(57)【要約】      （修正有）【課題】糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分中の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであるアクセプターへ、５−Ｎ−アセチルノイラミニン酸残基を伝達する方法の提供。【解決手段】インビトロで５’−シチジン−一リン酸の存在下に、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸から、またはその機能均等物から、アクセプター、すなわち糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分中の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであるアクセプターへ、５−Ｎ−アセチルノイラミニン酸残基を伝達するための、特定のアミノ酸モチーフを欠如する可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用であって、前記可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩが特定のアミノ酸を含む、前記使用。【選択図】図１１
2019088306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ；
（ｂ）シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物；
（ｃ）糖タンパク質および糖脂質から選択されるグリコシル化されたターゲット分子；ターゲット分子は１以上のアンテナを含み、少なくとも１つのアンテナは末端構造としてガラクトシル残基のＣ６位にヒドロキシル基をもつβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有する；
（ｄ）グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする水溶液
を含む水性組成物であって、
さらに、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素を含む水性組成物。
【請求項２】
５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、および５’ヌクレオチダーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の水性組成物。
【請求項３】
請求項１および２に記載の組成物におけるシアリルトランスフェラーゼ酵素活性を維持するための、５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素の使用。
【請求項４】
請求項１および２に記載の組成物におけるシアリダーゼ酵素活性を阻害するための、５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素の使用。
【請求項５】
シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法であって、
（ａ）請求項１および２に記載の水性組成物を用意する；
（ｂ）工程（ａ）の水性組成物をインキュベートし、それによりシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物を補基質として反応させることにより、１以上の末端アンテナ形Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それにより５’−シチジン−一リン酸が形成される；
（ｃ）工程（ｂ）で形成された５’−シチジン−一リン酸のホスホエステル結合を加水分解し、それにより５’−シチジン−一リン酸仲介による阻害を低減し、それにより可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの活性を維持する；
工程を含み、
それにより、シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法。
【請求項６】
その方法を０℃〜４０℃の温度で実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）と（ｃ）を同じ容器内で実施する、請求項５および６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）および（ｃ）を、２時間〜９６時間、２時間〜２３時間、２時間〜６時間、および約２時間からなる群から選択される期間実施する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）および（ｃ）を、６時間〜９６時間、６時間〜２３時間、および約６時間からなる群から選択される期間実施する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）および（ｃ）を、２３時間〜９６時間、および約２３時間からなる群から選択される期間実施する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）および（ｃ）を約９６時間実施する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
シアリル化された免疫グロブリンの調製物であって、それぞれの免疫グロブリンはヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩに対する複数のアクセプター部位を有し、シアリル化された免疫グロブリンの調製物における約２５％未満がシアリル化されておらず、約７５％以上がシアリル化されている、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法により得られる調製物。
【請求項１３】
５’−シチジン−一リン酸の存在下で、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分、すなわちシアリル化された糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である部分におけるα２，６グリコシド結合をインビトロ加水分解するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用。
【請求項１４】
可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置４０６までのアミノ酸を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列である、請求項１３および１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｎ末端トランケーション欠失または内部欠失を有する特定のグリコシルトランスフェラーゼバリアントの特性に関する。本明細書に開示する変異体はいずれも、補基質（補助基質）(co-substrate)としてのＣＭＰ活性化されたシアル酸の存在下で、かつ適切なアクセプター部位の存在下で、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ酵素活性を示す。本開示中で述べる基本的知見は、そのような酵素がシアリジル部分の伝達を触媒できるだけでなく、それらがグリカンからの末端結合シアル酸の加水分解開裂をも触媒できるということである。特に、シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）の存在下でグリコシルトランスフェラーゼ活性は阻害され、シアリダーゼ活性は刺激されることが見出された。シアリダーゼ活性は、基準（野生型）ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドのポリペプチド配列中の特定範囲のアミノ酸（位置９０−１０８）の存在に依存することが見出された。Ｎ末端トランケーションバリアントにおけるこの配列部分の欠失は、ＣＭＰの存在下および非存在下で共に明らかにシアリダーゼ活性を無効にすることが見出された。よって、本明細書中で述べるＣＭＰ仲介フィードバック調節を用いる組成物、使用および方法を開示する。
【０００２】
これまでの知見と異なり、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ変異体、特に（ただし、それらに限定されない）ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；野生型アミノ酸配列；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照）のバリアントであって、それぞれの野生型ポリペプチドの最初の８９個のＮ末端アミノ酸を伴うトランケーション欠失をもつもの（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をもつ変異体）は、シアリダーゼ酵素活性を示すことが見出された。本開示中で述べる基本的知見は、この変異酵素はシアリジル部分の伝達を触媒できるだけではないということである；事実、このα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ変異体はグリカンからの末端結合シアル酸の加水分解開裂をも触媒できる。本開示はさらに、予想外のフィードバック阻害の所見を報告する。特に、シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）の存在下でグリコシルトランスフェラーゼ活性は阻害され、シアリダーゼ活性は刺激されることが見出された。よりいっそう意外なことに、最初の８９個のＮ末端アミノ酸を伴う欠失変異体だけでなく、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の他のＮ末端トランケーションバリアントもシアリダーゼ酵素活性を示すことが見出された。ただし、シアリダーゼ活性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による基準（野生型）ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドのポリペプチド配列中の特定範囲のアミノ酸（位置９０−１０８，図１を参照）の存在に依存することが見出された。Ｎ末端トランケーションバリアントにおけるこの配列部分の欠失は、ＣＭＰの存在下および非存在下で共に明らかにシアリダーゼ活性を無効にすることが見出された。よって、本明細書中で述べるＣＭＰ仲介フィードバック調節を用いる組成物、使用および方法、特にＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の制御加水分解に関するものを開示する。さらに、ＣＭＰ非感受性ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いる組成物、使用および方法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２）はある物質から他への官能基の伝達を触媒する。グリコシルトランスフェラーゼ（酵素スーパーファミリー）は、糖タンパク質、糖脂質およびグリコサミノグリカンの炭水化物部分の合成に関与する。特定のグリコシルトランスフェラーゼは、活性化された糖ドナーの単糖部分をアクセプター分子へ逐次伝達することによりオリゴ糖を合成する。したがって、“グリコシルトランスフェラーゼ”は、糖部分をそれのヌクレオチドドナーからポリペプチド、脂質、糖タンパク質または糖脂質のアクセプ
ター部分へ伝達するのをを触媒する。このプロセスは“グリコシル化”としても知られる。たとえば糖タンパク質の構造部分である炭水化物部分は、“グリカン”とも呼ばれる。グリカンはすべての既知の翻訳後タンパク質修飾の最も多くを構成する。グリカンは、接着、免疫応答、神経細胞移動および軸索伸長にわたる広範な生物学的認識プロセスに関与する。グリカンは、糖タンパク質の構造部分として、タンパク質フォールディングならびにタンパク質の安定性および生物活性の支持においても役割をもつ。
【０００４】
グリコシルトランスフェラーゼ触媒作用において、単糖単位であるグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＵＡ）およびキシロースは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）−α−Ｄ誘導体として活性化される；アラビノースはＵＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化される；マンノース（Ｍａｎ）およびフコースは、それぞれＧＤＰ−α−ＤおよびＧＤＰ−β−Ｌ誘導体として活性化される；シアル酸（＝β−Ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ；＝Ｎｅｕ５Ａｃ；＝ＳＡ；＝ＮＡＮＡ）はシアル酸のＣＭＰ誘導体として活性化される。ＣＭＰ活性化されたシアル酸（＝ＣＭＰ−β−Ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ，後記を参照）は、ヌクレオチド一リン酸の形態の唯一の天然ヌクレオチド糖であると思われる。
【０００５】
多種多様なグリコシルトランスフェラーゼがグリカンの合成に関与している。糖タンパク質の炭水化物部分の構造多様性は特に大きく、複雑な生合成経路により決定される。真核細胞では、小胞体(endoplasmic reticulum)（“ＥＲ”）の内腔およびゴルジ体におい
て糖タンパク質のグリカン部分の翻訳後生合成が起きる。糖タンパク質の単一（分枝または線状）炭水化物鎖は一般にＮ−またはＯ−結合型グリカンである。翻訳後プロセシングに際して、炭水化物は一般にアスパラギンを介して（“Ｎ−結合型グリコシル化”）、またはセリンもしくはトレオニンを介して（“Ｏ−結合型グリコシル化”）、ポリペプチドに結合する。グリカンの合成は、Ｎ−またはＯ−結合型（＝“Ｎ−／Ｏ−結合型”）のいずれであっても、幾つかの異なる膜固定型グリコシルトランスフェラーゼの活性により作用を受ける。糖タンパク質は１以上のグリカン結合したアミノ酸（＝“グリコシル化部位”）を含む場合がある。個々のグリカン構造は線状または分枝状の場合がある。分枝は炭水化物の顕著な特徴であり、それはＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチドに一般的な線状性と対照的である。グリカン構造体は、それらの基本構築ブロックである単糖の不均一性が大きいことと合わせて、高い多様性を示す。さらに、特定の糖タンパク質種のメンバーにおいては特定のグリコシル化部位に結合するグリカンの構造が変動する可能性があり、こうしてそれぞれの糖タンパク質種、すなわちポリペプチド部分の同一アミノ酸配列を共有する種における、ミクロ不均一性が生じる。
【０００６】
シアリルトランスフェラーゼ（＝“ＳＴ”）は、ドナー化合物から（ｉ）糖脂質もしくはガングリオシドの末端単糖アクセプター基への、または（ｉｉ）糖タンパク質のＮ−／Ｏ−結合型グリカンの末端単糖アクセプター基への、シアル酸残基の伝達を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである。本開示の目的について、ドナー化合物は“補基質(co-substrate)”とも呼ばれる。ヒトＳＴ種を含めた哺乳動物シアリルトランスフェラーゼについては、共通のドナー化合物であるシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸（＝ＣＭＰ−β−Ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ；＝ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ；＝ＣＭＰ−ＮＡＮＡ；＝ＣＭＰ−シアル酸；＝ＣＭＰ−ＳＡ）がある。当業者に周知のとおり、ＣＭＰ−シアル酸はシアリルトランスフェラーゼに特異的な態様のドナー化合物である；さらに、ＣＭＰ−９−フルオレセイニル−シアル酸を含めた（それに限定されない）機能均等物がある。レセプター部位へのシアル酸残基（またはその機能均等物）の伝達および共有結合は、“シアリル化する(sialylating)”および“シアリル化(sialylation)”とも呼ばれる。
【０００７】
シアリル化された糖タンパク質のグリカン構造体において、(１以上の)シアリル部分は通常はオリゴ糖の末端位置にみられる。よって、シアリル化された部位の量に応じて、１以上のシアル酸残基はその糖タンパク質のグリカン部分の一部を形成する可能性がある。シアル酸は、末端、すなわち露出位置にあるため、多種多様な生物学的認識現象に関与し、種々の生物学的相互作用に役立つ可能性がある。糖タンパク質には１より多いシアリル化部位、すなわちシアリルトランスフェラーゼの基質として作用できる、シアル酸残基の伝達に適したアクセプター基である部位が存在する可能性がある。そのような１より多い部位は、原則として、糖タンパク質の異なるグリコシル化部位に結合した複数の線状グリカン部分の末端にある可能性がある。さらに、分枝グリカンはシアリル化が起きうる複数の部位をもつ場合がある。
【０００８】
現在の知識によれば、末端シアル酸残基は、（ｉ）ガラクトシル−Ｒにα２→３（α２，３）結合、（ｉｉ）ガラクトシル−Ｒにα２→６（α２，６）結合、（ｉｉｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミニジル−Ｒにα２→６（α２，６）結合、（ｉｖ）Ｎ−アセチルグルコサミニジル−Ｒにα２→６（α２，６）結合、および（ｖ）シアリジル−Ｒにα２→８／９（α２，８／９）結合した状態でみられる可能性がある；これらにおいて、−Ｒはアクセプター基質部分の残部を意味する。したがって、シアリルコンジュゲートの生合成において作用するシアリルトランスフェラーゼは、一般にそれのそれぞれの単糖アクセプター基質に従って、かつそれが触媒するグリコシド結合の３、６または８／９位置に従って、命名および分類される。したがって、当技術分野で知られている文献、たとえばPatel RY, et al, Glycobiology 16 (2006) 108-116には、真核細胞シアリルトランスフェラー
ゼに、グリコシド結合の形成に際してＮｅｕ５Ａｃ残基が伝達されるアクセプター糖残基のヒドロキシル位置に応じて、（ｉ）ＳＴ３Ｇａｌ、（ｉｉ）ＳＴ６Ｇａｌ、（ｉｉｉ）ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ、または（ｖ）ＳＴ８Ｓｉａなどの表記がなされている。より総称的なシアリルトランスフェラーゼの表記、たとえばＳＴ３、ＳＴ６、ＳＴ８も行なうことができる；よって、“ＳＴ６”は詳細にはα２，６シアリル化を触媒するシアリルトランスフェラーゼを包含する。
【０００９】
二糖部分β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（＝Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）は糖タンパク質のＮ−結合型グリカンのアンテナ(antenna)
にしばしばみられる末端残基であるが、Ｏ−結合型グリカンおよび糖脂質にも存在する場合がある。さらに、末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ部分は、あるターゲット糖タンパク質においてガラクトシルトランスフェラーゼ酵素活性の結果として生成する可能性がある。酵素β−ガラクトシド−α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（＝“ＳＴ６Ｇａｌ”）は、グリカンまたはグリカン分枝（当技術分野で“アンテナ”としても知られる）の末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃアクセプター部分のα２，６−シアリル化を触媒することができる。その一般的側面については、DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676の文献を参照する。ヒトおよび他の哺乳動物には、ＳＴ６Ｇａｌの幾つかの種（アイソザイム）があると思われる。本開示は、特にヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（＝ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；ＩＵＢＭＢ酵素命名法によればＥＣ  ２．４．９９．１）およびそのバリアントを開示するが、それらに限定されない。
【００１０】
ＳＴ６グループのシアリルトランスフェラーゼは、２つのサブグループＳＴ６ＧａｌおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃを含む。ＳＴ６Ｇａｌ酵素の活性は、Ｎｅｕ５Ａｃ残基を、グリカンまたはグリカンのアンテナにおける末端Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃの一部である遊離ガラクトシル残基のＣ６  ヒドロキシル基へ伝達するのを触媒し、それによりグリカンに、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ部分のガラクトシル残基に連結した末端シアル酸残基α２→６を形成する。得られた新たにグリカン中に形成された末端部分はＮｅｕ５Ａｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃである。
【００１１】
ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ）の野生型ポリペプチドは、本明細書の提出時点で“ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１５９０７．１”として公にアクセスできるＮＣＢＩデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/115445)に開示されていた。さらに、コード配列を含む情報がデータベースエントリー“Ｇｅｎｅ  ＩＤ：６４８０”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6480)内にコンパイルされたハイパーリンクとして提供されている。
【００１２】
哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、下記のものを備えたいわゆる“ＩＩ型構造(type II architecture)”を、他の哺乳動物ゴルジ常在グリコシルトランスフェラーゼと共有している：（ｉ）短い細胞質Ｎ末端テイル、（ｉｉ）膜貫通フラグメント、続いて（ｉｉｉ）可変長ステム領域、および（ｉｖ）ゴルジ体の内腔に面したＣ−末端触媒ドメイン(Donadio S. et al. in Biochimie 85 (2003) 311-321)。したがって、Ｎ末端トランケーション欠失を伴う“可溶性”シアリルトランスフェラーゼは、少なくともＩＩ型構造のエレメント（ｉ）および（ｉｉ）を欠如する。哺乳動物シアリルトランスフェラーゼはそれらの触媒ドメインにおいて有意の配列相同性を示すと思われる。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの構造および機能に関する最近のデータは、Kuhn B. et al. (Biol. Crystallography D69 (2013) 1826-1838)に開示されている。
【００１３】
マウス、ラットおよびヒトを含めたある哺乳動物において、ＳＴ６Ｇａｌは広範な組織分布をもつ。それは肝臓、すなわち血清糖タンパク質合成の主要部位に、特に多量に存在する(Weinstein J. et al. J. Biol. Chem 257 (1982) 13835-13844)。一方で、シアリルトランスフェラーゼは主に膜結合形態でゴルジおよびトランスゴルジネットワーク(trans-Golgi network)内に存在し、そこでそれは新たに合成された分泌型または細胞表面型の糖タンパク質の翻訳後修飾に関与する。他方で、可溶性形態のＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは血清中に存在し(Kim Y.S. et al Biochim. Biophys Acta 244 (1971) 505-512; Dalziel M. et al. Glycobiology 9 (1999) 1003-1008)、主に肝臓から(Kaplan, H.A.et al. J. Biol. Chern. 258 (1983) 11505-11509; van Dijk, W.et al. Biochem. Cell. Biol. 64 (1986) 79-84; Dalziel M. et al. (前掲))、触媒ドメインをそれの膜アンカーから遊離するタンパク質分解事象により誘導される(Kaplan et al., 前掲; Weinstein, J. et al. J. Biol. Chem. 262 (1987) 17735-17743)。よって、本来は膜固定型(membrane-anchored)であったグリコシルトランスフェラーゼの、膜アンカーを含むＮ末端トランケーションを伴うバリアントはいずれも、用語“可溶性バリアント”に含まれる。可溶性バリアントは、たとえばその部分を膜アンカーと共にタンパク質からタンパク質分解除去することにより、あるいは元のタンパク質のＮ末端トランケート形をコードするバリアント核酸配列を発現させることにより作製でき、その際、そのトランケーションは膜アンカー（膜貫通フラグメント，ＩＩ型構造のエレメント（ｉｉ））を含む。
【００１４】
Donadio S. et al. (前掲)は、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの膜アンカーを含まない幾つかのＮ末端トランケート型バリアントをＣＨＯ細胞において組換え発現させた。その著者らは、最初の３５、４８、６０および８９アミノ酸の欠失を含むＮ末端欠失により、酵素活性をもち、シアル酸を外部アクセプターへ伝達できるｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉバリアントが得られることを見出した。
【００１５】
グリコシル化は、タンパク質のフォールディング、安定性、および生物活性調節に影響を及ぼす重要なタンパク質翻訳後修飾である。シアリル残基は通常はＮ−グリカンの末端位置に露出しており、したがって、生物学的認識およびリガンド機能に対する主要な関与因子である。重要な例として、末端シアル酸残基を特徴とするグリカンを含むＩｇＧは、炎症反応軽減を誘導することが見出され、かつ血清半減期の延長を示した。したがって、グリコシルトランスフェラーゼを酵素による特定のグリカン構造体の合成に使用することは、療法用タンパク質、特に療法用モノクローナル抗体の、直接インビトロＮ−グリコシ
ル化に対する工学的ツールとなりつつある。
【００１６】
原核細胞由来のグリコシルトランスフェラーゼは通常は複雑な糖タンパク質構造体には作用しないので、インビトロ糖工学操作の目的には哺乳動物由来のシアリルトランスフェラーゼが好ましい。たとえば、Barb et al. (2009)は、単離されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いて免疫グロブリンＧの高度にシアリル化された形態のＦｃフラグメントを製造した。しかし、種々の宿主（メトロトローフ(methylotrophic)酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、培養ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)細胞、大腸菌(E. coli)−ベースの発現系）において組換え発現させたｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの低い発現収率および／または活性の貧弱さのため、そのような適用のための組換えｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの入手はなお限られている。
【００１７】
Kleineidam R.G. et al. Glycoconjugate Journal (1997) 14: 57-66は、ラット肝臓由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの多数の阻害物質を開示している。具体的には、それぞれシチジン、２’−ＣＭＰ、３’−ＣＭＰおよび５’−ＣＭＰの存在下で７０％、４０％、３９％および７１％のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ阻害がみられ、その際、各阻害物質は０．２５ｍＭの濃度で試験された。
【００１８】
グリコシル化されたターゲット分子、たとえば糖タンパク質または糖脂質をインビトロシアリル化するための哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの使用が当技術分野で知られているが、逆の反応（シアリダーゼ活性、すなわちグリカン部分からの末端シアリル残基の加水分解開裂）は一般にこれまでノイラミニダーゼにより提供されている。しかし、本発明者らによる独自の知見は、哺乳動物由来のシアリルトランスフェラーゼの可溶性バリアントがＣＭＰの存在下でシアリダーゼ活性を示すというものである。事実、Ｎ末端トランケーションにより膜貫通ドメインを欠失したヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの可溶性バリアントの特定の例は、（ｉ）ターゲット糖タンパク質のシアリル化、および（ｉｉ）シアリル化されたターゲット糖タンパク質からのシアリル残基の加水分解開裂の両方に使用できる。ＣＭＰの存在およびＣＭＰと可溶性バリアントの相互作用に応じて、シアリル化を定量的に制御できる。２以上のアンテナ形(antennal)グリカンアクセプター部位をもつターゲット分子を伴う特定の態様において、本開示は、幾つかのアクセプター部位のうち１つだけにおいてシアリル化を可能にする、またターゲット分子の２以上またはすべてのアクセプター部位ですらシアリル化する手段、方法および条件を提供する。
【００１９】
これは、特に免疫グロブリン、および他のグリコシル化されたターゲット分子のインビトロ糖工学操作の分野において、多種多様な方法への道を開く。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Patel RY, et al, Glycobiology 16 (2006) 108-116
【非特許文献２】DallOlio F. Glycoconjugate Journal 17 (2000) 669-676
【非特許文献３】Donadio S. et al. in Biochimie 85 (2003) 311-321
【非特許文献４】Kuhn B. et al. (Biol. Crystallography D69 (2013) 1826-1838)
【非特許文献５】Weinstein J. et al. J. Biol. Chem 257 (1982) 13835-13844
【非特許文献６】Kim Y.S. et al Biochim. Biophys Acta 244 (1971) 505-512
【非特許文献７】Dalziel M. et al. Glycobiology 9 (1999) 1003-1008
【非特許文献８】Kaplan, H.A.et al. J. Biol. Chern. 258 (1983) 11505-11509
【非特許文献９】van Dijk, W.et al. Biochem. Cell. Biol. 64 (1986) 79-84
【非特許文献１０】Weinstein, J. et al. J. Biol. Chem. 262 (1987) 17735-17743
【非特許文献１１】Barb et al. (2009)
【非特許文献１２】Kleineidam R.G. et al. Glycoconjugate Journal (1997) 14:  57-66
【発明の概要】
【００２１】
本明細書に開示する他のすべての側面のうち第１側面および特定の態様には、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ；
（ｂ）シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物；
（ｃ）糖タンパク質および糖脂質から選択されるグリコシル化されたターゲット分子；ターゲット分子は１以上のアンテナを含み、少なくとも１つのアンテナは末端構造としてガラクトシル残基のＣ６位にヒドロキシル基をもつβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有する；
（ｄ）グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする水溶液
を含む水性組成物であって、
さらに、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素を含む水性組成物を開示する。
【００２２】
本明細書に開示する他のすべての側面のうち第２側面および特定の態様には、第１側面に従った組成物におけるシアリルトランスフェラーゼ酵素活性を維持するための、および／またはシアリダーゼ酵素活性を阻害するための、５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素の使用を開示する。
【００２３】
本明細書に開示する他のすべての側面のうち第３側面および特定の態様には、シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法であって、
（ａ）請求項１および２に従った水性組成物を用意する；
（ｂ）工程（ａ）の水性組成物をインキュベートし、それによりシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物を補基質として反応させることにより、１以上の末端アンテナ形Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それにより５’−シチジン−一リン酸が形成される；
（ｃ）工程（ｂ）で形成された５’−シチジン−一リン酸のホスホエステル結合を加水分解し、それにより５’−シチジン−一リン酸仲介による阻害を低減し、それにより可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの活性を維持する；
工程を含み、
それにより、シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法を開示する。
【００２４】
本明細書に開示する他のすべての側面のうち第４側面および特定の態様には、シアリル化された免疫グロブリンの調製物を開示し、それぞれの免疫グロブリンはヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩに対する複数のアクセプター部位を有し、シアリル化された免疫グロブリンの調製物における約２５％未満がシアリル化されておらず、約７５％以上がシアリル化されており、その際、調製物は第３側面に従った方法により得られる。
【００２５】
本明細書に開示する他のすべての側面のうち第５側面および特定の態様には、５’−シチジン−一リン酸の存在下で、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分、すなわちシアリル化された糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である部分におけるα２，６グリコシド結合をインビトロ加水分解するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０
８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用を開示する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１  野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉポリペプチドのアミノ酸配列、および本明細書に開示する欠失バリアントにおいてトランケートされるそのＮ末端部分の表示。トランケーションにおける欠失部分を“Ｘ”により表わす。下線を施したのはＣＭＰ誘導によるシアリダーゼ活性に必須であることが見出された位置９０−１０８のアミノ酸である。
【図２】図２  ＨＥＫ細胞において一過性発現し、それから分泌された△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉバリアントの電気泳動および染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。列１はサイズ標準品を示し、標準品に従った分子量ｋＤａを左に示す。列２：精製した△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉトランケーションバリアント（５μｇのタンパク質をゲルに装填した）。
【図３】図３  ＨＥＫ細胞において一過性発現し、それから分泌された△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉバリアントの電気泳動および染色後のＳＤＳゲル。列１はサイズ標準品を示し、標準品に従った分子量ｋＤａを左に示す。列２：△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉトランケーションバリアント（５μｇのタンパク質をゲルに装填した）。
【図４】図４  組換え体△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いたＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化のタイムコース。
【図５】図５  組換え体△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉにより触媒されるＧ２＋２ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡの形成の動態を、異なるシアリル化ターゲット分子種の相対含量を決定する基礎として取得した質量スペクトルにより示したもの。
【図６】図６  ＣＴＰによる、組換え体△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性の阻害。末端ガラクトース残基をもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ，“アシアロ(asialo)”）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびビ−シアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を種々の時点について示す。
【図７】図７  △８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性：精製したＩｇＧ１  ＭＡＢ  Ｇ２＋２ＳＡを△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと共にＣＭＰの非存在下でインキュベーション。末端ガラクトース残基をもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を種々の時点について示す。
【図８】図８  △８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性：精製したＩｇＧ１  ＭＡＢ  Ｇ２＋２ＳＡを△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと共にＣＭＰの存在下でインキュベーション。末端ガラクトース残基をもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を種々の時点について示す。
【図９】図９  △８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性：精製したＩｇＧ１  ＭＡＢ  Ｇ２＋２ＳＡを△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと共にＣＭＰの存在下でインキュベーション。末端ガラクトース残基をもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を種々の時点について示す。
【図１０】図１０  △８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性：精製したＩｇＧ１  ＭＡＢ  Ｇ２＋２ＳＡをデルタ５７ＳＴ３−Ｇａｌ−Ｉと共にＣＭＰの存在下でインキュベーション。末端ガラクトース残基をもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を種々の時点について示す。
【図１１】図１１  シアリル化反応混合物中における５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３の非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。用いた５’−ヌクレオチダーゼの量は０〜０．５μｇであった。陰性対照：０μｇの５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３．
【図１２】図１２  シアリル化反応混合物中における５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３の非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。０．１μｇの５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３を含むシアリル化反応混合物。
【図１３】図１３  シアリル化反応混合物中における５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３の非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。０．２５μｇの５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３を含むシアリル化反応混合物。
【図１４】図１４  シアリル化反応混合物中における５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３の非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。０．５μｇの５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３を含むシアリル化反応混合物。
【図１５】図１５  シアリル化反応混合物中におけるアルカリホスファターゼの非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。用いた５’−ヌクレオチダーゼの量は０〜１００μｇであった。陰性対照：０μｇのアルカリホスファターゼ．
【図１６】図１６  シアリル化反応混合物中におけるアルカリホスファターゼの非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。１μｇのアルカリホスファターゼを含むシアリル化反応混合物。
【図１７】図１７  シアリル化反応混合物中におけるアルカリホスファターゼの非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。５μｇのアルカリホスファターゼを含むシアリル化反応混合物。
【図１８】図１８  シアリル化反応混合物中におけるアルカリホスファターゼの非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。１０μｇのアルカリホスファターゼを含むシアリル化反応混合物。
【図１９】図１９  シアリル化反応混合物中におけるアルカリホスファターゼの非存在下または存在下における△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化。末端ガラクトース残基のみをもつグリカン（Ｇ２＋０ＳＡ）、モノシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋１ＳＡ）およびジシアリル化されたグリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）を含む抗体の相対含量を示す。１００μｇのアルカリホスファターゼを含むシアリル化反応混合物。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
用語“a”、“an”および“the”は、状況からそうではないことが明らかに示されない
限り、一般に複数表記、すなわち“１以上の(one or more)”を含む。本明細書中で用い
る“複数(plurality)”は１より多いことを意味すると解釈される。たとえば、複数は少
なくとも２、３、４、５またはより多いことを表わす。具体的に述べない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書中で用いる用語“または(or)”は包括的であると解釈される。
【００２８】
具体的に述べない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書中で用いる用語“約(about)”は当技術分野で普通の許容範囲内、たとえば平均の２標準偏差以内であると解釈される。約は、記載した数値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると解釈できる。状況からそうではないことが明らかでない限り、本明細書中に提示するすべての数値は用語“約”により修飾できる。
【００２９】
用語“アミノ酸”は、一般にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に取り込むことができるいずれかのモノマー単位を表わす。本明細書中で用いる用語“アミノ酸”には下記の２０の天然または遺伝子コードされるアルファ−アミノ酸が含まれる：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェラルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。“Ｘ”残基が規定されていない場合、これらは“いずれかのアミノ酸”と規定すべきである。これら２０種類の天然アミノ酸の構造は、たとえばStryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。他のアミノ酸、たとえばセレノシステインおよびピロリジンも遺伝子コードすることができる(Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466)。用語“アミノ酸”には非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（たとえば、修飾された側鎖および／または主鎖をもつもの）、およびアミノ酸アナログも含まれる。たとえば下記を参照：Zhang et al. (2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher et al. (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, およびBudisa et al. (2001) “Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acid,” Protein Sci. 10(7):1281-1292。さらに説明するために、アミノ酸は一般に、置換もしくは非置換アミノ基、置換もしくは非置換カルボキシ基、および１以上の側鎖もしくは側基、またはこれらのいずれかの基のアナログを含む有機酸である。代表的な側鎖には、たとえば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル��アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基のいずれかの組合わせが含まれる。他の代表的なアミノ酸には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：光活性化可能なクロスリンカーを含むアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピンラベルしたアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を含むアミノ酸、他の分子と共有結合または非共有結合により相互作用するアミノ酸、フォトケージド(photocaged)および／または光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたは非ビオチンアナログを含むアミノ酸、グリコシル化されたアミノ酸、他の炭水化物修飾されたアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学開裂および／または光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１以上の有毒部分を含むアミノ酸。
【００３０】
用語“タンパク質”は、リボソーム翻訳プロセスの生成物としてのポリペプチド鎖（アミノ酸配列）を表わし、その際、ポリペプチド鎖は翻訳後フォールディングプロセスを受けて三次元タンパク質構造になっている。用語“タンパク質”には、１以上の翻訳後修飾、たとえば（ただし、それらに限定されない）グリコシル化、リン酸化、アセチル化およびユビキチン化を含むポリペプチドも含まれる。
【００３１】
本明細書に開示するいずれかのタンパク質、特に本明細書に開示する組換え製造されたタンパク質は、特定の態様において、組換えタンパク質に遺伝学的に架橋したペプチド配列である“タンパク質タグ”を含むことができる。タンパク質タグは、タンパク質分解によるタグの除去を容易にするための特異的プロテアーゼ開裂部位をもつリンカー配列を含むことができる。特定の態様として、“アフィニティータグ”は、アフィニティー法を用いてターゲットをそれの粗製の生物供給源から精製できるようにターゲットタンパク質に付加される。たとえば、供給源は、ターゲットタンパク質を発現する形質転換した宿主生物、または形質転換した宿主生物によりターゲットタンパク質がその中へ分泌された培養上清であってもよい。アフィニティータグの具体的態様には、キチン結合タンパク質(chitin binding protein)（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質(maltose binding protein)（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)（ＧＳＴ）が含まれる。ボリ（Ｈｉｓ）タグは、特定の金属キレーティングマトリックスへの結合を容易にする広く用いられているタンパク質タグである。
【００３２】
用語“キメラタンパク質”、“融合タンパク質”または“融合ポリペプチド”はそれぞれ同様に、そのアミノ酸配列が少なくとも２つの別個のタンパク質に由来するアミノ酸配列のサブ配列の融合生成物であるタンパク質を表わす。融合タンパク質は一般にアミノ酸配列の直接操作により製造されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする“キメラ”遺伝子から発現される。
【００３３】
用語“組換え体”は、組換え法によって意図的に修飾されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を表わす。本明細書中で用語“組換え核酸”は、本来、インビトロで、一般にエンドヌクレアーゼによる核酸操作により形成された核酸であって、普通は自然界にみられない形態のものを意味する。よって、線状の単離された変異体ＤＮＡポリメラーゼ核酸、または普通は連結していないＤＮＡ分子をライゲートさせることによりインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも本発明の目的に関して組換え体とみなされる。組換え核酸が作製されて宿主細胞に再導入されると、それは非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなくインビボ細胞機構を使って複製するであろうということは理解される；しかし、そのような核酸は、組換え作製されるとその後は非組換え的に複製するけれども、本発明の目的に関してなお組換え体とみなされる。“組換えタンパク質”または“組換え製造タンパク質”は、組換え法を用いて、すなわち前記の組換え核酸の発現により製造されたタンパク質である。
【００３４】
用語“宿主細胞”は、単細胞性の原核生物および真核生物（たとえば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、および放線菌）と、細胞培養において増殖させたより高等な植物または動物に由来する単一細胞の両方を表わす。
【００３５】
用語“グリコシル化”は、グリコシル残基をアクセプター基に共有結合させる化学反応を意味する。具体的アクセプター基の一つは、ヒドロキシル基、たとえば他の糖のヒドロキシル基である。“シアリル化(sialylation)”は、アクセプター基がシアル酸（＝Ｎ−
アセチルノイラミニン酸）残基と反応する特定の形態のグリコシル化である。そのような反応は一般に、シアリルトランスフェラーゼ酵素により、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸をドナー化合物または補基質として用いて触媒される。
【００３６】
“シアリル化”は、それを可能にする条件下でのグリコシルトランスフェラーゼ酵素活性（特定の場合にはシアリルトランスフェラーゼ酵素活性）の結果の特定の態様である。
一般に、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性が起きうる（＝“グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする”条件下の）水性組成物は、具体的にはｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲、より具体的にはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲に緩衝化できる、よりいっそう具体的には溶液を約ｐＨ６．５に緩衝化できる緩衝塩、たとえばトリス、ＭＥＳ、リン酸塩、酢酸塩、または他の緩衝塩により緩衝化される必要があることを当業者は認識している。緩衝液はさらに中性塩、たとえばＮａＣｌを含有することができるが、これに限定されない。さらに、特定の態様において、当業者は二価カチオン、たとえばＭｇ２＋またはＭｎ２＋を含む塩、たとえばＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２（これらに限定されない）を水性緩衝液に添加することを考慮できる。さらに他の特定の態様において、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする水性組成物は、抗酸化剤および／または界面活性剤を含むことができる。当技術分野で既知の、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件には、周囲（室）温度、より一般的には０℃〜４０℃、特に１０℃〜３０℃の範囲、特に約２０℃の温度が含まれる。前記条件はそのような酵素活性を可能にする一般的条件を示すが、グリコシルトランスフェラーゼ活性はさらに、補基質として、活性化された糖ドナー（たとえば、具体的にはＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）の存在をさらに必要とする。しかし、用語“グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする”は必ずしも補基質の存在を含まないと解釈される。よって、本明細書において用語“グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする”には、本開示の対象である哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼの加水分解（シアリダーゼ）活性、特に５’−シチジン−一リン酸（ＣＭＰ）の存在下での加水分解活性を可能にする条件も含まれる。
【００３７】
用語“グリカン”は、多糖またはオリゴ糖、すなわち酸加水分解すると複数の単糖が得られるマルチマー化合物を表わす。糖タンパク質は１以上のグリカン部分を含み、それらはポリペプチド鎖の側基に一般にアスパラギンもしくはアルギニン（“Ｎ−結合型グリコシル化”）を介して、またはセリンもしくはトレオニンを介して（“Ｏ−結合型グリコシル化”）共有結合している。
【００３８】
複雑なグリカン構造体の酵素合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、複雑な生物活性糖タンパク質を得るための魅力的な方法である。たとえば、Barb et al. Biochemistry 48 (2009) 9705-9707は、単離されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いて、効力の高いシアリル化された形態の免疫グロブリンＧのＦｃフラグメントを製造した。しかし、糖タンパク質の療法適用における関心の高まりは、シアリルトランスフェラーゼを含めたグリコシルトランスフェラーゼの需要の増大をもたらす。糖タンパク質のシアリル化を増大または改変するための種々の方策が、Bork K. et al. J. Pharm. Sci. 98 (2009) 3499-3508により記載された。魅力的な方策は、組換え製造されたタンパク質（たとえば、免疫グロブリンおよび成長因子であるが、これらに限定されない）、特に療法用タンパク質の、インビトロシアリル化である。この目的で、幾つかの研究者グループは、形質転換した生物におけるシアリルトランスフェラーゼの発現、および組換え製造されたシアリルトランスフェラーゼの精製を記載している。原核細胞由来のグリコシルトランスフェラーゼは通常は複雑な糖タンパク質（たとえば、抗体）に対しては作用しないので、哺乳動物由来のシアリルトランスフェラーゼが優先的に研究された。
【００３９】
本明細書の開示内容およびすべての側面ならびに本発明の側面および態様の対象となる具体的な糖タンパク質は、限定ではなく、細胞表面−糖タンパク質および可溶性形態で血清中に存在する糖タンパク質（“血清糖タンパク質”）、特に哺乳動物由来のものである糖タンパク質を含む。“細胞表面−糖タンパク質”は、その一部が膜の表面にあって表面−糖タンパク質のポリペプチド鎖の膜アンカー部分により膜に結合している糖タンパク質であると解釈され、その膜は生物細胞の一部である。細胞表面−糖タンパク質という用語には、単離された形態の細胞表面−糖タンパク質、およびその可溶性フラグメントであって、たとえばタンパク質分解開裂により、またはそのような可溶性フラグメントの組換え製造により、膜アンカー部分から分離されたものも含まれる。“血清糖タンパク質”は、血清中に存在する糖タンパク質、すなわち全血の非細胞部分中に、たとえば細胞性血液成分の沈降後の上清中に存在する血液タンパク質であると解釈される。限定ではなく、特に考慮される具体的な血清糖タンパク質は免疫グロブリンである。本明細書中で述べる特定の免疫グロブリンは、ＩｇＧグループ（ガンマ重鎖を特徴とする）、具体的には４つのＩｇＧサブグループのいずれかに属する。本発明の開示内容、側面および態様について、用語“血清糖タンパク質”にはモノクローナル抗体も含まれる；モノクローナル抗体は当技術分野で技術的に周知であり、たとえばハイブリドーマ細胞により、または形質転換した宿主細胞を用いて組換えにより産生できる。さらなる血清特異的な糖タンパク質は、キャリヤータンパク質、たとえば血清アルブミン、フェツイン(fetuin)、またはフェツインがメンバーであるヒスチジンリッチ糖タンパク質のスーパーファミリーの他の糖タンパク質メンバーである。さらに、限定ではなく、本発明のすべての開示内容、側面および態様に関して特に考慮される具体的な血清糖タンパク質は、グリコシル化されたタンパク質シグナル伝達分子である。このグループの具体的な分子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）である。
【００４０】
糖タンパク質のインビトロ工学操作のために、グリコシルトランスフェラーゼを効果的なツールとして使用できる(Weijers 2008)。哺乳動物由来のグリコシルトランスフェラーゼは基質としての糖タンパク質と適合し、これに対し細菌性グリコシルトランスフェラーゼは通常はより簡単なオリゴ糖のような基質を修飾する。そのため、糖タンパク質のグリカン部分における合成による変更は、有利には哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを好ましいツールとして用いて行なわれる。しかし、糖工学操作にグリコシルトランスフェラーゼを大規模適用するためには、適切な酵素を多量に（すなわち、工業的量で）入手できることが要求される。本発明の開示は、特に下記を備えたタンパク質を提供する：（ｉ）ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉシアリルトランスフェラーゼ活性、および（ｉｉ）１以上のアクセス可能なガラクトシル基質部分をもつターゲット糖タンパク質の定量的に制御されたインビトロシアリル化に使用できるシアリダーゼ活性。
【００４１】
重要なことに、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフは、この酵素がシアリダーゼ活性を示すことができるために必要である。同時に、このアミノ
酸モチーフは、この酵素が５’−ＣＭＰと相互作用するために必要である。きわめて顕著に、位置１から位置１０８までの連続Ｎ末端範囲のアミノ酸を欠如したトランケーション欠失変異体である可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩバリアントは、ＣＭＰの存在下ですらシアリダーゼ活性を示さない。よって、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩにおいてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフはこれらの特性が存在するために必須であると結論された。
【００４２】
シアリダーゼ活性で処理するのに適したターゲットには、一方ではアシアロ糖タンパク質、すなわちシアル酸残基がシアリダーゼの作用により除去されている糖タンパク質が含まれる。他方で、ビ−シアリル化された糖タンパク質をシアリダーゼ活性の基質として使用できる。きわめて有利には、アシアロ−、モノ−シアリル化、およびビ−シアリル化免疫グロブリン、特にＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、特異的基質である。
【００４３】
野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉをメトロトローフ酵母ピキア・パストリスにおいて発現させ、発現したポリペプチドを宿主生物の分泌経路へターゲティングさせた際に、組換え産生されたｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの種々のトランケート型バリアントがみられた。一般に、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ由来のタンパク質をクロマトグラフィー精製し、特に質量分析により、またＮ末端からアミノ酸配列を決定することにより（エドマン分解(Edman degradation)）分析した。これらの手段により、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのトランケーション、特にＮ末端トランケーションが詳細に解明された。
【００４４】
幾つかの顕著なトランケーションバリアントが、形質転換したピキア・パストリスの上清中に同定された。これらのバリアントは、おそらく酵母細胞からの分泌に際して部位特異的タンパク質分解開裂から生じたか、あるいは培養したピキア属株の上清中に存在する１以上の細胞外プロテアーゼによるエンドプロテオリシス開裂(endoproteolytic cleavage)から生じた可能性がある。
【００４５】
同定した各トランケーションバリアントに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による野生型ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩポリペプチドのＮ末端からカウントして各トランケーション欠失の最後のアミノ酸位置の番号を指示する“デルタ”（＝“△”）表示を付与した。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの特定のＮ末端トランケーションバリアント△８９および△１０８を組換え発現させ、より詳細に調べた。
【００４６】
原核細胞、たとえば大腸菌およびバチルス属種(Bacillus sp.)、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス、ならびに哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞およびＨＥＫ細胞を含めた種々の宿主生物においてｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ野生型タンパク質ならびに△８９および△１０８トランケーションバリアントを発現させるための発現ベクターを構築した。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの△８９および△１０８トランケーションバリアントのための発現構築体を含むベクターを分子的に組み立て、それによりヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの△８９バリアントを幾つかの形質転換した宿主生物において組換え製造する手段を得た。組換え発現した酵素の精製を容易にするために、これらの構築体がコードするコードされたトランケーションポリペプチドは、特定の態様において場合によりＮ末端Ｈｉｓ−タグを含んでいた。
【００４７】
本明細書に開示する他のすべての側面のうちある側面および特定の態様は、糖タンパク質中のグリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒することができるバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼである。特に、このバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質グリカンのＮ−アセ
チルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の形成を触媒し、それにより遊離Ｎ−アセチルノイラミニン酸を生成することができる。本明細書に開示するすべての側面のうち特定の態様において、このバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩを開示するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性酵素である。本明細書に開示する教示には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む相同シアリルトランスフェラーゼが含まれる。
【００４８】
本明細書に開示するすべての側面のうち特定の態様において、α２，６グリコシド結合の加水分解を触媒することができるバリアントである哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩからアミノ酸欠失により誘導された哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼであり、その配列がＮ末端からの欠失によりトランケートされる。本明細書に開示するすべての側面のうちさらなる特定の態様において、Ｎ末端からのトランケーション欠失は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１−位置８９の連続配列である。
【００４９】
本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、本明細書に開示するいずれかの態様によるバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼのポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。融合タンパク質または融合ポリペプチドは、２以上のポリペプチドのアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドである。それらの２以上のポリペプチドは相補的機能をもつことができ、それらのポリペプチドのうち１つは補足的機能特性を提供してもよく、あるいはそれらのポリペプチドのうち１つは融合ポリペプチド中の他のものと無関係な機能をもっていてもよい。オルガネラターゲティング配列または保持配列を含む１以上のポリペプチドを目的ポリペプチドと融合させて、その目的ポリペプチドを特定の細胞オルガネラにターゲティングさせ、あるいは目的ポリペプチドを細胞内に保持させることができる。融合ポリペプチドの発現、精製および／または検出を補助するキャリヤー配列を含む１以上のポリペプチドを目的ポリペプチドと融合させることができる（たとえば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃタグ、６×Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ融合体など）。特定の融合パートナーは、その融合ポリペプチドを発現させる宿主生物の分泌経路へその融合ポリペプチドのバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ部分を指向させることができるＮ末端リーダーペプチドを含む。それにより、細胞外間隙および周囲培地への分泌が促進される。なお、本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、本明細書に開示するいずれかの態様によるバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードする、または本明細書に開示するいずれかの態様によるバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを一部として含む融合ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列である。重要なことに、ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までの配列、またはヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩに対して相同なシアリルトランスフェラーゼの場合にはその相同均等物を含む。
【００５０】
なお、本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、発現ベクターであり、それはターゲット遺伝子、およびその発現ベクターで形質転換した宿主生物におけるターゲット遺伝子の発現を促進する配列を含み、その際、ターゲット遺伝子は本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
なお、本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、形質転換した宿主生物であり、その際、宿主生物は本明細書に開示する発現ベクターで形質転換されている。特に有利には、ヒト胎児腎２９３(Human Embryonic Kidney 293 （ＨＥＫ）)細胞を用いて本明細書に開示する方法を実施することができる。これらの細
胞の格別な利点は、それらがトランスフェクション、それに続く培養およびターゲット遺伝子の一過性発現にきわめて好適なターゲットであるということである。よって、ターゲットタンパク質を組換え発現により産生させるためにＨＥＫ細胞を効果的に使用できる。著しく有利には、翻訳生成物を分泌経路へ指向させるように発現構築体を設計して、本明細書に開示するバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼまたは融合ポリペプチドを分泌させる。それでもなお、ジャーカット(Jurkat)、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳおよびチャイニーズハムスター卵巣(Chinese Hamster Ovary)（ＣＨＯ）細胞は周知の代替細胞であり、形質転換および本明細書に開示するすべての側面の特定の態様のための代替宿主生物として含まれる。
【００５２】
なお、本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、バリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを組換え製造するための方法であり、その方法は、発現ベクターで形質転換した宿主生物において本明細書に開示するバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を発現させる工程を含み、その際、ポリペプチドが形成され、それによりバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼが製造される。
【００５３】
従来の知識によれば、グリコシルトランスフェラーゼのＮ末端トランケート型バリアントは、それらが膜貫通ドメインを欠如するため、インビトロで有利に使用される。よって、そのようなバリアントは溶液中でグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒および実施するために有用である。意外にも特にＮ末端トランケート型バリアント△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉがインビトロで、たとえばグリコシル化された抗体と共に５’−ＣＭＰの存在下でインキュベートした際に、種々の活性を示すことを見出して本明細書に開示する。よって、本開示の特定の態様ならびに本発明のすべての側面および態様は、ビ−シアリル化された糖タンパク質、すなわち２つの別個の末端Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を糖タンパク質の１以上のグリカン部分に含む糖タンパク質の、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒することができる、バリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼである。特定の態様において、１つのα２，６グリコシド結合のみが加水分解される。さらなる特定の態様において、ビ−シアリル化された糖タンパク質はビ−シアリル化されたＩｇＧ免疫グロブリンである。
【００５４】
代表例として、ＩｇＧ−ＦｃグリカンＧ２はアンテナ付き(antennate)分枝の末端に２
つのガラクトース部分をもち、それらをシアリル化することができる。適切な反応条件下で、Ｎ末端トランケート型バリアント△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉは、免疫グロブリンＦｃ部分にビ−シアリル化されたＧ２グリカン（Ｇ２＋２ＳＡ）をもつＩｇＧの合成を触媒する。しかし、５’−ＣＭＰが蓄積すると、この酵素バリアントは、ビ−シアリル化された（Ｇ２＋２ＳＡ）抗体から加水分解によりシアル酸部分を除去するシアリダーゼとして作用し、モノ−シアリル化された（Ｇ２＋１ＳＡ）抗体を生成する。この特性は予想外に見出され、固有のシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）活性であると思われる。
【００５５】
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉについての基礎的刊行物には、この酵素はいかなるシアリダーゼ活性も含まないと述べられている；参照：Sticher et al. Glycoconjugate Journal 8 (1991) 45-54。本発明の意外な知見からみて、同じ酵素を用い、シアリル化反応混合物中のＣＭＰを制御することによりその酵素の反応速度を制御して、モノ−、ビ−またはより高度にシアリル化されたグリカンをもつ糖タンパク質を優先的に合成することが可能になる。さらなる利点は、両方の活性、すなわちシアリル化活性とシアリダーゼ活性が同じ酵素により同じ反応器において得られることである。
【００５６】
しかし、本開示に述べる全般的知見は、糖タンパク質中のグリカンのＮ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分のα２，６グリコシド結合の加水分解を触媒することができるバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、具体的には本開示によるグリコシルトランスフェラーゼが存在するということである。既知のシアリルトランスフェラーゼ（シアリル化）活性に加えて、意外な知見は、少なくともＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をもつＮ末端トランケート型ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩについて具体的に示すように、この酵素により触媒される一般的なシアリルトランスフェラーゼ活性だけでなくシアリダーゼの酵素活性があるということであった。興味深いことに、代表例においてこれら２つの活性は同時にはみられなかった；それによって予想外の知見を部分的に説明できる。よって、ＣＭＰの非存在下で初期にはシアリルトランスフェラーゼ活性が優性であり、シアリダーゼ活性はインキュベーション中の後期に、十分な量のＣＭＰが蓄積した時点で初めて明らかになる。それでもなお、同じ酵素の２つの別個の活性を明らかに認識することによって、たとえばインキュベーション時間の変更によりターゲット分子のシアリル化度を制御することができる。
【００５７】
しかし、きわめて洗練された方法で、シアリルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素をシアリル化反応混合物に添加することによりシアリル化を最大限にすることができる。こうして副産物ＣＭＰは除かれ、シアリルトランスフェラーゼによるシアリル化触媒作用が拮抗されることはない。
【００５８】
なお、本明細書に開示する他のすべての側面のうちもうひとつの側面および特定の態様は、本明細書に開示するバリアント哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼ、具体的にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をもつＮ末端トランケート型ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのグリコシルトランスフェラーゼ活性を維持するための、および／またはシアリダーゼ活性を阻害するための、シアリルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解することができる酵素の使用である。
【００５９】
そのような制御されたシアリル化は、目的とするシアリル化度をもつモノ−、ビ−、およびより高度にシアリル化された糖タンパク質をインビトロで合成するための新規手段として提供される。よって、ＩｇＧ分子について目的とする技術的効果を示すことにより例示するが、本明細書の開示内容に従った使用により他の糖タンパク質を同様な方法で処理することもできる；ただし、グリコシルトランスフェラーゼ活性に関して、糖タンパク質は２以上の末端アンテナ付きβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を含む。同じ論法が糖脂質にも当てはまる。
【００６０】
具体例において、組換えヒト化ＩｇＧ１およびＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍａｂ）、すなわちＧ２＋０ＳＡ（＝２つのアクセプター部位が存在し、いずれのアクセプター部位においてもシアリル化されていない）を特徴とするもの、ならびにＥＰＯ（＝エリスロポエチン）をシアリル化実験（３０μｇの酵素／３００μｇのターゲットタンパク質）におけるターゲットとして用いた。△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを標準的な反応条件下で用い、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡ（＝モノ−シアリル化，２つのうち１つのアクセプター部位がシアリル化されたもの）およびＧ２＋２ＳＡ（＝ビ−シアリル化，両方のアクセプター部位がシアリル化されたもの）状態を質量分析により分析した。
【００６１】
高い発現速度および効率的な精製法であるため、代表的△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉも機能均等な酵素も多量に高純度で入手できる。バリアント△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素は高分子量基質について活性であり、モノクローナル抗体はそれらのうちの一例にすぎ
ない。インキュベーション時間に応じて、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩをＣＭＰ加水分解酵素と組み合わせたものは、２アンテナ型(bi-antennary)グリカンをもつモノクローナル抗体を基質として用いるシアリル化実験において良好な性能を示す。本開示の態様を用いて、比較的短いインキュベーション期間、たとえば８時間後に、好ましいビ−シアリル化されたグリカンが著しく有利に得られる。４アンテナ型(tetra-antennary)グリカンも基
質として受け入れられる（データを示していない）。これらの結果は、療法用抗体のインビトロ糖工学操作のための技術的利点を立証する。
【００６２】
下記の項目は本明細書に提示する教示を実施するための本開示の特定の側面および特定の態様をさらに提示する。
１．  ５’−シチジン−一リン酸の存在下で、Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分、すなわちシアリル化された糖タンパク質または糖脂質中のグリカンの末端構造である部分におけるα２，６グリコシド結合をインビトロ加水分解するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用。
【００６３】
２．  可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置４０６までのアミノ酸を含む、項目１に記載の使用。
【００６４】
３．  可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列である、項目１および２に記載の使用。
４．  糖タンパク質が、細胞表面−糖タンパク質および血清−糖タンパク質からなる群から選択される、項目１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【００６５】
５．  血清−糖タンパク質が、グリコシル化されたタンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化された免疫グロブリン、およびグリコシル化されたウイルス由来のタンパク質から選択される、項目４に記載の使用。
【００６６】
６．  糖タンパク質が組換え製造される、項目１〜５のいずれか１項に記載の使用。
７．  糖タンパク質が哺乳動物由来の形質転換された宿主細胞において組換え製造される、項目６に記載の使用。
【００６７】
８．  糖タンパク質がヒト由来の免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンであり、その免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、項目１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【００６８】
９．  糖タンパク質が、ＥＰＯおよびアシアロフェツインから選択される、項目１〜７のいずれか１項に記載の使用。
１０．
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ；
（ｂ）シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物；
（ｃ）糖タンパク質および糖脂質から選択されるグリコシル化されたターゲット分子；ターゲット分子は１以上のアンテナを含み、少なくとも１つのアンテナは末端構造としてガラクトシル残基のＣ６位にヒドロキシル基をもつβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有する；
（ｄ）グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする水溶液
を含む水性組成物であって、
さらに、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素を含む水性組成物。
【００６９】
１１．  可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置４０６までのアミノ酸を含む、項目１０に記載の水性組成物。
【００７０】
１２．  可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列である、項目１０および１１に記載の水性組成物。
【００７１】
１３．  グリコシル化されたターゲット分子が、細胞表面−糖タンパク質および血清−糖タンパク質からなる群から選択される、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００７２】
１４．  血清−糖タンパク質が、グリコシル化されたタンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化された免疫グロブリン、およびグリコシル化されたウイルス由来のタンパク質から選択される、項目１０〜１３のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００７３】
１５．  糖タンパク質が組換え製造される、項目１０〜１４のいずれか１項に記載の水性組成物。
１６．  糖タンパク質が哺乳動物由来の形質転換された宿主細胞において組換え製造される、項目１５に記載の水性組成物。
【００７４】
１７．  糖タンパク質がヒト由来の免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンであり、その免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、項目１０〜１６のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００７５】
１８．  糖タンパク質が、ＥＰＯおよびアシアロフェツインから選択される、項目１０〜１６のいずれか１項に記載の水性組成物。
１９．  水溶液が、水、ｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲に緩衝化できる緩衝塩、ならびに場合により中性塩、二価カチオンを含む塩、抗酸化剤、界面活性剤、およびその混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目１０〜１８のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００７６】
２０．  組成物が０〜４０℃の温度を有する、項目１０〜１９のいずれか１項に記載の水性組成物。
２１．  ５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素が、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、および５’ヌクレオチダーゼからなる群から選択される、項目１０〜２０のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００７７】
２２．  アルカリホスファターゼが、細菌由来のアルカリホスファターゼ、エビ−アルカリホスファターゼ、子ウシ腸アルカリホスファターゼ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、およびその混合物からなる群から選択される、項目２１に記載の水性組成物。
【００７８】
２３．  水性組成物がさらにＺｎ２＋イオンを含む、項目２２に記載の水性組成物。
２４．  ５’ヌクレオチダーゼが、哺乳動物由来の、特にヒト由来の５’ヌクレオチダーゼＣＤ７３である、項目２１に記載の水性組成物。
【００７９】
２５．  ５’−シチジン-一リン酸仲介による阻害を低減し、それによりＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのシアリル化活性を維持するための、項目１０〜２４のいずれか１項に記載の水性組成物の使用。
【００８０】
２６．  シアリル化活性が、補基質からガラクトシル残基のＣ６位置にヒドロキシル基をもつβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分へのシアル酸残基またはその機能均等物の伝達および共有結合を触媒し、その部分は糖タンパク質および糖脂質から選択されるグリコシル化されたターゲット分子のグリカンの末端構造である、項目２５に記載の使用。
【００８１】
２７．  シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法であって、
（ａ）項目１０〜２４のいずれか１項に記載の水性組成物を用意する；
（ｂ）工程（ａ）の水性組成物をインキュベートし、それによりシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物を補基質として反応させることにより、１以上の末端アンテナ形Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それにより５’−シチジン−一リン酸が形成される；
（ｃ）工程（ｂ）で形成された５’−シチジン−一リン酸のホスホエステル結合を加水分解し、それにより５’−シチジン−一リン酸仲介による阻害を低減し、それにより可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの活性を維持する；
工程を含み、
それにより、シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法。
【００８２】
２８．  その方法を０℃〜４０℃の温度で実施する、項目２７に記載の方法。
２９．  工程（ｂ）と（ｃ）を同じ容器内で実施する、項目２７および２８に記載の方法。
【００８３】
３０．  工程（ｂ）および（ｃ）を、２時間〜９６時間、２時間〜２３時間、２時間〜６時間、および約２時間からなる群から選択される期間実施する、項目２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【００８４】
３１．  工程（ｂ）および（ｃ）を、６時間〜９６時間、６時間〜２３時間、および約６時間からなる群から選択される期間実施する、項目２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【００８５】
３２．  工程（ｂ）および（ｃ）を、２３時間〜９６時間、および約２３時間からなる群から選択される期間実施する、項目２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
３３．  工程（ｂ）および（ｃ）を約９６時間実施する、項目５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【００８６】
３４．  インビトロで５’−シチジン−一リン酸の存在下に、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸から、またはその機能均等物から、アクセプター、すなわち糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分中の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであるアクセプターへ、５−Ｎ−アセチルノイラミニン酸残基を伝達するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを欠如する可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用。
【００８７】
３５．  可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１０９から位置４０６までのアミノ酸を含む、項目３４に記載の使用。
【００８８】
３６．  可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列である、項目３４および３５に記載の使用。
【００８９】
３７．  糖タンパク質が、細胞表面−糖タンパク質および血清−糖タンパク質からなる群から選択される、項目３４〜３６のいずれか１項に記載の使用。
３８．  血清−糖タンパク質が、グリコシル化されたタンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化された免疫グロブリン、およびグリコシル化されたウイルス由来のタンパク質から選択される、項目３７に記載の使用。
【００９０】
３９．  糖タンパク質が組換え製造される、項目３４〜３８のいずれか１項に記載の使用。
４０．  糖タンパク質が哺乳動物由来の形質転換された宿主細胞において組換え製造される、項目３９に記載の使用。
【００９１】
４１．  糖タンパク質がヒト由来の免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンであり、その免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、項目３４〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【００９２】
４２．  糖タンパク質が、ＥＰＯおよびアシアロフェツインから選択される、項目３４〜４０のいずれか１項に記載の使用。
４３．
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを含む可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ；
（ｂ）シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物；
（ｃ）糖タンパク質および糖脂質から選択されるグリコシル化されたターゲット分子；ターゲット分子は１以上のアンテナを含み、少なくとも１つのアンテナは末端構造としてガラクトシル残基のＣ６位にヒドロキシル基をもつβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン部分を有する；
（ｄ）グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする水溶液
を含む水性組成物であって、
さらに、グリコシルトランスフェラーゼ酵素活性を可能にする条件下で５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素を含む水性組成物。
【００９３】
４４．  可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１０９から位置４０６までのアミノ酸を含む、項目４３に記載の水性組成物。
【００９４】
４５．  可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列である、項目４３および４４に記載の水性組成物。
【００９５】
４６．  グリコシル化されたターゲット分子が、細胞表面−糖タンパク質および血清−糖タンパク質からなる群から選択される、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００９６】
４７．  血清−糖タンパク質が、グリコシル化されたタンパク質シグナル伝達分子、グリコシル化された免疫グロブリン、およびグリコシル化されたウイルス由来のタンパク質から選択される、項目４３〜４６のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００９７】
４８．  糖タンパク質が組換え製造される、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の水性組成物。
４９．  糖タンパク質が哺乳動物由来の形質転換された宿主細胞において組換え製造される、項目４８に記載の水性組成物。
【００９８】
５０．  糖タンパク質がヒト由来の免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンであり、その免疫グロブリンがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、項目４３〜４９のいずれか１項に記載の水性組成物。
【００９９】
５１．  糖タンパク質が、ＥＰＯおよびアシアロフェツインから選択される、項目４３〜４９のいずれか１項に記載の水性組成物。
５２．  水溶液が、水、ｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲に緩衝化できる緩衝塩、ならびに場合により中性塩、二価カチオンを含む塩、抗酸化剤、界面活性剤、およびその混合物からなる群から選択される化合物を含む、項目４３〜５１のいずれか１項に記載の水性組成物。
【０１００】
５３．  組成物が０〜４０℃の温度を有する、項目４３〜５２のいずれか１項に記載の水性組成物。
５４．  シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法であって、
（ａ）項目４３〜５３のいずれか１項に記載の水性組成物を用意する；
（ｂ）工程（ａ）の水性組成物をインキュベートし、それによりシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸またはその機能均等物を補基質として反応させることにより、１以上の末端アンテナ形Ｎ−アセチルノイラミニル−α２，６−β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基を形成し、それにより５’−シチジン−一リン酸が形成される；
（ｃ）工程（ｂ）で形成された５’−シチジン−一リン酸を蓄積させる；
工程を含み、
それにより、シアリル化されたターゲット分子をインビトロで製造する方法。
【０１０１】
５５．  その方法を０℃〜４０℃の温度で実施する、項目５４に記載の方法。
５６．  工程（ｂ）と（ｃ）を同じ容器内で実施する、項目５４および５５に記載の方法。
【０１０２】
５７．  工程（ｂ）および（ｃ）を、２時間〜７２時間からなる群から選択される期間実施する、項目５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
５８．  項目１０〜２４のいずれか１項に記載の組成物におけるシアリルトランスフェラーゼ酵素活性を維持するための、５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素の使用。
【０１０３】
５９．  項目１０〜２４のいずれか１項に記載の組成物におけるシアリダーゼ酵素活性を阻害するための、５’−シチジン−一リン酸中のホスホエステル結合を加水分解できる酵素の使用。
【０１０４】
６０．  シアリル化された免疫グロブリンの調製物であって、それぞれの免疫グロブリンはヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩに対する複数の
アクセプター部位を有し、その際、シアリル化された免疫グロブリンの調製物中のアクセプター部位の２５％未満がシアリル化されておらず、７５％以上がシアリル化されている、項目２７〜３３のいずれか１項に記載の方法に従って得られる調製物。
【０１０５】
６１．  シアリル化された免疫グロブリンの調製物中のアクセプター部位の２０％未満がシアリル化されておらず、８０％以上がシアリル化されている、項目６０に記載の調製物。
【０１０６】
６２．  シアリル化された免疫グロブリンの調製物中のアクセプター部位の１０％未満がシアリル化されておらず、９０％以上がシアリル化されている、項目６０に記載の調製物。
【０１０７】
以下の実施例は本開示の特定の態様およびその使用の具体例である。それらを説明の目的で述べるにすぎず、本開示を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
シアリルトランスフェラーゼ酵素活性についての試験
アシアロフェツイン（脱シアリル化されたフェツイン，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）をアクセプターとして用い、ＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡ（ＣＭＰ−９−フルオレセイニル−ＮｅｕＡｃ）をドナー基質として用いた(Brossmer, R. & Gross H. J. (1994) Meth. Enzymol. 247, 177-193)。ドナー化合物からアシアロフェツインへのシアル酸の伝達を測定することにより、シアリルトランスフェラーゼの酵素活性を決定した。反応ミックス（３５ｍＭのＭＥＳ，ｐＨ６．０，０．０３５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０７％のＢＳＡ）は、２．５μｇの酵素試料、５μＬのアシアロフェツイン（２０ｍｇ／ｍＬ）および２μＬのＣＭＰ−９−フルオロ−ＮＡＮＡ（１．０ｍｇ／ｍＬ）を、５１μＬの総体積中に含有していた。反応ミックスを３７℃で３０分間、インキュベートした。１０μＬの阻害物質ＣＴＰ（１０ｍＭ）の添加により反応を停止した。反応ミックスを、０．１Ｍトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．５で平衡化したＰＤ１０脱塩用カラムに装填した。平衡化用緩衝液を用いてフェツインをカラムから溶離した。画分サイズは１ｍＬであった。形成されたフェツインの濃度を蛍光分光光度計により決定した。励起波長は４９０ｎｍであり、発光を５２０ｎｍで測定した。酵素活性をＲＦＵ(relative fluorescence unit（相対蛍光単位））として表示した。１０，０００ＲＦＵ／μｇは０．０８３９ｎｍｏｌ／μｇ×分の比活性に等しい。
【０１０９】
実施例２
ＳＤＳゲル電気泳動
ＮｕＰＡＧＥゲル（４〜１２％，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分析用ＳＤＳゲル電気泳動を実施した。試料（３６μＬ）を１２μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、８５℃で２分間、インキュベートした。一般に５μｇのタンパク質を含有するアリコートをゲルに装填した。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてゲルを染色した。
【０１１０】
実施例３
エドマン分解によるＮ末端シーケンシング
発現したヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのバリアントのＮ末端配列を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した試薬およびデバイスを用いるエドマン分解により分析した。試料の調製を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＰｒｏＳｏｒｂ試料調製カートリッジ（カタログ番号４０１９５０）およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＰｒｏＢｌｏｔｔ  Ｍｉｎｉ  ＰＫ／１０メンブレン（カタログ番号０１１９４）の指示マニュア
ルの記載に従って行なった。シーケンシングのためにＰｒｏｃｉｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを用いた。
【０１１１】
実施例４
グリコシル化されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
ＨＥＫ細胞において発現したヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのバリアントの分子質量を分析した。グリコシル化された形態のヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉが産生され、産生された物質をＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）ならびにＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１ソフトウェアを用いて分析した。質量分析測定のために、試料をエレクトロスプレー媒体（２０％アセトニトリル＋１％ギ酸）中で緩衝化した。ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）  Ｇ−２５カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による緩衝液交換を行なった。濃度１ｍｇ／ｍＬのシアリルトランスフェラーゼバリアント２０μｇを予備平衡化したカラムに適用し、遠心により溶離した。得られた溶出液をエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析した。
【０１１２】
実施例５
脱グリコシル化されたヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素の質量分析
ＨＥＫ細胞において発現したヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのバリアントの分子質量を分析した。脱グリコシル化された形態のヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）ならびにＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１ソフトウェアを用いて分析した。
脱グリコシル化のために、シアリルトランスフェラーゼの試料を変性および還元した。１００μｇのシアリルトランスフェラーゼに４５μＬの変性用緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジニウム）および１３μＬのＴＣＥＰ（＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；０．１ｍＭ，変性用緩衝液中に希釈）を添加した。さらに、塩酸グアニジニウムの全濃度が約４Ｍになるように、適宜な体積の超純水を添加した。試料を３７℃で１時間インキュベートした後、超純水で予備平衡化したＢｉｏ−ＳｐｉｎＲ  ６トリスカラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて緩衝液を交換した。全試料をカラムに適用し、遠心により溶離した。得られた溶出液に０．１Ｕ／μＬのＰＮＧａｓｅ−Ｆ溶液５．５μＬを添加し、３７℃で一夜インキュベートした。その後、試料を３０％のＡＣＮ（＝アセトニトリル）および１％のＦＡ（＝ホルムアミド）に調整し、エレクトロスプレーイオン化質量分析により分析した。
【０１１３】
実施例６
哺乳動物宿主細胞におけるヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのトランケート型バリアント△８９の一過性発現のためのｐＭ１ＭＴ発現構築体のクローニング
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのトランケート型バリアント△８９を、一過性発現のためにエリスロポエチンシグナルペプチド配列（Ｅｐｏ）および２アミノ酸（“ＡＰ”）のペプチドスペーサーを用いてクローニングした。Ｅｐｏ−ＡＰ−△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築体のためにコドン最適化ｃＤＮＡを合成した；参照：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３。ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード領域には、天然リーダー配列およびＮ末端タンパク質配列の代わりに、宿主細胞系の分泌機構による発現ポリペプチドの適正プロセシングを確実にするためのエリスロポエチンシグナル配列プラスＡＰリンカー配列がある。さらに、発現カセットは、予備消化したｐＭ１ＭＴベクターフラグメント（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の多重クローニング部位へのクローニングのためのＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を備えている。したがって、ＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期(immediate-early)エンハンサー／プロモーター領域、続
いて調節発現のための“イントロンＡ”、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルの制御下にある。ＨＥＫ細胞におけるＥｐｏ−ＡＰ−△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築体の発現、および細胞上清中への△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質の分泌は、実施例８の記載に従って実施された。
【０１１４】
実施例７
哺乳動物宿主細胞におけるヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのトランケート型バリアント△１０８の一過性発現のためのｐＭ１ＭＴ発現構築体のクローニング
ヒトＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのトランケート型バリアント△１０８を、一過性発現のためにエリスロポエチンシグナルペプチド配列（Ｅｐｏ）および４アミノ酸（“ＡＰＰＲ”）のペプチドスペーサーを用いてクローニングした。Ｅｐｏ−ＡＰＰＲ−△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築体のためにコドン最適化ｃＤＮＡを合成した；参照：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６。天然ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ由来のｍＲＮＡリーダーおよびＮ末端タンパク質配列を、ＨＥＫ宿主細胞系の分泌機構によるポリペプチドの適正プロセシングを確実にするためにエリスロポエチンシグナル配列および“ＡＰＰＲ”リンカー配列で交換した。さらに、発現カセットは、予備消化したｐＭ１ＭＴベクターフラグメント（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の多重クローニング部位へのクローニングのためのＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をもつ。それにより、ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉコード配列の発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期エンハンサー／プロモーター領域の制御下に置かれた；発現ベクターはさらに調節発現のための“イントロンＡ”、およびＢＧＨポリアデニル化シグナルを備えている。ＨＥＫ細胞におけるＥｐｏ−ＡＰＰＲ−△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ構築体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の発現、および細胞上清中への△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉタンパク質の分泌は、実施例８の記載に従って実施された。
【０１１５】
実施例８
ＨＥＫ細胞の形質転換ならびに一過性発現および分泌
プラスミドＤＮＡのトランスフェクションによる一過性遺伝子発現(transient gene expression)（ＴＧＥ）は、哺乳動物細胞培養においてタンパク質を製造するための迅速な方策である。組換え体ヒトタンパク質の高レベル発現のために、懸濁適応させたヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞系をベースとするＴＧＥプラットホームを用いた。細胞をシェーカーフラスコ内において３７℃で無血清培地条件下に培養した。約２×１０６ｖｃ／ｍＬの細胞に、２９３−Ｆｒｅｅ（商標）  （Ｍｅｒｃｋ）トランスフェクション試薬により複合体形成したｐＭ１ＭＴ発現プラスミド（０．５〜１ｍｇ／Ｌ  細胞培養物）を製造業者のガイドラインに従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの３時間後、発現を増強するために、バルプロ酸(valproic acid)、すなわちＨＤＡＣ阻害物質を添加した（最終濃度４ｍＭ）(Backliwal et al. (2008), Nucleic Acids Research 36, e96)。毎日、培養物に６％（ｖ／ｖ）のダイズペプトン水解物ベースの供給物を補足した。培養上清をトランスフェクション後７日目に遠心により採集した。
【０１１６】
実施例９
形質転換したＨＥＫ細胞の上清からのヒトＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＮ末端トランケーションバリアントの精製
ＨＥＫ細胞を実施例８の記載に従って形質転換した。発現構築体を実施例６および７に従って作製した。
簡略化した精製プロトコルを用いて、ＨＥＫ細胞発酵の上清から２種類のバリアントＥｐｏ−ＡＰ−△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩおよびＥｐｏ−ＡＰＰＲ−△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを精製した。第１工程で、体積０．１Ｌの培養上清を濾過し（０．２μｍ）、溶液を緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．５）に対して透析した。透析物を、緩衝液Ａで平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）  ｆｆ(Fast Flow)カラム（１．６
ｃｍ×２ｃｍ）に装填した。１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した後、１０ｍＬの緩衝液Ａお
よび２００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＬの緩衝液Ａの直線勾配で酵素を溶離し、続いて２００ｍＭのＮａＣｌを含む４８ｍＬの緩衝液Ａを用いる洗浄工程を行なった。画分（４ｍＬ）を分析用ＳＤＳゲル電気泳動により分析した。
△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素を含有する画分をプールし、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．０）に対して透析した。透析したプールを、緩衝液Ｂで平衡化したＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆｆカラム（０．５ｃｍ×５ｃｍ）に装填し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ｂを用いて溶離した。酵素を含有する画分（１ｍＬ）をプールし、緩衝液Ｂに対して透析した。タンパク質濃度を２８０ｎｍ（Ｅ２８０ｎｍ［１ｍｇ／ｍＬ］＝１．９３１）で測定した。質量分析は、組換え発現したＥｐｏ−ＡＰ−△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素がＮ末端アミノ酸ＡＰを含まずに分泌されたことを示した。この所見は予想外であり、発現したタンパク質のＥｐｏ部分が除去された状態の、シグナルペプチダーゼによる異例な開裂を指摘した。組換え体ヒト△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素について、３．７５ｎｍｏｌ／μｇ×分の比活性が決定された。図２は、ＨＥＫ細胞から精製した組換え体△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素を含有する画分をプールし、貯蔵緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム，１００ｍＭの塩化ナトリウム，ｐＨ６．５）に対して透析した。２８０ｎｍの波長でモル吸光係数１．８７１を用いてタンパク質濃度を決定した。Ｅｐｏ−ＡＰＰＲ−△１０８−ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ発現構築体で形質転換したＨＥＫ細胞から分泌された組換えタンパク質の質量分析により、Ｎ末端配列“ＡＰＰＲ”が確認され、こうしてシグナルペプチダーゼによる予想したＥＰＯシグナル配列の開裂が示された。ＨＥＫ細胞からの組換え体ヒト△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉバリアントについて、＞６００ＲＦＵ／μｇの比活性が決定された。図３は、ＨＥＫ細胞から精製した組換え体△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１１７】
実施例１０
△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いるヒト化モノクローナル抗体ＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化
高度にガラクトシル化されたヒト化モノクローナル抗体ＩｇＧ４  ＭＡＢをシアリル化実験に用いた。反応混合物は、ＩｇＧ４  ＭＡＢ（３００μｇ；５５μＬの３５ｍＭ酢酸ナトリウム／トリス緩衝液，ｐＨ７．０中）、ドナー基質ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（１５０μｇ；５０μＬの水中）およびシアリルトランスフェラーゼ（３０μｇの△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；２０ｍＭのリン酸カリウム、０．１ＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．５  中）を含有していた。試料を３７℃で一定時間インキュベートした。反応を停止するために、試料を−２０℃で凍結した。質量分析のために、１００μＬの変性用緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム）および３０μＬのＴＣＥＰ（＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；０．１ｍＭの変性用緩衝液中に希釈）を試料に添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。予備平衡化したｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）  Ｎａｐ５−カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、試料をエレクトロスプレー媒体［２０％のＡＣＮ（＝アセトニトリル），１％のＦＡ（＝ホルムアミド）］中に緩衝化した。試料をエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析し、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡ  Ｎ−グリカンの含量を決定した。Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆ  ＵｌｔｉｍａおよびＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）を用い、使用したソフトウェアはＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１であった。シアリル化の反応速度を決定するために、反応物を最大７２時間インキュベートした。図４は、インキュベーション期間の異なる時点で得られた異なる状態にシアリル化されたターゲットタンパク質の相対量を示す。
Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡの含量を、質量分析により決定した。バリアント△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉについては、２時間のインキュベーション後に既に高含量（８８％）のビ−シアリル化された形態のＧ２＋２ＳＡが得られた。参照：図４。このデータは、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの固有のＣＭＰ−依存性シアリダーゼ（ノイ
ラミニダーゼ）活性のためＧ２＋０ＳＡおよびＧ２＋１ＳＡが経時的に再び増加したことをも示す。４８時間のインキュベーション後、７１％のＧ２＋１ＳＡ含量が得られた。
図５は、異なるＩｇＧ４  ＭＡＢ試料の質量分析により得られたスペクトルを示す。試料を時点ｔ＝０（下パネル）、時点ｔ＝８時間（中パネル）および時点ｔ＝４８時間（上パネル）で採取した。Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡグリカンを含むＩｇＧ分子の質量スペクトルにおける１電荷状態(one charge state)の質量電荷比(mass over
charge)（ｍ／ｚ）信号を表示する。異なる状態にシアリル化された種の相対強度がこれらの信号から導かれる。図４に対応して、ｔ＝０時間ではＧ２＋０ＳＡが主グリカン種である。ｔ＝８時間では、Ｇ２＋２ＳＡに対する信号が優勢形態であり、これに対しｔ＝４８時間ではＧ２＋１ＳＡが最も多量に存在する種である。決定した数値については図４を参照されたい。
【０１１８】
実施例１１
ＣＴＰによる△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性の阻害
化合物シチジン−５’−三リン酸（ＣＴＰ）は強力なシアリルトランスフェラーゼ阻害物質であることが知られている(Scudder PR & Chantler EN BBA 660 (1981) 136-141)。
シアリダーゼ活性が△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉに固有の活性であることを立証するために、阻害実験を実施した。第１相実験では、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４
ＭＡＢのシアリル化を実施して、高含量のＧ２＋２ＳＡを達成した（参照：実施例１０）。７時間のインキュベーション後、Ｇ２＋２ＳＡ含量は９４％であった。その後、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性を阻害するためにＣＴＰを添加した（ＣＴＰの最終濃度：０．６７ｍＭ）。種々の時点で試料を採取し、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡの含量を質量分析により決定した。結果を図６に示す。図４に示した阻害物質を含まない状態と比較して、シアリダーゼ活性により生じたＧ２＋２ＳＡの分解は有意に低減した。７２時間のインキュベーション後、７３％のＧ２＋２ＳＡがなお存在していた。既知のシアリルトランスフェラーゼ活性の阻害物質によるシアリダーゼ活性の阻害は、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの同じ活性中心に両方の活性があることを強く指摘する。
【０１１９】
実施例１２
△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ１  ＭＡＢのシアリル化
１５ｍｇの量の高度にガラクトシル化されたヒト化モノクローナル抗体ＩｇＧ１  ＭＡＢをシアリル化処理に用いた。反応混合物は、規定量のＩｇＧ１  ＭＡＢ（１５ｍｇ；２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのトリス緩衝液，ｐＨ８．０を含有する１，８５４μＬの水性緩衝液中）、ドナー基質ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（７，５００μｇ；２，５００μＬの水中）およびシアリルトランスフェラーゼ（１，５００μｇ；組換え製造し、精製した△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ；２０２μＬの２０ｍＭのリン酸カリウム、０．１ＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．５  中）を含有していた。成分を混合し、得られた反応混合物を３７℃で、２時間、４時間、８時間、２４時間、および４８時間を含む種々の時間、インキュベートした。シアリル化された抗体の精製を実施例１３に従って実施した。
シアリル化度を分析するために、１２４μＬの変性用緩衝液（６Ｍの塩化グアニジニウム；水中）および３０μＬのＴＣＥＰ（＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；０．１ｍＭ，変性用緩衝液中に希釈）を７６μＬ（２５０μｇのＩｇＧ１  ＭＡＢに相当する）に添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。その後、予備平衡化したｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）  Ｎａｐ５−カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、試料をエレクトロスプレー媒体［２０％のＡＣＮ（＝アセトニトリル），１％のＦＡ（＝ホルムアミド）］中に緩衝化した。その後、試料をエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析し、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡ  Ｎ−グリカンの含量を決定した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）を用い、使用したソフトウェアはＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１であった。
【０１２０】
実施例１３
シアリル化されたＩｇＧ１  ＭＡＢの精製
実施例１２のインキュベートしたシアリル化反応混合物からシアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−ＮＡＮＡを分離するために、インキュベートしたＩｇＧ１  ＭＡＢをプロテインＡを用いて精製した。２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（＝エチレンジアミン四酢酸），ｐＨ７で平衡化したプロテインＡカラムに反応混合物を適用した。カラムを２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＴＭＡＣ（＝塩化テトラメチルアンモニウム）、５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ５．０で洗浄し、次いで２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．１で洗浄した。ＩｇＧ１  ＭＡＢを２５ｍＭクエン酸Ｎａで溶離した。低ｐＨにおける自然脱シアリル化を避けるために、１Ｍトリス，ｐＨ９．０を用いてｐＨをｐＨ７．０に調整した。この方法を用いて、純粋な形態のシアリル化されたＩｇＧ１  ＭＡＢを一般的収量１２ｍｇで得た。
【０１２１】
実施例１４
ＣＭＰの存在下および非存在下でのＩｇＧ１  ＭＡＢに対する△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉのシアリダーゼ活性
シチジン一リン酸（５’−ＣＭＰ，＝ＣＭＰ）はシアリルトランスフェラーゼ酵素により触媒される反応の生成物であり、グリコシルトランスフェラーゼ反応中に補基質ＣＭＰ−ＮＡＮＡから生成する。シアリル化反応のインキュベーション時間に伴なって、ＣＭＰが反応混合物中に蓄積する。固有のシアリダーゼ活性がＣＭＰ依存性であることを立証するために、実施例１２の記載に従ってＣＭＰ−ＮＡＮＡの存在下で△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉと共にインキュベートすることにより、高度にシアリル化されたＩｇＧ１モノクローナル抗体ＩｇＧ１  ＭＡＢ  Ｇ２＋２ＳＡを製造し、実施例１３の記載に従って精製した。実施例１２に従ってシアリル化のためのインキュベーション期間８時間で高度にシアリル化された１，２５０μｇ（１９４μＬ中）の量のＩｇＧ１  ＭＡＢに、１２５μｇのシアリルトランスフェラーゼバリアント（３０μｇ/３００μｇ  ＩｇＧ１  ＭＡＢ）を添加した。種々のＮ末端トランケート型ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ酵素バリアントをＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性について調べた:
・  △８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ  （実施例９）
・  △１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ  （実施例９）
・  △５７  ｈＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手）
△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（１６．８μＬ，１２５μｇを含む）、△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（１７．３μＬ，１２５μｇを含む）、△５７  ｈＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ（２０．１μＬ，１２５μｇを含む）および陰性対照（酵素なし，２０．１μＬの超純水）を用いて、４つの異なる実験を行なった。これらの酵素をＣＭＰ（モル濃度で１０倍過剰）の存在下および非存在下でシアリダーゼ活性について試験した。濃度は下記に示すとおりであった：
△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（１６．８μＬ，１２５μｇを含む）：１１，８μｇのＣＭＰ（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍＬ，２３，６μＬ）
△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（１７．３μＬ，１２５μｇを含む）：１２，３μｇのＣＭＰ（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍＬ，２４，５μＬ）
△５７  ｈＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ（２０．１μＬ，１２５μｇを含む）：１２，３μｇのＣＭＰ（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍＬ，２４，５μＬ）
陰性対照（酵素なし）：１２，３μｇのＣＭＰ（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍＬ，２４，５μＬ）
試料を３７℃で２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３５ｍＭのトリス，ｐＨ６．５  中においてインキュベートした。種々のインキュベーション時間後、アリコートを試料として採
取し、分析した。
試料中のＩｇＧ１  ＭＡＢのシアリル化度を分析するために、１２４μＬの変性用緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム，水中）および３０μＬのＴＣＥＰ（＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン；０．１ｍＭ，変性用緩衝液中に希釈）を７６μＬ（２５０μｇのＩｇＧ１  ＭＡＢに相当する）に添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。その後、予備平衡化したｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  Ｎａｐ５−カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、試料をエレクトロスプレー媒体（２０％のＡＣＮ（＝アセトニトリル），１％のＦＡ（＝ホルムアミド））中に緩衝化した。その後、試料をエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析し、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡ  Ｎ−グリカンの含量を決定した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）を用い、使用したソフトウェアはＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１であった。
結果を図７〜１０に示す。ＣＭＰを含まない反応混合物中においては、４６時間のインキュベーション後ですらＧ２＋２ＳＡの分解がみられなかった（図７）。これに対し、ＣＭＰの存在下ではＧ２＋１ＳＡ含量の増加を伴うＧ２＋２ＳＡ分解が測定された（図８）。前記条件下で、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩはＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性を示し、これに対し△１０８  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（図９）および△５７  ＳＴ３Ｇａｌ−Ｉ（図１０）はＣＭＰの存在下でシアリダーゼ活性を示さなかった。後者の場合、この酵素は２−３グリコシド結合に特異的であることが認められている。
【０１２２】
実施例１５
ホスファターゼ酵素活性の存在下で△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉを用いるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化
反応中に形成されたＣＭＰを連続的に除去することにより、△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩのＣＭＰ−依存性シアリダーゼ活性の抑制を調べた。
これらの実験には、酵素（ｉ）５’−ヌクレオチドに対して幅広い特異性をもつ５’−ヌクレオチダーゼ（ＥＣ  ３．１．３．５）、および（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）（両方とも業者により提供された）を用いた。ここで用いた特定の５’−ヌクレオチダーゼはｅｃｔｏ−５’−ヌクレオチダーゼまたはＣＤ７３(Cluster of Differentiation 73(クラスター分類７３))としても知られ、ヒトにおいてはＮＴ５Ｅ
遺伝子によりコードされる。両酵素ともＣＭＰを脱リン酸化する；すなわち、ＣＭＰ中のホスホエステル結合の加水分解を触媒する。この実施例の実験には、補基質ＣＭＰ−ＮＡＮＡからシアリルトランスフェラーゼ反応により生成したＣＭＰを分解するために、これらの酵素を用いた。ＣＭＰの非存在下では△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉの固有のシアリダーゼ活性はみられなかった。
１，０００μｇのＩｇＧ４  ＭＡＢ（１８２μＬ）に、５００μｇのＣＭＰ−ＮＡＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ，１６６．７μＬ）、１００μｇの△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−Ｉ（１３．４μＬ，３０μｇ／３００μｇ  ＩｇＧ４  ＭＡＢ）および種々の量のヌクレオチダーゼ（Ｎｕ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を添加した。ＡＰの活性にはＺｎ２＋イオンが必須であるので、これらを最終濃度０．１ｍＭになるように添加した。用いた緩衝液は２０ｍＭ酢酸ナトリウム／トリス，ｐＨ６．５であった。
種々の量の酵素を反応混合物に添加して、脱リン酸化酵素の作用を調べた：
１）５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３を０．１μｇ／μＬの濃度で用いた。反応物に０．１０μｇ、０．２５μｇおよび０．５０μｇを添加した。
２）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を１μｇ／μＬおよび１０μｇ／μＬの濃度で用いた。反応物に１μｇ、５μｇ、１０μｇおよび１００μｇを添加した。
それぞれの量の酵素を添加した後、試料を３７℃でインキュベートした。試料を幾つかの時点で採取して、シアリル化度を制御した。したがって、１１０μＬの変性用緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム）および３０μＬのＴＣＥＰ（０．１ｍＭ，変性用緩衝液中に希釈）を９０μＬの試料（約２５０μｇのＩｇＧ４  ＭＡＢ）に添加し、試料を３７℃で１時間インキュベートした。その後、予備平衡化したｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）  Ｎａｐ５−カラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、試料をエレクトロスプレー媒体［２０％のＡＣＮ（＝アセトニトリル），１％のＦＡ（＝ホルムアミド）］中に緩衝化した。次いで、試料をエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析し、Ｇ２＋０ＳＡ、Ｇ２＋１ＳＡおよびＧ２＋２ＳＡ  Ｎ−グリカンの含量を決定した。Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＨＤＭＳデバイス（Ｗａｔｅｒｓ  ＵＫ）を用い、使用したソフトウェアはＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ  ４．１であった。
５’−ヌクレオチダーゼＣＤ７３の存在下または非存在下での△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化の結果を図１１〜１４に示す；アルカリホスファターゼの存在下または非存在下での△８９  ｈＳＴ６Ｇａｌ−ＩによるＩｇＧ４  ＭＡＢのシアリル化の結果を図１５〜１９に示す。明らかになったように、５’−ＣＭＰ中のホスホエステル結合を加水分解できるホスファターゼ活性を導入することにより、ＣＭＰ仲介シアリダーゼ活性は効果的に低減し、シアリルトランスフェラーゼ活性は増強された。
【図１】
2019088306.tif 000003
【図２】
2019088306.tif 000004
【図３】
2019088306.tif 000005
【図４】
2019088306.tif 000006
【図５】
2019088306.tif 000007
【図６】
2019088306.tif 000008
【図７】
2019088306.tif 000009
【図８】
2019088306.tif 000010
【図９】
2019088306.tif 000011
【図１０】
2019088306.tif 000012
【図１１】
2019088306.tif 000013
【図１２】
2019088306.tif 000014
【図１３】
2019088306.tif 000015
【図１４】
2019088306.tif 000016
【図１５】
2019088306.tif 000017
【図１６】
2019088306.tif 000018
【図１７】
2019088306.tif 000019
【図１８】
2019088306.tif 000020
【図１９】
2019088306.tif 000021
【配列表】
2019088306000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで５’−シチジン−一リン酸の存在下に、ドナー化合物シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミニン酸から、またはその機能均等物から、アクセプター、すなわち糖タンパク質または糖脂質のグリカン部分中の末端β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンであるアクセプターへ、５−Ｎ−アセチルノイラミニン酸残基を伝達するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置９０から位置１０８までのアミノ酸モチーフを欠如する可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩの使用であって、
前記可溶性ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１０９から位置４０６までのアミノ酸を含む、前記使用。
【請求項２】
可溶性β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列である、請求項１に記載の使用。
【外国語明細書】
2019088306000001.pdf