(57)【要約】【課題】リポソームを構成する特定の構成成分の含有比率を調整することで、所定の範囲内における任意のｐＨ条件下でリポソームのゼータ電位をプラスからマイナスへ移行させることのできるｐＨ感受性リポソームを提供する。【解決手段】リン脂質と、ステロイド類と、アニオン性物質と、両イオン性物質とを、膜構成成分として含み、膜構成成分全体に対して、アニオン性物質を０〜２０質量％、及び前記両イオン性物質を５〜２０質量％含むことを特徴とする。そして、以下の各ｐＨ条件の水性媒体中に分散させたとき、リポソームのゼータ電位が、ｐＨ５以下でプラスであり、ｐＨ８以上でマイナスであり、そして、ｐＨ５〜８の間で、ｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行するようにした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質と、ステロイド類と、アニオン性物質と、両イオン性物質とを、膜構成成分として含むｐＨ感受性リポソームであって、
当該リポソームは、前記膜構成成分全体に対して、前記アニオン性物質を０〜２０質量％、及び前記両イオン性物質を５〜２０質量％含み、
前記リポソームを以下の各ｐＨ条件の水性媒体中に分散させたとき、前記リポソームのゼータ電位が、ｐＨ５以下でプラスであり、ｐＨ８以上でマイナスであり、そして、ｐＨ５〜８の間で、ｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行することを特徴とする、ｐＨ感受性リポソーム。
【請求項２】
前記アニオン性物質が、前記膜構成成分全体に対して、２．５〜１５質量％の比率で含まれる請求項１に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項３】
前記アニオン性物質と、前記両イオン性物質との含有比率が１：１〜１：３である請求項２に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項４】
前記アニオン性物質が、常温で固体の飽和脂肪酸である請求項１〜３のいずれか記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項５】
前記両イオン性物質が、ラウリルベタイン（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）を含むＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；コカミドプロピルベタイン、ラウラミドプロピルベタインを含む脂肪酸アミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；ココアンホ酢酸ナトリウム、ラウロアンホ酢酸ナトリウムを含むイミダゾリン型ベタイン；アルキルジメチルタウリンを含むアルキルスルホベタイン；アルキルジメチルアミノエタノール硫酸エステルを含む硫酸型ベタイン；及びアルキルジメチルアミノエタノールリン酸エステルを含むリン酸型ベタインからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１〜４いずれか記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項６】
前記常温で固体の飽和脂肪酸が、パルミチン酸又はステアリン酸である請求項４に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐＨ感受性リポソームに関し、より詳細には、膜構成成分としてのアニオン性物質と、両イオン性物質とを所定の比率で含むｐＨ感受性リポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、生物学的に活性な分子を細胞質内に送達するためのキャリアとして注目されている。リポソームを用いた薬剤送達における主な課題は、通常のリポソームでは膜融合性が低いため、細胞質内へ移行した後で、脂質二分子膜に内包された薬剤の放出が遅いことである。これを解決するため、生理的条件下では安定でありながら、細胞質内に移行した後、酸性条件下で不安定化されるｐＨ感受性リポソームが開発されている。例えば、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いたリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質がｐＨに応答して集合構造が転移し、酸性環境（ｐＨ５以下）で内包物を放出することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、カチオン性両親媒性分子と、アニオン性両親媒性分子及び両イオン性両親媒性分子の少なくとも１種とを構成脂質として含むリポソームを水性媒体中に分散させたとき、酸性ｐＨ環境下で、該リポソームがプラスのゼータ電位を有し、かつ、塩基性ｐＨ環境下で、該リポソームがマイナスのゼータ電位を有しており、該ゼータ電位が、該分散液のｐＨの増加に伴って、プラスからマイナスへと変化すると、保持していた目的物質が放出されることが報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５５８８６１９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Duzgunes N, Straubinger RM, Baldwin PA, Friend DS, Papahadjopoulos D. Proton-induced fusion of oleic acid-phosphatidylethanolamine liposomes. Biochemistry. 1985 24(13):3091-3098.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このようなｐＨ感受性リポソームは一般的に不安定であるため、水性媒体中におけるゼータ電位がゼロとなるｐＨ値を所望の範囲に設定すること、すなわち、リポソームの膜融合性を、酸性から塩基性までの幅広い範囲内で任意に設定することが難しく、ｐＨ感受性リポソームが有する潜在的な用途への期待に応えられないという問題があった。
【０００７】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであって、リポソームを構成する特定の構成成分の含有比率を調整することで、所定の範囲内における任意のｐＨ条件下でリポソームのゼータ電位をプラスからマイナスへ移行させることのできるｐＨ感受性リポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの実施形態に係るｐＨ感受性リポソームは、リン脂質と、ステロイド類と、アニオン性物質と、両イオン性物質とを、膜構成成分として含み、膜構成成分全体に対して、アニオン性物質を０〜２０質量％、及び両イオン性物質を５〜２０質量％含むことを特徴とする。そして、以下の各ｐＨ条件の水性媒体中に分散させたとき、リポソームのゼータ電位が、ｐＨ５以下でプラスであり、ｐＨ８以上でマイナスであり、そして、ｐＨ５〜８の間で、ｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行するようにした。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、リポソームを構成する特定の構成成分の含有比率を調整することで、幅広い範囲の任意のｐＨ条件下でリポソームのゼータ電位をプラスからマイナスへ移行させることのできるｐＨ感受性リポソームを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態にかかるｐＨ感受性リポソームの製造方法のフローチャートである。
【図２】実施例１〜６で製造したリポソームを水性媒体に分散して測定したゼータ電位のｐＨプロフィールである。
【図３】比較例１及び２で製造したリポソームを水性媒体に分散して測定したゼータ電位のｐＨプロフィールである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好適な実施の形態について、以下の順序により説明する。
１．     ｐＨ感受性リポソームの成分及び組成
２．     ｐＨ感受性リポソームの製造方法
３．     ｐＨ感受性とその発現機構
４．     形状、用途又は使用方法
【００１２】
［ｐＨ感受性リポソームの成分及び組成］
（膜構成成分）
膜構成成分としては、リン脂質やステロイド類の他、リポソームにｐＨ感受性を付与するためのアニオン性物質及び両イオン性物質等があげられる。以下、順を追って説明する。
【００１３】
（１）リン脂質
リン脂質は、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水基とリン酸基等で構成される親水基を持つ両親媒性物質である。リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトールのようなグリセロリン脂質、スフィンゴミエリンのようなスフィンゴリン脂質、カルジオリピンのような天然または合成のジホスファチジル系リン脂質およびこれらの誘導体、さらには、これらを常法に従って水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等を用いることができる。これらのうちでも、ＨＳＰＣ等の水素添加されたリン脂質等が好ましい。リン脂質の量は、膜構成成分全体中、通常、２０質量％以上であり、好ましくは４０質量％以上である。また、その他の膜構成成分の量は、通常、８０質量％以下であり、好ましくは６０質量％以下である。
【００１４】
（２）ステロイド類
膜の構成成分として、上記リン脂質の他に、ステロイド類をさらに含むことができる。ステロイド類としては、ステロール、胆汁酸、プロビタミンＤ、ステロイドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロール類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロールが好ましい。
ステロイド類の含有量は、特に制限されるものではないが、リポソームの構成成分全体に対して、０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。また、３０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、５質量％以下がさらに好ましい。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができる。ステロイド類は１種単独でも２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１５】
（３）アニオン性物質
リポソームにｐＨ感受性を付与するためのアニオン性物質は、ジアシルグリセロールヘミスクシネート、ジアシルグリセロールヘミマロネート、ジアシルグリセロールヘミグルタレート、ジアシルグリセロールヘミアジペート、ジアシルグリセロールヘミシクロヘキサン-１,４-ジカルボン酸、脂肪酸、例えば、オレイン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ネルボン酸、ベヘン酸等が挙げられるが、これらに限定はされない。特に、常温で固体の飽和脂肪酸が好ましく、パルミチン酸やステアリン酸が特に好ましい。本明細書において、常温とは１０℃〜３０℃をいう。膜構成成分の全体量に対する上記アニオン性物質の含有割合は、０〜２０質量％であり、２．５質量％以上が好ましく、５質量％以上がさらに好ましい。一方、含有割合の上限は、２０質量％がよく、１５質量％が好ましい。アニオン性物質の含有割合が２０％を超えると膜構成成分を含む水性媒体中で乳化状態を維持することが難しく、白濁、凝集や沈殿が生じて不均質なリポソーム製剤となってしまう。
【００１６】
（４）両イオン性物質
リポソームにｐＨ感受性を付与するための両イオン性物質としては、ラウリルベタイン（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）等のＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；コカミドプロピルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン等の脂肪酸アミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；ココアンホ酢酸ナトリウム、ラウロアンホ酢酸ナトリウム等のイミダゾリン型ベタイン；アルキルジメチルタウリン等のアルキルスルホベタイン；アルキルジメチルアミノエタノール硫酸エステル等の硫酸型ベタイン；アルキルジメチルアミノエタノールリン酸エステル等のリン酸型ベタインを挙げることができる。膜構成成分の全体量に対する上記両イオン性物質の含有割合は、５〜２０質量％であり、７質量％以上が好ましい。一方、含有割合の上限は、２０質量％がよく、１５質量％が好ましい。両イオン性物質の含有割合が２０質量％を超えるとリポソーム（脂質二重膜）構造を保つことが難しい。
【００１７】
（５）その他の添加剤
本発明のｐＨ感受性リポソームは、必要に応じてその他の添加剤を含むことができる。例えば、酸化防止剤として、トコフェロール同族体、即ち、ビタミンＥなどが挙げられる。また、リポソーム表面を修飾する親水性高分子の脂質誘導体は、リポソームの構造安定を損なうものでなければ特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、及びこれらの誘導体が挙げられる。中でもポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール誘導体が望ましい。親水性高分子の脂質誘導体の分子量は、２００〜５万程度であることが好ましく、１０００〜１万程度であることがより好ましい。
【００１８】
（内包物質）
本発明のｐＨ感受性リポソームは、水溶性又は脂溶性の種々の目的物質を内包することができる。リポソームに目的物質を保持させる方法は、目的物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物の場合には、リポソーム製造時に薬物を水性媒体に溶解させて調製することができる。保持されなかった水溶性薬物はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより目的物質を保持したリポソームと分離できる。他方、脂溶性薬物の場合には、膜構成成分が有機溶媒に溶けている状態で薬物を混合してリポソームを形成することにより、例えば二分子膜小胞体の疎水部に目的物質を保持させることができる。非限定的な具体例を挙げると、シスプラチンや５−フルオロウラシル等を含む抗がん剤の他、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、老化防止剤、ホルモン剤、ビタミン剤、ヘモグロビン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、ワクチン、発毛剤、保湿剤、色素類、美白剤、顔料、生理食塩水、水の１または２以上の組み合わせなどがある。
【００１９】
［ｐＨ感受性リポソームの製造方法］
本発明のｐＨ感受性リポソームの製造方法は特に制限されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、リン脂質と、ステロイド類と、アニオン性物質と、両イオン性物質と、その他の任意成分とを含む混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などを用いて、ｐＨ感受性リポソームを製造することができる。あるいは、上記混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去してｐＨ感受性リポソームを製造することもできる。また、上記混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去してｐＨ感受性リポソームを製造することもできる。その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用してｐＨ感受性リポソームを製造してもよい。
【００２０】
なお、好ましい実施形態としては、図１に示す製造方法に基づいて、本発明のｐＨ感受性リポソームを製造することができる。以下、図１を参照しながら、本発明に係るｐＨ感受性リポソームの好ましい製造方法について説明する。
【００２１】
ステップＳ０１では、少なくとも１種のジオールと、少なくとも１種のポリオールとを加温条件下に混合し、これらを均質化してジオールとポリールとの混合物を調製する。膜構成成分を溶解するジオールとしては、１，２−アルカンジオール又は１，３−アルカンジオールが好ましい。１，２−アルカンジオール又は１，３−アルカンジオールとしては、１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，２−オクタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−デカンジオール、１，３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、プロピレングリコール等が挙げられる。１，２−アルカンジオール又は１，３−アルカンジオールは、一種または二種以上を併用することができる。
【００２２】
また、ポリオールは、３価以上のポリオールであり、例えばトレハロース、スクロース、ソルボース、メレジトース、グリセロール、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール、ラフィノース等が挙げられる。好ましくは、ソルビトール、及びグリセロールである。
【００２３】
ジオールとポリオールとの混合割合は、膜構成成分を均一に溶解しうる限り特に限定されないが、１：５〜５：１が好ましく、１：２〜２：１がさらに好ましく、ほぼ１：１が最も好ましい。また、ジオールとポリオールとのの使用量は、膜構成成分を溶解しうる限り特に限定されないが、膜構成成分の全質量に対して２０〜１００倍程度、好ましくは３０〜６０倍程度使用することで、生成したｐＨ感受性リポソームを安定化することができる。
【００２４】
次に、ステップＳ０２において、均質化した状態の上記混合物に、膜構成成分を添加する。そして、添加した膜構成成分をジオールとポリオールとの混合物に溶解した混合物溶液を調製する。リン脂質等の各成分を別々に添加、混合してもよいが、あらかじめ全ての膜構成成分を混合しておきこれらを上記混合物に添加することが、可溶化の効率を上げるために好ましい。このとき、それぞれの膜構成成分の含有量は、上述した範囲内であれば特に限定されないが、アニオン性物質と両イオン性物質との含有比率が１：１〜１：３の範囲内であることが好ましい。
【００２５】
ステップＳ０３では、ステップＳ０２で調製した混合物溶液と、あらかじめ８０℃〜８５℃で加温しておいた水性媒体とを混合する。このとき、混合物全体に対する水性媒体の添加量は、膜構成成分がリポソームを形成するための適切な濃度領域となるように調整する。
【００２６】
ステップＳ０４では、８０℃〜８５℃で膜構成成分が溶解している水性媒体を、室温付近まで急冷することでリポソームを生成させる。冷却方法は、特に限定されるものではないが、例えば、容器を、冷水を入れた浴槽内に入れる方法の他、容器内に混合物を入れた状態で当該容器を冷蔵庫等に入れる方法などを採用できる。冷却温度は、リポソームが生成する温度であれば限定されるものではない。
【００２７】
そして、ステップＳ０５では、水性媒体中に白濁した状態で存在するリポソームをろ過やデカンテーションなど任意の方法で回収することができる。
【００２８】
［ｐＨ感受性とその発現機構］
本実施形態のｐＨ感受性リポソームは、ｐＨ条件の異なる種々の水性媒体中に分散させたとき、そのゼータ電位が、ｐＨ５以下でプラスであり、ｐＨ８以上でマイナスであり、そして、ｐＨ５〜８の間で、ｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行するという性質を有する。
【００２９】
ここで、水性媒体中に分散されたリポソーム粒子の荷電状態の指標として用いたゼータ電位は、粒子から充分に離れて電気的に中性である領域の電位をゼロと定義し、このゼロ点を基準として測った場合の、「滑り面」の電位と定義されている。微粒子の場合、ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなり粒子の安定性は高くなる。逆に、ゼータ電位がゼロに近くなると、粒子は凝集しやすくなる。そこで、ゼータ電位は分散された粒子の分散安定性の指標として用いられる（北原文雄、古澤邦夫、尾崎正孝、大島広行、「Ｚｅｔａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌゼータ電位：微粒子界面の物理化学」、サイエンティスト社、１９９５）。
【００３０】
従って、本実施形態のｐＨ感受性リポソームは、表面電荷が、ｐＨ５〜８の間でｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行するという挙動を示すため、リポソーム分散液のｐＨが５以下の酸性条件下で目的物質を保持して安定に存在し、リポソーム分散液のｐＨが５〜８の間でゼータ電位がゼロになるｐＨ条件で不安定となり膜融合を起こして内包物を放出すると考えられる。ゼータ電位の測定方法としては公知の方法を用いることができる。例えば、帯電した粒子が分散している系に、外部から電場をかけると、粒子は電極に向かって泳動（移動）するが、その速度は粒子の荷電に比例するため、その粒子の泳動速度を測定することによりゼータ電位を測定することができる。電気泳動光散乱測定法は、別名レーザードップラー法と呼ばれ、泳動している粒子からの散乱光を観測することによって、ゼータ電位が求められる。
【００３１】
［形状、用途又は使用方法］
本実施形態のｐＨ感受性リポソームは、水性媒体に分散させたとき、酸性ｐＨ環境下でプラスのゼータ電位を有し、かつ、塩基性ｐＨ環境下でマイナスのゼータ電位を有するといった、従来にないｐＨ応答挙動を示すことができる。近年、遺伝子や核酸誘導体などのマイナスに荷電した物質を細胞内へ導入する研究が行われている。本実施形態のｐＨ感受性リポソームは、ｐＨ５以下の酸性条件下でプラスの表面電荷を有するため、これらの物質を吸着することができ、ｐＨ５〜８の弱酸性から中性条件でこれらの物質を放出して細胞内へ導入するために用いることができる。また、形状についても特に制限はなく、粒子径が１００ｎｍ〜１０μｍの多重層リポソームであっても単層リポソームであってもよい。本実施形態のｐＨ感受性リポソームは、その用途によって適宜粒子径を調整することも可能である。例えば、生体内への投与を目的とするのであれば、２００ｎｍ以下の粒径に調整することが好ましい。具体的な粒子径の調整方法は、エクストルーダーを用いて、孔径の小さいフィルターを通過させることによって、粒子径の調節が可能である。粒子径が１００ｎｍ程度又はそれ以下の小さいサイズの単層リポソームはその大きさが均一であって熱力学的に安定であり、化粧料として用いた場合にも皮膚への浸透性が良好であるといわれている。
【実施例】
【００３２】
以下の実施例は、本発明の１つの態様及び局面を実証し、さらに例示するために記載するものであり、本発明の範囲を限定していると解釈すべきではない。
【００３３】
［実施例１］
プロパン−１，２−ジオール１０．０ｇにソルビトール１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機３５０ｒｐｍにて加温撹拌溶解し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、パルミチン酸０．０５ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．１ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。
【００３４】
上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、１〜２時間汎用撹拌機３５０ｒｐｍで撹拌した。加温を停止し、撹拌しながら急冷し、室温程度まで冷却し生成したリポソームをろ過して回収した。
【００３５】
［実施例２］
プロパン−１，２−ジオール１０．０ｇにグリセリン１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機３５０ｒｐｍにて加温撹拌し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．８２ｇ、コレステロール０．１８ｇ、ステアリン酸０．１ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．２ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。
【００３６】
上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、１〜２時間ホモミキサーにて８，０００ｒｐｍで撹拌した。加温を停止し、撹拌しながら急冷し、室温程度まで冷却し生成したリポソームをろ過して回収した。
【００３７】
［実施例３］
プロパン−１，２−ジオール５．０ｇにグリセリン１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機５００ｒｐｍにて加温撹拌し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．１ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、エクストルーダーで処理した。
【００３８】
［実施例４］
プロパン−１，２−ジオール３０．０ｇにソルビトール１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機６００ｒｐｍにて加温撹拌溶解し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．２ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、エクストルーダーで処理した。
【００３９】
［実施例５］
１，３−ブチレングリコール１０．０ｇにグリセリン１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機６００ｒｐｍにて加温撹拌し、均質化する。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、パルミチン酸０．０５ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．１ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、エクストルーダーで処理した。
【００４０】
［実施例６］
１，３−ブチレングリコール３０．０ｇにソルビトール１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機６００ｒｐｍにて加温撹拌溶解し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、パルミチン酸０．１５ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．３ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、エクストルーダーで処理した。
【００４１】
［比較例１］
１，３−ブチレングリコール５．０ｇにグリセリン１５．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機３５０ｒｐｍにて加温撹拌し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．４１ｇ、コレステロール０．０９ｇ、パルミチン酸０．０５ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、１〜２時間後、エクストルーダー処理した。
【００４２】
［比較例２］
グリセリン１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機３５０ｒｐｍにて加温撹拌溶解し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．８２ｇ、コレステロール０．１８ｇ、パルミチン酸０．０５ｇ、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン０．１ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、１〜２時間汎用撹拌機３５０ｒｐｍで撹拌した。加温を停止し、撹拌しながら急冷し、室温程度まで冷却しろ過した。
【００４３】
［比較例３］
グリセリン１０．０ｇを加え、８０℃〜８５℃にて汎用撹拌機３５０ｒｐｍにて加温撹拌溶解し、均質化した。加温撹拌しているこの液に、ホスファチジルコリンを含む水添レシチン０．８２ｇ、コレステロール０．１８ｇ、パルミチン酸０．０５ｇを添加し、同様に撹拌溶解した。上記で調製した混合物溶液に、予め、８０℃〜８５℃に加温した精製水を１００ｇになるよう加えて撹拌しながら混合し、１〜２時間ホモミキサーを用いて８，０００ｒｐｍで撹拌した。加温を停止し、撹拌しながら急冷し、室温程度まで冷却した。本比較例では、油脂の再析出が多く（乳化力不足と考えられる）、リポソーム作成が不能であった。
【００４４】
［３］ゼータ電位の測定
上記実施例及び比較例で調製したリポソームの水性分散液を、水酸化カリウム水溶液とリン酸水溶液を使用して種々のｐＨに調整し、２６℃恒温条件下にてマルバーン社製の商品名ゼータサイザーナノシリーズＺＳＰを用いてゼータ電位を測定した。その結果を図２及び３に示す。図２に示したように、実施例１〜６で調製したリポソームは、ｐＨ５以下の水性媒体中ではすべてプラスのゼータ電位を有し、ｐＨ５．４からｐＨ７．６の間でｐＨ値の増加とともにゼータ電位がゼロに近づき、プラスからマイナスへ移行することが分かった。この範囲よりもｐＨが高くなるとゼータ電位がマイナスの値に変化した。これに対し、図３に示したように、比較例１で調製したリポソームは、ｐＨ４以下でわずかにプラスのゼータ電位を示したがゼータ電位の絶対値が小さいためこの領域では極めて不安定であると考えられる。また、比較例２で調製したリポソームはすべてのｐＨでマイナスのゼータ電位を示した。このように、実施例１〜６で調製したリポソームはｐＨ感受性を示すとともに、ｐＨ５以下でゼータ電位の絶対値が大きいため安定して存在しうることが分かった。
【図１】
2019042679.tif 000002
【図２】
2019042679.tif 000003
【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月24日(2018.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質と、ステロイド類と、アニオン性物質と、両イオン性物質とを、膜構成成分として含み、当該膜構成成分を、１，２−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール又はこれらの混合物からなるジオールと、ソルビトール、グリセロール又はこれらの混合物からなる三価以上のポリオールとを混合した溶媒に溶解した後、当該溶液を水性媒体に分散させて得られるｐＨ感受性リポソームであって、
当該リポソームは、前記膜構成成分全体に対して、前記アニオン性物質を２．５〜１５質量％、及び前記両イオン性物質を５〜２０質量％含み、
前記両イオン性物質が、ラウリルベタイン（ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン）を含むＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；コカミドプロピルベタイン、ラウラミドプロピルベタインを含む脂肪酸アミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酸ベタイン；ココアンホ酢酸ナトリウム、ラウロアンホ酢酸ナトリウムを含むイミダゾリン型ベタイン；アルキルジメチルタウリンを含むアルキルスルホベタイン；アルキルジメチルアミノエタノール硫酸エステルを含む硫酸型ベタイン；及びアルキルジメチルアミノエタノールリン酸エステルを含むリン酸型ベタインからなる群より選択される少なくとも１つであり、
前記リポソームを以下の各ｐＨ条件の水性媒体中に分散させたとき、前記リポソームのゼータ電位が、ｐＨ５以下でプラスであり、ｐＨ８以上でマイナスであり、そして、ｐＨ５〜８の間で、ｐＨ値の増加とともにプラスからマイナスへ移行することを特徴とする、ｐＨ感受性リポソーム。
【請求項２】
前記膜構成成分を溶解する溶媒が、前記ジオールと前記三価以上のポリオールとを３：１〜１：２の割合で含む請求項１に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項３】
前記アニオン性物質と、前記両イオン性物質との含有比率が１：１〜１：３である請求項２に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項４】
前記アニオン性物質が、常温で固体の飽和脂肪酸である請求項１〜３のいずれか記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項５】
前記常温で固体の飽和脂肪酸が、パルミチン酸又はステアリン酸である請求項４に記載のｐＨ感受性リポソーム。