(57)【要約】【課題】多量のＣＲＭ１９７を確実かつ安価に産生するための方法の提供。【解決手段】本発明は、大腸菌宿主細胞において組換えＣＲＭ１９７タンパク質を産生するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、減少ゲノム大腸菌をインキュベートすることを含む。ＢＬ２１などの野生型大腸菌株における産生と比較した、ＣＲＭ１９７の収量における大幅な増加は、本発明による減少ゲノム大腸菌宿主細胞において達成される。【選択図】図１
2019058195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法であって、前記組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するｏｍｐＡ、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、Ｋ−１２株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５、又は、別の大腸菌Ｋ−１２株における対応するＤＮＡセグメントの欠失を含む、方法。
【請求項２】
前記天然の親大腸菌株が、Ｋ−１２株  ＭＧ１６５５である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１リットル当たり少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナル配列が、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル配列が、ＹｔｆＱである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ４２株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ６９株である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記減少ゲノム大腸菌が、ｒｅｌＡ遺伝子であって、前記ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７または５４８位に少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子を含み、前記突然変異が、５４７位でのＧ→Ａ突然変異、５４７位でのＧ→Ｔ突然変異、５４８位でのＣ→Ｇ突然変異、または５４８位でのＣ→Ｔ突然変異のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｐｏｌＢ（ｂ００６０）、機能ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、及び機能ｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４）遺伝子の１つ以上を欠く、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
（ｂ）ＣＲＭ１９７の発現を誘導することと、を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、発酵装置内で実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下のうちの１つ以上：（１）工程（ａ）が、前記減少ゲノム大腸菌を３７℃で最大１９時間成長させ、続いて工程（ｂ）の前及び後で、約２０〜３０℃で成長させることを含む、（２）工程（ａ）及び（ｂ）が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、（３）工程（ａ）において、ｐＨが、６．５〜７．５の範囲である、ならびに／あるいは（４）ｐＨが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
発現が、工程（ｂ）において、好適な量のＩＰＴＧを添加することによって誘導される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
発現が、２００〜２７５のＯＤ６００で誘導される、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵装置が、０．５〜５０，０００リットルの培養物を含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｃ）洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＲＭ１９７が、１つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を欠く、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するｏｍｐＡ、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記ヌクレオチド配列は、発現制御配列に動作可能に連結されており、天然の親大腸菌株が、Ｋ−１２株であり、ここで、前記減少ゲノム大腸菌宿主は、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５、又は、別の大腸菌Ｋ−１２株における対応するＤＮＡセグメントの欠失を含む、減少ゲノム大腸菌宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月３日に出願された米国仮出願第６１／９４７，２３４号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、大腸菌、好ましくは減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株における組換えＣＲＭ１９７の産生を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
ジフテリア毒素（ＤＴｘ）は、ジスルフィド架橋によって一緒に連結されたＡ（活性）ドメイン及びＢ（結合）ドメインを含有する、５３５個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖として合成されたコリネバクテリウムジフテリアの二成分外毒素である。この毒素は、細胞受容体（ＨＢ−ＥＧＦ受容体）に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に進入し、そこでＡドメインがンパク質分解切断によりＢドメインから解放される。次に、Ａドメインは、Ｂドメインによって作られた細孔を通してエンドソームを退出して、細胞質に進入し、そこでそれはタンパク質合成を阻害して最終的に細胞死をもたらす。
【０００４】
ＣＲＭ１９７は、タンパク質を酵素的に不活性かつ非毒性にする、グリシンに対するグルタミン酸の単一アミノ酸置換（Ｇ５２Ｅ）を含有するＤｔｘの突然変異型である。ＣＲＭ１９７は、被包性細菌に対する共役ワクチンの理想的な担体であることが分かっている。共役ワクチンは、免疫原性が乏しく、Ｔ細胞非依存性莢膜多糖類に共有結合的に連結し、よって、高度に免疫原性であり、抗原（複数可）に対して長期間持続する免疫をもたらす共役抗原を作り出すＣＲＭ１９７を含む。
【０００５】
担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含有するワクチンは、数百万人の小児を免疫するために成功裏に使用されており、これにはＭｅｎｖｅｏ（登録商標）（髄膜炎菌の血清群Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙに対する４価の共役ワクチン）、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（登録商標）及びＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（登録商標）（髄膜炎菌の血清型Ｃに対する）、Ｖａｘｅｍ−Ｈｉｂ（登録商標）及びＨｉｂＴＩＴＥＲ（登録商標）（Ｂ型インフルエンザ菌Ｈｉｂに対する）、ならびに多価の肺炎球菌共役体Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）が含まれる。
【０００６】
破傷風及びジフテリア毒素とは対照的に、ＣＲＭ１９７は、化学的解毒を必要とせず、したがって、均質に精製され、共役に直接使用することができる。ＣＲＭ１９７は、現在、βファージの多重溶原菌から発現されるコリネバクテリウムジフテリアＣ７、またはシュードモナスフルオレッセンスのプラスミド系からのいずれかの発酵によって製造される。ＣＲＭ１９７の収量（Ｃ．ジフテリア発酵中に培地中に放出される）は低く、数十ｍｇ／Ｌ〜約２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、バイオセーフティーレベル２の施設を必要とし、１ミリグラムのＣＲＭ１９７当たり約＄５００（米ドル）の小売価格となる。単回投与ワクチンは、典型的には、約１０及び６０μｇのＣＲＭ１９７を含有し、１憶５千万を超える投与が毎年使用される。現在の共役ＣＲＭ１９７ワクチンの需要は供給を上回り、発展途上国におけるワクチンプログラムの開始が遅れ、数百万人の小児の健康が危険に曝されている。
【０００７】
さらに、一部の癌において高度に発現されるヘパリン結合上皮増殖因子（ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦ）の可溶性形態に結合するＣＲＭ１９７の能力に基づき、卵巣癌などの癌治療におけるＣＲＭ１９７の治療上の使用の可能性が最近報告された。この治療可能性の研究開発は、さらに多くの株を現在の産生方法に位置付ける。
【０００８】
ＣＲＭ１９７の高価格及び供給不足に寄与する唯一の最大要因は、産生に主要な大腸菌において多量のＣＲＭ１９７を生成する能力が歴史的にないことである。ＣＲＭ１９７の不溶性形態は大腸菌において比較的中程度の収量まで発酵させることができるが、不溶性産物の一部のみしか可溶性形態に変換することができない（Ｓｔｅｆａｎら、２０１１）。大腸菌において多量の可溶性ＣＲＭ１９７を産生することは、さらにより困難となっている。治療に使用するための多量のＣＲＭ１９７を確実かつ安価に産生するための方法は、当該技術分野において大幅な進歩となるだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、大腸菌宿主細胞において組換えＣＲＭ１９７タンパク質を産生するための方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、減少ゲノム大腸菌をインキュベートすることを含む。ＢＬ２１などの野生型大腸菌株における産生と比較した、ＣＲＭ１９７の収量における大幅な増加は、本発明による減少ゲノム大腸菌宿主細胞において達成される。ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは、大腸菌宿主細胞における発現をコドン最適化する。好ましい実施形態では、天然の親大腸菌株は、Ｋ１２株である。別の実施形態では、本方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結されたＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む天然のＫ１２株大腸菌をインキュベートすることを含む。
【００１０】
一態様では、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌宿主細胞（好ましくは減少ゲノム大腸菌宿主細胞）の周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するシグナル配列をコードする核酸配列に融合され、それにより、１リットル当たり約１グラム〜１リットル当たり約１０グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が達成される。本発明のこの態様によると、大腸菌宿主（好ましくは減少ゲノム大腸菌宿主）は、大腸菌周辺質へのＣＲＭ１９７の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする５’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠くＣＲＭ１９７タンパク質をコードする３’ＣＲＭ１９７部分とを含む核酸配列を含む、発現ベクターを含む。好ましくは、ＣＲＭ１９７の発現は誘導性であり、本方法は、（ａ）大腸菌（好ましくは減少ゲノム大腸菌）を成長させる工程と、（ｂ）ＣＲＭ１９７の発現を誘導する工程とを含む。好ましくは、本方法は、発酵装置内で実行される。
【００１１】
関連した態様では、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞は、タンパク質コード配列に動作可能に連結された誘導性プロモーター（例えば、ｌａｃ誘導体プロモーター）を含む発現ベクターで形質転換され、ＣＲＭ１９７の発現は好適な量の誘導剤（例えば、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））の添加によって誘導される。好ましくは、振盪フラスコ条件下で、誘導は、約０．１〜約１．５（より好ましくは約０．２〜約０．９、さらにより好ましくは約０．３〜約０．６）の、６００ｎｍ（その波長で、１光学密度（ＯＤ）単位は約０．８×１０９細胞／ｍｌに相当する）での光学密度で生じる。発酵条件下で、誘導は、好ましくは、約１００〜４００、より好ましくは約１５０〜３００、最も好ましくは２００〜２７５（例えば、２３０〜２５０）のＯＤ６００で生じる。他の関連した態様では、成長及び／または誘導中の培養物のｐＨは、約６．５〜約７．５であり、成長及び／または誘導温度は、約２０℃〜約３０℃（好ましくは約２５℃）であり、成長培地は、血清、酵母抽出物、及び動物由来の副産物を含まない。特に好ましい実施形態では、（例えば減少ゲノム）大腸菌を成長させることは、３７℃で比較的短い初期インキュベーション（例えば、１〜３時間）を行い、続いて誘導前及び後に２０℃〜３０℃で（好ましくは約２５℃で）成長させることを含むか、あるいは誘導前及び後に２０℃〜３０℃で（好ましくは約２５℃で）連続成長させることを含む。
【００１２】
関連した実施形態では、得られた可溶性ＣＲＭ１９７の収量は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約．７ｇ／Ｌ、少なくとも約１．０ｇ／Ｌ、少なくとも約１．３ｇ／Ｌ、少なくとも約１．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１．７ｇ／Ｌ、少なくとも約２．０ｇ／Ｌ、少なくとも約２．３ｇ／Ｌ、少なくとも約２．５ｇ／Ｌ、少なくとも約２．７ｇ／Ｌ、少なくとも約３．０ｇ／Ｌ、少なくとも約３．５ｇ／Ｌ、少なくとも約３．７ｇ／Ｌ、少なくとも約４．０ｇ／Ｌ、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約５．５ｇ／Ｌ、少なくとも約６．０ｇ／Ｌ、少なくとも約７．０ｇ／Ｌ、少なくとも約８．０ｇ／Ｌ、少なくとも約９．０ｇ／Ｌ、または少なくとも約１０．０ｇ／Ｌである。他の実施形態では、得られた可溶性ＣＲＭ１９７の収量は、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌ、または約１．０ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌである。他の実施形態では、得られた可溶性ＣＲＭ１９７の収量は、約２．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌ、または約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌである。他の実施形態では、得られた可溶性ＣＲＭ１９７の収量は、約３．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約９．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約８．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約７．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約６．０ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌ、または約３．０ｇ／Ｌ〜約４．０ｇ／Ｌである。
【００１３】
関連した態様では、５’シグナル配列部分は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）依存性シグナル配列（ＤｓｂＡ、ＴｏｌＢ、及びＴｏｒＴ分泌シグナルなど）、Ｓｅｃ−依存性シグナル配列（ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、ＬａｍＢ、ＬｉｖＫ、及びＰｅｌＢ分泌シグナルなど）、またはツインアルギニン透過（ＴＡＴ）シグナル配列（ＴｏｒＡ及びＳｕｆｌ分泌シグナルなど）をコードする。一部の実施形態では、５’シグナル配列部分は、Ｓｅｃ−依存性シグナル配列、好ましくはＯｍｐＡまたはＯｍｐＦ分泌シグナルをコードする。特に好ましい実施形態では、５’シグナル配列部分は、ｏｍｐＦ分泌シグナルをコードする。
【００１４】
他の好ましい実施形態では、５’シグナル配列部分は、ＭｇｌＢ、ＭａｌＥ、ＯｐｐＡ、ＲｂｓＢ、Ａｇｐ、ＦｋｐＡ、ＹｔｆＱ、ＨｄｅＡ、ＨｄｅＢ、ＯｍｐＣ、及びＧｌｎＨ分泌シグナルから選択されるシグナル配列をコードする。特に好ましい実施形態では、５’シグナル配列部分は、ＹｔｆＱ分泌シグナルをコードする。
【００１５】
別の関連した態様では、大腸菌宿主細胞は、発現制御配列に動作可能に連結された、周辺質におけるＣＲＭ１９７の移行及び／または折り畳みを補助するための１つ以上のタンパク質をコードする配列を含む１つ以上の核酸をさらに含む。周辺質におけるＣＲＭ１９７の移行及び／または折り畳みを補助するための１つ以上のタンパク質をコードする配列を含む核酸（複数可）は、ＣＲＭ１９７をコードするヌクレオチド配列を含む同じ発現ベクターの一部であるか、または異なる発現ベクターに位置し得る。ＣＲＭ１９７の移行及び／または折り畳みを補助するためのタンパク質は、限定されないが、シャペロン（Ｓｋｐ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＣａｆｌＭ、及びＣａｆｌＡなど）、ジスルフィド結合形成タンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤなど）、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰｐｉＡ、ＰｐｉＤ、ＦｋｐＡ、及びＳｕｒＡなど）、可溶性パートナータンパク質（ＭＢＰ、ＧＳＴ、及びチオレドキシンなど）、分泌経路タンパク質（ＹｅｂＦ、ＭａｌＥ、ＨｌｙＡ、Ｈｉｒｕｄｉｎ、ＯｍｐＦ、及びＳｐｙなど）、プロテアーゼ阻害剤（ＹｃｃＡなど）、及び搬出飽和を緩和するタンパク質（ＰｓｐＡなど）を含む。
【００１６】
別の実施形態では、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、シグナル配列に融合されず、それにより、１リットル当たり約２グラム〜１リットル当たり約２５グラムの不溶性ＣＲＭ１９７の収量が達成される。本発明のこの態様によると、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主は、その天然のシグナル配列を欠き、それにより、ＣＲＭ１９７タンパク質が大腸菌宿主の細胞質において発現される、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
【００１７】
いくつかの態様では、本発明は、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞において組換えＣＲＭ１９７タンパク質を産生するための方法に関し、本方法は、周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクター内に連結すること、発現ベクターで大腸菌宿主細胞を形質転換すること、及び形質転換した大腸菌宿主細胞を、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な培養培地中で培養することを含み（可溶性ＣＲＭ１９７の収量は約１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは約２〜１０ｇ／Ｌである）、培養物から大腸菌細胞を採取し、洗剤の不在下で機械的方法により採取した細胞を溶解することをさらに含む。任意に、本方法は、得られた溶解物の可溶性画分を得ること（例えば、遠心分離して、可溶性と不溶性画分を分離することにより）、及び可溶性画分（大腸菌宿主によって産生された可溶性ＣＲＭ１９７を含む）を１つ以上の精製工程に供することをさらに含む。一実施形態では、可溶性ＣＲＭ１９７は、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーに供される。好ましい実施形態では、大腸菌宿主細胞は、減少ゲノム大腸菌宿主細胞である。
【００１８】
他の態様では、本発明は、発現ベクターを含む（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞に関し、該発現ベクターは、大腸菌周辺質へのＣＲＭ１９７の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする５’シグナル配列部分と、発現制御配列に動作可能に連結された、その天然のシグナル配列を欠くＣＲＭ１９７タンパク質をコードする３’ＣＲＭ１９７部分とを含む、核酸配列を含む核酸配列を含む。好ましい実施形態では、大腸菌宿主細胞は、少なくとも減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２株から欠失される遺伝子を欠くか、または少なくとも減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９株から欠失される遺伝子を欠く減少ゲノム大腸菌宿主細胞である。
【００１９】
本発明のこれら及び他の実施形態は、本明細書において以下により詳細に記載される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
減少ゲノム大腸菌宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法であって、前記組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するシグナル配列に融合された、前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、前記天然の親大腸菌株が、Ｋ１２株、好ましくはＫ１２  ＭＧ１６５５である、前記方法。
（項目２）
１リットル当たり少なくとも２グラム、１リットル当たり少なくとも３グラム、１リットル当たり少なくとも４グラム、または１リットル当たり少なくとも５グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３）
前記シグナル配列が、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、ＭａｌＥ、ＯｐｐＡ、ＲｂｓＢ、Ａｇｐ、ＦｋｐＡ、ＹｔｆＱ、ＨｄｅＡ、ＨｄｅＢ、ＯｍｐＣ、及びＧｌｎＨシグナル配列からなる群から選択される、項目２に記載の前記方法。
（項目４）
前記シグナル配列が、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱである、項目３に記載の前記方法。
（項目５）
前記シグナル配列が、ＹｔｆＱである、項目４に記載の前記方法。
（項目６）
前記減少ゲノム大腸菌が、大腸菌株ＭＧ１６５５より約２％〜約４０％小さい、好ましくは約５％〜約３０％小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目７）
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、−ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５を欠失している、項目６に記載の前記方法。
（項目８）
前記減少ゲノム大腸菌が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、項目７に記載の前記方法。
（項目９）
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ４２株である、項目７に記載の前記方法。
（項目１０）
前記減少ゲノム大腸菌が、ＭＤＳ６９株である、項目８に記載の前記方法。
（項目１１）
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｒｅｃＡ（ｂ２６９９）遺伝子を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１２）
前記減少ゲノム大腸菌が、ｒｅｌＡ遺伝子であって、前記ｒｅｌＡ遺伝子のコード配列の５４７または５４８位に少なくとも１つの点突然変異を有するｒｅｌＡ遺伝子を含み、前記突然変異が、５４７位でのＧ→Ａ突然変異、５４７位でのＧ→Ｔ突然変異、５４８位でのＣ→Ｇ突然変異、または５４８位でのＣ→Ｔ突然変異のうちの１つ以上から選択される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１３）
前記減少ゲノム大腸菌が、機能ｐｏｌＢ（ｂ００６０）、ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、及び任意にｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４）遺伝子を欠く、項目１〜１２のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１４）
前記減少ゲノム大腸菌が、以下の修飾：（ｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１５）
前記減少ゲノム大腸菌が、挿入配列を含まない、項目１〜１４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１６）
前記ＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列が、前記大腸菌宿主細胞における発現のために最適化される、項目１〜１５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１７）
（ａ）前記減少ゲノム大腸菌を成長させることと、
（ｂ）ＣＲＭ１９７の発現を誘導することと、を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目１８）
前記方法が、発酵装置内で実行される、項目１７に記載の前記方法。
（項目１９）
工程（ａ）が、前記減少ゲノム大腸菌を３７℃で最大１９時間成長させ、続いて工程（ｂ）の前及び後で、約２０〜３０℃、好ましくは約２５℃で成長させることを含む、項目１７または１８に記載の前記方法。
（項目２０）
工程（ａ）及び（ｂ）が、血清、酵母抽出物、または他の動物由来の副産物を含まない成長培地中で行われる、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２１）
工程（ａ）において、ｐＨが、６．５〜７．５の範囲である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２２）
前記ｐＨが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、またはヒスチジン緩衝液を用いて維持される、項目１７〜２１のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２３）
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、項目２２に記載の前記方法。
（項目２４）
発現が、工程（ｂ）において、好適な量のＩＰＴＧを添加することによって誘導される、項目１７〜２３のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２５）
発現が、１００〜４００、好ましくは２００〜２７５、より好ましくは２３０〜２５０のＯＤ６００で誘導される、項目１８〜２４のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２６）
前記発酵装置が、０．５〜５０，０００リットルの培養物を含む、項目１８〜２５のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２７）
（ｃ）洗剤の不在下で、前記培養した減少ゲノム大腸菌細胞を機械的に破砕し、前記得られた細胞溶解物を遠心分離して、可溶性画分を得る、さらなる工程を含む、項目１７〜２６のいずれか一項に記載の前記方法。
（項目２８）
前記機械的破砕が、超音波処理または微細流動化を含む、項目２７に記載の前記方法。
（項目２９）
ＣＲＭ１９７が、１つ以上の精製工程により、前記可溶性画分から精製される、項目２７または２８に記載の前記方法。
（項目３０）
前記１つ以上の精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目２９に記載の前記方法。
（項目３１）
前記精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、項目３０に記載の前記方法。
（項目３２）
ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合されず、それにより、１リットル当たり約２グラム〜１リットル当たり約２０グラムの不溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３３）
前記不溶性ＣＲＭ１９７が、１つ以上の可溶化工程に供される、項目３２に記載の前記方法。
（項目３４）
ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ｏｍｐＦまたはｙｔｆＱシグナル配列に融合され、前記減少ゲノム大腸菌宿主が、次の修飾：（ｉ）前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５の欠失、（ｉｉ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するための、ｉｌｖＧ遺伝子における天然−２フレームシフト突然変異を補完する突然変異の導入、ならびに（ｉｖ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含み、
それにより、１リットル当たり少なくとも１グラム、好ましくは１リットル当たり少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量が得られる、項目１に記載の前記方法。
（項目３５）
前記減少ゲノム大腸菌宿主が、そこから、前記大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２をさらに欠失している、項目３４に記載の前記方法。
（項目３６）
発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌宿主であって、前記発現ベクターが、前記大腸菌周辺質へのＣＲＭ１９７の輸送を指向することが可能なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする５’シグナル配列部分と、その天然のシグナル配列を欠く前記ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする３’ＣＲＭ１９７部分と、を含む核酸配列を含む、前記減少ゲノム大腸菌宿主。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣＲＭ１９７の不溶性形態の検査を目的とした実験に使用されたＣＲＭ１９７配列におけるヘアピン構造の解放をもたらすＤＮＡ配列の変化を示す。最適化した配列（Ｂ）は、より高い最小エネルギー（本来の配列の−４．２７と比較して、最適化した配列は−１．６８）を生成し、二次構造をほどき、本来の配列に対して開始部位（ＡＴＧ）とリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の両方の認識を強化する。
【図２】減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２  ｒｅｃＡ株（ｒｅｃＡ欠失を有するＭＤＳ４２株）におけるＣＲＭ１９７のサイトゾル発現を示す。振盪フラスコ培養物を、最小培地中で０．５の光学密度（ＯＤ）まで成長させ、次に、示されるように、０または２５０μＭのいずれかのＩＰＴＧで誘導された。電気泳動は４〜１２％勾配アクリルアミドビス−トリスゲルを用い、続いてＧｅｌＣｏｄｅ染色試薬を用いてタンパク質染色を行った。１レーンにつき、０．０４ＯＤの材料を充填した。Ｍ＝マーカーレーン、Ｔ＝全細胞タンパク質、Ｓ＝可溶性画分、Ｉ＝不溶性画分。多量のサイトゾルＣＲＭ１９７が不溶性画分（矢印）中に存在し、不溶性ＣＲＭ１９７の産生における構築物及び株の強固な性質を確認した。
【図３】減少ゲノムＭＤＳ４２ｒｅｃＡ株におけるＣＲＭ１９７の周辺質送達に関して検査されたシグナル配列を示す。上のパネル（Ａ）は、コドン最適化したＣＲＭ１９７配列の５’端に融合された異種シグナル配列の図である。下の左側のパネル（Ｂ）は、３つの大腸菌分泌経路を代表するシグナル配列を図示する。下の右側のパネル（Ｃ）は、周辺質におけるＣＲＭ１９７の移行及び／または折り畳みを補助するそれらの能力を試験するために、ＣＲＭ１９７と同時発現されたタンパク質を図示する。
【図４】ＯｍｐＡ及びＯｍｐＦシグナル配列を用いた、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡにおけるＣＲＭ１９７発現のタンパク質ゲル分析を示す。シャペロンとしてΔａａ１−５  ＹｃｃＡ（ＯｍｐＡ＋ＣＲＭ１９７＋／−ＹｃｃＡ）またはΔａａ１−５  ＹｃｃＡ（ＯｍｐＦ＋ＣＲＭ１９７＋／−ＹｃｃＡ）のいずれかを用いた、２５℃での早期（パネルＡ及びＣ；０．０１のＯＤ６００で誘導剤を添加）及び後期（パネルＢ及びＤ；約０．４のＯＤ６００で誘導剤を添加）誘導。矢印は、各誘導剤シリーズにおけるＣＲＭ１９７の最高レベルを示す。ＣＲＭ１９７の真下に移行する内因性大腸菌タンパク質に留意されたい。ゲル方法は、図２に関して記載される通りであった。周辺質試料は、周辺質化緩衝液（Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の補助により調製された。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で１０分間、７，５００×ｇで遠心分離することにより、２ＯＤ試料を採取した。上清を除去し、細胞ペレットを５０μｌの周辺質化緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び３０Ｕ／μｌのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム）に穏やかに再懸濁した。室温で５分後、５０μｌの氷冷水を迅速に再懸濁ペレットに添加した。混合物を、１５分間、４，０００×ｇで遠心分離することにより、スフェロプラストから周辺質画分を分取する前に氷上で５分間インキュベートした。周辺質画分を代表する上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。０．１２ＯＤ単位と等しい量を充填した。
【図５】ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ宿主細胞におけるＣＲＭ１９７発現に対する、炭素源としてグルコースまたはグリセロールを使用する作用を比較する。パネルＡは、全細胞タンパク質（１レーンにつき、０．０４ＯＤを充填）を示す。パネルＡは、単離した周辺質タンパク質（１レーンにつき、０．１２ＯＤを充填）を示す。高濃度のＣＲＭ１９７がグルコース補足した培地において生成されたことに留意されたい。「４２のみ」と表示されるレーンは、発現ベクターを含まない（即ち、ＣＲＭ１９７を発現しない）ＭＤＳ４２ｒｅｃＡを用いた対照レーンである。
【図６】ＭＤＳ４２プラットホーム上に構築された４つの株と、ＭＤＳ６９プラットホーム上に構築された４つの株とを含むｏｍｐＡシグナル配列に融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現ベクターを保有する、８つの減少ゲノム大腸菌株におけるＣＲＭ１９７発現のタンパク質ゲル分析を示す。試験したＭＤＳ４２株は、（ｉ）ＭＤＳ４２、（ｉｉ）ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、（ｉｉｉ）ＭＤＳ４２  ｍｅｔａｂ（ｒｐｈ及びｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正ならびにｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含むＭＤＳ４２株）、及び（ｉｖ）ＭＤＳ４２  Ｂｌｏｎ  ｍｅｔａｂ（ＩＳ挿入が祖先大腸菌ｌｏｎプロモーターの−１０領域から−３５領域を分離するＢ株大腸菌のｌｏｎプロモーター領域の配列を摸倣するための、Ｌｏｎプロテアーゼ（ｂ０４３９）プロモーター領域の修飾をさらに含むＭＤＳ４２  ｍｅｔａｂ）である。試験したＭＤＳ６９株は、（ｉ）ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ（ｒｐｈ及びｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正ならびにｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子の欠失を含むＭＤＳ６９株）、（ｉｉ）ＭＤＳ６９  Ｂｌｏｎ  ｍｅｔａｂ（上述のＬｏｎプロテアーゼプロモーター修飾をさらに含むＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ）、（ｉｉｉ）ＭＤＳ６９  ｌｐｐ  ｍｅｔａｂ（ｌｐｐ遺伝子の欠失をさらに含むＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ（ＭＧ１６５５のヌクレオチド１７５５２６０−１７５５６８７）、及び（ｉｖ）ＭＤＳ６９  Ｂｌｏｎ，ｌｐｐ  ｍｅｔａｂである。パネルＡ及びＣは、示されるＩＰＴＧ濃度で誘導した後に単離された全細胞タンパク質を示す。パネルＢ及びＤは、並行して行われた周辺質単離を示す。ゲル方法は、図２に記載される通りであった。
【図７】ＭＤＳ４２及びＭＤＳ６９プロテアーゼ株におけるＣＲＭ１９７発現のタンパク質ゲル分析を示す。パネルＡ及びＣは、示されるＩＰＴＧ濃度で誘導した後に単離された全細胞タンパク質を示す。パネルＢ及びＤは、並行して行われた周辺質単離を示す。ゲル方法は、図２に記載される通りであった。
【図８】１０リットル規模の既定最小培地中で、ＯｍｐＡシグナル配列に融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現ベクターを保有する、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２  ｍｅｔａｂ株を流加発酵した後の、発酵試料のタンパク質ゲル及びウエスタンブロットを示す。パネルＡ：全細胞タンパク質（ＴＣＰ）及び周辺質（Ｐｅｒｉ）調製物を、示される発酵ＯＤで回収した。ＩＰＴＧは、ＯＤ＝２００で添加された。パネルＢ：抗ジフテリア毒素抗体を用いたウエスタンブロットは、ＣＲＭ１９７を決定的に特定するために使用された。ＣＲＭ１９７は誘導前に発現されなかったことに留意されたい。ＳＦＣ＝振盪フラスコ対照である。ＴＣＰ及びＰｅｒｉ試料のレーンにつき、それぞれ、０．０４及び０．１２ＯＤが充填された。ゲル方法は、図２に記載される通りであった。
【図９】（ｉ）ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ株におけるＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７の発現後の、従来の洗剤系緩衝液を用いて単離された全細胞タンパク質（ＴＣＰ）（パネルＡ及びパネルＢの左側３つのレーン）、及び（ｉｉ）周辺質タンパク質調製物（パネルＢの右側３つのレーン）のタンパク質ゲルを示す。パネルＡ：全細胞タンパク質の試料（左側）は、高速（２１ｋｇ）で１０分間遠心分離され、次いで再分析された（右側）。ＣＲＭ１９７は、可溶性画分には見られなかった。パネルＢ：全細胞タンパク質（ＴＣＰ）及び周辺質画分の高速遠心分離は、ＣＲＭ１９７が洗剤に曝露された細胞質画分において不溶性であり（左側）、洗剤に曝露されなかった周辺質画分において可溶性である（右側）ことを示す。ゲル方法は、図２に記載される通りであった。矢印は、可溶性画分において現れなかったＴＣＰ中のＣＲＭ１９７を示す。
【図１０】洗剤及び機械的溶解のタンパク質ゲルならびにＣＲＭ１９７溶解度を示す。ＣＲＭ１９７に融合されたｏｍｐＡをコードする発現ベクターを保有するＭＤＳ４２ｒｅｃＡ細胞は、図８に関して記載されるように流加発酵に供された。溶解剤の存在下で、（Ａ）洗剤（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）、細胞膜を破砕する非イオン性洗剤の専有混合物）または（Ｂ）機械的（超音波処理）溶解のいずれかを用いて、細胞を溶解した。洗剤の不在下での溶解が高レベルの可溶性ＣＲＭ１９７をもたらしたことに留意されたい。ＧＳＨ：ＧＳＳＧ＝グルタチオンの酸化比に還元、Ｍ＝マーカー、Ｓｏｌ＝可溶性画分、ＴＣＰ＝全細胞タンパク質。誘導剤（ＩＰＴＧ）＝３５μＭ。
【図１１】ＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７をコードする発現ベクターを保有するＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ宿主細胞の発酵を示すグラフである。ＣＲＭ１９７は、流加発酵において、１．９５ｇ／Ｌの最大収量が達成された最大３０時間点まで増加することが分かった。
【図１２】発酵試料において多量の可溶性ＣＲＭ１９７を示す図１１の発酵からのタンパク質ゲルを示す。ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株は、炭素源としてグルコースを有する最小培地中で流加発酵に供された。誘導剤の添加前（２２時間）、または２８もしくは２９時間のいずれかで回収した試料は音波処理によって均質化され、異なる細胞画分が単離された。ＣＲＭ１９７は、可溶性（Ｓｏｌ）画分において排他的に見られた。ＴＣＰ＝全細胞タンパク質、Ｉｎｓｏｌ＝不溶性画分。
【図１３】ＣＲＭ１９７の２カラム精製の結果を示す。パネルＡ：図１２に示される２８時間発酵試料の５０ＯＤは、微細流動化装置（ＭＦ）の均質化に供された。可溶性及び不溶性（ＩＳ）画分を単離し、可溶性材料（２５ＯＤ当量）をフェニルセファロースカラム上に充填した。「可溶性」と表示された３つのレーンは、それぞれ、０．１、０．０７、及び０．０４ＯＤの事前充填された可溶性試料である。ＣＲＭ１９７含有材料は、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出された。５つの２．５ｍｌの試料を連続して回収し（左から右）、丸で示される画分をプールした。主な溶出試料から精製除去され、蒸留水のみを用いた溶出後に見られた少量の未プロセスＣＲＭ１９７（矢印）に留意されたい。パネルＢ：パネルＡからプールした試料をＤＥＡＥセファロースカラム上に充填し、異なる塩濃度（０．１ＭのＮａＣｌ、続いて１ＭのＮａＣｌ、及び最後に１．５ＭのＮａＣｌ）を用いて溶出した。最高純度のＣＲＭ１９７は１ＭのＮａＣｌで溶出された。抗ジフテリア毒素抗体（１：１０００希釈）ウエスタンブロットは、並行して行われたタンパク質染色ゲルに沿って示される。Ｆ、通過画分；Ｗ、カラム洗浄；ＭＦ＝微細流動化後の総破砕物、ＩＳ＝微細流動化破砕物の遠心分離後の不溶性画分、Ｓ＝微細流動化破砕物の遠心分離後の可溶性画分。
【図１４】野生型Ｂ株ＢＬＲ（ＤＥ３）と比較した、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡにおけるＣＲＭ１９７発現のタンパク質ゲル分析。細胞を、タンパク質を周辺質に指向するｏｍｐＡ−ＣＲＭ１９７融合をコードする発現ベクターで形質転換し、振盪フラスコ中で、２５℃で１９時間成長させた。ＣＲＭ１９７の発現は、示される濃度でＩＰＴＧを添加することにより、ＯＤ＝０．３（後期段階）で誘導された。周辺質タンパク質を単離し、分析した。ＣＲＭ１９７の真下に移行する内因性大腸菌タンパク質に留意されたい。
【図１５】ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ及びＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ低突然変異速度宿主におけるｐＳＸ２−ＯｍｐＡ  ＣＲＭ１９７及びｐＳＸ２−ＯｍｐＦ  ＣＲＭ１９７発現から生成された周辺質画分のタンパク質ゲル分析。ＯｍｐＦ−ＣＲＭ１９７クローンは、同じ宿主における、及び同じ誘導条件を用いたｏｍｐＡ−ＣＲＭ１９７クローン（レーン８〜９）よりも、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａ低突然変異宿主（レーン５〜６）において多くの可溶性周辺質ＣＲＭ１９７を産生する。レーン１１〜１５は、細胞採取後の培地上清の試料を表し、これらの誘導及び成長条件下で、ほとんど、または全くＣＲＭ１９７が培地中に放出されないことを示す。
【図１６−１】ＣＲＭ１９７  ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。図１６Ａは、成熟ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｂは、細胞質における発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｃは、シグナル配列プロセシング（図１６Ａ）またはＮ末端メチオニン除去（図１６Ｂ）後に産生された成熟ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６−２】ＣＲＭ１９７  ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。図１６Ａは、成熟ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｂは、細胞質における発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｃは、シグナル配列プロセシング（図１６Ａ）またはＮ末端メチオニン除去（図１６Ｂ）後に産生された成熟ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６−３】ＣＲＭ１９７  ＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。図１６Ａは、成熟ＣＲＭ１９７タンパク質の発現及びプロセシングを周辺質空間に指向するために、シグナル配列で発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｂは、細胞質における発現に最適化されたＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＤＮＡ配列を示す。図１６Ｃは、シグナル配列プロセシング（図１６Ａ）またはＮ末端メチオニン除去（図１６Ｂ）後に産生された成熟ＣＲＭ１９７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１７】大腸菌Ｋ株及び／またはＢ株において相対的存在量に従い分類された減少ゲノムＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株におけるＣＲＭ１９７の周辺質送達に関して検査されたシグナル配列を示す。
【図１８】減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株にＯＤ約０．３で添加された２５μＭの誘導剤（ＩＰＴＧ）での、次のシグナル配列：ＯｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、及びＧｌｎＨ（誘導Ａ）ならびにＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、Ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡ、及びＹｔｆＱ（誘導Ｂ）を有する周辺質ＣＲＭ１９７のμｇ／ＯＤ（上のパネル）及びμｇ／ｍｌ（キャリパー分析）を示す。
【図１９】減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株にＯＤ約０．３で添加された３５μＭの誘導剤（ＩＰＴＧ）での、次のシグナル配列：ＯｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、及びＧｌｎＨ（誘導Ａ）ならびにＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、Ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡ、及びＹｔｆＱ（誘導Ｂ）を有する周辺質ＣＲＭ１９７のμｇ／ＯＤ（上のパネル）及びμｇ／ｍｌ（キャリパー分析）を示す。
【図２０】減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株にＯＤ約０．３で添加された５０μＭの誘導剤（ＩＰＴＧ）での、次のシグナル配列：ＯｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、及びＧｌｎＨ（誘導Ａ）ならびにＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、Ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡ、及びＹｔｆＱ（誘導Ｂ）を有する周辺質ＣＲＭ１９７のμｇ／ＯＤ（上のパネル）及びμｇ／ｍｌ（キャリパー分析）を示す。
【図２１】減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株にＯＤ約０．３で添加された、０、２５、３５、及び５０μＭの誘導剤でのＯｍｐＦシグナル配列、ならびに０、２５、３５、５０、７５、１００、１５０、及び２５０μＭの誘導剤でのＹｔｆＱシグナル配列で得られた周辺質ＣＲＭ１９７のμｇ／ＯＤ（上のパネル）及びμｇ／ｍｌ（キャリパー分析）を比較する。結果は、２セットの実験の平均である。
【図２２】ＯＤ＝０．３（後期段階）で添加された５０μＭ（ＯｍｐＦ）または５０、７５、１００、１５０、２５０μＭ（ＹｔｆＱ）の誘導剤濃度での、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列を有するＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂの周辺質（Ｐ）及び培地（Ｍ）におけるＣＲＭ１９７収量を比較するタンパク質ゲル分析である。試料は、分析用に指定されたＯＤで回収された。
【図２３】示される誘導剤濃度での、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列を有するＭＤＳ  ｍｅｔａｂ細胞における、及びｏｍｐＦシグナル配列を有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞におけるＣＲＭ１９７の周辺質発現を比較する。誘導剤はＯＤ約２（非常に後期の誘導）で添加され、試料はキャリパーによって分析された。（可溶性）周辺質ＣＲＭ１９７のｇ／Ｌ（ＯＤ６００＝２５０に外挿）は、誘導剤の各濃度で示される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、様々な形態で具体化されることが可能であるが、いくつかの実施形態の以下の説明は、本開示が本発明の例示として考えられ、本発明を図示される特定の実施形態に限定することが意図されないという理解によりなされる。見出しは単に便宜上のために提供され、いかなる方法でも本発明を制限するものと解釈されない。任意の見出し下に図示される実施形態は、任意の他の見出し下に図示される実施形態と組み合わせることができる。
【００２２】
別途明示的に示されない限り、本出願に指定される様々な範囲においおける数値の使用は、近似として記述されるが、記述される範囲内の最小値と最大値は両方とも、用語「約」が先行する。このように、記述される範囲を上回る及び下回るわずかな変動は、範囲内の値と実質的に同じ結果を達成するために使用され得る。本明細書で使用される、用語「約」及び「およそ」とは、数値を指す場合、問題の関連技術の者に明白かつ一般的な意味を有するものとする。また、範囲の開示は、列記される最小値と最大値の間の各値、ならびにそのような値によって形成され得る任意の範囲を含む連続する範囲として意図される。これは、有限の上限及び／または下限を含むまたは含まない、形成され得る範囲を含む。これは、所与の開示される数字を別の開示される数字に分けることにより導出可能である比率も含む。したがって、当業者は、多くのそのような比率、範囲、及び比率の範囲が本明細書に提示されるデータ及び数字から明白に導かれ得、全てが本発明の様々な実施形態を表すことを理解するだろう。
【００２３】
本明細書で使用される「減少ゲノム」細菌は、そのゲノム（例えば、タンパク質コード遺伝子）の約１％〜約７５％が欠失した、例えば、ゲノムの約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実践に使用される減少ゲノム細菌は、好ましくは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも２パーセント（２％）及び最大２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する。好ましくは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも５パーセント（５％）及び最大３０パーセント（３０％）小さい。より好ましくは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも８パーセント（８％）〜１４パーセント（１４％）〜２０パーセント（２０％）（その間の任意の数を含む）小さい。あるいは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満小さいように操作され得る。用語「天然の親株」とは、株系の基礎を表すと科学会により一般的に理解される自然界または天然の環境に見られ、より小さいゲノムを有する細菌株を生成するためにそのゲノム上で一連の欠失を行うことができる細菌株を意味する。天然の親株は、操作された株が比較される株も指し、操作された株は、天然の親株の完全補体未満を有する。ゲノムが一連の欠失後に小さくなったパーセンテージは、「全ての欠失後の欠失された塩基対の総数」を「全ての欠失前のゲノムにおける塩基対の総数」で除し、１００を乗じることにより計算される。同様に、ゲノムが天然の親株より小さいパーセンテージは、より小さいゲノムを有する株（それが産生されたプロセスに関わらず）におけるヌクレオチドの総数を天然の親株におけるヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。
【００２４】
一実施形態では、「減少ゲノム」細菌は、上記のゲノム量の除去が最小培地上で成長する生物の能力に許容できないほど影響を及ぼさない細菌を意味する。２つ以上の遺伝子の除去が本文脈において最小培地上で成長する生物の能力に「許容できないほど影響を及ぼす」かは、特定の用途に依存する。例えば、増殖における３０％の減少は、一用途では許容可能であるが、別の用途では許容可能ではない場合がある。加えて、ＤＮＡ配列をゲノムから欠失する有害作用は、培養条件を変更するなどの手段により減少される場合がある。そのような手段は、さもなければ許容できない有害作用を許容可能なものに変える場合がある。一実施形態では、増殖速度は、親株とほぼ同じである。しかしながら、親株よりも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％〜約５０％低い範囲の増殖速度は、本発明の範囲内である。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約１５分〜約３時間の範囲であってよい。好適な減少ゲノム細菌の非限定的な例ならびにＤＮＡを大腸菌などの細菌から欠失するための方法は、米国特許第６，９８９，２６５号、同第７，３０３，９０６号、同第８，１１９，３６５号、同第８，０３９，２４３号、及び同第８，１７８，３３９号に開示されており、その各々は、本明細書において参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「ｂ番号」は、Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１４５３−１４７４（１９９７）に記載されるように、Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の各遺伝子に割り付けられる固有のＩＤを指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「ＣＲＭ１９７」は、交差反応材料１９７（ＣＲＭ１９７）である、ＣＲＭ１９７においてグリシン（野生型毒素において５２位）のグルタミン酸での置換をもたらす単一Ｇ→Ａ遷移を有するジフテリア毒素突然変異型を指す。このミスセンス突然変異は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性の損失に関与する。例えば、Ｇｉａｎｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２（１０）：４０６３−４０６９（１９８４）を参照されたい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、減少ゲノム大腸菌宿主細胞において組換えＣＲＭ１９７タンパク質を産生するための方法が提供される。例えば、野生型大腸菌宿主株と比較して、意外にも高収量の組換えＣＲＭ１９７が減少ゲノム大腸菌宿主株を使用した不溶性または可能性形態において産生され得ることが分かった。一態様では、本方法は、宿主細胞の細胞質において、不溶性ＣＲＭ１９７の増加した産生をもたらす。他の態様では、本方法は、宿主細胞の周辺質において、可溶性ＣＲＭ１９７の増加した産生をもたらす。好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌宿主細胞を作製するために使用される天然の親大腸菌株は、Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株などのＫ−１２株である。
【００２８】
一部の実施形態では、Ｋ−１２  ＭＧ１６５５などの天然のＫ−１２株は、本明細書に記載される方法による組換えＣＲＭ１９７を産生するために使用される。
【００２９】
本発明に従って使用するためのＣＲＭ１９７のヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。例えば、ＣＲＭ１９７は、化学的に合成されるか、またはコーニーバクテリオファージ（ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）βによって保有されるジフテリア毒素の野生型構造遺伝子の既知のヌクレオチド配列に基づく部位特異的突然変異誘発により調製され得る（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，８０：６９５３−６９５７（１９９３））。好ましくは、ＣＲＭ１９７のヌクレオチド配列は、大腸菌における発現に最適化される。
【００３０】
異種核酸の様々な配列特徴は最適化され得、翻訳開始領域の修飾、ｍＲＮＡ構造要素の変更、及び異なるコドンバイアスの使用を含むが、これらに限定されない。大腸菌宿主細胞における発現を改善するために核酸配列を最適化するための方法は、当該技術分野において既知であり、米国特許第７，５６１，９７２号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、大腸菌における発現のための、ＣＲＭ１９７のヌクレオチド配列の最適化は、少なくともコドン最適化を含む。大腸菌においてほとんど使用されない異種核酸配列におけるコドンの存在は、コードされるタンパク質の翻訳を遅らせ、大腸菌宿主細胞において発現の減少をもたらし得る。よって、一態様では、大腸菌における一般的なコドン使用は、大腸菌におけるＣＲＭ１９７の発現を最適化するために使用される。大腸菌における発現のためのＣＲＭ１９７の最適化は、好ましくは、二次構造の干渉を最小に抑えることも含む。二次構造の干渉は、転写及び翻訳を妨害することにより、大腸菌における異種タンパク質の発現の減少をもたらし得る。例えば、開始部位でのｍＲＮＡ二次構造は、翻訳効率と逆相関している。大腸菌の周辺質における発現に最適化された例示的なＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードする上流領域に付加されるとき、配列番号１として提供される（図１６Ａ）。大腸菌の細胞質における発現に最適化された例示的なＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列は、上流のＡＴＧ開始コドンに付加されるとき、配列番号３として提供される（図１６Ｂ）。本発明の方法が配列番号１として記載されるＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列に限定されないことを理解する。大腸菌における発現のために異種ヌクレオチド配列を最適化するためのさらなる戦略は、当該技術分野において既知であり、上述の戦略に加えて、またはその代替えとして使用され得る。
【００３１】
発現系を含む大腸菌などの遺伝子操作された細菌宿主細胞から組換え異種タンパク質を調製するためのプロセスは、当業者に周知である。組換えＣＲＭ１９７は、これらの方法のいずれかにより、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞において発現され得る。一態様では、本方法は、発現系を含む減少ゲノム大腸菌宿主細胞に関し、該発現系は、プロモーターが誘導されるときにＣＲＭ１９７が宿主細胞において発現されるように、誘導性プロモーターに動作可能に連結されたＣＲＭ１９７をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様では、プロモーターは、好適な量のＩＰＴＧを添加することにより誘導される。ポリヌクレオチドの減少ゲノム大腸菌宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、微量注入法、電気穿孔、接合、感染などを含むがこれらに限定されない、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されるものなどのいくつかの標準的な分子生物学技術のいずれかにより達成され得る。同様に、宿主において、ポリヌクレオチドを維持、伝播、もしくは発現する、及び／またはポリペプチドを発現するのに好適な任意の系またはベクターは、本発明を実践するために使用することができる。例えば、適切なＤＮＡ配列は、標準的な技術により、プラスミドなどのベクター内に挿入され得る。
【００３２】
本発明の一態様は、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞におけるＣＲＭ１９７の周辺質発現に関する。周辺質におけるタンパク質の発現は産業用途に使用され、Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３）、Ｈｏｃｋｎｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：４５６−６３２（１９９４）、及びＨａｎｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：５４−６０（１９９８）に概説されており、その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。よって、いくつかの実施形態では、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結された、シグナル配列に融合された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む（例えば、減少ゲノム）大腸菌を成長させることを含む方法が提供され、該シグナル配列は、大腸菌宿主の周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向する。これらの方法によると、意外にも高収量の無傷可溶性ＣＲＭ１９７が産生され、可溶性ＣＲＭ１９７の実質的に全てが回収され得る。
【００３３】
タンパク質上のシグナル配列の存在は、大腸菌の内膜にわたって新しく翻訳されたタンパク質の周辺質空間への輸送を促進する。次に、シグナル配列が切断され、したがって、天然のＣ．ジフテリアシグナル配列の、大腸菌の周辺質へのＣＲＭ１９７の移送を指向するシグナル配列との置換が、最終的に、同じアミノ酸配列を有する成熟タンパク質をもたらす。
【００３４】
大腸菌周辺質への異種タンパク質の指向を可能にするシグナル配列の代表的な例は以下に列記される。本発明の方法に有用なシグナル配列が以下に列記されるものに限定されないことを理解する。好ましくは、シグナル配列は、大腸菌において発現されるとき、周辺質への少なくとも７０、８０、９０、または１００％のポリペプチドの指向をもたらす。
【表１Ａ】
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【００３５】
本発明に従って使用するためのさらなるシグナル配列は、ＣｐｄＢ（３’−ヌクレオチダーゼ／２’，３’−環状ヌクレオチド２’−ホスホジエステラーゼ）、ＹｄｅＮ（推定上のスルファターゼ）、ＯｓｍＹ（高浸透圧による誘導）、ＡｒｔＩ（サブユニットアルギニンＡＢＣ輸送体）、ＧｌｔＬ（グルタミン酸塩ＡＢＣ輸送体）、及びＣｙｂＣ（シトクロームｂ５６２）を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
好ましい実施形態では、シグナル配列は、ｙｔｆＱ、ＯｍｐＡ、及びＯｍｐＦシグナル配列から選択される。特に好ましい実施形態では、シグナル配列は、ＯｍｐＦシグナル配列である。別の特に好ましい実施形態では、シグナル配列は、ＹｔｆＱシグナル配列である。
【００３７】
任意の減少ゲノム大腸菌株が本明細書に記載の方法に従い宿主細胞として使用され得る。一態様では、減少ゲノム大腸菌は、５％〜３０％または５％〜２０％など、その天然の親株のゲノムよりも少なくとも２パーセント（２％）及び最大４０パーセント（４０％）（その間の任意の数字を含む）小さいように遺伝子操作されるゲノムを有する。ゲノムが一連の欠失後に小さくなったパーセンテージは、「全ての欠失後の欠失された塩基対の総数」を「全ての欠失前の親株のゲノムにおける塩基対の総数」で除し、１００を乗じることにより計算される。別の態様では、減少ゲノム細菌は、４．４１Ｍｂ〜３．７１Ｍｂ、４．４１Ｍｂ〜３．２５Ｍｂ、または４．４１Ｍｂ〜２．７８Ｍｂのゲノムを有する。本明細書に記載の方法に従って使用するための減少ゲノム大腸菌株は、国際特許公開第ＷＯ２００３／０７０８８０号に記載の方法により、親大腸菌株の累積ゲノム欠失により産生され得る。
【００３８】
親大腸菌株は、任意の大腸菌株であってよいが、好ましくはＫ−１２株（例えば、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４７０７６）もしくはＷ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５））またはＢ株である。特に好ましい親大腸菌株は、４，６３９，６７４の塩基対を有するゲノムを有するＫ−１２  ＭＧ１６５５株（注釈版ｍ５６、ＮＣＢＩ受入番号Ｕ０００９６１）である。
【００３９】
一態様では、親大腸菌株は、米国特許第８，１７８，３３９号（参照により本明細書に組み込まれる）の表２〜２０に列記される遺伝子のうちの１つ以上を欠くＫ−１２株である。好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、少なくとも次の遺伝子（Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４５３−７４及びＧｅｎＢａｎｋ受入番号４０００９６に記述される名称に基づき「ｂ」番号で識別される）：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−ｂ４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、及びｂ４４５５を欠き、これらは、減少ゲノム（または多重欠失）ＭＤＳ３９株を作製するために、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５から欠失された遺伝子である。別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ１７８６をさらに欠き、これは減少ゲノムＭＤＳ４０株を作製するために、ＭＤＳ３９から欠失された遺伝子である。別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ０１５０−ｂ０１５３０をさらに欠き、これは、ＭＤＳ４１を作製するために、ＭＤＳ４０から欠失された遺伝子である。また別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ２９４５（ｅｎｄＡ）をさらに欠き、これは、減少ゲノムＭＤＳ４２株を作製するために、ＭＤＳ４１から欠失された遺伝子である。さらに別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、及びｂ０３４６−ｂ０３５４のうちのいずれかをさらに欠き、これは、減少ゲノムＭＤＳ４３株を作製するために、ＭＤＳ４２から欠失された遺伝子である。また別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、ｂ０５０２のうちのいずれかをさらに欠き、これは、ＭＤＳ６０を作製するために、ＭＤＳ４３から欠失された遺伝子である。また別の好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、次の遺伝子：ｂ０５６６−ｂ０５７５、ｂ２２０９、ｂ０１６０−ｂ０１６１、ｂ１４３１−ｂ１４４４、ｂ３６４３、ｂ１０３７−ｂ１０４３、ｂ０３８３、ｂ０２２６−ｂ０２３４、ｂ２１１５−ｂ２１３２のうちのいずれかをさらに欠き、これは、ＭＤＳ６９を作製するために、ＭＤＳ６０から欠失された遺伝子である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用するための減少ゲノム大腸菌Ｋ−１２株は、ＭＤＳ４１、ＭＤＳ４２、ＭＤＳ６０、またはＭＤＳ６９である。
【００４０】
本発明において使用するための大腸菌宿主細胞は、好ましくは、機能ｒｅｃＡ遺伝子（ｂ２６９９）を含むが、機能ｒｅｃＡ遺伝子（ｂ２６９９）を欠く大腸菌もＣＲＭ１９７を産生するために宿主細胞として使用され得る。例えば、ＭＤＳ４０株、ＭＤＳ４１株、ＭＤＳ４２株、またはＭＤＳ６９株などの減少ゲノム大腸菌株は、修飾された大腸菌Ｋ−１２株から遺伝子を完全にまたは部分的に欠失することによるｂ２６９９の不活性化により修飾され得る。一実施形態では、ＯｍｐＡシグナル配列に融合されたＣＲＭ１９７は、機能ｒｅｃＡ遺伝子を欠く減少ゲノム大腸菌宿主において発現される。
【００４１】
別の態様では、減少ゲノム大腸菌は、ＷＩＰＯ公開第２０１３／０５９５９５号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＶ、及びＰｏｌ  Ｖをコードする遺伝子からなる群から選択される１つ以上の非機能遺伝子を含む。一実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、非機能ＰｏｌＢ（ｂ００６０によりコードされる、大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５ゲノム上に６３４２９−６５７８０を統合する）遺伝子、及びＤｉｎＢ（ｂ０２３１によりコードされる、ＭＧ１６５５ゲノム上に２５０８９８−２５１９５３を統合する）遺伝子を有する。別の実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、非機能ＰｏｌＢ、ＤｉｎＢ、及びＵｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４によりコードされる、ＭＧ１６５５ゲノム上に１２２９９９０−１２３１６６７を統合する）遺伝子を有する。好ましくは、遺伝子（複数可）は、完全なまたは部分的な欠失により不活性にされる。例えば、ｐｏｌＢ、ｄｉｎＢ、及びｕｍｕＤＣ遺伝子は、ＭＤＳ４０株、ＭＤＳ４１株、ＭＤＳ４２株、またはＭＤＳ６９株などの減少ゲノム大腸菌株において非機能性にされ得る。
【００４２】
別の態様では、減少ゲノム大腸菌（例えば、ＭＤＳ４０株、ＭＤＳ４１株、ＭＤＳ４２株、またはＭＤＳ６９株）は、（ａ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化する、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生する、ならびに（ｃ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子産物の発現を減少させるように遺伝子修飾されている。
【００４３】
ピリミジンヌクレオチドの合成を触媒する酵素である大腸菌オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、ｐｙｒＥ遺伝子であるｂ番号ｂ３６４２によりコードされる。ｐｙｒＥ遺伝子は、上流ｒｐｈ遺伝子（ｂ３６４３）を有するオペロンに存在する。ｐｙｒＥ遺伝子は、ｒｐｈ遺伝子のコード領域における−１フレームシフト突然変異により、ＭＧ１６５５及びＷ３３１０などの大腸菌Ｋ−１２株において準最適なレベルで発現される。オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性は、ｒｐｈ−ｐｙｒＥオペロンのプロモーターをｐｙｒＥの翻訳開始部位の近くにもってくるｒｐｈコード配列を完全に除去する欠失により強化され得る。あるいは、米国特許第８，２９３，５０５号（その内容は、参照により組み込まれる）に記載される方法のいずれかが、オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化するために使用され得る。
【００４４】
大腸菌アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩは、通常、ｉｌｖＧ遺伝子によりコードされる大きいサブユニット、及びｉｌｖＭ遺伝子（ｂ３７６９）によりコードされる小さいサブユニットからなる。大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株のｉｌｖＧ配列は破壊され、実際、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ７７４８８．１に記載されるように、偽遺伝子（ｂ番号ｂ４４８８）である。ｉｌｖＧ偽遺伝子は、２つの別個のコード配列ｉｌｖＧ＿１（ｂ３７６７）及びｉｌｖＧ＿２（ｂ３７６８）から構成される。ＭＧ１６５５などのＫ−１２株におけるｉｌｖＧ偽遺伝子配列は、他の大腸菌株（例えば、Ｂ株、Ｏ株等）に見られる無傷ｉｌｖＧ遺伝子に対して、９８３位及び９８４位でのヌクレオチドＧＴの欠失を含む。これらのヌクレオチドの欠失はフレームシフト突然変異をもたらし、Ｋ−１２  ｉｌｖＧ偽遺伝子配列の９８２〜９８４位でのヌクレオチドＴＧＡは、ｉｌｖＧ＿１に相当するｉｌｖＧの切断形態をもたらす未成熟終止コドンとしての機能を果たす。よって、ｉｌｖＧの正常な遺伝子産物は発現されず、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩは大腸菌Ｋ−１２株に存在しない。減少ゲノム大腸菌は、ｉｌｖＧ遺伝子において天然−２フレームシフト突然変異を補足する突然変異の導入により、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するように修飾され得る。あるいは、減少ゲノム大腸菌は、米国特許第７，３００，７７６号（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法のいずれかにより、活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生するように修飾され得る。
【００４５】
大腸菌Ｋ株のｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子は、それぞれ、グリオキシレート短絡酵素及びアセチル−ＣｏＡシンセターゼの発現を調節する調節タンパク質をコードする隣接遺伝子である。ｉｃｌＲ（イソシトレートリアーゼ調節因子）遺伝子であるｂ番号ｂ４０１８は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４８５２４で記載される。ａｒｐＡ（アンキリン様調節タンパク質）遺伝子であるｂ番号ｂ４０１７は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４４９３３で記載される。ａｒｐＡ遺伝子は、Ｋ−１２株配列に対してＢＬ２１ＤＥ３及びＲＥＬ６０６などのＢ株のゲノム配列において部分的に欠失されることが分かった。ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子は、ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子配列の全てまたは一部の欠失により、例えば、米国特許第６，９８９，２６５号の列８行４５〜列１４行４１に記載の「傷跡のない」欠失方法により、減少ゲノム大腸菌において不活性化され得る（即ち、非機能性にされる）。
【００４６】
他の実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、米国特許第８，３６７，３８０号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の突然変異のうちのいずれかを有するｒｅｌＡ遺伝子を含む。例えば、ＭＤＳ４０株、ＭＤＳ４１株、ＭＤＳ４２株、またはＭＤＳ６９株などの減少ゲノム大腸菌株は、これらの突然変異のうちのいずれかを組み込むように修飾され得る。
【００４７】
本発明に従って使用するための減少ゲノム大腸菌は、上述の修飾のいずれの組み合わせを含み得る。一部の好ましい実施形態では、少なくともＭＤＳ４２の欠失を含む、または少なくともＭＤＳ６９の欠失を含み、（ａ）オロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を強化する、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩを産生する、ならびに（ｃ）ｉｃｌＲ及びａｒｐＡ遺伝子産物の発現を減少させるように遺伝子修飾された減少ゲノム大腸菌が、ＣＲＭ１９７の周辺質産生のための宿主として採用される。減少ゲノム大腸菌は、好ましくは、機能ｒｅｃＡ遺伝子を含む。
【００４８】
様々なタンパク質コード遺伝子が減少ゲノム細菌を形成するために欠失され得る。大腸菌及び他の細菌において、欠失され得るＤＮＡ配列の種類は、一般的に、生物または生物の遺伝子産物の安定性に悪影響を及ぼすものを含む。不安定性を生じるそのような要素は、ゲノム不安定性において役割を果たし得る転移性要素、挿入配列、及び他の「利己的ＤＮＡ」要素を含むが、これらに限定されない。例えば、挿入配列（ＩＳ）要素及びそれらの関連する転置は、時折、細菌ゲノムに見出され、よって欠失の標的である。ＩＳ配列は大腸菌において一般的であり、それらの全てが欠失され得る。本文の明確性の目的のため、我々は、無傷または不完全に関わらず、ゲノムにおいて１つの点から別の点に移動することができるＤＮＡ要素を一般的に指すために、ＩＳ要素及び転移性要素という用語を使用する。科学技術におけるＩＳ要素の有害作用の例は、それらが配列決定の伝播中に宿主大腸菌のゲノムからプラスミド内に移ることができるという事実である。この人為産物は、宿主細胞から全てのＩＳ要素を欠失させることにより防止することができる。特定の用途のため、活性及び不活性プロファージなどのゲノム不安定性に関連する他の特定の遺伝子も欠失され得る。特に好ましい実施形態では、本発明による減少ゲノム大腸菌宿主は、そこから全ての挿入配列を欠失している（即ち、挿入配列を含まない）。関連する態様では、減少ゲノム大腸菌宿主は、全てのＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ５、ＩＳ１５０、及びＩＳ１８６挿入配列を欠く。
【００４９】
本発明の減少ゲノム細菌は、例えば、限定されないが、細菌の成長及び代謝に不要なある特定の遺伝子、偽遺伝子、プロファージ、望ましくない内因性制限−修飾遺伝子、病原性遺伝子、毒素遺伝子、線毛遺伝子、周辺質タンパク質遺伝子、インベイシン遺伝子、リポ多糖体遺伝子、クラスＩＩＩ分泌系、ファージ毒性決定因子、ファージ受容体、病原性島、ＲＨＳ要素、未知の機能の配列、及び細菌の同じ天然親種の２株間で共通して見られない配列を欠くようにも操作され得る。細胞生存に必要ではない他のＤＮＡ配列も欠失または削除され得る。
【００５０】
特定の好ましい実施形態では、天然の親大腸菌Ｋ株のゲノムよりも５パーセント（５％）〜３０パーセント（３０％）小さいゲノムを有し、全ての挿入配列（ＩＳ）要素を欠く減少ゲノム大腸菌が提供される。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムマップ上のＩＳ要素の位置は、図１及び米国特許第８，１７８，３３９号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）の表２に示される。大腸菌において一般的に生じ、除去され得る挿入配列要素は、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ４、ＩＳ５、ＩＳ３０、ＩＳ１５０、ＩＳ１８６、ＩＳ６００、ＩＳ９１１、及びＩＳ１０を含むが、これらに限定されない。好ましくは、天然の親大腸菌株は、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株である。
【００５１】
別の特に好ましい実施形態では、減少ゲノム大腸菌は、次の遺伝子：ｂ００１８、ｂ０１５０、ｂ０１５２−ｂ０１５３、ｂ０１６１、ｂ０２２７、ｂ０２５０、ｂ０２９１−ｂ０２９３、ｂ０２９７、ｂ０３１６、ｂ０３２９、ｂ０３６５、ｂ０３７１、ｂ０３７６、ｂ０３８３−ｂ０３８４、ｂ０４９４、ｂ０４９７−ｂ０４９８、ｂ０５４５、ｂ０５５３、ｂ０５５９、ｂ０５６２、ｂ０５６５、ｂ０５６７、ｂ０５６９、ｂ０５７２−ｂ０５７４、ｂ０６１１、ｂ０７００、ｂ０７０４、ｂ０８３９、ｂ０９８３−ｂ０９８６、ｂ１０２３−ｂ１０２４、ｂ１０７２、ｂ１０７９−ｂ１０８０、ｂ１０８３、ｂ１０３８−ｂ１０３９、ｂ１０４１−ｂ１０４３、ｂ１３２９、ｂ１３５７、ｂ１３６９、ｂ１３７７、ｂ１３８３、ｂ１３８６、ｂ１４３５−ｂ１４３６、ｂ１４４０、ｂ１５６２、ｂ１８７８、ｂ１８８９、ｂ１９２０、ｂ１９９５、ｂ２０００、ｂ２０６２、ｂ２１２３、ｂ２１２６、ｂ２１３１−ｂ２１３２、ｂ２１９０、ｂ２２０９、ｂ２４８７、ｂ２６３７、ｂ２６４７、ｂ２９４５、ｂ３０４３、ｂ３０４６−ｂ３０４８、ｂ３２１５−ｂ３２１６、ｂ３２１９、ｂ３３２５、ｂ３３２９、ｂ３３３８、ｂ３４８２、ｂ３５７９、ｂ３５８４、ｂ３５８６、ｂ３５９３、ｂ３５９６、ｂ４０８０、ｂ４０８８、ｂ４１０５、ｂ４２８０、ｂ４２９０−ｂ４２９２、ｂ４３０９−ｂ４３１１、ｂ４３１４、ｂ４３１６−ｂ４３２０、ｂ４４１２、ｂ４４１５、ｂ４４５５、及びｂ４４８７単独またはいずれの組み合わせを含むが、これらに限定されない、１つ以上の周辺質タンパク質遺伝子の欠失（複数可）を含む。
【００５２】
本発明の別の態様では、Ｋ−１２  ＭＧ１６５５などの天然のＫ−１２株は、本明細書に記載の方法による組換えＣＲＭ１９７を産生するために使用される。
【００５３】
組換えタンパク質は、Ｓｋｐ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＣａｆｌＭ、ＣａｆｌＡ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＰｐｉＡ、ＰｐｉＤ、ＦｋｐＡ、ＳｕｒＡ、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ＹｅｂＦ、ＭａｌＥ、ＨｌｙＡ、Ｈｉｒｕｄｉｎ、ＯｍｐＦ、Ｓｐｙ、ＹｃｃＡ、及びＰｓｐＡを含むが、これらに限定されない組換えタンパク質の適切な折り畳みを提供し得るシャペロン／ジスルフィド結合形成酵素と同時発現され得る。組換えタンパク質の周辺質発現に有用なこのようなタンパク質の核酸配列は、米国特許第５，７４７，６６２号、同第５，５７８，４６４号、及び同第６，０２２，９５２号（その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
ＣＲＭ１９７をコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞（減少ゲノムまたは天然Ｋ１２株）は、任意の発酵形式で培養することができる。例えば、本明細書において、振盪フラスコ培養、バッチ、流加、半連続、及び連続発酵モードを使用することができる。本明細書で、使用される「発酵」は、文献上の発酵が採用される実施形態、及び他の非発酵性培養モードが採用される実施形態の両実施形態を含む。さらに、１リットル規模及びより大きい発酵量を含む任意の発酵規模が採用され得る。一実施形態では、発酵量は１リットルまたは少なくとも１リットルである。他の実施形態では、発酵量は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットル、５０，０００リットル以上であるか、または少なくともそれらである。
【００５５】
様々な実施形態では、発酵培地は、栄養豊富培地、最小培地、及び鉱物塩培地の中から選択され得る。好ましい実施形態では、最小培地または鉱物塩培地が選択される。培地は、好ましくは、血清及び動物由来産物を含まないか、または実質的に含まない。鉱物塩培地は、典型的には、鉱物塩及び炭素源（例えば、グルコース、スクロース、またはグリセロール）からなる。鉱物塩培地を作製するために使用される鉱物塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウムもしくは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムもしくは塩化マグネシウム、ならびに塩化カルシウム、ホウ酸塩、及び鉄、銅、マンガン、及び亜鉛の硫酸塩などの微量鉱物の中から選択されるものを含む。ペプトン、トリプトン、アミノ酸、または酵母抽出物などの有機窒素源は、鉱物塩培地に含まれない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えば、アンモニウム塩、水性アンモニア、及びガス状アンモニアの中から選択され得る。好ましい鉱物塩培地は、炭素源としてグルコースを含有する。鉱物塩培地と比較すると、最小培地も鉱物塩及び炭素源を含有し得、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン、または他の成分を補充し得るが、これらは非常に最小レベルで添加される。
【００５６】
複数の実施形態では、標的培養細胞密度は、誘導剤、好ましくはＩＰＴＧがタンパク質産生を開始させるために添加されるときに達成される。誘導時の細胞密度、誘導剤の濃度、ｐＨ、及び温度が発現に最適な条件を決定するために変動し得ることを理解する。
【００５７】
好ましい実施形態では、培養物のｐＨは、約６．５〜７．５である。
【００５８】
形質転換した減少ゲノム大腸菌の成長、培養、及び／または発酵は、生存可能な温度範囲内で行われるが、好ましくは、約２０℃〜約３０℃であり、より好ましくは、約２５℃である。別の好ましい実施形態では、培養は、３７℃での比較的短い初期インキュベーション（例えば、１〜３時間）、続いて、誘導前及び誘導後に、約２０℃〜約３０℃、好ましくは約２５℃で成長させることを含む。他の実施形態では、培養は、誘導前及び誘導後に約２５℃で成長させることを含む。
【００５９】
複数の実施形態では、振盪フラスコ条件下で、誘導剤は、２０〜３０℃、好ましくは２５℃のインキュベーション温度で、約０．１〜約１．５、より好ましくは約０．２〜約０．９、さらにより好ましくは約０．３〜約０．６）の、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）で添加される。６００ｎｍで、１ＯＤ単位は、約０．８×１０９細胞／ｍｌに相当する。他の実施形態では、発酵条件下で、誘導剤は、約１００〜４００、より好ましくは約１５０〜３００、最も好ましくは２３０〜２５０のＯＤ６００で添加される。
【００６０】
本方法は、野生型大腸菌Ｂ株などの従来の発現系と比較して、適切にプロセスされたＣＲＭ１９７のレベルの増加を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、可溶性ＣＲＭ１９７における増加を提供する。この文脈において、用語「可溶性」とは、生理学的条件下で、緩衝液中で１０〜３０分間回転させたとき、タンパク質が約５，０００〜２０，０００×重力の遠心分離で沈殿しないことを意味する。逆に、「不溶性」とは、生理学的条件下で、緩衝液中で１０〜３０分間回転させたとき、タンパク質が５，０００〜２０，０００×重力での遠心分離により沈殿し得ることを意味する。
【００６１】
本発明の方法は、（例えば、減少ゲノム）大腸菌宿主細胞から産生された組換えＣＲＭ１９７の回収を含み得る。可溶性タンパク質として周辺質において産生されるとき、可溶性形態の組換えＣＲＭ１９７の回収は、好ましくは、洗剤及び溶解剤の不在下で、大腸菌宿主細胞を機械的に溶解することにより達成される。機械的破砕は、典型的には、超音波処理（Ｎｅｐｐｉｒａｓ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６：２４７−２７０（１９６４））、微細流動化（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３３：１３３０−１３４２（１９８９））、またはビーズ粉砕（Ｌｉｍｏｎ−Ｌａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２１（５）：７４５−７７４（１９７９））を伴う。当該技術分野において既知の他の機械的方法も採用され得る。
【００６２】
組換えＣＲＭ１９７は、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、免疫沈降法などを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の標準的な技術により精製され得る。好ましい実施形態では、組換えＣＲＭ１９７の精製は、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。
【００６３】
ＣＲＭ１９７の収量は、キャピラリーゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析などの当業者に既知の方法により決定され得る。活性アッセイは、タンパク質の収量に関する情報も提供し得る。タンパク質収量の有用な尺度は、培養量当たりの組換えタンパク質の量（例えば、タンパク質のグラム／培養物のリットル）、活性タンパク質のパーセントもしくは画分（例えば、活性タンパク質の量／アッセイに使用されたタンパク質の量）、全細胞タンパク質のパーセントもしくは画分、タンパク質／細胞の量、及び乾燥バイオマスのパーセントもしくは比率を含む。
【００６４】
ＣＲＭ１９７を評価するための活性アッセイは、当該技術分野において既知であり、文献に記載されており、免疫学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡ、ならびに受容体結合アッセイ、例えば、ジフテリア毒素受容体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）結合を含み得る。一実施形態では、活性は、アッセイされた総量と比較される、抽出上清中の％活性組換えＣＲＭ１９７タンパク質により表される（即ち、アッセイに使用されたＣＲＭ１９７の総量に対する、アッセイにより活性であると決定されたＣＲＭ１９７の量に基づく）。別の実施形態では、活性は、標準、例えば、天然タンパク質と比較した、抽出上清中の％活性組換えＣＲＭ１９７タンパク質により表される（即ち、各試料から同量のタンパク質がアッセイに使用される標準試料中の活性タンパク質の量に対する、上清抽出試料中の活性ＣＲＭ１９７タンパク質の量に基づく）。複数の実施形態では、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、または約９９％〜１００％の組換えＣＲＭ１９７タンパク質が活性であると決定される。
【００６５】
ＣＲＭ１９７の同一性を確認する手段も当該技術分野において既知であり、例えば、タンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、Ｎ末端配列決定分析、またはペプチドマッピングを使用する、ペプチド質量フィンガープリントにより分析され得る。
【００６６】
以下は、とりわけ、本発明の好ましい実施形態である。
【００６７】
減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラム、好ましくは少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
【００６８】
減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラム、好ましくは少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含み、該減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株は、そこから、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、及びｂ２９４５を欠失し、任意に、次のさらなる修飾：（ｉ）ｂ４０１７、ｂ４０１８、及びｂ３６４３の欠失、及び（ｉｉ）ｂ４４８８の９８２位でＡＴジヌクレオチドの挿入を有し、インキュベーション条件は、動物由来の血清または他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
【００６９】
減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株宿主において組換えＣＲＭ１９７を産生するための方法は、組換えＣＲＭ１９７タンパク質の発現に好適な条件下で、発現制御配列に動作可能に連結される減少ゲノム大腸菌宿主の周辺質へのＣＲＭ１９７タンパク質の移送を指向するＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に融合された、ＣＲＭ１９７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株をインキュベートし、それにより、１リットル当たり少なくとも１グラム、好ましくは少なくとも２グラムの可溶性ＣＲＭ１９７の収量を得ることを含み、インキュベーション条件は、動物由来の血清もしくは他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含み、該減少ゲノム大腸菌Ｋ１２株は、そこから、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株の少なくとも次のＤＮＡセグメント：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、及びｂ０５０２を欠失し、任意に、次のさらなる修飾：（ｉ）ｂ４０１７、ｂ４０１８、及びｂ３６４３の欠失、ならびに（ｉｉ）ｂ４４８８の９８２位でＡＴジヌクレオチドの挿入を有し、インキュベーション条件は、動物由���の血清または他の動物由来の副産物を含まない最小培地中で大腸菌宿主細胞を培養することを含む。
【実施例】
【００７０】
実施例１
減少ゲノム大腸菌宿主における不溶性ＣＲＭ１９７の細胞質発現
ＣＲＭ１９７は、現在、βファージの多重溶原菌、またはシュードモナスフルオレッセンスの組換えプラスミド系から発現される、コリネバクテリウムジフテリアＣ７の発酵によって製造される。Ｃ．ジフテリアにおけるＣＲＭ１９７の収量は低く（最大で約２００ｍｇ／Ｌ）、バイオセーフティーレベル２（ＢＳＬ２）の施設を必要とする。Ｐ．フルオレッセンスにおける産生は、高収量（約２ｇ／Ｌ）をもたらすが、両宿主は、多くの可動性要素、潜在性（ｃｙｒｐｔｉｃ）プロファージ、及び病原性機能を有する遺伝子残余を保持する。細菌発酵において、挿入配列（ＩＳ）要素の可動性は、関心の遺伝子を不活性化する挿入をもたらす場合がある。最終結果は、発酵不良または望ましくない切断産物の発現である場合があり、その両方が経済的に問題であり、潜在的に危険である。加えて、ＣＲＭ１９７のその毒性親への復帰突然変異は、最悪の結果をもたらす可能性がある。ＣＲＭ１９７の復帰突然変異は、組織培養細胞において検出された毒性活性に起因した可能性がある（Ｑｉａｏら、２００８）。よって、減少した突然変異速度を有する発現系は、復帰突然変異の最低レベルのリスクと合わせた最も高い信頼性及び生産性をもたらし得る。
【００７１】
ＣＲＭ１９７の高値及び供給不足に起因する唯一の最大要因は、産生に主要な大腸菌において多量のＣＲＭ１９７を生成する能力が歴史的にないことである。ＣＲＭ１９７は、細菌の細胞質において発現されるとき不溶性であり、標準的な商業的大腸菌株において作製されたとき、使用前に再度折り畳むことを必要とする。比較的低量のＣＲＭ１９７が従来の株において産生されるため、減少ゲノム大腸菌株のＭＤＳ４２が、振盪フラスコ培養において、不溶性ＣＲＭ１９７の産生宿主として試験された。
【００７２】
減少ゲノムＭＤＳ４２株は、国際特許公開第ＷＯ２００３／０７０８８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法により産生された。簡潔に述べると、一連の減少ゲノム株（ＭＤＳ０１−ＭＤＳ３９）は、親株の大腸菌ＭＧ１６５５からの核酸配列の一連の３９の累積欠失（およそ１４．１％のゲノム）を作製することにより産生された。Ｋ−１２配列及びＩＳデータベースの全ての配列を含有するゲノムスキャンチップ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へのハイブリダイゼーションは、全てのＩＳ要素を欠くように設計された第１の株であるＭＤＳ３９が、予想外に、その産生中に新しい位置に転座したＩＳ要素のさらなるコピーを含有したことを明らかにした。これらのＩＳ要素は、ＭＤＳ４０を産生するために欠失された。ｆｈｕＡＣＤＢ（ｔｏｎＡ遺伝子座）は、ＭＤＳ４１を産生するためにＭＤＳ４０から欠失された。ＭＤＳ０１−ＭＤＳ４１を産生するために作製された各累積欠失の位置及び機能は、米国特許第８，１７８，３３９号（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）の表２に見ることができる。次いで、ｅｎｄＡ遺伝子は、ＭＤＳ４２を産生するためにＭＤＳ４１から欠失された。ＭＤＳ６９を作製するために、２７のさらなる核酸欠失がＭＤＳ４２において作製された。ＭＤＳ４２及びＭＤＳ４２（ＭＤＳ４３、ＭＤＳ４４、ＭＤＳ６９など）に基づく全ての株は、挿入配列を含まない。
【００７３】
不溶性ＣＲＭ１９７を産生するために、ＣＲＭ１９７配列においてヘアピン構造の解放をもたらすＤＮＡ配列変化を含む、修飾したＣＲＭ１９７配列を採用した。最適化したＣＲＭ１９７配列は、翻訳開始を阻害し、開始部位（ＡＴＧ）及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の両方の認識を強化する二次構造を除去する。図１を参照されたい。
【００７４】
天然のＣＲＭ１９７シグナル配列は除去され、最適化したＣＲＭ１９７配列（ｃｙｔｏ−ＣＲＭ１９７、配列番号３）は、ＰＣＲにより増幅され、カナマイシン抵抗性カセットを含有し、クローン化した配列の発現を駆動するためにラクトース誘導性プロモーターを使用する発現ベクターｐＳＸ２内にサブクローン化された。ＣＲＭ１９７（その天然のシグナル配列を欠く）を含有するプラスミドｐＳＸ２は、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２株内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。簡潔に述べると、３ｍｌの培養物を、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充し、２０ｍｌの培養物を初期ＯＤ６００＝０．０７５に播種するために使用された、Ｋｏｒｚ最小培地（Ｋｏｒｚ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９（１）：５９−６５（１９９５））中で飽和に成長させた。次に、振盪フラスコを用いて、最適レベルの不溶性細胞質ＣＲＭ１９７を産生した成長温度及び誘導剤（ＩＰＴＧ）濃度を（プラスミド選択性抗生物質カナマイシンを補充した最小培地中で）決定した。最適なＩＰＴＧ濃度は、２５０μＭであると決定された。図２は、ＩＰＴＧの添加前に０．５（後期誘導）のＯＤ６００に成長させた３つの別個の培養物からの全細胞タンパク質の高速遠心分離後の、全細胞タンパク質（Ｔ）ならびに可溶性画分（Ｓ）及び不溶性画分（Ｉ）を分析するタンパク質ゲルの例である。意外にも、多量のｃｙｔｏ−ＣＲＭ１９７が不溶性画分に存在した（図２を参照、矢印）。タンパク質標準に対して定量したとき、振盪フラスコの結果は、ＯＤ６００が２００の適度の発酵において、１０〜１２ｇ／Ｌのｃｙｔｏ−ＣＲＭ１９７を予測する。減少ゲノム大腸菌宿主細胞における不溶性ＣＲＭ１９７の産生は、従来の大腸菌株よりも１０倍高かった。
【００７５】
実施例２
減少ゲノム大腸菌宿主における可溶性ＣＲＭ１９７の周辺質発現
次に、減少ゲノム大腸菌株における可溶性ＣＲＭ１９７の産生が、周辺質空間へのＣＲＭ１９７の発現を指向することにより試験された。ＣＲＭ１９７は、大腸菌において可溶性形態で産生することが大層難しいと証明されている。高度に発現されたタンパク質の周辺質空間への搬出は、正しいタンパク質折り畳み及びジスルフィド架橋の形成に最適な非減少環境を提供することにより安定性を補助する。この目的のため、最高レベルのＣＲＭ１９７の周辺質送達を生じたシグナル配列及びシャペロンタンパク質を特定するために、いくつかの同時発現されたシャペロンタンパク質と組み合わせて、６つのシグナル配列が検証された。図３は、検証されたシグナル配列及び同時発現されたシャペロンタンパク質を図示する。検証されたシグナル配列は、３つの大腸菌分泌経路の各々からの代表的なシグナル配列を含んだ。
【００７６】
大腸菌をコドン最適化したＣＲＭ１９７オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から注文した。ＣＲＭ１９７  ＯＲＦは、ＰｅｌＢシグナル配列をコードする配列が先行した。ｐｅｌＢ及びＣＲＭ１９７  ＯＲＦは、ｐＳＸ２発現ベクター内にクローン化するのを容易にするように設計された配列に隣接した。５’隣接配列−ＰｅｌＢシグナル配列−ＣＲＭ１９７  ＯＲＦ（終止コドンを含む）−３’隣接配列のヌクレオチド配列を下の表１に提供し、隣接配列は下線付きで表示され、、ＰｅｌＢシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は太字、ＣＲＭ１９７  ＯＲＦは標準文字である。
【００７７】
表１：ｐｅｌＢ（太字）−ＣＲＭ１９７ヌクレオチド配列（標準文字）＋隣接配列（下線付き）：
【００７８】
【表１−１】
2019058195.tif 000004
【表１−２】
2019058195.tif 000005
【００７９】
ＰｅｌＢ−ＣＲＭ１９７  ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は、ｐＳＸ２ベクターへのクローン化に必要な隣接領域を生成するために、センスプライマー（ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＣＴＧＣＣＡＡＣＣ）及びアンチセンスプライマー（ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ）を用いてＤＮＡ２．０クローンからＰＣＲ増幅された。
【００８０】
代替えのシグナル配列は、２または３工程ＰＣＲプロセスを使用して、ＣＲＭ１９７  ＯＲＦに融合された。第１の工程では、シグナル配列のＣ末端コード領域及びＣＲＭ１９７のＮ末端コード領域の両方を網羅するセンスプライマーは、ＣＲＭ１９７のＣ末端コード領域を網羅するアンチセンスプライマーと一緒に使用された。第２の工程では、シグナル配列のＯＲＦを完了するプライマーは、ＣＲＭ１９７のＣ末端コード領域を網羅する同じプライマーと共に使用された。シグナル配列のＮ末端領域を網羅する短いプライマー及びＣＲＭ１９７のＣ末端コード領域を網羅する同じプライマーを含んだＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７構築物の場合では、第３の工程が使用された。大腸菌ｏｍｐＡ及びＯｍｐＦシグナル配列をＣＲＭ１９７  ＯＲＦに融合するために使用されたプライマーは、以下に記載される。
【００８１】
大腸菌ｏｍｐＡコードされたシグナル配列をＣＲＭ１９７  ＯＲＦに融合するために以下のプライマーが使用された。工程１に関して、センスプライマー＝５’−ＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＧＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡ−３’であり、アンチセンスプライマー＝５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ−３’であった。工程２に関して、センスプライマー＝５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣ−３’であり、アンチセンスプライマー＝５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ−３’であった。工程３に関して、センスプライマー＝５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧ−３’であり、アンチセンスプライマー＝５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ−３’であった。
【００８２】
ｏｍｐＦコードされたシグナル配列をＣＲＭ１９７  ＯＲＦに融合するために、以下のプライマーが使用された。工程１に関して、センスプライマー＝５’−ＧＴＴＡＧＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡ−３’であり、アンチセンスプライマー＝５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ−３’であった。工程２に関して、センスプライマー＝５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴ−３’であり、アンチセンスプライマー＝５’−ＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡ−３’であった。
【００８３】
完了したシグナル配列−ＣＲＭ１９７  ＰＣＲ産物をｐＳＸ２発現ベクター内にクローン化した。シグナル配列−ＣＲＭ１９７  ＰＣＲ産物の末端は、ｐＳＸ２ベクターの配列と重複する１５ｂｐの配列を保有した。ｐＳＸ２ベクターは、クローン化反応を容易にするために、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ及びＳａｃ  Ｉで直線化された。クローン化反応は、組換えｐＳＸ２発現ベクターを生成するためにＩＳ６０９のさらなる欠失を有する、ＭＤＳ４２、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、またはＭＤＳ４２ｒｅｃＡ内に形質転換された。シグナル配列−ＣＲＭ１９７領域及び隣接ベクター配列は、配列分析により検証された。
【００８４】
図３（Ｂ）に図示されるシグナル配列とＣＲＭ１９７配列（その天然のシグナル配列を欠く）との組み合わせを含有するプラスミドｐＳＸ２は、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２株またはＭＤＳ４２ｒｅｃＡ株（ｒｅｃＡ遺伝子の欠失を有するＭＤＳ４２株（ｒｅｃＡ１８１９対立遺伝子））内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。シグナル配列及びシャペロンタンパク質に加えて、検査された培養評価項目は、温度、誘導剤（ＩＰＴＧ）濃度、及び誘導剤が添加された時間点（初期［０．０１のＯＤ６００ｎｍ］または後期［約０．４のＯＤ６００ｎｍ］）を含んだ。以下の条件は、ＣＲＭ１９７の周辺質分泌に最適であると決定され、これらの条件は、後続の実験：（ｉ）３７℃で短時間のインキュベーションが先行する（例えば、２時間）、約２５℃の温度での成長、（ｉｉ）後期誘導（約０．４のＯＤ６００でＩＰＴＧを添加）、及び（ｉｉｉ）１５〜３５μＭ（ｃｙｔｏ−ＣＲＭ１９７の最適な発現に必要とされる約１／１０）の誘導剤（ＩＰＴＧ）濃度において使用された。
【００８５】
簡潔に述べると、３ｍｌの培養物を、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充し、２０ｍｌの培養物を初期ＯＤ６００＝０．０７５に播種するために使用された、Ｋｏｒｚ最小培地中で飽和に成長させた。２０ｍｌの培養物（１２５ｍｌのバッフル付きＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて）を、３７℃の振盪インキュベータ（２５０ｒｐｍ）内に２時間設置した。次に、培養物を２５℃の振盪インキュベータに移動し、ＯＤ６００が０．３〜０．４になるまで監視した。その時点で、ＩＰＴＧを示される濃度で添加した。誘導された培養物を一晩、２５Ｃの振盪インキュベータ内でインキュベートした。誘導合計時間は１８〜２２時間であった。誘導後、培養物のＯＤ６００が決定された。２ＯＤ単位を表す培養物のアリコートを、周辺質試料を作製するためにプロセスした。周辺質試料は、周辺質化緩衝液（Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の補助により調製された。１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で１０分間、７５００×ｇで遠心分離することにより、２ＯＤ試料を採取した。上清を取り除き、細胞ペレットを５０μｌの周辺質化緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２０％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び３０Ｕ／μｌのＲｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム）中に穏やかに再懸濁した。室温で５分後、５０μｌの氷冷水を迅速に再懸濁ペレットに添加した。混合物を、１５分間４０００×ｇで遠心分離することによりスフェロプラストから周辺質画分を分取する前に、氷上で５分間インキュベートした。周辺質画分を代表する上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に調製した。１レーンにつき、０．１２ＯＤ単位と等しい量を充填した。
【００８６】
ＣＲＭ１９７の周辺質内への最大分泌をもたらす最も良好なシグナル配列及び誘導特徴を図４に示す。周辺質シグナルＯｍｐＡ及びＯｍｐＦは、周辺質へのＣＲＭ１９７の最大移送を容易にすることが分かった。３つの同時発現されたシャペロンタンパク質のいずれも周辺質送達に異なって影響を与えなかった（例示的な発現が図４のＹｃｃＡと、及びそれなしで比較されたとき）。ＯｍｐＡ及びＯｍｐＦはほぼ類似する量の周辺質ＣＲＭ１９７をもたらすように思われたため、ＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７は、後続の実験に使用された。
【００８７】
ｏｍｐＡ及びｏｍｐＦを含むｓｅｃ−依存性経路の成分の発現は、カタボライト抑制を受ける可能性があるため、ｏｍｐＡ−ＣＲＭ１９７の産生に対する炭素源としてのグリセロールの影響は、上述の条件下で、振盪フラスコ培養において、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２株のグルコースと比較された。図５に図示されるように、グリセロールを補充した最小培地は、グルコースと比較して、劇的に低いレベルのＣＲＭ１９７発現をもたらした。したがって、グルコースは、全ての後続の実験において炭素源として使用された。
【００８８】
次に、いくつかの異なる減少ゲノム大腸菌宿主細胞における周辺質ＣＲＭ１９７の産生が比較された。よって、ＭＤＳ４２株またはＭＤＳ６９株のいずれかの背景内の一連の欠失は、（ｉ）細胞代謝を最適化した欠失、または（ｉｉ）ＣＲＭ１９７発現に悪影響を及ぼす可能性があるプロテアーゼ（例えば、Ｂｌｏｎ）を除去またはそのレベルを減少させる欠失のいずれかを含有するＭＤＳ４２に関して上述される最適な条件に基づき、振盪フラスコ培養において、周辺質（可溶性）ＣＲＭ１９７の産生に対するそれらの作用について検査された。ＭＤＳ４２に基づく次の減少ゲノム大腸菌株が試験された：ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ、ＭＤＳ４２ｍｅｔａｂ、及びＭＤＳ４２Ｂｌｏｎ／ｍｅｔａｂ。ＭＤＳ４２ｍｅｔａｂは、（ｉ）ｉｃｌＲ（ｂ番号ｂ４０１８、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４８５２４で記載される）及びａｒｐＡ遺伝子（ｂ番号ｂ４０１７、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４４９３３で記載される）を欠失させる、（ｉｉ）ｒｐｈ遺伝子（ｂ３６４３）を欠失させる（それにより、下流ｐｙｒＥ遺伝子の転写レベルを増加させる）、ならびに（ｉｉｉ）９８２位でのＡＴジヌクレオチドの挿入によって（活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩの発現をもたらす）ｉｌｖＧフレームシフト突然変異を補正することにより作製された。ＭＤＳ４２Ｂｌｏｎ／ｍｅｔａｂは、ＭＤＳ４２ｍｅｔａｂに関して記載される修飾、ならびにＩＳ挿入が祖先大腸菌ｌｏｎプロモーターの−３５領域を−１０領域から分離する、Ｂ株大腸菌のｌｏｎプロモーター領域の配列を摸倣するために、ｌｏｎプロテアーゼ（ｂ０４３９）プロモーター領域の修飾を含有する。ＭＤＳ６９に基づく次の減少ゲノム大腸菌株が試験された：ＭＤＳ６９ｍｅｔａｂ（ＭＤＳ４２ｍｅｔａｂに関して上述されるように修飾されたＭＤＳ６９株）、ＭＤＳ６９Ｂｌｏｎ／ｍｅｔａｂ（Ｂｌｏｎプロテアーゼ修飾を含むようにさらに変更されたＭＤＳ６９ｍｅｔａｂ、ＭＤＳ６９ｌｐｐ／ｍｅｔａｂ（リポタンパク質ｌｐｐを欠失するようにさらに修飾されたＭＤＳ６９ｍｅｔａｂ（ｂ１６７７）、及びＭＤＳ６９Ｂｌｏｎ／ｌｐｐ／ｍｅｔａｂ（Ｂｌｏｎプロテアーゼ修飾及びリポタンパク質ｌｐｐ遺伝子欠失の両方を含むようにさらに修飾されたＭＤＳ６９ｍｅｔａｂ）。
【００８９】
図６は、これらの株におけるＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７発現を比較する。検査した８つの株のうち、最高レベルのＣＲＭ１９７発現は、代謝活性（代謝株）の強化を目的とした欠失を含有したこれらの株（ＭＤＳ４２またはＭＤＳ６９背景のいずれかの上で）において明らかであった。しかしながら、意外にも、試験した全ての株が全細胞タンパク質調製物（図６のパネルＡ及びＣ）におけるタンパク質ゲルでも明らかであった大量の周辺質ＣＲＭ１９７（図６のパネルＢ及びＤ）を含有した。重要なことに、これらの結果は、プロテアーゼ欠失Ｂｌｏｎが代謝株においてＣＲＭ１９７レベルに影響を与えなかったことを示す。加えて、その不在によりｓｅｃ−依存性周辺質輸送系を「解放する」と考えられた非常に多数のリポタンパク質タンパク質Ｌｐｐの除去は、周辺質ＣＲＭ１９７レベルに影響を与えないことも分かった。これらの実験からの培地は、誘導後に単離され、ＣＲＭ１９７放出に関して検査された。ＣＲＭ１９７は、検査したどの株の培地においても特定されなかった。表２は、最高周辺質ＣＲＭ１９７発現レベルを生成したＭＤＳ株の収量結果の要約である。これらの結果は、同じゲル上で実行されたタンパク質標準と共に示される４つの株からのＣＲＭ１９７の染色強度を比較することによって得られた。振盪フラスコ値は、１００または２００ＯＤ６００のいずれかに達する発酵におけるＣＲＭ１９７の量を予測するために外挿された。表２に示される４つの株は、典型的には、流加発酵において３００のＯＤに達し、これらの株が従来の株において現在可能であるよりもはるかに多くのＣＲＭ１９７を生成する能力を有することを示唆する。
【表２】
2019058195.tif 000006
【００９０】
ＣＲＭ１９７は、高品質のＣＲＭ１９７産生の誘発を提供したタンパク質分解切断に高度に感受性である（Ｂｉｓｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５１４０−５１（１９８７）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＧＥＮ  Ｎｅｗｓ，Ｄｅｃ．１，２０１２）。別個の実験一式では、周辺質ＣＲＭ１９７の産生は、減少ゲノム大腸菌株からのプロテアーゼ遺伝子の標的除去が周辺質におけるＣＲＭ１９７の増加をもたらすかを決定するために、一連のプロテアーゼ欠失株において検査された。よって、次のプロテアーゼコード遺伝子が組み合わせで別個に欠失された：ｄｅｇＰ（ｂ０１６１）、ｐｒｃ（ｂ１８３０）、ｈｔｐＸ（ｂ１８２９）、ならびにｌｏｎプロモーター領域の一部分。個々に、または組み合わせのいずれかでのプロテアーゼ遺伝子の欠失は、ＣＲＭ１９７の発現レベルに影響を与えなかった。プロテアーゼ遺伝子の特定の組み合わせを欠失するように修飾された減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２株がＣＲＭ１９７の周辺質発現に対して作用がなかったことを図示する図７を参照されたい。このデータは、ＭＤＳ４２またはＭＤＳ６９に基づく減少ゲノム大腸菌株において産生されたとき、おそらくこれらの株における低レベルのプロテアーゼ活性により、ＣＲＭ１９７のタンパク質分解切断が生じないことを示す。
【００９１】
実施例３
流加発酵におけるＣＲＭ１９７産生
次に、減少ゲノム大腸菌株におけるＣＲＭ１９７株の商業規模の拡大が検査された。よって、ＭＤＳ４２代謝株におけるＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７は、１０リットル規模の既定最小培地中で流加発酵に供された。発酵条件は、０．１８ＯＤに播種された３７℃でのバッチ相を含み、バッチ培地中の１％グルコースが消費されるまで（約７．５時間）成長させた。流加相は、バッチ培地がグルコースを枯渇したときに生じるＤＯスパイクにより誘引された。供給は、重量測定法で制御された０．３Ｍｕ（１／時間）の成長速度をもたらすように指数関数的供給速度で開始された（約１２．５時間）。誘導点は、利用可能なリン酸塩がほぼ枯渇した時点であるように決定された。誘導点約２時間前の時点で、温度を２５℃に変更し、供給速度を、０．２Ｍｕ（１／時間）の成長速度をもたらす速度に下げた。誘導剤（１００ｕＭ）が添加されたら、約７時間の間、１時間当り８０ｇのグルコースが添加されるように、供給を一定速度に変更した。発酵ＯＤ６００は３００に近づき、図８に図示されるように、非常に高レベルの周辺質標的ＣＲＭ１９７を生成した。最適な条件での第２の発酵は、試験発酵において高レベルの一貫性を示す約２ｇ／Ｌの周辺質ＣＲＭ１９７レベルをもたらした。
【００９２】
上述の結果は、振盪フラスコ及び１０Ｌの流加発酵の両方において、ＭＤＳ４２及びＭＤＳ６９などの減少ゲノム大腸菌産生宿主において得られた可溶性ＣＲＭ１９７の驚くべき収量を示す。
【００９３】
予備発酵分析中に観察された問題の１つは、全細胞タンパク質単離におけるＣＲＭ１９７の可溶性形態の減少であった。周辺質単離方法は、大規模には適用できないため、可溶性ＣＲＭ１９７単離の一般方法が開発された。初期実験は、不溶性であった従来の全細胞タンパク質（ＴＣＰ）単離後に観察されたＣＲＭ１９７が可溶性形態で単離することができるかを判断するために行われた。よって、ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ株におけるＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７は、上述の１０リットル規模の既定最小培地中で流加発酵に供された（３７℃でのインキュベーション、続いて誘導剤の添加前の２５℃での短期間のインキュベーションを含む）。多量の周辺質ＣＲＭ１９７を含有する細胞は、全細胞タンパク質（ＴＣＰ）を単離するために、市販の非イオン性洗剤系緩衝液での標準的な洗剤消化に供された。全細胞タンパク質の試料を高速（２１ｋｇ）で１０分間遠心分離し、可溶性画分を単離した。ＴＣＰの試料及び可溶性画分を分析した。図９のパネルＡに図示されるように、ＣＲＭ１９７の可溶性周辺質形態は、洗剤の均質化により完全に不溶性となった。逆に、周辺質調製物（上述のように）は、高速遠心分離に供されたとき、周辺質ＣＲＭ１９７は、予想通り、可溶性形態を維持した。図９のパネルＢを参照されたい。
【００９４】
不溶性のＣＲＭ１９７の画分を回収する試みにおいて、洗剤系の細菌細胞溶解は、洗剤溶解と比較してＣＲＭ１９７を生成するための産生レベルのプラットホームのより助けとなり、商業的規模拡大プロセスにおいて周辺質を単離する必要性を排除するであろう細胞溶解の機械的方法と比較された。加えて、溶解は、下の表３に記載されるタンパク質の溶解を強化することが知られる化学剤の存在下で行われた。
【００９５】
表３：溶解方法及び溶解剤のリスト
【表３】
2019058195.tif 000007
【００９６】
超音波処理及び微細流動化は５０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）中で行われ、全ての溶解方法はリゾチームとベンゾナーゼとの商業混合物であるＬｙｓｏｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で実行された。次に、表３に列記される薬剤の各々は、別個の調製物において試験された。図１０は、洗剤または機械的溶解により行われた一連の単離の例である。可溶性ＣＲＭ１９７は、洗剤溶解を用いて得ることができず、溶解剤を含んだ洗剤溶解を用いた、可溶性ＣＲＭ１９７のわずかな増加のみが明らかであった。グリセロール及びスクロースは、洗剤単独と比較したとき、可溶性画分に見られた可溶性ＣＲＭ１９７の量を多少高めた（図１０のパネルＡ）。しかしながら、機械的溶解は、可溶性画分において、ＣＲＭ１９７のレベルを劇的に増加させた。実際、ＣＲＭ１９７レベルの劇的な増加は、超音波処理（図１０のパネルＢ）または微細流動化が使用されたか否かに関わらず、機械的溶解に供された全試料からの可溶性画分において明らかであった。さらに、機械的溶解後に得られた可溶性ＣＲＭ１９７の量は、溶解剤によって著しく異ならなかった（表３の他の全ての薬剤と「薬剤なし」を比較）。機械的溶解方法から生成された結果の取りまとめは、ＭＤＳ４２におけるＣＲＭ１９７（短い３７℃でのインキュベーション、続いて２５℃での成長、及び２５〜３５μＭのＩＰＴＧでの後期段階誘導を含む培養条件を使用）が７．２〜８．３％の全細胞タンパク質及び６．３〜７．７％の可溶性タンパク質を含むことを示唆する。これらの結果は、機械的溶解が大規模な商業的発酵に使用される細胞破砕の標準的な方法であり、多量の可溶性ＣＲＭ１９７を生成する能力を暗示するため、興味深い。
【００９７】
前述のデータに基づき、可溶性ＣＲＭ１９７を生成するための好適な商業的プロトコルは、細胞が低速遠心分離によって回収され、好適な緩衝液（例えば、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ約８）中で、機械的手段により（例えば、超音波処理または微細流動化）溶解される、周辺質シグナル配列（例えば、ｏｍｐＡまたはｏｍｐＦによりコードされる）に融合されたＣＲＭ１９７コード配列をコードする発現ベクターを保有する減少ゲノム大腸菌宿主の２５℃での発酵を含む。残渣を除去するために遠心分離した後、可溶性ＣＲＭ１９７は、次に、上清から単離される。振盪フラスコ中で、培養物を２５℃及び２５〜３５ｍＭのＩＰＴＧでインキュベートし、９５〜１００％のＣＲＭ１９７を可溶性形態で単離した。
【００９８】
ｏｍｐＡ−ＣＲＭ１９７融合を含有する発現ベクターを保有する減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株を用いた（上述のように）発酵の結果の要約は、下の表４に示される。これらの発酵は、既定最小培地及び対数成長後期での誘導剤ＩＰＴＧの添加を用いた流加条件下で生じた。発酵規模は１０リットルであった。誘導剤の濃度を変更することにより、周辺質ＣＲＭ１９７の量は０．５から約２ｇ／Ｌに増加した。
【表４】
2019058195.tif 000008
【００９９】
図１１は、１００μＭの誘導剤濃度を採用する発酵の詳細を図示する。全細胞タンパク質（ＴＣＰ）単離物を可溶性（Ｓｏｌ）及び不溶性（Ｉｎｓｏｌ）画分と比較するこの発酵からのゲルは、発酵中、可溶性ＣＲＭ１９７の強固な発現を明らかに示した（図１２を参照）。
【０１００】
減少ゲノム大腸菌宿主株の流加発酵における可溶性ＣＲＭ１９７の産生に最適な条件は以下の通りであった。温度に関して、３７℃でインキュベーションすることにより、バッチ相において成長を開始させ、続いて誘導剤（この場合、ＩＰＴＧ）の添加前に２０〜２５℃に温度を変更することが最適であった。最適なｐＨ範囲は６．５〜７．５（例えば、６．５、７．０、または７．５）である。最適な誘導剤濃度は１００〜２５０μＭのＩＰＴＧである（成長の後期対数期中に添加された）。培地条件に関して、最小培地条件は適切であると判断され、費用削減の利点及び動物由来の産物を含まない既定条件を有する。重要なことには、従来の大腸菌株は、最小培地中で盛んに成長しない。これらの最適な条件を採用することにより、少なくとも４ｇ／Ｌの可溶性ＣＲＭ１９７の標的収量が減少ゲノム大腸菌宿主株（例えば、ＭＤＳ４２またはＭＤＳ６９）を用いた１０Ｌ規模の発酵において確実に産生され得ると推定される。
【０１０１】
実施例４
ＣＲＭ１９７の下流プロセシング
減少ゲノム大腸菌におけるＣＲＭ１９７の産生及び機械的溶解後、ＣＲＭ１９７は精製され得る。ＣＲＭ１９７が発酵条件下でＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂから産生されたかを判断するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（フェニルセファロース）と陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セルロース）との組み合わせを使用して、小規模の精製が行われた。図１１に示される５０ＯＤ単位の２８時間発酵試料は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の溶液中で、微細流動化装置（ＭＦ）を用いて均質化に供された。得られた均質物を、１０分間２１，０００ｇで遠心分離し、可溶性及び不溶性（ＩＳ）画分を単離した。ウエスタンブロット及びジフテリア毒素（ＤＰＸ）に対してポリクローナル抗体を用いて、ＣＲＭ１９７が可溶性画分において非常に豊富であることが分かった（図１３のパネルＡは、３つの濃度（０．１、０．０７、及び０．０４ＯＤ）での、微細流動化装置（ＭＦ）及び再懸濁不溶性（ＩＳ）画分を、プレカラム可溶性画分と比較する）。可溶性画分（２５ＯＤ等価）を濾過し（０．４５μｍ）、１３％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸アンモニウムとし、１０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化されたフェニルセファロースカラム（フェニルセファロースＨＰ  ＨｉＴｒａｐ，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）上に充填した。０．６Ｍの硫酸アンモニウム、６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてカラムを洗浄し、ＣＲＭ１９７を低塩条件（１０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）下で溶出した。次に、５つの２．５ｍＬの溶出した画分を抗ＤＰＸウエスタンブロット及びタンパク質染色により分析した（図１３のパネルＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌと表示されたレーン）。小量の未プロセスＣＲＭ１９７（図１３のパネルＡ、矢印）は、主の溶出した試料から離れて精製され、蒸留水で最終洗浄された。次に、図１３のパネルＡにおいて丸が付けられた画分をプールし、蒸留水で１：２に希釈し、１０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化されている、１ｍｌのＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有するカラム上に充填した。試料を充填し、通過液を回収した後、カラムを３容量の５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。増加塩化ナトリウム濃度：１００ｍＭのＮａＣｌ（２回、３ｍｌ）、１ＭのＮａＣｌ（３ｍｌ）、及び１．５ＭのＮａＣｌ（３ｍｌ）を用いてＣＲＭ１９７を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、最も高純度の可溶性ＣＲＭ１９７が１ＭのＮａＣｌを用いて溶出されたことを明らかにしたが、かなりの量が尚もカラムに結合されたままであった。
【０１０２】
これらの結果は、減少ゲノム大腸菌宿主株において産生されたＣＲＭ１９７が非常に可溶性であり、既存の精製方法を用いて高純度に単離され得ることを示す。
【０１０３】
実施例５
野生型株と比較した減少ゲノム大腸菌宿主におけるＣＲＭ１９７産生
減少ゲノム大腸菌株におけるＣＲＭ１９７の周辺質産生が類似する条件下で野生型大腸菌株におけるＣＲＭ１９７の産生と比較された。よって、ＣＲＭ１９７大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）がＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７融合を保有するｐＳＸ２ベクターで形質転換され、周辺質産生が評価され、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ４２ｒｅｃＡ株におけるＣＲＭ１９７の周辺質産生と比較された。発酵条件は上述の通りであった。３７℃での短い成長開始相の後、０．２％グルコース（及びＢＬＲ（ＤＥ３に関しては３１μｇ／ｍｌのイソロイシン）培養物）を補充したＫｏｒｚ培地中で、細胞を２５℃で１９時間成長させた。ＣＲＭ１９７の発現は、１５または２５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて、ＯＤ＝０．３で誘導された。
【０１０４】
図１４に図示されるように、周辺質ＣＲＭ１９７の産生において少なくとも約５倍の増加が野生型Ｂ株と比較して減少ゲノム大腸菌宿主において観察された。
【０１０５】
さらなる実験は、ＯｍｐＦ−ＣＲＭ１９７融合が、ＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７融合と比較して、減少ゲノム大腸菌宿主において多量の可溶性周辺質ＣＲＭ１９７を実際にもたらしたことを明らかにした。減少ゲノム大腸菌宿主ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株及びＭＤＳ６９  ｌｏｗｍｕｔ株（ｐｏｌＢ（ｂ００６０）、ｄｉｎＢ（ｂ０２３１）、及びｕｍｕＤＣ（ｂ１１８３−ｂ１１８４）の欠失をさらに含むＭＤＳ６９株）は、ＯｍｐＦ−ＣＲＭ１９７融合をコードする発現ベクターで形質転換され、ＣＲＭ１９７の周辺質発現は、同じ条件下で、ＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７融合をコードする発現ベクターを保有するＭＤＳ６９  ｌｏｗｍｕｔ宿主における発現と比較された。３７℃での短い成長開始相の後、０．２％グルコースを補充したＫｏｒｚ培地中で、細胞を２５℃で２３時間成長させた。ＣＲＭ１９７の発現は、２５または３５ｍＭのＩＰＴＧを用いて、ＯＤ＝０．３〜０．３４で誘導された。周辺質タンパク質を単離し、各株における可溶性ＣＲＭ１９７の発現を分析した。図１５に図示されるように、ＯｍｐＡ−ＣＲＭ１９７構築物と比較して、高収量のＣＲＭ１９７がＯｍｐＦ−ＣＲＭ１９７構築物で得られた。
【０１０６】
実施例６
減少ゲノム大腸菌株における様々なシグナル配列を用いたＣＲＭ１９７産生試験
シグナル配列は、周辺質画分の２Ｄゲル分析によって決定されるように、大腸菌Ｂ株及びＫ株の周辺質におけるそれらの存在量に基づき選択された（Ｈａｎ，Ｍｅｅ−Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１７（４）：４３７−４４２（２０１４））。表５は、選択されたシグナル配列及びＢ株及びＫ株の周辺質におけるそれらの相対的存在量を列挙する。
【表５】
2019058195.tif 000009
【０１０７】
表５及び図１７に図示されるシグナル配列及びＣＲＭ１９７配列（その天然のシグナル配列を欠く）の組み合わせを含有するプラスミドｐＳＸ２（ＭｇｌＢ、ＭａｌＥ、ＯｐｐＡ、ＲｂｓＢ、Ａｇｐ、ＦｋｐＡ、ＹｔｆＱ、ＨｄｅＡ、ＨｄｅＢまたはＧｌｎＨ；ＯｍｐＦ及びＯｍｐＣも試験された）は、減少ゲノム大腸菌ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ株（図１８〜２１においてＴ６９  Ｍｅｔａ）内に形質転換され、振盪フラスコ培養において検査された。上述のように、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂは、ＭＤＳ６９背景上に次の修飾：（ｉ）ｉｃｌＲ（ｂ番号ｂ４０１８、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４８５２４で記載）及びａｒｐＡ遺伝子（ｂ番号ｂ４０１７、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ＧｅｎｅＩＤ番号９４４９３３で記載）の欠失、（ｉｉ）ｒｐｈ遺伝子（ｂ３６４３）の欠失、ならびに（ｉｉｉ）９８２位でのＡＴジヌクレオチドの挿入によるｉｌｖＧフレームシフト突然変異の補正を含む。簡潔に述べると、スターター培養物を生成するために、ＭＯＰＳ最小培地−カナマイシン（ＭＭＭ／Ｋａｎ）−グルコース条痕板からの形質転換した細菌のコロニー形成単位を、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した３ｍｌのＫｏｒｚ最小培地中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。スターター培養物は、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに２０ｍｌのＫｏｒｚ／０．２％グルコース／ＫａｎをＯＤ６００＝０．０５となるように播種し、３７℃で１．５時間成長させ、次いで２５℃に変更し、ＯＤ６００が約０．３になるまで成長させるために使用された。その時点で、誘導剤（ＩＰＴＧ）を２５μＭ、３５μＭ、または５０μＭの濃度で添加した（後期誘導）。次に、後期誘導を２５℃で２０時間成長させ、２ＯＤの培養物を採取した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＋Ｌｙｓｏｎａｓｅを用いて全細胞タンパク質を調製し、震央周辺質化方法（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ）を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。
【０１０８】
図＿１８〜２０は、それぞれ、示されるシグナル配列（誘導Ａ−ＯｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、ＧｌｎＨ；誘導Ｂ−ＯｍｐＦ、ＭｇｌＢ、Ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡ、ＹｔｆＱ）を用いた、２５μＭ、３５μＭ、または５０μＭの誘導剤濃度での（可溶性）ＣＲＭ１９７の周辺質収量を示す。２５μＭの誘導剤濃度での全てのシグナル配列で、良好な収量が得られた（図１８）。興味深いことに、３５μＭの誘導剤濃度で、ＹｔｆＱシグナル配列を用いたＣＲＭ１９７の収量は、他の試験したシグナル配列を用いた、この誘導剤濃度で得られたＣＲＭ１９７の収量に対して大幅に増加した（図１９）。この作用は、５０μＭの誘導剤濃度でさらにより顕著になり、ＣＲＭ１９７の収量は高いままであり、一方他の試験したシグナル配列を用いたＣＲＭ１９７の収量は、この誘導剤濃度で大幅に減少した（図２０）。よって、ＣＲＭ１９７とＹｔｆＱシグナル配列との組み合わせは、試験した他のシグナル配列とのＣＲＭ１９７の組み合わせよりも大幅に広い誘導範囲を有すると判断された。
【０１０９】
ＹｔｆＱシグナル配列を用いたＣＲＭ１９７の誘導範囲をさらに評価するために、上述の方法に従い、各々８つのＩＰＴＧ（誘導剤）レベルの２つの培養物を、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂ（０、２５、３５、５０、７５、１００、１５０、及び２５０μＭ）において試験した。対照として、ＣＲＭ１９７及びＯｍｐＦシグナル配列を用いたＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂに関して、各々４つのＩＰＴＧレベルの２つの培養物も試験した（０、２５、３５、５０μＭ）。全細胞タンパク質（ＴＣＰ）及びキャリパーの周辺質分析用の２ＯＤ試料を回収した。
【０１１０】
各誘導剤レベルに関して試験した２つの培養物の平均結果を図２１に図示する。ＹｔｆＱシグナル配列（ＹｔｆＱ−ＣＲＭ１９７）との組み合わせでのＣＲＭ１９７の収量は、最大１００μＭの全誘導剤レベルにわたって高いままであった。しかしながら、ＯｍｐＦとの組み合わせでのＣＲＭ１９７の収量は、２５及び３５μＭの誘導剤濃度でのみ高かった。図２２は、５０μＭのＩＰＴＧ（ＯｍｐＦ）ならびに５０、７５、１００、１５０、及び２５０μＭのＩＰＴＧ（ＹｔｆＱ）での、周辺質（Ｐ）及び培地（Ｍ）におけるＣＲＭ１９７収量に対するＯｍｐＦ及びＹｔｆＱシグナル配列の作用を比較するタンパク質ゲルである。意外にも、ＹｔｆＱシグナル配列に関して、大量の周辺質ＣＲＭ１９７が５０、７５、及び１００μＭの誘導剤濃度で明らかであったが、ＯｍｐＦ配列に関して、非常に少量の周辺質ＣＲＭ１９７が５０μＭの誘導剤濃度で存在した。
【０１１１】
簡潔に述べると、スターター培養物を生成するために、ＭＯＰＳ最小培地−カナマイシン（ＭＭＭ／Ｋａｎ）−グルコース条痕板からの形質転換した細菌のコロニー形成単位を、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した３ｍｌのＫｏｒｚ最小培地中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。スターター培養物は、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに２０ｍｌのＫｏｒｚ／０．２％グルコース／ＫａｎをＯＤ６００＝０．０５となるように播種し、３７℃で１．５時間成長させ、次いで２５℃に変更し、ＯＤ６００が約０．３になるまで成長させるために使用された。その時点で、誘導剤（ＩＰＴＧ）を２５μＭ、３５μＭ、または５０μＭの濃度で添加した（後期誘導）。次に、後期誘導を２５℃で２０時間成長させ、２ＯＤの培養物を採取した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＋Ｌｙｓｏｎａｓｅを用いて全細胞タンパク質を調製し、震央周辺質化方法を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。
【０１１２】
次に、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂにおけるＯｍｐＦまたはＹｔｆＱのいずれかのシグナル配列との組み合わせ、及び大腸菌Ｂ株（ＢＬ２１ＤＥ３）におけるＯｍｐＦとの組み合わせのＣＲＭ１９７収量に対する、非常に後期誘導（ＯＤ６００約２）の作用を評価した。簡潔に述べると、２５℃のスターター培養物を生成するために、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシニン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｉｎ）を補充した３ｍｌのＫｏｒｚ最小培地を、形質転換したＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂまたはＢＬ２１ＤＥ３のコロニー形成単位を播種し、３７℃で一晩インキュベートし、０．２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシニン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｉｎ）を補充した１５ｍｌのＫｏｒｚ最小培地を１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに播種し、これを２５℃で一晩成長させるために使用した。スターター培養物を使用して、９０ｍｌのＫｏｒｚ／０．２％グルコース／カナマイシンを５００ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにＯＤ６００＝０．１となるように播種し、続いてＯＤ６００＞２となるまで２５℃で成長させ（飽和またはほぼ飽和）、次に、様々なＩＰＴＧ濃度で誘導するために（非常に後期誘導）、１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコの４×２０のアリコートに分けた。誘導物を２５℃で２０時間成長させ、２ＯＤの培養物を分析用に採取した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ＋Ｌｙｓｏｎａｓｅを用いて全細胞タンパク質（ＴＣＰ）を調製した。震央周辺質化方法を用いて周辺質及びスフェロプラスト画分を調製した。図２３に示されるように、最大１００μＭのＩＰＴＧまでの良好な周辺質発現は、ＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂにおけるＣＲＭ１９７とＯｍｐＦシグナル配列との組み合わせに関して観察され、これは、２００ｍＭの誘導剤濃度で減少し、おそらく不溶性に起因する。良好な周辺質発現は、最大４００μＭのＩＰＴＧ（試験された最高濃度）までのＭＤＳ６９  ｍｅｔａｂにおけるＣＲＭ１９７とＹｔｆＱシグナル配列との組み合わせに関して観察され、不溶性ＣＲＭ１９７は観察されなかった。弱い発現は、試験された全誘導剤濃度（２５〜２００μＭ）で、ＢＬ２１（ＤＥ３）株におけるＣＲＭ１９７とＯｍｐＦの組み合わせに関して観察された。ＣＲＭ１９７はスフェロプラストにおいて観察されなかった。
【０１１３】
要約−示されるデータは、減少ゲノム大腸菌宿主における可溶性ＣＲＭ１９７の産生が従来の方法によって得られる収量の１０倍である収量を送達したことを示す。減少ゲノム大腸菌宿主における産生は、効率を増大し、製造費用を削減することが予想される。さらに、減少ゲノム大腸菌宿主における産生は、非減少ゲノムを用いた従来の細菌において産生されたものよりも清浄で安全でもある。これらの改善は、薬学的タンパク質製品の産生に広く影響し、最終的には、それらを必要するリスクがある集団のワクチンへのアクセスを広げるだろう。さらに、ＣＲＭ１９７の高収量は、幅広い範囲のシグナル配列との組み合わせで観察された。ＣＲＭ１９７との組み合わせでＹｔｆＱシグナル配列において観察された幅広い誘導範囲は、ＹｔｆＱがＫ株大腸菌と比較したＢ株大腸菌において非常に多い量で見出され、例示的な減少ゲノム株がＫ株に基づくため、意外であった。減少ゲノム大腸菌におけるＹｔｆＱとの組み合わせでのＣＲＭ１９７の幅広い誘導範囲は、誘導剤の濃度がタンパク質の産生中に変えることができ、したがって、これらの宿主におけるＣＲＭ１９７との組み合わせでのＹｔｆＱシグナル配列の使用がＣＲＭ１９７の収量のさらなる増加をもたらすため、大きな利点である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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