(57)【要約】      （修正有）【課題】電子顕微鏡法のための生体分子支持膜としてのグラフェン表面を、使用前に清浄化する方法を提供する。【解決手段】生体試料を受容するための支持体であって、少なくとも１つの支持部材を備え、前記少なくとも１つの支持部材に付着されたグラフェンを含み、前記グラフェンが部分水素化グラフェンであることを特徴とする支持体に関する。グラフェン表面を水素プラズマ又はヘリウムプラズマ又はネオンプラズマと、表面不純物を除去するために十分な時間接触させることを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフェン表面を清浄化する方法であって、前記グラフェン表面を水素プラズマ又はヘリウムプラズマ又はネオンプラズマと、前記グラフェン表面の化学的又は物理的構成を変えることなく表面不純物を除去するのに十分な時間接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
プラズマが、１〜１４ｅＶの範囲のエネルギーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プラズマが、水素プラズマである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プラズマが、不活性プラズマである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
プラズマが、ネオンプラズマである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
プラズマが、５〜１０eＶの範囲のエネルギーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
プラズマが、ヘリウムプラズマである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
グラフェン表面が、プラズマと１〜３０秒間接触する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
グラフェン表面が、プラズマと１〜１０秒間接触する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グラフェンが、部分水素化グラフェンである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により得られる清浄化グラフェン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料のための支持体、例えば、生体分子のための支持体の技術分野にある。
【背景技術】
【０００２】
改良された電子顕微鏡、より安定なクライオステージ及び高い量子効率を有する直接電子検出器が、近年、生物学的電子顕微鏡（ＥＭ，electron microscopy）に革新を引き起
こし、大きな分子及びウイルスの近原子分解能３Ｄ構造を可能にしてきた（Grigorieff, N. & Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral virusesfrom electron cryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21, 265-273 (2011)、Campbell, M. G. et al. Movies of ice-embedded particles enhanceresolution in electron cryomicroscopy. Structure 20, 1823-1828 (2012)、Bai, X.-C., Fernandez, I.
S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution
from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013)）。電子低温顕微
鏡法（クライオ−ＥＭ）は、タンパク質構造を決定するために使用されている。それは、なお開発中の方法であり、得られる３Ｄ再構成の分解能は、着実に増大してきている。現行の方法論によって、近原子分解能を得ることができる。分解能がさらに増大するにつれて、製薬業界は、恐らくはｘ線結晶学と並行して、この技術を利用して、薬物のそれらのタンパク質標的への結合の仕方を理解することを期待している。依然として、グリッド設計及び調製は、それらが初期にほとんど３０年前に電子低温顕微鏡法（クライオ−ＥＭ）用に開発されたので、大部分は変わらないままである（Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances in Optical and Electron Microscopy (Barer, R. & Cosslett, V. E.) 8, 107-135 (Academic Press, 1982)、Dubochet, J. et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228(1988)、Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. & McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 308, 32-36 (1984)）。
【０００３】
生体試験片のクライオ−ＥＭで使用される現行のグリッドに関していくつかの問題がある。第１に、電子偏向表面電荷の蓄積及び試料のビーム誘導運動は、準最適画像をもたらす（Henderson, R. & McMullan, G. Problems in obtaining perfect images by single-particle electron cryomicroscopy of biological structures in amorphous ice. Microscopy 62, 43-50 (2013)、Brilot, A. F. et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology 177, 630-637 (2012)、Brink, J., Sherman, M. B., Berriman, J. & Chiu, W. Evaluation of charging on macromolecules in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy 72, 41-52 (1998)、Downing, K. H., McCartney, M. R. & Glaeser, R. M. Experimental characterization and mitigation of specimen charging on thin films with one conducting layer. Microsc. Microanal. 10, 783-789 (2004)）。第２に、ガラス化直前に存在する薄い水膜の表面積と体積との大きな比は、タンパク質を空気−水界面に蓄積させ、変性及び強い優先配向をもたらす（Dubochet, J. et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988)、Taylor, K. A. & Glaeser, R. M. Retrospective on the early development of cryoelectronmicroscopy of macromolecules and a prospective on opportunities for the future. Journal of Structural Biology 163, 214-223 (2008)）。グラフェンの出現、そしてより最近になって、グラフェン（Geim, A. K. Graphene: status and prospects. Science 324, 1530-1534 (2009)、Elias, D. C. et al. Control of graphene's properties by reversible hydrogenation: evidence for graphane. Science 323, 610-613 (2009)）は、これらの長くそのままの問題に対処することを可能にする。
【０００４】
現在、電子顕微鏡法のための支持体として、非晶質炭素がしばしば使用される。典型的には、薄い炭素膜（２０〜２００Å厚さ）を、典型的な金属メッシュグリッドの間隙に及ぶホーリー非晶質炭素の比較的厚い層の上に浮遊させる（Grassucci, R. A., Taylor, D.
J. & Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryoelectron microscopy. Nat Protoc 2, 3239-3246 (2007)）。これらの薄い炭素膜は、帯電を減少させ、表面へのタンパク質の吸着のために粒子濃度を増加させ、分子の配向分布を変化させると考えられる。格子をポンプでｍＴｏｒｒ圧にした後に存在する残存空気ガスをイオン化することにより作られる不十分に制御されたプラズマを使用する方法であるグロー放電は、炭素支持層を親水性にさせる。これは、それに吸着性を与えて、その後のクライオ−ＥＭによる画像化のために氷の薄層中にタンパク質の一様分布を作り出すのを助ける（Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances in Optical and Electron Microscopy (Barer, R. & Cosslett, V. E.) 8, 107-135 (Academic Press, 1982)）。
【０００５】
非晶質炭素基材は、いくつかの不利点を有する。第１に、それらは、とりわけ、信号対ノイズ比（ＳＮＲ，signalto noise ratio）が正確な粒子整列に重要である比較的小さ
い分子（５００ｋＤａ未満）にとって有害である、画像中のノイズに著しく寄与する。第２に、タンパク質は、支持炭素との相互作用によって配向優先傾向をしばしば取り、これらの配向は、現行方法を使用して十分には制御されない。第３に、薄い非晶質炭素は、電子ビームを偏向させ、試料上に強い静電気力を及ぼし得るかなりの移動性表面電荷を蓄積する不良伝導体である。最後に、表面上へのタンパク質の吸着を制御することは、グロー放電状態を再現することの困難性のために、及びそれらの年数及び保存環境に依存して汚染が炭素表面上に蓄積するので、困難である。
【０００６】
グラフェンは、六方格子構造で一緒に結合された、１原子のみの厚さの炭素原子のシートから構成された注目すべき材料である。結合された構造は、グラファイトにおけるのと同じであり、非局在化電子を共有するｓｐ２結合炭素の網状組織からなる。結果として、グラフェンは、注目すべき伝導性及び機械的強度を有し、グラフェンを電子顕微鏡法のための優れた支持膜にさせる。グラフェンは、１／２．１Åまでのすべての空間周波数で電子に対して透過性である機械的に強固な伝導体であり、したがって、電子顕微鏡法におけるナノスケール試験片の画像化のための可能性のある基材である。浮遊グラフェンであってもよい、グラフェンは、氷中の分子の画像化に使用される典型的なホールに及ぶサブミクロン距離にわたって弾道学的に電荷を伝導し、したがって、電子ビーム露光の間の表面電荷の蓄積を著しく減少させる傾向にある。対照的に、非晶質炭素は、堆積中の状態に依存して、その特性及び伝導率（蒸発した非晶質炭素について約１０−３Ｓ／ｃｍ）が広く変わり得る半導体であり、これは、それらの生成に使用される典型的なサーマルエバポレーターにおいて十分に制御されない。このことは、非晶質炭素を表面帯電しやすくさせ、非常に低い線量の電子露光においてさえもその組成物中のビーム誘導化学変化の影響を強く受けやすくさせる。グラフェンの面内機械的強度（ヤング率約１ＴＰａ）は、それを安定で強固な基材としてさらに推奨する。
【０００７】
そのかなりの潜在的な利点及び化学蒸着（ＣＶＤ，chemical vapor deposition）を使
用する大規模製造の容易さにもかかわらず、グラフェンは、生体物質と一緒の使用に広くは採用されてこなかった。これには２つの主な理由があり、すなわち、グラフェンが疎水性であり、これは水溶液からのタンパク質の堆積をおおむね妨げており、及び表面汚染物（成長の間に形成されるか又はその後に取扱い及び保存の間に吸着される）の影響を受けやすいことである。生体分子の画像化のための基材としてグラフェンを使用する従来の試みがなされてきたが、グラフェン表面を親水性にさせることは、ほとんどのタンパク質（ＤＭＰ−３０）と相溶性でない過酷な溶媒の使用を必要としたか、又はグラフェンの酸化
グラフェンへの変換を必要とした。
【０００８】
クライオ−ＥＭにおける主要な問題は、ガラス状氷の薄層内のタンパク質の分布の精密な制御である。ブロッティング及びガラス化の間に、タンパク質は、しばしば空気／水界面又は炭素支持メンブレンに分離する。
【０００９】
酸化グラフェンは、同様の目的に使用されてきたが（Pantelic, R. S., Meyer, J. C.,
Kaiser, U., Baumeister, W. & Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology 170, 152-156 (2010)、Pantelic, R. S. et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology 174, 234-238 (2011)、Pantelic, R. S., Suk, J. W., Hao, Y., Ruoff, R. S. & Stahlberg, H. Oxidative Doping Renders Graphene Hydrophilic, Facilitating Its Use As a Support in Biological TEM. Nano Lett. 11, 4319-4323 (2011)）、酸素が炭素又は水素よりも強く電子を散乱させ、したがって、薄い非晶質炭素とほとんど同じくらいにバックグラウンド信号を与えるので、酸化グラフェンは問題を提示する。さらに、酸化グラフェンは、絶縁体であり、汚染のないグラフェンと比較してその機械的強度を低下させる結晶欠陥を含み、それが蓄積表面電荷の中和をあまりできなく、及びそれを氷の薄層のための支持体としてあまり安定でなくさせる。
【００１０】
グラフェンは、その疎水性がそれらの信頼性のある堆積を不可能にし、及びそれが容易に汚染されやすいので、生体分子によって使用されない。これらの欠点は、グラフェンが生体分子のＥＭ又は生体分子の吸着若しくは他の付着を伴う他の用途、例えば、センサ若しくは同様の用途に適用されてこなかったことを意味する。
【００１１】
半導体物理の非関連分野で、低エネルギー水素プラズマへの露出が、グラフェンをその完全水素化形態であるグラファンに変換させ得ることが示されてきた（Elias, D. C. et al. Control of graphene's properties by reversible hydrogenation: evidence for graphane. Science 323, 610-613 (2009)、Burgess, J. S. et al. Tuning the electronic properties of graphene by hydrogenation in a plasma enhanced chemical vapor deposition reactor. Carbon 49, 4420-4426 (2011)）。水素化グラフェンは、生体試料によってＥＭには使用されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Grigorieff, N. & Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electroncryo-microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 21, 265-273 (2011)
【非特許文献２】Campbell, M. G. et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryomicroscopy. Structure 20, 1823-1828 (2012)
【非特許文献３】Bai, X.-C., Fernandez, I. S., McMullan, G.& Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013)
【非特許文献４】Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances in Optical and Electron Microscopy (Barer, R.& Cosslett, V. E.) 8, 107-135 (Academic Press, 1982)
【非特許文献５】Dubochet, J. et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988)
【非特許文献６】Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. &McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature 308, 32-36 (1984)
【非特許文献７】Henderson, R. & McMullan, G. Problems in obtaining perfect images by single-particle electron cryomicroscopy of biological structures in amorphous ice. Microscopy 62, 43-50 (2013)
【非特許文献８】Brilot, A. F. et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology 177, 630-637 (2012)
【非特許文献９】Brink, J., Sherman, M. B., Berriman, J. & Chiu, W. Evaluation of charging on macromolecules in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy 72, 41-52 (1998)
【非特許文献１０】Downing, K. H., McCartney, M. R. & Glaeser, R. M. Experimental characterization and mitigation of specimen charging on thin films with one conducting layer. Microsc. Microanal. 10, 783-789 (2004)
【非特許文献１１】Taylor, K. A. & Glaeser, R. M. Retrospective on the early development of cryoelectron microscopy of macromolecules and a prospective on opportunities for the future. Journal of Structural Biology 163, 214-223 (2008)
【非特許文献１２】Geim, A. K. Graphene: status and prospects. Science 324, 1530-1534 (2009)
【非特許文献１３】Elias, D. C. et al. Control of graphene's properties by reversible hydrogenation: evidence for graphane. Science 323, 610-613 (2009)
【非特許文献１４】Grassucci, R. A., Taylor, D. J. & Frank, J. Preparation ofmacromolecular complexes for cryoelectron microscopy. Nat Protoc 2, 3239-3246(2007)
【非特許文献１５】Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U.,Baumeister, W. & Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology 170,152-156 (2010)
【非特許文献１６】Pantelic, R. S. et al. Graphene: Substrate preparation andintroduction. Journal of Structural Biology 174, 234-238 (2011)
【非特許文献１７】Pantelic, R. S., Suk, J. W., Hao, Y., Ruoff, R. S. & Stahlberg, H. Oxidative Doping Renders Graphene Hydrophilic, Facilitating Its Use As a Support in Biological TEM. Nano Lett. 11, 4319-4323 (2011)
【非特許文献１８】Burgess, J. S. et al. Tuning the electroni cproperties of graphene by hydrogenation in a plasma enhanced chemical vaporde position reactor. Carbon 49, 4420-4426 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来技術に関連する問題を克服しようと努めるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上で述べたとおり、グラフェン膜は、電子顕微鏡法のための支持膜として使用されてきた。しかしながら、グラフェン支持膜は、現在は生体分子の電子顕微鏡法に使用されていない。その理由は、グラフェンシートが極めて疎水性であることである。これは、タンパク質などの生体分子のグラフェン上への信頼性ある堆積を不可能にする克服できない問題をもたらしてきた。さらに、汚染されていないグラフェン表面は、容易に汚染され、これはそれらを通常の非晶質炭素同然にさせる。グラフェンをＥＭ支持体として使用可能にさせる従来技術の試みは、グラフェンの酸化グラフェンへの変換をもたらした。しかしながら、酸化グラフェンは、酸素原子の存在のために強い電子散乱特性を有する。事実、ＥＭ支持膜としての酸化グラフェンの使用は、薄い非晶質炭素とほぼ同じくらいのバックグラウンド信号を与える。酸化グラフェンは、機械的強度の低下及び蓄積表面電荷の中和の問題を含むさらなる欠点を有する。したがって、グラフェン及び酸化グラフェンなどのグラフェン誘導体は、生体分子の電子顕微鏡法にとって通常の非晶質炭素と同然のままである。
【００１５】
対照的に、本発明者らは、グラフェンの部分水素化が、グラフェンの極めて疎水性の特性を改善する際に有用であり得ることを発見した。この部分水素化は、グラフェンの特性に不可欠な炭素原子の六方格子を保ちながら、行うことができることは注目に値する。さらに、グラファンなどにおける完全水素化よりもかなり低い、水素化の低い割合が、生体分子の信頼性のある堆積を可能にする親水性グラフェン表面の生成に信じられないほど有効であることは非常に意外なことである。
【００１６】
本発明者らは、グラフェン表面が使用前に清浄化され得る方法も教示する。本発明者らは、小原子プラズマ（水素又はヘリウム又はネオンなど）の使用が、それらがその結晶構造を害することなく不純物を選択的に除去する（すなわち、グラフェンを清浄化する）低エネルギーで使用され得ることを教示する。
【００１７】
したがって、一態様において、本発明は、生体試料を受容するための支持体であって、少なくとも１つの支持部材を備え、前記少なくとも１つの支持部材に付着されたグラフェンを含み、前記グラフェンが部分水素化グラフェンであることを特徴とする支持体を提供する。
【００１８】
好適には、前記グラフェンは、０．０１％〜５０％水素化されたグラフェンである。
【００１９】
好適には、前記グラフェンは、３％〜１０％水素化されたグラフェン、好ましくは５％水素化されたグラフェンである。
【００２０】
好適には、本発明のグラフェン（部分水素化グラフェン）は、６８°〜９０°の範囲；より好適には７８°〜８７°の範囲；より好適には８２°〜８４°の範囲；より好適には約又はおよそ８３°；最も好適には８３°の水−グラフェン（空気−水−グラフェン）接触角を有する。接触角の測定は、以下により詳細に検討され；図１が参照される。
【００２１】
好適には、少なくとも１つの支持部材は、支持膜に付着されており、グラフェンは、前記支持膜に付着されている。
【００２２】
好適には、前記支持膜は、伝導性材料、好適には導電性材料を含む。
好適には、前記支持膜は炭素を含む。
【００２３】
好適には、支持体は、複数の支持部材を含む。
好適には、グラフェンは、前記支持部材のそれぞれに付着されている。
好適には、支持体は、センサ支持体である。
好適には、支持体は、ＥＭ支持体である。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、前記部分水素化グラフェンが、グラフェンの少なくとも第１の領域及びグラフェンの少なくとも１つのさらなる領域を含み、前記第１の領域が第１の水素化値に水素化されており、前記少なくとも１つのさらなる領域が異なる水素化値に水素化されている上に記載されたとおりの電子顕微鏡法支持体に関する。
【００２５】
好適には、上に記載されたとおりの前記電子顕微鏡法支持体は、前記部分水素化グラフェンに吸着された生体分子をさらに含む。
好適には、前記生体分子は、親水性生体分子である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、電子顕微鏡法のための、生体分子を支持する部分水素化グラフェン表面の使用に関する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、部分水素化グラフェンを作製する方法であって、グラフェンの表面に水素イオン又は水素原子を適用することを含み、前記水素イオン又は水素原子は、２１ｅＶまで、より好適には１〜２１ｅＶの範囲のエネルギーで適用されることを特徴とする方法に関する。好適には、エネルギーは、１〜１４ｅＶの範囲である。
好適には、前記水素の適用は、グラフェンの水素飽和前に終了される。
好適には、前記水素イオン又は水素原子は、水素プラズマの形態で適用される。
好適には、前記グラフェンは、前記水素プラズマと１１〜８０秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、前記水素プラズマと１８〜２２秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、支持体上に取り付けられたグラフェンである。好適には、前記支持体は、電子顕微鏡法支持体である。
【００２８】
別の態様において、本発明は、上に記載されたとおりの方法により得られる部分水素化グラフェンに関する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、グラフェン表面を清浄化する方法であって、前記グラフェン表面を水素プラズマ又はヘリウムプラズマ又はネオンプラズマと表面不純物を除去するのに十分な時間接触させることを含む方法に関する。
好適には、前記プラズマ原子は、１〜１４ｅＶの範囲のエネルギーにある。
好適には、前記プラズマは、不活性プラズマである。例えば、前記プラズマは、好適には不活性ガスからなり、これは、それがグラフェンにおいて安定な化学変化を誘導しないという利点を有する。
好適には、前記プラズマは、ネオンプラズマである。最も好適には、前記プラズマは、ヘリウムプラズマである。
好適には、前記グラフェン表面は、前記プラズマと１〜３０秒間接触する。
好適には、前記グラフェン表面は、前記プラズマと１〜１０秒間接触する。
好適には、前記グラフェンは、部分水素化グラフェンである。
【００３０】
別の態様において、本発明は、上に記載されたとおりの方法により得られる清浄化グラフェンに関する。
【００３１】
別の態様において、本発明は、電子顕微鏡法における使用のための、グラフェンの調製のための１〜１４ｅＶの範囲のエネルギーでの水素プラズマの使用に関する。好適には、グラフェンは、部分水素化により調製される。好適には、グラフェンは、不純物の除去により調製される。
【００３２】
別の態様において、本発明は、生体試料を画像化する方法であって、
前記生体試料を上に記載されたとおりの支持体上に構成し、前記支持体を電子顕微鏡の電子ビーム中に配置し、画像データを収集することを含む方法に関する。画像データは、分析用の画像データであってもよい。
【００３３】
別の態様において、本発明は、生体試料の電子顕微鏡法画像を提供するように操作可能な画像化装置であって、上に記載されたとおりの支持体上に取り付けられた生体試料、前記支持体上に入射するように配置された電子顕微鏡の電子ビーム、及び画像データを収集するように操作可能な収集デバイスを備える装置に関する。画像データは、分析用の画像データであってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
グラフェンは、その疎水性がそれらの信頼性ある堆積を不可能にし、及びそれが容易に汚染されるので、従来技術では生体分子によって使用されない。
【００３５】
本発明は、グラフェン格子を劣化させることなく、グラフェンの表面特性を調節するための低エネルギー水素プラズマの使用に関する。これは、グラフェンの特性を変化させて、その表面上へのタンパク質の堆積を可能にし、それらの分布を精密に制御する。さらに、それは、汚染物を非破壊的に除去することによりグラフェン表面を清浄化する。したがって、本発明は、グラフェン表面上のタンパク質の分布を精密に制御するために使用され得る。本発明者らは、単粒子電子低温顕微鏡法を使用しての画像化及び３次元再構成におけるその有用性を実証する。本発明は、グラフェン表面などのグラフェン上へのウイルス、タンパク質又は他の生体分子の制御された吸着を必要とする他の生物学的用途にも有用である。これらの用途には、グラフェンベースのセンサ、例えば、グラフェン表面と接触する分子の存在、濃度及び／又は他の特性を検出するためのセンサが含まれる。
【００３６】
本発明者らは、グラフェン格子を劣化させることなく、グラフェンの表面特性を調節するための低エネルギー水素プラズマの使用を教示する。これは、グラフェンの特性を変化させて、その表面上へのタンパク質の堆積を可能にし、それらの分布を精密に制御する。これはまた、汚染物を非破壊的に除去することによってグラフェン表面を清浄化する。
【００３７】
本発明者らは、上に記載された従来技術の問題に対処し得る低エネルギー水素プラズマによるグラフェンの低レベル水素化、すなわち、表面汚染物の除去及び／又はグラフェンをタンパク質などの生体分子のための基材としての使用に好適に親水性にすることを教示する。そのエネルギーがグラフェンのためのスパッタ閾値より十分に低い水素プラズマを使用することによって、本発明者らは、浮遊格子に対する有意な損傷を観察しない。さらに、本発明者らは、水素プラズマ線量がタンパク質の表面密度に直接関係するグラフェン上のタンパク質分布を調整することができる。これは、クライオ−ＥＭ用途などのＥＭ用途、及び／又はバイオセンサ用途などのセンサ用途にとって特に有利である。
【００３８】
生体試料の電子顕微鏡法は、典型的には１／１．５Å〜１／５００Åの分解能にわたって操作される。グラフェンなどの基材は、およそ１／２．１Åの有効最小分解能を有するので、それらは、生体分子の研究にとって「不可視」とみなされてもよい。
【００３９】
本発明者らは、水素プラズマ処理グラフェン上で画像化された７０Ｓ及び８０Ｓリボソームの３Ｄ再構成を決定することにより電子顕微鏡法におけるこの方法の使用を実証する。
【００４０】
本発明者らは、グラフェン格子の部分水素化が、水溶液からのタンパク質の吸着を誘発し得、他の可変要素に関係なく粒子表面密度の制御を可能にすることを示す。クライオ−ＥＭ調製試料において、他の可変要素には湿度、ブロット時間などが含まれてもよい。グラフェンへのそれらの吸着を調整することによって、本発明者らは、空気／水界面におけるタンパク質の凝集及び変性に関連する従来技術の問題を解決する。本発明者らは、部分水素化グラフェンが、再生不可能性、帯電及びバックグラウンドノイズの増加を含めて、非晶質炭素に関連する問題を減少させることを示す。
【００４１】
さらに、本発明者らは、低エネルギー水素プラズマが、それがグラフェン格子それ自体を減少させ得るようにもはるかに速く表面汚染物を選択的に除去し得ることを示す。これは、グラフェンの水素化状態へのさらなる変化を回避又は最小限にしながら、不純物の除去（清浄化）を有利に可能にする。
【００４２】
グラフェンは、低エネルギー水素プラズマで処理される場合、タンパク質の吸着のための再生可能及び調整可能な表面である。これに基づいて、本発明者らは、電子顕微鏡法のための生体試験片の調製が、試行錯誤の技術から、タンパク質の構造的一体性又は画像の
品質を損なうことなく表面状態の選別の系統的方法に移ることを想定する。
【００４３】
さらに、本発明は、氷の安定性の増加、及び／又は粒子の運動の低下などのクライオ−ＥＭにおける利点を与え、これらは以下により詳細に検討される。
【００４４】
重要なことには、この方法は、プラズマ内のエネルギーイオンが、グラフェン格子から原子を直接除去し又は損傷させるのには不十分なエネルギーを有するように、プラズマが本明細書で教示されるとおりに制御される、グラフェン格子のためのエネルギー閾値の考えに依存する。したがって、グラフェン格子に行われる得る唯一の改変は、プラズマの種との化学反応を介している。グラフェン格子からの炭素原子の直接除去のための閾値エネルギーは、ほぼ２１ｅＶで確立されている。好適には、このエネルギーよりも十分に低いプラズマが、グラフェンのスパッタリングがないことを確実にするために使用される。
【００４５】
実施例において、本発明者らは、清浄のために水素を使用する本発明を実証する。しかしながら、エネルギーが直接反跳事象を介してグラフェン格子から炭素原子を除去するには不十分である他のイオン種も、それらの作用も水素について説明されたとおりの表面との化学反応に限定されるので、有用である。これらには、例えば、ヘリウム、例えば、５〜１０ｅＶの範囲のヘリウムが含まれる。ヘリウムは、それがグラフェン表面と反応しないが、汚染を除去するので特に所望である。
【００４６】
疎水性グラフェンを電子顕微鏡法に使用可能なようにさせるための従来技術の試みは、非常に過酷な処理を必要としてきた。一部の場合に、グラフェンは、酸化グラフェンに変換されてきた。酸化グラフェンは、いくつかの欠点を有し、これらには、絶縁体としてのその挙動、蓄積表面電荷の中和における問題、及びクライオ−ＥＭに必要とされる薄い氷層のための支持体としての機械的強度／安定性を低下させることが含まれる。
【００４７】
従来技術は、生体分子のＥＭ研究のための基材としてグラフェンを使用可能にさせることに失敗してきた。
【００４８】
グラフェンを処理するために使用される原子／条件の選択によって、それは物理的に変わらない一方で化学的に改変され得ることは、本発明の重要な利点である。言い換えれば、本発明者らは、グラフェン内の結合構造を変化させることができるが、ＥＭにおけるその使用に不可欠なその物理的特性を破壊する、グラフェン格子から原子を除去することはできない。
【００４９】
本発明者らは、非常に低い割合の水素化（例えば、１炭素当たり０．１〜２０％の水素）でさえも、ＥＭのための表面上に生体分子の信頼性ある堆積を可能にするために十分な親水性を回復するのに十分であり得ることを教示する。
【００５０】
材料科学の分野で、グラファンと呼ばれる物質が生成されてきた。グラファンは、完全に水素化された炭素シートである。グラファンでは、各炭素は、水素に加えて、３個の炭素にｓｐ３結合している。対照的に、本発明者らは、グラフェンの部分水素化を教示する。このように、グラフェンの特性は保存される一方で、有利には、グラフェン表面にわたって生体分子の分布を可能にし、ＥＭ研究で優れた結果を容易にするのに十分な水素化を与える。格子構造が完全に保存されることは、本発明の利点である。理論に拘束されることを望まないが、当然に、本発明の部分水素化グラフェンにおける水素結合炭素の精密な結合長さは、完全に水素化されていないグラフェンの結合長さと比較して変わってもよい。しかしながら、重要なことは、グラフェンの六方格子構造が本発明によって保存されることである。
【００５１】
この研究の過程において、予想され得たよりもはるかに低い水素化値で、親水性が部分水素化グラフェンシートについて飽和され得るという非常に意外なことが発見された。この研究の前に、親水性は、１００％水素化（すなわち、グラファン）で飽和に達すると予想された。しかしながら、本明細書で提示されるデータによれば、親水性は、事実およそ２０％の水素で飽和又は近飽和にある。
【００５２】
グラフェン又はグラファンなどのある特定の物質が従来技術で電子顕微鏡法下に置かれてきたが、これらは主として材料科学の分野での研究であったことに留意することが重要である。グラフェンは、電子工学の分野で材料科学者に所望のものであり、その理由は、グラフェン膜が半導体コンピュータチップにおける使用のために化学蒸着により成長させられてもよいからである。グラフェンの伝導性への関心によって、それは、シリコンなどの古典的半導体の可能性のある将来の競合者として材料科学の分野で研究されてきた。これらの研究において、グラフェンは、純粋に研究される試料として電子顕微鏡法と組み合わされてきた。生成されてきた一部の新規な材料は、それらの構造を識別するためにＥＭにかけられてきた。当技術分野のどこにも生体分子などの生体試料のための支持基材としての部分水素化グラフェンの教示は存在してこなかった。これは、本発明により直接なされた貢献である。
【００５３】
広範な態様において、本発明は、それに吸着された生体分子を含む部分水素化グラフェンに関する。
【００５４】
グラフェンシートの清浄化
本発明者らは、本明細書で記載されるとおりの小原子プラズマによるグラフェンの処理の閾値効果を研究した。水素化が行われるよりもかなり前に清浄化効果が観察され得ることは相当に所望のものである。理論に拘束されることを望まないが、グラフェンを処理するために使用されるプラズマ中の高いエネルギーの小原子は、グラフェンの化学反応性（水素化など）に必要とされるよりもはるかに低いエネルギー及び／又ははるかに短い時間尺度で汚染物を容易に破壊及び除去し得ると考えられる。したがって、小原子プラズマによるグラフェンのより低いエネルギー又はより短い時間スケールを使用することによって、グラフェンの有効な汚染除去又は清浄化が、グラフェンシートの化学的又は物理的構成を変えることなく行われ得る。
【００５５】
好適には、プラズマは、水素、ヘリウム又はネオンプラズマである。好適には、プラズマは、ヘリウム又はネオンプラズマなどの不活性プラズマである。好適には、プラズマは、ネオン又はヘリウムプラズマである。好適には、プラズマは、ネオンプラズマである。最も好適には、プラズマは、ヘリウムプラズマである。
【００５６】
ヘリウムプラズマは、本発明によるグラフェンシートなどのグラフェンの処理に適する。ヘリウムプラズマは、好適には２１ｅＶまで、より好適には１〜２１ｅＶの範囲、より好適には１〜１４ｅＶ、より好適には１４．０ｅＶ以下、最も好適には５〜１０ｅＶのエネルギーで表面に当たるイオンによって使用される。
【００５７】
水素プラズマは、本発明によるグラフェンシートなどのグラフェンの処理にとりわけ適する。水素プラズマは、好適には２１ｅＶまで、より好適には１〜２１ｅＶの範囲、より好適には１〜１４ｅＶ、より好適には１４．０ｅＶ以下のエネルギーで表面に当たるイオン又は原子によって使用される。
【００５８】
ネオンプラズマは、本発明によるグラフェンを処理するために使用されてもよい。ネオンプラズマを使用する場合、比較的大きいサイズのネオン原子のために比較的低いエネルギーがより望ましい。これに関して、プラズマ状態のネオンをなお維持しながらグラフェ
ンへの損傷が回避されるように、プラズマシース電圧及び表面に当たるイオンの究極エネルギーに特別の注意が払われなければならない。
【００５９】
アルゴンプラズマは、大きなサイズのアルゴン原子がグラフェン格子に損傷を与える恐れがあるので、非常に低いエネルギー及び／又は露出時間においてを除いて、グラフェンの清浄化にそれほど有用でないようである。
【００６０】
グラフェンの非破壊的清浄化のためのエネルギー選択
低エネルギーイオン及び原子の場合、一回衝突における最大伝送エネルギーＴｍａｘは、
【００６１】
【数１】
2019069890.tif 000002
【００６２】
である。ここで、ｍは、プラズマ中のイオン／原子の質量であり、Ｍは、標的原子（この場合は炭素）の質量であり、Ｅは、プラズマ中のイオン／原子のエネルギーである。したがって、炭素に当たるネオンの場合、
【００６３】
【数２】
2019069890.tif 000003
【００６４】
である。したがって、２１ｅＶ未満のＴｍａｘがほしい場合、グラフェンの表面に当たるイオンのエネルギーは、
【００６５】
【数３】
2019069890.tif 000004
【００６６】
となるはずであり、又は１４．１ｅＶ未満のＴｍａｘの場合、１３．１ｅＶ未満のＥｍａｘとなるはずである。
【００６７】
しかしながら、プラズマ中の粒子の実際のエネルギーは、一般にボルツマン統計に従うエネルギーの分布を構成する。さらに、表面の近くのプラズマのエッジにおいて、プラズマシースと呼ばれる電子の欠乏している領域がしばしば存在する。このシースは、プラズマから試料の表面の中にイオンをかなりの（数ｅＶ）エネルギーで加速させ得る電場を含む。損傷が最小限又は無いことを確実にするために、操作者は、グラフェンの表面に当たる原子及びイオンが上記のＥｍａｘ値を十分下回るように、プラズマの温度（エネルギー）及び構成を適切に選択すべきであり；比較的低いエネルギーの選択は、閾値Ｔｍａｘを超えるエネルギーの分布の高エネルギー尾部におけるイオン／原子が非常に少ないという利点を有する。
【００６８】
したがって、上記指針を考慮に入れると、熟練作業者は、本発明によって適切なエネルギー及びプラズマ構成を選択し得る。例えば、ネオンを使用する場合、５〜１０ｅＶのネルギーが最適である。
【００６９】
同様の計算を、Ｈ、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｆ、Ｎなどの他の原子（原子プラズマ）について行うことができる。最も好適には、本発明で使用されるプラズマは、Ｈ、Ｈｅ又はＮｅである。
【００７０】
本発明のグラフェン様相を清浄化するために、好適にはＨｅ、Ｎｅ及び／又は他の希ガスが使用され−これらは、グラフェンを化学的に改変することなく汚染物の除去（すなわち、グラフェンの清浄化）を可能にする利点を有する。
【００７１】
したがって、ネオンのための最も好適なプラズマエネルギーは、５〜１０ｅＶである。
【００７２】
理論によって拘束されることを望まないが、現発明におけるプラズマ処理のための原子の適切性における主たる考慮事項は、グラフェンの表面に当たる原子（電子ではない）種のエネルギー及びグラフェン格子を化学的に改変するそれらの能力である。特に、原子が大きければ大きいほど、プラズマ状態にそれらを維持するためにより大きいエネルギーが必要となる。これらのより大きいエネルギーでは、グラフェンシートから炭素原子を除去するための閾値を超える危険がある。グラフェンシートからの炭素原子の除去に必要なレベルを超えてエネルギーを与えられた原子を含むいかなるプラズマも、本発明における使用には適さない。酸素を含むプラズマも、格子と化学的に反応し、したがって、それを酸化グラフェンに変換させ、又はそれを完全に破壊する傾向があり、これらの両方ともは、本発明に望ましくなく、したがって、酸素を含むプラズマは、本発明における使用に適さない。
【００７３】
最も好適には、本発明によるプラズマは、ネオン又はヘリウム又は水素プラズマである。最も好適には、本発明によるプラズマは、ヘリウム又は水素プラズマである。好ましくは、水素プラズマは、グラフェンの調整又は水素化のために使用される。好ましくは、水素又はヘリウム又はネオンプラズマは、グラフェンから不純物を清浄化又は除去するために使用され、最も好ましくは、ヘリウムプラズマは、グラフェンから不純物を清浄化又は除去するために使用される。
【００７４】
グラフェンから不純物を清浄化又は除去するために、好適には前記グラフェンは、前記プラズマ（水素プラズマ又はヘリウムプラズマ又はネオンプラズマなど）と１〜３０秒間、好ましくは１〜１０秒間接触させる。
【００７５】
この清浄化効果は、プラズマ中のエネルギー種とグラフェンの表面上の汚染分子とが化学反応し、それにより、それらを揮発させ、それらの除去を生じさせることによって達成される。
【００７６】
「清浄（clean）グラフェン」又は「清浄化（cleaned）グラフェン」は、以下のとおりの清浄（clean）又は清浄化（cleaned）とみなされる：
「清浄」＝汚染物の質量／単位面積＜グラフェンの質量／単位面積／１００、又は汚染物の表面積＜グラフェンの表面積／１００；より好適には、「清浄」＝汚染物の質量／単位面積＜グラフェンの質量／単位面積／１０００、又は汚染物の表面積＜グラフェンの表面積／１０００。
【００７７】
水素化
グラフェンの水素化は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって行われてもよい。最も好ましくは、水素化は、水素プラズマで処理することによって行われる。しかしながら、水素原子をグラフェン表面に送達するためにイオンビームを使用することによって同様に行なわれてもよい。重要な教示は、水素イオン又は水素原子をグラフェンの表面に正しいエネルギーレベルで適用することである。
【００７８】
グラフェン結晶粒界
エネルギーレベルに関して、本発明によって使用されるべき最大エネルギーレベルは、２１電子ボルト（ｅＶ）である。２１ｅＶを超えるエネルギーレベルでは、炭素原子がグラフェン格子から叩き出され得る可能性がある。明らかに、これは、それが重要なグラフェンの格子構造を破壊するので非常に望ましくない。このために、格子に当たる２１ｅＶ以下の原子又はイオンのエネルギーが好ましい。
【００７９】
グラフェンの単一シートは、しばしば多数のグラフェン結晶の寄せ集めから構成される。これらの結晶間の粒界には、「５−７欠陥」（時に「Ｓｔｏｎｅ−Ｗａｌｅｓ欠陥」と呼ばれる）として知られる交互結合配列がある。５−７欠陥における炭素原子は、依然としてｓｐ２結合されているが、それらの除去のためのエネルギーは、結合パターンにおけるこれらのエッジ欠陥のために上で特定された２１ｅＶよりも低い。これらのエッジ欠陥炭素原子を１５ｅＶ程度に低いエネルギーで破壊することが可能である。したがって、好適には本発明によって、１４ｅＶ（１４．０ｅＶなど）以下のイオンエネルギーが有利に用いられる。これは、処理されるグラフェンの領域が粒界を含む場合にとりわけ有利である。
【００８０】
一般に、エネルギーが低ければ低いほど、プラズマは維持するのがより困難であり得る。したがって、グラフェン格子中の炭素の破壊を回避するためにより低いエネルギーレベルを必要とするにもかかわらず、好適にはエネルギーレベルは、グラフェン格子の破壊を安全に回避する一方で可能な限り高い。これは、処理に使用されるプラズマのより容易な管理／維持の利点を与える。これは、より短い露出時間の利点も与える。
【００８１】
好適には、水素化のためのプラズマエネルギーは、１ｅＶ〜１４ｅＶの範囲である。
好適には、水素化のためのプラズマエネルギーは、１４ｅＶ未満である。好適には、水素化のためのプラズマエネルギーは、１ｅＶ〜１４ｅＶ未満の範囲である。
【００８２】
水素化のために、例えば、以下に記載されるとおりの市販の装置を使用して、好適には、前記グラフェンは、水素プラズマと１１〜１６５秒間、好適には１１〜１２０秒間、好適には１１〜８０秒間、好適には１１〜４０秒間、好適には１５〜２５秒間、好適には１８〜２２秒間、最も好適には２０秒間接触させる。これらの値は、リボソーム吸着に特に有利であり；２０秒間は、この用途に特に有利であり、リボソームなどの研究される分子のとりわけ一様な分布という具体的な利点を与える。
【００８３】
好適には、前記グラフェンは、水素プラズマと１０〜４０秒間接触させる。
【００８４】
プラズマの作製及び維持は、熟練作業者にとって日常的なものであり、市販のプラズマ発生器を使用して行うことができる。
【００８５】
理論によって拘束されることを望まないが、低エネルギープラズマは異なる密度及びそれらの形状を有することができ、試料及びチャンバー壁の電気的制御並びに発生方法は、単位面積当たり、単位時間当たり電子又はイオンによる「当たり」の数、及びイオン又は電子のエネルギーに強く影響を与えることができる。これは、時に（例えば）投与される水素の「線量」と称される。したがって、上に記述されるとおりのプラズマの密度又は他の要因は、単位時間当たり適用される水素の「線量」に影響を与え得る。したがって、プラズマの所定密度について、露出の時間の増加は、線量の増加をもたらす。本明細書で教示されるとおりのプラズマによる処理のタイミングは、実証されるとおりの例示的な投与を与える。当業者が種々の密度、エネルギー又は電気のプラズマを使用する場合、本明細書で教示されるとおりの水素化又は清浄化のレベルを達成するためにそれに応じてタイミングを調整することは彼らの能力の十分に範囲内である。何らかのさらなる指針が必要とされる場合、処置されたグラフェン（部分水素化グラフェン）の水素化のレベルは、本明細書で教示されるとおりに簡単に評価又は推定することができ（例えば、接触角測定又はグラフェン格子パラメータの変化の回折測定によって）、「線量」は、水素化の所望のレベルを達成するために調整することができる。
【００８６】
利点
グラフェン上へのタンパク質などの生体分子の吸着が容易化されることは、本発明の重要な利点である。言い換えれば、グラフェン表面上へのタンパク質の堆積が、今や制御され得ることは、本発明の利点である。
【００８７】
部分水素化グラフェンＥＭ支持体が作製されるとすぐに、それは、まさしく任意の他のグラフェンＥＭ支持体の場合のように処理又は使用される。例えば、クライオ−ＥＭ試料は、標準的なロボット技術によって調製されてもよい。
【００８８】
部分水素化グラフェン支持体は、グラフェンシートを部分水素化することによって作製されてもよく、又は部分水素化グラフェンを調製し、次いで、それを支持体上に配置することによって作製されてもよい。これらがどちらの方法で製造されるにしても、典型的には操作者の選択の問題である。グラフェン支持体を調製し、次いで、それらを必要な程度に部分水素化し、それにより、支持体のバー又は壁又は周辺部の上に部分水素化グラフェンの移動の間に生じ得る汚染の問題を回避することは有利であり得る。したがって、一実施形態において、ＥＭ支持体上に存在する場合、グラフェンを清浄化又は部分水素化することが好ましい。
【００８９】
本発明者らは、氷中のタンパク質などの生体分子の分布を精密に制御するために水素化グラフェンの使用を教示する。このようにして吸着されたタンパク質は、７０Ｓ及び８０Ｓリボソームの３次元再構成により証明されるとおりのそれらの構造的一体性を保持する（実施例参照のこと）。本発明は、タンパク質吸着のための表面状態の系統的スクリーニングを可能にし、生物学的電子顕微鏡法のための試料調製の最も不十分に制御された様相に対処する。
【００９０】
さらに、本発明者らは、氷中の個別のリボソームを追跡し、それらのビーム誘導運動が、有利には本発明による部分水素化グラフェン上でほぼ５倍低下することを見出す。部分水素化グラフェン支持体による氷埋め込み粒子の強化は、生物学的電子顕微鏡法における試料調製と画像品質の両方ともを向上させる。したがって、本発明者らは、水素プラズマ処理グラフェンがビーム誘導運動を実質的に低下させることによってクライオ−ＥＭ画像
を向上させることを実証する。
【００９１】
本発明は、試料運動の低下の利点を与える。本発明は、画像品質の増加の利点を与える。
【００９２】
他の用途
そのゲートが流体と接触するように設計されるトランジスタを含むバイオセンサは公知である。このようなデバイスは、所望の粒子がゲートに近づいて来ると、トランジスタの伝導性が変わり、信号が読み出されることを可能にするように構成される。センサに結合している（すなわち、検出される）実体は、所望の任意の小粒子、例えば、所望のタンパク質、ウイルス粒子又は任意の他の小部分であり得る。
【００９３】
部分水素化グラフェンなどの、本発明による調整可能なグラフェンを使用すると、所望の部分（例えば、タンパク質、ウイルス粒子又は他の実体）が結合されているか否かに応じてその伝導性を変化させるトランジスタ型バイオセンサを製作することが可能である。本発明によって与えられる重要な利益は、このようなトランジスタ型デバイスに統合されるのに理想的である物質（グラフェン）を使用して粒子の特異的結合のための表面を生成させ及び／又は調整する能力である。
【００９４】
生体分子又は化学分子などの分子のための検出器（センサ）は、本発明によって製作されてもよい。例えば、部分水素化グラフェンは、高感度素子として、例えば、ナノスケール電界効果デバイスにおける高感度平面素子として部分水素化グラフェンを使用するバイオセンサなどのセンサの製作に使用されてもよい。
【００９５】
このようなデバイスは、半導体ナノワイヤ（参考文献４６〜４８に記載）、カーボンナノチューブ（参考文献４９に記載）、又はグラフェン（参考文献５０〜５１に記載）を使用して作られてもよい。本発明によれば、センサ（例えば、システム）における高感度素子は、部分水素化グラフェン、例えば、部分水素化グラフェンのある部分を含む。このような高感度素子は、典型的には、特定の分子が表面に結合するか、又は表面に結合した１若しくは２以上の分子に結合するときに、部分水素化グラフェンの電子特性が変化するように、試料と接触するように構築される。次いで、電子特性におけるこの変化は、デバイスからの電気信号として読み出すことができる。例えば、本発明は、Patolskyのシリコンナノワイヤを本発明の部分水素化グラフェンで置き換えることによって参考文献４７に記載されたような単一ウイルスを検出するデバイスに関してもよい。
【００９６】
別の実施形態において、本発明は、バイオマーカーに対する抗体が部分水素化グラフェンに結合されている前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，Prostate Specific Antigen）などのが
んバイオマーカーのためのセンサを提供する。この実施形態において、センサは、例えば、ナノワイヤを部分水素化グラフェンに置き換える又はそれで増強することによって、本発明の部分水素化グラフェンをセンサアレイの高感度／伝導性部品の中に代用して、参考文献５２に記載されたとおりに構築されてもよい。
【００９７】
別の実施形態において、Ｃａ２＋は、例えば、参考文献４６に記載されたとおりのカルモデュリンによって検出されてもよく；この実施形態において、カルモデュリンは、部分水素化グラフェンにカップリング、例えば、結合されていてもよい（参考文献５２のナノワイヤに代えて、又はそれに加えて）。
【００９８】
多くの他のセンサ用途が、本明細書で提供される教示による部分水素化グラフェンを使用して当業者によって行われてもよい。公知のバイオセンサで使用されてきたシリコンナノワイヤと違って、グラフェン（例えば、本発明による部分水素化グラフェン）は、並外
れたレベルの電子感度の利点を与え、小分子の個別タンパク質への単一結合事象でさえも検出を可能にし得る。部分水素化グラフェンの使用は、グラフェンベースのセンサへのタンパク質の吸着などの生体分子吸着の特異的制御を可能にし、それにより、大多数の可能性のある検出戦略を可能にする。さらに、本発明の方法（例えば、プラズマ法）は単一デバイス又はチップ上の大規模製作に容易に受け入れやすいので、特異的分子を検出するように調整された複数のこのようなセンサの製作を可能にする。
【００９９】
好適には、本発明のセンサは、バイオセンサである。
【０１００】
別の態様において、本発明は、センサの高感度素子が部分水素化グラフェンを含む、生物学的センサなどのセンサに関する。好適には、部分水素化グラフェンは、上に記載されたとおりの方法によって得られる。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、生体分子を吸着することができる表面を含むセンサであって、前記表面が部分水素化グラフェンを含むセンサに関する。
好適には、前記グラフェンは、０．０１％〜５０％水素化グラフェンである。
好適には、グラフェンは、３％〜１０％水素化グラフェン、好ましくは５％水素化グラフェンである。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、上に記載されたとおりの支持体を備えるセンサに関する。
【０１０３】
本発明は、本明細書に記載されるとおりに生成されたグラフェンの調整可能な特性を利用するこれら及び他の使用において用途を見出す。重要な利点は、本発明者らが、グラフェン表面上への親水性分子（タンパク質など）の吸着を制御する方法を今や教示し、これは、操作者の選択によっていかなる数の仕方でも利用され得ることである。
【０１０４】
グラフェン表面の調整
生体試料は、生物からの、又はそれに由来するいかなる試料も意味する。この試料は、粗試料であっても、又は精製若しくは部分精製試料であってもよい。試料は、体液などの流体、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、精液、尿又はいかなる他の体液であってもよい。試料はさらには、細菌、ウイルス又は他の微生物などの全生物を含んでもよい。試料は、生物からの細胞を含んでもよい。試料は、以下に記載されるような、生物から抽出又は精製された１又は２以上の生体分子を含んでもよい。
好適には、試料はインビトロでの試料である。
【０１０５】
生体分子は、タンパク質、核酸、炭水化物又は脂質などの、生きた生物により産生される分子を意味する。好適には、生体分子は、タンパク質又はタンパク質複合体である。好適には、生体分子は、親水性生体分子である。グラフェン表面へのタンパク質又は他の生体分子の結合は、電荷状態、部分結合の親水性／疎水性、又は行き渡っている塩／緩衝液／溶媒によって変わり得る。グラフェン表面の親水性が今や表面の水素化の割合を調節することにより調整され得ることは、本発明の利点である。
好適には、生体分子は、インビトロでの生体分子である。
【０１０６】
水素化値は、水素化％として表されてもよい。これは、ｓｐ３Ｈ−結合炭素原子に変換されたｓｐ２−結合炭素原子の割合を意味する。言い換えれば、それは、グラフェンシート中の炭素原子のどれだけの割合が会合水素原子を累積したかの尺度である。あらゆる炭素原子がＨ−結合されていれば、これは１００％水素飽和（グラファン）であり；炭素原子がまったくＨ−結合されていなければ、これは０％水素飽和（グラフェン）であり；本発明は、０％超で、１００％未満の値、すなわち、部分水素化グラフェンに関する。
【０１０７】
水素化は、当技術分野で知られたいかなる適切な手段によって測定されてもよい。水素化の評価のための例示的な技術は、実施例で実証される。例えば、水素化は、図１で実証されるとおりに水−グラフェン接触角を測定することにより推定されてもよい。この場合、２０秒の水素プラズマ露出時間は、およそ５％の水素化に相当し；８０秒の水素プラズマ露出時間は、およそ２０％の水素化に相当する、などである。同様に、図３を参照して、２０秒の水素プラズマ露出（図３ｃ）は、およそ５％の水素化であり；４０秒の水素プラズマ露出（図３ｄ）は、およそ１０％の水素化である、などである。代わりに、水素化は、以下のとおりにグラフェン−水界面エネルギーを計算することによって推定されてもよい。
【０１０８】
グラフェン−水界面エネルギーの計算
固体表面上のガス環境における液滴の場合、液−固界面エネルギーＷ、は、ヤング−デュプレの式：
Ｗ＝γω（１＋ｃｏｓθ）
（ここで、γωは、水の表面張力７２ｍＪ／ｍ２である（参考文献４４））
により、液滴と表面の間の平衡接触角に関係する。成長させられたままのグラフェン試料からの接触角（θｇｒ＝９１±１．７°）及びデータへの指数適合からの飽和値（θｇｒｈ＝６６±１．３°）を使用すると、水素プラズマ処理による表面エネルギーの変化は、ちょうど２つの表面についての界面エネルギーにおける変化：
ΔＷ＝ｃｏｓθｇｒ−ｃｏｓθｇｒｈ
であり、これは、測定された値について、−０．１９±０．０２ｅＶ／ｎｍ２である。銅基材の存在は、ネイティブなグラフェンについて測定された角度で小さい減少を生じさせ得るが（Shih, C.-J. et al. Breakdown in the wetting transparency of graphene. Phys. Rev. Lett. 109, 176101 (2012)）、それは、基材がすべての測定値に同じ効果を有
する場合、界面エネルギーの変化を計算するために使用される角度の変化に対して無視できる効果を有する。
【０１０９】
代わりに、格子定数（格子中の炭素原子間の平均距離）の変化が、グラフェンの水素化の評価として測定されてもよい。これは、例えば、本明細書で図６などの図を参照して説明されるとおりに行われる、例えば、電子回折を使用して行われてもよい。
【０１１０】
意外なことに、低レベルの水素化、例えば、０．１〜２０％の水素化が、部分水素化グラフェン表面への親水性分子の吸着を容易にするのに十分であった。
【０１１１】
好適には、本発明の水素化グラフェンは、炭素当たり０．０１〜５０％の水素を含んでもよく；又は炭素当たり０．０１〜１０％の水素を含んでもよく；又は炭素当たり１〜１０％の水素を含んでもよく；又は炭素当たり３〜１０％の水素を含んでもよく；又は炭素当たり３〜５％の水素を含んでもよい。
【０１１２】
【表１】
2019069890.tif 000005
【０１１３】
パターン化グラフェン
有利には、水素化の異なる度合いが、同じ物理的グラフェンシート内の異なる空間的位置（領域）で与えられてもよい。これは、一部の領域が比較的高い度合いに水素化され、他の領域が比較的低い度合いに水素化されるように、水素化の間にシートの異なる領域をマスキングすることにより行われてもよい。理想的には、一端に高い水素化値を有するグラフェンＥＭ支持体をもたらすことが望ましくあり得、水素化プロセスの間にマスキングを引き上げ、その結果、同じグラフェン支持体の他端は低い水素化値で残される。このように、最適水素化値は、グラフェン表面上に堆積されることが意図される特定の生体分子について決定される。可変の水素化を有するこれらの段階的グラフェン支持体は、本発明の部分水素化グラフェンのための較正又は最適水素化レベルの選択にとりわけ有用である。
【０１１４】
水素化の間のマスキングは、当技術分野で公知のいかなる適切な手段によって行われてもよい。例えば、グラフェン近くの電極の使用が用いられもよく、これは、それが適所にある間に水素原子をグラフェン表面から離して保護し又は偏向させる。このような電極は、特定の時間的経過にわたってグラフェン表面を横切って（例えば、グラフェン表面の真上を）引き上げられてもよく、その結果、最初に露出されるグラフェンは、最長の水素化処理を享受し（したがって、最高の水素飽和度）、最も長くマスキングされるグラフェンの領域は、水素への最低の露出を享受する（したがって、炭素当たり水素の最低値）。代わりに、表面に衝突するイオンをある電極に別のものよりもより近くで遅らせるように、グラフェンを横切る場を確立するために、２以上の電極を用いることができる。したがって、グラフェン基材を横切る線量の勾配は、有利にはグラフェン表面に直接マスキング材料を適用することを必要とせずに達成されてもよい。
【０１１５】
任意選択により、パターン化グラフェンを生成するように様々な量の水素化を同じグラフェンシートの異なる領域又は部分に適用するために、水素イオンの指向性ビームが使用されてもよい。
【０１１６】
一実施形態において、グラフェン上の異なる領域（空間的位置）は、異なるレベル又は
値に水素化される。
【０１１７】
一実施形態において、グラフェンは、グラフェン上のある位置における第１の水素化値からグラフェン上の第２の位置における第２の（異なる）水素化値まで均一に段階的に変化させてもよい。
【０１１８】
好適には、本発明のＥＭ支持体は、酸化グラフェンを含まない。
【０１１９】
好適には、本発明のＥＭ支持体は、グラファンを含まない。
【０１２０】
グラファンは、グラフェンではない。グラファンは、完全に水素化された炭素シートである。グラファンシート中の炭素は、それぞれ水素と結合する。言い換えれば、グラファン中の炭素と水素との比は、１対１である−存在するあらゆる炭素原子は、会合水素原子を有する。これは、十分又は完全（１００％）な水素飽和である。この物質は、グラファンである。本発明は、部分水素化グラフェンに関する。部分水素化は、水素原子による炭素原子の１００％未満（すなわち、１対１未満）の飽和を意味する。部分水素化グラフェンは、水素原子と結合も会合もしていない炭素原子を含む。したがって、部分水素化は、当技術分野におけるその通常の意味を有するべきである。部分水素化グラフェンは、結合水素原子と会合した炭素原子を少なくとも一部有するが、それらのすべてを有するわけではない。本発明が基づくのは、この中間の部分水素化グラフェン物質の意外な特性である。
【０１２１】
支持体構築
好適には、支持体は、電子顕微鏡法支持体又はバイオセンサ支持体などのセンサ支持体である。最も好適には、支持体は、電子顕微鏡法支持体である。電子顕微鏡法支持体は、電子顕微鏡法により調べられる試料の電子顕微鏡中への又はそれから外への運搬を可能にする装置である。機械的強度の度合いは、支持体の周辺壁又は周縁又は部材（バーなど）によって支持体に与えられる。調べられる試料は、支持体の周辺により規定される領域内の支持体の上に取り付けられる。試料それ自体は、典型的には支持体によって運ばれる格子又は膜の上に取り付けられる。
【０１２２】
支持体の格子又は膜部分は、典型的にはメッシュ又は「ホーリー膜（holey film）」構造を有する。これらの膜は、典型的には２つの数字、例えば、「２／１」によって当技術分野で記述される−これは、１マイクロメートル間隔で２マイクロメートルの孔又は穴を有する箔を意味する。同様に、２／４と指定される箔は、４マイクロメートルの間隔で、２マイクロメートルの穴又は孔を有する、などである。
【０１２３】
好適には、前記支持体部材は、バーである。好適には、前記支持バーは、グリッドに配置される。時に、ＥＭ支持体は、ＥＭグリッドと称される。
【０１２４】
支持膜は、支持箔と称されてもよい。
【０１２５】
好適には、グラフェンは、電子顕微鏡法支持体上に取り付けられている場合に水素化される。
【０１２６】
好適には、清浄化されるグラフェン表面は、電子顕微鏡法支持体上に取り付けられたグラフェンの表面である。
【０１２７】
グラフェン支持体が、電子顕微鏡法、例えば、生体分子の電子顕微鏡法における使用のために記述される場合、これは、当技術分野におけるその通常の意味を有する。特に、Ｅ
Ｍにおける使用の「ために」は、ＥＭにおける使用に「適する」ことを意味する。半導体科学の分野における実験用グラフェンシートは、純粋にその用途に使用され得る配置に形成されていない限り、生体分子のＥＭに「適さない」。
【０１２８】
好適には、支持体は、ＥＭ用途の寸法に作られている。
ＥＭ用途の寸法に作られては、３ｍｍ直径グリッドを意味してもよい。
【０１２９】
好適には、支持体は、ガラス状氷の薄い層を許容するように構成される。
【０１３０】
好適には、支持体は、伝導性である。
【０１３１】
好適には、支持体は、例えば、ＥＭ中の電荷散逸を促進するように、電気制御装置に操作可能に接続されるか、又はそのように適合される。
【０１３２】
好適には、支持体は、ＥＭのためのロボットによる取扱い及び／又はロボットによる試料調製を可能にするように適合される。
【０１３３】
好適には、支持体は、真空チャンバーにおいて密封される。
【０１３４】
好適には、支持体は、例えば、輸送又は貯蔵を容易にするために、保護環境で密封される。
【０１３５】
好適には、支持体は、輸送及び／又は取扱いの間の機械的保護のために包装される。
【０１３６】
一部の実施形態において、支持体は、アルミニウム又はステンレス鋼又はチタンを含んでもよい。
【０１３７】
好適には、支持体は、モリブデン、金、銅又はニッケルの１又は２以上を含む。最も好適には、支持体は、金を含む。
【０１３８】
好適には、支持体は、シリコンを含まない。
【０１３９】
グラフェンシートは、支持体のいずれかの側又は両側に適用されてもよい。
【０１４０】
支持体がホーリー炭素の層、例えば、金グリッド上にホーリー炭素の層を含む場合、好適にはグラフェンは、ホーリー炭素側に適用される。
【０１４１】
好適には、支持体は、支持体の周辺に１又は２以上の機械的マーカー、例えば、切り欠きを含んでもよい。これは支持体の配向に役立つという利点を有する。
【０１４２】
好適には、支持体は、Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ（商標）グリッドである。
【０１４３】
好適には、支持体は、穿孔支持膜を含む。好適には、穿孔支持体は、１又は複数の穴を有してもよい。好適には、穿孔支持体は、所定の穴サイズを有する。
【０１４４】
好適には、支持膜は、支持体それ自体の壁又は周縁又はバーに取り付けられる。
【０１４５】
穴は、いかなる形状のものであってもよい。好適には、穴は、円形又は正方形であってもよい。
【０１４６】
好適には、穴は、規則的に反復するパターンで配置されてもよい。
【０１４７】
好適には、穴サイズは、操作者の選択により決定される。
【０１４８】
好適には、支持膜で使用される穴は、０．０５〜１０μｍの寸法を有する。
最も好適には、支持膜が非晶質炭素を含む場合、使用される穴の寸法は、０．０５〜１０μｍの範囲である。
【０１４９】
好適には、バー幅は、操作者の選択により決定される。
【０１５０】
好適には、支持膜は、固体で、伝導性の薄膜である。
【０１５１】
好適には、支持膜は、１００〜５００アングストローム厚さである。
好適には、支持膜は、非晶質炭素を含む。
【０１５２】
好適には、支持膜は、１００〜５００オングストローム厚さの層の非晶質炭素支持膜を含む。
【０１５３】
好適には、支持体は、炭素膜、「自家製」炭素膜、又は他の供給元からの穿孔膜中に不規則な穴を含んでもよい。
【０１５４】
好適には、支持膜は、炭素膜である。
【０１５５】
最も好適には、支持体は、例えば、独国Jena市のQuantifoil Microtools GmbH 社によ
り生成された、３００メッシュ金グリッド上にホーリー炭素支持膜を含む。
【０１５６】
さらなる特定の及び好ましい態様は、添付の独立及び従属請求項に記載される。従属請求項の特徴は、必要に応じて、及び特許請求の範囲に明示的に記載されるもの以外と組み合わせて、独立請求項の特徴と組み合わされてもよい。
【０１５７】
装置の特徴が機能を与えるために操作可能であるように記載される場合、これは、その特徴を与える、又はその特徴を与えるように適合若しくは構成される装置の特徴を含む。
【０１５８】
さらなる用途
生体分子と相互作用するように部分水素化により調整されたグラフェンは、グラフェンベースのセンサを含めて、様々な用途で使用され得る。
【０１５９】
本発明は、電子顕微鏡法（ＥＭ）、例えば、クライオ−ＥＭに特定の用途を見出す。特に、本発明は、生体分子の電子顕微鏡法にとりわけ有用である。
【０１６０】
本発明の方法は、浮遊グラフェン表面などのグラフェン表面上のタンパク質の分布を精密に制御するために使用され得る。本発明者らは、単粒子電子低温顕微鏡法を使用しての画像化及び３次元再構成におけるその有用性を実証する。本発明の方法が、グラフェンを必要とする他の生物学的用途に使用されてもよいことは明らかである。
【０１６１】
本発明によって生成されたグラフェンベースの支持体（グリッド）は、前記支持体の製造、販売及び使用などの産業で用途を見出す。
【０１６２】
本発明の方法は、グラフェン製品の生成及び／又は清浄化に用途を見出す。
【０１６３】
本発明は、グラフェンベースのデバイス及びセンサの製造、並びに本明細書で教示される非破壊的仕方でのグラフェンの清浄化において用途を見出す。本発明は、その表面が検出又はアッセイのために特異的なタンパク質又は生体分子と相互作用するように調整されるグラフェンセンサのアレイの生成に使用されてもよい。本発明は、これを行うための直接的な及び非常に拡張性のある手段を提供する。
【０１６４】
本発明者らは、タンパク質と相互作用するようにグラフェン表面を特異的に調整する能力を提供する。これは、グラフェンとタンパク質のとの相互作用に依存するいかなるセンサ又はデバイスも特定の用途のために設計され得ることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
本発明の実施形態をこれから、添付の図面を参照して、さらに説明する。
【図１】低エネルギー水素プラズマ処理後のグラフェンの特徴付けを示す図である。プロットは、露出時間に対する空気−水−グラフェンの接触角を示し、差込み図は、角度を測定するために使用した光学顕微鏡写真の実施例を含む。曲線は、データへの指数関数的適合であり、速度定数は１／５６秒である。誤差バーは、ｙにおける各線量での３〜５の測定値の標準偏差であり、露出時間の推定精度は、ｘにおいて±１秒である。ディフラクトグラム（Diffractograms）（ｂ〜ｄ）：水素プラズマ露出前（ｂ）、２０秒後（ｃ）及び４０秒後（ｄ）の同じ浮遊グラフェン試料の制限視野電子回折パターン（selected area electron diffraction pattern）。矢印は、２．１４Åでの０〜１１０の反射を指し、３つのディフラクトグラムすべてについての尺度を設定する。ｂに対するｃ及びｄの格子定数の変化は、測定における誤差未満であり、近似的に０．９％に等しい（図６）。
【図２】水素プラズマ処理前（ａ）及び３０秒後（ｂ）の浮遊グラフェンの電子顕微鏡写真を示す図である。スケールバーは１０００Åであり、公称デフォーカスは−２．０μｍであり、線量は２５ｅ−／Å２である。ｃにおけるプロットは、各顕微鏡写真における総画像強度に対して正規化した、各完全顕微鏡写真におけるパワースペクトルを示し（図７ａ〜図７ｃ）、ここで、上側の黒色曲線は、２８±１．４Å厚さの非晶質炭素であり、赤色曲線（ａ）は、プラズマ前のグラフェン（画像ａ）であり、青色曲線（ｂ）は、プラズマ後のグラフェン（画像ｂ）である。
【図３】水素プラズマ処理グラフェン上のリボソームの画像を示す図である。パネルａ〜パネルｄは、８０Ｋにおけるガラス化氷中の７０Ｓリボソームの電子顕微鏡写真を示す。パネルａは、１０ｓＨプラズマ線量で処理された標準Qunatifoilグリッドである。パネルｂ〜パネルｄは、単層グラフェンで被覆され、それぞれ、１０、２０及び４０ｓのＨプラズマで処理されたQuantifoilグリッドである。他のブロッティング及びガラス化条件のすべては、４つの試料すべてについて同じである。差込み図は、各画像からの選択部分の拡大であり、粒子の典型的な分布を示す。スケールバーは、主画像について１０００Å、及び差込み図について２００Åである。
【図４】プラズマ処理グラフェン上のリボソーム構造データの分析を示す図である。パネルａは、グラフェン上の粒子の３つの顕微鏡写真から１９Åに再構成された、高度好熱菌（T. thermophilus）７０Ｓリボソームの電子密度マップの３Ｄレンダリングを示す。重ね合わせリボン図は、結晶構造のマップへの剛体適合である。パネルｂは、グラフェン基材（赤色点線）及び非晶質炭素基材（黒色点線）に対する２０６１個リボソームの配向角の等積射影である。画像ｃは、グラフェン上で５．０Åに再構成された出芽酵母（S.cerevisiae）８０Ｓリボソームの不鮮明電子密度マップを介した１．３Å切片である。４０Ｓサブユニットのぼやけ（矢印）は、試料の構造的不均一性（conformationalheterogeneity）のためであり；フーリエ空間における配向のこの及び非最適範囲は、マップの分解能を制限する。パネルｄは、グラフェン（赤色点線）及び非晶質炭素（黒色点線）上の２００５０個８０Ｓリボソームの配向の射影である。
【図５】グラフェン基材上のタンパク質の運動の低下を示す図である。高エネルギー電子で照射されたグラフェン上の氷中のタンパク質粒子は、２つの明確な運動の位相を示す。その初期の位置からの８０Ｓリボソームの平均変位を、非晶質炭素（黒色＼）とグラフェン（赤色−）基材の両方について時間に対してプロットする。各点は、その位置が一定電子ビーム照射（３００ｋｅＶ；１６ｅ−／Å２／秒）下の５フレーム移動平均を使用して測定された２００５０個粒子のＲＭＳ変位を表す。適合点についての誤差バーは、平均値の標準誤差であり、各末端に隣接する２つの点についての誤差バーは、適合切片から計算する（方法を参照のこと）。差込み図は、７つの無作為に選択された粒子についての個別の軌道を示し、ここで、点は、粒子の初期及び最終の位置を示す（水平及び垂直スケールは、同じであり；各軌道原点は、５Åだけ水平に補正されている）。
【図６】制限視野ディフラクトグラムからの方位角積分強度プロットを示す図である。プロットは、グラフェンへの変換と比較して格子定数における変化を測定するために使用された、水素プラズマ処理前及び８０秒の水素プラズマ処理後に取られた方位角積分ディフラクトグラムである。矢印で示される、０〜１１０ピーク位置の差は、−１．７×１０−３Å−１であり、これは、格子定数における−０．４％のシフトに相当する。これは、試料から試料への測定値の精度未満であり、これは、グリッド上のグラフェンメンブレンの伸縮のために格子定数の変動（標準偏差＝０．９％）によって制限される。
【図７】炭素基材の低線量画像を示す図である。パネルａは、未処理グラフェンを示し、パネルｂは、３０秒の水素プラズマ処理後のａと同じ試料である。パネルｃは、比較のための２８Å厚さの非晶質炭素を示す。差込み図は、（１０２４ｐｘ）２に縮小した、各画像のパワースペクトル（ＦＦＴ）であり、誤差バーはすべて２０００Åである。パネルｄは、マイカ基材上のｃからの炭素層のエッジの接触モードＡＦＭトポグラフィー画像であり、これは、炭素層の厚さを正確に測定するために使用した（誤差バーは５０００Åである）。矢印（ａ）は、マイカ基材上の切断炭素層のエッジを指す。パネルｅは、ｄからの高さ値のヒストグラムを含み、ガウシアン適合で厚さを決定する。比較的小さい赤色ピークは、マイカ基材の高さであり、比較的大きいピークは、非晶質炭素層上の高さであり、差は、２８±１．４Åである。
【図８】氷中リボソームの電子ディフラクトグラムである。パネルａは、図３ａ中の浮遊氷からの制限視野回折パターンを示し、ここで、３．７０Å及び２．１４Åにおける非晶質氷についての最初の２つの散乱デバイシェラー環は、矢印によって示される（Dubochet, J. et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988)）。中心部における白色の円板は、ワイヤ上の自家製白金ボールである一次ビーム止めの影である。パネルｂは、図３ｃ中の浮遊グラフェン上の氷中リボソームについての回折パターンを示し、ここで、単層グラフェンの２．１４Åでの０〜１１０の反射が示され、３つのディフラクトグラムすべてについて倍率スケールを設定する。同様に、パネルｃは、図３ｄの場合の浮遊グラフェン上の氷中リボソームについてのディフラクトグラムを示し、０〜１１０のピークが示される。さらなる回折ピークは、薄膜の表面上の小さい汚染氷結晶からであり、これは、顕微鏡写真で目視できる。各ディフラクトグラムのためのカメラ長は、同じであり、公称４７ｃｍである。
【図９】Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｓｈｅｌｌ相関係数を示す図である。データセットの２つのランダムな半分からリファインされた再構成電子密度マップを使用して、７０Ｓ（ａ）及び８０Ｓ（ｂ）リボソームについて計算し、再構成過程を通してそれぞれを別個に保った（「至適基準（gold standard）」）（Mindell, J. A. & Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. Journal of Structural Biology 142, 334-347 (2003)）。０．１４３基準（Patolsky, F. et al. Electrical detection of single viruses. P Natl Acad Sci USA 101, 14017-14022 (2004)）を使用して、３つの顕微鏡写真を使用してのグラフェン上の２０６１個粒子からの７０Ｓマップの分解能は、１９．０Åであった。グラフェン上の２０，０５０個粒子からの８０Ｓマップの分解能は、５．２Åであり、５．０Åに対して改善をほとんど示さず、運動補正した（ｂ、赤色曲線）。本発明者らは、これを、分解能が運動補正前に６．１Å及び運動補正後に５．１Åである、同じリボソーム試料に関する以前に公表されたデータベースからランダムで選択した同じ数の粒子を使用する再構成と比較した（黒色曲線）（Bai, X.-C., Fernandez, I. S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosomestructures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013)）。
【図１０】７０Ｓリボソーム電子密度マップを介した７６切片のモンタージュを示す図である。各切片は４．５８Å厚さであり、スケールバーは５００Åである。［実施例］
【０１６６】
本発明の実施形態の実施例を、添付の図面を参照して、本明細書で詳細に開示する。本発明は、開示されたまさにそれらの実施例に限定されないこと、及び様々な変形及び変更が、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物により定義されるとおりの本発明の範囲から逸脱することなく当業者によって、そこで行われ得ることが理解される。
【０１６７】
方法
グラフェン成長
グラフェンは、銅箔基材上で化学蒸着（ＣＶＤ）により成長させた（Reina, A. et al.
Large area, few-layer graphene films on arbitrary substrates by chemical vapordeposition. Nano Lett. 9, 30-35 (2009)、Li, X. et al.Large-Area Synthesis of High-Quality and Uniform Graphene Films on Copper Foils. Science 324, 1312-1314 (2009)）。簡潔には、２５μｍの銅箔（Alfa社製Aesar#13382）の約１８ｃｍ２の一片を乾燥−ポンプ吸い込みＣＶＤ炉の２５ｍｍ直径の石英管に入れ、２０ｍＴｏｒｒ未満に排気し、次いで、反応管中の圧力を５００ｍＴｏｒｒにもっていき、２０ｓｃｃｍの流量で水素（９９．９９９％）ガスの連続流に曝露した。オーブンの温度を熱電対制御下で約１５分の経過をかけて１０００℃に上昇させた。温度が到達するとすぐに、追加の２０ｓｃｃｍのメタン（９９．９９９％）を１５分の間反応チャンバーに加え、合計圧力を７００ｍＴｏｒｒにもっていった。メタン添加が終わった後、加熱を切り、反応管を２時間をかけて連続水素流下で周囲温度にゆっくりと冷却した。冷えるとすぐに、水素流を止め、チャンバーを乾燥窒素で通気し、銅箔上のグラフェンを成長管から取り出し、使用前に清浄な低湿度貯蔵ボックス内の厳密に清浄化されたFluorwareウェーハ容器に保存した。
【０１６８】
接触角測定
グラフェン水接触角を測定するために、特注ディスクパンチを使用して個別の３．２ｍｍ直径のディスクを銅箔上のグラフェンから打ち抜いた。ディスクを、最初にＣＭＯＳグレードイソプロピルアルコール（Sigma社製）にそれらを１０秒間浸すことにより清浄化
し、次いで、残存溶媒が蒸発した後、グリッドがＲＦコイルのエッジから１５±１ｃｍに位置する市販のプラズマ反応チャンバー（Fischione社製Model 1070）内の硝酸清浄化ガ
ラススライド上に置いた。水素の供給源は、高純度電気分解水素発生器（Dominik社製Hunter model 20HMD）であった。ゼロ時間露出線量の制御は、様々な溶媒清浄化処理と一緒
及び一緒でないものを含み；本発明者らは、接触角が実験誤差内に両方ともについて同じであることを見出した。各ディスクを光学顕微鏡（Zeiss社製Axiophot）に取り付け、１
８ＭＯｈｍの脱イオン水１μＬの液滴を適用し、顕微鏡に付属の較正デジタルカメラ（Zeiss社製ERc5s）を使用してピペット先端で引き抜き後直ちに（５秒以内に）画像化した。本発明者らは、液滴蒸発速度（１．４ｎＬ／秒）を測定し、それが、水適用と画像取得の間の遅れの間の角度の無視できる変化（０．５°未満）を与えることを見出した。各画像をその後に分析して、基材面と、液滴が表面に会う点における液滴に対する接平面との間の角度をグラフを使って測定することにより接触角を得た。この測定を、プラズマ線量のそれぞれについて３〜６回行い；次いで、画像中で測定した液滴体積とゼロプラズマ線量についての値との比で除すことによって正規化した。本発明者らは、この正規化がこの少量の体積のピベット操作の際の誤差を補正するのに必要であることを見出した。次いで、複数の測定値を平均し、標準偏差を各線量における角度の誤差とみなした。最後に、本発明者らは、以下に記載されるとおりにその後にグラフェンをＥＭグリッドに移し、次いで、電子顕微鏡でそれらを画像化することにより、打ち抜きディスクを被覆するグラフェン
の存在を確認した。
【０１６９】
グラフェングリッドの調製
浮遊単層グラフェンＥＭグリッドを作製するために、本発明者らは、Regan et al（Regan, W. et al. A direct transfer of layer-area graphene. Appl. Phys. Lett. 96, 113102 (2010)）により最初に記載され、参考文献３０でさらに発展されたものに基づく方
法を使用する。本発明者らは、アンチキャピラリーピンセットを使用して、それらを個別にそれぞれクロロホルム、アセトン及びイソプロピルアルコール（Sigma-Aldrich社製、
超高純度半導体グレード溶媒）に約１５秒間浸漬することにより３００メッシュ金製グリッド（Quantifoil社製Au 300 1.2/1.3）上の市販のホーリー炭素を清浄することによって開始した。本発明者らは、これが、製造後のQuantifoil膜上に残存するいずれかの残留フォトレジスト及び大きな表面汚染物を除去するのに役立つことを見出した。空気中でブロッティング乾燥させた後、本発明者らは、次いで、上に述べたプラズマ反応器内の特注ステンレス鋼サスペンジョンホルダにグリッドを取り付けた。チャンバーを１０−５Ｔｏｒｒ未満に排気し、次いで、超高純度アルゴン及び酸素（ＢＯＣ９９．９９９９％）を９：１の質量比で２１ｍＴｏｒｒまで定常圧力に入れた。自動調整ＲＦプラズマを４０ワット（３Ｗ未満の逆電力）でスパークさせ、特定の時間適用した。次いでQuantifoilグリッドをグラフェン移動のために直ちに使用した。Qunatifoilグリッドをグラフェン単層で被覆するために、銅上のグラフェンの３．２ｍｍディスクをより大きな箔から特注機械式パンチを使用して切断した。このディスクをアセトン、及びイソプロパノール（Sigma社製、CMOSグレード）にそれぞれ１０〜１５秒間浸漬し、使用前にブロッティング乾燥させた。
次いで、プラズマ清浄化Quantifoilグリッドをディスクに炭素側を下にして適用した。光学顕微鏡（Zeiss社製Axiophot）を使用して、グリッド「サンドイッチ」を検査し、グリ
ッドとディスクの両方ともが平坦であり、粒子状汚染物を含まず、次の工程前に互いと良好な接触状態にあることを確認した。次いで、７μＬのＣＭＱＳグレードイソプロピルアルコールをグリッドの上部に加え、その液滴を空気中で乾燥させた。アルコールの後退メニスカスは、グラフェン表面と接触状態のQuantifoilの炭素膜を引き、これは、表面からの反射光の色の変化により立証された。次に、グリッド−ディスクサンドイッチを結晶皿中緩衝ＦｅＣｌ３（Sigma社製）の約５０ｍＬに２０分間浮かせた。次いで、グリッドを
、炎に当てたＰｔ輪によって３２％ＨＣｌ（Sigma社製CMOSグレード）に５分間、次いで
１０％ＨＣｌに５分間移し、続いて１８ＭＯｈｍの脱イオン水中で３回すすぎ洗いした。最終の水ステップ後、その輪を使用してグリッドを酸洗浄化されたガラス製ペトリ皿内のろ紙（Ｗｈａｔｍａｎｎ＃１）片に移し、使用まで低湿度ボックス中に保存した。
【０１７０】
水素処理浮遊グラフェンの回折研究
浮遊グラフェンの制限視野回折研究を、以下の方法で水素プラズマ露出前後に行った：最初に、ＣＶＤ成長グラフェンを上に記載したとおりの前清浄化Quantifoilグリッドに移した。７５％／２５％Ａｒ／Ｏ２プラズマで５０Ｗにて５分間清浄化したシングル傾斜ホルダ（FEI社製）に取り付けた。その残留カラム圧が公称８８ｎＴｏｒｒ（最接近イオン
ポンプで測定した）であるFEI社製Tecnai F30顕微鏡によって３００ｋｅＶ電子で画像化
し、試料を取り囲む汚染防止シールドを、液体窒素で冷却した。制限視野ディフラクトグラムは、約３０ｅ／Å２／秒のフルエンス、６９０ｍｍの公称カメラ長、１秒間の露出時間、及び試料における０．３０μｍ２の検査視野（interrogated area）に相当する１０
μｍ直径の制限視野開口部を使用して、液体冷却２Ｋ×２Ｋ  ＣＣＤカメラ（Tietz社製F224HD）で収集した。実カメラ長は、多結晶アルミニウムの薄膜の１１１〜３１１格子反
射を使用して較正した。第１のディフラクトグラムを収集した後、試料をカラムから取り出し、直ちに、依然としてホルダに取り付けられていながら密封されて慎重に清浄化された容器で、ホルダ中に取り付けられていながら水素プラズマに露出されるプラズマチャンバーに移送し、次いで、直ちに第２のデータセットの収集のための電子顕微鏡に戻した。この移動プロセスを使用する反復実験の間に、本発明者らは、グラフェン試料の汚染の証
拠を何ら見なかった。最終のディフラクトグラムを白地に黒に反転して、印刷する場合にコントラストを改善した。
【０１７１】
水素プラズマ処理グラフェングリッドを使用してのガラス化及びクライオ−電子顕微鏡法
V. Ramakrishnan labにより提供された高度好熱菌７０Ｓリボソームの凍結保存品（Voorhees, R. M., Weixlbaumer, A., Loakes, D., Kelley, A. C. & Ramakrishnan, V. Insights into substrate stabilization from snapshots of thepeptidyl transferase center of the intact 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol.16, 528-533 (2009)）を解凍し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、６ｍＭ  ＢＭＥ中７０ｎＭの濃度に、その間ずっと氷上に保ちながら希釈した。グラフェングリッドを、上に記載したとおりの純粋水素プラズマで、使用直前に指示された時間処理した。４℃及び１００％相対湿度に平衡にしたクライオプランジャ（FEI社製Vitrobot IV）に入れ；３μＬの試料を適用し、６０秒間インキュベートさせ、−２０の力で２秒間ブロッティングし、次いで、その融点のちょうど上で液体エタン中に押し込んだ。次いで、グリッドを画像化のためにFEI社製Polara電子顕微鏡に移動する
まで、液体窒素中に保存した。ガラス化リボソームを、約８０〜９０Ｋの温度で公称倍率２３ｋ×にて非常に低い線量条件（２．５ｅ−／Å２／秒；ｌｏｗ  ＭＡＧモードで０．２ｅ／Å２未満の前露出）下に３００ＫｅＶ電子で画像化した。露出はＣＭＯＳ直接電子検出器（FEI社製back-thinned Falcon II）上で１秒であり、較正ピクセルは、試料にお
いて（４．５８Å）２に相当する。
【０１７２】
単粒子データ分析及びモデル適合
２２８２個の粒子を、半自動群法（semiautomated swarm method）によるEMAN2のボク
サープログラムを使用して３枚の顕微鏡写真から選択した（Tang, G. et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural
Biology 157, 38-46 (2007)）。次に、粒子を前処理し、Relion（Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach tocryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology 180, 519-530(2012)）で７６×７６ピクセルボックス
（スケールは、４．５８Å／ｐｘ）に抽出し、これは、CTFFIND3を使用してのＣＴＦフィッティングを含んだ（Mindell, J. A. & Grigorieff, N. Accurate determination of localdefocus and specimen tilt in electron microscopy. Journal of Structural Biology142, 334-347 (2003)）。１８クラスの２Ｄ分類の１ラウンド後に、２２１個の粒子
を捨て、残りの２０６１個を３Ｄリファインメント（3D refinement）に使用した。３Ｄ
リファインメントは、５０Åに低域濾波した、参考文献３３からの結晶構造から生成した初期モデルを使用してRelionで行った。３Ｄリファインメントは、３．６°の推定角度正確度及び１９．３Åの分解能で収束した。最終マップを１９．３Åに低域濾波した。最終リファインメント反復（Relionにおける回転及び傾斜）で画像化した各粒子に割り当てた角度を使用して、配向のプロットを生成した。UCSF Chimera剛体フィッティングアルゴリズム（Pettersen, E. F.et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research andanalysis. J Comput Chem 25, 1605-1612 (2004)）を使用して、２ＷＤＫ及び２ＷＤＬからの合わせたＰＤＢをマップに適合させた。マップ及びモデルの３ＤレンダリングをChimeraで作成した。
【実施例１】
【０１７３】
グラフェンの水素化
この実施例で、本発明者らは、部分水素化グラフェンを作製する方法を実証する。
【０１７４】
本発明者らは、水素イオン又は水素原子をグラフェンの表面に適用する（この実施例では、水素プラズマによる）。
【０１７５】
水素プラズマは、１〜２１ｅＶの範囲のエネルギーで適用する。
【０１７６】
水素化（本実施例では水素プラズマによる）に応じてグラフェン表面の疎水性の変化を測定するために、本発明者らは、銅基材上でＣＶＤにより成長させた場合の水、空気及びグラフェン間の静的接触角を測定した。１μｌの水滴を銅上のグラフェンに適用し、デジタルカメラに付属の較正光学顕微鏡を使用して画像化した（図１ａ差込み図）。各測定を、方法で詳述したとおりに、５０ｍＴｏｒｒで、およそ１０〜１５ｅＶであると推定されるエネルギー（電子温度）の純粋水素プラズマへの連続的に増加する線量の露出について反復した。これらの測定の結果を図１ａに示す。本発明者らは、接触角が、１／５６秒の速度定数で９１±１．７°の値から６６±１．３°の飽和値に指数関数的に低下することを見出した。本来のグラフェンについての９１°の接触角（図１ａ）は、グラフェンについて報告された値（Taherian, F., Marcon, V., van der Vegt, N. F. A. & Leroy, F. What is the contact angle of water on graphene? Langmuir 29, 1457-1465 (2013)）の広い範囲内に十分にあり、６０〜８０°の範囲の接触角は、典型的には非晶質炭素基材上のタンパク質堆積に使用されるもの（Dubochet, J., Groom, M. & Mueller-Neuteboom, S. in Advances inOptical and Electron Microscopy (Barer, R. & Cosslett, V. E.) 8, 107-135(Academic Press, 1982)）と同等である。
【０１７７】
低エネルギー水素プラズマ中に存在する主な種は、Ｈ、Ｈ＋、Ｈ２＋、Ｈ３＋及び自由電子である（Mendez, I., Gordillo-Vazquez, F. J., Herrero, V. J. & Tanarro, I. Atom and ion chemistry in low pressure hydrogen dc plasmas. J Phys Chem A110, 6060-6066 (2006)）。この事実及びグラフェンの延長水素プラズマ処理がそれをグラファンに完全に変換する（Elias, D. C. et al. Control of graphene's properties by reversible hydrogenation: evidence for graphane. Science 323,610-613 (2009)）という観察に基づいて、本発明者らは、グラフェンとプラズマとの一次化学反応が反応
ｓｐ２Ｃ＋Ｈ＜−＞ｓｐ３ＣＨ
を介したグラフェン格子の直接水素化であることを予期する。
【０１７８】
基材格子のグラフェンへの変換をモニターするために、本発明者らは、電子回折を使用してプラズマ露出後の格子定数における変化を測定した。結果を図１ｂに示す。プラズマ処理８０秒の線量後、グラフェン格子の０〜１１０反射からのピークは、広がり、より低い周波数にわずかにシフトする（図６）。測定における誤差は、精度を約１％に制限する。グラフェン形成の従来の研究（ここでは、格子定数は、グラファンへの完全変換後におよそ５％だけ低下する（Elias, D. C. et al. Control of graphene's properties by reversiblehydrogenation: evidence for graphane. Science 323, 610-613 (2009)））に基づいて、これは、８０秒の線量後のグラフェンにおける炭素−炭素ｓｐ２結合のｓｐ３−Ｈ結合への変換について約１０％の上界に相当する。さらに、プラズマ処理後のディフラクトグラムにおける鋭いピーク（図１ｃ〜図１ｄ）は、下にあるグラフェン格子が保存されていることを実証する。興味深いことに、グラファンへのグラフェン格子の部分還元でさえも、疎水性にかなりの変化をもたらし、接触角の減少を飽和させる。ガス中の固体表面上の液滴の接触角についてのヤング−デュプレの式を使用して、本発明者らは、水素プラズマにより誘発される水−グラフェン表面界面エネルギーの変化を計算するために上記の接触角測定値を使用することができる。結果は、銅上の成長したままのグラフェンについての９１°から６６°の飽和値への接触角のシフトは、０．１９±０．０２ｅＶ／ｎｍ２のグラフェン−水界面エネルギーの減少に相当することである。
【実施例２】
【０１７９】
グラフェン清浄化
この実施例で、本発明者らは、水素プラズマ処理などの小原子プラズマ処理が、グラフ
ェン上の表面汚染物を除去することを実証する。
【０１８０】
特に、本発明者らは、グラフェン表面を清浄化する方法であって、前記グラフェン表面を水素プラズマと接触させることを含む方法を示す。接触の時間は、以下に示されるとおりに、表面不純物を除去するのに十分な時間である。
【０１８１】
本発明者らは、プラズマ処理前後の電子顕微鏡法のための基材としてのグラフェンの特性を研究し、それを非晶質炭素と比較した。Quantifollグリッドに移した浮遊グラフェンは、タンパク質を画像化するために典型的な条件（３００ｋｅＶ、２５ｅ−／Å２、３９０００×倍率）下で電子によって調べる場合、かなりの量の表面汚染物を示す（図２ａ及び図７ａ）。グラフェンを３０秒の水素プラズマに露出すると、大部分の表面汚染を除去するが（図２ｂ及び図７ｂ）、水素及び恐らくは一部の非揮発汚染残留物の追加のために、画像中のバックグラウンド信号レベルはわずかに増加する（図２ｃ中の赤色及び青色曲線を比較されたい）。非晶質炭素の妥当に薄い２８±１．４Å層と比較して（図２ｃ及び図７ｃ〜図７ｅ）、処理グラフェン格子のバックグラウンド信号は、かなり低く、特徴がなく、Thon環は存在しない（図２ｃ）。
【０１８２】
本発明者らは、水素プラズマが、それがグラフェンそれ自体を改変するよりも、はるかに速くグラフェン上の表面汚染を除去又は減少させることに注目する。これは、炭化水素汚染物が、エネルギープラズマとの化学反応により容易に分解及び揮発されるからである。グラフェンｓｐ２結合は化学的改変に対して非常に耐性であるので、それは、プラズマ中の原子水素によってゆっくりと還元されるだけである。重要なことには、１０〜１５ｅＶの範囲の水素種は、格子においてそれらのｓｐ２結合から炭素原子を直接除去する（およそ２１ｅＶ）には不十分なエネルギーを有し（Russo, C. J. & Golovchenko, J. A. Atom-by-atom nucleation and growth of graphene nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 5953-5957(2012)、Krasheninnikov, A. V. & Banhart, F. Engineering of nanostructured carbon materials with electron or ion beams. Nat Mater 6, 723-733 (2007)、Xie, L., Jiao, L. & Dai, H. Selective etching of graphene edges by hydrogen plasma. J. Am. Chem. Soc. 132,14751-14753 (2010)）、バルク格子に対する損傷の可能な機構としてスパッタリングを排除する。
【実施例３】
【０１８３】
グラフェン表面の調整
この実施例で、本発明者らは、本発明によるグラフェンの部分水素化によるグラフェンへのタンパク質の吸着の制御を示す。本発明者らはグラフェンの疎水性を制御し得ることを示してきたが、本発明者らは、次いで、７０Ｓリボソームを使用してクライオ−ＥＭのための基材としての水素プラズマ処理グラフェンを試験した。本発明者らは単層グラフェンをQuantifoilＥＭグリッド上に移し、それらを様々な線量の水素プラズマをかけ、それらを使用して、７０Ｓリボソームのガラス化試料を調製した。図３ａは、グラフェンのないグリッド上で、７０Ｓ粒子が非常に少ししかガラス状氷中に目視できないことを示すが、大部分は、Quantifoil炭素の表面及び穴のエッジに結合しているからである（穴のエッジにおけるリボソームの環に留意されたい）。１０秒の水素プラズマで処理したグラフェングリッドと同一の凍結及びブロッティング条件を使用すると、ガラス状氷の小パッチのみが目視できた（図３ｂ）。これは、グラフェン表面の不完全な濡れを示し、この線量での接触角の小さい変化と一致する（図１ａ）。２０秒の水素プラズマ後、グラフェン表面は、より一様に濡れ、氷品質は非常に改善され、顕微鏡写真１枚当たりおよそ６００個のリボソーム粒子である（１．２μｍの直径穴、図３ｃ）。この粒子密度（６０７個選択粒子／μｍ２）は、グラフェンのないグリッド上のもの（５７個選択粒子／μｍ２、図３ａ及び図３ｃを比較されたい）よりもはるかに大きく、７０Ｓリボソームがグラフェン表面に吸着することを示す。穴のエッジの周りの粒子の輪は、もはや存在せず、リボソームが
水素処理グラフェン表面に一様に吸着することを示す。４０秒へのプラズマ線量のさらなる増加は、非常に高密度に充填されたリボソームをもたらす（およそ１９００個粒子／μｍ２、図３ｄ）。図３ａ、図３ｃ及び図３ｄ中の浮遊氷の場合、制限視野ディフラクトグラムは、氷のガラス状の性質を実証し、及びグラフェン層の存在を立証するために最初の低い線量画像後に取得した（図８）。全体として、これらの結果は、他の条件（ブロット時間、湿度など）を一様に保ち、それにより実験者が氷中の粒子分布を調整するためにグラフェン表面を使用することを可能にする場合、水素プラズマ線量と表面粒子密度との間の単調な関係があることを示す。
【実施例４】
【０１８４】
部分水素化グラフェンを含む電子顕微鏡法支持体
生体試料を受容するための電子顕微鏡法支持体は、上に記載したとおりに生成する。支持体は、上記方法の項に記載したとおりに、支持バーを備え、前記支持バーに付着されたグラフェンを含み、前記グラフェンは、部分水素化グラフェンであることを特徴とする。ここで、本発明者らは、この部分水素化グラフェンのクライオ−ＥＭのための基材としての使用を実証する。グラフェン表面に吸着された生体分子の構造的一体性を立証するために、本発明者らは、図３ｃに示されたものを含めて、グラフェン支持層の存在がその後の電子回折により立証される３枚の顕微鏡写真から７０Ｓリボソームの３次元構造を決定した。３枚の顕微鏡写真から選択した２０６１個の粒子を使用して、本発明者らは、１９Åの分解能で再構成電子密度マップを得（図９ａ）、これを、図４ａ〜図４ｃ及び図１０に示す。本発明者らは、剛体フィッティングを使用して参考文献３３からの７０Ｓリボソームの結晶構造を適合させ、それが分子中にほとんどゆがみをもたないモデルとよく一致することを見出した（図４ｄ）。最後に、本発明者らは、再構成の間に各粒子に割り当てた角度を使用してグラフェン基材上のリボソームの配向分布を評価した。結果を図４ｅにモルワイデ（Molleweide）等積図法を使用してプロットする。リボソームはグラフェン上で優先的配向を示す一方で、配向分布は、グロー放電非晶質炭素上で最適条件下に得た同様のデータと比べて遜色がない（図４ｂの射影に黒色で示す）（Bai, X.-C., Fernandez, I. S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013)）。
【実施例５】
【０１８５】
画像品質の改善
粒子画像における欠陥は、しばしば短距離運動の経験的モデルを使用して特徴付けられる。モデルは、ガウシアン関数を使用して、経験的に決定されたフィッティングパラメータ（Debye-Waller熱パラメータ又はＢ因子）が画像品質の尺度を与える高分解能情報の喪失を特徴付ける（Voorhees, R. M., Weixlbaumer, A., Loakes, D., Kelley, A. C. & Ramakrishnan, V. Insights into substrate stabilization from snapshots of the peptidyl transferase center of the intact 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol.16, 528-533 (2009)）。多くの可変要素が、ビーム誘導粒子移動、試験片荷電、照射損傷及び
試料不均一性を含めて、Ｂ因子の一因となり得る。画像のゆがみ及び粒子運動の複雑な性質は、簡単なガウシアン関数によって数学的に十分にはモデル化されないが、Ｂ因子の変化は、所与の方法の改善を特徴付けるために有用である。本発明者らは、非晶質炭素と比較してグラフェン上の８０ＳリボソームのＢ因子の約３５％（８２Å２）の減少を観察した。したがって、グラフェンは、いかなる粒子画像の情報内容も改善すると予期することができる。
【０１８６】
改善された画像品質の原因を調査するために、本発明者らは、各顕微鏡写真から収集した高速度フレーム捕獲データを分析した。本発明者らの８０Ｓデータは、１６フレームについて１ｅ−／Å２／フレームの直接電子検出器を使用して取得した。５フレーム移動平均を使用して、本発明者らは露出の間に各リボソームの運動を追跡した。本発明者らは、
各データセット中の２００５０個粒子すべての各フレームについてアンサンブル平均を計算し、図５にその軌道をプロットする。８０Ｓ粒子のビーム誘導移動は２つの線形位相を有し、これを本発明者らはプロットにおいて別個に適合する。直線の勾配は、移動の速度であり、図５は、このために場合によって「速度プロット」と称されてもよい。１秒当たり１６画像を捕獲した。この実施例におけるグラフェンは、２０秒水素処理されており、図３（ｃ）で使用した材料に相当する。初期の速い位相は、本発明によって調製したグラフェン上で４．４±０．２Å／秒（χ２＝０．００１８）及び非晶質炭素上で６．５±０．２Å／秒（χ２＝０．００２７）の速度を有する。第２の位相の速度は、本発明によって調製したグラフェン上で０．９１±０．０２Å／秒（χ２＝０．０００５１）及び非晶質炭素上で４．１８±０．０４Å／秒（χ２＝０．００１４）である（非晶質炭素は、本発明の優れた性能を示す比較情報として含まれた従来技術の材料である）。本発明者らは、最初と最後の２つの点を適合から省略するが、それらが、３又は４フレーム平均からであり、したがって、示されたとおりに有意により多くの誤差を有するからである。さらに、最初のフレームについて計算した粒子の位置に対するゼロ変位の点の割当てはいくらか任意である。真の初期粒子の位置は、運動の第１相への適合からｙ−切片として取得することもでき、合計粒子変位のより低い推定をもたらす。
【０１８７】
本発明者らは、ビーム誘導粒子移動の第１の位相が、試験片上の電荷及び応力の複雑な初期蓄積によっており、これは、照射領域の部分にわたる大きな電場の増加及び放射線分解による氷内の密度変化を含んでもよい（「充電位相」）ことを仮定する。対照的に、第２の位相の定常速度は、ビームにより誘導される明らかに一定の力に対する基材の機械的応答により支配されていると思われる（「機械的応答位相」）。両方の位相についての粒子速度は、グラフェンについてより小さく、すなわち、初期の充電位相の間に約３０％の減少及び機械的応答位相の間にほとんど５倍の減少である。これは、注目に値し、意外なことであり、本発明者らが予期したものよりもさらにより良好である。
【０１８８】
本発明者らはまた、新たに開発した運動補正アルゴリズム（Bai, X.-C., Fernandez, I.S., McMullan, G. & Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic  resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife 2, e00461 (2013)）を使用して、３Ｄ再構成の間の粒子運動について補正した。本発明者らは、これはグラフェンデータについてマップを有意には改善しないが、一方で非晶質炭素上の同じ試料に適用した同じアルゴリズムは、実に再構成の有意な改善をもたらすことを見出した（図９ｂ）。これは、本発明者らが、本発明によって粒子の運動を減少させた事実と一致し、したがって、運動補正はあまり有効でない。
【０１８９】
したがって、本発明者らは、本発明による優れた性能を、従来技術と直接比較することにより示す。本発明は、画像ごとにより多くの情報を提供する。本発明は、画像ごとにより大きい分解能を提供する。本発明は、画像ごとにより大きい信号を提供する。本発明は、粒子がより容易に整列されることを可能にする。したがって、多くの技術的利益が、本発明によって提供される。
【０１９０】
要約
これらの実施例で、本発明者らは、部分水素化（例えば、低エネルギー水素プラズマを使用して）が、グラフェン疎水性を非破壊的に改変して、生体分子の相互作用を可能にし得ることを実証してきた。炭素原子２０個ごとに約１個の水素原子の付加でさえも、疎水性にかなりの変化をもたらし、表面へのタンパク質の吸着をもたらす（例えば、２０秒の線量、図３ｃ）。格子の部分水素化のみによる界面エネルギーの大きな変化及び接触角の飽和を理解するために、本発明者らは、以下のモデルを提案する。水−グラフェン界面エネルギーは、水と非極性グラフェン格子との間の疎水性相互作用によって支配されている。格子への水素の付加は、グラフェン表面の近くの水分子の秩序を破壊する。それぞれの
水素付加は、水素間の距離間隔が疎水性表面の近くの水の配位の長さスケールと同等になるまで界面エネルギーを減少させる。本発明者らが３００Ｋにおける水中の水素結合の平均エネルギー（Pauling, L. General Chemistry. (W.H. Freeman and Co., 1970)）を約
０．２１ｅＶ又は０．２１ｅＶに等しいとみなすとすると、本発明者らが測定する界面エネルギーの変化は、界面に対する１ｎｍ２当たりのエネルギーに値する約０．９０の水素結合の付加に相当する。この距離は、水中の疎水性相互作用の長さスケールに相当し（Israelachvili, J. & Pashley, R. The hydrophobic interaction is long range, decaying exponentially with distance. Nature 300, 341-342 (1982)）、これは、１．０±０
．１ｎｍの減衰定数で指数関数的に減衰する。これは、水素プラズマ処理が主として、溶液中の水分子の局所秩序化を破壊する水素の付加によってグラフェン格子を親水性にすると本発明者らが結論することに導く。
【０１９１】
これらの同じ水素がまた同様に、表面への分子の水素結合のための部位を提供することによってグラフェン表面上のタンパク質分布を制御する。クライオ−ＥＭにおける主たる問題は、ガラス状氷の薄層内のタンパク質の分布の精密な制御である。ブロッティング及びガラス化の間に、タンパク質は、しばしば空気／水界面又は炭素支持メンブレンに分離する。本発明者は、グラフェン格子の部分水素化が、水溶液からのタンパク質の吸着をもたらすことができ、クライオ−ＥＭ試料調製における他の可変要素（例えば、湿度、ブロット時間など）に関係なく粒子表面密度の制御を可能にすることを示す。それらのグラフェンへの吸着を調整することによって、本発明者らは、空気／水界面におけるタンパク質の凝集及び変性に関連する問題を取り除く。グラフェンは、構造生物学で使用される分解能（２．１Åを超える）で有効には目視できず、それは、再現不可能性、帯電及びバックグラウンドノイズの増加を含めた、非晶質炭素に関連する問題をなくす。さらに、本発明者らは、低エネルギー水素プラズマが、それがグラフェン格子それ自体を減少させ得るよりも非常に速く表面汚染物を選択的に除去し得ることを示す。グラフェンは、低エネルギー水素プラズマで処理される場合、タンパク質の吸着について再現可能で調整可能な表面である。
【０１９２】
クライオ−ＥＭにおける別の主たる問題は、画像品質の劣化であり、これは、本発明によるグラフェン基材を使用して２つの方法で改善される。第１に、グラフェンは、構造生物学で使用される分解能（１／２．１Å未満）で有効には目視できず、それが非晶質炭素の代わりに使用される場合、バックグラウンド信号を減少させる。第２に、グラフェンは、ビーム誘導粒子移動を減少させ、したがって、各画像で利用できる高分解能構造情報を増加させる。グラフェン上で画像化されたリボソームは、ビーム誘導運動の２つの位相を示し、これらの両方ともは、典型的な非晶質炭素基材に対してかなり減少している。初期の「充電位相」における約３０％の減少は、氷の中及び上の電荷の初期蓄積を減少させるグラフェン膜の高伝導性によっているようである。第２の「機械的応答位相」の間の粒子速度の５倍の減少は、非晶質炭素（約５０〜２００ＭＰａ）（Reina, A. et al. Large area, few-layer graphene films on arbitrary substrates by chemical vapor deposition. Nano Lett. 9, 30-35 (2009)）と比較したグラフェンの機械的強度の増加（１ＴＰａ）（Lee, C., Wei, X., Kysar, J. W. & Hone, J. Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayer graphene. Science 321,385-388 (2008)、Suenaga, K. & Koshino, M. Atom-by-atomspectroscopy at graphene edge. Nature 468, 1088- 1090 (2010)）によって説明することができるが、電荷蓄積の減少による試料中の電気的に誘導される応力の減少を伴うようである。これらの粒子運動の詳細な力学及び根底にある機構を解明するためのさらなる研究は、非常に所望のものである。これら及び他の利点の両方ともは、部分水素化を介しての生体試料による使用にグラフェンを適切にさせる本発明によってなされる重要な寄与から生じる。
【０１９３】
これに基づいて、本発明は、問題がばら撒かれて成功の現実的な期待を欠く試行錯誤の
従来技術から、タンパク質の構造的一体性及び画像の品質を保存するのに役立つ表面状態の調整の系統的プロセスへと改善される、電子顕微鏡法のための生体試験片の調製を提供する。
【０１９４】
本発明をもたらすこの研究は、欧州連合の第７次フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７−２０１３）／ＥＲＣグラント協定第２６１１５１号の下で欧州研究会議から財政的支援を受けている。
【０１９５】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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