(57)【要約】【課題】CADの罹患予測を補助することのできる、CADの罹患リスクの判定方法を提供する。【解決手段】FH遺伝子及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の両方のダメージングバリアントを有するオリゴジーンFHを有する患者は、高いLDLコレステロール値及び高度に上昇したCADに対するオッズを有することを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の生物学的試料において、ABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1から構成されるLDL上昇アクセサリー遺伝子のいずれか１以上の変異を検出することを含む、冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定補助方法。
【請求項２】
さらに、FH遺伝子の変異を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異の両方が検出される場合には、冠動脈疾患の罹患リスクが高いと判定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下の順位で冠動脈疾患の罹患リスクが高いと判定される、請求項２に記載の方法。
（１）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（２）FH遺伝子の変異を有する被検者
（３）LDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（４）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有さない被検者
【請求項５】
FH遺伝子の変異がヘテロ接合性である、請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
FH遺伝子がLDLR、PCSK9及び／又はAPOBである、請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者が１５歳以上でありかつ180 mg/dL以上又は１４歳以下でありかつ140 mg/dL以上のLDLコレステロールレベルを有する、請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定の補助方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（家族性高コレステロール血症）
家族性高コレステロール血症（Familialhypercholesterolemia：FH）は、原発性の高LDLコレステロール血症（primary hyper low-density lipoprotein cholesterolemia）、腱黄色腫（tendon xanthomas）及び早期冠動脈疾患｛premature coronaryartery disease｝の臨床の3つの徴候により特徴づけられる（非特許文献１）。
【０００３】
FHは、LDL receptor（LDLR）、apolipoprotein B（APOB）及び proproteinconvertase subtilisin/kexin type 9（PCSK9）等のLDL代謝に関連した遺伝子におけるダメージング突然変異（damaging mutations）により引き起こされることが知られている（非特許文献２）。
FHは、常染色体優性遺伝性疾患であり、ヘテロ接合体性FH（以下、ヘテロFHと称する場合がある）とホモ接合性FH（以下、ホモFHと称する場合がある）がある。
【０００４】
（冠動脈疾患）
冠動脈疾患（CAD：coronary artery disease）は、冠動脈に狭窄または閉塞が生じる疾患として知られている。冠動脈疾患の罹患のリスクは、遺伝子的要因、高齢、喫煙、高血圧、高コレステロール、糖尿病、運動不足、肥満等によって増加すると言われている。
【０００５】
（先行技術）
家族性高コレステロール血症の遺伝子解析方法として、「FH関連遺伝子変異、特にLDLR遺伝子の全エクソンおよびエクソン ・イントロン境界領域における遺伝子変異もしくは遺伝子多型の有無を一度に検出可能なプライマーセット」が知られている（特許文献１）。
冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法として、「BTN2A1中の遺伝子多型、又はILF3中の遺伝子多型のうちの少なくとも1個の遺伝子多型を決定することを特徴とする日本人における冠動脈疾患の遺伝的リスクの検出方法（特許文献２）」が知られている。
先行技術では、本発明の冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定の補助方法を開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2013-17478号公報
【特許文献２】特開2011-172543号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Goldstein JL, Hobbs HH, Brown MS. Familial hypercholesterolemia. In:Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors. The metabolic and molecularbases of inherited disease. New York: McGraw-Hill, 2001:2863e913.
【非特許文献２】Soutar AK, Naoumova RP. Mechanisms of disease: genetic causes offamilial hypercholesterolemia. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007;4:214-225.
【非特許文献３】Posey JE,Harel T, Liu P, Rosenfeld JA, James RA, Coban Akdemir ZH, et al. Resolution ofdisease phenotypes resulting from multilocus genomic variation. N Engl J Med.2017;376:21-31.
【非特許文献４】Blue GM,Kirk EP, Giannoulatou E, Sholler GF, Dunwoodie SL, Harvey RP, Winlaw DS.Advances in the genetics of congenital heart disease: a clinician's guide. J AmColl Cardiol. 2017;69:859-870.
【非特許文献５】Tada H,Kawashiri MA, Ikewaki K, Terao Y, Noguchi T, Nakanishi C, et al. Alteredmetabolism of low-density lipoprotein and very-low-density lipoprotein remnantin autosomal recessive hypercholesterolemia: results from stable isotopekinetic study in vivo. Circ Cardiovasc Genet. 2012;5:35-41.
【非特許文献６】Tada H,Kawashiri MA, Takata M, Matsunami K, Imamura A, Matsuyama M, et al. Infantilecases of sitosterolaemia with novel mutations in the ABCG5 gene: extremehypercholesterolaemia is exacerbated by breastfeeding. JIMD Rep.2015;21:115-122.
【非特許文献７】Tada H,Kawashiri MA, Ohtani R, Noguchi T, Nakanishi C, Konno T,et al. A novel type offamilial hypercholesterolemia: double heterozygous mutations in LDL receptorand LDL receptor adaptor protein 1 gene. Atherosclerosis. 2011;219:663-666.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では、CADの罹患予測を補助することのできる、CADの罹患リスクの判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、FH遺伝子及びLDL上昇アクセサリー遺伝子（LDL-altering accessory genes）の両方のダメージングバリアントを有するオリゴジーンFHを有する患者（特に、重度に上昇したLDLコレステロール値を有する患者の中でのオリゴジーンFHを有する患者）は、高いLDLコレステロール値及び高度に上昇したCADに対するオッズを有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下の通りである。
１．被験者の生物学的試料において、ABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1から構成されるLDL上昇アクセサリー遺伝子のいずれか１以上の変異を検出することを含む、冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定補助方法。
２．さらに、FH遺伝子の変異を検出することを含む、前項１に記載の方法。
３．FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異の両方が検出される場合には、冠動脈疾患の罹患リスクが高いと判定される、前項２に記載の方法。
４．以下の順位で冠動脈疾患の罹患リスクが高いと判定される、前項２に記載の方法。
（１）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（２）FH遺伝子の変異を有する被検者
（３）LDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（４）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有さない被検者
５．FH遺伝子の変異がヘテロ接合性である、前項１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．FH遺伝子がLDLR、PCSK9及び／又はAPOBである、前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．前記被験者が１５歳以上でありかつ180 mg/dL以上又は１４歳以下でありかつ140 mg/dL以上のLDLコレステロールレベルを有する、前項１〜６のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規なCADの罹患リスクの判定方法又は判定補助方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】FH変異の分類。被験者におけるFH変異の有病率を示す。
【図２】LDL上昇アクセサリー遺伝子変異の分類。被験者におけるLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の有病率を示す。
【図３】FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の存在／数に基づく被験者の分類。重度の高コレステロール血症を有する被験者における遺伝子型決定および表現型決定をした。被験体を、FH変異の存在／数、LDL上昇アクセサリー遺伝子変異（グループ１〜５）に基づいて5つの群に分けた。グループ１は、突然変異のない被験者を示す。グループ２は、従来のFH遺伝子における単一の突然変異を有さず、かつLDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有する被験者を示す。グループ３は、従来のFH遺伝子における単一の突然変異を有し、かつLDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有さない被験者を示す。グループ４は、従来のFH遺伝子における単一の突然変異およびLDL上昇のアクセサリー突然変異を有する被験者を示す。グループ５は、従来のFH遺伝子に二重変異を有するホモFHを有する被験者を示す。
【図４】LDLコレステロール値に対するFH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の影響。LDLコレステロールレベルを変異状態（グループ１〜５）ごとにプロットした。* P <0.05、** P <0.001。
【図５】CADに対するFH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の影響。CADのオッズ比は、年齢、性別、高血圧、糖尿病、喫煙及びLDLコレステロールレベルを調整した後の多変量ロジスティック回帰を用いて計算した。各系列における■（四角）はサンプルサイズを示し、横線は95%CI（信頼区間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、冠動脈疾患の罹患リスクの判定方法又は判定補助方法に関する。以下で詳細に説明する。
【００１４】
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法では、FH遺伝子及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の両方における変異（遺伝子多型、タンパク質切断）の有無を検出する。また、本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法では、遺伝子多型（一塩基多型）に代わり、該多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を検出しても良い。すなわち、本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法では、該連鎖不平衡にある一塩基多型の有無を検出することも含む。
【００１５】
（FH遺伝子）
FH遺伝子は、家族性高コレステロール血症（FH）の原因遺伝子であり、3つのFH関連遺伝子LDLR、PCSK9及びAPOBの突然変異に起因する。
LDLR遺伝子、ApoB遺伝子及びPCSK9遺伝子は常染色体優性遺伝性高コレステロール血症（autosomal dominant hypercholesterolemia; ADH）の病因遺伝子である。
【００１６】
（LDL上昇アクセサリー遺伝子）
LDL上昇アクセサリー遺伝子（LDL-altering accessory genes）は、下記の実施例より抽出したLDLの上昇に関与する遺伝子であるABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1からなる。LDLRAP1遺伝子は劣勢遺伝形式を示すARHの病因遺伝子である。
【００１７】
（オリゴジーン）
「オリゴジーン（oligogenic）」の疾患の概念が近年の包括的遺伝子解析の進展に基づき確立されている。複数の低頻度のダメージングバリアントが、オリゴジーンの疾患を介してメンデル遺伝病と関連付けられている（非特許文献３及び４）。
近年の研究により、LDLreceptor adaptor protein 1（LDLRAP1）遺伝子における変異により引き起こされる常染色体性劣性高コレステロール血症（autosomal recessive hypercholesterolemia：ARH）、又はATP-binding cassette sub-family G member 5/8 （ABCG5/8）遺伝子における変異により引き起こされるシトステロール血症等の脂質関連常染色体劣性遺伝疾患を引き起こす遺伝子のヘテロ接合性のダメージングバリアントであっても、オリゴジーン遺伝（oligogenic inheritance）に相加的に寄与し得ることが明らかになっている（非特許文献５〜７）。
【００１８】
（オリゴジーンFH）
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法で検出する「オリゴジーンFH」は、従来のFH遺伝子における変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子における変異の両方が存在することをいう。
「オリゴジーンFHを検出する」とは、従来のFH遺伝子における変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子における変異の両方を検出することをいう。
「従来のFH遺伝子における変異」とは下記の表３のいずれか１以上のヘテロ接合性の変異であり、「LDL上昇アクセサリー遺伝子における変異」とは下記の表４のいずれか１以上のホモ接合性及び／又はヘテロ接合性の変異である。
【００１９】
（罹患リスク）
「罹患リスク」は、ある疾患に罹るおおよその確率、またはある疾患に罹らないおおよその確率を意味する。「罹患リスクが高い」とは、他の被験者と比較して、ある疾患に罹るおおよその確率が高いことを意味し、感受性が高いと言い換えることができる。一方、「罹患リスクが低い」とは、他の被験者と比較して、ある疾患に罹るおおよその確率が低いことを意味し、感受性が低い、あるいは抵抗性が高いと言い換えることができる。
「罹患リスクの判定」とは、ある疾患に罹る可能性の判断を意味し、罹患危険性の予測と言い換えることができる。
【００２０】
本実施例において、以下の知見を得ている。さらに、本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法は、該知見を基にして完成している。
なお、ヘテロFHの血中TC（平均±SD）は330±60 mg/dl、ホモFHでは669±104 mg/dl、正常者では179±26 mg/dlである。よって、ホモFH及びヘテロFHは、正常者と比較して、それぞれ約2倍及び約4倍となっている（参照：特許文献１）。
すなわち、本発明の高LDLコレステロールレベルとは、約180 mg/dL以上（15歳未満の場合140 mg/dL以上）を意味する。
（１）オリゴジーンFHを有する被験者は、FH変異（FH遺伝子の変異）及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、高いLDLコレステロールレベルを示す（又は、将来高くなる可能性がある）。例えば、現在、高いLDLコレステロールレベルを示さない若い人が、将来高LDLコレステロールレベルになることを予測（判定）できる。
また、オリゴジーンFHを有する患者（特に、重度に上昇したLDLコレステロールを有する患者の中でオリゴジーンFHを有する患者）は、LDLコレステロールがより高く（将来さらに高くなる可能性がある、重篤化の可能性がある）及びCADのリスクが高い。
（２）オリゴジーンFHを有する被験者は、ヘテロFHのみを有する被検者と比較して、有意に高いLDLコレステロールレベルを示す（又は、将来高くなる可能性がある）。例えば、現在、高いLDLコレステロールレベルを示さない若い人が、将来高LDLコレステロールレベルになることを予測（判定）できる。また、オリゴジーンFHを有する被験者は、ヘテロFHを有する患者よりもより厳格な治療等が必要になることを事前に予測（判定）することができる。
（３）LDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有する患者は、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、高いLDLコレステロールレベルを示す（又は、将来高くなる可能性がある）。例えば、現在、高いLDLコレステロールレベルを示さない若い人が、将来高LDLコレステロールレベルになることを予測（判定）できる。
（４）遺伝子解析により、タンパク質切断変異が見つかった場合には、遺伝子多型変異と比較して、より重症な臨床像、例えば、重篤な家族性高コレステロール血症、重篤なCADに呈する可能性があることを早期に予見可能となる。
（５）LDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有する患者（特に、LDLコレステロール値が高いLDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有する患者）は、該変異が高LDLコレステロールレベルの原因の可能性があり、さらに、CADのリスクが高く、さらに重篤化する可能性がある。すなわち、厳格な治療等が必要になる。
（６）オリゴジーンFHを有する被験者は、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、CADのリスクが高い。
【００２１】
本発明においては、オリゴジーンFHを検出することによって、CADの罹患リスクを判定することができる。高いLDLコレステロールレベルを有する患者群において、オリゴジーンFHを検出することによって、CAD罹患リスクを有する患者群及び／又はCAD罹患リスクが低い患者群を選別することができる。
オリゴジーンFHを検出することによって、将来高LDLコレステロールレベルになることを予測できる。また、高いLDLコレステロールレベルを有する患者群において、オリゴジーンFHを検出することによって、より高いLDLコレステロール（重篤化の可能性）を有する患者群を選別することができる。
LDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を検出することによって、将来、CADに罹患する、さらにはCADが重篤化することを予測できる。また、高いLDLコレステロールレベルを有する患者群において、オリゴジーンFHを検出することによって、CAD罹患リスクを有する患者群及び／又はCAD罹患リスクが低い患者群を選別することができる。
【００２２】
本発明において、オリゴジーンFHが検出された被験者は、FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異が検出されない被験者、FH遺伝子の変異が検出されLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異が検出されない被験者、並びにFH遺伝子の変異が検出されずLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異が検出された被験者と比較して、CADの罹患リスクが相対的に高いと判定できる。より詳しくは、以下の順位で冠動脈疾患の罹患リスクが高いと判定できる。
（１）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（２）FH遺伝子の変異を有する被検者
（３）LDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有する被検者
（４）FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異を有さない被検者
【００２３】
（CADの罹患リスクの判定方法）
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法の工程は、特に限定されないが、例えば、以下の工程を例示することができる。
（ｉ）被験者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、（ｉｉ）前記工程（ｉ）において得られた生体試料中のゲノムDNA上のFH遺伝子の下記表３に示す変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の下記表４に示す変異が存在する位置の塩基の種類を決定し、FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異の有無を決定する工程、並びに（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）において決定された変異の有無に基づいて、当該被験者のCADの罹患リスクを判定する工程を含む方法であり得る。
【００２４】
また、本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法は、（ｉ）被験者から、ゲノムDNAを含有する生体試料を採取する工程、（ｉｉ）前記工程（ｉ）において得られた生体試料中のゲノムDNA上のFH遺伝子の下記表３に示す変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の下記表４に示す変異が存在する位置の塩基の種類を決定し、FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異の有無を決定する工程、並びに（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）においてFH遺伝子の下記表３に示す変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の下記表４に示す変異を両方有するときに、当該被験者のCADの罹患リスクが高いと判定する（判定を補助する）工程を含む方法であり得る。
【００２５】
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法は、CADの罹患予測を補助する方法、あるいは、CADの罹患リスクの検査方法としても利用することができる。
【００２６】
（被験者）
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法の対象となる「被験者」は、特に限定されず、例えば、健常者、CADを罹患している（可能性がある）と診断された患者、LDLコレステロールレベルが180 mg/dL以上（15歳未満の場合140 mg/dL以上）である患者、原発性の高LDLコレステロール血症の患者、腱黄色腫の患者、早期冠動脈疾患の患者又はこれらの合併症の患者を挙げることができる。
【００２７】
（生物学的試料）
本明細書において「生物学的試料」は、ゲノム遺伝子解析が可能であれば特に限定されず、例えば被験者から単離された組織、細胞、体液、尿およびそれらの混合物を挙げることができる。ここで体液とは、血液、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液、間質液）などを例示できる。好ましくは、被験者から単離された血液を例示できる。
【００２８】
「生物学的試料」は、被験者から単離された組織、細胞、体液、尿およびそれらの混合物から調製された核酸抽出液であってもよい。核酸抽出物はゲノムDNAを含むものであることが好ましい。核酸抽出液の調製は、自体公知の核酸調製法に従い、核酸を抽出することにより実施できる。
【００２９】
（オリゴジーンFHの検出）
被験者から採取した生物学的試料におけるオリゴジーンFHの検出は、自体公知の遺伝子多型の検出方法に従って実施することができ、遺伝子多型の検出を実施できる限りにおいていずれの方法も使用することができる。
【００３０】
遺伝子多型の検出は、具体的には、例えば、遺伝子多型を含むDNA断片を増幅し、次いで該DNA断片に存在する遺伝子多型を検出することにより実施できる。
【００３１】
遺伝子多型を含むDNA断片の増幅は、自体公知の核酸増幅法により実施することができる。核酸増幅法として、ポリメラーゼ連鎖反応（polimerase chain reaction；以下、PCRと略称する。）、リアルタイムPCR（real-time PCR）、LCR（ligase chainreaction）、LAMP（loop-mediated isothermal amplification）法等を例示できる。
【００３２】
DNA断片の増幅に使用されるプライマーは、例えば、検出する遺伝子多型が存在する部位を含む連続する少なくとも10塩基以上、好ましくは10〜100塩基、より好ましくは10〜50塩基の配列を増幅することのできるオリゴヌクレオチドを、当該遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計し、自体公知の核酸合成法にしたがって合成することにより取得できる。また、市販されているプライマーやプローブから所望のものを選択して利用することもできる。プライマーは、検出する遺伝子多型が存在する部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において1又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００３３】
増幅用プライマーは、1つの遺伝子多型のみを検出する場合には、該1つの遺伝子多型のみが増幅されるように、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方がその遺伝子多型部位にハイブリダイズするように設計することができる。このようなプライマーは、増幅反応が起こったか否かを測定することにより遺伝子多型を検出することができる。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質などにより標識することができる。
【００３４】
遺伝子多型の種類や数に拘らずに、増幅産物中の遺伝子多型を検出することを目的として、遺伝子多型部位を含む所望の領域を挟むように2つのプライマーを設計することも可能である。このようなプライマーを使用して得られる増幅産物のサイズ、塩基配列、高次構造等の差異に基づいて、遺伝子多型を検出することができる。
【００３５】
遺伝子多型の検出を得られた増幅産物のサイズの差異に基づいて行う場合には、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などにより、サイズの差異による移動度の違いを利用して、特定の遺伝子多型を検出することができる。また、制限酵素断片長多型（restriction fragment length polymorphism：RFLP）を利用して検出することもできる。この場合には、遺伝子多型を含む領域を増幅した後、得られた増幅産物を、所定の遺伝子多型に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化された増幅産物は、遺伝子多型の種類に応じてサイズが異なるため、上述と同様に電気泳動法等を利用して検出することができる。
【００３６】
遺伝子多型の検出を塩基配列の差異に基づいて遺行う場合には、得られた増幅産物を直接配列決定すること（ダイレクトシークエンシング法）により、特定の遺伝子多型を検出することができる。配列決定は、例えばジデオキシ法、マキサム−ギルバート法などの自体公知の方法により実施できる。
【００３７】
遺伝子多型の検出を立体構造の差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、PCR−単鎖高次構造多型（single nucleoitde conformation polymorphism：SSCP）分析により、特定の遺伝子多型を検出することができる。PCR−SSCP分析は、PCRにより得られた増幅産物を熱変性によって一本鎖DNAとした後、これを電気泳動により分離し、配列変化による移動度の変化を解析する方法であり、遺伝子多型の差異によって一本鎖DNAの高次構造が異なることにより移動度が異なることを利用するものである。
【００３８】
遺伝子多型の検出は、遺伝子多型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、例えば、検出する遺伝子多型が存在する部位を含む連続する少なくとも10塩基以上、好ましくは10〜100塩基の配列、より好ましくは10〜50塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを、当該遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計し、自体公知の核酸合成法にしたがって合成することにより取得できる。プローブを設計するとき、検出する遺伝子多型がプローブのほぼ中心部に存在するように設計することが好ましい。プローブは、検出する遺伝子多型部位を含み、試料から調製したDNA等とハイブリダイズして該遺伝子多型を特異的に検出可能なものである限りどのようなものであってもよく、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、ガラスビーズ、ガラス基板、シリコンウエハ、または樹脂などの支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、プローブは、検出する遺伝子多型について作製したプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ又はDNAチップの形で用いることもできる。
【００３９】
ハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型の特異的な検出に十分な条件であり、例えば、試料から調製したDNA等に検出する遺伝子多型が存在するときにはハイブリダイズするが、遺伝子多型が存在しない、または他の遺伝子多型が存在するときにはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、42℃で1×SSC（0.15 M NaCl、0.015 M クエン酸ナトリウム）、0.1％の硫酸ドデシルナトリウムを含む緩衝液による42℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４０】
遺伝子多型の検出は、上記例示した方法以外にも、当業者に公知の方法によって検出することができる。そのような方法として、定量的リアルタイムPCR検出法（TaqMan法）インベーダー（Invader）法、変性勾配ゲル電気泳動法（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE）、及びランダムに切断された数千万−数億のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定する手法等を例示できる。
【００４１】
（CADの罹患リスクの判定用試薬キット）
本発明において、オリゴジーンFHを検出し得るプライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドを含む、CADの罹患リスクの判定用試薬キットを提供することができる。本発明に係る試薬キットは、上記オリゴヌクレオチド以外に、上記伝子多型の検出を実施するために必要な１種以上の成分を含むものであり得る。そのような成分としては、特に限定されるものではないが、制限酵素、ポリメラーゼ、緩衝液、dNTP、標識用および検出用試薬（蛍光色素等）等を挙げることができる。
【００４２】
本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法および該リスクの判定用試薬キットにより、客観的、簡便、迅速かつ高い精度でCADの罹患リスクを判定することができる。したがって、本発明に係るCADの罹患リスクの判定方法を実施することにより、CADの罹患リスクがあると判定された被験者に対して、その治療においてCADを形成しないように、適用する治療薬の種類の選定、治療スケジュールの調整、療養指導の強化等を行うことができる。
【００４３】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
本実施例は、金沢大学の倫理委員会の承認を受けた。承認後の全ての手続きは、人体実験（施設および国家）に関する責任委員会の倫理基準｛the ethical standards of the responsible committee on human experimentation (institutional and national)｝、及び2008年に改訂された1975年のヘルシンキ宣言を遵守した。遺伝子解析のためのインフォームド・コンセントは全ての被験者から同意を得た。
【実施例】
【００４５】
FH遺伝子の変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子と定義した4つの遺伝子の変異を検出し、該変異の存在及び数と諸臨床症状（兆候）との関係を評価した。詳細は、以下の通りである。
【００４６】
［被験者］
血清LDLコレステロールレベル180 mg/dL以上、又は15歳未満の被験者の場合140 mg/dL以上である500人の無関係な日本人の被験者（平均年齢45歳、男性203人 [41%]、CAD 患者= 123人[25%]）に係るデータを横断形式（cross-sectional manner）において遡及的に解析した。被験者は、LDLレベルの増加の既知の副因を有さずかつ全データを有した。全ての被験者において、脂質降下療法（lipid-lowering therapies）の導入前に評価したデータを使用した。
【００４７】
［FHの臨床兆候］
LDLコレステロールの有意な上昇に加えて、以下のFHの臨床兆候について被験者を評価した：
a）腱黄色腫（手、肘、膝等の裏の腱黄色腫、又はアキレス腱の肥大；厚さ9 mm以上のアキレス腱のX線評価）又は結節型黄色腫、及び
b）日本動脈硬化学会により推奨される基準による患者の2等親中のFH又は早期CADの家族歴（Teramoto T, Sasaki J, Ishibashi S, Birou S, Daida H, Dohi S, et al.Familial hypercholesterolemia. J AtherosclerThromb. 2014;21:6-10.）。
【００４８】
［結果］
被験者の臨床兆候を表１に示す。合計324人（65％）の被験者が2つのFHの臨床的兆候（黄色腫及び家族歴）のいずれかを示した。多くのパラメータにおいて、CAD有り及び無しの間で有意差がみられた。
【００４９】
【表１】
2019136000.tif 000002
FHはfamilial hypercholesterolemia、CADはCoronary artery disease、HDLはhigh-density lipoprotein、LDLはlow-density lipoproteinを示す。
【００５０】
［脂質異常関連メンデル遺伝子のエクソン配列の決定］
標準的なDNA抽出プロトコールを用いて、各被験者のゲノムDNAを末梢白血球から単離した。DNAはプールし、サイズで選別し、シークエンシングアダプタに連結し、及びKapa DNA Library Preparationを用いて配列決定した標的配列をエンリッチに増幅した。３つのFH遺伝子（LDLR、PCSK9及びAPOB）及び４つのLDL上昇アクセサリー遺伝子（ABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1）における全てのコーディングエクソンを捕捉するためにA custom NimbleGen in-solution DNA capture library（Roche NimbleGen Inc.）を設計した。標的配列エンリッチな産物をIllumina MiSeq（イルミナ株式会社）を用いて配列決定した。
【００５１】
［結果］
決定したエクソンの染色体番号、ゲノム座標及び遺伝子名を表２に示す。
３つのFH遺伝子であるLDLR、APOB及びPCSK9、並びに、４つのLDL上昇アクセサリー遺伝子であるABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1の標的配列決定を行った。各被験者の標的カバー率（target coverage）は全ての標的エクソンの98％以上において20倍以上であった。
【００５２】
【表２−１】
2019136000.tif 000003
【００５３】
【表２−２】
2019136000.tif 000004
ABCG5はATP-binding cassette sub-familyG member 5、ABCG8はATP-binding cassette sub-family G member 8、APOBはapolipoprotein B、APOEはapolipoprotein E、LDLRはLDL receptor、LDLRAP1はLDL receptor adaptor protein 1、PCSK9はproprotein convertasesubtilisin/kexin type 9を示す。
【００５４】
［LDLR、PCSK9及びAPOB遺伝子におけるFHの原因バリアントの決定］
以下の基準のいずれか１を満たした場合にFHの原因バリアント（causative variant）と定義した：
a）LDLR遺伝子でのレア（東アジア人におけるマイナーアリル頻度1％未満）タンパク質切断バリアント（truncating variants）（フレームをシフトする未成熟終止、挿入若しくは欠失、又は標準的なスプライシング部位）；
b）5つのsilico softwares（SIFT, Polyphen2-HDIV, Polyphen2-HVAR,MutationTaster-2, and LRT）によりダメージングと予測されたものとして定義された、LDLR遺伝子でのレアダメージングミスセンスバリアント（Khera AV, Won HH, Peloso GM, Lawson KS, Bartz TM, Deng X, et al. Diagnosticyield and clinical utility of sequencing familial hypercholesterolemia genes inpatients with severe hypercholesterolemia. JAm Coll Cardiol. 2016;67:2578-2589.）；
c）LDLR、PCSK9又はAPOBにおいてFHを引き起こすClinVarに登録した病原性又は病原性様バリアント（Landrum MJ, Lee JM, Riley GR, Jang W, Rubinstein WS, Church DM, etal. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and humanphenotype. Nucleic Acids Res.2014;42:D980-D985.）；及び
d）日本人において家族性高コレステロール血症を引き起こすPCSK9 p.Val4Ile及びp.Glu32Lysバリアント（Mabuchi H, Nohara A, Noguchi T, Kobayashi J, Kawashiri MA, Inoue T,et al. Genotypic and phenotypic features in homozygous familialhypercholesterolemia caused by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9) gain-of-function mutation. Atherosclerosis.2014;236:54-61.及びOhta N, Hori M, Takahashi A, Ogura M, Makino H, Tamanaha T, et al.Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 V4I variant with LDLR mutationsmodifies the phenotype of familial hypercholesterolemia. J Clin Lipidol. 2016;10:547-555.）。
さらに、これらのバリアントが標準的なACMG基準（the standardACMG criteria）に基づいて「病原性」又は「病原性様」と分類されるかどうかを評価した（Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al.Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a jointconsensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomicsand the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17:405-424.）。
【００５５】
［結果］
結果を表３及び図１に示す。
248人の被験者（50％）においてLDLR及び／又はPCSK9遺伝子において原因変異を有する（図３のグループ３に該当する）「古典的FH（classical FH）」を同定した。
「Yu W, Nohara A,Higashikata T, Lu H, Inazu A, Mabuchi H. Molecular genetic analysis of familialhypercholesterolemia: spectrum and regional difference of LDL receptor genemutations in Japanese population. Atherosclerosis.2002;165:335-342.」に記載の通り、LDLR遺伝子におけるナンセンス変異（c.2431A>T, p.Lys811X）は、本実施例のコホート内で頻繁に観察された（n = 81、31%）。
加えて、本実施例のコホートにおける被験者は、APOB遺伝子における原因変異を内包しなかったが、「Mabuchi H, Nohara A, Noguchi T, Kobayashi J, Kawashiri MA, Inoue T,et al. Genotypic and phenotypic features in homozygous familialhypercholesterolemia caused by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9) gain-of-function mutation. Atherosclerosis.2014;236:54-61.」に記載の通り、PCSK9遺伝子における機能獲得型変異（c.94G>A, p.Glu32Lys）は比較的頻繁に観察された（n= 36、14%）。
【００５６】
【表３−１】
2019136000.tif 000005
【００５７】
【表３−２】
2019136000.tif 000006
LDLRはLDL receptor、PCSK9はProprotein convertase subtilisin/kexin type 9を示す。
【００５８】
［LDL上昇アクセサリー遺伝子におけるFHの原因アクセサリーバリアントの決定］
以下の基準のいずれか１を満たした場合にABCG5、ABCG8、APOE及びLDLRAP1遺伝子におけるFH表現型についての原因「アクセサリー」バリアントと定義した：
a）レアタンパク質切断バリアント；
b）レアダメージングミスセンスバリアント；及び
c）高コレステロール血症を引き起こすClinVarに登録された病原性又は病原性様バリアント。
さらに、これらのバリアントが標準的なACMG基準に基づいて「病原性」又は「病原性様」と分類されるかどうかを評価した（Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al.Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a jointconsensus recommendation of the American College of Medical Genetics andGenomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17:405-424.）。
【００５９】
［結果］
結果を表４及び図２に示す。
LDL上昇アクセサリー遺伝子であるABCG5/8、APOE又はLDLRAP1における有害突然変異（図３のグループ2及び4）が57人（11％）の被験者において同定され、該患者の中で27人（11人）のFH患者（図３のグループ4）が見つかった。前記変異のいくつかはシトステロール血症又はARHを引き起こすことが知られているが、他の変異はAPOE7に関するものであった。
【００６０】
【表４】
2019136000.tif 000007
ABCG5はATP-binding cassette sub-family G member 5、ABCG8はATP-binding cassette sub-family G member 8、APOEはapolipoprotein E、LDLRAP1はLDL receptoradaptor protein 1を示す。
【００６１】
［被験者の分類］
有意に上昇した（高い）LDLコレステロールレベルを有する被験者において、FH変異（表３の全ての変異）及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異（表４の全ての変異）の存在／数に基づいて被験者を5つのグループに分けた（図３のグループ1〜5）。従来のFH遺伝子における変異（ヘテロFH遺伝子変異）及びLDL上昇アクセサリー遺伝子における変異１以上を有する被験者を「オリゴジーンFHを有する被検者」と定義した（図３のグループ４）。
【００６２】
［生化学解析］
被検者は、一晩絶食後、血液サンプルを採血された。総コレステロール、トリグリセリド、及び高密度リポタンパク質コレステロールの血清レベルを、自動装置を用いて酵素的に（Qualigent、積水メディカル）決定した。トリグリセリドレベルが400 mg/dL未満の場合はLDLコレステロールレベルをFriedewaldの計算式を用いて計算した。それ以外の場合は、LDLコレステロールレベルを酵素的に決定した。
【００６３】
［臨床評価］
高血圧を、降圧薬使用前に、収縮期血圧40 mmHg以上及び拡張期血圧90 mmHg以上の場合と定義した。糖尿病の存在は、日本糖尿病学会による説明の通りに（Committee of the Japan Diabetes Society on the Diagnostic Criteriaof Diabetes Mellitus, Seino Y, Nanjo K, Tajima N, Kadowaki T, Kashiwagi A, etal. Report of the committee on the classification and diagnostic criteria ofdiabetes mellitus. J Diabetes Investig.2010;1:212-228.）、又は糖尿病治療薬の使用に基づき定義した。CADは、狭心症、心筋梗塞、若しくは冠動脈中の重度の狭窄性領域（狭窄性75％以上）の存在で同定した。なお、乳児の場合には、血管造影、コンピュータ断層撮影、若しくは、心電図によるいずれかで同定した。
【００６４】
［統計学的解析］
カテゴリ変数はパーセンテージで表した。フィッシャーの厳密検定またはカイ2乗検定を使用して、グループ間の相違を適宜評価した。正規分布を有する連続変数は、平均±標準偏差として提示した。非正規分布変数の場合、中央値と四分位範囲を示した。連続変数の平均値を独立データのスチューデントt検定と比較し、中央値をノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定と比較した。テューキーのHSD（honestly significant difference）検定を用いて、FH突然変異及び／又は他のLDL上昇アクセサリー遺伝子突然変異の存在に従って分離したグループ間でLDLコレステロールレベルを比較した。LDLコレステロール上昇の効果量を、年齢及び性別を調整した線形回帰モデルを用いて評価した。CADに対するオッズ比（OR）は、年齢、性別、高血圧、糖尿病、喫煙及びLDLコレステロールの調整を伴うロジスティック回帰を使用して計算した。全ての統計分析は、R統計ソフトウェアを使用して行った。全ての両側のP値<0.05は、グループ間の統計的有意差を示す。
【００６５】
［結果］
各グループにおける被験者の特徴を表５に要約した。表５に記載のグループ間で変異型の割合に有意差はみられなかった。
次に、グループ間のLDLコレステロールレベルを比較し、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の存在に基づいて分けた。FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子変異の存在とLDLコレステロールレベルとの関係について、以下の結果を得た。
（１）オリゴジーンFHを有する被験者は、ダメージングバリアント無しの被験者と比較して、有意に高いLDLコレステロールレベルを示した（図４のグループ１対グループ４、265mg/dL, 95% confidence interval [CI] 216−312, and 210 mg/dL, 95% CI 189−243; P =3.7 × 10−12）。
当該結果より、オリゴジーンFHを有する被験者は、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、有意に高いLDLコレステロールレベルを示し（又は、将来高くなると考えられる）。
また、重度に上昇したLDLコレステロールを有する患者の中で、オリゴジーンFHを有する患者は、LDLコレステロールがより高い（重篤化の可能性）及びCADのリスクが高いことが明らかになった。
（２）オリゴジーンFHを有する被験者のLDLコレステロールレベルは、単一FH変異として定義された「古典的FH」を有する被験者よりも有意に高かった（図４のグループ４対グループ３、265 mg/dL, 95% CI 216−312 vs. 233 mg/dL, 95% CI 207−275,respectively; P = 0.04）。
当該結果より、オリゴジーンFHを有する被験者は、ヘテロFHのみを有する被検者と比較して、有意に高いLDLコレステロールレベルを示す（又は、将来高くなる可能性がある）。すなわち、オリゴジーンFHを有する患者は、ヘテロＦＨを有する患者よりもより厳格な治療等が必要になることが明らかになった。
（３）従来の古典的FH遺伝子における1変異（ヘテロ変異）はLDLコレステロールを34 mg/dL上昇させた（95% CI: 25−43;P = 9.3×10−7、表６）。
（４）アクセサリー遺伝子における変異はLDLコレステロールを18 mg/dL上昇させた（95% CI: 3−33; P = 0.0156、表６）。
当該結果より、LDL上昇アクセサリー遺伝子変異を有する患者は、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、高いLDLコレステロールレベルを示す（又は、将来高くなる可能性が高い）ことが明らかになった。
（５）LDLR遺伝子における1つのタンパク質切断変異（protein truncating mutation）が、LDLR又はPCSK9遺伝子における1つのミスセンス変異と比較して、LDLコレステロール値により大きな影響を与えることを発見した（表６）。
当該結果より、遺伝子解析をして、タンパク質切断変異が見つかった場合には、より重症な臨床像を呈する可能性があることを早期に予見可能となることが明らかになった。
（６）FH変異の蓄積とともに、LDL上昇アクセサリー遺伝子変異の蓄積はCADのオッズを上昇させる傾向を確認した（図５）。
当該結果より、LDLコレステロール値が高い冠動脈疾患の患者からアクセサリー変異が見つかった場合には、該変異が原因の可能性があり、さらに、冠動脈疾患のリスクがあり、加えて冠動脈疾患が重篤化する可能性がある。すなわち、厳格な治療等が必要になることが明らかになった。
（７）オリゴジーンFHを有する被験者は、ダメージングバリアントを有しない被験者と比較して、有意に増加したCADに対するオッズを示した（図５のグループ１対グループ４、オッズ比[OR]5.0; 95% CI 2.2−7.4; P = 1.1 × 10−4）。
当該結果より、オリゴジーンFHを有する被験者は、FH変異及びLDL上昇アクセサリー遺伝子の変異がない被験者と比較して、CADのリスクが高いことが明らかになった。
【００６６】
【表５】
2019136000.tif 000008
FHはfamilial hypercholesterolemia、CADはcoronary artery disease、HDLはhigh-density lipoprotein、LDLはlow-density lipoprotein、LDLRはlow-density lipoprotein receptor、PCSK9はproprotein convertase subtilisin/kexin type 9を示す。*5人の被験者がダブル変異を示した。
【００６７】
【表６】
2019136000.tif 000009
FHはfamilial hypercholesterolemia、LDLRはLDL receptor、PCSK9はproprotein convertase subtilisin/kexin type 9を示す。
【００６８】
【表７】
2019136000.tif 000010
FHはfamilial hypercholesterolemia、ORはオッズ比（odds ratio）を示す。上記の変数を含む多変量ロジスティック回帰分析を実施した。
【００６９】
［総論］
本実施例において、5％以下の被験者がLDL上昇アクセサリー遺伝子だけでなくFH遺伝子における有害突然変異を内包し、このような変異は、LDLコレステロールの有意な上昇がみられた個人（individuals）の間でLDLコレステロールレベルに有意に影響することを見出した。また、本実施例の結果は、「オリゴジーンFH」のコンセプトを初めて確立した。
重度のヘテロ型FHの定義は、近年国際動脈硬化学会（International Atherosclerosis Society）により提案され、主に古典的な冠危険因子に焦点を当てている（Santos RD, Gidding SS, Hegele RA, Cuchel MA, Barter PJ, Watts GF, etal. Defining severe familial hypercholesterolaemia and the implications forclinical management: a consensus statement from the internationalatherosclerosis society severe familial hypercholesterolemia panel. Lancet Diabetes Endocrinol. 2016;4:850-861.）。
本実施例において、有意に上昇したLDLコレステロールレベルを有する被験者での「LDL上昇アクセサリー遺伝子」変異の存在が、LDLコレステロールレベルに影響を与えることを見出した。
本実施例の結果は、FH遺伝子及び「LDL上昇アクセサリー」遺伝子における有害変異を有するこれらのオリゴジーンFHが、少なくとも高いLDLコレステロールレベルの存在下において、重度のFHの進行を部分的に説明できることを示した。
【００７０】
本実施例より以下の知見を得た。
（１）LDL上昇アクセサリー遺伝子を含む遺伝学的背景の検査は、有意に上昇したLDLコレステロールを有する患者においてきわめて有用である。最近の研究は遺伝学的高リスクを有する個人の特定がスタチン療法の実施（Natarajan P, Young R, Stitziel NO, Padmanabhan S, Baber U, Mehran R,et al. Polygenic risk score identifies subgroup with higher burden ofatherosclerosis and greater relative benefit from statin therapy in the primaryprevention setting. Circulation. 2017;135:2091-2101.）及び健康的なライフスタイル（Khera AV, Emdin CA, Drake I, Natarajan P, Bick AG, Cook NR, et al.Genetic risk, adherence to a healthy lifestyle, and coronary disease. N Engl J Med. 2016;375:2349-2358.）により大きな利点をもたらす。遺伝学的情報は、高血圧、糖尿病及び喫煙等の古典的な冠危険因子の進展のかなり前に決定できる。したがって、オリゴジーンFHであるかどうかを判定することを含む遺伝子検査は、FHの臨床的兆候が未だ進行していない若年者により有用である。
（２）ポリジーンFHは、重度の高コレステロール血症患者（東アジア人、特に、日本人）の間に存在している。
（３）重度に上昇したLDLコレステロールを有する患者の中で、オリゴジーンFHを有する患者は、より高いLDLコレステロール及び高度に増加したCADに対するオッズを有する。
（４）重度のFHの進行を部分的に説明できるオリゴジーンFHは、LDLコレステロールレベルの上昇と、LDLコレステロールレベルが有意に上昇した患者のCADに対するオッズの増加と相関している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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