(57)【要約】      （修正有）【課題】選択反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析とも称される方法によってホルマリン中で固定された生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質を直接定量するのに特に有利なＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の特定のペプチド、およびそれらのペプチドの派生イオン化特性を提供する。【解決手段】タンパク質試料は、Liquid Tissue（登録商標）試薬およびプロトコルを使用して生体試料から調製され、ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法により、タンパク質試料中の記載のペプチドの少なくとも１つまたは複数を定量することによってLiquid Tissue（登録商標）試料中でＰＤ−Ｌ１タンパク質は定量される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを測定するための方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つまたは複数の修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量すること；および前記試料中の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを算出することを含み、前記量が相対量または絶対量である、方法。
【請求項２】
１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Liquid Tissue（登録商標）プロトコルにより調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５一項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞または固形組織である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、１つの生体試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７に示されるＰＤ−Ｌ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質消化物中の１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および／または定量することが、修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在、および患者または対象における肺癌を含む癌との関連性を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量または前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質の量の検出および／または定量の結果を、肺癌を含む癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量またはＰＤ−Ｌ１タンパク質の量の検出および／または定量の結果を、癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出および／または定量することと多重形式で組み合わされて、肺癌を含む癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料が得られた患者または対象に、治療的有効量の治療剤を投与することをさらに含み、前記治療剤および／または投与される前記治療剤の量が、１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量、またはＰＤ−Ｌ１タンパク質の量に基づく、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療または前記治療剤が、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現する癌細胞に指向される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
表１内のペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７）のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０以上、および／またはそれらに対する抗体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
癌は、増殖および分裂する細胞を殺傷し、様々に機能する一群の治療剤を用いて治療される。一般的な化学療法剤群は、個別または併用のいずれかで数十年にわたって使用されており、この一般的な薬剤群は、臨床腫瘍学の実践における従来的および慣例的な癌治療となっている。そのような従来の化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主な特性の１つである、急速に分裂するすべての細胞を殺傷することにより作用する。しかしながら、これらの薬剤は、増殖する正常細胞も殺傷し、ゆえにこれらの薬剤は、癌細胞を殺傷するための「標的化」手法とは考えられていない。近年では、癌細胞のみを特異的に標的とする多くの癌治療剤が開発されており、該治療剤は、癌細胞においてのみ発現するが、正常細胞においては発現しないタンパク質を特異的に攻撃する。この手法は、癌治療に対する「標的化」手法と考えられる。ごく最近では、「標的化」様式により癌細胞を殺傷する別の手法は、癌細胞を殺傷するように癌患者の免疫系の能力を増強させるように免疫系を特異的に調節するというものである。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現の増加により、これらの細胞が宿主の免疫系を回避することが可能になることは周知である。癌細胞が高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腎細胞癌腫は、腫瘍の攻撃性を増加させおよび死亡のリスクを４．５倍増加させる。加えて、その癌細胞中にＰＤ−Ｌ１のより高い発現を伴う卵巣癌患者は、より低いＰＤ−Ｌ１の発現を伴う患者より、予後が有意に不良である。これらの患者では、ＰＤ−Ｌ１の発現は、上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数と逆相関し、これは、癌細胞の外側で発現したＰＤ−Ｌ１がＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性を抑制し得ることを示す。このことは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の開発を促進するものであり、癌細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１の提示を抑制し、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞のより大きな癌細胞殺傷活性を可能にするためのものである。癌を治療するためのこの近年の手法に基づき、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を用いて特定の癌を治療することが所定の患者における免疫により行われる癌細胞の殺傷に重大な影響を有し得るかどうかを決定するために、癌細胞中のＰＤ−Ｌ１の発現レベルを理解することが重要である。
【発明の概要】
【０００３】
癌治療のための治療法の決定を改善するため、癌患者から得られた患者由来の生体試料において直接的にＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを定量的に決定するために有用である１つまたは複数のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにおいて使用するためのペプチドおよびペプチド配列を提供する。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質のサブシーケンス由来の特定のペプチドを提供する。ＰＤ−Ｌ１は、プログラム細胞死１リガンド１、分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）タンパク質、およびＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られる。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＣＤ２７４遺伝子によりコードされ、本明細書でＰＤ−Ｌ１と称される。
【０００５】
タンパク質由来の各ペプチドについてのペプチド配列および断片化／遷移イオンは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとも呼ばれる、質量分析ベースの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）アッセイで有用であり、これは、以降本明細書でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイと称する。ＰＤ−Ｌ１タンパク質およびこのタンパク質のアイソフォームのＳＲＭ／ＭＲＭ分析用のペプチドの使用を記載する。
【０００６】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使用して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の切断に由来する特定のペプチドの１つまたは複数の存在を検出し、その相対または絶対定量的レベルを測定することができ、それによって、質量分析によって生体試料から得られる所定のタンパク質調製物中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の総量を測定する手段を提供することができる。これらのタンパク質から得られる、利用可能なすべてのまたはすべての一部のペプチドは、単一のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで同時に分析することもできる、また、個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの任意の組み合わせにより分析することもできる。それぞれのペプチドにより、質量分析によって生体試料から得られる所定のタンパク質調製物中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の総量の測定が可能になる。
【０００７】
本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌患者組織（例えば、切除腫瘍および生検）などの患者組織試料から得られた細胞から調製される複合タンパク質溶解物試料中でこれらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。その特許に記載される方法は、Expression Pathology Inc.（メリーランド州ロックビル）から入手可能であるLiquid Tissue（登録商標）試薬およびプロトコルを用いて適宜行うことができる。
【０００８】
癌患者から外科的に摘出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、病理学的実践において認められた慣例である。結果として、ホルムアルデヒド／ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、これらの患者からの組織の最も広範に入手できる形態である。ホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、典型的に、ホルマリンと称されるホルムアルデヒドの水溶液を採用する。「１００％」のホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０容量％または３７質量％のホルムアルデヒド）と、酸化および重合の程度を制限するための少量の安定剤、通常、メタノールを伴って構成される。組織を保存する最も一般的な方法は、１０％の中性緩衝ホルマリンと一般に呼ばれるホルムアルデヒド水溶液中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定した全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。したがって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者組織の分析において、最も受け入れられ、頻繁に活用される方法であるだろう。
【０００９】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果を使用し、組織（生体試料）が採取および保存された患者または対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）中のこれらのタンパク質のいずれかまたはすべての正確かつ精密な定量的レベルを、これらのタンパク質の潜在的なアイソフォームの正確かつ精密な定量的レベルに加えて、相関させることができる。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者が、患者または対象のための適切な治療法を決定することも可能にする。罹患組織中または別の患者／対象試料中のタンパク質発現のレベルに関する診断上および治療上で重要な情報を提供するそのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、そのようなアッセイは、癌の病期、程度、または組織学を診断し、癌細胞の増殖を止めるのに最も効果的であるだろう治療剤を決定し、患者または対象が応答する可能性が最も高い治療剤の決定を導くように設計することができる。
【００１０】
より具体的には、患者からの癌細胞中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上のペプチドの検出および／または定量は、どの治療レジメンに従うべきかを示すことができるタンパク質情報を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記載のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対または絶対レベルを定量または測定し、またＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の特定の修飾ペプチドの相対または絶対レベルも測定することができる。修飾の例としては、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。
【００１２】
タンパク質およびタンパク質のアイソフォームの相対定量的レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論により、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積（signature peak area）（例えば、特徴的ピーク面積または積分断片イオン強度）を比較することによって、決定することができる。個別のＰＤ−Ｌ１ペプチドの相対レベルは、異なる試料（例えば、対照試料および患者の組織または対象の組織から調製された試料）中で決定することができる。あるいは、各ペプチドがそれ自体の特定のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する場合、ＰＤ−Ｌ１特徴的ペプチドの１つまたは複数について複数のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を比較することが可能である。ピーク面積を比較することによって、１つの生体試料中、または１つまたは複数の追加または異なる生体試料中の、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の相対レベルおよび潜在的なタンパク質のアイソフォーム含有量を決定することが可能である。このように、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の特定のペプチドの相対量、それゆえ、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、および潜在的なアイソフォームの相対量を、同じ実験条件下で複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超える）生体試料にわたって決定することができる。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論により、そのペプチドの特徴的ピーク面積を、生体試料からの同じタンパク質調製物中の異なるタンパク質由来の別の異なるペプチドの特徴的ピーク面積と比較することによって、単一の試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の所定のペプチドに対して相対定量を決定することができる。
【００１３】
そのような方法論を使用して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の特定のペプチドの量、それゆえ、それぞれの対応するタンパク質およびそれらの潜在的なアイソフォームの量を、同一の試料中または異なる試料中で互いに比較して決定することができる。個別のペプチドの相対定量は、試料中または試料間の別のペプチドの量と比較して行われ得るため、生体試料中のタンパク質の容量に対する絶対重量、または重量に対する絶対重量にかかわらず、（例えば、互いに比較してピーク面積を決定することによって）存在するペプチドの相対量を決定することが可能である。ゆえに、生体試料からのタンパク質調製物中のＰＤ−Ｌ１ペプチドの量を使用して、様々な試料中および試料間のＰＤ−Ｌ１タンパク質の量を決定し得る。異なる試料間の個別の特徴的ピーク面積に関する相対定量データは、一般的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量に正規化される（例えば、試料の総タンパク質濃度、および分析される容量が試料の正規化に使用される）。相対定量を、単一の試料中および／または多くの試料にわたって、複数のタンパク質およびＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の多くのペプチドにわたって同時に実施して、相対タンパク質量、つまり他のペプチド／タンパク質に対する１つのペプチド／タンパク質についてのさらなる知見を得ることができる。
【００１４】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質の絶対定量的レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定され、それは、１つの生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の個別のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、既知量の試料中で「スパイクされた」１つまたは複数の内部標準物（例えば、同位体標識標準物）の既知量のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較されることによる。一つの実施形態では、内部標準物は、１つまたは複数の重同位体で標識された１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する、まったく同一のＰＤ−Ｌ１ペプチドの合成バージョンである。質量分析が、天然ＰＤ−Ｌ１ペプチド特徴的ピークとは異なり別であり、コンパレータピーク（comparator peak）として使用することのできる、予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを生成するように、そのような同位体標識内部標準物が合成される。ゆえに、内部標準物が、既知量の生体試料からのタンパク質またはペプチド調製物中に既知量でスパイクされ、質量分析によって分析されるとき、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することができる。この数値比較が、対応するタンパク質の濃度または重量が決定され得る生体試料からの元のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかの算出を可能にする。断片ペプチドについての絶対定量データは、典型的に、試料ごとに分析されるタンパク質の量にしたがって表示される。絶対定量は、多くのペプチドにわたって実施することができ、それが、同時に単一の試料中および／または複数の試料にわたる複数のタンパク質（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ等）の定量決定を可能にし、個別の生体試料および／または個別の試料のコホート全体における絶対タンパク質量についての見識を得ることができる。一つの実施形態では、タンパク質の定量は、Ｇｙｇｉらよって米国特許第７，５０１，２８６号に記載されるようなペプチド標準物を使用して行ってよい。
【００１５】
本明細書で用いる時、定量する、定量、測定する、測定という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、標準物質（例えば、内部標準物）などの分析物の相対または絶対レベルを決定することを意味する。
【００１６】
本明細書に記載のアッセイ法を、例えば、ホルマリン固定組織などの患者由来または対象由来の組織を採用する際に、癌の病期の決定を助けるものとして使用することができる。本明細書に記載のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイはまた、その患者または対象の治療における使用にどの治療剤が最も有利であり得るかの決定を助けるものとして使用することもできる。
【００１７】
本明細書に記載の癌に関連するタンパク質のレベルを検査するために、腫瘍の部分的または全体の外科的摘出を通して、または疑わしい疾患の有無を決定するために行われる生検手法のいずれかを通して、患者または対象から摘出された癌性組織、または癌性である疑いのある組織に対して分析を行うことができる。組織の試料を分析して、患者の組織または対象の組織中にＰＤ−Ｌ１タンパク質が存在するかどうか、およびタンパク質のどの形態が存在するかを決定する。さらには、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現レベルを決定し、健常組織中に見出される「正常」または基準レベルと比較することができる。健常組織中に見出されるタンパク質の正常または基準レベルは、例えば、癌を有さない１つまたは複数の個体の関連組織に由来し得る。あるいは、正常または基準レベルは、癌に罹患していない関連組織（例えば、同じ器官の部分）の分析によって、癌を有する個体に対して得られ得る。
【００１８】
タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより決定されるタンパク質またはペプチドのモル、質量、または重量で表される量として定義することができる。このレベルまたは量は、分析される溶解物中のタンパク質または別の構成成分の総レベルまたは量に正規化され得るか（例えば、マイクロモル／マイクログラムのタンパク質、またはマイクログラム／マイクログラムのタンパク質で表される）、または重量基準当たりのＤＮＡの量にさえ正規化され得る（例えば、マイクロモルまたはマイクログラム／マイクログラムのＤＮＡ）。加えて、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、例えば、マイクロモル濃度またはナノグラム／マイクロリットルで表される、容量基準で決定され得る。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定されるタンパク質またはペプチドのレベルまたは量を、分析される細胞の数に正規化することもできる。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびこのタンパク質のアイソフォームに関する情報を使用して、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびそのアイソフォーム、または断片ペプチドのレベルを、正常組織中で観察されるレベルと相関させるか、または比較することにより、癌の組織学的病期またはグレードの決定を助けることができる。一旦癌の組織学的病期および／またはグレード、および／またはＰＤ−Ｌ１タンパク質発現特性が決定されると、その情報は、例えば、アッセイされたタンパク質（例えば、ＰＤ−Ｌ１）の異常発現を特徴とする癌組織を特異的に治療するために開発された（化学的および生物学的）治療剤の一覧と照合させることができる。特定の個体からのＰＤ−Ｌ１タンパク質アッセイからの情報をＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的とする治療剤の一覧と照合することは、癌の治療に対する個別化医療アプローチを表す。本明細書に記載のアッセイ方法は、診断および治療の決定のための源として患者または対象自身の組織からのタンパク質の分析を用いることにより個別化医療アプローチの基盤を形成する。
【００２０】
ペプチド生成
原理的には、既知の特異性の任意のタンパク質分解プロセスによって調製される、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の任意の予測されるペプチドが、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在量を決定するために、代理レポーターとして使用され得る。しかしながら、実際は、ほんのわずかなペプチドのみが本明細書に記載のアッセイにおける使用に好適であることが見出されている。さらには、あるとすれば、ＰＤ−Ｌ１から誘導することができる膨大な数の可能性のあるペプチドのうちのどのペプチドがアッセイに好適であり得るかを、経験的に予測することは可能でない。
【００２１】
一つの実施形態では、試料は、既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよび／またはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃのうちの１つまたは複数）で消化される。タンパク質分解処理から生じる１つまたは複数のペプチドを代理レポーターとして使用して、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイなどの好適なアッセイにおいて、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のうちの１つまたは複数の存在量を決定することができる。同様に、ＰＤ−Ｌ１タンパク質中で修飾されることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する任意の予測されるペプチド配列を使用して、試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の修飾の程度をアッセイしてもよい。
【００２２】
ＰＤ−Ｌ１断片ペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されるLiquid Tissue（登録商標）プロトコルの使用を含む様々な方法によって生成され得る。Liquid Tissue（登録商標）プロトコルおよび試薬は、組織／生体試料中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に好適なペプチド試料を作製することができる。Liquid Tissue（登録商標）プロトコルでは、組織／生体は、緩衝液中で、高温で長期間維持され（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分間〜約４時間）、タンパク質架橋を逆転または解放する。採用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または界面活性剤含有緩衝液）であり、有利には、質量分析の妨げとならない緩衝液である。次に、組織／生体試料を、前記生体試料の組織および細胞構造を破壊し、前記試料を液化するのに十分な時間（例えば、約３７℃〜約６５℃で約３０分〜約２４時間）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含むが、これらに限定されない１つまたは複数のプロテアーゼで処理する。加熱およびタンパク質分解の結果得られた物は、液体で可溶性の希釈可能な生物分子溶解物である。一連の実施形態では、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃから選択される２つ以上のプロテアーゼが、生体試料のタンパク質分解処理に採用される。
【００２３】
ペプチド分離およびアッセイ
一旦溶解物が調製されると、試料中のペプチドは、それらの分析および測定（定量）を促進する様々な技術に供され得る。分析を質量分析により行う場合、分析を促進するために、１つまたは複数のクロマトグラフ法が採用され得る。
【００２４】
一つの実施形態では、ペプチドは、質量分析計器による分析の前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって分離される。例えば、ペプチドを、Jupiter Proteo 90A C12、４μｍ樹脂（Phenomenex、カリフォルニア州トーランス）で１２ｃｍのベッド長さに自己充填したPicoFrit（１００μｍ  ＩＤ／１０μｍ先端ＩＤ、New Objective）カラムを用いて、nanoAcquityLCシステム（Waters、マサチューセッツ州ミルフォード）、またはEASY-nLC II（Thermo Scientific、カリフォルニア州サンノゼ）上で分離することができる。ペプチドを、８００ｎＬ／分の流量で、０．１％ギ酸を含有する１％〜５０％アセトニトリルから１２分間のクロマトグラフィー勾配にわたって溶出することができる。液体クロマトグラフィーによって一旦分離されると、溶出されたペプチドは、分析のために質量分析計内に指向される。一つの実施形態では、質量分析計は、ナノスプレー源を備える。
【００２５】
別の実施形態では、ペプチドは、例えば、免疫学ベースの精製（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー）、イオン選択培地におけるクロマトグラフィーなどの親和性技術によって分離され得る。ペプチドが修飾されている場合は、炭水化物修飾ペプチドの分離のためのレクチンなどの適切な媒体を使用して分離を達成することもできる。さらに別の実施形態では、質量分析前にペプチドの免疫学的分離を採用するＳＩＳＣＡＰＡ法が採用される。ＳＩＳＣＡＰＡ技術は、例えば、米国特許第７，６３２，６８６号に記載されている。さらに他の実施形態では、レクチン親和性法（例えば、親和性精製および／またはクロマトグラフィーを使用して、質量分析による分析の前に溶解物からペプチドを分離し得る。レクチンベースの方法を含む、ペプチドの群の分離のための方法は、例えば、Geng et al., J. Chromatography B, 752: 293-306（2001）に記載されている。免疫親和性クロマトグラフィー技術、レクチン親和性技術、および親和性分離および／またはクロマトグラフィーの他の形態（例えば、逆相、サイズベースの分離、イオン交換）は、質量分析によるペプチドの分析を促進するために任意の好適な組み合わせで使用されてよい。
【００２６】
驚くべきことに、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列は、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由は明らかになっていない。特に、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのLiquid Tissue（登録商標）溶解物中で、効率的にまたはまったく検出されることができなかったことが見出された。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も好適なペプチドを予測することができなかったため、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のための信頼できる正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のLiquid Tissue（登録商標）溶解物中の修飾および非修飾ペプチドを実験的に同定する必要があった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、いくつかのペプチドは、例えば、うまくイオン化しないかまたは他のタンパク質とはっきりと異なる断片を生成しないため、質量分析により検出することが難しい可能性があると考えられている。ペプチドはまた、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）にてうまく分解できないか、またはガラスまたはプラスチック製品に付着し得る。したがって、ホルマリン固定組織試料から調製されたLiquid Tissue（登録商標）溶解物中に検出することができる、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来のそれらのペプチド（例えば、表１および２のペプチド）は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイをＰＤ−Ｌ１タンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに採用することができるペプチドである。一つの実施形態では、単一の試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の断片の同時調製に採用されるプロテアーゼは、トリプシンであるだろう。
【００２７】
本明細書（例えば、表１および／または２）に記載の様々な実施形態に見出されるＰＤ−Ｌ１ペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製された複合Liquid Tissue（登録商標）溶解物中の全タンパク質のトリプシン消化により、ＰＤ−Ｌ１タンパク質から誘導された。別段の指定がない限り、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Liquid Tissue（登録商標）溶解物を質量分析によって分析して、質量分析によって検出および分析されるＰＤ−Ｌ１タンパク質由来のペプチドを決定した。質量分析用に好ましい特定のペプチドのサブセットの同定は、次の項目に基づく：１）タンパク質由来のどのペプチドがLiquid Tissue（登録商標）溶解物の質量分析中にイオン化するかの実験的決定；および２）Liquid Tissue（登録商標）溶解物の調製に使用されるプロトコルおよび実験条件で残存するペプチドの能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、試料調製中に修飾された形態で残存するペプチド内の修飾アミノ酸残基の能力までも及ぶものである。
【００２８】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞からのタンパク質溶解物を、Liquid Tissue（登録商標）試薬およびプロトコルを用いて調製し、これは、組織の顕微解剖を介して試料管に細胞を収集し、その後細胞をLiquid Tissue（登録商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。一旦ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けると、組織／細胞は、非限定的な例では、プロテアーゼトリプシンなどのプロテアーゼを使用して、完全に消化される。各タンパク質溶解物は、プロテアーゼを用いたインタクトなポリペプチドの消化により一群のペプチドへと変化する。各Liquid Tissue（登録商標）溶解物を（例えば、イオントラップ質量分析により）分析して、ペプチドの複数の包括的なプロテオーム調査を行った。この場合、各タンパク質溶解物中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により同定され得る可能な限り多くのペプチドを同定するものとして、データを提示した。単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできる限り多くのペプチドを同定するために、イオントラップ質量分析計または包括的プロファイリングを実施することのできる質量分析計の別の形態が、分析に典型的に採用される。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において開発および実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに最も有利である装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであるとしばしば考えられる。
【００２９】
採用された条件下で、一旦、単一の溶解物の単一ＭＳ分析において可能な限り多くのペプチドが同定されると、ペプチドの一覧が照合され、その溶解物中に検出されたタンパク質を判定するために使用された。そのプロセスは、複数のLiquid Tissue（登録商標）溶解物に対して繰り返され、非常に長いペプチドの一覧を単一のデータセットに照合した。その種類のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析されたその種類の生体試料中で、具体的には生体試料のLiquid Tissue（登録商標）溶解物中で検出されることができ、ゆえに、例えば、ＰＤ−Ｌ１タンパク質などの特定のタンパク質に対するペプチドを含むペプチドを表すと考えることができる。
【００３０】
一つの実施形態では、そのそれぞれが表１に記載される、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７）の絶対または相対量の決定に有用であると同定されるＰＤ−Ｌ１トリプシンペプチド。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されるLiquid Tissue（登録商標）溶解物における質量分析によって検出された。ゆえに、表１中のペプチドのそれぞれ、またはそれらのペプチド（例えば、表１に列挙されるこれらのペプチドの内の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）の任意の組み合わせは、ホルマリン固定患者または対象組織中直接を含む、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対する定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に対する候補である。
【表１】
2019058171.tif 000002
【００３１】
表１に記載されるＰＤ−Ｌ１ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のLiquid Tissue（登録商標）溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析は、いずれの特定の器官部位に由来するいずれの特定のペプチドに対しても、選択性が観察されなかったことを示した。ゆえに、前記ペプチドは、任意の生体試料または体内の任意の器官部位から生じる任意のホルマリン固定組織からのLiquid Tissue（登録商標）溶解物上のＰＤ−Ｌ１タンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うのに好適である。
【００３２】
同位体標識されているがそれ以外はこの実施形態に示されるペプチドのうちの１つまたは複数と同一であるペプチドを含む組成物を、本明細書に提供し、それらの調製使用、特に質量分析標準物質としての使用を下記に記載する。
【００３３】
一つの実施形態では、表１の１つまたは複数のペプチド、またはこれらのペプチド（例えば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上）の任意の組み合わせが、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない、質量分光分析に依存しない方法によりアッセイされる。一つの実施形態では、アッセイは、ホルマリン固定組織を用いて行われる。ペプチドの（絶対または相対）量に対する情報がどのように得られるかにかかわらず、この情報は、患者または対象内の癌の存在を示す（診断する）こと、癌の病期／グレード／状態を決定すること、予後を提供すること、または患者または対象に関する治療剤または治療レジメンを決定することを含む、本明細書に記載の任意の方法に採用され得る。
【００３４】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う際に重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に採用してよい装置の種類である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において開発および実行することができるが、現在、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに最も有利である装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。その種類の質量分析計が、細胞内に含有される全タンパク質からの数十万から数百万の個別のペプチドからなり得る極めて複雑化したタンパク質溶解物中の単一の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えられ得る。
【００３５】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の各ペプチドに対してＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて情報を活用することが望ましい。そのさらなる情報は、アッセイが効率的に行われ得るように、特異的標的化ペプチドの正しく、的を絞った分析を行うように、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を指示し、それに命令を与える際に使用され得る。
【００３６】
一般に、標的ペプチド、および特定のＰＤ−Ｌ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオン型のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含み得る。ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用され得るさらなるペプチド情報は、表１の一覧からの１つの（１）ＰＤ−Ｌ１ペプチドについて表２に示される。表２に示されるようにペプチドについて記載されるこのさらなる情報は、調製され得、獲得され得、他のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせ（例えば、トリプシンおよび／またはＬｙｓ  Ｃ）作用により生成されるものを含むＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の任意の他のペプチドの分析に適用され得る。配列番号４のペプチドに対する１つ、２つ、３つ、または４つの遷移イオンは、任意およびすべての組み合わせにおいて、アッセイのために使用され得る。
【表２】
2019058171.tif 000003
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のアッセイに好適なペプチド（例えば、表１に示され、配列番号１〜７として示されるペプチド）は、切断されるとサブペプチドを産生し得るさらなるタンパク質分解部位をペプチド配列の内部に含有し得る。そのようなサブペプチドは、所望のプロテアーゼのタンパク質分解切断部位について同定されたペプチドの配列を評価することによって認識可能である。一つの実施形態では、トリプシンペプチドは、トリプシンによるさらなる切断時にサブペプチドをもたらすことができるさらなる内部トリプシン切断部位を含み得る。別の実施形態では、トリプシンペプチドは、トリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓＣのうちのいずれか１つまたは２つ、またはそれ以上による切断時にサブペプチドの形成をもたらすことのできる、トリプシンＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓＣを含むが、これらに限定されない、プロテアーゼのための内部部位を含有し得る。別の実施形態では、ＬｙｓＣペプチドは、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはトリプシンのうちのいずれか１つまたは２つ、またはそれ以上による切断時にサブペプチドの形成をもたらすことのできる、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはトリプシンなどの他のプロテアーゼのための内部部位を含有し得る。そのようなサブペプチド、および具体的には、配列番号１〜７に示されるペプチドのうちのいずれか１つまたは複数のトリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓＣ切断断片が、記載され本開示の範囲内であることが理解される。
【００３８】
本明細書に記載される実施形態は、表１および２のペプチドのうちの１つまたは複数を含む組成物を含み、同位体標識されているが、それ以外は表１および２に見出されるペプチドのうちの１つまたは複数と同一であるペプチドを任意選択的に含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、表１および２のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ（７）すべてを含む。そのような組成物は、そのアミノ酸配列が、同位体標識されているが、それ以外は表１および２に見出されるペプチドのうちの１つまたは複数と同一であるペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を任意選択的に含み得る。表１および２のペプチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上を含む、同位体標識された合成または天然ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が採用される場合、プロテアーゼ処理は、同位体標識されているが、それ以外は表１および２のペプチドと同一であるペプチドを解放する。そのような同位体標識された生物学的または生合成ペプチドは、例えば、プログラム細胞溶解物中、または組織培養物中で同位体標識されたアミノ酸を使用して調製され得る。それぞれの同位体標識されたペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される１つまたは複数の同位体で標識され得る。ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来のペプチドを含む組成物は、同位体標識されていてもいなくても、そのタンパク質由来のペプチドのすべて（例えば、トリプシンペプチドの完全なセット）を含有する必要はない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来のすべてのペプチドを組み合わせて含有するわけではなく、特に、表１および表２に示されているペプチドのすべてを含有するわけではない。ペプチドを含有する組成物は、乾燥または凍結乾燥した材料、液状（例えば、水性）溶液または懸濁液、アレイ、またはブロットの形態であり得る。
【００３９】
一つの実施形態では、特定のＰＤ−Ｌ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＰＤ−Ｌ１タンパク質のＬｙｓＣタンパク質分解から生じるペプチドについての各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００４０】
別の実施形態では、特定のＰＤ−Ｌ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＰＤ−Ｌ１タンパク質のトリプシンタンパク質分解から生じるペプチドについての各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。
【００４１】
さらに別の実施形態では、特定のＰＤ−Ｌ１ペプチドに関するさらなる情報は、各ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、およびＰＤ−Ｌ１タンパク質のトリプシンおよび／またはＬｙｓＣタンパク質分解から生じるペプチドについての各遷移イオンのイオン型のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上を含む。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の単一のトリプシンおよび／またはＬｙｓＣタンパク質分解ペプチドは、関連するさらなる情報とともに、診断決定に採用される。
【００４２】
ある特定の実施形態
本発明のある特定の実施形態を下記に記載する。
【００４３】
１．生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを測定するための方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つまたは複数の修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量すること；および前記試料中の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを算出することを含み、前記量が相対量または絶対量である、方法。
【００４４】
２．１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および／または定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００４５】
３．前記分画工程が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群より選択される、実施形態２に記載の方法。
【００４６】
４．前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Liquid Tissue（登録商標）プロトコルによって調製される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４７】
５．前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【００４８】
６．前記タンパク質消化物がトリプシンおよび／またはＬｙｓＣ消化物を含む、実施形態５に記載の方法。
【００４９】
７．前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
【００５０】
８．使用される質量分析の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または複数選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態７に記載の方法。
【００５１】
９．前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【００５２】
１０．前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞または固形組織である、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【００５３】
１１．前記生体試料がホルマリン固定組織である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００５４】
１２．前記生体試料がパラフィン包埋組織である、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【００５５】
１３．前記生体試料が腫瘍から得られる組織である、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００５６】
１４．前記腫瘍が原発腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５７】
１５．前記腫瘍が二次腫瘍である、実施形態１３に記載の方法。
【００５８】
１６．修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することをさらに含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
【００５９】
１７（ａ）．前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、１つの生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の試料または生体試料中の同一のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００６０】
１７（ｂ）．前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、１つの生体試料中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７に示されるＰＤ−Ｌ１タンパク質の約８〜約４５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００６１】
１８．１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する添加内部標準ペプチドと比較される、実施形態１７（ａ）または１７（ｂ）に記載の方法。
【００６２】
１９．前記内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態１８に記載の方法。
【００６３】
２０．前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の重安定同位体（heavy stable isotope）を含む、実施形態１９に記載の方法。
【００６４】
２１．前記タンパク質消化物中の１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および／または定量することが、修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在、および患者または対象における癌との関連性を示す、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
【００６５】
２２．１つまたは複数の修飾および／または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量または前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質の量の前記検出および／または定量の結果を、癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【００６６】
２３．１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量、または前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質の量の前記検出および／または定量の結果を、癌の診断上の病期／グレード／状態と相関させることが、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出および／または定量することと多重形式で組み合わされて、癌の診断上の病期／グレード／状態に関するさらなる情報を提供する、実施形態２２に記載の方法。
【００６７】
２４．前記生体試料が得られた患者または対象に対し、１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの有無または量、あるいはＰＤ−Ｌ１タンパク質の量に基づいて、治療を選択することをさらに含む、実施形態１〜２３のいずれかに記載の方法。
【００６８】
２５．前記生体試料が得られた患者または対象に、治療的有効量の治療剤を投与することをさらに含み、治療剤および／または投与される治療剤の量が、１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量、あるいはＰＤ−Ｌ１タンパク質の量に基づく、実施形態１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００６９】
２６．前記治療または治療剤が、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現する癌細胞に指向される、実施形態２４および２５に記載の方法。
【００７０】
２７．前記生体試料が、Liquid Tissue（登録商標）プロトコルおよび試薬を採用して１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を定量するために処理されているホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００７１】
２８．前記１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、表１中のペプチドのうちの１つまたは複数である、実施形態１〜２８のいずれかに記載の方法。
【００７２】
２９．表１中のペプチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、および／またはそれらに対する抗体を含む組成物。
【００７３】
例示的なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法
以下に記載される方法は、１）ＰＤ−Ｌ１タンパク質の質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために使用することのできるＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の候補ペプチドを同定し、２）ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の標的ペプチドのための個別のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ（１つまたは複数）を開発し、３）定量アッセイを癌診断および／または最適治療の選択に適用するために使用された。
【００７４】
１．ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭ候補断片ペプチドの同定：
ａ．１つまたは複数のプロテアーゼ（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を使用して、ホルマリン固定生体試料からLiquid Tissue（登録商標）タンパク質溶解物を調製して、タンパク質を消化させる。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue（登録商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の全断片ペプチドを同定し、この場合、個別の断片ペプチドは、リン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含有しない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計において、Liquid Tissue（登録商標）溶解物中の全タンパク質断片を分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を有するＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の全断片ペプチドを同定する。
ｄ．完全長ＰＤ−Ｌ１タンパク質全体から特定の消化方法により生成された全ペプチドを測定することは潜在的に可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid Tissue（登録商標）タンパク質溶解物中で直接質量分析により同定されるものである。
ｅ．患者または対象組織中で特異的に修飾され（リン酸化、グリコシル化等）、イオン化され、ゆえに、ホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue（登録商標）溶解物を分析するとき、質量分析計中で検出することができるペプチドは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして同定される
【００７５】
２．ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の断片ペプチドのための質量分析アッセイ：
ａ．Liquid Tissue（登録商標）溶解物中で同定された個別の断片ペプチドについての三連四重極質量分析計におけるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない、最適クロマトグラフィー条件のための断片ペプチドに対する最適保持時間を決定する。
ｉｉ．各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、およびそれぞれの断片ペプチドに対するそれぞれの遷移イオンのイオン型を決定する。
ｉｉｉ．次いで、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて、三連四重極質量分析計においてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる固有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析の分析から、固有のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の関数として、検出されるＰＤ−Ｌ１タンパク質の断片ペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の相対および絶対量の両方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施する。
ｉ．相対的定量は、以下により達成され得る：
１．１つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue（登録商標）溶解物中で検出された所定のＰＤ−Ｌ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるホルマリン固定生体試料からの少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるLiquid Tissue（登録商標）溶解物中の同一のＰＤ−Ｌ１断片ペプチドの同一のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること
２．１つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue（登録商標）溶解物中で検出された所定のＰＤ−Ｌ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、異なる別個の生物学的起源由来の他の試料中の、他のタンパク質由来の断片ペプチドから発生したＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在の増加または減少を決定し、この場合、ペプチド断片についての２つの試料間のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較は、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化される。
３．ＰＤ−Ｌ１タンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でのそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所定のＰＤ−Ｌ１ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料からの同一のLiquid Tissue（登録商標）溶解物中の異なるタンパク質に由来する他の断片ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在の増加または減少を決定すること。
４．これらのアッセイを、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の非修飾断片ペプチド、修飾断片ペプチドの両方に適用することができ、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これらに限定されず、修飾ペプチドの相対レベルは、非修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ様式で決定される。
ｉｉ．所定のペプチドの絶対定量は、個別の生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の所定の断片ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、生体試料からのタンパク質溶解物中にスパイクされた内部断片ペプチド標準物のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、達成され得る。
１．内部標準物は、調べられているＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生体試料中の内部断片ペプチド標準物および天然断片ペプチドの両方について別々に決定され、その後、両方のピーク面積が比較され得る。
２．これは、非修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、また、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対的量を決定するのと同一の様式で決定され得る。
【００７６】
３．断片ペプチド定量の癌診断および治療への適用
ａ．ＰＤ−Ｌ１タンパク質の断片ペプチドレベルの相対および／または絶対定量を実施し、癌の分野で十分に理解されている、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現と患者および対象の腫瘍組織における癌の病期／グレード／状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
ｂ．ＰＤ−Ｌ１タンパク質の断片ペプチドレベルの相対および／または絶対定量を実施し、異なる治療戦略からの臨床転帰との相関を実証し、この場合、この相関は、この分野ですでに実証されているか、または患者または対象のコホート、およびそれらの患者または対象からの組織にわたる相関研究により将来実証することができる。一旦以前に確立された相関関係、または将来得られる相関関係のいずれかがこのアッセイにより確認されると、本アッセイ方法を使用して、最適な治療戦略を決定することができる。
【００７７】
内部標準物は、調べられているＰＤ−Ｌ１タンパク質由来の断片ペプチドの標識された合成バージョン（または、タンパク質分解時に放出される断片ペプチドの標識された合成バージョンを含むタンパク質またはポリペプチド）であることができる。この標準物は、既知量で試料中にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、生体試料中の内部断片ペプチド標準物および天然断片ペプチドの両方について、別々に決定され、その後、両ピーク面積が比較されることができる。
【００７８】
これは、非修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用可能であり、この場合、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれるが、これに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルは、非修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同一の様式で決定することができる。
【００７９】
ホルマリン固定患者由来または対象由来の組織の分析に基づいた組織中のＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルの評価は、それぞれの特定の患者または対象に関する診断、予後、および治療的関連情報を提供することができる。生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを測定するための方法であって、質量分析を使用して、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つまたは複数の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および／または定量すること；および前記試料中の修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを算出することを含み、前記レベルは、相対レベルまたは絶対レベルである、前記方法を本明細書に記載する。関連する実施形態では、１つまたは複数のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することは、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較により、生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を決定することを含み、生体試料中のそれぞれのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、内部標準物は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の重安定同位体を含む、同位体標識内部標準ペプチドである。
【００８０】
本明細書に記載される生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質（または、そのサロゲートとしての断片ペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または対象における癌の診断上の指標として使用され得る。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルの測定からの結果を採用して、組織中に見出されるＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを、正常および／または癌性または前癌性組織中に見出されるＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルと相関させること（例えば、比較すること）により、診断上の癌の病期／グレード／状態を決定し得る。
【００８１】
ホルマリン固定患者組織中の特定のタンパク質のレベルを検出するために使用されている唯一の現行方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。この方法は、患者腫瘍組織試料からの単一の組織切片において一回につき１つのタンパク質のみを分析し、そのため、複数のタンパク質を分析するためには、複数の組織切片を調べなければならず、それには多くの時間および労力がかかる。ＩＨＣは、抗体を使用して標的タンパク質の存在を検出し、タンパク質への抗体の非特異的結合の可能性があるため、任意のＩＨＣ実験における信号バックグラウンドの生来の大きな可能性がある。加えて、ＩＨＣは、良くても半定量的でしかない。これらの問題に起因して、ＩＨＣは、複数のタンパク質の客観的な定量的分析を同時に提供することができない。本実施形態は、患者組織試料の単一の切片を活用して、１００％アッセイ特異性を伴って、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の客観的定量を同時に提供することができ、多くの時間および費用を節約しながら、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現に関するより一層有益なデータを提供する。
【００８２】
この多重ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイはまた、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、およびｃＭｅｔなどの薬物標的タンパク質を含む、ＰＤ−Ｌ１タンパク質以外の他のさらなるタンパク質の同時分析を含むことができる。これは、さらなるタンパク質の分析が、どの追加の薬物が特定の癌の治療に有用であり得るかということも示すため、有益である。さらなる例となる薬物標的タンパク質の分析に基づいた追加の薬物の例としては、ＥＧＦＲ受容体を標的とするアービタックス、ＩＧＦ−１Ｒを標的とするフィギツムマブ、およびｃ−Ｍｅｔおよび血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）を標的とするフォレチニブが挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬物の例は、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＲＧ７４４６と呼ばれる遺伝子操作されたモノクローナル抗ＰＤＬ１抗体である。この抗体は、単独で、または例えば固形腫瘍に対してはAvastin（登録商標）（ベバシズマブ）と、および転移性黒色腫に対してはZelboraf（登録商標）（ベムラフェニブ）と組み合わせて使用され得る。
【００８３】
核酸およびタンパク質の両方を同一のLiquid Tissue（登録商標）生体分子の調製物から分析することができるので、タンパク質が分析される際に同一の試料中の核酸から、疾患の診断および薬物治療の決定に関するさらなる情報を生成することが可能である。例えば、ＰＤ−Ｌ１タンパク質が、増加したレベルである特定の細胞により発現される場合、ＳＲＭによりアッセイされるとき、データは細胞の状態に関する情報を提供することができ、細胞の、無秩序な成長、潜在的な薬物耐性、および癌の発生の可能性を得ることができる。同時に、ＰＤ−Ｌ１遺伝子および／またはそれらがコードする核酸およびタンパク質（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライス変異体）の状態に関する情報を、同一のLiquid Tissue（登録商標）生体分子の調製物中に存在する核酸から得ることができ、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。ＰＤ−Ｌ１タンパク質由来でなく、同一の生体分子の調製物中に存在する任意の遺伝子および／または核酸は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価されることができる。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質、および／または１つ、２つ、３つ、４つ以上のさらなるタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を試験することによって分析され得る。これらの核酸を、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失、挿入の識別、および／または単一塩基対多型、遷移、塩基転換、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、突然変異の存在の決定のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上により、検査することができる。
【００８４】
上の説明および、方法および組成物の例示的な実施形態は、本開示の範囲を例証するものである。しかしながら、当業者には明らかであろう変形のため、本開示は、上記の特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【配列表】
2019058171000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月10日(2018.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織のヒト生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の量を測定するための方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１つのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、質量分析を使用して検出および定量すること；および前記試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の量を算出することを含み、前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが配列番号４のペプチドであり、前記量が相対量または絶対量である、方法。
【請求項２】
１つのＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質消化物が、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、１つの生体試料中の前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、異なる別個の生体試料中の同一のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドを定量することが、生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を、既知量の添加内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、前記生体試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質消化物中のＰＤ−Ｌ１タンパク質断片ペプチドの量を検出および定量することが、修飾または非修飾ＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在、および組織サンプルが得られた患者または対象における癌との関連性を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
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