(57)【要約】      （修正有）【課題】低減された操作の量での細胞のトランスフェクションを可能にしながら、懸濁液における真核細胞の増殖を可能にする細胞培地および一過性トランスフェクションシステムの提供。【解決手段】培養における複数の真核細胞内への（例えば、発現可能な核酸のような）１つまたは複数の高分子のトランスフェクションおよびその後の発現による導入をサポートし、かつ導入／トランスフェクションに続く細胞の培養および増殖をさらにサポートし、少なくとも１つの細胞の増殖は、新鮮な培地が補給されることのない培地で継続するシステム。細胞を培養しかつ細胞の形質転換／トランスフェクションを行うのに有用な組成物およびキット。【選択図】図４
2019088304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法：
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約２×１０６から約２×１０７細胞／ｍｌの間の細胞密度を有する、工程；
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を第１の期間にわたってインキュベートする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも１つの発現増強物質組成物と接触させる工程；
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記トランスフェクション増強物質の存在下で第２の期間にわたってインキュベートする工程；および
前記第２の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
【請求項２】
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記浮遊培養物が、２９３細胞、２９３細胞の派生物、２９３Ｆ細胞、２９３Ｆ細胞の派生物、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞の派生物、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞の派生物、ＣａｐＴ細胞、ＣａｐＴ細胞の派生物、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ細胞の派生物、ＣＯＳ−７細胞、ＣＯＳ−７の派生物、Ｓｐ２／０細胞、またはＳｐ２／０細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記浮遊培養物が２９３Ｆ細胞の派生物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記浮遊培養物の量が、約２００μＬから約５Ｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現組成物が、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも１つ、または前述の任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記発現組成物がバルプロ酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
バルプロ酸（ＶＰＡ）の濃度が、約０．２０ｍＭから約２５ｍＭの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
バルプロ酸の前記濃度が、約０．２５ｍＭから約２４ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２３ｍＭ、０．２７ｍＭから約２３ｍＭ、０．２８ｍＭから約２３ｍＭ、０．２９ｍＭから約２２ｍＭ、約０．３０ｍＭから約２１ｍＭ、約０．３１ｍＭから約２０ｍＭ、約０．３２ｍＭから約１９ｍＭ、約０．３３ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３４ｍＭから約１８ｍＭ、約０．３５ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３６ｍＭから約１６ｍＭ、約０．３７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１４ｍＭ、約０．４１ｍＭから約１３ｍＭ、約０．４２ｍＭから約１２ｍＭ、約０．４３ｍＭから約１１ｍＭ、約０．４４ｍＭから約１０ｍＭ、約０．４５ｍＭから約９ｍＭ、約０．４６ｍＭから約８ｍＭ、約０．４７ｍＭから約７ｍＭ、約０．４８ｍＭから約６ｍＭ、約０．４９ｍＭから約５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５５ｍＭから約３ｍＭ、０．６ｍＭから約２ｍＭまたは０．７５から約１．５ｍＭ、約０．１５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１６ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１７ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１８ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１９ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．３０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．６０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．７０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．８０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．９０ｍＭから約１．５ｍＭ、または約０．１０ｍＭから約１．５ｍＭの範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約０．２ｍＭから約１００ｍＭの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約０．５から約８０ｍＭ、約０．４ｍＭから約７０ｍＭ、約０．５ｍＭから約６０ｍＭ、約０．６ｍＭから約５０ｍＭ、約０．７ｍＭから約４０ｍＭ、約０．８ｍＭから約３０ｍＭ、約０．９ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約２ｍＭから約１０ｍＭ、約３ｍＭから約９ｍＭ、約４ｍＭから約８ｍＭ、または約５ｍＭから約７ｍＭの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約２ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、約３ｍＭから約４ｍＭ、約４ｍＭから約５ｍＭ、約５ｍＭから約６ｍＭ、約６ｍＭから約７ｍＭ、約７ｍＭから約８ｍＭ、約８ｍＭから約９ｍＭ、または約９ｍＭから約１０ｍＭの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、または約１０ｍＭであってもよい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現組成物が酢酸リチウムを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養物におけるＬｉＡｃの最終濃度が、約０．２５から約２５ｍＭの範囲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養物におけるＬｉＡｃの前記最終濃度が、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現組成物が酪酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約０．２５から約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記浮遊培養物の量が、約２５ｍＬμｌから約５０Ｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記浮遊培養物の量が、約１００ｍＬμｌから約１Ｌの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記浮遊培養物の量が、約２００ｍＬμｌから約５００ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約１×１０６から約２０×１０６細胞／ｍｌの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約２×１０６から約６×１０６の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターがｐＣＤＮＡ３．３の派生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ｐＣＤＮＡ３．３の前記派生物がＷＰＲＥエレメントを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現ベクターがＷＰＲＥエレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、８０％を上回ったままの細胞生存率で、２．５×１０６細胞／ｍｌを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清／無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、１種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＰＫＢａからなるリストから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、１種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が、１種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の期間が、約２時間から約４日、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第１の期間が、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までであってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の期間が、約１０時間から約１０日、約２時間から５日、約２．５時間から４日、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第１の期間が、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までであってもよい、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願の共通の所有者による、その内容全体が本明細書で完全に述べられるように参照により本明細書に明示的に組み込まれる２０１２年５月２日出願の米国仮出願第６１／６４１，８６４号に対する３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の権利を、本出願は主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、トランスフェクションおよび細胞培養の分野に関する。特に、本発明は、培養された哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現をもたらすのに適したトランスフェクションシステムを提供する。本発明は、さらに、哺乳類細胞における組換えタンパク質の高収率な発現のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞培養培地は、制御された、人工の、インビトロ環境における、細胞の維持および増殖に必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特性および処方は、特定の細胞の要求に応じて変化する。重要なパラメータは、モル浸透圧濃度、ｐＨ、および栄養素組成物を含む。
【０００４】
細胞培養培地処方物は、文献に十分に記載されており、多くの培地が市販されている。早期の細胞培養の作業において、培地処方物は、血液の化学的組成物および物理化学的性質（例えば、浸透圧、ｐＨ等）に基づくものであり、「生理溶液」とよばれた（Ringer, S., J. Physiol. 3:380-393 (1880）; Waymouth, C., In: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1, Academic Press, London, pp. 99-142 (1965); Waymouth, C., In Vitro 6:109-127 (1970))。しかしながら、哺乳類の身体の異なる組織における細胞は、酸素／二酸化炭素分圧、並びに、栄養素、ビタミン、および微量元素の濃度に関する異なる微小環境にさらされており、よって、異なる細胞タイプの成功するインビトロ培養は、異なる培地処方物の使用を必要とし得る。典型的な細胞培養培地の成分は、アミノ酸、有機および無機塩、ビタミン、微量金属、糖、脂質、並びに核酸を含み、そのタイプおよび量は、所与の細胞または組織タイプの特定の要求に応じて変化し得る。
【０００５】
培地処方物は、動物、植物、および細菌の細胞を含む多くの細胞タイプを培養するために使用されてきた。培養された細胞は、生理的プロセスの研究および有用な生体物質の産生を含む多くの用途を有する。このような有用な産物の例は、モノクローナル抗体、ホルモン、増殖因子、酵素等を含む。このような産物は、多くの商業的なおよび治療上の用途を有し、組換えＤＮＡ技術の出現により、細胞は、これらの産物を大量に産生するために設計される。また、培養された細胞は、常に、ベクターおよび／またはワクチンとして使用され得るウイルスの単離、同定、および増殖のために使用される。よって、インビトロで細胞を培養する能力は、細胞生理学の研究のために重要であるだけでなく、そうでなければ対費用効果の高い手段では得ることのできない有用な物質の産生のために必要でもある。
【０００６】
インビトロ細胞培養培地を用いて増殖された種々の細胞タイプのうち、特に興味深いのは、上皮由来の細胞である。上皮は、より高度な生物体の臓器および腺の内表面と外表面に沿って並ぶ。環境と生物体との間の外部界面（例えば、皮膚）での、または臓器と間質腔との間の内部界面（例えば、腸の粘膜内壁）でのこの局在のため、上皮は、ホメオスタシスの維持における主要な役割を有する。上皮は、例えば、栄養素および老廃物の輸送および透過性を調節することにより、この機能を行う（Freshney, R. I., in: Culture of Epithelial Cell, Freshney, R. I., ed., New York: Wiley-Liss, pp. 1-23 (1992)）。
【０００７】
上皮を構成する細胞は、一般的に上皮細胞とよばれる。これらの細胞は、皮膚におけるような多層において、または肺の肺胞におけるような単層において存在し得る。予想されるとおり、上皮細胞の構造、機能、および生理は、組織に特異的であることが多い。例えば、皮膚の表皮の上皮細胞は、重層化された扁平上皮として組織化され、主に、生物体のための防護壁を形成することを伴い、一方、多くの腺の分泌性上皮細胞は、分泌性タンパク質および糖タンパク質を産生することにおける主な役割を有する立方状細胞の単層でみられることが多い。しかしながら、それらの位置または機能に関わらず、上皮細胞は、通常、再生性である。つまり、通常の条件下においては、または、損傷もしくは他の活性化刺激に対する反応において、上皮細胞は分裂または増殖することができる。この再生能は、種々の初代上皮細胞および細胞株がうまくインビトロで培養されるポイントへと、上皮細胞のインビトロの操作を促進した（Freshney, Id.）。
【０００８】
種々の上皮細胞および上皮細胞株の単離および使用が文献で報告され、一方、上皮の形態を示す、ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３（「２９３細胞」）は、外因性リガンド受容体の発現、ウイルスの産生、並びに同種および異種の組換えタンパク質の発現の研究に特に有用であることが証明された。例えば、米国特許第５，１６６，０６６号は、候補精神活性剤の同定およびスクリーニングに有用であると証明されているベンゾジアゼピン結合部位を有する機能的ＧＡＢＡ受容体を含む安定した２９３細胞株の構築を記載している。また、２９３細胞は、ワクチン産生に使用され得るまたは組換えタンパク質発現のためのアデノウイルスベクターの構築に使用され得る、天然のアデノウイルスおよび組換えアデノウイルスなどのウイルスを産生するために使用されている（Garnier, A., et al., Cytotechnol. 15:145-155 (1994); Bout, A., et al., Cancer Gene Therapy 3(6):S24, abs. P-52 (1996); Wang, J.-W., et al., Cancer Gene Therapy 3(6):S24, abs. P-53 (1996)）。最終的に、２９３細胞は、種々の組換えヒトタンパク質のラージスケールの産生において有用であると証明されている（Berg, D. T., et al., BioTechniques 14(6):972-978 (1993); Peshwa, M. V., et al., Biotechnol. Bioeng. 41:179-187 (1993); Garnier, A., et al., Cytotechnol. 15:145-155 (1994)）。
【０００９】
大まかに線維芽細胞とよばれる細胞は、多くの異なる組織から単離されており、結合組織細胞であることが理解される。胎児組織および成体組織由来の、大まかに線維芽細胞性の細胞とよばれる細胞株を培養することは明らかに可能である。線維芽細胞は、特徴的には、「紡錘体」の外観を有する。線維芽細胞様の細胞は、線維芽細胞に固有の形態学的な特性を有する。細胞が培養容器の表面上に単層として増殖するとき、光学顕微鏡下で、それらはとがって、伸長されて（「紡錘体形状で」）現れる。細胞株は、コラーゲンタイプＩのような、適切なマーカーによる確認後に、線維芽細胞または線維芽細胞様としてみなされ得る（Freshney, R. I., in: Culture of Epithelial Cells, Freshney, R. I., ed., New York: Wiley-Liss, pp. 1-23 (1987)）。
【００１０】
ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣由来の上皮細胞および線維芽細胞の両方として分類される。チャイニーズハムスター卵巣を発端とする細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）（Kao, F.-T. And Puck, T. T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275-1281 (1968)）は長年培養されてきたが、その同一性はまだ確認されていない。
【００１１】
大多数の哺乳類初代上皮細胞、哺乳類線維芽細胞、上皮細胞株、および線維芽細胞株は、典型的には、単層培養で増殖される。しかしながら、いくつかの用途に対しては、このような細胞を浮遊培養として培養することが有利である。例えば、浮遊培養は三次元空間で増殖する。しかしながら、同様のサイズの容器における単層培養は、容器の表面に二次元的にしか増殖することができない。よって、浮遊培養は、単層培養と比較して、より高い細胞収率と、それに対応して生体（例えば、ウイルス、組換えポリペプチド等）のより高い収率とをもたらし得る。さらに、浮遊培養は、単層培養で必要とされることが多いトリプシン処理および遠心分離を行うのではなく、培養容器へと新鮮な培養培地を単純に添加すること（希釈継代培養）によって、フィードおよびスケールアップがより容易となることが多い。フィーディングの容易性と浮遊培養がスケールアップされ得る容易性は、同等の数の細胞を扱うのにかかる実質的な時間と労力の節約を示す。
【００１２】
しかしながら、初代上皮細胞、初代線維芽細胞、上皮細胞株、および線維芽細胞株のような、多くの接着依存性細胞は、浮遊培養に適応させることは容易ではない。それらは概して、最適な増殖のために基質に対する足場に依存するため、懸濁液におけるこれらの細胞の増殖は、ラテックスまたはコラーゲンビーズのようなマイクロキャリアへのそれらの付着を必要とし得る。よって、このような様式で増殖させる細胞は、典型的な単層培養よりも高密度な培養が可能でありながら、技術的には、なおも表面に接着されており、よって、これらの細胞の継代培養は、単層培養の継代培養のために使用される工程と同様の工程を必要とする。さらに、大きなバッチ培養または発酵培養が確立される場合、大量のマイクロキャリアが培養容器の底面に沈降することが多く、よって、細胞にせん断損傷を生じさせることなく懸濁液においてマイクロキャリア（および、よって細胞）を維持するためのより複雑な撹拌機構を必要とする（Peshwa, M. V., et al., Biotechnol. Bioeng. 41:179-187 (1993)）。
【００１３】
多くの形質転換細胞が、懸濁液で増殖することができるが（Freshney, R. I., Culture of 動物 Cells: A Manual of Basic Technique, New York: Alan R. Liss, Inc., pp. 123-125 (1983)）、成功した浮遊培養は、比較的高いタンパク質培地または血清もしくは（付着因子フィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンのような）血清成分を有する培地の補給、または、不都合となり得る、複雑化した灌流培養コントロールシステム（Kyung, Y.-S., et al., Cytotechnol. 14:183-190 (1994)）を必要とすることが多い。さらに、多くの上皮細胞は、懸濁液で増殖させると、継代培養の成功に干渉して培養による生体の増殖率および産生を低減し得る、凝集物または「クランプ」を形成する。クランプが生じると、培地にさらされる細胞全体の表面積が減少し、細胞は栄養が欠乏し、老廃物を培地中へと効率よく交換することができない。この結果、増殖が遅くなり、得られる細胞密度が減少し、タンパク質発現が損なわれる。
【００１４】
概して、細胞培養培地処方物には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（５〜２０％ｖ／ｖ）または動物の胚、臓器、もしくは腺（０．５〜１０％ｖ／ｖ）由来の抽出物のような規定されていない成分を含む様々な添加物が補給される。ＦＢＳは、動物細胞培養培地において最も一般的に適用されるサプリメントであるが、新生仔ウシ、ウマ、およびヒトを含む他の血清源もまた、常に使用される。培養培地の補給のための抽出物を準備するために使用される臓器または腺は、顎下腺（Cohen, S., J. Biol. Chem. 237:1555-1565 (1961)）、脳下垂体（Peehl, D. M., and Ham, R. G., In Vitro 16:516-525 (1980）；米国特許第４，６７３，６４９号）、視床下部 (Maciag, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5674-5678 (1979); Gilchrest, B. A., et al., J. Cell Physiol. 120:377-383 (1984)）、目の網膜(Barretault, D., et al., Differentiation 18:29-42 (1981))、および脳（Maciag, T., et al., Science 211:1452-1454 (1981)）を含む。これらのタイプの化学的に規定されていないサプリメントは、細胞培養培地におけるいくつかの有用な機能をもたらす（Lambert, K. J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R. E. et al., Eds., Academic Press New York, pp. 85-122 (1985)）。例えば、これらのサプリメントは、不安定なまたは非水溶性の栄養素のための担体またはキレート剤を提供し；有毒な部分と結合して中和し；ホルモンおよび増殖因子、プロテアーゼインヒビターおよび必須の、しばしば未同定のまたは規定されていない低分子量栄養素を提供し；物理的なストレスおよび損傷から細胞を保護する。よって、血清または臓器／腺の抽出物は、通常、動物細胞の培養のために最適な培養培地を提供するために、比較的低コストのサプリメントとして用いられる。
【００１５】
残念ながら、組織培養用途における血清または臓器／腺抽出物の使用は、いくつかの障害を有する（Lambert, K. J. et al., In: 動物 Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R. E. et al., Eds., Academic Press New York, pp. 85-122 (1985)）。例えば、これらのサプリメントおよび血清の化学組成は、単一の製造業者由来であってさえ、ロット間で変化する。また、サプリメントは、培養細胞の健康および最終生成物の品質を深刻に蝕み得る、感染因子（例えば、マイコプラズマおよびウイルス）により汚染され得る。また、血清または動物の抽出物のような規定されていない成分の使用は、培養細胞の、栄養上のおよびホルモンの必要条件の真の確定および解明を妨げ、よって、培養における細胞増殖および分化での特定の増殖因子または栄養素の効果を、制御された方法で研究する能力を排除する。さらに、規定されていないサプリメントは、研究者が、培養細胞における、異常増殖および分化、並びに疾患関連の変化を研究するのを妨げる。生体物質の工業的産生において細胞培養培地を使用するものに対して最終的におよび最も重要なことに、培養培地の血清および臓器／腺の抽出物の補給は、血清または抽出物タンパク質の非特異的な同時精製のために、培養培地由来の所望の物質の精製のコストを増加させて複雑にし得る。
【００１６】
組換えタンパク質発現の向上したレベルは、血清が補給された培地で増殖された細胞においてみられる発現のレベルに対して相対的に、無血清の培地で増殖された細胞から得られる（Battista, P. J. et al., Am. Biotech. Lab. 12:64-68 (1994)）。しかしながら、無血清の培地は、アルブミン、フェチュイン、種々のホルモン、および他のタンパク質を含む、１つまたは複数の種々の動物由来の成分をなおも含み得る。タンパク質またはペプチドの存在によって、組換えタンパク質の精製は、難しく、時間がかかり、および高価になる。
【００１７】
血清または臓器／腺の抽出物の使用のこれらの障害を克服するために、多くのいわゆる「合成」培地が開発されている。単一細胞タイプの培養をサポートするために特に処方されることが多いこれらの培地は、規定されていないサプリメントを含まず、代わりに、規定量の精製された増殖因子、タンパク質、リポタンパク質、および通常は血清または抽出物のサプリメントによって提供される他の物質を組み込む。このような培養培地における成分（およびその濃度）は正確に知られているので、これらの培地は、一般的に、「合成培養培地」として言及される。「合成培養培地」と互換的に使用される場合があるのは、用語「無血清培地」または「ＳＦＭ」である。多くのＳＦＭ処方物は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能である、内皮細胞、ケラチノサイト、単球／マクロファージ、リンパ球、造血幹細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、または肝細胞の培養をサポートするために設計されたもののように市販されている。しかしながら、ＳＦＭと合成培地との違いは、ＳＦＭが、血清およびタンパク質画分（例えば、血清アルブミン）を欠くが、臓器／腺の抽出物のような他の規定されていない成分を欠くとは限らない培地であることである。実際に、報告されているまたは市販されているいくつかのＳＦＭは、ケラチノサイトのインビトロ培養をサポートするいくつかの処方物を含む、このような規定されていない成分を含む（Boyce, S. T., and Ham, R. G., J. Invest. Dermatol. 81:33 (1983); Wille, J. J., et al., J. Cell. Physiol. 121:31 (1984); Pittelkow, M. R., and Scott, R. E., Mayo Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., et al., J. Virol. 61:1061 (1987); Shipley, G. D., and Pittelkow, M. R., Arch. DermatoL 123:1541 (1987); Shipley, G. D., et al., J. Cell. Physiol. 138:511-518 (1989); Daley, J. P., et al., FOCUS (GIBCO/LTI) 12:68 (1990);米国特許第４，６７３，６４９号および米国特許第４，９４０，６６６号）。よって、ＳＦＭは、用語の真の定義において、合成培地とみなすことはできない。
【００１８】
合成培地は、概して、使用者にいくつかの明確な利益を提供する。例えば、合成培地の使用は、細胞が血清含有または抽出物含有培地で培養されるときにマスクされ得る、細胞生理学上の特定の増殖因子または他の培地成分の効果の研究を促進させる。さらに、合成培地は、典型的には、血清または抽出物を含むものよりも、かなり低い量のタンパク質（実際に、合成培地は、「低タンパク質培地」とよばれることが多い。）を含み、合成培地において培養された細胞により産生された生体物質の精製を、はるかに単純に、およびより安価にする。
【００１９】
ビタミン、アミノ酸、有機および無機塩、並びに緩衝剤を主成分とするいくつかの極めて単純な合成培地が、細胞培養のために用いられている。しかしながら、このような培地（「基本培地」とよばれることが多い）は、ほとんどの動物細胞によって必要とされる栄養的な内容において、通常、深刻に不十分である。よって、ほとんどの合成培地は、培地をより栄養的に複雑にするが、培地の無血清のおよび低いタンパク質内容物を維持するための追加の成分を、基本培地に組み込む。このような成分の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のような、天然の（動物の）または組換え源由来の所定の増殖因子；脂肪酸、ステロール、およびリン脂質のような脂質；ホスホエタノールアミン、エタノールアミンおよびリポタンパク質のような脂質誘導体および複合体；インシュリン、ヒドロコルチゾン、およびプロゲステロンのようなタンパク質およびステロイドホルモン；ヌクレオチド前駆体；並びに所定の微量元素を含む（Waymouth, C., in: Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, Vol. 1: Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture, Barnes, D. W., et al., eds., New York: Alan R. Liss, Inc., pp. 23-68 (1984), and by Gospodarowicz, D., Id., at pp 69-86 (1984)により概説される）。
【００２０】
しかしながら、細胞培養培地における動物タンパク質サプリメントの使用はまた、所定の障害を有する。例えば、特にサプリメントが、培養される細胞の供給源と異なる動物由来である場合、培養培地および／またはそれから精製される産物が免疫原性となり得るというリスクがある。治療として使用される生体物質がこのような培養培地から精製される場合、所定の量のこれらの免疫原性タンパク質またはペプチドは、同時精製され得、そのような治療を受ける動物においてアナフィラキシーを含む免疫反応を誘導し得る。
【００２１】
この潜在的な問題を回避するために、培養される細胞と同じ種由来のサプリメントが使用され得る。例えば、ヒト細胞の培養は、サプリメントとしてＨＳＡを用いて促進され得るが、ウシ細胞の培養のための培地は、代わりにＢＳＡを使用する。しかしながら、このアプローチは、培養培地中へと汚染物質および外来性の病原体（例えば、ＨＳＡ調製物由来のクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、またはＢＳＡ調製物由来のウシ海綿状脳症（「狂牛病」）プリオン）を導入するリスクを負い、動物およびヒトの治療の調製物におけるこのような培地の使用に、明らかに否定的な影響を与え得る。実際に、このような安全性の理由から、バイオテクノロジー産業および政府機関は、いよいよ、このような病原体を含み得る動物由来タンパク質を含む細胞培養培地の使用を規制し、阻止し、禁止しようとさえしている。
【００２２】
ＳＦＭにおける動物タンパク質の使用の制限を克服するために、いくつかの試みが、動物タンパク質を完全に含まない動物細胞培養培地を構築するためになされている。例えば、いくつかの培養培地は、窒素の供給源および他の必須の栄養素を提供するために、基本培地中に酵母細胞の抽出物を組み込んでいる（例えば、イギリス特許出願第９０１６７３号； Keay, L., Biotechnol. Bioengin. 17:745-764 (1975)参照）。他のアプローチにおいて、小麦グルテンの加水分解物が、酵母抽出物を追加しまたは追加することなく、動物細胞のインビトロでの増殖を促進するために使用されている（日本特許出願第２−４９５７９号）。細菌培養において典型的に使用されている、血清が肉の酵素消化物またはαラクトアルブミンまたはカゼイン（例えば、ペプトン）のようなタンパク質の酵素消化物により置き換えられている、さらなる他の培地が開発されている（Lasfargues, E. Y., et al., In Vitro 8(6):494-500 (1973); Keay, L., Biotechnol. Bioeng. 17:745-764 (1975); Keay, L., Biotechnol. Bioeng. 19:399-411 (1977); Schlager, E.-J., J. Immunol. Meth. 194:191-199 (1996)）。しかしながら、これらのアプローチのいずれも、種々の動物細胞の培養に最適な培養培地を提供しなかった。さらに、小麦、大麦、ライ麦およびオート麦を含む、所定の植物由来の抽出物は、動物細胞由来の無細胞系でタンパク質合成を阻害することが示されており（Coleman, W. H., and Roberts, W. K., Biochim. Biophys. Acta 696:239-244 (1982)）、細胞培養培地におけるこれらの植物由来のペプチドの使用は、実際に、インビトロでの動物細胞の増殖を刺激するよりもむしろ阻害することを示唆する。より近年では、ライスペプチドを含む動物細胞培養ＳＦＭ処方物が記載され、種々の正常および形質転換動物細胞の培養において有用であることが示されている（その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１０３，５２９号参照）。
【００２３】
細胞培養培地への動物由来のサプリメントの添加により引き起こされる潜在的な問題にもかかわらず、このようなサプリメントは、日常で使用される。合成培地にしばしば添加される、１つのこのようなサプリメントは、トランスフェリンである。トランスフェリンは、細胞に鉄を届けるためにインビボで機能する。哺乳類細胞による鉄取り込みのメカニズムが総説されている（Qian, Z. M. and Tang, P. L. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1269, 205-214）。鉄は、エネルギー生成および酸素的呼吸を含む、数多くの代謝プロセスで補助因子として必要とされるので、無血清培地には、インビトロでのほとんどの細胞の成功的な培養のために必要な鉄を届けるために、トランスフェリンが補給されることが多い。トランスフェリンの調製物における種々の潜在的な外来性の因子についての懸念は、トランスフェリンの代替物として使用され得る、他の天然の鉄担体化合物の探求を促している。この探求は、天然の鉄担体が血清由来であることが多く、よって、血清補給の上記制限を受けるという事実により複雑になっている。
【００２４】
天然由来の金属担体を用いる制限を克服するために、所定の金属結合化合物が、培養細胞に、金属、特に亜鉛、鉄、マンガンおよびマグネシウムを供給する際の使用のために調査されている。キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）のような単純な担体、および所定のその酸または塩（例えば、クエン酸塩、ピコリン酸塩、および安息香酸またはヒドロキサム酸の誘導体）が、所定の無血清の増殖培地において有用であることが示されている（米国特許第５，０４５，４５４号および米国特許第５，１１８，５１３号; Testa et al., Brit. J. Haematol. 60:491-502, (1985); Ganeshaguru et al., Biochem. Pharmacol. 29:1275-1279 (1980); White et al., Blood 48:923-929 (1976)参照）。
【００２５】
これらの参照文献は、いくつかの金属担体を開示するが、データの解釈は、いくつかの実験のファクターにより複雑になる。データは、限られた数の細胞株から集められ、１回の継代の結果を示す。さらに、培地には血清が補給された。血清は、本質的に、トランスフェリンおよび他の潜在的な鉄担体を含む。血清またはトランスフェリンなしの１回または２回の継代後であっても、血清が補給された培地において培養された細胞の増殖には「キャリーオーバー効果」がある（例えば、Keenan, J. and Clynes, M. (1996) In Vitro Cell Dev. Biol-Animal 32, 451-453参照）。他の既知の金属結合化合物は、鉄を届けるためではなく、身体から取り除くために、医薬に使用されている。残念なことに、多くのこれらの単純な鉄キレート性化合物は、培養細胞に対する十分な鉄の利用可能性または培養細胞による取り込みを提供しない。
【００２６】
特定の細胞タイプの増殖に関する適切な培地処方物がいったん決定されると、所望の生体物質の産生を最適化するための当の細胞を変化させることが必要であることが頻繁にある。生体物質の効果的な産生および精製における重要な工程は、材料が産生される細胞内への、１または複数の高分子（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸等）の導入である。これは種々の方法により達成され得る。細胞内に高分子を導入するための１つの広く使用される方法は、トランスフェクションとして知られる。
【００２７】
典型的に、標的細胞は、細胞の増殖のために最適化された細胞培養培地における所望の細胞密度へと増殖される。いったん所望の密度に達すると、培地は、トランスフェクションプロセスのために最適化された培地に交換される。ほとんどの環境下で、トランスフェクションのために使用される培地は、細胞の増殖をサポートしないが、トランスフェクション培地は、細胞内に核酸を導入することの目的のためのみに使用される。その結果、当該プロセスは、概して、通常、遠心分離により培養物から細胞を回収することと、増殖培地の影響を取り除くために細胞を洗浄することと、関心高分子の存在下でトランスフェクション培地に細胞を懸濁することと、高分子の取り込みに十分な期間にわたって、トランスフェクション培地において細胞をインキュベートすることと、任意で、細胞からトランスフェクション培地を取り除きかつトランスフェクション培地の残余物を洗浄し、その後、トランスフェクトされた細胞を増殖培地に再懸濁することとを必要とする。増殖培地をトランスフェクション培地に交換し、細胞を洗浄し、トランスフェクション培地を増殖培地に戻す交換をする工程は、非常に多くの実践的な細胞の操作を必要とし、これにより、組換えＤＮＡ技術の時間と費用を実質的に追加する。
【００２８】
過去の例として、２９３細胞は、複合培地（つまり、ＤＭＥＭ）の、血清が補給されたバージョンで単層培養で培養されている。懸濁液で増殖させる場合、２９３細胞は、細胞の大きなクラスターへと凝集する傾向がある。これらの大きな細胞凝集物の形成は、細胞の生存率を低減する。凝集物の中心における細胞は培地に直接さらされていないため、これらの細胞は、培地中の栄養素へのアクセスが制限されており、また、老廃物を培地中へと交換することにおいて困難性を有する。さらに、培地へのこの低減されたアクセスは、クラスター中の細胞を、培地中へと導入される因子による遺伝子操作（つまり、核酸による形質転換）に適さないものとする。これらの困難性の結果、２９３細胞は概して、生体材料の産生のための浮遊培養において使用されていない。
【００２９】
よって、低減された操作の量での細胞のトランスフェクションを可能にしながら、懸濁液における真核細胞の増殖を可能にする細胞培地および一過性トランスフェクションシステムについての、当該分野における必要性がまだ残っている。このような培地は、好ましくは、無血清および／もしくは化学的に規定されたおよび／もしくは無タンパク質の培地、並びに／または高い密度まで哺乳類細胞の増殖を促進し、かつ／もしくは組換えタンパク質の発現のレベルを増加させて、細胞のクランピングを低減し、血清、トランスフェリン、インシュリン等のような動物タンパク質の補給を必要としない、動物由来の材料を欠く培地であるべきである。好ましくは、このタイプの培地は、２９３細胞およびＣＨＯ細胞のような線維芽細胞および上皮細胞を含む、通常足場依存性である哺乳類細胞の浮遊培養を可能にする。好ましくは、このような培地はまた、現在使用可能な培地で概して得ることができるよりも高い密度で上記細胞タイプを培養することおよび培養を可能にする。さらに、このような培養培地は、バイオテクノロジー産業において培養された哺乳類細胞により産生される、高い量の商業的にまたは科学的に重要な生体物質（例えば、ウイルス、組換えタンパク質、生物製剤、組換え抗体等）の、より簡単で、より対費用効果の高い、効率的な産生および精製を可能にし、哺乳類細胞の培養を使用する方法におけるより一貫性のある結果を提供する。これらのおよび他の必要性は、本発明により満たされる。
【発明の概要】
【００３０】
概要
本発明は、細胞培養およびトランスフェクションシステムを提供し、これにより、システムは、培養における複数の真核細胞内への（例えば、発現可能な核酸のような）１つまたは複数の高分子のトランスフェクションおよびその後の発現による導入をサポートし、かつ導入／トランスフェクションに続く細胞の培養および増殖をさらにサポートし、少なくとも１つの細胞の増殖は、新鮮な培地が補給されることのない培地で継続する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、さらなるその増殖をサポートすべく、細胞の存在から、細胞の導入／トランスフェクション中に使用した培地を除去する、補充する、または交換する必要はない。他の好ましい実施形態では、導入／トランスフェクション後に、細胞の増殖および発現可能な核酸由来の発現されたタンパク質の産生が、導入／トランスフェクションを行った培地の量の最大で約１０倍以下とほぼ同じ量である培地の量で達成され得る。本発明の培地を使用するとき、細胞内に核酸を導入した後に、および内部に核酸が導入された細胞が核酸を発現するようさらに培養する前に、培地を補充、交換、または補給する必要はない。
【００３２】
一過性発現は、迅速な哺乳類のタンパク質産生のためのシステムの選択を急速なものにしている。一過性トランスフェクションのフレキシビリティは、手中のタンパク質に対するコンセプトからの迅速な実現時間を可能にし、多くの異なるタンパク質は、同時にまたは連続的に産生され得る。一過性トランスフェクション技術における次の重要な進歩は、一過性の形式の速さおよびフレキシビリティを失うことなく安定発現システムを用いて達成される発現レベルに近づけるまたは同じにすることである。本発明者らは、初めて、細胞がトランスフェクトされた後７日以内に、ヒトＩｇＧおよび非（ａｎｏｎ）−ＩｇＧタンパク質の１ｇ／Ｌより多い（約２ｇ／Ｌまで）発現レベルを生成するための、高い密度の２９３Ｆ細胞培養を利用する、新規な、一過性トランスフェクションシステムの開発を報告する。
【００３３】
このような高いレベルのタンパク質発現を達成するために、このような培地における高密度増殖に適している浮遊細胞集団と組み合わされる、高密度増殖の培養培地を含む新規の細胞培養システムは、所定の個体群の哺乳類細胞が２０×１０６細胞／ｍｌまでの（より典型的には約１５×１０６細胞／ｍｌまでの）生存細胞密度に達することを可能にするように開発された。これらの超高密度培養は、タンパク質の量的な収率を有意に増加させる、従来の手順よりも高い細胞密度でトランスフェクションを可能にする。添加物  トランスフェクションに続くまたはトランスフェクション中の１つまたは複数の発現増強物質処方物の添加はまた、現在市販されている一過性トランスフェクションシステムによりみられる発現レベルよりも最大で１０から１２倍高いレベルに、タンパク質の発現レベルを増大させることが見出された。親の浮遊培養哺乳類細胞は、高密度培養条件下での向上した増殖および生存率特性に適応させ、その後さらに、増加したタンパク質産生のために選択された。得られた高密度に適応した細胞は、親細胞株と比較して、増加した増殖率、増加した細胞サイズ、および増加した特定の産生性を有する。最終的に、トランスフェクション方法は、全体として、タンパク質収率をさらに増加させる１つまたは複数の発現増強物質処方物と組み合わせて使用される、１つまたは複数のトランスフェクション薬剤を用いることにより最適化された。
【００３４】
これらの向上の全てが、単一の発現システムに組み合わされた場合、タンパク質のレベルは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システムと比較して、ＩｇＧおよび非ＩｇＧ組換えタンパク質の両方について１０倍にまで増加し、１ｇ／Ｌより多い発現レベルが複数のタンパク質について達成された。さらに、タンパク質の機能性は、市販されている有名なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３システムと比較した場合に、本発明の高収率発現システムで発現されるいくつかのタンパク質について比較可能であることが示された。合わせて、これらの結果は、機能的なタンパク質収率における有意な増加が、単一の使用が容易なフォーマット内にタンパク質の発現技術における多数の進歩を組み込んだ哺乳類の新規な一過性発現システムを用いて達成され得ることを示す。
【００３５】
本発明は、（ａ）細胞を本発明の細胞培養培地と接触させる工程、（ｂ）培養において、細胞の培養をサポートするのに適した条件下で細胞を維持する工程、および（ｃ）任意で、タンパク質産物を形成するために核酸を発現させる工程を含む、真核細胞を培養する方法も提供する。
【００３６】
また、本発明は、培養において、少なくとも１つの真核細胞内に１つまたは複数の高分子を導入するための方法を提供し、当該方法は、（ａ）培養において、請求項１に記載の培地において少なくとも１つの真核細胞を培養する工程、（ｂ）該少なくとも１つの細胞において少なくとも１つの高分子を１つまたは複数導入させるのに十分な条件下で、培養内に、該少なくとも１つの高分子を導入する工程、および（ｃ）その産生が該少なくとも１つの分子により制御される産物を産生するために、培地において、該少なくとも１つの細胞を培養する工程を含み、該少なくとも１つの細胞の増殖は、新鮮な培地を有することのない培地で継続し、ここで、該少なくとも１つの細胞の増殖をサポートすべく、該少なくとも１つの細胞の存在から、導入中に使用した培地を除去する必要はなく、および／またはここで、導入後に、増殖は、導入を行った培地の量の最大で約１０倍以下とほぼ同じ量である培地の量での培養で達成される。
【００３７】
本発明は、インビトロでの細胞の培養およびトランスフェクションのためのキットも提供し、当該キットは、本発明の細胞培養培地を含み、任意で以下のうちの１つまたは複数をさらに含む：細胞内への少なくとも１つの分子の導入のための１つまたは複数の剤、並びに培養における少なくとも１つの細胞を培養するためのおよび／または培養において少なくとも１つの細胞内に少なくとも１つの高分子を導入するための、１つまたは複数の高分子、少なくとも１つの細胞、および説明書。
【００３８】
本発明は、少なくとも１つの真核細胞、少なくとも１つの細胞内への少なくとも１つの高分子の導入のための１つまたは複数の剤、および１つまたは複数の高分子からなる群から選択される少なくとも１つの成分と、本発明の細胞培養培地とを含む組成物も提供する。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、本発明の図面および明細書、並びに特許請求の範囲の記載に照らせば、当業者にとって明らかであろう。
[本発明1001]
以下の工程を含む、培養された真核細胞である組換えタンパク質を産生する方法：
高密度培養培地において細胞を含む浮遊培養物を得る工程であって、前記浮遊培養物が、約2×106から約2×107細胞／ｍｌの間の細胞密度を有する、工程；
発現タンパク質を産生することが可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸を、前記細胞にトランスフェクトする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を第1の期間にわたってインキュベートする工程；
前記トランスフェクトされた細胞を、少なくとも1つの発現増強物質組成物と接触させる工程；
前記ベクターが前記タンパク質を発現するように、前記トランスフェクトされた細胞を、前記発現増強物質組成物の存在下で第2の期間にわたってインキュベートする工程；および
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程。
[本発明1002]
前記培養された真核細胞が、高密度条件下での増殖に適応した浮遊培養物である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記浮遊培養物が、293細胞、293細胞の派生物、293Ｆ細胞、293Ｆ細胞の派生物、ＰＥＲ−Ｃ6細胞、ＰＥＲ−Ｃ6細胞の派生物、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞の派生物、ＣａｐＴ細胞、ＣａｐＴ細胞の派生物、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ細胞の派生物、ＣＯＳ−7細胞、ＣＯＳ−7の派生物、Ｓｐ2／0細胞、またはＳｐ2／0細胞の派生物を含み、前記細胞が、高密度条件下での増殖に適応している、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記浮遊培養物が293Ｆ細胞の派生物を含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記浮遊培養物の量が、約200μＬから約5Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記発現増強物質組成物が、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸のうちの少なくとも1つ、または前述の任意の組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
バルプロ酸（ＶＰＡ）の濃度が、約0．20ｍＭから約25ｍＭの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バルプロ酸の前記濃度が、約0．25ｍＭから約24ｍＭ、約0．26ｍＭから約23ｍＭ、0．27ｍＭから約23ｍＭ、0．28ｍＭから約23ｍＭ、0．29ｍＭから約22ｍＭ、約0．30ｍＭから約21ｍＭ、約0．31ｍＭから約20ｍＭ、約0．32ｍＭから約19ｍＭ、約0．33ｍＭから約17ｍＭ、約0．34ｍＭから約18ｍＭ、約0．35ｍＭから約17ｍＭ、約0．36ｍＭから約16ｍＭ、約0．37ｍＭから約15ｍＭ、約0．40ｍＭから約14ｍＭ、約0．41ｍＭから約13ｍＭ、約0．42ｍＭから約12ｍＭ、約0．43ｍＭから約11ｍＭ、約0．44ｍＭから約10ｍＭ、約0．45ｍＭから約9ｍＭ、約0．46ｍＭから約8ｍＭ、約0．47ｍＭから約7ｍＭ、約0．48ｍＭから約6ｍＭ、約0．49ｍＭから約5ｍＭ、約0．50ｍＭから約4ｍＭ、約0．50ｍＭから約4ｍＭ、約0．55ｍＭから約3ｍＭ、0．6ｍＭから約2ｍＭまたは0．75から約1．5ｍＭ、約0．15ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．16ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．17ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．18ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．19ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．20ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．25ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．30ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．40ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．50ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．60ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．70ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．80ｍＭから約1．5ｍＭ、約0．90ｍＭから約1．5ｍＭ、または約0．10ｍＭから約1．5ｍＭの範囲である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記発現増強物質組成物がプロピオン酸ナトリウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの最終濃度が、約0．2ｍＭから約100ｍＭの範囲である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記培養物におけるプロピオン酸ナトリウムの前記最終濃度が、約0．5から約80ｍＭ、約0．4ｍＭから約70ｍＭ、約0．5ｍＭから約60ｍＭ、約0．6ｍＭから約50ｍＭ、約0．7ｍＭから約40ｍＭ、約0．8ｍＭから約30ｍＭ、約0．9ｍＭから約20ｍＭ、約1ｍＭから約15ｍＭ、約2ｍＭから約10ｍＭ、約3ｍＭから約9ｍＭ、約4ｍＭから約8ｍＭ、または約5ｍＭから約7ｍＭの範囲であり、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約1ｍＭから約10ｍＭ、約1ｍＭから約2ｍＭ、約2ｍＭから約3ｍＭ、約3ｍＭから約4ｍＭ、約4ｍＭから約5ｍＭ、約5ｍＭから約6ｍＭ、約6ｍＭから約7ｍＭ、約7ｍＭから約8ｍＭ、約8ｍＭから約9ｍＭ、または約9ｍＭから約10ｍＭの範囲であってもよく、特定の好ましい非限定的な実施形態において、ＮＡＰＰの最適な最終濃度が、約1ｍＭ、約1．5ｍＭ、約2ｍＭ、約2．5ｍＭ、約3ｍＭ、約3．5ｍＭ、約4ｍＭ、約4．5ｍＭ、約5ｍＭ、約5．5ｍＭ、約6ｍＭ、約6．5ｍＭ、約7ｍＭ、約7．5ｍＭ、約8ｍＭ、約8．5ｍＭ、約9ｍＭ、約9．5ｍＭ、または約10ｍＭであってもよい、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記発現増強物質組成物が酢酸リチウムを含む、本発明1006の方法。
[本発明1014]
前記培養物におけるＬｉＡｃの最終濃度が、約0．25から約25ｍＭの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記培養物におけるＬｉＡｃの前記最終濃度が、約0．26ｍＭから約20ｍＭ、約0．27ｍＭから約15ｍＭ、約0．28ｍＭから約10ｍＭ、約0．29ｍＭから約5ｍＭ、約0．3ｍＭから約4．5ｍＭ、約0．31ｍＭから約4ｍＭ、約0．35ｍＭから約3ｍＭ、約0．5ｍＭから約2．5ｍＭ、約1ｍＭから約3ｍＭ、約1．5ｍＭから約2．5ｍＭ、または約2ｍＭから約3ｍＭの範囲である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記発現増強物質組成物が酪酸を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
前記培養物における酪酸の最終濃度が、約0．25から約25ｍＭ、約0．26ｍＭから約20ｍＭ、約0．27ｍＭから約15ｍＭ、約0．28ｍＭから約10ｍＭ、約0．29ｍＭから約5ｍＭ、約0．3ｍＭから約4．5ｍＭ、約0．31ｍＭから約4ｍＭ、約0．35ｍＭから約3ｍＭ、約0．5ｍＭから約2．5ｍＭ、約1ｍＭから約3ｍＭ、約1．5ｍＭから約2．5ｍＭ、または約2ｍＭから約3ｍＭの範囲である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記浮遊培養物の量が、約25ｍＬμｌから約50Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記浮遊培養物の量が、約100ｍＬμｌから約1Ｌの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記浮遊培養物の量が、約200ｍＬμｌから約500ｍＬの範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約1×106から約20×106細胞／ｍｌの間である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記トランスフェクション工程の前記細胞密度が、約2×106から約6×106の範囲である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記発現ベクターがｐＣＤＮＡ3．3の派生物である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
ｐＣＤＮＡ3．3の前記派生物がＷＰＲＥエレメントを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記発現ベクターがＷＰＲＥエレメントを含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記トランスフェクション工程の後に、前記高密度培養培地の交換、補充、または補給を必要としない、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、交換、補充、または補給されない、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記高密度培養培地が、トランスフェクトされた細胞の増殖を、80％を上回ったままの細胞生存率で、2．5×106細胞／ｍｌを超える細胞密度で促進することが可能な、無血清／無タンパク質の、化学的に規定された培養培地である、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記高密度培養培地が、トランスフェクション工程の後に、前記培地の補給、交換、または補充を必要としない、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第2の期間の後に、前記トランスフェクトされた細胞を収集する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記発現タンパク質を精製する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を発現する、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記発現増強タンパク質が、ＡＫＴ、Ｐ18、Ｐ21、Ｂｃｌ−ＸＬ、およびＰＫＢａからなるリストから選択される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を一過性に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記細胞が、1種または複数種の発現増強タンパク質を安定に発現する、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記第1の期間が、約2時間から約4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記第2の期間が、約10時間から約10日、約2時間から5日、約2．5時間から4日、約3から約90時間、約4から約85時間、約5から約80時間、約6から約75時間、約7から約70時間、約8から約65時間、約9から約60時間、約10から約55時間、約11から約50時間、約12から約45時間、約13から約40時間、約14から約35時間、約15から30時間、約16から約24時間、約17から約24時間、約18から約24時間、約19から約24時間、約20から約24時間、約21から約24時間、約22から約24時間、または約23から約24時間の範囲であり、他の好ましい非限定的な実施形態において、第1の期間が、約15時間まで、約16時間まで、約17時間まで、約18時間まで、約19時間まで、約20時間まで、約21時間まで、約22時間まで、約23時間まで、約24時間まで、約25時間まで、約26時間まで、約27時間まで、約28時間まで、約29時間まで、または約30時間までであってもよい、本発明1001の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明は、付随する図面に関連して、単なる実施例により本明細書に記載される。ここでの詳細における図面に対する具体的な参照により、示される詳細は、実施例によるものであって、本発明の好ましい実施形態の説明的な議論の目的のためのみのものであり、本発明の原理および概念の態様の、最も有用であり、容易に理解される記載と考えられるものを提供するために示されることが強調される。この点において、本発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に、本発明の構造的な詳細を示すための試みはなされていない。
【００４１】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態に従う一過性トランスフェクションシステムを用いて達成できる細胞密度を示すグラフである。高密度増殖に適応した細胞を、３回の継代にわたって種々の培地にゆっくりと適応させた。細胞が適応された培地は、本発明の一実施形態に従う高密度培養培地（黒い丸）、テスト培地１（黒い三角）、テスト培地２（白い三角）、テスト培地３（白いひし形）を含む。細胞は、０．２×１０６細胞／ｍｌで３０ｍｌのフラスコに播種される前に、各培地において複数回の継代にわたって培養された。細胞密度および生存率は、８日間にわたってモニタリングされた。
【図２】図２は、本発明のいくつかの実施形態に従う一過性トランスフェクションシステムでの使用のための、細胞株の発現最適化の概要を述べる棒グラフである。親２９３Ｆ細胞株は、その後に高密度培養培地に適応させる複数の継代培養物に分けられた。高密度での増殖が可能である種々の継代培養物が、その後、組換えテストタンパク質（ヒトＩｇＧ）を発現するそれらの能力について選択され、評価された。細胞の継代培養物は、同じ親２９３Ｆ細胞株由来の２つの異なる継代培養物の細胞よりも組換えＩｇＧを３５％から４５％多く発現する、高収率に適応した２９３Ｆ細胞（Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ａｄａｐｔｅｄ  ２９３Ｆ  Ｃｅｌｌ）（右のセットの複数の棒）を記録した。
【図３】図３は、いくつかの実施形態に従う一過性トランスフェクションシステムで使用される種々の増強物質の効果の概要を述べる棒グラフである。発現増強物質は、それが有意にタンパク質産生を向上させることが確認された。成分は、２つの安定した増強物質溶液に処方された。発現増強物質１の添加は、ｈＩｇＧ発現を２倍にした（最初の２つの棒を比較）。増強物質２の単独の添加は、ＩｇＧの発現を高めることにおけるわずかな効果のみを示すが、増強物質１と組み合わせて添加した場合には、対照に対してほぼ３倍以上のｈＩｇＧを提供する（３番目と４番目を比較）。
【図４】図４は、いくつかの実施形態による高収率一過性トランスフェクションシステムおよび先行技術の一過性トランスフェクションシステム（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システム）を用いた、４つの異なるおよび固有のタンパク質の発現レベルの比較を示す。図４Ａは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたヒトＩｇＧの発現における５倍よりも多い増加を示す。図４Ｂは、市販のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたＣｒｉｐｔｏの発現における５．２倍よりも多い増加を示す。図４Ｃは、市販のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたβ２アドレナリン受容体の発現におけるほぼ４倍の増加を示す。図４Ｄは、市販のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたウサギＩｇＧの発現における１１倍よりも多い増加を示す。
【図５】図５は、いくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムおよび先行技術の一過性トランスフェクションシステムを用いて達成されたＥＰＯの発現レベルを比較する棒グラフである。ＥＰＯは、本発明の一過性発現システムおよびＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システムを用いて発現された。本発明のシステムは、１ｍｌ（２４ウェルのプレート形式）から１Ｌ（３Ｌの振とうフラスコ形式）までスケーラブルである。特定のタンパク質の発現レベルにおける信頼性のある再現性が、３つの異なる研究室における、３つの別個の分析からの結果にみられた。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、真核細胞および原核生物細胞の両方の増殖のための改良された培地処方物を提供する。本発明の培地は、細胞増殖、培養物中の細胞への高分子の導入、ならびに増殖、導入および／または培養中の補充、置換、補給、または交換を必要としない細胞培養を支持する。本発明の培地は、任意の細胞の増殖および培養を支持または増強するために使用され得る。本発明はまた、１つ以上の望まれない成分、例えば、動物由来成分の代わりとして、または置換するために使用され得る化合物を提供する。置換化合物は、望まれない成分の少なくとも１つの望ましい機能を提供する。
【００４３】
定義
以下の記述では、細胞培養および組換えＤＮＡ技術に使用される多くの用語が、広範に利用される。本明細書および特許請求の範囲の明確でより一貫した理解のために、その用語の範囲を含めて、次に定義を示す。
【００４４】
培養への高分子または化合物の「導入」という語は、培養培地への高分子または化合物の供給をいう。
【００４５】
少なくとも１つの細胞への高分子または化合物の「導入」という語は、高分子または化合物が細胞中に内部移行するように、細胞へ高分子または化合物を供給することをいう。例えば、高分子または化合物は、トランスフェクション、形質転換、注入、および／またはリポソーム導入を使用して、細胞中に導入され得、当業者に周知の他の方法を使用して細胞に導入されてもよい。好ましくは、高分子または化合物は、リポソーム導入により細胞中へ導入される。高分子は、好ましくは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、または核酸である。高分子は、タンパク質であり得る。あるいは、高分子は、ペプチドであり得る。あるいは、高分子は、ポリペプチドであり得る。高分子はまた、核酸であり得る。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「高分子」という語は、生体分子を包含する。ひとつの実施形態では、高分子という語は、核酸を指す。好ましい実施形態では、高分子という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。より好ましくは、高分子という語は、ＤＮＡを指す。より好ましくは、高分子という語は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を指す。高分子は、荷電または非荷電であり得る。ＤＮＡ分子は、荷電高分子の一例である。いくつかの場合では、本明細書中で使用されるとき、「高分子」という語は、「発現可能な核酸」という語と交換可能に使用され得る。
【００４７】
「トランスフェクション」という語は、本明細書では、核酸、タンパク質または他の高分子が発現されるように、または細胞中の生体機能を有するように、核酸、タンパク質または他の高分子を標的細胞へ送達することを意味するために使用される。
【００４８】
本明細書中で使用されるとき、「発現可能な核酸」という語は、分子量にかかわらず、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を包含し、「発現」という語は、これに限定されないが、一過性発現および安定発現の両方を含む細胞内の核酸の機能的存在のいかなる具現をも意味する。機能面は、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質の送達による発現阻害を包含する。
【００４９】
「核酸の発現」という語およびその相当語句は、細胞中の核酸の複製、ＤＮＡのメッセンジャーＲＮＡへの転写、ＲＮＡのタンパク質への翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、および／または細胞中のタンパク質輸送、またはそれらのバリエーションもしくは組み合わせを指す。
【００５０】
「成分」という語は、化学的起源であろうと生物学的起源であろうと、細胞生育または細胞増殖を維持または促進するために、細胞培養培地に使用され得る任意の化合物をいう。「構成成分」、「栄養素」および「成分」という語は、交換可能に用いられ得、全てそのような化合物を指す。細胞培養培地で使用される典型的な成分としては、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、およびタンパク質などが挙げられる。インビトロ細胞培養を促進または維持する他の成分は、特定のニーズに従って、当業者により選択され得る。本発明の培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの天然（動物）起源または組換え起源に由来する１つ以上の増殖因子、脂肪酸、ステロールおよびリン脂質などの１つ以上の脂質、ホスホエタノールアミン、エタノールアミンおよびリポタンパク質などの１つ以上の脂質誘導体および複合体、１つ以上のタンパク質、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびプロゲステロンなどの１つ以上のステロイドホルモン、１つ以上のヌクレオチド前駆体；および１つ以上の微量元素から成る群から選択される１つ以上の成分を含有し得る。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「細胞」という語は、真核細胞および原核生物細胞の全タイプをいう。好ましい実施形態では、該用語は、真核細胞、特に哺乳類細胞を指す。限定されないが、実施形態のある例示では、「細胞」という語は、ヒト２９３細胞、または、例えば、浮遊状態で増殖できる２９３変種などの、その変種を指すことになる。特に好ましいものは、浮遊培養中に生育、増殖およびトランスフェクトされ得る２９３細胞の変種であり、特に、高密度（例えば、約２×１０６細胞／ｍｌ超、より好ましくは約３×１０６細胞／ｍｌ超、または任意で約４×１０６細胞／ｍｌ超）で培養され得るそれらの変種である。そのような２９３細胞株変種は、ＥＸＰＩ２９３（商標）Ｆ細胞である。これに限定されないが、他の実例となる実施形態では、「細胞」という語は、ＣＨＯ細胞を指すことになる。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、本発明に従った細胞培養、およびトランスフェクションワークフロー実行の目的と同じことを使用する本発明の方法の文脈中に使用されるときの「高密度」という語は、一般的に、既知の細胞株、または約１×１０６細胞／ｍｌ超、より好ましくは約２×１０６細胞／ｍｌ超、最も好ましくは約３×１０６細胞／ｍｌ超、またはさらには任意で約４×１０６細胞／ｍｌ超、または最大で約２０×１０６細胞／ｍｌの密度に適切な細胞培養培地中で増殖または培養され得、一方では、高効率でトランスフェクトされる能力をさらに保持して、高レベル（例えば、２００μｇ／ｍｌ超〜最大約１ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上のレベル）で標的タンパク質を発現できる既知の細胞株の変種を指す。
【００５３】
「高密度培養培地」という言い回しは、哺乳類細胞の増殖を持続することができる、好ましくは、細胞がその生存率を約８０％超で維持しつつ、さらには、効率的にトランスフェクトされかつ多量の組換えタンパク質を発現する浮遊細胞の能力を維持しつつ、約２×１０７細胞／ｍｌまでの密度において浮遊状態で増殖することができる、任意の培養培地を指すために本明細書中で使用される。本発明の実践で使用される「高密度培養培地」は、種々の用途および使用の間で変化し得、使用される細胞株の性質、発現ベクターの細胞への移入のために選択されるトランスフェクション様式の性質、および下記のシステムに添加される任意の発現増強物質の量および性質に依存し得る。にもかかわらず、本一過性発現システムおよび方法における使用のために企図される好ましい「高密度培養培地」は、典型的に、無血清、無タンパク質であり、浮遊細胞の培養および増殖を、約２×１０７細胞／ｍｌまで、より典型的には、約２×１０６細胞／ｍｌ〜約１×１０７細胞／ｍｌの間の密度で可能にし、一過性発現システムで産生されるタンパク質収率を、少なくとも２００μｇ／ｍＬ（細胞培養液）を超え、２ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）まで、より典型的には、約５００μｇ／ｍｌ（細胞培養液）〜約１ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）の間にすることが、さらに可能である。理想的には、本発明に従って使用される高密度培養培地は、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌ、約２×１０６〜約２×１０６細胞／ｍｌ、または約２．５×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で細胞のトランスフェクションを促進する。本発明の実践での使用に適切な実例となる高密度培養培地としては、ＨｕＭＥＣ基本無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ  ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）−８培地、培地２５４、培地、１０６、培地、１３１、培地、１５４、培地、１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）−６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ−１００基本培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）−ＩＩ完全培地、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＳＦ−９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＨＣ基本培地、ＬＨＣ−８培地、２９３ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、ＡＥＭ増殖培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイト−ＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ−８培地、ＬＨＣ−９培地、および任意のその派生物または改変物が挙げられるが、これらに限定されない。限定されないが、ある好ましい実施形態では、高密度培養培地は、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＥＸＰＩ２９３（登録商標）発現培地、または同様な培地、またはその改変型であり得る。上記列挙した実例となる高密度培養培地は、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞変種、２９３細胞、２９３細胞変種、ＣａｐＴ細胞、ＣａｐＴ細胞変種、または高密度培養システムでの使用に適応した任意の他の細胞の高密度増殖、拡大、トランスフェクト、および維持に、特に適切であり得る。
【００５４】
「高密度培養に適応した細胞」という言い回しは、約８０％以上の細胞生存率を保持しながら、高密度培養培地における高密度での増殖に適応した同親細胞系譜由来の細胞系譜または（非クローンの）細胞集団を指すことになる。そのような細胞は、＞４０、＞５０、＞６０、＞７０、または＞８０回の連続的継代に渡って高密度で細胞を維持すること、および増殖培地の割合を所望の高密度培養培地で徐々に置き換えることにより、親細胞集団から単離または選択され得る。任意に、該工程の間に、種々の細胞プールは、トランスフェクション効率および／またはタンパク質発現を同時に評価しながら、個々に拡大させ、かつ選択手順へ供してもよいので、非クローンの細胞集団は、高密度での持続および増殖、高効率のトランスフェクション、ならびに所望の組換えタンパク質の高レベル発現できるものが選択され得る。種々の細胞タイプおよび系譜が、この選択手順に供され得ることは、該技能を有する実践者には容易に分かる一方で、ＣＨＯ細胞由来の細胞系譜、２９３線維芽細胞由来の細胞系譜、およびＣａｐＴ細胞由来の細胞が、高密度増殖条件に適応させる選択手順に特に受け入れられることが分かっている。理想的には、高密度増殖培養に適応し、本発明の使用に受け入れられる細胞はまた、高効率にトランスフェクトもでき、および／または少なくとも約２００μｇ／ｍＬ（細胞培養）を超え、約２ｍｇ／ｍＬ（細胞培養）まで、より典型的には、約５００μｇ／ｍｌ（細胞培養）から約１ｍｇ／ｍＬ（細胞培養）までの間の収率で組換えタンパク質を発現することもできる。理想的には、本発明に従って使用される高密度培養に適応した細胞は、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌ、約２×１０６〜約２×１０６細胞／ｍｌ、または約２．５×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で持続およびトランスフェクトできる。
【００５５】
「細胞培養（cell culture）」または「培養（culture）」は、人工的環境、インビトロ環境で細胞を維持することを意味する。
【００５６】
「培養（cultivation）」は、好都合な増殖および／または分化および／または継続的生存率の条件下、インビトロで細胞を維持することを意味する。「培養」は、「細胞培養」と交換可能に使用され得る。培養は、生存可能細胞数／培養培地（ml）により評価される。高分子の導入後の培養は、好ましくは、産物の産生、例えば、ウイルスのタンパク質産物などを含む。
【００５７】
本明細書中に使用されるとき、「培地を補充、置換、または補給する」という語は、多量の新鮮な細胞培養培地を、培養物中の既存の培地に添加すること、および／または培養物中の既存の培地を、新鮮な培地で置き換えることを指す。新鮮な培地は、培養でその増殖を支持するための、細胞と接触していない、少なくとも１つの細胞または培地に導入される１つ以上の高分子または化合物を含有しない培地である。熟練した職人は、細胞数測定（手動または自動）、トリパンブルー色素排除試験、タンパク質または他の物質の産生、アラマーブルーアッセイ、１つ以上の代謝産物の存在または濃度、細胞接着、形態的外観、使用した培地の分析などの当技術分野で周知の技術により細胞増殖および／または細胞生存率をモニターすることにより、除去および／または補充、置換または補給の必要性があるかどうかまたはそこから利益を得るかどうかを判定できる。１つまたはモニター技術の組み合わせは、培地が、増殖、少なくとも１つの高分子の導入および／または少なくとも１つの高分子の導入後の培養を支持する必要があるかどうかを判定するために、使用され得る。
【００５８】
「組換えタンパク質」は、宿主細胞に導入された核酸によりコードされるタンパク質を指す。宿主細胞は、核酸を発現する。「核酸を発現する」という語は、「核酸によりコードされるＲＮＡからタンパク質を発現する」と同義である。本明細書中で使用されるとき、「タンパク質」という語は、重合したアミノ酸、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質などを指す。
【００５９】
「タンパク質収率」という語は、培養した細胞により発現されたタンパク質の量を指し、例えば、産生タンパク質のグラム／ｍｌ培地で測定され得る。もし、タンパク質が細胞により分泌されないならば、タンパク質は、当業者に周知の方法により、細胞内部から単離され得る。もし、タンパク質が細胞により分泌されるならば、タンパク質は、当業者に周知の方法により、培養培地から単離され得る。細胞から発現されるタンパク質の量は、当業者により、容易に測定され得る。タンパク質は、組換えタンパク質であり得る。
【００６０】
「タンパク質産物」は、タンパク質による産生または作用に関する産物である。タンパク質産物は、タンパク質であり得る。タンパク質産物はまた、産物を産生する１つ以上の他の物質によるタンパク質の作用から得られた産物でもよい。そのような作用の例は、タンパク質による酵素作用である。
【００６１】
「浮遊培養」は、培養容器中の大多数または全部の細胞が、浮遊状態で存在する細胞培養を意味し、容器内の容器表面または別の表面に、培養容器中の少数の細胞が付着しているかもしくは細胞は全く付着していない。好ましくは、「浮遊培養」は、培養容器中の７５％以上の細胞が浮遊状態にあり、培養容器上または培養容器中の表面に付着していない。より好ましくは、「浮遊培養」は、培養容器中の８５％以上の細胞が浮遊状態にあり、培養容器上または培養容器中の表面に付着していない。さらにより好ましくは、培養容器中の９５％以上の細胞が浮遊状態で存在し、培養容器上または培養容器中の表面に付着していない、「浮遊培養」である。
【００６２】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、細胞の単層培養または浮遊培養のいずれか、トランスフェクション、および培養に適切であり、単層培養または浮遊培養中の細胞のタンパク質発現に適切である。好ましくは、本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、細胞の浮遊培養、トランスフェクション、および細胞培養、ならびに浮遊培養中の細胞のタンパク質産物の発現のためにある。
【００６３】
「培養容器」は、例えば、培養細胞に無菌環境を提供できる、ガラス、樹脂、または金属の容器などの任意の容器を意味する。
【００６４】
「細胞培養培地（cell culture medium）」、「組織培養培地（tissue culture medium）」、「培養培地（culture medium）」（各々、複数は「培地（media）」）および「培地処方物」は、細胞または組織を培養するための栄養液を指す。これらの言い回しは、交換可能に使用され得る。
【００６５】
「組み合わせ（combining）」という語は、成分の混合（mixing）または混合（admixing）をいう。
【００６６】
分子の誘導体は、ベース分子を含むが、付加的または修飾側基を有するいくつかの化合物を包含する。好ましくは、「誘導体」は、ベース分子を、１つのみ、しかしおそらくは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つなどの反応分子と反応させることにより生成され得る。１段階反応が好ましいが、多段階、例えば、２段階、３段階、４段階、５段階、６段階などの反応が、誘導体生成技術で周知である。置換反応、縮合反応および加水分解反応が好ましく、誘導体化合物を生成するために組み合わされ得る。あるいは、誘導体化合物は、好ましくは、１段階、しかしおそらくは、２段階、３段階、４段階、５段階、６段階などの反応で、ベース化合物またはそれに対する置換または縮合生成物が生成できる化合物であり得る。
【００６７】
細胞培養培地は、多くの成分から成り、これらの成分は、培地から培地まで様々であり得る。細胞培養培地で使用される各成分は、その唯一の物理的および化学的特性を有する。成分の適合性および安定性は、水溶液中の成分の「溶解性」により、部分的に決定される。「溶解性（solubility）」および「可溶性の（soluble）」という語は、他の成分を含む溶液中で存在しとどまる成分の能力をいう。従って、成分は、もし、測定可能または検出可能な沈殿物の形成なく、溶液中に維持され得るならば、適合性がある。
【００６８】
「適合性成分」もまた、溶液中に一緒に維持され、「安定な」組み合わせを形成し得るこれらの培地成分を意味する。「適合性成分」を含む溶液は、細胞が培地から利用可能な１つ以上の成分の濃度が、細胞の最適または所望の増殖を、もはや支持しないレベルまで低減しているように、成分が沈殿せず、分解せず、実質的に腐敗しないとき、「安定」であると言われる。成分はまた、もし、分解が検出され得ず、１×細胞培養培地処方物の同成分の分解と比較したとき、分解がよりゆっくり起こるときであるならば、「安定」と考えられる。例えば、１×培地処方物で、グルタミンは、ピロリドンカルボン酸およびアンモニアに分解することが知られている。二価カチオンと組み合わせたグルタミンは、グルタミンおよび二価カチオンの両方が存在する溶液または組み合わせ中で、長時間かけても、グルタミンの分解は、ほとんどまたは全く検出できないので、「適合性成分」と考えられる。米国特許第５，４７４，９３１号を参照。従って、本明細書中で使用されるとき、「適合性成分」という語は、濃縮もしくは１×処方物のいずれかの溶液中に混合したとき、特定の培養培地成分の組み合わせが「安定」および「可溶性」であることをいう。
【００６９】
「１×処方物」という語は、実用濃度の細胞培養培地で見られるいくつかまたは全成分を含有する任意の水溶液を指すことになる。「１×処方物」は、例えば、細胞培養培地またはその培地成分の任意のサブグループを指し得る。１×溶液中の成分濃度は、インビトロで細胞を維持または培養するために使用される細胞培養処方物に見られるその成分濃度とほぼ同じである。細胞のインビトロ培養に使用される細胞培養培地は、定義により、１×処方物である。多くの成分が存在するとき、１×処方物中の各成分は、細胞培養中に培地中の各個々の成分濃度にほぼ同等である濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地は、他の成分の中で、０．２ｇ／ＬのＬ−アルギニン、０．０５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、および０．０２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸を含有する。これらのアミノ酸の「１×処方物」は、溶液中のこれらの成分のほぼ同じ濃度を含有する。従って、「１×処方物」というとき、溶液中の各成分は、記載された細胞培養培地に見られるものと同じまたはほぼ同じ濃度を有すると意図される。細胞培養培地の１×処方物の成分濃度は、当業者に周知である。例えば、Methods For Preparation of Media、Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss, N.Y. (1984)、Handbook of Microbiological Media, Second Ed., Ronald M. Atlas, ed. Lawrence C. Parks (1997) CRC Press, Boca Raton, Fla. and Plant Culture Media, Vol. 1：Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock, and H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA13 4QG England（これらの各々は、その全体が、参照することにより本明細書に組み入れられたものとする）参照。しかしながら、モル浸透圧濃度および／またはｐＨは、特に、１×処方物中にほとんど成分が含まれないとき、培養培地と比較して、１×処方物と違っていてもよい。
【００７０】
「１０×処方物」は、その溶液中の各成分濃度が、細胞培養中の培地の各個々の成分濃度より約１０倍濃い溶液をいう。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培養培地の１０×処方物は、他の成分の中で、２．０ｇ／ＬのＬ−アルギニン、０．５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、および０．２ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸（上記１×処方物と比較）を含有し得る。「１０×処方物」は、１×培養処方物に見られるものの約１０倍の濃度で多くの添加成分を含有し得る。容易に分かるように、「２５×処方物」、「５０×処方物」、「１００×処方物」、「５００×処方物」、および「１０００×処方物」は、１×細胞培養処方物と比較して、それぞれ、約２５倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍の濃度で成分を含有する溶液を指す。また、培地処方物および濃縮溶液のモル浸透圧濃度およびｐＨは変わり得る。
【００７１】
「微量元素」または「微量元素成分」という語は、培養培地中に存在する他の成分または成分の量および濃度と比較して、非常に低い（すなわち、「微量」）量または濃度でのみ、培養培地中に存在する成分をいう。本発明では、これらの用語は、Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｕ１＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｍｎ２＋、Ｆ−、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋およびＺｒ４＋およびその塩を包含する。例えば、次の塩は、本発明の培養培地中の微量元素として使用され得る：ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・１Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２、およびＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏ。微量元素成分の適切な濃度は、単に日常の実験に携わる当業者により決定され得る。
【００７２】
「アミノ酸」という語は、アミノ酸またはそれらの誘導体（例えば、アミノ酸似体など）の他に、それらのＤ型およびＬ型も指す。そのようなアミノ酸の例としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン、Ｎ−アセチルシステインが挙げられる。
【００７３】
「化学的に規定された」培地は、細胞培養に使用する前に、各化学種およびその個々の量が分かっているものである。化学的に規定された培地は、その化学種が未知および／または未定量である溶解物または加水分解物を使用しないで作成される。化学的に規定された培地は、本発明の培地のひとつの好ましい実施形態である。
【００７４】
「無血清培養条件」および「無血清条件」という語は、いずれのタイプの血清も排除する細胞培養条件をいう。
【００７５】
「無血清培地」（時々、「ＳＦＭ培地」と呼ばれる）は、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、仔ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒト血清など）を含有せず、一般的に、文字ＳＦＭにより指定される培地である。当業者によく知られている無血清培地の実例としては、限定されないが、ＨｕＭＥＣ基本無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ  ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）−８培地、培地２５４、培地、１０６、培地、１３１、培地、１５４、培地、１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）−６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ−１００基本培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）−ＩＩ完全培地、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＳＦ−９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＨＣ基本培地、ＬＨＣ−８培地、２９３ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、ＡＥＭ増殖培地、ＰＥＲ。Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイト−ＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ−８培地、ＬＨＣ−９培地、およびそれらの任意の派生物または改変物が挙げられる。
【００７６】
「無タンパク質」培養培地という言い回しは、タンパク質（例えば、血清アルブミンもしくは接着因子などの血清タンパク質、増殖因子などの栄養タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオン担体タンパク質）を含有しない培養培地をいう。好ましくは、もしペプチドが存在するならば、該ペプチドは、小ペプチド、例えば、ジペプチドまたはトリペプチドである。好ましくは、デカペプチドの長さ以上のペプチドは、無タンパク質培地中に存在するアミノ酸の約１％未満、より好ましくは、約０．１％未満、およびさらにより好ましくは、約０．０１％未満である。
【００７７】
本明細書中に使用されるとき、「低タンパク質」培養培地という言い回しは、少量のタンパク質のみ（典型的には、５〜１０％血清を補給した標準基本培地を含有する培養培地中で見られる全タンパク質の量または濃度の、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、または、約０．１％未満）を含有する培地をいう。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、「動物由来」物質という語は、組換えＤＮＡまたは組換え動物タンパク質ＤＮＡを含む動物源に全体的にまたは部分的に由来する物質をいう。好ましい培地は、動物性の所望物質を含有しない。
【００７９】
「発現増強物質」という語は、一般的には、現在記述の実施形態に従った培地培養処方物に補給するために使用される１つ以上の液体（好ましくは水性）添加剤をいい、前記添加剤は、現在記述の実施形態に従った一過性タンパク質発現系で産生される発現タンパク質の収率を改善するために選択される。該用語は、細胞サイクル進行、アポトーシス阻止、細胞増殖遅延および／またはタンパク質産生促進に影響するいくつかの化合物のいずれか１つ以上を包含する。本発明の文脈では、「発現増強物質」という語は、一般的に、一過性トランスフェクションシステムに添加されるいずれか１つ以上の化合物をいい、その存在は、標的タンパク質の発現を、そのような発現増強物質の非存在下で見られる発現レベルの少なくとも２倍から約１０倍まで上回って増強または促進する。現在記述の実施形態で使用するために適切な実例となる発現増強物質としては、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）などの添加剤、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＡＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、または 酪酸、または 前述の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。各特定の発現増強の最適濃度は、発現系の個々の特性および使用者の要求に従って変わり得、所与の実験計画でいずれか１つ以上の発現増強物質の最適濃度を構成するものの決定は、当業者レベルを有する熟練者の十分な範囲内である。例としてのみ、いくつかの実施形態では、本発明の実践で使用されるバルプロ酸（ＶＰＡ）の最適な最終濃度範囲は、約０．２０ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲であり得る。より好ましくは、ＶＰＡの最終濃度は、約０．２５ｍＭ〜約２４ｍＭ、約０．２６ｍＭ〜約２３ｍＭ、０．２７ｍＭ〜約２３ｍＭ、０．２８ｍＭ〜約２３ｍＭ、０．２９ｍＭ〜約２２ｍＭ、約０．３０ｍＭ〜約２１ｍＭ、約０．３１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．３２ｍＭ〜約１９ｍＭ、約０．３３ｍＭ〜約１７ｍＭ、約０．３４ｍＭ〜約１８ｍＭ、約０．３５ｍＭ〜約１７ｍＭ、約０．３６ｍＭ〜約１６ｍＭ、約０．３７ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１４ｍＭ、約０．４１ｍＭ〜約１３ｍＭ、約０．４２ｍＭ〜約１２ｍＭ、約０．４３ｍＭ〜約１１ｍＭ、約０．４４ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．４５ｍＭ〜約９ｍＭ、約０．４６ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．４７ｍＭ〜約７ｍＭ、約０．４８ｍＭ〜約６ｍＭ、約０．４９ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．５０ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．５０ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．５５ｍＭ〜約３ｍＭ、０．６ｍＭ〜約２ｍＭまたは０．７５〜約１．５ｍＭの範囲であり得る。限定されないが、いくつかの好ましい実施形態では、本発明の実践で使用されるＶＰＡの最終濃度は、約０．１５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．１６ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．１７ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．１８ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．１９ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．２０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．３０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．４０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．５０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．６０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．７０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．８０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．９０ｍＭ〜約１．５ｍＭまたは約０．１０ｍＭ〜約１．���ｍＭの間であり得る。限定されないが、いくつかの好ましい実施形態では、本発明の実践で使用されるＶＰＡの最終濃度は、約０．２０〜約１．５ｍＭ、約０．２１〜約１．４ｍＭ、約０．２２〜約１．４ｍＭ、約０．２３〜約１．４ｍＭ、約０．２４〜約１．４ｍＭ、約０．２５〜約１．３ｍＭ、約０．２５〜約１．２ｍＭ、約０．２５〜約１．１ｍＭ、または約０．２５〜約１．０ｍＭの間であり得る。
【００８０】
さらに実施形態では、本発明の実践で使用されるプロピオン酸ナトリウム（ＮａＰＰ）の最適な最終濃度は、約０．２ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲であり得る。限定されないが、ある好ましい実施形態では、ＮＡＰＰの最適な最終濃度は、約０．５〜約８０ｍＭ、約０．４ｍＭ〜約７０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約６０ｍＭ、約０．６ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．７ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．８ｍＭ〜約３０ｍＭ、約０．９ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、約３ｍＭ〜約９ｍＭ、約４ｍＭ〜約８ｍＭ、または約５ｍＭ〜約７ｍＭの範囲であり得る。限定されないが、ある好ましい実施形態では、ＮＡＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２ｍＭ、約２ｍＭ〜約３ｍＭ、約３ｍＭ〜約４ｍＭ、約４ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ〜約６ｍＭ、約６ｍＭ〜約７ｍＭ、約７ｍＭ〜約８ｍＭ、約８ｍＭ〜約９ｍＭ、または約９ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲であり得る。限定されないが、ある好ましい実施形態では、ＮＡＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、または約１０ｍＭであり得る。
【００８１】
さらに実施形態では、本発明の実践で使用される酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）の最適な最終濃度は、約０．２５〜約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．３５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、または約２ｍＭ〜約３ｍＭの範囲であり得る。
【００８２】
さらに実施形態では、本発明の実践で使用される酪酸の最適な最終濃度は、約０．２５〜約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．３５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１ｍＭ〜約３ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、または約２ｍＭ〜約３ｍＭの範囲であり得る。
【００８３】
本発明に従って使用される発現増強物質は、トランスフェクション前、または細胞および発現されたタンパク質を収集する前のトランスフェクション後、即時に培養培地に添加され得る。限定されないが、下記のいくつかの具体的な実施形態では、「増強物質１」は、一般的に、０．２５ｍＭ〜１ｍＭのバルプロ酸を指し、「増強物質２」は、一般的に、５ｍＭ〜７ｍＭのプロピオン酸ナトリウムを指す。しかしながら、もし、別途指示されたならば、増強物質１および増強物質２という語は、異なる増強物質化合物を包含し得る。発現増強物質は、培養培地に順次、または混合物として添加され得る。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、「ベクター」という語は、それに結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図する。ベクターのひとつのタイプは、「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なＤＮＡ断片をライゲートされ得る環状二重鎖ＤＮＡを指す。ベクターの別のタイプは、ファージベクターである。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、ここで、付加的ＤＮＡ断片は、ウイルスゲノム中にライゲートされ得る。あるベクターは、該ベクターが導入される宿主細胞において、自律複製（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）が可能である。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノム中に統合され得、それにより、宿主ゲノムに応じて複製される。さらに、あるベクターは、該ベクターが機能的に結合されている遺伝子の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書中、「組換え発現ベクター」または簡単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの通常最も使用される形態であるので、交換可能に使用され得る。本明細書中に記載の本発明の実践に従って使用されるあるベクターは、例えば、ｐＣＤＮＡ３．３またはその改変バージョンなどの当技術分野で使用される周知のベクターであり得る。本発明の実践に適切であり得るベクターへの改変のタイプの限定されない例としては、これに限定されないが、１つ以上のエンハンサー、１つ以上のプロモーター、１つ以上のリボソーム結合部位、または１つ以上の複製起点などの改変の付加といった改変が挙げられる。限定されないが、ある好ましい実施形態では、本発明の実践で使用される発現ベクターとしては、本一過性発現系における関心対象のタンパク質の発現改良のために選択される１つ以上のエンハンサーエレメントが挙げられ得る。選択されるエンハンサーエレメントは、関心対象のタンパク質を発現するために使用される発現可能な核酸配列に対して５'位または３'位に位置し得る。限定されないが、特に好ましいエンハンサーエレメントは、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、「発現タンパク質を産生可能な遺伝子配列を含む発現ベクター」という言い回しは、一般的に、細胞中もしくは無細胞発現系中、発現を支持するために必要な１つ以上の核酸配列または因子に加えて、関心対象の所望のタンパク質（本発明の使用者により選択される関心対象の前記タンパク質）の少なくとも１つのオープンリーディングフレームを有する発現可能な核酸配列を収容可能な、上記定義されたベクターをいう。本明細書中に定義された発現ベクター中に存在し得るそのような付加的核酸配列または因子としては、１つ以上のプロモーター配列、１つ以上のエンハンサーエレメント、１つ以上のリボソーム結合部位、１つ以上の翻訳開始配列、１つ以上の複製起点、または１つ以上の選択可能なマーカーが挙げられる。この目的に適合する様々な核酸配列または因子は、熟練者によく知られており、本発明の実践に使用するための１つ以上のその選択は、十分に熟練技術者の範囲内である。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む任意の核酸をいう。好ましい実施形態では、「核酸」は、ゲノムＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、およびオリゴＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡをいう。限定されないが、ある好ましい実施形態では、「核酸」は、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによる、または合成反応による重合体に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。もし存在するならば、ヌクレオチド構造の修飾は、重合体の集合前または集合後に行われ得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により妨害され得る。ポリヌクレオチドは、標識への結合などの合成後に成される修飾を含み得る。修飾の他のタイプとしては、例えば、類似体を含む１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの「キャップ」置換、例えば、無電荷結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジン（ply-L-lysine）など）などのペンダント部分を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、並びにポリヌクレオチドの非修飾形態もまた挙げられる。さらに、該糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基により置換され、標準的な保護基により保護され、または別のヌクレオチドに付加的結合させるために活性化され得、または固体または半固体担体に結合され得る。５'および３'末端ＯＨは、リン酸化され得るかまたはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子を有する有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドもまた、例えば、２'−Ｏ−メチル−、２'−Ｏ−アリル−、２'−フルオロ−もしくは２'−アジドリボースを含む一般的に当技術分野で周知のリボースもしくはデオキシリボース糖、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの基本的ヌクレオシド類似体を包含し得る。１つ以上のホスホジエステル結合は、別の結合基により置換され得る。これらの別の結合基としては、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ'、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ'は、独立して、Ｈであるか、またはエーテル（−−Ｏ−−）結合を含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルである）で置き換えられる実施形態が挙げられるが、これに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同じである必要はない。直前の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中に示した全ポリヌクレオチドに適用される。
【００８７】
本明細書中に使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」は、一般的に、短く、一般的に単鎖であり、一般的に、必ずしもそうではないが、約２００ヌクレオチド長未満である、一般的に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドの上記説明は、等しくおよび十分に、オリゴヌクレオチドに適用される。
【００８８】
本明細書中に使用されるとき、「第１の期間」という言い回しは、本明細書中に記載の本発明の方法に従って一過性トランスフェクション細胞のための方法の文脈に使用されるとき、一般的に、細胞集団への発現可能な核酸のトランスフェクトから、トランスフェクトされた細胞への１つ以上の発現増強物質の添加までの間の時間間隔をいう。典型的には、第１の期間は、約２時間〜約４日間の範囲である。限定されないが、ある好ましい実施形態では、第１の期間は、約３〜約９０時間、約４〜約８５時間、約５〜約８０時間、約６〜約７５時間、約７〜約７０時間、約８〜約６５時間、約９〜約６０時間、約１０〜約５５時間、約１１〜約５０時間、約１２〜約４５時間、約１３〜約４０時間、約１４〜約３５時間、約１５〜３０時間、約１６〜約２４時間、約１７〜約２４時間、約１８〜約２４時間、約１９〜約２４時間、約２０〜約２４時間、約２１〜約２４時間、約２２〜約２４時間または約２３〜約２４時間の範囲であり得る。他の好ましい限定されない実施形態では、第１の期間は、約１５時間、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間までまたは約３０時間までであり得る。
【００８９】
本明細書中に使用されるとき、「第２の期間」という言い回しは、本明細書中に記載の本発明の方法に従って一過性トランスフェクション細胞のための方法の文脈に使用されるとき、一般的に、１つ以上の発現増強物質の添加から、１つ以上の追加の増強物質の添加までまたはトランスフェクトされた細胞の収集およびそこで発現されたタンパク質の精製および単離までのいずれかの間の時間間隔をいう。典型的には、第２の期間は、約１０時間〜約１０日間の範囲であり、もし、発現されるタンパク質に最適であると決定されるならば、他の時間間隔が使用され得る。限定されないが、いくつかの好ましい実施形態では、第２の期間は、２時間〜５日間、２．５時間〜４日間、約３〜約９０時間、約４〜約８５時間、約５〜約８０時間、約６〜約７５時間、約７〜約７０時間、約８〜約６５時間、約９〜約６０時間、約１０〜約５５時間、約１１〜約５０時間、約１２〜約４５時間、約１３〜約４０時間、約１４〜約３５時間、約１５〜３０時間、約１６〜約２４時間、約１７〜約２４時間、約１８〜約２４時間、約１９〜約２４時間、約２０〜約２４時間、約２１〜約２４時間、約２２〜約２４時間または約２３〜約２４時間の範囲であり得る。他の好ましい限定されない実施形態では、第１の期間は、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間までまたは約３０時間までであり得る。
【００９０】
本明細書中に使用されるとき、「第３の期間」という言い回しは、本明細書中に記載の本発明の方法に従って一過性トランスフェクション細胞のための方法の文脈に使用されるとき、一般的に、少なくとも第１発現増強物質の添加から少なくとも第２発現増強物質の添加までの間の時間間隔をいう。第１および第２の発現増強物質の添加間の時間間隔は、そのような第１および第２の発現増強物質が事実上同時に添加され得るか、または単一処方物で提供されてもよい、いくつかの実施形態を通して、秒から日のオーダーであり得る。
【００９１】
本明細書中に使用されるとき、「複合体形成反応」または「複合培地」などは、一般的に、そこで核酸がトランスフェクション剤処方物に複合体化される、生理学的に許容可能な培養培地または反応を指す。典型的には、タンパク質を発現する目的のために、細胞に導入される核酸は、最初に、適切なトランスフェクション剤（例えば、カチオン性脂質処方物など）を用いて、脂質／核酸複合体または凝集体に複合体化される。
【００９２】
「遷移元素」または「遷移金属」（これらは、交換可能に使用され得る）は、該元素が、所与の一連の元素中の最多および最少の陽電性間で遷移結合として働くように、外殻でなく内殻の原子価電子殻が部分的にしか占有されていない元素を意味する。遷移元素は、典型的に、高融点、高密度、高極性または高磁気モーメント、多原子価、および安定錯体イオン形成能力により特徴付けられる。本発明に有用なそのような遷移元素としては、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルビジウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、ランタン（Ｌａ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、およびアクチニウム（Ａｃ）が挙げられる。本発明のものを含む培養培地組成物中に使用するための遷移元素として特に関心対象のものは、イオン、キレート、塩、および鉄（Ｆｅ２＋またはＦｅ３＋）錯体である。
【００９３】
様々な技術および剤は、「トランスフェクション」として知られている工程の標的細胞への高分子導入に利用可能である。通常使用される剤としては、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランおよび脂質が挙げられる。これらのタイプの剤の使用のための詳細なプロトコールの例としては、多数の参考テキストが入手可能で、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 9, Ausubel, et al. Eds., John Wiley and Sons, 1998がある。細胞のトランスフェクションのための別の方法は、当技術分野で周知であり、エレクトロポレーション法（遺伝子電気導入法）、ソノポレーション法、オプティカルトランスフェクション法、プロトプラスト融合法、インペールフェクション法、マグネトフェクション法、またはウイルス形質導入法が挙げられ得る。
【００９４】
細胞への「高分子導入用剤」または「トランスフェクション剤」は、細胞への高分子の移行を促進する当業者に周知の任意の材料、処方物または組成物である。例えば、米国特許第５，２７９，８３３号参照。いくつかの実施形態では、該剤は、「トランスフェクション剤」であり、１つ以上の核酸の、１つ以上の標的細胞への取り込みを増加する任意の化合物および／または組成物であり得る。様々なトランスフェクション剤は、当業者に周知である。適切なトランスフェクション剤としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマーを含む１つ以上の化合物および／または組成物、ポリリジンおよびポリアルギニンなどの正電荷のアミノ酸ポリマー、正電荷のデンドリマーおよび破砕されたデンドリマー、カチオン性β−シクロデキストリン含有ポリマー（ＣＤ−ポリマー）、およびＤＥＡＥ−デキストランなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞への高分子の導入用剤は、カチオン性脂質および／または中性脂質であり得る１つ以上の脂質を含み得る。好ましい脂質としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（４'−トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２−ジオレオイル−３−サクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ），コレステリル（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノエート（ＣｈｏＴＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ'−ジドデシル−Ｎ−［ｐ（２−トリメチルアンモニオエチルオキシ）ベンゾイル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１つ以上の脂質に結合したスペルミン（例えば，５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）およびジパルミトイルファスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミンド（ＤＰＰＥＳ））、リポポリリジン（ＤＯＰＥに結合したポリリジン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタミン）と結合した脂肪酸（ＴＦＡ）および／またはペプチド、例えばトリリシル−アラニル−トリスモノ−、ジ−、およびトリ−パルミテート、（３β−［Ｎ−−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミン−イニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
当業者には、上述の脂質のある組み合わせが、核酸の細胞への導入に特に適切であることが明らかであり、例えば、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥの３：１（重量／重量）の組み合わせがライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）の商品名で入手可能であり、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの１：１（重量／重量）の組み合わせがライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の商品名で入手可能であり、ＤＭＲＩＥおよびコレステロールの１：１（モル／モル）の組み合わせがライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＤＭＲＩＥ−Ｃ剤の商品名で入手可能であり、ＴＭ−ＴＰＳおよびＤＯＰＥの１：１．５（モル／モル）の組み合わせがライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の商品名で入手可能であり、およびＤＤＡＢおよびＤＯＰＥの１：２．５（重量／重量）の組み合わせがライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＬｉｐｆｅｃｔＡＣＥ（登録商標）の商品名で入手可能であることを知っていると考えられる。上述の脂質の組み合わせに加えて、他の化合物との混合物、特に、核局在配列を含むペプチドおよびタンパク質との混合物中の脂質を含む他の処方物は、当業者に周知である。例えば、国際特許公開第ＷＯ００／２７７９５号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２６８２５号（これらの両方とも、参照することにより本明細書中に組み入れられたものとする）参照。
【００９６】
リポソームなどの脂質集合体は、細胞への高分子の送達のための媒介物として有用であることが分かっている。特に、１つ以上のカチオン性脂質を含む脂質集合体は、アニオン性高分子（例えば、核酸）の細胞への送達に極めて効果的であることが示されている。ひとつの通常使用されるカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）である。ＤＯＴＭＡを単独で、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１混合物として含むリポソームは、核酸を細胞に導入するために使用されている。ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥの１：１混合物は、ライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）からＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）の商品名で市販されている。核酸を細胞に導入するために使用されている別のカチオン性脂質は、１，２−ビス（オレオイル−オキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）である。ＤＯＴＡＰは、オレオイル部分がＤＯＴＡＰ中のエーテル結合を介してプロピルアミン骨格に結合しているが、ＤＯＴＭＡ中ではエステル結合を介して結合していることで、ＤＯＴＭＡと異なる。ＤＯＴＡＰは、標的細胞により、より容易に分解されると思われる。トリメチルアンモニウム部分のメチル基のひとつがヒドロキシエチル基で置換される化合物の構造的に関係する基は、ホスホリパーゼＡ（Rosenthal, et al., (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206参照）のローゼンタールインヒビター（ＲＩ）に構造が似ている。ＲＩは、プロピルアミン核に結合したステアロイルエステルを有する。ＲＩのジオレオイル類似体は、通常、脂質部分のプロピルアミン核への結合により、ＤＯＲ１−エーテルおよびＤＯＲ１−エステルと略される。ヒドロキシエチル部分のヒドロキシル基は、例えば、カルボキシスペルミンへのエステル化により、さらに誘導体化され得る。
【００９７】
細胞への高分子の導入に使用されている別の分類の化合物は、脂質に結合したカルボキシスペルミン（Behr, et al., (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986および欧州特許公開（ＥＰＯ）第０３９４１１１号を参照）を含む。このタイプの化合物の例としては、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）および５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）が挙げられる。ＤＯＧＳは、プロメガ社（ウィスコンシン州マジソン市）からＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）の商品名で市販されている。
【００９８】
コレステロールのカチオン性誘導体（３β−［Ｎ−−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）は、合成され、ＤＯＰＥと一緒にリポソーム中に処方（Gao, et al., (1991) BBRC 179(1):280-285参照）され、ＤＮＡを細胞に導入するために使用されている。従って、処方されたリポソームは、ＤＮＡを、低レベルの細胞毒性で細胞に効率的に導入することが報告された。ポリリジンがＤＯＰＥに結合することにより生成されるリポポリリジン（Zhou, et al., (1991) BBA 1065:8-14参照）は、血清の存在下での核酸の細胞への導入が効率的であることが報告されている。
【００９９】
核酸を細胞に導入するために使用されているカチオン性脂質の他のタイプとしては、米国特許第５，６７４，９０８号および同第５，８３４，４３９号、および国際特許公開第ＷＯ００／２７７９５号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２６８２５号に記載のものなど、高密度ポリカチオン性アンモニウム、スルホニウムおよびホスホニウム脂質が挙げられる。本発明に従った高分子の送達のための、限定されないが、ひとつの具体的に好ましいトランスフェクション剤は、ライフテクノロジーズ社から入手可能なＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（商標）（国際特許公開第ＷＯ００／２７７９５号で公開された米国国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２６８２５号参照）である。細胞への高分子の送達に適切な、限定されないが、別の好ましいトランスフェクション剤は、ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）である。他の適切なトランスフェクション剤としては、ＬＩＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＬＴＸ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２.０、および米国特許出願公開第２０１２／０１３６０７３号（Yangら）（これを参照することにより本明細書に組み入れられたものとする）に開示の任意の脂質剤または処方物が挙げられる。様々な他のトランスフェクション剤は、当技術分野の熟練者に周知であり、本明細書に記載の一過性トランスフェクションシステムおよび方法に対するその適性を評価され得る。
【０１００】
本発明は、（ａ）少なくとも１つの高分子、好ましくは、発現可能な核酸分子の、培養物中の真核細胞への導入、（ｂ）少なくとも１つの高分子が導入されている細胞の培養、および任意で（ｃ）少なくとも１つの高分子が導入されている細胞における組換えタンパク質産物の産生または核酸の発現を支持する、高収率一過性トランスフェクションシステムであって、高分子を含有する培地は、細胞への少なくとも１つの高分子の導入後、ならびに培養前およびタンパク質産物の産生または核酸の発現の前に、培養物から除去するおよび新鮮な培地で置換する必要がない、高収率一過性トランスフェクションシステムを対象としている。
【０１０１】
本発明の一過性トランスフェクションシステム、本明細書中に記載の方法に従ったその使用は、細胞培養システムにおける迅速且つ再現可能な関心対象のタンパク質の高レベル発現をもたらす。典型的には、本一過性トランスフェクションシステムおよび方法は、所望の組換えタンパク質および使用される細胞タイプの個々の発現特性により、約２００μｇ（タンパク質）／Ｌ（培養液）〜約２ｇ（タンパク質）／Ｌ（培養液）の範囲のレベルで組換え発現タンパク質を産生可能である。本明細書中で提供される一過性トランスフェクションシステムおよび方法を使用して、使用者は、標準的な市販の一過性トランスフェクションシステムを使用して現在得られるものを超えて、約２倍から約２０倍までの発現タンパク質のレベルを得ることができる。本明細書中で提供される一過性トランスフェクションシステムおよび方法を使用して、使用者は、現代の一過性発現システムで見られるものより、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、または約１０倍までまたはそれ以上の発現タンパク質のレベルを得ることができる。例えば、組換えタンパク質を産生する本一過性トランスフェクションシステムを使用して、使用者は、例えば、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）発現システムなどの浮遊細胞の組換えタンパク質の産生を最適化した市販の一過性トランスフェクションシステムを使用して得られるタンパク質収率よりも約２倍から約１０倍までの高さの間のタンパク質収率を得ることができる。
【０１０２】
本発明のシステムは、他の因子の中でも、少なくとも高密度培養培地、少なくとも高密度増殖に適応した多くの浮遊細胞、任意で１つ以上の発現ベクターを含み、任意で１つ以上のトランスフェクション剤を含み、かつ任意で１つ以上の発現増強物質を含み、この本発明のシステムを使用すると、ひとつの高分子を少なくともひとつの細胞に導入した後、および少なくともひとつの高分子が導入され、タンパク質産物を産生または核酸を発現するためにさらに培養する前に、培地を補充、置換または補給する必要がない。本発明のシステムでは、培地は、理想的には、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質培地もしくは実質的に低タンパク質の培地、および／または動物由来成分を含有しない培地、またはこれらの特徴の組み合わせを有する培地である。
【０１０３】
本発明のひとつの限定されない態様では、化合物または高分子（例えば、核酸）の、培養物中の細胞への導入に関して、本発明の高収率培養培地は、典型的に、現在入手可能な一過性トランスフェクションシステムを使用して得られ得るものより、高い効率で細胞トランスフェクションを促進する。限定されないが、本発明の別の態様では、該システムはまた、トランスフェクション後に細胞が培養されるものよりも少ない量で細胞のトランスフェクションを行う必要もない。本発明のさらに別の関係する限定されない態様では、該システムは、現在入手可能な一過性トランスフェクションシステムより、高い細胞生存率を促進する。さらに関係する限定されない態様では、該システムは、現在入手可能な一過性トランスフェクションシステムより、高細胞密度（例えば、細胞／ｍｌ培養培地）を促進する。本発明の別の関係する限定されない態様では、該システムは、現在入手可能な一過性トランスフェクションシステムよりも、培養物中の細胞の組換えタンパク質発現の高いレベルを促進する。好ましくは、必然的ではないが、同量の培地は、少なくともひとつの高分子を細胞に導入し、細胞のトランスフェクションが起こった培地を置換、除去、補給もしくは補充することなく、引き続き培養するために使用され得る。あるいは、該細胞が分割されるか、または培地量が、約２倍、約５倍、約８倍または約１０倍からあまり増加しない。
【０１０４】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、少なくとも１つの高分子を導入するため、または任意の量の培養培地中の細胞をトランスフェクションおよび培養するために使用することを意図している。そのような導入は、好ましくは、トランスフェクトされる細胞を培養するために使用される培地の０．１〜１０倍の量で実行される。好ましくは、細胞培養量は、約１ミリリットルより多い。より好ましくは、細胞培養量は、約２００μｌ〜１００リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約２ｍｌ〜約５０リットルであり、最も好ましくは、約５ｍｌ〜約５リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約１００ｍｌ〜約５０リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約５０リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約５０リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約２５リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約１０リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約５リットルである。より好ましくは、細胞培養量は、約５００ｍｌ〜約１リットルである。
【０１０５】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物では、培地は、任意で、高分子またはトランスフェクションの導入を妨害し得る化合物、例えば、ポリスルホン酸化および／またはポリ硫酸化化合物などのポリアニオン性化合物などを含まない。好ましくは、該培地はデキストラン硫酸を含まない。
【０１０６】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、化合物または高分子（特に高分子、例えば、核酸、タンパク質およびペプチド）を、培地の交換をする必要なく、培養された細胞（例えば、トランスフェクションにより）に導入することを可能にする。ひとつの好ましい実施形態では、本発明は、真核細胞の培養およびトランスフェクションのための培地を提供する。
【０１０７】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物を使用して、当業者は、高分子または化合物（例えば、核酸）を培養物中の細胞に導入できる。好ましくは、高分子または化合物（例えば、核酸）は、少なくとも約２０％の細胞に導入される。より好ましくは、高分子または化合物（例えば、核酸）は、少なくとも約２０〜約１００％の細胞に導入される。より好ましくは、高分子または化合物（例えば、核酸）は、少なくとも約３０〜約１００％の細胞に導入される。より好ましくは、高分子または化合物（例えば、核酸）は、少なくとも約５０〜約１００％の細胞に導入される。実際に、高分子または化合物は、約２０％〜約９０％の細胞、約２０％〜約８０％の細胞、約３０％〜約６０、７０、８０または９０％の細胞、約２０、３０、４０または５０％〜約７０、７５、８０、８５、９０、９５または９８％の細胞などに導入され得る。さらには約６０、７０、７５または８０〜約９０％または１００％近くの細胞が、導入された分子または化合物を含み得る。
【０１０８】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物の好ましい実施形態では、１つ以上の望ましくない成分（すなわち、１つ以上の血清成分、１つ以上の規定されていない成分、１つ以上のタンパク質成分および／または１つ以上の動物由来成分）は、１つ以上の交換成分により、１つ以上の機能で置換または置換（replaced）されている。本発明の置換化合物は、任意に、１つ以上の金属結合化合物および／または１つ以上の遷移金属錯体、１つ以上の金属結合化合物との錯体の形態で１つ以上の遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む前記錯体を含んでもよい。好ましくは、該培地は、トランスフェリンまたは他の動物由来タンパク質もしくは抽出物などの１つ以上の天然由来金属担体の存在しないインビトロでの細胞培養を支持することが可能である。金属結合化合物は、培地に金属結合化合物を添加する前に、遷移金属との錯体であり得る。他の実施形態では、金属結合化合物は、培地に金属結合化合物を添加する前に、遷移金属との錯体ではない。好ましくは、本発明の培地は、トランスフェリンを含有せず、および／またはインスリンを含有しない。
【０１０９】
本発明はまた、培地を１つ以上の置換化合物と合わせることにより得られる細胞培養培地にも関する。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地であり、および／または動物由来成分を欠いている培地であり得る。該培地は、好ましくは、トランスフェリンを含有せず、および／またはインスリンを含有しない。いくつかの好ましい実施形態では、該培地は、インビトロでの細胞培養を支持することが可能であり、細胞に高分子を導入することを可能にできる。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換化合物は、金属結合化合物であり、および／または遷移金属錯体、少なくとも１つの金属結合化合物との錯体の、少なくとも１つの遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む前記錯体であり得る。本発明のこの態様で使用されるための、好ましい遷移元素、金属結合化合物、および遷移元素錯体としては、本明細書中に詳細に記載のものが挙げられる。
【０１１０】
本発明の置換化合物は、インビトロで培養される細胞への遷移金属の送達を促進する。好ましい実施形態では、該置換化合物は、鉄を送達でき、トランスフェリンを置換できる。好ましい置換化合物は、ヒドロキシピリジン誘導体である。好ましくは、ヒドロキシピリジン誘導体は、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、３−ヒドロキシ−４−ピロン、３−ヒドロキシピピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−ヒドロキシピリド−２−オン、１,２−ジメチル−３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−メチル−３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−ピリジノン、およびピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸−Ｎ−オキシド、２−ヒドロキシ−ニコチン酸から成る群から選択される。最も好ましくは、ヒドロキシピリジン誘導体は、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドである。
【０１１１】
本発明の置換化合物は、真核生物および／または原核生物細胞、組織、器官などを培養または増殖するための培地を含む任意の培地とともに使用され得る。そのような培地としては、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ−１６４０、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、α最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。市販されている（例えば、ライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）から）または特に当技術分野で周知である他の培地は、これに限定されないが、２９３ＳＦＭ、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＶＰ  ＳＦＭ、ＢＧＪｂ培地、ブリンスターＢＭＯＣ−３培地、細胞培養凍結培地、ＣＭＲＬ培地、ＥＨＡＡ培地、ｅＲＤＦ培地、フィッシャー培地、ガンボーグＢ−５培地、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補給培地、グレース昆虫細胞培地、ＨＥＰＥＳ緩衝培地、リヒター改変ＭＥＭ、ＩＰＬ−４１昆虫細胞培地、ライボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、１９９培地、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ＮＣＴＣ−１０９培地、シュナイダードロソフィア培地、ＴＣ−１００昆虫培地、ウェイマウスＭＢ７５２／１培地、ウィリアム培地Ｅ、無タンパク質ハイブリドーマ培地ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、ＡＩＭ  Ｖ培地、ケラチノサイトＳＦＭ、化学的に規定されたケラチノサイトＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）完全メチルセルロース培地、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、神経基本Ａ培地、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ（商標）Ａ培地、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ  Ｅ培地、内皮ＳＦＭ、ヒト内皮ＳＦＭ、ハイブリドーマＳＦＭ、ＰＦＨＭＩＩ、Ｓｆ９００培地、Ｓｆ９００ＴＩＳＦＭ、ＥＸＰＲＥＳＳ  ＦＩＶＥ（登録商標）培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−ＩＩ完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−Ｃ１００完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−Ｃ１００基本培地、ＰＢ−ＭＡＸ（商標）核型分析培地、ＫＡＲＹＯＭＡＸ骨髄核型分析培地、ノックアウトＤ−ＭＥＭおよびＣＯ２非依存性培地を含み、本発明に従って同等に使用され得る。上記培地は、ＪＲＨ社、シグマ社、ハイクローン社、およびバイオウィタカー社などの当業者に周知の製造会社から得られる。本発明の実践の使用に適切な培地の追加の例は、米国特許第５，１３５，８６６号および同第５，２３２，８４８号だけでなく、国際公開第ＷＯ８８／０２７７４号、同第ＷＯ９８／１５６１４号、同第ＷＯ９８／０８９３４号および欧州特許第０２８２９４２号（これらの全体は、参照することにより本明細書中に、具体的に組み入れられたものとする）中にも見られ得る。
【０１１２】
本発明はまた、本発明の培地で細胞を培養することを含み、かつ培地中の細胞を、１つ以上の細胞による高分子の取り込みをもたらす条件下で、１つ以上の高分子と接触させることを含む、細胞への高分子の導入方法も提供する。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地であり、および／または動物由来成分を欠いている培地であり得る。好ましい細胞としては、真核細胞が挙げられる。より好ましくは、該細胞は、哺乳類細胞である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まない。いくつかの好ましい実施形態では、該培地は、同じ培地で細胞の増殖およびトランスフェクションを可能にする。いくつかの実施形態では、該高分子は、１つ以上の核酸を含み得、および細胞による該核酸分子の取り込みをもたらす条件は、該核酸を、１つ以上の細胞に該核酸を導入させる剤と接触させることを包含する。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の培地と細胞とを含む組成物も提供する。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地、および／または動物由来成分を欠いている培地である。好ましい細胞としては、真核細胞が挙げられる。より好ましくは、該細胞は、哺乳類細胞である。最も好ましいものは、２９３線維芽細胞由来の浮遊細胞である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み得、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まない。好ましくは、該培地は、同じ培地で細胞の増殖およびトランスフェクションを支持し、より好ましくは、該培地は、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞の増殖および培養を支持し、前記培地は、組換えタンパク質を産生する目的で発現可能な核酸を導入した後に補充、置換、またはさもなければ補給される必要がない。
【０１１４】
本発明はまた、本発明の培地と高分子を１つ以上の細胞に導入するための１つ以上の剤とを含む組成物も提供する。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地、および／または動物由来成分を欠いている培地である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み得、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まない。好ましくは、該培地は、トランスフェクション剤を含み、該高分子は核酸である。該高分子はまた、タンパク質および／またはペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該剤は、その１つ以上のものがカチオン性脂質であり得る１つ以上の脂質を含む。より好ましくは、該剤は、単独または１つ以上の脂質との混合物で提供され得る、１つ以上のペプチドおよび／またはタンパク質を含む。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の培地と細胞に導入される１つ以上の高分子とを含む組成物も提供する。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地、および／または動物由来成分を欠いている培地である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み得、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まない。該高分子は、例えば、核酸および／またはタンパク質および／またはペプチドであり得、非複合体であり得、高分子を細胞に導入するための１つ以上の剤との複合体の形態であり得る。好ましくは、該高分子は核酸であり、１つ以上のトランスフェクション剤との複合体の形態であり得る。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の培地、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの高分子、少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの高分子を導入するための少なくとも１つの剤から成る群から選択される少なくとも１つの成分（またはその組み合わせ）を含む組成物を提供する。好ましくは、該細胞は、真核細胞である。より好ましくは、該細胞は、哺乳類細胞である。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地、および／または動物由来成分を欠いている培地である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み得、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まない。いくつかの好ましい実施形態では、該剤は、トランスフェクション剤であり、該高分子は核酸、例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡである。あるいは、該高分子は、タンパク質および／またはペプチドである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、該剤は、その１つ以上がカチオン性脂質であり得る１つ以上の脂質を含む。より好ましくは、該剤は、中性およびカチオン性脂質の混合物を含む。いくつかの実施形態では、剤は、単独でまたは１つ以上の脂質との混合物で提供され得る１つ以上のペプチドおよび／またはタンパク質を含む。好ましい実施形態では、該剤は、該高分子を該細胞に導入する該高分子と複合体化する。
【０１１８】
本発明はまた、細胞の培養およびトランスフェクションのための培地を含む少なくとも１つの容器を含む細胞の培養およびトランスフェクションのためのキットも提供する。そのようなキットはまた、本発明の培地、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの高分子、少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの高分子を導入するための少なくとも１つの剤、少なくとも１つの緩衝剤または緩衝塩、および少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの高分子を導入するためのキットを使用するための指示書から成る群から選択される少なくとも１つの成分（またはその組み合わせ）も含み得る。好ましくは、該培地は、無血清培地および／または化学的に規定された培地および／または無タンパク質もしくは低タンパク質培地、および／または動物由来成分を欠いている培地である。該培地は、１つ以上の置換化合物を含み得、好ましくは、トランスフェリンを含まず、および／またはインスリンを含まずおよび／または動物増殖因子を含まない。該培地は、金属結合化合物であり得る１つ以上の置換化合物を含み得、および／または１つ以上の置換化合物を含む１つ以上の複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、該培地は、１つ以上の複合体、金属結合化合物であり得る１つ以上の置換化合物を錯体化した１つ以上の遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む前記複合体を含み得る。いくつかの実施形態では、前記培地は、インビトロで細胞の培養を支持することが可能であり、そこで培養した細胞のトランスフェクションを可能にする。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、細胞のトランスフェクションのための脂質を含む少なくとも１つの容器をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、核酸を含む少なくとも１つの容器を含み得る。
【０１１９】
本発明のひとつの態様に従えば、遷移元素は、好ましくは、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、および アクチニウム、またはその塩もしくはイオンから成る群から選択され、好ましくは、鉄塩である。適切な鉄塩としては、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３またはＦｅＳＯ４またはＦｅ＋＋＋イオンまたはＦｅ＋＋イオンを含む他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
好ましい置換化合物としては、金属結合化合物が挙げられるが、これに限定されない。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３５８０号、国際特許公開第ＷＯ０１／１６２９４号を参照。
【０１２１】
本発明の金属結合化合物は、遷移元素と相互作用または結合でき、細胞によりその取込みが促進できる任意の高分子を含む。そのような相互作用／結合は、事実上、共有結合性または非共有結合性であり得る。本発明のこの態様で使用される金属結合化合物は、好ましくは、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、１，３，５−Ｎ，Ｎ'，Ｎ''−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノ−メチルベンゼン、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ'−テトラエチレンホスホン酸、トリスクシン（trisuccin）、酸性糖類 (例えば、グルコン酸第一鉄)、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ニコチン酸−Ｎ−オキシド、２−ヒドロキシ−ニコチン酸、モノ−、ビス−、またはトリス−置換２，２'−ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体(例えば、アセトヒドロキサム酸)、アミノ酸誘導体、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄ベースポルフィン（iron basic porphine）およびその誘導体、ＤＯＴＡ−リジン、テキサフィリン、サフィリン、ポリアミノカルボン酸、α−ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、エチルマルトール、３−ヒドロキシ−２−ピリジン、およびＩＲＣ０１１から成る群から選択される。ひとつの好ましい実施形態では、金属結合化合物は、ソルビトールまたはデキストランなどのポリオール、特にソルビトールである。関係する実施形態では、金属結合化合物は、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、３−ヒドロキシ−４−ピロン、３−ヒドロキシピピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−ヒドロキシピリド−２−オン、１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリド−４−オン、１−メチル−３−ヒドロキシピリド−２−オン、３−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−ピリジノン、エチルマルトールまたはピリドキサールイソニコチニルヒドラゾンなどのヒドロキシピリジン誘導体であり、および好ましくは、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドである。本発明のこの態様に従った特に好ましい実施形態では、遷移金属錯体は、ソルビトール−鉄錯体または２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド−鉄錯体であり得る。本発明の金属結合化合物はまた、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋などの二価カチオンとも結合し得る。
【０１２２】
本発明は、金属結合化合物であり得る１つ以上の置換化合物を含み、少なくとも１つのアミノ酸（Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン または Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−システインなど）、少なくとも１つのビタミン（ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸塩、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミンまたはビタミンＢ１２など）、少なくとも１つの無機塩（カルシウム塩、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＣｌ３、ＫＣｌ、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、セレン塩、ケイ素塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４または他の亜鉛塩など）、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、１つ以上のサイトカイン、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードチロニン、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８、およびチミジンから成る成分群から選択される１つ以上の成分をさらに含む細胞培養培地に関する。
【０１２３】
本発明の培養培地は、１つ以上の緩衝剤を任意に含んでもよい。適切な緩衝剤は、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ'−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、重炭酸塩および細胞培養用途の使用に適切な他の緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。適切な緩衝剤は、培養された細胞に実質的な細胞傷害性のない緩衝能力を提供するものである。適切な緩衝剤の選択は、細胞培養の通常の技術分野の範囲内である。
【０１２４】
本発明に従えば、本発明の細胞培養培地を形成するのに使用するために適切な培地は、１つ以上の成分を含み得、例えば、アデニン、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ヘパリン、緩衝剤、ヒドロコルチゾン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードチロニン、チミジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−システイン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸塩、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、組換えインスリン、カルシウム塩、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、セレン塩、ケイ素塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４または他の亜鉛塩（各成分は、インビトロの細胞培養を支持する量で添加される）から成る群から選択される１つ以上の成分を合わせることにより得られ得る。
【０１２５】
本発明はまた、エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳ、インスリン、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トランスフェリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ＋＋−パントテン酸塩、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、１つ以上のカルシウム塩、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、１つ以上のマグネシウム塩、１つ以上のマンガン塩、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、１つ以上のセレン塩、１つ以上のバナジウム塩、１つ以上の亜鉛塩（各成分は、インビトロの哺乳類上皮細胞の浮遊培養を支持する量で存在する）から選択される成分を含む細胞培養培地をも対象にする。本発明はまた、１つ以上のサイトカイン、ヘパリン、１つ以上の動物ペプチド、１つ以上の酵母ペプチドおよび１つ以上の植物ペプチド（最も好ましくは、１つ以上の米、アロエベラ、ダイズ、トウモロコシ、コムギ、エンドウマメ、カボチャ、ホウレンソウ、ニンジン、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、オオムギ、ココナツおよび／またはサヤマメ、および／または１つ以上の他の植物）から成る群から選択される１つ以上の栄養補助剤（例えば、国際特許公開第ＷＯ９８／１５６１４号で公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１８２５５号参照）を、任意にさらに含んでもよい。
【０１２６】
本発明で提供される培地は、無タンパク質であり得、１×処方物または濃縮した、例えば、１０×、２０×、２５×、５０×、１０×、５００×、もしくは１０００×などの培地処方物であり得る。
【０１２７】
本発明の培地はまた、乾燥粉末培地（「ＤＰＭ」）、粒剤（他処理ではなく、ｐＨ調節など水の添加が必要）、液体培地または培地濃縮物としてなどの、異なる形態で調製もされ得る。
【０１２８】
増殖または産物の産生のためではなく、維持のためのみに有用な培地である基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機塩もしくは無機塩、糖および他の成分を含む多くの成分を含み得、各成分は、インビトロで哺乳類上皮細胞の培養を支持する量で存在する。
【０１２９】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物では、該培地は、種々の細胞を培養するために使用され得る。好ましくは、該培地は、真核細胞を培養するために使用され得る。より好ましくは、該培地は、植物および／または動物細胞を培養するために使用され得る。より好ましくは、該培地は、哺乳類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞または鳥類細胞を培養するために使用され得る。より好ましくは、該培地は、哺乳類細胞を培養するために使用される。より好ましくは、該培地は、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管内上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）および樹立細胞株およびその系統（例えば、２９３胎児由来腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頚部上皮細胞およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、チャン細胞、デトロイト５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはその派生物）、いずれかの組織または器官からの線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、維管束組織（動脈、静脈、毛細管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃腺、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓、および線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ベロ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２Ｏ５細胞、マッコイ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ−（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、およびジェンセン細胞、またはその派生物が挙げられるが、これらに限定されない）を含む哺乳類細胞を培養するために使用され得る。最も好ましくは、該培地は、２９３細胞、２９３Ｆ細胞もしくはそれらの派生物、ＰＥＲ−Ｃ６細胞もしくはその派生物、ＣＨＯ細胞もしくはその派生物、ＣａｐＴ細胞もしくはその派生物、ＣＯＳ−７Ｌ細胞もしくはその派生物およびＳｐ２／０細胞もしくはその派生物から成る群から選択される哺乳類細胞、または上記定義された高細胞密度で培養が可能な任意の他の浮遊細胞株もしくは派生物を培養するために使用される。より好ましくは、該培地は、本発明の基本を形成する細胞培養培地での最適な増殖に特に適応した２９３細胞または改変２９３細胞株を培養するために使用される。限定されないが、いくつかの好ましい態様では、該培地は、浮遊状態で細胞を培養するために使用される。
【０１３０】
本発明の培地により支持される細胞は、任意の動物、好ましくは、哺乳類、および最も好ましくは、マウス由来またはヒト由来であり得る。本培地で培養される細胞は、正常細胞または異常細胞（例えば、形質転換細胞、樹立細胞、または患部組織試料由来の細胞）であり得る。
【０１３１】
本発明はまた、（ａ）細胞を本発明の細胞培養培地と接触させる工程；および（ｂ）該細胞の培養を支持するために適切な条件下で該細胞を培養する工程を含む、本明細書に記載の培養培地処方物を使用して哺乳類上皮細胞または線維芽細胞を培養する方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、任意で、培養した細胞を、１つ以上の細胞への１つ以上の高分子の導入をもたらす条件下で、１つ以上の高分子（好ましくは、１つ以上の核酸を含む）を含む溶液に接触させる工程を含んでもよい。好ましくは、本方法に従って培養した細胞（上記の任意の細胞を含み得る）は、浮遊状態で培養される。
【０１３２】
いくつかの態様では、一過性トランスフェクションおよび組換えタンパク質システムは、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌの範囲、より好ましくは、約２×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で、培養した哺乳類細胞の増殖および拡大に適切な高密度培養培地を含有し得る。いずれの培養培地も、使用する培養培地が哺乳類細胞の増殖を持続することができる、好ましくは、細胞がその生存率を約８０％超で維持しつつ、さらには、効率的にトランスフェクトされかつ大量の組換えタンパク質を発現する浮遊細胞の能力を維持しつつ、約２×１０７細胞／ｍｌまでの密度において浮遊状態で増殖することができるという条件で、本発明の実践に使用され得る。本発明の実践で使用される高密度培養培地は、種々の用途および使用間で変わり得、使用される細胞株の性質、一過性に発現される所望のタンパク質、発現ベクターの細胞への移入のために選択されたトランスフェクション様式の性質、および下記のシステムに添加された任意の発現増強物質の量および性質に依存し得る。それにもかかわらず、本一過性発現システムおよび方法における使用のために企図される好ましい高密度培養培地は、典型的には、無血清、無タンパク質であり、浮遊細胞の培養および増殖を、約２×１０７細胞／ｍｌまでの密度、より典型的には、約２×１０６細胞／ｍｌ〜約１×１０７細胞／ｍｌの間の密度で可能にし、一過性発現システムで産生されるタンパク質の収率を、少なくとも２００μｇ／ｍＬ（細胞培養液）を超え、２ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）まで、より典型的には、約５００μｇ／ｍｌ（細胞培養液）〜約１ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）にすることが、さらに可能である。理想的には、本発明に従って使用される高密度培養培地は、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌ、約２×１０６〜約２×１０６細胞／ｍｌ、または約２．５×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で、細胞のトランスフェクションを促進する。
【０１３３】
本発明の実践に適切な特に好ましい高密度増殖培地は、各化学種およびその個々の量が、細胞培養での使用前に分かっている、化学的に規定された培地であり得る。選択された化学的に規定された培地は、任意で、その化学種が既知ではないおよび／または定量されていない細胞または組織可溶化物または加水分解物を用いずに、作成され得る。
【０１３４】
本発明のいくつかの態様では、本発明の実践に特に適切なタイプの培地は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、仔ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、およびヒト血清などを完全に欠いている無血清培地（時々、「ＳＦＭ培地」と呼ばれる）である。限定されないが、当分野の熟練者に知られている実例となる無血清培地としては、ＨｕＭＥＣ基本無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ  ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）−８培地、培地２５４、培地、１０６、培地、１３１、培地、１５４、培地、１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）−６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ−１００基本培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）−ＩＩ完全培地、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＳＦ−９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＨＣ基本培地、ＬＨＣ−８培地、２９３ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、ＡＥＭ増殖培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイト−ＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ−８培地、ＬＨＣ−９培地、およびそれらの任意の派生物または改変物が挙げられる。
【０１３５】
本発明のいくつかの態様では、本発明の実践に特に適切なタイプの培地は、タンパク質を完全に欠いている（例えば、血清アルブミンもしくは接着因子などの血清タンパク質、増殖因子などの栄養タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオン担体タンパク質等の無い）無タンパク質培地（時々、「ＰＦＭ培地」と呼ばれる）である。好ましくは、もし、ペプチドが存在するならば、該ペプチドは、小ペプチド、例えば、ジペプチドまたはトリペプチドである。好ましくは、デカペプチドの長さ以上のペプチドは、該無タンパク質培地中に存在するアミノ酸の約１％未満、より好ましくは、約０．１％未満、およびさらにより好ましくは、約０．０１％未満である。
【０１３６】
理想的には、本発明での使用のために企図される無血清培地および無タンパク質培地の両方は、任意の動物由来物質または組換え動物ＤＮＡまたは組換え動物タンパク質ＤＮＡを含む動物源に全体的にもしくは部分的に由来する任意の物質をさらに欠いている。
【０１３７】
本発明の実践での使用に適切な実例となる高密度培養培地としては、ＨｕＭＥＣ基本無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ  ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４ＳＦＭ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）−８培地、培地２５４、培地、１０６、培地、１３１、培地、１５４、培地、１７１、培地１７１、培地２００、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ、培地１５４ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（商標）−６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）−３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アストロサイト培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）Ｃ−１００基本培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）−ＩＩ完全培地、ＣＤＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＳＦ−９００（商標）培地、ＬＨＣ基本培地、ＬＨＣ−８培地、２９３ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、ＡＥＭ増殖培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイト−ＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、ＬＨＣ−８培地、ＬＨＣ−９培地、および任意のその派生物または改変物が挙げられるが、これらに限定されない。限定されないが、ある好ましい実施形態では、高密度培養培地は、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、または同様の培地、またはその改変物であり得る。上記列挙した実例となる高密度培養培地は、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞変種、２９３細胞、２９３細胞変種、ＣａｐＴ細胞、ＣａｐＴ細胞変種、または高密度培養システムでの使用に適応した任意の他の細胞の高密度増殖、拡大、トランスフェクションおよび維持に特に適切であり得る。任意に、使用者は、本明細書中に記載の性質を有する新規の培養培地処方物を望み、代わりに、現在の培養培地を再処方もしくは改変することにしてもよい。
【０１３８】
いくつかの態様では、高密度増殖培地は、これに限定されないが、そのような培地は、ＣＤ  ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ−１６４０、ハムＦ−１０、ハムＦ−１２、α最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最少必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含むリストから選択され得る。市販（例えば、ライフテクノロジーズ社（カリフォルニア州カールスバッド市）から）またはさもなければ、当分野で周知の他の培地は、これに限定されないが、２９３ＳＦＭ、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＶＰ  ＳＦＭ、ＢＧＪｂ培地、ブリンスターＢＭＯＣ−３培地、細胞培養凍結培地、ＣＭＲＬ培地、ＥＨＡＡ培地、ｅＲＤＦ培地、フィッシャー培地、ガンボーグＢ−５培地、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補給培地、グレース昆虫細胞培地、ＨＥＰＥＳ緩衝培地、リヒター改変ＭＥＭ、ＩＰＬ−４１昆虫細胞培地、ライボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、１９９培地、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、ＮＣＴＣ−１０９培地、シュナイダードロソフィア培地、ＴＣ−１００昆虫培地、ウェイマウスＭＢ７５２／１培地、ウィリアム培地Ｅ、無タンパク質ハイブリドーマ培地ＩＩ（ＰＦＨＭＩＩ）、ＡＩＭ  Ｖ培地、ケラチノサイトＳＦＭ、化学的に規定されたケラチノサイトＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）完全メチルセルロース培地、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、神経基本Ａ培地、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ（商標）Ａ培地、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ  Ｅ培地、内皮ＳＦＭ、ヒト内皮ＳＦＭ、ハイブリドーマＳＦＭ、ＰＦＨＭＩＩ、Ｓｆ９００培地、Ｓｆ９００ＴＩＳＦＭ、ＥＸＰＲＥＳＳ  ＦＩＶＥ（登録商標）培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−ＩＩ完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−Ｃ１００完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ−Ｃ１００基本培地、ＰＢ−ＭＡＸ（商標）核型分析培地、ＫＡＲＹＯＭＡＸ骨髄核型分析培地、ノックアウトＤ−ＭＥＭおよびＣＯ２非依存性培地を含み、本発明に従って同等に使用され得る。上記培地は、ＪＲＨ社、シグマ社、ハイクローン社、およびバイオウィタカー社などの当業者に周知の製造会社から得られる。本発明の実践の使用に適切な培地の追加の例は、米国特許第５，１３５，８６６号および同第５，２３２，８４８号だけでなく、国際公開第ＷＯ８８／０２７７４号、同第ＷＯ９８／１５６１４号、同第ＷＯ９８／０８９３４号、および欧州特許第０２８２９４２号（これらの全体は、参照することにより本明細書中に、具体的に組み入れられたものとする）中に見られ得る。任意に、使用者は、本明細書中に記載の性質を有する新規の培養培地の処方物を望み、代わりに、現在の培養培地を再処方もしくは改変することにしてもよい。
【０１３９】
本発明は、上記のもの、特に、１つ以上の２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＯＳ−７Ｌ細胞およびＳｐ２／０細胞、またはそれらの任意の派生物などの、１つ以上の哺乳類上皮細胞または線維芽細胞をさらに含むこともできる、本発明の培養培地を含む組成物を、さらに提供する。
【０１４０】
本発明のいくつかの態様では、本発明の高収率一過性トランスフェクションシステムは、その生存率、効率的にトランスフェクトされる能力、または組換えタンパク質を高レベルに発現するその能力を実質的に減少させることなく、高密度条件下で増殖する、または増殖に適応した１つ以上の細胞または細胞株を含み得る。好ましくは、細胞は、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌの範囲、より好ましくは、約２×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で培養される哺乳類細胞の本発明の増殖および拡大における使用に適した細胞株である。限定されないが、細胞株が、約８０％を超える高密度でその生存率を維持しつつ、かつ高効率でトランスフェクトされかつ約２ｇ／Ｌ培養液までのレベルで組換えタンパク質を発現するその能力を保持しつつ、上記高密度条件下で増殖可能であれば、いずれの細胞株も使用され得る。そのような細胞株の同定は、当分野の熟練者の十分範囲内であり、その者は、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の使用のために適切な細胞株を同定できる。高密度培養に適応した細胞は、約８０％以上の細胞生存率を保持しながら、高密度培養培地での高密度の増殖に適応した同じ親細胞系譜由来の細胞系譜または（非クローンの）細胞集団であり得る。そのような細胞は、＞４０、＞５０、＞６０、＞７０、または＞８０回の連続的継代に渡って、および増殖培地の割合を、所望の高密度培養培地で徐々に置き換えて、高密度で細胞を維持することにより、親細胞集団から単離または選抜され得る。該工程中、高密度で持続および増殖され、高効率でトランスフェクトされ、および所望の組換えタンパク質を高レベル発現できる非クローンの細胞集団が選択され得るように、種々の細胞プールは、個々に拡大させ、トランスフェクション効率および／またはタンパク質発現効率を同時に評価しながら、選択工程を受けさせ得る。様々な細胞タイプおよび細胞系譜がこの選択工程を受け得ることは、当業者に容易に明らかである一方で、ＣＨＯ細胞由来の細胞系譜、２９３線維芽細胞由来の細胞系譜、およびＣａｐＴ細胞由来の細胞は、高密度増殖条件に適応させるための選択工程に特に受け入れられることが分かった。理想的には、高密度増殖培養に適応し、本発明の使用を受け入れられる細胞はまた、高効率でトランスフェクトされることが可能、および／または少なくとも約２００μｇ／ｍＬ（細胞培養液）を超え、約２ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）まで、より典型的には、約５００μｇ／ｍｌ（細胞培養液）〜約１ｍｇ／ｍＬ（細胞培養液）の間の収率で組換えタンパク質を発現することが可能である。理想的には、本発明に従って使用される高密度培養に適応した細胞は、約１×１０６〜約２０×１０６細胞／ｍｌ、約２×１０６〜約２×１０６細胞／ｍｌ、または約２．５×１０６〜約６×１０６細胞／ｍｌの範囲の密度で持続およびトランスフェクト可能である。
【０１４１】
限定のない例として、本明細書に記載の実施形態に従った高密度培養に適応し得る細胞または細胞株としては、培養した真核細胞、より好ましくは、培養した植物および／または動物細胞、より好ましくは、培養した哺乳類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞または鳥類細胞などの細胞が挙げられ得る。限定されないが、ある好ましい実施形態では、本明細書に記載の実施形態に従った高密度培養に適応し得る細胞または細胞株としては、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管内上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）および樹立細胞株およびその系統（例えば、２９３胎児由来腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頚部上皮細胞およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、チャン細胞、デトロイト５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはその派生物）、いずれかの組織または器官からの線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、維管束組織（動脈、静脈、毛細管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃腺、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓、および線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、ベロ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２Ｏ５細胞、マッコイ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ−（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、およびジェンセン細胞、またはその派生物が挙げられるが、これらに限定されない）を含む培養哺乳類細胞を含み得る。最も好ましくは、該培地は、２９３細胞、２９３Ｆ細胞もしくはそれらの派生物、ＰＥＲ−Ｃ６細胞もしくはその派生物、ＣＨＯ細胞もしくはその派生物、ＣａｐＴ細胞もしくはその派生物、ＣＯＳ−７Ｌ細胞もしくはその派生物およびＳｐ２／０細胞もしくはその派生物、または上記定義の高細胞密度で培養可能な任意の他の浮遊細胞株もしくは派生物から成る群から選択される哺乳類細胞を培養するために使用される。より好ましくは、該培地は、本発明の基本を形成する細胞培養培地での最適な増殖に特に適応した２９３細胞または改変２９３細胞株を培養するために使用される。限定されないが、本発明のいくつかの好ましい態様では、高密度培養での使用に適応した細胞は、浮遊細胞、または浮遊状態での培養に適応した接着細胞である。
【０１４２】
本発明の培地により支持される細胞は、任意の動物、好ましくは、哺乳類、および最も好ましくは、マウス由来またはヒト由来であり得る。本培地で培養される細胞は、正常細胞または異常細胞（例えば、形質転換細胞、樹立細胞、または患部組織試料由来の細胞）であり得る。
【０１４３】
本明細書中に記載の実施形態に従って培養される高密度に適応した細胞は、任意に、１種または複数種の発現増強タンパク質を発現してもよい。本明細書中で使用されるとき、「発現増強タンパク質」という語は、細胞により発現される任意のタンパク質をいい；該タンパク質の発現が、組換えタンパク質の発現を増強する。細胞または細胞集団による発現増強タンパク質の発現は、本実施形態の目的のために安定または一過性であり得る。種々のそのような発現増強タンパク質は、当分野で周知であり、例えば、ＰＫＢａ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｐ２１、Ｐ１８、およびＡＫＴなどのタンパク質を包含し得る。本発明のいくつかの態様では、本発明の高収率一過性トランスフェクションシステムとしては、関心対象の組換えタンパク質を一過性に発現するための１つ以上の発現ベクターが挙げられ得る。発現ベクターは、発現可能な核酸（例えば、最適化した対照タンパク質と比較したとき、発現効率を評価するための正の対照など）を、既に含んで提供され得、あるいは、該発現ベクターは、関心対象のタンパク質が組換えで、および細胞中高効率で発現され得るように、使用者が、関心対象のタンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現可能な核酸を、容易に挿入することができる形態で提供され得る。
【０１４４】
関心対象のタンパク質の組換え産生のために、タンパク質をコードする発現可能な核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増殖）のためにまたは発現のために複製可能なベクター中に挿入される。タンパク質をコードするＤＮＡは、容易に単離され、常法（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用により）を使用して、配列決定され得る。多くのベクターが入手可能である。ベクターの構成要素としては、一般的に、１つ以上の次のものが挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０１４５】
ａ）シグナル配列の成分
関心タンパク質は、直接にだけでなく、好ましくはシグナル配列、または成熟したタンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する、他のポリペプチドである、異種ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとしても、組換えで産生され得る。選択された異種のシグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識されおよび処理される（つまり、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳類細胞の発現において、哺乳類のシグナル配列並びにウイルスの分泌性のリーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが使用可能である。
【０１４６】
ｂ）複製起点
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、１つまたは複数の選択された宿主細胞において、ベクターが複製することを可能にする核酸配列を含む。概して、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立したベクターの複製を可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は、酵母に適しており、および種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。概して、複製成分の起点は、哺乳類の発現ベクターを必要としない（ＳＶ４０起点は、典型的には、それが初期プロモーターを含むという理由のみで使用され得る）。
【０１４７】
ｃ）選択遺伝子の成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択可能なマーカーともよばれる選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性の欠乏を補完する、または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するための、タンパク質をコードし、例えば、杆菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０１４８】
選択のスキームの一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。異種の遺伝子によりうまく形質転換するこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、よって選択レジメンを生き延びる。このような優性の選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、およびハイグロマイシンを使用する。
【０１４９】
哺乳類細胞についての適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体をコードする核酸を取り込む能力のある細胞成分の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩおよびＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
【０１５０】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子により形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地において形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸とともに増幅される。内在性のＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
【０１５１】
代替的に、ＧＳ遺伝子により形質転換された細胞は、ＧＳのインヒビターであるＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地において形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は、任意の他の同時形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅システムは、上記ＤＨＦＲ選択／増幅システムと組み合わせて使用され得る。
【０１５２】
代替的に、関心抗体、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、および他の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３'−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列により形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内在性のＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８のような、選択可能なマーカーについての選択因子を含む培地において細胞を増殖させることにより選択され得る。米国特許第４，９６５，１９９号参照。
【０１５３】
酵母における使用のために適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能力を欠く酵母の突然変異株についての選択マーカー、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１を提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、その後、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する既知のプラスミドにより補完される。
【０１５４】
さらに、１．６μｍの円環のプラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）酵母の形質転換のために使用され得る。代替的に、組換え仔ウシキモシンのラージスケールな産生のための発現システムは、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋ．  ｌａｃｔｉｓ）について報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クリベロマイセス属の工業的な株による、成熟した組換えヒト血清アルブミンの選択ためのマルチコピーの安定発現ベクターもまた開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０１５５】
ｄ）プロモーターの成分
発現およびクローニングベクターは、概して、宿主生物体により認識されるプロモーターを含み、関心タンパク質をコードする核酸に対して操作可能に結合される。種々のプロモーター配列が、真核生物について既知である。ほとんど全ての真核性遺伝子が、転写が開始される位置から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流でみられる他の配列は、ＮがあらゆるヌクレオチドであってもよいＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核性遺伝子の３'末端では、３'末端のコード配列に対するポリＡテールの追加に関するシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全てが、適切に、真核性の発現ベクター内に挿入される。
【０１５６】
哺乳類の宿主細胞におけるベクターからのタンパク質転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、または異種の哺乳類のプロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され得、提供されたこのようなプロモーターは、宿主細胞システムに適合している。
【０１５７】
ＳＶ４０ウイルスの早期および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型の初期プロモーターが、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして便利に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳類の宿主においてＤＮＡを発現するためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウスの細胞におけるヒトβインターフェロンのｃＤＮＡの発現についてのReyes et al., Nature 297:598-601 (1982)も参照。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列がプロモーターとして使用され得る。
【０１５８】
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高度な真核生物による、本発明による関心タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を導入することにより増加されまたは高められることが多い。多くのエンハンサー配列は、哺乳類の遺伝子から現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、およびインスリン）。しばしば、もっぱらではないが、真核細胞のウイルス由来のエンハンサーが使用される。例には、複製起点の後期側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核性のプロモーターの活性化のためのエレメントを高めることについてのYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、抗体コード配列に対して、位置５'または３'でベクター内にスプライスされ得るが、好ましくは、プロモーターから位置５'で配置される。さらなるエンハンサーが当該分野で知られており、例えば、哺乳類またはウイルスの遺伝子から得られた、または由来のエンハンサーを含み得る。本明細書での使用のために企図される、１つの特に好ましいエンハンサーは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【０１５９】
ｆ）転写終結成分
真核性の宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞の生物体由来の有核細胞）で使用される発現ベクターはまた、転写の終結のためにおよびｍＲＮＡを安定させるために必要な配列を含む。このような配列は、通常、真核性のまたはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５'および時折３'非翻訳領域から使用可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドのセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ増殖ホルモンのポリアデニル化領域である。国際出願公開第９４／１１０２６号および本明細書に記載される発現ベクターを参照。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本発明の実施に十分に適した発現ベクターは、例えば、ｐＣＤＮＡ３．３またはその改変されたバージョンのような、当該分野で使用されるよく知られるベクターのいずれかであり得る。本発明の実施において適しているベクターに対する改変のタイプの非限定的な例は、１つまたは複数のエンハンサー、１つまたは複数のプロモーター、１つまたは複数のリボゾーム結合部位、１つまたは複数の複製起点等の追加の改変のような改変を含むが、これに限定されない。ある好ましい非限定的な実施形態において、本発明の実施において使用される発現ベクターは、当該一過性発現システムにおいて、関心タンパク質の発現を向上させるために選択される１つまたは複数のエンハンサーのエレメントを含み得る。選択されるエンハンサーエレメントは、関心タンパク質を発現するために使用される発現可能な核酸配列に対して５'または３'に位置され得る。特に好ましい非限定的なエンハンサーエレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
【０１６１】
１つの好ましい非限定的な実施形態において、記載された本発明に従って使用される発現ベクターは、ｐｃＤＮＡベクター、または特にｐｃＤＮＡ３．３ベクター、より好ましくはｐｃＤＮＡ３．３ベクターの変種であり得る。ベクターは、任意に、例えば、エンハンスドＣＭＶプロモーターのような、エンハンスドプロモーターを含む。任意に、ベクターは、アデノＴ＋Ｍ領域、任意にＳＶ４０ｏｒｉ部位、任意にＳＶ４０スプライスドナー／アクセプター部位、または任意にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み得る。
【０１６２】
本発明のいくつかの態様において、本発明の高収率一過性トランスフェクションシステムは、１つまたは複数の発現増強物質を含み得る。発現増強物質は、一過性発現システムにおける組換えタンパク質の発現を増加させる１つまたは複数の化合物を含む水溶液であり得る。種々の発現増強物質は、当該分野で知られており、あらゆる１つまたは複数が、限定されることなく本発明の実施において使用され得る。
【０１６３】
概して、１つまたは複数のトランスフェクション増強物質は、発現可能な核酸もしくは発現ベクターを細胞にトランスフェクトしている間または後に、タンパク質発現細胞集団と接触される。２つまたはそれ以上の発現増強物質が使用される場合、各発現増強物質は、ほぼ同時に細胞と接触させてもよく、または、代替的には、発現増強物質は、順次、任意には、細胞と第１の発現増強物質との接触と、細胞と第２の発現増強物質との接触の間に、所定の時間が経過した後に、タンパク質発現細胞と接触させてもよい。
【０１６４】
任意の数の発現増強物質が、限定されることなく、本発明の実施に使用され得ることが当業者により容易に理解されるが、本実施形態で使用される適切な発現増強物質を構成するものの同定は、そのような者の十分な理解の範囲内であり、種々の非限定的な発現増強物質による説明が以下に記載されるが、その列挙は、本発明の実施における使用のために企図される、適切な発現の範囲を限定するものではないことが理解される。
【０１６５】
いくつかの態様では、１つまたは複数の発現増強物質は、記載される本実施形態に従って培養培地処方物を補給するために使用される、液体の（好ましくは水溶性の）添加物を含んでもよく、前記添加物は、記載される本実施形態に従って一過性タンパク質発現システムにおいて産生される発現タンパク質の収率を向上させるために選択される。１つまたは複数の発現増強物質は、細胞周期の進行に影響を与え、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を遅くし、および／またはタンパク質産生を増進する、１つまたは複数のいくつかの化合物を含み得る。本発明の内容において、用語「発現増強物質」は、概して、一過性トランスフェクションシステムに追加されるあらゆる１つまたは複数の化合物を指し、その存在は、標的タンパク質の発現を、このような発現増強物質の非存在下でみられる発現レベルの少なくとも２倍から約１０倍まで上回って増強または増進する。記載される本実施形態で使用のために適切な、例示的な発現増強物質は、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸、または上記のあらゆる組み合わせのような添加物を含むがこれらに限定されない。各具体的な発現増強物質の最適な濃度は、発現システムの個々の特性および使用者の要求に従って変化し、所与の実験シナリオにおけるあらゆる１つまたは複数の発現増強物質の最適な濃度を構成するものの決定は、当該分野において通常の技術レベルを有する実施者の十分な範囲内である。
【０１６６】
１つの例示的な実施形態において、発現増強物質は、バルプロ酸を含む処方物であり得る。本発明の実施で使用されるバルプロ酸（ＶＰＡ）の最適な最終濃度の範囲は、変化してもよいが、好ましくは、約０．２０ｍＭから約２５ｍＭの範囲、またはあらゆるサブレンジ、またはこの範囲により包含される濃度の値である。より好ましくは、ＶＰＡの最終濃度は、約０．２５ｍＭから約２４ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２３ｍＭ、０．２７ｍＭから約２３ｍＭ、０．２８ｍＭから約２３ｍＭ、０．２９ｍＭから約２２ｍＭ、約０．３０ｍＭから約２１ｍＭ、約０．３１ｍＭから約２０ｍＭ、約０．３２ｍＭから約１９ｍＭ、約０．３３ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３４ｍＭから約１８ｍＭ、約０．３５ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３６ｍＭから約１６ｍＭ、約０．３７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１４ｍＭ、約０．４１ｍＭから約１３ｍＭ、約０．４２ｍＭから約１２ｍＭ、約０．４３ｍＭから約１１ｍＭ、約０．４４ｍＭから約１０ｍＭ、約０．４５ｍＭから約９ｍＭ、約０．４６ｍＭから約８ｍＭ、約０．４７ｍＭから約７ｍＭ、約０．４８ｍＭから約６ｍＭ、約０．４９ｍＭから約５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５５ｍＭから約３ｍＭ、０．６ｍＭから約２ｍＭ、または０．７５から約１．５ｍＭの範囲であり得る。いくつかの好ましい非限定的な実施形態において、本発明の実施において使用されるＶＰＡの最終濃度は、約０．１５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１６ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１７ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１８ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１９ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．３０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．６０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．７０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．８０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．９０ｍＭから約１．５ｍＭ、または約０．１０ｍＭから約１．５ｍＭの間であり得る。いくつかの好ましい非限定的な実施形態において、本発明の実施において使用されるＶＰＡの最終濃度は、約０．２０から約１．５ｍＭ、約０．２１から約１．４ｍＭ、約０．２２から約１．４ｍＭ、約０．２３から約１．４ｍＭ、約０．２４から約１．４ｍＭ、約０．２５から約１．３ｍＭ、約０．２５から約１．２ｍＭ、約０．２５から約１．１ｍＭ、または約０．２５から約１．０ｍＭの間であり得る。
【０１６７】
別の例示的な実施形態において、発現増強物質は、プロピオン酸ナトリウム（ＮａＰＰ）を含む処方物であり得る。任意に、ＮａＰＰは、単独で、または上記のようなバルプロ酸と組み合わせて提供され得る。本発明の実施において使用されるＮａＰＰの最適な最終濃度の範囲は変化してもよいが、好ましくは約の範囲である。さらなる実施形態において、本発明の実施において使用されるＮａＰＰの最適な最終濃度は、約０．２ｍＭから約１００ｍＭの範囲、またはあらゆるサブレンジ、またはこの範囲内に包含される個々の濃度であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約０．５から約８０ｍＭ、約０．４ｍＭから約７０ｍＭ、約０．５ｍＭから約６０ｍＭ、約０．６ｍＭから約５０ｍＭ、約０．７ｍＭから約４０ｍＭ、約０．８ｍＭから約３０ｍＭ、約０．９ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約２ｍＭから約１０ｍＭ、約３ｍＭから約９ｍＭ、約４ｍＭから約８ｍＭ、または約５ｍＭから約７ｍＭの範囲であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約２ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、約３ｍＭから約４ｍＭ、約４ｍＭから約５ｍＭ、約５ｍＭから約６ｍＭ、約６ｍＭから約７ｍＭ、約７ｍＭから約８ｍＭ、約８ｍＭから約９ｍＭ、または約９ｍＭから約１０ｍＭの範囲であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、または約１０ｍＭであり得る。
【０１６８】
さらに別の例示的な実施形態において、発現増強物質は、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）を含む処方物であり得る。任意に、ＬｉＡｃは、単独で、または上記のようなＮａＰＰもしくはバルプロ酸と組み合わせて提供され得る。さらなる実施形態において、本発明の実施において使用される酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）の最適な最終濃度は、約０．２５から約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲であり得る。
【０１６９】
なおさらに別の例示的な実施形態において、発現増強物質は、酪酸を含む処方物であり得る。本発明の実施において使用される酪酸の最適な最終濃度は、約０．２５から約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲であり得る。
【０１７０】
本発明に従って使用される発現増強物質は、トランスフェクション直前もしくはトランスフェクション中、またはトランスフェクション後であるが細胞および発現されたタンパク質の収集前に、培養培地に添加され得る。以下に記載されるいくつかの具体的な非限定的な実施形態において、「増強物質１」は、概して、０．２５ｍＭ〜１ｍＭのバルプロ酸を指し、「増強物質２」は、概して、５ｍＭ〜７ｍＭのプロピオン酸ナトリウムを指す。しかしながら、別の方法で示される場合には、用語増強物質１および増強物質２は、異なる増強物質化合物を包含してもよい。発現増強物質は、順次、または混合物として培養培地に添加され得る。
【０１７１】
本発明のいくつかの態様において、本発明の高収率一過性トランスフェクションシステムは、培養細胞内への高分子の導入のための１つまたは複数の剤を含み得る（前記剤は、通常、「トランスフェクション剤」を指す）。記載される本実施形態に従って使用されるトランスフェクション剤は、生体分子、特に核酸分子を細胞内に導入するためのあらゆる化合物または他の化学的なモダリティであり得、これにより、核酸は生体機能を発揮する可能性があり、または発現可能な核酸である場合には、遺伝子または発現可能な前記核酸によりコードされるタンパク質が発現され得る。種々の適切なトランスフェクション剤が当該分野で知られており、あらゆる１つまたは複数が、限定されることなく、本発明の実施において使用され得る。
【０１７２】
本実施形態による使用のためのトランスフェクション剤は、細胞内への高分子の侵入を促進する、当業者に知られたあらゆる処方物または組成物である。例えば、米国特許第５，２７９，８３３号参照。いくつかの実施形態では、剤は、「トランスフェクション剤」であり得、１つまたは複数の標的細胞内への１つまたは複数の核酸の取り込みを増加させるあらゆる化合物および／または組成物であり得る。種々のトランスフェクション剤が当業者に知られる。適切なトランスフェクション剤は、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、正に荷電したアミノ酸ポリマー、例えば、ポリリジンおよびポリアルギニン、正に荷電したデンドリマー、および断片化されたデンドリマー、カチオン性β−シクロデキストリン含有ポリマー（ＣＤ−ポリマー）、ＤＥＡＥ−デキストラン等を含む、１つまたは複数の化合物および／または組成物を含み得るがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞内への高分子の導入のための剤は、カチオン性脂質および／または中性脂肪であり得る１つまたは複数の脂質を含み得る。好ましい脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）クロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（４'−トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）、コレステリル（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノエート（ＣｈｏＴＢ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ'−ジドデシル−Ｎ−［ｐ（２−トリメチルアンモニオエチルオキシ）ベンゾイル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアン−モニウムクロリド、１つまたは複数の脂質に結合されたスペルミン（例えば、５−カルボキシスペルミル（ｓｐｅｒｍｙｌ）グリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−ｔｅｔ−ラパルミチル（ｒａｐａｌｍｉｔｙｌ）スペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）およびジパルミトイルホスファチジル（ｐｈａｓｐｈａｔｉｄｙｌ）エタノールアミン５−カルボキシスペルミル（ｓｐｅｒｍｙｌ）アミド（ＤＰＰＥＳ））、リポポリリジン（ＤＯＰＥに結合されたポリリジン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタミン）と結合した脂肪酸（ＴＦＡ）および／またはペプチド、例えば、トリリシル−アラニル−トリス  モノ−、ジ−、およびトリ−パルミテート、（３β−［Ｎ−−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオ���セチル）−ジドデシル−Ｄ−塩化グルタミン酸塩（ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＴＭＡＧ）、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡＢ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミン−イニウム（ｉｎｉｕｍ）トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、並びにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
当業者は、上記脂質のある組み合わせが、細胞内への核酸の導入のために特に適していることが示されていることを理解し、例えば、ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）の組み合わせが、商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）でＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であり、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）の組み合わせが、商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）でＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であり、ＤＭＲＩＥとコレステロールの１：１（Ｍ／Ｍ）の組み合わせが、商品名ＤＭＲＩＥ−Ｃ剤でＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であり、ＴＭ−ＴＰＳとＤＯＰＥの１：１．５（Ｍ／Ｍ）の組み合わせが、商品名ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ（登録商標）でＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能であり、およびＤＤＡＢとＤＯＰＥの１：２．５（ｗ／ｗ）の組み合わせが、商品名ＬｉｐｆｅｃｔＡＣＥ（登録商標）でＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能である。上述の脂質の組み合わせに加えて、他の化合物との混合物における、特に、核局在配列を含むペプチドおよびタンパク質との混合物における、脂質を含む他の処方物は、当業者に知られている。例えば、その両方が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第００／２７７９５号として公開された、国際出願第９９／２６８２５号参照。
【０１７４】
リポソームのような脂質集合体は、細胞内への高分子の送達ための剤として有用であることが見出された。特に、１つまたは複数のカチオン性の脂質を含む脂質集合体は、細胞内へのアニオン性の高分子（例えば、核酸）の送達に極めて効率的であることを示した。１つの通常使用されるカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）である。ＤＯＴＭＡを単独で、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との１：１の混合物として含むリポソームは、細胞内に核酸を導入するために使用された。ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥの１：１の混合物は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）の商品名で市販されている。細胞内に核酸を導入するために使用されている別のカチオン性脂質は、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）である。オレオイル部分がＤＯＴＡＰにおいてエーテル結合を介してプロピルアミン骨格に結合されており、これに対してそれらはＤＯＴＭＡにおいてエステル結合を介して結合されていることにおいて、ＤＯＴＡＰはＤＯＴＭＡと異なる。ＤＯＴＡＰは、標的細胞により、より容易に分解されると考えられている。トリメチルアンモニウム部分のメチル基の１つがヒドロキシエチル基で置換されている、構造的に関連する基の化合物は、ホスホリパーゼＡのローゼンタールインヒビター（ＲＩ）と構造が類似している（Rosenthal, et al., (1960) J. Biol. Chem. 233:2202-2206参照。）。ＲＩは、プロピルアミンのコアに結合されたステアロイルエステルを有する。ＲＩのジオレオイル類似体は、通常、プロピルアミンのコアの脂質部分の結合に応じて、ＤＯＲ１−エーテルおよびＤＯＲ１−エステルと略記される。ヒドロキシエチル部分のヒドロキシル基は、例えば、カルボキシスペルミンに対するエステル化によりさらに誘導体化され得る。
【０１７５】
細胞内への高分子の導入のために使用される化合物の別のクラスは、脂質に付着されたカルボキシスペルミン部分を含む（Behr, et al., (1989) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86:6982-6986 and EPO 0 394 111参照）。このタイプの化合物の例は、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＰＰＥＳ）および５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）を含む。ＤＯＧＳは、ＴＲＥＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）の商品名でＰｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から市販されている。
【０１７６】
コレステロール（３β−［Ｎ−−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）のカチオン性誘導体が合成され、ＤＯＰＥとともにリポソーム中に処方され（Gao, et al., (1991) BBRC 179(1):280-285参照）、細胞内にＤＮＡを導入するために使用された。このように処方されたリポソームは、低いレベルの細胞毒性で、細胞内にＤＮＡを効率的に導入することが報告された。ＤＯＰＥに対してポリリジンを結合することにより形成されるリポポリリジン（Zhou, et al., (1991) BBA 1065:8-14参照）は、血清の存在下で細胞内に核酸を導入する時に有効であることが報告された。
【０１７７】
細胞内に核酸を導入するために使用されてきたカチオン性脂質の他のタイプは、米国特許第５，６７４，９０８号、米国特許第５，８３４，４３９号、および国際公開第００／２７７９５号として公開された国際出願第９９／２６８２５号に記載されるもののような、高度に充填されたポリカチオン性のアンモニウム、スルホニウム、およびホスホニウム脂質を含む。本発明による高分子の送達のための１つの特に好ましい非限定的なトランスフェクション剤は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（商標）である。国際公開第００／２７７９５号として公開された米国の国際出願第９９／２６８２５号参照。細胞への高分子の送達に適した別の好ましい非限定的なトランスフェクション剤は、ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）である。他の適切なトランスフェクション剤は、ＬＩＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＬＴＸ、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＩＮＶＩＶＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２．０、および（これに対する参照により本明細書に組み込まれる）Yang et al.による、米国特許出願公開第２０１２／０１３６０７３号に開示されるあらゆる脂質の剤または処方物を含む。種々の他のトランスフェクション剤は、当業者により知られており、本明細書に記載される一過性トランスフェクションシステムおよび方法に対するその適性について評価され得る。
【０１７８】
本発明は、（ａ）少なくとも１つの高分子、好ましくは発現可能な核酸分子の、培養における真核細胞中への導入、（ｂ）内部に少なくとも１つの高分子が導入された細胞の培養、および任意で（ｃ）内部に少なくとも１つの高分子が導入された細胞における組換えタンパク質産物の産生または核酸の発現、をサポートする高収率一過性トランスフェクションシステムに一部方向づけられ、ここで、高分子を含む培地は、培養から取り除かれる必要がなく、細胞内への少なくとも１つの高分子の導入後、並びに培養前およびタンパク質産物の産生または核酸の発現前に新鮮な培地と交換される必要がない。
【０１７９】
本発明の一過性トランスフェクションシステム、本明細書に記載される方法によるその使用は、細胞培養システムにおける、関心タンパク質の高いレベルの迅速で再現性のある発現をもたらす。典型的には、当該一過性トランスフェクションシステムおよび方法は、使用される細胞タイプおよび所望の組換えタンパク質の個々の発現特性に応じて、約２００μｇタンパク質／Ｌ培養液から約２ｇタンパク質／Ｌ培養液の範囲のレベルで、組換え発現タンパク質の産生を可能にする。本明細書のために提供される、一過性トランスフェクションシステムおよび方法を用いて、使用者は、標準的な市販されている一過性トランスフェクションシステムを使用して現在得られるものを超えて、約２倍から約２０倍までである、発現されたタンパク質のレベルを得ることができる。一過性トランスフェクションシステムおよび本明細書のために提供される方法を用いて、使用者は、現代の一過性発現システムでみられるよりも、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、もしくは約１０倍まで、またはそれ以上である、発現されたタンパク質のレベルを得ることができる。例えば、組換えタンパク質を産生するための当該一過性トランスフェクションシステムを用いて、使用者は、浮遊細胞における、組換えタンパク質の産生のために最適化された市販されている一過性トランスフェクションシステム、例えば、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）発現システムを用いて得られるタンパク質収率よりも、約２倍から約１０倍までの間で高い、タンパク質収率を得ることができる。
【０１８０】
方法
本発明は、さらに、高いレベルの関心タンパク質を発現するための方法に関する。本発明の方法は、（ａ）懸濁液において培養されるための、哺乳類細胞を得ることと、（ｂ）懸濁液における細胞の培養をサポートするのに十分な条件下で、細胞を本発明の培養培地と接触させることと、関心タンパク質をコードする発現可能な核酸を培養細胞にトランスフェクトすることと、トランスフェクトされた細胞を１つまたは複数の発現増強物質と接触させることと、トランスフェクトされた細胞を、関心タンパク質の発現を許容する条件下で規定された期間培養することと、細胞を収集することとを含む、懸濁液において哺乳類細胞（特に、上記のもの、および最も特には、２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＯＳ−７Ｌ細胞、およびＳｐ２／０細胞、またはあらゆるその派生物）を培養することを含み得る。
【０１８１】
本発明は、さらに、ポリペプチドを産生する方法およびこれらの方法により産生されたポリペプチドに関し、当該方法は、（ａ）細胞、好ましくは上記の哺乳類細胞、最も好ましくは２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＯＳ−７Ｌ細胞、およびＳｐ２／０細胞、またはあらゆるその派生物を得ることと、（ｂ）細胞内に核酸の導入を生じさせる条件下で、細胞を、ポリペプチドをコードする核酸を含む溶液と接触させることと、（ｃ）細胞による所望のポリペプチドの発現を支持する条件下で、本発明の培養培地で細胞を培養することとを含む。
【０１８２】
一態様では、本発明による組換えタンパク質を発現するための方法は、高密度培養培地において、細胞の培養物を得ることを含み得る。細胞は、好ましくは、２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣａｐＴ細胞、ＣＯＳ−７Ｌ細胞、もしくはＳｐ２／０細胞、または細胞が高密度培地における増殖に適しているあらゆるその派生物の浮遊培養物である。あらゆる量の細胞培養が本発明の実施において使用され得ることは、当業者により容易に理解されるが、培養は、典型的には、約２００μｌから１００リットル、より好ましくは、細胞培養の量は、約２ｍｌから約５０リットル、最も好ましくは、約５ｍｌから約５リットルである。いくつかの態様においては、細胞培養の量は、約１００ｍｌから約５０リットルであり得る。より好ましくは、細胞培養の量は、約５００ｍｌから約５０リットルである。より好ましくは、細胞培養の量は、約５００ｍｌから約２５リットルである。より好ましくは、細胞培養の量は、約５００ｍｌから約１０リットルである。より好ましくは、細胞培養の量は、約５００ｍｌから約５リットルである。より好ましくは、細胞培養の量は、約５００ｍｌから約１リットルである。いくつかの実施形態では、細胞培養の量は、約１００リットルまで、約９５リットルまで、約９０リットルまで、約８５リットルまで、約８０リットルまで、約７５リットルまで、約７０リットルまで、約６５リットルまで、約６０リットルまで、約５５リットルまで、約５０リットルまで、約４５リットルまで、約４０リットルまで、約３５リットルまで、約３０リットルまで、約３５リットルまで、約２０リットルまで、約１５リットルまで、約１０リットルまで、約９リットルまで、約８リットルまで、約７リットルまで、約６リットルまで、約５リットルまで、約４リットルまで、約２リットルまで、または約１リットルまでであり得る。
【０１８３】
一態様において、細胞培養は、約１．５×１０６細胞／ｍｌから約２０×１０６細胞／ｍｌの間の細胞密度、またはこれに包含されるあらゆる濃度、濃度範囲、もしくはサブレンジで維持され得る。
【０１８４】
記載される本発明に従って、細胞においてタンパク質を発現するために、細胞は、典型的には、新鮮な量の培地へと希釈される。最適な希釈は変化し得、例示の目的であるが、新鮮な量の培地へと希釈される細胞の密度は、０．５×１０６細胞／ｍｌから約１０×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは、１×１０６細胞／ｍｌから約５×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは、１．５×１０６細胞／ｍｌから約３×１０６細胞／ｍｌの間であり得る。
【０１８５】
一態様において、新鮮な量の培養培地への細胞の希釈の後に、細胞は、発現可能な核酸をトランスフェクトされる前に、一定の期間にわたって上記量で培養され得る。任意に、細胞は、２日間まで、より好ましくは約１日半まで、最も好ましくは約１日まで、培養され得る。任意に、細胞は、その中で培養される細胞の密度が最大約１００％、より好ましくは最大約９５％、最大約９０％、最大約８５％、最大約８０％、最大約７５％、最大約７０％、最大約６５％、最大約６０％、最大約５５％、最大約５０％、最大約４５％、最大約４０％、最大約３５％、最大約３０％、最大約２５％、最大約２０％、または最大約１５％増加するまで、新鮮な量の培地で培養され得る。
【０１８６】
一態様において、細胞が上記のような一定の期間にわたって高密度増殖培地において培養された後に、発現可能な核酸または発現ベクターが細胞にトランスフェクトされ得る。細胞内への発現ベクターの導入を達成するために、使用者が行う工程の正確なシーケンスは、当該分野において通常の技術レベルを有する実施者により容易に認識されるように、選択された具体的なトランスフェクション剤、細胞株、培地、および種々の他の実験パラメータに応じて異なり得る。例示のみにより、脂質ベースのトランスフェクションシステムが選択される場合（特に、少なくとも１つのカチオン性脂質を有するトランスフェクションシステム）、トランスフェクション剤は、まず、上記に定義されおよび本明細書に組み込まれる、「複合体化」または「複合体形成反応」として略式で知られるプロセスにおいて、脂質−ＤＮＡ複合体を形成するために、水溶液において核酸と接触される。このような反応は、典型的には、細胞が培養されているそれとは別個の反応容器において達成される。
【０１８７】
一態様において、上記の複合体化工程における脂質−ＤＮＡ複合体の形成後に、トランスフェクション複合体が培養細胞と接触され得る。細胞をトランスフェクション複合体と接触させた後に、細胞は、第１の期間にわたってトランスフェクション複合体の存在下で培養され得る。第１の期間の持続は、細胞の性質、使用されるトランスフェクション剤、および種々の当業者に知られる他の因子に応じて異なる。用語「第１の期間」は、本明細書に記載される本発明の方法に従って細胞の一過性トランスフェクションを行うための方法において使用される場合、概して、細胞集団への発現可能な核酸のトランスフェクトと、トランスフェクトされた細胞に対する１つまたは複数の発現増強物質の添加との間の時間間隔を指す。典型的には、第１の期間は、約２時間から約４日の範囲、または本明細書に包含されるあらゆる範囲もしくはサブレンジである。ある好ましい非限定的な実施形態において、第１の期間は、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり得る。他の好ましい非限定的な実施形態において、第１の期間は、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までであり得る。
【０１８８】
１つの非常に好ましい非限定的な実施形態において、培養培地は、細胞へのトランスフェクション複合体の導入後に、第１の期間の保持の間、交換されず、補給されず、または補充されない。
【０１８９】
本発明の一態様において、培養においてトランスフェクトされた細胞は、第１の期間の後に、１つまたは複数の発現増強物質と接触され得る。発現増強物質は、一過性発現システムにおける組換えタンパク質の発現を増加させる、１つまたは複数の化合物を含む水溶液であり得る。種々の発現増強物質が当該分野で知られ、あらゆる１つまたは複数が、限定されることなく、本発明の実施において使用され得る。
【０１９０】
概して、１つまたは複数のトランスフェクション増強物質は、発現可能な核酸もしくは発現ベクターを細胞にトランスフェクトしている間、またはその後に、タンパク質発現細胞の細胞群と接触される。２つまたはそれ以上の発現増強物質が使用される場合、各発現増強物質は、実質的に同時に細胞と接触させてもよく、または代替的には、発現増強物質は、タンパク質発現細胞と順次、任意には、細胞を第１の発現増強物質と接触させることと、細胞を第２の発現増強物質と接触させることとの間に、ある期間が経過した後に、接触させてもよい。
【０１９１】
任意の数の発現増強物質が、限定されることなく、本発明の実施に使用されることは当業者により容易に理解され、一方、本実施形態における使用のための適切な発現増強物質を構成するものの同定は、十分にそのような当業者の範囲内であり、非限定的な発現増強物質の種々の例示が以下に記載されるが、その列挙は、本発明の実施における使用のために企図される、適切な発現の範囲に限定されるものではないことが理解される。
【０１９２】
いくつかの態様において、１つまたは複数の発現増強物質は、記載された本実施形態による培養培地処方物を補給するために使用される液体の（好ましくは水溶性の）添加物を含み得、該添加物は、記載された本実施形態による一過性タンパク質発現システムにおいて産生される発現タンパク質の収率を向上させるために選択される。１つまたは複数の発現増強物質は、細胞周期進行に影響を与え、アポトーシスを阻害し、細胞増殖を遅め、および／またはタンパク質の産生を増進する、１つまたは複数のいくつかの化合物を含み得る。本発明の内容において、用語「発現増強物質」は、概して、一過性トランスフェクションシステムに添加されるあらゆる１つまたは複数の化合物を指し、その存在は、標的タンパク質の発現を、このような発現増強物質の非存在下でみられる発現レベルの少なくとも２倍から約１０倍まで上回って増強または増進する。記載される本実施形態による使用のために適切な、例示的な発現増強物質は、バルプロ酸（ＶＰＡ、酸およびナトリウム塩）、プロピオン酸ナトリウム、酢酸リチウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトースを含む糖、アミノ酸混合物、もしくは酪酸、または上記のあらゆる組み合わせ、のような添加物を含むが、これらに限定されない。各具体的な発現増強物質の最適な濃度は、発現システムの個々の特性および使用者の要求に従って変化し、所与の実験シナリオにおけるあらゆる１つまたは複数の発現増強物質の最適な濃度を構成するものの決定は、当該分野において通常の技術レベルを有する実施者の十分な範囲内である。
【０１９３】
１つの例示的な実施形態において、発現増強物質は、バルプロ酸を含む処方物であり得る。本発明の実施において使用されるバルプロ酸（ＶＰＡ）の最適な最終濃度の範囲は変化してもよいが、好ましくは、約０．２０ｍＭから約２５ｍＭの範囲であり、またはあらゆるサブレンジ、またはこの範囲により包含される濃度値である。より好ましくは、ＶＰＡの最終濃度は、約０．２５ｍＭから約２４ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２３ｍＭ、０．２７ｍＭから約２３ｍＭ、０．２８ｍＭから約２３ｍＭ、０．２９ｍＭから約２２ｍＭ、約０．３０ｍＭから約２１ｍＭ、約０．３１ｍＭから約２０ｍＭ、約０．３２ｍＭから約１９ｍＭ、約０．３３ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３４ｍＭから約１８ｍＭ、約０．３５ｍＭから約１７ｍＭ、約０．３６ｍＭから約１６ｍＭ、約０．３７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１４ｍＭ、約０．４１ｍＭから約１３ｍＭ、約０．４２ｍＭから約１２ｍＭ、約０．４３ｍＭから約１１ｍＭ、約０．４４ｍＭから約１０ｍＭ、約０．４５ｍＭから約９ｍＭ、約０．４６ｍＭから約８ｍＭ、約０．４７ｍＭから約７ｍＭ、約０．４８ｍＭから約６ｍＭ、約０．４９ｍＭから約５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５０ｍＭから約４ｍＭ、約０．５５ｍＭから約３ｍＭ、０．６ｍＭから約２ｍＭ、または０．７５から約１．５ｍＭの範囲であり得る。いくつかの好ましい非限定的な実施形態において、本発明の実施において使用されるＶＰＡの最終濃度は、約０．１５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１６ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１７ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１８ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．１９ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．２５ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．３０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．４０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．５０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．６０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．７０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．８０ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．９０ｍＭから約１．５ｍＭ、または約０．１０ｍＭから約１．５ｍＭの間であり得る。いくつかの好ましい非限定的な実施形態において、本発明の実施において使用されるＶＰＡの最終濃度は、約約０．２０から約１．５ｍＭ、約０．２１から約１．４ｍＭ、約０．２２から約１．４ｍＭ、約０．２３から約１．４ｍＭ、約０．２４から約１．４ｍＭ、約０．２５から約１．３ｍＭ、約０．２５から約１．２ｍＭ、約０．２５から約１．１ｍＭ、または約０．２５から約１．０ｍＭの間であり得る。
【０１９４】
別の例示的な実施形態において、発現増強物質は、プロピオン酸ナトリウム（ＮａＰＰ）を含む処方物であり得る。任意に、ＮａＰＰは、単独で、または上記のようなバルプロ酸と組み合わせて提供され得る。本発明の実施において使用されるＮａＰＰの最適な最終濃度の範囲は変化してもよいが、好ましくは、約の範囲である。さらなる実施形態において、本発明の実施において使用されるＮａＰＰの最適な最終濃度は、約０．２ｍＭから約１００ｍＭの範囲、またはあらゆるサブレンジ、もしくはこの範囲内に包含される個々の濃度であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約０．５から約８０ｍＭ、約０．４ｍＭから約７０ｍＭ、約０．５ｍＭから約６０ｍＭ、約０．６ｍＭから約５０ｍＭ、約０．７ｍＭから約４０ｍＭ、約０．８ｍＭから約３０ｍＭ、約０．９ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約１５ｍＭ、約２ｍＭから約１０ｍＭ、約３ｍＭから約９ｍＭ、約４ｍＭから約８ｍＭ、または約５ｍＭから約７ｍＭの範囲であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭから約１０ｍＭ、約１ｍＭから約２ｍＭ、約２ｍＭから約３ｍＭ、約３ｍＭから約４ｍＭ、約４ｍＭから約５ｍＭ、約５ｍＭから約６ｍＭ、約６ｍＭから約７ｍＭ、約７ｍＭから約８ｍＭ、約８ｍＭから約９ｍＭ、または約９ｍＭから約１０ｍＭの範囲であり得る。ある好ましい非限定的な実施形態において、ＮａＰＰの最適な最終濃度は、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、または約１０ｍＭであり得る。
【０１９５】
さらに別の例示的な実施形態において、発現増強物質は、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）を含む処方物であり得る。任意に、ＬｉＡｃは、単独で、または上記のようなＮａＰＰまたはバルプロ酸と組み合わせて提供され得る。さらなる実施形態において、本発明の実施において使用される酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）の最適な最終濃度は、約０．２５から約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲であり得る。
【０１９６】
さらに別の例示的なさらなる実施形態において、発現増強物質は、酪酸を含む処方物であり得る。本発明の実施において使用される酪酸の最適な最終濃度は、約０．２５から約２５ｍＭ、約０．２６ｍＭから約２０ｍＭ、約０．２７ｍＭから約１５ｍＭ、約０．２８ｍＭから約１０ｍＭ、約０．２９ｍＭから約５ｍＭ、約０．３ｍＭから約４．５ｍＭ、約０．３１ｍＭから約４ｍＭ、約０．３５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２．５ｍＭ、約１ｍＭから約３ｍＭ、約１．５ｍＭから約２．５ｍＭ、または約２ｍＭから約３ｍＭの範囲であり得る。
【０１９７】
本発明により使用される発現増強物質はトランスフェクションの直前もしくはトランスフェクション中、またはトランスフェクションで後あって細胞および発現されたタンパク質の収集前に、培養培地に添加され得る。以下に記載されるいくつかの特定の非限定的な実施形態において、「増強物質１」は、概して０．２５ｍＭ〜１ｍＭのバルプロ酸を指し、「増強物質２」は、概して５ｍＭ〜７ｍＭのプロピオン酸ナトリウムを指す。しかしながら、他の方法で表示される場合には、用語増強物質１および増強物質２は、異なる増強物質化合物を包含してもよい。発現増強物質は、順次、または混合物として、培養培地に添加され得る。
【０１９８】
ある態様において、２つまたはそれ以上の発現増強物質が使用される場合、２つまたはそれ以上の発現増強物質が実質的に同時に、トランスフェクトされた培養細胞と接触され得、代替的には、トランスフェクトされた培養細胞は、まず第１の発現増強物質と接触され得、第２の期間の後に、トランスフェクトされた培養細胞は、第２の発現増強物質と接触され得る。一態様において、「第２の期間」は、本明細書に記載される発明の方法に従って細胞の一過性トランスフェクションを行うための方法において使用される場合、概して、１つまたは複数の発現増強物質の添加から、１つまたは複数の追加の増強物質の添加までまたはトランスフェクトされた細胞の収集およびそこで発現されたタンパク質の精製もしくは単離までのいずれかの間の時間間隔を指す。典型的には、第２の期間は、約１０時間から約１０日の範囲であるが、発現されるタンパク質に最適であると決定される場合には、他の時間間隔が使用され得る。いくつかの好ましい非限定的な実施形態において、第２の期間は、２時間から５日、２．５時間から４日、約３から約９０時間、約４から約８５時間、約５から約８０時間、約６から約７５時間、約７から約７０時間、約８から約６５時間、約９から約６０時間、約１０から約５５時間、約１１から約５０時間、約１２から約４５時間、約１３から約４０時間、約１４から約３５時間、約１５から３０時間、約１６から約２４時間、約１７から約２４時間、約１８から約２４時間、約１９から約２４時間、約２０から約２４時間、約２１から約２４時間、約２２から約２４時間、または約２３から約２４時間の範囲であり得る。他の好ましい非限定的な実施形態において、第１の期間は、約１５時間まで、約１６時間まで、約１７時間まで、約１８時間まで、約１９時間まで、約２０時間まで、約２１時間まで、約２２時間まで、約２３時間まで、約２４時間まで、約２５時間まで、約２６時間まで、約２７時間まで、約２８時間まで、約２９時間まで、または約３０時間までであり得る。
【０１９９】
適切な時間が経過した後、使用者は、細胞を収集し、任意に、発現した組換えタンパク質を精製し得る。
【０２００】
本発明の方法は、上記のような実施形態により、処理中に培養培地を交換する、補給する、またはそうでなければ補充する必要なく、使用者が、組換えタンパク質を一過性に発現させることを可能にする。本明細書に記載される方法は、使用者が、約２ｇ／Ｌ培養細胞までの発現を行うことを可能にする。いくつかの実施形態では、使用者は、培養細胞のリットル毎について、約１．９ｇまで、約１．８ｇまで、約１．７ｇまで、約１．６ｇまで、約１．５ｇまで、約１．４ｇまで、約１．３ｇまで、約１．２ｇまで、約１．１ｇまで、または約１ｇまでの組換えタンパク質を発現させ得る。
【０２０１】
本発明はまた、任意に１つまたは複数の置換化合物（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を含む、組成物、特に上記のような高密度細胞の培養培地に方向づけられる。本発明はまた、例えば、真核細胞、特に動物細胞のインビトロでの培養の方法を含む、このような組成物の使用の方法に方向づけられる。本発明はまた、このような培養培地と、１つまたは複数の細胞、とりわけ本明細書において具体的に参照されるこれらの細胞とを含む組成物、並びに１つまたは複数の上記組成物を含むキットに関する。本発明はまた、１つまたは複数のプロモーター、エンハンサー、および上記で定義されおよび本明細書に組み込まれるように、培養細胞において発現可能な核酸を発現するために必要とされる他のエレメントと組み合わされる、１つまたは複数の発現可能な核酸配列を含む発現ベクターに関する。本発明はまた、１つまたは複数の発現増強物質組成物を含む組成物、とりわけ、培養された細胞における前記の発現可能な核酸の発現を、少なくとも２倍〜２．５倍高めるために選択されるものに関する。任意に、発現増強物質は、同時に処方されるまたは別個に提供される、２つまたは発現増強物質の組み合わせであり得る。本発明はまた、トランスフェクション剤、特に、培養された細胞の内部に１つまたは複数の核酸分子（ｎｕｃｌｅａｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の送達を促進するために最適化されたものに関する。本発明はまた、１つまたは複数の上記組成物、ベクター、発現増強物質、トランスフェクション剤等を含むキット、および１つまたは複数の上記組成物、特に本明細書において具体的に参照されるこれらの細胞を含むキットに関する。
【０２０２】
別の態様において、本発明は、インビトロでの細胞の培養についてのキットに関する。キットは、１つまたは複数の容器を含み、第１の容器は、本発明の培養培地を含む。キットは、さらに、１つまたは複数の追加の容器を含み、各容器は、１つまたは複数のサイトカイン、ヘパリン、１つまたは複数の動物または動物由来ペプチド、１つまたは複数の酵母ペプチド、および１つまたは複数の植物ペプチド（好ましくは、米、アロエベラ、大豆、トウモロコシ、小麦、エンドウ、カボチャ、ホウレンソウ、ニンジン、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、大麦  ココナッツおよび／もしくはサヤマメ並びに／または１つまたは複数の他の植物由来の１つまたは複数のペプチドである）からなる群から選択される１つまたは複数のサプリメントを含む。
【０２０３】
本発明のキットは、さらに、核酸および／または少なくとも１つの高分子、例えば核酸の、本発明の培地で培養された細胞内への導入を促進する剤、つまり、トランスフェクション剤を含む、１つまたは複数の容器を含み得る。好ましいトランスフェクション剤は、カチオン性脂質等を含むがこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明の一態様によるキットは、１つまたは複数の本発明の培地、１つまたは複数の金属結合性化合物および／または１つまたは複数の遷移元素複合体であり得る１つまたは複数の置換化合物、並びに任意に１つまたは複数の核酸およびトランスフェクション剤を含み得る。本発明の別の態様によるキットは、１つまたは複数の細胞培養培地（その１つは基本培地であり得る）、および任意に１つまたは複数の置換化合物を含み得る。本発明のキットはまた、細胞を培養しおよび／または高分子もしくは化合物（例えば、ＤＮＡのような核酸）を細胞内に導入するためのキットを使用するための説明書を含み得る。
【０２０５】
本明細書に記載される方法および用途に対する他の適切な変更および適合は明白であり、本発明またはそのあらゆる実施形態の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当該関連のある分野における当業者にとって容易に明らかとなるであろう。本発明は、詳細にここに記載され、これが、例示のみの目的のために本明細書に含まれ、本発明を限定することを意図とされない、以下の実施例に対する参照により明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０２０６】
目的：
タンパク質収率を最大に（例えば、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システムのような、市販されている一過性発現システムにより得られるものに対して少なくとも２倍超に）するための細胞培養培地およびトランスフェクションシステムを開発すること。システムは、複数のタンパク質のタイプについておよび種々の浮遊細胞において有効であるべきである。システムは、再現性を増加させ、変動性を最小化するべきであり、スケーラブルであるべきである（マルチウェルプレートからラージスケールへ）。本発明のさらなる実施形態は、向上した発現ベクターの開発、本発明の培養システムにおける高密度培養条件下での増殖に適応した高密度細胞株、トランスフェクション増強物質、例えばバルプロ酸およびプロピオン酸ナトリウム（とりわけ）等の組み込みおよび使用を含む。トランスフェクション中またはトランスフェクション後の培地交換を伴わず、簡易で使用しやすい、高い細胞密度でのトランスフェクションを可能にするためのプロトコールを開発することは、本発明のさらなる目的である。
【０２０７】
また、明確性のために別個の実施形態の内容で記載されている本発明のある特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが理解される。また、逆に、簡潔性のために単一の実施形態の内容で記載されている本発明の種々の特徴は、別個に、またはあらゆる適切な部分的な組み合わせで提供され得る。
【０２０８】
実施例１：高密度培養培地
種々の市販の無血清、無タンパク質の培養培地が、約１４×１０６細胞／ｍｌまでの細胞密度を有する適応した２９３Ｆ細胞株の生存率を維持するそれらの能力について評価され、その後、本発明の実施において使用された。１週間を超える時間枠にわたって培養細胞株の生存率を１５×１０６細胞／ｍｌ近くの密度に達しても高く維持する、無血清、無タンパク質の培地が選択されたが、また、約３×１０６細胞／ｍｌの驚くべき高い細胞密度でのトランスフェクションを可能にした（対して、現在市販されている一過性トランスフェクションシステムについては１×１０６細胞／ｍｌ）。結果を図１に示し、これは、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いて達成可能な、得られた細胞密度のグラフを示す。これまでに高密度増殖に適応した細胞を、３回の継代にわたって種々のテスト増殖培地にゆっくりと適応させた。細胞が適応された培地は、本発明の一実施形態による高密度培養培地（黒い丸）、テスト培地１（黒い三角）、テスト培地２（白い三角）、およびテスト培地３（白いひし形）を含む。細胞は、０．２×１０６細胞／ｍｌで３０ｍｌフラスコに播種される前に、各培地において複数回の継代にわたって培養された。細胞密度および生存率が、実験の過程にわたって、増殖培地を補充せず、交換せず、またはそうでなければ補給せずに、８日間にわたってモニタリングされた。選択された増殖培地の１つ（高密度増殖培地、黒い丸）は、実験の過程にわたって生存率を実質的に低下させることなく、培養された浮遊細胞の驚くべき高い密度を維持することができた。よって、当業者は、細胞株の変種である特定の細胞株を用いる使用のための種々の増殖培地を、容易に評価することが可能であり、ここで増殖培地は、培地を交換、補給、または補充することなく規定された期間にわたって浮遊細胞の高密度の培養を促進する能力に基づいて選択され得る。このようなことは、当業者により、過度の実験を行うことなく達成され得る。
【０２０９】
実施例２：細胞株の最適化
種々の浮遊細胞が、本発明の実施において使用され得るが、選択された高密度増殖培地における使用および本実施形態による使用に適応した細胞株を使用することが好ましい。さらに、細胞は、高密度増殖、高い生存率、および増加したタンパク質発現のために具体的に選択され得る。このことを達成するために、親２９３Ｆ線維芽細胞は、数回の継代にわたって段階的な培地交換をともなう、広範な適応プロセスを受けた。さらに、適応した細胞のサイズおよび発現能力は、後の世代で増加することがわかった。細胞は、継代７２回でＡＴＣＣに預けて、遺伝子解析による検証を受け、マイコプラズマ汚染のない２９３Ｆ細胞として認証された。細胞は解凍され、それらの生存率が検証された。細胞は、安定性、発現性能、および培養中および約２０×１０６細胞／ｍｌの密度まで増殖したときに高い生存率を保持するそれらの能力を検証するために、３０回にわたって継代された。上記のような、増加した細胞密度、生存率、およびヒトＩｇＧ発現のために選択された細胞集団は、もとの細胞株（ライン１）よりも約１．７倍多いｈＩｇＧを示した。高収率に適応した細胞（ライン３）はまた、増殖率、生存率、および細胞サイズを増加させた。
【０２１０】
図２は、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムでの使用のための、細胞株の発現最適化の概要を述べる棒グラフを示す。親２９３Ｆ細胞株は、その後に高密度培養培地に適応させる複数の継代培養物に分けられた。高密度での増殖が可能である種々の継代培養物が、その後、組換えテストタンパク質（ヒトＩｇＧ）を発現するそれらの能力について選択され、評価された。高収率に適応した２９３Ｆ細胞（右のセットの複数の棒）を特徴づける細胞の継代培養物は、同じ親２９３Ｆ細胞株由来の細胞の２つの異なる継代培養物よりも、３５％から４５％多く組換えＩｇＧを発現した。このように、当業者は、増殖培地での使用のために具体的に選択された細胞株または細胞株の派生物を容易に得ることが可能となり、培地を交換、補給、または補充することなく規定された期間にわたって浮遊細胞の高密度の培養を促進する能力に基づいて選択され得る。このようなことは、当業者により、過度の実験を行うことなく達成され得る。
【０２１１】
実施例３：一過性トランスフェクションが発現増強物質により補助される
化学的な添加物のパネルは、タンパク質収率に対する、各成分または１つもしくは複数の成分の組み合わせの相対的寄与を評価するための組み合わせの実験においてテストされた。種々のトランスフェクション／発現増強物質は、それが有意にタンパク質産生を向上させることが確認された。成分は、２つの安定した増強物質溶液に処方された。トランスフェクション増強物質１（上記に定義されるように、バルプロ酸（ｖａｌｐｒｉｏｃ  ａｃｉｄ））はｈＩｇＧを２倍にする。増強物質２（上記に定義されるように、プロピオン酸ナトリウム）は、単独では強い効果を有しないが、増強物質１と組み合わせると、対照（増強物質１も増強物質２もいずれも有しない）に対してほぼ３倍多いｈＩｇＧを提供する。
【０２１２】
図３は、いくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムにおいて使用される種々の増強物質１および増強物質２の効果の概要を述べる棒グラフを示す。成分は、２つの安定した増強物質溶液に処方された。発現増強物質１の添加は、ｈＩｇＧの発現を２倍にした（最初の２つの棒を比較）。増強物質２単独の添加は、ＩｇＧの発現を高めることにおけるわずかな効果のみを示すが、増強物質１と組み合わせて添加した場合には、対照に対してほぼ３倍多いｈＩｇＧを提供する（３番目と４番目を比較）。
【０２１３】
実施例４：タンパク質発現の結果
本発明の一過性発現のシステムは、１ｇ／Ｌから最大で約２ｇ／Ｌまでの間のヒトＩｇＧおよびＣｒｉｐｔｏを産生し得る。本発明のシステムの一過性発現システムは、図４Ａから図４Ｄに示されるタンパク質の一過性タンパク質発現において、市販されているＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システムと比較した場合、３．５倍〜１１．８倍の間の増加を示した。図４は、いくつかの実施形態による高収率一過性トランスフェクションシステムおよび従来技術の一過性トランスフェクションシステム（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システム）を用いた、４つの異なるおよび固有のタンパク質の発現レベルの比較を示す。図４Ａは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたヒトＩｇＧの発現における５倍より多い増加を示す。図４Ｂは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたＣｒｉｐｔｏの発現における５．２倍より多い増加を示す。図４Ｃは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたβ２アドレナリン受容体の発現におけるほぼ４倍の増加を示す。図４Ｄは、市販されているＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘシステムと比較した場合、本発明のいくつかの実施形態による一過性トランスフェクションシステムを用いたウサギＩｇＧの発現における１１倍より多い増加を示す。
【０２１４】
実施例５：ＥＰＯ発現、スケーラビリティ、および再現性
次に、本発明者らは、広く使用される、臨床的重要性のある発現タンパク質を用いて、一過性トランスフェクションシステムのスケーラビリティおよび再現性を試験することを探求した。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、本発明の一過性トランスフェクションシステム（グラフの右側の複数の棒）およびＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システム（グラフの左側の複数の棒）を用いて発現された。当該発明のシステムは、１ｍｌ（２４ウェルプレートの形式において）から１Ｌ（３Ｌの振とうフラスコ形式）までスケーラブルである。非常に良い再現性が、３つの異なる研究室における、３つの別個の分析からの結果にみられた。
【０２１５】
結論：
２つの異なるタンパク質の１ｇ／Ｌの発現が、高収率一過性トランスフェクションシステムを用いて達成された。高密度培養培地は、高密度のトランスフェクションを可能にした。一過性タンパク質発現に対する有意な向上が、細胞株の選択を介して得られた。トランスフェクション増強物質は、高い細胞密度でのトランスフェクションおよび発現を向上させる。結果は非常にスケーラブルであり、かつ再現性がある。本発明の一過性トランスフェクションシステムは、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３システムと比較して、タンパク質発現における、３．５倍〜１５倍の増加を達成した。
【０２１６】
本明細書において言及される全ての出版物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれるように、各個々の出版物、特許、または特許出願が具体的におよび個々に示されるのと同じ範囲において、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、ここに定義を含む本明細書が統制するであろう。本出願におけるあらゆる参照の引用および識別は、このような参照が本発明に対する従来技術として使用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【図１】
2019088304.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月14日(2019.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．高密度条件下での増殖に適応している、浮遊２９３細胞、
ｂ．高密度培養培地、
ｃ．少なくとも1つの発現増強物質
を含む、発現システム。
【請求項２】
前記浮遊２９３細胞が、それらが由来する親細胞株と比較して、高密度培養条件下で向上した増殖および生存率特性ならびに向上した組換えタンパク質発現に適応する、請求項１記載の発現システム。
【請求項３】
前記発現増強物質組成物がバルプロ酸（ＶＰＡおよびナトリウム塩）を含む、請求項１記載の発現システム。
【請求項４】
前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸塩、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、酪酸、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項３記載の発現システム。
【請求項５】
前記浮遊２９３細胞が、２９３細胞の派生物、２９３Ｆ細胞、または２９３Ｆ細胞の派生物である、請求項１記載の発現システム。
【請求項６】
前記高密度培養培地が、無血清／無タンパク質の化学的に規定された培養培地である、請求項１記載の発現システム。
【請求項７】
前記高密度培養培地が、８０％を上回ったままの細胞生存率で、２．５×１０６細胞／ｍｌを超える密度で、トランスフェクトされた２９３細胞の増殖を促進する能力を有する、請求項１記載の発現システム。
【請求項８】
前記高密度培養培地が、２×１０６から２×１０７細胞／ｍｌの間の密度で前記浮遊２９３細胞を支持することができる、請求項１記載の発現システム。
【請求項９】
トランスフェクション剤をさらに含む、請求項１記載の発現システム。
【請求項１０】
前記トランスフェクション剤がカチオン性脂質を含む、請求項９記載の発現システム。
【請求項１１】
前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸塩、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ガラクトース、酪酸、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１記載の発現システム。
【請求項１２】
前記発現増強物質組成物が、プロピオン酸ナトリウム、ＬｉＡｃ、もしくはガラクトース、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１記載の発現システム。
【請求項１３】
前記プロピオン酸ナトリウムが、０．２ｍＭから１００ｍＭの範囲、さらに任意で０．５から８０ｍＭまたは０．６ｍＭから５０ｍＭの範囲での使用時の最終濃度を達成するのに十分な量で提供され；前記ＬｉＡｃが、０．２５から２５ｍＭの範囲、さらに任意で０．２６ｍＭから２０ｍＭまたは０．５ｍＭから２．５ｍＭの範囲での使用時の最終濃度を達成するのに十分な量で提供される、請求項１２記載の発現システム。
【請求項１４】
前記ＶＰＡが、０．２０ｍＭから２５ｍＭの範囲での使用時の最終濃度を達成するのに十分な量で提供され；任意で、バルプロ酸の濃度が、０．２５ｍＭから２４ｍＭまたは０．４４ｍＭから１０ｍＭの範囲である、請求項３記載の発現システム。
【請求項１５】
発現タンパク質を産生可能な遺伝子配列を含む発現ベクターを含む発現可能な核酸をさらに含む、請求項１記載の発現システム。
【請求項１６】
前記発現ベクターがＷＰＲＥエレメントを含む、請求項１５記載の発現システム。
【請求項１７】
前記高密度培養培地が、前記２９３細胞がトランスフェクトされた後に、新鮮な培地に交換、補充、または補給されない、請求項１記載の発現システム。