(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト又は動物対象における、１若しくは２以上の心臓チャネル病、又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態、或いはそれらの両方を予防するための組成物及び方法の提供。【解決手段】ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害及びＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤と；空リポソームであり、薬理学的活性剤の投与の前、同時又は後に投与される１又は２以上のリポソームとを含む組成物及び方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物対象における、１若しくは２以上の心臓チャネル病、又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態、或いはそれらの両方を予防するための組成物であって、
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤と、
１又は２以上のリポソームと
を含み、
前記リポソームが、空リポソームであり、かつ前記薬理学的活性剤の投与の前、同時又は後に投与され、
前記空リポソームが、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態を低減させるのに有効な量で提供される、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、薬理学及び心臓病学に関し、より詳細には、心筋ＩＫｒチャネルの遺伝的、薬剤誘発性阻害を治療的に変化させるためリポソームベースの組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、その背景を、修正されない場合に心筋細胞活動電位における再分極の延長、トルサード・ド・ポアンツ、及びＱＴ延長症候群を誘発し得る先天的欠損の修正又は治療薬による機能的介入を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における心室ＱＴの再分極の期間を制御するための組成物及び方法に関連して記載する。本発明は、非経口投与（静脈内又は皮下）投与前にＱＴ延長薬をリポソームと結合させるか、あるいは、ＱＴ延長の高いリスクを有することが知られている治療薬の前若しくは治療薬と同時に、又は毒物注入の直後に空リポソームを投与することのいずれかからなる。
【０００３】
心臓の鼓動は、心筋の興奮及び収縮の的確に制御された規則的な間隔の波によるものである。イオンベースの脱分極及び再分極の間の電流は、電波を測定する身体の特定の部位に装着した電気的リード（心電図）により測定することができる。Ｐ波は、心房の脱分極の波を表す。心房全体が脱分極すると、波が０に戻る。０．１秒後、心室が完全に脱分極し、その結果ＱＲＳ群がもたらされる。３つのピークは、電流が心室の中を広がる様式によるものである。この後、心室のＴ波又は再分極が続く。標準ＥＣＧでのＱＲＳ群の開始からＴ波の終点の間に測定されたＱＴ間隔は、心筋細胞の再分極相（又は心室の脱分極及び再分極）の完了までの期間に相当する。この間隔の期間は、遺伝的差異、心臓病、電解質均衡、毒物注入及び薬剤が原因で変化する可能性がある。ＱＴ間隔の延長は、結果として心室性不整脈及び突然死をもたらす可能性がある。
【０００４】
薬剤誘発性ＱＴｃ延長症候群（ＬＱＴＳ，long QTc Syndrome）すなわち、活動電位持
続時間の延長は、政府が定める薬剤中止の一般的な原因である。ＱＴｃ延長は、心室細動に移行するトルサード・ド・ポアンツ（ＴｄＰ，Torsades de Pointes）、多形性心室性頻拍の予測不可能な危険因子である。薬剤誘発性ＬＱＴＳは、ＴｄＰがそれに続く場合に致死性の有害反応を成す可能性があるすべての処方の約３％を占める。１又は２以上のＱＴｃ延長薬を同時に服用している患者は、ＴｄＰのリスクが高い。ＴｄＰの全体の発生頻度は統計的にまれであるが、罹患した個体にとっては臨床的に有意であり、薬剤について臨床試験を開始させる前に、この薬剤の作用についてのアッセイを必須とする。
【０００５】
一般的な構造の多種多様な薬剤は、結果として後天性ＬＱＴＳをもたらすヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ＫＣＮＨ２又はｈＥＲＧ，human ether-a-go-go-related gene）コード化Ｋ＋チャネル及び心筋遅延整流性カリウム電流ＩＫ（ＫＶ１１．１）を遮断する。ＬＱＴＳの薬剤が関連した高リスクは、薬剤開発上の主な障害物であり、多くの薬剤が、臨床前開発中に取り止め、承認後黒枠警告を指定され、市場から回収されてきた。カリウムチャネルをコードする１０個の異なる遺伝子における５００の可能性がある変異に基づく常染色体劣性又は優性ＬＱＴＳは、米国内で１：３０００の発生率又は約１００，０００名でみられる。ＱＴ間隔延長又はＬＱＴＳのリスクは、無症状の米国人母集団の２．５％に発症する。この症候群は、発現した場合、未処置の患者において重篤な不整脈及び突然死をきたすおそれがある。ＬＱＴＳ誘発剤による薬剤治療を受けている無症候性先天性ＬＱＴＳ患者における心臓死の確率は高まる。
【０００６】
後天性ＬＴＱＳのウォッシュアウトの大部分は、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によりコード化されたカリウムイオンチャネルの閉塞によるものである。高濃度のｈＥＲＧ遮断薬は一般にＱＴｃ間隔延長を誘発し、ＴｄＰの確率を高める。薬剤誘発性ＴｄＰの症例の１０％までが、１３の主要な遺伝的変異、４７１の様々な変異、及び１２４の遺伝子多型によるものである可能性がある（Chig, C 2006）。
【０００７】
ＬＱＴＳの検出のためのシステム及び方法は、以前に説明されてきた。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０００４５４９号明細書（Kohls et al. 2010）は、患者から回収した一組のＥＣＧデータを回収したＥＣＧデータの多数のデータベースと比較することによって、患者においてＬＱＴＳを検出するシステム及び方法を開示している。多数のデータベースは、患者の以前のＥＣＧを含有するデータベース、既知の後天性ＬＱＴＳ特性データベース、及び既知の遺伝的ＬＱＴＳ特性データベースを含むものとなる。患者のＥＣＧをこれらのデータベースと比較することは、ＥＣＧの成果からＱＴ間隔の変化、Ｔ波形態の変化、Ｕ波形態の変化として、そのような発生の検出を容易にし、ＬＱＴＳの既知の遺伝的パターンと整合し得る。システム及び方法は、患者の性別及び民族性に感受性があり、これらの因子はＬＱＴＳに影響を及ぼすことが示されていることから、さらに、ＱＴ持続時間を薬剤作用に関するデータベースに整合させることができる。システム及び方法は、また、現行のＥＣＧ管理システム及び記憶デバイスに容易に統合される。
【０００８】
ＬＱＴＳの診断及び処置のためのシステム及び方法は、米国特許出願公開第２００８／０２５５４６４号明細書（Michael,2008）に記載されている。Michaelの発明は、患者の心周期におけるＱＴ間隔延長を検出するために、電気的収縮期（ＱＴ，electrical systole）と機械的収縮期（ＱＳ２，mechanical systole）からＱＴ／ＱＳ２比を導出するＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ，Long QT Syndrome）を診断するためのシステムを含む。プロセッサは、マイクロホン及び胸部電極から収縮期を得、ＱＴ／ＱＳ２比を算出し、ディスプレイに結果を出力する。プロセッサは、患者においてＬＱＴＳを診断するために、このＱＴ／ＱＳ２比をメモリに格納された閾値と比較することができる。ユーザーインターフェースは、プログラミング、セットアップ及びディスプレイのカスタマイズを提供する。モードセレクターにより、このシステムが、ＬＱＴＳを診断するための心音計、１２誘導心電計又は機械として選択的に作動可能となる。ＬＱＴＳなどの心臓病を診断するための関連した方法は、同じ心周期の間のＱＴとＱＳ２を測定すること、ＱＴ／ＱＳ２比を算出すること、及び結果を経験的データから導出された閾値と比較することを含む。方法は、安静時と運動中の両方の収縮期を測定することを含んでもよく、薬剤有効性、投与量最適化及び後天性ＬＱＴＳ因果関係に関する各試験に用いてもよい。
【０００９】
不整脈の処置のための方法は、米国特許出願公開第２００７／００４８２８４号明細書（Donahue and Marban, 2007）に提示されている。方法は、心臓の電気的性質を調整する少なくとも１つのある量のポリヌクレオチドを投与することを含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソームやアデノウイルスベクターなど微小送達系媒体を用いて使用され得る。
【００１０】
不整脈の処置又は予防のための方法、組成物、投与レジーム、及び投与経路は、Fedida et al.(2010)の米国特許出願公開第２００１／００１２０８９０号明細書に記載されている。Fedidaの発明では、イオンチャネル調節化合物をそれを必要とする対象に投与することにより、早期後脱分極及びＱＴ間隔延長が低減又は排除され得る。イオンチャネル調節化合物は、シクロアルキルアミンエーテル化合物、特にシクロヘキシルアミンエーテル化合物であってもよい。早期後脱分極、ＱＴ間隔延長及び／又はトルサード・ド・ポアンツを誘発するイオンチャネル調節化合物の組成物及び薬剤もまた記載される。Fedidaの発明はまた、イオンチャネル調節化合物と併せて提供され得る抗酸化剤を開示し、この抗酸化剤の非限定例としては、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、ルテイン、リコピン、ビタミンＢ２、コエンザイムＱ１０、システイン、並びにビルベリー、ターメリック（クルクミン）、ブドウ種子又はマツ樹皮エキス、及びイチョウなどの薬草が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０００４５４９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０２５５４６４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／００４８２８４号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００１／００１２０８９０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Chig, C 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））及びニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））はそれぞれ、非小細胞肺がん及び慢性骨髄性白血病の処置のために承認されたチロシンキナーゼ阻害薬である。両方とも、ヒト及び動物におけるＱＴ延長をもたらすことが示されている。リポソームは、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によりコード化されたＩＫｒ（ＫＶ１１．１）チャネルに対する薬剤誘発性効果を改善することが示されている。本研究は、リポソームもＩＫｒチャネルに対するクリゾチニブ及びニロチニブの効果を低下させるかどうかを判定するために行った。ｈＥＲＧで安定的にトランスフェクトしたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ，human embryonic kidney）２９３細胞を使用した標準インビトロＩＫｒアッセイにおいて、クリゾチニブ及びニロチニブを試験した。用量反応を判定し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０，50% inhibitory concentration）を算出した。ＨＥＫ２９３細胞をリポソームと混合したクリゾチニブ及びニロチニブで処理した場合、これらの２つの薬剤のＩＫｒチャネル阻害効果に著しい減少がみられた。リポソーム被包性ＱＴ延長薬の使用、又はこれらの薬剤をリポソーム、例えば空リポソームと混合するだけで、これらの心臓易罹患性が低下することが見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤と；空リポソームであり、前記薬理学的活性剤の投与の前、同時又は後に投与される１又は２以上のリポソームとを含む、ヒト又は動物対象における、１若しくは２以上の心臓チャネル病（cardiac channelopathies）、又は心パターン（cardiac patterns）における異常若しくは変化に起因する状態、或いはそれらの両方を予防するための組成物を含む。一態様では、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態は、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である。別の態様では、組成物は、心臓関連又は非心臓関連の疾患の処置において使用される１又は２以上の薬剤の投与により誘発されるＩＫｒチャネル阻害の延長又はＱＴ延長の処置又は予防のために使用される。別の態様では、１又は２以上の活性剤（active agent）は、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジリン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、１又は２以上の活性剤は：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、組成物は、経腸、非経口、静脈内、腹腔内又は経口投与に適応する。一態様では、組成物は、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態を引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤、及び心臓チャネル病又は活性剤によって引き起こされる心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態を低減させるのに十分な量の空リポソームを含む、治療有効量の組成物から本質的になる。別の態様では、活性剤及びリポソームは、一緒に結合又はコンジュゲートされてもよい。別の態様では、リポソームは、アニオン性、カチオン性、又は中性のリポソームを含む。別の態様では、リポソームは、脂質又はリン脂質壁を含み、ここで、脂質又はリン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、レチノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択される。別の態様では、組成物は、薬学的に許容される分散媒、溶媒又は媒体をさらに含み、ここで、活性剤、リポソーム、又はそれらの両方が分散媒、溶媒又は媒体中に溶解、分散又は懸濁している。別の態様では、リポソームは、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。別の態様では、リポソームは、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤、並びに空リポソームであり、治療的活性剤又は薬剤の投与の前、同時又は後に投与され、ＩＫｒチャネル病又はＱＴ延長を低減又は排除するのに十分な量で提供される１又は２以上のリポソームを含む、ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ−関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによってＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こすヒトにおける治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する１又は２以上の有害反応を予防又は処置するための組成物を含む。一態様では、治療的活性剤又は薬剤は、ヒト又は動物対象における１又は２以上の心臓性又は非心臓性疾患の予防又は処置に使用される。別の態様では、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態は、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である。別の態様では、組成物は、心臓性又は非心臓性疾患の処置に使用される１又は２以上の薬剤の投与によって誘発されるＩＫｒチャネル阻害の延長又はＱＴ延長の処置又は予防のために使用される。別の態様では、１又は２以上の活性剤は、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジリン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、１又は２以上の活性剤は：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、組成物は、経腸、非経口、静脈内、腹腔内又は経口投与に適応する。別の態様では、活性剤及びリポソームは、一緒に結合又はコンジュゲートされてもよい。別の態様では、リポソームは、アニオン性、カチオン性、又は中性のリポソームを含む。別の態様では、リポソームは、脂質又はリン脂質壁を含み、ここで、脂質又はリン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、レチノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール及びジアシルグリセロールスクシネート）からなる群から選択される。別の態様では、リポソームは、１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の直径を有する球状のリポソームである。別の態様では、リポソームは、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。別の態様では、リポソームは、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、ヒト又は動物対象における１又は２以上の心臓チャネル病、心パターンにおける異常若しくは変化又はその両方を予防又は処置する方法であって、１又は２以上の心臓チャネル病、心パターンにおける異常若しくは変化又はその両方の予防又は処置を必要とするヒト又は動物対象を特定するステップと；ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによりＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤；及び空リポソームであり、１又は２以上の心臓チャネル病、心パターンにおける異常若しくは変化を予防又は処置するのに十分な量の、薬理学的活性剤の投与前、同時又は後に投与される１又は２以上のリポソーム；及び、活性剤、リポソーム、又はそれらの両方が溶解、分散又は懸濁している任意選択の薬学的に許容される分散媒、溶媒又は媒体とを含む、治療有効量の組成物をヒト又は動物対象に投与するステップとを含む方法を含む。一態様では、組成物は、ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによりＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤及び空リポソームを含む治療有効量の組成物から本質的になり、空リポソームの量は、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長を抑制するのに十分である。一態様では、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態は、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である。別の態様では、１又は２以上の活性剤は、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジリン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される。別の態様では、リポソームは、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。別の態様では、リポソームは、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む。別の態様では、１又は２以上の活性剤は：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明は、ヒト又は動物対象における治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する１又は２以上の有害反応を予防又は処置するための方法であって、ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによりＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する１又は２以上の有害反応の予防又は治療を必要とするヒト又は動物対象を特定するステップと；空リポソームであり、治療的活性剤又は薬剤の投与前、同時、又は投与後に投与されるか、あるいは治療的活性剤又は薬剤が充填されている１又は２以上のリポソームを含む治療有効量の組成物をヒト又は動物対象に投与するステップと；薬剤誘発性チャネル病に対するリポソームと治療的活性剤又は薬剤との組合せの効果を測定するステップであり、組成物が、治療的活性剤又は薬剤によって誘発されるチャネル病を低減又は排除するステップとを含む方法を含む。一態様では、１又は２以上の活性剤又は薬剤は、アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、ヒト又は動物対象における薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ又は任意の他の活性剤の投与に起因するＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを予防又は処置するための方法であって、薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ又は任意の他の活性剤の投与に起因するＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つの予防又は処置を必要とするヒト又は動物対象を特定するステップと；空リポソームであり、薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ又は任意の他の活性剤の投与前、同時、又は投与後に投与される１又は２以上のリポソームを含む治療有効量の組成物をヒト又は動物対象に投与するステップであり、組成物が、治療的活性剤又は薬剤によって誘発されるチャネル病を低減又は排除するステップとを含む方法を含む。一態様では、活性剤は、薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長が原因で、以前に臨床試験が不成功であった。別の態様では、方法は、薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長の副作用が原因で不成功であったか又は限定された臨床使用の履歴のある薬剤を、臨床試験において特定するステップをさらに含む。一態様では、１又は２以上の活性剤は、アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン； クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、薬理学的活性剤により引き起こされるチャネル病を低減する候補薬剤を評価する方法であって、（ａ）患者の第１のサブセットに候補薬剤、及び患者の第２のサブセットにプラセボを投与するステップあり、組成物が、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす薬理学的活性剤と、空リポソームであり、治療的活性剤又は薬剤の投与前、同時、又は投与後に投与される１又は２以上のリポソームとを組み合わせて提供されるステップと；（ｂ）ある一組の患者から薬剤誘発性チャネル病に罹患している疑いのある者についてチャネル病を測定するステップと；（ｃ）候補薬剤又はプラセボの投与後にステップ（ａ）を反復するステップと；（ｄ）組成物が、患者の第２のサブセットにおいて生じる低減と比較して、統計学的に有意な薬剤誘発性チャネル病の低減をもたらすかどうかを判定するステップであり、統計学的に有意な低減が、候補薬剤が前記疾患状態を処置するのに有用であることを示すステップとを含む方法を含む。一態様では、薬剤は、薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長が原因で、以前に臨床試験が不成功であった。別の態様では、１又は２以上の活性剤は：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される。一態様では、方法はインビトロで行われる。
すなわち本発明は以下に関する。
（１）ヒト又は動物対象における、１若しくは２以上の心臓チャネル病、又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態、或いはそれらの両方を予防するための組成物であって、
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤と、
１又は２以上のリポソームと
を含み、
前記リポソームが、空リポソームであり、かつ前記薬理学的活性剤の投与の前、同時又は後に投与され、
前記空リポソームが、心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態を低減させるのに有効な量で提供される、前記組成物。
（２）心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態が、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である、上記（１）に記載の組成物。
（３）心臓関連又は非心臓関連の疾患の処置において使用される１又は２以上の薬剤の投与によって誘発されるＩＫｒチャネル阻害の延長、又はＱＴ延長の処置若しくは予防のために使用される、上記（１）に記載の組成物。
（４）１又は２以上の活性剤が、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジレン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル、又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される、上記（１）に記載の組成物。
（５）１又は２以上の活性剤が：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン； セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される、上記（１）に記載の組成物。
（６）経腸、非経口、静脈内、腹腔内又は経口投与に適合される、上記（１）に記載の組成物。
（７）活性剤及びリポソームが、一緒に結合又はコンジュゲートされてもよい、上記（１）に記載の組成物。
（８）リポソームが、アニオン性、カチオン性、又は中性のリポソームを含む、上記（１）に記載の組成物。
（９）リポソームが、脂質又はリン脂質壁を含み、前記脂質又は前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、レチノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択される、上記（１）に記載の組成物。
（１０）薬学的に許容される分散媒、溶媒又は媒体をさらに含み、活性剤、リポソーム、又はそれらの両方が、前記分散媒、前記溶媒又は前記媒体中に溶解、分散又は懸濁している、上記（１）に記載の組成物。
（１１）リポソームが、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（１）に記載の組成物。
（１２）リポソームが、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（１）に記載の組成物。
（１３）ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ−関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こすヒトにおける治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する１又は２以上の有害反応を予防又は処置するための組成物であって、
ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬理学的活性剤と、
１又は２以上のリポソームと
を含み、
前記リポソームが、空リポソームであり、かつ前記治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する有害反応を低減させるのに有効な量で前記治療的活性剤又は薬剤の投与の前、同時又は後に投与される、
前記組成物。
（１４）治療的活性剤又は薬剤が、ヒト又は動物対象における１又は２以上の心臓性又は非心臓性疾患の予防又は処置に使用される、上記（１３）に記載の組成物。
（１５）心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態が、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である、上記（１３）に記載の組成物。
（１６）心臓性又は非心臓性疾患の処置に使用される１又は２以上の薬剤の投与によって誘発されるＩＫｒチャネル阻害の延長又はＱＴ延長の処置又は予防のために使用される、上記（１３）に記載の組成物。
（１７）１又は２以上の活性剤が、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジレン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル、又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される、上記（１３）に記載の組成物。
（１８）経腸、非経口、静脈内、腹腔内又は経口投与に適応する、上記（１３）に記載の組成物。
（１９）活性剤及びリポソームが、一緒に結合又はコンジュゲートされてもよい、上記（１３）に記載の組成物。
（２０）リポソームが、アニオン性、カチオン性、又は中性のリポソームを含む、上記（１３）に記載の組成物。
（２１）リポソームが、脂質又はリン脂質壁を含み、前記脂質又は前記リン脂質が、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、レチノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択される、上記（１３）に記載の組成物。
（２２）リポソームが、１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の直径を有する球状のリポソームである、上記（１３）に記載の組成物。
（２３）リポソームが、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（１３）に記載の組成物。
（２４）リポソームが、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（１３）に記載の組成物。
（２５）１又は２以上の活性剤が：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン； セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される、上記（１３）に記載の組成物。
（２６）ヒト又は動物対象における１又は２以上の心臓チャネル病、心パターンにおける異常若しくは変化、又はその両方を予防又は処置する方法であって、
前記１又は２以上の心臓チャネル病、心パターンにおける異常若しくは変化、又はその両方の予防又は処置を必要とするヒト又は動物対象を特定するステップと、
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす１又は２以上の薬学的活性剤と、１又は２以上のリポソームと、任意選択の薬学的に許容される分散媒、溶媒又は媒体とを含む治療有効量の組成物を、前記ヒト又は動物対象に投与するステップであって、
前記リポソームが、空リポソームであり、かつ前記薬学的活性剤の投与前、同時、又は投与後に投与され、
前記活性剤、前記リポソーム、又はそれらの両方が、溶解、分散又は懸濁している、ステップと
を含む、前記方法。
（２７）心臓チャネル病又は心パターンにおける異常若しくは変化に起因する状態が、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流、多形性心室性頻拍、ＱＴｃ、ＬＱＴ２、ＬＱＴＳの延長、又はトルサード・ド・ポアンツに関与するイオンチャネルの阻害である、上記（２６）に記載の方法。
（２８）１又は２以上の活性剤が、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジレン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル、又はシサプリドのうちの少なくとも１つから選択される、上記（２６）に記載の方法。
（２９）リポソームが、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（２６）に記載の方法。
（３０）リポソームが、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）を含む、上記（２６）に記載の方法。
（３１）１又は２以上の活性剤が：アロキシ；アミオダロン；亜ヒ酸；アステミゾール；ベプリジル；クロロキン；クロルフェニラミン；クロルプロマジン（ソラジン）；シサプリド；セレクサ；シタロプラム；クラリスロマイシン；エリスロマイシン；クルクミン；ジソピラミド；ドフェチリド；ドンペリドン；ドキソルビシン；ドロネダロン；ドロペリドール；グレパフロキサシン；ハルドール；ハロペリドール；ハロファントリン；イブチリド；レボメタジル；リドフラジン；ロラチジン；ロボスタチン；メソリダゾン；メサドン；メタンスルホンアニリド；モキシフロキサシン；パロナシトロン；ペンタマジン；ピモジド；プレニラミン；プロブコール；プロカインアミド；プロパフェノン；ピリラミン；キニジン；テルフェニジン；セルチンドール；ソタロール；スパルフロキサシン；チオリダジン；又はバンデタニブのうちの少なくとも１つから選択される、上記（２６）に記載の方法。
（３２）ヒト又は動物対象における治療的活性剤、又は薬剤の投与に起因する１又は２以上の有害反応を予防又は処置するための方法であって、
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）の活性を阻害することによって、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす前記治療的活性剤又は薬剤の投与に起因する前記１又は２以上の有害反応の予防又は処置を必要とするヒト又は動物対象を特定するステップと；
１又は２以上のリポソームを含む治療有効量の組成物を前記ヒト又は動物対象に投与するステップであって、前記リポソームが、空リポソームであり、かつ前記治療的活性剤又は薬剤の投与前、同時、又は投与後に投与されるか、あるいは前記治療的活性剤又は薬剤が充填されている、ステップと；
薬剤誘発性チャネル病に対する前記リポソームと、前記治療的活性剤又は薬剤との組合せの効果を測定するステップであって、前記組成物が、前記治療的活性剤又は薬剤によって誘発される前記チャネル病を低減又は排除する、ステップと
を含む、前記方法。
（３３）ヒト又は動物対象における薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ、又は任意の他の活性剤の投与に起因するＩＫｒチャネル阻害、又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを予防又は処置するための方法であって、
薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ又は任意の他の活性剤の投与に起因するＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つの予防又は処置を必要とする前記ヒト又は動物対象を特定するステップと；
１又は２以上のリポソームを含む治療有効量の組成物を、前記ヒト又は動物対象に投与するステップであって、
前記リポソームが、空リポソームであり、かつ薬剤誘発性チャネル病を引き起こすクリゾチニブ、ニロチニブ又は任意の他の活性剤の投与前、同時、又は投与後に投与され、
前記組成物が、前記治療的活性剤又は薬剤によって誘発されるチャネル病を低減又は排除する、ステップと
を含む、前記方法。
（３４）活性剤が、薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長が原因で、以前に臨床試験が不成功であった、上記（３３）に記載の方法。
（３５）薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長の副作用が原因で不成功であったか又は限定された臨床使用の履歴のある薬剤を、臨床試験において特定するステップをさらに含む、上記（３３）に記載の方法。
（３６）薬理学的活性剤によって引き起こされるチャネル病を低減する候補薬剤を評価する方法であって、
（ａ）患者の第１のサブセットに候補薬剤、及び患者の第２のサブセットにプラセボを投与するステップであって、組成物が、ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長のうちの少なくとも１つを引き起こす薬理学的活性剤と、１又は２以上のリポソームとを組み合わせて提供され、前記リポソームが、空リポソームであり、かつ治療的活性剤又は薬剤の投与前、同時、又は投与後に投与される、ステップと；
（ｂ）一組の患者から薬剤誘発性チャネル病に罹患している疑いのある者についてチャネル病を測定するステップと；
（ｃ）前記候補薬剤又は前記プラセボの投与後にステップ（ａ）を反復するステップと；
（ｄ）前記組成物が、患者の前記第２のサブセットにおいて生じる低減と比較して、統計学的に有意な前記薬剤誘発性チャネル病の低減をもたらすかどうかを判定するステップであって、統計学的に有意な低減が、前記候補薬剤が前記疾患状態を処置するのに有用であることを示す、ステップと
を含む、前記方法。
（３７）薬剤が、薬剤誘発性ＩＫｒチャネル阻害又はＱＴ延長が原因で、以前に臨床試験が不成功であった、上記（３６）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のために、本発明の詳細な説明への参照を以下の添付の図面と併せて行う。
【図１】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するテルフェナジンの効果を示すグラフである。
【図２】テルフェナジンに曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅の電流−電位（Ｉ−Ｖ）関係を示すグラフである。
【図３】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するテルフェナジンの効果を示すグラフである。
【図４】テルフェナジンに曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図５】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するＥ−４０３１の効果を示すグラフである。
【図６】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するクルクミンの効果を示すグラフである。
【図７】クルクミンに曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図８】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するクルクミン（リポソームクルクミンとして）の効果を示すグラフである。
【図９】クルクミン（リポソームクルクミンとして）に曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図１０】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するクルクミン（リポソーム＋クルクミン）の効果を示すグラフである。
【図１１】クルクミン（リポソーム＋クルクミン）に曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図１２】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するリポソームの効果を示すグラフである。
【図１３】リポソームに曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図１４】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するリポソーム＋Ｅ−４０３１の効果を示すグラフである。
【図１５】リポソーム＋Ｅ−４０３１に曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図１６】２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するリポソーム＋テルフェナジンの効果を示すグラフである。
【図１７】リポソーム＋テルフェナジンに曝露させたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。
【図１８Ａ−１８Ｂ】クリゾチニブ、リポソーム単独、及びクリゾチニブ＋リポソームの存在下で、ＩＫｒテールピーク振幅を測定することによって得られる、ＩＫｒテール電流密度平均値及び電位依存性を示すグラフである。
【図１９Ａ−１９Ｂ】ニロチニブ、リポソーム単独、及びニロチニブ＋リポソームの存在下で、ＩＫｒテールピーク振幅を測定することによって得られる、ＩＫｒテール電流密度平均値及び電位依存性を示すグラフである。
【図２０】ウサギの心臓のＲＲ間隔（ｍｓ）に対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２１】ウサギの心臓のＰＲ間隔（ｍｓ）に対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２２】ウサギの心臓のＱＲＳ間隔（ｍｓ）に対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボの効果を示すグラフである。
【図２３】ウサギの心臓のＱＴ間隔（ｍｓ）に対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２４】ウサギの心臓のＱＴｃ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ間隔に対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２５】ウサギの心臓のＲＲ間隔（ｍｓ）に対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２６】ウサギの心臓のＰＲ間隔（ｍｓ）に対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２７】ウサギの心臓のＱＲＳ間隔（ｍｓ）に対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２８】ウサギの心臓のＱＴ間隔（ｍｓ）に対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図２９】ウサギの心臓のＱＴｃ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ間隔に対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を示すグラフである。
【図３０Ａ−３０Ｂ】クリゾチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ＋リポソーム、及びニロチニブ＋リポソームで処理したウサギにおけるＱＴ延長を示すグラフである。動物に１０分間ＩＶ負荷用量を投与後、１５分間維持用量を投与した。リポソームは、薬剤の負荷用量の前にＩＶで５分間投与した。クリゾチニブの負荷用量及び維持用量はそれぞれ、１、２及び３ｍｇ／ｋｇ、並びに０．４、０．８及び１．２ｍｇ／ｋｇであった（図３０Ａ）。ニロチニブの用量はそれぞれ、２、４及び５．５ｍｇ／ｋｇ、並びに０．１４、０．２８及び０．３９ｍｇ／ｋｇであった（図３０Ｂ）。リポソームの用量はｍｇ／ｋｇベースで薬剤の用量の９倍とした。プロットした値は、１群当たり３例のウサギに対し、平均値の平均値＋標準誤差である。統計学的比較を図２３及び２８に記載のように行った。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下で詳細に論じるが、本発明が、広範囲の具体的な文脈において具現化することができる多くの適用可能な発明的な概念を提供することを認識すべきである。本明細書で取り上げられる具体的な実施形態は、本発明を作製及び使用する具体的な方法についての単なる説明的なものにすぎず、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２２】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書中で定義される用語は、本発明に関連がある分野の当業者により一般に理解されている意味を持つ。「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの語は、単数のもののみを指すことを意図されておらず、説明のために具体的な実施例が使用され得る全体的な集合を含む。本明細書中の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を説明するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲で略述されていることを除き、本発明の範囲を設定するものではない。
【００２３】
本明細書では、「クルクミン」、「ジフェルロイルメタン」又は「１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン）」という用語は、植物ウコン（Curcuma longa）の根茎で発見された主な着色の素である天然に存在する化合物である（例えば、米国特許第５，６７９，８６４号明細書、Krackov et alを参照）。
【００２４】
「リポソーム」という用語は、その壁又は膜が脂質、とりわけリン脂質で形成されているカプセルを指し、場合によりステロール、とりわけコレステロールの付加を伴う。
【００２５】
本明細書では、「インビボ」という用語は、体内であることを指す。本出願中で使用される通りに使用される「インビトロ」という用語は、非生体系で行われる操作を指すものとして理解される。
【００２６】
本明細書では「受容体」という用語は、例えば、細胞の表面に存在し、リガンドを活性化することにより細胞の活性化を媒介する分子を指すが、包括的に、対応物に特異的に結合する任意の分子を意味するためにも用いられる。一組の特異的な結合対は、任意に一方を「受容体」及び他方を「リガンド」と呼ぶ場合がある。特定の生理学的機能がこの特異的な結合に関連していることを要しない。したがって、例えば、「受容体」は、抗体、抗体の免疫学的応答部分、他の分子を補完するように設計された分子などを含む場合がある。実際に、本発明の文脈において、「受容体」と「リガンド」との間の区別は完全に不適切であり、本発明は、他の分子のいずれの結合よりも高い親和性で互いに特異的に結合する対の分子に関する。しかし、説明のために、本発明の方法は、標的受容体（ここで再度、対応物が反応又は結合することを求める相手の分子にすぎない）に関して論じられ、「リガンド」は単に対応物を表すにすぎない。
【００２７】
本明細書では、「処置」という用語は、本明細書中で言及される状態、特に疾患又は障害の症状を示す患者における状態の処置を指す。
【００２８】
本明細書では、「処置する」という用語は、本発明の化合物の任意の投与を指し、（ｉ）疾患の病態又は症状を経験若しくは呈している動物における疾患を抑制すること（すなわち、病態及び／又は症状のさらなる進行を抑止すること）；又は（ii）疾患の病態又は症状を経験若しくは呈している動物における疾患を改善させること（すなわち、病態及び／又は症状を反転させること）を含む。「制御する」という用語は、予防する、処置する、根絶する、改善させる、又は制御する状態の重症度を低減させることを含む。
【００２９】
本明細書に記載の「有効量」又は「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医によって探究中の組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的な反応を誘発する対象化合物の量を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、化合物「の投与」又は「を投与すること」という用語は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤などの経口剤形；ＩＶ、ＩＭ若しくはＩＰなどの注射用剤形；クリーム剤、ゼリー剤、粉末剤又はパッチなどの経皮吸収型剤形；バッカル剤形；吸入粉末剤、噴霧剤、懸濁剤など；及び直腸坐剤を含むが、これらに限られない、治療的に有用な形態及び治療的に有用な量で個体の体内に導入することができる形態で、本発明の化合物を処置を必要とする個体に対して与えることを意味するものとして理解される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「静脈内投与」という用語は、注射及び他の様式の静脈内投与を含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、担体、希釈剤又は賦形剤を記載する際の「薬学的に許容される」という用語は、製剤の他の成分と適合し、製剤のレシピエントにとって有害であってはならない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ｈＥＲＧ」という用語は、ＫＣＮＨ２遺伝子によってコードされたヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子を指す（www.genecards.comを参
照）。ＫＣＮＨ２遺伝子は、心臓の鼓動を調和させる心臓の電気的活動に寄与するカリウムイオンチャネルのαサブユニットであるＫｖ１１．１としても知られるタンパク質をコードする。具体的に、ｈＥＲＧ含有チャネルが心筋活動電位において再分極ＩＫｒ電流を媒介する。細胞膜を越えて電流を伝達するイオンチャネルの能力が阻害されると、ＱＴ延長症候群と呼ばれる潜在的に致命的な疾患をきたす。これまでに上市された臨床的に成功したいくつかの薬剤が、ｈＥＲＧを阻害し、したがって、突然死のリスクを生じることが見出された。この薬剤誘発性副作用が、ｈＥＲＧ阻害を、薬剤開発中に避けなければならない重要なターゲットにした。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ＩＫｒチャネル」という用語は、心臓の筋肉細胞（心筋細胞）からカリウム（Ｋ＋）イオンを伝達する「急速」遅延整流性電流（ＩＫｒ）を指す。この電流は、心筋活動電位の間の細胞膜の静止状態（再分極）への回復時を正確に測定するのに重大な意味を持つ。往々にして、「ｈＥＲＧチャネル」及びＩＫｒという用語は互換可能に使用されるが、ｈＥＲＧは体内の天然に存在するチャネルの部分を形成し、心臓の場合にはＩＫｒである細胞型において測定された電流の名称により称される場合がより一般的である。
【実施例１】
【００３５】
心室ＱＴ間隔の再分極持続時間を制御するための組成物及び方法
心室ＱＴ間隔の再分極持続時間を制御するための組成物及び方法が本明細書中で開示される。本発明の方法は、修正されない場合に心筋細胞活動電位における再分極の延長、ト
ルサード・ド・ポアンツ及びＱＴ延長症候群を誘発し得る先天的欠損の修正又は治療薬による機能的介入を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明は、非経口投与（静脈内又は皮下）投与前にＱＴ延長薬をリポソームと結合させるか、あるいは、ＱＴ延長の高いリスクを有することを知られている１若しくは２以上の治療薬の前若しくは治療薬と同時、又は毒物注入の直後に空リポソームを投与することのいずれかからなる。本発明の知見は、クルクミン及び他のＱＴ延長剤の有害作用が、リポソームクルクミン及び空リポソームのボルテックスされた混合物を用いることで用量依存的に抑止されることを示す。
【００３６】
イオンチャネルは、調節イオンにより、形質膜及び細胞の細胞内小器官にわたって電気化学的勾配（活動電位）を確立及び制御するポア形成内在性膜タンパク質である。このチャネルは、水で満たされたポアの周りに密接して詰め込まれた環状の配置のタンパク質として集合したものである。イオンは、化学、電気的信号、温度又は機械力により開口又は閉口し得るチャネルを一列で通過する。イオンチャネル機能障害は、これらのチャネルをコードする遺伝子の変異又はイオン流動に干渉する薬剤に関連し得る。心筋細胞膜の心電解質カリウム、カルシウム及びナトリウムチャネルにおける機能障害は、協調的な筋細胞収縮及び正常な血液循環の維持に必要である電流及び正常な活動電位における異常を誘発し、結果的に心臓性の臨床症状をもたらす。４０個のメンバーの中心的な役割、及び１２個のサブファミリーの電位開口型カリウムチャネルの（ＫＶ）役割は、活動電位後に細胞膜を再分極することである。心筋細胞Ｋ＋チャネルのカリウムイオンの流動は、電解電流、脱分極及び再分極のレベルを調節する。先天性及び／又は薬剤誘発性チャネル欠陥は、病的状態、及び、もしそうでなければ無症状の個人の死亡に関連している。遺伝子ＫＣＮＨ２又はｈＥＲＧ（ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子）によって適切にコードされたチャネルは、Ｋｖ１１．１及び急速活性化整流性Ｋ＋電流ＩＫｒのＬｖ１１．１αサブユニットと称されるタンパク質を含有する。この細胞膜チャネルは、心筋細胞からＫ＋イオンを伝達することにより「急速」遅延整流性電流ＩＫｒを媒介し、心筋の電位を静止状態（再分極）に回復させるのにきわめて重要なメカニズムである。
【００３７】
ｈＥＲＧチャネルポアドメインは既知の３次元構造を欠いているものの、その推定上の構造に対する洞察は部位特異的変異誘発データ（Stansfeld PJ, Gedeck P, Gosling M, Cox B, Mitcheson JS, Sutclif MJ:Drug block of the hERG potassium Channel: insight from modeling. Proteins 200768(2): 568-580）から得られている。ｈＥＲＧチャネルポアキャビティ内で、イオン流動及び電流は、開口又は閉口状態に応じて及び重要な高親和性薬剤結合部位での薬剤相互作用により修正され得る。これらの部位は、ポアの内部へリックス上の芳香族アミノ酸残基（Ｙ６５２及びＦ６５６）である。薬剤により媒介される最も重要な電流、心筋細胞を再分極する感受性遅延性ＩＫｒ（急速）電流及びＩＫｓ（遅延）整流性電流は、標準的な心電図（ＥＣＧ，electrocardiogram）上にＱＴ間隔として表示され、これが心拍数について補正された場合には慣習的にＱＴｃとして定義される。
【００３８】
Jervell A, Lang-Nielson F: Congenital deaf-mutism, functional heart disease with prolongation of the QT interval and sudden death.  Am Heart J. 1957 54: 59-68によって最初に記載されたイオンチャネルにおける先天的欠損は、活動電位の再分極を決定する電流のバランスを変更し、ＬＱＴＳ不整脈及び突然の心臓死の素因になる。異常なイオンチャネル機能、遅延性再分極、心電図でのＱＴ間隔延長、及びトルサード・ド・ポアンツとして知られている重篤な多形性心室性頻拍によって特徴付けられる先天性ＬＱＴＳ、家族性不整脈原性症候群のサブタイプを生じる変異が特定されてきた。ｈＥＲＧ遺伝子の様々な変異及びそのコード化タンパク質は、チャネル機能の欠陥及びいくつかの臨床症候群へと移行する。２型先天性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ２，Type 2 congenital long-QT syndrome）は、ＫＣＮＨ遺伝子におけるＡ６１４Ｖミスセンス変異に起因し、Ｋｖ１１．１タンパク質の欠失及びその結果としてのチャネル機能障害の４つのクラスによって特徴付けられる。これらの異常なＫｖ１１．１チャネルは（クラス１）、優性細胞内輸送欠損性イオンチャネルタンパク質：通常、ミスセンス変異を原因とする、（クラス２）、細胞を２４時間２７℃でインキュベートする又は薬剤Ｅ−４０３１に曝露する場合、補正可能な表現型（Zhou Z, Gong Q, January CT: Correction of defective protein trafficking of a mutant HERG potassium channel in human long QT syndrome: Pharmacological and temperature effects. J Biol Chem.1999 274: 31123-31126）、（クラス３）チャネル開閉、及び（クラス４）浸透（Anderson CL, Delisle BP, Anson BD, et al.: Most LQT2 Mutations Reduce Kv11.1 (hERG) Current by a Class2 (Trafficking Deficient) Mechanism. Circulation 2006 113:365-373）を含む。これらのうちの任意のもの、特に「急速」電流による遮断は、活動電位を延長し、ＥＣＧ上にＱＴ間隔延長及び他のＴ波又はＵ波の異常の出現として表われる。このような状況において、内向き脱分極電流の活性化が再分極の分散の増強を誘発する。後者は、不均一な興奮性の回復、及びトルサード・ド・ポアンツ（ＴｄＰ）の誘発、早期心室性期外収縮（ＰＶＣ，premature ventricular contraction）をもたらす。（Ｒ−０ｎ−Ｔ）。これは、心室脱分極、すなわちＲ波が再分極の終点での相対不応期（Ｔ波の後半）と同時に生じ、病的なＴ−Ｕ波及びトルサードを惹起する状況である。持続性ＴｄＰは、心筋の機能的不応状態のゾーン及び心不整脈（cardiac arryhthmias）を引き起こす。トルサードにおけるＥＣＧ読み取り値は、等電基線の辺りのＱＲＳ群の特徴的なねじれを伴う急速多形性心室性頻拍を示す。これは心臓の電気軸の１８０°もの回転、長期及び短期ＲＲ−間隔として特徴付けられ、これは臨床的に、動脈圧の低下、失神、心室細動及び突然死に至る逆行変性を引き起こす。
【００３９】
ＥＣＧにおいて、ＩＫｒ電流間隔の遅延は、男性で４４０ｍｓ超、女性で４６０ｍｓ超である場合、ＱＴ延長と同義である。構造上及び治療上、多種多様な薬剤によるｈＥＲＧ  Ｋ＋チャネルの薬理学的阻害は、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の臨床的に後天性の形態に移行する。先進諸国においてＱＴ延長薬剤が処方全体の２〜３％を占める一方、ＱＴ延長の報告発生率及び投与量は、それぞれの薬剤の種類の中で著しく異なる。後者は、クラス１Ａ及びクラスIII抗不整脈薬、抗ヒスタミン薬、抗菌薬、抗精神病薬、三環系抗うつ薬、消化管運動改善薬、及び抗狭心症薬を含む。近年、クルクミノイドがヒト心臓性Ｋ＋チャネルを遮断すると報告された（Moha ou Maati H, Ducroq J, Rivet J Faivre J.F. Le Grande M, Bois P: Curcumin blocks the recombinant human cardiac KCNQ1/ KCNE1 channels (IKs)stably expressed in HEK 293 cells. Congress de Physiologie, de Pharmacologie et de Therapeutique, Clermont-Ferrand , France, 9-11 Avril. 2008 Fund. Clin. Pharmacol.22(Suppl.1)）。
【００４０】
ＱＴ延長の発生率の上昇は、低マグネシウム血症、低カリウム血症、低カルシウム血症（hypocalcalcemia）、低酸素症、アシドーシス、心不全、左室肥大、低心拍、性別が女性であること、低体温症及びくも膜下出血の存在下でも生じる場合がある。所与のＱＴ間隔での不整脈の重症度、及びＴｄＰの発症は、薬剤ごと及び患者ごとに異なり、特定の薬剤の用量又は血漿中濃度と直線的に相関していない場合もある。一方、ＱＴ間隔の延長により測定される再分極を著しく変化させる、カリウム（Ｋ＋）流出に影響する抗不整脈心臓薬（クラスIII）及び非心臓薬は、患者をトルサードに罹患しやすくする。ＴｄＰへの傾向の増大に関連している付加的な要因としては、家族性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）が含まれる。家族性ＬＱＴＳの最も一般的な原因は、遺伝子の変異である。
【００４１】
ＫｖＬＴＱ１のためのＫＣＮＱ１コード、低速遅延性カリウム整流カリウムチャネルのαサブユニットは、心臓で高発現する。ヘテロマーチャネルを通る電流は、ｍｉｎＫ  βサブユニットと相互作用する場合、ＩＫｓとして知られている。ミスセンス変異すると、それは活動電位を終了するために必要な再分極電流の量を低減させる。これらのＬＴＱ１変異は全症例の３５％に相当し、重症度が最も少なく、通常、失神を引き起こす。
【００４２】
ＫＣＮＨ２又はｈＥＲＧ遺伝子は、変異した場合、すべての遺伝的症例の３０％に相当し、急速遅延整流カリウムチャネルｈＥＲＧ＋ＭｉＲＰ１のサブユニットである。ＩＫｒとして知られるこのチャネルを通る電流は、活動電位の終了及びＱＴ間隔の長さに関与している。この電流が低減すると、ＬＱＴ２をもたらす。急速電流は、薬剤感受性が最も高いだけでなく、そのヒス−プルキンエ細胞及び中心室筋中のＭ細胞での不整脈促進性作用に関連している。薬剤誘発性ＬＱＴｓは、抗不整脈薬、抗ヒスタミン薬、抗精神病薬及び他の薬剤を用いた場合に生じる。遺伝的ＬＱＴＳ及びＬＱＴＳ誘発性薬剤の組合せは、致死的な副作用への易罹患性を高める。ＬＫＴＳを引き起こす薬剤のほとんどは、ｈＥＲＧ遺伝子を介してＩＫｒ電流を遮断する。このチャネルは、結合した場合、電流伝達を遮断するチロシン６５２及びフェニルアラニン６５６において意図しない薬剤結合を呈する。遺伝子ＳＣＮ５Ａのまれではあるが致死的な変異は、ナトリウムチャネルのαサブユニットの不活性化、脱分極中のＮａ＋流入及び電流ＩＮａ延長を遅くする。活動電位において遅発のチャネルを通る電流の継続した脱分極は、遅発性のバースト状電流を誘発する（ＬＱＴ３）。
【００４３】
Ｌ型カルシウムチャネルは、「早期後脱分極」として、ＬＱＴＳ後、活動電位の定常期中、再開する。それらの活性は、アドレナリン性の刺激に感受性があり、再分極障害の下、アドレナリン作動性の状態中、突然死のリスクを高める。このような対象では、運動後、又は薬剤とは無関係である感情的な驚き後、ＴｄＰが誘発され得る。ＬＱＴ４−１３と称される付加的で珍しくまれな変異が存在する。
【００４４】
心拍数の他に、ＱＴ持続時間は、記録及び測定技術、交感−迷走神経活性、薬剤、電解質障害、心臓性又は代謝性疾患、日内変動及び遺伝子ＬＱＴ２変異で変化する。これらのパラメータは、薬剤誘発性ＴｄＰの既報告の発生頻度を、薬剤開発中の臨床研究、市販後調査、疫学調査及び症例報告と緩やかに関連付ける。臨床前薬剤開発中のＱＴ延長の検出は、中止につながる可能性があり、薬剤関連のＱＴ延長の実際の発生頻度についてのあらゆる包括的な理由を排除する（Yap YG, Camm A J. Drug induced QT prolongation and torsades de pointes.Heart. 2003;89:1363-1372）。いくつかのＱＴ延長薬が、開発中又は上市後に回収されてきた。これらには、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジリン（Terodilene）、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル、レボメタジル及びシサプリドが含まれる。
【００４５】
遺伝子及び年齢に関連した易罹患性：ＱＴ延長薬剤事象に対する素因が存在する：これには、肝Ｃ４５０阻害薬を服用中で、遺伝的な素因を持っている又はＤＮＡ多型のある器質的心疾患患者が含まれる。高齢の女性では一般に若年の女性よりも易罹患性が高く、一方、若年の男性では、高齢の男性に比して易罹患性が高い。
【００４６】
ＱＴ延長薬についての現在の治療法、及び遺伝子型のＱＴ感受性：薬理学的療法：ＬＱＴＳの第一選択処置、心停止及び突然死の１３％の発生率を伴う潜在的な致死性疾患。（ｉ）デクスラゾキサン：（エデト酸のピペラジンジオン環状誘導体）。同剤は、乳がん患者に３００ｍｇ／Ｍ２を超えて投与されるエピルビシンに関連したアントラサイクリン誘発性心毒性の可能性を減じるが、排除しない。静脈内デクスラゾキサンの使用は、アントラサイクリンのみに限定される。すなわち、それは、アントラサイクリンを含有しない化学療法レジメンでは禁忌となる。（ii）β遮断薬：交感神経性刺激療法としてのプロプラノロールは、ＬＱＴ１において心事象のリスクを８１％低下させる可能性があり、また貫壁性再分極分散（ＴＤＲ，transmural dispersion of repolarization）のイソプロテレノール増大及びＴｄＰを抑制する可能性がある。但し、適切なプロプラノロール処置においては、なおも１０％が心事象を発症する。ＬＱＴ２対象では、心事象リスクは５９％減少するが、一方で２３％が依然として心事象を発症する。（iii）ナトリウムチャネル遮断薬：ＬＱＴ３対象のうち３２％が、適切なプロプラノロールで心事象を発症する。心拍数の低いこれらの患者においては、β遮断薬は、再分極の分散及びＴｄＰのリスクを上昇させる場合がある。活動電位のフェーズ２の間の不活性化を防止し、遅発性のＩＮａの持続的増加を誘発するナトリウムチャネル変異を伴うＬＱＴ３対象、メキシレチン（Shimizu W Antzelevitch C: Sodium channel block with mexiletine is effective in reducing dispersion of repolarization and preventing torsade depointes in LQT2 and LQT3 models of the long QT syndrome.1997 Circulation 96: 2038-2047）クラスＩＢナトリウムチャネル遮断薬を使用するＱＴ延長の原因となるものは、ＴＤＲの低減によりＱＴ間隔を短縮させる。（iv）カリウム補充：ＩＫｒ及びＩＫ１の両方は、細胞外カリウムレベルに感受性がある。血漿中濃度をベースラインよりも１．５ｍＥｑ／Ｌ上昇させることで、ＱＴｃ間隔が２４％低減し得る（Compton SJ, Lux RL, Ramsey MR, et al.: Genetically defined therapy of inherited long QT syndrome. Correction of abnormal repolarization by potassium. 1996 94:1018-1022）及び（Etheridge SP, Compton SJ, Tristani-Firouzi M, Mason JW: A new oral therapy for long QT syndrome: long term oral potassium improves repolarization in patients with hERG mutations. J AM Coll Cardiol 2003 42:1777-1782）が、不整脈防止につながるというエビデンスはない。（Ｖ）カリウムチャネル開口薬：ニコランジル、２〜２０ｕｍｏｌ／Ｌで静脈内投与されるカリウムチャネル開口薬は、ＬＱＴ１及びＬＱＴ２対象のＱＴ間隔を短縮させる（Shimizu W Antzelevitch C: Effects of a K(+) channel opener to reduce transmural dispersion of repolarization and prevent torsade de pointes LQT1,LQT2, and LQT3 models of the long QT syndrome. Circulation,2000 102: 702-712）。（vi）ｈＥＲＧ電流エンハンサー：ＲＰＲ  ２６０２４３は、モルモットの筋細胞におけるドフェタリド誘発性活動電位延長を反転させる（Kang J, Chen XL, Wang H, et al.: Discovery of a small molecule activator of the human ether-a-go-go -related gene(HERG) cardiac K+ channel.Mol Pharmacol 2005 67: 827-836）。（vii）カルシウムチャネル遮断薬：Ｌ型カルシウムチャネルを介したカルシウム流入は、定常期、活動電位の持続時間及び活動電位のＱＴ間隔を維持する。ベラパミル、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬、及びＩＮａの阻害薬は、ＱＴ間隔を短縮させ、ＬＱＴＳモデルにおいてＴｄＰを抑制する。低い心拍数でＱＴが大幅に短縮された、発作性心房心室結節性リエントリー性頻拍のある患者において使用される。ｈＥＲＧ阻害ＥＣ５０は、８３ｕＭである。ベラパミルを適切な投与量で投与した場合、トルサード・ド・ポアンツが回避され得る（Fauchier L, Babuty D Poret P, Autret ML, Cosnay P, Fauchier JP: Effect of Verapamil on QT interval dynamicity. AM J Cardiol.1999 83(5):807-808 A10-1）。（viii）輸送異常補正：心筋細胞膜の膜貫通イオンポアを形成するタンパク質及び糖タンパク質の輸送の異常は、対応する電流の振幅を低減させ、ＬＱＴＳにおいて役割を果たす。テルフェナジン又はタプシガルジンの代謝産物であるフェキソフェナジンは、ＬＱＴ２に関連した選択的ミスセンス変異におけるｈＥＲＧを遮断することなく、そのような異常な輸送を回復することができる。（ix）ギャップ結合カップリングエンハンサー：ギャップ結合は、小分子と電流の両方が心筋細胞間で移されることを可能にする細胞間チャネルである。心不全及び肥大は、ギャップ結合の脱共役に関連している。ギャップ結合を増強することで、ＬＱＴＳにおいて再分極の分散が増強される抗不整脈作用を引き起こすことができる。合成ペプチドＡＡＰ１０ギャップ結合エンハンサーの注入は、ウサギ左室標本におけるＱＴ間隔を低減させる（Quan XQ, Bai R, Liu N, Chen BD, Zhang CT. Increasing gap junction coupling reduces transmural dispersion of repolarization and prevents torsades de points in rabbit LQT3 model. J Cardiovasc Electrophysiol 2007 18:1184-1189）。
【００４７】
本発明に記載のこの非臨床試験は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ，United States Food and Drug Administration）医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準２１ＣＦＲ  Ｐａｒｔ５８、経済開発協力機構（ＯＥＣＤ，Organization for Economic Cooperation and Development）医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準［Ｃ（９７）１８６／Ｆｉｎａｌ］（１９９７年１１月２６日発表）及び日本国厚生労働省（ＭＨＬＷ，Japanese Ministryof Health, Labour and Welfare）医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準に関する省令第２１号（１９９７年３月２６日）に従って実施した。
【００４８】
研究の概要：１）被験物：クルクミン、空リポソーム、リポソームクルクミン（０．０１４、０．２０、３．４及び１１．４μＭ）；２）試験の方式：ｈＥＲＧ発現ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞株；３）実施する試験：ホールセルパッチクランプによる電流取得及び解析；４）実験温度：３５±２℃。
【００４９】
被験物の適用：１）閉鎖循環式灌流下（２ｍＬ／分）で、各濃度に５分間曝露；２）フロースルー灌流下（２ｍＬ／分）でウォッシュアウト期間、さらに閉鎖循環式灌流（２ｍＬ／分）で５分間、；３）陽性対照、（１００ｎＭ  Ｅ−４０３１及びテルフェナジン（０．０１、０．０３、０．１ｕＭ）を、同じ細胞株及び同じ継代から得た未処置の細胞に、閉鎖循環式灌流下（２ｍＬ／分）で５分間加えた；４）クルクミン、テルフェナジン及びＥ−４０３１をそれぞれ、空リポソームで１５分間ボルテックスし、その後試験した。研究全体を通じて、細胞をパルスプロトコルの持続的な刺激の下に置き、それぞれの条件について５分間の曝露後、細胞電流を記録した。
【００５０】
データ取得デザイン：取得値：１．０ｋＨｚ。化合物又は媒体／溶媒等価物を試験する際の取得のためのデザイン：ベースライン条件で行った１回の記録、濃度１、２、３又は４の下で行った１回の記録、及びウォッシュアウト後（第４の濃度後に限る）に行った１回の記録。陽性対照を試験する際の取得のためのデザイン：ベースライン条件で行った１回の記録、陽性対照の存在下で行った１回の記録、及びｎ＝上記のプロトコル全体が適用された可能性のあるパッチを適用した応答性の細胞の数。
【００５１】
統計解析：対応のあるステューデントｔ検定を用いて統計的比較を行った。被験物について、様々な被験物濃度への曝露後に記録した電流を、ベースライン条件で記録した電流と統計的に比較した。ウォッシュアウト後に記録した電流を、最大濃度の被験物後に測定した電流と統計的に比較した。同様に、陽性対照後に記録した電流を、ベースライン条件で記録した電流と比較した。ｐが０．０５以下の場合、有意差があると判断した。
【００５２】
データ除外基準：１）薬剤曝露の時間枠が守られていない；２）不安定な封；３）パッチを適用した細胞がテール電流を生じない；４）陽性対照に有意な効果がみられない；及び５）試験の期間を通じて、容量の一過性振幅の変位が１０％超。
【００５３】
クルクミン、リポソームクルクミン、空リポソーム及び陽性対照Ｅ−４０３１及びテルフェナジンのインビトロでの効果を、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）でトランスフェクトしたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を使用したヒト遅延整流電流で判定した。
【００５４】
ＩＫｒチャネル阻害及び心毒性は、一部のクラスの薬剤、特にＩＫｒチャネル阻害及び／又はインビボでのＱＴ延長を引き起こす薬剤にとって、主な不都合なものとなってきた。前臨床の薬剤開発中、多くの薬剤にこの活性が見出され、その結果、多くの有望な薬剤のクラスが中止となった。この活性の結果として、いくつかのＱＴ延長薬剤は中止され、非常に制限的に使用される。例としては、以下に限定されないが、クリゾチニブ、ニロチニブ、テルフェナジン、アステミゾール、グレパフロキサシン、テロジリン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル及びシサプリドが含まれる。
【００５５】
ＬＱＴＳ及びＴｄＰのリスクを高める、現在市販されている多数の薬剤がある。一部の非限定例を以下に示す：
【００５６】
アロキシ又はパロナシトロンＨＣＬ：５−ヒドロキシトリプタミン−３受容体アンタゴニスト、術後悪心及び嘔吐用静脈注射薬。（Eisai社，Helsinn、Switz.）有害作用としては、２．２５ｍｇ超の用量でＥＫＧ２％超、ＱＴ延長５％超、徐脈４％超が含まれる。
【００５７】
アミオダロン（コルドローンＸ）クラスIII抗不整脈薬、ＷＰＷ症候群向け、心室性不整脈向け：男性に比し女性の方がリスクは低いとされる。１〜３％が主にクラスIII効果を有する。洞房結節機能障害、及び心不整脈亢進。ＭＯＡは、心筋細胞−活動電位持続時間、及び不応期の延長、不整脈及びＴｄＰの悪化に関連があるＱＴ間隔の１０％増加、並びに非競合的α−及びβ−アドレナリン阻害である。ＴｄＰの有り無し両方で、フルオロキノロン、マクロライド系抗生物質又はアゾールの同時投与によるＱＴｃ延長。TEVA Pharmaceuticals IND.社。
【００５８】
亜ヒ酸：無効性のｈＥＲＧ遮断薬（ＩＣ５０は３００ｕＭを超える）は、ｈＥＲＧ電流に間接的効果を有する場合がある、抗がん剤。製造元は、Cephalon社である。
【００５９】
アステミゾール＊：Janssen社より市販されている第２世代のヒスタミンＨ１及びＨ３受容体アンタゴニスト、並びに抗マラリア剤。テルフェニジン及びハロペリドールに対して構造的に類似。本来はアレルギー性鼻炎に使用：まれではあるが致死的な不整脈を理由に、米国内ではもはや入手不可。ＩＣ５０は、５０ｎＭでのｈＥＲＧテール電流である。
【００６０】
ベプリジル：低い効力の持効性カルシウムチャネル遮断薬である（ＥＣ５０は１０ｕＭである）。両方のＫ＋チャネルは、カルシウムチャネル遮断薬に対し感応性の標的である。それは、濃度依存的に急速成分ｈＥＲＧを遮断し（ＥＣ５０は０．５５ｕＭである）、心筋遅延整流Ｋ＋電流の低速成分を生じるＫｖＬＱＴ１／ＩｓＫ  Ｋ＋チャネルも阻害する。これらの変化は、ＱＴ延長をもたらす可能性がある。それはまた、重大な抗労作性関連狭心症、及び降圧活性を持つカルモジュラムアンタゴニストである。製造元TOCRIS Bioscience Inc社。
【００６１】
クロロキン：抗マラリア薬：Novartis Pharma AG社、濃度及び時間依存的にｈＥＲＧチャネルを阻害する。最大半量の阻害濃度（ＩＣ５０）２．５ｕＭ。
【００６２】
クロルフェニラミン：ＱＴ延長を誘発する低い効力の第１世代の抗ヒスタミンＨ１遮断薬、すなわち、濃度依存的なｈＥＲＧ遮断薬。同薬は、活性化及び不活性化状態においてチャネルに作用するが、閉塞状態では作用しない。第１及び第２世代の抗ヒスタミン薬の過剰投与は、Ｋ＋電流に作用することにより不整脈性作用を及ぼす。
【００６３】
クロルプロマジン（ソラジン）：１９５０年にRhone-Poulec社によって開発された抗精神病薬／制吐薬／統合失調症薬。同薬は、心不整脈を引き起こす（Fowler NO, McCall D, Chou TC, Hilmes JC, Hanenson IB,:Electrocardiographic changes and cardiac arrhythmias in patients receiving psychotropic drugs. Am J Cardiol 1976 37(2): 223-230）。
【００６４】
シサプリド：Janssen社により消化管運動改善薬として使用：同薬は、そのＱＴ延長副作用のために２０００年に中止された（Layton D, Key C, Shakir SA: Prolongation of the QT interval and cardiac arrhythmias associated with cisapride: limitations of the pharmacoepidemiological studies conducted and proposals for the future. Pharmacoepidemiol Drug Saf. 2003 12(1):31-40）。
【００６５】
セレクサ（シタロプラム）QT prolonger Forest Labs社：カリウムｈＥＲＧチャネルの直接的な遮断を介してＱＴｃ間隔を延長し、ｈＥＲＧカリウムチャネルの数を効果的に減少する細胞膜のｈＥＲＧタンパク質発現を妨害し、及び、脱分極延長をもたらすＩ型カルシウム電流を遮断する選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ，selective serotonin reuptake inhibitor）（Witchel,H. J. (2011). Drug-induced hERG block and QT syndrome. Cardiovasc Ther. 29(4):251-259）。
【００６６】
クラリスロマイシン及びエリスロマイシン：抗生物質、男性よりも女性が感受性が高い。両方ともＱＴ延長及びＴｄＰを引き起こす。エリスロマイシンは、ＩＣ５０３８．９で濃度依存的にｈＥＲＧ電流を低減させ（reductes）、クラリスロマイシンは４５．７ｕＭで臨床的に適切な濃度で低減させる。
【００６７】
クルクミン（ジフェルロイルメタン）：ｈＥＲＧ電流を阻害する（Moha ou Maati H, Ducroq J, Rivet J Faivre J.F. Le Grande M, Bois P: Curcumin blocks the recombinanthuman cardiac KCNQ1/ KCNE1 channels (IKs) stably expressed in HEK 293 cells.Congress de Physiologie,de Pharmacologie et de Therapeutique,Clermont-Ferrand , France, 9-11 Avril. 2008 Fund. Clin. Pharmacol. 22(Suppl.1)）。クルクミンは、ＩＣ５０３．５ｕＭで、中程度の効力のある分子である（Katchman AN, Koerner J, Tosaka T, Woosley RL, Eberty SN: Comparative evaluation of HERG currents and QWT intervals following challenge with suspected torsadogenic and non-torsdogenic drugs. J Pharmacol Exp Ther. 2006 316(3):1098-1106）。
【００６８】
ジソピラミド：後天性ＬＱＴＳに関連しているクラス１抗不整脈薬（Vaughan Williams分類）。用量依存的にＱＴ間隔を延長し、ＱＲＳ群ＱＴを拡張する（ＩＣ５０７．２３ｕＭ）。ナトリウム及びカリウムの両方のチャネルを遮断し、フェーズ「Ｏ」脱分極を抑制し、心房及び心室の組織の活動電位の持続時間を延長する。
【００６９】
ドフェチリド：Pfizer社よりタイコシン経口カプセル剤として名前を記された、洞調律及び心房細動の維持のために使用されるクラスIII抗不整脈薬。選択的にＩＫｒ、外向き
遅延整流カリウム電流を遮断する。ＴｄＰは、用量関連発生率が０．３〜１０．５％の重篤な副作用である。これは、処置前ＱＴｃが４７９ｍｓを上回る場合には、死亡リスクの上昇が２倍となる。強力なｈＥＲＧ遮断薬：ＩＣ５０は１０ｎＭである。
【００７０】
ドンペリドン：制吐薬として使用される抗ドパミン作用薬。Janssen Pharmaceuticals社。米国内では入手不可。心停止及び不整脈、及び新生児におけるＱＴ延長の増加に関連している（Djeddi D, Kongolo G, Lefaix C, Mounard J, Leke A: Effect of domperidone on QT interval in neonates. J Pediatrics 2008 153(5): 596-598）。
【００７１】
ドキソルビシン：３０ｕＭでＱＴｃが１３％延長する；ｈＥＲＧチャネルを有意に遮断することなく急性ＱＴ延長を引き起こすが、ＩＫｓを阻害する（ＩＣ５０：４．７８ｕＭ）。
【００７２】
ドロネダロン：アミオダロンの非ヨウ素化アナログ。（ＩＣ５０７０ｎＭでｈＥＲＧを遮断）心房細動患者４０，０００名超に使用。＋３０ｍＶで活性化後、−４０ｍＶで測定された野生型ｈＥＲＧテールは、ＩＣ５０値５９ｎＭで遮断された。チャネル活性化高外部［Ｋ＋］（９４ｍＭ）に非依存的な膜脱分極に生じる遮断を伴うｈＥＲＧ阻害に続くチャネル開閉が、Ｉ（ｈＥＲＧ）阻害の効力を抑制し、Ｙ６５２及びＦ６５６芳香族酸残基に依存しない。Chemsky (Shanghai) International社及びSanofi-Avantis社により「Ｍｕｔｔａｇ」として製造。英国国立衛生研究所は２０１０年、費用に基づき同薬をブロックした。
【００７３】
ドロペリドール：中枢鎮静、制吐、麻酔補助剤であり、ＱＴ間隔延長、ＴｄＰ及び突然死に関連。ｔｅｓｔ  ｐｕｌｓｅを５０ｍＶとした後、ｈＥＲＧテール電流は、ＩＣ５０７７．３ｎＭで阻害された。ｈＥＲＧチャネルは、開口及び不活性化状態において影響を受けた。効力は、Ｐｈｅ−６５６からｔｈｒ又はＳｅｒ−６３１からＡｌａの変異に伴って低下する。本化合物について１４社がリストアップされる。
【００７４】
グレパフロキサシン：ＰＱＴＳを含むいくつかの重篤な心血管事象を引き起こす経口フルオロキノロン系抗菌薬であり、市場から自主的に回収された（WHO 1999）。
【００７５】
ハルドール、ハロペリドール：強力なｈＥＲＧ遮断薬、統合失調症治療薬、激越、静脈内又は推奨用量を上回って投与された場合、突然死、ＱＴ延長及びＴｄＰ上昇のリスクあり。Janssen-Silag社
【００７６】
ハロファントリン：抗マラリア薬、心不整脈及び有意なＱＴ延長に関連あり。男性に比べて女性により高い感受性がある。Glaxo-Smith-Kline社
【００７７】
イブチリド：Pfizer社によりカヴァート（corvert）。心房粗動及び細動向けの純クラスIII抗不整脈薬、男性に比べて女性により高い感受性がある。緩徐型内向きナトリウム
電流を誘発。Ｋ電流を遮断しないが、活動電位を延長する。
【００７８】
レボメタジル：オピエートアゴニスト／鎮痛薬、麻薬性依存。メサドンと同様、Roxanne Labs社は、心室調律障害を理由に市場から回収した。
【００７９】
リドフラジン：抗不整脈活性を伴うピペラジン系カルシウムチャネル遮断薬。カリウムチャネルのαサブユニットの強力なｈＥＲＧ遮断薬（ＩＣ５０１６ｎＭ）。開口活性化状態を優先的に阻害する。ｈＥＲＧに対してベラパミルに比し１３倍超強力。
【００８０】
ロラチジン、クラリチン：第２世代の抗ヒスタミン薬。ｈＥＲＧ遮断薬としてＩＣ５０１７３ｎＭでｈＥＲＧ再分極電流に間接的効果を及ぼし得る。Schering-Plough社により市販。
【００８１】
ロボスタチン：低い効力のｈＥＲＧ合成遮断薬。
【００８２】
メソリダゾン：統合失調症治療薬。
【００８３】
メサドン：濃度依存的に電位開口型心筋カリウムチャネルと相互作用し、メサドンを服用している患者に、重篤な心不整脈、並びにＴｄＰ及び心室細動による死亡を引き起こす。ＩＣ５０は、４．８ｕＭ（ヘロインについては４２７ｕＭと比較して）の抗ドパミン薬である。メサドン関連ＴｄＰ素因は、女性、高投与量、Ｓ−メサドンのＣＹＰ２  Ｂ６低代謝群及びＤＮＡ多型である。非経口の（parenterol）メサドン及びクロロブタノールの組合せは禁忌となる。ＱＴ延長活性は、主として、Ｒ−メサドンよりも３〜５倍強力にｈＥＲＧ電流を遮断するＳ−メサドンによるものである。
【００８４】
メタンスルホンアニリド（Ｅ−４０３１）：きわめて強力な化合物であり、ｎＭ濃度でｈＥＲＧを阻害する。標準アッセイで陽性対照として使用。
【００８５】
モキシフロキサシン：ｈＥＲＧチャネル遮断薬：１００ｕＭでＱＴｃを２２％延長し、一方、デクスラゾキサンにより防止されず。
【００８６】
ペンタマジン：無効性のｈＥＲＧ遮断薬（ＩＣ５０は３００ｕＭを超える）、抗感染性
、ニューモシスチス肺炎。ＱＴ間隔延長及びＴｄＰに関連しており、それ故、ｈＥＲＧ再分極に対して未知の間接的効果を及ぼし得る。
【００８７】
ピモジド：統合失調症治療薬、トゥレットチック症。
【００８８】
プレニラミン：中等度のｈＥＲＧ遮断薬
【００８９】
プルブコール：抗高脂血症薬、高コレステロール治療薬、米国内ではすでに入手不可。
【００９０】
プロカインアミド：抗不整脈薬。
【００９１】
プロパフェノン：低い効力のｈＥＲＧ遮断薬（ＩＣ５０は１ｕＭを超える）。
【００９２】
ピリラミン：低い効力のｈＥＲＧ遮断薬。
【００９３】
キニジン：抗不整脈薬  女性の方が男性よりも高い感受性がある。
【００９４】
セルデーン（テルフェニジン）：強力なｈＥＲＧ遮断薬。
【００９５】
セルチンドール：中等度の効力のｈＥＲＧ遮断薬。
【００９６】
ソタロール：ＬＱＴ２モデル、カリウムチャネル拡張薬であるニコランジル拡張薬によって、作用が阻止される。同薬は心室頻拍、心房細動について抗不整脈薬、β遮断薬として作用し得る（Ducroq J., Printemps R, Le Grand M.: Additive effects ziprasidone and D,L-sotalol on the action potential in rabbit purkinje fibers and on the hERG potassium current. J.Pharmacol. Toxicol Methods 2005 52:115-122）。１２８８例の患者の２％がＱＴ延長を示した。４５５ｍｓを超えるＱＴｃはＴｄＰをもたらす。
【００９７】
スパルフロキサシン：抗菌薬。
【００９８】
チオリダジン：中等度の効力のｈＥＲＧ遮断薬。
【００９９】
バンデタニブ：Astra-Zeneca社により市販されている経口キナーゼ阻害薬は、進行性転移性又は局所進行性甲状腺髄様がんに承認されている。ＱＴ延長、ＴｄＰ及び突然死が枠組み警告に含まれている。最も一般的な（５％を超える）グレード３／４の有害反応としては、ＱＴ延長疲労及び発疹が含まれる。
【０１００】
活性型フェキソフェナジンの抗ヒスタミンプロドラッグであるテルフェナジン、及びＥ−４０３１を、本研究の基準化合物として選択した。テルフェニジンは、特にマクロライド系抗生物質又はケトコナゾールと組み合わせて服用した場合、心室性不整脈心毒性作用が報告されている。本研究の被験物として使用されたものと同じ細胞株において入手したデータからＩＣ５０  ｈＥＲＧ阻害作用の値９９ｎＭを算出した。クラスIII抗不整脈薬であるＥ−４０３１は、１つの臨床的な例外を除き、専ら研究目的のために使用される合成毒物である（Okada Y., 1996）。その作用機序は、ｈＥＲＧ電位開口型カリウムチャネルを遮断することである。Ｅ−４０３１は、１００ｎＭで電流密度の９０．６％を阻害した。観察された阻害は、同一の条件で作成された内部検証データに一致し、本化合物について公表された阻害値とも一致する。これらの結果は、ｈＥＲＧ−選択的阻害剤、本事例ではテルフェナジン及びＥ−４０３１に対する試験の方式の感応性を確証する。
【０１０１】
ホールセルＩＫｒ  ｈＥＲＧ電流に対するクルクミンの効果：選択した濃度のクルクミンの適用後及びウォッシュアウト期間後、電位パルスの間に誘発されたホールセル電流をベースライン条件下で記録した。プロトコルに従って、４通りの濃度のクルクミンをｈＥＲＧ電流阻害について分析した。細胞は１秒間で脱分極し、保持電位（−８０ｍＶ）から最大値＋４０ｍＶまで、−４０ｍＶで開始して１０ｍＶずつ漸増した。膜電位はその後１秒間で−５５ｍＶに再分極し、最終的に−８０ｍＶに回復した。
【０１０２】
ホールセルテール電流振幅は、−４０から＋４０ｍＶまでの電流の活性化後、−５５ｍＶの保持電位で測定した。電流振幅をこのテール電流の最大値（ピーク）で測定した。電流密度は、一過性の容量極小化前に測定したセルキャパシタンスにより電流振幅を分割することで得た。
【０１０３】
電流減弱及び溶媒効果補正：すべてのデータポイントを溶媒効果及び時間依存電流減弱について補正した。被験物で実施したのと同じ時間枠にわたり被験物不含条件（DMSO）で実験デザインを適用することで電流減弱及び溶媒効果を同時に測定した。これらのいわゆる媒体実験中に測定した電流振幅の減少（溶媒効果及び時間依存的減弱の両方に相当）は、溶媒の効果及び経時的な電流振幅の必然的な減弱を除いて、被験物の影響を区別するために被験物の存在下で測定した振幅の減少分から減算した。
【０１０４】
本明細書中で示した研究は、ＩＫｒに関してＤＭＳＯ中で可溶化されたクルクミンの効果を定量化した。クルクミンの濃度（０．０１４、０．２、３．４及び１１．４μＭ）は本研究の設計時に入手可能な情報に基づいた。濃度は：（１）計画された最小のフェーズ１用量レベルでの予測ヒト血漿中レベル；（２）計画された最高のフェーズ１用量レベルでの予測ヒト血漿中濃度；（３）予測ヒト治療域血漿中レベルの３０倍；及び（４）予測ヒト治療域血漿中レベルの１００倍に基づき選択した。これらの選択した濃度は、クルクミンのヒト心臓電気生理学に対する効果についての有用な予測を与えるものと思われる。Sami Labs社（インド、バンガロール）で、クルクミン９９．２％純度を、ＧＭＰ条件で合成し、遮光して４℃で保管した。本研究に含まれる細胞に曝露させるために用いられる各クルクミン濃度の１ｍＬのアリコートを、そのクルクミン含有量について独立して分析した。後続の研究のために、ＧＭＰグレードのリポソームクルクミンをPolymun GmbH社（オーストリア、ウィーン）で製剤化し、４℃で保管した。リポソームはPolymun GmbH社から入手し、テルフェナジン及びＥ０４０３１はSigma Aldrich Fine Chemicals社から購入した。
【０１０５】
【表１】
2019131581.tif 000002
【０１０６】
テルフェナジンは、ＩＣ５００．０６５ｕｍｏｌａｒ（６５ｎＭ）の効力でＩＫｒを阻害した。
【０１０７】
【表２】
2019131581.tif 000003
【０１０８】
図１は、表２で示されたデータのグラフによる表示である。図２は、テルフェナジンに曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅の電流−電位（Ｉ−Ｖ）関係のグラフである。図３は、２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するテルフェナジンの効果のグラフである。図４は、テルフェナジンに曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係のグラフである。
【０１０９】
【表３】
2019131581.tif 000004
【０１１０】
Ｅ−４０３１はＩＣ５０５０ｎＭでＩＫｒを阻害した。図５は、２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するＥ−４０３１の効果を示すグラフである。
【０１１１】
【表４】
2019131581.tif 000005
【０１１２】
１１．４μＭの濃度で、クルクミンは、Ｉ＋２０でｈＥＲＧテール電流密度の７９．６％の阻害を引き起こした（ｎ＝７）。対応のあるステューデントのｔ検定により、ベースライン時及び０．２〜１１．４μＭのクルクミン存在下で測定した正規化電流密度における差異が、統計学的に有意な所定の閾値（ｐ≦０．０５）に達したことが確認された。表３は、統計解析から得られたｐ値を提供する。電流の５０％の阻害が、本研究で選択された濃度の範囲内（０．０１４〜１１．４μＭ）で達成された。４．９μＭのＩＣ５０値は、得られたデータから算出した。図６は、表４で示されたデータのグラフである。図７は、クルクミンに曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ
−Ｖ関係のグラフである。
【０１１３】
【表５】
2019131581.tif 000006
【０１１４】
統計解析から得られたｐ値は、ベースラインから１１．４ｕＭでの電流密度のボーダーラインの有意差を示すが、電流阻害の程度はＩＣ５０未満であった。
【０１１５】
図８は、２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するクルクミン（リポソームクルクミンとして）の効果を示すグラフであり、図９はクルクミン（リポソームクルクミンとして）に曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係のグラフを示すグラフである。
【０１１６】
表５において、整流内向き電流は、ｈＥＲＧテール電流に対するクルクミンの阻害効果が、正の保持電位でより高い効力を持つ、電位依存的であることを示した。ウォッシュアウト後に記録した電流は、クルクミン（リポソームクルクミン）の最高濃度（１１．４μＭ）後に記録した電流と統計的に比較した。
【０１１７】
【表６】
2019131581.tif 000007
【０１１８】
リポソーム濃度は０．７、１２、４１ｎｇ／ｍｌであった。いずれの用量レベルでのクルクミンからも有意差はなかった。
【０１１９】
図１０は、２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するクルクミン（リポソーム＋クルクミン）の効果を示すグラフであり、図１１はクルクミン（リポソーム＋クルクミン）に曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係のグラフである。ウォッシュアウト後に記録した電流は、１１．４μＭのクルクミンの最高濃度後に記録した電流と同様に統計的に比較した。電流ＩＣ５０は到達されなかった。
【０１２０】
【表７】
2019131581.tif 000008
【０１２１】
リポソームは、インビトロでのｈＥＲＧチャネルに対する阻害効果を示さない。ウォッシュアウト後に記録した電流は、リポソームの最高濃度（４１．１９３ｎｇ／ｍＬ）後に記録した電流と統計的に同等であった。図１２は、表７で示されたデータのグラフであり、図１３は、リポソームに曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係のグラフである。
【０１２２】
【表８】
2019131581.tif 000009
【０１２３】
図１４は、２０ｍＶでのトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流密度に対するリポソーム＋Ｅ−４０３１の効果を示すグラフであり、図１５はリポソーム＋Ｅ−４０３１に曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係のグラフである。
【０１２４】
３０〜３００ｎＭの濃度でＥ−４０３１でボルテックスした場合、空リポソームは、Ｅ−４０３１の抗ｈＥＲＧ効果、Ｅ−４０３１阻害を妨げない。ウォッシュアウト後に記録した電流は、リポソーム＋Ｅ−４０３１の最高濃度後に記録した電流と統計的に比較した。
【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
本明細書中の上記の表９で示したデータを、図１６にグラフにより表示し、図１７は、リポソーム＋テルフェナジンに曝されたトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からのｈＥＲＧ電流振幅のＩ−Ｖ関係を示すグラフである。３０〜３００ｎＭの濃度でテルフェナジンでボルテックスした場合、ｈＥＲＧ電流密度のテルフェナジン阻害に対する空リポソームの影響はみられなかった。
【０１２７】
本明細書中の上記で示したデータは、試験の対象となる濃度の範囲内で及び本研究の特定の文脈において、クルクミンがＩＫｒ電流をダウンモジュレートする、すなわち、クルクミンがｈＥＲＧ遺伝子によってコード化されたタンパク質と相互作用し、チャネル開閉機能を活性化し、イオンフローを減少させることを示唆する。クルクミノイド混合物（７８％クルクミン）による同様の観察結果が発表された（Moha ou Maati H, Ducroq J, Rivet J Faivre J.F. Le Grande M, Bois P:Curcumin blocks the recombinant human cardiac KCNQ1/ KCNE1 channels (IKs)stably expressed in HEK 293 cells. Congress de Physiologie, de Pharmacologie et de Therapeutique, Clermont-Ferrand, France, 9-11 Avril. 2008 Fund. Clin. Pharmacol.22(Suppl.1)）。これらのデータは、それらの当初の知見を支持するものであり、クルクミン（ジフェルロイルメタン）分子が、すべてではないが支配的なＩＫｒ阻害を示すことを強調する。
【０１２８】
リポソームクルクミン又はリポソームとクルクミンとのボルテックスされた混合物が、正常な開閉機能が生じることを可能にするクルクミンにより、ＩＫｒダウンモジュレートを妨げたとする本発明の知見は、クルクミンのリポソーム封入が必ずしもチャネル薬受容体部位との相互作用を阻止しないことを示唆する。Ｋ＋チャネルの受容体の親和性の特異性及び程度、又は優先的な相互作用に関する疑問に関連するが、空リポソームは、クルクミンがない状態で、又はＥ−４０３１及びテルフェナジンの存在下で、ｈＥＲＧ遺伝子によりコード化されたタンパク質と相互作用しないように思われた（Zavhariae U, Giordanetto F, Leach AG: Side chain flexabilities in the human ether-a-go-go related potassium channel (hERG) together with matched-pair binding studies suggest a new binding mode for channel blockers. J Med Chem 2009 52(14): 4266-4276）。
【０１２９】
クルクミンにより誘発されたＩｋｒ／ｈＥＲＧ抑制は、クルクミンがリポソーム中に内包された場合、又は、曝露前に単にリポソームでボルテックスされただけの場合、軽減される。このリポソームとクルクミン以外の静脈内ＱＴ延長薬との組合せ静脈内投与は、インビボでのＱＴ遅延を軽減し得る。
【実施例２】
【０１３０】
リポソームは、心筋ＩＫｒチャネルの薬剤誘発性阻害を改善する。
クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））及びニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））はそれぞれ、非小細胞肺がん及び慢性骨髄性白血病の処置のために承認されたチロシンキナーゼ阻害薬である。両方とも、ヒト及び動物におけるＱＴ延長をもたらすことが示されている。リポソームは、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によりコード化されたＩＫｒ（ＫＶ１１．１）チャネルに対する薬剤誘発性効果を改善することが示されている。本研究は、リポソームもＩＫｒチャネルに対するクリゾチニブ及びニロチニブの効果を低下させるかどうかを判定するために行った。ｈＥＲＧで安定的にトランスフェクトしたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を使用した標準インビトロＩＫｒアッセイにおいて、クリゾチニブ及びニロチニブを試験した。用量反応を判定し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０ｓ）を算出した。ＨＥＫ２９３細胞をリポソームと混合したクリゾチニブ及びニロチニブで処理した場合、これらの２つの薬剤のＩＫｒチャネル阻害効果に著しい減少がみられた。リポソーム被包性ＱＴ延長薬の使用、又はこれらの薬剤をリポソームと混合するだけで、これらの心臓性の傾向が低下することが見出された。
【０１３１】
クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））は、ＡＬＫ陽性腫瘍の患者における非小細胞肺がんの処置のために承認された未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害薬である。ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））は、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病のために承認されたＢＣＲ−ＡＢＬキナーゼ阻害薬である。両方の薬剤ともに、ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によりコード化された、心臓における遅延整流性Ｋ＋電流（ＩＫｒ又はＫＶ１１．１）に関与するイオンチャネルを阻害する。ＩＫｒチャネルの阻害は、重篤な多形性心室性頻拍又はトルサード・ド・ポアンツにつながりかねないＱＴｃの延長をもたらし得る（Yap YG, Camm A J. Drug induced QT prolongation and torsades de pointes. Heart. 2003;89:1363-1372）。クリゾチニブはヒト及び動物におけるＱＴ延長を引き起こし、一方、ニロチニブはヒトにおけるＱＴ延長を引き起こすことが示されているのみである。
【０１３２】
ＩＫｒチャネル阻害及び心毒性は、一部の分類の薬剤にとって、主な不都合なものとなり得る。臨床試験前の医薬品開発の間のＩＫｒチャネル阻害及び／又はインビボでのＱＴ延長の検出は、有望な薬剤群の開発の断念につながり得る。いくつかのＱＴ延長薬が、開発中又は上市後に回収されてきた。これらには、テルフェナジン、アステミゾール、グリパフロキサシン、テロジリン、ドロペリドール、リドフラジン、レボメタジル、セルチンドイル及びシサプリドが含まれる。
【０１３３】
開発中、クリゾチニブは、１．１μＭの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）でＩＫｒチャネルを阻害することが示されたことから（FDA Pharmacology Review of Xalkori(R) (crizotinib), IND No. 202570,2011a, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2011/202570Orig1s000PharmR.pdf(accessed October 9, 2013)）、ＱＴ間隔延長の可能性が示唆された。ＩＣ５０値は、臨床関連用量でヒトにおいてみられるＣｍａｘ未満であるか同等であった。クリゾチニブを静脈内で処理されたイヌは、心拍及び収縮力の低下、左室拡張末期圧の上昇、並びにＰＲ、ＱＲＳ及びＱＴ間隔の増加を示した（FDA Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics Review of Xalkori(R)(crizotinib), IND No. 202570, 2011b,www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2011/202570Orig1s000ClinPharmR.pdf(accessed October 9, 2013)）。これらの前臨床の知見は、臨床試験において時折観察されたＱＴｃ延長、徐脈及び心停止と相関する（FDA Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics Review of Xalkori(R)(crizotinib), IND No. 202570, 2011b,www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2011/202570Orig1s000ClinPharmR.pdf(accessed October 9, 2013)、Xalkori (2013) [packageinsert], Pfizer Laboratories, New York, NY, revised February 2013）。ニロチニブは、０．１３μＭのＩＣ５０でＩＫｒチャネルを阻害することが示された（FDA Pharmacology Review of Tasigna(R) (nilotinib), IND No. 22-068,2007a, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_PharmR_P1.pdfand www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_MedR_P2.pdf,(accessed October 25, 2013)）。しかし、クリゾチニブとは対照的に、６００ｍｇ／ｋｇまでを経口処置されたイヌは、ＱＴ延長を示さなかった（FDA Pharmacology Review of Tasigna(R) (nilotinib), IND No. 22-068,2007a, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_PharmR_P1.pdfand www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_MedR_P2.pdf,(accessed October 25, 2013)）。クリゾチニブ及びニロチニブによるイヌを対象とした各試験の１つの違いとは、クリゾチニブは静脈内投与したのに対し、ニロチニブは経口投与したことである。クリゾチニブを用いた場合、臨床試験は、治療用量のニロチニブとＱＴｃ延長との関連性を示した。（FDA Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics Review of Tasigna(R)(nilotinib), IND No. 22-068, 2007b,www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_ClinPharmR.pdf,(accessed October 24, 2013)、Tasigna (2013), Packageinsert, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ, revised September 2013）。
【０１３４】
Dohertyらによる研究（Doherty KR,Wappel RL, Talbert DR, Trusk PB, Moran DM, Kramer JW, Brown AM, Shell SA, Bacus S. Multi-parameter in vitro toxicity testing of crizotinib, sunitinib, erlotinib, and nilotinib in human cardiomyocytes. Toxicol Appl Pharmacol. 2013;272(1):245-55）は、インビトロでヒト心筋細胞に対するクリゾチニブ及びニロチニブの複数の効果を明らかにした。これらの効果としては、心臓細胞死、カスパーゼ活性化の増加、及びスーパーオキシド産生の増加が含まれた。心臓細胞の形態は、個々の心臓細胞の正常な拍動パターンの乱れに伴って変化した。クリゾチニブについては、心筋イオンチャネルＩＫｒ、ＮａＶ１．５及びＣａＶがそれぞれ１．７、３．５及び３．１μＭのＩＣ５０で阻害された。ニロチニブについては、ＩＣ５０はそれぞれ、０．７、３μＭ超及び３μＭ超であった。
【０１３５】
本発明者らは以前、リポソームがＩＫｒチャネルのクルクミン誘発性阻害を軽減することを明らかにしている（Helson L, Shopp G, Bouchard A, Majeed M. Liposome mitigation of curcumin inhibition of cardiac potassium delayed-rectifier current. J Recep Lig Channel Res. 2012;5:1-8）。本研究は、ＩＫｒチャネルに対するクリゾチニブ及びニロチニブの効果に関する結果を示し、リポソームの添加がこれらの効果を改善するかどうかを判定する。
【０１３６】
クリゾチニブは、１１及び５６μＭの濃度で、それぞれ、２０ｍＶでのＩＫｒテール電流密度の５６及び８９％の阻害を引き起こした（図１８Ａ）。対応のあるステューデントのｔ検定は、ベースライン時並びに１１及び５６μＭのクリゾチニブの存在下で測定した正規化電流密度の差異が、統計学的に有意な所定の閾値（ｐ≦０．０５）に達したことを確認した（図１０）。ＩＣ５０はクリゾチニブ単独で８．９μＭであった（表１０）。クリゾチニブを室温で１０分間リポソームと９：１の比率で（例えば、クリゾチニブ５６μＭ［２５μｇ／ｍＬ］に対しリポソーム２２５μｇ／ｍＬ）ボルテックスした場合、５６μＭの最高濃度のクリゾチニブのみが統計的に有意な阻害（５９％）に達した。ＩＣ５０は４４μＭであった（表１０）。リポソーム単独は、ＩＫｒテール電流密度に何ら効果を及ぼさなかった（図１８Ａ）。
【０１３７】
ニロチニブは、０．１及び１μＭの濃度で、それぞれ、５４％及び７４％と、２０ｍＶでのＩＫｒテール電流密度の統計的に有意な阻害を引き起こした（図１９Ａ）。ＩＣ５０はニロチニブ単独で０．０８μＭであった（表１０）。ニロチニブを室温で１０分間リポソームと９：１の比率で（例えば、ニロチニブ１μＭ［０．５μｇ／ｍＬ］に対しリポソーム４．５μｇ／ｍＬ）ボルテックスした場合、１μＭの最高濃度であってもニロチニブのＩＫｒチャネルに対する効果はみられなかった。ＩＣ５０は１μＭを超えた（表１０）。リポソーム単独は、ＩＫｒテール電流密度に何ら効果を及ぼさなかった（図１９Ａ）。
【０１３８】
整流内向き電流の電流−電位関係は、テール電流で観察された阻害が、クリゾチニブ及びニロチニブの両方について電位依存的ではなかったことを示した（それぞれ図１８Ｂ及び図１９Ｂ）。
【０１３９】
図１８Ａ及び図１８Ｂはそれぞれ、ベースライン条件下、並びにクリゾチニブ単独、リポソーム単独、及びクリゾチニブ＋リポソーム存在下で、２０ｍＶでのＩＫｒテールピーク振幅を測定することで得られたＩＫｒテール電流密度平均値及び電位依存性を示す。クリゾチニブ＋リポソームについては、クリゾチニブをリポソームと９：１の比率で、例えばクリゾチニブ５６μＭ（２５μｇ／ｍＬ）に対しリポソーム２２５μｇ／ｍＬで混合し、ボルテックスした。図１８Ａは、ベースライン電流密度に対して平均化、正規化し、時間及び溶媒の影響を補正した、３〜４個の細胞から測定された電流密度を示すグラフである。プロットした値は、平均値の平均値±標準偏差である。薬剤曝露後及びベースライン時の電流密度レベルの統計的比較を、反復の対応のあるステューデントのｔ検定（＊）を用いて行った。ｐ≦０．０５である場合、有意差ありと判断した。図１８Ｂは、クリゾチニブの試験した最高濃度（５６μＭ）でのＩＫｒテール電流阻害の電位依存性を示すグラフである。
【０１４０】
図１９Ａ及び図１９Ｂはそれぞれ、ベースライン条件下、並びにニロチニブ単独、リポソーム単独、及びニロチニブ＋リポソーム存在下で、２０ｍＶでのＩＫｒテールピーク振幅を測定することで得られたＩＫｒテール電流密度平均値及び電位依存性を示す。ニロチニブ＋リポソームについては、ニロチニブをリポソームと９：１の比率で、例えばニロチニブ１μＭ（０．５μｇ／ｍＬ）に対しリポソーム４．５μｇ／ｍＬで混合し、ボルテックスした。図１９Ａは、ベースライン電流密度に対して平均化、正規化し、時間及び溶媒の影響を補正した、３個の細胞から測定された電流密度のグラフである。プロットした値は、平均値の平均値±標準偏差である。薬剤曝露後及びベースライン時の電流密度レベルの統計的比較を、反復の対応のあるステューデントのｔ検定（＊）を用いて行った。ｐが０．０５以下の場合、有意差ありと判断した。図１９Ｂは、ニロチニブの試験した最高濃度（１μＭ）でのＩＫｒテール電流阻害の電位依存性を示すグラフである。
【０１４１】
【表１０】
2019131581.tif 000011
【０１４２】
陽性対照Ｅ−４０３１は、１００ｎＭの濃度で電流密度に統計的に有意な減少をもたらした。Ｅ−４０３１を２回試験し、６７及び７９％阻害という観察結果を得た（データは示されず）。これらの結果は、本実験室の内部検証データの範囲内であった。
【０１４３】
試薬。クリゾチニブ及びニロチニブは、Reagents Direct社から入手した。陽性対照Ｅ
−４０３１（Ｎ−［４−［［１−［２−（６−メチル−２−ピリジニル）エチル］−４−ピペリジニル］カーボン−イル］フェニル］無水メタンスルホンアミドジヒドロクロライド）は、Sigma-Aldrich社から入手した。空リポソームは、Polymun GmbH社から入手した。リポソームは、９．７：１の比率のＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）及びＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−［１−グリセロール］）からできている。クリゾチニブ又はニロチニブ＋リポソームについては、クリゾチニブ又はニロチニブをリポソームと９：１の比率で混合し、１０分間室温でボルテックスした；例えば、クリゾチニブ５６μＭ（２５μｇ／ｍＬ）をリポソーム２２５μｇ／ｍＬでボルテックスした。内部ピペット溶液の組成は、１４０−ｍＭ  ＫＣｌ、１．０−ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４．０−ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、５．０−ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０−ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１０−ｍＭ  スクロースであった（ｐＨ７．４±０．０５）。ｈＥＲＧ外部溶液の組成は１４０．０−ｍＭ  ＮａＣｌ、５．０−ｍＭ  ＫＣｌ、１．８−ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０−ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０．０−ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１０．０−ｍＭ  デキストロースであった（ｐＨ７．３±０．０５）。
【０１４４】
細胞培養。ｈＥＲＧを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Wisent社、St. Bruno, Quebec, Canada）、１％最小必須培地ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び選択薬物として４００μｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８（ジェネテシン）（すべての成分をGibco/Invitrogen社、Burlington, Ontario,Canadaから入手）で補充した最小必須培地で維持し、継代数１２及び１６の間を使用した。ギガオーム（ＧＤ）シールが得られなかったか又は特徴的なテール電流を伴う電流を生じなかった細胞については、平衡化期間中に排除した。
【０１４５】
手順。ホールセルパッチクランプ法を用いて、イオンチャネルとの薬剤相互作用を機能的に評価した。３５ｍｍペトリ皿に置いたＨＥＫ２９３細胞を、１ｍＬのｈＥＲＧ外液で２回洗浄し、その後、２ｍＬのｈＥＲＧ外液を加えた。ペトリ皿は倒立位相差顕微鏡のステージ上に載せ、一定温度（３５℃±２℃）で維持した。Eppendorf PatchManマイクロマニピュレーター（Eppendorf Canada社、Mississauga, Ontario, Canada）を用いて、内部ピペット溶液を充填したホウケイ酸塩グラスマイクロピペットを、単一細胞上に配置した。密接な接触が得られるまで、マイクロピペットを細胞に向けて下げた。その後、わずかな陰圧をかけることで、ＧＤ−レンジ膜ピペットシールを作成した（抵抗は、５ｍＶ方形波を用いて測定した）。細胞キャパシタンスを直ちに測定し、換算率１ｐＦ／μｍ２を用いて細胞表面積を評価した。この細胞表面積を後に正味電流密度を算出するのに用いた。
【０１４６】
アナログフィルタリング後、１ｋＨｚに設定した４−ポールベッセルフィルタ（Frequency Devices社，Haverhill, Massachusetts）を使用して、すべての電流を記録した。コンピュータ制御された増幅器を通じて、細胞を１秒間で、−１０ｍＶで開始して１０ｍＶずつ漸増し、最大値＋４０ｍＶまで脱分極した（培養細胞）。その後、膜電位（ｍＶ）を１秒間で−５５ｍＶに回復させ、最終的に静止電位に再分極した。これにより、チャネルが活性化モードから非活性化モードへ移行し、再び活性化モードに戻ることで、エラー強さのあるテール電流を測定することが可能となった。ｈＥＲＧチャネルを通過するすべてのＫ＋選択的チャネルを、Ａｘｏｐａｔｃｈ−１Ｄ又はＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器を用いて記録し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａ又は１４４０Ａ  ＡＤ−ＤＡインターフェース（Axon instruments社，Foster City, California、現在Molecular Devices社）でデジタル化した。細胞電流の記録を、−４０ｍＶへの細胞脱分極の前に５００ｍｓで開始し、細胞が−８０ｍＶに再分極した後、５００ｍｓまで継続した。
【０１４７】
ベースライン時の記録を入手した後、被験薬物クリゾチニブ及びニロチニブを単独で、又はリポソームとの混合して、漸増濃度で、２０μＬのアリコートで直接実験容器に加え、小型ぜん動ポンプ（MP-1，Harvard Instruments社，Holliston, Massachusetts）を使用して閉鎖循環式灌流システムに分散させた。各濃度への曝露時間は５分間を限度とした。最高濃度の被験薬物の存在下での電流の記録後、フロースルー灌流システムを使用して、被験物を洗い流し、前に記載した通りの同じやり方で曝露後ｈＥＲＧ電流を得た。最後に３つの未処置の細胞を１００ｎＭのＥ−４０３１に曝した。Ｅ−４０３１の濃度は、被験物について行ったように実験容器に加えた。
【０１４８】
ＨＥＫ２９３など異種発現系により生じたｈＥＲＧ電流は、長期間の記録の間に減弱することが知られている。したがって、電流減弱として知られる電流密度の時間依存的低下を補正するべく、被験薬物の非存在下及び溶媒の存在下で、並行実験を行った。
【０１４９】
統計解析。電流密度の時間依存的低下の補正は、時間及び溶媒に関連する電流密度における変化を平均化すること、並びに「被験物」の結果を、結果として生じる補正率で掛け合わせることを伴っていた。すべての結果を、媒体の効果及び電流密度の時間依存的変化について補正した。
【０１５０】
本研究で使用した細胞集団内の細胞サイズの差異を補正するために、ｈＥＲＧ電流振幅を電流密度（ナノアンペア／ピコファラド［ｎＡ／ｐＦ］で）として表した。電流をpClamp 10.0ソフトウェア（Axon Instruments社）のClampfit  10.0モジュールを使用して解析した。各濃度の存在下で得られた結果を、ベースライン条件で測定した電流密度に対し正規化した正味電流密度として表した。
【０１５１】
ＩＫｒテール電流の振幅を、−４０ｍＶへの脱分極パルス前に記録した平均電流と、−５５ｍＶへの再分極パルスの開始時に記録した最大の一過的な電流との差異として算出した。被験物への細胞の曝露前後で得られた電流密度の差異の統計学的有意性を判断するために対応ｔ検定を行った。有意性はｐが０．０５未満として設定し、ここでｐは電流密度レベルの差異が偶然のみによる確率である。
【実施例３】
【０１５２】
ウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブの効果に関するインビボでの評価
ウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブの効果に関するインビボでの評価。本研究の目的は、ウサギ心臓の心臓電気生理学的（ＰＲ、ＱＲＳ、ＲＲ、ＱＴ及びＱＴｃ間隔）パラメータに対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのインビボでの効果を定量化することである。
【０１５３】
体重３ｋｇ〜４ｋｇの成体の雄ウサギ。クリゾチニブを、１０分間の注入時間にわたって１、２及び３ｍｇ／ｋｇ（負荷用量）を０．０５７ｍＬ／ｋｇ／分で、その後、それぞれ０．４、０．８及び１．２ｍｇ／ｋｇ（維持用量）を０．０３７ｍＬ／ｋｇ／分で１５分間の維持注入で試験した。各濃度は、本研究の設計時に入手可能な情報に基づき選択した。
【０１５４】
リポソームを、クリゾチニブの全用量に対して９：１の比率で静脈内ボーラス投与として注入した。
【０１５５】
【表１１】
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【０１５６】
ＥＣＧリードを装着したウサギに麻酔を施す。９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２中２．５％イソフルランＵＳＰ（Abbot Laboratories社，Montreal Canada）の混合物でウサギに麻酔した。左頸静脈を被験物の静脈内注入としてカニューレ処置した。ＥＣＧリードを動物に装着した。ＥＣＧによる継続的な記録を開始し、被験物の最終濃度の注入終了時に記録を終了した。
【０１５７】
各負荷用量（１、２及び３ｍｇ／ｋｇ）での注入を１０分間継続し、その後、各維持用量（０．４、０．８及び１．２ｍｇ／ｋｇ）での注入を１５分間行った。負荷用量の注入速度は０．０５７ｍｌ／ｋｇ／分、維持用量については０．０３７ｍｇ／ｋｇ／分とした。３例のウサギをクリゾチニブに曝露させた（ｎ＝３）。
【０１５８】
各負荷用量の注入開始５分前、リポソームを注射した。リポソームは９：１の比率で左耳静脈に静脈内ボーラス投与した。３例のウサギをリポソーム＋クリゾチニブに曝露させた（ｎ＝３）。実験手順全体を通じて継続的に記録。有意性検定を行った：有意性の閾値をｐ≦０．０５に設定した対応のあるステューデントのｔ検定。ｎ＝３。
【０１５９】
クリゾチニブ。クリゾチニブは、心拍数について統計学的に有意な用量依存的な低下（ＲＲ間隔の延長）を引き起こした。２及び３ｍｇ／ｋｇは、ＲＲ間隔をそれぞれ６７及び１１０ｍｓ増大した。２ｍｇ／ｋｇとした場合のクリゾチニブは、ＰＲ及びＱＲＳ間隔の統計学的に有意な延長を引き起こした。３ｍｇ／ｋｇのクリゾチニブへの曝露後、ＰＲ間隔が２３ｍｓ、ＱＲＳ間隔が１３ｍｓ増大した。クリゾチニブは、ＱＴ間隔の統計学的に有意な用量依存的な延長を引き起こした。
【０１６０】
２及び３ｍｇ／ｋｇで与えられた場合、それぞれ３４及び４８ｍｓのＱＴ間隔の延長を引き起こした。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ補正率を用いて心拍数の変化について補正を行った場合、クリゾチニブは依然として、緩徐な心拍数によって説明のつかない統計学的に有意な３８ｍｓのＱＴ間隔の延長を引き起こした。
【０１６１】
リポソーム＋クリゾチニブ。２ｍｇ／ｋｇとした場合のリポソーム＋クリゾチニブ（比率９：１）は、心拍数について統計学的に有意な低下（ＲＲ間隔の延長）を引き起こした。２及び３ｍｇ／ｋｇのクリゾチニブへの曝露後、ＲＲ間隔がそれぞれ６１及び９０ｍｓ増大した。
【０１６２】
リポソーム＋クリゾチニブは、ＰＲ及びＱＲＳ間隔の延長を引き起こした。リポソーム＋クリゾチニブのＰＲ及びＱＲＳ間隔に対する効果は、３ｍｇ／ｋｇの用量でのみ統計学的に有意であり、ＰＲ間隔については１５ｍｓ及びＱＲＳ間隔については７ｍｓの延長をもたらした。
【０１６３】
３ｍｇ／ｋｇでのリポソーム＋クリゾチニブは、２４ｍｓのＱＴ間隔の延長を引き起こした。一方、ＱＴ間隔に対するこの効果は、ベースライン条件で測定したＱＴ間隔と比較して統計学的に有意ではなかった。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ補正率を用いて心拍数の変化について補正を行った場合、３ｍｇ／ｋｇは、ＱＴ間隔の１５ｍｓの延長を引き起こしたが、それは依然として統計学的に有意ではなかった。
【０１６４】
本研究は、インビボでのウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するクリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブの効果を評価することを目的とした。クリゾチニブ単剤が、インビボでのウサギの心臓のＲＲ、ＰＲ、ＱＲＳ及びＱＴ間隔の用量依存的な延長を引き起こした。クリゾチニブのＲＲ及びＱＴ間隔に対する効果は１ｍｇ／ｋｇの場合、ＰＲ及びＱＲＳ間隔に対しては２ｍｇ／ｋｇの場合に統計学的に有意であった。
【０１６５】
リポソーム＋クリゾチニブが、インビボでのウサギの心臓のＲＲ、ＰＲ及びＱＲＳ間隔の延長を引き起こした。リポソーム＋クリゾチニブのＲＲ間隔に対する効果は２ｍｇ／ｋｇの場合に統計学的に有意であったが、一方、ＰＲ及びＱＲＳ間隔に対しては３ｍｇ／ｋｇでのみ統計学的に有意であった。リポソーム＋クリゾチニブは、インビボでのウサギの心臓のＱＴ間隔に統計学的に有意な延長を何ら引き起こさなかった。
【０１６６】
以下の表は、リポソームの存在によって提供される保護作用の指標を要約したものである。
【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
【表１３】
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【０１６９】
【表１４】
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【０１７０】
図２０：クリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのウサギの心臓のＲＲ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果
【０１７１】
【表１５】
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【０１７２】
【表１６】
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【０１７３】
図２１：クリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのウサギの心臓のＰＲ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果
【０１７４】
【表１７】
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【０１７５】
【表１８】
2019131581.tif 000019
【０１７６】
図２２：クリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのウサギの心臓のＱＲＳ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果
【０１７７】
【表１９】
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【０１７８】
【表２０】
2019131581.tif 000021
【０１７９】
図２３：クリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのウサギの心臓のＱＴ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果
【０１８０】
【表２１】
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【０１８１】
【表２２】
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【０１８２】
図２４：クリゾチニブ及びリポソーム＋クリゾチニブのウサギの心臓のＱＴｃ  Ｖａｎ
ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ間隔に対するインビボでの効果
【実施例４】
【０１８３】
ウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果に関するインビボでの評価
ウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果に関するインビボでの評価。本研究の目的は、ウサギの心臓からの心臓電気生理学的（ＰＲ、ＱＲＳ、ＲＲ、ＱＴ及びＱＴｃ間隔）パラメータに対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのインビボでの効果を定量化することである。
【０１８４】
試験の方式。体重３ｋｇ〜４ｋｇの成体の雄ウサギ。
【０１８５】
被験用量。ニロチニブを、１０分間の注入時間にわたって２、４及び５．５ｍｇ／ｋｇ（負荷用量）を０．０５７ｍＬ／ｋｇ／分で、その後、それぞれ０．１４、０．２８及び０．３９ｍｇ／ｋｇ（維持用量）を０．０３７ｍＬ／ｋｇ／分で１５分間の維持注入で試験した。各濃度は、本研究の設計時に入手可能な情報に基づき選択した。リポソームを、ニロチニブの全用量に対して９：１の比率で静脈内ボーラス投与として注射した。
【０１８６】
実施された試験。ＥＣＧリードを装着したウサギに麻酔を施す。手順。インビボでのウサギ。９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で２．５％イソフルランＵＳＰ（Abbot Laboratories社，Montreal Canada）の混合物でウサギに麻酔した。左頸静脈を被験薬物の静脈内注入としてカニューレ処置した。ＥＣＧリードを動物に装着し、Ｉｓｏ−ＤＡＭ８Ａ（Word Precision Instrument社製，Sarasota, FL,USA）を使用して５００ＨｚでＥＣＧ信号を選別し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａインターフェース（Axon Instruments社製，Foster City, CA, USA，（現在Molecular Devices社））を使用して２．０ｋＨｚのサンプリングレートでデジタル化した。初回投与分の化合物の注入を開始する前、５分間ＥＣＧの継続的な記録を開始し、最終投与分の注入終了時に記録を終えた。ベースラインＥＣＧ記録後、化合物の初回負荷用量の注入を開始した。初回負荷用量の終了時、注入を初回維持用量へ切り替えた。各用量にウサギを２５分間（１０分間の負荷用量後、１５分間の維持用量）曝露させた。選択したすべての用量の被験薬物又は媒体等価物にウサギを暴露させるまで、同一の手順を適用した。各負荷用量の注入の開始５分前、リポソームを注射した。リポソームは９：１の比率（μｇ／ｍＬベース）で左耳静脈に静脈内ボーラス投与した。インビトロでの心臓での実験のものと同じ方法で、ＥＣＧパラメータを解析し提示した。
【０１８７】
【表２３】
2019131581.tif 000024
【０１８８】
データ解析及び取得。実験手順全体を通じて継続的に記録。統計解析。各処置と比較したベースラインの値の差異の統計学的有意性を判定するために、対応一元配置ｔ検定を行った。クリゾチニブ若しくはニロチニブ単独と、クリゾチニブ若しくはニロチニブ＋リポソームとを比較するために、不均一な分散を仮定した独立一元配置ｔ検定を行った。有意性検定を行った：有意性の閾値をｐ≦０．０５に設定した対応のあるステューデントのｔ検定。ｎ＝３。
【０１８９】
ニロチニブは、心拍数の用量依存的な低下（ＲＲ間隔の延長）を引き起こした。５．５ｍｇ／ｋｇのニロチニブは、７８ｍｓのＲＲ間隔の統計学的に有意な延長を引き起こした。
【０１９０】
５．５ｍｇ／ｋｇまでの濃度でのリポソーム＋ニロチニブは、ＰＲ間隔に何ら統計学的に有意な効果をもたらさなかった。
【０１９１】
２ｍｇ／ｋｇとした場合のニロチニブは、ＱＲＳ間隔の統計学的に有意な延長を引き起こした。５．５ｍｇ／ｋｇのニロチニブは、７ｍｓのＱＲＳ間隔の延長を引き起こした。
【０１９２】
ニロチニブは、ＱＴ間隔の統計学的に有意な用量依存的な延長を引き起こした。４及び５．５ｍｇ／ｋｇは、それぞれ４１及び６６ｍｓのＱＴ間隔の延長を引き起こした。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ補正率を用いて心拍数の変化について補正を行った場合、ニロチニブは依然として、緩徐な心拍数では説明のつかないＱＴ間隔の統計学的に有意な延長を引き起こした。
【０１９３】
リポソーム＋ニロチニブ。５．５ｍｇ／ｋｇでのリポソーム＋ニロチニブ（比率９：１）は、心拍数の統計学的に有意な低下（ＲＲ間隔の延長）を引き起こした。５．５ｍｇ／ｋｇのニロチニブへの曝露後、ＲＲ間隔が６９ｍｓだけ増大した。
【０１９４】
５．５ｍｇ／ｋｇまでの濃度でのリポソーム＋ニロチニブは、ＰＲ及びＱＲＳ及びＱＴ間隔に対して何ら統計学的に有意な効果をもたらさなかった。
【０１９５】
本研究は、インビボでのウサギの心臓の心臓電気生理学的パラメータに対するニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブの効果を評価した。
【０１９６】
ニロチニブ単剤が、インビボでのウサギの心臓のＲＲ、ＱＲＳ及びＱＴ間隔の用量依存的な延長を引き起こした。ニロチニブのＲＲ間隔に対する効果は５．５ｍｇ／ｋｇでのみ統計的に有意であったが、一方、ＱＲＳ及びＱＴ間隔については２ｍｇ／ｋｇの場合に統計学的に有意であった。
【０１９７】
リポソーム＋ニロチニブが、インビボでのウサギの心臓のＲＲ間隔の延長を引き起こした。リポソーム＋ニロチニブのＲＲ間隔に対する効果は５．５ｍｇ／ｋｇの場合に統計学的に有意であった。リポソーム＋ニロチニブは、インビボでのウサギの心臓のＰＲ、ＱＲＳ及びＱＴ間隔に統計学的に有意な延長を一切もたらさなかった。
【０１９８】
以下の表は、リポソームの存在によって提供される保護作用の指標を要約したものである。
【０１９９】
【表２４】
2019131581.tif 000025
【０２００】
【表２５】
2019131581.tif 000026
【０２０１】
【表２６】
2019131581.tif 000027
【０２０２】
図２５は、ニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのウサギの心臓のＲＲ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果を示すグラフである。
【０２０３】
【表２７】
2019131581.tif 000028
【０２０４】
【表２８】
2019131581.tif 000029
【０２０５】
図２６は、ニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのウサギの心臓のＰＲ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果を示すグラフである。
【０２０６】
【表２９】
2019131581.tif 000030
【０２０７】
【表３０】
2019131581.tif 000031
【０２０８】
図２７は、ニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのウサギの心臓のＱＲＳ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果を示すグラフである。
【０２０９】
【表３１】
2019131581.tif 000032
【０２１０】
【表３２】
2019131581.tif 000033
【０２１１】
図２８は、ニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのウサギの心臓のＱＴ間隔（ｍｓ）に対するインビボでの効果を示すグラフである。
【０２１２】
【表３３】
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【０２１３】
【表３４】
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【０２１４】
図２９は、ニロチニブ及びリポソーム＋ニロチニブのウサギの心臓のＱＴｃ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｔｅｒ間隔に対するインビボでの効果を示すグラフである。
【０２１５】
表３５及び３６は、上記の結果を要約し、本発明の効果に関するさらなる情報を提供する。
【０２１６】
【表３５】
2019131581.tif 000036
【０２１７】
ＩＫｒ電流密度の５０％阻害（ＩＣ５０）をもたらした濃度を、図１８Ａ−Ｂ及び図１９Ａ−Ｂに示したデータから算出した。ａクリゾチニブ及びニロチニブについて、それぞれ、２２５及び４．５μｇ／ｍＬが、本アッセイで試験したリポソーム単独の最高濃度であった。
【０２１８】
【表３６】
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【０２１９】
インビトロでのＩＫｒ電流
クリゾチニブは、１１及び５６μＭの濃度で、それぞれ、２０ｍＶでのＩＫｒテール電流密度の５７及び８９％の阻害を引き起こしたことが見出された（図１８Ａ）。対応のあるステューデントのｔ検定は、ベースライン時並びに１１及び５６μＭのクリゾチニブの存在下で測定した正規化電流密度の差異が、統計学的に有意な所定の閾値（ｐ≦０．０５）に達したことを示した。ＩＣ５０はクリゾチニブ単独で８．９μＭであった（表３５）。クリゾチニブをリポソームと９：１の比率で混合した場合、５６μＭの最高濃度のクリゾチニブのみがベースラインに比し統計的に有意な阻害（５９％）に達した。ＩＣ５０は４４μＭであった。１１μＭでのリポソーム＋クリゾチニブは、ＩＫｒテール電流密度に何ら効果を及ぼさなかった。５６μＭでのリポソーム＋クリゾチニブは、ベースラインに比しＩＫｒテール電流密度に何ら有意な効果を及ぼさなかった。一方、１１及び５６μＭでのクリゾチニブとリポソーム＋クリゾチニブとの間の電流密度を比較すると、リポソームと混合した場合、クリゾチニブの効果である有意な阻害がみられた。リポソーム単独は、ＩＫｒテール電流密度に何ら効果を及ぼさなかった（図１８Ａ）。
【０２２０】
ニロチニブは、０．１及び１μＭの濃度で、ベースラインに比し、それぞれ５４％及び７４％と、２０ｍＶでのＩＫｒテール電流密度の統計的に有意な阻害を引き起こした（図１９Ａ）。ＩＣ５０はニロチニブ単独で０．０８μＭであった（表３５）。ニロチニブを１０分間室温でリポソームと９：１の比率でボルテックスした場合、１μＭの最高濃度であってもニロチニブのＩＫｒチャネルに対する効果はみられなかった。ＩＣ５０は１μＭを超えた。ニロチニブとリポソーム＋ニロチニブとの間の電流密度を比較すると、リポソームと混合した場合、０．１及び１μＭでのニロチニブの効果である有意な阻害がみられた。リポソーム単独は、ＩＫｒテール電流密度に何ら効果を及ぼさなかった（図１９Ａ）。
【０２２１】
整流内向き電流の電流−電位関係は、テール電流で観察された阻害が、クリゾチニブ及びニロチニブの両方について電位依存的ではなかったことを示した（それぞれ図１８Ｂ及び図１９Ｂ）。
【０２２２】
陽性対照、Ｅ−４０３１は、１００ｎＭの濃度で電流密度に統計的に有意な減少をもたらした。Ｅ−４０３１を２回試験し、６７及び７９％という観察結果を得た（データは示
されず）。
【０２２３】
インビトロでのウサギの心臓のＱＴｃ間隔
クリゾチニブは、１１及び５６μＭの濃度で、ＱＴｃ間隔の用量依存的な延長を引き起こした（図３０Ａ）。クリゾチニブをリポソームと９：１の比率で混合すると、クリゾチニブ誘発性ＱＴｃ延長の有意な阻害をもたらした。ニロチニブもまた、１４及び２８μＭの濃度で、ＱＴｃ間隔の用量依存的な延長を引き起こした（図３０Ｂ）。クリゾチニブの場合と同様、ニロチニブをリポソームと混合すると、ニロチニブ誘発性ＱＴｃ延長の有意な阻害をもたらした。シサプリド陽性対照は、ＱＴｃ間隔の予想された延長を示した。
【０２２４】
クリゾチニブ及びニロチニブのＥＣＧｓに対する効果は、ＬＶＰに対する効果に関連していた（表３６）。心臓をクリゾチニブ又はニロチニブ単独に曝露させると、ＬＶＰの低下がみられた。リポソームをクリゾチニブ又はニロチニブと混合すると、ＬＶＰに対する効果が元に戻った。
【０２２５】
インビボでの投与後のウサギのＱＴｃ間隔
１０分間にわたって静脈内注入により１、２及び３ｍｇ／ｋｇでクリゾチニブを投与し、その後１５分間維持用量を投与したウサギは、ＱＴ間隔の用量依存的な延長を示した（図２３）。クリゾチニブでの処理５分前、リポソームを注入すると、クリゾチニブ誘発性ＱＴｃ延長の有意な阻害がもたらされた。１０分間にわたって静脈内注入により２、４及び５．５ｍｇ／ｋｇでニロチニブを投与し、その後１５分間維持用量を投与したウサギは、ＱＴ間隔の用量依存的な延長を示した（図２８）。クリゾチニブの場合と同様、ニロチニブでの処理５分前、リポソームを注入すると、ニロチニブ誘発性ＱＴｃ延長の有意な阻害がもたらされた。
【０２２６】
これらのデータは、リポソームが、安定的にｈＥＲＧトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用したＩＫｒチャネルをこれらのキナーゼ阻害薬の阻害効果から保護し、インビトロ及びインビボでの両方の曝露に起因する心ＱＴｃ延長を改善することを立証する。これらの結果は、上記の薬剤をリポソームと混合することで、これらの阻害薬とＩＫｒチャネルとの相互作用が防止され、より正常なゲーティングキネティクスが生じるようになり、並びに臨床で生じ得るＱＴｃ延長の程度及び発生頻度を低下させることを立証する。
【０２２７】
ラパチニブ、スニチニブ及びバンデタニブを含む他のチロシンキナーゼ阻害薬もまた、ＱＴｃ間隔に影響を及ぼすことが示されている（Shah, R. R., Morganroth, J., and Shah, D. R.(2013). Cardiovascular safety of tyrosine kinase inhibitors: with aspecial focus on cardiac repolarization (QT interval). Drug Saf. 36(5)295-316）。インビトロで最も研究されたものは、ラパチニブである（Lee,H. A., Kim, E. J., Hyun, S. A., Park, S. G., and Kim, K. S.(2010). Electrophysiological effects of the anti-cancer drug lapatinib on cardiac repolarization. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 107(1):614-618）。ラパチニブは、５μＭで、単離したウサギのプルキンエ線維の活動電位持続時間を延長することが示された。このことは、ＩＣ５００．８μＭでＩＫｅチャネルに対する阻害効果、及び５μＭでＩＫｓ振幅に対する軽微な効果と関連していた。ＩＮａ、ＩＫ１又はＩＣａチャネルに対する効果は何ら観察されなかった。
【０２２８】
臨床では、クリゾチニブは、約４．２ｍｇ／ｋｇ又は１５６ｍｇ／ｍ２、ＢＩＤに相当する５００ｍｇ／日（１回２５０ｍｇ１日２回（ＢＩＤ））の用量で投与される。クリゾチニブについての新薬承認申請のＦＤＡのレビューから、５００ｍｇＢＩＤを投与されたがん患者の定常状態Ｃｍａｘは、平均で６５０ｎｇ／ｍＬ又は１．５μＭであった（Xalkori. (2011b). FDA Clinical Pharmacology and BiopharmaceuticsReview of Xalkori (crizotinib), IND No. 202570, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2011/202570Orig1s000ClinPharmR.pdf(accessed October 9, 2013)）。Mosseら（Mosse, Y. P., Lim, M. S., Voss, S.D., et al. (2013). Safety and activity of crizotinib for pediatric patients with refractory solid tumors or anaplastic large-cell lymphoma: a Children’s Oncology Group phase 1 consortium study. Lancet Oncol. 14(16): 472-480）は、小児がん患者の定常状態Ｃｍａｘが、２８０ｍｇ／ｍ２  ＢＩＤ投与後、６３０ｎｇ／ｍＬ（１．４μＭ）となると報告した。これは、ＩＣ５０が本試験で報告された８．９μＭ及びクリゾチニブの開発中に報告された１．１μＭで、インビトロでのＩＫｒチャネルに対する効果の完全な範囲内である（Xalkori(R). (2011a). FDA Pharmacology Review of Xalkori(R) (crizotinib),IND No. 202570, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2011/202570Orig1s000PharmR.pdf(accessed October 9, 2013)）。ニロチニブは、約５ｍｇ／ｋｇ又は１８８ｍｇ／ｍ２、ＢＩＤに相当する６００ｍｇ／日（３００ｍｇＢＩＤ）の用量で投与される。４００ｍｇＢＩＤを投与されたがん患者の定常状態Ｃｍａｘは１７５４ｎｇ／ｍＬ又は３．３μＭであった（Kim, K. P., Ryu, M. H., Yoo, C., et al. (2011). Nilotinib in patients with GIST who failed imatinib and sunitnib: importance of prior surgery on drug availability. Cancer Chemother. Pharmacol. 68(2):285-291）。４００ｍｇＢＩＤを投与された中国人患者の定常状態Ｃｍａｘは２１６１ｎｇ／ｍＬ又は４．１μＭであった（Zhou, L., Meng, F.,Yin, O., et al. (2009). Nilotinib for imatinib-resistant or -intolerant chronic myeloid leukemia in chronic phase, accelerated phase, or blast crisis: a single- and multiple-dose, open-label pharmacokinetic study in Chinese patients. Clin. Ther. 31(7):1568-1575）。本研究では、ＩＫｒアッセイにおいてＩＣ５０が０．０８μＭを示し、ニロチニブの開発中に０．１３μＭが報告された（Tasigna(R). (2007a). FDA Pharmacology Review of Tasigna(R)(nilotinib), IND No. 22-068,http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_PharmR_P1.pdf and http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/022068s000_MedR_P2.pdf,(accessed October 25, 2013)）。
【０２２９】
リポソームがクルクミンのＩＫｒチャネルに対する阻害効果を軽減することが以前報告されている（Helson L, Shopp G, Bouchard A, Majeed M. Liposome mitigation of curcumin inhibition of cardiac potassium delayed-rectifier current. J Recep Lig Channel Res. 2012;5:1-8）。クルクミン単独では、４．９μＭのＩＣ５０でＩＫｒチャネルを阻害し、試験した最高濃度（１１．４μＭ）で８０％の阻害をもたらした。本研究でのものと同じように、同一のリポソームを同一の比率で混合すると、試験した最高濃度クルクミン（１１．４μＭ）単独では４５％の阻害を達成した。混合しただけではなく、リポソームで封入したクルクミンもまた、クルクミン誘発性ＩＫｒ阻害の阻害；１１．４μＭの最高濃度で２５％の阻害をもたらした。本研究は、陽性対照Ｅ−４０３１を単独で試験した場合、ＩＣ５０は５６ｎＭであった。Ｅ−４０３１をリポソームと混合した場合、ＩＣ５０は２１０ｎＭに上昇した。
【０２３０】
吐酒石は、ラット及びヒトにＱＴ間隔延長を引き起こす三価のアンチモン薬である。吐酒石をリポソームで封入した場合、ＱＴ効果は消失する（Maciel NR, Reis PG, Kato KC, et al. Reduced cardio-vascular alterations of tarter emetic administered in long-circulating liposomes in rats. Toxicol Lett. 2010;199(3): 234-238）。吐酒石研究と本研究との間の１つの重要な差異は、使用されたリポソームの組成である。吐酒石研究で使用されたリポソームは、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール２０００ジステアロイルホスファチジル−エチアノールアミン（ethyanolamine）からなっていた。別の差異は、本研究が、単に薬剤をリポソームに混合するだけか又はＱＴ延長薬による処理前にリポソームを注入するだけで、薬剤を封入せずに、阻害効果をもたらしたことを示したことである。
【０２３１】
健常ボランティアにおける１つの臨床試験は、リポソームでの封入がＱＴ延長効果を消失させたことを示した。ヒト及び実験動物においてＱＴ間隔を増大させるブピバカインをリポソーム（Ｅｘｐａｒｅｌ（登録商標））中に封入した場合、同剤は７５０ｍｇの高用量で皮下投与されてもＱＴ延長を引き起こさなかった（Naseem A, Harada T, Wang D, Arezina R, Lorch U, Onel E, Camm AJ,Taubel J. Bupivacaine extended release liposome injection does not prolong QTc interval in a thorough QT/QTc study in healthy volunteers. J Clin Pharmacol. 2012;52(9):1441-7）。吐酒石研究での場合と同様、ここでは薬剤を封入し、リポソームの組成は本研究とは異なっていた：コレステロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３  ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）、トリカプリリン及び１，２−ジエルコイルホスファチジルコリン。
【０２３２】
薬剤のＩＫｒ（ｈＥＲＧ）電流に対する効果を評価するインビトロでのアッセイは、薬剤の臨床でのＱＴｃ間隔に対する潜在的な効果を予測しやすくするために広範に用いられている（Witchel, H. J. (2011). Drug-induced hERG block and QT syndrome. Cardiovasc Ther. 29(4):251-259）。これは有用なアッセイではあったが、時折、偽陽性の結果を生じた。本研究は、このインビトロでのアッセイが、ヒト及び動物の両方におけるインビボでのＱＴｃ延長のすぐれた予測となる例を示す。
【０２３３】
驚くべきことに、本研究のデータ、及びクルクミンについてのデータ（Helson L, Shopp G,Bouchard A, Majeed M. Liposome mitigation of curcumin inhibition of cardiacpotassium delayed-rectifier current. J Recep Lig Channel Res. 2012;5:1-8）に基づくと、クリゾチニブ及びニロチニブ並びにおそらくは他のＱＴｃ延長薬によるＩＫｒ抑制を軽減するために、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソーム内に薬剤を封入する必要はないように思われる。化合物をリポソームと単に混合するだけで十分であり得る。本発明は、経口投与されたＱＴ延長薬について、リポソームの徐放製剤の同時皮下投与で十分であり得ることを立証する。本明細書中で立証される方法及び技術を使用することで、ＱＴｃ延長に関するインビボでの動物モデルでのＱＴ延長薬を研究することが可能となる。
【０２３４】
本明細書で論じられたいずれの実施形態も、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に関して実施することが可能で、その逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するのに使用することができる。
【０２３５】
本明細書に記載された個々の実施形態は、説明として示されたものであり、本発明の制限として示されるものではないことが理解される。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態で使用することができる。当業者は、本明細書に記載された具体的な手順に対する多数の等価物を認識し、又は単なる通常の実験を用いて確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内であるとみなされ、請求項に包含される。
【０２３６】
本明細書で言及されたすべての出版物及び特許出願は、本発明が関連する当業者の技術のレベルにおいて表示される。すべての出版物及び特許出願は、それぞれの個々の出版物又は特許出願が参照により組み込まれることを具体的に及び個別に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
単語「a」又は「an」の使用は、請求項及び／又は本明細書において用語「含む（comprising）」と共に使用される場合、「１つの（one）」を意味し得るが、「１又は２以上（one or more）」、「少なくとも１つ（at least one）」、及び「１又は１を超える（one or more than one）」の意味とも一致する。請求項における用語「又は（or）」の使用は、代替物のみを指すことが明確に示されない、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は（and/or）」を意味するように使用されるが、開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約（about）」は、値が、その値を決定するために用いられているデバイス、方法に固有の誤差のばらつき、又は試験対象の間に存在するばらつきを包含することを示すために使用する。
【０２３８】
本明細書及び請求項で使用される場合、単語「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」などの、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに「含む（includes）」及び「含む（include）」などの、含む（including）の任意の形態）又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」などの、含有する（containing）の任意の形態）は、包含的又は非限定的であり、別の、列挙されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で提示される組成物及び方法のいずれかの実施形態において、「含む（comprising）」は、「本質的に〜からなる（consistingessentially of）」又は「〜からなる（consisting of）」に取って替わられる場合がある。本明細書で使用される場合、句「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、所定の完全なるもの（複数可）又はステップ、並びに請求される本発明の特徴又は機能に著しく影響を及ぼさないものを必要とする。本明細書で使用される場合、用語「なる（consisting）」は、列挙される完全なるもの（例えば、特徴、要素、特質、特性、方法／方法ステップ若しくは限定）又は完全なるものの群（例えば、特徴（複数可）、要素（複数可）、特質（複数可）、特性（複数可）、方法／方法ステップ若しくは限定（複数可））の存在を表すのに使用される。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、用語「又はこれらの組合せ（or combinations thereof）」は、用語に先行する列挙されたアイテムのすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つ、及び特定の文脈において順番が重要である場合は、同様にＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことが意図される。この例に続いて、明示的に含まれるのは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等などの１又は２以上のアイテム又は用語の反復を含有する組合せである。当業者は、文脈から特に明白でない限り、いずれの組合せでも典型的にはアイテム又は用語の数に制限はないことを理解する。
【０２４０】
本明細書で使用される場合、近似値を表す語句、限定されないが、「約（about）」、「実質的（substantial）」又は「実質的に（substantially）」などの語句は、そのように修飾した場合、必ずしも絶対又は完全ではないと理解されるものの、そのような状況が存在していると当業者が明示する旨を保証するには十分近いとみなされる状況を指す。記載が変動し得る範囲は、変化がどの程度大きいかに左右され、上記の語句で修飾されていない特徴に要求される特徴及び能力が依然として修飾された特徴にも備わっていると当業者に認識させるものとする。前述の議論によるが、一般に、本明細書において「約（about）」などの近似を示す語句で修飾された数値は、記載の数値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％だけ変動し得る。
【０２４１】
さらに、本明細書における項目の見出しは、３７  ＣＦＲ  １．７７の推奨に従うべく、あるいは体系上の手掛かりを提供するべく付与されている。これらの見出しは、本開示から公表されるであろういずれの請求項において記載される発明を限定又は特徴付けたりするものではない。具体的に、また例として、その見出しが「発明の分野」に言及していたとしても、いわゆる技術分野を記載するためにこの見出しの項において選択されている文言により請求項は限定されることはない。さらに、「背景技術」における技術の記載は、その技術が、本開示のいずれかの発明にとって先行する技術であると承認したものと解されるべきではない。同様に「概要」も、公表される請求項に記載の発明を特徴付けるものとみなされるべきではない。さらに、本開示において単数形で「発明」と言及するいずれの箇所も、本開示には新規な点が１つだけしかないと主張するべく用いられるべきではない。本開示から公表される複数の請求項の限定に従って複数の発明が述べられるので、このような請求項により、保護される発明及びその等価物が定義される。あらゆる例において、このような請求項の範囲は、本開示に照らして内容本位で考慮されるべきであり、本開示おいてに記載される見出しにより限定されるべきではない。
【０２４２】
本明細書に開示及び請求された組成物及び／又は方法のすべては、本開示に照らして過度な実験をすることなく作製し実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されたが、変形形態が、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物及び／又は方法、並びに方法のステップ又は方法のステップの順序に適用され得ることが、当業者には明らかとなる。当業者に明らかなこのような類似の置換及び変更はすべて、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
【０２４３】
参考文献−実施例１
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参考文献−実施例２
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追加の参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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