(57)【要約】【課題】フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい、小胞中の核酸を分析する方法を提供すること。【解決手段】核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、分析方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分析方法。
【請求項２】
核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分析方法。
【請求項３】
さらに前記小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記捕捉用担体が粒子状又はフィルター状である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記捕捉用担体が磁性粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記捕捉用担体がアビジン類を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記捕捉用担体がリガンドを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記リガンドが、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体である、請求項７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記酸性基を有する高分子が、酸性基を有する乳タンパク質、酸性基を有する合成高分子、並びにヘパリン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記酸性基を有する高分子がカゼインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項１１】
被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
工程（１−１）：被検者由来の生体試料を用いて請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（１−２）：前記工程（１−１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
判定方法。
【請求項１２】
被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
工程（２−１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
予後判定方法。
【請求項１３】
疾患治療薬の薬効評価方法であって、
工程（３−１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（３−２）：前記工程（３−１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
評価方法。
【請求項１４】
核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分離方法。
【請求項１５】
核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分離方法。
【請求項１６】
小胞を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子とを含む、
核酸分析又は小胞分離用組成物。
【請求項１７】
小胞を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
核酸分析又は小胞分離用キット。
【請求項１８】
核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含む、非特異吸着抑制剤。
【請求項１９】
酸性基を有する高分子を用いることを特徴とする、核酸の非特異吸着を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の分析方法、判定方法、予後判定方法、薬効評価方法、小胞の分離方法、核酸分析又は小胞分離用組成物、核酸分析又は小胞分離用キット、非特異吸着抑制剤、及び非特異吸着抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液中には、小胞中の核酸やキャリアタンパクと結合して存在する核酸（核酸複合体）、フリーの核酸などが存在する。これらはそれぞれ癌の進行や細胞分化など多彩な変化と関係していることが知られており、バイオマーカー開発や、疾患や予後の判定等への応用が期待されている。
【０００３】
一方、体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、また、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のマイクロＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されており（非特許文献１）、血清、血漿、血液などの生体試料からエクソソームを分離し、エクソソームに含まれるタンパク質やマイクロＲＮＡを新たなバイオマーカーとして疾患の早期診断や再発の発見に利用する試みがされている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３４４８０号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２６８５２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３−２１（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、エクソソーム等の小胞中の核酸、キャリアタンパクと結合して存在する核酸の複合体、フリーの核酸などの核酸は、その存在の仕方によりそれぞれ由来が異なるため、分析に先立ち、核酸を含む小胞、複合体、フリーの核酸のうち分析対象物であるものを単離しておくことが重要となる。
【０００７】
しかしながら、細胞培養液の上清や臨床検体等の生体試料はフリーの核酸等を含んでいるため、生体試料から分離した小胞中の核酸を分析する際に、担体や反応容器内壁に対するフリーの核酸等の分析対象外物質の非特異吸着に起因して、抗原抗体反応などの特異反応が阻害されることや陰性と判定されるべき検体が誤って陽性と判定されること（以下、偽陽性とも称する）がある。この偽陽性を減少させるために、小胞の捕捉を界面活性剤存在下で行う、或いは捕捉用担体にタンパク質やポリマーをオーバーコートするなどの手法が用いられてきたが、これまでの手法だけでは限界があった。偽陽性を減少させることは、エクソソームをはじめとする小胞を利用した疾患や予後の判定において、ますます重要な課題となってくる。
本発明が解決しようとする課題は、フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい、小胞中の核酸を分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法において、酸性基を有する高分子を系内に添加して小胞の捕捉を行うこと、又は生体試料や捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを用いることによって、フリーの核酸等の分析対象外物質の非特異吸着に起因する精度低下の発生が抑えられることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜１９＞を提供するものである。
【００１０】
＜１＞  核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分析方法。
【００１１】
＜２＞  核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分析方法。
【００１２】
＜３＞  さらに前記小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含む、前記＜１＞又は＜２＞に記載の分析方法。
＜４＞  前記捕捉用担体が粒子状又はフィルター状である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の分析方法。
＜５＞  前記捕捉用担体が磁性粒子である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の分析方法。
＜６＞  前記捕捉用担体がアビジン類を有する、前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の分析方法。
＜７＞  前記捕捉用担体がリガンドを有する、前記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の分析方法。
＜８＞  前記リガンドが、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体である、前記＜７＞に記載の分析方法。
＜９＞  前記酸性基を有する高分子が、酸性基を有する乳タンパク質、酸性基を有する合成高分子、並びにヘパリン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の分析方法。
＜１０＞  前記酸性基を有する高分子がカゼインである、前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の分析方法。
【００１３】
＜１１＞  被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
工程（１−１）：被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（１−２）：前記工程（１−１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
判定方法。
【００１４】
＜１２＞  被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
工程（２−１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
予後判定方法。
【００１５】
＜１３＞  疾患治療薬の薬効評価方法であって、
工程（３−１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（３−２）：前記工程（３−１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
評価方法。
【００１６】
＜１４＞  核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
前記小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分離方法。
【００１７】
＜１５＞  核酸を含む小胞を含有する生体試料と、前記小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分離方法。
【００１８】
＜１６＞  小胞を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子とを含む、
核酸分析又は小胞分離用組成物。
【００１９】
＜１７＞  小胞を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
核酸分析又は小胞分離用キット。
【００２０】
＜１８＞  核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含む、非特異吸着抑制剤。
【００２１】
＜１９＞  酸性基を有する高分子を用いることを特徴とする、核酸の非特異吸着を抑制する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の核酸分析方法は、フリーの核酸等の分析対象外物質に起因する精度低下が発生しにくい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜核酸分析方法＞
本発明の核酸分析方法は、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うこと、又は
生体試料及び捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを、特徴とするものである。
【００２４】
（酸性基を有する高分子）
本発明の核酸分析方法においては、生体試料及び捕捉用担体とは別に、酸性基を有する高分子を小胞捕捉工程の系内に添加してもよく、生体試料及び／又は捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを用いることで小胞捕捉工程の系内に酸性基を有する高分子を共存せしめてもよい。また、生体試料及び／又は捕捉用担体として酸性基を有する高分子で処理されたものを使用し、更にこれとは別に、酸性基を有する高分子を小胞捕捉工程の系内に添加してもよい。なお、酸性基を有する高分子で生体試料を処理する方法は特に限定されず、例えば、酸性基を有する高分子を加えた容器に、採取した生体試料を添加する方法等が挙げられる。また、酸性基を有する高分子で捕捉用担体を処理する方法も特に限定されるものではなく、例えば、ブロッキング処理として通常行われる方法が挙げられ、より具体的には、酸性基を有する高分子を含むバッファーに捕捉用担体を加え、静置又は混合する方法等が挙げられる。
このようにして酸性基を有する高分子を用いることによって、捕捉用担体表面に酸性基を有する高分子が付着し、非特異吸着を抑制することができる。
また、酸性基を有する高分子の系内への添加は、生体試料と捕捉用担体の接触前、接触時、接触後のいずれであってもよいが、生体試料と捕捉用担体の接触前に添加するのが好ましい。
【００２５】
また、酸性基としては、カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、フェノール性ヒドロキシル基、ジヒドロキシボリル基、これらの塩やイオン等が挙げられる。これらの中でも、非特異吸着抑制の観点から、カルボキシ基、リン酸基、スルホ基、これらの塩やイオンが好ましく、リン酸基が特に好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩；アミン塩等が挙げられる。なお、高分子は、酸性基を末端に有するものでも側鎖に有するものでもよい。
【００２６】
酸性基を有する高分子としては、水溶性のものが好ましい。また、酸性基を有する高分子は天然高分子でも合成高分子でもよく、１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、高分子が酸性基としてカルボキシ基を有する場合、カルボキシ基の一部がエチレングリコールやプロピレングリコール等でエステル化されていてもよく、また、酸性基を有する高分子がフェノール性ヒドロキシル基を有する場合や酸性基とは別にアルコール性ヒドロキシル基を有する場合、フェノール性ヒドロキシル基の一部、アルコール性ヒドロキシル基の一部又は全部が、酢酸、硝酸、硫酸、リン酸などと反応していてもよい。
【００２７】
酸性基を有する天然高分子としては、酸性基を有する乳タンパク質；ヘパリンやその誘導体；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等のポリペプチド類の他、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、ファーセラン、アラビアガム、ガッチガム、カラヤガム、トラガントガム、カンテン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ペントサンポリスルファート、カルボキシメチル化又はサクシニル化した多糖類（セルロース、デキストラン、デンプン、キトサンなどをカルボキシメチル化又はサクシニル化したもの）、これらの塩が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。酸性基を有する乳タンパク質としては、例えば、カゼイン、乳漿タンパク質濃厚物、無脂肪乾燥ミルク、スキムミルクが挙げられる。なお、酸性基を有する乳タンパク質として、部分加水分解物や架橋タンパク質等の乳タンパク質の誘導体を用いてもよい。ヘパリン誘導体としては、未処理のヘパリンに加え、低分子量化ヘパリン、脱Ｎ−硫酸化ヘパリン、脱２−Ｏ−硫酸化ヘパリン、脱６−Ｏ−硫酸化ヘパリン等が挙げられる。
これら酸性基を有する天然高分子の中でも、非特異吸着抑制の観点から、酸性基を有する乳タンパク質並びにヘパリン及びその誘導体から選ばれる１種又は２種以上が好ましく、カゼイン、ヘパリンがより好ましく、カゼインが特に好ましい。
【００２８】
酸性基を有する合成高分子としては、酸性基を有する重合性不飽和モノマー若しくはその塩に由来する繰り返し単位を有する重合体又は共重合体の他、無機ポリリン酸等が挙げられる。
ここで、酸性基を有する重合性不飽和モノマーとは、重合性不飽和基と酸性基を１分子中に有する化合物を意味する。
酸性基を有する重合性不飽和モノマーとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー、スルホ基を有する重合性不飽和モノマーが挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中では、非特異吸着抑制の観点から、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーが好ましい。
【００２９】
リン酸基を有する重合性不飽和モノマーとしては、非特異吸着抑制の観点から、リン酸基含有（メタ）アクリル酸エステル類が好ましく、下記式（１）で表されるモノマーがより好ましい。なお、式（１）中のｎが１であるモノマーとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルアシッドホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルアシッドホスフェートが挙げられる。
【００３０】
【化１】
2019205353.tif 000002
【００３１】
〔式（１）中、
Ｒ1及びＲ2は、水素原子又はメチル基を示し、
ｎは、平均値で１〜８を示し、好ましくは平均値で３〜６である（なお、「平均値」はＮＭＲで測定できる）。〕
【００３２】
カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、ビニル安息香酸、ケイ皮酸、へキサヒドロフタル酸モノ−２−（メタ）アクリロイルオキシエチル等の不飽和モノカルボン酸類；フマル酸、マレイン酸、イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類；マレイン酸モノメチル、マレイン酸モノエチル、イタコン酸モノメチル、イタコン酸モノエチル等の不飽和ジカルボン酸類の部分エステル化物等が挙げられ、無水マレイン酸、無水イタコン酸等の不飽和ジカルボン酸類の酸無水物を用いることもできる。これらの中では、非特異吸着抑制の観点から、不飽和モノカルボン酸類が好ましく、（メタ）アクリル酸がより好ましい。
【００３３】
スルホ基を有する重合性不飽和モノマーとしては、スチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、アリルスルホン酸、メタアリルスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等が挙げられる。
【００３４】
酸性基を有する合成高分子は、酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩に由来する繰り返し単位以外の繰り返し単位（以下、他の繰り返し単位とも称する）を有していてもよい。
他の繰り返し単位としては、芳香族ビニル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマー、飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類、アルキルビニルエーテル類、ビニル基含有アルコール類等に由来する繰り返し単位が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
上記芳香族ビニル系モノマーとしては、下記式（２）で表されるものが好ましく、下記式（３）で表されるものがより好ましい。
【００３６】
【化２】
2019205353.tif 000003
【００３７】
〔式（２）中、
環Ｑは、芳香環を示し、
Ｒ3は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ4は、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲン原子を示し、
ｐは０〜４の整数を示す。〕
【００３８】
【化３】
2019205353.tif 000004
【００３９】
〔式（３）中、Ｒ3、Ｒ4及びｐは、式（２）中の各記号と同義である。〕
【００４０】
式（２）中、環Ｑは、芳香環を示すが、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環が好ましく、ベンゼン環がより好ましい。
式（２）及び（３）中、Ｒ4で示されるアルキル基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１又は２がより好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ4で示されるアルコキシ基の炭素数としては、１〜４が好ましく、１又は２がより好ましい。また、当該アルコキシ基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
また、Ｒ4で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
また、ｐは０〜４の整数を示すが、０又は１が好ましい。なお、ｐが２〜４の整数の場合、ｐ個のＲ4は同一であっても異なっていてもよい。
【００４１】
上記芳香族ビニル系モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、２−メチルスチレン、３−メチルスチレン、４−メチルスチレン、４−エチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、３，４−ジメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−エトキシスチレン、２−クロロスチレン、３−クロロスチレン、４−クロロスチレン、２，４−ジクロロスチレン、２，６−ジクロロスチレン、４−クロロ−３−メチルスチレン等のスチレン系モノマーの他、１−ビニルナフタレン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン等が挙げられる。
【００４２】
上記（メタ）アクリレート系又は（メタ）アクリルアミド系のモノマーとしては、下記式（４）で表されるものが好ましい。
【００４３】
【化４】
2019205353.tif 000005
【００４４】
〔式（４）中、
Ｒ5は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ6は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ8−＊（Ｒ8は、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を示し、＊は、式（４）中のＲ7と結合する位置を示す）を示し、
Ｒ7は、有機基を示す。〕
【００４５】
式（４）中、Ｒ7で示される有機基の炭素数は、好ましくは１〜３０であり、より好ましくは２〜２０であり、更に好ましくは２〜１０であり、特に好ましくは２〜６である。
有機基としては、炭化水素基、炭化水素基の炭素原子の一部がケト基に置き換わった基が挙げられる。これら炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念である。
脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、ラウリル基等のアルキル基が挙げられる。脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基、アダマンチル基、ジシクロペンタニル基等が挙げられる。芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基、ベンジル基等のアラルキル基が挙げられる。
また、式（４）中、Ｒ8は、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基を示す。Ｒ8で示される炭化水素基としては、Ｒ7で示される炭化水素基と同様のものが挙げられる。Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
【００４６】
上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート等のアルキル（メタ）アクリレート；ベンジル（メタ）アクリレート等の芳香環構造を有する（メタ）アクリレート；イソボルニル（メタ）アクリレート、アダマンチル（メタ）アクリレート、ジシクロペンタニル（メタ）アクリレート等の脂環構造を有する（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、例えば、Ｎ−ｔ−ブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）オクチルアクリルアミド、ジアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４７】
上記飽和カルボン酸と不飽和アルコールとのエステル類としては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ネオデカン酸ビニル等が挙げられる。
また、アルキルビニルエーテル類としては、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル等が挙げられる。
また、ビニル基含有アルコール類としては、ビニルアルコール等が挙げられる。
【００４８】
酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と他の繰り返し単位を誘導するモノマーとの組み合わせとしては、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と（メタ）アクリレート系モノマーとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩と芳香族ビニル系モノマーとの組み合わせが好ましく、リン酸基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とブチル（メタ）アクリレートとの組み合わせ、カルボキシ基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩とスチレン及びα−メチルスチレンから選ばれる１種又は２種との組み合わせがより好ましい。
このような組み合わせで共重合体とすることによって、水分散性を有し、且つ捕捉用担体へのフリーの核酸等の非特異吸着を抑制する効果に優れる重合体とすることができる。
【００４９】
酸性基を有する合成高分子において、酸性基を有する重合性不飽和モノマー又はその塩に由来する繰り返し単位の含有量としては、水への分散性・溶解性の観点から、全繰り返し単位中、２０〜８０質量％が好ましい。酸性基を有する重合性不飽和モノマーがリン酸基を有する重合性不飽和モノマーである場合、より好ましくは３０〜７０質量％、特に好ましくは４０〜６０質量％であり、酸性基を有する重合性不飽和モノマーがカルボキシ基を有する重合性不飽和モノマーである場合、より好ましくは２０〜８０質量％、更に好ましくは３０〜７０質量％、特に好ましくは４０〜６０質量％である。なお、他の繰り返し単位の含有量は、残余である。
酸性基を有する合成高分子に含まれる繰り返し単位の含有量は、ＮＭＲで測定できる。
【００５０】
酸性基を有する合成高分子の重量平均分子量としては、１万〜１００万が好ましく、５万〜５０万がより好ましい。
上記重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（東ソー社製、ＨＬＣ−８２２２０ＧＰＣ）等を使用し、ポリスチレン換算で求めることができる。
【００５１】
酸性基を有する合成高分子は、市販品を用いても合成して使用してもよい。酸性基を有する合成高分子は、公知の方法で合成できる。
リン酸基を有する重合性不飽和モノマーに由来する繰り返し単位からなるホモポリマーの市販品としては、ポリホスマーＭ−１０１、ポリホスマーＰＥ−２０１、ポリホスマーＭＨ−３０１、ポリホスマーＰＰ−４０１（以上、ＤＡＰ社製）等が挙げられる。
リン酸基を有する重合性不飽和モノマーに由来する繰り返し単位と（メタ）アクリレート系モノマーに由来する繰り返し単位とを有するコポリマーとしては、ポリホスマーＭＨＢ−１０（ＤＡＰ社製）等が挙げられる。
また、カルボキシ基を有する合成高分子の市販品としては、スチレン／α−メチルスチレン／アクリル酸コポリマー（ＢＡＳＦ社製のジョンクリル６０３０等）、アクリル酸／エチルアクリレート／Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミドコポリマー（ＢＡＳＦ社製のウルトラホールド８、ウルトラホールド・ストロング等）、オクチルアクリルアミド／アクリル酸コポリマー（ナショナル・スターチ社製のアンフォーマーＶ−４２等）、アクリレート／メタクリレート／アクリル酸／メタクリル酸コポリマー（ユニオンカーバイド社製のアマホールドＤＲ２５等）、アクリレーツ／ジアセトンアクリルアミドコポリマー（互応化学工業社製のプラスサイズＬ−９５４０Ｂ等）、メチルビニルエーテル／マレイン酸アルキルコポリマー（ＩＳＰ社製のガントレッツＥＳ−２２５，同ＥＳ−４２５，同ＳＰ−２１５等）、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー（ナショナル・スターチ社製のレジン２８−１３１０等）、酢酸ビニル／クロトン酸／ネオデカン酸ビニルコポリマー（ナショナル・スターチ社製のレジン２８−２９３０等）、酢酸ビニル／クロトン酸／プロピオン酸ビニルコポリマー（ＢＡＳＦ社製のルビセットＣＡＰ等）、ビニルアルコール／イタコン酸コポリマー（クラレ社製のＫＭ−１１８等）等が挙げられる。
【００５２】
小胞捕捉工程における酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．０００００１〜２５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．０００００５〜２０％（ｗ／ｖ）である。
特に、酸性基を有する高分子を系内に添加して小胞捕捉を行う場合、酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．００００１〜１５％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．００００５〜１０％（ｗ／ｖ）であり、更に好ましくは０．０００１〜７．５％（ｗ／ｖ）であり、特に好ましくは０．０００５〜５％（ｗ／ｖ）である。一方、生体試料及び／又は捕捉用担体として、酸性基を有する高分子で処理されたものを用いる場合、酸性基を有する高分子の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．０００００１〜１０％（ｗ／ｖ）である。
【００５３】
（生体試料）
生体試料としては、核酸を含む小胞を含有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。培地、培養上清、破砕液に含まれる細胞は、真核生物由来でも細菌由来でもよい。
これらの中でも、生体試料としては、体液、細胞培養上清が好ましく、体液がより好ましく、ヒト由来の体液が特に好ましい。
【００５４】
体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、汗、胃液、間質液、関節液、眼房水、喀痰、胸水、口腔粘膜群、骨髄液、精液、消化液、組織液、体腔液、唾液、胆汁、膣液、涙、乳汁、尿、脳脊髄液、鼻腔液、糞便、腹水、羊水、リンパ液等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。なお、血液組成成分は、クエン酸、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
本発明の核酸分析方法は、血清や血漿等の臨床検体を生体試料として用いた場合であっても、非特異吸着に起因する精度低下が発生しにくく、広範な種類の生体試料に利用できる。
【００５５】
ここで、本発明の一実施形態で使用する「酸性基を有する高分子で処理された生体試料」としては、上記酸性基を有する高分子で処理されたものであれば特に限定されないが、ヘパリン及び／又はその誘導体で処理された生体試料が好ましい。なお、このような生体試料を用いる場合、酸性基を有する高分子で予め処理された生体試料を用いても、核酸分析の直前に、酸性基を有する高分子で生体試料を処理してもよい。
【００５６】
また、核酸を含む小胞は、脂質二重膜を有するものであれば特に限定されるものではなく、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソーム、細胞外ベシクル、微細小胞等が挙げられる。中でも、本発明の核酸分析方法は、エクソソームに含まれる核酸の分析に特に適する。
【００５７】
また、小胞は、通常、その表面に抗原が存在する。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ−βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソームを捕捉する場合は、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質を利用して捕捉するのが好ましい。
【００５８】
小胞捕捉工程における生体試料の濃度は、系内の液相全量に対して、好ましくは０．１〜９０％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１〜５０％（ｖ／ｖ）である。
【００５９】
（捕捉用担体）
捕捉用担体としては、小胞を捕捉できるものであれば特に限定されないが、通常、固相担体が用いられる。
また、捕捉用担体の使用量は、生体試料に対し、好ましくは０．００００１〜０．１質量倍、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量倍である。
【００６０】
固相担体の形状は特に限定されないが、例えば、トレイ状、球状、粒子状（ラテックス粒子等）、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、フィルター、カラム、試験管等が挙げられ、固液分離や洗浄の容易性の観点から、粒子状、フィルター状が好ましく、粒子状がより好ましい。
【００６１】
固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；シリカ；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
【００６２】
固相担体としては磁性粒子が好ましい。磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
これらの中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
【００６３】
ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ2Ｏ4（Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表現されるフェライト、Ｆｅ3Ｏ4で表現されるマグネタイト、γ−Ｆｅ2Ｏ3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ−Ｆｅ2Ｏ3及びＦｅ3Ｏ4のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００６４】
また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
上記単官能性モノマーとして、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。また、上記架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の架橋性（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００６５】
また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００６６】
第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
【００６７】
また、磁性粒子等の固相担体は、その表面にビオチン類結合部位を有する物質が固定されていてもよい。これにより、ビオチン化されたリガンドが固相担体に結合しやすくなる。
ビオチン類結合部位を有する物質としては、アビジン類が好ましい。アビジン類としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上の化合物等が挙げられる。固相担体の表面へのビオチン類結合部位を有する物質の固定は、日本国特許第４７１６０３４号公報に記載された方法等の公知の方法により行えばよい。
【００６８】
ここで、本発明者らの検討の結果、アビジン類を有する捕捉用担体を小胞の捕捉に使用した場合は、フリーの核酸等の分析対象外物質が特に非特異吸着しやすくなり、小胞に含まれる核酸を分析する際にノイズが出やすくなることが判明した。しかしながら、本発明の核酸分析方法を用いた場合においては、アビジン類を有する捕捉用担体を用いたときであっても、小胞捕捉工程における分析対象外物質の非特異吸着を抑えることができ、核酸分析を低ノイズ化できる。
【００６９】
また、本発明の一実施形態で使用する「酸性基を有する高分子で処理された捕捉用担体」としては、上記酸性基を有する高分子で処理されたものであれば特に限定されないが、酸性基を有する高分子でブロッキング処理されたものが好ましい。このような捕捉用担体を用いる場合、酸性基を有する高分子で予め処理された捕捉用担体を用いても、核酸分析の直前に、酸性基を有する高分子で捕捉用担体を処理してもよい。
【００７０】
（リガンド）
捕捉用担体としては、リガンドを有するものが好ましい。
リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
【００７１】
リガンドとしては、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質（例えば、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在するホスファチジルセリンなどの物質を認識するアネキシンＶなどのタンパク質）、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン、神経伝達物質等が挙げられる。これらの中でも、抗体、抗原、タンパク質、核酸が好ましく、抗体、抗原がより好ましく、抗体が特に好ましい。
上記抗体としては、小胞表面に存在する抗原を認識する抗体が好ましく、小胞表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体がより好ましい。小胞がエクソソームである場合は、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質を認識する抗体が特に好ましい。また、抗体はビオチン化されていてもよい。ビオチン化抗体をアビジン類で結合させた捕捉用担体を用いることによって、非特異吸着を更に抑制できる。
【００７２】
また、抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号等を参照して作製できる。
なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ等が挙げられる。
【００７３】
また、小胞表面に存在する抗原を認識するリガンドが結合した固相担体は、市販品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ９  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（いずれもＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＤ９  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ６３  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ８１  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ（いずれもＳＢＩ社製）等が挙げられる。
【００７４】
（小胞捕捉工程）
小胞捕捉工程においては、生体試料と捕捉用担体との接触により、核酸を含む小胞が捕捉用担体に捕捉される。
【００７５】
小胞捕捉工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、界面活性剤；アルブミン等のタンパク質；ショ糖等の糖類等を用いて行ってもよい。
これらの中では、非特異吸着抑制の観点、小胞へのダメージを抑える観点から、界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤がより好ましく、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤が特に好ましい。また、界面活性剤は、芳香族基を分子中に含まないものが好ましい。
例えば、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。これらの中でも、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール等が挙げられる。
界面活性剤を使用する場合、その使用量は、非特異吸着抑制の観点、小胞へのダメージを抑える観点から、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１５〜３．５％（ｗ／ｖ）である。
【００７６】
また、小胞捕捉工程における反応温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内であり、より好ましくは２〜３２℃の範囲内であり、特に好ましくは２〜２２℃の範囲内である。また、反応時間は、通常、１分間〜７２時間であるが、好ましくは５分間〜６０時間、より好ましくは１０分間〜４８時間、特に好ましくは１０分間〜３６時間である。
【００７７】
小胞捕捉工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００７８】
（洗浄工程）
本発明の分析方法は、洗浄工程を含んでいてもよい。洗浄工程は、上記小胞捕捉工程で小胞を捕捉した捕捉用担体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質の他、核酸や蛋白質等の分析対象外物質が更に除去される。小胞を捕捉した捕捉用担体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
【００７９】
上記洗浄工程は、通常、捕捉用担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように捕捉用担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、捕捉用担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。界面活性剤としては、上記小胞捕捉工程で使用してもよいものと同様のものが好ましい。
【００８０】
また、捕捉用担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の分析対象外物質を磁性粒子表面からさらに効率よく洗浄・分離除去できる。
具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。洗浄液としては、上記小胞捕捉工程で挙げた界面活性剤と緩衝液を含む洗浄液が好ましい。
【００８１】
（解離工程）
本発明の分析方法は、上記小胞捕捉工程又は洗浄工程の後、捕捉された小胞を担体から解離する解離工程を含んでいてもよい。
リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合が解離する条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、“Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ”  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
【００８２】
（核酸分析工程）
本発明の分析方法は、小胞捕捉工程、洗浄工程又は解離工程の後に、さらに小胞に含まれる核酸を分析する核酸分析工程を含むことが好ましい。
核酸の分析は常法にしたがっておこなえばよい。例えば、ＰＣＲ法、電気泳動法、シーケンス法、ハイブリダイゼーション法等の公知の方法に従った検出が挙げられる。核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（ｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
【００８３】
＜疾患判定方法＞
本発明の疾患判定方法は、被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、工程（１−１）：被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（１−２）：前記工程（１−１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。
例えば、核酸分析がシグナル強度の測定である場合は、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい。
本発明の疾患判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
【００８４】
本発明の疾患判定方法は、本発明の核酸分析方法により核酸を分析すること以外は公知の手法と同様にして行えばよい。例えば、疾患の判定は、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
【００８５】
＜予後判定方法及び薬効評価方法＞
本発明の予後判定方法は、被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、工程（２−１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。上記治療には疾患治療薬の投与や手術等の外科的手段も含まれる。
本発明の薬効評価方法は、疾患治療薬の薬効評価方法であって、工程（３−１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて本発明の核酸分析方法により核酸を分析する工程、及び工程（３−２）：前記工程（３−１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とするものである。
本発明の予後判定方法及び薬効評価方法は、本発明の核酸分析方法により核酸を分析すること以外は公知の手法と同様にして行えばよい。例えば、疾患治療薬を投与した場合を例に説明すると、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、予後が良好である可能性が高い、或いは疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい。上記疾患治療薬としては、上記疾患判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
【００８６】
より具体的には、予後判定及び薬効評価は、例えば、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
【００８７】
＜小胞分離方法＞
本発明の小胞分離方法は、核酸を含む小胞を含有する生体試料と、小胞を捕捉する捕捉用担体とを接触させて小胞を捕捉する小胞捕捉工程を含む小胞の分離方法であって、
小胞捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うこと、又は
生体試料及び捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とするものである。
【００８８】
本発明の小胞分離方法における小胞捕捉工程は、本発明の核酸分析方法の小胞捕捉工程と同様にして行えばよい。また、本発明の核酸分析方法と同様の洗浄工程、解離工程を含んでいてもよい。
本発明の小胞分離方法によれば、フリーの核酸等の分析対象外物質を除去することができる。
【００８９】
＜組成物及びキット＞
本発明の核酸分析又は小胞分離用組成物は、小胞を捕捉する捕捉用担体と、酸性基を有する高分子とを含むことを特徴とするものである。本発明の組成物としては、液状組成物が好ましい。
本発明の核酸分析又は小胞分離用キットは、小胞を捕捉する捕捉用担体と、酸性基を有する高分子を含む液剤とを備えることを特徴とするものである。当該キットは、上記捕捉用担体を、捕捉用担体を含む液剤として備えていてもよい。
これら本発明の組成物及びキットにおける捕捉用担体、酸性基を有する高分子は、本発明の核酸分析方法と同様のものを用いればよい。
【００９０】
本発明の組成物及び上記各液剤は、水、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、上記小胞捕捉工程で用いてもよいものと同様の界面活性剤が挙げられる。
また、本発明の組成物及び上記各液剤のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス緩衝液、炭酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
なお、本発明の組成物の調製方法としては、例えば、捕捉用担体の分散液に、酸性基を有する高分子を添加する方法、酸性基を有する高分子で処理された捕捉用担体を、反応バッファーに添加する方法等が挙げられる。
本発明の組成物及びキットは、上記分析方法、疾患判定方法、予後判定方法、薬効評価方法、小胞分離方法に有用である。
【００９１】
＜非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法＞
本発明の非特異吸着抑制剤は、核酸の非特異吸着を抑制させるための非特異吸着抑制剤であって、酸性基を有する高分子を含むものである。
本発明の核酸の非特異吸着を抑制する方法は、酸性基を有する高分子を用いることを特徴とするものである。
これら非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法における酸性基を有する高分子は、本発明の核酸分析方法と同様のものを用いればよい。具体的な方法としては、酸性基を有する高分子を系内（反応容器内）に添加する方法、生体試料や捕捉用担体を処理する方法が挙げられる。
本発明の非特異吸着抑制剤及び非特異吸着抑制方法により、捕捉用担体や反応容器内壁に対する核酸の非特異吸着を抑制できる。
【００９２】
上述した実施形態の他、本発明によれば、更に以下の核酸の分析方法等を提供できる。
【００９３】
〔１〕  核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記核酸捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分析方法。
【００９４】
〔２〕  核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分析方法。
上記〔１〕及び〔２〕の核酸分析方法によれば、分析対象外物質の非特異吸着が抑制され、生体試料中のフリーの核酸を高精度で分析できる。
【００９５】
〔３〕  被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
工程（１−１）：被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（１−２）：前記工程（１−１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
判定方法。
【００９６】
〔４〕  被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
工程（２−１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
予後判定方法。
【００９７】
〔５〕  疾患治療薬の薬効評価方法であって、
工程（３−１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（３−２）：前記工程（３−１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
評価方法。
【００９８】
〔６〕  核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分離方法であって、
前記核酸捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分離方法。
【００９９】
〔７〕  核酸を含有する生体試料と、前記核酸を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸を捕捉する核酸捕捉工程を含む核酸の分離方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分離方法。
【０１００】
〔８〕  核酸を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子とを含む、
核酸分析又は核酸分離用組成物。
【０１０１】
〔９〕  核酸を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
核酸分析又は核酸分離用キット。
【０１０２】
〔１０〕  核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記核酸複合体捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分析方法。
【０１０３】
〔１１〕  核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸の分析方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分析方法。
上記〔１０〕及び〔１１〕の核酸分析方法によれば、分析対象外物質の非特異吸着が抑制され、生体試料中の核酸複合体由来の核酸を高精度で分析できる。
【０１０４】
〔１２〕  被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための判定方法であって、
工程（１−１）：被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（１−２）：前記工程（１−１）で得られた分析結果を健常者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
判定方法。
【０１０５】
〔１３〕  被検者の疾患治療後の予後を判定するための予後判定方法であって、
工程（２−１）：治療後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（２−２）：前記工程（２−１）で得られた分析結果を治療前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
予後判定方法。
【０１０６】
〔１４〕  疾患治療薬の薬効評価方法であって、
工程（３−１）：疾患治療薬投与後の被検者由来の生体試料を用いて前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の分析方法により核酸を分析する工程、及び
工程（３−２）：前記工程（３−１）で得られた分析結果を疾患治療薬投与前の被検者由来の生体試料の分析結果と対比する工程を含むことを特徴とする、
評価方法。
【０１０７】
〔１５〕  核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸複合体の分離方法であって、
前記核酸複合体捕捉工程を、酸性基を有する高分子を系内に添加して行うことを特徴とする、
分離方法。
【０１０８】
〔１６〕  核酸複合体（核タンパク質等）を含有する生体試料と、前記核酸複合体を捕捉する捕捉用担体とを接触させて前記核酸複合体を捕捉する核酸複合体捕捉工程を含む核酸複合体の分離方法であって、
前記生体試料及び前記捕捉用担体から選ばれる少なくとも１種が、酸性基を有する高分子で処理されたものであることを特徴とする、
分離方法。
【０１０９】
〔１７〕  核酸複合体（核タンパク質等）を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子とを含む、
核酸分析又は核酸複合体分離用組成物。
【０１１０】
〔１８〕  核酸複合体（核タンパク質等）を捕捉する捕捉用担体と、
酸性基を有する高分子を含む液剤とを備える、
核酸分析又は核酸複合体分離用キット。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１１２】
まず、試験に先立ち、参考例１、比較例１〜４及び実施例１〜１２の反応バッファーとして、以下の反応バッファーを準備した。
参考例１の反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製１０×ＴＢＳを１０倍希釈、以下同じ））
比較例１〜４及び実施例１〜１２の反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水に、表１に示す各添加物質を、反応バッファー中の濃度が表１に示す濃度になるように添加したもの
【０１１３】
【表１】
2019205353.tif 000006
【０１１４】
次に、以下のサンプル（生体試料）を準備した。
ＨＴ２９培養上清（サンプル１）：ＥｘｏＣａｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．  ＭＥＸ−ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
正常ヒト血漿・プール  ＥＤＴＡ−２Ｎａ（サンプル２）：コージンバイオ社製
正常ヒト血漿・プール  ヘパリン処理（サンプル３）：コージンバイオ社製
正常ヒト血清・プール（サンプル４）：コージンバイオ社製
２９３Ｔ培養上清（サンプル５）：ＥｘｏＣａｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．  ＭＥＸ−ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
２２Ｒｖ１培養上清（サンプル６）：ＥｘｏＣａｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｋｉｔ（登録商標）Ｃｏｄｅ．  ＭＥＸ−ＳＡ（ＭＢＬ社製）に記載の方法に従い調製した。
正常ヒト血漿・プール  クエン酸処理（サンプル７）：コージンバイオ社製
【０１１５】
（試験例１）
小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、小胞を含む細胞培養上清と、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、反応バッファーへの界面活性剤（比較例）又は酸性基を有する高分子（実施例）の添加による非特異吸着抑制作用を確認した。具体的手順を以下に示す。
（１）  ビオチン化されたＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ社製、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７６−６）２．５μＬ、又はＡｎｔｉ−ＣＤ９  ｍＡｂ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００１−６）２．５μＬと、ＥｘｏＣａｐ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｋｉｔ(登録商標)Ｃｏｄｅ．  ＭＥＸ−ＳＡ（ＭＢＬ社製）０．５ｍｇとをＷａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬに懸濁させ、この懸濁溶液を室温で３０分間攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、抗体固定化磁性粒子を得た。
（２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記抗体固定化磁性粒子をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表２に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。
（３）  次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ、試験例１において以下同じ）１ｍＬで３回洗浄した。新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を用意し、ＨＴ２９培養上清を反応させた抗体固定化磁性粒子の懸濁液を１ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体固定化磁性粒子を集磁後、上清を抜き取り、洗浄バッファーを０．１ｍＬ添加した。この抗体固定化磁性粒子液０．１ｍＬより、ｍｉｃｒｏＲＮＡを回収した。ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃２１７１８４）を用いた。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，  ｎｏ  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。結果を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
2019205353.tif 000007
【０１１７】
表２に示すとおり、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳＯ、デオキシコール酸を系内に添加した場合は、小胞捕捉工程における非特異吸着の抑制は確認できなかったが、酸性基を有する高分子であるカゼインを系内に添加した場合は、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
【０１１８】
（試験例２）
小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、ＥＤＴＡ又は酸性基を有する高分子（ヘパリン）で小胞を含む血漿を処理したものと、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、酸性基を有する高分子で生体試料を処理することによる非特異吸着抑制作用を確認した。
すなわち、反応バッファーとして表１の参考例１のバッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血漿・プール  ＥＤＴＡ−２Ｎａ（サンプル２）又は正常ヒト血漿・プール  ヘパリン処理（サンプル３）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表３に示す。
【０１１９】
【表３】
2019205353.tif 000008
【０１２０】
表３に示すとおり、ＥＤＴＡで処理した生体試料を用いた場合は、小胞捕捉工程における非特異吸着の抑制は確認できなかったが、酸性基を有する高分子であるヘパリンで処理した生体試料を用いた場合は、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
【０１２１】
（試験例３−１）
反応バッファーとして表４に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表４に示す。
【０１２２】
【表４】
2019205353.tif 000009
【０１２３】
（試験例３−２）
ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ−ＣＤ３２６  （ＥｐＣＡＭ）  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００４−６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−６）に、それぞれ変更した以外は、試験例３−１と同様にして試験を行った。結果を表５に示す。
【０１２４】
【表５】
2019205353.tif 000010
【０１２５】
表４、５に示すとおり、０．１％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）、５．０％（ｗ／ｖ）のいずれのカゼイン濃度の反応バッファーを用いた場合においても、フリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
【０１２６】
（試験例３−３）
小胞とは反応しないマウス抗体を担体に結合させた陰性対照又は小胞特異的マーカー抗体を担体に結合させた陽性対照と、小胞を含む血清と、反応バッファーとを混合し、洗浄後、小胞内のｍｉＲＮＡを検出することで、反応バッファーへの酸性基を有する高分子の添加による非特異吸着抑制作用を確認した。
すなわち、反応バッファーとして表６に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血清・プール（サンプル４）を使用した以外は、試験例３−１と同様にして試験を行った。結果を表６に示す。
【０１２７】
【表６】
2019205353.tif 000011
【０１２８】
（試験例４−１）
試験例１において、生体試料の種類を変更した検討を行った。
すなわち、反応バッファーとして表７に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして２９３Ｔ培養上清（サンプル５）又は２２Ｒｖ１培養上清（サンプル６）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表７に示す。
【０１２９】
【表７】
2019205353.tif 000012
【０１３０】
（試験例４−２）
試験例１において、生体試料の種類を変更した検討を行った。
すなわち、反応バッファーとして表８に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血漿・プール  クエン酸処理（サンプル７）又は正常ヒト血漿・プール  ＥＤＴＡ−２Ｎａ（サンプル２）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表８に示す。
【０１３１】
【表８】
2019205353.tif 000013
【０１３２】
（試験例５−１）
Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２−ＲＥＶ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）、Ｔａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２−ＬＰＩ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（日本たばこ産業社製）をhttp://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/5324-MS300CA_j.PDFに記載のプロトコールに従い、磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製  ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）に結合させたものを準備した。これらのＴａｍａｖｉｄｉｎ（登録商標）２結合ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、又はＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．５ｍｇと、ビオチン化されたＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（ＭＢＬ社製、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７６−６）２．５μＬとを、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬに懸濁させ、この懸濁溶液を室温で３０分間攪拌し、非磁性成分を磁気分離により除去し、６種類の抗体固定化磁性粒子を得た。
抗体固定化磁性粒子として上記６種類の抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーとして表９に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表９に示す。
【０１３３】
【表９】
2019205353.tif 000014
【０１３４】
（試験例５−２）
抗体固定化磁性粒子として、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＥｐＣＡＭ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ（ＭＢＬ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−１１））を使用し、反応バッファーとして表１０に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして正常ヒト血清・プール（サンプル４）又は正常ヒト血漿・プール  クエン酸処理（サンプル７）を使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表１０に示す。
【０１３５】
【表１０】
2019205353.tif 000015
【０１３６】
（試験例５−３）
マウスＩｇＧ１抗体（ＭＢＬ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−３）、マウスＩｇＧ２ａ抗体（ＭＢＬ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７６−３）、又はマウスＩｇＧ２ｂ抗体（ＭＢＬ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７７−３）をhttp://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/5324-MS300CA_j.PDFに記載のプロトコールに従い、磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）に結合させたものを抗体固定化磁性粒子として準備した。
抗体固定化磁性粒子として上記３種類の抗体固定化磁性粒子を使用し、反応バッファーとして表１１に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表１１に示す。
【０１３７】
【表１１】
2019205353.tif 000016
【０１３８】
（試験例６）
試験例１において、小胞捕捉工程の系内のｐＨを変更した検討を行った。
すなわち、生理的塩濃度の塩を添加したクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、トリス緩衝液（ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）又は炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）を、カゼイン無添加又はカゼイン濃度１％（ｗ／ｖ）（反応バッファー中の濃度）としたものを、反応バッファーとして使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表１２に示す。
【０１３９】
【表１２】
2019205353.tif 000017
【０１４０】
（試験例７−１）
ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ−ＣＤ３２６  （ＥｐＣＡＭ）  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００４−６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−６）に、それぞれ変更し、反応バッファーとして表１３に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表１３に示す。
【０１４１】
【表１３】
2019205353.tif 000018
【０１４２】
（試験例７−２）
反応バッファーとして表１４に示す反応バッファーを使用した以外は、試験例７−１と同様にして試験を行った。結果を表１４に示す。
【０１４３】
【表１４】
2019205353.tif 000019
【０１４４】
表１３、１４に示すとおり、酸性基を有する高分子であるジョンクリル６０３０、ポリホスホマーを系内に添加することによって、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
【０１４５】
（試験例８−１）
試験例１の（１）と同様に抗体固定化磁性粒子を調製した。試験例８−１において、この捕捉用担体を非ブロッキング粒子１と称する。
次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記非ブロッキング粒子１を０．５ｍｇ加え、これに表１で示した実施例６の反応バッファーを０．３ｍＬ添加し、４℃、２４時間ブロッキング処理した後、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）１ｍＬで１回洗浄した。この捕捉用担体をブロッキング粒子１と称する。
次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、非ブロッキング粒子１又はブロッキング粒子１をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表１５に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。この反応後は、試験例１の（３）と同様の操作を行った。結果を表１５に示す。
【０１４６】
【表１５】
2019205353.tif 000020
【０１４７】
（試験例８−２）
ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ−ＣＤ３２６  （ＥｐＣＡＭ）  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００４−６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−６）に、それぞれ変更した以外は、試験例８−１と同様にして試験を行った。結果を表１６に示す。
【０１４８】
【表１６】
2019205353.tif 000021
【０１４９】
（試験例８−３）
ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ−ＣＤ３２６  （ＥｐＣＡＭ）  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００４−６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−６）に、それぞれ変更する以外は、試験例１の（１）と同様に抗体固定化磁性粒子を調製した。試験例８−３において、この捕捉用担体を非ブロッキング粒子２と称する。
次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、上記非ブロッキング粒子２を０．５ｍｇ加え、これに表１で示した実施例１０の反応バッファーを０．３ｍＬ添加し、４℃、２４時間ブロッキング処理した後、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）１ｍＬで１回洗浄した。この捕捉用担体をブロッキング粒子２と称する。
次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、非ブロッキング粒子２又はブロッキング粒子２をそれぞれ０．５ｍｇ加え、反応バッファーとして表１７に示す反応バッファーを０．３ｍＬ添加した。各チューブに、サンプルとしてＨＴ２９培養上清（サンプル１）を０．３ｍＬ添加し、４℃で２４時間反応させた。この反応後は、試験例１の（３）と同様の操作を行った。結果を表１７に示す。
【０１５０】
【表１７】
2019205353.tif 000022
【０１５１】
表１５〜１７に示すとおり、酸性基を有する高分子であるカゼイン、ジョンクリル６０３０で処理した捕捉用担体を用いることにより、小胞捕捉工程におけるフリーの核酸等の非特異吸着を抑制できた。
【０１５２】
（試験例９）
ＣＤ９抗体をＡｎｔｉ−ＣＤ３２６  （ＥｐＣＡＭ）  ｍＡｂ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＥＸ００４−６）に、ＩｇＧ２ａ抗体をＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＭＢＬ社製  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  （ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．Ｍ０７５−６）に、それぞれ変更し、反応バッファーとして表１８に示す反応バッファーを使用し、サンプルとして、正常ヒト血清・プール（サンプル４）、又は正常ヒト血清・プールに表１８に示す細胞培養上清の１０倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したものを使用した以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表１８に示す。
【０１５３】
【表１８】
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