(57)【要約】【課題】  単層培養からスフェロイド培養への変換を行うことを可能にする手法を提供すること。【解決手段】  本発明は、単層培養を行った細胞にコラゲナーゼを加え培養することにより単層培養からスフェロイド培養へ変換させることができる培養方法である。従来のトリプシン処理を行い、個々の細胞に分離するという不連続的な操作を行うことなく、コラゲナーゼの利用によりスフェロイド培養に変換させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単層培養した細胞にコラゲナーゼを添加し培養することにより細胞が集合しスフェロイドを形成するスフェロイド培養方法。
【請求項２】
コラゲナーゼの添加量が５０ユニット／ｍｌ（培養液当たり）以上とする請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
請求項１の手法において、細孔や空隙を有する三次元構造体に細胞を播種し培養したのちに、コラゲナーゼを添加し培養することにより細胞が集合しスフェロイドを形成するスフェロイド培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、コラゲナーゼを利用し、単層培養からスフェロイド培養への変換を行う培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来のスフェロイド培養は、培養した細胞を培養基材から剥離するためにトリプシン処理し、個々に分離し、この分離細胞をスフェロイド形成可能な低接着細胞培養プレートで培養又はスフェロイド形成添加剤を加え培養することによりスフェロイドを形成させることができる。【０００３】  トリプシン処理した細胞は、接着細胞培養プレートで培養することにより単層培養へと移行し、一方、低接着細胞培養プレートで培養又はスフェロイド形成添加剤を加えて培養することによりスフェロイド培養へと移行する。【０００４】  トリプシン処理した細胞は、その後の培養条件により、単層、スフェロイドのどちらにも移行可能であるため、用途に合わせた細胞培養プレートに移し替えて培養される。そのため、この方法による単層培養からスフェロイド培養への変換は、連続的に行われているということではない。【０００５】  低接着細胞培養プレート（特許文献１）を利用したスフェロイド培養の場合、プレート表面を低接着性に加工した培養プレート上で培養を行うが、細胞は低接着細胞培養プレートに播種される前にトリプシン処理される。【０００６】  また、スフェロイド培養では、スフェロイド形成添加剤としてマトリゲル又はノロゲンゲ抽出液（特許文献２）のような細胞外マトリックスを含んだ生体成分を利用する培養方法があるが、いずれも、培養した細胞をトリプシン処理し、細胞を個々に分離した後にスフェロイド化を行っている。【０００７】  コラゲナーゼは、主に、生体内組織から細胞分離する時、例えば、肝臓内への灌流液の添加成分として利用されているが、コラゲナーゼを単層培養からスフェロイド培養に変換させるためには利用されていない。【０００８】  また、コラゲナーゼは、培養細胞の細胞剥離にも使われるが、コラゲナーゼを単層培養からスフェロイド培養に変換させるためには利用されていない。【０００９】  小出らの文献（非特許文献１）には、マウス肝臓から取り出した細胞外マトリックス成分であるプロテオグリカンを利用したスフェロイド培養方法が開示されている。本文献においては、肝臓組織をコラゲナーゼ処理し、組織から細胞を分離し、その後、分離した細胞をプロテオグリカンと一緒に培養することでスフェロイド培養を行っている。コラゲナーゼは単に組織からの細胞分離手段として利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−０２２３６６
【特許文献２】特開２０１１−０６２１２９
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ‘Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ  ｈｉｇｈ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ’，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１（１９８９）３８５−３９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】  本発明は、単層培養からスフェロイド培養への変換をコラゲナーゼの添加と培養により行う手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】  請求項１記載のスフェロイドへの形態変化は、細胞培養基材で単層培養された細胞にコラゲナーゼを添加し、培養することにより細胞が集合しスフェロイド形成を行う培養方法である。
細胞培養基材には、単層培養ができる接着細胞培養プレート、接着細胞培養ディッシュ、接着細胞培養フラスコなどがある。【００１４】  コラゲナーゼは、従来、組織からの細胞分離に利用されているが、本発明に関わる研究開発から細胞を集合させスフェロイド化させる機能を有しているという知見が得られた。【００１５】  そのため、コラゲナーゼを活用して細胞を培養すると単層培養からスフェロイド培養へと変換させることが可能である。【００１６】  すなわち、請求項１にかかる発明は、コラゲナーゼを用いることにより単層培養からスフェロイド培養へ連続的に変換させることが可能となる。【００１７】  請求項２の記載は、コラゲナーゼの添加濃度を記載している。コラゲナーゼの添加濃度を５０ユニット／ｍｌ（以下：Ｕ／ｍｌ）（培養液当たり）以上にすることにより単層培養された細胞をスフェロイドに変換することができる。【００１８】  コラゲナーゼとは、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンを消化する酵素で、コラーゲンの一次構造に特有な−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−の繰り返し配列のＹ―Ｇ結合を切断する酵素である。（式中、Ｇｌｙはグリシンを示し、ｎは２以上の整数を示し、ＸおよびＹは各ｎにおいてそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）【００１９】  コラゲナーゼの酵素力価（ユニット数）は、ｐＨ７．５、３７度で、５時間にコラーゲンよりＬ−ロイシン１μｍｏｌを生じる酵素量を１ユニット（Ｕ：ｕｎｉｔ）とする。【００２０】  請求項３の記載は、三次元構造体内部において形成された単層培養細胞をコラゲナーゼの添加により直接スフェロイド培養に変換することを可能にする方法である。従来、三次元構造体内部で単層培養を行った後にスフェロイド培養に変換することは不可能であった。【００２１】  請求項３の三次元構造体とは、三次元に微細な細孔や空隙を有している構造体のことであり、その構造体に細胞を含んだ培養液を加えることで孔内に細胞を取り込み、構造体内部で細胞培養することができる。三次元の形状としては、円柱、立方体、直方体などどのような形をしていても良い。
【発明の効果】
【００２２】  本発明は、コラゲナーゼを添加して培養することにより単層培養からスフェロイド培養へ変換させることができる培養方法を提供する。本発明により、単層培養に使った細胞培養基材をそのまま使用してコラゲナーゼを添加し培養することでスフェロイド培養に変換することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】単層培養したＨｅｐＧ２細胞へコラゲナーゼ添加後、３日培養したスフェロイドの写真である。１ａ：ＨｅｐＧ２細胞の単層培養、１ｂ：単層培養後にコラゲナーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）添加、１ｃ：単層培養後にコラゲナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）添加、１ｄ：単層培養後にコラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）添加、１ｅ：単層培養後にコラゲナーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）添加、１ｆ：単層培養後にコラゲナーゼ（６００Ｕ／ｍｌ）添加。
【図２】単層培養したＡ５４９細胞へコラゲナーゼ添加後、４日培養したスフェロイドの写真である。２ａ：Ａ５４９細胞の単層培養、２ｂ：単層培養後にコラゲナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）添加、２ｃ：単層培養後にコラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）添加。
【図３】単層培養したＨＴ−２９細胞へコラゲナーゼ添加後、４日培養したスフェロイドの写真である。３ａ：ＨＴ−２９細胞の単層培養、３ｂ：単層培養後にコラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）添加、３ｃ：単層培養後にコラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）＋４ｘ−ＨＡ  ｍａｔｒｉｘ２．５％添加。
【図４】三次元構造体（ポリウレタンフォーム）で単層培養したＨｅｐＧ２細胞へコラゲナーゼ添加後、２日培養したスフェロイドの写真である。４ａ：ＨｅｐＧ２細胞のポリウレタンフォーム中での単層培養、４ｂ：単層培養後にコラゲナーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）添加。
【発明を実施するための形態】
【００２４】  以下、本発明の実施形態は図面を参照しながら詳細を説明する。
本発明は、スフェロイド培養において、生体内で連続的に行われている細胞形態の変化を模倣するという課題に対し、コラゲナーゼを用いて単層培養からスフェロイド培養へ変換させるために鋭意研究を行い開発されたものである。
【実施例】
【００２５】  ＜実験例１：ＨｅｐＧ２細胞：ヒト肝癌由来細胞株＞
ＨｅｐＧ２細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種しＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培養液で１  日間培養し、単層培養を行った。この単層培養した細胞に直接、コラゲナーゼ（５０〜６００Ｕ／ｍｌ）を添加し、３日間培養してスフェロイドを形成させた。【００２６】  培養結果を図１に示す。接着細胞培養プレートで１日間培養した場合は、単層培養（１ａ）になった。この単層培養にコラゲナーゼを添加すると、形態変化を起こし、３日後にはスフェロイド化（１ｂ〜１ｆ）していた。【００２７】  スフェロイドの形成は、コラゲナーゼ５０Ｕ／ｍｌ（培養液当たり）添加でスフェロイド化が確認できるようになる。コラゲナーゼを添加した５０〜６００Ｕ／ｍｌでスフェロイドを形成するが、４００Ｕ／ｍｌ以上の添加では形態はあまり変化しなくなった。スフェロイドは１００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ添加でより明確に形成されるため、スフェロイド形成に必要な添加量としては１００〜４００Ｕ／ｍｌが好ましい。【００２８】  ＜実験例２：Ａ５４９細胞：ヒト肺腺癌由来細胞株＞
次に、Ａ５４９細胞を用いて実験を行った。Ａ５４９細胞を１０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培養液で１日間培養して単層培養を行った。この単層培養した細胞に直接、コラゲナーゼ（１００〜２００Ｕ／ｍｌ）を添加し、４日間培養してスフェロイドを形成させた。【００２９】  培養結果を図２に示す。接着細胞培養プレートで１日間培養した場合は、単層培養（２ａ）になった。この単層培養にコラゲナーゼ１００Ｕ／ｍｌ（２ｂ）、２００Ｕ／ｍｌ（２ｃ）添加で４日後にはスフェロイド化していた。【００３０】  ＜実験例３：ＨＴ−２９細胞：ヒト結腸腺癌由来細胞株＞
ＨＴ−２９細胞を５００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（丸底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培養液で３日間培養して単層培養を行った。この単層細胞にコラゲナーゼを添加、又はコラゲナーゼ＋スフェロイド形成添加剤（４ｘ−ＨＡ  ｍａｔｒｉｘ：濃縮型ノロゲンゲ抽出物）を添加し、４日間培養してスフェロイドを形成させた。【００３１】  培養結果を図３に示す。接着細胞培養プレートで３日間培養した場合は、単層培養（３ａ）になった。この単層培養にコラゲナーゼ２００Ｕ／ｍｌを添加し４日培養すると、複数のスフェロイド（３ｂ）が確認できた。【００３２】  一方、単層培養（３ａ）にコラゲナーゼ＋４ｘ−ＨＡ  ｍａｔｒｉｘを添加した場合は、添加４日後に、細胞はより密に集合した１個のスフェロイド（３ｃ）を形成した。【００３３】＜実験例４：三次元構造体（ポリウレタンフォーム）で単層培養したＨｅｐＧ２細胞へコラゲナーゼ添加＞
ＨｅｐＧ２細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート内に配置した三次元構造体（ポリウレタンフォーム）に播種しＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培養液で１日間培養し、単層培養を行った。この単層培養にコラゲナーゼを添加し、２日間培養してスフェロイドを形成させた。【００３４】  培養結果を図４に示す。ポリウレタンフォーム内で１日間培養を行った場合は、単層培養（４ａ）になった。この単層培養にコラゲナーゼ２００Ｕ／ｍｌ添加し培養することでスフェロイド形成（４ｂ）が確認できた。コラゲナーゼの添加によりスフェロイドへの変換が三次元構造体内部においても可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】  本発明においては、コラゲナーゼを利用して、単層培養を行った接着細胞培養プレートをそのまま利用して単層培養からスフェロイド培養へ変換させることができる。このことにより、生体内で実際起こっている癌などの転移における連続的な細胞形態の変化を培養細胞により模倣することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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