(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞が光で照射されたときに細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である、キメラ光活性化タンパク質カチオンチャネルを含む組成物の提供。【解決手段】細胞膜で発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であって、タンパク質は、（ａ）ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）光応答性であり、（ｃ）細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である、動物細胞。【選択図】図１ａ−ｂ
2019205455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１１月５日に出願された米国特許仮出願第６１／４１０，７３６号、２０１０年１１月５日に出願された同第６１／４１０，７４４号、および２０１１年７月２６日に出願された同第６１／５１１，９１２号の優先権を主張し、これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本出願は、光活性化キメラタンパク質をその原形質膜上に発現する動物細胞を含む組成物と、前頭前皮質で同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを選択的に分極化するために、それを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの精神障害の精神生理学的基質は、自閉症および統合失調症に観察されるもののような、複雑な行動表現型に関連する遺伝的要因について、急速に明らかになっている情報にもかかわらず、不明なところが多い（Ｃｉｃｈｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １６６（５）：５４０（２００９）、Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２６（１）：３（２００９））。１つの目立って明らかになっている原理は、非常に広範囲の一見無関係な遺伝的異常が、同じクラスの精神医学的表現型を引き起こし得ることである（社会的行動障害等、Ｆｏｌｓｔｅｉｎ＆Ｒｏｓｅｎ−Ｓｈｅｉｄｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２（１２）：９４３（２００１））。この驚くべきパターンは、一般的な病態生理学的原理のもとに、多様な遺伝的要因を統合し得る、回路レベルの知見を単純化することを識別する必要性を指摘した。
【０００４】
１つのこのような回路レベルの仮説は、皮質細胞の興奮および抑制の比率（細胞のＥ／Ｉバランス）の上昇が、自閉症の社会的および認知的障害を引き起こし得るということである（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１１８、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ＆Ｍｅｒｚｅｎｉｃｈ，Ｇｅｎｅｓ，Ｂｒａｉｎ，ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ２（５）：２５５（２００３））。この仮説は、多くの自閉症関連遺伝子が、イオンチャネルおよびシナプスタンパク質内で機能獲得表現型に結合される（Ｂｏｕｒｇｅｒｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９（２），２３１（２００９））、および自閉症患者の約３０％が、臨床的に明らかな発作もまた示す（Ｇｉｌｌｂｅｒｇ＆Ｂｉｌｌｓｔｅｄｔ，Ａｃｔａ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ，１０２（５）：３２１（２０００））という観察を含む、病態生理学的根拠の多様な動向を、統合し得る可能性がある。しかしながら、このような不均衡（疾患の症状に関連する）が、長期的（例えば、進行中）または短期的な時間尺度で作用するかどうかについては、明らかになっていない。さらに、この仮説は、１つには依然として直接的な試験を受けるに至らないという理由で、決して普遍的に受け入れられるものではない。薬理学的および電気的な介入は、臨床設定にあるか、または自由に行動しているかに関わらず、社会的および認知的活動中の実験哺乳動物において、新皮質の興奮性細胞の活性を、抑制性細胞よりも選択的に支持する（受容体調節とは根本的に異なる方法で）ために必要な特異性を欠いている。自閉症および統合失調症の社会的および認知的障害が、大部分が診療における従来の精神薬理学的治療に対して応答しないことが証明されたことは、おそらく、このような問題に関連する。
【０００５】
光遺伝学は、機能しているインタクトの生体系とペースを保つために必要とされる時間精度（ミリ秒の時間尺度）で、自由に行動している哺乳動物および他の動物の体内でさえも、生体組織の標的細胞内の特定のイベントを制御するために使用される、遺伝的および光学的方法の組み合わせである。光遺伝学の特徴は、特定の標的機構の使用を通して細胞型分解能を維持しながら、ニューロン膜電位の時間的に正確な操作を可能にする、標的神経細胞の原形質膜への高速光応答性チャネルタンパク質の導入である。神経系の機能を調べるために使用することができる微生物オプシンの中には、光に応答して脱分極化を推進するために使用される、チャネルロドプシン（ＣｈＲ２、ＣｈＲ１、ＶＣｈＲ１、およびＳＦＯ）がある。わずか２〜３年の間に、光遺伝学の分野は、特定の細胞型が、インビボ神経回路等の生物組織の機能にどのように貢献するかという基本的な科学的理解をさらに深めてきた。また、臨床側では、光遺伝学によって動かされた研究が、パーキンソン病ならびに他の神経学的および精神医学的障害への洞察につながってきた。
【０００６】
しかしながら、皮質のＥ／Ｉバランスの比率の上昇が、自閉症の社会的および認知的障害ならびに統合失調症等の他の障害と関連し得るという仮説を調査するために、既存の光遺伝学的手段には制限がある。従来のチャネルロドプシンの光電流は、Ｅ／Ｉバランスに段階様の変化をもたらすことを排除する（替わりに、細胞のＥ／Ｉバランスにおける安定した変化の調査に好適でないであろう傾斜または変調を要する）著しい脱感作を示し、さらに、ＳＦＯおよび従来のＣｈＲのいずれも、青色光によって駆動され、それが、異なる回路要素集団（興奮性および抑制性ニューロン等）を駆動する効果の調製物内比較を排除する。したがって、皮質のＥ／Ｉバランスの操作および皮質切片中のγ振動の監視を可能にし、これらの操作が、どのように前頭前皮質内の同じ微小回路内に存在する下流ニューロンに影響を与えるかの調査を可能にするであろう手段が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
細胞が光で照射されたときに細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である、キメラ光活性化タンパク質カチオンチャネルを含む組成物を、本明細書に提供する。
【０００８】
細胞膜で発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であって、タンパク質は、（ａ）ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）光応答性であり、（ｃ）細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である、動物細胞を、本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、単離されているか、または細胞培養培地中にある。
【０００９】
細胞膜上に本明細書に記載のキメラタンパク質を発現する細胞を含む細胞集団もまた、本明細書に提供される。細胞膜上に本明細書に記載のキメラタンパク質を発現する細胞を含む、非ヒト動物および脳組織もまた、本明細書に提供される。
【００１０】
細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を符号化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、タンパク質は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、光応答性であり、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である、ポリヌクレオチドを、本明細書に提供する。ポリヌクレオチドを含むベクター（発現ベクター等）もまた、提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、またはレンチウイルスベクター）である。
【００１１】
さらに、細胞膜上に本明細書に記載のキメラタンパク質を発現する動物細胞を使用する方法もまた、本明細書に提供され、本方法は、キメラタンパク質を光で活性化することを含む。
【００１２】
さらに、同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを、選択的に脱分極化する方法であって、第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを選択的に脱分極化することであって、第１の光活性化タンパク質は、第１の波長を有する光に暴露されたときに脱分極化される、脱分極化と、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することであって、第２の光活性化タンパク質は、第２の波長を有する光に暴露されたときに脱分極化される、脱分極化と、を含む、方法を本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、第１または第２の光活性化タンパク質は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１、３、５、または７で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、または１４で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを選択的に脱分極化する方法であって、興奮性ニューロンで第１の光活性化タンパク質を発現することと、抑制性ニューロンで第２の光活性化タンパク質を発現することと、を含み、第１の光活性化タンパク質は、独立して、第１の波長を有する光に暴露されたときに脱分極化し、第２の光活性化タンパク質は、独立して、第２の波長を有する光に暴露されたときに脱分極化する、方法。いくつかの実施形態では、第１または第２の光活性化タンパク質は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１、３、５、または７で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、または１４で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンの脱分極化を選択的に阻害する化合物を識別するための方法であって、（ａ）第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを、第１の波長を有する光で選択的に脱分極化するか、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを、第２の波長を有する光で選択的に脱分極化すること、（ｂ）第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答して、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答して、抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定すること、（ｃ）興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンを化合物と接触させること、（ｄ）興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンのいずれかを化合物と接触させることが、いずれかのニューロンの脱分極化を選択的に阻害するかどうかを判定するために、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定すること、を含む、方法もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、第１または第２の光活性化タンパク質は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１、３、５、または７で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、または１４で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本明細書に記載の種々の実施形態の特性の１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してもよいことを理解されたい。本発明のこれらまたは他の態様は、当業者には明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】コンビナトリアル光遺伝学のための、改善された赤方偏移チャネルロドプシンの構造を描写する。（ａ）ＣａＭＫＩＩａプロモータの制御下でＶＣｈＲ１−ｅＹＦＰまたはＣ１Ｖ１−ｅＹＦＰをトランスフェクトした、培養海馬ニューロンの共焦点画像。四角は、最後のパネルに拡大された領域を示し、Ｃ１Ｖ１−ｔｓＹＦＰの樹状膜の局所化を示す。スケールバー：２０μｍ（左）、４μｍ（右）。（ｂ）示されるオプシンを発現する、培養中の海馬ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録からのピーク光電流。（ｃ）ＣｈＲ１、ＣｈＲ２、およびＶＣｈＲ１の配列比較。２つのＣ１Ｖ１変異形に対するスプライス部位を示す。推定の膜貫通ヘリックス１〜７を、棒で示し（ＴＭ１〜７）、突然変異したアミノ酸を灰色で示す。（ｄ）Ｃ１Ｖ１スプライス変異形１および２を発現する、ＨＥＫ細胞において記録された光電流振幅。（ｅ）示されるオプシンをトランスフェクトし、ＥＹＦＰに融合した培養海馬ニューロンの単一の共焦点平面画像。ＤＮＡ濃度は、構築物全体で一致していた。（ｆ）ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、Ｃ１Ｖ１野生型、Ｃ１Ｖ（Ｅ１２２Ｔ）、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）、およびＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）の作用スペクトル。光電流は、ＨＥＫ２９３細胞において２ミリ秒の光パルスで収集した。（ｇ）カチオン単離外部溶液を使用して、全細胞パッチクランプによって、ＨＥＫ細胞において−４０ｍＶの光電流量により測定された、Ｃ１Ｖ１スプライス変異形１のイオン透過度。データは、最大ピークＮａ電流に対して正規化した。（ｈ）白色で示される点突然変異位置を有するＣ１Ｖ１キメラの概略図。ＣｈＲ１配列を黒色で示し、ＶＣｈＲ１配列を灰色で示す。
【図２】コンビナトリアル光遺伝学のための、改善された赤方偏移チャネルロドプシンの試験を描写する。（ａ）示されるオプシンを発現する培養ニューロン内のチャネル閉鎖の時定数（ｔｏｆｆ）の代表的トレースおよび要約プロットであり、トレースは、ピーク電流に対して正規化される。（ｂ）ＣｈＲ２の非活性化と比較した、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔの不活性化である。（ｃ）他のＣ１Ｖ１変異形と対比した、Ｃ１Ｖ１二重変異Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔにおける電流の不活性化。（ｄ）２ミリ秒の５４２ｎｍの光パルスに応答して、示されるオプシンを発現する、培養ニューロンで記録された平均ピーク光電流。
【図３】前頭前部の錐体ニューロンにおける急性切片記録からの光電流を描写する。（ａ）ピーク光電流は、統合された蛍光強度との一貫した相関を示す。（ｂ）ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）およびＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）における蛍光−光電流の関係。黒色の線は、データを線形に当てはめたものである。（ｃ）５６０ｎｍの光パルス列または示される周波数での電流注入で刺激した、前頭前部の錐体ニューロンにおける急性切片の記録。要約グラフは、集団データを示す（ｎ＝６）。（ｄ）電流注入（２００ｐＡ、１０ミリ秒のパルス、左上）または示される波長および光パワー密度で２ミリ秒の光パルスに対する、成功したスパイクの割合。２０×２ミリ秒のパルスから構成される全パルス列は、Ｓｕｔｔｅｒ  ＤＧ−４光源を使用して顕微鏡対物レンズを通じて送達され、２０ｎｍのバンドパスフィルタおよび追加の減光フィルタを使用してフィルタ処理して、光パワーを減衰させた（２個の切片においてｎ＝６個の細胞）。（ｅ）Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２ＴまたはＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する細胞における、５４２ｎｍおよび６３０ｎｍの光パルスに対する電圧クランプ反応（上）。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔを発現する細胞における電流クランプの記録は、３．２ｍＷ  ｍｍ−２で、５Ｈｚ列の５０ミリ秒の６３０ｎｍの光に応答してスパイクを示す（下）。（ｆ）Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）における赤色光応答動態。５４０ｎｍおよび６３０ｎｍでＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）を発現する、培養ニューロンから記録された光電流の活性化時定数（τｏｎ）。光パワーは、６３０ｎｍで３．２ｍＷ  ｍｍ−２、５４０ｎｍで７．７ｍＷ  ｍｍ−２（ｎ＝５個の細胞、ｐ＝０．０００６対応ｔ検定）であったことに留意されたい。（ｇ）電圧クランプのトレースは、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）を発現するニューロンにおける、６３０ｎｍの光パルスに対する応答を示す。パルス長は、トレースの上に示される。１５０ミリ秒のトレースから計算されるτｏｎは、６７ミリ秒である。（ｈ）６３０ｎｍで５０ミリ秒のパルス（パワー密度３．２ｍＷ  ｍｍ−２）によって誘発されるスパイクを示す、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）を発現するニューロンからの電流クランプの記録。
【図４】興奮性錐体ニューロンおよび抑制性パルブアルブミン発現細胞の独立した活性化を描写する。（ａ）５６０ｎｍまたは４０５ｎｍで２ミリ秒の光パルス（５Ｈｚ、両方の波長において７．６ｍＷ／ｍｍ２）に応答して、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）またはＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）を発現する培養海馬ニューロンからの電流クランプの記録。（ｂ）皮質錐体ニューロンにＣ１Ｖ１、および抑制性パルブアルブミン陽性介在ニューロンにＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）を発現する、二重注入した動物における記録の構造。オプシンを独立して発現させるために、ＰＶ：：Ｃｒｅマウスに、Ｌｅｎｔｉ−ＣａＭＫＩｌα−Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）およびＡＡＶ５−ＥＦｌａ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）を含有する２つのウイルスの混合物を注入した。（ｃ）Ｃ１Ｖ１発現ＰＹＲ細胞およびＣｈＲ２発現ＰＶ細胞からシナプス入力を受容する、非発現ＰＹＲニューロンからの電圧クランプの記録。０ｍＶでクランプすると、４０５ｎｍの光パルスは短潜ＩＰＳＣを引き起こし、一方で５６０ｎｍのパルスは、小さな長潜の抑制性シナプス応答を誘起するのみである。（ｄ）ｃに示したものと同じ細胞からの電圧クランプの記録。−６５ｍＶでクランプすると、５６０ｎｍの光パルスは、ＥＰＳＣを引き起こすが、４０５ｎｍのパルスは、検出可能なシナプス電流を誘起しない。灰色の線は、個別のイベントを示し、黒色の線は、光パルスに引き起こされたものの平均を示す。（ｅ）ＣａＭＫＩＩａ：：Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）−ｔｓ−ｅＹＦＰおよびＥｆ１ａ−ＤＩＯ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを注入した麻酔ＰＶ：：ＣｒｅマウスにおけるｍＰＦＣオプトロード記録（図は、実験ステップを示す）。紫色（４０５ｎｍ）の光パルスは、緑色の光パルスに対する可変遅延（Ａｔ）を示す（例示トレース）。（ｆ）要約グラフは、紫色のパルスが、示される遅延時間で緑色光パルスに先行する状態で、緑色光に誘起されるスパイクの確率を示す。個々の点は、単一の記録からのものである。黒色の線は、全ての記録の平均を示す（ビンあたり＞３記録部位）。（ｇ）それぞれ、５６１ｎｍの刺激（右、上の波形）および４０５ｎｍの刺激（右、下の波形）に応答して発火する、１つの推定錐体ユニットおよび１つの推定ＰＶユニットを示す、ウイルスを注入したマウスからのオプトロード記録。
【図５】異なるインタクト系調製物におけるコンビナトリアル光遺伝的励起を描写する。（ａ）インビトロにおけるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２ＴおよびＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒでのコンビナトリアル投射制御。実験的パラダイムは、それぞれ、皮質−視床（ＣＴ）および底腹側（ＶＢ）視床−皮質細胞（ＴＣ）におけるＣ１Ｖ１およびＣｈＲ２の発現を示す。（ｂ）ＣＴおよびＴＣ両方の細胞から投射を受容する、ｎＲＴ細胞からの電圧クランプ記録。同時刺激（Ａｔ＝０ミリ秒）は、両方の投射から誘起されたＥＰＳＣの線形和をもたらす。（ｃ）ＴＣおよびＣＴ線維からの個々の閾値入力は、入力が正確に一致する場合にのみ、ｎＲＴニューロンにスパイクをもたらす。（ｄ）ＣＴ入力とＴＣ入力との間の遅延時間を左側に示す。水平方向の点線は、切断されたスパイクを示す。可変の待機時間（Ａｔ）で活性化されるＣＴおよびＴＣ線維によって誘起された、正規化した活動電位の数（６個のｎＲＴ細胞から）は、ＣＴおよびＴＣの入力が、５ミリ秒以内で同時に起こる場合にのみ効果的な統合をもたらすことを示す。要約データは、平均±標準誤差を表す。
【図６】時間スペクトル分離およびコンビナトリアル制御、すなわち進行中のシナプス活性下での改変されたＥ／Ｉ状態における回路の調節および発生パターンを描写する。（ａ）ＰＶニューロンのＳＳＦＯ活性化および錐体ニューロンにおけるＣ１Ｖ１活性化の実験的パラダイム。（ｂ）ＣａＭＫＩｌａ：：Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）およびＤＩＯ−ＳＳＦＯを発現する、ＰＶ：：Ｃｒｅマウスからの急性切片調製物における、錐体ニューロンからの０ｍＶでの電圧クランプ記録。ＳＳＦＯおよびＣ１Ｖ１は、青色の光パルスにより活性化され（２）、ＩＰＳＣ周波数は、持続的なＳＳＦＯ活性によって増加される（３、活性化前および後のＩＰＳＣ活性に対する差込図において上と下のトレースを比較）。持続的な黄色の光パルスは、ＳＳＦＯを非活性下し、Ｃ１Ｖ１を活性化し、一過的にＩＰＳＣ周波数を増加させる（４）。集団パワースペクトル（右）は、興奮性およびＰＶニューロン（４７０ｎｍのパルス）の同時活性化の際に増加される、光学的な興奮性ニューロン活性化（５９０ｎｍのパルス）の際のγ周波数活性を示す。トレースの下の図は、実験中のＣ１Ｖ１およびＳＳＦＯの予測活性を示す。（ｃ）観察されたγ周波数ピークは、事前のＳＳＦＯを介したＰＶニューロンの刺激に依存するものではなかった。（ｄ）ベースラインおよび初期の青色または橙色パルス後の、（ｂ）および（ｃ）からの要約ＩＰＳＣ周波数。トレースの下の図は、実験中のＣ１Ｖ１およびＳＳＦＯの予測活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、とりわけ、光活性化キメラタンパク質をその原形質膜上に発現する動物細胞を含む組成物と、前頭前皮質内で同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを選択的に分極化するためにそれを使用する方法を提供する。発明者らは、初めて、皮質のＥ／Ｉ上昇および皮膚切片のγ振動を監視する能力の実験的操作を可能にする、固有の生理学的特性を有するキメラタンパク質を開発した。これらの固有の光感受性キメラタンパク質は、非ヒト動物の前頭前皮質の興奮性神経回路または抑制性神経回路のいずれかで発現され、次いで、特定の波長を有する光に応答して、脱分極化することができる。さらに、本明細書に開示されるキメラ光感受性タンパク質を発現する、皮質興奮性または抑制性ニューロンを含む非ヒト動物からの脳切片は、同じ神経回路内に存在する興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンのいずれかの脱分極化を選択的に阻害することができる、化合物を探索するために使用することができる。
【００１８】
一般的技法
本発明の実践は、特に指示されない限り、当業者に周知である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法を採用する。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）（本明細書では併せて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称される）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，２００１までの付録を含む）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書では併せて「Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ」と称される）、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）、ならびにＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）等の文献に十分に記載されている。
【００１９】
定義
本明細書で使用されるように、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」という単数形は、特に指示されない限り、複数の参照を含む。
【００２０】
「動物」とは、任意の一般的な研究室モデルの生物、または哺乳動物等の脊椎動物であり得る。哺乳動物は、ヒト、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス、ラット、および他のげっ歯類を含むが、それらに限定されない。
【００２１】
本明細書に使用される際の「アミノ酸置換」または「突然変異」は、定義されたアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸構成要素が別のアミノ酸で改変または置換され、細胞内に改変された活性または発現レベルを有する、そのアミノ酸配列によって符号化されたタンパク質をもたらすことを意味する。
【００２２】
「キメラタンパク質」は、１つ以上の異なるタンパク質に由来する１つ以上の部分を含む、タンパク質である。キメラタンパク質は、キメラタンパク質を符号化する核酸をトランスフェクトした組み換え細胞を培養することによって、生成することができる。
【００２３】
本明細書の全体を通して挙げられる全ての最大数値制限は、全てのより低い数値制限が本明細書で明示的に書かれたかのように、そのようなより低い数値制限を含むことが意図される。本明細書の全体を通して挙げられる全ての最小数値制限は、全てのより高い数値制限が本明細書で明示的に書かれたかのように、そのようなより高い数値制限を含む。本明細書の全体を通して挙げられる全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲が、本明細書で明示的に書かれたかのように、そのようなより狭い数値範囲を含む。
【００２４】
Ｖ１Ｃ１キメラタンパク質およびそれを発現する細胞
いくつかの態様では、本明細書に開示される動物細胞は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１カチオンチャネルおよびコナミドリムシのからのＣｈＲ１カチオンチャネルに由来する、「Ｃ１Ｖ１」として既知の、キメラ光感受性タンパク質を含む。本タンパク質は、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列から構成され得る、さらに、ＣｈＲ１の対応する第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、ＶＣｈＲ１ポリペプチドの少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを、有してもよい。Ｃ１Ｖ１キメラオプシンタンパク質は、単独では十分にニューロンで発現しない、他のオプシンタンパク質の小片から構築され、強力で、赤方偏移した、安定なチャネルロドプシンである。いくつかの実施形態では、動物細胞は、細胞の原形質膜上に第２の光活性化タンパク質を発現し得る。第２の光活性化タンパク質は、光による活性化に応答して、細胞の原形質膜の過分極化を仲介することが可能であり得る。細胞の原形質膜の過分極化を仲介することが可能である光活性化タンパク質の例は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出すことができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本開示の実施形態はまた、Ｃ１Ｖ１の修飾形または突然変異形を対象とし得る。これらのタンパク質は、ニューロンに対して光学的制御を行使するために、単独でか、または種々の他のオプシンと組み合わせて、使用することができる。具体的には、他のオプシンと関連した、修飾されたＣ１Ｖ１の使用が、神経系障害に対する光学的制御に有用であると見られている。Ｃ１Ｖ１の特定の使用は、神経回路に対する時間的、空間的、および／または細胞型特異的な制御を、測定可能な尺度と相関させる、光遺伝学系または方法に関する。
【００２６】
Ｖ１Ｃ１キメラタンパク質
動物細胞の原形質膜上に発現される、光活性化キメラタンパク質を、本明細書に提供する。いくつかの態様では、本光活性化タンパク質は、ボルボックス・カルテリからのＶＣｈＲ１およびコナミドリムシからのＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質である。いくつかの実施形態では、本キメラタンパク質は、ＣｈＲ１の対応する第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＣｈＲ１の対応する第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換される、第１および第２の膜貫通ヘリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、ＣｈＲ１からの対応する部分によって置換される、第２および第３の膜貫通ヘリックスの間に位置する、細胞内ループドメインの少なくとも一部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質の第２および第３の膜貫通ヘリックスの間の細胞内ループドメイン全体が、ＣｈＲ１からの対応する細胞内ループドメインで置換され得る。他の実施形態では、ＣｈＲ１の対応する部分で置換される、第２および第３の膜貫通ヘリックスの間に位置する細胞間ループドメインの一部分は、配列番号１のＡ１４５にまで及び得る。他の実施形態では、キメラタンパク質は、ＣｈＲ１の対応する第１および第２の膜貫通ヘリックスならびに細胞内ループドメインによって置換される、第１および第２の膜貫通ヘリックスならびに細胞内ループドメインを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、さらに、ＣｈＲ１の対応する部分によって置換される、少なくとも一部分の第３の膜貫通ヘリックスを含む。別の実施形態では、ＣｈＲ１から対応する部分によって置換される、第３の膜貫通ヘリックスの一部分は、配列番号１のＷ１６３にまで及び得る。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、ＣｈＲ１のアミノ酸１−１４５およびＶＣｈＲ１のアミノ酸１０２−３１６を含む。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、ＣｈＲ１のアミノ酸１−１６２およびＶＣｈＲ１のアミノ酸１１９−３１６を含む。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を有さない、配列番号１で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、配列番号１で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。
【００２７】
他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態では、光は、約５４２ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が４０５ｎｍの波長を有する光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。
【００２８】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、Ｃ末端蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの具体的な実施形態では、Ｃ末端蛍光タンパク質は、強化された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）であり得る。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、細胞の原形質膜へのタンパク質の輸送を強化する、輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって修飾される。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出される。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質内のシグナルペプチド配列は、異なるシグナルペプチド配列で置換することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、または幹細胞であり得る。一実施形態では、動物細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、動物細胞は、細胞の原形質膜上に発現される第２の光活性化タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を仲介することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、ＮｐＨｒ、ｅＮｐＨｒ２．０、ｅＮｐＨｒ３．０、ｅＮｐＨｒ３．１、またはＧｔＲ３であってもよい。他の光活性化カチオンチャネル、アニオンポンプ、およびプロトンポンプに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出すことができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、他の光活性化カチオンチャネルタンパク質を発現する細胞と比べて、光に暴露された神経細胞において、強化された光電流を有する。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質によってもたらされる光電流の強化は、他の光活性化カチオンチャネルタンパク質を発現する細胞よりも、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、または１５倍のいずれか以上であり得る。
【００３１】
動物細胞の原形質膜上に発現される１つ以上の光活性化タンパク質であって、前記１つ以上の光活性化タンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１２、１３、または１４で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、コアアミノ酸配列を含み、輸送シグナル（例えば、原形質膜への輸送を強化するもの）をさらに含む、光活性化タンパク質もまた、本明細書に提供する。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合させることができ、またはコアアミノ酸配列のＮ末端に融合させることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に結合され得る。リンカーは、長さで約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちのいずれかであるアミノ酸を含んでもよい。リンカーはさらに、例えば、強化された黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出され得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含み得る。
【００３２】
Ｖ１Ｃ１キメラ突然変異体
いくつかの態様では、本発明は、置換または変異アミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含み、変異ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、また、いくつかの特定の態様では、改変した性質を保有してもよい。例えば、本明細書で説明される変異光活性化キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞原形質膜上の両方での増加したレベルの発現、光の異なる波長、具体的には赤色光に暴露されたときの改変した応答性、および／または特質の組み合わせを示すことができ、それにより、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドは、低い脱感作、高速非活性化、他の光活性化カチオンチャネルを用いた最低限の相互活性化のための低い紫色光活性化、および／または動物細胞での強力な発現という性質を保有する。
【００３３】
アミノ酸置換または突然変異を含む光活性化キメラタンパク質には、光に応答する能力および原形質膜の分極状態を制御する能力を保持しながらも、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を有するものが含まれる。例えば、アミノ酸置換または突然変異を含む光活性化タンパク質は、１つ以上のアミノ酸を、配列番号１に対応するアミノ酸配列に置換することによって、作製することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を含む、タンパク質を含み、改変された光活性化キメラタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、タンパク質の原形質膜にわたって、特徴的な光活性化性質、および／またはイオン流動を調節する能力を保持するが、いくつかの具体的な態様では、改変した性質を有してもよい。
【００３４】
天然タンパク質配列中のアミノ酸置換は、保存または非保存であり得、このような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によって符号化されたものであってもよく、またはそうでなくてもよい。標準的な２０種類のアミノ酸の「アルファベット」を、それらの側鎖の化学的性質に基づいて、化学的なファミリーに分類した。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するもの（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するもの（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するもの（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族を有する側鎖を有するもの（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換する）。「非保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸で置換する）。アミノ酸置換は、保存または非保存であり得る。さらに、アミノ酸置換は、Ｃ１Ｖ１レチナール結合ポケット、Ｃ１Ｖ１細胞内ループドメインの１つ以上、および／またはレチナール結合ポケットもしくは細胞内ループドメインの両方に、位置することができる。
【００３５】
したがって、本明細書では、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケットの全体を通した主要位置に特定のアミノ酸置換を有することができる、Ｃ１Ｖ１キメラ光活性化タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ１２２に突然変異を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ１６２に突然変異を有することができる。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ１６２およびＥ１２２の両方に突然変異を有することができる。いくつかの実施形態では、開示された変異Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質のそれぞれは、光に応答して動物細胞の膜を脱分極化することに使用するための特定の性質および特性を有することができる。
【００３６】
Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異ポリペプチド
本明細書では、動物細胞の原形質膜上に発現される、本明細書に開示される光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質であって、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｃ１Ｖ１活性（すなわち、光の活性化に応答して、動物細胞の脱分極化を触媒する能力）を保持しながらも、アミノ酸置換を受けており、突然変異が、配列番号１のＥ１２２に対応するグルタミン酸残基に存在し得る（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２）、光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｅ１２２に突然変異を有さないＣ１Ｖ１キメラ光活性化タンパク質と比べて、増加した光に対する感受性、増加した光の特定の波長に対する感受性、および／または増加した細胞の原形質膜の極性状態を調節する能力を有するキメラタンパク質をもたらすことができる、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｅ１２２に導入される置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、非保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｅ１２２における突然変異は、スレオニンであってもよい（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ）。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を有さない、配列番号３で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、配列番号３で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｃ末端輸送シグナルに融合させることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、リンカーによって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラ光活性化タンパク質に結合され得る。リンカーは、長さで５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーはさらに、例えば、強化された黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出され得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含み得る。
【００３７】
他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４６ｎｍの波長を有することができる。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２キメラタンパク質は、細胞が赤色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することができる。いくつかの実施形態では、赤色光は、約６３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が４０５ｎｍの波長を有する光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、または幹細胞であり得る。一実施形態では、動物細胞は、神経細胞であり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、動物細胞は、細胞の原形質膜上に発現される第２の光活性化タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を仲介することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、ＮｐＨｒ、ｅＮｐＨｒ２．０、ｅＮｐＨｒ３．０、ｅＮｐＨｒ３．１、またはＧｔＲ３であってもよい。
【００３８】
Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異ポリペプチド
本明細書では、動物細胞の原形質膜上に発現される、本明細書に開示される光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質であって、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｃ１Ｖ１活性（すなわち、光の活性化に応答して、動物細胞の脱分極化を触媒する能力）を保持しながらも、アミノ酸置換を受けており、突然変異が、配列番号１のＥ１６２に対応するグルタミン酸残基に存在し得る（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２）、光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｅ１６２に突然変異を有さないＣ１Ｖ１キメラ光活性化タンパク質と比べて、増加した光に対する感受性、増加した光の特定の波長に対する感受性、および／または増加した細胞の原形質膜の極性状態を調節する能力を有するキメラタンパク質をもたらすことができる、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｅ１６２に導入される置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、非保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｅ１６２における突然変異は、スレオニンであってもよい（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔ）。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を有さない、配列番号５で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、配列番号５で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｃ末端輸送シグナルに融合させることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、リンカーによって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質に結合され得る。リンカーは、長さで５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーはさらに、例えば、強化された黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出され得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含み得る。
【００３９】
他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５３５ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態では、光は、約５４２ｎｍの波長を有し得る。他の実施形態では、光は、約５３０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が４０５ｎｍの波長を有する光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２キメラタンパク質は、Ｃ末端蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、または幹細胞であり得る。一実施形態では、動物細胞は、神経細胞であり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、動物細胞は、細胞の原形質膜上に発現される第２の光活性化タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を仲介することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、ＮｐＨｒ、ｅＮｐＨｒ２．０、ｅＮｐＨｒ３．０、ｅＮｐＨｒ３．１、またはＧｔＲ３であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２光活性化キメラタンパク質は、Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、加速した光周期を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２光活性化キメラタンパク質は、Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質よりも、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍以上速い光周期を有することができる。
【００４０】
Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２二重変異ポリペプチド
本明細書では、動物細胞の原形質膜上に発現される、本明細書に開示される光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質であって、１つ以上のアミノ酸残基が、Ｃ１Ｖ１活性（すなわち、光の活性化に応答して、動物細胞の脱分極化を触媒する能力）を保持しながらも、アミノ酸置換を受けており、突然変異が、配列番号１のＥ１２２およびＥ１６２に対応するグルタミン酸残基に存在し得る（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２）、光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｅ１２２およびＥ１６２に突然変異を有さないＣ１Ｖ１キメラ光活性化タンパク質と比べて、増加した光に対する感受性、増加した光の特定の波長に対する感受性、および／または増加した細胞の原形質膜の極性状態を調節する能力を有するキメラタンパク質をもたらすことができる、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸Ｅ１２２およびＥ１６２に導入される置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、突然変異は、保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、非保存アミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、保存および非保存の両方のアミノ酸置換であってもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基Ｅ１２２およびＥ１６２における突然変異は、スレオニンであってもよい（Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を有さない、配列番号７で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、配列番号７で示される配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、アミノ酸配列を含むことができる。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質は、Ｃ末端輸送シグナルに融合させることができる。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、リンカーによって、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラ光活性化タンパク質に結合され得る。リンカーは、長さで５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００個のうちいずれかであるアミノ酸を含むことができる。リンカーはさらに、例えば、強化された黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質であるが、それらに限定されない、蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出され得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含み得る。
【００４１】
他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能である。いくつかの実施形態では、光は、緑色光であり得る。他の実施形態では、光は、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、光は、約５４６ｎｍの波長を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、細胞が４０５ｎｍの波長を有する光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を仲介することが可能ではない場合がある。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質と比べて、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、紫色光に暴露されたときに少ない活性化を示すことができる。いくつかの実施形態では、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、または幹細胞であり得る。一実施形態では、動物細胞は、神経細胞であり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、動物細胞は、細胞の原形質膜上に発現される第２の光活性化タンパク質をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を仲介することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、ＮｐＨｒ、ｅＮｐＨｒ２．０、ｅＮｐＨｒ３．０、ｅＮｐＨｒ３．１、またはＧｔＲ３であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２光活性化キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、減少した不活性化を有することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異光活性化キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質と比較して、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６ｖ、２７％、２８％、２９％、または３０％のいずれかを含めた、不活性化を行うことができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２光活性化キメラタンパク質は、Ｅ１２２／Ｅ１６２において突然変異が欠けているＣ１Ｖ１タンパク質よりも、または他の光活性化カチオンチャネルタンパク質と比べて、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍以上速い光周期を有することができる。
【００４２】
アミノ酸モチーフの細胞内輸送の強化
本開示は、哺乳類細胞の原形質膜への輸送を強化する１つ以上のアミノ酸配列モチーフの付加による、細胞内で発現される光活性化キメラタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物に由来する構成要素を有する光活性化キメラタンパク質は、哺乳類細胞によって発現されないかもしくは耐容性を示されない可能性があるか、または哺乳類細胞において高レベルで発現された場合に細胞内局在化障害を示す可能性がある。結果として、いくつかの実施形態では、細胞内で発現されるキメラ光活性化タンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）輸送シグナル、膜輸送シグナル、およびＮ末端ゴルジ体輸送シグナルから成る群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合される。哺乳類細胞の原形質膜への光活性化キメラタンパク質の輸送を強化する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光活性化タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に融合されてもよい。任意選択的に、光活性化タンパク質および１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態では、光活性化キメラタンパク質は、細胞の原形質膜へのタンパク質の輸送を強化する、輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって修飾される。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から導出される。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。細胞の原形質膜への光活性化タンパク質の輸送を強化することができるさらなるタンパク質モチーフは、米国特許出願第１２／０４１，６２８号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質中のシグナルペプチド配列は、欠失しているか、または異なるタンパク質由来のシグナルペプチド配列で置換されている。
【００４３】
動物細胞、非ヒト動物、および脳切片
本明細書に開示される光活性化キメラタンパク質を含む細胞を、本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、配列番号１に対応するＣ１Ｖ１タンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号３に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔタンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号５に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔタンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号７に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、または幹細胞であり得る。一実施形態では、動物細胞は、神経細胞であり得る。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。
【００４４】
動物における細胞の細胞膜上に発現される、本明細書に開示される光活性化キメラタンパク質を含む、非ヒト動物もまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、動物細胞は、配列番号１に対応するＣ１Ｖ１タンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号３に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔタンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号５に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２Ｔタンパク質を含む。他の実施形態では、動物細胞は、配列番号７に対応する変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、動物は、本明細書に記載の光活性化キメラタンパク質を含む動物は、前記光活性化キメラタンパク質を遺伝子導入により発現している。他の実施形態では、本明細書に記載の光活性化キメラタンパク質を含む動物は、アデノウイルスベクター等であるが、これに限定されない、光活性化タンパク質を持つベクターをウイルストランスフェクトされている。
【００４５】
切片中の細胞の細胞膜上に発現される、本明細書に開示される光活性化キメラタンパク質を含む、非ヒト動物に由来する生体脳切片を、本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、脳切片は、本明細書に記載の光活性化キメラタンパク質を遺伝子導入で発現する非ヒト動物に由来する。他の実施形態では、脳切片は、アデノウイルスベクター等であるが、これに限定されない、前記光活性化タンパク質を持つベクターをウイルストランスフェクトされている、非ヒト動物に由来する。いくつかの実施形態では、脳切片は、冠状脳切片である。いくつかの実施形態では、脳切片は、約１００μｍ、約１５０μｍ、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍ、または約５００μｍを含め、これらの値の間の任意の厚さを含む、いずれかの厚さである。
【００４６】
単離ポリヌクレオチド
例えば、少なくとも１つのＣ１Ｖ１ポリペプチド活性を有する、本明細書に記載の任意のキメラポリペプチドを符号化する単離Ｃ１Ｖ１ポリヌクレオチドを、本明細書に提供する。本開示は、配列番号２、４、６、または８の核酸と、少なくとも約１０、例えば、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００個のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または完全な（１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む、単離、合成、または組み換えのポリヌクレオチドを提供する。
【００４７】
本開示は、特に、Ｃ１Ｖ１および／またはその突然変異体を符号化する核酸を提供する。例えば、本開示は、単離核酸分子であって、核酸分子が、（１）配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチド、（３）配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチド、または（４）配列番号７によって表されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチドを符号化する、単離核酸分子を提供する。
【００４８】
プロモータおよびベクター
本開示はまた、上述の核酸を含む、発現カセットおよび／またはベクターを提供する。好適には、本開示のキメラタンパク質を符号化する核酸は、プロモータに動作可能に結合される。プロモータは当該技術分野において周知である。宿主細胞で機能する任意のプロモータを、本開示のＣ１Ｖ１および／またはその任意の変異形の発現に使用することができる。特定の動物細胞においてＣ１Ｖ１キメラタンパク質またはその変異形の発現を駆動するために有用である開始制御領域またはプロモータは非常に多く、当業者によく知られている。これらの核酸を駆動することが可能である実質的にあらゆるプロモータを使用することができる。
【００４９】
具体的には、興奮性神経細胞でのＣ１Ｖ１キメラタンパク質の組み換え発現が所望される場合には、ヒトカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）プロモータを使用してもよい。他の実施形態では、伸長因子１ａ（ＥＦ−１ａ）プロモータを、Ｃｒｅ誘発性組み換えＡＡＶベクターと併せて、パルブアルブミン−Ｃｒｅトランスジェニックマウスに使用して、発現Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質を抑制性ニューロンに標的化してもよい。
【００５０】
Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドまたはその変異形を符号化する、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクターもまた、本明細書に提供される。本発明に従って投与することができるベクターはまた、ベクターのポリヌクレオチドから転写されたときに、標的動物細胞の原形質膜上に光活性化キメラタンパク質の蓄積をもたらすであろうＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を符号化するポリヌクレオチドを含む、ベクターも含む。使用することができるベクターは、制限なく、レンチウイルス、ＨＳＶ、およびアデノウイルスベクターを含む。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶを含むが、これらに限定されない。レンチウイルスは、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス、およびエボラを含むがこれらに限定されない、他のウイルスのエンベロープタンパク質を有する偽型であってもよい。このようなベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ベクターは、組み換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、それらが感染する細胞のゲノム内に安定した部位特異的な様式で組み込むことができる、比較的小さい寸法のＤＮＡウイルスである。これらは、細胞の成長、形態、または分化に対するいずれの影響も誘発することなく幅広い細胞に感染することができ、またこれらはヒトの病理には関与していないと考えられる。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、シークエンシングされ、特徴付けられてきた。該ゲノムは、約４７００塩基を包含し、ウイルスの複製開始点としての役割を果たす約１４５塩基の末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を各末端に含む。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成の機能を担う２つの必須領域に分割される：ウイルスの複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分、ならびにウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右側部分。
【００５２】
遺伝子療法用のベクターとしてのＡＡＶの用途は、近年、急速に発達してきた。野生型ＡＡＶは、比較的高い力価で、ヒトを含む哺乳動物の分裂もしくは非分裂細胞または組織に感染し得、さらに、特定の部位で（染色体１９の長腕上）ヒト細胞内へ統合され得る（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２１１−２２１５，１９９０）（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ，ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１−３９５０，１９９１、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を有さないＡＡＶベクターは、部位特異的統合の特異性を欠くが、依然として外因性遺伝子の長期の安定した発現を仲介することができる。ＡＡＶベクターは、２つの形態で細胞内に存在し、１つは、染色体のエピソーム側であり、もう１つは、染色体内に統合されるが、前者が主要な形態である。さらに、ＡＡＶは、これまで、いずれのヒト疾患との関連も見出されておらず、その統合から生じる生物学的特性の変化も全く観察されていなかった。１６種類のＡＡＶの血清型が、文献に報告されており、それぞれ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６と称され、ＡＡＶ５は、もともと、ヒトから単離されたものである（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ，ａｎｄ  Ｈ．ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ．１９８４．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３４：５２−６３）が、ＡＡＶ１〜４およびＡＡＶ６は、全てアデノウイルスの研究中に発見された（Ｕｒｓｕｌａ  Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ，Ｈａｊｏ  Ｄｅｌｉｕｓ  ａｎｄ  Ｈａｒａｌｄ  ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９，７３：９３９−９４７）。
【００５３】
ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的な方法を使用して調製されてもよい。いずれの血清型のアデノ随伴ウイルスも好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｊ．  Ｒ．  Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）ｐｐ．１６５−１７４、Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，１９７４、Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ“Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ”Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）、およびＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ“Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ  Ｋｅｒｒ，ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照されたく、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６５６６１１８号、第６９８９２６４号、および第６９９５００６号、ならびにＷＯ／１９９９／０１１７６４号（標題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」）に見出すことができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。インビトロおよびインビボで遺伝子を移動させるためのＡＶＶに由来するベクターの使用が記載されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号およびＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、および同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失し、対象となる遺伝子によって置換された種々のＡＡＶ由来構築物、ならびにインビトロ（培養細胞内）またはインビボで（生物内で直接的に）対象となる遺伝子を移動させるためのこれらの構築物の使用について記載している。本発明による複製欠損組み換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によって隣接された対象となる核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を持つプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞株内にコトランスフェクトすることによって調製することができる。生成されたＡＡＶ組み換え体は、次いで、標準的な技術によって精製される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用するためのベクター（複数を含む）は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５，ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６を含むがこれらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）中にキャプシド形成される。したがって、本発明は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組み換えウイルス粒子（組み換えポリヌクレオチドを含むため、組み換え体である）を含む。このような粒子を生成する方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されている。
【００５５】
本明細書に記載の動物細胞について、１つ以上のベクターを、神経細胞、心臓細胞、または幹細胞に投与することができることを理解されたい。１つ以上のベクターが使用される場合、それらは、同時または異なる時点で、動物細胞に投与することができることを理解されたい。
【００５６】
本発明の方法
同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを、そのようなニューロンで本明細書に記載の光活性化キメラタンパク質を発現させることによって、選択的に脱分極化する方法を、本明細書に提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるもの等の第１の光活性化タンパク質は、興奮性ニューロンで発現し得、一方で、第２の光活性化タンパク質は、抑制性ニューロンで発現し得る。いくつかの実施形態では、興奮性ニューロンで発現される第１の光活性化タンパク質は、抑制性ニューロンで発現される第２の光活性化タンパク質とは異なる波長の光によって、活性化することができる。いくつかの実施形態では、第１および第２の光活性化タンパク質は、生きている非ヒト動物中、または非ヒト動物からの生体脳切片中に発現され得る。
【００５７】
他の実施形態では、同じ神経回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンの脱分極化を、そのようなニューロンで本明細書に記載の光活性化キメラタンパク質を発現させることによって、選択的に阻害する化合物を識別するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、興奮性ニューロンで発現し、一方で第２の光活性化タンパク質は、抑制性ニューロンで発現する。いくつかの実施形態では、興奮性ニューロンで発現される第１の光活性化タンパク質は、抑制性ニューロンで発現される第２の光活性化タンパク質とは異なる波長の光によって、活性化することができる。いくつかの実施形態では、第１および第２の光活性化タンパク質は、生きている非ヒト動物、または非ヒト動物の生体脳切片に発現され得る。
【００５８】
同じ微小回路内に存在するニューロンでＥ／Ｉバランスを選択的に改変するための方法
いくつかの態様では、同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを選択的に脱分極化するための方法であって、第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを選択的に脱分極化することであって、第１の光活性化タンパク質は、第１の波長を有する光に暴露されたときに、脱分極化される、脱分極化と、または、第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することであって、第２の光活性化タンパク質は、第２の波長を有する光に暴露されたときに、脱分極化される、脱分極化と、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。他の実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。他の光活性化カチオンチャネルの開示に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号、米国特許出願第６１／４１０，７０４号、および国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号に見出すことができ、それらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５９】
他の態様では、同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンを選択的に脱分極化するための方法であって、興奮性ニューロンで第１の光活性化タンパク質を発現することと、抑制性ニューロンで第２の光活性化タンパク質を発現することと、を含み、第１の光活性化タンパク質は、独立して、第１の波長を有する光に暴露されたときに、脱分極化し、第２の光活性化タンパク質は、独立して、第２の波長を有する光に暴露されたときに、脱分極化する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。他の実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、緑色光によって活性化することができる。一実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、約５６０ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。一実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、赤色光によって活性化することができる。別の実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、約６３０ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。他の実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、紫色光によって活性化することができる。一実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、約４０５ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。他の実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、緑色光によって活性化することができる。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、約１ミリ秒（ｍｓ）、約２ｍｓ、約３、ｍｓ、約４、ｍｓ、約５ｍｓ、約６ｍｓ、約７ｍｓ、約８ｍｓ、約９ｍｓ、約１０ｍｓ、約１５ｍｓ、約２０ｍｓ、約２５ｍｓ、約３０ｍｓ、約３５ｍｓ、約４０ｍｓ、約４５ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約７０ｍｓ、約８０ｍｓ、約９０ｍｓ、約１００ｍｓ、約２００ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約７００ｍｓ、約８００ｍｓ、約９００ｍｓ、約１秒、約１．２５秒、約１．５秒、または約２秒を含めた、これらの値の間の任意の時間を含む、いずれかの期間を有し得る、光パルスによって活性化される。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、約０．０５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．１ｍＷ  ｍｍ−２、約０．２５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．７５ｍＷ  ｍｍ−２、約１ｍＷ  ｍｍ−２、約２ｍＷ  ｍｍ−２、約３ｍＷ  ｍｍ−２、約４ｍＷ  ｍｍ−２、約５ｍＷ  ｍｍ−２、約６ｍＷ  ｍｍ−２、約７ｍＷ  ｍｍ−２、約８ｍＷ  ｍｍ−２、約９ｍＷ  ｍｍ−２、約１０ｍＷ  ｍｍ−２、約１１ｍＷ  ｍｍ−２、約１２ｍＷ  ｍｍ−２、約１３ｍＷ  ｍｍ−２、約１４ｍＷ  ｍｍ−２、約ｍＷ  ｍｍ−２、約１６ｍＷ  ｍｍ−２、約１７ｍＷ  ｍｍ−２、約１８ｍＷ  ｍｍ−２、約１９ｍＷ  ｍｍ−２、約２０ｍＷ  ｍｍ−２、約２１ｍＷ  ｍｍ−２、約２２ｍＷ  ｍｍ−２、約２３ｍＷ  ｍｍ−２、約２４ｍＷ  ｍｍ−２、または約２５ｍＷ  ｍｍ−２を含めた、これらの数の間の任意の値を含む、いずれかの光パワー密度を有し得る光パルスによって、活性化される。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、抑制性および興奮性ニューロンは、生きている非ヒト動物中に存在し得る。他の実施形態では、抑制性および興奮性ニューロンは、非ヒト動物からの脳切片中に存在し得る。
【００６１】
同じ微小回路内に存在するニューロンでＥ／Ｉバランスを選択的に改変する化合物を識別するための方法
いくつかの態様では、同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンの脱分極化を選択的に阻害する化合物を識別するための方法であって、（ａ）第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを、第１の波長を有する光で選択的に脱分極化するか、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを、第２の波長を有する光で選択的に脱分極化することと、（ｂ）第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答して、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答して、抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定することと、（ｃ）興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンを化合物と接触させることと、（ｄ）興奮性ニューロンまたは抑制性ニューロンのいずれかを、化合物と接触させることが、いずれかのニューロンの脱分極化を選択的に阻害するかどうかを判定するために、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。他の実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの態様では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、化合物は、コンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーであり得る。他の実施形態では、本方法は、哺乳動物において、心臓組織の機能または心臓活動電位に悪影響を及ぼすかどうかを判定するために、化合物をアッセイすることをさらに含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、緑色光によって活性化することができる。一実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、約５６０ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。一実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、赤色光によって活性化することができる。別の実施形態では、第１の光活性化タンパク質は、約６３０ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。他の実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、紫色光によって活性化することができる。一実施形態では、第２の光活性化タンパク質は、約４０５ｎｍの波長を有する光によって、活性化することができる。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、約１ミリ秒（ｍｓ）、約２ｍｓ、約３、ｍｓ、約４、ｍｓ、約５ｍｓ、約６ｍｓ、約７ｍｓ、約８ｍｓ、約９ｍｓ、約１０ｍｓ、約１５ｍｓ、約２０ｍｓ、約２５ｍｓ、約３０ｍｓ、約３５ｍｓ、約４０ｍｓ、約４５ｍｓ、約５０ｍｓ、約６０ｍｓ、約７０ｍｓ、約８０ｍｓ、約９０ｍｓ、約１００ｍｓ、約２００ｍｓ、約３００ｍｓ、約４００ｍｓ、約５００ｍｓ、約６００ｍｓ、約７００ｍｓ、約８００ｍｓ、約９００ｍｓ、約１秒、約１．２５秒、約１．５秒、または約２秒を含めた、これらの値の間の任意の時間を含む、いずれかの期間を有し得る、光パルスによって活性化することができる。いくつかの実施形態では、光活性化タンパク質は、約０．０５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．１ｍＷ  ｍｍ−２、約０．２５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．５ｍＷ  ｍｍ−２、約０．７５ｍＷ  ｍｍ−２、約１ｍＷ  ｍｍ−２、約２ｍＷ  ｍｍ−２、約３ｍＷ  ｍｍ−２、約４ｍＷ  ｍｍ−２、約５ｍＷ  ｍｍ−２、約６ｍＷ  ｍｍ−２、約７ｍＷ  ｍｍ−２、約８ｍＷ  ｍｍ−２、約９ｍＷ  ｍｍ−２、約１０ｍＷ  ｍｍ−２、約１１ｍＷ  ｍｍ−２、約１２ｍＷ  ｍｍ−２、約１３ｍＷ  ｍｍ−２、約１４ｍＷ  ｍｍ−２、約ｍＷ  ｍｍ−２、約１６ｍＷ  ｍｍ−２、約１７ｍＷ  ｍｍ−２、約１８ｍＷ  ｍｍ−２、約１９ｍＷ  ｍｍ−２、約２０ｍＷ  ｍｍ−２、約２１ｍＷ  ｍｍ−２、約２２ｍＷ  ｍｍ−２、約２３ｍＷ  ｍｍ−２、約２４ｍＷ  ｍｍ−２、または約２５ｍＷ  ｍｍ−２を含めた、これらの数の間の任意の値を含む、いずれかの光パワー密度を有し得る光パルスによって、活性化することができる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する興奮性ニューロンであり得る。他の実施形態では、興奮性ニューロンは、錐体ニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、神経細胞は、非ヒト動物の前頭前皮質に位置する抑制性ニューロンであり得る。さらに他の実施形態では、抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンであってもよい。いくつかの実施形態では、抑制性および興奮性ニューロンは、生きている非ヒト動物中に存在し得る。他の実施形態では、抑制性および興奮性ニューロンは、非ヒト動物からの脳切片中に存在し得る。
【００６３】
例示的実施形態
本開示は、中で発現されたときに、膜電圧を修飾する光活性化キメラオプシンに関する。本開示は、必ずしもこれらの文脈に限定されるわけではなく、本開示の種々の態様は、これらおよび他の文脈を使用した実施例の説明を通じて、理解することができる。
【００６４】
本開示の種々の実施形態は、哺乳動物細胞を含む、細胞膜での発現のために修飾された光活性化オプシンに関する。オプシンは、２つの異なるオプシンである、ボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）およびコナミドリムシチャネルロドプシン（ＣｈＲ１）の組み合わせに由来する。オプシンは、個々のオプシンが由来するいずれかのものよりも、高いレートのレベルにおける発現に有用である。
【００６５】
ある特定のより具体的な実施形態では、ＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラ（Ｃ１Ｖ１）の遺伝子配列は、主としてＶＣｈＲ１である。輸送に関連するＶＣｈＲ１配列の部分は、ＣｈＲ１の相同配列で置換される。
【００６６】
種々の実施形態は、哺乳動物細胞での発現を改善するための、輸送シグナルの付加を対象とした修飾に関する。
【００６７】
本開示のある特定の態様は、Ｃ１Ｖ１のさらなる修飾形を対象とする。例えば、ある特定の実施形態は、Ｅ１６２ＴからＣ１Ｖ１への突然変異を含み、実験では、加速した光周期（例えば、ほぼ３倍）をもたらすことが示唆されている。
【００６８】
種々の本開示の実施形態は、神経回路に対する時間的、空間的、および／または細胞型特異的な制御を、測定可能な尺度と相関させる、光遺伝学系または方法に関する。光遺伝学系は、Ｃ１Ｖ１および／またはＣ１Ｖ１変異形を含む、種々のオプシンを使用して、神経回路の部分に対する制御を確立する。例えば、種々の評価基準または症状は、神経障害と関連する可能性がある。光遺伝学系は、患者内の神経回路を、その選択的な制御の標的とする。光遺伝学系は、神経障害と関連する評価基準または症状について、患者を監視することを伴う。このようにして、光遺伝学系は、神経回路、その機能、および／または神経障害についての詳細な情報を提供することができる。
【００６９】
本明細書に説明される実施形態と一致して、具体的な実施形態は、種々のオプシンを使用して、障害を研究および調査することに関する。他の実施形態は、表現型およびエンドフェノタイプの識別および／または研究に関する。さらに他の実施形態は、治療標的の識別に関する。
【００７０】
本開示の態様は、速い時間尺度における、障害／疾患状態の人工的な誘発を対象とする。Ｃ１Ｖ１等のオプシンの使用が、加速した光周期に関する特性に基づいて、特に有用である。さらに、ある特定の実施形態は、可逆的な疾患状態を可能にし、それは、疾患状態を呈する場合および疾患状態を呈さない場合の、試験のための基準／対照点を確立するため、および／または同じ動物に対する治療効果を試験するために、特に有用であり得る。Ｃ１Ｖ１等のオプシンの使用は、光源を使用した細胞の制御を可能にする。Ｃ１Ｖ１は、光に反応して、細胞の膜電位に変化をもたらす。光の除去およびそれに続くＣ１Ｖ１活性化の休止は、細胞が、そのベースライン状態に戻ることを可能にする。種々の他の可能性が存在し、そのいくつかは、本明細書にさらに詳細に説明される。
【００７１】
本開示の種々の態様は、Ｃ１Ｖ１オプシンのＥ１２２Ｔ突然変異を対象とする。本開示のある特定の実施形態では、Ｅ１２２Ｔ突然変異は、Ｃ１Ｖ１またはその変異形の最大吸収を、未変異オプシンに対して赤色光スペクトルに偏移させる。
【００７２】
種々の本開示の実施形態は、哺乳動物細胞での発現のために修飾され、緑色光スペクトルでの最大吸収のためにＣｈＲ２に対して偏移された、オプシンに関する。Ｃ１Ｖ１オプシンは、オプシンの組み合わせに由来し、それが由来するオプシンのいずれかよりも高いレートで発現する。オプシンＣ１Ｖ１は、ボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）およびコナミドリムシチャネルロドプシン（ＣｈＲ１）に由来する。結果として得られるオプシンであるＣ１Ｖ１およびその変異形は、５３０ｎｍ〜５４６ｎｍの波長で、最大吸収を有する。
【００７３】
本開示のある特定の態様は、Ｃ１Ｖ１のさらなる修飾形を対象とする。例えば、ある特定の実施形態は、赤色光スペクトルに向かってＣ１Ｖ１の最大吸収を偏移させる、突然変異Ｅ１２２Ｔを含む。他の修飾は、さらなる突然変異Ｅ１６２Ｔを含み得、実験は、Ｅ１２２Ｔ突然変異によって提供される赤方偏移に加えて、加速した光周期を提供することを示唆する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＶＣｈＲ１に由来し、ＣｈＲ１の相同配列で置換される輸送配列を有する、膜貫通分子を提供する。いくつかの実施形態では、分子は、突然変異Ｅ１２２Ｔをさらに含む。他の実施形態では、分子は、Ｅ１６２ＴおよびＥ１２２Ｔに突然変異をさらに含む。ある特定の実施形態では、分子は、緑色光に応答して、イオンチャネルを活性化する。一実施形態では、分子は、おおよそ５４６ｎｍの最大光吸収を有する。別の実施形態では、分子は、おおよそ５３５ｎｍの最大光吸収を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、動物細胞であって、赤色光に応答性であるイオンチャネルを発現する、一体化した外因性分子を含み、外因性分子は、ＶＣｈＲ１に由来し、ＣｈＲ１からの相同配列によって置換される、その膜輸送配列を含む、動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、外因性分子は、Ｅ１２２Ｔをさらに含む。他の実施形態では、細胞は、それぞれ、４０５ｎｍおよび５６０ｎｍの波長を有する光に応答して、約１４％〜９４％の神経発火率を有する。他の実施形態では、細胞は、それぞれ、４０５ｎｍおよび５６０ｎｍの波長を有する光に応答して、約１１％〜７２％の神経発火率を有する。
【００７６】
本開示のさらなる例示的実施形態は、ＣｈＲ２配列を全く含まず、個別では十分に発現しない２つのオプシン遺伝子に由来し、本明細書にＣ１Ｖ１と称される、ハイブリッドＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラの使用に関する。本開示の実施形態はまた、Ｋｉｒ２．１チャネルから導出される膜輸送シグナルの付加を通じた、ＶＣｈＲ１の膜標的化の改善に関する。ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰを発現する培養ニューロンからの共焦点画像は、ＣｈＲ２と比較して、細胞内タンパク質の大部分を明らかにしたため、Ｋｉｒ２．１チャネルから導出される膜輸送シグナル（ｔｓ）を、ＶＣｈＲ１の膜標的化を改善するために使用した。このＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰの膜標的化は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較してわずかに強化されたが、ＶＣｈＲ１−ｔｓ−ＥＹＦＰを発現する培養海馬ニューロンから記録された平均光電流は、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰのものよりもわずかに大きかっただけである。したがって、本開示の実施形態は、ヘリックスを、他のＣｈＲからの対応するヘリックスと交換することによって修飾されているＶＣｈＲ１に関する。例えば、ヘリックス１および２がＣｈＲ１からの相同セグメントで置換された２つのキメラに、堅調な改善が発見された。スプライス部位が、ヘリックス２と３の間（ＣｈＲ１の残基Ａｌａ１４５）の細胞内ループにあるか、またはヘリックス３（ＣｈＲ１残基Ｔｒｐ１６３）内にあるかに関わらず、結果として得られるキメラは、いずれも、堅調に発現され、同様に強化された光電流およびスペクトル特性を示した。この結果は、ＣｈＲ１が、ほとんどの哺乳動物宿主細胞の膜での発現が弱く、そこへの統合が不十分であるため、予想外であった。
【００７７】
本開示の特定の態様は、神経科学に適した微生物オプシン遺伝子に関し、インタクトの哺乳動物の脳内の特定の細胞型において、光パルス列が、ミリ秒の時間尺度の膜電位変化へと変換することを可能にするものである（例えば、チャネルロドプシン（ＣｈＲ２）、ボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）、およびハロロドプシン（ＮｐＨＲ））。ＣｈＲ２は、単細胞の緑藻類コナミドリムシに由来するロドプシンである。本明細書に使用される際の用語「ロドプシン」は、少なくとも２つの構成要素、すなわち、オプシンタンパク質、および通常はレチナール（レチンアルデヒド）である共有結合される補因子を含む、タンパク質である。ロドプシンＣｈＲ２は、もともとはコナミドリムシゲノム中のクラミオプシン（Ｃｈｌａｍｙｏｐｓｉｎ）−４（Ｃｏｐ４）と称された、チャネルオプシン−２（Ｃｈｏｐ２）というオプシンに由来する。１つの脱分極化チャネルロドプシンであるＣｈＲ２の時間的な特性は、時間が正確な活動電位列の生成をもたらす、速い活性化および非活性化動態が挙げられる。長い時間尺度の活性化を要する用途については、通常は速いチャネルロドプシンのオフ動態を、遅延させることができることが発見された。例えば、チャネルロドプシンのある特定の実装では、事実上、脱分極化が所望される全時間に、１ｍＷ／ｍｍ２の光を適用し、これは、望ましいものに満たなくてもよい。
【００７８】
本明細書における考察の多くは、ＣｈＲ２を対象とする。別段に示されない限り、本開示には、多数の類似した変異形が含まれる。例には、Ｃｈｏｐ２、ＣｈＲ２−３１０、Ｃｈｏｐ２−３１０、およびボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＶＣｈＲ１のさらなる詳細については、”Ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ，”  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｊｕｎｅ  ２００８，１１（６）：６３１−３．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｐｒ  ２３を参照することができ、その開示は、参照によりその全体が完全に本明細書に組み込まれる。他の実装では、類似の修飾を、他のオプシン分子に行ってもよい。例えば、修飾／突然変異を、ＣｈＲ２またはＶＣｈＲ１変異形に対して行ってもよい。さらに、修飾した変異形を、光活性化イオンポンプと組み合わせて使用することができる。
【００７９】
本開示の実施形態には、天然に存在する配列の、比較的軽微なアミノ酸の変異形が含まれる。１つの例では、変異形は、天然に存在する配列のタンパク質配列と、約７５％を上回って相同である。他の変異形では、相同性は、約８０％を上回る。さらに他の変異形は、約８５％を上回る、９０％を上回る、またはさらに約９３％〜約９５％程度に高い、または約９８％の相同性を有する。この文脈における相同性とは、配列の類似性または同一性を意味するが、同一性が好ましい。この相同性は、配列分析において既知の標準的な技術を使用して、判定することができる。本開示の実施形態の組成物には、本明細書に提供されるタンパク質および核酸配列が含まれ、提供される配列と約５０％を上回って相同である、提供される配列と約５５％を上回って相同である、提供される配列と約６０％を上回って相同である、提供される配列と約６５％を上回って相同である、提供される配列と約７０％を上回って相同である、提供される配列と約７５％を上回って相同である、提供される配列と約８０％を上回って相同である、提供される配列と約８５％を上回って相同である、提供される配列と約９０％を上回って相同である、または提供される配列と約９５％を上回って相同である、変異形が含まれる。
【００８０】
本明細書に使用される場合、「標的細胞の刺激」は、概して、細胞の特性の修飾を説明するために使用される。例えば、標的細胞の刺激は、標的細胞の脱分極化または分極化につながり得る細胞膜の特性の変化をもたらし得る。具体的な例では、標的細胞は、ニューロンであり、刺激は、ニューロンによるインパルス（活動電位）の生成を促進または阻害することによって、インパルスの伝達に影響を及ぼす。
【００８１】
光活性化オプシンに関するさらなる詳細については、「Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｈｅｒｅｔｏ」と題される、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈらへの国際公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号を参照することができ、これは、参照によりその全体が本明細書に完全に組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
実施例１：キメラチャネルロドプシン変異形Ｃ１Ｖ１の開発
この実施例では、皮質のＥ／Ｉ上昇の駆動および皮質切片でのγ振動の監視、ならびに生きた動物でのインビボ実験を可能にするであろう手段を、１）用量反応の調査を可能にする、さらにより高い力価、２）Ｅ／Ｉバランスの段階様の変化を可能にする低い脱感作、および３）同じ調製物内での異なる集団の相対的な駆動を可能にする、赤方偏移した励起、の３つの主要な特性とともに、模索した。
【００８３】
これらの実験を、まず、赤方偏移および低下した脱感作の両方を示す１４、ＶＣｈＲ１に試みたが、以前の調査は、ＶＣｈＲ１を発現する細胞における光電流が小さい（−１００〜１５０ｐＡ１４）ことを示唆し、下流細胞（示されない）では強いシナプス活性を誘発しなかった。実際に、細胞にＶＣｈＲ１を発現することを初めて試みたとき、以前の発見と一致する、小さな光電流のみが観察された（図１Ａ）。ＶＣｈＲ１−ｉｓ−ＥＹＦＰを生成するために、Ｋｉｒ２．１チャネルから導出される膜輸送シグナルを付加することは、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較して、ごく限られた光電流の強化傾向をもたらした（図１Ｂ）。しかしながら、ＣｈＲ２において、膜貫通セグメントをＣｈＲ１からの相同領域で置換することは、膜の標的化を増加させ、光電流を強化したことに留意し、ＶＣｈＲ１のヘリックスと、他のＣｈＲからの対応するヘリックスとの間の類似の系統的交換が、同様に、ＨＥＫ細胞において強化された膜発現をもたらすという仮説を立てた。
【００８４】
材料および方法
キメラチャネルロドプシン変異形Ｃ１Ｖ１を、重複伸長ＰＣＲにより、野生型またはヒトコドン最適化のいずれかのチャネルロドプシン−１を、ヒトコドン適応ＶＣｈＲ１（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号ＡＣＤ７０１４２．１）と融合させることによって生成した。Ｃ１Ｖ１スプライス変異形を、重複ＰＣＲによって生成した。変異形１は、ＣｈＲ１の最初の１４５のアミノ酸およびＶＣｈＲ１のアミノ酸１０２〜３１６を含有していた。変異形２は、ＣｈＲ１の最初の１６２のアミノ酸およびＶＣｈＲ１のアミノ酸１１９〜３１６を含有していた。結果として得られたキメラＰＣＲフラグメントを、ＣａＭＫＩＩαプロモータ下で、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびレンチウイルス発現ベクターにクローニングした。膜輸送シグナルは、Ｋｉｒ２．１チャネル１から導出した。突然変異は、コード配列およびスプライス部位のシークエンシングによって確認した。ＡＡＶ仲介の遺伝子送達については、ＣａＭＫＩＩαプロモータとともに、オプシン−ＥＹＦＰ融合体を、ｐＡＡＶ２−ＭＣＳベクターの修飾形にサブクローニングした。Ｃｒｅ依存性オプシンの発現は、オプシン−ＥＹＦＰカセットを、伸長因子１ａ（ＥＦ−１α）プロモータの制御下で、互換性のないｌｏｘ部位（ｌｏｘＰおよびｌｏｘ２７２２）の対の間に逆向きにクローニングして、二重ｆｌｏｘの逆位オープンリーディングフレーム（Ｄ１０）を生成することによって、達成した。全ての構築物は、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｌａｂ（ｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ）から入手可能である。
【００８５】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および１％（ｗ／ｗ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ基礎培地で培養した。細胞を、０．１７５×１０６細胞／ｍｌの濃度でカバースリップに播種し、１μＭのオールトランスレチナールを補充した。一過的なトランスフェクションを、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行い、２０〜２８時間後に記録を行った。一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞内の光電流を、従来の全細胞パッチクランプにより記録した。外部溶液は、１４０  ＮａＣｌ、２  ＣａＣｌ２、２  ＭｇＣｌ２、２  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有した［ｍＭ］。内部溶液は、１１０  ＮａＣｌ、１０  ＥＧＴＡ、２  ＭｇＣｌ２、１  ＣａＣｌ２、５  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ（ｐＨは、ＣｓＯＨまたはＨＣｌのいずれかを使用して、７．２に調節した）を含有した［ｍＭ］。パッチピペットを、微小ピペット引具モデルＰ−９７（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を使用して、１．５〜２ＭΩの抵抗でマイクロヘマトクリット管（Ｈｅｃｈｔ−Ａｓｓｉｓｔａｎｔ，Ｓｏｎｄｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から引き出した。ＨＥＫ細胞の全細胞パッチクランプを、ＥＰＣ  ７（ＨＥＫＡ，Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）増幅器を用いて行った。アナログデータを、２０ｋＨｚでサンプリングし、Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ１０．１ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、表示した。波長依存性を記録するために、Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  Ｖユニット（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの光導体を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡の落射蛍光ポートに載置した。対物レンズに光を反射させるためにビーム分割器（７０％Ｒ／３０％Ｔ）を使用し、カバースリップ上において、４７０ｎｍで約１×１０２２光子ｍ−２ｓ−１の最終光子密度をもたらした。作用スペクトルの記録には、５０％の強度の光のみを使用した。ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  Ｖユニットを、ｐＣｌａｍｐソフトウェアと同期させたＴｉｌｌｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ＴＩＬＬ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で制御した。
【００８６】
結果
興味深いことに、キメラにおける最も強い改善は、ヘリックス１および２が、ＣｈＲ１からの相同体で置換された場合に見られた（図１Ｃ〜Ｄ）。膜標的化および光電流の大きさについて、２つのキメラＣｈＲ１−ＶＣｈＲ１チャネルを、培養ＨＥＫ２９３細胞において試験した。第１のものを、ＣｈＲ１のＡ１ａ１４５後の第２の細胞内ループに結合させ、第２のものを、ＣｈＲ１のＴｒｐ１６３後のヘリックス３内に結合させた（図１Ｃ）。いずれの変異形も、ＨＥＫ２９３細胞で同程度に十分に発現したが（図１Ｄ）、培養ニューロンにおいては、第２の変異形がより強く発現し（図１Ｅ）、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較して、非常に強化されたピーク光電流（８８８±１２８ｐＡ、ｎ＝１１個の細胞、ｐ＜０．０００５）を示した（図１Ｂ）。作用スペクトルピークは、ＣｈＲ２に対して強く赤方偏移したままであり（表１、図１Ｆ）、キメラのイオン選択性は、ＣｈＲ２およびＶＣｈＲ１について以前に報告されたものと類似していた（図１Ｇ）。Ｋｉｒ２．１輸送配列を、このハイブリッドに付加することは、さらに増加した光電流をもたらす傾向を見せた（１１０４±１２３ｐＡ、ｎ＝１２個の細胞、ＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰと比較してｐ＜０．０００５、Ｃ１Ｖ１−ＥＹＦＰと比較してｐ＝０．２３、図１Ｂ、表１〜２）。結果として得られるハイブリッドＣｈＲ１／ＶＣｈＲ１キメラは、ＣｈＲ２配列を全く含まず、単独では十分に発現しない２つのオプシン遺伝子から顕著に誘導され、本明細書にＣ１Ｖ１と称される（図１Ａ、Ｈ）。
【００８７】
実施例２：Ｃ１Ｖ１の光電流動態の最適化
この赤方偏移したオプシンの速い非活性化特性２８は、可視スペクトルの青色末端の方向に位置する波長によって活性化される、他のオプシンからの最大限の時間的ならびにスペクトル的な分離に必要となるであろう。しかしながら、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰによって提示される光電流は、ＣｈＲ２よりも１０倍を上回って遅い減衰、およびもともとのＶＣｈＲ１よりもさらに遅い減衰を示し（図２Ａ、Ｔｏｆｆが、それぞれ、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰ（ｎ＝４）およびＶＣｈＲ１−ＥＹＦＰ（ｎ＝５）に対して、１５６±１２ｍｓおよび１３２±１２ｍｓ、表１）、速い発火レートを要する用途へのＣ１Ｖ１の使用を排除する可能性があることが見出された。Ｃ１Ｖ１の光電流動態を補正するために、発色団領域に、既知の構造モデル２２、２８を使用して、より速い光周期動態、減少した不活性化、および減少した青色吸収を有する突然変異を探した（図１Ｈ）。次に、この突然変異が不活性化を減少させることを示す、ヘリックス２におけるグルタミン酸塩が豊富なモチーフの研究に基づいて３、グルタミン酸塩−１２２をスレオニンに突然変異させた。
【００８８】
材料および方法
Ｃ１Ｖ１ベクターでの全ての点突然変異は、部位特異的な突然変異生成（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によってプラスミドにおいて生成した。膜輸送シグナルは、Ｋｉｒ２．１チャネルから導出した。突然変異は、コード配列およびスプライス部位のシークエンシングによって確認した。
【００８９】
結果
ＣｈＥＴＡ−相同突然変異Ｅ１６２Ｔ２８は、光周期を、ほぼ３倍、著しく加速させた（Ｔｏｆｆ  ５８±４．７ミリ秒、ｎ＝７個の細胞、図２Ａ、表１）。驚くべきことに、ＣｈＲ２または他の微生物オプシンにおける類似の突然変異は、赤方偏移をもたらし２８，２９、Ｃ１Ｖ１においては、この突然変異は、望ましくない方向にある作用スペクトルを、浅色から５３０ｎｍに偏移させた（図１Ｆ、表１）。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔは、ＣｈＲ２の４６％の非活性化と比較して、２６％不活性化しただけであり（図２Ｂ、表１）、加えて、スペクトルは、さらに５４６ｎｍまで赤方偏移され（図１Ｆ、表１）、Ｃ１Ｖ１作用スペクトルの厄介な青色ショルダーの顕著な損失を示した。最終的に、二重変異Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔにおいては、作用スペクトルの赤方偏移および青色ショルダーの非存在を保持しながらも、電流の不活性化は、Ｅ１２２Ｔ変異のものよりもさらに低くさえあり、光周期は、Ｅ１６２Ｔと比較してもさらに速かった（Ｔｏｆｆ３４±４．９ミリ秒、ｎ＝７個の細胞、図２Ａ、図２Ｃ、表１）。さらに、Ｅ１２２変異が、光電流の振幅を大幅に減少させる一方で（図２Ｄ）、二重変異は、本来のＣ１Ｖ１−ｔｓの非常に高い電流特性を再現した。したがって、個々の突然変異の複数の驚くべきかつ有用な特性は、二重変異の輸送強化されたＣ１Ｖ１キメラにおいて保存された。
【００９０】
表１：ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、およびＣ１Ｖ１変異形のスペクトル／動態特性
２ミリ秒の光パルスをピーク活性化波長に使用して、ＨＥＫ細胞におけるピーク活性化波長を記録した。２ミリ秒の光パルスを最大活性化波長に使用して、非活性化動態（τｏｆｆ）およびピーク光電流を培養海馬ニューロンにおいて記録した。ＣｈＲ２とのコンビナトリアル活性化に最適な変異形を識別するために、４０５ｎｍおよび５６０ｎｍでの反応率をＨＥＫ細胞において記録した。光電流の脱感作を、３００ミリ秒の光パルスを使用して記録し、ピーク光電流（Ｉｍａｘ）の減衰を定常状態に対して定量化した。
【表１】
2019205455.tif 000003
表２：表１に示される全オプシンにわたるピーク光電流の振幅に対する、対応のないｔ検定からのＰ値比較の概要。光電流は、５４０ｎｍ（ＶＣｈＲ１およびＣ１Ｖ１変異形）または４７０ｎｍ（ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ））で２ミリ秒の光パルスを使用して、培養ニューロンにおいて記録した。
【表２】
2019205455.tif 000004
【００９１】
このように、個々の突然変異の複数の有用な特性は、二重変異体において、ともに保存された。
【００９２】
実施例３：前頭前皮質ニューロンにおける新規なＣ１Ｖ１キメラの使用  
これらの新規なＣ１Ｖ１オプシン遺伝子をニューロンにおいて試験するために、Ｃ１Ｖ１−ｔｓ−ＥＹＦＰを符号化するレンチウイルスベクターおよび点突然変異の組み合わせを生成した。これらのオプシンを、次いで、培養海馬ニューロンに発現させ、同一な刺激条件下（２ミリ秒のパルス、５４２ｎｍの光、５．５ｍＷ  ｍｍ−２）で全細胞光電流を記録して、光電流振幅における改善が、ＶＣｈＲ１と比較して、増加したＣ１Ｖ１の発現から直接的にもたらされたかどうかを判定した。
【００９３】
材料および方法
動物
野生型またはトランスジェニックのパルブアルブミン：：Ｃｒｅ  Ｃ５７／ＢＬ６Ｊ雄性マウスを、３〜５匹の群でケージに収容し、餌および水を自由に摂取させて１２時間の逆明／暗周期で保管した。実験プロトコルは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣに認可されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ基準のＣａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓについての指針を満たす。
【００９４】
海馬および皮質ニューロンにおける全細胞パッチクランプ電気生理学
初代海馬培養物を、ＰＯスプラーグドーリーラットから単離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）コーティングしたガラスのカバースリップに蒔き、ＦＵＤＲで処理して、神経膠の過剰成長を阻害した。内毒素不含プラスミドＤＮＡを、ＨＥＰＥＳ緩衝化した生理食塩水／ＣａＰＯ４混合物を使用して、培養ニューロンにトランスフェクトした。蛍光タンパク質発現によって識別される個々のニューロンからの電気生理学的記録を、３〜５ＭΩのガラスピペット中の標準的な内部溶液（［ｍＭ］１３０  Ｋグルコン酸塩、１０  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、１０  ＥＧＴＡ、２  ＭｇＣ１２、ＫＯＨでｐＨ７．３）を使用して、タイロード培地（［ｍＭ］  １５０  ＮａＣｌ、４  ＫＣｌ、２  ＭｇＣ１２、２  ＭｇＣ１２、１０  Ｄ−グルコース、１０  ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨでｐＨ７．３５）において取得した。皮質切片の生理学については、８〜９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊまたは事前にウイルスを注入したＰＶ：：Ｃｒｅマウスからの３００ｇｍの急性冠状切片を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して、氷冷スクロース切断溶液（［ｍＭ］１１  Ｄ−グルコース、２３４スクロース、２．５  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  ＭｇＳＯ４、０．５  ＣａＣ１２、２６  ＮａＨＣＯ３）に得た。切片を、３２℃で１時間、酸素化した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ；［ｍＭ］  １２４  ＮａＣ１、３  ＫＣ１、１．３  ＭｇＣ１２、２．４  ＣａＣ１２、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、２６  ＮａＨＣＯ３、１０  Ｄ−グルコース）中で回復させた。蛍光タンパク質の発現を識別した後、一定なＡＣＳＦ灌流下で、示される前頭前皮質層から個々のニューロンパッチを取得した。広い波長のキセノンランプ源（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＧ−４）からフィルタ処理した光を、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ）の蛍光ポートに結合させた。バンドパスフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ）は、２０ｎｍのバンド幅を有し、追加の減光フィルタ（ＴｈｏｒＬａｂｓ）で調節して、スペクトル全体にわたって光パワーの出力を均一化した。
【００９５】
培養細胞の画像を、露出１００ミリ秒、感度３０でＲｅｔｉｇａ  Ｅｘｉ  ＣＣＤカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を使用して、同じ顕微鏡において取得した。照射パワー密度は、標準的なＥＹＦＰフィルタセットで、５００ｎｍにおいて１２ｍＷ  ｍｍ−２であった。蛍光の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、体細胞および近位神経突起を含む領域を標識化し、光電流は面積あたりの平均チャネル発現ではなく膜結合チャネルの総数と関連する傾向にあるため、平均蛍光ではなく、その領域の全統合ピクセル強度を各細胞に対して計算することによって、行った。
【００９６】
ウイルスの調製および注入
レンチウイルス仲介およびＡＡＶ仲介の両方の遺伝子送達を、マウスにおけるオプシンの異種発現に使用した。示されるオプシンを、皮質の興奮性ニューロンを標的とするヒトカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）プロモータ、またはＣｒｅ誘発性カセットおよび続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と併用した伸長因子１ａ（ＥＦ−１ａ）のいずれかによって、駆動した。Ｃｒｅ誘発性組み換えＡＡＶベクターは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ，ＵＳＡ）によって生成し、パルブアルブミン：：Ｃｒｅトランスジェニックマウスと併せて使用して、パルブアルブミン陽性の介在ニューロンを標的化した。簡単にいうと、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａにおいて、ＡＡＶ構築物をｐＡＡＶ２−ＭＣＳの修飾形にサブクローニングし、ＡＡＶ５コーティングしたタンパク質で血清型にして、ウイルスベクターコアによってパッケージ化した。ＡＡＶベクターの最終的なウイルス濃度は、１×１０１２ゲノム複製（ｇｃ）／ｍＬであった。レンチウイルス構成物を、報告した通りに生成した。全ての構築物は、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  Ｌａｂ（ｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ）から入手可能である。定位ウイルス注入を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに認可されたプロトコルのもとに実行した。イソフルラン麻酔下に保った若齢（４〜６週齢）のマウスを、定位フレーム（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に配置し、ブレグマおよびラムダ頭蓋計測点を使用して高さを合わせた。皮質組織への損傷が最小となるように、開頭術を実行した。１０ｕＬのシリンジおよび３５ｇの勾配付きの針（Ｗｏｒｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、辺縁系前頭前皮質（Ｉｎｆｒａｌｉｍｂｉｃ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）（ＩＬ、ブレグマから前方１．８ｍｍ、側方０．３５ｍｍ、腹側−２．８５ｍｍ）を標的とした。ウイルスを０．１μＬ／分の速度で注入した。挙動研究のため、ウイルスを注入した対象に、さらに、局所送達用に付属の貫通性脳線維ありまたはなしのいずれかで、光の送達を促進するための慢性光ファイバー結合装置を埋め込み、記載のように皮質領域を標的化した（Ｄｏｒｉｃ  Ｌｅｎｓｅｓ，Ｃａｎａｄａ）。貫通性線維を、同じ前方および側方の座標から−２．５ｍｍの深さに定位挿入し、頭皮の接着閉鎖（Ｖｅｔｂｏｎｄ，３Ｍ）の前に接着性合着用セメント（Ｃ＆Ｂ  ＭｅｔａＢｏｎｄ）を使用して付着させた。手術からの回復後、動物に鎮痛剤を投与した。
【００９７】
結果
個々の構築物を発現する培養海馬ニューロンからの記録および統合された蛍光読み出しを、それぞれの個々の細胞から得た。個々の細胞において、蛍光レベルは、構築物全体で、測定された光電流振幅と緊密に相関していた（図３Ａ）。したがって、強く増加したＣ１Ｖ１の光電流は、主として、ニューロンにおける改善された発現からもたらされたと結論付けた。二重変異Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔは、試験した全ての範囲（光電流の大きさ、不活性化動態、および作用スペクトル）にわたって優れた能力を示したため、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）に対する能力もまた、統合された体細胞ＹＦＰ蛍光およびピーク光電流を測定することによって直接比較した。驚くべきことに、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ細胞は、同等の蛍光レベルで、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ細胞よりも強い光電流を示し（図３Ｂ）、単位コンダクタンスが増加した可能性を示唆した。
【００９８】
Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔが、錐体ニューロン内でスパイクを光学的に駆動するために好適であるかどうかを調べるために、ＣａＭＫＩＩａプロモータ下で、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ−ｔｓ−ＥＹＦＰ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩａ−Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ−ｔｓ−ＥＹＦＰ）を生成し、そのウイルスをマウスの前頭前皮質に注入した。２ミリ秒の光パルス列で、急性切片内の発現ニューロンからの反応を記録し、同じ周波数で一連の電流注入（１０ミリ秒、２００ｐＡ）に対する反応と比較した。５６０ｎｍのパルス列に対するニューロンの周波数反応は、同じ周波数での電流注入に対する反応と区別がつかないことが見出され（図３Ｃ、２つの切片においてｎ＝６個の細胞）、Ｃ１Ｖ１動態ではなく、細胞の固有特性が、高レートでスパイク性能を制限することを示唆する。類似の性能特性が、緑色、黄色、および琥珀色の照射範囲にわたって見られ、中程度の光強度（＜１０ｍＷ／ｍｍ２）で、哺乳動物におけるインビボ用途に好適な強い能力を有した（図３Ｄ）。実際に、５４０ｎｍおよび５９０ｎｍでの反応は、予想通り、低い光パワーで低い忠実度を有し、時間が正確な活動電位を誘起するという点で、同様に効果的であった（図３Ｄ）。
【００９９】
著しく赤方偏移した作用スペクトルにより、Ｃ１Ｖ１が、これまでいずれのオプシンにも報告されておらず、改善されたスペクトル分離ならびにより深い組織でのニューロンの制御を可能にするために重要な可能性のある、赤色光でのスパイクを駆動するためすら使用できる可能性を、考慮した。したがって、あらゆるＣ１Ｖ１変異形が、遠赤色光を使用してスパイクを駆動するために使用可能であるかどうかを試験した。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔの動態は、Ｃ１Ｖ１−Ｅｌ２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔのものよりも遅かったが、その作用スペクトルは、全ての変異形の中で最も赤方偏移し（図１Ｆ）、実際に、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔを発現する細胞は、二重変異体を発現する細胞よりも強く赤色光（６３０ｎｍ）に反応した（図３Ｅ、上）。動態上の６３０ｎｍでのＥ１２２Ｔ変異は、５４５ｎｍでのものよりも遅かったが（図３Ｆ）、光電流は、定義されたスパイク列を誘発するには十分な（図３Ｈ、図３Ｅ下）、より長いパルスの６３０ｎｍの光を中程度の強度で使用して動員した（図３Ｇ）。
【０１００】
実施例４：マウスの前頭前皮質ニューロンからの生体脳切片における新規なＣ１Ｖ１キメラの使用
本研究により、同じ微小回路内に存在する抑制性および興奮性ニューロンを、Ｃ１Ｖ１変異形を導入することにより標的化できるかどうかを判定することにした。生体脳切片内の２つのニューロン集団の独立した活性化を調査し、この場合、ＣａＭＫＩＩα−Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔｔｓ  ｅＹＦＰおよびＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ−ＥＹＦＰを、ＰＶ：：ＣｒｅマウスのｍＰＦＣに発現させた。
材料および方法
【０１０１】
８〜９週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊまたはウイルスを事前に注入したＰＶ：：Ｃｒｅマウスから単離した３００μｍの急性冠状切片を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を使用して、氷冷スクロース切断溶液（［ｍＭ］１１  Ｄ−グルコース、２３４スクロース、２．５  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、１０  ＭｇＳＯ４、０．５  ＣａＣｌ２、２６  ＮａＨＣＯ３）に得た。切片を、３２℃で１時間、酸素化した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、［ｍＭ］  １２４  ＮａＣｌ、３  ＫＣｌ、１．３  ＭｇＣｌ２、２．４  ＣａＣｌ２、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、２６  ＮａＨＣＯ３、１０  Ｄ−グルコース）中で回復させた。蛍光タンパク質の発現を識別した後、一定なＡＣＳＦ灌流下で、示される前頭前皮質層から個々のニューロンパッチを取得した。広い波長のキセノンランプ源（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＤＧ−４）からフィルタ処理した光を、顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ−ＬＦＳＡ）の蛍光ポートに結合させた。切片の生理学データを、Ｍａｔｌａｂからインポートし、特注のソフトウェアを使用して分析した。Ｓｏｈａｌら５５によって記載のように、ウェーブレット法を使用してパワースペクトルを計算した。簡単にいうと、各周波数ｆに対して、記録されたトレースを、まずｆ±５Ｈｚの間のバンドパスフィルタでフィルタ処理した。フィルタ処理したトレースを、次に、ウェーブレット関数で畳み込みを行い、
【数１】
2019205455.tif 000005
式中、＊は、畳み込みを意味する、σ＝５／（６ｆ）。次に、５００ミリ秒枠にわたるＷ（ｆ，ｔ）の振幅の二乗を、種々の周波数でのパワーを測定するために使用した。切片記録からの全てのパワースペクトルを、１／ｆに対して正規化した。
【０１０２】
培養細胞画像を、露出１００ミリ秒、感度３０でＲｅｔｉｇａ  Ｅｘｉ  ＣＣＤカメラ（Ｑｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎｃ．）を使用して取得した。照射パワー密度は、標準的なＥＹＦＰフィルタセットで、５００ｎｍにおいて１２ｍＷ  ｍｍ−２であった。蛍光の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、体細胞および近位神経炎を含む領域を標識化し、光電流は面積あたりの平均チャネル発現ではなく膜結合チャネルの総数と関連する傾向にあるため、平均蛍光発光ではなく、その領域の全統合ピクセル強度を各細胞に対して計算することによって、行った。
【０１０３】
電流クランプを使用して、単一の錐体細胞を一連のシミュレーションＥＰＳＣ波形で刺激した。個々のｓＥＰＳＣイベントは、２００ｐＡのピーク電流量を有し、２ミリ秒の時定数で減衰した。各実験は、ランダウンを最小化させるために、それぞれ長さ１０秒で、５秒間隔の１０個の掃引に分割した。各掃引を、５００ミリ秒のセグメントに分割した。各５００ミリ秒のセグメント中のｓＥＰＳＣの総数は、０〜２５０の間で均一な分布から無作為に選択した。次に、５００ミリ秒のセグメント内のｓＥＰＳＣの時間を、全セグメントに及ぶ均一な分布から無作為に選択し、非同期ニューロンの集団からの興奮性入力をシミュレートした。実験的に、これらの刺激パラメータは、０〜３０Ｈｚの発火レートで、錐体ニューロンを確実に駆動した。ベースラインとして示される条件において、５９０ｎｍの光の１０秒のパルスを、ｓＥＰＳＣプロトコルを実行する前に、オプシンを完全に不活性化するために送達した。オプシンが活性化された条件では、４７０ｎｍの光の１秒のパルスを、ｓＥＰＳＣプロトコルより先に行う。
【０１０４】
改変されたＥ／Ｉバランスが情報処理に与える正味の影響を理解するために、Ｉ−Ｏ曲線の形状および反応の変動性における関連変化を捉える、各ニューロンの入力ｓＥＰＳＣレートと出力スパイクレートとの間の相互情報量をコンピュータで算出した。まず、時間ビンで区切ることによりｓＥＰＳＣレートおよびスパイクレートの結合分布、ｓＥＰＳＣレート、およびスパイクレートを推定し、結合ヒストグラムを構築した。時間ビンは、１２５ミリ秒幅であり、ｓＥＰＳＣレートを、等間隔の１０個の０〜５００Ｈｚのビンに分割したが、相互情報量の結果は、広範なビンパラメータにわたり一貫していた。スパイクレートを、時間ビン幅が得られる最小の有意なビン幅を使用して、ビンに区切った（例えば、１２５ミリ秒の時間ビンに対して８Ｈｚのビン幅）。この結合ヒストグラムから、前述のように、コンピュータ相互情報量を、コンピュータ計算し、反応エントロピーとノイズエントロピーとの間の差異を等しくした。
【０１０５】
反応エントロピーにより、ニューロンの出力スパイクレートにおける不確実性の合計量を定量化する。ノイズエントロピーにより、入力レートが得られる出力スパイクレートに残る不確実性を定量化する。神経反応が伝達する入力刺激についての最大情報は、刺激セットのエントロピーであることに留意されたい。等間隔の１０個の入力ｓＥＰＳＣレートビンおよびこれらのビンにわたる均一な入力レートの分布に対して、入力レートのエントロピーは、ｌｏｇ２（１０）＝３．３２２ビットである。
【０１０６】
不十分なサンプリングの確率分布から計算した相互情報量は、上方にバイアスされ得る。結果として、相互情報量、反応エントロピー、およびノイズエントロピーの全ての報告値は、不十分なサンプリングのため、バイアスを補正した。この補正は、全データのより小さい分数（２分の１から８分の１）から値をコンピュータ計算し、無限データの限界を外挿することによって行う。１２５ミリ秒の時間枠を使用して、補正係数は、常に０．０７ビット未満であった。
【０１０７】
ベクターを上述のように作製し、注入を行った。
【０１０８】
結果
この一連の多重改変オプシン遺伝子を使用して、細胞のコンビナトリアル制御の可能性およびインタクトな哺乳動類系における投射を調査した。まず、同じ微小回路内に存在する興奮性および抑制性ニューロンが、Ｃ１Ｖ１変異形および従来のＣｈＲをこれらの２つの細胞集団内へ個別に導入することよって別々に標的化することができるかどうかを調べた。Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔを発現する培養海馬ニューロンは、２ミリ秒の緑色光パルス（５６０ｎｍ）に反応してスパイクするが、紫色光パルスではスパイクしないことが見出された。対照的に、ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒを発現する細胞は、２ミリ秒の４０５ｎｍの光パルスに反応してスパイクするが、２ミリ秒の５６１ｎｍの光パルスには反応しなかった（図４Ａ）。したがって、この原理を生体脳切片内で試験し、この場合、ＡＡＶ５−ＥＦｌａ−ＤＩＯ：：ＣｈＲ２−Ｈ１３４Ｒ−ＥＹＦＰとともに、ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩａ：：Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ−ｔｓ−ｍＣｈｅｒｒｙを、ＰＶ：：ＣｒｅマウスのｍＰＦＣに発現させた（図４Ｂ）。いずれのオプシンをも発現しない錐体ニューロンにおいて、４０５ｎｍの光パルスは、ＰＶ細胞の直接的な活性化のため、強く早い抑制性シナプス後電流を引き起こした（図４Ｃ）が、一方で、５６１ｎｍの光パルスは、短潜ＥＰＳＣ（図４Ｄ）、および局所的な抑制性ニューロンを駆動するＣ１Ｖ１発現錐体細胞から生じることが予測される長潜の多シナプスＩＰＳＣ（図４Ｃ）の両方を引き起こした。
【０１０９】
オプトロード記録を用いて、インビボでのこれらの独立した細胞要素の励起を調査した（図４Ｅ、左）。錐体ニューロンのスパイクに対するＰＶ細胞活性の抑制性効果を試験するために、種々のパルス間間隔で、５Ｈｚの紫色光パルス（ＰＶ細胞内でＣｈＲ２を活性化するため）を、５Ｈｚの緑色光パルス（興奮性錐体ニューロンでＣ１Ｖ１を活性化するため）より先に行う実験プロトコルを設計した。紫色光および緑色光のパルスが、１００ミリ秒離れていた場合（図４Ｅ、上トレース）、緑色光パルスに対する反応は、紫色パルスによって影響されなかった。しかしながら、紫色パルスと緑色パルスとの間の遅延が減少するにつれて、緑色光に誘発されるイベントは、より容易に阻害されるようになり、光パルスが十分な同期性を示したときに完全に無効となった（図４Ｅ、下のトレース、要約データは図４Ｆ）。これらのデータは、インタクトな哺乳動物内でのコンビナトリアル光遺伝的活性化（１つの集団を単独で、または別のものとの正確な時間の組み合わせで駆動する）を示し、オプシンの速度および送達される光パルスの特性を利用する。
【０１１０】
実施例５：視床網様核のニューロンに影響を及ぼす皮質視床（ＣＴ）および視床皮質（ＴＣ）のグルタミン酸軸索の独立した活性化の効果
直接的な細胞の体細胞刺激の代わりに、軸索投射に対するコンビナトリアル制御特性を検証するために、視床網様核のニューロン（ｎＲＴ）に影響を及ぼす皮質視床（ＣＴ）および視床皮質（ＴＣ）のグルタミン酸軸索の独立した活性化の効果（図５Ａ）を、視床切片において試験した。
【０１１１】
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの野生型（出生後９０〜１２０日）を、ペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、頭部を切除した。視床切片の調製および全細胞パッチクランプ記録を行った。記録は、Ｚｅｉｓｓ（Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡、および赤外線カメラを有する微分コントラスト光学を使用して視覚的に識別した、ｎＲＴ（視床網様）およびＴＣ（中継視床皮質）ニューロンから取得した。ＥＰＳＣおよび電流クランプ記録については、内部溶液は、（ｍＭ単位で）１２０  Ｋ−グルコン酸塩、１１  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１  ＣａＣｌ２、１０  Ｈｅｐｅｓ、１  ＥＧＴＡを含有した。ｐＨは、ＫＯＨ（２９０ｍＯｓｍ）で７．４に調節した。ＥＣｌ−は、ネルンストの式に基づいて約−６０ｍＶと推定した。電位は、−１５ｍＶの液体注入電位に補正した。電圧クランプ実験については、ニューロンを、−８０ｍＶでクランプし、ＥＰＳＣを、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストピクロトキシン（５０μＭ，Ｔｏｃｒｉｓ）の浴適用（ｂａｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によって薬理学的に単離した。全ての記録条件において、アクセス抵抗を監視し、細胞は、実験過程にわたってアクセス抵抗が＜１８ＭΩであり、抵抗の変化が＜２５％であった場合にのみ分析に含めた。
【０１１２】
６００ｎＬのｒＡＡＶ５／ＣａｍＫＩＩα−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰまたは９００ｎＬのｒＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩαＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）−ＴＳ−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスを、それぞれ、出生３０〜３５日後に、インビボでＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスの底腹側視床（ＶＢ）またはバレル皮質に定位注入した。皮質内および視床内（ＶＢ）注入を、同じマウスに行った（ｎ＝６）。（ブレグマから）皮質表面の後方１．３ｍｍ、側方３ｍｍ、下方１．１５ｍｍに、皮質内注入を行った。視床内注入は、皮質表面の後方１．７ｍｍ、側方１．５ｍｍ、下方３．５ｍｍであった。注入後約２〜３ヶ月でマウスを屠殺し、水平方向の脳視床切片を、上述のように、光学刺激およびインビトロ記録のために作製した。ＣＴ−ＴＣ−ｎＲＴ経路を介したｎＲＴニューロンの２シナプス性活性化を避けるために、ＶＢ視床を除去した。ＶＢ視床を切片から切断することで、全ての光感受性細胞体を除去し、ＣＴｎＲＴおよびＴＣ−ｎＲＴ投射の直接的な試験を可能にし、ｎＲＴニューロンの電気的な膜特性に影響を及ぼすことがなかった（示されない）。ＣｈＲ２発現ＴＣおよびＣ１Ｖ１発現ＣＴの軸索の光学的活性化を、それぞれ、光ファイバー（ＢＦＬ３７−３００，ＴｈｏｒＬａｂｓ）でｎＲＴに突出するＣＴおよびＴＣ経路に沿って上流に送達される、４０ｎｍおよび５６０ｎｍのレーザー刺激（５ミリ秒期間の光パルス、２〜３ｍＷ）（ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＩ）で行った。５０〜７０％の失敗（３０〜５０％の成功）、固定された反応動態、および低い反応振幅変動性をもたらす光パワーとして定義される、最小の刺激強度を使用した。結果として生じる最小の誘起ＥＰＳＣは、おそらく、記録した細胞に対するシナプス前の単一のＣＴ軸索またはＴＣ軸索の選択的な光学的活性化からもたらされたものである。刺激光パワーは、失敗の数が０になるまで、わずかに増加した（最小刺激より約５％上回る）。ＣＴおよびＴＣ入力を（同時に）刺激し、最小の誘起ＥＰＳＣおよびＥＰＳＰ（それぞれ独立して活動電位発火の閾値下）を、ｎＲＴ細胞において記録した。
【０１１３】
統計的有意性を、適宜、対応ｔ検定または対応のない両側ｔ検定を使用して計算した。データを、Ｍａｔｌａｂ  ＳｔａｔｉｓｔｉｃｓツールボックスまたはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して分析した。
【０１１４】
結果
ＴＣ軸索の最小刺激は、ｎＲＴニューロンに大きく速い興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）を誘起し、一方で、ＣＴ軸索の最小刺激は、ｎＲＴニューロンに小さく遅いＥＰＳＣを誘起し（図５Ｂ）、いずれもこれらの経路に典型的であった。
【０１１５】
次に、ＣＴおよびＴＣ入力のシナプス統合を、これらの２つの入力の間で可変の遅延条件下において調査した。各経路からの閾値下のＥＰＳＰは、５ミリ秒以内で同時に起こる場合にのみ、活動電位発火が閾値上になった（図５Ｃ〜Ｄ）。Ｃ１Ｖ１およびＣｈＲ２活性化の時間の正確性は、ＴＣおよびＣＴ入力間の遅延の確実な制御を可能にし、したがって、皮質および視床の相互結合性、ならびにＣＴおよびＴＣの軸索の近似性のため、これまで、既存の電気的、薬理学的、または光遺伝的技術では観察不可能であった、ｎＲＴ細胞における効果的なシナプス統合の狭い枠（−５ミリ秒）の決定を可能にした。これらの結果は、同じインタクトな調製物での異なる軸索投射の独立した活性化を初めて実証し、同じ標的細胞に対するそれらのコンビナトリアル効果を調べる。
【０１１６】
実施例６：同じ回路内で神経活性化の時間スペクトル分離を達成するためのＣ１Ｖ１およびＳＳＦＯの使用
上の２つの調製物の両方において、可視スペクトルの紫色（４０５ｎｍ）および緑色（５６０ｎｍ）レーザーを使用して、２つのオプシンの分離可能な活性化を達成した。４０５ｎｍのレーザーは、安全な非紫外光を送達するが、４７０ｎｍの光は、より深く組織を貫通し、散乱が少なく、より容易かつ経済的に一般的な青色光源から送達されるため、多くの用途については、青色応答性オプシンに４７０ｎｍのレーザー光を使用することが好ましい場合がある。これは、４７０ｎｍの光が、Ｃ１Ｖ１（図１Ｇ）、ならびにＣｈＲ２を部分的に活性化させることになるため、不可能に思われる場合があるが、コンビナトリアル制御は、４７０ｎｍの光でさえも達成可能であり、ＳＳＦＯの時間特性およびＣ１Ｖ１の赤方偏移性質の両方を利用して、インタクトな哺乳動物組織内での「時間スペクトル分離」を達成することができる。この可能性を検証するために、同じ調製物内で、安定して増強する興奮性または抑制性いずれかの細胞の律動的活性への影響を直接比較することが決定された（図６Ａ）。
【０１１７】
材料および方法
ＣｈＲ２−Ｄ１５６ＡおよびＳＳＦＯを、部位特異的な突然変異生成（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｐＬｅｎｔｉ−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥベクターに点突然変異を挿入することによって、生成した。ウイルス遺伝子送達、冠状脳の区分化、およびパッチクランプの記録を、上述のように行った。ＣａＭＫＩＩａ：：Ｃ１Ｖ１およびＤＩＯ−ＳＳＦＯをＰＶ：：ＣｒｅマウスのｍＰＦＣに発現させるため、二重ウイルス注入を行った。
【０１１８】
ＳＳＦＯを発現する細胞または組織を扱う際、周辺光による活性化を阻止するために、露光を最小化するように注意を払った。各実験の前に、ＳＳＦＯチャネルの全てを暗状態に変換し、光電流の減少を阻止するために、２０秒のパルスの５９０ｎｍの光を適用した。ＳＳＦＯの活性化および非活性化スペクトルを取得するために、培養ニューロンからの記録は、電圧クランプモードで行った。活性化スペクトルの記録のために、１秒のパルスの種々の波長を適用し、続いて１０秒の５９０ｎｍパルスを適用した。非活性化スペクトルは、まず、１秒の４７０ｎｍパルスを適用してＳＳＦＯを活性化し、続いて１０秒のパルスの種々の波長を適用することによって取得した。正味の活性化または非活性化は、それぞれ、第１または第２のパルスの後の光電流を、その細胞に対するピーク波長によって誘発された最大限の光電流変化で除することによる計算した。非活性化スペクトルの負の値は、例えば、１０秒の４７０ｎｍパルスが、チャネルを非活性化するのではなく光電流にわずかな増加をもたらした、トレースからもたらされた。これは、Ｓｕｔｔｅｒ  ＤＧ−４でのこれらの記録に使用した、比較的広い（２０ｎｍ）バンドパスフィルタ幅の結果であり得る。中間波長（４７０ｎｍ〜５２０ｎｍ）は、同じ理由から、チャネル集団に対して入り混じった効果を有することが予想される。
【０１１９】
ＳＳＦＯの統合特性についての光束計算は、各光パワーにおいて顕微鏡対物レンズを通る光束を計算し、続いて、記録された細胞の直径に基づいて細胞表面全体に光束に到達させるように分割し、細胞の形状を球状に近づけることによって、行った。
【０１２０】
結果
ＳＳＦＯは、Ｃ１Ｖ１を活性化させるものと同じ波長で効果的に非活性化することができ、強化された光感受性を有し、数分間わたるニューロンの双安定興奮を可能にする、２９分の減衰定数を有する新規な多重改変チャネルロドプシンである。ＳＳＦＯに関する情報は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号、ならびに米国特許出願第６１／４１０，７０４号、同第６１／４１０，７１１号に見出すことができ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣａＭＫＩＩａ：：Ｃ１Ｖ１およびＤＩＯ：：ＳＳＦＯを、ＰＶ：：ＣｒｅマウスのｍＰＦＣからの急性切片に発現させるために、二重ウイルス注入を行った。これらの条件下では、興奮性錐体細胞は赤方偏移した光に、抑制性ＰＶ細胞は青色光に応答するはずである。実際に、ＰＶ細胞においてＳＳＦＯを活性化させるための１秒の４７０ｎｍの光パルスに応答して、進行中のＩＰＳＣレートは、ベースラインでの８．５±１．２Ｈｚ（期間３、図６Ｂ）から青色光パルスの後の１６．８±２．１Ｈｚ（期間２、ｎ＝４回の記録、ｐ＜０．００５、対応ｔ検定、図６Ｃ）に安定して増加し、ＳＳＦＯ発現抑制性細胞の持続的な活性化を示した。４７０ｎｍの光もまた一過的にＣ１Ｖ１を活性化するとはいえ、この活性化は、点火後の非常に速いＣ１Ｖ１の非活性化のため、光パルス自体の間にのみに生じ得、点火後の持続期間は、ＳＳＦＯ活性のみによって特徴付けられ（図６Ｂ）、光遺伝学的制御モードの時間的分離を示す。興味深いことに、この長期間のＰＶニューロン活性の増加中に、ＩＰＳＣパワースペクトルに著しい上昇ピークの誘発はなく、この減少した調製物におけるＰＶニューロン単独の直接的な活性化が、ネットワークにおけるγ同期性の誘発には不十分であることを示唆する。しかしながら、非常に対照的に、４７０ｎｍの光パルス自体の間に、同じレベルのＰＶニューロン活性化だけでなく、Ｃ１Ｖ１発現錐体細胞の部分的な活性化もまた予測される場合、顕著なγピークが一貫して観察され（ピーク周波数３９．２±３．５Ｈｚ、ｎ＝４回の記録）、高γ範囲（＞６０Ｈｚ）に及んだ。
【０１２１】
さらに、同じ実験において（実際は、同じ記録された掃引の後半）、このＣ１Ｖ１錐体細胞単独の場合の５９０ｎｍの光（ＰＹ細胞内のＣ１Ｖ１の活性化およびＰＶ細胞内のＳＳＦＯの非活性化を同時に行う）での直接的活性化は、より低い周波数ピーク（２６．６±１Ｈｚ、ｎ＝６回の記録）で、堅調なγ同調性をもたらした。ＰＶ細胞での前のＳＳＦＯ活性化歴に関連するあらゆる残留ＰＶニューロン活性は、この作用には必要ではないことを示し、錐体細胞でのＣ１Ｖ１活性化の履歴のみを用いた、他の点では同一であり、ＩＰＳＣレートが上昇した前歴のない掃引は、同じ結果を誘発した）。これらの結果は、時間スペクトルのコンビナトリアル制御の総合的な原理を示し、さらに、錐体ニューロンにおける活性の上昇が、ネットワーク特性からγ振動を通じて生じ得ることを示唆する３１。興味深いことに、４７０ｎｍの光パルスの最中に、ＰＶおよび錐体細胞の両方の活性化が予測され、γ同期性が、興奮性ニューロンのみが活性化された場合よりも高い周波数で一貫して観察され、γ振動の誘発におけるＰＶおよび錐体細胞の両方の協調的な重要性についての情報を支持および拡大する３１−３３。
【０１２２】
結論
本研究の過程において、Ｃ１Ｖ１変異形と称される、新しい手段の系統がもたらされた。Ｃ１Ｖ１は、注目すべきことに、単独ではニューロンに十分に発現しないが、初期のゲノム研究で特定されていた他のオプシン遺伝子（ＶＣｈＲ１およびＣｈＲ１）が結集された、赤方偏移されたオプシン遺伝子である。Ｃ１Ｖ１は、ＣｈＲ２配列を全く有さないが、それにもかかわらず、ここで本明細書に報告されたその多重改変された変異形は、最も強力で、最も赤方偏移した、最も安定した既知のチャネルロドプシンを代表する。レチナール結合ポケット全体で重要なアミノ酸位置における突然変異生成は、（１）ＣｈＥＴＡ突然変異の高速相同体として生成される、高発現の赤方偏移したオプシン遺伝子であるＣ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）、（２）最も赤い作用スペクトルショルダーを示し、赤色光で活動電位を発火させるために使用可能ですらあるＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）、（３）最も低い脱感作、最も速い非活性化、ＣｈＲ２との最小限の交差活性化のための最も少ない紫色活性化、および強い発現を有する組み合わせの変異体であるＣ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）の生成をもたらした。実際に、Ｃ１Ｖ１変異形は、電流の大きさ、非活性化動態、および作用スペクトルの検討（表１）に基づいて、異なる用途に選択することができ、例えば、二光子作業では、ＣｈＲ２の２Ｐ活性化が、電流の大きさおよび速いチャネル閉鎖動態のために困難であるため、Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）が目的のものである可能性が高い。Ｃ１Ｖ１変異形は、細胞のＥ／Ｉバランスの上昇のレベルを増加させることが、以前は統合失調症および自閉症の両方に関連していた現象である、γ周期性の強度を増加させることにつながるという仮説の直接的な検証を可能にした。当然ながら、異なる手段もまた相乗効果があり、Ｃ１Ｖ１変異形をＣｈＲ２と一緒に使用することにより、この研究で取り組む２つの異なるニューロン集団である、興奮性錐体ニューロン、および高速スパイクのパルブアルブミン発現抑制性介在ニューロンにおいてスパイクの確実で別々な駆動を可能にし、安定して上昇した細胞のＥ／Ｉバランスが、γバンド回路活性の生成に効果的であり、光遺伝学的手段における動態およびスペクトルの両方の差異を十分に利用していることを確認する。この種類のコンビナトリアル活性化は、複数の細胞型を越えて複数の神経経路型にまで及び得、例えば、システム神経科学の念願の目標である、単一の脳領域内で、異なる位置から生じる２つの軸索求心性集中経路における分離可能なスパイクの活性化にまで及び得る。
【０１２３】
本発明を純粋に例示することを目的とし、したがって、決して本発明を限定すると見なされるべきではない実施例はまた、上記で論議される本発明の態様および実施形態を説明および詳述する。先述の実施例および詳細な説明は、限定ではなく例証として提供される。本明細書で引用される出版物、特許出願、および特許は、各個別出版物、特許出願、または特許が、参照することにより組み込まれると特異的および個別に示されたかのように、参照することにより本明細書に組み込まれる。上に記載された、および添付の付属書類に説明される種々の実施形態は、一緒におよび／または他の様式で実施されてもよい。本開示および付属文書における態様の１つ以上はまた、明らかなはずであり、有用である、特定の目的の用途にしたがって、さらに分離または統合された様式で実装されてもよい。具体的には、本明細書で引用される全ての出版物および付属文書は、本発明と関連して使用され得る組成物および方法を説明および開示する目的で、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。先述の発明は、理解を明確にする目的で、例証および一例として、いくらか詳細に説明されているが、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、ある変更および修正が行われてもよいことが、当業者に容易に明白となるであろう。
【０１２４】
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【０１２５】
配列
配列番号１（ヒト化Ｃ１Ｖ１アミノ酸配列）
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED
配列番号２（ヒト化Ｃ１Ｖ１ヌクレオチド配列）
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggctacgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaacaatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgctctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaagagatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagtttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcggagtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaacctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggtggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtcgagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggatctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcgacatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
配列番号３（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１２２Ｔアミノ酸配列）
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED
配列番号４（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１２２Ｔヌクレオチド配列）
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggctacgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaacaatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgctctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaaaccatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagtttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcggagtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaacctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggtggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtcgagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggatctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcgacatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
配列番号５（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１６２Ｔアミノ酸配列）
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED
配列番号６（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１６２Ｔヌクレオチド配列）
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggctacgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaacaatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgctctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaagagatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagtttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcgacgtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaacctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggtggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtcgagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggatctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcgacatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
配列番号７（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔアミノ酸配列）
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED
配列番号８（ヒト化Ｃ１Ｖ１  Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔヌクレオチド配列）
atgtcgcgacgcccgtggctccttgctctcgcattggcggtggcgcttgcagcgggatcggcaggagcgtcaaccggaagcgatgcgaccgtccccgtggctacgcaagacggaccagattacgtgttccacagagcccacgagcggatgttgtttcagacatcatacacacttgaaaacaatggtagcgtcatttgcatccctaacaatgggcagtgtttttgcctggcctggttgaaatcgaacggtacgaacgccgagaagctggcggcgaacattctgcagtggatcacattcgcactctcggcgctctgccttatgttctatggctaccagacttggaaatccacgtgtggttgggaaaccatctacgtagcaaccattgaaatgatcaagtttatcattgagtatttccatgagtttgacgaaccggccgtaatctactcatcgaatgggaataagacagtctggttgaggtatgcgacgtggctcctcacctgcccggtccttctgatccatctgagcaacctcacaggcctgaaggacgattatagcaaaaggactatgggcctgttggtttctgatgtgggatgcatcgtgtggggcgcaaccagcgccatgtgtacggggtggacgaagatcctgttcttcctcatctcattgagctatggtatgtatacctattttcatgctgctaaagtttatatcgaagcattccacacagttccaaaagggatttgtcgagaactggtccgagtgatggcctggacattctttgtggcttggggaatgtttccagtcctgtttctgctgggcacggaaggattcggtcatatcagcccttatggatctgccattgggcactccatcctcgacctgattgcaaagaacatgtggggtgtgctggggaattacctgcgcgtcaaaatccacgagcacatcctgttgtatggcgacatcagaaagaagcagaaaattacgatcgccggccaagagatggaggttgagacactggtggctgaagaggaggactaa
配列番号９（オルターナティブヒト化Ｃ１Ｖ１アミノ酸配列（Ｃ１Ｖ１＿２５））
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPATLWLSSGNGVVWMRYGEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED
配列番号１０（オルターナティブヒト化Ｃ１Ｖ１ヌクレオチド配列（Ｃ１Ｖ１＿２５））
Atgagcagacggccctggctgctggccctggctctcgctgtggccctggccgccggcagcgccggagccagcaccggcagcgacgccaccgtgcccgttgccacacaggacggccccgactacgtgttccaccgggcccacgagcggatgctgttccagaccagctacacccttgaaaacaacggcagcgtgatctgcatccccaacaacggccagtgcttctgcctggcctggctgaagtccaacggcaccaacgccgagaagctggccgccaacatcctgcagtggatcaccttcgccctgtctgccctgtgcctgatgttctacggctaccagacctggaagtccacctgcggctgggaggaaatctacgtggccaccatcgagatgatcaagttcatcatcgagtacttccacgagttcgacgagcccgccaccctgtggctgtccagcggaaacggcgtggtgtggatgagatacggcgagtggctgctgacctgccctgtgctgctgatccacctgagcaacctgaccggactgaaggatgactacagcaagagaaccatgggactgctggtgtccgatgtgggatgcatcgtgtggggagccacctccgccatgtgcaccggatggaccaagatcctgttcttcctgatcagcctgagctacggaatgtacacctacttccacgccgccaaggtgtacattgaggcctttcacaccgtgcctaagggaatctgcagagaactggtcagagtgatggcctggaccttcttcgtggcctggggaatgttccctgtgctgttcctgctgggaaccgagggattcggacacatcagcccttacggaagcgccatcggacacagcatcctggatctgatcgccaagaacatgtggggagtgctgggaaactacctgagagtgaagatccacgagcacatcctgctgtacggcgacatcagaaagaagcagaagatcaccatcgccggacaggaaatggaagtcgagaccctggtggccgaggaagaggat
配列番号１１  ＣｈＲ２アミノ酸配列
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAA
GFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR
YAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCL
GLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVL
SVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLV
EDEAEAGAVP
配列番号１２  ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAA
GFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR
YAEWLLTCPVILIRLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCL
GLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVL
SVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLV
EDEAEAGAVP
配列番号１３  ＳＦＯ
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP
配列番号１４（ＳＳＦＯ）
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVP
【図１ａ−ｂ】
2019205455.tif 000006
【図１ｃ】
2019205455.tif 000007
【図１ｄ−ｈ】
2019205455.tif 000008
【図２】
2019205455.tif 000009
【図３ａ−ｃ】
2019205455.tif 000010
【図３ｄ】
2019205455.tif 000011
【図３ｅ−ｈ】
2019205455.tif 000012
【図４ａ−ｄ】
2019205455.tif 000013
【図４ｅ−ｇ】
2019205455.tif 000014
【図５】
2019205455.tif 000015
【図６】
2019205455.tif 000016
【配列表】
2019205455000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ微小回路内に存在する興奮性または抑制性ニューロンの脱分極化を選択的に阻害する化合物を識別するための方法であって、
（ａ）第１の波長を有する光で第１の光活性化タンパク質を含む興奮性ニューロンを選択的に脱分極化するか、または第２の波長を有する光で第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することであって、前記第１または前記第２の光活性化タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むキメラタンパク質である、脱分極化することと、
（ｂ）第１の光活性化タンパク質を含む前記興奮性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答した、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または第２の光活性化タンパク質を含む抑制性ニューロンを選択的に脱分極化することに応答した、抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定することと、
（ｃ）前記興奮性ニューロンまたは前記抑制性ニューロンを化合物と接触させることと、
（ｄ）前記興奮性ニューロンまたは前記抑制性ニューロンのいずれかを前記化合物と接触させることが、いずれかのニューロンの脱分極化を選択的に阻害するかどうかを判定するために、前記興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を測定するか、または前記抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）を測定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の光活性化タンパク質は、配列番号１、３、５、または７で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、または１４で示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の光活性化タンパク質は、緑色光によって活性化され、前記第２の光活性化タンパク質は、紫色光によって活性化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抑制性および興奮性ニューロンは、生きている非ヒト動物中に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抑制性および興奮性ニューロンは、非ヒト動物からの生体脳切片中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抑制性および興奮性ニューロンは、前頭前皮質からのものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記興奮性ニューロンは、錐体ニューロンを含み、前記抑制性ニューロンは、パルブアルブミンニューロンを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物は、コンビナトリアル化学ライブラリーのメンバーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が心臓活動電位に悪影響を及ぼすかどうかを判定するために、心臓組織上で前記化合物をアッセイすることをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の光活性化タンパク質は、配列番号１１、１２、１３、または１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１または第２の光活性化タンパク質が、約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長の光によって活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１または第２の光活性化タンパク質が、Ｃ末端輸送シグナルをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
輸送シグナルが、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号１５）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１または第２の光活性化タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１２２においてＧｌｕからＴｈｒへのアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１または第２の光活性化タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１６２においてＧｌｕからＴｈｒへのアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１または第２の光活性化タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸１２２においてＧｌｕからＴｈｒへのアミノ酸置換、及び、アミノ酸１６２においてＧｌｕからＴｈｒへのアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の第１または第２の光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１８】
発現ベクターである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
プロモータに動作可能に結合された、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。