(57)【要約】【課題】細胞の三次元構造体である細胞集塊を用いて、その形状をイメージングにより解析することによって当該細胞集塊の突起形成能を評価する方法の提供。【解決手段】細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、（ａ）蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において取得された平面断層画像を解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する工程と、を有する、細胞集塊の突起形成能評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
（ａ）蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において取得された平面断層画像を解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する工程と、
を有する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）において、焦点位置の異なる２枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において取得した２枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊の突起部を判別する、
請求項１に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、さらに、細胞骨格が蛍光標識された細胞集塊である、請求項１又は２に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、さらに、核酸が蛍光標識されており、かつ前記工程（ａ）において、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像も取得する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項５】
さらに、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析して、前記細胞集塊を構成する各細胞の生死を判別する工程を有する、請求項４に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている各突起の長さ、最大幅、又は枝分かれの有無に基づいて評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起１本当たりの長さの平均値、及び突起１本当たりの枝分かれの本数の平均値からなる群より選択される１種以上に基づいて評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項９】
前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１０】
前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と、当該細胞集塊の総体積との割合に基づいて評価する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１１】
前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）における突起部が蛍光物質で標識された細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものであり、
前記細胞集塊を外部から刺激した状態における突起形成能を評価する、請求項１１に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１３】
前記外部からの刺激が、生理活性物質であり、
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、生理活性物質を接触させた後に形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊である、請求項１２に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１４】
前記生理活性物質が、抗がん剤である、請求項１３に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【請求項１５】
前記外部からの刺激が、非電離放射線又は電離放射線であり、
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊の少なくとも一部に非電離放射線又は電離放射線を照射した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものである、請求項１２に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞集塊（スフェロイド）の形状をイメージング（画像）により解析することによって当該細胞集塊の突起形成能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞の遊走・浸潤能を評価するために、細胞浸潤アッセイ(Invasion assay)が広く採用されている。この細胞浸潤アッセイとしては、平面培養（単層培養）した細胞の浸潤を評価するシステムが主流である。平面培養細胞の浸潤アッセイとしては、例えば、上層と下層が、遊走・浸潤能を備える細胞のみが透過できる膜、例えばポリカーボネート膜で仕切られたボイデンチャンバーを使用し、この上層に細胞を播いて所定時間培養した後、下層に移動した細胞を比色法等で検出する方法が挙げられる。また、細胞容器底面の一部分にのみ細胞を播いて所定時間培養した後、培養開始時点には細胞が播かれていなかった部分の細胞を検出する方法が挙げられる。ただし、これらの細胞浸潤アッセイでは、細胞が生体内のように立体的な構造を形成している状態での遊走・浸潤能を評価することはできない。
【０００３】
一方で、最近の研究により、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が、癌の悪性進行において中心的な役割をしており、癌転移に関わることが報告されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。ＥＭＴは、上皮細胞が細胞極性や細胞接着能を失い、浸潤性や遊走性を獲得することで間葉系様細胞へと変化するプロセスである。このため、細胞の抗がん剤処理された状態における遊走・浸潤能を評価することが、抗がん剤に対する感受性評価に重要である。抗がん剤を評価する際には、がん組織の三次元構造から生じる微小環境における作用効果を評価することが望まれるが、従来の平面培養した細胞を用いた細胞浸潤アッセイでは、がん組織の微小環境は再現できない。そこで、生体内のがん組織の微小環境を模した三次元構造のがん細胞の遊走・浸潤能を評価する方法が望まれている。
【０００４】
細胞の三次元構造体を用いて細胞の遊走・浸潤能を評価する方法も幾つか報告されている。例えば、非特許文献１には、ゲルで包埋されたがん細胞の細胞集塊を培養して突起構造を形成させた後、当該細胞集塊を上方から透過光顕微鏡で撮像し、得られた透過光平面画像における形成された突起構造領域の面積値に基づいて、遊走・浸潤能を評価する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−１７８３５号公報
【特許文献２】特開２０１７−１１３０００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Berens et al.，Journal of Visualized Experiments，2015，Nov 20;(105)． doi:10.3791/53409.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞の三次元構造体である細胞集塊を用いて、その形状をイメージングにより解析することによって当該細胞集塊の突起形成能を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記の細胞集塊の突起形成能評価方法を提供する。
［１］  細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、
（ａ）蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において取得された平面断層画像を解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する工程と、
を有する、細胞集塊の突起形成能評価方法。
［２］  前記工程（ａ）において、焦点位置の異なる２枚以上の前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得し、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において取得した２枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築し、当該立体画像を解析して前記細胞集塊の突起部を判別する、
前記［１］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［３］  前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、さらに、細胞骨格が蛍光標識された細胞集塊である、前記［１］又は［２］に記載の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［４］  前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、さらに、核酸が蛍光標識されており、かつ前記工程（ａ）において、前記核酸から発される蛍光の平面断層画像も取得する、前記［１］〜［３］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［５］  さらに、前記細胞集塊の核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析して、前記細胞集塊を構成する各細胞の生死を判別する工程を有する、前記［４］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［６］  前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている各突起の長さ、最大幅、又は枝分かれの有無に基づいて評価する、前記［１］〜［５］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［７］  前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起１本当たりの長さの平均値、及び突起１本当たりの枝分かれの本数の平均値からなる群より選択される１種以上に基づいて評価する、前記［１］〜［５］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［８］  前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、当該細胞集塊の総体積と当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、前記［１］〜［５］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［９］  前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合に基づいて評価する、前記［１］〜［５］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１０］  前記工程（ｃ）において、前記細胞集塊の突起形成能を、前記突起部の体積と当該細胞集塊の総体積との割合に基づいて評価する、前記［１］〜［５］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１１］  前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている、前記［１］〜［１０］のいずれかの細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１２］  前記工程（ａ）における突起部が蛍光物質で標識された細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものであり、
前記細胞集塊を外部から刺激した状態における突起形成能を評価する、前記［１１］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１３］  前記外部からの刺激が、生理活性物質であり、
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、生理活性物質を接触させた後に形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊である、前記［１２］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１４］  前記生理活性物質が、抗がん剤である、前記［１３］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
［１５］  前記外部からの刺激が、非電離放射線又は電離放射線であり、
前記工程（ａ）において撮像される前記細胞集塊が、ゲルに包埋されている細胞集塊の少なくとも一部に非電離放射線又は電離放射線を照射した後に、当該細胞集塊に形成された突起部を蛍光物質で標識したものである、前記［１２］の細胞集塊の突起形成能評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る細胞集塊の突起形成能評価方法では、細胞集塊を蛍光標識し、個々の細胞が識別可能な解像度で蛍光画像を撮像し、得られた蛍光画像をイメージング解析することにより突起部を判別する。このため、本発明に係る細胞集塊の突起形成能評価方法により、立体的構造を形成している状態における細胞の突起形成能を定量的に、かつ遺伝子解析等よりも簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、生死判定試薬で処理した抗がん剤未処理サンプルとＢａｔｉｍａｓｔａｔ処理サンプルの二値化画像である。
【図２】実施例１において、アクチン蛍光染色した抗がん剤未処理サンプルの二値化画像である。
【図３】実施例１において、各抗がん剤で処理した細胞集塊の立体画像から測定した中心球体積比（［細胞集塊の略球状の中心部の体積（ボクセル）］）／［細胞集塊の総体積（ボクセル）］）の結果を示した図である。
【図４】実施例１において、各抗がん剤で処理した細胞集塊の平面断層画像から測定した中心球体積比（［細胞集塊の略球状の中心部の体積（ボクセル）］）／［細胞集塊の総体積（ボクセル）］）の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る細胞集塊の突起形成能評価方法（以下、「本発明に係る突起形成能評価方法」ということがある。）は、細胞集塊の突起形成能を評価する方法であって、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する。
（ａ）蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する工程。
（ｂ）前記工程（ａ）において取得された平面断層画像を解析して、前記細胞集塊の突起部を判別する工程。
（ｃ）前記工程（ｂ）において判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する工程。
【００１２】
本発明においての突起形成能が評価される対象の細胞集塊は、細胞集塊が構築可能な接着性細胞であれば特に限定されるものではない。当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、例えば、動物から採取された細胞そのものであってもよく、初代培養細胞であってもよく、さらに継代培養された細胞であってもよく、動物から採取された細胞やそれを培養した細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。当該細胞集塊を構築する接着性細胞が由来する生物種は、動物であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物としては、サル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等の実験動物、家畜、又は愛玩動物である動物が好ましい。
【００１３】
当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の多分化能を備えた細胞であってもよく、多分化能を備えた細胞から分化誘導して得られた細胞であってもよい。また、生殖細胞であってもよく、上皮細胞、肝細胞、筋細胞などの分化後の成熟した体細胞であってもよい。
【００１４】
当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、正常細胞であってもよく、がん細胞のようにいずれかの生理機能に異常が生じている細胞であってもよく、いずれかの生理機能に異常が生じている細胞と正常細胞との両方であってもよい。ＥＭＴが生じたがん細胞は、浸潤能が高く、特にゲルに包埋された状態でも突起を形成することができる。そこで、例えば、がん細胞に対して本発明に係る突起形成能評価方法を実施してその突起形成能を評価することにより、当該がん細胞のＥＭＴの有無をも評価することができる。
【００１５】
本発明においての突起形成能が評価される対象の細胞集塊は、１種類の細胞のみから構築されていてもよく、２種類以上の細胞から構築されていてもよい。２種類以上の細胞から構築される場合、同種の生物種由来の細胞のみから構築された細胞集塊であってもよく、２種以上の生物種由来の細胞から構築された細胞集塊であってもよい。
【００１６】
本発明においての突起形成能が評価される対象の細胞集塊は、常法により構築することができる。具体的には例えば、内壁表面が細胞低接着性のＵ底培養用容器に、所定の数の細胞を含む細胞懸濁液を注入し、所定時間静置することによって、細胞集塊を形成することができる。当該Ｕ底培養用容器としては、スフェロイド形成に一般的に用いられている市販の細胞培養用容器や、ウェルの底面及び内壁面を細胞低接着性物質でコートしたウェルプレート等を用いることができる。
【００１７】
本発明においての突起形成能が評価される対象の細胞集塊は、突起を形成させる前に、予めゲルに包埋させておくことが好ましい。ゲルに包埋させることにより、元々の細胞集塊から新たに形成された突起部をより明確に判別することができる。
【００１８】
細胞集塊を包埋するゲルとしては、１種以上の細胞外マトリックスを構成する成分により構築されるゲルであることが好ましい。細胞集塊を細胞外マトリックスからなるゲルで包埋させることにより、生体内の細胞環境を模すことができ、より生体内に近い環境下での突起形成能を評価することができる。細胞外マトリックスを構成する成分としては、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。特に、がん細胞のような、細胞外マトリックスに対する浸潤能が突起形成能に大きく影響する細胞の細胞集塊の突起形成能を評価する場合には、突起形成前の細胞集塊は、細胞外マトリックスからなるゲルに包埋させておくことが好ましい。浸潤能を加味して突起形成能を評価することができるためである。
【００１９】
細胞集塊のゲルへの包埋は、常法により行うことができる。例えば、構築された細胞集塊を含む細胞培養用容器に、溶融させた状態のゲルを当該細胞集塊全体が浸漬するために充分な量注入し、静置してゲルを硬化させることにより、細胞集塊をゲルに包埋させることができる。当該ゲルとしては、細胞外マトリックスを構成する成分を含み、細胞培養のための基材に使用される市販のゲルを用いることもできる。
【００２０】
突起形成能を有する細胞を含む細胞集塊を充分な時間培養すると、突起が形成される。細胞集塊の培養は、当該細胞集塊を構成する細胞と同種の細胞を平面培養する場合と同様にして培養することができる。例えば、ゲルに包埋された細胞集塊は、細胞集塊を構成する細胞と同種の細胞を平面培養する場合に一般的に用いられる細胞培養用液体培地に浸漬させた状態で、二酸化炭素濃度又は酸素濃度が制御された環境下、２５〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃で培養することができる。培養環境の二酸化炭素濃度及び酸素濃度は、培養する細胞の種類等を考慮して適宜調整することができる。培養環境としては、例えば、二酸化炭素濃度が４〜６容量％、酸素濃度が１〜２２容量％の範囲内で制御されていることが好ましい。
【００２１】
細胞集塊を蛍光物質で標識した後、蛍光顕微鏡を用いて前記蛍光物質から発される蛍光で撮像し、得られた蛍光平面断層画像を画像解析することによって、突起部を細胞集塊のその他の部分から分割して判別する（工程（ａ）及び（ｂ））。このため、細胞集塊の蛍光標識は、少なくとも、突起部を構成する細胞と、細胞集塊のうちの突起が形成されなかった略球体部分と突起部との境界部分の細胞とが蛍光標識されていればよく、細胞集塊を構成する全細胞が蛍光染色されていることが好ましい。
【００２２】
突起部を判別するための細胞集塊の蛍光標識は、突起部を形成している細胞の生体分子に、これらに特異的に結合する物質を介して蛍光物質を結合させることにより行う。例えば、突起を形成させるための培養を行った後の細胞集塊を、当該細胞集塊を構成する細胞中に存在する生体分子に対する抗体を用いて蛍光免疫染色することにより、細胞集塊を蛍光標識することができる。蛍光免疫染色は常法により行うことができる。
【００２３】
突起部を判別するために蛍光標識される生体分子としては、突起部を形成している細胞内に存在している生体分子であれば特に限定されるものではない。本発明に係る突起形成能評価方法においては、アクチン、チューブリン等の細胞骨格を構成する生体分子や、リン脂質等の細胞膜を構成する生体分子に蛍光物質を結合させて蛍光標識した細胞集塊が好ましい。細胞骨格や細胞膜は細胞の辺縁部にあるため、これらの生体分子を蛍光標識することにより、突起の先端部をより明確に判別することができる。なかでも、細胞骨格を構成する生体分子を蛍光標識することがより好ましく、アクチンを蛍光標識することがさらに好ましい。細胞骨格、特にアクチン繊維は、遊走又は浸潤する細胞内において、細胞の運動方向に向かって伸長する。このため、アクチンを蛍光標識することにより、突起を形成する細胞の運動方向、すなわち突起の伸長方向をも解析することができる。
【００２４】
細胞集塊を構成するための細胞について、予め、細胞骨格を構成する生体分子や細胞膜を構成する生体分子を蛍光標識しておいてもよい。例えば、アクチンをＧＦＰ等の蛍光タンパク質と融合したキメラタンパク質を恒常的に発現させた形質転換細胞を用いて細胞集塊を構成し、これを培養することによって、アクチンが蛍光標識されることによって突起部が蛍光標識された細胞集塊が得られる。また、細胞質全体が蛍光標識されている形質転換細胞により構成された細胞集塊を、本発明に係る突起形成能評価方法で評価してもよい。例えば、特定のオルガネラに局在せず、細胞質全体に存在する蛍光タンパク質を恒常的に発現させた形質転換細胞は、細胞質全体が蛍光標識される。
【００２５】
工程（ａ）においては、蛍光標識された細胞集塊を、突起部の標識に用いた蛍光物質の励起光の照射下の蛍光顕微鏡で撮像し、当該蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する。この際、個々の細胞が識別可能な解像度の平面断層画像を取得する。蛍光顕微鏡としては、例えば、光電子増倍管等の検出器が取り付けられた共焦点レーザー顕微鏡やライトシート顕微鏡等を用いることができる。突起部を構成する各細胞が個別に識別可能な平面断層画像を画像解析することによって、より解像度の低い平面断層画像に基づく場合よりも、突起部がより明確に判別でき、また、突起部の構造についてより詳細に分析することができる。例えば、各突起部を形成する細胞の数や、どのように配置された細胞によって突起部が形成されているのかなどの情報も、画像解析により取得できる。
【００２６】
また、突起部を形成する細胞について、その形状を判別するための蛍光標識以外に、細胞の生理学的な状態や生理活性を解析するために有用な生体分子の蛍光標識も行い、それぞれの蛍光の平面断層画像を取得することが好ましい。具体的には、工程（ａ）において取得した平面断層画像と同一の顕微鏡視野について、それぞれの蛍光の励起光を順次照射し、各蛍光の平面断層画像を撮像する。取得された高解像度の平面断層画像の画像解析を行うことにより、突起部を構成するそれぞれの細胞の生理学的な状態や生理活性をも解析することができる。このように、本発明に係る突起形成能評価方法においては、個々の細胞が識別可能な解像度で撮像された蛍光平面断層画像を画像解析するため、突起を形成する細胞の生理学的な状態や活性もより詳細に解析することができる。
【００２７】
突起部の形状を判別するためではなく、細胞の生理学的な状態や生理活性を判別するために蛍光標識される生体分子としては、核酸が挙げられる。細胞内の核酸を蛍光標識することにより、主に細胞核が蛍光染色される。つまり、核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析することにより、細胞核の形状、１細胞当たりに含まれている細胞核の数なども判別することができ、細胞のおおよその細胞周期を判別することもできる。また、細胞集塊の各局所領域における細胞密度を測定することもできる。核の蛍光染色には、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、７−ＡＡＤ（７Ａｍｉｎｏ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）等の公知の蛍光性核酸染色剤の中から、適宜選択して用いることができる。また、核酸から発される蛍光の平面断層画像から細胞核領域を決定する画像解析は、例えば特開２０１１−７５２７８号公報に記載の方法等の公知の画像解析方法を利用して行うことができる。
【００２８】
また、細胞骨格や細胞膜などの細胞の辺縁部を蛍光標識することと同時に、生細胞の細胞核中の核酸と、死細胞の細胞核中の核酸を、それぞれ異なる蛍光で標識することも好ましい。核酸から発される蛍光の平面断層画像を解析することによって、細胞集塊を構成する細胞の生死状態を判別することができる。この場合には、生細胞の細胞核のみを染色してもよく、死細胞の細胞核のみを染色してもよい。また、生細胞の細胞核と死細胞の細胞核の蛍光染色は、市販されている生死判定試薬（例えば、「Nuclear ID green/ red生死判定試薬（ＥＮＺＯ社製）」など）を用いる等の常法により行うことができる。
【００２９】
工程（ａ）において取得する平面断層画像は、一顕微鏡視野につき、１枚であってもよいが、蛍光顕微鏡の焦点位置が異なる平面断層画像を２枚以上取得することが好ましく、細胞集塊の焦点位置が最小となる位置から最大となる位置までを等間隔で順次焦点位置を移動させて一連の平面断層画像群を取得することが特に好ましい。例えば共焦点レーザー顕微鏡では、共焦点領域を細胞集塊の高さ方向（Ｚ軸方向）へ少しずつずらしながら（対物レンズと細胞集塊とを光軸に対して直交する方向に相対的に移動させながら）、当該細胞集塊のＺ軸方向に直交する断面の平面断層画像を順次撮像することによって、焦点位置の異なる複数枚の平面断層画像を取得することができる。
【００３０】
この取得された一連の平面断層画像群を互いに重ね合わせることにより、細胞集塊の立体画像を構築することができる。この一連の平面断層画像群を取得する際の各平面断層画像の焦点位置の距離は、各平面断層画像をより滑らかに重ね合わせられるように、細胞集塊を構成する細胞よりも小さいことが好ましく、例えば、０．５〜５μｍとすることができる。一連の平面断層画像群からの立体画像の構築は、例えば、ＣＴ（コンピュータ断層撮影法）等の技術分野において公知の画像構築法により行うことができる。
【００３１】
細胞集塊の様々な方向に対して突起は形成されるため、１枚の平面断層画像には、細胞集塊の突起部の一部分しか表れていない。これに対して、構築された細胞集塊の立体画像に基づいて突起部を判別することにより、細胞集塊のあらゆる方向に向かって形成された突起部を判別でき、ひいては、細胞集塊を構成する細胞の突起形成能をより精確に評価することができる。
【００３２】
取得された平面断層画像又は構築された細胞集塊の立体画像を画像解析することにより、細胞集塊の突起部を判別する（工程（ｂ））。本発明においては、細胞集塊に形成された突起部を画像解析により判別するため、形成される突起部の本数や方向性、形状について定量化しやすい。また、細胞集塊中の個々の細胞が可視化されているため、突起部の形態や、突起部を構成する細胞の形態や運動性について、詳細な解析を行うこともできる。細胞集塊の突起部を判別する画像解析は、例えば、特開２００９−６３５０９号公報に記載の方法を利用して行うことができる。
【００３３】
具体的には、以下の方法で、立体画像から細胞集塊の突起部を判別することができる。まず、立体画像の画素（ボクセル）当たりの蛍光輝度値に基づき、予め設定しておいた閾値（蛍光標識された領域と蛍光標識されていない領域を区別するための閾値）を用いて二値化処理を行う。得られた二値化画像を、一画像に細胞集塊全体が収まる程度に縮小した画像を、突起部解析用画像とする。この突起部解析用画像中の蛍光標識された領域を、細胞集塊領域として認識する。この突起部解析用画像では、細胞集塊（蛍光標識された領域）は、略球体の一塊、又は略球体から突起状の構造が形成されている一塊としてあらわされる。
【００３４】
次いで、この細胞集塊領域に、境界に内接する球を設けていく。まず、境界に内接する球のうち、半径が最大となる内接球を設ける。さらに、この内接球を除いた領域に対して半径が最大となる内接球を設ける。この操作を、予め設定した半径の下限値に達するまで繰り返すことによって、複数の内接球の領域を得ることができる。設定された各内接球の外部に位置するそれぞれの点を、最も近い内接球の領域に含まれるように、細胞集塊領域を分割する。これにより、細胞集塊領域における全ての点が、内接球を含むいずれかの領域に区分けされることになる。この分割されたそれぞれの「内接球を含む領域」を、以下、「球状領域」という。
【００３５】
突起部と細胞集塊の中心の略球体部分とを区別するために、内接球の直径の閾値を予め設定しておく。内接球の直径の閾値は、内接球の直径が当該閾値よりも小さい球状領域は突起部であり、内接球の直径が当該閾値よりも大きい球状領域は略球体部分である、と区別できるように設定する。当該閾値は、特定の画素数として設定してもよく、内接球の最大値に対する比率（例えば、「内接球の最大値の１／２０の長さ（画素数）」など）で設定してもよい。内接球の最大値は、細胞集塊の中心の略球体部分の大部分が含まれる内接球である。内接球の直径がこの設定された閾値未満である球状領域を突起部として分割し、当該閾値以上である球状領域を突起部以外の領域（非突起部）として分割する。
【００３６】
突起部を構成する球状領域の中で、３個以上の球状領域と隣接する球状領域がある場合には、当該突起部は、分岐構造をとっている、と判別される。突起部を構成する球状領域の中で、Ｎ個（Ｎは３以上の整数）の球状領域と隣接する球状領域では、Ｎ−１個に分岐していることになる。一方で、突起部を構成する球状領域が全て１個又は２個の球状領域とのみ接している場合には、当該突起部は分岐のない直線状である、と判別される。
【００３７】
突起部の長さは、当該突起部を構成する各球状領域の内接球の中心点同士を直線で結んだ距離として測定できる。分岐構造を有する突起部の長さは、当該突起部のうち、互いに隣接する球状領域の内接球の中心点同士を直線で結んだ距離の最大値である。
【００３８】
突起部の幅は、当該突起部を構成する球状領域の内接球の直径に相当する。突起部の最大幅は、当該突起部を構成する球状領域の内接球の直径の最大値である。
【００３９】
平面断層画像から細胞集塊の突起部を判別するための画像解析は、内接球に代えて内接円を設ける以外は、前述の立体画像から細胞集塊の突起部を判別する際の画像解析と同様にして行うことができる。
【００４０】
判別された突起部に基づき、前記細胞集塊の突起形成能を評価する（工程（ｃ））。細胞集塊の突起形成能の評価は、例えば、細胞集塊に形成されている各突起の長さ、最大幅（太さ）、又は枝分かれの有無に基づいて評価することができる。画像解析により判別された全ての突起について、それぞれの長さ、最大幅、又は枝分かれの有無を特定する。次いで、これらの情報から、細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起１本当たりの長さの平均値、又は突起１本当たりの枝分かれの本数が決定できる。
【００４１】
工程（ｃ）における突起形成能の評価は、細胞集塊に形成されている突起の本数、方向性、最大長、突起１本当たりの長さの平均値、及び突起１本当たりの枝分かれの本数の平均値からなる群より選択される１種以上に基づいて行うことが好ましい。細胞集塊に形成されている突起の本数が多いほど、細胞集塊に形成されている突起の最大長が長いほど、突起１本当たりの長さの平均値が長いほど、突起１本当たりの枝分かれの本数の平均値が大きいほど、当該細胞集塊の突起形成能が高いと評価できる。
【００４２】
工程（ｃ）における突起形成能の評価は、当該細胞集塊の総体積と、当該細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合（［細胞集塊の略球状の中心部の体積（ボクセル）］）／［細胞集塊の総体積（ボクセル）］）（以下、「中心球体積比」ということがある。）に基づいて行うこともできる。ここで、「細胞集塊の略球状の中心部」は、前述の非突起部に相当する。中心球体積比が小さいほど、突起部の体積が大きく、細胞集塊の突起形成能が高いと評価できる。さらに、中心球体積比に変えて、突起部の体積と細胞集塊の略球状の中心部の体積との割合や、突起部の体積と細胞集塊の総体積との割合に基づいて、突起形成能を評価することもできる。
【００４３】
細胞集塊を特定の環境下で培養し、培養後の細胞集塊に対して本発明に係る突起形成能評価方法を実施することにより、当該細胞集塊を構成する細胞の当該環境下における突起形成能を評価することができる。例えば、ゲルに包埋されている細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊を蛍光物質で標識し、この蛍光標識した細胞集塊に対して本発明に係る突起形成能評価方法を実施することにより、細胞集塊を外部から刺激した状態における突起形成能を評価することができる。この外部からの刺激は、一過性のものであってもよく、突起形成をさせるために必要な培養の間中、継続してもよい。
【００４４】
例えば、外部からの刺激が生理活性物質の場合、生理活性物質を接触させた後に形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊に対して本発明に係る突起形成能評価方法を実施することにより、当該細胞集塊を構成する細胞が当該生理活性物質によって刺激された状態における突起形成能を評価することができる。具体的には、例えば、ゲルに包埋させた細胞集塊を、生理活性物質を含む培養培地に浸漬させる、又は細胞集塊が浸漬している培養培地に生理活性物質を添加し、そのまま充分な時間培養することによって、細胞集塊を生理活性物質によって刺激することができる。培養時間によっては、生理活性物質を含む培養培地を、生理活性物質を含まない新たな培養培地に交換して培養を継続してもよい。
【００４５】
生理活性物質とは、種々の生体反応を制御に関与する物質を意味する。本発明において外部刺激として使用する生理活性物質としては、ビタミンやホルモン、抗体等のような生体内に本来存在する物質であってもよく、酵素阻害剤、医薬品の有効成分となる化学合成品等のような生体内には本来存在しない物質であってもよい。また、生理活性物質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の複合タンパク質、糖類、多糖類、脂質、核酸、低分子化合物のいずれであってもよい。
【００４６】
本発明に係る突起形成能評価方法は、生体内の細胞の環境に近しい三次元構造体である細胞集塊を用いて突起形成能を評価する。このため、抗がん剤をはじめとする各種医薬品の有効成分に対する薬効評価に対して本発明に係る突起形成能評価方法を用いることにより、平面培養された細胞を用いた場合よりも、より生体に投薬した場合得られる薬効に近い薬効評価が可能になる。
【００４７】
例えば、がん患者から採取されたがん細胞を含む細胞集塊を抗がん剤を含む培養培地に浸漬させ、そのまま充分な時間培養した後に本発明に係る突起形成能評価方法を実施することにより、抗がん剤で処理された状態における当該がん患者のがん細胞の突起形成能を評価することができる。ＥＭＴが抑制されたがん細胞では、突起形成能が低下又は消失する。このため、抗がん剤処理により、未処理のがん細胞よりも突起形成能が低下したと評価された場合には、当該抗がん剤によりがん細胞のＥＭＴが抑制されている、すなわち、当該がん患者のがん細胞は当該抗がん剤に対して感受性であり、よって当該がん患者に当該抗がん剤を投与することによって有効な抗がん効果が期待できる、と評価できる。
【００４８】
細胞集塊を抗がん剤で刺激する場合には、突起部の形状を判別するために細胞骨格や細胞膜を蛍光標識することに加えて、細胞核も生細胞と死細胞を区別して蛍光染色しておくことが好ましい。工程（ａ）において取得した平面断層画像と同一の顕微鏡視野について、細胞核を標識した蛍光の平面断層画像を取得し、これを画像解析することによって、各細胞の生死状態も同時に解析できる。抗がん剤刺激前に比べて死細胞が明らかに多くなった場合には、当該抗がん剤によりがん細胞に細胞死が誘導されている、すなわち、当該がん患者のがん細胞は当該抗がん剤に対して感受性であり、よって当該がん患者に当該抗がん剤を投与することによって有効な抗がん効果が期待できる、と評価できる。
【００４９】
細胞集塊を抗がん剤で刺激する場合には、細胞骨格又は細胞膜の蛍光標識に加えて、カドヘリン、ＭＭＰ等のプロテアーゼなど、細胞の遊走能や浸潤能に関与すると考えられている生体分子も蛍光標識することもできる。工程（ａ）において取得した平面断層画像と同一の顕微鏡視野について、各生体分子を標識した蛍光の平面断層画像を取得し、これを画像解析することによって、これらの生体分子の細胞内における発現量や局在を解析することができる。得られた解析結果は、細胞の突起形成と細胞の遊走・浸潤との関係の解明に資すると期待できる。
【００５０】
細胞集塊に施される外部からの刺激は、放射線の照射であってもよい。放射線としては、可視光線、赤外線のような非電離放射線であってもよく、紫外線、エックス線、ガンマ線のような電離放射線であってもよい。以下、放射線照射による刺激を、「光刺激」ということがある。
【００５１】
細胞集塊への光刺激は、放射線を照射することによって行うことができる。光刺激は、放射線を、細胞集塊全体に照射してもよく、細胞集塊の一部にのみ照射してもよく、細胞集塊自体ではなく細胞集塊を包埋しているゲルの一部分にのみ照射してもよい。また、細胞集塊は、光刺激後に光刺激なしの状態で突起形成のために培養してもよく、突起形成のための培養期間中継続して放射線を照射していてもよい。光刺激後又は光刺激を継続した状態で培養し、形成された突起部を蛍光物質で標識した細胞集塊に対して本発明に係る突起形成能評価方法を実施する。
【００５２】
光刺激のように方向のある刺激の場合には、刺激の向きによって同じ強さ（光刺激の場合には照射強度や照度）の刺激であっても、細胞に与える影響が異なる場合がある。本発明に係る突起形成能評価方法は、個々の細胞が識別可能な解像度で撮像された蛍光画像に基づいて評価するため、照射する光の波長や照射強度、照度が突起形成能に与える影響のみならず、光の照射方向が突起形成能や細胞の運動方向に与える影響をも評価することができる。
【００５３】
細胞集塊に施される外部からの刺激は、熱刺激や冷刺激のような温度刺激であってもよい。細胞集塊の培養温度を高めることにより熱刺激を与えることができ、逆に細胞集塊の培養温度を低下させることにより冷刺激を与えることができる。
【実施例】
【００５４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
［実施例１］
がん細胞の細胞集塊に対して、各種抗がん剤で処理した後の突起形成能を調べた。がん細胞としては、ヒト乳がん細胞から樹立された培養細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を用いた。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを培養培地とし、３７℃、５容量％ＣＯ２環境下で行った。
抗がん剤は、Ｌ−Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ（Ｗａｋｏ社製）、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｗａｋｏ社製）、及びＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（Ｗａｋｏ社製）の５種を用いた。
【００５６】
＜ゲルに包埋させた細胞集塊の構築＞
培養培地に、２０００個のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞と、５μＬの１０×Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＥＣＭ」（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社製）を混合して、最終量が５０μＬになるようにＤＭＥＭ(phenol red free)で調整したがん細胞溶液を、スフェロイド形成用Ｕ底プレート「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）Ｕプレート」（住友ベークライト社製）の各ウェルに、１ウェル当たり５０μＬずつ注入した後、７２時間培養し、細胞集塊（スフェロイド）を形成させた。
【００５７】
Ｕ底プレートからスフェロイドを吸わないように注意しながら、可能な限り培養培地を吸引除去した後、マトリゲル（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を、１ウェル当たり１００μＬずつ静かに添加した。このＵ底プレートを３７℃インキュベーター内で１時間静置し、ゲルを硬化させてゲルに包埋させた細胞集塊を構築した。
【００５８】
＜抗がん剤処理と生死判定試薬処理＞
細胞集塊を包埋したゲル上に、Ｌ−Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ（終濃度１０μＭ）、Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ（終濃度４μＭ）、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ（終濃度１０μＭ）、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（終濃度４μＭ）、又はＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（終濃度１μＭ）を含有する培養培地を１００μＬ添加し、さらに、「Nuclear ID green/ red生死判定試薬」（ＥＮＺＯ社製）を０．１μＬ（培養培地の１／１０００量）添加した上で、４８時間培養し、浸潤させた。添加した生死判定試薬により、生細胞は赤蛍光、死細胞は緑蛍光に染色された。抗がん剤を添加しない以外は同様にして、生死判定試薬のみを含有する培養培地で培養したものを対照とした。
【００５９】
＜抗がん剤処理とアクチン染色＞
生死判定試薬を添加しない以外は＜抗がん剤処理と生死判定＞と同様にして、各種抗がん剤を含む培養培地でゲルに包埋された細胞集塊を４８時間培養した。その後、ゲルを吸わないように培養培地のみを吸引除去した後、ゲルの上に４％  パラホルムアルデヒド溶液を１５０μＬ添加し、室温で３０分間静置して細胞集塊を固定した。固定された細胞集塊をＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳを１５０μＬ添加して室温で１時間透過処理を行った。透過処理後の細胞集塊をＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、アクチン染色のためにＡｃｔｉｓｔａｉｎ６７０（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）をＰＢＳで１００倍希釈したものを添加し、４℃で一晩反応させた。
【００６０】
＜蛍光画像の取得＞
＜抗がん剤処理と生死判定＞及び＜抗がん剤処理とアクチン染色＞で調製した蛍光標識サンプルを、共焦点レーザー顕微鏡「ＦＶ１２００」（オリンパス社製）で撮像した。２０倍対物レンズ（ＬＵＣＰＬＦＬＮ×２０）で、Ｚスライス２μｍで撮像した。合計Ｚスライス枚数は、６０〜１００枚であった。
【００６１】
＜立体画像の構築＞
それぞれの蛍光標識サンプルに対して撮像された一連の平面断層画像群を重ね合わせて立体画像を構築した。得られた立体画像に対して、二値化処理し、二値化画像を得た。
【００６２】
生死判定試薬処理した蛍光標識サンプルのうち、抗がん剤未処理サンプルとＢａｔｉｍａｓｔａｔ処理サンプルから得られた二値化画像を図１に示す。また、アクチン染色した蛍光標識サンプルのうち、抗がん剤未処理サンプルから得られた二値化画像を図２に示す。図中、「Ｌｉｖｅ」は正細胞の細胞核の蛍光画像であり、「Ｄｅａｄ」は死細胞の細胞核の蛍光画像であり、「Ａｃｔｉｎ」はアクチンの蛍光画像である。「Ｚ−ａｘｉｓ」は細胞集塊のＺ軸方向からみた蛍光画像である。
【００６３】
＜生死判定＞
生死判定試薬処理した蛍光標識サンプルから得られた二値化画像について、赤蛍光の細胞核と緑蛍光の細胞核の数を計測した。定量結果を表１に示す。この結果、抗がん剤未処理サンプルでは、死細胞は少なかったのに対して、Ｂａｔｉｍａｓｔａｔ処理サンプルでは死細胞が全体の２４％程度で抗がん剤未処理の場合よりも多く、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ処理サンプルでは死細胞が７０％程度と非常に多かった。これらの結果は、ＢａｔｉｍａｓｔａｔとＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅの抗がん効果によって細胞死が誘導されたことを意味し、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、ＢａｔｉｍａｓｔａｔとＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅに対して感受性であること、ＢａｔｉｍａｓｔａｔよりもＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅに対する感受性の方が高いことが示された。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
＜突起部の判別＞
アクチン染色した蛍光標識サンプルから得られた二値化画像を、一画像に細胞集塊全体が収まる程度に縮小した画像を、突起部解析用画像とした。この突起部解析用画像中の蛍光標識された領域を、細胞集塊領域として認識し、この細胞集塊領域に、境界に内接する球のうち、半径が最大となる内接球を重ならないようにして設け、複数の半径が最大となる内接球を得た。設定された各内接球の外部に位置するそれぞれの点を、最も近い内接球の領域に含まれるように各内接球を含む領域を分割して球状領域を設定した。内接球の直径の閾値を、細胞２〜３個のサイズ相当である５０μｍに設定しておき、この閾値未満である球状領域を突起部として分割し、当該閾値以上である球状領域を突起部以外の領域（非突起部）として分割した。
【００６６】
＜突起形成能の評価＞
分割された突起部と非突起部の体積に基づいて、中心球体積比を算出した。具体的には、中心球体積比は、［非突起部の体積（ボクセル）］／（［突起部の体積（ボクセル）］＋［非突起部の体積（ボクセル）］）で算出した。算出した結果を図３に示す。図中、「Ｃｔｒｌ」は抗がん剤未処理サンプルを、「ｂｂ」はＢａｔｉｍａｓｔａｔ処理サンプルを、「ｍｙｔＣ」はＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ処理サンプルを、「ｐａｃ」はＰａｃｌｉｔａｘｅｌ処理サンプルを、「ｓｔｓ」はＳｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ処理サンプルを、「ｓｕｌ」はＬ−Ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ処理サンプルを、それぞれ示す。この結果、抗がん剤未処理サンプルでは中心球体積比は小さく、突起が多く形成されていた。これに対して、抗がん剤処理サンプルではいずれも中心球体積比は抗がん剤未処理サンプルよりも大きく、形成される突起が少なかったことが定量的に求められた。特に、ＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ処理サンプルとＢａｔｉｍａｓｔａｔ処理サンプルは、残る３種の抗がん剤処理サンプルよりも中心球体積比が高く、突起形成がより強く抑制されていた。これらの結果から、これら５種の抗がん剤で処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、未処理の場合よりも突起形成能が低下すると評価された。つまり、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞は、これら５種の抗がん剤により突起形成能が低下しており、これら５種の抗がん剤全てに対して感受性であること、特にＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣとＢａｔｉｍａｓｔａｔに対する感受性が高いことがわかった。
【００６７】
＜平面断層画像に基づく突起形成能の評価＞
アクチン染色した蛍光標識サンプルから取得された一連の平面断層画像群のうち、Ｚ軸方向に対して下部、中心部、上部の３枚を選択し、それぞれの平面断層画像に基づいて突起部を判別し、分割された突起部と非突起部の体積に基づいて、中心球体積比を算出した。算出した結果を図４に示す。各抗がん剤処理サンプルの３本のカラムのうち、左側のカラムが細胞集塊の下部の平面断層画像からの結果、真ん中のカラムが細胞集塊の中心部の平面断層画像からの結果、右側のカラムが細胞集塊の上部の平面断層画像からの結果、である。この結果、立体画像に基づいた結果と同様に、抗がん剤未処理サンプルよりも抗がん剤処理サンプルのほうが中心球体積比が大きく、形成される突起が少ないという傾向が観察された。ただし、測定値のばらつき（標準偏差）が大きく、また断面の位置ごとに中心球体積比が大きく異なっており、かつ、抗がん剤未処理サンプルと抗がん剤処理サンプルの差も大分小さかった。これらの結果から、平面断層画像に基づくよりも立体画像に基づくほうが、信頼性の高い評価結果が得られることが明らかである。
【００６８】
本発明に係る突起形成能評価方法によって、細胞集塊に対して突起形成能評価及び細胞生死判定を行うことにより、薬剤作用機序の分別（プロファイル）が可能となる。作用機序が未知の化合物に対して本発明を実施することによって、当該化合物の作用機序を推測することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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