(57)【要約】  【課題】腸バリアを改善する手法を提供すること。  【解決手段】プロテオグリカン、及び／又はイチジクの乳酸菌醗酵物を含有する、腸バリア改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカン、及び／又は
イチジクの乳酸菌醗酵物
を含有する、腸バリア改善用組成物。
【請求項２】
整腸用である、請求項１に記載の腸バリア改善用組成物。
【請求項３】
腸内ムチン量を増加させるための、請求項１又は２に記載の腸バリア改善用組成物。
【請求項４】
腸内細菌叢を改善させるための、請求項１又は２に記載の腸バリア改善用組成物。
【請求項５】
イチジクの乳酸菌醗酵物が、イチジクのラクトバチルス・ペントサス醗酵物である、請求項１〜４のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。
【請求項６】
経口組成物である、請求項１〜５のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。
【請求項７】
プロテオグリカン、及び
イチジクの乳酸菌醗酵物
を含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸バリア改善用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む脊椎動物は水や食物を摂取し吸収することにより生命を維持する。当該吸収は、消化管（特に腸）によって行われており、口から摂取する食物を含む外来の異物は消化管を通過する。また、それとともに様々な細菌が腸管に侵入し、栄養が豊富な環境のもと腸管に定着して増殖し、腸内フローラといわれる細菌叢を形成する。宿主が腸内細菌と良好な関係性を維持するため、腸管に特有の免疫機構が発達している。例えば、腸管上皮細胞は粘膜バリアを構築することにより腸内細菌と腸管上皮組織とを分けへだて、さらに、免疫担当細胞にシグナルを伝達することにより腸管免疫系を制御する。
【０００３】
腸管内部表面に存在する吸収上皮細胞は栄養や水分の吸収に特化した細胞であり，腸管上皮細胞の大部分を占めている。吸収上皮細胞の頂端面の表面は糖衣とよばれる糖鎖の集合体により覆われており、腸内細菌の腸管上皮細胞への侵入を防止する。同じく、腸管内部表面に存在する杯細胞は、粘液の主成分である糖タンパク質（ムチン）を多量に産生し分泌することにより腸の粘膜をおおう粘液の恒常性を維持し、腸管上皮細胞への腸内細菌の侵入を防いでいる。
【０００４】
このように、腸バリア機能（特に腸内の粘膜バリア）を維持することは、腸内の環境を維持し、健康を保つために重要である。このため、腸バリアを改善させる方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１４３７２号公報
【特許文献２】国際公開第１２／０９９２１６号
【特許文献３】特開２０１４−１８７９４８号公報
【特許文献４】特開２０１４−１８７９４９号公報
【特許文献５】特開２０１７−０６６０９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、腸バリアを改善する手法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物が腸バリアを改善させる可能性を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
プロテオグリカン、及び／又は
イチジクの乳酸菌醗酵物
を含有する、腸バリア改善用組成物。
項２．
整腸用である、項１に記載の腸バリア改善用組成物。
項３．
腸内ムチン量を増加させるための、項１又は２に記載の腸バリア改善用組成物。
項４．
腸内細菌叢を改善させるための、項１又は２に記載の腸バリア改善用組成物。
項５．
イチジクの乳酸菌醗酵物が、イチジクのラクトバチルス・ペントサス醗酵物である、項１〜４のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。
項６．
経口組成物である、項１〜５のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。
項７．
プロテオグリカン、及び
イチジクの乳酸菌醗酵物
を含有する、項１〜６のいずれかに記載の腸バリア改善用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア機能が不調である場合にこれを改善して通常の状態に戻す効果のみならず、腸バリア機能を通常の状態からさらに優れた状態にする効果をも有する。すなわち、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア修復用組成物としてのみならず、腸バリア亢進用組成物としても用いることができる。またさらに、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア機能を低下することを予め予防する効果も奏し得る。例えば、腸内炎症惹起物質等により腸バリア機能が低下する場合に、その惹起物質に暴露される以前に本発明の腸バリア改善用組成物を摂取しておくことにより、惹起物質に暴露された場合に生じるバリア機能低下を抑制又は防止すること効果が得られうる。すなわち、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア低下予防組成物としても用いることができる。また例えば、当該腸バリア改善用組成物は、特に整腸用組成物として好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】作製した小腸上皮モデルの概要を示す。
【図２】図１に示す小腸上皮モデルを用いて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）測定により膜電位差を測定することにより、腸バリアの評価を行った結果を示す。横軸は時間（ｈ）を示し、縦軸は膜電位差変化率（％）を示す。
【図３】プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物を摂取したヒトの、糞便中ムチン量検査の結果を示す。
【図４】プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物を摂取したヒトへのアンケートの集計結果を示す。
【図５】プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物を摂取したヒトの、腸内フローラの細菌種の解析の結果を示す。
【図６】大腸炎誘発モデルヘアレスマウスに対する、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物の炎症予防効果を検討した結果を示す。
【図７】プロテオグリカンを摂取したヒトの、糞便中フェノール量の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明に包含される腸バリア改善用組成物は、プロテオグリカン、及び／又は、イチジクのラクトバチルス・ペントサス醗酵物、を含有する。なお、当該組成物によりバリア機能が改善される腸は、小腸及び／又は大腸であることが好ましく、小腸がより好ましい。
【００１３】
プロテオグリカンはタンパク質をコアとして、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸等のグリコサミノグリカンが共有結合した複合多糖であり、動物組織、特に軟骨組織に多く存在する。プロテオグリカンは生体内で、コア蛋白質がさらにヒアルロン酸に結合した構造で存在することも知られており、その分子量は、数万〜数千万と大きい。その中でも、分子量が２０万〜２０００万程度のものが好ましく、１００万〜１８００万程度のものがより好ましく、１５０万〜１６００万程度のものがより好ましく、２５０万〜１５００万程度のものがさらに好ましく、５００万〜１５００万のものがよりさらに好ましい。なお、プロテオグリカンは分離精製したものだけでなく、粗精製物も使用できる。プロテオグリカンの定量は、ゲルクロマトグラフィーを用いて分子量分画を行ない（分子量マーカー；分子量既知デキストラン）、分子量が１万以上でかつ酸性糖および蛋白質の存在が確認された画分（又はその乾燥物）を測定することで行なう事ができる。なお、酸性糖の存在及び量は、カルバゾール硫酸法でウロン量を測定することにより、確認することができる。また、蛋白質の存在及び量は、２８０ｎｍ付近における吸光度により測定することができる。このような好ましいプロテオグリカンは、例えば国際公開第１２／０９９２１６号及び特開２０１７−０６６０９７号公報に記載の手法により調製し、また分子量を測定することができる。
【００１４】
本発明に係る腸バリア改善用組成物による、成人一日あたりのプロテオグリカン摂取量は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に制限はされない。例えば、乾燥質量換算で、１０〜１００００ｍｇ／ｄａｙが好ましく、５０〜５０００ｍｇ／ｄａｙがより好ましく、１００〜１０００ｍｇ／ｄａｙがさらに好ましく、１００〜５００ｍｇ／ｄａｙがよりさらに好ましい。
【００１５】
イチジクの乳酸菌醗酵物としては、イチジク破砕物を乳酸菌で醗酵処理したものが好ましく挙げられる。
【００１６】
イチジク（無花果）は、中近東原産のクワ科イチジク属の落葉高木であり、カプリフィッグ型（雄品種）とフィッグ型（雌品種）に区分される雌雄異株の植物であることが知られている。本発明では、イチジクのフィッグ型株が実らせる、果実内部に花が着生する隠花果を用いることが好ましい。品種としては限定するものではないが、「蓬莱柿」や「桝井ドーフィン」を好適に用いることができる。
【００１７】
イチジク破砕物は、イチジクの実（特に隠花果）を摘果後、必要に応じて花軸を除去し、収穫時の状態のまま（丸ごと）粉砕処理して得られるもの（全果破砕物）が好ましい。破砕方法については特に限定されるものではなく常法を使用することができる。また破砕度合いについては、醗酵処理において支障が出ない程度の流動性を有する破砕物であれば特に制限はされず、適宜設定することができる。破砕処理時の温度は常温でも良いが、１５℃以下、更に好ましくは１０℃以下の温度において処理することが好ましい。また、凍結した状態の果物をそのまま粉砕処理して得られるイチジク破砕物も、好ましい態様の一つである。
【００１８】
用いられる乳酸菌としては、例えばラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）等が好ましく挙げられ、特にラクトバチルス・ペントサスが好ましい。
【００１９】
醗酵処理としては、例えば、イチジク全果破砕物１ｇあたり１０６個以上、好ましくは１０７〜１０９個接種する方法が挙げられる。好ましい態様としては、１０９〜１０１１ＣＦＵ／ｍｌの乳酸菌を含有するスターターをイチジク全果破砕物に対して０．５〜１０質量％添加することで接種する方法が挙げられる。醗酵過程では醗酵液のｐＨが徐々に低下する。本発明ではｐＨが５．０以下になるまで醗酵させることが好ましく、４．６以下がより好ましく、４．３以下がさらに好ましい。また、醗酵は、好気醗酵、嫌気醗酵のいずれでも可能であるが、好ましくは嫌気醗酵である。好気醗酵の場合には撹拌醗酵よりも静置醗酵が好ましい。乳酸菌醗酵は、１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃の温度で行うことができる。醗酵させるイチジク全果破砕物が殺菌等の目的で行う加熱処理により温度が高い場合には、その余熱を利用し、乳酸菌スターターを上記温度内で加えることで醗酵を開始させることもできる。乳酸菌醗酵の時間は、例えば５時間〜７２時間、好ましくは１０時間〜３６時間である。なお、長時間醗酵を行うと、乳酸菌以外の残存微生物が増殖して品質を劣化させることがあるため、前述の発酵時間を目安に、出来るだけ短時間で終末酸度に達するように、接種される乳酸菌の菌種と菌数を調整することが好ましい。
【００２０】
本発明に係る腸バリア改善用組成物による、成人一日あたりのイチジクの乳酸菌醗酵物摂取量は、本発明の効果が得られる範囲であれば特に制限はされない。例えば、乾燥質量換算で、１０〜１００００ｍｇ／ｄａｙが好ましく、５０〜５０００ｍｇ／ｄａｙがより好ましく、１００〜１０００ｍｇ／ｄａｙがさらに好ましく、２００〜８００ｍｇ／ｄａｙがよりさらに好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る腸バリア改善用組成物における、プロテオグリカンとイチジクの乳酸菌醗酵物との含有質量比（プロテオグリカン：イチジクの乳酸菌醗酵物）は、例えば、１：０．１〜１０程度が好ましく、１：０．５〜５程度がより好ましく、１：１〜４程度がさらに好ましく、１：２〜３程度がよりさらに好ましい。
【００２２】
本発明に係る腸バリア改善用組成物における、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物の含有量は、本発明の効果が損なわれない範囲で適宜設定することができる。例えば、プロテオグリカンについては、１〜９０質量％程度、１０〜８０質量％、もしくは２０〜５０質量％程度等が挙げられる。また例えば、イチジクの乳酸菌醗酵物については、０．１〜９９質量％程度、１０〜８０質量％、もしくは２０〜５０質量％程度等が挙げられる。
【００２３】
本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア機能が不調である場合にこれを改善して通常の状態に戻す効果のみならず、腸バリア機能を通常の状態からさらに優れた状態にする効果をも有する。すなわち、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア修復用組成物としてのみならず、腸バリア亢進用組成物としても用いることができる。またさらに、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア機能を低下することを予め予防する効果も奏し得る。例えば、腸内炎症惹起物質等により腸バリア機能が低下する場合に、その惹起物質に暴露される以前に本発明の腸バリア改善用組成物を摂取しておくことにより、惹起物質に暴露された場合に生じるバリア機能低下を抑制又は防止すること効果が得られうる。すなわち、本発明に係る腸バリア改善用組成物は、腸バリア低下予防組成物としても用いることができる。また例えば、当該腸バリア改善用組成物は、特に整腸用組成物として好ましく用いることができる。
【００２４】
また、当該腸バリア改善用組成物は、上記プロテオグリカン又は上記イチジクの乳酸菌醗酵物を含有することにより、腸バリア改善という効果を奏することができる。ここで、上記プロテオグリカンは、特に経口摂取してから腸バリア改善効果（特に整腸効果）が奏されるまでの時間が比較的長い。つまり、当該効果がゆっくりと発現する。このため、上記プロテオグリカンを含有する腸バリア改善用組成物は、特に徐放性腸バリア改善用組成物ということもできる。一方、上記イチジクの乳酸菌醗酵物は、特に経口摂取してから腸バリア改善効果（特に整腸効果）が奏されるまでの時間が比較的短い。つまり、当該効果がすぐに発現する。このため、上記イチジクの乳酸菌醗酵物を含有する腸バリア改善用組成物は、特に即効性腸バリア改善用組成物ということもできる。このことから、特に上記プロテオグリカン及び上記イチジクの乳酸菌醗酵物を含有する腸バリア改善用組成物は、即効性及び徐放性の両方の効果を奏することができ、特に好ましい。
【００２５】
当該腸バリア改善用組成物は、摂取することにより、腸内細菌叢を改善する効果も奏し得る。より好ましくは、腸内フローラの細菌種のバランスを改善することができる。腸内フローラの細菌種のバランスが崩れている対象はもちろん、それほど崩れてはいない対象であっても、より好ましい細菌種バランスとなるよう促進することができる。
【００２６】
特に、摂取することにより、腸バリア改善に資する細菌を増加させる効果を奏し得る。より具体的には、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを増加させる効果、及び／又は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを増加させる効果を好ましく奏し得る。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはいわゆる善玉菌の代表格であり、整腸作用に優れる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓは腸管免疫系に対して免疫修飾作用を有すると考えられている。
【００２７】
また、当該腸バリア改善用組成物は、継続摂取した後、しばらく摂取を行わない場合であっても、整調効果が持続し得る。特に、腸内環境悪化に寄与する可能性のある細菌群（いわゆる悪玉菌）の増加抑制又は低下効果を奏し得る。例えば、クロストリジウムサブクラスターＸＩＶａやクロストリジウムクラスターＩXといった細菌群の増加抑制又は低下効果を奏し得る。クロストリジウムサブクラスターＸＩＶａはデオキシコール酸を産生する菌であり、デオキシコール酸は細胞老化に関連すると考えられている。
【００２８】
またさらに、当該腸バリア改善用組成物は、摂取することにより、腸内ムチン量を増加させる効果も奏し得る。これにより、腸の粘膜バリアが亢進され得る。
【００２９】
本発明に係る腸バリア改善用組成物は、特に制限されないが、経口組成物であることが好ましく、特に飲食品組成物であることが好ましい。腸内フローラや腸内環境を整える目的の飲食品組成物であることが最も好ましい。また、組成物の形態も、特に制限はされず、例えば固形状、液状、ゲル状等であり得る。また例えば、タブレット、カプセル、ドリンク、ゼリー、顆粒等であり得る。このような各組成物は常法によって調製することができる。
【００３０】
また、当該腸バリア改善用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物以外の成分を含有させることもできる。このようなその他成分としては、例えばｐＨ調整剤、増粘剤、界面活性剤、香味剤、甘味剤、湿潤剤等が挙げられるが、特に限定はされない。このような成分は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
本発明の組成物が液状又はゲル状であって、ｐＨ複合電極を用いて測定することができる場合において、組成物のｐＨは、例えば、好ましくは３．０〜８．０、より好ましくは３．０〜７．さらに好ましくは３．０〜５．５である。ｐＨ複合電極による測定は、組成物を希釈等を行なわずに、組成物そのままの状態で行なう。測定温度は２０℃で測定時間は２分とする。また、組成物のｐＨを調整する場合は、通常使用されるｐＨ調整剤、例えば、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、グルコン酸、マレイン酸、アスパラギン酸、コハク酸、グルクロン酸、フマル酸、グルタミン酸、アジピン酸、およびこれらの塩や、重炭酸ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを使用することができる。
【００３２】
増粘剤としては、例えばグアーガム、寒天、カラギーナン、キサンタンガム、アラビアガム等を挙げることができる。増粘剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
界面活性剤としては、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤または両性界面活性剤を配合することができる。具体的には、ノニオン界面活性剤としてはショ糖脂肪酸エステル、マルトース脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル等の糖脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、ポリオキシエチレン付加係数が４〜１５、アルキル基の炭素数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル系またはポリオキシエチレン付加係数が１０〜１８、アルキル基の炭素数が９であるポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、セバシン酸ジエチル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレンラノリン、ポリエチレンステロール、ポリエチレンラノリンアルコール、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等が挙げられる。アニオン界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等の硫酸エステル塩、ラウリルスルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩、ココイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルアラニンナトリウム等のアシルアミノ酸塩、ココイルメチルタウリンナトリウム等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等の酢酸ベタイン型活性剤、Ｎ−ココイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等のイミダゾリン型活性剤、Ｎ−ラウリルジアミノエチルグリシン等のアミノ酸型活性剤等が挙げられる。これらの界面活性剤は、単独または２種以上を組み合わせて配合することができる。ただ、食品組成物として用いる場合には、多量の界面活性剤を配合することは刺激性を高めることにつながるため、好ましくなく、留意すべきである。
【００３４】
香味剤としては、例えばメントール、カルボン酸、アネトール、オイゲノール、サリチル酸メチル、リモネン、オシメン、ｎ−デシルアルコール、シトロネール、α−テルピネオール、メチルアセテート、シトロネニルアセタート、メチルオイゲノール、シネオール、リナロール、エチルリナロール、チモール、スペアミント油、ペパーミント油、レモン油、オレンジ油、セージ油、ローズマリー油、珪皮油、シソ油、冬緑油、丁子油、ユーカリ油、ピメント油などの香料を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。香味剤の配合量は、組成物全量に対して、例えば０．０１〜５質量％、好ましくは０．０３〜１質量％配合することができる。
【００３５】
甘味剤としては、例えばサッカリン、サッカリンナトリウム、アセスルファームカリウム、ステビアエキス、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、グリチルリチン、ペリラルチン、ソウマチン、アスパルチルフェニルアラニンメチルエステル、メトキシシンナミックアルデヒド、パラチノース、パラチニット、キシリトール、ラクチトールなどが挙げられる。これら甘味剤は、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３６】
湿潤剤としては、例えばグリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ソルビトール、低分子量のポリエチレングリコール、単糖類、２糖類、オリゴ糖、還元水飴などの糖類などを単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３７】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００３９】
人工小腸上皮モデルを用いた腸バリア評価試験
Ｃａｃｏ細胞を用いて小腸上皮モデルを作製し、当該モデルに炎症性物質（ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ）により刺激を与え、刺激によるバリア破壊の程度をプロテオグリカン及びイチジク乳酸菌醗酵物がどの程度改善できるかを検討した。作製した小腸上皮モデルの概要を図１に示す。また、使用材料の詳細を以下に示す。
＜使用材料＞
細胞：ＣＡＣＯ−２（ＤＳＰ社ＥＣＡＣＣ細胞）  Ｐ＝４５
培地：
・Ｄ−ＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）
・抗生物質  Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ（ｇｉｂｃｏ）
＊ＦＢＳを１０％、抗生物質を１％になるよう調製した
継代・プレーティング時試薬：
・０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ｇｉｂｃｏ）を０．１％希釈して使用
＊中和は培地で行った。トリプシンを添加して５分以内に中和を行った。
プレーティング：
・トランズウェル  ポリカーボネート  メンブレン  パーミアブルサポート  
２４ウェルインサートセット（ＣＯＳＴＡＲ）
メンブレン直径：６．５ｍｍ、培養面積：０．３３ｃｍ２、孔サイズ：０．４μｍ
使用試薬（添加素材）：
・ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ（ｇｉｂｃｏ）：各１０ｎｇ／ｍＬ
・プロテオグリカン（調製方法は下述）
・イチジクの乳酸菌醗酵物  （調製方法は下述）
・Ｄ−ＭＥＭ培地（ＦＢＳ１０％）
【００４０】
〔プロテオグリカンの調製〕
国際公開第１２／０９９２１６号の実施例における、凍結サケ鼻軟骨からプロテオグリカンを抽出する方法に準じてプロテオグリカンを調製した。具体的には、凍結サケ鼻軟骨を破砕機で２ｍｍ程度サイズに粗粉砕し、水および温水による洗浄後、２．５倍量の蒸留水を加えて９５℃で３．５時間加熱し、加熱後、ろ過及び１６０００ｒｐｍの遠心分離により不要物（残渣）を除き、得られた上清を減圧濃縮により濃縮し、濃縮液を得た。下記の小腸上皮モデル又はヒト試験には、当該濃縮液を凍結乾燥して得た凍結乾燥物を用いた。また、下記の大腸炎モデルマウスの検討には、当該濃縮液を水で希釈して用いた。
【００４１】
なお、特開２０１７−０６６０９７号公報実施例に記載の方法で、得られた濃縮液に含有されるプロテオグリカン分子量（カルバゾール硫酸法により測定したウロン酸量クロマトグラムにより確認）を測定したところ、当該濃縮液は分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有していた。なお、分子量分布は１８０万〜２０００万程度であった。
【００４２】
〔イチジクの乳酸菌醗酵物の調製〕
桝井ドーフィンのイチジクの花軸部分を除去し、水で洗浄した。水分を除去した後に、フードプロセッサーを用いて粉砕し、イチジクの全果破砕物を得た。当該イチジクの全果破砕物２００ｇに対して、乳酸菌菌液を１０ｇ加え、均一になるように軽く混合した後、嫌気的条件下にて、３０℃、２４時間静置にて醗酵した。乳酸菌としては、ラクトバチルス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）を使用した。醗酵処理においては、醗酵処理物のｐＨ及び酸度を測定することにより醗酵処理の終点の確認を行った。得られた醗酵処理物を凍結乾燥させ、イチジクの乳酸菌醗酵物として用いた。
【００４３】
＜小腸上皮モデルの作製及び評価試験＞
トランズウェル  ポリカーボネート  メンブレン  パーミアブルサポートに、Ｃａｃｏ細胞を播種して培養し、小腸上皮モデル（図１）を作製した。播種後、１３日間細胞培養し（２〜３日ごとに培地交換した）、１４日目にＩＦＮ−γを添加し、１５日目にＴＮＦ−αとともにプロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物あるいはケルセチンを添加した。ケルセチンは炎症性物質抑制効果を有しており、従ってケルセチンを添加した場合には刺激物質の作用が抑制され腸バリア改善効果が得られる（ポジティブコントロール）。
【００４４】
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γは、刺激を与える目的で、小腸上皮モデルのＢａｓａｌ（基底膜側）に、プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物あるいはケルセチンは、小腸上皮モデルのＡｐｉｃａｌ（管腔側）に、それぞれ添加した（図１参照）。より詳細には、評価２４時間前にＩＦＮ−γを終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。また、評価開始１時間前（−１ｈ）にプロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物あるいはケルセチンを添加した。ケルセチンは終濃度２００μＭになるように添加した。また、評価開始直前（０ｈ）にＴＮＦ−αを終濃度１０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。評価は、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）測定  装置：Milli-cell ERS（Millipore 社）を用いて膜電位差を経時的に測定することにより行った。バリア機能が低下していれば膜電位差が減少する。また、全く刺激を加えずに同様の試験を行った。
【００４５】
これらの結果を図２に示す。なお、図２において「ｃｏｎｔ」はネガティブコントロールを示し、刺激も評価物質の添加も行っていないものを表す。「刺激」は刺激のみを加えたものを表す。また、図２においては、「ＰＧ」はプロテオグリカンの添加を、「イチジク」はイチジクの乳酸菌醗酵物の添加を、それぞれ表す。
【００４６】
刺激がない場合（すなわち、腸バリアが正常な状態）において（図２右側）、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物の添加群は、いずれも添加無し（ｃｏｎｔ）に比べて腸バリアの亢進が見られた。また、刺激がある場合（すなわち、腸バリアが不良な状態）において（図２左側）、プロテオグリカン添加群は何ら刺激を与えていない場合（ｃｏｎｔ）と同等であり、イチジクの乳酸菌醗酵物添加群は何ら刺激を与えていない場合以上に腸バリアを改善した。
【００４７】
ヒト試験１（糞便ムチン量及び整腸作用の検討）
下記成分を含有する３種類のハードカプセルを調製した。
カプセル１（ＰＧ）：上記プロテオグリカン（乾燥物）２００ｍｇ及びデキストリン４７２．５ｍｇ／６粒あたり
カプセル２（イチジク）：上記イチジクの乳酸菌醗酵物（乾燥物）４７２．５ｍｇ及びデキストリン４７２．５ｍｇ／６粒あたり
カプセル３（プラセボ）：デキストリン４７２．５ｍｇ／３粒あたり
【００４８】
そして、３０〜５０代の女性３３名を３グループ（カプセル１（ＰＧ）摂取群、カプセル２（イチジク）摂取群、及びカプセル３（プラセボ）摂取群）に分け、プラセボ対照二重盲検並行群間試験にて、６週間各カプセルを経口摂取させた。カプセル１（ＰＧ）摂取群及びカプセル２（イチジク）摂取群には一日６粒、カプセル３（プラセボ）摂取群には一日３粒、それぞれ摂取させた。
【００４９】
摂取開始時及び摂取開始４週間目に糞便を採取し、含まれるムチン量を検査した。また検査終了時、腸のはたらきに関し、摂取開始時との変化についてアンケートに回答してもらった。アンケートの質問項目は図４の下に記載した通りであり、いずれの質問項目についても、初期値（試験開始直前）を４とした時の検査終了直後の値を１〜７の７段階（数値が大きいほど回数若しくは量が多い、あるいは調子が良好である）で答えてもらい、平均値を算出した。
【００５０】
糞便中ムチン量検査の結果を図３に、アンケート集計結果を図４に、それぞれ示す。図３及び図４において、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、それぞれ示す。
【００５１】
図３から、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物の摂取群では、いずれも、腸内でのムチン量が増加したことがわかった。また、図４から、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物は、いずれも整腸効果を奏する傾向があることがわかった。特に、プロテオグリカンは摂取後比較的遅くに整腸効果が奏されること、一方イチジクの乳酸菌醗酵物では摂取後速やかに整腸効果が奏されること、もわかった。
【００５２】
またさらに、当該試験において、摂取終了直後、並びに、当該摂取終了から６週間後（以下「ウォッシュアウト後」ということがある）においても、各被験者から糞便を採取し、当該糞便検体を用いて、腸内フローラの細菌種の解析を行った。腸内フローラの細菌種の解析は、Ｔ−ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法を用いて行った。当該解析は、株式会社テクノスルガ・ラボに委託した。
【００５３】
カプセル１（ＰＧ）摂取群、カプセル２（イチジク）摂取群、及びカプセル３（プラセボ）摂取群の各被験者の各細菌種存在比率の平均を図５に示す。
【００５４】
なお、図５において、＊はプラセボ群と比較して有意差があったことを示す。より詳細には、摂取終了直後において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍがイチジク＞プラセボ  （ｐ＝０．０７５）、ＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓがＰＧ＞プラセボ  （ｐ＝０．０２４）、イチジク＞プラセボ  （ｐ＝０．０１５）であった。また、ウォッシュアウト後において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｕｂｃｌｕｓｔｅｒ  ＸＩＶａがイチジク＜プラセボ  （ｐ＝０．００１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＸがＰＧ＜プラセボ  （ｐ＝０．０６２）であった。
【００５５】
大腸炎モデルマウスを用いた検討
大腸炎誘発モデルヘアレスマウスに対する、プロテオグリカン及びイチジクの乳酸菌醗酵物の炎症予防効果を検討した。
【００５６】
使用動物：ＨＲ−１系雌性マウス（日本ＳＬＣ，８週齢）４０匹（ｎ＝１０）
病態惹起物質：デキストラン硫酸（ＤＳＳ）（分子量３６０００〜５００００；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）
試験群：４群（投与物質により群分け）
蒸留水群（陰性対照群）、
１．５％ＤＳＳ群（陽性対照群）、
１．５％ＤＳＳ＋イチジクの乳酸菌醗酵物群（被験物質Ａ投与群）、
１．５％ＤＳＳ＋プロテオグリカン群（被験物質Ｂ投与群）
測定項目：大腸炎スコア（ＤＡＩスコア：Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  Ｓｃｏｒｅ）
【００５７】
具体的には、マウスを４群に分け、１４日間連続して上記の各投与物質をゾンデにより摂取させた。なお、イチジクの乳酸菌醗酵物は一日あたり１ｇを、プロテオグリカンは一日あたり５ｍｇを、それぞれ摂取させた。その後、７日間連続してＤＳＳを摂取させ、さらにその後７日間は投与物質及びＤＳＳはいずれも摂取させず、さらにまたその後にＤＳＳを７日間連続して摂取させた。
【００５８】
各投与物質を摂取させた期間の最終日（ｄａｙ０）、その後連続してＤＳＳを摂取させた期間の最終日（ｄａｙ７）、さらにその後投与物質及びＤＳＳのいずれも摂取させなかった期間の最終日（ｄａｙ１４）、並びに、さらに又その後にＤＳＳ摂取を再開した期間の１日目、２日目、３日目、及び４日目（ｄａｙ１５、１６、１７、１８）において、測定したＤＡＩスコアを図６に示す。ＤＡＩスコアは大腸炎の重傷度を示す指標であり、数値が大きいほど重傷であることを示す。
【００５９】
プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物群を最初に摂取させた群では、ＤＳＳ摂取再開後の期間における大腸炎が抑制された。このことから、プロテオグリカン又はイチジクの乳酸菌醗酵物群には、大腸炎惹起物質（ここではＤＳＳ）への暴露が原因である大腸炎を予防する効果があることがわかった。
【００６０】
ヒト試験２（糞便中フェノール量の検討）
下記成分を含有する２種類のハードカプセルを調製した。
カプセル１（ＰＧ）：上記プロテオグリカン（乾燥物）２００ｍｇ及びデキストリン４７２．５ｍｇ／３粒あたり
カプセル３（プラセボ）：デキストリン４７２．５ｍｇ／３粒あたり
【００６１】
そして、３０〜５０代の女性３１名を２グループ（カプセル１（ＰＧ）摂取群、及びカプセル３（プラセボ）摂取群）に分け、プラセボ対照二重盲検並行群間試験にて、６週間各カプセルを経口摂取させた。カプセル１（ＰＧ）摂取群には一日３粒、カプセル３（プラセボ）摂取群には一日３粒、それぞれ摂取させた。なお、試験期間中に便秘薬を摂取した対象１名を解析から除外した。このため、カプセル１摂取群１５名、カプセル３摂取群１５名、で下述する結果解析を行った。
【００６２】
摂取開始時、摂取開始２週間目、及び摂取開始６週間目、に糞便を採取し、含まれるフェノールの量を測定した。糞便中フェノール量の測定は、株式会社テクノスルガ・ラボに委託した。
【００６３】
糞便中フェノール量の群間比較を行った結果を図７に示す。図７において、＊はｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を、それぞれ示す。プロテオグリカンは、糞便中フェノール量を有意に減少させる効果を奏すること、ひいては腸内環境を改善すること、がわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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