(57)【要約】      （修正有）【課題】高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼの製造方法の提供。【解決手段】該ニトリルヒドラターゼαサブユニットのアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸変異を有するニトリルヒドラターゼ（Ｘ１〜Ｘ２７は独立した任意のアミノ酸残基を表す）。（ａ）Ｘ１がバリン又はグリシン、（ｂ）Ｘ９がバリン又はトレオニン、（ｃ）Ｘ２３がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸、（ｄ）Ｘ２４がロイシン【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
αサブユニットにおいて、下記配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含む、改良型ニトリルヒドラターゼであって、ロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来であり、高温下でのアミド化合物耐性が野生型より向上していることを特徴とする改良型ニトリルヒドラターゼ。
（ｂ）配列番号４７：  Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＮＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＬＣ
（但し、Ｎはアスパラギン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン、Ｔはトレオニン、Ｌはロイシン、Ｘ9はＶ（バリン）又はＴ（トレオニン）であり、Ｘ１０はＡ（アラニン）、Ｘ１１はＶ（バリン）、Ｘ１２はＦ（フェニルアラニン）、Ｘ１３はＤ（アスパラギン酸）、Ｘ１４はＳ（セリン）、Ｘ１５はＱ（グルタミン）、Ｘ１６はＴ（トレオニン）、Ｘ１７はＨ（ヒスチジン）、Ｘ１８はＨ（ヒスチジン）、Ｘ１９はＶ（バリン）、Ｘ２０はＶ（バリン）、Ｘ２1はＶ（バリン）、Ｘ２２はＴ（トレオニン）である）；
【請求項２】
下記配列番号５０に示されるアミノ酸配列
ＭＳＥＨＶＮＫＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＸ７ＫＡＸ８ＥＴＬＬＹＥＲＧＬＩＴＰＡＡＶＤＲＶＶＳＹＹＥＮＥＩＧＰＭＧＧＡＫＶＶＡＫＳＷＶＤＰＥＹＲＫＷＬＥＥＤＡＴＡＡＭＡＳＬＧＹＡＧＥＱＡＨＱＩＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＮＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＬＣＳＣＹＰＷＰＶＬＧＬＰＰＡＷＹＫＳＭＥＹＲＳＲＶＶＡＤＰＲＧＶＬＫＲＤＦＧＦＤＩＰＤＥＶＥＶＲＸ２３Ｘ２４ＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９ＶＩＰＥＲＰＡＧＴＤＧＷＳＥＥＥＬＴＫＬＶＳＲＤＳＭＩＧＶＳＮＡＬＴＰＱＥＶＩＶ (配列番号５０)
（但し、Ｘ２がＴ（トレオニン）、Ｘ３がＥ（グルタミン酸）、Ｘ４がＹ（チロシン）、Ｘ５がＥ（グルタミン酸）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＴ（トレオニン）、Ｘ８がＩ（イソロイシン）、Ｘ２５がＳ（セリン）、Ｘ２６がＳ（セリン）、Ｘ２７がＩ（イソロイシン）、Ｘ２８がＹ（チロシン）、Ｘ２９がＩ（イソロイシン）である）を有する、請求項１に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取する、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は請求項５に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼ、及びその製造方法に関する。さらには、当該酵素をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び当該組換えベクターを有する形質転換体、並びにアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニトリルヒドラターゼは、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素である。当該酵素又は当該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造することが行われているが、この方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことで知られている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クレビシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等に属する微生物を挙げることができる。なかでもロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株はアクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００４】
一方、自然界に存在する微生物から単離したニトリルヒドラターゼやその遺伝子を利用するだけでなく、ニトリルヒドラターゼに対して、活性、基質特異性、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、熱安定性、基質に対する安定性、生成物に対する安定性等を変化させる目的でニトリルヒドラターゼに変異を導入することが試みられており、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のニトリルヒドラターゼにおいては、立体構造情報から基質特異性や熱安定性に関与する領域を予測し、それらの中から基質特異性の変化した変異酵素を取得している（特許文献２〜４参照）。また、本発明者らは、耐熱性又はアミド化合物耐性を共に向上させたニトリルヒドラターゼ遺伝子も取得している（特許文献５〜９参照）。
【０００５】
しかし、さらなる耐熱性及びアミド化合物耐性の向上、又は高温での反応が可能なニトリルヒドラターゼを開発し、アミド化合物の製造に用いることは、触媒コスト等の生産コストの観点などから非常に有用であり、その様な性能を有する酵素の取得は、反応時の酵素量の削減及びコスト削減等の観点から望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３１６２０９１号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０５６９９０号パンフレット
【特許文献３】特開２００４−１９４５８８号公報
【特許文献４】特開２００５−１６４０３号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／１１６２０６号パンフレット
【特許文献６】特開２００７−１４３４０９号公報
【特許文献７】特開２００７−４３９１０号公報
【特許文献８】特開２００８−２５３１８２号公報
【特許文献９】特開２０１０−１７２２９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型ニトリルヒドラターゼを提供し、より製造効率の高いアミド化合物の製造方法を可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列のうち、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したタンパク質が、ニトリルヒドラターゼ活性を有するとともに、高温下でのアミド化合物耐性が向上したものであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１３］を提供する。
［１］  αサブユニットにおいて、下記配列番号４６〜４９に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、改良型ニトリルヒドラターゼ；
（ａ）配列番号４６：  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＸ７ＫＡＸ８Ｅ
（但し、Ｒはアルギニン、Ｋはリジン、Ａはアラニン、Ｅはグルタミン酸、Ｘ１はチロシン以外のアミノ酸であり、Ｘ２〜Ｘ８はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｂ）配列番号４７：  Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＮＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＬＣ
（但し、Ｎはアスパラギン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン、Ｔはトレオニン、Ｌはロイシン、Ｘ9はセリン以外のアミノ酸であり、Ｘ１０〜Ｘ２２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｃ）配列番号４８：  Ｘ２３ＷＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｗはトリプトファン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｖはバリン、Ｘ２３はバリン以外のアミノ酸、Ｘ２５〜Ｘ２９はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｄ）配列番号４９：  ＶＸ２４ＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｘ24はトリプトファン以外のアミノ酸、Ｘ25〜Ｘ29はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）
［２］  αサブユニットにおいて、下記配列番号４６〜４９に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ；
（ａ）配列番号４６：  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＸ７ＫＡＸ８Ｅ
（但し、Ｒはアルギニン、Ｋはリジン、Ａはアラニン、Ｅはグルタミン酸、Ｘ１はチロシン以外のアミノ酸であり、Ｘ２〜Ｘ８はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｂ）配列番号４７：  Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＮＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＬＣ
（但し、Ｎはアスパラギン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン、Ｔはトレオニン、Ｌはロイシン、Ｘ９はセリン以外のアミノ酸であり、Ｘ１０〜Ｘ２０はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基、Ｘ２１はバリン、Ｘ２２はトレオニンを表す）；
（ｃ）配列番号４８：  Ｘ２３ＷＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｗはトリプトファン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｖはバリン、Ｘ２３はバリン以外のアミノ酸、Ｘ２５〜Ｘ２９はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｄ）配列番号４９：  ＶＸ２４ＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｘ24はトリプトファン以外のアミノ酸、Ｘ２５〜Ｘ２９はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）
［３］  αサブユニットにおいて、下記配列番号４６〜４９に示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、上記［１］に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ；
（ａ）配列番号４６：  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＲＸ７ＫＡＸ８Ｅ
（但し、Ｒはアルギニン、Ｋはリジン、Ａはアラニン、Ｅはグルタミン酸、Ｘ１はグリシン又はバリンであり、Ｘ２〜Ｘ８はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｂ）配列番号４７：  Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＮＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１ＣＸ２２ＬＣ
（但し、Ｎはアスパラギン、Ｖはバリン、Ｃはシステイン、Ｔはトレオニン、Ｌはロイシン、Ｘ９はバリン又はトレオニンであり、Ｘ１０〜Ｘ２０はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基、Ｘ２１はバリン、Ｘ２２はトレオニンを表す）；
（ｃ）配列番号４８：  Ｘ２３ＷＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｗはトリプトファン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｖはバリン、Ｘ２３はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択され、Ｘ２５〜Ｘ２９はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）；
（ｄ）配列番号４９：  ＶＸ２４ＤＳＸ２５Ｘ２６ＥＸ２７ＲＸ２８Ｘ２９Ｖ
（但し、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｒはアルギニン、Ｘ２４はロイシン、Ｘ２５〜Ｘ２９はそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基を表す）
［４］  前記配列番号４６において、Ｘ２がＴ（トレオニン）、Ｘ３がＥ（グルタミン酸）、Ｘ４がＹ（チロシン）、Ｘ５がＥ（グルタミン酸）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＴ（トレオニン）、Ｘ８がＩ（イソロイシン）であり、
前記配列番号４７において、Ｘ１０がＡ（アラニン）、Ｘ１１がＶ（バリン）、Ｘ１２がＦ（フェニルアラニン）、Ｘ１３がＤ（アスパラギン酸）、Ｘ１４がＳ（セリン）、Ｘ１５がＱ（グルタミン）、Ｘ１６がＴ（トレオニン）、Ｘ１７がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１８がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１９がＶ（バリン）、Ｘ２０がＶ（バリン）であり、
前記配列番号４８及び４９において、Ｘ２５がＳ（セリン）、Ｘ２６がＳ（セリン）、Ｘ２７がＩ（イソロイシン）、Ｘ２８がＹ（チロシン）、Ｘ２９がＩ（イソロイシン）である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ；
なお、配列番号４６に示されるアミノ酸配列は、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列の８〜１９位、配列番号４７に示されるアミノ酸配列は同配列の８８〜１０５位、配列番号４８及び４９に示されるアミノ酸配列は同配列の１５３〜１６４位に該当する。
［５］  配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
［６］  αサブユニットにおいて、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む改良型ニトリルヒドラターゼであって、下記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸変異を有する、前記改良型ニトリルヒドラターゼ。
（i）Ｘ１がＧ（グリシン）又はＶ（バリン）
（ii）Ｘ９がＶ（バリン）又はＴ（トレオニン）
（iii）Ｘ２３がＩ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、及びＴ（トレオニン）よりなる群から選択されるアミノ酸
（iv）Ｘ２４がＬ（ロイシン）
［７］  Ｘ２がＴ（トレオニン）、Ｘ３がＥ（グルタミン酸）、Ｘ４がＹ（チロシン）、Ｘ５がＥ（グルタミン酸）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＴ（トレオニン）、Ｘ８がＩ（イソロイシン）、Ｘ１０がＡ（アラニン）、Ｘ１１がＶ（バリン）、Ｘ１２がＦ（フェニルアラニン）、Ｘ１３がＤ（アスパラギン酸）、Ｘ１４がＳ（セリン）、Ｘ１５がＱ（グルタミン）、Ｘ１６がＴ（トレオニン）、Ｘ１７がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１８がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１９がＶ（バリン）、Ｘ２０がＶ（バリン）、Ｘ２５がＳ（セリン）、Ｘ２６がＳ（セリン）、Ｘ２７がＩ（イソロイシン）、Ｘ２８がＹ（チロシン）、Ｘ２９がＩ（イソロイシン）である、上記［６］に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ。
［８］  前記ニトリルヒドラターゼがロドコッカス属細菌又はノカルジア属細菌由来である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ；
［９］  上記［１］〜［８］のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１０］  上記［９］に記載のＤＮＡを含む組換えベクター；
［１１］  上記［１０］に記載の組換えベクターを含む形質転換体；
［１２］  上記［１１］に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取する、ニトリルヒドラターゼの製造方法；及び
［１３］  上記［１］〜［８］のいずれかに記載の改良型ニトリルヒドラターゼ又は［１１］に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型（変異型）ニトリルヒドラターゼを提供することができる。本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアミド化合物耐性に優れ、アミド化合物の製造効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プラスミドｐＳＪ０３４の構築図である。
【図２−１】各種微生物由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（Ｎ末端側の一部）を示す図である。
【図２−２】図２−１と同様のアミノ酸配列を示す図であり、図２−１のアミノ酸配列に続く配列を示している。
【図３】配列番号５０で示される、本発明のαサブユニットのアミノ酸配列である。
【００１２】
本出願は、日本特許出願２０１４−１１８０４１（２０１４年６月６日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．ニトリルヒドラターゼ
１．１  既知のニトリルヒドラターゼ
「ニトリルヒドラターゼ」は、αサブユニット及びβサブユニットのドメインが集合してなる高次構造をとり、補欠分子として非ヘム鉄原子、又は非コリン核コバルト原子を有している。これらのニトリルヒドラターゼは、それぞれ鉄型ニトリルヒドラターゼ及びコバルト型ニトリルヒドラターゼという呼称で区別されている。
【００１４】
鉄型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス属Ｎ−７７１株由来のものをその代表例として挙げることができる。この鉄型ニトリルヒドラターゼは、Ｘ線結晶構造解析がなされ、その立体構造が明らかになっている。その結果、当該酵素は、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）中の４つのアミノ酸残基を介して非へム鉄と結合している。
【００１５】
コバルト型ニトリルヒドラターゼとしては、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株（以下「Ｊ１菌」と称する場合がある）由来のもの、又はシュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のものを代表例として挙げることができる。
【００１６】
Ｊ１菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼは、活性中心を形成するαサブユニットのシステインクラスター（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ）で示される領域を介してコバルト原子と結合している。なお、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのシステインクラスターは、上記Ｊ１菌由来のシステインクラスターにおける上流側（Ｎ末端側）から第４番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフィン酸（Ｃｓｉ）であり、最も下流側（Ｃ末端側）の第６番目のシステイン（Ｃｙｓ）がシステインスルフェン酸（Ｃｓｅ）である。
【００１７】
上述の通り、補欠分子は、αサブユニット中のシステインクラスター「Ｃ（Ｓ／Ｔ）ＬＣＳＣ」で表される領域と結合している。このような補欠分子結合領域を含むニトリルヒドラターゼとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（旧ソ連特許１７３１８１４号（ＳＵ１７３１８１４））、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３９４８４（特開２００１−２９２７７２）、バチルス・スミシ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）（特開平９−２５４１８８）、シュードノカルディア・サーモフィラ（特開平９−２７５９７８）又はジオバチルス・サーモグルコシダシアス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ及び遺伝子配列でコードされるニトリルヒドラターゼが挙げられる。一方、βサブユニットは構造の安定性に関与していると考えられている。
【００１８】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）由来のニトリルヒドラターゼのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は「Ｐ２１２２０」である。また、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（ＳＵ１７３１８１４）由来のαサブユニットのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は「ＡＴＴ７９３４０」であり、βサブユニットのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は「ＡＡＴ７９３３９」である。ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＡＪ５８２６０５、ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＡＪ５８２６０５、ロドコッカス・ルーバーＴＨ（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．２３８０）のニトリルヒドラターゼ遺伝子は中国特許１０１４６３３５８号（ＣＮ１４６３３５８）に記載されている。さらに、ノカルジア・ＹＳ−２００２由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号「Ｘ８６７３７」であり、ノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓ由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号「ＡＹ１４１１３０」である。
【００１９】
配列表の配列番号１〜１９に、既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び塩基配列を記載する。
配列番号１：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来のβサブユニットの塩基配列
配列番号２：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来のβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号３：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来のαサブユニットの塩基配列
配列番号４：ロドコッカス・ロドクロウスＪ１由来のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号５：ロドコッカス・ロドクロウスＭ８のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号６：ロドコッカス・ルーバーＴＨのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号７：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３３のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号８：ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号９：ロドコッカス・ピリジノボランスＭＳ−３８のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１０：ノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１１：ノカルジア  ＳＰ．ＹＳ−２００２のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１２：アンカルチャード・バクテリウム  ＳＰ１のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１３：アンカルチャード・バクテリウム  ＢＤ２のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１４：ロドコッカス・ロドクロウス  ＡＴＣＣ３９４８４のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１５：シノリゾビウム・メディカエ  ＷＳＭ４１９のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１６：ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス  Ｑ６のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１７：シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１８：ロドコッカス・ロドクロウス  Ｃｒ４のαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号１９：コマモナス・テストステローニのαサブユニットのアミノ酸配列
【００２０】
また、各種微生物由来の既知のニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸（一文字表記）配列のアライメントを、図２−１及び２−２に示す。なお、図２−１、２−２のそれぞれにおいて、各アミノ酸配列は、上から順に、配列番号４、５〜１９に対応する。
【００２１】
本発明に係るニトリルヒドラターゼは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号１〜１９のいずれかに記載のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００２２】
また、本発明のニトリルヒドラターゼには、配列番号１〜１９のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１個または数個、具体的には、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００２３】
１．２  改良型ニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアミド化合物耐性が向上した新規な改良型ニトリルヒドラターゼである。
【００２４】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの由来は特に限定されず、例えば、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ＣＭＤ＝ｓｅａｒｃｈ＆ＤＢ＝ｐｒｏｔｅｉｎ）において登録されているニトリルヒドラターゼや、公知文献に記載されているニトリルヒドラターゼを利用することができる。
【００２５】
具体的には、例えば、ＷＯ２００５／１１６２０６号、特開２００７−１４３４０９号、特開２００７−４３９１０号、特開２００８−２５３１８２号、特開２０１０−１７２２９５号（参照により、本明細書に取り込まれる）に記載されたニトリルヒドラターゼを示すことができる。これらのニトリルヒドラターゼは耐熱性やアクリルアミド耐性を有するものだが、さらに本発明に係るアミノ酸置換を付加することにより、高温下でのアミド化合物耐性の向上という性質を付加することができる。
【００２６】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの一例として、αサブユニットが図３に示すアミノ酸配列（配列番号５０）を有するものを挙げることができる。図３に示すアミノ酸配列中、Ｎ末端から数えて８番目〜１９番目に配列番号４６に示されるアミノ酸配列、８８番目〜１０５番目に配列番号４７に示されるアミノ酸配列、１５３番目〜１６５番目に配列番号４８又は配列番号４９で示されるアミノ酸配列が存在する。
【００２７】
本発明における一つの実施態様として、配列番号５０に示されるアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸変異を有するものが挙げられる（Ｘ１〜Ｘ２９は独立した任意のアミノ酸残基を表す）。
（ａ）Ｘ１がグリシン又はバリン
（ｂ）Ｘ９がバリン又はトレオニン
（ｃ）Ｘ２３がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸
（ｄ）Ｘ２４がロイシン
【００２８】
他の実施態様として、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する改良型ニトリルヒドラターゼにおいて、Ｘ２がＴ（トレオニン）、Ｘ３がＥ（グルタミン酸）、Ｘ４がＹ（チロシン）、Ｘ５がＥ（グルタミン酸）、Ｘ６がＡ（アラニン）、Ｘ７がＴ（トレオニン）、Ｘ８がＩ（イソロイシン）、Ｘ１０がＡ（アラニン）、Ｘ１１がＶ（バリン）、Ｘ１２がＦ（フェニルアラニン）、Ｘ１３がＤ（アスパラギン酸）、Ｘ１４がＳ（セリン）、Ｘ１５がＱ（グルタミン）、Ｘ１６がＴ（トレオニン）、Ｘ１７がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１８がＨ（ヒスチジン）、Ｘ１９がＶ（バリン）、Ｘ２０がＶ（バリン）、Ｘ２５がＳ（セリン）、Ｘ２６がＳ（セリン）、Ｘ２７がＩ（イソロイシン）、Ｘ２８がＹ（チロシン）、Ｘ２９がＩ（イソロイシン）であり、かつ、上記（ａ）〜（ｄ）から選ばれる少なくとも一つの特徴を有するものが挙げられる。
【００２９】
なお、配列番号５０に示されるアミノ酸配列と、上記置換部位以外において、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び／又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３０】
また、配列番号５０に示されるアミノ酸配列において、上記置換部位以外において、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び／又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３１】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの他の一例としては、配列番号４で示される既知のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも一つの特徴を有するものが挙げられる。
（ｅ）αサブユニットの８番目のアミノ酸残基（チロシン）をグリシン又はバリンに置換したもの
（ｆ）αサブユニットの８８番目のアミノ酸残基（セリン）をバリン又はトレオニンに置換したもの
（ｇ）αサブユニットの１５３番目のアミノ酸残基（バリン）をイソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びトレオニンよりなる群から選択されるアミノ酸に置換したもの
（ｈ）αサブユニットの１５４番目のアミノ酸残基（トリプトファン）をロイシンに置換したもの
【００３２】
なお、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、上記置換部位以外において、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び／又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３３】
また、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、上記置換部位以外において、１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、同様の耐熱性及び／又はアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼも本発明の改良型ニトリルヒドラターゼに含まれる。
【００３４】
上記（ｅ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を、「Ｙα８Ｇ、Ｓα８８Ｖ、Ｖα１５３Ｉ、Ｗα１５４Ｌ」等と表記する。標準的アミノ酸はアルファベット１文字で表され、アミノ酸置換の態様は、置換位置（置換箇所までのアミノ酸残基数）を表す数字の左側に置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に置換後のアミノ酸の１文字表記を示すことで、上記のように表記することができる。
【００３５】
具体的には、配列番号４に示すαサブユニットのアミノ酸配列に関して、「Ｙα８Ｇ」と表記した場合は、αサブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）のうちＮ末端のアミノ酸残基から数えて（当該Ｎ末端のアミノ酸残基を含めて数えて）８番目のチロシン（Ｙ）がグリシン（Ｇ）に置換された改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様を意味する。
【００３６】
本発明のより好ましい改良型ニトリルヒドラターゼにおけるアミノ酸置換の態様は、それぞれ以下の１〜８の表記で表すことができる。
１．Ｙα８Ｇ
２．Ｙα８Ｖ
３．Ｓα８８Ｖ
４．Ｓα８８Ｔ
５．Ｖα１５３Ｉ
６．Ｖα１５３Ｌ
７．Ｖα１５３Ｍ
８．Ｖα１５３Ｔ
９．Ｗα１５４Ｌ
【００３７】
上記アミノ酸置換を生じさせるための塩基置換としては、以下の態様が好ましく挙げられる。
【００３８】
【表１】
2019088326.tif 000002
【００３９】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼの活性は、天然由来の特性を保持したままの野生型ニトリルヒドラターゼの活性に対して高温下でのアミド化合物耐性が向上している。
【００４０】
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物を、対応するアミド化合物に変換する水和反応（ＲＣＮ＋Ｈ２Ｏ→ＲＣＯＮＨ２）を触媒する酵素活性を意味する。活性測定は、基質であるニトリル化合物をニトリルヒドラターゼと接触させ、対応するアミド化合物に変換した後、当該アミド化合物を定量することにより算出することができる。基質としては、ニトリルヒドラターゼが反応すればいかなるニトリル化合物でも使用できるが、アクリロニトリルが好ましい。
【００４１】
反応条件は、基質濃度は２．５％、反応温度は１０℃から３０℃、反応時間は１０分から３０分の範囲である。酵素反応はリン酸を添加して停止させる。その後、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）やガスクロマトグラフィーにより、生成したアクリルアミドを分析することでアミド化合物の定量を行うことができる。
【００４２】
「高温下でのアミド化合物耐性」とは、高温下、アミド化合物存在下でもニトリルヒドラターゼ活性を維持することができることを意味する。「高温」とは、具体的には４０℃から６０℃、より好ましくは４５℃〜５５℃を意味する。
【００４３】
「高温下でのアミド化合物耐性」は、改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の培養物又は当該形質転換体から単離した改良型ニトリルヒドラターゼを、高温下、アクリルアミド等のアミド化合物（例えば、３０〜５０％の高濃度）の存在下で、基質であるアクリロニトリル等のニトリル化合物の消費量又は消費速度を分析することにより評価できる。例えば４０℃から６０℃の範囲で、改良型イントリルヒドラターゼをアミド化合物に接触させ、比較例（変異を施さないニトリルヒドラターゼ）に対し、消費量又は消費速度が１．１倍以上、好ましくは１．１５倍以上、より好ましくは１．２倍以上のニトリルヒドラターゼを高温下でのアミド化合物耐性であると評価することができる。
【００４４】
「アミド化合物」としては、例えば、下記一般式（１）：
Ｒ−ＣＯＮＨ２    （１）
（ここで、Ｒは、置換されていてもよい炭素数１〜１０の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数３〜１８のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基である。）
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Ｒが「ＣＨ２＝ＣＨ−」であるアクリルアミドが好ましい。
【００４５】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、既知のニトリルヒドラターゼをアミノ酸置換することで得られるものであり、例えば、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列（配列番号４）に上述の変異を導入し、高温下でのアミド化合物耐性が向上したニトリルヒドラターゼを選択することにより得られる。
【００４６】
Ｊ１菌以外のニトリルヒドラターゼにおいても対応する改変位置に同様の変異を導入することによって高温下でのアミド化合物耐性を向上させることができる。例えば、ニトリルヒドラターゼ産生菌としては、ロドコッカス・ロドクロウスＭ８（配列番号５）、ロドコッカス・ルーバーＴＨ（配列番号６）、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）、ロドコッカス・ピリジノボランスＭＷ３（配列番号７）、ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２（配列番号８）、ノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓ（配列番号１０）、ノカルジア・ＹＳ−２００２（配列番号１１）等が挙げられる。なお、ロドコッカス・ロドクロウスＭ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）は、上記Ｍ８菌から自然突然変異によって構成的にニトリルヒドラターゼを発現する株として選抜された菌株で、そのアミノ酸配列及び遺伝子配列に変異はない（米国特許第５，８２７，６９９号）。
【００４７】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、例えば、既知のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子に、周知の方法にしたがいランダムあるいは部位特異的に変異を導入し、所望の機能、すなわち高温下でのアミド化合物耐性を有する酵素を選択することで、取得することができる。
【００４８】
変異の導入方法としては、Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲのようなランダム変異導入法と、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法のようなＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（部位特異的変異導入法）を挙げることができる。
【００４９】
［Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ］
変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。ＰＣＲによるランダム変異導入法では、ＤＮＡ増幅時に厳密度（ストリンジェンシー）の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する（Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）ことができる。
このＥｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲでは、増幅されるＤＮＡの全域に対して任意の部位に変異が導入される。そうすると、得られた任意の部位に変異が導入された変異体の機能を検討することによって、タンパク質固有の機能に重要なアミノ酸やドメインの情報を得ることができる。Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの鋳型となるニトリルヒドラターゼは、野生株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによる増幅産物であるＤＮＡを用いることができる。
Ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの反応条件としては、例えば、反応液中のｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ又はｄＴＴＰ）のいずれか１種、２種又は３種の配合割合を他のｄＮＴＰに比べて減らした組成とする条件が挙げられる。これにより、ＤＮＡ合成の際、配合割合を減らしたｄＮＴＰが必要な箇所においては、誤って他のｄＮＴＰが用いられる可能性が高くなり、変異が導入される。また、他の反応条件としては、反応液中のＭｇＣｌ２及び／又はＭｎＣｌ２量を増やした組成とする条件も好ましく挙げられる。
【００５０】
［Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（部位特異的変異誘発）］
特定部位に変異を導入する方法で、一般的には、標的遺伝子を含むＤＮＡ鎖を一本鎖に解離し、目的の変異を含むオリゴヌクレオチド鎖をアニールさせて、ＤＮＡポリメラーゼで伸長させて二本鎖とし、これを大腸菌に組み込んで複製させ、目的とする変異を含むクローンを選択する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）等参照）。Ｋｕｎｋｅｌ法のほか、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等様々な方法が知られており、市販の突変異導入用キット、例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて簡便に実施することができる。
【００５１】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、上記のように既知のニトリルヒドラターゼ遺伝子に変異を導入する方法のほか、環境ＤＮＡからのメタゲノムスクリーニングによって取得することもできる。
【００５２】
１．３  改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ
本発明は、本発明の改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡも提供する。
本発明の「改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ」には、上記改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、高温下でのアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００５３】
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が３００〜２０００ｍＭ、温度が４０〜７５℃、好ましくは塩濃度が６００〜９００ｍＭ、温度が６５℃の条件を意味する。例えば、２×ＳＳＣで５０℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【００５４】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。ハイブリダイズするＤＮＡとしては、本発明の遺伝子ＤＮＡに対して少なくとも４０％以上、好ましくは６０％、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分断片が挙げられる。
【００５５】
１．４  組換えベクター、形質転換体
改良型ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。使用するベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００５６】
ベクターには、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。選択マーカーとしては、例えばカナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５７】
本発明の形質転換体に使用し得る宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のニトリルヒドラターゼを発現することができる限り特に限定されないが、例えば、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を用いることができる。
【００５８】
大腸菌を宿主とする場合、発現効率の高い発現ベクター、例えばｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐｋｋ２３３−２（アマシャムバイオサイエンス社製）又はｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス社製）などを用いることが好ましい。
【００５９】
細菌を宿主とする場合、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられ、ロドコッカス菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０等が挙げられる。これらのＡＴＣＣ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００６１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００６３】
植物細胞を宿主とする場合は、タバコＢＹ−２細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が用いられる。
【００６４】
宿主に大腸菌を使用した場合、発現した大部分のニトリルヒドラターゼがインクルージョンボディーとなり不溶化するため、菌体活性の低い形質転換体が得られる。一方、ロドコッカス菌を宿主として使用した場合、ニトリルヒドラターゼは可溶性画分に存在するため、高活性な形質転換体が得られる。宿主は目的に応じて選択すれば良いが、厳しい条件で改良型酵素を選抜する場合は高活性なロドコッカス菌の形質転換体を用いるのが好ましい。
【００６５】
１．５  改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法
改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質を採取することにより製造することができる。本発明はそのような改良型ニトリルヒドラターゼの製造方法も提供する。
【００６６】
本発明において、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも包含する。
【００６７】
形質転換体の培養は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行う。本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース及びデンプン等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、エタノール及びプロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸、若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はその他の含窒素化合物が挙げられる。
【００６８】
その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００６９】
培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。
【００７０】
また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
【００７１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
【００７２】
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定されるものではないが、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、例えばロドコッカス菌であればｐＨ６〜９に調整する。
【００７３】
培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、特にロドコッカス菌の形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。
【００７４】
上記培養条件で培養すると、高収率で本発明の改良型ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。
【００７５】
培養後、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体又は細胞の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。
【００７６】
破砕後、必要に応じて菌体又は細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した改良型ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
【００７７】
また、改良型ニトリルヒドラターゼが菌体内又は細胞内に生産される場合、菌体や細胞そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００７８】
改良型ニトリルヒドラターゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
【００７９】
形質転換体を培養して得られたニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
【００８０】
上記した方法のほか、無細胞タンパク質合成系を採用して改良型ニトリルヒドラターゼを産生することも可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００８１】
この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００８２】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
【００８３】
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ニトリルヒドラターゼは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。
【００８４】
２．アミド化合物の製造方法
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させ、生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
【００８５】
酵素触媒としては、分離精製されたニトリルヒドラターゼのほか、本発明の形質転換体を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の細胞（形質転換体）をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
【００８６】
ここで、「接触」とは、改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を同一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、例えば、分離精製した改良型ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物を混合すること、改良型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を発現する細胞（形質転換体）の培養容器にニトリル化合物を添加すること、当該細胞をニトリル化合物の存在下で培養すること、当該細胞の抽出液をニトリル化合物と混合することなどが含まれる。
【００８７】
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択される。
【００８８】
酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
【実施例】
【００８９】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ここで記載する「％」は、質量％を示す。
【００９０】
［実施例１］改良型ニトリルヒドラターゼ発現用プラスミドの作製
本発明のアミノ酸置換を導入するための鋳型となるプラスミドを以下の方法で作製した。
Ｊ１菌のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドはｐＳＪ０３４を使用した（図１）。ｐＳＪ０３４はロドコッカス菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドである。ｐＪＤ０３４は、ｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号公報に示す方法で作製した。すなわち、プラスミドｐＳＪ０２３をＸｂａＩの部分切断とＳｓｅ８３８７Ｉリンカーライゲーションにより、１箇所のＸｂａＩサイトをＳｓｅ８３８７Ｉに置換したプラスミドｐＳＪ０３３を作製した。次に、ｐＳＪ０３３をＳｓｅ８３８７Ｉで部分切断し、クレノウフラグメントを用いて末端平滑化を行い、セルフライゲーションすることによりプラスミドｐＳＪ０３４を作製した。
【００９１】
なお、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行攻法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（現ＮＩＴＥ特許生物寄託センター：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室））に寄託されている（原寄託日：１９８７年９月１８日）。
【００９２】
また、ｐＳＪ０２３は形質転換体「Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３」であり、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（現ＮＩＴＥ特許生物寄託センター：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室））に平成９（１９９７）年３月４日付けで国際寄託されている。
【００９３】
［実施例２］改良型ニトリルヒドラターゼの作製
実施例１で作製したプラスミドｐＳＪ０３４を使用し、アミノ酸置換を行った。ＰＣＲは、下記反応液組成、反応条件、プライマーを用いて行った。
【００９４】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水                                      ２０μｌ
ｐＳＪ０３４  （１ｎｇ／ｍｌ）                １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０ｍＭ）    ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０ｍＭ）    ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  （２×）        ２５μｌ
合        計                        ５０μｌ
【００９５】
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
【００９６】
【表２】
2019088326.tif 000003
【００９７】
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、１１ｋｂの増幅断片を確認し、１μｌのＤｐｎＩ（キットに付属）をＰＣＲ反応液に添加して３７℃で１時間反応させ、鋳型プラスミドの除去を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で精製し、精製したＰＣＲ反応物を用いてＪＭ１０９へ形質転換した。得られた培養物から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出し、オートシークエンサーＣＥＱ  ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。得られたプラスミドを表３のように命名した。
【００９８】
【表３】
2019088326.tif 000004
【００９９】
［実施例３］ロドコッカス形質転換体の作製
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。実施例２で調製したプラスミド１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）により２．０ｋＶ、２００ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。３０℃、３日間培養後のコロニーを形質転換体とした。
【０１００】
上記の工程で得られた各形質転換体をＭＹＫ培地（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）にそれぞれ接種し、３０℃にて２日間振盪培養し、ＧＧＰＫ培地（１．５％グルコース、１％グルタミン酸ナトリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％Ｍｇ２Ｏ４・７Ｈ２Ｏ、１％  ＣｏＣｌ２、０．１％尿素、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７．２）に１％植菌を行った。３０℃で３日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。その後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で菌体を洗浄し、菌体懸濁液を調製した。
【０１０１】
［実施例４］高温下でのアミド化合物耐性の評価
実施例３で得られた改良型ニトリルヒドラターゼのアミド化合物耐性を以下の方法で測定した。
菌体液０．２ｍｌと５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．８ｍｌとを混合し、さらに５．０％（ｗ／ｖ）のアクリロニトリルを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合液に加えて、１０℃で１０分間振盪しながら反応させた。次いで、菌体を濾別して、ガスクロマトグラフィーを用いて生成したアクリルアミドの量を定量した。
【０１０２】
＜分析条件＞
分析機器：  ガスクロマトグラフＧＣ２０１４（島津製作所製）
検出器：  ＦＩＤ（検出２００℃）
カラム：  ポラパックＰＳ（ウォーターズ社製カラム充填剤）を充填した１ｍガラスカラム
カラム温度：  １９０℃
【０１０３】
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのアクリルアミドを生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１０４】
次に、下記反応液組成及び反応条件で実験を行った。なお、反応に用いる各菌体懸濁液は、事前に測定した酵素活性から同一の活性量になるように１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で適宜希釈した。比較対照として、比較株であるＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０３４を使用した。
【０１０５】
＜反応液組成＞
５０％アクリルアミド溶液            ９４ｇ
アクリロニトリル                      ３ｇ
１Ｍ リン酸緩衝液                     １ｇ
菌液（同一の酵素活性単位（Ｕ）量）    ２ｇ
【０１０６】
＜反応条件＞
反応温度      ４５℃
反応時間      ３時間
【０１０７】
反応開始前（０時間）、３時間後にそれぞれ反応液１ｍｌをサンプリングし、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過し、得られた濾液をガスクロマトグラフィーに供した。残存するアクリロニトリルの割合(％)の分析結果を表４に示した。
【０１０８】
【表４】
2019088326.tif 000005
【０１０９】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ０３４よりもアクリロニトリルの消費率が１１０％以上であった。ニトリルヒドラターゼを使用したアミド化合物の合成反応において、高温・高濃度生成物への暴露による失活や、生成物であるアミド化合物による反応阻害が問題となる。本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。  
【０１１０】
［実施例５］改良型ニトリルヒドラターゼの作製
ＷＯ２０１２/１６４９３３に記載のニトリルヒドラターゼ（ｐＳＪ３０６Ａ）を使用し、実施例２と同様の方法でアミノ酸置換を行った。作製したプラスミドを表５に示す。
【表５】
2019088326.tif 000006
【０１１１】
表５に記載のプラスミドを実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスＡＴＣＣ１２６７４形質転換体を得、ＭＹＫ培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、以下の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。
【０１１２】
＜反応液組成＞
５０％アクリルアミド溶液          ９４ｇ
アクリロニトリル                    ３ｇ
１Ｍリン酸緩衝液                    １ｇ
菌液（同一の酵素活性単位（Ｕ）量）  １ｇ
【０１１３】
＜反応条件＞
反応温度      ４５℃
反応時間      ５時間
【表６】
2019088326.tif 000007
【０１１４】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ３０６Ａよりもアクリロニトリルの消費率が１１０％以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
【０１１５】
［実施例６］改良型ニトリルヒドラターゼの作製（ＪＢＲｓ）  ノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓ由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＹ１４１１３０）の発現プラスミドを以下の手法で作製した。
ベクター断片は、ｐＳＪ０３４を鋳型としたＰＣＲを行い、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）で調製した。
【０１１６】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
滅菌水                                      ２０μｌ
ｐＳＪ０３４  （１ｎｇ／ｍｌ）                １μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０ｍＭ）    ２μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  （１０ｍＭ）    ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  （２×）        ２５μｌ
合        計                          ５０μｌ
【０１１７】
＜ＰＣＲ反応条件＞
（９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃で９０秒）×３０サイクル
ＮＨ−Ｆ：ＧＡＡＧＴＧＡＴＣＧ ＴＡＴＧＡＧＴＧＡＡ ＧＡＣＡＣＡＣＴＣＡ ＣＴＧ（配列番号５１）
ＮＨ−Ｒ：ＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡ ＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴ ＣＡＴＴＣＣＴＴＴＣ ＡＴＣ（配列番号５２）
【０１１８】
上記で調製したベクター断片と、人工合成したノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓ由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号４４）をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（タカラバイオ）を用いてクローニングし、大腸菌ＨＳＴ０８（タカラバイオ）に形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを回収してＤＮＡ配列を確認し、ノカルジア  ｓｐ．ＪＢＲｓ由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミド（ｐＳＪ−ＪＢＲｓ）を得た。 
【０１１９】
さらに、ｐＳＪ−ＪＢＲｓを鋳型に使用し、実施例２と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表７に示す。
【表７】
2019088326.tif 000008
【０１２０】
表７に記載のプラスミドを実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスＡＴＣＣ１２６７４形質転換体を得、ＭＹＫ培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例４の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表８に示す。
【０１２１】
【表８】
2019088326.tif 000009
【０１２２】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ-ＪＢＲｓよりもアクリロニトリルの消費率が１０８％以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
【０１２３】
［実施例７］改良型ニトリルヒドラターゼの作製（Ｓ８５−２）
ロドコッカス・ピリジノボランスＳ８５−２由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＪ５８２６０５）の発現プラスミドは、人工合成したニトリルヒドラターゼ遺伝子（配列番号４５）を用いて実施例６と同様の手法で作製した。得られたプラスミドをｐＳＪ−Ｓ８５−２と命名した。
さらに、ｐＳＪ−Ｓ８５−２を鋳型に使用し、実施例２と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表９に示す。
【０１２４】
【表９】
2019088326.tif 000010
【０１２５】
表９に記載のプラスミドを実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスＡＴＣＣ１２６７４形質転換体を得、ＭＹＫ培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例４の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表１０に示す。
【０１２６】
【表１０】
2019088326.tif 000011
【０１２７】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ-Ｓ８５−２よりもアクリロニトリルの消費率が１３０％以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。   
【０１２８】
［実施例８］改良型ニトリルヒドラターゼの作製（Ｍ８）
ロドコッカス・ロドクロウス  Ｍ８由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＴＴ７９３４０、ＡＡＴ７９３３９）の発現プラスミドは、特開２０１１-２００１３２号公報に記載のプラスミドｐＳＪ−ＮＯ１Ａを使用し、実施例２と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表１１に示す。
【表１１】
2019088326.tif 000012
【０１２９】
表１１に記載のプラスミドを実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスＡＴＣＣ１２６７４形質転換体を得、ＭＹＫ培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例４の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表１２に示す。
【０１３０】
【表１２】
2019088326.tif 000013
【０１３１】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ-ＮＯ１Ａよりもアクリロニトリルの消費率が１１０％以上であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
【０１３２】
［実施例９］ロドコッカス・ロドクロウス（三井菌）
シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５由来ニトリルヒドラターゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  DD028560、DD028561）の発現プラスミドは、特開２０１１-２００１３２号公報に記載のプラスミドｐＳＪ−ＮＯ２Ａを使用し、実施例２と同様の方法でアミノ酸置換を実施した。作製したプラスミドを表１０に示す。
【０１３３】
【表１３】
2019088326.tif 000014
【０１３４】
表１３に記載のプラスミドを実施例３と同様の手法でロドコッカス・ロドロクロウスＡＴＣＣ１２６７４形質転換体を得、ＭＹＫ培地で培養した。得られた培養菌体を使用し、実施例４の条件で高温下のアミド化合物耐性の評価を実施した。結果を表１４に示す。
【０１３５】
【表１４】
2019088326.tif 000015
【０１３６】
上記結果より全ての改良型ニトリルヒドラターゼは、比較例であるｐＳＪ-ＮＯ２Ａよりもアクリロニトリルの消費率が２４０％であった。よって本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下、かつ高濃度のアクリルアミド存在下でもニトリルヒドラターゼ活性が維持されていることから、高温下でのアクリルアミド耐性が向上していると言える。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、高温下でのアクリルアミド耐性が向上しているため、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を効率良く製造することができ、アミド化合物の工業的生産に有用である。
【０１３８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【受託番号】
【０１３９】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８
Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２
【配列表フリーテキスト】
【０１４０】
配列番号２０：α８Ｇ−Ｆプライマー
配列番号２１：α８Ｇ−Ｒプライマー
配列番号２２：α８Ｖ−Ｆプライマー
配列番号２３：α８Ｖ−Ｒプライマー
配列番号２４：α８８Ｖ−Ｆプライマー
配列番号２５：α８８Ｖ−Ｒプライマー
配列番号２６：α１５３Ｉ−Ｆプライマー
配列番号２７：α１５３Ｉ−Ｒプライマー
配列番号２８：α１５３Ｌ−Ｆプライマー
配列番号２９：α１５３Ｌ−Ｒプライマー
配列番号３０：α１５３Ｍ−Ｆプライマー
配列番号３１：α１５３Ｍ−Ｒプライマー
配列番号３２：α１５３Ｔ−Ｆプライマー
配列番号３３：α１５３Ｔ−Ｒプライマー
配列番号３４：α１５４Ｌ−Ｆプライマー
配列番号３５：α１５４Ｌ−Ｒプライマー
配列番号３６：α１５３Ｉ・α１５４Ｌ−Ｆプライマー
配列番号３７：α１５３Ｉ・α１５４Ｌ−Ｒプライマー
配列番号３８：α１５３Ｌ・α１５４Ｌ−Ｆプライマー
配列番号３９：α１５３Ｌ・α１５４Ｌ−Ｒプライマー
配列番号４０：α１５３Ｍ・α１５４Ｌ−Ｆプライマー
配列番号４１：α１５３Ｍ・α１５４Ｌ−Ｒプライマー
配列番号４２：α１５３Ｔ・α１５４Ｌ−Ｆプライマー
配列番号４３：α１５３Ｔ・α１５４Ｌ−Ｒプライマー
配列番号４６：本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号４７：本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号４８：本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号４９：本発明に係る特定のアミノ酸
配列番号５０：本発明に係るαサブユニットのアミノ酸
配列番号５１：ＮＨ−Ｆプライマー
配列番号５２：ＮＨ−Ｒプライマー
配列番号５３：α８８Ｔ−Ｆプライマー
配列番号５４：α８８Ｔ−Ｒプライマー
【図１】
2019088326.tif 000016
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
2019088326.tif 000019
【配列表】
2019088326000001.app