(57)【要約】      （修正有）【課題】化合物N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-シアノ-2,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-10,14-ジオキソ-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-オクタデカヒドロピセン-4a-イル)-2,2-ジフルオロプロパンアミド、その多形体、その調製方法および使用方法、その薬学的組成物、ならびにそのキットおよび製品の提供。【解決手段】該化合物は、硬もしくは軟カプセル剤、錠剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、溶液剤、固体分散液剤、ウエハ剤（wafer）またはエリキシル剤として製剤化され、炎症または酸化ストレスに関連する状態の処置または予防に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式またはその薬学的に許容される塩である化合物：
2019011349.tif 000115
。
【請求項２】
下記式の化合物：
2019011349.tif 000116
。
【請求項３】
下記式の化合物の固体形態であって、
2019011349.tif 000117
該固体形態が、約１４°２θにおけるハロピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα）を有する、固体形態。
【請求項４】
下記式の化合物の多形体であって、
2019011349.tif 000118
約５．６、７．０、１０．６、１２．７および１４．６°２θにおけるピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα）を有する溶媒和物であるか；または
約７．０、７．８、８．６、１１．９、１３．９（二重ピーク）、１４．２および１６．０°２θにおけるピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα）を有する溶媒和物であるか；または
約７．５、１１．４、１５．６および１６．６°２θにおけるピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα）を有するアセトニトリル半溶媒和物（hemisolvate）であるか；または
約６．８、９．３、９．５、１０．５、１３．６および１５．６°２θにおけるピークを含むＸ線粉末回折パターン（ＣｕＫα）を有する溶媒和物である、
多形体。
【請求項５】
請求項１記載もしくは２の化合物、請求項３記載の固体形態、または請求項４記載の多形体を含む、医薬。
【請求項６】
請求項１記載もしくは２の化合物、請求項３記載の固体形態、または請求項４記載の多形体からなる有効成分と、
薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
経口、脂肪内（intraadiposally）、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、直腸内、くも膜下腔内、気管内、腫瘍内、臍帯内、膣内、静脈内、膀胱内（intravesicularlly）、硝子体内、リポソーム、局部、粘膜、非経口、直腸、結膜下、皮下、舌下、局所、経頬、経皮、経膣、クリーム中、脂質組成物中、カテーテル、洗浄、持続点滴、点滴、吸入、注射、局部送達または限局性灌流での投与用に製剤化されている、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
硬もしくは軟カプセル剤、錠剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、溶液剤、固体分散液剤、ウエハ剤（wafer）またはエリキシル剤として製剤化されている、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、油剤、軟膏剤、膏薬、乳剤、溶液剤、および懸濁液剤より選択される形態で局所投与用に製剤化されている、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
有効成分の量が０．０１重量％〜５重量％である、請求項６〜９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
患者における炎症または酸化ストレスに関連する状態を処置または予防することにおける使用のための、請求項６〜１０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
状態が、皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、神経変性疾患、中枢神経系の障害、ミトコンドリア機能障害、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病である、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
状態が、皮膚炎、熱傷もしくは化学熱傷、慢性創傷、ざ瘡、脱毛症、脱毛症以外の毛包障害、表皮水疱症、日焼け、日焼け合併症、皮膚色素沈着障害、老化関連の皮膚状態、術後創傷、皮膚損傷もしくは熱傷による瘢痕、乾癬、自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病の皮膚科学的徴候、皮膚がん、および皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害から選択される、皮膚疾患もしくは皮膚障害である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
皮膚炎がアレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、化学曝露による皮膚炎、または放射線皮膚炎である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
状態が、関節リウマチ、ループス、クローン病および乾癬より選択される、自己免疫疾患である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
状態が、脂肪性肝疾患および肝炎より選択される、肝疾患である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
状態が、ぶどう膜炎、黄斑変性症、緑内障、糖尿病黄斑浮腫、眼瞼炎、糖尿病性網膜症、角膜内皮疾患もしくは角膜内皮障害、術後炎症、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、および結膜炎の一形態より選択される、眼障害である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
状態が、肺炎症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、嚢胞性線維症および特発性肺線維症より選択される、肺疾患である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
状態が、放射線療法もしくは化学療法による粘膜炎である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
中枢神経系の障害が、発作性障害である、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
中枢神経系の障害が、てんかんである、請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
状態が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫および精上皮腫より選択される、がんである、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
状態が、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、生殖器がん、尿生殖器がん、頭部がん、腎がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、筋組織がん、頸部がん、口腔粘膜もしくは鼻粘膜がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がんおよび甲状腺がんより選択される、がんである、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
放射線療法、または請求項６記載の有効成分を含まない化学療法で患者を処置する前または処置した直後に、薬学的組成物が患者に投与されるように用いられる、請求項２２または２３記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
化学療法が、治療有効量の5-フルオロウラシルまたはドセタキセルを患者に投与することを含む、請求項２４記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
薬学的組成物の患者への投与が放射線療法または化学療法の副作用を減少させる、請求項２４記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
副作用が粘膜炎および皮膚炎である、請求項２６記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
患者におけるがんの治療に用いるための、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
がんが黒色腫である、請求項２８記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
患者が免疫療法での処置も受けている、請求項２８または２９記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
免疫療法が、樹状細胞に基づく免疫療法、または養子Ｔ細胞免疫療法である、請求項３０記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
免疫療法が、がんを標的化する免疫療法である、請求項３０記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2013年3月13日出願の米国仮出願第61/780,444号、2013年3月8日出願の米国仮出願第61/775,288号および2012年4月27日出願の米国仮出願第61/687,669号の優先権の恩典を主張し、それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
米国特許法施行規則1.821条(c)項に従って、配列表を、「REATP0073WO_ST25」と称する2013年4月24日に作成されたサイズ約6キロバイトを有するASCII準拠テキストファイルとして、本明細書に添えて提出する。上記ファイルの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
I. 発明の分野
本発明は一般に、化合物N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-シアノ-2,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-10,14-ジオキソ-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-オクタデカヒドロピセン-4a-イル)-2,2-ジフルオロプロパンアミドに関し、該化合物は本明細書においてRTA 408、63415またはPP415とも呼ばれる。本発明はまた、その多形体、その調製方法および使用方法、その薬学的組成物、ならびにそのキットおよび製品に関する。
【背景技術】
【０００４】
II. 関連技術の説明
天然トリテルペノイドであるオレアノール酸の抗炎症および抗増殖活性は化学修飾によって向上した。例えば、2-シアノ-3,12-ジオキソオレアナ-1,9(11)-ジエン-28-酸(CDDO)および関連化合物が開発された。いずれも参照により本明細書に組み入れられるHonda et al., 1997; Honda et al., 1998; Honda et al., 1999; Honda et al., 2000a; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Suh et al., 1998; Suh et al., 1999; Place et al., 2003; Liby et al., 2005; ならびに米国特許第8,129,429号、第7,915,402号、第8,124,799号および第7,943,778号を参照。メチルエステルであるバルドキソロンメチル(CDDO-Me)が、糖尿病性腎症および慢性腎疾患の処置および予防に関する第II/III相臨床試験において評価された。参照により本明細書に組み入れられるPergola et al., 2011を参照。
【０００５】
また、オレアノール酸の合成トリテルペノイド類似体は、マウスマクロファージにおける誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)およびCOX-2のIFN-γによる誘導などの細胞炎症プロセスの阻害剤であることがわかった。いずれも参照により本明細書に組み入れられるHonda et al, (2000a)、Honda et al. (2000b)、Honda et al. (2002)、ならびに米国特許第8,129,429号、第7,915,402号、第8,124,799号および第7,943,778号を参照。オレアノール酸から誘導される化合物は、複数のタンパク質標的の機能に影響し、それにより酸化ストレス、細胞周期調節および炎症に関連するいくつかの重要な細胞シグナル伝達経路の活性を調節することがわかった(例えばDinkova-Kostova et al., 2005; Ahmad et al., 2006; Ahmad et al., 2008; Liby et al., 2007aならびに米国特許第8,129,429号、第7,915,402号、第8,124,799号および第7,943,778号)。
【０００６】
公知のトリテルペノイド誘導体の生物活性プロファイルが変動することを前提とすれば、また、強力な抗酸化および抗炎症効果を有する化合物で処置または予防可能な疾患が多種多様であること、およびこの多様な疾患の範囲内で表される医学的必要性が満たされていない程度が大きいことを考慮すれば、異なった生物活性プロファイルを有する、1つまたは複数の適応症の処置または予防のための新規化合物を合成することが望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明のいくつかの局面では、下記式の化合物(本明細書においてはRTA 408、63415もしくはPP415とも呼ばれる)または薬学的に許容されるその塩が提供される。
2019011349.tif 000002
【０００８】
いくつかの態様では、化合物は薬学的に許容される塩の形態である。いくつかの態様では、化合物は塩の形態ではない。
【０００９】
本発明の別の局面では、上記化合物の多形体が提供される。いくつかの態様では、多形体は、約14°2θにおけるハロピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する。いくつかの態様では、X線粉末回折パターン(CuKα)は約8°2θにおけるショルダーピークをさらに含む。いくつかの態様では、X線粉末回折パターン(CuKα)は実質的に図59に示す通りである。いくつかの態様では、多形体はTg約150℃〜約155℃、例えばTg約153℃またはTg約150℃を有する。いくつかの態様では、多形体は、約150℃〜約155℃を中心とする吸熱を含む示差走査熱量(DSC)曲線を有する。いくつかの態様では、吸熱は約153℃を中心とする。いくつかの態様では、吸熱は約150℃を中心とする。いくつかの態様では、示差走査熱量(DSC)曲線は実質的に図62に示す通りである。
【００１０】
いくつかの態様では、多形体は、約5.6、7.0、10.6、12.7および14.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である。いくつかの態様では、X線粉末回折パターン(CuKα)は実質的に図75最上部のパターンに示す通りである。
【００１１】
いくつかの態様では、多形体は、約7.0、7.8、8.6、11.9、13.9(二重ピーク)、14.2および16.0°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である。いくつかの態様では、X線回折パターン(CuKα)は実質的に図75最上部から2番目のパターンに示す通りである。
【００１２】
いくつかの態様では、多形体は、約7.5、11.4、15.6および16.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有するアセトニトリル半溶媒和物(hemisolvate)である。いくつかの態様では、X線回折パターン(CuKα)は実質的に図75最下部から2番目のパターンに示す通りである。いくつかの態様では、多形体はTg約196℃を有する。いくつかの態様では、多形体は、約196℃を中心とする吸熱を含む示差走査熱量(DSC)曲線を有する。いくつかの態様では、示差走査熱量(DSC)曲線は実質的に図116に示す通りである。
【００１３】
いくつかの態様では、多形体は、約6.8、9.3、9.5、10.5、13.6および15.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である。いくつかの態様では、X線回折パターン(CuKα)は実質的に図75最下部のパターンに示す通りである。
【００１４】
本発明の別の局面では、上記化合物またはその多形体(例えば上記および下記の多形体のいずれか1つ)からなる有効成分と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は経口、脂肪内(intraadiposally)、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、直腸内、くも膜下腔内、気管内、腫瘍内、臍帯内、膣内、静脈内、膀胱内(intravesicularlly)、硝子体内、リポソーム、局部、粘膜、非経口、直腸、結膜下、皮下、舌下、局所、経頬、経皮、経膣、クリーム中、脂質組成物中、カテーテル、洗浄、持続点滴、点滴、吸入、注射、局部送達または限局性灌流での投与用に製剤化されている。いくつかの態様では、薬学的組成物は経口、動脈内、静脈内または局所投与用に製剤化されている。いくつかの態様では、薬学的組成物は経口投与用に製剤化されている。
【００１５】
いくつかの態様では、薬学的組成物は硬もしくは軟カプセル剤、錠剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、溶液剤、固体分散液剤、ウエハ剤(wafer)またはエリキシル剤として製剤化されている。いくつかの態様では、本発明の薬学的組成物は、溶解性および分散性を強化する剤をさらに含む。(例えば、溶解性および分散性を強化する剤としてはPEG、シクロデキストランおよびセルロース誘導体が挙げられるがそれに限定されない。)いくつかの態様では、化合物または多形体はゴマ油に懸濁している。
【００１６】
他の態様では、薬学的組成物は局所投与用に製剤化されている。他の態様では、薬学的組成物はローション剤、クリーム剤、ゲル剤、油剤、軟膏剤、膏薬、乳剤、溶液剤または懸濁液剤として製剤化されている。いくつかの態様では、薬学的組成物はローション剤、クリーム剤またはゲル剤として製剤化されている。いくつかの態様では、有効成分の量は約0.01重量%〜約5重量%、約0.01重量%〜約3重量%、または0.01重量%、0.1重量%、1重量%もしくは3重量%である。
【００１７】
本発明の別の局面では、炎症または酸化ストレスに関連する状態を処置または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、治療有効量の上記もしくは下記の薬学的組成物を該患者に投与する段階を含む方法が提供される。本発明は同様に、炎症または酸化ストレスに関連する状態を処置または予防することにおいて使用される、化合物N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-シアノ-2,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-10,14-ジオキソ-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-オクタデカヒドロピセン-4a-イル)-2,2-ジフルオロプロパンアミド(すなわちRTA 408)もしくは薬学的に許容されるその塩、または該化合物の多形体(例えば上記もしくは下記の多形体のいずれか1つ)、あるいは上記の実体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物(例えば上記の薬学的組成物を含む)に関する。本発明はまた、炎症または酸化ストレスに関連する状態の処置または予防用の医薬の調製のための、上記化合物、多形体または薬学的組成物の使用に関する。いくつかの態様では、状態は炎症に関連している。他の態様では、状態は酸化ストレスに関連している。いくつかの態様では、状態は皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病である。
【００１８】
本発明はさらに、皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病より選択される状態を処置または予防することにおいて使用される、化合物N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-シアノ-2,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-10,14-ジオキソ-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-オクタデカヒドロピセン-4a-イル)-2,2-ジフルオロプロパンアミド(すなわちRTA 408)もしくは薬学的に許容されるその塩、または該化合物の多形体(例えば上記もしくは下記の多形体のいずれか1つ)、あるいは上記の実体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物(例えば上記の薬学的組成物を含む)に関する。したがって、本発明は、皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病より選択される状態の処置または予防用の医薬の調製のための、上記化合物、多形体または薬学的組成物の使用に関する。本発明はまた、皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病より選択される状態を処置または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、治療有効量の上記化合物、多形体または薬学的組成物を該患者に投与する段階を含む方法に関する。いくつかの態様では、状態は皮膚疾患もしくは皮膚障害、例えば皮膚炎、熱傷もしくは化学熱傷、慢性創傷、ざ瘡、脱毛症、他の毛包障害、表皮水疱症、日焼け、日焼け合併症、皮膚色素沈着障害、老化関連の皮膚状態、術後創傷、皮膚損傷もしくは熱傷による瘢痕、乾癬、自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病の皮膚科学的徴候、皮膚がん、または皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害である。いくつかの態様では、皮膚疾患もしくは皮膚障害は皮膚炎である。いくつかの態様では、皮膚炎はアレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、化学曝露による皮膚炎、または放射線皮膚炎である。他の態様では、皮膚疾患もしくは皮膚障害は慢性創傷である。いくつかの態様では、慢性創傷は糖尿病性潰瘍、褥瘡または静脈性潰瘍である。他の態様では、皮膚疾患もしくは皮膚障害は脱毛症である。いくつかの態様では、脱毛症は禿頭症または薬物性脱毛症より選択される。他の態様では、皮膚疾患もしくは皮膚障害は皮膚色素沈着障害である。いくつかの態様では、皮膚色素沈着障害は白斑である。他の態様では、皮膚疾患もしくは皮膚障害は、皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害である。いくつかの態様では、皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害は角化症である。
【００１９】
他の態様では、状態は自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、ループス、クローン病または乾癬である。他の態様では、状態は肝疾患、例えば脂肪性肝疾患または肝炎である。
【００２０】
他の態様では、状態は眼障害、例えばぶどう膜炎、黄斑変性症、緑内障、糖尿病黄斑浮腫、眼瞼炎、糖尿病性網膜症、角膜内皮疾患もしくは角膜内皮障害、術後炎症、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、または結膜炎の一形態である。いくつかの態様では、眼障害は黄斑変性症である。いくつかの態様では、黄斑変性症は乾燥型である。他の態様では、黄斑変性症は湿潤型である。いくつかの態様では、角膜内皮疾患もしくは角膜内皮障害はフックス角膜内皮ジストロフィーである。
【００２１】
他の態様では、状態は肺疾患、例えば肺炎症、肺線維症、COPD、喘息、嚢胞性線維症または特発性肺線維症である。いくつかの態様では、COPDはタバコ煙によって誘発される。
【００２２】
他の態様では、状態は敗血症である。他の態様では、状態は、放射線療法もしくは化学療法による粘膜炎である。いくつかの態様では、粘膜炎は口腔に現れる。他の態様では、状態は放射線に対する曝露に関連している。いくつかの態様では、放射線曝露は皮膚炎につながる。いくつかの態様では、放射線曝露は急性曝露である。他の態様では、放射線曝露は分割曝露である。
【００２３】
他の態様では、状態はがんである。いくつかの態様では、がんは細胞腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫または精上皮腫である。他の態様では、がんは膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、生殖器がん、尿生殖器がん、頭部がん、腎がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、筋組織がん、頸部がん、口腔粘膜もしくは鼻粘膜がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がんまたは甲状腺がんである。
【００２４】
いくつかの態様では、放射線療法、またはRTA 408もしくはその多形体を含まない化学療法で対象を処置する前または処置した直後に前記薬学的組成物が投与される。いくつかの態様では、放射線療法、化学療法またはその両方で対象を処置する前と処置した後との両方で前記薬学的組成物が投与される。いくつかの態様では、処置は放射線療法または化学療法の副作用を減少させる。いくつかの態様では、副作用は粘膜炎および皮膚炎である。いくつかの態様では、処置は放射線療法または化学療法の有効性を強化する。いくつかの態様では、化学療法は、治療有効量の5-フルオロウラシルまたはドセタキセルを患者に投与することを含む。
【００２５】
さらなる併用処置療法も本開示により企図される。例えば、いくつかの態様では、薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置する方法は、薬学的有効量の第2の薬物の投与、放射線療法、免疫療法、遺伝子治療および手術からなる群より選択される1つまたは複数の処置をさらに含み得る。いくつかの態様では、方法は、(1) 腫瘍細胞と第2の薬物とを接触させる前に腫瘍細胞と化合物とを接触させる段階、(2) 腫瘍細胞と化合物とを接触させる前に腫瘍細胞と第2の薬物とを接触させる段階、または(3) 腫瘍細胞と化合物および第2の薬物とを同時に接触させる段階をさらに含み得る。いくつかの態様では、第2の薬物は抗生物質、抗炎症薬、抗悪性腫瘍薬、抗増殖薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬または免疫抑制薬であり得る。他の態様では、第2の薬物はアルキル化剤、アンドロゲン受容体モジュレーター、細胞骨格破壊剤、エストロゲン受容体モジュレーター、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、レチノイド受容体モジュレーター、トポイソメラーゼ阻害剤またはチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。いくつかの態様では、第2の薬物は5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、9-cis-レチノイン酸、アクチノマイシンD、アリトレチノイン、all-trans-レチノイン酸、アナマイシン(annamycin)、アキシチニブ、ベリノスタット(belinostat)、ベバシズマブ、ベキサロテン、ボスチニブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、CD437、セジラニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、ドセタキセル、ドラスタチン-10、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ヘキサメチルメラミン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イソトレチノイン、イクサベピロン、ラパチニブ、LBH589、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、MS-275、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オキサリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、セマキサニブ(semaxanib)、セムスチン、酪酸ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ストレプトゾトシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スニチニブ、タモキシフェン、テニポシド、チオテパ(thiopeta)、チオグアニン、トポテカン、TRAIL、トラスツズマブ、トレチノイン、トリコスタチンA、バルプロ酸、バルルビシン、バンデタニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビンである。
【００２６】
薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において炎症性成分を伴う疾患を処置または予防する方法も企図される。いくつかの態様では、例えば、疾患はループスまたは関節リウマチであり得る。他の態様では、疾患はクローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患であり得る。他の態様では、炎症性成分を伴う疾患は心血管疾患であり得る。別の態様では、炎症性成分を伴う疾患は、1型または2型糖尿病などの糖尿病であり得る。別の態様では、RTA 408、その多形体および薬学的組成物を使用して、糖尿病に関連する合併症を処置することもできる。そのような合併症は当業者に周知であり、例えば肥満、高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、高血圧、腎障害、神経障害、筋壊死、網膜症およびメタボリックシンドローム(シンドロームX)を含むがそれらに限定されない。他の態様では、炎症性成分を伴う疾患は、乾癬、ざ瘡またはアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患であり得る。そのような皮膚疾患の処置方法におけるRTA 408、その多形体および薬学的組成物の投与は、例えば局所または経口であり得るがそれらに限定されない。
【００２７】
他の態様では、炎症性成分を伴う疾患はメタボリックシンドローム(シンドロームX)であり得る。この症候群を有する患者は、以下の5つの症状の群より選択される3つ以上の症状を有することを特徴とする: (1) 腹部肥満; (2) 高トリグリセリド血症; (3) 低高密度リポタンパク質コレステロール(HDL); (4) 高血圧; および(5) 患者が糖尿病でもある場合に2型糖尿病に特有の範囲内にあり得る高空腹時血糖。これらの各症状は、参照により本明細書に組み入れられるthe Third Report of the National Cholesterol Education Program Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III, or ATP III), National Institutes of Health, 2001, NIH Publication No. 01-3670に定義されている。メタボリックシンドロームを有する患者は、顕性の真性糖尿病を有するかまたは発生される場合であれ、そうでない場合であれ、アテローム性動脈硬化症および冠動脈心疾患などの、2型糖尿病と共に生じる上記で列挙した大血管性合併症および微小血管性合併症を発生させる危険性の増加を有する。
【００２８】
本開示の別の一般的方法は、薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において心血管疾患を処置または予防する方法を伴う。いくつかの態様では、心血管疾患は例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋症、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、リウマチ性心疾患、弁疾患、冠動脈疾患、心内膜炎または心筋梗塞であり得るが、それらに限定されない。併用療法も対象において心血管疾患を処置または予防する方法について企図される。例えば、そのような方法は薬学的有効量の1つまたは複数の心血管薬を投与する段階をさらに含み得る。例えば、心血管薬はコレステロール低下薬、抗高脂血症薬、カルシウムチャネル遮断薬、降圧薬またはHMG-CoA還元酵素阻害剤であり得るがそれらに限定されない。いくつかの態様では、心血管薬の非限定的な例としてはアムロジピン、アスピリン、エゼチミブ、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピンまたはニトレンジピンが挙げられる。他の態様では、心血管薬の他の非限定的な例としてはアテノロール、ブシンドロール、カルベジロール、クロニジン、ドキサゾシン、インドラミン、ラベタロール、メチルドーパ、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、フェノキシベンザミン、フェントラミン、ピンドロール、プラゾシン、プロプラノロール、テラゾシン、チモロールまたはトラゾリンが挙げられる。他の態様では、心血管薬は例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンまたはシンバスタチンなどのスタチンであり得る。
【００２９】
薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において神経変性疾患を処置または予防する方法も企図される。いくつかの態様では、神経変性疾患は例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症(MS)、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択することができる。特定の態様では、神経変性疾患はアルツハイマー病である。特定の態様では、神経変性疾患は一次進行型、再発寛解型、二次進行型または進行再発型MSなどのMSである。いくつかの態様では、例えば、対象は霊長類であり得る。いくつかの態様では、対象はヒトであり得る。
【００３０】
薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において神経変性疾患を処置または予防する方法の特定の態様では、処置は対象の脳または脊髄においてニューロンの脱髄を抑制する。いくつかの態様では、処置は炎症性脱髄を抑制する。いくつかの態様では、処置は対象の脳または脊髄においてニューロン軸索の切断を抑制する。いくつかの態様では、処置は対象の脳または脊髄において神経突起の切断を抑制する。いくつかの態様では、処置は対象の脳または脊髄においてニューロンのアポトーシスを抑制する。いくつかの態様では、処置は対象の脳または脊髄においてニューロン軸索の再ミエリン化を刺激する。いくつかの態様では、処置はMS発作後に失われた機能を修復する。いくつかの態様では、処置は新たなMS発作を予防する。いくつかの態様では、処置はMS発作により生じる能力障害を予防する。
【００３１】
本開示の1つの一般的局面は、薬学的有効量の本開示のRTA 408、多形体または薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてiNOS遺伝子の過剰発現を特徴とする障害を処置または予防する方法を企図する。
【００３２】
本開示の別の一般的局面は、薬学的有効量の本開示のRTA 408、多形体または薬学的組成物を前記対象に投与する段階を含む、対象の細胞においてIFN-γ誘導性の一酸化窒素産生を阻害する方法を企図する。
【００３３】
本開示のさらに別の一般的方法は、薬学的有効量の本開示のRTA 408、多形体または薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象においてCOX-2遺伝子の過剰発現を特徴とする障害を処置または予防する方法を企図する。
【００３４】
薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において腎/腎臓疾患(RKD)を処置する方法も企図される。参照により本明細書に組み入れられる米国特許8,129,429を参照。RKDは、例えば毒性傷害により生じ得る。毒性傷害は、例えば造影剤または薬物により生じ得るがそれらに限定されない。例えば、薬物は化学療法薬であり得る。いくつかの態様では、RKDは虚血再灌流障害により生じ得る。いくつかの態様では、RKDは糖尿病または高血圧により生じる。いくつかの態様では、RKDは自己免疫疾患により生じ得る。RKDは慢性RKDまたは急性RKDとしてさらに定義することができる。
【００３５】
薬学的有効量の本開示の化合物を対象に投与する段階を含む、対象において腎/腎臓疾患(RKD)を処置するいくつかの方法では、対象は透析を受けたかまたは受けている。いくつかの態様では、対象は腎移植を受けたかまたは受ける候補である。対象は霊長類であり得る。霊長類はヒトであり得る。このまたは任意の他の方法における対象は、例えば雌ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、マウス、ラットまたはモルモットであり得る。
【００３６】
薬学的有効量の本開示のRTA 408、多形体または薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象において糸球体濾過率またはクレアチニンクリアランスを改善するための方法も本開示により企図される。
【００３７】
いくつかの態様では、薬学的組成物は1日当たり単一用量で投与される。他の態様では、薬学的組成物は1日当たり複数用量で投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物は薬学的有効量で投与される。
【００３８】
いくつかの態様では、用量は約1mg/kg〜約2000mg/kgである。他の態様では、用量は約3mg/kg〜約100mg/kgである。他の態様では、用量は約3、10、30または100mg/kgである。
【００３９】
他の態様では、薬学的組成物は局所投与される。いくつかの態様では、局所投与は皮膚への投与である。他の態様では、局所投与は眼への投与である。
【００４０】
他の態様では、薬学的組成物は経口投与される。他の態様では、薬学的組成物は眼内投与される。
[本発明1001]
下記式の化合物または薬学的に許容されるその塩：
2019011349.tif 000003
。
[本発明1002]
薬学的に許容される塩の形態である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
塩の形態ではない、本発明1001の化合物。
[本発明1004]
下記式を有する化合物の多形体であって、約14°2θにおけるハロピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する多形体：
2019011349.tif 000004
。
[本発明1005]
X線粉末回折パターン(CuKα)が約8°2θにおけるショルダーピークをさらに含む、本発明1004の多形体。
[本発明1006]
X線粉末回折パターン(CuKα)が実質的に図59に示す通りである、本発明1004の多形体。
[本発明1007]
Tg約150℃〜約155℃をさらに有する、本発明1004の多形体。
[本発明1008]
Tg約153℃をさらに有する、本発明1007の多形体。
[本発明1009]
Tg約150℃をさらに有する、本発明1007の多形体。
[本発明1010]
約150℃〜約155℃を中心とする吸熱を含む示差走査熱量(DSC)曲線をさらに有する、本発明1004の多形体。
[本発明1011]
吸熱が約153℃を中心とする、本発明1010の多形体。
[本発明1012]
吸熱が約150℃を中心とする、本発明1010の多形体。
[本発明1013]
実質的に図62に示す通りである示差走査熱量(DSC)曲線を有する、本発明1004の多形体。
[本発明1014]
下記式を有する化合物の多形体であって、約5.6、7.0、10.6、12.7および14.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である多形体：
2019011349.tif 000005
。
[本発明1015]
X線粉末回折パターン(CuKα)が実質的に図75最上部のパターンに示す通りである、本発明1014の多形体。
[本発明1016]
下記式を有する化合物の多形体であって、約7.0、7.8、8.6、11.9、13.9(二重ピーク)、14.2および16.0°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である多形体：
2019011349.tif 000006
。
[本発明1017]
X線粉末回折パターン(CuKα)が実質的に図75最上部から2番目のパターンに示す通りである、本発明1016の多形体。
[本発明1018]
下記式を有する化合物の多形体であって、約7.5、11.4、15.6および16.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有するアセトニトリル半溶媒和物(hemisolvate)である多形体：
2019011349.tif 000007
。
[本発明1019]
X線粉末回折パターン(CuKα)が実質的に図75最下部から2番目のパターンに示す通りである、本発明1018の多形体。
[本発明1020]
Tg約196℃をさらに有する、本発明1018の多形体。
[本発明1021]
約196℃を中心とする吸熱を含む示差走査熱量(DSC)曲線をさらに有する、本発明1018の多形体。
[本発明1022]
実質的に図116に示す通りである示差走査熱量(DSC)曲線を有する、本発明1018の多形体。
[本発明1023]
下記式を有する化合物の多形体であって、約6.8、9.3、9.5、10.5、13.6および15.6°2θにおけるピークを含むX線粉末回折パターン(CuKα)を有する溶媒和物である多形体：
2019011349.tif 000008
。
[本発明1024]
X線粉末回折パターン(CuKα)が実質的に図75最下部のパターンに示す通りである、本発明1023の多形体。
[本発明1025]
医薬において使用される、本発明1001〜1003のいずれかの化合物または本発明1004〜1024のいずれかの多形体。
[本発明1026]
本発明1001〜1003のいずれかの化合物または本発明1004〜1024のいずれかの多形体からなる有効成分と、
薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1027]
経口、脂肪内(intraadiposally)、動脈内、関節内、頭蓋内、皮内、病変内、筋肉内、鼻腔内、眼内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、直腸内、くも膜下腔内、気管内、腫瘍内、臍帯内、膣内、静脈内、膀胱内(intravesicularlly)、硝子体内、リポソーム、局部、粘膜、非経口、直腸、結膜下、皮下、舌下、局所、経頬、経皮、経膣、クリーム中、脂質組成物中、カテーテル、洗浄、持続点滴、点滴、吸入、注射、局部送達または限局性灌流での投与用に製剤化されている、本発明1026の薬学的組成物。
[本発明1028]
経口、動脈内、静脈内または局所投与用に製剤化されている、本発明1027の薬学的組成物。
[本発明1029]
経口投与用に製剤化されている、本発明1027または1028の薬学的組成物。
[本発明1030]
硬もしくは軟カプセル剤、錠剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、溶液剤、固体分散液剤、ウエハ剤(wafer)またはエリキシル剤として製剤化されている、本発明1026〜1029のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1031]
溶解性および分散性を強化する剤をさらに含む、本発明1026〜1030のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1032]
化合物または多形体がゴマ油に懸濁されている、本発明1026〜1031のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1033]
局所投与用に製剤化されている、本発明1026〜1028または1030〜1032のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1034]
ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、油剤、軟膏剤、膏薬、乳剤、溶液剤または懸濁液剤として製剤化されている、本発明1033の薬学的組成物。
[本発明1035]
ローション剤として製剤化されている、本発明1034の薬学的組成物。
[本発明1036]
クリーム剤として製剤化されている、本発明1034の薬学的組成物。
[本発明1037]
ゲル剤として製剤化されている、本発明1034の薬学的組成物。
[本発明1038]
有効成分の量が約0.01重量%〜約5重量%である、本発明1026〜1036のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1039]
有効成分の量が約0.01重量%〜約3重量%である、本発明1038の薬学的組成物。
[本発明1040]
有効成分の量が約0.01重量%である、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1041]
有効成分の量が約0.1重量%である、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1042]
有効成分の量が約1重量%である、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1043]
有効成分の量が約3重量%である、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1044]
炎症または酸化ストレスに関連する状態を処置または予防することを必要とする患者においてそれを行う方法であって、治療有効量の、本発明1001〜1003の化合物、本発明1004〜1024の多形体、または本発明1026〜1043のいずれかの薬学的組成物を該患者に投与する段階を含む、方法。
[本発明1045]
炎症または酸化ストレスに関連する状態を処置または予防することにおける使用のための、本発明1001〜1003のいずれかの化合物、または本発明1004〜1024のいずれかの多形体、または本発明1026〜1043のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1046]
炎症または酸化ストレスに関連する状態の処置または予防用の医薬の調製のための、本発明1001〜1003のいずれかの化合物、または本発明1004〜1024のいずれかの多形体、または本発明1026〜1043のいずれかの薬学的組成物の使用。
[本発明1047]
状態が炎症に関連している、本発明1044の方法、または本発明1045の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046の使用。
[本発明1048]
状態が酸化ストレスに関連している、本発明1044の方法、または本発明1045の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046の使用。
[本発明1049]
状態が皮膚疾患もしくは皮膚障害、敗血症、皮膚炎、変形性関節症、がん、炎症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、粘膜炎、急性臓器不全もしくは慢性臓器不全、肝疾患、膵炎、眼障害、肺疾患または糖尿病である、本発明1044および1047のいずれかの方法、または本発明1045および1047〜1048のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1048のいずれかの使用。
[本発明1050]
状態が皮膚疾患もしくは皮膚障害である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1051]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が皮膚炎、熱傷もしくは化学熱傷、慢性創傷、ざ瘡、脱毛症、他の毛包障害、表皮水疱症、日焼け、日焼け合併症、皮膚色素沈着障害、老化関連の皮膚状態、術後創傷、皮膚損傷もしくは熱傷による瘢痕、乾癬、自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病の皮膚科学的徴候、皮膚がん、または皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害である、本発明1050の方法、または本発明1050の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1050の使用。
[本発明1052]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が皮膚炎である、本発明1051の方法、または本発明1051の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1051の使用。
[本発明1053]
皮膚炎がアレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、化学曝露による皮膚炎、または放射線皮膚炎である、本発明1052の方法、または本発明1052の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1052の使用。
[本発明1054]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が慢性創傷である、本発明1051の方法、または本発明1051の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1051の使用。
[本発明1055]
慢性創傷が糖尿病性潰瘍、褥瘡または静脈性潰瘍である、本発明1054の方法、または本発明1054の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1054の使用。
[本発明1056]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が脱毛症である、本発明1051の方法、または本発明1051の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1051の使用。
[本発明1057]
脱毛症が禿頭症または薬物性脱毛症である、本発明1056の方法、または本発明1056の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1056の使用。
[本発明1058]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が皮膚色素沈着障害である、本発明1051の方法、または本発明1051の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1051の使用。
[本発明1059]
皮膚色素沈着障害が白斑である、本発明1058の方法、または本発明1058の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1058の使用。
[本発明1060]
皮膚疾患もしくは皮膚障害が、皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害である、本発明1051の方法、または本発明1051の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1051の使用。
[本発明1061]
皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害が角化症である、本発明1060の方法、または本発明1060の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1060の使用。
[本発明1062]
状態が自己免疫疾患である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1063]
自己免疫疾患が関節リウマチ、ループス、クローン病または乾癬である、本発明1062の方法、または本発明1062の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1062の使用。
[本発明1064]
状態が肝疾患である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1065]
肝疾患が脂肪性肝疾患または肝炎である、本発明1064の方法、または本発明1064の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1064の使用。
[本発明1066]
状態が眼障害である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1067]
眼障害がぶどう膜炎、黄斑変性症、緑内障、糖尿病黄斑浮腫、眼瞼炎、糖尿病性網膜症、角膜内皮疾患もしくは角膜内皮障害、術後炎症、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、または結膜炎の一形態である、本発明1063の方法、または本発明1066の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1066の使用。
[本発明1068]
眼障害が黄斑変性症である、本発明1067の方法、または本発明1067の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1067の使用。
[本発明1069]
黄斑変性症が乾燥型である、本発明1068の方法、または本発明1068の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1068の使用。
[本発明1070]
黄斑変性症が湿潤型である、本発明1068の方法、または本発明1068の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1068の使用。
[本発明1071]
角膜内皮疾患もしくは角膜内皮障害がフックス角膜内皮ジストロフィーである、本発明1067の方法、または本発明1067の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1067の使用。
[本発明1072]
状態が肺疾患である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1073]
肺疾患が肺炎症、肺線維症、COPD、喘息、嚢胞性線維症または特発性肺線維症である、本発明1072の方法、または本発明1072の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1072の使用。
[本発明1074]
肺疾患が肺炎症である、本発明1073の方法、または本発明1073の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1073の使用。
[本発明1075]
肺疾患が肺線維症である、本発明1073の方法、または本発明1073の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1073の使用。
[本発明1076]
肺疾患がCOPDである、本発明1073の方法、または本発明1073の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1073の使用。
[本発明1077]
COPDがタバコ煙によって誘発される、本発明1076の方法、または本発明1076の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1076の使用。
[本発明1078]
肺疾患が喘息である、本発明1073の方法、または本発明1073の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1073の使用。
[本発明1079]
状態が敗血症である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1080]
状態が、放射線療法もしくは化学療法による粘膜炎である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1081]
粘膜炎が口腔粘膜炎である、本発明1080の方法、または本発明1080の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1080の使用。
[本発明1082]
状態が、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症である、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1083]
電離放射線に対する曝露が皮膚炎をもたらす、本発明1082の方法、または本発明1082の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1082の使用。
[本発明1084]
電離放射線に対する曝露が急性曝露である、本発明1082〜1083のいずれかの方法、または本発明1082〜1083のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1082〜1083のいずれかの使用。
[本発明1085]
電離放射線に対する曝露が分割曝露である、本発明1082〜1083のいずれかの方法、または本発明1082〜1083のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1082〜1083のいずれかの使用。
[本発明1086]
状態ががんである、本発明1049の方法、または本発明1049の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1049の使用。
[本発明1087]
がんが癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫または精上皮腫である、本発明1086の方法、または本発明1086の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1086の使用。
[本発明1088]
がんが膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、生殖器がん、尿生殖器がん、頭部がん、腎がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、筋組織がん、頸部がん、口腔粘膜もしくは鼻粘膜がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がんまたは甲状腺がんである、本発明1086の方法、または本発明1086の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1086の使用。
[本発明1089]
化合物もしくは薬学的組成物が1日当たり単一用量で投与される、本発明1044〜1088のいずれかの方法、または本発明1045〜1088のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1088のいずれかの使用。
[本発明1090]
化合物もしくは薬学的組成物が1日当たり複数用量で投与される、本発明1044〜1088のいずれかの方法、または本発明1045〜1088のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1088のいずれかの使用。
[本発明1091]
薬学的組成物が約1mg/kg〜約2000mg/kgの単位用量で投与される、本発明1044〜1090のいずれかの方法、または本発明1045〜1088のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1088のいずれかの使用。
[本発明1092]
用量が約3mg/kg〜約100mg/kgである、本発明1091の方法、または本発明1091の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1091の使用。
[本発明1093]
用量が約3mg/kgである、本発明1092の方法、または本発明1092の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1092の使用。
[本発明1094]
用量が約10mg/kgである、本発明1092の方法、または本発明1092の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1092の使用。
[本発明1095]
用量が約30mg/kgである、本発明1092の方法、または本発明1092の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1092の使用。
[本発明1096]
用量が約100mg/kgである、本発明1092の方法、または本発明1092の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1092の使用。
[本発明1097]
化合物もしくは薬学的組成物が局所投与される、本発明1044〜1096のいずれかの方法、または本発明1045〜1096のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1096のいずれかの使用。
[本発明1098]
局所投与が皮膚への投与である、本発明1097の方法、または本発明1097の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1097の使用。
[本発明1099]
局所投与が眼への投与である、本発明1097の方法、または本発明1097の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1097の使用。
[本発明1100]
化合物もしくは薬学的組成物が経口投与される、本発明1044〜1096のいずれかの方法、または本発明1045〜1096のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1096のいずれかの使用。
[本発明1101]
化合物もしくは薬学的組成物が眼内投与される、本発明1044〜1096のいずれかの方法、または本発明1045〜1096のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1096のいずれかの使用。
[本発明1102]
放射線療法、または本発明1026の有効成分を含まない化学療法で対象を処置する前または処置した直後に薬学的組成物が投与される、本発明1044〜1101のいずれかの方法、または本発明1045〜1101のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1046〜1101のいずれかの使用。
[本発明1103]
放射線療法または化学療法で対象を処置する前と処置した後との両方で薬学的組成物が投与される、本発明1102の方法、または本発明1102の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1102の使用。
[本発明1104]
処置が放射線療法または化学療法の副作用を減少させる、本発明1102もしくは1103の方法、または本発明1102もしくは1103の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1102もしくは1103の使用。
[本発明1105]
副作用が粘膜炎および皮膚炎である、本発明1104の方法、または本発明1104の使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1104の使用。
[本発明1106]
処置が放射線療法または化学療法の有効性を強化する、本発明1102〜1105のいずれかの方法、または本発明1102〜1105のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1102〜1105のいずれかの使用。
[本発明1107]
化学療法が、治療有効量の5-フルオロウラシルまたはドセタキセルを患者に投与することを含む、本発明1102〜1105のいずれかの方法、または本発明1102〜1105のいずれかの使用のための化合物、多形体もしくは薬学的組成物、または本発明1102〜1105のいずれかの使用。
[本発明1108]
患者がヒトである、本発明1044〜1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
患者が非ヒト哺乳動物である、本発明1044〜1107のいずれかの方法。
【００４１】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明より明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体的な実施例が、本発明の具体的な態様を示すが例示のみを目的として与えられるということを理解すべきである。これは、本発明の精神および範囲内の各種の変更および改変が、この詳細な説明より当業者には明らかになるためである。単に特定の化合物が1つの特定の一般式に帰することをもって、それが別の一般式にも属することができないことを意味するわけではないことに留意されたい。
【００４２】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のいくつかの局面をさらに示すために含まれる。図面中には、それぞれ「質量変化」および「温度」を意味する、「Masseanderung」および「temperatur」を含む1つ以上のドイツ語が存在する。本明細書において提示される具体的な態様の詳細な説明との組み合わせでこれらの図面のうち1つを参照することで、本発明をより良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】RAW264.7細胞中のIFNγ誘導一酸化窒素産生および細胞生存率に対するRTA 408の効果。
【図２】抗酸化応答配列(ARE)活性化に対するRTA 408の効果: (a) NQO1-AREルシフェラーゼ活性; (b) GSTA2-AREルシフェラーゼ活性。
【図３ａ】(a) RTA 402; (b) 63415(RTA 408); (c) 63170; (d) 63171; (e) 63179; および(f) 63189による細胞処理後の相対Nrf2 GST ARE増加倍率。グラフはまた、WST1細胞増殖試薬を使用しかつ1時間後に吸光度を測定することでアッセイした細胞の生存率を示す。すべての薬物はDMSO中で投与し、細胞は、384ウェルプレートにおいて10% FBS、1%ペニシリンストレプトマイシンおよび0.8mg/mLジェネテシンを補充したDMEM低濃度グルコース中にて10,000細胞/ウェルで増殖させた。
【図３ｂ】図3aの説明を参照のこと。
【図３ｃ】図3aの説明を参照のこと。
【図３ｄ】図3aの説明を参照のこと。
【図３ｅ】図3aの説明を参照のこと。
【図３ｆ】図3aの説明を参照のこと。
【図４】HFL1肺線維芽細胞中のNrf2標的遺伝子発現に対するRTA 408の効果。(a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1。
【図５】BEAS-2B気管支上皮細胞中のNrf2標的遺伝子発現に対するRTA 408の効果。(a) NQO1; (b) HMOX1; (c) GCLM; (d) TXNRD1。
【図６】Nrf2標的タンパク質レベルに対するRTA 408の効果。(a) SH-SY5Y細胞; (b) BV2細胞。
【図７】RAW264.7細胞中のNQO1酵素活性に対するRTA 408の効果。
【図８】AML-12肝細胞系中の総グルタチオンレベルに対するRTA 408の効果。
【図９】NADPHのマーカーとしてのWST-1吸光度に対するRTA 408の効果。
【図１０ａ】NADPH合成に関与する遺伝子の発現に対するRTA 408の効果。(a) H6PD; (b) PGD; (c) TKT; (d) ME1。
【図１０ｂ】図10aの説明を参照のこと。
【図１０ｃ】図10aの説明を参照のこと。
【図１０ｄ】図10aの説明を参照のこと。
【図１１】(a) WST1生存率およびWST1/2生存率を重ね合わせた、マウスNIH3T3細胞系中のNF-κBルシフェラーゼレポーターのTNF-α誘導活性化に対するRTA 408の効果。(b) マウスNIH3T3細胞系中のNF-κBルシフェラーゼレポーターのTNF-α誘導活性化。グラフは、RTA 408濃度の対数的変化の関数としての相対変化倍率を示す。
【図１２】NF-κBルシフェラーゼレポーター構築物のTNF-α誘導活性化に対するRTA 408の効果。
【図１３】(a) WST1生存率およびWST1/2生存率を重ね合わせた、ヒトA549細胞系中のNF-κBルシフェラーゼレポーターのTNF-α誘導活性化に対するRTA 408の効果。(b) ヒトA549細胞系中のNF-κBルシフェラーゼレポーターのTNF-α誘導活性化。グラフは、RTA 408濃度の対数的変化の関数としての相対変化倍率を示す。
【図１４】IκBαのTNF-α誘導リン酸化に対するRTA 408の効果。
【図１５ａ】トランスアミナーゼ遺伝子発現に対するRTA 408の効果: (a) ALT1 (GPT1); (b) ALT2 (GPT2); (c) AST1 (GOT1); (d) AST1 (GOT2)。アスタリスクは対照群との統計上有意な差を示す(*P＜0.05; **P＜0.01)。
【図１５ｂ】図15aの説明を参照のこと。
【図１５ｃ】図15aの説明を参照のこと。
【図１５ｄ】図15aの説明を参照のこと。
【図１６】培養筋細胞中のピルビン酸レベルに対するRTA 408の効果(*P＜0.05)。
【図１７】LPS媒介性肺炎症モデルにおける63415の効果(LPS処置に対する炎症性誘発性サイトカインの変化%)。雌BALB/cマウスにおいて、化合物63415を1日1回3日間、0時間、24時間および48時間の時点で投与し、続いて63415の最終投与の1時間後にLPSを投与した。LPS投与の20時間後に動物を屠殺した。BALFを炎症性誘発性サイトカイン発現について検査した。化合物63415は炎症性誘発性サイトカインを用量依存的に減少させ、TNF-α、IL-6およびIL-12のピーク減少は50%〜80%の範囲であった。
【図１８】マウスにおけるLPS誘発肺炎症に対するRTA 408の効果。(a) 炎症性サイトカイン; (b) Nrf2標的。RTA 408を雌BALB/cマウス(n=10)に1日1回6日間、0時間、24時間、48時間、72時間、96時間および120時間の時点で投与した後、121時間の時点でLPSを投与し、141時間の時点で動物を屠殺した。炎症性誘発性サイトカインのタンパク質発現をBALF中でアッセイした。Nrf2バイオマーカーを肺中でアッセイした。アスタリスクは生理食塩水対照群との統計上有意な差を示す(*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001)。
【図１９】ブレオマイシン誘発肺炎症におけるBALF浸潤物に対する63415の効果: (a) BAL液細胞数; (b) 体重。C57BL/6マウスにおいて化合物63415を1日1回39日間、-10日目〜28日目に投与した。ブレオマイシンを0日目に投与した。毎日の体重を測定した。BALF細胞数を屠殺時に得た。炎症性浸潤物の有意な減少が観察された。慢性炎症スコア、間質性線維症、または線維化病巣の数の有意な改善は観察されなかった。
【図２０】ラットにおけるブレオマイシン誘発肺線維症に対するRTA 408の効果: (a) PMN; (b) ヒドロキシプロリン。アスタリスクはブレオマイシン対照群との統計上有意な差を示す(*P＜0.05)。
【図２１】ブレオマイシン誘発肺線維症を有するラットの肺中のNrf2標的酵素に対するRTA 408の効果。アスタリスクは生理食塩水対照群との統計上有意な差を示す(*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001)。
【図２２】マウスにおけるタバコ煙誘発COPDに対するRTA 408の効果。(a) KC; (b) IL-6; (c) TNF-α; (d) IFN-γ; (e) RANTES。RTA 408(63415)を用量レベル3mg/kg(低)、10mg/kg(中)および30mg/kg(高)で試験した。AIM類似体(63355)を同一試験において比較用に試験した。アスタリスクはCS対照群との統計上有意な差を示す。
【図２３】タバコ煙誘発COPDを有するマウスの肺中のNrf2標的酵素に対するRTA 408の効果。アスタリスクは生理食塩水対照群との統計上有意な差を示す(*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001)。剣標は、タバコ煙に曝露され媒体が投与されたマウスとの統計上有意な差を表す(†P＜0.05)。
【図２４ａ】BALB/cマウス敗血症モデルの体重に対する63415(RTA 408)の効果。LPSを0日目にすべての動物に投与した。(a) 体重:63415(RTA 408); (b) 体重:RTA 405; (c) 全身LPS: 生存率%:63415(RTA 408); (d) 全身LPS: 生存率%:RTA 405。RTA 405および63415(RTA 408)をいずれも1日1回5日間、-2日目〜2日目に投与した。化合物63415(RTA 408)は生存率を向上させた。63415処置BALB/cマウスにおける時間関数としての体重は敗血症のモデルとして役立つ。
【図２４ｂ】図24aの説明を参照のこと。
【図２４ｃ】図24aの説明を参照のこと。
【図２４ｄ】図24aの説明を参照のこと。
【図２５】放射線口腔粘膜炎モデルにおける63415の効果。RTA 405または63415(RTA 408)を雄シリアンゴールデンハムスターに1日2回20日間、-5日目〜-1日目および1日目〜15日目に投与した。放射線照射を0日目に行った。粘膜炎スコアは臨床徴候に基づいて0〜5の範囲とした(0: 完全に健康、1〜2: 軽度〜重度の紅斑; 3〜5: 様々な程度の潰瘍形成)。63415は30mg/kgおよび100mg/kgで粘膜炎を改善し、潰瘍形成の減少は最大36%であった。
【図２６】C57BL/6マウスの14日間マウス毒性試験におけるNrf2標的遺伝子誘導に対する63415の効果。1日1回14日間経口処置したマウスの肝臓中でNrf2標的遺伝子のmRNAを評価した。複数のNrf2標的遺伝子におけるmRNA発現の実質的な増加が観察され、これらは組織曝露と一致していた。
【図２７】ラット肝臓中のNrf2標的遺伝子誘導に対する63415の効果: (a) 標的遺伝子; (b) 負の調節因子。1日1回14日間経口処置したラットの肝臓中でNrf2標的遺伝子のmRNAを評価した。
【図２８】サル組織中のNrf2標的遺伝子に対する63415の効果: (a) 肝臓; (b) 肺。1日1回14日間経口処置したサル中でPanomics QuantiGene(登録商標)2.0 Plex技術を使用してNrf2標的遺伝子のmRNAを評価した。
【図２９】マウス肝臓中のNrf2標的酵素活性に対する63415の効果: (a) NQO1活性; (b) GST活性。1日1回14日間経口処置したマウスの肝臓中でNrf2標的酵素活性を評価した。NQO1およびGST酵素活性は用量依存的に誘導された。
【図３０】ラット肝臓中のNrf2標的酵素活性に対する63415の効果: (a) NQO1活性; (b) GST活性。1日1回14日間経口処置したラットの肝臓中でNrf2標的酵素活性を評価した。NQO1およびGST酵素活性は用量依存的に誘導された。
【図３１】カニクイザルの様々な組織中のNrf2標的酵素活性誘導に対する63415の効果: (a) NQO1活性; (b) GSR活性。
【図３２】毎日14日間の経口投与後のマウスの肝臓、肺および脳中のRTA 408濃度、ならびにマウス肝臓中のNQO1活性。(a) 毎日14日間の経口投与後のマウスにおけるRTA 408の組織分布。データは、試験における最終投与の4時間後に採取した組織中のRTA 408濃度の平均±標準偏差を表す。エラーバーの上側の数字は平均を表す。(b) マウス肝臓中RTA 408含有量とNQO1酵素活性との相関。個々のマウス肝臓中RTA 408含有量をこの報告の個々の酵素活性に対してプロットした。
【図３３】14日間毎日の経口投与後のラットの血漿、肝臓、肺および脳中のRTA 408濃度、ならびにラット肝臓中のNQO1活性。(a) 14日間毎日の経口投与後のラット中のRTA 408の組織分布。データは、試験における最終投与の4時間後に採取した組織中のRTA 408濃度の平均±標準偏差を表す。エラーバーの上側の数字は平均を表す。*2つの値が異常値であることから平均計算から除外された。異常値は、一組のデータをシャピロ-ウィルク正規性検定に不合格にする値として定義される。(b) ラット肝臓中RTA 408含有量とNQO1酵素活性との相関。個々のラット肝臓中RTA 408含有量をこの報告の個々の酵素活性に対してプロットした。100mg/kg RTA 408投与群の組織を6日目に採取したが、この群において観察された毒性が理由で肝臓NQO1酵素活性の評価ができなかった。
【図３４】サルPBMC中のNrf2活性化に対する63415処置の効果: (a) PBMC NQO1対血漿中濃度; (b) 肺NQO1対PBMC NQO1。
【図３５】63415の14日間サル毒性試験の概要。すべての用量は有害臨床徴候もなく十分な耐容性を示した。臨床化学データは明白な毒性を示唆しなかった。
【図３６】眼局所投与および経口投与後の血漿中RTA 408濃度に対する投与時間の効果。血漿中RTA 408濃度を毎日5日間のRTA 408の眼局所投与後にも測定し、初日後に取得した測定値と相対的には一致したままであると決定された。
【図３７】サル血漿中のRTA 408に対する曝露とPBMC中のNQO1およびSRXN1 mRNA発現との相関: (a) NQO1; (b) SRXN1。
【図３８】5日間の眼局所投与後の時間関数としての眼内の様々な組織または体液中のRTA 408の濃度。血漿中RTA 408濃度も眼局所投与後に測定した。
【図３９】異なる濃度の局所投与RTA 408に関する、急性放射線曝露によって引き起こされるグレード3皮膚炎の発生率に対するRTA 408の効果。
【図４０】異なる濃度の局所投与RTA 408に関する、30日間の処置過程にわたる急性放射線曝露によって引き起こされるグレード2皮膚炎の発生率に対するRTA 408の効果。
【図４１】異なる濃度の経口投与RTA 408に関する、28日間の処置過程にわたる急性放射線曝露によって引き起こされるグレード2皮膚炎の発生率に対するRTA 408の効果。
【図４２ａ】試験に使用したすべての動物を含む異なる各対照群の時間関数としての皮膚炎の臨床スコアの曲線下面積分析。
【図４２ｂ】試験の全30日間を完了した動物のみを含む異なる各対照群の皮膚炎の臨床スコアの持続時間の関数としての該スコアの曲線下面積分析。
【図４３】未処置、未処置および放射線曝露なし、媒体のみ、ならびに3、10および30mg/kgの3つの経口量のRTA 408における時間関数としての急性放射線皮膚炎の平均第1盲検スコア。皮膚炎スコアは、0が完全に健康であり、1〜2が軽度〜中程度の紅斑および最小の〜わずかな落屑を示し、3〜4が中程度〜重度の紅斑および落屑を示し、5が明白な潰瘍を示すとするスケールに基づいた。
【図４４】4日目〜30日目に隔日で測定した、未処置、未処置および放射線曝露なし、媒体のみ、ならびに3、10および30mg/kgの3つの経口量のRTA 408における時間関数としての急性放射線皮膚炎の平均スコア。皮膚炎スコアは、0が完全に健康であり、1〜2が軽度〜中程度の紅斑および最小の〜わずかな落屑を示し、3〜4が中程度〜重度の紅斑および落屑を示し、5が明白な潰瘍を示すとするスケールに基づいた。
【図４５】4日目〜30日目に隔日で測定した、未処置、未処置および放射線曝露なし、媒体のみ、ならびに0.01%、0.1%および1%の3つの局所量のRTA 408における時間関数としての急性放射線皮膚炎の平均スコア。皮膚炎スコアは、0が完全に健康であり、1〜2が軽度〜中程度の紅斑および最小の〜わずかな落屑を示し、3〜4が中程度〜重度の紅斑および落屑を示し、5が明白な潰瘍を示すとするスケールに基づいた。
【図４６】時間に対してプロットした分割曝露放射線皮膚炎の臨床スコア、および各試験群の皮膚炎スコアの変化。皮膚炎スコアは、0が完全に健康であり、1〜2が軽度〜中程度の紅斑および最小の〜わずかな落屑を示し、3〜4が中程度〜重度の紅斑および落屑を示し、5が明白な潰瘍を示すとするスケールに基づいた。
【図４７】観察期間全体にわたる各試験群の皮膚炎スコア(重症度x日数)を示すAUC分析のグラフ。皮膚炎スコアを試験の4日目〜30日目に2日ごとに評価した。
【図４８ａ】処理した前立腺がん細胞系LNCaPの595nmでの吸光度のグラフ。化学療法薬およびRTA 408で処理した細胞とRTA 408のみで処理した細胞とに対する相対的細胞毒性効果を示す。
【図４８ｂ】処理した前立腺がん細胞系DU-145の595nmでの吸光度のグラフ。化学療法薬およびRTA 408で処理した細胞とRTA 408のみで処理した細胞とに対する相対的細胞毒性効果を示す。
【図４９】3匹のマウス、すなわち処置なしの対照動物、電離放射線(単一線量、18Gy)のみに供された動物、ならびに電離放射線(単一線量、18Gy、0日目)とRTA 408(腹腔内17.5mg/kg、-3日目〜-1日目に1日1回、次に1日目、3日目および5日目に単一用量)との両方を与えた動物の腫瘍のルシフェラーゼ活性を示す、撮像マウスのカラー写真の白黒バージョン。矢印が示す色は強度を示し、強度は最高強度から最低強度の順で赤色、黄色、緑色および青色によって表される。
【図５０】穿刺誘導後の房水タンパク質濃度の減少に関する、異なるRTA 408製剤(濃い棒線)とMaxiDex(登録商標)(0.1%デキサメタゾン)およびマプラコラット(mapracorat)の文献値(薄い棒線)との比較。
【図５１】63415によるインビボでのNOの用量依存的抑制。CD-1マウス(n=6)にDMSOまたはAIMを経口胃管栄養法によって投与した。LPS(5mg/kg)を24時間後に投与した。LPS投与の24時間後、全血をNOアッセイ用に採取した。NO阻害は還元除タンパク血漿からGriess反応によって決定された。
【図５２】マウス組織中の63415(RTA 408)の広範な分布。マウスに25mg/kg 63415(RTA 408)または25mg/kg RTA 405を1日1回3日間経口投与した。血液(血漿および全血)ならびに組織(脳、肝臓、肺および腎臓)を最終投与の6時間後に採取した。薬物含有量の半定量的分析を行った。有意なレベルがCNS中で観察された。
【図５３】63415によるマウスの肝臓、肺および腎臓中のNQO1活性誘導。マウスに25mg/kgを1日1回3日間経口投与した。組織を最終投与の6時間後に採取し、NQO1活性の分析を行った。NQO1の有意な活性化が複数の組織中で観察された。
【図５４】63415の14日間マウス毒性試験の概要。C57BL/6マウスに1日1回14日間経口投与した。エンドポイントには生存率、体重、および臨床化学データが含まれた。すべての動物は14日目まで生存した。媒体群に比べて有意な体重変化は生じず、臨床化学データに基づく毒性の証拠はどの用量でも存在しなかった。
【図５５】C57BL/6マウスにおける14日間マウス毒性試験による63415の組織分布。脳、肺および肝臓の試料を最終投与の4時間後に採取し、高感度LC/MS/MS法を使用して63415含有量について定量化した。肺中の10mg/kgおよび100mg/kgでの曝露はNO誘導のインビトロIC50をそれぞれ55倍および1138倍超えた。脳中の10mg/kgおよび100mg/kgでの曝露はNO誘導のインビトロIC50をそれぞれ29倍および541倍超えた。
【図５６】Sprague Dawleyラット中の63415の組織分布。組織を14日目または6日目の最終投与(100mg/kg)の4時間後に採取し、抽出し、高感度LC/MS/MS法を使用して63415含有量について定量化した。化合物63415は十分に標的組織中に分布する。肺および脳中の10mg/kgでの曝露はNO阻害のインビトロIC50をそれぞれ294倍および240倍超える。
【図５７】カニクイザル中の化合物63415の標的組織分布。組織を14日目の最終投与の4時間後に採取した。化合物63415含有量を抽出し、高感度LC/MS/MS法を使用して定量化した。
【図５８】試料PP415-P1のFT-ラマンスペクトル(3400〜50cm-1)。非晶形(クラス1)と一致。
【図５９】試料PP415-P1のPXRD(1.5〜55.5°2θ)パターン。非晶形(クラス1)と一致。
【図６０】試料PP415-P1のTG-FTIRサーモグラム(25〜350℃)。非晶形(クラス1)と一致。
【図６１】試料PP415-P1のDMSO-d6中の1H-NMRスペクトル。非晶形(クラス1)と一致。
【図６２】試料PP415-P1のDSCサーモグラム。非晶形(クラス1)と一致。
【図６３】試料PP415-P1のDVS等温線。非晶形(クラス1)と一致。
【図６４】DVS測定後の試料PP415-P1のFT-ラマンスペクトル(上部)は、非晶形(クラス1)と一致し、DVS測定前の材料(下部)に比べて未変化である。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図６５】DVS測定後の試料PP415-P1のPXRDパターン(上部)は、非晶形(クラス1)と一致し、DVS測定前の材料(下部)に比べて未変化である。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図６６】試料PP415-P40のPXRDパターン(上部)は溶媒和形(クラス2)のパターン(下部、試料PP415-P19)と一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図６７】1週間後の安定性試料PP415-P2a(最上部)、PP415-P3a(最上部から2番目)、PP415-P4a(中央)およびPP415-P5a(最下部から2番目)のPXRDパターンは、非晶形(クラス1)と一致し、t0時点での出発材料(最下部、試料PP415-P1)に比べて差を示さない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図６８】2週間後の安定性試料PP415-P2b(最上部)、PP415-P3b(最上部から2番目)、PP415-P4b(中央)およびPP415-P5b(最下部から2番目)のPXRDパターンは、非晶形(クラス1)と一致し、t0時点での出発材料(最下部、試料PP415-P1)に比べて差を示さない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図６９】4週間後の安定性試料PP415-P2c(最上部)、PP415-P3c(最上部から2番目)、PP415-P4c(中央)およびPP415-P5c(最下部から2番目)のPXRDパターンは、非晶形(クラス1)と一致し、t0時点での出発材料(最下部、試料PP415-P1)に比べて差を示さない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図７０】溶媒和形(クラス2)の試料のFT-ラマンスペクトル(2400〜50cm-1)(PP415-P7: 最上部; PP415-P8: 最上部から2番目; PP415-P9: 最上部から3番目; PP415-P10: 最上部から4番目; PP415-P11: 中央; PP415-P15: 最下部から4番目; PP415-P17: 最下部から3番目; PP415-P21: 最下部から2番目; PP415-P24: 最下部)。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７１】溶媒和形(クラス2)のFT-ラマンスペクトル(1750〜1000cm-1)(PP415-P7: 上部)は非晶形(クラス1)のスペクトル(PP415-P1: 下部)と明らかに異なる。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７２】クラス2(試料PP415-P19: 最上部)、クラス3(試料PP415-P6: 最上部から2番目)、クラス4(試料PP415-P13: 最下部から2番目)およびクラス5(試料PP415-P14: 最下部)のFT-ラマンスペクトル(1750〜1000cm-1)は互いに著しく異なる。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７３】溶媒和形(クラス2)の試料のPXRDパターン(2〜32°2θ)(PP415-P7: 最上部; PP415-P8: 最上部から2番目; PP415-P10: 最上部から3番目; PP415-P15: 最上部から4番目; PP415-P17: 中央; PP415-P18: 最下部から4番目; PP415-P19: 最下部から3番目; PP415-P21: 最下部から2番目; PP415-P24: 最下部)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７４】溶媒和形(クラス2)のいくつかの試料のPXRDパターン(11〜21°2θ)(PP415-P7: 最上部; PP415-P8: 最上部から2番目; PP415-P10: 中央; PP415-P21: 最下部から2番目; PP415-P24: 最下部)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７５】クラス2(試料PP415-P19: 最上部)、クラス3(試料PP415-P6: 最上部から2番目)、クラス4(試料PP415-P13: 最下部から2番目)およびクラス5(試料PP415-P14: 最下部)のPXRDパターン(2〜32°2θ)は明確に異なる。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図７６】試料PP415-P7のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図７７】試料PP415-P21のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図７８】試料PP415-P24のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図７９】試料PP415-P29のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図８０】試料PP415-P47のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図８１】試料PP415-P48のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図８２】溶媒和形(クラス2)(下部、試料PP415-P7)および乾燥溶媒和形(クラス2)(上部、試料PP415-P30)のFT-ラマンスペクトル(1800〜700cm-1)は、同様であり、グラフ内ではほぼ識別不可能である小さな差しか示さない。スペクトルは比較目的でスケール調整されている。
【図８３】乾燥溶媒和形(クラス2)の試料PP415-P30のPXRDパターン(上部)と溶媒和形(クラス2)の試料PP415-P7のパターン(下部)との比較。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図８４】乾燥試料PP415-P30のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図８５】乾燥試料PP415-P18のFT-ラマンスペクトル(明灰色)は、当初の試料PP415-P15のスペクトル(濃灰色)と同一であり、グラフ内ではほぼ識別不可能である小さな差しか示さない。スペクトルは比較目的でスケール調整されている。
【図８６】いずれも溶媒和形(クラス2)ではあるが、乾燥試料PP415-P18のPXRDパターン(上部)は当初の試料PP415-P15のパターン(下部)との小さな差を示す。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図８７】試料PP415-P18のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図８８】試料PP415-P17のFT-ラマンスペクトル(上部)は、乾燥試料PP415-P19(中央)およびPP415-P32(下部)のスペクトルとほぼ同一であり、グラフ内ではほぼ識別不可能である小さな差しか示さない。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図８９】乾燥試料PP415-P19のPXRDパターン(中央)は当初の試料PP415-P17のパターン(上部)と異なるが、依然としてクラス2の形態と一致している。さらなる乾燥試料PP415-P32のパターン(下部)は、より低いS/N比を伴うよりブロードなピークを示す。この材料は結晶性がより低いが、依然としてクラス2の形態と一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９０】試料PP415-P19のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図９１】試料PP415-P32AのTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図９２】試料PP415-P21のFT-ラマンスペクトル(上部)は、乾燥試料PP415-P28(中央)およびPP415-P34(下部)のスペクトルと同一である。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９３】乾燥試料PP415-P28(中央)およびPP415-P34(下部)のPXRDパターンは、より低いS/N比を伴うよりブロードなピークを示し、これらの試料の結晶性が当初の試料PP415-P21のパターン(上部)に比べて低いことを示している。これらのパターンは多少異なるが、依然としてクラス2の形態と一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９４】乾燥試料PP415-P28のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図９５】乾燥試料PP415-P34のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス2)と一致。
【図９６】溶媒和形(クラス3)の試料のFT-ラマンスペクトル(2400〜50cm-1)(PP415-P6: 上部; PP415-P12: 中央; PP415-P20: 下部)。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９７】溶媒和形(クラス3)の試料のFT-ラマンスペクトル(1750〜1000cm-1)(PP415-P6: 最上部; PP415-P12: 最上部から2番目; PP415-P20: 最下部から2番目)は、例えば約1690cm-1において互いに非常に類似しており、差がごく小さいが、クラス1(PP415-P1: 最下部)とは明らかに異なる。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９８】溶媒和形(クラス3)の試料のPXRDパターン(2〜32°2θ)(PP415-P6: 上部; PP415-P12: 中央; PP415-P20: 下部)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図９９】溶媒和形(クラス3)の試料のPXRDパターン(13.5〜18.5°2θ)(PP415-P6: 上部; PP415-P12: 中央; PP415-P20: 下部)は小さな差を示す。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１００】試料PP415-P6のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス3)と一致。
【図１０１】試料PP415-P12のTG-FTIRサーモグラム。溶媒和形(クラス3)と一致。
【図１０２】乾燥溶媒和形(クラス3)の試料PP415-P25のTG-FTIRサーモグラム。
【図１０３】さらなる乾燥溶媒和形(クラス3)の試料PP415-P33のTG-FTIRサーモグラム。
【図１０４】溶媒和形(クラス3)(上部、試料PP415-P6)、乾燥溶媒和形(クラス3)(中央、試料PP415-P25)およびさらなる乾燥溶媒和形(クラス3)(下部、試料PP415-P33)のFT-ラマンスペクトル(1800〜700cm-1)は同一である。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１０５】溶媒和形(クラス3)(上部、試料PP415-P6)、乾燥溶媒和形(クラス3)(中央、試料PP415-P25)およびさらなる乾燥溶媒和形(クラス3)(下部、試料PP415-P33)のPXRDパターン(4〜24°2θ)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１０６】試料PP415-P13のTG-FTIRサーモグラム。アセトニトリル溶媒和形(クラス4)と一致。
【図１０７】アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(濃灰色、試料PP415-P13)およびアセトニトリル溶媒和形の乾燥材料(クラス4)(明灰色、試料PP415-P26)のFT-ラマンスペクトル(1800〜700cm-1)は同一であり、完全に重なり合っている。スペクトルは比較目的でスケール調整されている。
【図１０８】乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P26のPXRDパターン(下部)とアセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P13の基準パターン(上部)との比較。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされた。
【図１０９】乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P26のTG-FTIRサーモグラム。
【図１１０】アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(上部、試料PP415-P35)ならびに乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(中央、試料PP415-P36および下部、試料PP415-P37)のFT-ラマンスペクトル(1800〜700cm-1)は互いに一致している。スペクトルは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１１１】アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(上部、試料PP415-P35)ならびに乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(中央、試料PP415-P36および下部、試料PP415-P37)のPXRDパターン(4〜24°2θ)は互いに一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１１２】乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P36のTG-FTIRサーモグラム。
【図１１３】乾燥アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P37のTG-FTIRサーモグラム。
【図１１４】脱溶媒和アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P37のDVS等温線。
【図１１５】DVS測定後のアセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P37のPXRDパターン(下部)は、DVS測定前の材料(上部)に比べて未変化である。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図１１６】脱溶媒和アセトニトリル溶媒和形(クラス4)(試料PP415-P37)のDSCサーモグラム。
【図１１７】非晶形(クラス1)の試料PP415-P1と脱溶媒和アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P36との約1:1混合物のDSCサーモグラム。
【図１１８】非晶形(クラス1)の試料PP415-P1と脱溶媒和アセトニトリル溶媒和形(クラス4)の試料PP415-P36との約1:1混合物のDSCサーモグラム(実験番号: PP415-P39)。加熱走査(段階1)を173℃で30分間停止させ(段階2)、その後再開した(段階3)。
【図１１９】試料PP415-P14のTG-FTIRサーモグラム。THF溶媒和形(クラス5)と一致。
【図１２０】THF溶媒和形(クラス5)(破線、試料PP415-P14)、THF溶媒和形の乾燥材料(クラス5)(点線、試料PP415-P27)および非晶形(クラス1)(実線、試料PP415-P1)のFT-ラマンスペクトル(1800〜1100cm-1)。スペクトルは比較目的でスケール調整されており、規模に関する小さな変化を示すがスペクトル形状の対応する変化をほとんど示さない。
【図１２１】乾燥THF溶媒和形(クラス5)の試料PP415-P27のPXRDパターン(上部)とTHF溶媒和形(クラス5)の試料PP415-P14のパターン(下部)との比較。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図１２２】試料PP415-P27のTG-FTIRサーモグラム。乾燥THF溶媒和物(クラス5)と一致。
【図１２３】試料PP415-P41のPXRDパターン(上部)は、THF溶媒和形(クラス5)のパターン(中央、試料PP415-P14)と一致し、ヘプタン溶媒和形(クラス2)のパターン(下部、試料PP415-P19)と一致しない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１２４】試料PP415-P45のPXRDパターン(上部)は、THF溶媒和形(クラス5)のパターン(中央、試料PP415-P14)と一致し、ヘプタン溶媒和形(クラス2)のパターン(下部、試料PP415-P19)と一致しない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１２５】試料PP415-P41のPXRDパターン(最上部)はTHF溶媒和形(クラス5)と一致している。試料PP415-P41を1日間乾燥後(最上部から2番目、試料: PP415-P44)、材料は主に非晶質になる。低い強度を伴ういくつかのブロードなピークが残存している。さらに終夜乾燥後(最下部から2番目、試料PP415-P44a)、これらのブロードなピークの強度はさらに減少している。非晶形(クラス1)を基準として示す(最下部、試料: PP415-P42)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図１２６】試料PP415-P44aのTG-FTIRサーモグラム。非晶形(クラス1)と一致。
【図１２７】試料PP415-P45のPXRDパターン(最上部)はTHF溶媒和形(クラス5)と一致している。試料PP415-P45を1日間乾燥後(最上部から2番目、試料PP415-P46)、材料は主に非晶質になる。低い強度を伴ういくつかのブロードなピークが残存している。合計4日間の乾燥後(最下部から2番目、試料PP415-P46a)、パターンは未変化のままである。非晶形(クラス1)を基準として示す(最下部、試料PP415-P42)。パターンは比較目的でy方向にスケール調整はされていないがオフセットされている。
【図１２８】試料PP415-P46aのTG-FTIRサーモグラム。非晶形(クラス1)と一致。
【図１２９】試料PP415-P42のPXRDパターン(上部)は非晶形(クラス1)のパターン(下部、試料PP415-P1)と一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１３０】試料PP415-P43のPXRDパターン(上部)は、同形溶媒和形(クラス2)のパターン(下部、試料PP415-P19)と一致し、THF溶媒和形(クラス5)のパターン(中央、試料PP415-P14)と一致しない。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１３１】試料PP415-P47(上部)およびPP415-P48(中央)のPXRDパターンは同形溶媒和形(クラス2)のパターン(下部、試料PP415-P19)と本質的に一致しているが、いくつかの相違が存在する。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【図１３２】試料PP415-P49のPXRDパターン(上部)は非晶形(クラス1)のパターン(下部、試料PP415-P1)と一致している。パターンは比較目的でy方向にスケール調整され、オフセットされている。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
例示的態様の説明
一局面では、本発明は、化合物N-((4aS,6aR,6bS,8aR,12aS,14aR,14bS)-11-シアノ-2,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-10,14-ジオキソ-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12a,14,14a,14b-オクタデカヒドロピセン-4a-イル)-2,2-ジフルオロプロパンアミドを提供し、該化合物は本明細書においてRTA 408、63415またはPP415とも呼ばれる。他の非限定的局面では、本発明はまた、その溶媒和物を含むその多形体を提供する。他の非限定的局面では、本発明はまた、薬学的に許容されるその塩を提供する。他の非限定的局面では、これらの化合物およびその多形体の調製方法、薬学的組成物、ならびにキットおよび製品も提供される。
【００４５】
I. 定義
化学基の文脈で使用する場合、「水素」は-Hを意味し、「ヒドロキシ」は-OHを意味し、「オキソ」は=Oを意味し、「カルボニル」は-C(=O)-を意味し、「カルボキシ」は-C(=O)OH(-COOHまたは-CO2Hとも記される)を意味し、「ハロ」は独立して-F、-Cl、-Brまたは-Iを意味し、「アミノ」は-NH2を意味し、「ヒドロキシアミノ」は-NHOHを意味し、「ニトロ」は-NO2を意味し、イミノは=NHを意味し、「シアノ」は-CNを意味し、「イソシアネート」は-N=C=Oを意味し、「アジド」は-N3を意味し、一価の文脈で「ホスフェート」は-OP(O)(OH)2またはその脱プロトン化体を意味し、二価の文脈で「ホスフェート」は-OP(O)(OH)O-またはその脱プロトン化体を意味し、「メルカプト」は-SHを意味し、「チオ」は=Sを意味し、「スルホニル」は-S(O)2-を意味し、「スルフィニル」は-S(O)-を意味する。本出願において示す構造の原子上の任意の未定義の原子価は、その原子に結合している水素原子を暗に表す。
【００４６】
本開示の文脈では、下記式は同一の構造を表す。
2019011349.tif 000009
点が炭素上に描かれる場合、その点は、該炭素に結合した水素原子が頁の平面から出ることを示す。
【００４７】
特許請求の範囲および/または明細書において「含む(comprising)」という用語と共に使用する場合の「a」または「an」という単語の使用は、「1つ」を意味し得るが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」および「1つまたは2つ以上」の意味とも一致している。
【００４８】
本明細書を通じて、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために使用されるデバイス、方法に固有の誤差の変動、または試験対象の間で存在する変動を含むことを示すために使用される。「約」という用語は、X線粉末回折の文脈で使用する場合、報告値から±0.2°2θの値、好ましくは報告値から±0.1°2θの値を示すために使用される。「約」という用語は、示差走査熱量またはガラス転移温度の文脈で使用する場合、ピークの最大に対して±10℃の値、好ましくはピークの最大に対して±2℃の値を示すために使用される。「約」という用語は、他の文脈で使用する場合、報告値の±10%の値、好ましくは報告値の±5%の値を示すために使用される。「約」という用語を使用する場合は常に、示される正確な数値に対する明確な言及も含まれると理解すべきである。
【００４９】
「含む(comprise)」、「有する(have)」および「含む(include)」という用語は非限定的な連結動詞である。「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(includes)」および「含む(including)」などの1つまたは複数のこれらの動詞の任意の形態または時制も非限定的である。例えば、1つまたは複数の段階を「含む(comprises)」か、「有する(has)」かまたは「含む(includes)」任意の方法は、それらの1つまたは複数の段階のみを有することに限定されず、他の列挙されていない段階も網羅する。
【００５０】
明細書および/または特許請求の範囲において使用される「有効な」という用語は、所望の、予期されるまたは意図される結果を実現するために十分であることを意味する。患者または対象を化合物で処置する文脈において使用される場合の「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」とは、疾患を処置するために対象または患者に投与する際に疾患のそのような処置を実行するために十分なこの化合物の量を意味する。
【００５１】
X線粉末回折の文脈での「ハロピーク」という用語は、非晶質の固体または系に通常は特徴的である、多くの場合X線粉末ディフラクトグラム中で＞10°2θにわたるブロードなピークを意味する。
【００５２】
化合物に対する修飾語として使用する場合の「水和物」という用語は、該化合物が、例えば該化合物の固体形態において、各化合物分子に結合する1個未満(例えば半水和物)、1個(例えば一水和物)または2個以上(例えば二水和物)の水分子を有することを意味する。
【００５３】
本明細書において使用される「IC50」という用語は、得られる最大応答の50%である阻害用量を意味する。この定量的尺度は、所与の生物学的、生化学的もしくは化学的プロセス(またはプロセスの構成要素、すなわち酵素、細胞、細胞受容体もしくは微生物)を半分阻害するために特定の薬物または他の物質(阻害剤)がどの程度必要であるかを示す。
【００５４】
第1の化合物の「異性体」は、各分子が第1の化合物と同一の構成分子を含有しているが三次元でのそれらの原子の配置が異なる、別個の化合物である。
【００５５】
本明細書において使用される「患者」または「対象」という用語は、ヒト、サル、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそのトランスジェニック種などの生きている哺乳類生物を意味する。特定の態様では、患者または対象は非ヒト動物である。特定の態様では、患者または対象は霊長類である。特定の態様では、患者または対象はヒトである。ヒト対象の非限定的な例としては成人、若年、乳幼児および胎児がある。
【００５６】
本明細書において一般的に使用される「薬学的に許容される」とは、正しい医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織、臓器および/または体液と接触させて使用するために好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な損益比に相応している、化合物、材料、組成物および/または剤形を意味する。
【００５７】
「薬学的に許容される塩」とは、先に定義の通り薬学的に許容されかつ所望の薬理活性を有する、本発明の化合物の塩を意味する。そのような塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸; または1,2-エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、3-フェニルプロピオン酸、4,4'-メチレンビス(3-ヒドロキシ-2-エン-1-カルボン酸)、4-メチルビシクロ[2.2.2]オクタ-2-エン-1-カルボン酸、酢酸、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、o-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、シュウ酸、p-クロロベンゼンスルホン酸、フェニル置換アルカン酸、プロピオン酸、p-トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、tert-ブチル酢酸、トリメチル酢酸などの有機酸と共に形成される酸付加塩が挙げられる。薬学的に許容される塩としては、存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応可能な場合に形成可能な塩基付加塩も挙げられる。許容される無機塩基としては水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが挙げられる。許容される有機塩基としてはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、N-メチルグルカミンなどが挙げられる。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオンまたはカチオンは、その塩が全体として薬理学的に許容される限り重要ではないということを認識すべきである。薬学的に許容される塩ならびにその調製方法および使用方法のさらなる例はHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)に提示されている。
【００５８】
「予防」または「予防する」は、(1) 疾患の危険性がありかつ/または疾患に罹患しやすいが、疾患の病理または総体症状のいずれかまたは全部を未だ経験していないかまたは示していない対象または患者において、疾患の発症を阻害すること、および/あるいは(2) 疾患の危険性がありかつ/または疾患に罹患しやすいが、疾患の病理または総体症状のいずれかまたは全部を未だ経験していないかまたは示していない対象または患者において、疾患の病理または総体症状の発症を遅くすることを含む。
【００５９】
「プロドラッグ」とは、本発明に係る阻害剤にインビボで代謝的に変換可能な化合物を意味する。プロドラッグそれ自体は、所与の標的タンパク質に対する活性を有することも有さないこともある。例えば、ヒドロキシ基を含む化合物は、インビボでの加水分解によりヒドロキシ化合物に変換されるエステルとして投与することができる。インビボでヒドロキシ化合物に変換可能である好適なエステルとしては酢酸エステル、クエン酸エステル、乳酸エステル、リン酸エステル、酒石酸エステル、マロン酸エステル、シュウ酸エステル、サリチル酸エステル、プロピオン酸エステル、コハク酸エステル、フマル酸エステル、マレイン酸エステル、メチレン-ビス-β-ヒドロキシナフトエ酸エステル、ゲンチジン酸エステル、イセチオン酸エステル、ジ-p-トルオイル酒石酸エステル、メタンスルホン酸エステル、エタンスルホン酸エステル、ベンゼンスルホン酸エステル、p-トルエンスルホン酸エステル、シクロヘキシルスルファミン酸エステル、キナ酸エステル、アミノ酸エステルなどが挙げられる。同様に、アミン基を含む化合物は、インビボでの加水分解によりアミン化合物に変換されるアミドとして投与することができる。
【００６０】
「立体異性体」または「光学異性体」は、同一の原子が同一の他の原子に結合しているが三次元でのそれらの原子の配置が異なる、所与の化合物の異性体である。「鏡像異性体」は、左手および右手のように互いの鏡像である所与の化合物の立体異性体である。「ジアステレオマー」は、鏡像異性体ではない所与の化合物の立体異性体である。キラル分子は、立体中心または不斉中心とも呼ばれるキラル中心を含有し、キラル中心は、任意の2個の基の交換が立体異性体を生じさせる基を有する分子中の任意の地点であるが原子であるとは限らない。有機化合物中では、キラル中心は通常炭素原子、リン原子または硫黄原子であるが、他の原子が有機化合物および無機化合物中の立体中心であることも可能である。分子は、複数の立体中心を有することで、多くの立体異性体となることができる。その立体異性が四面体不斉中心(例えば四面体炭素)による化合物では、仮説上可能な立体異性体の総数は2nを超えず、ここでnは四面体立体中心の数である。多くの場合、対称性を有する分子は最大可能数よりも少ない数の立体異性体を有する。鏡像異性体の50:50混合物をラセミ混合物と呼ぶ。あるいは、一方の鏡像異性体が50%を超える量で存在するように鏡像異性体の混合物を鏡像異性的に濃縮してもよい。通常、鏡像異性体および/またはジアステレオマーは当技術分野において公知の技術を使用して分割または分離することができる。立体化学配置が規定されていない任意の立体中心またはキラリティー軸について、その立体中心またはキラリティー軸がそのR型、S型、または、ラセミ混合物および非ラセミ混合物を含むR型とS型との混合物として存在しうると企図される。本明細書において使用される「他の立体異性体を実質的に含まない」という語句は、組成物が15%以下、より好ましくは10%以下、さらに好ましくは5%以下、最も好ましくは1%以下の別の立体異性体を含有することを意味する。
【００６１】
「処置」または「処置する」は、(1) 疾患の病理または総体症状を経験しているかまたは示す対象または患者において疾患を阻害すること(例えば、病理および/または総体症状のさらなる発生を停止させること)、(2) 疾患の病理または総体症状を経験していかまたは示す対象または患者において疾患を寛解させること(例えば、病理および/または総体症状を逆転させること)、ならびに/あるいは(3) 疾患の病理または総体症状を経験しているかまたは示す対象または患者において疾患の任意の測定可能な減少を実行することを含む。
【００６２】
上記定義は、参照により本明細書に組み入れられる参考文献のいずれかにおける任意の矛盾する定義に取って代わる。しかし、特定の用語が定義されているという事実を、未定義の任意の用語が不確定であることを示すものと考えるべきではない。むしろ、すべての使用される用語は、当業者が本発明の範囲を認識しかつ本発明を実践することができるように、用語により本発明を説明するものと考えられる。
【００６３】
II. RTA 408および合成方法
RTA 408は、下記の実施例のセクションで説明する方法を使用して調製することができる。これらの方法は、当業者が適用する有機化学の原理および技術を使用してさらに改変および最適化することができる。例えば、そのような原理および技術は、参照により本明細書に組み入れられるMarch's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)で教示されている。
【００６４】
本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオンまたはカチオンは、その塩が全体として薬理学的に許容される限り重要ではないと認識すべきである。薬学的に許容される塩ならびにその調製方法および使用方法のさらなる例は、参照により本明細書に組み入れられるHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (2002)に提示されている。
【００６５】
RTA 408はプロドラッグ形態で存在してもよい。プロドラッグが医薬品の数多くの望ましい性質、例えば溶解性、バイオアベイラビリティ、製造性などを強化することが知られていることから、所望であれば、本発明のいくつかの方法において使用される化合物をプロドラッグ形態で実現してもよい。したがって、本発明は、本発明の化合物のプロドラッグ、およびプロドラッグを送達する方法を企図する。本発明において使用される化合物のプロドラッグは、修飾がルーチンの操作またはインビボのいずれかで開裂されて親化合物になるように、化合物に存在する官能基を修飾することで調製することができる。したがって、プロドラッグとしては例えば、プロドラッグが患者に投与される際に開裂してヒドロキシ、アミノまたはカルボン酸をそれぞれ形成する任意の基にヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基が結合した本明細書に記載の化合物が挙げられる。
【００６６】
RTA 408は、1個または複数の不斉置換炭素または窒素原子を含みうるものであり、光学活性体またはラセミ体として単離されうる。したがって、特定の立体化学配置または異性体が特に示されない限り、ある構造のすべてのキラル体、ジアステレオ異性体、ラセミ体、エピマー体、およびすべての幾何異性体が意図される。RTA 408はラセミ体およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、ジアステレオマー混合物および個々のジアステレオマーとして生じうる。いくつかの態様では、単一のジアステレオマーが得られる。本発明のRTA 408のキラル中心はS配置またはR配置を有しうる。
【００６７】
さらに、本発明のRTA 408を構成する原子は、そのような原子のすべての同位体形態を含むよう意図されている。本明細書において使用される同位体は、同一の原子番号を有するが異なる質量数を有する原子を含む。一般例としてかつ非限定的に、水素の同位体としてはトリチウムおよび重水素が挙げられ、炭素の同位体としては13Cおよび14Cが挙げられる。同様に、本発明の化合物の1個または複数の炭素原子をケイ素原子で置き換えることができると企図される。さらに、RTA 408の1個または複数の酸素原子を硫黄またはセレン原子で置き換えることができるということが企図される。
【００６８】
また、RTA 408およびその多形体は、本明細書に記述される適応症において使用される先行技術において公知の化合物に比べて有効であり、毒性が低く、長時間作用し、強力であり、生じる副作用が少なく、容易に吸収され、かつ/または良好な薬物動態プロファイル(例えば高い経口バイオアベイラビリティおよび/もしくは低いクリアランス)を示し、かつ/または他の有用な薬理学的、物理的もしくは化学的利点を示すことができるという利点を有しうる。
【００６９】
III. RTA 408の多形体
いくつかの態様では、本発明は、RTA 408の溶媒和物を含むRTA 408の異なる固体形態を提供する。予備調合および予備多形性試験を行ったところ、RTA 408は溶媒和物形成の傾向が強いことがわかった。クラス2、3、4および5の結晶形は溶媒和物と一致している。クラスの説明については以下の表1を参照。クラス2および3(2つの同形溶媒和物群)を乾燥させる試みは成功しなかった。これは、堅く結合した溶媒分子と一致している。いくつかの態様では、クラス4固体(アセトニトリル溶媒和物)の乾燥によって同形脱溶媒和形が得られた。いくつかの態様では、クラス5固体(THF溶媒和物)の乾燥によって非晶形クラス1が得られた。RTA 408の非溶媒和形としては非晶形(クラス1)、およびクラス4の脱溶媒和した結晶性溶媒和物(クラス4アセトニトリル溶媒和物と同形)が挙げられる。いくつかの態様では、非晶形は
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という高いガラス転移温度を有し、ごくわずかに吸湿性である(Δm = +0.4%、相対湿度50%→85%)。いくつかの態様では、非晶形は高温高湿条件下(すなわち40℃/相対湿度約75%で開放または80℃で閉鎖)で少なくとも4週間安定である。いくつかの態様では、非晶形(クラス1)は、クラス2材料から2段階法(クラス5への変換および引き続くクラス5の乾燥によって非晶形を得ること)および直接1段階法(冷水浴中でのアセトン溶液からの析出)で調製に成功した。クラス4の脱溶媒和した結晶性溶媒和物(クラス4溶媒和物と同形)は、わずかに吸湿性であり(相対湿度50%〜相対湿度85%で質量増加約0.7重量%)、融点196.1℃(ΔH = 29.31J/g)を有しうる。
【００７０】
63415の非晶形であるクラス1の試料をFT-ラマン分光法、PXRD、TG-FTIR、カールフィッシャー滴定、1H-NMR、DSCおよびDVSによって特性決定した(さらなる詳細は実施例の節を参照)。試料はEtOH約0.9重量%および微量のH2Oを含有することがわかった(TG-FTIRによる)。カールフィッシャー滴定によって含水量0.5重量%が決定された。DSCは
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という高いガラス転移温度を示す。DVSによれば、材料はわずかに吸湿性である(Δm = +0.4%、相対湿度50%→85%)。DSCまたはDVS実験において結晶化は観察されなかった。
【００７１】
非晶形の化学安定性を、アセトン、EtOAc、MeOHおよびMeCN、ならびに異なる水性媒体(例えば1% Tween 80水溶液、1% SDS水溶液、1% CTAB水溶液)を含む濃度1mg/mLの有機溶媒中にて6時間、24時間、2日および7日の時点で検査した。7日後のMeCN中溶液、および1%水性Tween 80媒体中懸濁液においてのみ、分解1%以上が観察された(全時点において254nmで、24時間後、2日後および7日後に242nmで)。
【００７２】
さらに、非晶形の安定性を高温高湿条件下(25℃/相対湿度62%および40℃/相対湿度75%で開放、ならびに60℃および80℃で閉鎖)での保存によって検査した。1週間後、2週間後および4週間後に保存試料をPXRDによって分析した。非晶質出発材料と異なる試料はなかった。
【００７３】
懸濁液平衡化、徐冷、蒸発および析出を含む、30回を超える結晶化および乾燥実験を行った。非晶形(クラス1)に加えて4つの新たな結晶形が得られた(クラス2、3、4および5)。
【００７４】
この4つの新たな形態(クラス2、3、4および5)をFT-ラマン分光法、PXRDおよびTG-FTIRによって特性決定した。すべての形態は溶媒和物と一致する(表1)。63415の結晶性非溶媒和形を得る目的で、減圧下またはN2流下で乾燥実験を行った。
【００７５】
（表１）得られたクラスの概要
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【００７６】
クラス2: 行われた大部分の結晶化実験によってクラス2の固体材料が得られた(以下の実施例の節を参照)。そのメンバーは、緊密に結合した溶媒分子との非化学量論的(0.5当量未満)な同形溶媒和物(ヘプタン、シクロヘキサン、イソプロピルエーテル、1-ブタノール、トリエチルアミン、および場合によってはヘキサン、他のエーテルなどの他の溶媒の)と一致しうる。このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンは互いに非常に類似しており、したがって、これらの構造は本質的に同一でありうるし、ごくわずかな差は組み込まれた異なる溶媒による。
【００７７】
クラス2の試料に対する乾燥実験では結晶性非溶媒和形は得られなかった。高温(80℃)および高真空(1x10-3mbar未満)であっても、緊密に結合した溶媒分子を完全には除去することはできず、溶媒含有量2重量%超が常に残留した。これらの部分乾燥試料の結晶性は減少したが、異なる構造への変換も実質的な非晶質化も観察されなかった。
【００７８】
クラス3: クラス3の固体材料は数回の結晶化によって得ることができる(以下の実施例の節を参照)。クラス3の試料は、緊密に結合した溶媒分子を有する、2PrOH、EtOH、およびおそらくアセトンの同形溶媒和物のようである。これらは、溶媒含有量約0.5当量を有する化学量論的半溶媒和物または非化学量論的溶媒和物と一致しうる。クラス2と同様に、このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンは互いに非常に類似しており、異なる溶媒を組み込む同様の構造を示している。
【００７９】
クラス2と同様に、乾燥実験は成功しなかった。非常に緊密に結合した溶媒分子は部分的にしか除去できなかった(すなわち、1x10-3mbarおよび80℃で最大3日後に約5.4重量%〜約4.8重量%)。PXRDパターンは未変化のままであった。
【００８０】
クラス4は7:3 MeCN/H2O溶媒系から得ることができる(以下の実施例の節を参照)。それはおそらく結晶性アセトニトリル半溶媒和物と一致する。(減圧下またはN2流下高温で)乾燥させることで、結晶構造の変化または破壊なしに溶媒分子の大部分を除去することができた(PXRDは未変化のままであった)。したがって結晶性非溶媒和形(むしろ脱溶媒和した溶媒和物)が得られた。それはわずかに吸湿性であり(相対湿度50%〜相対湿度85%で質量増加約0.7重量%)、融点196.1℃(ΔH = 29.31J/g)を有しうる。
【００８１】
クラス5は約1:1 THF/H2O溶媒系から得ることができる。クラス5は結合したTHF(およびおそらくH2O)を含有する。この2つの成分の含有量を容易に別々に定量化することができないことから、この結晶性溶媒和物の正確な性質は決定されなかった。
【００８２】
クラス5の乾燥によって、著しい脱溶媒和および非晶形(クラス1)の方向への変換が生じた。いくつかの態様では、クラス2ヘプタン溶媒和物を1:1 THF/H2Oに懸濁させてクラス5固体を形成した後、乾燥および非晶質化を行うことで、RTA 408の非晶形を調製することができる。
【００８３】
非晶形(クラス1)を調製することを目的とする実験を、クラス2出発材料を使用して行った。主に非晶質の材料(クラス1)を、クラス2材料から出発して、100mgおよび3gスケール(100mbar、80℃で乾燥、数日)上でクラス5を経由する2段階法で調製した。完全に非晶質の材料(クラス1)の調製は、冷水浴中でクラス2材料のアセトン溶液から非晶形(クラス1)を直接析出させることにより溶媒THFを回避する1段階法で可能であることがわかった。
【００８４】
IV.炎症および/または酸化ストレスに関係する疾患
炎症は、感染性生物または寄生性生物に対する抵抗性、および損傷組織の修復を与える、生物学的プロセスである。炎症は、限局性の血管拡張、発赤、腫脹および疼痛、感染部位または傷害部位に対する白血球の動員、TNF-αおよびIL-1などの炎症性サイトカインの産生、ならびに過酸化水素、スーパーオキシドおよびペルオキシナイトライトなどの活性酸素種または活性窒素種の産生を一般的に特徴とする。炎症の後期では、組織リモデリング、血管新生および瘢痕形成(線維症)が、創傷治癒プロセスの一部として生じ得る。正常な状況下では、炎症反応は制御され、一時的であり、感染症または傷害が適切に扱われれば組織的に消散する。しかし、急性炎症は、制御機構が機能停止した場合は過度でかつ生命を脅かすものになることがある。あるいは、炎症は慢性になりかつ累積的組織損傷または全身合併症を引き起こすこともある。本明細書に示された証拠に少なくとも部分的に基づき、RTA 408は炎症に関連する炎症または疾患の処置または予防に使用できる。
【００８５】
多くの重篤でかつ難治性のヒトの疾患は、炎症状態とは伝統的に見られていなかった、がん、アテローム性動脈硬化症および糖尿病などの疾患を含む炎症プロセスの調節不全を包含する。がんの場合、炎症プロセスは腫瘍の形成、進行、転移および治療抵抗性を含むプロセスに関連している。いくつかの態様では、RTA 408を、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫または精上皮腫、あるいは膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、生殖器がん、尿生殖器がん、頭部がん、腎がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、筋組織がん、頸部がん、口腔粘膜もしくは鼻粘膜がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がんまたは甲状腺がんを含むがんの処置または予防に使用することができる。脂質代謝障害と長きにわたり見られていたアテローム性動脈硬化症は、本質的に炎症状態であり、活性化マクロファージが動脈硬化巣の形成および最終的な破裂において重要な役割を果たすと現在は理解されている。炎症性シグナル伝達経路の活性化は、インスリン抵抗性の発生、および糖尿病性高血糖に関連する末梢組織損傷において役割を果たすこともわかった。スーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素およびペルオキシナイトライトなどの活性酸素種および活性窒素種の過剰産生は炎症状態の特徴である。ペルオキシナイトライト産生の調節不全のエビデンスが多種多様な疾患において報告された(Szabo et al., 2007; Schulz et al., 2008; Forstermann, 2006; Pall, 2007)。
【００８６】
関節リウマチ、ループス、乾癬および多発性硬化症などの自己免疫疾患は、免疫系における自己対非自己の認識機構および応答機構の機能障害により生じる、患部組織における炎症プロセスの不適切かつ慢性的な活性化を包含する。アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患では、神経損傷は、ミクログリアの活性化、および高レベルの誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)などの炎症促進性タンパク質に相関している。腎不全、心不全、肝不全および慢性閉塞性肺疾患などの慢性臓器不全は、線維症の発生および臓器機能の最終的な損失につながる慢性の酸化ストレスおよび炎症の存在に緊密に関連している。大血管および小血管を裏打ちする血管内皮細胞における酸化ストレスは、内皮障害につながることがあり、全身性心血管疾患、糖尿病合併症、慢性腎疾患および他の臓器不全形態、ならびに中枢神経系および網膜の変性疾患を含むいくつかの他の老化関連疾患の発生における重要な寄与要因であると考えられる。
【００８７】
多くの他の障害は、炎症性腸疾患を含む、患部組織における酸化ストレスおよび炎症; 炎症性皮膚疾患; 放射線療法および化学療法に関係する粘膜炎および皮膚炎; ぶどう膜炎、緑内障、黄斑変性症、および各種形態の網膜症などの眼疾患; 移植不全および移植拒絶反応; 虚血再灌流障害; 慢性疼痛; 変形性関節症および骨粗鬆症を含む、骨および関節の変性状態; 喘息および嚢胞性線維症; 発作性障害; ならびに統合失調症、うつ病、双極性障害、外傷後ストレス障害、注意欠陥障害、自閉スペクトル障害、および神経性食欲不振症などの摂食障害を含む神経精神医学的状態を包含する。炎症性シグナル伝達経路の調節不全は、筋ジストロフィーおよび各種形態の悪液質を含む筋消耗疾患の病理の主な要因であると考えられる。
【００８８】
生命を脅かす種々の急性障害は、膵臓、腎臓、肝臓または肺を包含する急性臓器不全、心筋梗塞または急性冠血管症候群、脳卒中、敗血症性ショック、外傷、重度の火傷、およびアナフィラキシーを含む、炎症性シグナル伝達の調節不全も包含する。
【００８９】
感染性疾患の多くの合併症は、炎症反応の調節不全も包含する。炎症反応は侵入する病原体を死滅させることができるが、過度な炎症反応は相当に破壊的であることもあり、いくつかの場合では、患部組織における一次損傷源であることがある。さらに、過度の炎症反応は、TNF-αおよびIL-1などの炎症性サイトカインの過剰産生による全身合併症につながることもある。これは、重度のインフルエンザ、重度の急性呼吸器症候群、および敗血症により生じる死亡の要因であると考えられる。
【００９０】
iNOSまたはシクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2)のいずれかの異常なまたは過度の発現は、多くの疾患プロセスの発症に関係づけられた。例えば、NOが強力な変異原であること(Tamir and Tannebaum, 1996)、および一酸化窒素がCOX-2を活性化することもあること(Salvemini et al., 1994)は明らかである。さらに、発がん物質アゾキシメタンが誘導するラット結腸腫瘍においてiNOSが著しく増加している(Takahashi et al., 1997)。オレアノール酸の一連の合成トリテルペノイド類似体は、マウスマクロファージにおける誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)およびCOX-2のIFN-γによる誘導などの細胞炎症プロセスの強力な阻害剤であることがわかった。いずれも参照により本明細書に組み入れられるHonda et al. (2000a); Honda et al. (2000b)およびHonda et al. (2002)を参照。
【００９１】
一局面では、本明細書に開示されるRTA 408は、γ-インターフェロンに対する曝露により誘導されるマクロファージ由来RAW 264.7細胞において一酸化窒素の産生を阻害するその能力を部分的に特徴とする。RTA 408は、NQO1などの抗酸化タンパク質の発現を誘導しかつCOX-2および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)などの炎症促進性タンパク質の発現を減少させるその能力をさらに特徴とする。これらの特性は、がん、電離放射線に対する局所曝露もしくは全身曝露による合併症、放射線療法または化学療法により生じる粘膜炎および皮膚炎、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患、虚血再灌流障害、腎不全および心不全を含む急性および慢性臓器不全、呼吸器疾患、糖尿病および糖尿病合併症、重度のアレルギー、移植拒絶反応、移植片対宿主病、神経変性疾患、眼および網膜の疾患、急性疼痛および慢性疼痛、変形性関節症および骨粗鬆症を含む変性骨疾患、炎症性腸疾患、皮膚炎および他の皮膚疾患、敗血症、火傷、発作性障害、ならびに精神神経障害を含む、酸化ストレスおよび炎症プロセスの調節不全を包含する多種多様な疾患および障害の処置に関係がある。
【００９２】
別の局面では、RTA 408を、眼疾患などの状態を有する対象を処置するために使用することができる。例えば、ぶどう膜炎、黄斑変性症(乾燥型と湿潤型との両方)、緑内障、糖尿病黄斑浮腫、眼瞼炎、糖尿病性網膜症、角膜内皮疾患および角膜内皮障害、例えばフックス角膜内皮ジストロフィー、術後炎症、ドライアイ、アレルギー性結膜炎、ならびに結膜炎の他の形態が、RTA 408で処置可能な眼疾患の非限定的な例である。
【００９３】
別の局面では、RTA 408を、皮膚疾患もしくは皮膚障害などの状態を有する対象を処置するために使用することができる。例えば、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、化学曝露による皮膚炎、および放射線皮膚炎を含む皮膚炎; 熱傷もしくは化学熱傷; 糖尿病性潰瘍、褥瘡および静脈性潰瘍を含む慢性創傷; ざ瘡; 禿頭症および薬物性脱毛症を含む脱毛症; 他の毛包障害; 表皮水疱症; 日焼けおよびその合併症; 白斑を含む皮膚色素沈着障害; 老化関連の皮膚状態; 術後創傷治癒; 皮膚損傷、手術もしくは熱傷による瘢痕の予防もしくは減少; 乾癬; 自己免疫疾患もしくは移植片対宿主病の皮膚科学的徴候; 皮膚がんの予防もしくは処置; 皮膚細胞の過剰増殖を包含する障害、例えば角化症が、RTA 408で処置可能な皮膚疾患の非限定的な例である。
【００９４】
理論に拘束されるものではないが、抗酸化/抗炎症Keap1/Nrf2/ARE経路の活性化は、本明細書に開示される化合物の抗炎症特性と抗腫瘍形成特性との両方に関係していると考えられる。
【００９５】
別の局面では、高レベルの酸化ストレスが引き起こす状態を1つまたは複数の組織において有する患者を処置するために、RTA 408を使用することができる。酸化ストレスは、異常に高いかまたは持続性のレベルのスーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素およびペルオキシナイトライト(一酸化窒素とスーパーオキシドとの反応により形成される)などの活性酸素種により生じる。酸化ストレスは急性炎症または慢性炎症のいずれかを伴うことがある。酸化ストレスは、ミトコンドリア機能障害、マクロファージおよび好中球などの免疫細胞の活性化、電離放射線などの外部作用物質、または細胞毒性化学療法薬(例えばドキソルビシン)に対する急性の曝露、外傷または他の急性組織傷害、虚血再灌流、循環不良または貧血、限局性または全身性の低酸素症または高酸素症、高レベルの炎症性サイトカインおよび他の炎症関連タンパク質、ならびに/あるいは高血糖または低血糖などの他の異常な生理状態により引き起こされることがある。
【００９６】
心筋梗塞、腎不全、移植不全および移植拒絶反応、脳卒中、心血管疾患および自己免疫疾患のモデルを含む、多くのそのような状態の動物モデルにおいて、Nrf2経路の標的遺伝子である誘導型ヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の発現の刺激が、著しい治療効果を有することがわかった(例えばSacerdoti et al., 2005; Abraham & Kappas, 2005; Bach, 2006; Araujo et al., 2003; Liu et al., 2006; Ishikawa et al., 2001; Kruger et al., 2006; Satoh et al., 2006; Zhou et al., 2005; Morse and Choi, 2005; Morse and Choi, 2002)。この酵素は遊離ヘムを鉄、一酸化炭素(CO)およびビリベルジン(続いて強力な抗酸化分子であるビリルビンに変換される)に分解する。
【００９７】
別の局面では、炎症により増悪した酸化ストレスにより生じる急性および慢性の組織損傷または臓器不全の予防または処置にRTA 408を使用することができる。この分類に属する疾患の例としては、心不全、肝不全、移植不全および移植拒絶反応、腎不全、膵炎、線維性肺疾患(特に嚢胞性線維症、COPDおよび特発性肺線維症)、糖尿病(合併症を含む)、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流障害、緑内障、脳卒中、自己免疫疾患、自閉症、黄斑変性症、ならびに筋ジストロフィーが挙げられる。例えば、自閉症の場合、中枢神経系における酸化ストレスの増加が疾患の発生に寄与し得ることを、研究は示唆している(Chauhan and Chauhan, 2006)。
【００９８】
酸化ストレスおよび炎症を、精神病、大うつ病および双極性障害などの精神障害; てんかんなどの発作性障害; 偏頭痛、神経因性疼痛または耳鳴などの疼痛および感覚症候群; ならびに注意欠陥障害などの挙動症候群を含む、中枢神経系の多くの他の障害の発生および病理に結びつける証拠もある。例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられるDickerson et al., 2007; Hanson et al., 2005; Kendall-Tackett, 2007; Lencz et al., 2007; Dudhgaonkar et al., 2006; Lee et al., 2007; Morris et al., 2002; Ruster et al., 2005; McIver et al., 2005; Sarchielli et al., 2006; Kawakami et al., 2006; Ross et al., 2003を参照。例えば、高レベルのTNF、インターフェロンγおよびIL-6を含む炎症性サイトカインは主な精神疾患に関連している(Dickerson et al., 2007)。ミクログリア活性化も主な精神疾患に結びついている。したがって、炎症性サイトカインの下方制御およびミクログリアの過度の活性化の阻害が、統合失調症、大うつ病、双極性障害、自閉スペクトル障害および他の精神神経障害の患者において有益である可能性がある。
【００９９】
したがって、単独の酸化ストレスまたは炎症により増悪する酸化ストレスを包含する病理では、処置は、上述のまたは本明細書全体にわたって記載の化合物などの本発明の化合物の治療有効量を対照に投与する段階を含み得る。処置は、予測可能な酸化ストレス状態(例えば臓器移植、もしくはがん患者に対する放射線療法の施行)の前に予防的に施行可能であるか、または確立した酸化ストレスおよび炎症を包含する設定において治療的に施行可能である。いくつかの態様では、放射線療法および/または化学療法を受けている患者を処置するために本発明の化合物を使用する場合、本発明の化合物を放射線療法または化学療法の前、途中および/または後に投与してもよく、該化合物を他の治療薬との組み合わせで投与してもよい。いくつかの態様では、本発明の化合物は、放射線療法または化学療法(異なる薬剤を使用する)の抗がん効果を減少させずに、放射線療法または化学療法に関連する副作用を予防しかつ/またはその重症度を減少させることができる。そのような副作用が放射線療法および/または化学療法の線量や用量を制限しうることから、いくつかの態様では、例えば放射線療法および/または化学療法の用量や線量を多くしかつ/または実行頻度を多くすることで処置有効性を増大させるために、本発明の化合物を使用することができる。いくつかの態様では、本発明の化合物を放射線療法および/または化学療法との組み合わせで投与する場合、所与の線量や用量の放射線療法および/または化学療法の有効性を強化することができる。いくつかの態様では、本発明の化合物を放射線療法および/または化学療法との組み合わせで投与する場合、所与の線量や用量の放射線療法および/または化学療法の有効性を強化し、かつ放射線療法および/または化学療法の副作用を減少させる(または少なくとも増加させない)ことができる。理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様では、組み合わせによるこの有効性は、本発明の化合物による炎症性転写因子NF-κBの活性の阻害によって生じうる。NF-κBはがん細胞中で多くの場合は慢性的に活性化され、そのような活性は治療耐性および腫瘍進行促進に関連している(例えばKarin, 2006; Aghajan et al., 2012)。いくつかの態様では、炎症およびがんを促進する他の転写因子、例えばSTAT3(例えばHe and Karin 2011; Grivennikov and Karin, 2010)も本発明の化合物によって阻害することができる。
【０１００】
敗血症、皮膚炎、自己免疫疾患および変形性関節症などの炎症状態を処置または予防するためにRTA 408を使用することができる。一局面では、RTA 408を使用することで、例えばNrf2の誘導および/またはNF-κBの阻害により炎症性疼痛および/または神経因性疼痛を処置または予防することができる。
【０１０１】
がん、炎症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、自閉症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、関節リウマチ、ループス、クローン病および乾癬などの自己免疫疾患、炎症性腸疾患、その発症が一酸化窒素またはプロスタグランジンのいずれかの過剰産生を包含すると考えられるすべての他の疾患、ならびに単独の酸化ストレスまたは炎症により増悪する酸化ストレスを包含する病理などの疾患を処置または予防するために、RTA 408を使用することができる。RTA 408を、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫または精上皮腫、あるいは膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、生殖器がん、尿生殖器がん、頭部がん、腎がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、筋組織がん、頸部がん、口腔粘膜もしくは鼻粘膜がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がんまたは甲状腺がんを含むがんの処置または予防に使用することができる。
【０１０２】
炎症の別の局面はプロスタグランジンEなどの炎症性プロスタグランジンの産生である。RTA 408は血管拡張、血漿の血管外漏出、限局性疼痛、高温、および炎症の他の症状を促進するために使用され得る。酵素COX-2の誘導型がそれらの産生に関連しており、高レベルのCOX-2が炎症組織に見られる。したがって、COX-2の阻害は炎症の多くの症状を緩和することができ、いくつかの重要な抗炎症薬(例えばイブプロフェンおよびセレコキシブ)はCOX-2活性を阻害することで作用する。シクロペンテノンプロスタグランジン(cyPG)のあるクラス(例えば15-デオキシプロスタグランジンJ2、別名PGJ2)が、炎症の組織的消散を刺激する上で役割を果たすことが示されている(例えばRajakariar et al., 2007)。COX-2はシクロペンテノンプロスタグランジンの産生にも関連している。したがって、COX-2の阻害は、炎症の完全消散に干渉することで、潜在的に組織中の活性化免疫細胞の残留を促進しかつ慢性的な「くすぶり型の」炎症を導くことがある。この効果は、選択的COX-2阻害剤を長期間使用する患者における心血管疾患の発生率の増加の原因であることがある。
【０１０３】
一局面では、RTA 408を使用することで、レドックス感受性転写因子の活性を制御するタンパク質上の制御システイン残基(RCR)を選択的に活性化することにより細胞内の炎症促進性サイトカインの産生を調節することができる。cyPGによるRCRの活性化は、抗酸化および細胞保護転写因子Nrf2の活性を強力に誘導し、かつ酸化促進性および炎症促進性転写因子NF-κBおよびSTATの活性を抑制するという、消散促進プログラムを開始させることがわかった。いくつかの態様では、RTA 408を使用して、抗酸化および還元分子(NQO1、HO-1、SOD1、γ-GCS)の産生を増加させ、酸化ストレスならびに酸化促進性および炎症促進性分子(iNOS、COX-2、TNF-α)の産生を減少させることができる。いくつかの態様では、RTA 408を使用して、炎症の消散を促進しかつ宿主に対する過度の組織損傷を制限することで、炎症事象を宿す細胞を非炎症状態に復帰させることができる。
【０１０４】
A. がん
いくつかの態様では、本開示のRTA 408、多形体および方法を使用することで、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し、細胞分化を誘導し、がん細胞増殖を阻害し、炎症反応を阻害し、かつ/または化学予防能力において機能することができる。例えば、本発明は以下の特性のうち1つまたは複数を有する新規多形体を提供する: (1) アポトーシスを誘導しかつ悪性細胞と非悪性細胞との両方を分化させる能力、(2) 多くの悪性細胞または前悪性細胞の増殖の阻害剤としてのサブマイクロモルまたはナノモルレベルでの活性、(3) 炎症性酵素である誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の新規合成を抑制する能力、(4) NF-κB活性化を阻害する能力、および(5) ヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の発現を誘導する能力。
【０１０５】
iNOSおよびCOX-2のレベルは特定のがんでは上昇し、発がんに関係づけられており、COX-2阻害剤はヒトにおける原発性結腸腺腫の発生率を減少させることがわかった(Rostom et al., 2007; Brown and DuBois, 2005; Crowel et al., 2003)。iNOSは骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)において発現し(Angulo et al., 2000)、がん細胞におけるCOX-2活性はプロスタグランジンE2 (PGE2)を産生させることがわかっており、プロスタグランジンE2はMDSCにおけるアルギナーゼの発現を誘導することがわかった(Sinha et al., 2007)。アルギナーゼおよびiNOSは、L-アルギニンを基質として利用しかつL-オルニチンおよび尿素、ならびにL-シトルリンおよびNOをそれぞれ産生する、酵素である。MDSCによる腫瘍微小環境からのアルギニンの枯渇と、NOおよびペルオキシナイトライトの産生との組み合わせは、T細胞の増殖を阻害しかつそのアポトーシスを誘導することがわかった(Bronte et al., 2003)。COX-2およびiNOSの阻害は、MDSCの蓄積を減少させ、腫瘍関連のT細胞の細胞毒性活性を修復し、腫瘍増殖を遅延させることがわかった(Sinha et al., 2007; Mazzoni et al., 2002; Zhou et al., 2007)。
【０１０６】
NF-κBおよびJAK/STATシグナル伝達経路の阻害は、がん上皮細胞の増殖を阻害しかつそのアポトーシスを阻害する戦略として関係づけられた。STAT3およびNF-κBの活性化は、がん細胞におけるアポトーシスの抑制、ならびに増殖、浸潤および転移の促進を生じさせることがわかった。これらのプロセスに関与する標的細胞の多くは、NF-κBとSTAT3との両方により転写制御されることがわかった(Yu et al., 2007)。
【０１０７】
NF-κBおよびSTAT3は、がん上皮細胞におけるそれらの直接的役割に加えて、腫瘍微小環境内に見られる他の細胞においても重要な役割を有する。動物モデルにおける実験は、がんの開始および進行に対する炎症の効果を伝播するには、がん細胞と造血細胞との両方においてNF-κBが必要であることを示した(Greten et al., 2004)。がん細胞および骨髄細胞におけるNF-κBの阻害は、得られる腫瘍の数および大きさをそれぞれ減少させる。がん細胞におけるSTAT3の活性化は、腫瘍関連の樹状細胞(DC)の成熟を生じさせるいくつかのサイトカイン(IL-6、IL-10)の産生を生じさせる。さらに、STAT3は、樹状細胞それ自体におけるこれらのサイトカインにより活性化される。がんのマウスモデルにおけるSTAT3の阻害は、DCの成熟を修復し、抗腫瘍免疫を促進し、腫瘍増殖を阻害する(Kortylewski et al., 2005)。いくつかの態様では、RTA 408およびその多形体を使用して、例えば前立腺がんを含むがんを処置することができる。いくつかの態様では、RTA 408およびその多形体を併用療法に使用して、例えば前立腺がんを含むがんを処置することができる。例えば下記実施例Hを参照。
【０１０８】
B. 多発性硬化症および他の神経変性状態
いくつかの態様では、多発性硬化症(MS)または他の神経変性状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、もしくは筋萎縮性側索硬化症について患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。MSは中枢神経系の炎症状態であることが知られている(Williams et al., 1994; Merrill and Benvenist, 1996; Genain and Nauser, 1997)。いくつかの検査に基づいて、炎症機構、酸化機構および/または免疫機構がアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびMSの発症に関与することを示唆する証拠が存在する(Bagasra et al., 1995; McGeer and McGeer, 1995; Simonian and Coyle, 1996; Kaltschmidt et al., 1997)。疫学的データは、アラキドン酸エステルからのプロスタグランジンの合成を遮断するNSAIDの慢性的使用がADの発生の危険性を著しく低下させることを示している(McGeer et al., 1996; Stewart et al., 1997)。したがって、NOおよびプロスタグランジンの形成を遮断する薬剤を、神経変性疾患を予防および処置するためのアプローチに使用することができる。典型的には、そのような疾患を処置するための治療用候補の成功は、血液脳関門を侵入する能力を必要とする。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2009/0060873号を参照。
【０１０９】
C. 神経炎症
いくつかの態様では、神経炎症の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。神経炎症は、中枢神経系におけるミクログリアおよびアストロサイトの応答および作用が基本的に炎症様の性質を有し、かつこれらの応答が多種多様な神経学的障害の発症および進行の中心をなすという概念を包含する。これらの概念はアルツハイマー病から他の神経変性疾患(Eikelenboom et al., 2002; Ishizawa and Dickson, 2001)、虚血性/毒性疾患(Gehrmann et al., 1995; Touzani et al., 1999)、腫瘍生物学(Graeber et al., 2002)、さらには正常な脳の発達に敷衍された。神経炎症は、ミクログリアおよびアストロサイトの活性化ならびにサイトカイン、ケモカイン、補体タンパク質、急性期タンパク質、酸化傷害、および関連する分子プロセスの誘導を含む、広範にわたる複雑な細胞応答を組み入れる。これらの事象がニューロンの機能に有害な効果を示すことで、ニューロン傷害、さらにはグリア活性化、最終的には神経変性につながることがある。
【０１１０】
D. 腎疾患
いくつかの態様では、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許8,129,429に教示される方法に基づき、腎不全および慢性腎疾患(CKD)を含む、腎疾患および腎障害の患者を処置するために、RTA 408およびその多形体を使用することができる。血液からの代謝老廃物の不十分なクリアランスおよび血中の電解質の異常な濃度を生じさせる、腎不全は、世界の至る所、特に先進国において重大な医学的問題である。糖尿病および高血圧は、慢性腎疾患(CKD)としても知られる慢性腎不全の最も重要な原因のひとつであるが、それはループスなどの他の状態にも関連している。急性腎不全は、特定の薬物(例えばアセトアミノフェン)もしくは有毒化学物質に対する曝露、またはショックもしくは移植などの外科的手順に関連する虚血再灌流障害により生じることがあり、慢性腎不全を生じさせることがある。多くの患者では、腎不全は、患者が生存を続けるために定期的な透析または腎移植を必要とする段階に進む。これらの手順のいずれも非常に侵襲的であり、著しい副作用および生活の質の問題に関連している。副甲状腺機能亢進症および高リン血症などの腎不全のいくつかの合併症には有効な処置薬が存在するが、腎不全の根本的な進行を停止または逆転させる利用可能な処置薬はわかっていない。したがって、損なわれた腎機能を改善可能な薬剤は、腎不全の処置における著しい進歩を意味するであろう。
【０１１１】
炎症はCKDの病理に著しく寄与する。酸化ストレスと腎機能障害との間にも強力な機構的結びつきが存在する。最終的に腎臓に傷害を与える炎症反応を生じさせる単球/マクロファージの動員を担うケモカインであるMCP-1の転写をNF-κBが制御する際に、NF-κBシグナル伝達経路はCKDの進行において重要な役割を果たす(Wardle, 2001)。Keap1/Nrf2/ARE経路は、ヘムオキシゲナーゼ1 (HO-1)を含む抗酸化酵素をコードするいくつかの遺伝子の転写を調節する。雌マウスにおけるNrf2遺伝子の消失はループス様糸球体腎炎を発生させる(Yoh et al., 2001)。さらに、いくつかの研究は、HO-1の発現が腎損傷および炎症に応答して誘導され、この酵素ならびにその産物のビリルビンおよび一酸化炭素が腎臓において保護的役割を果たすことを示した(Nath et al., 2006)。
【０１１２】
急性腎傷害(AKI)は、虚血再灌流、シスプラチンおよびラパマイシンなどの特定の薬理学的薬剤での処置、ならびに医学イメージングで使用する造影剤の静脈内注射の後に生じることがある。CKDの場合と同様に、炎症および酸化ストレスはAKIの病理に寄与する。造影剤誘導性腎症(RCN)の根本的な分子機構は十分に理解されていないが、血管収縮の持続、腎臓自己調節の障害、および造影剤の直接の毒性を含む事象の組み合わせは、いずれも腎不全に寄与する可能性が高い(Tumlin et al., 2006)。血管収縮は、腎血流量を減少させ、虚血再灌流および活性酸素種の産生を引き起こす。HO-1は、これらの条件下で強力に誘導されるものであり、腎臓を含むいくつかの異なる臓器において虚血再灌流障害を予防することが示された(Nath et al., 2006)。具体的には、HO-1の誘導はRCNのラットモデルにおいて保護的であることがわかった(Goodman et al., 2007)。再灌流も、部分的にはNF-κBシグナル伝達を通じて炎症反応を誘導する(Nichols, 2004)。臓器損傷を予防する治療戦略としてNF-κBの標的化が提案された(Zingarelli et al., 2003)。
【０１１３】
E. 心血管疾患
いくつかの態様では、心血管疾患の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。CV疾患の病因は複雑であるが、原因の大部分は、決定的な臓器または組織に対する不十分なまたは完全に中断した血液供給に関係している。多くの場合、そのような状態は1つまたは複数の動脈硬化巣の破裂により生じ、これは決定的な血管において血流を遮断する血栓の形成につながる。
【０１１４】
いくつかの例では、アテローム性動脈硬化症が決定的な血管において非常に広範であるため、狭窄(動脈の狭小化)が発生し、決定的な臓器(心臓を含む)に対する血流が慢性的に不十分であるということがある。そのような慢性虚血は、うっ血性心不全に関連する心肥大を含む多くの種類の終末器官損傷につながることがある。
【０１１５】
心血管疾患の多くの形態につながる根本的な欠陥であるアテローム性動脈硬化症は、血管平滑筋細胞の増殖および患部に対する白血球の浸潤を包含する炎症反応を動脈の裏層(内皮)の身体的欠陥または傷害が誘発する場合に生じる。最終的に、上記細胞とコレステロール保持リポタンパク質および他の材料の沈着物との組み合わせで構成される、動脈硬化巣として知られる合併病変が形成されることがある(例えばHansson et al., 2006)。現行の治療処置が与える著しい利点にもかかわらず、心血管疾患による死亡率は依然として高く、心血管疾患の処置における満たされていない著しい要求が残存している。
【０１１６】
HO-1の誘導は心血管疾患の種々のモデルにおいて有益であることがわかっており、低レベルのHO-1発現はCV疾患の高リスクに臨床的に相関している。したがって、アテローム性動脈硬化症、高血圧、心筋梗塞、慢性心不全、脳卒中、くも膜下出血および再狭窄を含むがそれに限定されない種々の心血管障害の処置または予防に、本発明の化合物を使用することができる。いくつかの態様では、本発明のRTA 408、多形体および方法を、抗凝固薬、血栓溶解薬、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、手術、冠動脈バイパス術、バルーン血管形成術、ステントの使用、細胞増殖を阻害する薬物、またはコレステロール値を低下させる薬物などであるがそれに限定されない他の公知の心血管治療との併用療法として使用することができる。
【０１１７】
F. 糖尿病
いくつかの態様では、糖尿病の患者を処置するために、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許8,129,429に教示される方法に基づき、本発明のRTA 408およびその多形体を使用することができる。糖尿病は、グルコースの循環レベルを身体が制御することの失敗を特徴とする複合疾患である。この失敗は、各種組織におけるグルコースの産生と吸収との両方を制御するペプチドホルモンであるインスリンの欠乏により生じることがある。インスリンの欠乏は、筋肉、脂肪および他の組織がグルコースを適切に吸収する能力を損ない、高血糖(異常に高レベルの血中グルコース)につながる。最も一般的には、そのようなインスリン欠乏は、膵臓の島細胞での不十分な産生により生じる。大部分の場合では、これは、1型糖尿病または若年発症糖尿病として知られる状態である、これらの細胞の自己免疫破壊により生じるが、身体外傷または何らかの他の原因によることもある。
【０１１８】
筋肉細胞および脂肪細胞がインスリンに対して応答性が低くなり、グルコースを適切に吸収せず、高血糖を生じさせる場合に、糖尿病が生じることもある。この現象はインスリン抵抗性として知られて、生じる状態は2型糖尿病として知られている。最も一般的な種類である2型糖尿病は、肥満および高血圧に非常に関連している。肥満は、インスリン抵抗性の発生に大きな役割を果たすと考えられる脂肪組織の炎症状態に関連している(例えば、Hotamisligil, 2006; Guilherme et al., 2008)。
【０１１９】
糖尿病は多くの組織の損傷に関連しており、これは主として、高血糖(および過剰なまたは不適切な回数の用量のインスリンにより生じることがある低血糖)が著しい酸化ストレス源であるためである。本発明のRTA 408、多形体および方法は、特にHO-1発現の誘導により酸化ストレスに対して保護するそれらの能力により、多くの糖尿病合併症の処置に使用することができる。先に記したように(Cai et al., 2005)、肝臓における慢性炎症および酸化ストレスが2型糖尿病の発生の主要な寄与要因であると疑われる。さらに、チアゾリジンジオンなどのPPARγアゴニストは、インスリン抵抗性を減少可能であり、また2型糖尿病の有効な処置薬であることが知られている。いくつかの態様では、本発明のRTA 408、多形体および方法は、チアゾリジンジオンなどのPPARγアゴニストとの併用療法として使用されてもよい。
【０１２０】
G. 関節炎
いくつかの態様では、本発明のRTA 408、多形体および方法を、関節炎の一形態を有する患者を処置するために使用することができる。いくつかの態様では、本発明のRTA 408および多形体で処置可能な関節炎の形態は、関節リウマチ(RA)、乾癬性関節炎(PsA)、強直性脊椎炎(AS)、反応性関節炎(ReA)および腸炎性関節炎(EA)を含む脊椎関節症(SpA)、若年性関節リウマチ(JRA)、ならびに早期炎症性関節炎である。
【０１２１】
典型的には、関節リウマチ(RA)の第1の徴候は滑膜裏層において現れ、滑膜線維芽細胞の増殖および関節縁での関節表面に対する付着を伴う(Lipsky, 1998)。続いて、マクロファージ、T細胞および他の炎症細胞が関節に補充され、そこでそれらはいくつかのメディエーターを産生する。メディエーターとしては、骨および軟骨の破壊につながる慢性続発症に寄与するサイトカインであるインターロイキン1 (IL-1)、および炎症において役割を果たす腫瘍壊死因子(TNF-α)が挙げられる(Dinarello, 1998; Arend and Dayer, 1995; van den Berg, 2001)。血漿中のIL-1の濃度は、健康な個人よりもRAの患者の方が著しく高く、特に血漿中IL-1レベルはRA疾患活性に相関している(Eastgate et al., 1988)。さらに、IL-1の滑液中レベルはRAの各種X線検査的および組織学的特徴に相関している(Kahle et al., 1992; Rooney et al., 1990)。
【０１２２】
関節炎の他の形態には、関節炎と乾癬との連関を特徴とする慢性炎症性関節症である乾癬性関節炎(PsA)がある。研究により、PsAが、いくつかの遺伝的、病原的および臨床的特徴を強直性脊椎炎、反応性関節炎および腸炎性関節炎を含む疾患の一群である他の脊椎関節症(SpA)と共有していることが明らかにされた(Wright, 1979)。最近、PsAがSpA群に属するという概念は、RAではなくPsAにおいて広範な腱付着部炎を示すイメージング研究からさらなる裏付けを獲得した(McGonagle et al., 1999; McGonagle et al., 1998)。より具体的には、腱付着部炎は、炎症腱付着部が末梢関節に近い場合に、SpAにおいて生じる最も早期の事象の1つであって、脊椎における骨リモデリングおよび関節強直ならびに関節滑膜炎につながる事象であると仮定された。TNF-αの量の増加は乾癬性皮膚(Ettehadi et al., 1994)と滑液(Partsch et al., 1997)との両方において報告された。最近の治験は、PsA (Mease et al., 2000)と強直性脊椎炎(Brandt et al., 2000)との両方における抗TNF処置の肯定的利点を示した。
【０１２３】
子どもの関節炎の最も一般的な形態に関する用語である若年性関節リウマチ(JRA)は、滑膜の慢性炎症および肥大を特徴とする疾病のファミリーに適用される。この用語は、欧州では若年性慢性関節炎および/または若年性特発性関節炎と呼ばれる疾病のファミリーと重複しているが完全に同義というわけではない。
【０１２４】
多関節JRAは、手の小関節を含む複数の関節(4ヶ所以上)における炎症および滑膜増殖を特徴とする別個の臨床的サブタイプである(Jarvis, 2002)。JRAのこのサブタイプは、その複数関節合併症と急速に経時的に進行するその能力との両方が理由で、重度であり得る。臨床的には別個であるが、多関節JRAは均一ではなく、患者は疾患症状、発症年齢、予後、および治療応答が異なる。これらの差異は、この疾患において生じ得る免疫および炎症発作の性質の変動のスペクトルを反映している可能性が非常に高い(Jarvis, 1998)。
【０１２５】
強直性脊椎炎(AS)は、脊椎関節症のより広範な疾患分類内のサブセットとなる疾患である。各種サブセットの脊椎関節症に罹患する患者は、細菌感染症から遺伝にわたる、多くの場合非常に困難な疾患病因を有する。しかし、すべての亜群では、疾患プロセスの最終結果は軸関節炎である。
【０１２６】
ASは、骨外性の症状を有するかまたは有さない中軸骨格の慢性全身性炎症性リウマチ性障害である。仙腸関節および脊椎が主として罹患するが、尻および肩関節、ならびにそれほど一般的ではないが末梢関節、または眼、脈管構造、神経系および胃腸管系など、一部の関節外構造も関与することがある。疾患の病因は未だ完全には理解されていない(Wordsworth, 1995; Calin and Taurog, 1998)。病因は主要組織適合性クラスI (MHC I) HLA-B27対立遺伝子に強力に関連している(Calin and Taurog, 1998)。ASは個人がその人生の全盛期に罹患するものであり、腱、靱帯、関節および骨の慢性痛および不可逆的損傷を引き起こすその潜在能力が理由で恐れられている(Brewerton et al., 1973a; Brewerton et al., 1973b; Schlosstein et al., 1973)。
【０１２７】
H. 潰瘍性大腸炎
いくつかの態様では、潰瘍性大腸炎の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。潰瘍性大腸炎は、大腸の裏層において炎症、および潰瘍と呼ばれるただれを引き起こす疾患である。通常、炎症は直腸および結腸下部において生じるが、結腸全体を冒すことがある。潰瘍性大腸炎は大腸炎または直腸炎と呼ばれることもある。炎症は結腸を多くの場合空にして、下痢を引き起こす。結腸の裏層をなす細胞を炎症が死滅させた場所で潰瘍が形成され、潰瘍は出血して膿汁を産生する。
【０１２８】
潰瘍性大腸炎は、小腸および結腸で炎症を引き起こす疾患の総称である炎症性腸疾患(IBD)である。潰瘍性大腸炎は、その症状が他の腸障害および別の種類のIBDであるクローン病と同様であるため、診断が困難なことがある。クローン病は、腸壁内のさらに深部で炎症を引き起こすため、潰瘍性大腸炎と異なる。また、クローン病は小腸で通常は生じるが、口、食道、胃、十二指腸、大腸、虫垂および肛門で生じることもある。
【０１２９】
I. クローン病
いくつかの態様では、クローン病の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。クローン病の症状としては腸炎ならびに腸狭窄および瘻孔の発生が挙げられ、多くの場合、神経障害がこれらの症状に伴って起こる。5-アミノサリチレート(例えばメサラミン)または副腎皮質ステロイドなどの抗炎症薬が典型的に処方されるが、常に有効というわけではない(Botoman et al., 1998で考察)。シクロスポリンでの免疫抑制は、副腎皮質ステロイドに抵抗性があるかまたは不耐性である患者に時々有益である(Brynskov et al., 1989)。
【０１３０】
クローン病の活性症例では、高濃度のTNF-αおよびIL-6が血液循環に分泌され、TNF-α、IL-1、IL-6およびIL-8が粘膜細胞により局部的に過剰に産生される(id.; Funakoshi et al., 1998)。これらのサイトカインは、骨発生、造血発生、ならびに肝臓、甲状腺および精神神経の機能を含む生理学的系に対する広範な効果を有することがある。また、炎症促進性IL-1βに有利なIL-1β/IL-1ra比の不均衡が、クローン病の患者において観察された(Rogler and Andus, 1998; Saiki et al., 1998; Dionne et al., 1998; 但しKuboyama, 1998を参照)。
【０１３１】
クローン病について提案された処置としては、各種サイトカインアンタゴニスト(例えばIL-1ra)、阻害剤(例えばIL-1β変換酵素の阻害剤、および抗酸化剤)ならびに抗サイトカイン抗体(Rogler and Andus, 1998; van Hogezand and Verspaget, 1998; Reimund et al., 1998; Lugering et al., 1998; McAlindon et al., 1998)の使用が挙げられる。特に、TNF-αに対するモノクローナル抗体が試みられ、クローン病の処置にある程度成功した(Targan et al., 1997; Stack et al., 1997; van Dullemen et al., 1995)。これらの化合物は本開示のRTA 408、多形体および方法との併用療法で使用可能である。
【０１３２】
J. 全身性エリテマトーデス
いくつかの態様では、SLEの患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。全身性エリテマトーデス(SLE)は、組織傷害につながる自己抗体および免疫複合体の組織中での沈着を特徴とする自己免疫リウマチ性疾患である(Kotzin, 1996)。MSおよび1型真性糖尿病などの自己免疫疾患とは対照的に、SLEは潜在的には複数の臓器系に直接関与し、その臨床症状は多様でかつ変動し得る(Kotzin and O'Dell, 1995により考察)。例えば、一部の患者は、皮疹および関節痛を主として示し、自然寛解を示し、ほとんど薬物療法を必要としないことがある。スペクトルの別の末端には、高用量のステロイドおよびシクロホスファミドなどの細胞毒性薬での治療を必要とする重度でかつ進行性の腎臓合併症を示す患者が存在する(Kotzin, 1996)。
【０１３３】
SLEによって産生される抗体の1つ、IgG抗dsDNA抗体がループス糸球体腎炎(G N)の発生に大きな役割を果たす(Hahn and Tsao, 1993; Ohnishi et al., 1994)。糸球体腎炎は、腎臓の血液精製糸球体の毛細管壁が糸球体基底膜の上皮側の癒着により肥厚する、重大な状態である。この疾患は多くの場合慢性および進行性であり、最終的な腎不全につながることがある。
【０１３４】
K. 過敏性腸症候群
いくつかの態様では、過敏性腸症候群(IBS)の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。IBSは、腹痛および腸習性の変化を特徴とする機能障害である。この症候群は青年期に始まることがあり、著しい能力障害に関連することがある。この症候群は均一な障害ではない。むしろ、IBSのサブタイプが、主な症状である下痢、便秘または疼痛に基づいて記述されている。発熱、体重減少および胃腸出血などの「警告」症状の非存在下で、限定的な精密検査が必要になる。
【０１３５】
IBSの原因についての証拠がますます、感染性腸炎と引き続くIBSの発生との間の関係を示唆している。炎症性サイトカインが役割を果たすことがある。確認された細菌性胃腸炎の履歴を有する患者の調査(Neal et al., 1997)では、25％が持続性の腸習性の変化を報告した。症状の持続は急性感染時の心理的ストレスによることがある(Gwee et al., 1999)。
【０１３６】
最近のデータは、小腸の細菌過剰繁殖もIBSの症状に役割を有することがあることを示唆している。1つの研究(Pimentel et al., 2000)では、水素呼気検査に付託された202名のIBS患者のうち157名(78%)が、細菌過剰繁殖について正の検査所見を有した。経過観察検査を行った47名の患者のうち25名(53%)が、抗生物質処置による症状(すなわち腹痛および下痢)を報告した。
【０１３７】
L. シェーグレン症候群
いくつかの態様では、シェーグレン症候群の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。原発性シェーグレン症候群(SS)は、主として中年女性が罹患する(女性対男性比9:1)慢性で緩徐進行性の全身性自己免疫疾患であるが、幼児期を含む全年齢で見ることができる(Jonsson et al., 2002)。疾患は、CD4+、CD8+リンパ球およびB細胞を含む単核細胞により浸潤する外分泌腺の、リンパ球性の浸潤および破壊を特徴とする(Jonsson et al., 2002)。さらに、腺外(全身)症状が患者の3分の1に見られる(Jonsson et al., 2001)。
【０１３８】
RAなどの他の全身性自己免疫疾患では、異所性胚中心(GC)に決定的な因子が同定された。GCを有するリウマチ性滑膜組織は、ケモカインCXCL13、CCL21およびリンホトキシン(LT)-β(濾胞中心および外套帯B細胞上で検出)を産生することがわかった。これらの分析物の多変量回帰分析は、CXCL13およびLT-βを、リウマチ性滑膜炎でのGCを予測する孤立性サイトカインとして同定した(Weyand and Goronzy, 2003)。最近、唾液腺中のCXCL13およびCXCR5が、B細胞およびT細胞を補充することで炎症プロセスにおいて必須の役割を果たし、したがってSSにおけるリンパ系新生および異所性GC形成に寄与することがわかった(Salomonsson et al., 2002)。
【０１３９】
M. 乾癬
いくつかの態様では、乾癬の患者を処置するために、本発明のRTA 408、多形体および方法を使用することができる。乾癬は、米国の人口の2〜2.6パーセント、すなわち580万〜750万人が罹患する、薄片および炎症の慢性皮膚疾患である。皮膚細胞が皮膚の表面の下のそれらの起源から急速に上昇し、それらが成熟する可能性ができる前に表面上に重層する場合に、乾癬が生じる。通常、この移動(代謝回転とも呼ぶ)は約1ヶ月を要するが、乾癬では代謝回転がわずか数日以内に生じることがある。乾癬は、その典型的な形態では、銀色の薄片で覆われた厚い赤色の(炎症の)皮膚の斑点を生じさせる。時々プラークと呼ばれるこれらの斑点は、通常かゆいかまたはひりひりする。最も多くの場合、プラークは肘、膝、脚の他の部分、頭皮、下背部、顔、手掌、および足底の上で生じるが、身体上のどの部分の皮膚上でも生じ得る。この疾患は手指の爪、足指の爪、ならびに生殖器および口内の軟部組織を冒すこともある。
【０１４０】
乾癬は、T細胞と呼ばれる白血球の種類を特に包含する免疫系により推進される皮膚障害である。通常は、T細胞は感染症および疾患に対して身体を保護するために役立つ。乾癬の場合、T細胞は誤って作用し、活性になることで他の免疫反応を誘発し、炎症および皮膚細胞の急速な代謝回転につながる。
【０１４１】
N. 感染性疾患
いくつかの態様では、本開示のRTA 408、多形体および方法は、ウイルス感染症および細菌感染症を含む感染性疾患の処置に有用であり得る。先に記したように、そのような感染症は重度の限局性または全身性の炎症反応に関連していることがある。例えば、インフルエンザは、肺の重度の炎症を引き起こすことがあり、細菌感染症は、敗血症の特徴である、複数の炎症性サイトサインの過剰産生を含む全身性超炎症反応を引き起こすことがある。さらに、本発明の化合物は、ウイルス病原体の複製の直接阻害に有用であり得る。以前の研究は、CDDOなどの関連化合物がマクロファージ中のHIVの複製を阻害し得ることを示した(Vazquez et al., 2005)。他の研究は、NF-κBシグナル伝達の阻害がインフルエンザウイルス複製を阻害し得ること、およびシクロペンテノンプロスタグランジンがウイルス複製を阻害し得ることを示した(例えば、Mazur et al., 2007; Pica et al., 2000)。
【０１４２】
本発明は、化合物RTA 408もしくは薬学的に許容されるその塩、または該化合物の多形体(例えば上記もしくは下記の多形体のいずれか1つ)、あるいは上記の実体のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物(例えば上記の薬学的組成物を含む)を使用する、上記IV節において言及した各疾患/障害/状態の処置または予防に関する。
【０１４３】
V.薬学的製剤および投与経路
RTA 408を種々の方法で、例えば経口的にまたは注射(例えば皮下、静脈内、腹腔内など)で投与することができる。投与経路に応じて、活性化合物を材料中にコーティングすることで、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然条件から化合物を保護することができる。疾患または創傷部位の持続灌流/点滴によりそれらを投与することもできる。
【０１４４】
非経口投与以外でRTA 408を投与するには、化合物をその不活性化を防ぐ材料でコーティングするかまたは化合物をそれと同時投与することが必要なことがある。例えば、治療用化合物を適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤中で患者に投与することがある。薬学的に許容される希釈剤としては食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。リポソームとしては水中油中水型CGF乳濁液および慣行的リポソームが挙げられる(Strejan et al., 1984)。
【０１４５】
RTA 408を非経口投与、腹腔内投与、脊髄内投与または脳内投与することもできる。分散液をグリセリン、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物中、ならびに油中で調製することができる。普通の保管および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有し得る。
【０１４６】
所要量のRTA 408を適切な溶媒中に、先に列挙した成分のうち1つまたは組み合わせを必要に応じて組み入れた後、濾過滅菌を行うことで、滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、塩基性分散媒体および先に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌担体に治療用化合物を組み入れることで、分散液は調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分(すなわち治療用化合物)と任意のさらなる所望の成分との粉末を、既に滅菌濾過したその溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１４７】
RTA 408は、直接噴霧乾燥手順を使用して、完全に非晶形にされてもよい。RTA 408を、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。治療用化合物および他の成分を硬もしくは軟シェルゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、または患者の食事に直接組み入れることもできる。治療用経口投与では、治療用化合物を例えば賦形剤と共に組み入れて、経口摂取用錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル剤を含むカプセル剤、エリキシル剤、乳剤、固体分散液剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウエハ剤などの形態で使用することができる。組成物および製剤中の治療用化合物の割合は当然異なり得る。そのような治療上有用な組成物中の治療用化合物の量は、好適な投与量が得られる量である。
【０１４８】
投与の容易さおよび投与量の均一性が理由で、単位剤形で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置される患者用の単位投与量として適した物理的に別々の単位を意味し、各単位は、所要の薬学担体と共同して所望の治療効果を生成するように計算される所定量の治療用化合物を含む。本発明の単位剤形の規格は(a) 治療用化合物の独自の特徴、および実現すべき特定の治療効果、ならびに(b) 患者における選択される状態の処置用にそのような治療用化合物を調合する当技術分野に内在的な限界により決定づけられかつそれに直接依存する。
【０１４９】
RTA 408を皮膚、眼または粘膜に局所投与することもできる。いくつかの態様では、化合物をローション剤、クリーム剤、ゲル剤、油剤、軟膏剤、膏薬、乳剤、溶液剤、懸濁液剤または乳剤に調製してもよい。あるいは、肺に対する局部送達が望ましい場合、乾燥粉末またはエアロゾル製剤での吸入により治療用化合物を投与することができる。
【０１５０】
通常、所定の患者に関連する状態を処置するために十分な治療有効投与量で、RTA 408を投与する。例えば、実施例および図面に示すモデル系などの、ヒトにおいて疾患を処置する上での有効性を予測可能な動物モデル系において、化合物の有効性を評価することができる。
【０１５１】
患者に投与されるRTA 408またはRTA 408を含む組成物の実際の投与量は、年齢、性別、体重、状態の重症度、処置される疾患の種類、以前のまたは同時の治療介入、患者の特発性、および投与経路などの身体的および生理的要因により決定することができる。これらの要因は当業者が決定可能である。典型的には、投与を担う開業医は、組成物中の有効成分の濃度、および個々の患者に適切な用量を決定する。任意の合併症に際しては、個々の医師が投与量を調整することができる。
【０１５２】
典型的には、有効量は、毎日、1日間または数日間の1回または複数回の用量投与において、約0.001mg/kg〜約1,000mg/kg、約0.01mg/kg〜約750mg/kg、約100mg/kg〜約500mg/kg、約1.0mg/kg〜約250mg/kg、約10.0mg/kg〜約150mg/kgで変動する(当然、投与様式および先に論じた要因に依存する)。他の好適な用量範囲としては1日当たり1mg〜10,000mg、1日当たり100mg〜10,000mg、1日当たり500mg〜10,000mg、および1日当たり500mg〜1,000mgが挙げられる。いくつかの特定の態様では、量は1日当たり10,000mg未満、1日当たり750mg〜9,000mgの範囲である。
【０１５３】
有効量は1mg/kg/日未満、500mg/kg/日未満、250mg/kg/日未満、100mg/kg/日未満、50mg/kg/日未満、25mg/kg/日未満または10mg/kg/日未満であり得る。あるいは、それは1mg/kg/日〜200mg/kg/日の範囲であり得る。いくつかの態様では、量は、以下の実施例C1に記載のように、ゴマ油中懸濁液剤として製剤化される10、30、100または150mg/kgでありうる。いくつかの態様では、量は、以下の実施例C2およびC3に記載のように、経口胃管栄養法によって毎日投与される3、10、30または100mg/kgでありうる。いくつかの態様では、量は、以下の実施例C6に記載のように、経口投与される10、30または100mg/kgでありうる。例えば、糖尿病患者の処置に関して、単位投与量は、未処置患者に比べて血糖を少なくとも40%減少させる量であり得る。別の態様では、単位投与量は、非糖尿病患者の血糖値の±10%であるレベルまで血糖を減少させる量である。
【０１５４】
他の非限定的な例では、用量は、投与1回当たり約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重〜約1,000mg/kg/体重以上、およびその中の導出可能な任意の範囲も含み得る。ここで列挙した数字から導出可能な範囲の非限定的な例では、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を、先に記載の数字に基づいて投与することができる。
【０１５５】
特定の態様では、本開示の薬学的組成物は、例えば少なくとも約0.01%のRTA 408を含み得る。他の態様では、RTA 408は、例えば単位の重量の約0.01%〜約75%、または約0.01%〜約5%、およびその中の導出可能な任意の範囲を構成することができる。いくつかの態様では、以下の実施例FおよびGに示すように、RTA 408をゴマ油中0.01%、0.1%または1%懸濁液剤などの製剤中で使用することができる。いくつかの態様では、RTA 408を皮膚または眼への局所投与用に、薬学的に好適な担体を使用してまたは約0.01%〜10%の範囲の濃度の懸濁液剤、乳剤もしくは溶液剤として製剤化することができる。いくつかの態様では、濃度は約0.1%〜約5%の範囲である。最適濃度は標的器官、特定の製剤、および処置すべき状態に応じて変動しうる。
【０１５６】
単一用量または複数回用量のRTA 408を含む薬剤が企図される。複数回用量の送達用の所望の時間間隔は、ルーチンでしかない実験法を使用する当業者が決定することができる。一例として、約12時間の間隔で2用量を毎日患者に投与することができる。いくつかの態様では、薬剤を1日1回投与する。薬剤をルーチンのスケジュールで投与することができる。本明細書で使用するルーチンのスケジュールとは、所定の指定された期間を意味する。ルーチンのスケジュールは、そのスケジュールが所定のものである限り、長さが同一であるかまたは異なる期間を包含し得る。例えば、ルーチンのスケジュールは、1日2回、毎日、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、毎週、毎月、またはその中で設定される任意の数の日もしくは週毎の投与を包含し得る。あるいは、所定のルーチンのスケジュールは、最初の1週間は毎日2回、続いて数ヶ月は毎日1回の投与などを包含し得る。他の態様では、本発明は、薬剤を経口摂取可能なルーチンのスケジュール、およびそのタイミングが食物摂取に依存するかまたは依存しないルーチンのスケジュールを提供する。したがって、例えば、患者が摂食したかまたはこれから摂食するかにかかわらず、薬剤を毎朝および/または毎晩摂取することができる。
【０１５７】
VI.併用療法
本発明に記載のRTA 408および多形体は、単独療法としての使用に加えて、併用療法においても用途を見出す。有効な併用療法は、両薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤により、あるいは一方の組成物がRTA 408もしくはその多形体を含み、他方が第2の薬剤を含む、同時投与される2つの別個の組成物または製剤により、実現することができる。他の治療様式は、RTA 408またはその多形体の投与の前、途中または後に実行することができる。RTA 408またはその多形体を使用する治療は、数分〜数週の範囲の間隔で他の薬剤の投与に先行または後続しうる。一般に、他の薬剤およびRTA 408またはその多形体を別々に投与する態様では、各薬剤が有利な併用効果を依然として発揮できるように、各送達の間に著しく長い期間をおかないことを確実にするであろう。そのような場合、RTA 408または多形体および他の治療薬の投与を通常は互いに対して約12〜24時間以内、より好ましくは互いに対して約6〜12時間以内に行い、遅延時間を約12時間のみとすることが最も好ましいと企図される。しかし、いくつかの状況では、処置期間を著しく延長し、各投与間で数日(2、3、4、5、6または7)〜数週(1、2、3、4、5、6、7または8)が経過するようにすることが望ましいことがある。
【０１５８】
また、RTA 408もしくはその多形体または他の薬剤の2回以上の投与が望ましいと考えられる。これに関して、様々な組み合わせを使用することができる。例えば、RTA 408またはその多形体を「A」とし、他の薬剤を「B」とする場合、合計3回および4回の投与に基づく以下の順列が例として挙げられる。
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【０１５９】
他の組み合わせが同様に企図される。本発明において使用可能な薬理学的作用物質の非限定的な例としては、がんの処置において有益であることが知られている任意の薬理学的作用物質が挙げられる。いくつかの態様では、RTA 408またはその多形体とがんを標的化する免疫療法、遺伝子療法、放射線療法、化学療法剤または手術との組み合わせが企図される。RTA 408またはその多形体と2種以上の特異療法を含む2つ以上の上記方法との組み合わせも企図される。いくつかの態様では、免疫療法は、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))、アレムツズマブ(キャンパス(登録商標))、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、セツキシマブ(アービタックス(Eribitux)(登録商標))およびパニツムマブ(ベクティビックス(登録商標))などであるがそれに限定されない、がんを標的とする他の抗体、またはイブリツモマブチウキセタン(ゼヴァリン(登録商標))、トシツモマブ(ベキサール(登録商標))、ブレンツキシマブベドチン(アドセトリス(Adcetris)(登録商標))、ado-トラスツズマブエムタンシン(カドシラ(Kadcyla)(商標))もしくはデニロイキンジフチトクス(denileukin dititox)(オンタック(Ontak)(登録商標))などの結合抗体でありうる。さらに、いくつかの態様では、RTA 408またはその多形体は、シプロイセルT(プロベンジ(登録商標))などの樹状細胞に基づく免疫療法、または養子T細胞免疫療法との併用療法において使用されると想定される。
【０１６０】
さらに、RTA 408またはその多形体は、アントラサイクリン、タキサン、メトトレキサート、ミトキサントロン、エストラムスチン、ドキソルビシン、エトポシド、ビンブラスチン、カルボプラチン、ビノレルビン、5-フルオロウラシル、シスプラチン、トポテカン、イホスファミド、シクロホスファミド、エピルビシン、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ペメトレキセド、メルファラン、カペシタビンおよびオキサリプラチンなどであるがそれに限定されない化学療法薬との組み合わせで使用されると企図される。いくつかの態様では、RTA 408またはその多形体は、電離放射線の使用を含むがそれに限定されない放射線療法との組み合わせで使用される。いくつかの態様では、がん治療薬の効果が、RTA 408およびその多形体との投与を通じて相乗的に強化される。いくつかの態様では、RTA 408を含む併用療法が、前立腺がんを例えば含むがんを処置するために使用される。例えば以下の実施例Hを参照。
【０１６１】
いくつかの態様では、本方法は、(1) 腫瘍細胞と第2の化学療法薬とを接触させる前に腫瘍細胞と化合物とを接触させる段階、(2) 腫瘍細胞と化合物とを接触させる前に腫瘍細胞と第2の化学療法薬とを接触させる段階、または(3) 腫瘍細胞と化合物および第2の化学療法薬とを同時に接触させる段階をさらに含みうる。特定の態様では、第2の化学療法薬は抗生物質、抗炎症薬、抗悪性腫瘍薬、抗増殖薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬または免疫抑制薬でありうる。他の態様では、第2の化学療法薬はアルキル化剤、アンドロゲン受容体モジュレーター、細胞骨格攪乱物質、エストロゲン受容体モジュレーター、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、レチノイド受容体モジュレーター、トポイソメラーゼ阻害剤またはチロシンキナーゼ阻害剤でありうる。特定の態様では、第2の化学療法薬は5-アザシチジン、5-フルオロウラシル、9-cis-レチノイン酸、アクチノマイシンD、アリトレチノイン、all-trans-レチノイン酸、アンナマイシン(annamycin)、アキシチニブ、ベリノスタット(belinostat)、ベバシズマブ、ベキサロテン、ボスチニブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、CD437、セジラニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、ドセタキセル、ドラスタチン-10、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エルロチニブ、エトポシド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ヘキサメチルメラミン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イソトレチノイン、イクサベピロン、ラパチニブ、LBH589、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、MS-275、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オキサリプラチン、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、セマキサニブ(semaxanib)、セムスチン、酪酸ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ストレプトゾトシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スニチニブ、タモキシフェン、テニポシド、チオペタ(thiopeta)、チオグアニン、トポテカン、TRAIL、トラスツズマブ、トレチノイン、トリコスタチンA、バルプロ酸、バルルビシン、バンデタニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビンである。
【０１６２】
さらに、本開示のRTA 408、多形体、薬学的組成物を利用する、心血管疾患の処置用の併用療法が企図される。例えば、そのような方法は、本開示のRTA 408、多形体および薬学的組成物に加えて薬学的有効量の1つまたは複数の心血管薬を投与する段階をさらに含みうる。心血管薬は例えばコレステロール低下薬、抗高脂血症薬、カルシウムチャネル遮断薬、降圧薬またはHMG-CoA還元酵素阻害剤でありうるがそれに限定されない。いくつかの態様では、心血管薬の非限定的な例としてアムロジピン、アスピリン、エゼチミブ、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピンまたはニトレンジピンが挙げられる。他の態様では、心血管薬の他の非限定的な例としてアテノロール、ブシンドロール、カルベジロール、クロニジン、ドキサゾシン、インドラミン、ラベタロール、メチルドーパ、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、フェノキシベンザミン、フェントラミン、ピンドロール、プラゾシン、プロプラノロール、テラゾシン、チモロールまたはトラゾリンが挙げられる。他の態様では、心血管薬はアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンまたはシンバスタチンなどのスタチンでありうる。
【実施例】
【０１６３】
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれる。当業者は、以下の実施例において開示される技術が、本発明の実行において十分に機能することを本発明者が発見した技術を代表するものであり、したがってその実行の好ましい様式を構成すると考えられうることを認識すべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の真意および範囲を逸脱することなく、開示されている具体的な態様に多くの変更を行い、なお類似または同様の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０１６４】
A. RTA 408(63415)の合成
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試薬および条件: (a) (PhO)2PON3(DPPA)、Et3N、トルエン、0℃で5分間、次に室温で終夜、約94%; (b) ベンゼン、80℃で2時間; (c) HCl、CH3CN、室温で1時間; (d) CH3CF2CO2H、DCC、DMAP、CH2Cl2、室温で終夜、RTA 401から73%(4工程)。
【０１６５】
化合物1: トルエン(400mL)、RTA 401(参照により本明細書に組み入れられるHonda, et al., 1998; Honda et al., 2000b; Honda et al., 2002; Yates et al., 2007; ならびに米国特許第6,326,507号および第6,974,801号が例えば教示する方法に従って調製可能)(20.0g、40.6mmol)およびEt3N(17.0mL、122.0mmol)の溶液を反応器に加え、攪拌下で0℃に冷却した。ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)(13.2mL、61.0mmol)を攪拌下0℃で5分かけて加え、混合物を連続的に室温で終夜攪拌した(HPLC-MSチェックはRTA 401の残留を示さず)。反応混合物をシリカゲルカラム上に直接添加し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2中0%〜5% EtOAc)で精製して化合物1(19.7g、約94%、部分的に化合物2に変換)を白色泡状物として得た。
【０１６６】
化合物2: 化合物1(19.7g、約38.1mmol)およびベンゼン(250mL)を反応器に加え、攪拌下80℃に2時間加熱した(HPLC-MSチェックは化合物1の残留を示さず)。反応混合物を減圧濃縮して粗化合物2を固体残渣として得て、これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
【０１６７】
化合物3: 粗化合物2(38.1mmol以下)およびCH3CN(200mL)を反応器に加え、攪拌下で0℃に冷却した。HCl(12N、90mL)を0℃で1分かけて加え、混合物を連続的に室温で1時間攪拌した(HPLC-MSチェックは化合物2の残留を示さず)。反応混合物を0℃に冷却し、10% NaOH(約500mL)を攪拌下で加えた。次に飽和NaHCO3(1L)を攪拌下で加えた。水相をEtOAc(2x500mL)で抽出した。一緒にした有機相をH2O(200mL)、飽和NaCl(200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して粗化合物3(16.62g)を明黄色泡状物として得て、これをさらに精製せずに次の工程に使用した。
【０１６８】
RTA 408: 粗アミン3(16.62g、35.9mmol)、CH3CF2CO2H(4.7388g、43.1mmol)およびCH2Cl2(360mL)を室温での攪拌下で反応器に加えた。次にジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(11.129g、53.9mmol)および4-(ジメチルアミノ)-ピリジン(DMAP)(1.65g、13.64mmol)を加え、混合物を連続的に室温で終夜攪拌した(HPLC-MSチェックは化合物3の残留を示さず)。反応混合物を濾過して固体副生成物を除去し、濾液をシリカゲルカラム上に直接添加し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中0%〜20% EtOAc)で2回精製して化合物RTA 408(16.347g、RTA 401から4工程で73%)を白色泡状物として得た。
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【０１６９】
B. 薬力学
RTA 408の薬力学的一次効果を評価するためのインビトロおよびインビボ試験の概要を以下に示す。
【０１７０】
1. インビトロでのKeap1-Nrf2およびNF-κBに対するRTA 408の効果
AIMによるIFNγ誘導NO産生の阻害はNrf2依存的である(Dinkova-Kostova, 2005)。RAW264.7マウスマクロファージを、96ウェルプレート中に、0.5% FBSを補充したRPMI 1640中30,000細胞/ウェルの三つ組でプレーティングし、37℃および5% CO2でインキュベートした。翌日、細胞をDMSO(媒体)またはRTA 408で2時間前処理した後、マウスIFNγ 20ng/mLで24時間処理した。亜硝酸イオン(NO2-)がNOの安定的な一次分解産物であることから、培地中の亜硝酸イオンレベルを一酸化窒素の代替として、グリース試薬系(カタログ番号G2930、Promega)を製造者の説明書に従って使用して測定した。細胞生存率を、WST-1細胞増殖試薬(カタログ番号11644807001、Roche Applied Science)を製造者の説明書に従って使用して評価した。IC50値を、細胞生存率に対して正規化されたIFNγ誘導一酸化窒素産生の抑制に基づいて決定した。RTA 408での処置によってIFNγ誘導NO産生が用量依存的に抑制され、平均IC50値は3.8±1.2nMとなった。代表的実験の結果を図1に示す。RTA 408のIC50値は化合物63170(8±3nM)、63171(6.9±0.6nM)、63179(11±2nm)および63189(7±2nM)のIC50値よりも45%〜65%低いことがわかった。63170、63171、63179および63189は下記式の化合物である。
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【０１７１】
2. Nrf2標的遺伝子に対するRTA 408の効果
RTA 408を2つの異なるルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験してAREの活性化を評価した。試験した第1のルシフェラーゼレポーターは、ヒトNQO1遺伝子のプロモーターに由来する単一のAREの制御下とした。これにより、培養哺乳動物細胞中のNrf2転写因子に内在する活性の定量的評価が可能になる。NQO1-AREルシフェラーゼレポータープラスミドからのホタルルシフェラーゼの発現は、ヒトNADPH:キノンオキシドレダクターゼ1(NQO1)遺伝子のプロモーター領域内で同定された抗酸化応答エレメント(ARE)に対応する特異的エンハンサー配列にNrf2を結合させることで制御される(Xie et al., 1995)。NQO1-AREルシフェラーゼレポータープラスミドは、HindIII/XhoIクローニング部位を使用するpLuc-MCSベクター(ニュージャージー州ピスカタウェイ、GenScript Corp.)にヒトNQO1-ARE(
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)を挿入することで構築された。10% FBSならびにペニシリンおよびストレプトマイシン(各)100U/mLを補充したDMEM(Invitrogen)中に維持したHuH-7ヒト肝臓がん細胞系に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して、NQO1-AREルシフェラーゼレポータープラスミド、およびウミシイタケルシフェラーゼを恒常的に発現させかつ遺伝子導入レベルの正規化のための内部標準として使用されるpRL-TKプラスミドを一過性に遺伝子導入した。遺伝子導入の30時間後に細胞をRTA 408で18時間処理した。ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性をDual-Gloルシフェラーゼアッセイ(カタログ番号E2920、Promega)によってアッセイし、発光シグナルをL-Max IIルミノメーター(Molecular Devices)上で測定した。ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケ活性に対して正規化し、正規化されたホタル活性の媒体対照(DMSO)に対する誘導倍率を計算した。図2aは、この細胞系中のRTA 408によるルシフェラーゼ活性の用量依存的誘導を示す。値は3つの独立した実験の平均値を表す。HuH-7細胞中でNQO1 AREからの転写を2倍増加させるために必要なRTA 408(12nM)は63189(14.9nM)よりも20パーセント少なかった。同様に、HuH-7細胞中でNQO1 AREからの転写を2倍増加させるために必要なRTA 408は63170(25.2nM)および63179(29.1nM)よりもそれぞれ2.1〜2.4倍少なかった。
【０１７２】
また、ルシフェラーゼレポーター活性化に対するRTA 408の効果をAREc32レポーター細胞系中で評価した。この細胞系は、ヒト乳がんMCF-7細胞に由来しており、ラットGSTA2 ARE配列の8コピーの転写制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子が安定的に遺伝子導入される(参照により本明細書に組み入れられるWang, et al., 2006)。RTA 408で18時間の処理後、ホタルルシフェラーゼ活性を、ONE-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、カタログ番号E6110)を製造者の説明書に従って使用して測定した。AREc32レポーター細胞系中で用量依存的応答が観察された(図2b)。NQO1-AREおよびGSTA2-AREのいずれのレポーターアッセイシステムにおいても、15.6nM RTA 408での処理後にルシフェラーゼ活性の約2倍誘導が明らかであった。GSTA2-ARE(AREc32)ルシフェラーゼ活性試験の結果に着目するとき、GSTA2-ARE誘導に対する63415(RTA 408)の効果をWST1生存率試験と併せてRTA 402、63170、63171、63179および63189の効果と直接比較することができる(図3a〜f)。RTA 402の値と比較する場合、63415は5つの比較化合物のうち最速のGSTA2-ARE媒介性転写の誘導を示し、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて4倍誘導に到達するために濃度93nMが必要であった。すべての他の化合物は遥かに高い濃度でのみ同様の誘導を示し、ルシフェラーゼ活性の4倍誘導を実現するために63170は濃度171nMを必要とし、63171は濃度133nMを必要とし、63179は濃度303nMを必要とし、63189は濃度174nMを必要とした。これらの値は、同量の活性を導くために必要な活性化合物の量の、RTA 402に対する1.86倍(63415)、3.40倍(63170)、2.65倍(63171)、6.05倍(63179)および3.47倍(63189)の増加に対応する。
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【０１７３】
また、RTA 408は、HFL1ヒト胎児肺線維芽細胞系およびBEAS-2Bヒト気管支上皮細胞系において公知のNrf2標的遺伝子の転写レベルを増加させることがわかった。10%ウシ胎仔血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したF-12K培地中でHFL1細胞を培養した。10%ウシ胎仔血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM/F-12培地中でBEAS-2B細胞を培養した。細胞を6ウェルディッシュ中にて密度2.5x105細胞/ウェルでプレーティングした。翌日、細胞をDMSO(媒体)またはRTA 408(7.8、15.6、31.3、62.5もしくは125nM)で18時間処理した。各ウェルは同量の媒体を受け取った。処理後、培地を除去し、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)を使用して収集した。溶解液をQIAShredderカラム(Qiagen、カタログ番号79654)を使用して均質化し、RNAをRNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を使用して単離した。逆転写用に、RNA(1μg)をOligo(dT)12-18プライマーおよびH2Oと組み合わせて最終量を23.25μLとした。混合物を70℃に10分間加熱した後、氷上に置いた。5Xファーストストランド緩衝液8μL、1mg/mL BSA 2μL、20mM DTT 2μL、5mM dNTPミックス4μL、RNaseOUT(商標)0.25μLおよびSuperscript(登録商標)II逆転写酵素0.5μLを含有するマスターミックスをRNA混合物に加え、42℃で1時間インキュベートした。反応液を70℃に10分間加熱することで不活性化した。反応混合物をH2Oで1:3希釈した後、qPCRにおいて使用した。希釈逆転写反応液2.5μLを1組のPCRプライマー(最終濃度0.36μM)、2X iQ(商標)SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad、カタログ番号170-8885)およびH2Oと組み合わせて最終量を20μLとした。PCRプライマーの配列は以下の通りである: グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット(GCLM)順方向プライマー
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、逆方向プライマー
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; ヘムオキシゲナーゼ-1(HMOX1)順方向プライマー
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、逆方向プライマー
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; NAD(P)Hホスホグルコン酸脱水素酵素キノン1(NQO1)順方向プライマー
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、逆方向プライマー
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; リボソームタンパク質S9(RPS9)順方向プライマー
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、逆方向プライマー
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; チオレドキシン還元酵素1(TXNRD1)順方向プライマー
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、逆方向プライマー
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。すべてのプライマーの特異性および増幅効率は既に確認した。cDNAを以下のサイクル条件を使用して増幅した: (95℃で3分間、44サイクルの95℃で30秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間、続いて増分0.5℃の55℃〜95℃の融解曲線)。各Nrf2標的遺伝子の相対的存在量を比較CT法(ΔΔCT)を使用して決定した。PCR反応を各試料について三つ組のウェル中で実行した。2つの独立した実験を上記の条件を使用して行った。定量的PCRによって測定したように、HFL1肺線維芽細胞をRTA 408で18時間処理することで、NQO1、HMOX1、GCLMおよびTXNRD1を含むいくつかのNrf2標的遺伝子の発現が増加した(図4a〜d)。試験したすべての遺伝子について、RTA 408による誘導は用量依存的であり、15.6nMという低濃度で明らかであった。BEAS-2B気管支上皮細胞をRTA 408で18時間処理することで、評価したすべてのNrf2標的遺伝子が同様に用量依存的に増加した(図5a〜d)。また、RTA 408は同様の濃度で正常ヒトメサンギウム細胞(nHMC)、マウスBV2小グリア細胞系およびヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞系中のNrf2標的遺伝子の発現を増加させた。
【０１７４】
Nrf2標的NQO1およびHMOX1のタンパク質レベルをSH-5Y5YおよびBV-2細胞中でウエスタンブロット法によって測定した後、RTA 408で処理した。SH-SY5Y細胞を6ウェルプレート中にて密度4x105細胞/ウェルでプレーティングした。BV-2細胞を6ウェルプレート中にて密度2.5x104細胞/ウェルでプレーティングした。プレーティングの24時間後(BV-2)または48時間後(SH-SY5Y)、細胞をRTA 408で24時間処理した。処理後、細胞を冷PBSで2回洗浄し、溶解緩衝液中で収集した。細胞を超音波処理し、細胞片を遠心分離(18,000rcfで10分、Beckman Coulter、microfuge 18遠心分離機)によって除去した。上清中の総タンパク質を、BSAを基準とし、Bio-Radタンパク質試薬を使用して定量化した。等量の総細胞タンパク質をSDS-PAGE上で分離し、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。5%ミルクを含有するTBST(1xTBSおよび0.1% Tween-20)中で膜を1時間ブロッキングし、TBSTで3回洗浄し、一次抗体と共に4℃で終夜インキュベートした。NQO1抗体はAbcamから(#AB2346)、HMOX1(HO-1)抗体はSanta Cruzから(#sc-10789)、アクチン抗体はMilliporeから得た(#MAB 1501)。TBSTでの洗浄後、二次抗体をTBST + 5%ミルク中に室温で1時間加えた。AffiniPureヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG二次抗体はJackson ImmunoResearchから得た(それぞれカタログ番号111-035-144および115-035-146)。膜をTBST中で洗浄し、ECLを使用して現像し、X線フィルムに露光した。また、RTA 408での処理はSH-SY5Y細胞中のNQO1タンパク質レベルを用量依存的に増加させた(図6a)。HMOX1タンパク質は未処理またはRTA 408処理SH-SY5Y細胞中で検出されなかった。BV2細胞中では、RTA 408での処理は最大125nMの濃度でNQO1およびHMOX1タンパク質レベルを増加させた(図6b)。RTA 408によるSK-N-SH細胞中のNrf2タンパク質発現誘導のEC50値(56.4nM)は63171のEC50値(122nM)、63189のEC50値(102nM)および63179のEC50値(126nM)よりも45%〜65%低かった。同量の63170(54.6nM)が必要であった。
【０１７５】
EC50を細胞内ウエスタンNQO1アッセイを使用して測定し、このアッセイでは細胞を評価対象の化合物と共に3日間インキュベートした。関心対象の化合物とのインキュベーション後、細胞をマウスNQO1抗体と反応させ、翌日に細胞をIRDye-800CW抗マウスIgG抗体と反応させた。標的シグナルを可視化した後、分析した。
【０１７６】
RAW264.7マウスマクロファージ細胞の24時間の処理は、Nrf2標的遺伝子および対応するタンパク質産物の誘導と整合するように、NQO1酵素活性を用量依存的に増加させ、増加は7.8nMにおいて明らかであった(図7)。NQO1酵素活性を修正Prochaskaアッセイ(参照により本明細書に組み入れられるProchaska and Santamaria, Anal Biochem. 169:328-336, 1988)によって測定した。
【０１７７】
まとめると、複数の細胞系からのこれらのデータは、RTA 408での処理が、抗酸化応答配列によって制御される転写活性を増加させ、Nrf2標的遺伝子の発現を増加させ、Nrf2標的遺伝子産物であるNQO1の活性を増加させることを実証している。
【０１７８】
3. 細胞の酸化還元能力のマーカーに対するRTA 408の効果
グルタチオンおよびNADPHは、細胞の酸化還元能力の維持に必要な決定的因子である。グルタチオンの合成に関与するいくつかの遺伝子(例えばGCLCおよびGLCM)ならびにNADPHの合成に関与するいくつかの遺伝子[例えばヘキソース-6-リン酸脱水素酵素(H6PD)およびリンゴ酸酵素1(ME1)]は、Nrf2によって調節されることが実証された(Wu, 2011)。総グルタチオンレベルに対するRTA 408処理の効果を、マウスAML-12肝細胞系中で、GSH-Glo(商標)グルタチオンアッセイキット(Promega、カタログ番号V6912)を製造者の説明書に従って使用して評価した。AML-12細胞をRTA 408で24時間処理することで総細胞グルタチオンレベルは用量依存的に増加した(図8)。図示されるデータは2つの独立した実験を表す。総グルタチオンの2倍超の増加が15.6nMという低いRTA 408濃度で観察された。RAW264.7マウスモデルを使用する、RTA 408によるグルタチオンレベル誘導のEC50値(9.9nM)は、63170のEC50値(12.1nM)、63171のEC50値(23.2nM)および63189(16nM)のEC50値よりも22%〜57%低かった。
【０１７９】
酸化還元感受性色素WST-1(Roche Applied Science、カタログ番号11644807001)の吸光度によって測定される、NADPHレベルに対するRTA 408処理の効果を、HCT-116細胞中で評価した。WST-1吸光度は、生細胞によるNAD(P)Hの解糖的産生を測定することで細胞生存率を評価するために一般的に使用される。したがって、細胞生存率に対する任意の効果の非存在下でNADPH産生が増加する状況では、WST-1吸光度も増加する(参照により本明細書に組み入れられるBerridge et al., 1996)。また、NADPH産生に関与するいくつかの主要遺伝子はNrf2によって調節されることがわかった(いずれも参照により本明細書に組み入れられるThimmulappa et al., 2002; Wu, et al., 2011)。24時間のRTA 408処理はWST-1吸光度を用量依存的に増加させた(図9)。これはNADPHレベルが増加したことを示唆している。
【０１８０】
また、NADPH合成経路に関与する遺伝子の発現に対するRTA 408の効果をこの試験において評価した。HCT-116細胞をRTA 408で24時間処理し、H6PD、ホスホグルコン酸脱水素酵素(PGD)、トランスケトラーゼ(TKT)およびME1のmRNAレベルを定量的PCRを使用して測定した。HCT-116細胞を6ウェルディッシュ中にて密度3x105細胞/ウェルでプレーティングした。翌日、細胞をDMSO(媒体)、10nM RTA 408または50nM RTA 408で24時間処理した。各ウェルは同量の媒体を受け取った。処理後、培地を除去し、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)を使用して収集した。溶解液をQIAShredderカラム(Qiagen、カタログ番号79654)を使用して均質化し、RNAをRNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を使用して単離した。逆転写用に、RNA(1μg)をOligo(dT)12-18プライマーおよびH2Oと組み合わせて最終量を23.25μLとした。混合物を70℃に10分間加熱した後、氷上に置いた。5Xファーストストランド緩衝液8μL、1mg/mL BSA 2μL、20mM DTT 2μL、5mM dNTPミックス4μL、RNaseOUT(商標)0.25μLおよびSuperscript(登録商標)II逆転写酵素0.5μLを含有するマスターミックスをRNA混合物に加え、42℃で1時間インキュベートした。反応液を70℃に10分間加熱することで不活性化した。反応混合物をH2Oで1:3希釈した後、qPCRにおいて使用した。希釈逆転写反応液2.5μLを1組のPCRプライマー(最終濃度0.36μM)、2X iQ(商標)SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad、カタログ番号170-8885)およびH2Oと組み合わせて最終量を20μLとした。PCRプライマーの配列は以下の通りである: リボソームタンパク質S9(RPS9)順方向プライマー
2019011349.tif 000029
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000030
; ヘキソース-6-リン酸脱水素酵素(H6PD)順方向プライマー
2019011349.tif 000031
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000032
、ホスホグルコン酸脱水素酵素(PGD)順方向プライマー
2019011349.tif 000033
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000034
、トランスケトラーゼ(TKT)順方向プライマー
2019011349.tif 000035
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000036
; リンゴ酸酵素1(ME1)順方向プライマー
2019011349.tif 000037
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000038
。すべてのプライマーの特異性および増幅効率は事前に確認した。cDNAを以下のサイクル条件を使用して増幅した: (95℃で3分間、44サイクルの95℃で30秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間、続いて増分0.5℃の55℃〜95℃の融解曲線)。各標的遺伝子の相対的存在量を比較CT法(ΔΔCT)を使用して決定した。PCR反応を各試料について三つ組のウェル中で実行した。2つの独立した実験を上記の条件を使用して行った。RTA 408での処理によって、NADPH合成に関与する遺伝子の発現が用量依存的に増加した(図10a〜d)。
【０１８１】
要約すると、RTA 408での処理は、AML-12肝細胞中の総グルタチオンレベルを増加させ、HCT-116細胞中のNADPH産生のマーカーであるWST-1吸光度を増加させた。この観察は、NADPH合成に関与する酵素をコードするいくつかの主要遺伝子の発現の増加と相関した。
【０１８２】
4. TNFα誘導NF-κBシグナル伝達に対するRTA 408の効果
NF-κBは、多くの免疫応答および炎症応答の調節において中心的役割を果たす転写因子である。RTA 402および他のAIMは種々の細胞系中の炎症性NF-κBシグナル伝達を阻害することがわかった(Shishodia, 2006; Ahmad, 2006; Yore, 2006)。マウスNIH3T3/NF-κB-luc細胞系(Panomics)を使用して、NF-κB-Lucレポーターに対するRTA 408ならびに化合物63171、63179、63170および63189の効果を調査した。NIH3T3/NF-κB-luc細胞系は、NF-κB応答配列の8コピーによって調節されるホタルルシフェラーゼレポーターの染色体組み込みを維持する。これらの化合物の効果はNF-κB IC50の値を測定することで定量化することができる。RTA 408はIC50 1.2μMを示し、これを生存率に関して正規化した際にIC50 1.4μMを示した。他の4つの化合物はそれぞれNIH3T3/NF-κB IC50値1.7、0.2、1.1および1.1μMを示し、これを生存率に関して正規化した際にIC50値1.8、0.6、1.1および1.0μMを示した。RTA 408およびそのNF-κBに対する効果を投与の関数としてプロットし、相対変化倍率ならびにWST1およびWST1/2を図11aおよびbに示す。複数のNF-κB転写応答配列の制御下でルシフェラーゼレポーター構築物を安定的に遺伝子導入したヒト子宮頸部腺がん細胞系であるHeLa/NF-κB-Luc細胞中で、TNFα誘導NF-κBシグナル伝達に対するRTA 408の効果を評価した。HeLa/NF-κB-Luc細胞をRTA 408で1時間前処理した後、TNF-α(10ng/mL)でさらに5時間処理した。処理後、発光を測定し、TNF-α誘導ルシフェラーゼ活性に対するRTA 408前処理の効果を決定した。3つの独立した実験からの平均結果および標準偏差を図12に示す。RTA 408はTNF-α誘導NF-κB活性化を用量依存的に阻害し、IC50値は517±83nMであった。同様の結果が別のNF-κBレポーター細胞系(A549/NF-κB-Luc)中で観察され、この細胞系では、RTA 408はTNF-α誘導NF-κB活性化を阻害し、IC50値は627nM(614〜649nMの範囲)であった。RTA 408は、HeLa/NF-κB-Luc細胞中のNF-κBプロモーターレポーターからの発現を減少させる上で63189(854nM)および63170(953nM)よりもそれぞれ1.6〜1.8倍効率的であった。ヒトA549細胞系によるさらなる実験は、1.7μM、および生存率について1.7μMに正規化された値としての、RTA 408のIC50を示した。RTA 408のIC50は、それぞれIC50値1.1、1.4、2.0および1.0を示す63189、63179、63171および63170と同様の活性を示した。これらの値を生存率に関して正規化した際に、アッセイはそれぞれIC50 1.2、1.5、2.1および1.1μMを示した。RTA 408濃度の関数としてのNF-κBの変化倍率をWST1およびWST1/2曲線と共にプロットした。図13aおよびbに示す。
【０１８３】
また、NF-κB経路の活性化における主要段階であるIκBαのTNF-α誘導リン酸化に対するRTA 408の効果をHeLa細胞中で評価した。HeLa細胞をRTA 408で6時間前処理した後、TNF-α(20ng/mL)で5分間処理した。IκBαの総レベルおよびリン酸化レベルをウエスタンブロット法によって評価した。一次IκBα抗体はSanta-Cruzから(sc-371)、pIκBα抗体はCell Signalingから(9246)、アクチン抗体はMilliporeから得た(MAB 1501)。ペルオキシダーゼ結合affini-pureヤギ抗ウサギ(IgG)およびペルオキシダーゼ結合affini-pureヤギ抗マウスIgG二次抗体はJackson ImmunoResearchから購入した。タンパク質ブロットをECLを使用して現像し、X線フィルムに露光した。RTA 408は、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果と整合するように、IκBαのTNF-α誘導リン酸化を用量依存的に阻害した(図14)。
【０１８４】
また、RTA 408は、他の炎症性シグナル伝達経路、例えばIL-6誘導シグナル伝達性転写因子3(STAT3)リン酸化およびNF-κB活性化受容体リガンド(RANKL)誘導破骨細胞形成を阻害することが実証された。HeLa細胞中では、1μM RTA 408で6時間の前処理によって、IL-6が誘導するSTAT3のリン酸化が阻害された。STAT3(124H6)およびphospho-STAT3(Tyr705)モノクローナル抗体はCell Signaling Technologyから得た。ペルオキシダーゼ結合Affini-pureヤギ抗ウサギIgGおよびペルオキシダーゼ結合Affini-pureヤギ抗マウスIgGはJackson ImmunoResearchから得た。破骨細胞形成は、造血起源の細胞上でRANKLがその受容体RANKに結合することによる多段階分化プロセスである。これによってNF-κBおよびMAPKが活性化され、したがって、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ(TRAP)を含む破骨細胞特異的標的遺伝子の転写が増加する。RANKL誘導破骨細胞形成に対するRTA 408の効果をマウスマクロファージ細胞系RAW264.7中で評価した。RAW 264.7細胞を24ウェルプレート中にて密度5,000細胞/ウェルでプレーティングした。翌日、細胞をRTA 408で2時間処理した後、50ng/mL組換えマウスRANKL(R&D systems)で処理した。処理細胞を4日間インキュベートして破骨細胞に分化させた。破骨細胞への分化を、TRAP活性を測定することで評価した。要するに、細胞培養上清90μLを各試験ウェルから除去し、96ウェルプレートの三つ組ウェル(30μL/ウェル)にアリコートした。次にTRAPアッセイ緩衝液(Kamiya Biomedical)170μLを各ウェルに加え、プレートを37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、540nmでの吸光度をSpectramax M2プレート読み取り分光光度計を使用して決定した。RTA 408はRANKL誘導TRAP活性および破骨細胞の形成を用量依存的に阻害し、IC50値は約5〜10nMであった。
【０１８５】
5. トランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子の発現に対するRTA 408の効果
RTA 408による28日間の毒性試験において、トランスアミナーゼの上昇がラット中、およびはるかに低い程度ではあるがサル中で観察された。ヒト中での関連AIM(バルドキソロンメチル)の経口投与後に同様の発見が観察された(Pergola, 2011)。この効果に関する1つの仮説は、AIMが細胞毒性の非存在下でトランスアミナーゼ遺伝子発現を直接的または間接的に増加させるというものである。RTA 408での処置がトランスアミナーゼmRNAレベルに影響するか否かを評価するために、マウスAML-12肝細胞をRTA 408で18時間処理し、トランスアミナーゼをコードする遺伝子のmRNAレベルを定量的PCRを使用して測定した。AML-12細胞を6ウェル培養皿中にてウェル当たり培地2mLを使用してウェル当たり3x105細胞でプレーティングした。翌日、細胞をDMSO(媒体)またはRTA 408 250nMおよび500nMによって37℃で18時間処理した。各ウェルは0.1% DMSOを受け取った。3つの独立した繰り返し実験を行った。処理後、培地を除去し、細胞をRLT緩衝液(Qiagen)を使用して収集した。溶解液をQIAShredderカラム(Qiagen、カタログ番号79654)を使用して均質化し、RNAをRNeasy Miniキット(Qiagen、カタログ番号74104)を使用して単離した。逆転写用に、RNA(1μg)をOligo(dT)12-18プライマーおよびH2Oと組み合わせて最終量を23.25μLとした。混合物を70℃に10分間加熱した後、氷上に置いた。5Xファーストストランド緩衝液8μL、1mg/mL BSA 2μL、20mM DTT 2μL、5mM dNTPミックス4μL、RNaseOUT(商標)0.25μLおよびSuperscript(登録商標)II逆転写酵素0.5μLを含有するマスターミックスをRNA混合物に加え、42℃で1時間インキュベートした。反応液を70℃に10分間加熱することで不活性化した。反応混合物をH2Oで1:3希釈した後、qPCRにおいて使用した。希釈逆転写反応液2.5μLを1組のPCRプライマー(最終濃度0.36μM)、2X iQ(商標)SYBR(登録商標)Green Supermix(Bio-Rad、カタログ番号170-8885)およびH2Oと組み合わせて最終量を20μLとした。PCRプライマーの配列は以下の通りである: リボソームタンパク質L19(Rpl19)順方向プライマー
2019011349.tif 000039
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000040
; NAD(P)H脱水素酵素キノン1(Nqo1)順方向プライマー
2019011349.tif 000041
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000042
; グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ1(Gpt1またはAlt1)順方向プライマー
2019011349.tif 000043
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000044
; グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ2(Gpt2またはAlt2)順方向プライマー
2019011349.tif 000045
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000046
; グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ1(Got1またはAst1)順方向プライマー
2019011349.tif 000047
、逆方向プライマー
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; グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ2(Got2またはAst2)順方向プライマー
2019011349.tif 000049
、逆方向プライマー
2019011349.tif 000050
。すべてのプライマーの特異性および増幅効率は既に確認した。cDNAを以下のサイクル条件を使用して増幅した: (95℃で3分間、44サイクルの95℃で30秒間、60℃で15秒間、72℃で15秒間、続いて増分0.5℃の55℃〜95℃の融解曲線)。各標的遺伝子の相対的存在量を比較CT法(ΔΔCT)を使用して決定した。PCR反応を各試料について三つ組のウェル中で実行した。RTA 408での処理はアラニントランスアミナーゼ1(Alt1またはGpt1)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ1(Ast1またはGot1)のmRNAレベルを増加させた(図15a、c)。RTA 408はアラニントランスアミナーゼ2(Alt2またはGpt2)のmRNAレベルに効果を示さず、アスパラギン酸トランスアミナーゼ2(Ast2またはGot2)のmRNAレベルを減少させた(図15b、d)。これらの結果は、RTA 408が試験濃度(250nMまたは500nM)でインビトロでのトランスアミナーゼ遺伝子発現に影響することを実証した。
【０１８６】
6. 解糖中間体レベルに対するRTA 408の効果
糖尿病マウスにおける試験は、バルドキソロンメチルが筋肉特異的インスリン刺激性グルコース取り込みを増加させることを実証した(Saha, 2010)。ヒトにおいて、バルドキソロンメチルを受けた患者が筋痙攣を経験する割合が、プラセボを受けた患者に比べて高いことが報告された(Pergola, 2011)。また、糖尿病患者においてインスリン投与後に筋痙攣が報告された。これは筋痙攣と筋グルコース代謝との関連の可能性を示唆している。解糖代謝に対するRTA 408の効果を、培養げっ歯類C2C12筋細胞中の乳酸およびピルビン酸レベルの評価を通じて評価した。乳酸レベルを測定するために、分化C2C12筋管をRTA 408またはインスリン1μMまたは2μMによって37℃で3時間処理した。緩衝液を除去し、細胞外乳酸レベルの測定用に保存した。細胞片を遠心分離(14,000rpmで10分)によってペレット化した後、乳酸を測定した。細胞内乳酸を測定するために、細胞をPBS中0.1% Triton X-100に懸濁し、25ゲージ針での剪断によって溶解させた。細胞溶解液を遠心分離し(14,000rpm、4℃で10分)、乳酸を上清中で測定した。細胞内および細胞外乳酸を乳酸アッセイキット(BioVision、カタログ番号K607-100)を使用して測定した。分化C2C12筋管のRTA 408 1μMまたは2μMで3時間の処理は、インスリンでの処理と同様に、細胞内および細胞外乳酸レベルを用量依存的に有意に増加させた。
【０１８７】
ピルビン酸レベルを測定するために、分化C2C12筋管をRTA 408 250nMもしくは500nMまたはインスリン100nMで18時間処理した。薬物処理後、培地を除去し、細胞をPBSで洗浄した。細胞ピルビン酸アッセイ緩衝液(ピルビン酸アッセイキット、BioVision、カタログ番号K609-100)に溶解させた。細胞溶解液を遠心分離し(14,000rpm、4℃で10分)、ピルビン酸レベルを上清中で測定した。C2C12分化筋管のRTA 408 250nMまたは500nMで18時間の処理は、やはり細胞内ピルビン酸レベルを用量依存的に有意に(P＜0.0001、アスタリスクで記述する)増加させた(図16)。まとめると、これらの結果は、RTA 408が試験濃度で筋肉の解糖中間体にインビトロで影響しうることを実証しているが、試験RTA 408濃度でのこのインビトロ系からの結果が、ヒトにおける臨床的に関連性のある用量レベルでのグルコース代謝に対する潜在的効果にどのようにして関連するかは不明である。
【０１８８】
7. MRP-1によるRTA 408流出のインビトロ評価
薬物候補の1つの特徴は、化合物の流出比である。流出比は、化合物はどれほど容易に膜を通じて輸送されるかの尺度となる。MRP-1タンパク質、または多剤耐性補助タンパク質1は、細胞膜を通じた有機アニオンおよび他の小分子の輸送を促進することに役立つタンパク質のファミリーの一員である。通常、流出比がより大きいことは、薬物候補が細胞外により容易に輸送され、細胞内プロセスを調節する上での利用可能性がより低くなることを意味する。また、同様のタンパク質は血液脳関門を通じた化合物の輸送を調節する。RTA 408のMRP-1における流出比(1.3)は実験によって63170(10)および63171(11.2)よりも約10倍低く、63179(56.5)および63189(57.1)よりも40倍超低いと決定された。理論によって拘束されるものではないが、RTA 408は、MRP-1の良好な基質、および/または血液脳関門におけるp-糖タンパク質媒介流出に資する候補ではない可能性がある。いくつかの態様では、RTA 408を中枢神経系(CNS)障害を処置するために使用することができる。
【０１８９】
C.肺疾患の動物モデルにおけるRTA 408の保護効果
RTA 408を肺疾患のいくつかの動物モデルにおいて、肺中でのその潜在的有効性を評価するために試験した。すべての試験において、RTA 408をゴマ油中で毎日3〜150mg/kgの範囲の用量レベルで経口投与した。大部分の場合、RTA 408を最初の数日間投与した後、肺損傷応答を誘導した。
【０１９０】
1. マウスにおけるLPS誘発肺炎症
RTA 408をマウスにおけるLPS誘発肺炎症の2つの試験において試験した。予備的用量範囲発見試験であるように意図される第1の試験において、RTA 408(30、100または150mg/kg)を1日1回3日間経口投与した後、最終投与の1時間後にLPSを投与した。気管支肺胞洗浄液(BALF)をLPS投与の20時間後(RTA 408の最終投与の21時間後)に採取し、Luminex(商標)技術を使用して炎症性マーカー(すなわちIL-6、IL-12p40、TNF-αおよびRANTES)のレベルについて評価した。RTA 408処理によってすべての用量でIL-12p40が、用量100および150mg/kgでTNF-αが有意に減少した(図17)。第2の試験において、RTA 408(10、30または100mg/kg)を毎日6日間投与した後、最終投与の1時間後にLPSを投与した。この試験において、用量レベル100mg/kgで3日目から体重の有意な減少が観察された。TNF-αの有意な減少が用量10mg/kgで観察され、IL-12p40、TNF-αおよびRANTESの有意な減少が用量30mg/kgで観察された(図18a)。この試験におけるマウスの肺のさらなる評価は、10および30mg/kgでのNQO1酵素活性の有意な減少(2,6-ジクロロフェノール-インドフェノールの減少率の測定による)および総GSH(GSH-Glo(商標)、ウィスコンシン州マジソン、Promega)の増加を含む、関連性のあるNrf2標的遺伝子との有意な結合を明らかにした(図18b)。
【０１９１】
2. ブレオマイシン誘導肺線維症
また、RTA 408の効果をマウスおよびラットにおけるブレオマイシン誘導肺線維症モデルにおいて評価した。第1の予備試験において、RTA 408(10、30または100mg/kg)を経口胃管栄養法によってマウスに毎日39日間投与し、10日目にブレオマイシン負荷(鼻腔内)を行った。最終投与日に肺組織を採取し、組織診断を行って炎症および間質性線維症の程度を評価した。このモデルでは、試験したRTA 408用量で統計上有意な効果は観察されなかった(図19aおよびb)。Lovelace Respiratory Research Instituteにおいて詳細に特徴づけられたラット肺線維症モデルを使用してさらなる評価を行った。この試験では、0日目にラットにブレオマイシンまたは生理食塩水を気管内投与によって負荷した。負荷後、動物はRTA 408(3、10または30mg/kg)を経口胃管栄養法によって毎日28日間受けた。動物における過度の脱水および下痢が理由で、用量30mg/kgの投与を14日目に停止した。残りの動物について、気管支肺胞洗浄液を28日目にフローサイトメトリーによる炎症性浸潤物の評価用に採取し、肺組織をヒドロキシプロリンレベルについてLC-MSおよび病理組織診断によって分析した。ブレオマイシン硫酸塩の負荷によって好中球の実質的な放出およびBALF中の可溶性コラーゲンの増加、ならびに肺中のヒドロキシプロリンの増加が誘発された。RTA 408 3mg/kgおよび10mg/kgでの処理は、肺中への多形核(PMN)細胞浸潤を有意に抑制し、ヒドロキシプロリン沈着を有意に減少させた(約10%〜20%)(図20aおよびb)。
【０１９２】
重要なことに、病理組織学的評価は、RTA 408で処置したラットにおける、三重染色によって評価されるコラーゲン沈着の有意な減少を明らかにした。ブレオマイシン対照動物が主に中程度の染色を示した一方で、RTA 408 10mg/kgで処置した動物は最小〜軽度の染色を示した(表2)。
【０１９３】
（表２）三重染色の強度によって評価されるラット肺中のコラーゲン沈着に対するRTA 408の効果
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a値は、ブレオマイシン誘発肺変性の区域内に間質三重染色を示す動物中の染色強度を表す。
【０１９４】
また、この試験におけるラットの肺のさらなる評価は、Quantigene Plex 2.0 Multiplexアッセイ(カリフォルニア州サンタクララ、Affymetrix)によってアッセイされる、関連性のあるNrf2標的遺伝子との有意な結合を明らかにした(図21)。RTA 408は、ブレオマイシンに曝露されたラットの肺中のNQO1、Txnrd、GsrおよびGstの酵素活性を有意にかつ用量依存的に増加させた。これは、この疾患設定におけるRTA 408によるNrf2活性化を実証している。NQO1の酵素活性を、DCPIPの減少速度を測定することで評価した。Txnrd、GstおよびGstの酵素活性を、Cayman Chemical(ミシガン州アナーバー)の市販のキットを使用して測定した。
【０１９５】
3. マウスにおけるタバコ煙誘発COPD
また、RTA 408をタバコ煙誘発COPDのマウスモデルにおいて試験した。マウスはRTA 408(3、10または30mg/kg)を経口胃管栄養法によって毎日2週間受け、RTA 408投与期間中、毎週5日間タバコ煙に曝露された。試験の終わりに肺組織およびBALFを炎症性浸出物およびサイトカインの分析用に採取した。この実験では、Luminex(商標)技術を使用して測定したように、3mg/kgのRTA 408という低用量のRTA 408の複数用量投与によって、KC(ヒトIL-8の機能的マウス相同体)およびTNF-αを含む炎症性誘発性サイトカインが有意に抑制された。この試験の結果の概要を図22a〜eに示す。AIM類似体(63355)を同一試験において比較用に試験した。63355は下記式の化合物である。
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【０１９６】
また、この試験におけるマウスの肺のさらなる評価は、関連性のあるNrf2標的遺伝子との有意な結合を明らかにした(図23)。DCPIPの減少速度として測定される肺中のNQO1酵素活性はタバコ煙曝露によって有意に減少したが、RTA 408の投与がこの損失を補った。また、Txnrd酵素活性が用量30mg/kgのRTA 408によって誘導された。一般に、処置によってGsr酵素活性は改変されず、Gst酵素活性は減少し、いずれもこれらの酵素の経時的応答の結果のようであった。Txnrd、GstおよびGstの酵素活性を、Cayman Chemical(ミシガン州アナーバー)の市販のキットを使用して測定した。
【０１９７】
4. マウスにおける卵白アルブミン誘発喘息
また、RTA 408の潜在的活性を卵白アルブミン誘発喘息のマウスモデルにおけるパイロット試験において評価した。マウスを0日目および14日目に卵白アルブミンおよび水酸化アルミニウムの腹腔内注射によって感作し、14日目、25日目、26日目および27日目に生理食塩水中卵白アルブミンを鼻腔内負荷した。マウスは1〜13日目および15〜27日目にRTA 408(3、10または30mg/kg)を経口胃管栄養法によって毎日受けた。感作および卵白アルブミン負荷後、媒体処置マウスの白血球の総数は正の対照(デキサメタゾン)処置マウスに比べて有意に増加した。媒体処置マウスにおいてT細胞およびB細胞の数の増加も観察された。30mg/kgのRTA 408での処置は気道内のB細胞の数および割合を有意に減少させた。RTA 408(3mg/kgおよび30mg/kg)は、気道中で検出されたマクロファージの数も有意に減少させたが、マクロファージの平均割合は有意に減少させなかった。これらの観察はこのモデルにおける潜在的有効性を示唆している。
【０１９８】
5. マウスにおけるLPS誘発敗血症に対するRTA 408の効果
敗血症を0日目にLPS(21mg/kg)の腹腔内注射によって誘発し、生存率を4日目まで追跡した。RTA 408(10、30または100mg/kg)を-2日目〜2日目に経口胃管栄養法によって毎日投与した。媒体対照群では、動物の60%が4日目まで生存した(このモデルにおいて予測された生存率約40%よりも高い)。RTA 408処置群では、10mg/kg用量群の動物の80%および30mg/kg用量群の動物の90%が4日目まで生存した(図24cおよびd)。100mg/kg用量群では、動物の90%が4日目まで生存し、わずか1件の死が4日目に生じた。RTA 408が誘導したこれらの効果はこのモデルにおける著明な有効性を示しているが、媒体対照群における相対的に高い生存率が理由で対照群とRTA 408処置群との間の統計上有意な差はなくなった。化合物RTA 405を使用して得られた結果も提示する(図24aおよびb)。RTA 405は下記式の化合物である。
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【０１９９】
6. 放射線誘発口腔粘膜炎に対するRTA 408の効果
ハムスターの頬嚢に向けられる急性放射線に対する曝露は、ヒトにおける潰瘍性口腔粘膜炎において観察される影響と同様の影響を生成する。これらの影響としては、重度の紅斑および血管拡張、粘膜びらん、ならびに潰瘍形成を特徴とする、中程度〜重度の粘膜炎が挙げられる。このモデルにおけるRTA 408の効果を評価するために1回の試験を行った。0日目に各ハムスターに、左頬嚢に向けられる急性放射線量40Gyを与えた。RTA 408(10、30または100mg/kg)を-5日目〜-1日目および1日目〜15日目に1日2回経口投与した。6日目から隔日で28日目まで、口腔粘膜炎を標準的6ポイントスコアリングスケールを使用して評価した。30mg/kgおよび100mg/kgのいずれの用量のRTA 408も潰瘍性粘膜炎の持続時間の有意な減少を引き起こした(図25)。さらに、粘膜炎スコア3以上の動物の割合の用量依存的減少も観察された。しかし、30または100mg/kgでのRTA 408の投与は、放射線照射されたハムスターの体重増加の有意な用量依存的減少を引き起こした。20%を超える体重減少が理由で、100mg/kg用量群の8匹のハムスターのうち2匹を2日目に安楽死させた。
【０２００】
7. インビボでのNrf2バイオマーカーの誘導に対するRTA 408の効果
上記のように、RTA 408の主要な分子標的は、抗酸化細胞保護の中心的な転写調節因子であるNrf2である。Nrf2の活性化は、NQO1、GSH合成に関与する酵素[すなわちグルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニットおよび調節サブユニット(GclcおよびGclm)]、解毒に関与する酵素(すなわちグルタチオンS-トランスフェラーゼ[Gst])、ならびに流出トランスポーター[すなわち多剤耐性関連タンパク質(Mrp)]を含む、一連の細胞保護遺伝子の上方制御を誘導する。これらの遺伝子の誘導によって、抗酸化能力の増加、グルタチオン合成の誘導、ならびに細胞からの潜在的に有害な分子の結合および排出を特徴とする、酸化傷害に対して保護を行うための協調的な細胞の働きが生じる。上記の様々な動物モデルにおいて評価した有効性エンドポイントおよびNrf2標的遺伝子発現に加えて、Nrf2標的遺伝子の発現を誘導するRTA 408の能力も、RTA 408で処置した健康なマウス、ラットおよびサルから採取した組織を使用して評価した。
【０２０１】
マウス、ラットおよびサルにおけるRTA 408の非GLP 14日毒性試験の一部として、選択されたNrf2標的遺伝子のmRNAおよび酵素活性レベルを測定する目的で組織を採取した。マウスおよびラットでは、肝臓試料を14日目の最終投与の4時間後に採取した。サルでは、血液(PBMC単離用)、肝臓、肺および脳の組織を14日目の最終投与の24時間後に採取した。上記のNQO1、Gstおよびグルタチオン還元酵素(Gsr)の酵素活性を組織ホモジネート中で測定した。mRNA標的の直接定量化のためにxMAP(登録商標)Luminex(登録商標)磁気ビーズを使用するハイブリダイゼーションに基づくアッセイを包含するQuantigene Plex 2.0技術を製造者のプロトコールに従って使用してmRNAレベルを決定した。さらに、血漿および組織中のRTA 408濃度をTQD質量分析計(マサチューセッツ州ミルフォード、Waters)上でLC/MS/MS法によって測定した。
【０２０２】
一般に、RTA 408は様々なNrf2標的遺伝子の発現を用量10、30および100mg/kgで用量依存的に増加させた(図26、図27a、図28aおよびb)。また、げっ歯類の肝臓ならびにサルの肝臓および肺中のNQO1、GstおよびGsr酵素活性の用量依存的増加が明らかにしたように、RTA 408によるNrf2標的遺伝子の転写上方制御によって抗酸化応答の機能的増加が生じた(図29aおよびb、図30aおよびb、図31aおよびb)。さらに、げっ歯類において、RTA 408の肝臓曝露は、Nrf2のプロトタイプ標的遺伝子であるNQO1の酵素活性レベルに相関していた(図32b、図33b)。サルにおいて、NQO1およびスルフィレドキシン(sulfiredoxin)1(SRXN1)のPBMC中のmRNA発現のレベルはいずれもRTA 408に対する血漿曝露に相関していた(図37aおよびb)。全体として、RTA 408はmRNAレベルおよびNrf2標的の活性を増加させ、そのような増加は一般に組織曝露および血漿曝露に相関していた。このことは、Nrf2標的がNrf2活性化のありうるバイオマーカーとして役立つことができ(図34aおよびb)、健康なヒト対照におけるRTA 408の薬理活性を評価するために有用でありうることを示唆している。
【０２０３】
D. 安全性薬理学
GLPに準拠する安全性薬理学プログラムをRTA 408を使用して完了した。これは心血管系に関するインビトロおよびインビボ(サル)試験、ならびにラットにおける呼吸器系および中枢神経系に関する試験を含んだ。
【０２０４】
1. HEK293細胞中で発現されたクローン化hERGチャネルに対するRTA 408の効果の評価
この試験は、ヒト胎児腎臓(HEK293)細胞系中で安定的に発現されるhERG(human ether-a-go-go-related gene)チャネルによって導通される急速活性型内向き整流性カリウム電流(IKr)に対するRTA 408の効果を評価するために行った。hERG関連カリウム電流に対するRTA 408の効果を、ホールセルパッチクランプ電気生理学法を使用して評価した。hERG QPatch_Kv11.1アッセイにおいて、RTA 408はIC50値12.4μMを有すると決定された。この値は63170の値(4.9μM)および63189の値(3.8μM)よりもそれぞれ2.5〜3倍高かった。RTA 408のIC50値は63171の値(15.7μM)と同様であった。
【０２０５】
2. カニクイザルにおけるRTA 408の心血管評価
意識があって自由に移動するカニクイザルにおけるRTA 408の潜在的心血管効果を評価するために1回の試験を行った。同じ4匹の雄および4匹の雌のカニクイザルにラテン方格法に従って媒体(ゴマ油)およびRTA 408を用量レベル10、30および100mg/kgで投与した。各動物がすべての処置を受けるまで、各週に1匹の動物/性別/処置が投与を受けた後、投与間に14日の休薬期間を設けた。媒体およびRTA 408をすべての動物に経口胃管栄養法によって用量5mL/kgで投与した。
【０２０６】
体温、血圧、心拍数の測定および心電図(ECG)の評価用に遠隔測定送信器を動物に装着した。体温、収縮期、拡張期および平均の動脈圧、心拍数、ならびにECGパラメータ(QRS持続時間ならびにRR、PRおよびQT間隔)を投与の少なくとも2時間前から投与の少なくとも24時間後まで連続的にモニタリングした。ECG追跡図を心血管モニタリングデータから指定の時点で印刷し、理事会の認定を受けた循環器専門獣医が定性的に評価した。試験での1回目の投与前に、未処置動物を心血管エンドポイントについて少なくとも24時間連続的にモニタリングし、これらのデータを試験を通じた補正QT間隔の計算に使用した。
【０２０７】
罹患率、死亡率、傷害、ならびに食物および水の利用可能性に関する観察をすべての動物において1日少なくとも2回行った。臨床観察を投与前、投与の約4時間後、および心血管モニタリング期間の終了後に行った。体重を各処置投与の前日に測定および記録した。
【０２０８】
用量レベル10、30および100mg/kgでのRTA 408は死亡、有害な臨床徴候を生じさせず、体重、体温、血圧、または定性的もしくは定量的(PR、RR、QRS、QT間隔)ECGパラメータを生じさせなかった(図35; 表45)。100mg/kg用量群において、補正QT間隔の小さい(平均1.6%)が統計上有意な増加が観察されたが、個々の動物データは、試験物に関連する効果を示すQTcの一貫した増加を示さなかった。結果的に、個々の動物において変化の規模が小さく、一貫した応答が欠けていたことから、QTcのこれらのわずかな増加はRTA 408処置に関連するとは考えられなかった。したがって、RTA 408の経口投与は、最大100mg/kgの用量でカニクイザルの心血管機能に対する効果を生じさせなかった。
【０２０９】
3. ラットにおけるRTA 408の神経行動学的評価
ラットにおいてRTA 408の潜在的な急性神経行動学的毒性を評価した。10匹の雄および10匹の雌CD(登録商標)[Crl:CD(登録商標)(SD)]ラットの3つの処置群はRTA 408を用量レベル3、10または30mg/kgで受けた。10匹の動物/性別の1つのさらなる群が対照として使用され、媒体(ゴマ油)を受けた。媒体またはRTA 408をすべての群に経口胃管栄養法によって用量10mL/kgで1日目に1回投与した。
【０２１０】
罹患率、死亡率、傷害、ならびに食物および水の利用可能性に関する観察をすべての動物において1日2回行った。1日目の投与前および機能観察バッテリー(FOB)による各評価後に臨床徴候の観察を行った。FOB評価は投与前(-1日目)ならびに投与後約4時間および24時間の時点で行った。体重を1日目の投与前に測定および記録した。
【０２１１】
用量3、10および30mg/kgでのRTA 408は死亡、有害な臨床観察、または試験した任意の神経行動学的尺度に対する効果を生じさせなかった。30mg/kg群において投与の約24時間後に、潜在的に試験物に関連しうる、体重増加のわずかな減少が観察された。この試験において評価した基本的な神経行動学的エンドポイントに関して、RTA 408は最大30mg/kgの用量でラットにおいていかなる有害効果も生じさせなかった。
【０２１２】
4. ラットにおけるRTA 408の肺評価
ラットにおいて肺機能に対するRTA 408の効果を評価した。8匹の雄および8匹の雌CD(登録商標)[Crl:CD(登録商標)(SD)]ラットの3つの処置群はRTA 408を用量レベル3、10または30mg/kgで受けた。8匹の動物/性別の1つのさらなる群が対照として使用され、媒体(ゴマ油)を受けた。媒体またはRTA 408をすべての群に経口胃管栄養法によって用量10mL/kgで1日目に1回投与した。
【０２１３】
死亡率、罹患率、傷害、ならびに食物および水の利用可能性に関する観察をすべての動物において1日2回行った。臨床観察を投与前、投与の約4時間後、および8時間の肺モニタリング期間の終了後に行った。体重をRTA 408投与日に測定および記録した。肺機能(呼吸数、一回換気量および毎分換気量)を、ベースラインを確立するために投与前の少なくとも1時間、および投与後の少なくとも8時間モニタリングした。
【０２１４】
用量3、10および30mg/kgでのRTA 408は死亡、有害な臨床観察、または評価した任意の肺パラメータに対する効果を生じさせなかった。したがって、この試験において評価した基本的な肺エンドポイントに関して、RTA 408は最大30mg/kgの用量でラットにおいていかなる有害効果も生じさせなかった。
【０２１５】
E. 非臨床的概観
1. 薬物動態
RTA 408を、そのPKおよび代謝特性を評価するためにインビトロとインビボの両方で調査した。インビトロ試験は、RTA 408の血漿タンパク質結合および血液/血漿分配、チトクロムP450(CYP450)の阻害および誘導を決定し、かつマウス、ラット、サルおよびヒトの肝ミクロソームが形成する代謝産物を同定するために行った。RTA 408の反復投与後のインビボでの吸収および分布に関するデータは、毒性試験から血漿および選択された組織中の薬物レベルのモニタリングを通じて主に得た。血漿、血液および組織中のRTA 408濃度を適切な正確さおよび精度で測定するために、高感度および高選択性の液体クロマトグラフィー-質量分析に基づく生体分析法(LC/MS/MS)を使用した。測定はTQDおよびQToF質量分析計(Waters)上で行った。
【０２１６】
a. 吸収
RTA 408の吸収および全身薬物動態挙動をマウス、ラットおよびサルにおいて単回および反復(毎日)経口投与後に試験した。用量10〜100mg/kgでの懸濁液製剤の経口投与後、最大濃度がマウスにおいて1〜2時間以内、ラットおよびサルにおいて1〜24時間以内に観察された。RTA 408に対する曝露はラットにおいて最高である傾向にあり、マウスおよびサルにおいてはより低いレベルが観察された。経口投与後に観察されたRTA 408の見かけの終末半減期の推定値は一般に6〜26時間の範囲であったが、いくつかの場合、見かけの長期吸収相が理由で決定的な半減期推定値が計算できなかった。
【０２１７】
RTA 408に対する全身曝露は雄と雌とで一般に同様であった。毎日反復の経口投与後のRTA 408に対する曝露は単回投与後に観察された曝露よりもわずかに高い(2倍以下)傾向にあった。一般に、懸濁液製剤での用量範囲3〜100mg/kgのRTA 408の投与は、全身曝露の用量依存的増加を生じさせた。しかし、より高い用量(サルにおいて100〜800mg/kg; ラットにおいて500〜2000mg/kg)の投与は曝露の同様な増加を生じさせなかった。これは用量100mg/kg超での吸収の飽和を示唆している。RTA 408(3mg/kg)の最適化されていない(ゆるく充填された)カプセル製剤をサルに経口投与した後、用量正規化された全身曝露は懸濁液製剤で観察されたそれに比べていくらか低い傾向があった。
【０２１８】
RTA 408の吸収および全身薬物動態挙動をラットにおいて単回および反復局所投与を使用して試験した。0.01%〜3%の範囲のRTA 408の投与は、同様の経口投与に比べて低い血漿中濃度を示した。一般に、RTA 408に対する全身曝露は用量依存的に増加した。局所投与製剤はゴマ油中懸濁液剤として製剤化した。
【０２１９】
ウサギを使用してRTA 408の眼吸収および全身薬物動態挙動を評価した。RTA 408を眼に1日1回5日間局所投与した。眼投与は、RTA 408を経口投与する場合に比べて低い血漿中RTA 408濃度を示した(図36)。連続5日後の血漿中のRTA 408の量でさえも、初回投与後の濃度に比べて小さな変化しか示さず、初回投与後とRTA 408を経口投与した場合とを比較すると、後者は血漿中濃度が約100倍高かった(図36)。
【０２２０】
b. 分布
RTA 408の血漿タンパク質結合率をマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ミニブタ、サルおよびヒトの血漿中にてRTA 408濃度10〜2000ng/mLで超遠心分離法を使用して評価した。RTA 408は血漿タンパク質に広範に結合した。非臨床種における血漿タンパク質結合率は93%(マウス)〜99%超(ミニブタ)の範囲であり、結合率は毒性試験種(ラットおよびサル)において95%、ヒトにおいて97%であった。試験したどの種においても濃度依存的タンパク質結合の証拠は存在しなかった。血液/血漿分配率実験の結果は、RTA 408が主に血液の血漿画分中に直線的に分布する傾向にあって、試験したすべての種およびすべての濃度について血液:血漿比が1.0未満であったことを示す。
【０２２１】
組織中のRTA 408の分布をマウス、ラットおよびサルへの経口投与後に検査した。14日非GLP毒性試験において、選択された組織(肝臓、肺および脳)を、試験の最終用量を投与した後に単一の時点(ラットおよびマウスでは4時間; サルでは24時間)で採取し、RTA 408含有量についてLC/MS/MSを使用して分析した。RTA 408は肺、肝臓および脳中に容易に分布する。肺中では、マウスおよびラットにおける4時間でのRTA 408濃度は、血漿中濃度と同様であるかまたはそれよりもわずかに高く(2倍未満)、一方、サルにおける24時間の時点では、肺中RTA 408濃度は血漿中濃度よりも6〜16倍高かった。同様のパターンが脳で観察された。対照的に、肝臓中RTA 408濃度は4時間の時点のマウスおよびラットの血漿中濃度よりも5〜17倍高く、24時間の時点のサルの血漿中濃度よりも2〜5倍高かった。
【０２２２】
組織中のRTA 408の薬力学的効果をマウス、ラットおよびサルにおいて、薬物曝露用に採取した14日薬物試験と同一の組織中でのNrf2標的遺伝子の誘導をモニタリングすることで評価した。検査した組織中でのNQO1、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(Gst)およびグルタチオン還元酵素(Gsr)の酵素活性の用量依存的増加が明らかにしたように、RTA 408によるNrf2標的遺伝子の誘導は抗酸化応答の増加を生じさせた。酵素活性は上記のように測定した。さらに、げっ歯類において、肝臓中RTA 408含有量は、Nrf2のプロトタイプ標的遺伝子であるNQO1の酵素活性レベルに相関していた。サルにおいて、NQO1およびスルフィレドキシン1(SRXN1)の末梢血単核球(PBMC)中のmRNA発現のレベルはいずれもRTA 408の血漿曝露に相関していた(図37aおよびb)。全体として、RTA 408はげっ歯類およびサルにおいてNrf2のバイオマーカーを誘導し、そのような誘導は一般にRTA 408に対する組織および血漿の曝露に十分に相関していた。
【０２２３】
RTA 408を眼局所投与によってウサギに投与した際に、該化合物の最高濃度が角膜、網膜または虹彩中で観察された一方、硝子体、房水および血漿は有意に低いRTA 408濃度を示した(図38)。
【０２２４】
c. 代謝
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)再生系およびウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)反応混合物の存在下でRTA 408をマウス、ラット、サルおよびヒトの肝ミクロソームと共に60分間インビトロでインキュベートした後、RTA 408の代謝を調査した。RTA 408の大規模な代謝回転が霊長類のミクロソームで観察され、サルおよびヒトの両方のミクロソーム中で60分のインキュベーションの終了時に残留した親分子は10%未満であった。対照的に、代謝の程度はげっ歯類のミクロソームにおいてより低く、インキュベーションの終了時に残留した親分子は65%超であった。RTA 408の様々な潜在的代謝産物に利用可能な信頼できる基準が存在しないことから、観察された代謝産物を定量的に評価できなかった。定性的観点からはRTA 408代謝産物の同様のパターンが種を超えて観察され、このパターンは、RTA 408の還元およびヒドロキシル化、ならびにRTA 408またはその還元/ヒドロキシル化代謝産物のグルクロン酸抱合に一致する質量のピークを含んだ。ヒトに独自の代謝産物は観察されず、ヒトミクロソームインキュベーションにおけるすべてのピークは1つまたは複数の前臨床種においても観察された。特に、インビトロミクロソームデータに基づけば、選択されたげっ歯類および非げっ歯類の毒性種であるラットまたはサルにおいてすべてのヒト代謝産物が存在した。
【０２２５】
d. 薬物動態学的薬物相互作用
チトクロムP450(CYP450)媒介代謝を阻害するRTA 408の能力を、プールされたヒト肝ミクロソーム、および特異的CYP450酵素の標準的基質を使用して評価した。RTA 408はCYP2C8およびCYP3A4/5を直接阻害し、Ki値は各酵素について約0.5μMであった。試験した他の酵素(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19またはCYP2D6)では有意な阻害は観察されず、試験した最高濃度(3μM)での阻害率は50%未満であった。さらに、試験した任意の酵素の代謝依存的阻害の証拠はほとんどまたは全くなかった。CYP3A4/5媒介薬物-薬物相互作用の可能性を調査する将来の試験が、これらのデータ、および経口投与後に胃腸(GI)管中で限局的に実現されうる潜在的に高い濃度に基づいて必要になることがある。
【０２２６】
CYP450酵素発現を誘導するRTA 408の能力を培養ヒト肝細胞を使用して評価した。プロトタイプ誘導剤がCYP活性の予想される増加を引き起こす条件下で、RTA 408(最大3μM)は培養ヒト肝細胞中のCYP1A2、CYP2B6またはCYP3A4酵素活性の誘導剤ではなかった。酵素活性は、単離ミクロソーム中のCYP1A2、CYP2B6およびCYP3A4についてフェナセチン、ブプロピオンおよびテストステロンの基質変換をそれぞれモニタリングすることで測定した。
【０２２７】
F. 急性放射線皮膚炎に対するRTA 408の効果
急性放射線皮膚炎の局所または経口予防薬としてのRTA 408の効果を検査した。雄BALB/cマウスを使用して、線量30Gyの放射線を0日目に投与した(表3)。ゴマ油媒体またはRTA 408を-5日目〜-1日目および1日目〜30日目にラットに投与した。RTA 408をゴマ油中3、10および30mg/kgで経口投与し、かつゴマ油中0.01%、0.1%および1%の組成パーセントで局所投与した。皮膚炎を4日目〜30日目に隔日で盲検評価した。12日目に皮膚炎の典型的ピークが観察され、用量の投与4時間後に4匹のマウスを屠殺した。残りのマウスは30日目の投与4時間後に屠殺した。12日目および30日目に、放射線照射された皮膚試料と共に血漿をmRNA検査および組織学的検査用に採取した。
【０２２８】
（表３）急性放射線皮膚炎モデルの試験設計
2019011349.tif 000054
【０２２９】
マウスをRTA 408で処置した試験群では、RTA 408を経口または局所投与薬で投与した際に、皮膚炎の発生率は重症度においてわずかに減少したようであった(図39〜42)。さらに、試験群の平均皮膚炎臨床スコアを時間関数としてプロットする曲線は、経口形態または局所形態のRTA 408の投与による、特にRTA 408を経口投与を通じて投与した場合の、未処置試験群からの何らかの変化(図43〜45)を示す。さらに、以下の表4および表5でわかるように、経口投与薬を通じてRTA 408で処置されたマウスにおいて、臨床スコアが3を超える皮膚炎に罹患したマウスの割合は有意に低く、一方、RTA 408の局所投与薬を投与された試験群において、臨床スコアが2を超える皮膚炎に罹患したマウスの割合はわずかに低かった。
【０２３０】
（表４）臨床皮膚炎検査においてスコアが2を超えかつRTA 408を含有する局所処置薬を投与された試験群当たりのマウスの割合
2019011349.tif 000055
【０２３１】
（表５）臨床皮膚炎検査においてスコアが3を超えかつRTA 408を含有する経口処置薬を投与された試験群当たりのマウスの割合
2019011349.tif 000056
【０２３２】
G. 分割曝露放射線皮膚炎に対するRTA 408の効果
局所投与を通じてRTA 408を利用して、分割曝露放射線皮膚炎の影響を寛解させることに向けてのRTA 408の効果を測定した。Balb/cマウスを使用して、局所製剤でのRTA 408をマウスに-5日目〜30日目に毎日、0.01%〜1%の範囲の3つの用量で投与した。0〜2日目および5〜7日目に1日当たり6回の線量10Gyをマウスに放射線照射した。マウスの臨床皮膚炎スコアを4日目から試験の終わりまで2日ごとに盲検で評価した。図46では、グラフは、時間関数としてプロットされた各群の平均臨床スコアを示す。このグラフは、RTA 408の0.1%〜1%局所製剤で処置したマウスのスコアの統計上有意な改善を示す。試験および処置パラメータは表6に見ることができる。
【０２３３】
（表６）分割曝露放射線皮膚炎の試験条件
2019011349.tif 000057
【０２３４】
図46に示された平均臨床スコアを分析することで曲線下面積(AUC)分析を行い、これにより、皮膚炎がどれほど長く持続したかに関する皮膚炎の重症度が得られた。このAUC分析によって、異なる群のマウスと異なる組成割合のRTA 408の効果との直接比較が可能になった(図47および表7)。局所RTA 408製剤の投与は、グレード2およびグレード3病変を、マウスを媒体にのみ曝露した際の60%および33%から、濃度1%のRTA 408によってそれぞれ21%および6%に減少させた。他のRTA組成物は何らかの活性は示したが、1%製剤が示した活性ほど有意ではなかった。
【０２３５】
（表７）各処置群の皮膚炎スコアの割合
2019011349.tif 000058
【０２３６】
H. 腫瘍増殖に対するRTA 408およびがん治療薬の相乗効果
伝統的化学療法薬との組み合わせで使用されるRTA 408の効果の試験を行うことで、潜在的処置の有効性を決定した。2つの異なる前立腺がん細胞系であるLNCaPおよびDU-145に対するRTA 408の効果を決定するためにインビトロ試験を行った。図48aでわかるように、5-フルオロウラシルによるインビトロでの前立腺がん細胞系(LNCaP)の処置は、0.125〜0.5μMの範囲の用量でのRTA 408と組み合わせた際に細胞毒性の統計上有意な増加を示す。図48bに示すように、前立腺細胞系DU-145およびドセタキセルを使用した場合、RTA 408は化学療法薬の細胞毒性を、0.125〜0.75μMのRTA 408の投与について統計上有意に増幅した。この証拠は、RTA 408ががん治療薬と相乗的に作用しうるものであって、いくつかの態様ではがん患者を処置する上での有効性を増大させるために使用可能であるという概念を裏付ける。
【０２３７】
インビトロアッセイの成功裏の結果の後、ホタルルシフェラーゼを発現させるように操作されたLNCaP/C4-2BおよびDU145ヒト前立腺がん(本明細書ではそれぞれC4-2B-LucおよびDU145-Lucと呼ぶ)を使用してパイロットインビボアッセイを行った。特に、これらの細胞系はいずれもアンドロゲン非依存的に増殖する。10% FBSを補充したRPMI 1640中で細胞を培養した。細胞をTrypLE Express(Invitrogen)を使用して収集し、PBS中で洗浄し、カウントした。細胞を、30μL当たり細胞3x106個(別途記載がない限り)の最終濃度に到達するようにPBS中で再構成し、別々の管中にアリコートした。増殖因子減少型Matrigel(BD Bioscience)を+4℃で終夜解凍し、30μLアリコートで管に移した。細胞/Matrigel溶液をビバリウムに移し、注射直前に1:1比で混合した。各マウス(合計3匹の動物の群当たりn=1)は腫瘍細胞の単回皮下注射を受けた。腫瘍を4週間予め樹立した。次に1匹の動物をRTA 408(17.5mg/kg、腹腔内)で1日1回3日間(-3日目〜-1日目)処置した。翌日(0日目)、RTA 408で処置された動物およびもう1匹の動物を、腫瘍が埋め込まれた骨盤領域に限局化された単一線量18Gyの放射線で処置した。RTA 408で前処理したマウスは3回のさらなる用量のRTA 408(17.5mg/kg、腹腔内)を翌週にわたって隔日に1回受けた。第3の動物は処置を受けず、正の対照として使用された。腫瘍進行をライブイメージングによって毎週モニタリングした。ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を検出するために、マウスにD-ルシフェリンを腹腔内注射し、5分後に製造者(Caliper LifeScience)のプロトコールに従って撮像した。撮像前にマウスをイソフルラン吸入によって麻酔し、IVIS Lumina XRシステム(Caliper LifeScience)上で撮像した。標準化を目的として、対照腫瘍を撮像するために必要な最小露光時間を決定し、すべての動物をこれらの条件下で撮像した。7日目に、IR処置動物において対照と比較しての腫瘍サイズの見かけの減少は視認できず、一方、RTA 408とIRとの両方を受けた動物はより小さな腫瘍画像を示した。14日目および21日目に、対照動物は腫瘍の発生および増殖の継続を示し、一方、電離放射線で処置された動物は何らかの改善を特に21日目に示した。他方、RTA 408および電離放射線で処置された動物は7日目〜14日目に進行を示さず、21日目には見える腫瘍を有さなかった。1週間当たりの腫瘍の進行は図49に見ることができる。インビトロデータおよびインビボデータはいずれも、RTA 408が異なるがん治療薬の活性を補完することで該薬剤の有効性を増加させるようであることを示す。
【０２３８】
I. 眼炎症モデルに対するRTA 408の効果
眼炎症に対するRTA 408の効果の試験をニュージーランドアルビノ系のウサギを使用して行った。ウサギをウサギ各12匹の5つの群に分け、3つの異なる濃度のRTA 408(0.01%、0.1%および1%)、Voltarene(c) collyre 0.1%、および媒体(ゴマ油)を投与した。各ウサギに穿刺誘導前の60分以内に3回の点滴を、穿刺誘導後の30分以内に2回の点滴を投与した。各点眼は50μLとし、両眼に投与した。時点当たりの動物6匹の房水を穿刺誘導の30分後に採取し、2時間後に再度採取した。炎症の量を房水中タンパク質濃度によって決定した。図50に示すように、RTA 408による房水タンパク質の減少は、製剤中わずか0.01%のRTA 408で、最高濃度の他の参照化合物(MaxiDexまたはマプラコラット)のいずれかによる房水タンパク質の減少と同様であった。すべての濃度のRTA 408が、房水タンパク質濃度を減少させる上で誤差の範囲内の相対的に同様の効果を示すようであったことから、RTA 408の濃度を増加させることの効果は無視できるようであった。
【０２３９】
J. 多形体スクリーニング
プレフォーミュレーションおよび多形性試験を化合物63415について行った。この試験の一部として、室温で最も安定な無水形、およびありうる水和物を相当に高い可能性で同定することを目的に予備多形性プログラムを行った。相平衡化、乾燥実験および他の技術を含む合計30回の結晶化実験を行った。得られたすべての固体をFT-ラマン分光法によって特性決定した。すべての新たな形態をPXRDおよびTG-FTIR、ならびに場合によってはDSCおよびDVSによって特性決定した。
【０２４０】
さらに、非晶形を調製し、特性決定した。異なる技術およびアプローチを使用するいくつかの実験を行って非晶形を調製した。非晶形をFT-ラマン分光法、PXRD、TG-FTIR、DSC、DVSおよびカールフィッシャー滴定によって特性決定した。非晶形の安定性を高湿高温条件で4週間にわたって試験した。
【０２４１】
1. 出発材料および命名法
2つのバッチの63415を出発材料として使用した(表8)。本開示において63415はPP415とも呼ばれる。このプロジェクト中に受け取ったかまたは発生させたすべての試料はPP415-Pxという形式の独自の識別コードを受け取った。Pxは試料/実験の数を意味する(x=1、2、...n)。
【０２４２】
（表８）出発材料
2019011349.tif 000059
【０２４３】
2. 化合物63415バッチ番号0414-66-1(PP415-P1): 非晶形
出発材料63415バッチ番号0414-66-1をFT-ラマン分光法、PXRD、TG-FTIR、カールフィッシャー滴定、1H-NMR、DSC、DVSおよび適切な溶解度測定によって特性決定した。結果を表9に要約する。
【０２４４】
（表９）63415出発材料(PP415-P1)の特性決定
2019011349.tif 000060
【０２４５】
FT-ラマンスペクトル(図58)を出発材料の基準スペクトルとして使用する。PXRD(図59)は鋭いピークパターンを示さない。約10〜20°2θでのブロードなハロが非晶質材料に特徴的である。
【０２４６】
TG-FTIRサーモグラム(図60)は、25〜200℃でEtOH約0.9重量%(すなわち約0.1当量)および微量のH2Oの漸進的損失を示す。分解はT＞290℃で開始する。
【０２４７】
カールフィッシャー滴定によって含水量0.5重量%が決定された。
【０２４８】
1H-NMRスペクトル(図61)は、構造と一致し、EtOH約0.08当量をTG-FTIRサーモグラムと一致して示す。
【０２４９】
DSCサーモグラム(図62)は、1回目の加熱走査においてTg = 152.7℃(ΔCp = 0.72J/g℃)で非晶質材料のガラス転移を示す。急冷後の2回目の走査においてガラス転移はTg = 149.7℃(ΔCp = 0.45J/g℃)で生じた。
【０２５０】
DVS等温線(図63)は、相対湿度50%から相対湿度0%に相対湿度を低下させた際に1.0重量%の漸進的質量損失が生じ、相対湿度0%で平衡に達したことを示す。相対湿度を相対湿度95%に上昇させた際に2.1重量%の漸進的質量増加(相対湿度0%での質量に対して)が生じ、相対湿度95%で平衡に達した。相対湿度を相対湿度95%から相対湿度50%に低下させた際に、最終質量は出発質量よりも0.2重量%低かった。相対湿度85%での0.4重量%の質量増加(出発質量に対する)によって、試料はわずかに吸湿性であると分類される。
【０２５１】
DVS測定後の試料のFT-ラマンスペクトル(図64)およびPXRDパターン(図65)は、測定前の試料のスペクトルおよびパターンに比べて変化していない。
【０２５２】
PP415-P1出発材料の溶解度概算値を12種の溶媒および4種の溶媒混合物中にて室温で、手動希釈と目視との組み合わせによって測定した(表10)。この方法に固有の実験誤差が理由で、溶解度の値は、大まかな推定値と見なされるように意図されており、結晶化実験の設計のためにのみ使用されるべきである。すべての溶媒混合物は体積比(v/v)として列挙する。
【０２５３】
（表１０）PP415-P1(非晶質)出発材料の溶解度概算値
2019011349.tif 000061
a 約1日後に析出を観察;
b 25℃で水分活性a(H2O)約0.7;
c 50℃で水分活性a(H2O)0.9超;
d 最初は溶解未完了(S＜1)、しかし固体残渣は一晩で完全に溶解(S＞1)。
【０２５４】
3. 化合物63415バッチ番号2083-69-DC(PP415-P40): クラス2
63415バッチ番号2083-69-DCはヘプタン溶媒和物である。この材料(PP415-P40)をPXRDによって特性決定したところ、クラス2と一致することがわかった(図66)。
【０２５５】
クラス2は、緊密に結合した溶媒との非化学量論的(0.5当量未満)な同形溶媒和物(ヘプタン、シクロヘキサン、イソプロピルエーテル、1-ブタノール、トリエチルアミン、ならびに場合によってはヘキサンおよび他のエーテルなどの他の溶媒の)と一致するようである。
【０２５６】
7.9°2θおよび13.8°2θでのPP415-P40のパターンにおいて見える小さなピークはクラス3、4または5のピークと一致しない。それらの起源はこの時点では明らかではない。
【０２５７】
4. 非晶形の化学安定性
非晶形の化学安定性を異なる溶媒中で7日間にわたって検査した。
【０２５８】
濃度1mg/mLの溶液/懸濁液を4つの有機溶媒(アセトン、MeOH、MeCN、EtOAc)および3つの水性界面活性剤媒体(1% SDS水溶液、1% Tween 80水溶液、1% CTAB水溶液)中で調製した。
【０２５９】
4つの別々の溶液/懸濁液を溶媒ごとに調製し、6時間、24時間、2日間および7日間平衡化し、続いてHPLCによって分析した。
【０２６０】
HPLCクロマトグラムから得られた相対面積%を表11に示す。化合物は希釈液(MeCN中0.1%ギ酸)中で多少不安定なようである。手順の間に(すなわち約24時間以内に)、基準試料(PP415-P1、手順の始めと終わりに実行)の面積%は254nmで99.9%から99.3%に減少し、242nmで99.9%から99.5%に減少した。この効果によって、手順(以下の順序に設定: 7日、2日、24時間、6時間)の終わり頃に測定された試料が影響を受ける可能性があり、得られた面積%が過小評価される可能性がある。
【０２６１】
（表１１）63415の非晶形(PP415-P1)による化学安定性実験a
2019011349.tif 000062
a 第3の波長(210nm)で信号強度は弱く、信号対雑音比は大きく、したがって積分は行われなかった
b 懸濁液。すべての時点ですべての材料が溶解したわけではない
c 懸濁液。24時間および6時間の時点ですべての固体が溶解したわけではない
【０２６２】
7日後のMeCN中溶液、および1%水性Tween 80媒体中懸濁液において、分解1%以上が観察された(全時点において254nmで、24時間後、2日後および7日後に242nmで)。
【０２６３】
5. 非晶形の保存安定性
63415の非晶形の基本的性質および物性についてさらに知るために、高い温度および相対湿度での保存によって非晶形に負荷をかけた。
【０２６４】
非晶形(PP415-P1出発材料)の試料を25℃/相対湿度約62%(飽和NH4NO3水溶液の上)および40℃/相対湿度約75%(飽和NaCl水溶液の上)で開放下保存し、60℃および80℃で密閉した(表12)。0週間、1週間、2週間および4週間の時点で試料をPXRDによって検査し、出発材料PP415-P1と比較した。
【０２６５】
（表１２）63415の非晶形(PP415-P1)による保存安定性実験
2019011349.tif 000063
【０２６６】
1週間後(1週間の時点、図67)、2週間後(2週間の時点、図68)および4週間後(4週間の時点、図69)、粉末X線ディフラクトグラムが0週間の時点の出発材料と比べて差を示さないことから、4つの試料はすべて依然として非晶質であった。
【０２６７】
6. 結晶化実験および乾燥実験
a. 結晶化実験
室温で最も安定な無水形、およびありうる水和物を相当に高い確率で同定するために、非晶形から出発して相平衡化、熱溶液からの結晶化、および蒸発実験を行った。得られたすべての材料をFT-ラマン分光法によって特性決定し、選択された試料はPXRDでも特性決定した。
【０２６８】
FT-ラマンスペクトルをピーク位置の類似性に従ってクラスに分類した。当初の試料(PP415-P1、表8参照)は結晶化生成物と共に分類した。しかし、1つのクラス内のスペクトルは厳密に同一であるわけではなく、類似している。小さな差およびピークシフトが存在する可能性がある。FT-ラマンスペクトルを単独で考慮する場合、1つのクラスのスペクトルが同一の多形体に属するか否かを決定することは難しい。
【０２６９】
PANalytical X'Pert(Highscore Plus)ソフトウェアを使用して、PXRDパターン中のピークを決定し、次に該パターンをクラスターに分類した。これらのクラスターによって、類似性の高いパターンが同定される。しかし、1つのクラスター内には小さいが有意な差が存在する。したがって、1つのクラスター内のパターンは、必ずしも同一の多形体と一致するわけではないが、非常に類似した分子構造を有する異なった形態を表す。すべての場合でFT-ラマンクラスはPXRDクラスターと一致する。
【０２７０】
b. 懸濁液平衡化実験
懸濁液平衡化実験を1種の溶媒および11種の溶媒混合物中で行った(表13)。選択された溶媒0.2〜2.0mL中のPP415-P1約100mgの懸濁液を調製し、22〜24℃で4〜15日間振盪した。固体を回収しかつFT-ラマン分光法によって特性決定し、大部分の固体はPXRDでも特性決定した。
【０２７１】
（表１３）非晶形(PP415-P1)から出発する懸濁液平衡化実験
2019011349.tif 000064
水分活性: a 50℃でa(H2O)約0.5; b 50℃でa(H2O)約0.85; c 64℃でa(H2O) 0.99超; d スペクトルは溶媒信号を含まず
【０２７２】
c. 熱溶液からの結晶化
PP415-P1の熱溶液を1種の溶媒および4種の溶媒混合物中で調製した(表14)。速度約0.2K/分で5℃に徐冷した際に、3つの場合(-P20、-P21、-P24)で析出が観察された。2つの場合(-P22、-P23)では、4〜5℃で2日間の保存後であっても固体は析出しなかった。ここで溶媒をN2流下室温で蒸発させた。固体を回収し、FT-ラマン分光法によって特性決定し、非晶質出発材料であるFT-ラマンクラス1とは異なるスペクトルを有する固体についてはPXRDでも特性決定した。
【０２７３】
（表１４）非晶形(PP415-P1)から出発する徐冷実験
2019011349.tif 000065
a 徐冷および5℃で2日間の攪拌後に析出なし; 溶媒をN2流下室温で蒸発
b スペクトルは溶媒信号を含む
【０２７４】
d. 蒸発/析出実験
PP415-P1の透明溶液を3種の溶媒混合物中で調製した(表15)。次に溶媒を周囲条件下室温でゆっくりと蒸発させた。しかし、3つの実験のうち2つ(-P15および-P17)において、蒸発が始まる前に白色固体が析出した。得られた固体をFT-ラマン分光法およびPXRDによって検査した。
【０２７５】
（表１５）非晶形(PP415-P1)による緩徐蒸発実験
2019011349.tif 000066
a スペクトルは溶媒信号を含む
【０２７６】
e. 乾燥実験
溶媒和物を脱溶媒和しかつ63415の非溶媒和結晶形を得るという目的で、各クラスの少なくとも1つの試料を減圧乾燥させた(表16)。乾燥材料をFT-ラマン、PXRDおよびTG-FTIRによってさらに特性決定した。
【０２７７】
（表１６）結晶化実験によって得た試料に対して行った乾燥実験
2019011349.tif 000067
a 脱溶媒和は成功、溶媒含有量の有意な減少、試料は主に非晶質; PXRDにおけるブロードなピークはごくわずか
b 試料はPXRDにおけるよりブロードなピークが示すように結晶性がより低い
c 脱溶媒和は成功、溶媒含有量の有意な減少、試料は依然として結晶性; 構造に変化なし
【０２７８】
7. 新規形態(クラス)の特性決定
a. 新規クラスの概要
この試験では、63415の非晶形に加えて4つの新規結晶形を得た(表17)。
【０２７９】
（表１７）得られたクラスの概要
2019011349.tif 000068
【０２８０】
クラス2: 大部分の結晶化実験によってクラス2の固体材料が得られた。これらの試料は、緊密に結合した溶媒分子との非化学量論的(0.5当量未満)な同形溶媒和物(ヘプタン、シクロヘキサン、イソプロピルエーテル、1-ブタノール、トリエチルアミン、ならびに場合によってはヘキサンおよび他のエーテルなどの)と一致するようである。このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンは互いに非常に類似しており、したがって、これらの構造は本質的に同一でありうるし、ごくわずかな差は組み込まれた異なる溶媒による。
【０２８１】
クラス2の試料に対する乾燥実験では結晶性非溶媒和形は得られなかった。高温(80℃)および高真空(1x10-3mbar未満)であっても、緊密に結合した溶媒分子を完全には除去することはできず、溶媒含有量2重量%超が常に残留した。これらの試料の結晶性は減少したが、異なる構造への変換も実質的な非晶質化も観察されなかった。
【０２８２】
クラス3: クラス3の固体材料は数回の結晶化実験によって得られた。クラス3の試料は、緊密に結合した溶媒分子を有する、2PrOH、EtOH、およびおそらくアセトンの同形溶媒和物のようである。これらは、溶媒含有量約0.5当量を有する化学量論的半溶媒和物または非化学量論的溶媒和物と一致しうる。クラス2と同様に、このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンは互いに非常に類似しており、異なる溶媒を組み込む同様の構造を示している。
【０２８３】
クラス2と同様に、乾燥実験は不成功であった。非常に緊密に結合した溶媒分子は部分的にしか除去できなかった(1x10-3mbarおよび80℃にて最大3日で約5.4重量%〜約4.8重量%)。PXRDパターンは未変化のままであった。
【０２８４】
クラス4: クラス4の材料は7:3 MeCN/H2O溶媒系からのみ得られた。それはおそらく結晶性アセトニトリル半溶媒和物と一致する。
【０２８５】
(減圧下またはN2流下高温で)乾燥させることで、結晶構造の変化または破壊なしに溶媒の大部分を除去することができた(PXRDは未変化のままであった)。したがって結晶性非溶媒和形(むしろ脱溶媒和した溶媒和物)が得られた。それはわずかに吸湿性であり(相対湿度50%〜相対湿度85%で質量増加約0.7重量%)、融点196.1℃(ΔH = 29.31J/g)を有しうる。
【０２８６】
クラス5: クラス5も1つの溶媒系(約1:1 THF/H2O)からのみ得られたものであり、結合したTHF(およびおそらくH2O)を含有する。この2つの成分の含有量を別々に定量化することができないことから、この結晶性溶媒和物の正確な性質を決定することはできない。
【０２８７】
クラス5の乾燥によって、完全な脱溶媒和および非晶形(クラス1)への変換が生じた。クラス2材料から非晶形を調製する1つの可能な方法は、クラス2からクラス5に変換し、続いて乾燥および非晶質化を行うことである。
【０２８８】
b. クラス1 - 非晶形
63415の非晶形であるクラス1はいくつかの結晶化実験によって得られた(表18)。大部分の結晶化実験はクラス2、3、4または5の結晶性材料を生じさせた。
【０２８９】
出発材料であるPP415-P1は非晶質であり、クラス1に属する。非晶形(クラス1)を調製することのみを目的とするさらなる実験を行った。
【０２９０】
（表１８）クラス1の固体材料を生じさせる結晶化実験
2019011349.tif 000069
a 徐冷および5℃で2日間の攪拌後に析出なし; 溶媒をN2流下室温で蒸発
【０２９１】
c. クラス2 - 同形溶媒和物(例えばヘプタン)
大部分の結晶化実験によってクラス2の固体材料が得られた(表19)。さらに、クラス2のヘプタン溶媒和物であるPP415-P40の1つのバッチを出発材料として使用した(表8参照)。
【０２９２】
クラス2のFT-ラマンスペクトルは明らかに互いに類似している(図70)が、小さな差を示す。それらは非晶質出発材料クラス1のスペクトル(図71)ならびにクラス3、4および5のスペクトル(図72)と著しく異なる。
【０２９３】
クラス2のPXRDパターン(図73)によって材料の結晶性が確認される。試料のパターンは互いに非常に類似しているが小さな差を示す(図74)。クラス2のパターンはクラス3、4および5のパターンと明らかに異なる(図75)。
【０２９４】
試料PP415-P7のTG-FTIRサーモグラム(図76)は、約100℃〜290℃の2段階でのEtOAcおよびヘプタン約7.5重量%の損失、ならびに温度T＞290℃での分解を示す。TG-FTIR実験の前に試料を短時間(約5分間)減圧(10〜20mbar)乾燥させて未結合の過剰な溶媒を除去した。EtOAcおよびヘプタンの両方の損失が同一温度範囲内で一緒に生じ、両溶媒は構造内で緊密に結合しているようである。半溶媒和物の理論上のEtOAc含有量(沸点 = 76℃)は7.4重量%であり、半溶媒和物の理論上のヘプタン含有量(沸点 = 98℃)は8.3重量%である。残念ながら、これら2つの成分の含有量を別々に定量化することはできない。
【０２９５】
試料PP415-P21のTG-FTIRサーモグラム(図77)は、約140℃〜約250℃の2段階でのシクロヘキサン約5.8重量%の損失、および温度T＞250℃での分解を示す。シクロヘキサンの沸点81℃で、溶媒は構造内で緊密に結合しているようである。半溶媒和物の理論上のシクロヘキサン含有量は7.1重量%である。したがって、試料PP415-P18はおそらく非化学量論的シクロヘキサン溶媒和物(0.5当量未満の溶媒含有量を有する)と一致する。
【０２９６】
試料PP415-P24のTG-FTIRサーモグラム(図78)は、約50℃〜約160℃の1段階での1BuOH約16.6重量%の損失、160℃〜230℃の第2の段階での1BuOH(6.6重量%)のさらなる損失、および温度T＞230℃での分解を示す。1BuOHの沸点117℃で少なくとも第2の段階の溶媒は構造内で緊密に結合しているようである。半溶媒和物の理論上の1BuOH含有量は6.3重量%である。
【０２９７】
試料PP415-P29のTG-FTIRサーモグラム(図79)は、約50℃〜約220℃でのEtOAcおよびTEA約5.1重量%の損失を示し、その大部分は180℃〜210℃の1段階でのものである。分解は温度T＞220℃で生じる。EtOAcおよびTEAの両方の損失が同一温度範囲内で一緒に生じ、両溶媒は構造内で緊密に結合しているようである(EtOAcの沸点は77℃、TEAの沸点は89℃)。
【０２９８】
試料PP415-P47のTG-FTIRサーモグラム(図80)は、最大240℃の温度でのクラス2に典型的な2段階の質量損失(EtOAc合計約7.9重量%)を示し、これは非常に緊密に結合した溶媒分子を示している。
【０２９９】
試料PP415-P48のTG-FTIRサーモグラム(図81)は、当初は漸進的な、次に180℃〜200℃の明確な段階における、ギ酸エチルおよび水約3.5重量%の質量損失を示す。T＞240℃での分解と同時にギ酸エチルのさらなる損失が生じる可能性がある。
【０３００】
したがって、クラス2の試料はいずれも、緊密に結合した溶媒分子を有する非化学量論的(0.5当量未満)同形溶媒和物と一致する可能性がある。このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンが互いに非常に類似していることから、構造は互いに本質的に同一であって、組み込まれた溶媒分子のサイズおよび形状が異なることによる単位セル寸法の小さな歪みまたは単位セル内の原子位置の小さな変化のみを伴うという可能性がある。
【０３０１】
（表１９）クラス2の固体材料を生じさせる結晶化実験
2019011349.tif 000070
a 出発材料: PP415-P40、クラス2; すべての他の実験ではPP415-P1、クラス1を出発材料として使用した。
【０３０２】
d. クラス2の試料に対する乾燥実験
63415の無水形を得るという目的でクラス2のいくつかの試料を脱溶媒和するために、該試料を減圧下で(および一部については高温で)乾燥させた。乾燥試料の詳細および特性決定を以下の表20に示す。
【０３０３】
しかし、80℃および1x10-3mbar未満の減圧下で3日間乾燥させたとしても、緊密に結合した溶媒分子を完全には除去することはできず、溶媒含有量2重量%超が残留した(試料-P32および-P34参照)。PXRDパターンはこれらの試料の結晶性が減少したことを示すが、異なる構造への変換は観察されなかった。
【０３０４】
（表２０）クラス2の試料に対する乾燥実験
2019011349.tif 000071
a PXRDによれば多少結晶性が低い
【０３０５】
したがって、クラス2溶媒和物は非常に緊密に結合した溶媒分子を有するようである。それらを脱溶媒和または変換/非晶質化することは困難である。
【０３０６】
e. PP415-P7→PP415-P30
1:2 EtOAc/ヘプタン中での懸濁液平衡化実験により得られた試料PP415-P7クラス2の固体材料を減圧下で数日間(1〜10mbar、50〜70℃)乾燥させた(PP415-P30として)。
【０３０７】
乾燥クラス2材料(PP415-P30)のFT-ラマンスペクトルは、当初のスペクトル(試料PP415-P7、図82)との小さな差を示すが、依然としてクラス2と一致している。
【０３０８】
乾燥クラス2材料(PP415-P30)のPXRDパターンは、わずかによりブロードで強度がより小さいピークを示す(図83)が、依然としてクラス2と一致している。
【０３０９】
乾燥試料PP415-P30のTG-FTIRサーモグラム(図84)は、約50℃〜250℃の2段階でのヘプタン約2.5重量%(およびいくらかのEtOAc)の損失、ならびに温度T＞250℃での分解を示す。試料PP415-P7のTG-FTIR(図76)と比較すると、2段階の溶媒損失は維持されるが、試料中の溶媒の総量はPP415-P7における約7.5重量%からPP415-P30における約2.5重量%に減少した。
【０３１０】
したがって、この溶媒和物を高温(50〜70℃)および1〜10mbarの減圧下で脱溶媒和する試みは、溶媒の部分的損失しか引き起こさなかった。
【０３１１】
f. PP415-P15→PP415-P18
1:2 DCM/IPE中での析出実験により得られた試料PP415-P15クラス2の固体材料を減圧(約2〜20mbar)下室温で約2時間乾燥させた(PP415-P18として)。
【０３１２】
PP415-P18のFT-ラマンスペクトルは試料PP415-P15のスペクトルと同一であり(図85)、いずれもクラス2と一致している。
【０３１３】
PP415-P18のPXRDパターンはPP415-P15のパターンとの小さな差を示す(図86)。PP415-P18は依然としてクラス2と一致している。
【０３１４】
TG-FTIRサーモグラム(図87)は、約140℃〜約250℃の2段階でのIPE約7.0重量%の損失、および温度T＞250℃での分解を示す。IPEの沸点67℃で、溶媒は構造内で緊密に結合しているようである。半溶媒和物の理論上のIPE含有量は8.4重量%である。
【０３１５】
残念ながら、乾燥段階前の材料のTG-FTIRは記録されていなかった。しかし、溶媒が構造中に非常に緊密に結合しているようであり、変化がFT-ラマンスペクトルおよびPXRDパターンにおいて全く(または少ししか)観察されないことから、乾燥は構造または溶媒含有量に対して有意な効果を示さなかったと考えられる。
【０３１６】
g. PP415-P17→PP415-P19→PP415-P32
1:3 EtOAc/ヘプタン中での析出実験により得られた試料PP415-P17クラス2の固体材料を減圧(約2〜20mbar)下室温で約2時間乾燥させた(PP415-P19として)。
【０３１７】
PP415-P19のFT-ラマンスペクトルは試料PP415-P17のスペクトルと同一であり(図88)、変化は観察できず、いずれもクラス2と一致している。
【０３１８】
PP415-P19のPXRDパターンはPP415-P17のパターンとわずかに異なる(図89)が、依然としてクラス2と一致している。
【０３１９】
TG-FTIRサーモグラム(図90)は、約140℃〜約270℃の2段階でのヘプタン約7.6重量%の損失、および温度T＞270℃での分解を示す。ヘプタンの沸点98℃で、溶媒は構造内で緊密に結合しているようである。半溶媒和物の理論上のヘプタン含有量は8.3重量%である。
【０３２０】
さらなる乾燥実験(80℃、1x10-3mbar未満、3日)をPP415-P32と同一の試料に対して行った。
【０３２１】
FT-ラマンスペクトルは未変化のままであった(図88)。PXRDパターンは依然としてクラス2と一致している(図89)が、試料は(ピークがよりブロードであり、より低いS/N比を有したことから)結晶性がより低い。
【０３２２】
TG-FTIRサーモグラム(図90)はヘプタン約2.2重量%の損失を示し、その大部分は170℃〜200℃の1段階でのものであり、また、温度T＞250℃での分解を示す。
【０３２３】
したがって、ヘプタン含有量は7.6重量%から2.2重量%にのみ減少し、これにより溶媒分子の緊密な結合が確認された。
【０３２４】
h. PP415-P21→PP415-P28→PP415-P34
約1:5 EtOH/シクロヘキサン中での徐冷実験により得られた試料PP415-P21クラス2の固体材料を減圧下で数日間(2〜20mbar、室温〜60℃)乾燥させた(PP415-P28として)。
【０３２５】
乾燥クラス2材料(PP415-P28)のFT-ラマンスペクトルは、クラス2のスペクトル(試料PP415-P21、図92)との小さな差を示すが、依然としてクラス2と一致している。
【０３２６】
乾燥クラス2材料(PP415-P28)のPXRDパターンは、PP415-P21のパターンと比べてブロードで強度が低いピークを示し(図93)、これは乾燥試料の結晶性がより低いことを示している。しかし、パターンは依然としてクラス2と一致している。
【０３２７】
乾燥試料PP415-P28のTG-FTIRサーモグラム(図94)は、約140℃〜約250℃の2段階でのシクロヘキサン約3.0重量%の損失、および温度T＞250℃での分解を示す。試料PP415-P21のTG-FTIR(図77)と比較すると、2段階の溶媒損失は維持されるが、試料中の溶媒の総量はPP415-P21における約5.8重量%からPP415-P28における約3.0重量%に減少した。
【０３２８】
したがって、この溶媒和物の脱溶媒和は、結晶性の部分的損失と並行した溶媒の部分的損失のみを生じさせたようである。
【０３２９】
この試料のさらなる乾燥(80℃、1x10-3mbar未満、3日)をPP415-P34として行った。
【０３３０】
FT-ラマンスペクトルは未変化のままであった(図92)。PXRDパターンは依然としてクラス2と一致している(図93)が、試料は(ピークがよりブロードであり、より低いS/N比を有したことから)結晶性がより低い。
【０３３１】
TG-FTIRサーモグラム(図95)は、25℃〜270℃の2段階でのシクロヘキサン約2.3重量%の損失、および温度T＞270℃での分解を示す。
【０３３２】
したがって、シクロヘキサン含有量は3.0重量%から2.3重量%にのみ減少し、これにより溶媒分子の緊密な結合が確認された。
【０３３３】
i. クラス3 - 同形溶媒和物(例えばエタノール)
いくつかの結晶化実験によってクラス3の固体材料が得られ、FT-ラマン分光法、PXRDおよびTG-FTIRによって特性決定した(表21)。
【０３３４】
クラス3のFT-ラマンスペクトルは明らかに互いに類似している(図96)が、小さな差を示す(図97)。クラス3のスペクトルは非晶質出発材料クラス1のスペクトル(図98)ならびにクラス2、4および5のスペクトル(図72)と著しく異なる。
【０３３５】
クラス3のPXRDパターン(図99)によって材料の結晶性が確認される。3つの試料のパターンは互いに類似しているが、小さいが有意な差を示す(図100)。クラス3のパターンはクラス2、4および5の結晶パターンと明らかに異なる(図75)。
【０３３６】
試料PP415-P6のTG-FTIRサーモグラム(図100)は25℃〜250℃での2PrOH約5.4重量%の損失を示し、その大部分は約170℃〜190℃の1段階でのものである。分解は温度T＞250℃で開始する。TG-FTIR実験の前に試料を短時間(約5分間)減圧(10〜20mbar)乾燥させて未結合の過剰な溶媒を除去した。半溶媒和物の理論上の2PrOH(沸点 = 82℃)含有量は5.1重量%である。
【０３３７】
試料PP415-P12のTG-FTIRサーモグラム(図101)は25℃〜250℃でのEtOH約4.9重量%(および微量の水)の損失を示し、その大部分は約160℃〜190℃の1段階でのものである。分解は温度T＞250℃で開始する。半溶媒和物の理論上のEtOH(沸点 = 78℃)含有量は4.0重量%である。
【０３３８】
したがってクラス3の試料は、緊密に結合した溶媒内容物を有する、2PrOH、EtOH、およびおそらくアセトンの同形溶媒和物のようである。それらは化学量論的半溶媒和物と一致しうる。しかし、これらの形態が非化学量論的溶媒和物であることを除外することはできない。
【０３３９】
このクラス内のラマンスペクトルおよびPXRDパターンが互いに非常に類似していることから、構造は本質的に同一であって、異なる溶媒分子が組み込まれたことによる単位セル寸法の小さな歪みまたは単位セル内の原子位置の小さな変化のみを伴うという可能性がある。
【０３４０】
（表２１）クラス3の固体材料を生じさせる結晶化実験
2019011349.tif 000072
【０３４１】
j. クラス3の試料に対する乾燥実験
2PrOH中での懸濁液平衡化実験により得られたクラス3の試料の1つ(PP415-P6)を減圧下で数日間(2〜20mbar、室温〜60℃、表22)乾燥させた(PP415-P25として)。
【０３４２】
この乾燥クラス3材料である試料PP415-P25のTG-FTIRサーモグラム(図102)は、50℃〜250℃での2PrOH約5.4重量%の損失を示し、その大部分は170℃〜190℃の1段階でのものであり、290℃〜320℃での2PrOH約1.0重量%の別の損失を示し、温度T＞320℃での分解を示す。溶媒含有量が2PrOH約5.4重量%である当初のクラス3試料PP415-P6のTG-FTIR(図103)と比較すると、溶媒含有量は有意には減少しなかったようである。
【０３４３】
溶媒和物を脱溶媒和して63415の非溶媒和無水形を得るという目的で、この材料を高真空および高温(1x10-3mbar未満、80℃)下で3日間さらに乾燥させた(PP415-P33として、表22)。
【０３４４】
さらに乾燥させたこのクラス3材料である試料PP415-P33のTG-FTIRサーモグラム(図103)は、50℃〜210℃での2PrOH約4.2重量%の損失を示し、その大部分は160℃〜190℃の1段階でのものであり、210℃〜290℃での2PrOH約0.5重量%の別の損失を示し、温度T＞290℃での分解を示す。
【０３４５】
試料PP415-P6およびPP415-P25の溶媒含有量と比較すると、溶媒含有量は約5.4重量%から約4.8重量%にしか減少しなかった。
【０３４６】
（表２２）クラス3の試料に対する乾燥実験
2019011349.tif 000073
【０３４７】
クラス3(試料PP415-P6)、クラス3の乾燥材料(試料PP415-P25)およびクラス3のさらなる乾燥材料(試料PP415-P33)のFT-ラマンスペクトルは同一であり、変化を示さない(図104)。
【０３４８】
クラス3(試料PP415-P6)およびクラス3のさらなる乾燥材料(試料PP415-P33)のPXRDパターンは有意な差を示さず、一方、クラス3の最初の乾燥材料のパターン(試料PP415-P25、図105)からのいくつかの小さなシフトおよび差が存在する。すべてのパターンはクラス3と一致する。
【０３４９】
乾燥が溶媒含有量に対して大きな影響を示さなかったことから、乾燥材料のFT-ラマンスペクトルおよびPXRDパターンが非乾燥材料に比べて差を示さないということは驚くべきことではない。
【０３５０】
したがって、クラス3は、非常に緊密に結合した溶媒分子を有する同形溶媒和物(2PrOH、EtOHおよびおそらくアセトン)のクラスであり、該溶媒分子はここで適用される乾燥条件(1x10-3mbarおよび80℃で最大3日)によって部分的にしか除去できなかった(約5.4重量%〜約4.8重量%)。
【０３５１】
k. クラス4 - アセトニトリル溶媒和物
クラス4は7:3 MeCN/H2O溶媒混合物からのみ得られた(表23)。クラス4(PP415-P13)を得る実験をPP415-P35として繰り返すことで、さらなる乾燥試験用のさらなる材料を調製した。
【０３５２】
クラス4(試料PP415-P13)のFT-ラマンスペクトル(図72)およびPXRDパターン(図75)はクラス2、3および5のスペクトルおよびパターンと著しく異なる。
【０３５３】
クラス4のTG-FTIRサーモグラム(試料PP415-P13、図106)は25℃〜270℃でのMeCN約3.4重量%(および微量の水)の損失を示し、その大部分は約180℃〜210℃の1段階でのものである。分解は温度T＞270℃で開始する。TG-FTIR実験の前に試料を短時間(約5分間)減圧(10〜20mbar)乾燥させて未結合の過剰な溶媒を除去した。半溶媒和物の理論上のMeCN(沸点 = 81℃)含有量は3.6重量%である。
【０３５４】
（表２３）クラス4の固体材料を生じさせる結晶化実験
2019011349.tif 000074
【０３５５】
l. クラス4に対する乾燥実験
約7:3 MeCN/H2O中での懸濁液平衡化実験により得られたクラス4の試料をN2流下で数日減圧乾燥させた(表24)。
【０３５６】
（表２４）クラス4の試料に対する乾燥実験
2019011349.tif 000075
a 溶媒内容物はおそらくMeCNおよびH2Oであるが、量が少ないことから決定は困難
【０３５７】
乾燥クラス4材料(PP415-P26)のFT-ラマンスペクトルはクラス4のスペクトル(PP415-P13、図107)と同一である。
【０３５８】
乾燥クラス4材料(PP415-P26)のPXRDパターンはクラス4の試料PP415-P13のパターン(図108)との非常に小さな差しか示さない。いくつかのピークはよりよく分解されたようであり、ピーク強度はシフトした。非晶質化は観察されなかった。PP415-P26のパターンはクラス4と一致している。
【０３５９】
乾燥クラス4材料である試料PP415-P26のTG-FTIRサーモグラム(図109)は、170℃〜250℃でのMeCN約2.8重量%の損失、および温度T＞300℃での分解を示す。試料PP415-P13のTG-FTIR(図106)と比較すると、試料の溶媒含有量は3.4重量%から2.8重量%に減少した。
【０３６０】
したがって、試料は部分的に脱溶媒和した溶媒和物のようである。第2の乾燥実験および引き続く特性決定に十分な量の材料が残らなかったことから、実験PP415-P13を繰り返した(PP415-P35として)。クラス4のさらなる材料を調製し、この新たに調製した材料によって2つの乾燥実験を行った。
・PP415-P36: 減圧(1x10-3mbar未満)下80℃で3日間乾燥
・PP415-P37: N2流下80℃で3日間乾燥
これらの乾燥クラス4試料(PP415-P36および-P37)のFT-ラマンスペクトルはクラス4のスペクトル(すなわちPP415-P35、図110)と一致している。
【０３６１】
クラス4材料(試料PP415-P35)ならびにクラス4の乾燥試料(試料PP415-P36およびPP415-P37)のPXRDパターン(図111)は同一である。乾燥試料は結晶性である。
【０３６２】
クラス4のこれらの乾燥試料のTG-FTIRサーモグラム(PP415-P36は図112、PP415-P37は図113)は、25℃〜280℃の2段階でPP415-P36およびPP415-P37においてそれぞれ約0.6重量%および約0.9重量%という少ない溶媒含有量(MeCNおよび/またはH2O)しか示さない。溶媒内容物はおそらくMeCNおよびH2Oであるが、量が少ないことから決定は困難である。分解は温度T＞280℃で開始する。
【０３６３】
したがって、結晶構造を破壊することなく、この溶媒和物の溶媒の大部分を除去することができた。結晶性非溶媒和形(むしろ脱溶媒和した溶媒和物)が得られた。
【０３６４】
m. 乾燥および脱溶媒和したクラス4のさらなる特性決定
クラス4(MeCN溶媒和物)の乾燥によって、1重量%未満(TG-FTIR)に減少した溶媒含有量を有する脱溶媒和した溶媒和物が得られた。
【０３６５】
脱溶媒和時に構造の変化は生じなかった(FT-ラマンおよびPXRD)。結晶性の有意な損失は生じなかった。
【０３６６】
したがって、現在までに知られた唯一のものである63415の非溶媒和結晶形が得られた。
【０３６７】
この脱溶媒和クラス4材料をDVSおよびDSCによってさらに特性決定した。
【０３６８】
DVS等温線(図114)は、相対湿度50%での初期平衡化時間中に約0.4重量%の質量増加が生じたことを示す。測定中、相対湿度50%から相対湿度0%に相対湿度を低下させた際に約1.3重量%の漸進的で可逆的な質量損失が生じた。平衡に達した。相対湿度を相対湿度95%に上昇させた際に約0.8重量%の漸進的質量増加(相対湿度50%での平衡化質量に対して)が観察された。平衡に達した。相対湿度を相対湿度50%に低下させた後、最終質量は平衡化出発質量よりも0.1重量%低いままであった。相対湿度を相対湿度50%から相対湿度85%に増加させた際の約0.7重量%の質量増加によって、試料はわずかに吸湿性であると分類された。
【０３６９】
測定後の試料のPXRDパターンは測定前のパターンに比べて未変化である(図115)。
【０３７０】
脱溶媒和クラス4材料の試料のDSCサーモグラム(図116)は、約150℃で予想されたであろう非晶形に起因するガラス転移を示さない代わりに、おそらく融点に対応するT = 196.1℃(ΔH = 29.31J/g)での最大を有する鋭い吸熱ピークを示し、270℃まで分解を示さない。
【０３７１】
さらに、非晶質材料クラス1と脱溶媒和クラス4材料との約1:1混合物によってDSC実験を行うことで、該非晶質材料が該脱溶媒和クラス4に変換および結晶化されるか否かを検査した。これは、(生じるとすれば)非晶形のガラス転移温度
2019011349.tif 000076
超および脱溶媒和クラス4の融点
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未満で生じると予想される事象である。
【０３７２】
混合物のDSCサーモグラム(図117)は、T = 156.7℃(ΔH = 1.47J/g)でのピークを有する吸熱事象、および197.0℃(ΔH = 14.1J/g)でのピークを有する第2の吸熱事象を示す。第1の事象は非晶質材料(
2019011349.tif 000078
でのガラス転移)に起因しうる可能性がある。第2の事象は
2019011349.tif 000079
での脱溶媒和クラス4の融解に対応する可能性がある。混合物の融解熱(ΔH = 14.1J/g)は純粋な脱溶媒和クラス4の融解熱(ΔH = 29.3J/g)の半分と十分に相関している。
【０３７３】
非晶質材料のありうる結晶化に対応する、ガラス転移温度と融点との間の温度範囲内の発熱事象は観察することができない。したがって、非晶形の脱溶媒和クラス4形態への変換は、このタイムスケールでは生じなかったようであった。
【０３７４】
非晶質材料クラス1と脱溶媒和クラス4材料との約1:1混合物によるさらに別のDSC実験において、ありうる結晶化のための時間を取るために、加熱を173℃(ガラス転移温度と融点との間)で停止した。
【０３７５】
混合物のDSCサーモグラム(図118)は、T = 161.4℃(ΔH = 0.31J/g)でのピークを有する吸熱事象、および201.4℃(ΔH = 11.4J/g)でのピークを有する第2の吸熱事象を示す。第1の実験と同様、第2のピークの融解熱は増加しなかったし、非晶形が脱溶媒和クラス4形態に変換された徴候も見られない。
【０３７６】
曲線状ベースライン(-50℃〜150℃)はおそらく人為的なもの(試料ホルダーの蓋が曲がっていることによる)である。
【０３７７】
n. クラス5 - THF溶媒和物
クラス5は1:1 THF/H2O溶媒混合物からのみ得られた(表25)。
【０３７８】
クラス5のFT-ラマンスペクトル(図71)およびPXRDパターン(図75)はクラス2、3および4のスペクトルおよびパターンと著しく異なる。
【０３７９】
クラス5のTG-FTIRサーモグラム(試料PP415-P14、図119)は25〜200℃でのTHFおよびH2O約36.1重量%の損失を示し、その大部分は約100℃〜130℃の1段階でのものである。TG-FTIR実験の前に試料を短時間(約5分間)減圧(10〜20mbar)乾燥させて未結合の過剰な溶媒を除去した。THFおよびH2Oの両方の損失が同一温度範囲内で一緒に生じた。分解は温度T＞300℃で開始する。三溶媒和物の理論上のTHF(沸点 = 66℃)含有量は28.1重量%である。残念ながら、この2つの成分の含有量を別々に定量化することができないことから、正確な溶媒和状態を決定することはできない。
【０３８０】
試料PP415-P41およびPP415-P45の実験および特性決定に関する詳細を示す。
【０３８１】
（表２５）クラス5の固体材料を生じさせる結晶化実験
2019011349.tif 000080
b 出発材料: PP415-P40、クラス2; この表におけるすべての他の実験ではPP415-P1、クラス1を出発材料として使用した
c 100mgスケールの代わりに3gスケール実験
【０３８２】
o. クラス5の試料に対する乾燥実験
約1:1 THF/H2O中での懸濁液平衡化実験により得られたクラス5の試料(PP415-P14)を減圧下で数日間(2〜20mbar、室温〜60℃、表26)乾燥させた(PP415-P27として)。
【０３８３】
（表２６）クラス5の試料の乾燥実験
2019011349.tif 000081
a 主に非晶質、低いS/N比を有するいくつかのブロードなピークのみ
【０３８４】
乾燥材料(PP415-P27)のFT-ラマンスペクトルは、クラス5のスペクトル(PP415-P14、図120)と異なっており、そのピークがブロード化されていることからクラス1の非晶質出発材料PP415-P1のスペクトルにより類似している。
【０３８５】
乾燥クラス5材料(PP415-P27)のPXRDパターンは、低いS/N比を有するいくつかのブロードで低強度のピークのみを示し、これは試料の低い結晶性を示している(図121)。いくつかのピークがクラス5と一致する可能性がある一方、例えば7.35°2θでのピークは新規のまたはシフトしたものである。
【０３８６】
乾燥クラス5材料のTG-FTIRサーモグラム(図122)は、25℃〜290℃での約0.3重量%の質量損失、および温度T＞290℃での分解を示す。試料は無水である。
【０３８７】
したがって、減圧乾燥によって材料はその溶媒内容物およびその結晶性の大部分を失った。
【０３８８】
8. 非晶形を調製するための実験
非晶形クラス1を調製することを目的とする実験を、クラス2材料(PP415-P40、表8)を出発材料として使用して行った。いくつかの戦略および方法を試みた。
・クラス2をクラス5に変換した後、クラス5を乾燥させて非晶形クラス1を得ること。
・可能ならばICHクラス3溶媒を使用して非晶形クラス1をクラス2から直接調製すること。
主に非晶質の材料を、クラス2材料から出発して、100mgおよび3gスケール上でクラス5を経由する2段階法で調製した。
【０３８９】
ICHクラス2溶媒THFを回避しかつ完全に非晶質の材料を得るために、手順を1段階法に単純化するという目的で、さらなる実験を行った。最も有望な方法は、冷水浴中でのアセトン溶液からの析出であることがわかった。この直接法は、クラス5を経由する2段階法よりもはるかによい結果を与える。
【０３９０】
a. クラス5を経由する非晶形の調製
クラス2のPP415-P40を出発材料として使用する結晶化実験を、このヘプタン溶媒和物をクラス5(おそらくTHF溶媒和物)に変換した後、クラス5を乾燥させることで非晶質材料を得るという目的で行った(表27)。
【０３９１】
クラス5は、クラス2または3よりも脱溶媒和および非晶質化が容易であることから、良好な中間体段階であると考えられる。
【０３９２】
（表２７）クラス5材料を経由する非晶形クラス1の調製を目的とする実験の概要
2019011349.tif 000082
a 主に非晶質、低いS/N比を有するいくつかのブロードなピークのみ
【０３９３】
b. 段階1: クラス2のクラス5への変換
ヘプタン溶媒和物クラス2のTHF溶媒和物クラス5への変換をPP415-P40(ヘプタン溶媒和物)材料を(1:1)THF/H2O混合物に懸濁させ、懸濁液を室温で平衡化することでうまく行った(PP415-P41、100mgスケール)。得られた固体材料はTHF溶媒和物クラス5と一致している(図123)。
【０３９４】
mgスケールからgスケールへの第1のスケールアップ実験(x30、すなわち3gスケール)をPP415-P41と類似して行った。クラス2ヘプタン溶媒和物出発材料(PP415-P40)をTHF/H2O(1:1)中で1日間平衡化し、クラス5THF溶媒和物(PP415-P45、図124)にうまく変換した。
【０３９５】
c. 段階2: 乾燥によるクラス5材料の非晶質化
API MFGのサイトにおいて使用可能な条件を考慮に入れて、クラス5材料(THF溶媒和物)を減圧(約100mbar)下高温(80℃)で乾燥させた。
【０３９６】
100mgスケール実験の材料であるPP415-P41を80℃および100mbarで1日間乾燥後、主に非晶質の材料に変換した(PP415-P44、図125)。PXRDパターンは、低い強度を有するいくつかのブロードなピークしか示さない。さらに終夜乾燥(80℃、100mbar)後、これらのブロードなピークの強度はさらに減少している(PP415-P44a)。この材料のTG-FTIRは、25℃〜280℃でのTHF約0.9重量%(および微量の水)の漸進的損失、ならびに温度T＞300℃での分解を示す(図126)。
【０３９７】
また、3gスケール実験の材料PP415-P45を80℃および100mbarで乾燥させた(PP415-P46として)。それを、低い強度を有するいくつかのブロードなピークしか有さない主に非晶質の材料に一晩かけて変換した(図127)。合計4日間の乾燥(80℃、100mbar)後、これらのブロードなピークは依然として存在する(-P46a、図128)。この材料のTG-FTIRはTHF含有量を示さないが、25℃〜250℃での水約0.4重量%の漸進的損失、および温度T＞250℃での分解を示す(図129)。
【０３９８】
d. 非晶形を直接得る
クラス2材料から出発してクラス5を経由する2段階法で非晶形を調製することは、大体成功したが、完全には成功しなかった。したがって、ICHクラス2溶媒THFの使用を回避しかつ完全に非晶質の材料を得るために、手順を1段階法に単純化するという目的で、さらなる実験を行った(表28)。
【０３９９】
N2流下、THF中でのクラス2溶液の蒸発実験において非晶形クラス1をクラス2材料から直接調製した(PP415-P42、図129)。
【０４００】
著しい量の残留溶媒を有する不完全に乾燥したヘプタン/ヘキサン溶媒和物を再現する試みとして、8:2 THF/ヘキサン溶液中でのクラス2溶液の蒸発を行った(溶媒混合物中で同様の沸点を示すように、ヘキサンをヘプタンの代わりに使用した)。しかし、得られた固体は、同形溶媒和物のクラスであるクラス2と一致し、クラス5と一致しない(PP415-P43、図130)。
【０４０１】
ICHクラス2溶媒THFを回避するために、ICHクラス3溶媒中で蒸発実験を行った。
【０４０２】
N2流下、EtOAc中でのクラス2溶液の蒸発によって、クラス2と一致するPXRDパターンを有する結晶性材料が得られた(PP415-P47、図130)。TG-FTIR(図80)は、最大240℃の温度でのクラス2に典型的な2段階の質量損失(EtOAc合計約7.9重量%)を示し、これは非常に緊密に結合した溶媒分子を示している。
【０４０３】
ギ酸エチル中での蒸発によっても結晶性クラス2材料が得られ、非晶形は得られなかった(PP415-P48、図131)。TG-FTIR(図78)は、当初は漸進的な、次に180℃〜200℃の明確な段階における、ギ酸エチル約3.5重量%の質量損失を示す。T＞240℃での分解と同時にギ酸エチルのさらなる損失が生じる可能性がある。
【０４０４】
しかし、冷(5℃)水浴にアセトン溶液を加えることで、クラス2材料はうまく非晶形クラス1に変換された(PP415-P49、図132)。
【０４０５】
非晶形を調製するためのこの直接法は、よりよい結果を与えるものであり、2段階法よりも有望な経路である。
【０４０６】
（表２８）クラス2出発材料から非晶形を直接得ることを目的とする実験の概要
2019011349.tif 000083
【０４０７】
9. 機器構成 - 典型的測定条件
FT-ラマン分光法: OPUS 6.5ソフトウェア付きBruker RFS100; Nd:YAG 1064nm励起、Ge検出器、3500〜100cm-1範囲; 典型的測定条件: 名目レーザー出力100〜300mW、走査64〜128回、分解能2cm-1。
【０４０８】
PXRD: Stoe Stadi P; Mythen1K検出器; Cu-Kα線; 標準的測定条件: 透過; 管出力40kVおよび40mA; 湾曲Geモノクロメーター; ステップ幅0.02°2θ、ステップ時間12秒または60秒、走査範囲1.5〜50.5°2θまたは1.0〜55°2θ; 検出器モード: ステップ走査; 検出器ステップ1°2θまたは6°2θ; 標準的試料調製: 2つのアセテート箔の間に試料10〜20mgを配置; 試料ホルダー: Stoe透過試料ホルダー; 測定中に試料を回転。
【０４０９】
TG-FTIR: Bruker FT-IR分光計Vector 22付きのNetzsch Thermo-Microbalance TG 209; アルミニウムるつぼ(微細孔付き)、N2雰囲気、加熱速度10K/分、25〜250℃または25〜350℃の範囲。
【０４１０】
DSC: Perkin Elmer DSC 7; 金るつぼ(密閉式または微細孔付き)、試料はN2環境中に充填、加熱速度10K/分、-50〜250℃または350℃の範囲、走査間に時々-50℃に急冷(-200K/分で)。
【０４１１】
DVS: Projekt Messtechnik Sorptions Prufsystem SPS 11 - 100nまたは表面測定システムDVS-1。試料を微量天秤の上のアルミニウムまたは白金ホルダー上に配置し、相対湿度50%で2時間平衡化した後、所定の湿度プログラムを開始した。
(1) 相対湿度50→0%(5%/h); 相対湿度0%で5時間
(2) 相対湿度0→95%(5%/h); 相対湿度95%で5時間
(3) 相対湿度95→50%(5%/h); 相対湿度50%で2時間
【０４１２】
初期質量に対する相対湿度85%での質量増加に基づいて吸湿性を以下のように分類した: 潮解性(液体を形成するために十分な水が吸着)、非常に吸湿性(質量増加15%以上)、吸湿性(質量増加15%未満、但し2%以上)、わずかに吸湿性(質量増加2%未満、但し0.2%以上)、または非吸湿性(質量増加0.2%未満)。
【０４１３】
溶媒: すべての実験においてFluka、MerckまたはABCRの分析用溶媒を使用した。
【０４１４】
溶解度概算値の決定: 溶解度概算値は物質約10mgの懸濁液を溶媒0.05mLに段階希釈することで決定した。物質が溶媒合計10mL超の添加によって溶解しなかった場合、溶解度は1mg/mL未満として示される。この方法に固有の実験誤差が理由で、溶解度の値は、大まかな推定値と見なされるように意図されており、結晶化実験の設計のためにのみ使用されるべきである。
【０４１５】
化学安定性の決定: 各溶媒1.0mL中のPP415-P1材料1.0mgの4つの試料を調製した。得られた懸濁液/溶液を温度制御Eppendorf Thermomixer Comfort攪拌機中にて攪拌速度500rpm、25℃で7日間、2日間、24時間および6時間平衡化した。必要であれば、固相をフィルター遠心分離(0.5μm PVDF膜)によって分離した。濾液を希釈液(MeCN中0.1%ギ酸)中で濃度0.2mg/mL以下(不明、懸濁液ではおそらくより低い)に希釈し、表29に示すHPLC法を使用して検査した。基準として、PP415-P1材料を希釈液中で濃度0.25mg/mLに希釈し、HPLC手順の最初および終わりに加えた。
HPLC結果
【０４１６】
（表２９）化学安定性の決定に使用したHPLC法
2019011349.tif 000084
【０４１７】
10. 略語
方法
AUC  曲線下面積分析
DSC  示差走査熱量
DVS  動的蒸気収着
FTラマン  フーリエ変換ラマン分光法
1H-NMR  プロトン核磁気共鳴分光法
HPLC  高速液体クロマトグラフィー
PXRD  粉末X線回折
TG-FTIR  熱重量分析とフーリエ変換赤外分光法との組み合わせ
【０４１８】
化学物質
1BuOH  1-ブタノール
CTAB  臭化セチルトリメチルアンモニウム
DCM  ジクロロメタン
DEE  ジエチルエーテル
DMF  N,N-ジメチルホルムアミド
EtOAc  酢酸エチル
EtOH  エタノール
IPE  イソプロピルエーテル
MeCN  アセトニトリル
MEK  メチルエチルケトン
MeOH  メタノール
PEG  プロピレングリコール
PTFE  ポリテトラフルオロエチレン、テフロン
2PrOH  2-プロパノール、イソプロパノール
SDS  ドデシル硫酸ナトリウム
TBME  tert-ブチルメチルエーテル
TEA  トリエチルアミン
THF  テトラヒドロフラン
Tween 80  ポリオキシエチレン(80)ソルビタンモノオレエートまたはポリソルベート80
【０４１９】
遺伝子、タンパク質および生物学的パラメータ
AIM  抗酸化炎症モジュレーター
Akr1c1  アルド-ケト還元酵素ファミリー1、メンバーc1
ALP  アルカリホスファターゼ
ALT  アラニントランスアミナーゼ
ARE  抗酸化剤応答配列
AST  アスパラギン酸トランスアミナーゼ
AUC  曲線下面積
BAL  気管支肺胞洗浄
BALF  気管支肺胞洗浄液
Bil  ビリルビン
BUN  血中尿素窒素
COPD  慢性閉塞性肺疾患
COX-2  シクロオキシゲナーゼ-2
Cr  クレアチン
CYP450  チトクロムP450
Eh-1  エポキシドヒドロラーゼ1
G6PD  グルコース-6-リン酸脱水素酵素
Gclc  グルタミン酸システインリガーゼ触媒サブユニット
Gclm  グルタミン酸システインリガーゼ調節サブユニット
Ggt1  γ-グルタミルトランスフェラーゼ
Glrx  グルタレドキシン-1
Glu  グルコース
GOT  グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ
GPT1  グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
Gpx3  グルタチオンペルオキシダーゼ3
GSH  グルタチオン
GSR  グルタチオン還元酵素
GSs  グルタチオン合成酵素
GST  グルタチオンS-トランスフェラーゼ
GSTa1  グルタチオンS-トランスフェラーゼα1
GSTp1  グルタチオンS-トランスフェラーゼπ1
Gy  グレイ
H6PD  ヘキソース-6-リン酸脱水素酵素
hERG  ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子
HMOX1  ヘムオキシゲナーゼ(開環)1
HO-1  ヘムオキシゲナーゼ
IFNγ  インターフェロン-γ
IL  インターロイキン
iNOS  誘導型一酸化窒素合成酵素
IκBα  B細胞核内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーインヒビターα
KC  マウスIL-8関連タンパク質
Keap1  Kelch様ECH関連タンパク質-1
LPS  リポ多糖
ME1  リンゴ酸酵素1
MPCE  小核多染性赤血球
Mrp  metG関連タンパク質
Mrps  多剤耐性関連タンパク質
NADPH  還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
NFκB  活性化B細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー
NO  一酸化窒素
NQO1  NAD(P)Hキノン酸化還元酵素1
Nrf2  核因子(赤血球由来)様2
p-IκBα  リン酸化IκBα
PBMC  末梢血単核球
PCE  多染性赤血球
PGD  ホスホグルコン酸脱水素酵素
PMN  多形核
RANTES  ランテス(regulated and normal T cell expressed and secreted)
SOD1  スーパーオキシドジスムターゼ1
SRXN1  スルフィレドキシン-1
TG  総グリセリド
TKT  トランスケトラーゼ
TNFα  腫瘍壊死因子α
Txn  チオレドキシン
TXNRD1  チオレドキシン還元酵素1
xCT  溶質輸送体ファミリー7、メンバー11
【０４２０】
その他
API  医薬品有効成分
aq.  水性
b.p.  沸点
cryst.  結晶性
decomp.  分解
d  日
eq.  当量
equil.  平衡
evap.  蒸発
h  時間
mat.  材料
min  分
m.p.  融点
MS  モレキュラーシーブ
part.  部分的に
precip.  析出
r.h.  相対湿度
rpm  毎分回転数
r.t.  室温(約25℃)
S/N  信号対雑音(比)
solv.  溶媒
susp.  懸濁液
T  温度
Tg  ガラス転移温度
theo.  理論値
vis. obs.  目視
w  週
wt.-%  重量パーセント
【０４２１】
K. さらなる表
（表３０）試料および行った実験のリスト
2019011349.tif 000085
2019011349.tif 000086
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2019011349.tif 000099
【０４２２】
（表３１）図51のパラメータ
2019011349.tif 000100
【０４２３】
（表３２）63415: 一次インビボADMET - 主要一次ADMETアッセイおよびエンドポイント
2019011349.tif 000101
【０４２４】
（表３３）図54のパラメータ
2019011349.tif 000102
【０４２５】
（表３４）63415はインビボ小核試験において遺伝毒性が陰性である
2019011349.tif 000103
【０４２６】
（表３５）図35のパラメータ
2019011349.tif 000104
【０４２７】
（表３６）63415および63355のインビトロ活性
2019011349.tif 000105
【０４２８】
（表３７）図52のパラメータ
2019011349.tif 000106
【０４２９】
（表３８）図53のパラメータ
2019011349.tif 000107
【０４３０】
本明細書において開示および特許請求したすべての化合物、多形体、製剤および方法を、本開示に照らして、過度の実験なしに実施および実行することができる。本発明の化合物、多形体、製剤および方法を好ましい態様に関して説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲より逸脱することなく、化合物、多形体、製剤および方法、ならびに本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変動を適用することができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連する特定の薬剤で、同一のまたは同様の結果を実現しながら、本明細書に記載の薬剤を代用することができることは明らかであろう。当業者には明らかなすべてのそのような同様の代用物および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０４３１】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に開示の参考文献を補足する例示的な手順上のまたは他の詳細を与える限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
2019011349.tif 000108
2019011349.tif 000109
2019011349.tif 000110
2019011349.tif 000111
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【図１】
2019011349.tif 000119
【図２】
2019011349.tif 000120
【図３ａ】
2019011349.tif 000121
【図３ｂ】
2019011349.tif 000122
【図３ｃ】
2019011349.tif 000123
【図３ｄ】
2019011349.tif 000124
【図３ｅ】
2019011349.tif 000125
【図３ｆ】
2019011349.tif 000126
【図４】
2019011349.tif 000127
【図５】
2019011349.tif 000128
【図６】
2019011349.tif 000129
【図７】
2019011349.tif 000130
【図８】
2019011349.tif 000131
【図９】
2019011349.tif 000132
【図１０ａ】
2019011349.tif 000133
【図１０ｂ】
2019011349.tif 000134
【図１０ｃ】
2019011349.tif 000135
【図１０ｄ】
2019011349.tif 000136
【図１１】
2019011349.tif 000137
【図１２】
2019011349.tif 000138
【図１３】
2019011349.tif 000139
【図１４】
2019011349.tif 000140
【図１５ａ】
2019011349.tif 000141
【図１５ｂ】
2019011349.tif 000142
【図１５ｃ】
2019011349.tif 000143
【図１５ｄ】
2019011349.tif 000144
【図１６】
2019011349.tif 000145
【図１７】
2019011349.tif 000146
【図１８】
2019011349.tif 000147
【図１９】
2019011349.tif 000148
【図２０】
2019011349.tif 000149
【図２１】
2019011349.tif 000150
【図２２】
2019011349.tif 000151
【図２３】
2019011349.tif 000152
【図２４ａ】
2019011349.tif 000153
【図２４ｂ】
2019011349.tif 000154
【図２４ｃ】
2019011349.tif 000155
【図２４ｄ】
2019011349.tif 000156
【図２５】
2019011349.tif 000157
【図２６】
2019011349.tif 000158
【図２７】
2019011349.tif 000159
【図２８】
2019011349.tif 000160
【図２９】
2019011349.tif 000161
【図３０】
2019011349.tif 000162
【図３１】
2019011349.tif 000163
【図３２】
2019011349.tif 000164
【図３３】
2019011349.tif 000165
【図３４】
2019011349.tif 000166
【図３５】
2019011349.tif 000167
【図３６】
2019011349.tif 000168
【図３７】
2019011349.tif 000169
【図３８】
2019011349.tif 000170
【図３９】
2019011349.tif 000171
【図４０】
2019011349.tif 000172
【図４１】
2019011349.tif 000173
【図４２ａ】
2019011349.tif 000174
【図４２ｂ】
2019011349.tif 000175
【図４３】
2019011349.tif 000176
【図４４】
2019011349.tif 000177
【図４５】
2019011349.tif 000178
【図４６】
2019011349.tif 000179
【図４７】
2019011349.tif 000180
【図４８ａ】
2019011349.tif 000181
【図４８ｂ】
2019011349.tif 000182
【図４９】
2019011349.tif 000183
【図５０】
2019011349.tif 000184
【図５１】
2019011349.tif 000185
【図５２】
2019011349.tif 000186
【図５３】
2019011349.tif 000187
【図５４】
2019011349.tif 000188
【図５５】
2019011349.tif 000189
【図５６】
2019011349.tif 000190
【図５７】
2019011349.tif 000191
【図５８】
2019011349.tif 000192
【図５９】
2019011349.tif 000193
【図６０】
2019011349.tif 000194
【図６１】
2019011349.tif 000195
【図６２】
2019011349.tif 000196
【図６３】
2019011349.tif 000197
【図６４】
2019011349.tif 000198
【図６５】
2019011349.tif 000199
【図６６】
2019011349.tif 000200
【図６７】
2019011349.tif 000201
【図６８】
2019011349.tif 000202
【図６９】
2019011349.tif 000203
【図７０】
2019011349.tif 000204
【図７１】
2019011349.tif 000205
【図７２】
2019011349.tif 000206
【図７３】
2019011349.tif 000207
【図７４】
2019011349.tif 000208
【図７５】
2019011349.tif 000209
【図７６】
2019011349.tif 000210
【図７７】
2019011349.tif 000211
【図７８】
2019011349.tif 000212
【図７９】
2019011349.tif 000213
【図８０】
2019011349.tif 000214
【図８１】
2019011349.tif 000215
【図８２】
2019011349.tif 000216
【図８３】
2019011349.tif 000217
【図８４】
2019011349.tif 000218
【図８５】
2019011349.tif 000219
【図８６】
2019011349.tif 000220
【図８７】
2019011349.tif 000221
【図８８】
2019011349.tif 000222
【図８９】
2019011349.tif 000223
【図９０】
2019011349.tif 000224
【図９１】
2019011349.tif 000225
【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
2019011349.tif 000228
【図９５】
2019011349.tif 000229
【図９６】
2019011349.tif 000230
【図９７】
2019011349.tif 000231
【図９８】
2019011349.tif 000232
【図９９】
2019011349.tif 000233
【図１００】
2019011349.tif 000234
【図１０１】
2019011349.tif 000235
【図１０２】
2019011349.tif 000236
【図１０３】
2019011349.tif 000237
【図１０４】
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【図１０５】
2019011349.tif 000239
【図１０６】
2019011349.tif 000240
【図１０７】
2019011349.tif 000241
【図１０８】
2019011349.tif 000242
【図１０９】
2019011349.tif 000243
【図１１０】
2019011349.tif 000244
【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
2019011349.tif 000247
【図１１４】
2019011349.tif 000248
【図１１５】
2019011349.tif 000249
【図１１６】
2019011349.tif 000250
【図１１７】
2019011349.tif 000251
【図１１８】
2019011349.tif 000252
【図１１９】
2019011349.tif 000253
【図１２０】
2019011349.tif 000254
【図１２１】
2019011349.tif 000255
【図１２２】
2019011349.tif 000256
【図１２３】
2019011349.tif 000257
【図１２４】
2019011349.tif 000258
【図１２５】
2019011349.tif 000259
【図１２６】
2019011349.tif 000260
【図１２７】
2019011349.tif 000261
【図１２８】
2019011349.tif 000262
【図１２９】
2019011349.tif 000263
【図１３０】
2019011349.tif 000264
【図１３１】
2019011349.tif 000265
【図１３２】
2019011349.tif 000266
【配列表】
2019011349000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月23日(2018.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物または薬学的に許容されるその塩：
2019011349.tif 000267
。