(57)【要約】【課題】細菌の培養工程において、培養後に得られる細菌における異常型コロニーを形成する変異個の出現を抑制しつつ、良好な生産性で細菌菌体を製造するための新たな方法を提供すること。【解決手段】細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、細菌菌体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、細菌菌体の製造方法。
【請求項２】
細菌が芽胞形成細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
芽胞形成菌がバチルス（Bacillus）属細菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
芽胞形成菌が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミグラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）およびバチルス・エスピー（Bacillus sp.）からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗生物質が、ストレプトマイシン、リンコマイシン、エリスロマイシン、リファンピシン、クロラムフェニコール、アクチノマイシン、フシジン酸、リピアマイシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリンおよびチオストレプトンからなる群より選択される１種類以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
抗生物質がストレプトマイシンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記最終段よりも前の段の液体培地における抗生物質の濃度が0.001ppm〜10,000ppmである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記最終段よりも前の段の液体培地における抗生物質の濃度が1.0〜90ppmである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質の濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、異常型コロニーを形成する変異個体の出現を低減させた細菌の培養方法。
【請求項１０】
細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質の濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、細菌の液体培養中の異常型コロニーを形成する変異個体の出現及び増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の多段階の液体培養中に生じうる、異常型コロニーを形成する変異個体の発生および増殖を抑制しつつ、良好な生産性で細菌菌体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、酵素や有用物質の生産、発酵食品の生産、有機物の分解、整腸剤、微生物農薬、微生物肥料等、種々の分野に利用されている。
いずれの分野でも菌体を調製するために細菌の培養を行う必要があるが、コロニー形態に異常を示す変異個体が培養中に出現し、本来の性質を持った個体と比べて優位に増殖することで、培養終了後の菌体においては本来の有用な性質が損なわれてしまっているケースが存在する。
【０００３】
例えば、非特許文献１において、Bacillus属細菌の液体培地での数千世代の継代培養中に、コロニー形態などに異常を示す変異個体が出現し、本来の個体に優先して増殖することで、完全に置き換わってしまう現象が観察されている。このような現象は、特定の培養環境に特化して不要な代謝系を脱落させた変異個体が、本来の個体よりも優位に増殖することで生じるものと推測される。
非特許文献２においては、Bacillus subtilis 916株のBacillomycin LとSurfactinの生合成能欠損変異株が、野生型株と異なるコロニー形態を示すことが示されている。Bacillomycin LおよびSurfactinは一部の植物病害に対し防除効果を示すことが知られており、コロニー形態の変異と有用な性質の喪失がリンクしている例と考えられる。
また、非特許文献３においては、Bacillus subtilis G3株の抗菌活性強化のための育種において、親株とコロニー形態が変化した株において、Itulin Aの生産量が増えた例が示されている。
非特許文献４においては、Aneurinibacillus migulanus （旧分類Bacillus brevis）ATCC9999株について、カルチャーコレクション保管株から6タイプのコロニー形態が検出されたこと、およびそれらのGramicidin S生産性が異なることが示されている。
非特許文献５においては、Bacillus subtilis  VT30M株およびBacillus licheniformis
VT3株のコロニー形態変異株が、野生型と比べて異なる酵素生産性や抗生物質耐性を示した例が示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biotechnology progress 2005, 21, 4, 1026-1031
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, 4 1897-1910
【非特許文献３】Zhiwu Bingli Xuebao 2008, 38, 2, 185-191
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, 20, 6620-6628
【非特許文献５】Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 3026-3028
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、細菌の液体培養において、特に、多段階培養を行う場合において、コロニー形態に異常を示す変異個体が培養中に出現し、本来の性質を持った個体と比べて優位に増殖することで、培養終了後の菌体において本来の有用な性質が損なわれてしまっているケースが存在するという問題があるが、このような現象を抑制するための効果的な技術はこれまで報告がなかった。
したがって、本発明では、細菌の多段階の液体培養工程において、培養後に得られる細
菌におけるコロニー形態に異常を示す変異個体の出現を抑制しつつ、良好な生産性で細菌菌体を製造するための新たな方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含む培地を用いて培養し、最終段では抗生物質の濃度を前の段よりも低下させて培養することにより、培養終了後に得られる細菌集団におけるコロニー形態に異常を示す変異個体の出現を顕著に低減しつつ、良好な生産性で細菌菌体を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
[１]細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質の濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、細菌菌体の製造方法。
[２]細菌が芽胞形成細菌である、[１]に記載の方法。
[３]芽胞形成菌がバチルス（Bacillus）属細菌である、[２]に記載の方法。
[４]芽胞形成菌が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミグラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）およびバチルス・エスピー（Bacillus sp.）からなる群より選択される、[３]に記載の方法。
[５]抗生物質が、ストレプトマイシン、リンコマイシン、エリスロマイシン、リファンピシン、クロラムフェニコール、アクチノマイシン、フシジン酸、リピアマイシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリンおよびチオストレプトンからなる群より選択される１種類以上である、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]抗生物質がストレプトマイシンである、[５]に記載の方法。
[７] 前記最終段よりも前の段の液体培地における抗生物質の濃度が0.001ppm〜10,000ppmである、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８] 前記最終段よりも前の段の液体培地における抗生物質の濃度が1.0〜90ppmである、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[９] 細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質の濃度を当該前の段よりも低下させて培養す
る工程を含む、異常型コロニーを形成する変異個体の出現を低減させた細菌の培養方法。[１０] 細菌の多段階の液体培養工程において、最終段よりも前の段で抗生物質を含有する液体培地で細菌を培養し、最終段で抗生物質の濃度を当該前の段よりも低下させて培養する工程を含む、細菌の液体培養中の異常型コロニーを形成する変異個体の出現及び増殖を抑制する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、多段階培養で用いる培地中に抗生物質を含有させて細菌を培養し、最終段で抗生物質の量を低下させて細菌を培養することで、細菌の液体培養終了時点のコロニー形態に異常を示す変異個体の比率を低下させつつ、良好な生産性で細菌菌体を製造することができる。コロニー形態に異常を示す変異個体は望ましい性質を喪失している可能性が高いので、このような変異個体を低減させることで、培養によって得られた細菌菌体を酵素や有用物質の生産、発酵食品の生産、有機物の分解、整腸剤、微生物農薬や微生物肥料等の用途に好ましい状態で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】異常型コロニーの形態の一例を示す図（写真）。異常型コロニーを○で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、細菌の種類は液体培養することができ、固体培地上でコロニーを形成するものであれば特に制限されず、グラム陽性細菌でもグラム陰性細菌でもよいが、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、シゲラ（Shigella）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、エルシニア（Yersinia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ブルセラ（Brucella）属細菌、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、アセトバクテリウム（Acetobacterium）属細菌、メタノバクテリウム（Methanobacterium）属細菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌などが挙げられる。
この中では、バチルス属細菌、パエニバチルス属細菌、ジオバチルス属細菌、クロストリジウム属、スポロサルシナ属等の芽胞形成細菌がより好ましい。
【００１１】
バチルス属細菌としてはバチルス属に分類される細菌であれば特に制限されないが、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス レンタス（Bacillus lentus）、バチルス ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・サイアメンシス（Bacillus siamensis）、バチルス ロータス（Bacillus lautus）、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ピチノティ（Bacillus pichinotyi）、バチルス・アシドカルダリウス（Bacillus acid
ocaldarius）、バチルス・アルカリコラ（Bacillus alkalicola）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・シクロヘプタニカス（Bacillus cycloheptanicus）、バチルス・ アネウリニリティカス（Bacillus aneurinilyticus）、バチルス・ミグラヌス（Bacillus migulanus）、バチルス・アビッサリス（Bacillus abyssalis）、バチルス・アエスツアリイ（Bacillus aestuarii）、バチルス・ポリミグザ（Bacillus polymyxa）、またはバチルス・エスピー（Bacillus sp.）が挙げられる。
【００１２】
パエニバチルス属細菌としては、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans)、パエニバチルス・アミロリティカス（Paenibacillus amylolyticus）、パエニバチルス・ペオリアテ（Paenibacillus peoriate）、パエニバチルス・エルギー（Paenibacillus elgii）などが挙げられる。
【００１３】
ジオバチルス属細菌としては、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（Geobacillus thermoglucosidasius）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカス（Geobacillus caldoxylosilyticus）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）などが挙げられる。
【００１４】
クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・クリベリ(Clostridium kluyveri)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・アミノブチリカム(Clostridium aminobutyricum)、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）などが挙げられる。
【００１５】
スポロサルシナ属細菌としては、スポロサルシナ・パステウリ（Sporosarcina pasteurii）、スポロサルシナ・ウレアエ（Sporosarcina ureae）、スポロサルシナ・サイクロフィラ（Sporosarcina psychrophila）、スポロサルシナ・サーモトレランス（Sporosarcina thermotolerans）などが挙げられる。
【００１６】
本発明の方法において培養される細菌は、非遺伝子組み換え細菌でもよいし、遺伝子組み換え細菌でもよいが、抗生物質耐性遺伝子を含まない細菌であることが好ましい。
また、本発明の方法において培養される細菌は野生型でも変異型でもよいが、後者の場合であっても、抗生物質耐性変異は有しない細菌であることが好ましい。
【００１７】
本発明の細菌菌体の製造方法及び細菌の培養方法は、細菌を、抗生物質を含有する液体培地で培養する工程を含む。
液体培地は、培養対象の細菌の種類によって適宜選択でき、細菌の培養に適した濃度の、炭素源および窒素源などの培地成分を含んだ一般的な液体培地を使用することができる。
例えば、炭素源としては、糖（でんぷん、グルコース、ラクトース、グリセロール、アラビノース、リボース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、セロビオース、マルトース、スクロース、トレハロース、キシリトールなど）もしくは糖源原料、アルコール、有機酸、有機酸塩、アルカンまたは他の一般的な炭素源が例示され、窒素源としては、大豆由来成分、酵母由来成分、コーン由来成分、動植物タンパク質およびその分解物、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム
等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素等が例示される。
炭素源および窒素源以外の培地成分としては、微量金属塩、アミノ酸、ビタミン等が挙げられ、必要に応じて適宜添加することができる。
【００１８】
本発明の方法において、抗生物質としては、異常型コロニー出現率を非添加時と比べて低減できるものであれば特に限定されないが、具体的には、ストレプトマイシン、リンコマイシン、エリスロマイシン、リファンピシン、クロラムフェニコール、アクチノマイシン、フシジン酸、リピアマイシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトンが例示される。この中で特に好ましくは、ストレプトマイシンである。
【００１９】
抗生物質は、細菌の生育を阻害しない（亜致死量以下）濃度であることが好ましく、液体培地中の抗生物質の濃度が0.001ppm以上10,000ppm以下となるように添加することが好ましい。
抗生物質の濃度は、細菌に対する増殖阻害濃度以下であることが好ましく、細菌の種類にもよるが、例えば、1,000ppm以下であることが好ましく、300ppm以下であることがより好ましく、90ppm以下であることがさらに好ましい。一方、抗生物質の濃度の下限は異常型コロニーの出現を抑制できる濃度であればよいが、0.01ppm以上であることが好ましく、0.1ppm以上であることがより好ましく、1ppm以上であることがさらに好ましい。
【００２０】
抗生物質は、最終段よりも前の段で液体培地に添加する。抗生物質は、液体培地に培養開始時から含有させてもよいが、培養途中に添加してもよい。培養途中に添加する場合、菌体がある程度増殖した段階で添加することが好ましく、例えば、培養開始から1〜10時間の間に添加することが好ましい。また、液体培地中の抗生物質の濃度は、培養途中に補充するなどして変化させてもよい。
【００２１】
液体培養工程は、植え継ぎを伴う２段階以上の培養より成る。２段階以上であれば培養段数は何段でもよいが、好ましくは２〜４段階の多段階培養であってもよい。
なお、１段階目は１個の培養容器、２段階目は４個の培養容器、というように後段になるにつれて培養容器の数を増やしてもよい。また１段階は１Ｌ、２段階目は１０Ｌ、というように後段になるにつれて培養容器の容量を増やしてもよい。
多段階培養の培養時間について、例えば、２段階の培養を行う場合、細菌を１段階目の培地に接種して10〜40時間、好ましくは20〜30時間培養を行い、１段階目の培養で得られた菌体の一部を２段階目の培地に接種し、15〜80時間、好ましくは20〜50時間培養を行う態様が挙げられ、トータルの培養時間としては好ましくは25〜120時間、より好ましくは30〜80時間である。
例えば、３段階の培養を行う場合、細菌を１段階目の培地に接種して10〜40時間、好ましくは20〜30時間培養を行い、１段階目の培養で得られた菌体の一部を２段階目の培地に接種し、５〜40時間、好ましくは10〜30時間培養を行い、２段階目の培養で得られた菌体の一部を３段階目の培地に接種し、15〜80時間、好ましくは20〜50時間培養を行う態様が挙げられ、トータルの培養時間としては好ましくは30〜160時間、より好ましくは35〜110時間である。
例えば、４段階の培養を行う場合、細菌を１段階目の培地に接種して10〜40時間、好ましくは20〜30時間培養を行い、１段階目の培養で得られた菌体の一部を２段階目の培地に接種し、５〜40時間、好ましくは10〜30時間培養を行い、２段階目の培養で得られた菌体の一部を３段階目の培地に接種し、５〜40時間、好ましくは10〜30時間培養を行い、３段階目の培養で得られた菌体の一部を４段階目の培地に接種し、15〜80時間、好ましくは20〜50時間培養を行う態様が挙げられ、トータルの培養時間としては好ましくは35〜200時間、より好ましくは60〜140時間である。
【００２２】
このように、液体培養を多段階で行う場合、そのうちの、最終段を除く少なくともいずれかの１つの段階で抗生物質を含有する培地を用いて培養を行い、最終段では抗生物質を含有させた段階よりも低い抗生物質濃度で培養を行えばよい。最終段で抗生物質濃度を下げることにより、増殖阻害や芽胞形成阻害を起こす要因を除外することになるため、より迅速に培養工程を進めることができる。通常微生物の多段階培養による生産では、最終段がもっとも大きな規模となることが一般的であるため、最終段で抗生物質濃度を下げることは、製造コストの抑制につながる。
例えば、最終段における抗生物質の濃度を、抗生物質を含有させた段階における抗生物質の濃度の１／２以下、１／５以下、１／１０以下、１／５０以下、または１／１００以下とすることができ、最終段における抗生物質の濃度をゼロ（検出限界以下）にしてもよい。
例えば、後述の実施例１のように、培養を３段階で行い、１段階目と２段階目は抗生物質を添加し、３段階目は抗生物質を添加せず、２段階目の培養液を１％植え継ぐことで抗生物質濃度を２段階目の100分の１に低下させるような培養方法とすることもできる。
また、抗生物質の濃度を段階ごとで徐々に減らすこともでき、その場合、最終段における抗生物質の濃度は、最大濃度の１／２以下、１／５以下、１／１０以下、１／５０以下、または１／１００以下とすることができる。
なお、抗生物質を含有する培地を用いて培養する期間はトータルで10時間以上であることが好ましい。
【００２３】
培養温度は細菌の種類によって適宜選択できるが、例えば、10℃〜50℃、好ましくは15℃〜50℃、より好ましくは15℃〜40℃である。
その他の、酸素濃度、ｐＨ等の各種条件については、通常の細菌の液体培養に使用される条件であればよいが、例えば、好気条件（例えば、酸素濃度15〜50％）で、撹拌しつつ培養する条件が例示される。培地のｐＨは6.5〜8.5が好ましく、7.0〜8.0がより好ましい。
【００２４】
異常型コロニーが出現するかどうかは、抗生物質を用いた液体培養後に、得られた菌体の一部を採取し、それをコロニー同士が接着せず、コロニー形態が識別できる程度の濃度に希釈し、寒天培地などの固体培地上に塗布して培養し、出現するコロニーの形態を観察することで確認することができる。
異常型コロニーとは、野生型の細菌のコロニー形態とは異なる形態を示すコロニーを意味する。例えば、表３に示すように、正常型コロニーの形態がほぼ円形で、側面がレンズ上で、表面が平滑またはムコイド状であるのに対し、異常型コロニーは、形態が不規則で、側面が扁平で、表面が粗面であるような場合が挙げられる。形態面の異常、側面の異常、表面の異常のうち、１つ以上に該当すれば異常型コロニーということができる。図１は異常型コロニーの形態の一例を示し、丸で囲われているものが異常型コロニーである。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２６】
（実施例１）
500mL三角フラスコ（バッフル付）を用い、表１に記載の培地成分を含む液体培地をそれぞれ100mLずつ作成し、オートクレーブ滅菌を行った。なおメイラード反応を避けるため、グルコースは別途滅菌の上、無菌的に混合した。
【００２７】
【表１】
2019058083.tif 000002
【００２８】
表２に記載の通り、試験区を設定した。各試験区の条件に従い、フィルター滅菌したストレプトマイシン水溶液を、無菌的に培地へ添加した。
普通寒天培地上に生育させたバチルス・ズブチリスITB105株（NITE BP-01727）のコロニーより１白金耳を取って植菌した後、30℃、150rpmで振とう培養を行った（1段目）。18時間後に、それぞれ1mLを分取して新たな培地に植え継ぎ、同様に振とう培養を行った（2段目）。さらに24時間後に、それぞれ1mLを分取して新たな培地に植え継ぎ、同様に振とう培養を行った（3段目）。3段目の培養液について、30時間後にサンプリングを行った。
【００２９】
【表２】
2019058083.tif 000003
【００３０】
得られた培養液について、滅菌水で1×107倍に希釈し、100μLを普通寒天培地に塗布して37℃で一晩培養した。コロニーの出現数を計測し、CFUを算出した。また出現したコロニーについて、表３の基準に従い親株のコロニー形態と明らかに異なるものを異常型コロニーとして出現数の計測を行い、全体に占める比率を算出した。その結果を表４に示す。その結果、３段階培養において、全く抗生物質を加えなかった場合は異常コロニーが約５％出現したが、１段目および２段目にストレプトマイシンを加え、３段目は加えずに培養
した場合には異常型コロニーの出現が見られなかった。また、１段目、２段目、３段目の全てにおいてストレプトマイシンを加えた場合には、異常型コロニーは出現しなかったものの、コロニーの出現数及び正常型コロニーの出現数が低く、試験区番号２〜６と比較して、細菌菌体の生産性が低くなった。
【００３１】
【表３】
2019058083.tif 000004
【００３２】
【表４】
2019058083.tif 000005
【図１】
2019058083.tif 000006