(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオファブリケートされた皮革材料を製造するために用いることができる組換えコラーゲンを産生するための方法、バイオファブリケートされた材料を含む物品、組換えもしくは操作コラーゲンを含有する皮革様特性を有する材料の提供。【解決手段】酵母細胞中でヒドロキシル化コラーゲンを産生する、組換え酵母細胞であって、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、前記組換え酵母細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え酵母細胞であって、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドを含む、前記組換え酵母細胞。
【請求項２】
前記αケトグルタル酸トランスポーターが、配列番号１と少なくとも９０％同一である配列を有する、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、前記酵母細胞中の発現のために最適化されている、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、前記酵母細胞のゲノム中に組み換えられるか、または前記酵母細胞中のコード配列ｍＲＮＡの産生を可能にする転写制御要素を含む組換えベクター中にエピソーム的に存在する、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項５】
コラーゲン、またはそのコラーゲン断片をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項６】
プロリル４−ヒドロキシラーゼ、プロリル３−ヒドロキシラーゼ、及びリシルヒドロキシラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項７】
前記コラーゲンまたはそのコラーゲン断片が、少なくとも１つのヒドロキシリシル残基においてグリコシル化されている、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項８】
グリコシルヒドロキシラーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項９】
前記酵母細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の組換え酵母細胞を産生するための方法であって、前記酵母細胞中のコード配列ｍＲＮＡの産生を可能にする１つ以上の転写制御要素に作動可能に連結されるαケトグルタル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチドで前記酵母細胞を形質転換することを含む、前記方法。
【請求項１１】
酵母細胞中でヒドロキシル化コラーゲンを産生する方法であって、請求項１に記載の組換え酵母細胞を培地中で培養することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記培養において前記組換え酵母細胞によって産生された前記改変組換えコラーゲンを単離または精製することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法によって得られるコラーゲン。
【請求項１４】
請求項１３に記載のコラーゲンを含む、バイオファブリケートされた皮革材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆｉｂｒｉｌｓと題名が付けられた米国特許出願第１５／４３３，５６６号、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  ａ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆｉｂｒｉｌｓと題名が付けられた同第１５／４３３，６５０号、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｔｒａｉｎｓと題名が付けられた同第６２／５２６，９１２号、及びＹｅａｓｔ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎと題名が付けられた同第６２／５３９，２１３号に関し、かつＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｔｒａｉｎｓと題名が付けられ、２０１７年９月２２日に出願された同第６２／５６２，１０９号の優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本明細書のこの発明は、酵母の遺伝子操作を受けた株、ならびに組換えタンパク質及び炭水化物を産生するための方法を提供する。ある実施形態では、本明細書の発明は、酵母の遺伝子操作を受けた株、ならびにバイオファブリケートされた皮革材料を製造するために用いることができる組換えコラーゲンを産生するための方法、バイオファブリケートされた材料を含む物品、及び／または組換えもしくは操作コラーゲンを含有する皮革様特性を有する材料を提供する。酵母株は、αケトグルタル酸トランスポーター（ｋｇｔＰ）、及び／またはＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼ、イノシトール−リン酸ホスファターゼ、ＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼならびに／もしくはＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、アルドノラクトナーゼ、グルクロノラクトンレダクターゼ、Ｄ−グルクロン酸レダクターゼ、ウロノラクトナーゼ、Ｄ−グルクロノキナーゼ、グルクロン酸−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ、ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼ、及び／またはヘキソキナーゼなどの、アスコルビン酸合成経路が機能することを可能にする１つ以上のポリペプチドの使用を通してヒドロキシル化反応を改善することによって、増加した量のヒドロキシル化タンパク質（例えば、コラーゲン）及び炭水化物を産生するように改変される。
【０００３】
関連技術の記載
皮革は、家具装飾品、衣類、靴、旅行かばん、ハンドバッグ及びアクセサリー、ならびに自動車の用途を含む多種多様な用途で使用される。皮革の推定される世界規模の貿易額は、およそ年間１，０００億ＵＳドルであり（Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｌｅａｔｈｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｉｅｎｎａ，２０１０）、皮革製品に対する継続かつ増加する需要がある。伝統的な皮革の生産は、動物の皮及び化学物質に関して浪費している。皮革製品への継続かつ増加する需要を維持するための動物の皮への増え続ける需要は、我々の増々緊迫した食料源にさらなる圧力を与え、一方化学廃棄物は、我々のむしばまれる環境条件の一因となり続ける。したがって、皮革の製造に関する経済的、環境的及び社会的損失の点からみて、この需要を満たすための新たな方法が必要とされる。技術的及び美的傾向に追いつくために、皮革製品の製造業者及びユーザは、天然成分を取り入れる、優れた強度、均一性、加工性、及びファッショナブルかつ魅力的な美的特性を呈する新材料を探し求めている。
【０００４】
人口増加及び地球環境を考慮すれば、皮に似た美観及び改善された機能性を有する代替材料が必要となるであろう。皮革は、動物の皮であり、ほとんど全てがコラーゲンからなる。バイオファブリケートされた材料に組み込まれ得るコラーゲンの新たな供給源が必要とされている。
【０００５】
組換え的に発現されたコラーゲンを用いるバイオファブリケートされた材料の生産は、多様な商用用途に必要な形態及び量で、コラーゲンを効率的に生産する方法に対する必要性を含む、多くの課題に直面している。一部の用途には、より柔らかく、より浸透性のコラーゲン成分が望ましく、他のものでは、より硬く、より耐性があり、かつ耐久性のコラーゲン成分が必要とされる。
【０００６】
本発明者らは、組換え酵母細胞がアスコルビン酸を産生するように、αケトグルタル酸トランスポーターを提供するｋｇｔＰ遺伝子で、及び／またはアスコルビン酸合成経路が機能することを可能にする１つ以上の遺伝子で組換え酵母を操作することによって、これらの課題に対処しようとした。
【０００７】
発明の概要
本発明の一態様は、α−ケトグルタル酸トランスポーターを含有する改変酵母細胞を目的とする。改変には、酵母がαケトグルタル酸トランスポーターを作製することを可能にするｋｇｔＰ遺伝子の酵母への形質転換が含まれる。酵母細胞は、プロリン及び／またはリシン残基をヒドロキシル化して、ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及びヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、ならびにヒドロキシリシル残基のグリコシル化をもたらすタンパク質を発現及び／または過剰発現するようにさらに改変されてもよい。本発明のある実施形態では、本発明は、酵母中のヒドロキシル化タンパク質（例えば、コラーゲン）などのタンパク質または炭水化物の産生を改善するための方法を提供する。本方法は、酵母がαケトグルタル酸トランスポーター及びタンパク質または炭水化物を産生することを可能にするために、ｋｇｔＰ遺伝子、タンパク質または炭水化物に関するＤＮＡならびにプロモーター、ターミネーター、及びマーカーに関するＤＮＡを酵母中に挿入すること（例えば、形質転換することまたはゲノム的に組み込むこと）を含む。本方法はまた、プロリン及び／またはリシン残基をヒドロキシル化するタンパク質（複数可）を発現する遺伝子を挿入することも含む。
【０００８】
本発明の別の態様は、アスコルビン酸を産生する改変酵母細胞を目的とする。改変には、アスコルビン酸合成経路が機能することを可能にする遺伝子を挿入することが含まれる。ある実施形態では、本発明は、アスコルビン酸を産生する改変酵母細胞を作製するための方法を提供する。本方法は、機能的なアスコルビン酸経路を完了するのに必要な遺伝子を挿入することを含む。この方法では、アスコルビン酸合成経路の一部のためのタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上を、酵母細胞に供給されるアスコルビン酸経路前駆体から下流に挿入することだけが必要であることが予想される。別の実施形態では、本発明は、培地中で改変酵母細胞を増殖させることを含む、酵母細胞中で細胞内アスコルビン酸を産生する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、一定量の細胞内アスコルビン酸を有する改変酵母細胞を提供する。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、αケトグルタル酸トランスポーターを含有し、かつアスコルビン酸を産生する改変酵母細胞を目的とする。本酵母細胞は、プロリン及び／またはリシン残基をヒドロキシル化して、ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及びヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、ならびにヒドロキシリシル残基のグリコシル化をもたらすタンパク質を発現及び／または過剰発現するようにさらに改変されてもよい。本方法は、機能的なアスコルビン酸経路を完了するのに必要な遺伝子及びαケトグルタル酸トランスポーターを酵母中に挿入することを含む。本方法はまた、プロリン及び／またはリシン残基をヒドロキシル化するタンパク質（複数可）を発現する遺伝子を挿入することも含み得る。別の実施形態では、本発明は、培地中で改変酵母細胞を増殖させることを含む、酵母細胞中で細胞内アスコルビン酸を産生する方法を提供する。本発明のある実施形態では、本発明は、αケトグルタル酸トランスポーターを含有し、かつアスコルビン酸を産生する酵母中でのヒドロキシル化コラーゲンなどのタンパク質または炭水化物の産生を改善するための方法を提供する。
【００１０】
発明の詳細な記載
本明細書に記載され、例示されるように、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、異なるヒドロキシル化度を有する組換えＩＩＩ型ウシコラーゲンを発現するために使用することができる。組換えコラーゲンのヒドロキシル化は、それぞれアルファ及びベータサブユニットウシプロリル−４−ヒドロキシラーゼをコードするウシＰ４ＨＡ及びウシＰ４ＨＢの共発現によって達成される。しかしながら、本発明は、ＩＩＩ型コラーゲンの産生及び発現に限定されるものではなく、他のタンパク質または炭水化物、他の種類のコラーゲンのサブユニットをコードするポリヌクレオチドならびにプロリン残基、リシン残基、またはプロリン及びリシン残基の両方をヒドロキシル化する酵素を用いて行われてもよい。ＩＩＩ型トロポコラーゲンは、ホモ三量体である。しかしながら、いくつかの実施形態では、コラーゲンは、当初から２つのプロ−α１（Ｉ）鎖及び１つのプロ−α２（Ｉ）鎖から構成されているＩ型コラーゲンなど、異なるポリペプチド鎖から構成されるヘテロ三量体を形成するであろう。
【００１１】
コラーゲン。コラーゲンは、皮革の主成分である。皮膚、または動物の皮は、相当量の線維状タンパク質であるコラーゲンを含有する。コラーゲンは、少なくとも２８の別個のコラーゲン型のファミリーの一般名称であり、獣皮は、通常Ｉ型コラーゲンであるが、ＩＩＩ型コラーゲンを含む他のコラーゲン型を、皮革の形成で使用することができる。「コラーゲン」という用語は、未処理の（例えば、プロコラーゲン）ならびに三重らせん構造を有する翻訳後修飾及びタンパク質分解されたコラーゲンを包含する。
【００１２】
コラーゲンは、アミノ酸の繰り返しトリプレット、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−によって特徴付けられ、コラーゲン中のアミノ酸残基のうちのおよそ３分の１がグリシンである。最大４００個の可能なＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットが存在し得るが、Ｘは、プロリンであることが多く、Ｙはヒドロキシプロリンであることが多い。異なる動物は、コラーゲンの異なるアミノ酸組成物を産生することができ、これは、得られる皮革において異なる特性及び差異を結果としてもたらし得る。
【００１３】
コラーゲンの構造は、長さが異なる３本の絡み合ったペプチド鎖からなることができる。コラーゲンの三重らせん（または単量体）は、約１，０５０個のアミノ酸の長さのアルファ鎖から作製されることができ、これにより、三重らせんは、およそ１．５ｎｍの直径を有する、ほぼおよそ３００ｎｍの長さのロッドの形態をとる。
【００１４】
コラーゲン線維は、動物の皮の種類に応じて直径の範囲を有してもよい。Ｉ型コラーゲンに加えて、皮膚（皮）は、ＩＩＩ型コラーゲン（レチクリン）、ＩＶ型コラーゲン、及びＶＩＩコラーゲンを含む他の型のコラーゲンを含んでもよい。様々な型のコラーゲンは、哺乳動物の身体の全体にわたって存在する。例えば、皮膚及び動物の皮の主成分であることに加えて、Ｉ型コラーゲンはまた、軟骨、腱、血管結紮、臓器、筋肉、及び骨の有機部分にも存在する。動物の皮膚または皮に加えて、哺乳動物の身体の様々な領域からコラーゲンを単離するために、成果を収めた努力がなされている。数十年前に、研究者は、中性のｐＨにおいて、酸可溶化されたコラーゲンが、天然組織で観察されるものと同じ横紋パターンから構成された線維に自己組織化することを見出した；Ｓｃｈｍｉｔｔ  Ｆ．Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９４２；２０：１１）。これは、再生医療及び様々な生物医学的応用におけるコラーゲンの使用をもたらした。さらに近年になると、コラーゲンは、組換え技術を用いて、細菌及び酵母から採集されている。
【００１５】
コラーゲンは、塩橋などの静電相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子力、分極力、疎水性相互作用、及び酵素反応によって触媒されることが多い共有結合を含む物理的及び化学的相互作用の組み合わせを通して形成かつ安定化される。様々な別個のコラーゲン型が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、及びヒトを含む脊椎動物のコラーゲンで特定されている。
【００１６】
一般に、コラーゲン型は、ローマ数字で番号付けされており、各コラーゲン中に見つかる鎖は、アラビア数字によって特定されている。様々な異なる型の天然発生コラーゲンの構造及び生物学的機能の詳細な説明は、当該技術分野において利用可能であり、例えば、Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ  Ｅ．，ａｎｄ  Ｎｉｍｍｉ（１９９２）“Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２８２：２５０−２７２；Ｋｉｅｌｔｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｆａｍｉｌｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，”Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｒｏｙｃｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂ．Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ  ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１０３−１４７；及びＰｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ−  ａｎｄ  Ｋ．Ｉ．Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ（１９９５）“Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔhｅｒａｐｙ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：４０３−４３４を参照されたい。
【００１７】
Ｉ型コラーゲンは、生物の総コラーゲンのうちのおよそ８０〜９０％を構成する骨及び皮膚の主要な線維状コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンは、多細胞生物の細胞外マトリックス中に存在する主構造巨大分子であり、総タンパク質質量のうちのおよそ２０％を構成する。Ｉ型コラーゲンは、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ１Ａ２遺伝子によってそれぞれコードされる、２本のα１（Ｉ）鎖と１本のα２（Ｉ）鎖とを含むヘテロ三量体分子である。インビボでは、コラーゲン線維、繊維、及び繊維束の組み立ては、発達段階中に起こり、細胞運動性及び栄養輸送を可能にしながら、組織に対して機械的支持を提供する。他のコラーゲン型は、Ｉ型コラーゲンほど豊富ではなく、異なる分布パターンを呈する。例えば、ＩＩ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液において優勢なコラーゲンであり、一方ＩＩＩ型コラーゲンは、血管中に高レベルでみられ、皮膚ではより少ない程度で見つかる。
【００１８】
ＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子によってコードされる３本の等しいａ１（ＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。精製されたＩＩ型コラーゲンは、当該技術分野において既知の方法によって、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ（１９８２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ８２：３３−６４に記載される手順によって、組織から調製され得る。
【００１９】
ＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚及び血管組織で見つかった主要な線維状コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる３本の等しいα１（ＩＩＩ）鎖を含むホモ三量体コラーゲンである。ＣＯＬ３Ａ１遺伝子は、宿主細胞、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中の発現（配列番号１０）に対して最適化され得る。ＩＩＩ型コラーゲンを組織から精製するための方法は、例えば、Ｂｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：５２４３−５２４８；及び上記のＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓで見出すことができる。
【００２０】
ＩＶ型コラーゲンは、線維よりはむしろシートの形態で基底膜において見つかる。最も一般的には、ＩＶ型コラーゲンは、２本のα１（ＩＶ）鎖と１本のα２（ＩＶ）鎖とを含有する。ＩＶ型コラーゲンを含む特定の鎖は、組織特異的である。ＩＶ型コラーゲンは、例えば、Ｆｕｒｕｔｏ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４４：４１−６１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載される手順を用いて精製することができる。
【００２１】
Ｖ型コラーゲンは、主として、骨、腱、角膜、皮膚、及び血管で見つかる線維状コラーゲンである。Ｖ型コラーゲンは、ホモ三量体及びヘテロ三量体の形態の両方で存在する。Ｖ型コラーゲンの１つの形態は、２本のα１（Ｖ）鎖と１本のα２（Ｖ）鎖とのヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンの別の形態は、α１（Ｖ）、α２（Ｖ）、及びα３（Ｖ）鎖のヘテロ三量体である。Ｖ型コラーゲンのさらなる形態は、α１（Ｖ）のホモ三量体である。Ｖ型コラーゲンを天然源から単離するための方法は、例えば、Ｅｌｓｔｏｗ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ（１９８３）Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３：１８１−１９３、及びＡｂｅｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．２：４９３−５０２で見出すことができる。
【００２２】
ＶＩ型コラーゲンは、小さな三重らせん領域と、２つの大きな非コラーゲン性の残り部分とを有する。ＶＩ型コラーゲンは、α１（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、及びα３（ＶＩ）鎖を含むヘテロ三量体である。ＶＩ型コラーゲンは、多くの結合組織で見つかる。ＶＩ型コラーゲンを天然源からどのように精製するかの説明は、例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４８：３７３−３８１、及びＫｉｅｌｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．９９：７９７−８０７で見出すことができる。
【００２３】
ＶＩＩ型コラーゲンは、特定の上皮組織で見つかる線維状コラーゲンである。ＶＩＩ型コラーゲンは、３本のα１（ＶＩＩ）鎖のホモ三量体分子である。ＶＩＩ型コラーゲンを組織からどのように精製するかの説明は、例えば、Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９０４２−９０４８、及びＢｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３１６８−３１７２で見出すことができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、角膜内のデスメ膜で見つけることができる。ＶＩＩＩ型コラーゲンは、２本のα１（ＶＩＩＩ）鎖と１本のα２（ＶＩＩＩ）鎖とを含むヘテロ三量体であるが、他の鎖組成も報告されている。ＶＩＩＩコラーゲンの自然界からの精製のための方法は、例えば、Ｂｅｎｙａ  ａｎｄ  Ｐａｄｉｌｌａ（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１６０−４１６９、及びＫａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３９３０−３９３７で見出すことができる。
【００２４】
ＩＸ型コラーゲンは、軟骨及び硝子体液で見つかる線維付随性コラーゲンである。ＩＸ型コラーゲンは、α１（ＩＸ）、α２（ＩＸ）、及びα３（ＩＸ）鎖を含むヘテロ三量体分子である。ＩＸ型コラーゲンは、非三重らせんドメインによって分離された数個の三重らせんドメインを有するＦＡＣＩＴ（断続性三重らせんを有する線維付随性コラーゲン）コラーゲンとして分類されている。ＩＸ型コラーゲンを精製するための手順は、例えば、Ｄｕａｎｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２１：８８５−８８９；Ａｙａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６２：７５３−７６１；ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄａｍａｇｅ，Ｇｌａｕｅｒｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．３−２８で見出すことができる。
【００２５】
Ｘ型コラーゲンは、α１（Ｘ）鎖のホモ三量体化合物である。Ｘ型コラーゲンは、例えば、成長板で見つかった肥大軟骨から単離されており；例えば、Ａｐｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０６（１）：２１７−２４を参照されたい。
【００２６】
ＸＩ型コラーゲンは、ＩＩ型及びＩＸ型コラーゲンと関連する軟骨性組織において、及び体内の他の場所において見出すことができる。ＸＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩ）、α２（ＸＩ）、及びα３（ＸＩ）鎖を含むヘテロ三量体分子である。ＸＩ型コラーゲンを精製するための方法は、例えば、上記のＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．で見出すことができる。
【００２７】
ＸＩＩ型コラーゲンは、主としてＩ型コラーゲンと関連して見つかるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＩ型コラーゲンは、α１（ＸＩＩ）鎖を含むホモ三量体分子である。ＸＩＩ型コラーゲン及びその変異体を精製するための方法は、例えば、Ｄｕｂｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６４：１３１５０−１３１５６；Ｌｕｎｓｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００８７−２００９２；及びＷａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２００９３−２００９９で見出すことができる。ＸＩＩＩ型は、例えば、皮膚、腸、骨、軟骨、及び横紋筋で見つかる非繊維状コラーゲンである。ＸＩＩＩ型コラーゲンの詳細な説明は、例えば、Ｊｕｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４７００−２４７０７で見出され得る。
【００２８】
ＸＩＶ型は、α１（ＸＩＶ）鎖を含むホモ三量体分子として特徴付けられるＦＡＣＩＴコラーゲンである。ＸＩＶ型コラーゲンを単離するための方法は、例えば、Ａｕｂｅｒｔ−Ｆｏｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５７５９−１５７６４、及び上記のＷａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．で見出すことができる。
【００２９】
ＸＶ型コラーゲンは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンと構造が一致する。天然型ＸＶコラーゲンの構造及び単離についての情報は、例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４４−１０１４８；Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４：２２０−２２４；Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４７７３−４７７９；及びＭｕｒａｇａｋｉ，Ｊ．（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：４０４２−４０４６で見出すことができる。
【００３０】
ＸＶＩ型コラーゲンは、例えば、皮膚、肺線維芽細胞、及び角化細胞で見つかる線維付随性コラーゲンである。ＸＶＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩ型コラーゲンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６５６５−６５６９；及びＹａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：８５６−８６３で見出すことができる。
【００３１】
ＸＶＩＩ型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡抗原としても知られる半接着斑膜貫通コラーゲンである。ＸＶＩＩ型コラーゲンの構造及びＸＶＩＩ型コラーゲンをコードする遺伝子に関する情報は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８８２５−８８３４；及びＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１（１）：８３−８６で見出すことができる。
【００３２】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＸＶ型コラーゲンと構造が類似しており、肝臓から単離され得る。ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの構造及び天然源からの単離の説明は、例えば、Ｒｅｈｎ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：４２３４−４２３８；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：４２２９−４２３３；Ｒｅｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９２４−１３９３５；及びＯｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９：４９４−４９９で見出すことができる。
【００３３】
ＸＩＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲンファミリーの別のメンバーであると考えられており、横紋筋肉腫細胞から単離されたｍＲＮＡ中で見出されている。ＸＩＸ型コラーゲンの構造及び単離の説明は、例えば、Ｉｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：１３７−１４６；Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：８８４−８８６；及びＭｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：１８５４９−１８５５７（１９９４）で見出すことができる。
【００３４】
ＸＸ型コラーゲンは、ＦＡＣＩＴコラーゲン性ファミリーの新たに発見されたメンバーであり、ひな鳥の角膜中で特定された（例えば、Ｇｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：Ａ１１１９；及びＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ＩＯＶＳ  ３９：Ｓ１１２８を参照されたい）。
【００３５】
「コラーゲン」という用語は、上述したＩ型コラーゲンからＸＸ型コラーゲン、ならびに天然、合成、半合成、または組換え体であろうがなかろうが、任意の他のコラーゲンを含む既知のコラーゲン型のいずれか１つを指す。これは、本明細書に記載されるコラーゲン、改変コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質のうちの全てを含む。この用語はまた、モチーフ（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ（式中、ｎは整数である）を含むプロコラーゲン及びコラーゲン様タンパク質またはコラーゲン性タンパク質も包含する。これは、コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の分子、コラーゲン分子の三量体、コラーゲンの線維、ならびにコラーゲン線維の繊維を包含する。これはまた、フィブリル化され得る化学的に、酵素的にまたは組換え的に改変されたコラーゲンもしくはコラーゲン様分子、ならびにコラーゲンの断片、コラーゲン様分子及びナノファイバ―に組み立てることが可能なコラーゲン性分子を指す。組換えコラーゲン分子は、天然であろうとまたは操作を受けていようと、一般に本明細書に記載される繰り返し−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ配列を含むであろう。
【００３６】
コラーゲン組成物中のコラーゲンは、１００％のウシＩ型コラーゲンまたは１００％のＩＩＩ型ウシコラーゲンなどの単一型のコラーゲン分子を均一に含有し得るか、またはウシＩ型及びＩＩＩ型分子の混合物などの異なる種類のコラーゲン分子もしくはコラーゲン様分子の混合物を含有し得る。このような混合物は、＞０％、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または＜１００％の個々のコラーゲンもしくはコラーゲン様タンパク質成分を含んでもよい。この範囲は、全ての中間値を含む。例えば、コラーゲン組成物は、３０％のＩ型コラーゲンと７０％のＩＩＩ型コラーゲンを含んでもよく、または３３．３％のＩ型コラーゲンと、３３．３％のＩＩ型コラーゲンと、３３．３％のＩＩＩ型コラーゲンとを含んでもよく、このコラーゲンの百分率は、組成物中のコラーゲンの総質量に基づくか、またはコラーゲン分子の分子割合に基づいている。
【００３７】
「コラーゲン線維」とは、トロポコラーゲン（コラーゲン分子の三重らせん）から構成されるナノファイバ―である。トロポコラーゲンはまた、三重らせん構造を呈するトロポコラーゲン様構造も含む。本発明のコラーゲン線維は、１ｎｍ及び１μｍの範囲に及ぶ直径を有してもよい。例えば、本発明のコラーゲン線維は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｎｍ（１μｍ）の範囲に及ぶ平均または個々の線維径を有してもよい。この範囲は、全ての中間値及び部分範囲を含む。本発明の実施形態のいくつかでは、コラーゲン線維は、ネットワークを形成するであろう。コラーゲン線維は、帯状パターンを呈する線維に結びつくことができ、これらの線維は、線維のより大きな凝集体に結びつくことができる。いくつかの実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様線維は、ウシまたは他の従来の皮革のトップグレインまたは表層におけるものと同様な直径及び配向を有するであろう。他の実施形態では、コラーゲン線維は、従来の皮革のトップグレイン及び真皮層のものを構成する直径を有してもよい。
【００３８】
「コラーゲン繊維」は、密集し、かつ繊維の方向における高い整列度を呈するコラーゲン線維から構成される。これは、１μｍ超から１０μｍ超まで、例えば、＞１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２μｍまたはそれ以上に直径を変化させることができる。本発明のコラーゲン線維のネットワークのいくつかの実施形態は、５μｍを超える直径を有するコラーゲン繊維の実質的な内容物を含有しない。皮革のグレイン面の組成は、より粗な繊維束を含有する真皮などのそのより内部の部分とは異なり得る。
【００３９】
「フィブリル化」とは、コラーゲン線維を作製するプロセスを指す。これは、ｐＨを上昇させることによって、またはコラーゲン溶液もしくは懸濁液の塩濃度を調製することによって実行することができる。フィブリル化コラーゲンの形成において、コラーゲンは、線維を形成するために、任意な適切な時間の長さにわたって、例えば、１分〜２４時間及び全ての中間値にわたってインキュベートされ得る。
【００４０】
本明細書に記載されるフィブリル化コラーゲンは、一般には、平坦なシート、湾曲形状／シート、円筒形、撚糸、及び複雑な形状を含む、任意の適切な形状及び／または厚さに形作られてもよい。これらのシート及び他の形態は、実際には、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｍｍを超える；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００ｃｍまたはそれ以上の厚さ、幅または高さを含む、任意の線寸法を有してもよい。
【００４１】
フィブリル化コラーゲンは、任意の量のまたは任意の実質的な量のより高次の構造を欠如してもよい。好ましい実施形態では、本コラーゲン線維は、切り離されて、動物の皮膚で見つかる大きなコラーゲン繊維を形成せず、強靭かつ均一な非異方性構造をバイオファブリケートされた皮革に提供するであろう。
【００４２】
他の実施形態では、一部のコラーゲン線維は、より高次の構造に束ねられるか、または整列され得る。バイオファブリケートされた皮革におけるコラーゲン線維は、０、＞０、０ｌ、１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、＜１．０、または１．０の範囲に及ぶ配向指数を呈することができ、０の配向指数は、他の線維との整列を欠如するコラーゲン線維を描写し、１．０の配向指数は、完全に整列したコラーゲン線維を描写している。この範囲は、全ての中間値及び部分範囲を含む。当業者であれば、Ｓｉｚｅｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．６１：８８７−８９２（２０１３）またはＢａｓｉｌ−Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５９：９９７２−９９７９（２０１１）を参照することによっても組み込まれる配向指数に精通している。
【００４３】
バイオファブリケートされた皮革は、特定の条件下で育てられた動物の特定の種または品種によって産生されるコラーゲン線維に特性が似ているか、またはそれを模倣するコラーゲン線維を含有するようにフィブリル化または加工され得る。
【００４４】
あるいは、フィブリル化及び加工条件は、例えば、天然の皮革における線維と比べて、線維径、整列度または架橋度を減少または増加させることによって、天然で見出されるものとは別のものであるコラーゲン線維を提供するように選択することができる。
【００４５】
ヒドロゲルと呼ばれることもあるコラーゲンの架橋ネットワークは、コラーゲンがフィブリル化されるときに形成され得るか、またはこれはフィブリル化後にネットワークを形成する場合もあり、いくつかの変更例では、コラーゲンをフィブリル化するプロセスもゲル状のネットワークを形成する。一旦形成されると、フィブリル化コラーゲンネットワークは、クロム、アミン、カルボン酸、硫酸塩、亜硫酸塩、スルホン酸塩、アルデヒド、ヒドラジド、スルフヒドリル、ジアザリン、アリール−、アジド、アクリレート、エポキシド、またはフェノールを含む二官能性、三官能性、または多官能性反応性基を有する分子を組み込むことによって、さらに安定化され得る。
【００４６】
フィブリル化コラーゲンネットワークはまた、他の薬剤（例えば、重合が可能であるポリマーまたは他の好適な繊維）と重合されてもよく、これは、マトリックスをさらに安定化させて、所望の末端構造を提供するために使用することができる。アクリルアミド、アクリル酸、及びそれらの塩をベースとしたヒドロゲルは、逆懸濁重合を用いて調製することができる。本明細書に記載されるヒドロゲルは、極性モノマーから調製されてもよい。使用されるヒドロゲルは、天然ポリマーヒドロゲル、合成ポリマーヒドロゲル、またはこれら２つの組み合わせであってもよい。使用されるヒドロゲルは、グラフト重合、架橋重合、水溶性ポリマーから形成されたネットワーク、放射線架橋などを用いて得られてもよい。重合を増強させるために、少量の架橋剤が、ヒドロゲル組成物に添加されてもよい。
【００４７】
平均または個々のコラーゲン線維長は、バイオファブリケートされた皮革の厚さ全体にわたって、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ｎｍ（１μｍ）；５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００μｍ（１ｍｍ）の範囲に及ぶことができる。これらの範囲は、全ての中間値及び部分範囲を含む。
【００４８】
線維は、それらの長さの５０、１００、２００、３００、４００、５００μｍまたはそれ以上にわたって他の線維と整列してもよく、またはほとんどまたは全く整列を示さなくてもよい。他の実施形態では、一部のコラーゲン線維は、より高次な構造に束ねられるか、または整列され得る。
【００４９】
バイオファブリケートされた皮革中のコラーゲン線維は、０、＞０、０ｌ、１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、＜１．０、または１．０の範囲に及ぶ配向指数を呈することができ、０の配向指数は、他の線維との整列を欠如するコラーゲン線維を描写し、１．０の配向指数は、完全に整列したコラーゲン線維を描写している。この範囲は、全ての中間値及び部分範囲を含む。当業者であれば、Ｓｉｚｅｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．６１：８８７−８９２（２０１３）またはＢａｓｉｌ−Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５９：９９７２−９９７９（２０１１）を参照することによっても組み込まれる配向指数に精通している。
【００５０】
バイオファブリケートされた皮革のコラーゲン線維密度は、約１〜１，０００ｍｇ／ｃｃ、好ましくは、全ての中間値を含む５〜５００ｍｇ／ｃｃの範囲に及ぶことができ、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００ｍｇ／ｃｃである。
【００５１】
バイオファブリケートされた皮革中のコラーゲン線維は、単峰性、二峰性、三峰性、または多峰性分布を呈してもよく、例えば、バイオファブリケートされた皮革は、それぞれが２つの異なるモードのうちの１つの周りに配置された線維径の異なる範囲を有する、２つの異なる線維調製物から構成されてもよい。このような混合物は、異なる直径を有する線維によって付与される、バイオファブリケートされた皮革に及ぼす付加的、相乗的、またはバランスの取れた物理的特性を付与するように選択され得る。
【００５２】
天然皮革製品は、皮革製品の重量に基づいて、１５〜３００ｍｇ／ｃｃのコラーゲンを含有し得る。バイオファブリケートされた皮革は、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０ｍｇ／ｃｃのコラーゲン濃度などの、バイオファブリケートされた皮革の重量に基づく、従来の皮革と同様なコラーゲンまたはコラーゲン線維の含量を含有し得る。
【００５３】
ヒドロゲルと呼ばれることもあるフィブリル化コラーゲンは、その最終用途に基づいて選択される厚さを有してもよい。フィブリル化コラーゲンのより濃いまたはより濃縮された調製物は、一般的には、より厚いバイオファブリケートされた皮革を作製する。バイオファブリケートされた皮革の最終厚さは、架橋、脱水及び潤滑によって引き起こされた収縮の前の線維調製物のもののわずか１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％であってもよい。
【００５４】
「架橋」とは、コラーゲン分子間内の化学結合の形成（または再形成）を指す。架橋反応は、コラーゲン構造を安定化させ、場合によっては、コラーゲン分子間のネットワークを形成する。当該技術分野において既知の任意の好適な架橋剤を使用することができ、この任意の好適な架橋剤としては、クロムに基づくものなどの無機塩、ホルムアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ポリエポキシ化合物、ガンマ線照射、及びリボフラビンを用いた紫外線照射が挙げられるが、これらに限定されない。架橋は、任意の既知の方法によって実行され得る；例えば、それぞれが、参照により組み込まれる、Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．２２：６０６−６２１（１９６４）；Ｈｏｕｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６７：８２４−８３０（１９７５）；Ｓｉｅｇｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７１：４８２６−４８３０（１９７４）；Ｍｅｃｈａｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４５：６４４−６５３（１９７１）；Ｍｅｃｈａｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４１：１５９７−１６０４（１９７０）；及びＳｈｏｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５４：２６１−２６３（１９６８）を参照されたい
【００５５】
架橋剤としては、イソシアネート、カルボジイミド、ポリ（アルデヒド）、ポリ（アジリジン）、無機塩、ポリ（エポキシ）、酵素、チイラン、フェノール、ノボラック、レゾール、ならびにリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、またはヒドロキシリシンなどのアミノ酸側鎖と反応する化学的性質を有する他の化合物が挙げられる。
【００５６】
コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質は、コラーゲン線維間の化学的及び／または物理的架橋を促進するために、化学的に修飾されてもよい。コラーゲン分子上のリシン、グルタミン酸、及びヒドロキシル基などの反応性基が、コラーゲンのロッド状線維構造から突出しているために、化学的架橋が可能であり得る。これらの基を巻き込む架橋は、コラーゲン分子がストレス下で互いにずれを生じることを防止し、したがって、コラーゲン繊維の機械的強度を増加させる。化学的架橋反応の例としては、リシンのε−アミノ基との反応、またはコラーゲン分子のカルボキシル基との反応が挙げられるが、これらに限定されない。トランスグルタミナーゼなどの酵素もまた、グルタミン酸とリシンとの間に架橋を生成して、安定なγ−グルタミル−リシン架橋を形成するために使用されてもよい。隣接するコラーゲン分子の官能基間の架橋を誘導することは、当該技術分野において既知である。架橋は、フィブリル化コラーゲンヒドロゲル由来の材料から得られる物理的特性を調整するために本明細書で実装され得る別のステップである。
【００５７】
さらに、フィブリル化しているコラーゲンまたはフィブリル化されたコラーゲンは、架橋または潤滑化されてもよい。コラーゲン線維は、ネットワーク形成の前に、ネットワーク形成、またはネットワークゲル形成中に、クロムまたは少なくとも１つのアルデヒド基を含有する化合物で、もしくは植物性タンニンで処理され得る。架橋は、フィブリル化コラーゲン皮革をさらに安定化させる。例えば、アクリルポリマーで前処理され、その後、Ａｃａｃｉａ  Ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａなどの植物性タンニンで処理されたコラーゲン線維は、増加した水熱安定性を呈することができる。他の実施形態では、グリセルアルデヒドは、フィブリル化コラーゲンの熱安定性、タンパク質分解耐性、ならびにヤング率及び引張応力などの機械的特性を増加させるために、架橋剤として使用されてもよい。
【００５８】
コラーゲン線維のネットワークを含有するバイオファブリケートされた材料は、０、＞０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０％またはそれ以上の、従来の皮革に使用されるなめし剤を含む架橋剤を含有してもよい。架橋剤は、コラーゲン線維もしくはバイオファブリケートされた材料の他の成分に共有結合してもよく、またはこれらと非共有結合で結合してもよい。好ましくは、バイオファブリケートされた皮革は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％以下の架橋剤を含有するであろう。
【００５９】
「潤滑」は、脂肪または他の疎水性化合物もしくは線維−線維結合を調節または制御する任意の材料などの潤滑剤を、コラーゲンを含む皮革に、またはバイオファブリケートされた製品に対して脱水中に適用するプロセスを記述する。皮革の美観の望ましい特徴は、材料の剛性及び手ざわりである。この特性を達成するために、線維及び／または繊維の間の水介在水素結合が、潤滑剤の使用を通して皮革内で制限される。潤滑剤の例としては、脂肪、生物学的油、鉱油または合成油、タラ肝油、硫酸化油、ポリマー、有機官能性シロキサン、及び従来の皮革を加脂するために使用される他の疎水性化合物または薬剤ならびにこれらの混合物が挙げられる。潤滑は、天然皮革の加脂にいくつかの点では類似しているが、バイオファブリケートされた製品は、その製造方法、より均質な組成及びより単純な組成のために、潤滑剤でより均一に処理され得る。
【００６０】
他の潤滑剤としては、界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、カチオン性ポリマー界面活性剤、アニオン性ポリマー界面活性剤、両親媒性ポリマー、脂肪酸、改変脂肪酸、非イオン性親水性ポリマー、非イオン性疎水性ポリマー、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル、天然ゴム、合成ゴム、樹脂、両親媒性アニオン性ポリマー及びコポリマー、両親媒性カチオン性ポリマー及びコポリマー、ならびにこれらの混合物ならびにこれらの水、アルコール、ケトン、及び他の溶媒中のエマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。
【００６１】
潤滑剤は、コラーゲン線維を含有するバイオファブリケートされた材料に添加することができる。潤滑剤は、線維の動きを容易にするか、または柔軟性、脆性の低下、耐久性もしくは耐水性などの皮革様特性を付与する任意の量で組み込まれ得る。潤滑剤含量は、バイオファブリケートされた皮革の約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、及び６０重量％の範囲に及ぶことができる。
【００６２】
バイオファブリケートされた皮革または材料の特性を変更するために、他の添加剤が添加されてもよい。好適な添加剤としては、染料、顔料、香料、樹脂、及び微細粒子が挙げられるが、これらに限定されない。樹脂が、材料の伸縮性、強度、及び柔らかさを変更するために添加されてもよい。好適な樹脂としては、エラストマー、アクリルコポリマー、ポリウレタンなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適なエラストマーとしては、スチレン、イソプレン、ＫＲＡＹＴＯＮ（登録商標）エラストマー、Ｈｙｃａｒ（登録商標）アクリル樹脂などのブタジエンコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。樹脂は、約５％〜２００％で、または約５０％〜１５０％で（コラーゲンの重量に基づいて）使用されてもよく、これらの範囲は全ての値及びそれらの間の部分範囲、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１４０などを含む。
【００６３】
「脱水（ｄｅｈａｙｄｒａｔｉｎｇ）」または「脱水（ｄｅｗａｔｅｒｉｎｇ）」は、水溶液、懸濁液、ゲル、またはフィブリル化コラーゲンを含有するヒドロゲルなどのコラーゲン線維及び水を含有する混合物から水を除去するプロセスを記述する。水は、濾過、蒸発、凍結乾燥、溶媒交換、真空乾燥、対流乾燥、加熱、照射もしくはマイクロ波処理によって、または水除去についての他の既知の方法によって除去され得る。加えて、コラーゲンの化学架橋も、とりわけリシン、アルギニン、及びヒドロキシリシンなどの親水性アミノ酸残基を使い果たすことによって、結合水をコラーゲンから除去することが知られている。本発明者らは、アセトンが、コラーゲン線維を迅速に脱水し、水和コラーゲン分子に結合した水も除去することができることを見出した。脱水後のバイオファブリケートされた材料または皮革の水分含量は、好ましくはバイオファブリケートされた皮革の６０重量％以下、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、または６０重量％以下である。この範囲は、全ての中間値を含む。水分含量は、２５℃での６５％の相対湿度における平衡状態及び１気圧にて測定される。
【００６４】
「グレインテクスチャ」は、フルグレインレザーの質感、トップグレインレザー、コレクトグレインレザー（人工的なグレインが適用されている）、またはより粗のスプリットグレインレザーの質感に美観的または質感的に類似している皮革様の質感を記述する。好都合には、本発明のバイオファブリケートされた材料は、皮革の表面グレインに似た微細なグレインをもたらすように調整され得る。
【００６５】
本発明における物品は、履物類、衣服、手袋、家具または車両室内装飾品、ならびに他の皮革商品及び製品を含むができる。これには、衣類、例えば、オーバーコート、コート、ジャケット、シャツ、ズボン、パンツ、半ズボン、水着、下着、ユニフォーム、エンブレムもしくはレター、衣装、ネクタイ、スカート、ドレス、ブラウス、レギンス、手袋、ミトン、靴、靴部品、例えば、靴底、腰革、前皮、折り返し、継ぎ目革、及びカウンター、礼装用靴、運動靴、ランニングシューズ、カジュアルシューズ、運動、ランニングまたはカジュアルシューズの部品、例えば、つま先キャップ、つま先ボックス、アウトソール、ミッドソール、アッパー、レース、アイレット、カラー、裏地、アキレスノッチ、ヒール、及びカウンター、ファッションまたは女性用靴もしくはそれらの靴部品、例えば、アッパーソール、アウターソール、トウスプリング、トウボックス、装飾、つま革、裏地、ソックス、中敷き、プラットフォーム、カウンター、ヒールまたはハイヒール、ブーツ、サンダル、ボタン、サンダル、帽子、マスク、ヘッドギア、ヘッドバンド、ヘッドラップ、及びベルト；宝飾品、例えば、ブレスレット、時計バンド、及びネックレス；手袋、傘、杖、札入れ、携帯電話またはウェアラブルコンピュータのカバー、財布、バックパック、スーツケース、ハンドバッグ、フォリオ、フォルダ、箱、及び他の身の回り品；運動、スポーツ、狩猟またはレクリエーションの道具一式、例えば、ハーネス、馬勒、手綱、ビット、革紐、ミット、テニスラケット、ゴルフクラブ、ポロ、ホッケー、またはラクロスの道具一式、チェス盤及びゲームボード、メディシンボール、キックボール、野球、ならびに他の種類のボール、及び玩具；ブックバインディング、ブックカバー、額縁またはアートワーク；家具及び家庭、事務所または他の内装もしくは外装部品、例えば、椅子、ソファー、ドア、座席、オットマン、間仕切壁、コースター、マウスパッド、デスクブロッター、または他のパッド、テーブル、ベッド、床、壁もしくは天井のカバーリング、床材；自動車、船舶、航空機及び他の車両製品、例えば、座席、ヘッドレスト、装飾用品、パネリング、ステアリングホイール、操縦桿またはコントロールカバーリング、及び他のラップまたはカバーリングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
コラーゲン線維のバイオファブリケートされたネットワークまたはバイオファブリケートされた皮革の物理的特性は、コラーゲンの型、フィブリル化されたコラーゲンの濃度の量、フィブリル化、架橋、脱水及び潤滑化の程度を選択することによって選択または調整することができる。
【００６７】
多くの有利な特性は、強靭で、柔軟かつ実質的に均一な特性を得られたバイオファブリケートされた材料または皮革に提供することができるコラーゲン線維のネットワーク構造に関連する。本発明によるバイオファブリケートされた皮革の好ましい物理的特性としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ＭＰａまたはそれ以上の範囲に及ぶ引張強度、１、５、１０、１５、２０、２５、３０％またはそれ以上の範囲に及ぶ破断伸びによって決定される柔軟性、４、５、６、７、８ｍｍまたはそれ以上のＩＳＯ  １７２３５によって決定される軟性、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍｍまたはそれ以上の範囲に及ぶ厚さ、及び１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００ｍｇ／ｃｃまたはそれ以上の、好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｃｃのコラーゲン密度（コラーゲン線維密度）が挙げられる。上記範囲は、全ての部分範囲及び中間値を含む。
【００６８】
厚さ。その最終用途に応じて、バイオファブリケートされた材料または皮革は、任意の厚さを有してもよい。その厚さは、好ましくは、約０．０５ｍｍ〜２０ｍｍの範囲、ならびにこの範囲内の任意の中間値、例えば、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ｍｍまたはそれ以上である。バイオファブリケートされた皮革の厚さは、コラーゲン含量を調整することによって制御することができる。
【００６９】
弾性率。弾性率（ヤング率としても知られる）は、物体または物質に力が加えられる場合に、物体または物質の弾性的に（すなわち、非永続的に）変形されることに対する抵抗を測定する数値である。物体の弾性率は、弾性変形領域におけるその応力−歪み曲線の勾配として定義される。より硬い材料は、より高い弾性率を有することになる。弾性率は、テクスチャーアナライザーを用いて測定することができる。
【００７０】
バイオファブリケートされた皮革は、少なくとも１００ｋＰａの弾性率を有することができる。これは、１００ｋＰａ〜１，０００ＭＰａの範囲、ならびにこの範囲内の任意の中間値、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ＭＰａとすることができる。バイオファブリケートされた皮革は、その弛緩状態の長さから最大３００％、例えば、その弛緩状態の長さの＞０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、または３００％まで伸長することができる。
【００７１】
引張強度（極限引張強度としても知られる）は、サイズを縮める傾向にある負荷に耐える圧縮強度とは対照的に、伸長する傾向にある負荷に耐えるための材料または構造の能力である。引張強度は、引張または引き離されることに抵抗し、一方圧縮強度は圧縮または一緒に押されることに抵抗する。
【００７２】
バイオファブリケートされた材料の試料は、インストロン試験機を用いて引張強度について試験することができる。クランプが試料の端部に取り付けられ、試料が破断するまで反対方向に引かれる。良好な強度は、試料が少なくとも１ＭＰａの引張強度を有する場合に実証される。バイオファブリケートされた皮革は、少なくとも１ｋＰａの引張強度を有することができる。これは、１ｋＰａ〜１００Ｍｐａの範囲ならびにこの範囲内の任意の中間値、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００ｋＰＡ；０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ＭＰａの範囲とすることができる。
【００７３】
引裂き強度（引裂き抵抗としても知られる）は、材料が引裂きの作用にどれほど良く耐えることができるかの尺度である。しかしながら、より具体的には、これは材料（通常、ゴム）が張力を受けて、いかなる切断の増大にでもどれほど良く耐えるかであり、通常、ｋＮ／ｍで測定される。引裂き抵抗は、ＡＳＴＭ  Ｄ４１２法（これは引張強度、弾性率及び伸びを測定するのに使用される）によって測定することができる。ＡＳＴＭ  Ｄ６２４は、引裂きの形成（引裂き開始）に対する抵抗及び引裂きの拡張（引裂き伝播）に対する抵抗を測定するために使用することができる。これらの２つどちらが測定されるかに無関係に、試料は２つのホルダの間に保持され、前述の変形が生じるまで、均一な引張り力が加えられる。次いで、加えられた力を材料の厚さによって割ることによって、引裂き抵抗が算出される。バイオファブリケートされた皮革は、同じ架橋剤（複数可）または潤滑剤を用いて加工された、同じ型のコラーゲン、例えば、ウシＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンを含む同じ厚さの従来のトップグレインまたは他の皮革のものの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、または２００％もしくはそれ以上の引裂き抵抗を呈することができる。バイオファブリケートされた材料は、約１〜５００Ｎの範囲の引裂き強度、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ならびにこの範囲内の任意の中間値の引裂き強度を有することができる。
【００７４】
軟性。ＩＳＯ  １７２３５：２０１５は、皮革の軟性を決定するための非破壊法を特定している。これは、全ての非剛性皮革、例えば、靴甲革、張り革、皮製品皮革、及び衣類皮革に適用可能である。バイオファブリケートされた皮革は、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２ｍｍまたはそれ以上のＩＳＯ  １７２３５によって決定される軟性を有することができる。
【００７５】
グレイン。皮革のトップグレイン面は、その柔らかな質感及び滑らかな表面のために最も望ましいとされることが多い。トップグレインは、コラーゲン線維の高度に多孔質のネットワークである。グレインの強度及び引裂き抵抗は、多くの場合、トップグレイン単独の実際の適用には限界があり、従来の皮革製品は、多くの場合、非常に粗いグレインを有する真皮で裏打ちされる。強靭かつ均一な物理的特性または増大した厚さを有して製造され得る本明細書に開示されるバイオファブリケートされた材料は、真皮の裏打ちの必要なしにトップグレインに似た製品を提供するように使用することができる。
【００７６】
他の成分の含量。いくつかの実施形態では、コラーゲンは、エラスチンまたは非構造動物タンパク質などの他の皮革成分を含まない。しかしながら、いくつかの実施形態では、バイオファブリケートされた皮革中のアクチン、ケラチン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、グロブリン、ムチン、ムチノイド、非コラーゲン構造タンパク質、及び／または非コラーゲン非構造タンパク質の含量は、バイオファブリケートされた皮革の０、１、２、３、４、５、６、７、８、９〜１０重量％の範囲であってもよい。他の実施形態では、アクチン、ケラチン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、グロブリン、ムチン、ムチノイド、非コラーゲン構造タンパク質、及び／または非コラーゲン非構造タンパク質の含量は、バイオファブリケートされた皮革の＞０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０重量％またはそれ以上の範囲に及ぶ量で、バイオファブリケートされた皮革に組み込まれてもよい。このような成分は、フィブリル化、架橋、脱水または潤滑化中に、またはこれらの後に導入されてもよい。
【００７７】
コラーゲンの含量。本発明によるバイオファブリケートされた材料または皮革は、従来の皮革と比較して、増加したコラーゲン含量を含有する。本発明の範囲内では、バイオファブリケートされた材料または皮革中のコラーゲン含量は、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上から９５％、９０％、８５％。８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％またはそれ以下の範囲であり、記載された下限値及び上限値と境を接する全ての範囲及び部分範囲を含む。
【００７８】
「革用染料」とは、皮革またはバイオファブリケートされた皮革を着色するために使用することができる染料を指す。これらとしては、酸性染料、直接染料、レーキ、硫化染料、塩基性染料、及び反応染料が挙げられる。染料及び顔料もまた、バイオファブリケートされた皮革の生産中に、コラーゲン線維を含む懸濁液またはネットワークゲル中などのバイオファブリケートされた皮革の前駆体に組み込むことができる。
【００７９】
「フィラー」。いくつかの実施形態では、バイオファブリケートされた皮革は、ミクロスフェアなどの、皮革の成分以外のフィラーを含んでもよい。脱水した線維ネットワークの組織を制御するための１つの方法は、脱水中に線維を間隔を空けて保持する充填材を含むようにすることである。これらのフィラー材料としては、ナノ粒子、ミクロ粒子、または製革業で一般的に使用されるシンタンなどの様々なポリマーが挙げられる。これら充填材は、最終の脱水された皮革材料の一部とすることができるか、または充填材は、犠牲的とすることができ、すなわち、これらは分解されるか、またはより多孔質の線維ネットワークのために開放空間を残して溶解除去される。これらのフィラーの形状及び寸法は、脱水された線維ネットワークの配向を制御するために使用されてもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、フィラーは、ポリマーミクロスフェア（複数可）、ビーズ（複数可）、繊維（複数可）、ワイヤ（複数可）、または有機塩（複数可）を含むことができる。他の材料もまた、本発明によるバイオファブリケートされた皮革中に、またはコラーゲン線維のネットワーク中に埋め込まれるか、または別の方法で組み込まれてもよい。これらとしては、織布及び不織布繊維の両方を含む１つの繊維、ならびに綿、羊毛、カシミア、アンゴラ、亜麻、竹材、靱皮、麻、ダイズ、シーセル、乳または乳タンパク質から産生された繊維、絹、クモの糸、組換え的に産生されたペプチドまたはポリペプチドを含む他のペプチドまたはポリペプチド、キトサン、菌糸体、細菌セルロースを含むセルロース、木材繊維を含む木材、レーヨン、リヨセル、ビコース、抗菌糸（Ａ．Ｍ．Ｙ．）、ソーブテック、ナイロン、ポリエステル、ｌｙｃｒａ（登録商標）などのエラストマー、スパンデックスまたはエラスタンならびに他のポリエステル−ポリウレタンコポリマー、アラミド、炭素繊維及びフラーレンを含む炭素、ガラス繊維及び不織布を含むガラス、シリコン及びシリコン含有化合物、鉱物粒子及び鉱物繊維を含む鉱物、ならびに鉄、鋼、鉛、金、銀、プラチナ、銅、亜鉛及びチタンを含む金属または金属合金が挙げられるが、これらに限定されず、これらは、粒子、繊維、ワイヤの形態、またはバイオファブリケートされた皮革に組み込むために好適な他の形態であってもよい。このようなフィラーは、導電性材料、磁性材料、蛍光材料、生物発光材料、燐光材料または他の光ルミネッセンス材料、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。これらの成分の混合物または配合物もまた、例えば、本明細書に開示された化学的及び物理的特性を改変するために、バイオファブリケートされた皮革に埋め込まれるか、または組み込まれてもよい。
【００８１】
コラーゲンの様々な形態が、動物界全体で見出されている。本明細書で使用されるコラーゲンは、脊椎動物及び無脊椎動物の両方を含む動物源から、または合成源から得ることができる。コラーゲンはまた、既存の動物処理の副産物から供給されてもよい。動物源から得られるコラーゲンは、当該技術分野で既知の標準的な実験室技術、例えば、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ．  Ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，２０１４  Ｄｅｃ．，１２（１２）；５８８１−５９０１）を用いて単離することができる。
【００８２】
本明細書に記載されるコラーゲンはまた、バイオリアクターで増殖させた細胞からのものを含む、細胞培養技術によって得られてもよい。
【００８３】
コラーゲンはまた、組換えＤＮＡ技術を介して得られてもよい。非ヒトコラーゲンをコードする構築物が酵母に導入されて、非ヒトコラーゲンを産生することができる。例えば、コラーゲンは、例えばＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母を用いて産生されてもよい。コラーゲン及びコラーゲン様タンパク質の組換え体発現は、Ｂｅｌｌ，ＥＰ  １２３２１８２Ｂ１，Ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｌａｔｉｎ；Ｏｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，４２８，９７８号、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ；ＶａｎＨｅｅｒｄｅ，ｅｔ  ａｌ．、米国特許第８，１８８，２３０号、Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓにより報告されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、組換え体コラーゲンは、皮革の生産には使用されていない。
【００８４】
本発明で有用である材料としては、バイオファブリケートされた皮革材料の天然または合成織布、不織布、編物、メッシュ生地、及びスペーサーファブリックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
コラーゲン線維を保持するいかなる材料も本発明において有用とすることができる。一般に、有用である布は、１平方インチ当たり３００本の糸から１平方フィート当たり１本の糸の範囲に及ぶメッシュまたは約１１μｍ以上の直径の細孔サイズを有する。スパンレース素材も有用であり得る。いくつかの実施形態では、水溶性布が有用である。利用される場合、コラーゲンの溶液に曝された布地の一部は、溶解して空隙または孔を布地に形成し、コラーゲンがその空隙または孔を満たす。水溶性布は、通常、ポリビニルアルコール繊維から形成され、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート及びデンプンなどの樹脂で被覆される。あるいは、空隙または孔は、天然または合成織布、不織布、編物、メッシュ生地、及びスペーサーファブリックなどの二次材料で覆われてもよい。
【００８６】
あるいは、バイオファブリケートされた皮革材料は、布地に切り込まれた空隙または孔を塞ぐために使用されてもよい。空隙または孔のサイズは、付与される設計に応じて変化してもよい。空隙または孔の形状は、設計に応じて変化してもよい。空隙または孔の好適な寸法は、約０．１インチ〜約５メートルの範囲に及んでもよい。好適な形状としては、円形、正方形、矩形、三角形、楕円形、卵形、及びブランドロゴの形が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
一部の材料は、バイオファブリケートされた皮革の接合を改善するために、それら自体を前処理させる。前処理は、布地のコラーゲンコーティング、樹脂コーティング、デボレ（バーンアウト法としても知られる）、化学薬品、またはこれらの組み合わせを含むことができる。例えば、セルロース繊維から作製された材料のための化学的前処理は、過ヨウ素酸塩（酸化体）溶液処理を含むことができる。好適なセリロース繊維は、ビスコース、アセテート、リヨセル、竹材、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。酸化体は、セルロース中の糖環を開環させて、コラーゲンが開放環に結合することを可能にする。溶液中の酸化体の濃度は、所望の酸化の範囲に応じる。一般には、酸化体の濃度が高いほど、または反応時間が長いほど、より高い酸化度が達成される。本発明のある実施形態では、酸化反応は、所望の酸化のレベルを達成するのに望ましい時間で行うことができる。酸化反応は、使用される酸化体の種類に応じて、様々な温度で行うことができる。本発明者らは、室温（２０℃〜２５℃、好ましくは２３℃）または周囲温度で、１５分〜２４時間の時間範囲にわたって、制御された酸化を用いることを選択した。しかしながら、１７．５℃〜３０℃の範囲に及ぶ温度が使用されてもよいことも想定される。時間に関しては、制御された酸化が、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間〜３６時間、３０時間、２４時間、２０時間、１８時間、１５時間であってもよく、本明細書で許容される全ての範囲及び部分範囲を含んでもよいことが可能であることが想定される。過ヨウ素酸ナトリウムの量は、布地の２５重量％〜１００重量％オファーの範囲である。本明細書で使用される場合、オファーとは、セルロースの重量％に基づく添加剤の量を意味する。他の化学的前処理は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｇ  ＨｅｒｍａｎｓｏｎによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに教示されている。
【００８８】
本明細書に記載されるようなバイオファブリケートされた皮革（例えば、バイオレザー）溶液は、本明細書で論じられるような本酵母株によって産生される組換え体コラーゲンに加えて、及びこれと組み合わせて、任意の適切な非ヒトコラーゲン源を含んでもよい。
【００８９】
本明細書に記載されるコラーゲン材料の形成における初期工程として、出発コラーゲン材料が溶液中に置かれ、フィブリル化され得る。コラーゲンの濃度は、およそ０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、例えば、０．７５ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌ〜７ｇ／Ｌ、または２ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌ、または２．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、または３ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの範囲であってもよい。コラーゲンのフィブリル化は、コラーゲン溶液への塩の導入を通して誘導され得る。塩または、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、及び塩化ナトリウムなどの塩の組み合わせのコラーゲン溶液への添加は、コラーゲン溶液のイオン強度を変更することができる。コラーゲンのフィブリル化は、より大きな水素結合、ファンデルワールス相互作用、及び共有結合を通しての静電相互作用の増加の結果として生じ得る。好適な塩濃度は、例えば、およそ１０ｍＭ〜５Ｍ、例えば５０ｍＭ〜２．５Ｍ、または１００ｍＭ〜１Ｍ、または２５０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲であり得る。
【００９０】
コラーゲンネットワークはまた、ｐＨに非常に敏感であり得る。フィブリル化工程中に、ｐＨは、直径及び長さなどの線維寸法を制御するために調整され得る。好適なｐＨは、およそ５．５〜１０、例えば、６〜９、または７〜８の範囲であり得る。濾過の前のフィブリル化工程の後に、溶液のｐＨは、およそ３．５〜１０、例えば、３．５〜７、または３．５〜５のｐＨ範囲に調整される。コラーゲン線維の全体的な寸法及び組織は、得られルフィブリル化コラーゲン由来材料の堅牢性、ストレッチ性、及び通気性に影響を与えるであろう。これは、異なる堅牢性、柔軟性、及び通気性を必要とし得る様々な用途にフィブリル化コラーゲン由来皮革を作製するために役立ち得る。
【００９１】
脱水された線維ネットワークの組織を制御するための１つの方法は、乾燥中に線維を間隔を空けて保持する充填材を含むことである。これらのフィラー材料は、ナノ粒子、ミクロ粒子、ミクロスフェア、ミクロ繊維、または製革業で通常使用される様々なポリマーを含むことができる。これらの充填材は、最終の脱水された皮革材料の一部とすることができるか、または充填材は、犠牲的とすることができ、すなわち、これらは分解されるか、またはより多孔質の線維ネットワークのために開放空間を残して溶解除去される。
【００９２】
コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質は、コラーゲン線維間の化学的及び物理的な架橋を促進するために、化学的に改変されてもよい。コラーゲン様タンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ  ２０１２／０１１６０５３  Ａ１号に教示された。化学的架橋は、コラーゲン分子上のリシン、グルタミン酸、及びヒドロキシル基などの反応性基が、コラーゲンのロッド状線維構造から突出しているために可能であり得る。これらの基に関与する架橋は、コラーゲン分子がストレス下で互いにずれを生じることを防止し、したがって、コラーゲン線維の機械的強度を増大させる。化学的架橋反応の例としては、リシンのε−アミノ基との反応、またはコラーゲン分子のカルボキシル基との反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
トランスグルタミナーゼなどの酵素もまた、グルタミン酸とリシンとの間に架橋を生成し、安定なγ−グルタミル−リシン架橋を形成するために使用することができる。隣接するコラーゲン分子の官能基間に架橋を誘導することは、当該技術分野において既知である。架橋は、フィブリル化コラーゲンヒドロゲル由来の材料から得られる物理的な特性を調整するために本明細書で実装され得る別の工程である。
【００９４】
一旦形成されると、フィブリル化コラーゲンネットワークは、クロム、アミン、カルボン酸、硫酸塩、亜硫酸塩、スルホン酸塩、アルデヒド、ヒドラジド、スルフヒドリル、ジアザリン、アリール−、アジド、アクリレート、エポキシド、またはフェノールを含む二官能性、三官能性、または多官能性反応性基を有する分子を組み込むことによって、さらに安定化され得る。
【００９５】
フィブリル化コラーゲンネットワークはまた、ヒドロゲルを形成するか、または線維特性を有する他の薬剤（例えば、重合が可能であるポリマーまたは他の好適な繊維）で重合されてもよく、これは、マトリックスをさらに安定化させ、かつ所望の末端構造を提供するために使用することができる。アクリルアミド、アクリル酸、及びそれらの塩をベースとしたヒドロゲルは、逆懸濁重合を用いて調製することができる。本明細書に記載されるヒドロゲルは、極性モノマーから調製されてもよい。使用されるヒドロゲルは、天然ポリマーヒドロゲル、合成ポリマーヒドロゲル、またはこれら２つの組み合わせであってもよい。使用されるヒドロゲルは、グラフト重合、架橋重合、水溶性ポリマーから形成されたネットワーク、放射線架橋などを用いて得られてもよい。重合を増強させるために、少量の架橋剤が、ヒドロゲル組成物に添加されてもよい。
【００９６】
コラーゲン溶液の粘度は、２０℃で１ｃＰ〜１０００ｃＰの範囲、例えば、１０、２０、３０、５０、７５、９０、１００、１５０、２２５、３００、４００、４５０、５００、５２５、５７５、６００、６５０、７００、８００、９００などのこれらの間にある全ての値及び範囲を含むことができる。溶液は、表面に注がれ、噴霧され、塗装され、または塗布することができる。粘度は、どのように最終材料が形成されるかに応じて変化してもよい。より高い粘度が望ましい場合、既知の増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロースなどが、溶液に添加され得る。あるいは、溶液中のコラーゲンの量を、粘度を変化させるように調整することができる。
【００９７】
コラーゲン溶液の柔軟性は、該コラーゲン溶液の堆積を通して完全に作製される新たな材料の産生、例えば、バイオファブリケートされた皮革レース材料または３次元材料の作成を可能にする。ある点では、コラーゲン溶液は、例えば、バイオファブリケートされた皮革またはバイオレザーを形成するための液状皮革として機能することができる。液状皮革は、注がれ、分注され、ノズルを通して噴霧されるか、または二次材料を液状皮革中にロボットで適用もしくは浸漬することができる。テクスチャー表面は、材料の形成プロセスにおいて、有孔材料を利用することによって達成することができる。液状皮革はまた、マスキング、ステンシル、及び成形技術の使用も可能にする。バイオファブリケートされた皮革の溶液の適用はまた、これが適用される材料の特性を改変することも可能にする。例えば、バイオファブリケートされた皮革の溶液は、端材をより強く、よりしなやかに、より固く、より柔軟に、より弾力性にまたはより軟性にすることができる。
【００９８】
すでに述べたように、上述の方法から誘導されたバイオファブリケートされた皮革材料は、動物の皮から作製された皮革に類似する全般的な構造的及び物理的特性を有することができる。一般に、本酵母細胞によって産生されたコラーゲンに加えて、本明細書に記載されるバイオファブリケートされた皮革材料は、動物の皮または皮膚がフィブリル化コラーゲンの調製において使用されるコラーゲンの供給源であり得るが、動物の皮または皮膚のシートまたは断片以外の供給源から誘導されてもよい。コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質の供給源は、任意の動物（例えば、哺乳動物、魚）、またはより詳細には、培養された細胞／組織源（特定の微生物を含む）から単離されてもよい。
【００９９】
バイオファブリケートされた皮革材料は、その中に含有される線維ネットワークを安定化させる薬剤を含んでもよく、またはフィブリル化を促進する薬剤を含有してもよい。前章で述べた通り、架橋剤（更なる安定性を提供するための）、核形成剤（フィブリル化を促進するための）、及び追加の重合剤（さらなる安定性のための）が、所望の特性（例えば、強度、曲げ性、ストレッチ性など）を備えたフィブリル化コラーゲン材料を得るためのフィブリル化の前に（または後に）、コラーゲン溶液に添加されてもよい。
【０１００】
すでに述べたように、脱水または乾燥後に、上述した方法から誘導された操作を受けたバイオファブリケートされた皮革材料は、２０重量％以下、または１７．５重量％以下、または１５重量％以下、または１２．５重量％以下、または１０重量％以下の水分含量を有する。操作を受けたバイオファブリケートされた皮革材料の水分含量は、異なる目的及び所望の特性のために、皮革材料を得るための仕上げ工程において微調整されてもよい。
【０１０１】
すでに述べたように、これらのバイオファブリケートされた皮革のいずれかは、なめし処理されてもよい（例えば、植物（タンニン）、クロム、ミョウバン、ジルコニウム、チタン、鉄塩、またはこれらの組み合わせを含むなめし剤、もしくは任意の他の適切ななめし剤を用いて）。したがって、本明細書に記載の得られたバイオファブリケートされた皮革材料のいずれかにおいて、得られた材料は、ある割合の（例えば、０．０１％〜１０％、または０．０２５％〜８％、または０．０５％〜６％、または０．１％〜５％、または０．２５％〜４％、または０．５％〜３％、または０．７５％〜２．５％、または１％〜２％）残留なめし剤（例えば、タンニン、クロムなど）を含んでもよい。したがって、得られたバイオファブリケートされた皮革材料中のコラーゲン線維は、なめし処理されるように、例えば劣化に抵抗するために架橋されるように改変される。
【０１０２】
バイオファブリケートされた皮革材料は、表面テクスチャーを提供するために処理されてもよい。好適な処理としては、エンボス加工、デボス加工、及び材料の下の有孔プレートを用いた真空成形が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知であるように、エンボス加工及びデボス加工が行われる圧力及び温度は、所望のテクスチャー及び設計に応じて変化してもよい。製革業で既知の表面コーティング及び仕上げ剤が、バイオファブリケートされた皮革材料に適用されてもよい。
【０１０３】
上述のように、本明細書に記載のバイオファブリケートされた皮革の作製についての変更例のいずれかにおいて、材料は、脱水の前に、コラーゲンがフィブリル化されると、及び／またはフィブリル化が生じた後に別途に、なめし処理（架橋）することができる。例えば、なめし処理は、アルデヒド（例えば、Ｒｅｌｕｇａｎ  ＧＴＷ）及び／または任意の他のなめし剤を用いて架橋することを含んでもよい。したがって、一般に、なめし剤は、アルデヒド架橋剤などの任意のコラーゲン線維架橋剤、クロム、アミン、カルボン酸、硫酸塩、亜硫酸塩、スルホン酸塩、アルデヒド、ヒドラジド、スルフヒドリル、ジアジリンを含む。
【０１０４】
バイオファブリケートされた皮革材料を含む材料を作製するための一部の方法は、材料を提供することと、材料をコラーゲンとの結合に好適にさせるために、材料を前処理することと、コラーゲン溶液を材料に適用することと、乾燥させることとを含む。乾燥は、真空を通しての水分除去、加熱空気乾燥、周囲空気乾燥、加熱加圧及び圧力乾燥を含むことができる。前処理が必要とされる場合には、前処理は、空隙または孔を材料に切り込むこと、特定の繊維を化学的に除去すること、及び化学薬品またはコラーゲン溶液で材料を処理することのいずれかである。他の方法は、材料の前処理を必要としない。前処理が必要とされない場合には、この材料は、部分的に水溶性であるか、またはコラーゲンを保持するが水を通過させるかのいずれかである。好適なメッシュサイズは、１平方インチ当たり３００本の糸から１平方フィート当たり１本の糸の範囲である。本明細書で使用される場合、布に接着されるまたは接着するという用語は、手で引っ張るときに、バイオファブリケートされた皮革が布から容易に剥離しないように付着されることを意味する。接着の有効性を試験するための好適な方法は、Ｉｎｓｔｒｏｎ（登録商標）材料試験機などの機器で行われる剥離強度試験である。機械の顎部がバイオファブリケートされた皮革材料に取り付けられ、皮革材料が接着された材料と顎部とが、その材料が引裂かれるか、または分離するまで引き離される。引裂くための力は、Ｎ／ｍｍで報告される。好適な剥離強度は、約０．５Ｎ／ｍｍ  Ｎ／ｃｍ２〜１００Ｎ／ｍｍ、例えば、０．７５Ｎ／ｍｍ〜７５Ｎ／ｍｍ、または１Ｎ／ｍｍ〜５０Ｎ／ｍｍ、１．５Ｎ／ｍｍ〜２５Ｎ／ｍｍの範囲であり、記載された上限値及び下限値によって定義される全ての範囲及び部分範囲を含む。
【０１０５】
タンパク質（例えば、コラーゲン）中のプロリン及びリシン残基のヒドロキシル化。コラーゲンを含める、プロリン及びリシンを含有するタンパク質のポリペプチドの主要な翻訳後修飾は、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）及びヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）を生じるプロリン及びリシン残基のヒドロキシル化、ならびにヒドロキシリシル残基のグリコシル化である。これらの修飾は、３つのヒドロキシラーゼ−−プロリル４−ヒドロキシラーゼ、プロリル３−ヒドロキシラーゼ、及びリシルヒドロキシラーゼ−−ならびに２つのグリコシルトランスフェラーゼによって触媒される。インビボでは、これらの反応は、ポリペプチドが、さらなる修飾を阻害する三重らせんコラーゲン構造を形成するまで起こる。
【０１０６】
プロリル−４−ヒドロキシラーゼ。この酵素は、プロリン残基の（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）へのヒドロキシル化を触媒する。参照により組み込まれる、Ｇｏｒｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４５（２）：（２０１０）。以下の実施例は、Ｐ４ＨＡ（配列番号８（Ｐｉｃｈｉａに最適化された）または配列番号１５（天然））及びＰ４ＨＢ（配列番号９（Ｐｉｃｈｉａに最適化された）または配列番号１６（天然））によってコードされた四量体ウシプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（２アルファ及び２ベータ鎖）を使用するが、アイソフォーム、アルソログ、変異体、断片及び非ウシ源からのプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（例えば、ヒトプロリル−４−ヒドロキシラーゼ）もまた、これらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限りにおいて使用されてもよい。Ｐ４ＨＡ１の別の例は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／１７６７１０（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ：１０ｑ２２．１；Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ  （ＧＲＣｈ３８）：１０：７３，００７，２１６−７３，０９６，９７３（ＮＣＢＩから）によりさらに記載されており、Ｐ４ＨＢ１の別の例は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／１７６７９０（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃａｔｉｏｎ：１７ｑ２５．３；Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅs（ＧＲＣｈ３８）：１７：８１，８４３，１５７−８１，８６０，６６７（ＮＣＢＩから）にさらに記載されており、これらは両方共、参照により組み込まれる。
【０１０７】
本出願の文脈において、「変異体」は、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似度行列を用いて、Ｐ４ＨＡ及びＰ４ＨＢアミノ酸配列などの基準アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を含み、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連した配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中程度に関連する配列に、そしてＢＬＯＳＵＭ８０は、より遠縁に当たる配列に使用することができる。特に断りのない限り、類似度スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性率は、ＢＬＡＳＴＰの正のスコアに基づき、配列同一性率は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコアの配列対中の総残基の数及び分率を示し、ＢＬＡＳＴＰの「正値」は、アライメントスコアが正値を有し、互いに類似している残基の数及び分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度を有するか、または同一性または類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、１０の期待値の閾値、３のワードサイズ、行列としてＢＬＯＳＵＭ６２、及び１１のギャップペナルティ（イグジステンス）ならびに１のギャップペナルティ（エクステンション）、及び条件付き組成スコア行列調整を使用する。ＢＬＡＳＴＰについての他のデフォルト設定は、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（２０１７年８月１４日に最終アクセス）に利用可能なものにより記載されており、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲内では、「変異体」は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を保持する。
【０１０８】
本発明のある実施形態では、酵母細胞は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼを過剰産生するように操作を受ける。非限定的な例は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片の発現ベクターへの組み込みである。本発明のある実施形態では、プロリル−４−ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片を含有する発現ベクターは、誘導性プロモーターの制御下にある。好適な酵母細胞、発現ベクター、及びプロモーターは以下に記載されている。
【０１０９】
プロリル３−ヒドロキシラーゼ。この酵素は、プロリン残基のヒドロキシル化を触媒する。３−ヒドロキシラーゼ１前駆体［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ］は、ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００１０９６７６１．１（配列番号４）により、またはＮＭ＿００１１０３２９１．１（配列番号５）により記載されている。さらなる説明は、参照により組み込まれる、Ｖｒａｎｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２３６１５−２３６２１  （２００４）またはｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／６１０３３９（２０１７年７月１４日に最終アクセス）を参照されたい。この酵素は、その天然型で使用することができる。しかしながら、アイソフォーム、オルソログ、変異体、断片及び非ウシ源からのプロリル３−ヒドロキシラーゼもまた、これらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限りにおいて使用されてもよい。
【０１１０】
本出願の文脈において、「変異体」は、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似度行列を用いて、プロリル３−ヒドロキシラーゼアミノ酸配列などの基準アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を含み、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連した配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中程度に関連する配列に、そしてＢＬＯＳＵＭ８０は、より遠縁に当たる配列に使用することができる。特に断りのない限り、類似度スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性率は、ＢＬＡＳＴＰの正のスコアに基づき、配列同一性率は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコアの配列対中の総残基の数及び分率を示し、ＢＬＡＳＴＰの「正値」は、アライメントスコアが正値を有し、互いに類似している残基の数及び分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度を有するか、または同一性または類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、１０の期待値の閾値、３のワードサイズ、行列としてＢＬＯＳＵＭ６２、及び１１のギャップペナルティ（イグジステンス）ならびに１のギャップペナルティ（エクステンション）及び条件付き組成スコア行列調整を使用する。ＢＬＡＳＴＰについての他のデフォルト設定は、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（２０１７年８月１４日に最終アクセス）に利用可能なものにより記載されており、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲内では、「変異体」は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を保持する。
【０１１１】
本発明のある実施形態では、酵母細胞は、プロリル−３−ヒドロキシラーゼを過剰産生するように操作を受ける。非限定的な例は、プロリル−３−ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、プロリル−３−ヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片の発現ベクターへの組み込みである。本発明のある実施形態では、プロリル−３−ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、プロリル−３−ヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片を含有する発現ベクターは、誘導性プロモーターの制御下にある。好適な酵母細胞、発現ベクター、及びプロモーターは以下に記載されている。
【０１１２】
リシルヒドロキシラーゼ。リシルヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１１．４）は、Ｘ−ｌｙｓ−ｇｌｙ配列中のリシン残基のヒドロキシル化によるヒドロキシリシンの形成を触媒する。この酵素は、約８５ｋＤの分子質量を有するサブユニットからなるホモ二量体である。リシルヒドロキシラーゼの一次構造とプロリル−４−ヒドロキシラーゼのサブユニットの２つのタイプ（１７６７１０、１７６７９０）との間には、これらの２つのコラーゲンヒドロキシラーゼ間の速度論的特性に顕著な類似性にもかかわらず、有意な相動性は見出されていない。例えば、コラーゲン中のリシルヒドロキシラーゼ反応において形成されたヒドロキシリシン残基は、２つの重要な機能；第１に、それらのヒドロキシ基が炭水化物、単糖類のガラクトースまたは二糖類のグルコシルガラクトースのいずれかのための付着部位として働くことと、第２に、これらが分子間コラーゲン架橋を安定化させることとを有する。
【０１１３】
例示的なリシルヒドロキシラーゼは、ＰＬＯＤ１プロコラーゲン−リシン，２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ１［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ（ウシ）］であり、２０１７年５月２５日に更新され、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／２８１４０９（２０１７年７月１４に最終アクセス）に参照により組み込まれるＧｅｎｅ  ＩＤ：２８１４０９（配列番号６）により記載される。別の例は、配列番号７に記載されており、これは、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓのリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）を記述する。さらに別の例は、配列番号１４に記載されており、これは、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓの二機能性酵素、アルギニンデメチラーゼ及びリシル−ヒドロキシラーゼＪＭＪＤ６である。リシルヒドロキシラーゼ酵素は、その天然型で使用することができる。しかしながら、アイソフォーム、オルソログ、変異体、断片及び非ウシ源からのリシルヒドロキシラーゼもまた、これらが酵母宿主細胞中でヒドロキシラーゼ活性を保持する限りにおいて使用されてもよい。
【０１１４】
本出願の文脈において、「変異体」は、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似度行列を用いて、リシルヒドロキシラーゼアミノ酸配列などの基準アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を含み、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連した配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中程度に関連する配列に、そしてＢＬＯＳＵＭ８０は、より遠縁に当たる配列に使用することができる。特に断りのない限り、類似度スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性率は、ＢＬＡＳＴＰの正のスコアに基づき、配列同一性率は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコアの配列対中の総残基の数及び分率を示し、ＢＬＡＳＴＰの「正値」は、アライメントスコアが正値を有し、互いに類似している残基の数及び分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度を有するか、または同一性または類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、１０の期待値の閾値、３のワードサイズ、行列としてＢＬＯＳＵＭ６２、及び１１のギャップペナルティ（イグジステンス）ならびに１のギャップペナルティ（エクステンション）及び条件付き組成スコア行列調整を使用する。ＢＬＡＳＴＰについての他のデフォルト設定は、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（２０１７年８月１４日に最終アクセス）に利用可能なものにより記載されており、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲内では、「変異体」は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を保持する。
【０１１５】
本発明のある実施形態では、酵母細胞は、リシルヒドロキシラーゼを過剰産生するように操作を受ける。非限定的な例は、リシルヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、リシルヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片の発現ベクターへの組み込みである。本発明のある実施形態では、リシルヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド、リシルヒドロキシラーゼ活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片を含有する発現ベクターは、誘導性プロモーターの制御下にある。好適な酵母細胞、発現ベクター、及びプロモーターは以下に記載されている。
【０１１６】
αケトグルタル酸トランスポーター。ｋｇｔＰ遺伝子は、Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中に存在し、境界膜を横切るαケトグルタル酸の取込み及びそれに付随するカチオンの受入れを担うαケトグルタル酸トランスポーターをコードする（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏＬ−Ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  Ｐｅｒｍｅａｓｅ  ｂｙ  ＰｈｏＡ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＷＯＮＧＩ  ＳＥＯＬｔ  ＡＮＤ  ＡＡＲＯＮ  Ｊ．ＳＨＡＴＫＩＮ，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｊａｎ．１９９３，ｐ．５６５−５６７）。この遺伝子は、シアノバクテリアに形質転換されている（Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ２−Ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｉｎ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｋｇｔＰ  Ｇｅｎｅ，ＭＡＲＩＡ  ＦＥＬＩＸ  ＶＡＺＱＵＥＺ−ＢＥＲＭＵ  ＤＥＺ，ＡＮＴＯＮＩＡ  ＨＥＲＲＥＲＯ，ＡＮＤ  ＥＮＲＩＱＵＥ  ＦＬＯＲＥＳ，ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｊａｎ．２０００，ｐ．２１１−２１５）。
【０１１７】
本発明者らは、ｋｇｔＰ遺伝子を酵母に形質転換することが、より健常な生物体を提供することを見出している。さらに、酵母がコラーゲンなどのタンパク質または炭水化物を産生する場合、形質転換された酵母が、タンパク質または炭水化物が作製され、かつヒドロキシル化が生じる小胞体においてαケトグルタル酸をより利用可能にすることによって、タンパク質または炭水化物の産生を増加させ、コラーゲンのヒドロキシル化を改善した。
【０１１８】
例示的なｋｇｔＰ遺伝子は、配列番号２に記載されており、一方例示的なαケトグルタル酸トランスポーターは、配列番号１に記載されている。この酵素は、その天然型で使用することができる。しかしながら、アイソフォーム、オルソログ、変異体、断片及び非Ｅ．ｃｏｌｉ源からのαケトグルタル酸トランスポーターもまた、これらが酵母宿主細胞中でαケトグルタル酸トランスポーター活性を保持する限りにおいて使用されてもよい。さらに、ｋｇｔＰ遺伝子は、酵母における発現のために最適化されてもよい。例えば、Ｐｉｃｈｉａ中の発現に最適化されたαケトグルタル酸トランスポーター遺伝子（ｋｇｔＰ）の例は、配列番号３に記載されている。
【０１１９】
本出願の文脈において、「変異体」は、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似度行列を用いて、αケトグルタル酸トランスポーターアミノ酸配列などの基準アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、または９９％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を含み、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連した配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中程度に関連する配列に、そしてＢＬＯＳＵＭ８０は、より遠縁に当たる配列に使用することができる。特に断りのない限り、類似度スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性率は、ＢＬＡＳＴＰの正のスコアに基づき、配列同一性率は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコアの配列対中の総残基の数及び分率を示し、ＢＬＡＳＴＰの「正値」は、アライメントスコアが正値を有し、互いに類似している残基の数及び分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度を有するか、または同一性または類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、１０の期待値の閾値、３のワードサイズ、行列としてＢＬＯＳＵＭ６２、及び１１のギャップペナルティ（イグジステンス）ならびに１のギャップペナルティ（エクステンション）、及び条件付き組成スコア行列調整を使用する。ＢＬＡＳＴＰについての他のデフォルト設定は、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（２０１７年８月１４日に最終アクセス）に利用可能なものにより記載されており、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲内では、「変異体」は、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ活性を保持する。
【０１２０】
本発明のある実施形態では、酵母細胞は、αケトグルタル酸トランスポーターを過剰産生するように操作を受ける。非限定的な例は、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチド、αケトグルタル酸トランスポーター活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片の発現ベクターへの組み込みである。本発明のある実施形態では、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするポリヌクレオチド、αケトグルタル酸トランスポーター活性を発現するそのアイソフォーム、そのオルソログ、その変異体、またはその断片を含有する発現ベクターは、誘導性プロモーターの制御下にある。好適な酵母細胞、発現ベクター、及びプロモーターは以下に記載されている。
【０１２１】
アスコルビン酸合成経路が機能することを可能にする１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（複数可）
Ｌ−アスコルビン酸、酵母、植物、及び動物のアスコルビン酸合成経路が、Ｓｍｉｒｎｏｆｆ（２００１）Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ＆  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ６１−２４１−２６６  ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔｓ  Ａｓａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄ．）．Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００４に記載されている。様々な遺伝子が、個々に、または組み合わされて、酵母中のアスコルビン酸合成を可能にするために使用することができる。これらとしては、例えば、植物の経路については、ＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースをＬ−ガラクトース−１−Ｐに変換するＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼ、Ｌ−ガラクトース−１−ＰをＬ−ガラクトースに変換するイノシトール−リン酸ホスファターゼ、ＧＤＰ−Ｄ−マンノースをＧＤＰ−Ｌ−ガラクトースに変換するＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼをコードする遺伝子またはポリヌクレオチドが、酵母に形質転換され得ることが含まれる。Ｐｉｃｈｉａは、この経路を完了するために必要な他の遺伝子をすでに有している。これらの遺伝子は、以下の酵素を提供する：ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、マンノース−６−リン酸−イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼ及びマンノース−１−リン酸−グアニリルトランスフェラーゼ。
【０１２２】
動物の経路については、以下の遺伝子を付加することができる：Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンをＬ−アスコルビン酸に変換するＬ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グロン酸をＬ−グロノ−１，４−ラクトンに変換するアルドノラクトナーゼ、Ｄ−グルクロン酸をＤ−グルクロノラクトンに変換するグルクロノラクトンレダクターゼ、Ｄ−グルクロン酸をＬ−グロン酸に転換するＤ−グルクロン酸レダクターゼ、Ｄ−グルクロン酸をＤ−グルクロノラクトンに変換するウロノラクトナーゼ、Ｄ−グルクロン酸−１−ＰをＤ−グルクロン酸に変換するＤ−グルクロノキナーゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸をＤ−グルクロン酸−１−Ｐに変換するグルクロン酸−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−Ｄ−グルコースをＵＤＰ−グルクロン酸に変換するＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ−グルコース−１−ＰをＵＤＰ−Ｄ−グルコースに変換するＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、Ｄ−Ｇｌｃ−６−ＰをＤ−グルコース−１−Ｐに変換するホスホグルコムターゼ、及び／またはＤ−グルコースをＤ−Ｇｌｃ−６−Ｐに変換するヘキソキナーゼ。
【０１２３】
酵母がアスコルビン酸を作製することを可能にするために、酵素の全てについての遺伝子の全てを形質転換する必要はない。実際には、本発明においては、酵母細胞に供給されたアスコルビン酸経路前駆体から下流のアスコルビン酸合成経路の一部についてのタンパク質をコードする遺伝子のうちの１つ以上を挿入することだけが必要であることが想定される。例えば、Ｌ−ガラクトース−１−ＰをＬ−ガラクトースに変換する酵素イノシトール−リン酸−ホスファターゼに対する遺伝子を酵母に挿入し、次いで、酵母がＬ−アスコルビン酸を産生することを可能にするＬ−ガラクトース−１−Ｐを酵母に供給することができる。
【０１２４】
ＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａから提供されてもよく、配列番号２１のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む。
【０１２５】
ＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼの代表的なアミノ酸配列は、配列番号２２に記載されている。
【０１２６】
イノシトール−リン酸ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２５）は、既知のクラスの酵素であり、Ｌ−ガラクトース１−リン酸（Ｌ−Ｇａｌ  １−Ｐ）、Ｄ−ミオイノシトール３−リン酸（Ｄ−Ｉｎｓ  ３−Ｐ）及びＤ−ミオイノシトール１−リン酸（Ｄ−Ｉｎｓ  １−Ｐ）に作用するホスファターゼである。ベータ−グリセロリン酸（グリセロール２−Ｐ）も、また比較的程度は低いが、Ｄ−ガラクトース１−リン酸（Ｄ−Ｇａｌ  １−Ｐ）、アルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸（ａ−Ｄ−Ｇｌｃ  １−Ｐ）、Ｄ−マンニトール１−リン酸及びアデノシン２’−一リン酸も基質として使用することができる。Ｄ−フルクトース１−リン酸（Ｄ−Ｆｒｕ  １−Ｐ）、フルクトース１，６−ビスリン酸（Ｆｒｕ  １，６−ｂｉｓＰ）、Ｄ−グルコース６−リン酸（Ｄ−Ｇｌｃ  ６−Ｐ）、Ｄ−アルファ−グリセロリン酸（グリセロール３−Ｐ）、Ｄ−ソルビトール６−リン酸及びＤ−ミオイノシトール２−リン酸とは活性がない。六員環基質中のＣ１リン酸位置が、触媒にとって重要である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの７１、９１、９３、９４、及び２２１におけるアミノ酸位置は、金属結合に寄与し、アミノ酸位置７１及び２１３は、基質結合に寄与する。代表的なヌクレオチド配列を配列番号２３に示す。
【０１２７】
イノシトール−リン酸ホスファターゼの１つのアイソフォームを配列番号２４に示す。
【０１２８】
ＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１８）は、既知のクラスの酵素であり、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）の生合成における関与工程に先立つＧＤＰ−Ｄマンノースの可逆的エピマー化を触媒して、高エネルギーのグリコシル−ピロホスホリル結合の加水分解をもたらす。２つの別個のエピマー化反応を触媒することができ、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−Ｌ−ガラクトース及びＧＤＰ−Ｌグロースの両方を放出することができる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて、領域１４３−１４５、２１６−２１及び／または２４１−２４３は、基質結合に関与し、１つ以上の位置１４５、１７４、１７８、２１７、及び／または３０６は、酵素活性に関与し、位置５８、７８、１７４、及び／または１７８のうちの１つ以上は、ＮＡＤ結合に関与し、位置１０３、２０３、２２５、３０６、及び／または３５６のうちの１つ以上は基質結合に関与する。
【０１２９】
本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、配列番号２５のアミノ酸配列の全てまたは一部をコードすることができる。
【０１３０】
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．８）は、既知のクラスの酵素であり、アスコルビン酸の生合成に関与する。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおいて、位置１５６は活性に関与し、好ましくは、アミノ酸１０２〜６１０またはＦＡＤ結合に関与するアミノ酸１２３〜２５８を有するその断片のみを含有する。
【０１３１】
本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアイソフォームのアミノ酸配列、例えば配列番号２６の全てまたは一部をコードすることができる。
【０１３２】
第２のアイソフォームは、配列がＫＳＰＩＳＰＡＦＳＴＳＥＤＤＩＦＳＷＶ（配列番号２７）及びＷＹＮＨＶＰＰＤＳＲＰＳＰＥＫＧＨＨＲ（配列番号２８）から４９４〜５１２において変更され、５１３〜６１０が欠けている上記配列に由来する。
【０１３３】
グルクロノラクトンレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．２０）は、既知のクラスの酵素であり、Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン＋ＮＡＤＰ（＋）＜＝＞Ｄ−グルクロノ−３，６−ラクトン＋ＮＡＤＰＨの反応を触媒し、例えば、公共的にアクセスできるＵｎｉＰｒｏｔデータベースから以下に概説されるような多数の生物から当該技術分野において既知である。
【表１−１】
2019058165.tif 000002
【表１−２】
2019058165.tif 000003
【０１３４】
アルドノラクトナーゼは、当該技術分野において既知であり、場合によっては、グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）とも呼ばれ、公共的にアクセスできるＵｎｉＰｒｏｔデータベースから以下に概説されるような多数の生物から既知である。
【表２−１】
2019058165.tif 000004
【表２−２】
2019058165.tif 000005
【表２−３】
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【表２−４】
2019058165.tif 000007
【０１３５】
Ｄ−グルクロン酸レダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１９）は、既知のクラスの酵素であり、例えば、公共的にアクセスできるＵｎｉＰｒｏｔデータベースから以下に概説されるような多数の生物に由来する。
【表３−１】
2019058165.tif 000008
【表３−２】
2019058165.tif 000009
【表３−３】
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【表３−４】
2019058165.tif 000011
【表３−５】
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【表３−６】
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【０１３６】
ウロノラクトナーゼは、既知のクラスの酵素（ＥＣ３．１．１．１９）であり、Ｄ−グルクロノ−６，２−ラクトン＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞Ｄ−グルクロン酸の反応を触媒し、グルクロノラクトナーゼまたはＤ−グルクロノ−６，２−ラクトンラクトノヒドロラーゼとしても知られ、この酵素活性に関連する多くの酵素が既知であり、ＥＣ３．１．１．１９を参照されたい。
【０１３７】
Ｄ−グルクロノキナーゼ（ＥＣ２．７，１，４３）は、既知のクラスの酵素であり、例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａに由来し、結合に関与するアミノ酸１２６−１３６によるＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌａｃＡ）の生合成に関与する。本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、配列番号２９のアミノ酸配列の全てまたは一部をコードすることができる。
【０１３８】
グルクロン酸−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、ＵＴＰ＋１−ホスホ−アルファ−Ｄ−グルクロン酸の二リン酸＋ＵＤＰ−グルクロン酸への化学反応を触媒する既知のクラスの酵素（ＥＣ２．７．７．４４）であり、例えば、公共的にアクセスできるＵｎｉＰｒｏｔデータベースから以下に概説されるような多数の生物から当該技術分野において既知である。
【表４−１】
2019058165.tif 000014
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０１３９】
ＵＤＰ−Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２）は、ＵＤＰ−グルコース＋２ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ  ＵＤＰ−グルクロン酸＋２ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２２）の化学反応を触媒する既知のクラスの酵素であり、配列番号３０の全てまたは一部を含むことができる。
【０１４０】
ＵｎｉＰｒｏｔの公共的に利用可能なデータベースからの他の配列は、下記の通りである。
【表５】
2019058165.tif 000018
【０１４１】
ＵＴＰ−グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）は、既知のクラスの酵素であり、グルコース−１−リン酸ウロジリルトランスフェラーゼ（またはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ）としても知られ、炭水化物代謝に関与する酵素である。これは、ＵＤＰ−グルコースをグルコース−１−リン酸及びＵＴＰから合成する。当該技術分野においては、このクラスに関連する様々な種から数百もの既知の配列が存在する。
【０１４２】
ホスホグルコムターゼ（ＥＣ５．４．２．２）は、既知のクラスの酵素であり、α−Ｄ−グルコースモノマー上のリン酸基を１’位から６’位に順方向に、または６’位から１’位まで逆方向に転移させる酵素である。当該技術分野においては、このクラスに関連する様々な種から数百もの既知の配列が存在する。
【０１４３】
ヘキソキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１）は、ヘキソース（六炭糖）をリン酸化して、リン酸ヘキソースを形成する既知のクラスの酵素である。当該技術分野においては、このクラスに関連する様々な種から数百もの既知の配列が存在する。
【０１４４】
組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）中のプロリン残基のヒドロキシル化度のアッセイ。本発明により産生された組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）中のプロリン残基のヒドロキシル化度は、参照により組み込まれる、Ｃｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：５１（２０１２）によって記載される液体クロマトグラフィー−質量分析法を含む既知の方法によってアッセイすることができる。
【０１４５】
組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）中のリシン残基のヒドロキシル化度のアッセイ。リシンのヒドロキシル化及びコラーゲンの架橋は、参照により組み込まれる、Ｙａｍａｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４４６，ｐａｇｅｓ  ９５−１０８．；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００８）により記載されている。本発明により産生された組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）中のリシン残基のヒドロキシル化度は、参照により組み込まれる、Ｈａｕｓｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３３（３）：５９１−５９３（１９６７）によって記載される方法を含む既知の方法によってアッセイすることができる。
【０１４６】
ヒドロキシル化度。本発明により産生されたタンパク質（例えば、コラーゲン）中のプロリンまたはリシン残基のヒドロキシル化度は、好ましくは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または１００％である。プロリン残基にリシン残基を加えたヒドロキシル化度が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または１００％であることも本発明の範囲内である。
【０１４７】
コラーゲンの融点。コラーゲン中のプロリン、リシン、またはプロリン及びリシン残基のヒドロキシル化度は、ヒドロキシル化アミノ酸残基の既知の含量を有する対照コラーゲンと比較したヒドロゲルなどの水和コラーゲンの融解温度によって推定することができる。コラーゲンの融解温度は、より高度にヒドロキシル化されたコラーゲンが、一般により高い融解温度を有する状態で、２５〜４０℃の範囲であり得る。この範囲は、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９及び４０℃から選択される温度によって上限及び下限と境を接する部分範囲を含む全ての中間の部分範囲及び値を含む。
【０１４８】
コドン改変。本発明の範囲内において、酵母宿主細胞中に導入される遺伝子配列が、その天然の配列から改変されることが想定される。このプロセスは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母によって発現された組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）の量を改変するために、組換え酵母によって分泌される組換えタンパク質（例えばコラーゲン）の量を改変するために、組換え酵母中の組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）の発現の速度を改変するために、または組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）中のリシンまたはプロリン残基のヒドロキシル化度を改変するために、目的のタンパク質（例えば、天然で見出されるコラーゲンＤＮＡ配列などのコラーゲン）をコードするポリヌクレオチド配列の変更を含む。コドン改変はまた、ヒドロキシラーゼなどの他のタンパク質に同様な目的のために、またはヒドロキシラーゼを特定の細胞内もしくは細胞外区画に向けるために、例えば、プロリンヒドロキシラーゼを組換えタンパク質（例えば、コラーゲン）分子と同じ区画、例えば小胞体に向けるために適用されてもよい。コドン選択は、ＲＮＡ二次構造に及ぼす効果、転写及び遺伝子発現に及ぼす効果、翻訳伸長の速度に及ぼす効果、ならびに／またはタンパク質折り畳みに及ぼす効果に基づいて行われてもよい。
【０１４９】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするコドンは、組換えコラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードするｍＲＮＡ中の二次構造を低減または増加させるように改変されてもよく、または冗長なコドンを、酵母中の全てのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）、平均して酵母宿主細胞によって最も頻繁に使用されるコドンで、酵母中の全てのタンパク質コード配列に基づいて（例えば、コドンサンプリング）、酵母宿主細胞によってあまり頻繁に使用されないコドンで、もしくは酵母宿主細胞によって多量に発現されるタンパク質中に出現するか、または酵母宿主細胞により分泌されるタンパク質中に出現する（例えば、遺伝子を高度に発現された遺伝子または発現宿主から分泌可能なタンパク質をコードする遺伝子に「見えるようにする」高コドン適合度指数（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）に基づくコドン選択）冗長なコドンで置き換えるように改変されてもよい。
【０１５０】
コドン改変は、タンパク質コード配列の全てまたは一部に、例えば、コード配列の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、または第１０の１０％のうちの少なくとも１つ、もしくはこれらの組み合わせに適用されてもよい。これはまた、特定のアミノ酸配列をコードするコドンに、または冗長なコドンによってコードされる一部であるが全てではないアミノ酸をコードするコドンにも選択的に適用されてもよい。例えば、ロイシン及びフェニルアラニンに対するコドンだけが、上述したようにコドン改変が行われてもよい。２つ以上のコドンによってコードされるアミノ酸は、当該技術分野において周知である遺伝子暗号表によって記載されている。
【０１５１】
コドン改変は、参照により組み込まれる、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｇｅｎｅｇｐｓ（２０１７年７月１３日に最終アクセス）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ  ｏｒ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ，Ａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７  （２００６）：２８５．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．１７  Ａｕｇ．２０１７によって記載されているいわゆるコドン最適化法を含む。
【０１５２】
コドン改変はまた、ｍＲＮＡ二次構造の形成を可能にするような、または二次構造を最小化もしくは排除するようなコドンの選択も含む。この一例は、リボゾーム結合部位または開始コドンにおいて、またはそれらの周りで二次構造の強い二次構造を排除、低減または弱めるようにコドン選択を行うことである。
【０１５３】
本発明のある実施形態では、αケトグルタル酸トランスポーター遺伝子配列が、酵母、特にＰｉｃｈｉａで使用するために最適化される。最適化αケトグルタル酸トランスポーター遺伝子（ｋｇｔＰ）の一例を配列番号３に記載する。
【０１５４】
コラーゲン断片。組換えコラーゲン分子は、トロポコラーゲン（三量体コラーゲン）を形成することができる天然コラーゲン分子または天然コラーゲンのアミノ酸配列と（またはその線維形成領域もしくは[Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ]ｎを実質的に含むセグメントに）少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一または類似するアミノ酸配列を有する改変コラーゲン分子もしくは短縮型コラーゲン分子のアミノ酸配列の断片、例えば、それぞれ、参照により組み込まれる、受入番号ＮＰ＿００１０２９２１１．１（配列番号１１）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／７７４０４２５２、２０１７年８月２３日に最終アクセス）、ＮＰ＿７７６９４５．１（配列番号１２）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／２７８０６２５７、２０１７年８月２３日に最終アクセス）、及びＮＰ＿００１０７０２９９．１（配列番号１３）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／１１６００３８８１、２０１７年２月９日に最終アクセス）により記載される、Ｃｏｌ１Ａ１，Ｃｏｌ１Ａ２、及びＣｏｌ３Ａ１のアミノ酸配列のものを含むことができる。
【０１５５】
コラーゲンまたはヒドロキシラーゼをコードする遺伝子は、配列を付加または除去するために、短縮されても、または別の方法で改変されてもよい。このような改変は、ポリヌクレオチドまたはベクターのサイズをカスタマイズするために、発現されたタンパク質を小胞体または他の細胞内もしくは細胞外区画に向けるために、またはコードされたタンパク質の長さを制御するために行われてもよい。例えば、本発明者らは、プレ配列のみを含有する構築物が、完全なプレ−プロ配列を含有するものよりも良好に働くことが多いことを見出した。プレ配列は、Ｐ４ＨＢに融合されて、コラーゲンが同様に局在化しているＥＲ中でＰ４ＨＢを局在化した。
【０１５６】
コラーゲン及びヒドロキシラーゼに対する改変コード配列。コラーゲンまたはヒドロキシラーゼ、もしくは他のタンパク質に対するポリヌクレオチドコード配列は、ポリヌクレオチドコード配列は、既知のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、または１００％同一もしくは類似するタンパク質であって、非改変分子の本質的な特性、例えば、トロポコラーゲンを形成するための能力またはコラーゲン中のプロリンもしくはリシン残基をヒドロキシル化するための能力を保持するタンパク質をコードするように改変されてもよい。コラーゲン分子中のグリコシル化部位が、除去または付加されてもよい。改変は、酵母宿主細胞によるコラーゲン収率またはその分泌を促進するために、もしくはその構造的、機能的、または審美的特性を変更するために行われてもよい。改変コラーゲンまたはヒドロキシラーゼコード配列はまた、本明細書に記載されるようにコドン改変されてもよい。
【０１５７】
ＢＬＡＳＴＮは、コラーゲン、本明細書に記載される１つ以上のヒドロキシラーゼ、またはシグナル、リーダーもしくは分泌ペプチドまたは本明細書に開示される任意の他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどの基準ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％または＜１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を特定するために使用することができる。高度に類似した配列を見つけるように修正された代表的なＢＬＡＳＴＮ設定は、１０の期待値の閾値、２８のワードサイズ、０のクエリ幅内での最大マッチ、１／−２のマッチ／ミスマッチスコア、及びリニアギャップコストを用いる。低複雑領域は、フィルタリングされるか、またはマスクされ得る。標準ヌクレオチドＢＬＡＳＴのデフォルト設定は、当該技術分野において周知である。
【０１５８】
ＢＬＡＳＴＰは、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、またはＢＬＯＳＵＭ８０などの類似度行列を用いて、コラーゲンアミノ酸配列などの基準アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、または＜１００％の配列同一性、または類似性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を特定するために使用することができ、ＢＬＯＳＵＭ４５は密接に関連した配列に、ＢＬＯＳＵＭ６２は中程度に関連する配列に、そしてＢＬＯＳＵＭ８０は、より遠縁に当たる配列に使用することができる。特に断りのない限り、類似度スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくであろう。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性率は、ＢＬＡＳＴＰの正のスコアに基づき、配列同一性率は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一である高スコアの配列対中の総残基の数及び分率を示し、ＢＬＡＳＴＰの「正値」は、アライメントスコアが正値を有し、互いに類似している残基の数及び分率を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列とこれらの同一性または類似性の程度を有するか、または同一性または類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が企図され、本開示により包含される。代表的なＢＬＡＳＴＰ設定は、１０の期待値の閾値、３のワードサイズ、行列としてＢＬＯＳＵＭ６２、及び１１のギャップペナルティ（イグジステンス）ならびに１のギャップペナルティ（エクステンション）及び条件付き組成スコア行列調整を使用する。ＢＬＡＳＴＰについての他のデフォルト設定は、当該技術分野において周知である。
【０１５９】
本明細書に開示されるポリペプチドに適用される「変異体」、「改変配列」または「類似体」という用語は、生物学的に活性な分子のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、または９９％同一または類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、誘導体は、天然の配列または以前に操作された配列のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。誘導体は、天然の分子または以前に操作された分子のアミノ酸配列に対して付加、欠失、置換、またはこれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、誘導体は、天然コラーゲン配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のプロリンもしくはリシン残基を組み込むか、または欠失してもよい。このような選択は、組換えトロポコラーゲンまたはフィブリル化コラーゲンの緩みまたは引き締まりを改変するために行われてもよい。
【０１６０】
誘導体は、アミノ酸残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、または２６〜３０個の付加、置換、または欠失を有する変異体ポリペプチドを含んでもよい。付加または置換もまた、非天然アミノ酸または改変アミノ酸の使用を含む。誘導体はまた、システイン残基、またはヒドロキシル化もしくはグリコシル化残基間の架橋などのポリペプチドに対する化学的修飾を含んでもよい。
【０１６１】
酵母株。本発明は、コラーゲンもしくは他のタンパク質、または炭水化物を産生するために酵母を利用する。詳細には、本発明は、増加したヒドロキシル化度を有するコラーゲンまたは他の炭水化物を産生するために改変された酵母を利用する。この酵母は、遺伝子発現ｋｇｔＰ遺伝子、ヒドロキシラーゼを発現する遺伝子、または機能的アスコルビン酸合成経路を完了するのに必要な遺伝子（複数可）のうちの１つ以上を挿入することによって、αケトグルタル酸及び／またはアスコルビン酸を産生または過剰産生するように操作を受けてもよい。
【０１６２】
好適な酵母としては、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｋｏｍａｔａｇａｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のもの及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。酵母は改変させるか、またはハイブリダイズさせてもよい。ハイブリダイズさせた酵母は、同じ種の異なる株、同じ属の異なる種、または異なる属の株の混合育種である。本発明により使用され得る酵母株の例には、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｅｐｈａｌｏｃｅｒｅａｎａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｅｒｅｍｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｙａｎｍａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎａｋａｓｅｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｈｅｅｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｅｘｉｇｕａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｃａｃｔｏｐｈｉｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどが挙げられる。
【０１６３】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、ヒトインターフェロンガンマなどの生物治療用タンパク質を組換え的に発現するために使用されてきた酵母種である（Ｒａｚａｇｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ４５：５２−６０（２０１７）を参照されたい）。これは、ＩＩＩ型コラーゲン及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現するために使用されている（Ｖｕｏｒｅｌａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６７０２−６７１２（１９９７）を参照されたい）。コラーゲン及びプロリル−４−ヒドロキシラーゼはまた、コラーゲン性材料を産出するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでも発現されている（Ｐｉｎｋａｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（４）：３２０−３２４（２０１１）を参照されたい）。
【０１６４】
一実施形態では、本発明は、コドン最適化コラーゲン、ヒドロキシラーゼ（複数可）、αケトグルタル酸トランスポーター、及び／または機能的アスコルビン酸合成経路を完了するために必要な遺伝子（複数可）を発現するように操作を受けたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株を目的とする。有用なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株としては、野生型（ＰＰＳ−９０１０株）；ＰＰＳ−９０１０のゆっくりとメタノールを利用する誘導体であるａｏｘ１Δ（ＭｕｔＳ）（ＰＰＳ−９０１１株）；及びプロテアーゼを欠くｐｅｐ４Δ、ｐｒｂ１Δ（ＰＰＳ−９０１６株）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの株は、公共的に利用可能であり、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．＿ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｅｌｌ−ｓｔｒａｉｎｓ．でＡＴＵＭから得ることができる。
【０１６５】
酵母のためのポリペプチド分泌配列。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞によってコードされるポリペプチドは、酵母からのその分泌を容易にするポリペプチド配列に融合される。例えば、ベクターは、分泌ペプチドをコードする配列に融合されたコラーゲンに対するコード配列を含むキメラ遺伝子をコードすることができる。この目的のために使用することができる分泌配列としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓアルファ交配因子プレプロ配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓアルファ交配因子プレ配列、ＰＨＯ１分泌シグナル、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒからのα−アミラーゼシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉからのグルコアミラーゼシグナル配列、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓからの血清アルブミンシグナル配列、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｃｙｅｓ  ｍａｘｉａｎｕｓからのイヌリナーゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのインベルターゼシグナル配列、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのキラータンパク質シグナル配列、及びＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓからのリゾチームシグナル配列が挙げられる。当該技術分野において既知の他の分泌配列も使用されてもよい。
【０１６６】
酵母プロモーター及びターミネーター。いくつかの実施形態では、以下の酵母プロモーターのうちの１つ以上が、ベクターに組み込まれて、目的のタンパク質（例えば、コラーゲン）、ヒドロキシラーゼ（複数可）、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするｍＲＮＡ、及び／または機能的アスコルビン酸合成経路を完了するために必要な遺伝子（複数可）の転写を促進することができる。これらのプロモーターは当該技術分野において既知であり、ｐＡＯＸ１、ｐＤａｓ１、ｐＤａｓ２、ｐＰＭＰ２０、ｐＣＡＴ、ｐＤＦ、ｐＧＡＰ、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ１、ｐＦＢＡ２、ｐＡＯＸ２、ｐＲＫＩ１、ｐＲＰＥ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＡＤＨ２、ｐＴＰＩ１、ｐＦＢＰ１、ｐＴＡＬ１、ｐＰＦＫ１、ｐＧＰＭ１、及びｐＧＣＷ１４が挙げられる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、酵母ターミネーター配列は、ベクターに組み込まれて、目的のタンパク質（例えば、コラーゲン）、ヒドロキシラーゼ（複数可）、αケトグルタル酸トランスポーターをコードするｍＲＮＡ、及び／または機能的アスコルビン酸合成経路を完了するために必要な遺伝子（複数可）の転写を終結する。これらのターミネーターとしては、ＡＯＸ１  ＴＴ、Ｄａｓ１  ＴＴ、Ｄａｓ２  ＴＴ、ＡＯＤ  ＴＴ、ＰＭＰ  ＴＴ、Ｃａｔ１  ＴＴ、ＴＰＩ  ＴＴ、ＦＤＨ１  ＴＴ、ＴＥＦ１  ＴＴ、ＦＬＤ１  ＴＴ、ＧＣＷ１４  ＴＴ、ＦＢＡ２  ＴＴ、ＡＤＨ２  ＴＴ、ＦＢＰ１  ＴＴ、及びＧＡＰ  ＴＴが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
ペプシン以外のペプチダーゼ。ペプシンは、Ｎ末端及びＣ末端配列を除去することによって、コラーゲンをトロポコラーゲンに加工するために使用することができる。他のプロテアーゼとしては、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、フィカイン、及びブロメラインが挙げられるが、これらに限定されず、この目的のために使用されてもよい。本明細書で使用される場合、「安定なコラーゲン」とは、特定の濃度のペプシンまたは他のプロテアーゼに曝露された後に、コラーゲンの初期濃度の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％が依然として存在することを意味する。好ましくは、同じ条件下で同じ時間処理された不安定なコラーゲンと比べて、安定なコラーゲンの少なくとも７５％がペプシンまたは別のプロテアーゼによる処理後にそのまま残るであろう。翻訳後修飾の前に、コラーゲンはヒドロキシル化されておらず、ペプシンの高濃度（例えば、１：２００またはそれ以上のペプシン：タンパク質の比）の存在下で分解する。
【０１６９】
翻訳後修飾されると、コラーゲンをペプシンまたは別のプロテアーゼと接触させて、コラーゲンのＮ末端及びＣ末端プロペプチドを切断し、これによって、コラーゲンフィブリル化を可能にする。ヒドロキシル化コラーゲンは、非ヒドロキシル化コラーゲンと比べてより良好な熱安定性を有し、高濃度のペプシン消化に対して、例えば、１：２５〜１：１のペプシン：総タンパク質比において耐性である。したがって、組換えコラーゲンの早期タンパク質分解を回避するために、ヒドロキシル化コラーゲンを提供することは有用である。
【０１７０】
代替発現系。コラーゲン及び他のタンパク質は、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ以外の他の種類の酵母細胞で発現されることが可能であり、例えば、別の酵母、メチロトローフ酵母、または他の生物で発現されてもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、多数の発現ベクターのうちのいずれかと共に使用することができる。一般的に使用される発現ベクターは、酵母における繁殖のための２Ｐ複製起点及び外来遺伝子の効率的な転写のためのＥ．ｃｏｌｉのＣｏｌ  Ｅ１起点を含有するシャトルベクターである。このような２Ｐプラスミドに基づくベクターの典型的な例は、ｐＷＹＧ４であり、これは、２Ｐ  ＯＲＩ−ＳＴＢ要素、ＧＡＬ１−１０プロモーター、及び２Ｐ  Ｄ遺伝子ターミネーターを有する。このベクターにおいて、Ｎｃｏｌクローニング部位は、発現されるポリペプチドに対する遺伝子を挿入するために、かつＡＴＧ開始コドンを提供するために使用される。別の発現ベクターはｐＷＹＧ７Ｌであり、これは、インタクトな２αＯＲＩ、ＳＴＢ、ＲＥＰ１及びＲＥＰ２、ならびにＧＡＬ１−１０プロモーターを有し、ＦＬＰターミネーターを使用する。このベクターでは、コードポリヌクレオチドは、ＢａｍＨＩまたはＮｃｏｌ部位に、その５’末端でポリリンカー中に挿入される。挿入されたポリヌクレオチドを含有するベクターは、カルシウム及びポリエチレングリコールによる処理の際にＤＮＡを取り込むスフェロプラストを生成するために細胞壁を除去した後か、またはインタクトな細胞をリチウムイオンで処理することによるかのいずれかで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に形質転換される。
【０１７１】
あるいは、ＤＮＡは、電気穿孔法によって導入することができる。形質転換体は、例えば、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、またはヒスチジンに対して栄養要求性である宿主酵母細胞と共に、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、またはＬＥＵ２−Ｄなどの選択マーカー遺伝子を用いて、選択することができる。
【０１７２】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどのメチロトローフ酵母中には、多くのメタノール応答性遺伝子があり、それぞれの発現は、プロモーターとも称されるメタノール応答性調節領域によって制御される。このようなメタノール応答性プロモーターのいずれも、本発明の実施で使用するために好適である。特異的調節領域の例としては、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）、Ｐ４０プロモーター、及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのカタラーゼ遺伝子に対するプロモーターなどが挙げられる。
【０１７３】
メチロトローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａも言及される。メタノール上での増殖は、ＭＯＸ（メタノールオキシダーゼ）、ＤＡＳ（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）、及びＦＭＨＤ（ギ酸デヒドロゲナーゼ）などのメタノール代謝の重要な酵素の誘導をもたらす。これらの酵素は、総細胞タンパク質の最大で３０〜４０％を構成することができる。ＭＯＸ、ＤＡＳ、及びＦＭＤＨ産生をコードする遺伝子は、メタノール上での増殖によって誘導された強いプロモーターによって制御され、グルコース上の増殖により抑制される。これらのプロモーターのうちのいずれかまたは３つ全ては、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の異種遺伝子の高レベルの発現を得るために使用することができる。したがって、一態様では、動物コラーゲンまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドは、誘導性Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングされる。産物の分泌が望ましい場合、酵母中での分泌のためのシグナル配列をコードするポリヌクレオチドがこのポリヌクレオチドと共にフレーム内に融合される。さらなる実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、栄養要求性宿主の欠損を補うよう使用することができる、ＵＲＡ３またはＬＥＵ２などの栄養要求性マーカー遺伝子を含有する。
【０１７４】
次いで、発現ベクターは、当業者に既知の技術を用いてＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ宿主細胞を形質転換するために使用される。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの形質転換の有用な特徴は、発現ベクターの最大１００コピーのゲノム中への自発的組み込みである。ほとんどの場合、組み込まれたポリヌクレオチドは、頭−尾配置を示す多量体を形成する。組み込まれた外来ポリヌクレオチドは、非選択条件下であっても、いくつかの組換え株において有糸分裂的に安定であることが示されている。この高コピー組み込みの現象により、系の高産生能力がさらに示される。
【０１７５】
外来ＤＮＡは、酵母ゲノムに挿入されるか、またはエピソームに保持されて、コラーゲンを産生する。コラーゲンのＤＮＡ配列は、ベクターを介して酵母中に導入される。外来ＤＮＡは、任意の非酵母宿主ＤＮＡであり、例えば、哺乳動物、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、及び細菌が挙げられるが、これらに限定されない。酵母中のコラーゲン産生に好適な哺乳動物ＤＮＡとしては、ウシ、ブタ、カンガルー、アリゲーター、ワニ、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、コヒツジ、ダイナソー、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
アスコルビン酸の産生を可能にするＤＮＡもまた、単一の、または複数のベクター上で挿入することができる。植物経路については、遺伝子ＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼ、イノシトール−リン酸ホスファターゼ、ＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼに対するＤＮＡが、ベクターを介して酵母細胞に挿入される。Ｐｉｃｈｉａは、ベクターを介して酵母細胞に形質転換されたグルコースからアスコルビン酸を産生するための経路における残りの遺伝子を含有することがすでに知られている。
【０１７７】
アスコルビン酸経路に関するＤＮＡは、それ自体で、またはタンパク質のＤＮＡと組み合わせて挿入されてもよい。アスコルビン酸経路は、ほとんどのタンパク質を産生するのに好適である健常な酵母株の作製を可能にする。
【０１７８】
αケトグルタル酸トランスポーターの産生を可能にするためのＤＮＡもまた、単一のベクター上で挿入することができる。酵母に最適化されたｋｇｔＰ遺伝子が、ベクターを介して酵母細胞中に挿入される。
【０１７９】
αケトグルタル酸トランスポーターのＤＮＡは、それ自体で、またはタンパク質もしくは炭水化物のＤＮＡと組み合わせて挿入されてもよい。αケトグルタル酸トランスポーターは、ほとんどのタンパク質及び炭水化物を産生するのに好適である、健常な、急速に増殖する酵母株を可能にする。このトランスポーターはまた、ヒドロキシル化コラーゲンの増加した産生も可能にする。
【０１８０】
ＤＮＡは、ベクター中に挿入させることができる。酵母中のタンパク質の発現に有用なベクターは既知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｖｏｌ．２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３；Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５３：５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ（１９８６）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３；Ｂｉｔｔｅｒ（１９８７）Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１５２：６７３−６８４；及びＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）を参照されたい（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。他の好適なベクターとしては、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−プレ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏ、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−プレプロ−Ｐ４ＨＢ  Ｇ４１８、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−ＰＨＯ１−Ｐ４ＨＢ  Ｈｙｇｒｏ、ｐＤＦ  Ｃｏｌ３Ａ１修飾ゼオシン、ｐＣＡＴ−Ｃｏｌ３Ａ１修飾ゼオシン、ＡＯＸ１ランディングパッドを有するｐＤＦ−Ｃｏｌ３Ａ１修飾ゼオシン、ｐＨＴＸ１−ＢｉＤｉ−Ｐ４ＨＡ−プレ−プロ−Ｐ４ＨＢ  ｈｙｇｒｏが挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクターは、通常、ＤＮＡの直線化のための少なくとも１つの制限部位を含む。
【０１８１】
選択プロモーターは、組換えタンパク質の産生を改善することができ、目的のタンパク質（例えば、コラーゲン）またはヒドロキシラーゼをコードする配列を含むベクター中に含まれ得る。本発明で使用するために好適なプロモーターとしては、ＡＯＸ１メタノール誘導プロモーター、ｐＤＦ脱抑制プロモーター、ｐＣＡＴ脱抑制プロモーター、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘導双方向性プロモーター、ｐＨＴＸ１構成型双方向性プロモーター、ｐＧＣＷ１４−ｐＧＡＰ１構成型双方向性プロモーター、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適なメタノール誘導プロモーターとしては、ＡＯＸ２、Ｄａｓ  １、Ｄａｓ  ２、ｐＤＦ、ｐＣＡＴ、ｐＰＭＰ２０、ｐＦＤＨ１、ｐＦＬＤ１、ｐＴＡＬ２、ｐＦＢＡ２、ｐＰＥＸ５、ｐＤＡＫ１、ｐＦＧＨ１、ｐＲＫＩ１、ｐＲＥＰ２、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
上記によれば、ベクターが、コラーゲン、ヒドロキシラーゼ（複数可）、αケトグルタル酸トランスポーターの任意の組み合わせもしくは部分的組み合わせ、または全てのこれらの全体のもののうちの少なくとも１つから選択される遺伝子、及び／または機能的アスコルビン酸合成経路を完了するために必要な遺伝子（複数可）のそれぞれを含有する一体型のベクターであるように操作することができることが想定される。
【０１８３】
一体型のベクターを含める、本発明によるベクターにおいて、ターミネーターは、酵母に組み込まれたベクターにおいて利用されるそれぞれのオープンリーディングフレームの末端に配置され得る。ターミネーターのＤＮＡ配列は、ベクター中に挿入される。ベクターを複製するために、複製起点が複製を開始させるために必要である。複製起点のためのＤＮＡ配列は、ベクター中に挿入される。酵母ゲノムに対する相同性を含む１つ以上のＤＮＡ配列が、酵母ゲノムへの組換え及び組み込みを容易にするために、または酵母細胞に形質転換されるとベクターを安定化するために、ベクター中に組み込まれてもよい。
【０１８４】
本発明によるベクターはまた、一般には、正常に形質転換された酵母細胞を選択するために使用される、少なくとも１つの選択マーカーを含むであろう。これらのマーカーは、時には、抗生物質耐性に関連し、これらのマーカーはまた、ある特定のアミノ酸を伴って、または伴わずに増殖するための能力に関連してもよい（栄養要求性マーカー）。好適な栄養要求性マーカーとしては、ＡＤＥ、ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＬＹＳ、ＴＲＰ及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。組換えベクターを含有する酵母細胞の選択をもたらすために、選択マーカーのための少なくとも１つのＤＮＡ配列が、ベクターに組み込まれる。
【０１８５】
本発明のいくつかの実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質を含む組換え体の酵母で発現されたタンパク質中のリシン及びプロリンなどのアミノ酸残基は、ヒドロキシル化を欠いてもよく、または対応する天然もしくは非改変タンパク質、例えばコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質よりも小さい、または大きいヒドロキシル化度を有してもよい。他の実施形態では、コラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質を含む組換え体の酵母で発現されたタンパク質中のアミノ酸残基は、グリコシル化を欠いてもよく、または対応する天然もしくは非改変タンパク質、例えばコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質よりも小さい、または大きいグリコシル化度を有してもよい。
【０１８６】
例えば、ヒドロキシル化コラーゲンは、ヒドロキシル化が不十分なコラーゲン（＜３２℃）よりも高い融解温度（＞３７℃）を有し、ヒドロキシル化が不十分なコラーゲンよりも良好にフィブリル化し、目的の材料により強靭な構造を形成する。コラーゲン調製物の融解温度は、そのヒドロキシル化度を推定するために使用されてもよく、例えば、２５〜４０℃の範囲とすることができ、ならびに全ての中間値、例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、及び４０℃、ならびに前述の値から選択される温度による下限値及び上限値が境を接する部分範囲が使用のためにコラーゲンの集団を選択するために用いることができる。
【０１８７】
ヒドロキシル化が不十分なコラーゲンは、靴またはバッグなどの耐久性品目には適していないゼリー状材料のみを形成する場合があるが、より柔らかい、またはより吸収性の製品中に配合することができる。ヒドロキシル化度を増加させることによって、コラーゲンの熱安定性を改善することが可能であり、それから製造されるバイオファブリケートされた材料の強度も改善することができる。これらのバイオファブリケートされた材料は、靴、バッグ、椅子などを含むより大きな耐久性を要求する品目により好適であり得る。ヒドロキシル化度を調節するための手段として、それぞれの酵素のコピーまたは発現の回数が増加されてもよいことが想定され、細胞培養の温度、ｐＨ、及び炭素源の変更も想定される。
【０１８８】
上記の操作された酵母細胞は、コラーゲンまたは他のタンパク質もしくは炭水化物を産生するための宿主として利用することができる。これを行うために、細胞は発酵槽内の培地中に配置され、制御されたｐＨ条件下で、１２時間から１週間の範囲の時間、溶解酸素及び炭素源が供給される。好適な培地としては、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母エキストラクトペプトンデキストロース（ＹＰＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質が酵母細胞中で産生され、一例としてコラーゲンを使用するという事実のために、コラーゲンを単離するためには、酵母の分泌性株を使用するか、または酵母細胞を溶解してコラーゲンを放出させることのいずれかを行わねばならない。コラーゲンは、その後、例えば、遠心分離、沈降、濾過、クロマトグラフィーなどの従来の技術を通して精製することができる。
【実施例】
【０１８９】
以下の非限定的な実施例は、本発明の例示である。本発明の範囲は、これらの実施例に記載される詳細に限定されるものではない。
【０１９０】
実施例１
アスコルビン酸についての機能的植物合成経路を可能にする酵母の改変。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＢＧ１０株（野生型）を、ＡＴＵＭ（以前はＤＮＡ  ２．０）から得た。ＧＤＰ−Ｌ−Ｇａｌホスホリラーゼ（配列番号１９）、イノシトール−リン酸−ホスファターゼ（配列番号２０）及びＧＤＰ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（配列番号１８）のＤＮＡ配列を含有するベクターを、野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中に挿入し、改変株を生成した。このＤＮＡをＰｍｅＩによって消化させて、ＰＰ１（野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株）に形質転換した。これは、宿主株として好適であった。
【０１９１】
実施例２
実施例１からの宿主株を以下に記載される通りに改変する。
【０１９２】
天然ＩＩＩ型ウシコラーゲンをコードするＤＮＡを配列決定し、この配列をポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコルによって増幅させて、直線状ＤＮＡ配列を作成する。
【０１９３】
Ｐ４ＨＡ／Ｂ酵素をコードするＤＮＡを配列決定し（配列番号８及び配列番号９）、この配列をポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコルによって増幅させて、直線状ＤＮＡ配列を作成する。
【０１９４】
このＤＮＡを、Ｐｉｃｈｉａ電気穿孔プロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）を用いて、実施例１からの株に形質転換する。酵母細胞を、Ｐ４ＨＡ／Ｂ共発現プラスミドで形質転換し、形質転換体をＨｙｇｒｏプレート上で（２００ｕｇ／ｍｌ）選択する。
【０１９５】
実施例１から得られた株の単一コロニーを、１００ｍｌのＹＰＤ培地中に接種し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０度で一晩増殖させる。翌日に、培養物が約３．５のＯＤ６００（約３〜５×１０７個の細胞／ＯＤ６００）に達したときに、これを新鮮なＹＰＤで約１．７のＯＤ６００まで希釈し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０度でさらに１時間増殖させる。
【０１９６】
細胞を３，５００ｇで５分間遠心沈殿し、水で１回洗浄し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのＤＤＴ（新たに添加）、及び０．６Ｍのソルビトールの１０ｍｌ中に再懸濁させる。
【０１９７】
各形質転換体に対して、８×１０８個の細胞を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのＤＤＴ、０．６Ｍのソルビトールの８ｍｌにアリコートし、室温で３０分間インキュベートする。
【０１９８】
細胞を５０００ｇで５分間遠心沈殿し、氷冷した１Ｍのソルビトール１．５ｍｌで３回洗浄し、氷冷した１Ｍのソルビトール８０ｕｌ中に再懸濁させる。
【０１９９】
様々な量（約５ｕｇ）の直線化ＤＮＡを細胞に添加し、ピペット操作によって混合する。
【０２００】
細胞及びＤＮＡ混合物（８０〜１００ｕｌ）を、０．２ｃｍの電気穿孔キュベットに添加し、Ｐｉｃｈｉａ−プロトコルを用いてパルスする（１５００ｖ、２５ｕＦ、２００Ω）。
【０２０１】
これらの細胞を、ＹＰＤ及び１Ｍのソルビトールの（１：１）混合物１ｍｌ中に直ちに移し、３０度で＞２時間インキュベートする。
【０２０２】
これらの細胞を、異なる密度で播種し、３０℃で２日間インキュベートする。
【０２０３】
２日後にプレート上に出現した単一のコロニーを、２４深型ウェルプレート内の２ｍＬのＢＭＧＹ培地中に接種し、９００ｒｐｍで振盪しながら摂氏３０度で少なくとも４８時間増殖させる。得られた細胞を、以下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びペプシンアッセイを用いて、コラーゲンについて試験する。
【０２０４】
酵母細胞を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒを用いて、１４分間継続して３０Ｈｚの速度で、１×溶解緩衝液で溶解させる。溶解緩衝液は、２．５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（最終濃度５０ｍＭ）、４３８．３ｍｇのＮａＣｌ（最終濃度１５０ｍＭ）、５ｍｌのグリセロール（最終濃度１０％）、０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度１％）、及び４２ｍｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水から作製される。
【０２０５】
溶解した細胞を、卓上遠心分離機上で２，５００ｇにて４℃で１５分間遠心分離する。上清を保持し、ペレットを廃棄する。
【０２０６】
２−メルカプトエタノールの存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを上清、分子量マーカー、陰性対照及び陽性対照に対して行う。電気泳動後にゲルを取り出し、クマシーブルーで染色し、次いで水中で脱色する。
【０２０７】
ペプシンアッセイを、以下の手順で行う。
【０２０８】
ペプシン処理の前に、ＢＣＡアッセイを行い、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロトコルにより各試料の総タンパク質を得る。全ての試料についての最低濃度に対して総タンパク質を正規化する。（注記：最低の総タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ未満である場合、その濃度を正規化には使用しない）。
【０２０９】
１００ｕＬの溶解物を微小遠心管中に置く。以下を含有するマスターミックスを作成する：３７％のＨＣＬ（１００μＬ当たり０．６μＬの酸）及びペプシン（原液は脱イオン水中１ｍｇ／ｍＬであり、ペプシンの最終添加は、１：２５比のペプシン：総タンパク質（重量：重量）でなければならない）。ペプシンの添加後、ピペットで３回混合し、試料を室温で１時間インキュベートして、ペプシン反応を起こさせる。１時間後に、β−メルカプトエタノールを含有する１：１容量のＬＤＳローディングバッファーを各試料に添加し、７０℃で７分間インキュベートさせる。（この状況では、１００ｕＬのＬＤＳが添加されねばならない）。次いで、１４，０００ｒｐｍで１分間回転させて、混濁を取り除く。
【０２１０】
試料の上部からの１８ｕＬを、３〜８％のＴＡＥ緩衝液上に添加し、ゲルを１５０Ｖで１時間１０分、泳動する。
【０２１１】
実施例３
アスコルビン酸を産生する酵母
実施例１からの細胞を、グルコース含有培地培地中に接種し、振盪しながら３０℃で増殖させる。試料を異なる時点（例えば、２４、４８、７２時間など）で収集し、市販のキットを使用することによって、細胞内及び細胞外の両方でアスコルビン酸について分析する。アスコルビン酸の量は、経時的に一定である。
【０２１２】
実施例４
アスコルビン酸及びヒドロキシル化コラーゲンを産生する酵母
実施例２からの細胞を、グルコース含有培地培地中に接種し、振盪しながら３０℃で増殖させる。試料を異なる時点（例えば、２４、４８、７２時間など）で収集し、市販のキットを使用することによって、細胞内及び細胞外の両方でアスコルビン酸について分析する。コラーゲン発現レベル及びヒドロキシル化もまた、既知の方法により分析する。
【０２１３】
実施例５
αケトグルタル酸トランスポーターを含むための酵母の改変。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株（野生型）を、ＡＴＵＭ（（以前はＤＮＡ  ２．０）から得た。
【０２１４】
ｋｇｔＰ（配列番号３）のＤＮＡ配列を含有するベクターを、野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中に挿入し、改変株を生成した。このＤＮＡをＢａｍ  ＨＩによって消化し、ＰＰ１（野生型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株）に形質転換した。これは、宿主株として好適であった。
【０２１５】
ｋｇｔＰ遺伝子をＨＡタグでタグ付けした。組換え遺伝子を、抗ＨＡ抗体を用いて、ウェスタンブロットにより検出した。ブロット上に示されたバンドは、ｋｇｔＰ遺伝子についての予想した分子量を有した。
【０２１６】
実施例６
αケトグルタル酸トランスポーターを発現し、かつヒドロキシル化コラーゲンを産生するための酵母の改変
実施例５からの宿主株を以下に記載される通りに改変する。
【０２１７】
天然ＩＩＩ型ウシコラーゲンをコードするＤＮＡを配列決定し（配列番号１０）、この配列をポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコルによって増幅させて、直線状ＤＮＡ配列を作成する。
【０２１８】
Ｐ４ＨＡ／Ｂ酵素をコードするＤＮＡを配列決定し（配列番号８及び配列番号９（Ｐｉｃｈｉａ最適化）または配列番号１５及び１６（天然））、この配列をポリメラーゼ連鎖反応「ＰＣＲ」プロトコルによって増幅させて、直線状ＤＮＡ配列を作成する。
【０２１９】
コラーゲン配列を含有する直線状ＤＮＡを、ｐｉｃｈｉａゲノム中に挿入し、Ｐ４ＨＡ／Ｂ配列を含有する直線状ＤＮＡを、ｐｉｃｈｉａゲノム中に挿入する。
【０２２０】
このＤＮＡを、Ｐｉｃｈｉａ電気穿孔プロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ＃１６５２６６０）を用いて、実施例５からの株に形質転換する。酵母細胞を、Ｐ４ＨＡ／Ｂ共発現プラスミドで形質転換し、形質転換体をＨｙｇｒｏプレート上で（２００ｕｇ／ｍｌ）選択する。
【０２２１】
実施例１から得られた株の単一コロニーを、１００ｍｌのＹＰＤ培地中に接種し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０度で一晩増殖させる。翌日に、培養物が約３．５のＯＤ６００（約３〜５×１０７個の細胞／ＯＤ６００）に達したときに、これを新鮮なＹＰＤで約１．７のＯＤ６００まで希釈し、２１５ｒｐｍで振盪しながら３０度でさらに１時間増殖させる。
【０２２２】
細胞を３，５００ｇで５分間遠心沈殿し、水で１回洗浄し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのＤＤＴ（新たに添加）、及び０．６Ｍのソルビトールの１０ｍｌ中に再懸濁させる。
【０２２３】
各形質転換体に対して、８×１０８個の細胞を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのＤＤＴ、０．６Ｍのソルビトールの８ｍｌにアリコートし、室温で３０分間インキュベートする。
【０２２４】
細胞を５０００ｇで５分間遠心沈殿し、氷冷した１Ｍのソルビトール１．５ｍｌで３回洗浄し、氷冷した１Ｍのソルビトール８０ｕｌ中に再懸濁させる。
【０２２５】
様々な量（約５μｇ）の直線化ＤＮＡを細胞に添加し、ピペット操作によって混合する。
【０２２６】
細胞及びＤＮＡ混合物（８０〜１００ｕｌ）を、０．２ｃｍのキュベットに添加し、Ｐｉｃｈｉａ−プロトコルを用いてパルスする（１５００ｖ、２５ｕＦ、２００Ω）。
【０２２７】
これらの細胞を、ＹＰＤ及び１Ｍのソルビトールの（１：１）混合物１ｍｌ中に直ちに移し、３０度で＞２時間インキュベートする。
【０２２８】
これらの細胞を、異なる密度で播種する。
【０２２９】
単一のコロニーを、２４深型ウェルプレート内の２ｍＬのＢＭＧＹ培地中に接種し、９００ｒｐｍで振盪しながら摂氏３０度で少なくとも４８時間増殖させる。得られた細胞を、以下の手順に従って、細胞溶解、ＳＤＳ−ｐａｇｅ及びペプシンアッセイを用いて、コラーゲンについて試験する。
【０２３０】
酵母細胞を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒを用いて、１４分間継続して３０Ｈｚの速度で、１×溶解緩衝液で溶解させる。溶解緩衝液は、５ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（最終濃度５０ｍＭ）、４３８．３ｍｇのＮａＣｌ（最終濃度１５０ｍＭ）、５ｍｌのグリセロール（最終濃度１０％）、０．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最終濃度１％）、及び４２ｍｌのＭｉｌｌｉｐｕｒｅ水から作製される。
【０２３１】
溶解した細胞を、卓上遠心分離機上で２，５００ｇにて４℃で１５分間遠心分離する。上清を保持し、ペレットを廃棄する。
【０２３２】
２−メルカプトエタノールの存在下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを上清、分子量マーカー、陰性対照及び陽性対照に対して行う。電気泳動後にゲルを取り出し、クマシーブルーで染色し、次いで水中で脱色する。
【０２３３】
ペプシンアッセイを、以下の手順で行う。
【０２３４】
ペプシン処理の前に、ＢＣＡアッセイを行い、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプロトコルにより各試料の総タンパク質を得る。全ての試料についての最低濃度に対して総タンパク質を正規化する。（注記：最低の総タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ未満である場合、その濃度を正規化には使用しない）。
【０２３５】
１００ｕＬの溶解物を微小遠心管中に置く。以下を含有するマスターミックスを作成する：３７％のＨＣＬ（１００μＬ当たり０．６μＬの酸）及びペプシン（原液は脱イオン水中１ｍｇ／ｍＬであり、ペプシンの最終添加は、１：２５比のペプシン：総タンパク質（重量：重量）でなければならない）。ペプシンの添加後、ピペットで３回混合し、試料を室温で１時間インキュベートして、ペプシン反応を起こさせる。１時間後に、β−メルカプトエタノールを含有する１：１容量のＬＤＳローディングバッファーを各試料に添加し、７０℃で７分間インキュベートさせる。（この状況では、１００ｕＬのＬＤＳが添加されねばならない）。次いで、１４，０００ｒｐｍで１分間回転させて、混濁を取り除く。
【０２３６】
試料の上部からの１８ｕＬを、３〜８％のＴＡＥ上に添加し、ゲルを１５０Ｖで１時間１０分、泳動する。アミノ酸分析を行って、ヒドロキシル化率を決定した。ｋｇｔＰの発現は、アルファケトグルタル酸の小胞体中への輸送を可能にし、これが、コラーゲン及びヒドロキシル化コラーゲンのレベルの増加をもたらす。
【０２３７】
実施例７
アスコルビン酸経路を有する実施例１からの酵母を、実施例５の手順で改変し、トランスポーターを酵母に形質転換し、アスコルビン酸経路及びｋｇｔＰトランスポーターの両方を有するＰｉｃｈｉａを提供する。
【０２３８】
実施例８
アスコルビン酸経路及びｋｇｔＰのトランスポーターの両方を有する実施例７からの酵母を、実施例２の手順で改変し、アスコルビン酸経路、ｋｇｔＰのトランスポーター及びヒドロキシル化コラーゲンを有するＰｉｃｈｉａを提供する。
【０２３９】
実施例９
Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼに対する遺伝子（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入）を、Ｐｉｃｈｉａ中の発現のためにコドン最適化した（配列番号１７）。この遺伝子を、構成的プロモーターｐＤＦ下でクローニングし、使用された抗生物質マーカーはゼオシンであった。実施例２と同じ電気穿孔法を用いてプラスミドをＰｉｃｈｉａ細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤプレート上に播種した。プレートを３０℃で２日間、または形質転換体がプレート上に現れ始めるまでインキュベートした。
【０２４０】
プレートから６個の形質転換体を拾い上げ、２４ウェルプレート内の２ｍｌのＢＭＧＹ培地中で、３０℃にて一定の振盪を加えながら１８時間増殖させた。１８時間後に、様々な濃度の基質（Ｌ−グロノ−１，４−ラクトン）を増殖培養物に添加した（０、０．１及び１ｇ／Ｌの最終濃度）。野生型Ｐｉｃｈｉａ細胞を、実験のための対照として使用し、基質も対照培養物に添加した。基質の添加後２０時間で培養物を採取した。光学密度を正規化し、機械的剪断によって、細胞を水中で溶解させた。２つの方法を用いて、細胞溶解物中のアスコルビン酸濃度を定量化した。第１の方法では、アブカムキット（カタログ番号ａｂ６５３５６）を使用して、反応混合物の蛍光強度を測定した。第２の方法は、サリバン及びクラーク法として知られ、異なる細胞溶解物試料についての吸光度がアスコルビン酸の産生の尺度として記録された。Ｌ−グロノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ遺伝子を有する形質転換体の細胞溶解物は、対照（野生型Ｐｉｃｈｉａ及び基質なしで増殖された形質転換体）よりも高い蛍光強度及び高い吸光度を示した。予備データは、１ｇ／Ｌの基質が細胞に添加されると、アスコルビン酸が生成され、約１０ｎｍｏｌのアスコルビン酸が、後の時点（基質の添加後３６時間）で産生されることを示唆した。
【０２４１】
配列表
配列番号１
【表６−１】
2019058165.tif 000019
配列番号２
【表６−２】
2019058165.tif 000020
配列番号３
【表６−３】
2019058165.tif 000021
配列番号４
【表６−４】
2019058165.tif 000022
配列番号５
【表６−５】
2019058165.tif 000023
配列番号６
【表６−６】
2019058165.tif 000024
配列番号７
【表６−７】
2019058165.tif 000025
配列番号８
【表６−８】
2019058165.tif 000026
配列番号９
【表６−９】
2019058165.tif 000027
配列番号１０
【表６−１０】
2019058165.tif 000028
配列番号１１
【表６−１１】
2019058165.tif 000029
配列番号１２
【表６−１２】
2019058165.tif 000030
配列番号１３
【表６−１３】
2019058165.tif 000031
配列番号１４
【表６−１４】
2019058165.tif 000032
配列番号１５
【表６−１５】
2019058165.tif 000033
配列番号１６
【表６−１６】
2019058165.tif 000034
配列番号１７
【表６−１７】
2019058165.tif 000035
配列番号１８
【表６−１８】
2019058165.tif 000036
配列番号１９
【表６−１９】
2019058165.tif 000037
配列番号２０
【表６−２０】
2019058165.tif 000038
配列番号２１
【表６−２１】
2019058165.tif 000039
配列番号２２
【表６−２２】
2019058165.tif 000040
配列番号２３
【表６−２３】
2019058165.tif 000041
配列番号２４
【表６−２４】
2019058165.tif 000042
配列番号２５
【表６−２５】
2019058165.tif 000043
配列番号２６
【表６−２６】
2019058165.tif 000044
配列番号２７
【表６−２７】
2019058165.tif 000045
配列番号２８
【表６−２８】
2019058165.tif 000046
配列番号２９
【表６−２９】
2019058165.tif 000047
配列番号３０
【表６−３０】
2019058165.tif 000048
【配列表】
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【外国語明細書】
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