(57)【要約】      （修正有）【課題】疾患によるアンジオポエチン−２（Ang2）レベルの増加により、Tie2上の共通の接触部分に対する結合について、Ang1と競合し、Ang1の休止促進作用が遮断される。これを防ぐため、Ang2とAng1とを区別する能力があるポリペプチドアンジオポエチン阻害剤を提供する。【解決手段】改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含むポリペプチドであって、アンジオポエチン-1と比較してアンジオポエチン-2に優先的に結合するポリペプチドを開示する。また、ポリペプチドをコードしている核酸配列、並びにがん及び炎症などの疾患の治療におけるポリペプチドの薬学的使用も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含むポリペプチドであって、アンジオポエチン-1と比較してアンジオポエチン-2に優先的に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記アンジオポエチン受容体が、Tie2である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
改変されたTie2エクトドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して1〜30個のアミノ酸の変化を含むヒトTie2の変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210の変異体を含み、前記変異体が、配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210と比較して1〜30個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号1又は配列番号2の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号1又は配列番号2の残基150〜230内に1つ以上の突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号1又は配列番号2の154、161、167、168、169、170、171及び226位のうちの1つ以上に突然変異を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号1又は2の161、167及び168位に突然変異を含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して、F161I、ΔR167、ΔH168、V154L、P171A、E169D、V170I及びT226Sから選択される1つ以上の突然変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
突然変異F161Iを含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
突然変異ΔR167/ΔH168を含む、請求項１０又は請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
突然変異F161I、ΔR167及びΔH168を含む、請求項１１又は１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記断片が、少なくとも50アミノ酸残基の長さである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
少なくとも10:1の親和性の比でAng2及びAng1に結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
10nM未満のKdでAng2に結合し、且つ/又は1μMを超えるKdでAng1に結合する、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしている、核酸。
【請求項２０】
図9又は図10Aに示される1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を含む、配列番号4若しくは配列番号5の変異体又はその一部を含む、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
請求項１９又は請求項２０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２４】
アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態の予防又は治療に使用するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物。
【請求項２５】
アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療するための医薬を調製するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物の使用。
【請求項２６】
それを必要とする被験体においてアンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、医薬として有効な量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記疾患又は状態が、がん、炎症、敗血症、血管形成、浮腫、網膜症、加齢黄斑変性又は高血圧である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して突然変異F161Gを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して突然変異F161G、ΔR167及びΔH168を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び動物における疾患の治療に有用なポリペプチドに関する。特に、本発明は、アンジオポエチン-2のポリペプチド阻害剤及びがんなどの疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンジオポエチン-2(Ang2)は、70kDaの分泌リガンドであり、その発現の増大はがん、敗血症及び成人呼吸窮迫症候群を含めた様々な疾患に関係している(1、2)。Ang2に対する一次受容体は、血管内皮細胞及び骨髄細胞で主に発現している膜貫通チロシンキナーゼTie2(3)である(1、4)。Ang2は発生における血管再形成において重要な役割を担うが、成人組織におけるAng2濃度は通常低い。疾患におけるAng2レベルの増加により、当該分子はTie2上の共通の接触部分に対する結合について、関連するアゴニストAng1と競合できるようになる(3)。Ang1は、血管周囲細胞によって構成的に産生される防御タンパク質であり、炎症、血管漏出及び内皮アポトーシスを抑制することにより血管機能並びに休止を維持する(1、5)。Ang2によるAng1の拮抗作用は、Ang1の休止促進作用を遮断し、Ang2誘導性の血管再形成、炎症、漏出及び浮腫に関与する。内皮Tie2に対するその作用に加えて、Ang2は疾患に関連する他の作用をいくつか有する。例えば、該リガンドは、内皮インテグリンに結合し、活性化して血管形成の発生を促進することが最近示され(6)、Ang2は腫瘍浸潤Tie2発現単球に作用して腫瘍生成を促進する(7、8)。
【０００３】
複数の疾患経過に関与するため、抗体及びアプタマーを含めた、Ang2阻害剤の開発には多くの取組みがあった(9〜11)。腫瘍退縮を促進し、がんにおける転移性疾患を抑制し、気道炎症における白血球浸潤及び血管再形成を減少させるAng2阻害剤の報告により、これらの分子及び関連する分子についての研究結果は有望視されてきた(7、10、12、13)。
【０００４】
病態レベルのリガンドを遮断するための抗体の使用に対する補完的な手法は、サイトカイン又はリガンドトラップである(14)。これらの分子は、可溶性融合タンパク質として通常投与される受容体エクトドメイン断片から形成され、標的リガンドを捕捉する。臨床用途におけるリガンドトラップの例には、腫瘍壊死因子-α受容体の可溶形であるエタネルセプト、並びに血管内皮細胞増殖因子受容体-1及び-2の断片のキメラ融合タンパク質であるアフリベルセプトがある(15)。リガンドトラップには大きな利点がある。通常、それらは抗体より小さく良好な組織透過性を有し、標的の生物学的に活性な部分をすでに認識し、免疫系からの保護を一般に必要としない。Ang2に特異的なリガンドトラップは、魅力的な療法になり得る。しかしながら、Ang2の天然の受容体であるTie2は、Ang2に結合するのと同じく良好に又はさらにより良く防御リガンドAng1に結合する(3、16、17)。
【０００５】
新たなタンパク質機能を工学的に作製するのに最も有効な戦略の1つは、定方向タンパク質進化である(18、19)。この過程は、天然の進化において数百万年かけて生じる所望の突然変異の選択及び蓄積を研究室内で数週間の間に基本的に反復する。定方向進化は、一連のライブラリ構築と通常in vitroでの標的タンパク質の突然変異形態の発現と選択の反復を含む。残念なことに、配列スペースをin vitroで生成し、検索するためのこの反復手法は、しばしば困難であり、多大な労力を要する。体細胞高頻度突然変異(SHM)によりその免疫グロブリン可変(IgV)領域を構成的に多様化するB細胞株(20)により、新規な抗体特異性の多様化と選択を合わせて行うことが可能になる。活性化誘導デアミナーゼ(AID)の作用によって導入されるIg遺伝子内の遺伝的バリエーションを、個々の細胞における表面Igの選択可能な発現と組み合わせる(21)。より最近では、そのような細胞株を使用して、外生的に発現される緑色蛍光タンパク質の変異体を進化させている(22、23)。しかしながら、B株において所望の表現型を選択できるならば、この戦略は、多様なタンパク質の定方向進化に対して非常に大きな可能性を理論的に有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Augustin HG、Young Koh G、Thurston G、Alitalo K (2009) Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol 10:165〜177頁.
【非特許文献２】Huang H、Bhat A、Woodnutt G、Lappe R (2010) Targeting the ANGPT-TIE2 pathway in malignancy. Nat Rev Cancer 10:575〜585頁.
【非特許文献３】Maisonpierre PCら (1997) Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277:55〜60頁.
【非特許文献４】De Palma Mら(2005) Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8:211〜26頁.
【非特許文献５】Brindle NPJ、Saharinen P、Alitalo K (2006) Signaling and Functions of Angiopoietin-1 in Vascular Protection. Circ Res 98:1014〜1023頁.
【非特許文献６】Felcht Mら(2012) Angiopoietin-2 differentially regulates angiogenesis through TIE2 and integrin signaling. J Clin Invest 122:1991〜2005頁.
【非特許文献７】Mazzieri Rら (2011) Targeting the ANG2/TIE2 Axis Inhibits Tumor Growth and Metastasis by Impairing Angiogenesis and Disabling Rebounds of Proangiogenic Myeloid Cells. Cancer Cell 19:512〜526頁.
【非特許文献８】Welford AFら (2011) TIE2-expressing macrophages limit the therapeutic efficacy of the vascular-disrupting agent combretastatin A4 phosphate in mice. J Clin Invest 121:1969〜73頁.
【非特許文献９】White RRら(2003) Inhibition of rat corneal angiogenesis by a nuclease-resistant RNA aptamer specific for angiopoietin-2. Proc Natl Acad Sci U S A 100:5028〜5033頁.
【非特許文献１０】Oliner Jら (2004) Suppression of angiogenesis and tumor growth by selective inhibition of angiopoietin-2. Cancer Cell 6:507〜16頁.
【非特許文献１１】Koh YJら(2010) Double Antiangiogenic Protein, DAAP, Targeting VEGF-A and Angiopoietins in Tumor Angiogenesis, Metastasis, and Vascular Leakage. Cancer Cell 18:171〜184頁.
【非特許文献１２】Holopainen Tら (2012) Effects of Angiopoietin-2-Blocking Antibody on Endothelial Cell-Cell Junctions and Lung Metastasis. J Natl Cancer Inst 104:461〜475頁.
【非特許文献１３】Tabruyn SPら (2010) Angiopoietin-2-Driven Vascular Remodeling in Airway Inflammation. Am J Pathol 177:3233〜3244頁.
【非特許文献１４】Economides ANら (2003) Cytokine traps: multi-component, high-affinity blockers of cytokine action. Nat Med 9:47〜52頁.
【非特許文献１５】Huang C (2009) Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODYTM technology. Curr Opin Biotech 20:692〜699頁.
【非特許文献１６】Davis Sら(1996) Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 87:1161〜9頁.
【非特許文献１７】Yuan HT、Khankin EV、Karumanchi SA、Parikh SM (2009) Angiopoietin 2 Is a Partial Agonist/Antagonist of Tie2 Signaling in the Endothelium. Mol Cell Biol 29:2011〜2022頁.
【非特許文献１８】Jackel C、Kast P、Hilvert D (2008) Protein Design by Directed Evolution. Annu Rev Biophys 37:153〜173頁.
【非特許文献１９】Tracewell CA、Arnold FH (2009) Directed enzyme evolution: climbing fitness peaks one amino acid at a time. Curr Opin Chem Biol 13:3〜9頁.
【非特許文献２０】Sale JE、Calandrini DM、Takata M、Takeda S、Neuberger MS (2001) Ablation of XRCC2/3 transforms immunoglobulin V gene conversion into somatic hypermutation. Nature 412:921〜926頁.
【非特許文献２１】Cumbers SJら (2002) Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines. Nat Biotech 20:1129〜1134頁.
【非特許文献２２】Wang L、Jackson WC、Steinbach PA、Tsien RY (2004) Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sci USA 101:16745〜16749頁.
【非特許文献２３】Arakawa Hら (2008) Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Res 36:e1.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがってAng2阻害剤を改善する必要性がまだある。特に、Ang2とAng1とを区別する能力があるポリペプチドアンジオポエチン阻害剤の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含むポリペプチドであって、アンジオポエチン-1と比較してアンジオポエチン-2に優先的に結合する、ポリペプチドを提供する。
【０００９】
一実施形態において、アンジオポエチン受容体は、Tie2である。好ましくは、ポリペプチドは、改変されたTie2エクトドメインを含む。
【００１０】
一実施形態において、ポリペプチドは配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して1〜30個のアミノ酸の変化を含むヒトTie2の変異体を含む。
【００１１】
別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210の変異体を含み、その変異体は、配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210と比較して1〜30個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。
【００１２】
別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有する。
【００１３】
ポリペプチドは、配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して、F161G、F161I、ΔR167、ΔH168、V154L、P171A、E169D、V170I及びT226Sから選択される1つ以上の突然変異を好ましくは含む。
【００１４】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161Iを含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161Gを含む。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、突然変異ΔR167/ΔH168を含む。特に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161I、ΔR167及びΔH168を含む。別の特に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161G、ΔR167及びΔH168を含む。
【００１５】
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、例えばポリペプチドは、配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基を含んでよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記の断片は少なくとも50アミノ酸残基の長さである。
【００１７】
一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも10:1の親和性の比でAng2及びAng1に結合する。例えば、ポリペプチドは、10nM未満のKdでAng2に結合することができ、且つ/又はポリペプチドは、1μMを超えるKdでAng1に結合することができる。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、上記のポリペプチドをコードしている核酸を提供する。
【００１９】
一実施形態において、核酸は、図9又は図10Aに示される1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を含む配列番号4若しくは配列番号5の変異体又はその一部を含む。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、上記のポリペプチド又は核酸と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態の予防又は治療に使用するための、上記のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を提供する。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療するための医薬を調製するための、上記のポリペプチド、核酸又は医薬組成物の使用を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、それを必要とする被験体においてアンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、医薬として有効な量の上記のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【００２６】
一実施形態において、疾患又は状態は、がん、炎症、敗血症、血管形成、浮腫、網膜症、加齢黄斑変性又は高血圧である。
【００２７】
本発明の実施形態は、Ang2に優先的に結合し、またこのリガンドの損傷作用を、Ang1の防御作用を抑制することなく遮断するために使用できる、Tie2エクトドメインの変異体形態を提供する。これは、SHMにより駆動される遺伝子の多様化とB細胞株における表面提示とを組み合わせて、Ang2に優先的に結合するTie2エクトドメインの形態を進化させることによって実現された。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含むポリペプチドであって、アンジオポエチン-1と比較してアンジオポエチン-2に優先的に結合する、ポリペプチド。
[項目２]
前記アンジオポエチン受容体が、Tie2である、項目１に記載のポリペプチド。
[項目３]
改変されたTie2エクトドメインを含む、項目２に記載のポリペプチド。
[項目４]
配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して1〜30個のアミノ酸の変化を含むヒトTie2の変異体を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目５]
配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210の変異体を含み、前記変異体が、配列番号2、又は配列番号1の残基23〜210と比較して1〜30個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目６]
配列番号1又は配列番号2の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、項目１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目７]
配列番号1又は配列番号2の残基150〜230内に1つ以上の突然変異を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目８]
配列番号1又は配列番号2の154、161、167、168、169、170、171及び226位のうちの1つ以上に突然変異を含む、項目７に記載のポリペプチド。
[項目９]
配列番号1又は2の161、167及び168位に突然変異を含む、項目８に記載のポリペプチド。
[項目１０]
配列番号1若しくは配列番号2又はその断片に対して、F161I、ΔR167、ΔH168、V154L、P171A、E169D、V170I及びT226Sから選択される1つ以上の突然変異を含む、項目１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目１１]
突然変異F161Iを含む、項目１０に記載のポリペプチド。
[項目１２]
突然変異ΔR167/ΔH168を含む、項目１０又は項目１１に記載のポリペプチド。
[項目１３]
突然変異F161I、ΔR167及びΔH168を含む、項目１１又は１２に記載のポリペプチド。
[項目１４]
配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、項目１３に記載のポリペプチド。
[項目１５]
配列番号3の少なくとも50アミノ酸残基を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
[項目１６]
前記断片が、少なくとも50アミノ酸残基の長さである、項目１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目１７]
少なくとも10:1の親和性の比でAng2及びAng1に結合する、項目１〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
[項目１８]
10nM未満のKdでAng2に結合し、且つ/又は1μMを超えるKdでAng1に結合する、項目１７に記載のポリペプチド。
[項目１９]
項目１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードしている、核酸。
[項目２０]
図9又は図10Aに示される1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入を含む、配列番号4若しくは配列番号5の変異体又はその一部を含む、項目１９に記載の核酸。
[項目２１]
項目１９又は項目２０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
[項目２２]
項目２１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[項目２３]
項目１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド又は核酸と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
[項目２４]
アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態の予防又は治療に使用するための、項目１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物。
[項目２５]
アンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療するための医薬を調製するための、項目１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物の使用。
[項目２６]
それを必要とする被験体においてアンジオポエチン-2媒介疾患又は状態を予防又は治療する方法であって、医薬として有効な量の項目１〜２３のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸又は医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法。
[項目２７]
前記疾患又は状態が、がん、炎症、敗血症、血管形成、浮腫、網膜症、加齢黄斑変性又は高血圧である、項目２４〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
[項目２８]
前記ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して突然変異F161Gを含む、項目１〜２７のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
[項目２９]
前記ポリペプチドが、配列番号1又は配列番号2に対して突然変異F161G、ΔR167及びΔH168を含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、医薬組成物、使用又は方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】受容体エクトドメインの定方向進化を示す図である。(A)B細胞の高頻度突然変異における定方向進化の戦略を示す図である。
【図１Ｂ】受容体エクトドメインの定方向進化を示す図である。(B)ヒトAng1及びAng2の受容体結合P-ドメインのアラインメントを示す図である。
【図１Ｃ】受容体エクトドメインの定方向進化を示す図である。(C)Tie2の残基1〜442を組み込んでおり、定方向進化に使用された表面発現構築物の略図である。
【図１Ｄ】受容体エクトドメインの定方向進化を示す図である。(D)表面発現構築物でトランスフェクトしたDT40細胞の抗FLAG免疫蛍光染色を示す図である。
【図１Ｅ】受容体エクトドメインの定方向進化を示す図である。(E)Tie2エクトドメインを発現しているDT40細胞のフローサイトメトリーを示す図である。トランスフェクトしていない(灰色のプロット)及びトランスフェクトした(青いプロット)細胞に、His6タグを付けた1nM Ang1若しくはAng2又はリガンド無しを30分間結合させた後に、抗His及び蛍光二次抗体で染色した。
【図２Ａ】リガンド特異的なTie2エクトドメインの進化を示す図である。(A)1nM Ang1とインキュベーションし、抗Ang1及び蛍光二次抗体と蛍光抗FLAG(発現)とで共染色した後のDT40細胞のFACSプロットである。多角形は、ソート1(上のプロット、左)、2(上のプロット、中央)及び4(上のプロット、右)のソートにおいて細胞を選択するために使用したゲートを示す。次いでソート4の細胞を1nM Ang1及び1nMビオチン化Ang2とインキュベートし、抗Ang1/蛍光二次抗体及び蛍光標識ストレプトアビジンにより結合を検出した。最も高いAng2結合について細胞を選択した。多角形は、ソート5(下のプロット、左)及び6(下のプロット、中央)のソートで細胞を選択するために使用したゲートを示す。ソート8(下のプロット、右)の後に、多角形に表示される細胞を配列決定のために選択した。
【図２Ｂ】リガンド特異的なTie2エクトドメインの進化を示す図である。(B)野生型受容体を発現しているDT40細胞と進化させた(R3)細胞集団の1nM Ang1及びAng2の結合に対する比較を示す図である。灰色のプロットは、リガンドの非存在下での各細胞集団に対する染色後の蛍光を示す。
【図３Ａ】3個のアミノ酸変化が、Tie2の結合特異性を切り替えることを示す図である。(A)示される一次配列は、本明細書において配列番号2と定義されるヒトTie2の残基1〜442である。R3細胞から20個の無作為配列を決定し、全てがF161I置換及びR167、H168欠失を実証した。F161I置換及びR167/H168欠失を含むこの図に示される配列は、本明細書において配列番号3と定義される。
【図３Ｂ】3個のアミノ酸変化が、Tie2の結合特異性を切り替えることを示す図である。(B)F161I置換はβシートに、欠失は受容体:リガンド接触部分のターンに位置することを示す図である。オレンジ色=Ang2、青色=Tie2。PDBアクセッション2GY7でモデル化されている(26)。
【図４Ａ】進化させたエクトドメインがAng2に特異的に結合することを示す図である。(A)分泌される野生型及び進化させたエクトドメインをHEK293細胞で発現させた後に精製し、SPRセンサーに固定化した。野生型又は進化させたエクトドメインに対するAng1及びAng2結合の分析を示す図である。
【図４Ｂ】進化させたエクトドメインがAng2に特異的に結合することを示す図である。(B)分泌される野生型エクトドメイン及びF161I置換若しくはR167、H168二重欠失を持つエクトドメインを発現させ、精製して、固定化したAng1若しくはAng2に対する結合についてELISAで分析した図である。データを、1回の実験を3つ組の測定で少なくとも3回実施した平均及び標準偏差として示す。
【図５Ａ】進化させたエクトドメインが、内皮細胞に対するAng2の作用を遮断することを示す図である。(A)Aktリン酸化のAng1-活性化に対するAng2のアンタゴニスト作用を、内皮細胞株EA.hy926において試験した図である。細胞を、200ng/mL Ang2並びに25μg/mL野生型(Wt)又はR3エクトドメインの非存在下及び存在下で50ng/mL Ang1と30分間活性化した後に、細胞を溶解し、ゲル電気泳動し、図の通りS473でリン酸化されているAkt(pAkt)又は全AKT(tAkt)を認識する抗体で免疫ブロットした。
【図５Ｂ】進化させたエクトドメインが、内皮細胞に対するAng2の作用を遮断することを示す図である。(B)Aktリン酸化の活性化に対する1μg/mL Ang2のアゴニスト活性を、25μg/mL R3の非存在下及び存在下で試験し、比較のために50ng/mL Ang1に対する作用も示した図である。Ang2によって誘導される低レベルのpAktを見るために、ブロットを過剰露出したため余分な非特異的バンドが見える。pAktを矢印で表示する。
【図５Ｃ】進化させたエクトドメインが、内皮細胞に対するAng2の作用を遮断することを示す図である。(C)高濃度のAng2(1μg/mL)に反応する内皮細胞の移動は、R3エクトドメインによって阻害されたが、この突然変異エクトドメインは、Ang1(50ng/mL)に反応する移動に影響を及ぼさないことを示す図である。データを、3つの独立した実験の平均及びSEMとして示す。
【図６】Tie2-Hypermut2表面発現プラスミドのプラスミド地図を示す図である。RSVプロモーター(濃緑色)及び下流のTie2表面提示配列(赤色)を、Ig相同性領域(ピンク色)、SV40 polyA配列(淡青色)及びβアクチンプロモーター(薄緑色)とともに示す。プラスミドの直鎖化に使用したNot1制限部位のおおよその位置も示す。
【図７Ａ】DT40 Ig遺伝子座へのTie2-Hypermut2の標的化組込みを示す図である。(A)再編成されていない及び再編成されたIg遺伝子座、並びに相同性領域(ピンク色)を含むTie2-Hypermut2並びに組み込まれた構築物の略図である。プライマーP4及びP5の位置を表示する。
【図７Ｂ−Ｃ】DT40 Ig遺伝子座へのTie2-Hypermut2の標的化組込みを示す図である。再編成されていない遺伝子座において組込みが起こらなかった場合、P4/P5を用いる形質転換体由来のDT40ゲノムDNAのPCRは、(B)において3つの代表的なクローンに確認された493bpの部分を増幅する。Tie2-Hypermut2が再編成された遺伝子座に組み込まれる場合、プライマーGW1/GW2を用いるトランスフェクトしたDT40由来ゲノムDNAのPCR増幅は、(C)において3つのクローンで示される1189bpの部分を増幅する。DNA無しの対照増幅(Cont)及びトランスフェクトしていないDT40ゲノムDNA由来の増幅(Unt)も示し、nsは非特異的増幅産物を示す。
【図８】DT40細胞の抗FLAG免疫ブロットを示す図である。トランスフェクトしていない(Unt)DT40及び3つのトランスフェクトしたクローンから細胞溶解物を調製し、FLAGエピトープタグに対して免疫ブロットした。
【図９−１】非発現DT40集団における突然変異を示す図である。抗FLAGによる染色及びAng1結合の後にFACSによって選択した非発現DT40からゲノムDNAを調製し、Tie2エクトドメインをコードしているDNAの増幅に使用した。大腸菌(E Coli)に形質転換した後に、30個の無作為に選択したコロニーを配列決定した。示した核酸一次配列(本明細書において配列番号4と称する)は、ヒトTie2エクトドメイン、即ち配列番号1の残基1〜442(本明細書において配列番号2と称する)をコードする。突然変異したヌクレオチドを赤色にし、置換されたヌクレオチドを上に示し、ダッシュは欠失を示す。いくつかの突然変異は発現に影響を及ぼさなかったが、これらは発現を取り除く(ablate)する欠失を伴った。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０Ａ】R3 Ang2特異的結合集団における突然変異を示す図である。ゲノムDNAを、図5に示したR3集団から調製し、Tie2エクトドメインをコードしているDNAの増幅に使用した。大腸菌に形質転換した後に、20個の無作為に選択したコロニーを配列決定した。(A)示される核酸一次配列(本明細書において配列番号5と称する)は、配列番号4の残基401〜750を含む。突然変異したヌクレオチドを赤色にし、置換されたヌクレオチドを上に示し、ダッシュは欠失を示す。20個全ての配列に見られたヌクレオチド変化に下線を引く。
【図１０Ｂ】R3 Ang2特異的結合集団における突然変異を示す図である。ゲノムDNAを、図5に示したR3集団から調製し、Tie2エクトドメインをコードしているDNAの増幅に使用した。大腸菌に形質転換した後に、20個の無作為に選択したコロニーを配列決定した。(B)示されるアミノ酸一次配列(本明細書において配列番号6と称する)は、配列番号1の残基101〜300を含む。突然変異に起因するアミノ酸の変化を赤で示し、20個全ての配列に見られた変化に下線を引く。
【図１１】精製した可溶性エクトドメインFc融合タンパク質を示す図である。Hek293細胞で発現させ、ニッケルカラムで精製した後の、野生型(Wt)及びR3エクトドメインFc融合タンパク質のクマシー染色ゲルである。質量マーカーの位置を、kDaで表示する。
【図１２−１】ヒトTie2のアミノ酸配列を示す図である。データベースアクセッション番号Q02763に記載の通り、ヒトTie2の完全長アミノ酸配列(配列番号1)を示す。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【図１３】進化させたエクトドメインが、in vivoで限局性浮腫を抑制することを示す図である。対照担体(黒色)、LPS(赤色)、R3エクトドメインとLPS(青色)又は不活性ΔR167、H168エクトドメインとLPS(紫色)を注入したマウスにおける局所的浮腫形成の定量分析である。注入の2時間後に採取した個々のマウスひざのデータを、平均皮下組織厚(脛骨骨膜と表皮の間の距離)、最小値及び最大値+/-SDとして表示し、最低9つのデータ点について対応する対照と比較した(*P<0.005、**P<0.0001、スチューデントt-検定)。実験は、独立した2回(マウス99〜101及び67〜69、72、73)で同じLPSストックを用いて実施した。
【図１４】進化させたエクトドメインが、in vivoで限局性浮腫を抑制することを示す図である。表示の通り対照担体、LPS又はR3エクトドメインとLPSを注入したマウスにおける局所的浮腫形成の定量分析である。注入の1時間後に採取した個々のマウスひざのデータを、マウス1匹当たり4つのデータ点の平均皮下組織厚及びSDとして表示する。データは、マウスの対応する各対について示す。
【図１５−１】突然変異体がAng1に結合しないが、R3と比較してAng2結合の増大を示すことを示す、R3 I161G突然変異体の結合のSPR分析を示す図である。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１６】固定化したAng2に対するR3及びR3 I161G突然変異体のELISA結合が、R3 I161G突然変異体のAng2結合が改善したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
一態様において、本発明は、改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含むポリペプチドであって、アンジオポエチン-1と比較してアンジオポエチン-2に優先的に結合する、ポリペプチドに関する。
【００３０】
アンジオポエチン受容体
「アンジオポエチン受容体」とは、アンジオポエチンに選択的に又は特異的に結合する作用物質を意味する。好ましくは、アンジオポエチン受容体は、Tie2(Ig及びEGF相同ドメイン-2を持つチロシンキナーゼ)であり、これはチロシンプロテインキナーゼ受容体TIE-2、アンジオポエチン-1受容体、内皮チロシンキナーゼ、内膜内皮細胞キナーゼ、チロシンプロテインキナーゼ受容体TEK、p140 TEK、及びCD抗原202bとしても公知である。Tie2は、IUBMB酵素命名法により分類EC=2.7.10.1の受容体型チロシンキナーゼに分類される。ヒトTie2のアミノ酸配列は、UniProtKB/Swiss-Protデータベースアクセッション番号Q02763の下に見ることができ、配列番号1に示す(図12)。
【００３１】
改変されたアンジオポエチン受容体及びその断片
本明細書に記載されるポリペプチドは、改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片を含む。「改変された」とは、ポリペプチド配列が、野生型アンジオポエチン受容体に対して、例えばヒトTie2(Q02763、配列番号1及び図12に示す)と比較して、1つ以上の差異(例えばアミノ酸の置換、欠失又は挿入)を含むことを意味する。したがって、ポリペプチドは、アンジオポエチン受容体、好ましくはヒトTie2、の変異体、突然変異体又は他の改変された形態であり得る。
【００３２】
好ましくは、ポリペプチドは、野生型アンジオポエチン受容体に対して少なくとも2つ又は少なくとも3つのアミノ酸変化を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型受容体又はその断片中の対応する配列と比較して、例えばヒトTie2(配列番号1)又はその断片と比較して、1〜30、1〜20、1〜10、1〜5、2〜30、2〜20、2〜10若しくは2〜5個のアミノ酸の差異を含み得る。
【００３３】
アミノ酸変化は、置換、欠失又は挿入を含んでよい。置換変異体とは、天然の配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去されたもの、及び同じ位置でその場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子内のアミノ酸が1つだけ置換された単一であってもよく、同じ分子内で2つ以上のアミノ酸が置換された複数であってもよい。
【００３４】
挿入変異体とは、天然の配列の特定の位置でアミノ酸に直接隣接して挿入された1つ以上のアミノ酸を持つものである。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のαカルボキシ又はαアミノ官能基のいずれかに接続していることを意味する。
【００３５】
欠失変異体とは、天然の配列中の1つ以上のアミノ酸残基が除去されたものである。例えば、欠失変異体は、分子の特定の領域において1つ、2つ又はそれ以上のアミノ酸残基が欠失していてよい。欠失突然変異は、記号Δによって本明細書に表示される。
【００３６】
「断片」とは、アンジオポエチン受容体の完全長配列の一部を意味し、典型的にはその部分は独立して折りたたまれる能力があり、且つ/又は完全長配列の1つ以上の構造的若しくは生物学的特性を保持する。したがって、本明細書に記載の通り、断片はAng1と比較してAng2に優先的に結合する能力がある。好ましい断片は、典型的には長さ10〜1000、20〜800、30〜500、30〜800、30〜500、50〜500、50〜300又は100〜200アミノ酸残基である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、断片は、アンジオポエチン受容体の細胞外ドメイン(エクトドメイン)の実質的に全て、又は少なくとも一部を含む。用語「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」とは、本来細胞膜の外面に露出しており、典型的にはAng2に対する結合に関与する、アンジオポエチン受容体内のアミノ酸配列のことを指す。アンジオポエチン受容体の細胞外及びリガンド結合ドメインは、X線検査、突然変異分析及び抗体結合研究を含めた当技術分野において公知の方法によって決定することができる。突然変異の手法には、エスケープ突然変異体の選択と合わせた無作為飽和突然変異生成、及び挿入突然変異生成の技術がある。受容体内のリガンド結合領域を同定するのに適切な別の戦略は、アラニン(Ala)スキャニング突然変異生成として公知である。例えばCunninghamら、Science、244、1081〜1985頁(1989)を参照のこと。この方法は、荷電アミノ酸側鎖を含有する領域の同定を含む。同定した各領域内の荷電残基(即ちArg、Asp、His、Lys及びGlu)が、Alaで置き換えられ(突然変異体1分子当たり1領域)、得られた受容体のリガンド結合を試験して、リガンド結合における特定の領域の重要性を評価する。リガンド結合ドメインの位置を決定するさらなる方法は、中和抗体の使用による。通常、これら及び類似の方法の組合せを使用して、細胞外にありAng2に対する結合に関与するドメインの位置を決定する。
【００３８】
一実施形態において、ポリペプチドは、ヒトTie2の少なくとも残基1〜442又は残基23〜210に対して相同なアミノ酸配列を含む。ヒトTie2の残基1〜442は、図3Aに示され、本明細書において配列番号2と定義される。例えば、ポリペプチドは、配列番号1の残基1〜442若しくは残基23〜210の変異体又は相同体である配列を含んでよく、例えば、配列番号1の残基1〜442又は残基23〜210と比較して1〜30、1〜10若しくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含む。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1の少なくとも残基100〜210、150〜210若しくは150〜170の変異体又は相同体を含んでよい。
【００３９】
好ましくは、改変されたアンジオポエチン受容体又はその断片は、野生型アンジオポエチン受容体の一部、例えば少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300若しくは少なくとも500アミノ酸残基にわたって又は配列の完全長に対して、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の相同性又は配列同一性を示す。「相同性」という用語は、「配列同一性」と同一視できる。例えば、ポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又はその断片、例えば、配列番号1又は配列番号2の少なくとも30、100若しくは300アミノ酸残基にわたって又は配列番号1の残基1〜442若しくは残基23〜210に対して上記任意の程度の配列同一性を有してよい。
【００４０】
配列同一性の比較は、目で、又はより通常には、容易に利用できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。これら市販のコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを使用して、2つ以上の配列間の差異をもたらした可能性がある進化的事象を最も反映している2つ以上の配列をアラインさせる。したがって、これらのアルゴリズムは、同一又は類似のアミノ酸のアラインメントにポイントを加算し、ギャップの挿入、ギャップ伸長及び非類似アミノ酸のアラインメントにペナルティを与える評価法で動作する。比較アルゴリズムの評価法は、
i)ギャップが挿入される度毎のペナルティスコアの割当て(ギャップペナルティスコア)、
ii)既存のギャップが追加の位置で伸長される度毎のペナルティスコアの割当て(伸長ペナルティスコア)、
iii)同一アミノ酸のアラインメントに対する高スコアの割当て、及び
iv)非同一アミノ酸のアラインメントに対する可変スコアの割当てを含む。
【００４１】
ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを改変することが可能である。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウェアを使用する場合には、初期設定値を使用することが好ましい。
【００４２】
非同一アミノ酸のアラインメントに対して付与されるスコアは、置換マトリックスとも呼ばれるスコアリングマトリックスに従って指定される。そのような置換マトリックスにおいて定められたスコアは、進化の間に或るアミノ酸が別のものに置換される可能性は異なり、置換されるアミノ酸の物理的/化学的性質に依存するという事実を反映している。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸で置換される可能性は、疎水性アミノ酸で置換される可能性と比較してより高い。したがって、スコアリングマトリックスは、同一アミノ酸に対して最も高いスコア、同一でないが類似しているアミノ酸に対してより低いスコア及び同一でなく類似してもいないアミノ酸に対してさらに低いスコアを指定することになる。最も頻繁に使われるスコアリングマトリックスは、PAMマトリックス(Dayhoffら(1978)、Jonesら(1992))、BLOSUMマトリックス(Henikoff及びHenikoff (1992))及びGonnetマトリックス(Gonnetら(1992))である。
【００４３】
そのようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムには、それだけには限らないが、Vector NTI(Invitrogen Corp.)並びにClustalV、ClustalW及びClustalW2プログラム(Higgins DG及びSharp PM(1988)、Higginsら(1992)、Thompsonら(1994)、Larkinら(2007))がある。異なるアラインメントツールの選択は、www.expasy.orgにおいてExPASyプロテオミクスサーバから利用可能である。配列アラインメントを実施できるソフトウェアの別の例は、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)であり、米国バイオテクノロジー情報センターのウェブページから利用可能であり、これは現在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で見ることができ、Altschulら(1990)J. Mol. Biol. 215、403〜410頁に最初に記載された。
【００４４】
ソフトウェアが一旦アラインメントを作製したら、％類似性及び％配列同一性を算出することが可能になる。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部としてこれを行い、数値的な結果を生成する。
【００４５】
一実施形態において、配列アラインメントを実施するにはClustalWソフトウェアを使用することが好ましい。好ましくは、ClustalWによるアラインメントは、ペアワイズアラインメントに対して以下のパラメータで実施される:
【００４６】
【表１】
2019088293.tif 000002
【００４７】
ClustalW2は、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所によるインターネット上で、EMBL-EBIウェブページwww.ebi.ac.ukで、ツール-配列分析-ClustalW2の中で利用可能である。現在では、ClustalW2ツールの正確なアドレスは、www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2である。
【００４８】
別の実施形態において、配列アラインメントを実施するにはVector NTI中のプログラムAlign X(Invitrogen)を使用することが好ましい。一実施形態において、Exp10は、以下の初期設定で使用できる:
ギャップ開始ペナルティ:10
ギャップ伸張ペナルティ:0.05
ギャップ分離ペナルティ範囲:8
スコアマトリックス:blosum62mt2
【００４９】
好ましい突然変異
いくつかの実施形態において、実施例において下に記載の通り、ポリペプチドは、野生型Tie2エクトドメイン配列と比較して、1つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、ヒトTie2配列(配列番号1)又はその断片(例えば配列番号2)の残基150〜230に1つ以上の突然変異(例えば置換、欠失又は挿入)を含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号1又は2の領域150〜180、より好ましくは160〜175、最も好ましくは160〜170に1つ以上の突然変異を含む。
【００５０】
一実施形態において、ポリペプチドは、ヒトTie2配列(配列番号1)又はその断片(例えば配列番号2)の、154、161、167、168、169、170、171及び226位のうち1つ以上に突然変異を含む。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号1又は2の161、167及び168位のうちの1つ、2つ若しくは3つに突然変異を含む。
【００５１】
好ましくは、ポリペプチドは、ヒトTie2配列(配列番号1)又はその断片(例えば配列番号2)に対して以下の突然変異:F161G、F161I、ΔR167、ΔH168、V154L、P171A、E169D、V170I及びT226Sのうちの1つ以上を含む。
【００５２】
一実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161Iを含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、突然変異ΔR167/ΔH168を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、例えば配列番号1又は配列番号2に対して、少なくとも以下の突然変異の組合せ:F161I、ΔR167及びΔH168を含む。
【００５３】
一実施形態において、ポリペプチドは、突然変異F161Gを含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、突然変異ΔR167/ΔH168を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、例えば配列番号1又は配列番号2に対して、少なくとも以下の突然変異の組合せ:F161G、ΔR167及びΔH168を含む。
【００５４】
特に好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3の少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300個のアミノ酸残基、又は完全長、即ち突然変異F161I、ΔR167及びΔH168によって改変された配列番号2の配列を含む(図3Aを参照のこと)。突然変異F161I、ΔR167及びΔH168が存在することを条件として、例えば配列番号3と比較して1〜30、1〜10若しくは1〜5個のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含む、配列番号3の変異体及び相同体も考えられる。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3の少なくとも残基100〜210、150〜210若しくは150〜170の変異体又は相同体を含んでよい。突然変異F161I、ΔR167及びΔH168が保持されることを条件として、配列番号3の少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300若しくは少なくとも500アミノ酸残基又は完全長に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の相同性又は配列同一性を示している配列も記載される。
【００５５】
別の実施形態において、ポリペプチドは、前のパラグラフに記載の通り突然変異I161G(配列番号3に対する)を含む配列番号3の変異体、又はその変異体若しくは相同体を含む。配列番号3に対する突然変異I161Gは、配列番号2に対する突然変異F161Gに対応する。したがっていくつかの実施形態において、配列番号2に対する突然変異F161G、ΔR167及びΔH168が存在することを条件として、ポリペプチドは、配列番号3の少なくとも30、少なくとも100又は完全長に対して少なくとも70％、90％若しくは95％の配列同一性を含む。
【００５６】
さらなる突然変異
代替の突然変異を含むさらに改変されたアンジオポエチン受容体を、本明細書に記載される方法に類似の方法を使用し、下記の実施例を具体的に参照しながら構築することができる。例えば、細胞株において、in vitro体細胞高頻度突然変異を使用して、選択された標的に対して特異性を持つタンパク質を進化させる方法については、例えばWO 00/22111、WO 02/100998及びWO 03/095636に記載されている。
【００５７】
Ang2に対する優先的結合
本発明のポリペプチドは、Ang1と比較して優先的にAng2に結合する。換言すれば、ポリペプチドは、Ang1よりもAng2に通常選択的であり、例えば同じ条件下で、ポリペプチドは、Ang1より高い親和性でAng2に結合する。結合親和性は、当技術分野において公知の標準的な技術、例えば表面プラスモン共鳴、ELISAなど(例えば実施例において以下に記載の通り)を使用して測定することができ、結合(Ka)又は解離(Kd)定数のいずれかで表して定量化することができる。
【００５８】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも2:1の親和性の比でAng2及びAng1に結合する(例えば、Ka(Ang2)/Ka(Ang1)≧2)。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、Ang2/Ang1について少なくとも5:1、少なくとも10:1、少なくとも100:1、少なくとも1000:1又は少なくとも10,000:1の親和性の比を有してよい。例えば、ポリペプチドは、100μM未満、好ましくは1μM未満、より好ましくは100nM未満、最も好ましくは10nM未満のKdでAng2に結合し得る。ポリペプチドは、10nMより大きい、好ましくは100nMより大きい、より好ましくは1μMより大きい、最も好ましくは100μMより大きいKdでAng1に結合し得る。一実施形態において、ポリペプチドはAng1に結合しない(例えば、ポリペプチドは、標準的なアッセイ条件下で、Ang1に対してごくわずかな結合を示す又は実質的に結合を示さない)。
【００５９】
核酸、発現ベクター及び宿主細胞
上記のポリペプチドをコードしている核酸配列も本明細書に提供される。適切な核酸配列は、ヒトTie2など公開されているアンジオポエチン受容体の配列に基づいて当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。ヒトTie2の残基1〜442(即ちエクトドメイン)をコードしている核酸配列を、図9に示す(配列番号4)。配列番号4の残基401〜750を、図10Aに示す(配列番号5)。
【００６０】
本発明によるポリペプチドをコードする突然変異を含む変異体核酸配列も、図9及び10Aに示す。配列が、図9A又は10に示される突然変異のうちの少なくとも1つを含むことを条件として、典型的にはそのような変異体配列は、配列番号4若しくは配列番号5又はその一部、例えばいずれかの配列の少なくとも50、100、200、500若しくは1000ヌクレオチド残基又は完全長に対して少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％又は少なくとも99％の配列同一性を示す。配列同一性は、ポリペプチド配列に関して上に記載のとおり決定することができる。
【００６１】
改変されたアンジオポエチン受容体をコードしている変異体核酸配列は、天然の受容体をコードしているDNAの部位特異的突然変異誘発法など当技術分野において公知の方法によって容易に調製される。そのような配列は、宿主細胞における所望の組換えポリペプチドの発現に適切なベクターにクローニングすることができる。用語「組換え」とは、宿主細胞において組換えDNA発現によって産生されるタンパク質のことを指す。宿主細胞は、原核細胞(例えば大腸菌などの細菌細胞)又は真核細胞(例えば、酵母又は哺乳動物細胞)であってもよい。例えば、ポリペプチドをコードしている核酸は、発現ベクターに入れることができ、次いでそのベクターはサルCOS細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされる。組換え宿主細胞を適切な培地中で増殖させ、宿主細胞で発現させた所望の断片若しくはアミノ酸配列変異体を、クロマトグラフィー又は他の精製方法によって組換え細胞培養物から回収する。
【００６２】
コンジュゲート及び融合タンパク質
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、生物活性を増大させるさらなる部分にコンジュゲートさせてもよい。例えば、ポリペプチドは、ウイルス配列などの異種ポリペプチドと、細胞受容体と、TNF、インターフェロン若しくはインターロイキンなどのサイトカインと、凝血促進活性を有するポリペプチドと、細胞毒素と、並びに他の生物学的若しくは免疫学的活性を持つポリペプチドと融合してもよい。例えば、一実施形態において、Ang2を発現する細胞を殺すことが望ましい場合があり、これは上述のポリペプチドに細胞毒素(例えばジフテリア、リシン若しくはシュードモナス毒素又は化学療法剤)をコンジュゲートすることによって実現できる。そのような融合は、組換え細胞培養法(例えばポリペプチドをさらなるポリペプチド部分に融合する)によって、又はジスルフィド交換若しくはチオエステル結合(例えばイミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチルイマデート(mercaptobutyrimadate)を使用する)を介する結合などの方法を使用して、ポリペプチドのアミノ酸残基側鎖若しくはC末端カルボキシルに細胞毒性部分を共有結合的に架橋することによって、容易に作られる。
【００６３】
診断用途
本明細書に記載されるポリペプチドは、in vitro又はin vivoのいずれかでAng2を検出する様々な方法に使用してよい。診断用途の場合、ポリペプチドは検出可能な部分で標識してよい。検出可能な部分は、直接又は間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生じることができる任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、3H、14C、32P、36S若しくは125Iなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン若しくはルシフェリンなどの蛍光若しくは化学発光化合物、例えば126I、32P、14C若しくは3Hなどの放射性アイソトープ標識、又はアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ若しくはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。
【００６４】
Hunterら、Nature 144:945頁(1962)、Davidら、Biochemistry 13:1014頁(1974)、Painら、J. Immunol. Meth. 40:219頁(1981)及びNygren、J.、Histochem. and Cytochem. 30:407頁(1982)によって記載される方法を含めて、検出可能な部分にポリペプチドを別々にコンジュゲートする当技術分野において公知の任意の方法を利用してよい。
【００６５】
本明細書に記載されるポリペプチドは、Ang2を検出するための、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ並びに沈殿アッセイなど任意のアッセイ形式に利用してよい。
【００６６】
競合結合アッセイは、限られた量の本明細書に記載されるポリペプチドとの結合について、標識した標準(標識したAng2であってよい)が、試験サンプル分析物(例えばヒトAng2)と競合する能力を利用する。試験サンプル中にあるAng2の量は、ポリペプチドに結合する標準の量に反比例する。結合する標準の量の決定を容易にするために、競合の前後にポリペプチドを不溶化してもよく、それによりポリペプチドに結合している標準及び分析物を、結合せずに残っている標準及び分析物と都合よく分離することができる。
【００６７】
サンドイッチアッセイは、検出しようとするタンパク質の異なる部分に各々結合できる2つのポリペプチドの使用を含む。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプル分析物を、固体支持体に固定化されている第1のポリペプチドに結合させ、その後第2のポリペプチドを分析物に結合させ、したがって不溶性の3成分複合体を形成させる。例えばDavid及びGreene、米国特許第4,376,110号を参照のこと。第2のポリペプチドは、検出可能な部分でそれ自体が標識されてもよく(直接サンドイッチアッセイ)、又は検出可能な部分で標識された抗体を使用して測定されてもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアッセイの1つ型はELISAアッセイであり、その場合には検出可能な部分は酵素である。
【００６８】
本明細書に記載されるポリペプチドは、検出可能な部分で標識したポリペプチドを患者に、好ましくは血流に投与し、標識したポリペプチドの患者内における存在及び部位をアッセイする、in vivo画像化にも有用となり得る。この画像化技術は、例えば新生物の病期分類及び治療に有用となり得る。核磁気共鳴、放射線検査又は当技術分野において公知の他の検出方法によるかを問わず、ポリペプチドは、哺乳動物において検出可能な任意の部分で標識することができる。
【００６９】
医薬製剤
本明細書に記載されるポリペプチドは、薬学的使用のための様々な組成物に製剤化してよい。そのような剤形は、本質的に無毒であり、非治療的である薬学的に許容される担体を包含する。そのような担体の例には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝液物質、例えばリン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三珪酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース性物質及びポリエチレングリコールがある。ポリペプチドの局所性又はゲル性形態のための担体には、多糖、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム若しくはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコール及び木蝋アルコールがある。全ての投与に対して、従来通りのデポ剤形態が適切に使用される。そのような形態には、例えばマイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、膏薬、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠及び徐放性調製物がある。典型的にはポリペプチドは、約0.1mg/mL〜100mg/mLの濃度でそのようなビヒクルに製剤化されることになる。
【００７０】
徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性基材があり、その基材は造形品形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルである。徐放性基材の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら、J. Biomed. Mater. Res. 15:167頁(1981)及びLanger、Chem.Tech.、12: 98〜105頁(1982)に記載されるポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート))、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びγエチル-L-グルタミン酸の共重合体(Sidmanら、Biopolymers、22:547頁(1983))、非分解性エチレン酢酸ビニル(Langerら、上記)、ルプロンデポ(商標)(乳酸グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)などの分解性乳酸-グリコール酸共重合体、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸がある。エチレン酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーにより、100日を超える分子の放出が可能になるが、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。被包性ポリペプチドが、長期間体内に留まると、37℃での水分への曝露により変性又は凝集し、生物活性が喪失する可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を工夫することができる。例えば、凝集機序が、チオジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であると発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適当な添加物の使用、及び特定のポリマー基材組成物の開発によって実現することができる。
【００７１】
徐放性ポリペプチド組成物は、リポソームに封入された形態も含む。ポリペプチドを含有するリポソームは、Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:3688頁(1985)、Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77:4030頁(1980)、米国特許第4,485,045号、米国特許第4,544,545号に記載のものなど当技術分野において公知の方法によって調製できる。通常リポソームは、小さい(約200〜800オングストローム)単層型であり、脂質含量は、約30mol.％コレステロールより大きく、選択される割合は、最適なHRG療法に応じて調整される。循環時間を向上させたリポソームについては、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【００７２】
アンジオポエチン-2関連疾患の治療
治療適用の場合、本発明のポリペプチドは、薬学的に許容される剤形で哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、該剤型は、静脈内にボーラス投与として若しくは長時間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所又は吸入経路によってヒトに投与できるものを含む。ポリペプチドは、局所的及び全身的な治療効果を及ぼすために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内又は病巣周囲経路によっても適切に投与される。例えば、卵巣腫瘍の治療においては、腹腔内経路が特に有用となり得る。
【００７３】
疾患の予防又は治療の場合、ポリペプチドの適当な用量は、治療しようとする疾患の種類、疾患の重症度及び経過、ポリペプチドが予防又は療法目的で投与されるか、治療歴、患者の病歴及びポリペプチドに対する反応、並びに主治医の判断で決まることになる。ポリペプチドは、1回の又は数回の治療に亘って患者に適切に投与される。
【００７４】
本明細書に記載されるポリペプチドは、腫瘍性及び非腫瘍性の疾患並びに障害を含めた様々なアンジオポエチン-2関連障害の治療に有用である。様々な疾患におけるAng2の役割が、多数の研究で確認されてきた。例えば、がん(Olinerら、2004年、Cancer Cell 6、507〜16頁、Mazzieriら、2011年、Cancer Cell 19、512〜26頁、Thurston及びDaly、2012年、CSHLP Perspectives in Medicine)、全身性炎症性状態/敗血症(Thurston及びDaly、2012年、CSHLP Perspectives in Medicine)、気道炎症(Tabruynら、2010年、Am J Pathol 177、3233〜3243頁)、眼内血管新生:糖尿病性網膜症、新生児における酸素誘導網膜症及び加齢黄斑変性(Rennelら、2011年、Microcirculation 18、598〜607頁)、動静脈奇形(Hashimotoら、2001年、Circ Res 89、111〜113頁)、肺高血圧(Dewachterら、2006年、Am J Respir Crit Care Med 174、1025〜1033頁)に関する上の刊行物を参照のこと。
【００７５】
治療可能な新生物及び関連する状態には、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、肝癌、卵巣癌、卵胞膜細胞腫、アレノブラストーマ、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮内膜増殖症、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌、頭頸部癌、上咽頭癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚癌、血管腫、海綿状血管腫、血管芽細胞腫、膵臓癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、グリア芽細胞腫、神経鞘腫、乏突起細胞腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、腎細胞癌、前立腺癌、母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍に関連するものなど)及びメーグス症候群がある。
【００７６】
治療可能な非腫瘍性状態には、慢性炎症及び肺の炎症を含めた炎症、敗血症、血管形成、浮腫、糖尿病性及び他の網膜症、加齢黄斑変性、高血圧、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、甲状腺過形成(バセドウ病を含む)、角膜及び他の組織移植、ネフローゼ症候群、妊娠高血圧腎症、腹水、心嚢貯留液(心膜炎に関連するものなど)並びに胸水がある。
【００７７】
例えば、1回以上の個別投与による場合であれ、持続注入による場合であれ、疾患の型及び重症度に応じて約1μg/kg〜15mg/kgのポリペプチドが、患者に投与する場合の最初の候補用量である。典型的な1日の投与量は、上記の因子に応じて約1μg/kg〜100mg/kg又はそれ以上の範囲であってよい。数日間又はより長期にわたる反復投与の場合、疾患の症状に所望の抑制が起こるまで状態に応じて治療は繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有効であってもよい。この療法の進展は、例えば、X線撮影腫瘍画像化を含む従来通りの技術及びアッセイにより容易に監視される。
【００７８】
本発明の別の実施形態によると、疾患の予防又は治療におけるポリペプチドの有効性は、ポリペプチドをその目的に有効な別の作用物質と連続的に又は併用して投与することによって改善でき、該作用物質としては、腫瘍壊死因子(TNF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、酸性若しくは塩基性線維芽細胞増殖因子(FGF)又は肝細胞増殖因子(HGF)の血管形成活性を阻害又は中和することができる抗体、組織因子、プロテインC若しくはプロテインSの凝固活性を阻害又は中和することができる抗体(1991年2月21日に公開されたEsmonら、PCT出願特許公開番号WO 91/01753を参照のこと)、又は1つ以上の従来通りの治療剤、例えばアルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝拮抗物質、抗生物質、ピリミジン類似体、5-フルオロウラシル、プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾルヌクレオシド若しくは副腎皮質ステロイドがある。そのような他の作用物質は、投与される組成物中に存在してもよく又は別々に投与されてもよい。また、放射性物質の照射又は投与を含むかどうかにかかわらず、ポリペプチドは放射線治療と連続的に又は併用して適切に投与される。
【００７９】
一実施形態において、腫瘍の血管新生は併用療法において攻撃される。本明細書に記載される1つ以上のポリペプチドは、例えば腫瘍、又はもしあればその転移巣、の壊死を観察することによって決定される治療上有効な用量で担腫瘍患者に投与される。さらなる有益な効果が観察されない又は臨床検査が腫瘍若しくはいかなる転移巣の痕跡も示さない時点まで、この療法は続けられる。次いでTNFは、単独で、或はα-、β-若しくはγ-インターフェロン、VEGFアンタゴニスト、抗HER2抗体、ヘレグリン、抗ヘレグリン抗体、D-因子、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、又は抗プロテインC抗体、抗プロテインS抗体若しくはC4b結合タンパク質など腫瘍における微小血管凝集を促進する作用物質(1991年2月21日に公開されたEsmonら、PCT出願特許公開番号WO 91/01753を参照のこと)などの助剤、又は熱若しくは放射線と併用して投与される。
【００８０】
助剤はその有効性に違いがあるので、従来通りの様式のマトリックススクリーニングによって腫瘍に対するその影響を比較することが望ましい。所望の臨床効果が実現されるまで、ポリペプチド及び助剤の投与を繰り返すことができる。固形腫瘍が、四肢、又は大循環から離れている影響を受けやすい他の部位に見つかる場合、本明細書に記載される治療剤は、離れた腫瘍又は器官に投与される。他の実施形態において、抗FGF又は抗PDGF中和抗体など、FGF若しくは血小板由来増殖因子(PDGF)アンタゴニストが、ポリペプチドと組み合わせて患者に投与される。
【００８１】
他の用途
本明細書に記載されるポリペプチドは、Ang2に対する親和性精製作用物質としても有用である。この過程において、ポリペプチドは、当技術分野において周知の方法を使用してセファデックス樹脂又は濾紙などの適切な支持体に固定化される。次いで固定化した抗体を、精製しようとするAng2を含有するサンプルと接触させ、その後、固定化したポリペプチドに結合しているAng2以外のサンプル中の実質的に全ての材料を除去する適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ポリペプチドからAng2を遊離するグリシン緩衝液、pH 5.0など別の適切な溶媒で支持体を洗浄する。
【実施例】
【００８２】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することにより、ここでさらに例示される。
【００８３】
[実施例1]
材料及び方法
材料
ヒトTie2エクトドメイン(1〜442)及び血小板由来増殖因子受容体β(膜貫通配列を含む残基514〜562)と、アミノ末端のアラニン5個のリンカーに続けてFLAGエピトープをコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応によって生成した。これらの増幅産物をpcDNA3.1にライゲーションし、次いでベクターpHypermut2に移した(23)。全ての構築物を、配列決定によって確認した。Ang1、Ang2、ビオチン化Ang2及びマウス抗Ang1は、R & D Systemsから入手した。FITCにコンジュゲートされた抗FLAG、及びフィコエリトリン若しくはフィコエリトリン/Cy5にコンジュゲートされたストレプトアビジンは、Sigmaから、並びにアロフィコシアニン(APC)にコンジュゲートされた抗His6はAbCamから入手した。Percp/Cy5.5にコンジュゲートされたヤギ抗マウスを、Biolegendから入手した。
【００８４】
定方向進化
DT40ニワトリB細胞株AIDRCL4(23)を、7％ウシ胎児血清及び3％ニワトリ血清を含むRPMI-1640中で、37℃、5％ CO2で増殖させた。トランスフェクションは、Gene Pulser(BioRad)を250V、950μFで使用して、0.4cmキュベットでエレクトロポレーションによって実施し、安定なトランスフェクタントをピューロマイシンで選択した。再編成されたIg遺伝子座にTie2構築物を組み込んだトランスフェクトしたクローンを、以前に記載されたとおりPCRによって同定した(23)。エピトープタグに対する免疫ブロットによって発現を確認し、非透過性細胞の免疫染色によってTie2エクトドメイン及び表面発現を確認した。
【００８５】
リガンド結合及び蛍光活性化細胞ソートのために、DT40細胞を、10％ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、適切なリガンドと室温で30分間インキュベートした後に洗浄し、抗Ang1、抗FLAG、抗His6又は蛍光標識ストレプトアビジン(ビオチン化Ang2検出用)及び蛍光標識二次抗体を用いて、4℃で適宜染色した。50,000,000〜100,000,000個の細胞を、常法通りFACSによってソートし、選択した細胞をさらに増殖させるために培地に直接回収した。細胞を増殖させ、結果及び考察に記載の通り繰り返しソートした。
【００８６】
DT40細胞において外生的に発現しているTie2表面発現構築物を配列決定するために、DT40細胞からゲノムDNAを調製した。Tie2エクトドメイン挿入物をPCRによって増幅し、配列決定用細菌プラスミドにクローニングし、大腸菌に形質転換した。コロニーを無作為に選択し、プラスミドを配列決定した。
【００８７】
可溶性エクトドメインの発現
Hek293細胞における発現では、野生型Tie2エクトドメイン(1〜442)をコードしているcDNAを、ヒトFcタグ及びC末端His6配列の上流でpcDNA 3.1(Richard Kammerer博士の好意により提供された)にサブクローニングした。部位特異的突然変異誘発法を使用して、進化した突然変異体に対応するようにこの野生型配列を改変した。部位特異的突然変異誘発法は、QuickChangeプロトコール(Agilent Technologies)を使用して基本的に実施し、配列決定によって確認した。
【００８８】
ポリエチレンイミンを使用して懸濁液中でHEK293細胞をトランスフェクトし(28)、細胞を3〜4日間増殖させ培地中に融合タンパク質を蓄積させることによって、可溶性エクトドメインFc融合タンパク質を得た。遠心分離によって培地から破片を除去し、Ni-NTAクロマトグラフィー(Qiagen)を行い、その後10％グリセロールを含有するトリス緩衝食塩水に緩衝液交換することによって融合タンパク質を精製した。ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を決定した。タンパク質を、4℃で貯蔵した。
【００８９】
結合アッセイ
ForteBio Octet instrument(Pall Life Sciences)を使用して表面プラスモン共鳴を実施した。融合タンパク質を5μg/mLでセンサーに固定化し、製造業者によって詳述される通り動態的結合アッセイを実施した。
【００９０】
ELISAアッセイを、5μg/mL Ang1又はAng2を固定化した96穴プレートで実施した。1mg/mL BSA及び0.1％ Triton-X100を含有するTBSでブロッキングした後に、異なる濃度の融合タンパク質を1時間結合させ、洗浄後に、結合している融合タンパク質を、抗Tie2エクトドメイン抗体、続いてペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で検出し、比色定量した。
【００９１】
細胞性アッセイ
内皮細胞株EA.hy926を、10％ウシ胎児血清を含有するDMEM中で、37℃、5％ CO2で培養した。細胞を、無血清培地中でインキュベーションすることにより静止させた後に、25μg/mLの野生型若しくは進化させたエクトドメインFcのある又はない状態で、Ang1、Ang2又は両方で30分間活性化した。洗浄後、細胞を溶解し、等量の細胞性タンパク質をSDS/PAGEによって分離した後に、免疫ブロットによりS473-リン酸化-Akt及び全Aktを検出した。
【００９２】
移動アッセイは、8μm細孔径の挿入部を含有するトランスウエル組織培養ウェル(Becton-Dickinson、UK)中で実施した。可溶性エクトドメインFc融合タンパク質のある又はない状態で、250μg/mL BSAを含有する無血清培地をAng1又はAng2と一緒にウェルの下部チャンバーに入れた。250μg/mL BSAを含有する無血清培地中の105個の内皮細胞を上部チャンバーに入れ、細胞を37℃で4時間移動させた。上面の細胞を、綿棒で穏やかに除去し、4％ホルムアルデヒドで膜を固定した。膜をPBSで洗浄し、核をDAPI(0.1μg/mL)で染色した。膜をグリセロールに封入し、膜を通って移動している細胞の数を、各挿入膜の下側で5箇所の無作為な場所の倍率で数えた。
【００９３】
結果及び考察
細胞表面提示を、免疫グロブリン遺伝子座を標的とした遺伝子を多様化する特定のB細胞株の能力と組み合わせることにより、タンパク質結合及び他の機能の定方向進化のための強力な戦略を得られる可能性がある(図1A)。したがって、本発明者らは、この手法を使用して、防御リガンドAng1よりAng2に優先的に結合するTie2エクトドメインを進化させようと試みた。Ang2はその受容体結合ドメインにおいて70％より高いアミノ酸配列同一性をAng1と共有する(図1B)。これを行うため、リンカー配列、エピトープタグ及びPDGF受容体膜通過領域と一緒にTie2エクトドメインの残基1〜442をコードしているcDNA配列を、B細胞におけるエクトドメインの表面発現用に構築した(図1C)。エピトープタグは、表面発現レベルの定量化を可能にするために組み込まれた。先行する研究は、アンジオポエチン結合が、Tie2の残基23〜210だけを必要とすることを示している(24)。しかしながら、他のタンパク質において相互作用ドメインから遠い部位の突然変異が、結合能力にしばしば影響を及ぼし得ることは公知であり(25)、そのため本発明者らは、定方向進化戦略において、Tie2エクトドメインの残基210を超える追加の部分を含めた。cDNA構築物を、ニワトリ細胞株DT40のIg遺伝子座への標的化組込みのために、ベクターpHypermut2(23)にクローニングした(図6)。通常ニワトリB細胞は、上流にある多数のIgV偽遺伝子部分を使用する遺伝子変換の組合せ、及び鋳型を使わない体細胞高頻度突然変異によってそのIg遺伝子座を多様化する。本発明者らは、IgV偽遺伝子ドナーが欠失しているDT40の変異体を使用したので、それは高頻度突然変異によってしか多様化しない(23)。免疫ブロット及びPCRによって、安定にトランスフェクトしたクローンを、再構成されたIgV遺伝子座由来構築物の発現に対して選択した(図7、8)。表面発現を、抗FLAG免疫蛍光によって確認した(図1D)。本発明者らは、フローサイトメトリーによって、エクトドメインがAng1及びAng2に結合する能力を有することも確認した(図1E)。細胞表面におけるAng1及びAng2に対する見かけの結合親和性は、異なる濃度のAng1又はAng2とインキュベートし、フローサイトメトリー(データ不掲載)を行うことによって得られ、Ang1について0.70+/-0.36nM(n=5)、Ang2について2.00+/-0.30nM(n=3)の見かけのKdが明らかになった。
【００９４】
Ang2に優先的に結合するTie2を進化させるために、本発明者らは、二段階戦略を使用した。最初にAng1に結合するエクトドメインの能力を減少させ、次いで試験し、必要に応じてAng1結合を低く維持したままAng2結合を増加させることを目指した。第1段階では、細胞をAng1とインキュベートして、その結合を抗Ang1及びフィコエリトリン/Cy5コンジュゲート二次抗体によって検出し、一方、Tie2エクトドメイン構築物の発現をFITCコンジュゲート抗FLAGで監視した(図2A)。2つの細胞亜集団が観察され、一方はエクトドメインの発現及びAng1の結合について陰性であり、他方は両方について陽性であった(図2A)。二重陰性集団のTie2エクトドメイン構築物を配列決定することにより、細胞は構築物を保持しているが、発現を不活化する突然変異又は欠失を含有することが確認された(図9)。発現について陽性で、Ang1結合が最低の細胞をFACSによって選択し、拡大増殖させた(図2A)。選択及び拡大増殖を4回反復した後に、親細胞と比較してAng1結合が減少した細胞集団を得た。次いで本発明者らは、強いAng2結合を確かにするために選択戦略を変更した。本発明者らは、ラウンド4の細胞をAng1及びビオチン化Ang2と一緒にインキュベートし、蛍光二次試薬で2つのリガンドの結合を監視した(図2A、下のプロット)。最も高いAng2結合及び低いAng1結合を持つ細胞を、FACSによって選択した。この選択及び拡大増殖レジメを4回行った後に、Ang2に対して明らかな優先的結合を持つ細胞集団を進化させ、それをR3と称した。
【００９５】
Ang1及びAng2に結合する能力について、親及びR3細胞の直接比較を各リガンドに対して実施した(図2B)。野生型Tie2を発現している親細胞が両方のリガンドに結合できたのに対し、R3集団の細胞は、Ang2だけに結合できるように見え、ごくわずかなAng1結合しかなかった。
【００９６】
次に、本発明者らは、優先的なAng2結合を持つ細胞上で発現するエクトドメインをコードしている配列を得た(図2A)。10個の配列を決定し、全てが、共通する変化のセットを有し、具体的にはF161はIによって置き換えられ、R167及びH168の直列の欠失があった(図3A)。F/I置換は、F165コドンにおけるTTCからATCへの単一ヌクレオチド変化の結果であった。RH二重欠失は、コドンP166の最後のCとR167をコードしているCGG及びコドンH168の最初の2つのヌクレオチドであるCAの喪失に起因した。これにより、P166の新たなコドンであるCCTが創製され、R167/H168が除去された(図10)。これらの変化に加えて、いくつかの他の突然変異、具体的にはV154L、P171A、E169D、V170I及びT226Sが、R3集団中に見つかった(図10)。しかしながら、これらのいずれもが、全ての配列に存在するというわけではなかった。興味深いことに、Tie2エクトドメインの公開されている構造の調査により、F161I置換とR167H168二重欠失の両方が、アンジオポエチンに対する受容体の結合接触部分において生じることが明らかになった(図3B)。
【００９７】
進化させたエクトドメインの結合特性をより詳細に分析するために、本発明者らは、カルボキシ末端Fc-タグを持つ野生型エクトドメイン(残基1〜442)を構築し、部位特異的突然変異誘発法によってF161I及びΔR167、H168をこの配列に導入した。野生型及びR3エクトドメインを、およそ80kDaの分泌性可溶性タンパク質としてHEK293細胞で発現させ、精製した(図11)。Ang1及びAng2の結合を、表面プラスモン共鳴を使用して検討した。予想通りに、野生型エクトドメインは両方のリガンドに結合した(図4A)。対照的に、進化させたエクトドメインは、Ang2だけに結合することができ、ごくわずかなAng1結合しか示さず(図4A)、これは、この変異体エクトドメインについて細胞表面で発現させた場合の観察と一致した(図2B)。Ang2と進化させたエクトドメインとの相互作用の親和性(Kd=2.4+/-0.3nM)は、野生型エクトドメインのそれ(4.1+/-0.8nM(n=3))と同程度であった。Ang2の最大結合(Bmax=0.25+/-0.02任意単位)は、野生型(Bmax=0.67+/-0.06任意単位(n=3))より低かった。3残基だけの変化が、受容体エクトドメインの結合特異性にそのような劇的な転換を引き起こしたことは本発明者らにとって驚くべきことであった。2残基の喪失及びFからIへの保存的置換によってこのタンパク質の免疫原性が変化する可能性がきわめて低く、このことは、治療的に使用した場合に、進化した形態が免疫系によく寛容されるであろうことを示唆している。
【００９８】
本発明者らは、結合に対するF161I置換及びΔR167、H168二重欠失のそれぞれの作用を検討することに関心があった。したがって本発明者らは、F161I置換又はΔR167、H168変化を持つ野生型Fc可溶性エクトドメインを構築し、ELISAアッセイでAng1及びAng2結合を試験した。Ang1への結合において、野生型とF161I-エクトドメインの間に識別可能な差異はなかった(図4C)。同様に、野生型とF161I-エクトドメインの両方が、Ang2に等しく良く結合した(図4C)。対照的に、R167/H168の欠失は、Ang1及びAng2に対するエクトドメイン結合を完全に消失させた(図4C)。これは予想外の結果であり、定方向進化によって導入された変化が、相加的ではなく一意的な組合せによる方法で作用して、エクトドメインの結合特異性を切り替えていることを示した。
【００９９】
Ang2に結合しているTie2エクトドメインの結晶構造は、Tie2のF161がAng2のF469と重なっていることを示す(26)。Ang1において相当する位置は、FではなくG残基である。F161からIへの置換は、この位置の疎水的な特徴を保持するが、Tie2中のF161とAng2中のF469の間の芳香族の重なりに負の影響を及ぼすことになる。Tie2中のR167は、Ang2中のD448と塩橋を作るように見える。D448及び周囲の配列は、Ang2とAng1の間で保存されているので、R167の喪失が、両方のリガンドに対する結合に同様に影響を及ぼし得ることが予想される。エクトドメイン内では、H168が、Ang2中でS417及びY476と水素結合を形成し、P452とも相互作用する(26)。Ang1において、Y476及びP452は保存されているが、S417はIである。しかしながら、R167及びH168の喪失は、Ang1/2とTie2との接触部分の性質を著しく破壊し又は変化させると予想できる。
【０１００】
Ang2の細胞作用に対する、R3エクトドメインの作用を試験するために、本発明者らは、内皮細胞株EA.hy926において、Ang1のAng2拮抗作用を妨害する能力を検討した。Ang1を投与した内皮細胞はAktの活性化を示し、報告されているAng2のアンタゴニスト作用と一致して、この活性化はAng2によって抑制された(図5A)。Ang1及びAng2に結合するこの融合タンパク質の能力から予想される通り、Ang1 + Ang2と野生型エクトドメインの混在は、Aktの活性化をさらに抑制した。しかしながら、進化させたエクトドメインをAng1及びAng2と共に添加した場合、Ang2の抑制作用は低下し、Aktの活性化が回復した(図5A)。進化させたエクトドメインの作用をさらに検討するために、本発明者らは、Ang2のアゴニスト活性に対する作用を試験した。高濃度のAng2が、内皮細胞におけるシグナル伝達を刺激することはこれまでに報告されており(27)、図5Bに示すように、EA.hy926細胞において1μg/mL Ang2は、Aktリン酸化を低レベルで刺激した。しかしながら、Ang1の刺激作用は進化させたエクトドメインの混在による影響を受けなかったが、Ang2のアゴニスト活性は遮断された(図5B)。進化させたエクトドメインのAng2を阻害する能力の追試として、本発明者らは、内皮細胞の移動に対する高濃度のAng2のアゴニスト活性を検討した。50ng/mL Ang1と1μg/mL Ang2の両方が、内皮細胞移動を刺激した(図5C)。進化させたエクトドメインの添加は、Ang1誘導移動に影響を及ぼさなかったが、Ang2に反応する移動を遮断した(図5C)。
【０１０１】
表面提示とSHMにより駆動される多様化とを組み合わせることにより、様々な病理に関連するリガンドであるAng2に対する結合特異性及び捕捉能が劇的に変化した新たな形態のTie2エクトドメインを進化させることが可能になった。このエクトドメインの可溶形はAng2に結合し、Ang2がAng1を拮抗することを防ぎ、また、高濃度のAng2に関連するアゴニスト活性を阻害する。Ang2とは対照的に、Ang1は血管保護に重要な役割を有し、そのためAng1を妨害することなくAng2を遮断することができる分子は、治療上の使用、特に炎症を伴う状態に対して著しい有益性がある。
【０１０２】
参考文献
2019088293.tif 000003
2019088293.tif 000004
【０１０３】
[実施例2]
Ang2リガンドトラップR3のin vivo活性
アンジオポエチンには、血管炎症及び透過性を調節する重要な役割がある(1、2)。Ang2の上昇は、多臓器機能不全を伴う敗血症、成人呼吸窮迫症候群並びに腎不全を含めた様々な状態に関連する炎症及び浮腫に関係している(3〜5)。Ang2は、血管漏出によって特徴づけられる局所的な炎症反応を刺激し(6)、炎症促進性サイトカイン、及びリポ多糖類(LPS)を含めた他の刺激物質によって誘導される血管炎症及び浮腫に重要な媒介物質である(7、8)。したがって、進化させたエクトドメインの活性をin vivoで試験するために、本発明者らは、マウスにおいてLPSによって誘導される限局性浮腫形成を阻害するタンパク質の能力を検討した。動物は、対照ビヒクル、LPS、進化させたエクトドメイン(R3)とLPS、又は結合しないΔR167、H168エクトドメインとLPSをひざの皮下に注入された。図13に示すように、注入の2時間後に、皮下組織厚によって測定されるように、LPSは皮下浮腫を生じた。しかしながら、進化させたエクトドメインと一緒に投与した場合にこの作用は遮断され、これは、結合して、Ang2媒介血管透過性を遮断するエクトドメインの能力と一致した。対照的に、結合しないΔR167、H168エクトドメインは、LPS誘導浮腫を阻害できなかった。ひざへのLPS注入1時間後に、類似の実験を実施して限局性浮腫を検討した。再び、進化させたエクトドメイン(R3)は、炎症に関連する限局性浮腫を誘導するLPSの能力を遮断した(図14)。
【０１０４】
方法
同腹仔C57Bl/6マウス(年齢及び性を合わせた)を、Leicester大学の特定病原体障壁部門で育種されているコロニーから得た。マウスを人道的に拘束し、精製した進化させたエクトドメイン又は対照エクトドメインタンパク質(PBSに希釈した10μLの容量中)15μgのある又はない状態で、LPS(大腸菌0111:B4、TLR品質、Enzo Life Sciences, Inc)5μgを投与した。注入部位は、マウスひざであった。手順は、内務省規則及び組織ガイドラインに準拠した。注入後の異なる時間に、マウスを頚椎脱臼によって処分し、組織学的分析用にひざを調製した(固定、中性緩衝食塩水中の6％(v/v)トリクロロ酢酸を使用する脱灰、及びパラフィン包埋)。5μm切片をライト染色で染色し、脛骨骨膜から表皮までの距離を比較測定可能なものを選択し(Delta Pix InSight(v.3.3.1)画像化ソフトウェアを使用する)、皮下組織厚の値を得た(局所的浮腫)。処理について盲検で、各切片から9〜13個のデータポイントを得た。対応ありのデータセットの対応なしt-検定によって統計分析を実施し、p<0.05を有意と見なした。
【０１０５】
参考文献
2019088293.tif 000005
【０１０６】
[実施例3]
Ang2リガンドトラップの改善
進化させたTie2エクトドメイン(R3と称する)によって得た洞察を使用して、本発明者らは、Ang2結合を改善することができたさらなる突然変異体を生成した。進化させた、Ang2特異的リガンドトラップ(R167/H168の欠失及びFからI161への置換)がAng2特異的な結合を提示する考え得る機序を分析することによって、本発明者らは新たな突然変異体を生成した。基本的に、これは、公開されている野生型構造だが、進化させたエクトドメイン(R3)に本発明者らが創製した変化を含めた構造をコンピュータ的に可視化することによって、進化させたエクトドメインの特異的なAng2結合に関与する可能性がある、考え得る水素結合、塩橋、静電的及び疎水的相互作用を決定することを伴った。これから、161位におけるより小さい残基は、Ang1結合を増加させることなくAng2結合をさらに増加させ得るという仮定が導かれた。この突然変異体(R167及びH168における欠失並びに161グリシン)を創製し、発現させ、結合についてSPRでアッセイした(図15)。新たな突然変異体は、Ang1よりもAng2に特異的な結合を示し(進化させたR3タンパク質のように)、且つ、当初の進化させたエクトドメインより高レベルのAng2に対する結合を提示した。この新たな突然変異体は、本発明者らの当初のR3 Ang2特異的リガンドトラップの発展形である。Ang2に対する結合をELISAによっても分析し、再びAng2結合の増大を示した(図16)。
【０１０７】
上の明細書に記載の全ての刊行物を、参照により本明細書に組み込む。本発明の範囲及び精神を逸脱しない本発明に記載されている方法及びシステムの様々な改変及び変形は、当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載しているが、請求の通り、本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、生化学及び生物工学又は関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実行するために記載されている様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１Ａ】
2019088293.tif 000006
【図１Ｂ】
2019088293.tif 000007
【図１Ｃ】
2019088293.tif 000008
【図１Ｄ】
2019088293.tif 000009
【図１Ｅ】
2019088293.tif 000010
【図２Ａ】
2019088293.tif 000011
【図２Ｂ】
2019088293.tif 000012
【図３Ａ】
2019088293.tif 000013
【図３Ｂ】
2019088293.tif 000014
【図４Ａ】
2019088293.tif 000015
【図４Ｂ】
2019088293.tif 000016
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2019088293.tif 000019
【図６】
2019088293.tif 000020
【図７Ａ】
2019088293.tif 000021
【図７Ｂ−Ｃ】
2019088293.tif 000022
【図８】
2019088293.tif 000023
【図９−１】
2019088293.tif 000024
【図９−２】
2019088293.tif 000025
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【配列表】
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