(57)【要約】      （修正有）【課題】通性嫌気性であり、かつホモ乳酸発酵によって（Ｓ）−乳酸を産生する好熱細菌株の作出。【解決手段】通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞、および、該細菌を適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて培養し、（Ｓ）−乳酸を単離することを含む、エナンチオマー的に純粋な（Ｓ）−乳酸の産生方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞。
【請求項２】
さらに、内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子が不活化されまたは欠損している、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
内在性の胞子形成遺伝子の不活化または欠損故の胞子形成欠損誘導体である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記胞子形成遺伝子がｓｉｇＦである、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．８％または９９．９％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
さらに、内在性のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）が不活化されまたは欠損している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
前記遺伝子が、相同組換えによって不活化されまたは欠損している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項９】
グラム陽性細菌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
Geobacillus属に属する、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記Geobacillus属の種がGeobacillus thermoglucosidansである、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
エナンチオマー的に純粋な（Ｓ）−乳酸の産生方法であって、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の好熱細菌細胞を培養すること、そして（Ｓ）−乳酸を単離することを含む方法。
【請求項１３】
前記炭素含有供給原料が、キシロース、グルコースまたはスクロースを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養が、５０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、１５重量％以下、特に１０重量％以下、または５重量％、４重量％、３重量％もしくは２重量％以下の副産物が形成される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、１０重量％以下、特に６重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸の産生のための好熱細菌細胞の改変、遺伝子改変された細胞、およびエナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸およびその塩（ラクテートとして知られている）は、医薬、生物分解性ポリマーおよび食品加工を含む種々の分野において有用な、商業的に採算の取れる産物である。通性嫌気性である好熱性細菌、例えばGeobacillusは、乳酸の工業生産にとって理想的な生物であると思われる。それらは、３７〜７５℃の温度で増殖することができ、最適温度は５５〜６５℃であり（Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446）、５０℃を超える温度で嫌気性の工業的発酵を許す。この高い温度は、工業規模で発酵させる場合に、いくつかの利点を有する。すなわち、感染のリスクがより低く、したがってエナンチオマー純度がより高い、反応がより速い、冷却コストがより低い等である。Geobacillus属の通性嫌気性は、嫌気性条件下での、または少なくとも低酸素分圧下での発酵を可能にし、このことは、工業的規模にとって望ましい。なぜなら、比較的安価な装置および加工を可能にするからである。さらに、これらの細菌の栄養要求量は、これもまた比較的安価な工業プロセスを可能にする乳酸菌、例えばLactobacillus属の種の栄養要求量よりも少ない。
【０００３】
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、嫌気性条件下で、または少なくとも低酸素分圧下で増殖される場合に乳酸を産生することが知られている。例として、G. caldotenax、G. caldoxylosilyticus、G. debilis、G. kaustophilus、G. pallidus、G. stearothermophilus、G. tepidimans、G. thermodenitrificans、G. thermoglucosidans、G. thermoleovorans、G. toebii、G. tropicalisが挙げられる。
【０００４】
G. thermoglucosidansは、キシロース、アラビノース、グルコース、フルクトース、スクロースおよびセロビオースから乳酸を産生することができる（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号）。工業用途にとって、スクロース、グルコース、キシロースもしくはアラビノース、またはそれらの混合物を含有する供給原料が最も関係する。グルコースおよびキシロースを同時に利用する能力（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号）は、リグノセルロース系供給原料に由来する発酵性の糖を用いる場合に、G. thermoglucosidansの重要な利点である。
【０００５】
通性嫌気性である公知のGeobacillus属の種の１の不利な点は、それらが混合酸発酵を行って、乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を主な発酵産物として産生するという事実である。本願において、有機酸の用語はまた、その対応する塩をも含むことが意味される。
【０００６】
別の不利な点は、ほとんどの種が、エナンチオピュアな乳酸を産生しないことである。キラル純度は、ポリ乳酸ポリマーの製造に関して重要な局面である。従って、商業的用途のためにエナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸を産生することは必須である。しかし、今日までに、Geobacillus属の種によって産生された乳酸のエナンチオ純度に関して限られた情報のみが利用できる。（Ｓ）−乳酸のための他の用語が、Ｌ−乳酸またはＬ（＋）−乳酸であると理解されるべきである。本願において、これらの用語は互換的に用いられる。同様に、用語（Ｒ）−乳酸、Ｄ−乳酸およびＤ（−）−乳酸が互換的に用いられる。
【０００７】
Payton & Hartleyは、G. stearothermophilus PSIIが、ｐＨ制御されていない振とうフラスコ条件においてグルコース上で増殖されるときに、（Ｓ）−乳酸、酢酸およびエタノールを産生する混合酸発酵プロファイルを有することを示している (Payton & Hartley, 1985, FEMS Microbiol. Lett. 26:333-336)。キラル純度は、言及されていない。後の研究で、PSIIおよびその誘導体は、G. stearothermophilusにとって典型的でなく、G. caldotenaxにより密接に関係しているように見えることが示されている(Amarteyら、1991、Biotechnol. Lett. 13:621-626; Greenら、2001、国際公開第０１／４９８６５号)。低い収率が、この菌株を工業的用途に適しないものにしている。
【０００８】
Dannerらは、スクロースおよびグルコースから、G. stearothermophilus ＩＦＡ６およびＩＦＡ９により（Ｓ）−乳酸を産生することを示している(Dannerら、1998、Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:895-903)。菌株ＩＦＡ６は、グルコースから有意な量のエタノール、酢酸およびギ酸副産物を産生し、一方、菌株ＩＦＡ９は産生しない。キラル純度は、グルコース上で増殖されるときに、ＩＦＡ６については９９．２２〜９９．８５％であり、ＩＦＡ９については９９．４％であることが報告された(Dannerら、1998、Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:895-903)。培養条件は、酵母抽出物およびカゼインペプトンを含む富栄養培地の使用に基づいたが、これは、工業生産のためには望ましくない。菌株ＩＦＡ６と比較して、菌株ＩＦＡ９は、より高い産物濃度で低下された生産性を有し、このことが、工業生産にあまり適しないものにしている。さらに、菌株ＩＦＡ６は、収率が低く、このことがまた、工業生産に適しないものにしている。
【０００９】
Rao & Satyanarayanaは、G. thermoleovoransを用いた乳酸産生を示しているが、収率およびキラル純度について言及していない(Rao & Satyanarayana, 2009, Appl. Biochem. Biotechnol. 159:464-477)。
【００１０】
Greenらは、ｐＨ制御されていない振とうフラスコ条件で、９９．２％のキラル純度および０．７ｇ／ｇの収率を伴って、G. thermoglucosidans LN-9を用いて（Ｓ）−乳酸を産生したことを示している(Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号)。上記の低い収率が、工業的用途に適しないものにしている。
【００１１】
Atkinsonらは、G. thermoglucosidans NCIMB 11955を用いてキシロースまたはグルコースから、有意な量のエタノール、酢酸およびギ酸副産物を伴って乳酸を産生したことを示している(Atkinsonら、2006、国際公開第２００６／１１７５３６号)。グルコース上での収率は０．６４  ｇ／ｇであり、これは、工業的用途には低すぎる。キラル純度は開示されていない。
【００１２】
Tangらは、G. thermoglucosidans M10EXGを用いた乳酸産生を示している。微好気性条件下では、乳酸が主要産物であり、有意な副産物として、酢酸、エタノールおよびギ酸を伴った。嫌気性条件下では、ギ酸が主要産物であり、主要な副産物として、乳酸、酢酸およびエタノールを伴った。記載された収率は、工業的用途には低すぎる。（Ｓ）−乳酸のキラル純度は、＞９９％と報告された (Tangら、2009、Biotechnol. Lett. 102:1377-1386)。
【００１３】
G. thermoglucosidansは、好熱性のBacillus属の種として記載されている（Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495；Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446；Coorevitsら、2012、Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485）。G. thermoglucosidansは以前、Bacillus thermoglucosidasiusとして知られており（Suzukiら、1983、Syst. Appl.Microbiol. 4:487-495）、２００１年にＮａｚｉｎａらによってG. thermoglucosidasiusに改名され（Nazinaら、2001、Int. J.Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446）、後にＣｏｏｒｅｖｉｔｓらによってG. thermoglucosidansに改名された（Coorevitsら、2012、Int.Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485）。基準株は、土壌から単離された（Suzukiら、1976、Appl. Environ. Microbiol. 31:807-812）。当初は絶対好気性と報告されていたが、後の研究が通性嫌気性増殖および（Ｓ）−乳酸産生を報告している（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号；Fongら、2006、Extremophiles 10:363-372）。温度範囲は４２〜６９℃であり、最適温度は６２℃である（Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495）。エタノール産生のためのG. thermoglucosidans株の遺伝的改変が報告されている（Greenら、2001、国際公開第０１／４９８６５号；Atkinsonら、2008、国際公開第０８／０３８０１９号）。これは、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２Ｔのための遺伝的ツール、およびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を破壊する方法の記載を含む（Atkinsonら、2006、国際公開第２００６／１１７５３６号、および2008、国際公開第２００８／０３８０１９号）。キシロースおよびグルコース上で増殖された細胞についての代謝経路および流量が、G. thermoglucosidans  Ｍ１０ＥＸＧについて報告されている（Tangら、2009、Biotechnol. Lett. 102:  1377-1386）。
【００１４】
本発明者らは、G. thermoglucosidans ＤＳＭ  ２５４２によって産生された酸のキラル純度が、培地の組成および／または糖の源に依存して変わり得ることを見出した。本発明者らは、（Ｓ）−乳酸のキラル純度が８９〜＞９９％であることを見出した。しかし、基質の選択および培地の組成における融通性のために、工業的に関係するあらゆる条件下でエナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸を産生する誘導体への要求がある。
【００１５】
上記から、公知のGeobacillus株は混合酸発酵を生じ、ホモ乳酸型のエナンチオピュアな乳酸産生を示さないと結論付けられ得る。
【００１６】
工業用途にとって魅力的な特性、例えば低い栄養要求、広い糖の消費能力、炭水化物加水分解（ｃａｒｂｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）酵素を産生する能力、高い増殖速度、高い生産性、浸透圧ストレスに対する耐性および遺伝的アクセシビリティを有する細菌株（例えばGeobacillus株）を、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな乳酸の産生に用いることができることが、明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的の１つは、通性嫌気性であり、かつホモ乳酸発酵によって（Ｓ）−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、通性嫌気性であり、かつエナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。
【００１９】
通性嫌気性であるGeobacillus属の種を用いる乳酸産生における（Ｓ）−乳酸の収率およびキラル純度は、菌株および培養条件に依存して変わり得る。したがって、キラル的に純粋な（Ｓ）−乳酸をホモ乳酸型のやり方で産生するために改変された改善されたGeobacillusのための要求がある。
【００２０】
文献に記載されたキラル不純度をもたらし得るいくつかのオプションがある。（Ｒ）−乳酸は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性によってピルビン酸から形成されることができ、乳酸ラセマーゼの活性によって（Ｓ）−乳酸から形成されることができ、またはメチルグリオキサール経路を介して形成されることができる。
【００２１】
メチルグリオキサールシンターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．９９．１１）は、メチルグリオキサール経路の最初の工程におけるジヒドロキシアセトンリン酸のメチルグリオキサールおよびオルトリン酸への転化を触媒する。次に、メチルグリオキサールは、２つの異なる経路を介して（Ｓ）−乳酸または（Ｒ）−乳酸に転化され得る。したがって、メチルグリオキサール経路は、（Ｓ）−乳酸および（Ｒ）−乳酸双方の産生に関してキラル不純物の源であり得る。Escherichia coliでは、メチルグリオキサールシンターゼをコードするｍｇｓＡ遺伝子の破壊が、（Ｓ）−乳酸および（Ｒ）−乳酸双方の産生に関してキラル純度を向上させた（Grabarら、2006、Biotechnol. Lett. 28:1527-1535）。グラム陽性菌では、メチルグリオキサール経路の活性に関してはほとんど知られていない。中温性のBacillus subtilisでは、ｍｇｓＡ遺伝子が、バシリチオール生合成における最初の２つの酵素をコードする遺伝子と一緒にオペロン中にコードされている（Gaballaら、2010、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:6482-6486；Helmann、2011、Antioxidants & Redox signaling 15:123-133）。最近、Ｃｈａｎｄｒａｎｇｓｕらは、バシリチオールがメチルグリオキサールの無毒化に関与していることを実証した（Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715）。バシリチオール依存性メチルグリオキサール経路は、グリオキサラーゼＩ（ＧｌｘＡ）およびグリオキサラーゼＩＩ（ＦｌｘＢ）を利用して、メチルグリオキサールを（Ｒ）−乳酸に転化する（Chandrangsuら、2014）。また、メチルグリオキサールは、グリオキサラーゼＩＩＩの予測される相同物であるＹｄｅＡ、ＹｒａＡおよびＹｆｋＭの活性によって、（Ｒ）−乳酸に転化されることができる（Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715）。
【００２２】
G. thermoglucosidansのゲノム配列から、本発明者らは、予測されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を回収し得たが、明白な乳酸ラセマーゼ遺伝子を回収できなかった。メチルグリオキサールを（Ｒ）−乳酸へ転化するための両方の経路に関して、B. subtilisにおいて解析されたように(Chandrangsu et al., 2014, Mol. Microbiol. 91:706-715)、G. thermoglucosidansにおける最も接近した相同物は、非常に低いアミノ酸配列同一性を有する（ＹｗｂＣに関して４６％；ＹｕｒＴに関して３４％；ＹｄｅＡに関しては相同物は見出されなかった；ＹｒａＡに関して３０％；およびＹｆｋＭ  に関して３５％）。これに対して、B. subtilis ＭｇｓＡは、７２％のアミノ酸配列同一性を有するG. thermoglucosidans相同物を有する。上記ゲノム情報に基づくと、上記（Ｒ）−乳酸産生は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性によって引き起こされ、乳酸ラセマーゼによってでもメチルグリオキサール経路によってでもないと予測されるだろう。驚いたことに、本発明者らは、メチルグリオキサールシンターゼをコードすると予測されるｍｇｓＡ遺伝子を破壊することにより、（Ｒ）−乳酸産生を排除することができた。
【００２３】
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、主な産物としての乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を伴う混合酸発酵を示す。副産物の産生における必須酵素をコードする遺伝子の破壊が、所望の産物の産生を向上させる一般的なアプローチである。しかしながら、特定の遺伝子の破壊の影響は、宿主の代謝全体に応じて、様々な副作用を有し得る。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードするEscherichia  coli  ｐｆｌＡ、および二機能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするａｄｈＥにおける単一突然変異が、改善された乳酸産生を、増加されたピルビン酸副産物形成、残留酢酸およびエタノール産生、ならびに非常に低下されたバイオマス収率と共に結果し（ｐｆｌＡ−）、または主な発酵産物としての酢酸を伴う改善された乳酸産生を結果する（ａｄｈＥ−）（Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7:104-115）。いくつかのE. coli株では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＡＢ遺伝子座が破壊されて、ギ酸の産生を排除している（Zhouら、2003、Appl. Environ. Microbiol. 69:2237-2244；Liuら、2011、Appl. Biochem. Biotechnol. 164:162-169）。培地中での乳酸蓄積における、ギ酸チャネルタンパク質をコードするｆｏｃＡの重要性が、最近示されたので（Beyerら、2013、J. Bacteriol. 195:1428-1435）、それは、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＡＢ欠損を有するE. coli株の表現型に寄与しているだろう。緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiでは、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のノックアウトが、乳酸発酵を向上させたが、細胞外グリセリンおよび酢酸の濃度をも増大させた（Catalanottiら、2012、Plant Cell 24:692-707）。
【００２４】
G. thermoglucosidansにおいて、ｐｆｌＢＡ遺伝子は集中的にａｄｈＥ遺伝子に向けられている。実際的な理由のために、本発明者らは、一改変において、ｐｆｌＢＡとａｄｈＥの一部とを欠損させることによって、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢおよびａｄｈＥを破壊することに決めた。驚くべきことに、本発明者らは、他の副産物に影響を与えることなく、そして乳酸発酵性能に影響を与えることなく、エタノール、酢酸およびギ酸副産物の形成をほぼ排除することができた。例えば、本願において、副産物形成がほぼ排除されるとは、本明細書中に記載されているように遺伝子操作された細胞を発酵させることによって、産生された乳酸の総量に対する副産物（例えばエタノール、酢酸およびギ酸）の重量が、１０重量％以下、特に５重量％、４重量％、３重量％または２重量％以下であることを意味する。乳酸および副産物の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による誘導体化および分析によって決定され得る。
【００２５】
胞子形成の欠損が、Bacillus属の種の工業用途に所望される特性である。遺伝子改変された微生物の封じ込め使用に関する２００９年５月６日の欧州議会および理事会の指令２００９／４１／ＥＣによれば、遺伝子改変された微生物の封じ込め使用は、上記微生物がヒトの健康および環境に対して呈するリスクに関して分類されるべきである。Bacillus属の種が胞子形成欠損表現型を有することは、環境中に広がるリスクを最小にする手段と考えられる。胞子形成欠損表現型を得るための様々な方法が知られており、例えば、自然発生的な胞子形成欠損誘導体を選択すること（Greenら、2001、国際公開第０１／４９８６５号）、または、例えばｓｐｏ０Ａ（Gonzy-Treboulら、1992、J. Mol. Biol. 244:967-979；Atkinsonら、2010、国際公開第２０１０／０５２４９９号）もしくはｓｉｇＦ（Flemingら、1995、Appl. Environ. Microbiol. 61:3775-3780；Wangら、2005、J. Appl. Microbiol. 98:761-767；Kovacsら、2010、Appl. Environ. Microbiol. 76:4085-4088）を破壊することにより胞子形成経路の破壊に向けることが挙げられる。
【００２６】
すなわち、本発明は、第１の局面において、通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞を開示する。
【００２７】
内在性遺伝子は、微生物中に存在する遺伝子である。言うまでもなく、遺伝子が不活化されまたは欠損しているところの、本明細書中に記載された細菌は、上記遺伝子が上記細菌中に本来は存在することを必要とする。反対の指摘が無ければ、本願において、遺伝子へのあらゆる言及は、内在性遺伝子を意味する。微生物中に導入される遺伝子は、内在性遺伝子でない。
【００２８】
別の局面では、通性嫌気性であり、ホモ乳酸型でありかつ（Ｓ）−乳酸をエナンチオピュアな形態で産生する、遺伝子操作された好熱細菌細胞が提供される。
【００２９】
本発明において、ホモ乳酸発酵とは、炭化水素源から乳酸を、１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％、４重量％、３重量％または２重量％以下の副産物、例えばギ酸、酢酸およびエタノールの形成を伴って産生することと定義される。このパーセンテージは、乳酸（（Ｓ）−乳酸および存在しうる（Ｒ）−乳酸を含む）の総重量に対する副産物の総重量に関する。乳酸と、エタノール、酢酸およびギ酸の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による誘導体化および分析によって決定され得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、１０重量％以下、特に６重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下である。言い換えると、ホモ乳酸発酵において形成されギ酸の重量は、乳酸の総重量に対して、例えば、１０重量％以下、より特に６重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下でありうる。同様に、エタノールの重量は、１０重量％、６重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下であり得、また、酢酸の量は、１０重量％、６重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下でありうる。
【００３１】
本明細書において、ｍｇｓＡは、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子を指し、その配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号２３で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号２４で提供される。ｍｇｓＡに隣接するヌクレオチド領域は、配列番号１１、１２、１５および１６のＰＣＲプライマーによって同定され得る。
【００３２】
本発明は、別の局面において、遺伝子操作された好熱細菌細胞に関し、ここで、ｍｇｓＡ遺伝子の他に、内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子がまた、不活化されまたは欠損している。
【００３３】
好ましい実施形態では、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化される。あるいは、ピルビン酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子とアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＥが、別々の工程で不活化または欠損され得る。ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥに隣接するヌクレオチド領域は、配列番号１９〜２１のＰＣＲプライマーによって同定されることができる。
【００３４】
本明細書において、ｐｆｌＢＡは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼをそれぞれコードするピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子ＡおよびＢを意味する。
【００３５】
ｐｌｆＡは、ピルビン酸ギ酸リアーゼＡ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする）を指し、その配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号２７で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号２８で提供される。ｐｌｆＢは、ピルビン酸ギ酸リアーゼＢ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする）を指し、その配列は、配列番号２５で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号２６で提供される。本発明において、ａｄｈＥは、二機能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子Ｅを指し、その配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号２９で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号３０で提供される。
【００３６】
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された細胞において、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）もまた、不活化されまたは欠損している。ｐｔａのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号３１で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号３２で提供される。ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼをコードする）の不活化または欠損はさらに、内在性ｐｔａ活性に関連するレムナント（ｒｅｍｎａｎｔ）酢酸産生を最小にする。得られた株（ｐｔａが不活化されまたは欠損している）は、酢酸について栄養要求性である。したがって、この遺伝子操作された細胞を発酵させる場合には、酢酸が増殖培地に補われなければならない。
【００３７】
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された好熱細菌細胞がまた、内在性胞子形成遺伝子の不活化または欠損によって、胞子形成欠損型にされている。
【００３８】
別の実施形態では、不活化または欠損された胞子形成遺伝子が、ｓｉｇＦである。
【００３９】
ｓｉｇＦは、胞子形成遺伝子を指し、そのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号３３で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号３４で提供される。ｓｉｇＦに隣接するヌクレオチド配列は、配列番号３〜６のＰＣＲプライマーによって同定されることができる。
【００４０】
本発明に従う別の実施形態では、本発明に従う細胞において、（Ｓ）−乳酸が、少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．８％または９９．９％のエナンチオマー純度を伴って産生される。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態では、上記細胞において、遺伝子ｍｇｓＡ、ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥまたはｓｉｇＦの１以上が、相同組換えによって不活化されまたは欠損している。
【００４２】
さらに別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞である。好ましくは、上記細胞が、Bacillus属に属する。
【００４３】
さらに別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞である。好ましくは、上記細胞が、Geobacillus属に属する。
【００４４】
また別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、Geobacillus thermoglucosidansである。
【００４５】
本発明の目的の１つは、通性嫌気性であり、かつ、ホモ乳酸発酵によって（Ｓ）−乳酸を産生するGeobacillus株を作出することである。
【００４６】
キラル純度は、ポリ乳酸ポリマーの製造にとって重要な局面である。したがって、商業的な用途のためにエナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸を産生することが不可欠である。
【００４７】
すなわち、本発明は、一局面において、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のGeobacillus属の種を遺伝子工学によって遺伝子改変する方法を開示する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、エナンチオピュアな乳酸を産生する方法を提供する。該方法は、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて本発明に従う好熱細菌細胞を培養する工程と、（Ｓ）−乳酸を単離する工程とを含む。
【００４９】
別の局面では、本発明は、エナンチオピュアな乳酸の産生方法であって、炭素含有供給原料がキシロース、グルコースまたはスクロースを含むところの方法を提供する。
【００５０】
培養の温度は好ましくは、５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃の温度で実行される。
【００５１】
本発明の文脈において、遺伝子の不活化または欠損は、上記細胞によって産生され得る所望のポリペプチドをコードする遺伝子、および／または上記細胞による一次代謝物もしくは二次代謝物の産生に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の改変でありうる。原則として、これは、コードされるタンパク質の細胞レベルを引き下げることによってなされることができる。細胞レベルの引下げは、例えば、関心のある酵素をコードする遺伝子の標的不活化によって達成され得る。遺伝子は、その全体が除去されることができる。しかしながら、代替案として、遺伝子の一部の欠損もまた、コードされるタンパク質の活性の低減をもたらしうる。代わりに、または追加的に、遺伝子の調節または発現の原因となるヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサーおよび翻訳開始部位などが改変または除去されることができる。関心のあるタンパク質の活性に影響を与える別の方法が、必要であるならば、輸送シグナルの改変、またはアンチセンスＲＮＡの導入でありうる。
【００５２】
染色体改変は、子孫細胞にわたって遺伝子の機能性の安定した分布を確実にするので、好ましい。染色体における所望の機能性の欠損は、非相同組換えによってならびに相同組換えによってなされることができる。相同組換えは、機能性を導入するための、除去するための、または同時に導入かつ除去するための機会を開いているので、好ましい。
【００５３】
相同組換えが意図される場合には、形質転換ＤＮＡはさらに、操作される特定の細胞のゲノム標的配列に相同であるＤＮＡ配列を含有する。当業者であれば、相同組換えを得るのに１００％の同一性は必要とされないことを理解するであろう。８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、９８％または９９％の同一性も十分であろう。通常、相同組換えによって染色体中に挿入され得る関心のあるＤＮＡ配列は、相同組換えを可能にするのに十分な長さを有する相同配列によって隣接される。そのような長さは、少なくとも約２００ｂｐ、例えば約２００〜約１５００ｂｐ、好ましくは約５００〜約１０００ｂｐでありうる。
【００５４】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性は、上記２つの配列間で同じであるアミノ酸のパーセンテージを指す。同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。Ｂｌａｓｔｐアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄが１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅが３、Ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ａ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅが０であり、ＭａｔｒｉｘがＢＬＯＳＵＭ６２であり、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓが１１のＥｘｉｓｔｅｎｃｅおよび１のＥｘｔｅｎｓｉｏｎであり、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓがＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。
【００５５】
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の同一性は、上記２つの配列間で同じであるヌクレオチドのパーセンテージを指す。同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。Ｂｌａｓｔｎアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄが１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅが２８、Ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ａ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅが０、Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓが１、−２、Ｇａｐ  ＣｏｓｔｓがＬｉｎｅａｒである。
【００５６】
上述したように、Geobacillus thermoglucosidansにおける上記遺伝子を同定する配列はいずれも、関心のある遺伝子を遺伝子工学によって改変するのに１００％同じである必要はない。さらに、他の種に由来する関連する好熱細菌細胞において、遺伝子はこれらの配列から逸脱しうる。しかしながら、Geobacillus thermoglucosidans遺伝子を使用することにより、これらの遺伝子と相同でありかつ同じ機能性を有する配列が当業者によって容易に同定されることができ、そして相同組換えをこれらの菌株において実行するための対応するプライマーが作製され得る。したがって、たとえ上記同定された遺伝子の配列からの逸脱が、ある特定の菌株に存在しても、相同遺伝子は容易に同定されることができる。そのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知の技術を用いて決定されることができ、そして必要ならば、隣接する遺伝子配列と同じであるまたは相補的である新しいプライマーセットが定義されることができる。
【００５７】
本発明に従う細胞は、当該技術分野において公知の技術を用いて作製され得る。特に、エレクトロポレーションによる好熱細菌中へのＤＮＡ導入方法が、Van Kranenburgら、2007、国際公開第２００７／０８５４３３号、およびCrippsら、2009、Metab. Eng. 11:398-408に記載されている。
【００５８】
エレクトロポレーションによるこれらBacillus属の種の形質転換は、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のBacillus属の種と、所望の機能性および／または特定のBacilliのゲノム配列に相同であるＤＮＡ配列を含む適切な形質転換ＤＮＡとを含有する懸濁物を通る高電圧放電によって達成されることができる。
【００５９】
（Ｓ）−乳酸は、本明細書に記載された遺伝子操作された好熱細菌細胞を、炭水化物源（例えばグルコースおよび／またはキシロース）の存在下で、当該技術分野において公知の方法によって発酵させることによって得られることができる。発酵の間に、微生物によって分泌された乳酸は通常、塩基、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩基性塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの水酸化物、炭酸塩および／または炭酸水素塩を用いて中和される。マグネシウム塩基、例えば水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび／または炭酸水素マグネシウムが通常好ましい。したがって、いくつかの局面では、本発明は特に、エナンチオピュアな（Ｓ）−乳酸の産生方法に関し、上記方法は、本明細書に記載された好熱細菌細胞を、マグネシウム塩基（例えば、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび炭酸水素マグネシウムの少なくとも１つから選択される）の存在下で、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて培養すること、そして（Ｓ）−乳酸を単離することを含む。
【００６０】
発酵後、（Ｓ）−乳酸（またはその塩）は、乳酸および／またはラクテートを水性溶液から分離するために知られている多くの従来技術のいずれかによって発酵ブロスから分離される。分離効率を高めるために、分離前に、基質または微生物（バイオマス）の粒子が除去され得る。上記分離は、遠心分離、濾過、フロキュレーション（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）、フロテーション（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）または膜濾過によって行われうる。これは、例えば、発酵による乳酸の調製のための連続方法が記載されている国際公開第０１／３８２８３号から知られている。本明細書における発酵の検討は通常、バッチ法を指すが、方法全体の一部または全てが連続的に実行されうる。
【００６１】
発酵ブロスからの（Ｓ）−乳酸（またはその塩）の分離後、上記産物は、１つまたは複数の精製工程、例えば抽出、蒸留、結晶化、電気透析、濾過、活性炭による処理、イオン交換等にかけられうる。種々の残留物流は、任意的に処理された後に、発酵容器へまたは先に実行された任意の精製工程へリサイクルされうる。
【実施例】
【００６２】
材料および方法
菌株およびプラスミド
本研究において用いられた菌株およびプラスミドが、表１に記載される。
【００６３】
Escherichia coliが、好気的条件下で３７℃にてＬＢブロス（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）中でルーチン的に培養された。適切な場合には、クロラムフェニコールおよび／またはアンピシリンが、それぞれ２０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌの濃度で用いられた。
【００６４】
G. thermoglucosidansが、特に明記されない限り、好気的条件下で５２℃、５５℃または６０℃にて、ＴＧＰ培地中でルーチン的に増殖された。ＴＧＰ培地（Taylorら、2008、Plasmid 60:45-52）は、１７ｇ／Ｌのトリプトン、３ｇ／Ｌのダイズペプトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４をｐＨ７．０にて含有し、そしてオートクレーブ後に４ｍｌ／Ｌのグリセリンおよび４ｇ／Ｌのピルビン酸Ｎａが添加された。ＴＧＰプレートについて、１０ｇ／Ｌのアガーが用いられた。適切な場合には、培地がクロラムフェニコール（８μｇ／ｍＬ）で補充された。
【００６５】
【表１】
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2019088328.tif 000003
【００６６】
ＤＮＡ操作技術
標準的なＤＮＡ操作技術が、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）によって記載されているように実行された。
【００６７】
ｐＮＷ３３Ｎ誘導体の構築が、E. coliにおいて実行された。
【００６８】
１００ｍＬ培養物からの大規模E. coliプラスミドＤＮＡ単離が、Ｊｅｔｓｔａｒ  ２．０  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。１ｍＬ培養物からの小規模E. coliプラスミドＤＮＡ単離が、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｕｒｅ（登録商標）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）キットを用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
【００６９】
E. coliコンピテントセルが、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）によって記載されているように、塩化カルシウムを用いて作製され、そしてヒートショックによって形質転換された。
【００７０】
クローニング目的のＰＣＲ反応が、ハイフィデリティＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
【００７１】
コロニー−ＰＣＲ分析のために、コロニーが爪楊枝で採集され、そして少量の細胞物質がＰＣＲ反応チューブに移された。細胞が、電子レンジにおける１０００Ｗでの１分間のインキュベーションによって破壊された。ｒＴａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｄｅｓ）を有する５０μＬまたは２５μＬのＰＣＲ反応混合物が、メーカーによって推奨されるように調製され、そして破壊された細胞を有する上記反応チューブに加えられた。
【００７２】
G. thermoglucosidansのエレクトロポレーション
G. thermoglucosidansが、Ｃｒｉｐｐｓら（Crippsら、2009、Metab. Eng. 11:398-408）によって記載されたプロトコルに基づいて、エレクトロポレーションによって形質転換された。G.thermoglucosidansは、５５℃で一晩増殖され、そして１ｍＬが、バッフルを備えた２５０ｍｌ三角フラスコ中の予め温められた５０ｍｌのＴＧＰ培地に接種するために用いられた。ＯＤ６００が約１．０となるまで、細胞が６０℃（１８０ｒｐｍ）にてインキュベートされた。フラスコは１０分間氷上で冷却され、そして細胞が遠心分離（４℃）によってペレット化された。次に、細胞が、氷冷されたエレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン）で４回洗浄された。洗浄工程の容量は、５０ｍｌ、２５ｍｌ、１０ｍｌおよび１０ｍｌであった。最終ペレットは、１．３ｍｌの氷冷されたエレクトロポレーションバッファー中に再懸濁され、そしてエレクトロコンピテントセルの６０μｌのアリコートが−８０℃にて貯蔵され、またはエレクトロポレーションに直接用いられた。
【００７３】
エレクトロコンピテントセルの６０μｌのアリコート（解凍済み）が、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡと混合され、次いで、冷却されたエレクトロポレーションキュベット（ギャップ幅０．１ｃｍ）に移された。Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーション条件は、２．５ｋＶ、１０μＦおよび６００Ωであった。エレクトロポレーション後に、細胞は、５０ｍｌプラスチックチューブ中の１ｍｌの予め温められた（５２℃）ＴＧＰに移され、そして５２℃で１８０ｒｐｍにて２時間、回収された。回収された細胞懸濁物はペレット化され、そして１５０μｌを除く全ての上清が破棄された。ペレットは、残りの上清中に再懸濁された。１／１０および９／１０の容量が、８μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＴＧＰプレート上にプレーティングされた。プレートは、５２℃で２４〜４８時間インキュベートされた。プレート上に現れたコロニーは、８μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有する新鮮なＴＧＰプレートに移され、そして５５℃にて一晩インキュベートされた。増殖したものが、プライマー１およびプライマー２（表２）を用いたコロニーＰＣＲによって、プラスミドの存在について試験された。
【００７４】
組込み
Geobacillus-E. coliシャトルベクターｐＮＷ３３ｎが、先に記載されたように（Crippsら、2009、Metab. Eng. 11:398-408）、G. thermoglucosidansにおける組込みベクターとして用いられた。８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する２０ｍＬのＴＧＰに、グリセリンストックからの形質転換された菌株が接種された。５５℃、１８０ｒｐｍにて一晩の増殖後、適切な希釈物が、８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＴＧＰプレート上にプレーティングされた。その後、これらのプレートは、６８℃にて２４時間インキュベートされた。シングルコロニーが、新鮮なプレート（５２℃でインキュベートされた）に画線され、これらのコロニーにおいてコロニーＰＣＲが行われて、シングルクロスオーバーを有するコロニーを同定した。適切なプライマー組合せが、上流断片または下流断片を介したシングルクロスオーバーを同定するのに用いられた（表２；それぞれ、ｐＲＭ３の組込みのための６５５−１７０および６５６−５７１のプライマー組合せ、ｐＪＳ４３の組込みのための７５４−１７０および９９１−５７１のプライマー組合せ，ｐＲＭ１２の組込みのための７４４−１７０および８０８−５７１のプライマー組合せ）。次に、陽性コロニーの染色体ＤＮＡが、Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ  Ｇｒａｍ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離され、そして、コロニーＰＣＲの結果を確かめるために、上記ＰＣＲが、単離された染色体ＤＮＡに関して繰り返された。上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーおよび下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーが、第２の組換え工程のために選択された。
【００７５】
ダブルクロスオーバーを得るために、一次組込み体が、クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中で複数回継代培養された。適切な希釈物（１０−４、１０−５、１０−６）がＴＧＰプレート上にプレーティングされた。単離されたコロニーが、８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。ダブルクロスオーバー突然変異体は、クロラムフェニコール感受性である。適切なプライマー組合せ（表２；ΔｓｉｇＦのための６５５−６５６、ΔｍｇｓＡのための７５４−９９１およびΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥのための７４４−８０８のプライマー組合せ）を用いたＰＣＲ分析を使用して、野生型を欠損突然変異体から識別し、そしてプラスミドの不在を確認した。全ての改変が、ＰＣＲ産物の配列決定によって確かめられた。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
発酵
ＴＭＭ培地は、Ｆｏｎｇら（Fongら、2006）から改変され、そして１Ｌにつき、６０ｇ／Ｌのグルコース；３０ｇ／Ｌのキシロース；８．３７ｇのＭＯＰＳ、０．２３ｇのＫ２ＨＰＯ４；０．５１ｇのＮＨ４Ｃｌ；０．５０ｇのＮａＣｌ；１．４７ｇのＮａ２ＳＯ４；０．０８ｇのＮａＨＣＯ３；０．２５ｇのＫＣｌ；１．８７ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．４１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１６．０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１．０ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｍｇのＨ３ＢＯ３；０．１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；７．０ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇのチアミン；０．１ｍｇのリボフラビン；０．５ｍｇのニコチン酸；０．１ｍｇのパントテン酸；０．５ｍｇのピリドキサミンＨＣｌ；０．５ｍｇのピリドキサールＨＣｌ；０．１ｍｇのＤ−ビオチン；０．１ｍｇの葉酸；０．１ｍｇのｐ−アミノ安息香酸；０．１ｍｇのコバラミンを含んでいた。ｐＨはｐＨ７．２に調整された。グルコース、キシロース、金属およびビタミンは、フィルター滅菌された。培地はオートクレーブ処理された。ＴＭＭ１、ＴＭＭ２．５およびＴＭＭ５はそれぞれ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌおよび５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ）で補充されていた。
【００７８】
ＳＴＭＭ培地は、Ｋ２ＨＰＯ４（１．００ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（２．５０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５．００ｇ／Ｌ）およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（５０ｍｇ／Ｌ）の濃度がＴＭＭ培地と異なり、そしてＤ，Ｌ−メチオニン（６８．５ｍｇ／Ｌ）およびベタイン（０．１４ｇ／Ｌ）で補充された。
【００７９】
ＴＭＭ５またはＳＴＭＭ５中の１００ｍＬの前培養物が、コンデンサー（おおよそ１５℃の水道水を流すことにより冷却される）を装備した０．７５ＬのＭｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵装置（Ｉｎｆｏｒｓ）において、（１０ｖ／ｖ％）４００ｍＬのＴＭＭ１、ＴＭＭ２．５またはＳＴＭＭ５に接種するために用いられた。ｐＨは、滅菌した２．５ＭのＫＯＨ、滅菌した７５ｇ／ＬのＭｇ（ＯＨ）２または滅菌した７５ｇ／ＬのＣａ（ＯＨ）２の添加によって、ｐＨ７．２に調整された。温度は６０℃であった。撹拌速度は３００ｒｐｍであった。
【００８０】
サンプルが、（Ｒ）−乳酸および（Ｓ）−乳酸ならびに生じうる副産物の測定のために、上記発酵物から抜き出された。サンプルは遠心分離され、そして残渣が、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ  ０．２２μｍフィルター（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた濾過によって除去された。濾液が、さらなる分析まで−２１℃にて貯蔵された。
【００８１】
糖が、Ｔｈｅｒｍｏ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＳＡ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いたＨＰＬＣによって測定された。有機酸（乳酸、酢酸、ギ酸、コハク酸、フマル酸、ピルビン酸）およびエタノールが、誘導体化および気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を用いて測定された。（Ｒ）−ラクテートおよび（Ｓ）−ラクテートが乳酸メチルにメチル化され、そしてキラルカラム上でのヘッドスペース分析によって測定された。
【００８２】
実施例１
G. thermoglucosidansによるエナンチオピュアな乳酸の産生
G. thermoglucosidans中のｓｉｇＦ遺伝子を欠損させるために、組込みプラスミドｐＲＭ３が構築された。ｓｉｇＦ遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに上流断片を得るための６５３と６５４のプライマー組合せ（表２）および下流断片を得るための６５１と６５２のプライマー組合せ（表２）を用いたＰＣＲによって生成された。最初に、下流断片が、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片として、同じ酵素で切断されたｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされた。次に、上流断片が、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、同じ酵素で切断されたこの構築物中にクローニングされて、プラスミドｐＲＭ３を結果した。ｐＲＭ３の構築は、E. coli ＴＧ９０においてなされた。ｐＲＭ３配列の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。
【００８３】
プラスミドｐＲＭ３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２にエレクトロポレーションされた。シングルクロスオーバー突然変異体を得るために、材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられた。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
【００８４】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた６０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。１５のコロニーが、クロラムフェニコールに感受性であった。１２のコロニーが所望の改変を有し、３のコロニーが野生型に戻っていた。１のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦと命名された。欠損が、配列決定によって確かめられた。
【００８５】
【表３】
2019088328.tif 000005
【００８６】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦが、ＴＭＭ１およびＴＭＭ２．５を用いたｐＨ制御された（ＫＯＨ）発酵において評価された。発酵物が分析された。結果が表３に要約されている。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦは、キシロースおよびグルコースを同時に消費した。産生された（Ｓ）−乳酸のキラル純度は、キラル的に純粋な乳酸のためのスペックよりかなり下である。
【００８７】
G. thermoglucosidans中のｍｇｓＡ遺伝子（４２３ｂｐ）の２６７ｂｐを欠損させるためにプラスミドｐＪＳ４３が構築された。ｍｇｓＡ遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに、ｍｇｓＡ下流断片を得るための７５０と９９９のプライマー組合せおよび上流ｍｇｓＡ断片を獲得するための１０００と７５３のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。得られた２つのＰＣＲ産物は次いで、これらを一緒に融合するために、７５０と７５３のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて鋳型として用いられた。産物は、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片として、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたプラスミドｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされて、プラスミドｐＪＳ４３を結果した。ｐＪＳ４３の構築は、E. coli  ＴＧ９０においてなされた。ｐＪＳ４３ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
【００８８】
プラスミドｐＪＳ４３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。１つのシングルクロスオーバー組込み体が、さらなる研究のために選択された。
【００８９】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた６０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。全てのコロニーがクロラムフェニコールに感受性であるように見えた。２５のコロニーが分析された。４のコロニーが所望の改変を有し、２１のコロニーが野生型に戻っていた。１のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
【００９０】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡが、ＳＴＭＭ２．５を用いた、ｐＨ制御された（Ｍｇ（ＯＨ）２）発酵において評価された。発酵物が分析された。結果が表４に要約されている。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡは、キシロースおよびグルコースを同時に消費した。産生された（Ｓ）−乳酸のキラル純度は９９．６％であり、これはキラル的に純粋であると考えられる。これらのデータは明らかに、G. thermoglucosidansにおけるメチルグリオキサール経路の明らかな不完全性にも拘らず、ｍｇｓＡの破壊が、キラル的に純粋な（Ｓ）−乳酸を産生する能力を結果することを示す。
【００９１】
【表４】
2019088328.tif 000006
【００９２】
実施例２
G. thermoglucosidansによるエナンチオピュアなホモ乳酸の産生
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡはなおも、有意な量のギ酸およびエタノールを産生し、酢酸は少量の副産物であった（表４）。ｐｌｆＡおよび／またはｐｆｌＢ、ならびにａｄｈＥの突然変異は、多くの細菌においてギ酸およびエタノールの産生に影響を及ぼすことが知られているが、これらの遺伝子を破壊することによる副作用は予測できない。
【００９３】
G. thermoglucosidansにおける遺伝子ｐｆｌＢ、ｐｆｌＡおよびａｄｈＥを（部分的に）欠損させるために、プラスミドｐＲＭ１２が構築された。ｐｆｌＢＡの上流隣接領域、および収束的に向きを定められるａｄｈＥの上流隣接領域が、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに上流ｐｆｌＢＡ断片を得るための７３９と８０５のプライマー組合せおよび上流ａｄｈＥ断片を獲得するための８０６と８０７のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。続いて、得られた２つのＰＣＲ産物は、これらを一緒に融合するために、７３９と８０７のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて、鋳型として用いられた。産物は、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片として、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたプラスミドｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされて、プラスミドｐＲＭ１２を結果した。ｐＲＭ１２の構築は、E. coli  ＤＨ５αにおいてなされた。ｐＲＭ１２ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
【００９４】
プラスミドｐＲＭ１２が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流ｐｆｌＢＡ隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、上流ａｄｈＥ隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
【００９５】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた１２０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。２のコロニーがクロラムフェニコールに感受性であった。一方が所望の改変を有し、他方は野生型に戻っていた。上記一方のコロニーがG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
【００９６】
【表５】
2019088328.tif 000007
【００９７】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥが、５．０ｇ／Ｌの酵母抽出物、６０ｇ／Ｌのグルコースおよび３０ｇ／Ｌのキシロースを含有するＳＴＭＭ培地を用いた、ｐＨ制御された（Ｃａ（ＯＨ）２）発酵において評価された。発酵物が３の時点で分析された。結果を表５にまとめる。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥは、キシロースおよびグルコースを同時に消費した。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｍｇｓＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥによって産生された（Ｓ）-乳酸のキラル純度は、９９．７％以上であった。酢酸およびギ酸の産生は、乳酸１ｇにつき６．７ｍｇであった。エタノール産生は、検出され得なかった。これらのデータは明らかに、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ複合体遺伝子の破壊が、エタノール、ギ酸および酢酸の産生を有意に低下させて、ホモ乳酸型の、キラル的に純粋な（Ｓ）−乳酸発酵を結果することを示す。
【配列表】
2019088328000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月18日(2019.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性かつ通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生し及びゲオバチルス（Geobacillus）属に属する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞。
【請求項２】
さらに、内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子が不活化されまたは欠損している、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
内在性の胞子形成遺伝子の不活化または欠損故の胞子形成欠損誘導体である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記胞子形成遺伝子がｓｉｇＦである、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも９８％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
少なくとも９９％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
少なくとも９９．５％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
少なくとも９９．８％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
少なくとも９９．９％のエナンチオマー純度を有する（Ｓ）−乳酸を産生する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
さらに、内在性のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）が不活化されまたは欠損している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子が、相同組換えによって不活化されまたは欠損している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項１３】
前記ゲオバチルス属の種がゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geobacillus thermoglucosidans）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
エナンチオマー的に純粋な（Ｓ）−乳酸の産生方法であって、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の好熱細菌細胞を培養すること、そして（Ｓ）−乳酸を単離することを含む方法。
【請求項１５】
前記炭素含有供給原料が、キシロース、グルコースまたはスクロースを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養が、５０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、１５重量％以下の副産物が形成される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、１０重量％以下の副産物が形成される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、５重量％以下の副産物が形成される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、４重量％以下の副産物が形成される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、３重量％以下の副産物が形成される、請求項請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、２重量以下の副産物が形成される、請求項請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、１０重量％以下である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、６重量％以下である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、１重量％以下である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、０．２５重量％以下である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
形成されたギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、０．１重量％以下である、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
すなわち、本発明は、第１の局面において、通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞を開示する。特には、本発明は、グラム陽性かつ通性嫌気性でありかつ（Ｓ）−乳酸を産生し及びゲオバチルス（Geobacillus）属に属する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡの不活化または欠損を含む細胞を開示する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本明細書において、ｍｇｓＡは、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子を指し、その配列は、ゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geobacillus thermoglucosidans）について、配列番号２３で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号２４で提供される。ｍｇｓＡに隣接するヌクレオチド領域は、配列番号１１、１２、１５および１６のＰＣＲプライマーによって同定され得る。