(57)【要約】      （修正有）【課題】実験室内の条件下で分離された木部組織の形成層細胞から植物繊維を得ることを可能にし、植物からの繊維生産の代替となる方法の提供。【解決手段】以下の（ア）〜（エ）のステップを含む、植物のメリステム細胞から繊維を得る方法；（ア）植物のメリステム形成層細胞を特定し、分離するステップと、（イ）分離されたメリステム形成層細胞を増殖させるステップと、（ウ）培養されたメリステム形成層細胞から繊維に類似した構造の生産を誘導するステップと、（エ）繊維に類似した細胞（プロトファイバー）から繊維を生産するステップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のメリステム細胞から繊維を得る方法であって、
（ア）植物のメリステム形成層細胞を特定し、分離するステップと、
（イ）分離されたメリステム形成層細胞を増殖させるステップと、
（ウ）培養されたメリステム形成層細胞から繊維に類似した構造の生産を誘導するステップと、
（エ）繊維に類似した細胞（プロトファイバー）から繊維を生産するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ステップ（ア）のメリステム形成層細胞の前記特定は細胞の選択的染色によって行われる請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ア）の前記細胞の前記分離は染色によって特定された植物の部位の組織片によって行われる請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（イ）の前記メリステム形成層細胞の前記増殖は、第一培地においてこれらの細胞のin vitro細胞培養によって行われる前記各請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記第一培地は多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記植物ホルモンはオーキシン、サイトカイン、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ウ）の前記繊維に類似した構造の誘導は第二培地において行われる前記各請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（ウ）の前記繊維に類似した構造の誘導は２つのステップで行われ、第一ステップは攪拌下の容器で、第二ステップは気泡塔型バイオリアクターで行われる請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記第二培地は多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含み、前記第二培地の一部である前記植物ホルモンは前記第一培地に存在する植物ホルモンとは異なる前記各請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記第二培地の前記植物ホルモンはオーキシン、ジベレリン、サイトカイン、アブシジン酸及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
木部組織から形成層のメリステム細胞を特定し、分離する方法であって、
（i）植物材料の茎の先端部分を取り、第一染色試薬溶液に浸すステップと、
（ii）植物の異なる高さから接線切片を作るステップと、
（iii）顕微鏡下で染色した細胞を特定し、木部組織の成分を特定するステップと、
（iv）植物材料の茎の先端部分を取り、第二染色試薬溶液に浸すステップと、
（v）植物の異なる高さから断面の接線切片を作るステップと、
（vi）顕微鏡下で染色した細胞を分析し、対象の木部組織のメリステム形成層細胞が存在する高さを特定するステップと、
（vii）外植片を得るために対象の前記メリステム形成層細胞が特定された高さの前記植物材料から新たに薄い接線切片を作るステップと、
（viii）前記ステップ（vii）で得られた前記外植片を、酵素を含む培養液に入れるステップと、
（ix）遊離細胞の存在を確認するステップと
を含むことを特徴とし、
前記ステップ（viii）の前記培養液に含まれる前記酵素はペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる、方法。
【請求項１２】
前記ステップ（i）の前記第一染色試薬は生体染色試薬である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記生体染色試薬はピンクのアニリン及びブルーのアニリンからなるグループから選ばれる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ステップ（i）はピンクのアニリン及びブルーのアニリンの２つの染色試薬で行われる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第二染色試薬は化学的マーカーである請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記化学的マーカーはリグニンの合成物であることを特定できる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記リグニンのマーカーはニトロブルーテトラゾリウム（NBT）である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
分離されたメリステム形成層細胞を増殖する方法であって、
（i）遊離メリステム形成層細胞の懸濁液を培養液に確立するステップと、
（ii）細胞の乾燥重量2g/L〜15g/Lの安定した懸濁液を維持するステップと、
（iii）新鮮な培地に乾燥重量1g/L〜15g/Lの細胞を加えて常時攪拌し、ステップ（iii）の安定した懸濁液の継代培養を行うステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１９】
前記方法は発光ダイオードシステムによって前記懸濁液の光照射と合わせて行われる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（i）は２つのステップで行われ、第一ステップは攪拌下の容器で、第二ステップは気泡塔型バイオリアクターで行われる請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
培養されたメリステム形成層細胞から繊維に類似した構造を得る方法であって、
（i）メリステム細胞を、多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含む第一培地に懸濁するステップと、
（ii）前記メリステム細胞を前記ステップ（i）から取り、再度多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含む第二培地に懸濁するステップと、
（iii）前記懸濁液を第一誘導期間攪拌するステップと、
（iv）前記細胞を培地から分離し、再度新鮮な第二培地を添加するステップと、
（v）前記懸濁液を第二誘導期間攪拌するステップと
を含むことを特徴とし、前記第二培地は前記第一培地のものとは異なる植物ホルモンを含む、方法。
【請求項２２】
前記方法は攪拌下の容器で行われ、続いて気泡塔型バイオリアクターで行われる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記第一培地の前記植物ホルモンは、オーキシン、サイトカイン、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸及びこれらの混合物のグループから選ばれる請求項２１又は２２記載の方法。
【請求項２４】
前記第二培地の植物ホルモンは、オーキシン、ジベレリン、サイトカイン、アブシジン酸及びこれらの混合物のグループから選ばれる請求項２１〜２３記載の方法。
【請求項２５】
メリステム細胞及び繊維に類似した構造のトランスクリプトミクス的な分析が追加的におこなわれる前記各請求項のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジープロセス、特に植物の木部組織のメリステム形成層細胞のin vitro増殖及びそれの産業対象の製品への変換に関する。詳しくは、本発明は植物の木部組織のメリステム形成層細胞の分離と培養及び培養された細胞から繊維を取得することに関する。
発明の経緯
【０００２】
製紙業界は環境への影響が最も大きい産業の一つである。なぜなら、そのプロセスのすべての段階が潜在的に有害であるからである。環境への影響はその原料の調達に始まる。紙の消費が増えるに従い、パルプを生産するためにより多くの木を必要とするが、多くの場合これは単一栽培でまかなわれ、通常これは土壌を荒らす。製紙産業にとってのもう一つの樹木源は天然森林であるが、それは森林伐採・生態系の攪乱を意味し、その結果温室効果ガスの自然制御が優位に損なわれる。
【０００３】
これらの問題に対する解決策として、植物繊維のin vitro培養と、製紙産業及びセルロース製品関係産業のニーズに応えることのできる繊維の実験室での生産が挙げられる。これによって森林伐採の問題を回避することができ、木質組織をパルプにするために施される処理による汚染を減らす。また、外部の環境要因や気象に関係なく繊維を生産することができる。
【０００４】
しかし、現時点までは、文献には植物の木部組織のメリステム形成層細胞の培養方法も、この細胞から繊維を生産する方法も報告されていない。この種の技術の開発の第一のハードルは、繊維に変化する能力のある、培養に適した細胞を入手することである。
【０００５】
Ogitaらは、特に竹における木化プロセスを研究するために、植物の細胞を懸濁状態に維持することのできる培養方法を紹介している（Ogita, S; Nomuro, T; Kishimoto, T; Kato, E. 2012. A novel xylogenenic suspension culture model for exploring lignification in Phyllostachys bamboo. Plant Methods. 8:40）。また、KumarらはDalbergia Sissooの形成層の細胞の懸濁により苗の再生を行った（Kumar A et. al. 1991. Morphogenesis response of cultured cells of cambial origino f a mature tree. Dalbergia sissoo Roxb. Plant Cell Rep. 9(12): 703-706）。その結果、芽の分化が得られた。
【０００６】
同様に、文献US8.24.230は、分裂する能力を持つ形成層から派生した均質の細胞系統を分離取得する方法を示している。これらの細胞は草本の形成層を含む組織、特に草本の貯蔵根から得られる。
【０００７】
しかしながら、最新の技術には木質の培養した細胞の繊維への変換はおろか、細胞の培養についての報告はない。
【０００８】
さらに、繊維のin vitro増殖への制約要素として、繊維形成の生物学的知識が乏しいことが挙げられる。繊維は独立した細胞であって師部にも木部にも属し、幅が広い形をしており、木化した密度の高い二次細胞壁を有し、各細胞の両末端にある屈折部から発する鋭利な又は尖った先端を有する。分化初期段階における繊維の特定は難しく、その成長の度合いと植物の器官内の位置的特徴及び縦長の形や前形成層、形成層細胞特有の直径の大きさと行った特徴に依存する。
【０００９】
また、従来の技術には、繊維の早期の成長の生化学的、遺伝子学的また細胞学的マーカーについての報告は見られない。これは、分化のごく早期の段階では繊維への変化を決定する細胞上の要因はその活動を終えているので、その開始プロセスにおける繊維を目撃し、得ることが難しいからである。
【００１０】
したがって、製紙産業をはじめとする様々な産業に使用できる、培養され、増殖され、後に繊維を得るのに適した細胞を特定する、植物細胞から繊維を得る最新の方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、植物種の木部組織のメリステム形成層細胞から繊維を得る方法を提供することにより前記課題を見事に解決する。本発明の方法は、
（ア）植物のメリステム形成層細胞を特定し、分離するステップと、
（イ）分離されたメリステム形成層細胞を増殖させるステップと、
（ウ）培養されたメリステム形成層細胞から繊維に類似した構造の生産を誘導するステップと、
（エ）繊維に類似した構造から繊維を生産するステップと
からなる。
【００１２】
本発明は、バイオテクノロジープロセスによりin vitroで繊維を得ること、これらの細胞をもとに繊維に類似した構造（本明細書において「プロトファイバー」と称す）を誘導すること、最終的に産業に応用できる繊維を取得することを可能にする。
【００１３】
本発明はさらに、植物材料を１種以上の染色試薬で染色すること、植物の異なる高さから接線切片を取ること、対象の細胞の顕微鏡による特定、ある酵素を含む培地に投入する外植片の取得を含む、植物種の木部組織のメリステム形成層細胞を特定し、分離する方法に関する。
【００１４】
本発明のもう一つの対象は、細胞が後に分化するのに適した条件に保つ、植物の木部組織のメリステム形成層細胞の増殖方法である。このメリステム細胞増殖方法は、分離されたメリステム形成層細胞培地に懸濁し、安定した懸濁液を作り懸濁液を新鮮な培地で継代培養することからなる。
【００１５】
本発明はまた、培養された木部組織のメリステム形成層細胞から繊維に類似した構造を得る方法に関する。この方法は、第一培地に木部組織のメリステム形成層細胞を懸濁し、次いで第二培地に新たに懸濁し、第一誘導期間として懸濁を維持し、その後細胞を分離し、最後に第二培地を追加し第二誘導期間として攪拌下で懸濁を維持することからなる。
【００１６】
また、本発明の方法はさらに、メリステム形成層細胞及び繊維に類似した構造（プロトファイバー）のトランスクリプトーム的分析も含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】未染色の茎先端の4mm下におけるカットを示す。A：横断面100X。B：接線縦断面100X。
【図２】A：木部のピンク色アニリンによる染色、B：木部のブルー色アニリンによる染色の接線切片40Xを示す。
【図３】リグニン補助マーカーNBTを使用して染色した茎先端の下におけるカットを示す。A：横断面100X。B：接線切片100X。
【図４】細胞生存率の観察を示す。A：明視野で表示。B:蛍光フィルターで表示。
【図５】A:木部の形成層から派生するメリステム細胞：丸みを帯び、有核、空胞性、淡い黄色、明視野で観察、40X。B: FDAでの生存率を示す導管形成層から派生するメリステム細胞、40X。
【図６】木部組織の導管形成層から派生するメリステム細胞を示す。A:DICで観察された細胞、40X。B:偏光で観察した細胞、40X。C〜D: Calcoflour で染色され、「プロトファイバー」となるべく早期細胞分化開始するところを示す、40X。
【図７】導管形成層から派生するメリステム細胞から繊維が形成され始めるところを示す。A:明視野。B：DIC。C：偏光。40X。
【図８】木部の導管形成層から派生するメリステム細胞に由来する繊維に類似した構造「プロトファイバー」の形成開始プロセスを示す。A：細胞増殖プロセス中のメリステム細胞から発生しつつある、少なくとも4個の核を有する明確な空洞からなる隔壁型プロトファイバー。B：活動的で生存能力のあるFDAプロトファイバー。40X。
【図９】共原形質的に成長しつつあるプロトファイバーを示す。A：Calcoflour で染色され、セルロースの存在を示している。B：DIC。C：偏光。結晶セルロースの存在と、侵入生長のための筋繊維再編成らしきものを示している。40X。
【図１０】プロトファイバーが共原形質的成長して先端の幅を拡張し始めている状態を示す。
【図１１】プロトファイバーが侵入生長プロセスを開始している状態を示す。A：プロトファイバーが幅を広げ、壁部が外部肥厚中のプロセスを示す。B：プロトファイバーが幅を広げ、その両端で侵入生長が開始している状態を示す。40X。
【図１２】侵入・細胞壁肥厚中で、おそらくリグニンの二次壁の成膜プロセス中のプロトファイバーを示す。DIC、100X。
【図１３】プロトファイバーの培地の分画遠心を示す。
【図１４】温室条件におけるE. grandisの培養を示す。
【図１５】本発明の方法によるE. grandisの染色例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は木部のメリステム形成層細胞から植物繊維を得る方法に関し、次のステップからなる。
（ア）植物のメリステム形成層細胞を特定し、分離するステップ、
（イ）分離されたメリステム形成層細胞を増殖させるステップ、
（ウ）培養されたメリステム形成層細胞から繊維に類似した細胞（プロトファイバー）の生産を誘導するステップ、
（エ）繊維に類似した細胞（プロトファイバー）から繊維を生産するステップ
【００１９】
したがって、本発明の方法は分離された木部のメリステム形成層細胞から実験室の条件下で植物繊維を得ることを可能にし、この繊維は、製紙産業をはじめとする、繊維質のセルロース原料を必要とする様々な産業に有用である。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、この植物繊維を得る方法のステップ（ア）は細胞の選択的染色によって行われる。この染色により、増殖及び繊維に類似した構造「プロトファイバー」への分化に適した木部のメリステム形成層細胞の正確な発見を可能にする。染色後、適切なメリステム形成層細胞が存在する植物の一部の組織片によって細胞の分離を行う。
【００２１】
組織片を採取したら細胞をそれを含む組織から分離し、その後ステップ（イ）に従いその増殖のためにin vitro状態で第一培地に投入する。
【００２２】
好ましくは、この第一培地は多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含むとよい。本第一培地の一部の植物ホルモンとしては、好ましくはオーキシン、サイトカイン、ジベレリン、エチレン、ジャスモン酸及びこれらの混合物から選ばれる。
【００２３】
本発明の一実施形態では、第一培地の多量要素には窒素、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びリンが含まれる。同様に、微量要素には好ましくはホウ素、コバルト、銅、鉄、マンガン、カリウム、モリブデン、亜鉛が含まれる。一方、ビタミンには好ましくはビタミンＢ複合体、多価アルコール、アミノ酸が含まれる。
【００２４】
本発明の方法によれば、ステップ（イ）でメリステム細胞を増殖させた後、ステップ（ウ）のプロトファイバー生産の誘導が行われる。これは第二培地で行われる。
【００２５】
好ましくは、本発明のこのステップ（ウ）は、多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤及び植物ホルモンからなる第二培地で行われる。
【００２６】
本発明の一実施形態においては、第二培地には多量要素として窒素、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びリンが含まれる。同様に、微量要素には好ましくはホウ素、コバルト、銅、鉄、マンガン、カリウム、モリブデン、亜鉛が含まれる。一方、ビタミンには好ましくはビタミンＢ複合体、多価アルコール、アミノ酸が含まれる。
【００２７】
好ましくは、第二培地の植物ホルモンは（イ）ステップの第一培地に含まれる植物ホルモンとは異なるものとする。好ましい実施形態では、第二培地には植物ホルモンとしてオーキシン、サイトカイン、ジベレリン、ブラシノステロイド、エチレン及びこれらの混合物が選ばれる。
【００２８】
その後、（ウ）ステップのプロトファイバーはその培養とリグニン化誘導により植物繊維そのものに変換され、以後アポトーシスが起こり、かくして真の木部組織の繊維が出現する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（イ）及びステップ（ウ）は２つの段階で行われ、そのうち第一段階は攪拌下の容器で、第二段階は気泡塔型バイオリアクターで行う。
【００３０】
本発明のもう一つの目的として、次の各ステップからなることを特徴とする、木部組織のメリステム形成層細胞を特定し分離する新しいプロセスがある。
（i）植物材料の茎の先端部分を取り、第一染色試薬溶液に浸す。
（ii）植物の異なる高さから接線切片を作る。
（iii）顕微鏡下で染色した細胞を特定し木部組織の成分を特定する。
（iv）植物材料の茎の先端部分を取り、第二染色試薬溶液に浸す。
（v）植物のそれぞれ異なる高さから断面の接線切片を作る。
（vi）顕微鏡下で染色した細胞を特定し、対象の木部のメリステム形成層細胞が存在する高さを特定する。
（vii）対象のメリステム形成層細胞が特定された高さの植物材料から新たに薄い接線切片を作る。
（viii）外植片を、酵素を含む培養液に入れる。
（ix）遊離細胞の存在を確認する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（i）の第一染色試薬は生体染色試薬である。本発明の別の好ましい実施形態では、この生体染色試薬はピンクのアニリン及びブルーのアニリンからなるグループから選ばれる。
【００３２】
同様に、本発明の好ましい実施形態では、このステップ（i）の染色プロセスは、ピンクのアニリンとブルーのアニリンの２回で行われる。
【００３３】
図１が示すとおり、一定の植物種の茎先端以下の未染色切片においては、存在する様々な細胞の種類を特定することができるが、プロトファイバーに分化できるメリステム細胞は見られない。
【００３４】
本発明の目的の一つであるステップ（i）の染色は、ピンクのアニリンの場合もブルーのアニリンの場合も、木部組織の細胞を特定することができる（図２）。したがって、アポトーシスが起こった細胞であって増殖できない細胞が特定される。
【００３５】
本発明の方法によれば、その後ステップ（iv）において第二染色が行われ、培養に適している木部のメリステム形成層細胞が特定される。本発明の好ましい実施形態では、第二染色試薬は化学的マーカーである。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ（iv）の化学的マーカーはリグニンの合成である。本発明の一実施形態では、リグニンマーカーはニトロブルーテトラゾリウム（NBT）である。
【００３７】
図３が示すとおり、本発明の好ましい実施形態によれば、ステップ（iv）の後、ステップ（v）として植物のそれぞれ異なる高さから横断及び接線切片を採取し、これらはステップ（vi）で顕微鏡で分析され、メリステム形成層細胞が特定される。この図３において、本発明のプロセスで染色されたメリステム形成層細胞の内部がいかに青色に染色されているかがわかる。
【００３８】
これらの細胞が特定されたら、本発明方法のステップ（vii）において、顕微鏡で対象の形成層細胞が特定された部位の植物材料から薄い接線切片を作り、外植片を得る。本発明の好ましい実施形態において、このように得られた外植片は酵素を含む培地に投入される。
【００３９】
好ましくは、ステップ（viii）における培養液に含まれる酵素はペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルロース及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる。
【００４０】
本発明の一実施形態において茎先端の部分は発芽後２カ月〜１年半経った植物の、先端に最も近い箇所から採取される。これらは本発明の方法のステップ（i）の第一染色試薬に浸される。本発明の好ましい実施形態においては、第一染色試薬の濃度は20mg/mL〜250mg/mLの範囲にある。
【００４１】
この実施形態によれば、茎先端の部分はこの第一染色試薬の溶液に浸され第一期間放置される。本発明の好ましい実施形態において、第一期間は１〜６時間、好ましくは２〜８時間である。
【００４２】
好ましくは、ステップ（i）の染色後、ステップ（ii）の切片を茎先端の下1mm〜8cmの各位置で採取する。
【００４３】
一方、本実施形態では、ステップ（iv）としてステップ（i）と類似した方法で茎先端の部分を採取し、第二染色試薬溶液に浸す。好ましくは、第二染色試薬の濃度は１mg/mL〜10mg/mLの範囲にある。ステップ（i）、ステップ（ii）と同様に、これらの試料は第二期間放置され、この第二期間は１〜８時間、好ましくは２〜５時間であり、切片は茎先端の下1mm〜8cmの各位置で採取する。
【００４４】
本発明の本実施形態においては、プロトファイバーに分化できるメリステム細胞が存在する部分を特定すると、ステップ（vii）に基づいて切片を採取し、このようにして得られた外植片は消毒され、滅菌条件下で処理され、ステップ（viii）で酵素を含む培養液に投入される。好ましくは、この酵素の濃度は0.01%〜1.5%とする。
【００４５】
好ましくは、外植片は第三期間攪拌下に置かれる。好ましくは、この第三期間は４〜３０日間、より好ましくは５〜８日間である。以後、滅菌条件下でステップ（ix）が行われる。図４が示すとおり、ステップ（ix）において、分離された細胞の存在と生存可能性が確認される。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、ステップ（viii）及び（ix）は１回以上行われる。
【００４７】
本発明のもう一つの目的は分離されたメリステム細胞を増殖する方法である。この方法は次の各ステップからなることを特徴とする。
（i）木部導管形成層から派生した遊離したメリステム細胞の懸濁液を培養液に確立する。
（ii）細胞の乾燥重量2g/L〜20g/Lの安定した懸濁液を維持する。
（iii）新鮮な培地に乾燥重量2g/L〜20g/Lの細胞を加えて常時攪拌し、ステップ（iii）の安定した懸濁液の継代培養を行う。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態は、発光ダイオードシステムによる光照射下で培養され、木部組織の導管形成層から派生したメリステム細胞を増殖する方法である。図５は、フルオレセイン二酢酸（FDA）による染色が明らかに示すように、培養され生存可能な、木部組織の導管形成層から派生したメリステム細胞を示す。
【００４９】
さらに、本発明は導管形成層から派生した、分離され培養されたメリステム細胞から繊維に類似した構造「プロトファイバー」を得る方法を示す。この方法は、
（i）メリステム形成層細胞を、多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含む第一培地に懸濁する。
（ii）ステップ（i）のメリステム形成層細胞を取り、再度多量要素、微量要素、ビタミン、抗酸化剤、植物ホルモンを含む第二培地に懸濁する。
（iii）懸濁液を第一誘導期間攪拌する。
（iv）細胞を培地から分離し、再度新鮮な第二培地を添加する。
（v）懸濁液を第二誘導期間攪拌する。第二培地は第一培地のものとは異なる植物ホルモンを含む。
【００５０】
本発明の一実施形態においては、本発明のプロトファイバーを得る方法は２つのステップで行われ、第一ステップは攪拌下の容器で、第二ステップは気泡塔型バイオリアクターで行われる。
【００５１】
本発明の一実施形態においては、第一培地の多量要素は窒素、カルシウム、マグネシウム、カリウム、リンからなる。同様に、好ましくは微量要素はホウ素、コバルト、銅、鉄、マンガン、カリウム、モリブデン、亜鉛からなる。一方、ビタミンは、好ましくはビタミンＢ複合体、多価アルコール、アミノ酸からなる。
【００５２】
好ましくは、第一培地に含まれる植物ホルモンは、オーキシン、サイトカイン、ジベレリン、エチレン、アブシジン酸及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる。
【００５３】
本発明の一実施形態においては、第二培地は窒素、カルシウム、カリウム、リンを含む多量要素からなる。また好ましくは微量要素はホウ素、コバルト、銅、鉄、マンガン、カリウム、モリブデン、亜鉛からなる。一方、ビタミンは、好ましくはビタミンＢ複合体、多価アルコール、アミノ酸からなる。また、この第二培地に含まれる植物ホルモンはオーキシン、ジベレリン、サイトカイン、アブシジン酸及びこれらの混合物からなるグループから選ばれる。
【００５４】
本発明の一実施形態によれば、形成層から派生したメリステム細胞からプロトファイバーを得るには、ステップ（i）に基づき乾燥重量3〜20g/ｍLの範囲でこれらの細胞の懸濁が行われ、細胞の生存率が75%以上であることを確認する。
【００５５】
本実施形態のステップ（ii）のために、ステップ（i）の懸濁液を第二培地で1.5〜6.5g/Lまで希釈する。
【００５６】
かくして得た懸濁液はステップ（viii）に基づき第一誘導期間攪拌下の容器に収容され、後にステップ（iv）に基づき分離され、ステップ（v）に基づき新鮮な第二培地に再度懸濁され、再度攪拌される。
【００５７】
すでに示したとおり、本発明の一実施形態においては、プロトファイバー生産方法は２つのステップで行われ、第二ステップは気泡塔型バイオリアクターで行われる。この実施形態、リアクターの送風量は0.25L/min〜0.9L/minである。
【００５８】
図６はメリステム細胞がプロトファイバーに分化し始める状態を示す。図７は同様に、木部のメリステム形成層細胞からプロトファイバーが形成され始める状態を示す。
【００５９】
一方、図８は細胞増殖プロセス中の木部のメリステム形成層細胞から派生するメリステム形成層細胞から発生しつつある、少なくとも４個の核（図において丸でマークされる）を有する隔壁型プロトファイバーを示す。
【００６０】
図９は共原形質的に成長しつつあるプロトファイバーを示し、両先端が高度に屈折しているのが明確である。一方、図１０は共原形質的成長中のプロトファイバーが先端の幅を拡張し始めている状態を示す。
【００６１】
図１１は発生したプロトファイバーが侵入生長プロセスと壁部の外部肥厚プロセスを開始し、またその両端で侵入生長を開始している状態を示す。また、図１２はその後の侵入・細胞壁肥厚プロセスのプロトファイバーを示す。
【００６２】
一方、本発明のプロトファイバー取得方法においては、ステップ（iv）及び（v）において、まだ分化していない木部組織のメリステム形成層細胞から得られるプロトファイバーを分離するために追加的に懸濁液の分画４遠心が行われる。図１３は本発明で得られたプロトファイバーの分画遠心の一例を示す。
【００６３】
本発明によれば、ここに示した各実施形態には分離されたメリステム形成層細胞及び得られたプロトファイバーのトランスクリプトミクス的な分析を行うステップが追加的に行われる。この分析は通常、周知のRNAの抽出及び塩基配列決定プロトコルを以て行われる。
【００６４】
例
参考植物材料として、Eucalyptus grandis（E. grandis）が選ばれた。これは、その木質と、製紙産業の原料に適するとされる短い繊維の存在により、世界で最も多く栽培されている樹種である。
【００６５】
E. grandisの種子を温室条件下で培養して苗を得、それらを基にメリステム細胞を抽出した。図１４は温室条件下で発芽した苗を示す。
【００６６】
例１：メリステム細胞の特定と分離
ピンクのアニリン水溶液（50ｍｇ／ｍL前後）及びブルーのアニリン水溶液（90ｍｇ／ｍL前後）を調剤し、その中に薬8ｃｍの長さの茎先端部分を浸漬した（図１５）。部分は常温下で３〜８時間液中に放置された。以後、茎先端からそれぞれ4mm、1cm、2cm及び4cm下を切断し、顕微鏡で観察した。
【００６７】
一方、約3.0〜5.0g/Lのニトロブルーテトラゾリウム（N6876 − SIGMA-ALDRICH）水溶液を調剤し、約8cmの茎先端の部分を採取し、常温下で3〜8時間液中に放置した。以後、茎先端からそれぞれ4mm、1cm、2cm及び4cm下を切断し、顕微鏡で観察した。
【００６８】
プロトファイバーに分化するに適している木部組織の形成層のメリステム細胞を含む箇所が特定された後、茎の外植片を得、滅菌した水に入れ、その後ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルロースなどの酵素又はこれらの混合物を3〜10%の濃度で加えた培養液に入れた。
【００６９】
遊離細胞の存在及びその生存率は顕微鏡による観察によって検討した。
【００７０】
例２：メリステム細胞の増殖
木部組織の導管形成層から派生するメリステム細胞を乾燥重量約6g/Lの濃度で安定するまで滅菌条件下で培地で懸濁させた。
【００７１】
その後、この懸濁液を新鮮な培地に2〜10g/L接種して継代培養を行った。
【００７２】
例３：照明を利用してのメリステム細胞増殖
約6g/Lの懸濁を行い、2W/m2〜10W/m2の照度の発光ダイオードによる垂直照明を行った。1サイクル２４時間照明。
【００７３】
例４：プロトファイバー誘導
乾燥重量6〜9g/Lの濃度になるよう、生存率が75%以上の分離されたメリステム細胞を懸濁した。1.5〜4g/Lまで希釈するまで、プロトファイバー誘導培地を加えた。細胞の生存率を調べ、懸濁液の濃度を安定させた。
【００７４】
各懸濁液は80〜100rpmの軌道撹拌機で攪拌した。その後、生存率、濃度及びプロトファイバー誘導率を調べるためにサンプルを抽出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【外国語明細書】
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