(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の異なる病原体の種および／または変種を含む異なる病原体（例えば、ウイルス）ファミリーに属する少なくとも２種類の不特定の病原体の鑑別用のプライマーを決定するシステムならびに方法を提供する。【解決手段】それぞれ異なるウイルスファミリーのウイルスの種および血清型の複数のゲノムについてそれぞれのマルチ配列アラインメントを実行し、それぞれのコンセンサス配列を各アラインメント結果において識別することを含む２種類の不特定の病原体の鑑別用のプライマーのセットを取得する方法を提供する。【選択図】図１
2019058175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類の不特定の病原体の鑑別用のプライマーのセットを取得する方法であって、
前記不特定の病原体の各々が異なるウイルスファミリーに属し、各ウイルスファミリーは、複数の異なるウイルスの種および血清型を含み、
前記それぞれ異なるウイルスファミリーのウイルスの種および血清型の複数のゲノムについてそれぞれのマルチ配列アラインメントを実行し、前記異なるウイルスファミリーの各々についてのアラインメント結果を生成すること；
（ｉ）最小閾値を超える同一性、
（ｉｉ）最小閾値を超える長さ、および
（ｉｉｉ）最小閾値を超える融解温度
を有するそれぞれのコンセンサス配列を各アラインメント結果において識別すること；
識別されたコンセンサス配列を前記異なるウイルスファミリーについてそれぞれ調整されたアラインメント結果としてまとめること；
前記それぞれ調整されたアラインメント結果から、ヒト配列およびヒトを宿主とする有機体の配列に対して最小同一性を有する配列の除去を行い、それぞれのウイルス特異的アラインメント結果を形成すること；
前記ウイルス特異的アラインメント結果において差集合解析を実施し、前記不特定の病原体に対するコンセンサス配列のそれぞれの集合を取得することであって、前記差集合解析が差集合および和集合演算を使用して実行され、前記集合が、前記それぞれのウイルス特異的アラインメント結果で見出された配列を表す核酸塩基の集合である、取得すること；
前記コンセンサス配列のそれぞれの集合からプライマー配列を選択すること；
を含み、
前記ヒト配列およびヒトを宿主とする有機体の配列に対する最小同一性が、少なくとも９０％であり；
前記ヒトを宿主とする有機体の配列が、ヒトに存在することが知られているか、または疑われるウイルスの配列であり；
前記差集合解析において、前記プライマーが１種類のウイルスファミリーを別のウイルスファミリーから一意に識別できない場合に除去される、
方法。
【請求項２】
前記マルチプル配列アラインメントが、クラスタルＸ、クラスタルＷ、またはクラスタルオメガを使用して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同一性の最小閾値が少なくとも９７％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記同一性の最小閾値が１００％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記長さの最小閾値が少なくとも１５塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記長さの最小閾値が少なくとも２５塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融解温度の最小閾値が少なくとも６０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記融解温度の最小閾値が少なくとも６５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記長さの最小閾値が少なくとも２０塩基であり、前記同一性の最小閾値が少なくとも９７％であり、前記融解温度の最小閾値が少なくとも６０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コンセンサス配列の長さは、可変であり、所望の融解温度を達成するために、前記最小閾値を上回って選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマー配列を選択する工程が、前記異なるウイルスファミリー用のアンプリコンが少なくとも１００塩基の長さの差を有するように実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記除去がＢｌａｓｔＮを用いて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマー配列が、１００〜８００塩基の長さを有するアンプリコンを生成するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不特定の病原体が、２つの異なる系統発生の目に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを生成するためにプライマー配列を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーの集合が、前記不特定の病原体の各々について１〜５対のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記異なるウイルスファミリーがインフルエンザとエボラである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月２１日出願の米国特許出願第６２／０８３１２５号を有する仮出願の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、特に、エボラウイルス感染および症状が似ているインフルエンザウイルス感染との鑑別に関連するような、ウイルス感染の迅速な識別および鑑別のための診断システムならびに診断方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれかが、現在特許請求されている発明に先行する技術であるか、もしくはそれに関連するということ、または特別にもしくは暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
米国では、季節性インフルエンザＡ（「インフルエンザ」）は、年間、人口の５〜２０％が感染し、その結果、約２０万人が入院し、約３９,０００人がインフルエンザ関連死に至ると考えられている。最新の２００９〜２０１０年の「豚インフルエンザ」などのパンデミック期間中に、これらの数字は、さらに４３００〜８９００万症例まで上昇した（８,８７０〜１８,３００の推定される追加のインフルエンザ関連死をもたらした）。インフルエンザＡに加えて、エボラウイルスはまた、パンデミックの可能性を示し、発熱、筋肉／身体の痛み、頭痛、および重度の疲労の存在を含む初期の臨床症状をインフルエンザＡ感染と共有する。そのような類似性は、インフルエンザの流行がエボラ感染の存在または疑いと一致する特定の課題を提起する。ウイルス病原体の迅速な識別および鑑別は、臨床ケアとして最も重要であり、インフルエンザ患者の疫学的封じ込め（例えば、抗ウイルス薬でのホームケア）は、エボラ患者のケアに必要なプロトコルと著しく異なる（例えば、緩和的サポートでの隔離に大きく依存している）。
【０００５】
エボラ感染の診断は、多くの方法で実行することができ、ほとんどの場合、ウイルス核酸の検出方法を使用する。例えば、ウイルス核タンパク質の遺伝子に特異的なプライマーセットを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による多くのフィロウイルス種の検出は、エボラおよびエボラ関連ウイルスを含む多種多様なウイルス種を迅速に網羅することが報告されている（Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｊａｎ；１７１（１）：３１０−３）。このような方法は、都合の良いことに、速い分析を可能にするが、残念ながら他の非フィロウイルスに対する鑑別診断値を提供することができない。ウイルス診断の別のアプローチでは、患者の血清からの全ＲＮＡは、ＰＣＲ増幅、その後に、次世代シークエンシングに供された（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｊａｎ ５；４２２（１）：１−５）。インフルエンザに対するエボラの鑑別に強力かつ潜在的に適する一方で、このような技術は、広範な試料の取り扱いを必要とする傾向があり、相当のコストを伴う場合が多い。試料中のウイルスを識別するためのさらに別の公知のアプローチでは、ＰＣＲ増幅を用いて産物を生成し、次いで、既知の系統樹に対して整列させる（Ｊ  Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００７ Ｊａｎ；４５（１）：２２４−６)。しかしながら、このようなアプローチは、一般に、かなりの系統学的距離を有するウイルスの識別に適さない。
【０００６】
さらに、インフルエンザウイルスまたはエボラウイルスの識別のための既知のＰＣＲプロトコルは、典型的には、診断パネルの様々なウイルス株の存在を識別するのに役立つプライマーの集合を用いるマルチプレックスＰＣＲを使用する（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ １９９８；２６：１３９７−１４０２；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９ Ｊａｎ；３７（１）：１−７；Ｊ  Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９ Ｊａｎ；３７（５）：１３５２−１３５５；Ｊ  Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００７ Ｆｅｂ；４５（２）：５８４−５８９を参照されたい）。そのような試験パネルは、都合の良いことに、特異性の高い鑑別診断を可能にするが、ウイルスおよび血清型特異的プライマーを必要とする。残念ながら、特定のウイルスに非常に特異的であるが、これらのプライマーは、他のウイルスの変異体、特に新しい変異体または高度な多様性を有する変異体に特異的ではない可能性がある。さらに、同じクラスの複数のウイルスの検出が望まれる場合、プライマーの複雑さは、ヒトがプライマーの集合を合理的に設計する能力を急速に上回る。
【０００７】
このような複雑なタスクに対処するために、様々なソフトウェアツールが開発されている。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ＳＣＰｒｉｍｅｒは、候補プライマーを識別するために、第１の工程でウイルスファミリーの全配列の系統樹を作成し、次いで、最小のプライマーの集合に達するように、ｇｒｅｅｄｙセットカバリングプロブレム（ＳＣＰ）アルゴリズムを実行し、次いで、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの融点をマッチさせるために余分なものを除去するソフトウェアスイートである（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００６，Ｖｏｌ ３４，Ｎｏ．２２ ｐ：６６０５−６６１１を参照されたい）。プライマー対の選択を容易にするが、このような分析は、計算が複雑で、ウイルスのファミリーまたは種内のすべてのウイルスをまだ網羅することができない場合がある。さらに、このような方法は、依然として縮重プライマーの使用を必要とし、非特異的結合のリスクを増大させる。さらに、そのような方法はまた、ウイルスのターゲット集合が非常に多様である場合に問題となる傾向がある。
【０００８】
複数の配列アラインメントを回避しながら、多様なターゲット集合に伴う困難を克服するために、ファミリーレベルのコンセンサスプライマー上で識別するためのｇｒｅｅｄｙアルゴリズムも使用する多重プライマー予測（ＭＰＰ）ツールが開発された（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ.２００９，Ｖｏｌ ３７，Ｎｏ．１９，ｐ：６２９１−６３０４を参照されたい）。上記のアプローチと概念的に類似する一方で、ＭＰＰツールは、典型的には、縮重プライマー配列を必要としないが、比較的短いプライマー（１０ヌクレオチド）を生成し、ヒト配列またはヒトを宿主とする非ヒト（例えば、感染による細菌またはウイルス）配列の非特異的結合およびプライミングの可能性を増加させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、エボラウイルスまたはインフルエンザウイルスのいくつかの検出方法は当技術分野で知られているが、それらの全てまたはほとんど全ては、１以上の欠点がある。したがって、特に、鑑別診断が、エボラウイルスまたはインフルエンザウイルスによるウイルス感染の区別に必要とされる場合に、改良された検出システムを提供する必要性が依然として存在する。診断が、単一の試料中のエボラウイルスおよびインフルエンザウイルスの複数の株を網羅しなければならない場合に、このような必要性はさらに複雑になる。したがって、ウイルス配列の比較的大きな多様性に起因して、病原体に対する高い特異性を有し、アッセイ条件下でヒトＤＮＡにハイブリダイズしない適切なオリゴヌクレオチド配列を迅速に識別するためのシステムおよび方法も緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、異なるクラスの病原体用のプライマーを、異なるクラスのメンバーのコンセンサス配列を使用して決定することができることを発見した。最も典型的には、該コンセンサス配列は、様々な病原体配列の連続的なアラインメントおよび処理、ヒト配列に対する補正、および異なるクラス用のそれぞれのプライマー間の差集合演算によって得られる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の主題の一態様において、本発明者らは、２種類の不特定の病原体の鑑別用のプライマーの集合を取得する方法を企図する。企図される方法において、不特定の病原体の各々は、異なる系統の病原体（例えば、ウイルス）ファミリーに属し、各病原体ファミリーは、複数の異なる病原体の種および／または血清型を含む。最も好ましくは、企図される方法は、異なる病原体ファミリーの各々についてのアラインメント結果をもたらすために、それぞれ異なる病原体ファミリーの病原体種および血清型の複数のデジタル表現ゲノムについて、アラインメント装置を介してそれぞれのマルチ配列アラインメントを実行する工程を含む。このような方法はまた、（ｉ）最小閾値を超える相同性、（ｉｉ）最小閾値を超える長さ、および（ｉｉｉ）最小閾値を超える融解温度を有するそれぞれのコンセンサス配列を各アラインメント結果において識別する工程を含む。さらに別の工程において、識別されたコンセンサス配列を、異なる病原体ファミリーについてそれぞれ調整されたアラインメント結果としてまとめ、さらに別の工程において、それぞれ調整されたアラインメント結果配列から配列を除去して（除去配列がヒト配列およびヒトを宿主とする配列に対して最小相同性を有する）、それぞれのウイルス特異的アラインメント結果を形成する。次いで、差集合解析（ｓｅｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）をウイルス特異的アラインメント結果上で実行し、不特定の病原体に対するコンセンサス配列のそれぞれの集合を取得し、次いで、プライマー配列をコンセンサス配列のそれぞれの集合から選択する。
【００１２】
最も好ましくは、マルチ配列アラインメントは、クラスタルＸ、クラスタルＷ、またはクラスタルオメガを使用して実行される。さらに、相同性の最小閾値が少なくとも９７％（場合によっては、該相同性は１００％）であり、長さの最小閾値は、少なくとも１５塩基、より典型的には少なくとも２０塩基、最も典型的には少なくとも２５塩基であるが、融解温度の最小閾値は、少なくとも６０℃、より一般的には少なくとも６５℃であることが企図される。
【００１３】
さらに企図される態様において、解析エンジンは、病原体の科または目のいくつかの異なるメンバー（例えば、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ）のアラインメントを含有する、クラスタルＸ、クラスタルＷ、またはクラスタルオメガからフォーマットされた結果を処理するようにプログラム／構成される。すべてのウイルスメンバーの核酸塩基のアラインメントを比較することにより、保存領域を見つけることができる。次いで、これらの保存領域を、１つのクラスの病原体のすべてのメンバーを一意に識別するためのプライマー配列の開発のために収集する。保存領域が見つけられないか、または領域が融解温度要件を満たすオリゴマーを得ることができない場合には、このアルゴリズムは、最小のミスマッチ塩基が所望の融点に到達するのを可能にする。アラインメント内の各塩基位置は、ミスマッチ塩基の付加時に、ウイルスクラスの最も代表的なものである塩基位置が、互換性の最大の程度を可能にするために使用されるように割り当てられた保存スコアである。次いで、プライマー配列を、ＢｌａｓｔＮを用いて選別し、潜在的なヒト配列への任意のマッピングを除去し、偽陽性率を減らす。その後の分析により、重複配列を除去する。除去工程はＢｌａｓｔＮを用いて実行され、ヒトおよびヒトを宿主とする配列に対する最小相同性（例えば、ヒトに存在することが知られているまたは疑われるウイルス配列）が少なくとも９０％である、より典型的には少なくとも９５％であることがさらに一般的に好ましい。本発明の主題を限定するものではないが、差集合解析は、差集合および和集合演算を使用して実行され、かつ／またはプライマー配列は、１００〜８００塩基の長さを有するアンプリコンを生成するように選択される。不特定の病原体が２つの異なる系統発生の目に属することも企図される。最後に、方法は、さらに、ウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを生成するためにプライマー配列を決定する工程を含むことができ、かつ／またはプライマーの集合は、不特定の病原体の各々について１〜５対のプライマーを含むことが企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の主題による、コンピュータで見つけるプライマーの識別方法の例示的な概略フロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは今回、病原体（複数可）および／または株のうちのどれが存在するかは先験的に知られていない単一試料において、病原体（例えば、エボラウイルス）の１種類以上の株の、別の病原体（例えば、インフルエンザウイルス）の１種類以上の株に対する多重鑑別検出のためのシステムおよび方法を発見した。最も典型的には、該検出は、最も一般的には、全血もしくは血清、または血漿である生体試料中の、症状が似た様々なウイルス、特に、エボラウイルス（ザイール）およびインフルエンザＡを標的とするオリゴヌクレオチドの集合に基づいている。本発明の主題の特に好ましい態様において、該オリゴヌクレオチドの全ては、高度に保存された（場合によって、すべての株間で１００％保存されている）領域を標的とし、６５℃以上の融点Ｔｍを有する。
【００１６】
他の多重アッセイとは対照的に、企図されるアッセイは、多くの選択肢の中から単一の血清型を鑑別および識別するために使用されないが、各クラス内の血清型のほとんどまたはすべてを網羅しながら病原体の未知の（不特定の）クラスを区別するために使用されることに特に留意すべきである。さらに、企図されるプライマーはまた、非標的特異的結合、特に、宿主ゲノムまたは宿主ゲノム中に存在することが予想されるか、もしくは知られている核酸への結合を除外するように選択される。最後に、プライマーは、プライマーダイマーおよびクロスハイブリダイゼーション（すなわち、病原体の第１のクラス用に設計されたプライマーが、病原体の第２のクラスに結合すること）を回避するように選択される。
【００１７】
以下にさらに詳細に示されているように、本発明者らは、概念的に単純で効果的なコンピュータ実装アルゴリズムを使用して、独特な標的配列を識別し、それに対して、インフルエンザＡおよび／またはエボラウイルス含有試料の迅速な識別を可能にするためのプライマーパネルを（相補的配列の方向または相補的配列の逆方向のいずれかで）設計した。もちろん、以下の実施例は、エボラウイルスおよびインフルエンザウイルス検出のための有用性を証明する一方で、本発明の主題が特定の配列情報に依存しないので、企図されるシステムおよび方法は任意の病原体に適することが理解されるべきである。さらに、本明細書に記載のシステムおよび方法は、多数の（ならびにその個々のおよび多重の可能性を有する）標的部位を迅速に識別するのに適し、エンドユーザが特定の増幅プラットフォーム用の最良のプライマー対（複数可）を選択するのを可能にすることに留意すべきである。
【００１８】
図１は、本発明の主題による典型的なコンピュータ実装作業の流れを例示的に示す。しかしながら、本明細書に記載のすべての方法は、特に本明細書に示さない限り、または特に文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができることに留意すべきである。特定の実施形態に関して本明細書に提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにするものであり、特に請求される本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言語は、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００１９】
ここで、第１の工程１１０において、病原体の１つのクラス（例えば、病原体の属または種の血清型のすべてのメンバー）の利用可能なすべての核酸配列は、１種以上の供給源、典型的には、デジタルＦＡＳＴＡフォーマット中の配列データベースから得られる。当技術分野で公知のそのような多くのデータベースがあり、すべてのデータベースは本明細書で使用するのに適すると考えられる。さらに、データのフォーマットは、必ずしもＦＡＳＴＡフォーマットに限定される必要はなく、ＦＡＳＴＱ、ＢＡＭ、ＳＡＭ、ＥＭＢＬ、ＧＣＧ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＲＡＷ、ＩＧなどを含む様々な代替フォーマットも企図されることに留意すべきである。しかしながら、ＦＡＳＴＡフォーマットが一般的に好ましく、必要に応じて、他のフォーマットがＦＡＳＴＡフォーマットに再フォーマットすることができることを認識すべきである。
【００２０】
同様に、データベースは、オンラインでデータを提供することができるか、またはデータベースは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭメモリなど上の物理的なファイルであり得ることが理解されるべきである。提供方法に関係なく、配列データは、好ましくは、工程１２０に示すように、複数の配列の迅速なアラインメントを可能にするように構成される解析エンジンによって獲得される。最も好ましくは、そのようなアラインメントは、マルチ配列アラインメントであり、特に好ましいアライナには、クラスタルフォーマット１３０中の対応するアラインメントを生成するためのクラスタルＯなどの、アラインメントを生成するシーディッドガイドツリー（ｓｅｅｄｅｄ ｇｕｉｄｅ ｔｒｅｅｓ）およびＨＭＭプロファイル−プロファイル技術（ｐｒｏｆｉｌｅ−ｐｒｏｆｉｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を使用するものが含まれる。あるいは、アラインメントはまた、多数の代替方法で実行することができ、局所領域に基づく（例えば、Ｋａｌｉｇｎ）、高速フーリエ変換に基づく（例えば、ＭＡＦＦＴ）、または系統樹認識法に基づく（例えば、ＷｅｂＰＲＡＮＫ）アラインメントを使用することができる。
【００２１】
したがって、特定の方法に捕われず、病原体の単一クラスのすべての配列は、多重配列アラインメントを生成するために処理され、次いで、工程１４０でさらに処理され、適切な配列１５０の集合を作成し、その中の全てのメンバーは所定のパラメータを満たすことが企図される。処理工程１４０は、好ましくは、（ｉ）最小閾値を超える相同性、（ｉｉ）最小閾値を超える長さ、および（ｉｉｉ）最小閾値を超える融解温度を有するアラインメント全体のコンセンサス配列が識別されるアプローチでマルチ配列アラインメント全体を使用する。
【００２２】
最も典型的には、コンセンサス配列は、相同性が所定の最小または最大の長さ（典型的には、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基などと１００塩基未満、９０塩基未満、７０塩基未満などとの間）について所定の閾値（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、もしくは１００％）またはそれを上回る領域について徐々に識別される。容易に理解されるように、長さの決定は、所望の融点の関数でもある。最も典型的には、融解温度は、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃、または少なくとも６８℃である。したがって、本発明の主題の少なくともいくつかの態様において、そのように識別されるコンセンサス配列は、少なくとも２０塩基の長さについての最小閾値、少なくとも９７％の相同性についての最小閾値を有し、溶融温度の最小閾値は少なくとも６０℃である。
【００２３】
所定の相同性に関しては、ユーザが所望の最小閾値を提供することが企図され、ほとんどの場合、最小閾値は９０％を超える相同性である。例えば、適切な相同性の最小閾値は９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％を含む。容易に理解されるように、最小相同性の程度は、病原体のクラスメンバーの多様性および数の関数であり、最小閾値はより多様なクラスについてはより低い（例えば、少なくとも９５％）が、比較的保存されたクラスはより高い最小閾値（例えば、少なくとも９８％）を有し得ることが一般的に好ましい。
【００２４】
同様に、所定の長さに関して、ユーザが必要な最小長を提供し、適切な最小長は、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基などであることが企図される。一方、実際の長さは、最小長、必要な最小相同性、および所望の最小融解温度（配列の各々についての）を使用して解析エンジンによって決定することができることに留意すべきである。コンセンサス配列の選択された長さに応じて、融点の決定は、１３塩基未満のサイズを有するオリゴヌクレオチドについては式（Ｉ）を用い、１３塩基以上のサイズを有するオリゴヌクレオチドについては式（ＩＩ）に従って実行することができる。
Ｔｍ≒４＊（Ｇ＋Ｃ）＋２＊（Ａ＋Ｔ）−５            （Ｉ）
Ｔｍ＝６４．９＋４１＊（Ｇ＋Ｃ−１６．４）／（Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）    （ＩＩ）
【００２５】
プライマーは、典型的には、オリゴヌクレオチドが所定の融点（例えば、６５℃）を満たすか、または超えるような長さで保持／選択される。次いで、そのように識別されたコンセンサス配列は、異なる病原体ファミリーについてそれぞれ調整されたアラインメント結果としてまとめられる。異なる視点から見ると、各病原体は、配列の全てが相同性、長さ、および溶融温度の最小閾値と一致する独自調整アラインメント結果を有する。もちろん、アッセイが多重単一ポットアッセイである場合、第１および第２の異なる病原体のクラスについての所定の融解温度は、５℃以下離れている、より典型的には４℃以下離れている、さらにより典型的には３℃以下離れている、最も典型的には２℃以下離れている（例えば、同じ温度）ことを認識すべきである。
【００２６】
工程１４０において、該解析エンジンは、典型的には１つの病原体の目、科、または属に属する異なる病原体種のアラインメントを含有する、クラスタルＸ、クラスタルＷ、またはクラスタルオメガからの結果ファイルに取り込む。これらのアラインメントファイルを考慮して、該解析エンジンは、すべてのメンバー間の保存領域について検索し、好ましくは、塩基が１００％保存された領域を識別する。１００％保存された領域を見つけることに失敗すると、該解析エンジンは、最も高い保存領域を報告する。これらの領域から、該解析エンジンは、様々なサイズの可能性のあるオリゴマーを作成する。適切な最小長は、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基などである。
【００２７】
次いで、さらなる工程において、それぞれの調整されたアラインメント結果中のそのように識別され、特徴付けられたコンセンサス配列を、工程１６０に示すように解析エンジンでさらに処理し、ヒト配列および／またはヒトに少なくとも潜在的に存在すると合理的に予想することができる他の配列の配列にマッチする（またはＰＣＲ条件下でハイブリダイズ）配列を除去する。配列のマッチングは様々な方法で行うことができ、すべての既知の方法が、本明細書で使用するのに適すると考えられる。しかしながら、特に適切なマッチングアルゴリズムは、マッチング配列を識別するためのＢｌａｓｔＮを含む。認識されるように、任意のマッチング配列（例えば、７０％以上、より典型的には８０％以上、最も典型的には９０％以上の相同性を有するか、またはヒトもしくは他のウイルス標的とのＴｍの差が７℃未満、より典型的には５℃未満、最も典型的には３℃未満）を、次いで、それぞれ対応する病原体特異的（例えば、ウイルス特異的）アラインメント結果に達するように、それぞれの調整されたアラインメント結果配列から排除する。このように、さらなる処理は、宿主（例えば、ヒト）ゲノムへのプライマーの結合に起因し得る偽陽性のアッセイ結果を排除するのに役立つ。
【００２８】
次いで、最後に、本発明者らは、病原体特異的アラインメント結果１６２および１６４上で差集合解析を実行し、病原体のコンセンサス配列のそれぞれの集合を取得する。最も典型的には、差集合解析１７０は、差集合および和集合演算として（典型的には、ＦＡＳＴＡフォーマットファイルを使用して）実行され、次いで、診断ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用するのに適する両方の病原体クラスに対して独特な配列１７２を生成する。用語「集合」は、前の工程で見出された配列を表す核酸塩基の集合であり、用語「差集合」は、別の集合Ａの中に存在しない一集合Ｂの要素として定義されることに留意されたい。本例では、それらの違いはオリゴマーである。和集合は、集合Ｂにも存在する集合Ａの要素として定義される。これら２つの演算を考慮して、対称差集合は、集合Ａおよび集合Ｂから重複しない全てのオリゴマーをもたらす。
【００２９】
ウイルス配列に由来するオリゴマーを含有する複数のＦＡＳＴＡフォーマットファイルを考慮して、工程１７０において、該解析エンジンは、１種類の病原体ファミリーを一意に識別するオリゴマーの集合として各ファイルを処理する。これらの集合を作成すると、病原体ファミリーの複数の集合に属するオリゴマーを発見するため、差集合および和集合演算が実行される。次いで、これらのオリゴマーは、１種類の病原体ファミリーを別の病原体ファミリーから一意に識別できない場合に除去される。次いで、オリゴマーの残りのものは、１種類のウイルスファミリーを一意に識別するオリゴマーの集合として戻され、次いで、同じアッセイ（例えば、ＤＮＡチップ）内の別々の病原体ファミリーを一意に識別する他のオリゴマーと混合することができる。
【００３０】
もちろん、本明細書に提示される適切な配列は、合成のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体であり得、融解温度のすべての計算は、異なる化学的性質により温度の変化を考慮することを理解すべきである。例えば、該配列は、ペプチド核酸骨格、糖−リン酸、または糖リン酸／スルホン酸骨格を含むことができる。同様に、企図される配列中の塩基は、天然の核酸塩基（例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル）であるが、天然に存在する塩基と安定なまたは不安定な水素結合を作る非天然塩基（例えば、イノシン、イソ−Ｃ、イソ−Ｇ、ＰＩＣＳ、３ＭＮ、３ＦＢ、ＭＩＣＳなど）でもあり得る。さらに、適切なオリゴヌクレオチドは、１以上の位置において縮重塩基を有するか、またはミスマッチを可能にする塩基を有してもよいことに留意すべきである。もちろん、核酸塩基のすべてが、必要に応じて、放射性同位元素または他の同位体（例えば、ＮＭＲ活性標識）を含むことに留意すべきである。同様に、好ましくはないが、骨格が１以上の標識部分を含んでよいことも企図される。
【００３１】
該オリゴヌクレオチドは、オリゴの単一タイプ、典型的にはＤＮＡオリゴマーであることがさらに企図される。しかしながら、ＲＮＡオリゴマーまたは混合型のオリゴマーはまた、本明細書で使用するのに適すると考えられる。さらに、適切なオリゴマーは、親和性マーカー（例えば、ビオチン）、または直接的（例えば、蛍光団、放射性同位元素）もしくは間接的に識別および／または定量するための他の標識を有するものを含むことに留意すべきである。
【００３２】
典型的な例では、多重検出が所望される場合、キットは、ＰＣＲまたはＬＣＲ反応を介して増幅産物またはライゲーション産物を生成するのに適するオリゴヌクレオチドの少なくとも１対を含む。容易に理解されるように、そのような対は、ウイルスの特定の株もしくは血清型に特異的であるか、または複数の株もしくは血清型を網羅するように選択される。オリゴヌクレオチドの複数の対が使用される場合、そのような対は、ウイルス標的および／または増幅産物間で最小の交差反応性を有するか、または交差反応性が全くないように選択されることが一般的に企図され、そのような対は、多重反応において同時に使用することができる。その点では、多重ＰＣＲまたはＬＣＲは、特に、異なるウイルス（例えば、エボラウイルスおよびインフルエンザＡウイルス）の特異的配列を標的とするオリゴの対を使用して実行される。
【００３３】
ウイルスの複数の株を網羅するために、オリゴヌクレオチドがウイルスゲノム（例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ開始構造）の高度に保存された領域を標的とし、類似またはさらには同一の融点を有することが特に好ましい。したがって、本発明者らは、選択されたウイルスを容易に識別するためのカスタムアセンブルキットで使用することができるオリゴヌクレオチドの選択を企図する。例示的な配列および組成物は、以下でより詳細に示されている。上記の例は、本発明の主題の多くの例示的な実施形態を提供する。各実施形態は、本発明の要素の単一の組み合わせを表しているが、本発明の主題は、開示された要素の全ての可能な組み合わせを含むと考えられる。このように、一実施形態が要素Ａ、Ｂ、およびＣを含み、第２の実施形態が要素ＢおよびＤを含む場合、明示的に開示されなくとも、本発明の主題はまた、Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤの他の残りの組み合わせを含むことも考えられる。
【００３４】
コンピュータへ指示される任意の言語は、個々にもしくは共同で動作するサーバ、インタフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、制御装置、またはコンピューティングデバイスの他のタイプを含むコンピューティングデバイスの任意の適切な組み合わせを含むように読まれるべきであることに留意すべきである。該コンピューティングデバイスは、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に格納されたソフトウェア命令を遂行するように構成されたプロセッサを含むことを理解すべきである。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示された装置に関連して以下に説明するように、役割、責任、または他の機能を提供するコンピューティングデバイスを構成する。さらに、開示された技術は、コンピュータベースのアルゴリズム、プロセス、方法、または他の命令の実装と関連付けられる開示された手順をプロセッサに遂行させるソフトウェア命令を格納する非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として具体化することができる。いくつかの実施形態において、様々なサーバ、システム、データベース、またはインタフェースは、おそらくＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開鍵と秘密鍵の交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコル、もしくは他の電子情報の交換方法に基づいて標準化されたプロトコルまたはアルゴリズムを使用してデータを交換する。デバイス間のデータ交換は、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、またはパケット交換ネットワークの他の種類；回路交換ネットワーク；セル交換ネットワーク；または他の種類のネットワーク上で行うことができる。
【００３５】
既に説明したものの他に、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく多くの変更が可能であることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の趣旨を除いて限定されるものではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際、すべての用語は、文脈と一致する最も広い可能な方法で解釈されるべきである。特に、用語「含む」および「含んでいる」は、非排他的な方法で要素、構成要素、もしくは工程を指すものとして解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素、もしくは工程が存在するか、または利用されるか、または明確に参照されていない他の要素、構成要素、もしくは工程と組み合わされ得ることを示す。さらに、本明細書の説明および以下の特許請求の範囲で使用される場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その」の意味は、特に文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用さる場合、「における（ｉｎ）」の意味は、特に文脈が明確に指示しない限り、「における（ｉｎ）」および「についての（ｏｎ）」を含む。最後に、本明細書の特許請求の範囲は、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、文脈は、ＡプラスＮ、またはＢプラスＮなどではない群からの１つの要素のみを必要とするものと解釈されるべきである。
【００３６】
本出願は以下の発明をも含む。
（１）
２種類の不特定の病原体の鑑別用のプライマーの集合を取得する方法であって、
前記不特定の病原体の各々は異なるウイルスファミリーに属し、各ウイルスファミリーは、複数の異なるウイルスの種および血清型を含み、
前記それぞれ異なるウイルスファミリーのウイルスの種および血清型の複数のゲノムについてそれぞれの複数の配列アラインメントを実行し、前記異なるウイルスファミリーの各々についてのアラインメント結果を生成すること；
（ｉ）最小閾値を超える相同性、
（ｉｉ）最小閾値を超える長さ、および
（ｉｉｉ）最小閾値を超える融解温度
を有するそれぞれのコンセンサス配列を各アラインメント結果において識別すること；
前記異なるウイルスファミリーについてそれぞれ調整されたアラインメント結果の中に識別されたコンセンサス配列を収集すること；
前記それぞれ調整されたアラインメント結果の配列から、ヒト配列およびヒトを宿主とする配列に対する最小相同性を用いて除去を行い、それぞれのウイルス特異的アラインメント結果を形成すること；
前記ウイルス特異的アラインメント結果上で差集合解析を実行し、前記不特定の病原体に対するコンセンサス配列のそれぞれの集合を取得すること；ならびに、
プライマー配列を前記コンセンサス配列のそれぞれの集合から選択すること
を含む方法。
（２）
前記複数の配列アラインメントが、クラスタルＸ、クラスタルＷ、またはクラスタルオメガを使用して実行される、（１）に記載の方法。
（３）
前記相同性の最小閾値が少なくとも９７％である、（１）に記載の方法。
（４）
前記相同性の最小閾値が１００％である、（１）に記載の方法。
（５）
前記長さの最小閾値が少なくとも１５塩基である、（１）に記載の方法。
（６）
前記長さの最小閾値が少なくとも２５塩基である、（１）に記載の方法。
（７）
前記融解温度の最小閾値が少なくとも６０℃である、（１）に記載の方法。
（８）
前記融解温度の最小閾値が少なくとも６５℃である、（１）に記載の方法。
（９）
前記長さの最小閾値が少なくとも２０塩基であり、前記相同性の最小閾値が少なくとも９７％であり、前記融解温度の最小閾値が少なくとも６０℃である、（１）に記載の方法。
（１０）
前記コンセンサス配列間の相同性が、塩基単位の増加によって決定される、（１）に記載の方法。
（１１）
前記コンセンサス配列の長さは、可変であり、前記所望の融解温度を達成するために、前記最小閾値を上回って選択される、（１）に記載の方法。
（１２）
前記プライマー配列を選択する工程が、前記異なるファミリー用のアンプリコンが少なくとも１００塩基の長さの差を有するように実行される、（１）に記載の方法。
（１３）
前記除去工程がＢｌａｓｔＮを用いて実行される、（１）に記載の方法。
（１４）
前記ヒト配列およびヒトを宿主とする配列に対する最小相同性が、少なくとも９０％である、（１）に記載の方法。
（１５）
前記ヒトを宿主とする配列が、前記ヒトに存在することが知られているか、または疑われるウイルス配列である、（１）に記載の方法。
（１６）
前記差集合解析が、差集合および和集合演算を使用して実行される、（１）に記載の方法。
（１７）
前記プライマー配列が、１００〜８００塩基の長さを有するアンプリコンを生成するように選択される、（１）に記載の方法。
（１８）
前記不特定のウイルスが、２つの異なる系統発生の順序に属する、（１）に記載の方法。
（１９）
さらに、ウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを生成するためにプライマー配列を決定する工程を含む、（１）に記載の方法。
（２０）
前記プライマーの集合が、前記不特定の病原体の各々について１〜５対のプライマーを含む、（１）に記載の方法。
【図１】
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