(57)【要約】      （修正有）【課題】ゼアラレノンまたはその誘導体を加水分解するためのポリペプチドの提供。【解決手段】ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは特定のアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を有するヒドロラーゼであり、前記機能的変異体の配列は少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一であるポリペプチド、前記ポリペプチドを含有する添加物、前記ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドならびに前記ポリペプチドを使用してゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するための方法。【選択図】図３Ａ
2019088287.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号１から１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を備えるヒドロラーゼであって、機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間に少なくとも４０％の配列同一性があるヒドロラーゼであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドは、少なくとも１つの保存アミノ酸配列セグメントもしくはこの機能的変異体を有し、アミノ酸配列セグメントの機能的変異体は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９２％および最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有しており、少なくとも１つの保存アミノ酸配列セグメントは、配列番号１を有する配列のアミノ酸配列＋２４から＋５０、＋５２から＋７７、＋７９から＋８７、＋８９から＋１４５、＋１５０から＋１７１、＋１７７から＋１９３、＋２２３から＋２２８、＋２３０から＋２３７、＋２３９から＋２４７、＋２４９から＋２５５、＋２５７から＋２６１、＋２６３から＋２７０、＋２７２から＋２７９、＋２９７から＋３０１、＋３０３から＋３１３、＋２４から３２８、＋１から＋３２８の群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
機能的変異体は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および挿入の群から選択された少なくとも１つのアミノ酸修飾を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドは、少なくとも０．０１Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも０．１Ｕ／ｍｇ、特に少なくとも１Ｕ／ｍｇの比活性；および／または多くとも５０μＭ、好ましくは多くとも３．５μＭ、特に多くとも０．５μＭのＺＥＮの加水分解のＫＭ値；および／または少なくとも０．０５ｓ−１、好ましくは少なくとも０．６ｓ−１、特に少なくとも５ｓ−１のＺＥＮの加水分解のｋｃａｔ値；および／または少なくとも０．００００１μＭ−１ｓ−１のＺＥＮの加水分解のｖｍａｘ値を有することを特徴とする、請求項１、２または３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドは、配列番号２、５から７、９、１１、１２および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を含有していてよく、機能的変異体は、少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％のアミノ酸同一性を有し、ｐＨ５．０でのポリペプチドのｐＨ安定性は少なくとも１５％、好ましくは５０％および特に好ましくは９０％になることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドは、配列番号１、２、５から７、９、１１、１２および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を含有しており、機能的変異体は少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するので、ポリペプチドは３０℃から７５℃、好ましくは３８℃から５５℃、特に好ましくは３８℃から５２℃の範囲内の温度で最高酵素活性を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドは、配列番号１、５、６、９、１１、１２および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を有しており、機能的変異体は少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有し、ポリペプチドは９０℃、好ましくは７５℃、および特に好ましくは６０℃の温度まで熱的に安定性であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドは、以下の：２２、２３、２５、２６、２７、２９、３１、３２、３５、３７、４２、４３、４６、５１、５３、５４、５７、６０、６９、７２、７３、７８、８０、８４、８８、９５、９７、９９、１１４、１１８、１１９、１２３、１３２、１４１、１４６、１４８、１４９、１５４、１６３、１６４、１６５、１６９、１７０、１７２、１７６、１８０、１８２、１８３、１９０、１９１、１９４、１９６、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１６、２１７、２２０、２２１、２２２、２２９、２３１、２３３、２３８、２４０、２４４、２４５、２４６、２４８、２４９、２５１、２５４、２５６、２６０、２６２、２６３、２６６、２６９、２７１、２７７、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９２、２９６、２９８、３０２、３０７、３０８、３０９、３１１、３１４、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５および３２６の群から選択される位置のうちの少なくとも１つにおいて配列番号１と比較してアミノ酸配列の少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドは、アミノ酸配列において配列番号１と比較して：Ｄ２２Ａ、Ｓ２３Ｑ、Ｓ２３Ｌ、Ｎ２５Ｄ、Ｉ２６Ｖ、Ｆ２７Ｙ、Ｆ２７Ｈ、Ｓ２９Ｐ、Ｒ３１Ａ、Ｆ３２Ｙ、Ｒ３５Ｋ、Ｒ３５Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｖ４２Ｉ、Ｖ４３Ｔ、Ｆ４６Ｙ、Ｓ５１Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｄ５３Ｇ、Ｎ５４Ｍ、Ｎ５４Ｒ、Ｌ５７Ｖ、Ｌ６０Ｉ、Ｓ６９Ｇ、Ｐ７２Ｅ、Ｖ７３Ａ、Ａ７８Ｓ、Ｎ８０Ｈ、Ｆ８４Ｙ、Ｉ８８Ｌ、Ｔ９５Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｒ９９Ｋ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１８Ｖ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１２３Ｉ、Ｌ１３２Ｖ、Ａ１４１Ｓ、Ｉ１４６Ｖ、Ｉ１４６Ｌ、Ａ１４８Ｇ、Ａ１４９Ｖ、Ａ１５４Ｐ、Ｐ１６３Ｔ、Ａ１６４Ｔ、Ｙ１６５Ｃ、Ｙ１６５Ｈ、Ｖ１６９Ｉ、Ｌ１７０Ｒ、Ａ１７２Ｇ、Ａ１７６Ｍ、Ａ１７６Ｖ、Ｙ１８０Ｆ、Ｄ１８２Ｔ、Ｆ１８３Ｙ、Ｉ１９０Ｖ、Ｇ１９１Ｓ、Ｋ１９４Ｔ、Ｋ１９４Ｅ、Ｆ１９６Ｙ、Ｖ１９７Ｃ、Ｖ１９７Ｒ、Ｅ１９８Ｒ、Ｅ１９８Ｓ、Ｋ２０１Ｄ、Ｋ２０１Ｇ、Ｐ２０４Ｓ、Ｐ２０４Ａ、Ａ２０５Ｓ、Ｋ２０６Ｐ、Ａ２０７Ｍ、Ｍ２０８Ａ、Ｑ２０９Ｒ、Ｌ２１０Ａ、Ｌ２１０Ｓ、ΔＰ２１２、Ｔ２１３Ｖ、Ｐ２１４Ａ、Ｅ２１６Ｔ、Ｅ２１６Ｇ、Ａ２１７Ｉ、Ｎ２２０Ｈ、Ｌ２２１Ｍ、Ｋ２２２Ｒ、Ｋ２２２Ｑ、Ｇ２２９Ａ、Ａ２３１Ｖ、Ｆ２３３Ｗ、Ｆ２３３Ｙ、Ｆ２３３Ｈ、Ａ２３８Ｇ、Ｈ２４０Ｎ、Ｈ２４０Ｓ、Ｄ２４４Ｅ、Ｒ２４５Ｑ、Ｍ２４６Ｌ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｇ、Ｑ２４９Ｒ、Ｋ２５１Ｎ、Ｉ２５４Ｖ、Ｉ２５６Ｌ、Ａ２６０Ｍ、Ｔ２６２Ｄ、Ｔ２６２Ｇ、Ｉ２６３Ｔ、Ｅ２６６Ｄ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｎ、Ｌ２７１Ｖ、Ｌ２７７Ｅ、Ｅ２８０Ａ、Ｅ２８０Ｌ、Ｈ２８１Ｒ、Ｈ２８１Ｑ、Ａ２８２Ｖ、Ｑ２８３Ｒ、Ｄ２８４Ｌ、Ｄ２８４Ｒ、Ｉ２８５Ｌ、Ｉ２８６Ｍ、Ｒ２８７Ｅ、Ｒ２８７Ｄ、Ｒ２９２Ｋ、Ｒ２９２Ｔ、Ｑ２９６Ａ、Ｑ２９６Ｅ、Ｈ２９８Ｖ、Ｌ３０２Ｓ、Ｌ３０７Ｑ、Ｆ３０８Ｓ、Ｄ３０９Ａ、Ａ３１１Ｐ、Ａ３１４Ｖ、Ｌ３１７Ｆ、Ｓ３１９Ｑ、Ｓ３１９Ｐ、Ｓ３１９Ｒ、Ｓ３２１Ａ、Ｓ３２１Ｔ、Ｔ３２３Ａ、Ｐ３２５Ａ、Ａ３２６Ｐを含む群から選択される少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドは、配列番号３２から６９の群から選択される下記のアミノ酸モチーフのうちの少なくとも１つを含有することを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドは、少なくとも１つの位置で少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含有しており、保存的アミノ酸置換はＧからＡ；またはＡからＧ、Ｓ；またはＶからＩ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｓ；またはＩからＶ、Ｌ、Ｍ；またはＬからＩ、Ｍ、Ｖ；またはＭからＬ、Ｉ、Ｖ；またはＰからＡ、Ｓ、Ｎ；またはＦからＹ、Ｗ、Ｈ；またはＹからＦ、Ｗ、Ｈ；またはＷからＹ、Ｆ、Ｈ；またはＲからＫ、Ｅ、Ｄ；またはＫからＲ、Ｅ、Ｄ；またはＨからＱ、Ｎ、Ｓ；またはＤからＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｑ；またはＥからＱ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎ；またはＳからＴ、Ａ；またはＴからＳ、Ｖ、Ａ；またはＣからＳ、Ｔ、Ａ；またはＮからＤ、Ｑ、Ｈ、Ｓ；またはＱからＥ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｒへの置換から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドであって、ポリペプチドはゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解する特性を有し、ヌクレオチド配列は請求項１から５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドをコードする、および／またはヌクレオチド配列は配列番号１６から３１の群から選択されるヌクレオチド配列との少なくとも７０％の配列同一度を有する、および／またはヌクレオチド配列は中等度のストリンジェンシー条件下で配列番号１６から３１の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列および／または少なくとも２００ヌクレオチド、特に少なくとも１００ヌクレオチドを備えるこれらの部分配列および／またはヌクレオチド配列もしくはこの部分配列の相補的ストランドを用いるとハイブリダイズすることを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解する添加物であって、添加物は配列番号１から１５の群から選択される１つのアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはこれらの機能的変異体を含有し、機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間の配列同一性は少なくとも４０％になり、および補助物質もまた存在することを特徴とする添加物。
【請求項１４】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドがその中に含有されていることを特徴とする、請求項１３に記載の添加物。
【請求項１５】
補助物質は、少なくとも１種の不活性担体ならびに場合により追加の成分、例えばビタミン類および／またはミネラル類および／または酵素類および／またはマイコトキシン類を解毒するための追加の成分から選択されることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の添加物。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチドは、添加物中に多くとも１０，０００Ｕ／ｇ、好ましくは多くとも１，０００Ｕ／ｇ、より好ましくは多くとも１００Ｕ／ｇおよび最も好ましくは多くとも１０Ｕ／ｇの濃度で存在することを特徴とする、請求項１３、１４または１５に記載の添加物。
【請求項１７】
添加物は、カプセル形またはコーティング形で存在することを特徴とする、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の添加物。
【請求項１８】
特にブタ、家禽類もしくは水産養殖のための飼料製品または食品中のゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するための請求項１３から１７のいずれか一項に記載の添加物の使用。
【請求項１９】
ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するための方法であって、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体は、配列番号１から１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を有するポリペプチドによって加水分解され、機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間の配列同一性は少なくとも４０％になることを特徴とする方法。
【請求項２０】
ポリペプチドは、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の添加物中で使用されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドまたは添加物は、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体で汚染された食品または動物飼料製品と混合され、汚染された食品または動物飼料製品は水分と接触させられ、およびポリペプチドまたは添加物は、汚染された食品または動物飼料製品中に含有されるゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％が加水分解されることを特徴とする、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するためのポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドならびにこのようなポリペプチドを含有する添加物ならびにこのようなポリペプチドの使用ならびにゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシン類は、糸状菌によって生成される二次代謝産物である。マイコトキシン類の重要な代表は、以前はＦ−２トキシンとして公知であった、様々なフザリウム菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｎｇｉ）により生成される、世界中で見出すことができるゼアラレノン（ＺＥＮ）である。これらの真菌類は、栽培植物、特に例えば様々な種類の穀物を侵襲するが、真菌侵襲は、通例は真菌の増殖および／またはマイコトキシン生成が貯蔵までに発生する可能性がある場合には収穫前に発生する、または貯蔵に先行して、もしくは不適切な貯蔵条件下のいずれかでは収穫後にさえ発生することがある。ＦＡＯ（食糧農業機関）は、世界中の農産物の２５％がマイコトキシン類で汚染されるために、実質的な経済的損害が生じると推定している。近年完了したある国際的試験では、計２３，７８１例のサンプルが２００９年１月から２０１１年１２月にかけて分析されたが、検査の結果、これらのうち８１％が少なくとも１種のマイコトキシンに対して陽性、４５％がＺＥＮに対して陽性であった。ＺＥＮは、世界中の全ての領域ならびに試験した全てのタイプの穀物および飼料作物、例えばトウモロコシ、大豆粉、小麦、ふすま、ＤＤＧＳ（トウモロコシ蒸留かす）ならびに最終動物用飼料混合物中において１００％までの発生率で見出されている。
【０００３】
ＺＥＮは、下記の構造式：
【０００４】
【化１】
2019088287.tif 000003
を備える、ポリケチド代謝経路によって合成される非ステロイド性エストロゲン性大環状ラクトンであり、ＩＵＰＡＣ命名法によるこれの名称は、（２Ｅ，１１Ｓ）−１５，１７−ジヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１８），２，１４，１６−テトラエン−７，１３−ジオンである。
【０００５】
しかし、天然には様々なＺＥＮ誘導体もまた発生し、ＺＥＮの酵素的または化学的修飾によって形成される可能性がある。例には、グリコシドＺＥＮコンジュゲートまたは真菌、植物もしくは哺乳動物代謝によって形成される硫酸塩を含有するＺＥＮ誘導体ならびに特にヒトもしくは動物生体内で形成されたＺＥＮ代謝産物が含まれる。以下では、ＺＥＮ誘導体は、自然に発生する、または化学もしくは生化学合成によって合成されるＺＥＮコンジュゲートもしくはＺＥＮ代謝産物、特にα−ゼアラレノール（α−ＺＥＬ；（２Ｅ，７Ｒ，１１Ｓ）−７，１５，１７−トリヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ−［１２．４．０］−オクタデカ−１（１８），２，１４，１６−テトラエン−１３−オン）、β−ゼアラレノール（β−ＺＥＬ；（２Ｅ，７Ｓ，１１Ｓ）−７，１５，１７−トリヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１８），２，１４，１６−テトラエン−１３−オン）、α−ゼアララノール（α−ＺＡＬ；（７Ｒ，１１Ｓ）−７，１５，１７−トリヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１８），１４，１６−トリエン−１３−オン）、β−ゼアララノール（β−ＺＡＬ；（７Ｓ，１１Ｓ）−７，１５，１７−トリヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１４），１５，１７−トリエン−１３−オン）、ゼアラレノン１４−スルフェート（Ｚ１４Ｓ；［（２Ｅ，１１Ｓ）−１５−ヒドロキシ−１１−メチル−７，１３−ジオキソ−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１８），２，１４，１６−テトラエン−１７−イル］ハイドロジェンスルフェート）、ゼアラレノン−１４−グリコシド（Ｚ１４Ｇ；（２Ｅ，１１Ｓ）−１５−ヒドロキシ−１１−メチル−１７−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロピラン−２−イル］オキシ−１２−オキサビシクロ［１２．４．０］オクタデカ−１（１８）２，１４，１６−テトラエン−７，１３−ジオン）ならびにゼアララノン（ＺＡＮ；（１１Ｓ）−１５，１７−ジヒドロキシ−１１−メチル−１２−オキサビシクロ−［１２．４．０］−オクタデカ−１（１８），１４，１６−トリエン−７，１３−ジオン）であると理解される。
【０００６】
ＺＥＮならびにＺＥＮ誘導体、特にα−ＺＥＬ、β−ＺＥＬ、Ｚ１４Ｓ、α−ＺＡＬ、β−ＺＡＬ、Ｚ１４ＧおよびＺＡＮは、高度の化学的および物理的安定性を有するために、さらに加工食品および動物飼料製品、例えばパンもしくはビール中でも検出することができる。
【０００７】
ＺＥＮはエストロゲン受容体に結合し、ホルモン崩壊を引き起こすことがあり、経口摂取後には即時に吸収され、動物によって２つの立体異性代謝産物であるα−ＺＥＬおよび／またはβ−ＺＥＬに変換される可能性がある。例えば、α−ＺＥＬだけではなくα−ＺＡＬおよび／またはＺＡＮもまたＺＥＮよりはるかに強度のエストロゲン性作用を有する。他方で、共役ＺＥＮ誘導体は、ＺＥＮより低いエストロゲン活性を有するが、ＺＥＮは一部の状況下では消化管内でこれらのＺＥＮ誘導体から再び放出される可能性がある。
【０００８】
ＺＥＮの急性毒性は相当に低く、経口ＬＤ５０は２０，０００ｍｇ／ｋｇ（体重）までであるが、動物またはヒトにおいて長期曝露に伴って亜急性および／または亜慢性毒性作用、例えば催奇形性、発癌性、エストロゲン性および免疫抑制作用を発生させることがある。ＺＥＮに汚染された食品は哺乳類動物における発達障害を引き起こし、ブタ、特にコブタは、ＺＥＮに対して極めて高感受性である。食品中の０．５ｐｐｍを超えるＺＥＮ濃度は発達障害を生じさせ、例えばブタにおける１．５ｐｐｍを越える濃度は高エストロゲン血症を生じさせる可能性があり、濃度が１２ｐｐｍのＺＥＮはウシにおける自然流産の原因とされている。ゼアラレノンは、粘膜、特に胃粘膜ならびに口腔粘膜を通して迅速に吸収されるので、即時の定量的非活性化が必須である。ＺＥＮは、経口投与の３０分後でさえ血中で検出できる。この場合には、単離酵素の使用は微生物に関する幾つかの利点、例えばより高い比活性またはより迅速な作用を提供する。ＺＥＮには有害な作用があるために、欧州連合には、拘束力のある食料品中のＺＥＮの上限ならびに動物飼料製品中のＺＥＮの上限についての勧告が存在する（ＥＣ  Ｎｏ．１８８１／２００６）。
【０００９】
食品および動物飼料製品のＺＥＮ汚染を減少させるための主要な戦略は、例えば、「農業生産工程管理（ＧＡＰ）」を遵守することにより真菌の増殖を制限することである。これには、特に、種子への害虫や真菌の侵襲を生じさせない、または農業廃棄物を農地から直ちに取り除くことを保証することが含まれる。さらに、農地での真菌増殖は、殺菌剤を使用することによって減少させることができる。収穫後、収穫された物質は、真菌増殖を予防するために１５％未満の残留湿気レベルおよび低温で貯蔵されなければならない。同様に、真菌侵襲によって汚染された物質は、この後の加工処理の前に除去されなければならない。対策リストがあるにもかかわらず、Ｉ．Ｒｏｄｒｉｇｅｓ  ａｎｄ  Ｋ．Ｎａｅｈｒｅｒ（２０１２）は、例えば２００９年から２０１１年における米合衆国や中央ヨーロッパなどの最高の農産物規格を備える地域においてさえ、検査されたトウモロコシサンプルの各々２９％および３９％がＺＥＮで汚染されていたと報告している。
【００１０】
食料品または動物飼料製品からＺＥＮを除去するための追加の可能性には、マイコトキシンの吸着および／または形質転換が含まれる。これは、マイコトキシンの吸着剤への結合が広範囲のｐＨにわたって強力および特異的であり、消化管内で安定性のままでいることを必要とする。一部の非生物学的吸着剤、例えば活性炭およびシリケートまたはコレスチラミンなどの合成ポリマーはアフラトキシン類に対しては効率的に使用できるが、他のマイコトキシン類に対するこれらの使用は制限される。吸着剤の主要な欠点は、一部の場合には栄養摂取のために不可欠である他の分子の非特異的結合である。酵母または酵母抽出物などの生物学的吸着剤についても文献に記載されてきたが、非生物学的吸着剤と同様の制限を有する。
【００１１】
物理的および化学的処置によるＺＥＮの解毒もまた制限される。ＺＥＮは熱処理によっては効果的に不活性化できないが、ＺＥＮ含量は、酸化剤を用いて、例えば１０％過酸化水素溶液を用いて８０℃で１６時間にわたる抽出および処置によって８３．９％減少させることができる。食料品および動物飼料製品の製造中における抽出法およびオゾンまたは過酸化水素などの酸化剤の使用は、高額の費用、品質低下ならびに場合によっては低効率および低特異性のために制限される。
【００１２】
例えばトリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、グリオクラディウム・ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）もしくはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株などの微生物および／またはこれらから単離された酵素、例えばヒドロラーゼまたはペルオキシダーゼなどによるＺＥＮの生体内変化は、例えば、Ｅ．Ｖｅｋｉｒｕ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２０１０，７６，７，２３５３−２３５９によって記載されている。
【００１３】
ＥＰ０９３８５７５Ｂ１は、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）もしくはノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の細菌、特にＲ．グロベルルス（Ｒ．ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）およびＮ．グロベルラ（Ｎ．ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）のＺＥＮ分解特性について記載している。
【００１４】
ＷＯ０２／０７６２０５は、触媒三残基によってＺＥＮの分解を触媒する、α，β−ヒドロラーゼおよびゼアラレノンヒドロラーゼ１（ＺＨＤ１）を含む、グリオクラジウム・ロゼウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）から単離された酵素のＺＥＮ分解作用について記載している。
【００１５】
ＷＯ２０１２／１１３８２７は、組換えゾナーゼ類、つまりＺＥＮを分解し、消化管内で安定性のままでいる酵素について開示している。これらには、例えばサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄｉａ  ｆｕｓｃａ）、ストレプトマイセス・エクスフォリエート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ）、アシドボランス・デラフィエルディイ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）および特にストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの微生物が含まれる。
【００１６】
ＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体を加水分解できるポリペプチドまたは酵素もまた、ゾナーゼ類と指名されてよい。
【００１７】
以下で使用する用語は、専門用語から取り出されており、各々は、この反対のことが指示されない限り伝統的な意味で使用される。そこで、例えば、用語「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さならびに例えば調節エレメント、構造エレメント、遺伝子、プラスミド、全ゲノムおよびこれらのフラグメントの群を含む、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ分子などの配列の全てのタイプの遺伝子物質に関する。「ポリペプチド」の用語には、例えば、５００個までのアミノ酸を備える酵素、抗体ならびにポリペプチドなどのタンパク質、例えば、ペプチド阻害剤、例えばアミノ酸１０個未満の短い配列長を備えるタンパク質もしくは同様に短鎖ポリペプチドのドメイン、例えば受容体、リガンド、ペプチドホルモン、タグなどが含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける用語「位置」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列内の単一の特定の塩基またはアミノ酸に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許第０９３８５７５号明細書
【特許文献２】国際公開第２００２／０７６２０５号
【特許文献３】国際公開第２０１２／１１３８２７号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】ＥＣ  Ｎｏ．１８８１／２００６
【非特許文献２】Ｅ．Ｖｅｋｉｒｕ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．，２０１０，７６，７，２３５３−２３５９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
そこで本発明の１つの課題は、これを用いるとＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体を加水分解ＺＥＮおよび／または加水分解ＺＥＮ誘導体へ迅速および確実に転換させることが可能になるポリペプチドを利用可能にすることである。この課題を解決するために、本発明は本質的に、このポリペプチドが配列番号１から１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を備えるヒドロラーゼであって、機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間に少なくとも７０％の配列同一性があるヒドロラーゼであることを特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明による用語「配列同一性」は百分率で表す配列同一性に関する。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列については、配列同一性は視覚的に決定できるが、好ましくはコンピュータプラグラムによって計算する。配列比較は、さらにまた配列セグメント内で実施されるが、このセグメントは参照配列の連続配列であると理解され、好ましくは配列の保存領域を含む。
【００２２】
本明細書の場合、配列同一性は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴ＝Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｇｉｃ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、特にポリペプチドに対してはＢＬＡＳＴＰおよびポリヌクレオチドに対してはＢＬＡＳＴＮを用いて決定したが、これらはＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）のホームページ上で利用可能である（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。そこで、２つ以上の配列をＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）のアルゴリズムに従って相互に比較することができる。本発明のこの課題のためには、このプログラムを２０１３年５月１５日バージョンで使用した。プログラム設定として基本設定を、詳細には、アミノ酸配列比較のためには：「ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」＝１００；「ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」＝１０；「ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ」＝３；「ｍａｔｒｉｘ」＝ＢＬＯＳＯＭ６２；「ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ」＝「ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」；「ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」＝「ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」ならびにヌクレオチド配列比較のためにはｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１；ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ：１０；ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝５、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝２；ｆｉｌｔｅｒ＝ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ；ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｓｃｏｒｅｓ：２−３；ｆｉｌｔｅｒ  ｓｔｒｉｎｇ：Ｌ；ｍを使用した。
【００２３】
用語「機能的ポリペプチド変異体」または「機能的変異体」は、まずポリペプチドの「対立遺伝子変異体」およびポリペプチドの「機能的フラグメント」に、次にポリペプチドの「修飾」に関するが、このとき酵素機能は本質的に変化しないままである。用語「対立遺伝子変異体」は、ヌクレオチド配列内において天然型突然変異によって形成され、およびアミノ酸配列内で１つの変化を誘発するポリペプチドであって、これの酵素機能が影響を受けていないポリペプチドに関する。「修飾」は、例えば、ポリペプチドもしくは変異ポリペプチドを備えるＣまたはＮ末端融合であってよいが、このとき突然変異は少なくとも１個のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって、詳細には特定部位突然変異誘発、即ちランダム変異導入法、組み換えおよび／または任意の他のタンパク質工学法によって入手できる。用語「置換」、「挿入」および「欠失」は、本明細書では、当業者が習熟している遺伝子工学における一般的な意味で使用される。用語「機能性フラグメント」は、ポリペプチドの一部もしくは部分配列またはこの機能的変異体の一部および／または部分配列を意味しており、酵素機能は本質的に保持される。酵素機能は特に酵素反応機序が変化しないままの場合に保持される。つまり、マイコトキシンは同一場所で加水分解され、比残留活性「機能的変異体」は、元のポリペプチドに基づいて少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、特に少なくとも１０％、および特に少なくとも５０％になる。配列番号１から１５を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチドは、相互および同一酵素いずれかの機能的対立遺伝子変異体であり、これらの配列は異なる微生物を起源とする。これは、配列同一性率によって測定される相互の密接な関係ならびに全ポリペプチドがＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体に同一分解機序によって作用するという事実から著明に認識できる。
【００２４】
配列番号１から１５を備えるポリペプチドのアミノ酸配列には相互に類似性があるために、これらのポリペプチドの１つの機能的変異体は、配列番号１から１５を有する特許請求されたポリペプチドの２つ以上と少なくとも４０％の配列同一性を有する可能性がある。
【００２５】
このようなアミノ酸配列またはこれの機能的変異体を選択することにより、ＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体の驚くべき迅速および完全な加水分解が検出されている。
【００２６】
本発明の好ましいまた別の実施形態に対応するように、このポリペプチドは、少なくとも１つの保存アミノ酸配列セグメントもしくはこの機能的変異体を含有する１つのアミノ酸配列を有しており、このアミノ酸配列セグメントの機能的変異体は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも９２％および最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有しており、少なくとも１つの保存アミノ酸配列セグメントは、配列番号１を有する配列のアミノ酸配列＋２４から＋５０、＋５２から＋７７、＋７９から＋８７、＋８９から＋１４５、＋１５０から＋１７１、＋１７７から＋１９３、＋２２３から＋２２８、＋２３０から＋２３７、＋２３９から＋２４７、＋２４９から＋２５５、＋２５７から＋２６１、＋２６３から＋２７０、＋２７２から＋２７９、＋２９７から＋３０１、＋３０３から＋３１３、＋２４から３２８、＋１から＋３２８の群から選択される。少なくとも１つのこのような保存アミノ酸配列セグメントが存在するために、さらにＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体の迅速および完全な加水分解に加えて、以前に公知のＺＥＮを分解するポリペプチドと比較して特に高い活性値も有するポリペプチドを利用できるようにすることが可能になる。
【００２７】
同等に優れた結果は、本発明のまた別の機能的実施形態によって、機能的変異体が１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および挿入の群から選択された少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する場合に達成されている。
【００２８】
ポリペプチドが少なくとも０．０１Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも０．１Ｕ／ｍｇ、特に少なくとも１Ｕ／ｍｇの比活性；および／または多くとも５０μＭ、好ましくは多くとも３．５μＭ、特に多くとも０．５μＭのＺＥＮの加水分解のＫＭ値；および／または少なくとも０．０５ｓ−１、好ましくは少なくとも０．６ｓ−１、特に少なくとも５ｓ−１のＺＥＮの加水分解のｋｃａｔ値；および／または少なくとも０．００００１μＭ−１ｓ−１、好ましくは少なくとも０．０００１μＭ−１ｓ−１、特に少なくとも０．００１μＭ−１ｓ−１のＺＥＮの加水分解のｖｍａｘ値を有する方法で本発明をさらに実施することによって、ＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体は、特に迅速および完全に加水分解することができ、特に解毒される。
【００２９】
さらに、ポリペプチドは、配列番号２、５から７、９、１１、１２および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を含有していてよいが、この機能的変異体は、少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％のアミノ酸同一性を有し、ｐＨ５．０でのポリペプチドのｐＨ安定性は少なくとも１５％、好ましくは５０％および特に好ましくは９０％になる。この方法で、このポリペプチドがゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を、例えば、哺乳動物の胃などの酸性媒質中でさえ分解および／または解毒するのを保証することができる。ポリペプチドのｐＨ安定性は、本明細書では、各最適ｐＨでの活性に比較してパーセンテージで表した、ｐＨ５．０でのポリペプチドの残留活性である。
【００３０】
本発明のまた別の実施形態によると、ポリペプチドは、配列番号１、２、５から７、９、１１および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体であって、少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有している機能的変異体を含有してよく、従って、このポリペプチドは３０℃から７５℃、好ましくは３８℃から５５℃、特に好ましくは３８℃から５２℃の温度範囲内で最高酵素活性を有する。この種類のまた別の実施形態によって、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体はさらに中等温度好性の温度でさえ、特にヒトおよび家畜の体温でさえポリペプチドによって加水分解および／または解毒されることが保証される。ポリペプチドが最高酵素活性を有する温度は、ポリペプチドの最適温度と規定されている。
【００３１】
本発明のまた別の実施形態によると、ポリペプチドは、配列番号１、５、６、９、１１、１２および１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体であって、これらのアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも４０％の配列同一性を有する機能的変異体を有しており、このポリペプチドは９０℃、好ましくは７５℃、および特に好ましくは６０℃の温度まで熱的に安定性である。これは、ポリペプチドおよびこの酵素機能が、例えば容器に入れた輸送中または供給材料のペレット成形中に発生する可能性のある高温ストレス下でさえ本質的に無傷のままであることを保証する。ポリペプチドの熱安定性は、１５分間の予備インキュベーション後に、ポリペプチドが各最適温度での活性と比較して５０％の残留活性を有する温度であると規定されている。
【００３２】
ポリペプチドは、ゼアラレノンおよび／またはＺＥＮ誘導体のエステル基の酸素非依存性および補因子非含有加水分解のために好適なα，β−ヒドロラーゼであって、加水分解を触媒して、セリン、グルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸およびヒスチジンからなるアミノ酸三残基、ならびに配列番号１に比較した位置が示されている触媒三残基、例えばＳ１２８、Ｄ２６４およびＨ３０３を有するα，β−ヒドロラーゼを有するように選択されてよい。
【００３３】
ＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体の加水分解は、下記の反応機序によってゼアラレノンまたはこの誘導体のエステル基上で配列番号１から１５のポリペプチドのいずれかを用いると成功する。
【００３４】
【化２】
2019088287.tif 000004
【００３５】
非毒性加水分解ゼアラレノン（ＨＺＥＮ）および／または加水分解ＺＥＮ誘導体を形成するためのＺＥＮの加水分解は、本発明によるポリペプチド、特にα，β−ヒドロラーゼによって発生する。ＨＺＥＮから脱カルボキシル化加水分解ＺＥＮ（ＤＨＺＥＮ）および／または脱カルボキシル化加水分解ＺＥＮ誘導体へのこの後の脱カルボキシル化は、通常は自然に発生する。
【００３６】
特に、上記の触媒三残基によって、ＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体を完全に加水分解することが可能であるが、このとき分解反応は、特に酸性範囲内にあるｐＨで良好なｐＨ安定化作用を有する。
【００３７】
驚くべきことに、上記の触媒三残基のセリンの前の３個のアミノ酸およびセリンの後の３個のアミノ酸からなる配列セグメント内にＹ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄから選択される少なくとも１個の極性アミノ酸ならびにＦ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｐから選択される少なくとも１個の非極性アミノ酸を含有するポリペプチドを用いると一様に良好な結果を達成することが可能であること、およびさらに少なくとも１つの酵素動態パラメータを改良することが可能であることが見出されている。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは以下の位置：２２、２３、２５、２６、２７、２９、３１、３２、３５、３７、４２、４３、４６、５１、５３、５４、５７、６０、６９、７２、７３、７８、８０、８４、８８、９５、９７、９９、１１４、１１８、１１９、１２３、１３２、１４１、１４６、１４８、１４９、１５４、１６３、１６４、１６５、１６９、１７０、１７２、１７６、１８０、１８２、１８３、１９０、１９１、１９４、１９６、１９７、１９８、２０１、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１２、２１３、２１４、２１６、２１７、２２０、２２１、２２２、２２９、２３１、２３３、２３８、２４０、２４４、２４５、２４６、２４８、２４９、２５１、２５４、２５６、２６０、２６２、２６３、２６６、２６９、２７１、２７７、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２９２、２９６、２９８、３０２、３０７、３０８、３０９、３１１、３１４、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５および３２６のうちの少なくとも１つにおいて配列番号１に比較してアミノ酸配列の少なくとも１つの突然変異を有する。これらの位置は、配列番号１を備えるポリペプチドと特に活性でこの配列との高度の同一性を有する配列番号２から６を有するポリペプチドとの配列相違に由来する。配列番号１を備えるポリペプチドがこれらの位置の少なくとも１つで修飾されると、配列番号２から６のアミノ酸変異体はこの位置に取って代われるので、これらの位置がポリペプチドの酵素動態パラメータに重大な影響を及ぼすこと、および配列番号１とさらに高度の配列同一性を有する配列番号２から６との組み合わせもまたより高い活性を生じさせることを証明することができる。
【００３９】
本発明の１つの実施形態によると、このポリペプチドは、アミノ酸配列において配列番号１と比較して：Ｄ２２Ａ、Ｓ２３Ｑ、Ｓ２３Ｌ、Ｎ２５Ｄ、Ｉ２６Ｖ、Ｆ２７Ｙ、Ｆ２７Ｈ、Ｓ２９Ｐ、Ｒ３１Ａ、Ｆ３２Ｙ、Ｒ３５Ｋ、Ｒ３５Ｑ、Ｖ３７Ａ、Ｖ４２Ｉ、Ｖ４３Ｔ、Ｆ４６Ｙ、Ｓ５１Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｄ５３Ｇ、Ｎ５４Ｍ、Ｎ５４Ｒ、Ｌ５７Ｖ、Ｌ６０Ｉ、Ｓ６９Ｇ、Ｐ７２Ｅ、Ｖ７３Ａ、Ａ７８Ｓ、Ｎ８０Ｈ、Ｆ８４Ｙ、Ｉ８８Ｌ、Ｔ９５Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｒ９９Ｋ、Ｉ１１４Ｍ、Ｉ１１８Ｖ、Ｋ１１９Ｒ、Ｖ１２３Ｉ、Ｌ１３２Ｖ、Ａ１４１Ｓ、Ｉ１４６Ｖ、Ｉ１４６Ｌ、Ａ１４８Ｇ、Ａ１４９Ｖ、Ａ１５４Ｐ、Ｐ１６３Ｔ、Ａ１６４Ｔ、Ｙ１６５Ｃ、Ｙ１６５Ｈ、Ｖ１６９Ｉ、Ｌ１７０Ｒ、Ａ１７２Ｇ、Ａ１７６Ｍ、Ａ１７６Ｖ、Ｙ１８０Ｆ、Ｄ１８２Ｔ、Ｆ１８３Ｙ、Ｉ１９０Ｖ、Ｇ１９１Ｓ、Ｋ１９４Ｔ、Ｋ１９４Ｅ、Ｆ１９６Ｙ、Ｖ１９７Ｃ、Ｖ１９７Ｒ、Ｅ１９８Ｒ、Ｅ１９８Ｓ、Ｋ２０１Ｄ、Ｋ２０１Ｇ、Ｐ２０４Ｓ、Ｐ２０４Ａ、Ａ２０５Ｓ、Ｋ２０６Ｐ、Ａ２０７Ｍ、Ｍ２０８Ａ、Ｑ２０９Ｒ、Ｌ２１０Ａ、Ｌ２１０Ｓ、ΔＰ２１２、Ｔ２１３Ｖ、Ｐ２１４Ａ、Ｅ２１６Ｔ、Ｅ２１６Ｇ、Ａ２１７Ｉ、Ｎ２２０Ｈ、Ｌ２２１Ｍ、Ｋ２２２Ｒ、Ｋ２２２Ｑ、Ｇ２２９Ａ、Ａ２３１Ｖ、Ｆ２３３Ｗ、Ｆ２３３Ｙ、Ｆ２３３Ｈ、Ａ２３８Ｇ、Ｈ２４０Ｎ、Ｈ２４０Ｓ、Ｄ２４４Ｅ、Ｒ２４５Ｑ、Ｍ２４６Ｌ、Ｓ２４８Ｔ、Ｓ２４８Ｎ、Ｓ２４８Ｇ、Ｑ２４９Ｒ、Ｋ２５１Ｎ、Ｉ２５４Ｖ、Ｉ２５６Ｌ、Ａ２６０Ｍ、Ｔ２６２Ｄ、Ｔ２６２Ｇ、Ｉ２６３Ｔ、Ｅ２６６Ｄ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｎ、Ｌ２７１Ｖ、Ｌ２７７Ｅ、Ｅ２８０Ａ、Ｅ２８０Ｌ、Ｈ２８１Ｒ、Ｈ２８１Ｑ、Ａ２８２Ｖ、Ｑ２８３Ｒ、Ｄ２８４Ｌ、Ｄ２８４Ｒ、Ｉ２８５Ｌ、Ｉ２８６Ｍ、Ｒ２８７Ｅ、Ｒ２８７Ｄ、Ｒ２９２Ｋ、Ｒ２９２Ｔ、Ｑ２９６Ａ、Ｑ２９６Ｅ、Ｈ２９８Ｖ、Ｌ３０２Ｓ、Ｌ３０７Ｑ、Ｆ３０８Ｓ、Ｄ３０９Ａ、Ａ３１１Ｐ、Ａ３１４Ｖ、Ｌ３１７Ｆ、Ｓ３１９Ｑ、Ｓ３１９Ｐ、Ｓ３１９Ｒ、Ｓ３２１Ａ、Ｓ３２１Ｔ、Ｔ３２３Ａ、Ｐ３２５Ａ、Ａ３２６Ｐを含む群から選択される少なくとも１つの突然変異を有する。このようなポリペプチドを用いると、特に解毒するために、短期間内にＺＥＮを完全に加水分解することが可能であり、このポリペプチドの比活性は、少なくとも６．００Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも７．００Ｕ／ｍｇ、特に少なくとも８．００Ｕ／ｍｇになる。単位の「Ｕ」もしくはさらに「単位」は、絶対触媒活性の尺度であり、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．２）中の３２℃で１μｍｏｌのＺＥＮ／分の加水分解によって規定され、この「触媒活性」は規定の反応条件下での基質の酵素的変換を意味し、および「比活性」は触媒活性とポリペプチド質量濃度（単位体積当たりの質量）の比率を意味すると理解されている。
【００４０】
ポリペプチドが、配列番号３２から５０を有する配列を備える下記のアミノ酸モチーフのうちの少なくとも１つがこの中に含まれるように具体化されると、少なくとも１７．００Ｕ／ｍｇ、好ましくは少なくとも８．００Ｕ／ｍｇの比活性を有するポリペプチドを利用可能にすることができる。驚くべきことに、配列番号５１から５８を有する配列を備える下記のアミノ酸モチーフのうちの少なくとも１つがこの中に含有されると、ポリペプチドの酵素活性は、例えば７個のアミノ酸を含有するモチーフと比較してさらに増加させられることが見出されている。配列番号５９から６９を有する配列を有する下記のアミノ酸モチーフのうちの少なくとも１つがこの中に含有されると、いっそう高い比活性が達成される。
【００４１】
最後に、本発明のまた別の実施形態によると、ポリペプチドは少なくとも１つの位置で少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含有しており、この保存的アミノ酸置換は、ＧからＡへ；またはＡからＧ、Ｓへ；またはＶからＩ、Ｌ、Ａ、Ｔ、Ｓへ；またはＩからＶ、Ｌ、Ｍへ；またはＬからＩ、Ｍ、Ｖへ；またはＭからＬ、Ｉ、Ｖへ；またはＰからＡ、Ｓ、Ｎへ；またはＦからＹ、Ｗ、Ｈへ；またはＹからＦ、Ｗ、Ｈへ；またはＷからＹ、Ｆ、Ｈへ；またはＲからＫ、Ｅ、Ｄへ；またはＫからＲ、Ｅ、Ｄへ；またはＨからＱ、Ｎ、Ｓへ；またはＤからＮ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｑへ；またはＥからＱ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｎへ；またはＳからＴ、Ａへ；またはＴからＳ、Ｖ、Ａへ；またはＣからＳ、Ｔ、Ａへ；またはＮからＤ、Ｑ、Ｈ、Ｓへ；またはＱからＥ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｒへの置換から選択され、この用語「保存的アミノ酸置換」は、当業者によって保存的である、つまり類似の特異性を有すると見なされる他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。このような特異性には、例えば、アミノ酸のサイズ、極性、疎水性、電荷もしくはｐＫｓ値が含まれる。保存的変異は、例えば、１個の酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸との、塩基性アミノ酸と別の塩基性アミノ酸との、または極性アミノ酸と別の極性アミノ酸との置換であると理解されている。
【００４２】
このような保存的アミノ酸置換を用いると、この比活性が親ポリペプチドと比較してほぼ同一であるが、好ましくは少なくとも０．１Ｕ／ｍｇ増加している機能的ポリペプチド変異体を生成することができる。
【００４３】
本発明のまた別の課題は、さらにこれを用いるとＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体の迅速および確実な加水分解のためのポリペプチドを合成することが可能である単離ポリヌクレオチドを利用可能にすることである。
【００４４】
この課題を解決するために、本発明は、単離ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得、ここで、このポリペプチドはゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解する特性を有する、およびこのヌクレオチド配列は本発明による少なくとも１つのポリペプチドをコードする、および／またはこのヌクレオチド配列は配列番号１６から３１の群から選択されるヌクレオチド配列との少なくとも７０％の配列同一度を有する、および／またはこのヌクレオチド配列は中等度のストリンジェンシー条件下で配列番号１６から３１の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列および／または少なくとも２００ヌクレオチド、特に少なくとも１００ヌクレオチドを備えるこれらの部分配列および／またはヌクレオチド配列もしくはこの部分配列の相補的ストランドを用いると加水分解することを特徴とする。
【００４５】
発現させるべきヌクレオチド配列、特にこれらのトリプレット（コドン）は、通例は宿主細胞に依存して変化させられるので、コドンバイアスは宿主細胞に従って最適化される。これは、８０％よりはるかに低い、さらに７０％よりも低い、または６０％より低い配列同一度を有するポリヌクレオチドさえ同一ポリペプチドをコードできるという事実を生じさせる。配列同一性度を決定するための配列比較はさらに配列セグメント内でも実施されなければならないが、このとき１つのセグメントは参照配列の連続配列であると理解すべきである。ヌクレオチド配列についての配列セグメントの長さは、通常は１５から６００である。
【００４６】
本発明の単離ヌクレオチド配列または配列セグメントを用いると、通例は少なくとも１５、３０または４０ヌクレオチドの長さを有する核酸プローブを生成することができる。典型的には、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンによって標識されているこのようなプローブを用いると、標準方法を使用することにより、ＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体を分解する特性を備えるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同定することができる。このような配列を同定するための出発材料として、例えば、個別微生物、ゲノムＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリ由来のＤＮＡ、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡを使用できる。
【００４７】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さを備えるヌクレオチド配列および／またはヌクレオチドプローブに対しては、中等度のストリンジェンシー条件は、０．３％のドデシル・スルフェートナトリウム（ＳＤＳ）、２００μｇ／ｍＬの断片化および変性サケ精子ＤＮＡならびに３５％のホルムアルデヒドを含有する５×のＮａＣｌ（ＳＰＥ、０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭのＥＤＴＡ）が用意されたＮａ−ＥＤＴＡバッファー中の４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションであると規定されており、この後に標準サザンブロット条件が続き、この担体材料は終了後に３回、５５℃で各々２×のナトリウムクロライド・シトレートバッファー（ＳＳＣ、３００ｍＭのＮａＣｌおよび３０ｍＭのトリナトリウム・シトレート、０．２％のＳＤＳ）を用いて１５分にわたり洗浄する。
【００４８】
１５から１００ヌクレオチドの長さを備えるヌクレオチド配列および／またはヌクレオチドプローブについては、中等度のストリンジェンシー条件は、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．６）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のデンハルト液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、１ｍＭのナトリウム・ピロホスフェート、１ｍＭのナトリウム・ジハイドロジェンホスフェート、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．２ｍｇ／ｍＬの酵母ＲＮＡからなるバッファー中でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションであると規定されているが、このときプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは計算融点（Ｔｍ）より５℃から１０℃低い温度で実施され、ＴｍはＢｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，４８：１３９０）による計算によって決定される。これに続いて、実験は標準サザンブロット条件下で継続する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。担体材料は、最後に１５分間にわたり０．１％のＳＤＳを含有する６×のＳＣＣバッファー［ｓｉｃ；ＳＳＣ  ｂｕｆｆｅｒ］を用いて１回、および１５分間にわたり計算Ｔｍより下の５℃から１０℃で各々６×ＳＳＣバッファーを用いて２回洗浄する。
【００４９】
本発明のさらにもう一つの課題は、これを用いると規定もしくは複合マトリックス中、例えば食品または動物飼料製品中においてＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体の迅速および確実な加水分解を達成することが可能である添加物を利用可能にすることである。
【００５０】
この課題を解決するために、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解する添加物であって、この添加物は配列番号１から１５から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を有する少なくとも１つのポリペプチドを含有し、この機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間の配列同一性は少なくとも７０％になり、および補助物質もまた存在する添加物が利用可能である。
【００５１】
このような添加物を用いると、ＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体から加水分解ＺＥＮおよび／または加水分解ＺＥＮ誘導体への生化学的変換が可能である。この添加物はさらにまた、例えば、工業的方法においてＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体の立体選択的加水分解のためにも使用できる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、添加物は、補助物質が少なくとも１種の不活性担体ならびに場合により追加の成分、例えばビタミン類および／またはミネラル類および／または酵素類および／またはマイコトキシン類を解毒するための追加の成分から選択されるように具体化される。例えば食品および動物飼料製品中にこのような添加物を使用することによって、存在する可能性がある任意の量のＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体が確実に加水分解される、特にこの食品または動物飼料製品を消費する対象の生体に有害な影響を及ぼさない程度まで解毒されることを保証することが可能である。
【００５３】
ここで本発明によるポリペプチドは、さらに本発明による少なくとも１つのポリペプチドに追加して少なくとも１種の酵素、例えばタンパク質の分解に参加するプロテアーゼ、またはデンプンもしくは繊維もしくは脂肪もしくはグリコーゲンの代謝において役割を果たす酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼもしくはグルカナーゼならびに例えばヒドロラーゼ、脂肪分解酵素、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、フィターゼ、キシラナーゼおよび／またはこれらの組み合わせを追加して含有する酵素調製物中にも存在してよい。
【００５４】
本発明の追加の使用分野には、本発明の少なくとも１つのポリペプチドに加えて、さらにマイコトキシン類を解毒するための少なくとも１つの成分、例えばマイコトキシン分解酵素、例えばアフラトキシンオキシダーゼ、エルゴタミンヒドロラーゼ、エルゴタミンアミダーゼ、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、オクラトキシンアミダーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミノオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼおよび／または少なくとも１種のマイコトキシン分解微生物、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および／または少なくとも１種のマイコトキシン結合成分、例えば微生物細胞壁または無機物質、例えばベントナイトを含有する酵素調製物が含まれる。
【００５５】
本発明の１つの特に好ましい実施形態によると、このポリペプチドは、多くとも１０，０００Ｕ／ｇ、好ましくは多くとも１，０００Ｕ／ｇ、より好ましくは多くとも１００Ｕ／ｇおよび最も好ましくは多くとも１０Ｕ／ｇの濃度で存在するので、ＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体を迅速に変換させること、および特にこれらが被験者、特に汚染された食品または動物飼料製品を摂取する哺乳動物の身体によって既に吸収されてしまう前に、これらを非毒性または低毒性代謝産物、特にＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮに変換させることが可能である。
【００５６】
本発明の１つの実施形態によると、このポリペプチドは、カプセル形もしくはコーティング形で存在するが、このときＷＯ９２／１２６４５に記載された方法などの標準方法をカプセル封入またはコーティングのために使用できる。カプセル封入および／またはコーティングによって、ポリペプチドを全く変化させずに、特に分解もしくは損傷させずに使用部位へ運ぶことが可能なので、例えば保護シェルが動物の消化管内で溶解された後にのみ、ポリペプチドが作用し始め、従って、ＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体のより標的化された迅速および完全な分解を酸性プロテアーゼリッチおよび嫌気性媒質中でさえ達成することができる。さらに、カプセル封入またはコーティングによって添加物中のポリペプチドの熱安定性を増加させることもまた可能である。
【００５７】
本発明のまた別の課題は、特にブタ、家禽類および水産養殖のための動物飼料製品中、食品中またはトウモロコシ蒸留かす中のゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するための添加物の使用である。本発明による添加物を使用することによって、食品または動物飼料製品および／またはウモロコシ蒸留かす中に含有されるＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体を加水分解および／または解毒することが可能であり、このような解毒はおよそ１Ｕ／ｇ（汚染された食品または動物飼料製品）のポリペプチド濃度を用いた場合でさえ可能である。
【００５８】
本発明のまた別の課題は、さらにこれを用いるとＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体を迅速および確実に加水分解できる方法を利用可能にすることである。
【００５９】
この課題を解決するために、本方法は、配列番号１から１５の群から選択される１つのアミノ酸配列またはこれらの機能的変異体を有するゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体が加水分解されるような方法で実施されるが、この機能的変異体と少なくとも１つのアミノ酸配列との間の配列同一性は少なくとも４０％になる。
【００６０】
本発明の１つの実施形態によると、本方法は、この方法におけるポリペプチドが本発明に対応する添加物中で使用されるような方法で実施される。
【００６１】
また別の好ましい実施形態によると、本方法は、ポリペプチドまたはこの中の添加物がゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体で汚染された食品または動物飼料製品と混合され；汚染された食品または動物飼料製品は水分と接触させられ、およびポリペプチドまたは添加物は汚染された食品または動物飼料製品中に含有されるゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体を加水分解するような方法で実施される。水分を含む食品または動物飼料製品、例えばマッシュまたはスラリーの場合は、経口摂取される前に水分を含む食品または動物飼料製品中でゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体の加水分解が発生するであろう。本方法によって、ゼアラレノンおよびゼアラレノン誘導体がヒトおよび動物に及ぼす有害な作用の大部分が排除されることを保証できる。この場合の水分は、水または水性液の存在を意味し、これには例えば唾液または消化管中に存在する他の液体も含まれると理解される。消化管は、口腔、咽頭（のど）、食道および胃腸管またはこれらの同等物であると規定されているが、動物については用語が異なる場合がある、および／または個々の成分は動物の消化管内では存在しない場合がある。
【００６２】
本発明による方法は、さらにまた食品または動物飼料製品が経口摂取される前にペレット化されるような方法で実施されてもよい。
【００６３】
本発明の１つの実施形態によると、本方法は、ゼアラレノンおよび／または少なくとも１つのゼアラレノン誘導体の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％が加水分解されるように実施される。このため、例えば動物またはヒトにおける亜急性および／または慢性毒性作用、例えば催奇原性、発癌性、エストロゲン性および免疫抑制作用を抑制することができる。
【００６４】
以下では代表的な実施例ならびに図面に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】配列番号１を有するポリペプチドについての経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、図１Ａ内のポリペプチドはタグ付けされておらず、図１ＢではポリペプチドはＣ末端６×Ｈｉｓタグを有し、図１ＣではポリペプチドはＮ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図２】配列番号１を有するポリペプチドのミエハリス・メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）動態を示す図である。
【図３Ａ】配列番号１を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｂ】配列番号２を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｃ】配列番号５を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｄ】配列番号６を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｅ】配列番号７を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｆ】配列番号９を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｇ】配列番号１１を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｈ】配列番号１２を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【図３Ｉ】配列番号１５を有する精製ポリペプチドによる、経時的なＺＥＮの分解ならびに代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの増加を示す図であり、この配列はＣ末端６×Ｈｉｓタグを有する。
【実施例】
【００６６】
［実施例１］
ＺＥＮおよび／または少なくとも１つのＺＥＮ誘導体を加水分解できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾、クローニングおよび発現
アミノ酸の置換、挿入または欠失は、「急速変換部位特異的突然変異誘発キット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を取扱説明書に従って使用してＰＣＲによるヌクレオチド配列の突然変異によって実施した。代替物として、完全ヌクレオチド配列もまた取り寄せた（ＧｅｎｅＡｒｔ社）。ＰＣＲ突然変異誘発によって生成した、および／またはＧｅｎｅＡｒｔ社から取り寄せたヌクレオチド配列は、さらに場合によりアミノ酸レベルでＣまたはＮ末端６×Ｈｉｓタグを含有しており、標準方法によってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させるために発現ベクター内に組み込み、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で形質転換させ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させたが（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ，Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９４２９３，２００７；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、この作業のためには任意の他の好適な宿主細胞が使用されてもよい。
【００６７】
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで遺伝子を発現できるＤＮＡ構築物を意味する。特に、「発現ベクター」は、ヌクレオチド配列をコードするポリペプチドをそこでゲノム内に組み込むため、または染色体外腔内に自由に存在させるため、およびこのヌクレオチド配列をコードするポリペプチドを細胞内で発現させ、さらに場合により細胞からこのポリペプチドを取り除くために宿主細胞内に運搬するために好適なＤＮＡ構築物を意味する。
【００６８】
用語「宿主細胞」は、発現させるべきヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含有しており、本発明によるポリペプチドを合成できる全ての細胞を意味する。特に「宿主細胞」は、原核および／または真核細胞、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の胞子を含むと理解されている。
【００６９】
ポリペプチドの触媒活性を決定するために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合は可溶性細胞溶解物および／またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の場合は培養上清を使用した。ＫＭ値、ｖｍａｘ、ｋｃａｔおよび比活性を決定するために、ポリペプチドはニッケル−セファロースカラムの上方で標準方法によってクロマトグラフィーにより選択的に濃縮させた。タンパク質濃度の決定は、標準方法によって、ＢＣＡ法によって計算するか（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ＫｉｔＰｒｏｄ  ＃２３２２５）または好ましくはｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｅｒｖｅｒ，  ｉｎ  Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄ）：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５，ｐｐ．５７１−６０７）でのＰｒｏｔＰａｒａｍプログラムを用いてオンラインで入手される各タンパク質についての比減衰係数を用いる測光法のいずれかによって実施した。
【００７０】
［実施例２］
配列同一性および保存アミノ酸配列セグメントの決定
相互に比較しての配列番号１から１５を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチドの全ポリペプチド長に基づく配列同一性率の決定は（表１）、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、特に全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のホームページで使用可能なＢＬＡＳＴＰを用いて実施した。そこで、２つ以上の配列をＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９７），２５：３３８９−３４０２）のアルゴリズムに従って相互に比較することができる。プログラム設定としては基本設定を使用したが、詳細には：「ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」＝１００；ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」＝１０；「ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ」＝３；「ｍａｔｒｉｘ」＝ＢＬＯＳＯＭ６２；「ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ」＝「ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」；「ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」＝「ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」を使用した。
【００７１】
保存アミノ酸配列セグメントを決定するために、相互に少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号１から６を有するポリペプチドをＣＯＢＡＬＴソフトウエア（Ｊ．Ｓ．Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａｇａｒｗａｌａ，２００７，ＣＯＢＡＬＴ：Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ−Ｂａｓｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：１０７３−７９）を、標準パラメータ、特にパラメータ（「ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ」：−１１、−１；「ｅｎｄ−ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ」：−５、−１；「ｕｓｅ  ＲＰＳ  ＢＬＡＳＴ」：ｏｎ；「Ｂｌａｓｔ  Ｅ−ｖａｌｕｅ」：０．００３；「ｆｉｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｃｏｌｕｍｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｐｕｔｅ」：ｏｎ；「ｕｓｅ  ｑｕｅｒｙ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ」：ｏｎ；「ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ」：４；「ｍａｙ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅ」：０，８；「ａｌｐｈａｂｅｔ」：ｒｅｇｕｌａｒ；「ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｖｅｒｓａｔｉｏｎ  ｓｅｔｔｉｎｇ」：３ｂｉｔｓ）を用いて比較した。この解析の結果は保存アミノ酸を表す。少なくとも５個の連続保存アミノ酸の下記の範囲が、つまり配列番号１を有するセグメントに対する保存アミノ酸配列セグメントとして規定された：位置＋２４から位置＋５０のセグメントＡ、位置＋５２から位置＋７７のセグメントＢ、位置＋７９から位置＋８７のセグメントＣ、位置＋８９から位置＋１４５のセグメントＤ、位置＋１５０から位置＋１７１のセグメントＥ、位置＋１７７から位置＋１９３のセグメントＦ、位置＋２２３から位置＋２２８のセグメントＧ、位置＋２３０から位置＋２３７のセグメントＨ、位置＋２３９から位置＋２４７のセグメントＩ、位置＋２４９から位置＋２５５のセグメントＪ、位置＋２５７から位置＋２６１のセグメントＫ、位置＋２６３から位置＋２７０のセグメントＬ、位置＋２７２から位置＋２７９のセグメントＭ、位置＋２９７から位置＋３０１のセグメントＮおよび位置＋３０３から位置＋３１３のセグメントＯ。
【００７２】
ポリペプチドの相互の配列同一性率および配列番号１を有する配列の保存アミノ酸配列セグメントに比較した個別ポリペプチドの保存アミノ酸配列セグメントの配列同一性率の決定は上記のように実施した。結果は、表１および２に示した。
【００７３】
【表１】
2019088287.tif 000005
2019088287.tif 000006
2019088287.tif 000007
【００７４】
【表２】
2019088287.tif 000008
2019088287.tif 000009
2019088287.tif 000010
【００７５】
［実施例３］
ポリペプチドによる細胞溶解物中でのＺＥＮの加水分解
ポリペプチドがＺＥＮを非毒性もしくは低毒性代謝産物ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮに分解する能力を決定するために、配列番号１７を有するヌクレオチド配列によってコードされた配列番号１を備えるポリペプチドは実施例１に記載したようにこれ自体で、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＣ末端および／またはＮ末端６×Ｈｉｓタグを備えて合成した。配列番号１８から３１を有するヌクレオチド配列によりコードされた配列番号２から１５を有するアミノ酸配列を備えるポリペプチドは、Ｃ末端でのみ６×Ｈｉｓを用いて標識した。２．０から２．５の光学密度（ＯＤ  ６００ｎｍ）を有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養の１００ｍＬ部分を４℃で遠心分離により採取し、２０ｍＬのブルンナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）無機培地（ＤＳＭＺ微生物培地番号４６２、２０１２）中に再懸濁させた。細胞懸濁液は、フレンチ・プレス（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓ）を２０，０００ｐｓｉで用いて３回処理することにより溶解させた。生じた細胞溶解物は、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むブルンナー無機培地中で調製した１：１０、１：１００または１：１，０００希釈液中で調製した。ＺＥＮ分解実験のためには、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍＬの希釈細胞溶解物および３１μＬのＺＥＮ基質ストック液を含む９．９ｍＬのブルンナー無機培地を使用した。全体的に見ると、そこで細胞溶解物は１：１０００、１：１０，０００および／または１：１００，０００に希釈された。使用したＺＥＮ基質ストック液は、２．０８ｍＭのＺＥＮ溶液（４０体積％のＣＡＮ＋６０体積％のＨ２Ｏ）であった。この溶液を調製するために、結晶形にあるＺＥＮ（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ製のＢｉｏｐｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、製品番号００１１０９、純度は少なくとも９８％）を計量し、この後に溶解させた。各分解バッチは、２５ｍＬガラス製バイアル中で実施し、２５℃および１００ｒｐｍで撹拌しながら計１２０時間インキュベートした。０、０．５、１、２、５、２４、４７、７２および１２０時間後に、各時点に１ｍＬのサンプルを採取し、ポリペプチドを１０分間にわたり９９℃で不活性化し、−２０℃で貯蔵した。サンプルを解凍した後、不溶性成分は遠心分離により分離した。ＺＥＮ、ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。これを実施するために、代謝産物は２５０ｍｍ×３ｍｍの寸法および５μｍの粒径を有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）カラム上でのクロマトグラフィーにより、移動相として１ｍＬ／Ｌの濃度のギ酸を含むアセトニトリル水性混合液を使用して分離した。２７０ｎｍでのＵＶシグナルは、イオン化源としてエレクトロスプレー電離線（ＥＳＩ）を使用して記録した。ＺＥＮ、ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮは、増強モードでＱＴｒａｐ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（トリプル四重極、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって定量した。遅くとも２４時間後には、いずれのバッチにおいても実質的量のＺＥＮはこれ以上検出できなかった。ＺＥＮの大部分、即ち８０％超はＨＺＥＮまたはＤＨＺＥＮに転換された。
【００７６】
図１は、経時的なＺＥＮの分解およびＨＺＥＮの増加ならびにタグ付けしていない１つの例としての１：１０，０００に希釈した細胞溶解物溶液についてのＤＨＺＥＮ（図１Ａ）、配列番号１を備えるＣ末端６×Ｈｉｓタグ付け（図１Ｂ）およびＮ末端６×Ｈｉｓタグ付け（図１Ｃ）ポリペプチドを示している。この図からは、１）実験開始直後に採取された最初のサンプル中（０時間後）ではもはやほとんど全くＺＥＮを検出できなかったことからＺＥＮの反応が直接的および完全に発生すること、および２）Ｃ末端またはＮ末端のどちらでもタグを取り付けた結果として明記できる活性の損失が発生しなかったことが明らかである。
【００７７】
［実施例４］
細胞溶解物中でのポリペプチドによるＺＥＮ誘導体の加水分解
ポリペプチドがＺＥＮに加えてＺＥＮ誘導体もまた非毒性および／または低毒性代謝産物に転換させる能力を決定するために、配列番号１から１５を有するポリペプチドを実施例３に記載したようにＣ末端Ｈｉｓタグを用いて調製し、配列番号１７から３１を有する配列を備える各合成ヌクレオチド配列を分解１５における細胞溶解物として使用した。
【００７８】
分解実験は、実施例３に記載したように実施したが、各ポリペプチドはα−ＺＥＬ、β−ＺＥＬ、α−ＺＡＬ、β−ＺＡＬ、Ｚ１４Ｇ、Ｚ１４ＳおよびＺＡＮから構成される群から選択された各ＺＥＮ誘導体を用いて試験した。細胞溶解物は１：１０，０００の総希釈率で使用した。２．０８ｍＭのＺＥＮ溶液（４０体積％のＣＡＮ＋６０体積％のＨ２Ｏ）の代わりに、等モルの、つまり２．０８ｍＭのＺＥＮ誘導体溶液を基質ストック液として使用した。α−ＺＥＬ、β−ＺＥＬ、α−ＺＡＬ、β−ＺＡＬおよびＺＡＮは、Ｓｉｇｍａ社から入手し、分析のための標準物質として使用した。Ｚ１４ＧおよびＺ１４Ｓは、Ｐ．Ｋｒｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７（Ｍｙｋｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，４，１８０−１８４）およびＭ．Ｓｕｌｙｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８９，１５０５−１５２３）によって記載されたような方法によって少なくとも９０％の純度で調製し、分析のための標準物質として使用した。実施例３と比較したまた別の相違は、サンプルが１回だけ、つまり２４時間後にだけ採取されたことである。分解実験中のＺＥＮ誘導体の濃度の低下は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量した。α−ＺＥＬ、β−ＺＥＬ、Ｚ１４ＧおよびＺ１４Ｓは、Ｍ．Ｓｕｌｙｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，４０８−４１６）の方法によって測定した；α−ＺＡＬ、β−ＺＡＬおよびＺＡＮは、Ｐ．Ｓｏｎｇｓｅｒｍａｓｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｊ．ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒ．，９７，１５５−１６１）の方法によって測定した。驚くべきことに、全分解実験において２４時間の培養後にはＺＥＮ誘導体の出発量の０から最大１３％しか存在しないことが見出された。
【００７９】
［実施例５］
ポリペプチドならびにこれらの変異体の比活性および酵素動態パラメータ
ポリペプチドおよびこれらの変異体の比活性は測光法により決定したが、このとき使用した全ポリペプチドはＣ末端６×Ｈｉｓタグを有していた。ポリペプチドおよび／またはこれらの変異体の調製、濃縮および精製は、実施例１に記載したように実施した。ＺＥＮからＨＺＥＮへの分解は、３１５ｎｍの波長での吸光度の減少に基づいて測定した。ＺＥＮおよびＨＺＥＮのモル吸光係数（ε）は実験により決定し、０．００７８８９５Ｌμｍｏｌ−１ｃｍ−１および０．００３０８５７Ｌμｍｏｌ−１ｃｍ−１となることが見出された。吸光係数は強度のｐＨ依存性を有するので、このため活性は必ず同一ｐＨで、および好ましくはさらに同一マトリックス内で正確に測定されなければならない。測定は、３２℃のＵＶ−ＶＩＳ光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ−２００１）において２００から２，５００ｎｍの波長範囲内で石英キュベット内の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．２）バッファー溶液中で実施した。
【００８０】
２．０８ｍＭのＺＥＮ溶液（４０体積％のＡＣＮ＋６０体積％のＨ２Ｏ）をＺＥＮ基質ストック液として使用した。この溶液を調製するために、結晶形にあるＺＥＮ（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ製のＢｉｏｐｕｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ、製品番号００１１０９、純度は少なくとも９８％）を計量し、この後に溶解させた。ＺＥＮ基質希釈液（０．７９μＭ、１．５７μＭ、２．３６μＭ、３．１４μＭ、４．７１μＭ、６．２８μＭ、７．８５μＭ、９．４２μＭ、１０．９９μＭ、１２．５６μＭ、１４．１３μＭ、１５．７１μＭ、１７．２８μＭおよび１８．８５μＭ）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．２）を用いて調製した。ポリペプチド溶液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．２）を使用しておよそ７０ｎｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。ＺＥＮ基質希釈液は、水浴中で３２℃へ予備加熱した。
【００８１】
各ＺＥＮ基質希釈液の１００μＬ部分を０．２μＬのポリペプチド溶液と混合し、吸光度を５分間にわたり測定し、この後すぐにポリペプチド溶液およびＺＥＮ基質希釈液の各組み合わせを少なくとも２回測定した。
【００８２】
ＺＥＮおよびＨＺＥＮの吸光係数を考慮に入れて、経時的な吸光度における勾配に基づいて各基質濃度について反応速度を計算した。
【００８３】
用語「ＫＭ値」もしくは「ミハエリス・メンテン定数」は、単位μＭもしくはｍＭの酵素親和性を説明するためのパラメータを意味するが、これらはＨ．Ｂｉｓｓｗａｎｇ（２００２，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ＩＳＢＮ  ３−５２７−３０３４３−Ｘ，ｐａｇｅ  １９）による線形ヘインズ（Ｈａｎｅｓ）プロットを用いて計算するが、このとき好ましくはこの目的でＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １２．０プログラムにおける関数「酵素動態、単一基質」が使用される。用語「酵素反応の触媒定数」もしくは「ｋｃａｔ値」は、ｓ−１で与えられ、好ましくはＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １２．０プログラムの「酵素動態、単一基質」関数を用いて計算されるポリペプチドおよび／または酵素の変換速度を説明するためのパラメータを意味する。「最大酵素率」もしくは「ｖｍａｘ値」はμＭ／ｓもしくはｍＭ／ｓの単位で与えられ、ＫＭ値を用いた類推によって線形ヘインズ（Ｈａｎｅｓ）プロットを用いて計算するが、このためには好ましくはＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １２．０プログラムの関数「酵素動態、単一基質」を使用する。
【００８４】
比活性は、以下の方程式：
【００８５】
【数１】
2019088287.tif 000011
（式中、１単位は３２℃の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液（ｐＨ＝８．２）中で１分当たり１μｍｏｌのＺＥＮの加水分解として規定されている。）によって使用するｖｍａｘおよび酵素濃度によって計算した。
【００８６】
下記に配列番号１を有するポリペプチドについての酵素パラメータＫＭ、ｖｍａｘ、ｋｃａｔおよび比活性を決定するための生データを示した。表３は、各ＺＥＮ基質濃度での反応速度を示し、図２は各ミエハリス・メントン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ）グラフを示し、表４は対応する酵素動態パラメータを示している。使用した酵素溶液は、６８ｎｇ／Ｌの濃度を有していた
【００８７】
【表３】
2019088287.tif 000012
2019088287.tif 000013
【００８８】
【表４】
2019088287.tif 000014
【００８９】
試験したポリペプチドの比活性は、配列番号１については８．２５Ｕ／ｍｇ、配列番号２については１０．５６Ｕ／ｍｇ、配列番号３については８．３６Ｕ／ｍｇ、配列番号４については８．３３Ｕ／ｍｇ、配列番号５については８．５６Ｕ／ｍｇ、配列番号６については９．９５Ｕ／ｍｇ、配列番号７については３．８３Ｕ／ｍｇ、配列番号８については２．５７Ｕ／ｍｇ、配列番号９については４．８７Ｕ／ｍｇ、配列番号１０については５．１２Ｕ／ｍｇ、配列番号１１については３．８８Ｕ／ｍｇ、配列番号１２については２．７８Ｕ／ｍｇ、配列番号１３については６．４３Ｕ／ｍｇ、配列番号１４については３．３３Ｕ／ｍｇおよび配列番号１５については７．７６Ｕ／ｍｇである。
【００９０】
試験したポリペプチド変異体の比活性は、表５および表６に列挙した。
【００９１】
【表５】
2019088287.tif 000015
2019088287.tif 000016
2019088287.tif 000017
2019088287.tif 000018
2019088287.tif 000019
2019088287.tif 000020
2019088287.tif 000021
2019088287.tif 000022
【００９２】
【表６】
2019088287.tif 000023
【００９３】
［実施例６］
汚染されたトウモロコシ中でのＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体の分解
複合マトリックス中および低ｐＨでポリペプチドが天然型ＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体を分解する能力を決定するために、汚染されたトウモロコシを配列番号１から６を有する様々な濃度のポリペプチドの１つと混合し、ＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体の分解を追跡した。
【００９４】
汚染されたトウモロコシを粉砕して分解実験において使用したが、このとき１バッチは１ｇの粉砕した汚染されたトウモロコシ、８．９ｍＬの１００ｍＭアセテートバッファー（ｐＨ４．０）および０．１ｍＬのポリペプチド溶液から構成した。濃縮および精製ポリペプチド溶液は、実施例５に記載したように調製し、これらを１０ｍＵ／ｍＬ、１００ｍＵ／ｍＬおよび／または１，０００ｍＵ／ｍＬの濃度へ希釈した。そこでこのバッチでは絶対量で１ｍＵ（＝１ｍＵ／ｇ（トウモロコシ））、１０ｍＵ（＝１０ｍＵ／ｇ（トウモロコシ））および／または１００ｍＵ（＝１００ｍＵ／ｇ（トウモロコシ））を使用した。各分解バッチは、２５ｍＬ中で実施し、３７℃および１００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。酵素を加える前および／または１時間のインキュベーション後、１ｍＬのサンプルを採取し、ポリペプチドを９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、サンプルを−２０℃で貯蔵した。サンプルを解凍した後、不溶性成分は遠心分離により分離した。ＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体の濃度は、Ｍ．Ｓｕｌｙｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９，１５０５−１５２３）によって記載されたようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定した。このトウモロコシ中のＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体の含量は、ＺＥＮについては２３８ｐｐｂ、α−ＺＥＬについては１５ｐｐｂ、β−ＺＥＬについては２３ｐｐｂ、Ｚ１４Ｇについては３２ｐｐｂおよびＺ１４Ｓについては８１ｐｐｂであった。表７は、分解実験におけるＺＥＮおよびＺＥＮ誘導体含量の減少率を示している。
【００９５】
【表７】
2019088287.tif 000024
【００９６】
［実施例７］
ＺＥＮおよび／またはＺＥＮ誘導体を加水分解するためのポリペプチドを含有する添加物
ＺＥＮを加水分解するための添加物を調製するために、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）によって発現した、配列番号１、２、６および１３を有するポリペプチドの発酵上清を精密濾過および限外濾過（排除限界：１０ｋＤａ）によって標準条件下で精製し、およそ９重量％の乾燥物質濃度まで濃縮した。これに続いて、これらのポリペプチド含有溶液は、スプレー乾燥機（Ｍｉｎｉ  Ｂ２９０、Ｂｕｅｃｈｉ製）内の標準条件下で乾燥粉末を形成するためにさらに処理した。これら４種の粉末は、この後にＺ１、Ｚ２、Ｚ６およびＺ１３と指名した。Ｚ１、Ｚ２、Ｚ６および／またはＺ１３は、さらにオーバーヘッド式攪拌機内で１重量％の添加物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ６および／またはＺ１３および９９重量％のベントナイトの比率でおよそ１μｍの平均粒径を有するベントナイトと混合した。生じた添加物は、添加物Ｚ１．Ｂ、Ｚ２．Ｂ、Ｚ６．ＢおよびＺ１３．Ｂと指定した。さらに、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ６およびＺ１３は、オーバーヘッド式撹拌器中でベントナイトおよびビタミン微量元素濃縮物と０．１重量％の添加物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ６および／またはＺ１３、０．９重量％のビタミン微量元素濃縮物および９９重量％のベントナイトの比率で混合した。生じた添加物は、添加物Ｚ１．ＢＶＳ、Ｚ２．ＢＶＳ、Ｚ６．ＢＶＳおよびＺ１３．ＢＶＳと指定した。１００ｇの添加物Ｚ１．ＢＶＳ、Ｚ２．ＢＶＳ、Ｚ６．ＢＶＳおよびＺ１３．ＢＶＳは、２００ｍｇの硫酸鉄、５０ｍｇの硫酸銅、１３０ｍｇの酸化亜鉛、１３０ｍｇの酸化マンガン、２．５５ｍｇの炭酸カルシウム、１６０ｍｇのビタミンＥ、６．５ｍｇのビタミンＫ３、６．５ｍｇのビタミンＢ１、１４ｍｇのビタミンＢ２、１５ｍｇのビタミンＢ６、０．１５ｍｇのビタミンＢ１２、１５０ｍｇのニコチン酸、３０ｍｇのパントテン酸および５．３ｍｇの葉酸を含有していた。
【００９７】
添加物は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．２）中で３０分間かけて抽出し、さらに同一バッファー中でさらに希釈したので、ポリペプチドの最終濃度はおよそ７０ｎｇ／ｍＬであった。
【００９８】
これに続いて、これらの溶液のゼアラレノン分解作用を実施例５に記載したように決定した。対応する活性は、Ｚ１については８．２３０Ｕ／ｇ、Ｚ２については９．３１０Ｕ／ｇ、Ｚ６については９．２１４Ｕ／ｇ、Ｚ１．Ｂについては８３Ｕ／ｇ、Ｚ２．Ｂについては９２Ｕ／ｇ、Ｚ２．Ｃについては９０Ｕ／ｇ、Ｚ１３．Ｂについては５７Ｕ／ｇ、Ｚ１．ＢＶＳについては８Ｕ／ｇ、Ｚ２．ＢＶＳについては９Ｕ／ｇ、Ｚ６．ＢＶＳについては９Ｕ／ｇおよびＺ１３．ＢＶＳ．については６Ｕ／ｇであった。
【００９９】
添加物Ｚ１、Ｚ２、Ｚ６、Ｚ１３、Ｚ１．Ｂ、Ｚ２．Ｂ、Ｚ６．Ｂ、Ｚ１３．Ｂ、Ｚ１．ＢＶＳ、Ｚ２．ＢＶＳ、Ｚ６．ＢＶＳおよびＺ１３．ＢＶＳがＺＥＮ誘導体であるα−ＺＥＬ、β−ＺＥＬ、α−ＺＡＬ、β−ＺＡＬ、Ｚ１４Ｇ、Ｚ１４ＳおよびＺＡＮを分解する能力は、実施例４に記載したように試験したが、１００μＬの細胞溶解物の代わりにおよそ７０ｎｇ／ｍＬのポリペプチド濃度を備える１００μＬのポリペプチド溶液を使用した。６時間インキュベートした後、未加水分解ＺＥＮ誘導体としては出発量の最大１５％しか存在しなかった。
【０１００】
［実施例８］
最適温度
配列番号１、２、５、６、７、９、１１、１２および１５を有するポリペプチドに最適な温度を決定するために、これらのポリペプチドは実施例１に記載したようにＣ末端６×Ｈｉｓタグを用いてクローニングし、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて精製した。予備実験では、ＺＥＮの完全変換を実験条件（３０℃で０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー（Ｔｅｏｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｎｈａｇｅｎ，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ２．０  ｔｏ  １２．０．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｚｔｓｃｈｒｆｔ，１９３８，２９９：４１６−４１９）（ｐＨ７．５））下で保証できる濃度を３時間の実験時間後に決定した。調製物は、最適温度を決定するために分解バッチにおいてこのように決定した濃度で使用した。実験はＰＣＲサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）内で２０℃±１０℃、４０℃±１０℃および必要であれば６０℃±１０℃℃（各範囲内の１０種の温度；温度はＰＣＲサイクラー内で事前に規定した。）で温度勾配関数を使用して実施した。これらのバッチのために、Ｔｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファーを対応する酵素濃度および０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ＋５ｐｐｍのＺＥＮと各最適ｐＨで混合した。酵素を添加していない０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｐｍのＺＥＮを用いるバッチを陰性コントロールとして使用した。０時間、０．５時間、１時間、２時間および３時間のインキュベーション時間後、１種のインキュベーション温度毎に１サンプルを採取し、９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、−２０℃で貯蔵した。解凍後、サンプルをＨＰＬＣバイアルへ移した。ＺＥＮ、ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮは、ＨＰＬＣ−ＤＡＤによって分析した。このように実施するために代謝産物は４．６ｍｍ×１５０ｍｍの寸法および５μｍの粒径を備えるＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑ  Ｃ１８カラム上でのクロマトグラフィーにより分離した。５ｍＭのアンモニウムアセテートを含むメタノール水混合液を移動相として使用した。２７４ｎｍでのＵＶシグナルを記録した。代謝産物は、同伴標準系列を含めることによって定量した。最適温度は、分解曲線について決定された勾配に基づいて決定したが、このとき最適温度は勾配が最大となる温度であると規定された。表８は、最適温度を示している。
【０１０１】
【表８】
2019088287.tif 000025
【０１０２】
［実施例９］
熱安定性
配列番号１、２、５、６、７、９、１１、１２および１５を備えるポリペプチドの熱安定性を決定するために、これらは実施例１に記載したようにＣ末端６×Ｈｉｓタグを用いてクローニングし、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて精製した。これらを次に各最適温度±１０℃で勾配関数を用いてＰＣＲサイクラー内でインキュベートした。０分後、１５分後、３０分後および６０分後に、１バッチ当たりおよび１つの温度当たり１サンプルを採取した。これらのプレイインキュベートしたサンプルは、次に分解実験において０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｐｍのＺＥＮを含む各最適ｐＨのＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー内で使用した。予備実験において、ＺＥＮの完全反応を３時間の実験期間後に実験条件（３０℃で０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー（ｐＨ７．５））下で完全な反応を保証できた濃度を各ポリペプチドについて決定した。これにより決定した各酵素濃度をバッチにおいて使用した。分解バッチを３０℃でインキュベートした。サンプル採取は、０時間、０．５時間、１時間、２時間および３時間のインキュベーション時間後に実施した。次に、ポリペプチドは９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、サンプルは−２０℃で貯蔵した。解凍後、サンプルをＨＰＬＣバイアルへ移し、実施例８に記載したようにＨＰＬＣ−ＤＡＤによって分析した。
【０１０３】
熱安定性は、ポリペプチドが１５分間のプレインキュベーション後の最適温度と比較して５０％残留活性を有する温度であると規定されている。活性の尺度として、分解曲線における勾配を使用する。温度安定性は、表９に示した。
【０１０４】
【表９】
2019088287.tif 000026
【０１０５】
［実施例１０］
最適ｐＨ
配列番号１、２、５、６、７、９、１１、１２および１５を有するポリペプチドの最適ｐＨを決定するために、これらは実施例１に記載したようにＣ末端６×Ｈｉｓタグを用いてクローニングし、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させて精製した。予備実験において、３時間の実験期間後に実験条件下でＺＥＮの完全な変換を保証できた濃度を各ポリペプチドについて決定した（３０℃で０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー（ｐＨ７．５））。各酵素濃度をこれらのバッチにおいて使用した。分解バッチは、３．０、４．０、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１１．０および１２．０のｐＨレベルでＳｔｅｎｈａｇｅｎバッファー中で実施した。０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｐｍのＺＥＮを用いる分解バッチのために、インキュベーションを３０℃で実施した。Ｔｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー中のバッチは、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｐｍのＺＥＮを用いてｐＨ３．０、ｐＨ７．０およびｐＨ１２．０で陰性コントロールとして使用した。サンプル採取は、０時間、０．５時間、１時間、２時間および３時間のインキュベーション時間後に実施した。次に、ポリペプチドを９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、サンプルは−２０℃で貯蔵した。解凍後、サンプルをＨＰＬＣバイアルへ移し、実施例８に記載したようにＨＰＬＣ−ＤＡＤによって分析した。最適ｐＨは分解曲線について見出された勾配に基づいて決定したが、このとき勾配が最大であったｐＨを最適ｐＨとして規定した。表１０は、最適ｐＨレベルを示している。
【０１０６】
【表１０】
2019088287.tif 000027
【０１０７】
［実施例１１］
ｐＨ５．０でのｐＨ安定性
ｐＨ安定性を決定するために、実施例１０からのポリペプチドはＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー（ｐＨ５．０）中および各最適ｐＨで１時間、２５℃でインキュベートした。これらのプレインキュベートしたサンプルは分解実験において、バッチにおいて０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｍのＺＥＮとともに各最適ｐＨにある１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中の最適ｐＨを決定するために使用された濃度と同一濃度の各ポリペプチド中で使用した。これらのバッチを各最適温度でインキュベートした。サンプル採取は、０時間、０．５時間、１時間、２時間および３時間のインキュベーション時間後に実施した。次に、ポリペプチドは９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、サンプルは−２０℃で貯蔵した。解凍後、サンプルをＨＰＬＣバイアルへ移し、実施例８に記載したようにＨＰＬＣ−ＤＡＤによって分析した。ｐＨ安定性は、本明細書では、各最適ｐＨでの活性に比較してパーセンテージで表したｐＨ５．０でのポリペプチドの残留活性として規定した。５．０についてのｐＨ安定性は、表１１に示した。
【０１０８】
【表１１】
2019088287.tif 000028
【０１０９】
［実施例１２］
ＺＥＮ分解実験
ＺＥＮからＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮへの分解は、配列番号１、２、５、６、７、９、１１、１２および１５を備えるポリペプチドについての１つの実施例として実施した。分解バッチは、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｐｐｍのＺＥＮを用いてＴｅｏｒｅｌｌ−Ｓｔｅｎｈａｇｅｎバッファー（ｐＨ７．５）中で実施した。分解バッチを３０℃でインキュベートした。サンプル採取は、０時間、０．５時間、１時間、２時間および３時間のインキュベーション時間後に実施した。次に、ポリペプチドは９９℃で１０分間かけて熱不活性化し、サンプルは−２０℃で貯蔵した。解凍後、サンプルをＨＰＬＣバイアルへ移し、実施例８に記載したようにＨＰＬＣ−ＤＡＤによって分析した。ポリペプチド濃度は、完全分解がおよそ３時間後に達成されるように選択した。図３は分解動態を示しているが、このときｙ軸はＺＥＮ、ＨＺＥＮおよびＤＨＺＥＮの濃度をマイクロモル毎リットル（μｍｏｌ／Ｌ）で示し、ｘ軸はインキュベーション時間を時間（ｈ）で示している。
【０１１０】
＊μＭはマイクロモルを意味し、単位μｍｏｌ／Ｌに対応する。
【図１】
2019088287.tif 000029
【図２】
2019088287.tif 000030
【図３Ａ】
2019088287.tif 000031
【図３Ｂ】
2019088287.tif 000032
【図３Ｃ】
2019088287.tif 000033
【図３Ｄ】
2019088287.tif 000034
【図３Ｅ】
2019088287.tif 000035
【図３Ｆ】
2019088287.tif 000036
【図３Ｇ】
2019088287.tif 000037
【図３Ｈ】
2019088287.tif 000038
【図３Ｉ】
2019088287.tif 000039
【配列表】
2019088287000001.app
【外国語明細書】
2019088287000001.pdf