(57)【要約】      （修正有）【課題】植物での機能性遺伝子試験の速度を加速し、高い栄養価、病気およびストレスに対する高い耐性、および商業的に有用な化合物の生産増大を含む、改善された特性を持つ植物を操作する方法が求められている。【解決手段】Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムを用いた遺伝子ターゲッティングのための材料および方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞内のゲノム材料を修飾する方法であって：
（ａ）ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはキメラｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む核酸を、前記細胞内に導入するステップ（前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、または前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、前記植物細胞に内因性である配列を標的化する）；および
（ｂ）前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列が標的化される前記配列で、またはその付近で、または、前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが標的化される前記配列で、またはその付近で、二本鎖切断を誘導する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ分子を、前記細胞内に導入するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
前記の導入するステップは、前記植物細胞に、前記のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および、前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたは前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸を、送達するステップを含み、
前記の送達するステップは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスによる、
方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、
前記ＤＮＡウイルスは、ジェミニウイルスである、
方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、
前記ＲＮＡウイルスは、トブラウイルスである、
方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、
前記の導入するステップは、前記植物細胞に、前記のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列、および、前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたは前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸配列を含む、Ｔ−ＤＮＡを送達するステップを含み、
前記の送達するステップは、アグロバクテリウム属またはエンシファー属を介する、
方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、
前記のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸配列は、構成的な、細胞特異的な、誘導性の、または、スーサイドエクソンの選択的スプライシングにより活性化される、プロモーターに作動可能に連結される、
方法。
【請求項７】
請求項１の方法であって、
前記の導入するステップは、Ｃａｓ９、および、前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたは前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸の微粒子銃を含む、
方法。
【請求項８】
請求項１の方法であって、
前記植物細胞は、単子葉植物由来である、
方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、
前記単子葉植物は、小麦、トウモロコシ、米、またはセタリア属である、
方法。
【請求項１０】
請求項１の方法であって、
前記植物細胞は、双子葉植物由来である、
方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、
前記双子葉植物は、トマト、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、キャッサバ、またはシロイヌナズナ属である、
方法。
【請求項１２】
請求項１の方法であって、
前記の導入するステップの後に、前記のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたは前記のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドにより標的化された前記配列で、またはその付近で、二本鎖切断が生じているかどうか決定するために、前記植物細胞をスクリーニングするステップをさらに含む、
方法。
【請求項１３】
請求項１の方法であって、
前記植物細胞から植物を再生するステップをさらに含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、
遺伝学的に所望の植物系統を取得するために、前記植物を異種交配するステップをさらに含む、
方法。
【請求項１５】
配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む、
植物細胞。
【請求項１６】
配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、
植物細胞。
【請求項１７】
Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、
ウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１７のウイルスベクターであって、
前記ベクターは、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、
ウイルスベクター。
【請求項１９】
請求項１７のウイルスベクターであって、
前記ウイルスは、トブラウイルスまたはジェミニウイルスである、
ウイルスベクター。
【請求項２０】
配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、
Ｔ−ＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項２０のＴ−ＤＮＡを含む、
アグロバクテリウム株。
【請求項２２】
植物細胞内でＣａｓタンパク質を発現する方法であって：
配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むＴ−ＤＮＡを含む、アグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを提供するステップ（前記のポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結される）；
前記のアグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを、前記植物細胞と接触させるステップ；および
前記植物細胞内で、前記核酸配列を発現するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法であって、
前記プロモーターは、誘導性プロモーターである、
方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、
前記誘導性プロモーターは、エストロゲン誘導性プロモーターである、
方法。
【請求項２５】
請求項２２の方法であって、
前記植物細胞を、前記Ｃａｓタンパク質と関連するガイドＲＮＡをコードする核酸と接触させるステップをさらに含む、
方法。
【請求項２６】
請求項２２の方法であって、
前記植物細胞は、プロトプラストである、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９０，６９４号からの優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
［連邦支援の研究に関する陳述］
本発明は、米国国立衛生研究所により授けられたＧＭ  ８３４７２０、および、全米科学財団により授けられたＤＢＩ０９２３８２７の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
【０００３】
［技術分野］
本願は、植物における遺伝子ターゲッティングのための材料および方法に関し、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用を含む遺伝子ターゲッティングのための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
生細胞内でのＤＮＡ配列の正確な修飾を可能にする技術は、基礎研究および応用研究の両方に役立てることができる。正確なゲノム修飾−標的化突然変異誘発または遺伝子ターゲッティング（ＧＴ）のいずれか−は、標的細胞のＤＮＡ修復機構に依存する。標的化突然変異誘発に関しては、配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）により仲介されるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）パスウェイにより頻繁に修復され、切断部位において変異をもたらす。一方で、ドナー分子がＳＳＮとともに共送達されれば、次のＤＳＢは、ドナー分子上に存在する配列と切断部位付近の配列の相同組換え（ＨＲ）を刺激することができる。その結果として、ドナー分子により行われる任意の修飾配列は、ゲノム中に安定的に組み込まれる（ＧＴと呼ばれる）。植物でＧＴを実施する試みは、極めて低いＨＲ頻度に悩まされることが多い。ほとんどの場合、ドナーＤＮＡ分子は、ＮＨＥＪを介して非論理的に組み込まれる。このプロセスは、相同「アーム」のサイズにかかわらず生じ；ホモロジーの長さがおよそ２２ｋｂまで増えると、ＧＴに有意な亢進をもたらさない（Ｔｈｙｋｊａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３５：５２３−５３０，１９９７）。しかしながら、ＳＳＮとともにＤＳＢを導入すると、ＨＲによるＧＴの頻度を大いに増大させることができる（Ｓｈｕｋｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４３７−４４１，２００９；およびＴｏｗｎｓｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４４２−４４５，２００９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムを、植物ゲノム操作に用いることができるという知見に一部基づく。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ゲノムＤＮＡに、選択部位で修飾を生じさせるための、相対的に簡単で効果的なツールを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて標的化ＤＳＢまたは一本鎖切断を生じさせることができ、制限されずに、標的化突然変異誘発、遺伝子ターゲッティング、遺伝子置換、標的化欠失、標的化反転、標的化転座、標的化挿入、および多重標的ＲＮＡの共発現により方向付けられる単細胞での多重ＤＳＢを介した多重ゲノム修飾に用いることができる。この技術を用いて、植物での機能性遺伝子試験の速度を加速し、高い栄養価、病気およびストレスに対する高い耐性、および商業的に有用な化合物の生産増大を含む、改善された特性を持つ植物を操作することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本願は、植物細胞内のゲノム材料を修飾するための方法を特徴とする。その方法は、（ａ）ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはキメラｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む核酸を、細胞内へ導入するステップ（ここで、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、または、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、植物細胞に内因性である配列を標的化する）；および（ｂ）ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列が標的化される配列で、またはその付近で、または、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが標的化される配列で、またはその付近で、二本鎖切断を誘導する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ分子を、細胞に導入するステップ、を含むことができる。導入するステップは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸を、植物細胞に送達するステップを含むことができ、送達するステップは、ＤＮＡウイルス（例えばジェミニウイルス）またはＲＮＡウイルス（例えばトブラウイルス）による。導入するステップは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列、および、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸配列を含む、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に送達するステップを含むことができ、送達はアグロバクテリウム属またはエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）を介する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、構成的な（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）、細胞特異的な、誘導性の、または、スーサイドエクソンの選択的スプライシングにより活性化される、プロモーターに、作動可能に連結することができる。導入するステップは、Ｃａｓ９およびｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドをコードする核酸の微粒子銃を含むことができる。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、構成的な、細胞特異的な、誘導性の、または、スーサイドエクソンの選択的スプライシングにより活性化される、プロモーターに、作動可能に連結することができる。植物細胞は、単子葉植物（例えば、小麦、トウモロコシ、米、またはセタリア属）由来、または、双子葉植物（例えば、トマト、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、キャッサバ、またはシロイヌナズナ属）由来であってよい。その方法は、導入するステップの後に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドにより標的化される配列で、またはその付近で、二本鎖切断が生じているかどうかを判定するために、植物細胞をスクリーニングするステップをさらに含むことができる。また、その方法は、植物細胞から植物を再生するステップも含むことができ、一部の実施態様では、その方法は、遺伝学的に所望の植物系統を得るために、植物を異種交配するステップを含むことができる。
【０００７】
別の態様では、本願は、配列番号１２と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む植物細胞、および、配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む植物細胞を特徴とする。
【０００８】
別の態様では、本願は、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを特徴とする。ウイルスベクターは、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ウイルスベクターは、トブラウイルスまたはジェミニウイルス由来であってよい。
【０００９】
別の態様では、本願は、配列番号１２のアミノ酸配列８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むＴ−ＤＮＡを特徴とする。また、本願は、Ｔ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム株も特徴とする。
【００１０】
さらに別の態様では、本願は、植物細胞においてＣａｓタンパク質を発現するための方法を特徴とする。その方法は、配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを提供するステップ（ポリペプチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている）；アグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを植物細胞と接触させるステップ；および、植物細胞内で核酸配列を発現させるステップ、を含むことができる。プロモーターは、誘導性プロモーター（例えば、エストロゲン誘導性プロモーター）であってよい。その方法は、植物細胞を、Ｃａｓタンパク質と関連するガイドＲＮＡをコードする核酸と接触させるステップをさらに含むことができる。植物細胞は、プロトプラストであってよい。
【００１１】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する当業者の一人により一般に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例であり、制限することを意図しない。
【００１２】
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細を、添付の図面および以下の説明に示す。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド配列を含むｐＭＤＣ３２プラスミド（標準的なＴ−ＤＮＡ発現プラスミド）の概略図である。プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号６に示す。
【図２】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド配列を含むｐＦＺ１９プラスミド（エストロゲン誘導性Ｔ−ＤＮＡ発現ベクター）の概略図である。プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号７に示す。
【図３】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含むｐＮＪＢ１２１プラスミド（ジェミニウイルスのレプリコンＴ−ＤＮＡベクター）の概略図である。プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号８に示す。
【図４Ａ】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドがアグロバクテリウム属またはジェミニウイルスのレプリコンにより送達された、植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能の証拠を提供する。植物コドン最適化Ｃａｓ９配列を持つＴ−ＤＮＡの図である。ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（ｓｇＲＮＡと表す）は、シロイヌナズナ属のＡｔＵ６−２６プロモーター（ＰＵ６）の下流に置かれた。「ｌｏｌｌｙｐｏｐｓ」は、レプリカーゼ（Ｒｅｐ）により仲介される複製に重要な、長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）を示す。灰色のボックスは、同じくレプリコン機能に重要な、短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）を示す。ラベルの無い灰色の矢印は、レプリコンの環状化の際にＣａｓ９発現を作動することができる３５Ｓプロモーターである。また、Ｃａｓ９発現は、プロモーターとして機能するＬＩＲによって作動することもできる。描かれた構築物全体は、ＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる。
【図４Ｂ】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドがアグロバクテリウム属またはジェミニウイルスのレプリコンにより送達された、植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能の証拠を提供する。ＰＣＲ産物を含むアガロースゲルの写真であり、植物細胞でのジェミニウイルスのレプリコンの環状化を示す。ＰＣＲプライマー（図４Ａ中の小さな矢印）を用いて、レプリコンを保有するアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡを感染させた細胞からＤＮＡを増幅した。ジェミニウイルスレプリカーゼをコードするプラスミド（ｐＲｅｐ）の存在下でのみ、レプリコンの環状化および増幅が生じた。
【図４Ｃ】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドがアグロバクテリウム属またはジェミニウイルスのレプリコンにより送達された、植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能の証拠を提供する。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのＳｕｒＡ／ＳｕｒＢ遺伝子座における、Ｃａｓ９により誘導された変異の検出を示す。ｐＲＥＰおよび図４Ａに描かれたＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡを含む２株のアグロバクテリウム属を用いて、タバコの葉組織をシリンジインフィルトレーションした（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）；これは、ジェミニウイルスのレプリコンを用いた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により仲介される突然変異誘発を試験するために行なった。あるいは、葉組織を、ＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡのみを含むアグロバクテリウム属の単一株でインフィルトレーションした；これは、標準的なアグロバクテリウム属のＴ−ＤＮＡの送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により仲介される突然変異誘発を試験するために行なった。インフィルトレーション後５日に、ゲノムＤＮＡを分離し、ＳｕｒＡ／ＳｕｒＢ内のＣａｓ９標的部位を増幅するように設計されたＰＣＲ反応においてテンプレートとして用いた。生じるアンプリコンをＡｌｗＩで消化し、バンドをゲル電気泳動により分離した。
【図４Ｄ】Ｃａｓ９コード配列およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドがアグロバクテリウム属またはジェミニウイルスのレプリコンにより送達された、植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能の証拠を提供する。ＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡおよびｐＲＥＰ  Ｔ−ＤＮＡで形質転換されたサンプル中の切断耐性アンプリコンから生じた配列（配列番号１〜５）を示す。ＰＡＭ，プロトスペーサー近接モチーフ。
【図５】非機能性黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードするレポータープラスミドの概略図である。
【図６】ＹＦＰレポータープラスミドを用いた、プロトプラスト中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ機能の証拠としての、蛍光レベルをプロットしたグラフである。タバコプロトプラストを調製して様々な構築物で形質転換して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による標的化切断を試験し、そして、フローサイトメトリーによりＹＦＰ蛍光を測定した。カラム１は、ＹＦＰレポーター、および、Ｃａｓ９、およびＡｔＵ６−２６プロモーターにより発現されるｃｒ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡを発現する構築物で、形質転換された細胞から観察される蛍光レベルを示す。カラム２は、レポーター、Ｃａｓ９、およびＡｔ７ＳＬ２−２プロモーターにより発現されるｃｒ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡで、形質転換された細胞から観察される蛍光レベルを示す。カラム３は、レポーターのみで形質転換された、細胞で観察される蛍光を示し（ネガティブコントロール）；カラム４は、ＹＦＰを発現する構築物で形質転換された細胞での傾向を示す（ポジティブコントロール）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
植物での効率的なゲノム操作は、修飾すべきＤＮＡ配列に標的化二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することにより可能にすることができる。ＤＳＢは、細胞のＤＮＡ修復パスウェイを活性化し、それを利用して、切断部位付近で所望のＤＮＡ配列修飾を達成することができる。標的化ＤＳＢは、配列特異的なヌクレアーゼ（ＳＳＮ）（特別なクラスのタンパク質であり、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）を含む）を用いて導入することができる。特異的なＤＮＡ配列の認識は、ＳＳＮによりコードされる特異的なアミノ酸との相互作用を介して達成される。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの開発以前、ＳＳＮを操作する試みは、ＤＮＡ配列に結合するアミノ酸間で予測不可能なコンテキスト依存性であった。ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、この困難性を大いに軽減したが、それらの大きいサイズ（平均して、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼモノマーは、それぞれ２．５〜３ｋｂのコード配列を含む）および反復性は、ベクターサイズおよび安定性が心配な場合の適用でのそれらの使用を妨げ得る（Ｖｏｙｔａｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ，６４：３２７−３５０，２０１３）。
【００１５】
本願は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、植物ゲノム操作に、簡単で効果的なツールとして用いることができるという知見に一部基づく。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、ＲＮＡ塩基対合を用いてＤＮＡ切断を方向付ける、原核生物の適応性の免疫系の構成要素である。ＤＮＡをＤＳＢに方向付けるには、２つの構成要素：Ｃａｓ９タンパク質（エンドヌクレアーゼとして機能する）、およびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列（Ｃａｓ９／ＲＮＡ複合体を標的ＤＮＡ配列へ方向付けるのを助ける）を必要とする（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９（６）：４６７−４７７，２０１１）。単一の標的ＲＮＡの修飾は、Ｃａｓタンパク質のヌクレオチド標的を変えるのに十分であり得る。ある場合には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、単一のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドとして操作して、Ｃａｓ９切断活性を方向付けることができる（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１，２０１２）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、他に記載のとおり、細菌、酵母、ヒト、およびゼブラフィッシュにおいて使用することができる（例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（３）：２３３−２３９，２０１３；Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１３５，２０１３；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１）：８１９−８２３，２０１３；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１）：８２３−８２６，２０１３；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（３）：２３０−２３２，２０１３；および、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１（３）：２２７−２２９，２０１３を参照）。
【００１６】
植物でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの有用性は、これまでに示されていない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、相対的に小さなゲノムを有する原核生物細胞由来であり、そこでは、Ｃａｓ９は、有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ活性の存在下で、細胞内で安定して発現される。したがって、本明細書に記載の植物細胞の働きが始まった場合に、Ｃａｓ９導入遺伝子の発現が植物細胞において可能であるかどうか、および、Ｃａｓ９が植物コンテキストにおいてＲＮＡ−ガイドおよびＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ活性と適切に協調するかどうか、不明確であった。加えて、植物細胞での異種タンパク質の発現は、異なるコドンの使用に起因して、一般に難易度が高い。さらに、植物ゲノムの大きいサイズは、ゲノムＤＮＡの非特異的切断が細胞に遺伝毒性を誘導し得るという可能性を増大させるので、植物でのＣａｓ９発現による少しの毒性が予期された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、１０〜２０ヌクレオチドを含む特異的な認識配列で作動することが報告されていて、それは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、および亜鉛フィンガーヌクレアーゼのような、大部分の他のレアカッティングのエンドヌクレアーゼシステムよりも、特異性が低い。
【００１７】
本明細書に記載のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的化ＤＳＢまたは一本鎖切断を生じさせることができ、制限されずに、標的化突然変異誘発、遺伝子ターゲッティング、遺伝子置換、標的化欠失、標的化反転、標的化転座、標的化挿入、および多重標的ＲＮＡの共発現により方向付けられる単細胞での多重ＤＳＢを介した多重ゲノム修飾に用いることができる。この技術を用いて、植物での機能性遺伝子試験の速度を加速し、高い栄養価、病気およびストレスに対する高い耐性、および商業的に有用な化合物の生産増大を含む、改善された特性を持つ植物を操作することができる。ＤＳＢをレポーター遺伝子および内因性の遺伝子座に標的化することにより、概念実証実験を植物の葉組織において行なうことができる。それから、その技術を、プロトプラストおよび植物全体における使用に、および、ウイルスに基づく送達システムにおける使用に、適応させることができる。最終的に、多重ゲノム操作は、ＤＳＢを、同一のゲノム内の多重部位に標的化することにより実証することができる。
【００１８】
一般に、本明細書に記載のシステムおよび方法は、少なくとも２つの構成要素：植物細胞内（例えば植物ゲノム内、または、レポーターなどの染色体外プラスミド内）の特定の配列に相補的な（したがってそれを標的化する）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、または単一のｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド）、および、標的配列で植物ＤＮＡを切断することができるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、を含む。代表的なＣａｓ９コード配列は、配列番号６のヌクレオチド９７７１〜１４０４５に、（また、配列番号７のヌクレオチド４３３１〜８６０５、および配列番号８のヌクレオチド９４８７〜１３７６１にも）示される。ある場合には、システムは、植物配列を標的化するドナー配列を含む核酸を含むこともできる。エンドヌクレアーゼは、所望の遺伝子座（単数）（または複数）での標的化ＤＮＡ二本鎖切断を生じることができ、植物細胞は、ドナーＤＮＡ配列を用いて二本鎖切断を修復することができ、それにより、植物ゲノム中に修飾を安定して取り込む。
【００１９】
Ｃａｓ９タンパク質は、２つの独特な活性部位−ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み、それは、部位特異的なニックを逆側のＤＮＡ鎖に生じさせる（Ｇａｓｉｕｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９（３９）：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６，２０１２）。ＲｕｖＣ様ドメインはＣａｓ９タンパク質のアミノ末端付近であり、ｃｒＲＮＡに非相補的に標的ＤＮＡを切断すると考えられ、一方で、ＨＮＨ様ドメインはタンパク質の中央にあり、ｃｒＲＮＡに相補的に標的ＤＮＡを切断すると考えられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の代表的なＣａｓ９配列を配列番号１１に示し（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢナンバーＱ０３ＪＩ６も参照）、および、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓｅ由来の代表的なＣａｓ９配列を配列番号１２に示す（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢナンバーＱ９９ＺＷ２も参照）。したがって、本明細書に記載の方法は、配列番号１１または配列番号１２の配列を有するＣａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて行なうことができる。しかしながら、一部の実施態様では、本発明に記載の方法は、配列番号１１または配列番号１２と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の配列同一性を有する、Ｃａｓ９機能性変異をコードするヌクレオチド配列を用いて行なうことができる。さらに、Ｃａｓ９は２つの部分に分けることができ、１つの部分はＨＮＨドメインを含み、他方はＲｕｖＣドメインを含む。ＨＮＨドメインは、ＲＮＡガイドと関連してそれ自体で少しの切断活性を有し得て、従って、本願は、配列番号１１（例えば、配列番号１１のアミノ酸８２８〜８７９）または配列番号１２（例えば、配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２）内のＨＮＨドメインと、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の配列同一性を有する、ＨＮＨドメインを含むＣａｓ９ポリペプチドの使用も検討する。
【００２０】
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号により参照される配列との間の配列同一性のパーセントは、以下のように決定される。まず、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンによるＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、特定の配列識別番号で示された配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで、オンラインで得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使い方を説明する取扱説明書は、ＢＬＡＳＴＺに添付のリードミーファイルで確認することができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて、２つの配列間の比較を行なう。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられ、一方で、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するために、オプションを以下のように設定する：−ｉは、比較される第一の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定し；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは、−１に設定し；−ｒは、２に設定し；および、他のオプションは全て、それらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを用いて、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを産出することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ  −ｑ  −１  −ｒ  ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションを以下のように設定する：−ｉは、比較される第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定し；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；および、他のオプションは全て、それらの初期設定のままにする。例えば、以下のコマンドを用いて、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを産出することができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ  −ｉ  ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ  −ｊ  ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｏ  ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較される配列がホモロジーを共有する場合は、指定の出力ファイルは、ホモロジーのこれらの領域をアライン配列として示す。２つの比較される配列がホモロジーを共有しない場合は、指定の出力ファイルは、アライン配列を示さない。
【００２１】
アラインした時点で、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を数えることにより、マッチ数を決定する。配列同一性のパーセントは、マッチ数を、同定された配列（例えば、配列番号１１）に示される配列の長さで、または、連結された（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ）長さ（例えば、同定された配列に示される配列由来の１００の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで割って、その後、生じた値に１００を掛けることにより決定される。例えば、配列番号１１に示される配列とアラインした場合に１３００マッチを有するアミノ酸配列は、配列番号１１に示される配列と９３．７％同一である（すなわち、１３００÷１３８８×１００＝９３．７）。なお、配列同一性のパーセント値は、小数第一位に四捨五入する。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は、７５．１に切り捨てて、一方で、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は、７５．２に切り上げる。長さの値は常に整数であることにも注意すべきである。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「機能性変異」は、タンパク質またはタンパク質ドメインの、触媒的に活性の突然変異体を指すことを意図する。そのような突然変異体は、親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同レベルの活性、または、より高いレベルまたはより低いレベルの活性を有することができる。
【００２３】
ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、エンドヌクレアーゼコード配列、および、適用可能な場合はドナー配列を含む、構築物（単数または複数）は、植物、植物部分、または植物細胞に、例えば微粒子銃を用いて送達することができる。あるいは、システムの構成要素は、アグロバクテリウム属により仲介される形質転換を用いて送達することができる。一部の実施態様では、システムの構成要素は、ウイルスベクター（例えば、ＤＮＡウイルス、制限されずに、ジェミニウイルスなど（例えば、キャベツ葉巻ウイルス、マメ黄化萎縮ウイルス、小麦萎縮ウイルス、トマト葉巻ウイルス、トウモロコシ線条ウイルス、タバコ葉巻ウイルス、またはトマトゴールデンモザイクウイルス）、または、ナノウイルス（例えば、ソラマメ壊疽性黄化ウイルス）由来のベクター、または、ＲＮＡウイルス、例えば、制限されずに、トブラウイルス（例えば、タバコ茎壊疽ウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＸ）、またはホルデイウイルス（例えば、大麦ストライプモザイクウイルス）由来のベクターにおいて送達することができる。
【００２４】
植物、植物部分、または植物細胞を、エンドヌクレアーゼをコードする配列およびｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（および、一部の場合には、ドナー配列）で、感染またはトランスフェクトした後、任意の適切な方法を用いて、ＧＴまたは標的化突然変異誘発が標的部位で生じているかどうか決定することができる。一部の実施態様では、表現型の変化は、ドナー配列が標的部位内に取り込まれていることを示すことができる。また、ＰＣＲに基づく方法を用いて、ゲノムの標的部位が、標的化変異またはドナー配列を含むかどうか、および／または、正確な組換えがドナーの５’および３’末端で生じているかどうか、確認することもできる。標的化変異を検出するための一つの方法（本明細書において「ＰＣＲ消化」と呼ぶ）は、Ｚｈａｎｇら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：１２０２８−１２０３３，２０１０）により記載される。正確な組換えを検出する方法は、ドナー配列に対してホモロジーを有するプローブを用いたサザンブロッティングを含む。
【００２５】
一部の実施態様では、本明細書で提供される方法は、植物、植物部分、または植物細胞内に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはキメラｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む核酸を導入するステップ（ここで、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、植物細胞に内因性であるヌクレオチド配列を標的化する）を含むことができ、および、植物、植物部分、または植物細胞内に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ分子（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその一部、例えば、ＨＮＨドメインを含むＣａｓ９ポリペプチドの一部、または、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸）を導入するステップ（ここで、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ分子は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列（またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド）が標的化する配列で、またはその付近で、二本鎖切断を誘導する）も含むことができる。
【００２６】
本明細書で提供される方法で用いられる植物、植物部分、および植物細胞は、植物の任意の種由来であってよい。一部の実施態様では、例えば、本明細書で提供される方法は、単子葉植物、その一部、またはそれ由来の細胞を利用することができる。例示的な単子葉植物は、制限されずに、小麦、トウモロコシ、米、ラン、タマネギ、アロエ、本物のユリ（ｔｒｕｅ  ｌｉｌｉｅｓ）、草（例えば、セタリア属）、潅木および木（例えば、ヤシおよび竹）、および食用植物、例えば、パイナップルおよびサトウキビを含む。例示的な双子葉植物は、制限されずに、トマト、キャッサバ、ダイズ、タバコ、ジャガイモ、シロイヌナズナ属、バラ、パンジー、ヒマワリ、ブドウ、イチゴ、カボチャ、マメ、エンドウ、およびピーナッツを含む。
【００２７】
一部の実施態様では、本明細書に記載の方法は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドにより標的化される配列で、またはその付近で、ＤＳＢが生じているかどうか、決定するために、植物、植物部分、または植物細胞をスクリーニングするステップを含むことができる。例えば、Ｚｈａｎｇら（上記）により記載されるＰＣＲ消化アッセイを用いて、ＤＳＢが生じているかどうかを決定することができる。他の有用な方法は、制限されずに、Ｔ７アッセイ、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ、およびサザンブロッティング（制限酵素の結合配列が、予測される切断部位に、またはその付近に存在する場合）を含む。
【００２８】
加えて、植物部分または植物細胞が用いられる一部の実施態様では、本明細書で提供される方法は、植物部分または植物細胞から植物を再生するステップを含むことができる。また、その方法は、遺伝学的に所望の植物系統を取得するために、植物（例えば、核酸が導入された植物、または、出発原料として使用された植物部分または植物細胞の再生後に得られた植物）を繁殖させるステップも含むことができる。植物を再生および繁殖する方法は、当分野においてよく確立されている。
【００２９】
配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）同一のアミノ酸配列を有するＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸、または、配列番号１１のアミノ酸８２８〜８７９、または配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）同一のアミノ酸配列を含むＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸を含む、植物、植物部分、および植物細胞もまた、本明細書において提供される。
【００３０】
また、本願は、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクターも提供する。例えば、ウイルスベクターは、配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施態様では、ウイルスベクターは、配列番号１１のアミノ酸８２８〜８７９、または配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有することができる。ベクターは、任意の適切なタイプのウイルス、例えば、トブラウイルスまたはジェミニウイルス由来であってよい。
【００３１】
配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）同一のアミノ酸配列を有するＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、Ｔ−ＤＮＡ分子もまた、本明細書において提供される。一部の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡは、配列番号１１のアミノ酸８２８〜８７９、または配列番号１２のアミノ酸８１０〜８７２と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３２】
また、本願は、本明細書に記載のＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム株も提供する。
【００３３】
加えて、本願は、植物、植物部分、または植物細胞において、Ｃａｓタンパク質を発現する方法を提供する。そのような方法は、例えば、（ａ）配列番号１１または配列番号１２と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むＴ−ＤＮＡを含む、アグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを提供するステップ（ここで、Ｃａｓ９をコードする配列はプロモーターに作動可能に連結される）、（ｂ）アグロバクテリウム属またはエンシファー属のベクターを、植物、植物部分、または植物細胞と接触させるステップ、および（ｃ）植物、植物部分、または植物細胞において、核酸配列を発現させるステップ、を含むことができる。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、エストラジオールにより誘導されるＸＶＥプロモーター；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２４：２６５−２７３，２０００）、細胞特異的プロモーター、または、スーサイドエクソンの選択的スプライシングにより活性化されるプロモーターであってよい。一部の実施態様では、そのような方法はまた、植物、植物部分、または植物細胞を、Ｃａｓタンパク質と関連があるガイドＲＮＡをコードする核酸と接触させるステップ、および、ガイドＲＮＡを発現させるステップ、を含むこともできる。
【００３４】
本発明は以下の実施例においてさらに説明され、それは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００３５】
実施例１−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素を発現するためのプラスミド
植物におけるゲノム編成に関するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を示すために、Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、ＡｔＵ６−２６またはＡｔ７ＳＬ−２）（そこからｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを発現する）をコードするように、プラスミドを構築した。植物のコドン最適化Ｃａｓ９コード配列を合成し、ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙエントリープラスミドにクローン化した。加えて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）プロモーターＡｔＵ６−２６およびＡｔ７ＳＬ２−２により作動されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを合成し、第二のＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙエントリープラスミドにクローン化した。ｃｒＲＮＡ配列の効率的な再構築を可能にするために（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより仲介されるＤＳＢに再度方向付ける役割がある）、逆転のタイプＩＩＳ制限酵素部位（例えば、ＢｓａＩおよびＥｓｐ３Ｉ）を、ｃｒＲＮＡヌクレオチド配列内に挿入した。適切なタイプＩＩＳ制限酵素で消化することにより、オリゴヌクレオチドを用いてｃｒＲＮＡ配列内に標的配列を効率的にクローン化することができる。Ｃａｓ９およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ＡｔＵ６−２６またはＡｔ７ＳＬ２−２）によるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの発現の両方に関するエントリープラスミドを、ｐＭＤＣ３２（２ｘ３５Ｓプロモーターを有する標準的なＴ−ＤＮＡ発現プラスミド；図１および配列番号６）、ｐＦＺ１９（エストロゲン誘導性Ｔ−ＤＮＡ発現ベクター；図２および配列番号７；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２４（２）：２６５−２７３，２０００）、およびｐＮＪＢ１２１（ジェミニウイルスのレプリコンＴ−ＤＮＡベクター；図３および配列番号８）内に組み換えた。
【００３６】
実施例２−体細胞植物組織でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムがＳＳＮとして機能する能力を示すために、ジェミニウイルスのレプリコンＴ−ＤＮＡベクター、ｐＮＪＢ１２１を、Ｃａｓ９およびｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド配列の両方をコードするように修飾した（図４Ａ）。標的ＲＮＡ配列（ｃｒＲＮＡ内のヌクレオチド配列によりコードされる；Ｃａｓ９切断を方向付ける要因である）を、内因性のＳｕＲＡおよびＳｕＲＢ遺伝子内の配列に相同であるように設計した。ＳｕＲ遺伝子座にマッチするｃｒＲＮＡの標的部分の配列は５’−ＧＵＧＧＧＡＧＧＡＵＣＧＧＵＵＣＵＡＵＡ（配列番号９；５’ＧはＳｕＲ遺伝子座にマッチしないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写に必要である）であった。ｐＮＪＢ１２１はジェミニウイルスのレプリコンであるが、レプリカーゼ（Ｒｅｐ）の不存在下では、増幅は生じない。したがって、Ｒｅｐの不存在下でのｐＮＪＢ１２１は、標準的なＴ−ＤＮＡベクターであり、レプリコンは形成されない。修飾ｐＮＪＢ１２１プラスミドは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍの葉組織に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたシリンジインフィルトレーションにより送達した。インフィルトレーション後５日に、ＰＣＲ消化を用いて、Ｃａｓ９により仲介される変異に関してＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ配列を評価した（図４Ｃ）。対応する標的配列での変異の存在は、植物の葉細胞でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を示した。
【００３７】
実施例３−プロトプラストでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性
植物でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性をさらに示すために、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのプロトプラスト内のＤＮＡ配列の標的化突然変異誘発を評価する。標的ｃｒＲＮＡ配列は、内因性のＡＤＨ１またはＴＴ４遺伝子（シロイヌナズナ属）、または、組み込まれたｇｕｓ：ｎｐｔＩＩレポーター遺伝子またはＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ（タバコ属）内に存在する配列と相同であるように再設計した。プロトプラストは、シロイヌナズナ属およびタバコ属の葉組織から単離され、Ｃａｓ９およびＡＤＨ１−またはＴＴ４−標的ｃｒＲＮＡ、またはＣａｓ９およびｇｕｓ：ｎｐｔＩＩ−またはＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ−標的化ｃｒＲＮＡをコードするプラスミドをそれぞれ用いてトランスフェクトされる。ゲノムＤＮＡは、トランスフェクション後５〜７日に抽出し、対応する標的配列での変異を評価する。ＡＤＨ１、ＴＴ４、ｇｕｓ：ｎｐｔＩＩまたはＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ遺伝子内での変異の検出は、植物プロトプラストにおける内因性遺伝子を標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を示す。
【００３８】
当初の研究では、Ｚｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６１：２０−２７，２０１３）により記載される方法と同様の方法を用いて、染色体外レポータープラスミドを切断する能力に関して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを評価した。レポータープラスミドは、非機能性黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ；図５および配列番号１０）をコードする。ＹＦＰ発現は、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ複合体に関する標的配列の横の内部コード配列のダイレクトリピートにより破壊される。Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ標的配列での標的化ＤＳＢの生成は、ダイレクトリピート配列の組み換えを生じ、それにより、ＹＦＰ遺伝子の機能を回復する。タバコＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ遺伝子座由来の配列を、ダイレクトリピート間のＹＦＰレポーター中にクローン化した。それから、この部位を標的化するｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの構築物を生産した。ＳｕＲ遺伝子座を標的化するｃｒＲＮＡの部分の配列は、５’−ＧＵＧＧＧＡＧＧＡＵＣＧＧＵＵＣＵＡＵＡ（配列番号９；再度、５’ＧはＳｕＲ遺伝子座にマッチしないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写に必要である）であった。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのプロトプラストを、Ｃａｓ９、ｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、およびＹＦＰレポーターをコードするプラスミドで形質転換し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ活性の結果としてのＹＦＰ発現の回復を、フローサイトメトリーによりモニターした。ＹＦＰをコードするポジティブコントロールのプラスミドを用いて、細胞の９４．７％が形質転換されて、ＹＦＰを発現した（図６、カラム４）。レポーターのみを用いて形質転換された細胞は、辛うじてバックグラウンドを超える活性レベルを与えた（図６、カラム３）。Ｃａｓ９およびｃｒ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡを発現する構築物を用いて細胞を形質転換した場合、有意な活性が観察され、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ複合体が標的を切断することを示した。ＡｔＵ６−２６プロモーターにより発現されるｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡに関しては、細胞の１８．８％が蛍光を発した（図６、カラム１）。Ａｔ７ＳＬ２−２プロモーターによりｃｒ／ｔｒａｃｒ  ＲＮＡが発現した場合、細胞の２０．７％がＹＦＰ陽性であった（図６、カラム２）。ＹＦＰを発現する細胞の検出は、植物プロトプラストでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの機能を示した。
【００３９】
実施例４−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた、プロトプラストでの多重ゲノム操作
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、異なるＤＮＡ配列において多重ＤＳＢを生じる能力を、植物プロトプラストを用いて評価する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を、ＴＴ４、ＡＤＨ１、および染色体外ＹＦＰレポータープラスミド（同一のシロイヌナズナ属のプロトプラスト内）に方向付けるために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドプラスミドを、多重ｃｒＲＮＡ標的配列を発現するように修飾する。これらの配列は、ＴＴ４、ＡＤＨ１およびＹＦＰレポータープラスミド内に存在する配列に相同であるように設計する。Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、およびＹＦＰレポータープラスミドを用いた、シロイヌナズナ属のプロトプラストへのトランスフェクションの後に、ＹＦＰを発現する細胞を定量化および単離し、ゲノムＤＮＡを抽出する。ＹＦＰを発現する細胞における、ＡＤＨ１およびＴＴ４遺伝子内の変異の観察は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが、シロイヌナズナ属の細胞における多重ゲノム操作を促進することができることを示唆する。
【００４０】
タバコ属のプロトプラストでの多重ゲノム操作を示すために、多重ｃｒＲＮＡを含むプラスミドを、組み込まれたｇｕｓ：ｎｐｔＩＩレポーター遺伝子、ＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ、およびＹＦＰレポータープラスミドと相同である配列をコードするように修飾する。シロイヌナズナ属のプロトプラストで記載した方法と同様に、タバコ属のプロトプラストを、Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド、およびＹＦＰレポータープラスミドを用いてトランスフェクトする。ＹＦＰを発現する細胞を定量化および単離し、ゲノムＤＮＡを抽出する。ＹＦＰを発現する細胞における、組み込まれたｇｕｓ：ｎｐｔＩＩレポーター遺伝子およびＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ内の変異の観察は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが、タバコ細胞における多重ゲノム操作を促進することができることを示唆する。
【００４１】
実施例５−植物体でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性
植物体でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を示すために、Ｃａｓ９、および、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｃｒ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド配列の、両方をコードするように、ｐＦＺ１９  Ｔ−ＤＮＡを修飾する。標的ＤＮＡ配列は、内因性ＡＤＨ１またはＴＴ４遺伝子内に存在する。生じたＴ−ＤＮＡを、アグロバクテリウム属を用いたフローラルディップ法（ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ）により、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのゲノム内に組み込む。Ｃａｓ９発現は、エストロゲンへの直接曝露により、一次トランスジェニック植物において誘導される。体細胞の葉組織由来のゲノムＤＮＡを抽出し、対応するゲノムの遺伝子座における変異に関して、ＰＣＲ消化により評価する。ＡＤＨ１またはＴＴ４遺伝子内の変異の観察は、植物体でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を示す。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性は、Ｔ２種子（誘導されたＴ１親から生産される）を、対応するゲノムの遺伝子座での、ヘテロ接合またはホモ接合型の変異に関してスクリーニングすることにより評価することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが多重ゲノム操作を行なうことができる能力を、ＡＤＨ１およびＴＴ４の両方と相同の配列を有する多重ｃｒＲＮＡを含むプラスミドを修飾することにより評価する。生じたＴ−ＤＮＡプラスミドをシロイヌナズナ属のゲノム内に組み込み、Ｃａｓ９発現を一次トランスジェニック植物において誘導し、Ｔ１およびＴ２植物の両方においてＡＤＨ１およびＴＴ４遺伝子を評価することにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ活性を評価する。ＡＤＨ１およびＴＴ４遺伝子の両方での変異の観察は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓが、シロイヌナズナ属の植物において多重ゲノム操作を促進することができることを示唆する。
【００４２】
実施例６−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素のウイルス送達
植物ウイルスは、異種核酸配列の送達のための（例えばＲＮＡｉ試薬のため、または異種タンパク質を発現するための）、効果的なベクターであり得る。有用な植物ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス、タバコ茎壊疽ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、および大麦ストライプモザイクウイルス）およびＤＮＡウイルス（例えば、キャベツ葉巻ウイルス、マメ黄化萎縮ウイルス、小麦萎縮ウイルス、トマト葉巻ウイルス、トウモロコシ線条ウイルス、タバコ葉巻ウイルス、トマトゴールデンモザイクウイルス、およびソラマメ壊疽性黄化ウイルス；Ｒｙｂｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２０１１；および、Ｇｌｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７，１３４−１４１）の両方を含む。そのような植物ウイルスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素の送達に関して修飾され得る。ＤＮＡウイルス（ジェミニウイルスのレプリコン；Ｂａｌｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２６：１５１−１６３，２０１４）を用いて、概念実証実験をＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍの葉細胞で行なった。この目的を達成するために、内因性ＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ遺伝子座に対するホモロジーを含むようにｃｒＲＮＡ配列を修飾した。生じたプラスミドを、Ｃａｓ９と並べて、ｐＮＪＢ１２１（ジェミニウイルス複製（ＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡ）に必要なシス作用エレメントを有するＴ−ＤＮＡデスティネーションベクター）にクローン化した（図４Ａ）。アグロバクテリウム属による、レプリカーゼタンパク質をコードするＴ−ＤＮＡ（Ｒｅｐ；ＲＥＰ  Ｔ−ＤＮＡ）に伴うＬＳＬ  Ｔ−ＤＮＡの共送達は、ジェミニウイルスのレプリコンの複製放出（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ）をもたらした（図４Ｂ）。Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム属を用いたシリンジインフィルトレーションにより、タバコ葉組織に送達された。インフィルトレーション後５〜７日に、ＰＣＲ消化を用いて、Ｃａｓ９により仲介される変異に関してＳｕＲＡ／ＳｕＲＢ配列を評価した（図４Ｃ）。消化耐性ＰＣＲアンプリコンをクローン化してシーケンスした。対応する標的配列における変異の存在は、植物ウイルスが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素の送達に効果的なベクターであることを示す（図４Ｄ）。
【００４３】
［他の実施態様］
本発明は、その詳細な説明とともに説明されているが、前述の説明は、説明目的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月3日(2019.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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