(57)【要約】【課題】低侵襲の細胞活性測定用デバイスを提供する。【解決手段】一面側に凹部状のマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第１層と、前記第１層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第２層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第２層の、前記第１層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第２層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える細胞活性測定用デバイス。【選択図】図２
2019037180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第１層と、
前記第１層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第２層と、
前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、
前記第２層の、前記第１層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第２層と一体成形されたマイクロレンズと、
を備える細胞活性測定用デバイス。
【請求項２】
前記環境因子検出プローブが多孔質である、請求項１に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項３】
前記マイクロチャンバは、前記マイクロチャンバの底部及び開口部の中心を結ぶ中心軸に直行する断面積ａが、前記マイクロチャンバの底部からの距離がｌ１である断面積ａ１と、前記マイクロチャンバの底部からの距離がｌ２である断面積ａ２と、を有し、ｌ２＞ｌ１のときａ２＞ａ１であり、
前記マイクロチャンバの内側面の少なくとも一部に、前記環境因子検出プローブが配置されている、
請求項１又は２に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項４】
前記第１層及び前記第２層が、透光性を有する材料で形成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項５】
前記環境因子検出プローブを２種以上備え、前記２種以上の環境因子検出プローブが、それぞれ異なる種類の環境因子の量に応じて光学的変化を生じる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項６】
前記環境因子の少なくとも１種が酸素であり、前記第１層が酸素の透過を阻害する材料で形成されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項７】
前記環境因子検出プローブの少なくとも１種が、酸素濃度に依存してリン光寿命が変化する材料を含む、請求項６に記載の細胞活性測定用デバイス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、前記マイクロチャンバに、前記細胞を収容する工程と、
前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程と、
前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程と、
を含む、細胞活性測定方法。
【請求項９】
（ａ）測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、
（ｂ）前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第１層を形成する工程と、
（ｃ）前記第１層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された第２層を形成する工程と、
（ｄ）前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置に形成された前記第１層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、
を含む、細胞活性測定用デバイスの製造方法。
【請求項１０】
前記環境因子検出プローブ層が発泡剤を含み、
前記発泡剤を反応させて、前記環境因子検出プローブ層を発泡させる工程を、さらに含む、
請求項９に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。
【請求項１１】
前記工程（ｃ）が、前記第１層上に、第２層を形成する材料を塗布して第２層を形成し、マイクロレンズ形状の凹部を有するモールドを、前記第２層に押し当てて硬化させること、を含む、
請求項９又は１０に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。
【請求項１２】
前記工程（ｄ）において、前記環境因子検出プローブ層が、前記第１層の凹部の内面の一部のみに残るように前記環境因子検出プローブ層を除去する、
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞活性測定用デバイス、細胞活性測定方法、及び細胞活性測定用デバイスの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生物学的活性を測定する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングをはじめとする幅広い分野における基盤技術となっている。
従来から公知の細胞の活性計測方法のうち、個々の細胞を解析した上で分離する手法の一例としてフローセルソーターによる計測が挙げられる。フローセルソーターでは、電荷を持たせた液滴中に蛍光染色処理後の細胞を単離して滴下する。そして、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小に基づいて液滴の落下方向を電界の印加で制御し、複数の容器に細胞を分画して回収することができる（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kamarck,M.E.  Methods Enzymol. 第１５１巻第１５０頁から第１６５頁（１９８７年）
【発明の概要】
【０００４】
本発明の１実施形態は、一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第１層と、前記第１層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第２層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第２層の、前記第１層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第２層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える細胞活性測定用デバイスである。
【０００５】
また、本発明の１実施形態は、前記実施形態の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、前記細胞活性測定用デバイスのマイクロチャンバに、前記細胞を収容する工程と、前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程と、前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程と、を含む、細胞活性測定方法である。
【０００６】
また、本発明の１実施形態は、（ａ）測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、（ｂ）前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第１層を形成する工程と、（ｃ）前記第１層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された第２層を形成する工程と、（ｄ）前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置に形成された前記第１層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、を含む、細胞活性測定用デバイスの製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの一例を示す斜視図である。
【図２】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの一例を示す断面図である。
【図３】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの一例を示す断面図である。
【図４】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの一例において、マイクロレンズによる集光効果を示す模式図である。
【図５】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの使用方法の一例を示す。
【図６】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの使用方法の一例を示す断面図である。
【図７】本発明の１実施形態にかかる細胞活性測定用デバイスの製造方法の一例を示す概略図である。
【図８】環境因子検出プローブが多孔質である細胞活性測定用デバイスの製造方法の一例を示す概略図である。
【図９】マイクロレンズの曲率半径Ｒ＝１５０μｍに固定し、厚みｄを変動させたときの、環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。グラフ中、「受光強度比」は、マイクロレンズがない場合の受光強度を１とした場合の比率を示す。
【図１０】マイクロレンズの厚みｄ＝５０μｍに固定し、曲率半径Ｒを変動させたときの、環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。グラフ中、「受光強度比」は、マイクロレンズがない場合の受光強度を１とした場合の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
≪細胞活性測定用デバイス≫
１実施形態において、本発明は、細胞活性測定用デバイスを提供する。本実施形態の細胞活性測定用デバイスは、一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第１層と、前記第１層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第２層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第２層の、前記第１層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第２層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える。
【０００９】
図１は、本実施形態の細胞活性測定用デバイスの構成例を示す斜視図である。図２は、本実施形態の細胞活性測定用デバイスの構成例を示す断面図である。細胞活性測定用デバイス１は、第１層１０と、第２層２０とから構成されている。第１層１０の一面側には、凹部状のマイクロチャンバ１１が形成されている。マイクロチャンバ１１の内面には、環境因子検出プローブ３０が配置されている。第２層２０には、マイクロレンズ２１が一体成形されている。細胞活性を測定する際には、マイクロチャンバ１１内に細胞を収容し、細胞の代謝で産生又は消費される環境因子を、環境因子検出プローブ３０で検出して、細胞活性を測定する。細胞は、培地（細胞培養液など）とともに、マイクロチャンバ１１内に収容されてもよい。
【００１０】
（第１層）
第１層１０は、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されている。本明細書において、「環境因子」とは、細胞の代謝で産生又は消費される物質を意味する。環境因子としては、例えば、グルコース、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素種、過酸化水素、二酸化炭素、タンパク質、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。測定対象の環境因子は、１種であってもよく、２種以上であってもよい。測定対象の環境因子が２種以上である場合、第１層１０は、当該２種以上の環境因子のいずれの透過も阻害する材料で構成される。第１層１０が、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されることにより、環境因子がマイクロチャンバ１１の外部に拡散することを防ぐことができる。また、マイクロチャンバ１１内の環境因子が隣接するマイクロチャンバ１１に移動することを防ぎ、各マイクロチャンバ１１に収容された細胞毎に、正確に細胞活性を測定することができる。
【００１１】
例えば、環境因子が、酸素、二酸化炭素等の気体である場合、第１層１０は、ガスバリア性の高い材料で構成される。一例として、環境因子が酸素である場合、第１層１０は、酸素の透過を阻害する材料で構成される。
また、一例として、第１層１０は、透光性を有する材料で構成される。第１層１０が、透光性を有する材料で構成されることにより、環境因子検出プローブ３０に対して効率よく光が照射される。また、環境因子検出プローブ３０の光学的変化を効率よく検出することができる。
また、第１層１０は細胞培養液自体の流出入も阻害することで、マイクロチャンバ１１ごとに独立した空間としている。
【００１２】
環境因子が酸素である場合、第１層１０は、例えば、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）で構成されていてもよい。ＥＶＯＨは、生体適合性が高いため、細胞に対する侵襲性が低い。また、ガスバリア性が高く、酸素の透過を阻害する。さらに、ＥＶＯＨは、透光性を有する。なお、ＥＶＯＨは、酸素以外の多くの環境因子の透過も阻害するため、環境因子が酸素以外の物質である場合も、第１層１０の材料として用いることができる。
【００１３】
第１層１０の厚さｔ１０は、特に限定されないが、例えば、１０μｍ〜１ｍｍが例示される。第１層１０の厚さｔ１０が前記範囲内であると、マイクロチャンバ１１の容積を環境因子の検出に適度なものとし得るとともに、細胞活性測定用デバイス１の重量が適度なものとなる。厚さｔ１０は、２０〜５００μｍとしてもよく、３０〜３００μｍとしてもよい。一例として、厚さｔ１０は、４０〜２００μｍである。
【００１４】
第１層１０の一面側には、凹部状のマイクロチャンバ１１が形成されている。マイクロチャンバ１１の数は特に限定されず、１個であってもよく、２個以上であってもよい。マイクロチャンバ１１の数は、細胞活性測定用デバイス１のサイズに合わせて、適宜適当な数を形成することができる。第１層１０に複数のマイクロチャンバ１１が形成されている場合、マイクロチャンバ１１の配列方式は、特に限定されず、細胞活性測定用デバイス１の形状に合わせて、適宜適切な配列方式を選択することができる。一例として、マイクロチャンバ１１は、格子状に配列することができる。
【００１５】
マイクロチャンバ１１が複数ある場合、隣接するマイクロチャンバ間の距離ｄ１１は、特に限定されず、細胞活性測定用デバイス１のサイズ及びマイクロチャンバ１１の数に応じて、適宜設定すればよい。第１層１０の材料についての測定対象である環境因子の拡散係数を考慮し、マイクロチャンバ１１内の当該環境因子が拡散して、隣接するマイクロチャンバ１１に至る時間が、当該環境因子を測定するための時間よりも長くなるように、距離ｄ１１を設定してもよい。また、距離ｄ１１は、全て同じである必要はなく、マイクロチャンバ１１の位置によって距離ｄ１１を変更してもよい。距離ｄ１１としては、例えば、１０〜５００μｍが例示される。
【００１６】
マイクロチャンバ１１は、第１層の一面側に形成された孔である。孔は貫通孔であってもよく、貫通しない孔であってもよい。図２の例では、マイクロチャンバ１１は第１層１０を貫通しない孔として形成されているが、マイクロチャンバ１１は、第１層１０に貫通孔を形成していてもよい。マイクロチャンバ１１が、第１層を貫通する貫通孔である場合、マイクロチャンバ１１に対応する位置に貫通孔を有する第１層１０に、第２層２０を積層することによって、マイクロチャンバ１１が形成されていてもよい。かかる構成も「第１層の一面側にマイクロチャンバを有する」構成に含まれる。マイクロチャンバ１１の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。マイクロチャンバ１１の形状としては、例えば、円柱形状、楕円柱形状、多角柱形状、半球形状、円錐台形状、多角錐台形状等が挙げられるが、これらに限定されない。図２の例では、マイクロチャンバ１１は円柱形状である。
【００１７】
マイクロチャンバ１１のサイズは、特に限定されず、細胞の種類、測定対象とする環境因子の種類等に応じて、任意のサイズとすることができる。例えば、ヒト細胞を対象とする場合、マイクロチャンバ１１の容積としては、１０３〜１０７μｍ３を例示できる。
また、例えば、マイクロチャンバ１１が円柱形状である場合、マイクロチャンバ１１の横断面の円の直径φ１１は、３０〜２００μｍとすることができる。直径φ１１は、５０〜１５０μｍであってもよく、７０〜１２０μｍであってもよい。一例として、直径φ１１は９０〜１００μｍである。また、例えば、マイクロチャンバ１１が円柱形状である場合、マイクロチャンバ１１の高さｈ１１は、５〜９０μｍとすることができる。高さｈ１１は、１０〜８０μｍとしてもよく、２０〜７０μｍとしてもよい。一例として、高さｈ１１は、３０〜５０μｍである。
【００１８】
一例として、マイクロチャンバ１１は、図３の例のように、マイクロチャンバ１１の底部及び開口部の中心を結ぶ中心軸Ｃに直行する断面積ａが、前記マイクロチャンバの底部からの距離がｌ１である断面積ａ１と、前記凹部の底部からの距離がｌ２である断面積ａ２とを有する場合、ｌ２＞ｌ１のときａ２＞ａ１であるような形状を有するものであってもよい。そのようなマイクロチャンバ１１の形状としては、例えば、半球形状、円錐台形状、多角錐台形状等が挙げられる。図３の例では、マイクロチャンバ１１は円錐台形状である。
【００１９】
マイクロチャンバ１１の内面には、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブ３０が配置されている。環境因子検出プローブ３０は、測定対象である環境因子と反応し、光学的変化を生じる。「光学的変化」とは、少なくとも１つの光学的性質に変化が生じることを意味する。光学的性質の例としては、例えば、蛍光強度、蛍光寿命、リン光強度、リン光寿命、吸光度、吸収波長等が挙げられるが、これらに限定されない。
マイクロチャンバ１１に細胞を収容してインキュベートすると、細胞の代謝により、マイクロチャンバ１１内の環境因子の量が変化する。当該環境因子の量的変化に依存して、環境因子検出プローブ３０に光学的変化が生じる。そのため、環境因子検出プローブ３０の光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ１１に収容された細胞の代謝活性を測定することができる。
【００２０】
例えば、検出対象の環境因子が酸素である場合、環境因子検出プローブ３０は、酸素濃度に依存してリン光寿命が変化する材料を含んでいてもよい。例えば、環境因子検出プローブ３０は、公知のリン光試薬を含むことができる。リン光試薬としては、例えば、金属ポルフィリン、金属フタロシアニン、ルテニウム錯体、イリジウム錯体等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、金属ポルフィリン又は金属フタロシアニンにおいて、中心金属の具体例としては、白金、亜鉛、パラジウム等が挙げられる。一例として、環境因子検出プローブ３０は、白金ポルフィリンを含んでいてもよい。白金ポルフィリンの例としては、オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）が挙げられる。ＰｔＯＥＰは、常温下で安定なリン光を発生し、酸素濃度が上昇するとリン光寿命が低下する性質を有する。そのため、ＰｔＯＥＰは、酸素濃度を測定するためのリン光試薬として適している。環境因子検出プローブ３０がＰｔＯＥＰを含む場合、酸素透過性の高いポリスチレン（ＰＳ）を用いたＰｔＯＥＰ−ＰＳの薄膜を含んでいてもよい。
【００２１】
環境因子検出プローブ３０は、マイクロチャンバ１１の内面において、細胞活性測定用デバイス１に照射される光を受光可能な位置に配置される。細胞活性測定用デバイス１に照射される光は、環境因子検出プローブ３０に生じる光学的変化を検出するために照射されるものである。例えば、環境因子検出プローブ３０に生じる光学的変化が蛍光強度やリン光寿命の変化である場合、環境因子検出プローブ３０に蛍光又はリン光を発生させるための励起光が、細胞活性測定用デバイス１に照射される。
環境因子検出プローブ３０は、照射光を受光可能な位置であれば、特に制限なくマイクロチャンバ１１の内面に配置することができる。例えば、環境因子検出プローブ３０は、マイクロチャンバ１１の底部内面に配置されてもよく、内側面に配置されてもよい。また、底部内面及び内側面の両方に、環境因子検出プローブ３０を配置してもよい。なお、環境因子検出プローブ３０は、底部内面及び内側面のいずれに配置される場合であっても、底部内面又は内側面の全面に配置されている必要はなく、底部内面又は内側面の少なくとも一部に配置されていればよい。
【００２２】
例えば、図２の例のように、マイクロチャンバ１１が円柱形状である場合、環境因子検出プローブ３０は、マイクロチャンバ１１の底部内面に配置することができる。
また、例えば、図３の例のように、マイクロチャンバ１１が、ｌ２＞ｌ１のときａ２＞ａ１であるような形状を有する場合、環境因子検出プローブ３０は、マイクロチャンバ１１の内側面に配置してもよい。この場合、環境因子と接触する環境因子検出プローブ３０の表面積が大きくなるため、環境因子の検出感度を高めることができる。なお、図３の例では、環境因子検出プローブ３０は、マイクロチャンバ１１の内側面にしか配置されていないが、内側面とともに底部内面にも配置されていてもよい。
【００２３】
また、環境因子検出プローブ３０は、多孔質であってもよい。環境因子検出プローブ３０を多孔質とした場合、環境因子検出プローブ３０が環境因子と接触する表面積が大きくなる。そのため、環境因子によって生じる光学的変化を検出しやすくなり、環境因子の検出感度を高めることができる。
【００２４】
なお、測定対象の環境因子が２種以上である場合、２種以上の環境因子検出プローブ３０を用いて、それぞれ環境因子を検出してもよい。この場合、マイクロチャンバ１１の内面を区画分けし、各区画に異なる種類の環境因子検出プローブ３０を配置してもよい。あるいは、２種以上の環境因子検出プローブ３０を、互いに重なるように、マイクロチャンバ１１の内面に配置してもよい。
例えば、第１の環境因子を第１の環境因子検出プローブで検出し、第２の環境因子を第２の環境因子検出プローブで検出する場合、第１の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ１１の内面の第１区画に配置し、第２の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ１１の内面の第２区画に配置してもよい。
また、例えば、第１の環境因子検出プローブを、マイクロチャンバ１１の内面のいずれかに配置された第２の環境因子検出プローブに、重ねて配置してもよい。この場合、第１の環境因子検出プローブは、マイクロチャンバ１１内の細胞培養液と直接接触して、細胞培養液中の第１の環境因子を検出する。一方、第２の環境因子検出プローブは、第１の環境因子検出プローブ内を拡散して第２の環境因子検出プローブまで到達した、第２の環境因子を検出する。      
【００２５】
環境因子検出プローブ３０の厚さｔ３０は、特に限定されない。環境因子と接触するのは表層のみであるため、厚さｔ３０を厚くしても、環境因子検出プローブ３０の性能が大きく向上することはない。環境因子検出プローブ３０の厚さｔ３０は、例えば、０μｍ超５μｍ以下とすることができる。厚さｔ３０は、０μｍ超３μｍ以下であってもよく、０μｍ超２μｍ以下であってもよく、０μｍ超１μｍ以下であってもよい。一例として、厚さｔ３０は１μｍである。環境因子検出プローブ３０の厚さｔ３０が薄すぎると、環境因子の測定に十分な光学的変化が得られない場合があり、また、厚さｔ３０が厚すぎると、環境因子に感度のない部分に光学的変化が生じ、感度が鈍る場合がある。そのため、環境因子の種類、及び環境因子検出プローブ３０を構成する材料に応じて、適正な厚さｔ３０を求めてもよい。
【００２６】
環境因子検出プローブ３０が多孔質である場合、環境因子は多孔質構造中を拡散し、環境因子検出プローブ３０が第１層１０と接する面付近まで移動し得る。そのため、環境因子検出プローブ３０が多孔質である場合、環境因子検出プローブ３０の厚さｔ３０を厚くすることにより、環境因子の感度を高め得る。環境因子検出プローブ３０が多孔質である場合には、厚さｔ３０は、例えば、０μｍ超１００μｍ以下とすることができる。また、多孔質の孔径は、例えば、０．５μm〜１００μmである。
【００２７】
(第２層)
第２層２０は、第１層１０の、マイクロチャンバ１１を有する面の他面側に、積層されている。第２層２０は、第１層１０の材料と異なる材料で構成されてもよく、同じ材料で構成されてもよい。また、第２層２０において、第１層１０と接する面の他面側には、マイクロレンズ２１が一体成形されている。すなわち、第２層２０の他面側とマイクロレンズ２１との間には継ぎ目がない。第２層２０とマイクロレンズ２１とは、同一の材料であることが好ましい。マイクロレンズ２１は、細胞活性測定用デバイス１に照射される光を、環境因子検出プローブ３０に集光する機能を有する（図４参照）。
【００２８】
第２層２０を構成する材料は、特に限定されない。第２層２０は、例えば、透光性を有する材料で構成することができる。また、第２層２０に一体成形されるマイクロレンズ２１の集光効率を高めるために、屈折率の高い材料で第２層２０を構成してもよい。例えば、細胞活性測定用デバイス１に対する照射光の波長に関して、１．３〜２．０程度の屈折率を有する材料で第２層２０を構成することができる。また、第２層２０にマイクロレンズ２１を一体成形するために、熱硬化性材料又は光硬化性材料を用いて、第２層２０を構成してもよい。
【００２９】
第２層２０を構成する材料としては、例えば、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等から、上記のような性質を有する樹脂を適宜選択して用いてもよい。具体例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ＮＴＴアドバンストテクノロジー社製の高屈折率樹脂（＃１８１６５、＃１８１６６、＃６２０５、Ｅ３７５４、＃７２００）、三菱ガス化学社製のルミプラス（登録商標）シリーズ等が挙げられる。これらの樹脂は、透光性を有し、屈折率が高く、熱硬化性又は光硬化性である。例えば、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ３０がＰｔＯＥＰを含む場合、励起光として３８３ｎｍの光を用いることができる。前記具体例として挙げた樹脂における３８３ｎｍの光の屈折率は１．４〜１．９程度である。
【００３０】
第２層２０の厚さｔ２０は、特に限定されないが、例えば、１０〜１ｍｍが例示される。第２層２０の厚さｔ２０が前記範囲内であると、細胞活性測定用デバイスの重量が適度なものとなる。厚さｔ２０は、３０〜５００μｍとしてもよく、５０〜２００μｍとしてもよい。一例として、厚さｔ２０は、１００〜２００μｍである。
【００３１】
マイクロレンズ２１は、第２層２０の一面側に一体成形されている。マイクロレンズ２１は、第１層１０が有するマイクロチャンバ１１に対応する位置に配置されている。１つのマイクロチャンバ１１に対しては、１つのマイクロレンズ２１が配置されている。一例として、マイクロレンズ２１は、マイクロレンズ２１の中心点と、マイクロチャンバ１１の底面の中心点と、マイクロチャンバ１１の開口部の中心点とが、一直線上に並ぶように配置される。細胞活性測定用デバイス１に照射された光は、マイクロレンズ２１を通過する際に屈折し、環境因子検出プローブ３０に集光される（図４参照）。マイクロレンズ２１は、第２層２０と一体成形されているため、マイクロレンズ２１と第２層２０とがシームレスに繋がっている。そのため、マイクロレンズ２１と第２層２０との境界付近でひずみ等を生じることがなく、マイクロレンズ２１を透過した光が第２層２０との間で散乱や屈折などの影響を受けることを抑えられる。
【００３２】
マイクロレンズ２１のサイズは、特に限定されないが、例えば、環境因子検出プローブ３０を覆い得るサイズとすることができる。マイクロレンズ２１の曲率半径Ｒ及び厚みｄは、マイクロチャンバ１１のサイズ、環境因子検出プローブの配置位置、第２層２０を構成する材料の屈折率等により、適宜選択することができる。例えば、マイクロレンズ２１の曲率半径Ｒは、５０〜３００μｍとすることができる。曲率半径Ｒは、１００〜２００μｍであってもよく、１２０〜１８０μｍであってもよい。また、マイクロレンズ２１の厚みｄは、例えば、１０〜１２０μｍとすることができる。厚みｄは、２０〜１００μｍであってもよく、３０〜８０μｍであってもよい。一例として、マイクロレンズ２１の曲率半径Ｒは１５０μｍであり、厚みｄは５０μｍである。
【００３３】
上記のような構成を備える細胞活性測定用デバイス１は、一例として、シート状である。細胞活性測定用デバイス１がシート状である場合、軽量で嵩張らず、扱いやすい。また、マイクロチャンバ１１の配置の自由度が高く、多数のマイクロチャンバ１１を形成して、一度に多くの細胞の細胞活性を別々に測定することもできる。また、軽量であり柔軟性があることから、細胞へのダメージを抑えられる。
細胞活性測定用デバイス１がシート状である場合、細胞活性測定用デバイス１の平面形状は、測定対象の細胞を培養する培養容器等に応じて、適当な平面形状を選択すればよい。例えば、シャーレ中の培養細胞の細胞活性を測定する場合には、細胞活性測定用デバイス１の平面形状は円形とすることができる。
【００３４】
（他の構成）
上記構成のほか、細胞活性測定用デバイス１は、他の構成を含んでいてもよい。
例えば、マイクロチャンバ１１内には、環境因子検出プローブ３０に加えて、環境因子の量を電気化学的手段によって電気信号に変換するセンサが配置されていてもよい（図示せず）。そのようなセンサとしては、例えば、酸素センサ、各種バイオセンサ（例、グルコースセンサ）等が挙げられる。
あるいは、マイクロチャンバ１１内には、特定の生体分子に特異的に結合する生体分子検出プローブが配置されていてもよい（図示せず）。生体分子検出プローブとしては、例えば、抗体、レセプタータンパク質、酵素、アプタマー、核酸等が挙げられる。
【００３５】
また、マイクロチャンバ１１の内面は、親水性被膜等でコーティングされていてもよい。あるいは、マイクロチャンバ１１の内面を、タンパク質の吸着を阻害する物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ））等でコーティングしてもよい。
【００３６】
≪細胞活性測定方法≫
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを用いた細胞活性測定方法を提供する。本実施形態の細胞活性方法は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程（以下、「工程Ｉ」という。）と、前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程（以下、「工程ＩＩ」という。）と、前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程（以下、「工程ＩＩＩ」という。）と、を含む。
【００３７】
図５は、細胞活性測定用デバイス１の使用方法の一例を示す図である。図６は、細胞活性測定用デバイス１を用いて細胞活性を測定している状態の一例を示す断面図である。図５、６では、培養容器５０で培養される細胞６０の細胞活性を、細胞活性測定用デバイス１で測定している。なお、培養容器５０中には、図示しない培地（細胞培養液）が存在しており、細胞６０は当該培地中で培養されている。
【００３８】
本実施形態の細胞活性測定方法において、活性測定の対象となる細胞は、特に限定されない。ヒト細胞であってもよく、ヒト以外の動物の細胞であってもよく、植物細胞であってもよい。また、原生動物、菌類、細菌類等であってもよい。ヒト細胞又はヒト以外の動物の細胞である場合、細胞の例としては、体細胞、生殖細胞、受精卵、幹細胞（例、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞など）、幹細胞から誘導された分化細胞（例、心筋細胞など）、免疫細胞、がん細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞は、図５、６の例のような培養細胞であってもよく、組織検体中の細胞であってもよい。細胞は浮遊細胞であっても接着細胞であってもよい。
【００３９】
また、活性測定の対象となる細胞が培養細胞である場合、図５、６の例のように、培養容器５０において培養中の細胞６０に対して、細胞活性測定用デバイス１を適用してもよい。培養容器５０の形状は、特に限定されず、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一例として、図５の例のようなシャーレ状の培養容器が挙げられる。
以下、シャーレ状培養容器５０で培養される細胞６０を細胞活性測定対象の例として、本実施形態の細胞活性測定方法の各工程について説明する。
【００４０】
（工程Ｉ）
工程Ｉは、細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程である。
本工程では、培養容器５０で培養される細胞６０に対して、細胞活性測定用デバイス１を被せればよい。これにより、図６の例のように、各マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂに細胞が収容される。なお、本明細書において、「マイクロチャンバに細胞が収容される」とは、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内に位置する場合に加えて、図６の例のように、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内の空間に接している場合も含まれる。また、細胞活性測定用デバイス１をかぶせた時に、マイクロチャンバ１１と培養容器５０とによって、測定対象となる細胞の周囲に閉鎖的な空間を形成する場合も含まれる。
【００４１】
各マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂに収容された細胞６０は、それぞれマイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内に代謝によって生じる環境因子を放出する。あるいは、代謝によって、各マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂに存在する環境因子を消費する。
【００４２】
なお、本工程では、熱の移動による培養環境への悪影響を抑制するために、細胞活性測定用デバイス１を、予め培養容器５０内の培地と同じ温度に保温しておいてもよい。
また、マイクロチャンバ１１内の空間と接する細胞６０の数は、単数であってもよく、複数であってもよい。
【００４３】
（工程ＩＩ）
工程ＩＩは、マイクロレンズが一体成形された一面側から、細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程である。
本工程では、図６の例のように、細胞活性測定用デバイス１のマイクロレンズ２１ａ、２１ｂ側に配置される光源４０から、細胞活性測定用デバイス１に対して光を照射する。当該照射光を、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂが受光することにより、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内の環境因子の量に依存して、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂにそれぞれ光学的変化が生じる。
【００４４】
照射する光の波長は、測定対象の環境因子の種類、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化の種類に応じて、適宜選択すればよい。例えば、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂがＰｔＯＥＰを含み、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化がリン光寿命の変化である場合、波長３８３ｎｍの紫外線を光源４０から照射することができる。
【００４５】
光源４０から細胞活性測定用デバイス１に照射された光は、マイクロレンズ２１ａ、２１ｂを通過する際に屈折し、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂにそれぞれ集光される。そのため、照射光の照射量が少ない、例えば照射光の光強度が小さい場合であっても、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂは、光学的変化が生じるのに十分な量の光を受光し得る。
光源４０から細胞活性測定用デバイス１に照射された光は、マイクロレンズ２１ａ、２１ｂのない部分においては、第２層２０及び第１層１０を透過して、細胞６０に照射される。そのため、照射光によって細胞６０への影響が起こり得るため、照射光の照射量はなるべく少なくすることが望ましい。
本実施形態では、マイクロレンズを細胞活性測定用デバイスに一体的に設けることにより、マイクロレンズを備えない細胞活性測定用デバイスにより測定する場合に比べ、照射光の照射量を少なくすることができる。そのため、、例えば、照射光として紫外線を用いる場合にも、細胞６０に対するダメージを低減することができる。
【００４６】
（工程ＩＩＩ）
工程ＩＩＩは、環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程である。
本工程においては、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂにそれぞれ配置される環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化をそれぞれ検出する。光学的変化の検出手段は、当該光学的変化の種類に応じて、適宜選択すればよい。一例として、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化がリン光寿命である場合、リン光寿命の検出には、蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計、蛍光撮像装置等を用いることができる。
【００４７】
環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化の検出は、マイクロレンズ２１ａ、２１ｂが配置される側、及び培養容器５０が配置される側のいずれで行ってもよい。マイクロレンズ２１ａ、２１ｂが配置される側で検出光の検出を行う場合、マイクロレンズ２１ａ、２１ｂにより検出光が集光されるため、光学的変化の検出感度が高く成り得る。また、いずれの側で検出光の検出を行う場合においても、検出光を検出器に導くための光学系を別途設計して用いてもよい。
【００４８】
環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化は、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂにおける環境因子の量にそれぞれ依存する。そのため、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂの光学的変化は、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内の環境因子の量を反映しており、当該環境因子の量は、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内の細胞の細胞活性を反映している。例えば、測定対象の環境因子が酸素である場合を例にすると、細胞６０の代謝によって、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内の酸素が消費される。細胞６０の活性が高いほど、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内で消費される酸素の量が多くなり、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂ内の酸素濃度が低下する。
環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂが、酸素濃度が低いほどリン光寿命が長くなる材料を含んでいる場合、酸素濃度の低下に伴い環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂのリン光寿命が長くなる。したがって、例えば、環境因子検出プローブ３０ａのリン光寿命が、環境因子検出プローブ３０ｂのリン光寿命よりも長い場合には、マイクロチャンバ１１ａ内の空間に接触する細胞６０の活性が、マイクロチャンバ１１ｂ内の空間に接触する細胞６０の活性よりも高いことを意味する。
このように、環境因子検出プローブ３０ａ、３０ｂに生じる光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ１１ａ、１１ｂに収容された細胞の活性をそれぞれ測定することができる。
【００４９】
本実施形態の細胞活性測定方法においては、培養容器内で培養される細胞の活性をそのまま測定できるため、細胞活性の測定による細胞への影響を小さくすることができる。また、照射光をマイクロレンズにより環境因子検出プローブに集光するため、照射光を少なくすることができ、細胞への影響をより低減できる。
【００５０】
さらに、マイクロチャンバの容積は、培養容器５０の容積に対して微小であるため、マイクロチャンバ内は外側の環境と比べて環境因子の濃度変化がより大きくなる。そのため、高い感度で環境因子を検出できる。また、マイクロチャンバ内では環境因子の濃度変化が大きくなるため、比較的短時間で測定を行うことができる。
【００５１】
本実施形態の細胞活性測定方法は、例えば以下の用途に利用することができる。
【００５２】
（用途例１：幹細胞の培養管理プロセスでの利用）
再生医療分野では、幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）をインビトロで増殖、分化させて、所望の細胞組織を生成する培養管理プロセスが存在する。上記の培養管理プロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、培養細胞の生物学的活性を測定することが不可欠となる。
上記の培養管理プロセスでは、幹細胞から生成される細胞組織を人体に戻すことが前提となる。そのため、上記の培養管理プロセスでは、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ培養細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる幹細胞の培養管理プロセスにおいて有用である。
【００５３】
（用途例２：卵細胞の選別での利用）
体外受精では、成功率を高めるために、より活性の高い受精卵を選別して子宮内に戻すことが行われている。上記の体外受精においても、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ卵細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。
かかる受精卵の活性測定の一例として、酸素センサを受精卵近傍に近づけて酸素濃度を求める手法が検討されている。しかし、細胞の代謝物は培地全体に拡散されることから、精度のよい活性測定は困難であった。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる卵細胞の選別の工程において有用である。
【００５４】
（用途例３：医薬品のスクリーニングでの利用）
医薬品のスクリーニングでは、医薬品が人体に及ぼす影響を確認するために、薬剤に感作された細胞の活性測定が行われる。一例として、新薬投与による心筋梗塞の有無を評価する場合、幹細胞から分化誘導した心筋細胞に薬剤を感作させて、その細胞の活性測定によって医薬品の安全性を評価することが想定される。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる医薬品のスクリーニングの工程において有用である。
【００５５】
≪細胞活性測定用デバイスの製造方法≫
１実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、（ａ）測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、（ｂ）前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第１層を形成する工程と、（ｃ）前記第１層上に、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第２層を形成する工程と、（ｄ）前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置に形成された前記第１層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、を含む。
【００５６】
図７は、本実施形態の製造方法の一例を示す概略図である。
まず、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で構成される環境因子検出プローブ層３１を用意する。環境因子検出プローブ層３１は、凸部（以下、「プローブ層凸部」という。）３３を一面側に有している（図７（１）；工程（ａ））。なお、環境因子検出プローブ層３１の一面側は、プローブ層凸部３３を有する結果として、プローブ層凹部３２を有している。プローブ層凹部３２とプローブ層凸部３３とは、互いに環境因子検出プローブ層３１の一面側における高さが異なる。プローブ層凹部３２は、環境因子検出プローブ層３１の一面側において、２以上の凸部を形成した結果として、形成されてもよい。また、プローブ層凸部３３は、環境因子検出プローブ層３１の一面側において、２以上の凹部を形成した結果として形成されてもよい。
次に、環境因子検出プローブ層３１のプローブ層凸部３３を有する面上に、測定対象の環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第１層１０を形成する。第１層１０は、第１層１０によりプローブ層凸部３３が覆われるように形成される（図７（２）；工程（ｂ））。環境因子検出プローブ層３１の、プローブ層凹部３２に対応する位置には第１層凸部１６が形成され、プローブ層凸部３３に対応する位置には第１層凹部１５が形成される。
次に、第１層１０上に、第２層２０を形成する。第２層２０の、プローブ層凸部３３に対応する位置には、マイクロレンズ２１が一体成形されている（図７（３）〜（５）；工程（ｃ））。すなわち、第２層２０の第１層凹部１５に対応する位置に、マイクロレンズ２１が一体形成される。なお、図７の例では、マイクロレンズ形状の凹部７１を有するモールド７０を用いて、第２層２０にマイクロレンズ２１を一体成形している。
次に、環境因子検出プローブ層３１を除去する。この際、環境因子検出プローブ層３１が、プローブ層凸部３３に対応する位置に形成された第１層凹部１５の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層３１の除去を行う。これにより、第１層凹部１５の内面に環境因子検出プローブ３０が形成される（図７（６）；工程（ｄ））。
なお、図７の例では、最後にモールド７０を離型して、細胞活性測定用デバイス１を製造している（図７（７））。
以下、本実施形態の製造方法における各工程について説明する。
【００５７】
（工程（ａ））
工程（ａ）は、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部（プローブ層凸部）を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程である。
【００５８】
環境因子検出プローブ層３１は、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料（以下、「環境因子検出材料」という。）で形成される。例えば、環境因子が酸素である場合、酸素の量に依存してリン光寿命が変化するリン光試薬を含む材料で、環境因子検出プローブ層が形成されてもよい。リン光試薬の例としては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００５９】
環境因子検出プローブ層３１は、公知の方法を特に制限なく用いて、形成することができる。例えば、平板基板上に、環境因子検出材料を塗布して、環境因子検出材料からなる層を形成し、当該層の一面側にプローブ層凹部３２及びプローブ層凸部３３を形成することにより、環境因子検出プローブ層３１を形成してもよい。環境因子検出材料からなる層の形成には、例えば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。また、プローブ層凹部３２及びプローブ層凸部３３の形成には、例えば、マイクロブラスト法、ドライエッチング法等を用いることができる。
【００６０】
あるいは、平板基板上に、環境因子検出材料を塗布し、凹凸形状を有するモールドをプレスすることにより、プローブ層凹部３２及びプローブ層凸部３３を一面側に有する環境因子検出プローブ層３１を形成してもよい。
【００６１】
あるいは、環境因子検出材料で形成された既存の樹脂シートに、上記のような方法でプローブ層凹部３２及びプローブ層凸部３３を形成して、環境因子検出プローブ層３１として用いてもよい。例えば、環境因子が酸素である場合には、ＰｔＯＥＰを含むスチレン樹脂シート等を用いることができる。
【００６２】
環境因子検出プローブ層３１の厚さは、製造予定の細胞活性測定用デバイス１におけるマイクロチャンバ１１の高さｈ１１以上であれば、特に限定されない。環境因子検出プローブ層３１の厚さとしては、例えば、１０〜３００μｍが挙げられる。環境因子検出プローブ層３１の厚さは、５０〜２００μｍであってもよく、１００〜２００μｍであってもよい。
【００６３】
また、プローブ層凹部３２及びプローブ層凸部３３のサイズは、製造予定の細胞活性測定用デバイス１におけるマイクロチャンバ１１のサイズに応じて、適宜選択すればよい。本実施形態の製造方法により製造される細胞活性測定用デバイス１において、マイクロチャンバ１１のサイズは、本工程におけるプローブ層凸部３３のサイズに規定される。そのため、プローブ層凸部３３のサイズとしては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」において、マイクロチャンバ１１のサイズとして挙げたものと同様のものが挙げられる。また、プローブ層凹部３２の幅は、細胞活性測定用デバイス１におけるマイクロチャンバ１１間の距離を規定する。
【００６４】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、環境因子検出プローブ層のプローブ層凸部を有する面上に、プローブ層凸部が覆われるように、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第１層を形成する工程である。
【００６５】
本工程において、第１層１０は、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料（以下、「環境因子透過阻害材料」という。）で形成される。第１層１０を形成する材料は、測定対象である環境因子の種類に応じて、適宜選択すればよく、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
環境因子検出プローブ層３１のプローブ層凸部３３を有する面に、環境因子透過阻害材料を塗布する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。たとえば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。なお、環境因子透過阻害材料は、プローブ層凸部３３が覆われるように塗布され、第１層１０は、プローブ層凸部３３を覆うように形成される。
【００６６】
上記のように、環境因子検出プローブ層３１上に第１層１０を形成すると、第１層１０の環境因子検出プローブ層３１に接する面には、プローブ層凸部３３及びプローブ層凹部３２のそれぞれ対応する位置に、第１層凹部１５及び第１層凸部１６が形成される。
【００６７】
本工程において形成される第１層１０の厚さ（第１層凸部１６の先端から他面側まで）は、特に限定されないが、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」において第１層の厚さｔ１０として例示したものと、同様のものが例示される。
【００６８】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、第１層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第２層を形成する工程である。
【００６９】
本工程において、第２層２０は、第１層１０と異なる材料で形成されてもよく、同じ材料で形成されてもよい。第２層２０を形成する材料としては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、塗布方法としては、第１層１０の形成において例示した方法と同様の方法が例示される。
【００７０】
本工程において形成される第２層２０の厚さは、特に限定されず、製造予定の細胞活性測定用デバイス１における第２層２０の厚さｔ２０及びマイクロレンズ２１の厚みｄに応じて、適宜選択すればよい。
【００７１】
第２層２０は、環境因子検出プローブ層３１のプローブ層凸部に対応する位置に（すなわち第１層凹部１５の対応する位置に）、マイクロレンズ２１が一体成形されている。
第２層２０にマイクロレンズ２１を一体成形する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、図７の例では、第１層上に、第２層を形成する材料を塗布して第２層２０（マイクロレンズ２１を有さない第２層２０）を形成し、マイクロレンズ形状の凹部７１を有するモールド７０を、第２層２０に押し当て、第２層２０を硬化することにより、マイクロレンズ２１の一体成形を行っている。モールド７０を用いてマイクロレンズ２１の一体成形を行うことにより、環境因子検出プローブ層３１のプローブ層凸部３３に対応する位置（すなわち、第１層凹部１５に対応する位置）へのマイクロレンズ２１の配置を容易に行うことができる。
【００７２】
モールド７０を第２層２０に押し当てた後、第２層２０を硬化させる方法は、第２層２０を形成する材料に応じて、適宜選択すればよい。例えば、第２層２０が紫外線硬化樹脂で形成される場合には、紫外線照射により第２層２０を硬化させることができる。また、第２層２０が熱硬化樹脂で形成される場合には、熱を加えることにより第２層２０を硬化させることができる。
【００７３】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）は、環境因子検出プローブ層が、プローブ層凸部に対応する位置に形成された第１層の凹部の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層を除去し、第１層凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程である。
【００７４】
本工程では、環境因子検出プローブ層３１が、第１層凹部１５の内面のみに残るように、、環境因子検出プローブ層３１を除去する。なお、「第１層凹部１５の内面のみに残る」とは、第１層凹部１５の内面の少なくとも一部が、環境因子検出プローブ層３１で被覆されている状態を指し、且つ第１層凹部１５全体が環境因子検出プローブ層３１で満たされた状態は除かれる。第１層凹部１５の内面に残された環境因子検出プローブ層３１は、第１層凹部１５の内面全体を被覆してもよく、内面の一部のみを被覆していてもよい。一例として、環境因子検出プローブ層３１は、第１層凹部１５の内面の一部のみに残るようにする。第１層凹部１５の内面に残された環境因子検出プローブ層３１は、第１層凹部１５の底部内面及び内側面の少なくとも一部を被覆し、環境因子検出プローブ３０を形成する。
第１層凹部１５の内面に残す環境因子検出プローブ層３１の位置及び厚さは、特に限定されず、形成する環境因子検出プローブ３０の配置及び厚さｔ３０に応じて、適宜選択すればよい。環境因子検出プローブ３０の位置及び厚さｔ３０としては、「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げた例と同様の例が挙げられる。
【００７５】
環境因子検出プローブ層３１の除去方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ドライエッチング法、マイクロブラスト法等を用いることができる。
【００７６】
（他の工程）
本実施形態の製造方法は、上記工程（ａ）〜（ｄ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、モールドを離型する工程（離型工程）、環境因子検出プローブ層を発泡させる工程（発泡工程）等が挙げられる。
【００７７】
＜離型工程＞
工程（ｃ）において、モールド７０を用いてマイクロレンズ２１の一体成形を行った場合、本実施形態の製造方法は、モールド７０を離型する工程を含んでいてもよい。モールド７０の離型は、工程（ｄ）の後に行ってもよく、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に行ってもよい。
【００７８】
＜発泡工程＞
環境因子検出プローブ層３１が、発泡剤を含む環境因子検出材料で形成されている場合、本実施形態の製造方法は、当該発泡剤を反応させて、環境因子検出プローブ層３１を発泡させる工程を含んでいてもよい。この場合、環境因子検出プローブ３０が多孔質である、細胞活性測定用デバイス１を製造することができる。図８は、発泡工程を含む場合の本実施形態の製造方法の一例を示す概略図である。
【００７９】
発泡工程を含む場合、工程（ａ）では、発泡剤を含む環境因子検出材料で形成された環境因子検出プローブ層を用意する。図８の例では、発泡剤を含む環境因子検出材料を用いて形成された環境因子検出プローブ層を３１’で示している。
発泡工程は、一例として、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に行う。本実施形態の製造方法が、離型工程を含み、離型工程を工程（ｃ）と工程（ｄ）との間に行う場合には、発泡工程は離型工程の前に行ってもよく、離型工程の後に行ってもよい。
図８の例では、図８（６）が発泡工程を示しており、発泡後の環境因子検出プローブ層を３１”で示している。
【００８０】
環境因子検出プローブ層３１’を発泡させる工程では、環境因子検出プローブ層３１’に含まれる発泡剤を反応させて、環境因子検出プローブ層３１’を発泡させる。発泡剤を反応させる方法は、発泡剤の種類に応じて、適宜選択すればよい。発泡剤としては、例えば、炭酸カルシウムを用いることができ、この場合、ベーク処理を行うことにより反応させることができる。
【００８１】
本実施形態の製造方法によれば、個々のマイクロチャンバに対応する位置に、マイクロレンズを効率よく配置することができる。そのため、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスの製造を効率よく行うことができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
第１層をＥＶＯＨ、第２層をＰＤＭＳ、第２層の厚さｔ２０＝１００μｍ、マイクロチャンバの直径φ１１＝１００μｍの細胞活性測定用デバイスを仮定し、マイクロレンズの厚みｄ及び曲率半径Ｒの一方を固定し、一方を変動させた場合に、環境因子検出プローブが受光する光強度を計算した。
照射光としては、３８３ｎｍの紫外線を仮定した。ＰＤＭＳにおける３８３ｎｍの紫外線の屈折率はｎ＝１．４４とした。計算の簡略化のために、ＥＶＯＨはＰＤＭＳと光学的に等価とした。
マイクロレンズありの場合の光強度をＩ、マイクロレンズ無しの場合の光強度をＩ０とすると受光強度比は下記式で与えられる。
【００８４】
【数１】
2019037180.tif 000003
【００８５】
図９は、マイクロレンズの曲率半径Ｒ＝１５０μｍに固定し、厚みｄを変動させた場合の環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。図１０は、マイクロレンズの厚みｄ＝５０μｍに固定し、曲率半径Ｒを変動させた場合の環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。図９及び図１０のグラフ中、「受光強度比」は、マイクロレンズがない場合の受光強度を１とした場合の比率を示す。
図９及び図１０において受光強度を算出した範囲では、いずれの場合も、マイクロレンズがない場合と比較して、受光強度が１．５倍以上となった。マイクロレンズの厚みｄ＝５０μｍ、曲率半径Ｒ＝１５０μｍとしたとき、マイクロレンズがない場合と比較して受光強度は約２倍となった。
【符号の説明】
【００８６】
１…細胞活性測定用デバイス、１０…第１層、１１、１１ａ、１１ｂ…マイクロチャンバ、１５…第１層凹部、１６…第１層凸部、２０…第２層、２１、２１ａ、２１ｂ…マイクロレンズ、３０…環境因子検出プローブ、３１…環境因子検出プローブ層、３１’…発泡剤を含む環境因子検出プローブ層、３１”…発泡させた環境因子検出プローブ層、３２…プローブ層凹部、３３…プローブ層凸部、４０…光源、５０…培養容器、６０…細胞、７０…モールド、７１…モールドの凹部
【図１】
2019037180.tif 000004
【図２】
2019037180.tif 000005
【図３】
2019037180.tif 000006
【図４】
2019037180.tif 000007
【図５】
2019037180.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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