(57)【要約】【課題】  生体内へのカテキン類の吸収を制御する、カテキン類吸収制御剤を効率良く探索又は評価する方法、並びにカテキン類の吸収制御方法を提供する。【解決手段】以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。（Ａ）ＤＴＤＳＴポリペプチドに被検物質とカテキン類を接触させる工程（Ｂ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を検出同定する工程、および（Ｃ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ａ）ＤＴＤＳＴポリペプチドに被検物質とカテキン類を接触させる工程
（Ｂ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を検出同定する工程、および
（Ｃ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
【請求項２】
前記ＤＴＤＳＴポリペプチドが、ＤＴＤＳＴポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の工程（Ｄ）〜（Ｆ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ｄ）ＤＴＤＳＴ発現可能細胞に被検物質を接触させる工程
（Ｅ）前記細胞におけるＤＴＤＳＴの発現レベルを測定する工程、および
（Ｆ）ＤＴＤＳＴの発現レベルを促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
【請求項４】
カテキン類が、エピガロカテキン及び／又はエピガロカテキンガレートである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＤＴＤＳＴの発現又は活性を制御する、非治療的なカテキン類の吸収制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカテキン類吸収制御剤の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑茶は古くから愛飲されてきた飲料である。この緑茶には、茶カテキンと総称される、３−ヒドロキシフラバン構造を有する化合物が多く含まれている。茶カテキンには、抗酸化作用、殺菌作用、抗癌作用、抗腫瘍作用、血圧低下作用、血糖値上昇抑制作用、体脂肪低減作用、抗疲労作用等、健康にとって有益な多くの作用を有することが知られている。
しかし、茶カテキンを経口摂取しても、生体内への吸収率が低いことが知られている。例えば、茶カテキンの１種であり、水溶性低分子であるエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）をヒトやラットが経口摂取した場合、その血中移行率は２％程度と著しく低いものである（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
そこで、カテキン化合物の生体内への吸収性を向上させる研究が数多くなされている。例えば、特許文献１及び２には、セリン、アスパラギン酸、リンゴ酸、カプリン酸、ラウリン酸、グレープフルーツ果汁、コハク酸、システイン、アスパラギン、イソロイシン、ピニトール等がカテキン化合物の吸収を促進することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２４７２８２号公報
【特許文献２】特開２０１１−７９７７０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】K．NAKAGAWA，et  al.，Biosci．Biotech．Biochem.，1997，vol．61(12)，p．1981-1985
【非特許文献２】L．Chen，et  al.，Drug  Metab．Dispos.，1997，vol．25(9)，p．1045-1050
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生体内へのカテキン類の吸収を制御するカテキン類吸収制御剤を効率良く探索又は評価する方法、並びにカテキン類の吸収制御方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、カテキン類の吸収に関与する因子について検討したところ、マウスの下部小腸において発現している硫酸トランスポーター（ＤＴＤＳＴ）が、カテキン類の取込みに関与する輸送因子として機能することを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ａ）ＤＴＤＳＴポリペプチドに被検試料とカテキン類を接触させる工程
（Ｂ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を検出同定する工程、および
（Ｃ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
２）以下の工程（Ｄ）〜（Ｆ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ｄ）ＤＴＤＳＴ発現可能細胞に被検物質を接触させる工程
（Ｅ）前記細胞におけるＤＴＤＳＴの発現レベルを測定する工程、および
（Ｆ）ＤＴＤＳＴの発現レベルを促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
３）ＤＴＤＳＴの発現又は活性を制御する、非治療的なカテキン類の吸収制御方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、カテキン類の吸収を促進又は抑制する物質を簡易且つ効率よく探索又は評価することができ、また、生体内におけるカテキン類の吸収を制御することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＥＧＣｇの取込み活性（ＤＴＤＳＴ発現卵母細胞）。
【図２】ＥＧＣの取込み活性（ＤＴＤＳＴ発現卵母細胞）。
【図３】経時的なＥＧＣｇ取込み量（ＤＴＤＳＴ発現卵母細胞）。
【図４】ＥＧＣｇの取込み活性（ＤＴＤＳＴ発現ＣＨＯ細胞）
【図５】経時的なＥＧＣｇ取込み量（ＤＴＤＳＴ発現ＣＨＯ細胞）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において「カテキン類吸収制御」とは、生体内、特に腸管から血中へのカテキン類の吸収を促進又は抑制することをいう。
また本明細書における「カテキン類」とは、３−オキシフラバンのポリオキシ誘導体であり化学式Ｃ１５Ｈ１４Ｏ６で表される化合物と、その誘導体に相当する一連のポリフェノール化合物を包含する意味である。本発明のカテキン類吸収制御剤は、茶葉から抽出した茶カテキン類の生体内への吸収に好適に用いることができる。茶カテキン類には、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン（ＥＣ）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）等の遊離型カテキン類や、遊離型カテキン類にガレート基が結合した、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）等のガレート型カテキン類が含まれる。本発明のカテキン類の吸収制御におけるカテキン類としては、茶カテキン類が好ましく、ＥＧＣｇ、ＥＧＣがより好ましく、ＥＧＣｇがさらに好ましい。
【００１２】
本発明者らは、カテキン類を継続摂取したマウスの小腸において、カテキン類の吸収性が高い部位が存在することを見出したことから、ショットガンプロテオミクスを用いて当該部位に発現する分子を探索し、硫酸トランスポーターとして知られているＤＴＤＳＴを選抜した。そして、ＤＴＤＳＴをトランスフェクションした細胞においてカテキン類の取込み量が増加することを見出した（後記実施例）。
これらの結果は、ＤＴＤＳＴがカテキン類の取込み（輸送）に関与する因子、すなわちカテキン類の輸送体として機能し、ＤＴＤＳＴの当該機能を調節することによりカテキン類の吸収制御が可能であり、また当該ＤＴＤＳＴを用いることによりカテキン類吸収制御剤の探索が可能であることを示すものである。
【００１３】
本発明のカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法は、一態様として、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）により行われる。
（Ａ）ＤＴＤＳＴポリペプチドに被検試料とカテキン類を接触させる工程
（Ｂ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を検出同定する工程、および
（Ｃ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
【００１４】
また、本発明のカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法は、別の態様として、以下の工程（Ｄ）〜（Ｆ）により行われる。
（Ｄ）ＤＴＤＳＴ発現可能細胞に被検物質を接触させる工程
（Ｅ）前記細胞におけるＤＴＤＳＴの発現レベルを測定する工程、および
（Ｆ）ＤＴＤＳＴの発現レベルを促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
【００１５】
ＤＴＤＳＴは、ＧｅｎＢａｎｋにＧｅｎｅＩＤ: １３５２１、１８３６、１１７２６７として登録されている。マウスＤＴＤＳＴは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１６】
本発明の方法において、ＤＴＤＳＴポリペプチドは、カテキン類の輸送体としての機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、ＤＴＤＳＴポリペプチドは、生体から単離された小腸若しくは小腸細胞等の天然にＤＴＤＳＴポリペプチドを発現する組織や細胞、又はそれらの培養物、例えば腸管から単離した腸管上皮幹細胞を培養することで得られる腸管上皮構造体であるエンテロイド；ＤＴＤＳＴポリペプチドを担持した細胞の膜；ＤＴＤＳＴポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及びＤＴＤＳＴポリペプチドを有する人工脂質二重膜等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用されるＤＴＤＳＴポリペプチドの範囲に含まれる。
【００１７】
好ましい態様においては、ＤＴＤＳＴ発現可能細胞、すなわち小腸上皮細胞等の天然にＤＴＤＳＴポリペプチドを発現する細胞、又はＤＴＤＳＴポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞或いはそれらの培養物が使用される。
ＤＴＤＳＴポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞は、ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞、好ましくはＤＴＤＳＴ遺伝子が恒常的に発現可能なように宿主細胞に導入されている細胞であり、ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸が、染色体外要素として当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞、又は当該核酸が染色体組み込みにより当該核酸が複製可能となるように導入されている細胞が挙げられる。ここで、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡの何れでも良い。当該ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞は、前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＤＴＤＳＴの発現に適したベクターとを連結させることにより得られたＤＴＤＳＴ発現ベクターを宿主細胞に導入することにより得ることができる。宿主細胞へのＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸の導入は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載された形質転換、トランスフェクション等の方法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等に準じて行なうことができる。
【００１８】
前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸は、ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報、例えば、マウスＤＴＤＳＴをコードする核酸に対応する既知の塩基配列の情報（配列番号１）等に基づき、前記塩基配列から作製した適切なプライマー対を用いたＰＣＲ法及び／又は前記塩基配列から作製した適切なプローブとｃＤＮＡライブラリーとを用いたハイブリダイゼーション法等により得ることができる。
【００１９】
前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸は、細胞への導入後に、前記核酸によりコードされるポリペプチドが、カテキン類輸送体としての機能を発現するものであれば、前記核酸に含まれるＤＴＤＳＴ遺伝子の塩基配列において１又は数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を有していてもよい。前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、１）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸、２）配列番号１に示される塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつそれによりコードされるポリペプチドがカテキン類輸送能（取込み能）を有するポリペプチドである核酸、３）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつそれによりコードされるポリペプチドがカテキン類輸送能（取込み能）を有するポリペプチドである核酸、等が挙げられる。前記２）又は３）の核酸は、マウス由来の核酸であってもよく、他の動物に由来する核酸であってもよい。
【００２０】
ここで、塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Lipman,DJ.,Pearson.WR.:Science,1985,227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ  Ｖｅｒ.１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
また、塩基配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」の「数個」とは、例えば、対象となるヌクレオチド配列の総ヌクレオチド数の２０％以下の最大整数、好ましくは同じく１０％以下の最大整数、より好ましくは同じく５％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく４％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく３％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく２％以下の最大整数、さらにより好ましくは同じく１％以下の最大整数を意味する。また本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のヌクレオチドの付加が含まれる。
【００２１】
また、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上若しくは約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Joseph Sambrook,David W.Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２２】
前記ＤＴＤＳＴ発現ベクターは、前記ＤＴＤＳＴをコードする核酸と、用いられる宿主細胞におけるＤＴＤＳＴポリペプチドの発現に適したベクターとを連結させることにより得られる。前記ベクターは、調製が容易であり、用いられる宿主細胞に効率よく導入でき、当該宿主細胞においてＤＴＤＳＴを発現させることができるベクターであればよく、好ましくは、大腸菌のプラスミド、酵母のプラスミド、レトロウイルスベクター等の動物ウイルスベクターが望ましい。
【００２３】
また、前記宿主細胞としては、前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸が効率よく発現され、かつ培養が容易なものであればよく、特に限定されないが、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ（ＨＥＫ）細胞、Ｓｆ−９  ｉｎｓｅｃｔ細胞等が挙げられる。
【００２４】
本発明の方法に使用される前記ＤＴＤＳＴ発現可能細胞は、例えば、当該細胞におけるＤＴＤＳＴの機能の発現、タンパク質レベルでの発現、遺伝子レベルでの発現、蛍光物質の導入等を指標として選択することができる。前記ＤＴＤＳＴポリペプチドをコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入されている細胞の選択には、適切な選択培地等を用いることができる。
【００２５】
ＤＴＤＳＴ発現可能細胞の培養に用いられる培地としては、当該ＤＴＤＳＴを発現する細胞が生育するのに適した成分、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質）、血清（例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ等）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等を成分とする培地であればよい。前記培地は、市販されている培地であってもよい。ＤＴＤＳＴポリペプチドを発現する細胞の培養に用いられる培地としては、かかる細胞に適した培地であればよく、特に限定されないが、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地等が挙げられる。
【００２６】
工程（Ａ）において、ＤＴＤＳＴポリペプチドと、被験物質及びカテキン類との接触は、例えば被験物質及びカテキン類を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、ＤＴＤＳＴ発現可能細胞を培養液に載置すること、或いは、ＤＴＤＳＴ発現可能細胞が載置された培養液に、被験物質及びカテキン類質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。
ここで、ＤＴＤＳＴを発現する細胞の播種時の細胞濃度は、２４Ｗｅｌｌプレートを使用した場合、１×１０４〜２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、１×１０５〜１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのがより好ましい。また、被験物質の添加濃度は、０．０１〜１０質量％（固形残分）とするのが好ましく、０．１〜１質量％（固形残分）とするのが好ましい。また、カテキン類の添加濃度は、０．１〜２質量％とするのが好ましい。
【００２７】
尚、本発明において、被験物質としては、特に限定されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
【００２８】
ＤＴＤＳＴポリペプチドと被験物質及びカテキン類との接触は、室温（２５℃）〜３７℃で通常０．１時間〜４時間程度、好ましくは０．５〜２時間程度、培養するのが好ましい。
【００２９】
次いで、工程（Ｂ）において、ＤＴＤＳＴポリペプチドのカテキン類取込み能が検出同定される。
具体的には、細胞や膜中に取り込まれたカテキン類を抽出してその量が測定され、測定されたカテキン類の取込み量に基づいて、被験物質のカテキン類取込み能が同定される。
カテキン類の抽出は、適宜抽出溶媒を選択することができ、通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、水、メタノール、エタノール、酢酸メチル、又は酢酸エチルが好ましい。また、抽出に際して酸やアルカリなどを添加し、抽出溶媒のｐＨを調整してもよい。
カテキン類の定量は、吸光光度計等の光分析装置を用いた定量や、ＬＣ／ＭＳやＮＭＲ等の電磁気分析装置やＨＰＬＣ等の分離分析装置を用いて行うことができる。
【００３０】
カテキン類取込み能の同定は、被験物質を添加したカテキン類取込み量を、被験物質を添加しないカテキン類取込み量と比較することによって行うことができる。また、被験物質を添加したカテキン類取込み量を、被験物質を添加したＤＴＤＳＴを発現しない細胞のカテキン類取込み量と比較することによって行うこともできる。また、被験物質と対照物質を添加したカテキン類取込み量を、対照物質を添加したカテキン類取込み量と比較することによっても行うことができる。
すなわち、上記ＤＴＤＳＴにおけるカテキン類の取込み量に対して被験物質が及ぼす作用は、被験物質添加群と非添加群との間、ＤＴＤＳＴポリペプチド発現群と非発現群との間、又は被験物質および対照物質群と対照物質群との間で、カテキン類の取込み量を比較することによって決定することができる。
【００３１】
斯くして、被験物質添加により、カテキン類の取込み量が促進される場合、当該被験物質をカテキン類吸収促進剤として評価又は選択することができ、カテキン類の取込み量が低下する場合は、当該被験物質をカテキン類吸抑制剤として評価又は選択することができる（工程（Ｃ））。
【００３２】
工程（Ｄ）において、被験物質とＤＴＤＳＴ発現可能細胞との接触は、工程（Ａ）において示した条件と同様の条件で行うことができる。
【００３３】
工程（Ｅ）において、ＤＴＤＳＴの発現レベルの測定としては、例えば、被験物質を接触させる細胞群と接触させない群（対照細胞）を用意し、ＤＴＤＳＴの発現を遺伝子又はタンパク質レベルで測定し、必要に応じて当該測定値を定量化した後、両者間で比較することにより行うことができる。なお、対照細胞としては、被験物質を接触させない代わりに、対照物質を接触させたものを用いてもよい。
【００３４】
ＤＴＤＳＴの発現レベルは、当該分野で通常使用される任意の解析方法によって測定することができる。遺伝子発現解析方法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ、等が挙げられる。
タンパク質発現（活性）の解析方法としては、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等が挙げられる。
【００３５】
好適には、ＤＴＤＳＴプロモーター領域−レポーター遺伝子構築物を含む細胞における転写活性をレポーターアッセイにより測定すること、ＤＴＤＳＴを内在的に発現するＣａｃｏ−２細胞におけるｍＲＮＡの発現量を測定すること、腸管から単離した腸管上皮幹細胞を培養することで得られる腸管上皮構造体であるエンテロイドにおけるＤＴＤＳＴの発現量を測定すること等が挙げられる。
【００３６】
上記のように測定したＤＴＤＳＴの発現レベルに基づき、カテキン類吸抑制剤を選択又は表することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞におけるＤＴＤＳＴの発現レベルが被験物質を添加しない対照細胞でのレベルと比較して、低下・減少していれば、カテキン類吸収抑制剤として評価又は選択でき、増強・増加していれば、カテキン類吸収促進剤として評価又は選択することができる（工程（Ｆ））。
【００３７】
このようにして選択されたカテキン類吸制御剤、例えばカテキン類吸収促進剤は、カテキン類の吸収を促進するための素材又は製剤として、カテキン類を含有する医薬品、医薬部外品、食品に配合すること、或いはこれらと組み合わせて使用することにより、カテキン類の吸収を促進させることが可能である。
【００３８】
また、本発明は、ＤＴＤＳＴの発現又は活性を制御する、非治療的なカテキン類吸収制御方法を提供する。
ここで、ＤＴＤＳＴの発現制御としては、ＤＴＤＳＴの数が増加又は減少する限り、特に制限はされず、例えば、ゲノムに含まれるＤＴＤＳＴ遺伝子のコピー数の増加又は減少、ｍＲＮＡへの転写の過程の促進又は抑制、ｍＲＮＡの分解又はその抑制、タンパク質への翻訳の過程の促進又は抑制等が挙げられる。
また、ＤＴＤＳＴの活性制御には、カテキン類の取込み能、或いはカテキン類の輸送能の増強又は低下が挙げられる。
【００３９】
ＤＴＤＳＴの活性制御は、具体的には、例えばＤＴＤＳＴの発現又は活性を増強又は抑制する有効量の物質を、ヒトを含む哺乳動物に摂取又は投与することが挙げられる。
例えば、上述した探索方法によって選択されたカテキン類吸収制御剤の摂取又は投与は、ＤＴＤＳＴの活性制御方法の一態様となり得る。
なお、本発明においては、ヒトを含む哺乳動物への上記摂取又は投与は、非治療的なものが想定される。ここで、「非治療的」とは、医療行為、すなわち医師又は医師の指示による治療を目的とした人体への処理行為を含まない概念である。
【００４０】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ａ）ＤＴＤＳＴポリペプチドに被検物質とカテキン類を接触させる工程
（Ｂ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を検出同定する工程、および
（Ｃ）前記ポリペプチドのカテキン類取込み能を促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
＜２＞前記ＤＴＤＳＴポリペプチドが、ＤＴＤＳＴポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現されたものである、＜１＞の方法。
＜３＞以下の工程（Ｄ）〜（Ｆ）を含むカテキン類吸収制御剤の探索又は評価方法。
（Ｄ）ＤＴＤＳＴ発現可能細胞に被検物質を接触させる工程
（Ｅ）前記細胞におけるＤＴＤＳＴの発現レベルを測定する工程、および
（Ｆ）ＤＴＤＳＴの発現レベルを促進又は抑制する被験物質をカテキン類吸収制御剤として選択又は評価する工程
＜４＞カテキン類が、エピガロカテキン及び／又はエピガロカテキンガレートである、＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞ＤＴＤＳＴポリペプチドが脂質二重膜上にＤＴＤＳＴポリペプチドが発現されたものである、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜６＞遺伝的に操作された組換え細胞が、ＤＴＤＳＴのｃＲＮＡを卵母細胞に導入した細胞である、＜２＞の方法。
＜７＞ＤＴＤＳＴ発現可能細が、ＤＴＤＳＴの遺伝子を恒常的に発現させた細胞である、＜３＞の方法。
＜８＞ＤＴＤＳＴの発現又は活性を制御する、非治療的なカテキン類の吸収制御方法。
【実施例】
【００４１】
実施例１  カテキン類の取込亢進作用（１）
（１）方法
１）ＤＴＤＳＴのクローニングおよびｃＲＮＡ合成
マウス小腸ｃＤＮＡを鋳型としてＤＴＤＳＴのＯＲＦ領域をＰＣＲにより増幅し、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加してｐＳＰ６４  ｐｏｌｙ（Ａ）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１２４１）にクローニングした。ＤＴＤＳＴのＯＲＦ領域は配列番号１で示されるヌクレオチド配列である。クローニングしたｐＳＰ６４  ｐｏｌｙ（Ａ）ベクターを、遺伝子導入部位の下流にあるＢｇｌＩＩ制限酵素サイトで切断し、一本鎖ＤＮＡとした。切断後のＤＮＡを電気泳動して一本鎖化されていることを確認し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  ＰＣＲ  ＆  Ｇｅｌ  ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ，ＮＰＫ−６０１）を用いてＤＮＡを回収・精製した。上記操作により得た一本鎖ＤＮＡを鋳型として、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  ＳＰ６  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＡＭ１３４０）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。合成したｃＲＮＡはＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，２７１０４）を用いて精製した。
【００４２】
２）卵母細胞の摘出
氷冷した０．０５％  ＭＳ２２２（Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma）水溶液に２０分間浸してアフリカツメガエルを麻酔した後、氷上にて腹部を切開して卵巣を摘出した。摘出した卵巣を適度にほぐした後、Ｏｏｃｙｔｅ  Ｒｉｎｇｅｒ  ２（Ｏ
Ｒ２）バッファー（８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）にて５〜６回洗浄した。終濃度１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼ（和光純薬、０３４‐２２３６３、５００ｍｇ／ｕｎｉｔｓ）を添加して２０〜２５分間振とうしながら室温でインキュベートし、後述する濾胞除去がスムーズに行えることを確認できた時点でコラーゲナーゼ処理を終了した。反応は氷冷したＯＲ２バッファー添加により終了し、卵母細胞をＯＲ２バッファーにて念入りに洗浄した。
【００４３】
３）濾胞除去
摘出直後〜１日後の卵母細胞をＤｅｆｏｌｉｃｕｌａｔｅ溶液（１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に浸し、顕微鏡下でピンセットを用いて濾胞を除去した。
【００４４】
４）遺伝子導入（マイクロインジェクション）
マニピュレーター（ＭＭ３、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を用いて水または上述したＤＴＤＳＴのｃＲＮＡ水溶液（５００ｎｇ／μＬ）をガラスキャピラリーに充填し、Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ２０１０（フィジオテック）を用いて一つの卵母細胞につき５０ｎＬずつ注入した。
【００４５】
５）卵母細胞の培養
卵母細胞は５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｒｔｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＢＳ；８８ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＫＣｌ、０．３３ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．４１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．４ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）にて１８℃で培養した。
【００４６】
６）基質取込みアッセイ
遺伝子導入後、３日間培養した卵母細胞を用いてアッセイを行った。基質として１００μＭ  ＥＧＣｇまたは１００μＭ  ＥＧＣ（１ｍＭアスコルビン酸含有）を添加したＭＢＳ（ｐＨ７．０）に卵母細胞を浸し、２３〜２５℃で２時間インキュベートした。インキュベート終了は氷冷ＭＢＳの添加により行い、さらに氷冷ＭＢＳで５回洗浄した後に卵母細胞を回収した。回収した細胞は測定時まで−８０℃にて保管した。
【００４７】
７）カテキン抽出、定量
検出感度を向上させるため、卵母細胞４つを合わせて１つのサンプル（Ｎ＝１）とした。４つの卵母細胞に４００μＬのＭＢＳ（ｐＨ６．０）を添加し、氷上にて超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＩＥＲ  １５０、強度４、１０ｓｅｃ）により細胞を破砕して遠心分離した（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。上清を回収し、酢酸エチル１０００μＬを添加して４分間激しく混合し、遠心分離した（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。有機相（上層）９００μＬを回収した後、水層（下層）にさらに酢酸エチル１０００μＬを添加して同様に混合・遠心し、有機相１０００μＬを回収した。回収した有機層をチューブに合わせ、２ｍＭアスコルビン酸水溶液を２μＬ添加した後、減圧遠心機（常温）にて乾燥させた。完全に乾燥した後、１０％アセトニトリル水溶液（０．５％アスコルビン酸添加）に再溶解した。これをＨＰＬＣ−ＭＳ（条件は下記の通り）に導入し、ピーク面積よりＥＧＣｇおよびＥＧＣの定量を行った。
【００４８】
測定機器（HPLC）：infinity 1260 (Agilent Technologies)
カラム：L-column2 ODS（化学物質評価研究機構）
移動相：A：0.1% ギ酸水溶液、B：アセトニトリル （以下の比率で自動混合）
測定条件：流速0.7 mL/min、測定時間12 min/sample
【００４９】
測定機器（MS）：3200QTRAP (AB SCIEX)
SCAN  type:MRM
Polarity:negative
Parameter  table:analyte,  EGCg;MRM(m/z),  457→169
【００５０】
【表１】
2019088239.tif 000002
【００５１】
８）統計解析
結果は全て平均±標準誤差で示した。有意差検定はｔ検定で行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００５２】
（２）結果
ＤＴＤＳＴのｃＲＮＡを卵母細胞に導入した際のＥＧＣｇ取込み活性を評価した。その結果、対照である水を導入した群と比較して、ＤＴＤＳＴのｃＲＮＡの導入により約２．３倍のＥＧＣｇ取込み量の増加が認められた（図１）。同様にＥＧＣに関して評価を行った結果、ＤＴＤＳＴのｃＲＮＡの導入により約１１．４倍のＥＧＣ取込み量の増加が認められた（図２）。これらＥＧＣｇやＥＧＣの卵母細胞への取込み量の増加が非特異的な吸着によるものかどうかを検討するため、経時的な取込み量を評価した。その結果、対照である水を導入した群でのＥＧＣｇの取込み量にほとんど変化は認められなかったが、ＤＴＤＳＴのｃＲＮＡを導入した群では、時間に依存したＥＧＣｇの取込み量の増加が確認された（図３）。
【００５３】
実施例２  カテキン類の取込亢進作用（２）
（１）方法
１）ＣＨＯ細胞を４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈとなるように撒き、Ｆ−１２培地（１０％ＦＢＳ）中で一晩培養した。翌日、ＸｆｅｃｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、４０μｇＤＴＤＳＴ発現ベクター（ｐＣＤＮＡ３．１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｖ７９０２０のマルチクローニングサイトに配列番号１で示されるヌクレオチド配列のうち終始コドンを除いたヌクレオチド配列を挿入）またはコントロールベクターを、プロトコールに従いトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後に、限界希釈法により９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞を播種しなおし、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＦ−１２培地（１０％ＦＢＳ）にて、培養を継続し、安定発現株を樹立した。樹立した細胞株は、ＤＴＤＳＴの遺伝子発現およびＥＧＣｇの取込み活性を指標に、高発現株の選択を行った。
【００５４】
２）基質取込みアッセイ
ＣＨＯ細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅとなるように撒き、Ｆ−１２培地（１０％ＦＢＳ）中で一晩培養した。翌日、７００μＬのＨＢＳＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）に培地を交換し１時間平衡化を行った。１時間後、溶媒である８０％エタノールまたは１００μＭ  ＥＧＣｇを含むＨＢＳＳ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、３０分間培養を行った。３０分後、氷冷したＰＢＳにて細胞を２度洗浄し、−８０℃にて細胞を凍結した。
【００５５】
３）カテキン抽出およびＥＧＣｇの細胞内取込み量測定
細胞を融解後、４００μＬのＨＢＳＳ  ｂｕｆｆｅｒを加え、氷上にて超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ  ＳＯＮＩＦＩＥＲ  １５０、強度２、２ｓｅｃ）により細胞を破砕して遠心分離した（１５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。上清を回収し、酢酸エチル１０００μＬを添加して４分間激しく混合し、遠心分離した（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）。有機相（上層）９００μＬを回収した後、水層（下層）にさらに酢酸エチル１０００μＬを添加して同様に混合・遠心し、有機相１０００μＬを回収した。回収した有機層をチューブに合わせ、２ｍＭアスコルビン酸水溶液を２μＬ添加した後、減圧遠心機（常温）にて乾燥させた。完全に乾燥した後、１０％アセトニトリル水溶液（０．５％アスコルビン酸添加）に再溶解した。これをＨＰＬＣ−ＭＳ（条件は下記の通り）に導入し、ピーク面積よりＥＧＣｇの定量を行った。
【００５６】
測定機器(HPLC) ：infinity 1260 (Agilent Technologies)
測定機器(MS) ：Triple Quad 4500 (AB SCIEX)
カラム：L-column2 ODS (化学物質評価研究機構)
移動相：A：0.1% ギ酸水溶液、B：アセトニトリル 
(以下の比率で自動混合)
測定条件：流速0.7 mL/min、測定時間7 min/sample
【００５７】
【表２】
2019088239.tif 000003
【００５８】
４）統計解析
結果は全て平均±標準誤差で示した。有意差検定はｔ検定で行い、ｐ＜０．０５を有意水準とした。
【００５９】
（２）結果
ＤＴＤＳＴを安定的に発現させたＣＨＯ細胞株を用いて、ＥＧＣｇ取込み活性を評価した。その結果、Ｍｏｃｋに対して約１．９倍のＥＧＣｇ取込み量の増加が認められた（図４）。ＣＨＯ細胞へのＥＧＣｇの取込み量の増加が非特異的な吸着によるものかどうかを検討するため、経時的な取込み量を評価した。その結果、Ｍｏｃｋに対してＤＴＤＳＴを発現させた細胞での、ＥＧＣｇの経時的な取込み量の傾きが大きいことが示され、時間に依存したＥＧＣｇの取込み量の増加が確認された（図５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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