(57)【要約】      （修正有）【課題】三量体、六量体、１２〜１８量体等が混在せず、均一な製品として製造することができ、かつ、天然のアディポネクチンと同等以上の活性を有する分子改変体アディポネクチンの提供。【解決手段】マトリリンファミリータンパク質のコイルドコイルドメインのような三量体化ドメインと、アディポネクチンの球状領域とを含む融合タンパク質とすることにより、自然に会合し、均一な三量体を形成することができる分子改変体アディポネクチン。スタフィロコッカス属（ブドウ球菌属）のプロテインＡのＺＺドメインを更に含み、前記プロテインＡのＺＺドメインが前記マトリリンのコイルドコイル領域のＮ末端側に位置する、分子改変体アディポネクチン。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチンのＣ末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチン。
【請求項２】
マトリリンのコイルドコイル領域がＮ末端側に位置し、アディポネクチン球状領域がＣ末端側に位置する、請求項１に記載の分子改変体アディポネクチン。
【請求項３】
少なくとも１つのスタフィロコッカスのプロテインＡのＺＺドメインをさらに含む、請求項１又は２に記載の分子改変体アディポネクチン。
【請求項４】
プロテインＡのＺＺドメインが、マトリリンのコイルドコイル領域のＮ末端側に位置する、請求項３に記載の分子改変体アディポネクチン。
【請求項５】
マトリリンがマトリリン−２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子改変体アディポネクチン。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項３又は４に記載のアディポネクチン。
【請求項７】
配列番号５、７、９及び１１から選択されるアミノ酸配列を含む請求項６に記載の分子改変体アディポネクチン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子改変体アディポネクチンの三量体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子改変体アディポネクチンをコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号４、６、８及び１０から選択される核酸配列を含む、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の核酸又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
薬学的有効量の請求項８に記載の改変型アディポネクチンの三量体と、製剤学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
動脈硬化症の治療又は予防のための請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動脈硬化症が、狭心症、心筋梗塞又は脳梗塞である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子改変体アディポネクチンに関する。より詳しくは、アディポネクチンのＣ末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂肪食や運動不足による肥満は、メタボリックシンドロームや糖尿病などの発症および増悪を促進するだけでなく、心血管疾患のリスクを高めることが知られている。特に、わが国では、心疾患及び脳血管疾患は、死因の約２７％を占め、心血管病が三大死因の１つとなっている。心血管病は、食生活や生活習慣の変化による肥満及び運動不足に伴い、近年増加している。例えば、急性心筋梗塞の発症数は、わが国では年間約２５万人と推定され、そのうち、約３０％が死亡すると推定される。また、虚血性心疾患（狭心症及び心筋梗塞）の継続的な医療を受けている患者数は約９０万人と推定される。虚血性心疾患の治療には、心臓カテーテル治療が可能であるが、発症から６時間以上経過したり、肥満症や糖尿病患者では、特に心筋梗塞の病巣縮小が見込まれない場合が多い。そのため、現在行われている心臓カテーテル治療に加え、補助的治療としての薬剤の開発が望まれている。
【０００３】
アディポネクチンは、１９９６年に発見された脂肪細胞に特異的に発現し分泌されるアディポカインの一種である。アディポネクチンは、他のホルモンと比較して、極めて多量に血漿中に存在する。アディポネクチンには、様々な機能があり、グルコースレベルの制御や、脂肪酸分解を含む代謝プロセスに加え、動脈硬化抑制、心保護作用、心筋梗塞の病巣縮小、傷ついた血管の修復、マクロファージの血管壁への接着、ＬＤＬの貪食抑制などに関与することが知られている。アディポネクチンの血中レベルの低下が、肥満にともなうメタボリックシンドローム、糖尿病、心血管疾患、がんなどの生活習慣病の発症および増悪の原因の一つである。アディポネクチンは、平滑筋増殖の抑制、動脈硬化症の治療に有効であると考えられている（特許文献１）。
【０００４】
アディポネクチンは、約３０ｋＤａのポリペプチドであり、健康なヒトの循環中では、２〜３０ｍｇ／Ｌの範囲で存在する。アディポネクチンは、Ｎ末端のコラーゲンタンパク質に類似する領域（コラーゲン様ドメイン、ｃＡｄ）、及びＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ）から構成される。そのうち、特にＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ）が、動脈硬化の予防及び治療に有用であることが知られている（特許文献２）。
【０００５】
血漿中のアディポネクチンは、三量体（低分子量トリマー）、六量体（中程度分子量ヘキサマー）、１２〜１８量体（高分子量多量体）等が混在した状態で存在している。アディポネクチン総量よりも、１６量体又はそれ以上の高分子多量体レベルが、肥満、冠状動脈疾患等に相関が強いことが知られており、高分子多量体が最も生理活性が高いと考えられている（非特許文献１）。
【０００６】
アディポネクチンによるほとんどの心保護シグナルのメカニズムは、ＡＭＰＫの活性化により媒介される。アディポネクチンは、抗炎症、抗酸化及び抗アポトーシス作用を有し、これらの作用により、虚血再灌流に対する保護効果がもたらされることが確認されている。低下しているアディポネクチンを補充することや、ＡＭＰＫやＰＰＡＲを活性化することは、肥満にともなうメタボリックシンドローム、糖尿病、心血管疾患、がんの治療法になることが示されている（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３５３８７１１号公報
【特許文献２】国際公開第２００３／０９９３１９号（特許第４１４７２２０号公報）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ  ２０１２；２（４）：  ２５３−３６６
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，５０３，４９３−４９９（２０１３）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，１０９６−１１０３（２００５）
【非特許文献４】Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．７４（２００７）４７１−４７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
天然型のアディポネクチンは、コラーゲン様ドメインを介して三量体、六量体、１２〜１８量体等が混在した状態として存在する。そのため、天然型のアディポネクチンを用いた医薬品の製造の際には、多量体形成の制御ができず、均一なアディポネクチンを得ることが困難であるため、製造面での品質等の規格設定の点で問題があり扱いにくい。
【００１０】
本発明は、均一な製品として製造することができ、かつ、天然のアディポネクチンと同等以上の活性を有する分子改変体アディポネクチン、及び分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明では、三量体化ドメインと、アディポネクチンの球状領域とを含む融合タンパク質とすることにより、分子改変体アディポネクチンを作成することとした。本発明の分子改変体アディポネクチンは、自然に会合し、均一な三量体を形成する。アディポネクチンは、１２〜１８量体等の多量体が活性を持つと考えられていたが、驚くべきことに、三量体を形成する本願発明の分子改変体アディポネクチンが、天然のアディポネクチンと同等又はそれを凌駕するほどの効果を有することが見出された。
【００１２】
そこで、本発明では、アディポネクチンのＣ末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とを含む、分子改変体アディポネクチンが提供される。この分子改変体アディポネクチンは、マトリリンのコイルドコイル領域により、効率的に三量体を形成することができる。
【００１３】
本発明の分子改変体アディポネクチンは、マトリリンのコイルドコイル領域がＮ末端側に位置し、アディポネクチン球状領域がＣ末端側に位置するものを用いることができる。
本発明の分子改変体アディポネクチンは、少なくとも１つのスタフィロコッカスのプロテインＡのＺＺドメインをさらに含んでもよく、このプロテインＡのＺＺドメインは、マトリリンのコイルドコイル領域のＮ末端側に位置してもよい。
分子改変体アディポネクチンに含まれるマトリリンには、マトリリン−２を使用することができる。
【００１４】
本発明の分子改変型アディポネクチンは、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものを用いることができる。また、本発明の分子改変体アディポネクチンは、配列番号５、７、９及び１１から選択されるアミノ酸配列を含むものを用いることができる。
【００１５】
本発明の別の実施態様として、上記分子改変体アディポネクチンの三量体が提供される。
【００１６】
また、本発明のさらに別の実施態様として、上記分子改変体アディポネクチンをコードする核酸が提供される。本発明の核酸として、配列番号４、６、８及び１０から選択される核酸配列を含むものが好ましい。
【００１７】
またさらに、本発明の実施態様として、上記核酸を含むベクターが提供される。本発明のさらに別の実施態様として、上記核酸又は上記ベクターを含む、宿主細胞が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の態様として、分子改変体アディポネクチンの三量体と、製剤学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、動脈硬化症の治療又は予防のため、糖尿病の治療又は予防のため、又は肥満の治療又は予防のために使用することができる。動脈硬化症には、狭心症、心筋梗塞又は脳梗塞が含まれる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、多様な複数量体を形成する天然型アディポネクチンと比べて、均一な三量体を形成し、かつ、天然型アディポネクチンと同等又はそれを凌駕する生理学的活性を有する分子改変体アディポネクチンを提供することができる。例えば、天然型アディポネクチンの約３分の１の濃度の分子改変体アディポネクチンで、天然型アディポネクチンと同等の効果を奏することができる。
【００２０】
さらに、本発明の分子改変体アディポネクチンは、天然のアディポネクチンが媒介するシグナル伝達機構を活性化するため、アディポネクチンの欠乏により惹起される疾患、例えば、動脈硬化症のような心血管病、心不全、心臓肥大を含む心疾患、致死性不整脈、脳梗塞、肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症のようないわゆる生活習慣病及び悪性腫瘍（がん）などの、予防及び治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アディポネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）、ＭＡＴＲＩＬＩＮ−２アミノ酸配列（配列番号２）及びＺＺドメインアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。アディポネクチンのアミノ酸配列及びＭＡＴＲＩＬＩＮ−２アミノ酸配列において、アディポネクチン球状領域及びコイルドコイル領域のアミノ酸配列を、それぞれ、太字で示した。
【図２】ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄのＤＮＡ配列（配列番号４）及びｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄのアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図３】ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄのＤＮＡ配列（配列番号６）及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄのアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図４】ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺのＤＮＡ配列（配列番号８）及びｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺのアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。
【図５】ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺのＤＮＡ配列（配列番号１０）を示す図である。
【図６】ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ  アミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。
【図７】ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによるＡＭＰＫ及びＡＫＴの活性化を示すウェスタンブロットの写真である。
【図８】ラット心筋細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによるＡＭＰＫ及びＡＫＴの活性化を示すウェスタンブロットの写真である。
【図９】ラット線維芽細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによるＡＭＰＫ及びＡＫＴの活性化を示すウェスタンブロットの写真である。
【図１０】ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによる抗アポトーシス効果を示す写真とグラフである。上段は、ＴＵＮＥＬ染色及びＤＡＰＩ染色の結果の代表的な写真であり、下段は、定量的に解析したＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を示すグラフである。
【図１１】ラット心筋細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによるによる抗アポトーシス効果を示す写真とグラフである。上段は、ＴＵＮＥＬ染色の結果の代表的な写真であり、下段は、定量的に解析したＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を示すグラフである。
【図１２】ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによる抗炎症効果を示すグラフである。右のグラフはＩＬ−１βの発現量を示し、左のグラフは、ＴＮＦαの発現量を示す。
【図１３】ラット心筋細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによる抗炎症効果を示すグラフである。グラフは、ＴＮＦαの発現量を示す。
【図１４】ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによる虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響を示す写真とグラフである。写真は、虚血領域（ＡＡＲ）を示すエバンスブルー染色と、梗塞領域（ＩＡ）を示す２，３，５−トリフェリニルテトラゾリンクロライドにより染色した後の心臓組織の切片の写真であり、グラフは、左室領域（ＬＶ）に対する虚血領域（ＡＡＲ）の割合（ＡＡＲ／ＬＶ）、虚血領域（ＡＡＲ）に対する梗塞領域（ＩＡ）の割合（ＩＡ／ＡＡＲ）、及び左室領域（ＬＶ）に対する梗塞領域（ＩＡ）の割合（ＩＡ／ＬＶ）を示す。
【図１５】ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによる虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響を示す写真とグラフである。写真は、エバンスブルーと２，３，５−トリフェリニルテトラゾリンクロライドにより染色した後の心臓組織の切片の写真であり、グラフは、ＡＡＲ／ＬＶ、ＩＡ／ＡＡＲ及びＩＡ／ＬＶを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（分子改変体アディポネクチン）
本願発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチン球状領域及びマトリリンのコイルドコイル領域を含む融合タンパク質であり、好ましくは、Ｎ末端側にマトリリンのコイルドコイル領域、Ｃ末端側にアディポネクチン球状領域が融合したものである。アディポネクチン球状領域に、コイルドコイル領域を融合させることによって、三量体を極めて高効率に形成することができる。
【００２３】
また、分子改変体アディポネクチンは、スタフィロコッカスのプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインであるＺＺドメインをさらに含んでもよい。ＺＺドメインは、融合タンパク質である分子改変体アディポネクチンのＮ末端若しくはＣ末端、又は、Ｎ末端とＣ末端の両方に連結することができる。好ましくは、Ｎ末端にＺドメインを連結する。Ｚドメインを連結することにより、一般的に、宿主細胞から発現される際に、可溶性画分でのタンパク質の発現が促進されることが知られている。本願の分子改変体アディポネクチンは、ＺＺドメインを含まなくともアディポネクチンと同等の生理活性、例えば、ＡＭＰＫ活性化効果、抗アポトーシス効果、抗炎症効果、心筋梗塞の病巣縮小効果等を奏するが、驚くべきことに、ＺＺドメインの導入により、可溶性画分での発現促進のみならず、より低濃度のタンパク質でも、天然のアディポネクチンと同等の生理活性を奏することが確認された。
【００２４】
本発明の分子改変体アディポネクチンは、例えば、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。また、本発明の分子改変体アディポネクチンは、例えば、配列番号５、７、９及び１１のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明の分子改変体アディポネクチンは、通常の遺伝子工学的方法によって製造することができる。より詳細には、分子改変体アディポネクチンをコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、これを適切な宿主細胞中に導入して発現させることにより、本願発明の分子改変体アディポネクチンを製造することができる。
【００２６】
（アディポネクチン）
本願発明の分子改変体アディポネクチンに含まれるアディポネクチンのＣ末端側の球状領域は、天然のアディポネクチンに由来することができる。天然のアディポネクチンは、既にアミノ酸配列が決定されており、公知の手段により入手することができる。本発明には、ヒトのアディポネクチンを使用するのが好ましく、例えば、配列番号１（図１）のアミノ酸配列を有するアディポネクチンを用いることができる。アディポネクチンは、上述のとおり、Ｎ末端のコラーゲンタンパク質に類似する領域（コラーゲン様ドメイン、ｃＡｄ）、及びＣ末端側の球状領域（ｇＡｄ）から構成される。アディポネクチンのＣ末端の球状領域のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。アディポネクチンの活性を有する限り、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の１個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上の相同性を有するものが例示できる。
【００２７】
（三量体化ドメイン）
本発明の分子改変体アディポネクチンは、アディポネクチンのＣ末端側球状領域のＮ末端側に、多量体化ドメインが連結されている。多量体化ドメインは、多量体化ドメインと結合したポリペプチドが多量体化するのを促進する。多量体化ドメインは、好ましくは、三量体化ドメインであり、一般にコイルドコイルドメインを有する。このような三量体ドメインの例として、イソロイシンジッパー、マトリリン（ｍａｔｒｉｌｉｎ）ファミリータンパク質、ＧＣＮ４等のコイルドコイルドメインを例示することができる。特に好ましいのは、マトリリンファミリータンパク質のコイルドコイルドメインである。マトリリンファミリータンパク質は、分泌性細胞外マトリクスタンパク質であり、マトリリン−１からマトリリン−４により構成される。本明細書中では、マトリリン−１からマトリリン−４からなるマトリリンファミリータンパク質を、単にマトリリンとも称する。
【００２８】
マトリリン−１は、非関節性軟骨の細胞外マトリクスの成分であり、主に軟骨細胞から分泌される。マトリリン−２は、マトリクス会合に関与する分泌性タンパク質である。マトリリン−３は、軟骨性組織で発現される分泌性タンパク質である。マトリリン−４は、胎児性腎臓、胚及び胎盤で発現され、軟骨の細胞外マトリクスに対して重要な分泌性タンパク質である。このうち、特に、本発明には、ヒトのマトリリンを使用するのが好ましく、特に、ヒトのマトリリン−２のコイルドコイルドメインが、三量体化ドメインとして好適に使用される。マトリリン−２のアミノ酸配列は、配列番号２（図１）で表され、コイルドコイルドメインは、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。三量体形成活性を有し、かつ、分子改変体アディポネクチンの活性を損なわない限り、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の１個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。変異体ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上の相同性を有するものが例示できる。
【００２９】
アディポネクチンの球状領域を三量体化ドメインと融合することにより、生じた融合タンパク質が三量体を形成する。天然のアディポネクチンが、三量体、六量体、それらが組み合わさった多量体からなる混合物であるのに対し、本願の分子改変体アディポネクチンは、発現されたポリペプチドの少なくとも約６０％、さらに好都合には少なくとも約７０％、最も望ましくは少なくとも約７５％が三量体として存在する。
【００３０】
（ＺＺドメイン）
本発明の分子改変体アディポネクチンは、さらに、スタフィロコッカスのプロテインＡのＺドメインを含んでもよい。Ｚドメインは、スタフィロコッカスのプロテインＡに由来する、抗体のＦｃ領域に結合するドメインである。Ｚドメインは、フォールディングされていない又は誤ったフォールディングをされたタンパク質を可溶化するために一般的に用いられる（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９４，３３，４２０７−４２１１参照）。２つのＺドメインをタンデムに並べた、ＺＺドメインとして使用することが好ましい。ＺＺドメインは、配列番号３（図１）に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用することができる。ＺＺドメインをコードするヌクレオチド配列として、例えば、ｐＥＺＺ１８（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）など市販のベクターを利用することができる。タンパク質の可溶化を促進し、分子改変体アディポネクチンの活性を損なわない限り、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限らず、これらのアミノ酸配列の１個又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は付加したアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドを用いることができる。このような変異体ポリペプチドとして、配列番号３のアミノ酸配列に対し、アミノ酸の保存的置換を有するものが挙げられる。また、変異体のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列に８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は９８％以上の相同性を有するものが例示できる。
【００３１】
（精製用タグ）
分子改変体アディポネクチンは、精製を容易にするために、精製用のタグを含んでもよい。精製用タグとしては、当業者に広く知られており、特に限定されないが、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）タグ等を使用することができる。精製後にタグを含む領域は必ずしも切断される必要はないが、タグを含む領域を切断する場合には、プロテアーゼ等の認識部位を精製用タグの隣接部に導入して、当該プロテアーゼにより切断してもよい。
【００３２】
アディポネクチン球状領域とマトリリンのコイルドコイル領域との間には、任意のリンカーが含まれていてもよい。リンカーは、特に限定されないが、マトリリンのコイルドコイル領域や、アディポネクチン球状領域の隣接する領域に由来するものを用いることができる。
【００３３】
（核酸）
本願発明で使用できる核酸は、アディポネクチンのＣ末端側球状領域と、マトリリンのコイルドコイル領域とをそれぞれコードする核酸配列を含む。このような核酸配列として、例えば、配列番号１のアミノ酸１１４〜２４４のアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び配列番号２のアミノ酸９１２〜９５２のアミノ酸配列をそれぞれコードする核酸配列を含むものが例示できる。さらに、スタフィロコッカスのプロテインＡのＺＺドメインをコードする核酸配列を含ませてもよい。プロテインＡのＺＺドメインをコードする核酸として、ｐＥＺＺ１８（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）など市販のベクターに由来するものを使用してもよい。また、プロテインＡのＺＺドメインをコードする核酸には、例えば、配列番号３のアミノ酸配列からなるＺＺドメインをコードする核酸配列を使用することができる。
【００３４】
さらに、本願発明で使用できる核酸に、精製を容易にするために上述の精製用のタグをコードする核酸配列を含ませてもよい。また、任意のリンカー配列をコードする核酸配列を含ませてもよい。本願発明で使用できる核酸は、上述の分子改変体アディポネクチンのアミノ酸配列をコードするものであれば、その配列は特に限定されない。例えば、配列番号４、６、８及び１０の核酸配列、又は、配列番号５、７、９及び１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いることができる。
【００３５】
（ベクター）
発現ベクターは、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等を用いることができ、例えば、ｐＥＴ−２４ａ−ｄのようなｐＥＴ系、ｐＵＣ系、ｐＢＩ系、ｐＳＭＡ計、ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ系、λｇｔ１１、λＺＡＰ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の任意のベクターを、宿主細胞に合わせて使用することができ、特に限定されない。発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、ターミネーター、選択マーカー、複製起点等を含ませたものを用いることができる。
【００３６】
宿主は、原核生物及び真核生物のいずれをも用いることが可能である。原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌等を用いることができ、真核生物宿主には、酵母菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞等を用いることができる。
【００３７】
発現ベクターを導入する方法としては、任意の公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。分子改変体アディポネクチンは、宿主細胞の培地から公知の方法で回収し、精製することにより、得ることができる。発現された分子改変体アディポネクチンは、三量体化ドメインにより、三量体を形成し、細胞内に蓄積又は細胞外に分泌される。回収及び精製には、一般的な方法により行うことができ、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど、各種のクロマトグラフィーを用いることができる。また、三量体を形成しているかどうかは、非加熱および非還元の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびウェスタンブロット解析等により、容易に確認することができる。
【００３８】
（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、本発明の分子改変体アディポネクチンを有効成分とし、さらに薬学的に許容される担体を加えて、種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。また、本発明の分子改変体アディポネクチンをコードする核酸を含む遺伝子治療用ベクターを有効成分として、さらに薬学的に許容される担体を加えて種々の投与形態の医薬組成物とすることができる。医薬組成物の投与形態として、経口投与及び非経口投与が可能である。非経口投与の場合には、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内への投与など、種々の形態が可能である。
【００３９】
経口投与用の医薬組成物としては、例えば、錠剤、カプセル、顆粒、細粒、シロップ、腸溶剤、徐放性カプセル等を例示することができる。経口投与用の医薬組成物には、乳糖、結晶セルロース、デンプンなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウムなどの滑沢剤のような担体を用いることができる。さらに、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、セラセフフェート、ヒプロメロースフタル酸エステル等のコーティング剤によりコートしてもよい。また、カプセルの場合には、腸溶性コーティング剤等により、腸溶性カプセルとすることもできる。
【００４０】
静脈内、動脈内、皮下、筋肉内及び腹腔内投与用の薬剤には、例えば、蒸留水、安定化剤、乳化剤、緩衝剤等の担体を含ませることができる。当業者は、保存安定性等を考慮して担体を選択することができる。本願発明の医薬組成物は、例えば、分子改変体アディポネクチンを０．０１〜０．０５μｇ／日の投与量で投与可能であるが、この投与量は投与ルート、性別、年齢、体重、疾患の状態等により変更可能である。
【００４１】
本願発明の分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物は、アディポネクチンがアディポネクチン受容体に結合することにより活性化されるＡＭＰＫを活性化するため、天然のアディポネクチンにより治療及び予防効果が見込まれる疾患に対して、同様の高い治療及び予防効果が期待できる。例えば、本願発明の分子改変体アディポネクチンを含む医薬組成物は、動脈硬化症のような心血管病、心不全、心臓肥大を含む心疾患、致死性不整脈、脳梗塞、肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症のようないわゆる生活習慣病及び悪性腫瘍（がん）などに対して、予防及び治療効果を奏する。
予防及び治療とは、疾患の発症の予防及び疾患の治療のみならず、当該疾患に伴う症状の予防及び治療、当該疾患の再発の抑制をも包含する概念である。治療には、根治治療のみならず、処置前と比べて症状が改善する場合をも含む。
【００４２】
以下に実施例に基づいて本発明を説明するが、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００４３】
＜実施例１：ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株の作製＞
ヒトのアディポネクチン（配列番号１）の球状領域（１１４残基から２４４残基まで）のアミノ末端にヒトのマトリリン２（配列番号２）のコイルドコイル領域（９１２残基から９５２残基まで）を連結したポリペプチド（以下、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ）（配列番号５）（図２）を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）（図２）を設計し、発現ベクターにクローニングするための５’末端へのＮｄｅＩ認識配列および３’末端へのＸｈｏＩ認識配列を付加したＤＮＡを人工合成した。この合成ＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（メルク株式会社）のＴ７プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（メルク株式会社）に導入してｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株を得た。
【００４４】
＜実施例２：ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株の作製＞
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ（配列番号５）のアミノ末端に黄色ブドウ球菌のプロテインＡに由来するＺＺ領域（配列番号３）を連結したポリペプチド（以下、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ）（配列番号７）（図３）を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号６）（図３）を設計し、発現ベクターにクローニングするための５’末端へのＮｃｏＩ認識配列および３’末端へのＸｈｏＩ認識配列を付加したＤＮＡを人工合成した。この合成ＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２４ｄ（＋）（メルク株式会社）のＴ７プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（メルク株式会社）に導入してＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株を得た。
【００４５】
＜実施例３：ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株の作製＞
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ（配列番号５）のカルボキシル末端にＺＺ領域（配列番号３）を連結したポリペプチド（以下、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ）（配列番号９）（図４）を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号８）（図４）を設計し、発現ベクターにクローニングするための５’端へのＮｃｏＩ認識配列および３’末端へのＸｈｏＩ認識配列を付加したＤＮＡを人工合成した。この合成ＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２４ｄ（＋）（メルク株式会社）のＴ７プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（メルク株式会社）に導入してｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株を得た。
【００４６】
＜実施例４：ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株の作製＞
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ（配列番号５）のアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にＺＺ領域（配列番号３）を連結したポリペプチド（以下、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ）（配列番号１１）（図６）を大腸菌で発現させるため、このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１０）（図５）を設計し、発現ベクターにクローニングするための５’末端へのＮｃｏＩ認識配列および３’末端へのＸｈｏＩ認識配列を付加したＤＮＡを人工合成した。この合成ＤＮＡをプラスミドｐＥＴ−２４ｄ（＋）（メルク株式会社）のＴ７プロモーターの下流に挿入し、得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（メルク株式会社）に導入してＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株を得た。
【００４７】
＜実施例５：ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄの調製と性状解析＞
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株について、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む２ｘＹＴ培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）とＨｉＴｒａｐ  ＴＡＬＯＮ  ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）によって連続的に精製した。この精製物について、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびウェスタンブロット解析を行い、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄが３量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
【００４８】
＜実施例６：ＺＺ融合型ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄの調製と性状解析＞
ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ発現大腸菌株、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株およびＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ発現大腸菌株のそれぞれについて、カナマイシンとイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む２ｘＹＴ培地を用いて培養し、遠心分離で回収した菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む緩衝液に再懸濁して超音波破砕を行った。得られた細胞破砕物を遠心分離によって可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をＨｉＴｒａｐ  ＴＡＬＯＮ  ｃｒｕｄｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムによって連続的に精製した。この精製物について、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質濃度測定を行った。また、非加熱および非還元の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析およびウェスタンブロット解析を行い、３種類のＺＺ融合型ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄが３量体を形成していること、および高純度であることを確認した。
【００４９】
＜実施例７：ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによるＡＭＰＫ及びＡｋｔ活性作用の検討＞
ラットの心筋細胞を用いて、分子改変体アディポネクチンｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより心保護シグナルが活性化されることを確認した。
【００５０】
ラットの心筋細胞をＤＭＥＭ中で培養し、１０μｇ／ｍｌのｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより１８時間処理した。心筋細胞を溶解バッファー中にてホモジナイズし、３０μｇ量のタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動後、分離したタンパク質を膜に転写させ、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、一次抗体を１：１，０００の割合で希釈し、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体を１：１５，０００の割合で希釈して用いた。検出は、ＥＣＬ−ＰＬＵＳウエスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ製）を用いた。用いた一次抗体は、ｐ−ＡＭＰＫ（リン酸化ＡＭＰＫ）、ｐ−Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）に対する抗体である（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）。抗チューブリン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）は、タンパク量の内部標準としてチューブリン量を測定するために用いた。ここで、ＡＭＰＫは、アディポネクチンシグナル伝達機構における中心的なメディエーターであり、アディポネクチン受容体が活性化されることにより、リン酸化されるタンパク質である。ＡＭＰＫがリン酸化され、活性化されると、心肥大抑制、糖尿病性心筋症抑制、心筋梗塞抑制に働く心保護シグナルが活性化され（Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ  ２０１２；  ２（４）：  ２５３−３６６）、また、糖取り込みや、脂肪酸の燃焼を引き起こすシグナルが活性化されることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２：  Ｖｏｌ．８，１２８８−１２９５）。リン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）は、さらにその下流のＡｋｔをリン酸化する。結果を図７に示す。図中左は、Ｐ−ＡＭＰＫ、Ｐ−Ａｋｔであり、右は、念のために、Ｐ−ＡＭＰＫについて再度ウエスタンブロッティングを行った結果である。＋はｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより処理したものであり、−は未処理のものである。
【００５１】
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより処理したものは、ｐ−ＡＭＰＫ及びｐ−Ａｋｔ量がコントロールに比較して高まっており、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。
【００５２】
＜実施例８：ラット心筋細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによるＡＭＰＫ及びＡｋｔ活性作用の検討＞
ラットの心筋細胞を用いて、実施例７と同様に、他の分子改変体アディポネクチンでも心保護シグナルが活性化されることを確認した。
【００５３】
ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺにより、実施例７と同様にラットの心筋細胞を処理した。心筋細胞を溶解バッファー中にてホモジナイズし、３０μｇ量のタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動後、分離したタンパク質を膜に転写させ、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、一次抗体を１：１，０００の割合で希釈し、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体を１：１５，０００の割合で希釈し用いた。検出は、ＥＣＬ−ＰＬＵＳウエスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ製）を用いた。用いた一次抗体は、ｐ−ＡＭＰＫ（リン酸化ＡＭＰＫ）、Ｔ−ＡＭＰＫ（全ＡＭＰＫ）、ｐ−Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）、Ｔ−Ａｋｔ（全Ａｋｔ）に対する抗体である。抗チューブリン抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ社）は、タンパク質の内部標準としてチューブリン量を測定するために用いた。結果を図８に示す。右と左の写真は、念のために２回のウェスタンブロットを行ったものである。
【００５４】
分子改変体アディポネクチンは全て、ｐ−ＡＭＰＫ及びｐ−Ａｋｔ量がコントロールに比較して高まっており、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。特に、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにおいて、ＡＭＰＫ及びＡｋｔの活性化が顕著であった。
【００５５】
＜実施例９：ラット線維芽細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによるＡＭＰＫ及びＡｋｔ活性の検討＞
ラット線維芽細胞でも、他の種の分子改変体アディポネクチンによりアディポネクチンシグナルが活性化されることを確認した。
【００５６】
ラット線維芽細胞を、１０μｍ／ｍｌの濃度のＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺの分子改変体アディポネクチンにより１８時間処理した。実施例８同様に、ウエスタンブロッティングによりｐ−ＡＭＰＫ（リン酸化ＡＭＰＫ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、Ｔ−ＡＭＰＫ（全ＡＭＰＫ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ｐ−Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）、Ｔ−Ａｋｔ（全Ａｋｔ）を検出した。結果を図９に示す。線維芽細胞でも、分子改変体アディポネクチンにより、アディポネクチンシグナルが活性化していることが確認された。特に、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにおいて、ＡＭＰＫ及びＡｋｔの活性化が顕著であった。
【００５７】
＜実施例１０：ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによる抗アポトーシス効果の検討＞
ラット心筋細胞が、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
【００５８】
ラット心筋細胞を、無血清培地中にて酸素正常状態で４８時間又は低酸素状態（＜１％のＯ２及び５％のＣＯ２、３７℃）で１２時間処理し、その後１０μｍ／ｍｌのｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄの存在下又は非存在下の酸素条件下（＜２１％のＯ２及び５％のＣＯ２、３７℃）に２４時間静置した。通常の方法に従い、ＴＵＮＥＬ染色（緑）を行い、アポトーシスを起こした細胞を染色した。ＤＡＰＩ染色（青）により全ての死細胞を染色した。
【００５９】
ＴＵＮＥＬ染色及びＤＡＰＩ染色の結果の代表的な写真を図１０の上段に示し、定量的に解析したＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を下段のグラフに示す。低酸素状態におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合、すなわち、アポトーシスによる死細胞の割合が、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ処理によりコントロールと比べて有意に減少し、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄが抗アポトーシス作用を奏することが示された。
【００６０】
＜実施例１１：ラット心筋細胞を用いたＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ及びＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺによる抗アポトーシス効果の検討＞
ラット心筋細胞が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても、低酸素状態により引き起こされるアポトーシスが抑制されることを確認した。
【００６１】
実施例１０同様に、ラット心筋細胞をＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺにより処理して、アポトーシスによる死細胞の割合を計測した。
【００６２】
ＴＵＮＥＬ染色の結果の代表的な写真を図１１の上段に示し、定量的に解析したＴＵＮＥＬ陽性のアポトーシスによる死細胞の割合を下段のグラフに示す。低酸素状態におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合、すなわち、アポトーシスによる死細胞の割合が、他の種の分子改変体アディポネクチンによってもコントロールと比べて有意に減少し、他の種の分子改変体アディポネクチンが抗アポトーシス作用を奏することが示された。
【００６３】
＜実施例１２：ラット心筋細胞を用いたｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄによる抗炎症効果（ＴＮＦα及びＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現量の抑制）の検討＞
心筋細胞の炎症が、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより抑制されることを確認した。心筋細胞は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）による刺激を受けると、ＴＮＦα及びＩＬ−１βを産生し、炎症を生じる。ＴＮＦα及びＩＬ−１βのｍＲＮＡ量に基づき、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄが炎症を抑制することを確認した。
【００６４】
ラット新生児心筋細胞（ＮＲＶＭ）を２４ウェルの培養皿に２５０μｌ／ウェル（２．５×１０５細胞／ウェル）の濃度で播種した。１０μｍ／ｍｌの濃度のｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより１時間処理した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳにより６時間処理して炎症性サイトカインであるＴＮＦα及びＩＬ−１βの発現を誘導した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＮＦα及びＩＬ−１βのｍＲＮＡ量を測定した。コントロールには、分子改変体アディポネクチンの代わりにＰＢＳを使用した。結果を図１２に示す。
【００６５】
ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより、ＴＮＦα及びＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現量がコントロールに比べて減少しており、炎症が抑制されたことが確認された。
このように、分子改変体アディポネクチンを用いた場合、１０μｇ／ｍｌの濃度で抗炎症効果が確認された。
一方で、天然のアディポネクチンでは、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ−α産生を測定した場合、１０μｇ／ｍｌの濃度ではＴＮＦα産生を抑制しなかったが、３０μｇ／ｍｌの濃度で抑制することが確認されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，１０９６−１１０３（２００５））。これらのことから、本願発明の分子改変体アディポネクチンは、天然のアディポネクチンの約３分の１の濃度でも同等の効果を奏することが示された。
【００６６】
＜実施例１３：ラット心筋細胞を用いた抗炎症効果（ＴＮＦ抑制）の検討＞
心筋細胞の炎症が、他の種の分子改変体アディポネクチンによっても抑制されることを確認した。
【００６７】
ラット新生児心筋細胞（ＮＲＶＭ）を２４ウェルの培養皿に２５０μｌ／ウェル（２．５×１０５細胞／ウェル）の濃度で播種した。１０μｍ／ｍｌの濃度のＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺにより１時間処理した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳにより６時間処理して炎症を誘導した。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＮＦαのｍＲＮＡ量を測定した。コントロールには、分子改変体アディポネクチンの代わりにＰＢＳを使用した。結果を図１３に示す。
【００６８】
ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺにより、ＴＮＦα発現量がコントロールに比べて減少しており、炎症が抑制されたことが確認された。
【００６９】
＜実施例１４：分子改変体アディポネクチン処理による虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響＞
分子改変体アディポネクチンｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄにより、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが、野生型無処理マウスと比較して減少することを確認した。
【００７０】
１．０μｇ／ｇの分子改変体アディポネクチンｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄを複数のＣ５７ＢＬ／６系統マウスの頚動脈内に投与した。コントロールのマウスには、ＰＢＳを投与した。
【００７１】
投与から３０分後にＬＡＤ血管結紮を３０分行い、続いて４８時間再灌流した。ＬＡＤ動脈を再縫合後、１ｍｌの１．０％エバンスブルー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｌａｌ  Ｃｏ．）を頸静脈から注入し、非梗塞組織を染色した。その後、心臓を取り出し、ＰＢＳにより洗浄後、横断面の切片を作成し、２３℃にて５分間、１．０ｍｌの１．５％の２，３，５−トリフェリニルテトラゾリンクロライド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｌａｌ  Ｃｏ．）により染色し、梗塞領域を染色した。
【００７２】
図１４中の写真は、虚血領域（ＡＡＲ）を示すエバンスブルーと、梗塞領域（ＩＡ）を示す２，３，５−トリフェリニルテトラゾリンクロライドにより染色した後の心臓組織の写真を示す。青色の部分は、虚血の影響を受けていない、健康な心筋を表し、白色領域は、死んだ組織を表す。さらに、イメージＪソフトウエアを用いて、コンピューター面積測定を行い、左室領域（ＬＶ）、虚血領域（ＡＡＲ）、梗塞領域（ＩＡ）の面積を決定した。左室領域（ＬＶ）に対する虚血領域（ＡＡＲ）の割合（ＡＡＲ／ＬＶ）、虚血領域（ＡＡＲ）に対する梗塞領域（ＩＡ）の割合（ＩＡ／ＡＡＲ）、及び左室領域（ＬＶ）に対する梗塞領域（ＩＡ）の割合（ＩＡ／ＬＶ）を図１４のグラフに示す。コントロールと比較して、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄを投与した群は、ＩＡ／ＡＡＲ及びＩＡ／ＬＶが減少した。よって、ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄが心筋梗塞縮小に有効であることが示された。
【００７３】
＜実施例１５：分子改変体アディポネクチン処理による虚血再灌流障害後の梗塞サイズの影響＞
他の分子改変体アディポネクチンによっても、虚血再灌流障害後の梗塞サイズが減少することを確認した。
【００７４】
１．０μｇ／ｇのＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺを、実施例１４同様に投与した。コントロールのマウスには、ＰＢＳを投与した。
実施例１４同様に、虚血再灌流障害の後、エバンスブルー染色及び２，３，５−トリフェリニルテトラゾリンクロライド染色を行い、虚血領域（ＡＡＲ）、梗塞領域（ＩＡ）及び左室領域（ＬＶ）の面積を測定してグラフ化した。結果を図１５に示す。コントロールと比較して、分子改変体アディポネクチンを投与した群は、ＩＡ／ＡＡＲ及びＩＡ／ＬＶが減少した。よって、ＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ又はＺＺ−ｈＭａｔ２ｃｃ−ｇＡｄ−ＺＺが心筋梗塞縮小に有効であることが示された。
【図１】
2019205355.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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