(57)【要約】      （修正有）【課題】フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法の提供。【解決手段】溶液中に存在するフィブリノーゲンモノマーがイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる工程、樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出緩衝液で溶出させる工程、及び溶出したフィブリノーゲンモノマーを、孔径が約１５ｎｍから約３５ｎｍの範囲のフィルターで濾過する工程を含む、フィブリノーゲンを精製する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって：
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法。
【請求項２】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法。
【請求項３】
第１および第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は同じである、請求項２に記載の前記方法。
【請求項４】
工程（ｉｉ）で回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることをさらに含む、請求項１に記載の前記方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）および／または工程（ｉｖ）で回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることをさらに含む、請求項２または３に記載の前記方法。
【請求項６】
工程（ｉ）の前に、原材料を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項７】
陰イオン交換樹脂が強陰イオン交換樹脂である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項８】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を、約１５０ｍＭから約２７０ｍＭのＮａＣｌの存在下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
フィブリノーゲンを、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる、請求項４〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
フィブリノーゲンを、遊離アミノ酸を約０．５〜１０％ｗ／ｖの濃度で含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる、請求項７項に記載の前記方法。
【請求項１１】
遊離アミノ酸がアルギニンである、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）の前に、原材料にウイルス不活性化工程を行う、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂から回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液に、ウイルス不活性化工程を行う、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料または溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる前に、該溶液にウイルス不活性化工程を行う、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１５】
ウイルス不活性化工程は、低温殺菌または有機溶媒および界面活性剤による処理を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１６】
原材料が可溶化した血漿寒冷沈降物である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）の前に、原材料からビタミンＫ依存性タンパク質を除去するか、または低減させる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１８】
原材料に水酸化アルミニウムを添加してビタミンＫ依存性タンパク質を原材料から沈殿させることによって、ビタミンＫ依存性タンパク質を除去するか、または低減させる、請求項１７に記載の前記方法。
【請求項１９】
工程（ｉ）の前に、原材料にグリシンを添加することによってフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を原材料から沈殿させ、沈殿したタンパク質を回収し、沈殿したタンパク質を可溶化し、可溶化したタンパク質を工程（ｉ）において疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させることをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２０】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料または溶液のｐＨが約６．５から約８．５である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２１】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料および／または溶液を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させる前に、該疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を約６．５から約８．５のｐＨで平衡化する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２２】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は、メルカプトエチルピリジン、ｎ−ヘキシルアミンおよびフェニルプロピルアミンからなる群から選択されるリガンドを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２３】
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は、ｎ−ヘキシルアミンを含む、請求項２２に記載の前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法によって回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液。
【請求項２５】
全タンパク質の少なくとも８０％のフィブリノーゲンを含む、請求項２４に記載の溶液。
【請求項２６】
（ａ）全タンパク質の少なくとも７５％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１μｇ未満のプラスミノーゲン：
を含む溶液。
【請求項２７】
全タンパク質１ｍｇ当たり１．５×１０−５Ｕ未満の第ＩＩ因子をさらに含む、請求項２６に記載の溶液。
【請求項２８】
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５０ｎｇ未満のプラスミノーゲン：
を含む溶液。
【請求項２９】
（ａ）全タンパク質１ｍｇ当たり３．５×１０−６Ｕ未満の第ＩＩ因子；および／または
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５０μｇ未満のフィブロネクチン：
をさらに含む、請求項２８に記載の溶液。
【請求項３０】
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり２０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ未満のプラスミノーゲン：
を含む溶液。
【請求項３１】
（ａ）全タンパク質１ｍｇ当たり２．７×１０−６Ｕ未満の第ＩＩ因子；および／または
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５μｇ未満のフィブロネクチン：
をさらに含む、請求項３０に記載の溶液。
【請求項３２】
全タンパク質の少なくとも８０％のモノマーフィブリノーゲンを含む、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項３３】
フィブリノーゲンは、約０℃から約８℃の温度で溶液を貯蔵して少なくとも４週間後に約９０％から１００％の活性を保持している、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項３４】
フィブリノーゲンは、約３０℃の温度で溶液を貯蔵して５週間後に約６０％から約７０％の活性を保持している、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項３５】
請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の溶液および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項３６】
少なくとも５ｍＬの容量を有し、フィブリノーゲンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬ含む、請求項３５に記載の前記医薬製剤。
【請求項３７】
少なくとも５ｍＬの容量を有し、フィブリノーゲンを少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ含む、請求項３５に記載の前記医薬製剤。
【請求項３８】
フィブリノーゲン不足に関連した症状を治療または予防する方法であって、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の溶液または請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の医薬製剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
症状が、無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症および異常フィブリノーゲン血症からなる群から選択される、請求項３８に記載の前記方法。
【請求項４０】
フィブリノーゲン不足に関連した症状を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の溶液の使用。
【請求項４１】
症状は、無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症および異常フィブリノーゲン血症からなる群から選択される、請求項４０に記載の前記使用。
【請求項４２】
請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の溶液を含むフィブリン糊。
【請求項４３】
安定な液体フィブリノーゲン溶液を生産する方法であって：
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法。
【請求項４４】
安定な液体フィブリノーゲン溶液を生産する方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲンを含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法。
【請求項４５】
回収した溶液中におけるフィブリノーゲンは、約０℃から約８℃の温度で貯蔵して少なくとも４週間後に約９０％から１００％の活性を保持している、請求項４３または４４に記載の前記方法。
【請求項４６】
回収した溶液中におけるフィブリノーゲンは、約３０℃の温度で貯蔵して少なくとも５週間後に約６０％から約７０％の活性を保持している、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも５ｍＬの安定した薬学的に許容されるフィブリノーゲン溶液を含有する容器であって、フィブリノーゲンの濃度は少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、前記容器。
【請求項４８】
フィブリノーゲンを精製する方法であって：
（ｉ）溶液中に存在するフィブリノーゲンモノマーがイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる工程；
（ｉｉ）該樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出緩衝液で溶出させる工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの溶出したフィブリノーゲンモノマーを、孔径が約１５ｎｍから約３５ｎｍの範囲のフィルターで濾過する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、少なくとも１種の治療タンパク質を含有する溶液中における不純物のレベルを低下させる方法および得られた治療タンパク質含有溶液に関する。より具体的には、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）を含む原材料中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼのレベルを低下させる方法に関する。本発明はまた、一般的に、このような方法によって回収されたフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液および医薬製剤ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に生じるタンパク質、または組換え治療タンパク質を含む溶液から前記タンパク質を精製する現行法では通常、少なくとも数種の不純物が最終調製物に持ち越される。場合によっては、プロテアーゼなどの不純物が存在すると、特に貯蔵中に溶液中の治療タンパク質の安定性が損なわれる。このため、多くの治療タンパク質は、凍結乾燥調製物または凍結調製物として貯蔵される。
【０００３】
安定性を損なうレベルの不純物は、多くの様々な種類の治療タンパク質に影響を及ぼす可能性があり、このことは止血の維持に使用される治療タンパク質では特に問題である。止血は、血管への損傷（例えば、破裂）後の出血を防御する重要な生理学的プロセスである。止血を促進するには、３つの基本的な機構：（ｉ）血管収縮、（ｉｉ）破裂部位の血小板凝集、；および（ｉｉｉ）血液凝固がある。血液凝固中、損傷を受けた内皮細胞は、組織因子（第ＩＩＩ因子）を放出し、これは次にＣａ２＋の補助により第ＶＩＩ因子を活性化する。活性化した血小板によって放出された第ＸＩＩ因子は、第ＸＩ因子を活性化する。活性化した第ＶＩＩ因子および第ＸＩ因子は、第Ｘ因子の活性化を導く酵素反応のカスケードを促進する。活性のある第Ｘ因子（第Ｘａ因子）は、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、Ｃａ２＋および血小板トロンボプラスチン因子（ＰＦ３）と共に、プロトロンビン活性化因子を活性化する。プロトロンビン活性化因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換し、トロンビンはフィブリノーゲン（第Ｉ因子）をフィブリンに変換し、フィブリンは損傷部位を覆う最初の網目を形成する。最初の網目は次に、第ＸＩＩＩ因子によって密集したフィブリン血餅に変換され、部位が修復されるまで裂傷を封じる。血液凝固カスケードにおいて、トロンビンはまた、循環中に主にフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）と複合体を形成する糖タンパク質補因子前駆体である第ＶＩＩＩ因子を活性化する。第ＶＩＩＩ因子は第ＩＸａ因子と相互作用して、Ｃａ＋２およびリン脂質の存在下で第Ｘ因子を活性化する。
【０００４】
フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子および／またはフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）を含む血液凝固に関連した１種または複数のタンパク質のいずれかのレベルの不足は、先天的であろうと、後天的であろうと、血液の凝固不十分および出血の危険性を導く恐れがある。現在の治療の選択肢は、１種または複数の治療タンパク質の内在的なレベルを回復させて止血を維持することを目的とした、前記治療タンパク質の医薬品調製物の投与に限定される。しかし、通常、献血された血漿または組換え原料から得られる既存の医薬品調製物は、酵素前駆体およびプロテアーゼ（例えば、プロトロンビン、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および／またはその他のプロテアーゼ）を含み、貯蔵中にフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子またはＶＷＦなどの治療タンパク質の安定性を損なう可能性がある。結果として、このような調製物は、水性溶液中において比較的不安定で、長期貯蔵には凍結乾燥または凍結した調製物に限定される。
【０００５】
臨床に応用するために、フィブリノーゲンは通常ヒト血漿から精製するが、その場合、フィブリノーゲンは全血漿タンパク質の約２〜５％（１．５〜４．０ｇ／Ｌ）を占めるに過ぎない。従来、血漿からのフィブリノーゲンの精製は、フィブリノーゲンを血漿から寒冷沈降させ、その後、エタノール、硫酸アンモニウム、βアラニン／グリシン、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）または低イオン強度溶液のいずれかで沈殿させる古典的な血漿分画法によって実施されている。このような方法は、比較的高い収率および均一性を達成できる。より高い純度が必要な場合、クロマトグラフィー技術がしばしば使用される。しかし、商用規模の製造方法に適した既存の沈殿およびクロマトグラフィー技術では通常、溶液中におけるフィブリノーゲンの安定性を損なう可能性がある酵素前駆体またはプロテアーゼ（例えば、プロトロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびプラスミノーゲン）などの汚染タンパク質を含むフィブリノーゲン調製物が生産される。例えば、プロトロンビンが存在する場合、プロトロンビンはセリンプロテアーゼトロンビンに活性化されて、次にこれはフィブリノーゲンをフィブリンに変換することが可能である。同様に、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンの両方が存在する場合、ｔＰＡはプラスミノーゲンをその活性型であるプラスミンに活性化し、次にフィブリノーゲンをフィブリンに加水分解することが可能である。結果として、フィブリノーゲン調製物は、水性溶液中で比較的不安定であることから、長期貯蔵には凍結乾燥調製物または凍結調製物に限定される。
【０００６】
特定の汚染物質；例えば、フィブロネクチンは固定されたゼラチンに、プラスミノーゲンは固定されたリシンに吸収させることができる（非特許文献１）。しかし、特定の親和性樹脂の使用は、大規模の商業的方法には適さない。その理由としては、親和性樹脂自体が繰り返し使用するには丈夫さが不十分で、一般的に処理時間および経費の両方が著しく増大することが挙げられる。
【０００７】
特許文献１は、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを使用して、フィブリノーゲン含有溶液からフィブリノーゲンを精製する方法を対象とする。特に、この方法は、フィブリノーゲンをマトリクスに結合させる条件下でフィブリノーゲン含有溶液をイオン交換マトリクスに添加し、その後、少なくとも１種のオメガアミノ酸を含む溶液でイオン交換マトリクスを洗浄することを含む。これは、樹脂からプラスミノーゲンを区別して除去しやすくするために行われる。その後、マトリクスに結合したフィブリノーゲンをマトリクスから溶出させる。
【０００８】
特許文献２は、フィブリノーゲンと結合する第三級または第四級アミンを接合したヒドロキシル化ポリマー支持体を含有する陰イオン交換樹脂を使用してフィブリノーゲンを精製する方法を提供する。
【０００９】
特許文献３は、主要なフィブリノーゲン画分がタンパク質１ｍｇ当たりプラスミノーゲン約６００ｎｇを含有するように、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンがマトリクスに結合し、フィブリノーゲンとプラスミノーゲンとを別々に選択的に溶出させる条件下で、金属が固定されたイオンアフィニティークロマトグラフィーマトリクスを使用することを教示している。
【００１０】
本発明は、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼのレベルを低下させる方法を提供する。精製したタンパク質は、液体調製物として貯蔵中安定であり、前記タンパク質のレベルの不足に関連した状態を治療または予防することを含む臨床適用または獣医学的適用に使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１２４０２００号（米国特許第６９６０４６３号）
【特許文献２】国際公開第２０１２０３８４１０号
【特許文献３】欧州特許第１５１９９４４号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｖｕｅｎｔｏ等、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８３（２）：３３１〜３３７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様では、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって：
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様では、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度は、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する
。
【００１５】
別の態様では、本明細書で記載したような本発明の方法によって回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を提供する。
【００１６】
別の態様では、少なくとも５ｍＬの安定した薬学的に許容されるフィブリノーゲン溶液を含有する容器であって、フィブリノーゲンの濃度は少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、前記容器を提供する。
【００１７】
別の態様では、本明細書で記載したような本発明の方法によって回収したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも７５％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１μｇ未満のプラスミノーゲン
を含む溶液を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５０ｎｇ未満のプラスミノーゲン
を含む溶液を提供する。
【００２０】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり２０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ未満のプラスミノーゲン
を含む溶液を提供する。
【００２１】
別の態様では、フィブリノーゲン不足に関連した症状を治療または予防する方法であって、本明細書で開示したような本発明の溶液または医薬製剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、フィブリノーゲン不足に関連した症状を治療または予防するための医薬品の製造における、本明細書で記載したような本発明の溶液の使用を提供する。
【００２３】
別の態様では、本明細書で記載したような本発明の溶液を含むフィブリン糊を提供する。
【００２４】
別の態様では、安定な液体フィブリノーゲン溶液を生産する方法であって：
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００２５】
別の態様では、安定な液体フィブリノーゲン溶液を生産する方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲンを含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００２６】
本発明の別の態様では、フィブリノーゲンを精製する方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲンモノマーがイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる工程；
（ｉｉ）該樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出緩衝液で溶出させる工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの溶出したフィブリノーゲンモノマーを孔径が約１５ｎｍから約３５ｎｍの範囲のフィルターで濾過する工程
を含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】溶液をフィブリノーゲンに対してネガティブモードでＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）に通過させたときの、様々なｐＨレベルにおけるフィブリノーゲン溶液からのフィブリノーゲン、プラスミノーゲンおよびｔ−ＰＡの回収率を示す図である。各群の棒は（左から右に）：フィブリノーゲン回収率、プラスミノーゲン回収率およびｔ−ＰＡ回収率を表す。
【図２】溶液をフィブリノーゲンに対してネガティブモードでＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）に通過させたときの、様々なｐＨレベルにおけるフィブリノーゲン溶液からのフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子の回収率を示す図である。各群の棒は（左から右に）：フィブリノーゲン回収率、プラスミノーゲン回収率、ｔ−ＰＡ回収率および第ＩＩ因子を表す。
【図３】溶液をフィブリノーゲンに対してネガティブモードでＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）に通過させたときの、様々なｐＨレベルにおけるフィブリノーゲン溶液からのフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子の回収率を示す図である。各群の棒は（左から右に）：フィブリノーゲン回収率、プラスミノーゲン回収率、ｔ−ＰＡ回収率および第ＩＩ因子を表す。
【図４ａ】溶液をフィブリノーゲンに対してネガティブモードでＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）に通過させたときの、様々なｐＨレベルにおけるフィブリノーゲン含有溶液からのフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子の回収率を示す図である。各群の棒は（左から右に）：フィブリノーゲン回収率、プラスミノーゲン回収率、ｔ−ＰＡ回収率および第ＩＩ因子回収率を表す。
【図４ｂ】ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラム（図４ａ）の素通り画分から回収したフィブリノーゲン含有溶液の室温（約２０℃）で６日間にわたる安定性を、初期凝固タンパク質（ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｌｏｔｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の％によって測定して示した図である。各群の棒は（左から右に）：Ｔ＝１日目、Ｔ＝３日目、Ｔ＝６日目を表す。
【図４ｃ】ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラム（図４ａ）の素通り画分から回収したフィブリノーゲン含有溶液の室温（約２０℃）で６日間にわたる安定性を、凝固タンパク質の％によって測定して示した図である。各群の棒は（左から右に）：Ｔ＝１、Ｔ＝３日目、Ｔ＝６日目を表す。
【図５】本発明の一実施形態による方法から得られた画分中におけるフィブリノーゲン、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲンおよび第ＩＩ因子の血漿寒冷沈降物からＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ溶出物までの処理回収率（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を示した図である。各群の棒は（左から右に）：フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子を表す。
【図６】ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱクロマトグラフィー樹脂から回収したモノマーフィブリノーゲンの純度を、サイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムの分析によって測定して示した図である。
【図７】ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱクロマトグラフィー樹脂から、様々な伝導率の溶出緩衝液（１９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２１．５ｍＳ／ｃｍ（菱形）；２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２２．５ｍＳ／ｃｍ（四角）；２１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２３．５ｍＳ／ｃｍ（三角）；１％（ｗ／ｗ）アルギニン／２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＳ／ｃｍ（十字））を使用して回収したフィブリノーゲンの濾過性を示した図である。
【図８】ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱクロマトグラフィー樹脂から回収した液体フィブリノーゲンを２〜８℃（菱形）で９週間または３０℃（四角）で７週間のいずれかで貯蔵し、そのフィブリノーゲン活性をｔ＝０での初期フィブリノーゲン活性のパーセントとして示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書を通じて、文脈で特に必要とされない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記述された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を含むが、いかなるその他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群も排除しないことを意味するものと理解されたい。
【００２９】
本明細書における全ての先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知の全ての事項への言及は、先行刊行物（もしくは先行刊行物から得られる情報）または公知の事項が、本明細書が関与する開発分野において共通の一般的知識の一部を構成するという認識または承認または何らかの形態の示唆ではなく、かつそのように解釈されないものとする。
【００３０】
本明細書で使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に明確に記載していなければ、複数の態様を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「製剤」参照する場合は、単一の製剤および２種類以上の製剤を含む。
【００３１】
反論を示唆するものがない場合は、本明細書を通じて「％」含量という場合、％ｗ／ｗ（重量／重量）を意味するものと考えられる。例えば、全タンパク質の少なくとも８０％のフィブリノーゲンを含む溶液とは、全タンパク質の少なくとも８０％ｗ／ｗの濃度でフィブリノーゲンを含む溶液を意味するものと考えられる。これは、例えば、凝固タンパク質アッセイから得られたフィブリノーゲンの量を標準的タンパク質アッセイ（例えば、ビ
ウレット）から得られた全タンパク質量で割って、１００を掛けることによって算出できる。凝固タンパク質アッセイでは、トロンビンを試料に添加すると血餅が形成されるが、この血餅はほとんど全てフィブリンである。血餅は、非凝固タンパク質を含有する上清から遠心分離できる。その後、血餅を洗浄し、アルカリ性尿素またはその他の物質によって溶解し、タンパク質濃度を分光光度法によって測定する。血餅の大部分がフィブリンなので、タンパク質濃度は、フィブリノーゲン濃度に相当する。したがって、試料中の凝固タンパク質の量は、試料の全タンパク質と非凝固タンパク質成分の間の差に相当する。
【００３２】
原材料（例えば、血漿または細胞培養上清）からのフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの精製は通常、従来の分画法によって実施され、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦは、例えば、エタノール、硫酸アンモニウム、βアラニン／グリシン、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）および／または低イオン強度溶液を使用して溶液から沈殿される。様々なクロマトグラフィー工程を使用する現在の血漿精製方法は、関心のあるタンパク質の比較的高い収率および均一性での調製を実現することができる。しかし、これらの方法では通常、臨床応用のための安定な液体調製物を製剤化するには適さない量の不純物が残存する調製物が生じる。プロトロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびプラスミノーゲンなどの不純物は、不安定化レベルのこれらの不純物は水溶液中においてフィブリノーゲンを加水分解することがあり、したがって、特に製造中および／または長期貯蔵中にフィブリノーゲンを不安定にするので、特に問題である。
【００３３】
本発明は、少なくとも一部には、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料を疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂に通過させ、樹脂を通過したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を回収することが、溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの不安定化レベルを低下させるために既存の精製方法の効果的な代替法であるという発見に基づいている。
【００３４】
したがって、本発明の一態様では、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって、
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００３５】
一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む回収溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、原材料と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％低下する。
【００３６】
別の態様では、安定な液体フィブリノーゲン溶液を生産する方法であって：
（ｉ）原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む原材料を該樹脂に通過させること；および
（ｉｉ）該樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること
を含み、該溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００３７】
一実施形態では、フィブリノーゲンを含む回収溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、原材料と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９８％低下する。
【００３８】
クロマトグラフィー法は通常、本明細書では樹脂またはマトリクスとも同義に称される固体支持体を使用する。適切な固体支持体は、当業者には周知である。例には、ガラスおよびシリカゲルなどの無機担体、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、二機能性アクリル酸のビニルコポリマーおよび様々なヒドロキシル化モノマーなどの合成もしくは天然に生じる有機担体などが含まれる。市販の担体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）、Ｃａｐｔｏ（商標）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）、ＧｉｇａＣａｐ（商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（商標）、Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ（商標）、Ｍａｃｒｏｓｏｒｂ（商標）およびＸＡＤ（商標）樹脂の名称で販売されている。
【００３９】
クロマトグラフィー工程は一般的に、非変性条件下で、約＋１０℃から＋３０℃の範囲の都合のよい温度で、より一般的には周囲温度で実施する。クロマトグラフィー工程は、適宜、バッチ式で、または連続的に実施してもよい。カラム、遠心、濾過、傾瀉などの都合のよいいかなる分離方法を使用してもよい。
【００４０】
しばしばミックスモードまたはマルチモードクロマトグラフィーとも呼ばれる疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）は、当業者には周知である。ＨＣＩＣは、固体支持体に連結した結合部分を使用しており、この結合部分は、本発明の方法に従って、原材料中の不純物（例えば、プロトロンビン、ｔＰＡおよびプラスミノーゲンなどの酵素前駆体およびプロテアーゼ）を代表とする１種または複数のタンパク質に対して特異的であってもよい。
【００４１】
当業者公知の任意の適切なＨＣＩＣ樹脂を使用することができる。一実施形態では、ＨＣＩＣ樹脂は、メルカプトエチルピリジン（４−メルカプトエチルピリジン、例えば、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標））、ｎ−ヘキシルアミン（例えば、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標））およびフェニルプロピルアミン（例えば、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標））からなる群から選択されるリガンドを含む。一実施形態では、ＨＣＩＣ樹脂は、ｎ−ヘキシルアミンを含む。
【００４２】
ＨＥＡ、ＭＥＰおよびＰＰＡなどのＨＣＩＣリガンドは、タンパク質の表面疎水性に基づいて分離を可能にするが、疎水性クロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー；ＨＩＣ）を使用したフィブリノーゲンを精製するためのその他の方法でしばしば見られるリオトロピック塩の添加を必要としないことが利点である。伝統的な疎水性相互作用クロマトグラフィーとは対照的に、ＨＣＩＣは、塩濃度よりもｐＨに基づいて
制御される。ＨＣＩＣ樹脂はまた、高い結合能および速い流速を実現し、研究室および産業規模の精製に理想的である。
【００４３】
ＨＣＩＣ樹脂は、床高約２ｃｍから約４０ｃｍのカラムに充填されることが多い。産業規模では、床高は通常少なくとも１０ｃｍで、典型的には約１５ｃｍから２５ｃｍの範囲である。産業用カラムのカラム径は、２０ｃｍから約１．５ｍまでの範囲であってもよい。このようなカラムは、ＨＣＩＣ樹脂製造指示書による流速で操作され、典型的な流速は５０〜１００ｃｍ／ｈｒの範囲である。流速に上限があるのは、一部にはＨＣＩＣ樹脂に圧力の制約があるためである。ＨＥＡ樹脂では、例えば、操作圧の上限は＜３ｂａｒ（＜３００ｋＰａ）である。ＨＣＩＣ樹脂の典型的な動的結合容量（結合タンパク質の１０％が破過する）は、樹脂１ｍＬ当たり結合タンパク質約２０から３０ｍｇである。本発明では、フィブリノーゲンのような豊富なタンパク質はカラムを通過することができる一方、プラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼなどのあまり多くないタンパク質はＨＣＩＣ樹脂に結合するので、ＨＣＩＣカラムに比較的大量のタンパク質を添加することが可能である。バッチの処理にはサイズのより小さいカラムおよび／またはより少ないカラム使用回数のいずれかが必要となるので、このことは産業規模の製造のために有利である。
【００４４】
本発明者等はまた、本発明の方法によってＨＣＩＣ樹脂を通過したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料のｐＨは、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの回収率および不純物の除去を制御するために調節できることを発見した。したがって、本明細書で開示した実施形態では、ＨＣＩＣ樹脂を通過したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料のｐＨは約６．０から約９．５である。特定の実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料は、好ましくは約４．０、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０、９．２５、９．５または１０．０のｐＨでＨＣＩＣ樹脂を通過する。特定の実施形態では、ＨＣＩＣ樹脂を通過したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料のｐＨは約７．０である。特定の実施形態では、溶液または原材料を添加する前に、ＨＣＩＣ樹脂を約４．０、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５、８．０、８．２５、８．５、８．７５、９．０、９．２５、９．５または１０．０のｐＨに平衡化する。
【００４５】
本発明の方法はまた、必要に応じて、他の不純物を除去するために複数のさらなるクロマトグラフィー工程を採用し、こうして最終調製物の純度を高めることができる。さらなるクロマトグラフィー精製工程は、本発明によるＨＣＩＣ樹脂でのフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの精製前後のいずれかに実行することができる。例えば、工程（ｉｉ）においてＨＣＩＣ樹脂から回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を、別のクロマトグラフィー樹脂に通過させることができる。
【００４６】
さらなるクロマトグラフィー精製工程は、別のＨＣＩＣ樹脂を使用してもよい。したがって、本発明の別の態様では、フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質のレベルを低下させる方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少な
くとも１種のタンパク質を含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００４７】
一実施形態では、工程（ｉｖ）で回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、原材料と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９８％低下している。
【００４８】
別の態様では、安定した液体フィブリノーゲン溶液を製造する方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲンを含む原材料を第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；
（ｉｉ）第１の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で回収した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に通過させること；および
（ｉｖ）第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂を通過したフィブリノーゲンを含む溶液を回収すること；
を含み、ここでクロマトグラフィー工程の条件は、原材料中に存在するプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質が第１および／または第２の樹脂に結合するような条件であり、工程（ｉｖ）で回収した溶液中におけるプラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子およびその他のプロテアーゼからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質の濃度が、原材料と比較して少なくとも５０％低下している、前記方法を提供する。
【００４９】
一実施形態では、工程（ｉｖ）で回収したフィブリノーゲン含む溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、原材料と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９８％低下している。
【００５０】
本明細書で開示した実施形態では、第２のＨＣＩＣ樹脂は、第１のＨＣＩＣ樹脂とは異なる。本明細書で開示した別の実施形態では、第１および第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂は同じである。工程（ｉｉ）でＨＣＩＣ樹脂から回収したフィブリノーゲ
ンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を同じＨＣＩＣ樹脂を通過させる場合、樹脂に結合し得るいかなる不純物も除去するために、工程（ｉｉ）の後および工程（ｉｉｉ）で回収した溶液を再度ＨＣＩＣ樹脂に通過させる前に、ＨＣＩＣ樹脂を洗浄することが所望されることがある。
【００５１】
さらなるクロマトグラフィー樹脂はまた、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂であってもよい。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、負荷電を有する分子は、正荷電を有する固体支持体に引きつけられる。正荷電を有する固体支持体は、当業者公知の任意の手段によって調製することができ、固体支持体に負荷電を有する機能的リガンドを共有結合することが通常必要である。適切な負荷電を有する機能的リガンドは、溶液から分離しようとする分子によってほぼ決まる。適切な陰イオン交換樹脂の例は、機能的な第四級アミン基（Ｑ）および／または第三級アミン基（ＤＥＡＥ）またはジエチルアミノプロピル基（ＡＮＸ）を含む樹脂である。市販の陰イオン交換クロマトグラフィーマトリクスには、限定はしないが、ＤＥＡＥセルロース、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｏｒｏｓ（商標）ＰＩ２０、ＰＩ５０、ＨＱ１０、ＨＱ２０、ＨＱ５０、Ｄ５０、ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＭｏｎｏＱ（商標）、ＭｉｎｉＱ（商標）、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｑおよび３ＯＱ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商標）、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製のＷＰ  ＰＥＩ（商標）、ＷＰ  ＤＥＡＭ（商標）、ＷＰ  ＱＵＡＴ（商標）、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．社製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＱＡ、Ｂｉｏｒａｄ社製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）ＤＥＡＥ、Ｑ  ＨｙｐｅｒＺ（商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）ＭおよびＬＳ（商標）ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ（商標）ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（商標）ＬＳ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（商標）Ｍ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＤＯＷＥＸ（商標）Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｉｏｎ  ＭａｔｒｉｘおよびＤＯＷＥＸ（商標）ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ  Ｅ７７、弱塩基性陰イオン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００およびＱ８００、ＥＭＤ社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ３  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＤＭＡＥ、Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）弱および強陰イオン交換体ｔｙｐｅ  ＩおよびＩＩ、ＤＯＷＥＸ（商標）弱および強陰イオン交換体ｔｙｐｅ  ＩおよびＩＩ、Ｄｉａｉｏｎ（商標）弱および強陰イオン交換体ｔｙｐｅ  ＩおよびＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ（商標）、Ｔｏｓｏｈ社製のＴＳＫ（商標）ゲルＱおよびＤＥＡＥ  ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ３ＱＡＥ−２６−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−６５ＯＭおよび６５０Ｃ、ならびにＷｈａｔｍａｎ社製のＱＡ５２（商標）、ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５１（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＤＥ５３（商標）、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）ＤおよびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ（商標）Ｑが含まれる。
【００５２】
所望に応じて、陰イオン交換クロマトグラフィーマトリクスの代わりに、陰イオン交換クロマトグラフィー膜を使用してもよい。市販の陰イオン交換膜には、限定はしないが、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ、Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＭｕｓｔａｎｇ（商標）ＱおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（商標）Ｑ膜が含まれる。
【００５３】
本明細書で開示した一実施形態では、陰イオン交換樹脂は強陰イオン交換樹脂である。本明細書で開示した別の実施形態では、強陰イオン交換樹脂には、第四級アミン機能性リガンド（例えば、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに見られるような−Ｎ＋（ＣＨ３）３）が含まれる。さらに別の実施形態では、陰イオン交換樹脂は、ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（登録商標）などの架橋基を介してヒドロキシル化メタクリル酸ポリマーに接合したトリメチルアミン基である。
【００５４】
一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦに関してポジティブモードで実施される。すなわち、使用した条件は、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料が陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過するとき、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦは樹脂に連結した正荷電を有する官能基に結合し、溶液中の不純物は樹脂からフロースルー（素通り）画分に通過させ、廃棄またはその他の目的のために回収することができるような条件である。フロースルー画分が一旦樹脂を通過したら、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を当業者公知の適切な洗浄緩衝液で洗浄することができる。洗浄緩衝液の構成物および洗浄工程の条件は通常、樹脂に結合したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦが洗浄工程中保持されるように選択する。当業者はまた、洗浄緩衝液を参照する場合は、溶出緩衝液またはクロマトグラフィーに関して類似の緩衝液は、緩衝能が限定された、または緩衝能のない溶液を含むことができることを認識するだろう。
【００５５】
本明細書で開示した一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂からフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを溶出する前に、イプシロン−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）を含む洗浄液で樹脂を洗浄する。洗浄緩衝液にε−ＡＣＡを添加することによって、最初の通過中に陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合する可能性があるプロテアーゼ（プラスミノーゲンなど）の溶出を促進することができる。適切な洗浄工程の一例は、米国特許第６，９６０，４６３号に記載されている。
【００５６】
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合したままのフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを溶出させるために、当業者公知の任意の適切な溶出緩衝液を使用することができる。フィブリノーゲンを含む溶液からプラスミノーゲンおよび／またはｔ−ＰＡおよび／またはその他のプロテアーゼを除去するために、本発明者等は、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液が、同様に樹脂に結合することがあるフィブリノーゲン凝集物および／またはその他のタンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ、フィブロネクチンまたはプロテアーゼ）の溶出を最小限に抑え、陰イオン交換樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出させることを発見した。したがって、本明細書で開示した一実施形態では、フィブリノーゲンを、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。これは、伝導率の範囲が約１８ｍＳ／ｃｍ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）から約３２ｍＳ／ｃｍ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の溶出緩衝液と同等である。
【００５７】
別の実施形態では、フィブリノーゲンを、ＮａＣｌ約１５０ｍＭから約２７０ｍＭを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。これは、伝導率の範囲が約１８ｍＳ／ｃｍ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）から約２９ｍＳ／ｃｍ（２７０ｍＭ  ＮａＣｌ）の溶出緩衝液と同等である。
【００５８】
別の実施形態では、フィブリノーゲンを、約１７０ｍＭから約２３０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。これは、伝導率の範囲が約１９ｍＳ／ｃｍ（１７０ｍＭ  ＮａＣｌ）から約２５ｍＳ／ｃｍ（２３０ｍＭ  ＮａＣｌ）の溶出緩衝液と同等である。
【００５９】
別の実施形態では、フィブリノーゲンを、約２００ｍＭから約２２０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。これは、伝導率の範囲が約２２ｍＳ／ｃｍ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ）から約２４ｍＳ／ｃｍ（２２０ｍＭ  ＮａＣｌ）の溶出緩衝液と同等である。
【００６０】
別の実施形態では、フィブリノーゲンを、約１９０ｍＭから約２１０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。
【００６１】
別の実施形態では、フィブリノーゲンを、約１５０ｍＭから約１９０ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させる。
【００６２】
別の実施形態では、溶出緩衝液の伝導率は、１８から３２ｍＳ／ｃｍ；または２０から２５ｍＳ／ｃｍ；または２１から２３．５ｍＳ／ｃｍ；または２２から２３ｍＳ／ｃｍの範囲である。好ましい実施形態では、溶出緩衝液の伝導率は約２２．５ｍＳ／ｃｍである。
【００６３】
本明細書で開示した実施形態では、溶出緩衝液は、フィブリノーゲンの凝集物よりもフィブリノーゲンモノマーの溶出を促進する濃度の遊離アミノ酸を含む。別の実施形態では、溶出緩衝液は、約０．５から１０％（ｗ／ｗ）の濃度の遊離アミノ酸を含む。任意の適切な遊離アミノ酸をこの濃度範囲で使用することができる。一実施形態では、遊離アミノ酸はアルギニンである。別の実施形態では、溶出緩衝液は、約４から約１０％（ｗ／ｗ）の範囲のアルギニンを含む。
【００６４】
その他の実施形態では、溶出緩衝液は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｗ）アルギニン；または１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｗ）アルギニンを含む。
【００６５】
一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、フィブリノーゲンに関してはネガティブモードで、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦに関してはポジティブモードで実施される。すなわち、使用した条件は、フィブリノーゲンおよび第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料が陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過するとき、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦは樹脂に連結した正荷電を有する官能基に結合し、溶液中のフィブリノーゲンは樹脂からフロースルー（素通り）画分に通過させるような条件である。フィブリノーゲンを含有するフロースルー画分が一旦樹脂を通過したら、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を当業者公知の適切な洗浄緩衝液で洗浄することができる。洗浄緩衝液の構成物および洗浄工程の条件は通常、樹脂に結合した第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦが洗浄工程中保持されるように選択する。
【００６６】
一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料を、約１５０ｍＭから約２７０ｍＭのＮａＣｌの存在下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる。これは、伝導率の範囲が約１８ｍＳ／ｃｍ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）から約２９ｍＳ／ｃｍ（２７０ｍＭ  ＮａＣｌ）と同等である。これらの条件下で、特にモノマー型のフィブリノーゲンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過し、凝集物ならびにＩｇＧおよびフィブロネクチンなどのその他の不純物を含有するフィブリノーゲンは樹脂に結合する。他の実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または原材料は、約１７０ｍＭから約２３０ｍＭ（約１９ｍＳ／ｃｍから約２５ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌまたは約２００ｍＭから約２２０ｍＭ（約２２ｍＳ／ｃｍから約２４ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌの存在下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過する。この種の条件下では、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合することが予
測される。
【００６７】
第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを、ＮａＣｌなどの塩を少なくとも３００ｍＭ含む溶出緩衝液で陰イオン交換樹脂から溶出させることができる。特定の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを、約５００ｍＭのＮａＣｌでイオン交換樹脂から溶出させる。フィブリノーゲンおよび第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦが陰イオン交換樹脂に結合する場合、溶出工程は、フィブリノーゲンが最初に溶出し（例えば、前記の実施形態で設定した条件を使用して）、次いで５００ｍＭ  ＮａＣｌなどのより高濃度の塩を使用して第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦが溶出できるように実施することができる。
【００６８】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程を使用する場合、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料をＨＣＩＣ樹脂に通過させる前および／または後のいずれかで実施することができる。本明細書で開示した一実施形態では、方法はさらに、工程（ｉｉ）で回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることを含む。別の実施形態では、本明細書で記載したように、第１および第２のＨＣＩＣクロマトグラフィー工程を使用する場合、方法はさらに、工程（ｉｉ）および／または工程（ｉｖ）で回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることを含む。
【００６９】
本明細書で開示した一実施形態では、方法はさらに、工程（ｉ）の前に、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させることを含む。
【００７０】
当業者であれば、本発明によって使用した追加のクロマトグラフィー工程の数は、最終調製物に必要な純度のレベルに左右されることを理解しているものと予想される。例えば、本発明の方法は、本明細書で開示したように、２、３、４または５回のクロマトグラフィー工程を含んでいてもよい。例えば、方法に２回のクロマトグラフィーが含まれる場合、工程の順番は、ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣであり；方法に３回のクロマトグラフィー工程が含まれる場合、工程の順番はＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣであり；方法に４回のクロマトグラフィー工程が含まれる場合、工程の順番はＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣまたはＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＩＥＸ／ＩＥＸまたはＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＩＥＸまたはＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＨＣＩＣまたはＩＥＸ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣ／ＩＥＸまたはＩＥＸ／ＩＥＸ／ＩＥＸ／ＨＣＩＣである；などである（「ＩＥＸ」は陰イオン交換クロマトグラフィーを示す）。必要な純度レベルは、溶液の企図する使用（例えば、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ不足の患者の治療のため）および／または水性調製物としてより長期の貯蔵期間が必要である場合によって決定される。
【００７１】
クロマトグラフィーは、当業者公知の任意の手段を使用して実施することができる。例えば、本発明によるクロマトグラフィー工程は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐａｌｌ
ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＢｉｏ−Ｒａｄから入手可能なものなどの軸流カラムを
使用するか、またはＰｒｏｘｃｙｓから入手可能なものなどの放射流カラムを使用することができる。本発明によるクロマトグラフィー工程はまた、膨張床技術を使用して実行することができる。
【００７２】
一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む回収溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、原材料と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％低下している。
【００７３】
プラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼなどの不純物の除去を最大限にする方法は、溶液中のフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの安定性および効率が、特に長期貯蔵中において明らかに改善されるので、特に有利である。液体形態での貯蔵は、患者にすぐに使用することができるので、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液には特に有利である。精製したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの凍結乾燥調製物の使用では、それらを必要とする対象に投与する直前に、注射用に適切な緩衝液および／または水で凍結乾燥タンパク質を再構成することが必要であるのとは対照的である。
【００７４】
フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液からプロテアーゼまたはそれらの酵素前駆体（プラスミノーゲンなど）を除く利点は、残存するプロテアーゼおよび／または酵素前駆体（例えば、プラスミンまたはプラスミノーゲン）を阻害するために抗線溶剤を添加する必要性を最小限に抑えられることである。このような薬剤の例には、プラスミンのウシタンパク質阻害剤であるアプロチニン；神経毒副作用も付随する合成プラスミン阻害剤であるトラネキサム酸が含まれる。
【００７５】
他の有利な特性は、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液からＨＣＩＣによって分離したプラスミノーゲンは、さらに処理して、例えば、臨床使用するためにプラスミノーゲン含有濃縮物を作製できることである。したがって、ＨＣＩＣを使用して単一の開始溶液からプラスミノーゲンならびにフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液の両方を調製することができる。
【００７６】
他の有利な特性は、ＨＣＩＣ樹脂の生産費用がアフィニティークロマトグラフィー法で使用するリシン−セファロース（商標）または固定されたリシン樹脂の費用よりもはるかに経済的であることである。
【００７７】
他の有利な特性は、プロテアーゼ（例えば、第ＩＩ因子）を除去するために、ＨＣＩＣを水酸化アルミニウム（例えば、アルハイドロゲル（商標））工程と置き換えて使用できることである。アルハイドロゲル（商標）は現在、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦの商用生産において広く使用されている。しかし、この材料は、バッチ当たり通常使用される１００ｋｇではかなり費用が高い。さらに、アルハイドロゲル（商標）は、手動の取り扱いを必要とすることが多く、この材料は１回使用した後に廃棄する。対照的に、ＨＣＩＣ工程は完全に自動化することができ、樹脂は複数のバッチの製造において使用することができる。
【００７８】
別の有利な特性は、カラムの洗浄および樹脂の浄化法の最中にウイルスおよびプリオンを含む病原体の不活性化および除去するために使用することができるＮａＯＨ１ＭにＨＣＩＣ樹脂が適合することである。
【００７９】
本発明の方法から得られた液体調製物はまた、費用のかかる貯蔵および輸送手段を必要とし、使用直前に解凍しなければならない凍結調製物を使用するよりも有利である。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを凍結乾燥または凍結した調製物として貯蔵する場合でも、再構成または解凍したタンパク質がより長期間安定であるため有利である。例えば、材料を医療処置のために万一に備えて再構成したが、医学的考察に基づいて使用が必要とされなかった場合、このことは明らかである。こういった材料は、プロトロンビンおよび／またはｔ−ＰＡおよび／またはその他のプロテアーゼが存在するためにフィブリノーゲンはわずかな短い期間しか安定ではないので、通常は廃棄される。
【００８０】
特定の実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含有する本発明の液体調製物は、液体または凍結乾燥または凍結した調製物として貯蔵する。
【００８１】
本発明の別の態様では、フィブリノーゲンを精製する方法であって：
（ｉ）フィブリノーゲンモノマーがイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる工程；
（ｉｉ）該樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出緩衝液で溶出させる工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの溶出したフィブリノーゲンモノマーを、孔径が約１５ｎｍから約３５ｎｍの範囲のフィルターで濾過する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００８２】
一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶液（工程（ｉ））は、プラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼが疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂に結合し、フィブリノーゲンが該樹脂を通過するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む原材料を該樹脂に通過させた後で回収する。
【００８３】
一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から選択する。
【００８４】
一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂または弱陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、第四級アミノ基が含まれる。例には、第四級アルキルアミンおよび第四級アルキルアルカノールアミン、またはアミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノプロピル、アミノ、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニウムおよびポリアミンが含まれる。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は第三級もしくは第四級アミンが接合したポリマー支持体であるか、または第三級もしくは第四級アミンが接合したヒドロキシル化ポリマー支持体である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、メタクリル酸ポリマー支持体が含まれる。一実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂はＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）ＨＱである。別の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂はＧｉｇａＣａｐ（商標）Ｑ−６５０Ｍである。その他の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂はカラムに充填する。
【００８５】
所望に応じて、陰イオン交換クロマトグラフィー膜は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の代わりに使用することができる。市販の陰イオン交換クロマトグラフィー膜には、限定はしないが、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｑ、Ｐａｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＭｕｓｔａｎｇ（商標）ＱおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＩｎｔｅｒｃｅｐｔ（商標）Ｑ膜が含まれる。
【００８６】
一実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂または弱陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂である。
【００８７】
市販の陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂には、限定はしないが、例えば、スルホン酸をベースにした基（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商標）、Ｔｏｓｏｈ社製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、ＢｉｏＲａｄ社製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ（商標）Ｓ、Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）Ｓ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）ＭおよびＬＳ（商標）ＳＰおよびＳｐｈｅｒｏｄｅｘ（商標）ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチルをベースにした基（例えば、ＥＭＤ社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＳＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｏｒｏｓ（商標）Ｓ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピルをベースにした基（例えば、Ｔｏｓｏｈ社製のＴＳＫ（商標）Ｇｅｌ  ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＰｏｒｏｓ（商標）ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチルをベースにした基（例えば、ＥＭＤ社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＳＯ３”）；スルホキシエチルをベースにした基（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社製のＳＥ５２、ＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｓ）、カルボキシメチルをベースにした基（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商標）、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．社製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＣＭ、ＢｉｏＲａｄ社製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＣＭ、Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（商標）ＬＳ  ＣＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）Ｃ５００およびＣ２００、Ｗｈａｔｍａｎ社製のＣＭ５２（商標）、ＣＭ３２（商標）、ＣＭ２３（商標）およびＥｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｉｏｎ  Ｃ、Ｔｏｓｏｈ社製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸をベースにした基（例えば、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製のＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸をベースにした基（例えば、Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社製のＷＰ（商標）ＣＢＸ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＤＯＷＥＸ  ＭＡＣ−３（商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）弱陽イオン交換体、ＤＯＷＥＸ（商標）弱陽イオン交換体およびＤｉａｉｏｎ（商標）弱陽イオン交換体ならびにＥＭＤ社製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−）；スルホン酸をベースにした基（例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．社製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ（商標）ＳＰ、Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＤＯＷＥＸ（商標）Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ膜、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、ＤＯＷＥＸ（商標）Ｓｔｒｏｎｇ  ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトリン酸をベースにした基（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社製のＰｌ  １）を有するものが含まれる。所望に応じて、陽イオン交換クロマトグラフィー膜、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（商標）Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ；Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ）は、陽イオン交換マトリクスの代わりに使用することができる。
【００８８】
一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶液のｐＨは約ｐＨ７からｐＨ１０の範囲で
ある。一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶液のｐＨは約ｐＨ８である。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、フィブリノーゲンを含む溶液と類似のｐＨを有する緩衝液で予め平衡化し、フィブリノーゲン添加後に洗浄する。
【００８９】
一実施形態では、溶出緩衝液の伝導率は、約１８から約３０ｍＳ／ｃｍの範囲である。例えば、溶出緩衝液の伝導率は、約１８から約２５ｍＳ／ｃｍ；または約１９から約２４ｍＳ／ｃｍ；または約２０から約２４ｍＳ／ｃｍ；または約２１から約２３ｍＳ／ｃｍの範囲であってもよい。一実施形態では、溶出緩衝液の伝導率は約２２ｍＳ／ｃｍである。その他の実施形態では、溶出緩衝液はＮａＣｌを含む。一実施形態では、溶出緩衝液は、ＮａＣｌを約１８０ｍＭから約２３０ｍＭ、または約１９０ｍＭから約２１０ｍＭの範囲の濃度で含む。一実施形態では、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度は約２００ｍＭである。
【００９０】
一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液は、約０．５から約１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を含有する。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液のタンパク質濃度は、約４から約８ｍｇ／ｍＬの範囲である。特定の実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液は、約６ｍｇ／ｍＬである。
【００９１】
一実施形態では、濾過（工程（ｉｉｉ））の前に、溶出したフィブリノーゲンモノマーに、１種または複数のアミノ酸が配合される。一実施形態では、アミノ酸は、アルギニンまたはグリシンまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液におけるアミノ酸の濃度は、約０．５から約１０％（ｗ／ｗ）の範囲である。一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液におけるアミノ酸の濃度は、約１％から約６％（ｗ／ｗ）、または約２％から約６％（ｗ／ｗ）、または約２％から約５％（ｗ／ｗ）である。一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶出緩衝液は、約２％、または約３％、または約４％、または約５％（ｗ／ｗ）のアルギニンが配合される。
【００９２】
一実施形態では、溶出したフィブリノーゲンモノマーのｐＨは約ｐＨ７から約ｐＨ９である。
【００９３】
一実施形態では、工程（ｉｉ）のフィルターの孔径は、約１５ｎｍから約３５ｎｍ；または約１５ｎｍから約３０ｎｍ；または約１５ｎｍから約２５ｎｍ；または約１５ｎｍから約２０ｎｍの範囲である。
【００９４】
ウイルス濾過は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）または「デッドエンド」濾過（通常フロー濾過としても知られている）のいずれかを使用して実施することができる。ウイルスフィルターは元々、ＴＦＦにおいて非対称膜の上部スキン層に隣接した供給流を用いて使用するために考案された。ＴＦＦは、濃度の偏りおよび付着を抑えるために、膜表面を掃引することによって高い流速を実現する。しかし、デッドエンド濾過は簡単で費用が低いので、デッドエンド濾過用に特に考案されたウイルスフィルターが普及することになった。ＴＦＦとは対照的に、これらのデッドエンドフィルターは通常、供給流に面した膜のより解放された側で操作されるので、タンパク質凝集物およびその他の付着物がマクロ多孔質な基礎部分内に捕捉され、それによってウイルスを保持するスキン層が保護される。使い捨てのデッドエンドフィルターを使用する利点には、系の設計および検証が簡単で、労力および費用が抑えられることが含まれる。
【００９５】
デッドエンド濾過には通常、表面から膜内へ流体を向かわせる単一のポンプを使用することが必要である。
【００９６】
タンジェンシャル濾過には一般的に、フィルター膜の表面で一定の流速を維持するため
の第１のポンプおよび膜の裏で陰圧を生じさせることによって膜内へタンパク質を引き込む第２のポンプが必要である。
【００９７】
一実施形態では、濾過はデッドエンド濾過によって実施する。
【００９８】
一実施形態では、デッドエンド濾過方法は、一定圧濾過または一定速度濾過のいずれかを使用して実施する。一実施形態では、デッドエンド濾過方法は、一定圧濾過を使用して実施する。
【００９９】
濾過は通常、本明細書で使用するウイルス除去膜の材料に応じて、膜が持ちこたえられるレベルと同じか、または下回る濾過圧、例えば、約０．２から約３．４ｂａｒの圧で実施する。一実施形態では、濾過圧は、約０．２ｂａｒから約３．４ｂａｒの間で維持する。別の実施形態では、濾過圧は、約１から約３ｂａｒ；または約１から約２ｂａｒ；または約１．２から約２ｂａｒで維持する。別の実施形態では、濾過圧は、約１．５ｂａｒから約１．９ｂａｒで維持する。
【０１００】
温度は、タンパク質溶液の粘度およびウイルス除去膜による濾過の流速に影響を及ぼすことがある。当業者には、濾過工程で使用する溶液は通常、約０℃から関心のあるタンパク質が変性する温度までの範囲内の温度であることは理解されよう。溶液の温度は、約１０℃から約５０℃までの範囲内であると適切である。一実施形態では、溶液の温度は、約１８℃から約３５℃までの範囲内である。別の実施形態では、溶液は、約１８℃から約２６℃の室温で濾過する。
【０１０１】
一実施形態では、ウイルスフィルターの能力は、フィルター表面積の１ｍ２当たり少なくとも０．２０ｋｇまたは少なくとも０．５０ｋｇまたは少なくとも０．７５ｋｇまたは少なくとも１．００ｋｇまたは少なくとも１．２５ｋｇまたは少なくとも１．５０ｋｇまたは少なくとも２ｋｇのフィブリノーゲンである。
【０１０２】
場合により、大きなサイズの粒子を除去するために、ウイルス濾過の前に前濾過または清澄濾過工程を使用することができる。一実施形態では、前濾過は、ウイルス除去膜よりも大きな孔径の膜を含むプレフィルターで実施する。一実施形態では、プレフィルターは、孔径約０．１μｍの膜フィルターである。別の実施形態では、プレフィルターは、Ｐａｌｌナイロン膜フィルター（ＳＫＬ  ７００２  ＮＴＰ  ０．１μｍもしくはＦＴＫＮＩ）またはタンパク質凝集物および／または微粒子の除去のために類似の特性を有する市販のその他のプレフィルターから選択する。前濾過は、ウイルスフィルターと並べて、またはウイルスフィルターとは並べずに実施することができる。一実施形態では、前濾過は、ウイルスフィルターと並べて実施する。
【０１０３】
本発明のこの態様によるウイルス濾過法に適したフィルターは、当業者に公知であろう。一例には、特にＰｌａｎｏｖａ  ＢｉｏＥｘ（商標）が含まれる。このようなフィルターは、時々「小型ウイルス」除去フィルターと呼ばれる。
【０１０４】
一実施形態では、フィルター膜は、平板シートまたは中空線維膜である。平板シート膜の例には、Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）ＳＶ４等級小型ウイルス除去フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの親水化したＰＶＤＦフィルター膜が含まれる。一実施形態では、フィルターは、Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）ＳＶ４等級である。
【０１０５】
その他の実施形態では、フィルター膜は、中空線維膜である。中空線維膜は、各中空線維の壁が、細かい毛細管と相互接続した空隙から構成された孔の３次元ウェブ構造を含有するストロー型の中空線維の束を含有していてもよい。中空線維フィルターの例には、中
空線維膜形態に親水性に改変されたフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）を組み込んだＰｌａｎｏｖａ（商標）ＢｉｏＥＸ（商標）フィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。一実施形態では、フィルターは、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）ＢｉｏＥＸである。
【０１０６】
一実施形態では、２種類以上の小型ウイルスフィルターを連続して使用する。一実施形態では、濾過は、約１５から約２０ｎｍの範囲の孔径の連続した２種類のフィルターを使用して実施する。このような濾過工程によって、パルボウイルス様ＭＶＭのために少なくともＬＲＶ６．９ｌｏｇＬＲＶでフィブリノーゲンを製造することが潜在的に可能である。
【０１０７】
本発明の別の態様では、溶液中に存在するフィブリノーゲンがイオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる。すなわち、イオン交換クロマトグラフィーは、溶液が樹脂を通過したとき、溶液中に存在するフィブリノーゲン凝集体、プラスミノーゲンおよびフィブロネクチンなどの不純物は、樹脂に連結した荷電を有する官能基に結合し、溶液中に存在するフィブリノーゲン、特にフィブリノーゲンモノマーは、樹脂からフロースルー（素通り）画分に通過するような条件下で、フィブリノーゲンに関してネガティブモードで実施される。フィブリノーゲンを含有するフロースルー画分が一旦樹脂を通過したら、イオン交換クロマトグラフィー樹脂を当業者公知の適切な洗浄緩衝液で洗浄することができる。洗浄緩衝液の構成物および洗浄工程の条件は通常、結合した不純物が洗浄工程中樹脂に保持されるように選択する。
【０１０８】
一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂または陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂から選択する。
【０１０９】
一実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶液を、約１５０ｍＭから約２７０ｍＭのＮａＣｌの存在下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる。これは、約１８ｍＳ／ｃｍ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）から約２９ｍＳ／ｃｍ（２７０ｍＭ  ＮａＣｌ）の範囲の伝導率と同等である。これらの条件下で、特にモノマー形態のフィブリノーゲンは陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過し、一方、凝集物ならびにプラスミノーゲンおよびフィブロネクチンなどのその他の不純物を含有するフィブリノーゲンは樹脂に結合する。他の実施形態では、フィブリノーゲンを含む溶液は、約１７０ｍＭから約２３０ｍＭ（約１９ｍＳ／ｃｍから約２５ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌまたは約２００ｍＭから約２２０ｍＭ（約２２ｍＳ／ｃｍから約２４ｍＳ／ｃｍ）のＮａＣｌの存在下で陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を通過する。この種の条件下で、不純物は陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合し、フィブリノーゲンは樹脂からフロースルー画分に通過すると予測される。
【０１１０】
本発明の方法によって回収されたフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液は、室温であっても、既存の凍結乾燥調製物よりも安定性が高いフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの調製物を形成するので、有利である。必要に応じて、輸送および／または貯蔵中に低温を確保することができない長期輸送経路において、このことは特に有利であり得る。溶液中におけるフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの安定な貯蔵はまた、多くの点で、製造、使用、輸送およびそれらを必要とする患者への投与を容易にする。本発明によって調製したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦは安定性が高いので、多くの医薬品調製物において、状況によっては望ましくない副作用を導く可能性があるか、または潜在的危険性を低下させるために回避すべき繊維素溶解阻害剤またはフィブリノーゲン溶解阻害剤などの安定剤を添加しないで済ませること
が可能である。
【０１１１】
本明細書で使用した「安定」という用語は、貯蔵前のフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの活性レベルと比較して（例えば、本発明によるフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液の回収直後に測定された活性レベルと比較して）、貯蔵期間後のフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの活性の損失がほとんどないか、または実質的にないことを意味する。本明細書で開示した一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液は、約０℃から約３０℃の温度で、貯蔵期間後に少なくとも７０％の活性、好ましくは少なくとも８０％の活性、より好ましくは少なくとも９０％の活性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の活性、最も好ましくは１００％の活性を保持している。当業者であれば、フィブリノーゲン活性は貯蔵期間開始直前のフィブリノーゲン調製物で測定することができ、この初期値を１００％活性と指定して使用して、貯蔵期間中の様々な時点で測定したフィブリノーゲン活性をこれと比較したこの初期値に対する割合として表現できることが理解されよう。
【０１１２】
本明細書で開示した一実施形態では、本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンは、約２℃から約８℃の温度で溶液を貯蔵して少なくとも４週間後に約９０％から１００％の活性を保持しており、好ましくは約２℃から約８℃の温度で溶液を貯蔵して４週間後に約９０％の活性を保持している。本明細書で開示した別の実施形態では、フィブリノーゲンは、約３０℃の温度で溶液を貯蔵して少なくとも４週間後に約６０％から８０％の活性を保持しており、好ましくは約３０℃の温度で溶液を貯蔵して５週間後に約６０％から約７０％の活性を保持している。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの活性レベルは、当業者公知の任意の手段によって測定することができる。フィブリノーゲンの活性の適切な測定方法の例は、例えば、Ｍａｃｋｉｅ等（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２１：３９６〜４０４、２００３）によってまとめて記載されている。特定の方法には、Ｃｌａｕｓｓ（Ｃｌａｕｓｓ、１９５７、Ａｃｔａ−Ｈａｅｍａｔｏｌ．１７、２３７〜２４６）および／または凝固タンパク質（Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ  Ｋ．、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９５５；７（補足１４）：１〜５４またはＦｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔ  Ｐｈ．Ｅｕｒ．Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ９０３、２０１２）が含まれる。結果は、凝固タンパク質の％；初期凝固タンパク質の％および／またはＣｌａｕｓｓ法または類似法を使用して測定した初期フィブリノーゲン活性の％として報告することができる。
【０１１３】
当業者であれば、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む回収溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度は、貯蔵の長さおよび／または貯蔵条件（例えば、温度）を決定づける可能性があることを理解しているものと予想される。例えば、回収溶液中のプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度が原材料と比較して８０％に低下している調製物は、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む回収溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの濃度が原材料と比較してわずか５０％に低下している調製物と比較して、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの活性をあまり不安定化することなく、長期間および／または高温で貯蔵できることが理解されよう。
【０１１４】
本発明の方法は研究室規模で実施することができる一方、条件をあまり変化させることなく産業規模まで規模拡大することが可能である。したがって、本明細書で開示した一実施形態では、本発明の方法は、産業または商用規模で実施される。好ましくは、本発明の
方法は、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの商用規模の製造に適している。例えば、本発明の方法の開始材料として血漿画分を使用するとき、商用規模製造には、少なくとも約５００ｋｇの血漿から得られた血漿画分を使用することが必要であろう。より好ましくは、開始血漿画分は、バッチ当たり少なくとも約５，０００ｋｇ、７，５００ｋｇ、１０，０００ｋｇおよび／または１５，０００ｋｇの血漿から得られる。特定の実施形態では、本発明のフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液および医薬製剤は、血漿画分または組換え原材料から商用規模で製造する。
【０１１５】
フィブリノーゲンおよび／または第ＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を、臨床適用または獣医学的適用のため（例えば、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ不足の対象に投与するため、またはフィブリン糊として使用するため）に使用する場合、当業者であれば、溶液中の活性のあるウイルス含量（ウイルス力価）およびその他の感染の可能性がある因子（例えば、プリオン）のレベルを低下させることを所望されることがあることを理解しているものと予想される。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料（すなわち、開始材料）を血漿から得る場合、このことは特に所望されることがある。溶液中のウイルス力価を低下させる方法は当業者には公知である。例には、低温殺菌（例えば、グリシン（例えば、２．７５Ｍ）およびスクロース（例えば、５０％）などの高濃度の安定化剤および／またはその他の選択した賦形剤もしくは塩の存在下で、溶液を６０℃で１０時間インキュベートすること）、乾熱処理、ウイルス濾過（溶液をナノフィルター；例えば、２０ｎｍカットオフに通過させること）および／または溶液を適切な有機溶媒および界面活性剤で、溶液中のウイルスを不活性化する期間および条件下で処理することが含まれる。溶媒界面活性剤は、特にフィブリノーゲンおよび第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む血漿由来生成物において、エンベロープウイルスを不活性化するために２０年にわたって使用されてきた。したがって、当業界で公知の様々な試薬および方法を使用して実施することができる（例えば、参照によって本明細書に組み入れる米国特許第４５４０５７３号および米国特許第４７６４３６９号を参照のこと）。適切な溶媒には、トリ−ｎ−ブチルホスフェート（ＴｎＢＰ）およびエーテル、好ましくはＴｎＢＰ（通常約０．３％）が含まれる。適切な界面活性剤には、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）８０、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０およびトリトンＸ−１００（通常約０．３％）が含まれる。溶媒および界面活性剤濃度を含む処理条件の選択は、一部には原材料の特性に左右され、純度が低い原材料は一般的に高濃度の試薬およびより極端な反応条件を必要とする。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０で、特に好ましい組み合わせはポリソルベート８０およびＴｎＢＰである。原材料は、存在する可能性があるいかなるエンベロープウイルスも不活性化するのに十分な温度および時間で、溶媒および界面活性剤試薬と撹拌することができる。例えば、溶媒界面活性剤処理は、２５℃で約４時間実施することができる。溶媒界面活性剤化学物質はその後、例えば、Ｃ−１８疎水性樹脂などのクロマトグラフィー媒体に吸着させるか、または関心のあるタンパク質を吸着する条件下でイオン交換樹脂の素通り画分へ溶出させることによって除去する。
【０１１６】
ウイルス不活性工程は、本明細書で開示した方法の任意の適切な段階で実施することができる。一実施形態では、工程（ｉ）の前に、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料にウイルス不活性化工程を行う。別の実施形態では、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー樹脂（すなわち、工程（ｉｉ）および／または（ｉｖ））から回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液に、ウイルス不活性化工程を行う。本明細書で開示した一実施形態では、ウイルス不活性化工程は、低温殺菌または有機溶媒および界面活性剤による処理を含む。本明細書で開示した別の実施形態では、ウイルス不活性化工程は、ウイルス濾過を含む。ウイルス濾過を使用する場合、本発明者らは、濾過工程前に遊離アミノ酸（例えば、ア
ルギニン）を添加すると、フィルターからのフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの流動速度および回収を顕著に改善できることを見いだした。このような方法の一例は、米国特許第７９１９５９２号に記載されている。
【０１１７】
本明細書で開示した一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料または溶液を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる前に、該溶液にウイルス不活性化工程を行う。処理した溶液または原材料を陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる前に溶媒界面活性剤処理などのウイルス不活性化工程を使用する利点は、陰イオン交換樹脂では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの樹脂への結合ならびにフロースルー（素通り）画分による有機溶媒および界面活性剤の除去を促進する条件を利用することによって、有機溶媒および界面活性剤を処理溶液から除去できることである。
【０１１８】
低温殺菌は、フィブリノーゲンを含む溶液（本明細書ではまた、「フィブリノーゲン溶液」と称する）中では特に、タンパク質凝集物およびポリマーを生じ得る。したがって、場合によっては、低温殺菌した溶液中における凝集物／ポリマーのレベルを低下させることが所望されることがある。これは、当業者公知の任意の手段によって実施することができるが、さらなるクロマトグラフィー精製によって便利に実現することができる。本明細書で開示した一実施形態では、低温殺菌した溶液または原材料は、いかなる凝集物またはポリマーもフロースルー（素通り）画分に除去されるように、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦに関してポジティブモードで陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させる。
【０１１９】
「原材料」という用語は、本明細書ではフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む任意の溶液を示すために使用する。原材料はまた、当業者公知のその他のタンパク質（例えば、治療タンパク質）を含むことがある。例には、血液凝固カスケードに関与するタンパク質が含まれる。本明細書で開示した一実施形態では、原材料はフィブリノーゲンを含む。
【０１２０】
フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む適切な原材料は当業者に公知である。例には、血漿または可溶化した血漿寒冷沈降物などの血漿画分またはヒトもしくは動物血漿もしくは血漿画分から得られた可溶化した第Ｉ画分ペースト、組換技術による細胞培養画分、トランスジェニック動物のミルクから得られた画分などが含まれる。組換フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦタンパク質の原料も本発明による原材料として使用するために適している。原材料が血漿または血漿画分の場合、プールされた輸血血漿であってもよく、または個々のドナーから入手してもよい。本明細書で開示した一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料は、可溶化した血漿寒冷沈降物である。全血から得られるか、またはアフェレーシスによって収集したこの成分は、凍結した新鮮な血漿を１〜６℃の間で制御解凍し、沈殿物を回収することによって調製する。寒冷不溶性沈殿物は、再凍結する。寒冷沈降物アフェレーシス１単位は、全血から得られた寒冷沈降物２単位とほぼ同等である。これは、凍結した新鮮な血漿由来の第ＸＩＩＩ因子およびフィブロネクチンなどのその他のタンパク質と共にフィブリノーゲン、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦのほとんどを含有する。フィブリノーゲンのその他の原料は、解凍し、遠心もしくは濾過によって寒冷沈降物を除去することによって凍結血漿から調製することができる第Ｉ画分沈殿物である。得られた寒冷上清物を次にエタノールと混合して、第Ｉ画分を沈殿させる。例えば、第Ｉ画分沈殿物は、約８％（ｖ／ｖ）エタノールをｐＨ７．２で添加し、温度を約−３℃に制御することによって得ることができる（Ｃｏｈｎ等、１９４６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６２：４５９〜４７５）。一実施形態では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料は、寒冷沈
降物である。
【０１２１】
明細書において「プロテアーゼ」とは、ＨＣＩＣ樹脂に曝露したとき、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦが樹脂を通過する条件下でＨＣＩＣ樹脂に結合することができる、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料または溶液中に存在する任意のプロテアーゼおよび／またはその酵素前駆体であってもよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（例えば、プラスミン、トロンビン、トリプシン）、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢおよびカテプシンＨ）、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ペプシン）、メタロプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼ）およびグルタミン酸プロテアーゼを含むいかなる種類であってもよい。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料をヒトまたは動物の血漿から得る場合、プロテアーゼ／酵素前駆体には、プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、トロンビン、エラスターゼ、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、血漿カリクレインなどが含まれることがある。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液に関して、除去することが特に好ましいプロテアーゼ／酵素前駆体は、プラスミノーゲンである。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液から除去することが好ましいその他のプロテアーゼ／酵素前駆体は、ｔ−ＰＡ、プロおよび／または活性トロンビン（第ＩＩ／ＩＩａ因子）である。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料を細胞培養上清から得るとき、プロテアーゼ／酵素前駆体には、セリンプロテアーゼ（例えば、カゼイナーゼ）、メタロプロテアーゼ（例えば、ゼラチナーゼ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０もしくはＭＭＰ１２を含むマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））、アスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）などの任意の宿主細胞プロテアーゼ、中でも酸プロテアーゼが含まれることがある。
【０１２２】
場合によって、原材料を工程（ｉ）においてＨＣＩＣ樹脂に通過させる前に、原材料の不純物を除去するか、または不純物のレベルを低下させることが所望されることがある。原材料から不純物を除去するか、または不純物のレベルを低下させると、クロマトグラフィー精製中のＨＣＩＣ樹脂への負荷を低下させ、したがって、原材料からのプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼの分離効率を改善することができる。不純物は、例えば、原材料からフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを沈殿させ、沈殿したタンパク質を回収することによって除去するか、または低下させてもよい。フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む原材料からフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを沈殿させる適切な方法は当業者に公知である。一例には、水酸化アルミニウム懸濁液を原材料に添加することが含まれ、これは、ビタミンＫ依存性タンパク質（例えば、凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ）ならびにプロトロンビン（第ＩＩ因子）およびｔ−ＰＡなどの水酸化アルミニウムに結合親和性を有するその他のタンパク質を血漿または血漿寒冷沈降物から除去するために特に有用である。
【０１２３】
したがって、本明細書で開示した一実施形態では、工程（ｉ）の前に、原材料からビタミンＫ依存性タンパク質を除去するか、または低減させる。他の実施形態では、ビタミンＫ依存性タンパク質を、原材料に水酸化アルミニウムを添加することによって除去するか、または低減させる。水酸化アルミニウムは、アルハイドロゲル（登録商標）の形態で、最終濃度が約１０％から約８０％ｗ／ｗになるまで原材料に添加してもよい。いくつかの実施形態では、水酸化アルミニウムは、最終濃度約１０％から約５０％（ｗ／ｗ）の範囲で原材料に添加する。その他の実施形態では、水酸化アルミニウムは、最終濃度約１０％
から約３０％（ｗ／ｗ）の範囲で原材料に添加する。好ましい実施形態では、濃度は、約１５％から約３０％（ｗ／ｗ）である。最も好ましくは、最適なフィブリノーゲン回収およびプロトロンビンなどの不純物の除去のために、水酸化アルミニウムは約１５％から約２５％（ｗ／ｗ）で原材料に添加する。別の実施形態では、ビタミンＫ依存性タンパク質を、水酸化アルミニウムを使用したバッチ吸着によって原材料から除去する。
【０１２４】
本発明の別の態様では、本明細書で記載したように、本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液を提供する。一実施形態では、溶液中におけるプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼのレベルは、全タンパク質の２０％未満、好ましくは全タンパク質の１０％未満、より好ましくは全タンパク質の５％未満、または全タンパク質の１％未満、または全タンパク質の０．１％未満、または全タンパク質の０．０１％未満、または全タンパク質の０．００１％未満、または全タンパク質の０．０００１％未満である。当業者であれば、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液中に存在するプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼのレベルは、溶液の企図する使用または貯蔵の長さに左右され得ることを理解しているものと予想される。例えば、溶液を約０℃から約８℃の室温で少なくとも４週間貯蔵する場合、その溶液が含むプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼが（全タンパク質の）約１０％より多いことは許容され得る。溶液を約３０℃の温度で少なくとも４週間貯蔵する場合、その溶液が含むプラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼが（全タンパク質の）約１０％未満であることが所望され得る。
【０１２５】
本明細書で開示した一実施形態では、本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンを含む溶液を提供する。別の実施形態では、溶液は、全タンパク質の少なくとも８０％のフィブリノーゲンを含む。
【０１２６】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも７５％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１μｇ未満のプラスミノーゲン
を含む溶液
を提供する。
【０１２７】
一実施形態では、溶液は、全タンパク質１ｍｇ当たり１．５×１０−５Ｕ未満の第ＩＩ因子をさらに含む。
【０１２８】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５０ｎｇ未満のプラスミノーゲン
を含む溶液を提供する。
【０１２９】
一実施形態では、溶液はさらに：
（ａ）全タンパク質１ｍｇ当たり３．５×１０−６Ｕ未満の第ＩＩ因子；および／または
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５０μｇ未満のフィブロネクチン
を含む。
【０１３０】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ未満のプラスミノーゲンを含む溶液を提供する。
【０１３１】
本発明の別の態様では：
（ａ）全タンパク質の少なくとも９０％のフィブリノーゲン；
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり２０ｐｇ未満の組織プラスミノーゲン活性化因子；および／または
（ｃ）全タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ未満のプラスミノーゲンを含む溶液を提供する。
【０１３２】
一実施形態では、溶液はさらに：
（ａ）全タンパク質１ｍｇ当たり２．７×１０−６Ｕ未満の第ＩＩ因子；および／または
（ｂ）全タンパク質１ｍｇ当たり１５μｇ未満のフィブロネクチン
を含む。
【０１３３】
本明細書で開示した方法によって回収した溶液中におけるフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの濃度および不純物（例えば、プラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼ）の濃度は、当業者公知の任意の手段によって測定することができる。フィブリノーゲンを測定するための適切アッセイ法の例は、Ｍａｃｋｉｅ等（Ｂｒ  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００３  Ｍａｙ；１２１（３）：３９６〜４０４）に記載されている。サイズ排除ＨＰＬＣはまた、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子を含む溶液中におけるフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子または不純物の濃度を測定するために使用することができる（例えば、Ｃａｒｄｉｎａｌｉ等、２０１０、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．４９３（２）：１５７〜１６８；およびＫｏｓｌｏｓｋｉ等、２００９、ＡＡＰＳ  Ｊ．１１（３）；４２４〜４３１）。ＨＰＬＣはまた、当業者によるフィブリノーゲンのモノマーと凝集物の間の区別を可能にする。さらに、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦの濃度は、使用するアッセイの感度によって異なることがある。例えば、Ｃｌａｕｓｓアッセイを使用して測定した溶液中のフィブリノーゲンの濃度は、ＨＰＬＣによって同じ溶液で測定した濃度よりもわずかに低いことがある。
【０１３４】
本明細書で開示した一実施形態では、溶液中におけるモノマーフィブリノーゲンの濃度は、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定すると全タンパク質の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。
【０１３５】
本発明の別の態様では、本明細書で開示した方法によって回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。薬学的に許容される希釈剤および／または賦形剤を含む適切な薬学的に許容される担体は、当業者には公知である。例には、溶媒、分散媒、抗真菌剤および抗菌剤、表面活性剤、等張剤および吸収剤などが含まれる。
【０１３６】
医薬製剤はまた、適切な安定化剤、例えば、アミノ酸、炭水化物、塩および界面活性剤
の組み合わせを添加することによって製剤化することができる。特定の実施形態では、安定化剤には、糖アルコールおよびアミノ酸の混合物が含まれる。安定化剤は、糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）およびアミノ酸（例えば、プロリン、グリシンおよびアルギニン）の混合物を含むことができる。好ましい実施形態では、製剤は、アルギニンなどのアミノ酸を含む。その他の実施形態では、製剤は、最高１００ｍＭの濃度の二価金属イオンおよび米国特許第７０４５６０１号に記載されたような複合体形成剤を含む。特定の実施形態には、米国特許第７０４５６０１号の実施例１に記載されたような製剤１から７が含まれる。特定の実施形態では、製剤は、いかなる抗線溶剤またはアルブミンなどの安定化タンパク質も添加することなく製剤化する。実施形態では、製剤がフィブリノーゲンを含む場合、ｐＨは、好ましくは約６．５から７．５であり、浸透圧は少なくとも２４０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇである。
【０１３７】
医薬製剤はまた、分注および長期貯蔵の前に濾過によって滅菌してもよい。好ましくは、製剤は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６カ月またはそれ以上の月数間、元の安定特性を実質的に保持する。例えば、２〜８℃または２５℃で貯蔵した製剤は通常、６カ月以上貯蔵しても、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定すると、実質的に同じ分子サイズ分布を保持することができる。医薬製剤の特定の実施形態は、２〜８℃および／または室温で貯蔵したとき、少なくとも６カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３６カ月またはそれ以上であっても、商用の薬学的使用のために安定であり、適切であり得る。
【０１３８】
本明細書で記載したような本発明の溶液および医薬製剤は、注射製剤などの多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。製剤およびその後の投与（投薬）は、当業者の範囲内である。投薬は、治療する対象の応答性に左右されるが、所望する効果（例えば、フィブリノーゲンの正常な血漿レベルへの回復）が必要な限りずっと継続する。当業者は、最適な投薬量、投与方法および反復数を容易に決定することができる。
【０１３９】
本明細書で開示した一実施形態では、本発明の医薬製剤は、少なくとも５ｍＬの容量を有し、フィブリノーゲンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬ含む。別の実施形態では、医薬製剤の容量は少なくとも５ｍＬで、フィブリノーゲンを少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ含む。特定の実施形態では、医薬製剤の容量は少なくとも５ｍＬで、フィブリノーゲンを約２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。別の態様では、少なくとも５ｍＬの安定した薬学的に許容されるフィブリノーゲン溶液を含有する容器であって、フィブリノーゲンの濃度は少なくとも２０ｍｇ／ｍＬである、前記容器を提供する。
【０１４０】
本発明の別の態様では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ不足に関連した症状を治療または予防する方法であって、本明細書で開示したように本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液または本明細書で開示したような本発明の医薬製剤を、それらを必要とする対象に投与することを含む、前記方法を提供する。
【０１４１】
本発明の別の態様では、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ不足に関連した症状を治療または予防するための医薬品の製造における、本明細書で開示したような本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液の使用を提供する。当業者であれば、フィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ不足に関連した症状の種
類はよくわかるであろう。一実施形態では、このフィブリノーゲン症状は、無フィブリノーゲン血症、低フィブリノーゲン血症および異常フィブリノーゲン血症からなる群から選択される。一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ症状は、出血障害である血友病Ａ（例えば、血小板機能欠陥、血小板減少症またはフォンビルブランド病）、血管損傷、外傷もしくは手術による出血、抗凝固療法による出血、肝臓疾患による出血からなる群から選択される。
【０１４２】
本明細書で開示したように、本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンおよび／または第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含む溶液で治療することができるその他の症状には、大怪我および重篤な出血および熱傷が含まれる。低フィブリノーゲン血症および無フィブリノーゲン血症の場合、本発明によって調製したフィブリノーゲンを含む溶液は、フィブリノーゲン不足の状態を補うためにそれらを必要とする患者に静脈注射することができ、投薬量は不足の程度に基づいて当業者が決定することができる。
【０１４３】
本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンを含む溶液はまた、プラスミノーゲンおよび／または組織プラスミノーゲン活性化因子および／またはその他のプロテアーゼが不安定レベルではないため、フィブリン糊（フィブリンシーラント（ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔ）としても知られている）の使用において有利である。ｔＰＡは、プラスミノーゲンを活性型プラスミンに変換し、これは次にフィブリン血餅を消化することから、局所適用（例えば、止血）において血餅形成を低下させる。
【０１４４】
フィブリン糊は通常、２種類の成分：（ｉ）フィブリノーゲン（第ＸＩＩＩ因子およびアプロチニンなどの線溶阻害剤と一緒であることが多い）および（ｉｉ）トロンビン（カルシウムイオンと一緒であることが多い）を含む。２種類の成分は、すぐに使える接着剤を調製するために再構成される。フィブリン糊は、カルシウムおよび第ＸＩＩＩ因子の存在下でフィブリノーゲンとトロンビンの組み合わせを使用して架橋したフィブリン繊維を形成することによって、血液凝固の最終工程を刺激するために、臨床適用および獣医学的適用に使用する。フィブリン糊は、臨床薬および獣医薬において、止血、創傷閉鎖、癒着予防および創傷治癒を含めて様々に応用される。フィブリン糊はまた、密封縫合ならびに骨、軟骨および腱などの結合組織を結合するために、皮膚の創傷（皮膚移植を含む）を閉じるために使用することができる。したがって、本明細書で開示した別の態様では、本明細書で開示したように、本発明の方法によって回収したフィブリノーゲンを含む溶液を含むフィブリン糊を提供する。
【０１４５】
当業者であれば、本明細書で記載した本発明では、特に記載したもの以外の変更および改変も許容されることがわかるであろう。本発明には、精神および範囲内に入るこのような変更および改変が全て含まれることを理解されたい。本発明はまた、本明細書で述べるか、または示した工程、特徴、組成物および化合物全てを、個別に、または集合的に含み、前記工程または特徴の任意の２種以上のありとあらゆる組み合わせも含む。
【０１４６】
ここで本発明の所定の実施形態を以下の実施例を参照にして記載するが、これらは単に例示することを目的とするものであって、前述した一般原則の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４７】
〔実施例１〕
ＨＥＡ、ＰＰＡおよびＭＥＰ疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂によるフィブリノーゲンの精製
プールしたヒト血漿寒冷沈降物を開始材料（すなわち、フィブリノーゲン含有原材料）として使用した。簡単に説明すると、プールした血漿寒冷沈降物は、２０ｍＭクエン酸３
ナトリウム、２００ｍＭイプシロン−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）、６０ＩＵ／ｍＬヘパリンおよび５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２±２）を含有する抽出緩衝液中において３１±２℃で３０分間可溶化した（緩衝液４ｇ当たり寒冷沈降物１ｇ）。次に、水酸化アルミニウム２％（ｗ／ｗ）を可溶化した寒冷沈降物に２５％（ｗ／ｗ）の濃度で添加した。その後、水酸化アルミニウムゲルを遠心または深層濾過のいずれかによって除去し、フィブリノーゲン含有上清をＨＣＩＣクロマトグラフィー樹脂によるクロマトグラフィーでさらに精製するために回収した。
【０１４８】
フィブリノーゲン含有上清を、ＨＥＡ、ＰＰＡまたはＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂のいずれか１．８ｍＬを充填したクロマトグラフィーカラムに添加した。クロマトグラフィーカラムを、６．５から８．５の範囲の様々なｐＨの２５ｍＭトリスで予め平衡化した。フィブリノーゲン含有上清を、クロマトグラフィーカラムに約１１ｍＬ／ｍＬ樹脂の比で添加した。ＨＣＩＣ精製は、フィブリノーゲンに関してネガティブモードで実施され、フィブリノーゲンを未結合フロースルー画分に素通りさせ、一方、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲンおよび第ＩＩ因子のほとんどは樹脂に結合して維持した。
【０１４９】
図１から３は、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）、ＰＰＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）およびＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）を使用したフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子のポストクロマトグラフィー精製後の工程回収率を示す。結果は、ｐＨはこれらの樹脂へのプラスミノーゲン結合にはほとんどまたは全く影響を及ぼさず、一方、樹脂へのｔ−ＰＡの結合は、低いｐＨ範囲で最も効果的に見えることを示す。ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラムは、素通り画分において最も高いフィブリノーゲン回収率を示し、試験した操作ｐＨ範囲では、ＰＰＡおよびＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラムの両方で認められた回収率と比較して、フィブリノーゲン回収率にほとんど影響を及ぼさないようであった。ＰＰＡおよびＭＥＰ両カラムは、ｐＨ８．５で素通り画分において最高のフィブリノーゲン回収率を示した。
【０１５０】
〔実施例２〕
ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌによって低下したフィブリノーゲン溶液における不純物レベル
実施例１によって調製したフィブリノーゲンを含有する可溶化寒冷沈降物約４８．５ｍＬを、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０または８．５のいずれかの２５ｍＭトリスで予め平衡化した５ｍＬ  ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラムに添加した。ＨＣＩＣ精製は、フィブリノーゲンに関してネガティブモードで実施され、フィブリノーゲンを未結合フロースルー画分に素通りさせ、一方、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲンおよび第ＩＩ因子は樹脂に結合して維持した。図４ａは、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）を使用したポストクロマトグラフィー精製後のフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子の工程回収率を示す。結果は、ｐＨはＨＣＩＣ樹脂へのプラスミノーゲンおよび第ＩＩ因子の結合にはほとんどまたは全く影響を及ぼさず、一方、樹脂へのｔ−ＰＡの結合は、６．５〜７．０の低いｐＨ範囲で最も効果的に見えることを示す。フィブリノーゲンの回収率は、カラム洗浄を実施しなかったにもかかわらず、様々なｐＨ条件下で、素通り画分において９０％を上回った。図４ａに示したように、これらの結果は、ＨＣＩＣ樹脂によって可溶化寒冷沈降物などの粗フィブリノーゲン含有原材料中におけるプロテアーゼが効果的に除去されることを示している。例えば、ｐＨ７．０で実施した実験条件は、可溶化寒冷沈降物溶液からの第ＩＩ因子は≧９９．９％、ｔ−ＰＡは≧８８．３％およびプラスミノーゲンは≧％９８．２％低下することを示した。
【０１５１】
フィブリノーゲンは、室温（約２０℃）で少なくとも６日間溶液中で安定に維持された。結果は図４ｂおよび図４ｃに示す。
【０１５２】
〔実施例３〕
ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌによって精製されたフィブリノーゲン溶液中における不純物のレベル
実施例１によって生成したアルハイドロゲル（商標）吸着工程後に得られたフィブリノーゲン含有上清約５００ｍＬを、２５ｍＭトリスｐＨ７．０で予め平衡化したＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）の樹脂３６ｍＬを充填したＸＫ１６／３０カラムに添加した。素通り画分は、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子を試験するために収集した。結果の概要を以下の表１に示す。
【０１５３】
【表１】
2019011346.tif 000002
【０１５４】
〔実施例４〕
ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌによって精製したフィブリノーゲン溶液中における不純物のレベルに対するグリシン沈殿の効果
実施例１によって生成したアルハイドロゲル吸着工程後のフィブリノーゲン含有上清に、グリシン２．４Ｍ、２．７Ｍ  ＮａＣｌ、２．１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２３ｍＭクエン酸３ナトリウムを含む生理食塩水（ｐＨ６．６〜７．３）を添加することによって、さらに沈殿工程を行った。可溶化した沈殿物を３０℃まで温めてから、同様に３０℃でインキュベートしたグリシン緩衝液を、生成物の緩衝液に対する比１：２で添加した。混合物を１０分間撹拌し、得られた沈殿物を遠心によって液相から回収した。主にフィブロネクチンおよびＩｇＧを含有する液相を廃棄して、フィブリノーゲン含有沈殿物を収集し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭクエン酸３ナトリウム、１０ｍＭトリス−（ヒドロキシメチルメチルアミン）および４．５ｍＭスクロースを含有する可溶化緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。可溶化したフィブリノーゲン中間体（２５０ｍＬ）は、１μｍフィルターを使用して清澄にしてから、ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂３６ｍＬを充填し、２５ｍＭトリスｐＨ７．０で予め平衡化したＸＫ１６／３０カラムに通過させた。素通り画分は、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子を試験するために収集し、結果の概要を以下の表２に示した。
【０１５５】
結果は、プラスミノーゲン、ｔ−ＰＡおよび第ＩＩ因子のＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂への結合は、実施例２で記載した条件下で観察されたものと比較して、これらの処理条件下でより効果的であることを示している。解析結果は、工程の回収率がフィブリノーゲン約９３％、プラスミノーゲン６％、ｔ−ＰＡ１２％および第ＩＩ因子５％であることを示した。
【０１５６】
【表２】
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【０１５７】
〔実施例５〕
血漿寒冷沈降物から精製したフィブリノーゲンの調製
処理工程１−血漿寒冷沈降物の可溶化；
処理工程２−可溶化した血漿寒冷沈降物のアルハイドロゲル（商標）（水酸化アルミニウム）吸着（アルハイドロゲル（商標）濃縮物：標的１５から２０％ｗ／ｗ、１０から５０％ｗ／ｗの範囲）および遠心または濾過助剤の存在下での深層濾過などの方法を使用したフィブリノーゲン含有上清の回収。あるいは、この工程は、フィブリノーゲンに関してネガティブモード（素通り）のＨＣＩＣクロマトグラフィー工程またはフィブリノーゲンに関していずれもネガティブモードのＨＣＩＣおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって置き換えることができる。ＨＣＩＣおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの両方を組み合わせて使用する場合、処理工程３を選択する；
処理工程３−工程２のフィブリノーゲン含有上清からのフィブリノーゲンのグリシン沈殿。あるいは、この工程は、フィブリノーゲンに関してネガティブモードの陰イオン交換クロマトグラフィーによって置き換えることができる；
処理工程４−可溶化した工程３のグリシン沈殿物をフィブリノーゲンに関してネガティブモードのＨＣＩＣクロマトグラフィー樹脂に通過させる；
処理工程５−病原体を不活性化するために、工程４で回収した精製フィブリノーゲン溶液を溶媒もしくは界面活性剤で処理するか、または低温殺菌する；
処理工程６−工程５の処理溶液をフィブリノーゲンに関してポジティブモードの陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂に通過させ、弱く結合したタンパク質を樹脂から洗浄し、フィブリノーゲンを樹脂から溶出させる；
処理工程７−工程６の陰イオン交換樹脂から溶出したフィブリノーゲンにナノ濾過（３５ｎｍまたは２０ｎｍまたは３５／２０ｎｍの組み合わせ）を行い；
処理工程８−工程７で濾過したフィブリノーゲンを限外濾過（５０、１００、２００および３００ｋＤａ膜フィルター）する。
【０１５８】
〔実施例６〕
ＨＣＩＣおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによる精製フィブリノーゲンの調製
ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラムを使用した混合型クロマトグラフィー工程で、実施例１から３で記載した工程によって、寒冷沈降物約１００ｇを調製した３回の実験室規模の実験を完遂した。
【０１５９】
主にフィブリノーゲンを含有するＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）カラムからの素通り画分に、ウイルス不活性化のため溶媒／界面活性剤処理を一晩行った。
【０１６０】
次に、ウイルスを不活性化した溶液を２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を使用して≦１０ｍＳ／ｃｍまで希釈してから、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ樹脂約４１２ｍＬを充填した陰イオン交換カラム（ＸＫ５０／３０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。フロースルー画分を廃棄し、ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱカラムを９０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＥＡＣＡを含有する洗浄緩衝液（ｐＨ８．０）４カラム容量で洗浄した。これらのクロマトグラフィー条件下で、最初のフロースルー画分および洗浄画分は主にプラスミノーゲンおよびｔ−ＰＡを含有し、一方、フィブリノーゲンはクロマトグラフィー樹脂に結合したままだった。モノマー型のフィブリノーゲンはＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱカラムから、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１０ｍＭクエン酸３ナトリウム、４６ｍＭスクロースおよび１．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む溶出緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して選択的に溶出し、フィブリノーゲン凝集物および低分子量タンパク質はＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ樹脂に結合したままにした。
【０１６１】
ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱクロマトグラフィー溶出物に通過した、可溶化寒冷沈降物から生じた生成物中間体の特徴を、フィブリノーゲン、ｔ−ＰＡ、プラスミノーゲン、フィブロネクチンおよび第ＩＩ因子のレベルならびに様々な処理段階でのこれらのタンパク質それぞれの処理工程回収率によって明らかにした。表３に示した結果は、研究室規模で一貫して行った３回の別々のバッチの平均値を表している。血漿寒冷沈降物から開始してＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ溶出物までの、処理全体のフィブリノーゲンおよび同時精製したタンパク質の回収率を図５に示す。
【０１６２】
ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱクロマトグラフィー樹脂から回収したフィブリノーゲンの純度は、サイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラムの分析によって明らかなように、９５％を上回った。ＴＳＫＧｅｌ（商標）Ｇ４０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で分析したフィブリノーゲンのＨＰＬＣ特性の代表例を図６に示す。図６に示したように、フィブリノーゲンモノマーは約１７．４分の保持時間で溶出し、全ピーク面積の９６．６％に当たり、一方フィブリノーゲンダイマーおよび／またはその他の高分子量タンパク質は約１４．８分の保持時間で溶出した。
【０１６３】
実施例５および６で記載した方法に従って、他のフィブリノーゲンバッチをパイロット規模（血漿同等物８１ｋｇ）で製造した。フィブリノーゲン調製物の特徴を表４に示す。
【０１６４】
〔実施例７〕
精製したフィブリノーゲンのウイルス濾過
ＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）−ＨＱ溶出工程に１９０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（２１．５ｍＳ／ｃｍ）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（２２．５ｍＳ／ｃｍ）、２１０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（２３．５ｍＳ／ｃｍ）または１％（ｗ／ｗ）アルギニンを含有する２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液（２５ｍＳ／ｃｍ）のいずれかを使用した実施例６の方法に従って、２０ｎｍウイルスフィルターによる濾過性を得られたフィブリノーゲン調製物で調べた。
【０１６５】
この方法では、調製物に３％（ｗ／ｗ）アルギニンをｐＨ約７．５で配合することが必要であった（試料のタンパク質濃度は約６ｇ／Ｌであった）。次に、配合した調製物は、ウイルス濾過工程前に０．１μｍフィルターを使用して濾過した。ウイルス濾過工程は、４７ｍｍＰａｌｌ  ＳＶ４（商標）フィルターを用いて、デッドエンド様式で、定圧１．８ｂａｒを使用して実施した。結果は、１９０ｍＭ、２００ｍＭまたは２１０ｍＭのいずれかを使用してＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）ＨＱカラムから得られたフィブリノーゲン調
製物は、類似の濾過特性を生じることを示唆している。対照的に、１％（ｗ／ｗ）アルギニンを含有する２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液を使用してＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）ＨＱカラムから溶出したフィブリノーゲン調製物は、フィルターに迅速に付着した（図７）。
【０１６６】
〔実施例８〕
安定性試験
前記の実施例５で記載した方法によって回収した精製フィブリノーゲン溶液を滅菌濾過し、９／７週にわたって２℃〜８℃または３０℃で安定性試験を行った。２℃〜８℃に置いた液体フィブリノーゲン調製物は、貯蔵期間９週間後にＣｌａｕｓｓ法によって測定したところ、元の活性の約９０％を保持していた。３０℃に置いた液体フィブリノーゲン調製物は、貯蔵期間２週間後に元の活性の約７０％を保持し、少なくとも５週間はさらなる活性の喪失はなかった。６０％を下回る活性のさらなる低下は、３０℃で７週間インキュベートすることによって認められた。３０℃でのフィブリノーゲン活性の喪失は、プロテアーゼ阻害剤（Ｃ１エステラーゼ）を添加しても貯蔵期間５週間にわたるフィブリノーゲン活性の損失を阻害しなかったので、タンパク質分解よりも熱変性によるものと考えられる。安定性データの概要を図８に示す。
【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
【表４】
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【０１６９】
〔実施例９〕
ＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌを使用した第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦを含有する溶液中における血漿プロテアーゼレベルの低下
この実施例は、ＨＣＩＣクロマトグラフィー工程も、第ＶＩＩＩ因子および／またはＶＷＦ含有調製物中におけるプロテアーゼを低下させるために使用できることを示す。この方法には、実施例４から得られたフィブリノーゲン含有溶液を、深層フィルターを使用して清澄化してから、清澄化した溶液を第２の疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）樹脂に通過させることが必要である。ＨＣＩＣ工程は、プラスミノーゲンなどのプロテアーゼが樹脂に結合し、一方、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦが樹脂を通過することができる条件下で操作した。特に、ＸＫ５０／３０カラムにＨＥＡ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）樹脂３４０ｍＬを充填した。カラムは、５０ｍＭトリスｐＨ６．７で予め平衡化した。次に、実施例４によって調製した清澄なフィブリノーゲン溶液をこのカラムに添加し、カラムを５０ｍＭトリスｐＨ６．７で洗浄した。素通り画分を収集し、第ＶＩＩＩ因子、ＶＷＦ、プラスミノーゲンおよびｔ−ＰＡのレベルを測定した（ＶＷＦ：ＲＣｏ＝フォンビルブランドリストセチンコファクター）。４回の個々の実験から得られた平均結果の概要を、表５に示す。結果は、ＨＣＩＣクロマトグラフィー工程は第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦを含む画分からプラスミノーゲンおよびｔＰＡなどのプロテアーゼを効果的に除去したことを示す。さらに、第ＶＩＩＩ因子およびＶＷＦの良好な回収率が認められた。
【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
〔実施例１０〕
様々な方法から精製したフィブリノーゲンの比較研究
実施例６で記載したように、本発明の方法によって製造したフィブリノーゲン調製物を国際公開第２００１０４８０１６号、国際公開第２０１２０３８４１０号および国際公開第２０１３１３５６８４号で記載された方法によって製造したフィブリノーゲン調製物と比較した。
【０１７２】
（ａ）国際公開第２００１０４８０１６号で記載された方法の好ましい実施形態によって製造されたフィブリノーゲン調製物。
【０１７３】
簡単に説明すると、この方法には、抽出緩衝液（０．８Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＡＣＡ（イプシロン−アミノカプロン酸）、２０ｍＭクエン酸Ｎａ、６０ＩＵ／ｍＬヘパリン、ｐＨ７．３）中に第Ｉ画分ペーストを懸濁することが必要である（抽出緩衝液８．３３ｇに対して第Ｉ画分１ｇ）。次に、この溶液を３７℃で１．５時間混合してから、２％Ａｌ（ＯＨ）３（アルハイドロゲル）溶液５０ｇを第Ｉ画分１ｇに添加した（１０．８％）。この混合物を室温で１５分間攪拌して、次に５０００ｇで１０分間遠心し、ペレットを廃棄した。アルハイドロゲル処理した上清にグリシン／ＮａＣｌ緩衝液（グリシン２．１Ｍ、２０ｍＭクエン酸Ｎａ、３．６Ｍ  ＮａＣｌおよび２．４ｍＭ  ＣａＣｌ２）を添加した（いずれの溶液も３０℃に予め平衡化した）。上清の緩衝液への添加は、約４．５分で完了した（緩衝液２．０５部に対して上清１部）。次に、この混合物を３０℃で２０分間攪拌してから５０１０ｇで１０分間遠心した（上清を廃棄した）。次に、沈殿物を緩衝液Ｄ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、１０ｍＭトリス、４５ｍＭスクロース、ｐＨ６．９）に室温で２時間混合して再溶解した（第Ｉ画分を再懸濁するために使用した量の１／３の量）（国際特許第０１４８０１６号、実施例１、１．１．１〜１．１．６項）。次に、再溶解したフィブリノーゲンを含有する溶液をＭａｃｒｏＰｒｅｐ（商標）ＨＱカラム（床高２０ｃｍのＸＫ２６）に添加した。カラムを、少なくとも１．５カラム容量（ＣＶ）のＭＱ緩衝液（５０ｍＭトリス、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＡＣＡ、ｐＨ８．０、１０ｍＬ／分（１１３ｃｍ／ｈｒ）で予め平衡化した。カラム後の伝導度が調製した緩衝液の９０〜１１０％になるまで、平衡化を継続した。次に、フィブリノーゲン溶液をこのカラムに添加し、カラムを６ＣＶのＭＱ緩衝液で洗浄した。フィブリノーゲンは、ＭＥ緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１ｍ
Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭクエン酸Ｎａ、１０ｍＭトリスおよび４５ｍＭスクロース、ｐＨ７．０）を使用して単一ピークとして溶出した。カラムは、２ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌを使用して再生することができた（国際公開第２００１０４８０１６号、実施例２）。
【０１７４】
（ｂ）国際公開第２０１２０３８４１０号および国際公開第２０１３１３５６８４号で以前に記載された方法の好ましい実施形態によって製造されたフィブリノーゲン調製物。
【０１７５】
確立された方法によって血漿から生産した寒冷沈降物をほぼ中性のｐＨで再構成または可溶化し、Ａｌ（ＯＨ）３による吸着を行い、得られたゲルを遠心によって除去した。次に、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理によって上清のウイルスを不活性化した。Ｓ／Ｄ化合物、トリトンおよびＴｎＢＰを植物油で抽出し、水相をＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ−ＴＭＡＥと接触させた。フィブリノーゲンがゲルに結合せず、したがってフロースルーまたは上清に見いだされるクロマトグラフィー条件（ｐＨ値６．９〜７．１および浸透圧５７０〜６１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌ）を使用した。結合していないフィブリノーゲンの溶液は、グリシン添加後（最終濃度１ｍｏｌ／ｌでｐＨ＝７．４）、フィブリノーゲンを沈殿させるために２０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で約９０分間撹拌した。その後、フィブリノーゲン含有沈殿物を遠心によって分離して、中間体フィブリノーゲンペーストを生成した。中間体フィブリノーゲンペーストを２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝約８．０）に再懸濁した。次に、得られた懸濁液を濾過し、限外濾過／ダイアフィルトレーションを行った。次に、得られたフィブリノーゲン含有溶液をＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ（登録商標）に添加し、フィブリノーゲン溶液を添加する前に、再懸濁するために使用したのと同じトリス緩衝液でクロマトグラフィーゲルまたは樹脂を予め平衡化した。緩く結合した物質を平衡化緩衝液で、次いで洗浄緩衝液（ｐＨ＝約７．０および伝導率約１２．０ｍＳ／ｃｍに調節したクエン酸ナトリウム１．５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム６．０ｇ／ｌ）で洗浄した。次に、フィブリノーゲンを溶出緩衝液（洗浄緩衝液と同じｐＨに調節し、約７．０ｇ／ｌのＮａＣｌ、伝導率約１３．１〜１５ｍＳ／ｃｍに調節したクエン酸ナトリウム１．５ｇ／ｌ、グリシン１０．０ｇ／ｌ）でクロマトグラフィーカラムから溶出した。
【０１７６】
国際公開第２００１０４８０１６号、国際公開第２０１２０３８４１０号および国際公開第２０１３１３５６８４号で記載された方法から得られたフィブリノーゲン含有溶液の全タンパク質（ビウレット）、フィブロネクチンおよびプラスミノーゲンレベルを試験した。さらに、２〜８℃および３０℃で試料の安定性試験を行った。
【０１７７】
フィブリノーゲン調製物の特性の比較を表６に示す。試験の結果は、本発明の方法から製造されたフィブリノーゲンは、その他の方法と比較してプラスミノーゲン含有レベルが低いことを示す。
【０１７８】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月25日(2018.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲンを精製する方法であって：
（ｉ）溶液中に存在するフィブリノーゲンモノマーがイオン交換クロマトグラフィー樹脂に結合するように選択された条件下で、フィブリノーゲンを含む溶液を該樹脂に通過させる工程；
（ｉｉ）該樹脂からフィブリノーゲンモノマーを溶出緩衝液で溶出させる工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの溶出したフィブリノーゲンモノマーを、孔径が約１５ｎｍから約３５ｎｍの範囲のフィルターで濾過する工程
を含む、前記方法。
【外国語明細書】
2019011346000001.pdf