(57)【要約】      （修正有）【課題】アマミノクロウサギの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及び個体識別方法の提供。【解決手段】アマミノクロウサギの個体識別に用いられる特定の塩基配列からなる８組のＰＣＲプライマーセットである。これら少なくとも８組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてアマミのクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする少なくとも８種類のポリメラーゼ連鎖反応を行い、マイクロサテライト多型解析法により個体識別を行うアマミのクロウサギの個体識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アマミノクロウサギの個体識別に用いられるＰＣＲプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列からなるプライマーＡと、配列番号２の塩基配列からなるプライマーＢとからなる第１プライマーセット、
配列番号３の塩基配列からなるプライマーＣと、配列番号４の塩基配列からなるプライマーＤとからなる第２プライマーセット、
配列番号５の塩基配列からなるプライマーＥと、配列番号６の塩基配列からなるプライマーＦとからなる第３プライマーセット、
配列番号７の塩基配列からなるプライマーＧと、配列番号８の塩基配列からなるプライマーＨとからなる第４プライマーセット、
配列番号９の塩基配列からなるプライマーＩと、配列番号１０の塩基配列からなるプライマーＪとからなる第５プライマーセット、
配列番号１１の塩基配列からなるプライマーＫと、配列番号１２の塩基配列からなるプライマーＬとからなる第６プライマーセット、
配列番号１３の塩基配列からなるプライマーＭと、配列番号１４の塩基配列からなるプライマーＮとからなる第７プライマーセット、及び
配列番号１５の塩基配列からなるプライマーＯと、配列番号１６の塩基配列からなるプライマーＰとからなる第８プライマーセットからなる、ＰＣＲプライマーセット。
【請求項２】
ペンタラグス・フルネスィ（Ｐｅｎｔａｌａｇｕｓ  ｆｕｒｎｅｓｓｉ）の個体識別に用いられる、請求項１に記載のＰＣＲプライマーセット。
【請求項３】
少なくとも８組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてアマミノクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする少なくとも８種類のポリメラーゼ連鎖反応を行い、マイクロサテライト多型解析法により個体識別を行うアマミノクロウサギの個体識別方法において、
上記ＰＣＲプライマーセットとして、請求項１又は２に記載のものを用いる、アマミノクロウサギの個体識別方法。
【請求項４】
上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の長さを比較することにより個体識別を行う、請求項３に記載のアマミノクロウサギの個体識別方法。
【請求項５】
上記ＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の塩基配列を決定し該塩基配列を比較することにより個体識別を行う、請求項３に記載のアマミノクロウサギの個体識別方法。
【請求項６】
上記ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング温度Ｔａを５０℃〜７０℃とする、請求項３〜５のいずれか１項に記載のアマミノクロウサギの個体識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ多型の検出によるアマミノクロウサギの個体識別方法及びこれに用いるＰＣＲプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウサギ目ウサギ科に属するアマミノクロウサギは、世界で奄美大島及び徳之島にのみ生息する日本固有種である。生息地である原生林の減少及びマングースやノネコ等の外来生物による捕食の影響により、本種は絶滅の危険性が高いといわれている。
【０００３】
アマミノクロウサギは、文化財保護法により国の特別天然記念物に指定されているほか、絶滅のおそれのある野生動植物の種の保存に関する法律では国内希少野生動植物種に指定されている。また、アマミノクロウサギの保全対策としては、文部科学省、農林水産省、環境省の３省により保護増殖事業計画が策定されており、その中において生息状況の調査及びモニタリングや生物学的特性の把握等を早急に進める必要性が指摘されている。
【０００４】
野生生物の保全対策を立てるためには、分布域や個体数といった生息状況に関する情報を把握する必要がある。アマミノクロウサギは、林道上や沢沿いの岩の上など開けた場所に糞を排泄するという性質があるため、野外でも比較的糞が見つけやすい。そのため、これまでのアマミノクロウサギを対象とした生息状況調査では、「糞粒法」により生息個体密度の推定が行われてきた。
【０００５】
糞粒法とは、調査員が調査区画内で確認した１日当たりの糞粒数を１頭当たりの日平均排泄糞粒数で除算することで区画面積当たりの生息密度を推定する手法である。かかる手法は特殊な機器等を使用しないことから、簡単で安価に調査を行うことが可能である。
【０００６】
ところで、近年の分子遺伝学的手法の発展により、ポリメラーゼ連鎖反応（つまり、ＰＣＲ）法を用いたゲノムＤＮＡの多型の判別により個体を識別する方法が確立されている。具体的には、シバ属植物の品種、系統または個体を識別する方法やテンの個体を識別する方法が開発されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−０２７５６６号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０９９５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、アマミノクロウサギについては、ゲノムＤＮＡの多型判別による個体識別の方法は確立されていない。したがって、従来の糞粒法に依存する他ないのが現状である。
【０００９】
しかし、糞粒法を用いたアマミノクロウサギの生息密度の推定手法においては、野外での気象条件の影響により糞粒が消失するおそれがある。また、食べた餌の種類によりアマミノクロウサギから排泄される糞粒数が変動することが知られている。したがって、従来の糞粒法によるアマミノクロウサギの生息密度の推定値は正確性に欠ける。そこで、より正確に生息個体数を推定する方法の開発が求められている。
【００１０】
本発明は、かかる背景に鑑みてなされたものであり、アマミノクロウサギの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及び個体識別方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、アマミノクロウサギの個体識別に用いられるＰＣＲプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列からなるプライマーＡと、配列番号２の塩基配列からなるプライマーＢとからなる第１プライマーセット、
配列番号３の塩基配列からなるプライマーＣと、配列番号４の塩基配列からなるプライマーＤとからなる第２プライマーセット、
配列番号５の塩基配列からなるプライマーＥと、配列番号６の塩基配列からなるプライマーＦとからなる第３プライマーセット、
配列番号７の塩基配列からなるプライマーＧと、配列番号８の塩基配列からなるプライマーＨとからなる第４プライマーセット、
配列番号９の塩基配列からなるプライマーＩと、配列番号１０の塩基配列からなるプライマーＪとからなる第５プライマーセット、
配列番号１１の塩基配列からなるプライマーＫと、配列番号１２の塩基配列からなるプライマーＬとからなる第６プライマーセット、
配列番号１３の塩基配列からなるプライマーＭと、配列番号１４の塩基配列からなるプライマーＮとからなる第７プライマーセット、及び
配列番号１５の塩基配列からなるプライマーＯと、配列番号１６の塩基配列からなるプライマーＰとからなる第８プライマーセットからなる、ＰＣＲプライマーセットにある。
【００１２】
本発明の他の態様は、少なくとも８組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてアマミノクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする少なくとも８種類のポリメラーゼ連鎖反応を行い、マイクロサテライト多型解析法により個体識別を行うアマミノクロウサギの個体識別方法において、
上記ＰＣＲプライマーセットとして、上記のものを用いる、アマミノクロウサギの個体識別方法にある。
【発明の効果】
【００１３】
上記ＰＣＲプライマーセットは、上記第１〜第８プライマーセットという特定配列の８組のプライマーセットを有する。即ち、上記特定配列の８組のプライマーセットの組合せからなる。これらのプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行うことにより、アマミノクロウサギに対する精度の優れた個体識別が可能になる。たとえ測定対象の集団内に互いに血縁関係のある個体が存在していたとしても、高い精度での個体識別が可能になる。
【００１４】
上記ＰＣＲプライマーセットを用いた個体識別方法においては、アマミノクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とする少なくとも８種類のポリメラーゼ連鎖反応（つまり、ＰＣＲ）を行う。つまり、上述の８組のプライマーセットをそれぞれ用いてＰＣＲを行う。これにより、マイクロサテライト多型解析法によるアマミノクロウサギの個体識別を行うことができる。具体的には、ゲノムＤＮＡ中に存在する２塩基から数塩基を単位とした反復配列（つまり、マイクロサテライト）をＰＣＲにより増幅して、その反復配列の繰り返しの数に基づいてゲノムＤＮＡの多型性を識別し、個体識別を行うことができる。
【００１５】
上記個体識別方法においては、ＰＣＲに少なくとも８組の上記特定の組合せのプライマーセットをそれぞれ用いている。そのため、非常に精度の高い識別が可能になり、上述のようにたとえ測定対象の集団内に互いに血縁関係のある個体が存在していたとしても、高い精度で個体識別を行うことができる。
【００１６】
また、上記ＰＣＲプライマーセットを用いると、アマミノクロウサギの例えば糞のような排泄物から採取したＤＮＡに対しても反復配列の増幅が可能になる。そのため、アマミノクロウサギの個体自体に直接接触することなく、測定対象エリア内に存在する個体の識別が可能になる。したがって、上述のとおり保護が求められているアマミノクロウサギの個体に対して、フィジカルなダメージ等の悪影響を与えることなく個体識別が可能になる。
【００１７】
以上のように、本発明によれば、アマミノクロウサギの個体識別が可能になるＰＣＲプライマーセット及び個体識別方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
上記ＰＣＲプライマーセットは、アマミノクロウサギの個体識別に用いることができる。アマミノクロウサギの学名はペンタラグス・フルネスィ（Ｐｅｎｔａｌａｇｕｓ  ｆｕｒｎｅｓｓｉ）である。ＰＣＲプライマーセットは、第１〜第８プライマーセットからなる。
【００１９】
第１プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるプライマーＡと、配列番号２の塩基配列からなるプライマーＢとからなる。第２プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるプライマーＣと、配列番号４の塩基配列からなるプライマーＤとからなる。第３プライマーセットは、配列番号５の塩基配列からなるプライマーＥと、配列番号６の塩基配列からなるプライマーＦとからなる。第４プライマーセットは、配列番号７の塩基配列からなるプライマーＧと、配列番号８の塩基配列からなるプライマーＨとからなる。
【００２０】
第５プライマーセットは、配列番号９の塩基配列からなるプライマーＩと、配列番号１０の塩基配列からなるプライマーＪとからなる。第６プライマーセットは、配列番号１１の塩基配列からなるプライマーＫと、配列番号１２の塩基配列からなるプライマーＬとからなる。第７プライマーセットは、配列番号１３の塩基配列からなるプライマーＭと、配列番号１４の塩基配列からなるプライマーＮとからなる。第８プライマーセットは、配列番号１５の塩基配列からなるプライマーＯと、配列番号１６の塩基配列からなるプライマーＰとからなる。
【００２１】
具体的には、プライマーＡは、第１プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＣＴＧＣＣＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＴＧＧ（配列番号１）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＢは、第１プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＴＣＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＡＣ（配列番号２）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２２】
プライマーＣは、第２プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＴＣＧＴＣＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴ（配列番号３）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＤは、第２プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＧＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＴＣＡ（配列番号４）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２３】
プライマーＥは、第３プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＣＣＴＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＴ（配列番号５）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＦは、第３プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＴＴＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号６）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２４】
プライマーＧは、第４プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＡＣＡＧ（配列番号７）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＨは、第４プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＴＧＣＣＣＴＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＧ（配列番号８）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２５】
プライマーＩは、第５プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ（配列番号９）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＪは、第５プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡ（配列番号１０）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２６】
プライマーＫは、第６プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＴＴＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡ（配列番号１１）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＬは、第６プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧ（配列番号１２）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２７】
プライマーＭは、第７プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＧＣＣＴＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴ（配列番号１３）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＮは、第７プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧ（配列番号１４）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２８】
プライマーＯは、第８プライマーセットのフォワード側のプライマーであり、ＡＣＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣ（配列番号１５）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。プライマーＰは、第８プライマーセットのリバース側のプライマーであり、ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧ（配列番号１６）という塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２９】
配列番号１〜１６の塩基配列からなる各プライマーは、例えば市販のＤＮＡシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００３０】
ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲは、アマミノクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として行うことができる。ゲノムＤＮＡは、アマミノクロウサギの組織、体毛、体液、排せつ物等から抽出することができる。ゲノムＤＮＡの抽出方法は、特に限定されず、対象試料に応じて最適な方法を採用すればよい。
【００３１】
また、アマミノクロウサギの個体識別は、上述の８組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の長さを比較することにより行うことができる。この場合には、比較的簡単な操作で個体識別を行うことができる。ポリメラーゼ連鎖反応物（つまり、ＰＣＲ産物）の長さは、アガロース、アクリルアミド等のゲル中での電気泳動により測定することができる。ゲルとしては、特に限定されるわけではないが、例えばアプライド・バイオシステムズ社製のＰＯＰ−７TMポリマーなどの市販品を利用することができる。
【００３２】
また、上述の８組のＰＣＲプライマーセットをそれぞれ用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って得られるポリメラーゼ連鎖反応物の塩基配列を決定し、その塩基配列を比較することにより個体識別を行うこともできる。この場合には、より一層正確な個体識別が可能になる。塩基配列の決定方法は、特に限定されないが、例えば市販のシークエンサーを用いて行うことができる。
【００３３】
ポリメラーゼ連鎖反応（つまり、ＰＣＲ）は、例えば次のようにして行うことができる。まず、ＰＣＲ反応用緩衝液中で、アマミノクロウサギから抽出したゲノムＤＮＡと、第１〜第８プライマーセットのうちの１つのプライマーセットと、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼとを混合する。ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰと、ｄＴＴＰと、ｄＧＴＰと、ｄＣＴＰとの混合物である。次いで、混合物を適当な温度サイクルで反応させることにより、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ反応用緩衝液は、特に限定されるわけではないが、例えば市販品を用いることができる。
【００３４】
ポリメラーゼ連鎖反応は、第１〜第８プライマーセットのうちの一組（フォワード側プライマー及びリバース側プライマー）のプライマーセットを用いて行う。上記個体識別方法においては、第１〜第８プライマーセットをそれぞれ用いて少なくとも８回のポリメラーゼ連鎖反応を行う。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応の反応条件は、目的の反応物が増幅するように、適宜調整することができる。例えば、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液１〜１０μｌ、ゲノムＤＮＡ１０〜５００ｎｇ、フォワード側の各プライマー０．２〜１．０μＭ、リバース側の各プライマー０．２〜１．０μＭ、ｄＮＴＰ２．０〜３．０ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ０．２５〜２．５Ｕを混合し、全液量が１０〜１００μｌとなるように希釈した混合物を用いることができる。
【００３６】
ポリメラーゼ連鎖反応における温度条件（サイクル条件）は、例えば次のようにして行うことができる。
ステップ１（１サイクル）：９４〜９６℃、約１〜５分
ステップ２（３０〜４５サイクル）：９４〜９６℃、約１０〜６０秒→５０〜７０℃（アニーリング温度Ｔａ）、約１０〜６０秒→６８〜７２℃、約１０〜６０秒
ステップ３（１サイクル）：６８〜７２℃、約１〜１０分
【００３７】
ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング温度Ｔａは５０℃〜７０℃にすることが好ましい。この場合には、より正確な個体識別が可能になる。反復配列以外の領域が増幅されることをより抑制するという観点から、アニーリング温度Ｔａは、５５℃以上がより好ましく、６０℃以上がさらに好ましい。また、ＰＣＲプライマーセットがゲノムＤＮＡにより結合しやすくなるという観点から、アニーリング温度Ｔａは、６８℃以下がより好ましく、６５℃以下がさらに好ましい。
【００３８】
プライマーセット１〜８におけるフォワード側及びリバース側の少なくとも一方の末端には、蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。この場合には、ＰＣＲ反応後の検出を容易にすることができる。蛍光物質としては、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（つまり、ＨＥＸ）、６−カルボキシフルオレッセイン（つまり、ＦＡＭ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（つまり、Ｒｏｘ）等を用いることができる。
【実施例】
【００３９】
（実験例）
本例は、アマミノクロウサギの反復配列（つまり、マイクロサテライト）からプライマーの設計を行い、プライマーの有効性を確認する例である。
【００４０】
まず、プライマー設計のためにアマミノクロウサギのゲノムＤＮＡを採取した。ゲノムＤＮＡの採取には、環境省から提供されたアマミノクロウサギの成獣の筋肉片を用いた。筋肉片からのゲノムＤＮＡの抽出は、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製のディーエヌイージー・ティシュー・キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）を用いて行った。
【００４１】
次に、次世代シークエンサーを用いて、筋肉片から採取したゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。次世代シークエンサーとしては、イルミナ（ｉｌｌｍｉｎａ）社製のマイセック（ＭｉＳｅｑ）を用いて行った。次世代シークエンサーから出力された配列データは、付属のソフトウェアを使用する事によりベースコール及び標準のフィルタリングを実施した。
【００４２】
次に、コンピュータソフトウェア「キューディーディー  バージョン３．１．２（ＱＤＤ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．２）」を用いて、ゲノムＤＮＡの塩基配列データが収容されたファスタ（ｆａｓｔａ）形式ファイルから、マイクロサテライト配列を含み、かつ、マイクロサテライト配列の両側にプライマーを設計するための十分な長さ（具体的には１００ｂｐ以上）の隣接配列が存在する配列データを抽出した。これらの配列データうち、７４６個の配列データからフォワード側及びリバース側のプライマーセットの設計が可能であった。「キューディーディー」については、下記参考文献を参照することができる。
【００４３】
（参考文献）
「キューディーディー：ア  ユーザ  フレンドリ  プログラム  トゥ  セレクト  マイクロサテライト  マーカーズ  アンド  デザイン  プライマーズ  フローム  ラージ  シークエンシング  プロジェクツ（ＱＤＤ：ａ  ｕｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔｓ.）」  バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ），２０１０，  ２６（３）,  ｐ．４０３−４０４
【００４４】
次いで、これら７４６個のプライマーセットのうち、ポリメラーゼ連鎖反応物（つまり、ＰＣＲ産物）の長さが３００ｂｐ以下で、かつ、上述のコンピュータソフトウェア「キューディーディー  バージョン３．１．２（ＱＤＤ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．２）」から出力されるプライマー３ペナルティスコア（ＰＲＩＭＥＲ３  ＰＥＮＡＬＴＹ  ＳＣＯＲＥ）が０．１以下であるという条件を満たす２６組のマイクロサテライト遺伝子座を特定した。後述のようにアマミノクロウサギの個体識別に実際に使用する８組のプライマーセット（具体的に、プライマーＡ〜Ｐ）について、遺伝子座名、その長さ、フォワード側又はリバース側の種類、標識用の蛍光色素の種類、アニーリング温度Ｔａを表１に示す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
表１に示されるように、第１プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１８２のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＡ（フォワードプライマー）及びプライマーＢ（リバースプライマー）からなる。プライマーＡの配列を配列番号１に示し、プライマーＢの配列を配列番号２に示す。
【００４７】
第２プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ６１のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＣ（フォワードプライマー）及びプライマーＤ（リバースプライマー）からなる。プライマーＣの配列を配列番号３に示し、プライマーＤの配列を配列番号４に示す。
【００４８】
第３プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７３のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＥ（フォワードプライマー）及びプライマーＦ（リバースプライマー）からなる。プライマーＥの配列を配列番号５に示し、プライマーＦの配列を配列番号６に示す。
【００４９】
第４プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７１のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＧ（フォワードプライマー）及びプライマーＨ（リバースプライマー）からなる。プライマーＧの配列を配列番号７に示し、プライマーＨの配列を配列番号８に示す。
【００５０】
第５プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ１９のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＩ（フォワードプライマー）及びプライマーＪ（リバースプライマー）からなる。プライマーＩの配列を配列番号９に示し、プライマーＪの配列を配列番号１０に示す。
【００５１】
第６プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ３７０のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＫ（フォワードプライマー）及びプライマーＬ（リバースプライマー）からなる。プライマーＫの配列を配列番号１１に示し、プライマーＬの配列を配列番号１２に示す。
【００５２】
第７プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４３５のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＭ（フォワードプライマー）及びプライマーＮ（リバースプライマー）からなる。プライマーＭの配列を配列番号１３に示し、プライマーＮの配列を配列番号１４に示す。
【００５３】
第８プライマーセットは、遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４２のマイクロサテライトに対するプライマーセットであり、プライマーＯ（フォワードプライマー）及びプライマーＰ（リバースプライマー）からなる。プライマーＯの配列を配列番号１５に示し、プライマーＰの配列を配列番号１６に示す。
【００５４】
次に、第１〜第８の各プライマーセットについて、マイクロサテライトマーカーとしての有効性を確認する。具体的には、各プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、アマミノクロウサギの筋肉片３０検体から抽出したＤＮＡについて対立遺伝子の検出を行った。これらの筋肉片は、２００９年〜２０１５年に奄美大島で回収されたアマミノクロウサギの個体から採取したものである。
【００５５】
まず、キアゲン社製の「ディーエヌイージー・ティシュー・キット」を用いて、筋肉片からのゲノムＤＮＡを抽出した。次に、鋳型ＤＮＡ（濃度：５０ｎｇ／μＬ)１．０μＬ、蛍光標識したフォワードプライマー（濃度：５０μＭ）、未標識のリバースプライマー（濃度：５０μＭ）各０．１μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製の「ＴＡＫＡＲＡ  ＥＸ  Ｔａｑ（登録商標）  ＨＳ」（濃度：５ｕｎｉｔｓ／μＬ）０．０５μＬ、酵素添付品の１０×ＰＣＲバッファー１．０μＬ、及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（濃度：２．５ｍＭ  ｅａｃｈ)０．８μＬの混合物を滅菌ｍｉｌｌｉ-Ｑ水（つまり、滅菌超純水）で希釈して総量を１０μＬとした。鋳型ＤＮＡが筋肉片から抽出したゲノムＤＮＡである。
【００５６】
この混合液を以下のＰＣＲサイクル条件で反応させた。
ステップ１（１サイクル）：９５℃、２分
ステップ２（３０サイクル）：９５℃、３０秒→各プライマーセットのアニーリング温度Ｔａ（表１参照）、２０秒→７２℃、２０秒
【００５７】
次に、ＰＣＲ産物を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の「３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」及びアプライド・バイオシステムズ社製の「Ｔｈｅ  ＧｅｎｅＳｃａｎTM  ５００  ＲＯＸTM  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ」を用いて検出し、アプライド・バイオシステムズ社製の「ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ４．０」により断片サイズを決定した。各操作は、添付のマニュアルに従って行った。
【００５８】
各プライマーセットを用いて検出される対立遺伝子（つまり、アリル）の数を表２に示す。具体的には、上述の各プライマーセットを用いたＰＣＲを行って検出されるＰＣＲ産物の長さのバリエーション数を計測し、これを対立遺伝子数とした。
【００５９】
また、ヘテロ接合体率の期待値（つまり、エクスペクティッド・ヘテロザイゴシティ、ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）Ｈexp、ヘテロ接合体率の観察値（オブザーブド・ヘテロザイゴシティ、ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）Ｈobsを表２に示す。
【００６０】
ヘテロ接合体率の期待値Ｈexpは、下記の数式（１）で計算される。数式（１）において、Ｐiはｉ番目の対立遺伝子のサンプル頻度を示し、Ｋは対立遺伝子の数を示す。
【００６１】
【数１】
2019058102.tif 000003
【００６２】
ヘテロ接合体率の観察値Ｈobsは、あるマーカー座におけるヘテロ接合している個体の割合を示す。
【００６３】
また、アマミノクロウサギの個体識別に対する各プライマーセットの有効性を判断するために、コンピュータソフトウェア「ギムレット  バージョン１．３．３（ＧＩＭＬＥＴ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３．３）」(ナタニエル・ヴァリエール（Ｎａｔｈａｎｉｅｌ  Ｖａｌｉｅｒｅ）作  ２００２)を用いて個体識別確率（プロバビリティ・オブ・アイデンティティ（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ））ＰＩＤを計算した。
【００６４】
個体識別確率ＰＩＤには、非血縁個体間（つまり、非血縁集団内）の個体識別確率ＰＩＤtheoricと、同胞個体間（つまり、血縁集団内）の個体識別確率ＰＩＤsibsとがある。非血縁個体間の個体識別確率は、集団内の血縁の存在を無視した理論上の値であるため、個体識別確率の理論値といわれることがある。
【００６５】
非血縁個体間の個体識別確率ＰＩＤtheoricは、パートコー・ディ・アンド・ストロベック・シー（Ｐａｅｔｋａｕ  Ｄ．  ＆  Ｓｔｒｏｂｅｃｋ  Ｃ）著、マイクロサテライト・アナリシス・オブ・ジェネティック・バリエイション・イン・ブラック・ベア・ポピュレイションズ（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌａｃｋ  ｂｅａｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．）、「モレキュラー・エコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）」、米国、１９９４年、第３巻、ｐ４８９−４９５の記載に従って計算した。第１〜第８プライマーセットについて、累積のＰＩＤtheoricの結果を表２に示す。なお、第１プライマーセットの累積のＰＩＤtheoricは、第１プライマーセットのＰＩＤtheoric値であり、第ｎプライマーセットの累積のＰＩＤtheoricは、第１プライマーセット〜第ｎプライマーセットまでの各ＰＩＤtheoricの積から算出される。
【００６６】
同胞個体間の個体識別確率ＰＩＤsibsは、タバーレット・ピー・アンド・ルイカート・ジー（Ｔａｂｅｒｌｅｔ  Ｐ．  ＆  Ｌｕｉｋａｒｔ  Ｇ）著、ノンインベイシブ・ジェネティック・サンプリング・アンド・インディイジュアル・アイデンティフィケイション・データ（Ｎｏｎ-ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）、「バイオロジカル・ジャーナル・オブ・ザ・リンネン・ソサイティ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｅｌｅ  Ｌｉｎｎｅａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、英国、１９９９年、第６８巻、ｐ４１−５５の記載に従って計算した。第１〜第８プライマーセットについて、累積のＰＩＤsibsの結果を表２に示す。なお、第１プライマーセットの累積のＰＩＤsibsは、第１プライマーセットのＰＩＤsibs値であり、第ｎプライマーセットの累積のＰＩＤsibsは、第１プライマーセット〜第ｎプライマーセットまでの各ＰＩＤsibsの積から算出される。
【００６７】
【表２】
2019058102.tif 000004
【００６８】
表２より知られるごとく、第１〜第８プライマーセットにおいては、これら８つのプライマーセットを組み合わせた非血縁個体間の個体識別確率ＰＩＤtheoricが２．３５×１０-9であり、同胞個体間の個体識別確率（ＰＩＤsibs）が４．９４×１０-4であった。即ち、別個体でありながら同じ対立遺伝子型を持つものが出現する確率は、非血縁集団を想定した場合において１／４２５３５０９１５個体、同胞集団を想定した場合においても１／２０２４個体と推定される。したがって、第１〜第８プライマーセットは、これらを組み合わせることにより十分な個体識別能を有していることがわかる。
【００６９】
なお、本例においては、上述のように２６種類のマイクロサテライト遺伝子座を特定し、実際には２６組のプライマーセットを設定している。上記の８組以外の残りの１８組のプライマーセットについては、これらを用いなくても上述のように十分に個体識別が可能であることが示された。したがって、これらの残り１８組のプライマーセットについては、その塩基配列等の記載は省略する。上記の８組のプライマーセットとともに、これらの残りの１８組のプライマーセットのうちの少なくとも１組とをさらに組み合わせることも可能である。この場合には、さらに正確な個体識別が可能になることを確認している。
【００７０】
（実施例）
本例は、上述の実験例において有用性が確認された８組のプライマーセットを用いて、野外サンプルによる実証実験を行う例である。本例においては、野外の様々な場所で採取したアマミノクロウサギの糞サンプルからＤＮＡを抽出し、糞サンプルから個体識別を行う。
【００７１】
まず、アマミノクロウサギが生息する奄美大島の森林に設定した任意の調査ルートにおいて、野生のアマミノクロウサギの糞を６日間にわたり採取した。採取した糞は冷凍保存した。このようにして、２０７個のアマミノクロウサギの糞の検体（試料１〜試料２０７）を得た。これらの検体は、実験に使用するまで、−２５℃のフリーザーで冷凍保存した。
【００７２】
次いで、キアゲン社製の「キアアンプ・ディーエヌエー・ストゥール・ミニ・キット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）」を用いて、糞からＤＮＡを抽出した。抽出は添付のマニュアルに従って行った。また、フォワード側プライマーを蛍光標識した各プライマーセット（第１プライマーセット〜第８プライマーセット）を合成した。
【００７３】
具体的には、マーカー座２ｒｅｐ−ＧＡ１８２の第１プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＡ）、マーカー座２ｒｅｐ−ＣＡ７１の第４プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＧ）、及びマーカー座２ｒｅｐ−ＧＡ３７０の第６プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＫ）には、５’末端側に、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（つまり、ＨＥＸ）からなる蛍光標識物質を結合させた。
【００７４】
マーカー座２ｒｅｐ−ＣＡ１９の第５プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＩ）、及びマーカー座２ｒｅｐ−ＧＡ１４３５の第７プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＭ）には、５’末端側に、アプライドシステムズジャパン社製のＮＥＤからなる蛍光標識物質を結合させた。
【００７５】
マーカー座２ｒｅｐ−ＣＡ６１の第２プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＣ）、マーカー座２ｒｅｐ−ＣＡ７３の第３プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＥ）、及びマーカー座２ｒｅｐ−ＧＡ１４２の第８プライマーセットのフォワード側プライマー（つまり、プライマーＯ）には、６−カルボキシフルオレッセイン（つまり、ＦＡＭ）からなる蛍光標識物質を結合させた。
【００７６】
次に、アマミノクロウサギの糞から抽出した鋳型ＤＮＡ（濃度：５０ｎｇ／μＬ)１．０μＬ、蛍光標識したフォワードプライマー(濃度：５０μＭ)、未標識のリバースプライマー(濃度：５０μＭ)各０．１μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製の「ＴＡＫＡＲＡ  ＥＸ  Ｔａｑ（登録商標）  ＨＳ(濃度：５ｕｎｉｔｓ／μＬ)」０．０５μＬ、酵素添付品の１０×ＰＣＲバッファー１．０μＬ、及びｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（濃度：２．５ｍＭ  ｅａｃｈ)０．８μＬの混合物を滅菌ｍｉｌｌｉ-Ｑ水（つまり、滅菌超純水）で希釈して総量を１０μＬとした。
【００７７】
この混合液を以下のＰＣＲサイクル条件で反応させた。
ステップ１（１サイクル）：９５℃、２分）
ステップ２（３５サイクル）：９５℃、３０秒→各プライマーセットのアニーリング温度Ｔａ（表１参照）、２０秒→７２℃、２０秒
【００７８】
次に、実験例と同様に、ＰＣＲ産物の検出及び断片サイズの決定を行った。
【００７９】
糞から抽出したＤＮＡはアレリック・ドロップアウト（ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｒｏｐｏｕｔ）やフォールス・アレル（ｆａｌｓｅ  ａｌｌｅｌｅ）による判定エラーを引き起こしやすいことが知られている。そのため、ＰＣＲ増幅及び断片サイズの決定は、１検体あたり全ての座位について最低３回ずつ繰り返して行った。そして、３回のうち少なくとも２回以上同一の対立遺伝子型を示したものをその座位の対立遺伝子型とした。１回目と２回目と３回目の結果が異なる場合には、最高で５回目まで分析を繰り返し、３回以上同一の対立遺伝子型を示したものをその座位の対立遺伝子型とした。
【００８０】
個体識別は、すべてのマーカー座について対立遺伝子型が決定できたサンプルのみを対象とし、コンピュータソフトウェア「サーバス・バージョン３．０．７（Ｃｅｒｖｕｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．７）」を用いて判定した。かかる判定は、マーシャル・ティ．シー（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｔ．Ｃ．）、スレイト・ジェイ（Ｓｌａｔｅ  Ｊ．）、クルーク・エル（Ｋｒｕｕｋ  Ｌ．）、ペンバートン・ジェイ・エム（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  Ｊ．Ｍ．）著、スタティスティカル・コンフィデンス・フォー・ライクリフッド−ベースド・パターナティ・インフェレンス・イン・ナチュラル・ポピュレイションズ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ-ｂａｓｅｄ  ｐａｔｅｒｎｉｔｙ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．）、「モレキュラー・エコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）」、米国、１９９８年、第７巻、ｐ．６３９−６５５に記載に従って行った。２０７個の糞サンプルのうちの一部の結果を表３及び表４に示す。
【００８１】
【表３】
2019058102.tif 000005
【００８２】
【表４】
2019058102.tif 000006
【００８３】
表３、表４中、個体番号が同じものが同じ個体であり、各表は、同じ個体毎に整理されている。表３及び表４においては、１〜１０番目の個体の結果を示しているが、他の個体も識別されたことを確認している。
【００８４】
表３及び表４に示すように、野外から採取したアマミノクロウサギの糞サンプルによる実証実験では、全体の６５．７％にあたる１３６検体において全てのマーカー座の対立遺伝子が決定できた。残りの７１検体のうち、４０検体では１つ以上のマーカー座で対立遺伝子が検出できたが、全体の１５．０％にあたる３０検体ではいずれのマーカー座でも対立遺伝子が検出できなかった。これらの７１検体については、表への記載を省略してある。
【００８５】
全てのマーカー座について対立遺伝子が決定できた１３６検体について個体識別判定を行った結果、４８個体（個体番号１〜４８）について識別ができた。これら４８個体のうち、１８個体（個体番号３１〜４８）は検出回数が１回のみであったが、残りの３０個体（個体番号１〜３０）は複数回にわたって検出できた。４８個体のうちの１０個体（個体番号１〜１０）の結果を表３及び表４に示している。
【００８６】
また、個体番号１〜１０、個体番号１３〜２２、個体番号２４〜２５及び個体番号２７については、複数日にまたがって糞が確認されており、少なくとも２日以上調査ルート近傍に滞在していたことが明らかとなった。
【００８７】
以上のように、第１〜第８プライマーセットからなるＰＣＲプライマーセットは、アマミノクロウサギの生息個体数の推定及び行動圏の把握に有用であることがわかる。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号：１はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１８２のフォワード側プライマー（プライマーＡ）の塩基配列を示す。
配列番号：２はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１８２のリバース側プライマー（プライマーＢ）の塩基配列を示す。
配列番号：３はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ６１のフォワード側プライマー（プライマーＣ）の塩基配列を示す。
配列番号：４はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ６１のリバース側プライマー（プライマーＤ）の塩基配列を示す。
配列番号：５はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７３のフォワード側プライマー（プライマーＥ）の塩基配列を示す。
配列番号：６はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７３のリバース側プライマー（プライマーＦ）の塩基配列を示す。
配列番号：７はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７１のフォワード側プライマー（プライマーＧ）の塩基配列を示す。
配列番号：８はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ７１のリバース側プライマー（プライマーＨ）の塩基配列を示す。
配列番号：９はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ１９のフォワード側プライマー（プライマーＩ）の塩基配列を示す。
配列番号：１０はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＣＡ１９のリバース側プライマー（プライマーＪ）の塩基配列を示す。
配列番号：１１はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ３７０のフォワード側プライマー（プライマーＫ）の塩基配列を示す。
配列番号：１２はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ３７０のリバース側プライマー（プライマーＬ）の塩基配列を示す。
配列番号：１３はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４３５のフォワード側プライマー（プライマーＭ）の塩基配列を示す。
配列番号：１４はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４３５のリバース側プライマー（プライマーＮ）の塩基配列を示す。
配列番号：１５はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４２のフォワード側プライマー（プライマーＯ）の塩基配列を示す。
配列番号：１６はアマミノクロウサギ（ペンタラグス・フルネスィ）の遺伝子座２ｒｅｐ−ＧＡ１４２のリバース側プライマー（プライマーＰ）の塩基配列を示す。
【配列表】
2019058102000001.app