(57)【要約】【課題】銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能な技術を提供すること。【解決手段】硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴下し、滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成する工程（Ｉ）と、前記寒天培地に対象の菌を増殖させる工程（ＩＩ）と、前記境界部の内側に発生した対象の菌を銀耐性菌とし、前記境界部の外側に発生した対象の菌を銀感受性菌と判定する工程（ＩＩＩ）と、を少なくとも行う、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定方法などを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴下し、滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成する工程（Ｉ）と、
前記寒天培地に対象の菌を増殖させる工程（ＩＩ）と、
前記境界部の内側に発生した対象の菌を銀耐性菌とし、前記境界部の外側に発生した対象の菌を銀感受性菌と判定する工程（ＩＩＩ）と、
を少なくとも行う、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定方法。
【請求項２】
硫黄源を含有する寒天培地と、
銀イオンを含む溶液と、
を少なくとも有する、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定方法、及び銀耐性菌又は銀感受性菌の判定キットに関する。より詳しくは、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
銀は、抗菌作用があることが知られており、殺菌能力だけでなく、防カビ能力なども持ち合わせている。銀の抗菌性は、主に銀イオン（Ａｇ＋）によるものとされており、銀イオンは、浴槽水の殺菌、衣類・履物等の殺菌・消臭に利用されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
その一方で、銀に対し、耐性のある細菌やカビ（真菌）などがあることが知られており、例えば、非特許文献１には、バシラス属の細菌の中には、銀耐性のある菌があることが開示されている。これらの菌に対しては、銀の抗菌力が作用しないため、銀を用いたとしても除菌等をすることはできない。
【０００４】
ここで、出願人の一方は、以前に発明者として、特許文献２にて、サルモネラ菌等培養の過程で硫化水素を産生する細菌を、ＤＨＬ寒天培地等鉄源を有する分離培地で分離し、ＴＳＩ寒天培地その他確認培地を用いてサルモネラ菌を肉眼で簡便に判定する技術を開示している。
【０００５】
このように、各種の菌を肉眼で簡便に判定できる技術は、水道水、飲料、食品、食品に接触する器具、医療機器、これらに用いられる各種部品等における菌の判定において非常に有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平３−７２０１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１０６５８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gunawan, C.; Teoh, W. Y.; Marquis, C. P.; Amal, R., Induced Adaptation of Bacillus sp. to Antimicrobial Nanosilver. Small 2013, 9 (21), 3554-3560
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、銀に耐性のある菌が存在することが知られてはいたものの、銀耐性菌か否かを簡便に判別する手法は存在しなかった。特に、目視にて簡便に判定できるような手法は、銀耐性菌や銀感受性菌の研究の分野などにおいては非常に有用であり、その開発が望まれていた。
【０００９】
そこで、本発明では、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能な技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、まず、硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴下し、滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成する工程（Ｉ）と、前記寒天培地に対象の菌を増殖させる工程（ＩＩ）と、前記境界部の内側に発生した対象の菌を銀耐性菌とし、前記境界部の外側に発生した対象の菌を銀感受性菌と判定する工程（ＩＩＩ）と、を少なくとも行う、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明では、硫黄源を含有する寒天培地と、銀イオンを含む溶液と、を少なくとも有する、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定キットも提供する。
【００１２】
なお、本発明において、「銀耐性菌」とは、銀（主に銀イオン）による影響を受けない菌をいう。また、「銀感受性菌」とは、銀（主に銀イオン）による影響を受ける菌をいう。銀による影響とは、例えば、菌の増殖の抑制や低減、菌の除去などをいう。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能となる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実験例１の結果を示す図面代用写真である。
【図２】実験例２の結果を示す図面代用写真である。
【図３】実験例３の結果を示す図面代用写真である。
【図４】実験例４の結果を示す図面代用写真である。
【図５】実験例５の結果を示す図面代用写真である。
【図６】実験例６の結果を示す図面代用写真である。
【図７】実験例７において、境界部の観察結果を示す図面代用写真である。
【図８】実験例７において、抗菌部の観察結果を示す図面代用写真である。
【図９】実験例７において、非抗菌部の観察結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１６】
１．判定方法
本願発明者らは、図１の図面代用写真に示すように、硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴化すると、滴下した部分を中心として円状に滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成することを見出した。この現象を、本願発明者らは、「銀月反応」と命名した。また、前記境界部は銀色の円環であることから、本願発明者らは「銀環」と命名した。
【００１７】
また、本願発明者らは、抗菌部には銀感受性菌は増殖せず、非抗菌部には銀感受性菌が増殖することを見出した。一方で、銀耐性菌の場合は、抗菌部での増殖が認められることも見出した。この様子は肉眼で観察可能であることから、本発明に係る判定方法を用いれば、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能となる。
【００１８】
更に、本発明に係る判定方法を用いれば、培地上に形成された、銀環や銀耐性菌又は銀感受性菌のコロニー（集落）を、顕著に目視にて確認できるため、菌の検出の精度を向上することも可能となる。そのため、細菌又は真菌の検査現場において、銀耐性菌又は銀感受性菌を容易に分離でき、検査効率を格段に向上させることができる。
【００１９】
更に、本発明に係る判定方法を用いれば、銀耐性菌又は銀感受性菌に関する、判定キット、判定デバイス等を提供できる。これにより、銀耐性菌や銀感受性菌を新たな生物資源として活用することもできる。
【００２０】
以下、本発明に係る判定方法における各工程について、詳細に説明する。
【００２１】
（１）工程（Ｉ）
工程（Ｉ）は、硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴下し、滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成する工程である。
【００２２】
抗菌部、境界部、及び非抗菌部は、図１を用いて説明すると、円環（銀環）の内側が抗菌部、円環自体が境界部、円環の外側が非抗菌部である。
【００２３】
なお、図１では抗菌部が略円状に形成されているが、本発明では、抗菌部、境界部、及び非境界部の形状は特に限定されず、抗菌部の形状が、略扇状、略半円状等であってもよい。また、境界部及び非境界部も、変形した抗菌部の形状にあわせて変形した形状等であってもよい。
【００２４】
硫黄源は特に限定されず、例えば、チオ硫酸ナトリウムなどから選ばれる１種又は２種以上の硫黄源等が挙げられる。本発明では、これらの中でも特に、チオ硫酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【００２５】
寒天培地は、硫黄源を含有すれるものであれば特に限定されず、例えば、ＤＨＬ（Desoxycholate-hydrogen sulfide-lactose）寒天培地、Ｘ−ＳＡＬ寒天培地、ＭＬＣＢ（Mannitol lysine crystal violet brilliant green）寒天培地、ＳＳ−ＳＢ（Salmonella-Shigella Sucrose Bromcresolpurple）寒天培地等の寒天培地を挙げられる。また、本発明では、前記寒天培地として、市販のものを用いてもよい。
【００２６】
なお、工程（Ｉ）で用いる寒天培地には、硫黄源のみならず、例えば、クエン酸鉄アンモニウムなどから選ばれる１種又は２種以上の鉄源等が含有されていてもよい。
【００２７】
また、前記寒天培地には、本発明の効果を損なわない範囲で、栄養源等が添加されていてもよく、この栄養源等は、培養する菌の性質などに応じて、自由に用いることができる。
【００２８】
前記栄養源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、レシチン等の炭素源：硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸‐アンモニウム、リン酸二アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素源：アミノ酸、ペプトン等の有機窒素源；ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガン等の無機栄養源；その他各種ビタミンなどから選ばれる１種又は２種以上の栄養源等が挙げられる。
【００２９】
銀イオンを含む溶液は特に限定されず、例えば、硝酸銀溶液、フッ化銀溶液、アンモニア銀溶液、クエン酸銀溶液などから選ばれる１種又は２種以上の溶液等が挙げられる。本発明では、これらの中でも特に、硝酸銀溶液及び／又はフッ化銀溶液を用いることが好ましく、硝酸銀溶液を用いることがより好ましい。
【００３０】
銀イオンを含む溶液の濃度も特に限定されないが、高濃度のものが銀環を形成しやすいので好ましい。より好ましくは、飽和状態の溶液である。
【００３１】
工程（Ｉ）における反応時間（抗菌部、境界部及び非抗菌部を形成するまでの時間）は特に限定されないが、３０分以上であることが好ましく、１時間以上であることがより好ましく、２時間以上であることが更に好ましい。
【００３２】
また、工程（Ｉ）における反応温度は、約３７℃であることが好ましい。３７℃以下とすると、銀環が形成されるまでの時間が長くなってしまう。
【００３３】
（２）工程（ＩＩ）
工程（ＩＩ）は、前記寒天培地に対象の菌を増殖させる工程である。
【００３４】
対象の菌は特に限定されず、本発明に係る判定方法では、細菌、真菌等を含めたあらゆる菌を対象とすることができる。なお、本発明では、多くの菌種を含む、所謂、「菌群」と呼ばれるものも対象とすることができる。本発明では、これらの中でも特に、細菌及び／又は真菌を対象の菌とすることが好ましい。
【００３５】
対象の菌としては、例えば、サルモネラ属、シトロバクター属、プロテウス属、エドワージエラ属等に属する菌；大腸菌；Escherichia coli、Citrobacter、Klebsiella、Enterobacter、Proteus等の多くの菌種を含む大腸菌群；乳酸菌；ブドウ球菌などから選ばれる１種又は２種以上の菌等が挙げられる。
【００３６】
工程（ＩＩ）において、増殖させる際の条件は特に限定されず、増殖する菌の性質などに応じて、温度、時間等を自由に設定することができる。例えば、細菌では、３７℃で６時間、又は３７℃で２４時間若しくはそれ以上、真菌（カビ）では、２５℃（室温下）で１週間以上培養する条件等が挙げられる。
【００３７】
（３）工程（ＩＩＩ）
工程（ＩＩＩ）は、前記境界部の内側に発生した対象の菌を銀耐性菌とし、前記境界部の外側に発生した対象の菌を銀感受性菌と判定する工程である。
【００３８】
銀耐性菌及び銀感受性菌の定義については、上述したとおりである。また、本発明では、工程（ＩＩＩ）における判定は肉眼で行うことができることを特徴とする。
【００３９】
（４）その他の工程
本発明に係る判定方法では、上記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の工程を行ってもよい。
【００４０】
２．判定キット
本発明では、硫黄源を含有する寒天培地と、銀イオンを含む溶液と、を少なくとも有する、銀耐性菌又は銀感受性菌の判定キットも提供する。硫黄源、寒天培地、及び銀イオンを含む溶液については、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
【００４１】
本発明に係る判定キットを用いることで、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能となる。そのため、菌の検出の精度を向上することが可能となり、細菌又は真菌の検査現場において、銀耐性菌又は銀感受性菌を容易に分離でき、検査効率を格段に向上させることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００４３】
＜実験例１＞
本実験例１では、チオ硫酸ナトリウム及びクエン酸鉄アンモニウムを含むＤＨＬ培地（栄研化学社製）２０ｍＬを用い、直径１０ｃｍの円形シャーレに寒天培地を作製した。次いで、この寒天培地の中心に飽和硝酸銀溶液２５μＬを滴下し、３７℃にて５時間放置した。
【００４４】
本願発明者らは、飽和硝酸銀溶液は滴下後、滴下箇所を中心として略円状に拡散し、図１に示すように、端に銀色の円環（銀環）を形成することを目視にて確認した。
【００４５】
＜実験例２＞
本実験例２では、上記実験例１に記載の方法で作製した銀環が形成された寒天培地に、サルモネラ菌及び大腸菌を接種させ、３７℃で２４時間増殖させた。
【００４６】
本願発明者らは、図２に示すように、銀環（境界部）内側である抗菌部にはサルモネラ菌及び大腸菌は増殖せず、コロニー（集落）は形成されなかったことを確認した。一方で、外側である非抗菌部のみにこれらの菌が増殖し、コロニーの形成が認められた。
【００４７】
＜実験例３＞
本実験例３では、上記実験例１に記載の方法で作製した銀環が形成された寒天培地に、蓋をせずに１日放置して落下菌（主に真菌）の侵入を促進し、２５℃の室温下で１週間放置した。
【００４８】
本願発明者らは、図３に示すように、銀環（境界部）内側である抗菌部には真菌（カビ）は増殖せず、コロニーは形成されなかったことを確認した。一方で、外側である非抗菌部のみに真菌が増殖し、コロニーの形成が認められた。更に、本実験例３の結果から、銀環自体には、抗菌作用がないか、銀環内側である抗菌部と比較して抗菌作用が弱いことも推察された。
【００４９】
＜実験例４＞
本実験例４では、硫黄源であるチオ硫酸ナトリウムのみを加えた寒天培地を直径１０ｃｍの円形シャーレに作製した。また、鉄源であるクエン酸鉄アンモニウムのみを加えた寒天培地を直径１０ｃｍの円形シャーレに作製した。次いで、これらの寒天培地の中心に飽和硝酸銀溶液２５μＬをそれぞれ滴下し、３７℃にて５時間放置した。
【００５０】
図４は、実験例４の結果を示す図面代用写真であり、左側がチオ硫酸ナトリウムのみを加えた寒天培地を示し、右側がクエン酸鉄アンモニウムを加えた寒天培地を示している。これにより、本願発明者らは、銀環（境界部）の発生が、鉄源であるクエン酸鉄アンモニウムではなく、硫黄源であるチオ硫酸ナトリウムによって起こる現象であることを確認した。
【００５１】
＜実験例５＞
本実験例５では、上記実験例４に記載の方法で作製した銀環が形成された、硫黄源であるチオ硫酸ナトリウムのみを加えた寒天培地に、サルモネラ菌を接種させ、３７℃で２４時間増殖させた。
【００５２】
本願発明者らは、図５に示すように、銀環（境界部）内側である抗菌部にはサルモネラ菌は増殖せず、コロニーは形成されなかったことを確認した。一方で、外側である非抗菌部のみにサルモネラ菌が増殖し、コロニーの形成が認められた。
【００５３】
＜実験例６＞
本実験例６では、上記実験例４に記載の方法で作製した銀環が形成された、硫黄源であるチオ硫酸ナトリウムのみを加えた寒天培地に、蓋をせずに１日放置して落下菌（主に真菌）の侵入を促進した後、２５℃の室温下で１週間放置した。
【００５４】
図６は、実験例６の結果を示す図面代用写真であり、左側が銀感受性の真菌が増殖した様子を示し、右側が銀耐性の真菌が増殖した様子を示している。本願発明者らは、図６に示すように、銀環（境界部）内側である抗菌部には銀感受性の真菌は増殖しないが、銀耐性の真菌は増殖することを確認した。
【００５５】
上記実験例１〜６の結果から、本願発明者らは、硫黄源を含有する寒天培地に対して銀イオンを含む溶液を滴化すると、滴下した部分を中心として円状に滴下した部分に抗菌部と、該抗菌部の周囲に境界部（銀環）と、該境界部の外側に非抗菌部と、を形成することを見出した。
【００５６】
また、本願発明者らは、抗菌部には銀感受性菌は増殖せず、非抗菌部には銀感受性菌が増殖することを見出した。一方で、銀耐性菌の場合は、抗菌部での増殖が認められることも見出した。この様子は肉眼で観察可能であることから、本発明に係る判定方法を用いれば、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能となることが判明した。
【００５７】
＜実験例７＞
抗菌部、境界部（銀環）、及び非抗菌部の各部位を、電子顕微鏡を用いて、ＴＥＭ（Transmission Electron Microscope)観察した。
【００５８】
具体的には、以下の通りに実験を行った。
１．抗菌部、境界部（銀環）、及び非抗菌部の各試料を、カッターを用いて培地ごと、適当な大きさ（３ｍｍ×５ｍｍ）にカットした。
２．培地の水分を除去ために、ろ紙の上にカットした各試料を置いた。
３．水分が除去された各試料をＳｉ基板とガラスでサンドし、アラルダイトで固定接着した。
４．各試料をダイヤモンドカッターを用いて、３ｍｍ×１ｍｍの大きさにカットした。
５．耐水研磨紙（＃１２００）で各試料の厚さを０．１ｍｍにまで研磨した。
６．イオンスライサーを用いて、ＴＥＭ観察用に各試料を作製加工した。
７．電子顕微鏡（ＪＥＯＬ社製；型式：２０００ＥＸ２、ＴＯＰＣＯＮ社製；型式：００２Ｂ）を用いて、断面ＴＥＭ観察した。
【００５９】
図７〜９は、実験例７における観察結果を示す図面代用写真である。図７に示すように、境界部では、場所により銀粒子の大きさが異なり、全体的に１０ｎｍ〜１μｍ程の銀粒子が分布していた。また、図８に示すように、抗菌部では、銀粒子の大きさのバラつきが小さく、全体的に１０ｎｍ〜５００ｎｍ程の銀粒子が分布しており、試料全体に占める培地の割合はそれほど多くなかった。更に、図９に示すように、非抗菌部では、銀粒子の大きさのバラつきが小さく、全体的に１０ｎｍ程の銀粒子が分布しており、試料全体に占める培地の割合が多かった。
【００６０】
このことから、寒天培地全体に、銀粒子（直径数ｎｍ〜５０ｎｍ、直径１０ｎｍのサイズが多い）が分散しており、境界部（銀環）では、銀粒子が密集していた。また、抗菌部は銀粒子の割合が多く、非抗菌部は銀粒子の割合が少ないことが分かった。また、硝酸銀が銀ナノ粒子になる過程で非抗菌部側に行くほど銀の濃度が薄くなり、銀ナノ粒子の密度が低下していたことから、十分な抗菌作用を施す銀ナノ粒子密度が減ることにより、非抗菌部では抗菌作用がないと考えられた。
【００６１】
したがって、電子顕微鏡観察の結果、溶液中の銀イオンは、寒天培地内で銀ナノ粒子になることで、抗菌性が培地に付与されることが推察された。なお、本願発明者らは、硝酸銀水溶液の代わりにフッ化銀水溶液を用いた場合においても、同様の結果が得られることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明に係る判定方法を用いれば、銀耐性菌又は銀感受性菌を目視にて簡便に判定することが可能となる。そのため、水道水、飲料、食品、食品に接触する器具、医療機器、これらに用いられる各種部品等における、銀耐性菌又は銀感受性菌の検出を、簡便、迅速かつ高精度に行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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