(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、単純な構成でかつ合理的な細胞処理方法、デバイスおよびシステムを実現することを目的とする。【解決手段】  注液容器に装着して用いるデバイスであって、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含み、デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、注液容器の底面に近接して配置されるように構成される、前記デバイス【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
注液容器に装着して用いるデバイスであって、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含み、
デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、注液容器の底面に近接して配置されるように構成される、前記デバイス。
【請求項２】
吸気チューブにチェックバルブが設けられている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
第１貫通孔が、蓋体の周縁部付近に設けられている、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
注液容器が、培地を収容して注液するための容器であり、注液が、注液容器を回転させることにより行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
培地の注液を行うための方法であって、
（ａ）培地を収容した注液容器を用意するステップ、
（ｂ）注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入された注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入された吸気チューブとを含むデバイスを注液容器に装着するステップ、
（ｃ）注液容器を回転させて、注液チューブを介して培地を注液するステップ、および
（ｄ）注液容器を逆回転させて、注液を終了するステップ
を含む、前記方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）を繰り返して、複数回の注液作業を連続的におこなうステップ（ｅ）をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）の後、かつステップ（ｄ）の前に、（ｆ）注液量を判定するステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞処理方法、デバイスおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、心筋細胞等の利用が試みられている。このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた。
【０００３】
これらの細胞培養物は、従来、細胞培養センター（CPC : Cell Processing Center）と呼ばれるクリーンルームにおいて専門の知識を有する作業者による手作業で製造されており、このような細胞培養物の製造費用および製造にかかる労力は大きく、その効率化が望まれている。そこで、これらの細胞の培養に関する作業を多関節型ロボットにより行う自動細胞培養装置が提案されている（特許文献１）。しかしながら、細胞培養において作業者の手技に依存するような高度な作業を自動化することは困難であるなどの問題がある。
【０００４】
細胞培養において、廃液作業、注液作業などを含む培地交換プロセスは、作業者の手技に依存するプロセスであり、例えば、注液作業には、ピペットによる培養液の吸引・注液作業、液だれした培養液を拭き取る作業、ピペットの交換作業などの高度な作業が含まれている。特に、ピペットで注液ボトル内の培養液を吸引して、培養フラスコなどに注液する場合は、複雑なピペット操作に時間がかかることや、ピペット先端からの液だれリスクが高いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１６／１０４６６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような中、本発明者らは、細胞処理を効率よく行うための手段を開発するにあたり、特に、作業者の高度な手技に依存する注液作業を、効率よく迅速に実施することは困難であるなど問題に直面した。したがって、本発明の目的は、そのような問題を解決し、単純な構成でかつ合理的な細胞処理方法、デバイスおよびシステムを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中で、注液作業を迅速に行う場合に、液だれや注液量のバラツキなどが発生することに着眼した。さらに研究を進めた結果、注液を制限する手段を利用することで、上記問題が解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］注液容器に装着して用いるデバイスであって、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含む、前記デバイス。
［２］デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、蓋体に近接して配置されるように構成される、［１］に記載のデバイス。
［３］吸気チューブにチェックバルブが設けられている、［１］または［２］に記載のデバイス。
［４］第１貫通孔が、蓋体の周縁部付近に設けられている、［１］〜［３］のいずれかに記載のデバイス。
【０００９】
［５］液体の注液を行うための方法であって、（ａ）液体を収容した注液容器を用意するステップ、（ｂ）注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入された注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入された吸気チューブとを含むデバイスを注液容器に装着するステップ、（ｃ）注液容器を回転させて、注液チューブを介して液体を注液するステップ、および（ｄ）注液容器を逆回転させて、注液を終了するステップを含む、前記方法。
［６］ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）を繰り返して、複数回の注液作業を連続的におこなうステップ（ｅ）をさらに含む、［５］に記載の方法。
［７］ステップ（ｃ）の後、かつステップ（ｄ）の前に、（ｆ）注液時間から注液量を判定するステップをさらに含む、［５］または［６］に記載の方法。
【００１０】
［８］注液容器に装着して用いるデバイスであって、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含み、デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、注液容器の底面に近接して配置されるように構成される、前記デバイス。
［９］吸気チューブにチェックバルブが設けられている、［８］に記載のデバイス。
［１０］第１貫通孔が、蓋体の周縁部付近に設けられている、［８］または［９］に記載のデバイス。
［１１］注液容器が、培地を収容して注液するための容器であり、注液が、注液容器を回転させることにより行われる、［８］〜［１０］のいずれかに記載のデバイス。
【００１１】
［１２］培地の注液を行うための方法であって、（ａ）培地を収容した注液容器を用意するステップ、（ｂ）注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入された注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入された吸気チューブとを含むデバイスを注液容器に装着するステップ、（ｃ）注液容器を回転させて、注液チューブを介して培地を注液するステップ、および（ｄ）注液容器を逆回転させて、注液を終了するステップ
を含む、前記方法。
［１３］ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）を繰り返して、複数回の注液作業を連続的におこなうステップ（ｅ）をさらに含む、［１２］に記載の方法。
［１４］ステップ（ｃ）の後、かつステップ（ｄ）の前に、（ｆ）注液量を判定するステップをさらに含む、［１２］または［１３］に記載の方法。
【００１２】
［１５］液体を収容した注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットシステムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、を実行し、注液容器には、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含むデバイスが装着されており、所定の軸が、注液チューブの先端部に設定されることを特徴とする、前記ロボットシステム。
［１６］所定の軸上に、ロボットシステムの位置・姿勢制御の座標系（ＴＣＰ）が設定されることを特徴とする、［１５］に記載のロボットシステム。
［１７］注液容器の回転が、ロボットシステムのエンドエフェクタに把持された蓋体を介して行われることを特徴とする、［１５］または［１６］に記載のロボットシステム。
［１８］デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、蓋体に近接して配置されるように構成される、［１５］〜［１７］のいずれかに記載のロボットシステム。
［１９］注液が細胞培養フラスコに対して行われ、所定の軸と細胞培養フラスコの培養面とが平行で、細胞培養フラスコが、培養面を上にして傾斜して配置されることを特徴とする、［１５］〜［１８］のいずれかに記載のロボットシステム。
【００１３】
［２０］液体を収容した注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液する方法であって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始ステップ、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液ステップ、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了ステップ、を含み、注液容器は、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含むデバイスが装着されており、所定の軸が、注液チューブの先端部に設定されることを特徴とする、前記方法。
［２１］液体を収容した注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットを制御するためのプログラムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、をコンピュータに実行させ、注液容器は、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含むデバイスが装着されており、所定の軸が、注液チューブの先端部に設定されることを特徴とする、前記プログラム。
【００１４】
［２２］液体を収容した注液量が一定である注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットシステムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、を実行し、所定時間が、リアルタイムで測定された注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて算出されることを特徴とする、前記システム。
［２３］所定時間が、さらに逆回転において液体が注液されなくなるまでの時間ΔＴに基づいて算出されることを特徴とする、［２２］に記載のシステム。
［２４］所定時間が、さらに注液終了ステップを行わなかった場合の注液量に対する注液終了ステップを行った場合の最終注液比率Ｘ％に基づいて算出されることを特徴とする、［２２］または［２３］に記載のシステム。
［２５］注液容器が、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含むデバイスが装着されており、所定の軸が、注液チューブの先端部に設定されることを特徴とする、［２２］〜［２４］のいずれかに記載のシステム。
［２６］デバイスを注液容器に装着した状態で、蓋体から注液容器内に突出する吸気チューブの下端が、蓋体に近接して配置されるように構成される、［２５］に記載のシステム。
【００１５】
［２７］液体を収容した注液量が一定である注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液する方法であって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始ステップ、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液ステップ、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了ステップ、を含み、所定時間が、リアルタイムで測定された注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて算出されることを特徴とする、前記方法。
［２８］液体を収容した注液量が一定である注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットを制御するためのプログラムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、をコンピュータに実行させ、所定時間が、リアルタイムで測定された注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて算出されることを特徴とする、前記プログラム。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、注液を制限する手段を利用することで、効率よく迅速で精度の高い注液作業が可能であり、液だれの発生を防止することができるため、クリーンルームなどにおける細胞培養物の製造に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の第１実施態様にかかるデバイス１の概略図を示す。
【図２】図２は、図１のデバイス１を使用した注液作業を説明する模式図を示す。
【図３】図３は、収容容器１０の配置を説明する概念図を示す。
【図４】図４は、本発明の第２実施態様にかかるロボットシステムの概念図を示す。
【図５】図５は、図４のロボットシステムの動作を説明する模式図を示す。
【図６】図６は、第３実施態様にかかるロボットシステムの概念図を示す。
【図７】図７は、培地交換プロセスのフロー図を示す。
【図８】図８は、注液動作中の注液量と時間とのグラフを示す。
【図９】図９は、注液動作中の注液速度と時間とのグラフを示す。
【図１０】図１０は、注液終了動作開始後の注液量の予測方法を示す。
【図１１】図１１は、パラメータの導出と妥当性試験のフロー図を示す。
【図１２】図１２は、注液終了動作開始時刻の予測フローチャートを示す。
【図１３】図１３は、注液作業中の注液量と時間とのグラフを示す。
【図１４】図１４は、注液作業の妥当性試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明における液体を構成する成分は、例えば、水、生理食塩水、生理緩衝液（例えば、ＨＢＳＳ、ＰＢＳ、ＥＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、重炭酸ナトリウム等）、培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＩＭＤＭ等）、糖液（スクロース溶液、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ等）、海水、血清含有溶液、レノグラフィン（登録商標）溶液、メトリザミド溶液、メグルミン溶液、グリセリン、エチレングリコール、アンモニア、ベンゼン、トルエン、アセトン、エチルアルコール、ベンゾール、オイル、ミネラルオイル、動物脂、植物油、オリーブ油、コロイド溶液、流動パラフィン、テレピン油、アマニ油、ヒマシ油などが挙げられる。
【００１９】
本発明における収容容器は、とくに限定されないが、例えば、細胞培養容器、接着細胞用の細胞培養フラスコ、浮遊細胞用の細胞培養フラスコなどが挙げられる。細胞培養フラスコとは、略矩形の本体部分を有し、本体部分の平坦な面の少なくとも１つに細胞培養に必要となる表面処理が施されており、細胞培養面を下にして複数個重ねることで、多段培養が可能な容器をいう。
本発明における注液容器は、収容容器に注液する培地などを収容できる容器であれば、とくに限定されないが、例えば、シェイカーフラスコ、三角フラスコ、ローラーボトル、注液ボトル、ビーカー、培地瓶、角型培地瓶、滅菌瓶、滅菌ボトルなどが挙げられる。
【００２０】
本発明におけるロボットは、とくに限定されないが、例えば、直動・回転装置、マニピュレータ、多関節ロボットなどが挙げられる。多関節ロボットとしては、２軸多関節ロボット、３軸多関節ロボット、４軸多関節ロボット、５軸多関節ロボット、６軸多関節ロボット、７軸多関節ロボットなどが挙げられる。
【００２１】
本発明において「所定の軸」とは、注液容器を回転する際の回転中心となる軸をいい、注液容器が一般的な縦長の容器の場合は、所定の軸は容器の長軸に垂直な軸として設定される。
本発明において「ＴＣＰ」とは、ツールセンターポイント（Tool Center Point）をいい、ロボット先端部に位置するツール、グリッパ、作業対象物などの制御対象物の位置、姿勢を表現するための座標系をいう。ＴＣＰは、例えば、エンドエフェクタ（グリッパ、ツールなど）や作業対象物（フラスコ、ボトルなど）などの任意の位置、姿勢（動作、制御に都合の良い位置、姿勢）に設定でき、６軸多関節ロボットであれば、通常、ロボット第６軸の座標系に対して定義する。
【００２２】
本発明において、「所定の軸周りに回転させる」とは、対象物を所定の軸を中心に回転させることをいう。例えば、所定の軸を注液容器の開口部の一端に設定した場合は、かかる一端を中心にした回転動作だけで、注液容器内の液体の排出を行うことができる。また、例えば、所定の軸を注液容器の中心（重心）に設定した場合であっても、注液容器の中心軸まわりの回転動作と、円弧軌道の並進動作とを組み合わせて、上記のように注液容器の開口部の一端を中心に注液容器を回転させることもできる。
【００２３】
また、例えば、ロボットが、多関節ロボットである場合は、所定の軸と、ＴＣＰとを対応させることで、ロボット制御を効率化することができる。ロボットが、例えば６軸多関節ロボットである場合は、第６軸の回転軸と、ＴＣＰの回転軸とを平行にすることで、第６軸の回転動作と、第１〜５軸の少しの動作で、上記のように注液容器を回転させることができ、さらに、第６軸の回転軸と、ＴＣＰの回転軸とを一致させた場合は、第６軸の回転動作だけで上記のように注液容器を回転させることができる。
【００２４】
本発明における細胞の例としては、限定されずに、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞または心筋細胞などが好ましく、とくに好ましくは骨格筋芽細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞である。
【００２５】
以下、本発明の好適な実施態様について、図面を参照しつつ詳細に説明する。
〔第１実施態様〕
本発明の一側面は、注液容器に装着して用いるデバイスであって、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含む、前記デバイスに関する。
【００２６】
まず、本発明の第１実施態様について説明する。
図１は本発明の第１実施態様にかかるデバイス１の概略図、図２は、図１のデバイス１を使用した注液作業を説明する模式図、図３は、収容容器１０の配置を説明する概念図を示す。本実施態様において、液体は、培地であり、注液容器３０は、培地を収容する注液ボトルであり、収容容器１０は、細胞培養フラスコであり、注液作業は、クリーンルーム内で行われるものとして説明する。
なお、本願における各図において、説明を容易とするため、各部材の大きさは、適宜強調されており、図示の各部材は、実際の大きさを示すものではない。
【００２７】
図１に示すように、本発明の第１実施態様に係るデバイス１は、培地を収容した開口部３２を有する注液容器３０の口部３３に着脱自在に装着可能な蓋体５と、蓋体５の天板部５０に設けられた第１貫通孔５１に嵌入可能な注液チューブ６と、蓋体５の天板部５０に設けられた第２貫通孔５２に嵌入可能な吸気チューブ７とを含む。天板部５０は、注液容器３０の開口部３２を覆うことができる円盤状であり、周縁部から垂下する筒状スカート壁５３を有する。筒状スカート壁５３の内周面には内ネジ（図示せず）が設けられており、注液容器３０の口部３３の外周面に設けられた外ネジ（図示せず）に螺合させることができる。
【００２８】
第１貫通孔５１は、天板部５０の周縁部付近に配置されており、蓋体５を注液容器３０に装着した状態で、第１貫通孔５１に嵌入した注液チューブ６が、注液容器３０の口部３３の内周面付近に配置され、注液容器３０を傾けて培地を排出した際に、注液容器３０内に液体が残ることなく排出されるように構成されている。注液チューブ６の長さは、特に限定されないが、好ましくは０〜１００ｍｍ、より好ましくは１０〜６０ｍｍ、内径は、好ましくは１〜１０ｍｍ、より好ましくは３〜５ｍｍとすることができる。注液チューブ６は、第１貫通孔５１に嵌入した際に天板部５０から突出する長さを、特に限定されないが、好ましくは０〜１００ｍｍ、より好ましくは１０〜４０ｍｍに設定することができる。
【００２９】
吸気チューブ７の長さは、特に限定されないが、好ましくは０〜１００ｍｍ、より好ましくは１０〜６０ｍｍ、内径は、好ましくは０．５〜１０ｍｍ、より好ましくは２〜４ｍｍとすることができる。また、注液チューブと比較して、細径にするのが好ましい。吸気チューブ７は、第２貫通孔５２に嵌入した際に天板部５０から突出する長さは、吸気チューブ７の下端７１が蓋体５の天板部５０に近接して配置される長さであれば、特に限定されないが、好ましくは０〜１００ｍｍ、より好ましくは０〜４０ｍｍとすることができる。吸気チューブ７には、チェックバルブ７１が設けられており、注液容器３０の外側からの空気は通すが、注液容器３０の内側からの培地は通さないように構成されている。なお、チェックバルブは、注液容器３０の内側に配置されても良い。また、注液チューブ６、吸気チューブ７は、蓋体５と一体に形成されていても良い。
【００３０】
図２に示すように、デバイス１を使用する際は、培地を収容した注液容器３０にデバイス１を取り付けて傾斜させ、注液チューブ６の先端部６１を収容容器１０の開口部１２の注液容器３０側に位置決めする。この際に、注液チューブ６（第１貫通孔）が、吸気チューブ７（第２貫通孔）より下側になるように回転させ、位置決めすることで、注液容器３０を傾けた際に、液体が、吸気チューブ７側ではなく、注液チューブ６側に移動するように構成するのが好ましい。そして、注液チューブ６の先端部６１を回転軸として、注液容器３０を矢印方向に回転させて、注液容器３０内の培地をデバイス１側に移動させる（注液開始動作）。注液容器３０の開口部３２が下側に来るようにして回転を所定時間停止させると、培地が注液チューブ６から排出されて、収容容器１０に注液される（注液動作）。収容容器１０内の注液量が所定量に達すると、注液容器３０を矢印方向とは反対方向に逆回転させて停止させ、培地をデバイス１の反対側に移動させることで注液を終了する（注液終了動作）。
【００３１】
注液動作においては、培地が注液チューブ６から排出（注液）される注液量と、吸気チューブ７から流入する空気の吸気量は同じになる。そして、注液量および吸気量は、注液チューブ６の寸法、吸気チューブ７の寸法などにより制限されるため、チューブを使用しない場合と比較すると注液量が制限される（注液を制限する手段）。また、注液容器３０内に流入した空気が連続的な気泡となり、単位時間当たりの吸気量が一定になると、単位時間当たりの注液量も一定になる。この場合、注液作業における注液時間と注液量とが比例するため、注液量と注液に要する時間との関係を事前に測定しておき、測定結果に基づいて注液時間から注液量を判定することで、精度の高い注液作業を行うこともできる。
【００３２】
従来、例えば、７５ｍｌの培地を培養フラスコに注液する場合、注液ボトルにピペットを挿入して培地を吸引し、７５ｍｌの分量を目視で確認した上で、ピペットを移動して培養フラスコに注液するという煩雑な作業を繰り返す必要があった。一方で、本発明のデバイス１を用いることで、例えば、４８０ｍｌ程度の培地を収容した注液容器３０にデバイス１を取り付け、事前に測定した７５ｍｌの注液に要する時間分だけ注液動作を行い、これを６つの収容容器１０を交換しながら連続的（６回分）に行うことができる。これにより、従来の煩雑な作業を、注液容器３０の回転を繰り返すという単純な作業に置き換えることができ、ピペットの操作、移動、分量の目視確認などが不要になり、注液作業に係る時間を大幅に短縮することができる。
【００３３】
また、従来、ピペットを使用する場合、培地の吸引と排出が１つの流路を介して行われていたため、誤操作などにより液だれが発生していた。一方で、本発明のデバイスを用いることで、培地の吸引作業が不要になり、培地の排出と、空気の吸気が別々の流路で行われるため、液だれの発生を最小限に抑えることができる。さらに、本発明のデバイスを用いることで、培地の注液がチューブを介して行われるため、培地の注液方向や注液範囲が、チューブの突出方向や口径によって制限される（注液を制限する手段）。これにより、注液の照準の精度が向上し、例えば、細胞培養フラスコの開口部のような、小さな開口部を有する収容容器に対して正確に照準を合わせて注液作業を行うことができ、液だれの発生を最小限に抑えることができる。
【００３４】
そして、培地を注液する収容容器１０の配置は、様々な形を取ることができる。例えば、収容容器１０が細胞培養フラスコである場合、図３Ａに示すように、主面１４、１５が、回転軸に平行になるように配置することが好ましい。また、収容容器１０を土台Ｓなどに設置して、収容容器１０の主面１４（培養面）を上にして傾斜させて配置してもよい。これにより、注液チューブ６から排出された培地が、傾斜面に沿って流れ込むため、泡立ちが起きにくい。同様に、図３Ｂに示すように、収容容器１０を直立姿勢に配置して、注液容器３０の近位側に主面１４（培養面）が、遠位側に主面１５側が面するように配置してもよい。これにより、培地が口部１３の一側と主面１５との段差が小さな部分に沿って流れ込み、泡立ちが起きにくいだけでなく、培地が直接的に主面１４（培養面）に当たることがない。
【００３５】
上記のように、吸気チューブ７の下端７１を蓋体５の天板部５０に近接して配置した場合、培地中で連続的な気泡が発生するが、吸気チューブ７の突出する長さを長くすることで、注液容器３０内に気泡を発生させず、培地の泡立ちが起きにくくなるように構成することもできる。すなわち、注液容器３０を傾けて培地をデバイス１側に移動させた際に、注液容器３０の底面側には空気層が形成され、かかる空気層に吸気チューブ７の下端７１が位置づけられるように構成する。この場合の吸気チューブ７の天板部５０から突出する長さは、吸気チューブ７の下端７１が注液容器３０の底面に近接して配置される長さであれば、特に限定されないが、注液容器３０の底面から、好ましくは０〜１００ｍｍ、より好ましくは０〜５０ｍｍまでの長さとすることができる。そして、上記のように注液量と注液に要する時間との関係を事前に測定しておき、測定結果に基づいて注液時間から注液量を判定することで、精度の高い注液作業を行うこともできる。
【００３６】
以上、本発明の第１実施態様に係る注液デバイス１によれば、注液を制限する手段を利用することで、効率よく迅速で精度の高い注液作業が可能であり、液だれの発生を防止することができるため、クリーンルームなどにおける細胞培養物の製造に適している。
【００３７】
〔第２実施態様〕
本発明の別の側面は、液体を収容した注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットシステムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、を実行し、注液容器には、注液容器に着脱自在に装着可能な蓋体と、蓋体に設けられた第１貫通孔に嵌入可能な注液チューブと、蓋体に設けられた第２貫通孔に嵌入可能な吸気チューブとを含むデバイスが装着されており、所定の軸が、注液チューブの先端部に設定されることを特徴とする、前記ロボットシステムに関する。
【００３８】
次に、本発明の第２実施態様について説明する。
図４は本発明の第２実施態様にかかるロボットシステムの概念図、図５は、図４のロボットシステムの動作を説明する模式図を示す。なお、本願における各図において、説明を容易とするため、各部材の大きさは、適宜強調されており、図示の各部材は、実際の大きさを示すものではない。
また、図中、第１実施態様に係るデバイス１の構成と同一の構成については、同一の符号を付し、以下、第１実施態様との相違点について詳細に説明し、同様の事項については、説明を省略する。
【００３９】
図４に示されるように、ロボット２０は、基台に配置された、６軸垂直多関節型ロボットである。ロボット２０は、基台に対して旋回可能なベース２１と、ベース２１に連結され、ベース２１の旋回方向の垂直軸に対して傾倒可能な第１アーム２２と、第１アーム２２の先端側に連結され、第１アームに対して傾倒可能な第２アーム基端部２３と、第２アーム基端部２３の先端側に連結され、第２アーム基端部２３の軸方向に対して回転可能な第２アーム先端部２４と、第２アーム先端部２４の先端側に連結され、第２アーム先端部２４の軸方向に対して傾倒可能なハンド部２５と、ハンド部２５に連結されたグリッパ２６（エンドエフェクタ）を有している。なお、ハンド部２５は、その軸方向に沿って回転可能に構成されている。
【００４０】
また、ロボット２０は、ロボット２０の制御手順を記述したプログラムを記憶する記憶部４１と、かかるプログラムを処理してロボット２０を制御する処理部４２とを備えた制御装置４０と通信可能であり、ロボット２０は、制御装置４０による制御信号に従って自動的に動作することが可能である。ロボット２０は、このような構成により、グリッパ２６の位置・姿勢決めや、グリッパ２６の回転、開閉を自動で行うことができ、グリッパ２６により、注液容器３０の移送、傾斜、回転を自動で行うことができる。
【００４１】
以下、上述したロボットシステムを用いた、本実施態様の注液システムについて説明する。本実施態様において、ロボットシステムは、第１実施態様に示されるような注液容器３０を用いて収容容器１０内に液体を注液する際に、ロボット２０のグリッパ２６（エンドエフェクタ）を介して注液容器３０を回転させて液体を排出し、収容容器１０に注液するために用いられる。本実施態様において、液体は、培地であり、注液容器３０は、培地を収容する注液ボトルであり、収容容器１０は、細胞培養フラスコであり、注液作業は、クリーンルーム内で行われるものとして説明する。また、細胞培養フラスコは、その側面として、２つの主面１４、１５を有し、一方の主面１４には表面加工が施されており、主面１４を下面にした細胞の培養が可能であるものとして説明する。
【００４２】
図５の模式図を参照して、まず、ロボットシステムを使用する場合は、制御装置４０を起動して、記憶部４１に記憶されたプログラムを処理部４２に読み込ませる。処理部４２は、プログラムに基づいてロボット２０を制御して、グリッパ２６（図示せず）によりデバイス１が装着された注液容器３０の蓋体５を挟み込むようにして把持させる。この際に、デバイス１の第１貫通孔５１側が収容容器１０の方向に向くようにする。次に、ロボット２０を制御して、回転および並進動作を行い、第１貫通孔５１に嵌入された注液チューブ６の先端部６１を、収容容器１０の開口部１２の注液容器３０側に位置決めし、先端部６１と交わる注液容器３０の長軸に垂直な軸を回転軸Ａとして設定する（位置決め制御）。
【００４３】
この際に、収容容器１０および注液容器３０の位置や角度をモニタリングするカメラ（図示せず）と、ロボット２０とを連動させて、正確で位置合わせを自動的に行うようにしてもよい。したがって、ロボットシステムは、制御装置４０と通信可能なモニタリング用のカメラを含んでもよく、プログラムは、カメラでモニタリングした位置や角度に基づいてロボット２０を制御するプログラムであってもよい。回転軸Ａは、注液容器３０の長軸に対して垂直になるように設定し、先端部６１を収容容器１０の開口部１２の上方に配置し、開口部１２との距離を０〜３ｃｍの範囲に設定するのが好ましい。
【００４４】
次に、ロボット２０を制御して、蓋体５が取り付けられた注液容器３０を回転軸Ａ周りに矢印の方向に回転させる（注液開始制御）。図５に示されるように、本実施態様においては、注液開始制御における注液容器３０の開始角度は、注液チューブ６を上向きに水平から３０ｄｅｇに、停止角度は、注液チューブ６を下向きに水平から４５ｄｅｇに設定したが、これに限定されず、例えば、停止角度を５〜８５ｄｅｇの範囲に設定してもよい。これにより、注液チューブ６の先端部６１から排出された培地が、収容容器１０の口部１３の内壁や、容器本体１１の内壁に対して斜めに注液されるようにして、培地の泡立ちが起きにくくなるように構成してもよい。
【００４５】
次に、ロボット２０を制御して、注液容器３０の口部３３が下側に来るようにして回転を所定時間停止させると、注液容器３０内の培地が蓋体５側に移動して注液チューブ６から排出されて、収容容器１０に注液される（注液制御）。次に、所定時間経過すると、注液容器３０を矢印方向とは反対方向に逆回転させて開始角度で停止させ、培地を口部３３側とは反対方向に移動させることで注液を終了する（注液終了制御）。そして、収容容器１０を交換しながら注液開始制御、注液制御および注液終了制御を繰り返しロボット２０に実行させることで、複数の収容容器１０への注液作業を効率よく迅速に行うことができる。上記の所定時間は、注液量と注液時間との関係を事前に測定しておき、測定値および目標とする注液量に基づいて回転を停止させる時間（所定時間）を設定してもよい。
【００４６】
一方で、注液容器３０内の培地残量が少なくなった場合、グリッパ２６により把持されている蓋体５から注液容器３０だけを取り外し、新たな注液容器３０を蓋体５に取り付け、注液開始制御、注液制御および注液終了制御を繰り返しロボット２０に実行させてもよい。このように収容容器１０の交換、注液容器３０の交換を繰り返すことで、注液容器３０の回転軸Ａの設定（位置決め制御）を省略し、注液作業の中断時間を最小限にすることができる。本発明のロボットシステムは、少なくとも注液開始制御、注液制御および注液終了制御にかかる回転動作が実行できればよく、例えば、ロボットとして直動・回転装置のような簡易な装置を使用して回転、停止、逆回転のステップを繰り返すように構成してもよい。回転軸を蓋体５や注液容器３０に設定して、少なくとも注液制御時に注液チューブ６の先端部６１と開口部１２が近接するように構成してもよい。
【００４７】
収容容器１０の配置は、上記のように、収容容器１０（細胞培養フラスコ）の主面１４、１５が、回転軸Ａに平行になるように配置することが好ましいが、これをロボット制御で行うように構成してもよい。すなわち、例えば、ロボットシステムと通信可能なカメラで収容容器１０の配置を確認し、ロボット２０を制御して、収容容器１０の主面１４、１５の向きに合わせて回転軸Ａの位置決め制御を行うように、プログラムや処理部４２を構成してもよい。また、かかるカメラで収容容器１０内の注液量をリアルタイム測定して、注液量が所定量に達したら注液終了制御に移行するように構成してもよいし、ロボットシステムと通信可能な電子天秤で収容容器１０内の注液量を重さによってリアルタイム測定して、注液量が所定量の重さに達したら注液終了制御に移行するように構成してもよい。
【００４８】
また、本発明は、以下の処理を実行することによっても実現される。すなわち、上記の実施態様の機能を実現するソフトウェア（プログラム）を、ネットワークや各種の記憶媒体を介してロボットに読み込ませ、ロボットに内蔵された処理部（ＣＰＵやＭＰＵなど）がプログラムを実行する処理である。また、本発明は、プログラムを記憶した記憶部と、プログラムを処理する処理部とを備えた上記のような制御装置から、ロボットに制御信号を送信して動作させることによっても実現される。
【００４９】
以上、本発明の第２実施態様に係るロボットシステムによれば、注液を制限する手段を利用することで、効率よく迅速で精度の高い注液作業が可能であり、液だれの発生を防止することができるため、クリーンルームなどにおける細胞培養物の製造に適している。
【００５０】
〔第３実施態様〕
本発明の別の側面は、液体を収容した注液量が一定である注液容器を注液容器の長軸に垂直な軸周りに回転させることで、液体を注液するためのロボットシステムであって、所定の軸周りに、注液容器を回転させる注液開始制御、回転を所定時間停止させて、液体を注液する注液制御、および、所定の軸周りに、注液容器を逆回転させる注液終了制御、を実行し、所定時間が、リアルタイムで測定された注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて算出されることを特徴とする、前記システムに関する。
【００５１】
次に、本発明の第３実施態様について説明する。図６は、第３実施態様にかかるロボットシステムの概念図を示す。
図６に示されるように、本実施態様におけるロボットシステムは、電子天秤８０と通信可能であり、電子天秤８０は、収容容器１０の重さをリアルタイムで測定して注液量および注液流量を算出し、制御装置４０にフィードバックすることができる。
【００５２】
本実施態様において、ロボットシステムは、注液制御に移行して回転を所定時間停止させる際に、電子天秤８０によってリアルタイム測定された注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて、所定時間を設定することができる。所定時間は、例えば、注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］の傾きから、目標とする注液量に達するまでの時間を算出することによって設定する。そして、所定時間に達すると、所定の軸周りに注液容器を逆回転させて注液終了制御に移行する。このように、注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて所定時間を設定するように構成することで、収容容器１０に注液される注液量の精度が高くなる。
【００５３】
一方で、注液開始制御における開始角度、停止角度、回転速度（角速度）、注液終了制御における逆回転速度、注液容器３０内の液体残量などに起因して、注液終了制御中（逆回転中）に注液チューブ６内の液体が排出（注液）される場合がある。したがって、本実施態様におけるロボットシステムは、注液終了制御中に注液される可能性のある液体の注液量も考慮に入れた上で、注液制御における所定時間が設定されるように構成することもできる。
【００５４】
例えば、事前に、一連の注液開始制御、注液制御および注液終了制御を行い、注液終了制御（逆回転）において、注液チューブ６内の液体がすべて排出（注液）されるまでの時間ΔＴを測定する。そして、かかる時間ΔＴを記憶部４１に記憶しておき、実際の注液制御において、上記のように、注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］に基づいて算出された所定時間から、時間ΔＴを差し引いた時間を所定時間として設定することもできる。これにより、注液制御から注液終了制御への移行を時間ΔＴ分だけ早く行うことができ、注液終了制御中に注液チューブ６内の液体が排出される場合であっても、収容容器１０に注液される注液量の精度を高くすることができる。
【００５５】
また、注液終了制御における逆回転速度（角速度）が遅い場合は、注液流量は徐々に小さく、すなわち、注液終了制御中の時間ΔＴにおける注液流量は、注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］の様な比例関係ではなく、緩やかな曲線を描く。したがって、時間ΔＴにおいて、注液終了制御を行わなかった場合の注液量と、注液終了制御を行った場合の注液量とに差が生じることがある。本実施態様におけるロボットシステムは、かかる差も考慮に入れた上で、注液制御における所定時間が設定されるように構成することもできる。
【００５６】
例えば、注液終了制御を行わなかった場合の注液量に対する注液終了制御を行った場合の注液量の比率（最終注液比率Ｘ％）を事前に測定して記憶部４１に記憶しておき、実際の注液制御において、注液流量Ｑ［ｍｌ／ｓ］、時間ΔＴおよび最終注液比率Ｘ％から、時間ΔＴ後の注液量Ｖｘ［ｍｌ］を算出する。そして、目標とする注液量から注液量Ｖｘ［ｍｌ］を差し引いた注液量Ｖｅ［ｍｌ］に達する時間を所定時間として設定することで、注液量に差が生じる場合であっても、収容容器１０に注液される注液量の精度を高くすることができる。
【実施例】
【００５７】
以下に、第３実施態様にかかるロボットシステムを実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５８】
例１：手動による注液作業
図７に一般的な培地交換プロセスのフロー図を示す。培地交換プロセスは、フラスコ内の培養液を排出し、新たな培養液をフラスコ内に注液する一連の作業であり、液だれなく、速やかに実施しなければならないが、作業者の感覚動作に頼っている作業である。培地交換プロセスは廃液プロセスと注液プロセスで構成され、注液プロセスはキャップ取外し・新たな培養液のピペッターによる注液作業・キャップ取付けなどの作業で構成される。注液プロセスには、ピペットによる培養液の吸引・注液作業のほかに、フラスコのキャップの取外し・取付け作業、液だれした培養液を拭き取る作業、ピペットの交換作業なども含まれている。
【００５９】
収容容器１０として、接着細胞用の細胞培養フラスコ（サーモフィッシャー社製、Ｔ５００フラスコ）を使用した。Ｔ５００フラスコの排出口（開口部１２）の外径は２８．２［ｍｍ］、内径は２５．８［ｍｍ］、厚さは１．２［ｍｍ］であった。実際の培地交換作業において細胞処理作業従事者は、電動ピペットを用いて注液ボトル内の培養液を吸引後、フラスコ内に注液する作業を行った。１セット８個のフラスコに対してそれぞれ７５ｍｌの培養液を注液した。２セット分の作業分析をしたところ。１セットあたり５５０ｓ〜５６０ｓの作業時間を要しており、１フラスコ当たりの注液作業時間は約７０ｓという結果が得られた。
【００６０】
例２：デバイスを使用した注液作業
チェックバルブ７１として、株式会社キジマ製１０５−１５００１を、ロボットとして、６軸垂直多関節型産業用ロボット：安川電機製ＭＯＴＯＭＡＮ−ＭＨ３Ｆ（第１アーム：２６０ｍｍ、第２アーム：２７０ｍｍ）を、コントローラとして、ＲＴＬｉｎｕｘ（登録商標）環境をベースとしたシステムを、電子天秤として、１００ｍｓ周期で測定値を取得可能なエー・アンド・デイ製ＥＫ−６１０ｉを使用した。注液ボトルにデバイスを装着し、デバイスの蓋体をロボットのグリッパに固定し、注液チューブの先端をＴＣＰ（Ｔｏｏｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｏｉｎｔ）とし、ＴＣＰを中心とした姿勢変化のみでＴ５００フラスコへの注液作業を行った。さらに、ロボット第６軸の回転軸とＴＣＰとを一致させることで、第６軸のみの動作で注液作業を行えるようにした。
【００６１】
図５に示すように、フラスコを上向きに水平から３０ｄｅｇ傾いた初期姿勢から、下向きに水平から４５ｄｅｇ傾いた姿勢まで回転して停止し、電子天秤の上に置いたフラスコへ注液ボトル内の培養液を注液した。４８０ｍｌの培養液を全て注液したときの注液量（injection volume）、時間（time）、注液速度（injection velocity）を図８、図９に示す。注液速度は注液開始および終了を除いた区間（注液時間３〜５３ｓ、注液量１０〜４１２ｍｌ）でほぼ一定となっていることから、注液量の制御に適した方法であることが確認できた。
【００６２】
例３：ロボットによる注液作業
ロボットを制御して、４８０ｍｌの培養液を６回に分けて７５ｍｌずつ注液した。誤差を考慮し、培養液の容量は７５ｍｌ×６回分より多くした。１回の注液の目標精度は±２％とした。ロボットによる注液作業は、（１）フラスコを上向きに水平から３０ｄｅｇ傾いた初期姿勢から、下向きに水平から４５ｄｅｇ傾いた姿勢に回転し、注液を開始する、注液開始動作（制御）、（２）フラスコを下向きに水平から４５ｄｅｇ傾いた姿勢で停止した状態で注液する、注液動作（制御）、（３）注液終了動作は，フラスコを下向きに水平から４５ｄｅｇ傾いた姿勢から初期姿勢に戻し注液を終了する、注液終了動作の３段階に分けて行った。
【００６３】
液だれなく、かつ、スムーズな動作を実現するために、注液開始動作を３２ｄｅｇ／ｓ、注液終了動作を１０８ｄｅｇ／ｓ(角速度：axis velocity)とした。１回の注液量を７５ｍｌにするためには、注液終了動作開始後の注液量を予測して、注液動作から注液終了動作に移行する必要があった。注液終了動作開始後の注液量の予測方法を図１０に示す。注液終了動作を開始してから注液量が増加しなくなるまでの時間（ΔＴ）と、注液終了動作しなかった場合の注液量に対する注液終了動作した場合の最終注液比率（Ｘ％）をパラメータとして設定し、注液動作中に取得した測定値の傾きから注液終了動作しなかった場合の注液量を求め、そこから注液終了動作開始後の注液量を算出した。なお、所定の軸周りの角速度パターン（第６軸の角速度パターン）は、同図では、方形となっているが、台形、Ｓ字などの加速パターンでもよく、限定されるものではない。
【００６４】
図１１の手順で、パラメータ導出とパラメータを使用した動作確認を行った。最初に，注液作業を繰り返したときのデータを分析することにより、パラメータを決定した。注液終了動作開始注液量を仮に７０ｍｌとし、４８０ｍｌの培養液を５回に分けて注液する実験を３セット実施した。注液終了動作開始時刻の予測フローチャートを図１２に、その際の注液量を図１３に、分析結果を表１に示す。
【表１】
2019205400.tif 000002
【００６５】
図１３に示すように、電子天秤からの取得データは一度最大値に達した後で最終的な値に落ち着くが、最初に安定後の値に到達するまでの時間をΔＴとした。例２の実験から注液量が１０ｍｌ程度を超えると注液速度は安定することがわかったが、注液終了動作に近い値を使用した方がより正確に予測できると考えられるため、４０ｍｌから６０ｍｌの傾きを用いることとした。表１の平均値をパラメータとして採用することとし、ΔＴを１．０７ｓ、注液終了動作間注液率を８０．８８％に決定した。
【００６６】
次に、決定したパラメータを用いて動作確認を実施した。４８０ｍｌの培養液を６回に分けて７５ｍｌずつ注液する実験を３セット実施した結果を図１４、表２に示す。フラスコ外やチューブ先端に液だれが生じることなく、目標精度±２％（required accuracy）の範囲で注液作業を実施できた。例１の分析結果によると、手作業の場合の１回当たりの注液作業時間は約７０ｓであった。それに対して、図１３の結果から、ロボットを用いた場合の１回の注液時間は約１５ｓであった。今回実施した手法では注液ボトルから直接注入するため、吸引作業は不要であった。ロボットによる作業と手作業を組み合わせた場合、キャップ取外し・取付けを手作業で行ったとしても、作業時間を半分以下に短縮できることが確認できた。
【００６７】
【表２】
2019205400.tif 000003
【図１】
2019205400.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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