(57)【要約】【課題】従来法に比べて、簡便かつ迅速に、より正確に、ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の量を測定する方法およびキットの提供。【解決手段】検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定する方法であって、検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程、及び基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体と、前記脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む、方法。【選択図】図１
2019011978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定する方法であって、
検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程、及び
基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体と、前記脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記脱シアリル化がシアリダーゼ処理による、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脱フコシル化が過ヨウ素酸酸化による、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
さらに、以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記検体中のＡＧＰを定量する工程、及び
前記フコシル糖鎖の量を前記ＡＧＰ量で規格化する工程。
【請求項６】
検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
（Ａ）脱シアリル化用試薬、
（Ｂ）抗ＡＧＰ抗体が固定されたＥＩＡ用基材、および
（Ｃ）ＥＩＡ用基材に固定化された抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化するための試薬。
【請求項７】
さらに、（Ｄ）標識レクチンを含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
標識レクチンがビオチン標識レクチンである、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
さらに、（Ｅ）アビジン標識酵素を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
さらに、
（Ｆ）検体中のＡＧＰを定量するための、抗ＡＧＰ抗体が固定されたサンドイッチＥＬＩＳＡ用基材、及び
（Ｇ）酵素標識抗ＡＧＰ抗体を含む溶液
を含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１２】
前記脱シアリル化用試薬がシアリダーゼを含む、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
前記脱フコシル化試薬が過ヨウ素酸ナトリウムを含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
がんの診断用である、請求項６〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
がん治療の予後診断用である、請求項６〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
がん治療ががんに対する手術、化学療法、免疫療法、抗体療法及び放射線療法から選択される、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質におけるフコシル糖鎖の量を測定する方法およびキットに関する。より詳細には、該糖タンパク質は、ヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質の大部分は糖鎖の修飾を受けている。糖タンパク質の中には、主として血中に存在し、種々の疾患や病態と関連があって臨床への応用の対象となっているものも多い。
非特許文献１には、血中ＡＧＰの測定法が記載されており、多くのがん腫で担がん患者でのＡＧＰ濃度は有意に高値を示すこと、術後の予後予測にはＡＧＰ濃度との相関はないものの、ＡＧＰ糖鎖の高フコシル化がその判定に強く関連することが明らかにされている。特許文献１には、術後がん患者の予後予測判定方法が示されている。
【０００３】
また、悪性腫瘍における臨床病理や種々の治療効果に対応して、ＡＧＰ糖鎖のフコシル化が変動することも明らかになってきた．例えば、本発明者らは、機能糖鎖としてよく知られるシアリルＬｅＸ構造（NANAα2,3Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNAc）のＡＧＰ糖鎖への付
加ががん・非がんで有意に変わること、またフコシル化量が予後予測や化学療法の効果判定に極めて有用な診断マーカーになり得ることを明らかにしてきた（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４２５３２３３号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hashimoto, S. et al., Cancer, 101:2825-2836, 2004
【非特許文献２】Yazawa, S. et al., PLoS ONE 11(6): e0156277 (2016)
【非特許文献３】Biomed. Res. Inter., Vol 2013, Artical ID, 834790, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＧＰのフコシル糖鎖の量を用いてがん患者における術後の予後予測や化学治療効果の評価をする際には、血清から、N型糖鎖の分岐度とフコシル化量を区別する2種のレクチンを含むゲルで血清蛋白を別々に泳動・分離した後、抗AGP抗体で特異的にそれぞれの糖鎖
フォームをもつAGPを捕捉してそれぞれの量比をもとめる交叉親和性免疫電気泳動法(crossed-affinoimmunoelectrophoresis (CAIE法))（非特許文献１）や、血清から非特許文献
３に記載の方法でＡＧＰを精製し、その糖タンパク質から分離・精製した糖鎖について、質量分析法により糖鎖を網羅的に解析すること等が行われている（非特許文献２）。また血中のＡＧＰ量については、抗ＡＧＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法が一般的である。
しかしながら、本発明者らは、従来法では、例えば、悪性腫瘍と関連してＡＧＰが高シアリル化している場合、ＡＧＰの量は実際よりも低値を示すことを見出した。つまり、従来法では、ＡＧＰの正確な量が測定できないことを見出した。
本発明は、上記課題に鑑み、従来法に比べて、簡便かつ迅速に、より正確に、ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の量を測定する方法およびキットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検体中のＡＧＰを脱シア
リル化すること、基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体によって血清中のＡＧＰを捕捉し、ＡＧＰの糖鎖のフコシル基を、フコース結合レクチンで検出することで上記課題が解決できることを見出し、本発明に到達した。本発明は下記の通りである。
【０００８】
〔１〕  検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定する方法であって、
検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程、及び
基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体と、前記脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む、方法。
〔２〕  前記脱シアリル化がシアリダーゼ処理による、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  前記脱フコシル化が過ヨウ素酸酸化による、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  さらに、以下の工程を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
前記検体中のＡＧＰを定量する工程、及び
前記フコシル糖鎖の量を前記ＡＧＰ量で規格化する工程。
〔６〕  検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
（Ａ）脱シアリル化用試薬、
（Ｂ）抗ＡＧＰ抗体が固定されたＥＩＡ用基材、および
（Ｃ）ＥＩＡ用基材に固定化された抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化するための試薬。
〔７〕  さらに、（Ｄ）標識レクチンを含む、〔６〕に記載のキット。
〔８〕  前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である、〔７〕に記載のキット。
〔９〕  標識レクチンがビオチン標識レクチンである、〔７〕又は〔８〕に記載のキット。
〔１０〕  さらに、（Ｅ）アビジン標識酵素を含む、〔９〕に記載のキット。
〔１１〕  さらに、
（Ｆ）検体中のＡＧＰを定量するための、抗ＡＧＰ抗体が固定されたサンドイッチＥＬＩＳＡ用基材、及び
（Ｇ）酵素標識抗ＡＧＰ抗体を含む溶液
を含む、〔６〕〜〔１０〕のいずれかに記載のキット。
〔１２〕  前記脱シアリル化用試薬がシアリダーゼを含む、〔６〕〜〔１１〕のいずれかに記載のキット。
〔１３〕  前記脱フコシル化試薬が過ヨウ素酸ナトリウムを含む、〔６〕〜〔１２〕のいずれかに記載のキット。
〔１４〕  がんの診断用である、〔６〕〜〔１３〕のいずれかに記載のキット。
〔１５〕  がん治療の予後診断用である、〔６〕〜〔１４〕のいずれかに記載のキット。〔１６〕  がん治療ががんに対する手術、化学療法、免疫療法、抗体療法及び放射線療法から選択される、〔１５〕に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来法に比べて、簡便かつ迅速に、より正確に、ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の量を測定する方法およびキットの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施態様における、血清検体の脱シアリル化によるＡＧＰ量測定への影響を示す図である。横軸は従来のAGPの測定値で、縦軸は同一検体を脱シアリル化して測定したＡＧＰ（AS-AGP）の濃度を示す。
【図２】本発明の一実施態様における、脱フコシル化による抗ＡＧＰ抗体の抗原結合能への影響を示す図である。基材に固定したそれぞれの抗体について、一定量のＡＧＰ抗原に対する結合能を比較したものであり、ａは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化しなかった場合を示し、ｂは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化した場合を示す。
【図３】本発明の一実施態様における、脱フコシル化による抗ＡＧＰ抗体に対するヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）の結合への影響を示す図である。基材に固定したそれぞれの抗体について、ａは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化しなかった場合を示し、ｂは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化した場合を示す。
【図４】本発明の一実施態様における、脱フコシル化後の還元処理による抗ＡＧＰ抗体の抗原結合能への影響を示す図である。基材に固定した抗ＡＧＰ抗体について、一定量のＡＧＰ抗原を加え、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）でフコシル基を測定した場合であって、ａは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化せず、かつ還元処理もしなかった場合を示し、ｂは、抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化したが還元処理をしなかった場合を示し、ｃは抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化した後に還元処理をした場合を示す。
【図５】本発明の一実施態様における、フコシル糖鎖を有するＡＧＰの濃度を測定するのに際して用いた検量線を示す図であって、高フコシル化されているＡＧＰを含む血清から非特許文献３に記載の方法で精製し脱シアリル化したＡＧＰを用いた場合のものである。
【図６】本発明の一実施態様における、化学療法を施行したがん患者の予後と血清AGPのフコシル糖鎖量の推移を示す図である。この内、Ａ、Ｂ、Ｃでは３種類、Ｄでは２種類のレジメンによる化学療法を施行した。Ａは食道がん（ステージI）、Ｂは大腸がん（ステージIV）症例で予後不良を示し、Ｃは胃がん（ステージII）、Ｄは大腸がん（ステージII）症例で、予後良好を示す。
【図７】本発明の一実施態様における、抗ＰＤ‐１抗体を投与された肺がん患者における、投与前と３回目投与前（１ヶ月目）における血清中のフコシル化ＡＧＰ量について、画像診断による腫瘍の変化別に示した図である。Ａ、Ｂはいずれも腫瘍の大きさの和が（２０％以上）増大（PD, progressive disease）、Ｃは腫瘍の大きさの和が（３０％以上）減少（PR, partial response）した場合である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定する方法およびキットを含む。
尚、本明細書において、ヒトα１‐酸性糖タンパク質を「ＡＧＰ」と記載することがある。また、ヒイロチャワンタケレクチンを「ＡＡＬ」と記載することがある。
【００１２】
［検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程］
本発明の一実施態様に係る測定方法は、検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程を含む。
検体中のＡＧＰの糖鎖が高シアリル化されたままであると、後工程におけるＥＩＡ法における抗AGP抗体によるAGPの捕捉及びレクチンによるフコシル基の検出が阻害されてしまう。
【００１３】
（検体）
検体の由来動物は、ヒトやラットなどのほ乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。検体としては、ヒト由来の体液が好ましく、例えば、血液、リンパ液、髄液、尿などが挙げられる。採取や保存は常法に従うことができる。また、血液の場合、血漿、血清が好ましく、その調製や保存は常法に従うことができる。
【００１４】
（脱シアリル化）
脱シアリル化は、ＡＧＰ糖鎖の非還元末端のシアル酸結合であるα2,3及びα2,6のシアル酸残基を遊離できるものであれば特に制限されない。脱シアリル化酵素を用いて行われることが好ましく、例えば、シアリダーゼ（別名：ノイラミニダーゼ）が挙げられる。
シアリダーゼとしては、ＡＧＰ糖鎖で非還元末端に存在するα2,3及びα2,6のシアリル基に対して特異性を持つエキソ型であれば特に限定されない。また、種々の生物由来のシアリダーゼを使用することもできる。シアリダーゼは１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよいが、両シアリル結合を効率よく加水分解するアルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のシアリダーゼを用いることが好ましい。
【００１５】
シアリダーゼによる脱シアリル化処理におけるシアリダーゼの使用量は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、ＡＧＰ１μｇあたり、好ましくは０．００５ｍＵ以上、より好ましくは０．０１ｍＵ以上、さらに好ましくは０．０２ｍＵ以上である。一方、好ましくは２ｍＵ以下、より好ましくは１．５ｍＵ以下、さらに好ましくは１ｍＵ以下である。
尚、基質としてシアリルラクトースを使用し、ｐＨ５．０、３７℃において１分間に１μｍｏｌのシアル酸を分解するのに要する酵素量を１Ｕ（ユニット）とする。
【００１６】
また、シアリダーゼによる脱シアリル化の処理時間は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、好ましくは２０分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは１時間以上である。一方、好ましくは１６時間以下、より好ましくは１２時間以下、さらに好ましくは６時間以下である。
【００１７】
また、シアリダーゼによる脱シアリル化における処理温度は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、好ましくは室温（例えば、２５℃）以上、より好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上である。一方、上限はシアリダーゼが活性を保つ温度であって、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３８℃以下である。
【００１８】
また、シアリダーゼによる脱シアリル化における緩衝液としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度も、生化学的手法を用いる場合の一般的な濃度を用いることができる。
【００１９】
緩衝液のｐＨは、脱シアリル化が進行すれば特に制限されないが、好ましくは６．０以上、より好ましくは６．５以上、さらに好ましくは６．８以上である。一方、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下、さらに好ましくは７．２以下である。
【００２０】
シアリダーゼによる脱シアリル化後にはシアリダーゼを失活させることが好ましい。失活は常法に従うことができる。例えば、血清１０μｌ当たり９０μｌのＰＢＳで希釈された状態で、９０℃で５分間の処理をすること等が挙げられる。
【００２１】
［ＥＩＡ法によりフコシル糖鎖の量を測定する工程］
本発明に係る測定方法は、上記検体中のＡＧＰを脱シアリル化する工程の後、基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体と、前記脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む。
【００２２】
本工程において、該ＥＩＡ法に用いる、基材に固定された抗ＡＧＰ抗体は、その糖鎖が
脱フコシル化されたものである。
【００２３】
抗ＡＧＰ抗体（Ｆｃ領域）の糖鎖がフコシル化されたままであると、ＥＩＡを行った際に、前記脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンが、該ＡＧＰのフコシル基のみならず、基材に固定された抗ＡＧＰ抗体のフコシル基にまで結合してしまい、該ＡＧＰ糖鎖のフコシル基の量を正確に測定することができない。
【００２４】
該基材としては、例えば、プレートに設けられたウェルや、ビーズなどが挙げられる。
ＥＩＡに用いる、基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体は、脱フコシル化前の抗ＡＧＰ抗体を基材に固定した後に該基材上で脱フコシル化したものであってもよいし、基材に固定する段階で予め糖鎖が脱フコシル化されているものであってもよい。脱フコシル化前の抗ＡＧＰ抗体でも、予め糖鎖が脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体でも、基材に固定する方法は、従来のＥＩＡ法で用いられる方法を用いることができる。
【００２５】
（脱フコシル化）
ＥＩＡに用いる基材に固定された脱フコシル化前の抗ＡＧＰ抗体に対して脱フコシル化を行う場合、その方法は特に制限されないが、脱フコシル化用溶液を用いた処理によることが好ましく、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を用いた過ヨウ素酸酸化が挙げられる。
【００２６】
過ヨウ素酸を用いる場合のその濃度は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは７ｍＭ以上、さらに好ましくは８ｍＭ以上である。一方、好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１５ｍＭ以下、さらに好ましくは１２ｍＭ以下である。
【００２７】
また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の処理時間は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは２０分以上、より好ましくは３０分以上、さらに好ましくは５０分以上である。一方、好ましくは１６時間以下、より好ましくは１２時間以下、さらに好ましくは６時間以下である。
【００２８】
また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化における処理温度は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上、さらに好ましくは２５℃以上である。一方、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３５℃以下、さらに好ましくは３０℃以下である。
【００２９】
また、過ヨウ素酸を用いる場合の緩衝液としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。また、該緩衝液は、適宜、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）や、Ｔｗｅｅｎ‐２０やＴｗｅｅｎ‐８０などの界面活性剤を含んでいてもよい。緩衝液および界面活性剤の濃度としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な濃度を用いることができる。
【００３０】
緩衝液のｐＨは、脱フコシル化が進行すれば特に制限されないが、好ましくは６．０以上、より好ましくは６．５以上、さらに好ましくは６．８以上である。一方、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．５以下、さらに好ましくは７．２以下である。
【００３１】
過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化は遮光下で行われることが好ましい。
また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の後には、基材を緩衝液で洗浄し、1％BSA含有PBSで室温2時間乃至は4℃一晩保温し、洗浄液(例えば、0.05%Tween20含有PBS)で洗浄してからＥＩＡを行うなど、従来のＥＩＡに用いる基材の調製と同様の調製をすることができ
る。
【００３２】
また、一般に、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の後に還元処理をすることで抗体の活性を保護することがあるが、本発明に係る測定方法では、該還元処理をしてもしなくても、ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の定量結果に有意差がないことから、脱フコシル化後に還元処理工程を含まないことが好ましい。
【００３３】
（脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチン）
該レクチンは、AGP糖鎖に存在するFucα1,3GlcNAｃ糖鎖に結合するものであればよく、好ましくはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）である。これらは、天然のものでもよく人工的に作製されたものでもよい。また、天然のＡＡＬと相同性の高い組換えタンパク質でもよく、相同性が高いとは、例えば、８０％以上の相同性であることを指す。該ＡＡＬは、従来のＥＩＡ法に用いられる標識や修飾がなされていてもよい。
【００３４】
（検出）
脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識するレクチンが該フコシル基を認識してＡＧＰに結合したことを検出する方法としては、従来のＥＩＡを用いることができる。レクチン自体を標識して使用してもよいし、あるいは、例えば、レクチンを予めビオチン標識しておいて、ＡＧＰのフコシル基と該ビオチン標識レクチンとを結合させた後、アビジン標識した酵素を結合させ、該酵素の反応による発色または発光を用いて検出してもよい。
【００３５】
上記酵素としては、いずれの場合も、従来のＥＩＡ法に用いられる一般的な酵素を用いることができる。例えば、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリ・フォスファターゼ（ＡＬＰ）などが挙げられる。
【００３６】
基質としては、使用する酵素に対応するものであればよく、例えば、ＨＲＰの基質であれば３，３’，５，５’‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）や２，２’‐アジノビス［３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸］‐ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、ｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）などが挙げられる。ＡＬＰの基質であれば、パラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）などが挙げられる。
【００３７】
（ＥＩＡ）
本工程におけるＥＩＡは、従来法と同様に行うことができる。反応温度や反応時間のほか、試薬の種類や試薬の濃度、蛍光や発色の検出方法等のいずれも常法に従うことができる。
一例として、脱シアリル化されたＡＧＰのフコシル基を認識して結合するレクチンをビオチン標識ＡＡＬとし、アビジン標識酵素ＨＲＰを加えて基質ＴＭＢに対する発色によりその結合を検出する場合を記載する。
【００３８】
まず、前述したように、過ヨウ素酸酸化で脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体が固定されたＥＩＡ用基材を準備する。基材への非特異的吸着を防ぐために、常法で用いられるブロッキング用緩衝液、例えば3％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSによってブロッキン
グを行ってもよい。
次に、脱シアリル化されたＡＧＰを含む試料を用いて、基材に固定され、脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体と、該脱シアリル化されたＡＧＰとを結合させた後、結合しなかった成分を洗浄液（例えば、0.05％Tween20 を含むPBS）で洗浄して除去する。
次に、ビオチン標識ＡＡＬを用いて、該抗ＡＧＰ抗体に結合した脱シアリル化ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖と、該ビオチン標識ＡＡＬとを結合させ、結合しなかったビオチン標識ＡＡＬを洗浄液による洗浄で除去する。
次に、アビジン標識酵素ＨＲＰを用いて、該ビオチン標識ＡＡＬとアビジン標識酵素ＨＲＰとを結合させ、結合しなかったアビジン標識酵素ＨＲＰを洗浄液による洗浄で除去する。
次に、該酵素ＨＲＰの基質ＴＭＢを加え、従来の抗体‐レクチンＥＩＡ法と同様にして発色を検出する。
本発明に係る測定方法では、さらに、前記発色量からフコシル化ＡＧＰの量を換算する工程を含むことが好ましい。
本工程で用いる方法としては、上記ＥＩＡで測定された発色量または発光量から、検量線を用いて検体中のフコシル化ＡＧＰ量を換算する方法が挙げられる。
検量線は、例えば、血清または腹水から非特許文献３に記載された方法で得た高フコシル化ＡＧＰに対して脱シアリル化を行い、これに対して同様のＥＩＡ法によって得たフコシル化ＡＧＰ量と発色量または発光量との関係から作成することが好ましい。
【００３９】
本発明に係る測定方法は、さらに、前記検体中のＡＧＰを定量する工程、フコシル糖鎖の量を前記ＡＧＰ量で規格化する工程を含むことが好ましい。
【００４０】
［検体中のＡＧＰを定量する工程］
本発明に係る測定方法は、検体中のＡＧＰを定量する工程を含むことが好ましい。
検体中のＡＧＰを定量する方法は制限されないが、例えば、検体中のＡＧＰを脱シアリル化した後、それを希釈して得た溶液を用いて、基材に固定された抗ＡＧＰ抗体と酵素標識した抗ＡＧＰ抗体とを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行い、検量線を用いて酵素反応に基づく発色量または発光量から検体中のＡＧＰの濃度に換算する方法等が挙げられる。
検量線は、例えば、標準試料とする市販のＡＧＰ（濃度が既知）に対して脱シアリル化を行い、これを用いて、基材に固定された抗ＡＧＰ抗体と酵素標識した抗ＡＧＰ抗体とを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行い、ＡＧＰ量（濃度）と発色量または発光量との関係から作成することが好ましい。
【００４１】
［フコシル糖鎖の量をＡＧＰ量で規格化する工程］
本発明に係る測定方法は、さらに、上記で得られた検体中のフコシル糖鎖の量を、上記「検体中のＡＧＰを定量する工程」で得られたＡＧＰ量で規格化する工程を含むことが好ましい。
従来法では、Ｎ型糖鎖に付加したフコースの分析がCAIE法やMALDI-TOF-MSにより可能であったが、その操作は煩雑であり、結果を迅速に得ることができず、その定量化は困難であるのに対し、本工程により、簡便かつ迅速に、検体中のＡＧＰの単位量あたりのフコシル糖鎖の量を算出することができる。
【００４２】
［ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の量を測定するためのキット］
本発明の他の実施態様は、検体中のヒトα１‐酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）におけるフコシル糖鎖の量を測定するためのキットであって、下記の要素（Ａ）〜（Ｃ）、好ましくは（Ａ）〜（Ｄ）、より好ましくは（Ａ）〜（Ｅ）を含むキットである。
（Ａ）脱シアリル化用試薬、
（Ｂ）抗ＡＧＰ抗体が固定化されたＥＩＡ用基材
（Ｃ）ＥＩＡ用基材に固定化された抗ＡＧＰ抗体を脱フコシル化するための試薬、
（Ｄ）ビオチン標識レクチンなどの標識レクチン（例えば、ＡＡＬ）、及び
（Ｅ）アビジン標識酵素（例えば、ＨＲＰ）。
【００４３】
該キットは、さらに、（Ｆ）検体中のＡＧＰを定量するための、抗ＡＧＰ抗体が固定化されたサンドイッチＥＬＩＳＡ用基材、および（Ｇ）酵素（例えば、ＨＲＰ）標識抗ＡＧＰ抗体を含む溶液を含むことが好ましい。
また、該キットは、さらに、希釈用緩衝液、ブロッキング用緩衝液を含むことが好ましい。
【００４４】
前記（Ａ）、（Ｃ）乃至（Ｅ）、（Ｇ）の好ましい種類や濃度、標識、使用時の条件等としては、前述の本発明に係る測定方法の説明に記載した説明が援用される。また、各溶液については、使用前には適宜濃縮されていてもよく、使用直前に水等で適宜希釈することができる。
また、前記（Ａ）、（Ｃ）乃至（Ｅ）、（Ｇ）のいずれも、複数の溶媒や溶液を含む場合には、それらは混合されて一の容器に収容されていてもよいし、別々の容器に収容されていてもよい。
また、前記（Ｂ）及び（Ｆ）の好ましい態様としては、前述の本発明に係る測定方法の説明に記載した態様が挙げられる。
【００４５】
該キットは、がんの診断用であることが好ましく、また、がん治療の予後診断用であることも好ましい。がんとしては、ＡＧＰにおけるフコシル糖鎖の量の増減に影響を与えるがんであることが好ましいが、これまでの研究から対象とするがんの臓器特異性は低く、幅広いがん腫へ適用できる。
がん治療としては、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法及び免疫療法からなる群から選択される１以上が挙げられる。好ましくは、手術、化学療法、及び放射線療法からなる群から選択される１以上である。免疫療法としては、抗体医薬や分子標的薬を用いた免疫療法が挙げられる。
【００４６】
また、該キットは、さらに、前述の本発明に係る測定方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
＜実施例１＞
［脱シアリル化］
検体であるヒト血清8μlに2ｍUのシアリダーゼを含む92μlのPBSを加え、３７℃で２時間保温後、９０℃で５分間の加熱によりシアリダーゼを失活させ、脱シアリル化サンプルを得た。そして、抗ＡＧＰ抗体とＨＲＰ標識抗ＡＧＰ抗体を用いた従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてＡＧＰ濃度を測定した。具体的には、96ウェルプレートのウェルに1
ウェル当たり0.2μgの抗AGP抗体（DAKO社）を加え固定化後、適宜希釈液（2％BSA及び0.1%Tween20を含むPBS）で希釈したサンプルを加えて室温で2時間保温し、次いでHRP標識AGP抗体を用いた。
ここで、ＡＧＰ濃度を測定するのに際して検量線を用いた。検量線は、濃度が既知の精製ＡＧＰ（シグマ‐アルドリッチ社）を上記同様にシアリダーゼ処理し、これを標準物質として、上記同様のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行って作成した。
【００４９】
（脱シアリル化によるＡＧＰ検出への影響）
脱シアリル化によるＡＧＰ検出への影響を検討した。具体的には、上記のようにして脱シアリル化処理をしてＡＧＰ濃度を測定した場合と、同一血清試料を用いて従来法として脱シアリル化しなかった場合とで比較した。
【００５０】
その結果を図１に示す。両測定値には強い相関が認められたが、脱シアリル化処理をした場合の測定値は、従来法による測定値に比べ、全体で２．０４±０．７９の高値を示した。従って、脱シアリル化処理をしない場合のＡＧＰ量測定では本来検出されるべきＡＧ
Ｐが十分検出されないことが示された。
【００５１】
＜実施例２−１＞
［ウェルへの抗ＡＧＰ抗体の固定］
９６ウェルプレートのウェルに１ウェル当たり２μｇの抗ＡＧＰ抗体（ＤＡＫＯ社）を加え、３７℃で１時間保温後または４℃で一晩放置した。洗浄液でウェルを洗浄後、該ウェルに３％ＢＳＡを含むＰＢＳを加え、室温で２時間静置した。
【００５２】
［抗ＡＧＰ抗体の脱フコシル化］
洗浄液で該ウェルを３回洗浄後、１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を含む０．１ＭのＴ‐ＰＢＳ（ｐＨ７．０）を加えて、室温で遮光下、１時間静置し、抗ＡＧＰ抗体の糖鎖を酸化した（脱フコシル化）。
該ウェルを洗浄液で再び３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加え、室温で２時間、または４℃で一晩反応させた後、洗浄液で３回洗浄して、後述するＥＩＡに用いた。
該脱フコシル化により、抗体に一般に存在する、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）が結合するフコシル糖鎖（Fucα1,6GlcNAc）は分解される。すなわち、プレートに固定された抗ＡＧＰ抗体の重鎖のＦｃ部位には、一般にＮ型２本鎖の糖鎖が２本存在するため、それぞれにα1,6フコシル基が付加することがあるが、該過ヨウ素酸酸化により該糖鎖
は分解される。
【００５３】
（脱フコシル化による抗ＡＧＰ抗体の抗原結合能への影響）
過ヨウ素酸酸化による抗ＡＧＰ抗体の脱フコシル化による、抗ＡＧＰ抗体の抗原（ＡＧＰ）結合能への影響を検討した。具体的には、抗ＡＧＰ抗体を過ヨウ素酸酸化したものとしなかったものに対し、精製ＡＧＰ（シグマ‐アルドリッチ社）の一定量を抗原として、ＨＲＰ標識抗ＡＧＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
その結果を図２に示す。ａは、無処理抗ＡＧＰ抗体、ｂは過ヨウ素酸酸化処理した抗ＡＧＰ抗体で一定量のＡＧＰを捕捉した場合であり、両ＡＧＰ量は全く変わらず、過ヨウ素酸酸化処理の抗体活性への影響は認められなかった。
【００５４】
＜実施例２−２＞
（脱フコシル化による抗ＡＧＰ抗体に対するレクチンの結合への影響）
過ヨウ素酸酸化処理した抗ＡＧＰ抗体に対するレクチンへの結合の有無を検討した。具体的には、過ヨウ素酸酸化処理をした抗ＡＧＰ抗体、又はしなかった抗ＡＧＰ抗体が固定されたプレートを用いて、一定量のＡＧＰを該抗ＡＧＰ抗体に結合させ、これにビオチン標識ＡＡＬを反応させた後、ＨＲＰ標識アビジンを加えてその発色量を比較した。
その結果を図３に示す。ａは抗ＡＧＰ抗体を過ヨウ素酸酸化処理しなかった場合、ｂは抗ＡＧＰ抗体を過ヨウ素酸酸化処理した場合であり、ＡＡＬの結合を比較すると、過ヨウ素酸酸化によって著しい減弱が認められた。フコース結合レクチンであるAALはα1,6フコシル基に最も強く親和性を持つが、抗体に存在するフコシル基はα1,6フコシル基のみで
あることから、抗ＡＧＰ抗体のフコシル基（Fucα1,6GlcNAc）の脱フコシル化が示された。
【００５５】
＜実施例２−３＞
（脱フコシル化後の還元処理の有無による抗ＡＧＰ抗体の抗原結合能への影響）
抗ＡＧＰ抗体の過ヨウ素酸酸化処理後の還元保護化の必要性の有無を検討した。具体的には、（ａ）無処理抗ＡＧＰ抗体、（ｂ）過ヨウ素酸酸化処理抗ＡＧＰ抗体、又は（ｃ）過ヨウ素酸酸化と還元処理をした抗ＡＧＰ抗体が固定されたプレートを用いて、一定量の脱シアリル化ＡＧＰを捕捉させて、ビオチン標識ＡＡＬを用いたＥＩＡの結果を比較した。還元処理は、０．２５Ｍジメチルアミンボランおよび０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で室温９０分処理を行った（対照としてｂは０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で室温９０
分処理）。
その結果を図４に示す。ａ、ｂより、過ヨウ素酸酸化処理をするとビオチン標識ＡＡＬの結合が著しく減弱するものの、ｂ、ｃより、その後の還元処理による結果の差は殆ど認められなかった。従って、過ヨウ素酸酸化処理抗ＡＧＰ抗体の還元保護は不要とした。
【００５６】
＜実施例３＞
［ＥＩＡ］
脱シアリル化したサンプルを、希釈液で１μｇ／１００μｌに調製し、脱フコシル化された抗ＡＧＰ抗体が固定されているウェルに添加して室温で２時間反応させた。
反応後、洗浄液で３回洗浄し、希釈液で０．５μｇ／ｍｌに調製したビオチン標識ＡＡＬを加えて、室温で１時間反応させた。
反応後、洗浄液で３回洗浄し、希釈液で１００ｎｇ／ｍｌに調整したホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したアビジンを加えて、室温で３０分間反応させた。
反応後、洗浄液で３回洗浄し、基質としてTMB Blue Substrate Chromogen液（ＤＡＫＯ社）１００μｌを加えて、室温で５分間静置した。
その後、１Ｎの硫酸５０μｌを加えて反応を停止し、比色定量（検出波長４５０ｎｍ）を行った。
【００５７】
ここで、高フコシル化ＡＧＰを含むプール血清から非特許文献３に記載の方法で高フコシル化ＡＧＰを精製し、上記シアリダーゼ処理からＥＩＡまでの一連の操作を行い、これを標準物質として検量線を作成した。検量線は図５の通りである。更に、該検量線から、フコシル化ＡＧＰ量として１００μｇ／ｍＬ＝１００Ｕと定義し、被検体中の１μｇのＡＧＰについてのフコシル化ＡＧＰ量を求めた。
【００５８】
＜実施例４＞
[化学療法施行症例におけるがん患者の予後予測]
術後（術前も含む）抗がん剤の化学療法施行症例における予後と血清のフコシル化AGP
量の経時的解析を行った。
その結果を図６に示す。
Ａ（食道がんステージI）では、術前に1st line、術後2nd及び3rd lineの化学療法を施行した。術後９９日目（POD）でがんの転移が認められ、334日目（POD）にがん死した。
血清フコシル化ＡＧＰ量は化学療法2nd line以降漸次上昇を続けた。
Ｂ（大腸がんステージIV）では術後311日目（POD）に再発を認め、713日目（POD）にがん死した。再発直後の化学療法開始直後に一旦は低下した血清フコシル化ＡＧＰ量はその後上昇に転じ、いずれも著しい高値を示した。
一方、Ｃ（胃がんステージII）では術後の1st line、及び再発が認められた術後370日
目以降の2nd、3rd lineの化学療法施行で奏功が認められたが、血清フコシル化AGP量も長期間低値であった。
更に、Ｄ(大腸がんステージII)では長期間のfollow-upでがんの再発・転移は認められ
ていない。術後1st line及び2nd lineの化学療法が施行されたが、血清フコシル化ＡＧＰ量はいずれも低値を維持した。従って、化学療法施行症例の予後については、予後不良（Ａ、Ｂ）と良好（Ｃ、Ｄ）とで血清中のフコシル化ＡＧＰ量の変動にはっきりとした相違が示され、血清中のフコシル化ＡＧＰ測定の化学療法の効果判定への応用が示唆された。
【００５９】
＜実施例５＞
［抗ＰＤ‐１抗体投与肺がん患者の予後予測］
免疫チェックポイント阻害剤としての抗ＰＤ‐１抗体の臨床応用が進んでいるが、化学療法同様、免疫療法など、とりわけ膨大な医療費負担に繋がる治療法についてはその効果判定のためのバイオマーカーの開発が急務とされている。そこで、オプジーボ投与の肺が
ん患者における血清フコシル化ＡＧＰ量の変動を調べた。
その結果を図７に示す。肺がん患者Ａ〜Ｃに対するオプジーボ投与開始前（図中の「ｐｒｅ．」）と３回目投与直前の投与開始1ヶ月目（図中の「１Ｍ」）のそれぞれの血清フ
コシル化ＡＧＰ量を測定した。Ａ及びＢは１ヶ月目の腫瘍の画像診断からPD (progressive disease)、つまり腫瘍の大きさの和が２０％以上増加し、一方、ＣではPR (partial response)、つまり腫瘍の大きさの和が３０％以上減少したことが認められた。それぞれの
血清フコシル化ＡＧＰ量は、Ａ、Ｂ共に高値が変わらなかったが、Ｃでは極めて高い値は投与によって急速に低下した。化学療法同様、免疫療法においても、フコシル化ＡＧＰ量測定の治療効果判定への有用性が示された。
【図１】
2019011978.tif 000003
【図２】
2019011978.tif 000004
【図３】
2019011978.tif 000005
【図４】
2019011978.tif 000006
【図５】
2019011978.tif 000007
【図６】
2019011978.tif 000008
【図７】
2019011978.tif 000009