(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞の形質誘導を簡便且つ高効率で制御可能な細胞培養基材及び形質制御方法を提供する。【解決手段】間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満である。間葉系幹細胞の形質制御方法は、前記間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材上で、間葉系幹細胞を培養する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材。
【請求項２】
前記凹凸のパターンが格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状、ラビリンス状、ライン状又はドット状である、請求項１に記載の間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材上で、間葉系幹細胞を培養することを特徴とする間葉系幹細胞の形質制御方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が１種以上の抗炎症性因子を分泌する、請求項３に記載の間葉系幹細胞の形質制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材及び形質制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療とは、自身の又は他人の細胞を用いて、疾患（特に、自己免疫疾患）を治療する治療法である。投与する細胞の種類としては、Ｔ細胞又は間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）が挙げられる。Ｔ細胞を用いる場合は自家移植であり、ＭＳＣを用いる場合は自家移植だけでなく、大部分が他家移植である。そのため、ＭＳＣは、細胞治療において使用される細胞の中で、最も産業化されている。また、近年、ＭＳＣはその分化能ではなく、抗炎症性因子の分泌能が治療効果に寄与していることが明らかとなり、その抗炎症性が評価されつつある。
【０００３】
また、最近では、富士フィルム株式会社が独自に開発した細胞外マトリックスとＭＳＣとを組み合わせて培養することで、ＭＳＣが持つ抗炎症作用を大幅に高めることに成功している（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】富士フィルム株式会社（社長：助野 健児）、"再生医療分野における画期的な研究成果、間葉系幹細胞の抗炎症作用を大幅に高めることに成功〜細胞培養に適した細胞外マトリックス「セルネスト」により治療効果が向上〜"、［online］、平成29年3月8日、富士フィルム株式会社ホームページ、ニュースリリース、［平成29年8月1日検索］、インターネット〈URL：http://www.fujifilm.co.jp/corporate/news/articleffnr_1162.html〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載の方法では、炎症因子による抗炎症因子の誘導が必要な上、特殊な細胞外マトリックスを利用する必要があり、より簡便にＭＳＣの抗炎症作用を制御する方法が求められていた。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＭＳＣの形質誘導を簡便且つ高効率で制御可能な細胞培養基材及び形質制御方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満である。
【０００８】
前記凹凸のパターンが格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状、ラビリンス状、ライン状又はドット状であってもよい。
【０００９】
本発明の第２態様に係る間葉系幹細胞の形質制御方法は、上記第１態様に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材上で、間葉系幹細胞を培養する方法である。
【００１０】
前記間葉系幹細胞が１種以上の抗炎症性因子を分泌してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様の細胞培養基材によれば、間葉系幹細胞の形質誘導を簡便且つ高効率で制御することができる。上記態様の間葉系幹細胞の形質制御方法によれば、特定の形質を有するように誘導された間葉系幹細胞を簡便且つ高効率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材（パターン：ライン状）の拡大平面図及び拡大正面図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材（パターン：ドット状）の拡大平面図及び拡大正面図である。
【図２Ａ】実施例１におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ）の細胞数を示すグラフである。
【図２Ｂ】実施例１におけるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ）の細胞数を示すグラフである。
【図３Ａ】実施例１におけるｈＭＳＣ−ＢＭの培養上清中のタンパク質濃度を示すグラフである。
【図３Ｂ】実施例１におけるｈＭＳＣ−ＡＴの培養上清中のタンパク質濃度を示すグラフである。
【図４】実施例１におけるｈＭＳＣ−ＢＭの培養上清中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材≫
本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材は、細胞が接着する面に凹凸のパターンを有し、前記凹凸の幅が５０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満である。
【００１４】
後述の実施例に示すように、本実施形態の細胞培養基材の凹凸のナノパターン上で間葉系幹細胞を培養することで、当該凹凸が細胞表面を刺激するため、炎症性因子等の形質誘導因子を用いずに、間葉系幹細胞の形質誘導を簡便且つ高効率で制御することができる。
【００１５】
ここでいう、「形質」としては、間葉系幹細胞が有する形質であればよく、例えば、細胞増殖能、細胞分化能、未分化維持能、炎症性、抗炎症性、抗線維化、標的部位への遊走能等が挙げられる。また、「形質誘導」とは、間葉系幹細胞において、上記例示された形質を有するように誘導することを意味する。
【００１６】
本実施形態の細胞培養基材で用いられる間葉系幹細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等の間葉系に属する細胞への分化能を持つ細胞であり、骨、血管又は心筋を構成する細胞となり得るものである。
【００１７】
前記間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞、滑膜組織由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、歯胚由来間葉系幹細胞、耳介軟骨膜由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、靭帯由来間葉系幹細胞、腱由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞由来間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞由来間葉系幹細胞等が挙げられる。
【００１８】
また、前記間葉系幹細胞の由来する動物種も、特に限定されず、無脊椎動物であってもよく、脊椎動物であってもよい。前記無脊椎動物としては、例えば、カニ、貝類、クラゲ、エビ等が挙げられる。
【００１９】
前記脊椎動物としては、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等が挙げられる。
【００２０】
前記哺乳類としては、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。
【００２１】
前記鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、ホロホロチョウ等が挙げられる。
【００２２】
前記爬虫類としては、ワニ、カメ、及びトカゲ等が挙げられる。
【００２３】
前記両生類としては、カエル、及びイモリ等が挙げられる。
【００２４】
前記魚類としては、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、サケ等が挙げられる。
【００２５】
本実施形態の細胞培養基材は、基板上に凹凸のパターンを有する。また、基材は、細胞を培養する際や、滅菌処理のような前処理によって変形しないものであれば特に限定されない。基材は全体が同一の材料から構成されていてもよく、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されていてもよい。
【００２６】
基材の形態としては、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、たとえば、６、１２、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。
【００２７】
［基板］
基材が、それぞれ異なる材料からなる、凹凸のパターンと、凹凸のパターンを支持するための基板とから構成されている場合、基板の材質としては、細胞培養用途に用いられるものであれば、特別な限定はない。基板の材質としてより具体的には、例えば、ガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン等が挙げられる。これらの材質を用いることにより、自家蛍光物質が低く、培養された細胞を蛍光顕微鏡に観察することができる。
【００２８】
［凹凸パターン］
凹凸のパターンとしては、例えば、格子状、放射線状、平面に多角形が連続した形状（例えば、ハニカム構造状等）、ラビリンス状、ライン状又はドット状等が挙げられる。図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材の拡大平面図及び拡大正面図である。図１Ａは、凹凸のパターンがライン状である場合を示している。図１Ｂは凹凸のパターンがドット状である場合を示している。図１Ａの拡大正面図において、凸部の形状が直方体型のライン状を示している。凹凸のパターンがライン状である場合での凸部の形状は、これに限定されず、角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型、半円柱型（半円柱には、半楕円柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等であってもよい。
【００２９】
また、図１Ｂにおいて、凸部の横断面が円形型であり、縦断面が直角形型である（すなわち、凸部の形状が円柱状である）ドット状を示している。凹凸のパターンがドット状である場合での凸部の横断面又は縦断面は、これに限定されず、三角形及び四角形等の多角形型、円形型（円形には、略円形、楕円形、略楕円形、半円形、扇形を含む）、台形型、波型等であってもよい。すなわち、凹凸のパターンがドット状である場合での凸部の形状としては、例えば、角柱型（角柱には、直方体、立方体を含む）、角錐台型（角錐台には、双角錐台を含む）、円柱型（円柱には、楕円柱、半円柱、半楕円柱、扇形柱を含む）、円錐台型（円錐台には、楕円錐台、双円錐台を含む）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３０】
凹部及び凸部の幅は、５０ｎｍ以上１，０００ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることがより好ましく、１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。幅が上記範囲であることにより、間葉系幹細胞の細胞表面を刺激し、炎症性因子等の形質誘導因子を用いずに、間葉系幹細胞の形質誘導を簡便且つ高効率で制御することができる。なお、凸部の形状が円柱型、円錐台型である場合は、幅は凸部上面の直径を示す。
【００３１】
凹凸パターンの凸部の表面までの距離は、１０ｎｍ〜１００μｍが好ましい。凸部の表面までの距離が上記範囲内である場合、基材の自家蛍光を抑制しやすい。このため、上記範囲内の距離の基材を用いると、培養された細胞の蛍光顕微鏡による観察が容易である。
【００３２】
［凹凸パターンの形成方法］
凹凸パターンを形成する方法は、特に限定されない。凹凸パターンを形成する方法としては、例えば、凹凸パターンを支持するための基材の表面に形成された感光性組成物層を選択的に露光した後、露光された感光性組成物層から凹部に相当する箇所を現像液により除去するフォトリソグラフィー法、基板表面に形成されたインプリント材料の層に凹凸のパターンを備える押し型を押し付けた後にインプリント材料を硬化させるインプリント法、基板表面に凸部に相当する箇所を被覆するマスクを設けた後に、エッチングのような化学的処理により基板表面に凹部を形成する方法、サンドブラストや種々の工作機械によって基板表面を研削加工する方法、所定の形状のパターンの凸部を構成する材料を基板の表面に貼り付ける方法等が挙げられる。フォトリソグラフィー法やインプリント法には、従来から種々の目的で使用されている感光性樹脂組成物や、感光性ＳＯＧ（スピンオングラス）材料を特に制限なく用いることができる。
【００３３】
（感光性樹脂組成物）
凹凸パターンの形成に使用される感光性樹脂組成物としては、例えば、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤を含有する感光性樹脂組成物等が挙げられる。感光性樹脂組成物は、ポジ型、ネガ型のいずれであってもよい。
【００３４】
樹脂成分としては、例えば、細胞培養に用いることができるものであれば、特別な限定はない。中でも、エチレン性不飽和結合を有する化合物の重合体が好ましい。エチレン性不飽和結合を有する化合物に含まれる重合性の官能基としては、例えば、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、及びアリル基等が挙げられる。エチレン性不飽和結合を有する化合物としては、例えば、単官能、２官能、又は３官能以上の多官能の、（メタ）アクリレート化合物、（メタ）アクリルアミド化合物、ビニル化合物、及びアリル化合物等を用いることができる。これらのエチレン性不飽和結合を有する化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３５】
エチレン性不飽和結合を有する多官能の化合物としては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、エチレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、プロピレンオキシド変性ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート等の３官能以上のアクリレート；ポリイソシアネート化合物とヒドロキシ基含有（メタ）アクリレートモノマーと、を反応させて得られる多官能ウレタン（メタ）アクリレート；多価アルコールとＮ−メチロール（メタ）アクリルアミドとの縮合物等が挙げられる。これらの多官能の化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３６】
エチレン性不飽和結合を有する２官能の化合物としては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレンポリトリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピルフタレート、２−（メタ）アクロイルオキシエチル−２−ヒドロキシエチルフタレート、グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物、ウレタンモノマー、γ−クロロ−β−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、β−ヒドロキシエチル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート、及びβ−ヒドロキシプロピル−β’−（メタ）アクリロイルオキシエチル−ｏ−フタレート等が挙げられる。
【００３７】
上記グリシジル基含有化合物にα，β−不飽和カルボン酸を反応させて得られる化合物としては、例えば、トリグリセロールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。上記ウレタンモノマーとしては、例えば、β位に水酸基を有する（メタ）アクリルモノマーとイソホロンジイソシアネート、２，６−トルエンジイソシアネート、２，４−トルエンジイソシアネート、１，６−ヘキサメチレンジイソシアネート等との付加反応物、ＥＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート、及びＥＯ，ＰＯ変性ウレタンジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００３８】
エチレン性不飽和結合を有する単官能の化合物としては、（メタ）アクリル酸エステル類、（メタ）アクリルアミド類、アリル化合物、ビニルエーテル類、ビニルエステル類、スチレン類等が挙げられる。これらの化合物は、単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３９】
（メタ）アクリル酸エステル類としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ｔ−オクチル（メタ）アクリレート、クロロエチル（メタ）アクリレート、２，２−ジメチルヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フルフリル（メタ）アクリレート、フェニル（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＰＯ付加物の（メタ）アクリレート、フェノールのＥＯ／ＰＯ共付加物の（メタ）アクリレート、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノエチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート、ＥＯ／ＰＯ共重合体のモノ（メタ）アクリレート、及びＥＯ／ＰＯ共重合体のモノメチルエーテルモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００４０】
（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−アリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４１】
ビニルエーテル類としては、ヘキシルビニルエーテル、オクチルビニルエーテル、デシルビニルエーテル、エチルヘキシルビニルエーテル、メトキシエチルビニルエーテル、エトキシエチルビニルエーテル、クロルエチルビニルエーテル、１−メチル−２，２−ジメチルプロピルビニルエーテル、２−エチルブチルビニルエーテル、ヒドロキシエチルビニルエーテル、ジエチレングリコールビニルエーテル、ジメチルアミノエチルビニルエーテル、ジエチルアミノエチルビニルエーテル、ブチルアミノエチルビニルエーテル、ベンジルビニルエーテル、テトラヒドロフルフリルビニルエーテル等のアルキルビニルエーテル；ビニルフェニルエーテル、ビニルトリルエーテル、ビニルクロルフェニルエーテル、ビニル−２，４−ジクロルフェニルエーテル、ビニルナフチルエーテル、ビニルアントラニルエーテル等のビニルアリルエーテル等が挙げられる。
【００４２】
ビニルエステル類としては、ビニルブチレート、ビニルイソブチレート、ビニルトリメチルアセテート、ビニルジエチルアセテート、ビニルバレート、ビニルカプロエート、ビニルクロルアセテート、ビニルジクロルアセテート、ビニルメトキシアセテート、ビニルブトキシアセテート、ビニルフエニルアセテート、ビニルアセトアセテート、ビニルラクテート、ビニル−β−フェニルブチレート、安息香酸ビニル、サリチル酸ビニル、クロル安息香酸ビニル、テトラクロル安息香酸ビニル、ナフトエ酸ビニル等が挙げられる。
【００４３】
スチレン類としては、スチレン；メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルスチレン、イソプロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキシルスチレン、シクロヘキシルスチレン、デシルスチレン、ベンジルスチレン、クロルメチルスチレン、トリフルオロメチルスチレン、エトキシメチルスチレン、アセトキシメチルスチレン等のアルキルスチレン；メトキシスチレン、４−メトキシ−３−メチルスチレン、ジメトキシスチレン等のアルコキシスチレン；クロロスチレン、ジクロロスチレン、トリクロロスチレン、テトラクロロスチレン、ペンタクロロスチレン、ブロモスチレン、ジブロモスチレン、ヨードスチレン、フルオロスチレン、トリフルオロスチレン、２−ブロモ−４−トリフルオロメチルスチレン、４−フルオロ−３−トリフルオロメチルスチレン等のハロスチレン等が挙げられる。
【００４４】
カチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー、Ｘ線、及び電子線等の放射線の照射を受けてカチオンを生じるものであり、そのカチオンが重合開始剤となりうる化合物である。
【００４５】
カチオン重合開始剤としては、例えば、ヨードニウム塩やスルホニウム塩のようなオニウム塩型のカチオン重合開始剤を用いることができる。オニウム塩型のカチオン重合開始剤を構成する、オニウムイオンの対イオンとなるアニオンは、フッ素化アルキルフルオロリン酸アニオン、ヘキサフルオロリン酸アニオン、又はヘキサフルオロアンチモン酸アニオン（ＳｂＦ６−）が好ましい。
【００４６】
感光性樹脂組成物に含まれる溶剤は、均一な感光性樹脂組成物を調製可能であり、露光による効果を阻害しないものであれば特に限定されない。溶剤の沸点は、５０℃〜２００℃が好ましい。
【００４７】
溶剤の具体例としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、シクロヘキサンのような脂肪族炭化水素；メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、及び１−ブタノールのようなアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−ヘプタノン、乳酸エチル、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、プロピレングリコールモノメチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジメチルエーテル、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、ジブチルエーテル、メチル−３−メトキシプロピオネート、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ブチルセロソルブ、ジエチレングリコールジエチルエーテル、ヘキシレングリコール、シクロヘキサノン、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ピルビン酸エチル、及びエチルセロソルブアセテート等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４８】
感光性樹脂組成物は、樹脂成分、カチオン重合開始剤、及び溶剤の他に、従来から感光性樹脂組成物に使用されている種々の添加剤を含んでいてもよい。このような添加剤としては、付加的樹脂、増感剤、可塑剤、安定剤、着色剤、カップリング剤、レベリング剤等が挙げられる。
【００４９】
感光性樹脂組成物は、上記各成分を３本ロールミル、ボールミル、サンドミル等の撹拌機で混合（分散・混練）し、必要に応じて５μｍメンブランフィルタ等のフィルタで濾過して調製することができる。
【００５０】
［基材の製造方法］
基材の製造方法は、上述の感光性樹脂組成物を露光して硬化させ、所望するパターンを有する基材を形成できる方法であれば特に限定されない。細胞培養基材の製造方法としては、例えば、基板上に、感光性樹脂組成物を塗布して塗布膜を形成する塗布工程と、基板上の塗布膜を露光して硬化させる露光工程と、を含む方法が挙げられる。上記の基材の製造方法は、必要に応じて、基板上の塗布膜を露光して硬化させた後に、露光された塗布膜を基板から剥離させる、剥離工程を含んでいてもよい。
【００５１】
塗布工程において、感光性樹脂組成物が塗布される基板は、基材を製造する過程で変形や劣化が生じないものであれば特に限定されない。基板の材質としては、上述の（基板）と同様のものが挙げられる。
【００５２】
凹凸のパターンの形成方法としては、上述の（凹凸パターンの形成方法）と同様のものが挙げられる。
【００５３】
基板上に塗布膜を形成する方法は特に限定されず、所定量の感光性樹脂組成物を基板上に滴下する方法や、ロールコータ、リバースコータ、バーコータ等の接触転写型塗布装置を用いる方法や、スピンナー（回転式塗布装置）、カーテンフローコータ等の非接触型塗布装置を用いる方法が挙げられる。
【００５４】
塗布膜を形成した後は、塗布膜を備える基板を減圧条件下におき、塗布膜を脱気してもよい。
【００５５】
露光工程において、塗布膜を露光する方法は、塗布膜を良好に硬化できればよく、特に限定されない。露光には、例えば、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、キセノンランプ、カーボンアーク灯等の紫外線を発する光源を用いればよい。塗布膜を露光する際の露光量は、感光性樹脂組成物の組成や、塗布膜の膜厚等を考慮して適宜定められる。典型的には、塗布膜を露光する際の露光量は、１０〜１０００００ｍＪ／ｃｍ２が好ましく、１００〜５００００ｍＪ／ｃｍ２がより好ましい。
【００５６】
塗布膜を露光する方法は特に限定されないが、最初に大気中で塗布膜を露光して部分的に塗布膜の硬化を進行させてもよい。これにより、露光工程において、感光性樹脂組成物が基板上からはみ出すことを防ぎ、後に、塗布膜を水中で露光することが可能となる。大気中での露光を行わずに、塗布膜を水中で露光すると、塗布膜が水に溶解する場合がある。大気中で塗布膜を露光した後に、水中で塗布膜を露光すると、酸素によるラジカル重合阻害を低減することが出来、良好な硬化膜を得ることができる。
【００５７】
また、露光工程は、真空中での塗布膜の露光を含んでいてもよい。真空中での塗布膜の露光を行うと、感光性樹脂組成物の塗布膜を基板に密着させた状態で硬化させることができ、所望するパターンの基材を形成しやすい。また、真空中での塗布膜の露光を行う場合、基板上面より塗布膜に対して圧力を印加しながら露光を行ってもよい。この場合、感光性樹脂組成物の塗布膜をより基板に密着させた状態で硬化させることができる。露光工程が、真空中での露光や、圧力を印加しながらの真空中での露光を含むと、特に、基材が備える凹凸のパターンに対応する鋳型を用いて基材を形成する場合に、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。このような条件下で塗布膜の露光を行うことにより、感光性樹脂組成物が硬化する際の収縮が抑制されるため、鋳型の凹凸パターンを基材に正確に転写することができる。
【００５８】
塗布膜を真空中で露光する方法としては、例えば、塗布膜の表面を、例えばＰＥＴフィルムのようなフィルムで被覆した後に、少なくともフィルムと塗布膜との間を真空にした状態で塗布膜を露光する方法が挙げられる。塗布膜に圧力を印加しながら露光を行う場合に、塗布膜に圧力を印加する方法としては、例えば、負圧露光等の方法が挙げられる。
【００５９】
上記のような方法で露光されて硬化した塗布膜は、必要に応じて鋳型から剥離させた後基材として使用される。
【００６０】
また、露光されて硬化した塗布膜は、プラズマ処理してもよい。硬化した塗布膜に対して、プラズマ処理することにより、細胞が接着しやすい基材を形成することができる。プラズマ処理に用いるプラズマは特に限定されないが、例えばＯ２プラズマ、Ｎ２プラズマ、ＣＦ４プラズマ等が挙げられる。プラズマ処理を行うタイミングは特に限定されず、硬化した塗布膜を基板から剥離させる前後のいずれのタイミングでプラズマ処理を行ってもよい。
【００６１】
さらに、鋳型から剥離された基材は、リンス液によるリンスを行ってもよい。基材がリンス液によりリンスされることで、未反応の光重合性モノマーや光重合開始剤のような細胞毒性の原因となりうる化合物を基材の表面から除去することができる。リンス液としては、例えばプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、アセトン等の有機溶剤、水等が挙げられる。
【００６２】
≪間葉系幹細胞の形質制御方法≫
本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の形質制御方法は、上記実施形態の間葉系幹細胞の形質誘導制御用細胞培養基材上で、間葉系幹細胞を培養する方法である。
【００６３】
本実施形態の形質制御方法によれば、特定の形質を有するように誘導された間葉系幹細胞を簡便且つ高効率で得ることができる。
【００６４】
＜培養工程＞
本実施形態の形質制御では、上述の基材を用いて、間葉系幹細胞を培養する。培養温度は、２５℃以上４０℃以下が好ましい。また、培養時間は細胞の状態によって適宜設定することができ、例えば、１時間以上５０時間以下とすることができる。上述の基材を用いることにより、間葉系幹細胞の形質誘導が促進され、従来法より短時間且つ簡便に間葉系幹細胞を特定の形質を有するように誘導することができる。
【００６５】
使用する培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、適宜選択することができる。前記培地として具体的には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられる。培養工程において、培地は細胞の増殖速度に応じて、適宜新しいものに交換すればよい。
【００６６】
本実施形態の形質制御方法を用いることで、例えば、間葉系幹細胞における抗炎症性又は炎症性のサイトカインの分泌能を向上させることができる。中でも、間葉系幹細胞は、１種以上の抗炎症性サイトカインを分泌することが好ましい。前記抗炎症性又は炎症性のサイトカインとしては、例えば、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ／Ａｃｒｐ３０、Ａｇｇｒｅｃａｎ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＤＮＦ、ＣＤ１４、ＣＤ３０、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  １、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｃ５／Ｃ５ａ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ Ｄ、Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＣＲＰ、Ｃｒｉｐｔｏ−１、Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ、Ｄｋｋ−１、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥＧＦ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ／ＣＤ１０５、ＥＭＭＰＲＩＮ、Ｆａｓ  Ｌｉｇａｎｄ、ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１９、Ｆｌｔ−３  Ｌｉｇａｎｄ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＦ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ  α、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−１α／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２    ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８    ＢＰａ、ＩＬ−１９、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２α／β／γ、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ３／ＰＳＡ、Ｌｅｐｔｉｎ、ＬＩＦ、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２／ＮＧＡＬ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＣＬ３／ＣＣＬ４、ＭＩＰ−１α／β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＭＭＰ−９、Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ／ＢＢ、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ−３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＲＡＧＥ、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＢＰ４、Ｒｅｌａｘｉｎ−２、Ｒｅｓｉｓｔｉｎ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｅ１／ＰＡＩ−１、ＳＨＢＧ、ＳＴ２／ＩＬ−１  Ｒ４、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＦＦ３、ＴｆＲ、ＴＧＦ−α、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１、ＴＮＦ−α、ｕＰＡＲ、ＶＥＧＦ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ＢＰ等が挙げられ、これらに限定されない。これらサイトカインのうち１種を分泌していてもよく、２種以上を分泌していてもよい。
【００６７】
＜用途＞
本実施形態の形質制御方法により特定の形質を有するように誘導された間葉系幹細胞は、自己免疫疾患等の疾患での細胞治療に好適に用いることができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［製造例１］ＡｒＦ（フッ化アルゴン）パターンからの転写による基材の作製
アクリル樹脂を主成分とする感光性樹脂組成物を含むラジカル重合型ネガ型のレジストをフォトレジスト組成物として用いた。ＡｒＦ露光機Ｎｉｋｏｎ Ｓ３０８を用いて形成した表１に示す凹凸のパターン（Ｓｍｏｏｔｈ、Ｐ１〜４及びＬＳ１〜７）を有する０．８ｃｍ×０．８ｃｍのシリコンウエハーに対し、ラジカル重合ネガレジストを１ｍｌ滴下し、１００Ｐａの減圧条件下に３０分置いて塗布膜を脱気するとともに、凹凸パターンにラジカル重合ネガレジストを埋め込んだ。続いて、塗布膜を備えるシリコン基板１２枚を、大気中で紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量で露光を行った。続いて、ＰＥＴ基板（三菱化学株式会社製）に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを塗布した基板を、前記した露光によって硬化した膜上に膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストが接するように覆い、真空中で、紫外線照射装置（ＨＭＷ−５３２Ｄ、ＯＲＣ社製）を用いて、９９９Ｊ／ｍ２の露光量での露光を５回繰り返して塗布膜及び膜厚１μｍのラジカル重合ネガレジストを硬化させた。硬化した塗布膜から鋳型を剥離した後、硬化した塗布膜をプロピレングリコール−１−メチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）に１０分間浸漬してリンスした後、窒素ガスを硬化した塗布膜に吹き付けて乾燥させた。続いて、乾燥された硬化した塗布膜に対して、圧力４０Ｐａ、温度４０℃、出力５０Ｗ、処理時間２０秒、酸素流量２００ｍｌ／分の条件で、プラズマ処理装置（ＴＣＡ−３８２２、東京応化工業株式会社製）を用いてＯ２プラズマ処理を行って、基材（Ｓｍｏｏｔｈ、Ｐ１〜４及びＬＳ１〜７）を得た。
【００７０】
【表１】
2019058149.tif 000002
【００７１】
なお、表１中、Ｓｍｏｏｔｈとは凹凸パターンを形成していない、コントロールとして使用する平面の基板を示す。また、幅とは、凸部の幅を示す。
【００７２】
［実施例１］ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ）及びヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ）の形質誘導
（１）細胞の準備
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＢＭ）及びヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ−ＡＴ）はそれぞれＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．より購入し、使用した。予め培養しておいた。
【００７３】
（２）細胞の形質誘導
次いで、（１）で準備したｈＭＳＣ−ＢＭ（２．５×１０３ｃｅｌｌｓ）及びｈＭＳＣ−ＡＴ（２．０×１０３ｃｅｌｌｓ）を製造例１で得られた基材（Ｓｍｏｏｔｈ、Ｐ１〜４及びＬＳ１〜７）又は２４ウェルプレート（ポリスチレン製）に播種して一晩培養した。次いで、培地（１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ含有、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα含有、又は、ＬＰＳ及びＴＮＦα不含）を交換し、その４８時間後に各細胞及び各培養上清を回収した。なお、製造例１で得られた基材（Ｓｍｏｏｔｈ、Ｐ１〜４及びＬＳ１〜７）では、ＬＰＳ及びＴＮＦα不含の培地を用いて培養した。
【００７４】
（３）細胞数の測定
次いで、回収した各ＭＳＣの細胞数を計測した。結果を図２Ａ（ｈＭＳＣ−ＢＭ）及び図２Ｂ（ｈＭＳＣ−ＡＴ）に示す。なお、図２Ａ及び図２Ｂにおいて、「ＰＳ  ｃｏｎｔ」とは、２４ウェルプレート（ポリスチレン製）でｈＭＳＣ−ＢＭ又はｈＭＳＣ−ＡＴを培養したものを示す。また、「ＰＳ  ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍＬ」とは、２４ウェルプレート（ポリスチレン製）でｈＭＳＣ−ＢＭ又はｈＭＳＣ−ＡＴを１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ含有培地にて培養したものを示す。また、「ＰＳ  ＴＮＦ１０ｎｇ／ｍＬ」とは、２４ウェルプレート（ポリスチレン製）でｈＭＳＣ−ＢＭ又はｈＭＳＣ−ＡＴを１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα含有培地にて培養したものを示す。また、「ＬＳ７５」〜「ＬＳ１００」とは、ＬＳ１〜７の基材でｈＭＳＣ−ＢＭ又はｈＭＳＣ−ＡＴを培養したものを示す。また、「φ１００」〜「φ５００」とは、Ｐ１〜４の基材でｈＭＳＣ−ＢＭ又はｈＭＳＣ−ＡＴを培養したものを示す。
【００７５】
図２Ａ及び図２Ｂから、基材のパターンによって、細胞数について大きな変化はなかった。また、ＬＰＳやＴＮＦα処理によって、細胞数に変化はなかった。また、細胞播種濃度は、ｈＭＳＣ−ＡＴのほうがｈＭＳＣ−ＢＭよりも低かったが、４８時間後の細胞数はｈＭＳＣ−ＡＴがｈＭＳＣ−ＢＭの約２倍近く多かった。このことから、細胞増殖能はｈＭＳＣ−ＡＴの方が高いことが示唆された。
【００７６】
（４）タンパク質濃度の測定
次いで、回収した各上清のタンパク質濃度をＢＣＡ法により測定した。結果を図３Ａ（ｈＭＳＣ−ＢＭ）及び図３Ｂ（ｈＭＳＣ−ＡＴ）に示す。なお、図３Ａ及び図３Ｂにおいて、製造例１で得られた基材（Ｓｍｏｏｔｈ、Ｐ３（φ３００）、並びに、ＬＳ１（ＬＳ７５）及び５（ＬＳ３００））を用いてｈＭＳＣ−ＢＭ及びｈＭＳＣ−ＡＴを培養した結果を示している。
【００７７】
図３Ａ及び図３Ｂから、基材のパターンによって、タンパク質濃度が変化することが明らかとなった。
【００７８】
（５）ＰＧＥ２濃度の測定
次いで、ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の濃度を測定した。なお、ＰＧＥ２は生理機能脂質であり、マクロファージ等の免疫細胞に作用して、炎症を強力に抑制することが知られている。結果を図４に示す。なお、図４において、製造例１で得られた基材（Ｓｍｏｏｔｈ、及び、Ｐ２〜４（φ２００〜φ５００））を用いてｈＭＳＣ−ＢＭを培養した結果を示している。
【００７９】
図４から、基材のパターンによって、ＰＧＥ２濃度が高くなることが明らかとなった。
【００８０】
以上のことから、本実施形態の細胞培養基材を用いることで、ＭＳＣの抗炎症作用等の形質誘導を制御できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本実施形態の細胞培養基材によれば、間葉系幹細胞の形質誘導を簡便且つ高効率で制御することができる。本実施形態の間葉系幹細胞の形質制御方法によれば、特定の形質を有するように誘導された間葉系幹細胞を簡便且つ高効率で得ることができる。
【符号の説明】
【００８２】
１…ライン状凸部、２…ドット状凸部、１０，２０…基材
【図１Ａ】
2019058149.tif 000003
【図１Ｂ】
2019058149.tif 000004
【図２Ａ】
2019058149.tif 000005
【図２Ｂ】
2019058149.tif 000006
【図３Ａ】
2019058149.tif 000007
【図３Ｂ】
2019058149.tif 000008
【図４】
2019058149.tif 000009