(57)【要約】【課題】本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤、あるいはその抑制剤を含有する化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品を提供する。【解決手段】アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤。
【請求項２】
前記アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩が、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸脂肪酸エステル及びアスコルビン酸アルキルエーテルのいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の表皮肥厚抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の表皮肥厚抑制剤を含有する、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮肥厚抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
顔や手の甲などに見られる慢性的な紫外線曝露により生じる皮膚異常の一つに表皮肥厚が挙げられる。一方、臀部などの紫外線非曝露部の表皮層は加齢に伴い徐々に委縮することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００３】
表皮が肥厚すると、病理学的側面における人体への影響のみならず、キメが粗くなるなどの美容的損失を伴うことから、特に女性にとって生活の質（ＱＯＬ）を低下させる原因の一つであると考えられる。
【０００４】
表皮肥厚の発症に関与すると言われている物質として、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）やＦＧＦ−２（線維芽細胞増殖因子−２）、トリプターゼ、インターロイキン−２２などのサイトカインや、フィブロネクチン、ＡＤＡＭ（Ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）といった生体物質が挙げられるが、その発症機序の全貌はいまだ解明されていない（非特許文献２及び特許文献１、２、３参照）。
【０００５】
表皮肥厚はすなわち表皮層が厚くなる現象であることから、肥厚化した表皮を正常な状態に戻すことを期待して、表皮のターンオーバーを促進する効果があるレチノイドやトコフェロールを含有する表皮肥厚促進剤や、ピーリング効果があるα−ヒドロキシカルボン酸を含有する化粧用製剤などが提案されている（特許文献４及び５参照）。
【０００６】
しかしながら、前記表皮肥厚促進剤や化粧用製剤は紫外線曝露により生じた症状を治療することを目的に適用するものであり、表皮肥厚を未然に防止することを目的に適用するものではない。
【０００７】
また、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する目的で、スフィンゴシンからなる表皮肥厚抑制剤などが知られているが（特許文献６参照）、スフィンゴシンはそれ自体が不安定な物質であることや製剤の経時安定性の確保が難しいことに加え、安全面の観点から配合できる油剤や界面活性剤の種類及び配合量が限られるなどの理由から、産業上の利用可能性に多くの制約があることが問題であった（特許文献７、８、９参照）。
【０００８】
ところで、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩としては、アスコルビン酸を含有した組成物に皮膚肥厚抑制効果があることや、２−Ｏ−α−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸に表皮肥厚抑制効果があることなどがすでに知られている（特許文献１０及び１１参照）。しかし、前記アスコルビン酸を含有した組成物の表皮に対する抑制効果は明確ではなく、２−Ｏ−α−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸以外のアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に実質的な表皮肥厚の抑制作用が確認されたという報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１２−１５８５７３号公報
【特許文献２】特開２０１３−１２９６１７号公報
【特許文献３】特開２００６−１３７７４４号公報
【特許文献４】特開２０１３−２０９３３４号公報
【特許文献５】特開２０１５−１４７７９７号公報
【特許文献６】特許第３３４２６７２号公報
【特許文献７】特開２００９−２９８７５７号公報
【特許文献８】特開２０１６−０８４３６０号公報
【特許文献９】特許第５１１２６７３号公報
【特許文献１０】特開２００８−５４０６４３号公報
【特許文献１１】特許第３９１１６４２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】標準皮膚科学  第８版  ｐｐ．１４７−１４８（医学書院）
【非特許文献２】藤田英樹著  日本臨床免疫学会会誌（Ｖｏｌ．３５  Ｎｏ．３）  ｐｐ．１６８−１７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を有効成分として配合することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記の課題を解決しようとして、鋭意検討を重ねた結果、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する作用があることを見出した。
【００１３】
したがって、本発明は、以下のものに関する。
（１）  アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を有効成分として含有することを特徴とする、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤。
（２）  前記アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩が、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸脂肪酸エステル及びアスコルビン酸アルキルエーテルのいずれかであることを特徴とする、前記（１）に記載の表皮肥厚抑制剤。
（３）  前記（１）又は（２）のいずれかに記載の表皮肥厚抑制剤を含有する、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品。
【発明の効果】
【００１４】
本発明であるアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含有することを特徴とする、紫外線により生じる表皮肥厚を抑制する表皮肥厚抑制剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品として、種々の形態に広く汎用的に利用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の形態をとり得る。
【００１６】
本発明者らは、本発明に至るにあたり、紫外線曝露により生じる表皮肥厚の現象について、以下の通り、明らかにした。すなわち、表皮層が紫外線に曝露された時、曝露量などの条件に応じて、表皮細胞は、核酸やタンパク質及び脂質などの生体分子が受けた損傷の修復や再合成、並びに活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成やサイトカインなどの分泌といった挙動を示して、周辺の環境を変化させうることに着目した。紫外線曝露の影響は、細胞死（アポトーシス、ネクローシスなど）などももたらすが、表皮層における細胞死は表皮細胞の減少を表すものであり、実質的に表皮の委縮をもたらすものであることを鑑みると、非特許文献１で示されるような表皮肥厚が生じる要因は、細胞死に至らなかった細胞自身及び周辺の細胞が増殖することによるものであることが明らかとなった。
【００１７】
本発明者らは、上記の事実から、紫外線曝露がきっかけとなって起こる細胞増殖を抑制することができれば、表皮肥厚を抑制できると考え、鋭意検討を重ねた結果、検討した様々な成分の中でもアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩に紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制する作用があることを見出すに至った。
【００１８】
本発明において用いられる有効成分は、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体若しくはそれらの塩又はこれらの組み合わせであれば特に限定されない。アスコルビン酸誘導体としては、アスコルビン酸を基本骨格とするものとして通常知られているとおりの意味のものであれば特に限定されず、例えば、生理的作用を有するものとして知られているアスコルビン酸誘導体などが挙げられ、具体的にはアスコルビン酸リン酸エステル、アスコルビン酸硫酸エステル、アスコルビン酸脂肪酸エステル、アスコルビン酸アルキルエーテルなどが挙げられる。表皮肥厚の抑制作用を勘案すれば、アスコルビン酸リン酸エステルが好ましく、リン酸アスコルビルマグネシウムがより好ましい。アスコルビン酸の塩としては、例えば、アスコルビン酸ナトリウムなどが挙げられる。アスコルビン酸の塩やアスコルビン酸誘導体は、上記例示したものなどの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。一般的に、アスコルビン酸リン酸エステルなどのアスコルビン酸誘導体やアスコルビン酸ナトリウムなどのアスコルビン酸の塩は、生体内においてアスコルビン酸イオンとして存在することなどにより、アスコルビン酸と同様の生理的作用を有し得ることが知られている。
【００１９】
より具体的な例としては、アスコルビン酸（ＢＡＳＦジャパン社）、アスコルビン酸（結晶）（ＤＳＭニュートリションズ社）、アスコルビン酸ナトリウム（ＢＡＳＦジャパン社）、アスコルビン酸ナトリウム（結晶）（ＤＳＭニュートリションズ社）、「ＶＣエチル」（日本精化社）などの３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＶＣ−ＩＰ」（日光ケミカルズ社）などのテトラ２−ヘキシルデカン酸アスコルビル、「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＶＣ−ＰＭｇ」（日光ケミカルズ社）や「アスコルビン酸ＰＭ」（昭和電工社）、「ＡＰＭ（リン酸アスコルビルＭｇ」（アイ・ティー・オー社）などのリン酸アスコルビルマグネシウム；「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＣＰ」（日光ケミカルズ社）などのジパルミチン酸アスコルビル；「Ｌ−アスコルビン酸パルミチンエステル」（ＤＳＭニュートリションズ社）などのパルミチン酸アスコルビル；「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）  ＶＣ−ＳＳ」（日光ケミカルズ社）などのアスコルビン酸硫酸２ナトリウム；「ステイＣ−５０」（ＤＳＭニュートリションズ社）や「リン酸Ｌ−アスコルビルナトリウム」（ＢＡＳＦジャパン社）などのリン酸アスコルビルナトリウム；「アプレシエ（登録商標）（ＡＰＰＳ）」（昭和電工社）などのパルミチン酸アスコルビルリン酸３ナトリウム；ステアリン酸アスコルビルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩の含有量は、表皮肥厚の抑制作用が認められる量であれば特に限定されないが、例えば、皮膚に適用する場合であれば、組成物の総量に対して、０．００１〜５質量％であり、０．０１〜４質量％が好ましく、０．１〜３質量％がより好ましく、０．５〜３質量％がさらに好ましい。一方、投与する場合であれば、一日当たりの投与量として５０〜３０００ｍｇが好ましく、３００〜２０００ｍｇがより好ましく、５００〜１０００ｍｇがさらに好ましい。投与する手段としては、経口又は注射等を介して実行することができる。
【００２１】
アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体またはそれらの塩を含有する表皮肥厚抑制剤は、それ自体として、又は他の成分とともに用いることにより、化粧品、医薬部外品、医薬品又は飲食品として利用され得る。
【００２２】
化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態は、例えば、スキンケア化粧品、メイクアップ化粧品、フレグランス化粧品、ボディケア化粧品、ヘアケア化粧品などが挙げられるが、これらに特に限定されない。
【００２３】
医薬品及び医薬部外品の具体的な形態は、特に限定されないが、皮膚に適用する形態であれば、上記した化粧品及び薬用化粧品の具体的な形態に加えて、例えば、腋臭防止剤、てんか粉剤、育毛剤（養毛剤）、除毛剤、染毛剤（脱色剤、脱染剤）、パーマネント・ウェーブ用剤、浴用剤、忌避剤などが挙げられ、より具体的な剤形としては軟膏、クリームなどが挙げられる。また、皮膚に適用しない形態は、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、輸液剤、経口剤、点鼻剤などが例示される。
【００２４】
本発明の抑制剤と抑制剤を含有する組成物は、その製造方法について特に限定されず、当業者に通常知られる方法にて製造できる。
【００２５】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
［１．調製］
リン酸アスコルビルマグネシウム（アイ・ティー・オー社）を５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に終濃度４００μｇ／ｍＬになるように溶解し、これを被験溶液とした。コメ抽出物についても、同様の操作により、終濃度５０μｇ／ｍＬになるように溶解し、これを被験溶液とした。
【００２７】
［２．不死化ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴ細胞の培養と紫外線の照射］
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、３５ｍｍシャーレに９．０×１０５ｃｅｌｌｓになるように播種した。その後、３５ｍｍシャーレを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。
【００２８】
培養後の培養上清を除去した各シャーレに、前述で調製した被験溶液  ０．１ｍＬを添加して、さらに２４時間培養した。培養後の培養上清を除去した各シャーレをハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；日水製薬社）  ２ｍＬで２度洗浄し、各シャーレにフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ  ２ｍＬを添加した。その後、紫外線を照射し、２４時間培養した。紫外線Ａ波（ＵＶＡ）の照射強度は、０（照射なし）、１０Ｊ／ｃｍ２とし、紫外線Ｂ波（ＵＶＢ）の照射強度は、０（照射なし）、２５ｍＪ／ｃｍ２とした。ＵＶＡ灯は（ＦＬ２０Ｓ−ＢＬＢ；東芝社）を、ＵＶＢ灯は（ＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳ、ＵＶＢ  Ｂｒｏａｄｂａｎｄ；Ｐｈｉｌｉｐｓ社）を用いた。強度測定には、デジタル式ＵＶＸ紫外線強度計ＵＶＸ  Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ（ＵＶＰ社）とＵＶ照射強度センサーＵＶＸ−３１（ＵＶＰ社）を用いた。
【００２９】
各シャーレ内のＨａＣａＴ細胞にＵＶＡまたはＵＶＢを照射した同日に、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いてＨａＣａＴ細胞を懸濁し、９６ウェル培養プレートに３．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。その後、９６ウェル培養プレートを３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。
【００３０】
培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ  ２ｍＬで２度洗浄した。その後、各ウェルに対し、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清を０．１ｍＬずつ添加し、２４時間培養した。ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した各シャーレから得られた培養上清は、各ウェルに添加する前に、室温、３，０００ｒｐｍの速度で５分間遠心にかけて、不要な物質を除去した。培養後の９６ウェル培養プレート内にある培養上清を除去し、ＨＢＳＳ  ２ｍＬで２度洗浄した。培養後の各ウェルについて、後述するタンパク定量を実施した。１つのデータを取得するのに必要なウェル数は、７以上とした。
【００３１】
［３．タンパク定量（細胞増殖率の測定）］
０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むリン酸緩衝溶液を９６ウェル培養プレートの各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して細胞を完全に溶解した。各ウェルにＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のＲｅａｇｅｎｔ  ＡとＲｅａｇｅｎｔ  Ｂの比を５０：１で混合した溶液を各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加して１分間シェイカーにかけて混合した。その後、３７℃で１０分間インキュベートして吸光マイクロプレートリーダーＶ  ｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３２】
［４．解析方法］
検量線をもとに、得られた吸光度からタンパク量を算出した。検量線の作成にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。ＢＳＡ濃度は２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０ｍｇ／ｍＬの５点とした。後述の結果（１）では、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射していない時の細胞増殖率をコントロール１、後述の結果（２）では、試料なし且つＵＶＡあるいはＵＶＢ照射した時の細胞増殖率をそれぞれコントロール２、コントロール３とした。これらを対照として（細胞増殖率＝１００％）、それぞれの被験溶液を作用させた時の細胞増殖率を算出した。後述の統計解析を用いて、有意に細胞増殖を抑制した時、表皮肥厚抑制効果があったと判断した。
【００３３】
［５．統計解析］
試験における統計学的有意差検定にはスチューデントのｔ検定を用いて、対応のない、両側検定の条件で実施した。有意水準は５％とした（ｐ＜０．０５）。
【００３４】
［６．結果（１）］
最初に、ＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により細胞増殖が誘導されるかどうか検討した結果、後述の表１に示すように、ＵＶＡまたはＵＶＢ非照射（コントロール１）と比較して、ＵＶＡまたはＵＶＢ照射により細胞増殖率が有意に高まることを確認した。
【００３５】
［６．結果（２）］
次に、被験溶液添加時のＵＶＡまたはＵＶＢ照射下における細胞増殖率を算出した結果、後述の表２に示すように、ＵＶＡまたはＵＶＢ非照射（コントロール２及び３）と比較して、実施例１はＵＶＡまたはＵＶＢを照射した影響により誘導される細胞増殖を有意に抑制した。しかし、比較例１は有意な細胞増殖抑制効果は見られなかった。なお、使用した被験溶液の培養細胞に対する毒性は認められなかった。表１及び２が示すように、実施例１の被験溶液はＵＶＡまたはＵＶＢ照射の影響による細胞の増殖を有意に抑制した。
【００３６】
【表１】
2019011254.tif 000002
【００３７】
【表２】
2019011254.tif 000003
【００３８】
以下に本発明の種々の処方例を挙げるが、本発明の技術的範囲はこれらの処方例に限定されない。
【００３９】
（処方例１〜４）化粧水
【表３】
2019011254.tif 000004
【００４０】
（処方例５〜８）クリーム
【表４】
2019011254.tif 000005
【００４１】
（処方例９〜１２）乳液
【表５】
2019011254.tif 000006
【００４２】
（処方例１３〜１６）美容液
【表６】
2019011254.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、紫外線曝露により生じる表皮肥厚を抑制することが可能であることから、表皮肥厚に基づく人体への悪影響を軽減することが期待される。