(57)【要約】【課題】不死化されたヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を製造する。【解決手段】ｈＤＰＣをヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）の存在下で培養すると共に、ｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化ヒト毛乳頭細胞（human dermal papilla cells：ｈＤＰＣ）を製造する方法であって、ｈＤＰＣをヒト多血小板血漿（platelet rich plasma：ＰＲＰ）の存在下で培養すること、及び、ｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（telomere reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢ細胞特異的Moloneyマウス白血病ウイルス挿入領域１（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion region 1 ：ＢＭＩ１）遺伝子を導入することを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法で得られる不死化ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）。
【請求項３】
ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を増殖させながら培養する方法であって、ｈＤＰＣをヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）の存在下で培養することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化されたヒト毛乳頭細胞（human dermal papilla cells：ｈＤＰＣ）及びそれを製造する方法、並びにヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を増殖させながら培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛乳頭細胞（Dermal papilla cells：ＤＰＣ）は、毛包誘導活性を有し、毛包の再生及び成長に重要な役割を果たしている。しかし、ＤＰＣを培養すると、その毛包誘導活性及び増殖性は、種々の生物学的ストレスにより誘導される細胞老化によって急速に失われてしまう。このため、ＤＰＣを不死化することが求められている。
【０００３】
一般に、細胞を不死化する試みにおいて、テロメア逆転写酵素（telomere reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢ細胞特異的Moloneyマウス白血病ウイルス挿入領域１（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion region 1 ：ＢＭＩ１）遺伝子が注目されている。細胞にはテロメア長の監視機構が存在し、細胞老化はテロメアの短縮によって引き起こされるところ、ＴＥＲＴ遺伝子はテロメア長を維持する役割を有することが知られている。また、細胞停止にはＰ１６及びＰ２１という２種のタンパク質が重要な役割を果たしていることが知られているところ、ＢＭＩ１遺伝子はＰ１６を不活性化することにより細胞停止を回避すると考えられる。
【０００４】
こうした知見に基づき、Haga等は、各種のヒト細胞にＰ１６ＩＮＫ４ａ特異的短ヘアピンＲＮＡ及びＢＭＩ１遺伝子を導入し、Ｐ１６を阻害して細胞停止を回避すると共に、ヒトＴＥＲＴを導入し、テロメア長の短縮による細胞老化を回避することにより、染色体を不安定化することなく各種のヒト細胞を不死化できることを示した（非特許文献１：Haga et al., Cancer Sci., 2007, 98:147-154）。
【０００５】
本発明者等は、この知見をマウスＤＰＣに適用し、レンチウイルスベクターを用いてＴＥＲＴ及びＢＭＩ１遺伝子をマウス鼻毛ＤＰＣに導入することにより、不死化ＤＰＣを作製することに成功した。更に、得られた不死化ＤＰＣを、単離ケラチノサイトを用いた毛再構成アッセイに供した結果、インビボ（in vivo）で新たに毛包を誘導する作用を有することを明らかにした（非特許文献２：Kiso et al., 45th Annual ESDR (European Society for Dermatological Research) meeting, Rotterdam, The Netherlands, 9-12 September 2015）。
【０００６】
ヒトにおける毛髪再生分野等への適用を考慮し、ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）についても不死化することが求められている。しかし、ｈＤＰＣを培養下で増殖させることは極めて困難であり、不死化の試みはこれまで成功していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Haga et al., Cancer Sci., 2007, 98:147-154
【非特許文献２】Kiso et al., 45th Annual ESDR (European Society for Dermatological Research) meeting, Rotterdam, The Netherlands, 9-12 September 2015
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、不死化されたヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）及びその製造方法を提供すると共に、ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を増殖させながら培養する方法を提供するものである。
【０００９】
本発明の一側面は、不死化ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）を製造する方法であって、ｈＤＰＣをヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）の存在下で培養すること、及び、ｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明の別の側面は、前記製造方法により得られる不死化ＤＰＣに関する。
【００１１】
本発明の更に別の側面は、ｈＤＰＣを増殖させながら培養する方法であって、ｈＤＰＣをヒトＰＲＰの存在下で培養することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１において、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）のＲＴ−ＰＣＲの結果を示すゲルの写真である。
【００１３】
【図２】図２は、実施例１において、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）のウェスタンブロットの結果を示す膜の写真である。
【００１４】
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、実施例１において、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）の第１３継代時の細胞の例（図３（ａ））と、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）の第１４継代時の細胞の例（図３（ｂ））を示す写真である。
【００１５】
【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、実施例１において第２継代後及びＰＲＰ存在下での培養後、遺伝子導入前のｈＤＰＣの染色体検査の結果（図４（ａ））と、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入した後のｈＤＰＣの染色体検査の結果（図４（ｂ））を示す写真である。
【００１６】
【図５】図５は、実施例１の遺伝子導入後のｈＤＰＣ（遺伝子導入群）における、毛包誘導能に関連する遺伝子マーカーの発現レベルを、遺伝子を導入しないｈＤＰＣ（対照群）に対する相対値として示すグラフである。ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、及びＷＮＴ５Ａは、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて高い発現を示す遺伝子マーカーであり、ＤＫＫ１は、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて低い発現を示す遺伝子マーカーである。
【００１７】
【図６】図６は、参考例１において、ＰＲＰ含有培地で２２日間培養した後のｈＤＰＣの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００１９】
［１．概要］
本発明者等は、単離したｈＤＰＣを、ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）を加えた培地で培養することで、ｈＤＰＣを増殖させながら培養することが可能となるのを見いだした。更に、増殖させたｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入することにより、不死化ヒト毛乳頭細胞（ｈＤＰＣ）が製造できることを見いだした。
【００２０】
単離したｈＤＰＣを、Ｄ−ＭＥＭにウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor 2：ＦＧＦ２）を加えた従前の培地で培養した場合、増殖が停止してしまい、継代を行うことができない。これに対し、後述の実施例に詳述するように、ＦＢＳに代えてＰＲＰを加えた培地で培養した場合には、継代以後も増殖を続けた（後記［実施例１］（２）参照）。ここから、ＰＲＰを加えた培地でｈＤＰＣを培養することにより、ｈＤＰＣを増殖させながら培養することが可能となることが分かった。
【００２１】
但し、ＰＲＰを加えた培地でｈＤＰＣを培養した場合でも、遺伝子導入をせずにそのまま継代を続けたところ、第１０継代で増殖が止まった。そこで、第２継代後のｈＤＰＣにＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したところ、遺伝子導入後のｈＤＰＣは、第１０継代後も増殖を続けた。ここから、ＰＲＰを加えた培地でｈＤＰＣを培養すると共に、ｈＤＰＣにＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入することにより、ｈＤＰＣを不死化することが可能となることが分かった（後記［実施例１］（６）参照）。
【００２２】
ここで、細胞形態に着目すると、遺伝子導入せずに培養したｈＤＰＣでは、時間経過とともにより大きくなっていく傾向が見られたが、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１１遺伝子を導入したｈＤＰＣでは、培養初期のような大きさに保たれている細胞も見られ、更に一部では細胞が凝集する場面も見られた。ＤＰＣはもともと凝集した細胞集団であることから、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣは、ＤＰＣの特性を保持していることが示唆される（後記［実施例１］（６）参照）。
【００２３】
また、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、同遺伝子を導入しないｈＤＰＣ（対照群）とを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction：ＲＴ−ＰＣＲ）にて比較したところ、ＴＥＲＴ遺伝子に関しては、遺伝子導入群のみ遺伝子発現が見られ、対照群では遺伝子発現は見られなかった。一方、ＢＭＩ１遺伝子に関しては、対照群でも僅かに遺伝子発現が認められたが、遺伝子導入群の方がより遺伝子発現が増強していることが分かった（後記［実施例１］（４）参照）。
【００２４】
更に、ウェスタンブロットにてタンパク質発現を確認したところ、ＲＴ−ＰＣＲと同様の結果が得られた。ヒト毛乳頭細胞はもともとＢＭＩ１遺伝子を発現しており、タンパク質レベルでも発現が検出されることが分かった。また更に遺伝子導入することで、ＢＭＩ１タンパク質の発現が増強した（後記［実施例１］（５）参照）。
【００２５】
一般に、細胞を不死化するには様々な方法が知られているが、ＳＶ４０等を使った細胞の不死化は染色体異常を起こしやすいとされている。しかし、遺伝子導入前後のｈＤＰＣの染色体を検査したところ、遺伝子導入前後の何れにおいても、染色体異常は見られなかった（後記［実施例１］（７）参照）。
【００２６】
また、遺伝子導入後のｈＤＰＣについて、毛包誘導能に関連する遺伝子マーカーの発現レベルを調べたところ、対照群と比較して、高発現が毛乳頭の活性維持を示す遺伝子マーカー（ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、及びＷＮＴ５Ａ）の発現が高く、低発現が毛乳頭の活性維持を示す遺伝子マーカー（ＤＫＫ１）の発現が低いことが分かった。従って、遺伝子導入後のｈＤＰＣは、高い毛包誘導能を有していることが示された（後記［実施例１］（８）参照）。
【００２７】
［２．不死化ｈＤＰＣを製造する方法］
以上の知見に基づき、本発明は、不死化ｈＤＰＣを製造する方法であって、ｈＤＰＣをヒトＰＲＰの存在下で培養すること、及び、ｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入することを含む方法（以下適宜「本発明の不死化方法」という）を提供する。
【００２８】
（２−１．定義）
本発明において「毛乳頭細胞」（dermal papilla cells：ＤＰＣ）とは、間葉系細胞として毛乳頭部（毛包の最底部）に位置し、毛細血管を通じて水分や栄養素、ホルモン、神経伝達物質等を受け取ると共に、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担う細胞をいう。「ヒト毛乳頭細胞」（human dermal papilla cells：ｈＤＰＣ）とは、ヒトに由来する毛乳頭細胞（ＤＰＣ）を意味する。
【００２９】
本発明において「プライマリー」（初期）細胞とは、生体組織から採取した後に細胞培養容器でごく限られた継代数（例えば５代以下、中でも４代以下、更には３代以下）だけ培養されて回収された初期の細胞である。中でも「初代」細胞とは、生体組織から採取した後に細胞培養容器で一度だけ培養されて回収された初期の細胞であり、「継代回数０（又は、第１世代）」の細胞ともいう。コンフルエント又はサブコンフルエントになった継代回数０の細胞を、当業者に公知の手法で継代操作することにより、増幅培養することが可能である。１度の継代操作により得られた細胞は、「継代回数１（又は、第２世代）」のｈＤＰＣという。継代操作数に対応して「継代回数２、３、４・・・ｎ（ｎ（整数）は継代回数）（第ｎ＋１世代）」と表現することができる。各継代操作の間に、細胞を凍結処理する工程が含まれていてもよい。
【００３０】
但し、プライマリー細胞から継代可能な回数は細胞種によって異なり、先に説明したようにｈＤＰＣの場合、ＰＲＰやＴＥＲＴ遺伝子・ＢＭＩ１遺伝子導入を用いない従来の培養法では、通常は第２継代を行うまで増殖させることは困難である。
【００３１】
本発明において「不死化」とは、プライマリー細胞の細胞分裂数の制限や細胞老化を解除し、連続的な細胞分裂能及び増殖能を付与することをいう。具体的には、制限されるものではないが、標準的な細胞培養条件下において、通常５継代以上、中でも６継代以上、好ましくは７継代以上、８継代以上、９継代以上、１０継代以上、１２継代以上、１５継代以上、２０継代以上、３０継代以上、更には５０継代以上の継代が可能となった状態をいうものとする。
【００３２】
（２−２．ｈＰＲＰ存在下でのｈＤＰＣの培養）
本発明の不死化方法では、ｈＤＰＣの培養に際し、ｈＰＲＰの存在下で培養を実施する。
【００３３】
本発明において「多血小板血漿」（platelet rich plasma：ＰＲＰ）とは、血液から得られる血漿であって、通常の血漿よりも血小板を多量に含む血漿を意味する。本発明において「ヒト多血小板血漿」（human platelet rich plasma：ｈＰＲＰ）とは、ヒト血漿に由来する多血小板血漿（ＰＲＰ）を意味する。本発明の不死化方法において、ｈＰＲＰはヒト血漿から調製したものでもよく、市販のものでもよい。ヒト血漿からｈＰＲＰを調製する手法は、例えばAmableらの論文（Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:67）等に記載されている。一方、市販のｈＰＲＰとしては、例えばPLTMax（登録商標）ヒト血小板溶解物（Human platelet lysate：ＨＰＬ）（メルクミリポア）等が挙げられる。
【００３４】
ＰＲＰはｈＤＰＣの培養期間全体に亘って存在していてもよいが、その一部の期間のみ存在していてもよい。例えば、プライマリーｈＤＰＣの培養開始時から培地にＰＲＰが存在していてもよく、プライマリーｈＤＰＣの培養途中、或いは第２継代又はそれ以上の継代後から培地にＰＲＰを加えてもよい。また、ＰＲＰを含む培地でｈＤＰＣを培養した後、更にＰＲＰを含まない培地で培養を行ってもよい。但し、不死化を行う細胞数を獲得する観点からは、通常６時間以上、中でも１２時間以上、１日以上、２日以上、更には４日以上、ＰＲＰの存在下で培養を行うことが好ましい。
【００３５】
培地中のＰＲＰの濃度は特に制限されないが、不死化の効果を得る観点からは、培地に対して通常１質量％以上、中でも２質量％以上、３質量％以上、更には５質量％以上のＰＲＰの存在下で、ｈＤＰＣの培養を行うことが好ましい。
その他のｈＤＰＣの培養条件は限定されず、従来公知の任意の培養方法を用いることができる。一般的なｈＤＰＣの培養条件は、例えばKiso et al. Journal of Dermatological Science 79 (2015) 110-118等に記載されている。
【００３６】
（２−３．ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子のｈＤＰＣへの導入）
本発明の不死化方法では、ｈＤＰＣにＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入する。また、細胞停止にはＰ１６及びＰ２１という２種のタンパク質が重要な役割を果たしていることが知られているところ、ＢＭＩ１はＰ１６を不活性化することにより細胞停止を回避すると考えられる。
【００３７】
本発明において「テロメア逆転写酵素」（ＴＥＲＴ）とは、テロメラーゼの構成要素となる逆転写酵素である。テロメラーゼは真核生物の染色体末端（テロメア）の特異的反復配列を伸長させる酵素であり、テロメア配列の鋳型となるＲＮＡと、テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、その他の制御サブユニットからなる複合体である。前述の通り、細胞にはテロメア長の監視機構が存在し、細胞老化はテロメアの短縮によって引き起こされるところ、ＴＥＲＴはテロメア長を維持する役割を有することが知られている。ヒトＴＥＲＴ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）は、GenBank（登録商標）にNM198253.2として登録されている。
【００３８】
本発明において「ＢＭＩ１遺伝子」とは、細胞質または核に局在するポリコーム抑制複合体１（polycomb repressive complex 1：ＰＲＣ１）の構成要素となる遺伝子である。前述の通り、細胞停止にはＰ１６及びＰ２１という２種のタンパク質が重要な役割を果たしていることが知られているところ、Ｂｍi１はＰ１６を不活性化することにより細胞停止を回避すると考えられる。ヒトＢＭＩ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）は、GenBank（登録商標）にNM005180.8として登録されている。
【００３９】
本発明の不死化方法において、ｈＤＰＣにＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入する手法は限定されず、従来公知の任意の導入法を用いることができる。導入法の例としては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の各種の組換ウイルスベクターを用いる方法が挙げられる。組換ウイルスベクターを用いたＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子の細胞への導入法は、例えばHaga et al., Cancer Sci., 2007, 98:147-154等に記載されている。遺伝子導入を確認する方法としては、従来公知のマーカー遺伝子を用いた選択等の手法を用いることができる。
【００４０】
（２−４．その他）
本発明の不死化方法において、ｈＤＰＣをヒトＰＲＰの存在下で培養する工程と、ｈＤＰＣにテロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入する工程との順序は任意である。即ち、ｈＤＰＣへの遺伝子導入前にヒトＰＲＰ存在下での培養を行ってもよく、ｈＤＰＣへの遺伝子導入後にヒトＰＲＰ存在下での培養を行ってもよく、ｈＤＰＣへの遺伝子導入前後にヒトＰＲＰ存在下での培養を行ってもよい。
【００４１】
［３．不死化ｈＤＰＣ］
以上説明した本発明の不死化方法によれば、不死化されたｈＤＰＣが得られる。斯かる不死化ｈＤＰＣは、プライマリーｈＤＰＣや通常の培養条件で培養されたｈＤＰＣとは異なり、培養下で増殖能を有し、繰り返し継代して培養することが可能である。また、生体のｈＤＰＣと比較しても、染色体に異常が生じることはない。更には、生体のｈＤＰＣと同様の毛包誘導作用を維持し、発毛及び育毛を促進する作用を有する。
【００４２】
なお、ｈＤＰＣが毛包誘導能を維持しているか否かは、毛包誘導能に関連する遺伝子マーカーの発現レベルを測定することにより検証することができる。斯かる遺伝子マーカーの例としては、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＤＫＫ１が挙げられる。これらのうち、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、及びＷＮＴ５Ａは、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて高い発現を示す。一方、ＤＫＫ１は、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて低い発現を示す。
【００４３】
［４．ｈＤＰＣを増殖させながら培養する方法］
また、本発明は、ｈＤＰＣを増殖させながら培養する方法であって、ｈＤＰＣをヒトＰＲＰの存在下で培養することを含む方法（以下適宜「本発明の培養方法」という）も提供する。
【００４４】
本発明の培養方法における用語の定義、培地へのＰＲＰ添加の条件、その他の培養条件等は、本発明の不死化方法について説明したとおりである。なお、培養開始時のｈＤＰＣの継代数は制限されないが、プライマリーｈＤＰＣであることが好ましい。
【００４５】
本発明の培養方法によれば、通常の培養方法では増殖させることが困難であったｈＤＰＣ、特にプライマリーｈＤＰＣを、増殖させながら培養することが可能となる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
【００４７】
［実施例１］
（１）ｈＤＰＣの調製：
ヒト頭部皮膚の個人手術材料から、実体顕微鏡下にて毛包を単離し、２６注射針を使用して毛球部を切断し、針の先端を使いヒト毛乳頭（hDP）を単離して、１０個以上のhDPを培養皿（TPP Techno Plastic Products）に接着させた。
【００４８】
（２）ｈＤＰＣの培養（１）：
前記（１）において単離されたｈＤＰを、以下の手順で培養した。
ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium：Ｄ−ＭＥＭ）低グルコース培地（和光純薬）に、１０％牛胎児血清、１０ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor 2：ＦＧＦ２）（Peprotech）、２０ｎｇ／ｍＬ 血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor-AA：ＰＤＧＦ−ＡＡ）（R&D Systems）、及び１％ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Penicillin-Streptomycin Solution：Ｐ／Ｓ）（和光純薬）を加えた培地で、ｈＤＰＣをまず２２日間培養した。その間、４日毎に培地交換を行った。
【００４９】
次に、Ｄ−ＭＥＭ低グルコース培地に１０％ 多血小板血漿（Platelet Rich Plasma：ＰＲＰ）及び１％ Ｐ／Ｓを加えた培地（ＰＲＰ含有培地）に変更し、４日間培養した。
【００５０】
培養皿で細胞がコンフルエントになったのを確認して、第１継代を実施した。継代は０．２５％ トリプシン（和光純薬）を加えて３７℃、３分間処理することにより、継代を実施した。その後、Ｄ−ＭＥＭに１０％ 牛胎児血清、１０ｎｇ／ｍＬ 塩基性線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor 2：ＦＧＦ２）（Peprotech）、及び２０ｎｇ／ｍＬ 血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor-AA：ＰＤＧＦ−ＡＡ）（R&D Systems）を加えた培地（ＰＲＰ不含有培地）に変更して、培養を継続した。
【００５１】
第１継代後、培養皿で細胞が再びコンフルエントになったのを確認して、前記と同様の手順で第２継代を実施した。
【００５２】
（３）遺伝子の調製及び導入：
以下の手順で遺伝子導入ベクターを調製し、前記（２）の第２継代後のｈＤＰＣに対して導入を行った。
【００５３】
ヒトテロメア逆転写酵素（telomere reverse transcriptase：ＴＥＲＴ）遺伝子のヌクレオチド配列情報（GenBank NM198253.2）に基づいて、以下のヌクレオチド配列を有するＰＣＲ用プライマー対を設計・作製した。このプライマー対を用い、ＰＣＲによってヒトゲノム中の当該遺伝子のタンパクコード領域を増幅した。
・センスプライマー：５’−ＧＴＡ ＣＧＴ ＴＡＡ ＣＧＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＴＣ−３’（配列番号３）
・アンチセンスプライマー：５’−ＡＴＧ ＡＧＧ ＴＣＧ ＡＣＧ ＴＣＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＴＣ−３’（配列番号４）
【００５４】
同様に、ヒトＢＭＩ１遺伝子のヌクレオチド配列情報（GenBank NM005180.8）に基づいて、以下のヌクレオチド配列を有するＰＣＲ用プライマー対を設計・作製した。このプライマー対を用い、ＰＣＲによってヒトゲノム中の当該遺伝子のタンパクコード領域を増幅した。
・センスプライマー：５’−ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＧ−３’（配列番号５）
・アンチセンスプライマー：５’−ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＣ−３’（配列番号６）
【００５５】
以上の手順で増幅されたヒトＴＥＲＴ遺伝子及びヒトＢＭＩ１遺伝子を２Ａペプチドで連結し、レンチウイルスベクタープラスミドであるpLVSIN-CMV Pur Vector（タカラバイオ）に常法で組み込むことにより、これらの遺伝子を担持するウイルスベクターを構築した。得られた遺伝子導入ベクターを、トランスフェクション用試薬であるLipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を用いてLenti-X 293T細胞（タカラバイオ）に導入し、機能解析用レンチウイルス発現システムであるVirapower Lentiviral Packaging Mix（Thermo Fisher Scientific）を用いてウイルスベクターを増幅した。
【００５６】
得られたウイルスベクターを含む培養上清を、第３継代後のｈＤＰＣに、４μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下で加え、１週間後にピューロマイシンによる薬剤選択を行った。薬剤選択により生存した細胞は、前記ウイルスベクターにより遺伝子が導入されたということができる。よって、生存細胞につき継代を継続した。
【００５７】
（４）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の確認：
第２継代後、前記（３）の手順でＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）について、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription polymerase chain reaction：ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、以下の手順により遺伝子の発現状況を確認した。
【００５８】
ヒト毛乳頭細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬）で２回洗浄後、ISOGEN（和光純薬）を用いてＲＮＡを回収した。ＲＮＡサンプルの濃度を２μｇ／μＬに調整し、Prime Script（タカラバイオ）、ランダムヘキサマー（タカラバイオ）、逆転写反応用オリゴｄＴプライマー（タカラバイオ）、及びリボヌクレアーゼ阻害剤（タカラバイオ）を使用し、マニュアルに従って逆転写を施行し、ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲは９８℃１０秒で変性、６２℃３０秒でアニーリング、７２℃、６０秒で合成、２５サイクル施行した。
【００５９】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すゲルの写真を図１に示す。ＴＥＲＴ遺伝子に関しては、遺伝子導入群のみ遺伝子発現が見られ、対照群では遺伝子発現は見られなかった。一方、ＢＭＩ１遺伝子に関しては、対照群でも僅かに遺伝子発現が認められるものの、遺伝子導入群において、遺伝子発現が増強していることが分かった。
【００６０】
（５）ウェスタンブロットによるタンパク質発現の確認：
第２継代後、前記（３）の手順でＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）について、ウェスタンブロットを用いて、以下の手順によりタンパク質の発現状況を確認した。
【００６１】
まず、以下の手順でＳＤＳサンプルを調製した。培養細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬）で二度洗浄し、ＲＩＰＡバッファー（和光純薬）１ｍＬを加え、細胞をスクレーパーで剥離した。得られた細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに移し、４℃、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を１．５ｍＬチューブに移した。移した細胞をＢＣＡアッセイキット（BioRad）にて調整し、タンパク質量を測定した。サンプルを１０００μｇ／ｍＬの濃度になるように調整した。また、TGXTM and TGX Stain-FreeTM Fastcast TM Acrylamide Kit and Starter Kit Instruction Manual（BioRad）を使用し、ゲルを作製した。サンプルに４×LaemｍＬi Sample Buffer（BioRad）を加え、９５℃で５分間処理した後、２０μＬ量をゲルにアプライし、１００Ｖの定電圧で３０分間の電気泳動を実施した。その後、ゲルをニトロセルロース膜（BioRad）に転写し、膜を１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて三度洗浄し、１％Casein Blockerを添加下１×ＴＢＳに室温にて１時間ブロッキングを施行した。その後、１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて３回洗い、抗ウサギＢＭＩ１モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology）を１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて１０００倍希釈、抗マウスＴＥＲＴモノクローナル抗体（SANTA CRUZ）を１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて１０００倍希釈し、４℃、７０ｒｐｍで４８時間処理を施行、１次抗体で処理した膜を１×ＴＢＳＴにて３回洗い、２次抗体を室温で６０分間反応させた。用いた２次抗体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase：ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて５０００倍希釈、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１×ＴＢＳＴ（BioRad）にて３０００倍希釈でそれぞれ使用した。２次抗体に反応させた膜を１×ＴＢＳＴにて３回洗い、ClarityTM Western ECL Substrate（BioRad）を使用し化学発光を室温で５分間行い、LAS4000mini（富士フイルム）にて観察した。
【００６２】
ウェスタンブロットの結果を示す膜の写真を図２に示す。結果は概ねＲＴ−ＰＣＲと同様であった。ＴＥＲＴ遺伝子に関しては、遺伝子導入群のみタンパク質の発現が見られ、対照群ではタンパク質の発現は見られなかった。一方、ＢＭＩ１遺伝子については、ヒト毛乳頭細胞はもともとＢＭＩ１遺伝子を発現しており、タンパク質レベルでも発現が検出されることが分かった。しかし、更に遺伝子を導入することで、ＢＭＩ１遺伝子発現タンパク質発現が増強することが分かった。
【００６３】
（６）ｈＤＰＣの培養（２）：
第２継代後、前記（３）の手順でＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）とを、Ｄ−ＭＥＭに１０％ 牛胎児血清及び１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２を加えた培地で更に培養した。培養皿で細胞がコンフルエントになったら、前記（２）と同様の手順で継代を実施した後、再びＤ−ＭＥＭに１０％ 牛胎児血清及び１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２を加えた培地で培養を継続した。
【００６４】
その結果、対照群のｈＤＰＣは、第１０継代で増殖が止まったのに対し、遺伝子導入群のｈＤＰＣは、第１０継代後も増殖を続けた。第１０継代で増殖が止まったものの継代を続けて第１３継代に至った対照群のｈＤＰＣの例を示す写真を図３（ａ）に、第１４継代時の遺伝子導入群のｈＤＰＣの例を示す写真を図３（ｂ）に示す。対照群のｈＤＰＣでは、ｈＤＰＣはより大きくなっていくが、遺伝子導入群のｈＤＰＣでは、培養初期のような大きさに保たれている細胞も見られ、更に一部では細胞が凝集する場面も見られた。
【００６５】
（７）染色体検査：
第２継代後、前記（３）の手順でＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）について、以下の手順により染色体の状況を確認した。
【００６６】
各群のｈＤＰＣを数回継代した後、２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ビオラモ）に７５００個／ｃｍ２で播種し、２日〜３日間培養した後、細胞が７０％〜８０％コンフルエントになった時点で、培地から血清や成長因子を除去しＤ−ＭＥＭのみとした。染色体検査は外部期間（ＢＭＬ）に委託して実施した。
【００６７】
遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）の第５継代時における染色体検査の結果を図４（ａ）に、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）の第１１継代時における染色体検査の結果を図４（ｂ）にそれぞれ示す。遺伝子導入の有無にかかわらず、何れのｈＤＰＣにおいても、染色体異常は見られなかった。
【００６８】
（８）毛包誘導能の検証：
前記（３）の手順でＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）と、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）について、以下の手順により毛包誘導能に関連するマーカーの発現レベルを測定し、その毛包誘導能を確認した。なお、遺伝子マーカーとしては、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、ＷＮＴ５Ａ、及びＤＫＫ１を測定対象とした。これらのうち、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、及びＷＮＴ５Ａは、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて高い発現を示す遺伝子マーカーであり、ＤＫＫ１は、逆に毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて低い発現を示す遺伝子マーカーである。
【００６９】
各群のｈＤＰＣを数回継代した後、遺伝子導入を行わなかったｈＤＰＣ（対照群）の第６継代時の細胞と、ＴＥＲＴ遺伝子及びＢＭＩ１遺伝子を導入したｈＤＰＣ（遺伝子導入群）の第７継代時の細胞のそれぞれについて、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン社製）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出・精製した。次に、得られた全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によってｃＤＮＡを合成した後、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、ＷＮＴ５Ａ、ＤＫＫ１、及びＧＡＰＤＨの各遺伝子マーカーについて、それぞれ対応するプライマーを用いた定量ＰＣＲを実施し、その発現レベルを測定した。
【００７０】
ここで、ＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、ＷＮＴ５Ａ、ＤＫＫ１、及びＧＡＰＤＨの各遺伝子マーカーの増幅に使用したプライマーの塩基配列を、以下の表に示す。
【表１】
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【００７１】
こうして定量ＰＣＲにより得られた各遺伝子マーカーの発現レベルの結果を、ＧＡＰＤＨの発現レベルで補正した。更に対照群における各遺伝子マーカーの発現レベルに対する、遺伝子導入群における各遺伝子マーカーの発現レベルの相対値を算出した。
【００７２】
得られた結果を図５のグラフに示す。本グラフの結果から明らかなように、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて高い発現を示す遺伝子マーカーＢＭＰ４、ＬＥＦ１、ＳＯＸ２、及びＷＮＴ５Ａは、遺伝子導入群のｈＤＰＣでは対照群と比べて相対的に高い発現レベルを示した一方、毛包誘導能を維持するｈＤＰＣにおいて低い発現を示す遺伝子マーカーＤＫＫ１は、遺伝子導入群のｈＤＰＣでは対照群と比べて相対的に低い発現レベルを示した。これらの結果から、遺伝子導入群のｈＤＰＣは、対照群と比べて高い毛包誘導能を有することが示された。
【００７３】
［参考例１］
前記［実施例１］（１）と同様の手順で調製したｈＤＰＣを、Ｄ−ＭＥＭ低グルコース培地（和光純薬）、５％ のPLTMax（登録商標）ヒト血小板溶解物（Human platelet lysate：ＨＰＬ）（メルクミリポア）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシン懸濁液（Penicillin-Streptomycin-Amphotericin Suspension：Ｐ／Ｓ／Ａ）（和光純薬）を加えた培地を用いたほかは、前記［実施例１］（２）と同様の手順で培養した。４日間毎に培地を新しいものに交換した。培養開始から１４日目の時点で培地中のＨＰＬの濃度を５％から１０％に変更した。培養開始から２７日間経過した時点で継代を行った。その後も同じ培地で培養し、４日から７日でサブコンフルエントになった時点で継代を実施した。その結果、ｈＤＰＣが増殖することを確認した。１４日間培養時点での細胞の写真を図６に示す。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、ｈＤＰＣを増殖させながら培養し、更には不死化することができることから、ヒトにおける毛髪等の研究や毛髪再生分野等への適用が期待され、その産業上の価値は高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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