(57)【要約】      （修正有）【課題】タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを精度良く判別するための手段の提供。【解決手段】タマネギに由来する核酸において、アリイナーゼ遺伝子１に対応する塩基配列を検出する第１検出工程、及びアリイナーゼ遺伝子２に対応する塩基配列を検出する第２検出工程を含み、第１検出工程でアリイナーゼ遺伝子１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程でアリイナーゼ遺伝子２の塩基配列が検出される場合に、タマネギは辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別する方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程、及び、
タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う第２検出工程を含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出され且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
【請求項２】
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第２検出工程が、前記核酸において、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の塩基を含む第２変異部位の検出を行うことを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含み、
第２検出工程が、
配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第３プライマー、及び／又は、配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第４プライマーを含む第２プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡを鋳型として第２核酸増幅反応を行うこと、並びに、第２核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程を含み、
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されない場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
【請求項５】
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
タマネギの形質の判別方法であって、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によりタマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
ａ）タマネギ細胞破砕時におけるピルビン酸の生成が従来品種と比べて低減されている；
ｂ）タマネギ細胞破砕した後の残存ＰＲＥＮＣＳＯ量が従来品種と比べて多い；及び
ｃ）タマネギ細胞破砕時における催涙因子（ＬＦ）の生成が従来品種と比べて低減されている
の１以上の形質を指標として、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること
を含む方法。
【請求項７】
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを育種する方法であって、
タマネギを、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別されたタマネギを育種に用いること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１０】
請求項８に記載のプライマーと、
請求項９に記載のプライマーと
を含み、
第１塩基と第２塩基とは同一である、或いは、第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は相同な第３塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１２】
配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は相同な第４塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１３】
請求項１１に記載のプライマーと、
請求項１２に記載のプライマーと
を含み、
第３塩基と第４塩基とは同一である、或いは、第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１４】
請求項８に記載のプライマー、請求項９に記載のプライマー及び請求項１０に記載のプライマーセットから選択される１つと、
請求項１１に記載のプライマー、請求項１２に記載のプライマー及び請求項１３に記載のプライマーセットから選択される１つと
を含む、タマネギの形質を判別するためのキット。
【請求項１５】
ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む、タマネギの辛み及び／又は催涙性を検出するためのマーカー遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別する方法、該方法に用いるためのプライマー、プライマーセット及びキット、並びに、該方法を利用したタマネギの育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、タマネギにおいて、辛みの原因成分であるＬＦ（催涙成分）の生成に関与する酵素であるアリイナーゼとして２９種のアリイナーゼが発現していること、その中で、特許文献１の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる特定のアリイナーゼが、タマネギの辛み・催涙性に関与する主たるアリイナーゼであること、前記特定のアリイナーゼの活性が抑制された涙の出ない・辛みの無い２系統のタマネギが作出されたことが記載されている。
【０００３】
非特許文献１には、特許文献１と同様に、アリイナーゼの活性が抑制された涙の出ない・辛みの無いタマネギが作出されたことが記されている。
【０００４】
非特許文献２には、特許文献１に記載の前記特定のアリイナーゼのアミノ酸配列と配列同一性の高いアリイナーゼのアミノ酸配列が記されている。しかし、このアリイナーゼが辛みや催涙性に寄与する程度やその他のアリイナーゼの存在は非特許文献２には示唆されていない。
【０００５】
非特許文献３〜６には、タマネギのアリイナーゼとして、非特許文献２に記載の前記特定のアリイナーゼとは別のアリイナーゼの存在が示唆されている。しかし、前記別のアリイナーゼについての配列情報、辛み・催涙性への関与の有無は一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５６７１６５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kato et al.「Production and characterization of tearless and non-pungent onion」DOI: 10.1038/srep23779
【非特許文献２】GenBank Accession No. AAA32639.1
【非特許文献３】King et al. 「A low-density genetic map of onion reveals a role for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome.」 Theor Appl Genet 96, 52-62 (1998)
【非特許文献４】Van Heusden, A. W., Shigyo, M., Tashiro, Y., Vrielink-van Ginkel, R. & Kik, C. AFLP linkage group assignment to the chromosomes of Allium cepa L. via monosomic addition lines. Theor Appl Genet 100, 480-486 (2000)
【非特許文献５】Martin, W. J. et al. Genetic mapping of expressed sequences in onion and in silico comparisons with rice show scant colinearity. Mol Genet Genom 274, 197-204 (2005)
【非特許文献６】Khrustaleva, L. et al. The chromosome organization of genes and some types of extragenic DNA in Allium. Acta Hort 969, 43-52 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に記載されている、特許文献１の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる特定のアリイナーゼの発現が抑制されたタマネギは、辛みがなく、催涙性のないタマネギである。しかし前記特定のアリイナーゼの遺伝子配列や、発現していない原因（調節領域、転写因子、遺伝子そのものの破壊等）は特許文献１には記載されていない。また発現していないアリイナーゼ遺伝子の情報も特許文献１には記載されていない。非特許文献１には、特許文献１と同様に、アリイナーゼの活性が抑制された涙の出ない・辛みの無いタマネギが作出されたことが記されているが、発現が抑制されているアリイナーゼの全配列や発現抑制の原因は記載されていない。
【０００９】
一方、タマネギのアリイナーゼ遺伝子はマルチコピー遺伝子であり、特許文献１に記載されているように発現しているものだけで２９種、発現していないものも含めると更に多種のアリイナーゼ遺伝子がタマネギに存在する。また、非特許文献２〜６にも、特許文献１に記載の前記特定のアリイナーゼ遺伝子とは別のアリイナーゼ遺伝子の存在が示されている。このため、タマネギにおいて、特許文献１に記載の前記特定のアリイナーゼをコードする遺伝子の不存在／存在を検出することにより辛みの無いタマネギであるか否かを判別しようとしても、他のアリイナーゼ遺伝子と誤検知する可能性があり実現は困難であった。
【００１０】
本発明は、タマネギにおいて、辛み及び催涙性に関与するアリイナーゼ遺伝子を、他の遺伝子と区別して特異的に検出することで、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別するための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書では、前記課題を解決する手段として以下の発明を開示する。
（１）タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程、及び、
タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う第２検出工程を含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出され且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
（２）第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第２検出工程が、前記核酸において、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の塩基を含む第２変異部位の検出を行うことを含む、
（１）に記載の方法。
（３）第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含み、
第２検出工程が、
配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第３プライマー、及び／又は、配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第４プライマーを含む第２プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡを鋳型として第２核酸増幅反応を行うこと、並びに、第２核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程を含み、
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されない場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
（５）第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含む、
（４）に記載の方法。
（６）タマネギの形質の判別方法であって、
（１）〜（５）のいずれかに記載の方法によりタマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
ａ）タマネギ細胞破砕時におけるピルビン酸の生成が従来品種と比べて低減されている；
ｂ）タマネギ細胞破砕した後の残存ＰＲＥＮＣＳＯ量が従来品種と比べて多い；及び
ｃ）タマネギ細胞破砕時における催涙因子（ＬＦ）の生成が従来品種と比べて低減されている
の１以上の形質を指標として、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること
を含む方法。
（７）辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを育種する方法であって、
タマネギを、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別されたタマネギを育種に用いること
を含むことを特徴とする方法。
（８）配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
（９）配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
（１０）（８）に記載のプライマーと、
（９）に記載のプライマーと
を含み、
第１塩基と第２塩基とは同一である、或いは、第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
（１１）配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は相同な第３塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
（１２）配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は相同な第４塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
（１３）（１１）に記載のプライマーと、
（１２）に記載のプライマーと
を含み、
第３塩基と第４塩基とは同一である、或いは、第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
（１４）（８）に記載のプライマー、（９）に記載のプライマー及び（１０）に記載のプライマーセットから選択される１つと、
（１１）に記載のプライマー、（１２）に記載のプライマー及び（１３）に記載のプライマーセットから選択される１つと
を含む、タマネギの形質を判別するためのキット。
（１５）ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む、タマネギの辛み及び／又は催涙性を検出するためのマーカー遺伝子。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のタマネギの判別方法によれば、外観上は判別することができない辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを正確に判別することができる。
【００１３】
本発明の育種方法によれば、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを素材の一つとして新品種を育種する場面において、目的とする辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを正確に選抜することができる。
【００１４】
本発明に係るプライマー、プライマーセット及びキットは、アリイナーゼ遺伝子１又はアリイナーゼ遺伝子２をそれぞれ特異的に増幅するために利用できる。
【００１５】
本発明に係るマーカー遺伝子は、タマネギの辛み及び／又は催涙性を検出するために利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】配列番号１の塩基配列、配列番号２の塩基配列、及び、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＡ３２６３９．１のアリイナーゼ遺伝子の塩基配列のアライメント結果と、各プライマーの位置を示す図である。
【図１−２】図１−１の続き
【図２】辛みの無いタマネギ＃６及び対照品種のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４の塩基配列のプライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物の検出結果を示す。
【図３−１】辛みの無いタマネギ＃６及び対照品種のゲノムＤＮＡを鋳型とし、各種プライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物におけるアリイナーゼ遺伝子１又はアリイナーゼ遺伝子２の検出結果を示す。
【図３−２】図３−１の続き
【図４】市販のタマネギ１４品種、対照品種及びタマネギ＃６からのゲノムＤＮＡを鋳型とし、各種プライマーセットを用いたＰＣＲの増幅産物におけるアリイナーゼ遺伝子１又はアリイナーゼ遺伝子２の検出結果を示す。
【図５】辛みの無いタマネギ＃６に由来する複数のＦ２タマネギの葉からのゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーセットとしてＳＦ２−ＳＲ１を用いたＰＣＲによる増幅産物におけるアリイナーゼ遺伝子１の検出結果を示す。
【図６】辛みの無いタマネギ＃６に由来するＦ２タマネギのうち、ゲノムＤＮＡ中にアリイナーゼ遺伝子１が検出されたタマネギの球（選抜球）と、検出されなかったタマネギの球（非選抜球）の、ピルビン酸生成量の測定結果を示す。
【図７−１】配列番号１の塩基配列における各プライマーの位置を示す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８−１】配列番号２の塩基配列における各プライマーの位置を示す。
【図８−２】図８−１の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜１．用語＞
本明細書では、ゲノムＤＮＡに含まれるアリイナーゼをコードする遺伝子であって、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む遺伝子を「遺伝子１」と称する。
【００１８】
本明細書ではまた、アリイナーゼをコードする遺伝子であって、ゲノムＤＮＡの塩基配列が配列番号２の塩基配列を含む遺伝子を「遺伝子２」と称する。
【００１９】
本明細書において「ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列を含む遺伝子」とは、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列が、配列番号１の塩基配列を含む遺伝子を指す。
【００２０】
本明細書においてｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）は、タマネギの細胞内で、ゲノムＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼにより生合成されたｍＲＮＡ前駆体が更にスプライシングを経てエクソン領域が連結した成熟ｍＲＮＡを指す。ゲノムＤＮＡからｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）が生成される過程が「転写」である。
【００２１】
本明細書においてｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）とは、ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素により合成されたｍＲＮＡに相補的な第１のＤＮＡと、第１のＤＮＡに相補的な（すなわちｍＲＮＡの塩基配列においてｕがｔに置換された塩基配列からなる）第２のＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡ、一本鎖の前記第１のＤＮＡ、又は、一本鎖の前記第２のＤＮＡのいずれかを指す。本明細書において「ｍＤＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列」とは、前記第２のＤＮＡの塩基配列を指す。
【００２２】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を指し、典型的にはＤＮＡを指す。ＲＮＡにおいては、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。ＤＮＡとしては、任意の位置のＴをＵに置換して合成したＵを含むＤＮＡも使用することができる。ポリヌクレオチドはイノシン（Ｉ）等の修飾ヌクレオチドを一部に含んでいてもよい。
【００２３】
ポリヌクレオチドは一本鎖として存在していてもよいし、二本鎖として存在していてもよい。ポリヌクレオチドが二本鎖として存在する場合は、少なくとも一方の鎖が、以下に規定する所定の特徴を備えるポリヌクレオチドであればよい。
【００２４】
ポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造することができる。
【００２５】
本発明において、「タマネギ由来の核酸」とは、形質を判別しようとするタマネギ（対象タマネギ）に由来するゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを指す。ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡは、それぞれ、ゲノムＤＮＡの増幅断片、ｍＲＮＡの増幅断片、ｃＤＮＡの増幅断片も包含する。
【００２６】
本発明において「塩基配列Ｘと相同な塩基配列Ｙ」、或いは、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが相同である」、というとき、塩基配列Ｘの相補配列からなるＤＮＡ鎖と、塩基配列ＹからなるＤＮＡ鎖とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせを指し、塩基配列ＸとＹとが部分的に異なっていてもよい。例えば、塩基配列Ｘの相補配列からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドとが、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。典型的には、塩基配列Ｘと「相同な」塩基配列Ｙというとき、塩基配列ＸとＹとが以下の関係のいずれかを満たすことを指す。
【００２７】
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと７０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｔ）に置換されている。
【００２８】
前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
【００２９】
前記（Ｂ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＩＳ、及びＢＬＡＳＴ）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。同一性の決定方法の詳細については、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２，１９７７及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，１９９０を参照されたい。
【００３０】
前記（Ｂ）において、同一性はより好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【００３１】
前記（Ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ  Ｅｄ  （２０１２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５〜５００ｍＭ、好ましくは２５〜３００ｍＭであり、温度が４０〜６８℃、好ましくは４０〜６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１〜７×ＳＳＣ、０．０２〜３％  ＳＤＳ、温度４０℃〜６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜０．３％  ＳＤＳ、温度５０〜６５℃で行うことができる。
【００３２】
＜２．本発明の第１の判別方法＞
本発明のタマネギの形質の判別方法は、第一に、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程、及び、
タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う第２検出工程を含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出され且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法である。この方法を本発明の「第１の判別方法」とする。
【００３３】
本発明者らは、アリイナーゼをコードする遺伝子の塩基配列として、通常のタマネギのゲノムＤＮＡには、遺伝子１の塩基配列と遺伝子２の塩基配列の両方が存在するのに対して、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギのゲノムＤＮＡでは、遺伝子２の塩基配列は存在するが遺伝子１の塩基配列は存在しないことを見出した。遺伝子１の塩基配列がコードするアリイナーゼは、特許文献１に記載の配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる特定のアリイナーゼであり、特許文献１には、前記特定のアリイナーゼの発現が抑制されたタマネギは辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであることが記載されてはいるものの、発現していない原因（調節領域、転写因子、遺伝子そのものの破壊等）は記載されていない。本発明者らは、驚くべきことに、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギでは、前記特定のアリイナーゼをコードする遺伝子１の塩基配列がゲノムＤＮＡ上に存在せず、且つ、辛みに関与しない、遺伝子１の塩基配列と相同性の高い遺伝子２の塩基配列がゲノムＤＮＡ上に存在することを見出した。ここで「辛み及び／又は催涙性の無いタマネギ」としては、代表的には、種子が国際寄託され受託番号ＮＣＩＭＢ  ４２２１９が付与されているタマネギ、その後代、これらを素材の一つとして育種された辛み及び／又は催涙性の無いタマネギ等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００３４】
配列番号１の塩基配列は、アリイナーゼ遺伝子１のｃＤＮＡ塩基配列であり、配列番号２の塩基配列は、アリイナーゼ遺伝子２のゲノムＤＮＡ塩基配列である。
【００３５】
第１検出工程における「配列番号１の塩基配列の検出」及び「（配列番号１の塩基配列の）第１変異部位の検出」は、それぞれ、「配列番号１の塩基配列に相当する塩基配列の検出」及び「（配列番号１の塩基配列の）第１変異部位に相当する塩基配列の検出」を意味する。同様に、第２検出工程における「配列番号２の塩基配列の検出」及び「（配列番号２の塩基配列の）第２変異部位の検出」は、それぞれ、「配列番号２の塩基配列に相当する塩基配列の検出」及び「（配列番号２の塩基配列の）第２変異部位に相当する塩基配列の検出」意味する。
【００３６】
「配列番号１の塩基配列に相当する塩基配列」とは、タマネギ由来の核酸がゲノムＤＮＡである場合は、ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列となるアリイナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列又はその相補塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｍＲＮＡである場合は、配列番号１においてＴがＵに置換された塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｃＤＮＡである場合は、配列番号１の塩基配列又はその相補塩基配列を指す。
【００３７】
「配列番号２の塩基配列に相当する塩基配列」とは、タマネギ由来の核酸がゲノムＤＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列又はその相補塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｍＲＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列からイントロン領域が除外され且つＴがＵに置換された塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｃＤＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列からイントロン領域が除外された塩基配列又はその相補塩基配列を指す。
【００３８】
「（配列番号１の塩基配列の）第１変異部位に相当する塩基配列」とは、タマネギ由来の核酸がゲノムＤＮＡである場合は、ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列となるアリイナーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡにおける、第１変異部位に相当する部位の塩基配列又はその相補塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｍＲＮＡである場合は、配列番号１においてＴがＵに置換された塩基配列における、第１変異部位に相当する部位の塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｃＤＮＡである場合は、配列番号１の塩基配列の第１変異部位又はその相補塩基配列を指す。
【００３９】
「（配列番号２の塩基配列の）第２変異部位に相当する塩基配列」とは、タマネギ由来の核酸がゲノムＤＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列の第２変異部位又はその相補塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｍＲＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列からイントロン領域が除外され且つＴがＵに置換された塩基配列における、第２変異部位に相当する部位の塩基配列を指し、タマネギ由来の核酸がｃＤＮＡである場合は、配列番号２の塩基配列からイントロン領域が除外された塩基配列における、第２変異部位に相当する部位の塩基配列又はその相補塩基配列を指す。
【００４０】
タマネギ由来の核酸としてゲノムＤＮＡを分析することは、対象タマネギの生育ステージや部位による量の変動がないため好ましい。更に、本発明の第１の判別方法では、遺伝子１の塩基配列の存在／不存在だけでなく、タマネギの辛みの有無にかかわらず存在する遺伝子２の塩基配列の存在も確認することで、分析が適切な条件で行われていることを確認することができるため好ましい。
【００４１】
次に「第１検出工程」について詳述する。
第１検出工程は、タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う工程である。該工程では、好ましくは、タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列又は配列番号１においてＴがＵに置換された塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列の相補塩基配列を少なくとも一部に含む塩基配列を検出する。
【００４２】
遺伝子１のｃＤＮＡ塩基配列である配列番号１の塩基配列と、遺伝子２のゲノムＤＮＡ塩基配列である配列番号２の塩基配列とをマッチングが最大となるようにアライメントとしたとき、図１−１、１−２に示すように、相同性の高い領域の中に幾つかのミスマッチした塩基が見出された。具体的には、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位、第１４６７位と、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位、第１８２２位とが、相同性の高い領域の中に含まれるミスマッチした塩基として挙げられる。
【００４３】
そこで、第１検出工程において、タマネギ由来の核酸に含まれる配列番号１の塩基配列を、配列番号２の塩基配列と誤検出することなく特異的に検出するためには、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことが好ましい。
【００４４】
タマネギ由来の核酸において配列番号１の塩基配列の第１変異部位を検出するための具体的な手段としては、以下の第１プライマーセットを用いて、タマネギ由来の核酸、特にゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことが好ましい。
【００４５】
第１プライマーセットは、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び、
配列番号１の塩基配列の、第１変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第２プライマー
の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことが特に好ましい。
【００４６】
第１プライマーの好ましい実施形態として、配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマーが例示できる。
【００４７】
第２プライマーの好ましい実施形態として、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーが例示できる。
【００４８】
第１プライマーの好ましい実施形態について説明する。
第１プライマーに関して述べた第１部分塩基配列は、配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２３塩基以上の連続した部分塩基配列である。第１部分塩基配列の塩基数の上限は特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下である。第１部分塩基配列は、前記の第１塩基を、３’末端から２塩基以内の塩基、好ましくは３’末端の塩基として含むことにより、第１核酸増幅反応において、第１プライマーの３’末端から、鋳型核酸上の遺伝子１のセンス鎖側の塩基配列のうち第１塩基に相当する塩基から３’末端側の領域が特異的に伸長される。
【００４９】
第１ポリヌクレオチドは、第１部分塩基配列と同一又は相同な第１塩基配列を３’末端に含む。ここで「相同」の定義は既述の通りである。より好ましくは、第１部分塩基配列と第１塩基配列とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（第１部分塩基配列の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、第１部分塩基配列の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。第１塩基配列の具体例としては、配列番号５、６、７又は８に示す塩基配列や、配列番号５、６、７又は８に示す塩基配列の３’末端から好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した部分からなる部分塩基配列が例示できる。第１ポリヌクレオチドが、「第１塩基配列を３’末端に含む」とは、第１ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が第１塩基配列のみからなる場合と、第１塩基配列と、第１塩基配列の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、第１核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。
【００５０】
本明細書では、配列番号５、６、７、８の塩基配列からなる第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマーを、それぞれ、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４と称し、配列番号１の塩基配列における位置を図７−１、７−２に示す。
【００５１】
第１プライマーは第１ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第１ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００５２】
第１プライマーセットが第１プライマーを含む場合、他方のプライマーは、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列において第１塩基よりも３’末端側に位置する領域に相補的な部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含むプライマーであることが好ましく、第２プライマーであることがより好ましい。
【００５３】
次に、第２プライマーの好ましい実施形態について説明する。
第２プライマーに関して述べた第２部分塩基配列は、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２３塩基以上の連続した部分塩基配列である。第２部分塩基配列の塩基数の上限は特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下である。第２部分塩基配列は、前記の第２塩基の相補塩基を、３’末端から２塩基以内の塩基、好ましくは３’末端の塩基として含むことにより、第１核酸増幅反応において、第２プライマーの３’末端から、鋳型核酸上の遺伝子１のアンチセンス鎖側の塩基配列のうち第２塩基の相補塩基に相当する塩基から３’末端側の領域が特異的に伸長される。
【００５４】
第２ポリヌクレオチドは、第２部分塩基配列と同一又は相同な第２塩基配列を３’末端に含む。ここで「相同」の定義は既述の通りである。より好ましくは、第２部分塩基配列と第２塩基配列とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（第２部分塩基配列の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、第２部分塩基配列の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。第２塩基配列の具体例としては、配列番号９、１０、１１又は１２に示す塩基配列や、配列番号９、１０、１１又は１２に示す塩基配列の３’末端から好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した部分からなる部分塩基配列が例示できる。第２ポリヌクレオチドが、「第２塩基配列を３’末端に含む」とは、第２ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が、第２塩基配列のみからなる場合と、第２塩基配列と、第２塩基配列の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、第１核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。
【００５５】
本明細書では、配列番号９、１０、１１、１２の塩基配列からなる第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーを、それぞれ、ＳＲ１、ＳＲ２、ＳＲ３、ＳＲ４と称し、配列番号１の塩基配列における位置を図７−１、７−２に示す。
【００５６】
第２プライマーは第２ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第２ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００５７】
第１プライマーセットが第２プライマーを含む場合、他方のプライマーは、配列番号１の塩基配列に含まれる１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列において第２塩基よりも５’末端側に位置する領域の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含むプライマーであることが好ましく、第１プライマーであることがより好ましい。
【００５８】
第１プライマーセットが第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせである場合、第１塩基と第２塩基とが同一である又は第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側に位置するように、第１プライマーと第２プライマーとが選択されればよい。第１プライマーセットが第１プライマーと第２プライマーとの組み合わせである場合の好適な形態では、第１プライマーに関して第１塩基は、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位又は第１３４８位であり、第２プライマーに関して第２塩基は、配列番号１の、第１８７位、第３５８位、第７９１位又は第１４６７位であり、ただし第１塩基は第２塩基と同一である又は第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側に位置する。
【００５９】
次に「第２検出工程」について詳述する。
第２検出工程は、タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う工程である。該工程では、好ましくは、タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列又は配列番号２においてＴがＵに置換された塩基配列の部分塩基配列又は該部分塩基配列の相補塩基配列を少なくとも一部に含む塩基配列を検出する。
【００６０】
第２検出工程において、タマネギ由来の核酸に含まれる配列番号２の塩基配列を、配列番号１の塩基配列と誤検出することなく特異的に検出するためには、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の塩基を含む第２変異部位の検出を行うことが好ましい。
【００６１】
タマネギ由来の核酸において配列番号２の塩基配列の第２変異部位を検出するための具体的な手段としては、以下の第２プライマーセットを用いて、タマネギ由来の核酸、特にゲノムＤＮＡを鋳型として第２核酸増幅反応を行うこと、並びに、第２核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことが好ましい。
【００６２】
第２プライマーセットは、
配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第３プライマー、及び、
配列番号２の塩基配列の、第２変異部位を含む部分塩基配列の相補塩基配列と同一又は相同な塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む第４プライマー
の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことが特に好ましい。
【００６３】
第３プライマーの好ましい実施形態として、配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は相同な第３塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含む第３プライマーが例示できる。
【００６４】
第４プライマーの好ましい実施形態として、配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は相同な第４塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含む第４プライマーが例示できる。
【００６５】
第３プライマーの好ましい実施形態について説明する。
第３プライマーに関して述べた第３部分塩基配列は、配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２３塩基以上の連続した部分塩基配列である。第３部分塩基配列の塩基数の上限は特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下である。第３部分塩基配列は、前記の第３塩基を、３’末端から２塩基以内の塩基、好ましくは３’末端の塩基として含むことにより、第２核酸増幅反応において、第３プライマーの３’末端から、鋳型核酸上の遺伝子２のセンス鎖側の塩基配列のうち第３塩基に相当する塩基から３’末端側の領域が特異的に伸長される。
【００６６】
第３ポリヌクレオチドは、第３部分塩基配列と同一又は相同な第３塩基配列を３’末端に含む。ここで「相同」の定義は既述の通りである。より好ましくは、第３部分塩基配列と第３塩基配列とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（第３部分塩基配列の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、第３部分塩基配列の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。第３塩基配列の具体例としては、配列番号１３、１４、１５又は１６に示す塩基配列や、配列番号１３、１４、１５又は１６に示す塩基配列の３’末端から好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した部分からなる部分塩基配列が例示できる。第３ポリヌクレオチドが、「第３塩基配列を３’末端に含む」とは、第３ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が第３塩基配列のみからなる場合と、第３塩基配列と、第３塩基配列の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、第２核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。
【００６７】
本明細書では、配列番号１３、１４、１５、１６の塩基配列からなる第３ポリヌクレオチドを含む第３プライマーを、それぞれ、ＵＦ１、ＵＦ２、ＵＦ３、ＵＦ４と称し、配列番号２の塩基配列における位置を図８−１、８−２に示す。
【００６８】
第３プライマーは第３ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第３ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００６９】
第２プライマーセットが第３プライマーを含む場合、他方のプライマーは、配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列において第３塩基よりも３’末端側に位置する領域に相補的な部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含むプライマーであることが好ましく、第４プライマーであることがより好ましい。
【００７０】
次に、第４プライマーの好ましい実施形態について説明する。
第４プライマーに関して述べた第４部分塩基配列は、配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２３塩基以上の連続した部分塩基配列である。第４部分塩基配列の塩基数の上限は特に限定されないが、好ましくは５０塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３５塩基以下、より好ましくは３０塩基以下である。第４部分塩基配列は、前記の第４塩基の相補塩基を、３’末端から２塩基以内の塩基、好ましくは３’末端の塩基として含むことにより、第２核酸増幅反応において、第４プライマーの３’末端から、鋳型核酸上の遺伝子２のアンチセンス鎖側の塩基配列のうち第４塩基の相補塩基に相当する塩基から３’末端側の領域が特異的に伸長される。
【００７１】
第４ポリヌクレオチドは、第４部分塩基配列と同一又は相同な第４塩基配列を３’末端に含む。ここで「相同」の定義は既述の通りである。より好ましくは、第４部分塩基配列と第４塩基配列とは、好ましくは３’末端から３塩基までの領域、より好ましくは３’末端から５塩基までの領域、より好ましくは３’末端から８塩基までの領域、より好ましくは３’末端から１０塩基までの領域（第４部分塩基配列の長さが１５塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から１５塩基までの領域、第４部分塩基配列の長さが２０塩基以上である場合は更に好ましくは３’末端から２０塩基までの領域）が同一であり、残りの５’末端側の領域が相同である。第４塩基配列の具体例としては、配列番号１７、１８、１９又は２０に示す塩基配列や、配列番号１７、１８、１９又は２０に示す塩基配列の３’末端から好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の連続した部分からなる部分塩基配列が例示できる。第４ポリヌクレオチドが、「第４塩基配列を３’末端に含む」とは、第４ポリヌクレオチドの塩基配列の全体が、第４塩基配列のみからなる場合と、第４塩基配列と、第４塩基配列の５’末端に接続された別の塩基配列とを含む場合の両方を包含する。前記別の塩基配列は、第２核酸増幅反応を実質的に阻害しないものであればよく、その塩基数としては例えば２０塩基以下、好ましくは１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは１又は２塩基である。
【００７２】
本明細書では、配列番号１７、１８、１９、２０の塩基配列からなる第４ポリヌクレオチドを含む第４プライマーを、それぞれ、ＵＲ１、ＵＲ２、ＵＲ３、ＵＲ４と称し、配列番号２の塩基配列における位置を図８−１、８−２に示す。
【００７３】
第４プライマーは第４ポリヌクレオチドからなるものであってもよいし、第４ポリヌクレオチドに、増幅産物の検出のための標識用タグ、標識物質、固定化用タグ等の有用な化学構造が付加されたものであってもよい。
【００７４】
第２プライマーセットが第４プライマーを含む場合、他方のプライマーは、配列番号２の塩基配列に含まれる１０〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列において第４塩基よりも５’末端側に位置する領域の部分塩基配列と同一又は相同な塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含むプライマーであることが好ましく、第３プライマーであることがより好ましい。
【００７５】
第２プライマーセットが第３プライマーと第４プライマーとの組み合わせである場合、第３塩基と第４塩基とが同一である又は第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側に位置するように、第３プライマーと第４プライマーとが選択されればよい。第２プライマーセットが第３プライマーと第４プライマーとの組み合わせである場合の好適な形態では、第３プライマーに関して第３塩基は、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位又は第１７０３位であり、第４プライマーに関して第４塩基は、配列番号２の、第１２７位、第４０９位、第９４３位又は第１８２２位であり、ただし第３塩基は第４塩基と同一である又は第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側に位置する。
【００７６】
本発明において、第１核酸増幅反応及び第２核酸増幅反応（以下「核酸増幅反応」と総称する）は、それぞれ、一般的なＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に従って行うことができる。
【００７７】
タマネギから鋳型となるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸の調製方法は常法に従い行うことができる。
【００７８】
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼであればよく、特に限定はされない。本発明においては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能である。また、プライマー濃度、サイクル数、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。
【００７９】
核酸増幅反応では、対象タマネギ由来の核酸に検出しようとする塩基配列が含まれる場合に、増幅産物として所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片が生じる。
【００８０】
核酸増幅反応による増幅産物を確認する方法は特に限定されない。例えば、核酸増幅反応終了後に、核酸増幅反応の反応液をゲル電気泳動により分画し、所定の標的領域を含むポリヌクレオチド断片に相当するサイズのバンドの有無を確認する方法や、増幅産物を標識し検出する方法が例示できる。また、核酸増幅反応を行いながらリアルタイムＰＣＲ法により増幅産物を検出することもできる。
【００８１】
＜３．本発明の第２の判別方法＞
本発明のタマネギの形質の判別方法は、第二に、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程を含み、
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されない場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法である。この方法を本発明の「第２の判別方法」とする。
【００８２】
第２の判別方法における第１検出工程は、第１の判別方法における第１検出工程と同様である。第２の判別方法における第１検出工程の具体的な実施形態は、第１の判別方法における第１検出工程における具体的な実施形態と同様である。
【００８３】
第２の判別方法における第１検出工程は、好ましくは、第１プライマー及び第２プライマーのうち少なくとも一方を含む第１プライマーセットを用い、タマネギの核酸を鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含む。第２の判別方法のこの実施形態における第１プライマー、第２プライマー、第１プライマーセット、第１核酸増幅反応、増幅産物の検出方法は、第１の判別方法について説明した通りである。
【００８４】
＜４．他の判別方法との組み合わせ＞
本発明の第１又は第２の判別方法は、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの他の判別方法と組み合わせて用いてもよい。複数種の判別方法を組み合わせることにより、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを正確に判別することができる。
【００８５】
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの他の判別方法としては、
ａ）タマネギ細胞破砕時におけるピルビン酸の生成が従来品種と比べて低減されている；
ｂ）タマネギ細胞破砕した後の残存ＰＲＥＮＣＳＯ量が従来品種と比べて多い；及び
ｃ）タマネギ細胞破砕時における催涙因子（ＬＦ）の生成が従来品種と比べて低減されている
の１以上の形質を指標として、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別することが挙げられる。
【００８６】
＜５．育種方法＞
本発明はまた、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを育種する方法であって、
タマネギを、本発明の第１又は第２の判別方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別されたタマネギを育種に用いること
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００８７】
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを素材の一つとして新品種を育種する場面において、本発明の第１又は第２の判別方法を用いて、交配により作出されたタマネギのなかから辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを正確に選抜することができる。選抜された辛み及び／又は催涙性の無いタマネギは、更なる育種に利用することができる。
【００８８】
＜６．プライマー、プライマーセット、キット＞
第１プライマー及び第２プライマーは、それぞれ、タマネギ由来の核酸における、配列番号１の塩基配列に相当する塩基配列を含む部分を特異的に増幅するためのプライマーとして有用である。
【００８９】
第１プライマーと第２プライマーとを含み、第１塩基と第２塩基とが同一である、或いは、第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とする第１プライマーセットは、タマネギ由来の核酸における、配列番号１の塩基配列に相当する塩基配列を含む部分を特異的に増幅するためのプライマーセットとして有用である。
【００９０】
第３プライマー及び第４プライマーは、それぞれ、タマネギ由来の核酸における、配列番号２の塩基配列に相当する塩基配列を含む部分を特異的に増幅するためのプライマーとして有用である。
【００９１】
第３プライマーと第４プライマーとを含み、第３塩基と第４塩基とが同一である、或いは、第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とする第２プライマーセットは、タマネギ由来の核酸における、配列番号２の塩基配列に相当する塩基配列を含む部分を特異的に増幅するためのプライマーセットとして有用である。
【００９２】
これらのプライマー又はプライマーセットのうち１以上を含むキットは、タマネギの形質を判別するためのキットとして有用である。当該キットは、更に、核酸増幅反応や増幅産物の確認に用いる各種要素（例えばＤＮＡポリメラーゼ、各種緩衝液、ｄＮＴＰｓ等）を含むことができる。
【００９３】
＜７．マーカー遺伝子＞
ｃＤＮＡ塩基配列が配列番号１の塩基配列を含むアリイナーゼ遺伝子１は、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギには存在せず、辛み及び／又は催涙性のある通常のタマネギには存在する。このため、アリイナーゼ遺伝子１は、タマネギの辛み及び／又は催涙性を検出するためのマーカー遺伝子として有用である。タマネギ由来の核酸においてアリイナーゼ遺伝子１が検出された場合には、該タマネギは辛み及び／又は催涙性を有すると判断することができ、タマネギ由来の核酸においてアリイナーゼ遺伝子１が検出されない場合には、該タマネギは辛み及び／又は催涙性を有さないと判断することができる。
【００９４】
＜８．更なる発明＞
本発明には更に以下のＡ〜Ｃの発明が含まれる。
Ａ．本発明の第１又は第２の判別方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであると判別された、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの植物体、若しくはその子孫、又はその部分。
Ｂ．以下の工程：
（ｉ）タマネギ種子に突然変異誘発処理を行う工程、
（ｉｉ）突然変異誘発処理したタマネギ種子を栽培してタマネギの植物体又はその部分を得る工程、並びに
（ｉｉｉ）得られたタマネギの植物体又はその部分より、本発明の第１又は第２の判別方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの植物体又はその部分を判別し、選抜する工程
を含む、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの植物体、若しくは、その子孫、又はその部分の製造方法。
Ｃ．本発明の第１又は第２の判別方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであると判別された、第一のタマネギの植物体と、第二のタマネギの植物体とを交配することを含む、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギの植物体、若しくはその子孫、又はその部分の製造方法。
Ａ〜Ｃの発明の具体的な態様は、特許文献１の記載を参照すればよい。
【実施例】
【００９５】
実施例1:タマネギの辛み・催涙性に関与するアリイナーゼの遺伝子配列の取得
特許文献1に記載の涙の出ない・辛みの無いタマネギ#6(タマネギ#6の種子はNCIMB 42219として国際寄託されている。以下「タマネギ#6」と称する)を3球、及び対照球としてタマネギ#6と同じ品種(以下「対照品種」と称する)で、且つ同じ回数の自殖を繰り返した辛みを有するタマネギ球(3球)を液体窒素で急速凍結した後、-80℃で凍結保存した。凍結した各タマネギ球の皮を剥ぎ、タマネギ組織100mgを測りとり、RNeasy Plant Mini kit (Qiagen社製)を用いて、添付のマニュアルに従ってtotal RNAを採取した。さらに採取したtotal RNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen社製)、及びRNase-Free DNase Set (Qiagen社製)を用いて、DNase処理を行った。処理後のtotal RNAは、Nanodrop (NanodropTechnologies社製)、及び Agilent 2100 Bioanalyzer (Aglent Technologies社製) による濃度測定・品質の確認を行った。品質確認において、サンプルのA260/A280が1.8以上、且つRNA Integrity Numberが8.0以上であることを確認し、TruSeq RNA Sample Prep Kit (illumina社製)を用いて添付マニュアルに従い、シーケンスライブラリーを調製した。調製したシーケンスライブラリーは次世代シーケンサHiSeq(illumina社製)を用いて、下記の条件でシーケンス解析を行った。
【００９６】
(シーケンス条件)
解析方法：Paired End、検体数：6、レーン数：3、読み取り塩基長：100塩基/リード
【００９７】
(データ処理)                            
得られたデータには、下記に挙げる情報処理を実施した。
・Chastityと呼ばれる計算式を用い、蛍光純度の低いデータを除去した。「Chastity」とは、4種類の塩基からのシグナル値の内、最大のものをI1、次のものをI2とした場合、「I1/(I1+I2)」で示す式で表され、本実施例では「I1/(I1+I2)>0.6」の条件でデータの選別を行った。
・選別したデータを、各検体固有Index情報により検体毎に振り分けた。
・アダプター配列を含むリードを除去し、さらにQuality Value20 以上の塩基を90％以上含むリードペアを抽出した。それら各検体のデータをすべて使用し、Trinity(URL: http://trinityrnaseq.sourceforge.net/index.html version 2013-02-25)を用いてDe novo アセンブルを行った。
・アセンブルデータ(推定Transcript配列)について、BLAST検索によるアノテーション付与を行った。アノテーションのプログラムにはBLASTXを、データベースには、NCBIのRefSeq-Fungi、RefSeq-Microbial、RefSeq-Plantのアミノ酸配列、及びNCBIの分類でAllieaeに登録されているアミノ酸配列と遺伝子配列をアミノ酸配列に変換した配列を統合したデータベースを用いた。BLASTXのパラメーターは、evalue 1E-5 / num_alignments 100 / outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qlen slen stitle qcovs qcovhsp"/その他はデフォルト条件を使用した。
【００９８】
結果、特許文献1に示される「アミノ酸配列5」を含むアリイナーゼをコードするcDNA塩基配列を取得した。「アミノ酸配列5」からなるアリイナーゼをコードするcDNA塩基配列を配列表の配列番号1に示す。
【００９９】
実施例2: 配列番号1の塩基配列がコードするアリイナーゼと相同性の高い他のアリイナーゼの配列取得
アリイナーゼをコードする配列番号1に示す塩基配列の開始コドンを含む末端部分に対応するフォワードプライマーと、前記塩基配列の終始コドンを含む末端部分に対応するリバースプライマーとを作製し、実施例1で用いたタマネギ#6及び対照品種から試料をそれぞれ100mg採取し、DNeasy Plant mini kit(Qiagen社製)を用いて添付マニュアルに従ってゲノムDNAを調製し、調製されたゲノムDNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。MultiNA電気泳動装置(株式会社島津製作所)を用いて増幅産物の解析を行った。プライマー塩基配列は以下の通りであり、プライマーの位置は図1-1及び図1-2に示す。
フォワードプライマー1：5’-ATGGAGTCTTACCACAAAGTTGGCAGT-3’(配列番号3)
リバースプライマー2：5’-GTAGCCCATACATGATCACAAACATGAAC-3’ (配列番号4)
【０１００】
増幅産物の電気泳動による分析結果を図2に示す。タマネギ#6、対照品種共に、同じサイズの増幅産物が確認された(図2)。増幅産物をダイレクトシーケンスした結果、タマネギ#6のゲノムDNAを鋳型とした場合の増幅産物は、エクソン部分において配列番号1の塩基配列と約95%の一致度を示す、配列番号1とは別の、配列番号2に示すゲノムDNA塩基配列を含むことが確認された(表1)。なお、配列番号1の塩基配列において、第1エクソンは第50位〜第339位であり、第2エクソンは第340位〜第651位であり、第3エクソンは第652位〜第935位であり、第4エクソンは第936位〜第1235位であり、第5エクソンは第1236位〜第1621位である。また、配列番号2の塩基配列において、配列番号1の第1エクソンに対応する部分は第1位〜第279位であり、配列番号1の第2エクソンに対応する部分は第391位〜第702位であり、配列番号1の第3エクソンに対応する部分は第804位〜第1087位であり、配列番号1の第4エクソンに対応する部分は第1188位〜第1487位であり、配列番号1の第5エクソンに対応する部分は第1591位〜第1975位である。一方で、対照品種のタマネギのゲノムDNAを鋳型とした場合の増幅産物は、cDNA塩基配列が配列番号1の塩基配列となる遺伝子のゲノムDNAの断片を含む増幅産物と、配列番号2の塩基配列を含むゲノムDNAの断片を含む増幅産物とが混在しており、ダイレクトシーケンスでは明瞭な結果は得られなかった。この結果から、対照品種のタマネギは、アリイナーゼ遺伝子として、cDNA塩基配列が配列番号1の塩基配列を含むアリイナーゼ遺伝子(以下「アリイナーゼ遺伝子1」と称する)と、ゲノムDNA塩基配列が配列番号2の塩基配列を含むアリイナーゼ遺伝子(以下「アリイナーゼ遺伝子2」と称する)との両方を有し、タマネギ#6は、アリイナーゼ遺伝子として、アリイナーゼ遺伝子2を有するが、アリイナーゼ遺伝子1を有さないことが示唆された。なお、アリイナーゼ遺伝子2は、それに対応するRNAが、実施例1のRNA-seq解析では検出されなかったことから、発現していない偽遺伝子だと考える。
【０１０１】
【表１】
2019058087.tif 000003
【０１０２】
実施例3:涙の出ない・辛みの無いタマネギと一般的なタマネギを判別可能なプライマーの作製
アリイナーゼ遺伝子1及びアリイナーゼ遺伝子2をそれぞれ特異的に検知するプライマーを作製するため、配列番号1、配列番号2及びGenBank Accession No. AAA32639.1のアリイナーゼ遺伝子の塩基配列を比較し、対応する位置であって、各プライマーの3'末端の1塩基以上が配列番号1の塩基配列及び配列番号2の塩基配列の一方のみと一致する、アリイナーゼ遺伝子1及びアリイナーゼ遺伝子2のうち一方のみを特異的に増幅するプライマーを作製した。またコントロールプライマーとして、配列番号1の塩基配列と配列番号2の塩基配列とに共通な部分にプライマーを作製した。各プライマーの塩基配列は表2に示し、プライマー位置は図7-1、7-2、8-1、8-2に記載した。
【０１０３】
【表２】
2019058087.tif 000004
【０１０４】
UF3プライマー(配列番号15)として、Yの位置がTであるものとCあるものとが混合したものを用いた。
【０１０５】
作製した各プライマーを用い、タマネギ#6及び対照品種の、実施例2で調製したゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、MultiNA電気泳動装置(株式会社島津製作所)を用いて増幅産物の解析を行った。結果を図3-1及び3-2に示す。図3-1及び3-2中に使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを示す。
【０１０６】
タマネギ#6のゲノムDNAを鋳型とした場合は、配列番号2の塩基配列に対応する増幅産物のみが得られ、対照品種のゲノムDNAを鋳型とした場合は、配列番号1の塩基配列に対応する増幅産物と配列番号2の塩基配列に対応する増幅産物の両方が得られた。この結果から、配列番号1の塩基配列を含むアリイナーゼ遺伝子1が検出できるか否かで、涙の出ないタマネギであるか対照品種であるかを判別できること、それを可能にするプライマーが作製できたと判断した。
【０１０７】
更に、上記プライマーの汎用性を確認するため、表2に示す市販のタマネギ14品種、上記対照品種及びタマネギ#6からのゲノムDNAを鋳型とし、上記プライマーの性能確認を行った。PCRの条件は上記と同様である。
【０１０８】
結果を図4に示す。図4における各レーンの番号は、表3の各番号のタマネギ品種に対応する。レーン1〜14が市販品種、レーン15が上記対照品種、レーン16がタマネギ#6の分析結果である。図4に示す結果から、市販品種14品種と対照品種はいずれアリイナーゼ遺伝子1とアリイナーゼ遺伝子2とを有していること、タマネギ#6はアリイナーゼ遺伝子2を有し且つアリイナーゼ遺伝子1を有していないことが確認できた。この結果は、上記プライマーを用いたタマネギ#6の判別方法は、品種に依存することなく広く適応可能であることを裏付ける。
【０１０９】
【表３】
2019058087.tif 000005
【０１１０】
実施例4: 検知法の利用
上記プライマーは、涙の出ない・辛みの無いタマネギ#6と有用形質を有する第二のタマネギとを一般的な交配方法にて交配した子孫の中から涙の出ない・辛みの無い且つ有用形質を取り込んだタマネギを選抜するために用いることができる。
【０１１１】
タマネギ#6と、肥大性が良い長日性タマネギを交配した。具体的には、タマネギ#6と肥大性が良い形質を有する雄性不稔長日性タマネギ(市販品種ではないHTA)を北海道の慣行法にて交配し、F1種子を得た。そのF1種子を播種し、北海道の慣行栽培法にてF1タマネギの球(F1球)を収穫した。収穫したF1球から自殖採種し、F2種子を得た。得られたF2種子を慣行法にて栽培し、F2タマネギの球(F2球)を得た。選抜は、F2球を栽培する過程において、4249球の葉をサンプルリングし、ゲノムDNAを抽出して鋳型とし、上記プライマーの内SF2-SR1、SF1-SR1、UF2-UR1の3セットを用いたPCRを実施した。そして、アリイナーゼ遺伝子2に対応する増幅産物が得られ、且つ、アリイナーゼ遺伝子1に対応する増幅産物が得られないF2球を選抜した。この基準で選抜されたF2球は、涙の出ない・辛みの無いタマネギ球と推定される。その結果、4249球から866球のタマネギを選抜した。図5に、複数のF2タマネギの葉からのゲノムDNAを鋳型としプライマーセットとしてSF2-SR1を用いたPCRによる増幅産物の検出結果の一例を示す。図5の上段はF2タマネギのサンプル名である。
【０１１２】
PCRでの選抜結果と表現系の一致を確認するため、上記検出において、アリイナーゼ遺伝子2の増幅産物が得られ、且つ、アリイナーゼ遺伝子1の増幅産物が得られなかったF2タマネギのF2球(「選抜球」と称する)の94球と、両方の増幅産物が得られたF2タマネギのF2球(「非選抜球」と称する)の30球について、官能評価、及び催涙性・辛みの指標であるピルビン酸量を測定した。ピルビン酸生成量の測定は、特許文献1に記載の方法を用いて行った。ピルビン酸生成量の測定結果を図6に示す。官能評価の結果、選抜球はすべて催涙性、辛みを感じなかった。また選抜球のピルビン酸生成量は1umol/g程度であり、特許第5671657号記載の涙の出ない・辛みの無いタマネギのピルビン酸生成量と同程度であった。一方、非選抜球は、官能評価において催涙性と辛みを感じ、ピルビン酸生成量は6umol/gよりも高い値であった。
【０１１３】
以上の結果は、本発明の検知法は、涙が出ない・辛みがないという形質を正しく選抜出来る方法であることを裏付ける。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、農業、食品製造等の分野において、辛みの無いタマネギを判別するために利用することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月19日(2018.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程、及び、
タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う第２検出工程を含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出され且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
【請求項２】
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第２検出工程が、前記核酸において、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の塩基を含む第２変異部位の検出を行うことを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含み、
第２検出工程が、
配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は、第３部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第３塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第３プライマー、及び／又は、配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は、第４部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第４塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第４プライマーを含む第２プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡを鋳型として第２核酸増幅反応を行うこと、並びに、第２核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程を含み、
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されない場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別すること、
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含み、第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にある第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むこと
を特徴とする方法。
【請求項５】
タマネギの形質の判別方法であって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりタマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
ａ）タマネギ細胞破砕時におけるピルビン酸の生成が従来品種と比べて低減されている；
ｂ）タマネギ細胞破砕した後の残存ＰＲＥＮＣＳＯ量が従来品種と比べて多い；及び
ｃ）タマネギ細胞破砕時における催涙因子（ＬＦ）の生成が従来品種と比べて低減されている
の１以上の形質を指標として、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること
を含む方法。
【請求項６】
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを育種する方法であって、
タマネギを、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別されたタマネギを育種に用いること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むプライマーと
を含み、
第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
配列番号２の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は、第３部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第３塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項９】
配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は、第４部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第４塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１０】
請求項８に記載のプライマーと、
請求項９に記載のプライマーと
を含み、
第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むプライマー、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる１０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むプライマー及び請求項７に記載のプライマーセットから選択される１つと、
請求項８に記載のプライマー、請求項９に記載のプライマー及び請求項１０に記載のプライマーセットから選択される１つと
を含む、タマネギの形質を判別するためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
（Ａ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘにおいて１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘと９０％以上の同一性を有する塩基配列である。
（Ｃ）塩基配列Ｙからなるポリヌクレオチドが、配列番号Ｘと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができる。
（Ｄ）塩基配列Ｘと塩基配列Ｙの一方における任意の位置のチミン（Ｔ）が、他方におけるウラシル（Ｔ）に置換されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
前記（Ａ）において「１若しくは数個」とは特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
前記（Ｂ）において、同一性はより好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
前記（Ｃ）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，４ｔｈ  Ｅｄ  （２０１２），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月20日(2018.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程、及び、
タマネギ由来の核酸において、配列番号２の塩基配列の検出を行う第２検出工程を含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されず且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出され且つ第２検出工程において配列番号２の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが、辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別することを特徴とする方法。
【請求項２】
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第２検出工程が、前記核酸において、配列番号２の塩基配列の、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の塩基を含む第２変異部位の検出を行うことを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び／又は、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって、配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含む第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含み、
第２検出工程が、
配列番号２の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって、第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は、第３部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第３塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第３プライマー、及び／又は、配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって、配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される１以上の第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は、第４部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第４塩基配列を３’末端に含むポリヌクレオチドを含む第４プライマーを含む第２プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡを鋳型として第２核酸増幅反応を行うこと、並びに、第２核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タマネギの形質の判別方法であって、
タマネギ由来の核酸において、配列番号１の塩基配列の検出を行う第１検出工程を含み、
第１検出工程が、前記核酸において、配列番号１の塩基配列の、第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される１以上の塩基を含む第１変異部位の検出を行うことを含み、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出されない場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別し、
第１検出工程において配列番号１の塩基配列が検出される場合に、前記タマネギが辛み及び／又は催涙性のあるタマネギと判別すること、
第１検出工程が、
配列番号１の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含む第１プライマー、及び、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマーを含み、第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にある第１プライマーセットを用いて、前記タマネギのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型として第１核酸増幅反応を行うこと、並びに、第１核酸増幅反応による増幅産物を確認することを含むこと
を特徴とする方法。
【請求項５】
タマネギの形質の判別方法であって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によりタマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
ａ）タマネギ細胞破砕時におけるピルビン酸の生成が従来品種と比べて低減されている；
ｂ）タマネギ細胞破砕した後の残存ＰＲＥＮＣＳＯ量が従来品種と比べて多い；及び
ｃ）タマネギ細胞破砕時における催涙因子（ＬＦ）の生成が従来品種と比べて低減されている
の１以上の形質を指標として、タマネギが辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること
を含む方法。
【請求項６】
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギを育種する方法であって、
タマネギを、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、辛み及び／又は催涙性の無いタマネギであるか否かを判別すること、及び、
辛み及び／又は催涙性の無いタマネギと判別されたタマネギを育種に用いること
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むプライマーと、
配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むプライマーと
を含み、
第１塩基が第２塩基よりも配列番号１の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
配列番号２の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第３部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第３塩基を３’末端から２塩基以内に含む第３部分塩基配列と同一又は、第３部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第３塩基配列を３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項９】
配列番号２の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第４部分塩基配列であって配列番号２の塩基配列の第３４位、第７０位、第１６６７位、第１７０３位、第１２７位、第４０９位、第９４３位及び第１８２２位から選択される第４塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第４部分塩基配列と同一又は、第４部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第４塩基配列を３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含むことを特徴とするプライマー。
【請求項１０】
請求項８に記載のプライマーと、
請求項９に記載のプライマーと
を含み、
第３塩基が第４塩基よりも配列番号２の塩基配列において５’末端側にあることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第１部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第１塩基を３’末端から２塩基以内に含む第１部分塩基配列と同一又は、第１部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第１塩基配列を３’末端に含む第１ポリヌクレオチドを含むプライマー、配列番号１の塩基配列の相補塩基配列に含まれる２０塩基以上の連続した第２部分塩基配列であって配列番号１の塩基配列の第９４位、第１３０位、第１３１２位、第１３４８位、第１８７位、第３５８位、第７９１位及び第１４６７位から選択される第２塩基と相補的な塩基を３’末端から２塩基以内に含む第２部分塩基配列と同一又は、第２部分塩基配列と３’末端から３塩基までの領域が同一であり且つ残りの５’末端側の領域が相同な第２塩基配列を３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含むプライマー及び請求項７に記載のプライマーセットから選択される１つと、
請求項８に記載のプライマー、請求項９に記載のプライマー及び請求項１０に記載のプライマーセットから選択される１つと
を含む、タマネギの形質を判別するためのキット。