(57)【要約】      （修正有）【課題】親水性基及び新油性基を有するリン酸脂質などからなり単層状又は多層状の小胞として組織されたリポソームを用い、医薬品、医薬部外品、化粧品などに配合され人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を、人体の外界との境界である表面、とりわけ皮膚を通じて体内に浸透し、より多く貯留することができるリポソーム製剤の提供。【解決手段】（Ａ）水酸基価から算出される平均重合度が２から２０のポリグリセリンと、（Ｂ）少なくとも１種のリン脂質成分と、（Ｃ）少なくとも１種の医薬品又は化粧品における有効成分を含有する医薬用又は化粧用のリポソーム製剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）水酸基価から算出される平均重合度が２から２０のポリグリセリンと、
（Ｂ）少なくとも１種のリン脂質成分と、
（Ｃ）少なくとも１種の医薬品又は化粧品における有効成分
を含有することを特徴とする医薬用又は化粧用のリポソーム製剤。
【請求項２】
前記リン脂質成分が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項３】
前記有効成分が、ビタミン及びその誘導体、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、鎮痒剤、抗酸化剤、保湿剤、美白剤、育毛剤、抗シワ剤、細胞賦活剤から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のリポソーム製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品などに含有され、人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を、人体の粘膜又は皮膚など外界との境界である表面を通じて体内に供給するリポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分は、他の化合物と配合され、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして処方や販売されているところ、人体の粘膜又は皮膚など外界との境界である表面を通じていかに体内に供与することができるかが重要視されている。
【０００３】
とりわけ、人体の皮膚は、大きく分類すると、外界との境界である表皮と、その表皮の内側に位置する真皮からなり、日常的に外界又は表皮の表面に存在する細菌、真菌、ウイルスなどにさらされている為にそのような人体にとって害をもたらす異物の侵入を防ぐバリア機能などを有するなど防御システムを具備しており、上記のような人体にとって有用な有効成分であったとしても、表皮を通じて真皮に浸透させることは容易ではない。
【０００４】
このため、上記の有効成分を、表皮を通じて真皮に浸透させるために、親水性基及び新油性基を有するリン酸脂質などからなり単層状又は多層状の小胞として組織されたリポソームを使用する方法が知られている。リポソームは、微粒子化が可能であると共に人体の細胞膜の構造と類似する構造を有する為に人体に馴染み易く、上記の有効成分を、表皮を通じて真皮に浸透させるために有力な手段である。
【０００５】
例えば、特許文献１には、所定量のグリセリンと、所定量のレシチンなどのリン脂質成分と、医薬品又は化粧品として有効な成分からなるリポソーム製剤が開示され、無害でエタノールのような刺激性の作用を及ぼすことないという効果を奏することが説明されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１２−５２０２４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されているリポソーム製剤では、グリセリンを配合することにより、形成されるリポソームの可撓性が向上し、その結果として皮膚深層中への有効成分の浸透力及び輸送力を増強する旨が記載されているが、グリセリンを配合したリポソームでは、それに配合され人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を皮膚の表皮を通じて真皮に十分に貯留することができず、それら有効成分を真皮へ浸透及び輸送して貯留させるためにさらなる改善が求められていた。
【０００８】
そこで、親水性基及び新油性基を有するリン酸脂質などからなり単層状又は多層状の小胞として組織されたリポソームを用い、医薬品、医薬部外品、化粧品などに配合され人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を、人体の外界との境界である表面、とりわけ皮膚を通じて体内に浸透し、より多く貯留することができるリポソーム製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
〔１〕すなわち、本発明は、（Ａ）水酸基価から算出される平均重合度が２から２０のポリグリセリンと、（Ｂ）少なくとも１種のリン脂質成分と、（Ｃ）少なくとも１種の医薬品又は化粧品における有効成分を含有することを特徴とする医薬用又は化粧用のリポソーム製剤である。
【００１０】
〔２〕そして、前記リン脂質成分が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記〔１〕に記載のリポソーム製剤である。
【００１１】
〔３〕そして前記有効成分が、ビタミン及びその誘導体、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、鎮痒剤、抗酸化剤、保湿剤、美白剤、育毛剤、抗シワ剤、細胞賦活剤から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記〔１〕又は前記〔２〕に記載のリポソーム製剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、親水性基及び新油性基を有するリン酸脂質などからなり単層状又は多層状の小胞として組織されたリポソームを用いて、医薬品、医薬部外品、化粧品などに配合され人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を、人体の外界との境界である表面、とりわけ皮膚を通じて体内に浸透し、より多く貯留することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】表皮及び真皮におけるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）の蓄積量を視覚的に示す図である。
【図２】表皮及び真皮におけるトコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）の蓄積量を視覚的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係るリポソーム製剤に関する実施の形態について、詳しく説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明を実施するに好ましい具体例であるから、技術的に種々の限定がなされているが、本発明は、以下の説明において特に発明を限定する旨が明記されていない限り、この形態に限定されるものではない。また、数値範囲を表す表記は上限と下限を含むものである。
【００１５】
本発明のリポソーム製剤は、所定量のポリグリセリン、所定量の少なくとも１種のリン脂質成分、少なくとも１種の医薬品又は化粧品における有効成分を含有するものである。
【００１６】
本発明の成分（Ａ）である水酸基価から算出した平均重合度２〜２０のポリグリセリンは、グリセリンやエピクロルヒドリンを原料とし、脱水縮合反応や付加反応等により得られた多価アルコールである。そして、水酸基価から算出した平均重合度２〜２０のポリグリセリンとしては、ジグリセリン、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリンなどが好ましく、さらに上記平均重合度２〜１５のポリグリセリンであることがより好ましい。水酸基価から算出した平均重合度が上記範囲のポリグリセリンを用いることにより、医薬品、医薬部外品、化粧品などに配合され人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有効成分を皮膚の真皮まで浸透させ貯留させることができる。また、上記ポリグリセリンは、それらの一種又は二種以上を用いることができる。さらに、本発明のリポソーム製剤を人体に用いるために、人体に対して毒性を有するエピクロルヒドリンを用いず、人体に対して安全性の高いグリセリンを用いてその脱水縮合により得られた上記ポリグリセリンを用いることが好ましい。
【００１７】
上記のポリグリセリンの平均重合度とは、水酸基価から算出したものであり、下記に示す式（ｉ）により算出する。また、式（ｉ）中の水酸基価は「基準油脂分析試験法」（日本油化学会制定）に準拠し測定する。具体的には、試料１ｇを無水酢酸・ピリジン溶液によりアセチル化する時、水酸基と結合した酢酸を中和するのに要する水酸化カリウム（ＫＯＨ）のｍｇ数で表され、下記の式（ｉｉ）で求められる。
平均重合度＝（１１２．２×１０３−１８×水酸基価）／（７４×水酸基価−５６．１×１０３）・・・（ｉ）
水酸基価＝（ａ−ｂ）×２８．０５／試料の採取量（ｇ）・・・（ｉｉ）
ａ：空試験による０．５Ｎ水酸化カリウム溶液の消費量（ｍｌ）
ｂ：本試験による０．５Ｎ水酸化カリウム溶液の消費量（ｍｌ）
【００１８】
成分（Ａ）の水酸基価から算出した平均重合度２〜２０のポリグリセリンは、上記のように合成したものを使用することができるが、市販品を使用することもできる。市販品としては、例えば、阪本薬品工業株式会社製のジグリセリンＳ、ポリグリセリン＃３１０、ポリグリセリン＃５００、ポリグリセリン＃７５０などを使用することができる。
【００１９】
そして、成分（Ａ）の水酸基価から算出した平均重合度２〜２０のポリグリセリンは、本発明のリポソーム製剤において、０．１〜５．０重量％配合されていることが好ましく、さらに、０．３〜４．５重量％配合されていることがより好ましい。上記ポリグリセリンが、上記の割合で配合されていることにより、単層状又は多層状のリポソームを形成するときにその形成を阻害することなく、安定したリポソームを形成することができ、上記有効成分を皮膚の表皮に留めることなく真皮まで浸透させ貯留させることができる。
【００２０】
本発明の成分（Ｂ）である少なくとも１種のリン脂質成分は、単層状又は多層状のリポソームを形成する基材である。そして、上記リン脂質成分としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２１】
そして、成分（Ｂ）である少なくとも１種のリン脂質成分は、本発明のリポソーム製剤において、４０〜９０重量％配合されていることが好ましく、さらに、５０〜８５重量％配合されていることがより好ましい。上記リン脂質が、上記の割合で配合されていることにより、安定した単層状又は多層状のリポソームを形成することができる。
【００２２】
本発明の成分（Ｃ）少なくとも１種の医薬品又は化粧品における有効成分は、人体の健康上において治癒又は改善をもたらす有用な化合物、又はその化合物を含有する製剤である。そして、上記有効成分としては、ビタミン及びその誘導体、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、鎮痒剤、抗酸化剤、保湿剤、美白剤、育毛剤、抗シワ剤、細胞賦活剤などが好ましい。また、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２３】
具体的には、ビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びビタミンＫなどの脂溶性ビタミンや、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ８、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２などのビタミンＢ群及びビタミンＣなどの水溶性ビタミンなどが好ましく、また、それらの誘導体も好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２４】
そして、抗炎症剤としては、クロベタゾールプロピオン酸エステル、ジフロラゾン酢酸エステル、モメタゾンフランカルボン酸エステル、ベタメゾン酪酸エステルプロピオン酸エステル、フルオシノニド、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル、ジフルプレドナート、アムシノニド、ジフルコルトロン吉草酸エステル、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、デプロドンプロピオン酸エステル、デキサメタゾンプロピオン酸エステル、デキサメタゾン吉草酸エステル、ベタメタゾン吉草酸エステル、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、フルオシノロナセトニド、プレドニゾロン吉草酸エステル酢酸エステル、トリアムシノロンアセトニド、フルメタゾンピバル酸エステル、アルクロメタゾンプロピオン酸エステル、クロベタゾン酪酸エステル、ヒドロコルチゾン酪酸エステル、デキサメタゾン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ホルモン剤や、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、ケトプロフェン、ピロキシカム、フェルビナク、ロキソプロフェンナトリウム水和物、スプロフェン、ベンダザック、ウフェナマート、イブプロフェンピコノール、ジメチルイソプロピルアズレン、グリチリルレチン酸などの非ステロイド剤や、アミノ安息香酸エステル、カンフル、酸化亜鉛、水酸化カルシウム、クロタミトンなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２５】
そして、抗菌剤としては、ビダラビン、アシクロビルなどの抗ウイルス剤、クロラムフェニコール、テトラサイクリン塩酸塩、フラジオマイシン硫酸塩、フシジン酸ナトリウム、ゲンタマイシン硫酸塩、クリンダマイシンリ酸エステル、ナジフロキサシンなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２６】
そして、抗真菌剤としては、トルナフタート、リラナフタート、クロトリマゾール、ミコナゾール硝酸塩、エコナゾール硝酸塩、イソコナゾール硝酸塩、スルコナゾール硝酸塩、オキシコナゾール硝酸塩、ビホナゾール、ネチコナゾール硝酸塩、ケトコナゾール、ラノコナゾール、ルリコナゾール、アロモルフィン硝酸塩、テルビナフィン硝酸塩、ブテナフィン硝酸塩、シクロピロクスオラミンなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２７】
そして、鎮痛剤としては、サリチル酸グリコール、サリチル酸メチル、アミノ安息香酸エステル、カンフルなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２８】
そして、鎮痒剤としては、アミノ安息香酸エステル、クロタミトンが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００２９】
そして、抗酸化剤としては、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸、α−トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、カテキン、クエルセチン、尿酸、ビルビリン、グルコース、フラボノイド、カロテノイド、ゼルロブラスミン、アルブミン、フェリチン、メタロトネイン、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンペルオキシターゼ、カタラーゼ、チオレドキシンなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３０】
そして、保湿剤としては、コラーゲン、ヒアルロン酸、セラミド、尿素、コンドロイチン硫酸ナトリウム、アミノ酸およびその塩などの保湿剤などが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３１】
そして、美白剤としては、ハイドロキノン、アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸、トラネキサム酸、ゲンチシン酸、アルブチン、プラセンタエキス、エラグ酸、コウジ酸、フェルラ酸、ルシノールなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３２】
そして、育毛剤としては、ミノキシジル、フィナステリド、セファランチン、センブリエキス、塩化カルプロニウムなどが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３３】
そして、抗シワ剤としては、レチノール、レチノイン酸などが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３４】
そして、細胞賦活剤としては、ＤＮＡ、プラセンタエキス、クロレラ抽出物などが好ましく、それらの一種又は二種以上を用いることができる。
【００３５】
そして、成分（Ｃ）である有効成分は、本発明のリポソーム製剤において、９．９〜５５．０重量％配合されていることが好ましく、さらに、１４．７〜４５．５重量％配合されていることがより好ましい。上記有効成分が、上記の割合で配合されていることにより、単層状又は多層状のリポソームを形成するときにその形成を阻害することなく、安定したリポソームを形成することができ、また、所望の効果を発現させながら過度の効果発現による薬害を生じさせない安定した効果を発現することができる。
【００３６】
一般的にリポソームを作成する方法としては、薄膜法、超音波法、逆相蒸発法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法、エクストルージョン法、エタノール注入法、脱水−再水和法などが用いられているが、これらの方法を２以上組み合わせて用いることもできる。本発明では、フラスコなどの容器内で少なくとも１種のリン脂質成分をアルコールなどの有機溶媒に溶解する工程、減圧下で加熱するなどして当該有機溶媒をほぼ完全に揮発させ除去する工程、残った薄膜に緩衝液を加えて攪拌しさらに超音波を照射する工程、そして、得られた懸濁液を微細孔に圧力をかけて通過させる工程を経て調整した。このようなリポソームの作成方法により、作成されたリポソームは、リン脂質成分が単層又は二重層を有する小胞状などとして形成され、表面が親水性化された構造となる。
【００３７】
また、皮膚の表面では皮脂と汗腺から排出される汗が混ざり皮脂膜を形成し外部からの刺激を防いでおり、健康な肌の皮脂膜はｐＨ４．５〜６．０の弱酸性に保たれているため、作成したリポソーム製剤を皮膚の表面に安定して接触させ、そのリポソーム製剤に含有されている上記有効成分を浸透させるために、そのリポソーム製剤を作成するときに電荷誘起剤を添加することができる。電荷誘起剤としては、親水基としてカルボン酸、スルホン酸、リン酸構造を持つ陰イオン界面活性剤が好ましい。具体的には、コール酸ナトリウム、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩などのカルボン酸型、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸ナトリウムなどのスルホン酸型、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウムなどの硫酸エステル型、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸カリウムなどのリン酸エステル型などが好ましい。
【００３８】
さらに、本発明のリポソーム製剤には、上記成分の他に、必要に応じて、メチルパラベンなどの防腐剤、ｌ−メントールなどの冷感剤、香料、色素などを配合することもできる。
【実施例】
【００３９】
〔実施例１〕
あらかじめ調整した、リポソームを形成する基材として大豆由来であるホスファチジルコリン（Soya phosphatidylcholine）１７．２ｍｇと、電荷誘起剤としてコール酸ナトリウム（sodium cholate）０．５９ｍｇ、そして、有効成分として、ビタミンＣ誘導体であるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）２．１８ｍｇとビタミンＥ誘導体であるトコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）０．７２ｍｇの量となるように、それぞれあらかじめ調整されたエタノール溶液を混合し（Soya PC/Sodium cholate/ VC-cetyl ether/Tocopherol acetateのモル比が80/5/20/6）、その後その混合液をロータリエバポレーターを用いて減圧下で４０℃の湯浴で加温してエタノールを留去した。そして、残った薄膜に０．１％エデト酸二ナトリウム（EDTA-2Na）、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）０．４ｍｇ、その緩衝液にジグリセリン０．１２ｍｇを添加した上でそれらを加えて撹拌し、バス型ソニケーターにて超音波処理を５分間行い、薄膜を懸濁させた。そして、押し出し機を用いて、前記の懸濁させた液を孔径１００ｎｍのポリカーボネートフィルターから押し出す操作を１０回行い、リポソーム製剤を作成した。
【００４０】
〔比較例１〕
ジグリセリン０．１２ｍｇの代わりに、グリセリン０．１２ｍｇを添加した以外は、実施例１と同様にリポソーム製剤を作成した。
【００４１】
〔比較例２〕
ジグリセリン０．１２ｍｇの代わりに添加剤を何も加えなかった以外は、実施例１と同様にリポソーム製剤を作成した。
【００４２】
実施例１及び比較例１〜２のリポソーム製剤を製剤における各成分の配合量の一覧を表１に示し、それらのリポソーム製剤に対する各成分の配合割合にて換算した一覧を表２に示す。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
【表２】
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【００４５】
＜透過性試験及び貯留性試験＞
実施例１及び比較例１〜２のリポソーム製剤を用いて、ビタミンＣ誘導体であるアスコルビン酸セチルエーテル及びビタミンＥ誘導体であるトコフェロール酢酸エステルの各有効成分が、皮膚の表皮及び真皮へ貯留する量を測定した。皮膚としては、皮膚科学研究で広く使用されており、ヒト皮膚組織構造に近いＹｕｃａｔａｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｉｇの皮膚（以下、ＹＭＰ皮膚という）を用いて行った。
【００４６】
具体的には、まず、あらかじめ−８０℃で凍結保存していたＹＭＰ皮膚を室温で自然解凍し、半解凍の状態でハサミにて皮下脂肪を除去して、さらに手術用メスにて真皮に付着している脂肪を除去した。そして、このように処理したＹＭＰ皮膚を、角層側がドナー側、真皮側がレシーバー側となるようにしてフランツ拡散セル（有効拡散面積：０．３８ｃｍ2）に装着した。そして、ドナーコンパートメントに各リポソーム製剤５００μＬを入れ、リザーバー側のレシーバー溶液として リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline:ＰＢＳの３０重量％エタノール溶液（ｐＨ  ７．４）５．０  ｍＬを使用した。試験中、レシーバー溶液はスターラーで連続的に撹拌し、恒温送水ポンプを用いて温度を３７℃に保った。試験中はパラフィルムを用い、ドナーコンパートメント上部を閉塞した閉塞条件で行った。透過性試験では、試験開始後０，１，２，４，６，２４時間ごとにレシーバー相より２００μｌ溶液を採取して、各サンプル中に含有されるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）、トコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）の量を高速液体クロマトグラフィーにより定量することで分析を行った。また、貯留性試験では，２４時間後の上記ＹＭＰ皮膚を取り出し、上記ＹＭＰ皮膚上のドナー溶液を十分にふき取った後、表皮と真皮に分離し、それぞれホモジナイザーを用いてすりつぶし、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を採取後フィルターでろ過し、そのろ液にて、同様に、各サンプル中に含有されるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）、トコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）の量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した。
【００４７】
高速液体クロマトグラフィーは、ポンプ（LC-20AD，島津製作所）、オートインジェクター（SIL-20AC，島津製作所）、UV 検出器（SPD-20A，島津製作所）、解析システム（CBM-20A，島津製作所）から成り、カラムはTSK-gel ODS-100Z 3 μm（100×2.0 mm，東ソー株式会社）、ガードカラムはTSK-gel guardgel ODS-100Z 3 μm（10×2.0 mm，東ソー株式会社）を使用した。移動相は，メタノール（0.1% トリフルオロ酢酸含有）：水（0.1% トリフルオロ酢酸含有）を97：3（v/v）の比率で用いた。流速は0.2 mL/min、UV波長は246 nm（アスコルビン酸セチルエーテル検出用）、285 nm（トコフェロール酢酸エステル検出用）、カラム温度は40℃とした。この条件におけるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）の保持時間は2.5 分、トコフェロール酢酸エステルの保持時間は10 分であった。定量については、内部標準品としてエルゴカルシフェロールを用い、内標準法を用いてアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）及びトコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）を定量した。
【００４８】
この結果、透過性試験において、試験開始後０，１，２，４，６，２４時間ごとのレシーバー相から採取した各サンプルには、いずれもアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）、トコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）は検出限界以下であることから、アスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）、トコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）のいずれも上記ＹＭＰ皮膚を透過しなかったと判断できる。
【００４９】
そして、貯留性試験において、実施例１及び比較例１〜２のリポソーム製剤を用いたときの表皮又は真皮におけるアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）又はトコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）の実際の蓄積量を、それぞれ６回試験行って定量し、それらの結果から表皮又は真皮の単位重量（ｍｇ）あたりの蓄積量（ｎｇ）に換算した後に算術平均を求めた。表皮又は真皮の単位重量（ｍｇ）あたりのアスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）又はトコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）の蓄積量（ｎｇ）に関するそれぞれの結果を表３に、表４に示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【００５２】
表３、表４及び図１、図２に示すように、アスコルビン酸セチルエーテル（VC-cetyl  ether）、トコフェロール酢酸エステル（Tocopherol acetate）は、表皮を浸透して真皮に到達し貯留されているが、グリセリンを配合した比較例１、何も配合しなかった比較例２に比べて優位に、ジグリセリンを配合した実施例１において最も多く真皮で貯留されていることが分かった。
【図１】
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【図２】
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