(57)【要約】      （修正有）【課題】疾患細胞に対するEGFR抗体の細胞毒性を選択的に増強することによる、EGFR+疾患細胞及びそれらを含む腫瘍を治療する方法の提供。【解決手段】(i)セツキシマブが結合するEGFRエピトープに結合する完全アンタゴニストEGFR抗体、又は該抗体のEGFR結合フラグメントもしくは該抗体に基づく単鎖ポリペプチドと、(ii)それにコンジュゲートされた微小管阻害毒素とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、裸の形態の該抗体に比べて(1)EGFR+癌細胞に対しては増強されかつ(2)EGFR+角化細胞に対しては実質的に変わらない細胞毒性効果を有し、該抗体と毒素がリンカーによってコンジュゲートされており、該毒素がDM-1であり、かつ該リンカーがスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)である、イムノコンジュゲート。【選択図】図６
2019069988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)セツキシマブが結合するEGFRエピトープに結合する完全アンタゴニストEGFR抗体、または該抗体のEGFR結合フラグメントもしくは該抗体に基づく単鎖ポリペプチドと、(ii)それにコンジュゲートされた微小管阻害毒素とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、裸の形態の該抗体に比べて(1)EGFR+癌細胞に対しては増強されかつ(2)EGFR+角化細胞に対しては実質的に変わらない細胞毒性効果を有し、該抗体と毒素がリンカーによってコンジュゲートされており、かつ該抗体がセツキシマブ、または、定常領域に1つ、2つもしくはそれ以上の良性の置換を含むセツキシマブ変異体であり、該毒素がDM-1であり、かつ該リンカーがスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)である、イムノコンジュゲート。
【請求項２】
セツキシマブ-SMCC-DM1である、請求項1記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
有効量の請求項1または2記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを混合する工程を含む、EGFR+疾患細胞の治療に有用な薬学的組成物を調製する方法。
【請求項４】
EGFR+疾患細胞に対する細胞毒性量の請求項1または2記載のイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
EGFR+疾患細胞を呈する対象を治療するための薬学的組成物であって、EGFR+疾患細胞に対して細胞毒性である量の請求項1または2記載のイムノコンジュゲートを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
EGFR+疾患細胞が、EGFR+癌細胞である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
EGFR+疾患細胞が、頭頸部の扁平上皮癌の細胞である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項８】
EGFR+疾患細胞が、結腸直腸癌細胞である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項９】
EGFR+疾患細胞が、造血細胞癌の細胞である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
EGFR+疾患細胞が、神経膠芽腫の細胞である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
EGFR+疾患細胞が、腎（renal）、肝臓、腎臓（kidney）、膀胱、乳房、膵臓、胃、卵巣、前立腺、肺、外陰部、子宮頸部および甲状腺の腫瘍細胞から成る群より選択される、請求項5記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、EGFRを発現する癌細胞集団を標的とし、かつメイタンシノイドなどの微小管損傷剤にコンジュゲートされた、パニツムマブまたはセツキシマブなどの抗EGFR抗体を含む、イムノコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗体などの細胞結合タンパク質を強力な細胞殺傷剤にコンジュゲートして、それらの抗癌活性を増強すること、いわゆる「魔法の弾丸」(magic bullet)を提供することは、矛盾したさまざまな臨床結果をもたらしている。
【０００３】
裸の抗体と比べて、イムノコンジュゲートは、しばしば、増強された細胞殺傷効力を示し、これは、抗体により標的化された抗原を発現する癌細胞に対するそれらの活性を増大させる。しかし、同様の効力増加が、同一の抗原を発現する正常細胞にも見られる。特に懸念されるのは、皮膚などの、急速に増殖する組織に対して細胞毒性が高まることである。例えば、メイタンシノイドとCD44v6抗体からなるCD44v6標的イムノコンジュゲートは、癌細胞に対して非常に活性であったが、中毒性表皮壊死症などの深刻な皮膚毒性が理由で中止された。こうした皮膚毒性は、同様にCD44v6を発現する皮膚細胞に対する該イムノコンジュゲートの活性が増大した結果として発生したものである(Tijink et al., Clin Cancer Res, 2006, 12:6064（非特許文献1）)。
【０００４】
別の細胞表面タンパク質である上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor)、つまりEGFRは、多くの腫瘍による該抗原の発現とその迅速な内在化のために、抗癌イムノコンジュゲートの開発のための魅力的な標的となっている。しかし、EGFRは皮膚組織でも発現されるので、抗体セツキシマブおよびパニツムマブなどの、EGFRを標的とする薬剤もまた、投与量の減量を要求するレベルの皮膚毒性、または場合によっては治療の中止が必要となるほど深刻なレベルの皮膚毒性を示す。
【０００５】
イムノコンジュゲートの場合には、これらの抗体の毒性が強力な細胞毒素へのコンジュゲーションを介して増幅される。こうしたことは、すでに正常細胞に対してもともと毒性であった抗体の問題を悪化させる。例えば、毒性のメイタンシノイドとのコンジュゲーションは、CD44v6抗体を介して送達された場合、皮膚細胞に対する重度の毒性を引き起こした。その結果、承認された抗EGFR抗体に基づく抗EGFRイムノコンジュゲートの開発は、このようなイムノコンジュゲートの高まった皮膚毒性に関する懸念のため、継続されていない。抗EGFRイムノコンジュゲートの開発のための代替戦略が推し進められている。
【０００６】
現在、抗EGFRイムノコンジュゲートは、特にこれらの安全性に対する懸念に対処するように、設計されつつある。こうしたコンジュゲートは、EGFRvIIIとして知られた、EGFRの突然変異型であるが天然に存在するバージョンを標的とする抗体に基づいているか、またはEGFRの立体配座の形態に基づいており、これらはいずれも腫瘍細胞上に主に現れるが、皮膚細胞上には現れない(それぞれ、US 7628986（特許文献1）、およびUS 7589180（特許文献2）)。例えば、抗EGFR抗体のMAb806は、癌細胞上にのみ見出されたEGFRエピトープを標的とする抗体であり、全てがヒトの皮膚などの正常な器官へのかなりの結合を示す最近のEGFR抗体に優る利点を提供する可能性がある。この特異性と共に、「最近のEGFR抗体と比較して、MAb 806の最も重要な利点は、MAb 806が細胞毒性薬に直接コンジュゲートされ得ることである」と広く認められており、このアプローチは、「細胞毒性コンジュゲーションがほぼ確実に深刻な毒性を誘発する」(特許文献2)という理由で、他のEGFR抗体では実現不可能である。微小管阻害ペイロード(payload)に連結されたEGFR MAb 806を含むイムノコンジュゲートは、進行した固形腫瘍を有する患者において現在第I相臨床試験中である。
【０００７】
裸の抗EGFR抗体およびそのイムノコンジュゲートをスクリーニングすることによって、EGFRに対する部分的アンタゴニスト活性および角化細胞に対する低減した活性を有するイムノコンジュゲート(US 2012/0156217（特許文献3）参照)、腫瘍微小環境において優先的に活性化される「マスクされた」抗EGFR抗体に基づくイムノコンジュゲート(WO 2009/025846（特許文献4）)、ならびに腫瘍内に優先的に蓄積し正常組織には蓄積しない中程度の親和性を有する抗体に基づくイムノコンジュゲート(WO 2012/100346（特許文献5）)を同定するために、引き続き努力がなされている。これらの戦略の全ては、最近承認された抗EGFR抗体がイムノコンジュゲートとしての開発には適さないと考えられたので、皮膚および他のEGFRを発現する器官に対する毒性を低減させることを目的としている。
【０００８】
本発明の目的は、EGFR+癌細胞を含むEGFR+疾患細胞およびそれらを含む腫瘍を治療するのに有用なイムノコンジュゲートを提供することである。本発明の別の目的は、疾患細胞に対するEGFR抗体の細胞毒性を選択的に増強するための方法を提供することである。この方法により、正常細胞に対する毒性の増強は本質的に回避される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】US 7628986
【特許文献２】US 7589180
【特許文献３】US 2012/0156217
【特許文献４】WO 2009/025846
【特許文献５】WO 2012/100346
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tijink et al., Clin Cancer Res, 2006, 12:6064
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、抗EGFR抗体セツキシマブの毒性メイタンシノイドへの切断不可能なリンカーを介したコンジュゲーションが、それに伴って生じる皮膚細胞に対する細胞毒性の増加なしに、癌細胞に対して増強された細胞毒性を示すイムノコンジュゲートをもたらす、という予期せざる初期の知見から導き出される。本発明者は、癌と角化細胞の両方に対するいくつかの抗EGFR抗体の活性が、メイタンシノイドおよび他の細胞殺傷剤に連結することによって非常に増強されるが、メイタンシノイドコンジュゲート化セツキシマブの活性は癌細胞に対してのみ増強され、角化細胞に対しては増強されないことを実証する。これらの研究では、サポリンなどの、微小管阻害毒素以外の細胞殺傷剤とセツキシマブとのコンジュゲートは、予期されたように、角化細胞に対して顕著に増強された付随する毒性を有することが見出された。
【００１２】
さらに、EGFRで完全なアンタゴニスト活性を有する別の抗体、すなわちパニツムマブもまた、メイタンシノイドなどの微小管阻害ペイロードにコンジュゲートした場合に、角化細胞などのEGFR+正常細胞を温存しながらEGFR+癌細胞に対して毒性を示すことにより、EGFR+細胞で選択的な増強を示すことが実証される。
【００１３】
本明細書に開示されるこれらおよび他の知見に基づいて、本発明は、癌細胞に対する抗体活性を増強するが角化細胞などの正常細胞に対しては増強しない、EGFR抗体と毒性ペイロードとを含むイムノコンジュゲートを作製するために不可欠な構成要素の選択を可能にする。この特性を有するイムノコンジュゲートは、完全なアンタゴニストであるEGFR抗体、微小管阻害薬である毒素、および最も望ましくは切断可能でないリンカーの選択を必要とする。これらの基準を適用することによって、角化細胞などの皮膚細胞を含むEGFR+正常細胞に対する毒性が付随して増加することなく、EGFR+癌細胞に対して顕著な治療活性を有する、EGFR抗体ベースのイムノコンジュゲートが提供される。皮膚細胞に対する毒性の追加的増強の欠如は、決定的に重要な意味を持つ。というのは、裸のEGFR標的抗体が高率発生の皮膚毒性によってすでに特性評価されており、こうした副作用を増強しないことが有益であるからである。
【００１４】
したがって、一般的な局面では、EGFRで完全なアンタゴニスト活性を有する抗体と、切断不可能なリンカーを介してそれにコンジュゲートされた毒素と、を含むイムノコンジュゲートが提供され、該イムノコンジュゲートは、裸形の該抗体に比べてEGFR+角化細胞に対して本質的に増強されていない細胞毒性効果を有する。EGFR+癌細胞に対するイムノコンジュゲートの細胞毒性効果は、増強されることが望ましい。毒性ペイロードは、望ましくは、微小管阻害毒素である。
【００１５】
また、一般的な局面では、EGFR抗体の抗癌活性を、正常なEGFR+細胞に対するその効果を増強することなく、増強するのに有用な方法が提供され、この方法は、
(i)  コンジュゲーションのために、完全EGFRアンタゴニストでありかつEGFRへの結合についてセツキシマブと競合するEGFR抗体を選択する段階；
(ii) EGFR抗体による送達のために、微小管阻害毒素を選択する段階；
(iii)選択されたEGFR抗体と微小管阻害毒素を連結するために、リンカーを選択する段階；および
該抗体と該毒素の間に該リンカーを組み込んだイムノコンジュゲートを作製し、それによって、EGFR+疾患細胞に対して増強されかつ正常なEGFR+角化細胞に対して本質的に増強されていない細胞毒性を有するイムノコンジュゲートを提供する段階を含んでなる。
【００１６】
特定の一局面では、セツキシマブおよびそれにコンジュゲートされた毒素を含むイムノコンジュゲートが提供され、該イムノコンジュゲートは、裸のセツキシマブに比べて、(1)EGFR+癌細胞に対して増強されかつ(2)EGFR+角化細胞に対して実質的に増強されていない細胞毒性効果を有し、ここで、該イムノコンジュゲートは、セツキシマブと、切断不可能なリンカーによってコンジュゲートされたメイタンシノイドDM-1などの微小管阻害毒素とを含む。他の態様では、該セツキシマブは、セツキシマブと同等のもの、例えば、セツキシマブのEGFR結合フラグメント、または受容体への抗体結合もしくは抗体コンジュゲート媒介細胞死滅に影響を与えることなく、抗体の定常領域もしくはフレームワーク領域に1つもしくは2つまたはそれ以上の良性の置換が組み込まれたセツキシマブのEGFR結合変異体である。例えば、キメラセツキシマブは、該抗体のよりヒト様のバージョンを作製するために、標準的な方法を用いてさらにヒト化することができる。あるいは、セツキシマブと機能的に同等であると考えられる、IMC-11F8としても知られるネシツムマブ(necitumumab)などの、完全ヒト抗EGFR抗体は、EGFRに結合してそれを強く阻害することができかつ受容体結合についてセツキシマブと競合する抗体について、ヒトFabライブラリーをスクリーニングすることによって、開発することができる(Li S., Kussie P., Fergusson KM, Structural basis for EGF receptor inhibition by the therapeutic antibody IMC-11F8. Structure. 2008 Feb;16(2):216-27)。
【００１７】
特定の別の局面では、パニツムマブおよびそれにコンジュゲートされた毒素を含むイムノコンジュゲートが提供され、該イムノコンジュゲートは、裸のパニツムマブに比べて、(1)EGFR+癌細胞に対して増強されかつ(2)EGFR+角化細胞に対して実質的に変わらない細胞毒性効果を有し、ここで、該イムノコンジュゲートは、パニツムマブと、切断不可能なリンカーによってコンジュゲートされたメイタンシノイドDM-1などの微小管阻害毒素とを含む。他の態様では、該パニツムマブは、パニツムマブのEGFR結合フラグメントであるか、または1つ、2つもしくはそれ以上の良性の置換が組み込まれているが、親パニツムマブのEGFR結合および阻害特性をまだ維持しているパニツムマブの変異体である。
【００１８】
好ましい態様では、抗体と毒素のコンジュゲーションは、切断不可能なリンカーを用いて達成される。切断不可能なリンカーの場合には、細胞毒性ペイロードの放出が、リソソームによる薬物コンジュゲートの細胞内破壊によって起こる。切断不可能なリンカーは、酸誘発性の切断、光誘発性の切断、ペプチダーゼ誘発性の切断、エステラーゼ誘発性の切断、またはジスルフィド結合の切断に対して実質的に抵抗性であり、一方、任意で使用することができるがあまり好ましくない切断可能なリンカーは、これらの列挙した切断剤の1つ以上により切断され得るリンカーである。こうした切断不可能なリンカーの例は、N-スクシンイミジル-4-(ヨードアセチル)-アミノベンゾエート(SIAB)、N-スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、N-スクシンイミジルブロモアセテート(SBA)、およびN-スクシンイミジル3-(ブロモアセトアミド)プロピオネート(SBAP)からなる群より選択されたハロアセチルベースの部分であるもの、または該ハロアセチルベースの部分から誘導され得るものを含む。あるいは、切断不可能なリンカーは、N-スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、κ-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)、およびN-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)からなる群より選択されたマレイミドベースの部分であるか、または該マレイミドベースの部分から誘導され得る；他の切断不可能なリンカーはマレイミドカプロイルである。(さらなる詳細については、US 2005/0169933; Yoshitake et al, 101 Eur. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem. 56-63 (1984); およびLiu et al, 18 690-697 (1979); ならびにDoronina et al, Bioconjugate Chem., 2006 Jan-Feb;17(1):114-24を参照されたい。)
【００１９】
好ましい態様では、コンジュゲーションは、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)などのリンカーのような切断不可能な架橋試薬を用いて達成される。切断不可能なリンカーの他の有用な形態には、1〜10個の反応性基を導入する、文献に記載されるような、N-スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スルホ-MBS、およびスクシンイミジル-ヨードアセテートが含まれる(Yoshitake et al, 101 Eur. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem. 56-63 (1984); およびLiu et al, 18 690-697 (1979)を参照されたい)。微小管阻害毒素としてのアウリスタチンを連結させるのに特に有用なものは、Bioconjugate Chem., 2006 Jan-Feb;17(1):114-24中にDoroninaらにより記載される切断不可能なマレイミドカプロイルリンカーである。
【００２０】
別の局面では、EGFR+癌細胞に対する細胞毒性量の本発明のEGFR抗体ベースのイムノコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
【００２１】
さらなる局面では、EGFR+癌細胞を治療するための本発明の薬学的組成物の使用が提供される。関連する局面では、EGFR+癌細胞を呈する対象に、EGFR+癌細胞に対する細胞毒性量の本イムノコンジュゲートを投与することを含んでなる、該対象を治療するための方法が提供される。
【００２２】
[本発明1001]
EGFR+疾患細胞に対するEGFR抗体またはそのEGFR結合フラグメントの細胞毒性を、正常なEGFR+細胞に対するその細胞毒性を増強することなく、増強するのに有用な方法であって、
(i)  コンジュゲーションのために、完全EGFRアンタゴニストでありかつEGFRへの結合についてセツキシマブと競合するEGFR抗体または該抗体のEGFR結合フラグメントを選択する段階；
(ii) EGFR抗体またはそのフラグメントによる送達のために、微小管阻害毒素を選択する段階；
(iii)選択されたEGFR抗体と微小管阻害毒素を連結するために、リンカーを選択する段階；および
該抗体と該毒素の間に該リンカーを組み込んだイムノコンジュゲートを作製し、それによって、EGFR+疾患細胞に対して増強されかつEGFR+角化細胞に対して本質的に増強されていない細胞毒性を有するイムノコンジュゲートを提供する段階
を含んでなる、方法。
[本発明1002]
選択された完全アンタゴニストEGFR抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
選択された微小管阻害毒素がメイタンシノイドである、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
選択されたリンカーが切断不可能なリンカー、好ましくはSMCCである、本発明1001、1002または1003の方法。
[本発明1005]
(i)セツキシマブが結合するEGFRエピトープに結合する完全アンタゴニストEGFR抗体、または該抗体のEGFR結合フラグメントもしくは該抗体に基づく単鎖ポリペプチドと、(ii)それにコンジュゲートされた微小管阻害毒素とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、裸の形態の該抗体に比べて(1)EGFR+癌細胞に対しては増強されかつ(2)EGFR+角化細胞に対しては実質的に変わらない細胞毒性効果を有し、該抗体と毒素がリンカーによってコンジュゲートされている、イムノコンジュゲート。
[本発明1006]
前記抗体が、セツキシマブ、または、定常領域に1つ、2つもしくはそれ以上の良性の置換を含むセツキシマブ変異体である、本発明1005のイムノコンジュゲート。
[本発明1007]
前記抗体がパニツムマブである、本発明1005のイムノコンジュゲート。
[本発明1008]
微小管阻害毒素がメイタンシノイドである、本発明1005、1006または1007のイムノコンジュゲート。
[本発明1009]
微小管阻害毒素がDM-1である、本発明1008のイムノコンジュゲート。
[本発明1010]
リンカーが切断不可能なリンカー、好ましくはスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル) -シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)である、本発明1005〜1009のいずれかのイムノコンジュゲート。
[本発明1011]
セツキシマブ-SMCC-DM1である、本発明1005のイムノコンジュゲート。
[本発明1012]
パニツムマブ-SMCC-DM1である、本発明1005のイムノコンジュゲート。
[本発明1013]
EGFR+疾患細胞に対する細胞毒性量の本発明1005〜1012のいずれかのイムノコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1014]
抗癌組成物を作製する方法であって、薬学的に許容される担体と、微小管阻害毒素にコンジュゲートされてイムノコンジュゲートを形成しているEGFR抗体とを組み合わせる段階を含んでなり、該イムノコンジュゲートが、癌細胞および角化細胞に対する裸の該抗体の効果と比べて、癌細胞に対して増強された効果および角化細胞に対して本質的に増強されていない効果を有する、方法。
[本発明1015]
EGFR+疾患細胞を治療するための、本発明1013の薬学的組成物の使用。
[本発明1016]
EGFR+疾患細胞を呈する対象を治療するための方法であって、該対象に、EGFR+疾患細胞に対して細胞毒性である量の本発明1005〜1012のいずれかのイムノコンジュゲートを投与する段階を含んでなる、方法。
[本発明1017]
EGFR+疾患細胞が、頭頸部癌細胞または結腸直腸癌細胞などの、EGFR+癌細胞である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
EGFR+疾患細胞に対する完全アンタゴニストEGFR抗体の効果を、正常なEGFR+細胞に対するその効果を増強することなく、増強するための方法であって、該抗体を微小管阻害毒素に切断不可能なリンカーにより連結する段階を含んでなる、方法。
[本発明1019]
完全アンタゴニストEGFR抗体を用いた治療に応答する腫瘍を呈する対象を治療するための方法であって、該抗体を用いた治療が、角化細胞によるEGFR抗体媒介性の有害応答を誘発するものであり、その改良が、微小管阻害毒素にコンジュゲートされた形態の完全アンタゴニストEGFR抗体を用いて該対象を治療することを含み、それによって、裸の抗体単独による治療に比べて、コンジュゲートされた抗体による治療に対する腫瘍応答が、治療に対する角化細胞の有害応答を本質的に増強することなく、増強される、方法。
本発明のこれらおよび他の局面は、添付の図面を参照して、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】裸の抗EGFR抗体およびそのメイタンシノイドコンジュゲートの角化細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。約2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をWST-8ベースの比色分析により測定した。US 2012/0156217に示された図の複製である。
【図２】裸の抗EGFR抗体およびそのメイタンシノイドコンジュゲートの癌細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。約2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をWST-8ベースの比色分析により測定した。US 2012/0156217に示された図の複製である。
【図３】裸の抗EGFR抗体セツキシマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートのH226癌細胞株に対する細胞毒性を示すグラフである。約2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で72時間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー(alamar blue)細胞生存アッセイにより測定した。
【図４】裸の抗EGFR抗体セツキシマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートのA431癌細胞株に対する細胞毒性を示すグラフである。約2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で72時間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー細胞生存アッセイにより測定した。
【図５】裸の抗EGFR抗体セツキシマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートの正常角化細胞株HaCaTに対する細胞毒性を示すグラフである。約2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー細胞生存アッセイにより測定した。
【図６】裸の抗EGFR抗体セツキシマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートの初代角化細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で72時間または5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー細胞生存アッセイにより測定した。
【図７】裸の抗EGFR抗体パニツムマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートの初代角化細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で72時間または5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー細胞生存アッセイにより測定した。
【図８】裸の抗EGFR抗体パニツムマブおよびそのメイタンシノイドコンジュゲートの初代角化細胞に対する細胞毒性を示すグラフである。2〜3,000細胞/ウェルを平底96ウェル組織培養プレートに播種し、培地中の各種濃度の被験物質と37℃で72時間または5日間インキュベートした。残存する細胞の生存をアラマーブルー細胞生存アッセイにより測定した。
【図９】実施例4で説明するように、本明細書で規定した基準に従って選択されていない要素を組み込んだイムノコンジュゲートによる結果を示す。パニツムマブおよびセツキシマブが非常に強力なEGFR活性化遮断剤であり、そのためコンジュゲーションによって正常角化細胞に対し増強されないが、J2898Aなどの部分的アンタゴニスト抗体は増強されることを示す(図10および11参照)。
【図１０】実施例4で説明するように、本明細書で規定した基準に従って選択されていない要素を組み込んだイムノコンジュゲートによる結果を示す。IMGN (J2989A)による部分的アンタゴニスト抗EGFR抗体がコンジュゲーション(IMGN289)によって正常角化細胞に対して増強されることを示す(さらにSetiady et al, Proceedings of the 104th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2013 Apr 6-10; Washington, DC. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2013;73(8 Suppl): Abstract nr 5463を参照されたい)。
【図１１】実施例4で説明するように、本明細書で規定した基準に従って選択されていない要素を組み込んだイムノコンジュゲートによる結果を示す。セツキシマブ突然変異型抗体6-LC (EGFRに対して部分的アンタゴニストにする低減された親和性を有する)の毒性が切断不可能なリンカーを介したペイロードへのコンジュゲーション(6LC-DM1)によって増強されることを示す。
【図１２】実施例4で説明するように、本明細書で規定した基準に従って選択されていない要素を組み込んだイムノコンジュゲートによる結果を示す。角化細胞に対するパニツムマブおよびパニツムマブ-DM1の効果を示し、切断不可能なリンカーを介したパニツムマブのDM1へのコンジュゲーション(Avid300-DM1)が正常細胞に対するその活性を増加させないことを明らかにする；2C9-DM1は、対照として用いたセツキシマブ-DM1コンジュゲートである。
【図１３】実施例4で説明するように、本明細書で規定した基準に従って選択されていない要素を組み込んだイムノコンジュゲートによる結果を示す。切断可能なリンカー(バリン-シトルリン)によるセツキシマブのMMAE微小管阻害ペイロードへのコンジュゲーション(セツキシマブ2C9-MMAE)が、正常細胞とMDA-MB-468癌細胞の両方に対するその活性を増強するのに対し、切断不可能なリンカー(SMCC)を介したコンジュゲーション(セツキシマブ2C9-DM1)は抗癌活性のみを増強し、それゆえに良好な治療ウィンドウを実証することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
好ましい態様の詳細な説明
本イムノコンジュゲートは、特に角化細胞などの皮膚細胞を含めて、多くの異なる細胞型の表面上に提示されるタンパク質である、ヒト上皮成長因子受容体(hEGFR)に結合する抗体に基づくものである。本明細書で使用する用語「hEGFR」は、ヒトher-1遺伝子の発現されてプロセシングされた産物を含む任意のタンパク質を指し、ここでは該タンパク質は、UniProtKB/Swiss-Prot P00533として指定される。用語EGFRは本明細書では総称的に使用され、野生型タンパク質とその全ての天然に存在する変異体を指す。用語「wtEGFR」は、ヒトEGFRの野生型形態のみに関連して、より特定的に使用される。用語「EGFRvIII」は、エクソン2〜7を欠くher-1遺伝子の変異型の発現されてプロセシングされた産物を含み、そのためher-1のエクソン1および8によりコードされたポリペプチド配列のみを含む、EGFR変異型タンパク質を指す。用語「ドメインIII」は、EGFRvIIIに関係がない代わりに、EGFR内のある位置を指し、EGFリガンドの結合、および高度にアンタゴニストの抗体セツキシマブとパニツムマブの結合にとって鍵となる、細胞外部位を表す(Voigt et al, 2012 November; 14(11): 1023-1031)。
【００２５】
本イムノコンジュゲートは、EGFRで完全アンタゴニストであるEGFR抗体を含む。「完全アンタゴニスト」であるEGFR抗体は、通常の過程では、wtEGFRを介してEGFリガンドにより刺激されるシグナルのwtEGFR結合型チロシンキナーゼへの伝達を完全にまたはほぼ完全に遮断する抗体である。完全アンタゴニストであるEGFR抗体は、特に、EGFRドメインIIIに直接結合するEGFR抗体である。これらの特性および5ナノモル濃度(nM)以下のEGFR結合親和性を有するEGFR抗体は、本イムノコンジュゲートに含めることが特に好ましい。この基準によると、図9に示されるように、少なくとも次の既知抗体は、本イムノコンジュゲートでの使用に適していない：J2898A、インテリマブ(intellimab)6-LC (WO 2012/100346に教示されるセツキシマブ変異体)、ニモツズマブ、およびマツズマブ。
【００２６】
完全アンタゴニストEGFR抗体が毒性ペイロードを送達するために選択される場合、その殺傷効果はEGFR+癌細胞に対してのみ増強され、角化細胞などのEGFR+正常細胞に対しては増強されないことが判明した。EGFR抗体が、部分的アンタゴニスト、すなわち一部のEGF媒介シグナルの伝達を可能にする抗体、である場合は、そうではない。毒素にコンジュゲートした場合、これらの部分的アンタゴニスト抗体は、EGFR+である正常細胞とEGFR+である癌細胞の両方で殺傷効果の増強を示す。
【００２７】
本イムノコンジュゲートは、さらに特定すると、一態様では、Eli Lilly and CompanyからErbitux（登録商標)という商品名で現在市販されている、セツキシマブとして知られるhEGFR抗体に基づいている。セツキシマブは、wtEGFRの細胞外ドメインに特異的に結合する組換えヒト/マウスキメラIgG1抗体である。セツキシマブの重鎖(SEQ ID No.1〜3)とセツキシマブの軽鎖(SEQ ID No.4〜6)の両方のCDRのアミノ酸配列は、本明細書に掲載される。また、セツキシマブの重鎖可変領域(SEQ ID No.7)と軽鎖可変領域(SEQ ID No.8)のアミノ酸配列は、セツキシマブの完全重鎖(SEQ ID No.9)および完全軽鎖(SEQ ID No.10)のアミノ酸配列と共に、掲載される。
【００２８】
本明細書で有用なセツキシマブ変異体は、ヒトEGFRへの結合についてセツキシマブと競合する高度にアンタゴニストのEGFR結合剤である。有用なセツキシマブ変異体は、上述されており、セツキシマブのEGFR結合部位、例えば本明細書に記載した軽鎖および重鎖CDRの全部、を含むセツキシマブのフラグメントが含まれる。本明細書で有用な他のセツキシマブ変異体は、抗原結合ドメインの外側に、例えばフレームワーク領域または定常領域(Fc)に、1つ、2つもしくはそれ以上の置換を組み込んだセツキシマブ変異体である。このような置換は、それらがセツキシマブそれ自体に比べて細胞毒性を低減させない、という意味で良性である。
【００２９】
別の態様では、本イムノコンジュゲートは、Vectibix（登録商標)という商品名で現在市販されている、パニツムマブとして知られるEGFR抗体に基づいている。パニツムマブは、wtEGFRの細胞外ドメインに特異的に結合する組換え完全ヒトIgG2抗体である。パニツムマブの重鎖と軽鎖のアミノ酸配列は、US 6,235,883およびUS 7,807,798に記載される。パニツムマブの有用な代替品は、EGFR結合についてパニツムマブと競合するそのEGFR結合変異体であり、例えば、その抗原結合部位を含むが、定常領域が他の方法で失われているかまたは改変されているパニツムマブのフラグメントである。
【００３０】
本イムノコンジュゲートはまた、上で定義したような完全アンタゴニスト活性を示すという条件で、さらに他のEGFR抗体に基づくことができ、例えば、EGFRのドメインIIIに選択的に結合するEGFR抗体、およびEGFと競合しかつEGFにより刺激された下流シグナリングの伝達を完全にまたはほぼ完全に遮断するその他のEGFR抗体をベースにすることができる。
【００３１】
本イムノコンジュゲートでは、セツキシマブまたはパニツムマブなどの完全アンタゴニストEGFR抗体が、メイタンシノイド毒素などの微小管阻害毒素にコンジュゲートされる。「微小管阻害毒素」とは、例えばチューブリンの形成を阻害するかまたはその組織化を阻害することによる細胞の有糸分裂に重要な微小管構造の妨害によって媒介される細胞毒性を有する、薬剤を意味する。
【００３２】
この毒素ファミリー内には、メイタンシノイドおよびアウリスタチン、ならびに最近開発された同じ作用機序を有する他の多くの薬剤が含まれる。アウリスタチンは、特に、チューブリンの重合を阻害することによって細胞複製をブロックし、したがって抗有糸分裂性である。本明細書で有用な、MMAEまたはベドチン(vedotin)として知られるアウリスタチンの構造は、以下に示される：
2019069988.tif 000003
。
【００３３】
メイタンシノイドの有用なさまざまな形態が存在する。これらは全てが、天然の分子であるメイタンシンの複雑な構造をベースにしている。
【００３４】
特に有用なものは、DM-1およびDM-4を含むメイタンシノイドである。具体的な態様では、EGFR MAbに結合した毒素は、以下に示される構造を有するDM-1である。
【００３５】
また、微小管阻害毒素として有用なものは、ドロスタチン、アウリスタチン、チューブリシン、およびクリプトフィシンである。各属内の有用な種の具体例としては、ドロスタチン10、モノメチルドロスタチン10、アウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、アウリスタチンF、モノメチルアウリスタチンF、HTI-286、チューブリシンM、ならびにチューブリン結合剤、例えばチューブリシンIM-1、チューブリシンIM-2、チューブリシンIM-3、コルヒチンDA、およびメイタンシノイドAP-3、DM-1、DM-4が挙げられる。
【００３６】
セツキシマブまたはパニツムマブなどの完全アンタゴニストEGFR抗体と、メイタンシノイドまたはアウリスタチンなどの微小管阻害毒素とのコンジュゲートは、現在知られているかまたは後で開発される、「切断不可能」なリンカーを連結する任意の技術を用いて、形成することができる。こうしたリンカーは、細胞外環境などの、対象に投与した後で通常遭遇する条件を通してずっと、インタクトのままであり、かつ抗体と毒素を共有結合で保持している。具体的には、切断不可能なリンカーは、細胞毒性ペイロードの放出が細胞内リソソームによる抗体の破壊によって達成されるADC構築物をもたらす。
【００３７】
リンカーを組み込む方法は、例えば、US 5,208,020; US 8,088,387; およびUS 6,441,163に記載される。好ましい方法は、EGFR抗体、例えばセツキシマブ、をスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)で修飾してマレイミド基を導入し、続いて、その修飾抗体をチオール含有メイタンシノイドと反応させて、チオエーテルで連結されたコンジュゲートを得ることである。得られた化学構造を以下に示す。抗体分子あたり1〜10の薬物分子を含むコンジュゲートが生じる。
2019069988.tif 000004
【００３８】
切断不可能なリンカーの他の有用な形態としては、N-スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スルホ-MBS、およびスクシンイミジル-ヨードアセテートが挙げられ、これらは、文献に記載されるように、1〜10個の反応性基を導入する(Yoshitake et al, 101 Eur. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem. 56-63 (1984); およびLiu et al, 18 690-697 (1979)を参照されたい)。微小管阻害毒素としてのアウリスタチンを連結させるのに特に有用なものは、Bioconjugate Chem., 2006 Jan-Feb;17(1):114-24中にDoroninaらにより記載される切断不可能なマレイミドカプロイルリンカーである。
【００３９】
具体的な態様では、本イムノコンジュゲートは、SMCCリンカーによってDM-1に連結されたセツキシマブを含む。
【００４０】
別の具体的な態様では、本イムノコンジュゲートは、SMCCリンカーによってDM-1に連結されたパニツムマブを含む。
【００４１】
したがって、一般的な局面では、EGFR抗体の抗癌活性を、正常なEGFR+細胞へのその効果を増強することなく、増強するのに有用な方法が提供され、この方法は、
(i)  コンジュゲーションのために、完全EGFRアンタゴニストであるEGFR抗体を選択する段階；
(ii) EGFR抗体による送達のために、微小管阻害毒素を選択する段階；
(iii)選択されたEGFR抗体を微小管阻害毒素に連結するために、切断不可能なリンカーを選択する段階；および
該抗体と該毒素の間に該リンカーを組み込んで、EGFR+疾患細胞に対して増強されるが正常なEGFR+細胞に対しては増強されていない細胞毒性を有するイムノコンジュゲートを得る段階を含んでなる。
【００４２】
前述の開示から理解されるように、完全アンタゴニストEGFR抗体は、好ましくはセツキシマブまたはパニツムマブである。微小管阻害毒素は、好ましくはアウリスタチンまたはメイタンシノイドであり、最も好ましくはDM-1である。切断不可能なリンカーは、好ましくはSMCCである。
【００４３】
別の具体的な態様では、完全アンタゴニストEGFR抗体はセツキシマブでない、というただし書きが付く。さらなる具体的な態様では、完全アンタゴニストEGFR抗体はパニツムマブでない、というただし書きが付く。
【００４４】
前記コンジュゲートの治療用製剤は、所望の純度を有するコンジュゲートを任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは安定剤と混合することによって(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編 [1980])、直接治療に使用するために、または貯蔵するために、凍結乾燥製剤もしくは水溶液剤の形態で調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用する投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、以下が含まれる：緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾール)；低分子量(約10残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清、アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばEDTA；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性の対イオン、例えばナトリウム；金属錯体(例：Zn-タンパク質錯体)；および/または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN、PLURONICSまたはポリエチレングリコール(PEG)。
【００４５】
インビボ投与に使用される活性成分は、無菌でなければならない。これは、滅菌膜を通すろ過によって容易に達成される。
【００４６】
持続放出製剤の調製が可能である。持続放出の適切な例は、コンジュゲートを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、該マトリックスは造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセル、の形態である。持続放出マトリックスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えば乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸。エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日以上にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。
【００４７】
前記コンジュゲートは、EGFR+疾患細胞を治療するのに有用である。このような治療は、該疾患細胞を呈する対象において該疾患細胞の数、サイズまたは分布の減少をもたらす。ある態様では、該コンジュゲートは、EGFR+癌細胞およびそれを含む腫瘍であるEGFR+疾患細胞を治療するために使用される。このような治療は、好ましくは、該癌細胞およびそれを含む腫瘍の数、サイズ、体積または分布の減少をもたらすか、あるいは該疾患細胞がそれらを呈する対象において該細胞および腫瘍の数、サイズ、体積または分布の点で増加する速度を少なくとも減少させる。
【００４８】
EGFR+癌細胞を呈する対象は、生検組織などの生理学的サンプル中のタンパク質または核酸前駆物質(DNAまたはRNA)として、該受容体を検出するアッセイを用いて、識別することができる。EGFRタンパク質に適する検査は、FDAにより承認されて市販されているDako社のEGFR pharmDx(登録商標)検査キットである。
【００４９】
EGFR+癌細胞を呈する対象の治療では、前記コンジュゲートの適切な投与量は、上記で定義したような、治療すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、薬剤を予防目的で投与するのかまたは治療目的で投与するのか、以前の治療法、患者の病歴および薬剤に対する応答、ならびに主治医の判断によって決まるだろう。薬剤は、適切には、一度にまたは一連の治療にわたって患者に投与される。
【００５０】
例えば、疾患のタイプおよび重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.1〜20mg/kg)のコンジュゲートは、例えば、1回または複数回の個別の投与であろうと、連続注入であろうと、患者に投与するための候補投与量である。典型的な1日投与量は、上で挙げた要因に応じて、約1μg/kg〜500mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる反復投与の場合には、病状に応じて、疾患の所望の症状抑制が生じるまで治療を継続する。しかし、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。したがって、イムノコンジュゲートの有効量は、単独で有効な量であるか、またはEGFR+疾患細胞の成長または増殖の速度を遅らせるまたは抑制する治療レジメンの一環として有効な量である、ことが理解されよう。
【００５１】
EGFR+疾患細胞は、例えば、EGFR抗体の結合によって、またはher-1をコードする細胞内mRNAの検出によって検出可能であるような、その表面上にEGFRを提示する疾患細胞である。特定のEGFR+疾患細胞には、その表面上に異常に高い密度および/または活性のEGFR分子を有するもの、あるいはEGFRのEGFRvIII変異体の存在を有するものが含まれる。
【００５２】
本コンジュゲートは、最初に負荷用量として、その後は維持用量として、静脈内注入により投与することが有用であり、例えば、90分かけて4mg/kgの初期用量で、その後52週もの間週1回30分かけて2mg/kgで、必要に応じて追跡調査しながら、投与することができる。パニツムマブコンジュゲートの具体的な事例では、投薬はパニツムマブそれ自体のために利用されるものに基づいてよく、2週間に1回6mg/kgを1時間の注入として投与することを含む。
【００５３】
本コンジュゲートは、造血細胞癌および固形腫瘍などの、EGFR+癌細胞およびそれを含む腫瘍の成長または増殖を抑制するために、さまざまな癌の治療において有用である。治療される疾患または障害としては、良性または悪性の腫瘍(例えば、腎(renal)、肝臓、腎臓(kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、および甲状腺)；肝癌；肉腫；神経膠芽腫；種々の頭頸部腫瘍；白血病およびリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。特定の態様では、該抗体または二価フラグメントは、本明細書に開示されるスクリーニングアッセイにより判別されるような、EGFRvIIIを発現する癌細胞の治療に使用される。特定の態様では、癌細胞は、頭頸部癌、特に頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、胃腸癌、神経膠芽腫などの脳腫瘍、非小細胞肺癌などの肺の腫瘍、ならびに乳房、膵臓、食道、腎臓、卵巣、子宮頸部および前立腺の腫瘍を含む、EGFR+提示癌細胞である。具体的な態様では、EGFR+癌は、セツキシマブがFDAの販売承認を受けている癌、例えば、頭頸部の扁平上皮癌および結腸直腸癌である。
【００５４】
本発明の方法から恩恵を受けることができる対象は、ヒトだけでなく、家畜、ペットなどの哺乳動物を含むことが理解されよう。
【００５５】
他の治療レジメンを本発明のコンジュゲートの投与と併用することが可能である。例えば、治療される患者は、体外照射などの放射線療法を受けてもよい。これとは別に、またはこれに加えて、化学療法剤を患者に投与してもよい。このような化学療法剤の調合および投薬計画は、メーカーの指示に従って、または当業者により経験的に決定されるように、使用することができる。化学療法剤の調合および投薬計画は、Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)にも記載される。化学療法剤は、コンジュゲートの投与に先行しても、後に続いてもよく、それと同時に投与することもできる。コンジュゲートは、任意の抗癌毒素、またはその他の適当な薬物、特にイリノテカン(CPT-11)、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびトポテカンなど、ならびにチロシンキナーゼ阻害剤、特にEGFRキナーゼ阻害剤、例えば、AG1478 ((4-(3-クロロアニリノ-6,7-ジメトキシキナゾリン)、ゲフィチニブ(イレッサ(登録商標))、エルロチニブ(タルセバ(登録商標))、ラパチニブ(タイケルブ(登録商標))、カネルチニブ(PD183805, Pfizer社)、PKI-166 (Novartis社)、PD158780およびペリチニブなどと組み合わせることができる。
【００５６】
また、他の腫瘍関連抗原もしくはそれらのリガンドに対する抗体またはコンジュゲートを投与することが望ましい場合もあり、例えば、ErbB2(例えば、ハーセプチン(登録商標)として販売されるトラスツズマブ、およびオムニターグ(登録商標)として販売されるペルツズマブ)、ErbB3、ErbB4、もしくは血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体、および/またはEGFもしくはTGFαに結合する抗体などを投与する。
【００５７】
本発明の別の態様では、本明細書に記載の疾患を治療するのに有用な量のコンジュゲートを含有する製品が提供される。この製品は容器とラベルを含む。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの各種材料から形成することができる。容器は、疾患を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、該容器は皮下注射針で穿刺可能なストッパー付きの静脈内用溶液バッグまたはバイアルであり得る)。容器上のまたは容器に付随するラベルは、該組成物が癌状態を治療するために使用されることを表示する。前記製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第2の容器をさらに含むことができる。それはさらに、商業上および使用上の観点から望ましい他の物質、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書と共に添付文書を含むことができる。
【００５８】
本発明による抗癌イムノコンジュゲートは、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と一緒に単位剤形で投与することができる。該コンジュゲートの単位用量は、適切には、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mgおよび400mgである。この薬物は、単回使用バイアル中に20mg/mLなどの濃度で、例えば0.9％生理食塩水などのビヒクル5mL中に100mg、10mL中に200mg、または20mL中に400mgの濃度で、製剤化することができる。
【００５９】
投与経路は、適切であればどのような経路を採用してもよく、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、嚢内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、経肺、または経口投与が使用される。
【実施例】
【００６０】
実施例1−セツキシマブ-SMCC-DM1コンジュゲートの調製(A〜H)
A.  セツキシマブ抗体の調製および測定
セツキシマブは、切断不可能なヘテロ二官能性架橋試薬SMCCを用いてDM1にコンジュゲートするために、公開市場から入手するか、またはWO 2012/100346に記載のように作製する。
【００６１】
次に、セツキシマブ抗体は50mMリン酸カリウム、50mM塩化ナトリウム、2mM EDTA; pH6.5緩衝液(緩衝液A)にバッファー交換した。この実験での全ての緩衝液は、発色性のカブトガニ血球抽出物(Limulus amoebocyte lysate: LAL)試験法(Cambrex社)を用いて、エンドトキシンが存在しないことを検査した。抗体の濃度は、280nmで1.45mL/mg/cmの吸光係数および145,781gの分子量を用いて測定した。
【００６２】
B.  SMCC原液の調製および測定
SMCCの20mM溶液(6.69mg/mL)(Concortis Biosystems Corp.)をDMSO中に調製した。この溶液をアッセイ緩衝液で1/40に希釈し、サンプルの吸光度を302nmで測定した。原液の濃度は、602/M/cmのモル吸光係数を用いて算出した。
【００６３】
C.  DM1原液の調製および測定
DM1(遊離チオール形態；Concortis Biosystems Corp.)の10mM溶液をDMA中に調製した(7.37mg/mL)。エタノール中の原液の希釈物の吸光度を280nmで測定した。原料DM1の濃度は、280nmで5700/M/cmのモル吸光係数を用いることにより算出した。原料DM1調製物中の遊離-SHの濃度は、エルマン試薬(DTNB)を用いて測定した。3％(v/v) DMAにしたアッセイ緩衝液中に該原液の希釈物を調製し、その後DMSO中の100mM DTNB(1/100容量)を添加した。412nmでの吸光度の増加を試薬ブランクに対して測定し、14150/M/cmの吸光係数を用いて濃度を算出した。エルマンアッセイから得られた-SHの濃度は、コンジュゲーション条件の計算においてDM1原液の濃度を表すために使用した。
【００６４】
D.  SMCC架橋剤によるセツキシマブの修飾
抗体は、20mg/mLの抗体で7.5倍モル過剰のSMCCを用いて修飾した。反応は、DMSO(5％v/v)を含む緩衝液A(95％v/v)中で撹拌しながら室温にて2時間行った。
【００６５】
E.  過剰のSMCCを除去するためのG25クロマトグラフィー
セツキシマブ-SMCC反応混合物は、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲルろ過した。負荷量と溶出量は、メーカーの指示(Amersham Biosciences社)に従った。修飾抗体の溶液の濃度は、上述した吸光係数を用いて分光光度法により測定した。
【００６６】
F.  セツキシマブ-SMCCとDM1とのコンジュゲーション
修飾抗体を1.7倍過剰のDM1とリンカーを介して(抗体あたり5リンカーと仮定して)反応させた。この反応は、DMA(6％v/v)を含む緩衝液A(94％v/v)中の10mg/mLの抗体濃度で行った。DM1の添加後、反応物を撹拌しながら室温で16.5時間インキュベートした。
【００６７】
G.  G25クロマトグラフィーによるコンジュゲーション精製
コンジュゲーション反応混合物は、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS), pH6.5(緩衝液B)で平衡化したセファデックスG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲルろ過した。負荷量と溶出量は、メーカーの指示(Amersham Biosciences社)に従った。セツキシマブのモルあたりに連結されたDM1分子の数は、溶出物質の252nmと280nmの両方での吸光度を測定することによって決定した。DM1/抗体比は、2および4であると分かった。得られたコンジュゲートを結合および細胞毒性について分析した。
【００６８】
H.  セツキシマブ-SMCC-DM1の試験
これらの研究において使用した細胞株は、以下の特徴を有する：
A431：ヒト外陰部上皮癌細胞株；ATCCから入手可能；96ウェルプレートで100μl/ウェルのDMEM-10％FBS中に4000細胞/ウェルで播種した。
H226：肺扁平上皮癌細胞株；ATCCで入手可能；96ウェル培養プレートで100μl/ウェルのRPMI-10％FBS中に4000細胞/ウェルで播種した。
MDA-MB-468：乳腺/乳房；転移部位：胸水に由来；ATCCから入手可能；ウシ胎児血清を10％の最終濃度まで添加した、ATCC配合のライボビッツ(Leibovitz's)L-15培地(カタログ番号30-2008)中に4000細胞/ウェルで播種した；96ウェルプレートに100μl/ウェル。
HaCaT：組織学的に正常な皮膚に由来するインビトロで自然に形質転換した角化細胞；武漢大学のタイプ・カルチャー・コレクションの中国センターから入手可能；96ウェル培養プレートで100μl/ウェルのDMEM-10％FBS中に2000細胞/ウェルで播種した。
HEKa：正常ヒト初代表皮角化細胞、成人；PromoCell GmbHから入手可能；100μl/ウェルのEpiLife培地、EpiLife培地 #MEP1500CA, Invitrogen社、＋HKGSヒト角化細胞増殖サプリメント(#S-001-5)中に4000細胞/ウェルで播種した。
【００６９】
結合研究は、DM1への抗体のコンジュゲーションがKDに影響を与えなかったことを示した；裸のセツキシマブ抗体とセツキシマブ-SMCC-DM1コンジュゲートの両方は、表面プラズモン共鳴によりEGFRに対して同じ結合親和性を有していた(約0.3nM、表1)。サンプルのインビトロ細胞毒性の評価は、セツキシマブ-SMCC-DM1コンジュゲートが癌細胞株に対してセツキシマブと比較して顕著により細胞毒性である(図3および4)が、驚くべきことに、セツキシマブ-SMCC-DM1と裸のセツキシマブは角化細胞に対して同じ細胞毒性を有する(図5および6)ことを示した。
【００７０】
（表１）DM1へのコンジュゲーションがセツキシマブKDに及ぼす影響
2019069988.tif 000005
【００７１】
異なるEGFR MAb(huML66およびhuEGFR-7R)に対するDM1コンジュゲーションの影響は、ImmunoGen社の公開された米国特許出願第2012/0156217号に実証されており、本明細書における図1および2は、その出願に添付されている図面の複製である。より具体的には、図1に示すように、huML66-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-SMCC-DM1イムノコンジュゲートを作製するための、抗EGFR抗体huML66およびhuEGFR-7Rのメイタンシノイドへのコンジュゲーションは、正常な角化細胞に対する細胞毒性を増加させる。同様に、予想された通り、huML66-SMCC-DM1およびhuEGFR-7R-SMCC-DM1イムノコンジュゲートを作製するための、抗EGFR抗体huML66およびhuEGFR-7Rのメイタンシノイドへのコンジュゲーションは、H226癌細胞株に対する該抗体の細胞毒性を著しく増強させる(図2)。
【００７２】
図3および4に示すように、セツキシマブ-SMCC-DM1イムノコンジュゲート(HC-LC/DM1)を作製するための、抗EGFR抗体セツキシマブ(HC-LC)のDM1コンジュゲーションは、予想された通り、図3に示すように、癌細胞に対する該抗体の細胞毒性を大いに増強させる。図4に示すように、これもまた予想された通り、セツキシマブ-SMCC-DM1イムノコンジュゲート(HC-LC/DM1)を作製するための、抗EGFR抗体セツキシマブ(HC-LC)のメイタンシノイドへのコンジュゲーションは、癌細胞に対する該抗体の細胞毒性を大いに増強させる。
【００７３】
しかし、まったく驚くべきことに、図5および6に示すように、セツキシマブ-SMCC-DM1イムノコンジュゲート(HC-LC/DM1)を作製するための、抗EGFR抗体セツキシマブ(HC-LC)のメイタンシノイドへのコンジュゲーションは、これらの薬剤の実質的に同じIC50値に反映されるように、角化細胞に対する細胞毒性を増加させなかった(裸抗体のIC50 0.4324に対してコンジュゲートのIC50 0.8269；図5、HaCaT-正常ヒト角化細胞株、裸抗体のIC50 0.9348に対してコンジュゲートのIC50 2.210；図6、HEKa-初代ヒト角化細胞)。本明細書で使用されるIC50は、細胞の50％を殺傷するのに必要な薬物の濃度を指す。
【００７４】
細胞毒性が増加するか否かの尺度は、アラマーブルー細胞生存アッセイを用いてもたらされたIC50値を比較することによって、上記で決定される(各実験は96ウェルプレートで三つ組にて行った)。1対数オーダー内の差は、有意とみなされず、細胞毒性に変化がないことを示すと考えられ、一方、1対数オーダーより大きい差は、細胞毒性に大きな変化があることを示す。
【００７５】
実施例2−霊長類での評価
カニクイザル種は、皮膚副作用を含めて、抗EGFR抗体の毒性を評価するための有益な高度予測モデルであることが以前に実証されている。EGFRを標的とする抗体についてのカニクイザルとヒトとの毒性データの高レベルの相関は、一部には、該抗体について非常に類似したKD値をもたらすサルおよびヒトEGFR受容体間の高度の相同性によるものである：
【００７６】
（表１）ヒトおよびカニクイザルEGFRへのセツキシマブとパニツムマブの結合親和性は、種を超えて一致している。ヒトEGFR(huEGFR)およびカニクイザルEGFR(cyEGFR)の組換え細胞外ドメインを用いたELISAにおいて最大結合の半量を達成するのに必要とされる抗体濃度(ピコモル濃度、pM)として定義される見かけの抗体親和性。出典：Koefoed et al, MABs. 2011 Nov-Dec; 3(6):584-595。
2019069988.tif 000006
【００７７】
セツキシマブ-SMCC-DM1イムノコンジュゲートは、特に、コンジュゲート化毒素が正常細胞に及ぼす抗体副作用の有意な増強を確認するために、霊長類で試験した。とりわけ、裸の完全アンタゴニスト抗EGFR抗体の場合に予想される副作用に比べて、質的に異なりかつ/または有意に悪化する皮膚副作用に対して細心の注意を払った。
【００７８】
この研究では最初に2匹の雄カニクイザルを使用し、これらの動物をケタミンで落ち着かせ、イソフルランで麻酔して抗体-薬物コンジュゲートの静脈内投与を容易にし、該コンジュゲートを10mg/kgで投与した。その後、急性毒性の全身兆候のために犠牲にする前に、動物を5日間観察し、さらに試験した。
【００７９】
詳細な病理組織学的分析は、重篤な皮膚科学的毒性または裸のセツキシマブ治療の結果として予想されるもの以外の他の深刻な質的に新しい皮膚副作用がないことを明らかにした。また、これらの動物には他の深刻なオンターゲット(on-target)の毒性が認められず、本発明のADCの安全性および裸抗体の著しい毒性増悪の欠如を実証している。
【００８０】
急性霊長類研究の無事完了に続いて、反復投与安全性試験を追加の動物で開始した。ADCを10mg/kgの用量で3週間に1回、4サイクルにわたって投与した。この用量および計画は、霊長類およびヒトにおいて他のADCの場合によく使用される投与計画に基づいて選択された(Poon KA et al, Preclinical safety profile of trastuzumab emtansine (T-DM1): mechanism of action of its cytotoxic component retained with improved tolerability. Toxicol Appl Pharmacol. 2013 Dec 1;273(2):298-313; カドサイラ(Kadcyla：商標)についてのFDA添付文書、2014年2月24日アクセス：
http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/1254271bl.pdf)。
【００８１】
ADCの予想された副作用である可逆的肝酵素上昇を別にすれば、裸のセツキシマブによる治療の結果としてすでに予想されたもの(セツキシマブのカニクイザルデータは、http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/bla/2004/125084_ERBITUX_PHARMR_P3.PDFで利用可能)以外の他の深刻かつ/もしくは質的に新しい皮膚副作用または他のオンターゲットの副作用は、この進行中の研究においてこれまで観察されていない。以前に抗CD44v6 ADC(これもまた、SMCC-DM1ペイロード技術を使用しており、正常な角化細胞により発現される抗原を標的とする)で報告された重度の皮膚毒性および中毒性表皮壊死症は、この研究では観察されていない(Tijink et al., Clin Cancer Res, 2006, 12:6064)。これらの安全性データは、完全アンタゴニストの裸の抗EGFR抗体のオンターゲット毒性が細胞毒性ペイロードへのコンジュゲーションの結果として有意には増強されない、というインビトロ結果をさらに立証する。
【００８２】
実施例3−パニツムマブ-SMCC-DM1コンジュゲートの調製(A〜H)
DM-1コンジュゲート化パニツムマブは、本質的にセツキシマブについて上述したように調製した。具体的には、以下の通りである。
【００８３】
A.  パニツムマブ抗体の調製および測定
パニツムマブは、切断不可能なヘテロ二官能性架橋試薬SMCCを用いてDM1にコンジュゲートするために、公開市場から入手するか、またはUS 6,235,883もしくはUS 7,807,798に記載のように調製する。
【００８４】
次に、パニツムマブ抗体は50mMリン酸カリウム、50mM塩化ナトリウム、2mM EDTA; pH6.5緩衝液(緩衝液A)にバッファー交換した。この実験での全ての緩衝液は、発色性のカブトガニ血球抽出物(Limulus amoebocyte lysate: LAL)試験法(Cambrex社)を用いて、エンドトキシンが存在しないことを検査した。抗体の濃度は、280nmで1.45mL/mg/cmの吸光係数および145,781gの分子量を用いて測定した。
【００８５】
B.  SMCC原液の調製および測定
SMCCの20mM溶液(6.69mg/mL)(Concortis Biosystems Corp.)をDMSO中に調製した。この溶液をアッセイ緩衝液で1/40に希釈し、サンプルの吸光度を302nmで測定した。原液の濃度は、602/M/cmのモル吸光係数を用いて算出した。
【００８６】
C.  DM1原液の調製および測定
DM1(遊離チオール形態；Concortis Biosystems Corp.)の10mM溶液をDMA中に調製した(7.37mg/mL)。エタノール中の原液の希釈物の吸光度を280nmで測定した。原料DM1の濃度は、280nmで5700/M/cmのモル吸光係数を用いることにより算出した。原料DM1調製物中の遊離-SHの濃度は、エルマン試薬(DTNB)を用いて測定した。原液の希釈物は、3％(v/v) DMAにしたアッセイ緩衝液中に調製し、その後、DMSO中の100mM DTNB(1/100容量)を添加した。412nmでの吸光度の増加を試薬ブランクに対して測定し、14150/M/cmの吸光係数を用いて濃度を算出した。エルマンアッセイから得られた-SHの濃度は、コンジュゲーション条件の計算においてDM1原液の濃度を表すために使用した。
【００８７】
D.  SMCC架橋剤によるパニツムマブの修飾
抗体は、20mg/mLの抗体で7.5倍モル過剰のSMCCを用いて修飾した。反応は、DMSO(5％v/v)を含む緩衝液A(95％v/v)中で撹拌しながら室温にて2時間行った。
【００８８】
E.  過剰のSMCCを除去するためのG25クロマトグラフィー
パニツムマブ-SMCC反応混合物は、緩衝液Aで平衡化したセファデックスG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲルろ過した。負荷量と溶出量は、メーカーの指示(Amersham Biosciences社)に従った。修飾抗体の溶液の濃度は、上述した吸光係数を用いて分光光度法により測定した。
【００８９】
F.  パニツムマブ-SMCCとDM1とのコンジュゲーション
修飾抗体を1.7倍過剰のDM1とリンカーを介して(抗体あたり5リンカーと仮定して)反応させた。この反応は、DMA(6％v/v)を含む緩衝液A(94％v/v)中の10mg/mLの抗体濃度で行った。DM1の添加後、反応物を撹拌しながら室温で16.5時間インキュベートした。
【００９０】
G.  G25クロマトグラフィーによるコンジュゲーション精製
コンジュゲーション反応混合物は、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH6.5(緩衝液B)で平衡化したセファデックスG25樹脂の1.5×4.9cmプレパックカラムを通してゲルろ過した。負荷量と溶出量は、メーカーの指示(Amersham Biosciences社)に従った。パニツムマブのモルあたりに連結されたDM1分子の数は、溶出物質の252nmと280nmの両方での吸光度を測定することによって決定した。DM1/抗体比は、2および4であると分かった。得られたコンジュゲートを結合および細胞毒性について分析した。
【００９１】
H.  パニツムマブ-SMCC-DM1の試験
これらの研究において使用した細胞株は、以下の特徴を有する：
MDA-MB-468：乳腺/乳房；転移部位：胸水に由来；ATCCから入手可能；ウシ胎児血清を10％の最終濃度まで添加した、ATCC配合のライボビッツ(Leibovitz's)L-15培地(カタログ番号30-2008)中に4000細胞/ウェルで播種した；96ウェルプレートに100μl/ウェル。
HaCaT：組織学的に正常な皮膚に由来するインビトロで自然に形質転換した角化細胞；武漢大学のタイプ・カルチャー・コレクションの中国センターから入手可能；96ウェル培養プレートで100μl/ウェルのDMEM-10％FBS中に2000細胞/ウェルで播種した。
【００９２】
角化細胞を用いたインビトロ研究は、パニツムマブの微小管阻害毒素への切断不可能なリンカーを介したコンジュゲーションがこの抗体の毒性を増強させないことを実証する。得られたADCは、裸のパニツムマブとだけでなく、完全アンタゴニスト抗体のセツキシマブに基づいた別のADCとも同様の角化細胞に対する安全性プロファイルを有する。MDA-MB-468癌細胞に対しては、該抗体を微小管阻害毒素に切断不可能なリンカーを介してコンジュゲートした結果として、パニツムマブの抗癌活性の大幅な増強が観察される。毒性の観察と同様に、パニツムマブベースのADCは、セツキシマブベースのADCと同様に活性であった。
【００９３】
実施例4−部分的アンタゴニストEGFR MAbコンジュゲートを用いた結果
本明細書で推奨されるものとは異なるイムノコンジュゲート成分を選択することの影響は、添付の図面に示される。図9は、J2989Aと指定された部分的アンタゴニストEGFR抗体が、DM-1にコンジュゲートした場合、正常な角化細胞に対して増強された活性を有することを示す。図10は、同様に、6-LC (EGFRに対してより低い相対的親和性を有するセツキシマブの置換変異体)と指定された別の部分的アンタゴニスト抗体が、DM-1にコンジュゲートした場合、やはり正常な角化細胞に対して増強された活性を有することを示す。図11は、角化細胞へのパニツムマブの効果が、DM-1にコンジュゲートした場合、角化細胞に対しては増強されないが、該コンジュゲートの抗癌効果は劇的に増強されることを示す(図12)。そして、図13は、セツキシマブのMMAEへの切断可能リンカー(バリン-シトルリン)によるコンジュゲーションが、正常細胞とMDA-MB-468癌細胞に対するその毒性を増強させるのに対し、切断不可能なリンカー(SMCC)を介したコンジュゲーションは抗癌活性を増強させることを示す。
【００９４】
したがって、これらの研究では、完全アンタゴニスト抗EGFR抗体のみが、切断不可能なリンカーを介したペイロードのコンジュゲーションによって、正常細胞に対して増強されなかったが、部分的アンタゴニストEGFR抗体の正常細胞に対する毒性は、コンジュゲーションによって増強された。さらに、本発明者らは、その後、ペイロードの作用機序を同じ(すなわち、微小管阻害薬)に維持しながら、切断可能なリンカー対切断不可能なリンカーのこの活性プロファイルに及ぼす影響を調べた。抗体は、Doronina et al, Nature Biotechnology Nov 7, 2003, Vol 21: pp 778-784に記載されるように、微小管阻害ペイロードMMAEに切断可能リンカーを介してコンジュゲートした。切断可能リンカーのデータは、完全アンタゴニスト抗体を切断可能リンカーを介してそのペイロードにコンジュゲートした場合、正常細胞に対するその毒性が増強されることを実証する。かくして、安全な抗EGFR ADCは、切断不可能なリンカーによって微小管阻害ペイロードに連結された、強力なアンタゴニストの抗EGFR抗体を組み込むべきである。
【００９５】
添付の特許請求の範囲は、実施例に記載された好ましい態様によって限定されるものではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【００９６】
参照配列
2019069988.tif 000007
【図１】
2019069988.tif 000008
【図２】
2019069988.tif 000009
【図３】
2019069988.tif 000010
【図４】
2019069988.tif 000011
【図５】
2019069988.tif 000012
【図６】
2019069988.tif 000013
【図７】
2019069988.tif 000014
【図８】
2019069988.tif 000015
【図９】
2019069988.tif 000016
【図１０】
2019069988.tif 000017
【図１１】
2019069988.tif 000018
【図１２】
2019069988.tif 000019
【図１３】
2019069988.tif 000020
【配列表】
2019069988000001.app