(57)【要約】【課題】本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制することが可能である表皮肥厚抑制用皮膚外用剤を提供することである。【解決手段】リンゴ果実抽出物を含有することで紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制用皮膚外用剤を得ることができた。この場合、リンゴ果実抽出物はリンゴ未成熟果実抽出物であることが好ましい。また、有効成分を組成物全量に対して０．０００５〜１質量％含有することが好ましい。更に、表皮肥厚抑制用皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ果実抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制用皮膚外用剤。
【請求項２】
前記リンゴ果実抽出物がリンゴ未成熟果実抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の表皮肥厚抑制用皮膚外用剤。
【請求項３】
前記有効成分を組成物全量に対して０．０００５〜１質量％含有することを特徴とする、請求項１又は２のいずれか１項に記載の表皮肥厚抑制用皮膚外用剤。
【請求項４】
化粧品、医薬部外品又は医薬品であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の表皮肥厚抑制用皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制用皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
顔や手の甲などに見られる慢性的な紫外線曝露により生じる皮膚異常の一つに表皮肥厚が挙げられる。一方、臀部などの紫外線非曝露部の表皮層は加齢に伴い徐々に委縮することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
表皮肥厚を発症した皮膚は、病理学的側面における人体への影響のみならず、キメが粗くなるなどの美容的損失を伴い、特に女性にとって生活の質（ＱＯＬ）を低下させる原因となりうることが知られている。
【０００４】
表皮肥厚の発症に関与すると言われている物質として、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）やＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子−２）、トリプターゼ、インターロイキン−２２などのサイトカインや、フィブロネクチン、ＡＤＡＭ（Ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）といった生体物質が挙げられるが、その発症機序の全貌はいまだ解明されていない（非特許文献２及び特許文献１、２、３参照）。
【０００５】
表皮肥厚はすなわち表皮層が厚くなる現象であることから、肥厚化した表皮を正常な状態に戻すことを期待して、表皮のターンオーバーを促進する効果があるレチノイドやトコフェロールを含有する表皮肥厚促進剤や、ピーリング効果があるα−ヒドロキシカルボン酸を含有する化粧用製剤などが提案されている（特許文献４及び５参照）。
【０００６】
しかしながら、前記表皮肥厚促進剤や化粧用製剤は紫外線曝露により生じた症状を治療することを目的に適用するものであり、表皮肥厚を未然に防止することを目的に適用するものではない。
【０００７】
一方で、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する目的で、スフィンゴシンからなる表皮肥厚抑制剤やリンゴ果実抽出物を含有したコラーゲンゲル収縮剤及び表皮肥厚抑制剤などが知られている（特許文献６及び７参照）。しかし、スフィンゴシンは、それ自体が不安定な物質であることや製剤の経時安定性の確保が難しいことに加え、安全面の観点から配合できる油剤や界面活性剤の種類及び配合量が限られるなどの理由から、皮膚外用剤としての利用可能性に多くの制約があることが問題であった（特許文献８、９、１０参照）。前記リンゴ果実抽出物を含有した表皮肥厚抑制剤として開示されている経口剤についても、紫外線に曝露した部位のみが表皮肥厚することを鑑みると、抑制効果を十分に発揮するのにふさわしい形態であるとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１２−１５８５７３号公報
【特許文献２】特開２０１３−１２９６１７号公報
【特許文献３】特開２００６−１３７７４４号公報
【特許文献４】特開２０１３−２０９３３４号公報
【特許文献５】特開２０１５−１４７７９７号公報
【特許文献６】特許第３３４２６７２号公報
【特許文献７】特開２０１０−２５４６６７号公報
【特許文献８】特開２００９−２９８７５７号公報
【特許文献９】特開２０１６−０８４３６０号公報
【特許文献１０】特許第５１１２６７３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】標準皮膚科学  第８版  ｐｐ．１４７−１４８（医学書院）
【非特許文献２】藤田英樹著  日本臨床免疫学会会誌（Vol.35 No.3）pp.168-175
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、リンゴ果実抽出物を有効成分とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する皮膚外用剤を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決しようとして、鋭意検討を重ねた結果、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制するリンゴ果実抽出物を配合してなる皮膚外用剤を見出した。
【００１２】
したがって、本発明は、リンゴ果実抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する皮膚外用剤を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、前記リンゴ果実抽出物がリンゴ未成熟果実抽出物であることを特徴とする、前記に記載の皮膚外用剤を提供するものである。
【００１４】
さらに本発明は、前記有効成分を組成物全量に対して０．０００５〜１質量％含有することを特徴とする、前記に記載の皮膚外用剤を提供するものである。
【００１５】
また本発明は、化粧品、医薬部外品又は医薬品であることを特徴とする、前記に記載の皮膚外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に記載のリンゴ果実抽出物を含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品として、種々の形態に広く汎用的に利用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の形態をとり得る。
【００１８】
本発明者らは、本発明に至るにあたり、紫外線曝露により生じる表皮肥厚の現象について、以下の通り、明らかにした。すなわち、表皮層が紫外線に曝露された時、曝露量などの条件に応じて、表皮細胞は、核酸やタンパク質及び脂質などの生体分子が受けた損傷の修復や再合成、並びに活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成やサイトカインなどの分泌といった挙動を示して、周辺の環境を変化させうる。紫外線曝露の影響は、細胞死（アポトーシス、ネクローシスなど）などももたらすが、表皮層における細胞死は表皮細胞の減少を表すものであり、実質的に表皮の委縮をもたらすものであることを鑑みると、非特許文献１で示されるような表皮肥厚が生じる要因は、細胞死に至らなかった細胞自身及び周辺の細胞が増殖することによるものであることが明らかとなった。
【００１９】
本発明者らは、上記の事実から、紫外線曝露がきっかけとなって起こる細胞増殖を抑制することができれば、表皮肥厚を抑制できると考え、鋭意検討を重ねた結果、様々な成分の中でも紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制するリンゴ果実抽出物を配合してなる皮膚外用剤を見出すに至った。
【００２０】
本発明に用いられるリンゴ果実抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ）の品種は特に限定されないが、例えば、ふじ、王林、紅玉、陸奥、津軽、旭、デリシャス、ジョナゴールド、陽光などが挙げられる。リンゴ果実の抽出部位は、全果、果肉、果皮、種など特に限定されない。さらに前記果実は成熟果、未成熟果（幼果）などの成熟状態を問わないが、特に未成熟果（幼果）が好ましく、１個あたりの重量が５〜２０ｇ程度の時期に摘果されたものが特に好ましい。前記の抽出部位、及び成熟状態の抽出物を１種又は２種以上組み合わせて用いても良い。
【００２１】
上記リンゴ果実抽出物の調整法は、特に限定されるものではないが、例えばこれらを乾燥又は乾燥せずにそのままあるいは裁断または粉砕等した後、低温もしくは常温〜加温下で溶剤により抽出する方法を挙げることができる。
【００２２】
抽出溶媒としては、一般的には水、低級１価アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等）、低級アルキルエステル（酢酸エチル等）、炭化水素（ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル等）、アセトニトリル等が挙げられる。
【００２３】
市販品としては、ファルコレックス  リンゴ  Ｂ（一丸ファルコス社）、リンゴ抽出液ＢＧ−J、フルーツリンクルプロテクトエッセンス（登録商標）（いずれも、丸善製薬社）、ベビーアップルエキス（片倉コープアグリ社）、アップルフェノン  Ｃ−１００（アサヒフードアンドヘルスケア社）、ポマクティブＨＦＶ（ユニテックフーズ社）などが挙げられる。
【００２４】
リンゴ果実抽出物の含有量は、表皮肥厚の抑制作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、組成物の総量に対して、０．０００５〜１質量％であり、０．００５〜０．５質量％が好ましく、０．００１〜０．２５質量％がさらに好ましい。なお、これらの値は乾燥物としての含有量である。
【００２５】
リンゴ果実抽出物を含有する皮膚外用剤は、それ自体として、又は他の成分とともに含有することにより、化粧品、いわゆる薬用化粧品を含む医薬部外品、医薬品として利用され得る。
【００２６】
化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態は、例えば、スキンケア化粧品、メイクアップ化粧品、フレグランス化粧品、ボディケア化粧品、ヘアケア化粧品などが挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００２７】
医薬品及び医薬部外品の具体的な形態は、皮膚に適用される態様であれば、その使用態様については特に限定されず、上記した化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態に加えて、例えば、腋臭防止剤、てんか粉剤、育毛剤（養毛剤）、除毛剤、染毛剤（脱色剤、脱染剤）、パーマネント・ウェーブ用剤、浴用剤、忌避剤などが挙げられ、より具体的な剤形としては軟膏、クリームなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の皮膚外用剤は、その製造方法について特に限定されず、当業者に通常知られる方法にて製造できる。
【００２９】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
［１．試料の調製］
アップルフェノン  Ｃ−１００（アサヒフードアンドヘルスケア社）を５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に終濃度５０μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ溶解し、これを被験溶液とした。同様の方法でコメ抽出物を溶解し、これを比較溶液とした。
【００３１】
［２．不死化ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴ細胞の培養と紫外線の照射］
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、３５ｍｍシャーレに９．０×１０５ｃｅｌｌｓになるように播種した。その後、３５ｍｍシャーレを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。
【００３２】
培養後の培養上清を除去した各シャーレに、前述で調製した被験溶液  ０．１ｍＬを添加して、さらに２４時間培養した。培養後の培養上清を除去した各シャーレをハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；日水製薬社）  ２ｍＬで２度洗浄し、各シャーレにフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  ２ｍＬを添加した。その後、紫外線を照射し、２４時間培養した。紫外線Ａ波（ＵＶＡ）の照射強度は、０（照射なし）、１０Ｊ／ｃｍ２とし、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）の照射強度は、０（照射なし）、２５ｍＪ／ｃｍ２とした。ＵＶＡ灯は（ＦＬ２０Ｓ−ＢＬＢ；東芝社）を、ＵＶＢ灯は（ＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳ、ＵＶＢ  Ｂｒｏａｄｂａｎｄ；Ｐｈｉｌｉｐｓ社）を用いた。強度測定には、デジタル式ＵＶＸ紫外線強度計ＵＶＸ  Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（ＵＶＰ社）とＵＶ照射強度センサーＵＶＸ−３１（ＵＶＰ社）を用いた。
【００３３】
各シャーレ内のＨａＣａＴ細胞にＵＶＡまたはＵＶＢを照射した同日に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、９６ウェル培養プレートに３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。その後、９６ウェル培養プレートを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。
【００３４】
培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ  ２ｍＬで２度洗浄した。その後、各ウェルに対し、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清を０．１ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清は、各ウェルに添加する前に、室温、３，０００ｒｐｍの速度で５分間遠心にかけて、不要な物質を除去した。培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ  ２ｍＬで２度洗浄した。培養後の各ウェルについて、後述するタンパク定量を実施した。
【００３５】
［３．タンパク定量（細胞増殖率の測定）］
０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝溶液を９６ウェル培養プレートの各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して細胞を完全に溶解した。各ウェルにＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のＲｅａｇｅｎｔ  ＡとＲｅａｇｅｎｔ  Ｂの比を５０：１で混合した溶液を各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して１分間シェイカーにかけて混合した。その後、３７℃で１０分間インキュベートして吸光マイクロプレートリーダーＶ  ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３６】
［４．解析方法］
検量線をもとに、得られた吸光度からタンパク量を算出した。検量線の作成にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。ＢＳＡ濃度は２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０ｍｇ／ｍＬの５点とした。後述の結果（１）では、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射していない時の細胞増殖率をコントロール１、後述の結果（２）では、試料なし且つＵＶＡあるいはＵＶＢ照射した時の細胞増殖率をそれぞれコントロール２、コントロール３とした。これらを対照として（細胞増殖率＝１００％）、それぞれの試料を作用させた時の細胞増殖率を算出した。各条件につき、６以上のウェル数の結果を用いて細胞増殖率の平均値を算出し、後述の統計解析を用いて、有意な差をもって細胞増殖を抑制した場合、表皮肥厚抑制効果があったと判断した。
【００３７】
［５．統計解析］
試験における統計学的有意差検定にはスチューデントのｔ検定を用いて、対応のない、両側検定の条件で実施した。有意水準は５％とした（ｐ＜０．０５）。
【００３８】
［６．結果（１）］
最初に、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により細胞増殖が誘導されるかどうか検討した結果、後述の表１に示すように、ＵＶＡまたはＵＶＢ非照射（コントロール１）と比較して、ＵＶＡまたはＵＶＢ照射により細胞増殖率が有意に高まることを確認した。
【００３９】
［６．結果（２）］
次に、被験溶液添加時のＵＶＡまたはＵＶＢ照射下における細胞増殖率を算出した結果、後述の表２に示すように、試料なし且つＵＶＡあるいはＵＶＢ照射（コントロール２及び３）と比較して、実施例１はＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により誘導される細胞増殖を有意に抑制した。しかし、比較例１は有意な細胞増殖抑制効果は見られなかった。なお、使用した被験溶液の培養細胞に対する毒性は認められなかった。表１及び２が示すように、実施例１の被験溶液はＵＶＡまたはＵＶＢ照射の影響による細胞の増殖を有意に抑制した。
【００４０】
【表１】
2019011256.tif 000002
【００４１】
【表２】
2019011256.tif 000003
【００４２】
以下に本発明の種々の処方例を挙げるが、本発明の技術的範囲はこれらの処方例に限定されない。
【００４３】
（処方例１〜４）化粧水
【表３】
2019011256.tif 000004
【００４４】
（処方例５〜８）クリーム
【表４】
2019011256.tif 000005
【００４５】
（処方例９〜１２）乳液
【表５】
2019011256.tif 000006
【００４６】
（処方例１３〜１６）美容液
【表６】
2019011256.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制することが可能であることから、表皮肥厚に基づく人体への悪影響を軽減することが期待される。