(57)【要約】【課題】本発明は、新規スクアレンエポキシダーゼの提供を目的とする。【解決手段】本発明は、スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
前記エポキシ基の導入される位置がスクアレンの10位および11位であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項４】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAであることを特徴とする請求項３に記載のDNA。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNAと80％以上の配列同一性を有するDNA
【請求項５】
請求項３または４に記載のDNAを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項１または２に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項７】
請求項１または２に記載のタンパク質に対するアプタマー。
【請求項８】
請求項１または２に記載のタンパク質の細胞内における発現を抑制または阻害する核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクアレン分子にエポキシ基を導入する新規酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在知られているスクアレンエポキシダーゼ（またはスクアレンモノオキシゲナーゼ）（EC1.1499.7）は、スクアレン分子の2位および3位の炭素原子にエポキシ基を導入する酵素で、ステロール類の前駆体として、スクアレン-2,3-エポキシドの合成過程を触媒する。スクアレンエポキシダーゼは、藻類を含む真核生物に広く存在している。
これまでに、発明者らは、大量（乾燥重量の30〜50％）の液状炭化水素を生産することが知られている単細胞性微細緑藻のボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）のスクアレンエポキシダーゼに関する研究を行ってきた。ボツリオコッカス・ブラウニーは、単一の種と考えられているが、生産する炭化水素のタイプが異なる、A、BおよびLの３品種が存在する。これら３品種の中で、バイオ燃料源として優れていると考えられているのは、石油に近い分岐型のトリテルペン炭化水素を生産し、その含量も平均的に高いことが知られているB品種である。B品種が生産するトリテルペン炭化水素には２種類あり、１つは主要成分であるボツリオコッセン類であり、もう１つはマイナー成分であるメチルスクアレン類（たとえば、trimethylsqualeneやtetramethylsqualene など）（非特許文献１、２および３）である。
【０００３】
メチルスクアレン類は、ボツリオコッカス・ブラウニーのB品種が生産する炭化水素としては、マイナー成分であるが、様々な誘導体（たとえば、botryoxanthinやbraunisanthinなど、（非特許文献４および５））として蓄積されている。これらのメチルスクアレン誘導体類の分子構造中には、（テトラメチル）スクアレン-10,11-エポキシドに由来する部分が存在し、実際に（テトラメチル）スクアレン-10,11-エポキシドが、本藻種に存在することが確認されている（非特許文献５）。さらに、本藻の品種が炭化水素を蓄積しているバイオポリマーも、長鎖脂肪族アルデヒドとスクアレン-10,11-エポキシドが縮合されたものから成ることから、本藻種におけるスクアレン-10,11-エポキシドの生合成は、従来考えられていた以上に盛んであると考えられる。したがって、光合成により固定された炭素を、燃料として利用しやすい炭化水素に変換するという点からは、スクアレン分子がエポキシ化されて他の分子に代謝されることは炭素の「無駄遣い」となり、このエポキシ化酵素の働きを抑えることが望まれる。
【０００４】
他方、スクアレン-10,11-エポキシドには、コレステロールの生合成を抑え、コエンザイムQの生合成を上昇させるという報告（非特許文献７）、抗腫瘍および抗ウイルス活性を有するスクアレン誘導体が10,11-スクアレンモノエポキシドから誘導されることが示唆されるとの報告（非特許文献８）などもあり、有用物質の生産という観点からも、スクアレン-10,11-エポキシドの生成に関与する酵素の特定は重要である。
【０００５】
しかしながら、スクアレンの10,11-エポキシドが見つかっている生物は限られていることもあり、その生合成酵素は未だに特定されてないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】HuangおよびPoulter，Phytochemistry 28:1467-1470 1989
【非特許文献２】Achitouvら，Phytochemistry 65: 3159-3165 2004
【非特許文献３】Mehmetら，J Nat Prod 80:953-958 2017
【非特許文献４】Okadaら, Tetrahedron Letts. 37:1065-1068 1996
【非特許文献５】Okadaら, Tetrahedron 53:11307-11316 1997
【非特許文献６】DelahaisおよびMetzger, Phytochemistry 44:671-678 1997
【非特許文献７】Bentingerら, Biochim Biophys Acta 1841:977-986 2014
【非特許文献８】Veraら, European J Org Chem. 31:5327-5336 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する新規酵素、より具体的には、スクアレンの少なくとも10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒する新規酵素の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、ボツリオコッカス・ブラウニーのトランスクリプトーム解析データベースについて、発現しているmRNAの中でスクアレンエポキシダーゼに類似のタンパク質をコードしているものが無いか調べた。参照アミノ酸配列として、モデル藻であるクラミドモナス・ラインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）のスクアレンエポキシダーゼの配列を用いて相同性検索を行ったところ、参照アミノ酸配列と相同性があり、スクアレンエポキシダーゼに特徴的なFAD結合領域および基質結合領域が保存されている４種類のアミノ酸配列を見いだした。この中の２種は、スクアレン-2,3-エポキシダーゼとしての活性を有していたが、他の２種にはそのような活性は認められなかった。そこで本藻種から得られたスクアレン-2,3-エポシダーゼ活性を有するアミノ酸配列を用いて、さらにトランスクリプトーム解析データベースについて、相同性検索を行ったところ、５つ目のアミノ酸配列が見つかった。
発明者らは、さらなる解析を進めた結果、上記他の3種の中からスクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒する活性（スクアレン-10,11-エポキシダーゼ活性）を有するタンパク質を見いだし、本発明を完成させた。当該スクアレン-10,11-エポキダーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列と他の生物由来のスクアレンエポキシダーゼのアミノ酸配列との同一性は、30〜40％程度で、ボツリオコッカス・ブラウニー由来のスクアレンエポキシダーゼとのアミノ酸配列同一性も、54%程度と低かった。
これまでに、スクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を持つスクアレンエポキシダーゼは見いだされておらず、本願明細書において初めて開示される。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）前記エポキシ基の導入される位置がスクアレンの10位および11位であることを特徴とする上記（１）に記載のタンパク質。
（３）上記（１）または（２）に記載のタンパク質をコードするDNA。
（４）下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAであることを特徴とする上記（３）に記載のDNA。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるDNAと80％以上の配列同一性を有するDNA
（５）上記（３）または（４）に記載のDNAを含有する組換えベクター。
（６）上記（１）または（２）に記載のタンパク質に対する抗体。
（７）上記（１）または（２）に記載のタンパク質に対するアプタマー。
（８）上記（１）または（２）に記載のタンパク質の細胞内における発現を抑制または阻害する核酸。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、スクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒し、スクアレン-10,11-エポキシドを産生する酵素が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のスクアレンエポキシダーゼの発現確認。Ａは、発現ベクターとしてpET32b(+)を、発現ホストとして大腸菌Rosetta-gami 2株を用いて発現させた結果を示す。N末端に Trx およびHis-tagを付加したリコンビナントタンパク質（分子量＝74kDa）として発現させた。0.5 mMのIPTGの存在／非存在下で、0、5および9時間、30℃で培養した。W：菌体ホモジネート、S：菌体ホモジネート上清画分、−：IPTG無添加，M：タンパク質分子量マーカー。Ｂは、発現ベクターとしてpET200を、発現ホストとして大腸菌/BL21（DE3）株を用いて発現させた結果を示す。N末端にHis-tagを付加したリコンビナントタンパク質（分子量＝60 kDa）として発現させた。1 mMのIPTGの存在下で、0および5時間、37℃で培養した。W：菌体ホモジネート、S：菌体ホモジネート上清画分、M：タンパク質分子量マーカー。
【図２】本発明のスクアレンエポキシダーゼの機能解析（１）。Ａはメバロン酸経路の律速酵素であるhydroxymethylglutaryl-CoA-reductase（HMGR）遺伝子の過剰発現酵母変異株に、BbSQE-V遺伝子を導入したのち、この変異株から抽出された脂溶性成分を、GC-EIMSに付した際のクロマトグラムを示す。Ｂはクロマトグラム上、当該酵母脂溶性成分に特異的に見られたピークに相当する化合物のEI-マススペクトルである。
【図３】酵母変異株に蓄積したスクアレンエポキシドのエポキシ基の位置を特定する方法の概要を示す。
【図４】図２に示す10,11-OSQ、10,11-diolおよび10,11-TMSを、それぞれGC-EIMSで分析した結果を示す。
【図５】精製したスクアレンエポキシドを13C NMRで解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の実施形態は、スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する新規酵素、すなわち、新規スクアレンエポキシダーゼである。
より具体的には、スクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を有する、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である（本明細書中において「本発明のスクアレンエポキシダーゼ」とも記載する）。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
本発明のスクアレンエポキシダーゼは、少なくとも、スクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒し、スクアレン-10,11-エポキシドを産生する活性を有している。これまでは、スクアレン-2,3-エポキシドを産生する反応を触媒する酵素しか見いだされていなかったが、本発明によって、スクアレン-10,11-エポキシドを産生する反応を触媒する酵素の一次構造が初めて明らかにされた。
なお、本発明にかかるスクアレンエポキシダーゼ（上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のタンパク質であってスクアレンにエポキシ基を導入する反応を触媒するタンパク質）と同じアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、活性を喪失したタンパク質またはポリペプチドも、本発明にかかるスクアレンエポキシダーゼに含まれる。すなわち、活性を喪失したタンパク質、ポリペプチドの使用も、本発明の実施に該当するものである。
【００１３】
本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」と記す場合、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個程度が好ましい。また、本明細書において、「80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよく、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。上記アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。
【００１４】
本発明の第２の実施形態は、本発明のスクアレンエポキシダーゼをコードするDNA（本明細書中において「本発明のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子」とも記載する）および当該DNAを含む組換えベクターなどの核酸構築物である。本発明にかかるスクアレンエポキシダーゼをコードするDNAとしては、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のDNAを挙げることができる。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含むDNA、
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、および
（ｃ）配列番号２で表される塩基配列を含むDNAと80％以上の配列同一性を有するDNA
【００１５】
本発明の第２実施形態にかかるDNAは、公知の技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術やPCR技術などを組み合わせて単離することができる。また、本発明の第２実施形態にかかるDNAには、配列番号２で表される塩基配列を含むDNA、当該DNAおよび当該DNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAならびに当該DNAおよび当該DNAの相補鎖と80%以上の配列同一性を有するDNAも含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存する経験的な実験条件である。通常、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度は高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。核酸同士のハイブリッドの形成は、相補鎖がその融点よりやや低い環境において再アニールする能力に依存する。より具体的に述べると、ストリンジェントな条件としては、上記DNAを単離することができる条件として、当業者によって選択される条件であれば特に限定はされず、例えば、洗浄段階において、42℃〜70℃、より好ましくは42℃〜65℃の温度条件の下、25mM〜450mM、より好ましくは25mM〜500ｍMのナトリウム濃度の条件が好ましい。このような条件としては、例えば、5×SSC（83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム）、0.1%SDS中、42℃で洗浄する条件などが挙げられる。さらに、温度を上げる等、より高いストリンジェントな条件にすることにより、相同性の高いDNAを得ることができる。
また、「80％以上の配列同一性を有するDNA」は80％以上の配列同一性を有するDNAであれば、何％であってもよく、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。
【００１６】
本発明のスクアレンエポキシダーゼは、当該技術分野における公知の遺伝子工学的技術により容易に作製することができる。また、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・ライゲーション（Native Chemical Ligation；NCL）法を組み合わせて作製してもよい。
本発明のスクアレンエポキシダーゼは、これをコードする核酸配列（例えば、配列番号２で表される配列）からなるDNAを適当な発現ベクターに挿入し、常法に基づいて、タンパク質を発現させ、単離精製を行うことで、調製することができる。
本発明のスクアレンエポキシダーゼは、種々の宿主細胞、例えば、大腸菌細胞、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞などを使用し、これらの細胞内で発現させることができる。本発明のスクアレンエポキシダーゼを発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現用ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pETなど（大腸菌宿主）、pEGF-C、pEGF-Nなど（動物細胞宿主）、pVL1392、pVL1393など（昆虫細胞宿主、バキュロウイルスベクター）、pG-1、p424、Yep13またはpPICZαなど（酵母細胞宿主）を使用することができる。これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカーおよびプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグおよびGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
発現用ベクターの作製は、当業者に公知の手法により実施することができ、適宜、市販のキットなどを使用して行うこともできる。
【００１７】
発現させたタンパク質を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のタンパク質を取得することができる。あるいは、細胞溶解物の沈殿画分から、変成したタンパク質をSDS-PAGEなどにより分離してもよい。さらに、当該沈殿画分から、適切な折りたたみを行わせ、活性のあるタンパク質を取得し、当該活性のあるタンパク質を分離・精製してもよい。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはグルタチオンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗HA抗体樹脂を、FLAGタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗FLAG抗体結合樹脂などを使用する方法）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００１８】
本発明の第３の実施形態は、本発明のスクアレンエポキシダーゼと結合する抗体（本明細書中において「本発明の抗体」とも記載する）である。
本発明の抗体の抗原は、スクアレンエポキシダーゼ活性を保持したものであっても、当該活性を喪失したものであってもよく、また、完全長タンパク質であっても、その一部であってもよい。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはそれら抗体の断片が含まれる。また、遺伝子工学的に修飾した、いわゆる、キメラ抗体も含まれる。
本発明の抗体断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、たとえば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域および軽鎖可変領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化可変領域）、ならびに、CDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
ここで、「モノクローナル」というのは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。たとえば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、たとえばハイブリドーマ法（Kohler and Milstein,Nature256:495(1975)）または組換え法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、本発明のモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)）。
【００１９】
本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、たとえば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原および／またはアジュバントを宿主動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイトおよびモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（MPL-TDM）が含まれる。
【００２０】
また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、たとえば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（1）宿主動物に免疫原を免疫する、（2）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（3）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（4）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたは他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、たとえば、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する１または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、または、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、または、腹水から調製することができる。
【００２１】
本発明の第４の実施形態は、本発明のスクアレンエポキシダーゼと結合するアプタマー（本明細書中において「本発明のアプタマー」とも記載する）である。
本発明のアプタマーは、本発明にかかるスクアレンエポキシダーゼと特異的に結合するもので、核酸分子（RNAまたはDNA）であっても、ペプチドであってもよい。核酸アプタマーについては、例えば、SELEX法などにより調製することができる（EllingtonおよびSzostak, Nature 346:818-822 1990；TuerkおよびGold, Science 249:505-510 1990）。また、ペプチドアプタマーについては、Phage display法、Cell surface display法などの細胞外ディスプレイ法、あるいは、酵母のTwo-hybrid法などの細胞内選択法などにより調製することができる（Reverdattoら, Curr Top Med Chem. 15:1082-1101 2015）。
なお、本発明のアプタマーの調製は、当業者であれば容易に実施できるが、専門の企業等（たとえば、コスモバイオ株式会社、CBC株式会社またはAptamer Sciences社など）に委託して行ってもよい。
【００２２】
本発明の第５の実施形態は、本発明のスクアレンエポキシダーゼの発現を抑制または阻害する核酸（本明細書中において「本発明の機能阻害核酸」とも記載する）である。
本発明の機能阻害核酸は、本発明のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子のmRNAの転写、翻訳等を阻害し、本発明のスクアレンエポキシダーゼの細胞（たとえば、ボツリオコッカス・ブラウニー（とくに、B race））内における発現を抑制または阻害する機能を有する。本発明の機能阻害核酸としては、たとえば、アンチセンスRNAもしくはDNA、デコイ核酸、リボザイム、siRNAまたはmiRNAなどを挙げることができる。これらの核酸は、当業者において周知の方法により調製することが可能である。あるいは、これらの機能阻害核酸の調製は、当業者であれば容易に実施できるが、専門の企業等（たとえば、コスモバイオ株式会社、タカラバイオ株式会社、シグマアルドリッチ社または株式会社ベックスなど）に委託して行ってもよい。
【００２３】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２４】
１．ボツリオコッカス・ブラウニー からのスクアレンエポキシダーゼ（BbSQE）様遺伝子の単離
In-houseのBotryococcus braunii Showa株（B race）のトランスクリプトームデータにつき、既報のスクアレン2,3-エポキシダーゼ（Uchida et al., PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0122649 April 1, 2015）であるBbSQE-I（GenBankアクセッション番号；AB923908（遺伝子）、BAR46029（タンパク質））およびBbSQE-II（GenBankアクセッション番号；AB986538（遺伝子）、BAR46030（タンパク質））のアミノ酸配列を参照配列として検索を行ったところ、新たにスクアレン-2,3-エポキシダーゼと相同性を示すタンパク質をコードするcontigが見つかった。
このcontig配列を元に、翻訳開始コドンと終始コドンにより挟まれる全領域の増幅を目的とした、遺伝子特異的プライマーを作製し、B. braunii Showa株のcDNAを鋳型としてPCRを行った。使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
BbSQE VF；GTGTTAGCTAGTGTTTTGG（配列番号３；フォワードプライマー）
BbSQE VR；CGCTAGAACTACTGTTGG（配列番号４；リバースプライマー）
得られたPCR産物（BbSQE-VまたはSQE-Vとする）をpBluescript SKベクターにクローニングし、常法により塩基配列を分析し、トランスクリプトームデータ上の塩基配列と一致していることを確認した。
得られた塩基配列の内、翻訳開始コドン（ATG）から終始コドンに相当する部分をPCRにより増幅し、酵母細胞でのタンパク質発現用ベクターであるp424プラスミド（奈良女子大理学部鍵和田聡教授から供与を受けた）に導入した（p424-BbSQE-V）。
ここでクローニングした遺伝子配列とそのアミノ酸配列を、各々、配列番号２および配列番号１として示す。
【００２５】
２．新規スクアレンエポキシダーゼのリコンビナントタンパク質
２種類の発現ベクターを用いて、上記１で単離した新規スクアレンエポキシダーゼ遺伝子（配列番号２）の大腸菌内における発現確認を行った。
２−１．pET32b(+)ベクター
pET32b(+)に新規スクアレンエポキシダーゼ遺伝子（BbSQEV）を挿入した発現ベクターで、大腸菌Rosetta-gami 2株を形質転換した。BbSQEVのN末端に Trx およびHis-tagを付加したリコンビナントタンパク質（分子量＝74kDa）として発現させた（図１Ａ）。形質転換した大腸菌を、0.5mM IPTG存在下／非存在下、30℃で培養後、菌体を回収し、ホモジネートした。培養後0時間の菌体ホモジネート（図１Ａ、0h W）と、5時間および9時間の菌体ホモジネート（図１Ａ、5h Wおよび9h W）および菌体ホモジネート上清画分（図１Ａ、5h Sおよび9h S）をSDS-PAGEにかけ、発現タンパク質の確認を行った。
その結果、培養後5時間および9時間の大腸菌内で、新規スクアレンエポキシダーゼの発現を確認することができた（図１Ａ，四角（点線）枠内）。
【００２６】
２−２．pET200ベクター
pET200にBbSQEVを挿入した発現ベクターで、大腸菌BL21（DE3）株を形質転換した。BbSQEVのN末端にHis-tagを付加したリコンビナントタンパク質（分子量＝60kDa）として発現させた（図１Ｂ）。形質転換した大腸菌を、1mM IPTG存在下、37℃で培養後、菌体を回収し、ホモジネートした。培養後0時間の菌体ホモジネート（図１Ｂ、0h W）と、5時間の菌体ホモジネート（図１Ｂ、5h W）および菌体ホモジネート上清画分（図１Ｂ、5h S）をSDS-PAGEにかけ、発現タンパク質の確認を行った。
その結果、培養後5時間の大腸菌内で、新規スクアレンエポキシダーゼの発現を確認することができた（図１Ｂ、四角（点線）枠内）。
【００２７】
３．新規スクアレンエポキシダーゼ活性の同定
３−１．新規スクアレンエポキシダーゼにより生産されたスクアレンエポキシドの精製
得られたp424-BbSQE-Vで、奈良女子大理学部鍵和田聡教授が作製した、スクアレン高蓄積酵母株KY354（=YPH500)株[MATα ade2-101 his3-delta200 leu2-delta1 lys2-801 trp1-delta63 ura3-52]を形質転換し、トリプトファンを制限したYeast synthetic drop-out mediumで培養した。この酵母変異株はスクアレンを大量に蓄積できるため、もし、導入した遺伝子がユニークなスクアレンエポキシダーゼ活性を持っていれば、ユニークなスクアレンエポキシドの蓄積が見られることが期待できる。酵母細胞は、培養温度30℃、220rpmの振とう培養を48時間行った後、遠心分離で回収した。
得られた酵母細胞をガラスビーズ法により破砕し、アセトンで脂溶性成分の抽出を行った。得られたアセトン抽出液は合一し、ロータリーエバポレーターで溶媒を留去、抽出物をn-ヘキサンに再溶解し、シリカゲルカラムクロマトに付した。
まず、n-ヘキサンで炭化水素をカラムから溶出させた後、展開溶媒を酢酸エチル／n-ヘキサン（5:95）に変え、スクアレンエポキシド画分を得た。得られたスクアレンエポキシド画分を、Cosmosil 5SL-II（10 mm x 250 mm）を用いた順相HPLCに付し、スクアレンエポキシドを含む画分を得た。移動相は酢酸エチル／n-ヘキサン（2.5:97.5）であり、流速は4.5 ml/min、210 nmで検出を行った。最後にこのスクアレンエポキシドを含む画分を、CAPCELL PAK ADMEカラム（4.6 mm x 250 mm）またはCosmosil Cholesterカラム（10 mm x 250 mm）を用いた逆相HPLCにより、さらに精製を行った。移動相は水／アセトニトリル（2.5:97.5）を用い、流速は 1 ml/min（CAPCELL PAK ADMEカラム）または3 ml/min（Cosmosil Cholesterカラム）、検出波長は210 nmを用いた（図２Ａ）。
【００２８】
３−２．GC-EIMS分析
上記３−１で精製したスクアレンエポキシドとコントロールとしてスクアレン-10,11-エポキシドの合成標品（Abad et al., J Org Chem, 60:3648-3656 1995に記載の方法に従って合成した ）をGC-EIMSに導入し、各々、分析を行った。装置はShimadzu GCMS-QP2010 Ultraを用い、試料導入部は260℃、イオン源は200℃に設定した。カラムはInertCap 1MS（膜厚0.25μm、内径0.25 mm、長さ60 m）を用い、試料導入部は以下の昇温プログラムを使用した；
50℃（1分保持）→（毎分10℃昇温）→260℃（50分保持）
分析の結果、ここで精製したスクアレンエポキシドは、スクアレン-10,11-エポキシドの合成標品とほぼ同じ保持時間を示し、分子量も合成標品と同じm/z=426を有することが明らかとなった（図２Ｂ）。
そこで次に、どの部分にエポキシ基が入ったスクアレンであるかを確認した。精製したスクアレンエポキシドを過塩素酸で加水分解しジオールへと変換し、さらにトリメチルシリル誘導体化した（図３）。
図２に示す10,11-diolと10,11-TMSをGC-EIMSで分析したところ、各々、m/z=195および267のフラグメントイオンが見られたことから、エポキシ基の位置はスクアレン分子の10位および11位にあると考えられた（図４）。
【００２９】
３−３．13C NMR解析
さらに、上記２−１で精製したスクアレンエポキシドを13C NMRで解析した。酵母から精製したスクアレンエポキシドの13C NMRのケミカルシフトは、合成標品のスクアレン-10,11-エポキシドのものと一致し、また、既報（Abad et al., J Org Chem 58:3991-3997 1993 ）に報告されている結果とも一致していた。一方、スクアレン-2,3-エポキシドに特徴的なケミカルシフト（おのおの、58.3(C2)および64.2(C3)）は観察されなかった（図５）。
以上の解析から、本発明にかかる新規のスクアレンエポキシドは、スクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒する活性を有すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、スクアレンの10位および11位にエポキシ基を導入する反応を触媒する新規酵素が提供される。本酵素または当該酵素の阻害物質や促進物質は、機能解明が進んでいないスクアレン-10,11-エポキシドの細胞内における働きを明らかにする有力なツールとしての利用が期待され、さらには、バイオ燃料の分野の進展にも貢献すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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