(57)【要約】【課題】糖タンパク質から、標識された糖鎖を迅速に調製する技術を提供する。【解決手段】容器内で、糖タンパク質を固定化した固相から、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の１０体積％以下になるまで、液体を除去する液体除去工程と、前記液体除去工程後の前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内で、糖タンパク質を固定化した固相から、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の１０体積％以下になるまで、液体を除去する液体除去工程と、
前記液体除去工程後の前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、
を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項２】
前記遊離工程において、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の４０体積％以下になるまで、前記固相から液体を除去する、請求項１に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項３】
前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を更に含む、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項４】
前記液体除去工程の前に、前記糖タンパク質に酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項５】
前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤の存在下で行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項６】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、請求項４又は５に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項７】
前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素又はこれらのいずれかを含む複合体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【請求項９】
前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質から遊離糖鎖を調製するために、糖タンパク質から遊離させた糖鎖を、糖鎖に特異的に結合する担体に捕捉させて回収する方法が知られている。例えば、特許文献１には、糖タンパク質が保持された固相（具体的には電気泳動で用いられる泳動ゲル又はブロッティングメンブレン）を得る工程と、当該固相を糖鎖遊離手段で処理する工程と、遊離した糖鎖を当該固相から溶出させて糖鎖を含む溶液を得る工程と、当該糖鎖を含む溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて当該捕捉担体上に糖鎖を捕捉する工程と、当該捕捉担体に結合しなかった糖鎖以外の物質を除去する工程と、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る工程と、糖鎖を分析する工程とを含む、糖タンパク質糖鎖の分析方法が開示されている。この方法においては、糖鎖の再遊離をラベル化試薬との交換反応によって行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１５６５８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１のように電気泳動を用いる場合、泳動分離された糖タンパク質の検出のため、糖タンパク質のバンドを、ゲル上で同位体標識又は染色によって可視化するか、メンブレン上に転写させた後に抗原抗体反応又は染色によって可視化する工程が必要となる。このように、糖タンパク質の分離には多くの時間を要する。さらに、可視化のために用いた成分が糖タンパク質に混在するため、糖鎖遊離の酵素反応に影響を及ぼしたり、遊離後の糖鎖試料に混入したりする。したがって、糖鎖を得るためにはそのような成分の分離が必要となり更なる時間を要する。さらに、糖鎖を、その分析に適した標識基が付された修飾体として得るために、糖鎖をタンパク質から一旦分離した後に標識工程が行われる。このように、糖タンパク質から糖鎖を修飾体として得るためには非常に多くの時間を要する。
【０００５】
また、糖タンパク質を結合させて固定することが可能な固相（例えば、抗体を特異的に捕捉するプロテインＡセファロース）が知られているが、このような固相は、もっぱら糖タンパク質の精製に用いられる。つまり、このような固相は、糖タンパク質を捕捉して夾雑物から分離し、その後、捕捉した糖タンパク質を再び固相から遊離させるために用いられる。糖タンパク質から糖鎖を遊離させる工程は、このようにして精製された糖タンパク質に対して行われるため、糖鎖を得るためにはやはり時間を要する。
【０００６】
一方で、糖タンパク質からの糖鎖調製は、常に迅速化が求められている。そこで、本発明は、糖タンパク質から、標識された糖鎖を迅速に調製する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］容器内で、糖タンパク質を固定化した固相から、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の１０体積％以下になるまで、液体を除去する液体除去工程と、前記液体除去工程後の前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［２］前記遊離工程において、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の４０体積％以下になるまで、前記固相から液体を除去する、［１］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［３］前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を更に含む、［１］又は［２］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［４］前記液体除去工程の前に、前記糖タンパク質に酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む前処理剤を接触させる前処理工程を更に含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［５］前記遊離工程を、酸由来型陰イオン性界面活性剤の存在下で行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［６］前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤及びリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる、［４］又は［５］に記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［７］前記固相が、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体及び無機担体からなる群より選ばれる、［１］〜［６］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［８］前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素又はこれらのいずれかを含む複合体である、［１］〜［７］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
［９］前記糖タンパク質が抗体であり、前記固相が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐからなる群より選ばれるリガンドを表面に有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の糖タンパク質の糖鎖を調製する方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、糖タンパク質から、標識された糖鎖を迅速に調製する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）〜（ｇ）は、参考例１、実験例１〜６で得られたＨＰＬＣスペクトルである。
【図２】参考例１及び実験例３のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピークについて、ピーク面積の和を１００とした場合の各々のピークの面積比率を示すグラフである。
【図３】参考例２及び実験例７のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１１個のピークについて、ピーク面積の和を１００とした場合の各々のピークの面積比率を示すグラフである。
【図４】参考例１、実験例８〜１２のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。
【図５】参考例２、実験例１３〜１７のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例２における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。
【図６】参考例１〜３のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。
【図７】参考例１、実験例１８〜２３、対照１のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。
【図８】参考例２、実験例２４〜２９、対照２のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例２における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１実施形態において、本発明は、容器内で、糖タンパク質を固定化した固相から、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の１０体積％以下になるまで、液体を除去する液体除去工程と、前記液体除去工程後の前記糖タンパク質に糖鎖遊離酵素を作用させ、糖鎖を含む遊離生成物を得る遊離工程と、を含む、糖タンパク質の糖鎖を調製する方法を提供する。
【００１１】
（固相に固定された糖タンパク質を含む試料）
《糖タンパク質》
本実施形態の方法において、糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。糖タンパク質の糖鎖部分は、Ｎ−結合型であってもよく、Ｏ−結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。また、糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。また、糖タンパク質における糖鎖結合部位は、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
【００１２】
糖タンパク質のタンパク質部分は、変性前の状態において、糖鎖部分をその内部に取り込むようにフォールディングしていてもよい。このようなタンパク質部分の分子量は、例えば１ｋＤａ以上であってもよく、１０ｋＤａ以上であってもよい。タンパク質部分の分子量範囲内の上限は特に限定されず、例えば１０００ｋＤａであってもよい。
【００１３】
具体的な糖タンパク質としては、例えば、抗体、ホルモン、酵素又はこれらのいずれかを含む複合体からなる群より選ばれる生理活性物質が挙げられる。ここで、複合体としては、抗原と抗体との複合体、ホルモンと受容体との複合体、酵素と基質との複合体等が挙げられる。これらの糖タンパク質は細胞培養工学的に調製される生理活性物質であることから、得られる糖鎖部分は不均一な状態であり、糖鎖分析の時間を短縮することの意義が特に大きい。
【００１４】
また、糖タンパク質が抗体を含む場合は、糖鎖解析の重要性が特に高い。この場合、抗体の活性等に影響を及ぼす糖鎖を迅速に遊離することができる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）等の低分子抗体；Ｆｃ領域と他の機能性タンパク質又はペプチドとの融合により構成されるＦｃ融合タンパク質又はペプチド等のＦｃ含有分子；放射性同位元素配位性キレート、ポリエチレングリコール等の化学修飾基を付加した化学的修飾抗体等が挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００１５】
また、抗体は、抗体医薬品候補又は抗体医薬品であってもよい。抗体医薬品候補は、抗体医薬品の開発途上にある物質であり、抗体医薬品としての活性及び安全性等の評価に供される物質である。抗体医薬品候補から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の開発を迅速化することができ、抗体医薬品から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の品質管理を迅速化することができる。
【００１６】
《固相》
本実施形態の方法において、糖タンパク質は、固相に固定されている。固相としては、例えば、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体、無機担体等が挙げられる。固定の態様としては、特異的結合による非共有結合（水素結合及びイオン結合）、並びに共有結合が含まれ、例えば泳動ゲルにアプライ又はブロッティングメンブレンに転写されることより単に保持されるに過ぎない態様は含まれない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ｋａ（単位Ｍ−１ｓ−１）が、例えば１０３以上、例えば１０４以上、例えば１０３〜１０５、例えば１０４〜１０５の親和性を有することが好ましい。
【００１７】
糖タンパク質を固定している固相は、糖タンパク質のタンパク質部分と非共有結合的又は共有結合的に連結しているリンカーを表面に有する担体であれば特に限定されない。
【００１８】
担体がその表面に有するリンカーとしては、例えば、糖タンパク質のタンパク質部分を捕捉可能なリガンドが挙げられる。リガンドとしては、糖タンパク質のタンパク質部分に親和性のある分子（以下、単に糖タンパク質に親和性のある分子という場合がある。）、イオン交換基又は疎水性基が表面に化学的に修飾された担体が挙げられる。
【００１９】
糖タンパク質に親和性のある分子は特に限定されず、捕捉すべき糖タンパク質に応じて当業者が容易に決定することができる。例えば、ペプチド性又はタンパク質性リガンド、アプタマー（糖タンパク質に特異的に結合可能な合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ又はペプチド）、化学合成性リガンド（チアゾール誘導体等）が挙げられる。
【００２０】
例えば、糖タンパク質が抗体である場合、糖タンパク質に親和性のある分子は、抗体又は抗体の定常領域であるＦｃ含有分子に特異的に結合するものであってもよい。より具体的には、ペプチド性又はタンパク質性リガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ等の微生物由来リガンド；それらのリガンドの組換え発現により得られる機能的改変体（類縁物質）；抗体のＦｃレセプター等の組換えタンパク質等が挙げられる。これにより、糖鎖解析の重要性が特に高い抗体について、スループット性の高い糖鎖試料調製及び解析が可能となる。
【００２１】
イオン交換基は、イオン交換機能により糖タンパク質を捕捉可能であり、かつ、カウンターイオンによってイオン強度依存的に糖タンパク質を脱離可能である官能基であれば特に限定されない。好ましくは、カルボキシル基（より具体的には、カルボキシメチル基等）、スルホン酸基（より具体的には、スルホエチル基、スルホプロピル基等）等の陽イオン交換基が挙げられ、四級アミノ基等の陰イオン交換基であってもよい。
【００２２】
疎水性基としては、例えば、炭素数２〜８のアルキル基又はアリール基が挙げられる。より具体的には、ブチル基、フェニル基、オクチル基等が挙げられ、これらの基は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
担体がその表面に有するリンカーとしては、上記の他、糖タンパク質のタンパク質部分の構成要素であるＣ末端アミノ酸残基のＣ末端と共有結合した連結基であってもよい。このような連結基としては、ペプチド固相合成で用いられる固相表面修飾試薬であるアミノ基含有化合物から誘導される連結基が挙げられる。
【００２４】
担体は、水に不溶な基材であって、上記のリンカーを固定化できるものであれば特に限定されず、有機担体、無機担体及びそれらの複合担体が挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子；架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類からなる担体が挙げられる。これらは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。無機担体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、モノリスシリカ等が挙げられる。
【００２５】
有機担体が水を含みやすい性質であるのに対して、無機担体は水を含みにくい。本実施形態の方法では、固相上で種々の反応を行うため、水を含みにくい無機担体を用いることが好ましい。これにより、酵素及び／又は試薬の効果を希釈させないため好ましい。酵素及び／又は試薬の効果の希釈防止は、分析における不要なシグナルの検出の防止に寄与する。したがって、担体は無機担体であることが好ましい。また、担体が無機担体であると、例えば、糖鎖遊離酵素により担体の一部が遊離することがなく、糖由来の樹脂を使用した場合に初めから樹脂に残存する糖の溶出が起こることがない。このため、遊離された糖鎖の分析において、不要なシグナルの出現を抑制しやすい。
【００２６】
担体の形状としては特に限定されず、粒子状であってもよく、非粒子状であってもよい。粒子状の担体（ビーズ）の場合、多孔質担体であってもよい。粒子状の担体の場合、平均粒子径は例えば１〜１００μｍであってもよい。平均粒子径が上記下限値以上であることは、通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。
【００２７】
非粒子状の担体としては、モノリスタイプのシリカゲル及び膜体等が挙げられる。モノリスタイプのシリカゲルは、マイクロメートルサイズの三次元網目状細孔（マクロ孔）と、ナノメートルサイズの細孔（メソ孔）とを有する、シリカゲルのバルク体である。マクロ孔の径は例えば１〜１００μｍであってもよく、１〜５０μｍであってもよく、１〜３０μｍであってもよく、１〜２０μｍであってもよい。マクロ孔が上記下限値以上であることは通液性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましい。メソ孔の径は例えば１〜１００ｎｍであってもよく、１〜５０ｎｍであってもよい。これによって糖を効率的に捕捉することができる。
【００２８】
担体の使用体積（粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、充填時の空隙の体積も含み、非粒子状担体にあっては、担体自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む）は、例えば０．００１〜０．１ｃｍ３であってもよく、例えば０．００１〜０．０１ｃｍ３であってもよい。上記下限値以上であることは、理論断数の低下を防ぐ点で好ましく、上記上限値以下であることは、通液性の点で好ましい。また、上記の体積であることにより、溶出後の分離液を、ＨＰＬＣ分析に適した濃度で得ることも容易となる。
【００２９】
固相は、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等の容器の中に充填された状態で使用されてもよい。
【００３０】
（固相に固定された糖タンパク質を含む試料の調製）
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、例えば、糖タンパク質を含む試料を上記の固相に接触させて捕捉することにより得ることができる。固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料は、糖鎖調製を迅速に行う観点から、糖タンパク質の精製（糖タンパク質をその夾雑物から分離すること）が行われていないものであってもよい。例えば、血液（例えば、血清、血漿）、リンパ液、腹腔浸出液、組織間液、脳脊髄液、腹水等の体液；Ｂ細胞、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞等の抗体産生細胞の培養上清；抗体産生細胞を移植した動物の腹水等が挙げられる。試料は、培養上清等の細胞培養工学的な糖タンパク質の調製物のように、タンパク質部分が均一であり、かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってもよい。
【００３１】
固相に固定されたタンパク質を含む試料は、上記の他に、糖タンパク質の固相合成によって得られる生成物であってもよい。
【００３２】
固相に接触させるべき糖タンパク質を含む試料における糖タンパク質の濃度は特に限定されず、例えば、０．１μｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。上記下限値以上であることは、検出の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００３３】
固相に接触させるべき糖タンパク質は、容器１つあたり０．００１μｇ〜１００ｍｇであってもよく、０．００１μｇ〜５ｍｇであってもよい。糖タンパク質の量が上記下限値以上であることは検出の点で好ましい。本実施形態の方法は工程数が少なく試料のロスが非常に少ないため、糖タンパク質が小スケール（特に０．００１〜５００μｇ）である場合に特に有用である。糖タンパク質の量が上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００３４】
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、固相に固定された糖タンパク質が液体成分中に分散された状態で用意されてもよいし、液体成分が分離された状態で用意されてもよい。
【００３５】
また、固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、上記の糖タンパク質を含む試料を固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した時点、又は固相合成が完了した時点で、夾雑物を含み得る。夾雑物としては、固相に固定すべき糖タンパク質を含む試料に含まれていた成分、糖タンパク質の固相合成に用いた試薬等が挙げられ、より具体的には、塩、低分子化合物、タンパク質（当該固相への結合性を有さないタンパク質）その他の生体分子が挙げられる。
【００３６】
したがって、固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は固相合成が完了した後に、洗浄処理が行われたものであってよい。これによって、糖タンパク質を固相に固定したまま、共雑物を除去することができる。洗浄は、固相に洗浄液を通液させることによって行うことができる。通液の方法としては、自然落下、吸引、加圧、遠心等の方法が挙げられる。
【００３７】
洗浄液としては、糖タンパク質のタンパク質部分と固相表面のリンカーとの結合を切断しない液性及び組成のものが当業者によって適宜選択される。具体的には、緩衝液その他の水溶液又は水であってもよい。水溶液を用いる場合、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。水溶液のｐＨがこの範囲内であれば、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。また、糖タンパク質が非共有結合によって固相に固定されている場合には、糖タンパク質の遊離を防止しやすい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。
【００３８】
（容器）
固相に固定された糖タンパク質を含む試料は、容器内に用意される。固相に固定された糖タンパク質は、当該容器内で調製されることが効率的で好ましい。容器は、液体及び固相の保持並びに固相を保持した状態での液体の分離（通液）が可能な容器であれば特に限定されず、例えば、カラム、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等が挙げられる。
【００３９】
［液体除去工程］
本実施形態の方法では、糖タンパク質を固定化した固相から、前記固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の１０体積％以下になるまで、液体を除去する。
【００４０】
実施例において後述するように、発明者らは、液体除去工程を行うことにより、遊離糖鎖の回収率を格段に増加させることができることを明らかにした。液体除去工程は乾燥工程といいかえることもできる。
【００４１】
ここで、固相の体積とは、固相が粒子状担体である場合、担体自体の体積に、充填時の空隙の体積も含み、非粒子状担体である場合、担体自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む。
【００４２】
また、固相に含まれる液体としては、固相に固定された糖タンパク質を含む試料を調製する過程で持ち込まれた液体、洗浄操作を行った場合の洗浄液、後述する前処理剤等が挙げられる。
【００４３】
固相に含まれる液体の除去は、例えば、加熱により行ってもよいし、風乾により行ってもよいし、減圧により行ってもよいし、凍結乾燥により行ってもよいし、遠心により行ってもよい。
【００４４】
また、液体除去工程では、固相に含まれる液体の溶媒のみを除去してもよいし、溶媒とともに溶質（例えば、後述する前処理剤に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤）を除去してもよい。
【００４５】
液体除去工程は、例えば、固相を５０℃で１５分以上、例えば２０分以上、例えば２５分以上、例えば３０分以上、例えば６０分以上維持することにより行うことができる。
【００４６】
液体除去工程は、固相に含まれる液体の体積が固相の体積の１０体積％以下になるまで、好ましくは５体積％以下になるまで、より好ましくは３体積％以下になるまで行うとよい。固相に含まれる液体の体積は、例えば、固相を遠心分離した場合に固相から分離される液体の体積を測定することにより求めることができる。
【００４７】
［遊離工程］
遊離工程では、液体除去工程後の固相に固定された糖タンパク質に、糖鎖遊離酵素を作用させて糖鎖を遊離し、遊離生成物を得る。本工程は、化学的断片化又は酵素学的断片化等によるタンパク質の断片化工程を実質的に含まない。
【００４８】
（糖鎖遊離酵素）
糖タンパク質に作用させる糖鎖遊離酵素としては、ペプチドＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＮＧａｓｅ  Ａ）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｈ、Ｅｎｄｏ−Ｆ、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）等が挙げられる。
【００４９】
糖鎖遊離酵素は、水又は緩衝液中に分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。水又は緩衝液は、糖鎖遊離酵素とともに、金属塩等の塩類、グリセロール等のタンパク質の安定化剤等の成分を含有していてもよい。
【００５０】
（脱糖鎖促進剤）
遊離工程は、脱糖鎖促進剤の存在下で行われてもよい。これによって、糖タンパク質からの糖鎖試料の回収率を向上させることができる。脱糖鎖促進剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤により、糖タンパク質のタンパク質部分が変性して三次構造が変化し、糖鎖遊離酵素が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
【００５１】
酸由来型陰イオン性界面活性剤は、有機酸から誘導される陰イオン性界面活性剤である。例えば、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。中でも、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤が好ましい。酸由来型陰イオン性界面活性剤がカルボン酸型陰イオン性界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分を変性させるが、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向にあると考えられる。
【００５２】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤−カルボン酸型陰イオン性界面活性剤》
カルボン酸型陰イオン性界面活性剤としては、Ｒ１−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるカルボン酸及びカルボン酸塩、並びに、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤）等が挙げられる。中でも、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−はアミノ酸残基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるアミノ酸及びその塩（Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤）が好ましい。
【００５３】
陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。なお、以下の全ての酸由来型陰イオン性界面活性剤の例示において、「塩」は少なくともナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩を例示するものとする。
【００５４】
《カルボン酸型陰イオン性界面活性剤−カルボン酸及びカルボン酸塩》
Ｒ１−ＣＯＯＸで示されるカルボン酸塩において、有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
【００５５】
高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６〜１８であってもよい。このような高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基を有するカルボン酸型陰イオン性界面活性剤の具体例としては、オクタン酸塩、デカン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩等が挙げられる。また、上記の高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基は置換されていてもよく、置換基は炭素数が例えば１〜３０のアルキル基又はアルコキシカルボニル基であってもよい。
【００５６】
オキシアルキレン基が介在した炭化水素基においては、１以上のオキシアルキレン基が主鎖に含まれていてもよい。オキシアルキレン基は、オキシエチレン基、オキシ−ｎ−プロピレン基、オキシイソプロピレン基等が挙げられる。オキシアルキレン基が介在している炭化水素基としては、例えば、Ｒ４−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｒ５−で表される基が挙げられる。
【００５７】
ここで、Ｒ４は、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、又は置換若しくは無置換のアリール基であってもよい。高級アルキル基及び高級不飽和炭化水素基の炭素数は６〜１８であってもよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１〜３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。また、ｎは、１〜１０であってもよい。また、Ｒ５は、シグマ結合、又は、エチレン基、メチレン基、ｎ−プロピレン基等のアルキレン基であってもよい。このようなカルボン酸塩の具体例としては、ラウレスカルボン酸塩（例えば、ラウレス−４−カルボン酸塩、ラウレス−６−カルボン酸塩）トリデセスカルボン酸塩（例えば、トリデセス−４−カルボン酸塩、トリデセス−６−カルボン酸塩）等が挙げられる。
【００５８】
フッ素置換された高級アルキル基においては、１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている。フッ素置換された高級アルキル基は、全ての水素原子がフッ素で置換されたペルフルオロアルキル基であってもよい。また炭素数は、６〜１８であってもよい。このようなペルフルオロアルキルカルボン酸及びペルフルオロアルキルカルボン酸塩の具体例としては、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸塩、ペルフルオロノナン酸塩等が挙げられる。
【００５９】
《カルボン酸型陰イオン性界面活性剤−アミノ酸及びその塩》
Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸで示されるアミノ酸又はその塩において、有機基Ｒ１及び陽イオンＸは、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【００６０】
また、Ｒ２は、水素原子又はアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等）である。Ｒ３は、置換又は無置換のエチレン基、メチレン基、ｎ−プロピレン基等であってもよく、Ｎ末端側の窒素原子と共に環を形成していてもよい。したがって、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−で示されるアミノ酸残基は、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基等であってもよく、天然アミノ酸由来の残基であってもよく、非天然アミノ酸由来の残基であってもよい。例えば、サルコシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、β−アラニン残基等のアミノ酸由来の残基が挙げられる。
【００６１】
Ｒ２が水素原子である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ−アシルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ラウロイルアスパラギン酸塩、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸塩、Ｎ−ミリストイルグルタミン酸塩、Ｎ−ココイルアラニン塩、Ｎ−ココイルグリシン塩、Ｎ−ココイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルプロリン、Ｎ−パルミトイルプロリン塩、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン塩、Ｎ−ステアロイルグルタミン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ−アシルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をより変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【００６２】
Ｒ２がアルキル基である場合の当該アミノ酸又はその塩（つまりＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ミリストイルサルコシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−イソプロピルグリシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩、Ｎ−ココイルサルコシン、Ｎ−ココイルサルコシン塩、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−オレオイルサルコシン、Ｎ−オレオイルサルコシン塩、Ｎ−リノレイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイルサルコシン塩等が挙げられる。酸由来型陰イオン性界面活性剤がＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸系界面活性剤であると、糖タンパク質のタンパク質部分をさらに変性させやすく、糖鎖遊離酵素を変性させにくい傾向がある。
【００６３】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤−スルホン酸型陰イオン性界面活性剤》
スルホン酸型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるスルホン酸又はスルホン酸塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換又は無置換のアリール基、二価の連結基（例えば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基等が挙げられる。
【００６４】
有機基Ｒ１のうち、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、及び陽イオンＸについては、上記のカルボン酸又はカルボン酸塩における有機基Ｒ１及び陽イオンＸと同様である。
【００６５】
具体的には、１−ヘキサンスルホン酸塩、１−オクタンスルホン酸塩、１−デカンスルホン酸塩、１−ドデカンスルホン酸塩；ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩；テトラデセンスルホン酸塩；アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ（ＳＯ３Ｘ）ＣＯＯＣＨ３）等（ｎは、１〜３０の整数）が挙げられる。
【００６６】
有機基Ｒ１が置換又は無置換のアリール基である場合、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖又は分岐のアルキル基であってもよく、当該直鎖又は分岐のアルキル基の炭素数は１〜３０であってもよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてもよい。このような芳香属系スルホン酸塩としては、トルエンスルホン酸塩、クメンスルホン酸塩、オクチルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンジスルホン酸塩、ナフタレントリスルホン酸塩、ブチルナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。
【００６７】
有機基Ｒ１が、二価の連結基（例えば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−等）が介在した高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基である場合のスルホン酸型界面活性剤としては、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＯ−置換されたイセチオン酸塩、当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基でＮ−置換されたタウリン塩等が挙げられる。当該高級アルキル基又は高級不飽和炭化水素基の炭素数は、６〜１８であってもよい。このようなスルホン酸型界面活性剤の具体例としては、ココイルイセチオン酸塩、ココイルタウリン塩、ココイル−Ｎ−メチルタウリン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ステアロイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリン塩等が挙げられる。
【００６８】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤−硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤》
硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは陽イオンを表す。）で表される硫酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００６９】
硫酸エステル塩の具体例としては、ラウリル硫酸塩、ミリスチル硫酸塩、ラウレス硫酸塩（Ｃ１２Ｈ２５（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＯＳＯ３Ｘ、ここで、ｎは１〜３０の整数）、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム（Ｃ８Ｈ１７Ｃ６Ｈ４Ｏ［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］３ＳＯ３Ｘ）等が挙げられる。
【００７０】
《酸由来型陰イオン性界面活性剤−リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤》
リン酸エステル型陰イオン性界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（ここで、Ｒ１は有機基を表し、Ｘは水素原子又は陽イオンを表す。）で表されるリン酸エステル又はリン酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同様である。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００７１】
リン酸エステル又はリン酸エステル塩の具体例としては、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸塩等が挙げられる。
【００７２】
《脱糖鎖促進剤の組成》
脱糖鎖促進剤は、水又は緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤が溶解又は分散された状態で用意されてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。脱糖鎖促進剤において、水又は緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩等の塩類が挙げられる。
【００７３】
（遊離工程の操作及び反応条件）
遊離工程では、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。
【００７４】
脱糖鎖促進剤を用いる場合は、糖鎖遊離酵素の至適条件（温度及びｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と脱糖鎖促進剤と糖鎖遊離酵素とを含む遊離反応液が調製されればよい。したがって、脱糖鎖促進剤を用いる場合には、固定された糖タンパク質を含む試料（以下、単に糖タンパク質を含む試料という場合がある。）、脱糖鎖促進剤、及び糖鎖遊離酵素はどのような操作手順で混合されてもよい。
【００７５】
例えば、糖タンパク質を含む試料と、脱糖鎖促進剤と、糖鎖遊離酵素とを同じタイミングで互いに混合して遊離反応液を調製してもよい。また、先に脱糖鎖促進剤を加え、その後に糖鎖遊離酵素を加えることで遊離反応液を調製してもよい。さらに、固相に固定された糖タンパク質が後述する前処理を経て得られたものである場合で、かつ、脱糖鎖促進剤と前処理に用いられる界面活性剤とが同一物質である場合には、前処理の時に、脱糖鎖促進剤に相当する分量の界面活性剤を、前処理剤に相当する分量の界面活性剤に上乗せして先に加えておき、引き続く遊離工程で（すでに脱糖鎖促進剤が存在している状態であるため）糖鎖遊離酵素のみを加えてもよい。
【００７６】
具体的には、すべての成分を混合させた遊離反応液を調製し、その後、至適温度に設定して、糖タンパク質から糖鎖を遊離させる反応を行うことができる。この場合、反応時間は例えば５秒〜２４時間であってもよい。
【００７７】
脱糖鎖促進剤を用いる場合には、糖タンパク質を含む試料と、酸由来型陰イオン性界面活性剤とを先に混合して糖タンパク質のタンパク質部分を変性させた後に、糖鎖遊離酵素と混合してもよい。この場合、変性時間は例えば５秒〜２４時間であってもよく、糖鎖遊離時間は例えば５秒〜２４時間であってもよい。
【００７８】
遊離反応液において、糖タンパク質の濃度は、例えば０．１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、例えば１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。遊離反応液中の糖タンパク質の濃度が上記下限値以上であることは、検出性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００７９】
脱糖鎖促進剤を用いる場合、遊離反応液において、脱糖鎖促進剤（但し、硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤を除く。）の濃度は、例えば０．０１〜３０質量％であってもよく、例えば０．２〜１．０質量％であってもよく、例えば０．２〜０．３質量％であってもよく、例えば０．２２〜０．２７質量％であってもよい。あるいは、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、糖タンパク質１μｇに対して０．００１μｇ〜１００ｍｇ以下となるように用いてもよい。
【００８０】
脱糖鎖促進剤が硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤である場合、遊離反応液における脱糖鎖促進剤の濃度は、０．０２〜０．４質量％であることが好ましく、０．０４〜０．４質量％であることがより好ましく、０．０４〜０．２質量％であることが更に好ましい。
【００８１】
脱糖鎖促進剤の使用量を上記の範囲に設定することによって、糖鎖遊離酵素の活性維持の点及び遊離糖鎖の回収量の点で良好となり、かつ、回収量の安定性の点でも良好となる。また、例えば遊離糖鎖の精製を固相担体によって行う場合に、乾燥時間の冗長を防止する点でも好ましい。
【００８２】
遊離反応液において、糖鎖遊離酵素の濃度は、例えば０．００１μＵ／ｍＬ〜１０００ｍＵ／ｍＬであってもよく、例えば０．０１μＵ／ｍＬ〜１００ｍＵ／ｍＬであってもよい。あるいは、糖鎖遊離酵素を糖タンパク質１μｇに対して０．００１μＵ〜１０００ｍＵとなるように用いてもよい。糖鎖遊離酵素の使用量を上記の範囲に設定することによって、効率的な糖鎖遊離が可能となる。
【００８３】
反応ｐＨは、糖鎖遊離酵素の至適ｐＨに合わせればよいが、例えば５〜１０であってもよい。反応温度も、糖鎖遊離酵素の至適温度に合わせればよいが、例えば４〜９０℃であってもよい。
【００８４】
遊離工程において、糖鎖遊離酵素を作用させながら、又は糖鎖遊離酵素を作用させた後に、固相に含まれる液体の体積が前記固相の体積の４０体積％以下になるまで、固相から液体を除去することが好ましい。
【００８５】
この工程は、液体除去工程、乾燥工程ともいうことができる。ここで、固相の体積とは、上述した液体除去工程と同様であり、固相が粒子状担体である場合、担体自体の体積に、充填時の空隙の体積も含み、非粒子状担体である場合、担体自体の体積に、メソ孔及びマクロ孔の体積も含む。
【００８６】
液体の除去は、固相に含まれる液体の体積が固相の体積の４０体積％以下になるまで、好ましくは１０体積％以下になるまで、より好ましくは５体積％以下になるまで、特に好ましくは３体積％以下になるまで行うとよい。
【００８７】
固相に含まれる液体の体積は、例えば、固相を遠心分離した場合に固相から分離される液体の体積を測定することにより求めることができる。
【００８８】
好ましくは、遊離工程の反応系を開放系にして溶媒が蒸発するように加熱する。加熱温度としては、例えば４０℃以上、例えば４５℃以上であってもよい。これによって、遊離工程の進行中に溶媒が蒸発して反応液の濃度が徐々に上昇するため、本実施形態の方法に供された糖タンパク質のスケールにかかわらず、糖鎖遊離が効率的に進む濃度に供することが容易である。さらに、遊離反応とともに溶媒除去が併せて行われるため、遊離工程と別に溶媒除去工程を行うための時間が短縮され又は不要となり、更に迅速な糖鎖調製が可能となる。加熱温度の範囲内の上限としては、糖鎖遊離酵素の変性を防ぐ観点から、例えば８０℃であってもよい。
【００８９】
遊離工程において液体を除去することにより、遊離工程の前に液体除去工程を実施するか否かにかかわらず上記の効果を得ることができる。
【００９０】
（遊離生成物）
遊離工程によって得られる遊離生成物は、遊離した糖鎖と、固相に結合したタンパク質とを含む。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていない。遊離生成物は、溶媒を含む状態で得てもよいし、特に遊離工程において開放系かつ加熱条件に供する場合には、溶媒が完全に蒸発した蒸発乾固物の状態で得てもよい。
【００９１】
本実施形態の方法では、糖鎖が遊離する一方、タンパク質部分は固相に固定されたままであるため、当該固相を分離するだけでタンパク質部分が除去される。一方で固相を分離して得られる分離液は、遊離した糖鎖とともに前処理工程で用いられた硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤及び遊離工程で用いられた脱糖促進剤が共に溶存した混合液となっている。糖鎖の分析手法によっては、糖鎖が上述の界面活性剤等と共存している混合液の状態で分析に供してもよい場合もあるが、例えば質量分析等で分析する場合には、分析前に混合液から糖鎖を精製することが好ましい。
【００９２】
糖鎖を精製する場合、例えば、ヒドラジド基を有するポリマーを精製用固相担体として用い、当該精製用固相担体に混合液を接触させることができる。混合液中では、遊離糖鎖は環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡状態を生じており、このアルデヒド基−ＣＨＯとヒドラジド基−ＮＨ−ＮＨ２とが特異的に反応し、安定的な結合−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−を形成する。これによって、精製用固相担体に遊離糖鎖を捕捉することができる。
【００９３】
精製用固相担体に捕捉された糖鎖は、再遊離させられてもよい。再遊離の手法としては、酸と有機溶媒との混合溶媒又は酸と水と有機溶媒の混合溶媒を固相担体に接触させて反応させることが挙げられる。当該混合溶媒のｐＨは例えば２〜９であってもよく、２〜７であってもよく、２〜６であってもよい。弱酸性から中性付近で反応させる場合には、シアル酸残基の脱離等、糖鎖の加水分解を抑制することができる点で好ましい。しかしながら、さらにｐＨが低い強酸条件も許容される。
【００９４】
後述するように、遊離させた糖鎖は、低分子化合物（標識化合物）で修飾することができる。低分子化合物は、分析手法に応じて適宜選択することができる。なお、低分子化合物とは、固相担体を構成する高分子化合物と区別されるものであり、好ましくは水又は緩衝液、有機溶媒に溶解可能な化合物であることが好ましい。
【００９５】
［前処理工程］
本実施形態の方法は、液体除去工程の前に前処理工程を更に含むことが好ましい。前処理工程において、容器内で、固相に固定された糖タンパク質を含む試料に上述した酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む前処理剤を接触させる。前処理工程を備えることにより、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が容易になる。その結果、糖鎖遊離処理に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００９６】
前処理工程は、糖タンパク質を含む試料を固相に接触させ糖タンパク質の捕捉が完了した後、又は、固相合成が完了した後若しくは更に洗浄処理が行われた後であって、糖鎖遊離酵素に接触させられる前に行われる。前処理工程を実施することにより、遊離工程において糖タンパク質に糖鎖遊離酵素が作用しやすくなる。
【００９７】
前処理剤は、酸由来型陰イオン性界面活性剤が、水又は緩衝液中に溶解した状態で用いられる。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤；リン酸塩等が挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５〜１０であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であると、後の工程で用いる糖鎖遊離酵素の活性を保ちやすい。糖タンパク質を含む試料において、水又は緩衝液中に含まれる糖タンパク質以外の成分としては、金属塩等の塩類、グリセロール等のタンパク質の安定化剤等が挙げられる。
【００９８】
前処理剤中の酸由来型陰イオン性界面活性剤（但し、硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤を除く。）の濃度は、例えば０．０１〜３０質量％であってもよく、例えば０．２〜１．０質量％であってもよく、例えば０．２〜０．３質量％であってもよく、例えば０．２２〜０．２７質量％であってもよい。当該濃度が上記下限値以上であること、及び上記上限値以下であることによって、後の糖鎖遊離工程において遊離させた糖鎖を、良好な回収率で得ることができる。
【００９９】
前処理剤中の酸由来型陰イオン性界面活性剤が硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤である場合、硫酸エステル酸型陰イオン性界面活性剤の濃度は、例えば０．０２〜０．４質量％であることが好ましく、０．０４〜０．４質量％であることがより好ましく、０．０４〜０．２質量％であることが更に好ましい。当該濃度が上記下限値以上であること、及び上記上限値以下であることによって、後の糖鎖遊離工程において遊離させた糖鎖を、良好な回収率で得ることができる。
【０１００】
前処理剤は、固相に接触させた後は、固相に固定された糖タンパク質から分離される。分離は、所定の使用量の全てを容器内に入れた後に一度に行ってもよいし、所定の使用量の一部を何回かに分けて入れ、その都度行ってもよい。前処理剤の分離は、減圧又は遠心分離等によって行うことができる。
【０１０１】
前処理工程を終えた固相に固定された糖タンパク質は、迅速調製の観点で、洗浄されることなく後述の遊離工程に供することができる。しかしながら、前処理工程の後、遊離工程の前に洗浄操作を行ってもよい。
【０１０２】
［標識工程］
本実施形態の方法は、前記遊離生成物に標識試薬を加え、前記糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る標識工程を更に含んでいてもよい。標識工程は、遊離工程を行った容器と同じ容器を用いて行われてもよいし、異なる容器内で行われてもよい。標識工程では、遊離生成物に標識化合物を含む標識試薬（標識反応液）を加え、糖鎖の標識体を含む標識生成物を得る。
【０１０３】
（標識化合物）
標識化合物は、糖鎖に対する反応性基と、糖鎖に付すべき修飾基とを有するものであれば特に限定されない。糖鎖に対する反応性基としては、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基等が挙げられる。修飾基は、糖鎖の分析手法に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１０４】
例えば、標識化合物が、糖鎖への反応性基としてオキシルアミノ基又はヒドラジド基を有する場合、糖鎖に付すべき修飾基としては、例えば、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基、リジン残基からなる群より選ばれるアミノ酸残基を選択することができる。
【０１０５】
標識化合物がアルギニン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定時にイオン化が促進され、検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基は蛍光性かつ疎水性であることから、修飾された糖鎖の逆相ＨＰＬＣ検出時に、分離性が向上及び蛍光検出感度が向上する点で好ましい。標識化合物がフェニルアラニン残基及び／又はチロシン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＵＶ吸収による検出に適する点で好ましい。標識化合物がシステイン残基を含む場合、当該残基の−ＳＨ基を標的としてＩＣＡＴ試薬（米国ＡＢＩ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がリジン残基を含む場合、当該残基のアミノ基を標的としてｉＴＲＡＱ試薬（米国Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＥｘａｃＴａｇ試薬（米国Ｐｅｒｋｉｎ社）等のラベル化試薬によるラベル化ができる。標識化合物がトリプトファン残基を含む場合、当該残基のインドール基を標的としてＮＢＳ試薬（日本国、島津製作所）によるラベル化ができる。
【０１０６】
また、例えば、標識化合物が糖鎖への反応性基としてアミノ基を有する場合、糖鎖に付すべき修飾基としては、芳香族基が挙げられる。アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物の使用では、還元アミノ化による修飾が行われる。芳香族基は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有するため、ＵＶ検出又は蛍光検出での検出感度が向上する点で好ましい。
【０１０７】
このような芳香族基を与える標識化合物としては、具体的には、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸、７−アミノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸、２−アミノ−９（１０Ｈ）−アクリドン、５−アミノフルオレセイン、ダンシルエチレンジアミン、２−アミノピリジン、７−アミノ−４−メチルクマリン、２−アミノベンズアミド、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、７−アミノ−１−ナフトール、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン、２−アミノ−６−シアノエチルピリジン、エチル  ｐ−アミノベンゾエート、ｐ−アミノベンゾニトリル及び７−アミノナフタレン−１，３−ジスルホン酸が挙げられる。
【０１０８】
中でも、２−アミノベンズアミドは、反応スケールが大きい場合であっても夾雑物（例えば、塩、タンパク質その他の生体分子）の影響を比較的受けにくい点で好ましい場合がある。一方、本実施形態の方法は、反応スケールが小さい場合に特に有用である。反応スケールが小さいほど夾雑物の影響を受けにくくなるため、より多種多様の標識試薬（標識反応液）へ適用することができる。なお、標識化合物としての機能が維持される限りにおいて、上述の化合物の誘導体もまた好ましく用いられる。
【０１０９】
標識化合物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒に溶解させて使用される。緩衝液としては、前述の遊離工程で用いられるものと同様の緩衝剤の水溶液が挙げられる。有機溶媒としては、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び酢酸等の極性有機溶媒、並びにヘキサン等の非極性溶媒が挙げられる。
【０１１０】
還元アミノ化による修飾においては、糖鎖の還元末端に形成されるアルデヒド基と標識化合物のアミノ基とを反応させ、形成されたシッフ塩基を還元剤により還元することで糖鎖の還元末端に修飾基が導入されることで、効率的な標識が可能となる。
【０１１１】
還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボラン等が挙げられる。
【０１１２】
中でも、安全性及び反応性の両方の観点から、ピコリンボラン（２−ピコリンボラン）を用いることが好ましい。同様の観点から、ピコリンボランを還元剤として用いる場合、標識化合物としては例えば２−アミノベンズアミドを用いることが好ましい。
【０１１３】
（標識工程の操作及び反応条件）
標識工程では、遊離生成物に対して標識試薬（標識反応液）を加える。還元アミノ化による修飾を行う場合、標識試薬は、アミノ基及び芳香族基を有する標識化合物、還元剤、及び溶媒を含んでいてもよい。標識工程においては、遊離工程が行われた容器を引き続いて用いるが、標識試薬を加える際に、遊離生成物に対して洗浄等、その相対的組成（溶媒以外の成分比）を変化させる処置は行われない。なお、遊離生成物に対して、水、緩衝液及び／又は有機溶媒を加えて溶解又は希釈することは許容される。
【０１１４】
標識化反応系は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒を溶媒とし、当該溶媒中に糖鎖及び標識化合物を含む標識反応液が、固相に固定されたタンパク質、その他遊離工程の残存物と混在した状態で構築される。
【０１１５】
緩衝液としては、前述の遊離工程で用いられるものと同様の緩衝剤の水溶液が挙げられる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性有機溶媒、有機酸（ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等）及びアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール等）等のプロトン性極性有機溶媒、並びにヘキサン等の非プロトン性非極性溶媒が挙げられる。これらの溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１１６】
標識化反応液において、標識試薬（標識反応液）は、例えば担体の使用体積の０．１〜１０倍体積で用いてもよく、例えば０．５〜５倍体積で用いてもよい。また、標識試薬中の標識化合物の濃度は、例えば１〜２０Ｍであってもよく、例えば２〜１５Ｍであってもよい。標識化合物の量が上記下限値以上であることは標識が定量的に行われる点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【０１１７】
標識反応液中の還元剤の濃度は、例えば０．５〜１０Ｍであってもよく、例えば１〜７．５Ｍであってもよい。還元剤の量が上記下限値以上であることは標識が定量的に行われやすい点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【０１１８】
溶媒の量は、担体の使用体積の０．５〜１０倍体積で用いてもよく、例えば１〜５倍体積で用いてもよい。溶媒の量が上記下限値以上であることは溶解性の点で好ましく、上記上限値以下であることは標識が定量的に行われる点で好ましい。
【０１１９】
標識反応液の反応温度は例えば４〜８０℃であってもよく、例えば２５〜７０℃であってもよい。反応温度が上記下限値以上であることは反応時間が短くなる点で好ましく、上記上限値以下であることは高温による糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。標識反応液の反応時間は、例えば５〜６００分であってもよく、例えば３０〜３００分であってもよい。反応時間が上記下限値以上であることは定量的な標識の点で好ましく、上記上限値以下であることは糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
【０１２０】
標識化反応は常温で速やかに進むため、標識試薬（標識反応液）を加えたときから標識化合物が作用して糖鎖標識体が生成する。したがって、標識試薬を加えた後、当該反応の完了の如何によらず任意のタイミングで後述の分離工程を行うことができる。あるいは、遊離工程後に後述する分離工程を行って分離液を得、その後、分離液に標識試薬を加えてもよい。
【０１２１】
以下、還元剤としてピコリンボランを用いた場合について説明する。還元剤としてピコリンボランを用いた場合は、溶媒としてプロトン性溶媒を含むことが好ましい。これによって、標識化合物（好ましくは２−アミノベンズアミド。ピコリンボランを用いる場合において以下同様。）及びピコリンボランを高濃度で溶解することができるため、標識工程に要する時間が短縮される。
【０１２２】
すなわち、標識試薬（標識反応液）は、２−アミノベンズアミド、ピコリンボラン及び溶媒を含んでいてもよい。毒性の低いピコリンボランを用いることにより、安全性の高い標識が可能となる。
【０１２３】
標識工程に要する時間の短縮効果をより好ましく得る観点から、プロトン性溶媒は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等の有機酸であることが好ましい。また、有機酸は標識反応系中で液体であることが好ましい。中でも、操作容易性の観点から、有機酸は酢酸であることが好ましい。
【０１２４】
溶媒中のプロトン性溶媒の濃度は、例えば４０〜１００体積％であってもよい。これによって、良好な標識効率が得られる。より良好な標識効率を得る観点から、溶媒中のプロトン性溶媒の濃度は、５０〜１００％以下であってもよく、７５〜１００体積％であってもよい。
【０１２５】
上述したプロトン性溶媒の沸点が比較的低い場合（例えば沸点が１４０℃未満である場合）、プロトン性溶媒に加えて、当該プロトン性溶媒よりも沸点が高い溶媒を併用してもよい。これによって、標識工程における上記の比較的沸点が低いプロトン性溶媒の揮発速度を遅延させることができる。その結果、標識工程中に未反応物の不所望の析出を抑制することができる。このことによって、収量よく標識糖鎖を得ることができる。このような沸点が高い溶媒（以下、高沸点溶媒と記載する。）を併用する態様は、糖鎖のスケールが小さい場合、溶媒の量が少ない場合、及び／又は、反応時間が長くなる場合に選択することができる。
【０１２６】
上述の高沸点溶媒としては、例えば沸点１４０〜２００℃の非プロトン性溶媒であってもよい。具体的な高沸点溶媒としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン等が挙げられる。
【０１２７】
高沸点溶媒を併用する場合、その量は、前記標識化合物である２−アミノベンズアミド及び前記還元剤の溶解性・反応性を向上させるという観点から、プロトン性溶媒よりも体積％が低いことが好ましく、プロトン性溶媒の４体積％以上１００体積％未満であってもよく、４〜７０体積％であってもよい。高沸点溶媒の量が上記下限値以上であることは、プロトン性溶媒の揮発速度を遅延させやすい点で好ましく、上記上限値以下であることは、プロトン性溶媒の効果（前記標識化合物である２−アミノベンズアミド及び前記還元剤の溶解性・反応性を向上させる効果）を得やすい点で好ましい。
【０１２８】
還元剤としてピコリンボランを用いる場合には、溶媒として酢酸とジメチルスルホキシドとの混合溶媒を用いることが最も好ましい。
【０１２９】
還元剤としてピコリンボランを用いる場合には、標識試薬（標識反応液）中の標識化合物の濃度は１〜２０Ｍであってもよく、２〜１５Ｍであってもよい。標識化合物の濃度が上記下限値以上であることは標識工程の時間短縮の点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【０１３０】
標識反応液中のピコリンボランの量は、例えば０．５〜１０Ｍであってもよく、例えば１〜７．５Ｍであってもよい。ピコリンボランの量が上記下限値以上であることは標識工程の時間短縮の点で好ましく、上記上限値以下であることは過剰試薬の除去が容易になる点で好ましい。
【０１３１】
還元剤としてピコリンボランを用いた場合は、溶媒の量は、担体の使用体積の０．１〜１０倍体積であってもよく、０．５〜５倍体積であってもよい。溶媒の量が上記下限値以上であることは溶解性の点で好ましく、上記上限値以下であることは標識工程の時間短縮の点で好ましい。
【０１３２】
標識反応液の反応温度は例えば４〜８０℃であってもよく、例えば２５〜７０℃であってもよい。反応温度が上記下限値以上であることは反応時間が短くなる点で好ましく、上記上限値以下であることは高温による糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。標識反応液の反応時間は、例えば２〜１２０分であってもよく、例えば５〜４０分であってもよい。反応時間が上記下限値以上であることは定量的な標識の点で好ましく、上記上限値以下であることは糖鎖の部分分解が抑制される点で好ましい。
【０１３３】
（標識生成物）
標識工程後の容器内には、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質が存在する。したがって、標識工程によって得られる標識生成物は、糖鎖の標識体及び固相に結合したタンパク質を含むということもできる。固相に結合したタンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が依然として切断されていない。標識生成物は、水、緩衝液及び／又は有機溶媒中に含まれていてよい。
【０１３４】
［分離工程］
（糖鎖標識体の溶出）
標識工程の後、標識生成物から固液分離によって糖鎖の標識体を含む分離液を得る分離工程を行ってもよい。これにより、糖鎖の標識体を容易に分離することができる。例えば、標識生成物に溶離液を通液することで、糖鎖の標識体を溶出することができる。この場合に用いる溶離液は、水、水溶液、コロイド溶液等の水系溶液であってよい。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有する性質を具備するものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えばクロマトグラフィーによって行う場合等）し、そのような性質を具備しないものを選択してもよい（標識糖鎖の分析を例えば質量分析によって行う場合等）。これによって、糖鎖の標識体を含む分離液が得られる。
【０１３５】
分離液中には、糖鎖の標識体とともに、標識工程で用いた余剰の標識化合物、及び遊離工程で脱糖鎖促進剤を用いた場合には酸由来型陰イオン性界面活性剤等の不要物が存在している。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有するものを選択した場合は、分離液中にタンパク質も混入する。溶離液として、固相とタンパク質部分との結合に対する切断能を有さないものを選択した場合は、分離液中にタンパク質は実質的に含まれない。
【０１３６】
（精製）
糖鎖の分析手法によっては、分離液から不要物を除去することで標識糖鎖を精製してもよい。不要物の除去は、分離液を精製用固相に通液して糖鎖の標識体を捕捉し、捕捉された糖鎖の標識体を再溶出することで行われてよい。
【０１３７】
精製用固相の一例として、標識糖鎖を非共有結合によって捕捉する固相が挙げられる。具体的には、シリカゲルカラム、アミノカラム、その他の順相固相を用いることができる。
【０１３８】
精製用固相の他の例として、標識糖鎖を共有結合によって捕捉する固相が挙げられる。これによって、タンパク質が混在している場合等において標識糖鎖の精製度を向上させることができる。具体的には、ヒドラジド基を有するポリマーを精製用固相担体として用いることができる。分離液中では、遊離糖鎖は環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡状態を生じているため、このアルデヒド基−ＣＨＯとヒドラジド基−ＮＨ−ＮＨ２とが特異的に反応し、安定的な結合−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−を形成する。これによって、精製用固相担体に遊離糖鎖を捕捉することができる。再遊離では、酸と有機溶媒との混合溶媒又は酸と水と有機溶媒の混合溶媒を固相担体に接触させて反応させることができる。当該混合溶媒のｐＨは、例えば２〜９であってもよく、２〜７であってもよく、２〜６であってもよい。弱酸性から中性付近で反応させると、シアル酸残基の脱離等糖鎖の加水分解を抑制することができる点で好ましい。しかしながら、更にｐＨが低い強酸条件も許容される。
【０１３９】
［分析工程］
本実施形態の方法によって調製された糖鎖の標識体は、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィーやＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、キャピラリ電気泳動）等の公知の方法により、定性的及び／又は定量的に分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅ、ＳｉｍＧｌｙｃａｎ（登録商標）等）を利用することができる。
【０１４０】
このような糖タンパク質の糖鎖分析によって、例えば、抗体医薬品の研究開発、製造及び品質保証等の際に行われる抗体医薬品の糖鎖修飾分析；糖鎖バイオマーカーの検索研究等の際に行われる血清等の検体中の糖タンパク質の分析；幹細胞の糖鎖分析；電気泳動ゲルバンド中の糖鎖分析；植物組織の糖鎖分析等を迅速に行うことが可能となる。
【実施例】
【０１４１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１４２】
［参考例１、実験例１〜６］
（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ結合モノリスシリカ上での糖鎖遊離及び糖鎖標識）
《参考例１》
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に４０μｇのヒトＩｇＧ（シグマ社製）を溶解させた液を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを結合させたモノリスシリカ（使用体積は約５μＬ）に供し、ＰＢＳで洗浄した。
【０１４３】
続いて、１００μＬの０．４質量％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム（以下、「ＮＬＳ」という場合がある。）水溶液（前処理剤）を通液させた。その後５０℃で１０分間乾燥させた（液体除去工程）。
【０１４４】
続いて、１．５μＬの５００ｍＵ／ｍＬ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液（Ｔａｋａｒａ社製）及びＮＬＳを含む１．５μＬの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ溶液と混合された後のＮＬＳの終濃度は０．２質量％）を加え、５０℃で１５分間、糖鎖遊離反応を行い、糖鎖を遊離させた。
【０１４５】
その後、２０μＬの２ＡＢ溶液（６．７ｍｇの２−アミノベンズアミド、３．３ｍｇの２−ピコリンボラン、９．９９μＬの酢酸、及び３．３３μＬのＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを混合した溶液）を加え、５０℃で４０分間反応させた。
【０１４６】
続いて、卓上遠心機で遠心し、粗２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液を得た。得られた粗２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液にアセトニトリルを加えモノリスシリカスピンカラムにアプライし、洗浄した後、５０μＬの純水で溶出し、精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液を得た。
【０１４７】
続いて、得られた精製２ＡＢ標識糖鎖を含む分離液１μＬについて、下記表１に示す条件でＨＰＬＣ測定を行った。
【０１４８】
【表１】
2019058133.tif 000002
【０１４９】
表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整した。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ１分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ２分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ２−Ｔ１）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ１，Ｔ２，ａ，ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積％を表わす。なお、全工程（抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ−モノリスシリカへの吸着からＨＰＬＣ検出まで）にかかった時間は約３時間であった。
【０１５０】
《実験例１〜６》
前処理工程における前処理剤及び遊離工程における酵素反応液の組成を表２に示すものに変更した点以外は参考例１と同様にして、ヒトＩｇＧの糖鎖を遊離及び標識し、ＨＰＬＣ測定を行った。表２中、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを示し、濃度は終濃度を示す。
【０１５１】
【表２】
2019058133.tif 000003
【０１５２】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図１（ａ）〜（ｇ）に示す。図１（ａ）〜（ｇ）中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。図１（ａ）は参考例１の結果を示し、図１（ｂ）は実験例１の結果を示し、図１（ｃ）は実験例２の結果を示し、図１（ｄ）は実験例３の結果を示し、図１（ｅ）は実験例４の結果を示し、図１（ｆ）は実験例５の結果を示し、図１（ｇ）は実験例６の結果を示す。
【０１５３】
その結果、図１（ａ）〜（ｇ）に示すように、２ＡＢ標識糖鎖が検出されたことが確認された。また、特に、実験例１〜３、６において、参考例１と同様のピークパターンが得られたことが明らかとなった。
【０１５４】
また、図２は、参考例１及び実験例３のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１０個のピークについて、ピーク面積の和を１００とした場合の各々のピークの面積比率を示すグラフである。
【０１５５】
その結果、参考例１及び実験例３において、ピークパターンは大きく違わないことが確認された。具体的には、面積比率１０％以上を占めるピークでは、参考例１と実験例３のピーク面積の差は±１０％以下であった。しかしながら、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合、実験例３の糖鎖の収率は約５３％であることが明らかとなった。
【０１５６】
［参考例２、実験例７］
《参考例２》
ヒトＩｇＧの代わりに抗体医薬品であるＥｎｂｒｅｌを用いた点以外は参考例１と同様にして、Ｅｎｂｒｅｌの糖鎖を遊離及び標識し、参考例２のＨＰＬＣ測定を行った。
【０１５７】
《実験例７》
ヒトＩｇＧの代わりに抗体医薬品であるＥｎｂｒｅｌを用いた点以外は実験例３と同様にして、Ｅｎｂｒｅｌの糖鎖を遊離及び標識し、実験例７のＨＰＬＣ測定を行った。
【０１５８】
図３は、参考例２及び実験例７のＨＰＬＣスペクトルにおける主要な１１個のピークについて、ピーク面積の和を１００とした場合の各々のピークの面積比率を示すグラフである。
【０１５９】
その結果、参考例２及び実験例７において、ピークパターンが一部異なることが確認された。具体的には、面積比率２０％以上を占めるピーク１において、参考例２と実験例７のピーク面積の差が±１０％を超えたことが明らかとなった。また、参考例２における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合、実験例７の糖鎖の収率は約３５％であることが明らかとなった。
【０１６０】
［実験例８〜１２］
（液体除去工程の検討）
前処理工程における前処理剤及び遊離工程における酵素反応液の組成を表３に示すものに変更し、液体除去工程の条件を表３に示すものに変更した点以外は上述した参考例１と同様にして、ヒトＩｇＧの糖鎖を遊離及び標識し、実験例８〜１２のＨＰＬＣ測定を行った。表３中、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを示し、濃度は終濃度を示す。
【０１６１】
【表３】
2019058133.tif 000004
【０１６２】
図４は、参考例１、実験例８〜１２のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。その結果、液体除去工程を５０℃、３０分間とした場合においては、実験例８〜１２の糖鎖の収率が９５％以上に向上することが明らかとなった。
【０１６３】
なお、参考例１において、５０℃で１０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の２０体積％以下であった。また、実験例８〜１２において、５０℃で３０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の３体積％以下であった。また、参考例１と実験例８〜１２のピークパターンは大きく違わないことが確認された。
【０１６４】
［実験例１３〜１７］
（液体除去工程の検討）
ヒトＩｇＧの代わりに抗体医薬品であるＥｎｂｒｅｌを用いて実験例８〜１２と同様の検討を行った。前処理工程における前処理剤及び遊離工程における酵素反応液の組成を表４に示すものに変更し、液体除去工程の条件を表４に示すものに変更した点以外は上述した参考例２と同様にして、Ｅｎｂｒｅｌの糖鎖を遊離及び標識し、実験例１３〜１７のＨＰＬＣ測定を行った。表４中、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを示し、濃度は終濃度を示す。
【０１６５】
【表４】
2019058133.tif 000005
【０１６６】
図５は、参考例２、実験例１３〜１７のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例２における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。その結果、液体除去工程を５０℃、３０分間とした場合においては、実験例１３〜１７の糖鎖の収率が１０５％以上に向上することが明らかとなった。
【０１６７】
なお、参考例２において、５０℃で１０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の２０体積％以下であった。また、実験例１３〜１７において、５０℃で３０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の３体積％以下であった。また、参考例２と実験例１３〜１７のピークパターンは大きく違わないことが確認された。
【０１６８】
［参考例３、４］
（液体除去工程の検討）
液体除去工程の条件を表５に示すものに変更した点以外は上述した参考例１と同様にして、ヒトＩｇＧの糖鎖を遊離及び標識し、参考例１〜３のＨＰＬＣ測定を行った。表５中、濃度は終濃度を示す。
【０１６９】
【表５】
2019058133.tif 000006
【０１７０】
図６は、参考例１〜３のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。その結果、液体除去工程の時間が長いほど糖鎖の収率が向上することが明らかとなった。
【０１７１】
なお、参考例３において、５０℃で５分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の４０体積％以下であった。また、参考例１において、５０℃で１０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の２０体積％以下であった。また、参考例４において、５０℃で２０分間液体除去工程を実施した後に固相に含まれる液体の体積は、固相の体積の１０体積％以下であった。
【０１７２】
［実験例１８〜２３］
（ＳＤＳ濃度の検討）
前処理工程における前処理剤及び遊離工程における酵素反応液の組成を表６に示すものに変更し、液体除去工程の条件を表６に示すものに変更した点以外は上述した参考例１と同様にして、ヒトＩｇＧの糖鎖を遊離及び標識し、対照１、実験例１８〜２３のＨＰＬＣ測定を行った。表５中、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを示し、濃度は終濃度を示す。
【０１７３】
【表６】
2019058133.tif 000007
【０１７４】
図７は、参考例１、実験例１８〜２３、対照１のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例１における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。その結果、前処理剤におけるＳＤＳの濃度が０．０４〜０．４質量％の範囲において、糖鎖の収率が高い傾向が認められた。
【０１７５】
［実験例２４〜２９］
（ＳＤＳ濃度の検討）
ヒトＩｇＧの代わりに抗体医薬品であるＥｎｂｒｅｌを用いて実験例１８〜２３と同様の検討を行った。前処理工程における前処理剤及び遊離工程における酵素反応液の組成を表７に示すものに変更し、液体除去工程の条件を表７に示すものに変更した点以外は上述した参考例２と同様にして、Ｅｎｂｒｅｌの糖鎖を遊離及び標識し、対照２、実験例２４〜２９のＨＰＬＣ測定を行った。表７中、「ＳＤＳ」はドデシル硫酸ナトリウムを示し、濃度は終濃度を示す。
【０１７６】
【表７】
2019058133.tif 000008
【０１７７】
図８は、参考例２、実験例２４〜２９、対照２のＨＰＬＣスペクトルに基づいて、参考例２における糖鎖の収率（ピーク面積の合計）を１００％とした場合の糖鎖の収率を算出した結果を示すグラフである。その結果、前処理剤におけるＳＤＳの濃度が０．０４〜０．２質量％の範囲において、糖鎖の収率が高い傾向が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明によれば、糖タンパク質から、標識された糖鎖を迅速に調製する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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