(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒマワリのベト病抵抗性遺伝子、とりわけベト病抵抗性ヒマワリ品種の提供。【解決手段】植物病原体ベト病に抵抗性であるヒマワリ品種であって、該品種は、特定の配列番号に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または該配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、ヒマワリ品種。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原体ベト病に抵抗性であるヒマワリ品種であって、該品種は、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、ヒマワリ品種。
【請求項２】
ベト病植物病原体が、プラスモパラ ハルステディイ（Plasmopara halstedii）またはプラスモパラ ヘリアンティ（Plasmopara helianthi）である、請求項１に記載のヒマワリ品種。
【請求項３】
該低下した酵素活性が、該遺伝子のコーディング配列における１つまたは複数の変異によって短縮型または非機能性のタンパク質が生成することによりもたらされる、請求項１または２に記載のヒマワリ品種。
【請求項４】
該１つまたは複数の変異が、アミノ酸置換、フレームシフトまたは未成熟終止コドンである、請求項３に記載のヒマワリ品種。
【請求項５】
該１つまたは複数の変異が、該抵抗性付与遺伝子のコーディング配列の配列モチーフ“ＷＲＤＹＬＲ”における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換の結果である、請求項４に記載のヒマワリ品種。
【請求項６】
該低下した発現が、該遺伝子の調節領域または非コーディング配列における１つまたは複数の変異によりもたらされる、請求項１または２に記載のヒマワリ品種。
【請求項７】
配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、請求項１から６のいずれか一項に記載のヒマワリ品種の種子、植物組織または植物部分。
【請求項８】
配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、請求項１から６のいずれか一項に記載のヒマワリ品種から得られた種子、植物組織または植物部分。
【請求項９】
植物病原体ベト病に抵抗性であるヒマワリ品種を提供するための方法であって、該方法が、ヒマワリ品種に、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を導入する工程を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、方法。
【請求項１０】
植物病原体ベト病に抵抗性であるか、または増大した抵抗性を有するヒマワリ品種を提供するための、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する遺伝子またはそのｃＤＮＡ配列、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子の使用。
【請求項１１】
配列番号２もしくは配列番号４を含むアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１または配列番号３を含む核酸配列。
【請求項１３】
配列番号２もしくは配列番号４を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する遺伝子または配列番号１もしくは配列番号３を含む核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明は、ヒマワリのベト病(downy mildew)抵抗性遺伝子に関し、とりわけベト病抵抗性のヒマワリ品種に関する。本発明はさらに、本発明のベト病抵抗性のヒマワリ品種を得るための方法およびヒマワリにベト病抵抗性を提供するための本発明の遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒマワリ属(Helianthus L.)は、キク科植物の１つの属であり、約５２種が含まれる。共通の表記“ヒマワリ”は、一般に、一年草のヒマワリ（Helianthus annuus）を示すために用いられる。一年草のヒマワリならびにキクイモ（Helianthus tuberosus）のような他の種は、食用作物や観賞用植物として温帯地域で栽培されている。栽培されたヒマワリ、一年草のヒマワリは、ヒマワリ属の最も身近な種である。一年草のヒマワリは、観賞目的と種子から植物油を得るための両方の目的で栽培されている。
【０００３】
ヒマワリにおける一般的かつ破壊的な疾病であるベト病は、植物を枯らし、または生育を妨げ、自立を減らし、大幅な収量低下（５０〜９５％まで）を引き起こし得る。ヒマワリは、植え付け後２−３週間以内に大雨が降った土壌で最もベト病になりやすい。
【０００４】
ベト病菌は、植物の絶対寄生菌である植物病原性卵菌のいくつかのタイプのいずれかを意味する。ベト病菌は、専らツユカビ科に属している。一般的に、栽培ヒマワリにおいてベト病を引き起こすベト病病原菌は、プラスモパラ ハルステディイ（Plasmopara halstedii）またはプラスモパラ ヘリアンティ（Plasmopara helianthi）である。
【０００５】
ヒマワリ栽培および品種改良の分野では、ベト病に対する新規の抵抗性遺伝子を同定する一定の必要性が存在している。しかしながら、同定された最も抵抗性の遺伝子は、一遺伝子の優性抵抗性遺伝子であって、これらの遺伝子により提供される抵抗性は、一般的に、ベト病病原菌が高頻度で進化し適応することにより、宿主植物に成功裏に感染する能力を取り戻すために、急速に失われる。従って、新たな抵抗性遺伝子、好ましくは抵抗性が病原菌の適応によって容易に失われない抵抗性遺伝子が、当技術分野で必要とされている。
【０００６】
既知のヒマワリ抵抗性遺伝子の欠点は、病原菌抵抗性を提供することに加えて、これらの遺伝子が、生育不全または自発的に起こる細胞死などの望ましくない表現型を伴うことが多いことである。従って、抵抗性に加えて、望ましくない表現型を提供しない、新しい抵抗性遺伝子が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
あらゆる必要性のうち、全てではないにしても、少なくとも部分的には当技術分野における必要性を満たすことが、本発明の目的である。
【０００８】
本発明のこの目的は、本明細書末尾の特許請求の範囲に記載されるヒマワリ品種および抵抗性遺伝子を提供することにより満たされる。
【０００９】
具体的には、本発明のこの目的は、第一の面によれば、植物病原体ベト病に対して抵抗性であるヒマワリ品種により満たされ、ここで、本発明の品種は、（ａ）配列番号２および／または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子（resistance conferring gene）、または配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、本発明の抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における本発明の抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または本発明のタンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における本発明のタンパク質の酵素活性と比較して低下している。
【００１０】
本発明の研究において、驚くべきことに、本発明の遺伝子の低下した発現または本発明のタンパク質の低下した酵素活性は、ヒマワリ植物にベト病に対する広範的かつ永続的な抵抗性を提供することが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明により、発現は、植物病原体ベト病に対して抵抗性ではないヒマワリ品種における本発明の抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下している。用語“抵抗性ではない”は、適当な疾患試験において、親植物などの適当な対照植物を用いて決定された抵抗性レベルが、本発明の植物において観察される抵抗性レベルよりも低いことを示す。従って、本発明の抵抗性は、ベト病に対する増加した抵抗性としても示され得る。本発明の好適な対照植物は、親植物に加えて、ベト病を有する植物のような当技術分野で一般的に示される植物であってもよい。
【００１３】
好適な疾患試験は、ベト病病原菌を植物に接種し、その後、葉の上面上に見られる大きな、角張ったまたは塊状の黄色領域または破壊された葉組織などの疾病症状の発生を観察する。
【００１４】
本発明の植物および対照植物における発現レベルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｍＲＮＡハイブリダイゼーションのような任意の適切な一般に公知の分子生物学的技術を用いて決定することができる。
【００１５】
本発明により、酵素活性は、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における、本発明のタンパク質の活性と比較して低下している。用語“抵抗性ではない”は、適当な疾患試験において、親植物などの適当な対照植物を用いて決定された抵抗性レベルが、本発明の植物において観察される抵抗性レベルよりも低いことを示す。従って、本発明の抵抗性は、ベト病に対する増加した抵抗性としても示され得る。本発明の好適な対照植物は、親植物に加えて、ベト病を有する植物のような当技術分野で一般的に示される植物であってもよい。好適な疾患試験は、ベト病菌を植物に接種し、その後、葉の上面上に見られる大きな、角張ったまたは塊状の黄色領域または破壊された葉組織などの疾病症状の発生を観察する。
【００１６】
本発明のタンパク質は、２−オキソグルタレート（２ＯＧ）ＦＥ（ＩＩ）−依存性オキシゲナーゼ活性を有する。該酵素は、Ｆｅ（ＩＩ）を絶対的に必要とし、ヒドロキシル化、不飽和化および酸化閉環反応を含む二電子酸化を触媒する。‘プライム(prime)’基質の酸化は、２ＯＧをコハク酸およびＣＯ２へ変換することを伴う。二酸素分子の酸素の一方はコハク酸に組み込まれる。不飽和化反応の場合には、他方の二酸素由来の酸素は、恐らく水に変換される。ヒドロキシル化反応において、アルコール生成物への二酸素からの酸素の部分的取り込みが、観察される水からの酸素の交換をかなりのレベルで生じる。従って、本発明の低下した活性は、出発化合物または酵素反応の結果化合物のいずれかである化合物を測定するアッセイを用いて決定され得る。好適な代替法として、本発明のタンパク質の低下した活性の本質的指標となるタンパク質レベルは、例えば、両者とも当業者に一般的に公知のＥＬＩＳＡまたはタンパク質ハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【００１７】
本発明の文脈中、ベト病に対する抵抗性は、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質をコード化する遺伝子によって本発明のヒマワリ品種に低下した発現または活性をもたらすことにより、個別に、または組み合わせて提供される。
【００１８】
本発明のヒマワリ品種は、ベト病を有する植物またはベト病抵抗性品種の変異誘発によって、その抵抗性を増大することにより得られ得る。例えば、突然変異は、発現レベルまたはタンパク質レベルのいずれかで、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）のような変異原性物質を用いるか、または植物材料にガンマ線もしくは高速中性子を照射することにより、これらの植物に導入することができる。得られた変異は、特異的またはランダムであってよい。後者の場合、本発明の抵抗性付与遺伝子における変異を担持する変異誘発された植物は、ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法（McCallum et al. (2000) Targeted screening for induced mutations. Nat. Biotechnol. 18, 455-457, および Henikoff et al. (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636）を用いて容易に同定することができる。簡単には、この方法は、Ｍ２世代の変異誘発された植物の大規模集団のゲノムＤＮＡからの目的の遺伝子のＰＣＲ増幅に基づいている。ＤＮＡ配列決定またはＣＥＬ−Ｉヌクレアーゼのような一本鎖特異的ヌクレアーゼ（Till et al. (2004) Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic Acids Res. 32, 2632-2641）を用いる点変異のスキャニングにより、本発明の遺伝子に変異を有する個々の植物が同定される。
【実施例】
【００１９】
本発明の第一の面の好ましい態様により、本発明のベト病病原菌は、プラスモパラ ハルステディイ（Plasmopara halstedii）および／またはプラスモパラ ヘリアンティ（Plasmopara helianthi）である。しかしながら、他のツユカビ科に属する病原菌およびヒマワリにベト病疾病を引き起こし得る病原菌は、本発明の範囲内であると意図される。
【００２０】
本発明の第一の面の別の好ましい態様により、本発明の低下した酵素活性は、本発明の遺伝子のコーディング配列における１つまたは複数の変異であって、その結果、短縮型または非機能性のタンパク質が得られることにより提供される。短縮型タンパク質は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡレベルで遺伝子転写物を分析することにより容易に決定することができ、非機能性タンパク質は、酵素アッセイで、またはコンフォメーション依存性抗体を用いて決定することができる。転写レベルでアッセイされ得る変異は、例えば、アミノ酸置換、フレームシフトまたは未成熟終止コドンである。
【００２１】
本発明の第一の面のとりわけ好ましい態様により、本発明のタンパク質の低下した活性をもたらす本発明の変異は、本発明の抵抗性を提供する遺伝子のコーディング配列の配列モチーフ“ＷＲＤＹＬＲ”またはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇにおける、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換(複数可)の結果生じる変異である。該配列モチーフは、配列番号２のアミノ酸位置１０７から１１２、および配列番号４のアミノ酸位置１１６から１２１で見出され得る。本発明者らは、この領域における変異が、とりわけ、ベト病抵抗性の表現型、すなわち観察される抵抗性のレベルに影響を与えることを見出した。とりわけ、Ｙ（Ｔｙｒ）および／またはＲ（Ａｒｇ）を含む変異は、ベト病抵抗性の表現型、すなわち観察される抵抗性のレベルに高度に相関している。
【００２２】
本発明のこの第一の面のさらに別の好ましい態様により、本発明の低下した発現は、本発明の遺伝子の調節領域または非コーディング配列における１つまたは複数の変異により提供される。本発明の遺伝子の調節領域の例は、プロモーターおよびターミネーター領域であり、非コーディング領域の例は、イントロン、とりわけその中のスプライシングに影響を及ぼすモチーフである。
【００２３】
第二の面により、本発明は、配列番号２および／または配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している、上記のヒマワリ品種の、または上記のヒマワリ品種から得られ得る種子、植物組織または植物部分を提供する。
【００２４】
第三の面により、本発明は、植物病原体ベト病に抵抗性であるヒマワリ品種を提供するための方法、またはヒマワリ品種の植物病原体ベト病に対する抵抗性を増大するための方法に関し、ここで、本発明の方法は、ヒマワリ品種に、配列番号２および／または配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子、または配列番号２および／または配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子を導入する工程を含み、該抵抗性付与遺伝子の発現が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該抵抗性付与遺伝子の発現と比較して低下しているか、または該タンパク質の酵素活性が、植物病原体ベト病に抵抗性ではないヒマワリ品種における該タンパク質の酵素活性と比較して低下している。
【００２５】
第四の面により、本発明は、植物病原体ベト病に対して抵抗性であるか、またはそれに対して増加した抵抗性を有するヒマワリ品種を提供するための、配列番号２もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化する遺伝子またはそのｃＤＮＡ配列、または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性、好ましくは９４％以上の配列同一性、より好ましくは９６％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するベト病抵抗性付与遺伝子の使用に関する。
【００２６】
第五の面により、本発明は、配列番号２もしくは配列番号４を含むアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
【００２７】
第六の面により、本発明は、配列番号１または配列番号３を含む核酸配列に関する。
【００２８】
第七の面により、本発明は、配列番号２もしくは配列番号４を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する遺伝子または配列番号１もしくは配列番号３を含む核酸配列に関する。
【図１】
2019088307.tif 000002
【図２】
2019088307.tif 000003
【配列表】
2019088307000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月26日(2019.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の第一の面のとりわけ好ましい態様により、本発明のタンパク質の低下した活性をもたらす本発明の変異は、本発明の抵抗性を提供する遺伝子のコーディング配列の配列モチーフ“ＷＲＤＹＬＲ”またはＴｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇにおける、アミノ酸欠失またはアミノ酸置換(複数可)の結果生じる変異である。該配列モチーフは、配列番号２のアミノ酸位置１２３から１２８、および配列番号４のアミノ酸位置１３２から１３７で見出され得る。本発明者らは、この領域における変異が、とりわけ、ベト病抵抗性の表現型、すなわち観察される抵抗性のレベルに影響を与えることを見出した。とりわけ、Ｙ（Ｔｙｒ）および／またはＲ（Ａｒｇ）を含む変異は、ベト病抵抗性の表現型、すなわち観察される抵抗性のレベルに高度に相関している。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月29日(2019.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】図１は、ＨａＴＺ−１オルソログタンパク質の配列およびＨａＴＺ−１オルソログＣＤＳの配列を示す。
【図２】図２は、ＨａＴＺ−２オルソログタンパク質の配列およびＨａＴＺ−２オルソログＣＤＳの配列を示す。
【外国語明細書】
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2019088307.tif 000013
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【配列表】
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