(57)【要約】【課題】レバウディオサイドＤの甘味質を有し、常温下でも水溶性に優れたステビオール配糖体組成物を提供する。【解決手段】レバウディオサイドＤをα−グルコシル化して得られる、レバウディオサイドＤの糖付加体であるα−グルコシルレバウディオサイドＤを５０％（Ｗ／Ｗ）以上含む、ステビオール配糖体組成物とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルコシルレバウディオサイドＤを５０％（Ｗ／Ｗ）以上含む、ステビオール配糖体組成物。
【請求項２】
α−グルコシルステビオール配糖体の含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、
α−グルコシルレバウディオサイドＤの含有量、または、レバウディオサイドＤおよびα−グルコシルレバウディオサイドＤの合計含有量が７０％（Ｗ／Ｗ）以上である、
ステビオール配糖体組成物。
【請求項３】
レバウディオサイドＤおよびα−グルコシルレバウディオサイドＤを含み、
レバウディオサイドＤに対するα−グルコシルレバウディオサイドＤの含量比が３．０以上である、
請求項１または２に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項４】
α−グルコシル残基量が１５．０％（Ｗ／Ｗ）以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項５】
当該組成物の１．００％（Ｗ／Ｖ）水溶液の、２０℃における波長６００ｎｍの可視光透過率が４０．００％以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項６】
当該組成物が水溶液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項７】
当該組成物が粉体又は顆粒である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項８】
甘味料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
【請求項９】
甘味料を含む飲料であって、当該甘味料の８０％（Ｗ／Ｗ）以上が請求項１〜５のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物である、飲料。
【請求項１０】
甘味料を含む食品であって、当該甘味料の８０％（Ｗ／Ｗ）以上が請求項１〜５のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物である、食品。
【請求項１１】
α−グルコシルレバウディオサイドＤを含むステビオール配糖体組成物の製造方法であって、
糖鎖供与体と、レバウディオサイドＤと、グルコシルトランスフェラーゼとを水溶液中で混合して酵素反応を行い、α−グルコシルレバウディオサイドＤを生成することと、
当該ステビオール配糖体組成物中のα−グルコシルレバウディオサイドＤの含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上になるようにすることと、
を含む製造方法。
【請求項１２】
前記糖鎖供与体がデキストリンであり、前記グルコシルトランスフェラーゼがデキストリングルコシルトランスフェラーゼである、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−グルコシルステビオール配糖体組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステビア甘味料は、キク科の植物ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａ  ＢＥＲＴＯＩ）（以下、「ステビア」と略称する。）の葉部から抽出精製した高甘味物質の混合品であり、高甘味を有する甘味料として知られている。ステビア高甘味成分は、主成分であるステビオサイドをはじめ、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、およびズルコサイドＡ（Ｄｕｌｕｃｏｓｉｄｅ  Ａ）の６種などが知られている。以下、本明細書において、レバウディオサイド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ）は「Ｒｅｂ」と略記し、レバウディオサイドＡ、Ｃ、Ｄ、およびＥのそれぞれを「Ｒｅｂ−Ａ」、「Ｒｅｂ−Ｃ」、「Ｒｅｂ−Ｄ」、および「Ｒｅｂ−Ｅ」と表記する場合がある。
【０００３】
ステビア抽出品には、主成分であるステビオサイドの比率の高い通常抽出品、あるいはＲｅｂ−Ａの含有量を多くし、味質の改善をした調整品が知られている。
【０００４】
一方でＲｅｂ−Ｄは、Ｒｅｂ−Ａよりも砂糖としての特徴と好ましい風味を示すことが知られており、そのようなＲｅｂ−Ｄを高濃度含む調整品も求められている。Ｒｅｂ−Ｄの精製法は、例えば特許文献１に報告されている。
【０００５】
しかしながら、Ｒｅｂ−Ｄは、室温での水中溶解性が低い。例えば特許文献２ではＲｅｂ−Ｄは、完全に溶解させるために、２時間に亘り水の沸点近くまで加熱する必要があることを報告している。このようにＲｅｂ−Ｄは水中溶解性が低いため、飲料や食品に用いることが困難である。そこで、より水溶性の高いＲｅｂ−Ｄが求められている。その解決手段として、例えば、特許文献３では、加熱処理したり、水溶性有機酸若しくはその塩、可溶化向上剤、増粘剤、または抗凝集剤などを添加剤として用いたりすることが提案されている。
【０００６】
またステビア抽出物の味質を改質する手段として、ステビア抽出物をα−グルコシル化したステビア抽出物およびその調節品について報告がなされている（特許文献４および５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８４１４９４９号公報
【特許文献２】特開２０１７−５１２０３号公報
【特許文献３】特開２０１６−１６５２９８号公報
【特許文献４】特公平５−２２４９８号公報
【特許文献５】特許３５０８１２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献３に記載の方法のように、水溶性有機酸又はその塩などの添加剤を用いると、Ｒｅｂ−Ｄ特有の甘味質が変質して損なわれてしまうおそれがある。そこで、本発明は、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質を有しつつ、常温下でも水溶性に優れたステビオール配糖体組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究の結果、Ｒｅｂ−Ｄをα−グルコシル化して糖鎖を付加することにより、Ｒｅｂ−Ｄと同じ又はほぼ同等の甘味質を維持しつつ、常温下でも水溶性に優れたＲｅｂ−Ｄの改質体が得られることを見出し、以下に示す本発明を完成させるに至った。
【００１０】
〔１〕α−グルコシルレバウディオサイドＤを５０％（Ｗ／Ｗ）以上含む、ステビオール配糖体組成物。
〔２〕α−グルコシルステビオール配糖体の含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、
α−グルコシルレバウディオサイドＤの含有量、または、レバウディオサイドＤおよびα−グルコシルレバウディオサイドＤの合計含有量が７０％（Ｗ／Ｗ）以上である、
ステビオール配糖体組成物。
〔３〕レバウディオサイドＤおよびα−グルコシルレバウディオサイドＤを含み、
レバウディオサイドＤに対するα−グルコシルレバウディオサイドＤの含量比が３．０以上である、
上記〔１〕または〔２〕に記載のステビオール配糖体組成物。
〔４〕α−グルコシル残基量が１５．０％（Ｗ／Ｗ）以上である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
〔５〕当該組成物の１．００％（Ｗ／Ｖ）水溶液の、２０℃における波長６００ｎｍの可視光透過率が４０．００％以上である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
〔６〕当該組成物が水溶液である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
〔７〕当該組成物が粉体又は顆粒である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
〔８〕甘味料である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物。
〔９〕甘味料を含む飲料であって、当該甘味料の８０％（Ｗ／Ｗ）以上が上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物である、飲料。
〔１０〕甘味料を含む食品であって、当該甘味料の８０％（Ｗ／Ｗ）以上が上記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のステビオール配糖体組成物である、食品。
〔１１〕α−グルコシルレバウディオサイドＤを含むステビオール配糖体組成物の製造方法であって、
糖鎖供与体と、レバウディオサイドＤと、グルコシルトランスフェラーゼとを水溶液中で混合して酵素反応を行い、α−グルコシルレバウディオサイドＤを生成することと、
当該ステビオール配糖体組成物中のα−グルコシルレバウディオサイドＤの含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上になるようにすることと、
を含む製造方法。
〔１２〕前記糖鎖供与体がデキストリンであり、前記グルコシルトランスフェラーゼがデキストリングルコシルトランスフェラーゼである、上記〔１１〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、Ｒｅｂ−Ｄと同じ又はほぼ同等の甘味質を有し、常温下でも水溶性に優れたステビオール配糖体組成物を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。
なお、本発明の説明においては、特段の規定がない限り、数値範囲を示す「ＡＡ〜ＢＢ」という記載は、「ＡＡ以上ＢＢ以下」を意味する（「ＡＡ」および「ＢＢ」は任意の数値を示す）。
【００１３】
＜１．ステビオール配糖体組成物＞
本発明のステビオール配糖体組成物は、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを主成分として含む組成物である。Ｒｅｂ−Ｄ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ｄ）は、下記式（１）により表されるステビオール配糖体である。
【００１４】
【化１】
2019088246.tif 000002
【００１５】
式（１）中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ次のとおり表される糖鎖である。下記Ｒ1およびＲ2に係る式中「Ｇｌｃ」はグルコース残基を表す。
【００１６】
【化２】
2019088246.tif 000003
【００１７】
本発明において、「α−グルコシルＲｅｂ−Ｄ」（α−グルコシルレバウディオサイドＤ）との用語は、α−グルコシル化されたＲｅｂ−Ｄを意味し、より具体的には、Ｒｅｂ−Ｄに対しα−グルコース分子が付加されたＲｅｂ−Ｄの誘導体を意味する。すなわち、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄは、Ｒｅｂ−Ｄと対比して、α−グルコース残基の数が増加しているものであればよい。α−グルコース分子は、例えば、上記Ｒ1およびＲ2の一方又は双方に付加されうる。また、上記Ｒ1およびＲ2のそれぞれに付加されたα−グルコース残基の数は、１又は複数でありうる。上記Ｒ1およびＲ2の双方にα−グルコース残基が付加されている場合、双方の基が有するα−グルコース残基の数は、同じ数であっても異なる数であってもよい。付加されたα−グルコー残基の数は、好ましくは１〜２０残基程度、より好ましくは１〜１０残基程度であり、さらに好ましくは１〜５残基程度である。水溶性および甘味質に係る本発明の効果が失われない限り、α−グルコース残基の数が上記の好ましい範囲を上回るα-グルコース残基を有するα−グルコシルＲｅｂ−Ｄが、本発明のステビオール配糖体組成物中に含まれていてもよい。Ｒｅｂ−Ｄに対する付加部位は、α−グルコース残基が連続して結合している糖鎖となっていることが好ましいが、本発明の効果が失われない範囲において、または、付加部位の一部にα−グルコース残基の分子数を超えない範囲において、他の糖残基が含まれていてもよい。
【００１８】
本発明のステビオール配糖体組成物は、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを少なくとも５０％（Ｗ／Ｗ）含む。当該組成物中のα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含有量は、好ましくは６０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、より好ましくは７０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、さらに好ましくは７５、８０、８５、または９０％（Ｗ／Ｗ）以上である。
【００１９】
Ｒｅｂ−Ｄを５０％（Ｗ／Ｗ）以上含む組成物では、Ｒｅｂ−Ｄの濃度が上がるほど水に対する溶解性が低くなり、常温下においては攪拌しても溶解せずに残渣が残ってしまう傾向が顕著となる。しかし、本発明のステビオール配糖体組成物は、Ｒｅｂ−Ｄを改質したα−グルコシルＲｅｂ−Ｄを主成分としており、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質を有していながら、常温下においてＲｅｂ−Ｄよりも水に溶解しやすい。なお、本明細書において、「常温」とは１５〜２５℃の範囲を意味し、代表的な温度としては約２０℃を意味する。
【００２０】
本発明のステビオール配糖体組成物は、一実施形態として、Ｒｅｂ−Ｄを主成分とするステビオール配糖体組成物を原料として製造することができる。この場合、未反応のＲｅｂ−Ｄが少ないほど組成物としての水溶性は向上する。本発明のステビオール配糖体組成物中のＲｅｂ−Ｄの含有量は、好ましくは１０％（Ｗ／Ｗ）以下であり、より好ましくは５％（Ｗ／Ｗ）以下であり、さらに好ましくは３．０、１．０、０．１、または０．０５％（Ｗ／Ｗ）以下である。
【００２１】
本発明のステビオール配糖体組成物は、他の一実施形態として、（Ａ）α−グルコシルステビオール配糖体の含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、且つ（Ｂ）α−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含有量、または、Ｒｅｂ−Ｄおよびα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの合計含有量が７０％（Ｗ／Ｗ）以上である、ステビオール配糖体組成物でありうる。上記のとおり、本発明のステビオール配糖体組成物は、Ｒｅｂ−Ｄおよびその他のステビオール配糖体を含むステビア抽出物やその調整品を原料として製造しうる。この場合、本発明のステビオール配糖体組成物は、α−グルコシルステビオール配糖体、Ｒｅｂ−Ｄおよびα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの量が上記のような形態を採りうる。
【００２２】
上記（Ａ）および（Ｂ）を満たす実施形態において、α−グルコシルステビオール配糖体の含有量は、好ましくは６０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、より好ましくは７０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、さらに好ましくは７５、８０、８３、８５または９０％（Ｗ／Ｗ）以上である。
【００２３】
また、上記（Ａ）および（Ｂ）を満たす実施形態において、α−グルコシルレバウディオサイドＤの含有量、または、レバウディオサイドＤおよびα−グルコシルレバウディオサイドＤの合計含有量は、好ましくは７５％（Ｗ／Ｗ）以上であり、より好ましくは８０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、さらに好ましくは８３、８５、または９０％（Ｗ／Ｗ）以上である。
【００２４】
本発明のステビオール配糖体組成物がＲｅｂ−Ｄおよびα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの双方を含む場合、Ｒｅｂ−Ｄに対するα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含量比（重量比）は、好ましくは３．０以上であり、より好ましくは３．３以上であり、さらに好ましくは３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０以上でありうる。Ｒｅｂ−Ｄが残存する場合であっても、Ｒｅｂ−Ｄとα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含量比を上記のようにすることによって、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質をより良好に保持しつつ、常温下の水溶性が改善されたステビオール配糖体組成物を得ることができる。
【００２５】
本発明のステビオール配糖体組成物の他の一実施形態としては、α−グルコシル残基量が、好ましくは１５．０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、より好ましくは２０．０％（Ｗ／Ｗ）以上であり、さらに好ましくは３０．０または３５．０％（Ｗ／Ｗ）以上であるステビオール配糖体組成物でありうる。α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを主成分として含む本発明のステビオール配糖体組成物において、α−グルコシル残基量が上記のような値であると、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄが十分に含まれており、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質を有しつつ常温下での水溶性が良好である。他方、α−グルコシル残基量の上限は、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質を保つ観点からすると、好ましくは６０％（Ｗ／Ｗ）以下であり、より好ましくは５０％（Ｗ／Ｗ）以下であり、さらに好ましくは４０％（Ｗ／Ｗ）以下でありうる。
【００２６】
なお、α−グルコシル残基量は、食品添加物公定書第８版および２０１６年ＪＥＣＦＡ（Ｊｏｉｎｔ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）規格の「Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ」などの記載に準じて測定することができる。α−グルコシル残基量については、下記実施例に記載の方法にて測定できる。
【００２７】
本発明のステビオール配糖体組成物の他の一実施形態としては、水に対する溶解度の観点から、当該組成物の１．００％（Ｗ／Ｖ）水溶液の、２０℃における波長６００ｎｍの可視光透過率が４０．００％以上であるステビオール配糖体組成物でありうる。このような可視光透過率を有する場合、本発明のステビオール配糖体組成物は２０℃の水溶液に対して少なくとも半溶解性を有する。可視光透過率は、より好ましくは、６０．００％以上であり、さらに好ましくは７０．００、８０．００、９０．００、または９５．００％以上である。可視透過率が９０．００％以上であれば、十分に溶解したといえる状態である。可視光透過率の高い値を有する組成物ほど、溶液状態での製品化、または飲料などへの添加物として好適である。なお、可視光透過率は、分光光度計を用いて測定可能であり、具体的には下記の実施例に示す方法により測定できる。
【００２８】
本発明のステビオール配糖体組成物の用途として好ましくは、甘味料が挙げられる。本発明のステビオール配糖体組成物は、Ｒｅｂ−Ｄと同じまたはほぼ同等の甘味質を有しているため、Ｒｅｂ−Ｄ特有の甘味質が求められるような場合に好適に用いることができる。Ｒｅｂ−Ｄは独特なすっきりとした切れの良い甘味質を有するが、水溶性が低いため、飲料および食品（以下、まとめて飲食品という場合がある。）への利用がしにくかった。しかし、本発明のステビオール配糖体組成物は、Ｒｅｂ−Ｄの甘味質を保持しつつ、常温下においても水溶性が向上しているため、Ｒｅｂ−Ｄを代替またはＲｅｂ−Ｄと併用する甘味料として、飲食品に対し広範囲に利用できる。
【００２９】
本発明のステビオール配糖体組成物には、他の任意成分が含まれていてもよい。例えば、本発明のステビオール配糖体組成物には、上記α−グルコシルＲｅｂ−Ｄの他に、ステビオサイド、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＢ、Ｒｅｂ−Ａ、Ｒｅｂ−Ｂ、Ｒｅｂ−Ｃ、Ｒｅｂ−Ｅ、Ｒｅｂ−Ｇ、Ｒｅｂ−Ｉ、Ｒｅｂ−Ｈ、Ｒｅｂ−Ｌ、Ｒｅｂ−Ｋ、Ｒｅｂ−Ｊ、Ｒｅｂ−Ｍ、Ｒｅｂ−ＮまたはＲｅｂ−Ｏなどの他のステビオール配糖体成分が含まれていてもよい。また、本発明のステビオール配糖体組成物には、さらに他の糖質が含まれていてもよい。他の糖質としては、例えば、グルコース、フラクトース、ガラクトースなどの単糖類、マルトール、イソマルトース、ラクトース、パラチノースなどの二糖類、マルトトリオース、エルロース、ラフィノース、ラクトスクロース、ケストース等の三糖類、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール等の糖アルコールなどが挙げられる。さらに、本発明のステビオール配糖体組成物には、糖質以外の甘味料成分が含まれていてもよい。糖質以外の甘味料成分としては、例えば、Ｌ−アスパルテル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（アスパルテーム）、サッカリン、グリチルリチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ネオテーム、アドバンテーム、ラカンカ、ソーマチンなどが挙げられる。本発明のステビオール配糖体組成物中におけるこれらの他の糖質および糖質以外の甘味料成分の含有量は５０％（Ｗ／Ｗ）未満であり、好ましくは３０％（Ｗ／Ｗ）以下であり、より好ましくは２０％（Ｗ／Ｗ）以下であり、さらに好ましくは１０、５、または３％（Ｗ／Ｗ）以下である。本発明のステビオール配糖体組成物には、さらに一般的に甘味料において用いられる、他の任意成分がさらに配合されていてもよい。
【００３０】
本発明のステビオール配糖体組成物は、水溶液であってもよいし、粉末または顆粒状の固形物であってもよい。水溶液の場合、Ｒｅｂ−Ｄに比べて、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄは水に溶けやすく、再結晶化しにくいため、工業的に大量生産される飲食品に添加する甘味料として利用しやすい。また、粉末または顆粒状などの固形物の場合でも、Ｒｅｂ−Ｄに比べ、常温下でも水に溶解しやすいので、飲食品に添加する甘味料として用いることに適している。
【００３１】
本発明のステビオール配糖体組成物を飲食品に添加する場合、その配合量は、飲食品の種類などの諸条件に応じて適宜調整してよい。本発明のステビオール配糖体組成物を用いてＲｅｂ−Ｄのような特有の甘味質を付与するする観点からは、当該飲食品に配合される甘味料全体のうち、８０、８５、または９０％（Ｗ／Ｗ）以上を本発明のステビオール配糖体組成物とすることが好ましい実施形態でありうる。あるいは、当該飲食品に配合される甘味料全体のうちα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの配合量が、５０、６０、７０、７５、８５、または９０％（Ｗ／Ｗ）以上であることが好ましい実施形態でありうる。
【００３２】
本発明のステビオール配糖体組成物を添加するのに好適な飲食品としては、例えば、果汁入り飲料、野菜飲料、栄養飲料などの酸性飲料、サイダー類、コーラ類、ガラナ、ジンジャーエールなどの炭酸飲料、コーヒー、紅茶、乳飲料、甘酒などの各種飲料、ゼリー、ムース、アイスクリーム、シャーベット、プリン、ヨーグルト等のデザート類、チョコレート、クッキー、ケーキ、チューインガム等の菓子類、ハードキャンディ、ソフトキャンディなどのキャンディ類、水産練り製品、漬物、ドレッシング、醤油、たれなどの塩性食品および調味料等が挙げられる。
【００３３】
＜２．ステビオール配糖体組成物の製造方法＞
本発明のステビオール配糖体組成物は、Ｒｅｂ−Ｄをα−グルコシル化して、所定の濃度以上のα−グルコシルＲｅｂ−Ｄを生成することによって得ることができる。一実施形態としては、例えば、（Ｉ）糖鎖供与体と、Ｒｅｂ−Ｄと、グルコシルトランスフェラーゼとを水溶液中で混合して酵素反応を行い、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを生成することと、（ＩＩ）当該ステビオール配糖体組成物中のα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上になるようにすること、によって本発明のステビオール配糖体組成物を製造することができる。
【００３４】
糖供与体としては、例えばα−グリコシル糖化合物、好ましくはα−グルコシル糖化合物などを用いうる。α−グルコシル糖化合物としては、例えばデキストリンなどが挙げられ、好ましくはサイクロデキストリンが挙げられる。
【００３５】
グルコシルトランスフェラーゼとしては、好ましくはα−グルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。糖供与体がデキストリンまたはシクロデキストリンである場合、グルコシルトランスフェラーゼとして、好ましくはデキストリングルコシルトランスフェラーゼまたはシクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼをそれぞれ用いうる。またグルコシルトランスフェラーゼとしては、例えばα１，４結合の形成を触媒するものが好適な酵素として挙げられる。
【００３６】
Ｒｅｂ−Ｄを含む原料としては、Ｒｅｂ−Ｄが含まれていれば一般的に入手可能なステビア抽出物を用いうるが、糖質としてＲｅｂ−Ｄを高濃度で含むものが好適である。Ｒｅｂ−Ｄを含む原料の例としては、Ｒｅｂ−Ｄを、好ましくは５０％（Ｗ／Ｗ）以上含み、より好ましくは６０％（Ｗ／Ｗ）以上含み、さらに好ましくは７０、７５、８０、８５、または９０％（Ｗ／Ｗ）以上含むものが挙げられる。高濃度のＲｅｂ−Ｄを含む原料を用いることにより、十分に酵素反応を行った後に溶媒を除去して固形物にすることにより、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを所定含有量以上含む本発明のステビオール配糖体組成物を容易に製造することができる。また、高濃度のＲｅｂ−Ｄを含む原料を用いることにより、吸着樹脂等を用いて精製する場合でも、精製前の段階でα−グルコシルＲｅｂ−Ｄが既にある程度高濃度の本発明のステビオール配糖体組成物とすることができるため、微量成分の精製に比べ、精製工程を簡素化し、大量生産が容易である。なお、Ｒｅｂ−Ｄを高濃度で含むステビオール配糖体組成物は、市販入手可能である。また、Ｒｅｂ−Ｄは、例えば米国特許第８４１４９４９号公報などに記載の方法で精製しうる。
【００３７】
酵素反応は、糖鎖供与体と、Ｒｅｂ−Ｄを含む原料と、グルコシルトランスフェラーゼとを水溶液中で混合して行う。酵素反応の温度、ｐＨ条件、反応時間などの諸条件は、酵素反応における一般的な条件設定に従って適宜調整してよい。例えば、α−グルコシル化については、特公平５−２２４９８号公報、特公昭５７−１８７７９号公報、および特許第３５０８１２７号公報などの文献があり、これらを参照しうる。
【００３８】
ステビオール配糖体組成物中のα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含有量が５０％（Ｗ／Ｗ）以上になるようにする方法は特に限定されるものではなく、例えば、（１）上記のように高濃度のＲｅｂ−Ｄを含む原料を用い、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを十分に生成させることにより行ってももよいし、あるいは、（２）酵素反応液をさらに濃縮または精製することにより行ってもよい。
【００３９】
Ｒｅｂ−Ｄなどのステビオール配糖体へのα−グルコシル化については、Ｒｅｂ−Ｄへの糖付加の位置は限定されず、特に制御しなくてもよい。
【００４０】
付加する糖鎖の量または長さは、酵素反応の反応時間や温度などによって調整することができる。また、酵素反応により一旦付加した糖鎖を、アミラーゼなどの酵素を用いて切断し、糖鎖の量または長さを調整することもできる。アミラーゼとしては、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどを用いうる。
【００４１】
α−グルコシル化反応を行った後、α−グルコシルＲｅｂ−Ｄを精製し、未反応糖供与体、未反応Ｒｅｂ−Ｄ、および失活させた酵素などの残渣を取り除いてもよい。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を挙げて本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４３】
＜実施例１および２＞
以下のようにして、高濃度Ｒｅｂ−Ｄの糖転移品（実施例１）および糖鎖調節品（実施例２）を合成した。
【００４４】
（１）高純度Ｒｅｂ−Ｄを原料に用いた酵素反応
試薬として以下のものを使用した。
・Ｒｅｂ−Ｄ高含有品「ＲＥＢＡＵＤＩＯＳＩＤＥ  Ｄ  ９５％」（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｉｎｋｏ  Ｇｒｏｕｐ製、組成は表１参照）
・デキストリン「サンデック＃７０」（三和澱粉工業株式会社製）
・塩化カルシウム（市販品）
・脱イオン水
・サイクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ（株式会社林原製）
・α−アミラーゼ「スピターゼＣＰ４０ＦＧ」（ナガセケムテックス株式会社製）
・β−アミラーゼ「β−アミラーゼＬ」（ナガセケムテックス株式会社製）
【００４５】
【表１】
2019088246.tif 000004
【００４６】
（２）糖転移反応
デキストリン２５ｇを脱イオン水４００ｍｌに加熱溶解させ、冷却した。次いで、Ｒｅｂ−Ｄ高含有品１０ｇ、塩化カルシウム０．２ｇを加えた。ｐＨを５．３に調整、７０℃まで加熱した後、サイクロデキストリングルコシルトランスフェラーゼ０．６ｍｌを添加し、７０℃で９時間反応させた。反応開始時に反応溶液は白濁していたが、３時間後には澄明となった。その後、９５℃で３０分間加熱し酵素を失活、反応を終了させ、ろ紙（Ｎｏ．５Ｃ）にてろ過を行い、溶液を約４００ｍｌ得た。この溶液を等分し、一方（反応液Ａ）は高純度Ｒｅｂ−Ｄの糖転移品を得るため吸着樹脂精製にかけた。もう一方は糖鎖調節品の合成に使用した。
【００４７】
（３）糖鎖調節反応
以下のように、糖転移反応で得た溶液のうち、約半分（約２００ｍｌ）を糖鎖調節反応の原料として使用して、糖鎖調節品を調製した。
【００４８】
糖鎖調節品用に準備した原料のｐＨを６．３に調整後、α−アミラーゼを０．０３ｇ、β−アミラーゼ０．１ｇを加え、５５℃で４時間反応させた。その後、９５℃で３０分間加熱し酵素を失活、反応を終了させ、ろ紙（Ｎｏ．５Ｃ）にてろ過を行いろ液を回収（反応液Ｂ）、吸着樹脂精製にかけた。
【００４９】
（４）吸着樹脂精製
反応液Ａと反応液Ｂの精製を以下の手順にて行った。
合成吸着樹脂ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）を１３８ｍｌ充填したカラムに反応液を通じ甘味成分を吸着させた。反応液通液後、樹脂体積の１５倍量（２０７０ｍｌ）の脱イオン水にて洗浄した後、９０％（体積濃度）メタノールを７倍量（９６６ｍｌ）カラムに通液させ、吸着した甘味成分を溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮した後、７０℃で乾燥させた。
【００５０】
以上の精製により、反応液Ａから６．５ｇの白色粉末（実施例１：糖転移品）を得た。反応液Ｂからは、５．５ｇの白色粉末（実施例２：糖鎖調節品）を得た。
【００５１】
＜糖付加の程度分析１：酵素処理ステビアの食品添加物公定書に準拠した分析＞
食品添加物公定書第８版に記載の「α−グルコシルトランスフェラーゼ処理ステビア」に準拠して実施例１および実施例２の分析を行った。
【００５２】
但し、ステビオール配糖体の分析は、２０１６年ＪＥＣＦＡ規格の「Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｓｔｅｖｉａ  Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ」に記載の手法に則り行った。
【００５３】
実施例１および実施例２各々の粉末約１ｇを水約５０ｍｌに溶解させ、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着用樹脂５０ｍｌを充てんした内径約２５ｍｍのガラス管に注ぎ、１分間に３ｍｌ以下の速さで流出させ、次いで水２５０ｍｌで洗浄した後、５０ｖｏｌ％エタノール２５０ｍｌを１分間に３ｍｌ以下の速さで流した。この溶出液を約１００ｍｌまで濃縮し酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４０ｍｌを加え、更に水を加えて約１８０ｍｌとした。得られた液を５５℃で５分振とうした後、グルコアミラーゼとして「グルコチーム＃２００００」（ナガセケムテックス社製）を０．２ｇ加え、５５℃で６０分振とうした。更に９５℃で約３０分間加熱失活した後、室温まで冷却し、脱イオン水を加えて正確に２００ｍｌとし、検液とした。別に定量用ステビオシドを乾燥し、その約３０ｍｇを精密に量り、脱イオン水／アセトニトリル＝２／１（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）溶媒に溶かして正確に５０ｍｌとし、ステビオシド標準液とした。検液及びステビオシド標準液をＪＥＣＦＡ規格のステビオール配糖体の定量法を準用して、高速液体クロマトグラフィーにより定量を行った。
【００５４】
［分析条件］
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ（Ｍ）２５０ｍｍ（株式会社島津ジーエルシー社製）
溶離液：リン酸緩衝液（ｐＨ２．６）／アセトニトリル＝２０００／９４１（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）
カラム温度：４０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【００５５】
次に、検液２０μｌを量り、Ｄ−グルコース定量用発色試液３ｍｌを正確に加えて振り混ぜた後、３７℃で正確に５分間放置した。室温まで冷却した後、波長５０５ｎｍにおける吸光度を測定した。対照液は、脱イオン水２０μｌを用いて検液と同様に操作して調製した。別に空試験を行い補正した。空試験液は、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４０ｍｌを正確に量り、水を加えて約１８０ｍｌとしたものを、５５℃で５分振とうした後、グルコアミラーゼ０．２ｇを加え、５５℃で６０分間放置し、更に９５℃で約３０分間加熱し、室温まで冷却し、水を加えて正確に２００ｍｌとした液を調製して用いた。空試験液を検液と同様に操作して、吸光度を測定した。別にブドウ糖を脱イオン水に溶解させ所定濃度の標準液を調製した。これらの標準液につき、検液と同様に操作して吸光度を測定し、検量線を作成した。この検量線と補正した検液の吸光度から検液中のＤ−グルコース濃度を求め、次式により検液中のα−グルコシル残基量（単位：Ｗ／Ｗ％）を求めた。
【００５６】
【数１】
2019088246.tif 000005
【００５７】
次いで、α−グルコシルステビオール配糖体及び未反応のステビオール配糖体の総量を次式により求め、総純度（単位：％（Ｗ／Ｗ））とした。
【００５８】
【数２】
2019088246.tif 000006
【００５９】
次いで、α−グルコシルステビオール配糖体の定量を行った。実施例１および実施例２各々の粉末約２０ｍｇを精密に量り、脱イオン水／アセトニトリル＝２／１（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）溶媒に溶かして正確に１０ｍｌとし、検液とした。検液及びステビオシド標準液につきステビオール配糖体量を測定し、未反応のステビオール配糖体量を求めた。そして次式によりα−グルコシルステビオール配糖体の含量（単位：％（Ｗ／Ｗ））を求めた。
【００６０】
【数３】
2019088246.tif 000007
【００６１】
糖付加の程度の測定結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2019088246.tif 000008
【００６３】
＜糖付加率の程度分析２：糖付加数分布の分析＞
実施例１および実施例２各々の粉末を約１ｍｇ／ｍｌとなるよう脱イオン水／メタノール＝１／１（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）溶媒に溶解させ、検液とした。検液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。
【００６４】
［分析条件］
カラム：ＲＳｐａｋ  ＤＣ−６１３（株式会社  昭和電工株式会社  製）
溶離液：溶離液Ａ  アセトニトリル／水＝１／１  （Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）
溶離液Ｂ  アセトニトリル
直線グラジエント：０分  Ａ：Ｂ＝３２：６８  →  ６０分  Ａ：Ｂ＝１００：０
カラム温度：４０℃
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ  ２１０ｎｍ
【００６５】
各保持時間のピークと成分の対応を下記表３の通りとし、ピーク面積に分子量補正をしつつ含量比を計算した。Ｒｅｂ−Ｄの含量を１とした。Ｒｅｂ−Ｄにグルコースが１分子、２分子または３分子付加したα−グルコシルＲｅｂ−Ｄの含量比は、それぞれ表３に示すとおりであった。なお、Ｒｅｂ−Ｄに対してグルコースが４分子以上付加したと予測されるピークも検出されたが、同定はしていない。
【００６６】
【表３】
2019088246.tif 000009
【００６７】
＜溶解度の定量化＞
原料の高純度Ｒｅｂ−Ｄ（比較例）、実施例１および実施例２の３つのサンプルの溶解度を比較した。
【００６８】
試験管に各サンプルを採取した後、常温の脱イオン水を添加し所定濃度の溶液を調製した。その後、マグネッチクスターラーにて１時間撹拌を行った。
【００６９】
溶解度は分光光度計（Ｖ−６５０ＤＳ  日本分光株式会社）により波長６００ｎｍの可視光透過率（％）を測定し、溶解度（透明性）の指標とした。コントロールとして脱イオン水の透過率を１００とし、透過率９０％以上を溶解（透明）、４０〜８９％を半溶解（半透明）、３９％以下を不溶（白濁）と定義した。表４〜６に、各サンプルの所定濃度における透過率の測定結果および溶解度の判定結果を示す。表中の可視光透過率の単位は％である。
【００７０】
溶解上限は、高純度Ｒｅｂ−Ｄは０．０５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）、実施例１は１０〜１５％（Ｗ／Ｖ）、実施例２は３〜５％（Ｗ／Ｖ）と推定された。
【００７１】
【表４】
2019088246.tif 000010
【００７２】
【表５】
2019088246.tif 000011
【００７３】
【表６】
2019088246.tif 000012
【００７４】
＜溶解度目視＞
原料の高純度Ｒｅｂ−Ｄ（比較例）、実施例１および実施例２の３つのサンプルの溶解度を比較した。
【００７５】
各サンプルを、常温の脱イオン水に溶解させ、所定濃度の溶液を作成した。その後、マグネッチクスターラーにて１時間撹拌を行い目視にて溶解状態を確認した。目視による溶解状態の判定結果を表７〜９に示す。
【００７６】
溶解上限は、高純度Ｒｅｂ−Ｄでは０．０５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）、実施例１では１５〜２０％（Ｗ／Ｖ）、実施例２では５〜７％（Ｗ／Ｖ）と推定された。
【００７７】
【表７】
2019088246.tif 000013
【００７８】
【表８】
2019088246.tif 000014
【００７９】
【表９】
2019088246.tif 000015
【００８０】
＜味質確認＞
原料である高純度Ｒｅｂ−Ｄ（比較例）と酵素反応により得られた実施例１および実施例２の３つのサンプルについて味質確認を行った。
【００８１】
実施例１および実施例２については吸着樹脂精製の操作後に残存するメタノールを除去するため、一旦脱イオン水に完全に溶解させた後、減圧乾燥、次いで７０℃で乾燥させ、メタノールが除去された粉末を味質確認に使用した。
【００８２】
蔗糖に対する相対甘味度を、高純度Ｒｅｂ−Ｄを２７０倍、実施例１を１２０倍、実施例２を１５０倍として、３つのサンプルを蔗糖の５％（Ｗ／Ｖ）相当の甘味度になるように飲料水に添加しパネラー５名で評価を行った。
【００８３】
その結果、３サンプルの甘味質について優位な差はなく、酵素反応により甘味質が変わることはなかった。