(57)【要約】      （修正有）【課題】癌細胞等での抗原消失エスケープ変異体の出現による免疫療法治療の失敗を防ぐ又は最小化する免疫療法の提供。【解決手段】（ａ）少なくとも２つの異なる抗原に結合する抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含む抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体であり、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）等の治療用制御物質と共発現させる二重特異性キメラ抗原受容体の提供。【選択図】図１
2019088330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ８α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１６】
癌に特異的な前記抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１７】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１−ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１８】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１９】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２０】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２１】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２２】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン−１−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２３】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項２４】
請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体と、治療用制御物質との組み合わせ。
【請求項２５】
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の組み合わせ。
【請求項２６】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかのうちの１つまたは複数に結合する、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項２７】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項２８】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項２９】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項２４に記載の組み合わせ。
【請求項３０】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項２９に記載の組み合わせ。
【請求項３１】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項２９に記載の組み合わせ。
【請求項３２】
請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体または請求項２４に記載の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項３６】
ＲＮＡウイルスである、請求項３５に記載のウイルス。
【請求項３７】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項３５に記載のウイルス。
【請求項３８】
請求項３２に記載のポリヌクレオチド、請求項１に記載のキメラ抗原受容体、または請求項２４に記載の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
【請求項３９】
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）である、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４０】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項４２】
ａ．請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体、請求項２４に記載の組み合わせ、請求項３２に記載のポリペプチド、請求項３４に記載のベクター、請求項３５に記載のウイルス、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項４２に記載の薬学的組成物と、
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
【請求項４４】
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２'−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５−フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（５−ＦＣ）、５−（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６−チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（アラ−Ｔ））、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数である、請求項４３に記載の組み合わせ。
【請求項４５】
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）請求項３４に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
【請求項４６】
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）請求項４２に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
【請求項４７】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項４８】
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項４９】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５０】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４８に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５１】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４８に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５２】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５３】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項５２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５４】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項５２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５５】
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５６】
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域、ならびに（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項５５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５７】
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５８】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ８α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項５７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項５９】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６１】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６２】
癌に特異的な前記抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６３】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１−ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６４】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６５】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６６】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６７】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６８】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン−１−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項６９】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項に６１記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項７０】
請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体と、ＥＧＦＲｔとの組み合わせ。
【請求項７１】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項７０に記載の組み合わせ。
【請求項７２】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記ＥＧＦＲｔが、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項７０に記載の組み合わせ。
【請求項７３】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項７２に記載の組み合わせ。
【請求項７４】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項７２に記載の組み合わせ。
【請求項７５】
請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体または請求項７０に記載の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７６】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項７７】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７８】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項７９】
ＲＮＡウイルスである、請求項７８に記載のウイルス。
【請求項８０】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項７８に記載のウイルス。
【請求項８１】
請求項７５に記載のポリヌクレオチド、請求項４７に記載のキメラ抗原受容体、または請求項７０に記載の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
【請求項８２】
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）である、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項８３】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項８２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項８４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項８５】
ａ．請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体、請求項７０に記載の組み合わせ、請求項７６に記載のポリペプチド、請求項７７に記載のベクター、請求項７８に記載のウイルス、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項８６】
請求項８５に記載の薬学的組成物と、
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
【請求項８７】
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２'−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５−フルロシトシン（５−ＦＣ）、５−（アザリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６−チオグアニン、合成二量体化薬（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（アラ−Ｔ））、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数である、請求項８６に記載の組み合わせ。
【請求項８８】
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）請求項７７に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
【請求項８９】
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）請求項８５に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
【請求項９０】
図４、９、または１１に記載される配列を含む、二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９１】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ８α膜貫通ドメイン、
ｄ．４−１ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ２Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９２】
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９３】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９４】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９５】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９６】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９７】
癌に特異的な前記抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９８】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１−ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項９９】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１００】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１０１】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１０２】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１０３】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン−１−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項１０４】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体およびそれを使用する遺伝子改変細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の免疫療法は、癌細胞上の単一抗原を標的とするように設計されている。しかしながら、例えば、癌細胞は不安定であり、一部の細胞はもはや標的抗原を有していない場合がある。抗原消失エスケープ変異体（ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｏｓｓ  ｅｓｃａｐｅ  ｖａｒｉａｎｔ）と称されるこれらの細胞は、療法による破壊を回避し、成長し続け、野放しに蔓延し得る。ゆえに、当該技術分野において、癌および他の疾患における治療の失敗を防ぐか、または最小化する療法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体を提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、治療用制御物質と共発現される。
【０００４】
一実施形態において、本発明は、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせをさらに提供し、ここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する。
【０００５】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体をさらに提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、（ｄ）４−１ＢＢ共刺激ドメイン、および（ｖｉ）ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体をさらに提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、ここで、その二重特異性キメラ抗原受容体はＥＧＦＲｔと共発現され、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔは、Ｔ２Ａリンカーを介して連結されている。
【０００７】
一実施形態において、上述の二重特異性キメラ抗原受容体、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせ、二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリペプチド、二重特異性キメラ抗原受容体を含むベクター、ウイルス、および遺伝子改変細胞、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせを含むベクター、ウイルス、および遺伝子改変細胞、またはそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物がまた提供される。
[本発明1001]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1002]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1003]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1004]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1005]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ−7Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−7Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1006]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1007]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1006の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1008]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1007の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1009]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1010]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1009の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1011]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1012]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1011の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1013]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4−1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ−1、ＬＦＡ−1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1014]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1015]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1016]
癌に特異的な前記抗原が、4−1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ−125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ−4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ−1受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1−ＣＡＭ、ＩＬ−13、ＩＬ−6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ−009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−1Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ  900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ−72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ1、ＴＲＡＩＬ−Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1017]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1−ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1018]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1019]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ−1）、ＣＡＭ−3001、ＣＣＬ11（エオタキシン−1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ−2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−1、ＩＬ−12、ＩＬ−23、ＩＬ−13、ＩＬ−17、ＩＬ−17Ａ、ＩＬ−22、ＩＬ−4、ＩＬ−5、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＩＬ−6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ−528、ミオスタチン、ＯＸ−40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1020]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1021]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1022]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン−1−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1023]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1024]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体と、治療用制御物質との組み合わせ。
[本発明1025]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1026]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかのうちの1つまたは複数に結合する、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1027]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1028]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ−7Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−7Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1029]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1030]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1031]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1032]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1024の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1033]
本発明1032のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1035]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1036]
ＲＮＡウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1037]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1038]
本発明1032のポリヌクレオチド、本発明1001のキメラ抗原受容体、または本発明1024の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1039]
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1040]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1039の遺伝子改変細胞。
[本発明1041]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1042]
ａ．本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1024の組み合わせ、本発明1032のポリペプチド、本発明1034のベクター、本発明1035のウイルス、本発明1038の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1043]
本発明1042の薬学的組成物と、
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1044]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）−5−（2−ブロモビニル）−2'−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5−フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（5−ＦＣ）、5−（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）−1−イル）−2，4−ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6−チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（アラ−Ｔ））、インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1043の組み合わせ。
[本発明1045]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1034のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1046]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1042の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1047]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1048]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1049]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1050]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1051]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ−7Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−7Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1052]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1053]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1054]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1055]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1056]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、ならびに（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1055の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1057]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1058]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1057の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1059]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4−1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ−1、ＬＦＡ−1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1060]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1061]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1062]
癌に特異的な前記抗原が、4−1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ−125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ−4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−1受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1−ＣＡＭ、ＩＬ−13、ＩＬ−6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ−009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−1Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ  900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ−72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ1、ＴＲＡＩＬ−Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1063]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1−ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1064]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1065]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ−1）、ＣＡＭ−3001、ＣＣＬ11（エオタキシン−1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ−2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−1、ＩＬ−12、ＩＬ−23、ＩＬ−13、ＩＬ−17、ＩＬ−17Ａ、ＩＬ−22、ＩＬ−4、ＩＬ−5、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＩＬ−6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ−1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ−528、ミオスタチン、ＯＸ−40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1066]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1067]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1068]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン−1−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1069]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1070]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体と、ＥＧＦＲｔとの組み合わせ。
[本発明1071]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1072]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記ＥＧＦＲｔが、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1073]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1074]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1075]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1070の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1076]
本発明1075のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1077]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1078]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1079]
ＲＮＡウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1080]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1081]
本発明1075のポリヌクレオチド、本発明1047のキメラ抗原受容体、または本発明1070の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1082]
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1083]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1082の遺伝子改変細胞。
[本発明1084]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1085]
ａ．本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1070の組み合わせ、本発明1076のポリペプチド、本発明1077のベクター、本発明1078のウイルス、本発明1081の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1086]
本発明1085の薬学的組成物と、
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1087]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）−5−（2−ブロモビニル）−2'−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5−フルロシトシン（5−ＦＣ）、5−（アザリジン−1−イル）−2，4−ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6−チオグアニン、合成二量体化薬（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（アラ−Ｔ））、インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1086の組み合わせ。
[本発明1088]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1077のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1089]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1085の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1090]
図4、9、または11に記載される配列を含む、二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1091]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．ＣＤ8αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ8α膜貫通ドメイン、
ｄ．4−1ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ2Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1092]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−3−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1093]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1094]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1095]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ−7Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−7Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ−7サイトカイン−リンカー−ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1096]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1097]
癌に特異的な前記抗原が、4−1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ−125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ−4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−1受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1−ＣＡＭ、ＩＬ−13、ＩＬ−6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ−009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−1Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ  900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ−72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ1、ＴＲＡＩＬ−Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1098]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1−ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1−ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1−ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1099]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1100]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ−1）、ＣＡＭ−3001、ＣＣＬ11（エオタキシン−1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ−2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−1、ＩＬ−12、ＩＬ−23、ＩＬ−13、ＩＬ−17、ＩＬ−17Ａ、ＩＬ−22、ＩＬ−4、ＩＬ−5、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＩＬ−6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ−1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ−528、ミオスタチン、ＯＸ−40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ−Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1101]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1102]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ−1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1103]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン−1−ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1104]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ−α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
例となる実施形態が、参照図面中に例示されている。本明細書に開示される実施形態および図面は、限定ではなく例示であると考えられることが意図される。
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態に従う、本発明のキメラ抗原受容体の略図を示す。ＡＳＴＲは抗原特異的標的指向領域であり、Ｌはリンカーであり、ＥＳＤは細胞外スペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＣＳＤは共刺激ドメインであり、ＩＳＤは細胞内シグナル伝達ドメインである。
【図２】本発明の一実施形態に従う、（ａ）抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲの成分、および（ｂ）ｅｐＨＩＶ−７  レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにパッケージ化された完全ｃＤＮＡを示す。
【図３】本発明の一実施形態に従う、二重特異性ＣＡＲ  ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列を示す。
【図４−１】本発明の一実施形態に従う、二重特異性ＣＡＲ  ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４−２】図４−１の続きを示す図である。
【図４−３】図４−２の続きを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に従う、ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−ＣＤ３ζ導入遺伝子構築物を示す。
【図６】本発明の一実施形態に従う、外因性γｃ非依存性成長を支持するためのＣγＣＲプラットフォームの発生を示す。（ａ）野生型対キメラサイトカイン受容体の概略図。ＩＬ−７Ｒα構成的サイトカイン受容体（ＣγＣＲ７）は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して完全長ヒトＩＬ−７Ｒα鎖につながれたヒトＩＬ−７サイトカインから成る。ＩＬ−２Ｒβ構成的サイトカイン受容体（ＣγＣＲ２）は、ＩＬ−７Ｒα細胞内シグナル伝達ドメインがヒトＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ細胞質ドメインで置換されていることを除いて、ＣγＣＲ７と同一である。（ｂ）発現構築物ＣγＣＲ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔの図。
【図７】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＩｇＧ４のヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質ドメインを含む主鎖ＣＡＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ｈｕＩｇＧヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／ＣＤ２８ｃｙｔｏ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの核酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図９−１】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ｈｕＩｇＧヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／ＣＤ２８ｃｙｔｏ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図９−２】図９−１の続きを示す図である。
【図９−３】図９−２の続きを示す図である。
【図９−４】図９−３の続きを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８αｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔの核酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図１１−１】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８αｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図１１−２】図１１−１の続きを示す図である。
【図１１−３】図１１−２の続きを示す図である。
【図１１−４】図１１−３の続きを示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔの核酸配列を示す。
【図１３−１】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１３−２】図１３−１の続きを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書に引用されるすべての参照物は、完全に明記されるかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を提供する。
【００１１】
当業者は、本発明の実践において使用され得る、明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を理解するであろう。実際に、本発明は、記載の方法および材料には全く限定されない。本発明の目的に対して、以下の用語が下記に定義される。
【００１２】
本明細書に記載の発明は、キメラ抗原受容体を提供する。キメラ抗原受容体は、免疫特異性を遺伝子改変細胞に移植する改変受容体である。単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が多重抗原に対する特異性を持つことによって、様々な利益を達成することができ、とりわけ、１患者あたり多数種のＴ細胞生成物を作製することと比べて労力が著しく減少することが挙げられる。
【００１３】
定義
キメラ抗原受容体の成分
本明細書で使用される場合、「抗原特異的標的指向領域」（ＡＳＴＲ）は、特定の抗原を標的とするＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする少なくとも２つの標的指向領域を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも３つ以上の異なる抗原を標的とする３つ以上の標的指向領域を含む。ＣＡＲ上の標的指向領域は、細胞外である。いくつかの実施形態において、抗原特異的標的指向領域は、抗体またはその機能的等価物またはそのフラグメントまたはその誘導体を含み、標的指向領域のそれぞれは、異なる抗原を標的とする。標的指向領域は、そのそれぞれが標的抗原に特異的である、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含み得る。しかしながら、そのそれぞれが本発明の様々な実施形態において使用され得る、結合サイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識をもたらす）、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質／ペプチドリガンド、ペプチド、および免疫応答を促すためのワクチン等の多数の代替物が存在する。実際に、当業者に理解されるように、高い親和性で所与の抗原に結合するほぼすべての分子が、抗原特異的標的指向領域として使用され得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせ等のＴ細胞）に移植する改変受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、少なくとも２つの異なる抗原を標的とし、直列に配列され、リンカー配列によって分離され得る。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは任意である。別の実施形態において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）は、メモリー細胞の増殖、生存、および／または発生を増強するＣＡＲの部分を指す。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。（例えば、他のタンパク質由来の）他の共刺激ドメインが、当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「細胞外スペーサードメイン」（ＥＳＤ）は、抗原特異的標的指向領域と膜貫通ドメインとの間の親水性領域を指す。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含む。他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含まない。その細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃフラグメント、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８αヒンジ、ならびに、例えばＧｌｙ３程小さくてもよい、ポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１およびＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、または（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域のいずれか１つまたは複数である。他の細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）または「細胞質ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示する、ＣＡＲの部分を指す。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例には、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。他の細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「リンカー」（Ｌ）または「リンカードメイン」または「リンカー領域」は、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１〜１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合、より長いリンカーが使用され得る。リンカーは、切断可能であってもよく、または切断可能でなくてもよい。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはそれらの機能的等価物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーには、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、変異体、および機能的等価物が挙げられる。他の実施形態において、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間に切断をもたらす、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（２Ａ）−Ｐｒｏ（２Ｂ）モチーフを含んでもよい。他のリンカーが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）は、細胞膜を横断するＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。他の膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００２０】
その他
本明細書で使用される場合、「抗原消失エスケープ変異体」は、標的抗原の発現の低減または消失を示す細胞を指し、それらの抗原は、本発明のＣＡＲによって標的とされる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞関連疾患」は、Ｂ細胞免疫不全、自己免疫性疾患、ならびに／またはＢ細胞と関連している過剰／無制御細胞増殖（リンパ腫および／もしくは白血病を含む）を含む。本発明の二重特異性ＣＡＲが治療手段として使用され得る、そのような疾患の例には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、反応性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性甲状腺疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、プレＢ急性リンパ芽球性白血病、全身性エリテマトーデス、分類不能型免疫不全、慢性リンパ性白血病、選択的ＩｇＡ欠乏および／またはＩｇＧサブクラス欠乏と関連している疾患、Ｂ細胞系リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、胸腺腫を伴う免疫不全、一過性低ガンマグロブリン血症および／または高ＩｇＭ症候群、ならびにＥＢＶ媒介性リンパ増殖性疾患等のウイルス媒介性Ｂ細胞疾患、およびＢ細胞が病態生理に関与する慢性感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
「有益な結果」には、疾患状態の重症度を緩和するか、もしくは軽減する、疾患状態が悪化するのを防ぐ、疾患状態を治癒する、疾患状態を発症するのを防ぐ、患者が疾患状態を発症する機会を低減する、および患者の寿命もしくは寿命の予想値を伸ばすことが含まれるが、これらには全く限定されない。
【００２３】
「癌」および「癌性」とは、典型的には、制御されていない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指すか、または述べる。癌の例には、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、ならびにアンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むがこれらに限定されない前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「共発現」は、２つ以上の遺伝子の同時の発現を指す。遺伝子は、例えば、単一のタンパク質または単一のポリペプチド鎖としてのキメラタンパク質をコードする核酸であり得る。例えば、本発明のＣＡＲは、治療用制御物質（例えば、トランケート型上皮成長因子（ＥＧＦＲｔ））と共発現され得、ＣＡＲは、第１のポリヌクレオチド鎖でコードされ、治療用制御物質は、第２のポリヌクレオチド鎖でコードされる。一実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチド鎖は、切断可能なリンカーをコードする核酸配列によって連結される。ＣＡＲおよび治療用制御物質系をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列によって連結される。代替的に、ＣＡＲおよび治療用制御物質は、リンカーを介して連結されていないが、代わりに例えば、２つの異なるベクターによってコードされている、２つの異なるポリヌクレオチドによってコードされる。さらに、本発明のＣＡＲは、治療用制御物質およびＣＣＲ、治療用制御物質およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）、または治療用制御物質およびＣＣＲおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現され得る。ＣＡＲ、治療用制御物質、およびＣＣＲは、共発現され、それぞれ、第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、その第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。ＣＡＲ、治療用制御物質、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）は、共発現され、第１、第２、および第４のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、それぞれ、その第１、第２、および第４のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列を介して、または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。ＣＡＲ、治療用制御物質、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）は、共発現され、それぞれ、第１、第２、第３、および第４のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、その第１、第２、第３、および第４のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。前述の配列が別々のベクターによってコードされる場合、これらのベクターは、同時に、または連続してトランスフェクトされ得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「状態」、「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、「疾患」、および「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）」は、患部細胞が、例えば、患部細胞上の特異抗原に対する抗体を発現する本発明のＣＡＲによって標的とされ得る、生理学的状態を含む。標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞（ＣＤ１９およびＣＤ２０）上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾細胞によって標的とされる疾患」は、治療的に有益な結果を実現するように遺伝子修飾細胞が患部細胞または健常な細胞を標的とするかどうかに関係なく、本発明の遺伝子修飾細胞によって、任意の疾患における任意の手段に関与する任意の細胞が標的とされることを包含する。遺伝子修飾細胞には、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞、または胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子修飾細胞は、本発明のＣＡＲを発現し、そのＣＡＲは、標的細胞の表面上で発現される抗原のいずれかを標的とし得る。標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、および芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的とされ得る他の抗原が当業者に明白であり、それらの代替の実施形態に関連して本発明のＣＡＲによって標的とされ得る。
【００２７】
「エフェクター機能」は、分化した細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾細胞」、「再配向細胞（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」、「遺伝子改変細胞」、または「修飾細胞」は、本発明のＣＡＲを発現する細胞を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、貪食細胞、形質細胞、およびＴ細胞を含むが、これらに限定されない、哺乳類免疫系の細胞を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、先天免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、後天（適応）免疫、自己免疫、および／または過活動免疫（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を含むが、これらに限定されない、免疫を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「哺乳類」は、限定されることなく、ヒトおよび非ヒト霊長動物、例えばチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ等の家畜動物；イヌおよびネコ等の飼育哺乳動物；マウス、ラット、モルモット等の齧歯動物を含む実験動物を含む、哺乳綱の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。このため、成体および新生児の対象、ならびに胎児は、雄性または雌性にかかわらず、本用語の範囲内に含まれることが意図される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、および／またはｔＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「裸のＤＮＡ」は、発現に適切な配向で好適な発現ベクター内にクローン化されたＣＡＲをコードするＤＮＡを指す。使用され得るウイルスベクターには、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）もしくはインテグラーゼ系のベクターシステムが含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る他のベクターが、当業者に明白である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「単鎖可変フラグメント」、「単鎖抗体可変フラグメント」、または「ｓｃＦｖ」抗体は、リンカーペプチドで結合された重鎖および軽鎖のみの可変領域を含む、抗体の形態を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、一疾患に関与し、本発明の遺伝子修飾細胞（遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない）によって標的とされ得る細胞を指す。他の標的細胞が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００３６】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、互いに交換可能であり、本明細書において同義的に使用される。例には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「治療剤」は、例えば、疾患を、治療する、阻害する、防ぐ、その影響を軽減する、その重症度を低減する、発症の可能性を低減する、その進行を緩徐にする、および／またはそれを治癒するために使用される薬剤を指す。治療剤によって標的とされる疾患には、限定されないが、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫が含まれ、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療用制御物質」は、細胞増殖を制御する、細胞選択（例えば、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を選択する）を促進する、細胞トラッキングを促進する、またはそれらの組み合わせを行う作用物質を指す。１つの実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を促進するように細胞増殖を上方制御することを含む。別の実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を減少させるか、または阻害するように細胞増殖を下方制御することを含む。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、治療的利点をもたらし得る二重特異性キメラ抗原受容体を発現する細胞の濃縮を促進し得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「形質導入」は、ウイルスベクターを使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、組換えＤＮＡ技術を使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ配列の、宿主細胞への導入を意味し、その導入遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素等の望ましい物質を産生させるように、宿主細胞にその導入遺伝子または配列を発現させるようにする。導入遺伝子または配列はまた、「クローン化された」または「外来」遺伝子または配列と呼ばれてもよく、細胞の遺伝子機構によって使用される、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、または他の配列等の制御性または調節配列を含み得る。遺伝子または配列は、非機能性配列または機能不明の配列を含み得る。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受容しかつ発現する宿主細胞は、「形質転換され」ており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、その宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含む、任意の源に由来し得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療」および「治療する」は、そこで対象が、たとえその治療が最終的に不成功であったとしても、標的とされる病態を防ぐか、もしくは鈍化（緩和）させる、病態を防ぐ、有益な結果を探究するか、もしくは得る、あるいは個体のその状態を発症する可能性を低下させることを目的とした、治療的処置および予防的もしくは予防手段の両方を指す。治療を必要とする者には、既にその状態を有している者、ならびにその状態を有し易い者、またはその状態が防がれるべき者が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、媒介物であって、これにより、宿主を形質転換しかつ導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得る、媒介物を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
【００４４】
本発明の説明
キメラ抗原受容体
いかなる前提によっても限定されることは望まないが、本発明のキメラ抗原受容体（例えば、二重特異性ＣＡＲ）は、例えば、単一の抗原が標的とされる場合、種々の療法の経過中に生じ得る抗原消失エスケープ変異体の成長による従来の治療的失敗を克服し得ると考えられる。したがって、本発明は、とりわけ、ＣＡＲをコードする核酸配列およびアミノ酸配列、ＣＡＲを含むベクター、ＣＡＲを含むウイルス、ＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞（再配向細胞）、ならびにそれらを作製し使用する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。他の実施形態において、ＣＡＲは、３つ以上の異なる抗原を標的とし、結合する。
【００４５】
一般的な実施形態において、本発明は、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸配列、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸を含むベクター、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むウイルス、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する宿主細胞（遺伝子修飾細胞等）、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）および治療用制御物質の組み合わせ、ならびにＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を治療剤として作製し、使用する方法に関する。
【００４６】
本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする。ＣＡＲ（二重特異性ＣＡＲ等）は、治療用制御物質、例えば、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、および／またはジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される。ＣＡＲおよび治療用制御物質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列を介して、または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を介して、連結され得る。本発明のＣＡＲは、それらが細胞内で発現され、次にその細胞が、少なくとも１つの抗原特異的標的指向領域と相互作用する少なくとも１つの分子の存在、例えば抗原の存在に応じて増殖し得るように、構築される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲとともに使用するための治療用制御物質は、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、またはＡＰ１９０３／Ｆａｓ系のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳ配列を介してＥＧＦＲｔに連結される。別の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳ配列を介してＥＧＦＲｔに連結される。
【００４８】
本明細書に記載のＣＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成され得、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。この実施形態において、抗原特異的標的指向領域はＮ末端にあり、直列に配列され、リンカーペプチドによって分離されている。抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインに連結される細胞外スペーサードメインに連結される。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに連結される。共刺激ドメインは、Ｃ末端の細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。１つを超える共刺激ドメインが使用される場合、複数の共刺激ドメインは、そのＮ末端で膜貫通ドメインと、およびそのＣ末端で細胞内シグナル伝達ドメインと直列に配列され得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型膜貫通タンパク質としてＣＡＲを細胞表面に方向付けるＮ末端シグナル配列をさらに含み得る。抗原特異的標的指向領域は、細胞外に面していてよく、細胞内シグナル伝達ドメインは細胞質内であってよい。
【００４９】
図１は、本発明のキメラ抗原受容体の略図を示す。
【００５０】
一実施形態において、ＣＡＲ中の細胞外スペーサードメインは任意である。そのようなＣＡＲにおいて、抗原特異的標的指向領域はＮ末端にあり、直列に配列され、リンカーペプチドによって分離されている。抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインに連結され得る。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに連結され得る。共刺激ドメインは、Ｃ末端の細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。１つを超える共刺激ドメインが使用される場合、複数の共刺激ドメインは、直列に配列され得、そのＮ末端に膜貫通ドメイン、およびそのＣ末端に細胞内シグナル伝達ドメインがある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型膜貫通タンパク質としてＣＡＲを細胞表面に方向付けるＮ末端シグナル配列をさらに含み得る。抗原特異的標的指向領域は、細胞外に面していてよく、細胞内シグナル伝達ドメインは細胞質内であってよい。
【００５１】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的指向領域
本発明のＣＡＲは、いくつかの（２つ以上、３つ以上等）異なる抗原を標的とし得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲであり、２つの異なる抗原を標的とする。上述のように、ＣＡＲの抗原特異的標的指向領域は、直列に配列され得、リンカーペプチドによって分離され得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、単一の患部細胞（癌性Ｂ細胞等）上の抗原、またはそれぞれが疾患に寄与する別々の細胞上で発現される抗原であり得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的のいずれかで関与する抗原である。
【００５２】
二重特異性ＣＡＲにおいて、少なくとも２つの異なる抗原特異的抗体またはそのフラグメントもしくはその誘導体は、抗原特異的標的指向領域内にクローン化され得る。抗体は、任意の、しかし少なくとも２つの別個の最適な抗原に特異的であり得る。抗原に特異的な抗体は、抗体のＦａｂフラグメントまたは抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００５３】
例えば、図２は、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的なＣＡＲを描写する本発明の一実施形態を示す。当業者によく知られている方法を使用して、複数の、少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、以下に記載される遺伝子修飾細胞によって標的とされ得る細胞上で標的抗原が発現される限り、ＩｇＧ４−ＣＤ２８−ζドメインの上流に（すなわち、Ｎ末端に）クローン化される。そのような技術が文献において完全に説明される。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の学術誌における研究書）。
【００５４】
１つの実施形態において、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異性を与えるのにＶＨドメイン単独で十分である場合（「単一ドメイン抗体」）、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ならびにＣＨ２およびＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する完全長ＩｇＧ重鎖（標的抗原に特異的）を含む。完全長ＩｇＧ重鎖は、適切な膜貫通ドメインを介して、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。完全に活性である抗原特異的標的指向領域を生成するためにＶＨおよびＶＬドメインの両方が必要な場合、ＶＨ含有ＣＡＲおよび完全長ラムダ軽鎖（ＩｇＬ）の両方が、活性の抗原特異的標的指向領域を生成するために細胞に導入される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。細胞には、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
別の実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、それぞれが異なる標的抗原に特異的である、少なくとも２つの単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、その中で１つの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端がポリペプチドリンカーを介して、他方（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）のＮ末端につながれており、ｓｃＦｖは、抗原の結合または結合の特異性を著しく破壊することなく発達してきた。（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ．１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９４９１、Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．１９９０  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８６１５）。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に結合する。これらのｓｃＦｖは、自然抗体の重鎖および軽鎖中にある定常領域（Ｆｃ）を欠く。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、直列に配列され、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合領域と膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００５６】
別の態様において、各ｓｃＦｖフラグメントは、重鎖の定常ドメインのすべて、または一部に融合され得る。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、結果として生じる抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００５７】
さらなる実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））単鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ−ｓｃＦＶを含むＣＡＲにおいて、各抗原に特異的な２つのｓｃＦｖは、直列ｓｃＦｖをもたらす２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域をもつ単一ペプチド鎖を生成することによって、一緒に連結される。（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ−Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，ＸＢ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＧＬ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＳＪ（２００６）．"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＭＵＣ−１  ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉ−ｓｃＦｖ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ"．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １９（８）：３５９−３６７、Ｋｕｆｅｒ，Ｐｅｔｅｒ；Ｌｕｔｔｅｒｂuｓｅ，Ｒａｌｆ；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａ．（２００４）．"Ａ  ｒｅｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４）。少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を含むＣＡＲは、２つの抗原のそれぞれに特異的な２つのｓｃＦｖを発現することになる。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、結果として生じる抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【００５８】
さらなる実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、ダイアボディを含む。ダイアボディにおいて、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒に折り重なるには短すぎるリンカーペプチドを用いて作製され、ｓｃＦｖを二量体化させる。さらにより短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）またはトリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）の形成をもたらす。テトラボディ（Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もまた使用され得る。
【００５９】
本発明のＣＡＲを作製するために、２つ以上の個々の抗原特異的標的指向領域は、単一のタンパク質分子上で共有結合的または非共有結合的のいずれかで互いに結合される。オリゴまたはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジまたは膜ヒンジ領域は、これらのドメインを互いに結合するために使用され得る。本発明のＣＡＲは、異なる組み合わせでともに結合される異なる抗原特異的標的指向領域のうちの２つ以上を含み得る。例えば、免疫グロブリン配列（例えば、ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体）を含む２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、互いに連結され得る。
【００６０】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的指向領域の標的
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）の抗原特異的標的指向領域は、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、またはそれらの組み合わせに特異的な抗原を標的とする。本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）によって標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも２つの異なる標的抗原に特異的な本発明のＣＡＲは、発現細胞のエフェクター機能を両標的抗原のいずれかに向け直すことが可能であり得る。構築物のこの特徴は、例えば、遺伝的に不安定なＢ細胞系悪性腫瘍を、単一の抗原特異性を使用して標的とする際の、抗原消失エスケープ変異体の問題を克服し得る。
【００６１】
本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）によって標的とされ得る癌に特異的な抗原には、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、またはビメンチンのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。癌に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、二重特異性キメラ抗原受容体は、少なくとも２つの異なる抗原を標的とし、結合する。本発明の二重特異性ＣＡＲによって結合される少なくとも２つの抗原の対の例には、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ１９およびＣＤ２２、ＣＤ２０およびＬ１−ＣＡＭ、Ｌ１−ＣＡＭおよびＧＤ２、ＥＧＦＲおよびＬ１−ＣＡＭ、ＥＧＦＲおよびＣ−ＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、Ｃ−ＭＥＴおよびＨＥＲ２、ならびにＥＧＦＲおよびＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。癌に特異的な抗原の他の対が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。さらに他の実施形態において、二重特異性キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とする。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る炎症性疾患に特異的な抗原には、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−α、またはＶＥＧＦ−Ａのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る神経障害に特異的な抗原には、βアミロイドまたはＭＡＢＴ５１０２Ａのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。神経障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る糖尿病に特異的な抗原には、Ｌ−１βまたはＣＤ３のいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。糖尿病または他の代謝障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る心血管系疾患に特異的な抗原には、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、およびスフィンゴシン−１−ホスファートのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。心血管系疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る感染性疾患に特異的な抗原には、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、およびＴＮＦ−αのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。感染性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
標的抗原のさらなる例には、特異的なまたは増幅された様式で癌細胞上に見出される表面タンパク質（例えば、Ｂ細胞リンパ腫におけるＩＬ−１４受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ４０、様々な癌腫におけるルイスＹおよびＣＥＡ抗原、乳癌および結腸直腸癌におけるＴａｇ７２抗原、肺癌におけるＥＧＦ−Ｒ、ヒト乳癌および卵巣癌においてしばしば増幅されている葉酸結合タンパク質およびＨＥＲ−２タンパク質）、またはウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０およびｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂおよび他のエンベロープ糖タンパク質、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等のオンコウイルス由来のエンベロープタンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＣＡＲの他の潜在的標的は、リガンドがＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質である場合、ＣＤ４、ならびに他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ、およびポリオウイルスの関連受容体分子を含む。
【００６９】
本発明のＣＡＲのさらなる標的は、Ｂ細胞関連疾患に関与する抗原を含む。本発明のＣＡＲのなおさらなる標的が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７０】
キメラ抗原受容体の共刺激ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、共刺激ドメインを含む。このドメインは、細胞増殖、細胞生存、およびメモリー細胞の発生を増強し得る。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。他のタンパク質由来の共刺激ドメインがまた、本発明のＣＡＲとともに使用され得る。さらなる共刺激ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。ＣＡＲが１つを超える共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは直列に配列され、任意にリンカーによって分離され得る。
【００７１】
キメラ抗原受容体の細胞外スペーサードメイン
本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このドメインは、適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインは、抗原特異的標的指向領域および膜貫通ドメインに付着される親水性領域を含む。細胞外スペーサードメインには、抗体のＦｃフラグメント、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８αヒンジ、Ｇｌｙ３等のポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１、ＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、もしくは（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７２】
キメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来する膜貫通配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。さらなる膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７３】
キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。このドメインは、細胞質内であってもよく、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示し得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【００７４】
キメラ抗原受容体におけるリンカー
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの２つ以上の成分は、１つまたは複数のリンカーによって分離される。例えば、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を含むＣＡＲにおいて、ＣＡＲ上の第１の標的指向領域は、ＣＡＲ上の第２の標的指向領域からリンカーを介して分離され得る。さらに、ＣＡＲは、リンカーを介して治療用制御物質に連結され得る。リンカーは、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１〜１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、５〜１２アミノ酸の長さ、５〜１５アミノ酸の長さ、または５〜２０アミノ酸の長さであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。例えば、１００アミノ酸よりも長い、より長いリンカーが、本発明の代替の実施形態に関連して使用されてもよく、例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために選択され得る。本発明において使用され得るリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
治療用制御物質
治療用制御物質は、細胞増殖を制御するか、細胞選択（例えば、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を選択する）を促進するか、またはそれらの組み合わせを行う。１つの実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を促進するように細胞増殖を上方制御することを含む。別の実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を減少させるか、または阻害するように細胞増殖を下方制御することを含む。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、治療的利点をもたらし得る二重特異性キメラ抗原受容体を発現する細胞の濃縮を促進し得る。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、追加の組成物と生化学的に相互作用することができ、その治療用制御物質の機能が制御されるようになる。例えば、ＥＧＦＲｔ（治療用制御物質）は、セツキシマブと生化学的に相互作用することができ、選択、トラッキング、細胞アブレーション、またはそれらの組み合わせにおけるＥＧＦＲｔの機能が制御されるようになる。
【００７６】
治療用制御物質の例には、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ−２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療用制御物質は、二重特異性キメラ抗原受容体と共発現される。
【００７７】
治療用制御物質の機能を制御する薬剤の例には、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−２'−デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５−フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（５−ＦＣ）、５−（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６−チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン（アラ−Ｔ））、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ｌ−ブチオニン−Ｓ，Ｒ−スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬剤は、治療用制御物質の使用前、使用中、または使用後に投与され得る。
【００７８】
上述のように、本発明のＣＡＲは、単一ポリペプチド鎖として合成され得る。ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲの場合、そのＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列−抗原特異的標的指向領域１−リンカー−抗原特異的標的指向領域２−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【００７９】
代替的に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列−抗原特異的標的指向領域１−リンカー−抗原特異的標的指向領域２−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【００８０】
ＣＡＲが２つを超える抗原特異的標的指向領域を含む場合、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列−抗原特異的標的指向領域１−リンカー−抗原特異的標的指向領域２−リンカー−（抗原特異的標的指向領域）ｎ−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン。そのようなＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。各抗原特異的標的指向領域は、リンカーによって分離され得る。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【００８１】
本発明は、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明の例となるＣＡＲの主鎖の核酸配列を提供する。具体的には、ＣＡＲの例となる主鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを含み得、細胞外スペーサードメインはＩｇＧ４ヒンジ領域であり、膜貫通ドメインはＣＤ２８由来の膜貫通領域であり、共刺激ドメインは４−１ＢＢ由来であり、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ鎖由来である（図７）。少なくとも２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、ＩｇＧ４ヒンジに対してＮ末端に挿入され得る。
【００８２】
本発明は、ＣＡＲがＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的である、本発明の例となる実施形態の核酸配列を提供する。１つの実施形態において、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲをコードする配列が、図３、８、または１０に示される。別の実施形態において、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲをコードする配列が、図４、９、または１１に示される。この例となる実施形態において、二重特異性ＣＡＲはＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的なｓｃＦｖを含み、各ｓｃＦｖは、リンカーによって分離されており、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインへと結合される細胞外スペーサードメインに結合されている。例となるＣＡＲは１組のｓｃＦｖ配列を示したが、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な任意のｓｃＦｖが使用され得る。特定の実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢ（ｃｙｔｏ）−ζ（ｃｙｔｏ）であり、図３および４に示される配列によってコードされる。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ＩｇＧ４ヒンジ細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【００８３】
別の実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤｌ９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ｈｕｌｇＧ４−ヒンジＣＨ２ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／ｃｙｔｏ−４１ＢＢ−ζを含む（図９〜１０）。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ヒトＩｇＧ４ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１９−Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８αＴＭ−４１ＢＢ共刺激−ζｃｙｔｏ（図１１〜１２）である。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【００８５】
トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）
ヒト上皮成長因子受容体（ｈｕＥＧＦＲ）（ヒトにおけるＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲ１）は、造血およびリンパ球新生系の細胞によって発現されることがない、成長因子受容体のＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼである。リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α）結合は、受容体チロシンキナーゼ不活性単量体の活性ホモ二量体への移行の結果として、ＥＧＦＲのＮ末端細胞外ドメインＩおよびＩＩ内で生じる。
【００８６】
ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩは、抗体（例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＩｇＧ１キメラ抗体）の結合部位を含む。ヒトＥＧＦＲは、例えば、細胞外ドメインＩＩＩ、ＩＶ、またはそれらの組み合わせ内に無傷の抗体結合部位（例えば、セツキシマブ結合部位）を保持する一方、ドメインＩおよびＩＩの除去、ならびにその細胞質側末端の欠失によるシグナル伝達活性が欠けていることによって、リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α）に結合できなくなり得ると考えられる（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｃｋｉｎｇ，ａｎｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  １１８（５）１２５５−１２６３）。
【００８７】
本明細書に記載のトランケート型ＥＧＦＲｔポリペプチドは、細胞ベースの療法の遺伝子改変のために少なくとも３つの使用法を有する：エクスビボ細胞精製、インビボ細胞トラッキング、および細胞アブレーション。一実施形態において、治療用制御物質として本発明のＣＡＲと使用するためのＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、ＥＧＦＲを標的とする小分子、抗ＥＧＦＲ抗体、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する。別の実施形態において、ＥＧＦＲｔは、図１２もしくは１３に示される配列、または図１２もしくは１３に示される配列と約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、もしくは約９５％相同である配列を含む。
【００８８】
本発明の一実施形態において、ｈｕＥＧＦＲｔは、ＣＡＲを発現する細胞を精製するか（例えば、エクスビボ細胞精製）、ＣＡＲを発現する細胞をトラッキングするか（例えば、インビトロもしくはインビボ細胞トラッキング）、または必要に応じて細胞アブレーションを誘起することによって、ＣＡＲを発現する細胞を制御する（例えば、インビボもしくはインビトロもしくはエクスビボ）ように、本発明のＣＡＲと共発現され得る。１つの実施形態において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。
【００８９】
キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）
養子免疫療法における外因性γｃサイトカインの使用の限界に基づき、本発明は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を提供する。強制構成的キメラサイトカイン受容体ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ−７Ｒα（ＣγＣＲ７）受容体シグナルの有用性を比較した。以下に記載されるように、キメラサイトカイン受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有する。
【００９０】
したがって、本発明の一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＣＲと共発現され得る。例えば、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現され得る。代替的に、二重特異性ＣＡＲは、ＣＣＲと共発現され得る。キメラサイトカイン受容体の例には、ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒα、ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメイン、ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ７Ｒαを含むＣＣＲは、ＩＬ−７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ−７サイトカインはリンカーを介してＩＬ−７Ｒα（ＩＬ−７受容体のα鎖）の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに連結されている。
【００９２】
ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメイン−ＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン−ＩＬ−２Ｒβの細胞質ドメインを含むＣＣＲは、ＩＬ−７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ−７サイトカインはリンカーを介してＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにＩＬ−２Ｒβ（ＩＬ−２受容体のβ鎖）の細胞質ドメインに連結されている。
【００９３】
ＩＬ−７サイトカイン−リンカー−ＩＬ２Ｒβを含むＣＣＲは、ＩＬ−７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ−７サイトカインはリンカーを介してＩＬ−２Ｒβの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに連結されている。
【００９４】
ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）
治療用導入遺伝子と、リンパ球毒性（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｃ）薬物に対する抵抗性を与える薬物抵抗性導入遺伝子とを共発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾は、インビボおよびエクスビボの両方で治療用細胞を選択する機会を提供する。変異したヒト酵素導入遺伝子である、ジヒドロ葉酸レダクターゼ二重変異体（ＤＨＦＲＦＳ；Ｌ２２Ｆ、Ｆ３１Ｓ）は、改変されたＴ細胞にメトトレキサート（ＭＴＸ）に対する抵抗性を与え、Ｂ細胞系腫瘍細胞を特異的に標的とするＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）を共発現する細胞の選択を可能にする。
【００９５】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ（例えば二重特異性ＣＡＲ）は、ＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現され得る。さらなる実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（変異ＤＨＦＲを含む）と共発現され得る。代替的に、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（変異ＤＨＦＲを含む）と共発現され得る。
【００９６】
本発明のＣＡＲとともに使用され得る他の選択マーカーには、メチル化−ＤＮＡ−タンパク質−システインメチルトランスフェラーゼ（ＭＤＭＴ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＭＤＭＴは、細胞を化学療法に対して抵抗性にし、ゆえに化学療法とＴ細胞療法との相乗作用が望ましい場合に使用され得る。
【００９７】
本発明のＣＡＲをコードするベクターがまた本明細書に提供される。ＣＡＲをコードするベクターはまたＥＧＦＲｔもコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするベクターはまた、ＣＣＲまたはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードする。他の実施形態において、ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするベクターはまた、ＣＣＤおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードする。いくつかの特定の実施形態において、ベクターは、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＣＣＲ、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）、または二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＣＣＲおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードし得る。本発明のＣＡＲを発現するために使用され得るベクターには、レンチウイルスベクター、γレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、改変ハイブリッドウイルス、裸のＤＮＡ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｋ等のトランスポゾン媒介ベクター、Ｐｈｉ３１等のインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の一例となる実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、図５に例示されるように、レンチウイルスベクターによって発現される。
【００９９】
本発明の遺伝子改変細胞
本発明はまた、本発明のＣＡＲを含みかつ安定して発現する遺伝子改変細胞を提供する。遺伝子改変細胞によって発現されるＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列はまた、Ｎ末端シグナル配列も含み得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれは上述されている。抗原特異的標的指向ドメインは、ＭＨＣ非拘束的な様式で、その様式ではＴ細胞受容体によって通常は結合されない抗原に特異的に結合することが可能である。
【０１００】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔを共発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲを共発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）を共発現する。別の実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）を共発現する。
【０１０１】
遺伝子改変細胞は、少なくとも２つの異なる標的抗原に特異的な、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を有するＣＡＲを発現する。１つの実施形態において、抗原特異的標的指向領域は、標的特異的抗体またはそれらの機能的等価物もしくはフラグメントもしくは誘導体を含む。抗原特異的抗体は、抗体のＦａｂフラグメントまたは抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。
【０１０２】
本発明のＣＡＲを含みかつ発現し得る遺伝子改変細胞には、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、遺伝子改変細胞は自家細胞である。例として、本発明の個々のＴ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ４−／ＣＤ８−、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−およびＣＤ４−／ＣＤ８＋細胞の混合群、または単一クローンの一群であり得る。本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞（例えば、ＣＤ２０＋および／またはＣＤ１９＋腫瘍細胞）とインビトロで共培養された場合、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、および他のＴ細胞エフェクターサイトカインを産生し得る。本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原特異的標的細胞とインビトロで共培養された場合、その標的細胞を溶解し得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ−エフェクターメモリー細胞、またはそれらの組み合わせうちのいずれか１つまたは複数であり得る。（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９  ２１（２）２２４−２３２）。
【０１０３】
遺伝子修飾細胞は、本発明のＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞に安定してトランスフェクトすることによって産生され得る。本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードするＤＮＡはまた、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／またはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードし得る。１つの実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結される。別の実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結され、第１もしくは第２のポリヌクレオチドは、同様にＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＣＣＲまたはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードする第３のポリヌクレオチドに連結される。さらなる実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結され、第１および第２のポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＣＣＲをコードする第３のポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードする第４のポリヌクレオチドに連結される。ウイルスベクターは一般的に異種遺伝子を細胞（例えば、Ｔ細胞）に運ぶために使用される。遺伝子修飾細胞を生成するために使用され得るウイルスベクターの例には、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
種々の方法は、本発明のＣＡＲを発現する安定したトランスフェクタントを生成する。１つの実施形態において、細胞に安定してトランスフェクトしかつ細胞を向け直す方法は、裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによるものである。裸のＤＮＡを使用することによって、再配向細胞を生成するために必要とされる時間は、著しく減少され得る。本発明のＣＡＲをコードする裸のＤＮＡを使用して細胞を遺伝子改変するためのさらなる方法には、（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、および／もしくは陽イオンポリマーを使用する）化学形質転換法、非化学形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、光学形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー、および／もしくはハイドロダイナミックデリバリー）、ならびに／または粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃を使用するインペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）および／もしくはマグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ））が含まれるが、これらに限定されない。単一の統合された非再配列ベクターおよびＣＡＲの発現の存在を示すトランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡大され得る。１つの実施形態において、エクスビボでの拡大のために選択された細胞はＣＤ８＋であり、抗原特異的標的細胞を特異的に認識しかつ溶解する能力を示す。
【０１０５】
ウイルス形質導入法もまた、本発明のＣＡＲを発現する再配向細胞を生成するために使用され得る。本発明の二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子修飾細胞を生成するために使用され得る細胞型には、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
適切な条件下での抗原によるＴ細胞の刺激は、細胞の増殖（拡大）および／またはＩＬ−２の産生をもたらす。本発明のＣＡＲを含む細胞は、１つまたは複数の抗原の、ＣＡＲの抗原特異的標的指向領域への結合に応答して、数を拡大する。本発明はまた、ＣＡＲを発現する細胞を作製しかつ拡大させる方法を提供する。その方法は、ＣＡＲを発現するベクターを細胞にトランスフェクトするか、または形質導入することと、該細胞を、受容体に対する標的抗原、組換え標的抗原、または抗体を発現する細胞で刺激することとを含み、前記細胞は、Ｔ細胞を作製しかつ拡大させるように増殖する。一実施形態において、細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞のうちのいずれか１つまたは複数であり得る。
【０１０７】
一例となる実施形態において、本発明の遺伝子改変細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２０抗原に特異的な二重特異性ＣＡＲを発現する。さらなる実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、二重特異性ＣＡＲ  ＣＤｌ９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４ｓｅｒ−リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ｈｕｌｇＧ４−ヒンジ−ＣＤ２８−４１ＢＢ（ｃｙｔｏ）−ζ（ｃｙｔｏ）、またはＣＤｌ９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４ｓｅｒ−リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ｈｕｌｇＧ４−ヒンジＣＨ２ＣＨ３−ＣＤ２８ｔｍ／ｃｙｔｏ−ζ、またはＣＤ１９−Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＣＤ８αヒンジ−ＣＤ８αＴＭ−４１ＢＢ共刺激−ζｃｙｔｏを発現する。
【０１０８】
一例となる実施形態において、本発明は、ＣＤ１９特異的およびＣＤ２０特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製しかつ拡大させる方法を提供する。その方法は、レンチウイルスを使用して、ＣＤ１９およびＣＤ２０二重特異性ＣＡＲを発現するベクターを、ＣＤ３ｘＣＤ２８ビーズ刺激精製セントラルメモリーＴ細胞（末梢血由来のＴ細胞等）に形質導入することと、ｒｈｕＩＬ−２および／またはＩＬ−１５の存在下でＴ細胞を成長させることと、Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋およびＣＤ２０＋細胞、組換えＣＤ１９およびＣＤ２０、または受容体に対する抗体で再度刺激することとを含み、Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的およびＣＤ２０特異的Ｔ細胞を作製しかつ拡大させるように増殖する。
【０１０９】
本発明の治療方法
本発明のＣＡＲを使用して、抗原消失エスケープ変異体から生じる治療の失敗を克服し、既存の療法に対する抵抗性を低減し、および／または本ＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患を治療することができる。
【０１１０】
したがって、本発明はまた、本発明のＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患の治療を必要とする対象における、該疾患を治療するための方法も提供する。その方法は、本発明のＣＡＲを含む組成物を提供すること、ならびに有効量のその組成物を、対象における抗原と関連している疾患を治療するように投与することを含む。
【０１１１】
本発明はまた、抗原消失エスケープ変異体から生じる治療の失敗を克服することを必要とする対象における疾患状態（例えば、Ｂ細胞疾患）において、該治療の失敗を克服するための方法も提供する。その方法は、本発明のＣＡＲを含む組成物を提供すること、ならびに有効量のその組成物を、対象における抗原と関連している疾患を治療するように投与することを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、その組成物は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質、またはＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞を含む。別の実施形態において、組成物の遺伝子修飾細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞であり、それらは本発明のＣＡＲを発現する。本発明の組成物は、単独で、または既存の療法と併せて投与され得る。他の療法が併せて使用される場合、本発明の組成物は、他の既存の療法と同時に、または連続して投与され得る。
【０１１３】
薬学的組成物
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および治療的有効量の本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を含む、薬学的組成物を提供する。組成物中の本発明のＣＡＲは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質、またはＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞のいずれか１つまたは複数であり得る。本組成物は、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチド、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲを含みＣＡＲと共発現されるタンパク質、またはＣＡＲを発現しかつＥＧＦＲｔ、ＣＣＲおよび／もしくはＤＨＦＲを共発現する遺伝子修飾細胞をさらに含み得る。「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性、および望ましい薬学的組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用、ならびにヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
【０１１４】
種々の実施形態において、本発明に従う薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達用に製剤化され得る。「投与経路」とは、エアロゾル、経鼻、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経粘膜、経皮、非経口、埋め込み型ポンプ、連続注入、局所適用、カプセル、および／または注射を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の投与経路を指し得る。
【０１１５】
本発明に従う薬学的組成物はまた、任意の薬学的に許容される担体を含有してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ある組織、臓器、または身体の部分から、別の組織、臓器、または身体の部分へと関心対象の化合物を運ぶか、または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または媒介物を指す。例えば、担体は、液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル封入材料、またはそれらの組み合わせであり得る。担体の各成分は、それが製剤の他の成分と適合性がなければならないという点で、「薬学的に許容され」なければならない。それはまた、その治療的利益を過度に上回る、毒性、過敏、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症の危険性を有してはならないという意味で、それが接触し得る任意の組織または臓器と接触する使用に適していなければならない。
【０１１６】
本発明に従う薬学的組成物はまた、経口投与用にカプセルに封入されるか、錠剤化されるか、または乳剤もしくはシロップに調製されてもよい。薬学的に許容される固形もしくは液体担体が、組成物を増強するか、もしくは安定させるために、または組成物の調製を促進するために添加され得る。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、および水が含まれる。固形担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンが含まれる。担体にはまた、単独で、または蝋とともに、モノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリン等の持続放出材料も含まれる。
【０１１７】
薬学的調製物は、必要に応じて、錠剤形成のための製粉、混合、造粒、および加圧、または硬性ゼラチンカプセル形成のための製粉、混合、および充填に関与する薬学の従来の技術に従って作製される。液体担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性懸濁液の形態である。そのような液体製剤は、直接経口投与または軟性ゼラチンカプセル内に充填されて投与されてもよい。
【０１１８】
本発明に従う薬学的組成物は、治療的有効量で送達され得る。正確な治療的有効量は、所与の対象における治療の有効性の観点において最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性度、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患タイプおよび段階、全身健康状態、所与の投薬量に対する応答性、および薬物療法のタイプを含む）、製剤物中の薬学的に許容される担体の性質、ならびに投与経路を含むが、これらに限定されない、様々な要因に応じて異なる。臨床および薬理学分野の技術者は、通例の実験方法を通して、例えば、化合物の投与に対する対象の反応を監視し、それに応じて投薬量を調整することによって治療的有効量を決定することができる。さらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【実施例】
【０１１９】
特許請求される発明をより良く例示するために以下の実施例が提供され、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。特定の材料が言及される範囲に関して、それは単に例示の目的であり、本発明を限定するとは意図されない。当業者は、独創的な能力を行使させることなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
【０１２０】
実施例１
図１は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体の略図である。本発明の一例となる実施形態において、図２は、二重特異性抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ２０二重特異性ＣＡＲの成分を示す。図２はまた、ｅｐＨＩＶ−７レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにパッケージ化された完全ｃＤＮＡの概略図も示す。図３および４は、一例となる二重特異性ＣＡＲ、すなわち、ＧＭＣＳＦｓｓ−ＣＤ１９ｓｃＦｖ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【０１２１】
実施例２
図５は、本発明の例となるＣＡＲのベクター構築物、すなわち、ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８共刺激−ＣＤ３ζ導入遺伝子構築物を示す概略図である。過去にＧｉｂｓｏｎらによって記述されたワンステップ等温ＤＮＡアセンブリ法を使用して、ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−ＣＤ２８ｔｍＣＤ２８共刺激−ＣＤ３ζ導入遺伝子を構築した（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｉｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３−３４５）。ＣＤ１９  ｓｃＦｖ構築物のＶＬおよびＶＨドメインを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、以前に記述されたＣＤ１９ＣＡＲ−ＣＤ２８−ζ導入遺伝子から配列決定した。Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｎ，Ｄｒｅｇｅｒ  Ｐ，Ｇｌａｓｓ  Ｂ，Ｓｕｒｅｄａ  Ａ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７；９２（１１）：１５３３−１５４８）。以前に記述されたＣＤ２０Ｒ−ＣＤ２８−ζ導入遺伝子を使用して、スプライス重複（ｓｐｌｉｃｅｄ−ｏｖｅｒｌａｐ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＣＤ２０  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを構築した（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ２０  ｉｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｓｃＦｖＦｃ：ｚｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＣＤ２０＋  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；４：７５−８３）。ＣＤ１９  ｓｃＦｖおよびＣＤ２０  ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを以前に記述されたように１８残基リンカーペプチドに連結した。ＰＣＲによってＣＤ１９Ｒ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ導入遺伝子を使用して、ＩｇＧ４−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８共刺激ドメインを配列決定した。以前に記述されたＣＤ１９Ｒ−ＣＤ２８−ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミド（Ｓｅｉｔａｒｏ  Ｔｅｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ１９−ＣＡＲ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．Ｏｃｔ．２６，２０１１）からのＣＤ１９Ｒ−ＣＤ２８部分のＮｈｅＩおよびＲｓｒＩＩの制限消化によって、ＣＤ３ζ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスデスティネーションベクターを調製した。制限消化されたζ−ｅｐＨＩＶ７デスティネーションベクター、ならびに５'末端に３０ｂｐ重複を含むそれぞれに対するプライマーを有する、ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２０ｓｃＦｖ、およびＩｇＧ４−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８共刺激−ＤＮＡフラグメントを使用して、ワンステップ等温ギブソンＤＮＡアセンブリ法によって、最終ＣＤ１９ｓｃＦｖ−ＣＤ２０ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８共刺激−ＣＤ３ζ構築物を構築した。
【０１２２】
（表１）二重特異性ＣＡＲ  ｅｐＨＩＶ−７トランスファープラスミド中の調節エレメント
2019088330.tif 000003
【０１２３】
実施例３
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ  ｅｐＨＩＶ−７トランスファープラスミドまたは抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ  ｅｐＨＩＶ−７トランスファープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗Ｆｃ抗体およびストレプトアビジンＰＥ（ＳＡ−ＰＥ）で染色し、次いで上記２つのＣＡＲの発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲおよび抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９  ＣＡＲの両方が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で発現された。
【０１２４】
ｅｐＨＩＶ−７トランスファープラスミドは、上記２つの二重特異性ＣＡＲとＥＧＦＲｔを共発現した。ビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体／ＳＡ−ＰＥ染色およびフローサイトメトリー解析の組み合わせを使用して、同じくトランスフェクトされた細胞上でＥＧＦＲｔ共発現を検出した。
【０１２５】
実施例４
初代ヒト末梢血由来Ｔ細胞をＯＫＴ３で活性化し、次いで、単一特異性抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０  ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ  ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを用いて、レンチウイルスによる（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｌｙ）形質導入を行った。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターもまた、単一特異性抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０  ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０とともに、ＥＧＦＲｔをコードした。このようにして、ＣＡＲを発現する細胞はＥＧＦＲｔを共発現した。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体およびＳＡ−ＰＥで染色し、次いで、ＥＧＦＲｔ発現および単一特異性または二重特異性ＣＡＲの共発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。単一特異性抗ＣＤ１９  ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち５１％がＥＧＦＲｔを発現し、単一特異性抗ＣＤ２０  ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち３８．５％がＥＧＦＲｔを発現し、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち６３．８％がＥＧＦＲｔを発現した。
【０１２６】
トランスフェクトされた細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体もまた、ＦＩＴＣ結合抗ＴＣＲαおよび抗ＴＣＲβ抗体染色ならびにフローサイトメトリー解析を使用して、同じくトランスフェクトされた細胞内で検出された。
【０１２７】
実施例５
ＣＤ１９、もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現するようにＨ９細胞を遺伝子修飾した。細胞を抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体で染色し、次いでＣＤ１９およびＣＤ２０の発現を検出するために、フローサイトメトリー解析に供した。サイトメトリー解析は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞の所望の発現プロファイルを確認した、すなわち、遺伝子改変されたＨ９細胞は、ＣＤ１９もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現し、それによって、抗原陰性抗原消失エスケープ変異体を含む癌標的細胞を刺激した。後に記述されるように、これらの細胞株はその後、ＣＡＲ発現Ｔ細胞株を刺激するために標的細胞として使用され、標的細胞を死滅させるエフェクター細胞として作用した。
【０１２８】
同様に、ＳＵＰ−Ｂ１５およびＤＨＬ−６細胞株中のＣＤ１９およびＣＤ２０発現の内在レベルを抗ＣＤ１９ＡＰＣおよび抗ＣＤ２０ＰＥ染色ならびにフローサイトメトリー解析を使用して分析した。ＳＵＰ−Ｂ１５細胞株は、高レベルのＣＤ１９および低レベルのＣＤ２０（ゆえに、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−）を発現し、かつＤＨＬ−１６細胞株は、高レベルのＣＤ２０および低レベルのＣＤ１９（ゆえに、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋）を発現した。
【０１２９】
実施例６
４時間のクロム放出アッセイを使用してエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定した。エフェクター細胞は、単一特異性抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０  ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０  ＣＡＲを発現するために、レンチウイルスによって形質導入された初代ヒトＴ細胞である。二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−Ｈ９細胞、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ−Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞のすべてを効果的に溶解した。１：１、３：１、１０：１、および３０：１の比率のエフェクター対標的において、それぞれ約２５％、４５％、５０％、および６０％の標的細胞が溶解された。
【０１３０】
対照的に、単一特異性ＣＡＲ発現Ｔ細胞株は、単一特異性ＣＡＲエフェクター細胞から逃れる抗原陰性抗原消失エスケープ変異体を溶解することができない。抗ＣＤ１９  ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋標的を溶解することができず、抗ＣＤ２０  ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−標的を溶解することができなかった。
【０１３１】
実施例７
二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−Ｈ９細胞、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ−Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞による刺激に応じたサイトカイン分泌（インターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ、ＩＦＮ−γ））に対して活性化された。ＩＦＮ−γ量を、共培養の２４時間後にＴ細胞および標的細胞の培養上清のサイトカインビーズアレイによって測定した。活性化された二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、全タイプの標的細胞による刺激に応じて少なくとも２５００ｐｇ／ｍｌ  ＩＮＦ−ｇを分泌した。対照的に、単一特異性ＣＡＲ発現Ｔ細胞株は、単一特異性ＣＡＲエフェクター細胞から逃れる抗原陰性抗原消失エスケープ変異体による刺激に応じて、サイトカインＩＮＦ−ｇ分泌に対して活性化されなかった。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９−ＣＤ２０＋標的細胞との共培養の際にＩＧＮ−γを分泌することができず、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０−標的細胞との共培養の際にＩＧＮ−γを分泌することができなかった。
インビトロでの刺激アッセイ
2019088330.tif 000004
【０１３２】
実施例８
以下の実施例は、Ｔ２Ａ配列を介してトランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）に連結されたＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体を説明する。ＥＧＦＲｔは、他のキメラ抗原受容体、例えば、二重特異性キメラ抗原受容体に連結され、それと共発現され得る。
【０１３３】
出願人は、ビオチン化セツキシマブを使用する免疫磁気精製、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学による細胞トラッキング、ならびに全身性セツキシマブ投与後のインビボでの細胞アブレーションのための、形質導入Ｔ細胞によって発現されたそのようなトランケート型ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）の有用性を示した。この例となる実施形態において、ＥＧＦＲｔのドメインＩおよびＩＩは除去されたが、ドメインＩＩＩおよびＩＶは保持された。
【０１３４】
ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ−ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス構築物は、示されるように（１）ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＶＨおよびＶＬ遺伝子断片、ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメインから成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列（Ｋｏｗｏｌｉｋ  ＣＫ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ２８  ｃｏｓｔｉｍｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ＣＤ１９−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６（２２）：１０９９５−１１００４）；（２）自己切断型のＴ２Ａ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ＡＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  "ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ"２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００４；２２（５）５８９−５９４）；ならびに（３）トランケート型ＥＧＦＲ配列を含む。
【０１３５】
レンチウイルス形質導入後のｈｕＥＧＦＲｔ＋ヒトＴ細胞の免疫磁気濃縮
ｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞の免疫磁気選択またはＦＡＣＳ選別のいずれかに対してビオチン化セツキシマブを使用した。出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔの共発現を指示する、自己不活性化レンチウイルスによって形質導入されたヒトＴ細胞の免疫磁気選択のために、市販の抗ビオチンマイクロビーズと併せてビオチン化セツキシマブを使用した。
【０１３６】
ＰＢＭＣまたは精製セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ）またはエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＥＭ）Ｔ細胞サブセットを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激し、次いで、レンチウイルスベクターによって形質導入して初代ヒトＴ細胞株のパネルを生成した；その２．６％〜４０％はｈｕＥＧＦＲｔおよびＣＡＲを発現した。選択されていない細胞をビオチン化セツキシマブおよび抗ビオチンマイクロビーズで標識し、次いで、その９０％がｈｕＥＧＦＲｔおよびＣＡＲを発現する選択された細胞集団を一貫して得るように分離した。
【０１３７】
選択されていないＴ細胞および選択された画分をビオチン化−セツキシマブおよびＰＥ結合ストレプトアビジンまたはＰＥ結合抗ビオチンＡｂのいずれかで染色し、次いで、フローサイトメトリー解析に供した。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の選択を、ＯＫＴ３芽細胞の形質導入の３日後（３８％から９８％に濃縮された）、または形質導入エフェクターメモリーＣＤ６２ＬＣＤ４５ＲＯ＋由来細胞の急速拡大の１サイクル後（２０％から９６％に濃縮された）、形質導入ＣＭＶｐｐ６５特異的ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の３サイクル後（１２％から９１％に濃縮された）、もしくは形質導入ＣＤ８＋ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の２サイクル後（３％から９７％に濃縮された）のいずれかで実施した。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＋細胞の選択を、形質導入ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の１サイクル後（２５から９２％に濃縮された）に実施した。
【０１３８】
レンチウイルスベクターに含まれるＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ−ＩＭＰＤＨ２ｄｍ構築物は、ＣＤ１９特異的ＣＤ２８共刺激ＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲ）のコドン最適化配列部分、続いて自己切断可能Ｔ２Ａ、ならびに選択マーカーｈｕＥＧＦＲｔおよびＩＭＰＤＨ２ｄｍ（ミコフェノラート２７の添加に応じて細胞生存を可能にさせるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子の二重変異体）を、伸長因子１プロモーター配列（ＥＦ−１ｐ）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）、および３ヌクレオチド停止コドンとともに含む。
【０１３９】
ＯＫＴ３媒介性の拡大に供される、選択されていない形質導入Ｔ細胞の培養物において、免疫磁気選択の前にｈｕＥＧＦＲｔ−細胞のｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞を上回る増殖優位性を観察した。しかしながら、免疫磁気選択後、ｈｕＥＧＦＲｔ発現のレベルおよび発現細胞の頻度は、ＯＫＴ３ベースの拡大１４の１４日間サイクルの３回連続した期間にわたって、安定したまままであった。免疫磁気選択後のＥＧＦＲｔ＋細胞の拡大倍率は、選択されていない培養物におけるｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞のものよりも有意に増強された。
【０１４０】
これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲｔが形質導入ヒトＴ細胞に独特である細胞表面マーカーとして役立つことができ、その後の、ＣＡＲも発現する安定したｈｕＥＧＦＲｔ発現細胞集団の、セツキシマブベースの免疫磁気精製を可能にすることを示す。
【０１４１】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用する養子移入ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のトラッキング
養子移入Ｔ細胞の生着をトラッキングするためのｈｕＥＧＦＲｔの有用性を試験するために、出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ヒトＴ細胞を移植されたＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲγＣｎｕｌｌマウスから血液および骨髄標本を収集した。
【０１４２】
まず、固定していない末梢血および骨髄単核細胞試料をビオチン化セツキシマブおよびＰＥ結合ストレプトアビジンで染色した後、フローサイトメトリー解析に供した。ヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞生着のレベル（２０％〜２５％）は、ＥＧＦＲｔ陰性もしくは陽性Ｔ細胞のいずれかを投与された動物において同様であったが、ヒトＣＤ４５およびＥＧＦＲについての二重染色は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋（すなわち、導入遺伝子を発現する）ヒトＴ細胞を、それらのｈｕＥＧＦＲｔ陰性カウンターパートから分離することを可能にした。
【０１４３】
次に、出願人らは、ＥＧＦＲ特異的診断キットを使用して、標準パラフィン包埋の固定組織標本が、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞浸潤の検出に適しているかどうかを特定しようと試みた。出願人らは、移植マウスからのパラフィン包埋した大腿骨の免疫組織化学的分析を実施し、骨髄中のｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞を検出した。これらのデータは、養子移入Ｔ細胞の頻度および組織分布の数量化のためのトラッキングマーカーとして役立つｈｕＥＧＦＲｔの有用性を支持する。
【０１４４】
ｈｕＥＧＦＲｔに結合するセツキシマブは、ヒトＴ細胞をＡＤＣＣに対して感作する
細胞表面選択／トラッキングマーカーの有用な特徴は、インビボでの細胞アブレーションのための標的として役立つその能力である。出願人らは、Ｔ細胞上でｈｕＥＧＦＲｔに結合されたセツキシマブがインビトロでｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを活性化する度合い、ならびにセツキシマブ投与がＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の養子移入ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の生着を減弱し得るかどうかを評価した。
【０１４５】
標的細胞として５１Ｃｒ標識化ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞、およびエフェクターとしてヒトＧＭ−ＣＳＦ活性化新鮮ＰＢＭＣを共培養した。次いで、セツキシマブの添加は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞をエフェクターによるＡＤＣＣ細胞溶解に対して特異的に感作した。ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の溶解を４時間のクロム放出アッセイによって測定し、結果は、セツキシマブ添加が溶解を、５０：１、２５：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的（エフェクター：標的）比率で、それぞれ、５％未満から約５０％、４５％、４０％、および１５％著しく増大させたことを示した。
【０１４６】
対照的に、このアッセイにおいて、ＣＤ２０特異的ｍＡｂリツキサンの添加は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣの誘起に対して効果を有さなかった。
【０１４７】
出願人らは次に、オートクリンＩＬ−２を分泌しかつホタルルシフェラーゼバイオフォトニック（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）レポーターを発現するように、さらに修飾されたｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ−２マウスのＴ細胞を誘導し、これらのｆｆＬｕｃ＋ｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ−２細胞を、静脈内注射を介してＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに養子移入し、それらにその後セツキシマブまたはリツキサンを与えた。移入されたＣＴＬＬ−２のインビボでの生着は、インビボバイオフォトニックイメージングによって測定されたように、Ｅｒｂｉｔｕｘ（毎日腹腔内に１ｍｇ）を与えたマウスにおいて有意に阻害された（９７％、Ｐ＜０．０５）。ｆｆＬｕｃ＋ｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ−２細胞のセツキシマブ媒介性の消失は、４〜６日間の間に生じた。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞を受けた患者に対する治療用制御物質としてのセツキシマブ投与の使用を支持する。
【０１４８】
実施例９
本実施例は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を説明し、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）であるＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ−７Ｒα（ＣγＣＲ７）が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有することを示す。トランケート型ＣＤ１９抗原（ＣＤ１９ｔ）を、細胞表面上のＣγＣＲの発現を示すように、Ｔ２Ａリンカーを介してＣγＣＲに連結した。本明細書に記載のキメラサイトカイン受容体は、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲ等の、本発明のキメラ抗原受容体に連結され得る。
【０１４９】
細胞内因性でリガンド非依存性のγｃサイトカインプラットフォームを生じるために、出願人らは、１０個のアミノ酸によってＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメインにつながれたＩＬ−７サイトカインから成るキメラγｃサイトカイン受容体（ＣγＣＲ）を作製した。ＩＬ−７Ｒシグナルを与えるＣγＣＲを作製するために、ＩＬ−７サイトカインを完全長ＩＬ−７Ｒα鎖につないだ（ＣγＣＲ７）。ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβシグナルを提供するＣγＣＲは、ＩＬ−７サイトカインを、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβの細胞質ドメインと融合されたＩＬ−７Ｒαの細胞外および膜貫通ドメインにつなぐことによって作製した（ＣγＣＲ２）。これらの単鎖キメラ受容体は、シグナル伝達のために内因性γｃ鎖を必要とすることが予想される。
【０１５０】
構築物を次いで、ＣγＣＲ導入遺伝子の後に、自己切断可能なＴ２Ａ配列、および細胞質トランケート型ＣＤ１９抗原（ＣＤ１９ｔ）が続くように生成した。ＣγＣＲおよびＣＤ１９ｔは、単一転写物として発現され、翻訳後に、２つの別々の１型膜タンパク質ＣγＣＲ（Ｔ２Ａ）およびＣＤ１９ｔをもたらすようにＴ２Ａ自己切断型ペプチドのＣ末端で切断される。単一転写物からの２つのタンパク質の発現に基づく、ＣγＣＲ（Ｔ２Ａ）対ＣＤ１９ｔ発現の比率は１：１であり、したがって、細胞表面ＣＤ１９ｔは、ＣγＣＲ細胞表面発現のしるしである。レンチウイルス形質導入およびこれら構築物の発現は次いで、ジャーカット細胞株およびＮＫ−９２細胞株の両方において見られるように、表面ＣＤ１９ｔ発現によって測定され得る。
【０１５１】
ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメインから１〜１２６個のアミノ酸を欠失しているトランケート型ＩＬ−７ＲαにつながれたＩＬ−７サイトカインを有する第３のＣγＣＲもまた作製した（ＣγＣＲ７ｔ）。内因性γｃ鎖とのＣγＣＲ７ｔ二量体形成の分子モデルが、シグナル伝達に必須である。ＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメインの１〜１２６個のアミノ酸の欠失は、ＣγＣＲ７ｔを非機能性にする。
【０１５２】
トランケート型ＣγＣＲ７発現は、サイトカイン非依存性細胞成長について機能的にシグナル伝達または支持しない。フローサイトメトリーは、レンチ形質導入ジャーカット（９５％  ＣＤ１９ｔ＋ＣγＣＲ７ｔ＋）およびテフ細胞株（９７％  ＣＤ１９ｔ＋ＣγＣＲ７ｔ＋）上の細胞表面ＣＤ１９ｔを検出した。ＣγＣＲ７ｔ発現ジャーカット細胞株でのＳＴＡＴ５リン酸化のウエスタンブロット分析は、非形質導入対照ジャーカット細胞株と比較して、リン酸化ＳＴＡＴ５の明らかな増加を検出しなかった。陽性対照ＯＫＴ３刺激ＰＢＭＣを５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５中で培養し、Ｋ５６２は、増加したリン酸化ＳＴＡＴ５の活性化を示した。したがって、２０日間培養されたＣγＣＲ７ｔ形質導入ＣＴＬの拡大および生存能はなお、サイトカインに左右された。
【０１５３】
ＣγＣＲ２およびＣγＣＲ７等の機能的ＣγＣＲが、外因性サイトカインの不在下でＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞の成長を支持し得るかを判定するために、本発明者らは各ＣγＣＲを発現するＣＴＬの拡大を測定した。ＣγＣＲ７ｔを発現するヒト初代Ｔ細胞は、外因性サイトカインの不在下では拡大できなかった。ＣγＣＲ２およびＣγＣＲ７の両方が、それぞれ５Ｕ／ｍｌおよび０．５Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２中で培養された親の細胞のものと同様の手法において、生存能の維持によってＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖を支持することが可能であった。ＣγＣＲ２＋対ＣγＣＲ７＋ＣＴＬについて測定された全細胞拡大の増加は、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２、およびＭ相に存在する核抗原タンパク質であるＫｉ６７の発現の増加と相関する（すなわち、ＣγＣＲ７に対する２６のＭＦＩ対ＣγＣＲ２に対する５２のＭＦＩ）。ＩＬ−２およびＩＬ−７シグナル伝達に応答して誘発される主要な抗アポトーシス性タンパク質である、より高度なＢｃｌ−２の発現が、ＣγＣＲ７＋対ＣγＣＲ２＋ＣＴＬにおいて観察され、ヒト初代Ｔ細胞の生存を維持するＣγＣＲ７の能力を支持した。このデータを合わせると、両方のＣγＣＲがサイトカイン非依存性Ｔ細胞生存能および拡大を支持するが、ＣγＣＲ７がエフェクターＣＤ８＋ＣＴＬの生存を維持する間、ＣγＣＲ２は増殖優位性を提供することが示唆される。
【０１５４】
ＣγＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボでのサイトカイン非依存性生着を示す
本発明者の研究所およびその他による研究は、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲγＣｎｕｌｌマウスにおけるヒトＣＴＬの生着が、ヒトＩＬ−１５またはＩＬ−２の外因性投与に依存することを示す。この依存性を克服すべくＣＴＬにおけるＣγＣＲ発現の可能性を試験するために、親のエフェクターＴ細胞、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬ、およびＣγＣＲ２＋ＣＴＬを外因性サイトカイン投与の不存在下で免疫不全ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲγＣｎｕｌｌマウスの尾静脈に注入した。８日目、１７日目、２４日目、および４８日目に１群あたり少なくとも４匹のマウスを収集し、血液および骨髄中のＴ細胞レベルを分析することによって全生着を比較した。
【０１５５】
血液中では、ＣγＣＲ２＋ＣＴＬは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬおよび親の細胞と比較して、非常に著しい（Ｐ＜０．００７）外因性サイトカイン非依存性生着を有した。骨髄中では、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬ（Ｐ＜０．０３）およびＣγＣＲ２＋ＣＴＬ（Ｐ＜０．０００５）の両方が、親の細胞と比較して著しい外因性サイトカイン非依存性生着を有した。ＣγＣＲ２＋ＣＴＬは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬと比較してより高い生着を有した。これは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬおよびＣγＣＲ２＋ＣＴＬの両方が外因性サイトカイン非依存性生着を支持することができるが、細胞の全割合が異なったことを示す。血液は、骨髄と比較して、ＣγＣＲ２＋ＣＴＬのより高い割合の生着を支持した。骨髄は、長期間にわたるＣγＣＲ７＋ＣＴＬの生着を支持した。重要なことには、細胞がいずれの群においても４８日目には血液および骨髄中にもはや存在しなかったように、生着は無限ではなかった。
【０１５６】
細胞内因性γｃサイトカインシグナルは、養子移入ＣＴＬの支持のための外因性サイトカイン投与の必要性に取って代わることができる。細胞内因性サイトカイン受容体を提供することで、養子免疫療法（養子移入ＣＴＬの長期残存）の主要な限界を克服することができる。これは、外因性サイトカインの投与の必要性を排除することができ、内因性細胞型に対する毒性およびバイスタンダー効果を低減することができる。
【０１５７】
実施例１０
本実施例は、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲに連結されたＣＤ１９キメラ抗原受容体が、メトトレキサートによって制御され得ることを示す。本明細書に記載の方法を使用して、本明細書に記載のジヒドロキシ葉酸受容体は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体に連結され得る。
【０１５８】
出願人らは、より低い毒性の薬学的利用可能な薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）によってＴ細胞の選択を可能にし得るヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）変異体を使用する、ヒト選択性（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）導入遺伝子を開発した。ＭＴＸは、チミジル酸ヌクレオチドの新規合成に必須の主要な酵素であるＤＨＦＲの競合的阻害を通して、その抗増殖性効果を発揮する。
【０１５９】
本実施例において、出願人らは、ＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９発現腫瘍を標的とするためのＣＤ１９ＣＡＲ）を共発現する初代ヒトＴ細胞の、ＤＨＦＲＦＳ（ｈＤＨＦＲ  Ｌ２２Ｆ／Ｆ３１Ｓ変異体）媒介性インビトロ選択の可能性を評価した。このストラテジーにおいて、本発明者らは、形質導入されたＴ細胞の混合群の、リンパ球毒性薬物ＭＴＸへの曝露は、非形質導入Ｔ細胞の排除およびＤＨＦＲＦＳ／ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞の選択的拡大をもたらすはずであり、総じて、共発現Ｔ細胞はＴ細胞群の抗腫瘍効果を増大すると仮定した。ここで、出願人らは、遺伝子修飾Ｔ細胞のＤＨＦＲＦＳ媒介性選択が、ＣＤ１９ＣＡＲ治療的導入遺伝子発現を強制し、かつ臨床的に達成可能な濃度のＭＴＸ（例えば、０．１μＭ  ＭＴＸ）の存在下でＣＡＲ＋安定組込み体の誘導を可能にしたことを示す。
【０１６０】
潜在的治療有用性のためのｈＤＨＦＲＦＳ選択アプローチをもたらすために、出願人らは、リボソームスキップＴ２Ａ配列によってそれぞれが分離されているＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）およびトラッキングマーカー（ｈｕＥＧＦＲｔ）としてのトランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチドと併せて、ｈＤＨＦＲＦＳを共発現するレンチウイルスベクターを設計した。
【０１６１】
ＣＴＬＬ２  Ｔ細胞に、まずこのＣＤ１９ＣＡＲ−ｈｕＥＧＦＲｔ−ｈＤＨＦＲＦＳレンチウイルスベクターを形質導入し、そのＭＴＸに対する抵抗性を評価した。レンチ形質導入の１０日後、細胞の７〜８％がＣＤ１９ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であった。
【０１６２】
ＭＴＸの不在下において、非形質導入および形質導入ＣＴＬＬ２細胞が、等しい割合で拡大した（それぞれ、２１および２７倍）。ＭＴＸ（０〜０．１μＭ）で８日間のインキュベーション後、８０％の生存を有する７倍拡大が、形質導入細胞において観察され、一方、非形質導入ＣＴＬＬ２細胞の０．０５μＭ以上のＭＴＸへの曝露は、非形質導入ＣＴＬＬ２細胞の拡大および生存能に対して強い阻害をもたらした。
【０１６３】
異なる濃度のＭＴＸでの培養物における８日後の形質導入ＣＴＬＬ２細胞のｈｕＥＧＦＲｔ発現レベルの評価は、導入遺伝子発現ｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞の著しいＭＴＸ媒介性濃縮をさらに明らかにした（０．０１、０．０２５、０．０５、および０．１μＭのＭＴＸで、それぞれ４９％、９３％、９８．５％、９９％）。
【０１６４】
選択されたＣＴＬＬ２細胞にとって耐性であり得るＭＴＸの最高用量をさらに特徴付けるために、０．１μＭ  ＭＴＸで８日間培養された形質導入ＣＴＬＬ２細胞を広範囲のＭＴＸ濃度（最大０．７５μＭ）で置き換えた。これらの、形質導入されかつ事前にＭＴＸ選択された細胞は、最大０．２５μＭのＭＴＸ濃度で９０〜１００倍拡大することが可能であり、それはＭＴＸの不在下での非形質導入対照ＣＴＬＬ２の拡大と等しかった。
【０１６５】
出願人らは、初代ヒトＴ細胞に、同じＣＤ１９ＣＡＲ−ｈｕＥＧＦＲｔ−ｈＤＨＦＲＦＳレンチウイルスベクターを形質導入した。精製ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、それらの養子移入後の残存の可能性に基づいて開始群として使用した。形質導入の１０日後、これらのＴ細胞を異なる濃度のＭＴＸで培養し、経時的な細胞数および生存能を評価した。１０日後、形質導入および非形質導入Ｔ細胞は、ＭＴＸの不在下では同等に（８０倍）拡大した。さらに、たとえ０．１μＭのＭＴＸであっても、形質導入Ｔ細胞は６３％の生存能を維持し、一方、非形質導入初代ヒトＴ細胞は、０．０２５μＭほどの低いＭＴＸ濃度で開始したが、生存能および拡大倍率の両方の強い阻害を示した。
【０１６６】
異なる濃度のＭＴＸでの培養物における１０日後の形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー評価は、導入遺伝子発現細胞の著しいＭＴＸ媒介性濃縮を明らかにした（例えば、０．０２５μＭ  ＭＴＸは、約５４％  ＣＤ１９ＣＡＲ＋および７９％  ＥＧＦＲｔ＋に濃縮した；０．０５μＭ  ＭＴＸは、約７６％  ＣＤ１９ＣＡＲ＋および８９％  ＥＧＦＲｔ＋に濃縮した）。
【０１６７】
培養物の６日目対１０日目におけるＣＤ１９ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ発現の比較は、経時的な、このＭＴＸ／ＤＨＦＲＦＳ媒介性選択の安定した進行を明らかにした（０日目：１８％  ＣＤ１９ＣＡＲ＋、２８％  ＥＧＦＲｔ＋；６日目：４８％  ＣＤ１９ＣＡＲ＋、７１％  ＥＧＦＲｔ＋；１０日目：７０％  ＣＤ１９ＣＡＲ＋、８８％  ＥＧＦＲｔ＋）。
【０１６８】
本明細書に引用されるすべての参照物は、完全に明記されるかのように参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、本発明がそこに属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を提供する。
【０１６９】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似または同等の本発明の実践において使用され得る多くの方法および材料を理解するであろう。実際に、本発明は、記載の方法および材料には全く限定されない。本発明の目的に対して、以下の用語が下記に定義される。
【０１７０】
これらの記述は、上記の実施形態を直接説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態の修正および／または変形を考えてもよいことを理解されたい。本記述の範囲内である任意のそのような修正または変形は、同様にその中に含まれることが意図される。具体的に言及されない限り、本明細書および特許請求の範囲の単語および語句は、通常の、および当出願分野における当業者に慣用的な意味において使用されることが、発明者の意図である。
【０１７１】
特許申請書提出時において、出願人に既知である本発明の種々の実施形態の前述の説明は、提案されており、例示および説明の目的を意図している。本説明は、包括的であるか、または本発明を開示される正確な形式に限定することを意図せず、多くの修正および変形が、上記の教示の観点から可能である。記載の本実施形態は、本発明の原理およびその実用的な用途の説明、ならびに他の当業者が種々の実施形態において、および企図される特定の使用に適した種々の修正を伴って本発明を利用できるようにするのに役立つ。したがって、本発明は、本発明を実行するために開示される特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【０１７２】
本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、本明細書の教示に基づいて、本発明およびそのより広範な態様から逸脱することなく変更および修正がなされることが可能であることが当業者にとって明白である。概して、本明細書で使用される用語は、概して「限定されない」用語（例えば、用語「含んでいる」は、「含んでいるがこれに限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む」は「含むがこれに限定されない」として解釈されるべきである等）として意図されることが当業者には理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月26日(2019.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。