(57)【要約】【課題】対象真菌に対する抗真菌剤の新たなスクリーニング方法の提供。【解決手段】本発明によるスクリーニング方法では、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼをコードする遺伝子で対象真菌を形質転換し、形質転換された対象真菌及び被験薬剤を共存させて前記対象真菌を培養し、培養後の対象真菌の細胞１０内における前記βグルカナーゼの局在１１の程度を蛍光測定によって観測し、観測された前記局在１１の程度が低いことを以って被験薬剤が対象真菌に対して抗真菌作用を発揮していると評価する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象真菌に対する抗真菌剤のスクリーニング方法であって、
（Ａ）蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼをコードする遺伝子で対象真菌を形質転換し、
（Ｂ）形質転換された対象真菌及び被験薬剤を共存させて前記対象真菌を培養し、
（Ｃ）培養後の対象真菌の細胞内における前記βグルカナーゼの局在の程度を蛍光測定によって観測し、
（Ｄ）観測された前記局在の程度が低いことを以って被験薬剤が対象真菌に対して抗真菌作用を発揮していると評価する、
前記スクリーニング方法。
【請求項２】
上記βグルカナーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁に含まれるグルカンを分解する酵素である請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験薬剤が生薬である請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象真菌に対する抗真菌剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌は、自然界における有機物分解者として物質（元素）循環と環境保全に欠かせない重要な役割を果すとともに、真菌の発酵能力の利用による多種多様な食品製造に寄与するなど、数多くの利点がある。他方、真菌の利用における利点に反して、真菌の有害の影響も少なくない。植物に寄生して病害をもたらしたり、食品の変質・腐敗や、建造物、日用品、産業製品の劣化を引き起こしたり、ヒトに対して日和見感染を含む各種疾患を引き起こしたりする真菌も数多く存在する。
【０００３】
真菌はヒトと同様に真核生物であるため真菌にのみ特異的に働く薬剤の開発は容易ではなく、既存の薬剤も少ない。例えば、特許文献１では、ヒトに毒性が少ない有望な抗真菌剤を高い確率で見つけだすことのできる抗真菌剤の効率的な選択方法を開発する必要性が強調されている。このように、ヒトへの影響が少なく、真菌に特異的に働く薬剤の探索ないし開発に役立つ知見が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−３１８４６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、従来の抗真菌薬には強い毒性を持つものも少なくない。例えば、ポリエン系のアムホテリシンＢによれば、真菌の細胞膜の成分であるエルゴステロールに結合して膜の脱分極を引き起こし、細胞内への水素イオンの流入および細胞内容物を流出せしめ、細胞内環境を劣化させることで真菌に対して殺菌的に作用するため、強い抗菌作用と広い抗真菌活性を呈するが、短所として腎障害などといった強い副作用の懸念がある。そういったことから、真菌の増殖や生存には重要であるが、ヒトにとっては無害であるか害が少ない作用機序に基づく新たな抗真菌薬の開発が望まれる。
【０００６】
上記事情を考慮し、本発明は、新たな作用機序に基づく抗真菌薬を見出すためのスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討した結果、本発明を完成した。
本発明は、対象真菌に対する抗真菌剤のスクリーニング方法を提供するものである。本発明によれば、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼをコードする遺伝子で対象真菌を形質転換し、形質転換された対象真菌及び被験薬剤を共存させて前記対象真菌を培養し、培養後の対象真菌の細胞内における前記βグルカナーゼの局在の程度を蛍光測定によって観測し、観測された前記局在の程度が低いことを以って被験薬剤が対象真菌に対して抗真菌作用を発揮していると評価する。
上記βグルカナーゼの非限定的な例として、Saccharomyces cerevisiaeの細胞壁に含まれるグルカンを分解する酵素が挙げられる。
また、βグルカナーゼに付与されている膜輸送シグナル配列と蛍光タンパク質の組合せでも同様の評価が可能である。
被験薬剤の非限定的な例として、生薬が挙げられる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、真菌の先端成長を阻害することができる薬剤を簡易な操作で見出すことができる。真菌の先端成長のためには、βグルカナーゼに代表される細胞壁分解酵素を当該真菌に含まれる細胞の先端に輸送させる必要がある。前記輸送を阻害することにより、真菌の先端成長が阻害され、以って、真菌の増殖を抑制することができる。これにより抗真菌作用が発現する。
【０００９】
上述の先端成長における細胞壁分解酵素の働きは、ヒトの細胞とは基本的には無関係である。つまり、薬剤による先端成長阻害作用については、当該作用自体はヒトに対して無害である。したがって、先端成長阻害作用を呈する薬剤は、ヒトへの害毒が少ない抗真菌剤になり得る。本発明によれば、そのような先端成長阻害作用の有無を、蛍光測定によって比較的手軽に判定することができるので、抗真菌剤のスクリーニングとして優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で製造したベクターのマップである。
【図２】Saccharomyces cerevisiaeの細胞の顕微鏡観察像である。
【図３】Saccharomyces cerevisiaeの細胞の顕微鏡観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明では、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼをコードする遺伝子で対象真菌を形質転換する。これによって、対象真菌内で蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼを産生せしめることができる。
【００１２】
蛍光タンパク質は蛍光性を有するタンパク質である。遺伝子によりコード可能であり対象真菌に導入可能であれば、蛍光タンパク質の種類は特に限定は無い。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質などが挙げられ、後述の実施例では緑色蛍光タンパク質の一種が用いられる。
【００１３】
蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列については、公知のものを参照してもよいし、例えば、pAcGFP1 Vector（Clontech社製）やpTagCFP-C（Evorgen社製）などという名称で市販されているベクターを用いてもよい。
【００１４】
βグルカナーゼは、グルコースで構成される多糖であるグルカンを加水分解してグルコオリゴ糖またはグルコースを生成する酵素である。真菌の成長時、特に先端成長においては、真菌が有する固い細胞壁の先端部の１，３−β−Ｄ−グルカンが自己分解酵素によって分解され、内部からの膨圧により伸長し、グルカン合成酵素によって１，３−β−Ｄ−グルカンが再び合成される。βグルカナーゼは、上述の自己分解酵素として作用する。
【００１５】
βグルカナーゼについては、対象真菌がもつ細胞壁に含まれる１，３−β−Ｄ−グルカンを分解し得るものであって、遺伝子によりコード可能であり対象真菌に導入可能であれば、特に限定は無く、公知のものを用いることもできる。また、βグルカナーゼをコードする遺伝子配列についても、酵母からクローニングしてもよいし、公知のものを参照してもよい。例えば、pTOWug2-836（#2303）（酵母遺伝資源センター（ＹＧＲＣ）提供）などという名称で提供されているベクターを用いてもよい。
【００１６】
対象真菌は任意に選択することができ、必ずしもヒトに対する病原菌である必要はない。後述の実施例では、Saccharomyces cerevisiaeを対象真菌とする例について記載される。なお、上述のグルカンの分解及び再合成は、真菌の先端成長における基本的な化学反応であるから、ある真菌におけるスクリーニングの結果を、他の真菌、例えば病原菌へのスクリーニングのために適用することができる可能性がある。
【００１７】
対象真菌を形質転換するための遺伝子は、上述の蛍光タンパク質とβグルカナーゼの両方をもつタンパク質をコードする。そのような遺伝子を得る方法は特に限定は無く、公知の遺伝子組み換え技術を適宜参照することができる。例えば、適宜のバイナリーベクターに、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をもつベクター及びβグルカナーゼをコードする遺伝子配列をもつベクターを組み込んで、蛍光タンパク質とβグルカナーゼとが結合したタンパク質をコードする遺伝子配列を構築することができる。
【００１８】
蛍光タンパク質とβグルカナーゼとが結合したタンパク質をコードする遺伝子で対象真菌を形質転換する方法についても、公知の遺伝子技術を適宜参照することができる。例えば、前記遺伝子配列をもつベクターを大腸菌の細胞に導入して大腸菌を形質転換して、その大腸菌を培養し、増幅した大腸菌群からプラスミド抽出を行うことにより、前記遺伝子配列をもつプラスミドを含む溶液を得てもよい。そして、前記プラスミドを含む溶液を用いて、対象真菌に前記遺伝子配列を導入し、形質転換を行うことができる。
【００１９】
こうして形質転換した対象真菌については、導入された蛍光タンパク質とβグルカナーゼとが結合したタンパク質をコードする遺伝子によるタンパク質産生を開始させることによって、対象真菌内に、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼを生成せしめることができる。遺伝子からのタンパク質産生については、遺伝子工学に関する従来技術を適宜参照することができる。
【００２０】
このように、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼを細胞内に含む対象真菌を培養すると、対象真菌が先端成長するために、真菌内の前記βグルカナーゼが細胞の先端へと移動すると考えられる。本発明によれば、対象真菌の培養時に被験薬剤を共存させることによって、当該被験薬剤がβグルカナーゼの移動を阻害するか否かを調べる。
【００２１】
被験薬剤を共存させながら対象真菌を培養する具体的方法については、真菌の培養に関する従来技術を適宜参照することができる。また、後述する実施例の記載を参考にすることもできる。
【００２２】
対象真菌の培養における、濃度や時間等の各種条件は、βグルカナーゼの局在の有無が観測しやすいように適宜定めることができる。例えば、対象真菌の濃度は以下のような考え方で定めることができる。顕微鏡観察しやすいように１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬから１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬでもよいし、フローサイトメーターや画像解析処理ソフトを用いる場合は１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ以下であってもよい。また、対象真菌に対する被験薬剤の暴露時間については、例えば、対象真菌の細胞周期の１〜３周期分などを非限定的に挙げることができる。
【００２３】
本発明でスクリーニングする被験薬剤は特に限定は無く、非限定的に生薬を挙げることができる。生薬とは、和漢薬や世界各地で古くから用いられた民間薬のうち、基原、性質などの理化学的性質が明らかにされ、薬理作用も研究された薬用天然物の総称である。
【００２４】
本発明では、培養後の対象真菌の細胞内における上述のβグルカナーゼの局在の程度を観測する。上述したように、本発明では、βグルカナーゼには蛍光タンパク質が結合しているため、当該タンパク質は蛍光性を有する。よって、βグルカナーゼの局在については、蛍光測定によって観測することができる。蛍光測定の具体的手段は特に限定は無く、光学測定における従来技術を適宜参照することができる。例えば、蛍光測定は、光学顕微鏡を用いた目視による観察や、顕微鏡観察像の画像分析による定量化などであってもよい。
【００２５】
対象真菌において先端成長が正常に進んでいる場合には、細胞壁はβグルカナーゼにより分解され、膨圧により伸長し、その後、細胞壁が合成酵素により合成される。このとき、βグルカナーゼは細胞内から細胞壁まで小胞輸送される。よって、対象真菌の先端成長が阻害されていない場合には、βグルカナーゼは細胞壁近辺に局在するものと予測される。逆に、被験薬剤を共存させたときにβグルカナーゼの局在の程度が小さくなっている場合には、上述のβグルカナーゼの輸送が被験薬剤の作用によって阻害されたと解釈することができる。このように、小胞輸送を阻害することができる薬剤をスクリーニングできれば、先端成長を抑制し抗真菌活性を有する薬剤の開発につながり得る。さらに、細胞壁はヒトにはなく酵母に存在するものなので選択毒性を持たせる可能性がある。
【００２６】
局在の程度と、抗真菌作用の発揮の評価について説明する。上述のように、真菌の成長及び／増殖のためにはβグルカナーゼの局在が伴う。よって、被験薬剤の作用によってβグルカナーゼの局在の程度が小さくなるのであれば、当該被験薬剤は抗真菌作用を発揮していると評価し得る。局在の程度が小さいことを、抗真菌作用の発揮であると評価する具体的手段は特に限定は無く、非限定的な例として、局在の程度について予め設けた閾値よりも低ければ抗真菌作用が有ると評価したり、局在の程度について複数の段階の評価基準を設けておき、それぞれの被験薬剤について、当てはまる基準に応じてグループ分けをしたり、複数の被験薬剤について抗真菌作用の優劣の比較のために局在の程度を比較すること、などが挙げられる。前記のような評価を行うことが被験薬剤についてのスクリーニングであると解することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではない。
【００２８】
この実施例では、Saccharomyces cerevisiaeを対象真菌として、各種生薬を被験薬剤とするスクリーニングの例を示す。
【００２９】
（１）形質転換のためのベクター構築
Invitrogen社にて市販される大腸菌と出芽酵母用バイナリーベクターであるｐＹＥＳ２を準備した。このベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）内にβグルカナーゼをコードする遺伝子配列（ＢＧＬ２）を挿入し、さらに、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列（ＥｍＧＦＰ）を付加した。本実験において、出芽酵母の先端成長を評価する上でこのベクターを利用することとした。ｐＹＥＳ２は、ＧＡＬ１プロモーターを有するため、ガラクトースによる目的遺伝子の発現をコントロールすることができる。
【００３０】
ＢＧＬ２はpTOWug2-836(#2303)よりポリメラーゼチェインリアクション（PCR）法を用いて得た。この際、BGL2のオープンリーディングフレーム（ORF）の上流（開始コドン側）に制限酵素サイト（Bam HI）が、下流（C末端側）にStopコドンと制限酵素サイト(Eco RI)が付加されるようにプライマーを設計した。このPCR産物を電気泳動後精製し、制限酵素処理の後、再度電気泳動、精製を経てリガーゼによりｐＹＥＳ２のベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）内にＢＧＬ２を挿入した。得られたベクターをｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２と表記する。
【００３１】
得られたｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２をInverse PCRの手法によって線状化した。ｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２が有するはstop codonを除去するためである。PCRによってStop codonを取り除い後、ＢＧＬ２のＣ末端にEcoR I配列をPCRで付加した。線状化後のベクターをｌｉｎｅｒ  ｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２と表記する。
【００３２】
別途、pRSET-EmGFPからEcoR IとXho Iで制限酵素処理を行った後精製することにより、蛍光タンパク質（Ｅｘ．４８７ｎｍ，Ｅｍ．５０９ｎｍ）をコードする遺伝子配列をもつベクターＥｍＧＦＰを得た。ここで、ｐＲＳＥＴ−ＥｍＧＦＰは市販品（Invitrogen社製）を用いた。
【００３３】
以上のようにして得たｌｉｎｅｒ  ｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２及びＥｍＧＦＰを、Ｔ４ｌｉｇａｓｅを用いてライゲーションした。ライゲーションでは、ＥｍＧＦＰ：ｌｉｎｅｒ  ｐＹＥＳ２−ＢＧＬ２＝１：８になるように混合し、１６℃、５時間反応させた。このようにして、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼをコードする遺伝子配列を持つベクターを得た。図１は、得られたベクターのマップである。ＢＧＬ２及びＥｍＧＦＰが繋がった箇所の配列は配列番号１のとおりである。当該配列における「gaattcgccacc」は、ＢＧＬ２及びＥｍＧＦＰを繋ぐ箇所の配列であり、この配列より前の配列がＢＧＬ２の配列に相当し、後の配列がＥｍＧＦＰの配列に相当する。
【００３４】
次に、プラスミド溶液を得るために、前記ベクターをE.coli DH5へ導入して形質転換せしめた。形質転換は、GMbiolab社製DH5α Competent cellに付属のプロトコールに従った。すなわち、ライゲーションミクスチャーをコンピテントセルに添加して、この細胞にヒートショックを与え、インキュベートし、その後、ＬＢプレートに播種して、培養した。このように形質転換した大腸菌から遠心分離によってプラスミド抽出を行い。プラスミド溶液を得た。
【００３５】
（２）対象真菌の形質転換
上述のようにして得たプラスミド溶液を用いて、エレクトロポレーションの手法によって、ＳＣ−Ｕｒａ寒天培地上で、対象真菌である出芽酵母S. cerevisiae を形質転換した。出芽酵母を洗浄し、ソルビトール溶液中で上述のプラスミドを加えてエレクトロポレーション用キュベットに移し、パルスした。パルス後にソルビトール溶液中で混合して、選択培地にプレーティングし、コロニーが出るまで約２週間培養した。
【００３６】
（３）被験薬剤との共存下での対象真菌の培養
この実施例では被験薬剤として各種生薬を用いた。各種生薬の抽出物をＤＭＳＯに溶解した。
【００３７】
上述のように製造した形質転換された対象真菌のコロニー１つをＳＣ−Ｕｒａラフィノース２％液体培地に懸濁し、振とう培養して前培養液を得た。別途、ＳＣ−Ｕｒａラフィノース２％液体培地を用意し、そこに前培養液を加えて振とう培養した。
２４ウェルプレートに２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌液１ｍＬを入れ、生薬抽出物２μＬ（終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加した。２４ウェルプレートのサンプルをウェルシェイカーにて３０℃、３００ｒ／ｍｉｎで５時間生育培養した。すべてのサンプルで生育培養後はＳＣ−Ｕｒａガラクトース２％ラフィノース１％培地に置き換え、生薬抽出物２μＬ（終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加し、３０℃で２時間誘導培養した。
【００３８】
ブランクとして、生薬抽出物を添加しない系でも培養を行った。
さらに、生薬抽出物の代わりに、既知の抗真菌剤でも行った。現在、ヒトの深在性真菌症で使用可能な４クラス（ポリエン系（アムホテリシンＢ）、アゾール系（ミコナゾール）、フロロピリミジン系（フルシトシン）、キャンディン系（ミカファンギン））を対象とした。それぞれの作用機作は、ポリエン系が細胞膜機能の破壊、アゾール系が細胞膜合成酵素阻害、フロロピリミジン系が核酸合成阻害、キャンディン系が細胞壁合成阻害であり、いずれの場合も先端への輸送を作用機作としていない。また、既存の微小管合成阻害剤であるノコダゾール（終濃度１０〜８０μｇ／ｍＬ）を添加した系でも培養を行った。微小管の合成が阻害されることにより、輸送ができなくなり、先端への局在が見られなくなることが予想できる。
【００３９】
（４）βグルカナーゼの局在性の観測
培養後の各菌液について、光学顕微鏡にて１００倍で可視光と蛍光で、１サンプルあたり顕微鏡の視野のランダムな複数の箇所で観察を行った。可視光で全体の個体の数と出芽している酵母の個数を計測し、蛍光では出芽部または分裂部で蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼの局在が見られる個体数を計測した。
【００４０】
図２は、上記観察における顕微鏡観察像である。図２（Ａ）は被験薬剤を共存させない系での観察像であり、図２（Ｂ）は生薬「クロモジ」の抽出物を被験薬剤として共存させた系での観察像である。それぞれの観察像の上段は可視光の観察像であり、下段は緑色の蛍光での観察像である。図２（Ａ）の観察像では、細胞１０の先端や分裂部に蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼの局在１１が存在する。他方、図２（Ｂ）の蛍光での観察像（下段）では、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼは細胞１０内に一様に存在しており、局在は認められなかった。このような観察を既知の抗真菌剤についても行った。図３は既知の抗真菌剤を共存させた系での観察像である。上段及び下段の意味は図２の場合と同様である。小胞輸送阻害剤であるノコダゾールとの共存系においては蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼの局在が認められなかったのに対し、抗真菌剤を共存させない系（コントロール）及び小胞輸送阻害とは異なるメカニズムの既知の抗真菌剤との共存系では、蛍光タンパク質が結合したβグルカナーゼの局在が細胞内で認められた。このように、今回のスクリーニングの評価系では、抗菌のメカニズムが小胞輸送阻害であるか否かを評価できることが明確になった。
【００４１】
次に、上記顕微鏡観察による計測について、以下のように局在の割合を数値化した。
Ａ＝Ｂ／Ｃ
ここで、Ａは局在している個数の割合であり、Ｂは局在が見られる個体数であり、Ｃは出芽している酵母の個数である。
【００４２】
（５）結果
上記算出されるＡ値は、酵母の細胞内におけるβグルカナーゼの局在の程度を表す指標である。当該Ａ値が低いことを以って、被験薬剤が対象真菌に対して抗真菌作用を発揮していると評価することができる。用いた被験薬剤を、以下、列挙する。併記する数値が算出されたＡ値（パーセンテージ）である。
【００４３】
生薬無添加８９．８、ノコダゾール（既知抗真菌剤）２１．５＊、アイソウ９２．０、
アガリスク９７．２、アシタバ９５．２、アマチャ５０．０、アキョウ９１．４、
アスナロ８８．６、アマチャズル８５．０、アカメガシワ７８．９、アザミネ９６．８、
アセンヤク９１．５、イカリソウ９４．４、イレイセン９６．１、イズイ９５．８、
イチョウハ７６．５、インチンコウ４０．０、イキョウ（小）９３．３、
コウイカ９７．２、ウラジロガシ９５．２、イキョウ（大）９６．２、ウバイ５．９＊、
ウワウルシ６６．７、ウヤク７７．３、エイジツ９７．３、エイメイソウ８６．４、
エンゴサク９４．７、エゾウコギ９２．３、オウギ９３．８、オウレン（唐）８８．０、
オウヒ８５．０、オウゴン９３．８、ウフルギョウ９６．０、オトギリソウ６４．７、
オウハク１７．３＊、オウレン（和）６５．４、オンジ８８．４、カイカ６９．０、
カイバ９５．７、カシュウ８０．６、カッコン８５．７、カロコン８５．７、
カントウカ８９．７、カイキンシャ９１．７、カキノハ９６．８、カゴソウ９６．８、
ガジュツ８７．５、カロニン８１．５、カンゾウ８６．７、ガイヨウ９６．３、
ガイハク９６．０、カキノシテイ９０．０、カシ９．５、カッコウ０．０＊、
カミツレ８１．６、カンキョウ９０．９、シャカンゾウ３７．５、キキョウ９５．７、
キジツ８８．９、キッピ８２．１、キバン８０．８、キンギンソウ９３．３、
キグシ９３．３、キクカ８９．３、キョウカツ８６．４、キンオウシ７３．３、
キンセンソウ７７．８、キコク８０．０、コウキクカ５１．７、キササゲ９２．３、
クマサザ８９．５、クワノハ８３．３、クコシ７３．４、クセキ８８．２、
クマヤナギ８２．６、クバク７５．０、クチナシ６１．２、クロモジ０．０＊、
ケイガイ１１．７＊、ケイケットウ０．０＊、ゴボウシ８８．５、ゲンジン７０．４、
ケイヒ８２．３、ゲンノショウコ９３．８、ケツメイシ０．０＊、ケツジツ９６．０、
ゴウイ１００、ゴウカンヒ９６．７、コウジュ８８．９、コウホン１００、
ウコギ９０．９、ベニバナ７８．６、コウジン８６．７、ウルチ１００、
コウボク８９．３、ゴシツ９６．４、ゴミシ０．０＊、ゴウカイ９５．７、
コウシ８７．５、コウブシ７５．０、ゴボウシ８３．３
【００４４】
Ａ値が３０％未満のものは、βグルカナーゼの輸送阻害作用が強いと評価し、上記列挙では、数値横に「＊」を付した。なお、Ａ値が３０％未満のものについては、再現性確認のために、同条件で３回実験を行ったところ、いずれも再現性が確認された。
本発明によれば、上記のように多量の被験薬剤について、ヒトへの悪影響が懸念されにくい態様での抗菌作用の発揮について、比較的容易かつ定量的にスクリーニングする手段が提供された。
【００４５】
（６）参考：病原菌への適用
上記Ａ値は、対象真菌としてSaccharomyces cerevisiaeを用いた際の結果である。Ａ値が小さいことについては、生薬の作用によりβグルカナーゼの小胞輸送が阻害され、細胞壁再合成のための細胞壁分解が出来ず、細胞壁がもろくなり浸透圧の調節がうまくいかなくなった結果、細胞外液が流入して液胞が肥大化したと解釈することが可能である。そのようなメカニズムは、種々の真菌において全般的に生じ得ることであると考えられることから、今回の実施例のように、スクリーニングについては病原菌とは異なる真菌を対象真菌として採用して、候補薬剤を絞り込んだうえで、病原菌への適用を観察することも可能である。
【符号の説明】
【００４６】
１０  細胞
１１  局在
【図１】
2019058081.tif 000003
【図２】
2019058081.tif 000004
【図３】
2019058081.tif 000005
【配列表】
2019058081000001.app