(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＣＲ法のＨＬＡタイピングのエラー及びシークエンスキャプチャー法の欠点を克服する、ＨＬＡ領域に特化された特有のプローブセットをデザインし、当該セットを用いて、多検体を同時に処理し、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉し、当該プローブセットにＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めて、各ＨＬＡ遺伝子の捕捉を夫々特異的に効率よく行い、精密にタイピングをする方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセット及び当該プローブセットを用いた、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング方法。得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化し、ＤＮＡ断片を前記プローブセットと混合してハイブリダイズし、ハイブリダイズしたＤＮＡ断片を濃縮し、濃縮したＤＮＡ断片からプローブを脱離させ、得られたＤＮＡ断片の配列決定をするＨＬＡ遺伝子のタイピング方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜３５５に示す塩基配列を各々有するオリゴヌクレオチドからなる、偽遺伝子を含むＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセット。
【請求項２】
ビオチン付加されている、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程、
断片化したＤＮＡ断片を請求項１に記載のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる工程、
プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を濃縮する工程、
濃縮したＤＮＡ断片からプローブを脱離させ、得られたＤＮＡ断片の配列決定をする工程、
を含む、ＨＬＡ遺伝子のタイピング方法。
【請求項４】
前記プローブセットに含まれる各オリゴヌクレオチドがビオチン標識され、前記濃縮する工程が、ストレプトアビジン固定化ビーズを添加することにより実施される、請求項３に記載のタイピング方法。
【請求項５】
ＤＮＡ断片の配列決定をする前に、ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する工程を更に含む、請求項３又は４に記載のタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シークエンスキャプチャー法を用いたＨＬＡ遺伝子タイピングにおいて使用する新規なプローブセットに関する。より詳細には、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉できると同時に、ＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めることにより、ＨＬＡ遺伝子の捕捉を特異的、かつ効率よく行え、なおかつ多検体の同時タイピングを可能にするプローブセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっている。主なものとして６種類の抗原が知られており、ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ）が含まれる。
【０００３】
ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｂ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、移植、輸血、薬剤副作用及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
【０００４】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１の他にＨＬＡ−ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ−ＤＲＢ６やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の他に同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ−ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一染色体上にＨＬＡ−ＤＲＢ１以外のＨＬＡ−ＤＲＢ遺伝子は位置しない。
【０００５】
各アリルのエクソンには多型性を示す複数の領域が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のアリルに共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が、複数のアリルに共通であることもある。最近では、ＨＬＡ遺伝子の５‘末端のプロモーター・エンハンサー領域、５’ＵＴ領域、３‘ＵＴ領域、イントロンなどにも多くの転写調節に関わる機能的な多型を有することも明らかになりつつある。ＨＬＡ領域には、これらの遺伝子構造に欠陥をもつ偽ＨＬＡ遺伝子も数多く存在するが、これらの偽遺伝子が生物学的機能を持たない単なる遺伝子の残骸か、何らかの生物学的機能を持っているかは、明らかでない。
【０００６】
ＨＬＡには高度な多型が存在するため対立遺伝子（アリル）の種類が極めて多いことも知られている。一方、ＨＬＡアリルを判定するＤＮＡタイピングは、移植の際のドナーとレシピエントとの組織適合性の一致に関連するのみならず、生活習慣病や自己免疫疾患、癌、ウイルス感染症における防御と重症化、薬剤副作用等と相関するとの報告もある。
【０００７】
しかしながら、従来のＤＮＡタイピング法で解明された情報の範囲では、特定のＨＬＡアリルが疾患発症にかかわっているのか、あるいは特定のＨＬＡアリルと強い連鎖不平衡にある非ＨＬＡ遺伝子が関与しているのか不明な場合が多い。これは、ＨＬＡゲノム領域の全体像が未解明であることが原因であると考えられる（非特許文献１）。
【０００８】
近年、いわゆる「次世代シークエンサー（Next Generation Sequencer：ＮＧＳ）」の出現により、高スループットでのＤＮＡタイピングが可能となっているが、次世代シークエンサーで採用されているＤＮＡタイピング法の主流は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）よって産生されるＰＣＲ産物をＮＧＳにより塩基配列を決定する方式である。
【０００９】
このＮＧＳによるＤＮＡタイピング法は、従来のＰＣＲ―ＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）−Ｌｕｍｉｎｅｘ法やＰＣＲ−ＳＢＴ（サンガ法によりＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ）法で問題となる複数の多型のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができない、いわゆるフェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じないこと、イントロン領域やプロモーター領域における多型をも検出できるため、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出が可能であること、さらには多数の検体を一度にタイピングできること、という長所をもつ。
【００１０】
ＮＧＳ法を含めてこれらの従来法で必須とされているＲＣＲ法は、ＰＣＲ増幅時のＤＮＡポリメラーゼによる誤塩基取り込み、ＤＮＡ伸長が他の染色体（例えば、母方由来染色体から、父方由来染色体への乗り換え）や相同性の高い他の遺伝子への乗り換えによるキメラ分子の産生、ＰＣＲプライマーに相当するゲノム領域の多型による特定のアリルが増幅されない現象（アリルドロップ）の解決困難な問題を有している。本発明の目的の一つは、このようなＨＬＡタイピングのエラーの原因となる諸問題をかかえるＰＣＲ法に代わる、正確なＨＬＡタイピングを開発することである。
【００１１】
一方、検体からのＤＮＡからライブラリ化した後、ＨＬＡ遺伝子由来ＤＮＡ断片を選択的に濃縮し、これを少数のサイクル数によるＰＣＲ増幅をするキャプチャー法は、従来法におけるＰＣＲ法の解決困難な問題を解消でき、複数のＨＬＡ遺伝子を網羅的かつ選択的に濃縮するシークエンスキャプチャー法は有効である。しかしながら、従来のシークエンスキャプチャー法で用いられているプローブでは、例えばＨＬＡ領域に存在する遺伝子座を網羅的に、かつ多検体を同時にタイピングすることが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０１１７３４号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「次世代シークエンサーによるＨＬＡ領域のターゲットリシークエンス」、細道一善、他、医学のあゆみ、Vol.233、No.13（2010年）1187〜1191頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よって本発明は、上記のようなＰＣＲ法におけるＨＬＡタイピングのエラー並びに従来のシークエンスキャプチャー法の欠点を克服し、ＨＬＡ領域に特化された特有のプローブセットをデザインし、当該プローブセットを用いることによって、多検体を同時に処理できるとともに、ＨＬＡ領域の遺伝子を網羅的に捕捉できると同時に、当該プローブセットにＨＬＡ偽遺伝子に対するプローブも含めることにより、各ＨＬＡ遺伝子の捕捉をそれぞれ特異的、かつ効率よく行える精密なタイピングを可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、下記に詳述する、ＨＬＡ領域の３７個のＨＬＡ遺伝子、またはＨＬＡ様遺伝子に特有の塩基配列を持つ３５５個のオリゴヌクレオチドからなるプローブセットを用いることにより、多検体について同時に３７個のＨＬＡ遺伝子、またはＨＬＡ様遺伝子の塩基配列の決定が可能であり、タイピングできることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、配列番号１〜３５５に示す塩基配列を各々有するオリゴヌクレオチドからなるＨＬＡ遺伝子タイピング用プローブセットを提供する。さらに本発明は、前記プローブセットを用いたＨＬＡ遺伝子のタイピング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のプローブセットは偽遺伝子に対してデザインされたプローブ（以下、「偽プローブ」と称する）も含んでおり、偽プローブに結合したＤＮＡ断片を適宜除去することにより、重要なＨＬＡ遺伝子を効率的にタイピングできる。本発明のプローブはＨＬＡ領域に含まれる３２遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＲＢ６、ＨＬＡ−ＤＲＢ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ８、ＨＬＡ−ＤＲＢ９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−Ｋ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｖ、ＨＬＡ−Ｙ、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）を網羅的にタイピングできるようにデザインされているため、多検体（現時点で最大９６検体）のこれら３２遺伝子座を同時にアリル（ＩＭＧＴ／ＨＬＡのデータベースで命名されているアリル名）を決定することが可能になる。また、特定のＨＬＡ遺伝子のみを増幅するＰＣＲの行程を含まないので、ＨＬＡタイピングの日常検査に欠かせない全自動化が可能になる。さらには、ＰＣＲを用いた従来法（ＮＧＳを用いた方法も含む）に比較して操作が簡易であり費用も安価にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シーケンスキャプチャー法を用いた遺伝子タイピング方法の概略を示す図である（日本組織適合性学会誌、第22巻、第2号、2015年、第89頁から引用）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ヒトゲノムのリファレンス配列ＨＧ１９／ＧＲＣｈ３７における各ＨＬＡ遺伝子は、およそ下記の表１に記載の領域に存在しており、その領域をカバーするようなプローブを設計するのが一般的である。
【００１９】
【表１】
2019058071.tif 000003
【００２０】
しかしながら、上記各領域には、リピート配列やＧＣが存在するために有効なプローブ設計が困難な領域が含まれ、或る程度ユニークな配列を基礎としてプローブ設計をすることが必要である。また、各ＨＬＡ遺伝子間の配列に類似する部分が存在するため、各遺伝子を特異的に捕捉するプローブの設計には困難が伴う。
【００２１】
本発明では、上記表１に記載の領域を基礎としながら、下記の表２に示した領域に基づいて各遺伝子を特異的に捕捉するのに有効な３３３個の新規なプローブを設計した。
なお、表２におけるプローブ設計開始位置及びプローブ設計終端位置は、リファレンス配列（ＨＧ１９／ＧＲＣｈ３７）における位置を示す。
【００２２】
【表２−１】
2019058071.tif 000004
【００２３】
【表２−２】
2019058071.tif 000005
【００２４】
【表２−３】
2019058071.tif 000006
【００２５】
【表２−４】
2019058071.tif 000007
【００２６】
【表２−５】
2019058071.tif 000008
【００２７】
【表２−６】
2019058071.tif 000009
【００２８】
【表２−７】
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【００２９】
【表２−８】
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【００３０】
【表２−９】
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【００３１】
【表２−１０】
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【００３２】
さらに本発明では、表１において「*」を付した遺伝子について、独自にカスタマイズした以下の表３〜表８に示す塩基配列を用いて追加的なプローブを設計した。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
【表７】
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【００３８】
【表８】
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【００３９】
前記表３〜表８に示す塩基配列に基づいて、以下の表９に示す領域で２２個の追加的プローブを設計した。前記表３〜８に示した塩基配列は、これまでに登録されているＨＬＡ遺伝子のアリル塩基配列から多数派となる塩基を選び、全アリルで中間的となるように作成した合成配列である。これらの配列に基づいて設計したプローブを追加することにより、リファレンス配列との違いが大きいＨＬＡ遺伝子型をもつサンプルにおけるキャプチャー効率の低下を防ぎ、安定したシーケンス収量を得ることができる。
【００４０】
【表９】
2019058071.tif 000020
本明細書に記載したプローブ設計開始（又は終端）位置の表記は、ＵＣＳＣのＢＥＤフォーマットに従って記載されている。また、表２及び表９における「Ｎｏ．」の数字は配列表における配列番号に対応している。
本発明の各プローブは、配列番号：１〜３５５に示す塩基配列を持つことを基本とするが、１個から数個（例えば、プローブ全長の１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは３％以内、さらに好ましくは１％以内）の塩基が置換、欠失、又は挿入された塩基配列を有するものであってもよい。ただし、本発明で意図するプローブ機能を発揮するものに限られる。
【００４１】
即ち、本発明に係るプローブセットは、リファレンス配列に基づいて設計した３３３個のプローブと、カスタマイズされた配列に基づいて設計した２２個の追加的プローブを含む３５５個のオリゴヌクレオチドからなるプローブを含み、各々のプローブは配列番号１〜３５５に示す塩基配列を有する。多くの偽ＨＬＡ遺伝子のプローブを含めた理由は、偽ＨＬＡ遺伝子のタイピングを可能にするとともに、発現ＨＬＡ遺伝子の捕捉をそれぞれ、特異的、かつ効率よく行うためである。
【００４２】
さらに本発明は、上記のプローブセットを用いたシーケンスキャプチャーを含むＨＬＡ遺伝子のタイピング方法を提供する。
シーケンスキャプチャー法を用いたタイピング方法の概略を図１に示す。当該方法は、具体的には、以下の工程を含む。
（１）被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程。
（２）断片化したＤＮＡ断片を上記本発明のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる工程。
（３）プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を濃縮する工程。
（４）濃縮したＤＮＡ断片からプローブを脱離させ、得られたＤＮＡ断片の配列決定をする工程。
【００４３】
（１）被験者から得たサンプル中に含まれるＤＮＡを断片化する工程は、当該分野のおける常法を用いて実施される。断片化されたＤＮＡの両末端は必要に応じて平滑化し、好ましくは、被験者（検体）毎に特有のインデックスを含むアダプターをライゲーションする。
【００４４】
（２）（１）で得られたＤＮＡ断片を、本発明のプローブセットと混合してハイブリダイズさせる。ハイブリダイズさせる条件は以下の通りである。
ハイブリダイゼーションの温度：４７℃
反応時間：２４時間以内
その他の条件は従来通りである。
【００４５】
なお、ハイブリダイズさせる前に、プローブセットに含まれる各プローブには後の濃縮工程においてビーズ等の分離用担体に担持された標識と結合可能な標識を付加しておくのが必要である。プローブを標識する物質としては、ビオチンを用いるのが好ましい。
【００４６】
（３）次いで、プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片を分離用担体に結合させることにより濃縮する。分離用担体としては、プローブがビオチン標識されている場合には、表面にストレプトアビジンを固定化した磁気ビーズが好ましく用いられる。
【００４７】
プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片は、ビオチンとストレプトアビジンと相互作用により分離用担体（磁気ビーズ）表面に固定化され、当該磁気ビーズを磁石に吸着させることにより目的とするＤＮＡ断片が濃縮される。一方、プローブとハイブリダイズしなかった（ＨＬＡ遺伝子関連以外の）ＤＮＡ断片は洗浄により除去される。
【００４８】
（４）次に、濃縮したＤＮＡ断片とプローブとを、常法を用いて脱離させる。脱離したＤＮＡ断片は、必要に応じてＰＣＲ増幅した後、シークエンス解析装置等を用いて塩基配列が決定される。その後、必要に応じて塩基配列情報に基づくデータ分析又はマッピングなどを実施する。
【実施例】
【００４９】
表２及び表９に記載した領域に基づいて、３５５個のプローブ（配列番号：１〜３５５）を設計して合成した。
４０検体のＤＮＡサンプルについて、得られた３５５個のプローブを用いて、シーケンスキャプチャー法により目的とするＤＮＡを濃縮し、プローブを脱離させた後に、ＮＧＳを用いて配列決定した。その結果を以下の表１０〜表２９に示す。なお、いずれのＨＬＡ遺伝子座についても第４区域（８桁）レベルまでのタイピングが可能であったが、多くのアリルについてレファレンス配列の情報が乏しく、第３区域（６桁）レベルあるいは第２区域（４桁）レベルまでしか命名されていないので、表１０〜表２９ではすべて第３区域（６桁）レベルあるいは第２区域（４桁）レベルでのアリルを表記した。
【００５０】
具体的な工程は以下の通りである。
ＨＬＡ遺伝子のシーケンスのためのＤＮＡライブラリーを市販のキットを用いて調整した。すなわち、ＤＮＡ１００ｎｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２アコースティックソルビライザー（Ｃｏｖａｒｉｓ）にて３００ｂｐを中心とした断片に切断し、ＤＮＡ断片の末端修復、アデニン付加、アダプターライゲーションの工程）にてライブラリーとした。このときアダプターはサンプルごとに異なる最大９６種類のインデックス配列を持つように調整した。
【００５１】
ライゲーションしたＤＮＡライブラリーはバイオアナライザー（アジレント）により断片長を、Ｑｕｂｉｔ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック）によりＤＮＡ濃度を測定し、測定情報にもとづいて、最大９６サンプルの調整済みＤＮＡライブラリーを等モル濃度にて混合した。
【００５２】
混合したＤＮＡライブラリーを本発明プローブが対象とする領域濃縮のためのシーケンスキャプチャーに用いた。シーケンスキャプチャーには上述のカスタムデザインにより合成したＳｅｑＣａｐＥＺ  ｃｈｏｉｃｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、混合ＤＮＡライブラリーとＳｅｑＣａｐＥＺ  ｃｈｏｉｃｅのカスタムオリゴプローブを４７℃で６４時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションならびにその後の洗浄の工程は全てＳｅｑＣａｐＥＺのプロトコールに従って行った。
【００５３】
カスタムオリゴプローブにハイブリダイズした目的領域のＤＮＡ断片はアダプター配列と特異的プライマーによりＰＣＲ増幅してシーケンスのためのライブラリーとした。最大９６サンプルの混合ライブラリーのシーケンスはＭｉＳｅｑを用い、３００ｂｐのペアエンドにて塩基配列のデータを得た。
【００５４】
【表１０】
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【００５５】
【表１１】
2019058071.tif 000022
【００５６】
【表１２】
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【００５７】
【表１３】
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【００５８】
【表１４】
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【００５９】
【表１５】
2019058071.tif 000026
【００６０】
【表１６】
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【００６１】
【表１７】
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【００６２】
【表１８】
2019058071.tif 000029
【００６３】
【表１９】
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【００６４】
【表２０】
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【００６５】
【表２１】
2019058071.tif 000032
【００６６】
【表２２】
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【００６７】
【表２３】
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【００６８】
【表２４】
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【００６９】
【表２５】
2019058071.tif 000036
【００７０】
【表２６】
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【００７１】
【表２７】
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【００７２】
【表２８】
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【００７３】
【表２９】
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【００７４】
表１０〜２９に示されるように、表１に示したプローブに用いた３７遺伝子のなかで、アリル名を持たないＨＬＡ−ＤＱＡ２，ＨＬＡ−ＤＱＢ２，ＨＬＡ−ＤＱＢ３，ＨＬＡ−ＤＰＡ２，ＨＬＡ−ＤＰＢ２，及びＨＬＡ−ＤＰＡ３の６遺伝子を除く３１遺伝子に、ＨＬＡ−Ｙ遺伝子を加えた３２遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＲＢ６、ＨＬＡ−ＤＲＢ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ８、ＨＬＡ−ＤＲＢ９、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−Ｋ、ＨＬＡ−Ｌ、ＨＬＡ−Ｖ、ＨＬＡ−Ｙ、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）のアリルの決定が可能であった。
【００７５】
ＨＬＡ−ＤＱＡ２，ＨＬＡ―ＤＱＢ２，ＨＬＡ−ＤＱＢ３，ＨＬＡ−ＤＰＡ２，ＨＬＡ−ＤＰＢ２，及びＨＬＡ−ＤＰＡ３の６遺伝子は、それぞれ塩基配列は決定されたが、いずれもＩＭＧＴ／ＨＬＡデータべースにレファレンス配列がなく、アリル名も命名されていないので、アリル名を決定できず、表１０〜２９には含まれていない。
【００７６】
プローブに含まれていないＨＬＡ−Ｙ遺伝子のアリルが決定できたのは、他のクラスＩ遺伝子プローブとの相同性の高さにより、ＨＬＡ−Ｙ遺伝子も捕捉されたものと思われる。なお、このＨＬＡ−Ｙは全てのヒトに存在するわけではなく、ＨＬＡ−Ａ３１や−Ａ３３ハプロタイプにのみに特異的に存在していた。なお、ＨＬＡ−Ｙは偽遺伝子である。
【００７７】
次に、ＰＣＲを用いる従来法であるＬｕｍｉｎｅｘ法を用いて同一の検体の配列タイピングを行った。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１における結果を対比して以下の表３０〜３４に示す。
【００７８】
表３０〜３４に示した結果から明らかなように、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子については、本発明の方法で得られたタイピング結果とＬｕｍｉｎｅｘ法で得られた結果とが完全に一致した。
【００７９】
一方、Ｔ３２０およびＴ３３４検体のＨＬＡ−Ｃについては、本発明の方法においては、従来法では検出できなかった頻度が稀なアリル（HLA-C*08:22およびHLA-C*04:82）を正確にタイピングすることができたため、Ｌｕｍｉｎｅｘのタイピング結果とは相違している。
【００８０】
また、エクソン３の多型を検出していないＬｕｍｉｎｅｘ法では「DRB1*14:01」とタイピングされたアリルについて、本発明では「DRB1*14:54:01」と正しくタイピングされた。なお、DRB1*14:01と DRB1*14:54:01はエクソン３の一塩基多型（ＳＮＰ）のみに違いがある。
【００８１】
【表３０】
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【００８２】
【表３１】
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【００８３】
【表３２】
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【００８４】
【表３３】
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【００８５】
【表３４】
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【図１】
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【配列表】
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