(57)【要約】      （修正有）【課題】ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法の提供。【解決手段】アミノ酸配列が、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメイン：Ｎ−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−Ｃを含むアミノ酸配列を含む抗体ノロウイルスに結合可能な。（ＦＲはフレームワーク領域のアミノ酸配列；ＣＤＲは相補性決定領域のアミノ酸配列；ＣＤＲ１は特定の配列からなるアミノ酸配列のいずれか；ＣＤＲ２は特定の配列からなるアミノ酸配列のいずれか；ＣＤＲ３は、特定の配列からなるアミノ酸配列のいずれか；前記抗体が、固相担体及び標識物質の少なくとも一方と結合されている、複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列を含む抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含み、
Ｎ  −  ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  −  Ｃ
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記ＣＤＲ１は配列番号：１〜６により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記ＣＤＲ２は、配列番号：７〜１２により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、かつ
前記ＣＤＲ３は、配列番号：１３〜１７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記抗体は、ノロウイルスに結合可能である。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体であって、前記ノロウイルスはGII/4型である。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体であって、
前記ＦＲ１は、配列番号：１８〜２３により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記ＦＲ２は、配列番号：２４〜２８により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記ＦＲ３は、配列番号：２９〜３４により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、かつ
前記ＦＲ４は、配列番号：３５〜３７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体を含み、前記抗体は、固相担体及び標識物質の少なくとも一方と結合されている、複合体。
【請求項５】
前記固相担体は、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター及び薄膜から選択される、
請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記標識物質は、蛍光物質、発光物質、色素、酵素及び放射性物質から選択される、
請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
請求項４に記載の複合体と、検出部とを含み、
前記検出部は、被分析物中の前記ノロウイルスと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出する、
検出装置。
【請求項８】
請求項４に記載の複合体と、被分析物とを接触させるステップと、
前記被分析物中の前記ノロウイルスと前記複合体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化を検出するステップとを含む、
検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノロウイルスに結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、ノロウイルスに結合する抗体を開示している。特許文献１に開示された抗体の少なくとも一部は、アルパカに由来する。特許文献１は、本明細書に参照として援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／０１０２１３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、アミノ酸配列を含む抗体であって、前記アミノ酸配列は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含み、
Ｎ  −  ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  −  Ｃ
ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示し、
前記ＣＤＲ１は配列番号：１〜６により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記ＣＤＲ２は、配列番号：７〜１２により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、かつ
前記ＣＤＲ３は、配列番号：１３〜１７により表されるアミノ酸配列のいずれかを含み、
前記抗体は、ノロウイルスに結合可能である、抗体に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる様々な遺伝子をライゲーションするために用いられたベクターのマップを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａに示されるベクターマップの詳細を示す。
【図２】図２は、ＶＨＨ抗体を発現するために用いられたベクターの合成手順を示す。
【図３】図３は、配列番号：38により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図４】図４は、配列番号：39により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図５】図５は、配列番号：40により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：５００ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：２５０ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：６２．５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３１．２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｆ】図６Ｆは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１５．６３ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図６Ｇ】図６Ｇは、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：７．８１ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：５００ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：２５０ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：６２．５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３１．２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｆ】図７Ｆは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１５．６３ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｇ】図７Ｇは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：７．８１ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図７Ｈ】図７Ｈは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３．９１ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。グラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：５００ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：２５０ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｄ】図８Ｄは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：６２．５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｅ】図８Ｅは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３１．２５ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｆ】図８Ｆは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：１５．６３ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｇ】図８Ｇは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：７．８１ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図８Ｈ】図８Ｈは、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体（濃度：３．９１ｎＭ）のノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図９】図９は、配列番号：３８により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、配列番号：３９により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、配列番号：４０により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、配列番号：４１により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、配列番号：４２により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、配列番号：４３により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体を固定し、ノロ抗原を濃度1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調製し順次加えたときのノロ抗原への結合能力のＳＰＲ評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明による抗体は、ノロウイルスに結合する。特に、本発明による抗体は、GII/4型ノロウイルスに結合する。特許文献１にも開示されているように、ノロウイルスに結合する抗体は、ＮからＣの方向に、以下の構造ドメインを含むアミノ酸配列を含む。
Ｎ  −  ＦＲ１  −  ＣＤＲ１  −  ＦＲ２  −  ＣＤＲ２  −  ＦＲ３  −  ＣＤＲ３  −  ＦＲ４  −  Ｃ
ここで、ＦＲは、フレームワーク領域のアミノ酸配列を示し、かつＣＤＲは、相補性決定領域のアミノ酸配列を示す。
【０００９】
本発明においては、ＣＤＲ１は配列番号：1〜6により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む。
【００１０】
本発明においては、ＣＤＲ２は、配列番号：7〜12により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む。
【００１１】
本発明においては、ＣＤＲ３は、配列番号：13〜17により表されるアミノ酸配列のいずれかを含む。
【００１２】
望ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号：1〜6、配列番号：7〜12、および、配列番号：13〜17のいずれかで表される。この場合、より望ましくは、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４は、それぞれ、配列番号：18〜23、配列番号：24〜28、配列番号：29〜34、および配列番号：35〜37のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む。
特に、本発明による抗体は、配列番号： 38〜43で表されるアミノ酸配列を含むことがより望ましい。
【００１３】
配列番号：38〜43により表されるアミノ酸配列を含む抗体は、ノロウイルスに結合し、特にGII/4型に結合する。
【００１４】
なお、本明細書において「含む」とは、「からなる」と、「本質的にからなる」とを包含する。
【００１５】
本発明の抗体は、ノロウイルスを検出するための検出装置または検出方法において用いられ得る。この場合、本発明の抗体は、他の物質と結合した複合体、例えば、固相担体及び標識物質の少なくとも一方に結合した複合体の状態で用いられてもよい。
【００１６】
固相担体は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。固相担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、薄膜などが挙げられる。固相担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、ガラスなどが挙げられる。抗体を固相担体へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
【００１７】
標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、放射性物質などが使用される。抗体を標識物質へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
【００１８】
本発明の抗体を用いた検出方法では、当該抗体を含む複合体と被分析物とが接触させられ、被分析物中のノロウイルスと、複合体中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。
【００１９】
本発明の抗体を用いた検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記物理量のいずれかを検出するための検出部を含む。検出部は、各種光度計、分光器、線量計など公知の装置で構成される。
【００２０】
本発明の抗体は、他の物質と結合した複合体の他、本発明の抗体を含む組成物、または本発明の抗体を含むキットとしても用いられ得る。
【実施例】
【００２１】
（実施例１）
ノロウイルスG11/4型の表面に存在するタンパク質に結合するペプチドとして、ＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。
【００２２】
（アルパカへの免疫および単核球の取得）
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、ノロウイルスGII/4型(NSW-2012)由来の抗原が作製された。すなわち、この型のカプシドタンパク質のPドメインタンパク質をリコンビナントし、ノロウイルスの抗原（配列番号：44）としてアルパカに免疫された（以下、ノロ抗原）。ノロ抗原はアジュバントを用いてアルパカに投与される前に調製された。
【００２３】
実施例１において用いられたノロ抗原（配列番号：44）の配列は以下の通りである。なお、本明細書における塩基またはアミノ酸の略号は、特許庁発行の、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」に従った。
MKMASNDANPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKIIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNSYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFSPKLGRVQFATDTDNDFETNQNTKFTPVGVIQDGGTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL（配列番号：44）
【００２４】
具体的には、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するノロ抗原が、アルパカへ投与された。１週間後、再度、同じ濃度を有するノロ抗原が、アルパカへ投与された。このようにして、５週間かけて５回、アルパカはリコンビナントタンパク質を用いて免疫された。さらに１週間後、アルパカの血液を採取した。次いで、以下のように血液から単核球が取得された。
【００２５】
リンパ球分離チューブ（株式会社グライナージャパンより購入、商品名：Leucosep）に、血球分離溶液（コスモ・バイオ株式会社より購入、商品名：Lymphoprep）が添加された。次いで、溶液は、摂氏20度の温度で1000×gで1分間遠心された。
【００２６】
アルパカから採取された血液は、ヘパリンによって処理された。次に、このように処理された血液に等量のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「PBS」という）が添加され、サンプル液を得た。次いで、サンプル液は血球分離溶液が添加されたリンパ球分離チューブに添加された。
【００２７】
リンパ球分離チューブは、摂氏20度の温度で800×gで30分遠心された。
【００２８】
単核球を含有する画分が回収され、３倍の容量を有するPBSが添加された。画分は、摂氏20度の温度で300×gで5分遠心された。沈殿物が、PBSを用いて穏やかに懸濁された。懸濁後、細胞数の測定のために10マイクロリットルの懸濁液が分離された。残りの懸濁液が、摂氏20度の温度で300×gで5分間遠心された。
【００２９】
沈殿物に２ミリリットルの容積を有するＲＮＡ保存溶液（商品名：RNAlater）が添加された。次いで、溶液は穏やかに懸濁された。懸濁液が、２本の1.5mLチューブに注入された。各チューブは、１ミリリットルの懸濁液を含んでいた。チューブは、摂氏−２０度の温度下で保存された。細胞数の測定のために分離された懸濁液（５マイクロリットル）が、チュルク液（１５マイクロリットル）と混合され、血球計算盤を用いて単核球の数が数えられた。
【００３０】
（ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製）
次に、単核球からTOTAL  RNAを抽出し、そしてVHH抗体のcDNA遺伝子ライブラリが以下の手順で作製された。以下の手順では、RNase free gradeの試薬および器具が使用された。
【００３１】
単核球分画に、トータルＲＮＡ抽出試薬（商品名：TRIzol Reagent、１ミリリットル）を加えた。試薬は緩やかに混和され、そして室温にて5分間放置された。クロロホルム（200マイクロリットル）が試薬に加えられ、そして15秒間、試薬は力強く振られた。試薬は、室温で２〜３分間静置された。試薬は、摂氏４度で15分間、12,000xg以下で遠心された。
【００３２】
上清が新しいチューブに移された。RNaseフリー水およびクロロホルム（各２００マイクロリットル）がチューブに加えられた。さらに500ミリリットルのイソプロパノールがチューブに加えられた。チューブに含まれる液体はボルテックスミキサーを用いて撹拌された。液体は室温で10分間静置された。次いで、液体は摂氏４度の温度で15分間、12,000xg以下で遠心された。上清が捨てられ、沈殿物が１ミリリットルの75%エタノールでリンスされた。この溶液は、摂氏４度の温度で５分間、7,500xg以下で遠心された。溶液は乾燥され、全RNAを得た。得られた全RNAは、RNaseフリー水に溶解された。
【００３３】
Total RNAからcDNAを取得するため、逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit）が用いられた。キットに含まれるRandom 6 merおよびOligo dT primerがプライマーとして用いられた。キットの標準プロトコルに従って、cDNAが取得された。
【００３４】
アルパカに含まれるＶＨＨ抗体の遺伝子が、cDNAからＰＣＲ法によって獲得された。ＰＣＲのための酵素はタカラバイオ株式会社よりEx-taqの商品名として入手された。
【００３５】
以下の試薬が混合され、混合液を得た。
10x buffer      5マイクロリットル
dNTPs           4マイクロリットル
Primer F        2マイクロリットル
Primer R        2マイクロリットル
cDNA template   1マイクロリットル
Ex-taq          0.25マイクロリットル
【００３６】
混合液は以下のＰＣＲ法に供された。
まず、混合液は、摂氏９５度で２分間で加熱された。
次いで、混合液の温度は、以下のサイクルに従って変化された。
摂氏９６度で３０秒間
摂氏５２度で３０秒間、そして
摂氏６８度で４０秒間。
このサイクルが３０回繰り返された。
最後に、混合液は、摂氏６８度で４分間加熱した後、摂氏４度で保存された。
このＰＣＲ法においては、以下のプライマーが使用された。
primer 1:  5’- GGTGGTCCTGGCTGC -3’  （配列番号：45）
primer 2:  5’- ctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggcTSAGKTGCAGCTCGTGGAGTC -3’  （配列番号：46）
primer 3:  5’- TGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’  （配列番号：47）
primer 4:  5’- TTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’  （配列番号：48）
primer 5:  5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’  （配列番号：49）
primer 6:  5’- tttgCtctGCGGCCGCagaGGCCgaTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’  （配列番号：50）
(参考文献：Biomed Environ Sci, 2012; 27(2):118-121)
【００３７】
３回のＰＣＲ法が実施された。
１回目のＰＣＲ法では、cDNA、Primer 1 およびPrimer 3からなるプライマーセットＡ、およびcDNA、Primer 1 およびPrimer 4からなるプライマーセットＢが用いられた。
２回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 3からなるプライマーセットＣ、およびプライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 4からなるプライマーセットＤが用いられた。
３回目のＰＣＲ法では、プライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 5からなるプライマーセットＥ、およびプライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Primer 2 およびPrimer 6からなるプライマーセットＦが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが形成された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥおよびプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。
【００３８】
（ファージライブラリの作製）
次に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリから、以下の手順に従ってファージライブラリが作製された。
【００３９】
市販されているプラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ株式会社より入手可能）由来のプラスミドベクター１（４０５７塩基対、図１Ａ参照）が、制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。図１Ａにおける制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）は、GGCCCAGCCGGCC（配列番号：51）により表される遺伝子配列からなる。制限酵素サイトＳｆｉＩ（ｂ）は、GGCCTCTGCGGCC（配列番号：52）により表される遺伝子配列からなる。図１Ｂは、プラスミドベクター１の詳細なベクターマップを示す。
【００４０】
プラスミドベクター１は、以下の配列からなる。
gacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccAAGCTTCGAAGGAGACAGTCATAatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgcGGCCCAGCCGGCCatggagcTCAAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCAGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCGATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTTGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTgtaGGCCtctGCGGCCGCagaGcaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcaTAGggttccggtgattttgattatgaaaagatggcaaacgctaataagggggctatgaccgaaaatgccgatgaaaacgcgctacagtctgacgctaaaggcaaacttgattctgtcgctactgattacggtgctgctatcgatggtttcattggtgacgtttccggccttgctaatggtaatggtgctactggtgattttgctggctctaattcccaaatggctcaagtcggtgacggtgataattcacctttaatgaataatttccgtcaatatttaccttccctccctcaatcggttgaatgtcgcccttttgtctttagcgctggtaaaccatatgaattttctattgattgtgacaaaataaacttattccgtggtgtctttgcgtttcttttatatgttgccacctttatgtatgtattttctacgtttgctaacatactgcgtaataaggagtctTAATAAgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgCATATGaAAATTGTAAgcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacaGGGCGCGTcccatATGgtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcga（配列番号：77）
【００４１】
同様に、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリも制限酵素ＳｆｉＩにより処理された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。
【００４２】
このように処理されたプラスミドベクター１が、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、１：２の割合で混合された。混合液に、酵素（東洋紡株式会社より入手、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２）が注入された。混合液は摂氏１６度の温度下で２時間静置された。このようにして、ＶＨＨ抗体遺伝子断片がプラスミドベクター１にライゲーションされた。
【００４３】
このようにしてライゲーションされたプラスミドベクター１を用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＨＳＴ０２）がトランスフェクトされた。
【００４４】
次いで、大腸菌は、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度を有するアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地上で１５時間、培養された。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれる遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。
【００４５】
培養後、２ＹＴプレート培地上に形成されたシングルコロニーの数をカウントすることでライブラリの濃度を算出した。その結果、ライブラリは、５ｘ１０７／ミリリットルの濃度を有していた。
【００４６】
（バイオパニング）
核内タンパク質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。
【００４７】
ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に結合するクローンを抽出するため、２回のバイオパンニングを実施した。
【００４８】
ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された大腸菌（ＨＳＴ０２）を、吸光度を示す値（OD600）が1.0になるまで摂氏３０度にて１００mLの 2YT AG（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１%グルコースを含有した２ＹＴ培地）の培地中で培養し、大腸菌を増殖させた。
【００４９】
ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を感染多重度（ＭＯＩ）がおよそ２０となるよう大腸菌含有培地へ加えた。
【００５０】
その後、培地が３０分ほど摂氏３７度で保温された。次いで、培地を4000rpmの回転数で10分間遠心し、大腸菌を回収した。１００mLの2YTAK培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏30度で、２１３ｒｐｍにて遠心しながら、大腸菌を一晩培養した。
【００５１】
上記のように培養された大腸菌を含有する培養液（１００ミリリットル）が、２本の遠沈管（容積：５０ミリリットル）に注入された。２つの培養液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清（各２０ミリリットル）が回収された。
【００５２】
上清（４０ミリリットル）が、NaCl（２．５Ｍ）を含有する20% PEG溶液（１０ミリリットル）に添加された。次いで、混合液は、転倒混和された。その後、混合液は、およそ１時間氷上にて冷却された。混合液は、４０００ｒｐｍの回転数で10分間遠心された。次いで、上清が除去された。10%グリセロールを含有するPBSが沈殿物に向けて注入された。最後に、沈殿物は、ほぐしながら溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。
【００５３】
（ノロ抗原に特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング）
（Ａ）  ノロ抗原の固定化
ノロ抗原をＰＢＳと混合し、ノロ抗原溶液を調製した。ノロ抗原の濃度は２マイクログラム／ミリリットルであった。ノロ抗原溶液（２ミリリットル）が、イムノチューブ（ヌンク社より購入）に注入された。ＮＰ溶液はイムノチューブ内で一晩静置された。このようにして、イムノチューブの内部にＮＰが固定された。
次いで、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たした。このようにして、ノロ抗原が抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。その後、イムノチューブの内部がＰＢＳを用いて３回、洗浄された。
【００５４】
（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ミリリットル）が、３％のスキムミルクを含有した３ミリリットルのＰＢＳと混合され、混合液を調製した。混合液は、ノロ抗原が固定化されたイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
イムノチューブは、室温にて１時間、静置された。
イムノチューブの内部は、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＳＴ」という）で１０回、洗浄された。
イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴにより満たされた。その後、イムノチューブは、１０分間、静置された。次いで、イムノチューブの内部は、ＰＢＳＴで１０回、洗浄された。
【００５５】
ノロ抗原に結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを抽出するために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）がイムノチューブに注入された。
イムノチューブには、パラフィルムからなる蓋が取り付けられた。次いで、イムノチューブは、ローテーターを用いて、１０分間、転倒しながら回転された。
【００５６】
溶液を中和するため、溶液は、１ｍＬの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ：６．８）を含有するチューブに移した。再度、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ミリリットル）を用いたファージの抽出を繰り返した。このようにして、３ｍＬの抽出液が得られた。
【００５７】
抽出液（１ｍＬ）が、９ｍＬの大腸菌ＨＳＴ０２と混合された。混合液は、摂氏３０度の温度で１時間、静置された。
【００５８】
コロニーを計数するため、大腸菌ＨＳＴ０２を含有する１０マイクロリットルの混合液は、２ＴＹＡ培地を含む小プレート（１０ミリリットル／プレート）にまかれた。
【００５９】
残りの混合液は遠心分離された。上澄み液は捨てられ、かつ沈殿物は２ＴＹＡ培地を含む大プレート（４０ミリリットル／プレート）にまかれた。これらの２つのプレートは、摂氏３０度の温度下にて一晩静置された。このようにして、１回目のパニングが行われた。
【００６０】
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。
【００６１】
２回目のパニングの後、大腸菌のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルは、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＧ培地を含有していた。
【００６２】
ウェル内の溶液が、摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で撹拌された。
【００６３】
増殖した大腸菌を含む溶液（５０マイクロリットル）が回収された。回収された溶液は、プレートに含まれる５０マイクロリットルの２ＹＴＡ培地と混合された。２ＹＴＡ培地は、感染多重度ＭＯＩが２０になるようなヘルパーファージを含有していた。溶液は、摂氏３７度の温度で４０分間静置された。
【００６４】
２ＹＴＡ培地を含むプレートは、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。上清が捨てられた。沈殿物が大腸菌を含んでいた。沈殿物は、２００マイクロリットルの２ＹＴＡＫ培地と混合された。混合液は、摂氏３０度にて一晩静置された。
【００６５】
混合液は、１８００ｒｐｍにて２０分間遠心分離された。大腸菌を含む上清が回収された。
【００６６】
（Ｃ）  ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体および抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入、商品名：ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに、２マイクログラム／ミリリットルの濃度を有する核内タンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるノロ抗原タンパク質溶液の容積は、５０マイクロリットルであった。９６ウェルプレートは、４℃で１晩、放置された。このようにして、ノロ抗原が各ウェルに固定された。
【００６７】
各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社より入手）を含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、ノロ抗原が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。
【００６８】
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージはノロ抗原と反応した。
【００６９】
各ウェルは、ＰＢＳＴを用いて３回、洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社より入手、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０マイクロリットル／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回、洗浄された。
【００７０】
発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より入手、商品名：1-STEP ULTRA TMB-ELISA）が各ウェルに注入された（５０マイクロリットル／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。
【００７１】
硫酸水溶液（１規定）が５０マイクロリットル／ウェルの濃度で各ウェルに添加され、反応を停止させた。
【００７２】
４５０ナノメートルの波長での溶液の吸光度が測定された。
【００７３】
良好な吸光度測定の結果を有する６ウェルが選択された。選択された６つのウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。ＤＮＡ配列の解析結果は、以下のとおりである。以下の６つのＤＮＡ配列が見いだされた。
（配列番号：53、54、55、56、57、58）
【００７４】
配列番号：53、54、55、56、57、58により表されるＤＮＡ配列から合成される蛋白質は、それぞれ以下のアミノ酸配列からなる。
（配列番号：38、39、40、41、42、43）
【００７５】
（抗ノロウイルス  ＶＨＨ抗体の発現）
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）がＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社より購入された。Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、ＰＣＲ法で３ｘＦｌａｇタグおよび２つの制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。図２を参照されたい。図２に示される手順が、以下、詳細に説明される。
【００７６】
まず、以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に付加された。
Primer 1: 5’- GCCGGCTGGGCcGCGAGGAGCAGCAGACCA -3’ （配列番号：59）
Primer 2: 5’- GCCCAGCCGGCcATGGCCATGGATATCGGA -3’ （配列番号：60）
【００７７】
次に、以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩを有する３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- CATGGATATCGGAATTAATTCggatccGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCctcgagCACCACCACCACCACCACTGA -3’ （配列番号：61）
Primer 2: 5’- TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGctcgagGATGTCATGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCggatccGAATTAATTCCGATATCCATG -3’ （配列番号：62）
【００７８】
２つの制限酵素ＢａｍｈＩおよびＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、この３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
【００７９】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、３ｘＦｌａｇタグＤＮＡ断片が、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
【００８０】
以下２つのプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社より入手、商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて、ＰＣＲ法により、５’末端側および３’末端側にそれぞれ制限酵素サイトＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩを有するＤＮＡ断片が作製された。
Primer 1: 5’- AAATACCTGCTGCCGccatggATATCGGAATTAATTCggcctctgcggccGCAggatccGACTACAAAGACCAT-3’ （配列番号：63）
Primer 2: 5’- ATGGTCTTTGTAGTCggatccTGCggccgcagaggccGAATTAATTCCGATATccatggCGGCAGCAGGTATTT-3’ （配列番号：64）
【００８１】
次に、２つの制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍｈＩ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片およびベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が処理された。
【００８２】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社より入手）を用いて、このＤＮＡ断片がベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）にライゲーションされた。このようにして、３ｘＦｌａｇタグおよび制限酵素サイトＳｆｉＩ（ａ）（ｂ）が付加されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が得られた。
【００８３】
ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）のシーケンスがグライナー社により解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
【００８４】
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が選択された。
【００８５】
ＰＣＲ法により得られた液体に含まれるベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＤＮＡ抽出キット（プロメガ社より入手）を用いて、５０マイクロリットルの蒸留水中で精製かつ回収された。このようにして回収されたベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）が、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。
【００８６】
一方、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片がライゲーションされたプラスミドベクター１が、ＳｆｉＩ制限酵素で処理された。このようにして、それぞれ配列番号：38、39、40、41、42および配列番号43により表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を含む以下の6つのＤＮＡ（配列番号：65、66、67、68、69および配列番号：70）が得られた。
【００８７】
これらの６つのＤＮＡは、ＳｆｉＩ制限酵素により処理された。次に、このようにして処理されたＤＮＡが、電気泳動法により回収された。回収されたＤＮＡ（配列番号：71、72、73、74、75および配列番号：76）は、ＳｆｉＩ制限酵素により処理されたプラスミドに、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ株式会社より入手）を用いてライゲーションされた。
【００８８】
ライゲーション溶液（２．５マイクロリットル）および大腸菌ＤＨ５α（ニッポンジーンより入手、２５マイクロリットル）が氷上にて混合された。混合液は、６分間、氷上にて静置された。次いで、混合液は、摂氏４２度で４５秒間加熱された。最後に、混合液は、１分間、氷上で静置された。この手順は、一般的なヒートショック法として知られている。
【００８９】
全量の混合液が、１００マイクログラム／ミリリットルの濃度でアンピシリンを含有するＬＢＡ培地上に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度で一晩静置された。
【００９０】
ＬＢＡ培地上に形成されたコロニーの中から、３つのコロニーが選択された。選択された３つのコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）で一晩培養された。
【００９１】
培養された大腸菌に含まれるプラスミドは、プラスミド抽出キット（株式会社キアゲンより入手、商品名：ＱＩＡｐｒｅｐｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて、ＬＢＡ培地から抽出された。目的のＶＨＨ抗体の遺伝子がプラスミドに挿入されていることを確認するため、プラスミドの配列がグライナー社によって解析された。シーケンスの解析のために、一般的なＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒセットが用いられた。
【００９２】
シーケンスの解析を通して目的通りに形成されたことが確認されたプラスミドが選択された。
【００９３】
選択されたプラスミドを用いて、大腸菌（Competent Cell BL21 (DE3) pLysS, ライフ  テクノロロジーズ社より入手）がヒートショック法によりトランフェクトされた。
【００９４】
トランスフェクトされた大腸菌を含有する溶液に、ＳＯＣ培地（５０マイクロリットル）が添加された。次いで、大腸菌は、２１３ｒｐｍで振とうされながら、摂氏３７度で１時間、回復培養された。
【００９５】
次いで、大腸菌溶液が回収された。回収された大腸菌溶液（５ミリリットル）は、ＬＢＡ培地に散布された。ＬＢＡ培地は、摂氏３７度の温度で一晩、静置された。
【００９６】
ＬＢＡ培地内に形成されたコロニーの中から、１つのコロニーが選択された。選択されたコロニーは、爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされたコロニーは、ＬＢＡ培地（３ミリリットル）中で、２１３ｒｐｍで振とうされながら摂氏３７度の温度で培養された。このようにして、培養液を得た。
【００９７】
さらに、培養液（２５ミリリットル）はＬＢＡ培地（５００ミリリットル）に混合された。６００ナノメートルの波長での混合液の吸光度が０．５になるまで、混合液は摂氏３７度の温度で１６０ｒｐｍで振とうされた。
【００９８】
吸光度が０．５となったのち、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）溶液が混合液に添加された。ＩＰＴＧ溶液の最終濃度は１ｍＭであった。混合液に含有される大腸菌は、摂氏３７度で６時間、培養された。培養された大腸菌を回収するため、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心された。
【００９９】
回収された大腸菌は、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液は、ボルテックスミキサーを用いて撹拌された。このようにして、大腸菌が洗浄された。次いで、混合液は、６０００ｒｐｍで１０分間、摂氏４度で遠心され、大腸菌を回収した。回収された大腸菌は、再度、１０倍の容量を有するＰＢＳに混合された。混合液に含有される大腸菌は、超音波を用いて破砕された。
【０１００】
大腸菌を含む破砕液は、１００００ｒｐｍで１５分間、摂氏４度で遠心された。上清が回収された。回収された上清は、０．４５マイクロメートルフィルタを用いて濾過された。
【０１０１】
濾液は、Ｈｉｓ−ｔｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて推奨プロトコルに従って精製された。精製時には、１ミリリットルの濾液のために３マイクロリットルの全量を有する溶出バッファが用いられた。濾液に含有される緩衝液が、ＰＤ−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて、ＰＢＳに置換された。置換時には、１ミリリットルの濾液のために２．５マイクロリットルの全量を有するＰＢＳが用いられた。このようにして、ＶＨＨ抗体を含有する溶液が得られた。
【０１０２】
このようにして得られた溶液に含有されるＶＨＨ抗体は、吸光度計（スクラム社より入手、商品名：ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて、２８０ナノメートルでの波長での吸収測定値に基づいて定量された。その結果、ＶＨＨ抗体の濃度は４ミリグラム／ミリリットルであった。
【０１０３】
（Ｄ−１）  ノロ抗原を用いたＶＨＨ抗体の表面プラズモン共鳴評価
ノロ抗原および表面プラズモン共鳴評価装置を用いて、ＶＨＨ抗体が以下のように評価された。表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」という）の詳細は以下の通りである。
ＳＰＲ評価装置：Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化バッファ：ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
ランニングバッファ：ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）
固定化用試薬：N-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびエチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（ＥＤＣ）
ノロ抗原
【０１０４】
ノロ抗原は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ノロ抗原の固定化のためには、ノロ抗原はｐＨ4.5を有する酢酸溶液で希釈され、50μg/mlの濃度で用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。
【０１０５】
被分析物として、配列番号：38〜40により表されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ抗体が用いられた。ランニングバッファに含有されるＶＨＨ抗体の濃度は、それぞれ、1.6ｎＭ、8ｎＭ、40ｎＭ、200ｎＭおよび1000ｎＭに調整され、順次添加された。図3、4、5は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ1.15nM、15.8ｎM、9.5nMであった。
【０１０６】
被分析物として、配列番号：41〜43により表されるアミノ酸配列を含む抗ノロ抗体が用いられた。１回目〜8回目の分析において、ランニングバッファに含有される抗ノロ抗体の濃度は、それぞれ、５００ｎＭ、250ｎＭ、125ｎＭ、62.5ｎM、31.25nM、15.63nM、7.81nMおよび3.91ｎＭに調整された。図6〜8は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ81.6ｎM、68.3nM、5.45nMであった。
【０１０７】
次に、ＶＨＨ抗体（配列番号38〜43）を固定し、ノロ抗原との結合について評価した。ＶＨＨ抗体は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００のコントロールソフトウェアに含まれているウィザードに従って固定化された。ノロ抗原の固定化のためには、ノロ抗原はｐＨ5.5を有する酢酸溶液で希釈され、50μg/mlの濃度で用いられた。酢酸溶液は、１マイクログラム／ミリリットルの濃度を有していた。被分析物として、ノロ抗原が用いられた。ランニングバッファに含有されるＶＨＨ抗体の濃度は、それぞれ、10ｎＭ、31.6ｎＭ、100ｎＭ、316ｎＭおよび1000ｎＭに調整され、順次添加された。図9、10、11、12、13および14は、ＳＰＲ評価装置Ｔ２００から得られた評価結果を示すグラフである。解離定数Ｋｄが、評価ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手）を用いて算出された。その結果、解離定数Ｋｄは、それぞれ4.15nM、15.9nM、9.57nM、4.98nM、13.1nMおよび10.3nMであった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、ノロウイルスに結合する新規な抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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