(57)【要約】      （修正有）【課題】幹細胞又は成長因子の非存在下で、骨性部位及び非骨性部位において組織の石化を誘導できる三次元多孔質多糖マトリックスの調製方法の提供。【解決手段】ｉ）少なくとも１つの多糖の量、架橋剤の量、及びポロゲン剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、ｉｉ）前記溶液を、約４℃〜約８０℃の温度で、前記多糖の量を架橋させるのに十分な時間置くことによって、当該溶液をヒドロゲルにトランスフォーメーションすること、ｉｉｉ）前記ヒドロゲルを溶媒、好ましくは水溶液に浸すこと、及びｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた多孔質多糖足場を洗浄することを含み、工程ｉ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ｉ）少なくとも１つの多糖の量、架橋剤の量、及びポロゲン剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｉｉ）前記溶液を、約４℃〜約８０℃の温度で、前記多糖の量を架橋させるのに十分な時間置くことによって、当該溶液をヒドロゲルにトランスフォーメーションすること、
ｉｉｉ）前記ヒドロゲルを溶媒、好ましくは水溶液に浸すこと、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた多孔質多糖足場を洗浄すること
を含み、
工程ｉ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含む、方法。
【請求項２】
ポロゲン剤が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、及びそれらの混合物からなる群において選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
多糖とポロゲン剤の重量比が、１：５０〜５０：１、好ましくは１：３０〜３０：１、好ましくは１：１２〜１２：１、の範囲であり、好ましくは１２：１４である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの多糖、及び１つの架橋剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｂ）工程ａ）の水溶液を凍結すること、
ｃ）工程ｂ）の凍結溶液を昇華させること
を含み、
工程ａ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含み、
工程ａ）の溶液中で多糖の架橋が起こる前に工程ｂ）が実施される、方法。
【請求項５】
前記多糖が、デキストラン、プルラン、寒天、アルギン酸、デンプン、ヒアルロン酸、イヌリン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多糖が、９５：５〜５：９５の範囲の比、好ましくは７５：２５（w/w）の比のプルラン／デキストラン混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記多糖が、約７０：２０：１０〜約５０：２０：３０、好ましくは約７０：２０：１０〜約５０：３０：２０の範囲の比、最も好ましくは約７３：２２：５（w/w）の比のプルラン／デキストラン／フコイダン混合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記架橋剤が、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノヒドロキシアパタイトが、０．３〜１Ｍに含まれる濃度、好ましくは０．６Ｍのリン酸溶液と、０．５〜１．５Ｍに含まれる濃度、好ましくは１Ｍの水酸化カルシウム溶液から、選択的に室温で化学沈殿することによって得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
アルカリ性多糖溶液中のナノヒドロキシアパタイトの濃度（w/v）が、０．０１〜１０％（w/v）、好ましくは０．１〜０．５％（w/v）、より好ましくは０．１〜０．３％（w/v）に含まれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる、多孔質多糖足場。
【請求項１２】
孔のサイズが、約１μm〜約５００μm、好ましくは約１０μm〜約２００μmに含まれ、孔隙率が、約４％〜約７５％、好ましくは約４％〜約５０％である、請求項１１記載の多孔質多糖足場。
【請求項１３】
骨の生成、好ましくは骨の修復及び／又は骨の発達に使用するための、請求項１〜１０記載の方法によって得られる、多孔質多糖足場。
【請求項１４】
異所性石化組織形成を刺激するのに使用するための、請求項１〜１０記載の方法によって得られる、多孔質多糖足場。
【請求項１５】
骨関連障害の処置において使用するための、請求項１〜１０記載の方法によって得られる、多孔質多糖足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトを含み、組織の石化を支援する多孔質多糖足場を調製するための方法に関する。本発明は、前記方法によって得られる多孔質多糖足場、及び骨形成のためのその使用をさらに提供する。
【０００２】
背景技術
骨関連障害の話題は、過去数年にわたってかなりの注目を集めている。自己骨及び同種骨を使用することは、骨欠損などの骨関連障害を克服するために、病院で広く行われている。しかしながら、自己骨を使用することは、二次的なトラウマをもたらすことが公知であり、同種骨は、免疫反発を引き起こす。加えて、自己骨及び同種骨の使用は、欠損部のサイズ及び局在に依存するので、自己骨及び同種骨には深刻な限界がある。例えば、大きな欠損部における移植片は、骨形成の完了前に体に再吸収されたので、この治療の成功について疑問が残ることが報告された（Hoexter DL. Bone regeneration graft materials J Oral Implantol. 2002;28(6); Delloye C, Cornu O, Druez V, Barbier O. Bone allografts: What they can offer and what they cannot. J Bone Joint Surg Br. 2007 May;89(5):574-9）。
【０００３】
これらの障害を治療するために、多くの仕事は、合成によって作られたインプラントであって、石化を誘導でき、新たな骨形成を支援できるインプラントで自然骨を置換することに関心を寄せている。従って、自然に自己発達しない組織を修復する三次元足場が探求されている。従って、細胞は、人工構造物の支援なしで三次元組織を形成する能力を単独では持たないので、足場に基づく組織工学は、再生医療の有望な戦略である。
【０００４】
その多孔質構造が足場内の細胞定着及び組織形成を促進するという理由により組織工学に適切な多孔質足場が、先行技術に開示されている。
【０００５】
しかしながら、骨関連障害の処置に前記足場を使用することは、損傷した骨の種類、サイズ、及び局在、並びに処置すべき被験体の性質、年齢、及び性別に依存するので、処置すべき疾患に関連する様々な欠点が依然としてある。
【０００６】
現在のところ、多くの仕事は、ヒドロキシアパタイトなどの生体活性及び生体適合性材料の使用に基づいている。実際、骨と結合できるヒドロキシアパタイトは、切断した骨を置換するための充填剤として、又は人工インプラントへの骨内部成長を促進するためのコーティング剤として使用されている。しかしながら、ヒドロキシアパタイトの使用は、骨性部位に対して主に有効なので、限界がある。
【０００７】
現在のところ、いかなる拒絶リスクもなく、再生する骨のサイズ及び局在に非依存的であり得る骨形成を提供する技術はない。
【０００８】
従って、損傷した骨の種類、サイズ、及び局在と関係なくあらゆる被験体で使用でき、骨形成を促進でき、骨誘導性を提供できる生体適合性多孔質材料のニーズがある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、骨形成に理想的な環境を提供でき、血管系の材料への成長を促進できる多孔質三次元多糖足場を調製した。驚くべきことに、及び予想外のことに、本発明者らは、ナノ結晶ヒドロキシアパタイトを含む多糖足場が、組織の石化を誘導することを示した。従って、ｉｎ  ｓｉｔｕの未分化細胞を骨細胞系統へと刺激することによって、本発明は、骨関連障害の処置の先行技術戦略の限界を克服する。
【００１０】
従って、本発明者らは、成長因子又は幹細胞の非存在下の非骨性部位における骨形成に非常に有望な多糖足場を見出した。従って、本発明は、骨関連障害を処置するための現在認められている技術にチャレンジするものであり、以下に開示される広範な可能性を提供する。
【００１１】
本発明は、多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ｉ）少なくとも１つの多糖の量、架橋剤の量、及びポロゲン剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｉｉ）前記溶液を、約４℃〜約８０℃の温度で、前記多糖の量を架橋させるのに十分な時間置くことによって、当該溶液をヒドロゲルにトランスフォーメーションすること、
ｉｉｉ）前記ヒドロゲルを溶媒、好ましくは水溶液に浸すこと、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた多孔質多糖足場を洗浄すること
を含み、
工程ｉ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含む、方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの多糖、及び１つの架橋剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｂ）工程ａ）の水溶液を凍結すること、
ｃ）工程ｂ）の凍結溶液を昇華させること
を含み、
工程ａ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含み、
工程ａ）の溶液中で多糖の架橋が起こる前に工程ｂ）が実施される、方法に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、本発明の方法によって得られる多孔質多糖足場に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、骨関連障害の処置において使用するための、本発明の方法によって得られる多孔質多糖足場に関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用される「多糖」という用語は、２つ以上の単糖単位を含む分子を指す。
【００１６】
本明細書において使用される「アルカリ性溶液」という用語は、正確に７を超えるｐＨを有する溶液を指す。
【００１７】
本明細書において使用される「水溶液」という用語は、溶媒が水である溶液を指す。
【００１８】
本明細書において使用される「ポロゲン剤」という用語は、固体構造内で孔を形成する能力を有する任意の固形剤を指す。
【００１９】
本明細書において使用される「架橋」という用語は、共有結合による１つの多糖鎖と別の多糖鎖の連結を指す。
【００２０】
本明細書において使用される「架橋剤」という用語は、本発明の多糖鎖の間に架橋を導入できる任意の薬剤を包含する。
【００２１】
本明細書において使用される「足場」又は「マトリックス」という用語は、１つ以上の種類の多糖鎖の三次元網目構造を含む半固体系を指す。使用される多糖（又は多糖の混合物）の特性、並びに網目構造の性質及び密度に応じて、このような構造は、平衡状態において様々な量の水を含み得る。以下において、「足場」及び「マトリックス」という用語は、互換可能である。
【００２２】
本明細書において使用される「ヒドロキシアパタイト」又は「マイクロヒドロキシアパタイト」又は「ＨＡ」という用語は、天然に存在する鉱物形態のカルシウムアパタイト（式Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）を有する）を指すが、通常はＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２と表記され、結晶単位格子が２つの要素を含むことを意味する。ＯＨ−イオンは、フッ化物、塩化物又は炭酸塩で置換でき、フッ素リン灰石又は塩素リン灰石が生じる。好ましくは、本発明の目的のために、ＯＨ−は、置換されない。ヒドロキシアパタイトは、骨及び歯のマトリックスの主要成分であり、骨及び歯に剛性を与える。典型的には、ヒドロキシアパタイトのマイクロ粒子のサイズは、１〜２０μm、好ましくは５〜１５μmに含まれる。
【００２３】
本明細書において使用される「ナノ結晶ヒドロキシアパタイト」又は「ナノヒドロキシアパタイト」又は「ｎ−ＨＡ」という用語は、１０〜１００nm、好ましくは２０〜８０nm、好ましくは３０〜７０nm、好ましくは３０〜６０nmに含まれるサイズ、最も好ましくは約５０nmのサイズを有するヒドロキシアパタイト結晶粒子を指す。好ましくは、ｎ−ＨＡ粒子は、針状である。好ましくは、本発明を実施するのに適切なｎ−ＨＡは、室温で化学沈殿することによって（例えば、水酸化カルシウム溶液を用いて、リン酸溶液を沈殿することによって）調製されるｎ−ＨＡである。
【００２４】
本明細書において使用される「多孔質複合多糖足場」という用語は、本発明のｎ−ＨＡと結合した多糖を含む多孔質足場を指す。
【００２５】
本明細書において使用される「生分解性」という用語は、排出され得るか、又はさらに代謝され得る非毒性化合物へとｉｎ  ｖｉｖｏで分解する材料を指す。
【００２６】
本明細書において使用される「昇華」という用語は、固体状態から蒸気状態への直接的な物理相転移を指す。より具体的には、昇華は、物質が液相を経ずに固体から気体に変化するプロセスである。溶液の昇華は、凍結乾燥プロセスを通じて得られ得る。
【００２７】
本明細書において使用される「凍結乾燥」という用語は、溶媒（すなわち、水）を凍結し、次いで、それを凍結状態で蒸発させることによって、急速冷凍した材料を高真空下で乾燥することを指す。
【００２８】
本明細書において使用される「処置する」、「処置」及び「治療」という用語は、治療処置及び予防、又は予防操作、又は骨細胞分化又は骨形成を刺激する操作を指す。このような表現は、骨障害症状の発症を遅らせる操作、並びに／又は骨障害の重症度及び／若しくは骨障害から発症するか、若しくは発症することが予想される症状の重症度を軽減する操作も包含する。この用語は、既存の骨障害症状を改善すること、さらなる症状を予防すること、又は骨成長を防止若しくは促進することをさらに含む。
【００２９】
本明細書において使用される「骨組織」という表現は、石灰化組織（例えば、頭蓋冠、脛骨、大腿骨、椎骨、歯）、骨梁、髄腔、皮質骨を指し、骨梁及び髄腔などの外周を包含する。「骨組織」という表現は、一般的には石化コラーゲンのマトリックス内に位置する骨細胞；骨細胞に栄養を提供する血管；骨髄穿刺液：関節液：骨組織由来骨細胞も包含し、脂肪髄を含み得る。最後に、骨組織は、全骨、全骨の切片、骨片、骨粉、骨組織生検、コラーゲン調製物、又はそれらの混合物などの骨産物を含む。本発明の目的のために、「骨組織」という用語は、特に明記しない限り、ヒト又は動物にかかわらず、前記骨組織及び産物のすべてを包含するのに使用される。
【００３０】
本明細書において使用される「骨関連障害」という表現は、骨形成及び骨吸収の障害を含む。好ましくは、「骨関連障害」という表現は、骨形成不全又は骨量減少に関連する疾患を指す。
【００３１】
骨関連障害の非限定的な例は、くる病、骨粗鬆症、骨軟化症、骨減少症、骨ガン、関節炎、くる病、骨折、骨欠損、溶骨性骨疾患、骨軟化症、骨脆弱化、骨ミネラル密度の減少、軟骨形成不全症、鎖骨頭蓋骨形成不全症、パジェット病、骨形成不全症、大理石骨病、強膜損傷、偽関節、歯周病、抗てんかん薬誘発性骨量減少、無重力誘発性骨量減少、閉経後骨量減少、変形性関節症、骨の浸潤性疾患、代謝性骨疾患、臓器移植関連骨量減少、青年期特発性脊柱側弯症、グルココルチコイド誘発性骨量減少、ヘパリン誘発性骨量減少、骨髄障害、栄養失調、カルシウム欠乏症、関節リウマチ、性腺機能低下症、ＨＩＶ関連骨量減少、腫瘍誘発性骨量減少、ガン関連骨量減少、ホルモン除去骨量減少、多発性骨髄腫薬誘発性骨量減少、老化に伴う顔面骨量減少、老化に伴う頭蓋骨量減少、老化に伴う顎骨量減少、老化に伴う頭骨量減少、及び宇宙旅行に伴う骨量減少である。
【００３２】
好ましくは、本明細書において使用される骨関連障害は、骨折、広範な骨欠損、くる病、骨粗鬆症、骨形成不全症、骨軟化症、骨減少症、骨ガン、溶骨性骨疾患、骨脆弱化、及び／又は骨ミネラル密度の減少である。
【００３３】
多孔質多糖足場及びそれを調製するための方法
第１の目的では、本発明は、多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ｉ）少なくとも１つの多糖の量、架橋剤の量、及びポロゲン剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｉｉ）前記溶液を、約４℃〜約８０℃の温度で、前記多糖の量を架橋させるのに十分な時間置くことによって、当該溶液をヒドロゲルにトランスフォーメーションすること、
ｉｉｉ）前記ヒドロゲルを溶媒、好ましくは水溶液に浸すこと、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）で得られた多孔質多糖足場を洗浄すること
を含み、
工程ｉ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含む、方法に関する。
【００３４】
孔隙率及び孔のサイズがポロゲン剤の濃度のコントロール下にあり得るように、ポロゲン剤の濃度は、足場に形成された孔の全孔隙率及びサイズの両方に影響を与える。
【００３５】
ポロゲン剤の非限定的な例は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、及びそれらの混合物である。これらの化合物の多くは、Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US)などの会社から市販されている。
【００３６】
好ましくは、本発明の文脈において、ポロゲン剤は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム又はそれらの混合物から選択される。
【００３７】
あるいは、ポロゲン剤は、架橋した多糖足場が水中に浸されるとすぐに溶解され得る無機塩であり得る。このようなポロゲン剤の例は、徐々に溶解され得る飽和食塩水を含む。
【００３８】
典型的には、多糖とポロゲン剤の重量比は、１：５０〜５０：１、好ましくは１：３０〜３０：１、好ましくは１：１２〜１２：１の範囲である。好ましい実施態様では、多糖とポロゲン剤の前記重量比は、約１２：１４である。
【００３９】
典型的には、工程ｉｉｉ）の水溶液は、水である。
【００４０】
あるいは、工程ｉｉｉ）の水溶液は、緩衝液である。緩衝液の非限定的な例は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、ビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、トリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、カコジル酸塩（ジメチルアルシン酸）、ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム生理食塩水）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、及びそれらの混合物である。
【００４１】
あるいは、工程ｉｉｉ）の水溶液は、酸性溶液である。酸は、クエン酸、塩酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、サリチル酸、安息香酸、及びグルタミン酸からなる群より選択され得る。
【００４２】
好ましくは、工程ｉｉｉ）の水溶液は、緩衝液である。最も好ましくは、工程ｉｉｉ）の水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００４３】
好ましくは、工程ｉｉ）の溶媒は、無機溶媒である。
【００４４】
一実施態様では、本発明の方法は、工程ｉｖ）で得られた足場を凍結乾燥することからなるさらなる工程を含み得る。凍結乾燥は、当技術分野で公知の任意の装置を用いて実施され得る。本質的には、３つのカテゴリーの凍結乾燥機がある：ロータリーエバポレーター、多岐管式凍結乾燥機、及び棚式凍結乾燥機。このような装置は、当技術分野において周知であり、freeze-dryer Lyovac (GT2, STERIS Rotary vane pump, BOC EDWARDS)などが市販されている。基本的には、チャンバーの真空は、０．１mBar〜約６．５mBarである。凍結乾燥は、少なくとも水分の９８．５％、好ましくは少なくとも水分の９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％を除去するのに十分な十分時間実施される。
【００４５】
別の実施態様では、本発明の方法は、本発明に従って調製した足場に水和することからなるさらなる工程を含み得る。前記水和は、足場を水溶液（例えば、脱イオン水、逆浸透膜でろ過した水、生理食塩水、又は適切な有効成分を含む水溶液）中に、所望の含水量を有する足場を生成するのに十分な時間浸すことによって、実施され得る。典型的には、最大含水量を含む足場が所望である場合、足場は、水溶液中に、足場をその最大サイズ又は体積に膨張させるのに十分な時間浸される。典型的には、足場は、水溶液中に、少なくとも約１時間、好ましくは少なくとも約２時間、より好ましくは約４時間〜約２４時間浸される。足場を所望のレベルに水和するのに必要な時間は、使用される多糖の組成、足場のサイズ（例えば、厚さ）、及び水溶液の温度、並びに他の要因などいくつかの要因に依存すると理解される。
【００４６】
好ましくは、水和した足場は、８０％超の水、好ましく９０％の水、より好ましくは９５％の水を含む。
【００４７】
第２の態様では、本発明は、多孔質多糖足場を調製するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも１つの多糖、及び１つの架橋剤の量を含むアルカリ性水溶液を調製すること、
ｂ）工程ａ）の水溶液を凍結すること、
ｃ）工程ｂ）の凍結溶液を昇華させること
を含み、
工程ａ）のアルカリ性水溶液が、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトをさらに含み、
工程ａ）の溶液中で多糖の架橋が起こる前に工程ｂ）が実施される、方法に関する。
【００４８】
工程ａ）の溶液中で多糖の架橋が起こる前に工程ｂ）が実施されることが、本発明の本質的な特徴である。典型的には、温度及び時間は、水溶液の架橋をコントロールするための主な要因である。多糖の架橋を防止するか、又は著しく制限するために、水溶液は、３７℃未満、より好ましくは４℃〜２５℃に含まれる温度で調製され得る。また、前記多糖の架橋を防止するために、工程ｂ）は、可能な限り迅速に実施され得る。
【００４９】
水溶液は、調製されるとすぐに凍結される。水溶液の凍結は、異なる速度（例えば、℃／分）で実施され得る。典型的には、凍結は、約１℃／分〜約２００℃／分、好ましくは約１℃／分〜約２０℃／分、最も好ましくは約５℃／分〜約１０℃／分の速度で実施され得る。溶液は、液体窒素又はドライアイスで凍結され得る。
【００５０】
水溶液を凍結したら、昇華を行い得る。好ましい実施態様では、本発明の多孔質多糖足場を調製するための方法は、凍結乾燥プロセスを含む。従って、本発明によれば、凍結乾燥プロセスは、水溶液中で架橋プロセスが起こる前に行われなければならない。凍結乾燥は、当技術分野において公知の任意の装置を用いて実施され得る。本質的には、３つのカテゴリーの凍結乾燥機がある：ロータリーエバポレーター、多岐管式凍結乾燥機、及び棚式凍結乾燥機。このような装置は、当技術分野において周知であり、freeze-dryer Lyovac (GT2, STERIS Rotary vane pump, BOC EDWARDS)などが市販されている。基本的には、急速冷凍した水溶液をチャンバーに置く。次いで、チャンバーの温度を、液化した蒸気の沸点よりも高いレベルに上昇させ、それにより蒸気を蒸発させ、除去する。典型的には、チャンバーの温度は、−７０℃〜−１℃、好ましくは−７０℃〜−４０℃、さらに好ましくは約−５０℃〜−４０℃であり得る。チャンバーの加熱は、チャンバーの圧力を減少させる真空の流れを伴う。典型的には、チャンバーの真空は、０．１mBar〜約６．５mBarである。典型的には、凍結乾燥は、少なくとも水分の９８．５％、好ましくは少なくとも水分の９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％を除去するのに十分な十分時間実施される。
【００５１】
水溶液の凍結乾燥は、水から氷粒子の形成を引き起こす。いかなる理論にも拘束されないが、上記温度及び圧力条件下で、凍結溶液に含まれる水を昇華させ、従ってそれにより、材料内のそれまで氷粒子が占有していた空間に間隙が残り、それに応じて形成された多孔質多糖足場が生成する。驚くべきことに、架橋プロセスは、凍結乾燥プロセス中に起こる。
【００５２】
従って、得られた足場の物質密度及び孔のサイズは、凍結水溶液の凍結乾燥速度をコントロールすることによって、変化し得る。凍結乾燥プロセスにおける重要なパラメーターは、真空度である。
【００５３】
本発明の目的のために、あらゆる種類の多糖が使用され得る。合成及び天然の多糖は、本発明の文脈において代替的に使用され得る。本発明を実施するのに適切な多糖の非限定的な例は、デキストラン、寒天、アルギン酸、ヒアルロン酸、イヌリン、プルラン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、スクレログルカン、カードラン、デンプン、セルロース、及びそれらの混合物である。例えば、酸性基（カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩）、アミノ基（エチレンアミン、ジエチルアミノエチルアミン、プロピルアミン）、疎水性基（アルキル、ベンジル）を持つ化学的に改変された多糖が含まれ得る。所望の材料を製造するのに使用され得る糖構造及び多糖は、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ソルビトール、マンニトール、イジトール、ズルシトール、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。これらの化合物の多くは、Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US)などの会社から市販されている。
【００５４】
典型的には、多糖の平均分子量は、約５，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトン、好ましくは約１００，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンである。典型的には、本発明の足場を調製するのに使用される多糖は、デキストラン、寒天、プルラン、イヌリン、スクレログルカン、カードラン、デンプン、セルロース、及びそれらの混合物などの天然の多糖である。あるいは、本発明の足場を調製するのに使用される多糖は、キトサン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＥＡＥ−プルラン、ＥＡ−プルラン、及びそれらの混合物などの正電荷の多糖である。あるいは、本発明の足場を調製するのに使用される多糖は、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、フコイダン、及びそれらの混合物などの負電荷の多糖である。あるいは、本発明の足場を調製するのに使用される多糖は、天然の多糖と負電荷の多糖との混合物である。典型的には、負電荷の多糖は、混合物の１〜２０％、好ましくは５〜１０％を示す。あるいは、本発明の足場を調製するのに使用される多糖は、天然の多糖と正電荷の多糖との混合物である。典型的には、正電荷の多糖は、混合物の１〜２０％、好ましくは５〜１０％を示す。
【００５５】
好ましくは、本発明の目的のために、前記多糖は、デキストラン、プルラン、寒天、アルギン酸、デンプン、ヒアルロン酸、イヌリン、ヘパリン、フコイダン、キトサン、及びそれらの混合物からなる群において選択される。本発明の特定の一実施態様では、前記多糖は、プルランとデキストランとの混合物である。典型的には、プルラン／デキストランの重量比は、９５：５〜５：９５（w/w）の範囲、好ましくは７５：２５（w/w）の比である。本発明の別の実施態様では、前記多糖は、プルランとデキストランとフコイダンとの混合物である。典型的には、プルラン／デキストラン／フコイダンの重量比は、約７０：２０：１０〜約５０：２０：３０、好ましくは約７０：２０：１０〜約５０：３０：２０の範囲であり、最も好ましくは約７３：２２：５（w/w）の比である。フコイダンは、血管新生を促進するので、本発明の多孔質多糖足場中のフコイダンの存在は、高度に有利である。
【００５６】
典型的には、共有架橋剤は、トリメタリン酸三ナトリウム（ＳＴＭＰ）、オキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）、エピクロロヒドリン、ホルムアルデヒド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、多糖を架橋させるのに適切な任意の他の化合物、及びそれらの混合物からなる群より選択される。これらの化合物の多くは、Sigma-Aldrich (St. Louis, Michigan, US)などの会社から市販されている。好ましくは、本発明の目的のために、前記架橋剤は、ＳＴＭＰである。典型的には、水溶液中の共有架橋剤の濃度（w/v）は、約１％〜約６％、より好ましくは約２％〜約６％、最も好ましくは約２％〜約３％である。典型的には、多糖と架橋剤の重量比は、２０：１〜１：１、好ましくは１０：１〜２：１の範囲である。
【００５７】
本発明の文脈において、ナノヒドロキシアパタイトは、市販のナノヒドロキシアパタイト（例えば、Inframat Corporation又はFluidinovaによって商品化されているもの）であり得る。好ましくは、本発明の文脈において有用なナノ結晶ヒドロキシアパタイトは、０．５〜１．５Ｍに含まれる濃度、好ましくは１Ｍの水酸化カルシウム溶液を用いて、０．３〜１Ｍに含まれる濃度、好ましくは０．６Ｍのリン酸溶液を室温で化学沈殿することによって得られる。典型的には、アルカリ性多糖溶液中のヒドロキシアパタイトの濃度（w/v）は、０．０１〜１０％（w/v）、好ましくは０．１〜０．５％（w/v）、より好ましくは０．１〜０．３％（w/v）に含まれる。典型的には、アルカリ性多糖溶液中のナノヒドロキシアパタイトの濃度（w/v）は、０．０１〜１０％（w/v）、好ましくは０．１〜０．５％（w/v）、より好ましくは０．１〜０．３％（w/v）に含まれる。
【００５８】
一実施態様では、本発明の方法を用いて得られる多孔質多糖足場が、所望の形態をとり得るように、ヒドロキシアパタイト、好ましくはナノヒドロキシアパタイトを含む工程ａ）又は工程ｉ）のアルカリ性水溶液は、工程ｂ）又は工程ｉｉ）の前に金型に注入され得る。本発明によれば、任意の形状金型が使用され得る。様々なサイズも想定され得る。金型は、任意の材料から作られ得るが、好ましい材料は、テフロンなどの非粘着性表面を含む。
【００５９】
あるいは、本発明の足場は、所望のサイズ及び形態をとるように、切断され、成形され得る。
【００６０】
本発明の方法は、任意の適切なプロセスを使用して足場を滅菌する工程をさらに含み得る。足場は、任意の適切な時点で滅菌され得るが、好ましくは、足場が水和される前に滅菌される。適切な放射線滅菌の技術は、例えば、セシウム１３７による、３５グレイで１０分間の照射である。適切な非放射線滅菌の技術は、ＵＶ照射、ガスプラズマ、又は酸化エチレンなどの当技術分野において公知の方法を含むが、これらに限定されない。例えば、Abtox, Inc of Mundelein, Illinoisから商品名PlazLyteで入手可能な滅菌システムを使用して、又はUS-5413760及びUS-5603895に開示されているガスプラズマ滅菌プロセスに従って、足場を滅菌し得る。
【００６１】
本発明の方法によって製造される足場は、任意の適切な包装材で包装され得る。望ましくは、包装材は、包装材が破られるまで、足場の無菌性を保つ。
【００６２】
さらなる実施態様では、工程ｉ）又はａ）のアルカリ性溶液は、薬物をさらに含む。従って、本発明は、薬物を含む多孔質多糖足場を提供する。典型的には、前記薬物は、ホルモン、放射性物質、蛍光物質、走化性物質、抗生物質、ステロイド性又は非ステロイド性鎮痛薬、免疫抑制剤、又は抗ガン剤、薬学的クラスのスタチンに属する薬物などの認められている治療効果を有する薬物である。好ましくは、前記薬物は、薬学的クラスのスタチンに属する。本明細書において使用される「スタチン」は、薬学的クラスのＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を指す。最近、この薬学的クラスの薬物のいくつかは、骨形成プロセスにおいて役割を果たすことが示された。好ましくは、前記スタチンは、ロバスタチン、アトルバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、及びシムバスタチンからなる群より選択される。より好ましくは、前記スタチンは、ロバスタチン、アトルバスタチン、メバスタチン、及びシムバスタチンからなる群より選択される。前記スタチンは、骨形成において役割を果たすので、本発明の文脈において非常に適切である。
【００６３】
さらなる実施態様では、アルカリ性溶液は、生物活性物質をさらに含む。典型的には、前記生物活性物質は、細胞経路の改変、及び細胞反応若しくは組織反応の改変などの様々なメカニズムにおいて重要な役割を果たすことが公知の物質である。前記生物活性物質は、成長因子、サイトカイン（リンフォカイン、インターロイキン、及びケモカイン）、抗酸化分子、血管新生促進分子、血管新生阻害剤、免疫調節剤、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、血漿由来生物活性物質、ＰＲＰ（多血小板血漿）由来物質、可溶性接着分子の中から選択される。
【００６４】
第３の態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる多孔質多糖足場に関する。これらの多孔質多糖足場は、実際には、本発明によって提供される顕著な特性を有する唯一のものである。本発明の多孔質多糖足場を調製するための方法が、ポロゲン剤の使用を含む場合、ポロゲン剤の濃度は、足場に形成された孔のサイズに影響を与える。従って、この特定の実施態様では、孔のサイズは、前記ポロゲン剤の濃度のコントロール下にあり得る。典型的には、足場の孔の平均サイズは、約１μm〜約５００μm、好ましくは約１０μm〜約２００μmである。典型的には、孔密度（又は孔隙率）は、約４％〜約７５％、好ましくは約４％〜約５０％である。当業者であれば、所望の特性を本発明の多孔質多糖足場に与え得る。典型的には、当業者であれば、生体分子、生物活性剤、薬物、抗炎症剤、添加剤、抗菌剤、着色剤、界面活性剤、及び分化剤からなる群において選択される１つ以上の化合物を追加し得る。前記化合物を本発明の多孔質多糖足場に組み込むための技術は、十分に当業者の能力の範囲内である。典型的には、前記化合物は、本発明の方法の工程ｉ）又はａ）のアルカリ性溶液に直接的に追加され得る。この特定の実施態様では、化合物は、本発明の多孔質多糖足場の構造内にあり得る。あるいは、前記化合物は、化合物の溶液を用いて前記足場を水和することからなる工程中に、多孔質多糖足場に組み込まれ得る。
【００６５】
一実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、１つ以上の生体分子をさらに含む。生体分子の非限定的な例は、薬物、ホルモン、放射性物質、蛍光物質、化学薬品又は薬剤、走化性物質、抗生物質、ステロイド性又は非ステロイド性鎮痛薬、免疫抑制剤、抗ガン剤、短鎖ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞付着のメディエーター、生物学的に活性なリガンド、インテグリン結合配列、リガンド、特定の成長因子のアップレギュレーションに影響を与える小分子、テネイシン−Ｃ、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、デコリン、トロンボエラスチン、トロンビン由来ペプチド、及びそれらの混合物である。本発明の多孔質多糖足場中の前記生体分子の存在は、処置効果を高め得るか、可視化を高め得るか、適切な方向を示し得るか、感染症に抵抗し得るか、治癒を促進し得るか、柔軟性又は任意の他の望ましい効果を増大させ得る。別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、生物活性物質をさらに含む。典型的には、前記生物活性物質は、細胞経路の改変、及び細胞反応若しくは組織反応の改変などの様々なメカニズムにおいて重要な役割を果たすことが公知の物質である。前記生物活性物質は、成長因子、サイトカイン（リンフォカイン、インターロイキン、及びケモカイン）、抗酸化分子、血管新生促進分子、血管新生阻害剤、免疫調節剤、炎症性サイトカイン、抗炎症性サイトカイン、血漿由来生物活性物質、ＰＲＰ（多血小板血漿）由来物質、及び可溶性接着分子の中から選択される。
【００６６】
さらなる実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、１つ以上の薬物をさらに含む。典型的には、前記薬物は、ホルモン、放射性物質、蛍光物質、走化性物質、抗生物質、ステロイド性又は非ステロイド性鎮痛薬、免疫抑制剤、又は抗ガン剤、薬学的クラスのスタチンに属する薬物などの認められている治療効果を有する薬物である。好ましくは、前記薬物は、薬学的クラスのスタチンに属する。好ましくは、前記スタチンは、ロバスタチン、アトルバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、及びシムバスタチンからなる群より選択される。より好ましくは、前記スタチンは、ロバスタチン、アトルバスタチン、メバスタチン、及びシムバスタチンからなる群より選択される。前記スタチンは、骨形成において役割を果たすので、本発明の文脈において非常に適切である。
【００６７】
別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、抗炎症剤をさらに含む。抗炎症剤の非限定的な例は、インドメタシン、アセチルサルチル酸、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカム、及びナプロキセンである；トロンビン、フィブリノゲン、ホモシステイン、及びエストラムスチンなどの血栓形成剤；並びに硫酸バリウム、金粒子、及び酸化鉄ナノ粒子（ＵＳＰＩＯ）などの放射線を通さない化合物、並びにそれらの混合物。
【００６８】
さらに別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、添加剤をさらに含む。使用される添加剤の量は、本発明の多孔質多糖足場の特定の用途に依存し、当業者であれば、通常の実験を使用して、容易に決定し得る。
【００６９】
さらに別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、抗菌剤をさらに含む。適切な抗菌剤は、当技術分野において周知である。適切な抗菌剤の非限定的な例は、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、及びブチルパラベンなどのアルキルパラベン；クレゾール；クロロクレゾール；ヒドロキノン；安息香酸ナトリウム；安息香酸カリウム；トリクロサン、及びクロルヘキシジン、及びそれらの混合物である。使用され得る抗菌剤及び抗感染症剤の他の例は、限定されないが、リファンピシン、ミノサイクリン、クロルヘキシジン、銀イオン剤、及び銀に基づく組成物、及びそれらの混合物である。
【００７０】
さらなる実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、足場の可視性を高めるための少なくとも１つの着色剤をさらに含む。適切な着色剤は、色素、顔料、及び天然着色料を含む。適切な着色剤の非限定的な例は、アルシアンブルー、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＦＩＴＣデキストラン、及びそれらの混合物である。
【００７１】
さらに別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む。本明細書において使用される界面活性剤は、水の表面張力を低下させる化合物を指す。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤、又はポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンなどの中性界面活性剤、及びそれらの混合物であり得る。
【００７２】
一実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、分化剤をさらに含む。好ましくは、このような分化剤は、骨形成に関与する薬剤である。あるいは、このような分化剤は、骨発生、血管新生、又は創傷治癒に関与する薬剤である。好ましくは、このような分化剤は、成長因子である。本発明の目的に適切な成長因子の非限定的な例は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、ストローマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）；ＴＧＦβスーパーファミリー因子；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ソマトロピン、成長分化因子（ＧＤＦ）、及びそれらの混合物である。
【００７３】
典型的には、成長因子は、本発明の多孔質多糖足場１個あたり１ng〜１００μgに含まれる濃度で存在する。
【００７４】
別の実施態様では、本発明の多孔質多糖足場は、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞などの細胞をさらに含む。
【００７５】
好ましくは、前記細胞は、哺乳類細胞である。本発明の目的に適切な哺乳類細胞の非限定的な例は、軟骨細胞、線維軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、滑膜細胞、上皮細胞及び肝細胞などの分化した細胞、又は幹細胞、胚幹細胞、誘導前駆幹細胞（ｉＰＳ）、異なるソースに由来する間葉幹細胞、骨髄、脂肪組織、末梢血前駆細胞、臍帯血前駆細胞、遺伝的にトランスフォーメーションされた細胞、及びそれらの混合物である。最も好ましくは、本発明の多孔質多糖足場に含まれる哺乳類細胞は、脂肪由来間質細胞である。典型的には、多孔質多糖足場に含まれる哺乳類細胞は、細胞２００個／mm3〜細胞３５０００個／mm3に含まれる細胞密度で存在する。
【００７６】
第４の態様では、本発明は、骨の生成に使用するための多孔質多糖足場であって、本発明の方法によって得られる、多孔質多糖足場に関する。
【００７７】
本明細書において使用される「骨の生成」という表現は、「骨の修復」及び「骨の発達」を包含する。
【００７８】
第５の態様では、本発明は、異所性石化組織形成を刺激するのに使用するための多孔質多糖足場であって、本発明の方法によって得られる、多孔質多糖足場に関する。本発明の文脈において、「異所性」という表現は、非骨組織を指す。従って、また、本発明は、非骨性部位において石化組織を誘導するのに使用するための多孔質多糖足場であって、本発明の方法によって得られる、多孔質多糖足場に関する。
【００７９】
好ましくは、異所性石化の前記刺激は、幹細胞及び／又は成長因子の非存在下で起こる。実際、本発明者らは、本発明の多孔質多糖足場が、幹細胞及び／又は成長因子の非存在下であっても、非骨性部位及び骨性部位（頭蓋冠部位又は大腿顆）において石化組織を誘導する能力を有することを示した。従って、本発明は、幹細胞及び／又は成長因子の存在下及び非存在下で、骨性部位及び非骨性部位において石化組織形成を刺激するのに有用な多孔質多糖足場を提供する。
【００８０】
本発明の多孔質多糖足場の使用
本発明者らは、本発明の多孔質多糖足場の移植が、高密度コラーゲンネットワーク及び血管形成、並びに骨芽細胞様細胞のリクルートの刺激につながることを示した。皮下部位における本発明の足場の前記移植は、高密度石化組織の形成、そしてそれ故骨形成につながる。
【００８１】
本発明者らは、本発明の足場は、移植した場合に、ＶＥＧＦ及びＢＭＰなどの成長因子を保持することを示した。本発明者らは、ｎ−ＨＡを含む足場の前記成長因子を保持する能力が、ｎ−ＨＡを含まない足場と比較してより高いことも証明した。
【００８２】
第６の態様では、本発明は、骨関連障害の処置において使用するための、本発明の方法によって得られる、多孔質多糖足場に関する。実際、本発明者らは、本発明の多孔質多糖足場が、おそらくは骨細胞への細胞の分化を通じて、細胞外石化マトリックスの産生を刺激する能力を示した。従って、本発明者らは、本発明の足場が骨関連障害の処置に有用であることを証明した。
【００８３】
第７の態様では、本発明は、多糖足場として使用するための、本発明の方法によって得られる、多孔質多糖足場に関する。
【００８４】
典型的には、多孔質多糖足場のサイズ及び形状は、置換しようとする骨の種類及びサイズ、並びに前記骨の局在に適合され得る。好ましくは、足場の形状は、球、円柱、立方体、又は矩形直方体である。好ましくは、前記足場のサイズは、０．５mm〜３０cmに含まれる。典型的には、本発明の多糖足場は、以下のように移植され得る：凍結乾燥した足場を欠損部内に置き、そのサイズを欠損部のサイズに適合させる。例えば、マウスの頭蓋冠部位における移植の場合、直径４mm及び深さ５００μmの欠損を施し、マトリックスをホストの組織に置いた。マウスにおいて、大腿顆に施した骨欠損は、約１mm3である。ラットにおいて、大腿顆に施した臨界サイズの欠損は、直径５mm及び深さ３mmである。これらの骨欠損は、マトリックスで充填する。大型動物（ヒツジ又はヤギ）における部分的な骨欠損の場合、中足に２．５cmの切除を施し、円柱状の多糖足場を欠損部内に置く。欠損部内に新たに形成された組織の分析を、１５日〜１２ヶ月の間に実施する。当業者であれば、新たに形成された前記組織を分析するのに適切な通常の技術を習得している。典型的には、前記分析は、ゴールドスタンダード技術のような組織形態計測法などのいくつかの侵襲的方法を使用して、実施し得る。あるいは、前記分析は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線コンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）、単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、又は放射線解析などの非侵襲的イメージング法を使用して、実施し得る。適切な技術の選択は、小型及び大型動物、又はヒトにおける骨の種類に依存する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】多孔質多糖足場。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による再水和前（図１Ａ）及び再水和後（図１Ｂ）のｎ−ＨＡを含むハイブリッド多孔質円板の巨視的な図。スケールバーは、１mmに対応する。
【図１Ｂ】多孔質多糖足場。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）による再水和前（図１Ａ）及び再水和後（図１Ｂ）のｎ−ＨＡを含むハイブリッド多孔質円板の巨視的な図。スケールバーは、１mmに対応する。
【図２Ａ】凍結乾燥多糖足場の電子顕微鏡。走査型電子顕微鏡によって、凍結乾燥足場の形態を分析した（図２Ａ）。ＰＢＳ中で再水和した後、環境走査電子顕微鏡（ESEM Philips XL 30）を用いて、水和した足場の孔隙率を観察した（図２Ｂ）。
【図２Ｂ】凍結乾燥多糖足場の電子顕微鏡。走査型電子顕微鏡によって、凍結乾燥足場の形態を分析した（図２Ａ）。ＰＢＳ中で再水和した後、環境走査電子顕微鏡（ESEM Philips XL 30）を用いて、水和した足場の孔隙率を観察した（図２Ｂ）。
【図３Ａ】多糖に基づくマトリックスによるヌードマウスにおける臨界サイズの欠損部の治癒。５ｘ１０５個の分化した脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）をロードしたか（左側）、又はロードしていない（右側）ｎ−ＨＡを含まない多糖マトリックス（図３Ａ）、又は多糖足場（図３Ｂ）で充填した頭蓋冠欠損部のマイクロＣＴ画像。移植の１５、３０、６０及び８４日後に、各種類の足場に関して同じ動物でイメージングを実施し、得られた画像をＤ１５、Ｄ３０、Ｄ６０、Ｄ８４とそれぞれ称する。移植した多糖足場の組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。頭蓋冠骨をコントロールとして使用した（図３Ｃ）。
【図３Ｂ】多糖に基づくマトリックスによるヌードマウスにおける臨界サイズの欠損部の治癒。５ｘ１０５個の分化した脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）をロードしたか（左側）、又はロードしていない（右側）ｎ−ＨＡを含まない多糖マトリックス（図３Ａ）、又は多糖足場（図３Ｂ）で充填した頭蓋冠欠損部のマイクロＣＴ画像。移植の１５、３０、６０及び８４日後に、各種類の足場に関して同じ動物でイメージングを実施し、得られた画像をＤ１５、Ｄ３０、Ｄ６０、Ｄ８４とそれぞれ称する。移植した多糖足場の組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。頭蓋冠骨をコントロールとして使用した（図３Ｃ）。
【図３Ｃ】多糖に基づくマトリックスによるヌードマウスにおける臨界サイズの欠損部の治癒。５ｘ１０５個の分化した脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）をロードしたか（左側）、又はロードしていない（右側）ｎ−ＨＡを含まない多糖マトリックス（図３Ａ）、又は多糖足場（図３Ｂ）で充填した頭蓋冠欠損部のマイクロＣＴ画像。移植の１５、３０、６０及び８４日後に、各種類の足場に関して同じ動物でイメージングを実施し、得られた画像をＤ１５、Ｄ３０、Ｄ６０、Ｄ８４とそれぞれ称する。移植した多糖足場の組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。頭蓋冠骨をコントロールとして使用した（図３Ｃ）。
【図４Ａ】多糖足場によって誘導した、皮下部位における異所性石化組織形成。（Ａ）多糖足場（ｎ−ＨＡ／足場）の円板２個（左側）、及び５ｘ１０５個の分化したＡＤＳＣを予め播種した円板１個（右側）を移植したマウスの１５、３０及び６０日目のマイクロＣＴ画像。（Ｂ）６０日目の巨視的な図。（Ｃ）組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。（Ｄ）６０日目に得られた非脱石灰化（Ｄ１；倍率ｘ１０）（Goldnerトリクロムによる染色）及び脱石灰化（Ｄ２；倍率ｘ２）（Ｄ３；倍率ｘ２０）切片（Masson染色）の組織学的検査。（Ｅ）３０日目及び６０日目の移植した材料で実施したVon Kossa染色。移植前のパラフィン包埋複合マトリックスを使用して、コントロールを実施した（倍率ｘ２）。
【図４Ｂ】多糖足場によって誘導した、皮下部位における異所性石化組織形成。（Ａ）多糖足場（ｎ−ＨＡ／足場）の円板２個（左側）、及び５ｘ１０５個の分化したＡＤＳＣを予め播種した円板１個（右側）を移植したマウスの１５、３０及び６０日目のマイクロＣＴ画像。（Ｂ）６０日目の巨視的な図。（Ｃ）組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。（Ｄ）６０日目に得られた非脱石灰化（Ｄ１；倍率ｘ１０）（Goldnerトリクロムによる染色）及び脱石灰化（Ｄ２；倍率ｘ２）（Ｄ３；倍率ｘ２０）切片（Masson染色）の組織学的検査。（Ｅ）３０日目及び６０日目の移植した材料で実施したVon Kossa染色。移植前のパラフィン包埋複合マトリックスを使用して、コントロールを実施した（倍率ｘ２）。
【図４Ｃ】多糖足場によって誘導した、皮下部位における異所性石化組織形成。（Ａ）多糖足場（ｎ−ＨＡ／足場）の円板２個（左側）、及び５ｘ１０５個の分化したＡＤＳＣを予め播種した円板１個（右側）を移植したマウスの１５、３０及び６０日目のマイクロＣＴ画像。（Ｂ）６０日目の巨視的な図。（Ｃ）組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。（Ｄ）６０日目に得られた非脱石灰化（Ｄ１；倍率ｘ１０）（Goldnerトリクロムによる染色）及び脱石灰化（Ｄ２；倍率ｘ２）（Ｄ３；倍率ｘ２０）切片（Masson染色）の組織学的検査。（Ｅ）３０日目及び６０日目の移植した材料で実施したVon Kossa染色。移植前のパラフィン包埋複合マトリックスを使用して、コントロールを実施した（倍率ｘ２）。
【図４Ｄ】多糖足場によって誘導した、皮下部位における異所性石化組織形成。（Ａ）多糖足場（ｎ−ＨＡ／足場）の円板２個（左側）、及び５ｘ１０５個の分化したＡＤＳＣを予め播種した円板１個（右側）を移植したマウスの１５、３０及び６０日目のマイクロＣＴ画像。（Ｂ）６０日目の巨視的な図。（Ｃ）組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。（Ｄ）６０日目に得られた非脱石灰化（Ｄ１；倍率ｘ１０）（Goldnerトリクロムによる染色）及び脱石灰化（Ｄ２；倍率ｘ２）（Ｄ３；倍率ｘ２０）切片（Masson染色）の組織学的検査。（Ｅ）３０日目及び６０日目の移植した材料で実施したVon Kossa染色。移植前のパラフィン包埋複合マトリックスを使用して、コントロールを実施した（倍率ｘ２）。
【図４Ｅ】多糖足場によって誘導した、皮下部位における異所性石化組織形成。（Ａ）多糖足場（ｎ−ＨＡ／足場）の円板２個（左側）、及び５ｘ１０５個の分化したＡＤＳＣを予め播種した円板１個（右側）を移植したマウスの１５、３０及び６０日目のマイクロＣＴ画像。（Ｂ）６０日目の巨視的な図。（Ｃ）組織ミネラル密度（ＴＭＤ）の定量的分析。（Ｄ）６０日目に得られた非脱石灰化（Ｄ１；倍率ｘ１０）（Goldnerトリクロムによる染色）及び脱石灰化（Ｄ２；倍率ｘ２）（Ｄ３；倍率ｘ２０）切片（Masson染色）の組織学的検査。（Ｅ）３０日目及び６０日目の移植した材料で実施したVon Kossa染色。移植前のパラフィン包埋複合マトリックスを使用して、コントロールを実施した（倍率ｘ２）。
【図５Ａ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、マウスの異所性部位における石化を誘導する。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける移植の１５日（Ｄ１５）、３０日（Ｄ３０）及び６０日（Ｄ６０）後の、マトリックスのみ（左側）（点線矢印によって示される）及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（右側）（プレーンな線の矢印によって示される）の皮下移植の代表的なマイクロＣＴ画像。（Ｂ）Microview画像分析器を用いて、再構築した三次元マイクロＣＴ画像から、骨ミネラル量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した（マトリックス（白色長方形）及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（黒色長方形））。データを平均±標準偏差（ｎ＝８）として示す。記号＊＊は、他のグループと比較した統計的な有意差を示す（＜０．０１）。
【図５Ｂ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、マウスの異所性部位における石化を誘導する。（Ａ）Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける移植の１５日（Ｄ１５）、３０日（Ｄ３０）及び６０日（Ｄ６０）後の、マトリックスのみ（左側）（点線矢印によって示される）及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（右側）（プレーンな線の矢印によって示される）の皮下移植の代表的なマイクロＣＴ画像。（Ｂ）Microview画像分析器を用いて、再構築した三次元マイクロＣＴ画像から、骨ミネラル量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した（マトリックス（白色長方形）及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（黒色長方形））。データを平均±標準偏差（ｎ＝８）として示す。記号＊＊は、他のグループと比較した統計的な有意差を示す（＜０．０１）。
【図６Ａ】マトリックス＋ｎ−ＨＡは、コラーゲンに基づく石化組織の形成を誘導する：新たに形成された組織の組織学的分析。（Ａ）１５日（Ｄ１５）及び６０日（Ｄ６０）後の、マウスに皮下移植したマトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的非脱石灰化断面：Von Kossa染色。（Ｂ）移植後６０日のマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）の代表的な組織学的脱石灰化断面：Goldner染色、画像は、足場に定着するインプラントの周囲にある非常に高密度なコラーゲン組織を示し、白色矢印によって示されるのは骨芽細胞様細胞であり、黒色矢印によって示されるのはコラーゲン組織内部の多数の血管である。
【図６Ｂ】マトリックス＋ｎ−ＨＡは、コラーゲンに基づく石化組織の形成を誘導する：新たに形成された組織の組織学的分析。（Ａ）１５日（Ｄ１５）及び６０日（Ｄ６０）後の、マウスに皮下移植したマトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的非脱石灰化断面：Von Kossa染色。（Ｂ）移植後６０日のマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）の代表的な組織学的脱石灰化断面：Goldner染色、画像は、足場に定着するインプラントの周囲にある非常に高密度なコラーゲン組織を示し、白色矢印によって示されるのは骨芽細胞様細胞であり、黒色矢印によって示されるのはコラーゲン組織内部の多数の血管である。
【図７Ａ】手術前（ＤＯ）、及びマウスにおける皮下移植後１５日（Ｄ１５）のマトリックスのＸＲＤパターン。（Ａ）マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）；（Ｂ）ｎ−ＨＡを含まないマトリックス。ＭＡＴＲＩ＋移植の１５日後のＸＲＤパターンにおいて、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の特異的ピークが観察されるだけである。サンプル処理に起因する岩塩のピーク（Ｈ）は、すべてのスペクトルで観察される。両グループに関して、３０日目及び６０日目に得られたＸＲＤパターンは、１５日目に観察されたものと類似している（データは示さず）。
【図７Ｂ】手術前（ＤＯ）、及びマウスにおける皮下移植後１５日（Ｄ１５）のマトリックスのＸＲＤパターン。（Ａ）マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）；（Ｂ）ｎ−ＨＡを含まないマトリックス。ＭＡＴＲＩ＋移植の１５日後のＸＲＤパターンにおいて、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の特異的ピークが観察されるだけである。サンプル処理に起因する岩塩のピーク（Ｈ）は、すべてのスペクトルで観察される。両グループに関して、３０日目及び６０日目に得られたＸＲＤパターンは、１５日目に観察されたものと類似している（データは示さず）。
【図８】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、内因性の骨誘導及び血管新生因子を保持していた。皮下移植した場合にマトリックス（白色長方形）及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（黒色長方形）内に形成された組織に保持されたＢＭＰ２（Ａ）及びＶＥＧＦ１６５（Ｂ）（１５日目、３０日目及び６０日目）の、ＥＬＩＳＡによる測定。ＢＣＡによって定量化したタンパク質１μgあたりに保持された成長因子（pg単位）で結果を表す。データを平均±標準偏差（ｎ＝サンプル６個）として示す。記号＊及び＊＊は、それぞれｐ＜０．０５及び＜０．０１の場合の、他のグループと比較した統計的な有意差を示す。
【図９Ａ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、ラットの大腿顆に施した臨界サイズの骨欠損部において、組織の高度な石化を誘導する。（Ａ）足場を用いないか（エンプティ）、又はマトリックス若しくはマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）を用いる移植後１５日（Ｄ１５）、３０日（Ｄ３０）及び９０日（Ｄ９０）の、ラットの大腿顆の代表的なマイクロＣＴ画像。（Ｂ）エンプティのグループ（白色長方形）、マトリックスグループ（灰色長方形）、及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（黒色長方形）の再構築した三次元マイクロＣＴ画像から、骨ミネラル量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）として示す。記号＊＊は、ｐ＜０．０１の場合の、他のグループと比較した統計的な有意差を示す。
【図９Ｂ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、ラットの大腿顆に施した臨界サイズの骨欠損部において、組織の高度な石化を誘導する。（Ａ）足場を用いないか（エンプティ）、又はマトリックス若しくはマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）を用いる移植後１５日（Ｄ１５）、３０日（Ｄ３０）及び９０日（Ｄ９０）の、ラットの大腿顆の代表的なマイクロＣＴ画像。（Ｂ）エンプティのグループ（白色長方形）、マトリックスグループ（灰色長方形）、及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）（黒色長方形）の再構築した三次元マイクロＣＴ画像から、骨ミネラル量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を測定した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４）として示す。記号＊＊は、ｐ＜０．０１の場合の、他のグループと比較した統計的な有意差を示す。
【図１０Ａ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、移植の９０日後、ラットの大腿顆に施した臨界サイズの骨欠損部において、高度な石化骨組織を誘導する；新たに形成された組織の組織学的分析。（Ａ）移植の９０日後のエンプティ、ラットの大腿顆に移植したマトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的非脱石灰化断面：Von Kossa染色。矢印は、骨欠損部の位置を示した。（Ｂ）移植後９０日のエンプティ、マトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的脱石灰化断面：Goldner染色、エンプティの骨欠損部では線維組織が形成されたのに対して、ＭＡＴＲＩＸ＋インプラント内では、マトリックスと直接接触して骨形成が起こり、増進された。
【図１０Ｂ】マトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）は、移植の９０日後、ラットの大腿顆に施した臨界サイズの骨欠損部において、高度な石化骨組織を誘導する；新たに形成された組織の組織学的分析。（Ａ）移植の９０日後のエンプティ、ラットの大腿顆に移植したマトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的非脱石灰化断面：Von Kossa染色。矢印は、骨欠損部の位置を示した。（Ｂ）移植後９０日のエンプティ、マトリックス及びマトリックス＋ｎ−ＨＡ（ＭＡＴＲＩ＋）サンプルの代表的な組織学的脱石灰化断面：Goldner染色、エンプティの骨欠損部では線維組織が形成されたのに対して、ＭＡＴＲＩＸ＋インプラント内では、マトリックスと直接接触して骨形成が起こり、増進された。
【００８６】
実施例
実施例１：無胸腺マウスの頭蓋冠部位における本発明の足場の移植。
材料と方法
ナノヒドロキシアパタイトの調製
０．６Ｍリン酸溶液（H3PO4Rectapur, Prolabo（登録商標）, France）及び１Ｍ水酸化カルシウム溶液（CaOH2 Alfa Aesar, Germany）を使用する湿式化学沈殿によって、ナノヒドロキシアパタイト（ｎ−ＨＡ）を調製した。１００mlのＨ３ＰＯ４溶液を１００mlのＣａＯＨ２溶液に、室温で激しく撹拌しながら３０分間かけて一滴ずつ加えた。反応終了時に、０．４．１０−３molの０．６Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、ｐＨを９に調整し、次いで、１２時間撹拌し続けた。
【００８７】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）走査電子顕微鏡法、及びＦＴＩＲ分析によって、ナノヒドロキシアパタイト（ｎ−ＨＡ）を特性決定した。ＴＥＭにより、ｎ−ＨＡが、５０nm長の針状結晶であることが明らかになった。ＦＴＩＲ分析により、５５９cm-1、６０１cm-1及び１０１８cm-1のリン酸イオンの特異的結合、及び１４１５cm-1の非特異的炭酸結合が示された。
【００８８】
複合多糖足場（ＭＡＴＲＩ＋）の調製
９ｇのプルラン及び３ｇのデキストランを、１４ｇのＮａＣｌを含む２７mLの蒸留水及び１３mLのナノヒドロキシアパタイト懸濁液（ｎ−ＨＡ、６．３６％w/v）に溶解させることによって調製したプルラン／デキストラン７５：２５の混合物（プルラン, MW 200,000, Hayashibara Inc, デキストランMW 500,000, Pharmacia）を使用して、マクロ多孔質複合足場（ＭＡＴＲＩ＋）を調製した。アルカリ性条件下、トリメタリン酸三ナトリウムＳＴＭＰ（Sigma）を使用して、化学的架橋を行った。つまり、１mLの１０Ｍ酸化ナトリウムを１０ｇの多糖混合物に加え、続いて、３００mgのＳＴＭＰを含む１mLの水を加えた。５０℃で１５分間インキュベーションした後、得られた足場を直径６mmの円板に切断し、ＰＢＳ１０Ｘ（ｐＨ７．４）中で中和し、次いで、０．０２５％ＮａＣｌ溶液で広範囲に洗浄した。凍結乾燥工程後、多孔質複合多糖足場を、使用するまで室温で保管した。架橋前に、１％のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）デキストラン（Sigma, St. Louis MO, USA）をこの混合物に加えることによって、蛍光足場を調製した。
【００８９】
ＡＤＳＣ培養及び骨形成分化
Gimble et al, 2007によって以前に記載されているように、０．１％（w/v）コラゲナーゼＩ型で分解した後のヒト脂肪組織から、脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）を単離し、培養した。基礎培地（１０％（v/v）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２培地（Invitrogen））、又はＡＤＳＣの骨芽細胞分化を誘導するための骨形成培地（１０％（v/v）ＦＢＳ（Lonza）、１０−８Ｍデキサメタゾン（Sigma）、５０mg/mlアスコルビン酸（Sigma）及び１０mMβ−グリセロリン酸塩（Sigma）を補充したＩＭＤＭ培地（Invitrogen））中で、残りの間質血管画分（ＳＶＦ）を培養した。
【００９０】
ヌードマウスの実験モデル
無胸腺マウスの頭蓋冠部位において、同所性新骨形成を評価した。１２週齢ヌードマウスをイソフルレン／Ｎ２Ｏ混合物で麻酔し、外科手術に供して、冠状の歯科用バーを使用して、左側及び右側頭頂骨に直径４mmの全層を作製した。ｎ−ＨＡを含まない円板状のマトリックス（グループ１）及びｎ−ＨＡを含む複合多糖足場ＭＡＴＲＩ＋（グループ２）を、頭頂骨の骨膜先端に移植した。グループ３は、移植前１週間に分化したＡＤＳＣに結合した複合多糖足場を移植したマウスに対応する。
【００９１】
異所性骨形成を研究するために、多糖に基づくマトリックス（グループ１）、細胞を含まない複合多糖足場（グループ２）又は分化したＡＤＳＣを予め播種したマトリックス（グループ３）を、無胸腺マウス（雌、１２週齢）の背側皮下腔に移植した。４つの足場をマウスに移植した。骨形成の後、移植後１５、３０及び６０日に非侵襲的高分解能Ｘ線断層撮影（マイクロＣＴ）分析を実施し、実験終了時（Ｄ６０）に組織学的検査を実施した。
【００９２】
高分解能Ｘ線断層撮影（マイクロＣＴ）分析
in vivo Explore Locus SP X-Rayマイクロコンピューター化断層撮影（マイクロＣＴ）装置（General Electric）において、等方性分解能４５μmで、マウスをスキャンした。回転中心の修正及びミネラル密度の校正をした後に、頭頂及び皮下領域の再構築を実施した。「Advanced Bone Analysis」（商標）ソフトウェア（GE）を使用して、骨の分析を実施した。バックグラウンドから石化要素を分離するために、ヒストグラムツールを使用して、濃淡値の閾値化を実施した。関心対象の領域（ＲＯＩ）において、石化組織の密度（ＴＭＤ）を決定した。
【００９３】
組織学的評価
実験期間の終了時に、マウスを安楽死させ、サンプルをばらばらにし、ＰＢＳ  ０．１Ｍ  ｐＨ７．４に溶解させた３．７％（v/v）パラホルムアルデヒド中で固定した。サンプルの一部分を脱石灰化し、パラフィンに包埋した。７ミクロンの永久切片を、ヘマトキシリン及びエオシン及びマッソントリクローム色素で染色した。Schenk et al, 1984によって記載されているように、サンプルの他の部分をメチルメタクリレートに包埋した。Leicaミクロトーム及びタングステンカーバイドブレードを使用して、縦切片（１５μmの厚さ）を調製した。切片をGoldnerトリクロム, Von Kossaで染色し、Nikon Eclipse 80i顕微鏡を使用して観察した。DXM 1200 C (Nikon)ＣＣＤカメラを使用して、写真を作製した。
【００９４】
結果
出発製剤にｎ−ＨＡを含め、PCT patent applications WO2009/047346及びWO2009/047347に開示されている方法に従って、３Ｄ多孔質マトリックス（図１）を得た。懸濁液中のｎ−ＨＡ（６．３６％（w/v））により、得られた３ＤマトリックスにおけるＨＡナノ粒子の均一分散が可能になった。ｎ−ＨＡマトリックスは、乾燥状態で、２．８＋／−０．１％（w/w）のＨＡを含んでいた。ｎ−ＨＡ懸濁液の代わりに乾燥形態のｎ−ＨＡを使用することにより、マトリックス内部に大きな凝集を誘導した。ｎ−ＨＡの存在下における３Ｄマトリックスは、特許取得済みのプロセスによってコントロールされる孔のサイズを有する多孔質（図２）である。
【００９５】
次いで、ｎ−ＨＡを含み（複合足場）ヒト脂肪由来間葉幹細胞（ＡＤＳＣ）を予め播種した直径４mmの円板の３Ｄ多孔質マトリックス、ｎ−ＨＡを含み（複合足場）ヒト脂肪由来間葉幹細胞（ＡＤＳＣ）を含まない前記３Ｄ多孔質マトリックス、ｎ−ＨＡを含まずヒト脂肪由来間葉幹細胞（ＡＤＳＣ）を予め播種した前記３Ｄ多孔質マトリックス、ｎ−ＨＡを含まずヒト脂肪由来間葉幹細胞（ＡＤＳＣ）を含まない３Ｄ多孔質マトリックスを、２つのマウスモデルにおいて評価した。
【００９６】
無胸腺マウスの頭蓋冠部位における同所性新骨形成により、ｎ−ＨＡに結合した多糖に基づくマトリックス（複合足場）のみが、ヌードマウスにおいて石化組織の形成を誘導したことが明らかになった。ｎ−ＨＡを含まない多孔質マトリックスは、６０日以内にいかなる石化も誘導しない。ヒト間葉幹細胞の非存在下、かつ、足場を骨欠損部から取り除いた場合であっても、複合マトリックスにより、同所性新骨形成が観察された（図３Ｂ）。移植後４週間に石化が起こり、時間とともに増加した（図３Ｃ）。組織学的検査（Goldnerトリクロム染色）により、ｎ−ＨＡを含まない多糖に基づくマトリックスを移植した場合には、線維組織が形成したのに対して、複合多糖足場は、マトリックス内のコラーゲンネットワークの局所産生に効率的な足場を提供することが明らかになった。
【００９７】
ｎ−ＨＡマトリックス（複合足場）は、骨欠損部外側の石化を誘導することが見出されたので、本発明者らは、異所性骨形成を刺激するその効力を次に調査した。本発明者らは、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスの移植により、６０日目においていかなる石化組織も形成されなかったことを観察した。対照的に、皮下部位におけるｎ−ＨＡマトリックス（本発明の複合多糖足場）の移植は、ＡＤＳＣを播種しなくても、移植後４週間に、高密度石化組織（図４Ａ及び４Ｂ）の形成をもたらした。石化は、時間とともに増加した。定量化により、移植後６０日において、石灰化組織のＴＭＤは約４２０mg/cm3であり、同所性部位（図４Ｃ）における移植した複合マトリックスの密度に近いことが示された。異所的に誘導した石化組織の非脱石灰化（図４Ｄ１）及び脱石灰化（図４Ｄ２）切片の組織学的分析により、ｎ−ＨＡマトリックス（複合多糖足場ＭＡＴＲＩ＋）は、高密度コラーゲンネットワーク及び血管形成、並びに骨芽細胞様細胞のリクルートを刺激したことが明らかになった（図４Ｄ３）。新たに形成された組織における石灰化のレベルを可視化するために、３０日目及び６０日目に、Von Kossa技術に従って、ｎ−ＨＡ／足場の切片を染色した（図４Ｅ）。パラフィン包埋複合多糖において、コントロールを実施した。この染色により、ｎ−ＨＡ／足場のかなり石灰化した組織が、移植の時間とともに増加することが示された。本発明者らの知る限りでは、幹細胞又は成長因子の非存在下でこの効果を与えることができる材料は、これまでになかった。
【００９８】
本発明者らは、比較のために、非骨性部位において、ｎ−ＨＡ単独の役割をさらに調査した。この目的のために、本発明者らは、皮下部位において、ｎ−ＨＡのみの移植を行った。１５日及び３０日後に、本発明者らは、異物に対する古典的な反応を観察しただけであった。実際、ｎ−ＨＡのみを移植した非骨性部位の非脱石灰化切片の組織学的検査（シアニンソロクロム染色）により、いかなる石化組織の存在も示されなかった。従って、ｎ−ＨＡのみの移植は、石化組織の形成をもたらさなかった。
【００９９】
従って、本発明者らは、本発明の多孔質複合多糖足場が、幹細胞又は成長因子の非存在下で、骨性部位及び非骨性部位において石化組織形成を刺激することによって、予想外の結果を提供することを示した。
【０１００】
実施例２：マウスの非骨性部位及びラットの骨性部位における本発明の足場の移植。
材料と方法
実施例１に記載されるように、本発明のナノヒドロキシアパタイト及び足場を調製した。本発明者らは、前記足場の移植を動物において評価した。手順及び動物処置は両方とも、National Society for Medical Researchによって策定されたPrinciples of Laboratory Animal Careに従った。認可（No: 3300048 of the Ministere de l’Agriculture, France）の下、University of Bordeaux Segalenの公認動物施設において研究を行い、Animal Research Committee of Bordeaux Universityによって承認された。
【０１０１】
マウスにおける非骨性移植：異所性骨形成分析
２つの異なる足場製剤：ｎ−ＨＡを含まない円板状マトリックス（グループ１）及びｎ−ＨＡを含む複合足場（ＭＡＴＲＩ＋）（グループ２）（直径４mm及び深さ６mmの円柱状）を、体重２５〜３０ｇの１２週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Charles River Laboratories, France）の背部に作製した皮下ポケットに挿入した。移植の１５、３０及び６０日後にサンプルを取り出し、マイクロＣＴ及び組織学的分析のために処理した。各グループにおいて、８個のサンプルを組織学的観察及びマイクロＣＴに使用した。
【０１０２】
ラットにおける骨性移植：同所性新骨形成分析
冠状の歯科用バーを使用して、体重１５０〜２００ｇのWistarラット（Charles River Laboratories, France）の左側及び右側大腿顆の両方に内部穴（直径５mm及び深さ６mm）を作製した。骨欠損部から骨片を除去し、足場を欠損部内に導入する前に、この穴を生理溶液（ＮａＣｌ０．９％（w/v））で洗浄した。２つの異なる足場製剤（ｎ−ＨＡを含まないマトリックス、及びｎ−ＨＡを含む複合足場）を、各骨欠損部に移植した。足場を用いないコントロール実験も行った。手術後１５、３０、６０及び９０日にインプラントを取り出し、マイクロＣＴ及び組織学的分析のために処理した。各グループにおいて、６個のサンプルをマイクロＣＴ及び組織学的観察に使用した。
【０１０３】
組織学的手順
各移植期間の終了時に、過剰量のペントバルビタールナトリウム（Nembutal（登録商標））を注射することによって、動物を安楽死させた。その後すぐに、インプラント及び周囲組織を取り出し、０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解させた４％（w/v）パラホルムアルデヒドで固定し、組織学の前にマイクロＣＴでスキャンした。次いで、組織学的分析のために、サンプルを調製した。一部分を脱石灰化し、脱水し、パラフィンに包埋した。薄片（厚さ７μm）を調製し、ヘマトキシリン及びエオシン、並びに類骨染色用のGoldnerトリクロムで染色した。他の部分を段階的な一連のエタノール中で脱水し、次いで、メチルメタクリレートで包埋し、続いて、これを重合させた。各インプラントから得られた４つの切片を用いて、改変したダイヤモンドブレードミクロトーム（Leica Microsystems SP1600, Rijswijk, The Netherlands）を使用して、１０〜１５μmの横切片を作製した。切片をGoldnerトリクロム、Von Kossaで染色し、Nikon Eclipse 80i顕微鏡を使用して観察した。DXM 1200 C (Nikon)ＣＣＤカメラを使用して、写真を作製した。
【０１０４】
マイクロコンピューター化断層撮影（マイクロＣＴ）
マイクロＣＴを使用して、インプラント及び周囲組織の三次元画像を現像した；これらのモデルを使用して、各移植部位における骨形成を定量化した。電源電圧８０kV、電流６０μA、及び分解能１５μmのex vivo General Electric (GE)マイクロＣＴ(Explore LP Locus, General Electric)を使用して、Ｘ線写真を得た。電源電圧１５０mV、電流４５０μA、及び分解能４５μmで、ｉｎ  ｖｉｖｏマイクロＣＴ（General Electric）を実施した。スキャン後、断面の切片を再構築し、Microviewソフトウェアを使用して３Ｄ分析を実施した。同じ閾値を使用して、各スキャン結果を再構築し、骨と空気とを区別した。各グループの骨ミネラル量（ＢＭＣ）及び骨ミネラル密度（ＢＭＤ）容量を測定し、スチューデントｔ検定を使用して統計的に分析した。
【０１０５】
皮下インプラントからのタンパク質抽出、並びにインプラント内に保持された骨形成因子及び血管新生成長因子のＥＬＩＳＡ分析
プロテアーゼ阻害剤（１０μg/mlアプロチニン（Sigma）、１０μg/mlロイペプチン（Sigma）及び１mM（４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）（Fluka）のカクテルを含むＰＢＳ中、電動破砕機を用いて、移植の２、１５、３０及び６０日後に取り出した皮下インプラントを氷上で破砕した。次いで、溶解物を１６０００rpm、４℃で２０分間遠心分離した。上清を回収し、次いで、ＥＬＩＳＡ分析のために−８０℃で凍結した。Smith PK et al. (1985)によって記載されているビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキット (Thermoscientific)を使用して、タンパク質の定量化を実施した。５５０nmで吸光度を読み込んだ。毎回の移植に関してそれぞれ、ｎ−ＨＡを含まないマトリックス（グループ１）及びｎ−ＨＡサンプルを含む複合足場ＭＡＴＲＩ＋（グループ２）が８個あった。マウスＶＥＧＦ免疫アッセイキット（MMV00, Quantikine（登録商標）, R&D sytems）、及びＢＭＰ−２免疫アッセイキット（DBP200, Quantikine（登録商標）, R&D sytems）をそれぞれ用いて、２つの異なるインプラント製剤内に保持されたＶＥＧＦ１６５及びＢＭＰ２の量を定量化した。
【０１０６】
Ｘ線回折分析
移植の１５、３０及び６０日後に、ｎ−ＨＡを含まないマトリックス及びｎ−ＨＡを含む複合足場ＭＡＴＲＩ＋の皮下インプラントを取り出した。いかなる有機組織も含まない微粉を得るために、それらを漂白剤により室温で２時間処理し、次いで、遠心分離してペレットのみの状態を維持した。二次モノクロメーターを備えるPANalytical X’pert MPD回折計(Bragg Brentano t-t geometry)及び銅放射線（平均λ＝１，５４１８Ａ°）を使用して、Ｘ線回折（ＸＲＤ）によって、構造特性を調査したところ、作用張力及び強度は、それぞれ４０kV及び４０mAであった。
【０１０７】
サンプルをシリコン製の単結晶ウエハーサンプルホルダー上に置いた。同じパラメーターを用いて、ディフラクトグラムをすべて測定した：角度範囲８〜８０°（２ｔ）、工程：０，０２°、測定時間：１時間；材料のＸ線回折（ＸＲＤ）分析後の、JCPDS-ICDDデータ（Diffract-Plus Eva Software, Bruker（登録商標））による相同定は、六方格子パラメーター（ａ＝９．３８９２Ａ°；ｃ＝６．９０１９Ａ°；α＝β＝９０°及びｇ＝１２０°；空間群：Ｐ６３／ｍ（１７６））を示す炭酸ヒドロキシアパタイト［Ｃａ１０（ＰＯ４）３（ＣＯ３）０，０１（ＯＨ）１，３］と適合した。
【０１０８】
統計的分析
すべてのデータを平均±標準偏差（ＳＤ）として表し、スチューデントｔ検定の標準分析を使用して分析した。ｐ＜０．０５（ａ）又はｐ＜０．０１（ｂ）の場合、差が有意であると考えた。
【０１０９】
結果
２つの異なる足場（ｎ−ＨＡを含まないマトリックス（グループ１）及びｎ−ＨＡを含む複合足場ＭＡＴＲＩ＋（グループ２））を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１５、３０及び６０日間移植した。両グループに関して、マイクロＣＴ、石化の定量化（ＢＭＣ及びＢＭＤ分析）、及び組織学的研究を実施した。マイクロＣＴ（図５Ａ）並びにＢＭＣ及びＢＭＤの定量化（図５Ｂ）によって示されるように、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスの移植により、１５日目〜６０日目に、いかなる石化組織も形成されなかった。対照的に、各時点（図１Ｂ）で測定したＢＭＣ（骨ミネラル量）及びＢＭＤ（骨ミネラル密度）によって定量化すると、ｎ−ＨＡを含むマトリックス（いかなる細胞及び成長因子も含まない）の皮下部位における移植は、高密度石化組織の形成をもたらす（図５Ａ）。石化プロセスは、１５日目に足場周辺から始まり（図１Ａ）、移植の６０日後に高密度石化組織をもたらす。
【０１１０】
組織学的データから、多孔質ｎ−ＨＡマトリックスは、ＭＡＴＲＩ＋の非脱石灰化切片のvon Kossa染色によって実証されるように、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスと比較して、１５日目及び６０日目に好ましい石化組織反応を示した。ＭＡＴＲＩ＋移植の６０日後のVon kossa染色は、１５日目の同じ足場と比較して強い。von kossaで染色した移植前のｎ−ＨＡマトリックスは、足場内のナノヒドロキシアパタイトの存在により、わずかな染色を示した（データは示さず）。しかしながら、この染色は、移植の３０及び６０日後に観察されたものよりもかなり弱い。
【０１１１】
また、ＭＡＴＲＩ＋の脱石灰化切片（図６Ｂ）において移植後６０日に実施したGoldner染色により、主にインプラント周辺の高密度線維状コラーゲン組織が明らかになった。いくつかのコラーゲン組織は、足場内に浸透し、白色矢印によって示されるいくつかの内側骨芽細胞様細胞（これは、組織学的写真の黒色矢印によってマークされる足場及び多数の血管と接している）を示している。移植のいかなる時点でも、炎症事象は、両足場で検出できななかった。
【０１１２】
移植前（Ｄ０）のｎ−ＨＡマトリックス、又は１５日目（Ｄ１５）に取り出したｎ−ＨＡマトリックスの粉末のＸＲＤパターンにより、スペクトルにおける１５日目のヒドロキシアパタイトの特異的ピークが明らかになった（図７Ａ）。おそらくはサンプルを漂白剤で処理したために、岩塩のピーク（Ｈ）がすべてのスペクトルにおいて観察された。両グループに関して、３０日目及び６０日目に得られたＸＲＤパターンは、１５日目に観察されたものと類似していた（データは示さず）。
【０１１３】
本発明者らは、ｎ−ＨＡマトリックスが、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスと比較して、内因性の骨形成及び血管新生成長因子と相互作用し得るかも調査した。本発明者らは、血管新生及び骨形成において基本的な役割を果たす２つの主な成長因子（アイソフォームＶＥＧＦ１６５及びＢＭＰ２）（これらは、それ自体が石化及び骨形成を誘導し得る骨誘導因子である）を試験した。２日間の移植は、材料の移植後に観察された炎症期に対応し、両サンプルは、程度は異なるが２つの成長因子を保持していた。注目すべきことに、ＭＡＴＲＩ＋に保持されたＢＭＰ２の量は、サンプルから抽出したタンパク質１μgあたり１．４１pgであるのに対して、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスは、タンパク質１μgあたり０．１２pgしか保持していない。ＶＥＧＦ１６５の場合、ＭＡＴＲＩ＋に保持された量、及びｎ−ＨＡを含まないマトリックスに保持された量は、それぞれタンパク質１μgあたり０．０８９pg及びタンパク質１μgあたり０．０５５pgである。移植の時間とともに、及び高密度石化組織の形成中、ＢＭＰ２（図８Ａ）及びＶＥＧＦ１６５（図８Ｂ）の濃度は、２日後に得られたデータと比較して、両グループにおいて減少したが、移植の３０及び６０日後のＭＡＴＲＩ＋グループでは、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスと比較して、依然として有意に高いままである。
【０１１４】
足場（ｎ−ＨＡを含まないマトリックス（グループ１）及びｎ−ＨＡを含む複合足場ＭＡＴＲＩ＋（グループ２））を、ラットの大腿顆における臨界サイズの骨欠損部（直径５mm及び深さ６mm）に１５、３０及び９０日間移植した。両グループに関して、マイクロＣＴ、石化の定量化（ＢＭＣ及びＢＭＤ分析）、及び組織学的分析を実施した。マイクロＣＴによって示されるように、ｎ−ＨＡを含むマトリックス（ＭＡＴＲＩ＋）（図９Ａ）は、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスと比較して、骨欠損部内に非常に高密度な石化組織を形成した。ＢＭＤ及びＢＭＣ（図９Ｂ）の定量化分析によって示されるように、石化は、移植の１５日目〜９０日目にかけて、移植の時間とともに増加している。コントロールグループ（エンプティ）におけるＢＭＤ及びＢＭＣは、移植のいかなる時点でも、他のグループよりも依然として低いままである。
【０１１５】
移植の９０日後の組織学的データにより、ｎ−ＨＡを含むマトリックス（ＭＡＴＲＩ＋）のvon Kossaによる染色は、ｎ−ＨＡを含まないマトリックスのみ又はエンプティのグループと比較して強いことを確認した（図１０Ａ）。Goldner染色により、エンプティの骨欠損部では線維組織なのに対して、移植の９０日後のＭＡＴＲＩ＋インプラント内では骨形成が増進され、ＭＡＴＲＩ＋インプラントとの直接接触が起こったことが明らかになった（図１０Ｂ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月25日(2019.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
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