(57)【要約】【課題】試料中に存在する細菌群を見落とすことなく検出し、試料中の細菌群集構造をより正確に把握することができる方法を提供する。【解決手段】本発明は、例えば、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物をＤＮＡマイクロアレイで解析することによる細菌群集構造の解析方法であって、前記増幅産物が、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合するフォワードプライマーと、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第１３６８番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合するリバースプライマーとを用いたＰＣＲによる増幅産物である、前記解析方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物をＤＮＡマイクロアレイで解析することによる細菌群集構造の解析方法であって、
前記増幅産物が、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合するフォワードプライマーと、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第１３６８番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合するリバースプライマーとを用いたＰＣＲによる増幅産物である、
前記方法。
【請求項２】
前記フォワードプライマーが、配列番号１に示される塩基配列を有するものであり、前記リバースプライマーが、配列番号２に示される塩基配列を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記解析の対象となる細菌が、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌａｍｉｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、α‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｂｌａｓｔｏｃａｔｅｌｌｉａ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａ、及びＳｏｌｉｂａｃｔｅｒからなる群より選ばれる３項目以上の細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多種多様な細菌によって構成される細菌群集の構造を明らかにするための解析手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、様々な問題となっている環境汚染、環境破壊などにおいて重要な役割を担う細菌および細菌群の追跡、環境診断、廃水処理などのバイオプロセスの状況診断には、試料中に含まれる多種多様な細菌によって構成される細菌群集中に、どのような細菌種がどの程度存在しているのかといった細菌群集構造の解析を迅速かつ簡便に実施することで、試料中の細菌の多様性を評価することが極めて重要となっている。
【０００３】
こうした試料中の細菌群集構造の解析を実施する方法としては、従来からあるＤＧＧＥ法及びＴ−ＲＦＬＰ法が挙げられるが、両手法共に、安価に実施できる手法であることから、広く利用されている手法である。しかし、ＤＧＧＥ法は、細菌群の直接的な同定まで実施するには工程数が多く、迅速な評価を実施するには適しているとは言い難い。また、Ｔ−ＲＦＬＰ法は、迅速に多様性を評価するには有用であるが、細菌群の直接的な同定が難しいため、解析精度がやや劣る。
【０００４】
近年、前記ＤＧＧＥ法及びＴ−ＲＦＬＰ法に加え、次世代シーケンサー法を利用して細菌群集構造の解析を実施する例が増えている。次世代シーケンサー法は、莫大な量の遺伝子情報を取得することが可能であり、これらを用いて細菌群集内の多様性に関して高精度に統計的な比較解析が可能であるなどの理由から、細菌群集構造解析手法の重要な選択肢となりつつある。しかし、次世代シーケンサー法は、技術の進展と共に費用の低価格化や、解析の効率化が進んできているとはいえ、他手法に比べ圧倒的に費用が高く、情報処理に莫大な時間を要する。そのため、迅速で安価な評価を行うことは難しく、日常的な検査を行うツールとしては利用し難い。
【０００５】
細菌群集構造解析手法としては、前記の他、ＤＮＡマイクロアレイ法も挙げることができる。ＤＮＡマイクロアレイ法は、あらかじめ把握したい細菌群を検出するプローブをＤＮＡマイクロアレイ上に搭載することが可能なため、解析に時間を要さないことから、迅速、簡便かつ比較的安価に評価を実施することができ、日常的な検査として利用し易い。
【０００６】
細菌群集構造の解析には、前記の通り複数の手法が挙げられるが、いずれの方法も、試料より抽出したゲノムＤＮＡに対し、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を対象としてＰＣＲ増幅を実施する。この時、細菌群集構造をより正確に把握するためには、適切なプライマーを選定することが重要となる。細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を対象としたプライマーは複数存在しており、各プライマーの全細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子にハイブリダイズ可能な割合は様々である。そのため、プライマーを適切に選定しなければ、本来試料中に存在するはずの細菌種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子が増幅されなくなり、検出不可能となることから、試料中の細菌群集構造を正確に把握することが困難となることは容易に想像できる。
【０００７】
これまでにも、上記手法などで細菌群集構造解析が実施されているが、使用されているプライマーが細菌の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対しハイブリダイズする割合について調査を実施すると、プライマーの組み合わせのうち、フォワード側及びリバース側のプライマーいずれか、あるいは両側共に、ハイブリダイズ可能な割合が低い、或いは、一部の門に対するハイブリダイズ可能な割合が極端に低い、などの課題点があり（特許文献１〜３）、より正確な細菌群集構造を把握するためには、より均一にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用することが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１５９１５７号
【特許文献２】特開２００８−２２８６９１号公報
【特許文献３】特開２００７−６８４３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、試料中に存在する細菌群を見落とすことなく検出し、試料中の細菌群集構造をより正確に把握することができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を対象とし、当該遺伝子の特定の塩基配列領域に結合するフォワード側及びリバース側のプライマーを設計して、細菌の基準株を対象とした検出率を向上させることで、結果的に細菌をより網羅的に検出することが可能となり、試料中の細菌群集構造をより正確に把握することができることを見出した。更に、解析手法にＤＮＡマイクロアレイを選択することにより、検出工程を簡略化し、解析に要する時間も短縮できるため、迅速、かつ、簡便に細菌群集構造を解析し把握することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
（１）細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物をＤＮＡマイクロアレイで解析することによる細菌群集構造の解析方法であって、
前記増幅産物が、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合するフォワードプライマーと、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第１３６８番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合するリバースプライマーとを用いたＰＣＲによる増幅産物である、
前記方法。
【００１２】
（２）前記フォワードプライマーが、配列番号１に示される塩基配列を有するものであり、前記リバースプライマーが、配列番号２に示される塩基配列を有するものである、上記（１）に記載の方法。
【００１３】
（３）前記解析の対象となる細菌が、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌａｍｉｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、α‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｂｌａｓｔｏｃａｔｅｌｌｉａ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａ、及びＳｏｌｉｂａｃｔｅｒからなる群より選ばれる３項目以上の細菌である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細菌群集構造解析方法によれば、従来の方法に比べて、より網羅的に細菌を検出することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本願発明にかかる細菌群集構造解析の方法（以下、「本発明の方法」ともいう。）の発明は、以下のとおりである。
すなわち、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物をＤＮＡマイクロアレイで解析することによる細菌群集構造の解析方法であって、前記増幅産物が、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合するフォワードプライマーと、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列における第１３６８番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合するリバースプライマーとを用いたＰＣＲによる増幅産物である、前記解析方法である。
ここで、本発明でいう、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列とは、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のGenBank（Genetic sequence data bank）において、Accession No. J01859として登録されている塩基配列（配列番号３５）である。
【００１７】
本発明の方法により、細菌群集構造解析される試料は、細菌を含有すると推定されるものであれば、液体、固体、半固体などのいずれでもよく、特に制限されない。例えば、環境試料、食品、生体試料などが例として挙げられる。より具体的には、活性汚泥、余剰汚泥などの汚泥、土壌、地下水、下水、加工食品、発酵食品、ヒトを含む動物や植物からの組織、細胞又は体液などが例として挙げられる。
【００１８】
本発明において、解析対象となる細菌の分類学上の門及び綱は、以下のものが挙げられ、これらの群より選ばれる３項目以上を解析対象とすることが好ましく、５項目以上を解析対象とすることがより好ましく、１５項目以上を解析対象とすることがさらに好ましく、２５項目以上を解析対象とすることが特に好ましく、全てを解析対象とすることが最も好ましい。以下に挙げたものの他、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕs門やＤｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ門など他の門、あるいは、候補門（門レベルの未培養系統群）を解析対象に加えてもよい。本発明の方法によれば、解析対象となる以下の細菌分類学上の門及び綱を検出するプローブを、本発明の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅対象範囲内に全て設計することができ、解析対象となる全ての細菌を一度に解析することができる。
【００１９】
＜解析対象となる細菌＞
Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｃｈｌａｍｉｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、α‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、β‐Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、γ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、δ−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｂｌａｓｔｏｃａｔｅｌｌｉａ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａ、及びＳｏｌｉｂａｃｔｅｒ。
【００２０】
具体的に、本発明の方法は、例えば以下の工程を有する。
（１）  試料から細菌のゲノムＤＮＡを抽出する工程、
（２）  （１）にて得られたゲノムＤＮＡを対象とし、所定のフォワードプライマー及び所定のリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅により、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物を得る工程、
（３）  得られた増幅産物をＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズする工程、
（４）  ＤＮＡマイクロアレイからシグナルを検出する工程、及び、
（５）  検出されたシグナルに基づいて細菌群集構造を解析する工程。
【００２１】
試料よりゲノムＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されない。一般的なフェノール／クロロホルム‐エタノール沈殿法も利用でき、市販のＤＮＡ抽出キットやＤＮＡ抽出装置を利用してもよい。
【００２２】
次に、ＰＣＲを行うことで抽出したゲノムＤＮＡから細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するが、使用するプライマーの組み合わせによって、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅される範囲及び長さが決定される。ＤＮＡマイクロアレイ法を用いて細菌群集構造を把握する場合、あらかじめ特定の細菌群を検出するプローブがＤＮＡマイクロアレイに搭載されているが、このプローブは当然増幅される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の範囲内で設計されている必要がある。
【００２３】
細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は約１５００塩基の配列情報を持っており、細菌の種類に関わらずにほぼ共通な配列を持つ保存領域と、種・属などによって配列の異なる可変領域があり、可変領域は保存領域に挟まれて存在している。そのため、可変領域を挟む両保存領域内にフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計し、ＰＣＲを行うことで増幅産物の配列に細菌の種や属を識別可能となるだけの多様性があらわれることになる。しかしながら、一つの可変領域からでは、すべての細菌種を識別できるだけの多様性は得られない。そのため、増幅される範囲が短い場合、範囲内に含まれる可変領域が少なくなり、特定の細菌群、特に分類学上において門及び綱レベルといった大きな枠組みで細菌群を検出する際にプローブの設計が困難になる、といった懸念がある。より網羅的に細菌群を検出するためには、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、増幅産物をプローブ設計に十分な長さを維持することができ、かつ、できる限り多くの細菌群に共通の配列が存在する保存領域内に設計する必要がある。
【００２４】
後述する本発明のフォワードプライマー及びリバースプライマー（配列番号１、２）の設計範囲において設計されたプライマーを使用すれば、得られる増幅産物がＤＮＡマイクロアレイに搭載するプローブを設計する際に、分類学上のどのレベルを対象としても十分な長さとなり、かつ、より多くの細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を網羅的に増幅することができるため、プローブの設計に支障を来たすことはない。
【００２５】
プライマーとしては、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列（配列番号３５）における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合するフォワードプライマーと、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列（配列番号３５）における第１３６８番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合するリバースプライマーとを用いる。
【００２６】
フォワードプライマーとしては、上記のとおり、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号３５）における第３１０番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合し得るように設計することが好ましく、当該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第３３１番目〜第３６５番目の塩基配列領域内に結合し得るように設計することがより好ましい。この範囲で設計したプライマーであれば、すでに公知となっている塩基配列をプライマーとして使用しても、新たに設計・作製して使用してもよく、特に制限はされない。さらに好ましいフォワードプライマーとして、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。上記塩基配列領域内であれば、細菌の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対しハイブリダイズする割合を、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％に保つことができ、かつ、検出対象となる細菌の分類学上の門及び綱全てに対応するよう設計することができる。
【００２７】
リバースプライマーとしては、上記のとおり、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号３５）における第１３６８番目〜第１３８２番目の塩基配列領域内に結合し得るように設計することが好ましく、当該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第１３８３番目〜第１４１０番目の塩基配列領域内に結合し得るように設計することがより好ましい。この範囲で設計したプライマーであれば、すでに公知となっている塩基配列をプライマーとして使用しても、新たに設計・作製して使用してもよく、特に制限はされない。さらに好ましいフォワードプライマーとして、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーが挙げられる。上記塩基配列領域内であれば、細菌の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対しハイブリダイズする割合を、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％に保つことができ、かつ、検出対象となる細菌の分類学上の門及び綱全てに対応するよう設計することができる。
【００２８】
各プライマーの長さとしては、特に限定はされないが、１５塩基〜２５塩基とすることが好ましい。長すぎるプライマーではアニーリング効率が低下し、短すぎるプライマーでは、十分なＴｍ値を確保できず、かつ、設計対象範囲とした位置への特異性が得られない可能性がある。
【００２９】
フォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれか一方、又は両方が標識化されていることが好ましい。これにより増幅産物が標識化され、後にＤＮＡマイクロアレイ（詳しくは当該アレイに搭載されているプローブ）とハイブリダイズさせた際にシグナルとして検出することができる。標識としては、蛍光色素、ラジオアイソトープ、化学発光物質等を使用できる。蛍光色素としては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｏｄａｍｉｎｅ、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７等、化学発光物質としてはルミノール誘導体やアクリジニウム誘導体等が挙げられるが、ＤＮＡマイクロアレイのシグナル検出装置で検出することができるのであれば、特に制限はない。
【００３０】
各プライマーの設計方法としては、Ｐｒｉｍｅｒ３、ＧｅｎｅＦｉｓｈｅｒ２などのデータベースを利用する方法が挙げられるが、限定はされない。
なお、設計した各プライマーの塩基配列が、細菌の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対しどの程度ハイブリダイズすることが可能かを確認する方法としては、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  II（ＲＤＰ−II）などのデータベースを利用する方法が挙げられるが、限定はされない。
【００３１】
ゲノムＤＮＡを対象とし、前述のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行うことにより、標識された細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物を得ることができる。
【００３２】
ＰＣＲ用酵素の例としては、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ株式会社）が挙げられ、ＰＣＲの反応条件のプログラム例としては、後掲の表３に記載のプログラムが挙げられるが、目的長の増幅産物を得られるＰＣＲ用酵素及びプログラムであれば特に制限はされない。
【００３３】
ＰＣＲを行った後、増幅産物が目的長に増幅されていることを確認する方法としては、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供する方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００３４】
目的長に増幅されていることが確認された増幅産物は、あらかじめ把握したい細菌群を検出するプローブが搭載されているＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせる。ＤＮＡマイクロアレイとしては、プローブが独立に、かつ、位置を特定できるように固定化されているものであれば、どのような種類でも使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイの例としては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）などのスライドガラス基板上やシリコン基板上といった平面基板上にプローブが固定化されているＤＮＡマイクロアレイと、ジェノパール（三菱ケミカル社）を例としたゲルを介して３次元的にプローブを固定化しているＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられるが、再現性及び検出感度から後者のＤＮＡマイクロアレイを用いることが好ましい。
【００３５】
ＤＮＡマイクロアレイ上に搭載されるプローブは、同一条件下で標識された増幅産物とハイブリダイズさせるため、プローブのＴｍ値を可能な範囲で一定にそろえる必要があるが、この条件を満たしており、増幅対象とした細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の範囲内（塩基配列領域内）に設計されていれば、配列番号３ないし配列番号３２に例示したプローブに限らず、公知となっている塩基配列をプローブとして使用しても、ＤＤＢＪのＣｌｕｓｔａｌＷプログラム等を利用して新たに設計して使用してもよい。なお、新たに設計したプローブの配列が細菌の基準株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対しどの程度ハイブリダイズすることが可能かを確認する方法としては、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＩ（ＲＤＰ−ＩＩ）などのデータベースを利用する方法が挙げられるが、限定はされない。
【００３６】
また、目、科、属又は種のレベルで個別に検出したい細菌群が存在する場合には、ＰＣＲによって増幅した細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の範囲に適合しており、かつ、他のプローブのＴｍ値の範囲内にあり、それらを検出することが可能なプローブであれば、合わせて搭載することもできる。
【００３７】
ＤＮＡマイクロアレイと標識された増幅産物とのハイブリダイズには、エアインキュベーターや自動ハイブリ洗浄装置（三菱ケミカル社）を利用してもよい。反応条件の例としては、５０℃、４時間が挙げられる。
【００３８】
洗浄作業を終えたＤＮＡマイクロアレイは、スキャナーを用いて、シグナルの検出及び数値化を行う。スキャナーとしては、標識に使用した物質を検出することができる装置を利用すれば良く、使用したＤＮＡマイクロアレイ専用のスキャナーを利用してもよい。スキャナーの例としては、Ｇｅｎｏｐａｌ  Ｒｅａｄｅｒ（三菱ケミカル社）が挙げられ、装置取扱い説明書に従い、所定の露光時間の条件にてＤＮＡマイクロアレイの撮像を行い、検出されたシグナル強度を基に換算された数値データを解析に使用すればよい。
【００３９】
数値データの処理方法としては、後述の方法が挙げられるがこれに限定はされない。プローブが搭載されていない複数のスポットの平均値をバックグラウンド値、この時の標準偏差の値を最小シグナル値とする。プローブが搭載されているスポットのシグナル強度の数値から、バックグラウンド値を減算し、正味シグナル値を算出する。正味シグナル値が最小シグナル値よりも低い場合は、それらを最小シグナル値に置き換える。
【００４０】
各スポットより検出された正味シグナル値を、各スポット上に搭載されたプローブが解析対象とする細菌の分類学上の門及び綱に対応させる。これにより、試料中に存在する細菌が、細菌分類学上のどの門及び綱に分類しているのかを確認でき、試料中の細菌群集構造を把握することが可能となる。
【００４１】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の記載によって制限されるものではない。
【実施例】
【００４２】
＜試料からのＤＮＡ抽出＞
試料として、試料Ａ（下水余剰汚泥）、試料Ｂ（下水初沈汚泥）、試料Ｃ（下水混合生汚泥）及び試料Ｄ（下水消化汚泥）を採取、それぞれからＤＮＡを抽出した。
ＤＮＡの抽出には、市販のＤＮＡ抽出キットである「ＦａｓｔＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰバイオメディカルズ社）」を用い、指示の通りＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液とした。
【００４３】
［実施例１〜４］
＜プライマーの選定＞
ＮＣＢＩよりＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列データ（GenBank Accession No. J01859（配列番号３５））をダウンロードし、細菌の配列の内、高度に保存された二つの塩基配列領域を基に、下記の表１に示すフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）について、設計及び合成（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を行った。なお、フォワードプライマー（配列番号１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第３４０番目〜第３５６番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものであり、リバースプライマー（配列番号２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第１３９１番目〜第１４０５番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものである。
【００４４】
また、この際、フォワードプライマーについては、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）による蛍光標識を行った。なお、各プライマーの細菌の全基準株に対するハイブリダイズ可能な割合は、ＲＤＰ−ＩＩのＰｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈプログラムを使用して確認を行ったところ、フォワードプライマーが９６．４％、リバースプライマーが９４．９％であった。このプライマーを使用することで、後に得られる増幅産物の長さは約１０００ｂｐとなる。
【００４５】
【表１】
2019058168.tif 000002
【００４６】
＜プローブの検索及び設計＞
検出対象とした細菌の分類学上の門及び綱の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対し、上記プライマーで増幅される範囲にプローブとして配置可能な配列を検索及び設計した。検索は、ＰｒｏｂｅＢａｓｅにて公知のプローブ配列を検索した。設計については、ＮＣＢＩより対象とする門及び綱の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列データをダウンロードし、ＤＤＢＪのＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて塩基配列の多重整列を行い、これを基に配列番号１及び配列番号２を使用して増幅される範囲内、かつ、対象とする門及び綱に対する配列特異性が高くなる配列を設計した。検索及び設計にて候補となった配列のＴｍ値を比較し、他と比べてＴｍ値が大きく異なるものについては１塩基から２塩基追加又は削除することで調整を行った。得られた配列を、下記の表２に、配列番号３から配列番号３２として記載する。
【００４７】
【表２】
2019058168.tif 000003
【００４８】
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
表２に記載の配列をプローブとするために、５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した。この５末端ビニル化オリゴＤＮＡを用い、プローブを三菱ケミカル製ＤＮＡチップ「ジェノパール」のプラットフォームを用いてアレイ化した。
【００４９】
＜細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅＞
反応用エッペンチューブ（０．２ｍＬ）に、ＤＮＡ溶液  １μＬ、フォワードプライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）  ０．５μＬ、リバースプライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）  ０．５μＬ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社）  ０．２５μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）  ５μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社）  ４μＬ、ＢＳＡ（１００μｇ／μＬ、バイオビジョン社）  ５μＬ、滅菌水  ３３．７５μＬを入れて、合計５０μＬとしたものを反応液とした。
前記反応用エッペンチューブをサーマルサイクラーにセットし、反応を開始した。なお、ＰＣＲプログラムは表３に示す通りに設定した。
【００５０】
【表３】
2019058168.tif 000004
【００５１】
＜増幅産物の確認＞
増幅産物が目的長（約１０００ｂｐ）に増幅されていることを確認するため、アガロースゲル電気泳動を実施した。アガロースゲルの濃度は１質量％とした。電気泳動用バッファーには１×ＴＡＥバッファーを使用した。電気泳動結果にて、試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ、試料Ｄのいずれも増幅産物が目的長に増幅されていることを確認した。
【００５２】
＜ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション＞
反応用エッペンチューブ（０．２ｍＬ）に増幅産物  ２０μＬ、滅菌水  ６４μＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ４８μＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ  ４８μＬ、０．５  Ｔｗｅｅｎ２０  ２０μＬを入れて、合計２００μＬとしたものをハイブリダイゼーション溶液とした。
ハイブリダイゼーション溶液の入った反応用エッペンチューブをサーマルサイクラーにセットし、９５℃、５分間加熱を行った後、即座に氷水中に漬け込み、５分静置した。
【００５３】
ハイブリダイゼーション溶液全量をハイブリチャンバーに入れ、上記で作製したＤＮＡマイクロアレイをハイブリチャンバー内に浸漬させた。ハイブリチャンバーに蓋をし、密閉した状態を、あらかじめ５０℃に温めておいたエアインキュベーターに入れ、そのままの状態で４時間遮光放置した。
【００５４】
＜洗浄＞
４時間経過後、ハイブリチャンバーをエアインキュベーターから取り出し、蓋を開けた。あらかじめ５０℃に温めておいた０．２４Ｍ  ＴＮＴバッファーの入ったコニカルチューブに、ハイブリチャンバーから底面をキムワイプなどに接触させて過剰な廃ブリ溶液を吸収除去したＤＮＡマイクロアレイをコニカルチューブに入れ、蓋をして、５０℃で２０分間加温した。２０分経過後、上記と同様の方法で、ＤＮＡマイクロアレイを同一バッファーの入った別のコニカルチューブに移し、更に５０℃で２０分間加温↓。２０分経過後、上記と同様の方法で、ＤＮＡマイクロアレイを０．２４Ｍ  ＴＮバッファーの入ったコニカルチューブに移し、５０℃で１０分間加温した。１０分経過後、上記と同様の方法で、ＤＮＡマイクロアレイを同一バッファーの入った８ｍＬのコニカルチューブに移し、回転架台を用いて５分以上回転撹拌した。
なお、０．２４Ｍ  ＴＮＴバッファー及び０．２４Ｍ  ＴＮバッファーの組成は表に示す通りである。
【００５５】
【表４】
2019058168.tif 000005
【００５６】
＜検出操作＞
ＤＮＡマイクロアレイをコニカルチューブから取り出し、Ｇｅｎｏｐａｌ  Ｒｅａｄｅｒ用検出ケース（三菱ケミカル社製）にセットした。
Ｇｅｎｏｐａｌ  Ｒｅａｄｅｒ（三菱ケミカル社製）を用い、装置取扱い説明書に従って、露光時間を４０秒の条件にてＤＮＡマイクロアレイの撮像を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。
【００５７】
＜解析＞
市販の表計算ソフトを用い、パソコン上でサンプル名称他、サンプルやＤＮＡマイクロアレイ、実験条件に関する情報とシグナル強度の数値を貼り付けた。
外れ値を除外した複数のバックグラウンドスポット（プローブが搭載されていないスポット）の平均値をバックグラウンド値とした。またその時の標準偏差の値を最小シグナル値とした。プローブスポットのシグナル値から、バックグラウンド値を減算し、正味シグナル値を算出した。正味シグナル値が最小シグナル値よりも低い場合はそれらを最小シグナル値に置き換えた。
結果を表６に示した。
【００５８】
［比較例１〜４］
下記の表５に示す配列番号３３及び配列番号３４に示される塩基配列を、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして合成（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を行った。フォワードプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第８番目〜第２７番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものであり、リバースプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第１４９１番目〜第１５０９番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものである。また、この際、フォワードプライマーについてはＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）による蛍光標識を行った。なお、各プライマーの細菌の全基準株に対するハイブリダイズ可能な割合は、ＲＤＰ−ＩＩのＰｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈプログラムを使用して確認を行ったところ、フォワードプライマーが１６．５％、リバースプライマーが４３．６％であった。このプライマーを使用することで後に得られる増幅産物の長さは約１４００ｂｐとなる。
【００５９】
【表５】
2019058168.tif 000006
【００６０】
上記プライマー（配列番号３３、３４）を使用した以外は、実施例１及び実施例２と同様にして処理を行った。なお、ＤＮＡマイクロアレイに搭載されているプローブは、いずれもこのプライマーで増幅される範囲内に含まれている。
結果を、下記の表６に示した。
【００６１】
【表６】
2019058168.tif 000007
【００６２】
比較例１〜４では検出できなかった門及び綱が、実施例ではほぼ全て検出できていることが確認され、配列番号１及び配列番号２のプライマーの組み合わせ（実施例）では、配列番号３３及び配列番号３４のプライマーの組み合わせ（比較例）に比べて、より正確に試料Ａ〜Ｄ中の細菌群集構造を把握することが可能であることが認められた。
【００６３】
［実施例５〜９、比較例５］
下記の表７に示す配列番号３６及び配列番号３７に示される塩基配列をフォワードプライマーとし、配列番号３８及び配列番号３９に示される塩基配列をリバースプライマーとして合成（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を行った。フォワードプライマーの内、塩基配列３６はＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第３１６番目〜第３３０番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものであり、配列番号３７は第３３６番目〜第３５１番目の塩基配列領域に位置するものである。また、リバースプライマーの内、配列番号３８はＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における第１３７２番目〜第１３８６番目の塩基配列領域に位置する（対応する）ものであり、配列番号３９は第１３８６番目〜第１４００番目の塩基配列領域に位置するものである。この際、フォワードプライマーについてはＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）による蛍光標識を行った。なお、各プライマーの細菌の全基準株に対するハイブリダイズ可能な割合は、ＲＤＰ−ＩＩのＰｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈプログラムを使用して確認を行ったところ、配列番号３６が８４．１％、配列番号３７が８５．０％、配列番号３８が８７．２％、配列番号３９が９２．２％であった。
【００６４】
【表７】
2019058168.tif 000008
【００６５】
配列番号１及び２、配列番号３３、３４、３６〜３９のフォワードプライマー及びリバースプライマーを下記の表８の通り組み合わせ、試料Ｅ（食品工場余剰汚泥）に対し、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅においてＰＣＲプログラムを下記の表９に示す通りに設定した以外は、実施例１〜４と同様の処理を行った。なお、ＤＮＡマイクロアレイに搭載されているプローブは、いずれもこれらのプライマーで増幅される範囲内に含まれている。結果を、下記の表１０に示した。
【００６６】
【表８】
2019058168.tif 000009
【００６７】
【表９】
2019058168.tif 000010
【００６８】
【表１０】
2019058168.tif 000011
【００６９】
比較例５では検出できなかった門及び綱が、実施例５〜９ではすべて検出できていることが確認され、実施例５〜９で用いたプライマーの組み合わせは、比較例５で用いたプライマーの組み合わせに比べ、より正確に試料Ｅ中の細菌群集構造を把握することが可能であることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の方法によれば、試料中に存在する細菌群を見落とすことなく検出し、試料中の細菌群集構造をより正確に把握することができる。したがって、本発明は、例えば活性汚泥の評価等、細菌が存在すると思われるあらゆる試料中の評価に利用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１〜３４、３６〜３９：合成ＤＮＡ
【配列表】
2019058168000001.app