ表皮細胞でのＴＭＮ１のシグナルペプチドの細胞内局在性の確認試験
タマネギ表皮細胞でのＴＭＮ１のシグナルペプチドの細胞内局在性を調べた。
【０１７７】
（１）プラスミドの構築
全長ＴＭＮ１を鋳型として、以下の表１４に示すプライマーを用いて、ＴＭＮ１のシグナルペプチド（ＴＭＮ１の１番目から４０番目までのアミノ酸残基からなるペプチド）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【０１７８】
【表１４】
2019135956.tif 000015
【０１７９】
次いで、「２．」の（１）と同様の方法（Ｇｅｔｅｗａｙ（登録商標）システム）を用いて、以下に示すＴＭＮ１（１−４０）をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを構築した。
ｐＯｓＴＭＮ１（１−４０）−ｍＲＦＰ（ｐＵＧＷ５１：３５Ｓ−ＯｓＴＭＮ１（１−４０）−ｍＲＦＰ−Ｔｎｏｓ）
【０１８０】
（２）形質転換
次いで、タマネギの表皮細胞に、（１）で構築したｐＯｓＴＭＮ１（Ｙ３５１Ａ）−ｍＲＦＰとｐＧＦＰ−ＡｔＳｅｃ２２とをアグロバクテリウム法により形質転換し、培養した。なお、ＡｔＳｅｃ２２は小胞体マーカーである。
【０１８１】
（３）蛍光観察
次いで、ＦＶ３００−ＢＸ−６１共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製）を用いて、共焦点画像分析を行った。結果を図８に示す。
【０１８２】
図８から、ＴＭＮ１（１−４０）−ｍＲＦＰは、ＥＲマーカー（ＧＦＰ−ＡｔＳｅｃ２２）と同様に、ＥＲネットワーク構造に分布していることが示された。このことから、ＴＭＮ１のアミノ酸配列のうち１番目から４０番目までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドは、タンパク質のＥＲへの輸送に必要であることが明らかとなった。
【０１８３】
図９は、分泌経路を介した複数の経路からのコメＴＭＮ１のプラスチド局在化の仮説モデルである。
以上のことから、ＴＭＮ１のＮ末端のシグナルペプチドはＥＲへの局在化に関与しており、Ｃ末端尾部はゴルジ体局在化に関与していることが明らかとなった。また、ＴＭＤ２はＴＭＮ１のプラスチド局在化能に必要かつ十分であることが明らかとなった。また、ＴＭＮ１は、Ａｍｙｌ−１と物理的に相互作用し、両者はゴルジ体からプラスチドへ取り込まれることが確かめられた。
また、ＴＭＮ１のゴルジ体への局在は、ＡＲＦ１及びＳＡＲ１のドミナントネガティブ変異体及びＢＦＡによって妨げられることが確かめられた。しかしながら、ＴＭＮ１のプラスチド局在化能は、ＥＲ−ゴルジ体間輸送経路の阻害剤の影響を受けないため、一部のＴＭＮ１はＥＲから直接プラスチドへ輸送されると推察された。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本実施形態のプラスチド移行シグナルペプチドによれば、トランジットペプチド／Ｔｏｃ−Ｔｉｃシステムを介さずに目的のタンパク質をプラスチドに蓄積させることができる。
【図１Ａ】
2019135956.tif 000016
【図１Ｂ】
2019135956.tif 000017
【図２Ａ】
2019135956.tif 000018
【図２Ｂ】
2019135956.tif 000019
【図２Ｃ】
2019135956.tif 000020
【図２Ｄ】
2019135956.tif 000021
【図２Ｅ】
2019135956.tif 000022
【図２Ｆ】
2019135956.tif 000023
【図３Ａ】
2019135956.tif 000024
【図３Ｂ】
2019135956.tif 000025
【図３Ｃ】
2019135956.tif 000026
【図４Ａ】
2019135956.tif 000027
【図４Ｂ】
2019135956.tif 000028
【図４Ｃ】
2019135956.tif 000029
【図５Ａ】
2019135956.tif 000030
【図５Ｂ】
2019135956.tif 000031
【図５Ｃ】
2019135956.tif 000032
【図５Ｄ】
2019135956.tif 000033
【図５Ｅ】
2019135956.tif 000034
【図５Ｆ】
2019135956.tif 000035
【図５Ｇ】
2019135956.tif 000036
【図６Ａ】
2019135956.tif 000037
【図６Ｂ】
2019135956.tif 000038
【図６Ｃ】
2019135956.tif 000039
【図６Ｄ】
2019135956.tif 000040
【図６Ｅ】
2019135956.tif 000041
【図７Ａ】
2019135956.tif 000042
【図７Ｂ】
2019135956.tif 000043
【図７Ｃ】
2019135956.tif 000044
【図８】
2019135956.tif 000045
【図９】
2019135956.tif 000046
【配列表】
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