(57)【要約】【課題】コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供する。【解決手段】コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、１２種のペプチドの有無を指標とし、前記コラーゲンが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定することを特徴とする。また、コラーゲン由来材料が２種類の動物種の混合物である場合も、ペプチドの組み合わせによって２種のそれぞれの動物種を特定することができる。種特異的ペプチドを指標とすれば、混合物に含まれる動物種の配合割合も求めることができる。分解しやすいＤＮＡ配列に代えてアミノ酸配列で特定するため精度が高く、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定できるため迅速な判断が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、下記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか１種を指標とし、表２に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定し、または
（２）配列番号１、２、４および５の４種を指標とし、下記表３に従い、前記コラーゲン由来材料が、ヒツジ、ヤギ、またはシカのいずれの動物種であるかを判定し、または、
（３）配列番号１、２、４、５、９、１１および１２の７種を指標とし、下記表４に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカまたはウサギのいずれの動物種であるかを判定し、または
（４）配列番号１、２、４、５、６、８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７のいずれかの１０種を指標とし、下記表５に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定し、または、
（５）配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか４種以上を指標とし、下記表６に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【表１】
2019088213.tif 000026
【表２】
2019088213.tif 000027
【表３】
2019088213.tif 000028
【表４】
2019088213.tif 000029
【表５】
2019088213.tif 000030
【表６】
2019088213.tif 000031
【請求項２】
コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、下記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中から２種以上を指標とし、表７に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種の何れの組み合わせかを判定し、または
（２）配列番号１〜１２の１２種のペプチドを指標とし、下記表８に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定し、または
（３）配列番号１、２、４、５、６、８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７のいずれかの１０種を指標とし、下記表９に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定し、または
（４）配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか３種以上を指標とし、下記表１０に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【表７】
2019088213.tif 000032
【表８】
2019088213.tif 000033
【表９】
2019088213.tif 000034
【表１０】
2019088213.tif 000035
【表１１】
2019088213.tif 000036
【請求項３】
コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、下記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に、表６に従い動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか３種以上を指標として、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメから選択される３種以上の動物種を含む場合の各動物種を判定し、または
（２）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか２種以上、および配列番号１〜２、配列番号４、配列番号８および配列番号１２の中から選択される少なくとも１種以上のペプチドを指標として、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメから選択される３種以上の動物種を含む場合に各動物種を判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【表１２】
2019088213.tif 000037
【表１３】
2019088213.tif 000038
【請求項４】
判定された動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせである場合に、配列番号３または配列番号７をチョウザメの指標とし、配列番号５をヒツジの指標とし、配列番号６をウマの指標とし、配列番号９をウサギの指標とし、配列番号１０をブタの指標とし、または配列番号１１をウシの指標として、前記コラーゲン由来材料に含まれるウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、またはチョウザメの含有割合を特定することを特徴とする、請求項２または請求項３記載のコラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【請求項５】
前記ペプチドの有無は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【請求項６】
前記コラーゲン由来材料は、皮革、膠、コラーゲン、またはゼラチンから選択されるいずれか１種である、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【請求項７】
前記コラーゲン由来材料は、文化財から抽出された膠である、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン由来材料の動物種を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膠は、動物の皮や骨、腱などから抽出したコラーゲンを主成分とし、漆器、仏像、仏具、木造建築物、バイオリンその他の楽器などの接着剤、東洋画の墨や墨汁その他の顔料の溶剤、絵具や絵画下地のバインダーなどとして使用されている。古代壁画や原始絵画の時代から使用されており、膠の動物種の同定により作品の材料や技法を解明することができ、および適切な展示・保存・修復方法を決定する一助となる。さらに、膠の動物種の同定によりオリジナル部分と後補部分とを識別することができ、ときには真贋問題の検討に寄与できる場合がある。
【０００３】
絵画や歴史資料に使用された膠の由来動物種を判定する方法として、質量分析法によるアプローチが多数報告されている。試料中のコラーゲンをプロテアーゼで切断し、生成したペプチド断片を質量分析計で検出し、コラーゲンのアミノ酸配列における種間の差異に基づいて判定する方法である。例えば、中世に描かれた作品 “Saint John the Evangelist”(プラハ国立美術館所蔵)上に塗られたバインダーをマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計を使いペプチドマスフィンガープリント法で分析したところ、ウサギ膠の使用が明らかになった（非特許文献１）。また、高分解能を有するフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計で１７世紀末のカトリック教区教会の祭壇を分析したところ、銀箔と釉薬の間の薄いタンパク質層から魚のコラーゲンに特異的な７つのペプチドが検出されたという（非特許文献２）。さらに、Ｊ．ポールゲッティ美術館のコレクションであるRomano Egyptianの三連祭壇画（紀元前１８０〜２００年）に使用されている膠着剤を高速液体クロマトグラフ質量分析計で分析したところ、ウシ由来のコラーゲンが同定されたという（非特許文献３）。
【０００４】
更に、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計で、コラーゲン由来の動物種特異的ペプチドを検出することにより効率的に膠の由来動物種を同定する方法もある（非特許文献４）。ウシ用の１５種のペプチド、ウサギ用の３種、チョウザメ用の３種を使用し、１００年前のトートン−フレス家のドーアールの接着剤と称されるウサギ膠に応用したところ、２種のウサギコラーゲンペプチドが同定されたという。また、１８世紀の聖マキシマム教会のわずか５０μｇの金箔サンプルを使用し、１３種の種特異的ウシコラーゲンペプチドを同定できたという。
【０００５】
また、試料から抽出した動物の線維状タンパク質群を、プロテアーゼで切断してペプチド断片にした後、この断片のアミノ酸配列を解析し、試料に含まれる動物種を鑑別する方法がある（特許文献１）。皮革の動物種を判別する方法であるが、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を優先的に用いて試料の動物種を鑑別するものであり、優先順位に従って、ウシ→シカ→ウマ→ブタ→ヒツジ→ヤギの順に動物種が鑑別される。一方、予め選択した６種のペプチドを使用し、動物種を特定する方法もある（特許文献２）。皮革に含まれるコラーゲンをトリプシン消化し、生じたマーカーペプチドを分析して当該皮革の動物種を判別するもので、複数のペプチドを組み合わせることで、簡便にいずれか１種の動物種に特定できるという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１５７２５０号
【特許文献２】特開２０１６−２２４００７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Kuckova et al., "Analysis of organic colouring and binding components in colour layer of art works", Anal Bioanal Chem (2005), vol. 382, p275−282
【非特許文献２】S. Dallongeville et al., "Proteomics applied to the authentication of fish glue: Application to a 17th century artwork sample", Analyst, (2013), vol. 138, p5357−5364
【非特許文献３】J. Mazurek et al., "Characterization of binding media in Egyptian Romano portraits using enzyme-linked immunosorbant assay and mass spectrometry", e-PS, (2014), vol. 11, p76-83
【非特許文献４】S. Dallongeville et al., "Identification of animal glue species in artworks using proteomics: Application to a 18th century gilt sample", Anal. Chem. (2011), vol. 83, p9431−9437
【非特許文献５】NC Schellmann, "Animal glues: a review of their key properties relevant to conservation", Studies in Conservation, (2007), vol. 52, p55-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
文化財の一部をなす膠は、それ自体が検証物である。膠から得られるデータと文献資料とを照合することで、歴史情報を読み解く一助となり、文献資料の空白を埋める可能性も高い。絵画等では、地塗り層と彩色層とに使用する膠が異なっている場合があり、層ごとに使用している膠の動物種を判別できれば絵画研究を補助し、文化財の保護・修復を適切に行うための情報としても利用することができる。したがって、少量の試料を用いて動物種を判別できる方法の開発が望まれる。
【０００９】
一方、膠は、原料に応じて骨膠、皮膠などに分類され、更に動物種に応じて、ウシ膠、ブタ膠、ウサギ膠、シカ膠、サカナ膠などに分類される。ウサギ膠などは、その名の通りウサギ皮から調製されるべきであるが、市販品の中には他の動物種由来の膠を混ぜているものがあることが記載されている（非特許文献５）。非特許文献５では、製造業者による原料情報、前処理、添加物などは、正確であるとは限らないと警告している。膠は複数の動物種が混合されると外観から動物種を判別することができず、混合物における動物種の特定が望まれる。しかしながら、上記特許文献１、特許文献２記載の方法は、１種の皮革を対象とするため、２以上の異なる動物種が混在する場合の膠の同定には適しない。したがって、２種の動物が混在する場合でもそれぞれの動物種を判別できる方法の開発が望まれる。
【００１０】
また、製品に付された原料情報と製品組成との相違は、膠に限定されるものではない。コラーゲンを原料とするゼラチンなどの動物種も判別できることが望まれる。
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、コラーゲン由来材料に使用された動物種を判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、各種動物のコラーゲンのトリプシン分解物を詳細に検討し、トリプシン分解物に含まれる特定の１２種のペプチドを組み合わせることで、当該コラーゲンの動物種を判定できること、上記１２種のペプチドを使用すれば２種の動物が混在する場合の各動物種を特定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち本発明は、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、下記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか１種を指標とし、表２に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定し、または
（２）配列番号１、２、４および５の４種を指標とし、下記表３に従い、前記コラーゲン由来材料が、ヒツジ、ヤギ、またはシカのいずれの動物種であるかを判定し、または、
（３）配列番号１、２、４、５、９、１１および１２の７種を指標とし、下記表４に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカまたはウサギのいずれの動物種であるかを判定し、または
（４）配列番号１、２、４、５、６、８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７のいずれかの１０種を指標とし、下記表５に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定し、または、
（５）配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか４種以上を指標とし、下記表６に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００１４】
【表１】
2019088213.tif 000002
【００１５】
【表２】
2019088213.tif 000003
【００１６】
【表３】
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【００１７】
【表４】
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【００１８】
【表５】
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【００１９】
【表６】
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【００２０】
また本発明は、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、上記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中から２種以上を指標とし、表７に従い、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種の何れの組み合わせかを判定し、または
（２）配列番号１〜１２の１２種のペプチドを指標とし、下記表８に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定し、または
（３）配列番号１、２、４、５、６、８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７のいずれかの１０種を指標とし、下記表９に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定し、または
（４）配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか３種以上を指標とし、下記表１０に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００２１】
【表７】
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【００２２】
【表８】
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【００２３】
【表９】
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【００２４】
【表１０】
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【００２５】
また本発明は、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、上記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に、上記表６に従い動物種を判別する方法であって、
（１）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか３種以上を指標として、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメから選択される３種以上の動物種を含む場合の各動物種を判定し、または
（２）配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか２種以上、および配列番号１〜２、配列番号４、配列番号８および配列番号１２の中から選択される少なくとも１種以上のペプチドを指標として、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメから選択される３種以上の動物種を含む場合に各動物種を判定することを特徴とする、コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００２６】
また本発明は、判定された動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせである場合に、配列番号３または配列番号７をチョウザメの指標とし、配列番号５をヒツジの指標とし、配列番号６をウマの指標とし、配列番号９をウサギの指標とし、配列番号１０をブタの指標とし、または配列番号１１をウシの指標として、前記コラーゲン由来材料に含まれるウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、またはチョウザメの含有割合を特定することを特徴とする、前記コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００２７】
更に本発明は、前記ペプチドの有無を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定することを特徴とする、前記コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００２８】
また、本発明は、前記コラーゲン由来材料が、皮革、膠、コラーゲン、またはゼラチンから選択されるいずれか１種である、前記コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【００２９】
また本発明は、前記コラーゲン由来材料は、文化財から抽出された膠である、前記コラーゲン由来材料の動物種を判定する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のコラーゲン由来材料の動物種を判定する方法によれば、コラーゲンのトリプシン分解物に含まれる特定の１２種のペプチドの有無を測定することで、当該コラーゲンの動物種がウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギ、またはチョウザメのいずれであるかを判別することができ、および２種類の混合物である場合にいずれの２種であるかを判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１において、ウシコラーゲントリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２】実施例１において、ウマコラーゲントリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図３】実施例１において、ブタコラーゲントリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図４】実施例１において、ヒツジコラーゲントリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図５】実施例１において、ウサギコラーゲントリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図６】実施例１において、シカ膠トリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】実施例１において、チョウザメ膠トリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８】実施例１において、ヤギ革トリプシン分解物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図９】実施例２において、試料ＣのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の第１は、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、前記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標にしてコラーゲン由来材料の動物種を判別する方法である。配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか１種を指標とし、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定することができる。また、配列番号１、２、４および５の４種を指標として、前記コラーゲン由来材料が、ヒツジ、ヤギまたはシカのいずれの動物種であるかを判定することができる。また、配列番号１、２、４、５、９、１１および１２の７種を指標とし、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカまたはウサギのいずれの動物種であるかを判定することができる。更に、配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１１および１２の１０種を指標とし、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定することができる。更に、全１２種のペプチドのいずれか４種以上を指標とし、前記コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種に由来するかを判定することができる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
本発明において「コラーゲン由来材料」とは、コラーゲンを主成分とするものを広く含み、動物の皮膚の生のままの原皮、前記原皮を鞣した鞣し皮、前記鞣し皮を使用した皮革製品；動物の骨、皮、腱などの熱湯抽出物である膠；動物の骨、皮、腱などを構成する主タンパク質であるコラーゲン；コラーゲンの熱変性・分解物であるゼラチンを含む。
【００３４】
本発明では動物種を判定するため、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドを試料とする。コラーゲンは、３本のポリペプチド鎖の三重螺旋構造を基本単位とし、−（Ｇｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ）ｎ−で示される、いわゆる「コラーゲン様配列」と呼ばれる一次構造を有する。生体内で前記一次構造を有するペプチド鎖が翻訳された後に、プロリンやリジンがそれぞれヒドロキシプロリンやヒドロキシリジンに変換され、前記三重螺旋構造を形成する。コラーゲンには、Ｉ型からＸＸＶＩＩＩ型までが知られ、生体を構成する部位によって異なるコラーゲン型が主成分となるが、いずれも上記一次構造と三重螺旋構造とを有する点で共通する。皮革や膠などに含まれるコラーゲンは、Ｉ型を主成分とすることが知られ、これをトリプシン分解することで、本発明の動物種の判定方法の測定試料として利用することができる。なお、コラーゲンのアミノ酸配列は動物間によって近似し、ゆえに抗原性の少ない生体材料として使用される場合も多い。しかしながら、種々の動物から得たコラーゲンのトリプシン分解物を詳細に検討したところ、前記トリプシン分解物を構成するペプチドの１２種を組み合わせると、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメの８種類の動物種を判定できることが判明した。
【００３５】
本発明では、８種の動物種の判定に使用するため、前記表１に示す１２種のペプチドを選択した。前記表１に示すペプチドの由来を表１１に示す。配列番号１で示すアミノ酸配列は、ウシ、ウマ、ブタ、シカおよびウサギのＩ型コラーゲンα１鎖のＮ末端側の三重螺旋開始アミノ酸を１とする場合に第３１６〜３２７番目の１２個のアミノ酸に相当する。同様に、配列番号２で示すアミノ酸配列は、ヒツジおよびヤギのＩ型コラーゲンα１鎖のＮ末端側の三重螺旋開始アミノ酸を第１とする場合に第３１６〜３２７番目の１２個のアミノ酸に相当する。これは、コラーゲン鎖の同位置にあるアミノ酸配列が、動物種によってわずかに相違し、動物種によっては種特異的ペプチドとなることを示す。本発明では、各種動物のＩ型コラーゲンのトリプシン消化によって生成するペプチドを詳細に検討し、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメの８種類の動物を特定できるペプチドとして表１に示す１２種のペプチドを選択した。
【００３６】
【表１１】
2019088213.tif 000012
【００３７】
表１１に示すように、配列番号３および配列番号７はチョウザメに特異的な配列であり、配列番号５はヒツジに特異的、配列番号６はウマに特異的、配列番号９はウサギに特異的、配列番号１０はブタに特異的、および配列番号１１はウシに特異的な配列である。したがって、配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか１種を指標とすれば、下記表２に示すように、その有無により、コラーゲン由来材料がウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、チョウザメのいずれであるかを特定することができる。なお、配列番号３と配列番号７とは、共にチョウザメに特異的な配列である。本発明では配列番号３または配列番号７のいずれか一方を使用してもよく、配列番号３と配列番号７の双方を使用してもよい。表２に従い、配列番号３で示すペプチドが検出された場合は、「チョウザメ」と、配列番号５で示すペプチドが検出された場合は、「ヒツジ」と判定される。なお、配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の全てを使用してもよい。例えば、配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１０で示すペプチドを検出せず、配列番号１１で示すペプチドを検出した場合に、「ウシ」と判定する。使用するペプチド数が増加するにつれて誤判定の可能性を低減することができ、好ましい。
【００３８】
2019088213.tif 000013
【００３９】
一方、コラーゲン由来材料が皮革などの場合、ヒツジとヤギとは構造が類似するため外観からの判定が難しく、電子顕微鏡による観察でさえ正確な判別は容易でない。前記表１１に示すように、配列番号５で示すペプチドはヒツジに特異的であるが、表１１にはヤギやシカに特異的な配列は含まれていない。しかしながら、配列番号１、２、４および５の４種のペプチドを使用し、下記表３に従ってその有無から、ヒツジ、ヤギ、シカの何れであるかを判定することができる。例えば、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物が、配列番号１および配列番号４のペプチドを含み、配列番号２および配列番号５のペプチドを含まない場合には、当該コラーゲン由来材料の動物種を「シカ」と判定する。表３に従えば、上記４種のペプチドは、ヒツジとヤギの間に２か所の相違を有し、ヒツジとシカの間に４か所の相違を有し、ヤギとシカの間に２か所の相違を有する。すなわち、何れの動物種間でも相互に２以上の相違を有する。このため、動物種が「シカ」である場合に、ヒツジやヤギとして判定される誤判定を回避することができる。
【００４０】
【表１３】
2019088213.tif 000014
【００４１】
更に、コラーゲン由来材料が膠の場合には、ウシやウサギが原料として使用されることが多い。配列番号１、２、４、５、９、１１および１２の７種を指標としてその有無を評価し、下記表４に従って判定すれば、何れの動物種間でも２以上の相違をもって、コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカまたはウサギのいずれであるかを判定することができる。
【００４２】
【表１４】
2019088213.tif 000015
【００４３】
更に、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメのいずれの動物種であるかを判定するために、配列番号１、２、４、５、６、８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７のいずれかの１０種を指標とする。表１に示す配列番号１〜１２のペプチドのうち、配列番号１０はブタに特異的なペプチドである。下記表５に従えば、ブタの種特異的ペプチドを指標とすることなく、各動物種間でいずれも２以上の相違をもって、「ブタ」を含む動物種を特定することができる。なお、本発明において「配列番号３または７」とは、配列番号３と配列番号７の何れか一方でもよく、配列番号３と配列番号７の双方を使用してもよいことを意味する。表５には、配列番号３と配列番号７との双方を記載した。
【００４４】
【表１５】
2019088213.tif 000016
【００４５】
本発明によれば、表６に従って、配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか４種以上を指標とし、コラーゲン由来材料が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメの８種のいずれの動物種であるかを判定することができる。前記したように配列番号１、２、４および５の４種のペプチドを指標とすれば、ヒツジ、ヤギ、シカの何れの動物種であるかを特定することができる。同様に、配列番号１、配列番号２、配列番号８、配列番号１１、および配列番号１２の５種を指標に使用すれば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、シカ、ウサギ、チョウザメの何れであるかを特定することができる。コラーゲン由来材料が皮革などの場合、外観から「ウシ」か「ウマ」かの判別が困難な場合は、この５種のペプチドを指標に使用することで動物種を判定することができる。また、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号８、および配列番号１２の５種を指標に使用すれば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、チョウザメの何れであるかを特定することができる。コラーゲン由来材料の外観から「ヒツジ」か「ヤギ」かの判別が困難な場合には、この５種のペプチドを指標に使用することで動物種を判定することができる。上記は例示である。このように判定したい動物種を特定できるペプチドを表６から選択し、表６に従って動物種を判定することができる。本発明では、動物種の特定に使用するペプチドは、表６に示す１２種のペプチドの中から選択され、４種以上であれば５種以上、６種以上、７種以上でもよく、いずれのペプチドを組み合わせるかは任意である。なお、全１２種のペプチドを使用すれば、上記８種の動物種間にそれぞれ２〜６種のペプチド有無の相違を持って動物種を特定することができる。
【００４６】
【表１６】
2019088213.tif 000017
【００４７】
本発明では、動物種の判定においてペプチドを指標とするため、ＤＮＡを使用する場合と比較して短時間で処理でき、かつＤＮＡよりも安定性が高いため判定精度を高く維持することができる。なお、コラーゲンはＧｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙを基本単位とし、動物種間で配列が近似するため、アミノ酸数が少ないペプチドを選択すると種特異性が生じない。しかしながら、本発明によれば、トリプシン消化後のアミノ酸数が１２〜２４の上記１２種のペプチドを使い、さらに組み合わせることで、高精度な動物種の判定が可能となる。
【００４８】
本発明の第２は、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、上記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に２種以上の動物種が混在する場合にこれら２種の動物種を判別する方法である。皮革の場合は単一の動物種が対象となるが、動物から抽出されたコラーゲンや膠、コラーゲンの変性・分解物であるゼラチンなどは２種が混合する可能性がある。しかしながら、本発明によれば、抽出されたコラーゲンのトリプシン分解物を試料に用いて、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギまたはチョウザメの何れの２種の動物種が混合されたかを特定することができる。判定の指標に使用するペプチドは、表１に示す配列番号１〜１２のペプチドである。上記表１１に示すように種特異的ペプチドもあり、他の動物に共通して含まれるペプチドもあるが、これらを組み合わせることで、２種の動物種が混合された場合でも、各動物を特定することができる。
【００４９】
例えば、配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種の中からいずれか２種以上を指標とし、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種の何れの組み合わせかを判定することができる。上記表１１に示すように、配列番号３、５〜７、９〜１１の７種のペプチドは、動物種に特異的なペプチドである。したがって、配列番号３、５〜７、９〜１１の７種のペプチドを指標とすれば、この特異的ペプチドを有する動物、すなわち、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、チョウザメの６種のいずれか２種の混合物について動物種を特定することができる。表７に動物種の組み合わせと指標となるペプチドの配列番号との関係を示す。なお、配列番号３および配列番号７はいずれもチョウザメに特異的ペプチドである。配列番号３と配列番号７の何れか一方を使用してもよく、配列番号３と配列番号７の双方を使用してもよい。本発明によれば、例えば、コラーゲン由来材料のトリプシン分解物について配列番号３と配列番号６との双方のペプチドを検出した場合には、この試料は「ウマとチョウザメ」との混合物であると判定することができる。一方、配列番号３、５〜７、９〜１１の７種の全てを使用してもよい。コラーゲン由来材料のトリプシン分解物が、配列番号９と配列番号１０のペプチドを含み、配列番号３、５〜７、および１１のペプチドを含まない場合は、当該コラーゲン由来材料の動物種は、「ブタとウサギ」と判定する。
【００５０】
【表１７】
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【００５１】
また、上記表７に示すペプチドに加えて他のペプチドを指標に含み、２種の動物種を特定することもできる。例えば、表１１に示す１２種の全てのペプチドを指標として使用し、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、チョウザメの６種のいずれか２種の混合物について動物種を特定することができる。表８に動物種の組み合わせと指標となるペプチドの配列番号との関係を示す。表７に従い全７種のペプチドを指標とした場合でも、例えば「ブタとウサギ」と「ブタとヒツジ」とは、ペプチドの有無に関して２か所の相違を有するに過ぎない。これに対し表８に示す全１２種のペプチドを使用し、表８に従って動物種を判定すれば、「ブタとウサギ」と「ブタとヒツジ」との間に、ぺプチドの有無に関して４か所の相違を有して動物種を特定することができる。
【００５２】
【表１８】
2019088213.tif 000019
【００５３】
更に、本発明では、配列番号１、２、４〜６，８、９、１１および１２、並びに配列番号３または７の１０種を指標とし、下記表９に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定することができる。なお前記したように、本発明において「配列番号３または７」とは、配列番号３と配列番号７の何れか一方でもよく、配列番号３と配列番号７の双方を使用してもよいことを意味する。表９には、配列番号３と配列番号７の双方を含めた。表９に従えば、各動物の組み合わせ相互間で１〜６の相違を有して動物種を特定することができる。配列番号１０は、「ブタ」に特異的なペプチドであるが、これを使用することなく複数のペプチドの組み合わせで２種混合物を特定できる特徴がある。
【００５４】
【表１９】
2019088213.tif 000020
【００５５】
更に、本発明では、表１に示す配列番号１〜１２の１２種のペプチドのいずれか３種以上を指標とし、下記表１０に従い、前記コラーゲン由来材料の動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シカ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせかを判定することができる。配列番号５〜７の３種は、それぞれヒツジ、ウマおよびチョウザメに特異的であるから、配列番号５と配列番号６のペプチドを含む試料を「ヒツジとウマ」と動物種を特定でき、配列番号５と配列番号７のペプチドを含む試料を「ヒツジとチョウザメ」と動物種を特定することができる。本発明では、少なくも３種以上、好ましくは７種、より好ましくは１０種、特に好ましくは全１２種を使用する。指標とするペプチド数が多いほど、誤判定の可能性を低減することができる。全１２種のペプチドと各動物種の組み合わせを下記表１０に示す。表９に従って１０種のペプチドを指標として動物種の組み合わせを判定すると、「ウシとブタ」および「ウシとシカ」との間に１カ所の相違が存在するのみであるが、配列番号１０を含む表１０に従って、全１２種のペプチドを指標とする場合は２か所の相違を有して動物種を特定できるため、誤判定の可能性を低減することができる。
【００５６】
【表２０】
2019088213.tif 000021
【００５７】
本発明の第３は、コラーゲン由来材料が３種以上の動物種を含む場合に、そのトリプシン分解物に含まれるペプチドについて、上記表１に示される配列番号１〜１２のペプチドを指標に、上記表６に従い動物種を判別する方法である。配列番号３、配列番号５〜７、配列番号９〜１１の７種で特定される、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメの種特異的ペプチドを指標とすれば、３種以上の動物種が混在する場合でも各動物種を特定することができる。
【００５８】
上記ペプチドの有無を評価する方法は、特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィーなどによりコラーゲンのトリプシン分解物から上記ペプチドを分離し、ペプチドシークエンスなどにより確認しつつ、その有無を評価することができる。また、ＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどであってもよい。本発明は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析することが好適である。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによれば、ＬＣ部でトリプシン分解物をカラムとの親和性によって分離でき、ＭＳ部でイオン化してから更に質量ごとに分離して検出することができるため、一連の操作を迅速に行うことができる。特に、三連四重極型質量分析装置を用いれば、１段目の四重極部でプレカーサーイオンを選択し、２段目の衝突室でそのイオンを壊して、３段目の四重極部で前記壊して得たプロダクトイオンの中から特定のイオンを検出する多重反応モニタリング方法（ＭＲＭモード）を設定することができるため、特異性の高い判定が可能となる。さらに、ＭＲＭモードによれば、一度の測定で複数のチャンネルを設定することができるため、一分析で多成分の分析が可能となる。
【００５９】
本発明では、トリプシン分解物が、上記表１で特定する配列番号１〜１２の１２種類のペプチドを含むか否かを分析し、その結果を上記表２〜表１０のいずれかと整合し、動物種を判定するものである。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析において、前記配列番号１〜１２のペプチドのプレカーサーイオンを特定し、発生するプロダクトイオン（測定イオン）を選択してＭＲＭチャンネルを設定することで、当該ペプチドを検出することができる。更に、別のプロダクトイオン（確認イオン）を特定し、対応するＭＲＭチャンネルを別途設定して測定することで確実性をさらに高くできる。測定イオンと確認イオンとを検出することで、確実にその有無を評価することができる。
【００６０】
本発明では、８種類の動物種判定に使用するペプチドはわずか１２種である。各ペプチドに対応するプレカーサーイオンや測定イオン、更には確認イオンの検出条件を予め設定し、一度の分析で上記１２種を同時に分析することで、簡便に動物種の判定を行うことができる。
【００６１】
更に、コラーゲンのトリプシン分解物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて分析して動物種を判定する場合、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置に更に判定用の電子機器を配設し、前記電子機器の記憶部に予め表２〜表１０の内容を記憶させ、演算部にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析装置の配列番号１〜１２の結果を入力させ、前記表２〜表１０の動物種と入力結果とを関連づけて動物種を判定させることができる。判定結果は、印字またはディスプレイ等に表示させてもよい。
【００６２】
本発明では、前記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの分析結果に基づいて、混合された２種類の動物種がウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギおよびチョウザメからなる群から選択される２種のいずれの組み合わせであると判定された場合には、その動物種の配合比を特定することができる。
【００６３】
判定された動物種が、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、チョウザメのいずれかを含む場合には、試料から種特異的ペプチドが検出されている。予め、ピーク面積、ピーク高さ、ピーク強度などから濃度との関係を示す検量線等を作成し、この検量線に従って試料に含まれる各動物種の濃度を求めた後、配合割合を求める。種特異的ペプチドを３種以上含む場合も同様である。本発明では、配列番号３または配列番号７をチョウザメの指標とし、配列番号５をヒツジの指標とし、配列番号６をウマの指標とし、配列番号９をウサギの指標とし、配列番号１０をブタの指標とし、または配列番号１１をウシの指標とすることができる。
【００６４】
動物種を判定するためのコラーゲンのトリプシン分解物は、常法により調製することができる。たとえば、皮革、膠、その他のコラーゲン由来材料からコラーゲンまたはゼラチンを抽出し、これをトリプシンで分解すればよい。トリプシン分解物に限定したのは、トリプシンが入手容易で、かつコラーゲン分解の再現性に優れるからである。なお、コラーゲンの分解にコラゲナーゼを使用する場合もあるが、本発明ではコラゲナーゼを使用しない。コラゲナーゼはコラーゲンをＧｌｙ−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙまで分解し、生成したペプチドの動物種特異性を失ってしまうためである。
【００６５】
コラーゲン由来材料が皮革の場合、トリプシン処理に先立ち、原皮やタンニン鞣し皮などの皮革の一部を水中で加熱して、皮革に含まれるコラーゲンを抽出することが望ましい。例えば、抽出効率を高めるため、皮革片を１ｍｍ角などに細切断し、これを１〜２０倍の水に投入し、加熱する。加熱処理は、温度５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃、特に好ましくは７０〜９０℃である。加熱時間は、皮革片のサイズにもよるが、５分から２時間、好ましくは１０分から１時間、特に好ましくは２０分から５０分である。これにより皮革に含まれるコラーゲンがゼラチン様に変化する。なお、皮革がクロム鞣し等の加工製品である場合は、クロム鞣しによる影響を除去する必要がある。皮革片を細切断した後に、皮革に対して１〜２０倍の０．２５％水酸化カルシウム溶液を加えて１０分〜２４時間振盪し、水洗後、この水洗試験片を上記と同様に加熱処理し、およびトリプシン処理すればよい。
【００６６】
また、コラーゲン由来材料が膠の場合、水中で加熱して溶解した後にトリプシンを添加して分解すればよい。コラーゲン由来材料がコラーゲンやゼラチンの場合も同様である。また、コラーゲン由来材料が、文化財から抽出された膠である場合や、顔料その他の無機物を含む場合がある。水中で加熱して溶解した後に不溶物を遠心やろ過などによって除去してもよい。
【００６７】
トリプシン処理は、コラーゲンがゼラチン様に変化した溶液に、温度１５〜６０℃でトリプシンを作用させる。反応時間は、１〜２４時間、好ましくは２〜１６時間、特に好ましくは４〜１６時間である。この際、反応液に緩衝液その他を添加してもよい。緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などがある。更に添加しうる試薬としては、塩化カルシウムなどの安定化剤、ドデシル硫酸ナトリウムや尿素などの変性剤などがある。遠心分離し、不溶の固形分などを除去し動物種判定用の試験液とすることができる。
【実施例】
【００６８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００６９】
各実施例で調製したサンプルのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は以下に従った。
（１）装置
ＬＣ／ＭＳ（アジレント・テクノロジー社製：１２００シリーズ）、および三連四重極型質量分析装置（エービーサイエックス社製、３２００ＱＴＲＡＰ）を使用した。
（２）ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム  粒子径５μｍ、長さ１５ｃｍ、直径２．１ｍｍ（スペルコ社製）
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：０−２分：Ａ液９８％、２．１−６分：Ａ液９８−４０％、６．１−８分：Ａ液４０−１０％、８．１−１０分：Ａ液９８％
流速：５００μｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
（３）質量分析条件
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ
分析モード：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）モード
イオンスプレー電圧：４．０ｋＶ
イオンソース温度：７００℃
（４）ＭＲＭチャンネル
配列番号１〜１２に示すペプチド１２種とその検出チャンネルとを下記表１２に示す。
【００７０】
【表２１】
2019088213.tif 000022
【００７１】
（実施例１）
（ｉ）ウシの皮膚抽出コラーゲンの分析を行った。ウシの皮膚抽出コラーゲン５０μｇを１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ塩化カルシウム中で温度６０℃、３０分加熱し、次いで、２．５μｇのトリプシンで１６時間トリプシン消化反応を行った（総液量１００μＬ）。その後、反応液に１．０％となるようにギ酸を加えて反応を停止し、０．４５μｍフィルターでろ過し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析用サンプルとした。
【００７２】
（ｉｉ）ウシの皮膚からペプシンを用いて調製したコラーゲン試料のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図１に示す。上記表６に示す配列番号１、配列番号４、および配列番号１１のペプチドのピークを検出したが、他のペプチドのピークは検出しなかった。なお、図１〜図８において、Ｐは配列番号のピークを意味する。
【００７３】
（ｉｉｉ）ウシの皮膚抽出コラーゲンに代えて、ウマ、ブタの皮膚からペプシンを用いてコラーゲン試料を調製し、上記と同様にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図２、および図３に示す。また、ヒツジ、ウサギの皮膚抽出コラーゲン（シグマアルドリッチ社製）についてウシの皮膚抽出コラーゲンと同様に操作してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図４、および図５に示す。
【００７４】
また、シカ膠（天野山文化遺産研究所から提供）、チョウザメ膠（関出ら、「チョウザメの浮き袋（鰾）によるアイシングラスの製法研究」、 受託研究報告書2012年度. 委託者: 株式会社フジキン、を参照して作成）を蒸留水中で４時間、温度６０℃で溶解した後、ウシの皮膚抽出コラーゲンと同様に操作してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図６および図７に示す。
【００７５】
また、ヤギ革を０．５ｇ切り出して試験片とし、これを１ｍｍ角に細切断した後、０．２５％水酸化カルシウム溶液１０ｍＬに浸漬し２時間振盪し、その後、細切断片を７回水洗した。５つの細切断片を採取し、水２００μＬを加え、８０℃で３０分間加熱した。次いで水を除去し、０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．６）、１ｍＭ塩化カルシウム中で５０μｇのトリプシンを加え、３７℃で４時間消化反応を行った。その後、反応液に１．０％となるようにギ酸を加えて反応を停止し、遠心分離した後、不溶の固形分などを除去し、その後０．４５μｍフィルターでろ過してヤギ革トリプシン分解物を得た。得られたヤギ革トリプシン分解物についてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＭＲＭのチャートを図８に示す。
【００７６】
図１〜図８で検出したペプチドと動物種との関係を表１３に示す。上記１２種のペプチドを検出すると、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ウサギ、またはチョウザメのいずれか１種に特定できることが判明した。
【００７７】
【表２２】
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【００７８】
（実施例２）
市販の膠・ゼラチン製品Ａ〜Ｔの２０種を試料として分析し、実施例１と同様にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。試料の原料表示、検出されたペプチドを表１４に示す。試料Ａは、配列番号１、配列番号４、配列番号１１のピークを有するが、他のピークを有しなかった。このため、「ウシ」と判定された。また、試料Ｃは、配列番号１、配列番号４、配列番号９、および配列番号１１のピークを有するが、他のピークを有しなかった。配列番号９は、「ウサギ」の種特異的ペプチドであり、配列番号１１は「ウシ」の種特異的ペプチドである。表６および表１０の動物種のパターンより「ウシ」と「ウサギ」の混合物と判定された。その他、試料Ｄ、試料Ｅ、試料Ｆ、試料Ｇ、試料Ｈ，試料Ｉ、試料Ｊ、試料Ｋ、試料Ｌ、試料Ｎ、試料Ｏ、試料Ｐ、試料Ｑ、試料Ｒ、試料Ｓ、試料Ｔも、種特異的ペプチドおよび表６および表１０の動物種パターンとから、それぞれの動物種を特定することができた。分析結果を表１４に示す。
【００７９】
一方、試料Ｂは、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１２のピークを有した。配列番号１０は、「ブタ」の種特異的ペプチドであり、配列番号１１は「ウシ」の種特異的ペプチドである。上記ペプチドの内、配列番号１、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２のペプチドは「ブタ」に由来し、配列番号１、配列番号４および配列番号１１のペプチドは「ウシ」に由来する。残る配列番号２を有する動物種として、表６から「ヒツジ」と「ヤギ」を選択することができる。「ヒツジ」は、配列番号２、配列番号５、配列番号１２のペプチドで特定され、「ヤギ」は、配列番号２、配列番号４、配列番号１２のペプチドで特定される。試料Ｂには、配列番号５のペプチドは存在しないため「ヒツジ」を含まない。これらから、試料Ｂは、「ブタ」、「ウシ」、「ヤギ」の３種を含むと判定された。
【００８０】
同様に、試料Ｍは、配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０〜配列番号１２のピークを有した。配列番号１０は、「ブタ」の種特異的ペプチドであり、配列番号１１は「ウシ」の種特異的ペプチドであり、配列番号６は「ウマ」の種特異的ペプチドである。これらの結果より動物種は「ウシ」、「ブタ」および「ウマ」の混合物と判定された。
【００８１】
図９に、試料ＣのＭＲＭのチャートを示す。チャートには、配列番号１、配列番号４、配列番号９、および配列番号１１のピークのみが検出されている。
【００８２】
【表２３】
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【００８３】
表１４に示すように、原料表示の動物種と本発明の分析結果で判明した動物種とが一致しない試料は、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ，Ｎ、Ｓであった。これらの中で、試料Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｓは原料表示動物と異なる動物種のみが検出された。試料Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎは、いずれも原料表示動物がウサギであるが、分析結果では「ブタ」か「ウシ」のいずれかである。非特許文献５において、ウサギ膠は、本来ウサギ皮から調製されるべきであるが、実際には他の動物種由来の膠を混ぜて市販されている場合があるとの記載と符合した。
【００８４】
（実施例３）
実施例２で２種以上の動物種の混在が認められた試料Ｃ、Ｇ、およびＭについて、その量比を算出した。試料Ｃおよび試料Ｇの測定は、以下に従った。Ｉ型コラーゲン濃度既知のウシコラーゲンとウサギコラーゲンで配列番号１１と配列番号９のピーク面積と濃度との関係を示す検量線を作成した。次いで、この検量線を用い、試料の配列番号１１のピーク面積からウシＩ型コラーゲン濃度を、配列番号９のピーク面積からウサギのＩ型コラーゲン濃度をそれぞれ求めた後、２種動物の配合割合を算出した。また、試料Ｍの測定は、Ｉ型コラーゲン濃度既知のウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ウマコラーゲンで配列番号１１、配列番号１０、および配列番号６のピーク面積と濃度との関係を示す検量線を作成した。次いで、この検量線を用い、試料の配列番号１１のピーク面積からウシＩ型コラーゲン濃度を、配列番号１０のピーク面積からブタＩ型コラーゲン濃度を、および配列番号６のピーク面積からウマＩ型コラーゲン濃度をそれぞれ求めた後、３種動物の配合割合を算出した。結果を表１５に示す。
【００８５】
【表２４】
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【００８６】
実施例３で使用した試料の中で、原料表示の動物種が１種であるが２種以上の動物種を検出した試料は、試料Ｃ、Ｇ、Ｍであった。表１５に示すように、試料Ｃおよび試料Ｍは、原料表示動物に混在する動物の配合割合が２割以下であり、偶発的な混入の可能性が推定された。一方、試料Ｇは、原料表示に記載のない動物種の配合割合が５０質量％以上であり、意図的な混入が示唆された。
【００８７】
（実施例４）
カンバス地にテンペラで描かれた絵画（カミーユ・ピサロ作、タイトル”収穫”、国立西洋美術館所蔵、所蔵番号ｐ．１９８４−０００３，１８８２年作）の地塗りが付着した張りしろを試料とした。
【００８８】
試料１ｍｇを６０℃の０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．６）、１ｍＭ塩化カルシウム中（総液量１００μl）で３０分加熱後、２．５μｇのトリプシンで酵素処理した。その後、反応液に１．０％となるようにギ酸を加えて反応を停止し、遠心分離した後、不溶の固形分などを除去し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。その結果、試料から、配列番号１、２、４、５、１１および１２のペプチドが検出された。ウシ特異的ペプチド（配列番号１１）とヒツジ特異的ペプチド（配列番号５）とを含み、この検出パターンからウシとヒツジと判定された。配列番号５のピーク面積と配列番号１１のピーク面積からその配合割合を算出したところ、ウシ６３．８質量％、ヒツジ３６．２質量％の混合物であった。
【００８９】
以前の研究（高嶋美穂  国立西洋美術館研究紀要No.16, 35-45,  2012.3.31）により、実施例４の絵画の地塗りの断面を電子顕微鏡と光学顕微鏡で観察することによって、地塗りは２層構造であることが報告されている。２種類の動物種由来の膠が検出され、また量の少ないヒツジ膠でも１／３以上であることから、地塗り層の層ごとに異なる膠を使用している可能性や、目止めと地塗り層の膠が異なっている可能性が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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