(57)【要約】  【課題】低温側での活性が向上している変異型酵素を提供する。  【解決手段】酵素の分岐型の塩橋を形成しているアミノ酸残基に、塩橋を消失させずに架橋強度を弱めるような変異を導入した変異型酵素とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基が、前記塩橋を維持しながら塩橋強度が小さくなるように変更されている、変異型酵素。
【請求項２】
前記親の酵素は、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列で特定される酵素と同じ酵素活性を有する、請求項１に記載の変異型酵素。
【請求項３】
前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離が３．２Å未満である、請求項１又は２に記載の変異型酵素。
【請求項４】
前記分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖が、前記酵素の至適温度以下の温度で単一のコンフォメーションをとる、請求項１〜３の何れかに記載の変異型酵素。
【請求項５】
前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つが、以下の構造を有する、請求項１〜４の何れかに記載の変異型酵素。
【化１】
2019088225.tif 000014
【請求項６】
前記分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアルギニン残基がリジン残基に置換されている、請求項１〜５の何れか１項に記載の変異型酵素。
【請求項７】
前記親の酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の少なくとも３０２位のアルギニン残基がリジン残基に置換されている、請求項１に記載の変異型酵素。
【請求項８】
前記親酵素より、前記親酵素の至適温度より低い温度での比活性が向上している、請求項１〜７の何れか１項に記載の変異型酵素。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の変異型酵素をコードする、核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載する核酸を含む、発現カセット又は発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載する核酸、又は請求項１０に記載する発現カセット若しくは発現ベクターを含む、形質転換体。
【請求項１２】
微生物である、請求項１１に記載する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜８の何れか１項に記載の変異型酵素、或いは請求項１１又は１２に記載する形質変換体を含む、リアクター。
【請求項１４】
請求項１〜８の何れか１項に記載の変異型酵素、請求項１１又は１２に記載する形質変換体、或いは請求項１３に記載するリアクターを用いて、目的物質を製造する方法。
【請求項１５】
親酵素の分岐型の塩橋を特定する工程と、
前記特定した塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基の少なくとも一つを、前記塩橋を維持しながら架橋強度が小さくなるように変更する工程と
を含む、変異型酵素の製造方法。
【請求項１６】
前記親酵素は、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列で特定される酵素と同じ酵素活性を有する、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離が３．２Å未満である、請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖が、前記酵素の至適温度以下の温度で単一のコンフォメーションをとる、請求項１５〜１７の何れかに記載の変異型酵素。
【請求項１９】
前記親酵素の分岐型の塩橋の少なくとも一つが、以下の構造を有する、請求項１５〜１８の何れかに記載の製造方法。
【化２】
2019088225.tif 000015
【請求項２０】
前記親酵素が有する前記分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアルギニン残基がリジン残基に置換されている、請求項１５〜１９の何れかに記載の製造方法。
【請求項２１】
得られる変異型酵素は、前記親の酵素より、前記親の至適温度より低い温度での比活性が向上している、請求項１５〜２０の何れかに記載の製造方法。
【請求項２２】
熱安定性を改善した変異型酵素の製造方法であって、
親酵素の塩橋部位を特定する工程と、
前記特定した塩橋を形成するアミノ酸残基を、前記塩橋を維持しながら架橋強度が増大するように変更する工程と
を含む、変異型酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定部位のアミノ酸を改変して低温での活性を改善した変異型酵素、これをコードする核酸、これを含む発現カセット、発現ベクター、及び形質転換体、これらの製造方法、並びにこれらを利用して目的物質を工業的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、触媒として生体中の様々な反応に関与するタンパク質であり、酵素を利用した各種機能性物質の生産、各種廃棄物質の処理などは、化学・物理的な方法に比べ、特異性が高く、反応に高温条件を要せず、大量廃液の問題もないために、エネルギーコストが小さく、環境への負荷が小さい技術として、食品・医薬品・エネルギー・廃棄物処理等の様々な分野で利用されている。
【０００３】
他方、酵素を利用した工業的な生産及び処理においては、生産又は処理効率の向上および製造又は処理コストの低減が解決すべき課題として残されている。例えば、酵素は、タンパク質であるため、その触媒作用を効果的に発揮させるには、ｐＨ、温度等の反応条件を厳密に制御する必要がある。ところが、工業的な生産又は処理において利用される酵素の多くは、至適温度が室温よりかなり高い温度であるため、このような温度条件で反応を行うための設備を要し、生産効率の低下および製造コストの増大の一要因となっている。このため、高温での反応に利用されている酵素の低温での活性が改善されれば、よりエネルギー効率の高い工業生産が可能となる。
【０００４】
Ｋ．  Ｓ．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ及びＲ．  Ｃａｖｉｃｃｈｉｏｌｉは、天然の低温適合性酵素に関する総説で、酵素の立体構造の高い柔軟性は、低い活性エンタルピーに翻訳され、低温での高い特異的な活性をもたらす一方、立体構造が不安定化し、基質親和性の低下をもたらす、ことを教示する（非特許文献１の要約）。また、Ｋ．  Ｓ．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉらは、多くの低温適合性酵素において、Ａｒｇ／Ｌｙｓ比が低減している報告に言及し、アルギニンが、一般的に、酵素の熱安定性を増大させることを教示している（非特許文献１の第４２４頁）。また、栗原らは、好冷性細菌の総括的な報告において、好冷性酵素でＡｒｇ／Ａｒｇ＋Ｌｙｓ比が低減しているものが多いと報告している（非特許文献２）
【０００５】
また、Ｇｕｏｚｅｎｇ  Ｗａｎｇらは、低温活性のキシラナーゼのＤ８３Ｎの置換で塩橋を破壊すると相対的に低温側の活性が高くなったものの熱安定性が低下し、Ｄ３９Ｎの置換で橋を破壊すると全体的に活性が低下し、熱安定性も低下したことを報告している（非特許文献３）。
【０００６】
しかしながら、Ｋ．  Ｓ．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉら及びＧｕｏｚｅｎｇ  Ｗａｎｇらが指摘する通り、通常、酵素の立体構造の柔軟性を高めると、酵素が不安定化するため、活性は低下し、場合によっては喪失してしまう。従って、立体構造の柔軟性を高める変異を導入した、工業的な利用が可能な酵素は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】”Cold-Adapted Enzymes”, K. S. Siddiqui and R. Cavicchioli, Annu. Rev. Biochem. 2006, 75, 403-433
【非特許文献２】生化学第８１巻第１２号，pp.１０７２―１０７９，２００９
【非特許文献３】Guozeng Wang et al..(2016) The disruption of two salt bridges of the cold-active xylanase XynGR40 results in an increase in activity, but a decrease in thermostability. Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2016) 1-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような技術水準にあって、低温側での酵素活性が向上し、低温下で工業的に利用可能な酵素活性を有する変異型酵素を提供することを目的とする。
本発明はまた、このような変異型酵素をコードする核酸、当該核酸を含む発現カセット、発現ベクター、及び形質転換体を提供することを他の目的とする。
本発明はまた、このような変異型酵素等の製造方法を提供することを他の目的とする。
本発明はまた、このような変異型酵素、ベクター、又は形質転換体を用いて、目的物質を製造する方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、酵素の塩橋部位に着目し、分岐型の塩橋を形成しているアミノ酸残基を、塩橋を消失させずに架橋強度を弱めるように変更することで、低温側での比活性レベルを増大させることに成功し、本発明に至った。
すなわち、本発明は、以下の変異型酵素、当該変異型酵素をコードする核酸、当該核酸を含む発現カセット、発現ベクター、及び形質転換体、当該変異型酵素等の製造方法、並びにこれら変異型酵素、発現カセット、発現ベクター、又は形質転換体を用いて、目的物質を製造する方法を提供する。
【００１０】
［１］親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基が、前記塩橋を維持しながら塩橋強度が小さくなるように変更されている、変異型酵素。
［２］前記親酵素は、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８のいずれかによって特定される酵素と同じ酵素活性を有する、［１］に記載の変異型酵素。
［３］前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離が３．２Å未満である、［１］又は［２］に記載の変異型酵素。
［４］前記分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖が、前記酵素の至適温度以下の温度で単一のコンフォメーションをとる、［１］〜［３］の何れかに記載の変異型酵素。
［５］前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つが、以下の構造を有する、［１］〜［４］の何れかに記載の変異型酵素。
【化１】
2019088225.tif 000002
［６］前記分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアルギニン残基がリジン残基に置換されている、［１］〜［５］の何れかに記載の変異型酵素。
［７］前記親酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の少なくとも３０２位のアルギニン残基がリジン残基に置換されている、［１］に記載の変異型酵素。
［８］前記親酵素より、前記親酵素の至適温度より低い温度での比活性が向上している、［１］〜［７］の何れかに記載の変異型酵素。
［９］［１］〜［８］の何れかに記載の変異型酵素をコードする核酸。
［１０］［９］に記載する核酸を含む、発現カセット又は発現ベクター。
［１１］［９］に記載する核酸、又は［１０］に記載する発現カセット若しくは発現ベクターを含む、形質転換体。
［１２］微生物である、［１１］に記載する形質転換体。
［１３］［１］〜［８］の何れかに記載の変異型酵素、或いは［１１］又は［１２］に記載する形質変換体を含む、リアクター。
［１４］［１］〜［８］の何れかに記載の変異型酵素、［１１］又は［１２］に記載する形質変換体、或いは［１３］に記載するリアクターを用いて、目的物質を製造する方法。
［１５］親酵素の分岐型の塩橋を特定する工程と、
前記特定した分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基の少なくとも一つを、前記塩橋を維持しながら塩橋強度が小さくなるように変更する工程と
を含む、変異型酵素の製造方法。
［１６］前記親酵素は、配列番号１、及び配列番号１５乃至１８のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、配列番号１、並びに配列番号１５乃至１８のいずれかによって特定される酵素と同じ酵素活性を有する、［１５］に記載の製造方法。
［１７］前記親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離が３．２Å未満である、［１５］又は［１６］に記載の製造方法。
［１８］前記分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖が、前記酵素の至適温度以下の温度で単一のコンフォメーションをとる、［１５］〜［１７］の何れかに記載の変異型酵素。
［１９］前記親酵素の分岐型の塩橋の少なくとも一つが、以下の構造を有する、［１５］〜［１８］の何れかに記載の製造方法。
【化２】
2019088225.tif 000003
［２０］前記親酵素が有する前記分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアルギニン残基がリジン残基に置換されている、［１５］〜［１９］の何れかに記載の製造方法。
［２１］得られる変異型酵素は、前記親酵素より、前記親酵素の至適温度より低い温度での比活性が向上している、［１５］〜［２０］の何れかに記載の製造方法。
［２２］熱安定性を改善した変異型酵素の製造方法であって、
親酵素の塩橋部位を特定する工程と、
前記特定した塩橋を形成するアミノ酸残基を、前記塩橋を維持しながら架橋強度が増大するように変更する工程と
を含む、変異型酵素の製造方法。
【００１１】
本発明は、酵素の分岐型の塩橋を形成しているアミノ酸残基を、塩橋を維持しながら塩橋の架橋強度が小さくなるように変更することで、低温側の活性を高めることに成功したものである。この基本原理は、様々な酵素に適用可能であり、典型的には、至適温度が室温より高く、より低温での利用が可能になることで、よりエネルギー効率の高い工業的な利用が可能になる酵素への適用が期待される。また、本発明の基本原理は、低温適合性の酵素にも適用可能である。すなわち、酵素の分岐型の塩橋を形成しているアミノ酸残基を、塩橋の架橋強度が大きくなるように変更することで、より高温での活性及び安定性を高められ、やはり、よりエネルギー効率の高い工業的な利用が可能な変異型酵素を提供することが期待される。
【００１２】
ここで、本願明細書で用いる幾つかの用語について説明する。
「塩橋」とは、タンパク質のなかでアミノ酸の側鎖間に働くイオン性相互作用であり、典型的には、塩基性のアミノ酸と酸性のアミノ酸の側鎖間で形成される。一般的には、「塩橋」は、タンパク質の三次元構造を安定化させるのに重要であると理解される。本願明細書では、近接するアミノ酸の相反する極性の側鎖の窒素および酸素原子間の距離が、６．５Å以内である場合に、「塩橋」とみなす。また、「分岐型の塩橋」とは、塩橋を形成するアミノ酸の側鎖間で水素結合が２つ以上形成されている構造を言う。「分岐型の塩橋」には、以下の３つのタイプがある（以下では、それぞれ「Ａタイプ」、「Ｂタイプ」及び「Ｃタイプ」という。）。
【化３】
2019088225.tif 000004
Ａタイプの塩橋は、塩基性アミノ酸（典型的にはアルギニン）側鎖のε位の窒素原子とη位の１つの窒素原子に結合している水素が酸性アミノ酸（典型的にはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）のカルボキシル基の２つの酸素原子と水素結合を２本形成している状態によって定義付けることができ、Ｂタイプの塩橋は、塩基性アミノ酸（典型的にはアルギニン）側鎖のη位の２つの窒素原子に結合している水素が酸性アミノ酸（典型的にはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）のカルボキシル基の２つの酸素原子と水素結合を2本形成している状態によって定義付けることができ、Ｃタイプの塩橋は、塩基性アミノ酸側鎖と酸性アミノ酸側鎖間に水素結合が２本形成されている状態のうち、ＡおよびＢタイプ以外の状態によって定義付けることができる。
【００１３】
本願明細書における「塩橋の強度」とは、水素結合の強度と静電的相互作用の強度の総和をいう。水素結合は水素結合を形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離に相関があり（４〜４０ｋＪ／ｍｏｌ）、静電的相互作用は塩橋を形成する側鎖の窒素と酸素の原子間距離の２乗に反比例する（４０〜４００ｋＪ／ｍｏｌ）。
本願明細書における「塩橋の強度を低減する」とは、水素結合の強度と静電的相互作用の強度の総和が低減していることを意味する。分岐型の塩橋は、典型的には図１に示すように、親酵素の分岐型の塩橋では２本以上の水素結合によりアミノ酸側鎖が引き合って、塩橋を形成する側鎖の窒素と酸素の距離が近くなり、静電的相互作用が増大している。一方で、塩橋を形成するアミノ酸を変更した変異酵素においては、アミノ酸側鎖間の距離やコンファメーションの変化などで、水素結合及び静電的相互作用自体が低減したり、塩橋を構成する水素結合が１本に減じたり、又は水素結合が消滅して、塩橋を形成する側鎖の窒素と酸素の距離が遠くなり、静電的相互作用も低減している。このような状態は、「塩橋の強度を低減する」に該当する。
【００１４】
本願明細書における「親酵素の至適温度より低い温度での比活性が向上している」とは、親酵素の至適温度より低い任意の温度、典型的には、親酵素の至適温度より低く５℃以上、好ましくは１０℃以上の任意の温度で、親酵素の比活性より高い比活性を有することを意味する。好ましい実施形態では、親酵素の至適温度から５℃まで、より好ましくは親酵素の至適温度から１０℃までの温度範囲での比活性の総和が、同じ温度範囲での親酵素の比活性の総和より高い。
本願明細書における「同じ酵素活性を有する」とは、同じ基質に対する同じ反応を触媒し、至適条件での比活性が元の酵素の５０％以上、典型的には８０％以上であることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一例により、「塩橋の強度を低減する」状態を模式的に示す概略図である。
【図２】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴのＡｒｇ３０２−Ａｓｐ３００の塩橋の構造を示す概略図である。
【図３】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴのＡｒｇ２１３−Ａｓｐ２５１の塩橋の構造を示す概略図である。
【図４】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴのＡｒｇ１２５−Ａｓｐ１９３の塩橋の構造を示す概略図である。
【図５】発現後の各組換え酵素（Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ１２５Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ」、「Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、及び「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」の変異型Ｅｆ−Ｍａｎ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動像の写真である。
【図６】精製処理後の「Ｒ３０２Ａ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎの各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動像の写真である。
【図７】精製処理後のＥｆ−ＭａｎＷＴ並びに各変異型Ｅｆ−Ｍａｎの各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度及び酵素活性値を示すグラフである。
【図８】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴにおける酵素活性の温度依存性を示すグラフである。
【図９】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ１２５Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、５０℃以下での酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１０】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ２１３Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、５０℃以下での酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１１】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ３０２Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、５０℃以下での酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１２】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、５０℃以下での酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１３】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、５０℃以下での酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１４】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ１２５Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ」、「Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、及び「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」の変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、２０℃における酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１５】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴと、「Ｒ３０２Ｋ」及び「Ｒ３０２Ａ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎとの、２０℃における酵素活性の比較を示すグラフである。
【図１６】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴ、並びに「Ｒ３０２Ｋ」及び「Ｒ３０２Ａ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎの５０℃における熱安定性を示すグラフである。
【図１７】Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴ、「Ｒ３０２Ｋ」変異型Ｅｆ−Ｍａｎ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来Ｍａｎ、及びＡ．  ｎｉｇｅｒ由来Ｍａｎの酵素活性を比較するグラフである。
【図１８】枯草菌由来のアルカリセルラーゼの全長アミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、上記の通り、低温側での活性が改善された変異型酵素、当該変異型酵素をコードする核酸、当該核酸を含む発現カセット、発現ベクター、及び形質転換体、当該変異型酵素等の製造方法、並びに当該変異型酵素等を用いて、目的物質を製造する方法に関する。以下では、本発明の実施形態により、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態により限定的に理解されるものではない。
【００１７】
１．変異型酵素
本発明による変異型酵素は、親酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基を、塩橋を維持しながら塩橋強度が小さくなるように変更しており、これにより、親酵素に比べ低温での活性が向上している。
本発明は、特定部位のアミノ酸残基に変異を導入して一定限度で構造に柔軟性を付与するものであり、この原理は、種々の酵素に適用可能である。したがって、親酵素について特に制限はなく、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼといった酵素に適用でき、工業的利用に対する需要が多い、酸化還元酵素、加水分解酵素及び異性化酵素が好ましく、加水分解酵素がより好ましく、糖加水分解酵素が特に好ましい。
【００１８】
酸化還元酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を挙げることができる。
転移酵素としては、例えば、αーグルコシルトランスフェラーゼ、サイクロデキストリン生成酵素（ｃｙｃｌｏ  ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎｅ  ｇｌｕｃａｎｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ：  ＣＧＴａｓｅ）等を挙げることができる。
異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼを挙げることができる。
【００１９】
加水分解酵素としては、例えば、アルカリプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミナーゼ等のプロテアーゼ類；デキストラナーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、アミロプルラナーゼ、グルコアミラーゼ、β-グルカナーゼ等のアミラーゼ類、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼ、ペクチナーゼ、フィターゼ、プロトペクチナーゼ、キシラナーゼ、アルカリセルラーゼ等のセルラーゼ類；マンナナーゼ、β-ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）、β-フラクトフラノシダーゼ（インベルターゼ、サッカラーゼ、プルラナーゼ、ヘスペリジナーゼ、アントシアナーゼ、リゾチーム、タンナーゼ、マルトオリゴシルトレハロース合成酵素（ＭＴＳａｓｅ）、マルトオリゴシルトレハロースヒドロラーゼ（ＭＴＨａｓｅ）、リパーゼ等のその他の加水分解酵素を挙げることができる。
中でも、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、マンナナーゼ、アルカリプロテアーゼ、セルラーゼ類等は本発明を適用するのに好ましい。特に、本発明者らが見出したシマミミズ由来の生澱粉分解酵素Ｉ型およびＩＩ型並びにシマミミズ由来のマンナナーゼは、本発明を適用するのに好ましい。また、枯草菌由来のアルカリプロテアーゼ、および枯草菌由来のアルカリセルラーゼも本発明を適用するのに好ましい。
【００２０】
本発明においては、親酵素の由来についても特に制限はなく、例えば、哺乳類、植物、無脊椎動物（例えば草食性の貝類、環形動物）、昆虫、微生物等に由来する酵素が挙げられる。工業的には、環形動物、微生物由来の酵素が用いられることが多く、例えば、シマミミズ、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌などに由来する酵素が用いられている。
【００２１】
もっとも、工業的利用の観点からは、室温以上、特に４０℃以上の温度での活性が工業的に利用可能なレベルであるが、４０℃以下、特に室温付近での活性が低く、このような温度を選択できない酵素を親酵素として選択することが好ましい。このような観点から、好ましい親酵素として、例えば、上述したシマミミズ由来の生澱粉分解酵素Ｉ型およびＩＩ型、シマミミズ由来のマンナナーゼ、枯草菌由来のアルカリプロテアーゼ、および枯草菌由来のアルカリセルラーゼを挙げることができる。
【００２２】
これらの酵素のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ＰＤＢ、ＰＩＲ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ＆  ＴｒＥＭＢＬ、ＰＲＦ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＧｅｎＰｅｐｔ  （ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＮＩＡＳ  ＤＮＡ  Ｂａｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースを利用して特定することができる。また、既知の配列決定方法を利用して決定してもよい。
【００２３】
幾つかの好ましい親酵素として、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するシマミミズマンナナーゼ、配列番号１５に示すシマミミズ由来の野生型生デンプン分解酵素ＩＩ型、配列番号１６に示す枯草菌由来のアルカリプロテアーゼ、並びに配列番号１７及び１８に示す枯草菌由来のアルカリセルラーゼが挙げられる。
本発明では、このような酵素のアミノ酸に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋、好ましくは塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、同じ酵素活性を有する酵素を親酵素とすることができる。好ましくは、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８の何れかで特定されるアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋、好ましくは塩橋を形成するアミノ酸は保存されている、アミノ酸配列を含み、配列番号１並びに配列番号１５乃至１８の何れかで特定される酵素と同じ酵素活性を有する酵素を親酵素とする。本願明細書でのアミノ酸配列の同一性は、ギャップを許し、最大の同一性が得られるアラインメントにおける同じアミノ酸の百分率（％）を言う。
なお、配列番号１６のアミノ酸配列は、数箇所で残基飛びがあり、配列同一性を決める際には、この残基飛びを配慮してアライメントする必要がある。また、配列番号１７の２２１〜２２７は触媒ドメインを発現する際に付けたタグの領域であり、配列同一性を決める際には、配列番号１８の対応する位置のアミノ酸配列に置き換えたアミノ酸配列に基づいて決めてもよい。
【００２４】
当業者であれば、例えば、当業者が通常用いる部位特異的変異導入法などを用いて、適宜、既知の酵素のアミノ酸に置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することができる。また、突然変異など自然に変異を生じる場合もある。人為的にアミノ酸配列に変異を導入する際には、元となった酵素のアミノ酸配列、立体構造、特性などの情報に加え、相同アミノ酸、活性中心等の技術常識を考慮して活性に悪影響を与えない変異を導入することができる。特に、本発明においては、分岐型の塩橋、好ましくは塩橋を形成するアミノ酸は保存されることが好ましい。また、酸性やアルカリ性に対する耐性を付与しているアミノ酸も保存することが好ましい。アミノ酸の置換等の酵素の特性に対する影響は、変異を導入した酵素を用いて酵素反応を行い、その際に対象とする特性に応じて適宜反応条件（ｐＨなど）を変動させて、元の酵素と酵素活性を比較して確認することができる。
【００２５】
化学的性質が類似するために、一般的に相互に置換可能とされる以下の各群のアミノ酸間での保存的置換は、塩橋を形成するアミノ酸以外での置換を行なう際の好ましい例である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２６】
本発明による変異型酵素では、親の酵素が有する分岐型の塩橋の少なくとも一つを形成するアミノ酸残基が変更されて、塩橋を維持しながらも親酵素に比べ塩橋強度が小さくなっている。
「塩橋」は、隣接するアミノ酸の相反する極性の側鎖間でイオン性相互作用が作用し、側鎖間で互いに引き合う構造をいい、典型的には水素結合を形成している。「分岐型の塩橋」は、この水素結合が２つ以上形成されている。本発明では、この分岐型の塩橋を標的にして変異を導入する。「塩橋」の特定は、Ｘ線結晶構造解析法などの従来公知のタンパク質の立体構造解析方法により酵素の立体構造を解析し、相反する極性の側鎖の窒素および酸素原子間の距離が、６．５Å以内である隣接するアミノ酸を同定することによって行うことができる。また、「分岐型の塩橋」の特定は、隣接するアミノ酸の相反する極性の側鎖が、２つ以上の水素結合を形成し得る極性基を有しているかによって行うことができる。
【００２７】
従って、上述した種々の酵素について、立体構造を解析し、「分岐型の塩橋」を特定することができ、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するシマミミズマンナナーゼ、配列番号１５に示すシマミミズ由来の野生型生デンプン分解酵素ＩＩ型、配列番号１６に示す枯草菌由来のアルカリプロテアーゼ、および配列番号１７に示す枯草菌由来のアルカリセルラーゼの触媒ドメインにおいて、立体構造解析で特定される分岐型の塩橋は、以下の通りである。
・シマミミズマンナナーゼ（配列番号１）
Ｒ６３：Ｅ１５９（触媒残基と相互作用されるので候補から除外）、Ｒ１２５：Ｄ１９３、Ｒ２１３：Ｄ２５１、Ｒ３０２：Ｄ３００
・シマミミズ由来の野生型生デンプン分解酵素ＩＩ型（配列番号１５）
１５８位、１８５位、１９５位（触媒残基と相互作用されるので候補から除外）、２１３位、３８０位のアルギニン（Ａｒｇ）残基
・枯草菌由来アルカリプロテアーゼ（配列番号１６）
１９位、２４７位、２７５位のアルギニン（Ａｒｇ）残基
・枯草菌由来アルカリセルラーゼ（配列番号１７）
３３９位、４２３位、４６４位、５６５位のアルギニン（Ａｒｇ）残基
【００２８】
「分岐型の塩橋」は、通常、塩基性アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基で形成される。塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリジンが挙げられ、酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が挙げられる。
また、分岐型の塩橋は、構造の観点から以下のタイプに分類できる。
【化４】
2019088225.tif 000005
「分岐型の塩橋」のタイプの特定は、上述した立体構造解析を通じて行うことができる。即ち、Ｘ線結晶構造解析法などの従来公知のタンパク質の立体構造解析方法により酵素の立体構造を解析し、相反する極性の側鎖の窒素および酸素原子間の距離が、６．５Å以内である隣接するアミノ酸を同定する。そして、隣接するアミノ酸の相反する極性の側鎖が、２つ以上の水素結合を形成し得る極性基を有している場合に分岐型の塩橋を形成していると特定できる。そして、当該分岐型の塩橋の水素結合の結合パターンが上記Ａ〜Ｃのいずれのパターンに合致するかを比較することで、分岐型の塩橋のタイプを特定する。なお、側鎖のコンフォメーションも同様に、Ｘ線結晶構造解析法などの立体構造解析方法により特定することができる。
【００２９】
本発明においては、このような分岐型の塩橋を形成するアミノ酸を、塩橋を消滅させずに塩橋強度が小さくなるように変更する。後述する実施例で実証している通り、分岐型の塩橋を消滅させる変異の導入は、酵素の安定性を損ない、実用的な温度での利用が困難になるが、塩橋を維持しながら塩橋強度を小さくすると、低温側での酵素活性が向上できると伴に、酵素の安定性が改善される。塩橋構造の変異は、塩橋を維持しながら塩橋強度を小さくする変異であれば特に制限は無いが、塩橋を形成するアミノ酸残基の種類、塩橋構造のタイプ、親酵素の分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離、酵素の立体構造における塩橋の位置、塩橋を形成するアミノ酸残基のコンフォメーションなどの観点から変異を導入することが好ましい。また、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸の変更は、例えば、アミノ酸の置換、付加若しくは削除、或いはアミノ酸の修飾によることができるが、典型的には、アミノ酸の置換による。
【００３０】
塩橋を形成するアミノ酸残基の種類の観点からは、例えば、塩基性アミノ酸残基の他の塩基性アミノ酸残基への置換、または酸性アミノ酸残基の他の酸性アミノ酸残基への置換が挙げられる。より具体的には、塩基性アミノ酸残基の場合、アルギニンをヒスチジン又はリジンに置換することができ、好ましくはアルギニンをリジンに置換する。酸性アミノ酸残基の場合は、アスパラギン酸及びグルタミン酸間で、相互に置換することができ、何れの置換でも塩橋強度が減少する事が有り得る。アルギニンをリジンに置換した場合には、分岐型の塩橋を構成する２本の水素結合が１本になり、又は水素結合が消滅するため、塩橋強度が顕著に低減する。
アミノ酸の置換による変異の典型例としては、親の酵素が有する分岐型の塩橋が、下記左列の群から選択されるアミノ酸残基対で形成され、この対が、下記右列のアミノ酸残基対に変更されている変異を挙げることができる。
【表１】
2019088225.tif 000006
【００３１】
特に、変異導入による低温での酵素活性の向上の観点で、アルギニン：アスパラギン酸対を、リジン：アスパラギン酸対、又はヒスチジン：アスパラギン酸対、に置換するのが好ましく、リジン：アスパラギン酸対に置換するのが特に好ましい。
【００３２】
塩橋構造のタイプの観点からは、Ａ及びＢタイプの分岐型の塩橋を変異導入の対象として選択することが好ましい。Ａ及びＢタイプの塩橋構造では、２本の水素結合により、両アミノ酸の極性側鎖がより近くに位置づけられ、その結果両側鎖の静電的相互作用が強くなるため、通常塩橋強度が大きい。このため、水素結合が減少又は消滅するようなアミノ酸の変異を与えると、１つの塩橋構造の変化で効率的な構造の柔軟化が起り、効果的に低温での酵素活性が向上するものと推測される。
【００３３】
本発明においては、親酵素の分子内に存在する分岐型の塩橋の複数で、アミノ酸の変異を導入してもよいが、その場合でもＡ又はＢタイプタイプの分岐型の塩橋を含めることが好ましい。また、低温側での酵素活性の向上と酵素の安定性の両方の観点から、Ａ又はＢタイプの分岐型の塩橋のみをアミノ酸の変異を導入する対象とすることが好ましい。
【００３４】
親酵素の分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離の点からは、変異導入の対象として、２つの水素結合の少なくとも１つ、好ましくは両方を形成するアミノ酸側鎖の窒素と酸素の原子間距離が４Å以下であることが好ましく、３．２Å未満であることがより好ましく、３Å未満であることがさらに好ましい。アミノ酸間の２つの水素結合を形成するアミノ酸側鎖の距離がこのぐらい近いとアミノ酸間の静電的相互作用が強くなるため塩橋強度が大きく、このような塩橋に変異を導入することでアミノ酸間の静電的相互作用が大幅に低減し、これにより効果的に低温での酵素活性が向上するものと推測される。
【００３５】
分岐型塩橋の変異においては、酵素の立体構造における塩橋の位置、例えば酵素の触媒残基と塩橋との距離も重要である。塩橋を形成するアミノ酸残基が酵素の触媒活性に直接関係するアミノ酸残基（触媒残基）である場合、または、酵素の立体構造上塩橋を形成するアミノ酸残基と触媒残基との距離が近すぎる場合には、塩橋の変異により酵素活性が低下する場合がある。酵素の立体構造上、このような位置になる分岐型の塩橋への変異の導入は避けることが望ましい。なお、「近すぎる」かは、通常、上述した、強度の高い塩橋を形成するアミノ酸側鎖間の距離（窒素と酸素の原子間距離）として例示した４．０Å以内であるか否かによって判断する。より好ましくは、上述した「塩橋」か否かを判断する基準、すなわち、６．５Å以内であるか否かによって判断する。
【００３６】
塩橋の変異においては、塩橋を形成するアミノ酸残基の側鎖のコンフォメーションも重要である。より具体的には、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸残基の側鎖が運動（典型的には回転）し、複数のコンフォメーションをとることがある。このようなコンフォメーションの中には、分岐型の塩橋を形成しなかったり、水素結合を形成しないコンフォメーションが存在するため、側鎖の運動が多く複数のコンフォメーションをとるアミノ酸残基は、側鎖の運動が少ないアミノ酸残基と比較して、塩橋を形成する確率が低くなる。従って、塩橋を構成するアミノ酸残基の側鎖の運動が少ない塩橋を変異導入の対象として選択することが好ましく、分岐型の塩橋を形成しなかったり、水素結合を形成しないコンフォメーションをとらない塩橋を変異導入の対象とすることがより好ましく、塩橋を構成するアミノ酸残基の側鎖が単一のコンフォメーションをとる塩橋を変異導入の対象とすることが特に好ましい。また、複数のコンフォメーションをとるアミノ酸残基であっても、酵素の至適温度より低い温度で、分岐型の塩橋を形成するコンフォメーションを取る確率が、６５％以上の塩橋を選択することが好ましく、７０％以上の塩橋を選択することがより好ましく、８０％以上がさらに好ましい。
【００３７】
また、分岐型の塩橋を形成する原子の配置も、塩橋の強度に影響する。即ち、２つの水素結合を形成する原子がほぼ同一平面上に配置存在するように配置される場合、塩橋の強度が強くなる傾向にある。従って、２本の水素結合を形成する原子がほぼ同一平面上に配置される塩橋を変異導入の対象として好適に選択することができる。
【００３８】
具体的に、配列番号１に示すマンナナーゼを例として以下に説明する。
このマンナナーゼの立体構造から、分子中に４つの分岐型塩橋（Ｒ６３：Ｅ１５９、Ｒ１２５：Ｄ１９３、Ｒ２１３：Ｄ２５１、Ｒ３０２：Ｄ３００）を有する。
このうちＲ６３：Ｅ１５９の塩橋は、立体構造上、触媒残基に極めて近いため、アミノ酸変異導入対象から除外することが好ましい。
他の３つの分岐型塩橋（Ｒ１２５：Ｄ１９３、Ｒ２１３：Ｄ２５１、Ｒ３０２：Ｄ３００）は、いずれもアミノ酸変異導入の候補として選択可能であり、これらの塩橋の塩橋強度が小さくなるようアミノ酸変異を導入することにより低温活性を向上し得る。
【００３９】
塩橋のタイプに着目すると、Ａタイプの塩橋（Ｒ３０２：Ｄ３００）およびＢタイプの塩橋（Ｒ２１３：Ｄ２５１）は、Ｃタイプの塩橋（Ｒ１２５：Ｄ１９３）と比較して塩橋強度が高いため、これらの塩橋をアミノ酸変異導入の候補として好適に選択し得る。特にＢタイプの塩橋（Ｒ２１３：Ｄ２５１）は塩橋のタイプの観点からは好適なアミノ酸変異導入の候補である。ただし、側鎖のコンフォメーションに着目すると、この塩橋（Ｒ２１３：Ｄ２５１）は図３に示すコンフィメーションａ)及びｂ)を同程度の頻度で取り得る。このコンフォメーションの変動により塩橋強度が影響を受けるため、Ｒ１２５：Ｄ１９３、又はＲ３０２：Ｄ３００の塩橋を変異導入の候補として選択する事が好ましい。
更に、塩橋を形成する側鎖の原子間距離の観点からは、塩橋（Ｒ３０２：Ｄ３００）は２本の水素結合の両方が３Å未満であるため好ましい。
【００４０】
上述のとおり、塩橋のタイプ、塩橋を形成するアミノ酸のコンフォメーション、塩橋を形成する側鎖間の距離などを総合的に判断すると、Ｒ３０２：Ｄ３００の塩橋に変異を導入することが好ましいと推測できる。このとき、アルギニンをリジンに置換する変異は、分岐型の塩橋における水素結合が解消され効果的に塩橋の強度を低減できるため好ましい。
【００４１】
２．変異型酵素の製造
本発明による変異型酵素は、上述した親酵素の立体構造を、Ｘ線結晶構造解析法により解析し、水素結合を形成するアミノ酸側鎖の窒素及び酸素原子間の距離が、６．５Å以内、好ましくは４Å以下、より好ましくは３．２Å未満、さらに好ましくは３．０Å以下である隣接するアミノ酸を同定し、隣接するアミノ酸の相反する極性の側鎖が、２つ以上の水素結合を形成し得る極性基を有しているかによって、分岐型の塩橋を特定する。また、塩橋のタイプについては、分子描写ソフト（Ｃｏｏｔなど）を用い、塩橋を実際に視覚化することで分岐型の塩橋を形成しているか否か、形成している場合はＡ、Ｂ、Ｃのどのタイプに属するかを特定する。
【００４２】
変異導入は、上記で詳細に述べた、塩橋を形成するアミノ酸残基の種類、塩橋構造のタイプ、親酵素の分岐型の塩橋を形成するアミノ酸側鎖間で水素結合を形成している水素と酸素の原子間距離、酵素の立体構造における塩橋の位置、塩橋を形成するアミノ酸残基のコンフォメーションなどの観点から行うことが好ましい。既知の酵素については、アミノ酸配列、立体構造、活性部位、触媒活性に直接関与するアミノ酸、および塩橋部位は、様々な文献及びデータベースで明らかになっており、変異を導入する塩橋を選択する際に考慮することが好ましい。
変異導入は、既知の方法を利用すればよく、例えば、部位特異的変異導入法によって行うことができる。例えば、親酵素をコードする核酸を含むプラスミドを作成し、これを鋳型にして、変異を導入するアミノ酸をコードするコドンを含むプライマーを用いてＰＣＲを行ない、変異を導入した塩基配列の核酸を増幅し、この核酸を含むプラスミドを酵母等の宿主に導入して形質転換し、形質転換した宿主を所定条件で培養して変異型の酵素を発現させることができる。産生された酵素は精製することが好ましい。
【００４３】
３．核酸、ベクター、及び発現カセット
本発明は、上記変異型酵素をコードする核酸も対象とする。核酸の典型的な例は、ＤＮＡであるが、ｍＲＮＡ等も対象となり得る。
本発明による核酸としては、例えば、配列番号１、並びに配列番号１５乃至１８の何れかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は配列番号２に示す塩基配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の配列同一性を有し、分岐型の塩橋を形成するアミノ酸に対応するコドンは、上述した変異導入後のアミノ酸に対応するコドンで置換されている、塩基配列を含み、親酵素と比較して低温での活性が向上している変異型酵素をコードする核酸を挙げることができる。本願明細書での塩基配列の同一性は、ギャップを許し、最大の同一性が得られるアラインメントにおける同じ塩基の百分率（％）を言う。
本発明は、このような核酸を含む、発現ベクター又は発現カセット、或いは当該核酸、発現ベクター又は発現カセットで宿主を形質転換した、形質転換体も対象とする。
発現カセットは、目的の酵素をコードする遺伝子の発現を調節するプロモーター、ターミネーター、オペレーター、エンハンサーなどのいわゆる調節因子を含み得、当業者によって適宜選択され得る。各種塩基配列を含むＤＮＡの合成および連結は、当業者が通常用い得る手法で行われ得る。遺伝子または該遺伝子を含む発現カセットを、ベクターに組み込んで、発現ベクターが構築される。ベクターとしては、既知のベクターから当業者によって適宜選択され得る。また、これらを用いて遺伝子を宿主のプラスミド又はゲノムに導入して、形質転換体を構築する。形質転換方法も、エレクトロポレーションなどの既知の方法を適用すればよい。
【００４４】
４．リアクター、目的物質の製造
本発明は、上述した変異型酵素、或いは形質変換体を含む、リアクターも対象とする。リアクターは、例えば、変異型酵素、或いは宿主生物を固定化する既存の記述を利用して製造することができる。
本発明では、上述した変異型酵素、形質変換体、或いはリアクターを用いて、酵素反応により目的物質を製造することも対象とする。用いる変異型酵素に応じて好適な反応条件を選択すれば良いが、本発明による変異型酵素は、親酵素に比べ、親酵素の至適温度より低い温度での酵素活性が向上している。従って、親酵素の至適温度より低い温度条件を選択することが好ましく、多くの場合、親酵素の至適温度より１０℃から２０℃低い温度を選択することが好ましい。また、親酵素に対して特に活性が向上している温度を選択することが好ましい。このような温度は、各温度で親酵素と酵素活性を比較する事で決定することができる。
【実施例】
【００４５】
以下では、シマミミズ由来のマンナナーゼを用いた実施例及び比較例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、以下の実施例等で実証される技術的事項の基本原理は、他の酵素にも適用可能である。また、以下の実施例等で用いる各手法は、既知の他の手法に置換し得ることも理解される。よって、本発明は以下の実施例等によって何ら限定されるものではない。
【００４６】
１．概要
エンド−β−１，４−マンナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７８）はマンナン内部のβ−１，４マンノシド結合を加水分解し、マンノビオースやマンノトリオースなどのマンノオリゴ糖を生産する酵素であり、細菌、カビなどがマンナナーゼを生産し、植物や無脊椎動物などより高等な生物においてもマンナナーゼが存在することが報告されている。シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｅｔｉｄａ）は、様々な酵素を持ち、マンナナーゼも有している。本試験では、シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｅｔｉｄａ）由来マンナナーゼ（以下、Ｅｆ−Ｍａｎと略称することがある）の分岐型塩橋に変異を導入して、塩橋の架橋強度を弱めた或いは塩橋を破壊した変異型酵素を作成し、その酵素特性について評価した。
【００４７】
２．実験材料及び使用機器
・シマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｅｔｉｄａ）
実験に使用したＥ．  ｆｅｔｉｄａは、長根産業（北海道）から購入した。Ｅ．  ｆｅｔｉｄａを水で洗浄後、２０℃で1晩絶食させた。その後、凍結乾燥し、乳鉢で細かく破砕し、ｍＲＮＡ抽出に使用した。
【００４８】
・配列決定
各酵素をコードするＤＮＡの配列はユーロフィンジェノミクス株式会社のＤＮＡシークエンスサービスに依頼し、その配列を明らかにした。その塩基配列からＥｆ−Ｍａｎのアミノ酸配列を決定した。
【００４９】
・Ｘ線立体構造解析
高エネルギー加速器研究機構が設置した放射光施設（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）のビームライン１７Ａにおいて収集したＸ線回折データに対し、複数のプログラム（ＸＤＳ，  ＣＣＰ４，  Ｃｏｏｔ）を用いて、Ｅｆ−Ｍａｎの立体構造及び分岐型塩橋を特定した。
【００５０】
・Ｅｆ−Ｍａｎ発現系
ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株）の発現系を構築した。Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノール資化性酵母である。メタノール資化には、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）が必要となり、Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓではＡＯＸ１遺伝子とＡＯＸ１プロモーターにより、ＡＯＸが生産され、メタノールを資化出来る。本発現系ではＡＯＸ１プロモーターの下流にＥｆ−Ｍａｎの遺伝子配列を挿入することによって、メタノール資化時にＥｆ−Ｍａｎを発現させる。また、このＧＳ１１５株はＨＩＳ４遺伝子に変異をいれ、ヒスチジン要求株としてある。
【００５１】
・使用培地
試験で用いた各培地の組成を以下に示す。
ＹＰＤ  （Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）培地
１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
２％  ｐｅｐｔｏｎｅ
２％  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  （ｇｌｕｃｏｓｅ）
ＹＰＤＳ＋Ｚｅｏｃｉｎ寒天培地
１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
２％  ｐｅｐｔｏｎｅ
２％  ｄｅｘｔｒｏｓｅ  （ｇｌｕｃｏｓｅ）
１Ｍ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ
２％  ａｇａｒ
１００  ｍｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎ  （ｆｉｎａｌ  ｃｏｎｃ．）
ＢＭＧＹ培地（１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）
１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
２％  ｐｅｐｔｏｎｅ
１００  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ  ６．０
１．３４％  ＹＮＢ  （Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）
４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ
１％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ
ＢＭＭＹ培地（０．５％  ｍｅｔｈａｎｏｌ）
１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
２％  ｐｅｐｔｏｎｅ
１００  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ｐＨ  ６．０
１．３４％  ＹＮＢ
４×１０−５％  ｂｉｏｔｉｎ
０．５％  ｍｅｔｈａｎｏｌ
２×ＴＹ培地
１．６％  ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ
１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ
２．５％  ＮａＣｌ
【００５２】
・ベクター
ｐＰＩＣＺαＡ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．  ｎｏ．Ｖ  １９５−２０)を用いた。これは、目的タンパク質のN末端側にα−ｆａｃｔｏｒ  シグナルペプチドを付加することにより、目的タンパク質を細胞外に分泌させることが出来る、細胞外分泌発現用ベクターである。また、Ｃ末端側に付加された６×Ｈｉｓの存在により、Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質として目的タンパク質を発現させることが出来る。形質転換体の選択はＺｅｏｃｉｎを用いて行なった。
【００５３】
３．野生型のＥｆ−Ｍａｎのアミノ酸配列の特定
ＰＣＲクローニングにより、野生型のＥｆ−Ｍａｎ（Ｅｆ−ＭａｎＷＴ）を得、上記シーケンサーを用いて、Ｅｆ−ＭａｎＷＴのアミノ酸配列を決定した。野生型のＥｆ−Ｍａｎのアミノ酸配列は配列番号１に示されＥｆ−Ｍａｎをコードする塩基配列は配列番号２に示される。
【００５４】
４．分岐型塩橋の特定
放射光施設（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ）のビームライン１７Ａにおいて収集したＸ線回折データを用いてＸ線結晶構造解析法により１．７Å分解能でＥｆ−Ｍａｎの立体構造を決定した。Ｅｆ−Ｍａｎの立体構造において、隣接する塩基性アミノ酸側鎖の窒素原子と及び酸性アミノ酸側鎖の酸素原子間の距離が６．５Å以内である場合に、「塩橋」とみなし、両アミノ酸が水素結合を２つ以上形成し得る側鎖を有する場合に「分岐型の塩橋」と特定した。通常、このような塩橋は、塩基性のアミノ酸残基（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）と酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸とグルタミン酸）との間で形成される。
構造解析の結果、Ｅｆ−Ｍａｎ分子内には、合計で１２本の塩橋が形成されていた。このうち、分岐型の塩橋を形成しているのは、Ａｒｇ６３−Ｇｌｕ１５９、Ａｒｇ１２５−Ａｓｐ１９３、Ａｒｇ２１３−Ａｓｐ２５１、およびＡｒｇ３０２−Ａｓｐ３００であった。それぞれの塩橋の構造を図２乃至４に示す。このうち、Ａｒｇ６３−Ｇｌｕ１５９の塩橋については、近傍にマンナナーゼの加水分解活性に必須と予想される触媒残基（Ｇｌｕ２９３）が存在するため、このアミノ酸残基への影響を回避するため、残り３つの分岐型の塩橋を変異導入対象として選定した。
【００５５】
５．変異型Ｅｆ−Ｍａｎの調製
選択した３つの分岐型の塩橋を形成するアルギニンをリジンへと置換して変異型Ｅｆ−Ｍａｎを調製した。変異導入は、選択した３つの塩橋の１つずつ、３本のうち２本、３本すべて、の計６通りを実施し、最終的に「Ｒ１２５Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ」、「Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、「Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」、及び「Ｒ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ」の６種類の変異型Ｅｆ−Ｍａｎを調製した。また、塩橋を形成するアルギニンをアラニンに置換して塩橋を消滅させる変異を導入した「Ｒ３０２Ａ」の変異型Ｅｆ−Ｍａｎを調製した。
変異の導入は、以下に示す部位特異的変異導入法により実施した。
【００５６】
１）野生型（ＷＴ）プラスミドの獲得
変異型Ｅｆ−Ｍａｎの設計の元となる野生型Ｅｆ−Ｍａｎとしては、配列番号３に示される組換えＥｆ−Ｍａｎを用いた。組換えＥｆ−Ｍａｎは、野生型Ｅｆ−Ｍａｎマンナナーゼの１位〜３６１位のアミノ酸配列（配列番号１）に対して、−１位〜−１６位にシグナルペプチドが付加されている。
ｐＰＩＣＺαＡをベクターとして用い、野生型Ｅｆ−Ｍａｎをコードする塩基配列部分を挿入し、ライゲーション後、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに導入して形質転換体を得た。得られた形質転換体をＺｅｏｃｉｎ含有低塩ＬＢ培地で培養した後、プラスミド抽出を行い、菌体から野生型Ｅｆ−Ｍａｎ（Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴ）をコードするＤＮＡを有するプラスミドを取得した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの形質転換体の培養は、５０ｍｌの２×ＴＹ培地２本を用いて培養し、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２５  ｐｒｅｐｓ  (Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｏｔ  ｎｏ．  ２９３７１０)を用いてプラスミド抽出を行った。操作方法はキットの方法を用いた。プラスミド抽出後、プラスミドの濃縮のために、以下に示す方法でエタノール沈殿を行った。
【００５７】
２）エタノール沈殿
プラスミド抽出溶液に対して０．６倍量のイソプロパノールを加えた。得られた混合液に対して１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え転倒混和した。室温で１０ｍｉｎ放置後、１５，０００ｒｐｍにて１５ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨て、１ｍｌの７０％エタノールを加え軽く転倒混和後、１５，０００ｒｐｍにて５ｍｉｎ遠心分離した。上清を完全に除去し、沈殿を風乾させた。１μｇ／μｌとなるよう滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を加え、沈殿を溶解させた。
【００５８】
３）プライマーの作製
Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴに部位特異的変異導入を行うために、以下のプライマーを作製した。変異導入部位を下線で示した。
【表２】
2019088225.tif 000007
【００５９】
４）変異導入
部位特異的変異導入はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ）のプロトコルに従って行った(http://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/R046A_j.pdf)。
【００６０】
・ＰＣＲ
上記のプライマーを用いて、Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴプラスミドを鋳型にＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した。反応液組成は以下の通りである。
【表３】
2019088225.tif 000008
また、ＰＣＲの条件は、以下の通りである。
【表４】
2019088225.tif 000009
増幅産物は下記に示すアガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。
【００６１】
・アガロースゲル電気泳動
ＰＣＲ産物を６×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと混和し、１．０％アガロースゲルにより電気泳動（１００Ｖ、２０ｍｉｎ）を行い、増幅断片の長さを確認した。
ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒの組成
３６％  グリセロール
３０  ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．０５％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ
０．０３５％  キシレンシアノール
【表５】
2019088225.tif 000010
【００６２】
・鋳型ＤＮＡ（Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴプラスミド）の制限酵素での消化
Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴプラスミドは反応液２０μｌに制限酵素Ｄｐｎ  Ｉ  （１０Ｕ／ｍｌ）を加え、３７℃で１ｈインキュベートすることで鋳型ＤＮＡ（Ｅｆ−Ｍａｎ  ＷＴプラスミド）を消化した。
【００６３】
・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの形質転換
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αにＤｐｎ  Ｉ処理した各ＰＣＲ反応液１．０μｌを添加し、穏やかに撹拌して氷上で３０ｍｉｎ静置した。４２℃で４０ｓｅｃヒートショックを与えた。４５０μｌのＬＢ液体培地を加え３７℃で３ｈ遥動攪拌しながらインキュベートした。インキュベート後、Ｚｅｏｃｉｎ含有低塩ＬＢプレートに培養液５０μｌを播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６４】
・コロニーＰＣＲによる変異導入の確認
真木寿治改訂（１９９７）  ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ  秀潤社に従ってコロニーＰＣＲを実施した。Ｚｅｏｃｉｎ含有低塩ＬＢプレートに形成されたコロニーをランダムに選び、それぞれ爪楊枝でつつき、採取物を以下のＰＣＲ反応液に浸け、次いで採取物を含む反応液を別のＺｅｏｃｉｎ含有低塩ＬＢプレートに植え継いだ。ＰＣＲの条件、プライマーは以下の通りである。
【表６】
2019088225.tif 000011
プライマーには５’−ＡＯＸ１  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３）及び３’ＡＯＸ１−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１４）を用いた。
シーケンサーによる配列解析の結果、目的の部位に変異が確認できたので、得られた大腸菌形質転換体を用いて以後の実験を行った。
【００６５】
６．Ｅｆ−Ｍａｎの酵母による異種発現
酵母におけるＥｆ−Ｍａｎの発現を、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｐｉｃｈｉａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
【００６６】
・プラスミド抽出（Ｍｉｄｉ  ｐｒｅｐ）
上記５の１）及び２）で記載した手順で、変異を導入した大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の形質転換体からプラスミドを抽出し、濃縮した。
【００６７】
・プラスミドの線状化
新しいエッペンチューブに、濃縮したＷＴプラスミド並びに各変異体プラスミドの抽出液１５μｌ、ＰｍｅＩ３μｌ、１０×ＮＥＢ  ｂｕｆｆｕｅｒ４（ｃｕｔ  ｓｍａｒｔ）３μｌ、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水９μｌを混合し３７℃で一晩インキュベートした。この反応液から１μｌを上述したアガロースゲル電気泳動にかけ切断されているかを確認した。
残りの反応液２９μｌにフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（ＰＣＩ）３０μｌを添加し、ボルテックスで混合した。１５，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎで遠心し、上清を新しいエッペンチューブに回収した。この上清に３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ５．２）３μｌを添加して混合し、１００％エタノール７５μｌを添加・混合した後、５ｍｉｎ間氷上に静置し、その後１５，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎで遠心し、上清を除去し、沈殿物を回収した。沈殿物に７０％エタノール１ｍｌを添加・混合した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ間遠心し、エタノールを除去し沈殿物を回収した。風乾させた後、沈殿物に滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１０μｌを加えて溶解した。
【００６８】
・コンピテントセル作製
５ｍｌのＹＰＤ培地に、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５株のシングルコロニーを植菌し、２８℃で終夜培養した。２５０ｍｌのＹＰＤ培地に、前培養から２５０μｌの培養液を植え継ぎ、ＯＤ６００が１．３−１．５になるまで、２８℃で終夜培養した。培養液を５００ｍｌ容遠沈管に移し、１，５００×ｇ、５ｍｉｎ、４℃で遠心し、沈殿物を回収した。この沈殿物に２５０ｍｌの冷滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を加えて懸濁した。懸濁液を同様に遠心し、沈殿物を取り出し、冷滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１２５ｍｌに懸濁し、懸濁液を同様に遠心し、沈殿物を取り出し、冷１Ｍソルビトール１０ｍｌに懸濁し、懸濁液を同様に遠心し、沈殿物を取り出し、冷１Ｍソルビトール５００μｌに懸濁した。
【００６９】
・エレクトロポレーション法による形質転換
コンピテントセル懸濁液８０μｌとＰｍｅＩ処理して線状化した各プラスミド液１０μｌを混合し、冷えた０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し氷上に５ｍｉｎ置いた。ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ＥＣＭ  ６００(Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．)を用いてキュベットに１回パルスを印加した。この時の条件は、１．５ｋＶ、１８６Ω、５０μＦであった。氷冷１Ｍソルビトール１ｍｌをキュベットに添加し、キュベットから４ｍｌ容チューブに移し、３０℃で１−２ｈインキュベートした。１ｍｌＹＰＤ培地を添加し、３０℃で４ｈシェイクしながらインキュベートした。インキュベート後、１００μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎを含有するＹＰＤＳプレートに、培養物１００μｌを接種し、２８℃で２日間培養した。
【００７０】
・マルチコピー形質転換体の選抜
マルチコピー形質転換体の選抜は形質転換プレートからシングルコロニーをピックアップし、終濃度１００／１０００／２０００μｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＤＳプレートに塗抹し、２８℃で２日間培養した。選抜したマルチコピー形質転換体はｐＰＩＣＺαＡ−ＥｆＭａｎを相同組換えにより、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの染色体上のＡＯＸ１遺伝子に挿入しているため、メタノールによって目的タンパク質を培養上清中に発現誘導することができる。以降の発現実験では、２０００μｇ／ｍｌＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＤＳプレートに生育した株を用いた。
【００７１】
・Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた発現
２５ｍｌのＢＭＧＹ培地に選抜した形質転換株のシングルコロニーを植菌し、２８℃、２００−２３０ｒｐｍでＯＤ６００が２−６になるまで２日間培養した。培養液を５０ｍｌ容ファルコンチューブに移し、３０００×ｇ、５ｍｉｎ、室温で遠心した。沈殿を取り出し、少量のＢＭＭＹ培地に懸濁し、２００ｍｌのＢＭＭＹ培地に植え継いだ。１７℃で７日間、２００−２３０ｒｐｍで振とうして培養した。発現誘導を維持するため、２４ｈごとに１００％メタノールを終濃度０．５％となるように添加した。また、メタノールを添加する直前に１ｍｌずつ培養液をサンプリングした。培養終了後、培養液を８，２００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。培養上清中の目的タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００７２】
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
培養後に回収した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルとした（「Ｒ３０２Ａ」の変異型Ｅｆ−Ｍａｎは、後述する精製処理後の各フラクションをサンプルとした）。Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685に記載の方法を参考に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのアクリルアミド濃度は分離ゲルを１０％として、ｒｕｎｎｉｎｇ  ｇｅｌとｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌを以下の通りに試薬を混合して作製した。
【表７】
2019088225.tif 000012
サンプル１０μｌと２×サンプルｂｕｆｆｅｒ１０μｌを混合して３ｍｉｎ煮沸した。煮沸混合物をゲルにアプライし、電気泳動は１枚当たり２０ｍＡ、３００Ｖで行った。分子量マーカーには、Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  (Ｂｉｏ−Ｒａｄ)を使用した。泳動終了後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｇ−２５０で染色し、１０％酢酸で脱色した。図５及び６に示す通り、３９．５ｋＤａに単一なバンドを得られたため、培養上清を以下の精製に供した。
【００７３】
７．Ｅｆ−ＭａｎＷＴ並びに変異型Ｅｆ−Ｍａｎの精製
Ｉ）硫酸アンモニウムによる塩析
培養上清に８０％飽和になるように硫酸アンモニウム（５６１ｇ／Ｌ）をスターラーバーで撹拌しながら、少量ずつ添加した。低温で一晩静置した後、溶液を１１，０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心し、上清を除去した。得られた少量の沈殿に２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え、溶解した。透析用セルロースチューブ（透過分子質量１２０００−１６０００、孔径４０−５０Å、三光純薬）に酵素溶液を入れ、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を外液とし、スターラーバーで撹拌しながら、４℃で一晩透析して脱塩を行った。ｐＰＩＣＺαＡは、発現タンパク質のＣ末端側に６つのヒスチジンから成るＨｉｓ−Ｔａｇが付与されるように設計されている。そこで、得られた粗酵素液をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィーに供し、発現タンパク質を精製した。
【００７４】
ＩＩ）ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィー
クロマトグラフィーの基本的仕様及び用いた各バッファーの組成
・基本仕様
ゲルマトリックス：６％ 高度架橋アガロース
平均粒子径：３４  μｍ
担体容量：1 ml
カラムサイズ：０．７×２．５  ｃｍ（１ｍｌ）
流速：１  ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ
２０  ｍＭ リン酸カリウムバッファー(ｐＨ  ７．０)
５００  ｍＭ  ＮａＣｌ
２０  ｍＭ  イミダゾール
・Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ
２０  ｍＭ  リン酸カリウムバッファー(ｐＨ  ７．０)
５００  ｍＭ  ＮａＣｌ
５００  ｍＭ  イミダゾール
【００７５】
処理手順
カラム中のゲルマトリックス（１ｍｌ）をＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌで平衡化した。硫安塩析後の粗酵素液を０．４５μｍフィルターでろ過した後で、クロマトグラフィーに１ｍｌアプライした。１ｍｌ／ｍｉｎの流速で、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ５ｍｌでゲルマトリックスを洗浄した。その後、同じ流速で、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ２０ｍｌで発現タンパク質を溶出させた。溶出液は約１ｍｌずつ分画した。各フラクションについてＡ２８０と加水分解活性を測定した。
【００７６】
８．各フラクションのＡ280と酵素活性を測定
Ｉ）Ａ280は、分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７７】
ＩＩ）酵素活性
酵素活性（加水分解活性）は、Somogyi M. (1952) Notes on Sugar Determination. The Journal of Biological Chemistry, 195: 19-23の記載に従って、ソモギ−ネルソン法による還元糖の定量により評価した。
【００７８】
試薬
ソモギ試薬（銅試薬）の調製
Ａ液：１５％硫酸銅液（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １５ｇ／１００ｍｌ）
Ｂ液：無水炭酸ナトリウム２５ｇ、酒石酸カリウムナトリウム（ロッセル塩）２５ｇ、炭酸水素ナトリウム２０ｇ、及び無水硫酸ナトリウム２００ｇを蒸留水で溶解し１Ｌとした。
ネルソン試薬（発色試薬）の調製
１０００ｍｌメスフラスコに（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ２５ｇを９００ｍｌの蒸溜水に溶解し、これに濃硫酸４２ｇとＮａ２ＨＡｓＯ４・７Ｈ２Ｏ３ｇを加え、蒸溜水を加えて全体積１Ｌとした。
基質溶液：０．４％（ｗ／ｖ）ｌｏｃｕｓｔ  ｂｅａｎ  ｇｕｍ
バッファー：０．１ＭＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．０）
【００７９】
分析手順
基質溶液５０μｌ、各フラクション流出液１０μｌ及びバッファー５０μｌを混合して試験試料とし、各フラクション流出液１０μｌ及びバッファー５０μｌを混合して、Ｂｌａｎｋ試料とした。各試料を３７℃で１５分インキュベートした後で、Ａ液４０μｌ、及びＢ液１ｍｌを混合して要事調製したソモギ試薬１００μｌを各試料に加え、ボルテックスで混合した。Ｂｌａｎｋ試料には基質溶液を加え、ボルテックスで混合した。各試料を１００℃で１０ｍｉｎ煮沸した後、１０分以上、氷水で急冷した。各試料にネルソン試薬１００μｌを加え、ボルテックスで混合後２０ｍｉｎ静置した。蒸留水１ｍｌを加え、遠心後、６５５ｎｍで吸光度を測定した。活性値（Ｕ／ｍｌ）は、１分間に１μｍｏｌのマンノースに相当する還元糖を遊離する酵素量として求めた。Ｅｆ−ＭａｎＷＴの試料並びに各変異型Ｅｆ−Ｍａｎにおける各フラクションの活性値をＡ２８０値と伴に、図７に示す。図７に示す通り、をＡ２８０の吸収ピークとマンナナーゼ活性のピークが一致し、目的タンパク質がＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰに吸着させていることが確認された。Ａ２８０の吸収ピークとマンナナーゼ活性のピークが一致したフラクションを酵素学的性質の評価に用いた。
【００８０】
９．Ｅｆ−ＭａｎＷＴ並びに変異型Ｅｆ−Ｍａｎの酵素学的性質の評価
以下で述べる酵素学的性質の測定では、全てｎ＝３で行い、上記精製によって得られた各組換え酵素試料を以下の表に示すタンパク質濃度として用いた。
【表８】
2019088225.tif 000013
【００８１】
１）低温での酵素活性の評価
Ｅｆ−ＭａｎＷＴの至適温度を確認するために、精製した組換え酵素（Ｅｆ−ＭａｎＷＴ）を、基質と、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の温度で１５分間反応させ、当該組換え酵素の活性をソモギ・ネルソン法で測定した。酵素活性の測定条件及び測定手順は、上記８のＩＩ）と同様である。Ｅｆ−ＭａｎＷＴの酵素活性の温度依存性を図８に示す。図８に示すとおり、Ｅｆ−ＭａｎＷＴの至適温度は約６０℃である。
変異型Ｅｆ−Ｍａｎの低温での酵素活性を調べるために、上記Ｅｆ−ＭａｎＷＴの至適温度（６０℃）よりも低温下での酵素活性を測定した。即ち、精製した各組換え酵素を、基質と、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃の温度で１５分間反応させ、各組換え酵素の活性をソモギ・ネルソン法で測定した。酵素活性の測定条件及び測定手順は、上記８のＩＩ）と同様である。Ｒ１２５Ｋ、Ｒ２１３Ｋ、Ｒ３０２Ｋ、Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ）およびＲ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋの各変異型Ｅｆ−ＭａｎとＥｆ−ＭａｎＷＴの酵素活性の測定結果を図９から１３に示し、２０℃におけるＥｆ−ＭａｎＷＴ及びＲ１２５Ｋ、Ｒ２１３Ｋ、Ｒ３０２Ｋ、Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２ＫおよびＲ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋの各変異型Ｅｆ−Ｍａｎの酵素活性の比較を図１４に示し、２０℃におけるＥｆ−ＭａｎＷＴ及びＲ３０２Ａの変異型Ｅｆ−Ｍａｎの酵素活性の比較を図１５に示す。当該２０℃は、変異型マンナナーゼを用いたマンノース製造温度として期待する温度である。
図１４および図９から１３に示すように、分岐型の塩橋の何れか一つの塩橋強度を小さくした変異型マンナナーゼ（Ｒ１２５Ｋ、Ｒ２１３Ｋ、Ｒ３０２Ｋ）のいずれも、野生型マンナナーゼの至適温度よりも低い温度（特に２０℃）での酵素活性が改善された。また、２つの変異を導入した変異型マンナナーゼ（Ｒ１２５Ｋ／Ｒ３０２Ｋ）および３つの変異を導入した変異型マンナナーゼ（Ｒ１２５Ｋ／Ｒ２１３Ｋ／Ｒ３０２Ｋ）のいずれも野生型マンナナーゼの至適温度よりも低い温度（特に２０℃）での酵素活性が改善された。
これらの結果より、親酵素分岐型の塩橋の塩橋強度を小さくするように変異を導入することにより、親酵素の至適温度よりも低い温度での酵素活性を向上できることを確認した。
また、図１５に示すように、分岐型の塩橋の一つを塩橋強度が小さくなるように置換した変異型マンナナーゼ（Ｒ３０２Ｋ）が、同じ塩橋を塩橋が消滅するように置換した変異型マンナナーゼ（Ｒ３０２Ａ）と比較しても、野生型マンナナーゼの至適温度よりも低い２０℃で、酵素活性がより改善された。この結果は、親酵素分岐型の塩橋の塩橋強度を小さくするように変異を導入することにより、塩橋を消滅させるように変異を導入するより、親酵素の至適温度よりも低い温度での酵素活性をより向上し得ることを確認した。
【００８２】
２）熱安定性の測定
Ｅｆ−ＭａｎＷＴ、並びにＲ３０２Ｋ、及びＲ３０２Ａの変異型Ｅｆ−Ｍａｎの５０℃における安定性を測定するために、各試料を、５０℃で、０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４５ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、７５ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ及び２４０ｍｉｎ処理し、残存活性をソモギ・ネルソン法で測定した。酵素活性の測定条件及び測定手順は、上記８のＩＩ）と同様である。各組換え酵素の温度安定性を図１６に示す。図１６に示す通り、５０℃では、Ｒ３０２Ｋ変異型Ｅｆ−Ｍａｎは、Ｅｆ−ＭａｎＷＴと温度安定性に大きな差は無いのに対して、Ｒ３０２Ａの変異型Ｅｆ−Ｍａｎでは、時間経過に伴い比活性が著しく減少し、塩橋を維持する変異により安定性が保持されることが確認された。
【００８３】
３）各種マンナナーゼとの活性比較
２種の市販酵素Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来マンナナーゼ(Ｍｅｇａｚｙｍｅ)、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来マンナナーゼ(Ｍｅｇａｚｙｍｅ)、及びＥｆ−ＭａｎＷＴと、Ｒ３０２Ｋ変異型Ｅｆ−Ｍａｎとを、４０℃の反応温度でマンナナーゼ活性を比較した。酵素活性の測定条件及び測定手順は、上記８のＩＩ）と同様である。各酵素の酵素活性の比較を図１７に示す。
図１７に示すとおり、今回具体的な対象酵素として使用したシマミミズ由来のマンナナーゼ（野生型）が市販酵素と比較して優れた酵素活性を有する。そして、本発明によると、かかるシマミミズ由来のマンナナーゼの酵素活性（特に低温での酵素活性）をさらに改善し得ることが示された。このように、本発明は、酵素活性の改善を可能とする技術に関するものであり、優れた酵素活性を有する親酵素のさらなる酵素活性の改善にも適用可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、低温での活性が改善された酵素が提供され、工業的生産及び処理でエネルギー効率の向上が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月16日(2017.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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