(57)【要約】【課題】本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いるための新規なＲＮＡ分子を提供することを目的とする。【解決手段】  ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子であって、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて少なくとも２番目から６番目のヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ分子とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子であって、
ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて少なくとも２番目から６番目のヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ分子。
【請求項２】
ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から１０番目のヌクレオチドの五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されている、請求項１に記載のＲＮＡ分子。
【請求項３】
ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて１番目のヌクレオチドの五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されていない、請求項１または２に記載のＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ＲＮＡ分子が、５’末端にパッセンジャー鎖と相補しない２ヌクレオチドを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ＲＮＡ分子が、８個から２８個のヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記相補的な配列がターゲット遺伝子と９０％以上の相補性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７】
全てのヌクレオチドが修飾のないＲＮＡである場合の、ターゲット遺伝子に対するＩＣ５０が１ｎＭ以下である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を製造する工程を含む方法。
【請求項９】
ターゲット遺伝子に対するＲＮＡ干渉法であって、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を製造する工程と、
生理的条件で前記ＲＮＡ分子と２重鎖を形成するパッセンジャー鎖と前記ＲＮＡ分子とで２重鎖を形成する工程と、
前記２重鎖を用いてＲＮＡ干渉法を行う工程と、
を含む、ＲＮＡ干渉法。
【請求項１０】
ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の選択方法であって、
請求項９のＲＮＡ干渉法を、複数の前記ＲＮＡ分子を用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子を選択する工程と、
を含む、ＲＮＡ分子の選択方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＲＮＡ分子の選択方法で選択されたＲＮＡ分子を用いて、オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能を調べる工程と、
前記オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能が所定レベル以下であるＲＮＡ分子を選択する工程と、
を含む、ＲＮＡ分子の選択方法。
【請求項１２】
ＲＮＡ干渉によってターゲット遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法であって、
細胞（ヒト個体の細胞を除く）に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いるＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉法は、細胞内で、特定のターゲット遺伝子の発現を特異的に抑制するための簡便で効率的な方法である。
【０００３】
しかし、当初予測されたよりも、本来のターゲットではない遺伝子（オフターゲット）に対しても、その遺伝子発現を抑制することが知られてきた（例えば、非特許文献１参照）。特に、ターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡのアフィニティが強くなれば、オフターゲット効果も大きくなることが明らかになっている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
このオフターゲット効果によって、本来の表現型ではない表現型も生じうるので、オフターゲット効果を抑制する工夫がなされてきた（例えば、特許文献１〜３参照）。中でも、五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されているヌクレオチドがガイド鎖の２番目にあるｓｉＲＮＡは、遺伝子発現の抑制活性を大きく損なうことなく、オフターゲット効果が減少していることが報告されている（例えば、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jackson, A.L. et al., (2003) Nature Biotechnology vol.21, p.635-7
【非特許文献２】Ui-Tei, K. et al., (2008) Nucleic Acids Res. vol.36, p.7100-7109.
【非特許文献３】Jackson, A.L. et al., (2006) RNA vol.12, p.1197-1205
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５３１５２０号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３８６７７号公報
【特許文献３】特表２０１７−５０２６６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いるための新規なＲＮＡ分子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オフターゲット効果の低いＲＮＡ配列を特定するために、鋭意努力していたところ、２’ＯＭｅ−ｓｉＲＮＡの修飾ｓｉＲＮＡは、ターゲット配列に対し強いアフィニティで対合するにもかかわらず、修飾位置を特定の場所にすることにより、２’ＯＭｅ−ｓｉＲＮＡの修飾ＲＮＡを増やしてもオフターゲット効果が増強するどころか、むしろ顕著なオフターゲット効果の低下が生じることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
本発明の一実施態様は、ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子であって、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて少なくとも２番目から６番目のヌクレオチドが、五炭糖の２’位が、−ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ分子である。このＲＮＡ分子において、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から１０番目のヌクレオチドの五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されていてもよい。また、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて１番目のヌクレオチドの五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されていなくてもよい。
【００１０】
前記ＲＮＡ分子が、５’末端にパッセンジャー鎖と相補しない２ヌクレオチドを有してもよい。前記ＲＮＡ分子が、８個から２８個のヌクレオチドからなってもよい。前記相補的な配列がターゲット遺伝子と９０％以上の相補性を有してもよい。全てのヌクレオチドが修飾のないＲＮＡである場合の、ターゲット遺伝子に対するＩＣ５０は、１ｎＭ以下であってもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の製造方法であって、上述したいずれかのＲＮＡ分子を製造する工程を含む方法である。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、ターゲット遺伝子に対するＲＮＡ干渉法であって、上述したいずれかのＲＮＡ分子を製造する工程と、生理的条件で前記ＲＮＡ分子と２重鎖を形成するパッセンジャー鎖と前記ＲＮＡ分子とで２重鎖を形成する工程と、前記２重鎖を用いてＲＮＡ干渉法を行う工程と、を含む、ＲＮＡ干渉法である。
【００１３】
本発明のさらなる実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の選択方法であって、上述のＲＮＡ干渉法を、複数の前記ＲＮＡ分子を用いてin vitroで行うことによって、前記複数のＲＮＡ分子の前記ターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、前記特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子を選択する工程と、を含む、ＲＮＡ分子の選択方法である。さらに、選択されたＲＮＡ分子を用いて、オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能を調べる工程と、前記オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能が所定レベル以下であるＲＮＡ分子を選択する工程と、を行ってもよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、ＲＮＡ干渉によってターゲット遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法であって、細胞（ヒト個体の細胞を除く）に、上記いずれかのＲＮＡ分子を投与する工程を含む、方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、ＲＮＡ干渉法に用いるための新規なＲＮＡ分子を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例で用いられたｓｉＲＮＡの配列を示した図である。下線はシード部分を示す。
【図２】本発明の実施例で用いられた、特異的遺伝子発現抑制及びオフターゲット効果を調べるためのレポーターの模式図である。
【図３】本発明の実施例で、各ｓｉＲＮＡ及び修飾ｓｉＲＮＡによる特異的遺伝子発現抑制を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例で、各ｓｉＲＮＡ及び修飾ｓｉＲＮＡによるオフターゲット効果を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１８】
＝＝ＲＮＡ分子＝＝
［ガイド鎖］
本発明の一実施態様は、ＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子であって、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて少なくとも２番目から６番目のヌクレオチドにおいて、五炭糖の２’位が、−ＯＣＨ３で置換されている。
【００１９】
五炭糖の２’位が、−ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ（以下、２’−Ｏ−メチルＲＮＡと称する）は、下記一般式の構造を有する。
【００２０】
【化１】
2019088196.tif 000002
五炭糖の２’位が−ＯＣＨ３で置換されているヌクレオチドは、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて少なくとも２番目から６番目のヌクレオチドであればよく、それ以外のヌクレオチドは、連続して、または不連続に置換されていてもよく、また置換されていなくてもよいが、１番目は置換されていないのが好ましく、また２番目から６番目、２番目から８番目、または２番目から１０番目が置換されていることが好ましく、そして２番目から６番目だけ、２番目から８番目だけ、または２番目から１０番目だけが置換されていることがより好ましい。
【００２１】
ＲＮＡ分子が、３’末端にパッセンジャー鎖に相補しないヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチドの個数は特に限定されないが、２〜４個であることが好ましく、２個であることが最も好ましい。このヌクレオチドの配列は特に限定されないが、ＣＧであることが好ましい。
【００２２】
ＲＮＡ分子の長さは特に限定されないが、ターゲット遺伝子に相補的な部分が８個から２８個であることが好ましく、１３個から２４個であることがより好ましく、１９個であることが最も好ましい。ターゲット遺伝子に相補的な配列は、ターゲット遺伝子と６０％以上の相補性を有することが好ましく、８０％以上の相補性を有することがより好ましく、９０％以上の相補性を有することがさらに好ましく、９５％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から８番目のヌクレオチドにおいては、１００％の相補性を有することが好ましいが、１個、２個、または３個程度相補性を有しなくてもよい。
【００２３】
ＲＮＡ分子のターゲット遺伝子に対するＩＣ５０は、全てのヌクレオチドが修飾のないＲＮＡである場合に、１ｎＭ以下であることが好ましく、５００ｐＭ以下であることがより好ましく、２００ｐＭ以下であることがさらに好ましい。
【００２４】
ガイド鎖を構成するヌクレオチドは、五炭糖の２’位が、−ＯＣＨ３で置換されているＲＮＡ以外のヌクレオチドについては、一部が他の修飾によって修飾されていてもよいが、全てのヌクレオチドが修飾されていないことが好ましい。
【００２５】
ＲＮＡ干渉法自体は、すでに広く使用されている技術であって、ＲＮＡ分子の具体的な配列は、周知技術に従って容易に決定することができる。また、このＲＮＡ分子の製造も、周知技術に従って容易に行うことができる。
【００２６】
ここで詳述したＲＮＡ分子をガイド鎖として、パッセンジャー鎖とともに用いてＲＮＡ干渉法を行うことにより、オフターゲットに対する遺伝子発現抑制を低減することができる。
【００２７】
［パッセンジャー鎖］
パッセンジャー鎖も、周知技術に従って容易に設計し、容易に製造することができる。以下に、設計の一例を示す。
【００２８】
パッセンジャー鎖の長さは特に限定されないが、ガイド鎖に相補的な部分が８個から２８個であることが好ましく、１３個から２４個であることがより好ましく、１９個であることが最も好ましい。
【００２９】
パッセンジャー鎖の配列は、ガイド鎖の相補的な塩基をもつように決めることができる。全ての塩基が相補的である必要はないが、ガイド鎖に相補的な配列は、ガイド鎖と６０％以上の相補性を有することが好ましく、８０％以上の相補性を有することがより好ましく、９０％以上の相補性を有することがさらに好ましく、９５％以上の相補性を有することがさらに好ましく、１００％の相補性を有することが最も好ましい。
【００３０】
パッセンジャー鎖が、３’末端にガイド鎖に相補しないヌクレオチドを有してもよい。このヌクレオチドの個数は特に限定されないが、２〜４個であることが好ましく、２個であることが最も好ましい。このヌクレオチドの配列は特に限定されないが、ＣＧであることが好ましい。
【００３１】
パッセンジャー鎖を構成するヌクレオチドは、ＤＮＡでも、ＲＮＡでも、ＤＮＡとＲＮＡのキメラでもよい。一部のヌクレオチドが修飾されていてもよいが、全てのヌクレオチドが修飾されていないことが好ましい。
【００３２】
＝＝ＲＮＡ干渉法＝＝
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子に対するＲＮＡ干渉法であって、上述したＲＮＡ分子を製造する工程と、生理的条件でそのＲＮＡ分子と２重鎖を形成するパッセンジャー鎖と、そのＲＮＡ分子とで２重鎖を形成する工程と、２重鎖を用いてＲＮＡ干渉法を行う工程と、を含む。２重鎖を用いたＲＮＡ干渉法は、周知技術に従って容易に行うことができる。例えば、ターゲット遺伝子を発現している培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の生物個体に対して、ＲＮＡ分子とパッセンジャー鎖で構成された２重鎖を導入することで、ターゲット遺伝子の発現を低下させることができる。
【００３３】
＝＝ＲＮＡ分子の選択方法＝＝
本発明の一実施態様は、ターゲット遺伝子を抑制するためのＲＮＡ干渉法においてガイド鎖として用いるためのＲＮＡ分子の選択方法であって、複数の上述したＲＮＡ分子を用いて、in vitroでＲＮＡ干渉法を行うことによって、複数のＲＮＡ分子のターゲット遺伝子に対する特異的な遺伝子発現抑制能を調べる工程と、特異的な遺伝子発現抑制能が所定レベル以上であるＲＮＡ分子を選択する工程と、を含む方法である。このようにしてＲＮＡ分子を選択することによって、ＲＮＡ干渉法において特に効率よくターゲット遺伝子を抑制するガイド鎖を得ることができる。
【００３４】
また、この選択方法は、選択されたＲＮＡ分子に対してオフターゲットに対する遺伝子発現抑制能を調べる工程と、オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能が所定レベル以下であるＲＮＡ分子を選択する工程と、を含んでもよい。オフターゲットに対する遺伝子発現抑制能は、周知技術に従って容易に調べることができる。例えば、ＲＮＡ分子の配列中、ターゲット遺伝子と相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から８番目の塩基配列を有するレポーター遺伝子を発現させた細胞に対し、調べたいＲＮＡ分子を用いて、in vitroでＲＮＡ干渉法を行うことによって、レポーター遺伝子に対する遺伝子発現抑制能を調べればよい。そして、その遺伝子発現抑制能が所定レベル以下であるＲＮＡ分子を選択することによって、ＲＮＡ干渉法において特に非特異的なオフターゲットの発現抑制能が低いガイド鎖を得ることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の範囲を限定するために記載されるものではない。
【００３６】
まず、図１に配列を示した２重鎖ＲＮＡを化学合成した。以下に、各２重鎖ＲＮＡのガイド鎖に導入した修飾を記載する。
【００３７】
ＲＮＡ：すべてリボヌクレオチドで構成されている。
【００３８】
ＤＮＡ：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から８番目のリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドに置換されている。
【００３９】
２’ＯＭｅ（４−６）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて４番目から６番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４０】
２’ＯＭｅ（３−７）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて３番目から７番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４１】
２’ＯＭｅ（２−３）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から３番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４２】
２’ＯＭｅ（２−４）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から４番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４３】
２’ＯＭｅ（２−６）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から６番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４４】
２’ＯＭｅ（２−８）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から８番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４５】
２’ＯＭｅ（２−１０）：ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から１０番目のリボヌクレオチドの２位の炭素がＯ−メチル化されている。
【００４６】
一方、遺伝子発現抑制効果を調べるためのレポーターとして、上記ガイド鎖と同じ塩基配列を有するＤＮＡ
５′−ＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡ−３′（配列番号１）
及びオフターゲット効果を調べるためのレポーターとして、ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から８番目のリボヌクレオチド以外は、上記ガイド鎖とは異なる塩基配列を有するＤＮＡ
５′−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＡ−３′（配列番号２）
を、それぞれ１コピー（図２左）または３コピー（図２右）を発現ベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）のルシフェラーゼ遺伝子の３’−ＵＴＲに挿入した。なお、上記ガイド鎖の配列番号１に対するＩＣ５０は、上記ガイド鎖が修飾のないＲＮＡで構成されている場合、１５６ｐＭである。
【００４７】
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養したＨｅＬａ細胞を、１ｘ１０５個／ｍＬの密度で２４ウエルプレートに播種し、１００ｎｇの各プラスミド（ｐｓｉＣＨＥＣＫ−ｇＣＭ、ｐＣＭ、ｇＳＭ、ｐＳＭ）及び１００ｎｇの内部標準用プラスミド（ｐＧＬ３）と、二重鎖ＲＮＡとを２μＬのlipofectamine2000とともにコトランスフェクトした。二重鎖ＲＮＡとして、（実験Ａ）では、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、２’ＯＭｅ（４−６）、２’ＯＭｅ（３−７）、２’ＯＭｅ（２−８）を最終濃度：０．０００５ｎＭ、０．００５ｎＭ．０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、または５ｎＭとして、（実験Ｂ）では、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、２’ＯＭｅ（２）、２’ＯＭｅ（２−３）、２’ＯＭｅ（２−４）、２’ＯＭｅ（２−６）、２’ＯＭｅ（２−８）、２’ＯＭｅ（２−１０）を、最終濃度：０．０５ｎＭ、０．５ｎＭ、または５ｎＭとして用いた。なお、コントロールのＲＮＡ（図ではｓｉＣＯＮＴ）としてはｓｉＧＹ４４１を導入した。２４時間後に細胞を回収し、deal-luciferase reporter assay system（Promega社）を用いて、firefly luciferase及びRenilla luciferaseの活性を測定し、firefly luciferaseの活性を用いて、Renilla luciferaseの活性を標準化した。結果を図３（特異的遺伝子発現抑制）及び図４（オフターゲット抑制）に示す。
【００４８】
図３に示すように、この条件では、オリジナルのｓｉＲＮＡを含むいずれのｓｉＲＮＡも強い抑制効果を示した。
【００４９】
一方、図４に示すように、オリジナルのｓｉＲＮＡは強いオフターゲット効果を示し、ＤＮＡ−ｓｉＲＮＡも、オリジナルのｓｉＲＮＡよりは弱いがかなり強いオフターゲット効果を示した。しかし、ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から連続して６番目以上のリボヌクレオチドの２位の炭素をＯ−メチル化すると、オフターゲット効果がほぼ観察されなくなった。それ以外の修飾ｓｉＲＭＡは、強弱はあるものの、オフターゲット効果を示した。
【００５０】
このように、ターゲット遺伝子に相補的な配列の５’末端側から数えて２番目から連続して６番目以上のリボヌクレオチドの２位の炭素をＯ−メチル化した修飾ｓｉＲＮＡは、特異的な遺伝子抑制効果を有しながら、オフターゲット効果が弱いという特徴を有する。
【図１】
2019088196.tif 000003
【図２】
2019088196.tif 000004
【図３】
2019088196.tif 000005
【図４】
2019088196.tif 000006
【配列表】
2019088196000001.app