(57)【要約】【課題】グリセロールからエリスリトールへの変換効率が優れた新規エリスリトール生産酵母を提供する。前記エリスリトール生産酵母を用いた、高効率なエリスリトールの製造方法を提供する。【解決手段】新規エリスリトール生産酵母は、モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）である。エリスリトールの製造方法は、前記モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株及びその変異株を、グリセロールを含む培地で培養し、エリスリトールを生産させる生産工程を備える方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）及びその変異株。
【請求項２】
請求項１に記載のモニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株及びその変異株を、グリセロールを含む培地で培養し、エリスリトールを生産させる生産工程を備えるエリスリトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規エリスリトール生産酵母及びその使用に関する。具体的には、本発明は、新規エリスリトール生産酵母であるモニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株、及び、前記モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株を用いたエリスリトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスリトールは、果実、キノコや発酵食品に含まれている天然の糖アルコールである。また、高甘味度甘味料として、低カロリーをうたった食品等に広く用いられている。
【０００３】
エリスリトールの製造方法としては、例えば、モニリエラ属又はトリコスポロノイデス属に属する酵母を、グルコース、フルクトース又はグリセロール等の発酵性糖質を炭素源とする培地を用いて培養し、エリスリトールを製造する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
一方、近年、環境への負荷を低減するエネルギーとして、バイオディーゼル燃料の需要が高まっている。その精製工程で、原料油脂の２０％程度のグリセロールが生成されることが知られている。この廃グリセロールには有効な用途がなかった。しかしながら、本発明者らは、これまでに、浸透圧耐性酵母であるモニリエラ・メガチリエンシスＳＮ−１２４Ａ株を用いて、廃グリセロールを基質として、エリスリトールへの変換に成功している（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−１５４５８９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kobayashi Y et al., “Erythritol production by Moniliella megachiliensis using nonrefined glycerol waste as carbon source.”, Letters in Applied Microbiology, Vol. 60, Issue 5, p475-480, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで用いられてきたエリスリトール生産酵母は、高濃度のグルコース存在下から単離してきたものであり、高濃度のグリセロール存在下から単離してきたものではなかった。工業用プロセスとして実用化するためには、グリセロールからエリスリトールへのより高い変換効率が求められ、より最適化されたエリスリトール生産酵母が求められていた。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、グリセロールからエリスリトールへの変換効率が優れた新規エリスリトール生産酵母を提供する。また、前記エリスリトール生産酵母を用いた、高効率なエリスリトールの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るエリスリトール生産酵母は、モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）及びその変異株である。
【００１０】
本発明の第２態様に係るエリスリトールの製造方法は、上記第１態様に係るモニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株及びその変異株を、グリセロールを含む培地で培養し、エリスリトールを生産させる生産工程を備える方法である。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様のエリスリトール生産酵母によれば、グリセロールをエリスリトールに高効率で変換することができる。上記態様のエリスリトールの製造方法によれば、高効率でエリスリトールを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例における各株のエリスリトール生産量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜エリスリトール生産酵母＞
本実施形態のエリスリトール生産酵母は、モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）及びその変異株である。
【００１４】
モニリエラ属は、分類学上、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、クロボキン亜門（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に分類され、目及び科については、未定である。モニリエラ属は、ジャム、マーマレード、ハチミツ等の食品や昆虫の幼生体表に見いだされた酵母であり、糖濃度の高い環境を好んで生育する。
【００１５】
本実施形態のＮＵ１株は、モニリエラ・メガチリエンシスＳＮ−１２４Ａ株（以下、単に「ＳＮ−１２４Ａ株」と称する場合がある）にＵＶ照射した後に２０質量％グリセロールを含む培地でスクリーニングを行い、単離されたＳＮ−１２４Ａ株の変異株である。ＮＵ１株は、２０１８年３月１６日付で、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００１６】
なお、「ＳＮ−１２４Ａ株」は、本発明者らが、乾燥果実から発見した極めて高い浸透圧耐性をもつ酵母である。また、６０質量％グルコース（３．３Ｍ溶液）中でも増殖が可能である（参考文献１：「若生勝雄ら、『Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＮ−１１５によるエリスリトールの生産』、醗酵工学、第６６巻、第４号、２１７〜２２３頁、１９８８年。」参照）。
【００１７】
ＮＵ１株について、細胞の大きさは、縦が約４μｍ以上７μｍ以下程度、横が約４μｍ以上１５μｍ以下程度である。また、ＮＵ１株は、２０質量％グリセロール中で好適に増殖し、至適温度は約３０℃、至適ｐＨはｐＨ７．０付近である。
【００１８】
また、本実施形態のＮＵ１株としては、その変異株も好適な例として挙げられる。
【００１９】
本明細書において、「変異株」とは、自然発生的又は人為的に、元の酵母株のゲノム（核ゲノム、ミトコンドリアゲノムを含む。以下、同じ。）に変異が生じた酵母株を意味する。ゲノムに変異を生じさせる人為的手法は、特に限定されず、化学的処理、遺伝子工学的手法等を例示することができる。化学的処理としては、紫外線照射、放射線照射、亜硝酸等が挙げられる。遺伝子工学的手法としては、遺伝子導入、ゲノム編集等が挙げられる。
【００２０】
なお、本明細書において、「ＮＵ１株の変異株」とは、ＮＵ１株のゲノムに変異が生じた酵母株であって、２０質量％グリセロール中で好適に増殖し、グリセロールをエリスリトールに変換可能な酵母株を指す。ＮＵ１株の変異株としては、ＮＵ１株の全ゲノムに対する変異の割合が、全ゲノム中の１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、３％以下であることがさらに好ましく、２％以下又は１％以下であることが特に好ましい。
【００２１】
上記の中でも、ＮＵ１株の変異株としては、グリセロールからエリスリトールへの変換効率がＳＮ−１２４Ａ株の１０倍以上であるものが好ましい。
【００２２】
本実施形態のＮＵ１株は、２０℃以上４０℃以下、ｐＨ３以上７以下、グリセロール濃度１０質量％以上５０質量％以下（好ましくは、１５質量％以上３５質量％以下）の条件下において増殖することができる。このような高濃度のグリセロール存在下では、他の酵母は生育困難であるため、本実施形態のＮＵ１株は、エリスリトール製造の工業用プロセスに適している。
【００２３】
後述の実施例に示すように、本実施形態のＮＵ１株は、グリセロールからエリスリトールを高効率で生産する。特に、従来利用されている酵母（ＳＮ−１２４Ａ株）と比較しても、グリセロールからエリスリトールを高効率で生産することが確認されている。
【００２４】
本実施形態のＮＵ１株の細胞から生産されたエリスリトールを得る方法としては、例えば、細胞の培養上清を回収する方法、細胞抽出物を調製する方法等が挙げられる。
【００２５】
細胞抽出物を調製する場合において、ＮＵ１株の細胞から細胞抽出物を抽出する公知の方法を用いることができる。細胞抽出物を抽出する公知の方法としては、例えば、熱水処理法、自己消化法、酵素分解法等の抽出方法が挙げられる。
【００２６】
（培地）
本実施形態のＮＵ１株は、酵母培養用の公知の培地を用いて培養することができる。培地としては、特に限定されないが、炭素源、窒素源、リン源、微量元素等を含む培地が例示される。
【００２７】
炭素源としては、グリセロールであることが好ましい。培地中のグリセロール濃度としては、１０質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、１５質量％以上３５質量％以下であることがより好ましい。
【００２８】
窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、アミン類、ペプトン、微生物エキス（酵母エキス等）等が挙げられる。
【００２９】
リン源としては、例えば、リン酸塩等が挙げられる。
【００３０】
微量元素としては、例えば、マグネシウム、カリウム、亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、鉄等が挙げられる。
【００３１】
そのような培地としては、例えば、炭素源を含まない公知の培地にグリセロール濃度が上記範囲となるように添加して調製した培地、炭素源を含む公知の培地の炭素源を上記範囲の濃度のグリセロールに置換した培地等が挙げられる。
炭素源を含まない公知の培地としては、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（ＹＮＢ）培地、ＹＥＰ培地等が挙げられる。
炭素源を含む公知の培地としては、例えば、Ｄｒｏｐ  Ｏｕｔ  Ｂａｓｅ（ＤＯＢ）培地、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地等が挙げられる。
【００３２】
また、培地は、ビタミン、ヌクレオチド、アミノ酸等の酵母の生育を促進する因子を含むことができる。
【００３３】
（培養条件）
本実施形態のＮＵ１株は、上記のとおり、比較的幅広い培養条件で増殖させることができる。ｐＨ条件としては、ｐＨ３以上７以下を例示することができ、ｐＨ３以上５以下が好ましい。
【００３４】
温度条件としては、２０℃以上３７℃以下を例示することができ、２５℃以上３５℃以下が好ましい。
【００３５】
ＮＵ１株の培養に際しては、菌体を直接培地に接種してもよく、液体培地で１日間以上４日間以下培養した前培養物を接種してもよい。
【００３６】
培養は、通気撹拌、振盪等の好気的条件で行うことができる。
【００３７】
培養時間は、炭素源が消費されるまで行うことができる。通常は、３日間以上１０日間以下行うことができる。
【００３８】
なお、培養液中のエリスリトール生産量は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の公知の方法を用いて、測定することができる。
【００３９】
＜エリスリトールの製造方法＞
本実施形態のエリスリトールの製造方法は、上記実施形態のモニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株及びその変異株を、グリセロールを含む培地で培養し、エリスリトールを生産させる生産工程を備える方法である。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について、説明する。
【００４０】
［生産工程］
生産工程は、ＮＵ１株及びその変異株を、グリセロールを含む培地で培養し、エリスリトールを生産させる工程である。
【００４１】
ＮＵ１株及びその変異株の好適な例としては、上述の「＜エリスリトール生産酵母＞」で記載したものと同様のものが挙げられる。中でも、モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）、又は、グリセロールからエリスリトールへの変換効率がＳＮ−１２４Ａ株の１０倍以上であるＮＵ１株の変異株であることが好ましく、モニリエラ・メガチリエンシスＮＵ１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６６９）であることがより好ましい。
【００４２】
また、ＮＵ１株の培養条件としては、上述の「＜エリスリトール生産酵母＞」で記載したものと同様のものが挙げられる。中でも、培地中のグリセロール濃度としては、１０質量％以上５０質量％以下であることが好ましく、１５質量％以上３５質量％以下であることがより好ましい。グリセロール濃度が上記範囲であることにより、エリスリトール生産酵母のみを生育させることができ、高効率でグリセロールからエリスリトールを生産することができる。
【００４３】
［任意工程］
本実施形態の製造方法は、生産工程に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、エリスリトールを回収する工程（回収工程）、ＮＵ１株の細胞を洗浄する工程（洗浄工程）等が挙げられる。これらの工程は、上述の生産工程の後に行うことができる。
【００４４】
（回収工程）
エリスリトールを回収する方法としては、例えば、エリスリトールを含む培養液と細胞とを分離する方法、細胞を破砕して細胞破砕物を調製する方法等が挙げられる。
【００４５】
培養液と細胞とを分離する方法としては、ろ過や遠心分離等の公知の方法により行うことができる。
【００４６】
ＮＵ１株の細胞の破砕方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。細胞の破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理等が挙げられる。物理的処理としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー、熱水処理等が挙げられる。化学的処理としては、中和処理、低張処理、凍結融解処理、自己消化処理、酵素分解処理等が挙げられる。これらの処理は、単独で行ってもよく、２種以上の処理を組み合わせて行ってもよい。
【００４７】
中和処理の方法としては、ｐＨ７以上１０以下程度の中和液に、ＮＵ１株の細胞を浸漬する方法が挙げられる。中和液の組成は、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液等を用いることができる。中和液への細胞の浸漬時間は、細胞が破壊される程度の時間とすればよく、例えば、１０分以上３０分以下程度が例示される。
【００４８】
低張処理の方法としては、水などの低張液に、ＮＵ１株の細胞を浸漬する方法が挙げられる。低張液の組成は、特に限定されず、ＮＵ１株の細胞が破裂する程度の低張な液体であればよい。低張液としては、例えば、水、低濃度の緩衝液等を挙げることができる。低張液への細胞の浸漬時間は、細胞が破裂する程度の時間とすればよく、例えば、１分以上３０分以下程度が例示される。
【００４９】
凍結融解処理の方法としては、ＮＵ１株細胞に対して、凍結と融解のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。凍結と融解のサイクル回数は、特に限定されず、ＮＵ１株の細胞が破砕される程度の回数であればよい。凍結と融解のサイクル回数は、例えば、１回以上５回以下程度が例示される。凍結及び融解の各時間は、特に限定されず、例えば、各々１０分以上３０分以下程度が例示される。
【００５０】
さらに、得られた培養液及び細胞破砕物からエリスリトールを分離することで、エリスリトール単体を得ることができる。
【００５１】
培養液及び細胞破砕物からのエリスリトールの分離方法は、特に限定されず、生化学物質の分離及び精製等に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて用いることができる。分離方法としては、例えば、遠視分離、洗浄、塩析、透析、再結晶、再沈殿、溶媒抽出、吸着、濃縮、ろ過、ゲルろ過、限外ろ過、各種クロマトグラフィー等が挙げられ、これらに限定されない。各種クロマトグラフィーとしては、例えば、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００５２】
（洗浄工程）
洗浄工程は、ｐＨ０．１以上５．０以下の洗浄液（緩衝液等）に細胞を懸濁し、次いでろ過や遠心分離等の方法で洗浄液から細胞を回収することにより行うことができる。
【００５３】
本実施形態の製造方法により得られたエリスリトールは、食品用の高甘味度甘味料、冷涼感を付与するための食品添加剤、歯磨き粉の添加剤、樹脂製造用の原料等として好適に用いられる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
［新規エリスリトール生産酵母の単離］
１．紫外線（ＵＶ）照射
既存のエリスリトール生産酵母であるモニリエラ・メガチリエンシスＳＮ−１２４Ａ株（以下、単に「ＳＮ−１２４Ａ株」と称する）を前培養した。培地としては、２質量％グルコース及び０．５質量％酵母エキス含有液体培地（以下、「ＧＹ液体培地」と称する）を用いた。培養条件としては、２９℃で振盪しながら１７時間培養した。６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が０．６〜０．８になった時点で、遠心分離し、菌体を回収した。次いで、２ｍＬのＰＢＳに懸濁した。次いで、懸濁液を小型シャーレに移し、撹拌子を添加して、撹拌しながら、クリーンベンチ内にて、３０分間紫外線（ＵＶ）照射した。次いで、暗所で１時間静置した。
【００５６】
２．２０質量％グリセロール含有培地を用いたスクリーニング
次いで、懸濁液を２０質量％グリセロール及び１％酵母エキス含有寒天培地（以下、「Ｇｌｙ−Ｙ寒天培地」と称する）上に塗布し、３日間３０℃で培養した。次いで、ＧＹ液体培地５ｍＬに、Ｇｌｙ−Ｙ寒天培地から大きいコロニーを１白金耳植菌し、３０℃で１晩培養した。次いで、得られた培養液１００μＬをＧＹ液体培地５ｍＬに植菌し、３０℃で８時間培養した。次いで、得られた培養液５０μＬをＧＹ液体培地５ｍＬに植菌し、３０℃で２４時間培養した。次いで、得られた培養液５０μＬを２０質量％グリセロール及び１％酵母エキス含有液体培地（以下、「Ｇｌｙ−Ｙ液体培地」と称する）に植菌し、３０℃で、１０日間、撹拌培養（回転数：２００ｒｐｍ）した。培養０、５、７、８及び１０日目の培養液を毎日１ｍＬずつ採取し、上清をサンプリングした。
【００５７】
３．エリスリトールの測定
得られたサンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２万倍希釈し、高速液体クロマトグラフィー（日本ダイオネクス社製、型番：ＩＣＳ−３０００）を用いて、エリスリトール濃度を測定した。
【００５８】
なお、具体的な分析条件としては、以下のとおりである。
サンプル：２５μＬ
溶離液：５００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液
流速：０．３ｍＬ／ｍＬ
カラム：Ｃａｒｂｏ  Ｐａｃ  ＭＡ−１（日本ダイオネクス社製）
検出器：パルスドアンペロメトリ検出器（日本ダイオネクス社製、型番：ＥＤ−５０、金電極）
測定時間：２０分
【００５９】
また、標準液として、５０μＭ及び１００μＭのエリスリトール溶液及びグリセロール溶液を調製した。特にエリスリトール生産量が優れた変異株（ＮＵ１株）及び野生株（ＳＮ−１２４Ａ株）のエリスリトール生産量を図１に示す。
【００６０】
図１から、全ての培養日数において、ＮＵ１株でのエリスリトール生産量のほうが、ＳＮ−１２４Ａ株でのエリスリトール生産量よりも良好であった。同濃度（２０質量％）のグリセロール含有培地を用いて培養したことから、グリセロールからエリスリトールへの変換効率は、ＮＵ１株のほうが良好であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本実施形態のエリスリトール生産酵母によれば、グリセロールをエリスリトールに高効率で変換することができる。本実施形態の製造方法によれば、高効率でエリスリトールを得ることができる。
【図１】
2019205365.tif 000002